(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エクトイン産生組換え酵母であって、そのゲノム中で、
(A)(i)アスパルトキナーゼをコードする少なくとも1つの核酸が、過剰発現し、且つ/又は誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下にある、且つ/又は
(ii)アスパラギン酸キナーゼをコードする少なくとも1つの核酸が、過剰発現し、且つ/又は誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下にある、
(B)NADとNADPの両方を補酵素として使用することができるアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする少なくとも1つの核酸が、過剰発現し、且つ/又は誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下にある、
(C)ジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼをコードする少なくとも1つの核酸が、過剰発現し、且つ/又は誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下にある、
(D)(i)ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼMET2をコードする少なくとも1つの核酸が、過剰発現し、且つ/又は誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下にある、
(ii)ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼMETXをコードする少なくとも1つの核酸が、過剰発現し、且つ/又は誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下にある、且つ/又は
(iii)ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼをコードする少なくとも1つの核酸が、過剰発現し、且つ/又は誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下にある、
(E)エクトインシンターゼをコードする少なくとも1つの核酸が、過剰発現し、且つ/又は誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下にある、
(F)(i)ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする少なくとも1つの内在性核酸が、欠失し、且つ/又は中断されている、且つ/又は
(ii)ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする少なくとも1つの核酸が独立して、
-  誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下にあり、
-  弱いプロモーターの制御下にあり、且つ/又は
-  不安定な形態である、
エクトイン産生組換え酵母。
【請求項２】
そのゲノム中で、アスパラギン酸トランスアミナーゼをコードする少なくとも1つの核酸が過剰発現し、且つ/又は誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下にある、請求項1に記載の組換え酵母。
【請求項３】
そのゲノム中で、オキソグルタル酸をグルタミン酸に変換するグルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも1つの核酸が、過剰発現し、且つ/又は誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下にある、請求項1又は2に記載の組換え酵母。
【請求項４】
そのゲノム中で、以下の改変:
(A)前記酵母のゲノムから、ジェネラルアミノ酸パーミアーゼAGP3をコードする少なくとも1つの内在性核酸が欠失し、
(i)ジェネラルアミノ酸パーミアーゼAGP3をコードする少なくとも1つの核酸が、挿入され、且つ誘導性又は抑制性プロモーターの制御下にある、且つ/又は
(ii)不安定化ジェネラルアミノ酸パーミアーゼAGP3をコードする少なくとも1つの核酸が挿入される、改変、
(B)前記酵母のゲノムから、分岐鎖アミノ酸パーミアーゼ3をコードする少なくとも1つの内在性核酸が欠失し、
(i)分岐鎖アミノ酸パーミアーゼ3をコードする少なくとも1つの核酸が、挿入され、且つ誘導性又は抑制性プロモーターの制御下にある、且つ/又は
(ii)不安定化分岐鎖アミノ酸パーミアーゼ3をコードする少なくとも1つの核酸が挿入される、改変、
(C)前記酵母のゲノムから、分岐鎖アミノ酸パーミアーゼ2をコードする少なくとも1つの内在性核酸が欠失し、
(i)分岐鎖アミノ酸パーミアーゼ2をコードする少なくとも1つの核酸が、挿入され、且つ誘導性又は抑制性プロモーターの制御下にある、且つ/又は
(ii)不安定化分岐鎖アミノ酸パーミアーゼ2をコードする少なくとも1つの核酸が挿入される、改変、
(D)前記酵母のゲノムから、ジェネラルアミノ酸パーミアーゼGAP1をコードする少なくとも1つの内在性核酸が欠失し、
(i)ジェネラルアミノ酸パーミアーゼGAP1をコードする少なくとも1つの核酸が、挿入され、且つ誘導性又は抑制性プロモーターの制御下にある、且つ/又は
(ii)不安定化ジェネラルアミノ酸パーミアーゼGAP1をコードする少なくとも1つの核酸が、挿入される、改変、
(E)前記酵母のゲノムから、高親和性グルタミンパーミアーゼGNP1をコードする少なくとも1つの内在性核酸が欠失し、
(i)高親和性グルタミンパーミアーゼGNP1をコードする少なくとも1つの核酸が、挿入され、且つ誘導性又は抑制性プロモーターの制御下にある、及び/又は
(ii)不安定化高親和性グルタミンパーミアーゼGNP1をコードする少なくとも1つの核酸が、挿入される、改変、
(F)ジェネラルアミノ酸パーミアーゼAGP1をコードする少なくとも1つの内在性核酸を、前記酵母のゲノムから欠失させる改変であって、
(i)ジェネラルアミノ酸パーミアーゼAGP1をコードする少なくとも1つの核酸が挿入され、且つ誘導性又は抑制性プロモーターの制御下にある、及び/又は
(ii)不安定化ジェネラルアミノ酸パーミアーゼAGP1をコードする少なくとも1つの核酸が、挿入される、改変、
(G)前記酵母のゲノムから、低親和性メチオニンパーミアーゼMUP3をコードする少なくとも1つの内在性核酸が欠失し、
(i)低親和性メチオニンパーミアーゼMUP3をコードする少なくとも1つの核酸が挿入され、且つ誘導性又は抑制性プロモーターの制御下にある、及び/又は
(ii)不安定化低親和性メチオニンパーミアーゼMUP3をコードする少なくとも1つの核酸が、挿入される、改変、
(H)前記酵母のゲノムから、高親和性メチオニンパーミアーゼMUP1をコードする少なくとも1つの内在性核酸が欠失し、
(i)高親和性メチオニンパーミアーゼMUP1をコードする少なくとも1つの核酸が、挿入され、且つ誘導性又は抑制性プロモーターの制御下にある、且つ/又は
(ii)不安定化高親和性メチオニンパーミアーゼMUP1をコードする少なくとも1つの核酸が、挿入される、改変、
(I)推定トランスポーターAQR1をコードする少なくとも1つの核酸が過剰発現する、改変、及び/又は
(J)ポリアミントランスポーター1をコードする少なくとも1つの核酸が過剰発現する、改変
のうちの少なくとも1つが実施されている、請求項1から3のいずれか一項に記載の組換え酵母。
【請求項５】
そのゲノム中で、請求項4に記載の改変のうち少なくとも2つが実施されている、請求項4に記載の組換え酵母。
【請求項６】
アスパルトキナーゼをコードする前記核酸が、酵母由来の核酸である、請求項1から5のいずれか一項に記載の組換え酵母。
【請求項７】
ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼMETXをコードする前記核酸が、細菌由来の核酸である、請求項1から6のいずれか一項に記載の組換え酵母。
【請求項８】
ジェネラルアミノ酸パーミアーゼ、分岐鎖アミノ酸パーミアーゼ3、分岐鎖アミノ酸パーミアーゼ2、ジェネラルアミノ酸パーミアーゼGAP1、高親和性グルタミンパーミアーゼGNP1、ジェネラルアミノ酸パーミアーゼAGP1、低親和性メチオニンパーミアーゼMUP3、及び高親和性メチオニンパーミアーゼMUP1をコードする前記核酸が、独立して、酵母由来の核酸である、請求項1から7のいずれか一項に記載の組換え酵母。
【請求項９】
過剰発現した前記核酸のうちの少なくとも1つが、強力なプロモーターの制御下にある、請求項1から8のいずれか一項に記載の組換え酵母。
【請求項１０】
前記誘導性又は抑制性プロモーターが、独立して、銅を用いた誘導性又は抑制性プロモーター、メチオニンを用いた誘導性又は抑制性プロモーター、及びスレオニンを用いた誘導性又は抑制性プロモーターからなる群から選択される、請求項1から9のいずれか一項に記載の組換え酵母。
【請求項１１】
前記弱いプロモーターが、独立して、pURA3、pRPLA1、pNUP57及びpGAP1からなる群から選択される、請求項1から10のいずれか一項に記載の組換え酵母。
【請求項１２】
前記誘導性又は抑制性プロモーターが、独立して、銅を用いた誘導性又は抑制性プロモーター、リジンを用いた誘導性又は抑制性プロモーター、及びメチオニンを用いた誘導性又は抑制性プロモーターからなる群から選択される、請求項1から11のいずれか一項に記載の組換え酵母。
【請求項１３】
エクトインを産生する方法であって、
(a)請求項1から12のいずれか一項に記載の組換え酵母を培養培地において培養する工程、及び
(b)前記培養培地から前記エクトインを回収する工程
を含む方法。
【請求項１４】
前記培養培地が、少なくとも炭素源を含む、請求項13に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エクトインのバイオプロダクションの分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
エクトイン(1,4,5,6-テトラヒドロ-2-メチル-4-ピリミジンカルボン酸)は、自然界の好塩性生物によって天然に産生される複素環式アミノ酸である。実際、これらの生物は、塩分の多い環境で生き残るために、浸透圧のカウンターウェイトとして機能する適合溶質としてエクトインを産生する。
【０００３】
実際、エクトインはまた、核酸、タンパク質、細胞膜、及び細胞全体を、紫外線、加熱、凍結、又は化学薬剤等の外部環境からの多数の攻撃によってもたらされる変性だけでなく、乾燥による変性からも保護することができる(例えば、Lentzen Gら、Appl Microbiol Biot. 2006年、72:623〜34頁、及びGraf Rら、Clin Dermatol. 2008年、26:326〜33頁を参照のこと)。したがって、エクトインはスキンケア用の化粧品に使用されている。
【０００４】
更に、エクトインは、タンパク質安定剤、化粧品添加剤、PCRエンハンサー、及び微生物の乾燥保護剤として興味深いことが見出されている。
【０００５】
これらの有利な特性により、エクトインは特に、ハロモナス・エロンガタ(Halomonas elongata)等の好塩菌を使用する細菌プロセスによって産生される。しかし、これらの方法は、高い塩濃度を必要とし、この高い塩濃度によって、プロセスが複雑になり、機器の重大な腐食を考慮することに伴いコストが増加する。
【０００６】
更に、細菌及び酵母の生合成経路を介したエクトイン等の必須アミノ酸の産生には、NADPHの形態でかなりの量の還元力が必要である。しかし、これらの微生物、特に酵母におけるグルコース代謝の主要経路は、解糖とそれに続く発酵でありこれによってNADHのみが産生される。したがって、複雑ではあるが、微生物内で許容可能なNADPH/NADHバランスを維持することは、生存可能な組換え微生物を維持しながら、エクトインのバイオプロダクションを最適化するために不可欠である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第2004/076659号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Lentzen Gら、Appl Microbiol Biot. 2006年、72:623〜34頁
【非特許文献２】Graf Rら、Clin Dermatol. 2008年、26:326〜33頁
【非特許文献３】DiCarloら、(Nucl. Acids Res.、vol. 41、No. 7、2013: 4336〜4343頁)
【非特許文献４】Bachmairら、1986年、Science、234巻(4773): 179〜186
【非特許文献５】Yuら、(2015年、Current Opinion in Biotechnology、36巻  : 199〜204頁)
【非特許文献６】Choら、(2010年、Genes & Development、24巻: 438〜442頁)
【非特許文献７】Fortmannら、(2015年、J Mol Biol、427巻(17) : 2748〜2756頁)
【非特許文献８】Ravidら、(2008年、Nat Rev Mol Cell Biol、9巻(9) : 679〜690頁)
【非特許文献９】Hochstrasser (1996年、Annu Rev Genet、30巻: 405〜439頁)
【非特許文献１０】D. Burkeら、Methods in yeast Genetics - A cold spring harbor laboratory course Manual (2000)
【非特許文献１１】Faehnle, C. R.ら、Journal of Molecular Biology 1055〜1068頁(2005)
【非特許文献１２】Stadtmanら、(1961、J Biol Chem、236巻(7) : 2033〜2038頁)
【非特許文献１３】Ono Hら、1999年、Journal of Bacteriology、p91〜99
【非特許文献１４】Yamagata (1987年、The Journal of Bacteriology、169巻(8) : 3458〜3463頁)
【非特許文献１５】Calnyantoら、(2006年、Microbiology、152巻: 105〜112頁)
【非特許文献１６】Yagiら、(1982年、Biochem、92巻: 35〜43頁)
【非特許文献１７】Noor及びPunekar(2005年、Microbiology、151巻  : 1409〜1419頁)
【非特許文献１８】Kuby, S.ら、(1966) Dehydrogenases and Oxidases Methods in Enzymology 9、116〜117頁
【非特許文献１９】He W.ら、(2007) BMC Structural Biology、7:38頁
【非特許文献２０】Susan-resiga及びNowak (biochemistry、2004年、43、15230〜15245頁)
【非特許文献２１】Wangら、(Biochemistry、2001年、40:1755〜1763頁)
【非特許文献２２】Fisherら、(2013) Chemi. Biol. Interact. 202 70〜77頁
【非特許文献２３】Sagersら、J.Bacteriology (1961) 82 233〜238頁
【非特許文献２４】Castano-Cerezo及びCanovas、Microbial Cell Factories 2009年、8:54頁
【非特許文献２５】Ganzhornら、(1987) The Journal of Biological Chemistry、262、3754〜61頁
【非特許文献２６】Bazaes S.ら、(2007) The Protein Journal、26、265〜269頁
【非特許文献２７】Mariet J. Van der Werfら、(1997) Arch Microbiol 167 : 332〜342頁
【非特許文献２８】Gerrard-Wheelerら、FEBS Journal 276 (2009) 5665〜5677頁
【非特許文献２９】Kerenら、(2013) Molecular Systems Biology 9:701頁
【非特許文献３０】Velculescuら、(1997) Cell 88、243〜251頁
【非特許文献３１】Blazeck & Alper (2013) Biotechnol. J. 8 46〜58頁
【非特許文献３２】Yamanishiら、(2013) ACS synthetic biology 2、337〜347頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、当技術分野では、その非常に効率的な合成及び分泌が可能になる、さらなるエクトイン産生方法が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
したがって、本発明は、そのゲノム中で、
(A)(i)アスパルトキナーゼをコードする少なくとも1つの核酸が、過剰発現し、且つ/又は誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下にある、且つ/又は
(ii)アスパラギン酸キナーゼをコードする少なくとも1つの核酸が、過剰発現し、且つ/又は誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下にある、
(B)アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする少なくとも1つの核酸、及び/又はNADとNADPの両方を補酵素として使用することができるアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする少なくとも1つの核酸が、過剰発現し、且つ/又は誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下にある、
(C)ジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼをコードする少なくとも1つの核酸が、過剰発現し、且つ/又は誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下にある、
(D)(i)ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼMET2をコードする少なくとも1つの核酸が、過剰発現し、且つ/又は誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下にある、
(ii)ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼMETXをコードする少なくとも1つの核酸が、過剰発現し、且つ/又は誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下にある、且つ/又は
(iii)ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼをコードする少なくとも1つの核酸が過剰発現し、且つ又は誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下にある、
(E)エクトインシンターゼをコードする少なくとも1つの核酸が過剰発現し、且つ/又は誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下にある、
(F)(i)ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする少なくとも1つの、好ましくはすべての内在性核酸が、欠失し、且つ/又は中断されている、且つ/又は
(ii)ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする少なくとも1つの、好ましくはすべての核酸が独立して、
-  誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下にあり、
-  弱いプロモーターの制御下にあり、且つ/又は
-  不安定な形態である、
エクトイン産生組換え酵母に関する。
【００１１】
開示された実施例に示すように、本発明の組換え酵母では、エクトイン産生が増加している。
【００１２】
前記有利な特性は、酵母を以下に記載の追加の改変により組み換えることによっても、更に高めることができる。
【００１３】
結果として、エクトイン産生組換え酵母は、以下に記載のエクトインを産生するための方法において有利に使用することができるか、又はエクトインの産生のために使用することができる。
【００１４】
本発明は更に、エクトインを産生する方法であって、
(a)本発明の組換え酵母を培養培地において培養する工程;及び
(b)前記培養培地からエクトインを回収する工程、
を含む方法に関する。
【００１５】
好ましくは、培養培地は少なくとも炭素源、好ましくはグルコース及びスクロースからなる群から選択される炭素源を含む。
【００１６】
本発明はまた、エクトイン産生のための本発明による組換え酵母の使用に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明者らは、親微生物と比較して、特に親酵母と比較して、エクトインを産生する能力が増加した遺伝子改変微生物、特に遺伝子改変酵母を考案した。
【００１８】
これらの遺伝子改変酵母を含むこれらの遺伝子改変微生物は、本明細書全体にわたって記載されている。
【００１９】
定義
本明細書で使用される「微生物」という用語は、人工的に改変されていない酵母を指す。微生物は、遺伝子エレメントを、この外来遺伝子エレメントを発現する微生物「受容体」に組み込んで提供する場合、又は遺伝子構築若しくはタンパク質発現のためのツールとして使用される場合、「供与体」となり得る。本発明の微生物は、エクトインの生合成のための遺伝子を発現する酵母から選択される。
【００２０】
本明細書で使用される「組換え微生物」若しくは「遺伝子改変微生物」又は「組換え酵母」若しくは「遺伝子改変酵母」という用語は、遺伝子改変又は遺伝子組み換えされた酵母を指す。これらの用語の通常の意味によれば、本発明の微生物は天然には見出されず、天然に見出される同等の微生物由来の遺伝子エレメントの導入によって又は欠失によって又は改変によって、改変されることを意味する。特定の淘汰圧下で、定方向突然変異誘発及び進化を組み合わせることによって、新しい代謝経路の発生及び進化を強制することにより改変することもできる(例えば、国際公開第2004/076659号を参照されたい)。
【００２１】
外来遺伝子が、宿主微生物においてそれらの発現を可能にするすべてのエレメントとともに微生物に導入される場合、微生物はこれらの遺伝子を発現するように改変されてもよい。微生物は、内在性遺伝子の発現レベルを調節するように改変されてもよい。酵母等の微生物の、外来DNAによる改変又は「形質転換」は、当業者にとって定型業務である。特に、本発明による微生物の遺伝子改変、より詳細には本明細書で規定される遺伝子改変は、DiCarloら、(Nucl. Acids Res.、vol. 41、No. 7、2013: 4336〜4343頁)に記載されているように、CRISPR-Casシステムを使用して実施してもよい。
【００２２】
「内在性遺伝子」という用語は、野生型株において、その遺伝子が遺伝子改変の前の微生物において存在していたことを意味する。内在性遺伝子は、内在性調節エレメントに加えて異種配列を導入することによって、若しくは内在性調節エレメントを置き換えて異種配列を導入することによって、又は遺伝子の1つ若しくは複数の補充コピーを染色体若しくはプラスミドに導入することによって過剰発現し得る。内在性遺伝子は、それらの発現及び/又は活性を調節するため改変されてもよい。例えば、コード配列に変異を導入して遺伝子産物を改変してもよく、又は内在性調節エレメントに加えて、若しくは内在性調節エレメントを置き換えて異種配列を導入してもよい。内在性遺伝子の調節により、遺伝子産物の活性が上方制御及び/若しくは増強されるか、又は代替的に、内在性遺伝子産物の活性が下方制御及び/若しくは減弱され得る。内在性遺伝子の発現を高める別の方法は、遺伝子の1つ又は複数の補充コピーを染色体又はプラスミドに導入することである。
【００２３】
「外来遺伝子」という用語は、この遺伝子は野生型微生物において天然に生じないが、当業者に周知の手段により、遺伝子が微生物に導入されたことを意味する。外来遺伝子が、宿主微生物においてそれらの発現を可能にするすべてのエレメントとともに微生物に導入される場合、微生物はこれらの遺伝子を発現することができる。外来DNAによる微生物の形質転換は、当業者にとって定型業務である。外来遺伝子は、宿主染色体に組み込んでもよく、又はプラスミド若しくはベクターから染色体外で発現させてもよい。細胞内での複製開始点及びコピー数に関して異なる様々なプラスミドが、すべて当技術分野で知られている。外来遺伝子の配列は、宿主微生物における発現に適合させることができる。実際、当業者は、コドン使用頻度バイアスの概念、及び推定されるタンパク質を改変せずに特定のコドン使用頻度バイアスに核酸配列を適合させる方法を知っている。
【００２４】
「異種遺伝子」という用語は、遺伝子が、それを発現するレシピエント微生物とは異なる微生物の種に由来することを意味する。それは微生物中に天然に生じない遺伝子を指す。
【００２５】
本出願において、すべての遺伝子は、それらの一般名により参照され、それらのヌクレオチド配列により、場合によってそれらのアミノ酸配列により参照される。受託番号に与えられた既知の遺伝子の参照を使用して、当業者は他の生物、細菌株、酵母、真菌、哺乳動物、植物等の同等の遺伝子を決定することができる。この定型作業は、他の微生物に由来する遺伝子と配列アラインメントを行うことにより決定することができるコンセンサス配列を使用し、縮重プローブを設計して、別の生物における対応する遺伝子をクローニングすることにより有利に行う。
【００２６】
当業者は、内在性遺伝子の発現を調節するための、特に上方制御又は下方制御するための異なる手段を知っている。例えば、内在性遺伝子の発現を高める、又は内在性遺伝子を過剰発現させる方法は、遺伝子の1つ又は複数の補充コピーを染色体又はプラスミドに導入することである。
【００２７】
別の方法は、遺伝子の内在性プロモーターをより強力なプロモーターに置き換えることである。これらのプロモーターは相同であっても異種であってもよい。本発明において特に興味深いプロモーターは、本明細書の他の場所でより詳細に記載されている。
【００２８】
核酸発現コンストラクトは、5'及び/又は3'認識配列及び/又は選択マーカーを更に含み得る。
【００２９】
「過剰発現」という用語は、遺伝子又は酵素の発現が、非改変微生物と比較して増加していることを意味する。酵素の発現の増加は、前記酵素をコードする遺伝子の発現を増加させることによって得られる。遺伝子の発現の増加は、当業者に知られているすべての技術によって行ってもよい。これに関して、特に、過剰発現することを目的とした核酸の上流に強力なプロモーターを実装すること、又はプロモーター、特に強力なプロモーターとターミネーターの間に前記核酸の複数のコピーを導入することが挙げられる。
【００３０】
「過少発現」という用語は、遺伝子又は酵素の発現が、非改変微生物と比較して減少していることを意味する。酵素の発現の減少は、前記酵素をコードする遺伝子の発現を減少させることによって得られる。遺伝子の発現の減少は、当業者に知られているすべての技術によって実行され得る。これに関して、特に、過少発現させることを目的とした核酸の上流に弱いプロモーターを実装することを挙げてもよい。親酵素よりも活性が低い前記酵素の変異体、又は親酵素よりも細胞内でより急速に分解される前記酵素の変異体をコードする核酸を実装することもまた、挙げてもよい。親酵素よりも急速に分解される前記親酵素の変異体は、デグロンタグ付加酵素を包含する。目的の遺伝子の転写活性化因子の発現の減少を挙げてもよい。
【００３１】
「誘導性プロモーター」という用語は、その活性が、
-  1つ又は複数の特定の代謝産物の存在下における場合。培地中の代謝産物濃度が高いほど、プロモーター活性がより強くなる;又は
-  1つ又は複数の代謝産物が低濃度で存在する場合、又は存在しない場合。これらの代謝産物は、存在が増加するとプロモーターの活性が誘発される代謝産物とは異なっている。培地中の代謝産物濃度が低いほど、プロモーター活性がより強くなる、
場合に、誘導される、すなわち増加するプロモーターを限定するために使用する。
【００３２】
「抑制性プロモーター」という用語は、その活性が、
-  1つ又は複数の特定の代謝産物の存在下における場合。培地中の代謝産物濃度が高いほど、プロモーター活性がより弱くなる;又は
-  1つ又は複数の代謝産物が低濃度で存在する場合、又は存在しない場合。これらの代謝産物は、存在が増加するとプロモーターの活性が抑制される代謝産物とは異なっている。培地中の代謝産物濃度が低いほど、プロモーター活性がより弱くなる、
場合に、抑制される、すなわち低下するプロモーターを限定するために使用する。
【００３３】
本明細書で使用される「デグロンタグ付加」酵素は、追加のタンパク質分解シグナルアミノ酸配列を含む酵素を意味し、この追加のタンパク質分解シグナルアミノ酸配列は、前記酵素を分解の対象とする破壊シグナルとして機能し、この分解は、(i)ユビキチンに依存しない分解、又は(ii)ユビキチンに依存する分解のいずれであってもよい。当該技術分野において「デグロン」とも呼ばれる前記追加のタンパク質分解シグナルは、破壊シグナルとして機能するアミノ酸配列を包含し、前記アミノ酸配列は、標的タンパク質分解をもたらす伝達可能な分解シグナルからなる。デグロンは「N-デグロン」を包含し、これは、よく知られているN末端ルールに従って、標的タンパク質の分解をもたらす転移可能なN末端アミノ酸である(Bachmairら、1986年、Science、234巻(4773): 179〜186)。N-デグロンの不安定な性質は、アセチル化又はアルギニル化修飾を受けやすく、最終的にユビキチン化及び分解をもたらす、その1番目のアミノ酸に起因する。一般に、デグロンは、標的タンパク質の分解を保証するために少なくとも2つの成分、すなわち、(i)ポリユビキチンタグ等の標的分解認識タグ、及び(ii)分解認識タグにきわめて近接している非構造化アミノ酸配列、を必要とする。タンパク質のデグロンタギングについて、特に本明細書において酵素のデグロンタギングについては、当業者はYuら、(2015年、Current Opinion in Biotechnology、36巻: 199〜204頁)、Choら、(2010年、Genes & Development、24巻: 438〜442頁)、又はFortmannら、(2015年、J Mol Biol、427巻(17) : 2748〜2756頁)、Ravidら、(2008年、Nat Rev Mol Cell Biol、9巻(9) : 679〜690頁)、及びHochstrasser (1996年、Annu Rev Genet、30巻: 405〜439頁)を参照してもよい。
【００３４】
酵素の「活性」は、「機能」という用語と交換可能に使用し、本発明との関係において、酵素が所望の反応を触媒する能力を示す。
【００３５】
酵素の「活性低下」又は「活性減弱」という用語は、アミノ酸配列における変異により得られたタンパク質の比触媒活性の低下、及び/又はヌクレオチド配列の変異により、又は同族の対応する遺伝子の欠失により、又はタンパク質のデグロンタギングにより得られた細胞内のタンパク質濃度の低下を意味する。
【００３６】
酵素の「活性増強」という用語は、例えば酵素をコードする遺伝子の過剰発現によって得られた、酵素の比触媒活性の増加、及び/又は細胞における酵素の量/利用可能性の増加を示す。
【００３７】
「コードする(encoding)」又は「コードする(coding)」という用語は、転写及び翻訳のメカニズムを介してポリヌクレオチドがアミノ酸配列を産生するプロセスを指す。
【００３８】
本発明において考慮される酵素をコードする遺伝子は、外来性又は内在性であり得る。
【００３９】
遺伝子の「減弱」とは、遺伝子が非改変微生物よりも劣った速度で発現することを意味する。減弱は、当業者に既知の手段及び方法により達成され得、相同組換えにより得られる遺伝子欠失、遺伝子へ外部エレメントを挿入することによる遺伝子減弱又は弱いプロモーター下での遺伝子発現を含む。当業者は、異なる強度を示す様々なプロモーターを知っており、弱い遺伝子発現のためにどのプロモーターを使用するべきかについて知っている。
【００４０】
本発明において実施される方法は、好ましくは、染色体上の特定の位置への異種ヌクレオチド配列の安定な導入のための、又は遺伝子改変微生物細胞における1つ又は複数の標的遺伝子の機能破壊のための、1つ又は複数の染色体組み込みコンストラクトの使用を必要とする。いくつかの実施形態では、標的遺伝子の破壊により、関連する機能性タンパク質の発現が妨げられる。いくつかの実施形態では、標的遺伝子の破壊により、破壊された遺伝子から非機能性タンパク質が発現する。
【００４１】
本発明の実施において変えることができる染色体組み込みコンストラクトのパラメーターには、相同配列の長さ;相同配列のヌクレオチド配列;組み込み配列の長さ;組み込み配列のヌクレオチド配列;及び標的遺伝子座のヌクレオチド配列、が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、各相同配列の長さの有効範囲は、20〜5,000塩基対、優先的には50〜100塩基対である。特定の実施形態では、各相同配列の長さは約50塩基対である。遺伝子ターゲティングに必要な相同性の長さの詳細については、D. Burkeら、Methods in yeast Genetics - A cold spring harbor laboratory course Manual (2000)を参照されたい。
【００４２】
いくつかの実施形態では、(a)上記のDNAコンストラクトが挿入されることが意図された破壊される遺伝子は、形質転換される微生物細胞の選択に有用な1つ又は複数の選択マーカーを有利に含み得る。前記選択マーカーは、本発明によるDNAコンストラクトに含まれる。
【００４３】
いくつかの実施形態では、選択マーカーは抗生物質耐性マーカーである。抗生物質耐性マーカーの実例としては、NAT1遺伝子産物、AUR1-C遺伝子産物、HPH遺伝子産物、DSDA遺伝子産物、KANR遺伝子産物、及びSH BLE遺伝子産物が挙げられるが、これらに限定されない。S. noursei(S.ノルセイ)のNAT1遺伝子産物は、ノーセオスリシン(Nourseothricin)に対する耐性を付与する;サッカロマイセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)のAUR1-C遺伝子産物は、Aureobasidin A(AbA)(オーレオバシジンA)に対する耐性を付与する;肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)のHPH遺伝子産物は、ハイグロマイシンB(Hygromycin B)に対する耐性を付与する;大腸菌(E. coli)のDSDA遺伝子産物は、唯一の窒素源としてD-セリンを含むプレート上で細胞を増殖させることができる;Tn903トランスポゾンのKANR遺伝子は、G418に対する耐性を付与する;ストレプトアロテイカス・ヒンダスタヌス(Streptoalloteichus hindustanus)のSH BLE遺伝子産物は、ゼオシン(ブレオマイシン)に対する耐性を付与する。
【００４４】
いくつかの実施形態では、抗生物質耐性マーカーは、本発明の遺伝子改変微生物細胞を単離した後に欠失させる。当業者は、特定の遺伝子状況において好適なマーカーを選択することができる。
【００４５】
いくつかの実施形態では、選択マーカーは、遺伝的に改変された微生物細胞の栄養要求性(例えば、栄養素要求性)をレスキューする。そのような実施形態では、親微生物細胞は、例えば、酵母のHIS3遺伝子産物、LEU2遺伝子産物、LYS1遺伝子産物、LYS2遺伝子産物、MET15遺伝子産物、TRP1遺伝子産物、ADE2遺伝子産物、及びURA3遺伝子産物等の、アミノ酸又はヌクレオチド生合成経路において機能する1つ又は複数の遺伝子産物における機能的破壊を含み、このことにより、1つ又は複数の栄養素(栄養要求性表現型)を補充しないと、親微生物細胞が培地において増殖できなくなる。次に、破壊された遺伝子産物の機能的コピーをコードする染色体を組み込んで親微生物細胞を形質転換することにより、栄養要求性表現型をレスキューすることができ(注意:遺伝子の機能的コピーは、クルイベロマイセス(Kluveromyces)、カンジダ(Candida)等の近縁種に由来する場合がある)、産生される遺伝子改変微生物細胞は、親微生物細胞の栄養要求性表現型の喪失に基づいて選択することができる。
【００４６】
プロモーター配列、コード配列(例えば、酵素コード配列)、又はターミネーター配列を含む各核酸配列について、参照配列が本明細書に記載されている。本明細書はまた、参照核酸配列と特定の百分率の核酸同一性を有する核酸配列を包含する。
【００４７】
目的のアミノ酸配列それぞれについて、参照配列を本明細書に記載する。本明細書はまた、参照アミノ酸配列と特定の百分率のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列(例えば、酵素アミノ酸配列)を包含する。
【００４８】
明らかな理由により、本明細書すべてにおいて、考慮されるヌクレオチド又はアミノ酸の同一性にそれぞれ適合する特定の核酸配列又は特定のアミノ酸配列は、所望の生物活性を示すタンパク質又は酵素を取得することに更につながるはずである。本明細書で使用される場合、2つの核酸配列間又は2つのアミノ酸配列間の「同一性の百分率」は、比較ウィンドウを介して両方の最適に整列した配列を比較することにより決定される。
【００４９】
したがって、比較ウィンドウ内のヌクレオチド又はアミノ酸配列の部分は、参照配列(付加又は欠失を含まない)と比較してこれらの付加又はこれらの欠失(例えば、「ギャップ」)を含み、こうして両配列間の最適なアライメントが得られる。
【００５０】
同一性の百分率は、比較される両配列について同一の核酸塩基又は同一のアミノ酸残基が認められる位置の数を決定し、次に、両核酸塩基間、又は両アミノ酸残基間で同一性が観察される位置の数を、比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、次に、結果に100を掛けて、計算して2つの配列間のヌクレオチド同一性の百分率又は2つの配列間のアミノ酸同一性の百分率を取得する。
【００５１】
配列最適化アラインメントの比較は、既知のアルゴリズムを使用してコンピューターによって実行してもよい。
【００５２】
最も好ましくは、配列同一性百分率は、CLUSTAL Wソフトウェア(バージョン1.82)を使用して決定し、パラメーターは以下のように設定する、すなわち、(1) CPU MODE=ClustalW mp; (2) ALIGNMENT="full"; (3) OUTPUT FORMAT="aln w/numbers"; (4) OUTPUT ORDER="aligned"; (5) COLOR ALIGNMENT="no"; (6) KTUP (word size)="default"; (7) WINDOW LENGTH="default"; (8) SCORE TYPE="percent"; (9) TOPDIAG="default"; (10) PAIRGAP="default"; (11) PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE="none"; (12) MATRIX="default"; (13) GAP OPEN="default"; (14) END GAPS="default"; (15) GAP EXTENSION="default"; (16) GAP DISTANCES="default"; (17) TREE TYPE="cladogram"及び(18) TREE GRAP DISTANCES="hide"。
【００５３】
「発酵」又は「培養」は、少なくとも1つの単純な炭素源、及び必要に応じて補助基質を含む、培養される微生物に適合した適切な培養培地を備えた発酵槽中で、一般に行われる。
【００５４】
本明細書に開示される微生物は、オキサロ酢酸(oxaloacetate)から産物を産生させるための発酵培地中で増殖させることができる。エクトインの最大産生のために、産生宿主として使用される微生物株は、好ましくは、炭水化物利用率が高い。これらの特性は、突然変異誘発及び選択、遺伝子工学によって付与される場合もあれば、天然の場合もある。本細胞の発酵培地、又は「培養培地」は、少なくとも約10g/Lのグルコースを含んでもよい。追加の炭素基質としては、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース等の単糖;ラクトース、マルトース、ガラクトース、スクロース等のオリゴ糖;デンプン又はセルロース等の多糖又はそれらの混合物、及びチーズホエイパーミエイトコーンスティープリカー、テンサイ糖蜜、並びに大麦麦芽等の再生可能な原料由来の未精製混合物を挙げてもよいが、これらに限定されない。その他の炭素基質としては、グリセロールが含まれ得る。
【００５５】
したがって、本発明において利用される炭素源は、多種多様な炭素含有基質を包含してもよく、生物の選択によってのみ制限されると考えられる。
【００５６】
上記の炭素基質及びそれらの混合物はすべて本発明に好適であると考えられるが、好ましい炭素基質はグルコース、フルクトース、及びスクロース、又はこれらと、C5糖、及びより詳細にはグルコースを使用するように改質された微生物用のキシロース及び/又はアラビノース等のC5糖との混合物である。
【００５７】
好ましい炭素基質はグルコースである。
【００５８】
適切な炭素源に加えて、発酵培地は、好適なミネラル、塩、補因子、緩衝液、及び培養物の増殖及び所望の産物の産生に必要な酵素経路の促進に好適な、当業者に既知の他の成分を含んでもよい。
【００５９】
更に、本発明による組換え微生物の増殖に好適な追加の遺伝子改変を考慮し得る。
【００６０】
「好気性条件」という用語は、好気性又は通性嫌気性微生物が末端電子受容体として二酸素を使用するのに十分な培養培地中の酸素濃度を指す。
【００６１】
「微好気性条件」とは、酸素濃度が空気中の酸素濃度より低い、つまり酸素濃度が最大6% O2の培養培地を指す。
【００６２】
「適切な培養培地」とは、例えば、炭素源又は炭素基質、窒素源、例えば、ペプトン、酵母抽出物、肉抽出物、麦芽抽出物、尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム;リン源、例えば、リン酸一カリウム又はリン酸二カリウム;微量元素(例えば、金属塩)、例えば、マグネシウム塩、コバルト塩及び/又はマンガン塩;並びに増殖因子、例えば、アミノ酸、ビタミン、増殖促進剤等の、細胞の維持及び/又は増殖に不可欠な若しくは有益な栄養素を含む培地(例えば、減菌液体培地)を指す。本発明による「炭素源」又は「炭素基質」又は「炭素の供給源」という用語は、ヘキソース(例えば、グルコース、ガラクトース又はラクトース)、ペントース、単糖、オリゴ糖、二糖(例えば、スクロース、セロビオース又はマルトース)、糖蜜、デンプン又はその誘導体、セルロース、ヘミセルロース及びそれらの組合せを含む、微生物の正常な増殖を支援するため当業者が使用することができる任意の炭素の供給源を意味する。
【００６３】
本発明に従って導入される遺伝子改変の全般的特徴
-  遺伝子は、相互に排他的ではない2種類の改変、すなわち、
・それらを強力なプロモーターの制御下に置くこと、及び/又は
・考慮される遺伝子の複数のコピーを挿入すること
によって過剰発現している。
【００６４】
-  すべてのゲノム改変は、既知の遺伝子工学技術に従って酵母に挿入される:
【００６５】
-  本発明による酵母ゲノムに導入される遺伝子コンストラクトに含まれる連続遺伝子は、以下の構造のものである、すなわち、
Prom1-ORF1-term1-ORF2-gene2-term2-…/…-Promn-ORFn-termn、式中、
-  Prom1は、コード配列ORF1の発現を制御する配列であり、
-  ORF1は、所望のタンパク質PROT1、特に所望の酵素PROT1をコードする核酸配列であり、
-  Term1は、新たに合成されたmRNAに、転写複合体からmRNAを放出するプロセスをトリガーするシグナルを提供することにより、転写終結を媒介する転写ターミネーター配列であり、
-  「1」、「2」、…/…「n」は、同じORF(オープンリーディングフレーム)、プロモーター、又はターミネーターを記述しても、記述しなくてもよい。遺伝子の順序は重要ではない。「n」は通常5〜20の範囲の整数である。これらのコンストラクトは、酵母染色体の1つの制御された位置に挿入される。いくつかの実施形態では、挿入部位は、挿入されたコンストラクトの機能にとっても、得られる遺伝子改変酵母の生存率にとっても必須ではない。
【００６６】
-  酵母が例えばサッカロマイセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)である場合、酵母ゲノムに導入され、サッカロマイセス・セレヴィシエ以外の生物に由来する遺伝子は、一般に「トランスコード」(一般にコドン最適化)されており、これらの遺伝子はS.セレヴィシエにおける発現に最適なコドン使用頻度で合成されることを意味する。S.セレヴィシエ由来のいくつかの遺伝子のヌクレオチド配列(タンパク質配列ではない)も改変(「トランスコード化」)され、前記遺伝子の内在性コピーによる組換えが最小限に抑えられている。
【００６７】
-  遺伝子は、酵母の遺伝子工学で使用される標準的な手順で欠失させてもよい。いくつかの実施形態では、欠失のための標的遺伝子は、上記の遺伝子コンストラクトの1つを挿入することによって中断されてもよく、或いは欠失のための標的遺伝子は、ヌクレオチドの短いストレッチで置き換えられる。
【００６８】
-  遺伝子発現の下方制御は、遺伝子の内在性コピーを破壊し、それを弱いプロモーターの制御下におけるORFのコピーで置き換えることにより得られる場合がある。弱いプロモーターのリスト及び配列は、本明細書の他の場所に記載されている。
【００６９】
-  遺伝子の内在性コピーを欠失させて(必要な場合)、ORFの新しいコピーを誘導性又は抑制性プロモーターの制御下に置くことにより、遺伝子を「誘導性又は抑制性」にすることができる。誘導性又は抑制性プロモーターは、環境条件又は外部刺激の変化によりその活性が調節又は制御される、すなわち増加するか又は低下するプロモーターである。誘導又は抑制は人工的に制御することができ、これには、目的の生物には天然に見出されない化合物、光、酸素レベル、熱又は寒さ等の非生物因子による誘導又は抑制が包含される。誘導性又は抑制性プロモーターのリスト及び配列は、本明細書の他の場所に記載されている。
【００７０】
-  本明細書の他の場所で既に明記されているように、タンパク質は、Yuら、2015年、(Current Opinion in Biotechnology、36巻: 199〜204頁)に記載されている「デグロン」技術を使用して不安定化させることにより、過少発現させることができる。手短に言えば、この技術は、タンパク質配列に、分解のためにタンパク質配列を標的とする改変を導入することで構成される。これは、N末端ルールとして知られる原理に従う1番目の2つのアミノ酸のみで、又はユビキチン-プレオテアソーム分解経路へのタンパク質全体を標的とするより大きな配列で構成され得る。
【００７１】
本発明による組換え酵母
本発明者らは、エクトインを産生する能力が増加した組換え微生物、特に組換え酵母を考案した。
【００７２】
本発明は、エクトイン産生が増加した組換え酵母に関し、ここで、エクトイン産生の増加は、遺伝子工学的方法により、そのゲノムに導入された複数の変異を通じて得られる。
【００７３】
本発明は、そのゲノム中で、
(A)(i)アスパルトキナーゼHOM3をコードする少なくとも1つの核酸が、過剰発現し、且つ/又は誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下にある、且つ/又は
(ii)アスパラギン酸キナーゼAKをコードする少なくとも1つの核酸が、過剰発現し、且つ/又は誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下にある、
(B)アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼHOM2をコードする少なくとも1つの核酸、及び/又はNADとNADPの両方を補酵素として使用することができるアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼHOM2をコードする少なくとも1つの核酸が、過剰発現し、且つ/又は誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下にある、
(C)ジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼEctBをコードする少なくとも1つの核酸が、過剰発現し、且つ/又は誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下にある、
(D)(i)ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼMET2をコードする少なくとも1つの核酸が、過剰発現し、且つ/又は誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下にある、
(ii)ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼMETXをコードする少なくとも1つの核酸が、過剰発現し、且つ/又は誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下にある、且つ/又は
(iii)ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼEctAをコードする少なくとも1つの核酸が、過剰発現し、且つ/又は誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下にある;
(E)エクトインシンターゼEctCをコードする少なくとも1つの核酸が、過剰発現し、且つ/又は誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下にある、
(F)(i)ホモセリンデヒドロゲナーゼHOM6をコードする少なくとも1つの、好ましくはすべての内在性核酸が欠失している、並びに/又は
(ii)ホモセリンデヒドロゲナーゼHOM6をコードする少なくとも1つの、好ましくはすべての核酸は独立して、
-  誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下にあり、
-  弱いプロモーターの制御下にあり、且つ/又は
-  不安定な形態である、
エクトイン産生組換え酵母に関する。
【００７４】
本発明者らは、これらの酵母細胞のゲノムに複数の遺伝子変異を導入することにより、酵母細胞によるエクトイン産生の増加を達成することができることを見出した。本明細書に十分に記載されているように、前記複数の遺伝子変異は、特定の遺伝子の過剰発現、特定の他の遺伝子の発現制御、並びに、更に他の遺伝子の抑制又は欠失を包含する。
【００７５】
得られた遺伝子改変酵母細胞の最適な生存率を同時に維持しながら、酵母細胞によるエクトイン産生の増加は、オキサロ酢酸及びアセチル-CoAの代謝を最適化し、後続の人工的に改変された代謝経路を主にエクトイン産生にむけることにより、発明者によって達成された。
【００７６】
長い研究期間の後、本発明者らは、オキサロ酢酸からの、後続の中間代謝産物ホスホアスパルチル及びアスパルチルセミアルデヒドへの変換を増加させ、更にアスパルチルセミアルデヒドのエクトインへの変換を強化することにより、特に、酸化還元状態、より詳細には適応したNADH/NADPHバランスを維持して、得られた組換え酵母細胞の良好な生存率を実現しながら、酵母細胞による高いエクトイン産生が得られると結論付けた。この最後の点は必須であり、研究作業全体を通じて発明者らにとって大きな課題であった。
【００７７】
本発明による提案された解決策により、予期せぬことに、より少ない還元力の消費、NADPHではなくNADHの形態での還元力の消費を通じて、及び/又はNADPHの代わりにNADHの産生を通じて、エクトイン産生経路全体にわたって酵母細胞内で生存可能なNADH/NADPH平衡を維持することができる。
【００７８】
本明細書に詳細に開示されるように、得られた組換え酵母細胞は、(i)アスパルトキナーゼをコードする遺伝子(HOM3)及び/又は(ii)アスパラギン酸キナーゼをコードする遺伝子(AK)の過剰発現及び/若しくは発現制御、特にアスパラギン酸キナーゼをコードする遺伝子(AK)の過剰発現及び/若しくは発現制御、好ましくはアスパラギン酸キナーゼ遺伝子(AK)の過剰発現をもたらすように遺伝子改変されている。
【００７９】
更に、本発明による組換え酵母は、アスパルチルセミアルデヒド産生のための中間代謝産物ホスホアスパルチルの最適な使用のためのさらなる遺伝子改変を含み、前記さらなる遺伝子改変は、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(HOM2)の過剰発現及び/若しくは発現制御、並びに/又はNADHとNADPHの両方を補酵素として使用することができるアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の過剰発現及び/若しくは発現制御を含む。
【００８０】
更に、本発明による組換え酵母は、エクトイン産生のための中間代謝産物アスパルチルセミアルデヒドの最適な使用のためのさらなる遺伝子改変を含み、前記さらなる遺伝子改変は、(i)ジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子(EctB)の過剰発現及び/又は発現制御、(ii)ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子(MET2;METX)及び/若しくはジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼ遺伝子(EctA)の過剰発現及び/又は発現制御、(iii)エクトインシンターゼ遺伝子(EctC)の過剰発現及び/又は発現制御、並びに(iv)ホモセリンデヒドロゲナーゼ遺伝子(HOM6)の過少発現及び/又は発現制御を含む。
【００８１】
本発明による組換え酵母のいくつかの実施形態では、前記酵母は、アスパラギン酸産生のための中間代謝産物オキサロ酢酸の最適な使用のためのさらなる遺伝子改変を含み、前記さらなる遺伝子改変は、(i)アスパラギン酸トランスアミナーゼ遺伝子(AAT2)の過剰発現及び/又は発現制御、及び/又は(ii)オキソグルタル酸(oxo-glutarate)をグルタミン酸遺伝子(GDH)に変換するグルタミン酸デヒドロゲナーゼの過剰発現及び/又は発現制御を含む。
【００８２】
本発明による組換え酵母のいくつかの実施形態では、前記酵母は、産生されるエクトインの最適な分泌のためのさらなる遺伝子改変を含み、前記さらなる遺伝子改変は、(i)ジェネラルアミノ酸(general amino acid)パーミアーゼ遺伝子(AGP3)の過少発現及び/又は発現制御、(ii)分岐鎖アミノ酸パーミアーゼ3遺伝子(BAP3)の過少発現及び/又は発現制御、(iii)分岐鎖アミノ酸パーミアーゼ2遺伝子(BAP2)の過少発現及び/又は発現制御、(iv)ジェネラルアミノ酸パーミアーゼ遺伝子(GAP1)の過少発現及び/又は発現制御、(v)高親和性グルタミンパーミアーゼ遺伝子(GNP1)の過少発現及び/又は発現制御、(vi)ジェネラルアミノ酸パーミアーゼ遺伝子(AGP1)の過少発現及び/又は発現制御、(vii)低親和性メチオニンパーミアーゼ遺伝子(MUP3;MUP1)の過少発現及び/又は発現制御、(viii)推定トランスポーター遺伝子(AQR1)の過剰発現及び/又は発現制御、及び/又は(ix)ポリアミントランスポーター1遺伝子(TPO1)の過剰発現及び/又は発現制御を含む。
【００８３】
特定の実施形態では、ジェネラルアミノ酸パーミアーゼ、分岐鎖アミノ酸パーミアーゼ3、分岐鎖アミノ酸パーミアーゼ2、ジェネラルアミノ酸パーミアーゼGAP1、高親和性グルタミンパーミアーゼGNP1、ジェネラルアミノ酸パーミアーゼAGP1、低親和性メチオニンパーミアーゼMUP3、及び高親和性メチオニンパーミアーゼMUP1をコードする核酸は、独立して、酵母由来の、好ましくはサッカロマイセス・セレヴィシエ由来の核酸である。
【００８４】
本発明による組換え酵母は、上記の遺伝子改変を含まない親酵母よりも高い収率でエクトインを産生する。
【００８５】
本発明による組換え酵母は、適切なグルタミン酸デヒドロゲナーゼ又は適切なアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ等、NADPHではなくNADHを利用する酵素の発現を促進するように遺伝子操作されている。
【００８６】
本発明による組換え酵母のいくつかの実施形態では、過剰発現したアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼは、強力なプロモーター及び/又は誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下に置かれているS.セレヴィシエの内在性遺伝子からなる。
【００８７】
いくつかの実施形態では、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼは、好ましくは、S.セレヴィシエHOM2遺伝子によってコードされる。
【００８８】
いくつかの実施形態では、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼは、最も好ましくは、本明細書の実施例に示されるように、NAD及びNADPの両方を使用する変異HOM2タンパク質をコードするS.セレヴィシエHOM2遺伝子の変異体によってコードされる。そのような遺伝子変異体は、例えば実施例に例示されており、HOM2-2と呼ばれている。この遺伝子変異体は、以下で説明するように変異したS.セレヴィシエHOM2遺伝子に対応する。
【００８９】
補酵素としてのNADPに対するHOM2の高い選択性を緩和し、NADに対する酵素の親和性を高めるために、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ変異体のいくつかのアミノ酸残基に向けられた変異の性質は、当業者に知られており、例えば、Faehnle, C. R.ら、Journal of Molecular Biology 1055〜1068頁(2005)に見出すことができる。特に、ヌクレオチド配列の115〜117位のヌクレオチドTCTの、ヌクレオチドGAGによる置換に対応するS39からE39への変異を挙げることができる。
【００９０】
当業者に周知のアミノ酸の命名法によれば、Sはセリンを表し、Eはグルタミン酸を表す。
【００９１】
いくつかの実施形態では、アスパルトキナーゼは、本明細書の実施例に示されるように、最も好ましくはS.セレヴィシエHOM3遺伝子によってコードされる。
【００９２】
アスパルトキナーゼをコードする遺伝子の過剰発現及び/又は発現制御
本発明による組換え酵母のいくつかの実施形態では、アスパルトキナーゼをコードする遺伝子の過剰発現は、酵母ゲノムの選択された位置に、アスパルトキナーゼコード配列を含む発現カセットの1つ又は複数のコピーを挿入することにより得られる。本発明に包含されているアスパルトキナーゼ及びアスパルトキナーゼをコードする遺伝子は、本明細書の他の場所で詳述されている。
【００９３】
これらの実施形態のいくつかでは、アスパルトキナーゼコード配列を含む発現カセットの前記1つ又は複数のコピーは、酵母細胞で機能する強力なプロモーター等の、アスパルトキナーゼの強力な発現を可能にする調節配列を含む。
【００９４】
本発明による組換え酵母のこれらの実施形態に加えて、又はその代替として、少なくとも1つのアスパルトキナーゼをコードする遺伝子は、酵母細胞にて機能する誘導性又は抑制性プロモーターの制御下にあり得る。
【００９５】
これらの実施形態では、アスパルトキナーゼをコードする遺伝子の発現制御は、天然酵母アスパルトキナーゼのオープンリーディングフレームの位置に、誘導性又は抑制性プロモーター等の誘導性調節配列を挿入して、酵母ゲノム中のこのゲノム位置にて最初に存在する内在性プロモーターを置換することにより得ることができる。
【００９６】
特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、アスパルトキナーゼをコードする遺伝子の過剰発現により、アスパラギン酸から、ホスホアスパルチル(phospho-aspartyl)とも呼ばれるアスパルチルリン酸(アスパルチル-P)への制御された変換レベルが得られ、これは、本発明による組換え酵母の高レベルの生存率に寄与するものと考える。少なくとも1つのアスパルトキナーゼコード配列が誘導性又は抑制性プロモーターの制御下にある場合にも同じことが当てはまる。
【００９７】
いくつかの好ましい実施形態において、前記アスパルトキナーゼをコードする遺伝子は、本明細書の実施例に示される、サッカロマイセス・セレヴィシエ由来のHOM3遺伝子である。
【００９８】
好ましい実施形態では、前記アスパルトキナーゼをコードする遺伝子は、強力なプロモーターpCCW12又は誘導性又は抑制性プロモーターpCUP-1-1の制御下に置かれる。
【００９９】
実例として、アスパルトキナーゼ遺伝子は、本明細書の実施例に示されるように、HOM6遺伝子内及び/又はSAM3遺伝子内に挿入され得る。
【０１００】
アスパラギン酸キナーゼをコードする遺伝子の過剰発現及び/又は発現制御
上記のアスパルトキナーゼの過剰発現及び/又は発現制御の代わりに、又はこれに対し補完的に、本発明による組換え酵母は、アスパラギン酸キナーゼをコードする遺伝子の過剰発現及び/又は発現制御を含むようなものであることもできる。
【０１０１】
したがって、本発明による組換え酵母の好ましい実施形態では、アスパラギン酸キナーゼをコードする遺伝子の過剰発現は、酵母ゲノムの選択された位置に、アスパラギン酸キナーゼコード配列を含む発現カセットの1つ又は複数のコピーを挿入することにより得られる。本発明に包含されているアスパラギン酸キナーゼ及びアスパラギン酸キナーゼをコードする遺伝子は、本明細書の他の場所で詳述されている。
【０１０２】
これらの実施形態のいくつかでは、アスパラギン酸キナーゼコード配列を含む発現カセットの前記1つ又は複数のコピーは、酵母細胞で機能する強力なプロモーター等の、アスパラギン酸キナーゼの強力な発現を可能にする調節配列を含む。
【０１０３】
本発明による組換え酵母のこれらの実施形態に加えて、又はその代替として、少なくとも1つのアスパラギン酸キナーゼをコードする遺伝子は、酵母細胞にて機能する誘導性又は抑制性プロモーターの制御下にあり得る。
【０１０４】
特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、アスパラギン酸キナーゼをコードする遺伝子の発現制御により、アスパラギン酸から、アスパルチルリン酸(アスパルチル-P)への制御された変換レベルが得られ、これは、本発明による組換え酵母の高レベルの生存率に寄与するものと考える。
【０１０５】
好ましい実施形態では、前記アスパラギン酸キナーゼをコードする遺伝子は、本明細書の実施例に示されるように、枯草菌(Bacillus subtilis)由来のAK遺伝子である。
【０１０６】
好ましい実施形態では、前記アスパラギン酸キナーゼをコードする遺伝子は、誘導性又は抑制性プロモーターpACU7の制御下に置かれる。
【０１０７】
実例として、アスパラギン酸キナーゼ遺伝子は、本明細書の実施例に示されるように、TRP1遺伝子内に挿入され得る。
【０１０８】
アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の過剰発現及び/又は発現制御
本発明による組換え酵母の好ましい実施形態では、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の過剰発現は、酵母ゲノムの選択された位置に、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼコード配列を含む発現カセットの1つ又は複数のコピーを挿入することにより得られる。本発明に包含されているアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ及びアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、本明細書の他の場所で詳述されている。
【０１０９】
これらの実施形態のいくつかでは、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼコード配列を含む発現カセットの前記1つ又は複数のコピーは、酵母細胞で機能する強力なプロモーター等の、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの強力な発現を可能にする調節配列を含む。
【０１１０】
本発明による組換え酵母のこれらの実施形態に加えて、又はその代替として、少なくとも1つのアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、酵母細胞にて機能する誘導性又は抑制性プロモーターの制御下にあり得る。
【０１１１】
特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの過剰発現により、中間代謝産物アスパルチルリン酸(アスパルチル-P)からアスパルチルセミアルデヒドへの変換が促進され得ると考える。少なくとも1つのアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼコード配列が誘導性又は抑制性プロモーターの制御下にある場合にも同じことが当てはまる。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼは、アスパルチルリン酸(アスパルチル-P)からアスパルチルセミアルデヒドへの変換を触媒するためにNADH又はNADPHの両方を使用する酵素変異体であり得る。
【０１１３】
いくつかの好ましい実施形態では、前記アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、サッカロマイセス・セレヴィシエ由来のHOM2遺伝子、又は本明細書の実施例に示されるような、前述したNADH及びNADPHの両方を利用するHOM2の変異体である。
【０１１４】
好ましい実施形態では、前記アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、誘導性又は抑制性プロモーターpACU5又は強力なプロモーターpCCW12の制御下に置かれる。
【０１１５】
実例として、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子は、本明細書の実施例に示されるように、HIS3遺伝子内及び/又はMUP3遺伝子内に挿入され得る。
【０１１６】
ジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子の過剰発現及び/又は発現制御
本発明による組換え酵母の好ましい実施形態では、ジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子の過剰発現は、酵母ゲノムの選択された位置に、ジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼコード配列を含む発現カセットの1つ又は複数のコピーを挿入することにより得られる。本発明に包含されているジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ及びジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、本明細書の他の場所で詳述されている。
【０１１７】
これらの実施形態のいくつかでは、ジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼコード配列を含む発現カセットの前記1つ又は複数のコピーは、酵母細胞で機能する強力なプロモーター等の、ジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼの強力な発現を可能にする調節配列を含む。
【０１１８】
本発明による組換え酵母のこれらの実施形態に加えて、又はその代替として、少なくとも1つのジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、酵母細胞にて機能する誘導性又は抑制性プロモーターの制御下にあり得る。
【０１１９】
特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、ジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼの過剰発現により、中間代謝産物アスパルチルセミアルデヒドから2,4-ジアミノ酪酸(2,4ーdiaminobutyrate)への変換が促進されると考える。少なくとも1つのジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼコード配列が誘導性又は抑制性プロモーターの制御下にある場合にも同じことが当てはまる。
【０１２０】
好ましい実施形態では、前記ジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、本明細書の実施例に示されるように、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)由来のEctB遺伝子、又はハロモナス・エロンガタ(場合によりクロモハロバクター・サレキシゲンス(Chromohalobacter salexigens)とも呼ばれる)由来のEctB遺伝子である。
【０１２１】
好ましい実施形態では、前記ジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、強力なプロモーターpCCW12及び/又は強力なプロモーターpTDH3の制御下に置かれる。
【０１２２】
実例として、ジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子は、本明細書の実施例に示されるように、HOM6遺伝子内及び/又はSAM3遺伝子内及び/又はMUP3遺伝子内及び/又はURA3遺伝子内に挿入され得る。
【０１２３】
ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の過剰発現及び/又は発現制御
本発明による組換え酵母の好ましい実施形態では、ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の過剰発現は、酵母ゲノムの選択された位置に、ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼコード配列を含む発現カセットの1つ又は複数のコピーを挿入することにより得られる。本発明に包含されているホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼ及びホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、本明細書の他の場所で詳述されている。
【０１２４】
これらの実施形態のいくつかでは、ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼコード配列を含む発現カセットの前記1つ又は複数のコピーは、酵母細胞で機能する強力なプロモーター等の、ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼの強力な発現を可能にする調節配列を含む。
【０１２５】
本発明による組換え酵母のこれらの実施形態に加えて、又はその代替として、少なくとも1つのホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、酵母細胞にて機能する誘導性又は抑制性プロモーターの制御下にあり得る。
【０１２６】
特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼの過剰発現により、アセチルCoAの存在下において、中間代謝産物2,4-ジアミノ酪酸からアセチル-2,4-ジアミノ酪酸(acetyl-2,4-diaminobutyrate)へのレベル変換が可能になり、結果として増加すると考える。少なくとも1つのホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼコード配列が誘導性又は抑制性プロモーターの制御下にある場合にも同じことが当てはまる。
【０１２７】
いくつかの好ましい実施形態では、前記ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、本明細書の実施例に示される、サッカロマイセス・セレヴィシエ由来のMET2遺伝子である。
【０１２８】
好ましい実施形態では、前記ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、本明細書の実施例に示される、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)由来のMETX遺伝子である。
【０１２９】
特に好ましい実施形態では、本発明による組換え酵母は、サッカロマイセス・セレヴィシエ由来のMET2遺伝子である少なくとも1つのホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子と、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のMETX遺伝子である少なくとも1つのホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子とを含む。
【０１３０】
好ましい実施形態では、前記ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、複数のコピーが存在する場合、前記遺伝子の各コピーに対して独立して、強力なプロモーターpPDC1又は誘導性若しくは抑制性プロモーターpACU6の制御下に置かれる。
【０１３１】
実例として、ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子は、本明細書の実施例に示されるように、SAM3遺伝子内及び/又はHIS3遺伝子内に挿入され得る。
【０１３２】
ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の過剰発現及び/又は発現制御
本発明による組換え酵母の好ましい実施形態では、ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の過剰発現は、酵母ゲノムの選択された位置に、ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼコード配列を含む発現カセットの1つ又は複数のコピーを挿入することにより得られる。本発明に包含されているジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼ及びジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、本明細書の他の場所で詳述されている。
【０１３３】
これらの実施形態のいくつかでは、ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼコード配列を含む発現カセットの前記1つ又は複数のコピーは、酵母細胞で機能する強力なプロモーター等の、ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼの強力な発現を可能にする調節配列を含む。
【０１３４】
本発明による組換え酵母のこれらの実施形態に加えて、又はその代替として、少なくとも1つのジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、酵母細胞にて機能する誘導性又は抑制性プロモーターの制御下にあり得る。
【０１３５】
特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼの過剰発現により、アセチルCoAの存在下において、中間代謝産物2,4-ジアミノ酪酸からアセチル-2,4-ジアミノ酪酸へのレベル変換が可能になり、結果として増加すると考える。少なくとも1つのジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼコード配列が誘導性又は抑制性プロモーターの制御下にある場合にも同じことが当てはまる。
【０１３６】
好ましい実施形態では、前記ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、本明細書の実施例に示されるように、ハロモナス・エロンガタ(場合によりクロモハロバクター・サレキシゲンスとも呼ばれる)由来のEctA遺伝子である。
【０１３７】
好ましい実施形態では、前記ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、強力なプロモーターpPDC1の制御下に置かれる。
【０１３８】
実例として、ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼ遺伝子は、本明細書の実施例に示されるように、LYP1遺伝子内及び/又はMUP3遺伝子内に挿入され得る。
【０１３９】
特定の実施形態では、本発明による組換え酵母は、そのゲノムが、
-  過剰発現し、且つ/又は誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下にあり、好ましくは誘導性又は抑制性プロモーターの制御下にある、ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼMETXをコードする少なくとも1つの核酸と、
-  過剰発現し、且つ/又は誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下にあり、好ましくは誘導性又は抑制性プロモーターの制御下にあり、ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼEctAをコードする少なくとも1つの核酸と
を含むようなものである。
【０１４０】
エクトインシンターゼをコードする遺伝子の過剰発現及び/又は発現制御
本発明による組換え酵母の好ましい実施形態では、エクトインシンターゼをコードする遺伝子の過剰発現は、酵母ゲノムの選択された位置に、エクトインシンターゼコード配列を含む発現カセットの1つ又は複数のコピーを挿入することにより得られる。本発明に包含されているエクトインシンターゼ及びエクトインシンターゼをコードする遺伝子は、本明細書の他の場所で詳述されている。
【０１４１】
これらの実施形態のいくつかでは、エクトインシンターゼコード配列を含む発現カセットの前記1つ又は複数のコピーは、酵母細胞で機能する強力なプロモーター等の、エクトインシンターゼの強力な発現を可能にする調節配列を含む。
【０１４２】
本発明による組換え酵母のこれらの実施形態に加えて、又はその代替として、少なくとも1つのエクトインシンターゼをコードする遺伝子は、酵母細胞にて機能する誘導性又は抑制性プロモーターの制御下にあり得る。
【０１４３】
特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、エクトインシンターゼの過剰発現により、中間代謝産物アセチル-2,4-ジアミノ酪酸からエクトインへのレベル変換が可能になり、結果として増加すると考える。少なくとも1つのエクトインシンターゼコード配列が誘導性又は抑制性プロモーターの制御下にある場合にも同じことが当てはまる。
【０１４４】
好ましい実施形態では、前記エクトインシンターゼをコードする遺伝子は、本明細書の実施例に示される、ハロモナス・エロンガタ由来のEctC遺伝子である。
【０１４５】
好ましい実施形態では、前記エクトインシンターゼをコードする遺伝子は、強力なプロモーターpTDH3及び/又は強力なプロモーターpTEF1の制御下に置かれる。
【０１４６】
実例として、エクトインシンターゼ遺伝子は、本明細書の実施例に示されるように、LYP1遺伝子内及び/又はMUP3遺伝子内及び/又はURA3遺伝子内に挿入され得る。
【０１４７】
ホモセリンデヒドロゲナーゼの欠失又は過少発現
本発明による組換え酵母は、
(i)ホモセリンデヒドロゲナーゼHOM6をコードする少なくとも1つの、好ましくはすべての内在性核酸が、欠失し、且つ/若しくは中断されている、且つ/又は
(ii)ホモセリンデヒドロゲナーゼHOM6をコードする少なくとも1つの、好ましくはすべての核酸が独立して、
-  誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下にあり、
-  弱いプロモーターの制御下にあり、且つ/又は
-  不安定な形態である、
ゲノムを有すると更に規定される。
【０１４８】
特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、ホモセリンデヒドロゲナーゼ遺伝子の過少発現により、ホモセリンへの変換による、産生されたアスパルチルセミアルデヒドの消費を減らすことによって、組換え酵母による2,4-ジアミノ酪酸産生を増加させると考える。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、ホモセリンデヒドロゲナーゼの過少発現を、例えば、この遺伝子の発現を、誘導性又は抑制性プロモーター等の抑制性調節配列の制御下に置くことによる、条件付きにすることができる。
【０１５０】
遺伝子発現を抑制する方法、標的遺伝子を中断する方法、又は標的遺伝子を欠失させる方法は、当業者に周知である。
【０１５１】
ホモセリンデヒドロゲナーゼの過少発現は、不安定化ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする核酸の挿入も包含する。不安定化ホモセリンデヒドロゲナーゼは、ホモセリンデヒドロゲナーゼの変異体であり、親ホモセリンデヒドロゲナーゼよりも酵母細胞内でより急速に分解される。
【０１５２】
好ましい実施形態では、不安定化ホモセリンデヒドロゲナーゼは、デグロンタグ付加ホモセリンデヒドロゲナーゼタンパク質からなる。
【０１５３】
例えば、ホモセリンデヒドロゲナーゼ遺伝子はloxPによって、又は例えばURA3.Kl-loxPによって中断することができ、したがって欠失する(これは、不活性化とも呼ばれる)。
【０１５４】
或いは、出願された例に示されているように、目的の遺伝子を含むカセットによって中断することができる。
【０１５５】
アスパルトキナーゼ(HOM3)
アスパルトキナーゼ酵素は、ATPの存在下でL-アスパラギン酸(L-aspartate)から4-ホスホ-L-アスパラギン酸(4-phospho-L-aspartate)への変換を触媒するための、当技術分野に記載されているタンパク質である。サッカロマイセス・セレヴィシエのゲノムによってコードされたアスパルトキナーゼは、HOM3と呼んでもよい。
【０１５６】
アスパルトキナーゼの活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
【０１５７】
これに関して、当業者は、有利には、Stadtmanら、(1961、J Biol Chem、236巻(7) : 2033〜2038頁)によって記載された方法を参照することができる。
【０１５８】
本明細書において好ましいアスパルトキナーゼは、2.7.2.4のEC番号を有する酵素である。
【０１５９】
好ましい実施形態によれば、アスパルトキナーゼをコードする核酸は、好ましくは原核生物及び真核生物を含む群中から選択される生物に由来する核酸であり得る。いくつかの実施形態では、アスパルトキナーゼをコードする核酸は、古細菌に由来する核酸であり得る。いくつかの実施形態では、アスパルトキナーゼをコードする核酸は、好ましくは枯草菌及び酵母から選択される生物に由来する核酸であり得る。いくつかの他の好ましい実施形態では、アスパルトキナーゼをコードする核酸は、酵母、特にサッカロマイセス・セレヴィシエに由来する核酸であり得る。
【０１６０】
更に好ましい実施形態によれば、アスパルトキナーゼをコードする核酸は、配列番号1の核酸と、少なくとも25%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%の核酸同一性、及び同じ性質の生物活性を有する配列からなる群から選択される核酸であり得る。配列番号1の核酸は、サッカロマイセス・セレヴィシエに由来するアスパルトキナーゼをコードし、これはHOM3とも呼ばれ得る。
【０１６１】
この配列に関する同じ性質の生物活性は、ATPの存在下でL-アスパラギン酸から4-ホスホ-L-アスパラギン酸への変換を触媒する酵素をコードする能力である。
【０１６２】
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも25%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、少なくとも26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の前記参照核酸配列とのヌクレオチド同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有する核酸配列を包含する。
【０１６３】
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも65%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の前記参照核酸配列とのヌクレオチド同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有する核酸配列を包含する。
【０１６４】
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも80%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の前記参照核酸配列とのヌクレオチド同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有する核酸配列を包含する。
【０１６５】
サッカロマイセス・セレヴィシエ由来のアスパルトキナーゼのアミノ酸配列については、当業者はUniProtデータベースの受託番号NP010972、又は本明細書記載の配列番号2を参照してもよい。
【０１６６】
別の特定の実施形態によれば、アスパルトキナーゼをコードする核酸は、配列番号2のアミノ酸配列と、少なくとも25%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%のアミノ酸同一性、及び同じ性質の生物活性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸であり得る。実例として、アクアマリーナ・アトランティカ(Aquamarina atlantica)に由来するアスパルトキナーゼは、配列番号2のアスパルトキナーゼと25%のアミノ酸同一性を有する。
【０１６７】
この配列に関する同じ性質の生物活性は、前述の通り、すなわち、ATPの存在下でL-アスパラギン酸から4-ホスホ-L-アスパラギン酸への変換を触媒する酵素をコードする能力である。
【０１６８】
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも25%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、少なくとも26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の前記参照核酸配列とのアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を包含する。
【０１６９】
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列と少なくとも65%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の前記参照アミノ酸配列とのアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を包含する。
【０１７０】
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の前記参照アミノ酸配列とのアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を包含する。
【０１７１】
上述のように、本発明におけるアスパルトキナーゼの発現レベルは、少なくとも1つのプロモーター及び少なくとも1つのターミネーターによって調節され、例えば、本明細書において以下により詳細に規定され、これらは前記アスパルトキナーゼをコードする核酸配列の5'及び3'の位置それぞれに存在する。
【０１７２】
本明細書の他の場所で明記されているように、アスパルトキナーゼは、本発明による組換え酵母において過剰発現し、且つ/又は誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下にある。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、アスパルトキナーゼの過剰発現は、前記組換え酵母内の強力なプロモーターによる対応する遺伝子の制御から生じ得る。
【０１７４】
いくつかの他の実施形態では、アスパルトキナーゼの過剰発現は、前記組換え酵母のゲノム内のアスパルトキナーゼをコードする配列の複数のコピーの存在から生じ得る。
【０１７５】
なおさらなる実施形態では、アスパルトキナーゼの過剰発現は、(i)前記組換え酵母内の強力なプロモーターによる対応する遺伝子の制御、及び(ii)前記組換え酵母のゲノム内のアスパルトキナーゼをコードする配列の複数のコピーの存在の両方から生じ得る。
【０１７６】
アスパラギン酸キナーゼ(AK)
アスパラギン酸キナーゼ酵素は、ATPの存在下でL-アスパラギン酸から4-ホスホ-L-アスパラギン酸への変換を触媒するための、当技術分野に記載されているタンパク質である。枯草菌のゲノムによってコードされるアスパラギン酸キナーゼは、AKと呼んでもよい。
【０１７７】
アスパラギン酸キナーゼの活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属し、アスパルトキナーゼに関して以前に示されたものと同じである。
【０１７８】
好ましい実施形態によれば、アスパラギン酸キナーゼをコードする核酸は、好ましくは原核生物及び真核生物を含む群中から選択される生物に由来する核酸であり得る。いくつかの実施形態では、アスパラギン酸キナーゼをコードする核酸は、古細菌に由来する核酸であり得る。いくつかの実施形態では、アスパラギン酸キナーゼをコードする核酸は、好ましくは枯草菌及び酵母から選択される生物に由来する核酸であり得る。いくつかの他の好ましい実施形態では、アスパラギン酸キナーゼをコードする核酸は、酵母、特にサッカロマイセス・セレヴィシエに由来する核酸であり得る。
【０１７９】
核酸配列については、NCBIデータベースの受託番号NC_000964.3に開示されているものを参照してもよい。
【０１８０】
更に好ましい実施形態によれば、アスパラギン酸キナーゼをコードする核酸は、配列番号3の核酸と、少なくとも25%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%の核酸同一性、及び同じ性質の生物活性を有する配列からなる群から選択される核酸であり得る。配列番号3の核酸は、枯草菌に由来するアスパラギン酸キナーゼをコードし、これはAKとも呼ばれ得る。
【０１８１】
この配列に関する同じ性質の生物活性は、ATPの存在下でL-アスパラギン酸から4-ホスホ-L-アスパラギン酸への変換を触媒する酵素をコードする能力である。
【０１８２】
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも25%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、少なくとも26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の前記参照核酸配列とのヌクレオチド同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有する核酸配列を包含する。
【０１８３】
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも65%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の前記参照核酸配列とのヌクレオチド同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有する核酸配列を包含する。
【０１８４】
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも80%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の前記参照核酸配列とのヌクレオチド同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有する核酸配列を包含する。
【０１８５】
枯草菌由来のアスパラギン酸キナーゼのアミノ酸配列については、当業者はUniProtデータベースの受託番号NP_389558.2、又は本明細書記載の配列番号4を参照してもよい。
【０１８６】
別の特定の実施形態によれば、アスパラギン酸キナーゼをコードする核酸は、配列番号4のアミノ酸配列と、少なくとも25%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%のアミノ酸同一性、及び同じ性質の生物活性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸であり得る。実例として、アクアマリーナ・アトランティカに由来するアスパラギン酸キナーゼは、配列番号4のアスパルトキナーゼと25%のアミノ酸同一性を有する。
【０１８７】
この配列に関する同じ性質の生物活性は、前述の通り、すなわち、ATPの存在下でL-アスパラギン酸から4-ホスホ-L-アスパラギン酸への変換を触媒する酵素をコードする能力である。
【０１８８】
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも25%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、少なくとも26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の前記参照核酸配列とのアミノ酸同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有するアミノ酸配列を包含する。
【０１８９】
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列と少なくとも65%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の前記参照アミノ酸配列とのアミノ酸同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有するアミノ酸配列を包含する。
【０１９０】
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の前記参照アミノ酸配列とのアミノ酸同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有するアミノ酸配列を包含する。
【０１９１】
上述のように、本発明におけるアスパラギン酸キナーゼの発現レベルは、少なくとも1つのプロモーター及び少なくとも1つのターミネーターによって調節され、例えば、本明細書において以下により詳細に規定され、これらは前記アスパラギン酸キナーゼをコードする核酸配列の5'及び3'の位置それぞれに存在する。
【０１９２】
本明細書の他の場所で明記されているように、アスパラギン酸キナーゼは、本発明による組換え酵母において過剰発現し、且つ/又は誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下にある。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、アスパラギン酸キナーゼの過剰発現は、前記組換え酵母内の強力なプロモーターによる対応する遺伝子の制御から生じ得る。
【０１９４】
いくつかの他の実施形態では、アスパラギン酸キナーゼの過剰発現は、前記組換え酵母のゲノム内のアスパラギン酸キナーゼをコードする配列の複数のコピーの存在から生じ得る。
【０１９５】
なおさらなる実施形態では、アスパラギン酸キナーゼの過剰発現は、(i)前記組換え酵母内の強力なプロモーターによる対応する遺伝子の制御、及び(ii)前記組換え酵母のゲノム内のアスパラギン酸キナーゼをコードする配列の複数のコピーの存在の両方から生じ得る。
【０１９６】
アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(HOM2)
アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼは、L-アスパルチル-4-リン酸の還元的脱リン酸化によるL-アスパラギン酸セミアルデヒドのNADPH依存性形成を触媒する、当技術分野で知られているタンパク質である。サッカロマイセス・セレヴィシエのゲノムによってコードされたアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼは、HOM2と呼んでもよい。
【０１９７】
アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
【０１９８】
本明細書において好ましいアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼは、EC番号1.2.1.11を有する酵素である。
【０１９９】
好ましい実施形態によれば、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸は、好ましくは原核生物及び真核生物を含む群中から選択される生物に由来する核酸であり得る。いくつかの実施形態では、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸は、古細菌に由来する核酸であり得る。いくつかの好ましい実施形態では、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸は、酵母、特にサッカロマイセス・セレヴィシエに由来する核酸であり得る。
【０２００】
他の好ましい実施形態によれば、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸は、サッカロマイセス・セレヴィシエ由来のアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの変異体又は変異型であり得、ここで、前記変異体酵素又は前記変異型酵素は、反応を触媒するためにNADH又はNADPHの両方を使用する。そのような変異体酵素又は変異型酵素は当技術分野において既知であり、本明細書において前述している。
【０２０１】
更に好ましい実施形態によれば、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸は、配列番号5及び配列番号6の参照核酸配列からなる群中から選択される核酸と、少なくとも27%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%の核酸同一性、及び同じ性質の生物活性を有する配列からなる群から選択される核酸であり得る。配列番号5及び配列番号6の核酸は、サッカロマイセス・セレヴィシエに由来するアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードし、これは本明細書において総称してHOM2とも呼ばれ得る。
【０２０２】
この配列に関する同じ性質の生物活性は、L-アスパルチル-4-リン酸の還元的脱リン酸化によるL-アスパラギン酸セミアルデヒドのNADPH依存性形成を触媒する酵素をコードする能力である。
【０２０３】
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも27%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、少なくとも28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の前記参照核酸配列とのヌクレオチド同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有する核酸配列を包含する。
【０２０４】
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも65%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の前記参照核酸配列とのヌクレオチド同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有する核酸配列を包含する。
【０２０５】
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも80%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の前記参照核酸配列とのヌクレオチド同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有する核酸配列を包含する。
【０２０６】
サッカロマイセス・セレヴィシエ由来のアスパラギン酸-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列については、当業者はUniProtデータベースの受託番号NP010442、又は本明細書記載の配列番号7を参照してもよい。
【０２０７】
別の特定の実施形態によれば、アスパラギン酸-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸は、配列番号7のアミノ酸配列と、少なくとも27%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%のアミノ酸同一性、及び同じ性質の生物活性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸であり得る。実例として、ラクトバチルス・ワサッチェンシス(Lactobacillus wasatchensis)に由来するアスパラギン酸-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼは、配列番号7のアスパラギン酸-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼと27%のアミノ酸同一性を有する。
【０２０８】
この配列に関する同じ性質の生物活性は、前述の通り、すなわち、L-アスパルチル-4-リン酸の還元的脱リン酸化によるL-アスパラギン酸セミアルデヒドのNADPH依存性形成を触媒する能力である。
【０２０９】
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも27%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、少なくとも28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の前記参照核酸配列とのアミノ酸同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有するアミノ酸配列を包含する。
【０２１０】
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列と少なくとも65%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の前記参照アミノ酸配列とのアミノ酸同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有するアミノ酸配列を包含する。
【０２１１】
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の前記参照アミノ酸配列とのアミノ酸同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有するアミノ酸配列を包含する。
【０２１２】
上述のように、本発明におけるアスパラギン酸-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現レベルは、少なくとも1つのプロモーター及び少なくとも1つのターミネーターによって調節され、例えば、本明細書において以下により詳細に規定され、これらは前記アスパラギン酸-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列の5'及び3'の位置それぞれに存在する。
【０２１３】
本明細書の他の場所で明記されているように、アスパラギン酸-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼは、本発明による組換え酵母において過剰発現し、且つ/又は誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下にある。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、アスパラギン酸-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの過剰発現は、前記組換え酵母内の強力なプロモーターによる対応する遺伝子の制御から生じ得る。
【０２１５】
いくつかの他の実施形態では、アスパラギン酸-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの過剰発現は、前記組換え酵母のゲノム内のアスパラギン酸-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする配列の複数のコピーの存在から生じ得る。
【０２１６】
なおさらなる実施形態では、アスパラギン酸-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの過剰発現は、(i)前記組換え酵母内の強力なプロモーターによる対応する遺伝子の制御、及び(ii)前記組換え酵母のゲノム内のアスパラギン酸-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする配列の複数のコピーの存在の両方から生じ得る。
【０２１７】
ジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ(EctB)
ジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ酵素は、グルタミン酸(glutamate)の存在下でアスパルチルセミアルデヒドから2,4-ジアミノ酪酸への変換を触媒するための、当技術分野に記載されているタンパク質である。ハロモナス・エロンガタのゲノムによってコードされたジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼは、EctB又はEctB.Heと呼んでもよい。
【０２１８】
ジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼの活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
【０２１９】
これに関して、当業者は、有利には、Ono Hら、1999年、Journal of Bacteriology、p91〜99によって記載された方法を参照することができる。
【０２２０】
本明細書において好ましいジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼは、2.6.1.76のEC番号を有する酵素である。
【０２２１】
好ましい実施形態によれば、ジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼをコードする核酸は、好ましくは原核生物及び真核生物を含む群中から選択される生物に由来する核酸であり得る。いくつかの実施形態では、ジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼをコードする核酸は、古細菌に由来する核酸であり得る。いくつかの実施形態では、ジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼをコードする核酸は、好ましくは細菌、特に緑膿菌、ハロモナス・エロンガタ、又はスポロサルシナ・ニューヨーケンシス(Sporocarcina newyorkensisn)から選択される生物、及び好ましくは緑膿菌又はハロモナス・エロンガタから選択される生物に由来する核酸であり得る。
【０２２２】
更に好ましい実施形態によれば、ジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼをコードする核酸は、配列番号8又は配列番号9の核酸と、少なくとも35%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%の核酸同一性、及び同じ性質の生物活性を有する配列からなる群から選択される核酸であり得る。
【０２２３】
この配列に関する同じ性質の生物活性は、グルタミン酸の存在下でアスパルチルセミアルデヒドから2,4-ジアミノ酪酸への変換を触媒する酵素をコードする能力である。
【０２２４】
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも35%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、少なくとも36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の前記参照核酸配列とのヌクレオチド同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有する核酸配列を包含する。
【０２２５】
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも65%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の前記参照核酸配列とのヌクレオチド同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有する核酸配列を包含する。
【０２２６】
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも80%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の前記参照核酸配列とのヌクレオチド同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有する核酸配列を包含する。
【０２２７】
ハロモナス・エロンガタ由来のジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列については、当業者はUniProtデータベースの受託番号WP_013332345.1、又は本明細書記載の配列番号10若しくは配列番号11を参照してもよい。
【０２２８】
別の特定の実施形態によれば、ジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼをコードする核酸は、配列番号10又は配列番号11のアミノ酸配列と、少なくとも35%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%のアミノ酸同一性、及び同じ性質の生物活性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸であり得る。
【０２２９】
この配列に関する同じ性質の生物活性は、前述の通り、すなわち、グルタミン酸の存在下でアスパルチルセミアルデヒドから2,4-ジアミノ酪酸への変換を触媒する能力である。
【０２３０】
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも35%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、少なくとも36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の前記参照核酸配列とのアミノ酸同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有するアミノ酸配列を包含する。
【０２３１】
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列と少なくとも65%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の前記参照アミノ酸配列とのアミノ酸同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有するアミノ酸配列を包含する。
【０２３２】
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の前記参照アミノ酸配列とのアミノ酸同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有するアミノ酸配列を包含する。
【０２３３】
上述のように、本発明におけるジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼの発現レベルは、少なくとも1つのプロモーター及び少なくとも1つのターミネーターによって調節され、例えば、本明細書において以下により詳細に規定され、これらは前記ジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼをコードする核酸配列の5'及び3'の位置それぞれに存在する。
【０２３４】
本明細書の他の場所で明記されているように、ジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼは、本発明による組換え酵母において過剰発現し、且つ/又は誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下にある。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、ジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼの過剰発現は、前記組換え酵母内の強力なプロモーターによる対応する遺伝子の制御から生じ得る。
【０２３６】
いくつかの他の実施形態では、ジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼの過剰発現は、前記組換え酵母のゲノム内のジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼをコードする配列の複数のコピーの存在から生じ得る。
【０２３７】
なおさらなる実施形態では、ジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼの過剰発現は、(i)前記組換え酵母内の強力なプロモーターによる対応する遺伝子の制御、及び(ii)前記組換え酵母のゲノム内のジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼをコードする配列の複数のコピーの存在の両方から生じ得る。
【０２３８】
ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼ(MET2;METX)
ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼ酵素は、アセチル-CoAと2,4-ジアミノ酪酸間の、CoAとアセチル-2,4-ジアミノ酪酸への反応を触媒するための、当技術分野に記載されているタンパク質である。サッカロマイセス・セレヴィシエのゲノムによってコードされたホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼはMET2と呼んでもよい。
【０２３９】
ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼの活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
【０２４０】
これに関して、当業者は、有利には、 Shuzo Yamagata (1987年、The Journal of Bacteriology、169巻(8) : 3458〜3463頁)によって記載された方法を参照することができる。
【０２４１】
本明細書において好ましいホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼは、2.3.1.31のEC番号を有する酵素である。
【０２４２】
好ましい実施形態によれば、ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸は、好ましくは原核生物及び真核生物を含む群中から選択される生物に由来する核酸であり得る。いくつかの実施形態では、ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸は、古細菌に由来する核酸であり得る。いくつかの実施形態では、ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸は、好ましくはコリネバクテリウム・グルタミカム及び酵母から選択される生物に由来する核酸であり得る。いくつかの他の好ましい実施形態では、ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸は、酵母、特にサッカロマイセス・セレヴィシエに由来する核酸であり得る。
【０２４３】
特定の実施形態によれば、ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼMETXをコードする核酸は、細菌、特にコリネバクテリウム・グルタミカム、大腸菌(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilius influenza)、ストレプトマイセス・ラベンデュラ(Streptomyces lavendulae)、レプトスピラ・インターロガン(Leptospira interrogans)、肺炎レンサ球菌(Streptococcus pneumonia)、及びヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)からなる群から独立して選択される細菌由来の核酸である。
【０２４４】
更に好ましい実施形態によれば、ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸は、配列番号12の核酸と、少なくとも27%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%の核酸同一性、及び同じ性質の生物活性を有する配列からなる群から選択される核酸であり得る。配列番号12の核酸は、サッカロマイセス・セレヴィシエに由来するホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼをコードし、これはMET2とも呼ばれ得る。コリネバクテリウム・グルタミカム由来のホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼは、通常METXと呼ばれる。
【０２４５】
この配列に関する同じ性質の生物活性は、アセチル-CoAと2,4-ジアミノ酪酸間の、CoAとアセチル-2,4-ジアミノ酪酸への反応を触媒する酵素をコードする能力である。
【０２４６】
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも27%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、少なくとも28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の前記参照核酸配列とのヌクレオチド同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有する核酸配列を包含する。
【０２４７】
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも65%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の前記参照核酸配列とのヌクレオチド同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有する核酸配列を包含する。
【０２４８】
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも80%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の前記参照核酸配列とのヌクレオチド同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有する核酸配列を包含する。
【０２４９】
サッカロマイセス・セレヴィシエ由来のホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列については、当業者はUniProtデータベースの受託番号NP014122、又は本明細書記載の配列番号13を参照してもよい。
【０２５０】
別の特定の実施形態によれば、ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸は、配列番号13のアミノ酸配列と、少なくとも27%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%のアミノ酸同一性、及び同じ性質の生物活性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸であり得る。実例として、アクアマリーナ・アトランティカに由来するホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼは、配列番号13のホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼと27%のアミノ酸同一性を有する。
【０２５１】
この配列に関する同じ性質の生物活性は、前述の通り、すなわち、アセチル-CoAと2,4-ジアミノ酪酸間の、CoAとアセチル-2,4-ジアミノ酪酸への反応を触媒する能力である。
【０２５２】
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも27%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、少なくとも28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の前記参照核酸配列とのアミノ酸同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有するアミノ酸配列を包含する。
【０２５３】
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列と少なくとも65%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の前記参照アミノ酸配列とのアミノ酸同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有するアミノ酸配列を包含する。
【０２５４】
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の前記参照アミノ酸配列とのアミノ酸同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有するアミノ酸配列を包含する。
【０２５５】
上述のように、本発明におけるホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼの発現レベルは、少なくとも1つのプロモーター及び少なくとも1つのターミネーターによって調節され、例えば、本明細書において以下により詳細に規定され、これらは前記ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列の5'及び3'の位置それぞれに存在する。
【０２５６】
本明細書の他の場所で明記されているように、本発明のいくつかの実施形態では、ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼは、本発明による組換え酵母において過剰発現し、且つ/又は誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下にある。
【０２５７】
いくつかの実施形態では、ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼの過剰発現は、前記組換え酵母内の強力なプロモーターによる対応する遺伝子の制御から生じ得る。
【０２５８】
いくつかの他の実施形態では、ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼの過剰発現は、前記組換え酵母のゲノム内のホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼをコードする配列の複数のコピーの存在から生じ得る。
【０２５９】
なおさらなる実施形態では、ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼの過剰発現は、(i)前記組換え酵母内の強力なプロモーターによる対応する遺伝子の制御、及び(ii)前記組換え酵母のゲノム内のホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼをコードする配列の複数のコピーの存在の両方から生じ得る。
【０２６０】
ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼ(EctA)
ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼ酵素は、アセチル-CoAの存在下で2,4-ジアミノ酪酸からアセチル-2,4-ジアミノ酪酸への変換を触媒するための、当技術分野に記載されているタンパク質である。ハロモナス・エロンガタのゲノムによってコードされたジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼは、EctA又はEctA.Heと呼んでもよい。
【０２６１】
ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼの活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
【０２６２】
これに関して、当業者は、有利には、Ono Hら、1999、Journal of Bacteriology、p91-99によって記載された方法を参照することができる。
【０２６３】
本明細書において好ましいジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼは、2.3.1.178のEC番号を有する酵素である。
【０２６４】
好ましい実施形態によれば、ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸は、好ましくは原核生物及び真核生物を含む群中から選択される生物に由来する核酸であり得る。いくつかの実施形態では、ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸は、古細菌に由来する核酸であり得る。いくつかの実施形態では、ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸は、好ましくは細菌、特にクロモハロバクター・サレキシゲンス、緑膿菌、タウエラ・エスピー28(Thaurea sp.28)、又はハロモナス・エロンガタから選択される生物に由来する核酸であり得る。
【０２６５】
更に好ましい実施形態によれば、ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸は、配列番号14の核酸と、少なくとも30%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%の核酸同一性、及び同じ性質の生物活性を有する配列からなる群から選択される核酸であり得る。
【０２６６】
この配列に関する同じ性質の生物活性は、アセチル-CoAの存在下で2,4-ジアミノ酪酸からアセチル-2,4-ジアミノ酪酸への変換を触媒する酵素をコードする能力である。
【０２６７】
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも30%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、少なくとも31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の前記参照核酸配列とのヌクレオチド同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有する核酸配列を包含する。
【０２６８】
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも65%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の前記参照核酸配列とのヌクレオチド同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有する核酸配列を包含する。
【０２６９】
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも80%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の前記参照核酸配列とのヌクレオチド同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有する核酸配列を包含する。
【０２７０】
ハロモナス・エロンガタ由来のジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列については、当業者はUniProtデータベースの受託番号WP_035409657.1、又は本明細書記載の配列番号15を参照してもよい。
【０２７１】
別の特定の実施形態によれば、ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸は、配列番号15のアミノ酸配列と、少なくとも30%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%のアミノ酸同一性、及び同じ性質の生物活性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸であり得る。
【０２７２】
この配列に関する同じ性質の生物活性は、前述の通り、すなわち、アセチル-CoAの存在下で2,4-ジアミノ酪酸からアセチル-2,4-ジアミノ酪酸への変換を触媒する能力である。
【０２７３】
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも30%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、少なくとも31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の前記参照核酸配列とのアミノ酸同一性、並びに同じ性質の生物活性を有するアミノ酸配列を包含する。
【０２７４】
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列と少なくとも65%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の前記参照アミノ酸配列とのアミノ酸同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有するアミノ酸配列を包含する。
【０２７５】
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の前記参照アミノ酸配列とのアミノ酸同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有するアミノ酸配列を包含する。
【０２７６】
上述のように、本発明におけるジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼの発現レベルは、少なくとも1つのプロモーター及び少なくとも1つのターミネーターによって調節され、例えば、本明細書において以下により詳細に規定され、これらは前記ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列の5'及び3'の位置それぞれに存在する。
【０２７７】
本明細書の他の場所で明記されているように、ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼは、本発明による組換え酵母において過剰発現し、且つ/又は誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下にある。
【０２７８】
いくつかの実施形態では、ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼの過剰発現は、前記組換え酵母内の強力なプロモーターによる対応する遺伝子の制御から生じ得る。
【０２７９】
いくつかの他の実施形態では、ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼの過剰発現は、前記組換え酵母のゲノム内のジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼをコードする配列の複数のコピーの存在から生じ得る。
【０２８０】
なおさらなる実施形態では、ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼの過剰発現は、(i)前記組換え酵母内の強力なプロモーターによる対応する遺伝子の制御、及び(ii)前記組換え酵母のゲノム内のジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼをコードする配列の複数のコピーの存在の両方から生じ得る。
【０２８１】
エクトインシンターゼ(EctC)
エクトインシンターゼ酵素は、アセチル-2,4-ジアミノ酪酸からエクトインへの変換を触媒するための、当技術分野に記載されているタンパク質である。ハロモナス・エロンガタのゲノムによってコードされたエクトインシンターゼは、EctC又はEctC.Heと呼んでもよい。
【０２８２】
エクトインシンターゼの活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
【０２８３】
これに関して、当業者は、有利には、Ono Hら、1999年、Journal of Bacteriology、p91〜99によって記載された方法を参照することができる。
【０２８４】
本明細書において好ましいエクトインシンターゼは、4.2.1.108のEC番号を有する酵素である。
【０２８５】
好ましい実施形態によれば、エクトインシンターゼをコードする核酸は、好ましくは原核生物及び真核生物を含む群中から選択される生物に由来する核酸であり得る。いくつかの実施形態では、エクトインシンターゼをコードする核酸は、古細菌に由来する核酸であり得る。いくつかの実施形態では、エクトインシンターゼをコードする核酸は、好ましくは細菌、特に緑膿菌、ハロモナス・エロンガタ、又はミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)から選択される生物に由来する核酸であり得る。
【０２８６】
更に好ましい実施形態によれば、エクトインシンターゼをコードする核酸は、配列番号16の核酸と、少なくとも35%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%の核酸同一性、及び同じ性質の生物活性を有する配列からなる群から選択される核酸であり得る。
【０２８７】
この配列に関する同じ性質の生物活性は、アセチル-2,4-ジアミノ酪酸からエクトインへの変換を触媒する酵素をコードする能力である。
【０２８８】
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも35%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、少なくとも36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の前記参照核酸配列とのヌクレオチド同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有する核酸配列を包含する。
【０２８９】
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも65%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の前記参照核酸配列とのヌクレオチド同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有する核酸配列を包含する。
【０２９０】
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも80%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の前記参照核酸配列とのヌクレオチド同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有する核酸配列を包含する。
【０２９１】
ハロモナス・エロンガタ由来のエクトインシンターゼのアミノ酸配列については、当業者はUniProtデータベースの受託番号WP_013332346、又は本明細書記載の配列番号17を参照してもよい。
【０２９２】
別の特定の実施形態によれば、エクトインシンターゼをコードする核酸は、配列番号17のアミノ酸配列と、少なくとも35%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%のアミノ酸同一性、及び同じ性質の生物活性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸であり得る。
【０２９３】
この配列に関する同じ性質の生物活性は、前述の通り、すなわち、アセチル-2,4-ジアミノ酪酸からエクトインへの変換を触媒する能力である。
【０２９４】
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも35%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、少なくとも36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の前記参照核酸配列とのアミノ酸同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有するアミノ酸配列を包含する。
【０２９５】
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列と少なくとも65%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の前記参照アミノ酸配列とのアミノ酸同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有するアミノ酸配列を包含する。
【０２９６】
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の前記参照アミノ酸配列とのアミノ酸同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有するアミノ酸配列を包含する。
【０２９７】
上述のように、本発明におけるエクトインシンターゼの発現レベルは、少なくとも1つのプロモーター及び少なくとも1つのターミネーターによって調節され、例えば、本明細書において以下により詳細に規定され、これらは前記エクトインシンターゼをコードする核酸配列の5'及び3'の位置それぞれに存在する。
【０２９８】
本明細書の他の場所で明記されているように、エクトインシンターゼは、本発明による組換え酵母において過剰発現し、且つ/又は誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下にある。
【０２９９】
いくつかの実施形態では、エクトインシンターゼの過剰発現は、前記組換え酵母内の強力なプロモーターによる対応する遺伝子の制御から生じ得る。
【０３００】
いくつかの他の実施形態では、エクトインシンターゼの過剰発現は、前記組換え酵母のゲノム内のエクトインシンターゼをコードする配列の複数のコピーの存在から生じ得る。
【０３０１】
なおさらなる実施形態では、エクトインシンターゼの過剰発現は、(i)前記組換え酵母内の強力なプロモーターによる対応する遺伝子の制御、及び(ii)前記組換え酵母のゲノム内のエクトインシンターゼをコードする配列の複数のコピーの存在の両方から生じ得る。
【０３０２】
ホモセリンデヒドロゲナーゼ(HOM6)
ホモセリンデヒドロゲナーゼ酵素は、NAD又はNADPの存在下で、L-ホモセリンからL-アスパラギン酸4-セミアルデヒドへの変換を触媒するための、当技術分野に記載されているタンパク質である。サッカロマイセス・セレヴィシエのゲノムによってコードされたホモセリンデヒドロゲナーゼは、HOM6と呼んでもよい。
【０３０３】
ホモセリンデヒドロゲナーゼの活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
【０３０４】
これに関して、当業者は、有利には、Calnyantoら、(2006年、Microbiology、152巻: 105〜112頁)によって記載された方法を参照することができる。
【０３０５】
本明細書において好ましいホモセリンデヒドロゲナーゼは、1.1.1.3のEC番号を有する酵素である。
【０３０６】
好ましい実施形態によれば、ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする核酸は、好ましくは原核生物及び真核生物を含む群中から選択される生物に由来する核酸であり得る。いくつかの好ましい実施形態では、ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする核酸は、酵母、特にサッカロマイセス・セレヴィシエに由来する核酸であり得る。
【０３０７】
特定の実施形態によれば、ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする核酸は、配列番号18の核酸であり得る。配列番号18の核酸は、サッカロマイセス由来のホモセリンデヒドロゲナーゼをコードし、これはHOM6とも呼ばれ得る。
【０３０８】
サッカロマイセス・セレヴィシエ由来のホモセリンデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列については、当業者はUniProtデータベースの受託番号AJR75529若しくはNP012673、又は本明細書記載の配列番号19を参照してもよい。
【０３０９】
上述のように、本発明におけるホモセリンデヒドロゲナーゼの発現レベルは、少なくとも1つのプロモーター及び少なくとも1つのターミネーターによって調節され、例えば、本明細書において以下により詳細に規定され、これらは前記ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列の5'及び3'の位置それぞれに存在する。
【０３１０】
本明細書の他の場所で明記されているように、本発明のいくつかの実施形態では、ホモセリンデヒドロゲナーゼは、(a)完全に若しくは部分的に欠失し、又は中断されている、或いは(b)誘導性又は抑制性プロモーターの制御下にある;弱いプロモーターの制御下にある;及び/又は本発明による組換え酵母における不安定化形態である。
【０３１１】
エクトイン産生組換え酵母の特定の実施形態
アスパラギン酸トランスアミナーゼの過剰発現及び/又は発現制御
本発明による組換え酵母の好ましい実施形態では、アスパラギン酸トランスアミナーゼをコードする少なくとも1つの核酸が過剰発現し、且つ/又は誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下にある。
【０３１２】
アスパラギン酸トランスアミナーゼ酵素(アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼとしても知られる)は、オキサロ酢酸及びL-グルタミン酸(L-glutamate)を産生するためのL-アスパラギン酸と2-オキソグルタル酸との反応を触媒するための、当技術分野に記載されているタンパク質である。サッカロマイセス・セレヴィシエのゲノムによってコードされたアスパラギン酸トランスアミナーゼ酵素は、AAT2と呼んでもよい。
【０３１３】
これらの実施形態によれば、アスパラギン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子の過剰発現は、酵母ゲノムの選択された位置に、アスパラギン酸トランスアミナーゼコード配列を含む発現カセットの1つ又は複数のコピーを挿入することにより得られる。本発明に包含されているアスパラギン酸トランスアミナーゼ及びアスパラギン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子は、本明細書の他の場所で詳述されている。
【０３１４】
これらの実施形態のいくつかでは、アスパラギン酸トランスアミナーゼコード配列を含む発現カセットの前記1つ又は複数のコピーは、酵母細胞で機能する強力なプロモーター等の、アスパラギン酸トランスアミナーゼの強力な発現を可能にする調節配列を含む。
【０３１５】
本発明による組換え酵母のこれらの実施形態に加えて、又はその代替として、少なくとも1つのアスパラギン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子は、酵母細胞にて機能する誘導性又は抑制性プロモーターの制御下にあり得る。
【０３１６】
特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、アスパラギン酸トランスアミナーゼの過剰発現により、オキサロ酢酸からアスパラギン酸への高レベルの変換が誘導され得ると考える。少なくとも1つのアスパラギン酸トランスアミナーゼコード配列が誘導性又は抑制性プロモーターの制御下にある場合にも、同じことが当てはまる。
【０３１７】
アスパラギン酸トランスアミナーゼの活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
【０３１８】
これに関して、当業者は、有利には、Yagiら、(1982年、Biochem、92巻: 35〜43頁)によって記載された方法を参照することができる。
【０３１９】
いくつかの実施形態では、前記アスパラギン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子は、本明細書の実施例に示される、サッカロマイセス・セレヴィシエ由来のAAT2遺伝子である。
【０３２０】
好ましい実施形態では、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼは、シロイヌナズナ(A.Thaliana)AAT2遺伝子によってコードされる。
【０３２１】
好ましい実施形態では、前記アスパラギン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子は、誘導性又は抑制性プロモーターpACU1又は強力なプロモーターpADH1又は強力なプロモーターpPGK1の制御下に置かれる。
【０３２２】
実例として、AAT2遺伝子は、本明細書の実施例に示されるように、CAN1遺伝子内及び/又はGNP1遺伝子内及び/又はMUP3遺伝子内に挿入され得る。
【０３２３】
本明細書において好ましいアスパラギン酸トランスアミナーゼは、EC番号2.6.1.1により知られている。
【０３２４】
アスパラギン酸トランスアミナーゼをコードする核酸は、好ましくは原核生物及び真核生物を含む群中から選択される生物に由来する核酸であり得る。いくつかの実施形態では、アスパラギン酸トランスアミナーゼをコードする核酸は、古細菌に由来する核酸であり得る。いくつかの好ましい実施形態では、アスパラギン酸トランスアミナーゼをコードする核酸は、酵母生物、最も好ましくはサッカロマイセス・セレヴィシエに由来する核酸であり得る。
【０３２５】
更に好ましい実施形態によれば、アスパラギン酸トランスアミナーゼ又はAAT2をコードする核酸は、配列番号20の核酸配列と、少なくとも39%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%の核酸同一性、及び同じ性質の生物活性を有する配列からなる群から選択される核酸であり得る。
【０３２６】
この配列に関する同じ性質の生物活性は、オキサロ酢酸及びL-グルタミン酸を産生するためのL-アスパラギン酸と2-オキソグルタル酸との反応を触媒する酵素をコードする能力である。
【０３２７】
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも39%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、少なくとも40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の配列番号20の核酸配列とのヌクレオチド同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有する核酸配列を包含する。
【０３２８】
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも65%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の配列番号20の核酸配列とのヌクレオチド同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有する核酸配列を包含する。
【０３２９】
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも80%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の配列番号20の核酸配列とのヌクレオチド同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有する核酸配列を包含する。
【０３３０】
サッカロマイセス・セレヴィシエ由来のアスパラギン酸トランスアミナーゼAAT2のアミノ酸配列については、当業者はUniProtデータベースの受託番号NP013127、又は本明細書記載の配列番号21を参照してもよい。実例として、大腸菌に由来するアスパラギン酸トランスアミナーゼは、配列番号21のアスパラギン酸トランスアミナーゼAAT2と39%のアミノ酸同一性を有する。
【０３３１】
別の特定の実施形態によれば、アスパラギン酸トランスアミナーゼをコードする核酸は、配列番号21のアミノ酸配列と、少なくとも39%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%のアミノ酸同一性、及び同じ性質の生物活性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸であり得る。
【０３３２】
この配列に関する同じ性質の生物活性は、前述の通り、すなわち、オキサロ酢酸及びL-グルタミン酸を産生するためのL-アスパラギン酸と2-オキソグルタル酸との反応を触媒する能力である。
【０３３３】
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも39%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、少なくとも40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の配列番号21のアミノ酸配列とのアミノ酸同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有するアミノ酸配列を包含する。
【０３３４】
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列と少なくとも65%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の配列番号21のアミノ酸配列とのアミノ酸同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有するアミノ酸配列を包含する。
【０３３５】
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の配列番号21のアミノ酸配列とのアミノ酸同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有するアミノ酸配列を包含する。
【０３３６】
上述のように、本発明におけるアスパラギン酸トランスアミナーゼの発現レベルは、少なくとも1つのプロモーター及び少なくとも1つのターミネーターによって調節され、例えば、本明細書において以下により詳細に規定され、これらは前記アスパラギン酸トランスアミナーゼをコードする核酸配列の5'及び3'の位置それぞれに存在する。
【０３３７】
本明細書の他の場所で明記されているように、アスパラギン酸トランスアミナーゼは、本発明による組換え酵母において過剰発現している。
【０３３８】
いくつかの実施形態では、アスパラギン酸トランスアミナーゼの過剰発現は、前記組換え酵母内の強力なプロモーターによる対応する遺伝子の制御から生じ得る。
【０３３９】
いくつかの他の実施形態では、アスパラギン酸トランスアミナーゼの過剰発現は、前記組換え酵母のゲノム内のアスパラギン酸トランスアミナーゼをコードする配列の複数のコピーの存在から生じ得る。
【０３４０】
なおさらなる実施形態では、アスパラギン酸トランスアミナーゼの過剰発現は、(i)前記組換え酵母内の強力なプロモーターによる対応する遺伝子の制御、及び(ii)前記組換え酵母のゲノム内のアスパラギン酸トランスアミナーゼをコードする配列の複数のコピーの存在の両方から生じ得る。
【０３４１】
グルタミン酸デヒドロゲナーゼの過剰発現及び/又は発現制御
本発明による組換え酵母の好ましい実施形態では、オキソグルタル酸を、グルタミン酸をコードする遺伝子に変換するグルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも1つの核酸が過剰発現し、且つ/又は誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下にある。
【０３４２】
したがって、特定の実施形態では、本発明の組換え酵母のゲノムは、オキソグルタル酸をグルタミン酸に変換するグルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも1つの核酸が過剰発現し、且つ/又は誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下にあるようなものである。
【０３４３】
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ酵素(NAD特異的グルタミン酸デヒドロゲナーゼとしても知られている)は、L-グルタミン酸を産生するための2-オキソグルタル酸の変換を触媒するための、当技術分野に記載されているタンパク質である。したがって、グルタミン酸デヒドロゲナーゼは、NADHの存在下で、2-オキソグルタル酸からL-グルタミン酸への変換を伴う化学反応に特異的に関与する酵素である。
【０３４４】
これらの実施形態によれば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ酵素をコードする遺伝子の過剰発現は、酵母ゲノムの選択された位置に、グルタミン酸デヒドロゲナーゼコード配列を含む発現カセットの1つ又は複数のコピーを挿入することにより得られる。本発明に包含されているグルタミン酸デヒドロゲナーゼ及びグルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、本明細書の他の場所で詳述されている。
【０３４５】
これらの実施形態のいくつかでは、グルタミン酸デヒドロゲナーゼコード配列を含む発現カセットの前記1つ又は複数のコピーは、酵母細胞で機能する強力なプロモーター等の、グルタミン酸デヒドロゲナーゼの強力な発現を可能にする調節配列を含む。
【０３４６】
本発明による組換え酵母のこれらの実施形態に加えて、又はその代替として、少なくとも1つのグルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、酵母細胞にて機能する誘導性又は抑制性プロモーターの制御下にあり得る。
【０３４７】
特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、グルタミン酸デヒドロゲナーゼの過剰発現により、オキソグルタル酸がグルタミン酸へ変換され、同時にNADが産生されると考える。少なくとも1つのグルタミン酸デヒドロゲナーゼコード配列が誘導性又は抑制性プロモーターの制御下にある場合にも同じことが当てはまる。
【０３４８】
グルタミン酸デヒドロゲナーゼの活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
【０３４９】
これに関して、当業者は、有利には、Noor及びPunekar(2005年、Microbiology、151巻: 1409〜1419頁)に記載された方法を参照することができる。
【０３５０】
好ましい実施形態では、前記グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、NADPHの代わりにNADHを使用するグルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードし、より詳細には、本明細書の例に示すように、エントジニウム・カウダツム(Entodinium caudatum)(GDH.Eca又はGDH2.Ecaとして表される)又はサッカロマイセス・セレヴィシエ(GDH2として表される)由来のGDH遺伝子である。特定の実施形態では、前記グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、エントジニウム・カウダツム由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする。
【０３５１】
本明細書における好ましいグルタミン酸デヒドロゲナーゼは、特に、EC番号1.4.1.2を有する酵素であり得る。
【０３５２】
好ましい実施形態では、前記グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、強力なプロモーターpTDH3又は誘導性若しくは抑制性プロモーターpCUP1-1の制御下に置かれる。
【０３５３】
実例として、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、本明細書の実施例に示されるように、HIS3遺伝子内及び/又はMUP3遺伝子内に挿入され得る。
【０３５４】
好ましい実施形態によれば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸は、好ましくは原核生物及び真核生物を含む群中から選択される生物に由来する核酸であり得る。いくつかの実施形態では、グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸は、古細菌に由来する核酸であり得る。いくつかの実施形態では、グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸は、好ましくはエントジニウム・カウダツム、枯草菌、クロストリジウム・シンビオサム(Clostridium symbiosium)から選択される生物に由来する核酸であり得る。
【０３５５】
更に好ましい実施形態によれば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸は、配列番号22の核酸配列と、少なくとも49%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%の核酸同一性、及び同じ性質の生物活性を有する配列からなる群から選択される核酸であり得る。配列番号22の核酸は、エントジニウム・カウダツムに由来するグルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードし、前記核酸配列は、酵母、特にサッカロマイセス・セレヴィシエにおける発現のためにコドン最適化されている。
【０３５６】
この配列に関する同じ性質の生物活性は、L-グルタミン酸を産生するための2-オキソグルタル酸の変換を触媒する酵素をコードする能力である。
【０３５７】
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも49%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、少なくとも50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の配列番号22の核酸配列とのヌクレオチド同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有する核酸配列を包含する。
【０３５８】
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも65%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の配列番号22の核酸配列とのヌクレオチド同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有する核酸配列を包含する。
【０３５９】
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも80%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の配列番号22の核酸配列とのヌクレオチド同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有する核酸配列を包含する。
【０３６０】
エントジニウム・カウダツム由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列については、当業者はUniProtデータベースの受託番号AAF15393、又は本明細書記載の配列番号23を参照してもよい。実例として、アルジア・インテスティナリス(Giardia intestinalis)に由来するグルタミン酸デヒドロゲナーゼは、配列番号23のグルタミン酸デヒドロゲナーゼと49%のアミノ酸同一性を有する。
【０３６１】
別の特定の実施形態によれば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸は、配列番号23のアミノ酸配列と、少なくとも49%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%のアミノ酸同一性、及び同じ性質の生物活性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸であり得る。
【０３６２】
この配列に関する同じ性質の生物活性は、前述の通り、すなわち、L-グルタミン酸を産生するための2-オキソグルタル酸の変換を触媒する能力である。
【０３６３】
本明細書に記載されるように、参照核酸配列と少なくとも49%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、少なくとも50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の配列番号23のアミノ酸配列とのアミノ酸同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有するアミノ酸配列を包含する。
【０３６４】
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列と少なくとも65%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の配列番号23のアミノ酸配列とのアミノ酸同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有するアミノ酸配列を包含する。
【０３６５】
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%の配列番号23のアミノ酸配列とのアミノ酸同一性、並びにまた同じ性質の生物活性を有するアミノ酸配列を包含する。
【０３６６】
上述のように、本発明におけるグルタミン酸デヒドロゲナーゼの発現レベルは、少なくとも1つのプロモーター及び少なくとも1つのターミネーターによって調節され、例えば、本明細書において以下により詳細に規定され、これらは前記グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸配列の5'及び3'の位置それぞれに存在する。
【０３６７】
本明細書の他の場所で明記されているように、グルタミン酸デヒドロゲナーゼは、本発明による組換え酵母において過剰発現している。
【０３６８】
いくつかの実施形態では、グルタミン酸デヒドロゲナーゼの過剰発現は、前記組換え酵母内の強力なプロモーターによる対応する遺伝子の制御から生じ得る。
【０３６９】
いくつかの他の実施形態では、グルタミン酸デヒドロゲナーゼの過剰発現は、前記組換え酵母のゲノム内のグルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする配列の複数のコピーの存在から生じ得る。
【０３７０】
なおさらなる実施形態では、グルタミン酸デヒドロゲナーゼの過剰発現は、(i)前記組換え酵母内の強力なプロモーターによる対応する遺伝子の制御、及び(ii)前記組換え酵母のゲノム内のグルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする配列の複数のコピーの存在の両方から生じ得る。
【０３７１】
目的化合物の排出輸送
本発明による組換え酵母のさらなる実施形態では、酵母細胞外への産生エクトインの排出輸送は、(i)酵母パーミアーゼをコードする遺伝子の過少発現によって、(ii)アミノ酸エクスポータータンパク質をコードする遺伝子の過少発現によって、又は(III)酵母パーミアーゼをコードする遺伝子の過少発現及びアミノ酸エクスポータータンパク質をコードする遺伝子の過少発現の両方によって増強され得る。
【０３７２】
パーミアーゼをコードする遺伝子の過少発現
以下に記載するように、本発明による組換え酵母において過少発現し得るパーミアーゼをコードする遺伝子は、AGP1、AGP3、BAP3、BAP2、GAP1、GNP1、MUP3及びMUP1を包含する。
【０３７３】
AGP1は、サッカロマイセス・セレヴィシエ由来のジェネラルアミノ酸パーミアーゼ1である。AGP1のアミノ酸配列については、UniProtデータベースの受託番号NP_009905を参照してもよい。核酸配列については、NCBIデータベースの受託番号NM_001178671を参照してもよい。
【０３７４】
AGP3は、サッカロマイセス・セレヴィシエ由来のジェネラルアミノ酸パーミアーゼ3である。AGP3のアミノ酸配列については、UniProtデータベースの受託番号NP_116600を参照してもよい。核酸配列については、NCBIデータベースの受託番号NM_001179912を参照してもよい。
【０３７５】
BAP3は、サッカロマイセス・セレヴィシエ由来のバリンアミノ酸パーミアーゼである。BAP3のアミノ酸配列については、UniProtデータベースの受託番号NP_010331を参照してもよい。核酸配列については、NCBIデータベースの受託番号NM_001180354を参照してもよい。
【０３７６】
BAP2は、サッカロマイセス・セレヴィシエ由来のLeu/Val/Ileアミノ酸パーミアーゼである。BAP2のアミノ酸配列については、UniProtデータベースの受託番号NP_009624を参照してもよい。核酸配列については、NCBIデータベースの受託番号NM_001178416を参照してもよい。
【０３７７】
GAP1は、サッカロマイセス・セレヴィシエ由来のジェネラルアミノ酸パーミアーゼである。GAP1のアミノ酸配列については、UniProtデータベースの受託番号NP_012965.3を参照してもよい。核酸配列については、NCBIデータベースの受託番号NM_001179829を参照してもよい。
【０３７８】
GNP1は、サッカロマイセス・セレヴィシエ由来の高親和性グルタミンパーミアーゼである。GNP1のアミノ酸配列については、UniProtデータベースの受託番号NP_010796を参照してもよい。核酸配列については、NCBIデータベースの受託番号NM_001180816を参照してもよい。
【０３７９】
MUP3は、サッカロマイセス・セレヴィシエ由来の低親和性メチオニンパーミアーゼである。MUP3のアミノ酸配列については、UniProtデータベースの受託番号NP_011827を参照してもよい。核酸配列については、NCBIデータベースの受託番号NM_001179116を参照してもよい。
【０３８０】
MUP1は、サッカロマイセス・セレヴィシエ由来の低親和性メチオニンパーミアーゼである。MUP1のアミノ酸配列については、UniProtデータベースの受託番号NP_011569を参照してもよい。核酸配列については、NCBIデータベースの受託番号NM_001181184を参照してもよい。
【０３８１】
本発明による組換え酵母のいくつかの実施形態では、前記組換え酵母は、AGP1、AGP3、BAP3、BAP2、GAP1、GNP1、MUP3及びMUP1パーミアーゼを包含する、パーミアーゼをコードする1つ又は複数の遺伝子の過少発現を有すると更に規定される。
【０３８２】
したがって、特定の実施形態では、本発明の組換え酵母のゲノムは、以下の改変:
(A)酵母のゲノムから、ジェネラルアミノ酸パーミアーゼAGP3をコードする少なくとも1つの、好ましくはすべての内在性核酸が欠失し、任意選択により、
(i)ジェネラルアミノ酸パーミアーゼAGP3をコードする少なくとも1つの核酸が、挿入され、且つ誘導性又は抑制性プロモーターの制御下にある、且つ/又は
(ii)不安定化ジェネラルアミノ酸パーミアーゼAGP3をコードする少なくとも1つの核酸が、挿入される、改変、
(B)酵母のゲノムから、分岐鎖アミノ酸パーミアーゼ3をコードする少なくとも1つの、好ましくはすべての内在性核酸が欠失し、任意選択により、
(i)分岐鎖アミノ酸パーミアーゼ3をコードする少なくとも1つの核酸が、挿入され、且つ誘導性又は抑制性プロモーターの制御下にある、及び/又は
(ii)不安定化分岐鎖アミノ酸パーミアーゼ3をコードする少なくとも1つの核酸が、挿入される、改変、
(C)酵母のゲノムから、分岐鎖アミノ酸パーミアーゼ2をコードする少なくとも1つの、好ましくはすべての内在性核酸が欠失し、任意選択により、
(i)分岐鎖アミノ酸パーミアーゼ2をコードする少なくとも1つの核酸が、挿入され、且つ誘導性又は抑制性プロモーターの制御下にある、且つ/又は
(ii)不安定化分岐鎖アミノ酸パーミアーゼ2をコードする少なくとも1つの核酸が、挿入される、改変、
(D)酵母のゲノムから、ジェネラルアミノ酸パーミアーゼGAP1をコードする少なくとも1つの、好ましくはすべての内在性核酸が欠失し、任意選択により、
(i)ジェネラルアミノ酸パーミアーゼGAP1をコードする少なくとも1つの核酸が、挿入され、且つ誘導性又は抑制性プロモーターの制御下にある、且つ/又は
(ii)不安定化ジェネラルアミノ酸パーミアーゼGAP1をコードする少なくとも1つの核酸が、挿入される、改変、
(E)酵母のゲノムから、高親和性グルタミンパーミアーゼGNP1をコードする少なくとも1つの、好ましくはすべての内在性核酸が欠失し、任意選択により、
(i)高親和性グルタミンパーミアーゼGNP1をコードする少なくとも1つの核酸が、挿入され、且つ誘導性又は抑制性プロモーターの制御下にある、且つ/又は
(ii)不安定化高親和性グルタミンパーミアーゼGNP1をコードする少なくとも1つの核酸が、挿入される、改変、
(F)酵母のゲノムから、ジェネラルアミノ酸パーミアーゼAGP1をコードする少なくとも1つの、好ましくはすべての内在性核酸が欠失し、任意選択により、
(i)ジェネラルアミノ酸パーミアーゼAGP1をコードする少なくとも1つの核酸が、挿入され、且つ誘導性又は抑制性プロモーターの制御下にある、且つ/又は
(ii)不安定化ジェネラルアミノ酸パーミアーゼAGP1をコードする少なくとも1つの核酸が、挿入される、改変、
(G)酵母のゲノムから、低親和性メチオニンパーミアーゼMUP3をコードする少なくとも1つの、好ましくはすべての内在性核酸が欠失し、任意選択により、
(i)低親和性メチオニンパーミアーゼMUP3をコードする少なくとも1つの核酸が、挿入され、且つ誘導性又は抑制性プロモーターの制御下にある、且つ/又は
(ii)不安定化低親和性メチオニンパーミアーゼMUP3をコードする少なくとも1つの核酸が、挿入される、改変、
(H)酵母のゲノムから、高親和性メチオニンパーミアーゼMUP1をコードする少なくとも1つの、好ましくはすべての内在性核酸が欠失し、任意選択により、
(i)高親和性メチオニンパーミアーゼMUP1をコードする少なくとも1つの核酸が、挿入され、且つ誘導性又は抑制性プロモーターの制御下にある、且つ/又は
(ii)不安定化高親和性メチオニンパーミアーゼMUP1をコードする少なくとも1つの核酸が、挿入される、改変、
(I)推定トランスポーターAQR1をコードする少なくとも1つの核酸が過剰発現する、改変、及び/又は
(J)ポリアミントランスポーター1をコードする少なくとも1つの核酸が過剰発現する、改変
のうちの少なくとも1つが実施されたようなものである。
【０３８３】
特定の実施形態では、これらの改変のうちの少なくとも2つ、特に少なくとも3つが実施されている。
【０３８４】
特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、パーミアーゼ遺伝子のいずれかの過少発現により、酵母細胞外、すなわち培養培地における産生エクトインの分泌が増加すると考える。
【０３８５】
パーミアーゼに関して、これらの遺伝子の1つ又は複数の過少発現は、例えば前記1つ又は複数のパーミアーゼ遺伝子の中断又は欠失による、それらの発現の完全な抑制を包含する。
【０３８６】
いくつかの実施形態では、パーミアーゼをコードする遺伝子の過少発現を、例えば、誘導性又は抑制性プロモーター等の抑制性調節配列の制御下にこの遺伝子の発現を置くことによる、条件付きにすることができる。
【０３８７】
遺伝子発現を抑制する方法、標的遺伝子を中断する方法、又は標的遺伝子を欠失させる方法は、当業者に周知である。
【０３８８】
パーミアーゼ遺伝子に関して、過少発現は、不安定化パーミアーゼタンパク質をコードする核酸の挿入、又は不安定化パーミアーゼタンパク質をコードする核酸の挿入、又はその両方も包含する。
【０３８９】
不安定化パーミアーゼは、パーミアーゼの変異体であり、親パーミアーゼよりも酵母細胞内でより急速に分解される。
【０３９０】
好ましい実施形態では、不安定化パーミアーゼは、デグロンタグ付加パーミアーゼタンパク質からなる。
【０３９１】
実施例に示されているように、AGP3遺伝子、BAP3遺伝子、GAP1遺伝子、GNP1遺伝子及びMUP3遺伝子は、loxPによって中断することができ、したがって欠失する
【０３９２】
アミノ酸エクスポータータンパク質をコードする遺伝子の過剰発現
以下に記載するように、本発明による組換え酵母において過剰発現し得るエクスポータータンパク質をコードする遺伝子は、AQR1及びTPO1を包含する。
【０３９３】
AQR1は、サッカロマイセス・セレヴィシエ由来のトランスポーターである。AQR1のアミノ酸配列については、UniProtデータベースの受託番号NP_014334を参照してもよい。核酸配列については、NCBIデータベースの受託番号NM_001182903を参照してもよい。
【０３９４】
TPO1は、サッカロマイセス・セレヴィシエ由来のポリアミントランスポーターである。TPO1のアミノ酸配列については、UniProtデータベースの受託番号NP_013072を参照してもよい。核酸配列については、NCBIデータベースの受託番号NM_001181848を参照してもよい。
【０３９５】
本発明による組換え酵母の好ましい実施形態では、トランスポーターをコードする遺伝子の過剰発現は、酵母ゲノムの選択された位置に、前記トランスポーターコード配列を含む発現カセットの1つ又は複数の追加コピーを挿入することにより得られる。
【０３９６】
特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、トランスポーターをコードする遺伝子の過剰発現により、酵母細胞外、すなわち培養培地における産生エクトインの分泌が増加すると考える。
【０３９７】
いくつかの実施形態では、トランスポーターをコードする遺伝子の過剰発現は、酵母ゲノムの選択された位置にトランスポーター遺伝子コード配列を含む発現カセットの1つ又は複数の追加コピーを挿入することにより得られる。これらの実施形態のいくつかでは、トランスポーターコード配列を含む発現カセットの前記1つ又は複数のコピーは、酵母細胞で機能する強力なプロモーター等の、前記トランスポーターの強力な発現を可能にする調節配列を含む。
【０３９８】
いくつかの他の実施形態では、トランスポーターをコードする遺伝子の1つのコピーを、酵母ゲノムの選択された位置に挿入する。これらその他の実施形態では、トランスポーターコード配列を含む発現カセットの前記1つ又は複数のコピーは、酵母細胞で機能する強力なプロモーター等の、前記トランスポーターの強力な発現を可能にする調節配列を含む。
【０３９９】
好ましい実施形態では、前記アミノ酸エクスポータータンパク質をコードする遺伝子AQR1は、強力なプロモーターpTEF3の制御下に置かれる。
【０４００】
実例として、本明細書の実施例に示されるように、AQR1遺伝子はPYK1遺伝子内に挿入され得る。
【０４０１】
好ましい実施形態では、前記アミノ酸エクスポータータンパク質をコードする遺伝子TPO1は、強力な誘導性若しくは抑制性プロモーターpSAM4又は強力な構成的プロモーターpTEF1の制御下に置かれる。
【０４０２】
TPO1の代わりにTPO1-1を使用することができる。TPO1-1は、リジン10、49、86、143、144、及び145がアルギニンに置き換えられた人工対立遺伝子である。
【０４０３】
本発明者らは、これらの改変が、TPO1を、ユビキチン-プロテアソーム経路を介した分解から保護し、したがってそれを安定化すると考える。
【０４０４】
好ましい実施形態では、前記アミノ酸エクスポータータンパク質をコードする遺伝子TPO1は、強力なプロモーターpTEF3の制御下に置かれる。
【０４０５】
実例として、TPO1遺伝子は、本明細書の実施例に示されるように、PYK1遺伝子内に挿入され得る。
【０４０６】
エクトイン産生のさらなる増加を考慮して、本発明による組換え酵母は、大量の中間産物オキサロ酢酸を産生するように、追加の遺伝子変化を含んでもよい。これらの任意の遺伝子変化については、本明細書では以下に記載する。
【０４０７】
エクトイン産生組換え酵母のさらなる実施形態
本発明による組換え酵母のいくつかの実施形態によれば、中間代謝産物オキサロ酢酸の産生の増加をもたらす条件下に、前記組換え酵母を置くことにより、エクトインの産生を更に増加させることができる。
【０４０８】
前記組換え酵母を、オキサロ酢酸の産生の増加をもたらす条件下に置くことは、酵母ゲノムにさらなる遺伝子改変を導入することにより実施することができる。
【０４０９】
本発明者らは、エクトイン産生組換え酵母に、以下に記載するさらなる遺伝子変化を導入することにより、エクトイン産生を最適に増加させることができることを見出した。
【０４１０】
エクトイン産生組換え酵母の第1のさらなる実施形態
本発明によるエクトイン産生組換え酵母のこれらの第1のさらなる実施形態によれば、組換え酵母のさらなる遺伝子工学を、中間産物ホスホエノールピルビン酸(phosphoenol pyruvate)(PEP)の産生を増加させる目的で実施する。
【０４１１】
特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、エクトイン産生組換え酵母に導入されたさらなる遺伝子変化によって、(i)NADPHの過剰産生がもたらされ、(ii)ホスホエノールピルビン酸からオキサロ酢酸及びピルビン酸(pyruvate)それぞれへの、制御され且つバランスのとれた変換がもたらされ、(iii)ピルビン酸からエタノールへの変換の減少、及びホスホエノールピルビン酸からオキサロ酢酸への変換へのリダイレクトがもたらされる、と考える。
【０４１２】
本発明によるエクトイン産生組換え酵母における遺伝子工学により導入されるこれらのさらなる遺伝子変化は、以下でより詳細に明記する。
【０４１３】
これらの実施形態によれば、グルコース-6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼ(MET19又はZWF1とも呼ばれる)及び6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、脱炭酸1(GND1とも呼ばれる)を過剰発現するように、遺伝子変化を導入する。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、MET19及びGND1の過剰発現により、NADPH産生の増加がもたらされると考える。
【０４１４】
これらの実施形態によれば、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(PEPC又はPPCとも呼ばれる)及び/又はホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ[ATP](PCK1又はPEPCKとも呼ばれる)を過剰発現するように、遺伝子変化を導入する。
【０４１５】
これらの実施形態によれば、ピルビン酸キナーゼ1(PYK1又はCDC19とも呼ばれる)及びピルビン酸キナーゼ2(PYK2)とも呼ばれる)を過少発現するように、遺伝子変化を導入する。これらの実施形態のいくつかでは、PYK2遺伝子を、過小発現させる代わりに欠失させてもよい。
【０４１６】
これらの実施形態のいくつかでは、ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子のうちの1つ又は複数が、好ましくは欠失により不活性化される。ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、それぞれPDC1、PDC5、PDC6と呼ばれる遺伝子を包含する。これらの実施形態のいくつかによれば、PDC1及び/又はPDC6遺伝子は、好ましくは中断又は欠失により不活性化されるが、他のピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子PDC5は変更されないままであるか、又は、弱いプロモーターで制御することにより、その発現が減少する。
【０４１７】
これらの実施形態のいくつかでは、組換え酵母のアルコールデヒドロゲナーゼ活性は、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の1つ又は複数の発現を変えることにより低下する。これらの実施形態のいくつかでは、ADH1の発現は、弱いプロモーターの制御下に、遺伝子を置くことにより、又は不安定化ADH1酵素を産生することにより、低下する。これらの実施形態のいくつかでは、ADH3、ADH4及びADH5のうちの1つ又は複数が、好ましくは中断又は欠失により不活性化されてもよい。
【０４１８】
これらの実施形態のいくつかでは、外来アセチルデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(MHPFとも呼ばれる)を酵母ゲノムに導入し、過剰発現させてもよい。
【０４１９】
これらの実施形態のいくつかでは、外来酢酸キナーゼをコードする遺伝子(ACKAとも呼ばれる)を酵母ゲノムに導入し、過剰発現させてもよい。
【０４２０】
これらの実施形態のいくつかでは、外来リン酸アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子(PTAとも呼ばれる)を酵母ゲノムに導入し、過剰発現させてもよい。
【０４２１】
グルコース-6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼ
グルコース-6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼ酵素は、NADPからNADPHへの還元と同時に、D-グルコース6-リン酸を、6-ホスホ-D-グルコノ-1,5-ラクトンへと触媒するための、当技術分野に記載されているタンパク質である。
【０４２２】
グルコース-6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼの活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
【０４２３】
これに関して、当業者は、有利には、Kuby, S.ら、(1966) Dehydrogenases and Oxidases Methods in Enzymology 9、116〜117頁によって記載された方法を参照することができる。
【０４２４】
本明細書において好ましいグルコース-6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼは、1.1.1.49のEC番号を有する酵素である。
【０４２５】
グルコース-6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼ(MET19とも呼ばれる)のアミノ酸配列については、UniProtデータベースの受託番号NP_014158.1を参照してもよい。核酸配列については、UniProtデータベースの受託番号NM_001183079.1を参照してもよい。
【０４２６】
6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、脱炭酸1
6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、脱炭酸1酵素は、NADPからNADPHへの還元と同時におこる、6-ホスホグルコン酸からリブロース5-リン酸及びCO2への酸化的脱炭酸を触媒するための、当技術分野に記載されているタンパク質である。
【０４２７】
6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、脱炭酸1の活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
【０４２８】
これに関して、当業者は、有利には、He W.ら、(2007) BMC Structural Biology、7:38頁によって記載された方法を参照することができる。
【０４２９】
本明細書において好ましい6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、脱炭酸1は、1.1.1.44のEC番号を有する酵素である。
【０４３０】
6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列、脱炭酸1(GND1とも呼ばれる)のアミノ配列については、UniProtデータベースの受託番号NP_012053を参照してもよい。核酸配列については、NCBIデータベースの受託番号NM_001179314を参照してもよい。
【０４３１】
ピルビン酸キナーゼ1
ピルビン酸キナーゼ1酵素は、ATPの存在下でピルビン酸からホスホエノールピルビン酸への変換を触媒するための、当技術分野に記載されているタンパク質である。
【０４３２】
ピルビン酸キナーゼ1の活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
【０４３３】
これに関して、当業者は、有利には、Susan-resiga及びNowak (biochemistry、2004年、43、15230〜15245頁)によって記載された方法を参照することができる。
【０４３４】
本明細書において好ましいピルビン酸キナーゼ1は、2.7.1.40のEC番号を有する酵素である。
【０４３５】
ピルビン酸キナーゼ1(PYK1とも呼ばれる)のアミノ酸配列については、UniProtデータベースの受託番号NP_009362を参照してもよい。核酸配列については、NCBIデータベースの受託番号NM_001178183を参照してもよい。
【０４３６】
ピルビン酸キナーゼ2
ピルビン酸キナーゼ2酵素は、ATPの存在下でピルビン酸からホスホエノールピルビン酸への変換を触媒するための、当技術分野に記載されているタンパク質である。ピルビン酸キナーゼ2は、解糖流量のレベルが非常に低い条件下で酵母細胞によって使用される場合がある。
【０４３７】
ピルビン酸キナーゼ2の活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
【０４３８】
これに関して、当業者は、有利には、Susan-resiga及びNowak (biochemistry、2004年、43、15230〜15245頁)によって記載された方法を参照することができる。
【０４３９】
本明細書において好ましいピルビン酸キナーゼ2は、2.7.1.40のEC番号を有する酵素である。
【０４４０】
ピルビン酸キナーゼ2(PYK2とも呼ばれる)のアミノ酸配列については、UniProtデータベースの受託番号NP_014992を参照してもよい。核酸配列については、NCBIデータベースの受託番号NM_001183767を参照してもよい。
【０４４１】
ピルビン酸デカルボキシラーゼアイソザイム1
ピルビン酸デカルボキシラーゼアイソザイム1はアルコール発酵中のピルビン酸からアセトアルデヒド及び二酸化炭素への非酸化的変換に関与する、当技術分野に記載されているタンパク質である。
【０４４２】
ピルビン酸デカルボキシラーゼアイソザイム1の活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
【０４４３】
これに関して、当業者は、有利には、Wangら、(Biochemistry、2001年、40:1755〜1763頁)によって記載された方法を参照することができる。
【０４４４】
本明細書において好ましいピルビン酸デカルボキシラーゼアイソザイム1は、4.1.1.1のEC番号を有する酵素である。
【０４４５】
ピルビン酸デカルボキシラーゼアイソザイム1(PDC1とも呼ばれる)のアミノ酸配列については、UniProtデータベースの受託番号NP_013145を参照してもよい。核酸配列については、NCBIデータベースの受託番号NM_001181931を参照してもよい。
【０４４６】
ピルビン酸デカルボキシラーゼアイソザイム5
ピルビン酸デカルボキシラーゼアイソザイム5はアルコール発酵中のピルビン酸からアセトアルデヒド及び二酸化炭素への非酸化的変換に関与する、当技術分野に記載されているタンパク質である。
【０４４７】
ピルビン酸デカルボキシラーゼアイソザイム5の活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
【０４４８】
これに関して、当業者は、有利には、Wangら、(Biochemistry、2001年、40:1755〜1763頁)によって記載された方法を参照することができる。
【０４４９】
本明細書において好ましいピルビン酸デカルボキシラーゼアイソザイム5は、4.1.1.1のEC番号を有する酵素である。
【０４５０】
ピルビン酸デカルボキシラーゼアイソザイム5(PDC5とも呼ばれる)のアミノ酸配列については、UniProtデータベースの受託番号NP_013235を参照してもよい。核酸配列については、NCBIデータベースの受託番号NM_001182021を参照してもよい。
【０４５１】
ピルビン酸デカルボキシラーゼアイソザイム6
ピルビン酸デカルボキシラーゼアイソザイム6はアルコール発酵中のピルビン酸からアセトアルデヒド及び二酸化炭素への非酸化的変換に関与する、当技術分野に記載されているタンパク質である。
【０４５２】
ピルビン酸デカルボキシラーゼアイソザイム5の活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
【０４５３】
これに関して、当業者は、有利には、Wangら、(Biochemistry、2001年、40:1755〜1763頁)によって記載された方法を参照することができる。
【０４５４】
本明細書において好ましいピルビン酸デカルボキシラーゼアイソザイム6は、4.1.1.1のEC番号を有する酵素である。
【０４５５】
ピルビン酸デカルボキシラーゼアイソザイム6(PDC6とも呼ばれる)のアミノ酸配列については、UniProtデータベースの受託番号NP_013235を参照してもよい。核酸配列については、NCBIデータベースの受託番号NM_001182021を参照してもよい。
【０４５６】
アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ
アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼは、NAD及び補酵素Aを使用して、アセトアルデヒドからアセチルCoAへの変換を触媒するための、当技術分野に記載されているタンパク質である。
【０４５７】
アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼの活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
【０４５８】
これに関して、当業者は、有利には、Fisherら、(2013) Chemi. Biol. Interact. 202 70〜77頁によって記載された方法を参照することができる。
【０４５９】
本明細書において好ましいアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼは、1.1.1.10のEC番号を有する酵素である。
【０４６０】
アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ(MHPFとも呼ばれる)のアミノ酸配列については、UniProtデータベースの受託番号NP_414885を参照してもよい。核酸配列については、NCBIデータベースの受託番号NC_000913.3に開示されているものを参照してもよい。
【０４６１】
酢酸キナーゼ
酢酸キナーゼは、酢酸とATPからリン酸アセチルを形成するための、当技術分野に記載されているタンパク質である。
【０４６２】
酢酸キナーゼの活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
【０４６３】
これに関して、当業者は、有利には、Sagersら、J.Bacteriology (1961) 82 233〜238頁によって記載された方法を参照することができる。
【０４６４】
酢酸キナーゼ(ACKAとも呼ばれる)のアミノ酸配列については、UniProtデータベースの受託番号NP_416799を参照してもよい。核酸配列については、NCBIデータベースの受託番号NC_000913.3に開示されているものを参照してもよい。
【０４６５】
リン酸アセチルトランスフェラーゼ
リン酸アセチルトランスフェラーゼは、アセチル-CoA及びアセチルリン酸の可逆的相互変換を触媒するための、当技術分野に記載されているタンパク質である。
【０４６６】
リン酸アセチルトランスフェラーゼの活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
【０４６７】
これに関して、当業者は、有利には、Castano-Cerezo及びCanovas、Microbial Cell Factories 2009年、8:54頁によって記載された方法を参照することができる。
【０４６８】
本明細書において好ましいリン酸アセチルトランスフェラーゼは、2.3.1.8のEC番号を有する酵素である。
【０４６９】
リン酸アセチルトランスフェラーゼ(PTAとも呼ばれる)のアミノ酸配列については、UniProtデータベースの受託番号NP_416800を参照してもよい。核酸配列については、NCBIデータベースの受託番号NC_000913に開示されているものを参照してもよい。
【０４７０】
アルコールデヒドロゲナーゼ1
アルコールデヒドロゲナーゼ1は、非分岐鎖一級アルコールからそれらの対応するアルデヒドへの変換を触媒するための、当技術分野に記載されているタンパク質である。
【０４７１】
アルコールデヒドロゲナーゼ1の活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
【０４７２】
これに関して、当業者は、有利には、Ganzhornら、(1987) The Journal of Biological Chemistry、262、3754〜61頁によって記載された方法を参照することができる。
【０４７３】
本明細書において好ましいアルコールデヒドロゲナーゼ1は、1.1.1.1のEC番号を有する酵素である。
【０４７４】
アルコールデヒドロゲナーゼ1(ADH1とも呼ばれる)のアミノ酸配列については、UniProtデータベースの受託番号NP_014555を参照してもよい。核酸配列については、NCBIデータベースの受託番号NM_001183340を参照してもよい。
【０４７５】
アルコールデヒドロゲナーゼ3
アルコールデヒドロゲナーゼ3は、非分岐鎖一級アルコールからそれらの対応するアルデヒドへの変換を触媒するための、当技術分野に記載されているタンパク質である。
【０４７６】
アルコールデヒドロゲナーゼ3の活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
【０４７７】
これに関して、当業者は、有利には、Ganzhornら、(1987) The Journal of Biological Chemistry、262、3754〜61頁によって記載された方法を参照することができる。
【０４７８】
本明細書において好ましいアルコールデヒドロゲナーゼ3は、1.1.1.1のEC番号を有する酵素である。
【０４７９】
アルコールデヒドロゲナーゼ3(ADH3とも呼ばれる)のアミノ酸配列については、UniProtデータベースの受託番号NP_013800を参照してもよい。核酸配列については、NCBIデータベースの受託番号NM_001182582を参照してもよい。
【０４８０】
アルコールデヒドロゲナーゼ4
アルコールデヒドロゲナーゼ4は、非分岐鎖一級アルコールからそれらの対応するアルデヒドへの変換を触媒するための、当技術分野に記載されているタンパク質である。
【０４８１】
アルコールデヒドロゲナーゼ4の活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
【０４８２】
これに関して、当業者は、有利には、Ganzhornら、(1987) The Journal of Biological Chemistry、262、3754〜61頁によって記載された方法を参照することができる。
【０４８３】
本明細書において好ましいアルコールデヒドロゲナーゼ4は、1.1.1.1のEC番号を有する酵素である。
【０４８４】
アルコールデヒドロゲナーゼ4(ADH4とも呼ばれる)のアミノ酸配列については、UniProtデータベースの受託番号NP_011258を参照してもよい。核酸配列については、NCBIデータベースの受託番号NM_001181122を参照してもよい。
【０４８５】
アルコールデヒドロゲナーゼ5
アルコールデヒドロゲナーゼ5は、非分岐鎖一級アルコールからそれらの対応するアルデヒドへの変換を触媒するための、当技術分野に記載されているタンパク質である。
【０４８６】
アルコールデヒドロゲナーゼ5の活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
【０４８７】
これに関して、当業者は、有利には、Ganzhornら、(1987) The Journal of Biological Chemistry、262、3754〜61頁によって記載された方法を参照することができる。
【０４８８】
本明細書において好ましいアルコールデヒドロゲナーゼ5は、1.1.1.1のEC番号を有する酵素である。
【０４８９】
アルコールデヒドロゲナーゼ5(ADH5とも呼ばれる)のアミノ酸配列については、UniProtデータベースの受託番号NP_009703を参照してもよい。核酸配列については、NCBIデータベースの受託番号NM_001178493を参照してもよい。
【０４９０】
エクトイン産生組換え酵母の第2のさらなる実施形態
本発明によるエクトイン産生組換え酵母のこれらのさらなる実施形態によれば、組換え酵母のさらなる遺伝子工学を、中間産物ホスホエノールピルビン酸(PEP)の産生を増加させる目的で実施する。
【０４９１】
特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、エクトイン産生組換え酵母に導入されたさらなる遺伝子変化によって、(i)NADPHの過剰産生がもたらされ、(ii)ホスホエノールピルビン酸からオキサロ酢酸及びピルビン酸それぞれへの、制御され且つバランスのとれた変換がもたらされ、(iii)ピルビン酸からエタノールへの変換の減少、及びホスホエノールピルビン酸からオキサロ酢酸への変換へのリダイレクトがもたらされる、と考える。
【０４９２】
この目的のために、本発明者らは、ホスホエノールピルビン酸から始まり、オキサロ酢酸の産生で終わる、完全に新規な代謝経路を考案した。
【０４９３】
本発明によるエクトイン産生組換え酵母における遺伝子工学により導入されるこれらのさらなる遺伝子変化は、以下でより詳細に明記する。
【０４９４】
これらの実施形態によれば、ピルビン酸キナーゼ1(PYK1とも呼ばれる)及び任意選択によりピルビン酸キナーゼ2(PYK2とも呼ばれる)を過少発現するように、遺伝子変化を導入する。これらの実施形態のいくつかでは、遺伝子を弱いプロモーター又は誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下に置くことにより、PYK1を過少発現させることができる。これらの実施形態のいくつかでは、PYK2は、例えば中断又は欠失により不活性化されてもよい。これらの実施形態のいくつかでは、PYK1遺伝子を、過小発現させる代わりに欠失させてもよい。これらの実施形態のいくつかでは、PYK1遺伝子及びPYK2遺伝子を、過小発現させる代わりに欠失させてもよい。
【０４９５】
これらの実施形態によれば、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ[ATP](PCK又はPCKA又はPEPCKとも呼ばれる)を(i)構成的過剰発現によるか、又は(ii)誘導性過剰発現によるかのいずれかによって過剰発現させるように、遺伝子変化を導入する。
【０４９６】
これらの実施形態によれば、(i)構成的過剰発現によるか、又は(ii)誘導性過剰発現によるかのいずれかによって、ペルオキシソーム型リンゴ酸デヒドロゲナーゼ(MDH3とも呼ばれる)等のリンゴ酸デヒドロゲナーゼを細胞質において過剰発現させるように、遺伝子変化を導入する。
【０４９７】
これらの実施形態によれば、NADP依存性リンゴ酸酵素3(ME3又はNADP-ME3とも呼ばれる)を、(i)構成的過剰発現によるか、又は(ii)誘導性過剰発現によるかのいずれかによって、過剰発現させるように、遺伝子変化を導入する。
【０４９８】
これらの実施形態によれば、例えば、(i)対応するコード配列を弱いプロモーター又は誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下に置くことにより、又は(ii)不安定型の前記アルコールデヒドロゲナーゼの産生により、1つ又は複数のアルコールデヒドロゲナーゼ、好ましくは、アルコールデヒドロゲナーゼ1(ADH1とも呼ばれる)、アルコールデヒドロゲナーゼ3(ADH3とも呼ばれる)、アルコールデヒドロゲナーゼ4(ADH4とも呼ばれる)及びアルコールデヒドロゲナーゼ5(ADH5とも呼ばれる)、を含む群から選択される1つ又は複数のアルコールデヒドロゲナーゼの発現を低下させるように、遺伝子変化を導入する。
【０４９９】
更にこれらの実施形態によれば、外来アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ(MHPFとも呼ばれる)を、(i)構成的過剰発現によるか、又は(ii)誘導性過剰発現によるかのいずれかによって過剰発現させるように、遺伝子変化を導入する。
【０５００】
ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(PPCK)
ホスホエノールカルボキシキナーゼ[ATP]酵素は、ヌクレオシド三リン酸とオキサロ酢酸との間の直接的ホスホリル転移を介しての、オキサロ酢酸からホスホエノールピルビン酸への変換を触媒するための、当技術分野に記載されているタンパク質である。
【０５０１】
ホスホエノールカルボキシキナーゼ[ATP]の活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
【０５０２】
これに関して、当業者は、有利には、Bazaes S.ら、(2007) The Protein Journal、26、265〜269頁、及びMariet J. Van der Werfら、(1997) Arch Microbiol 167 : 332〜342頁によって記載された方法を参照することができる。
【０５０３】
本明細書において好ましいホスホエノールカルボキシキナーゼ[ATP]は、4.1.1.49のEC番号を有する酵素である。
【０５０４】
ホスホエノールカルボキシキナーゼ[ATP](PCKAとも呼ばれる)のアミノ酸配列については、UniProtデータベースの受託番号NP_417862を参照してもよい。核酸配列については、NCBIデータベースの受託番号NC_000913に開示されているものを参照してもよい。
【０５０５】
本発明による好ましいホスホエノールカルボキシキナーゼは、4.1.1.32のEC番号を有するPEPCK等のホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼPPCKから選択することができる。
【０５０６】
リンゴ酸デヒドロゲナーゼ
リンゴ酸デヒドロゲナーゼ酵素は、NADHの存在下でリンゴ酸(malate)からオキサロ酢酸(oaxaloacetate)への変換を触媒するための、当技術分野に記載されているタンパク質である。
【０５０７】
リンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。例えば、参照MAK196-1KTの下で「リンゴ酸デヒドロゲナーゼアッセイキット」と題された、シグマ社が販売している市販キットを挙げることができる。
【０５０８】
リンゴ酸デヒドロゲナーゼ(MDH3とも呼ばれる)のアミノ酸配列については、UniProtデータベースの受託番号NP_010205を参照してもよい。核酸配列については、NCBIデータベースの受託番号NM_00118037を参照してもよい。
【０５０９】
NADP依存性リンゴ酸酵素3
NADP依存性リンゴ酸酵素3酵素は、NADPの存在下でリンゴ酸からピルビン酸への変換を触媒するための、当技術分野に記載されているタンパク質である。
【０５１０】
NADP依存性リンゴ酸酵素3の活性レベルを測定するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
【０５１１】
これに関して、当業者は、有利には、Gerrard-Wheelerら、FEBS Journal 276 (2009) 5665〜5677頁によって記載された方法を参照することができる。
【０５１２】
本明細書において好ましいNADP依存性リンゴ酸酵素3は、1.1.1.40のEC番号を有する酵素である。
【０５１３】
NADP依存性リンゴ酸酵素3(NADP-ME3又はME3とも呼ばれる)のアミノ酸配列については、UniProtデータベースの受託番号NP_197960を参照してもよい。核酸配列については、NCBIデータベースの受託番号NM_122489を参照してもよい。
【０５１４】
アルコールデヒドロゲナーゼ1、アルコールデヒドロゲナーゼ3、アルコールデヒドロゲナーゼ4、アルコールデヒドロゲナーゼ5、及びアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼは、上記の通りである。
【０５１５】
プロモーター
本明細書に開示されるように、本発明による組換え酵母を得るために遺伝子操作された目的の遺伝子の発現は、サッカロマイセス・セレヴィシエを含む酵母細胞において機能する適切な調節配列を含む。
【０５１６】
本明細書に開示されるように、目的のコード配列の所望の発現のために、(i)構成的強力プロモーター(本書では強力なプロモーターとも呼ばれる)、(ii)構成的弱プロモーター(また本書では弱いプロモーターと呼ばれる)、及び(iii)誘導性又は抑制性プロモーターを含む、種々のプロモーターを使用してもよい。異なる培地において相対的活性を有する酵母プロモーターのリストは、Kerenら、(2013) Molecular Systems Biology 9:701頁中に見出すことができる。
【０５１７】
所定の遺伝子の構成的過剰発現を可能にするプロモーターは、文献(Velculescuら、(1997) Cell 88、243〜251頁)中に見出し得る。
【０５１８】
本発明において、より詳細に、興味深い強力なプロモーターは、
・pTDH3(配列番号24)、
・pENO2(配列番号25)、
・pTEF KI(配列番号26)、
・pTEF3(配列番号27)、
・pTEF1(配列番号28)、
・pADH1(配列番号29)、
・pGMP1(配列番号30)、
・pFBA1(配列番号31)、
・pPDC1(配列番号32)、
・pCCW12(配列番号33)、及び
・pGK1(配列番号34)、
を含む群から選択され得る。
【０５１９】
特定の実施形態によれば、本発明による強力なプロモーターは、独立して、pTDH3、pENO2、pTEF-KI、pTEF3、pTEF1、pADH1、pGMP1、pFBA1、pPDC1、pCCW12及びpGK1からなる群から選択される。
【０５２０】
本発明においてより詳細には興味深い弱いプロモーターは、
・pURA3(配列番号36)、
・pRPLA1(配列番号37)、
・pNUP57(配列番号119)、及び
・pGAP1(配列番号120)、
を含む群から選択され得る。
【０５２１】
特定の実施形態によれば、本発明による弱いプロモーターは、独立して、pURA3、pRPLA1、pNUP57及びpGAP1からなる群から選択される。
【０５２２】
前述のように、誘導性又は抑制性プロモーターは、その活性が生物因子又は非生物因子の有無によって、また前記因子の量によって制御されるプロモーターである。したがって、いくつかのプロモーターについては、所与の因子の量が増加するか又は増加されると、特にそれらの活性が誘導されて増大し、したがって、前記因子の量が削減されるか又は減少すると、これらの同じプロモーターの活性は抑制され、したがって、低下する。誘導性又は抑制性プロモーターを含む本発明の組換え酵母の培養培地中の前記因子の量は、当業者によって決定され、したがって制御され得る。
【０５２３】
例えば、pSAM4プロモーターを含む本発明による組換え酵母の培養培地中のメチオニンの量を増加させると、このプロモーターの制御下で遺伝子の転写が誘導され、したがって増加する。これに対して、前記培養培地中のメチオニンの量を減少させると、このプロモーターの制御下で遺伝子の転写が抑制され、したがって減少する。
【０５２４】
別の例では、pCTR1プロモーターを含む本発明による組換え酵母の培養培地中の銅の量を増加させると、このプロモーターの制御下で遺伝子の転写が抑制され、したがって減少する。これに対して、前記培養培地中の銅の量を減少させると、このプロモーターの制御下で遺伝子の転写が誘導され、したがって増加する。
【０５２５】
この理由で、本明細書では、以下のプロモーターを「誘導性又は抑制性プロモーター」と呼ぶ。
【０５２６】
第1の実施形態によれば、本発明による誘導性又は抑制性プロモーターは、銅を用いた誘導性又は抑制性プロモーター、メチオニンを用いた誘導性又は抑制性プロモーター、及びスレオニンを用いた誘導性又は抑制性プロモーターを含む群から選択することができ、特に、
・pSAM4  -  メチオニン誘導性又は抑制性(配列番号38)、
・pCUP1-1  -  銅誘導性又は抑制性(配列番号39)、
・pCUP1.cgla  -  銅誘導性又は抑制性(配列番号40)、
・pCUP1.sba  -  銅誘導性又は抑制性(配列番号41)、
・pACU1  -  銅誘導性又は抑制性(配列番号42)、
・pACU2  -  銅誘導性又は抑制性(配列番号43)、
・pACU3p  -  銅誘導性又は抑制性(配列番号44)、
・pACU4p  -  銅誘導性又は抑制性(配列番号45)、
・pACU5  -  銅誘導性又は抑制性(配列番号46)、
・pACU6  -  銅誘導性又は抑制性(配列番号47)、
・pACU7  -  銅誘導性又は抑制性(配列番号48)、
・pACU8  -  銅誘導性又は抑制性(配列番号49)、
・pACU9  -  銅誘導性又は抑制性(配列番号50)、
・pACU10p  -  銅誘導性又は抑制性(配列番号51)、
・pACU11  -  銅誘導性又は抑制性(配列番号52)、
・pACU12  -  銅誘導性又は抑制性(配列番号53)、
・pACU13  -  銅誘導性又は抑制性(配列番号54)、
・pACU14  -  銅誘導性又は抑制性(配列番号55)、
・pACU15  -  銅誘導性又は抑制性(配列番号56)、
・pGAL/CUP1p  -  銅誘導性又は抑制性(配列番号57)、
・pCRS5  -  銅誘導性又は抑制性(配列番号58)、及び
・pCHA1  -  スレオニン誘導性又は抑制性(配列番号59)、
からなる群から選択される。
【０５２７】
この実施形態によれば、本発明による誘導性又は抑制性プロモーターは、特に、独立して、pSAM4、pCUP1-1、pCUP1.Cgla、pCUP1.Sba、pACU1、pACU2、pACU3p、pACU4p、pACU5、pACU6、pACU7、pACU8、pACU9、pACU10p、pACU11、pACU12、pACU13、pACU14、pACU15、pGAL/CUP1p、pCRS5、及びpCHA1からなる群から選択することができる。
【０５２８】
したがって、これらのプロモーターの活性は、上記のメチオニン、銅、又はスレオニンの存在の増加によって誘導され、メチオニン、銅、又はスレオニンの量が減少すると、それらの活性は低下する、つまり抑制される。
【０５２９】
第2の実施形態によれば、本発明による誘導性又は抑制性プロモーターは、銅を用いた誘導性又は抑制性プロモーター、リジンを用いた誘導性又は抑制性プロモーター、及びメチオニンを用いた誘導性又は抑制性プロモーターを含む群から選択することができ、特に、
・pCTR1  -  銅誘導性又は抑制性(配列番号60)、
・pCTR3  -  銅誘導性又は抑制性(配列番号61)、
・pCUR1  -  銅誘導性又は抑制性(配列番号62)、
・pCUR2  -  銅誘導性又は抑制性(配列番号63)、
・pCUR3  -  銅誘導性又は抑制性(配列番号64)、
・pCUR4  -  銅誘導性又は抑制性(配列番号65)、
・pCUR5p  -  銅誘導性又は抑制性(配列番号66)、
・pCUR6  -  銅誘導性又は抑制性(配列番号67)、
・pCUR7  -  銅誘導性又は抑制性(配列番号68)、
・pCUR8  -  銅誘導性又は抑制性(配列番号69)、
・pCUR9  -  銅誘導性又は抑制性(配列番号70)、
・pCUR10  -  銅誘導性又は抑制性(配列番号71)、
・pCUR11  -  銅誘導性又は抑制性(配列番号72)、
・pCUR12  -  銅誘導性又は抑制性(配列番号73)、
・pCUR13  -  銅誘導性又は抑制性(配列番号74)、
・pCUR14  -  銅誘導性又は抑制性(配列番号75)、
・pCUR15  -  銅誘導性又は抑制性(配列番号76)、
・pCUR16  -  銅誘導性又は抑制性(配列番号77)、
・pCUR17  -  銅誘導性又は抑制性(配列番号78)、
・pLYS1  -  リジン誘導性又は抑制性(配列番号79)、
・pLYS4  -  リジン誘導性又は抑制性(配列番号80)、
・pLYS9  -  リジン誘導性又は抑制性(配列番号81)、
・pLYR1p  -  リジン誘導性又は抑制性(配列番号82)、
・pLYR2p  -  リジン誘導性又は抑制性(配列番号83)、
・pLYR3p  -  リジン誘導性又は抑制性(配列番号84)、
・pLYR4p  -  リジン誘導性又は抑制性(配列番号85)、
・pLYR5p  -  リジン誘導性又は抑制性(配列番号86)、
・pLYR6p  -  リジン誘導性又は抑制性(配列番号87)、
・pLYR7p  -  リジン誘導性又は抑制性(配列番号88)、
・pLYR8  -  リジン誘導性又は抑制性(配列番号89)、
・pLYR9  -  リジン誘導性又は抑制性(配列番号90)、
・pLYR10  -  リジン誘導性又は抑制性(配列番号91)、
・pLYR11  -  リジン誘導性又は抑制性(配列番号92)、
・pMET17  -  メチオニン誘導性又は抑制性(配列番号93)、
・pMET6  -  メチオニン誘導性又は抑制性(配列番号94)、
・pMET14  -  メチオニン誘導性又は抑制性(配列番号95)、
・pMET3  -  メチオニン誘導性又は抑制性(配列番号96)、
・pSAM1  -  メチオニン誘導性又は抑制性(配列番号97)、
・pSAM2  -  メチオニン誘導性又は抑制性(配列番号98)、
・pMDH2  -  グルコース誘導性又は抑制性(配列番号35)、
・pJEN1  -  グルコース誘導性又は抑制性(配列番号118)、
・pICL1  -  グルコース誘導性又は抑制性(配列番号119)、
・pADH2  -  グルコース誘導性又は抑制性(配列番号120)、及び
・pMLS1  -  グルコース誘導性又は抑制性(配列番号121)、
からなる群から選択することができる。
【０５３０】
この特定の実施形態によれば、本発明の誘導性又は抑制性プロモーターは、独立して、pCTR1、pCTR3、pCUR1、pCUR2、pCUR3、pCUR4、pCUR5p、pCUR6、pCUR7、pCUR8、pCUR9、pCUR10、pCUR11、pCUR12、pCUR13、pCUR14、pCUR15、pCUR16、pCUR17、pLYS1、pLYS4、pLYS9、pLYR1p、pLYR2p、pLYR3p、pLYR4p、pLYR5p、pLYR6p、pLYR7p、pLYR8、pLYR9、pLYR10、pLYR11、pMET17、pMET6、pMET14、pMET3、pSAM1、pSAM2、pMDH2、pJEN1、pICL1、pADH2、及びpMLS1からなる群から選択することができる。
【０５３１】
したがって、これらのプロモーターの活性は、上記のメチオニン、銅、リジン又はグルコースの存在の増加によって抑制され、メチオニン、銅、リジン又はグルコースの量が減少すると、それらの活性は増加する、つまり誘導される。
【０５３２】
特定の実施形態では、本発明による誘導性又は抑制性プロモーターは、銅を用いた誘導性又は抑制性プロモーター、グルコースを用いた誘導性又は抑制性プロモーター、リジンを用いた誘導性又は抑制性プロモーター、メチオニンを用いた誘導性又は抑制性プロモーター、及びスレオニンを用いた誘導性又は抑制性プロモーターを含む群から選択することができる。
【０５３３】
より詳細な実施形態では、本発明の誘導性又は抑制性プロモーターは、独立して、pSAM4、pCUP1-1、pCUP1.Cgla、pCUP1.Sba、pACU1、pACU2、pACU3p、pACU4p、pACU5、pACU6、pACU7、pACU8、pACU9、pACU10p、pACU11、pACU12、pACU13、pACU14、pACU15、pGAL/CUP1p、pCRS5、pCHA1、pCTR1、pCTR3、pCUR1、pCUR2、pCUR3、pCUR4、pCUR5p、pCUR6、pCUR7、pCUR8、pCUR9、pCUR10、pCUR11、pCUR12、pCUR13、pCUR14、pCUR15、pCUR16、pCUR17、pLYS1、pLYS4、pLYS9、pLYR1p、pLYR2p、pLYR3p、pLYR4p、pLYR5p、pLYR6p、pLYR7p、pLYR8、pLYR9、pLYR10、pLYR11、pMET17、pMET6、pMET14、pMET3、pSAM1、pSAM2、pMDH2、pJEN1、pICL1、pADH2、及びpMLS1からなる群から選択することができる。
【０５３４】
より詳細には、同一又は異なる前記プロモーターは、配列番号24〜98及び116〜121の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列からなる群から選択される核酸の配列を、好ましくは特徴とする。
【０５３５】
Blazeck & Alper (2013) Biotechnol. J. 8 46〜58頁に記載されている合成プロモーターも、使用することができる。
【０５３６】
本発明の強力な、弱い、誘導性又は抑制性のプロモーターは、サッカロマイセス属の任意の生物に由来する可能性があり、特に、サッカロマイセス・セレヴィシエ、サッカロマイセス・ブラウディ(Saccharomyces boulardii)、サッカロマイセス・カステリイ(Saccharomyces castelii)、サッカロマイセス・バヤヌス(Saccharomyces bayanus)、サッカロマイセス・アルボリコラ(Saccharomyces arboricola)、サッカロマイセス・クドリアブゼビイ(Saccharomyces kudriavzevii)、アシュビア・ゴシッピイ(Ashbya gossypii)、クルイベロマイセス・ラクティス(Kluveromyces lactis)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、デバリオマイセス・カステリイ(Debaryomyces castelii)、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolitica)、及びサイバリンドネラ・ジャディニ(Cyberlindnera jadinii)からなる群から選択される生物に、独立して由来する可能性がある。
【０５３７】
本発明の強力な、弱い、誘導性又は抑制性のプロモーターは、サッカロマイセス・セレヴィシエ、サッカロマイセス・カステリイ、サッカロマイセス・バヤヌス、サッカロマイセス・アルボリコラ、サッカロマイセス・クドリアブゼビイ、及びクルイベロマイセス・ラクティス(Kluveromyces lactis)からなる群から選択される生物に、好ましくは由来する可能性がある。
【０５３８】
ターミネーター
本明細書に開示されるように、本発明による組換え酵母を得るために遺伝子操作された目的の遺伝子の発現は、サッカロマイセス・セレヴィシエを含む酵母細胞において機能する適切な転写ターミネーター配列を含む。
【０５３９】
同一又は異なる前記転写ターミネーターは、文献Yamanishiら、(2013) ACS synthetic biology 2、337〜347頁中に見出し得る。
【０５４０】
本発明において、より詳細には、興味深いターミネーターは、
・グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、アイソザイム2をコードする遺伝子由来のtTDH2(TDH2遺伝子=配列番号99)、
・tCYC1(=配列番号100)、
・tTDH3(=配列番号101)、及び
・アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子由来のtADH1(ADH1遺伝子=配列番号102)、
・アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子由来のtADH2(ADH2遺伝子=配列番号103)、
・トリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子由来のtTPI1(TPI1遺伝子=配列番号104)、
・O-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ及びO-アセチルセリンスルフヒドリラーゼをコードする遺伝子由来のtMET17(Met17遺伝子=配列番号105)、
・エノラーゼIIをコードする遺伝子由来のtENO2(ENO2遺伝子=配列番号106)、
・tMET3(=配列番号107)、及び
・3-ホスホグリセリン酸キナーゼをコードする遺伝子由来のtPGK1(PGK1遺伝子=配列番号108)、
・tDIT1(=配列番号109)、
・tRPL3(=配列番号110)
・tRPL41B(=配列番号111)
・tRPL15A(=配列番号112)
・tIDP1(=配列番号113)
を含む群から選択され得る。
【０５４１】
より詳細には、同一又は異なる前記ターミネーターは、配列番号99〜113の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列からなる群から選択される核酸の配列を、好ましくは特徴とする。
【０５４２】
組換え酵母
一般に、酵母は、急速に増殖することができ、細菌と比較して高密度で培養することができ、産業上の設定において無菌環境を必要としない。更に、酵母細胞は、産物抽出及び精製のプロセスが大幅に簡素化され、細菌細胞と比較して、培養培地からより容易に分離することができる。
【０５４３】
優先的には、本発明の酵母は、サッカロマイセス属、カンジダ属(Candida)、アシュビア属(Ashbya)、デッケラ属(Dekkera)、ピキア属(Pichia)(ハンゼヌラ属(Hansenula))、デバリオマイセス属(Debaryomyces)、クラビスポラ属(Clavispora)、ロデロマイセス属(Lodderomyces)、ヤロウィア属(Yarrowia)、ジゴサッカロマイセス属(Zigosaccharomyces)、シゾサッカロマイセス属(Schizosaccharomyces)、トルラスポラ属(Torulaspora)、クルイベロマイセス属(Kluyveromyces)、ブレタノマイセス属(Brettanomycces)、クリプトコッカス属(Cryptococcus)又はマラセチア属(Malassezia)のうちから選択されてもよい。
【０５４４】
より優先的には、酵母は、サッカロマイセス属、デッケラ属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロマイセス属、トルラスポラ属、ジゴサッカロマイセス属、又はブレタノマイセス属のクラブトリー陽性酵母であってもよい。
【０５４５】
より優先的には、酵母は、サッカロマイセス・セレヴィシエ、サッカロマイセス・ブラウディ、サッカロマイセス・ダグラシー(Saccharomyces douglasii)、サッカロマイセス・バヤヌス、ジゴサッカロマイセス・バイリ(Zigosaccharomyces bailii)、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、デッケラ・ブルセレンシス(Dekkera brucelensis)、デッケラ・インターメディア(Dekkera intermedia)、ブレタノマイセス・クステルシィ(Brettanomycces custersii)、ブレタノマイセス・インテルメディウス(Brettanomycces intermedius)、クルイベロマイセス・サーモトレランス(Kluyveromyces themotolerens)、トルラスポラ・グロボーサ(Torulaspora globosa)、又はトルラスポラ・グラブラータ(Torulaspora glabrata)の種に由来してもよい。
【０５４６】
より優先的には、組換え酵母は、サッカロマイセス属、及び好ましくはサッカロマイセス・セレヴィシエ種に属し得る。
【０５４７】
上述のように、本発明による組換え酵母は、本明細書に開示されたものから選択される少なくとも1つのDNAコンストラクトの挿入により低下するピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する。
【０５４８】
遺伝子内に特定のDNAコンストラクトを挿入するために実施される方法は、当業者の一般的な知識に属する。関連する方法については、本明細書における以下の実施例で、より詳細に説明する。
【０５４９】
培養条件
本発明はまた、エクトイン産生のための、例えば、上記で規定される、組換え酵母の使用に関する。
【０５５０】
本発明は更に、エクトインを産生する方法であって、
-  前述の組換え微生物を準備し、炭素源を含む培養培地で組換え微生物を培養する工程、及び
-  エクトインを回収する工程
を含む方法に関する。
【０５５１】
典型的には、本発明の微生物は、適切な培養培地において、約20℃〜約37℃の範囲、好ましくは27〜34℃の範囲の温度で増殖させる。
【０５５２】
本発明による組換え酵母がS.セレヴィシエ種に属する場合、温度は、適切な培養培地において、有利には27〜34℃の範囲であり得る。
【０５５３】
酵母に好適な増殖培地は、酵母窒素ベース、硫酸アンモニウム、及び炭素/エネルギー源としてデキストロースを含むブロス等の一般的な市販の培地、又は増殖に最適な割合でのペプトン、酵母抽出物、及びデキストロースのブレンドであるYPD培地である。他の規定された又は合成の増殖培地を使用してもよく、特定の微生物の増殖のための適切な培地は、微生物学又は発酵科学の当業者に知られている。
【０５５４】
「適切な培養培地」という用語は、上記で規定されている。
【０５５５】
本発明による組換え酵母のための既知の培養培地の例は、当業者に知られており、以下の刊行物、D. Burkeら、Methods in yeast Genetics  -  A cold spring harbor laboratory course Manual (2000)に示されている。
【０５５６】
発酵のための好適なpH範囲は、pH3.0〜pH7.5の間であってもよく、ここで、pH4.5〜pH6.5が初期条件として好ましい。
【０５５７】
発酵は、好気性条件下又は微好気性条件下で実施してもよい。
【０５５８】
発酵培地中の産物の量は、例えば、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)又はガスクロマトグラフィー(GC)等、当技術分野において知られている複数の方法を使用して決定することができる。
【０５５９】
本プロセスは、発酵のバッチ法を使用してもよい。古典的なバッチ発酵は、発酵の開始時に培地の組成が設定され、発酵中に人為的な変更を受けない閉鎖系である。したがって、発酵の開始時に、培地に所望の1つ又は複数の生物を接種すると、系に何も加えることなく発酵をもたらすことができる。しかし、典型的には、「バッチ」発酵は、炭素源の添加に関してバッチ式であり、多くの場合、温度、pH、及び酸素濃度等の因子を制御する試みが行われる。バッチ系では、系の代謝産物とバイオマスの組成は、発酵が停止するまで常に変化する。バッチ培養液内では、細胞は静的誘導期を経て高増殖対数期へ、最終的に増殖速度が低下又は停止する定常期へ進む。未処理である場合、定常期における細胞は最終的には死滅する。対数期における細胞は、一般に最終産物又は中間体の産生の大部分を担う。
【０５６０】
本発明では、フェドバッチ系も使用することができる。フェドバッチ系は、発酵が進行するにつれて炭素源基質が徐々に添加されることを除いて、典型的なバッチ系に類似している。フェドバッチ系は、異化産物抑制(例えば、グルコース抑制)が細胞の代謝を阻害する傾向にある場合、及び培地中に限定量の基質を有することが望ましい場合に、有用である。フェドバッチ系における実際の基質濃度の測定は、困難であり、したがって、pH、溶存酸素及びCO2等の廃棄ガスの分圧等の測定可能な因子の変化を基準にして推定される。
【０５６１】
発酵は、当技術分野において一般的であり、且つ周知であり、例は、参照により本明細書中に組み込まれているSunderlandら、(1992)中に見出され得る。本発明はバッチモードで実施されるが、この方法は連続発酵に適応可能であると考えられる。
【０５６２】
連続発酵は、規定の発酵培地が連続的にバイオリアクターに添加され、等量の馴化培地がプロセシングと同時に除去される開放系である。連続発酵は一般に、細胞が主に対数増殖期にある一定の高密度で培養物を維持する。
【０５６３】
連続発酵により、細胞の増殖又は最終産物の濃度に影響を与える1つの因子又は任意の数の因子を調整することができる。例えば、ある方法では、炭素源や窒素レベル等の制限栄養素を一定の割合に維持し、他のすべてのパラメーターを変更することができる。他の系では、培地の濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、増殖に影響する多くの因子を連続的に変更することができる。連続システムは、定常状態の増殖条件を維持しようとするため、培地が流しだされることによる細胞損失は、発酵中の細胞増殖速度に対してバランスを保たなければならない。連続発酵プロセスのための栄養素及び増殖因子を調整する方法、並びに産物形成の速度を最大化する技術は、産業微生物学の分野において周知である。
【０５６４】
本発明は、バッチプロセス、フェドバッチプロセス又は連続プロセスのいずれかを使用して実施することができ、任意の既知の発酵モードが好適であると考えられる。更に、細胞を、全細胞触媒として基板上に固定し、産生のための発酵条件に付してもよいと考えられる。
【０５６５】
エクトイン産生を更に改善するために、特定の実施形態は、上記のような、適切な培養培地において組換え酵母細胞を培養する工程であって、前記培養培地は最適量の炭素源、特にグルコースを含む、工程からなってもよい。
【０５６６】
好ましくは、細胞は、全培養期間の一部のみの間、そのような最適な培養培地において培養される。いくつかの実施形態では、酵母細胞は、前記最適な培養培地において、培養の開始後11、12、13、14、15又は16時間以上を包含する、培養の開始後10時間以上インキュベートされる。
【０５６７】
好ましくは、細胞は、そのような最適な培養培地において、培養の開始後6時間〜10時間、例えば8時間を含む、5時間〜15時間の範囲の期間の間に培養される。
【０５６８】
好ましい実施形態では、炭素源は、グルコースから構成される前記最適な培養培地に含まれる。好ましい実施形態では、前記最適な培養培地は、15w/w%以上のグルコースを含む、12w/w%以上のグルコースを含む。好ましい実施形態では、前記最適な培養培地は、最大で35w/w%のグルコースを含む、最大で40w/w%のグルコースを含む。
【０５６９】
したがって、上記の好ましい実施形態では、本発明によるエクトインの産生方法は、工程(a)と(c)との間に、前記最適な培養培地において酵母細胞を培養する工程からなる中間工程(b)を更に含んでもよい。
【０５７０】
エクトインの精製
本発明の特定の態様によれば、エクトインの発酵産生は、培養培地からエクトインを単離する工程を含む。培養培地からエクトインを回収する工程は、当業者にとって定型業務である。この工程は、蒸留、ガスストリッピング、浸透気化法、選択的沈殿又は液体抽出を含むが、これらに限定されない、当該技術分野において周知である複数の技術によって達成されてもよい。当分野の専門家は、分離される材料の特性に応じて各技術のパラメーターを調整する方法を知っている。
【０５７１】
本発明における微生物モデルとしての酵母は、合成されたエクトインが完全に細胞外に排出輸送されるために維持されており、したがって精製プロセスが単純化される。
【０５７２】
合成されたエクトインは、蒸留によって収集してもよい。蒸留は、特に水と共沸混合物を形成することによってエクトインの分離を促進させるために、培養培地とは異なる任意の成分を含んでもよい。この任意の成分は、有機溶媒であり、例えば、シクロヘキサン、ペンタン、ブタノール、ベンゼン、トルエン、トリクロロエチレン、オクタン、ジエチルエーテル、又はそれらの混合物である。
【０５７３】
ガスストリッピングは、ヘリウム、アルゴン、二酸化炭素、水素、窒素又はそれらの混合物のうちから選択されるガスのストリッピングにより達成される。
【０５７４】
液体抽出は、疎水性相としての有機溶媒、例えばペンタン、ヘキサン、ヘプタン、ドデカンにより達成される。
【０５７５】
「...と...との間(between...and...)」及び「...から...の範囲(ranging from...to...)」という用語は特に明記しない限り、限界値を包むと理解すべきである。
【０５７６】
以下の例及び図は、例証として提供され、本発明の限定を示唆していない。
【実施例】
【０５７７】
(実施例1)
本発明による組換えサッカロマイセス・セレヴィシエ株を作製するためのプロトコル
以下で実施されるすべての組換えサッカロマイセス・セレヴィシエ株は、標準的な酵母分子遺伝学手順(D. Burke、D. Dawson、T. Stearns CSHL Pressによる、Methods in yeast Genetics - A cold spring harbor laboratory course Manual (2000))を使用して、標準株から構築した。
【０５７８】
配列相同性を有するフリーのDNA末端を効率的に再結合する酵母の能力を使用して、以下の遺伝子のクラスターを一度で組換え酵母に組み込んだ。
【０５７９】
加えて、以下の遺伝子型の理解を深めるために、
-  ade2、his3、leu2、trp1及びura3は、栄養要求性マーカー遺伝子である。
-  小文字は考慮される遺伝子が不活性であることを意味し、大文字は活性遺伝子を反映している。
-  遺伝子名に続く「::」:は、遺伝子が、続くものによって中断されることを意味する(1を超える遺伝子が挿入される場合に、それらは角型括弧[]中に示される)。遺伝子の中断は、コード配列の全体的な欠失を伴うが、プロモーターは保存される。結果として、「::」が続く遺伝子は、不活性であり、小文字で示される。明記されていない場合、挿入された遺伝子の転写は、破壊された遺伝子のプロモーターによって制御される。
-  「遺伝子.Kl」は、遺伝子が、クルイベロマイセス・ラクティスに由来することを意味する。
【０５８０】
より詳細には、クローン化されるコード配列を、人工的に合成した。異種配列(非酵母)について、酵母コドン使用頻度(codon usage)を用いて同義のコード配列を得るために、核配列を改変した。制限酵素及び古典的なクローニング技術を用いて、各合成配列を、転写プロモーターと転写ターミネーターの間にクローニングした。各プロモーター配列には、上流遺伝子のターミネーターの配列と相同の50〜200ヌクレオチド配列が先行する。同様に、各遺伝子(プロモーター-コード配列-ターミネーターを含む遺伝子)のターミネーターの直後に、その遺伝子と相同な配列が続く。したがって、組み込まれるユニットのそれぞれは、上流のユニットと下流のユニット両方との、50〜200ヌクレオチド重複を有する。最初のユニットについて、プロモーターには、それが組み込まれる遺伝子座の酵母染色体ヌクレオチドと相同な50〜200ヌクレオチドが先行する。同様に、最後のユニットについて、ターミネーターに、それが組み込まれる遺伝子座の酵母染色体ヌクレオチドと相同な50〜200ヌクレオチドが続く。
【０５８１】
次に、各ユニットをプラスミドコンストラクトからPCR増幅し、オーバーラップ配列を有する直鎖状DNAのXユニットを産出する。この遺伝子の少なくとも1つは、組換えイベントを選択するための、栄養要求性マーカーである。すべての直鎖状断片は一度で酵母に形質変換され、組換え酵母は、使用されるマーカーに関連する栄養要求性について選択される。次に、PCR及びシーケンシングにより、配列の完全性を検証する。
【０５８２】
(実施例2)
エクトイン産生の比較例
A.最初に、2つの組換え株、すなわち、YA3370-20及びYA3371-46を取得する。これらの2つの株を、本発明による改変の一部のみを含むように、組換えた。
【０５８３】
したがって、これらの2つの株を以下に示す。
YA3370-20: ade2、can1::[pACU1-AAT2-tRPL3-pCUP1-1-PPC-5.Ec-tTPI1]x4、his3::[pACU5-HOM2-2-tRPL3-pTDH3-GDH-2.Eca-tIDP1]x4、hom6::[URA3-pCCW12-ECTB.He-tIDP1]x5、leu2、lyp1::[pPDC1-ECTA.He-tCYC1-pTDH3-ECTC.He-tTDH3]x2、pyk1::[LEU2.Kl-RS、pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1、pTEF3-AQR1-tRPL41B、pCUR3-PYK1-tPYK1]、sam3::[pPDC1-METX.Cg-tRPL3-pTDH3-MHPF.ec-tIDP1]x2、trp1::[pPDC1-PPC-5.Ec-tRPL3-pACU7-AK.Bs-tIDP1-TRP1]x6、ura3
YA3371-46: ade2、can1::[pACU1-AAT2-tRPL3-pCUP1-1-PPC-5.Ec-tTPI1]x4、his3::[pACU5-HOM2-2-tRPL3-pTDH3-GDH-2.Eca-tIDP1]x4、hom6::[URA3-pCCW12-ECTB.He-tIDP1]x5、leu2、lyp1::[pPDC1-ECTA.He-tCYC1-pTDH3-ECTC.He-tTDH3]x2、pyk1::[LEU2.Kl-RS、pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1、pTEF3-AQR1-tRPL41B、pCUR3-PYK1-tPYK1]、sam3::[pCCW12-ECTB.Pa-tRPL3-pTDH3-MHPF.Ec-tRPL41B]x4、trp1::[pPDC1-PPC-5.Ec-tRPL3-pACU7-AK.Bs-tIDP1-TRP1]x6、ura3
【０５８４】
PEPCK-1は、位置2のアルギニンアミノ酸をグリシンにより改変することによって安定化されたPEPCKの形態である。
【０５８５】
PPC-5は、アラニンがN+1に付加されたPPCのより安定な形態である。
【０５８６】
これらの株をすべて、YE(酵母抽出物)2%及びグルコース8%において24時間増殖させ、8時間後に500μMのCuSO4を添加した。培地中のエクトインの含有量は、24時間後に、製造元の推奨に従って、Waters社製のAccQ-Tag Ultra誘導体化キットを使用して、アミノ酸を測定するAccQ-Tagプレカラム誘導体化法を用いてアッセイした。
【０５８７】
これらの異なる株により得られたエクトインの量はそれぞれ以下の通りである、
-  YA3370-20:1g/L-1。
-  YA3371-46:1.55g/L-1。
【０５８８】
比較すると、天然株はエクトインを産生しない。
【０５８９】
この比較実験から、本発明による改変を含む組換え株は、本発明によるすべての遺伝子改変を含まない他の組換え株と同じ条件で培養すると、より多くのエクトインを産生するという結果になる。
【０５９０】
B.5つの他の組換え株、すなわち、YA3380-40B、YA3595-25、及びYA3595-34も取得した。
【０５９１】
これらの3つの株を以下に示す。
YA3380-40B: gnp1::[LEU2.Kl-RS、pADH1-AAT2-tRPL15A、pTEF3-MDH3-1-tRPL3、pPDC1-PEPCK-1.Ec-tMET25、pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1、pCCW12-ME3.At-tRPL3、pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1、pCCW12-ME3.At-tRPL3、pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1、pCCW12-ME3.At-tRPL3、pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1、pCCW12-ME3.At-tRPL3]、his3::[pACU5-ME3.At- tRPL3 -pACU6-METX-1.Cg-tIDP1]x11、hom6::[ TRP1.Kl、pCCW12.Sba-HOM3-tDIT1]、leu2、mup3::[HIS5.Sp、pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3、pCCW12-HOM2-1-tTDH3、pPGK1-AAT2-tTDH2、pENO2-MDH3-1-tRPL15A、pCUP1-1-GDH-2.Eca-tTPI1、pTDH3.Sba-ECTB.He-tIDP1、pPDC1-ECTA.He-tRPL41B、pTEF1.Sba-ECTC.He-tRPL15A]、pyk1::[LEU2.Kl、pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1、pPDC1-MDH3-1-tRPL15A、pTEF3-TPO1-tENO2、pCUR3-PYK1-7-tCYC1]、trp1、ura3
YA3595-25: ade2、gnp1::[LEU2.Kl-RS、pADH1-AAT2-tRPL15A、pTEF3-MDH3-1-tRPL3、pPDC1-PEPCK-1.Ec-tMET25、pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1、pCCW12-ME3.At-tRPL3、pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1、pCCW12-ME3.At-tRPL3、pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1、pCCW12-ME3.At-tRPL3、pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1、pCCW12-ME3.At-tRPL3]、his3、hom6::[ TRP1.Kl、pCCW12.Sba-HOM3-tDIT1]、leu2、mup3::[HIS5.Sp、pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3、pCCW12-HOM2-1-tTDH3、pPGK1-AAT2-tTDH2、pENO2-MDH3-1-tRPL15A、pCUP1-1-GDH-2.Eca-tTPI1、pTDH3.Sba-ECTB.He-tIDP1、pPDC1-ECTA.He-tRPL41B、pTEF1.Sba-ECTC.He-tRPL15A]、pyk1::[ LEU2.Kl、pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1、pPDC1-MDH3-1-tRPL15A、pTEF3-TPO1-tENO2、pCUR3-PYK1-7-tCYC1]、sam3::[ pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3 -pCUP1-1-HOM3-tDIT1]x7、trp1、ura3::[ pCCW12-ECTB.Ab- tRPL3 -pTDH3-ECTC.He-tRPL41B.Sba]x14
YA3595-34: ade2、gnp1::[LEU2.Kl-RS、pADH1-AAT2-tRPL15A、pTEF3-MDH3-1-tRPL3、pPDC1-PEPCK-1.Ec-tMET25、pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1、pCCW12-ME3.At-tRPL3、pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1、pCCW12-ME3.At-tRPL3、pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1、pCCW12-ME3.At-tRPL3、pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1、pCCW12-ME3.At-tRPL3]、his3、hom6::[TRP1.Kl、pCCW12.Sba-HOM3-tDIT1]、leu2、mup3::[HIS5.Sp、pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3、pCCW12-HOM2-1-tTDH3、pPGK1-AAT2-tTDH2、pENO2-MDH3-1-tRPL15A、pCUP1-1-GDH-2.Eca-tTPI1、pTDH3.Sba-ECTB.He-tIDP1、pPDC1-ECTA.He-tRPL41B、pTEF1.Sba-ECTC.He-tRPL15A]、pyk1::[LEU2.Kl、pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1、pPDC1-MDH3-1-tRPL15A、pTEF3-TPO1-tENO2、pCUR3-PYK1-7-tCYC1]、sam3::[pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3 -pCUP1-1-HOM3-tDIT1]x7、trp1、ura3::[ pCCW12-ECTB.Ab- tRPL3 -pTDH3-ECTC.He-tRPL41B.Sba]x9
【０５９２】
YA3380-40B株及びYA3595-25株を、YPA培地(1%酵母抽出物、2%ペプトン、0.01%アデニンヘミ硫酸)、グルコース8%、(NH4)2SO4 50mM、及びメチオニン0.5mM及びスレオニン0.85mMにおいて、24時間増殖させた。培地中のエクトインの含有量は、24時間後に、製造元の推奨に従って、Waters社製のAccQ-Tag Ultra誘導体化キットを使用して、アミノ酸を測定するAccQ-Tagプレカラム誘導体化法を用いてアッセイした。
【０５９３】
PEPCK-1は、位置2のアルギニンアミノ酸をグリシンにより改変することによって安定化されたPEPCKの形態である。
【０５９４】
これらの2つの株により得られたエクトインの量はそれぞれ以下の通りである、
-  YA3380-40B:211mg/L-1。
-  YA3595-25:1.29g/L-1。
【０５９５】
比較すると、天然株はエクトインを産生しない。
【０５９６】
YA3595-34株並びにYA3595-25株を、YPA培地(1%酵母抽出物、2%ペプトン、0.01%アデニンヘミ硫酸)、サッカロース8%、(NH4)2SO4 50mM、及びメチオニン0.5mM及びスレオニン0.85mMにおいて、24時間増殖させた。培地中のエクトインの含有量は、24時間後に、製造元の推奨に従って、Waters社製のAccQ-Tag Ultra誘導体化キットを使用して、アミノ酸を測定するAccQ-Tagプレカラム誘導体化法を用いてアッセイした。
【０５９７】
これらの2つの株により得られたエクトインの量はそれぞれ以下の通りである、
-  YA3595-25:2.63g/L-1。
-  YA3595-34:2.58g/L-1。
【０５９８】
比較すると、天然株はエクトインを産生しない。
【０５９９】
この比較実験から、本発明による改変を含む組換え株は、本発明によるすべての遺伝子改変を含まない他の組換え株と同じ条件で培養すると、より多くのエクトインを産生するという結果になる。
【０６００】
C.3つの他の組換え株、すなわち、YA4440,YA4442及びYA4444も取得した。
【０６０１】
これらの3つの株を以下に示す。
YA4440:MAT-α、gnp1::[ LEU2.Kl-RS、pADH1-AAT2-tRPL15A、pTEF3-MDH3-1-tRPL3、pPDC1-PEPCK-1.Ec-tMET17、pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1、pCCW12-ME3.At-tRPL3、pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1、pCCW12-ME3.At-tRPL3、pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1、pCCW12-ME3.At-tRPL3、pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1、pCCW12-ME3.At-tRPL3]、his3::[HIS3-pACU5-ME3.At-tRPL3、pACU6-METX-1.Cg-tIDP1]x5、hom6::[TRP1.Kl-RS、pCCW12.Sba-HOM3-tDIT1]、leu2、lys2Δ201、mup3::[HIS5.sp-RS、pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3、pCCW12-HOM2-1-tTDH3、pPGK1-AAT2-tTDH2、pENO2-MDH3-1-tRPL15A、pCUP1-1-GDH-21.Eca-tTPI1、pTDH3.Sba-ECTB.He-tIDP1、pPDC1-ECTA.He-tRPL41B、pTEF1.Sba-ECTC.He-tRPL15A]、pyk1::[ LEU2.Kl-RS、pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1、pPDC1-MDH3-1-tRPL15A、pTEF3-TPO1-tENO2、pCUR3-PYK1-7-tCYC1]、sam3::[pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3、pCUP1-1-HOM3-tDIT1-sam3]x5、trp1、trp4::[LYS2-loxP、pCCW12 -PEPCK-1.Ec-tTPI1、pCCW12-GDH2-tRPL3、pCCW12-METX-1.Cg-tRPL41B.Sba、pCCW12.Sba-HOM3-tRPL15A]、ura3::[ECTB.Ab-ECTC.He-URA3]x7
YA4442:MAT-α、gnp1::[ LEU2.Kl-RS、pADH1-AAT2-tRPL15A、pTEF3-MDH3-1-tRPL3、pPDC1-PEPCK-1.Ec-tMET17、pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1、pCCW12-ME3.At-tRPL3、pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1、pCCW12-ME3.At-tRPL3、pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1、pCCW12-ME3.At-tRPL3、pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1、pCCW12-ME3.At-tRPL3]、his3::[HIS3-pACU5-ME3.At-tRPL3、pACU6-METX-1.Cg-tIDP1]x5、hom6::[TRP1.Kl-RS、pCCW12.Sba-HOM3-tDIT1]、leu2、lys2Δ201、mup3::[HIS5.sp-RS、pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3、pCCW12-HOM2-1-tTDH3、pPGK1-AAT2-tTDH2、pENO2-MDH3-1-tRPL15A、pCUP1-1-GDH-21.Eca-tTPI1、pTDH3.Sba-ECTB.He-tIDP1、pPDC1-ECTA.He-tRPL41B、pTEF1.Sba-ECTC.He-tRPL15A]、pyk1::[ LEU2.Kl-RS、pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1、pPDC1-MDH3-1-tRPL15A、pTEF3-TPO1-tENO2、pCUR3-PYK1-7-tCYC1]、sam3::[pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3、pCUP1-1-HOM3-tDIT1-sam3]x5、trp1、trp4::[LYS2-loxP、pCCW12 -PEPCK-1.Ec-tTPI1、pCCW12-GDH1-tRPL3、pCCW12-METX-1.Cg-tRPL41B.Sba、pCCW12.Sba-HOM3-tRPL15A]、ura3::[ECTB.Ab-ECTC.He-URA3]x7
YA4444:MAT-α、gnp1::[ LEU2.Kl-RS、pADH1-AAT2-tRPL15A、pTEF3-MDH3-1-tRPL3、pPDC1-PEPCK-1.Ec-tMET17、pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1、pCCW12-ME3.At-tRPL3、pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1、pCCW12-ME3.At-tRPL3、pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1、pCCW12-ME3.At-tRPL3、pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1、pCCW12-ME3.At-tRPL3]、his3::[HIS3-pACU5-ME3.At-tRPL3、pACU6-METX-1.Cg-tIDP1]x5、hom6::[TRP1.Kl-RS、pCCW12.Sba-HOM3-tDIT1]、leu2、lys2Δ201、mup3::[HIS5.sp-RS、pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3、pCCW12-HOM2-1-tTDH3、pPGK1-AAT2-tTDH2、pENO2-MDH3-1-tRPL15A、pCUP1-1-GDH-21.Eca-tTPI1、pTDH3.Sba-ECTB.He-tIDP1、pPDC1-ECTA.He-tRPL41B、pTEF1.Sba-ECTC.He-tRPL15A]、pyk1::[ LEU2.Kl-RS、pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1、pPDC1-MDH3-1-tRPL15A、pTEF3-TPO1-tENO2、pCUR3-PYK1-7-tCYC1]、sam3::[pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3、pCUP1-1-HOM3-tDIT1-sam3]x5、trp1、trp4::[LYS2-loxP、pCCW12 -PEPCK-1.Ec-tTPI1、pCCW12-GDH2.Eca-tRPL3、pCCW12-METX-1.Cg-tRPL41B.Sba、pCCW12.Sba-HOM3-tRPL15A]、ura3::[ECTB.Ab-ECTC.He-URA3]x7
【０６０２】
GDH1及びGDH2は、内在性のサッカロマイセス・セレヴィシエ酵素であり、GDH2.Ecaはエントジニウム・カウダツム由来のGDH酵素である。
【０６０３】
これらの株は、エルレンマイヤーフラスコ中の、酵母抽出物2%、スクロース8%、メチオニン0.5mM、スレオニン4.2mM、尿素50mM、ビタミンB5 4μM、ビタミンB1 6μM、ビタミンB6 10μM、ビタミンB10 1.5μM、ビタミンB3 2.9μM、ビタミンB2 0.5μM、ビタミンB8 0.08μM、ビタミンB9 4.5nM、CuSO4 500μMにおいて、16時間28°Cで増殖させた。16時間後、500μMのCuSO4及び100mMの尿素を加え、培養物を更に8時間増殖させた。
【０６０４】
次に、エクトインをHPLC-UVによって検出したことを除いて、基本的に、Ono Hら、(1999) Journal of Bacteriology、p91〜99に記載されているようにして、エクトイン産生を評価した。
【０６０５】
これらの条件下で、YA4440は6.4g/Lのエクトインを産生し、YA4442は4.7g/Lのエクトインを産生し、YA4444は6.1g/Lのエクトインを産生した。これらの同じ条件では、野生型株(例えば、非組換え体)は検出可能量のエクトインを産生しないことが想起される。
【０６０６】
これら3つの株は同一であるが、GDH酵素が過剰発現している。上記の結果は、NADH依存性GDH(YA4440のGDH2及びYA4444のGDH2.Eca)の過剰発現によって、NADPH依存性GDH(YA4442のGDH1)の過剰発現よりも多くのエクトインの産生が可能になることを示している。
【０６０７】
したがって、NADH依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼの過剰発現によって、NADPH依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(GDH1)の過剰発現よりも多くのエクトインの産生が可能になる。
【配列表】
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