(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
混合装置（１２）と、リアクター壁（１６）によって画定されている反応室（１４）とを含む細胞培養装置（１０）であって、リアクター壁（１６）が気体および／または液体を添加するための少なくとも１つの接続部（１８、２０）を有し、反応室（１４）が内部体積（１５）を有し、反応室（１４）が、内部体積（１５）が初期の最小内部体積に対して少なくとも５００％拡張可能であるように形成され、
前記リアクター壁（１６）が伸長可能な材料を有しており、伸長可能な材料が少なくとも２００％の伸長性を有しており、
前記伸長可能な材料が弾性材料であり、除荷時に、負荷前に存在していた未変形の初期状態に戻ることを特徴とする、装置。
【請求項２】
伸長可能な材料が、天然ゴム、合成ゴム、ポリイソブチレン、シリコーンゴム、またはその混合物を含有していることを特徴とする、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
初期の最小内部体積が２ｍＬ〜１Ｌの範囲内にあり、１０Ｌ〜１００Ｌの最大内部体積へと拡張可能であることを特徴とする、請求項１または２に記載の装置。
【請求項４】
気体および／または液体を加えるため少なくとも１つの接続部（１８、２０）が、リアクター壁（１６）の伸長可能な材料を通り抜けていることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項５】
以下のステップ：
ａ）必要に応じて、８０℃〜１５０℃の温度でまたはガンマ線によりリアクター壁（１６）を滅菌するステップ、
ｂ）装置を充填するステップであって、細胞（２９）および必要に応じて第１の液体培地を反応室（１４）に入れるステップ、
ｃ）反応室（１４）内に第２の液体培地（２６）および／または気体を分注するステップであって、第２の液体培地が第１の液体培地（２６）の組成に対応する組成を有することが好ましく、
かつ
反応室（１４）の内部体積（１５）を、初期の最小内部体積に対して少なくとも５００％拡張するステップ、
を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の装置内での細胞培養方法。
【請求項６】
リアクター壁（１６）が伸長可能な材料を有しており、伸長可能な材料がステップｃ）で伸長されることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
第２の液体培地（２６）が、連続的におよび／または段階的に加えられることを特徴とする、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
反応室（１４）内で、細胞（２９）と、第２の液体培地（２６）と、必要に応じて第１の液体培地とが混合されることを特徴とする、請求項５から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップｃ）での分注の前および後で、液相（２８）が、内部体積（１５）の１０体積％〜８０体積％を占めることを特徴とする、請求項５から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
反応室（１４）内の細胞（２９）が、懸濁培養液中で存在することを特徴とする、請求項５から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
リアクター壁（１６）を、細胞培養の後に再使用することを特徴とする、請求項５から１０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、混合装置と、リアクター壁によって画定されている反応室とを含む細胞培養装置であって、リアクター壁が気体および／または液体を加えるための少なくとも１つの接続部を有し、反応室が内部体積を有する、細胞培養装置に関する。さらに本発明は、この装置内での細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞を培養するためのバイオリアクターは、反応室として、ガラス製、特殊鋼製、またはプラスチック製の容器を含むことが多く、これらの容器は、様々であるが固定した大きさを有している。ガラス製または特殊鋼製の容器は通常、複数回使用可能なリアクターとして用いられ、使用後に洗浄し、滅菌して、再利用される。特にプラスチック製の反応容器は、シングルユースとも呼ばれる１回の使用に限定されることがある。
【０００３】
さらに、プラスチック製のバイオリアクターであって、バッグの形態を有し、かつ使用中は通常シェーカー上に配置されるものが知られている。このバイオリアクターは、ウェーブバイオリアクター（Wave-Bioreaktoren)とも呼ばれる。
【０００４】
特に細胞を培養するための従来の反応容器は、予め定められた固定の反応体積を提供し、この固定の反応体積は、容器の大きさに柔軟性がないこと及び一般的には容器の形状にも柔軟性がないことに起因する。
【０００５】
反応体積が数リットルの、特に反応体積が１ｍ３超の産業規模のバイオリアクターに細胞を接種することを可能にするためには、ｍＬ規模の少量のスターター培養物のストックされた細胞から開始し、大きな反応体積に対して十分な量の細胞を製造しなければならない。このために、シードトレイン（英語：seed train）とも呼ばれるシードトレイン（独語：Anxuchtschiene）の枠組みの内で、細胞は小さな容器から次のより大きな容器に段階的に移され、そこで次のより大きな容器への次の移入まで細胞増殖が続けられる。
【０００６】
この一連の前培養では、細胞は、理想的には全体的に指数増殖期にある。細胞をより大きな容器に移すことを、植替え、継代、または植継ぎとも呼ぶ。多くの細胞が、対数増殖期または対数期とも呼ばれる指数増殖期に入るために、ある特定の細胞密度を必要とするので、細胞をより大きな体積に移す必要がある。細胞密度は通常、細胞培養液の体積当たりの細胞数として定義される。最大細胞密度に達すると、単位時間当たりの細胞数の増加を意味する細胞増殖がしばしば低下する。培地を希釈したり、またはさらなる培地を加えたりする可能性は、容器の固定された体積に起因して限定的である。
【０００７】
シードトレインにおける細胞増殖は、細胞の拡張とも表現される。シードトレインにおける拡張の目的は、産業的規模でのバイオリアクターの、植付けまたは播種とも呼ばれる接種に用い得る接種源とも呼ばれる接種材料の提供である。つまり、細胞株拡張とも表現される細胞拡張とは、通常は複数のプロセスステップを通して段階的に培養体積を拡張し、細胞を増やすことである。
【０００８】
細胞は、しばしば細胞懸濁液中に存在しており、細胞およびその細胞外代謝産物が、通常は水性培養液中に懸濁している。
【０００９】
Ｍ．Ｈｏｗａｌｄｔらは、「Ｋｕｌｔｉｖｉｅｒｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｓａｅｕｇｅｔｉｅｒｚｅｌｌｅｎ」、Ｂｉｏｐｒｏｚｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋ、第３版、Ｓｐｅｋｔｒｕｍ  Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、２０１１、４１０〜４１３頁において、哺乳動物細胞技術の産業的利用を説明しており、アップストリームプロセスの核心部分は、細胞バンク、接種、および発酵を含む。発酵のために、細胞バンクから一定分量を解凍して、振とうフラスコまたはスピナー内で培養する。その後この細胞を、生産の前段階としての細胞増大に用いる次に大きな培養容器、例えばスピナー、ウェーブバイオリアクター、または特殊鋼製バイオリアクターに植え替える。培養発酵槽で、可能な限り速く大きな細胞数を生成することで、短時間内に生産発酵槽に高い播種密度で接種することができるようになる。
【００１０】
ＥＰ２５４３７１９Ａ１は、メアンダー型バイオリアクターと、造血細胞の動的拡張、分化、および収穫のための方法を説明している。このバイオリアクターは、互い違いに配置された隔壁が底面に備えられたバイオリアクター容器を含み、これらの隔壁が、培地を層流でメアンダー状にガイドする。複数のメアンダー型バイオリアクターを、遮断弁を介してモジュール式に直列接続することができる。供給される細胞は、底面をほぼ覆い隠す細胞層を形成する。
【００１１】
Ｔ．Ｈ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚらは、「Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｐａｓｓａｇｉｎｇ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｅｅｄ  Ｔｒａｉｎｓ」、ＢＭＣ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ、２０１５、９（補遺９）：４３頁で、シードトレインを最適化するためのソフトウェアベースのツールを説明しており、細胞培養物をある規模から次に大きな規模に植え継ぐ最適な時点を算出している。
【００１２】
Ｂ．Ｗｒｉｇｈｔらは、「Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｓｅｅｄ−Ｔｒａｉｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ」、ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  １３（３）ｓ、２０１５年３月、１６〜２５頁において、改善したシードトレインを従来のシードトレインと対比させており、改善されたシードトレインの必要な時間および複雑さを、高細胞密度培養物の使用によって低減している。
【００１３】
製造元Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨの培養用バッグの取扱いに関するガイドライン、Ｈａｎｄｌｉｎｇ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ＭＡＣＳ（登録商標）ＧＭＰ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｂａｇｓ、２０１３年９月では、細胞拡張のための培養バッグが説明されており、この培養バッグは３つのチャンバーに区分されており、これらのチャンバーは、溶着継目の開放により、１００ｍＬの体積へと相互に結合することができる。
【００１４】
細胞拡張の際に細胞を次に大きな容器へと段階的に植継ぐのは、時間および手間のかかる作業工程である。それだけでなく植継ぎの際は細胞が一時的に培養容器外にあるため、細胞培養物の望ましくないコンタミネーションまたは汚染のリスクが上昇する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の課題は、細胞拡張の際の様々な大きさの複数の容器への細胞の植継ぎが不要な装置および方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記の課題は、混合装置と、リアクター壁によって画定されている反応室とを含む細胞培養装置であって、リアクター壁が気体および／または液体を加えるための少なくとも１つの接続部を有し、反応室が内部体積を有し、反応室が内部体積が、初期の最小内部体積に対して少なくとも５００％、好ましくは少なくとも７００％、より好ましくは少なくとも１０００％、さらに好ましくは少なくとも１５００％、特に好ましくは少なくとも２０００％拡張可能であるように、または反応室の水平断面が下から上に向かって増大するように形成されている、細胞培養装置によって解決される。内部体積は、初期の最小内部体積に対して１００００％を超えて拡張できないことが好ましい。
【００１７】
更にこの課題は、以下のステップを含む、本発明による装置内での細胞培養方法によって解決される。
ａ．必要に応じて、８０℃〜１５０℃の温度でまたはガンマ線によりリアクター壁を滅菌するステップ、
ｂ．装置を充填するステップであって、細胞および必要に応じて第１の液体培地を反応室に入れるステップ、
ｃ．反応室内に第２の液体培地および／または気体を分注するステップであって、第２の液体培地が第１の液体培地の組成に対応する組成を有することが好ましく、
かつ
反応室の内部体積が、初期の最小内部体積に対して少なくとも５００％、好ましくは少なくとも７００％、より好ましくは少なくとも１０００％拡張するステップ、
または
水平断面が下方から上方に向けて増大している反応室内の充填高さを上昇させ、反応室内の、第２の液体培地および必要に応じて第１の液体培地を含む液相の体積が、初期の最小液体体積に対して少なくとも５００％増加するステップ。
【００１８】
反応室の内部体積を少なくとも５００％拡張できるようにしたことにより、より大量の液体培地を同じ容器に加えることができ、したがって、反応室内の細胞数が増えていくにもかかわらず、液体培地の体積に対する細胞密度が最大細胞密度を上回らず、より大きな容器への細胞培養物の植継ぎが回避される。
【００１９】
本発明に基づく可変の反応室の内部体積は、拡張した最終体積だけでなく初期の最小内部体積も調整可能であるという理由でも有利である。これは、始めに細胞および培地を含む少量の細胞培養物だけが存在しているときに、大きな容器を使用することに比べて、細胞培養物のより小さな表面積対体積比を可能にする。特に、細胞培養物、即ち液相と、同様に容器内に存在している気相との間の始めの相界面も比較的小さい。
【００２０】
これに対し、比較的大きな容器内に少量の細胞培養物しか存在していない場合は、細胞培養物の表面積対体積比が大きく、細胞の乾燥に至るほどの培地の蒸発が生じる。これは、特に細胞の培養が室温より高い温度で実施される場合に該当する。
【００２１】
細胞培養物中の最小細胞密度を下回ることも細胞増殖を低下させ得るという理由からも、細胞拡張の始めに存在している細胞培養物の体積は通常は小さい。
【００２２】
反応として既に細胞増殖が理解されている本発明による反応室の内部体積は、細胞培養物の所望の細胞密度を有する所望の体積に達するまで、反応室内に存在している細胞数に実質的に対応しながら増大する。この反応室は、細胞培養物の拡張中に膨張し、必要に応じてその形状を変化させる。
【００２３】
より小さな容器からより大きな容器への細胞の植継ぎを回避することにより、望ましくないコンタミネーションのリスクが低下する。作業の手間ならびに更なる容器の材料および洗浄のための費用も節減される。
【００２４】
内部体積は、連続的な体積であることが好ましい。連続的な体積とは、本発明の範囲内では、例えば管結合またはチューブ結合だけで相互に結合している複数の区間への区分が存在しないことを意味する。
【００２５】
本発明の範囲内では、反応室の最も小さい調整可能な内部体積を、初期の最小内部体積と呼んでいる。初期の最小内部体積は、好ましくは２ｍＬ〜１Ｌの範囲内、より好ましくは５ｍＬ〜５００ｍＬの範囲内、特に好ましくは５ｍＬ〜１００ｍＬの範囲内にある。初期の最小内部体積は、反応室の最大内部体積へと拡張することができ、最大内部体積は、好ましくは１０Ｌ〜１００Ｌの範囲内、特に好ましくは１５Ｌ〜５０Ｌの範囲内にある。
【００２６】
内部体積は、連続的に拡張可能であることが好ましい。連続的に拡張可能とは、本発明の範囲内では、内部体積がその期間にわたって均一に増加すること、および／または最大内部体積までの内部体積の増加の全ての程度を無段階で調整可能であることを意味する。
【００２７】
リアクター壁は、生体適合性で、細胞培養物に対して毒性のない壁材料を有することが有利である。壁材料は、液体を透過せず、かつ熱、放射線、および／または化学物質による滅菌に対して安定していることが好ましい。
【００２８】
壁材料は、好ましくは１０℃〜１５０℃の範囲内で、より好ましくは２５℃〜１３０℃の範囲内で温度安定性である。それに加えて、壁材料は、好ましくはｐＨ５〜ｐＨ８の範囲内、より好ましくはｐＨ６〜ｐＨ７の範囲内のｐＨ値をもつ液体の存在下で安定している。さらに壁材料は、水中での膨潤挙動が低く、かつ水および水溶液に対して化学的および物理的に耐性があることが好ましい。
【００２９】
さらに壁材料は、好ましくは０．７〜１．６ｇ／ｃｍ３の範囲内、より好ましくは０．９〜１．６ｇ／ｃｍ３の範囲内、特に好ましくは０．９〜１．１ｇ／ｃｍ３の範囲内の密度を有している。
【００３０】
リアクター壁は、壁材料として、伸長可能な材料を有することが好ましく、伸長可能な材料が少なくとも２００％の伸長性を有することが好ましく、および／またはリアクター壁は、第１の部分および第２の部分を有しており、第１の部分は可動であり、第２の部分に対して液密に結合して配置されている。
【００３１】
伸長可能な材料がステップｃ）で伸長されることが好ましく、および／またはステップｃ）でリアクター壁の第１の部分がリアクター壁の第２の部分に対して移動する。
【００３２】
伸度εとは、通常は負荷下での物体の相対的な長さ変化のことであり、特に元の長さｌ０に対する長さ変化Δｌの比のことである。
【００３３】
【数１】
0006942201.tif 000002
【００３４】
伸長可能な材料は、少なくとも２つの空間方向に伸長可能であることが好ましく、これに関し提示された伸長性は、２つの空間方向の少なくとも１つに関する。
【００３５】
伸長性は、材料の形状を変化させる力の作用下での、伸長可能な材料の特性を表しており、材料が、割れるかまたは裂けることなくどのくらい伸長し得るかを示している。通常は、引裂伸度とも呼ばれる伸長性を、ＤＩＮ  ５３５０４：２０１７−０３に基づく引張試験によって測定する。
【００３６】
フックの法則は、伸度εの応力σへの依存性を表しており、Ｅは弾性率（Ｅ−Ｍｏｄｕｌ）とも呼ばれる弾性率（Ｅｌａｓｔｉｚｉｔａｅｔｓｍｏｄｕｌ）である。
【００３７】
【数２】
0006942201.tif 000003
【００３８】
伸長可能な材料は、ＤＩＮ  ５３５０４：２０１７−０３に対応して決定可能な弾性率を、好ましくは０．１〜０．５ＧＰａ、より好ましくは０．０２〜０．１ＧＰａ、特に好ましくは０．０３〜０．０７ＧＰａの範囲内で有している。さらに、伸長可能な材料のＤＩＮ  ＩＳＯ  ７６１９−１：２０１２−０２に基づいて決定可能なショアＡ硬度は、好ましくは２０〜１００の間、より好ましくは３０〜８０の間である。
【００３９】
伸長可能な材料は、高い弾性を有することが好ましい。材料が弾性と呼ばれるのは、除荷時に、負荷前に存在していた未変形の初期状態に戻る場合である。
【００４０】
伸長可能な材料はさらに、好ましくは３．５〜４１．４ＭＰａ、より好ましくは５．５〜３５．９ＭＰａの範囲内の引張強度を有している。伸長可能な材料の伸長性は、より好ましくは少なくとも３００％、さらに好ましくは少なくとも３３０％、特に好ましくは少なくとも５００％である。伸長可能な材料の伸長性は、通常は最大５０００％、好ましくは最大２０００％、より好ましくは最大１５００％である。引張強度および伸張性を決定するための測定法は、ＤＩＮ  ５３５０４：２０１７−０３に記載されている。
【００４１】
伸長可能な材料は、少なくとも１種のエラストマー、特に熱可塑性エラストマーを含有することが好ましい。伸長可能な材料はさらに、合成ゴム、例えばスチレンブタジエンゴム、クロロプレンゴム、ポリブタジエンゴム、エチレンプロピレンジエンゴム（ＥＰＤＭ）、シリコーンゴム、フッ素ゴム、ニトリルゴム、ポリウレタン（ＰＵ）、水素化アクリロニトリルブタジエンゴム（ＨＮＢＲ）、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、およびポリイソプロペン（ＰＩ）、天然ゴム、例えばラテックス、ならびにその混合物からなる群から選択されるポリマーを含有することが好ましい。
【００４２】
特に好ましいのは、伸長可能な材料が、ポリイソプロペン、ポリブチレン、および／またはシリコーンを含有することである。伸長可能な材料は、伸長可能な材料に対して好ましくは５０重量％超、特に好ましくは８０重量％超、特に好ましくは９０重量％超で、ポリイソプロペン、ポリブチレン、および／またはシリコーンを含有している。好ましいのは、伸長可能な材料が、伸長可能な材料に対して最大１００重量％で、ポリイソプロペン、ポリブチレン、および／またはシリコーンを含有することであり、特に好ましいのは、伸長可能な材料が、ポリイソプロペン、ポリブチレン、および／またはシリコーンを含むことである。
【００４３】
伸長可能な材料は、添加物、例えばタンパク質、特にカゼインおよび／またはコラーゲンを更に含有することができる。好ましいのは、伸長可能な材料が、カルボン酸エステル、脂肪、油、および樟脳のような軟化剤を含有することである。
【００４４】
天然ゴムおよび合成ゴムは、これらが高い弾性を有するので特に適している。ポリウレタンは、高い融解温度という利点を有している。
【００４５】
リアクター壁のうち反応室に向いている面が拡張可能であることが好ましい。この面は、本発明による方法のステップｃ）で拡張されることが好ましい。有利なのは、反応室に向いている面を拡張するために、伸長可能な材料が伸長されることである。伸長可能な材料が、第２の液体培地および／または気体を反応室内に分注することによって伸長されるのが好ましい。第２の液体培地および／または気体の分注は、昇圧状態での搬送によって行われることが好ましい。
【００４６】
その代わりに又はそれに加えて、リアクター壁の第２の部分のうち反応室に向いており、かつ反応室を画定している面が大きくなるように、リアクター壁の第１の部分が、リアクター壁の第２の部分に対して変位される。この場合、リアクター壁の第２の部分の一区間は、最初は反応室と直接的には接触しておらず、リアクター壁の第１の部分の変位によって初めて直接的に反応室に向かい、反応室を画定する。この場合、第１の部分および第２の部分は、リアクター壁の第１の部分と第２の部分の間の耐密だが可動の結合が存在するように配置されている。この液密結合部は、好ましくはゴムパッキンまたはゴムリップを含んでいる。
【００４７】
一実施形態では、リアクター壁が、管とも呼べる円筒側面の形状を有することが有利である。この側面の一方の側は、底面によって固定的に密閉されていることが好ましい。側面および必要に応じてこの底面が、リアクター壁の第２の部分であることが好ましい。リアクター壁の第１の部分は、第２の底面を含むことが好ましく、この第２の底面は、蓋と呼んでもよく、側面のもう一方の側で、より好ましくは側面の内側で、可動に配置されている。
【００４８】
さらなる一実施形態では、反応室が、反応室の水平断面が下から上に向かって増大するように形成されており、これに関し、下から上に向かう方向は、重力方向の逆である。反応室の水平断面は、連続的に増大していることが好ましく、これに関してより好ましいのは、第１の高さでの反応室の第１の水平断面が、第２の高さでの反応室の第２の水平断面の少なくとも２倍の大きさであり、第１の水平断面が第２の水平断面より上にあることであり、特に好ましいのは、第１の水平断面と第２の水平断面の間に、反応室の鉛直方向の最大広さの５０％未満に相当する間隔があることである。本発明による方法の過程で、反応室内の液相の充填レベルが増加し、その結果、水平断面が下から上に向かって増大している反応室内の充填高さが高くなり、かつ反応室内の、第２の液体培地および必要に応じて第１の液体培地を含んでいる液相の体積が、初期の最小液体体積に対して少なくとも５００％、より好ましくは少なくとも１０００％増加し、好ましくは１００００％を超えては増加しない。初期の最小液体体積とは、ステップｃ）で第２の液体培地が分注される前の反応室内の液相の体積を表している。初期の最小液体体積は、好ましくは１．５ｍＬ〜８００ｍＬの範囲内、より好ましくは３ｍＬ〜４００ｍＬの範囲内、特に好ましくは４ｍＬ〜１００ｍＬの範囲内にある。充填高さは、液相に関しており、リアクター壁またはリアクター底から気相に面した液体表面までの鉛直方向の最長間隔を表している。液相の体積に対する反応室内の液相と気相の間の相界面の比は、第２の液体培地の分注の際に、好ましくは１０倍未満、より好ましくは５倍未満で変化する。反応室は、必要に応じて、好ましくは柔軟な材料を含有する蓋で密閉されている。この蓋に、気体および／または液体を加えるための少なくとも１つの接続部を配置してもよい。
【００４９】
このリアクター壁は円錐形状を有することが好ましく、これに関して円錐の先端は、下方、即ち重力方向に向いている。
【００５０】
その代わりに又はそれに加えて、リアクター壁を、少なくとも部分的に蛇腹として実施することができ、このリアクター壁は、少なくとも部分的にアコーディオン状に折り畳まれている。
【００５１】
装置および特にリアクター壁は、１回の使用または複数回の使用のために形成することができる。１回の使用の場合には、反応室を使い捨てリアクターまたはシングルユースリアクターと呼ぶこともできる。この場合、特にリアクター壁は、細胞を培養するために１回使用した後に廃棄される。必要に応じて複数回使用するためには、少なくともリアクター壁ならびに気体および／または液体を加えるための少なくとも１つの接続部を、好ましくは細胞培養装置のうち細胞と接触するすべての面を、細胞培養の終了後に洗浄し、滅菌して、繰り返し用いる。
【００５２】
本発明による方法のステップｂ）では、反応室内に細胞および必要に応じて第１の液体培地を準備する。その代わりに、最初に細胞を反応室内に準備し、この細胞をその後、好ましくは本発明による方法のステップｃ）で第２の液体培地中に懸濁させてもよく、または最初に第１の液体培地を準備し、この第１の液体培地にその後、細胞を加えてもよい。
【００５３】
第１の液体培地と第２の液体培地は同じ組成を有することが好ましい。同じ組成とは、第１および第２の液体培地中の細胞の細胞外代謝産物の含有率が異なる場合も含んでいる。つまり、細胞を第１の液体培地中の懸濁液の状態で準備することができ、この細胞はその後、第２の液体培地を加えても希釈されるだけであり、したがって細胞懸濁液は、実質的には、ステップｃ）の前と後で細胞密度だけは異なるが、培地の組成は異ならない。
【００５４】
代替的な一実施形態では、第１の液体培地の組成と第２の液体培地の組成が相違していてよい。つまり、例えば第２の液体培地の組成を細胞の増殖期の進行に適合することができる。
【００５５】
第２の液体培地および必要に応じて第１の液体培地は、水を好ましくは少なくとも５０重量％、より好ましくは少なくとも７５重量％、特に好ましくは少なくとも９０重量％含有している。第２の液体培地および必要に応じて第１の液体培地は、水を最大で９９重量％含有することが好ましい。
【００５６】
第２の液体培地および必要に応じて第１の液体培地はさらに、無機塩、例えばＣａＣｌ２、Ｆｅ（ＮＯ３）３、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４、ＮａＣｌ、ＮａＨ２ＰＯ４、および／もしくはＮａＨＣＯ３、アミノ酸、例えばＬ−アルギニン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、および／もしくはＬ−バリン、ビタミン、例えばＤ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、リボフラビン、および／もしくはチアミン、ならびに／またはそのほかの成分、例えばＤ−グルコース、フェノールレッド、および／もしくはピルビン酸ナトリウムを含有することが好ましい。
【００５７】
特に好ましいのは、第２の液体培地および必要に応じて第１の液体培地が、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を少なくとも５０重量％、より好ましくは少なくとも７５重量％、特に好ましくは少なくとも９０重量％含有していることである。
【００５８】
第２の液体培地を連続的に加えることが好ましい。その代わりに第２の液体培地を段階的に加えることができ、これは少量ずつと呼ぶこともできる。連続的に供給する際の供給率は一定とすることができ、または細胞増殖に適合することができる。段階的に加える際は、時点と、段階ごとの加える体積とを細胞増殖に適合させることができ、または各々固定の時間間隔後に、固定の体積で行うことができる。
【００５９】
第２の液体培地を加えることに基づき、本発明による方法をフェドバッチ法と呼ぶこともできる。
【００６０】
そのうえ、さらなる気体および／またはさらなる液体を反応室に入れてもよい。リアクター壁は、気体および／または液体を加えるための少なくとも２つの接続部を有することが好ましい。有利なのは、ステップｃ）での第２の液体培地および／または気体の分注が、これらの接続部を通して行われることであり、これに関して特に好ましいのは、第２の液体培地および／または気体がそれぞれ別々に、１つの接続部を通って行われることである。特に、リアクター壁は、供給空気、および／または酸素、二酸化炭素、窒素、および／または反応室からの排出空気のための接続部を含むことができる。細胞培養装置が、滅菌フィルターを備えた接続部を含んでいることが好ましい。反応室は連続的に給気され、連続的に反応室から気体が排出されることが好ましく、これにより反応室内では気相の連続的な交換が行われる。
【００６１】
さらに、反応室を滅菌した備蓄容器と結合する接続部が、好ましくは滅菌フィルターなしで存在することができ、したがってさらなる液体、特に培養基を加えるための接続部が存在している。試料採取のための接続部も設けることができる。
【００６２】
リアクター壁が、気体および／または液体を加えるための少なくとも１つの接続部が配置された接続部材を備えていることが好ましい。
【００６３】
反応室内で、細胞と、第２の液体培地と、必要に応じて第１の液体培地とを、特に混合装置を用いて混合することが好ましい。混合装置は、回転軸を備えたミキサー、振動ミキサー、油圧式ミキサー、空圧式ミキサー、スタティックミキサー、またはシェーカーを含むことができる。
【００６４】
例えば、混合装置は撹拌器の形態で、特にマグネチックスターラーの形態で、反応室内に配置されている。反応室が、シェーカー、例えば振とう板またはオービタルシェーカー上に配置されることが好ましい。反応室が、シェーカー上で固定手段によって固定されることがさらに好ましく、この固定手段は伸長可能であることが好ましい。細胞を含有する第２の液体培地および必要に応じて第１の液体培地を、混合装置を使って波状運動させることが好ましい。
【００６５】
反応室は、気相および液相を内包していることが好ましく、これに関し、好ましくは懸濁液である液相は、第２の液体培地と、細胞と、必要に応じて第１の液体培地とを含んでいる。反応室内の気相と液相の体積比は、実質的に変化しないままであることが好ましく、これは、第２の液体培地および／または気体を分注する際の内部体積の拡張によって可能である。その結果、液相の体積に対する液相と気相の間の相界面の大きさも、実質的に一定のままであり、したがって蒸発効果も、培養期間にわたって実質的に変化しないままである。
【００６６】
ステップｃ）での分注の前は、液相が、内部体積の好ましくは２０体積％〜８０体積％、より好ましくは３０体積％〜７０体積％、特に好ましくは４０体積％〜６０体積％を占めている。さらにステップｃ）での分注の後は、液相が、内部体積の好ましくは１０体積％〜８０体積％、より好ましくは２０体積％〜６０体積％、特に好ましくは３０体積％〜５０体積％を占めている。反応室内に、好ましくは酸素を含有する気相が存在することは、特に好気性細胞の培養の際に有利である。
【００６７】
反応室内の細胞は、懸濁培養液中で存在することが好ましい。細胞は、特に非接着細胞を含んでおり、これは、細胞がリアクター壁または反応室内の他の面に、実質的に付着しないということである。
【００６８】
好ましいのは、細胞が、懸濁培養液中で存在する真核生物細胞、特に哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、および／または真菌細胞、特に好ましくは哺乳動物細胞を含んでいることである。その代わりにまたはそれに加えて、細胞が、原核生物細胞、例えばバクテリアを含むこともできる。
【００６９】
粘着細胞培養装置を利用すること、したがって反応室内に存在している細胞が粘着細胞を含んでいることも考えられる。
【００７０】
本発明による方法のステップｃ）では、反応室内に存在している細胞数が、細胞増殖によって増加することが好ましい。このために反応室を、好ましくは１５℃〜５０℃、より好ましくは２０℃〜４５℃、さらに好ましくは３５℃〜４０℃、特に好ましくは３６℃〜４８℃の範囲内の温度に温度調節する。
【００７１】
従来技術に基づく例示的一実施形態および本発明による実施形態を図面に示しており、以下に更に詳しく説明する。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】通常のシードトレインの概略図である。
【図２】伸長可能な材料を含んでいるリアクター壁を備えた本発明による細胞培養装置を示す図である。
【図３】可動に配置された第１の部分と、第２の部分とを含むリアクター壁を備えた本発明による細胞培養装置を示す図である。
【図４】円錐形のリアクター壁を備えた本発明による細胞培養装置を示す図である。
【図５】伸長可能な材料を含んでいるリアクター壁を備えた反応室の側面図である。
【図６】伸長可能な材料を含んでいるリアクター壁を備えた反応室のさらなる図である。
【図７】伸長可能な材料製のリアクター壁を備えた反応室を有する細胞培養装置の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
図１は、通常のシードトレインの進行を概略図で示している。スターター培養物を含有しているストック容器１から、細胞および培養培地を含んでいる細胞懸濁液の形態で、体積が１ｍＬで細胞密度が２×１０７細胞／ｍＬの細胞培養物を、第１の拡張容器２．１に入れる。生産容器４に植え付けるための接種材料としての細胞を十分に製造できるように、全部で４つの拡張容器２．１、２．２、２．３、および２．４を用いる。細胞増殖を妨げないために、体積当たりの最大細胞密度を上回るべきではないので、拡張中は細胞数の増加に伴って細胞懸濁液に新鮮な培地を加える。
【００７４】
第１の拡張容器２．１で最大充填レベルに達すると、細胞懸濁液を第１の拡張容器２．１から第２の拡張容器２．２に植え継ぎ、細胞増殖に応じてさらなる新鮮な培地を加える。これに対応して、細胞懸濁液を続いて第３の拡張容器２．３に、その後、第４の拡張容器２．４に植え継いでいく。
【００７５】
第１の拡張容器２．１から第４の拡張容器２．４へと、細胞懸濁液の体積は１２５ｍＬから１０Ｌに上昇する。第４の拡張容器２．４内にある細胞懸濁液を前生産容器３に植え付け、この前生産容器３は、５０Ｌの内部体積を有しており、ｎ−１段階とも呼ばれる。前生産容器３内で細胞数はさらに増加し、その結果、前生産容器３の中身が、５００Ｌの内部体積を有する生産容器４の植付けに用いられる。ここで示した容器は、バッチリアクターとも呼ばれる回分式反応器である。
【００７６】
図２は、伸長可能な材料を含んでいるリアクター壁１６を備えた本発明の細胞培養装置１０の概略図を示している。細胞懸濁液の必要な体積増加が同じ容器内で可能なことから、図１に基づく４つの拡張容器２．１、２．２、２．３、および２．４に代替し得る細胞培養装置１０を示している。
【００７７】
細胞培養装置１０は混合装置１２を含んでおり、混合装置１２上に反応室１４が配置されている。この混合装置１２は、例えばオービタルシェーカーである。内部体積１５を有する反応室１４は、リアクター壁１６によって画定されている。リアクター壁１６は、液体を加えるための接続部１８および気体を加えるための接続部２０を含んでおり、これに関し、気体を加えるための接続部２０は滅菌フィルター２２を備えている。これに加え、試料採取のためのチューブ２４が設けられている。
【００７８】
反応室１４は、液相２８も気相３０も内包している。液相２８は、第２の液体培地２６および必要に応じてさらに第１の液体培地ならびに細胞２９を含有している。
【００７９】
初期状態３２では、反応室１４は初期の最小内部体積を有しており、第２の液体培地２８および／または気体を、液体を加えるための接続部１８および／または気体を加えるための接続部２０に通して加えることにより、この実施形態では伸長可能な材料を有するリアクター壁１６が伸長し、これにより第１の伸長状態３４に達する。伸長可能な材料の伸長により、リアクター壁１６のうち反応室に向いている面１７が拡張する。第２の液体培地２６または気体をさらに加えることにより、リアクター壁１６がさらに伸長し、これにより第２の伸長状態３６に達する。
【００８０】
図１に示す容器２．１、２．２、２．３、および２．４とは違い、図２に示す本発明の実施形態では、液相２８、つまり細胞懸濁液の体積だけでなく、反応室１４の内部体積１５も増加し、したがって、本発明による反応室１４の最大内部体積に達するまでは、液相２８を次に大きな容器に入れ替えることはない。このことに対応して、細胞拡張を１つの容器内だけで実施することができる。
【００８１】
図３は、可動に配置された第１の部分１６．１と、第２の部分１６．２とを含むリアクター壁１６を備えた本発明の細胞培養装置１０を示している。本発明の細胞培養装置１０は混合装置１２を含んでおり、この実施形態では混合装置１２は撹拌器である。
【００８２】
内部体積１５を有する反応室１４は、リアクター壁１６の第１の部分１６．１およびリアクター壁１６の第２の部分１６．２によって画定されている。第１の部分１６．１は可動であり、第２の部分１６．２に対して液密に結合して配置されている。第２の部分１６．２は、管または円筒側面の形状を有しており、リアクター壁１６の第１の部分１６．１は、第２の部分１６．２内で上方へと変位することができ、これにより反応室１４の内部体積１５が拡張される。
【００８３】
図４は、円錐形のリアクター壁１６を備えた本発明の細胞培養装置１０を示している。この細胞培養装置１０は、撹拌器の形態の混合装置１２を含んでいる。内部体積１５を有する反応室１４は、円錐形状を有している。
【００８４】
水平断面４２が下方から上方に向けて増大している反応室１４内には、第２の液体培地２６と、必要に応じて第１の液体培地と細胞２９を含んでいる液相２８も、気相３０も存在している。液相２８は充填高さ４０に達している。円錐形状は、別の例のように成形されたリアクター壁１６に比べて、液相２８の体積が小さい場合でも、液相２８の体積に対する液相２８と気相３０の間にある相界面３８の比を十分に小さくすることを可能にし、したがって蒸発効果は大きくない。それにもかかわらず、細胞拡張における液相２８の体積については必要な増加は可能である。
【００８５】
図５は、伸長可能な材料を含んでいるリアクター壁１６を備えた反応室１４の側面図を示している。反応室１４は、伸長可能な材料の伸長によって拡張可能な内部体積１５を有している。このリアクター壁１６は、液体を加えるための接続部１８と、試料採取のための接続部１９と、気体を加えるための接続部２０と、排気口２１とが配置された接続部材４４を備えている。
【００８６】
図６は、図５に示した伸長可能な材料を含んでいるリアクター壁１６を備えた反応室１４のさらなる図を示している。接続部材４４は、液体を加えるための接続部１８と、試料採取のための接続部１９と、気体を加えるための接続部２０と、排気口２１とを有している。
【００８７】
図７では、伸長可能な材料製の反応室を有する細胞培養装置を概略的に示している。
【００８８】
これに関し、伸長可能な材料製の反応室１４は、例えば図５および図６に示しているように形成することができる。ただし代替的、および好ましいのは、反応室１４が、伸長可能な材料製のリアクター壁１６によって完全に包囲されており、かつ液体を加えるための接続部１８と、気体を加えるための接続部２０と、排気口２１と、試料採取のための接続部１９が、リアクター壁を構成している伸長可能な材料を直接的に通り抜けている場合である。この場合、液体を加えるための接続部１８、気体を加えるための接続部２０、排気口２１、および試料採取のための接続部１９のシーリングは、当業者に公知の通常の手法、例えば貼付によって行われる。
【００８９】
細胞を培養するために、培養培地４６が備蓄容器４８から、ポンプ５０、好ましくは空圧式ポンプにより、液体を加えるための接続部１８を介して反応室内に輸送される。その際、ポンプの搬送出力は、反応室１４内で培養されている細胞２９の増殖に応じている。この場合、培養培地４６を連続的に反応室１４内に搬送することができ、または段階的に搬送することもでき、その際は、反応室内に内包されている培養培地がほぼ使い果たされた場合にそれぞれ培養培地を再誘導する。空圧式ポンプの代わりに、反応室１４内に培養培地４６をコンタミネーションなく輸送可能なあらゆる任意のその他のポンプを用いることもできる。
【００９０】
気体を加えるための接続部２０を介し、細胞の培養に必要な気体、通常は酸素を含有する気体、例えば純酸素または空気またはさらに酸素富化空気を、反応室に供給する。気体を加えることは、気体用ポンプ５２によって行われる。気体と共に汚染が反応室内にもたらされるのを防ぐため、気体は、反応室内に加える前に滅菌フィルター５４に通される。気体用ポンプ５２として、例えば膜ポンプが適している。ただしここでも、気体を搬送できるあらゆる任意のその他の適切なポンプを用いることができる。
【００９１】
余分な気体は排気口２１に通して反応室１４から取り出すことができる。気体と共に望ましくない成分が反応室１４から出ていくのを防ぐため、排気口２１にも滅菌フィルター５４が接続している。
【００９２】
試料採取のための接続部１９は、適切な試料採取システム５６と結合している。ここでも、コンタミネーションがシステムにもちこまれる可能性を排除するように、かつ採取された試料が汚染されることもないように、試料採取システム５６が滅菌されている必要がある。試料を反応室１４から採取するために、試料採取のための接続部１９に、反応室１４内の圧力より低い圧力を印加できる必要があり、これにより、差圧に基づいて試料が反応室１４から採取される。試料採取システムとしては、例えば注射器が適しており、この注射器のプランジャーを試料採取のために引き、したがって試料採取中は、試料を収容するための空間が大きくなる。
【実施例１】
【００９３】
壁材料として伸長可能な材料を有する図２に基づく細胞培養装置内に、体積１０ｍＬの液相を準備した。反応室内の液相が２０Ｌの体積に達するまで、１０時間にわたって連続的に水性培地および空気を供給した。
【００９４】
この試験を、３種の異なる壁材料で実施した。リアクター壁はそれぞれ、実質的に天然ゴム、ポリイソプレン、またはポリウレタンを含んでなり、これらの材料はそれぞれ優れた生体適合性を有している。リアクター壁は始め、膨張前に約１００μｍの壁厚を有していた。
【００９５】
すべての３種の材料により、内部体積の少なくとも２０００％の体積膨張が達成された。ポリイソプレン製のリアクター壁および天然ゴム製のリアクター壁は、ポリウレタン製のリアクター壁よりさらに高い伸長性を有した。
【実施例２】
【００９６】
実質的にポリイソプレンを含んでなるリアクター壁を備えた図２に基づく細胞培養装置内に、酵母細胞（出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））を含有する水性懸濁液５００ｍＬを準備した。細胞を１４日間にわたって培養し、その一方で、追加的に全部で４．５Ｌの水性培地を段階的に加えた。全培養期間において代謝産物の生産を観察できた。
【実施例３】
【００９７】
実質的にポリイソプレンを含んでなるリアクター壁を備えた図２に基づく細胞培養装置を、１２０℃および２ｂａｒで２時間オートクレーブ処理した。ウシ胎児血清（ＦＫＳ）１０重量％を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含む細胞培養培地５０ｍＬを、オートクレーブ処理した装置内で、３７℃で７日間培養し、その後、細胞培養培地の試料を顕微鏡下で観察した。１０，０００倍の倍率で細胞は観察されなかった。したがってこの装置は無菌作業に適していた。
【符号の説明】
【００９８】
１  ストック容器
２  拡張容器
２．１  第１の拡張容器
２．２  第２の拡張容器
２．３  第３の拡張容器
２．４  第４の拡張容器
３  前生産容器
４  生産容器
１０  細胞培養装置
１２  混合装置
１４  反応室
１５  内部体積
１６  リアクター壁
１６．１  第１の部分
１６．２  第２の部分
１７  反応室に向いている面
１８  液体を加えるための接続部
１９  試料採取のための接続部
２０  気体を加えるための接続部
２１  排気口
２２  滅菌フィルター
２４  チューブ
２６  第２の液体培地
２８  液相
２９  細胞
３０  気相
３２  初期状態
３４  第１の伸長状態
３６  第２の伸長状態
３８  相界面
４２  水平断面
４４  接続部材
４６  培養培地
４８  備蓄容器
５０  ポンプ
５２  気体用ポンプ
５４  滅菌フィルター
５６  試料採取システム
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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