(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゴツコラ、アムラ、コタラヒムブツ、ヤマブシタケの各抽出物とジオスゲニン及び二価三価鉄塩を有効成分として含有して、アミロイド形成、炎症、および酸化ストレス経路を含むいくつかのリンクされたJAK2 / STAT3経路を標的とした神経炎症性疾患および神経変性疾患からの保護のための組成物。
【請求項２】
認知機能障害の予防又は／及び治療に用いられる請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の組成物において、
さらに、亜鉛を有効成分として含有した組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多種の機能を有する組成物に関する。さらに詳しくは、例えば認知機能障害予防機能、健康促進機能、栄養補助機能、美容機能その他多種の機能ないし効果を有する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、例えば美容機能を有するサプリメント（美容サプリメント）として、コラーゲン、ゴツコラ（ツボクサ）、及び海洋深層水を含有して構成したサプリメント（食品組成物）が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
特許文献１の食品組成物（美容サプリメント）によれば、ツボクサ、海洋深層水及びコラーゲンを併用することにより、それぞれの成分が有する作用により、肌の新陳代謝を高め、肌の老化を防止して美容効果を奏すると思われる。
【０００４】
また、従来、例えば健康促進機能を有するサプリメント（健康食品）として、アムラにツボクサ（ゴツコラ）を加えて混合して調製した健康サプリメント（健康食品）が提案されている（例えば、特許文献２参照）。この特許文献２のサプリメントによれば、アムラとツボクサ（ゴツコラ）との相乗作用により、アムラの薬効成分の効果を高め、これにより健康促進効果を向上することが可能になると思われる。
【０００５】
一方、本発明者は、薬理・生理作用を備えた新規な活性水として、水に二価三価鉄塩と有機ゲルマニウム化合物を含有させた活性水を発明するとともに（特許文献３）、この活性水よりさらに薬理・生理効果を一層向上させ得る新規な生体回復剤として、水に二価三価鉄塩と有機ゲルマニウム化合物を含有し、ローヤルゼリー又は／及びプロポリスを併用する生体回復剤を発明して提案した（特許文献４）。
【０００６】
そして、前者の「活性水」については、アメリカでもその有効性を評価されて特許を取得している（特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第３４９５７１２号公報
【特許文献２】特開２００７−１３５４９３号公報
【特許文献３】特開平１０−６６９８２号公報
【特許文献４】特開平１０−１１４６６６号公報
【特許文献５】米国特許第６２０３８２１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献１及び同２に記載のサプリメントによれば、それぞれ特性を有するサプリメント（文献１は食品組成物、文献２に健康食品）を得ることができる。
【０００９】
しかし、特許文献１は、ツボクサ（ゴツコラ）、海洋深層水及びコラーゲンの各成分（物質）がそれぞれ元来有する作用の相乗作用（効果）を利用したものである。また、特許文献２についても、アムラ及びツボクサ（ゴツコラ）の各成分（物質）が元来的に有する作用の相乗作用を利用したものである。そのため、各成分自体の効果を向上させることは期待できない。
【００１０】
本発明は上記したような実情に鑑みてなされたもので、組成物を構成する各物質（成分）が有する作用の相乗作用（効果）に加え、各物質自体の機能（効能）を予期し得ないほど大巾に向上し得るように、本発明者のこれまでの研究・開発の成果をこれに活用し、これまでに無い多種の機能を有する組成物の提供を目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決するために、研究、実験を続けた結果、その目的を達成したので、ここにその発明を提供する。
【００１２】
即ち、本発明のうち、１つの発明（第１の発明）は、組成物であって、ゴツコラ、アムラ、コタラヒムブツ、ヤマブシタケの各抽出物とジオスゲニン及び二価三価鉄塩を有効成分として含有したことを特徴とする。
【００１３】
本発明の他の１つの発明（第２の発明）は、第１の発明の組成物において、認知機能障害の予防又は／及び治療に用いられることを特徴とする。
【００１４】
本発明のさらに他の１つの発明（第３の発明）は、第１又は第２の発明の組成物において、さらに亜鉛を有効成分として含有したことを特徴とする。
【００１５】
ここで、各組成物について詳しく説明する。
二価三価鉄塩は近年開発された活性物質で、この活性物質（二価三価鉄塩）は二価鉄と三価鉄との中間の性質を示す単一の化合物、或いは二価鉄と三価鉄が共存する単一の化合物であると思われる。この二価三価鉄塩は現在工業的に生産可能である（例えば、特公平３−６３５９３号公報、特公平４−２７１７１号公報参照）。
【００１６】
二価三価鉄塩としては、例えば、下記式、
Ｆｅ+２ｍＦｅ＋３ｎＣｌ２ｍ＋３ｎ（式中ｍ及びｎは正の整数を示す）
で示される化合物が例示できる。
【００１７】
前記二価三価鉄塩は、例えば塩化第二鉄を水酸化ナトリウム，水酸化カルシウム，水酸化カリウム，水酸化リチウム等の強アルカリの水溶液に投入して原子価変換を起こさせた場合の遷移形態等として得られる（第１の方法）。この第１の方法による具体的製造方法として、例えば次の工程により得たものを例示する。即ち、塩化第二鉄を強アルカリの水溶液に溶解させる工程、この溶液を中和する工程、この中和した溶液を濃縮する工程、とを含んで製造する。
【００１８】
また、二価三価鉄塩は、三価の鉄塩と二価の金属塩とを混合した溶液によっても得られる。具体的には、例えば三価の鉄塩及び二価の金属塩を所定の比率で含有する所定濃度の希薄水溶液に、第二鉄塩を添加して溶解させ、得られた溶液を濃縮して製造することができる（第２の方法）。前記第二鉄塩としては、例えば塩化第二鉄、硫酸第二鉄、硝酸第二鉄を用いることができる。前記二価の金属塩としては、例えば塩化カルシウム，塩化マグネシウム，塩化亜鉛，硫酸マグネシウム，硝酸カルシウム，硝酸マグネシウム，硝酸亜鉛を用いることができる。
【００１９】
前記二価三価鉄塩の前記式中のｍ：ｎの比は前記化合物製造に用いる物質の種類等により特定の数値をとる。
【００２０】
前記二価三価鉄塩は、組成物を構成するゴツクラ（ツボクサ）その他の各物質が有する前記作用（効能）を大巾に増強する。したがって、例えば油性混合液中にゴツクラその他の各物質を混合し、これに前記二価三価鉄塩を添加混合することにより、前記各物質の有する機能（作用）を増強する。前記二価三価鉄塩は極く少量添加することにより、上記作用を発揮する。この成果は本発明者らによる実験により判明されている。本発明の組成物は、例えば内服剤として使用できる。
【００２１】
ゴツコラ（gotukola）は「ゴツクラ」とも称され、日本ではツボクサ（centella asiatica：センテラ  アジアティカ）として知られているハーブである。
【００２２】
ゴツコラ（ツボクサ）は、インドの伝統医学アーユルヴェーダで、古くからハンセン氏病などの感染による皮膚のただれや、潰瘍の治療薬として使用されてきた。その他にも、血行促進、血液浄化、免疫力の向上、知能向上、記憶力の向上効果など数多くの用途で使用されている。その成分としては、マデカソサイド、アジアチコサイド、アジアチン酸、マデカシン酸等のトリテルペン類、サボニゲン類などが確認されている。ゴツコラ（ツボクサ）は、バングラデシュ、タイ、スリランカでは、葉野菜として食されており、安全性については問題がないと考えられる。
【００２３】
アムラ（学名：pbyllanthus emblica）はコミカンソウ科の落葉性の小高木で、「インドスグリ」とも呼ばれている。サンスクリット語では「看護姉」との意味から「アーマラキー」、英語では「インディアングーズベリー」とも表記される。
【００２４】
アムラは、糖尿病や高血圧を予防する効果、コレステロール値を下げる効果、美肌効果、便秘改善、貧血予防、ストレスの抵抗力を高める効果、白髪や脱毛を予防する効果等の効果を有している。
【００２５】
コタラヒムブツ（学名：Salacia reticulata）は、ニシキギ目ニシギキ科サラシア属のつる性植物で、糖尿病の予防効果を有し、インドのアーユルベーダでは、糖尿病の治療薬として用いられ、その効果はＷＨＯで２００２年に認められている。
【００２６】
ジオスゲニンは、ヤマイモに含まれる天然成分で、滋養強壮に良い伝統生薬として古くから用いられ、抗ガン作用、食物アレルギー改善、アンチエイジング効果、ダイエット効果などの諸効能があることで知られている。
【００２７】
ヤマブシタケ（学名：Hericium erinaceus）は、サンゴハリタケ科サンゴハリタケ属の食用キノコの一種で、認知症治療にも注目されている。ヤマブシタケに含まれる成分の「ヘリセノン」は、認知症の特効薬として近年注目されている。その他にも感染症、循環器、消化器、内分泌などにさまざまな効果が期待されている。
【００２８】
亜鉛は、ヒトの体内に必須のミネラル１６種の中の１種で、味覚を正常に保つ。抗酸化作用を活性化する。免疫力を向上させる。発育や成長のサポートをする。そのほか、肌や髪を綺麗に保つ効果が期待されていると共にうつ状態の緩和に効果があると考えられている。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、組成物を構成するゴツコラ（ツボクサ）その他の各物質（成分）が有する作用の相乗作用（効果）に加え、各物質自体の機能（効能）を予期し得ないほど大巾に増強し得る組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の一実施例の試験方法を図示した説明図である。
【図２】図２Ａ〜図２Ｃは試験結果（１）である。
【図３】図３Ａ及び図３Ｂは試験結果（２）である。
【図４】試験結果（３）である。
【図５】試験結果（４）である。
【図６】図６Ａ〜図６Ｄは試験結果（５）である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下、本発明の組成物の実施形態の一例について説明する。
【００３２】
本実施形態の組成物は、構成物質（成分）として、ゴツコラ、アムラ、コタラヒムブツ、ヤマブシタケの各抽出物とジオスゲニン（ヤマイモ抽出物）及び二価三価鉄塩（ＭＲＮ−１００）を採用している。
【００３３】
前記組成物（Ａｎｔｉａ）は、例えば、ゴツコラ、アムラその他の各物質（成分）を粉粒状（粉末ないし顆粒状）に形成し、所望の方法で調製して製造することができる。
【００３４】
組成物の前記構成成分の配合割合は特に限定するものではないが、組成物の全量に対し、例えば、二価三価鉄塩（ＭＲＮ−１００）：約１．５〜４．０、ゴツコラ：約２０．０〜２８．０、アムラ：約１３．０〜１８．０、コタラヒムブツ：２０．０〜２６．０、ジオスゲニン：約２０．０〜２６．０、ヤマブシタケ：約１０．０〜１５．０程度の範囲を挙げることができる（単位重量％）。
【００３５】
なお、組成物の構成物質（成分）には、所望に応じて亜鉛を極く少量添加混合することも可能である。亜鉛の配合割合は特に限定されないが、組成物の全量に対し、例えば、約０．５〜１．５重量％程度の範囲を挙げることができる。
【００３６】
（実施例）
次に本発明の実施例を説明する。下記実施例はその一例として開示したもので、本発明はこれら限定されるものではないこと勿論である。
【００３７】
下記実施例では二価三価鉄塩（ＭＲＮ−１００）として、下記により製造したものを採用した。
【００３８】
１．０ｍｇの塩化第二鉄を１００ｍｌの０．５Ｎカセイソーダ水溶液に入れ、攪拌溶解させて２４時間静置する。前記溶液中に生じた不溶性物質を除去し、この溶液を塩酸で中和した後、減圧濃縮してデシケーター中で乾燥結晶化する。得られた結晶に５０ｍｌのイソプロピルアルコール８０重量％水溶液を加えて再溶解し、減圧濃縮して溶媒を除去、乾燥させ、この再溶解，濃縮，乾燥を数回繰り返すことにより０．２５ｍｇの結晶を得た。この結晶を水（蒸留水又は純水）に溶解して約１００倍〜約１０，０００倍に希釈した水溶液、即ち、前記二価三価鉄塩約０．０１％〜約１％水溶液（二価三価鉄塩の原液）とする。そして、前記原液を粉末化して二価三価鉄塩を製造し、この粉末状の二価三価鉄塩を使用する。
【００３９】
本実施例では、組成物として下記表のNo.１ないしNo.６の各物質（粉粒状）を各配合量で配合して製造した組成物（Ａｎｔｉａ）を試料として採用した。
【００４０】
【表１】
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【００４１】
ここで、上記試料を使用した本実施例の概要を説明する。
（背  景）
アルツハイマー病などの多くの神経変性疾患は、酸化ストレスに関連している。従って、抗酸化療法は、神経変性疾患の予防と治療について提案されている。
（目  的）
マウスで誘発される孤発性アルツハイマー病（SAD）に対して保護効果を発揮する抗酸化物質Antia（本件試料のこと。以下同じ）の能力を検証すること。Antiaは、食用ヤマブシタケ、ゴツコラおよびコタラヒムブツ植物、およびアムラ（インドグーズベリー）から抽出される抽出物とジオスゲニン（ヤマイモ塊茎からの抽出物）にＭＲＮ−１００（二価三価鉄塩）を配合した抗酸化物質である。
（方  法）
マウスにおけるSADの誘導には、ストレプトゾトシン（STZ）（3mg / kg）の単回脳室内（ICV）注射を使用した。 Antiaは、3つの用量（25、50、100 mg / kg /日）で21日間腹腔内（IP）に注射された。神経行動学的検査は、注射の最終日から24時間以内に実施された。その後、マウスは頸部脱臼と断頭により犠牲になった。海馬は、生化学的パラメーターの測定に使用するために、迅速に切除、重量測定、均質化された。
【００４２】
（結  果）
Antiaによる治療は、Morris水迷路でのマウスのパフォーマンスを顕著に改善した。さらに、生化学分析により、AntiaはGSH、MDA、NF-κB、IL-6、TNF-α、アミロイド-βなどのいくつかの化合物に対して保護効果を発揮することが示された。ウェスタンブロットを用いたさらなる研究により、JAK2 / STAT3経路に対するAntiaの保護効果が示された。
（結  論）
Antiaは、ICV-STZ注射により誘発される認知機能障害に対して有意な保護を発揮する。この効果は、アミロイド形成、炎症、および酸化ストレス経路のターゲティングを通じて達成される。JAK2 / STAT3経路は、SADなどの神経炎症性疾患および神経変性疾患の保護的役割を果たす。
【００４３】
次に、本実施例について詳細に説明する。
（序  論）
アルツハイマー病（AD）などの年齢関連の神経障害が増加している。ADは、記憶と認知の進行性低下を特徴とする神経変性障害であり、認知症の最も一般的な原因であり、すべての症例の60?80％を占めている。高齢者の最も一般的なタイプのADである孤発性アルツハイマー病（SAD）は、中枢神経系の進行性神経変性に関係している。酸化ストレス、アミロイド形成、炎症、およびオートファジー経路を含む、いくつかの経路がSADの可能なターゲットとして検討されている。
【００４４】
酸化ストレスマーカーの出現は、AD脳における最も初期の変化の1つであり、目に見えるアミロイド沈着と神経原線維変化の蓄積に先行している。酸化ストレスは、慢性炎症、AD、パーキンソン病などの多くの障害に関係している。脳のニューロンは、高い酸素消費とエネルギー産生を示すため、活性酸素種（ROS）と酸化的損傷の過剰な生成のリスクが非常に高くなっている。
【００４５】
AD脳では、通常、固形アミロイド-β（Aβ）およびタウタンパク質は、斑点（プラーク）およびもつれ（タングル）と呼ばれるアミロイド様フィラメントに集合する。現在、Aβが中枢神経系に蓄積して細胞疾患を開始する経路については未解決であるが、Aβがニューロンを損傷してニューロン死を引き起こす可能性のある、提示されたメカニズムには、Aβ自己凝集中のROS生成が含まれる。これがin vitroでニューロンの膜で発生すると、最終的にシナプス膜の脱分極、過剰なカルシウム流入、およびミトコンドリア障害に繋がる。
【００４６】
ADなどの神経変性疾患も神経炎症を伴うものである。転写因子NF-κBは、ニューロンの炎症反応に重要な役割を果たすこと分かっている。通常の生理学的条件下では、NF-κBはその阻害剤IκBαと細胞質複合体を形成するが、刺激されるとNF-κBはシクロオキシゲナーゼ-2（COX-2）、インターロイキン-1βなどの炎症性標的遺伝子の転写を誘導することができる（IL-1β）、インターロイキン-6（IL-6）、および腫瘍壊死因子-α（TNF-α）。さらに、神経炎症は、神経変性疾患のオートファジーと関係している。オートファジーの病理学的破壊は、神経炎症の開始または悪化を引き起こす可能性があり、逆に、神経炎症は、神経変性を悪化させる自食障害を引き起こす可能性がある。ヒトADおよびADのマウスモデルでは、オートファジーが減少し、タウ凝集体の病理学的蓄積に寄与することがわかっている。オートファジーは、ラパマイシンの哺乳類標的であるmTORによって調節されることが知られており、mTOR阻害は脳性麻痺のマウスモデルで神経炎症を防ぐことが示されている。さらに、GSK-3β阻害は、オートファジーを活性化することにより、虚血性脳損傷を受けたラットの皮質の神経炎症を阻害することが実証されている。
【００４７】
ADの薬理学的管理はこれまで限定的であった。非ステロイド系抗炎症薬（NSAID）の長期使用は、2007年にAD発症の可能性の減少に関与すると考えられた。エビデンスはまた、NSAIDがアミロイド斑に関連する炎症を軽減できるという概念を示唆したが、高い有害事象のために試験は中断された。ADのリスクを低下させることが示されている薬やサプリメントは存在しないし、残念ながら、現在のFDA承認のAD治療は症状の緩和のみを提供し、この病気を遅延または治癒させることはできない。
【００４８】
最近では、抗酸化物質は、酸化ストレス傷害を減らすことにより、ADの発症を防ぐことに注目が集まっている。さらに、植物からの薬物や栄養補助食品の使用と検索は、伝統的な医学で使用が実証されている植物化学物質に見られる健康上の利点もあり、近年加速している。ヤマブシタケと呼ばれる伝統的な中国薬用キノコの成分は、培養アストロサイトの神経成長因子合成を促進し、ヒトの軽度認知障害を改善する。ゴツコラ植物は、認知症と記憶改善に伝統的に使用されており、その抽出物はげっ歯類の記憶保持を改善し、ADのマウスモデルの海馬におけるアミロイドベータの病理を変化させ、調節することが示されている酸化ストレス反応は、ADで発生する神経変性の変化に関係している。植物由来のステロイド性サポゲニンであるジオスゲニンは、抗がん効果を発揮し、加齢に伴う認知障害を改善し、糖尿病性神経障害を緩和することが示されている。最近、ジオスゲニンが記憶機能を改善し、ADマウスモデルの軸索変性を減少させることが証明された。インドのスグリであるアムラは、強力なラジカル消去効果を持つことが示されており、酸化ストレス、カルボニルストレス、タンパク質の糖化、Aβ細動、アセチルコリンエステラーゼ阻害、神経炎症を標的としたバイオアッセイのパネルで、高度な神経保護能力を持っている。また、ADのラットモデルの認知機能、脳の抗酸化酵素、およびアセチルコリンエステラーゼ活性を改善する。最後に、kothala himbutu（Salacia reticulata）は、ストレプトゾトシン誘発の若い糖尿病ラットの有害な認知変化およびマウス海馬の水銀毒性から保護することが示されている。
【００４９】
この実施例では、ヤマブシタケ、ゴツコラ、ジオスゲニン、アムラ、コタラヒムブツなどの成分を含むAntiaと呼ばれる抗酸化製品の認知保護効果を検証する。これらの成分は、Antiaを生成するためにハイドロフェレート液MRN-100と一緒に処理される。MRN-100の従来の研究では、加齢に伴う酸化ストレスおよび内皮細胞ならびにマウスおよびヒト白血病細胞の酸化的損傷から保護することが示されている。 Antiaに関する最近の研究では、ヒト末梢血リンパ球の酸化ストレス誘発性ミトコンドリア機能障害を回復する能力が示されている。上記のAntiaの植物成分の神経保護効果に照らして、AntiaはADに関係する経路、すなわち酸化ストレス、アミロイド形成、炎症、およびオートファジー経路に有益な効果があると仮定した。ストレプトゾトシン（STZ）の脳室内（ICV）注射を介してSADで誘発されたマウスに対するAntiaの効果を研究した。これは、インスリンに対する脳の抵抗に基づいたSADの定評のある動物モデルであり、記憶障害、酸化ストレス、神経炎症、神経変性など、ヒトのSADの加齢に伴う病理を模倣するものである。ここでは、仮説を裏付ける行動、生化学、およびウェスタンブロット実験を提示する。
【００５０】
（方  法）
＜動  物＞
エジプトのカイロ大学薬学部の動物施設から、体重25?30 gのオスのアルビノマウスが提供され、研究を実施する前に1週間順化させた。動物は、一定温度（25±2°C）、相対湿度60±10％、明暗サイクル（12/12時間）の制御された環境条件で飼育された。標準的な食事と水は自由に摂取できた。動物の苦痛を最小限にし、使用する動物の数を減らすために、すべての努力が活用された。この研究は、動物実験の倫理委員会（カイロ大学薬局）によって承認され、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイド（2011）の推奨事項に準拠している。
【００５１】
＜化学薬品＞
STZは、Sigma-Aldrich Co.（米国ミズーリ州セントルイス）から購入した。 STZを生理食塩水（0.9％NaCl）に溶解し、フリーハンド法によりICVを10μL注入した。 Antiaは生理食塩水に3つの用量で溶解した：成人用量（1日4錠）に相当する25mg / kg、50 mg / kg、および100 mg / kg。次に、0.1ml / 20g-マウスの容量で腹腔内（i.p.）に投与した。実験の各日に新鮮な薬液を調製した。対照群は、同じ体積の同じ投与経路で生理食塩水注射を受けた。その他の化学物質はすべて最高の分析等級であった。
【００５２】
＜試料（Antia）＞
Antiaは、食用ヤマブシタケ、ゴツコラおよびコタラヒムブツ植物、ジオスゲニン（ヤマノイモの塊茎からの抽出物）、およびアムラ（インドグーズベリー）を含む、さまざまなキノコおよび植物に由来する天然化合物である。材料はMRN-100と呼ばれる鉄ベースの液体で処理される。 MRN-100はフィトシンから作られており、2価および3価の鉄酸塩（ハイドロ鉄酸塩流体）に由来する鉄ベースの化合物である。Antiaの正確な化学組成は現在も鋭意調査中である。Antiaは、ACM Co.、Ltd、Japanによって提供されたものである。Antiaは、MRN-100の濃度が約2×10-12 mol / Lの蒸留水（DW）で調製された。
【００５３】
＜SADの誘導＞
SADは、フリーハンド手順およびWarnockらによって更新されたに従って、STZ（3 mg / kg）をマウスの側脳室にICV注射することによって誘発された。大脳静脈穿通の可能性を回避するため。マウスをチオペンタール（5 mg / kg、ip）で麻酔した後、耳の上から下向きの圧力を使用して頭を安定させ、皮膚と頭蓋骨を介して直接脳室の間の正三角形を視覚化することで標的とした側脳室に針を挿入した目と頭蓋骨の中心でブレグマの位置を特定し、この点から約1mm外側に針を挿入する。マウスは、注射の1分後に正常に行動した。
【００５４】
＜実験計画＞
実験計画を図１に示す。マウスを任意に5つのグループに分け、それぞれに12匹の動物を入れた。グループI（対照）：マウスは21日間連続してICV注射を1回、腹腔内（i.p.）生理食塩水を注射し、正常な対照グループとして使用した。グループII（STZ）：マウスは、STZ（3 mg / kg、ICV）を1回投与され、SADのモデルとして使用された。グループIII（STZ +抗1）：マウスは、5時間後、連続21日間毎日、STZ（3 mg / kg、ICV）に続いてAntia（25 mg / kg、i.p）を受けた。グループIV（STZ + Antia 2）：マウスは、5時間後にSTZ（3 mg / kg、ICV）、続いてAntia（50 mg / kg、i.p）を投与され、その後21日間連続して毎日投与された。グループV（STZ + Antia 3）：マウスは、5時間後、連続21日間毎日、STZ（3 mg / kg、ICV）に続いてAntia（100 mg / kg、i.p）を受けた。治療終了の24時間後に、オブジェクト認識テストとモリス水迷路（MWM）テストを含む神経行動学的テストを実施し、ストレスの少ないテストからストレスの多いテストへと順番に並べた。概日変動の可能性を最小限に抑えるために、すべてのテストは、トップイルミネーションの下で動物の光サイクル中に実施された。
【００５５】
＜行動評価＞
オブジェクト認識テスト。オブジェクト認識テストは、長期記憶を評価し、認知を推定するために使用される。この研究では、実行されたテストは3日間連続で行われました。初日（馴化期）に、周囲の環境に適応させるために、各マウスを30 x 30 x 30 cm3の大きさの木製の箱に30分間入れた。2日目は習熟またはトレーニングのために指定され、2つの木製の立方体が同じ形、色、サイズで、壁の2 cmの箱の反対側の角に置かれた。各マウスをボックスの中央に置き、これら2つのオブジェクトを10分間探索するために放置した。3日目に、テストが行われた。2つの同一立方体の1つは、形状、サイズ、色が異なる新しいオブジェクトに置き換えられた。各マウスは、これら2つのオブジェクトに5分間再びさらされた。追加されたオブジェクトは、動物との実験の間に70％エタノールで洗浄され、行動が臭気の合図によって誘導されないようにした。すべてのオブジェクトと場所は、特定の場所またはオブジェクトの傾斜による潜在的なバイアスを減らすように調整された。マウスはオブジェクトを移動することができず、被験者は常に同じ壁に面したボックスに入れられた。動物の行動をビデオ録画し、次のパラメーターを計算した：
１）デターミネーションインデックス：新規および馴染みのあるオブジェクトの探索時間の差を、両方のオブジェクトの探索に費やした合計時間で割った値で、この結果は+1と-1の間で変化する。プラスのスコアは新規オブジェクトに費やした時間を示し、マイナスのスコアは馴染みのあるオブジェクトに費やした時間を示し、ゼロのスコアは好みの差がゼロを示す
２）認識指標：動物が新しいオブジェクトを探索するのに費やした時間。両方のオブジェクトの総探索時間の割合。
【００５６】
モリス水迷路テスト。MWMテストは、実験用マウスの空間学習と記憶を調査するために使用される。迷路は、4つの象限に分割されたステンレス鋼の円形タンク（直径210 cm、高さ51 cm）で構成され、深さ35 cmまで水（25±2oC）で満たされた。黒に塗られた水没プラットフォーム（幅10 cm、高さ28 cm）を水面下2 cmの目標四分円内に配置した。プラットフォームは、トレーニングとテストの間、一貫した位置に保たれた。プラットフォームを見えなくする目的で、水を不透明にするために紫色の無毒の染料が追加された。記憶獲得トライアル（120秒/トライアル）は、トライアルの間に少なくとも15分の間隔を空けて、4日間連続で1日に2回実行された。各取得トライアル中に、動物を自由に残して、ターゲット象限に隠されたプラットフォームを見つけた。マウスがプラットフォームを見つけたら、さらに20秒間休息させ、120秒以内に動物がプラットフォームに到達できなかった場合は、プラットフォームに優しく誘導し、20秒間維持した。平均逃避潜時は、各ラットが隠れたプラットフォームを見つけるのにかかる時間として計算され、獲得または学習の指標として使用された。 5日目に、マウスをプローブ試験セッションにかけた。そこでは、プラットフォームはプールから取り去られ、各ラットが60秒間プールをプローブできるようにした。事前に置かれた隠れたプラットフォームがある対象象限にいる各ラットが費やした時間は、検索または記憶の指標として記録された。
【００５７】
＜脳の処理＞
行動試験後、マウスを頸部脱臼により安楽死させ、脳を急速に解剖し、氷冷生理食塩水で洗浄した。海馬（n = 6）は、氷冷ガラス板上の各脳から切除された。海馬を氷冷生理食塩水でホモジナイズして、10％ホモジネートを調製し、いくつかのアリコートに分けて-80oCで保存した。もう一方の海馬は-80℃で保存され、ウェスタンブロット分析に使用された。
【００５８】
＜生化学的測定＞
酸化ストレスと炎症性バイオマーカーの決定。マロンジアルデヒド（MDA）のレベルを測定することにより、海馬の脂質過酸化を推定した。MDAは、内山と三原によって記述された方法に従って、チオバルビツール酸反応性物質を測定することによって測定された。さらに、脳グルタチオン（GSH）含有量は、Beutler et alによって記載された方法に従って、エルマン試薬を使用して分光光度法で決定された。結果は、Mmol / mgタンパク質として表現される。
【００５９】
酵素免疫測定法。海馬のTNF-αおよびIL-6のレベルは、それぞれRayBiotech Inc.（米国ジョージア州ノークロス）およびR＆D Systems Inc.（米国ミネアポリス）から購入したラットELISAキットを使用して推定した。手順は、製造元の指示に従って実行された。結果は、TNF-αとIL-6の両方のpg / mgタンパク質として提示される。
【００６０】
ウェスタンブロット分析。脳組織からタンパク質溶液を抽出した後、SDS-PAGE（10％アクリルアミドゲル）で等量のタンパク質（総タンパク質の20?30μg）を分離し、ポリフッ化ビニリデン膜（Pierce、Rockford、IL、USA）に転写したBio-Rad Trans-Blotシステムを使用する。ウェスタンブロットの免疫検出は、20 mM Tris-Cl、pH 7.5、150 mM NaCl、0.1％Tween 20および3％ウシ血清アルブミンを含むブロッキング溶液で、室温で1時間膜をインキュベートすることにより行われた。膜は、一次抗体P-JAK2（Tyr 1007/1008）、P-STAT3（Tyr 705）、IκB-α、GSK-3β、mTOR、COX-2、βのいずれかと4°Cで一晩インキュベートしたThermo Fisher Scientific Inc.（米国イリノイ州ロックフォード）から入手したアクチン。洗浄後、ペルオキシダーゼ標識二次抗体を添加し、膜を室温で1時間インキュベートした。 Image LabTM Software Version 5.1（Bio-Rad Laboratories , Inc.Hercules、CA、USA）を備えたChemiDoc?イメージングシステムを使用して、バンド強度を分析した。結果は、β-アクチンタンパク質のレベルに正規化した後、任意の単位で表示される。
【００６１】
タンパク質含有量の決定。タンパク質含量は、ブラッドフォードの方法に従って測定された。すべての結果は、タンパク質mgあたりの組織濃度として表される。
【００６２】
＜統計分析＞
データは平均値±標準誤差として示されている。データは、一元配置分散分析（ANOVA）に続いてTukey-Kramer多重比較検定を使用して分析された。 GraphPad Prismソフトウェア（Version 6; GraphPad Software、Inc. 米国カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して、統計分析を実行し、グラフィカルなプレゼンテーションを作成した。有意水準は、すべての統計検定でp <0.05に設定された。
【００６３】
（結  果）
ICV-STZ処理マウスの行動および生化学的機能に対するAntiaの効果は、神経行動テストおよび海馬内容の生化学的分析で測定された。神経行動試験に対するSTZおよびAntia（25、50および100 mg / kg）の効果は、Antia注射の最終日から24時間以内に実施された。 Morris水迷路を使用して、ICV-STZを注射したマウスに対するAntia治療の保護効果の可能性を調べた。平均エスケープレータンシー（MEL）の図２Ａに示すように、異なるグループのマウスは2日目の脱出に異なる時間を要した。アルツハイマー病のマウスは2日目に脱出に1.63倍の時間が掛かった。一方、Antiaのアルツハイマー病マウスは、2日目の対照マウスの1.08倍しか掛からなかった。これらの結果は、3日目と4日目にさらに確認された。 Morris水迷路の対象となる象限でマウスが過ごした時間に対するAntia効果の研究（図２Ｂ）では、対照マウスと比較して、アルツハイマー病のマウスは象限で25.4％の時間しか費やさなかったのに対して、25、50、および100 mg / kgのAntiaを投与したアルツハイマー病のマウスは、対照マウスと比較して、それぞれ72.5％、75.8％、および85.4%の時間を消費したことが明らかとなった。
【００６４】
STZとAntiaの効果は、新規オブジェクト認識テストの選別と選好指標によってさらに調べられた。対照群と比較した場合、STZ誘発SADマウスでは識別指数が減少したが、Antia投与（25、50、および100mg / kg）後、用量依存的に見て、STZ]グループと比較して有意に増加した。さらに、新規オブジェクトの探索に費やされた時間は、ICV-STZを注入されたマウスで、対照グループと比較して63％減少した。 Antia投与（25、50および100mg / kg）は嗜好指数を標準化し、Antia投与マウスは用量依存的に見慣れたオブジェクトよりも新しいオブジェクトを好むことを示した（図２Ｃ）。
【００６５】
ICV-STZ処理マウスの海馬の内容のいくつかの生化学的分析は、アミロイド形成、炎症、オートファジー、および酸化ストレス経路を減衰させるAntiaの能力を調べるために行われた。グルタチオン（GSH）およびマロンジアルデヒド（MDA）の海馬含有量に対するAntia治療の保護効果に関する研究を実施した。図３Ａの結果は、アルツハイマー病マウスのGSHレベルが対照マウスのGSHレベルの15.5％であったことを示している。一方、Antiaのアルツハイマー病マウスは、用量依存的にGSH含有量の上昇を示し、100 mg / kg Antia治療の対照GSHレベルの78.7％で最大になりました。 MDA海馬含有量のレベルの結果は、ICV-STZを注入したマウスのMDAレベルが、対照マウスと比較して4.3倍も有意に高いことを示している。一方、Antiaのアルツハイマー病マウスは、25、50、100 mg / kgの用量でAntiaを投与されたマウスのMDA含有量がそれぞれ3.5倍、2.5倍、1.8倍しか上昇しなかった（図３Ｂ）。
【００６６】
抗炎症性サイトカインの海馬含有量に対するICV-STZ注射の効果も、Antia治療の有無で調べた。 2つのサイトカイン、TNF-αおよびIL-6を調べた。図４の結果は、STZモデルマウスが対照マウスと比較してTNF-αおよびIL-6サイトカインの発現の有意な増加を示したことを示しているが、Antiaでの治療は用量依存的にこの誘導を阻害し、対照レベルに達した100 mg / kg。同様の傾向は、NF-κBp65の海馬内容にも見られる。図４の結果は、アルツハイマー病のマウスでNF-κBp65のレベルが増加していること、およびAntiaを持つアルツハイマー病のマウスで徐々に減少していることを示している。
【００６７】
アミロイドβは、通常は固体のタンパク質がアミロイド様のフィラメントに集合するアルツハイマー病のプラークを構成するため、ICV-STZを注射したマウスのアミロイドβ1-42海馬の内容に対するAntiaの効果を調べた。図5に描かれた結果は、STZモデルマウスが対照マウスと比較してアミロイドβの発現が約4倍増加したことを示している。興味深いことに、アミロイドβのレベルは、Antiaを持つアルツハイマー病マウスで有意に減少した。効果は用量依存的であり、100 mg / kgで最低レベルに達した。
【００６８】
さらにタンパク質発現を調べた。 STATおよびJAKタンパク質発現のリン酸化レベルは、アルツハイマー病の研究で使用されている確立された方法である。 Antiaによる治療がSTZマウスのSTAT発現のリン酸化を阻害するかどうかを調べた。予見されたように、STATタンパク質発現のリン酸化レベルは、対照マウスと比較して有意に減少した。しかし、STZマウスをAntiaで処理すると、STAT3のリン酸化レベルが有意に阻害された（図６Ａ）。 JAK2タンパク質の発現でも同様の結果が見られた。Antiaでの処理により、STZ注入によりJAK2のリン酸化レベルが大幅に阻害された（図６Ａ）。これらの結果は、JAK2 / STAT3経路に対するAntiaの保護効果を示している。
【００６９】
以前の研究では、グリコーゲンシンターゼキナーゼ-3（GSK-3）が神経原線維変化の主要成分であるタウタンパク質をリン酸化することが示されている。 GSK-3aの阻害は、アルツハイマー病の2つの病理学的特徴であるアミロイド斑と神経原線維変化の両方の形成を減少させる新しいアプローチを提供する。図６Ｂの結果は、アルツハイマー病マウスのGSK-3βレベルの発現が対照マウスのGSK-3βレベルよりも7倍高いことを示している。一方、Antiaで処理すると、GSK-3βの発現が劇的に阻害され、対照の約3倍になった。図６Ｂの結果は、アルツハイマー病マウスのIKB-αの発現が対照マウスのIKB-αレベルよりも約6.5倍大きいことも示している。一方、Antiaで処理すると、IKB-αの発現が劇的に阻害され、対照の約2.8倍になった。
【００７０】
いくつかの研究は、哺乳類のラパマイシン標的（mTOR）がアミロイドβおよびタウ誘発神経変性に関与する可能性があることを示している。以前の研究では、AD症例の内側側頭皮質のSer2481でリン酸化されたmTORのレベルが、対照症例と比較して高いことが示された。図6Cの結果は、STZ注射マウスは、対照マウスのレベルよりもそれぞれ5倍および6倍大きいmTORおよびp-AKTタンパク質発現の有意な増加レベルを示したが、Antiaでの治療はその増加を逆転させ、それに近づけた。
【００７１】
最後に、COX-2は炎症プロセスの重要な酵素である。図６Ｄの結果は、アルツハイマー病マウスがCOX-2発現の有意な誘導を示したことを示している。これは、対照マウスのCOX-2レベルの600％である。しかし、Antiaによる治療は、COX-2の発現を150％?300％に大幅に減少させた。
【００７２】
（検  討）
本研究の結果は、抗酸化物質Antiaがマウスで誘発されたSADに対して保護効果を発揮する能力を示している。 Antiaの成分は、以前からさまざまな神経再生および保護特性を持っていることが示されている。ヤマブシタケは神経成長因子を合成することが示されている。ゴツコラ抽出物は、実験動物のアルツハイマー病の脳のアミロイドβレベルを低下させる。ジオスゲニンは、マウスの認知能力を向上させる。アムラは、強力な神経保護効果と認知増強特性を持つ強力な抗酸化剤として機能する。また、コタラヒムブツは、若い糖尿病ラットの有害な認知変化およびマウス海馬の水銀毒性から保護する。ここで、Antiaは、アミロイド形成、炎症、オートファジー、および酸化ストレス経路を含むいくつかのリンクされた経路を標的とすることにより、マウスモデルの認知機能障害を軽減することが示されている。
【００７３】
本研究では、STZによるマウスでのSADの誘導は、モリス水迷路および新規オブジェクト認識テストの有意な認知機能低下を誘発した。 STZのICV注入は、人間の脳に類似したSADの進行性病理を模倣する実験モデルである。マウスがモリス水迷路のなじみのあるオブジェクトと新しいオブジェクトを識別できないこと、および新しいオブジェクト認識タスクを識別できないことからわかるように、STZ処理マウスは有意な学習および記憶障害を示した。これは、以前の研究と調和性を有する。ただし、取得試行中のエスケープレイテンシの大幅な上昇と、Morris水迷路テストのプローブトレイル中のターゲット象限で費やされた時間、および新規オブジェクト認識テストでの差別と選好指数の増加により、 Antiaは、STZによる空間記憶および短期記憶の障害を防止した。オブジェクト認識の記憶不足のこの改善は、Antiaのいくつかの成分の従来証明された効果に起因する可能性がある。例えば、ジオスゲニンには抗アミロイド形成効果があり、ヘリクシウムエリナセウスにはADのニューロン損失と認知症に対する強い神経保護効果があることが示されている。さらに、粉末乾燥ヤマブシタケの経口投与は、ヒトの軽度認知障害の改善に有効であることが実証されている。
【００７４】
ＳＴＺ投与は、ＮＦ−κＢおよび抗炎症性サイトカイン、すなわちＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の海馬内容の発現の有意な増加を示した。 NF-κBは、COX-2、IL-1β、IL-6、TNF-αなどの炎症性標的遺伝子の転写を誘導するニューロンの炎症反応に重要な役割を果たす。 TNF-αは全身性炎症に関与し、特に、β-セクレターゼ調節を介したアミロイド形成だけでなく、AD関連の脳神経炎症にも関与している。さらに、パーキンソン病やアルツハイマー病などの深刻な神経病理学的変化は、脳内のIL-6発現の増加と関連している。 NF-κBは、アミロイドβの生成に関与する律速酵素であるBACE-1発現レベルを調節することも示されている。 Janus Kinase / Signal Transducers and Activators and Transcription（JAK / STAT）シグナル伝達経路は、インターフェロンシグナル伝達を媒介する経路として1980年代に登場した。神経炎症には疾患が伴い、JAK2 / STAT3経路の活性化は病原性炎症を引き起こした。従って、JAK2 / STAT3経路のターゲティングは、ADなどの神経炎症性疾患および神経変性疾患の保護療法として使用できる。
【００７５】
本研究では、測定されたすべての炎症性サイトカインのレベルを低下させ、リン酸化STAT3およびJAK2の発現を劇的に阻害することにより示されるように、Antiaの投与は有意な抗炎症効果を有することが示された。 STAT3 / JAK2経路は、TNF-α産生にリンクされている。 TNF-αおよびNF-kBの顕著な阻害は、ヤマブシタケとして知られるHericium erinaceusの作用に起因する可能性がある。これは、接着分子およびIL-6やTNF- α。
【００７６】
神経炎症はオートファジーの不足に関連しており、これは神経変性に寄与する可能性がある。哺乳類のラパマイシン標的（mTOR）は、プロテインキナーゼB（Akt）とともにオートファジーを調節することが知られている。いくつかの研究は、mTORシグナル伝達とアミロイドβプラークの存在とADの認知障害との密接な関係を強調している。さらに、ADのヒトおよびラットの研究では、オートファジー活性化がGSK-3β阻害剤にリンクされており、その欠損がタウ凝集体の病理学的蓄積に寄与することが分かっている。
【００７７】
Antiaによる治療は、STZ注射後のmTOR、Akt、IKB-α、およびGSK-3βレベルの上昇した発現を反転させ、対照の発現に近づけた。最近の報告では、ジオスゲニンによるニューロンの軸索密度の増加が認知機能の有意な改善を引き起こしたことが示された。これは、mTOR経路を介した局所タンパク質翻訳を調節することが知られているPI3K-Akt経路の変調により達成でき、軸索再生に重要な役割を果たすものである
【００７８】
この研究の結果は、AntiaがGZを増加させ、STZ処理マウスの脂質過酸化を減少させることを示した。以前の研究は、自己凝集中のアミロイドβを介したROSの生成がニューロンを損傷し、ニューロン死を引き起こす可能性があることを示した。脂質過酸化は、膜を直接損傷するフリーラジカル媒介傷害の主要な結果の1つであると考えられており、AD患者の脳で脂質過酸化の増加が報告されている。 AntiaによるSTZ処理マウスの治療は、酸化ストレスパラメーターを改善した。これは、酸化ストレス誘発性のミトコンドリア機能障害とアポトーシスを逆転させる従来知られている能力に起因する可能性がある。さらに、ゴツコラとして一般に知られるツボクサは、顕著なフリーラジカル消去特性、脂質過酸化の減少、酸化ストレスによるDNA断片化からの保護を示し、アルツハイマー病の脳の病理を変化させる複数のメカニズムを提供することが従来発見された。従来の研究では、Antiaの成分を処理し、GSH、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、およびグルタチオンペルオキシダーゼの脳レベルを高め、酸化ストレスのレベルを阻害窒素、総フリーラジカルなどの酸化ストレスバイオマーカーの阻害するために使用されるハイドロフェラート液であるMRN-100の有益な抗酸化特性が示されたている。GSHは、ROSによって引き起こされる損傷を防ぐ能力を持ち、オリゴメトリックアミロイドβの酸化および神経毒性の変性から保護する可能性がある抗酸化剤である。
【００７９】
（結  論）
本研究から、AntiaはSTZのICV注射によって誘発される孤発性ADに対して有意な保護を発揮すると結論付けることができる。この効果は、アミロイド形成、炎症、および酸化ストレス経路を標的とすることにより達成される。JAK2 / STAT3経路は、Akt / mTOR /GSK-3β経路の調節によって媒介される、誘発された神経炎症の保護的役割を果たした。本出願人らの知る限りでは、これはSADなどの神経変性疾患に対するAntiaの保護効果を追求するために行われた最初の実施例である。
【要約】
【課題】  組成物を構成する各物質が有する作用の相乗効果に加え、各物質自体の効能を大巾に増強し得る組成物を提供する。
【解決手段】  ゴツコラ、アムラ、コタラヒムブツ、ジオスゲニン、ヤマブシタケの各抽出物及び二価三価鉄塩を有効成分として含有した組成物である。二価三価鉄塩を含有させることにより、組成物を構成する各物質自体の有する効能を予期し得ないほど大巾に増強する。
【選択図】  図１【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
0006861264.tif 000009
【図５】
0006861264.tif 000010
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
0006861264.tif 000012
【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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