(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水痘または帯状疱疹に対するワクチン組成物であって：
水痘帯状疱疹ウイルスの糖たんぱく質Ｅ；
以下の式１のグルコピラノシル脂質アジュバント；および
スクアレン：
を含み、
【化１】
0006815521.tif 000007
式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ独立してＣ１０−Ｃ１２アルキルであり；Ｒ２およびＲ４はそれぞれ独立してＣ８−Ｃ１０アルキルである、ワクチン組成物。
【請求項２】
グルコピラノシル脂質アジュバントが、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６がＣ１１アルキルである式１のアジュバントである、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
グルコピラノシル脂質アジュバントが、Ｒ２およびＲ４がＣ９アルキルである式１のアジュバントである、請求項１または２に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
グルコピラノシル脂質アジュバントが、ワクチン組成物の１回投与量中に、７．５μｇ〜２０μｇの量で含有される、請求項１〜３のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項５】
グルコピラノシル脂質アジュバントが、ワクチン組成物の１回投与量中に、９μｇ〜１８μｇの量で含有される、請求項１〜４のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項６】
スクアレンが、ワクチン組成物全体の１％（ｖ／ｖ）〜７％（ｖ／ｖ）の量で含有される、請求項１〜５のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項７】
スクアレンが、ワクチン組成物全体の１％（ｖ／ｖ）〜４％（ｖ／ｖ）の量で含有される、請求項１〜６のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項８】
糖たんぱく質Ｅが、ワクチン組成物の１回投与量中に、５μｇ〜１００μｇの量で含有される、請求項１〜７のいずれかに記載のワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、帯状疱疹を予防するためのワクチン組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）の一次感染は、主に顔や体幹にできる、伝染性の高い発疹を特徴とする水痘を引き起こす。最初の感染後、ウイルスＤＮＡは宿主神経細胞の細胞質内で何年間も休眠した状態となる。本ウイルスは成人において、再活性化され、帯状疱疹（ｈｅｒｐｅｓ  ｚｏｓｔｅｒ、ｚｏｓｔｅｒまたはｓｈｉｎｇｌｅｓ）を引き起こす可能性がある。
【０００３】
帯状疱疹は、一次感染時に発生したものとは異なる発疹を引き起こす。該発疹は激しい痛みを伴い、帯状疱疹後神経痛（ＰＨＮ）などのより深刻な症状につながる可能性がある。
【０００４】
水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）は、ヒトヘルペスウイルス３（ＨＨＶ−３）としても知られており、ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ  ｆａｍｉｌｙ）のアルファヘルペスウイルス亜科（ａｌｐｈａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ）のメンバーである。ＶＺＶは、約１２５，０００ヌクレオチドの２本鎖ＤＮＡゲノムを有する、エンベロープウイルスである。ＶＺＶのゲノムは、正二十面体のヌクレオカプシドに封入されている。ウイルス外被（表皮）は、ヌクレオカプシドとウイルスエンベロープとの間の空間に位置し、ウイルスによりコードされるたんぱく質および酵素からなるコンストラクトである。ウイルスエンベロープは、宿主細胞膜に由来し、ウイルスによりコードされる糖たんぱく質を含有する。
【０００５】
ＶＺＶゲノムは７０以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードし、そのうち９個は糖タンパク質（ｇＥ、ｇＩ、ｇＢ、ｇＨ、ｇＫ、ｇＮ、ｇＬ、ｇＣおよびｇＭ）をコードしており、これらは、ウイルス複製サイクルの異なる段階で機能すると推定される。
【０００６】
糖たんぱく質Ｅ（ｇＥ）は、ウイルス複製に必須であり（Mallory et al. (1997) J. Virol. 71: 8279-8288および Mo et al. (2002) Virology 304: 176-186）、感染細胞および成熟ビリオンに見られる最も豊富な糖たんぱく質である（Grose, 2002, The predominant varicella-zoster virus gE and gI glycoprotein complex, In Structure-function relationships of human pathogenic viruses, Holzenburg and Bogner (eds.), Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, NY）。
【０００７】
糖たんぱく質Ｉ（ｇＩ）は、感染細胞においてｇＥと複合体を形成し、それによって両法の糖たんぱく質のエンドサイトーシスを促進し、これらの糖たんぱく質はその後、最終的なウイルスエンベロープが得られるトランスゴルジに送達される（Olson and Grose (1998) J. Virol. 72: 1542-1551）。
【０００８】
糖たんぱく質Ｂ（ｇＢ）は、ウイルスの侵入に重要な役割を果たすと考えられおり、ウイルス中和抗体のエピトープを有し、ビリオン表面で２番目に多い糖たんぱく質である（Arvin (1996) Clin. Microbiol. Rev. 9: 361-381）。
【０００９】
糖たんぱく質Ｈ（ｇＨ）は、ウイルスの細胞間伝播を促進する融合機能を有すると考えられている。
【００１０】
現在、水痘または帯状疱疹を予防するために一般的に使用されている弱毒生ワクチンはいくつかの欠点を有する。第１に、ＶＺＶ感染に対する免疫が時間とともに低下し、ワクチンの効果が消えるといういくつかの証拠がある(Chaves et al. (2007) N. Engl. J. Med. 356: 1121-1129)。従って、ワクチン接種を受けた対象は、ＶＺＶによって引き起こされるより深刻な症状である、帯状疱疹にかかりやすいままである可能性がある。さらに、弱毒生ワクチンは、弱毒化された病原性を有する生ウイルスを用いて製造されているので、ワクチン接種対象はワクチン接種により水痘または帯状疱疹にかかりやすくなる可能性がある。実際、ワクチンに使用されたウイルス株によって引き起こされたと報告されている帯状疱疹のケースがいくつかある（Matsubara et al. (1995) Acta Paediatr Jpn 37: 648-50; および Hammerschlag et al. (1989) J Infect Dis. 160: 535-7）。さらに、該ワクチンには弱毒生ウイルスが存在するため、免疫機能が低下している対象には、ワクチンの使用が制限されることがある。
【００１１】
ウイルスの休眠後に神経細胞に沿って再出現する帯状疱疹を予防する効果を高めるためには、ＶＺＶ抗原に対する液性免疫の活性化よりも、細胞性免疫（ＣＭＩ）の活性化を有意に増強することが重要である。そのために、Ｔ細胞であるＴｈ１とＴｈ２（ヘルパーＴ細胞）のうち、Ｔｈ１の活性化を促進することにより、Ｔｈ１／Ｔｈ２比を高めることが重要である。
【００１２】
従って、弱毒生ワクチンの欠点を有することなく、細胞性免疫反応を選択的に高めることができる、新規の帯状疱疹ワクチン組成物の開発が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
発明の開示
技術的課題
本発明の目的は、安全性が高く、帯状疱疹予防効果に優れたワクチン組成物であって、弱毒生ワクチンの欠点を有することなく、細胞性免疫反応を選択的に高める、ワクチン組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
課題の解決
１．水痘または帯状疱疹に対するワクチン組成物であって：
水痘帯状疱疹ウイルスの糖たんぱく質Ｅ；
以下の式１のグルコピラノシル脂質アジュバント；および
代謝可能油：
を含み、
【化１】
0006815521.tif 000002
式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ独立してＣ１０−Ｃ１２アルキルであり；Ｒ２およびＲ４はそれぞれ独立してＣ８−Ｃ１４アルキルである、ワクチン組成物。
２．グルコピラノシル脂質アジュバントが、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６がＣ１１アルキルである式１のアジュバントである、上記１に記載のワクチン組成物。
３．グルコピラノシル脂質アジュバントが、Ｒ２およびＲ４がＣ１３アルキルである式１のアジュバントである、上記１に記載のワクチン組成物。
４．グルコピラノシル脂質アジュバントが、Ｒ２およびＲ４がＣ９アルキルである式１のアジュバントである、上記１に記載のワクチン組成物。
５．代謝可能油がスクアレンである、上記１に記載のワクチン組成物。
６．スクアレンが、ワクチン組成物全体の１％（ｖ／ｖ）〜７％（ｖ／ｖ）の量で含有される、上記５に記載のワクチン組成物。
７．スクアレンが、ワクチン組成物全体の１％（ｖ／ｖ）〜４％（ｖ／ｖ）の量で含有される、上記６に記載のワクチン組成物。
８．糖たんぱく質Ｅが、ワクチン組成物の１回投与量中に、５μｇ〜１００μｇの量で含有される、上記１に記載のワクチン組成物。
９．グルコピラノシル脂質アジュバントが、ワクチン組成物の１回投与量中に、７．５μｇ〜２０μｇの量で含有される、上記１に記載のワクチン組成物。
１０．グルコピラノシル脂質アジュバントが、ワクチン組成物の１回投与量中に、９μｇ〜１８μｇの量で含有される、上記９に記載のワクチン組成物。
１１．上記１〜１０のいずれかに記載の組成物を、対象に投与することを含む、水痘または帯状疱疹を予防または治療するための方法。
【発明の効果】
【００１５】
発明の効果
本発明のワクチン組成物は、帯状疱疹の予防に優れている。
【００１６】
本発明のワクチン組成物は、ＶＺＶ抗原に対する液性免疫反応と比較して、ＶＺＶ抗原に対する細胞性免疫反応を有意に高める。
【００１７】
本発明のワクチン組成物は、２つ以上のＴｈ１特異的サイトカインを生産するＴｈ１細胞の数を、大幅に増加させる。
【００１８】
本発明のワクチン組成物は、ＩｇＧ１の生産と比較して、ＩｇＧ２の生産を大幅に増加させる。
【００１９】
本発明のワクチン組成物は、ワクチン接種により、患者を帯状疱疹に感染させる可能性がない。
【００２０】
本発明のワクチン組成物は、免疫機能が低下している対象にも、投与することができる。
【００２１】
本発明のワクチン組成物は、持続性の予防効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、実験例３の実験による、ｇＥ抗原特異的ＩｇＧの生産を例示している。
【００２３】
【図２】図２は、実験例３の実験による、ｇＥ抗原特異的ＩｇＧ２ｃおよびＩｇＧ１の生産を図示している。
【００２４】
【図３】図３は、実験例４の実験による、ｇＥたんぱく質に特異的に、ＩＦＮ−γを分泌するＴ細胞の数を表示している。
【００２５】
【図４】図４は、実験例４の実験による、ｇＥ重複ペプチドに特異的に、ＩＦＮ−γを分泌するＴ細胞の数を証明している。
【００２６】
【図５】図５は、実験例４の実験による、全ＶＺＶに特異的に、ＩＦＮ−γを分泌するＴ細胞の数を提示している。
【００２７】
【図６】図６は、実験例５の実験による、ｇＥ抗原に特異的に分泌された、さまざまなＴｈサイトカインの量を表している。
【００２８】
【図７】図７は、実験例６の実験による、ｇＥ抗原特異的サイトカイン分泌細胞の分布を示している。
【００２９】
【図８】図８は、実験例７の実験による、ＶＺＶ抗原特異的ＩｇＧの生産を例示している。
【００３０】
【図９】図９は、実験例７の実験による、ＶＺＶ抗原特異的ＩｇＧ２ｃおよびＩｇＧ１の生産を図示している。
【００３１】
【図１０】図１０は、実験例８の実験による、全ＶＺＶに特異的に分泌された、ＩＦＮ−γの量を表示している。
【００３２】
【図１１】図１１は、実験例９の実験による、ＶＺＶ抗原特異的サイトカイン分泌細胞の分布を証明している。
【００３３】
【図１２】図１２は、実験例１０の実験による、ＶＺＶ抗原特異的ＩｇＧの生産と、実験例２−２の実験による、ｇＥまたは全ＶＺＶに特異的なＴ細胞の数を、提示している。
【００３４】
【図１３】図１３は、実験例１１の実験による、ｇＥ抗原特異的ＩｇＧの生産を表している。
【００３５】
【図１４】図１４は、実験例１１の実験による、ｇＥ抗原特異的ＩｇＧ２ｃおよびＩｇＧ１の生産を示している。
【００３６】
【図１５】図１５は、実験例１２の実験による、ｇＥたんぱく質に特異的に、ＩＦＮ−γを分泌する、Ｔ細胞の数を例示している。
【００３７】
【図１６】図１６は、実験例１２の実験による、ｇＥ重複ペプチドに特異的に、ＩＦＮ−γを分泌する、Ｔ細胞の数を図示している。
【００３８】
【図１７】図１７は、実験例１２の実験による、ＶＺＶ抗原特異的に、ＩＦＮ−γを分泌する、Ｔ細胞の数を表示している。
【００３９】
【図１８】図１８は、実験例１３の実験による、ｇＥたんぱく質刺激により分泌される、ＩＦＮ−γの量を証明している。
【００４０】
【図１９】図１９は、実験例１３の実験による、ｇＥ重複ペプチド刺激により分泌される、ＩＦＮ−γの量を提示している。
【００４１】
【図２０】図２０は、実験例１４の実験による、ｇＥたんぱく質に特異的に、ＩＦＮ−γを分泌するＴ細胞の数を表している。
【００４２】
【図２１】図２１は、実験例１４の実験による、全ＶＺＶに特異的に、ＩＦＮ−γを分泌するＴ細胞の数を示している。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
発明を実施するための最良の形態
本発明は、水痘帯状疱疹ウイルスの糖たんぱく質Ｅ、グルコピラノシル脂質アジュバント、および代謝油を含み、弱毒生ワクチンの欠点を有することなく、細胞性免疫反応を選択的に高めることにより、高い安全性と、帯状疱疹を予防する優れた効果を有する、帯状疱疹ワクチン組成物に関する。
【００４４】
以下に、本発明を詳細に説明する。
【００４５】
本発明のワクチン組成物は、水痘帯状疱疹ウイルスの糖たんぱく質Ｅ（ＶＺＶ）、以下の式１のグルコピラノシル脂質アジュバント、および代謝可能油を含む：
【化２】
0006815521.tif 000003
式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ独立してＣ１０−Ｃ１２アルキルであり；Ｒ２およびＲ４はそれぞれ独立してＣ８−Ｃ１４アルキルである。
【００４６】
本発明のワクチン組成物は、ＶＺＶの糖たんぱく質Ｅ（ｇＥ）を含む。本発明における糖たんぱく質Ｅ（ｇＥ）は、ＶＺＶの糖たんぱく質Ｅ、またはその免疫原性誘導体を意味する。本発明における免疫原性誘導体は、糖たんぱく質Ｅの一部が修飾されたものであってよい。例えば、本発明における免疫原性誘導体は、糖たんぱく質Ｅの一部が切断されたもの、糖たんぱく質Ｅの１つ以上のアミノ酸が別のアミノ酸で置換されたもの、糖たんぱく質Ｅの１つ以上のアミノ酸が除去されたもの、糖たんぱく質Ｅに１つ以上のアミノ酸が付加されたもの、または、糖たんぱく質Ｅの１つ以上のアミノ酸が化学的に修飾されたものであってよい。例えば、本発明の糖タンパク質Ｅは、配列番号１の配列で表すことができる。
【００４７】
本発明のワクチン組成物は、以下の式１のグルコピラノシル脂質アジュバントおよび代謝可能油を含む：
【化３】
0006815521.tif 000004
式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ独立してＣ１０−Ｃ１２アルキルであり；Ｒ２およびＲ４はそれぞれ独立してＣ８−Ｃ１４アルキルである。例えば、Ｒ２およびＲ４は、Ｃ８アルキル、Ｃ９アルキル、Ｃ１０アルキル、Ｃ１１アルキル、Ｃ１２アルキル、Ｃ１３アルキル、またはＣ１４アルキルであってよい。より具体的な例によれば、Ｒ２およびＲ４は、Ｃ９アルキルまたはＣ１３アルキルであってよい。例えば、Ｒ２およびＲ４は、Ｃ９アルキルであってよい。
【００４８】
本明細書で用いられる「代謝可能油」という用語は、その構造が代謝によって修飾される油を意味し、植物油、魚油、動物油、および合成油を含み、これらは生物毒性を有さず、代謝進行時に構造変化を受け得る。
【００４９】
本発明の特定の実施形態によれば、本発明の代謝可能油は、スクアレンである。スクアレンは、３０個の炭素を有するトリテルペン骨格の炭化水素である。代謝可能油またはエマルジョンとして使用されることが当業界において一般に知られている、様々なスクアレン、例えばサメ肝油からのスクアレンを使用することができる。スクアレンの例示的な組成物は、Fox CB et al. (2013) Vaccine 31 (49): 5848-55に記載されている。
【００５０】
帯状疱疹の予防効果を高めるためには、ＶＺＶ抗原に対する液性免疫の活性化を最小限に抑えながら、ＶＺＶ抗原に対する細胞性免疫（ＣＭＩ）の活性化を有意に増強することが重要である。
【００５１】
高レベルのＴｈ２特異的サイトカインは、提供された抗原に対する液性免疫反応の誘導に有利であり、一方高レベルのＴｈ１特異的サイトカインは、提供された抗原に対する細胞性免疫反応（ＣＭＩ）の誘導を優先する傾向がある。したがって、Ｔｈ２特異的サイトカインよりもＴｈ１特異的サイトカインが多く生成されるほど、細胞性免疫反応の活性化の程度が、液性免疫反応の活性化の程度よりも高くなる。
【００５２】
また、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−２の中から、同時に２つ以上のサイトカインを生産する細胞の数が多いほど、細胞性免疫反応の活性化の程度は高い。
【００５３】
さらに、細胞性免疫反応の活性化の程度が、液性免疫反応の活性化の程度よりも高くなるにつれて、ＩｇＧ２ｃ抗体の生産は、ＩｇＧ１抗体の生産と比較して大幅に増加する。
【００５４】
本発明のワクチン組成物は、対象の体内において、液性免疫反応の活性化の程度よりも、細胞性免疫反応の活性化の程度を、大幅に増加させることができる。
【００５５】
例えば、本発明のワクチン組成物は、対象の体内において、Ｔｈ２特異的サイトカイン（例えば、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）など）の生産と比較して、Ｔｈ１特異的サイトカイン（例えば、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、およびインターロイキン−２（ＩＬ−２））の生産を、有意に増加させることができる。
【００５６】
また、例えば、本発明のワクチン組成物は、活性化Ｔｈ１細胞においては、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−２の中から、１つのサイトカインのみを生産する細胞の数よりも、上述のサイトカインの中から２つ以上のサイトカインを同時に生産する細胞の数を大幅に増加させることができる。
【００５７】
さらに、例えば、本発明のワクチン組成物は、対象の体内において、ｇＥ特異的ＩｇＧ抗体の生産を大幅に増加させることができ、特に、ｇＥ特異的ＩｇＧ１抗体の生産と比較して、ｇＥ特異的ＩｇＧ２ｃ抗体の生産を大幅に増加させることができる。
【００５８】
本発明のワクチン組成物は、１回投与量中に、５μｇ〜１００μｇの糖たんぱく質Ｅを含有してよい。例えば、本発明のワクチン組成物は、１回投与量中に、５μｇ〜８０μｇ、具体的には５μｇ〜７０μｇ、より具体的には５μｇ〜６０μｇ、および最も具体的には５μｇ〜５０μｇの糖たんぱく質Ｅを含有してよい。
【００５９】
本発明のワクチン組成物は、１回投与量中に、７．５μｇ〜２０μｇ、具体的には９μｇ〜１８μｇ、より具体的には９μｇ〜１６μｇ、および最も具体的には１０μｇ〜１５μｇのグルコピラノシル脂質アジュバントを含有してよい。本発明の別の実施形態によれば、本発明のワクチン組成物は、１回投与量中に、１３μｇ〜１７μｇのグルコピラノシル脂質アジュバントを含有してよい。グルコピラノシル脂質アジュバントが上記の範囲に含まれると、細胞性免疫反応を選択的に最大化することができる。
【００６０】
本発明のワクチン組成物は、１回投与量中に、１〜７％（ｖ／ｖ）、より具体的には１〜５％（ｖ／ｖ）、および最も具体的には１〜４％（ｖ／ｖ）の代謝可能油を含有してよい。
【００６１】
本発明のワクチン組成物は、糖たんぱく質Ｅ、グルコピラノシル脂質アジュバント、および代謝可能油に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体などを含んでよい。例えば、本発明のワクチン組成物は、生理食塩水またはＰＢＳ(リン酸緩衝食塩水)を含んでよい。
【００６２】
本発明のワクチン組成物は、様々な形態で、製剤化および包装することができる。一実施形態によれば、糖たんぱく質Ｅを含有するがグルコピラノシル脂質アジュバントおよび代謝可能油を含有しない第１のバイアルと、グルコピラノシル脂質アジュバントおよび代謝可能油を含有するが糖たんぱく質Ｅを含有しない第２のバイアルとを、別々に包装して、使用前に混合してよい（ベッドサイド混合）。別の実施形態によれば、糖たんぱく質、グルコピラノシル脂質アジュバントおよび代謝油の全てを含むワクチン組成物を、１つのバイアル、１つのシリンジ（プレフィルドシリンジ）などに包装してよい。
【００６３】
発明の実施形態
以下に、実験例を参照して、本発明をより詳細に説明する。これらの実験例は、本発明を例示することのみを意図したものであり、本発明の範囲は、これらの実験例で例証されたものに限定されない。
【実施例】
【００６４】
実験例１：免疫化
ヒトは水痘感染の病歴があるので、マウスで水痘感染を模倣するために、弱毒生ワクチン（ＬＡＶ、３０００ｐｆｕ）を、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１回皮下注射して、一次免疫を行った（ＬＡＶプライミング）。ＬＡＶプライミング（０日目）から２８日後に、ＶＺＶタンパク質免疫原またはアジュバントを、含むかまたは含まない種々のＶＺＶワクチン組成物を筋肉内注射により投与して、二次免疫を行った。
【００６５】
ＶＺＶに対する液性免疫反応を測定するために、血液サンプルを、ＬＡＶプライミング時点で１回、その２８日後および４２日後にそれぞれ採取し（０日目、２８日目、および４２日目）、また、ＶＺＶに対するＣＭＩ（細胞性免疫反応）を測定するために、ＬＡＶプライミングの４２日後に（４２日目）脾臓サンプルから白血球を回収した。
【００６６】
一次免疫（ＬＡＶプライミング）、二次免疫（免疫化）および免疫反応測定を、以下の表１に示したように、要約する。以下の表１では、ｇＥは配列番号１のＶＺＶ糖たんぱく質Ｅを指し、ＬＡＶは弱毒生ウイルスを指し、ＳＬＡは式１のグルコピラノシル脂質アジュバントを指し（式中、Ｒ２およびＲ４はＣ９アルキルである）、またＳＥはスクアレンを指す。ＳＬＡおよびスクアレンは、Infectious Disease Research Institute (Seattle, US)およびSigma-Aldrich (St. Louis, MO)から、それぞれ入手した。
【００６７】
水酸化アラム（Ａｌｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）は、水酸化アルミニウムである；Ａｄｄａｖａｘ（登録商標）は、スクアレンベースの水中油型ナノエマルジョンである；Ｐａｍ３ＣＳＫ４は、ＴＬＲ１／２アゴニストであり、ＣＡＳ番号１１２２０８―００―１の合成トリアシル化リポタンパク質である；ｐｏｌｙＩＣは、ポリイノシン・ポリシチジン酸である；ＭＰＬは、モノホスホリルリピドＡである；およびＯＤＮ１８２６は、クラスＢ  ＣｐＧオリゴヌクレオチド―マウスＴＬＲ９リガンドである。さらに、免疫化、血液サンプル回収、および脾臓サンプル回収の日は、ＬＡＶプライミングの日である０日目から計算した。
【表１】
0006815521.tif 000005
【００６８】
実験例２：実験方法
実験例２−１：ＶＺＶ抗原特異的ＩｇＧ力価（ＶＺＶ特異的ＩｇＧ力価）を測定するための方法
一次免疫および二次免疫を実施した後、ＶＺＶ抗原特異的ＩｇＧ力価を測定するために、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）を行った。組換えｇＥたんぱく質またはＶＺＶ抗原（１μｇ／ｍＬ）を、ＥＬＩＳＡプレート上にコーディングして、４℃で一晩インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを３回洗浄し、ブロッキングを、２％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含有するＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で１時間行った。ＥＬＩＳＡプレートを洗浄後、希釈した血清サンプルを添加し、２時間インキュベートした。ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ、ＩｇＧ１、またはＩｇＧ２ｃ抗体を添加し、１時間インキュベートした。最終インキュベーション後、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）基質を添加することによりＨＲＰ反応を誘導した。ＥＬＩＳＡ停止溶液を添加することによってＨＲＰ反応を停止させ、分光計を使用して４５０ｎｍの波長で吸光度（ＯＤ）を測定した。
【００６９】
実験例２−２：酵素免疫スポットアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ）を用いてＶＺＶ抗原特異的細胞性免疫反応を測定するための方法
一次免疫および二次免疫を行った後、マウスＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ（酵素免疫スポット）アッセイを実施し、ＶＺＶ抗原特異的細胞性免疫反応（ＣＭＩ）を確認した。ＩＦＮ−γ捕捉抗体（５μｇ／ｍＬ）をＥＬＩＳＰＯＴプレートにコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。ＥＬＩＳＰＯＴプレートを３回洗浄し、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含む培地で、１時間ブロッキングを実施した。ＥＬＩＳＰＯＴプレートを洗浄後、免疫化したマウスから回収した白血球と、ｇＥたんぱく質、ｇＥ  ＯＬＰ（重複ペプチド）、またはＶＺＶライセートとを添加して、白血球刺激のために２４時間インキュベートした。白血球刺激終了時に、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを洗浄し、ビオチン化マウスＩＦＮ−γ検出抗体（２μｇ／ｍＬ）を添加してインキュベートした。プレート洗浄後に、ストレプトアビジン−ＨＲＰを添加して、再度インキュベートした。次に、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを洗浄後に、ＡＥＣ基質混合物を添加して、室温で反応を誘導した。反応を、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを水で洗浄することにより停止し、プレートを乾燥させた。得られたスポットの数を、装置でカウントした。
【００７０】
実験例２−３：抗原刺激により分泌されたサイトカインを特定するための方法（ＣＢＡアッセイ）
一次免疫および二次免疫を実施した後、抗原刺激によりＴ細胞によって分泌されるサイトカインの種類を特定するために、ＣＢＡ（サイトメトリックビーズアレイ）アッセイを行った。マウスから回収した白血球を、ｇＥたんぱく質またはＶＺＶライセートで３日間刺激し、遠心分離して上清を得、その後上清をマウスＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７  ＣＢＡキットによりサイトカインについてアッセイした。７種類のサイトカイン捕捉ビーズ（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、およびＩＬ−１７Ａ）、上清サンプル、およびサイトカイン検出ビーズを、２時間一緒に反応させ、ビーズを洗浄し、上清中のサイトカインの量を決定した。
【００７１】
実験例２−４：サイトカイン分泌細胞の分布を決定するための方法（ＩＣＳアッセイ）
一次免疫および二次免疫を実施した後、Ｔｈ１特異的サイトカインの分泌をＩＣＳ（細胞内サイトカイン染色）アッセイにより測定し、抗原特異的細胞性免疫反応を確認した。マウスから回収した白血球を、ｇＥたんぱく質で一晩刺激し、この時点で、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（ＢＦＡ）／ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（モネンシン）も添加し、細胞内のサイトカインが外部に分泌されるのを防いだ。刺激された白血球を洗浄後、白血球の細胞表面を、Ｔ細胞を特定する抗体（７−ＡＡＤ、ＣＤ３−ＦＩＴＣ、ＣＤ４−Ｖ５００）で標識した。反応終了後、白血球を洗浄、透過処理し、サイトカインに結合することができる抗体（ＴＮＦ−α−ＰＥ、ＩＦＮ−γ−ＡＰＣ、ＩＬ−２−Ｖ４５０）と反応させて、細胞内のサイトカインの存在を確認した。反応後、白血球を洗浄および固定し、抗原刺激によりサイトカインを分泌する細胞の分布を解析した。
【００７２】
実験例２−５：ｇＥ抗原刺激により分泌されたＩＦＮ−γサイトカインを決定するための方法（ＩＦＮ−γＥＬＩＳＡ）
一次免疫および二次免疫を実施した後、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＡアッセイを行い、抗原刺激によりＴ細胞によって分泌される典型的なエフェクターサイトカインである、ＩＦＮ−γの分泌量を決定した。マウスから回収した白血球を、ｇＥたんぱく質またはｇＥ重複ペプチドで３日間刺激し、遠心分離して上清を得、その後上清をＩＦＮ−γＥＬＩＳＡキットにより解析した。ＩＦＮ−γ捕捉抗体（４μｇ／ｍＬ）をＥＬＩＳＡプレート上にコーティングし、室温で一晩インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを３回洗浄し、ブロッキングを、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳで、１時間行った。ＥＬＩＳＡプレートを洗浄後、白血球刺激により得られた上清をＥＬＩＳＡプレートに添加し、室温で２時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを洗浄後、ビオチン化マウスＩＦＮ−γ検出抗体（４００ｎｇ／ｍＬ）を添加し、室温で２時間インキュベートした。洗浄後、ストレプトアビジン―ＨＲＰを添加し、再度２０分間インキュベートした。インキュベーション後、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、室温で２０分間基質溶液と反応させた。反応を停止溶液で停止させたのち、装置を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【００７３】
実験例３：ｇＥ抗原特異的ＩｇＧ力価（ｇＥ特異的ＩｇＧ力価）の測定
ｇＥ抗原特異的ＩｇＧ力価を、実験例２−１の方法により測定し、実験結果を図１および図２にまとめている。
【００７４】
図１に示したように、ｇＥ抗原特異的ＩｇＧの生産は、ｇＥ＋ＳＬＡ−ＳＥ群において、大幅に増加した。
【００７５】
図２に示したように、ＩｇＧ２ｃの生産は、ｇＥ＋ＳＬＡ−ＳＥ群において大幅に増加し、特に、ＩｇＧ２ｃの生産は、ＩｇＧ１の生産と比較して、大幅に増加した。図２において、横軸「０」を基準とした右側の棒グラフは、ＩｇＧ２ｃの生産を表し、左側の棒グラフは、ＩｇＧ１の生産を表している。
【００７６】
図１および図２を考慮にいれると、ｇＥ、ＳＬＡおよびＳＥを含む組成物の使用は、全ＩｇＧの生産およびＩｇＧ２ｃの生産を有意に増加させ、特に、ＩｇＧ１と比較してＩｇＧ２の生産を大幅に増加させることを確認した。これらの結果は、高いＩｇＧ２ｃの生産および高いＩｇＧ２ｃ／ＩｇＧ１比の両方を満たす、ｇＥ、ＳＬＡおよびＳＥを含む組成物が、最も高い帯状疱疹の予防効果を有することを意味している。
【００７７】
実験例４：ｇＥまたはＶＺＶ抗原特異的細胞性免疫反応の測定(ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ)
ｇＥたんぱく質、ｇＥ  ＯＬＰ、またはＶＺＶライセート特異的細胞性免疫反応を、実験例２−２の方法（ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイ）に従い測定し、実験結果を図３、図４および図５にまとめている。
【００７８】
図３に示したように、二次免疫後にｇＥタンパク質と特異的に反応したＴ細胞の数を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより確認したところ、代表的なＴｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γを分泌するＴ細胞の数が、ｇＥ、ＳＬＡ、およびＳＥの組み合わせ（ｇＥ＋ＳＬＡ−ＳＥ）を使用した場合に増加したことがわかる。
【００７９】
図４に示したように、二次免疫後のｇＥ重複ペプチドに特異的なＴ細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより確認したところ、図３の結果と同様に、ｇＥ、ＳＬＡおよびＳＥを含む組成物が、他の組成物と比較して、有意に増加した抗原特異的ＣＭＩを示したことがわかる。
【００８０】
図５に示したように、ｇＥ抗原による免疫化後の、ＶＺＶライセートによる刺激によって誘導された、全ＶＺＶに特異的なＴ細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより確認したところ、全ＶＺＶおよびｇＥ抗原に特異的なエフェクターサイトカインを分泌するＴ細胞の数が、ｇＥ、ＳＬＡ、およびＳＥの組み合わせにより増加したことを確認した。
【００８１】
図３、図４および図５を考慮に入れると、ｇＥ、ＳＬＡおよびＳＥを含む組成物（ｇＥ＋ＳＬＡ−ＳＥ）が、ＶＺＶ抗原特異的ＣＭＩならびにｇＥ特異的ＣＭＩを、最大限に増加させることができることを確認した。これは、ｇＥ＋ＳＬＡ−ＳＥ組成物が、他の組成物よりも、より高い帯状疱疹の予防効果を有することを意味している。
【００８２】
実験例５：抗原刺激により分泌されたサイトカインの量の確認（ＣＢＡアッセイ）
抗原刺激により分泌されたサイトカインの確認（ＣＢＡアッセイ）を、実験例２〜３の方法により実施し、実験結果を図６にまとめている。図６において、ＩＦＮ−ｇはＩＦＮ−γを意味している。
【００８３】
図６に示したように、様々なＴｈサイトカインがｇＥ、ＳＬＡおよびＳＥを含む組成物により分泌され、代表的なＴｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γ（正面から４番目）は大幅に増加したが、一方、Ｔｈ２サイトカインであるＩＬ−４（正面から２番目）およびＩＬ−６（正面から３番目）、またはＴｈ１７サイトカインであるＩＬ−１７Ａ（正面から６番目）の分泌は最小限であった。これは、ｇＥ、ＳＬＡおよびＳＥを含む組成物が、他の組成物よりも、より高い帯状疱疹の予防効果を有することを意味している。
【００８４】
実験例６：サイトカイン分泌細胞の分布の確認
抗原刺激によりサイトカインを分泌する細胞の分布を確認するためのアッセイ（ＩＣＳアッセイ）を実験例２〜４の方法により実施し、実験結果を図７にまとめている。
【００８５】
図７に示したように、ｇＥ＋ＳＬＡ−ＳＥ群の場合、２つ以上のＴｈ１特異的サイトカインを同時に分泌するＴ細胞の数が有意に増加したが（６９％）、これは高品質の抗原特異的Ｔ細胞が、ｇＥ＋ＳＬＡ−ＳＥによる免疫化によって誘発されたことを示している。これは、ｇＥ、ＳＬＡおよびＳＥを含む組成物が、他の組成物よりも、より高い帯状疱疹の予防効果を有することを意味している。
【００８６】
実験例７：ＶＺＶ抗原特異的ＩｇＧ力価（抗ＶＺＶ糖たんぱく質特異的ＩｇＧ力価）の測定
ｇＥ、ｇＩ、ＩＥ６３、ｇＢ、ｇＣおよびｇＬのいずれか１つを二次免疫の抗原として用いたこと、およびＳＬＡ−ＳＥをアジュバントとして用いたこと以外は、実験例２−１と同じ方法で、ＳＬＡ−ＳＥの使用による、様々なＶＺＶ抗原特異的ＩｇＧ力価を決定し、その結果を図８および図９にまとめている。
【００８７】
図８に示したように、ＶＺＶ抗原特異的ＩｇＧの生産は、ｇＥ＋ＳＬＡ−ＳＥ群において、有意に増加した。
【００８８】
図９に示したように、ＩｇＧ２ｃの生産は、ｇＥ＋ＳＬＡ−ＳＥ群において大幅に増加し、特に、ＩｇＧ２ｃの生産は、ＩｇＧ１の生産と比較して、有意に増加した。図９において、横軸「０」を基準とした右側の棒グラフは、ＩｇＧ２ｃの生産を表し、左側の棒グラフは、ＩｇＧ１の生産を表している。
【００８９】
図８および図９の結果を考慮に入れると、ｇＥ、ＳＬＡおよびＳＥを含む組成物の使用が、全ＩｇＧ生産およびＩｇＧ２ｃの生産を有意に増加させ、特に、ＩｇＧ１と比較してＩｇＧ２ｃの生産を大幅に増加させたことを確認した。これは、高いＩｇＧ２ｃの生産および高いＩｇＧ２ｃ／ＩｇＧ１比の両方を満たす、ｇＥ、ＳＬＡおよびＳＥを含む組成物が、最も高い帯状疱疹の予防効果を有することを意味している。
【００９０】
実験例８：ＶＺＶ抗原刺激により分泌されたサイトカインの量の確認
免疫化に続いて、抗原刺激により分泌されたサイトカインを確認するための実験（ＣＢＡ）アッセイを、ｇＥ、ｇＩ、ＩＥ６３、ｇＢ、ｇＣおよびｇＬのいずれか１つを二次免疫の抗原として用いたこと、およびＳＬＡ−ＳＥをアジュバントとして用いたこと以外は、実験例２−３と同じ方法で実施し、結果を表１０にまとめている。
【００９１】
図１０に示したように、ｇＥ＋ＳＬＡ−ＳＥ群の場合に、代表的なＴｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γの分泌量が大幅に増加した。これは、細胞性免疫反応（ＣＭＩ）が非常に活性化されたこと、および、ｇＥ、ＳＬＡおよびＳＥを含む組成物が、他の組成物よりも、より高い帯状疱疹の予防効果を有することを意味している。
【００９２】
実験例９：ＶＺＶ抗原特異的サイトカインを分泌する細胞の分布の確認
免疫化に続いて、抗原刺激によりエフェクターサイトカインを分泌するＴ細胞の分布を確認するための実験（ＩＣＳアッセイ）を、ｇＥ、ｇＩ、ＩＥ６３、ｇＢ、ｇＣおよびｇＬのいずれか１つを二次免疫の抗原として用いたこと、およびＳＬＡ−ＳＥをアジュバントとして用いたこと以外は実験例２−４と同じ方法で実施し、その結果を図１１にまとめている。
【００９３】
図１１に示したように、ｇＥ＋ＳＬＡ−ＳＥ群の場合に、Ｔｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、およびＴＮＦ−αを分布するＣＤ４＋Ｔ細胞の割合が有意に増加した。これは、細胞性免疫反応（ＣＭＩ）が非常に活性化されたこと、および、ｇＥ、ＳＬＡおよびＳＥを含む組成物が、他の組成物よりも、より高い帯状疱疹の予防効果を有することを意味している。
【００９４】
実験例１０：抗原の組み合わせによる、ＶＺＶ特異的免疫原性の特定
二次免疫時に、ｇＥ抗原を単独で用いた場合、および、ｇＥ抗原を別のＶＺＶ抗原と組み合わせて用いた場合に、誘導されるＶＺＶ特異的免疫原性を特定するために、ＶＺＶ抗原特異的ＩｇＧ力価およびＶＺＶ抗原特異的Ｔ細胞免疫反応を、実験例２−１および実験例２−２の方法により確認し、実験結果を図１２にまとめている。
【００９５】
図１２に示したように、ｇＥ抗原を単独で用いた場合に誘導されるＶＺＶ特異的抗体反応およびＴ細胞反応は、ｇＥ抗原をｇＩまたはＩＥ６３抗原と共に用いた場合に誘導されるＶＺＶ特異的免疫反応と、有意に異ならなかった。これは、ｇＥ、ＳＬＡおよびＳＥを含む組成物が、他の組成物よりも、より高い帯状疱疹の予防効果を有することを意味している。
【００９６】
実験例１１：ｇＥ抗原特異的ＩｇＧ力価（ｇＥ特異的ＩｇＧ力価）の測定
様々なアジュバントの使用によるｇＥ抗原特異的ＩｇＧ力価を、ｇＥを抗原として用いたこと、およびＳＬＡ−ＳＥ、水酸化アラム、Ａｄｄａｖａｘ、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、ｐｏｌｙＩＣ、ＭＰＬ、フラジェリン、イミキモド、およびＯＤＮ１８２６のいずれか１つを、二次免疫のアジュバントとして用いたこと以外は、実験例２−１と同じ方法で測定し、その結果を図１３および図１４にまとめている。
【００９７】
図１３に示したように、ｇＥ抗原特異的ＩｇＧの生産は、他のアジュバント群と比較して、ｇＥ＋ＳＬＡ−ＳＥ群において大幅に増加した。
【００９８】
図１４に示したように、ＩｇＧ２ｃの生産は、他のアジュバント群と比較して、ｇＥ＋ＳＬＡ−ＳＥ群において大幅に増加し、特に、ＩｇＧ２ｃの生産は、ＩｇＧ１の生産と比較して、有意に増加した。図１４において、横軸「０」を基準とした右側の棒グラフは、ＩｇＧ２ｃの生産を表し、左側の棒グラフは、ＩｇＧ１の生産を表している。
【００９９】
図１３および図１４を考慮にいれると、ｇＥ、ＳＬＡおよびＳＥを含む組成物の使用は、全ＩｇＧの生産およびＩｇＧ２ｃの生産を有意に増加させることを確認した。これは、ｇＥ、ＳＬＡおよびＳＥを含む組成物が、最も高い帯状疱疹の予防効果を有することを意味している。
【０１００】
実験例１２：ｇＥまたはＶＺＶ抗原特異的細胞性免疫反応の測定（ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ）
ｇＥたんぱく質、ｇＥ  ＯＬＰ、またはＶＺＶライセート特異的細胞性免疫反を、実験例２−２の方法（ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイ）により測定し、実験結果を図１５、図１６および図１７にまとめている。
【０１０１】
図１５に示したように、二次免疫後のｇＥたんぱく質に特異的に反応するＴ細胞の数を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより確認したところ、代表的なＴｈ１サイトカインである、ＩＦＮ−γを分泌するＴ細胞の数が、他のアジュバント群と比較して、ｇＥ＋ＳＬＡ−ＳＥ群において有意に増加したことがわかる。
【０１０２】
図１６に示したように、二次免疫後のｇＥ重複ペプチドに特異的なＴ細胞の数を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより確認したところ、図１５の結果と同様に、ｇＥ、ＳＬＡおよびＳＥを含む組成物が、他の組成物と比較して、有意に増加した抗原特異的ＣＭＩを示したことがわかる。
【０１０３】
図１７に示したように、ｇＥ抗原による免疫化後の、ＶＺＶライセートによる刺激によって誘導された全ＶＺＶに特異的なＴ細胞の数を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより確認したところ、全ＶＺＶに特異的なＩＦＮ−γを分泌するＴ細胞の数が、ｇＥ＋ＳＬＡ−ＳＥにより増加したことを確認した。
【０１０４】
図１５、図１６および図１７の結果を考慮にいれると、ｇＥ、ＳＬＡおよびＳＥを含む組成物が、ＶＺＶ抗原特異的ＣＭＩならびにｇＥ特異的ＣＭＩを、他の組成物と比較して、最大限に増加させることができることを確認した。これは、ｇＥ＋ＳＬＡ−ＳＥ組成物が、他の組成物よりも、より高い帯状疱疹の予防効果を有することを意味している。
【０１０５】
実験例１３：ｇＥ抗原またはＶＺＶ抗原刺激により分泌されたＩＦＮ−γサイトカインの確認（ＩＦＮ−γＥＬＩＳＡアッセイ）
ｇＥ抗原またはｇＥ  ＯＬＰ抗原刺激により分泌されたＩＦＮ−γサイトカインを確認するための実験（ＩＦＮ−γＥＬＩＳＡアッセイ）を、実験例２−５の方法により実施し、その結果を図１８および図１９にまとめている。
【０１０６】
図１８に示したように、二次免疫後にｇＥたんぱく質刺激により分泌されるＩＦＮ−γサイトカインの分泌量を観察したところ、典型的なＴｈ１エフェクターサイトカインであるＩＦＮ−γの分泌量が、他のアジュバント群と比較して、ｇＥ＋ＳＬＡ−ＳＥ群において増加したことを確認した。
【０１０７】
図１９に示したように、二次免疫後にｇＥ重複ペプチド刺激により分泌されるＩＦＮ−γサイトカインの分泌量を観察したところ、ＩＦＮ−γの分泌量が、他のアジュバント群と比較して、ｇＥ、ＳＬＡ、およびＳＥの組み合わせにより、増加したことを確認した。
【０１０８】
図１８および図１９の結果を考慮にいれると、ｇＥ、ＳＬＡおよびＳＥを含む組成物は、他のアジュバント含有組成物と比較して、代表的なＴｈ１エフェクターサイトカインの分泌量を増加させたが、これは、ｇＥ＋ＳＬＡ−ＳＥ組成物が、他の組成物よりも、より高い帯状疱疹の予防効果を有することを意味している。
【０１０９】
実験例１４：ＶＺＶ特異的免疫原性を誘導するＳＬＡ−ＳＥの最適な量の決定
表２は、最も効果的にＶＺＶ抗原特異的細胞性免疫反応（ＣＭＩ）を誘導できるＳＬＡ−ＳＥの最適な量を確認するための実験デザインを、まとめている。弱毒生ワクチン（ＬＡＶ、３，０００ｐｆｕ）を雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１回皮下注射し、その後２８日目に二次免疫（免疫化）を実施した。ＬＡＶプライミング後５６日目に、白血球を脾臓サンプルから回収し、ＶＺＶに特異的な細胞性免疫反応（ＣＭＩ）を確認した。
【表２】
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【０１１０】
ｇＥ抗原特異的細胞性免疫反応を実験例２−２の方法により測定し（ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイ）、実験結果を図２０にまとめている。
【０１１１】
ＶＺＶ抗原特異的細胞性免疫反応を実験例２−２に方法により測定し（ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイ）、実験結果を図２１にまとめている。
【０１１２】
図２０および図２１の結果を考慮に入れると、ＶＺＶ抗原特異的細胞性免疫反応を誘導するためのＳＬＡの最適な量は、７．５μｇ〜２０μｇの範囲内であることがわかる。
【図１】
0006815521.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
0006815521.tif 000027
【図２１】
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【配列表】
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