(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経堤細胞またはそれに由来する自律神経前駆細胞から副交感神経細胞を作製する方法であって、
（ａ）前記神経堤細胞またはそれに由来する自律神経前駆細胞を、cAMP産生促進剤、BDNFシグナル経路活性化剤、GDNFシグナル経路活性化剤、NGFシグナル経路活性化剤、NT-3シグナル経路活性化剤、ビタミンＣ、プロテインキナーゼＣ活性化剤、およびレチノイン酸受容体アゴニストの存在下で培養するステップ
を含む方法。
【請求項２】
前記プロテインキナーゼＣ活性化剤が、ホルボールエステルまたはインゲノールエステルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記レチノイン酸受容体アゴニストが、レチノイン酸、タミバロテン、またはCh55である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記プロテインキナーゼＣ活性化剤が、ホルボール12-ミリスタート13-アセタートであり、前記レチノイン酸受容体アゴニストが、オールトランスレチノイン酸である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
（ｂ）前記ステップ（ａ）の前に、前記神経堤細胞またはそれに由来する自律神経前駆細胞を、BMPシグナル経路活性化剤、SHHシグナル経路阻害剤、およびWntシグナル経路阻害剤の存在下で培養するステップ
をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記BMPシグナル経路活性化剤が、BMP2、BMP4、BMP7、またはBMP2/4であり、前記SHHシグナル経路阻害剤が、SANT-1、SANT-2、JK184、またはジェルビンであり、前記Wntシグナル経路阻害剤が、IWR-1、XAV939、またはIWP-2である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記神経堤細胞またはそれに由来する自律神経前駆細胞が、2×105〜5×105細胞/cm2の濃度で播種される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記神経堤細胞またはそれに由来する自律神経前駆細胞が、ヒト由来である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記神経堤細胞またはそれに由来する自律神経前駆細胞が、多能性幹細胞から分化誘導されたものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
cAMP産生促進剤、BDNFシグナル経路活性化剤、GDNFシグナル経路活性化剤、NGFシグナル経路活性化剤、NT-3シグナル経路活性化剤、ビタミンＣ、プロテインキナーゼＣ活性化剤、およびレチノイン酸受容体アゴニストを含んでなる、神経堤細胞またはそれに由来する自律神経前駆細胞から副交感神経細胞を作製するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、副交感神経細胞の作製方法に関する。特に、自律神経前駆細胞または神経堤細胞から副交感神経細胞を作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
自律神経は、末梢神経系に属し、中枢神経系と各臓器を接続する神経路を形成し身体機能調節に重要な役割を担っている。そのため、自律神経系細胞の脱落や機能障害は、各臓器の機能不全に繋がる。iPS細胞の確立により、ヒト細胞を用いた創薬支援や細胞移植治療が進みつつある一方で、臓器や組織由来の単一種の細胞の培養物は、そのような研究のために使用される材料として不十分である。臓器や組織を形成するための支持細胞や細胞外マトリックス、臓器や組織への補給路である血管系に加えて、機能制御を担う自律神経系のin vitroモデルが必要とされている。【０００３】
本発明者らは、これまでヒト多能性幹細胞より自律神経を効率的に誘導する技術を開発してきており、交感神経細胞または副交感神経細胞を選択的に誘導する方法をすでに報告している(例えば、特許文献１)。しかし、上記方法により副交感神経細胞を調製する場合には自律神経前駆細胞を低い密度で播種することが必要であり(高密度で播種すると交感神経細胞に分化する)、その結果、低い効率でしか副交感神経細胞を得ることができないという問題があった。そのため、化合物スクリーニングや細胞移植に応用するための副交感神経細胞を調製するためには、誘導効率の改善が不可欠である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第2016/194522号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記問題点に鑑み、本発明は、神経堤細胞またはそれに由来する自律神経前駆細胞から、より効率的に副交感神経細胞を作製する方法と提供することを目的としてなされたものである。神経栄養因子は高価であることから、本発明者らは、副交感神経細胞への分化効率を高めることができる安価な低分子化合物の探索を行った。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ホルボール12-ミリスタート13-アセタート(PMA)は、プロテインキナーゼC(PKC)活性化剤であり、Th2細胞分化の制御に必須の転写因子GATA3の発現を増大させることが知られる(M. Yamashita et al., "Identification of a conserved GATA3 response element upstream proximal from the Interleukin-13 gene locus", The Journal of Biological Chemistry, vol.277, pp. 42399-42408, 2002)。GATA3は、免疫細胞以外の種々の細胞にも発現しており、自律神経系の腫瘍細胞における発現も確認されている(D. Nonaka et al., "A study of Gata3 and Phox2b expression in tumors of the autonomic nervous system", The American Journal of Surgical Pathology, vol. 37, pp. 1236-1241, 2013)。しかし、現時点で、GATA3と交感／副交感神経細胞への分化誘導との関連は不明である。【０００７】
レチノイン酸(RA)は、ラット培養交感神経細胞における、交感神経マーカーであるチロシンヒドロキシラーゼ(TH)の発現レベルを減少させる一方で、副交感神経マーカーであるコリンアセチルトランスフェラーゼ(CHAT)の発現を増大させることが確認されている(M. Kobayashi et al., "Cholinergic differentiation of cultured sympathetic neurons induced by retinoic acid. Induction of choline acetyltransferase-mRNA and suppression of tyrosine hydroxylase-mRNA levels.", FEBS Letters, Vol. 337, pp. 259-264, 1994)。しかし、未分化の自律神経前駆細胞から交感／副交感神経細胞への分化誘導に対してRAが与える影響は明らかにされていない。【０００８】
本発明者らは、鋭意研究の結果、すでに報告した上記の交感／副交感神経細胞の選択的誘導方法に、さらにPMAおよびRAを組み合わせて用いることにより、高効率で副交感神経細胞を作製できることを見出した。【０００９】
すなわち、本発明は、一実施形態によれば、神経堤細胞またはそれに由来する自律神経前駆細胞から副交感神経細胞を作製する方法であって、前記神経堤細胞またはそれに由来する自律神経前駆細胞を、cAMP産生促進剤、BDNFシグナル経路活性化剤、GDNFシグナル経路活性化剤、NGFシグナル経路活性化剤、NT-3シグナル経路活性化剤、ビタミンＣ、プロテインキナーゼＣ活性化剤、およびレチノイン酸受容体アゴニストの存在下で培養するステップを含む方法を提供するものである。【００１０】
前記プロテインキナーゼＣ活性化剤は、ホルボールエステルまたはインゲノールエステルであることが好ましく、ホルボール12-ミリスタート13-アセタートであることがさらに好ましい。【００１１】
前記レチノイン酸受容体アゴニストは、レチノイン酸、タミバロテン、またはCh55であることが好ましく、オールトランスレチノイン酸であることがさらに好ましい。【００１２】
前記神経堤細胞またはそれに由来する自律神経前駆細胞は、前記ステップ（ａ）の前に、BMPシグナル経路活性化剤、SHHシグナル経路阻害剤、およびWntシグナル経路阻害剤の存在下で培養されることが好ましい。【００１３】
前記BMPシグナル経路活性化剤は、BMP2、BMP4、BMP7、またはBMP2/4であることが好ましく、前記SHHシグナル経路阻害剤は、SANT-1、SANT-2、JK184、またはジェルビンであることが好ましく、前記Wntシグナル経路阻害剤は、IWR-1、XAV939、またはIWP-2であることが好ましい。【００１４】
前記神経堤細胞またはそれに由来する自律神経前駆細胞は、2×105〜5×105細胞/cm2の濃度で播種されることが好ましい。【００１５】
前記神経堤細胞またはそれに由来する自律神経前駆細胞は、ヒト由来であることが好ましい。【００１６】
前記神経堤細胞またはそれに由来する自律神経前駆細胞は、多能性幹細胞から分化誘導されたものであることが好ましい。【００１７】
また、本発明は、一実施形態によれば、上記方法により得られた副交感神経細胞を提供するものである。【００１８】
前記副交感神経細胞は、PHOX2B、CHAT、およびMAP2を発現していることが好ましい。【００１９】
また、本発明は、一実施形態によれば、cAMP産生促進剤、BDNFシグナル経路活性化剤、GDNFシグナル経路活性化剤、NGFシグナル経路活性化剤、NT-3シグナル経路活性化剤、ビタミンＣ、プロテインキナーゼＣ活性化剤、およびレチノイン酸受容体アゴニストを含んでなる、神経堤細胞またはそれに由来する自律神経前駆細胞から副交感神経細胞を作製するためのキットを提供するものである。
【発明の効果】
【００２０】
本発明に係る方法によれば、追加の神経栄養因子を必要とせず、すでに報告した副交感神経の選択的誘導方法と同程度のコストにより、高い効率で副交感神経を作製することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、多能性幹細胞から交感神経細胞および／または副交感神経細胞へと分化誘導するための従来プロトコールを示す概要図である。
【図２】図２は、図１に示された従来プロトコールにより、培養開始から13〜87日目まで、分化誘導培地4(NDMのみ)中で培養して得られた細胞の顕微鏡像を示す図である(左上: THの染色像、右上: CHATの染色像、右下: THおよびCHATの染色像を重ねた画像、左下: 位相差顕微鏡像)。
【図３】図３は、培養開始から13〜87日目まで、分化誘導培地1(NDM + PMA)中で培養して得られた細胞の顕微鏡像を示す図である(左上: THの染色像、右上: CHATの染色像、右下: THおよびCHATの染色像を重ねた画像、左下: 位相差顕微鏡像)。
【図４】図４は、培養開始から13〜87日目まで、分化誘導培地2(NDM + RA)中で培養して得られた細胞の顕微鏡像を示す図である(左上: THの染色像、右上: CHATの染色像、右下: THおよびCHATの染色像を重ねた画像、左下: 位相差顕微鏡像)。
【図５】図５は、培養開始から13〜87日目まで、分化誘導培地3(NDM + PMA + RA)中で培養して得られた細胞の顕微鏡像を示す図である(左上: THの染色像、右上: CHATの染色像、右下: THおよびCHATの染色像を重ねた画像、左下: 位相差顕微鏡像)。
【図６】図６は、(A)図１に示された従来プロトコールにより、培養開始から13〜40日目まで、分化誘導培地4(NDMのみ)中で培養して得られた細胞、および、(B)培養開始から13〜44日目まで、分化誘導培地3(NDM + PMA + RA)中で培養して得られた細胞のTHおよびCHATの染色像を示す図である。
【図７】図７は、図６の結果を数値化して比較したグラフである。
【図８】図８は、培養開始から13〜87日目まで、分化誘導培地3(NDM + PMA + RA)中で培養して得られた細胞の顕微鏡像(A: PHOX2Bの染色像、B: CHATの染色像、C: 位相差顕微鏡像、D: PHOX2BおよびCHATの染色像を重ねた画像)、および、培養開始から13〜38日目まで、分化誘導培地3(NDM + PMA + RA)中で培養して得られた細胞の顕微鏡像(E: MAP2の染色像、F: PHOX2Bの染色像、G: 位相差顕微鏡像、H: AMP2およびPHOX2Bの染色像を重ねた画像)を示す図である。
【図９】図９は、培養開始から13〜37日目まで、分化誘導培地3(NDM + PMA + RA)中で培養して得られた細胞の、ニコチン刺激後のカルシウムイメージングを示す図である(左: 位相差顕微鏡像、右: 蛍光顕微鏡像)。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は本明細書中に説明した実施形態に限定されるものではない。
【００２３】
本発明は、第一の実施形態によれば、神経堤細胞またはそれに由来する自律神経前駆細胞から副交感神経細胞を作製する方法であって、（ａ）前記神経堤細胞またはそれに由来する自律神経前駆細胞を、cAMP産生促進剤、BDNFシグナル経路活性化剤、GDNFシグナル経路活性化剤、NGFシグナル経路活性化剤、NT-3シグナル経路活性化剤、ビタミンＣ、プロテインキナーゼＣ活性化剤、およびレチノイン酸受容体アゴニストの存在下で培養するステップ(以下、「分化誘導ステップ」とも記載する)を含む方法である。
【００２４】
「神経堤細胞」とは、脊椎動物の初期発生の胚において一過的に形成される神経堤組織から遊離される細胞であり、自律神経細胞を含む末梢神経細胞だけでなく、シュワン細胞、メラニン細胞、心筋などの種々の細胞への分化能を有する。本実施形態において用いることができる神経堤細胞は、任意の脊椎動物由来のものであってよいが、好ましくは、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、ヒトなどの哺乳動物由来であり、特に好ましくはヒト由来である。
【００２５】
本実施形態における神経堤細胞は、胚の神経堤組織から単離することができる。なお、神経堤は、頭部神経堤、迷走・坐骨神経堤、体幹部神経堤、および心臓神経堤に分類されるが、それらのいずれに由来する神経堤細胞も、自律神経細胞への分化能を有し、後述する分化誘導手順によって自律神経細胞に分化することができ、本実施形態において用いることができる。また、成体においても、骨髄、心臓、角膜、虹彩、歯髄、嗅粘膜など神経堤細胞由来の組織に、未分化かつ神経堤細胞と同様の多分化能を維持する神経堤由来細胞が存在しており、そのような成体組織から単離された神経堤由来細胞も、本実施形態における神経堤細胞に含まれてよい。
【００２６】
あるいは、本実施形態における神経堤細胞は、幹細胞から分化誘導することができる。ここで、「幹細胞」とは、自己複製能および分化能を有する細胞を意味する。幹細胞は、その分化能に応じて、全能性幹細胞、多能性幹細胞、単能性幹細胞などに分類されるが、本実施形態において用いることができる幹細胞は、少なくとも神経堤細胞に分化する能力を有するものであれば、いずれの幹細胞も本実施形態の方法において用いることができる。
【００２７】
本実施形態における神経堤細胞は、多能性幹細胞から分化誘導されたものであることが好ましい。多能性幹細胞には、例えば、胚性幹(ES)細胞、人工多能性幹(iPS)細胞、胚性生殖(EG)細胞、多能性生殖幹(mGS)細胞、Muse細胞などが挙げられる。本実施形態の方法においては、いずれの多能性幹細胞も用いることができるが、iPS細胞またはES細胞を用いることが好ましい。多能性幹細胞の調製方法は十分に確立されており(ヒト多能性幹細胞培養の実践プロトコール(第2版)、2010年、理化学研究所  発生・再生科学総合研究センター)、当分野において公知の方法にしたがって、皮膚や血液などから単離された細胞や、例えばMRC-5細胞のような樹立細胞株などの、任意の細胞から多能性幹細胞を調製することができる。あるいは、例えばATCC(American Type Culture Collection)などから入手した、すでに樹立されたES細胞株またはiPS細胞株を用いてもよい。また、本実施形態の方法においては、遺伝子工学的に改変された多能性幹細胞を用いてもよい。
【００２８】
多能性幹細胞を神経堤細胞に分化誘導する方法はすでに確立されており(例えば、国際公開第2016/194522号、Oh et al., Cell Stem Cell, Vol. 19, pp. 95-106, 2016、Fukuta et al., PLoS ONE, 9(12):e112291, 2014)、当分野において公知の方法にしたがって神経堤細胞を調製すればよい。具体的には、例えば、DMEM/HAM's F-12培地、ヒト幹細胞(hES)培地、N2培地、またはそれらの混合物などを基本培地として、ドルソモルフィン(DM)のようなBMPシグナル経路阻害剤、SB431542(SB)のようなTGFシグナル経路阻害剤、CHIR99021(CHIR)のようなWntシグナル経路活性化剤、bFGFのようなFGFシグナル経路活性化剤、上皮成長因子(EGF)のようなEGF受容体(EGFR)シグナル経路活性化剤などを適宜添加した条件下で、多能性幹細胞を培養することにより、神経堤細胞を調製することが好ましい。また、分化誘導の前には、Y-27632などのRhoキナーゼ(ROCK)阻害剤を含む培地を用いて2〜3日培養することにより、多能性幹細胞を事前調整することが好ましい(国際公開第2016/194522号参照)。
【００２９】
本実施形態における「自律神経前駆細胞」は、神経堤細胞に由来する細胞であって、神経堤細胞よりも自律神経系細胞への分化が進んだ細胞であり、交感神経細胞および副交感神経細胞への分化能を有するものをいう。本実施形態における自律神経前駆細胞は、SOX10およびPHOX2Bの両方の発現に基づいて定義され得る。本実施形態における自律神経前駆細胞は、上記の神経堤細胞の調製方法に準じた方法により調製することができる。
【００３０】
神経堤細胞またはそれに由来する自律神経前駆細胞は、副交感神経細胞へと分化誘導するまで、EGFや塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)などを添加した培地を用いて、分化能を維持したまま安定的に継代培養することができる(Fukuta et al., PLoS ONE, 9(12):e112291, 2014)。
【００３１】
本実施形態の方法では、神経堤細胞またはそれに由来する自律神経前駆細胞を、cAMP産生促進剤、BDNFシグナル経路活性化剤、GDNFシグナル経路活性化剤、NGFシグナル経路活性化剤、NT-3シグナル経路活性化剤、ビタミンＣ、プロテインキナーゼＣ活性化剤、およびレチノイン酸受容体アゴニストの存在下で培養する。
【００３２】
本実施形態における「cAMP産生促進剤」は、環状アデノシン一リン酸(cAMP)の産生を促進する任意の公知の化合物であってよく、例えば、フォルスコリン(FSK)、L-858051、ジブチリルcAMP(DB-cAMP)などが挙げられるが、これらに限定されない。本実施形態におけるcAMP産生促進剤としては、好ましくはフォルスコリンを用いることができ、培地におけるフォルスコリンの濃度は、好ましくは5〜50 μMとすることができる。
【００３３】
本実施形態における「BDNFシグナル経路活性化剤」は、脳由来神経栄養因子(BDNF)とその受容体TrkBおよびその下流のシグナル経路を活性化する任意の公知の化合物であってよい。本実施形態におけるBDNFシグナル経路活性化剤としては、好ましくはBDNFを用いることができ、培地におけるBDNFの濃度は、好ましくは1〜100 ng/mlとすることができる。
【００３４】
本実施形態における「GDNFシグナル経路活性化剤」は、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)およびその受容体GFRαおよびその下流のシグナル経路を活性化する任意の公知の化合物であってよい。本実施形態におけるGDNFシグナル経路活性化剤としては、好ましくはGDNFを用いることができ、培地におけるGDNFの濃度は、好ましくは1〜50 ng/mlとすることができる。
【００３５】
本実施形態における「NGFシグナル経路活性化剤」は、神経成長因子(NGF)とその受容体TrkAおよびその下流のシグナル経路を活性化する任意の公知の化合物であってよい。本実施形態におけるNGFシグナル経路活性化剤としては、好ましくはNGF-βを用いることができ、培地におけるNGF-βの濃度は、好ましくは1〜50 ng/mlとすることができる。
【００３６】
本実施形態における「NT-3シグナル経路活性化剤」は、ニューロトロフィン-3(NT-3)とその受容体TrkCおよびその下流のシグナル経路を活性化する任意の公知の化合物であってよい。本実施形態におけるNT-3シグナル経路活性化剤としては、好ましくはNT-3を用いることができ、培地におけるNT-3の濃度は、好ましくは1〜50 ng/mlとすることができる。
【００３７】
本実施形態における「ビタミンＣ」とは、アスコルビン酸およびその誘導体を意味する。本実施形態におけるビタミンＣは、アスコルビン酸、アスコルビン酸2-リン酸、もしくはそれらの塩、またはそれらの混合物であってよい。本実施形態におけるビタミンＣとしては、好ましくはアスコルビン酸を用いることができ、培地におけるアスコルビン酸の濃度は、好ましくは10〜100 μMとすることができる。
【００３８】
本実施形態における「プロテインキナーゼＣ活性化剤」は、プロテインキナーゼＣ(PKC)を活性化する任意の公知の化合物であってよい。本実施形態におけるPKC活性化剤としては、例えば、ホルボール12-ミリスタート13-アセタート(PMA)(別名:TPA)、ホルボール12,13-ジブチラート(PDBu)、12-デオキシホルボール13-アセタート(プロストラチン)、ホルボール12,13-ジヘキサノアートなどのホルボールエステル；インゲノール3-アンゲラート(I3A)(別名:PEP005)などのインゲノールエステル；ブリオスタチン１、ブリオスタチン2、DCP-LA(FR236924)、(-)-インドラクタムV、SC-9、SC-10、1-オレオイル-2-アセチルグリセロール(OAG)、1-O-ヘキサデシル-2-O-アラキドニル-sn-グリセロール、1,2-ジオクタノイル-sn-グリセロール、ホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸(PIP2)、レシニフェラトキシン、メゼレイン、RHC-80267、リポキシンA4などが挙げられる。本実施形態におけるPKC活性化剤には、これらから選択される単独または２以上を組み合わせて用いることができる。
【００３９】
本実施形態におけるPKC活性化剤は、好ましくはホルボールエステルまたはインゲノールエステルであり、特に好ましくはホルボール12-ミリスタート13-アセタート(PMA)である。培地におけるPKC活性化剤の濃度は適宜決定することができ、例えば、PMAであれば、培地におけるPMAの濃度は、好ましくは100 pg/ml〜10 μg/mlとすることができ、より好ましくは1〜100 ng/mlとすることができ、特に好ましくは1〜50 ng/mlとすることができる。
【００４０】
本実施形態における「レチノイン酸受容体アゴニスト」は、レチノイン酸受容体(RAR)を活性化できる任意の公知の化合物であってよく、RARアゴニスト活性を有するものであれば、レチノイドであってもよいし、レチノイド骨格を持たない化合物であってもよい。RARアゴニスト活性を有するレチノイドとしては、例えば、オールトランスレチノイン酸(ATRA)や9-シス-レチノイン酸(9cRA)などのレチノイン酸が挙げられる。RARアゴニスト活性を有するレチノイド骨格を持たない化合物としては、例えば、タミバロテン(Am80)、Ch55、TTNPB、AM580などが挙げられる。本実施形態におけるRARアゴニストには、これらから選択される単独または２以上を組み合わせて用いることができる。
【００４１】
本実施形態におけるRARアゴニストは、好ましくはレチノイン酸、タミバロテン、またはCh55であり、より好ましくはレチノイン酸であり、特に好ましくはオールトランスレチノイン酸(ATRA)である。培地におけるRARアゴニストの濃度は適宜決定することができ、例えば、ATRAであれば、培地におけるATRAの濃度は、好ましくは1 nM〜1 mMとすることができ、より好ましくは100 nM〜50 μMとすることができ、特に好ましくは500 nM〜10 μMとすることができる。
【００４２】
本実施形態の方法において使用できる培地は、公知の方法(例えば、Mizuseki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:5828-5833(2003)、Fukuta et al., PLoS ONE 9(12):e112291(2014)、国際公開第2016/194522号など)で用いられているDMEM/HAM's F-12培地、hES培地、N2培地、またはそれらの混合物などを基本培地として、上記成分を添加することにより調製することができる。本実施形態の方法における分化誘導ステップ（ａ）は、N2培地を基本培地とすることが好ましい。
【００４３】
また、分化誘導ステップ（ａ）で使用できる培地は、任意選択的に、CNTFシグナル経路活性化剤をさらに含んでもよい。本実施形態における「CNTFシグナル経路活性化剤」は、毛様体神経栄養因子(CNTF)とその受容体CNTFRおよびその下流のシグナル経路を活性化する任意の公知の化合物であってよい。本実施形態におけるCNTFシグナル経路活性化剤としては、好ましくはCNTFを用いることができ、培地におけるCNTFの濃度は、好ましくは1〜100 ng/mlとすることができる。
【００４４】
本実施形態の分化誘導ステップ（ａ）において、神経堤細胞またはそれに由来する自律神経前駆細胞は、例えば5×104〜5×105細胞/cm2の濃度範囲で播種されてよく、好ましくは2×105〜5×105細胞/cm2、より好ましくは2.5×105〜5×105細胞/cm2の濃度範囲で播種することができる。本実施形態の分化誘導ステップ（ａ）において、神経堤細胞またはそれに由来する自律神経前駆細胞は、接着培養され得る。接着培養には、好ましくは、ポリ-L-オルニチン、ポリ-D-リジン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲルなどの細胞外基質から選択される単独または２以上の混合物によりコートされたプレートなどを用いることができる。本実施形態の分化誘導ステップ（ａ）における培養条件は、細胞が由来する動物種によって異なるが、例えば、哺乳動物由来の神経堤細胞またはそれに由来する自律神経前駆細胞であれば、37℃、5%CO2条件下で培養することが好ましい。本実施形態の分化誘導ステップ（ａ）の期間は、作製される副交感神経細胞の所望の成熟度によって適宜変更され得るが、例えば、少なくとも20日間、30日間、50日間、70日間またはそれ以上であってよく、好ましくは20〜50日間であり、特に好ましくは20〜30日間である。
【００４５】
本実施形態の方法は、分化誘導ステップ（ａ）の前に、（ｂ）神経堤細胞またはそれに由来する自律神経前駆細胞を、BMPシグナル経路活性化剤、SHHシグナル経路阻害剤、およびWntシグナル経路阻害剤の存在下で培養するステップ(以下、「事前調整ステップ」とも記載する)をさらに含んでもよい。
【００４６】
本実施形態における「BMPシグナル経路活性化剤」は、骨形成タンパク質(BMP)とその受容体(BMPR-Iおよび／またはBMPR-II)およびその下流のシグナル経路(例えばSmad1、Smad5、Smad8など)を活性化する任意の公知の化合物であってよく、天然または改変されたBMPファミリータンパク質であってもよい。BMPファミリータンパク質としては、例えば、BMP2、BMP4、BMP7、BMP2/4などが挙げられ、これらから選択される単独または２以上を組み合わせて、本実施形態におけるBMPシグナル経路活性化剤として用いることができる。
【００４７】
本実施形態におけるBMPシグナル経路活性化剤は、好ましくはBMP4である。培地におけるBMPシグナル経路活性化剤の濃度は適宜決定することができ、例えば、BMP4であれば、培地におけるBMP4の濃度は、好ましくは0.1〜100 ng/mlとすることができ、より好ましくは5〜50 ng/mlとすることができる。
【００４８】
本実施形態における「SHHシグナル経路阻害剤」は、ソニック・ヘッジホッグ(SHH)とその受容体であるPatched(PTCH)、その隣接タンパク質であるSmoothened(SMO)、その下流のGlioma-associated oncogene(GLI)を含んでなるSHHシグナル経路を阻害する任意の公知の化合物であってよい。本実施形態におけるSHHシグナル経路阻害剤としては、例えば、SANT-1、SANT-2、ジェルビンのようなSMO阻害剤や、JK184のようなGLI阻害剤などが挙げられ、これらから選択される単独または２以上を組み合わせて、本実施形態におけるSHHシグナル経路阻害剤として用いることができる。
【００４９】
本実施形態におけるSHHシグナル経路阻害剤は、好ましくはSANT-1である。培地におけるSHHシグナル経路阻害剤の濃度は適宜決定することができ、例えば、SANT-1であれば、培地におけるSANT-1の濃度は、好ましくは20 nM〜2 μMとすることができ、より好ましくは100〜500 nMとすることができる。
【００５０】
本実施形態における「Wntシグナル経路阻害剤」は、Wntファミリータンパク質とその受容体(7回膜貫通型受容体であるFrizzled(Fz)、1回膜貫通型受容体である低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質5および6(LRP5/6)、オーファン受容体チロシンキナーゼ1および2(Ror1/2)、受容体型チロシンキナーゼ(Ryk)など)およびその下流のシグナル経路(β-カテニン経路、平面内細胞極性(PCP)経路、Ca2+経路)を阻害する任意の公知の化合物であってよく、そのような化合物から選択される単独または２以上を組み合わせて、本実施形態におけるWntシグナル経路阻害剤として用いることができる。
【００５１】
本実施形態におけるWntシグナル経路阻害剤は、Wnt-3aとその受容体FzおよびLRP5/6ならびにその下流のβ-カテニン経路を阻害する化合物であることが好ましく、そのような化合物としては、例えば、IWR-1のようなIWR化合物、XAV939、IWP-2のようなIWP化合物などが挙げられ、特に好ましくはIWR-1である。培地におけるWntシグナル経路阻害剤の濃度は適宜決定することができ、例えば、IWR-1であれば、培地におけるIWR-1の濃度は、好ましくは0.5〜100 μMとすることができ、より好ましくは2〜20 μMとすることができる。
【００５２】
本実施形態における事前調整ステップ（ｂ）で使用できる培地は、上で定義した分化培養ステップ（ａ）におけるものと同様の基本培地を用いて調製することができ、hES培地およびN2培地の混合培地を基本培地とすることが好ましく、その混合比率は1:3〜3:1の範囲であることが好ましい。本実施形態における事前調整ステップ（ｂ）は、接着培養または浮遊培養のいずれによっても行うことができる(国際公開第2016/194522号参照)。
【００５３】
本実施形態の方法によれば、すでに報告した副交感神経細胞の選択的誘導方法に、さらにPMAおよびRAを組み合わせて用いることのみにより、2×105細胞/cm2の高密度培養条件下でも、高効率で副交感神経細胞を作製することが可能である。なお、副交感神経細胞への選択的誘導効率は、副交感神経マーカーであるコリンアセチルトランスフェラーゼ(CHAT)と交感神経マーカーであるチロシンヒドロキシラーゼ(TH)との比率(CHAT/TH)に基づいて評価することできるが、本実施形態の方法によれば、CHAT/THが5以上、好ましくは10以上の高効率で副交感神経細胞を作製することができる。
【００５４】
本発明は、第二の実施形態によれば、上記方法により得られた副交感神経細胞である。上記方法により得られた細胞が副交感神経細胞であるかどうかは、PHOX2B、CHAT、およびMAP2(微小管関連タンパク質2)の発現により定義されることが好ましく、ニコチン性アセチルコリン受容体の存在も確認することがさらに好ましい。
【００５５】
本発明は、第三の実施形態によれば、cAMP産生促進剤、BDNFシグナル経路活性化剤、GDNFシグナル経路活性化剤、NGFシグナル経路活性化剤、NT-3シグナル経路活性化剤、ビタミンＣ、プロテインキナーゼＣ活性化剤、およびレチノイン酸受容体アゴニストを含んでなる、神経堤細胞またはそれに由来する自律神経前駆細胞から副交感神経細胞を作製するためのキットである。本実施形態における「cAMP産生促進剤」、「BDNFシグナル経路活性化剤」、「GDNFシグナル経路活性化剤」、「NGFシグナル経路活性化剤」、「NT-3シグナル経路活性化剤」、「ビタミンＣ」、「プロテインキナーゼＣ活性化剤」、および「レチノイン酸受容体アゴニスト」は、上で定義したものと同様である。
【００５６】
本実施形態のキットは、上で記載した試薬を適宜選択して含むことができる。また、本実施形態のキットは、上記試薬に加え、CNTFシグナル経路活性化剤などの追加試薬や、神経堤細胞またはそれに由来する自律神経前駆細胞を事前調整するための試薬(BMPシグナル経路活性化剤、SHHシグナル経路阻害剤、Wntシグナル経路阻害剤など)や、培養用のプレート、分化誘導のプロトコールを記載した説明書などををさらに含んでもよい。
【実施例】
【００５７】
以下に実施例を挙げ、本発明についてさらに説明する。なお、これらは本発明を何ら限定するものではない。【００５８】
＜試薬＞
下記実施例において使用した試薬情報(試薬名、製品番号、製造元、略称など)は下記の通りである。
・mTeSR1-cGMP (Stemcell Technologies: ST-85850G) - mTeSR1
・DMEM/Ham's F-12 (和光: 048-29785)
・DMEM (high-glucose) (和光: 043-30085) - DMEM
・Opti-MEM (Life Technologies: 31985-070)
・Fetal Bovine Serum (オーストラリア産) (和光: SFBS) - FBS
・Knockout Serum Replacement (Life Technologies: 10828-028) - KSR
・N2 supplement with transferrin (Apo) (和光: 141-09041) - N2 supplement
・MEM non-essential amino acids solution (和光: 139-15651) - NEAA
・Monothioglycerol solution (和光: 195-15791)
・Penicillin-streptomycin solution (和光: 168-23191) - P/S
・Brain Derived Neurotrophic Factor, Human, recombinant (和光: 020-12913) - BDNF
・Glial-cell Derived Neurotrophil Factor, Human, recombinant (和光: 075-04153) - GDNF
・Nerve Growth Factor-β, Human, recombinant (和光: 141-07601) - NGF
・Neurotrophin-3, Human, recombinant (和光: 141-06643) - NT-3
・L-アスコルビン酸エステルマグネシウム塩n水和物 (和光: 01319641) - Ascorbic Acid
・Y-27632 (和光: 253-00513)
・Forskolin (和光: 067-02191) - FSK
・Dorsomorphin (Simga-Aldrich: P5499-5MG) - DM
・SB431542 hydrate (Sigma-Aldrich: S4317-5MG) - SB
・CHIR99021 (Cayman Chemical Company: 13122) - CHIR
・IWR-1 (Sigma-Aldrich: I0161-5MG)
・SANT-1 (Sigma-Aldrich: S4572-5MG)
・骨形成因子4(truncated)、ヒト、組換え体 (和光: 022-17071) - BMP4線維芽細胞成長因子(塩基性)(basic FGF)、ヒト、組換え体 (和光: 064-04541) - bFGF
・iMatrix-511 (ニッピ: 892002)
・MPC polymer (日油: Lipidure CM5206E)
・Poly-L-ornithine hydrobromide (Sigma-Aldrich: P3655-10MG) - PLO
・Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement
・membrane (Sigma-Aldrich: L2020-1MG) - Laminin
・Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (和光: 162-23591) - PMA
・Reitonic acid (Sigma-Aldrich: R2625-50MG) - RA
・Accutase (Life Technologies: A11105-01)
・TrypLE express (Life Technologies: 12604-013)
・Ultrapure distilled water (Life Technologies: 10977-015) - DW
・D-PBS(-) (和光: 045-29795) - PBS
・Tris Buffer Powder, pH7.4 (タカラバイオ: T9153)
・塩酸 (和光: 080-01066)
・Albumin, from Bovine Serum (和光: 017-23294) - BSA
・ジメチルスルホキシド (和光: 074-29353) - DMSO
・ホルムアルデヒド液 (和光: 064-00406)
・10w/v%ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート溶液 (和光: 161-24801) - Tween-20
・ブロックエース粉末 (DSファーマバイオメディカル: UKB80)
・Can Get Signal（登録商標） Immunostain Solution A (東洋紡: NKB-501)
・Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody (rabbit polyclonal) (Merck Millipore: AB152)
・Anti-Choline Acetyltransferase antibody (rabbit polyclonal) (abcam: ab68779)
・Anti-PHOX2B antibody (mouse monoclonal) (proteintech: 66254-1-lg)
・Anti-PHOX2B antibody (rabbit monoclonal) (abcam: ab183741)
・Anti-MAP2 antibody (mouse monoclonal) (abcam: ab11267)
・Hoechst 33342 solution (同仁化学: 346-07951)
・F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor(登録商標) 488 conjugate (Life Technologies: A11017) - Alexa Fluor488
・F(ab')2-Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor(登録商標) 555 conjugate (Life Technologies: A21430) - Alexa Fluor555
・fluo-4/AM (Invitrogen :F14201, 50 μg×10本)
・(-)-Nicotine (Sigma-Aldrich: N3876-5ML)【００５９】
＜基本培地＞
(i) ヒト幹細胞(hES)培地
20% KSR、1% NEAA、1% Monothioglycerol solution、および1% P/Sを含有するDMEM/Ham’s F-12を、ヒト幹細胞用培地(hESM)として用いた。
(ii)N2培地
1% N2 supplement、1% NEAA、および1% P/Sを含有するDMEM/Ham’s F-12を、N2培地として用いた。【００６０】
＜Stock solutionの調製＞
・FSK stock solutionは、DMSOを用いて10 mM stock solutionとして調製した。
・DM stock solutionは、DMSOを用いて1 mM stock solutionとして調製した。
・SB stock solutionは、DMSOを用いて10 mM stock solutionとして調製した。
・CHIR stock solutionは、DMSOを用いて3 mM stock solutionとして調製した。
・IWR-1 stock solutionは、DMSOを用いて10 mM stock solutionとして調製した。
・SANT-1 stock solutionは、DMSOを用いて250 μM stock solutionとして調製した。
・BMP4 stock solutionは、0.1% BSAを添加した4 mM塩酸溶液を用いて100 μg/ml stock solutionとして調製した。
・bFGF stock solutionは、1mM Tris buffer (pH 7.4)で500 μg/mlに調整後、DMEMを用いて10 μg/ml stock solutionとして調製した。
・BDNF、GDNF、NGF、および、NT-3 stock solutionは、PBSを用いて10 μg/ml stock solutionとして調製した。
・Ascorbic Acid stock solutionは、PBSを用いて50 mg/ml stock solutionとして調製した。
・Y-27632 stock solutionは、Opti-MEMを用いて10 mM stock solutionとして調製した。
・PLO stock solutionは、DWを用いて1 mg/ml stock solutionとして調製した。
・PMA stock solutionは、DMSOを用いて10 μg/ml stock solutionとして調製した。
・RA stock solutionは、DMSOを用いて1 mM stock solutionとして調製した。【００６１】
＜1. 自律神経前駆細胞の調製＞
(1-1. iPS細胞の培養)
ヒトiPS細胞(201B7株)は、理化学研究所バイオリソースセンターより入手した。6-well plateの各ウェルにPBSを1.5 ml加え、さらにiMatrix-511(ニッピ:892002)を0.5 μg/cm2で加えて1時間コーティング処理を行った。その後、各ウェルから溶液を除去して、mTeSR1を2 ml添加し、さらにY-27632 stock solutionを最終濃度10 μMとなるように加えた。iPS細胞を、4×104〜1×105細胞/ウェル(4×102〜1×104細胞/cm2)で播種し、播種した翌日以降はY-27632を含まないmTeSR1により毎日培地交換しながら培養を継続した。【００６２】
iPS細胞がセミコンフルエントになるまで増殖したら、以下の手順により継代した。各ウェルからmTeSR1を除去し、37℃に温めたaccutase溶液を1 mlで加えて5分間インキュベートした。次に、各ウェル中のaccutase溶液をピペットを用いて培養面に噴きかけるようにしてiPS細胞を剥離させ、遠沈管に回収した。さらに1mlのPBSをウェルに加え、ウェルに残存するiPS細胞を遠沈管に回収した。200×g、4分間遠心した後、上清を除去し、mTeSR1を1 ml添加してiPS細胞を懸濁させた。細胞数をカウントし、濃度を調整後、iMatrixコーティングされた新しい6-well plateに播種した。【００６３】
(1-2. 自律神経前駆細胞の調製)
(i) iPS細胞の事前調整
MPC polymerを6-well plateの各ウェルに加え(〜300 μl)、クリーンベンチ内で1時間乾燥させることにより、ウェル表面を非接着性処理した。PBSにより各ウェルを洗浄後、10 μMのY-27632を含有するmTeSR1を2 ml加え、iPS細胞を1×106細胞/ウェルで播種した。その後、10 μMのY-27632を含有するmTeSR1により毎日培地交換しながら、細胞塊が形成されるまで2〜3日間培養した。【００６４】
(ii) 自律神経前駆細胞の調製
以下の工程1〜3により、iPS細胞を神経堤細胞へと分化させ、さらに、以下の工程4および5の事前調整処理により、細胞内シグナルを調整した自律神経前駆細胞を得た。
工程1: 最終濃度2 μMのDM、10 μMのSB、および10 ng/mlのbFGFを含有するhESMに交換し、2日間培養した。
工程2: 最終濃度3 μMのCHIR、20 μMのSB、および10 ng/mlのbFGFを含有するhESMに交換し、3日間培養した。
工程3: 最終濃度3 μMのCHIR、および10 ng/mlのbFGFを含有するhESM:N2(3:1)混合培地に交換し、2日間培養した。
工程4: 最終濃度10 μMのIWR-1、250 nMのSANT-1、25 ng/mlのBMP4、および10 ng/mlのbFGFを含有するhESM:N2(1:1)混合培地に交換し、2日間培養した。
工程5: 最終濃度10 μMのIWR-1、250 nMのSANT-1、25 ng/mlのBMP4、および10 ng/mlのbFGFを含有するhESM:N2(1:3)混合培地に交換し、3日間培養し、新しい同培地に交換し、さらに1日間培養した。【００６５】
＜2. 自律神経前駆細胞から副交感神経細胞への分化誘導＞
以下の手順により、ポリ-L-オルニチンおよびラミニンによりコートされた24-well plateを準備した。DWで調製したPLO溶液(20 μg/ml)により1時間コーティングした後、DWで1回洗浄し、PBSで調製したラミニン溶液(5 μg/ml)により2時間コーティングした。次にN2培地に、FSK(最終濃度10 μM)、BDNF(最終濃度10 ng/ml)、GDNF(最終濃度10 ng/ml)、NT-3(最終濃度10 ng/ml)、NGF(最終濃度10 ng/ml)、およびAscrobic Acid(最終濃度50 μg/ml)を添加して、neural differentiation medium(NDM)を調製した。【００６６】
NDMを用いて、以下の4種類の分化誘導培地を調製した。
分化誘導培地1:  NDM + PMA (最終濃度10 ng/ml)
分化誘導培地2:  NDM + RA (最終濃度1 μM)
分化誘導培地3:  NDM + PMA (最終濃度10 ng/ml) + RA (最終濃度1 μM)
分化誘導培地4:  NDMのみ (従来方法)【００６７】
上記工程5により得られた自律神経前駆細胞をPBSで1回洗浄後、TrypLE express(250 μl/ウェル)を添加し、5分間インキュベートすることにより細胞を剥離した。10% FBS含有DMEMを加えて酵素反応を停止させ、細胞を遠沈管に回収した。200×g、4分間遠心した後、上清を除去し、NDMにより細胞を懸濁させ、細胞数をカウントした。上記分化誘導培地1〜4により細胞濃度を調整し(〜2.5×105細胞/cm2)、上で準備したPLO/ラミニンコートされた24-well plateに、5×105細胞/ウェルで細胞を播種した。以降、1週間に2度、フレッシュな分化誘導培地1〜4により半量交換しながら培養を継続し、分化誘導培地1〜4による培養開始から20以上経過した培養物を、以下の手順により、免疫染色および細胞内カルシウムイメージングにより解析した。【００６８】
＜3. 免疫細胞染色＞
培養物をPBSで洗浄後、3.7%ホルムアルデヒド/PBS溶液で20分間固定した。その後、PBSで洗浄し、0.2% Tween-20/PBS溶液を加え、5分間インキュベートした。その後、0.2% Tween-20/PBS溶液を除去し、4%ブロックエース/0.2% Tween-20/PBS溶液を加え、30分間ブロッキングした。その後、0.2% Tween-20/PBSにより1回洗浄し、一次抗体/Can Get Signal Solution A(TOYOBO)を加え、4℃で一晩静置した。使用した一次抗体を以下に示す。
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) antibody: 1/200倍希釈
Anti-Choline Acetyltransferase (CHAT) antibody: 1/500倍希釈
Anti-PHOX2B (mouse monoclonal) antibody: 1/100倍希釈
Anti-PHOX2B (rabbit monoclonal) antibody: 1/100倍希釈
Anti-MAP2 (mouse monoclonal) antibody: 1/500倍希釈【００６９】
一次抗体溶液を除去し、0.2% Tween-20/PBSで2回洗浄後、二次抗体/Can Get Signal Solution A(Alexa Fluro488 (1/1000倍希釈)もしくはAlexa Fluor555(1/1000倍希釈))、またはHoechst 33342溶液(1/3000倍希釈)を加え、室温で1時間静置した。二次抗体溶液を除去し、0.2% Tween-20/PBSで2回洗浄後、蛍光顕微鏡にて観察した。【００７０】
結果を図2〜8に示す。図2は、培養開始から13〜87日目まで、分化誘導培地4(NDMのみ)により分化誘導を行った細胞についての結果を示す。左上図はTHの染色像を示し、右上図はCHATの染色像を示し、右下図は、THおよびCHATの染色像を重ねた画像を示し、左下図は位相差顕微鏡像を示す。交感神経マーカーTH陽性の細胞と副交感神経マーカーCHAT陽性の細胞とが混在している様子が観察された。この結果から、NDMにより分化誘導した場合には、自律神経前駆細胞は交感神経細胞および副交感神経細胞の両方に分化誘導されることが示された。【００７１】
図3は、培養開始から13〜87日目まで、分化誘導培地1(NDM + PMA)により分化誘導を行った細胞についての結果を示す。左上図はTHの染色像を示し、右上図はCHATの染色像を示し、右下図は、THおよびCHATの染色像を重ねた画像を示し、左下図は位相差顕微鏡像を示す。図2に比べ、TH陽性の細胞とCHAT陽性の細胞のどちらも顕著に減少していた。この結果から、PMAのみの添加は、分化誘導効率を低下させることが示された。【００７２】
図4は、培養開始から13〜87日目まで、分化誘導培地2(NDM + RA)により分化誘導を行った細胞についての結果を示す。左上図はTHの染色像を示し、右上図はCHATの染色像を示し、右下図は、THおよびCHATの染色像を重ねた画像を示し、左下図は位相差顕微鏡像を示す。図2に比べ、TH陽性の細胞とCHAT陽性の細胞の割合に有意な変化は見られなかった。この結果から、RAのみの添加は、分化誘導効率は変化しないことが示された。【００７３】
図5は、培養開始から13〜87日目まで、分化誘導培地3(NDM + PMA + RA)により分化誘導を行った細胞についての結果を示す。左上図はTHの染色像を示し、右上図はCHATの染色像を示し、右下図は、THおよびCHATの染色像を重ねた画像を示し、左下図は位相差顕微鏡像を示す。TH陽性の細胞がほとんど見られないのに対し、CHAT陽性の細胞が多数観察された。この結果から、PMAおよびRAを同時に添加することが副交感神経細胞への選択的分化誘導に重要であることが示された。【００７４】
図6Aは、培養開始から13〜40日目まで、分化誘導培地4(NDMのみ)により分化誘導を行った細胞についての結果を示し、図6Bは、培養開始から13〜44日目まで、分化誘導培地3(NDM + PMA + RA)により分化誘導を行った細胞についての結果を示す。また、図7は、図6の結果をImageJで解析して算出したCHAT陽性細胞とTH陽性細胞との比率(CHAT/TH)を示す。NDMのみにより分化誘導を行った場合には、CHAT陽性細胞とTH陽性細胞とがほぼ1:1で混在しているのに対し、NDM + PMA + RAにより分化誘導を行った場合には、CHAT陽性細胞がTH陽性細胞の10倍以上であった。この結果から、PMAおよびRAの添加により、自律神経前駆細胞を副交感神経細胞に選択的に分化誘導できることが確認された。【００７５】
図8は、分化誘導培地3(NDM + PMA + RA)を用いて、培養開始から13〜87日目まで分化誘導を行った細胞(図8A〜8D)、または13〜38日目まで分化誘導を行った細胞(図8E〜8H)についての、PHOX2B、CHAT、およびMAP2の染色像を示す。CHAT陽性細胞は、自律神経マーカーPHOX2Bについても陽性であった(図8A〜8D)。また、PHOX2B陽性細胞は、は成熟神経細胞マーカーMAP2についても陽性であった(図8E〜8H)。この結果から、分化誘導培地3(NDM + PMA + RA)により、副交感神経細胞を選択的に作製できたことが確認された。【００７６】
＜4. 細胞内カルシウムイメージング＞
さらに、細胞内カルシウムイメージングにより、分化誘導培地3(NDM + PMA + RA)で培養することにより得られた副交感神経細胞について、ニコチン刺激に対する応答性を評価した。1 mg/mlのfluo-4-AM (Invitrogen, F14201)/DMSOを、最終濃度5 μg/mlとなるように分化誘導培養24日目の培地に直接加えた。インキュベーター(37℃、5% CO2)内で30分間静置後、培地を除去し、リンガー液(149 mM NaCl、2.8 mM KCl、2 mM CaCl2、1 mM MgCl2、10m M HEPES、10 mM D-(+)-glucose (pH7.4))に置換した後、蛍光強度変化を検出することにより細胞内カルシウム濃度変化を測定した。測定にはオリンパス顕微鏡(IX81)、EM-CCD (Andor iXon+)、Metamorphソフトウェア(Molecular Devices)を用い、フレームレート2 fpsで300フレームの撮影を行った。また、ニコチン刺激は、最終濃度1 μMになるようにニコチンをリンガー液に添加することにより行った。測定後のデータ解析にはImageJを用いた。【００７７】
結果を図9に示す。培養開始から13〜37日目まで、分化誘導培地3(NDM + PMA + RA) により分化誘導を行って得られた神経細胞が、強いニコチン応答性を示すことが確認された。この結果は、作製された神経細胞が自律神経細胞の機能的特徴を有することを示すものであり、上記の免疫細胞染色の結果とあわせて、作製された神経細胞が副交感神経細胞であることが支持された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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