(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
豚サーコウイルス感染を予防及び／又は治療するワクチン組成物であって、
前記ワクチン組成物は、免疫量の豚サーコウイルス３型抗原と、免疫量の豚サーコウイルス２型抗原と、薬学的に許容可能な担体とを含み、
前記豚サーコウイルス３型抗原は豚サーコウイルス３型ＳＧ株抗原であり、前記ＳＧ株の寄託番号はＣＣＴＣＣ  ＮＯ．Ｖ２０１７１２であり、前記豚サーコウイルス２型抗原は豚サーコウイルス２型ＨＨ３株抗原であり、前記ＨＨ３株の寄託番号はＣＣＴＣＣ  ＮＯ．Ｖ２０１７２６であることを特徴とする
ワクチン組成物。
【請求項２】
前記豚サーコウイルス３型ＳＧ株抗原は豚サーコウイルス３型ＳＧ株又はその培養物の不活化全粒子ウイルス抗原であり、前記豚サーコウイルス３型ＳＧ株の培養物は１世代目以上の培養物であり、
前記豚サーコウイルス２型ＨＨ３株抗原は豚サーコウイルス２型ＨＨ３株又はその培養物の不活化全粒子ウイルス抗原であり、前記豚サーコウイルス２型ＨＨ３株の培養物は１世代目以上の培養物である請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
前記豚サーコウイルス３型ＳＧ株の培養物は５世代目以上の培養物であり、前記豚サーコウイルス２型ＨＨ３株の培養物は５世代目以上の培養物である請求項２に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
前記豚サーコウイルス３型ＳＧ株の培養物は５〜５５世代目の培養物であり、前記豚サーコウイルス２型ＨＨ３株の培養物は５〜４８世代目の培養物である請求項２に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
前記豚サーコウイルス３型ＳＧ株又はその培養物の不活化全粒子ウイルス抗原の含有量は不活化前が１０５．０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ以上であり、前記豚サーコウイルス２型ＨＨ３株又はその培養物の不活化全粒子ウイルス抗原の含有量は不活化前が１０５．０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ以上である請求項２に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
前記豚サーコウイルス３型ＳＧ株又はその培養物の不活化全粒子ウイルス抗原の含有量は不活化前が１０５．０〜１０７．０ＴＣＩＤ５０／ｍｌであり、前記豚サーコウイルス２型ＨＨ３株又はその培養物の不活化全粒子ウイルス抗原の含有量は不活化前が１０５．０〜１０７．０ＴＣＩＤ５０／ｍｌである請求項２に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
前記豚サーコウイルス３型ＳＧ株又はその培養物の不活化全粒子ウイルス抗原の含有量は不活化前が１０６．０ＴＣＩＤ５０／ｍｌであり、前記豚サーコウイルス２型ＨＨ３株又はその培養物の不活化全粒子ウイルス抗原の含有量は不活化前が１０６．０ＴＣＩＤ５０／ｍｌである請求項２に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
前記薬学的に許容可能な担体はアジュバントであり、前記アジュバントは、ホワイトオイル、ドレイクオイル、及び動物油、植物油又はミネラルオイル、或いは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム及び金属塩、或いは、水中にポリアクリル酸ナトリウムのゲル粒子を含むポリマーベースアジュバント、カルボマー、スクワラン又はスクアレン、ＩＳＡ２０６アジュバント、サポニン、油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョン、水中油中水型エマルジョンを含み、
前記アジュバントの含有量は５〜２０Ｖ／Ｖ％である請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
前記アジュバントは水中にポリアクリル酸ナトリウムのゲル粒子を含むポリマーベースアジュバントである請求項８に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
前記アジュバントの含有量は１０Ｖ／Ｖ％である請求項８に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
請求項１乃至１０のいずれか一項に記載のワクチン組成物の豚サーコウイルス感染による関連疾患を予防及び／又は治療する医薬の調製における使用であって、
前記豚サーコウイルス感染による関連疾患は、豚サーコウイルス２型の異なる遺伝子サブタイプ及び豚サーコウイルス３型の単独感染又は豚サーコウイルス２型の異なる遺伝子サブタイプ及び豚サーコウイルス３型の混合感染による関連疾患である、
ことを特徴とする、ワクチン組成物の豚サーコウイルス感染による関連疾患を予防及び／又は治療する医薬の調製における使用。
【請求項１２】
前記豚サーコウイルス感染による関連疾患は、離乳後仔豚多臓器性発育不良症候群と、豚皮膚炎腎症症候群と、繁殖障害と、心臓及び多臓器系炎症性反応とを含む請求項１１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、豚サーコウイルスの感染を予防及び／又は治療する２種混合ワクチン組成物、調製方法及び用途に関し、動物ウイルス学分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
豚サーコウイルス（Ｐｏｒｃｉｎｅ  ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓｅｓ、ＰＣＶ）は環状一本鎖ＤＮＡウイルスであり、ゲノム長さが約１.７ｋｂであり、最も小さい動物ＤＮＡウイルスの一つである。既に二種類のＰＣＶ、即ち、豚サーコウィルス１型（ＰＣＶ１）及び豚サーコウィルス２型（ＰＣＶ２）が存在することが確定されている。ＰＣＶ１は１９７４年初めにＰＫ細胞培養物の中で一種の汚染物質として鑑定して発見されたが、ＰＣＶ１は豚に対して病原性がない。ＰＣＶ２は１９９８年初めに報道され、ＰＣＶ２は臨床条件下で豚の豚サーコウィルス関連疾患（Ｐｏｒｃｉｎｅ  ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅｓ、ＰＣＶＡＤ）を引き起こすことが可能であり、主に離乳後仔豚多臓器性発育不良症候群、肺炎、豚皮膚炎、腎症症候群及び繁殖障害を引き起こし、主に呼吸、泌尿、腸管、リンパ、心血管、神経、繁殖システム及び皮膚の機能障害として現れ、全世界の生豚の養殖に深刻な経済的損失をもたらしている。
【０００３】
臨床的に、ＰＣＶ２ワクチンの普遍的な応用に伴い、免疫圧力の下で、ＰＣＶ２の変異速度が速まり、ＰＣＶ２ｂとＰＣＶ２ｄの間に介在する一種類の新たな遺伝子サブタイプのウイルス株が流行し始めるが、この種類のウイルスの特徴として、ＯＲＦ２遺伝子に突然変異が存在するか又は異なる遺伝子サブタイプの組み換えが存在する。当該新たなＰＣＶ２遺伝子サブタイプウイルス株の流行によって、その抗原と既存の遺伝子サブタイプの間に差異が存在し、既存の商品化されたワクチンはいずれもＰＣＶ２ａ又はＰＣＶ２ｂをワクチン株として調製されたものであり、最新流行するＰＣＶ２ウイルス株に対する完全な防御を行うことができない。
【０００４】
ある豚の繁殖障害症例において、ウイルスゲノムが２．０ｋｂであるサーコウイルスが１株分離され、後続的な試験の結果として、当該サーコウイルスは既知のサーコウイルスとのホモロジーが、ヌクレオチド配列であれアミノ酸配列であれ、いずれも５０％より小さいことが実証された。国際ウイルス学分類委員会の標準によると、サーコウイルス属のうち同一種類に属するウイルスは７５％より大きいゲノムヌクレオチド配列のホモロジーを有し、Ｃａｐタンパク質は７０％より大きいアミノ酸配列のホモロジーを有するべきである。これにより、当該ウイルスは一種の新たな豚サーコウィルス（ＰＣＶ３）であると確定されることができる。
【０００５】
最初、早くも１９８５年に、ＰＣＶ２によって引き起こされたシステム疾患が既に散発的な状態で勃発したが、重視できなかったことが原因として、１９９０年代末期に当該疾患が大規模に勃発した。新たな豚サーコウイルスは、豚皮膚炎腎症症候群（Ｐｏｒｃｉｎｅ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＰＤＮＳ）及び繁殖障害の面でＰＣＶ２と類似した病原学特性を持ち、ＰＣＶ２とＰＣＶ３の間でタンパク質のホモロジーが非常に低く、ＰＣＶ２ワクチンではＰＣＶ３に対する効果的な予防及び交差防御を行うことができない。
【０００６】
新たな豚サーコウイルスはＰＣＶ２の既存のこと及び新たな遺伝子サブタイプの間の混合感染は臨床的なＰＣＶ感染の複雑な状況をさらに悪化させるため、当該新たな臨床疫病に対して新たなワクチン組成物を調製するのは養豚場疾患防除にとって非常に重要である。
【発明の概要】
【０００７】
先行技術の不足を解決するために、本発明は豚サーコウイルスの混合感染を予防及び／又は治療するワクチン組成物を提供する。当該ワクチン組成物は、異なる種類の豚サーコウイルスの混合感染に対して効果的な防御することができ、著しい免疫特性を表している。
【０００８】
本発明の一目的は、豚サーコウイルスの感染を予防及び／又は治療するワクチン組成物を提供することである。前記ワクチン組成物は、免疫量の豚サーコウイルス３型抗原と、免疫量の豚サーコウイルス２型抗原と、薬学的に許容可能な担体とを含む。
【０００９】
本発明の別の一目的は、異なる豚サーコウイルス及び異なる遺伝子サブタイプの豚サーコウイルス２型の混合感染を予防及び／又は治療するワクチン組成物を提供することである。
【００１０】
本発明の別の一目的は、異なる地域由来の豚サーコウイルスの感染を予防及び／又は治療するワクチン組成物を提供することである。
【００１１】
本発明の別の一目的は、豚サーコウイルスの感染を予防及び／又は治療するワクチン組成物の調製方法を提供することである。前記ワクチン組成物の調製方法は、豚サーコウイルス３型ウイルス及び豚サーコウイルス２型ウイルスをそれぞれ増殖させるステップ（１）と、前記ステップ（１）で増殖された豚サーコウイルス３型ウイルス及び増殖された豚サーコウイルス２型ウイルをそれぞれ不活化するスステップ（２）と、前記ステップ（２）で不活化された豚サーコウイルス３型ウイルス抗原及び不活化された豚サーコウイルス２型ウイルス抗原を比率で混合し、アジュバントを加えて乳化させるステップ（３）とを含む。
【００１２】
本発明の別の一目的は、上記のワクチン組成物の豚サーコウイルスの感染関連疾患を予防及び／又は治療する医薬の調製における用途を提供することである。
【００１３】
発明の利点として、
【００１４】
（１）本発明に係るワクチン組成物は、良好な免疫原性を有し、一回免疫することで、有機体が急速に免疫力を生じるように刺激でき、流行株からの攻撃を効果的に防御し、かなり良い防御する役割を有し、比較的に低い抗原含有量で良好な免疫防御する役割を達成でき、製造コストをさらに削減する。
【００１５】
（２）本発明は、初めに豚サーコウイルス３型及び豚サーコウイルス２型のウイルス株により調製されたワクチン組成物を採用し、豚サーコウイルス２型及び豚サーコウイルス３型の感染又は混合感染に対して免疫防御を行うことができるし、異なる遺伝子サブタイプの豚サーコウイルス２型ウイルス株の感染又は混合感染に対しても防御を行うことができる。
【００１６】
（３）本発明に係るワクチンは、異なる地域由来の豚サーコウイルス３型ウイルス株及び豚サーコウイルス２型ウイルス株の混合感染に対して完全に防御することができ、幅広く防御することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の実施形態を説明する。
【００１８】
「豚サーコウイルス３型」は、ゲノム２．０ｋｂのサーコウイルスであって、既知のサーコウイルスとのホモロジーがヌクレオチド配列であれ、アミノ酸配列であれ、いずれも５０％より小さく、新たな豚サーコウィルスである。豚サーコウイルス３型は多様な病原と混合感染して豚皮膚炎腎症症候群、増殖性壊死性肺炎、繁殖障害、並びに心臓及び多臓器系炎症性反応を引き起こすことが可能である。
【００１９】
「豚サーコウイルス２型新（ｎｅｗ）遺伝子サブタイプ」は、新たなＰＣＶ２遺伝子サブタイプであって、そのＯＲＦ２遺伝子に突然変異が存在するか又は異なる遺伝子サブタイプの組み換えが存在し、ＰＣＶ２ｂの標識配列を有するが、遺伝進化解析で一つの独立的なブウランチを構成することを指す。豚が当該遺伝子サブタイプのウイルス株に感染した後に現れる臨床的特徴として、持続的な高温、食欲減退、気分の沈み、乱雑な被毛、痩せ細り及び成長速度の減速、剖検でいずれも異なる程度の肺硬変あり、リンパ腫大、腎臓に壊死箇所有りということである。
【００２０】
本発明は豚サーコウイルスの感染を予防及び／又は治療するワクチン組成物に関し、前記ワクチン組成物は免疫量の豚サーコウイルス３型抗原と、免疫量の豚サーコウイルス２型抗原と、薬学的に許容可能な担体とを含む。
【００２１】
豚サーコウイルスの混合感染に対して調製されたワクチン組成物は、免疫量の豚サーコウイルス３型又はその培養物の不活化抗原、弱毒全粒子ウイルス抗原、免疫量の豚サーコウイルス２型又はその培養物の不活化抗原、弱毒全粒子ウイルス抗原、及び薬学的に許容可能な担体を含むことが可能である。
【００２２】
本発明に係るワクチン組成物に含まれる豚サーコウイルス３型抗原及び豚サーコウイルス２型抗原は良好な免疫原性を有し、低い含有量で急速に免疫反応を活性化でき、豚に対してウイルス株からの攻撃を防御する。
【００２３】
「ワクチン組成物」は、豚サーコウイルス３型及び２型免疫原性を含有する医薬組成物を指す。当該医薬組成物は、豚の豚サーコウイルス３型及び２型に対する免疫反応を誘発、刺激又は強化することができる。
【００２４】
「不活化抗原」は、失活ワクチンとも称され、免疫力を生じるように抗原として用いられる不活化ウイルスの懸濁液を指す。不活化ワクチンの例は、ウイルス全粒子ワクチンと、スプリットワクチンとを含む。既知の方法により不活化ワクチンを容易に生成することができる。例えば、ウイルスをホルムアルデヒド水溶液で処理することで、不活化ウイルス全粒子ワクチンを取得することができる。スプリットワクチンは、エーテルで処理を行った後、ウイルスのエンベロープにより調製して得ることができる。
【００２５】
「弱毒全粒子ウイルス抗原」は、毒力が既に弱まったが、依然として宿主体内又は細胞上で複製され得るウイルスを指す。本発明で使用される用語「弱毒」は、病原に病原性をなくさせるが免疫原性を保持するように遺伝子に対して突然変異を行って、病原体の毒性を人工的に低下させることを指す。通常、ＵＶ放射線、化学処理又は体外連続高次継代培養により弱毒を図る。或いは、人工的な遺伝子変更により、例えば、毒力を弱めるように既知の配列における特定ヌクレオチドを欠失させる。
【００２６】
本発明の一実施形態として、本発明に係るワクチン組成物において、前記豚サーコウイルス３型抗原は豚サーコウイルス３型ＳＧ株抗原であり、前記ＳＧ株の寄託番号はＣＣＴＣＣ  ＮＯ．Ｖ２０１７１２であり、前記豚サーコウイルス２型抗原は豚サーコウイルス２型ＨＨ３株抗原であり、前記ＨＨ３株の寄託番号はＣＣＴＣＣ  ＮＯ．Ｖ２０１７２６である。
【００２７】
豚サーコウイルス３型ＳＧ株（Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ３、ｓｔｒａｉｎ  ＳＧ）は中国典型培養物保蔵センターに寄託され、寄託番号はＣＣＴＣＣ  ＮＯ．Ｖ２０１７１２であり、寄託日付は２０１７年３月２３日であり、寄託住所は中国武漢・武漢大学である。
【００２８】
本発明に係る新たな豚サーコウイルス２型は、ゲノム全長が１７６８個のヌクレオチドであり、ＰＣＶ２ｂの標識配列を有するが、遺伝進化解析で一つの独立的なブウランチを構成し、そのＯＲＦ２遺伝子に突然変異又は異なる遺伝子サブタイプの組み換えが存在し、新たなＰＣＶ２遺伝子サブタイプである。
【００２９】
豚サーコウイルス２型ＨＨ３株（Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ２、ｓｔｒａｉｎ  ＨＨ３）は、中国典型培養物保蔵センターに寄託され、寄託番号はＣＣＴＣＣ  ＮＯ．Ｖ２０１７２６であり、寄託日付は２０１７年６月４日であり、寄託住所は中国武漢・武漢大学である。
【００３０】
本発明に係るワクチン組成物に使用されるウイルス株は良好な免疫原性を有し、それから調製されたワクチン組成物は低い含有量で免疫システムを効果的に刺激でき、一回免疫することで、急速に免疫効力を生じることができ、有機体に対して完全に防御することができ、防御率は１００％に達し得る。
【００３１】
本発明に係るワクチン組成物はＰＣＶ２の異なる遺伝子サブタイプ及びＰＣＶ３の単独感染及び混合感染に対して完全に防御することができる。
【００３２】
本発明に係るワクチン組成物は、異なる地域由来のウイルス株に対して効果的に防御することができ、ワクチンの応用範囲を拡大させる。
【００３３】
本発明の一実施形態として、本発明に係るワクチン組成物において、前記豚サーコウイルス３型ＳＧ株抗原は豚サーコウイルス３型ＳＧ株又はその培養物の不活化全粒子ウイルス抗原であり、前記豚サーコウイルス３型ＳＧ株の培養物は１世代目以上の培養物であり、前記豚サーコウイルス２型ＨＨ３株抗原は豚サーコウイルス２型ＨＨ３株又はその培養物の不活化全粒子ウイルス抗原であり、前記豚サーコウイルス２型ＨＨ３株の培養物は１世代目以上の培養物である。
【００３４】
「培養物」とは、ウイルスの異なる世代目の継代培養物であり、異なる世代の間の遺伝子配列には僅かにごく小さい変異が発生し得ることが当業者に自明である。
【００３５】
本発明の好ましい一実施形態として、本発明に係るワクチン組成物において、前記豚サーコウイルス３型ＳＧ株の培養物は５世代目以上の培養物であり、前記豚サーコウイルス２型ＨＨ３株の培養物は５世代目以上の培養物である。
【００３６】
本発明のより好ましい一実施形態として、本発明に係るワクチン組成物において、前記豚サーコウイルス３型ＳＧ株の培養物は５〜５５世代目の培養物であり、前記豚サーコウイルス２型ＨＨ３株の培養物は５〜４８世代目の培養物である。
【００３７】
本発明に係る組成物の成分又は組成の量は治療有効量であることが好ましい。前記治療有効量は、過度な副作用を起こすことがなく、組成物が施用される宿主の中でそれらの免疫学上の効果が得られる必要的な量であることを指す。用いられる成分及び施用されるべき組成物の正確な量は、例えば、治療する疾患の種類、治療すべき動物の種類と年齢、施用される方式、及び組成物における他の成分のような多様な因子によって変わる。
【００３８】
本発明の一実施形態として、本発明に係るワクチン組成物において、前記豚サーコウイルス３型ＳＧ株又はその培養物の不活化全粒子ウイルス抗原の含有量は不活化前が１０５．０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ以上であり、前記豚サーコウイルス２型ＨＨ３株又はその培養物の不活化全粒子ウイルス抗原の含有量は不活化前が１０５．０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ以上である。
【００３９】
本発明に係るワクチン組成物における豚サーコウイルス３型ＳＧ株又はその培養物の不活化全粒子ウイルス抗原は良好な免疫原性を有し、一回免疫することで、有機体が急速に免疫力を生じるように刺激でき、不活化前の１０５．０ＴＣＩＤ５０／ｍｌである含有量を使用する場合においても良好な免疫防御する役割を達成でき、１００％の防御率を図る。
【００４０】
本発明に係るワクチン組成物における豚サーコウイルス２型ＨＨ３株の不活化全粒子ウイルス抗原は、良好な免疫原性を有し、一回免疫することで、有機体が急速に免疫力を生じるように刺激でき、不活化前の１０５．０ＴＣＩＤ５０／ｍｌである含有量を使用する場合においても良好な免疫防御する役割を達成でき、１００％の防御率を図る。
【００４１】
本発明の好ましい一実施形態として、本発明に係るワクチン組成物において、前記豚サーコウイルス３型ＳＧ株又はその培養物の不活化全粒子ウイルス抗原の含有量は不活化前が１０５．０〜１０７．０ＴＣＩＤ５０／ｍｌであり、前記豚サーコウイルス２型ＨＨ３株又はその培養物の不活化全粒子ウイルス抗原の含有量は不活化前が１０５．０〜１０７．０ＴＣＩＤ５０／ｍｌである。
【００４２】
本発明のより好ましい一実施形態として、本発明に係るワクチン組成物において、前記豚サーコウイルス３型ＳＧ株又はその培養物の不活化全粒子ウイルス抗原の含有量は不活化前が１０６．０ＴＣＩＤ５０／ｍｌであり、前記豚サーコウイルス２型ＨＨ３株又はその培養物の不活化全粒子ウイルス抗原の含有量は不活化前が１０６．０ＴＣＩＤ５０／ｍｌである。
【００４３】
本発明に係るワクチン組成物において、前記豚サーコウイルス３型ＳＧ株又はその培養物の不活化全粒子ウイルス抗原の含有量の範囲は、１０５．０〜１０６．０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ又は１０６．０〜１０７．０ＴＣＩＤ５０／ｍｌから選択されることも可能である。前記豚サーコウイルス２型ＨＨ３株又はその培養物の不活化全粒子ウイルス抗原の含有量の範囲は、１０５．０〜１０６．０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ又は１０６．０〜１０７．０ＴＣＩＤ５０／ｍｌから選択されることも可能である。
【００４４】
本発明の一実施形態として、本発明に係るワクチン組成物において、前記薬学的に許容可能な担体はアジュバントであり、前記アジュバントは、ホワイトオイル、ドレイクオイル、及び動物油、植物油又はミネラルオイル、或いは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム及び金属塩、或いは、ＭｏｎｔａｎｉｄｅＴＭＧｅｌ、カルボマー、スクワラン又はスクアレン、ＩＳＡ２０６アジュバント、サポニン、油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョン、水中油中水型エマルジョンを含む。
【００４５】
本発明の好ましい一実施形態として、本発明に係るワクチン組成物において、前記アジュバントはＭｏｎｔａｎｉｄｅＴＭＧｅｌである。
【００４６】
本発明に係る組成物に適用されるアジュバントの量は、有効量であることが好ましい。前記「有効量」は、アジュバントが本発明に係る抗原と併用される際、過度な副作用を起こすことがなく、宿主の中でそれらの免疫学上の効果が得られることに対して、必要的な、或いは十分的な量であることを指す。施用されるべきアジュバントの正確な量は、例えば、用いられる成分、治療する疾患の種類、治療すべき動物の種類と年齢、施用される方式、及び組成物における他の成分のような多様な因子によって変わる。
【００４７】
本発明の一実施形態として、本発明に係るワクチン組成物において、前記アジュバントの含有量は５〜２０Ｖ／Ｖ％である。
【００４８】
本発明の好ましい一実施形態として、本発明に係るワクチン組成物において、前記アジュバントの含有量は１０Ｖ／Ｖ％である。
【００４９】
本発明に係るワクチン組成物は、利用可能な技術を採用して配合することができ、薬学的に許容可能な担体と共に配合することが好ましい。例えば、オイルは、配合物を安定させるのに寄与するだけでなく、ワクチンアジュバントとしても機能する。油アジュバントは、自然由来であっても良いし、人工合成により得られたものであっても良い。
【００５０】
用語「アジュバント」は、組成物の免疫原性を高めるように、本発明の組成物の中に加えられる物質を指す。既知のアジュバントは、（１）水酸化アルミニウム、サポニン（Ｓａｐｏｎｉｎｅ）（例えば、ＱｕｉｌＡ）、アブリジン、ＤＤＡ、（２）アクリル酸又はメタクリル酸の重合体、無水マレイン酸とアルケニル誘導体の重合体、（３）ワクチンが水中油、油中水又は水中油中水型のエマルジョンの形で調製することができ、或いは、（４）ＭｏｎｔａｎｉｄｅＴＭＧｅｌを含むがこれらに限定されない。
【００５１】
特に、エマルジョンは、軽質流動パラフィンオイル、イソプレノイドオイル、例えば、スクワラン又はスクアレン、オレフィン、特に、イソブチレン又はデセンオリゴマー化されて生成されたオイル、直鎖型アルキル付きの酸又はアルコールにより形成されたエステル、より特に、植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールジ（オクタン酸エステル／カプリン酸エステル）、グリセリントリ（オクタン酸エステル／カプリン酸エステル）、プロピレングリコールジオレイン酸エステル、分岐脂肪酸エステル又はアルコールのエステル、特に、イソステアリン酸エステルに基づくことが可能である。オイルと乳化剤とを共に使用してエマルジョンを形成する。乳化剤は、非イオン界面活性剤、特に、ポリオキシエチル化脂肪酸（例えば、オレイン酸）、ソルビタン、マンニトール（例えば、無水マンニトールオレイン酸エステル）、グリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール、及び選択可能なエトキシ化されたオレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸、ヒドロキシオクタデカン酸により形成されたエステル、脂肪族アルコールと多価アルコール（例えば、オレイルアルコール）のエーテル、ポリオキシプロピレン・ポリオキシエチレンブロック共重合体、特に、ＰｌｕｒｏｎｉｃＲ、より特に、Ｌ１２１（Ｈｕｎｔｅｒ等、１９９５、「Ｔｈｅ  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ」（Ｓｔｅｗａｒｄ−Ｔｕｌｌ、Ｄ．Ｅ．Ｓ監修）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、ＮＹ、５１−９４；Ｔｏｄｄ等、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９９７、１５、５６４−５７０を参照）であることが好ましい。
【００５２】
特に、アクリル酸又はメタクリル酸重合体は、糖又は多価アルコールのポリアルケニルエーテルにより架橋される。これらの化合物はカルボマーと称される。
【００５３】
本発明は、ＭｏｎｔａｎｉｄｅＴＭＧｅｌであるアジュバントを用いることが好ましい。
【００５４】
本発明は、前記ワクチン組成物を調製する方法にも関する。前記方法は、前記豚サーコウイルス３型ＳＧ株又はその培養物を増殖培養し、前記豚サーコウイルス２型ＨＨ３株又はその培養物を増殖培養するステップ（１）と、前記ステップ（１）で増殖培養された豚サーコウイルス３型ＳＧ株又はその培養物を不活化し、前記ステップ（１）で増殖培養された豚サーコウイルス２型ＨＨ３株又はその培養物を不活化するステップ（２）と、不活化された前記豚サーコウイルス３型ＳＧ株又はその培養物及び不活化された前記豚サーコウイルス２型ＨＨ３株又はその培養物を比率で混合し、アジュバントを加えて乳化させるステップ（３）とを含む。
【００５５】
本発明に係るワクチン組成物は、さらに他の試薬を本発明に係る組成物の中に加えることもできる。例えば、本発明に係る組成物は、例えば、医薬、免疫賦活剤（例えば、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ-ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ-ＣＳＦ）及びインターロイキン２（ＩＬ２））、抗酸化剤、界面活性剤、着色剤、揮発性油、緩衝剤、分散剤、プロペラント及び防腐剤のような試薬を更に含むことができる。このような組成物を調製するためには、本分野において周知である方法を使用することができる。
【００５６】
本発明に係るワクチン組成物に基づいて経口剤型又は非経口剤型に調製されることができる。
【００５７】
皮内、筋肉、腹膜内、静脈内、皮下、鼻内又は硬脳膜外経路を経て投与可能な非経口剤型であることが好ましい。
【００５８】
本発明は、上記のワクチン組成物の豚サーコウイルス感染による関連疾患を予防及び／又は治療する医薬の調製における用途にも関する。前記豚サーコウイルス感染による関連疾患は、ＰＣＶ２の異なる遺伝子サブタイプ及び豚サーコウイルス３型の単独感染又は豚サーコウイルス２型の異なる遺伝子サブタイプ及び豚サーコウイルス３型の混合感染による関連疾患である。
【００５９】
本発明で使用される用語「豚サーコウイルス混合感染による関連疾患」は、豚サーコウイルス３型及び２型の混合感染に起因する疾患を指すためのものである。離乳後仔豚多臓器性発育不良症候群、豚皮膚炎腎症症候群、繁殖障害、及び心臓と多臓器系炎症性反応を非網羅的に含むがこれらに限定されない。
【００６０】
用語「予防及び／又は治療」は、豚サーコウイルス３型及び２型の混合感染に係わる場合において、豚サーコウイルス３型及び２型の複製を抑制し、豚サーコウイルス３型及び２型の感染を抑制するか、又は豚サーコウイルス３型及び２型がその宿主の体内で定住するのを防止し、並びに豚サーコウイルス３型及び２型感染の疾患又は病症の症状を軽減することを指す。ウイルス負荷量が減少し、病症が軽減されるか及び／又は摂食量及び／又は成長が増加すると、前記予防及び／又は治療が効果に達したとみなされることができる。
【００６１】
本発明の一実施形態として、本発明に係るワクチン組成物において、前記ＰＣＶ２遺伝子サブタイプは、ＰＣＶ２ａ、ＰＣＶ２ｂ、ＰＣＶ２ｄ、ＰＣＶ２新（ｎｅｗ）遺伝子サブタイプである。
【００６２】
本発明に係るワクチン組成物は、異なるＰＣＶ２遺伝子サブタイプ及びＰＣＶ３に対して効果的に防御することができ、ワクチンの応用範囲を拡大させ、ＰＣＶ２の各遺伝子サブタイプ及びＰＣＶ３の単独感染並びに混合感染に対して予防及び／又は治療を行うことができる。
【００６３】
本発明の一実施形態として、本発明に係るワクチン組成物において、前記豚サーコウイルス感染による関連疾患は、離乳後仔豚多臓器性発育不良症候群と、豚皮膚炎腎症症候群と、繁殖障と、心臓及び多臓器系炎症性反応とを含む。
【００６４】
以下、具体的な実施例と結び付けて本発明をさらに具体的に記述する。本発明の利点及び特徴は記述につれてより明らかになる。但し、これらの実施例は単に例示的なものあり、本発明の範囲に対していかなる制限も構成しない。当業者は、本発明の精神及び範囲を逸脱しないという前提で本発明に係る構成の詳細及び形態に対して変更又は置換を実施することができるが、これらの変更及び置換はいずれも本発明の技術的範囲に含まれるということを理解すべきである。
【００６５】
本発明の実施例で用いられる化学試薬はいずれも分析グレードであり、中国国薬集団から入手可能である。
【００６６】
本発明に係る試験方法は、特に説明がない限り、いずれも従来の方法である。記載される生物材料は、特に説明がない限り、いずれも商業的に入手可能である。
【００６７】
［実施例１］豚サーコウイルス３型の分離・同定
１．病理材料の由来
中国国内の一商品化養豚場で、従来の平均値に比べ、母豚の死亡率が９．４％増加し、受胎率が１．２％低下し、ミイラ変性胎子が８．２％増加する現象が現れた。臨床表現的に、影響を受けた母豚は、拒食現象を現し、多巣状丘疹、斑点及び表面皮膚炎の症状を呈した。流産した巣に異なる在胎週数のミイラ変性胎子が含有し、ＰＣＶ２関連流産の症状と一致している。母豚から観察された臨床表現及び流産症状全体として、豚サーコウィルス２型による繁殖障害疾患と一致するが、全ての母豚の腎臓、リンパ節、肺、皮膚及び死胎を含む異なる組織を免疫組織化及び定量ＰＣＲによりＰＣＶ２、ＰＲＲＳＶ、ＰＰＶ、ＣＳＦＶ、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ検査を行った結果、いずれも陰性であった。さらに原因を究明するために、各組織の病理材料を選び取って病原分離を行った。
【００６８】
２．ウイルス株の分離及び培養
病理材料を１：１０（体積比）でＤＭＥＭ培養液に加え、研磨して、組織懸濁液を調製し、組織懸濁液を繰り返して３回にかけて凍結融解させた後、１２０００ｒ／ｍｉｎ下で１５ｍｉｎ遠心し、上清液を収集し、上清液を０．２２μm膜フィルターを経てさらに濾過し、ろ液をＰＫ１５細胞上で継代させて、３７℃で１ｈ培養し、２％仔ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培養液を入れ替えるように加え、３７℃に置いて５日間培養する。ウイルスを含有する培養液を収穫し、培養液を２回にかけて凍結融解させた後、ウイルスを収穫する。
【００６９】
３．ＰＣＲ及びシークエンシング解析によるウイルス種の同定
上記のステップにおけるウイルス培養物を取って、核酸抽出試薬キットを用いてウイルスサンプルの核酸を抽出し、サーコウイルス種の特異的プライマーを使ってＰＣＲ増幅同定を行い、その結果、２０００ｂｐターゲットバンドをＰＣＲ増幅されたことが示された。ＰＣＲ生成物をシークエンシング社に送ってヌクレオチド配列決定を行い、配列決定結果に対して遺伝進化解析を行った。その結果、当該ウイルス株の全ゲノム配列及びアミノ酸配列は、既に報道された他のサーコウイルスとのホモロジーがいずれも５０％より小さいことが示された。然しながら、国際ウイルス学分類委員会の標準によると、サーコウイルス属における同一種類のウイルスは７５％より大きいゲノムヌクレオチド配列のホモロジーを有し、Ｃａｐタンパク質は７０％より大きいアミノ酸配列のホモロジーを有するべきである。これにより、当該ウイルスは新たな豚サーコウィルスであることが確定でき、目前豚の体で発見された第３の種類のサーコウイルスでもある。
【００７０】
［実施例２］豚サーコウイルス３型ワクチン株の選別
上記の分離された豚サーコウイルス３型に基づいて特異的プライマーを設計し、定量ＰＣＲにより、中国全国各地から採集された２３５部のＰＣＶ３陽性疑似サンプルを解析し、１２１株のＰＣＶ３ウイルスを選別して分離した。この１２１株のうち、各株の間のゲノムヌクレオチド配列のホモロジーは最大９８．９〜９９．６％に達し、Ｃａｐタンパク質アミノ酸配列のホモロジーは最大９７．７〜９９．５％に達する。本動物病原性試験及び免疫原性試験を行った結果、最終的に、１株の病原性が強く、免疫原性が良好で、広範囲性の高いＰＣＶ３ウイルス株が選別された。当該豚サーコウイルス３型ウイルスは、豚サーコウイルス３型ＳＧ株と命名され、寄託に提出された。
【００７１】
［実施例３］  豚サーコウイルス３型ＳＧ株の病原性試験
２８〜３０日齢のＥＬＩＳＡ検査を行った結果、ＰＣＶ２、ＰＣＶ３抗原、抗体が陰性である健康な仔豚１０匹を５匹／群になるようにランダムに２つの群に分け、第１の群はＰＣＶ３ＳＧ株（１０５．０ＴＣＩＤ５０／匹を含む）で筋肉注射によりウイルスチャレンジし、ブランクである比較群として第２の群はＤＭＥＭ培地を接種し、各群の仔豚を隔離して飼育する。ウイルスチャレンジ後、各群の仔豚を連続して観察し、その臨床症状、病理変化及びウイルス検査結果に基づいて判定を行う。その具体的な結果は、表１を参照する。
【表１】
0006914370.tif 000002
【００７２】
その結果、ウイルスチャレンジ群の全ての豚にいずれも３〜５日間持続的な４０．５℃以上の高温、食欲の減退、気分の沈み、乱雑な被毛、痩せ細り及び成長速度の減速が現れ、剖検でいずれも異なる程度の肺硬変、リンパ腫大、腎臓に壊死箇所有りの現象が現れたことである。各内臓及び器官組織に対してＰＣＲ検査を行うことで、豚サーコウイルス３型ウイルスを再度分離できた一方、ブランクである比較群は異常がなかった。これは、本発明に係る豚サーコウイルス３型ＳＧ株を仔豚に接種すると、仔豚を罹患させるおそれがあることを示している。臨床的特徴としては、典型的な豚サーコウイルス感染症状である。
【００７３】
［実施例４］豚サーコウイルス３型ＳＧ株抗原の調製
実施例２で選別された豚サーコウイルス３型ＳＧ株の異なる世代目の培養物をウイルス培養液量の１％（Ｖ／Ｖ）によって単一層のＰＫ１５継代細胞の中に取り込み、３７℃に置いて３０分間吸着した後、細胞保存液を加え、３７℃に置いて培養する。毎日１〜２回観察した結果、細胞生長状態が良好であり、３６〜３７℃に置いて４〜７日培養した後、細胞培養物を収穫し、収穫された細胞培養物を２〜３回凍結融解した後、ウイルス液を収穫し、ウイルス力価を測定する。細胞破片を除去するように、ウイルス液をホローファイバー（０．５μm〜２μm）濾過カラムで濾過して、また０．１％〜０．２％のホルムアルデヒド水溶液を加え、３７℃下で２４ｈ不活化し、完全に不活化されたウイルス抗原をワクチンを調製するために用いる。
【００７４】
［実施例５］豚サーコウイルス２型の分離・同定
１．病理材料の由来
中国国内の一免疫商品化ＰＣＶ２ワクチンの養豚場で、母豚が流産し、ミイラ変性胎子が増加する現象が散発的に起こった。影響を受けた母豚は、拒食現象を現し、流産した巣に異なる在胎週数のミイラ変性胎子を含有し、ＰＣＶ２関連流産の症状と一致している。免疫組織化及び定量ＰＣＲ検査を行った結果、ＰＣＶ２陽性であった。ＰＣＶ２商品化ワクチンで免疫した後でも依然として罹患豚組織からＰＣＶ２が検出されたため、その原因は深く究明するに値する。さらに原因を究明するために、各組織の病理材料を選び取って病原分離を行った。
【００７５】
２．ウイルス性株の分離及び培養
病理材料を１：１０（体積比）でＤＭＥＭ培養液に加え、研磨して、組織懸濁液を調製し、組織懸濁液を繰り返して３回にかけて凍結融解させた後、１２０００ｒ／ｍｉｎ下で１５ｍｉｎ遠心し、上清液を収集し、上清液を０．２２μm膜フィルターを経てさらに濾過し、ろ液をＰＫ１５細胞上で継代させて、３７℃で１ｈ培養し、２％仔ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培養液を入れ替えるように加え、３７℃に置いて５日間培養する。ウイルスを含有する培養液を収穫し、培養液を２回にかけて凍結融解させた後、ウイルスを収穫する。
【００７６】
３．ＰＣＲ及びシークエンシング解析によるウイルスの同定
上記のステップで収穫されたウイルス培養物を取って、核酸抽出試薬キットを用いてウイルスサンプルの核酸を抽出し、ＰＣＶ２の特異的プライマーを使ってＰＣＲ増幅同定を行い、その結果、１.７ｋｂターゲットバンドをＰＣＲ増幅されたことが示された。ＰＣＲ生成物をシークエンシング社に送ってヌクレオチド配列決定を行い、配列決定結果に対して遺伝進化解析を行った。その結果、当該ウイルス株の全ゲノム配列は、既に報道された他のＰＣＶ２とのホモロジーがいずれも９６％より小さく、アミノ酸配列は９４％より小さいということが示された。解析をさらにすることにより、当該ウイルス株はＰＣＶ２ｂとＰＣＶ２ｄの間に介在し、ＯＲＦ２遺伝子に突然変異が存在するか又は異なる遺伝子サブタイプの組み換えが存在するということを示しており、遺伝進化解析において、新たなＰＣＶ２遺伝子サブタイプに属している。
【００７７】
［実施例６］豚サーコウイルス２型ワクチン株の選別
上記の分離された豚サーコウイルス２型に基づいて特異的プライマーを設計し、定量ＰＣＲにより、中国全国各地の商品化ＰＣＶ２ワクチンで免疫した後に散発的に罹患した養豚場から採集された４２部のＰＣＶ２陽性疑似サンプルを解析して、１６株のＰＣＶ２ウイルスを選別して分離した。この１６株の間で、そのゲノムヌクレオチド配列のホモロジーは最大９９．６〜１００％に達し、Ｃａｐタンパク質アミノ酸配列ホモロジーは最大９９．５〜１００％に達し、解析をさらに行った結果、一つの遺伝子サブタイプに属している。本動物病原性試験及び免疫原性試験を行った結果、最終的に、１株の病原性が強く、免疫原性が良好で、広範囲性の高いＰＣＶ２ウイルス株が選別された。当該豚サーコウイルス２型ウイルスは、豚サーコウイルス２型ＨＨ３株と命名され、寄託に提出された。
【００７８】
［実施例７］豚サーコウイルス２型ＨＨ３株の病原性試験
２８〜３０日齢のＥＬＩＳＡ検査を行った結果、ＰＣＶ２、ＰＣＶ３抗原、抗体が陰性である健康な仔豚１０匹を５匹／群になるようにランダムに２つの群に分け、第３の群はＰＣＶ２ＨＨ３株（１０５．０ＴＣＩＤ５０／匹を含む）で筋肉注射によりウイルスチャレンジし、ブランクである比較群として第４の群はＤＭＥＭ培地を接種し、各群の仔豚を隔離して飼育する。ウイルスチャレンジ後、各群の仔豚を連続して観察し、その臨床症状、病理変化及びウイルス検査結果に基づいて判定を行う。その具体的な結果は、表２を参照する。
【表２】
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【００７９】
その結果、ウイルスチャレンジ群の全ての豚にいずれも３〜５日間持続的な４０．５℃以上の高温、食欲の減退、気分の沈み、乱雑な被毛、痩せ細り及び成長速度の減速が現れ、剖検でいずれも異なる程度の肺硬変、リンパ腫大、腎臓に壊死箇所有りの現象が現れたことである。各内臓及び器官組織に対してＰＣＲ検査を行うことで、豚サーコウイルス２型ウイルスを再度分離できた一方、ブランクである比較群は異常がなかった。これは、本発明に係る豚サーコウイルス２型ＨＨ３株を仔豚に接種すると、仔豚を罹患させるおそれがあることを示している。臨床的特徴としては、典型的な豚サーコウイルス感染症状である。
【００８０】
［実施例８］豚サーコウイルス２型ＨＨ３株抗原の調製
実施例６で選別された豚サーコウイルス２型ＨＨ３株の異なる世代目の培養物をウイルス培養液量の１％（Ｖ／Ｖ）によって単一層のＰＫ１５継代細胞の中に取り込み、３７℃に置いて３０分間吸着した後、細胞保存液を加え、３７℃に置いて培養する。毎日１〜２回観察した結果、細胞生長状態が良好であり、３６〜３７℃に置いて４〜７日培養した後、細胞培養物を収穫し、収穫された細胞培養物を２〜３回凍結融解した後、ウイルス液を収穫し、ウイルス液におけるウイルス力価を測定する。細胞破片を除去するように、ウイルス液をホローファイバー（０．５μm〜２μm）濾過カラムで濾過して、また０．１％〜０．２％のホルムアルデヒド水溶液を加え、３７℃下で２４ｈ不活化し、完全に不活化されたウイルス抗原をワクチンを調製するために用いる。
【００８１】
［実施例９］豚サーコウイルス３型及び２型である２種混合不活化ワクチンの調製
実施例４で調製された豚サーコウイルス３型ＳＧ株不活化抗原及び実施例８で調製された豚サーコウイルス２型ＨＨ３株の不活化抗原を比率で混合した後、水溶性アジュバントＧｅｌアジュバント（フランスＳＥＰＰＩＣ社）の中にゆっくり加え、加える過程で絶え間なく回転数が８００ｒｐｍである乳化機で１２ｍｉｎ撹拌して均一に混ぜ合わせる。ワクチンの具体的な配合割合は表３を参照する。
【表３】
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【００８２】
［実施例１０］豚サーコウイルス３型及び２型である２種混合不活化ワクチンの免疫原性試験
２８〜３０日齢の、ＥＬＩＳＡ測定を行った結果、ＰＣＶ２抗原、ＰＣＶ３抗原及び抗体が陰性である健康な仔豚５０匹を５匹／群になるようにランダムに１０個の群に分け、実施例９で調製された豚サーコウイルス３型及び２型である２種混合不活化ワクチンで免疫する。第５〜６の群はワクチン１で免疫し、第７〜８の群はワクチン２で免疫し、第９〜１０の群はワクチン３で免疫し、第１１〜１２の群はそれぞれ免疫ワクチン４及びワクチン５で免疫し、第１３〜１４の群は免疫せずにウイルスチャレンジすることである比較群とする。各免疫群はワクチンを２ｍｌ／匹を注射し、ウイルスチャレンジすることである比較群はＤＭＥＭ培地を２ｍｌ／匹を接種する。免疫後２８日目にウイルスチャレンジを行い、第５の群、第７の群、第９の群、第１１の群、第１３の群を豚サーコウイルス３型ＳＧ株により１０５．０ＴＣＩＤ５０／匹の分量でウイルスチャレンジし、第６の群、第８の群、第１０の群、第１２の群、第１４の群を豚サーコウイルス２型ＨＨ３株により１０５．０ＴＣＩＤ５０／匹の分量でウイルスチャレンジする。ウイルスチャレンジ後、各々の仔豚を連続して観察し、各々の仔豚の臨床症状、病理変化及びウイルス検査結果に基づいて判定を行い、その具体的な結果は表４を参照する。
【表４】
0006914370.tif 000005
【００８３】
その結果、豚サーコウイルス３型及び２型である２種混合不活化ワクチンは、仔豚を一回免疫した後、仔豚に１００％（５／５）防御を行うことができる一方、ウイルスチャレンジすることである比較群の仔豚はウイルスチャレンジ後に全て罹患したことが示された。これは、本発明に係る豚サーコウイルス３型及び２型である２種混合不活化ワクチンがかなり良い防御能力を有することを示している。
【００８４】
［実施例１１］豚サーコウイルス３型及び２型である２種混合不活化ワクチンの広範囲性防御試験
２８〜３０日齢の、ＥＬＩＳＡ検査を行った結果、ＰＣＶ２抗原、ＰＣＶ３抗原及び抗体が陰性である健康な仔豚１００匹を５匹／群になるようにランダムに２０の群に分け、第１５〜２４の群は実施例９で調製されたワクチン１で免疫し、第２５〜３４の群は免疫せずにウイルスチャレンジすることである比較群とする。各免疫群はワクチンを２ｍｌ／匹を注射し、ウイルスチャレンジすることである比較群はＤＭＥＭ培地を２ｍｌ／匹を接種する。免疫後２８日目にウイルスチャレンジを行い、第１５の群及び第２５の群は最近中国河南省から分離された豚サーコウイルス２ａ遺伝子サブタイプＨＮ０６株の強毒性のウイルス株でウイルスチャレンジし、第１６の群及び第２６の群は最近中国江蘇省から分離された豚サーコウイルス２ｂ遺伝子サブタイプＪＳ０４株の強毒性のウイルス株でウイルスチャレンジし、第１７の群及び第２７の群は最近中国吉林省から分離された豚サーコウイルス２ｄ遺伝子サブタイプＪＬ１３株の強毒性のウイルス株でウイルスチャレンジし、第１８の群及び第２８の群は最近中国重慶市から分離された豚サーコウイルス２新（ｎｅｗ）遺伝子サブタイプＣＱ１４株の強毒性のウイルス株でウイルスチャレンジし、第１９の群及び第２９の群は最近中国広東省から分離された豚サーコウイルス２新（ｎｅｗ）遺伝子サブタイプＧＤ１５株の強毒性のウイルス株でウイルスチャレンジし、第２０の群及び第３０の群は最近中国河南省から分離された豚サーコウイルス３型ＨＮ１２株の強毒性のウイルス株でウイルスチャレンジし、第２１の群及び第３１の群は最近中国江蘇省から分離された豚サーコウイルス３型ＪＳ０８株の強毒性のウイルス株でウイルスチャレンジし、第２２の群及び第３２の群は最近中国吉林省から分離された豚サーコウイルス３型ＪＬ１１株の強毒性のウイルス株でウイルスチャレンジし、第２３の群及び第３３の群は最近中国重慶市から分離された豚サーコウイルス３型ＣＱ０４株の強毒性のウイルス株でウイルスチャレンジし、第２４の群及び第３４の群は最近中国広東省から分離された豚サーコウイルス３型ＧＤ０５株の強毒性のウイルス株でウイルスチャレンジし、各群のウイルスチャレンジの分量はいずれも１０５．０ＴＣＩＤ５０／匹である。ウイルスチャレンジ後、各々の仔豚を連続して観察し、各々の仔豚の臨床症状、病理変化及びウイルス検査に基づいて判定を行う。その具体的な結果は、表５乃至表６を参照する。
【表５】
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【００８５】
その結果、ウイルスチャレンジ比較群である第２５〜２９の群はウイルスチャレンジ後にいずれも異なる程度に体温が４０．５℃以上に上昇し、３〜５日間持続し、食欲が減退し、気分が沈み、被毛が乱雑で、痩せ細り及び成長速度が減速する等の臨床症状が現れ、剖検でいずれも異なる程度に肺硬変、リンパ腫大、腎臓に壊死箇所有りの病理変化が現れたことが示された。各内臓及び器官組織に対してＰＣＲ検査を行うことで、豚サーコウイルス２型ウイルスを再度分離できた一方、免疫群である第１５〜１９の群はウイルスチャレンジ後に異常臨床症状がなく、剖検でも各組織器官に異常がなく、各内臓及び器官組織に対してＰＣＲ検査を行った結果、いずれもＰＣＶ２陰性を呈した。これは、本発明に係る豚サーコウイルス３型及び２型である２種混合不活化ワクチンは、一回免疫することで、豚に対して異なる地域由来及び異なる遺伝子サブタイプの豚サーコウイルス２型からの攻撃を効果的で完全に免疫防御をすることができ、且つ、各内臓及び器官組織からウイルスチャレンジしたＰＣＶ２を検出できないことを示している。
【表６】
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【００８６】
その結果、ウイルスチャレンジ比較群である第３０〜３４の群はウイルスチャレンジ後にいずれも異なる程度に体温が４０．５℃以上に上昇し、３〜５日間持続し、食欲が減退し、気分が沈み、被毛が乱雑で、痩せ細り及び成長速度が減速する等の臨床症状が現れ、剖検でいずれも異なる程度に肺硬変、リンパ腫大、腎臓に壊死箇所有りの病理変化が現れたことが示された。各内臓及び器官組織に対してＰＣＲ検査を行うことで、豚サーコウイルス３型ウイルスを再度分離できた一方、免疫群である第２０〜２４の群はウイルスチャレンジ後に異常臨床症状がなく、剖検でも各組織器官に異常がなく、各内臓及び器官組織に対してＰＣＲ検査を行った結果、いずれもＰＣＶ３陰性を呈した。これは、本発明に係る豚サーコウイルス３型及び２型である２種混合不活化ワクチンは、一回免疫することで、豚に対して異なる地域由来の豚サーコウイルス３型からの攻撃を効果的で完全に免疫防御をすることができ、且つ、各内臓及び器官組織からウイルスチャレンジしたＰＣＶ３を検出できないことを示している。
【００８７】
上記の結果は、本発明に係るワクチン組成物は、広範囲の免疫原性を有し、異なる地域由来の豚サーコウイルス３型及び２型ウイルス株に対していずれも完全に防御することができることを示している。
【００８８】
［実施例１２］  豚サーコウイルス３型及び２型である２種混合不活化ワクチンによる混合感染の防御試験
２８〜３０日齢の、ＥＬＩＳＡ検査を行った結果、ＰＣＶ２抗原、ＰＣＶ３抗原及び抗体が陰性である健康な仔豚２０匹を５匹／群になるようにランダムに四つの群に分ける。第３５の群は実施例９で調製されたワクチン１で免疫し、第３６の群は実施例９で調製されたワクチン４で免疫し、第３７の群は実施例９で調製されたワクチン５で免疫し、第３８の群は免疫せずにウイルスチャレンジすることである比較群とする。各免疫群にワクチンを２ｍｌ／匹を注射し、ウイルスチャレンジすることである比較群はＤＭＥＭ培地を２ｍｌ／匹を接種する。免疫後２８日目にウイルスチャレンジを行い、全ての群を豚サーコウイルス３型ＳＧ株と豚サーコウイルス２型ＨＨ３株との混合ウイルス液でウイルスチャレンジし、ウイルスチャレンジの分量は１０５.０ＴＣＩＤ５０／匹である。ウイルスチャレンジ後、各々の仔豚を連続して観察し、各々の仔豚の臨床症状、病理変化結果に基づいて判定を行う。その具体的な結果は、表７を参照する。
【表７】
0006914370.tif 000010
【００８９】
その結果、ウイルスチャレンジすることである比較群として第３８の群はウイルスチャレンジ後にいずれも異なる程度に体温が４０．５℃以上に上昇し、５日間持続し、食欲が減退し、気分が沈み、被毛が乱雑で、痩せ細り及び成長速度が減速する等の臨床症状が現れ、剖検でいずれも異なる程度に肺硬変、リンパ腫大、腎臓に壊死箇所有りの病理変化が現れ、免疫群である第３５の群はウイルスチャレンジ後に異常臨床症状がなく、剖検でも各組織器官に異常がなかった一方、免疫群である第３６の群及び第３７の群はＰＣＶ２及びＰＣＶ３の混合感染を効果的に防御できず、依然として罹患状態を呈することが示された。これは、本発明に係る豚サーコウイルス３型及び２型である２種混合不活化ワクチンは、一回免疫することで、豚に対してＰＣＶ２及びＰＣＶ３からの連合攻撃を効果的で完全に免疫防御をすることができることを示している。
【００９０】
［実施例１３］豚サーコウイルス３型及び２型である２種混合不活化ワクチンの応用試験
中国国内の一商品化養豚場で、従来の平均値に比べ、母豚の死亡率が９．８％増加し、受胎率が１．２％低下し、ミイラ変性胎子が８．６％増加する現象が現れた。臨床表現的に、影響を受けた母豚は、拒食現象を現し、多巣状丘疹、斑点及び表面皮膚炎の症状を呈した。流産した巣に異なる在胎週数のミイラ変性胎子が含有されている。臨床表現症状のある母豚から３６匹の妊娠した母豚を選んで、１８／群になるようにランダムにＡ群及びＢ群の二つの群に分ける。Ａ群はワクチン接種群であり、Ａ群を実施例９で調製されたワクチン１で免疫し、Ｂ群はブランクとして比較群である。免疫群にワクチンを２ｍｌ／匹を注射し、ブランクである比較群にＤＭＥＭ培地を２ｍｌ／匹を接種する。２つの群の母豚の仔豚生産状況を統計し、その結果は表８を参照する。
【表８】
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【００９１】
その結果、免疫群の母豚の仔豚生産に異常がなく、健康な仔豚を生産し、平均的に１１．７匹／巣を生産し、健康率は最大９９．５％である一方、ブランクである比較群は明らかなミイラ変性胎子及び虚弱仔豚の状況が現れ、健康な仔豚を平均的に６．９匹／巣を生産し、健康率は５８.８％であり、そのうち、３匹の母豚は流産状況が起こり、巣全体ミイラ変性胎子であり、免疫群とブランクである比較群の差異は顕著であることが示された。
【００９２】
表８の結果は、本発明に係る豚サーコウイルス３型及び２型である２種混合不活化ワクチンは、豚サーコウイルスに感染した母豚に対して良好な免疫防御する役割を有し、且つ既にＰＣＶに感染した母豚を防御を行うことができることを説明している。
【００９３】
一方、ブランクとして比較群であるＢ群が産んだ仔豚をそれぞれ隔離させて巣毎に飼育し、１５巣をＢ１群（Ｂ−１巣乃至Ｂ−１３巣を含み、Ｂ−６巣は巣全体ミイラ変性胎子であるため計算に入れない以外、合計１２巣の仔豚）、Ｂ２群（Ｂ−１４乃至Ｂ−１８巣を含み、Ｂ−１６巣及びＢ−１８巣は巣全体ミイラ変性胎子であるため計算に入れない以外、合計３巣の仔豚）の二つの群に分ける，Ｂ１群は母乳を飲む前に実施例９で調製されたワクチン１で免疫し、Ｂ２群はブランクとして比較群である。免疫群はワクチンを２ｍｌ／匹を注射し、比較群はＤＭＥＭ培地を２ｍｌ／匹を接種する。各々の仔豚を連続して観察し、各々の仔豚の臨床症状、病理変化及びウイルス検査に基づいて判定を行い、その具体的な結果は表９を参照する。
【表９】
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【００９４】
その結果、免疫群の仔豚は、異常臨床症状がなく、各組織器官をランダムに剖検した結果、同じく異常がなく、豚の各内臓及び器官組織を剖検してＰＣＲ検査を行った結果、いずれもＰＣＶ３及びＰＣＶ２陰性を呈した一方、ブランクである比較群の仔豚はいずれも異なる程度に体温が４０．５℃以上に上昇し、５日間持続し、食欲が減退し、気分が沈み、被毛が乱雑で、痩せ細り及び成長速度が減速する等の臨床症状が現れ、一部の豚は死亡し、剖検でいずれも異なる程度に肺硬変、リンパ腫大、腎臓に壊死箇所有りの病理変化が現れたことが示された。各内臓及び器官組織に対してＰＣＲ検査を行うことで、豚サーコウイルス３型及び豚サーコウイルス２型を再度分離できた。
【００９５】
ＰＣＶは豚の群の中で垂直感染されることが可能であるため、表９の結果は、本発明に係るサーコウイルス３型及び２型である２種混合ワクチンは、一回免疫することで、豚サーコウイルス３型及び２型に混合感染した仔豚に対して良好な免疫防御する役割を有し、且つ既にＰＣＶ３及びＰＣＶ２ウイルスに混合感染した仔豚に対して防御を行うことができ、防御率が１００％であることを説明している。
【００９６】
以上の記載は、単に本発明の好ましい実施例であり、本発明に対するいかなる形式的な制限も行わない。好ましい実施例として本発明を以上のように開示したが、本発明を限定するものではない。本分野における当業者であれば、本発明の技術方案を逸脱しない範囲で、上記のように開示された技術内容を利用して変更又は修飾を同等変化とする若干の等価実施例を実施することができるが、本発明の技術方案を逸脱せずに本発明の技術実質に基づいて上記の実施例に対して行われるいかなる簡単な修正、同等変化及び修飾は、全て依然として本発明の技術方案の範囲内に属する。