(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学式１で表示される化合物を含み、免疫促進活性を有し、そして大腸菌ＥＧ００２４（受託番号：ＫＣＴＣ１２９４８ＢＰ）由来である、免疫調節剤：
【化１】
0006963018.tif 000007
（式中、Ｇｌｃはグルコース、ＧｌｃＮはグルコサミン、ＨＥＰはヘプトース、ＫＤＯは２−ケト−３−デオキシ−オクトネート、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンであり、Ａ〜Ｆはホスフェート（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が結合し得る位置を表す。）。
【請求項２】
前記ホスフェートは、２〜６個であることを特徴とする、請求項１に記載の免疫調節剤。
【請求項３】
前記各ホスフェートは、化学式１のＡＢ、ＡＣ、ＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＢＣ、ＢＤ、ＢＥ、ＢＦ、ＣＤ、ＣＥ、ＣＦ、ＤＥ、ＤＦ、ＥＦ、ＡＢＣ、ＡＢＤ、ＡＢＥ、ＡＢＦ、ＡＣＤ、ＡＣＥ、ＡＣＦ、ＡＤＥ、ＡＤＦ、ＡＥＦ、ＢＣＤ、ＢＣＥ、ＢＣＦ、ＢＤＥ、ＢＤＦ、ＢＥＦ、ＣＤＥ、ＣＤＦ、ＣＥＦ、ＤＥＦ、ＡＢＣＤ、ＡＢＣＥ、ＡＢＣＦ、ＡＢＤＥ、ＡＢＤＦ、ＡＢＥＦ、ＡＣＤＥ、ＡＣＤＦ、ＡＤＥＦ、ＢＣＤＥ、ＢＣＤＦ、ＢＣＥＦ、ＢＤＥＦ、ＣＤＥＦ、ＡＢＣＤＥ、ＡＢＣＥＦ及びＡＢＣＤＥＦから構成される群から選ばれる位置に結合することを特徴とする、請求項１に記載の免疫調節剤。
【請求項４】
前記免疫調節剤は、Ｏ−連結された（Ｏ−ｌｉｎｋｅｄ）脂肪酸を有しないことを特徴とする、請求項１に記載の免疫調節剤。
【請求項５】
請求項１の免疫調節剤を有効成分として含む免疫補助剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）組成物。
【請求項６】
前記組成物は、Ｍｇ、Ｃａ、Ｓｒ、Ｂａ及びＲａから構成される群から選ばれる第２族元素又はその塩；Ｔｉ、Ｚｒ、Ｈｆ及びＲｆから構成される群から選ばれる第４族元素；アルミニウムの塩とその水和物；及び、ジメチルオクタデシルアンモニウムブロミドから構成される群から選ばれる免疫補助成分をさらに含むことを特徴とする、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
（ａ）抗原；（ｂ）請求項１の免疫調節剤；及び、（ｃ）ミョウバン（ａｌｕｍ）を含む、ワクチン組成物。
【請求項８】
前記抗原は、ペプチド、蛋白質、核酸、糖（ｓｕｇａｒ）、病原体、弱毒化された病原体、不活性化された病原体、ウイルス、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、細胞及び細胞断片から構成される群から選ばれることを特徴とする、請求項７に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
前記抗原は、日本脳炎ウイルス（Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）の抗原、ＨＩＢ（Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｔｙｐｅ  Ｂ）の抗原、ＭＥＲＳウイルスの抗原、ジカウイルスの抗原、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の抗原、百日咳の抗原、結核菌の抗原、炭疽菌抗原、ＨＡＶ（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ａ  ｖｉｒｕｓ）の抗原、ＨＢＶ（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ
ｖｉｒｕｓ）の抗原、ＨＣＶ（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ）の抗原、ＨＩＶ（ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）の抗原、ＨＳＶ（Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ）の抗原、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の抗原、コリネバクテリウムジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）の抗原、ボルデテラパーツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の抗原、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）の抗原、ＨＰＶ（ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）の抗原、水痘ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ  ｖｉｒｕｓ）の抗原、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）の抗原、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の抗原、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）の抗原、アシネトバクターバウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）の抗原、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）の抗原、ヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）の抗原、マラリア（プラスモジウム菌）の抗原、デングウイルスの抗原、ツツガムシ（Ｏｒｉｅｎｔｉａ  ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）の抗原、重症熱性血小板減少症候群（ｓｅｖｅｒｅ  ｆｅｖｅｒ  ｗｉｔｈ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓ；ＳＦＴＳ  Ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓ）の抗原、サーズコロナウイルス（ｓｅｖｅｒｅ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ−ｃｏｒｏｎａ  ｖｉｒｕｓ；ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）の抗原、インフルエンザウイルスの抗原、エボラウイルスの抗原及び肺炎球菌の抗原から構成される群から選ばれることを特徴とする、請求項７に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
前記ワクチンは、死菌ワクチン、弱毒化ワクチン、サブユニットワクチン、組換えワクチン、蛋白接合ワクチン、単価ワクチン、多価ワクチン又は混合ワクチン形態であることを特徴とする、請求項７に記載のワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な構造の免疫調節剤及びこれを含むワクチン組成物に関し、より詳細には、毒性を減少させたリポポリサッカライド（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ＬＰＳ）類似体である免疫調節剤及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポポリサッカライド（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ＬＰＳ）は、グラム陰性バクテリアの外膜の主要成分であり、様々な免疫細胞を促進させ、特に先天性免疫反応を触発させる。ＬＰＳは、サイトカイン分泌、補助刺激因子（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の発現及び抗原提示の誘導によって抗原提示細胞を活性化させ、これは先天性免疫反応と適応免疫反応を連結する（Ａｋｉｒａ  Ｓ，Ｕｅｍａｔｓｕ  Ｓ，Ｔａｋｅｕｃｈｉ  Ｏ，Ｃｅｌｌ１２４：７８３−８０１（２００６）；Ｓｃｈｎａｒｅ  Ｍ，Ｂａｒｔｏｎ  ＧＭ，Ｈｏｌｔ  ＡＣ，Ｔａｋｅｄａ  Ｋ，Ａｋｉｒａ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２：９４７−９５０（２００１））。
【０００３】
ＬＰＳは両親媒性ドメイン（脂質Ａ）、コアオリゴサッカライド（ｃｏｒｅ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ＯＳ）及びＯ−抗原（Ｏ−ａｎｔｉｇｅｎ或いはＯ−ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）の３個のドメインで構成されている。脂質Ａは、ＬＰＳの内毒素活性を担当し、様々な類型の免疫細胞のＴＬＲ４（ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４）信号伝達によって免疫促進効果を示すと知られている（Ｒａｅｔｚ  ＣＲ，Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ  Ｃ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ７１：６３５−７００（２００２））。減少された毒性を示す脂質Ａ誘導体が、ヒトワクチン免疫補助剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）開発にターゲットとされてきた。ＭＰＬ（Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  ｌｉｐｉｄ  Ａ）はサルモネラミネソタＲ型菌株（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｉｎｎｅｓｏｔａ  ｒｏｕｇｈ  ｓｔｒａｉｎ）から分離されたＬＰＳの非毒性誘導体である。また、アルミニウム塩とＭＰＬの組合せは、ＨＢＶ（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ）とＨＰＶ（ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）ワクチン用の免疫補助剤として承認されている。
【０００４】
ＬＰＳの場合、１９５０年代から坑癌効果が知られたが、ナノグラム（ｎｇ）レベルの汚染でも敗血症による死亡を招き得る毒性から使用し難いという不具合があった。このため、ＬＰＳの弱毒化の試みは続いており、特にポリサッカライドチェーンの除去又は脂質Ａの脱アシル化によって毒性を減少させることに成功した（Ｋａｔｚ  ＳＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．Ｄｅｃ１７；２７４（５１）：３６５７９−８４  １９９９）。特に、ＬＰＳのポリサッカライドチェーンを除去して得た脂質Ａのリン酸化から得たＭＰＬの場合、ＬＰＳの毒性を除去した免疫抗癌剤として開発されたが、その効果はわずかであると知られている。
【０００５】
本出願人は、以上の免疫補助剤の短所を補完した新規のＬＰＳ類似体を既に開発したことがある（大韓民国登録特許第１０−１５０９４５６号）。本明細書全体にわたって多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照として組み込まれ、本発明の属する技術分野のレベル及び本発明の内容をより明らかにする。
【０００６】
本発明者らは、既存のＬＰＳの使用時に問題とされてきた毒性を減少させる一方で、優れた免疫促進活性も示し得るＬＰＳ類似体を開発しようと努力した結果、ヒトの腸で発掘した大腸菌菌株から、Ｏ−抗原部位を持たないＬＯＳを分離精製し、脱アシル化させて、毒性の減少した新規な構造の免疫調節剤（ＥＧ−Ｉｍｍｕｎｅ  Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ；ＥＧ−ＩＭ）を発見し、これは優れた免疫促進活性を示し、免疫補助剤として利用できることを確認し、また、上記免疫調節剤とアルミニウム塩（ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｓａｌｔ）、すなわち、ミョウバン（ａｌｕｍ）を含むワクチン組成物は、それぞれ単独使用する場合に比べて優れた免疫促進活性を示すことを確認し、本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の目的は、新規な構造である化学式１で表示される免疫調節剤、及び該免疫調節剤を有効成分として含む免疫補助剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）組成物を提供することにある。
【化１】
0006963018.tif 000002
（式中、Ｇｌｃはグルコース、ＧｌｃＮはグルコサミン、ＨＥＰはヘプトース、ＫＤＯは２−ケト−３−デオキシ−オクトネート、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンであり、Ａ〜Ｆはホスフェート（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が結合し得る位置を表す。）
【０００８】
本発明の他の目的は、（ａ）抗原；（ｂ）化学式１で表示される免疫調節剤；及び、（ｃ）ミョウバン（ａｌｕｍ）を含むワクチン組成物を提供することにある。
【０００９】
上記の目的を達成するために、本発明は、化学式１で表示される免疫調節剤を提供する。
【化２】
0006963018.tif 000003
（式中、Ｇｌｃはグルコース、ＧｌｃＮはグルコサミン、ＨＥＰはヘプトース、ＫＤＯは２−ケト−３−デオキシ−オクトネート、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンであり、Ａ〜Ｆはホスフェート（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が結合し得る位置を表す。）
【００１０】
本発明はまた、前記免疫調節剤を有効成分として含む免疫補助剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）組成物を提供する。
【００１１】
本発明はまた、（ａ）抗原；（ｂ）化学式１で表示される免疫調節剤；及び、（ｃ）ミョウバン（ａｌｕｍ）を含むワクチン組成物を提供する。
【００１２】
本発明はまた、化学式１で表示される免疫調節剤を患者に処理することを特徴とする、免疫疾患の予防方法及び予防するための用途を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１Ａは、抽出されたＬＯＳを電気泳動及びシルバー染色によって確認した結果であり、図１Ｂは、ＬＯＳをアルカリ処理した時に脂質Ａの Ｏ-アシル鎖除によって抽出されたＬＯＳを基準に、免疫調節剤（ＥＧ−ＩＭ）の大きさが小さくなることを確認した結果である。Ｍはマーカーを表し、レーン１は脱アシル化前の抽出されたＬＯＳ（脱アシル化前ＬＯＳ）、レーン２は免疫調節剤（ＥＧ−ＩＭ）を表す。
【図２】図２は、本発明の免疫調節剤（ＥＧ−Ｉｍｍｕｎｅ  Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ；ＥＧ−ＩＭ）の構造を示す。Ｇｌｃはグルコース、ＧｌｃＮはグルコサミン、ＨＥＰはヘプトース、ＫＤＯは２−ケト−３−デオキシ−オクトネート、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンであり、Ａ〜Ｆはホスフェート（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が結合し得る位置を表す。
【図３】図３は、 血清中のサイトカイン濃度の分析結果を示す。免疫調節剤（ＥＧ−ＩＭ）又はＭＰＬを各３μｇずつ投与し、１時間及び４時間後にマウス心臓採血して血液を採取した後、分析した（ｎ＝３）。図３はＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０、ＴＮＦ−αの分析結果を、図４はＩＬ−５、ＩＬ−１０の分析結果を、図５はＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳの分析結果を示す。
【図４】図４は、血清中のサイトカイン濃度の分析結果を示す。免疫反応調節物質（ＥＧ−ＩＭ）又はＭＰＬを各３μｇずつ投与し、１時間及び４時間後にマウス心臓採血して血液を採取した後、分析した（ｎ＝３）。図４はＩＬ−５、ＩＬ−１０の分析結果を示す。
【図５】図５は、血清中のサイトカイン濃度の分析結果を示す。免疫反応調節物質（ＥＧ−ＩＭ）又はＭＰＬを各３μｇずつ投与し、１時間及び４時間後にマウス心臓採血して血液を採取した後、分析した（ｎ＝３）。図５はＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳの分析結果を示す。
【図６】図６は、ＥＧ−ＩＭ／ミョウバン（Ａｌｕｍ）を組み合わせて使用した場合、日本脳炎ウイルス（Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ；ＪＥＶ）抗原の特異−抗体力価を測定したものである。
【図７】図７は、日本脳炎ワクチン投与時にＩＦＮ−γ、ＩＬ−５サイトカイン分泌量を測定したものである。
【図８】図８は、ＥＧ−ＩＭ／Ａｌｕｍを組み合わせて使用した場合、ＨＩＢ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｔｙｐｅ  ｂ）抗原の特異−抗体力価を測定したものである。
【図９】図９は、ＥＧ−ＩＭ／ミョウバンを組み合わせて使用した場合、ＭＥＲＳコロナウイルススパイクＳ１抗原の特異−抗体力価を測定したものである。図９Ａは、ＭＥＲＳウイルス抗原特異的な血清中ＩｇＧ１抗体力価を示す。図９Ｂは、ＭＥＲＳウイルス抗原特異的な血清中ＩｇＧ２ａ抗体力価を示す。
【図１０】図１０は、組換えＭＥＲＳ−ＣｏＶスパイクＳ１蛋白質を使用したＭＥＲＳワクチン投与時に、ＭＥＲＳウイルスＳ１ＲＢＤ蛋白質刺激によるＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−５サイトカイン分泌量を測定したものである。
【図１１】図１１は、組換えＭＥＲＳ−ＣｏＶスパイクＲＢＤ蛋白質を使用したＭＥＲＳワクチン投与時に、ＩＦＮ−γサイトカイン分泌量を測定したものである。
【図１２】図１２は、ＥＧ−ＩＭ／Ａｌｕｍを組み合わせて使用した場合、ジカウイルス抗原の特異−抗体力価を測定したものである。
【図１３】図１３は、ジカワクチン投与時に、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−５サイトカイン分泌量を測定したものである。
【図１４】図１４は、ＥＧ−ＩＭ／ミョウバンを組み合わせて使用した場合、緑膿菌抗原の特異−抗体力価を測定したものである。図１４は、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＦＴ２抗原を使用して免疫化した場合を示す。
【図１５】図１５は、ＥＧ−ＩＭ／ミョウバンを組み合わせて使用した場合、緑膿菌抗原の特異−抗体力価を測定したものである。図１５は、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＦＴ１抗原を使用して免疫化した場合を示す。
【図１６】図１６は、 ＥＧ−ＩＭ／ミョウバンを組み合わせて使用した場合の緑膿菌抗原に対するマウス血清のオプソニン食作用活性の結果を示す。図１６Ａは、食細胞刺激誘導活性を示し、図１６Ｂは、血清濃度による食細胞刺激活性を示す。図１６Ｃは、補体が欠乏した場合と補体が含まれた場合の食細胞刺激活性を比較したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
別に定義しない限り、本明細書で使う全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術分野における熟練した専門家に通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使う命名法及び以下に記述する実験方法は、当該技術分野によく知られており、通常使用されるものである。
【００１５】
本発明の一実施例では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を用いて乾燥菌体を製造し、ＬＯＳを抽出した後アルカリ処理を使用してＬＯＳの毒性を除去することによって免疫調節剤（ＥＧ−Ｉｍｍｕｎｅ  Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ；ＥＧ−ＩＭ）を得、ＭＳ分析から、前記免疫調節剤（ＥＧ−ＩＭ）は化学式１の構造であることを確認した。
【００１６】
したがって、本発明は、一観点において、化学式１で表示される免疫調節剤（ＥＧ−Ｉｍｍｕｎｅ  Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ；ＥＧ−ＩＭ）に関する。
【化３】
0006963018.tif 000004
（式中、Ｇｌｃはグルコース、ＧｌｃＮはグルコサミン、ＨＥＰはヘプトース、ＫＤＯは２−ケト−３−デオキシ−オクトネート、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンであり、Ａ〜Ｆはホスフェート（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が結合し得る位置を表す。）
【００１７】
本明細書で使う用語、“ＬＯＳ（Ｌｉｐｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）”は、ＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）の変形体であって、天然ＬＰＳよりも短い糖鎖を有しており、分子量が小さいものを意味する。脱アシル化前ＬＯＳは、好ましくは、分子量が３，０００〜１０，０００Ｄａであり、より好ましくは３０００〜４０００Ｄａである。用語“脱アシル化ＬＯＳ”は、このようなＬＯＳにおいて脂質Ａのグルコサミンに−Ｃ（Ｏ）Ｏ−結合で結合した脂肪酸が除去され、ＬＯＳと対比して毒性が大きく減少したものを意味する。脂質Ａのグルコサミンに脂肪酸は−Ｃ（Ｏ）Ｏ−結合及び−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−結合によって結合している。本発明の脱アシル化ＬＯＳは、脂質Ａの脱アシル化によって−Ｃ（Ｏ）Ｏ−結合で結合した脂肪酸が除去されたものを指す。
【００１８】
前記ＥＧ−ＩＭは、種々の方法で製造できるが、本発明者らの先行特許である大韓民国特許登録第０４５６６８１号；ＷＯ２００４／０３９４１３；大韓民国特許登録第０７４０２３７号；及び、ＷＯ２００６／１２１２３２に開示された方法によって製造することができる。例えば、ＬＰＳに強塩基（例えば、０．２Ｎ  ＮａＯＨ）を処理して脱アシル化し、脂質Ａから一部の脂肪酸を除去して脱毒素化する。
【００１９】
本発明によれば、前記ＥＧ−ＩＭは、２〜６個のホスフェートが結合し、好ましくは３〜４個のホスフェートギガ結合し得るが、これに制限されるものではない。また、上記の化学式１においてホスフェート基の個数及び位置は、下記表１の例示の通りでよい。
【表１】
0006963018.tif 000005
【００２０】
前記ホスフェートは、化学式１のＡＢ、ＡＣ、ＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＢＣ、ＢＤ、ＢＥ、ＢＦ、ＣＤ、ＣＥ、ＣＦ、ＤＥ、ＤＦ、ＥＦ、ＡＢＣ、ＡＢＤ、ＡＢＥ、ＡＢＦ、ＡＣＤ、ＡＣＥ、ＡＣＦ、ＡＤＥ、ＡＤＦ、ＡＥＦ、ＢＣＤ、ＢＣＥ、ＢＣＦ、ＢＤＥ、ＢＤＦ、ＢＥＦ、ＣＤＥ、ＣＤＦ、ＣＥＦ、ＤＥＦ、ＡＢＣＤ、ＡＢＣＥ、ＡＢＣＦ、ＡＢＤＥ、ＡＢＤＦ、ＡＢＥＦ、ＡＣＤＥ、ＡＣＤＦ、ＡＤＥＦ、ＢＣＤＥ、ＢＣＤＦ、ＢＣＥＦ、ＢＤＥＦ、ＣＤＥＦ、ＡＢＣＤＥ、ＡＢＣＥＦ及びＡＢＣＤＥＦから構成される群から選ばれる位置に結合し得る。
【００２１】
本発明によれば、上記の化学式１において糖は、ヘキソース、ヘキソサミン、Ｎ−アセチルヘキソサミン、ヘプトース及びＫｄｏ（２−ケト−３−デオキシ−オクトネート）から構成される群から選ばれる。
【００２２】
本明細書で使う用語、“ヘキソース（ｈｅｘｏｓｅ）”は、１分子中に６個の炭素原子を含有した単糖類（ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を意味し、例えば、ケトヘキソース（プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース）、アルドヘキソース（アロース、アルトロース、グルコース、マンノ−ス、グロース、イドース、ガラクトース、タロース）、及びデオキシ糖（フコース、フクロース、ラムノース）があり、これらに限定されるものではない。
【００２３】
本発明によれば、前記ヘキソースはアルドヘキソースであり、一特定例において前記アルドヘキソースはグルコース又はガラクトースである。
【００２４】
本明細書で使う用語、“ヘプトース（ｈｅｐｔｏｓｅ）”は、１分子中に７個の炭素原子を含有した単糖類（ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を意味し、官能基（アルデヒド基及びケトン基）の位置によって、アルドヘプトース（ポジション１）及びケトヘプトース（ポジション２）に区分できる。前記アルドヘプトースは、例えば、Ｌ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトースがあり、これに限定されるものではない。前記ケトヘプトースは、例えば、セドヘプツロース及びマンノヘプツロースがあり、これに限定されるものではない。
本発明によれば、ヘキソサミンはグルコサミン、ガラクトサミンまたはマンノサミンであり、そして特定の例では、ヘキソサミンはグルコサミンである。
【００２５】
本発明によれば、前記Ｎ−アセチルヘキソサミンは、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン又はＮ−アセチルマンノサミンであり、一特定例において、前記Ｎ−アセチルヘキソサミンは、Ｎ−アセチルグルコサミンである。
【００２６】
本発明のＥＧ−ＩＭは、野生型ＬＰＳよりも少ない個数の糖を有するが、本発明の一実施例によれば、前記ＥＧ−ＩＭは５〜７個の糖を含むことができ、一特定例においてＥＧ−ＩＭの糖数は６〜７個であるが、これに制限されるものではない。
【００２７】
本発明のＥＧ−ＩＭは、Ｏ−連結された（Ｏ−ｌｉｎｋｅｄ）脂肪酸を有しない。
【００２８】
本発明のＥＧ−ＩＭは、脂質Ａから脂肪酸（例えば、Ｃ１４脂肪酸）が除去され（脱アシル化）、毒性が顕著に減少した特徴を有する。脂肪酸は、脂質Ａのグルコサミンに−Ｃ（Ｏ）Ｏ−結合又は−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−結合によって結合している。本発明でいう脱アシル化は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−結合で結合した脂肪酸が除去されることを意味する。
【００２９】
前記脱アシル化は、ＬＯＳにアルカリを処理して実施でき、前記アルカリは、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｂａ（ＯＨ）２、ＣｓＯＨ、Ｓｒ（ＯＨ）２、Ｃａ（ＯＨ）２、ＬｉＯＨ、ＲｂＯＨ及びＭｇ（ＯＨ）２を含み、より好ましくはＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｂａ（ＯＨ）２、Ｃａ（ＯＨ）２、ＬｉＯＨ及びＭｇ（ＯＨ）２であり、さらに好ましくはＮａＯＨ、ＫＯＨ及びＭｇ（ＯＨ）２であり、最も好ましくはＮａＯＨである。
【００３０】
本発明のＥＧ−ＩＭは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から由来したものであり、前記大腸菌は大腸菌ＥＧ００２４（受託番号：ＫＣＴＣ１２９４８ＢＰ）である。前記菌株は２０１５年１１月１９日付に韓国生命工学研究院微生物資源センターに寄託番号ＫＣＴＣ１２９４８ＢＰで寄託された。
【００３１】
本発明によれば、前記ＥＧ−ＩＭは免疫促進（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）活性を示す。
【００３２】
本明細書で使う用語、“免疫促進”は、初期免疫反応を誘導したり、抗原に対する既存の免疫反応を測定可能な程度に増加させることを意味する。
【００３３】
本発明の他の実施例では、ＥＧ−ＩＭをマウスに投与してマウス血清サイトカインのレベルを分析し、前記ＥＧ−ＩＭは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳのようなサイトカインの分泌を誘導させることを確認した。
【００３４】
したがって、本発明は、他の観点において、前記ＥＧ−ＩＭを有効成分として含む免疫補助剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）組成物に関する。
【００３５】
本発明のＥＧ−ＩＭは、免疫促進効能が従来の免疫補助剤に対比して優れているだけでなく、毒性も減少しており、本発明のワクチン組成物に非常に適している。本発明のＥＧ−ＩＭは、ＬＰＳの毒性を除去するためにＬＰＳのポリサッカライドチェーンを除去して得たリピドＡのリン酸化から得たＭＰＬ（Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  ｌｉｐｉｄ  Ａ）よりも毒性が少ない。
【００３６】
本発明の免疫補助剤組成物は、前記ＥＧ−ＩＭだけでも十分の免疫反応を誘導し、様々な疾患に対する予防効能を発揮でき、具体的に、前記免疫補助剤組成物は、癌治療用又は免疫疾患治療用に用いることができる。
【００３７】
本発明によれば、前記癌は、線維肉腫、膀胱癌、脳下垂体腺腫、神経膠腫、脳腫瘍、上咽頭癌、喉頭癌、胸腺腫、中皮腫、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、肝癌、膵癌、膵内分泌腫瘍、胆嚢癌、陰茎癌、尿管癌、腎細胞癌、前立腺癌、非ホジキンリンパ腫、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、形質細胞性腫瘍、白血病、小児癌、皮膚癌、卵巣癌、子宮頸癌であるが、これに制限されるものではない。
【００３８】
また、本発明によれば、前記免疫疾患は、アトピー皮膚炎、喘息、乾癬、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性肉芽腫、アレルギー性皮膚炎、胃腸管アレルギー、過敏性肺炎、食物過敏症、じんましん、湿疹、リューマチ関節炎、強直性脊椎炎、嚢線維症、固形臓器移植後及び慢性拒否症、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、多発性筋炎、強皮症、アジソン病、白斑症、悪性貧血、糸球体腎炎及び肺繊維症、炎症性腸疾患、グレーブス病でよいが、これに限定されるものではない。
【００３９】
また、選択的に、本発明の免疫補助剤組成物は、他の免疫補助成分をさらに含むことができ、例えば、Ｍｇ、Ｃａ、Ｓｒ、Ｂａ及びＲａから構成される群から選ばれる第２族元素又はその塩；Ｔｉ、Ｚｒ、Ｈｆ及びＲｆから構成される群から選ばれる第４族元素；アルミニウムの塩又はその水和物；又は、ジメチルオクタデシルアンモニウムブロミドを含むことができる。前記塩は、例えば、オキシド、ペルオキシド、ヒドロキシ、カーボネート、ホスフェート、ピロホスフェート、ハイドロゲンホスフェート、ジハイドロゲンホスフェート、サルフェート又はシリケートと共に形成される。
【００４０】
本発明によれば、本発明の免疫補助剤組成物においてさらに含み得る免疫補助成分は、マグネシウムヒドロキシ、マグネシウムカーボネート、ヒドロキシドペンタヒドレート、チタニウムジオキシド、カルシウムホスフェート、カルシウムカーボネート、バリウムオキシド、バリウムヒドロキシド、バリウムペルオキシド、バリウムサルフェート、カルシウムサルフェート、カルシウムピロホスフェート、マグネシウムカーボネート、マグネシウムオキシド、アルミニウムヒドロキシド、アルミニウムホスフェート及び水和されたアルミニウムポタシウムサルフェートから構成される群から選ばれる。
【００４１】
本発明によれば、前記免疫補助剤組成物は、アルミニウムヒドロキシ又はカルシウムホスフェートをさらに含むことができる。
【００４２】
本発明のさらに他の実施例では、ＥＧ−ＩＭとミョウバン（ａｌｕｍ）の免疫原性増強効果を確認するために、ＥＧ−ＩＭとミョウバン、そしてそれぞれ日本脳炎ウイルス抗原、ＨＩＢ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｂ）抗原、組換えＭＥＲＳ−ＣｏＶＳ１蛋白質及び組換えＭＥＲＳ−ＣｏＶＳ１ＲＢＤ蛋白質、ジカウイルスエンベロープ（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）蛋白質、緑膿菌ＦＴ２抗原又はＦＴ１抗原を混合してワクチンを製造し、それぞれのワクチンをマウスに投与して力価を測定し、サイトカインを分析した結果、それぞれのワクチンは抗体性免疫及び／又は細胞性免疫効能に優れていることを確認した。
【００４３】
本発明はさらに他の観点において、（ａ）抗原；（ｂ）化学式１で表示される免疫調節剤；及び、（ｃ）ミョウバン（ａｌｕｍ）を含むワクチン組成物に関する。
【００４４】
本発明はさらに他の観点において、化学式１で表示される免疫調節剤を、治療を要する患者に投与する段階を含む、免疫疾患の予防方法又は予防用途を提供する。
【００４５】
本明細書で使う用語、“抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）”は、免疫反応を誘導する物質である。したがって、本発明では、このような免疫反応誘導効能を示す物質を、制限なく使用することができる。
【００４６】
本発明の前記抗原は、ペプチド、蛋白質、核酸、糖（ｓｕｇａｒ）、病原体、弱毒化された病原体、不活性化された病原体、ウイルス、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、細胞又は細胞断片でよい。
【００４７】
本発明において前記抗原は、日本脳炎ウイルス（Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）の抗原、ＨＩＢ（Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｔｙｐｅ  Ｂ）の抗原、ＭＥＲＳウイルスの抗原、ジカウイルスの抗原、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の抗原、百日咳の抗原、結核菌の抗原、炭疽菌の抗原、ＨＡＶ（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ａ  ｖｉｒｕｓ）の抗原、ＨＢＶ（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ）の抗原、ＨＣＶ（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ）の抗原、ＨＩＶ（ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）の抗原、ＨＳＶ（Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ）の抗原、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の抗原、コリネバクテリウムジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）の抗原、ボルデテラパーツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の抗原、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）の抗原、ＨＰＶ（ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）の抗原、水痘ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ  ｖｉｒｕｓ）の抗原、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）の抗原、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の抗原、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）の抗原、アシネトバクターバウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）の抗原、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）の抗原、ヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）の抗原、マラリアの抗原、デングウイルスの抗原、ツツガムシ（Ｏｒｉｅｎｔｉａ  ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）の抗原、重症熱性血小板減少症候群（ｓｅｖｅｒｅ  ｆｅｖｅｒ  ｗｉｔｈ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓ；ＳＦＴＳ  Ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓ）の抗原、サーズコロナウイルス（ｓｅｖｅｒｅ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ−ｃｏｒｏｎａ  ｖｉｒｕｓ；ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）の抗原、インフルエンザウイルスの抗原、エボラウイルスの抗原及び肺炎球菌の抗原から構成される群から選ぶことができる。
【００４８】
本発明のワクチン組成物は、その基本的な組成、すなわち抗原と免疫調節剤（ＥＧ−ＩＭ）だけでも十分の免疫反応を誘導し、特定疾患に対する予防効能を発揮することができる。選択的に、本発明のワクチン組成物は、上に述べた追加の免疫補助成分をさらに含んでもよい。
【００４９】
また、本発明によれば、前記ワクチンは、死菌ワクチン、弱毒化ワクチン、サブユニットワクチン、組換えワクチン、蛋白接合ワクチン、単価ワクチン、多価ワクチン、混合ワクチンの形態でよい。
【００５０】
本発明に係るワクチンは、日本脳炎ワクチン、ヘモフィルスインフルエンザ（Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｔｙｐｅ  Ｂ）ワクチン、ＭＥＲＳワクチン、ジカワクチン、緑膿菌ワクチン、癌ワクチン、結核ワクチン、炭疽菌ワクチン、ＨＡＶワクチン、ＨＢＶワクチン、ＨＣＶワクチン、ＨＩＶワクチン、単純疱疹ワクチン、脳髄膜炎ワクチン、ジフテリアワクチン、百日咳ワクチン、破傷風ワクチン、水痘ワクチン、多剤耐性菌ワクチン、腸球菌ワクチン、葡萄球菌ワクチン、肺炎桿菌ワクチン、アシネトバクターワクチン、エンテロバクターワクチン、ヘリコバクターワクチン、マラリアワクチン、デング熱ワクチン、ツツガムシワクチン、重症熱性血小板減少症候群ワクチン、サースワクチン、エボラワクチン、インフルエンザワクチン及び肺炎球菌ワクチンでよく、好ましくは、日本脳炎ワクチン、ヘモフィルスインフルエンザワクチン、ＭＥＲＳワクチン、ジカワクチン、緑膿菌ワクチンでよい。
【００５１】
前記癌ワクチンは、これらによって制限されるものではないが、線維肉腫、膀胱癌、脳下垂体腺腫、神経膠腫、脳腫瘍、上咽頭癌、喉頭癌、胸腺腫、中皮腫、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、肝癌、膵癌、膵内分泌腫瘍、胆嚢癌、陰茎癌、尿管癌、腎細胞癌、前立腺癌、非ホジキンリンパ腫、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、形質細胞性腫瘍、白血病、小児癌、皮膚癌、卵巣癌及び子宮頸癌に対するワクチンから構成される群から選ぶことができる。
【００５２】
本発明に係るワクチンは、組成物総重量に対して前記免疫調節剤を１〜１０重量％で含むことができる。前記免疫調節剤を１重量％未満で含む場合は効果的な免疫効果を期待できなく、３０重量％を超える場合は免疫寛容現象が起きることがある。
【００５３】
本発明に係るワクチンは、組成物総重量に対して前記ミョウバン（ａｌｕｍ）を７０〜９９重量％で含むことができる。前記免疫調節剤を７０重量％未満で含む場合は、効果的な免疫効果を期待できない。
【００５４】
本発明のワクチン組成物は、薬剤学的に許容される担体を含むことができ、製剤時に通常利用されるものとして、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されない。本発明のワクチン組成物は、それらの成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘未剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。好適な薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ  ｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。
【００５５】
本発明のワクチン組成物は、経口又は非経口で投与でき、非経口投与の場合は、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、経皮投与などで投与できる。
【００５６】
本発明のワクチン組成物の適度の投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食物、投与時間、投与経路、排せつ速度及び反応感応性のような要因によって様々に処方できる。
【００５７】
本発明のワクチン組成物は、当該発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することによって、単位容量の形態で製造したり、又は多用量容器内に入れて製造することができる。このとき、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態でもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含んでもよい。
【００５８】
以下、実施例を用いて本発明をより詳しく説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものと解釈されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとっては明らかであろう。
【００５９】
製造例：免疫調節剤（ＥＧ−ＩＭ）の製造
１．乾燥菌体の製造
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を３７℃  ＴＳＢ（Ｔｒｉｐｔｉｃ  ｓｏｙ  ｂｒｏｔｈ，Ｄｉｆｃｏ）３０ｇ／Ｌ培地で２０時間８０ｒｐｍ以下で振盪培養し、遠心分離機を用いて菌体を回収した。回収した菌体にエタノールを混ぜて遠心分離し、沈殿物を得た。その後、得られた沈殿物にアセトンを添加して十分に混ぜた後、遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物にエチルエーテルを添加してよく混ぜた後、遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を６０℃乾燥オーブンで乾燥させ、乾燥菌体を製造した。
【００６０】
２．ＬＯＳ抽出
乾燥菌体の重量を測定した後、重量１ｇ当たり７．５ｍＬのＰＣＰ（フェノール、クロロホルム、ペトロリウムエーテル）抽出混合液を添加し、菌体菌からＬＯＳを分離した。この方法で分離して得たＬＯＳ抽出物は、回転蒸発器を用いて高温で有機溶媒を除去した。残っている抽出液は高温で遠心分離して沈殿物を得、沈殿物にエチルエーテルを添加して沈殿物を洗浄した。次に、精製水を入れて沈殿物を生成した。生成された沈殿物は遠心分離して上清液と分離し、沈殿物はエタノールで洗浄して回収した。高温乾燥オーブンで沈殿物を十分に乾燥させ、精製水で沈殿物を溶解させてＬＯＳを抽出した。
【００６１】
３．ＬＯＳの毒性除去
ＬＯＳ抽出物の含有量を確認した後、３ｍｇ／ｍＬ濃度にし、０．２Ｎ  ＮａＯＨと１：１ボリュームで混ぜる。６０℃恒温水槽で１２０分間反応させながら、１０分ごとに５秒間ｖｏｒｔｅｘを用いて混ぜた。その後、初期０．２Ｎ  ＮａＯＨ量の約１／５程度の１Ｎ酢酸を添加した。その後、エタノール沈殿法を用いて免疫調節剤であるＥＧ−ＩＭを得た。
【００６２】
４．ＬＯＳ及びＥＧ−ＩＭの定量及び確認
ＬＯＳ及びＥＧ−ＩＭの含有量は、２−チオバルビツール酸（２−Ｔｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒｉｃ  ａｃｉｄ）を用いたＫＤＯ（２−ケト−３−デオキシオクトン酸）定量法で測定し、濃度を測定した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで大きさによって分離し、シルバー染色によって確認し、図１に示した。図１のＡは、抽出されたＬＯＳを電気泳動及びシルバー染色によって確認した結果であり、図１のＢは、ＬＯＳをアルカリ処理した時、脂質Ａが分解されることによって抽出されたＬＯＳを基準に、ＥＧ−ＩＭの大きさが小さくなることを確認した結果である。Ｍはマーカー（ＳｅｅＢｌｕｅ(R)  Ｐｌｕｓ２  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  ｓｔａｎｄａｒｄ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＬＣ５９５２）を表し、レーン１は、脱アシル化前の抽出されたＬＯＳ（脱アシル化前ＬＯＳ）、レーン２は、脱アシル化されたＬＯＳであるＥＧ−ＩＭを表す。
【００６３】
実施例１：免疫調節剤（ＥＧ−ＩＭ）の構造分析
精製した試料は、精製水で適度に希釈した。Ｃ１８逆相カラム（ＡＣＱＵＩＴＹ  ＢＥＨ３００  Ｃ１８  １．７ｕｍ  ２．１×１５０ｍｍ）を機器（Ｗａｔｅｒ社のＵＰＬＣ）に装着した後、移動相Ａ（５０ｍＭぎ酸アンモニウムｐＨ４．５）と移動相Ｂ（１００％アセトニトリル）を用いて３５〜９５％濃度勾配を与えて試料を分離した。ＭＳ分析及びＭＳ／ＭＳ分析は、質量分析機（ＶＥＬＯＳ  ＰＲＯ、Ｔｈｅｒｍｏ社）を利用した。１００〜３０００ｍ／ｚ範囲の分子を分析し、ＭＳ分析の後、確認された５０〜２０００ｍ／ｚ範囲の分子を再び分析した。２３７２ｍ／ｚ分子量を持つ分子が主として（ｍａｊｏｒｌｙ）確認され、それぞれのピーク（ｐｅａｋ）を分析した構造模式図は、図２に示した。
【００６４】
実施例２：免疫調節剤（ＥＧ−ＩＭ）の免疫反応分析
１．免疫化及び血液サンプリング
５週齢で搬入し、１週間馴化した６週齢のマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、ｆｅｍａｌｅ、中央実験動物／ＳＬＣ  Ｊａｐａｎ）の後足大腿部の三角筋に、本発明に係るＥＧ−ＩＭ又はＭＰＬを各３μｇずつ投与した（ｎ＝３）。対照群マウスには食塩水を投与した。投与して１時間及び４時間後、キシラジン（Ｒｏｍｐｕｎ）／ケタミン麻酔液を腹腔投与してマウスを麻酔し、心臓採血して血液を採取した。冷蔵条件に血液を約４時間静置した後、４℃、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して血清を分離し、新しいチューブに移して−７０℃に保管した。
【００６５】
２．マウス血清サイトカインレベルの分析
マルチプレクスサイトカイン分析（Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ  ＭＡＰ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）を行い、サイトカイン及びケモカインのレベルを測定した。標的サイトカインは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳにし、分析装備［Ｌｕｍｉｎｅｘ２００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）］及び分析プログラム［ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ  Ａｎａｌｙｓｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）］を用いて実験結果を分析し、図３〜図５に示した。図３はＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０、ＴＮＦ−αの分析結果を、図４はＩＬ−５、ＩＬ−１０の分析結果を、図５はＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳの分析結果を示している。
【００６６】
図３〜図５から、ＥＧ−ＩＭを投与した場合、炎症誘発サイトカインであるＴＮＦ−αとＩＬ−６、Ｔｈ１−類型サイトカインであるＩＬ−１２ｐ４０、及びケモカインであるＩＰ−１０、ＭＩＧ−１、ＭＣＰ−１及びＲＡＮＴＥＳの分泌を誘導することが分かる。また、免疫調節剤−誘導サイトカインのレベルは、ＭＰＬによって誘導されたレベルより高かった。これは、Ｉｎ−ｖｉｖｏで免疫調節剤であるＥＧ−ＩＭの免疫刺激活性がＭＰＬに比べて優れていることを示す。
【００６７】
実施例３：死ワクチンに対するＥＧ−ＩＭ／Ａｌｕｍの効能分析
１．日本脳炎ワクチンの免疫
死ワクチンからＥＧ−ＩＭ／Ａｌｕｍの免疫原性増強効果を確認するために、日本脳炎ウイルス（Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ；ＪＥＶ）抗原を使用した。６週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス（コアテック、大韓民国）に、不活性化（ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ）日本脳炎ワクチン、又は日本脳炎ワクチン及びミョウバン（アルミニウムヒドロキシ；Ｂｒｅｎｎｔａｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の組合せを、不活性化日本脳炎ワクチン各０．５μｇ／マウス又は１μｇ／マウスを使用し、ミョウバン２５μｇ／マウス、ＥＧ−ＩＭ０．５μｇ／マウスを組み合わせて最終体積１００μｌにし、２週間隔で２回投与した。陰性対照群は、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ，ｐＨ７．３）を投与した。
【００６８】
２．ＪＥＶ抗原の特異−抗体力価の測定
最終投与日から２週後にマウスを麻酔して心臓採血し、血液サンプルを収集した。免疫後の血清内ＪＥＶ抗原の特異−抗体力価を測定するために、エンド−ポイント希釈ＥＬＳＩＡ（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）方法を利用した。ＪＥＶを１μｇ／ｍｌの濃度で希釈し、１００μｌ／ｗｅｌｌずつ９６−ウェルプレートにコーティング（４℃、一晩）した後、１％  ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）３００μｌでブロッキングをした（室温、１時間）。ブロッキング後、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０が含まれたＰＢＳで３回洗浄し、免疫後に得た血清を１０倍系列希釈し、各希釈血清１００μｌを反応させた（３７℃、２時間）。ＪＥＶ抗原−特異抗体を確認するために、ホースラディッシュペルオキシダーゼ−コンジュゲート抗−マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ，１１５−０３５−００３）、ＩｇＧ１抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ，ＳＴＡＲ１３２Ｐ）、ＩｇＧ２ａ抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ，ＳＴＡＲ１３３Ｐ）を反応させた後、ＴＭＢ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ，ＢＤ  Ｂｉｏ  ｓｃｉｅｎｃｅ，５５５５５２１４）を添加し、１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で反応を中止させた。実験結果は、４５０ｎｍで吸光度を測定し、免疫後に回収した血中ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ抗体力価を測定した。その結果、ＥＧ−ＩＭ／ミョウバンを用いた試験群では、ＥＧ−ＩＭ単独又はミョウバン単独を用いた試験群に比べて、ＪＥＶウイルス抗原−特異ＩｇＧ抗体生成がそれぞれ、１３倍、３倍程度増加した。また、ＥＧ−ＩＭ／ミョウバンを用いた試験群では、ＥＧ−ＩＭ単独又はミョウバン単独を用いた試験群に比べてそれぞれ、ＪＥＶウイルス抗原−特異ＩｇＧ１抗体生成が１２倍、３倍程度増加し、ＪＥＶウイルス抗原−特異ＩｇＧ２ａ抗体生成も、ＥＧ−ＩＭ／ミョウバンを用いた試験群で増加した（図６）。
【００６９】
したがって、免疫調節剤としてＥＧ−ＩＭを、免疫補助剤としてミョウバンを同時に含む本発明の日本脳炎ワクチンは、免疫効能、すなわちワクチン効能に非常に優れていることが分かる。
【００７０】
３．サイトカイン分析
最終投与日から２週後にマウスを麻酔して脾臓組織を摘出した後、単一細胞として分離して不活性化ＪＥＶ抗原又は組換えＪＥＶ  ｇＥ蛋白質５μｇ／ｍｌで刺激し、７２時間細胞培養した後、細胞培養液中のＩＦＮ−γ、ＩＬ−５サイトカイン分泌量をサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，ＤＹ４８５；ＤＹ４０５）で分析した。
【００７１】
その結果、ＥＧ−ＩＭ／ミョウバンを用いた試験群は、体液性免疫を増加させる機能を持つミョウバンを単独で用いた試験群に比べて、ＩＦＮ−γ分泌を増進させたが、ＩＬ−５分泌は増進させなかった（図７）。
【００７２】
したがって、ＥＧ−ＩＭ及びミョウバンを含む日本脳炎ウイルスワクチンは、抗体性免疫反応だけでなく、ＴＨ１−タイプ細胞性免疫誘導能にも優れていることが確認できる。
【００７３】
実施例４：コンジュゲートワクチンに対するＥＧ−ＩＭ／ミョウバンの効能分析
１．Ｂ型ヘモフィルスインフルエンザワクチンの免疫
コンジュゲートワクチンからＥＧ−ＩＭ／ミョウバンの免疫原性増強効果を確認するために、ＨＩＢ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｂ）抗原を使用した。６週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＳＬＣ，Ｊａｐａｎ）に、ＡｃｔＨＩＢ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｂ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅ，Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｔｏｘｏｉｄ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，Ｓａｎｏｆｉ  Ｐａｓｔｅｕｒ  ＳＡ）とＥＧ−ＩＭ／ミョウバンを混合して筋肉投与経路で２週間隔で３回投与した。投与容量は、ＡｃｔＨＩＢ  ２μｇ／マウス、ミョウバン２５μｇ／マウス又はＥＧ−ＩＭ  ０．５μｇ／マウスを混合した。
【００７４】
２．ＨＩＢ抗原の特異−抗体力価の測定
最終投与日から２週後にマウスを麻酔して心臓採血し、血液サンプルを収集し、ＨＩＢ抗原の特異−抗体力価を測定するために、ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｔｙｐｅ  ｂ  ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（ＸｐｒｅｓｓＢｉｏ，ＵＳ）を用いて血中ＩｇＧ抗体力価を測定した。
【００７５】
その結果、ＥＧ−ＩＭ／ミョウバンを用いた試験群では、商用ワクチンに比べて２倍増加したＨＩＢ抗原−特異ＩｇＧ抗体生成を示した（図８）。
【００７６】
したがって、免疫調節剤としてＥＧ−ＩＭを、免疫補助剤としてミョウバンを同時に含むＢ型ヘモフィルスインフルエンザワクチンは抗体性免疫反応を誘導し、免疫効能、すなわちワクチン効能に非常に優れていることが分かる。
【００７７】
実施例５：組換えワクチンに対するＥＧ−ＩＭ／ミョウバンの効能分析
＜ＭＥＲＳワクチン＞
Ｉ．組換えＭＥＲＳ−ＣｏＶスパイクＳ１蛋白質を使用した場合
１．ＭＥＲＳワクチンの免疫
組換えワクチンからＥＧ−ＩＭ／ミョウバンの免疫原性増強効果を確認するために、組換えＭＥＲＳ−ＣｏＶスパイクＳ１蛋白質（ｅＥｎｚｙｍｅ，ＭＥＲＳ−Ｓ１−００５Ｐ）を使用した。６週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＳＬＣ，Ｊａｐａｎ）に、組換えＭＥＲＳ−ＣｏＶスパイクＳ１蛋白質とミョウバン及び／又はＥＧ−ＩＭを混合して筋肉投与経路で２週間隔で３回投与した。投与容量は、Ｓ１蛋白質０．５μｇ／マウス又は１μｇ／マウス、ミョウバン２５μｇ／マウス又はＥＧ−ＩＭ  ０．５μｇ／マウスを混合した。
【００７８】
２．ＭＥＲＳウイルス抗原特異−抗体力価の測定
最終投与日から４週後にマウスを麻酔して心臓採血し、血液サンプルを収集し、ＭＥＲＳウイルス抗原特異−抗体力価を測定するために、ＥＬＩＳＡキットを用いて血中ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ抗体力価を測定した。
【００７９】
その結果、ＥＧ−ＩＭ／ミョウバンを用いた試験群では、ミョウバン単独を用いた試験群に比べて、濃度依存的にＭＥＲＳウイルス抗原−特異ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ抗体の生成が増加し、また、単独を用いた試験群に比べて、増加度は、ＩｇＧ２ａの場合がＩｇＧ１よりも高いことが確認された（図９）。したがって、免疫調節剤としてＥＧ−ＩＭを、免疫補助剤としてミョウバンを同時に含む本発明のＭＥＲＳワクチンは、免疫効能、すなわちワクチン効能に非常に優れていることが分かる。
【００８０】
３．サイトカイン分析
最終投与日から４週後にマウスを麻酔して脾臓組織を摘出した後、単一細胞として分離してｓ１蛋白質で刺激し、７２時間細胞培養した後、細胞培養液中のＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−５サイトカイン分泌量をサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，ＤＹ４８５；ＤＹ４０４；ＤＹ４０５）で分析した。
【００８１】
その結果、ＥＧ−ＩＭ／ミョウバンを用いた試験群は、体液性免疫を増加させる機能を持つミョウバンを単独で用いた試験群に比べて、濃度依存的にＩＦＮ−γ分泌を増進させたが、ＩＬ−４、ＩＬ−５分泌は却って減少した（図１０）。
【００８２】
ＩＩ．組換えＭＥＲＳ−ＣｏＶＳ１ＲＢＤ蛋白質を使用した場合
１．ＭＥＲＳワクチンの免疫
組換えワクチンからＥＧ−ＩＭ／ミョウバンの免疫原性増強効果を確認するために、組換えＭＥＲＳ−ＣｏＶＳ１ＲＢＤ蛋白質を使用した。６週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＳＬＣ，Ｊａｐａｎ）に、組換えＭＥＲＳ−ＣｏＶＳ１ＲＢＤ蛋白質とミョウバン及び／又はＥＧ−ＩＭを混合して筋肉投与経路で２週間隔で３回投与した。投与容量は、ＲＢＤ蛋白質１μｇ／マウスとミョウバン２５μｇ／マウス、Ａｄｄａｖａｘ  １２．５μｇ／マウス又はＥＧ−ＩＭ  ０．５μｇ／マウスを混合した。
【００８３】
２．サイトカイン分析
最終投与日から２週後にマウスを麻酔して脾臓組織を摘出した後、単一細胞として分離してＲＢＧ蛋白質で刺激し、７２時間細胞培養した。ＩＦＮ−γサイトカイン分泌に寄与するＴ細胞サブタイプを分析するために、各試験群を抗原で刺激する時にＣＤ４ブロキング抗体又はＣＤ８ブロキング抗体を処理した。７２時間後に細胞培養液を回数し、細胞培養液中のＩＦＮ−γサイトカイン分泌量をサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，ＤＹ４８５）で分析した。ＡｄｄａＶａｘ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）は対照免疫補助剤として使用された。
【００８４】
その結果、ＥＧ−ＩＭ／ミョウバンを用いた試験群は、体液性免疫を増加させる機能を持つミョウバンを単独で用いた試験群又はａｄｄａｖａｘを用いた試験群に比べて、ＩＦＮ−γ分泌を増進させることが確認できた（図１１）。
【００８５】
したがって、ＥＧ−ＩＭ及びミョウバンを含むＭＥＲＳワクチンは、抗体性免疫反応だけでなく、ＴＨ１−タイプ細胞性免疫誘導能にも優れていることが確認できる。
【００８６】
＜ジカワクチン＞
１．ジカワクチンの免疫
組換えワクチンからＥＧ−ＩＭ／ミョウバンの免疫原性増強効果を確認するために、組換えジカウイルスエンベロープ蛋白質を使用した。６週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＳＬＣ，Ｊａｐａｎ）に、組換えジカウイルスエンベロープ蛋白質とミョウバン及び／又はＥＧ−ＩＭを混合して筋肉投与経路で２週間隔で２回投与した。投与容量は、組換えジカウイルスエンベロープ蛋白質２μｇ／マウスとミョウバン２５μｇ／マウス又はＥＧ−ＩＭ  ０．５μｇ／マウスを混合した。
【００８７】
２．ジカウイルス抗原の特異−抗体力価の測定
最終投与日から２週後にマウスを麻酔して心臓採血し、血液サンプルを収集し、組換えジカウイルスエンベロープ蛋白質特異−抗体力価を測定するために、ＥＬＩＳＡキットを用いて血中ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ抗体力価を測定した。
【００８８】
その結果、ＥＧ−ＩＭ／ミョウバンを用いた試験群では、ＥＧ−ＩＭ又はミョウバン単独を用いた試験群に比べて、ジカウイルス抗原−特異ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ抗体生成を増進させ、単独を用いた試験群と比較して増加度は、ＩｇＧ２ａの場合がＩｇＧ１よりも高いことか確認された（図１２）。したがって、免疫調節剤としてＥＧ−ＩＭを、免疫補助剤としてミョウバンを同時に含む本発明のジカワクチンは、免疫効能、すなわちワクチン効能に非常に優れていることが分かる。
【００８９】
３．サイトカイン分析
最終投与日から２週後にマウスを麻酔して脾臓組織を摘出した後、単一細胞として分離してｓ１蛋白質で刺激し、７２時間細胞培養した後、細胞培養液中のＩＦＮ−γ、ＩＬ−５サイトカイン分泌量をサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，ＤＹ４８５；ＤＹ４０５）で分析した。
【００９０】
その結果、ＥＧ−ＩＭ／ミョウバンを用いた試験群は、体液性免疫を増加させる機能を持つミョウバンを単独で使用した試験群に比べて、濃度依存的にＩＦＮ−γ分泌を増進させたが、ＩＬ−５分泌は却って減少した（図１３）。
【００９１】
したがって、ＥＧ−ＩＭ及びミョウバンを含むジカワクチンは、抗体性免疫反応だけでなく、ＴＨ１−タイプ細胞性免疫誘導能にも優れることが確認できた。
【００９２】
実施例６：抽出蛋白質ワクチンに対するＥＧ−ＩＭ／ミョウバンの効能分析
１．緑膿菌ワクチンの免疫
抽出蛋白質ワクチンからＥＧ−ＩＭ／ミョウバンの免疫原性増強効果を確認するために、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＦＴ２抗原又はＦＴ１抗原を使用した。６週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＦＴ２抗原又はＦＴ１抗原、ミョウバン及び／又はＥＧ−ＩＭを混合し、抗原は１週間隔で５μｇ又は６．５μｇずつ２回投与した。ＰＢＳを投与した群を陰性対照群とした。
【００９３】
２．緑膿菌抗原の特異−抗体力価の測定
最終投与日から２週後にマウスを麻酔して心臓採血し、血液サンプルを収集し、緑膿菌特異−抗体力価を測定するために、ＥＬＩＳＡキットを用いて血中（ｔｏｔａｌ）ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ抗体力価を測定した。
【００９４】
その結果、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＦＴ２抗原を使用して免疫化した場合、ＥＧ−ＩＭ／ミョウバンを用いた試験群では、ＥＧ−ＩＭ又はミョウバン単独で使用した試験群に比べて、緑膿菌−特異ＩｇＧ抗体生成が増加した（図１４）。また、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＦＴ１抗原を使用して免疫化した場合も、ＥＧ−ＩＭ／ミョウバンを用いた試験群ではＥＧ−ＩＭ又はミョウバン単独で使用した試験群に比べて、抗原−特異ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ抗体の生成だけでなく、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＧＮ３（ＦＴ１  ｓｔｒａｉｎ）特異ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ抗体の生成が全て増加した（図１５）。これは、ＥＧ−ＩＭ／ミョウバンを免疫補助剤として使用すると、免疫化血清が、緑膿菌ワクチンに使用された抗原だけでなく、実際の感染菌体に対する反応性を高めることを示す。
【００９５】
３．緑膿菌ワクチン免疫化によって形成されたマウス血清のオプソニン貪食（ｏｐｓｏｎｏｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ）活性の測定
緑膿菌ワクチン免疫化によって形成されたマウス血清のオプソニン貪食活性を測定するために、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＦＴ２抗原６．５μｇを抗原単独、又はミョウバン及び／又はＥＧ−ＩＭを混合して２週間隔で２回投与した。最終免疫化２週後に心臓採血して血清を収集し、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡ１０３（ＦＴ２  ｓｔｒａｉｎ）に対してオプソニン貪食活性を測定した。具体的には、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＦＴ２を対数期まで育てて回収し、５６℃で３０分間熱不活性化（ｈｅａｔ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）させ、１００μｇ／ｍｌ  ＦＩＴＣ−Ｉｓｏｍｅｒ  Ｉと４℃で１時間反応させて菌株に蛍光を標示した。標示済み菌株はＰＢＳで数回洗浄し、オプソニン貪食活性試験用バッファ溶液（５％  ｄｅｆｉｎｅｄ  ＦＢＳ  ａｎｄ  ０．１％  ｇｅｌａｔｉｎ  ｉｎ  ＨＢＳＳ）を用いてＯＤ６００  ０．９となるように希釈した。蛍光標示された菌株をカウントし、５×１０６ＣＦＵを免疫化血清と混合し、不活性化ウサギ補体と混合して３０分間暗所で振盪培養した。その後、ＨＬ−６０細胞に菌株混合物を２０：１（菌株：ＨＬ−６０細胞）の比率で混合し、３０分間培養した。培養を終了した後、０．１％  ＢＳＡが含まれたＰＢＳで細胞を洗浄し、細胞を回収してｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩＴＭ  ｓｙｓｔｅｍ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とＦｌｏｗＪｏ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ，ＵＳＡ）を用いて分析した。オプソニン貪食活性は、ＨＬ−６０細胞に標示された平均蛍光強度（ｍｅａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ，ＭＦＩ）で示した。
【００９６】
その結果、ＥＧ−ＩＭ／ミョウバンだけを投与した陰性対照群、及び抗原とミョウバンを混合した試験群に比べて、抗原とＥＧ−ＩＭ／ミョウバン組合せを投与したマウス血清による食細胞作用が活発だった（図１６Ａ）。食細胞作用は血清濃度及び補体依存的だった（図１６Ｂ及び図１６Ｃ）。その結果から、ＥＧ−ＩＭ／ミョウバン組成物によって誘導された緑膿菌ワクチン抗原特異的な抗体が、緑膿菌に対するオプソノファゴサイトーシスを増進させ、抗体の機能が向上したことを確認した。
【００９７】
４．緑膿菌抗原の感染防御能の測定
緑膿菌抗原に対するＥＧ−ＩＭ／ミョウバンの感染防御能（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ）を確認するために、６週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＦＴ２抗原、ミョウバン及び／又はＥＧ−ＩＭを混合し、抗原は１週間隔で５μｇずつ２回投与した。ＰＢＳを投与した群を陰性対照群とした。最終投与日から２週後に血液サンプルを収集し、１週後に、マウスは、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＦＴ２ｓｔｒａｉｎ  ＰＡ１０３を１０  ＬＤ５０で致死チャレンジ（ｌｅｔｈａｌ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）して８日間生存を観察した。
【表２】
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【００９８】
上記の表２から確認できるように、ＥＧ−ＩＭ／ミョウバンを用いた試験群は、感染防御能が８０％近く誘導されたが、ＥＧ−ＩＭ又はミョウバン単独を用いた試験群は、感染防御能がほとんど誘導されなかった。
【００９９】
したがって、緑膿菌から抽出した水溶性蛋白質混合物を抗原とし、免疫調節剤としてＥＧ−ＩＭを、免疫補助剤としてミョウバンを混合した緑膿菌ワクチンは、抗体性免疫反応誘導能に優れ、感染防御能が優良に誘導されることが確認できる。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明の免疫調節剤は、内在性免疫及び特定病源体に対する適応免疫反応誘導能に優れており、免疫増強効能を発揮するだけでなく、毒性がほとんどないため、安全性に非常に優れている。また、本発明の免疫調節剤を含むワクチンは、免疫調節剤とミョウバン（ａｌｕｍ）の両方を含むことによって、免疫調節剤を単独で使用する場合に比べて、向上した免疫増強効能を発揮する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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