(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ゲノム中の１以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域を標的とする複数のＬＡＭＰ用プライマーを含むＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２検出用プライマーセットであって、
下記（１）〜（４）：
（１）配列番号１３〜１６の塩基配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む４つのプライマーを含むプライマーセット；
（２）配列番号１９〜２２の塩基配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む４つのプライマーを含むプライマーセット；
（３）配列番号２５〜２８の塩基配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む４つのプライマーを含むプライマーセット；および
（４）配列番号４３〜４６の塩基配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む４つのプライマーを含むプライマーセット、
からなる群より選ばれる１以上のプライマーセットを含む、プライマーセット。
【請求項２】
前記プライマーセットが、前記（１）のプライマーセットを含む、請求項１記載のプライマーセット。
【請求項３】
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ゲノム中の１以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域を標的とする複数のＬＡＭＰ用プライマーを含むＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２検出用プライマーセットであって、
下記（１）〜（４）：
（１）配列番号１３〜１８の塩基配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む６つのプライマーを含むプライマーセット；
（２）配列番号１９〜２４の塩基配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む６つのプライマーを含むプライマーセット；
（３）配列番号２５〜３０の塩基配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む６つのプライマーを含むプライマーセット；
（４）配列番号４３〜４８の塩基配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む６つのプライマーを含むプライマーセット、
からなる群より選ばれる１以上のプライマーセットを含む、プライマーセット。
【請求項４】
ＲＴ−ＬＡＭＰ法において請求項１〜３のいずれか一項記載のプライマーセットを用いて、被験体から得られた検体においてＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２を検出することを含む、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２を検査するための方法。
【請求項５】
前記検体が鼻腔スワブ、咽頭スワブ、唾液、または喀痰である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
検体の加熱処理後にＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２が検出される、請求項４または５記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか一項記載のプライマーセットを含む、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の検査試薬。
【請求項８】
下記（１）〜（３）を含む、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の検査キット：
（１）請求項１〜３のいずれか一項記載のプライマーセット；
（２）鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ；および
（３）逆転写酵素。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２検出用プライマーセット、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２を検査するための方法、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の検査試薬および検査キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
新型コロナウイルス感染症であるＣＯＶＩＤ−１９は、２０１９年に中国武漢市付近で発生が初めて確認され、その後、世界的流行を引き起こした新規感染症である。ＣＯＶＩＤ−１９は、コロナウイルスであるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２（Ｓｅｖｅｒｅ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ  ２）を原因とする感染症であることが判明している。【０００３】
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２は、一本鎖のプラス鎖ＲＮＡゲノムを有するエンベロープウイルスであり、ベータコロナウイルス属のＳＡＲＳ関連コロナウイルス（ＳＡＲＳｒ−ＣｏＶ）に属する。このウイルスは、２００３年に中国で流行したＳＡＲＳコロナウイルスであるＳＡＲＳ−ＣｏＶの直接の子孫ではないと考えられているものの、ＳＡＲＳ−ＣｏＶにちなんで、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２と命名された。【０００４】
現在、コロナウイルス由来核酸の特異的な増幅によりコロナウイルスを検出する技術として、ＲＴ−ＰＣＲ法が実用化されている。実際、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の検出でも、ＲＴ−ＰＣＲ法が早々に実用化された。しかし、ＲＴ−ＰＣＲ法によるコロナウイルスの検出は、検体の前処理時間も考慮すると、長時間（典型的には約６〜８時間）を要することから、迅速性に欠ける。これに関して、コロナウイルス由来核酸の特異的な増幅によるコロナウイルスの迅速な検出を可能にする技術としては、特定のプライマーセットを用いるＬＡＭＰ法が報告されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第５７４０１１２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、上記既報のＬＡＭＰ法は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２を標的とするものではないため、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の検出に支障があるという課題がある。【０００７】
したがって、本発明の目的は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２由来核酸の特異的な増幅によるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の迅速な検出を可能にする技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意検討した結果、特定のプライマーを用いたＲＴ−ＬＡＭＰ法により、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２由来核酸を特異的に増幅しつつ、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２を迅速に検出できることを見出した。本発明者らはまた、そのようなＲＴ−ＬＡＭＰ法が感度および簡便性に優れ、しかも高い診断感度および診断特異度などを実現できることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ゲノム中の１以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域を標的とする複数のＬＡＭＰ用プライマーを含むＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２検出用プライマーセットであって、
１以上のＯＲＦ領域が、Ｏｒｆ１ｂ、ＯｒｆＭ、ＯｒｆＮ、およびＯｒｆＳからなる群より選ばれる、プライマーセット。
〔２〕１以上のＯＲＦ領域が、下記（１）〜（６）からなる群より選ばれる、〔１〕のプライマーセット：
（１）配列番号５の塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列に対応するＯｒｆ１ｂ中の部分領域；
（２）配列番号３の塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列に対応するＯｒｆ１ｂ中の部分領域；
（３）配列番号７の塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列に対応するＯｒｆＭ中の部分領域；
（４）配列番号９の塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列に対応するＯｒｆＮ中の部分領域；
（５）配列番号１１の塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列に対応するＯｒｆＳ中の部分領域；および
（６）配列番号１２の塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列に対応するＯｒｆＳ中の部分領域。
〔３〕複数のＬＡＭＰ用プライマーが、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＦＩＰプライマー、およびＢＩＰプライマーを含む、〔１〕または〔２〕のプライマーセット。
〔４〕複数のＬＡＭＰ用プライマーが、下記（１）〜（６）からなる群より選ばれる、〔３〕のプライマーセット：
（１）配列番号１３〜１６の塩基配列、またはそれらの相補塩基配列をそれぞれ含む４つのプライマー；
（２）配列番号１９〜２２の塩基配列、またはそれらの相補塩基配列をそれぞれ含む４つのプライマー；
（３）配列番号２５〜２８の塩基配列、またはそれらの相補塩基配列をそれぞれ含む４つのプライマー；
（４）配列番号３１〜３４の塩基配列、またはそれらの相補塩基配列をそれぞれ含む４つのプライマー；
（５）配列番号３７〜４０の塩基配列、またはそれらの相補塩基配列をそれぞれ含む４つのプライマー；および
（６）配列番号４３〜４６の塩基配列、またはそれらの相補塩基配列をそれぞれ含む４つのプライマー。
〔５〕複数のＬＡＭＰ用プライマーが、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、ＬＦプライマー、およびＬＢプライマーを含む、〔１〕または〔２〕のプライマーセット。
〔６〕複数のＬＡＭＰ用プライマーが、下記（１）〜（６）からなる群より選ばれる、〔５〕のプライマーセット：
（１）配列番号１３〜１８の塩基配列、またはそれらの相補塩基配列をそれぞれ含む６つのプライマー；
（２）配列番号１９〜２４の塩基配列、またはそれらの相補塩基配列をそれぞれ含む６つのプライマー；
（３）配列番号２５〜３０の塩基配列、またはそれらの相補塩基配列をそれぞれ含む６つのプライマー；
（４）配列番号３１〜３６の塩基配列、またはそれらの相補塩基配列をそれぞれ含む６つのプライマー；
（５）配列番号３７〜４２の塩基配列、またはそれらの相補塩基配列をそれぞれ含む６つのプライマー；および
（６）配列番号４３〜４８の塩基配列、またはそれらの相補塩基配列をそれぞれ含む６つのプライマー。
〔７〕１以上のＯＲＦ領域が、ＯＲＦ１ｂを含む、〔１〕のプライマーセット。
〔８〕１以上のＯＲＦ領域が、（１）配列番号５の塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列に対応するＯＲＦ１ｂ中の部分領域を含む、〔２〕のプライマーセット。
〔９〕複数のＬＡＭＰ用プライマーが、（１）配列番号１３〜１６の塩基配列、またはそれらの相補塩基配列をそれぞれ含む４つのプライマーを含む、〔４〕のプライマーセット。
〔１０〕複数のＬＡＭＰ用プライマーが、（１）配列番号１３〜１８の塩基配列、またはそれらの相補塩基配列をそれぞれ含む６つのプライマーを含む、〔６〕のプライマーセット。
〔１１〕ＲＴ−ＬＡＭＰ法において〔１〕〜〔１０〕のいずれかのプライマーセットを用いて、被験体から得られた検体においてＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２を検出することを含む、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２を検査するための方法。
〔１２〕前記検体が鼻腔スワブ、咽頭スワブ、または喀痰である、〔１１〕の方法。
〔１３〕検体の加熱処理後にＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２が検出される、〔１１〕または〔１２〕の方法。
〔１４〕〔１〕〜〔１０〕のいずれかのプライマーセットを含む、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の検査試薬。
〔１５〕下記（１）〜（３）を含む、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の検査キット：
（１）〔１〕〜〔１０〕のいずれかのプライマーセット；
（２）鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ；および
（３）逆転写酵素。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２由来核酸を特異的に増幅しつつ、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２を迅速に検出できる。本発明は、感度および簡便性に優れ、しかも高い診断感度および診断特異度などを実現できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ゲノム中のＯｒｆ１ｂをコードする塩基配列（配列番号１）における１〜４０８０位のヌクレオチド配列に対応するＯｒｆ１ｂの部分塩基配列（配列番号２）を示す図である。下線部は、実施例においてＬＡＭＰ用プライマーで増幅された、第１部分領域（２４５塩基長）をコードする塩基配列（配列番号３）を示す。
【図２】図２は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ゲノム中のＯｒｆ１ｂをコードする塩基配列（配列番号１）における４０８１〜８０８８位のヌクレオチド配列に対応するＯｒｆ１ｂの部分塩基配列（配列番号４）を示す図である。下線部は、実施例においてＬＡＭＰ用プライマーで増幅された第２部分領域（２５６塩基長）をコードする塩基配列（配列番号５）を示す。
【図３】図３は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ゲノム中のＯｒｆＭをコードする塩基配列（配列番号６）を示す図である。下線部は、実施例においてＬＡＭＰ用プライマーで増幅された領域（２１５塩基長）をコードする塩基配列（配列番号７）を示す。
【図４】図４は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ゲノム中のＯｒｆＮをコードする塩基配列（配列番号８）を示す図である。下線部は、実施例においてＬＡＭＰ用プライマーで増幅された領域（２３１塩基長）をコードする塩基配列（配列番号９）を示す。
【図５】図５は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ゲノム中のＯｒｆＳをコードする塩基配列（配列番号１０）を示す図である。下線部は、実施例においてＬＡＭＰ用プライマーで増幅された、第１部分領域（２２９塩基長）をコードする塩基配列（配列番号１１）、および第２部分領域（２６６塩基長）をコードする塩基配列（配列番号１２）を示す。
【図６】図６は、標的核酸と４つのＬＡＭＰ用プライマーとの関係を示す図である。
【図７】図７は、標的核酸と６つのＬＡＭＰ用プライマーとの関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ゲノム中の１以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域を標的とする複数のＬＡＭＰ用プライマーを含むＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２検出用プライマーセットを提供する。標的とされる１以上のＯＲＦ領域は、Ｏｒｆ１ｂ、ＯｒｆＭ、ＯｒｆＮ、およびＯｒｆＳからなる群より選ばれる。
【００１３】
本発明において標的とされるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ゲノムは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の任意の株におけるＲＮＡゲノムである。このような株としては、例えば、Ｌ型およびＳ型の主要株、ならびにそれらの亜株が挙げられる。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ゲノムとしては、多数の株におけるＲＮＡゲノムが報告されている。例えば、このような多数の株のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ゲノムについては、インフルエンザウイルス遺伝子データベースＧＩＳＡＩＤ（Ｇｌｏｂａｌ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ  ｏｎ  Ｓｈａｒｉｎｇ  Ａｌｌ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｄａｔａ）の公開情報（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｉｓａｉｄ．ｏｒｇ／ｅｐｉｆｌｕ−ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｎｅｘｔ−ｈｃｏｖ−１９−ａｐｐ／）を参照することができる。
【００１４】
ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法は、等温反応による標的核酸の増幅を可能にする方法である。ＬＡＭＰ法は、６つの領域を含む４つ以上のプライマーにより標的核酸を特異的に増幅できるという特徴を有する。
【００１５】
複数のＬＡＭＰ用プライマーは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ゲノム中の標的ＲＮＡおよびそのｃＤＮＡの特定の領域に結合することができるように設計することができる。ＬＡＭＰ用プライマーの設計では、Ｆ３ｃ領域、Ｆ２ｃ領域、Ｆ１ｃ領域、Ｂ１領域、Ｂ２領域およびＢ３領域と表現される標的ＲＮＡ中の領域（３’側から５’側の向き）、ならびにＦ３領域、Ｆ２領域、Ｆ１領域、Ｂ１ｃ領域、Ｂ２ｃ領域およびＢ３ｃ領域と表現されるｃＤＮＡ中の領域（５’側から３’側の向き）が特定される。ここで、Ｆ１領域とＦ１ｃ領域、Ｆ２領域とＦ２ｃ領域、Ｆ３領域とＦ３ｃ領域、Ｂ１領域とＢ１ｃ領域、Ｂ２領域とＢ２ｃ領域、Ｂ３領域とＢ３ｃ領域は、互いに相補的な塩基配列からなる領域である。
【００１６】
複数のＬＡＭＰ用プライマーは、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＦＩＰプライマー、およびＢＩＰプライマーを含む（図６）。Ｆ３プライマーは、Ｆ３領域の塩基配列を含む。Ｂ３プライマーは、Ｂ３領域の塩基配列を含む。ＦＩＰプライマーは、５’側から３’側に向けてＦ１ｃ領域の塩基配列とＦ２領域の塩基配列とを含む。ＢＩＰプライマーは、５’側から３’側に向けてＢ１ｃ領域の塩基配列とＢ２領域の塩基配列とを含む。これらのプライマーの各塩基配列に対応する鋳型核酸中の領域を矢印で示す。矢印の向きは、対応するプライマーの各塩基配列上での方向性を示しており、矢印の始点が５’端、矢印の終点が３’端を示す。
【００１７】
複数のＬＡＭＰ用プライマーは、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＦＩＰプライマー、およびＢＩＰプライマーに加えて、ループプライマーとしてＬＦプライマーおよび／またはＬＢプライマーを含んでもよい（図７）。ループプライマーの併用により、増幅効率をさらに向上させることができる。ＬＦプライマーおよびＬＢプライマーは、それぞれ、ＬＦｃ領域およびＬＢ領域の塩基配列を含むことができる。また、ループプライマーは、増幅産物のループ部分に結合するように設計することもできる。ループ部分としては、例えば、Ｆ２ｃ領域の５’端からＦ１ｃ領域の３’端よりも３’側のヌクレオチド残基までの範囲、およびＢ２領域の３’端からＢ１領域の５’端よりも５’側のヌクレオチド残基までの範囲が挙げられる。
【００１８】
複数のＬＡＭＰ用プライマーは、上記領域の塩基配列またはその相補塩基配列における連続する少なくとも１３個のヌクレオチド残基を含むことができる。複数のＬＡＭＰ用プライマーはまた、上記領域の塩基配列またはその相補塩基配列における連続する少なくとも１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、または２５個のヌクレオチド残基を含んでいてもよい。
【００１９】
一実施形態では、標的とされる１以上のＯＲＦ領域は、Ｏｒｆ１ｂを含む。Ｏｒｆ１ｂをコードする塩基配列として、配列番号１の塩基配列が報告されている（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＭＮ９０８９４７中の１３４６８〜２１５５５位のヌクレオチド残基に対応）。ウイルスは、進化速度が速く多数の変異が蓄積し易い。一方で、９０％未満の同一性しか示さない塩基配列は、同一のウイルスに由来する塩基配列ではないとウイルス学的に考えることができる。このような観点によれば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２株間で生じ得るゲノム配列の差異をカバーしつつ、異なるウイルス（例、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）との交差反応を回避するためには、標的領域の塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列に基づいて複数のＬＡＭＰ用プライマーを設計することができる。したがって、Ｏｒｆ１ｂを標的とする場合、配列番号１の塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列に基づいて複数のＬＡＭＰ用プライマーを設計することができる。
【００２０】
好ましくは、Ｏｒｆ１ｂ上の標的は、配列番号３の塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列に対応するＯＲＦ１ｂ中の第１部分領域（２４５塩基長）、または配列番号５の塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列に対応するＯＲＦ１ｂ中の第２部分領域（２５６塩基長）である。このような第１部分領域に対して、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＦＩＰプライマー、およびＢＩＰプライマー（例、配列番号１９〜２２の塩基配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む４つのプライマー）、ならびに必要に応じて、ＬＦプライマー、およびＬＢプライマー（例、配列番号２３および２４の塩基配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む２つのループプライマー）を設計することができる。また、このような第２部分領域に対して、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＦＩＰプライマー、およびＢＩＰプライマー（例、配列番号１３〜１６の塩基配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む４つのプライマー）、ならびに必要に応じて、ＬＦプライマー、およびＬＢプライマー（例、配列番号１７および１８の塩基配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む２つのループプライマー）を設計することができる。
【００２１】
別の実施形態では、標的とされる１以上のＯＲＦ領域は、ＯｒｆＭを含む。ＯｒｆＭをコードする塩基配列として、配列番号６の塩基配列が報告されている（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：：ＭＮ９０８９４７中の２６５２３〜２７１９１位のヌクレオチド残基に対応）。ＯｒｆＭを標的とする場合、配列番号６の塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列に基づいてＬＡＭＰ用プライマーを設計することができる。
【００２２】
好ましくは、ＯｒｆＭ上の標的は、配列番号７の塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列に対応するＯｒｆＭ中の部分領域（２１５塩基長）である。このような部分領域に対して、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＦＩＰプライマー、およびＢＩＰプライマー（例、配列番号２５〜２８の塩基配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む４つのプライマー）、ならびに必要に応じて、ＬＦプライマー、およびＬＢプライマー（例、配列番号２９および３０の塩基配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む２つのループプライマー）を設計することができる。
【００２３】
さらに別の実施形態では、標的とされる１以上のＯＲＦ領域は、ＯｒｆＮを含む。ＯｒｆＮをコードする塩基配列として、配列番号８の塩基配列が報告されている（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＭＮ９０８９４７中の２８２７４〜２９５３３位のヌクレオチド残基に対応）。ＯｒｆＮを標的とする場合、配列番号８の塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列に基づいてＬＡＭＰ用プライマーを設計することができる。
【００２４】
好ましくは、ＯｒｆＮ上の標的は、配列番号９の塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列に対応するＯｒｆＮ中の部分領域（２３１塩基長）である。このような部分領域に対して、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＦＩＰプライマー、およびＢＩＰプライマー（例、配列番号３１〜３４の塩基配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む４つのプライマー）、ならびに必要に応じて、ＬＦプライマー、およびＬＢプライマー（例、配列番号３５および３６の塩基配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む２つのループプライマー）を設計することができる。
【００２５】
さらに別の実施形態では、標的とされる１以上のＯＲＦ領域は、ＯｒｆＳを含む。ＯｒｆＳをコードする塩基配列として、配列番号１０の塩基配列が報告されている（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＭＮ９０８９４７中の２１５６３〜２５３８４位のヌクレオチド残基に対応）。ＯｒｆＳを標的とする場合、配列番号１０の塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列に基づいてＬＡＭＰ用プライマーを設計することができる。
【００２６】
好ましくは、ＯｒｆＳ上の標的は、配列番号１１の塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列に対応するＯｒｆＳ中の第１部分領域（２２９塩基長）、または配列番号１２の塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列に対応するＯｒｆＳ中の第２部分領域（２６６塩基長）である。このような第１部分領域に対して、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＦＩＰプライマー、およびＢＩＰプライマー（例、配列番号３７〜４０の塩基配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む４つのプライマー）、ならびに必要に応じて、ＬＦプライマー、およびＬＢプライマー（例、配列番号４１および４２の塩基配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む２つのループプライマー）を設計することができる。また、このような第２部分領域に対して、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＦＩＰプライマー、およびＢＩＰプライマー（例、配列番号４３〜４６の塩基配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む４つのプライマー）、ならびに必要に応じて、ＬＦプライマー、およびＬＢプライマー（例、配列番号４７および４８の塩基配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む２つのループプライマー）を設計することができる。
【００２７】
特定の実施形態では、上記１以上のＯＲＦ領域を標的とする複数のＬＡＭＰ用プライマーを含むプライマーセットは、下記（ａ）〜（ｄ）により示される４つのプライマー、および必要に応じて下記（ｅ）および（ｆ）により示される２つのループプライマーを含むものとして特定することができる：
（ａ）上記１以上のＯＲＦ領域におけるＦ３領域内の連続する少なくとも１３個のヌクレオチド残基からなる塩基配列、またはその相補塩基配列を含む第１プライマー（Ｆ３プライマーまたはその相補プライマーに相当）；
（ｂ）上記１以上のＯＲＦ領域におけるＢ３領域内の連続する少なくとも１３個のヌクレオチド残基からなる塩基配列、またはその相補塩基配列を含む第２プライマー（Ｂ３プライマーまたはその相補プライマーに相当）；
（ｃ）上記１以上のＯＲＦ領域において、５’側から３’側に向けて、Ｆ１ｃ領域内の連続する少なくとも１３個のヌクレオチド残基からなる塩基配列、およびＦ２領域の連続する少なくとも１３個のヌクレオチド残基からなる塩基配列、またはそれらの相補塩基配列を含む第３プライマー（ＦＩＰプライマーまたはその相補プライマーに相当）；
（ｄ）上記１以上のＯＲＦ領域において、５’側から３’側に向けて、Ｂ１ｃ領域内の連続する少なくとも１３個のヌクレオチド残基からなる塩基配列、およびＢ２領域内の連続する少なくとも１３個のヌクレオチド残基からなる塩基配列、またはそれらの相補塩基配列を含む第４プライマー（ＢＩＰプライマーまたはその相補プライマーに相当）；
（ｅ）上記１以上のＯＲＦ領域において、Ｆ２ｃ領域の５’端からＦ１ｃ領域の３’端よりも３’側のヌクレオチド残基までの範囲にある領域（例、ＬＦｃ領域）内の連続する少なくとも１３個のヌクレオチド残基からなる塩基配列、またはその相補塩基配列を含む第５プライマー（ＬＦプライマーまたはその相補プライマーに相当）；ならびに
（ｆ）上記１以上のＯＲＦ領域において、Ｂ２領域の３’端からＢ１領域の５’端よりも５’側のヌクレオチド残基までの範囲にある領域（例、ＬＢ領域）内の連続する少なくとも１３個のヌクレオチド残基からなる塩基配列、またはその相補塩基配列を含む第６プライマー（ＬＢプライマーまたはその相補プライマーに相当）。
【００２８】
上記特定の実施形態において、Ｏｒｆ１ｂの上記部分領域が標的として意図される場合、下記領域に基づき、第１〜６プライマーを設計することもまた好ましい：
（ｉ）Ｆ３ｃ領域：配列番号２の塩基配列における２３〜１位のヌクレオチド残基からなる塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列；
（ｉｉ）Ｆ３領域：Ｆ３ｃ領域をコードする塩基配列の相補塩基配列；
（ｉｉｉ）Ｆ２ｃ領域：配列番号２の塩基配列における５８〜４０位のヌクレオチド残基からなる塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列；
（ｉｖ）Ｆ２領域：Ｆ２ｃ領域をコードする塩基配列の相補塩基配列；
（ｖ）Ｆ１ｃ領域：配列番号２の塩基配列における１２２〜９８位のヌクレオチド残基からなる塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列；
（ｖｉ）Ｆ１領域：Ｆ１ｃ領域をコードする塩基配列の相補塩基配列；
（ｖｉｉ）Ｂ１領域：配列番号２の塩基配列における１７５〜１５１位のヌクレオチド残基からなる塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列；
（ｖｉｉｉ）Ｂ１ｃ領域：Ｂ１領域をコードする塩基配列の相補塩基配列；
（ｉｘ）Ｂ２領域：配列番号２の塩基配列における２２６〜２０５位のヌクレオチド残基からなる塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列；
（ｘ）Ｂ２ｃ領域：Ｂ２領域をコードする塩基配列の相補塩基配列；
（ｘｉ）Ｂ３領域：配列番号２の塩基配列における２５６〜２３４位のヌクレオチド残基からなる塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列；および
（ｘｉｉ）Ｂ３ｃ領域：Ｂ３領域をコードする塩基配列の相補塩基配列。
より好ましくは、ＯＲＦ１ｂの上記部分領域を標的とする第１〜６プライマーは、配列番号１３〜１８の塩基配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む６つのプライマーである。
【００２９】
上記特定の実施形態において、Ｏｒｆ１ｂの上記部分領域が標的として意図される場合、下記領域に基づき、第１〜６プライマーを設計することもまた好ましい：
（ｉ）Ｆ３ｃ領域：配列番号４の塩基配列における２０〜１位のヌクレオチド残基からなる塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列；
（ｉｉ）Ｆ３領域：Ｆ３ｃ領域をコードする塩基配列の相補塩基配列；
（ｉｉｉ）Ｆ２ｃ領域：配列番号４の塩基配列における５０〜３１位のヌクレオチド残基からなる塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列；
（ｉｖ）Ｆ２領域：Ｆ２ｃ領域をコードする塩基配列の相補塩基配列；
（ｖ）Ｆ１ｃ領域：配列番号４の塩基配列における１０５〜８１位のヌクレオチド残基からなる塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列；
（ｖｉ）Ｆ１領域：Ｆ１ｃ領域をコードする塩基配列の相補塩基配列；
（ｖｉｉ）Ｂ１領域：配列番号４の塩基配列における１６３〜１３９位のヌクレオチド残基からなる塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列；
（ｖｉｉｉ）Ｂ１ｃ領域：Ｂ１領域をコードする塩基配列の相補塩基配列；
（ｉｘ）Ｂ２領域：配列番号４の塩基配列における２１７〜１９９位のヌクレオチド残基からなる塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列；
（ｘ）Ｂ２ｃ領域：Ｂ２領域をコードする塩基配列の相補塩基配列；
（ｘｉ）Ｂ３領域：配列番号４の塩基配列における２４５〜２２４位のヌクレオチド残基からなる塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列；および
（ｘｉｉ）Ｂ３ｃ領域：Ｂ３領域をコードする塩基配列の相補塩基配列。
より好ましくは、Ｏｒｆ１ｂの上記部分領域を標的とする第１〜６プライマーは、配列番号１９〜２４の塩基配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む６つのプライマーである。
【００３０】
上記特定の実施形態において、ＯｒｆＭの上記部分領域が標的として意図される場合、下記領域に基づき、第１〜６プライマーを設計することもまた好ましい：
（ｉ）Ｆ３ｃ領域：配列番号６の塩基配列における１９〜１位のヌクレオチド残基からなる塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列；
（ｉｉ）Ｆ３領域：Ｆ３ｃ領域をコードする塩基配列の相補塩基配列；
（ｉｉｉ）Ｆ２ｃ領域：配列番号６の塩基配列における３９〜２２位のヌクレオチド残基からなる塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列；
（ｉｖ）Ｆ２領域：Ｆ２ｃ領域をコードする塩基配列の相補塩基配列；
（ｖ）Ｆ１ｃ領域：配列番号６の塩基配列における９７〜７５位のヌクレオチド残基からなる塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列；
（ｖｉ）Ｆ１領域：Ｆ１ｃ領域をコードする塩基配列の相補塩基配列；
（ｖｉｉ）Ｂ１領域：配列番号６の塩基配列における１２３〜１００位のヌクレオチド残基からなる塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列；
（ｖｉｉｉ）Ｂ１ｃ領域：Ｂ１領域をコードする塩基配列の相補塩基配列；
（ｉｘ）Ｂ２領域：配列番号６の塩基配列における１８３〜１６５位のヌクレオチド残基からなる塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列；
（ｘ）Ｂ２ｃ領域：Ｂ２領域をコードする塩基配列の相補塩基配列；
（ｘｉ）Ｂ３領域：配列番号６の塩基配列における２１５〜１９５位のヌクレオチド残基からなる塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列；および
（ｘｉｉ）Ｂ３ｃ領域：Ｂ３領域をコードする塩基配列の相補塩基配列。
より好ましくは、ＯｒｆＭの上記部分領域を標的とする第１〜６プライマーは、配列番号２５〜３０の塩基配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む６つのプライマーである。
【００３１】
上記特定の実施形態において、ＯｒｆＮの上記部分領域が標的として意図される場合、下記領域に基づき、第１〜６プライマーを設計することもまた好ましい：
（ｉ）Ｆ３ｃ領域：配列番号８の塩基配列における１８〜１位のヌクレオチド残基からなる塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列；
（ｉｉ）Ｆ３領域：Ｆ３ｃ領域をコードする塩基配列の相補塩基配列；
（ｉｉｉ）Ｆ２ｃ領域：配列番号８の塩基配列における５７〜３７位のヌクレオチド残基からなる塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列；
（ｉｖ）Ｆ２領域：Ｆ２ｃ領域をコードする塩基配列の相補塩基配列；
（ｖ）Ｆ１ｃ領域：配列番号８の塩基配列における１０９〜８７位のヌクレオチド残基からなる塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列；
（ｖｉ）Ｆ１領域：Ｆ１ｃ領域をコードする塩基配列の相補塩基配列；
（ｖｉｉ）Ｂ１領域：配列番号８の塩基配列における１４３〜１２２位のヌクレオチド残基からなる塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列；
（ｖｉｉｉ）Ｂ１ｃ領域：Ｂ１領域をコードする塩基配列の相補塩基配列；
（ｉｘ）Ｂ２領域：配列番号８の塩基配列における２０３〜１８３位のヌクレオチド残基からなる塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列；
（ｘ）Ｂ２ｃ領域：Ｂ２領域をコードする塩基配列の相補塩基配列；
（ｘｉ）Ｂ３領域：配列番号８の塩基配列における２３１〜２１４位のヌクレオチド残基からなる塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列；および
（ｘｉｉ）Ｂ３ｃ領域：Ｂ３領域をコードする塩基配列の相補塩基配列。
より好ましくは、ＯｒｆＮの上記部分領域を標的とする第１〜６プライマーは、配列番号３１〜３６の塩基配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む６つのプライマーである。
【００３２】
上記特定の実施形態において、ＯｒｆＳの上記部分領域が標的として意図される場合、下記領域に基づき、第１〜６プライマーを設計することもまた好ましい：
（ｉ）Ｆ３ｃ領域：配列番号１０の塩基配列における１８〜１位のヌクレオチド残基からなる塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列；
（ｉｉ）Ｆ３領域：Ｆ３ｃ領域をコードする塩基配列の相補塩基配列；
（ｉｉｉ）Ｆ２ｃ領域：配列番号１０の塩基配列における４０〜２２位のヌクレオチド残基からなる塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列；
（ｉｖ）Ｆ２領域：Ｆ２ｃ領域をコードする塩基配列の相補塩基配列；
（ｖ）Ｆ１ｃ領域：配列番号１０の塩基配列における９２〜７０位のヌクレオチド残基からなる塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列；
（ｖｉ）Ｆ１領域：Ｆ１ｃ領域をコードする塩基配列の相補塩基配列；
（ｖｉｉ）Ｂ１領域：配列番号１０の塩基配列における１４９〜１２５位のヌクレオチド残基からなる塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列；
（ｖｉｉｉ）Ｂ１ｃ領域：Ｂ１領域をコードする塩基配列の相補塩基配列；
（ｉｘ）Ｂ２領域：配列番号１０の塩基配列における２００〜１７９位のヌクレオチド残基からなる塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列；
（ｘ）Ｂ２ｃ領域：Ｂ２領域をコードする塩基配列の相補塩基配列；
（ｘｉ）Ｂ３領域：配列番号１０の塩基配列における２２９〜２０７位のヌクレオチド残基からなる塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列；および
（ｘｉｉ）Ｂ３ｃ領域：Ｂ３領域をコードする塩基配列の相補塩基配列。
より好ましくは、ＯｒｆＳの上記部分領域を標的とする第１〜６プライマーは、配列番号３７〜４２の塩基配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む６つのプライマーである。
【００３３】
上記特定の実施形態において、ＯｒｆＳの上記部分領域が標的として意図される場合、下記領域に基づき、第１〜６プライマーを設計することもまた好ましい：
（ｉ）Ｆ３ｃ領域：配列番号１２の塩基配列における２０〜１位のヌクレオチド残基からなる塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列；
（ｉｉ）Ｆ３領域：Ｆ３ｃ領域をコードする塩基配列の相補塩基配列；
（ｉｉｉ）Ｆ２ｃ領域：配列番号１２の塩基配列における５９〜４１位のヌクレオチド残基からなる塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列；
（ｉｖ）Ｆ２領域：Ｆ２ｃ領域をコードする塩基配列の相補塩基配列；
（ｖ）Ｆ１ｃ領域：配列番号１２の塩基配列における１１４〜９３位のヌクレオチド残基からなる塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列；
（ｖｉ）Ｆ１領域：Ｆ１ｃ領域をコードする塩基配列の相補塩基配列；
（ｖｉｉ）Ｂ１領域：配列番号１２の塩基配列における１６５〜１４１位のヌクレオチド残基からなる塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列；
（ｖｉｉｉ）Ｂ１ｃ領域：Ｂ１領域をコードする塩基配列の相補塩基配列；
（ｉｘ）Ｂ２領域：配列番号１２の塩基配列における２２２〜１９９位のヌクレオチド残基からなる塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列；
（ｘ）Ｂ２ｃ領域：Ｂ２領域をコードする塩基配列の相補塩基配列；
（ｘｉ）Ｂ３領域：配列番号１２の塩基配列における２６６〜２４３位のヌクレオチド残基からなる塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列；および
（ｘｉｉ）Ｂ３ｃ領域：Ｂ３領域をコードする塩基配列の相補塩基配列。
より好ましくは、ＯｒｆＳの上記部分領域を標的とする第１〜６プライマーは、配列番号４３〜４８の塩基配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む６つのプライマーである。
【００３４】
配列番号１〜１２の各塩基配列に対する同一性パーセントは、上記のとおり９０％以上であり、好ましくは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または９９．５％以上である。同一性パーセントは、ＨｕａｎｇおよびＭｉｌｌｅのアルゴリズムに従うＬＡＬＩＧＮにより決定することができる（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．（１９９１）１２：３３７−３５７）。ＬＡＬＩＧＮは、Ｂｉｏｉｎｆｏｍａｔｉｃｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ＰｏｒｔａｌであるＥｘＰＡＳｙにおいて公開されている（ｈｔｔｐｓ：／／ｅｍｂｎｅｔ．ｖｉｔａｌ−ｉｔ．ｃｈ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＬＡＬＩＧＮ＿ｆｏｒｍ．ｈｔｍ）。したがって、簡便には、同一性パーセントは、上記のとおり公開されているプログラムであるＬＡＬＩＧＮをデフォルト設定で利用することにより決定することができる。ＬＡＬＩＧＮのデフォルト設定は、以下のとおりである。Ｃｈｏｏｓｅ  ｔｈｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ：ｌｏｃａｌ；Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｒｅｐｏｒｔｅｄ  ｓｕｂ−ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ：３；Ｅ−ｖａｌｕｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：１０．０；Ｓｃｏｒｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ５０；Ｏｐｅｎｉｎｇ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ：−１２；Ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ：−２。
【００３５】
上記のように算定される同一性パーセントでは、配列番号１〜１２の各塩基配列の全長に対して１０％以下の個数のヌクレオチド残基の変異（すなわち、置換、付加、欠失および挿入、ならびにそれらの組合せ）が許容される。例えば、配列番号Ｘの塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列においては、塩基配列Ｘの塩基配列の全長が１０００塩基長であれば、１００個までの変異が許容され、また、塩基配列Ｘの塩基配列の全長が１００塩基長であれば、１０個までの変異が許容される。許容される変異の個数は、意図される同一性パーセントの程度、および意図される塩基配列Ｘの全長に応じて変動するものであり、例えば１００個以下、好ましくは８０個以下、より好ましくは６０個以下、さらにより好ましくは４０個以下、特に好ましくは３０個以下、２５個以下、２０個以下、１５個以下、１２個以下、１０個以下、８個以下、６個以下、５個、４個、３個、２個、または１個である。より具体的には、標的としてＯＲＦ１ｂ中の上記部分領域（２５６塩基長）が意図される場合、配列番号２の塩基配列に対して９０％以上の同一性を示す塩基配列において許容される変異の個数は２５個以下であり、配列番号２の塩基配列に対して９２％以上の同一性を示す塩基配列において許容される変異の個数は２０個以下であり、配列番号２の塩基配列に対して９４％以上の同一性を示す塩基配列において許容される変異の個数は１５個以下であり、配列番号２の塩基配列に対して９６％以上の同一性を示す塩基配列において許容される変異の個数は１０個以下であり、配列番号２の塩基配列に対して９８％以上の同一性を示す塩基配列において許容される変異の個数は５個以下である。
【００３６】
特定の実施形態では、本発明で用いられるプライマーセットは、下記（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選ばれる１以上のプライマーセットを含むものであってもよい。
（Ａ）ＯＲＦ１ｂを標的とする下記（Ａ１）〜（Ａ４）からなる群より選ばれる１以上のプライマーセット：
（Ａ１）配列番号１３〜１６の塩基配列もしくはそれらの均等配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む４つのプライマー；
（Ａ２）配列番号１３〜１８の塩基配列もしくはそれらの均等配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む６つのプライマー；
（Ａ３）配列番号１９〜２２の塩基配列もしくはそれらの均等配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む４つのプライマー；および
（Ａ４）配列番号１９〜２４の塩基配列もしくはそれらの均等配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む６つのプライマー。
（Ｂ）ＯｒｆＭを標的とする下記（Ｂ１）および（Ｂ２）からなる群より選ばれる１以上のプライマーセット：
（Ｂ１）配列番号２５〜２８の塩基配列もしくはそれらの均等配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む４つのプライマー；および
（Ｂ２）配列番号２５〜３０の塩基配列もしくはそれらの均等配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む６つのプライマー。
（Ｃ）ＯｒｆＮを標的とする下記（Ｃ１）および（Ｃ２）からなる群より選ばれる１以上のプライマーセット：
（Ｃ１）配列番号３１〜３４の塩基配列もしくはそれらの均等配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む４つのプライマー；および
（Ｃ２）配列番号３１〜３６の塩基配列もしくはそれらの均等配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む６つのプライマー。
（Ｄ）ＯｒｆＳを標的とする下記（Ｄ１）〜（Ｄ４）からなる群より選ばれる１以上のプライマーセット：
（Ｄ１）配列番号３７〜４０の塩基配列もしくはそれらの均等配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む４つのプライマー；
（Ｄ２）配列番号３７〜４２の塩基配列もしくはそれらの均等配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む６つのプライマー；  
（Ｄ３）配列番号４３〜４６の塩基配列もしくはそれらの均等配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む４つのプライマー；および
（Ｄ４）配列番号４３〜４８の塩基配列もしくはそれらの均等配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む６つのプライマー。
均等配列は、対象の塩基配列に対して、置換、付加、欠失および挿入からなる群より選ばれる１〜５個（好ましくは１〜３個、より好ましくは１または２個、さらにより好ましくは１個）の塩基の修飾を含む塩基配列である。
【００３７】
好ましい特定の実施形態では、本発明で用いられるプライマーセットは、下記（Ａ’）〜（Ｄ’）からなる群より選ばれる１以上のプライマーセットを含むものであってもよい。
（Ａ’）ＯＲＦ１ｂを標的とする下記（Ａ１’）〜（Ａ４’）からなる群より選ばれる１以上のプライマーセット：
（Ａ１’）配列番号１３〜１６の塩基配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む４つのプライマー；
（Ａ２’）配列番号１３〜１８の塩基配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む６つのプライマー；
（Ａ３’）配列番号１９〜２２の塩基配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む４つのプライマー；および
（Ａ４’）配列番号１９〜２４の塩基配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む６つのプライマー。
（Ｂ’）ＯｒｆＭを標的とする下記（Ｂ１’）および（Ｂ２’）からなる群より選ばれる１以上のプライマーセット：
（Ｂ１’）配列番号２５〜２８の塩基配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む４つのプライマー；および
（Ｂ２’）配列番号２５〜３０の塩基配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む６つのプライマー。
（Ｃ’）ＯｒｆＮを標的とする下記（Ｃ１’）および（Ｃ２’）からなる群より選ばれる１以上のプライマーセット：
（Ｃ１’）配列番号３１〜３４の塩基配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む４つのプライマー；および
（Ｃ２’）配列番号３１〜３６の塩基配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む６つのプライマー。
（Ｄ’）ＯｒｆＳを標的とする下記（Ｄ１’）〜（Ｄ４’）からなる群より選ばれる１以上のプライマーセット：
（Ｄ１’）配列番号３７〜４０の塩基配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む４つのプライマー；
（Ｄ２’）配列番号３７〜４２の塩基配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む６つのプライマー；  
（Ｄ３’）配列番号４３〜４６の塩基配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む４つのプライマー；および
（Ｄ４’）配列番号４３〜４８の塩基配列、またはそれらの相補配列をそれぞれ含む６つのプライマー。
【００３８】
上述した１以上のＯＲＦ領域のなかでも、Ｏｒｆ１ｂを標的とするものが好ましく、Ｏｒｆ１ｂの部分領域（配列番号５）を標的とするものが特に好ましい。Ｏｒｆ１ｂまたはその部分領域（配列番号５）を標的とすることで、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２を高感度で検出することができる。
【００３９】
本発明はまた、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２を検査するための方法を提供する。本発明の方法は、ＲＴ−ＬＡＭＰ法において上述したような複数のＬＡＭＰ用プライマーを含むプライマーセットを用いて、被験体から得られた検体においてＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２を検出することを含む。
【００４０】
検体が得られる被験体としては、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に感染し得る任意の被験体を利用することができる。このような被験体としては、例えば、哺乳動物（例、ヒト、サル等の霊長類；マウス、ラット、ウサギ等の齧歯類；ウシ、ブタ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜または使役動物、イヌ、ネコ等の愛玩動物）、鳥類（例、ニワトリ）が挙げられる。好ましくは、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。臨床応用の観点から、被験体は、好ましくはヒトである。
【００４１】
検体としては、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２を含み得る任意の生物学的試料を利用することができる。このような検体としては、例えば、鼻腔スワブ、咽頭スワブ、喀痰、唾液、洗浄液（例、鼻腔洗浄液、口腔内洗浄液、気管支洗浄液、肺洗浄液）、血液（例、全血、血漿、血清）、脳脊髄液、およびその他の検体（例、感染細胞を含む検体）が挙げられる。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２を多量に含み得る検体を低侵襲性で迅速かつ簡便に入手する観点では、検体は、好ましくは、鼻腔スワブ、、咽頭スワブ、唾液、または喀痰である。
【００４２】
検体は、ＲＴ−ＬＡＭＰ法に供される前に、ＲＮＡ抽出（例、フェノ−ル／クロロホルム等の有機溶媒による抽出、および市販のキットによる抽出）の工程に付されてもよいが、ＲＮＡ抽出を省略することもできる。ＲＮＡ抽出を省略して検体をダイレクトにＲＴ−ＬＡＭＰ法に供することで、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２をより迅速に検出することができる。本発明の方法によれば、検体をダイレクトにＲＴ−ＬＡＭＰ法に供した場合であっても、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２を高感度に検出できることが確認されている。ＲＮＡ抽出を省略する場合、および／またはウイルス不活化を目的とする場合、検体は加熱処理されてもよい。例えば、１）検体をキャップ付きチューブに入れ、次いで、２）チューブ中の検体を高温（例、９５℃）で所定の時間（例、１〜３０分間）加熱処理し、その後、３）氷冷等で冷ました検体をＲＴ−ＬＡＭＰ法に供してもよい。
【００４３】
逆転写（ＲＴ）反応およびＬＡＭＰ反応は、並行して、または別々に行うことができる。ＲＴ反応では、逆転写酵素、および逆転写反応用プライマーが必要とされる。しかし、ＬＡＭＰ反応で使用されるＬＡＭＰ用プライマーは、逆転写反応用プライマーとしても兼用できる。したがって、ＲＴ反応では、ＬＡＭＰ用プライマーを逆転写反応用プライマーとして利用することができる。逆転写酵素としては、多数のものが知られている。本発明では、任意の逆転写酵素を適宜使用することができる。例えば、逆転写酵素として、トリ骨髄芽球症ウイルス（Ａｖｉａｎ  Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ：ＡＭＶ）由来の逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）が使用されてもよい。
【００４４】
ＬＡＭＰ反応は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の標的核酸を増幅し得る任意の条件で行うことができる。ＬＡＭＰ反応は等温条件下で標的核酸を増幅できる。したがって、本発明では、例えば５０〜８０℃（好ましくは６０〜７０℃）の等温条件下でＬＡＭＰ反応を行うことができる。ＬＡＭＰ反応時間は、増幅産物の検出に十分な時間（例えば約７〜１０分）に設定することができる。ＬＡＭＰ反応では、ＤＮＡポリメラーゼとして、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼが好適に使用される。本発明では、任意の鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを適宜使用することができるが、耐熱性鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの使用が好ましい。
【００４５】
増幅産物の検出は、例えば、蛍光を指標に行うことができる。この場合、増幅産物の検出は、例えば、カルセインを含む蛍光試薬やインタカレーターなど、増幅産物または増幅反応の存在に応じて蛍光を生ずる試薬を用い、生じた蛍光を検出することにより行うことができる。増幅産物の検出は、例えば、経時的に、または増幅反応を開始した後の特定の時点で行われる。また、核酸の増幅および増幅産物の検出は、装置を用いて行われてもよい。また、核酸の増幅および増幅産物の検出は、一つの装置によって簡便に行われてもよい。例えば、Ｇｅｎｅｌｙｚｅｒ（登録商標）ＦＩＩＩ（キヤノンメディカルシステムズ社）を用いることで、増幅産物を簡便かつ迅速に検出することができる。
【００４６】
検体中にＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２が含まれるか否かの判定は、例えば、特定の時点で増幅産物が予め定められた閾値以上であるか否かを基準として行うことができる。例えば、予め定められた値以上の強度の蛍光が測定されたときに、検体中にＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２が含まれると判定される。また、予め定められた値以上の強度の蛍光が測定されるまでに要した時間が、予め定められた時間よりも短い場合、検体中にＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２が含まれると判定してもよい。あるいは、市販のキットを利用してＲＴ−ＬＡＭＰ法が行われる場合、そのキットに添付される使用説明書の推奨条件にしたがって検体中にＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２が含まれると判定することも好ましい。
【００４７】
特定の実施形態では、本発明の方法は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２陽性と判定された被験体に、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ−１９）に奏功し得る薬物を投与することをさらに含んでいてもよい。このような薬物としては、例えば、レムデシビル、ファビピラビル、シクレソニド、ロピナビル、リン酸クロロキン、ヒドロキシクロロキン、ナファモスタット、カモスタット、イベルメクチン、抗インターロイキン−６受容体抗体（例、サリルマブ、トシリズマブ）、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に対する中和抗体、イムノグロブリン製剤（例、回復した患者の血漿から採取した病原体特異的な抗体を高濃度で含む製剤）が挙げられる。
【００４８】
本発明はまた、（Ａ）上述したような複数のＬＡＭＰ用プライマーを含むプライマーセットを含む、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の検査試薬、ならびに（Ｂ）（１）上述したような複数のＬＡＭＰ用プライマーを含むプライマーセット、（２）鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ（例、耐熱性鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ）、および（３）逆転写酵素を含む、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の検査キットを提供する。本発明の検査試薬および検査キットはまた、無機ピロホスファターゼ（例、耐熱性無機ピロホスファターゼ）、蛍光試薬、ｄＮＴＰｓ等の基質、緩衝液を含んでいてもよい。本発明の検査試薬および検査キットは、個々の容器（例、チューブ）に隔離された形態で各成分を含んでいてもよいが、２種以上の成分が同一容器中で予め混合されていてもよい。
【実施例】
【００４９】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。【００５０】
実施例１：ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ゲノム中の６つの領域を標的とするＲＴ−ＲＡＭＰ法によるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の検出
ＬＡＭＰ用プライマーとして、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ゲノム中のＯＲＦ領域であるＯｒｆ１ｂ、ＯｒｆＭ、ＯｒｆＮ、およびＯｒｆＳを標的とする６つのプライマーセットを設計した。プライマーセットの設計に際しては、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２  Ｗｕｈａｎ−Ｈｕ−１のゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＭＮ９０８９４７）を参照した。設計されたプライマーセットの詳細は、表１〜６のとおりである。これらのプライマーセットは、図１〜５に示される塩基配列により表される各種ＯＲＦ領域中の部分領域（図１〜５中の下線部を参照）を増幅するように設計されている。【００５１】
【表１】
0006905235.tif 000002
【００５２】
【表２】
0006905235.tif 000003
【００５３】
【表３】
0006905235.tif 000004
【００５４】
【表４】
0006905235.tif 000005
【００５５】
【表５】
0006905235.tif 000006
【００５６】
【表６】
0006905235.tif 000007
【００５７】
検体としては人工合成ＲＮＡを用いた。人工合成ＲＮＡの塩基配列は、配列番号３、５、７、９、１１、および１２に対応する（但し、チミンはウラシルに変換される）。人工合成ＲＮＡは、対応する塩基配列を有するＤＮＡを合成し、次に、合成ＤＮＡを元にＲＮＡを調製した。【００５８】
ＲＴ−ＬＡＭＰ法の詳細は、以下のとおりである。
先ず、上記プライマーセットを含むプライマー混合液（２．５μＬ）を調製した。プライマー混合液の組成を表７に示す。【００５９】
【表７】
0006905235.tif 000008
【００６０】
次に、プライマー混合液（２．５μＬ）を含む反応マスターミックス（２０μＬ）を調製した。反応マスターミックスの組成を表８に示す。【００６１】
【表８】
0006905235.tif 000009
【００６２】
各増幅反応液に対して、等温遺伝子増幅検出装置Ｇｅｎｅｌｙｚｅｒ（登録商標）ＦＩＩＩ（キヤノンメディカルシステムズ社製）を用いて増幅反応および検出を行った。
温度制御は、以下のように行った。
１）Ｐｒｅｈｅａｔ：４０℃
２）Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：６８℃（配列番号５）、６７℃（配列番号３）、６５℃（配列番号７、９、１１、１２）
３）Ｍｅｌｔ：９５〜７５℃、０．１℃／秒
鋳型核酸は、反応系あたり５００個、５０個、５個、または無し（水：ネガティブコントロール）の条件下で用いた。結果を表９に示す。【００６３】
【表９】
0006905235.tif 000010
【００６４】
その結果、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ゲノム中の上記６つのＯＲＦ領域を標的とした場合、いずれもＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２を検出することができたが、なかでも、Ｏｒｆ１ｂを標的とした場合にＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２を良好に検出することができた。特に、Ｏｒｆ１ｂ（配列番号５）を標的とした場合、高感度でＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２を検出することができた。したがって、ＲＴ−ＬＡＭＰ法において標的とされるＯＲＦ領域は、Ｏｒｆ１ｂが好ましく、特にＯｒｆ１ｂ（配列番号５）が好ましいことが確認された。【００６５】
実施例２：ＲＴ−ＬＡＭＰ法によるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の検出感度の検討（１）
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ゲノム配列の一部（２５６塩基長）を有する合成ＲＮＡ（一本鎖）を鋳型核酸として用いた。この鋳型核酸を、反応系あたり５００個、５０個、５個、または無し（水：ネガティブコントロール）の条件下で用いた。
ＲＴ−ＬＡＭＰ法は、実施例１と同様にして行った。ＲＴ−ＬＡＭＰ法におけるプライマーセットとしては、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ゲノム中のＯｒｆ１ｂ（配列番号５）に対するもの（実施例１参照）を用いた。結果を表１０に示す。【００６６】
【表１０】
0006905235.tif 000011
【００６７】
その結果、反応系中に５０コピー以上の標的ＲＮＡが存在する場合、１００％の確率で標的ＲＮＡを検出することができた。また、非特異反応は認められなかった。【００６８】
実施例３：ＲＴ−ＬＡＭＰ法によるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の検出感度の検討（２）
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ゲノム配列の全てを有するウイルスＲＮＡ（一本鎖）を鋳型核酸として用いた。このウイルス核酸を段階希釈し、どの程度の希釈倍率までウイルスＲＮＡを検出できるか検討した。
また、ＲＴ−LＡＭＰ法の感度を、ＲＴ−定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）法の感度と比較した。ＲＴ−ｑＰＣＲ法では、１）日本における国立感染症研究所（ＮＩＩＤ）がＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の検査に利用しているＯＲＦ領域（Ｎ  ｇｅｎｅ）に対する一対のプライマー、および世界保健機関（ＷＨＯ）がＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の検査に利用しているＯＲＦ領域（Ｅ  ｇｅｎｅ）に対する一対のプライマーを用いた。【００６９】
【表１１】
0006905235.tif 000012
【００７０】
【表１２】
0006905235.tif 000013
【００７１】
ＲＴ−ＬＡＭＰ法は、実施例１と同様にして行った。ＲＴ−ＬＡＭＰ法におけるプライマーセットとしては、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ゲノム中のＯｒｆ１ｂ（配列番号５）に対するもの（実施例１参照）を用いた。ＲＴ−ｑＰＣＲ法は、ＮＩＩＤの推奨するプロトコール（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｎｏｖｅｌ  Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ  ２０１９（ｎＣｏＶ−２０１９）  ｉｎ  Ｊａｐａｎ；Ａｄｖａｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｊ−ＳＴＡＧＥ；Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ；Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ：Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １８，２０２０）、およびＷＨＯの推奨するプロトコール（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｗｕｈａｎ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ  ２０１９  ｂｙ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ；−Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ａｎｄ  ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｓ  ｏｆ  Ｊａｎ  １３，  ２０２０−）にしたがって行った。結果を表１３に示す。【００７２】
【表１３】
0006905235.tif 000014
【００７３】
その結果、ＲＴ−LＡＭＰ法は、ＲＴ−ｑＰＣＲ法（ＮＩＩＤおよびＷＨＯ）と同様に、１０−４希釈のウイルスＲＮＡ（約２０コピー）まで１００％の確率で検出することができた。また、ＲＴ−LＡＭＰ法は、約１０分の短時間で１０−４希釈のウイルスＲＮＡを検出することができた。一方、ＮＩＩＤおよびＷＨＯによるＲＴ−ｑＰＣＲ法での検出時間は、それぞれ、約３１および約２９のＣｔ値の達成に要した２３分および２２分であった。したがって、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の検出について、本発明は、従来法に比し短時間で、従来法と同等の検出感度を実現できることが確認された。【００７４】
実施例４：ＳＡＲＳ−ＣｏＶとの交差反応性の検討
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２と近縁なウイルスであるＳＲＡＳ−ＣｏＶがＯｒｆ１ｂ（配列番号５）を標的とするプライマーセットを用いたＲＴ−ＬＡＭＰ法で交差反応性を示すか否かを評価した。ＳＲＡＳ−ＣｏＶ及びＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ゲノム配列全てを有するウイルスＲＮＡ（一本鎖）を鋳型核酸として用いた。ＲＴ−ＬＡＭＰ法は、実施例１と同様にして行った。ＳＡＲＳ−ＣｏＶを検出するためのＲＴ−ｑＰＣＲは、ＷＨＯの推奨する上記プロトコールにしたがって行った。結果を表１４に示す。【００７５】
【表１４】
0006905235.tif 000015
【００７６】
その結果、ＲＴ−ＬＡＭＰ法は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶと交差反応性が認められなかった。【００７７】
実施例５：ダイレクトＲＴ−ＬＡＭＰ法の検討
これまでの検査方法の多くは検体からＲＮＡを抽出する必要がある。しかし、ＲＮＡ抽出には高価なＲＮＡ抽出キットや設備が必要であり、また、一定レベルの熟練した技術が必要である。また、ＲＮＡ抽出には、３０分〜１時間程度の時間を要する。このことから、患者検体について、ＲＮＡを抽出することなく、増幅反応に直接用いることができるか検討した。【００７８】
方法は、以下のとおり行った。先ず、健常者の鼻腔スワブおよび咽頭スワブを混ぜた検体においてＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２を段階希釈し、ウイルス不活化のために９５℃１０分で熱処理した。次に、Ｏｒｆ１ｂの部分領域（配列番号５）に対するプライマーセットを用いて、どの程度の希釈倍率までウイルスＲＮＡを検出できるか検討した。熱処理検体を鋳型として増幅反応に直接用いたものがダイレクトＲＴ−ＬＡＭＰである。また、通常のＲＴ−ＬＡＭＰも実施例１と同様に実施し、感度比較を行った。さらに、ＲＴ−ｑＰＣＲ法の感度（ＮＩＩＤ）と比較した。その際、熱処理検体を鋳型としてＲＴ−ｑＰＣＲの増幅反応に直接用いたものがダイレクトＲＴ−ｑＰＣＲである。結果を表１５及び１６に示す。表１５と１６で使用した鼻腔スワブおよび咽頭スワブは同一人物の別日に採取したものを使用している。【００７９】
【表１５】
0006905235.tif 000016
【００８０】
【表１６】
0006905235.tif 000017
【００８１】
その結果、ダイレクトＲＴ−ＬＡＭＰ法は、ＲＴ−ＬＡＭＰ法と同様に２ｘ１０−６希釈ウイルス（約９０コピー）まで１００％の確率で検出できた。また、ダイレクトＲＴ−ＬＡＭＰ法は、約１０分の短時間で２ｘ１０−６希釈ウイルスを検出できた。一方、熱処理検体を用いたＲＴ−ｑＰＣＲでは検体の状態によっては、ＲＮＡを鋳型として用いるＲＴ−ｑＰＣＲより感度が約10倍低下することがわかった。このことから、ダイレクトＲＴ−ＬＡＭＰ法によれば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２  ＲＮＡの検体からの抽出を要することなく、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２  ＲＮＡを良好かつ迅速に検出できることが確認された。
【要約】
本発明は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２由来核酸の特異的な増幅によりＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の迅速な検出を可能にする技術を提供する。より具体的には、本発明は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ゲノム中の１以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域を標的とする複数のＬＡＭＰ用プライマーを含むＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２検出用プライマーセットであって、１以上のＯＲＦ領域が、Ｏｒｆ１ｂ、ＯｒｆＭ、ＯｒｆＮ、およびＯｒｆＳからなる群より選ばれる、プライマーセット、ならびに当該プライマーセットの使用に関する技術を提供する。【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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