(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケラチンを含む脱毛防止又は発毛促進用注射用薬学組成物。
【請求項２】
前記ケラチンは、加水分解されたケラチン又は水溶性高分子に結合されたケラチンである請求項１に記載の脱毛防止又は発毛促進用注射用薬学組成物。
【請求項３】
前記加水分解されたケラチンは、分子量が５００〜１０，０００ダルトン（Ｄａｌｔｏｎ）である請求項２に記載の脱毛防止又は発毛促進用注射用薬学組成物。
【請求項４】
前記水溶性高分子は、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルギン酸（ａｌｇｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ペクチン（ｐｅｃｔｉｎ）、カラギーナン（ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ）、コンドロイチン硫酸（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）、デキストラン硫酸（ｄｅｘｔｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ） 、キトサン、ポリリシン（ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ）、コラーゲン、ゼラチン、カルボ
キシメチルキチン、フィブリン（ｆｉｂｒｉｎ）、デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）、アガロース（ａｇａｒｏｓｅ）、プルラン（ｐｕｌｌｕｌａｎ）、ポリアクリルアミド（ＰＡＡｍ）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリル酸）（Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＡＡｃ））、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−エチルメタクリレート）Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＥＭＡ）、ポリビニルアセテート／ポリビニルアルコール（ＰＶＡｃ／ＰＶＡ）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（メチルメタクリレート−ｃｏ−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｐ（ＭＭＡ−ｃｏ−ＨＥＭＡ））、ポリ（ポリエチレングリコール−ｃｏ−ペプチド（Ｐ（ＰＥＧ−ｃｏ−ｐｅｐｔｉｄｅ））、アルギネート−ｇ−（ポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシド−ポリエチレンオキシド）（ａｌｇｉｎａｔｅ−ｇ−（ＰＥＯＰＰＯ−ＰＥＯ））、ポリ（ポリ乳酸−ｃｏ−グリコール酸）−ｃｏ−セリン）（Ｐ（ＰＬＧＡ−ｃｏ−ｓｅｒｉｎｅ））、コラーゲン−アクリレート（ｃｏｌｌａｇｅｎａｃｒｙｌａｔｅ）、アルギネート−アクリレート（ａｌｇｉｎaｔｅ−ａｃｒｙｌａｔｅ）、ポリ（ヒドロキシプロピルメタ
クリルアミド−ｇ−ペプチド）（Ｐ（ＨＰＭＡ−ｇ−ｐｅｐｔｉｄｅ））、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート／マトリゲル）（Ｐ（ＨＥＭＡ／Ｍａｔｒｉｇｅｌ））、ヒアルロン酸−ｇ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＨＡ−ｇ−ＮＩＰＡＡｍ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシド共重合体（ＰＥＯ−ＰＰＯ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ｓｅｒｉｅｓ）、ポリエチレンオキシド−ポリ乳酸共重合体（ＰＥＯ−ＰＬＡ）、ポリエチレンオキシド−ポリ乳酸グリコール酸共重合体（ＰＥＯ−ＰＬＧＡ）、ポリエチレンオキシド−ポリカプロラクトン共重合体（ＰＥＯ−ＰＣＬ）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ａｌｋｙｌ  ｅｔｈｅｒｓ、Ｂｒｉｊ  Ｓｅｒｉｅｓ）、ポリオキシエチレンキャスターオイル誘導体類（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｃａｓｔｏｒ  ｏｉｌ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒｅｓ）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｓｏｒｂｉｔａｎ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｅｓｔｅｒｓ、Ｔｗｅｅｎ  Ｓｅｒｉｅｓ）、及びポリオキシエチレンステアレート類（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｓｔｅａｒａｔｅｓ）からなるグループから選択された１種以上である請求項２に記載の脱毛防止又は発毛促進用注射用薬学組成物。
【請求項５】
前記ケラチンは、毛髪再生を促進する請求項１〜４のいずれか一項に記載の脱毛防止又は発毛促進用注射用薬学組成物。
【請求項６】
前記薬学組成物は、ベータカテニン（ｂｅｔａ  ｃａｔｅｎｉｎ）、Ｓｏｘ−９、Ｓｏｘ−２、Ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＣＤ１３３、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０、ＢＭＰ６、Ｐ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＭＳＸ２、ＦＯＸＮ１及びＣＤ１０からなるグループから選択された１種以上の発現量を増加させる請求項１〜５のいずれか一項に記載の脱毛防止又は発毛促進用注射用薬学組成物。 
【請求項７】
前記薬学組成物は、真皮層又は皮下組織に投与される請求項１〜６のいずれか一項に記載の脱毛防止又は発毛促進用注射用薬学組成物。
【請求項８】
前記薬学組成物は、経皮吸収促進剤（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｒ）をさらに含む請求項１〜７のいずれか一項に記載の脱毛防止又は発毛促進用注射用薬学組成物。
【請求項９】
前記経皮吸収促進剤は、スルホキシド（ｓｕｌｐｈｏｘｉｄｅ）、アゾン（ａｚｏｎｅ）、ピロリドン（ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）、脂肪酸、炭素数１〜４の低級アルコール、炭素数６以上の高級脂肪アルコール（ｆａｔｔｙ  ａｌｃｏｈｏｌ）、グリコール（ｇｌｙｃｏｌ）、尿素（ｕｒｅａ）、テルペン（ｔｅｒｐｅｎｅ）、テルペノイド（ｔｅｒｐｅｎｏｉｄ）、及びリン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）からなるグループから選択された１種以上である請求項８に記載の脱毛防止又は発毛促進用注射用薬学組成物。
【請求項１０】
Ｓ１）加水分解酵素とケラチンを反応させるステップと、Ｓ２）前記加水分解酵素を除去するステップとを含み、加水分解されたケラチンを含む、脱毛防止又は発毛促進用注射用薬学組成物の製造方法。
【請求項１１】
前記加水分解酵素は、プロテイナーゼ−Ｋである請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記加水分解酵素は、ビーズに固定されたものである請求項１０又は１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記第Ｓ２）ステップの後に、Ｓ３）加水分解酵素の活性を除去するステップをさらに含む請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１７年１月３１日に韓国に出願された特願第１０−２０１７−００１４０４７号に基づく優先権の利益を主張し、当該韓国特許出願の文献に開示されたすべての内容は本明細書の一部として含む。 
本発明は、ケラチンを含む脱毛防止又は発毛促進用注射用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
脱毛とは、正常に毛髪が存在すべき部分に毛髪が欠如している状態を指し、遺伝的な要因が最も主要な原因とされている。近年、社会的ストレスの増加に加えて、環境汚染やインスタント食品などの食習慣の欧米化、パーマや染色の頻度が多いこと、間違った頭皮ケアにより、脱毛症になる人は増える傾向にある。しかし、脱毛に関する明確な原因は未だに解明されておらず、むしろ最近になって脱毛症に悩む人はより一層増え、低年齢化も進んでいる。
脱毛症の治療法に関して、明確な効果を有するものは未だになく、東医宝鑑では、神応養真丹など脱毛にかかわるいくつかの処方があり、胡麻油（セサミ）などを使って脱毛の部位をマッサージしたり、処方された特定の漢方薬を酒浸して塗る方法や特定のツボを刺激する方法などがあるが、効果においては個人差が多いとされている。また、一般に適用される新薬素材は未だに報告されていない。
従来の脱毛症治療方法としては、ホルモン説と関連して、女性ホルモンを主材とした製剤があるが、皮膚炎の発症、ホルモン投与による副作用の発生などの報告があり、現在は使用が中止されている。最近使われている代表的な発毛剤は、当初、血行を促すための用途として開発されて用いられていたが、これを使用する患者の間でその副作用として発毛効果があることが知られ、後に発毛剤の原料として米国食品医薬品局（ＦＤＡ）から承認を受け、発毛治療剤として使用されている米国特許第３，３８２，２４７号のミノキシジル（６−Ａｍｉｎｏ−１，２−ｄｉｈｙｄｒｏ−１−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｉｍｉｎｏ−４−ｐｈｅｎｏｘｙｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）及び米国特許第５，２１５，８９４号に記載されたメルク社のフィナステリド（ｆｉｎａｓｔｅｒｉｄｅ）がある。
しかし、ミノキシジルの場合、べたつく使用感と肌への刺激を誘発する副作用が報告されており、フィナステリドの場合、現在経口投与製剤として使用されているが、その摂取による性機能障害などの副作用も報告されているだけでなく、脱毛においても、地道に服用しないと効果を期待できないという副作用がある。
このため、従来の発毛剤に代わる、脱毛防止及び発毛促進効果に優れた新しい治療薬の開発が必要となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第３，３８２，２４７号
【特許文献２】米国特許第５，２１５，８９４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者らは、上記のような問題点を解決するために、従来の発毛剤に代わる新しい治療剤について研究を続けている中で、ケラチンが発毛を促進し、脱毛を防ぐことができることを見出し、さらにケラチンを皮膚組織に注射する場合、皮膚に塗布した時よりも発毛促進又は脱毛防止効果に優れることを見出し、本発明を完成した。
本発明の目的は、ケラチンを含む脱毛防止又は発毛促進用注射用薬学組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記の目的を達成するために、本発明の一実施例によると、ケラチンを含む脱毛防止又は発毛促進用注射用薬学組成物を提供する。
本発明の一実施例において、前記ケラチンは、加水分解されたケラチン又は水溶性高分子に結合されたケラチンであってもよい。
前記加水分解されたケラチンは、分子量が５００〜１０，０００ダルトン（Ｄａｌｔｏｎ）であってもよい。
前記水溶性高分子は、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルギン酸（ａｌｇｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ペクチン（ｐｅｃｔｉｎ）、カラギーナン（ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ）、コンドロイチン硫酸（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）、デキストラン硫酸（ｄｅｘｔｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ） 、キトサン、ポリリシン（ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ）、コラーゲン、ゼラチン、カルボキシメチルキチン、フィブリン（ｆｉｂｒｉｎ）、デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）、アガロース（ａｇａｒｏｓｅ）、プルラン（ｐｕｌｌｕｌａｎ）、ポリアクリルアミド（ＰＡＡｍ）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリル酸）（Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＡＡｃ））、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−エチルメタクリレート）Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＥＭＡ）、ポリビニルアセテート／ポリビニルアルコール（ＰＶＡｃ／ＰＶＡ）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（メチルメタクリレート−ｃｏ−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｐ（ＭＭＡ−ｃｏ−ＨＥＭＡ））、ポリ（ポリエチレングリコール−ｃｏ−ペプチド（Ｐ（ＰＥＧ−ｃｏ−ｐｅｐｔｉｄｅ））、アルギネート−ｇ−（ポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシド−ポリエチレンオキシド）（ａｌｇｉｎａｔｅ−ｇ−（ＰＥＯＰＰＯ−ＰＥＯ））、ポリ（ポリ乳酸−ｃｏ−グリコール酸）−ｃｏ−セリン）（Ｐ（ＰＬＧＡ−ｃｏ−ｓｅｒｉｎｅ））、コラーゲン−アクリレート（ｃｏｌｌａｇｅｎａｃｒｙｌａｔｅ）、アルギネート−アクリレート（ａｌｇｉｎaｔｅ−ａｃｒｙｌａｔｅ）、ポリ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド−ｇ−ペプチド）（Ｐ（ＨＰＭＡ−ｇ−ｐｅｐｔｉｄｅ））、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート／マトリゲル）（Ｐ（ＨＥＭＡ／Ｍａｔｒｉｇｅｌ））、ヒアルロン酸−ｇ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＨＡ−ｇ−ＮＩＰＡＡｍ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシド共重合体（ＰＥＯ−ＰＰＯ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ｓｅｒｉｅｓ）、ポリエチレンオキシド−ポリ乳酸共重合体（ＰＥＯ−ＰＬＡ）、ポリエチレンオキシド−ポリ乳酸グリコール酸共重合体（ＰＥＯ−ＰＬＧＡ）、ポリエチレンオキシド−ポリカプロラクトン共重合体（ＰＥＯ−ＰＣＬ）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ａｌｋｙｌ  ｅｔｈｅｒｓ、Ｂｒｉｊ  Ｓｅｒｉｅｓ） 、ポリオキシエチレンキャスターオイル誘導体類（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｃａｓｔｏｒ  ｏｉｌ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒｅｓ）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｓｏｒｂｉｔａｎ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｅｓｔｅｒｓ、Ｔｗｅｅｎ  Ｓｅｒｉｅｓ）、及びポリオキシエチレンステアレート類（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｓｔｅａｒａｔｅｓ）からなるグループから選択された１種以上であってもよい。
【０００６】
ケラチンは、毛髪再生を促進することができる。
前記薬学組成物は、ベータカテニン（ｂｅｔａ  ｃａｔｅｎｉｎ）、Ｓｏｘ−９、Ｓｏｘ−２、Ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＣＤ１３３、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０、ＢＭＰ６、Ｐ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＭＳＸ２、ＦＯＸＮ１及びＣＤ１０からなるグループから選択された１種以上の発現量を増加させることができる。 
前記薬学組成物は、真皮層又は皮下組織に投与することができる。
前記薬学組成物は、経皮吸収促進剤（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｒ）をさらに含むことができる。
前記経皮吸収促進剤は、スルホキシド（ｓｕｌｐｈｏｘｉｄｅ）、アゾン（ａｚｏｎｅ）、ピロリドン（ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）、脂肪酸、炭素数１〜４の低級アルコール、炭素数６以上の高級脂肪アルコール（ｆａｔｔｙ  ａｌｃｏｈｏｌ）、グリコール（ｇｌｙｃｏｌ）、尿素（ｕｒｅａ）、テルペン（ｔｅｒｐｅｎｅ）、テルペノイド（ｔｅｒｐｅｎｏｉｄ）、及びリン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）からなるグループから選択された１種以上であってもよい。
【０００７】
前記加水分解されたケラチンは、Ｓ１）加水分解酵素とケラチンを反応させるステップと、Ｓ２）前記加水分解酵素を除去するステップとを含む、加水分解されたケラチンの製造方法によって製造することができる。
前記加水分解酵素は、プロテイナーゼ−Ｋであってもよい。
前記加水分解酵素は、ビーズに固定されてもよい。
前記加水分解されたケラチンの製造方法は、前記第Ｓ２）ステップの後に、Ｓ３）加水分解酵素の活性を除去するステップをさらに含むことができる。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のケラチンを含む注射用薬学的組成物は、毛髪の成長と毛包の形成を促進する。
また、本発明に係るケラチンを含む注射用薬学的組成物は、皮膚組織に注射する場合、皮膚に塗布した時よりも発毛促進又は脱毛防止効果に優れている。
したがって、本発明の薬学的組成物は、脱毛防止又は発毛促進用の治療剤として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ペギル化されたケラチンをＮＭＲ分析したデータである。
【図２】毛を除去したマウスに、実施例１〜６を注射した後、２週間後の発毛効果を示す図である。
【図３】毛を除去したマウスに、実施例１〜６を注射した後、２週間後にヘマトキシリン−エオシンで染色し、毛包形成の程度を示す写真である。
【図４】毛を除去したマウスに、実施例１〜６を注射した後、２週間後の毛髪成長の各段階における毛包形成の数を示すグラフである。
【図５】毛を除去したマウスに、実施例１〜６を注射した後、２週間後に形成された毛包の大きさを示すグラフである。
【図６】天然ケラチンとは分子量が異なる、加水分解されたケラチンが製造されうることを確認したＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す写真である。
【図７】ケラチンをヒト毛根細胞に処理する時、細胞の増殖が抑制されることを確認した図である。
【図８】ケラチンをヒト毛根細胞に処理する時、細胞との相互作用を分析して、細胞表面にケラチンが接着されることを確認し、これによりケラチンによって細胞凝集体の形成が誘導されることを確認した写真である。
【図９】ケラチンをヒト毛根細胞に処理する時、細胞の増殖に関わるｍＲＮＡの発現は抑制し、細胞の移動、細胞凝集体の誘導及び細胞外基質の合成に関わるｍＲＮＡの発現は増加することを示す図である。
【図１０】ケラチンをヒト毛根細胞に処理する時、発毛を誘導する因子として知られているＦＧＦ７、ＦＧＦ１０及びＢＭＰ６の分子発現が増加することを確認した図である。
【図１１】ケラチンをヒト外毛根鞘細胞に処理する時、細胞の移動及びＭａｔｒｉｘ  ｃｅｌｌへの分化に関わる因子であるベータカテニン（ｂｅｔａ  ｃａｔｅｎｉｎ）及びＰ−ｃａｄｈｅｒｉｎの発現が増加し、分化時に発現が減少する分子であるＣＤ３４の発現は減少することを確認した写真である。
【図１２】ケラチンをヒト外毛根鞘細胞に処理する時、Ｍａｔｒｉｘ  ｃｅｌｌへの分化に関わる因子であるＭＳＸ２、ＦＯＸＮ１及びＣＤ１０の遺伝子発現が増加し、分化時に発現が減少する分子であるＫＲＴ５及びＩＴＧＡ６の遺伝子発現が減少することを確認したグラフである。
【図１３】加水分解されたケラチンを外毛根鞘細胞に処理する時、細胞の移動及びクローンの活性に関わる因子であるベータカテニン（ｂｅｔａ  ｃａｔｅｎｉｎ）分子及び幹細胞性（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）に関与するＳｏｘ−９分子の発現が増加することを確認した図である。
【図１４】加水分解されたケラチンを外毛根鞘細胞に処理する時、幹細胞性に関与するＳｏｘ−９遺伝子及びベータカテニン遺伝子の発現が増加することを示すグラフである。
【図１５】加水分解されたケラチンを外毛根鞘細胞に処理する時、ベータカテニン分子が４倍以上発現することを確認した図である。
【図１６】加水分解されたケラチンをヒト毛乳頭細胞に処理する時、毛髪再生と幹細胞性に関わる細胞凝集体（ｃｅｌｌ  ａｇｇｒｅｇａｔｅ）の形成が５倍以上増加することを確認した図である。
【図１７】加水分解されたケラチンをヒト毛乳頭細胞に処理する時、アルカリ性リン酸細胞が発現する加水分解酵素（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）の活性が増加することを確認した写真である。
【図１８】加水分解されたケラチンをヒト毛乳頭細胞に処理する時、毛髪再生と幹細胞性因子であるベータカテニン、Ｓｏｘ−２、加水分解酵素（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＡＬＰａｓｅ）、ＣＤ１３３、ＦＧＦ−７及びＦＧＦ−１０分子の発現が増加することを確認した写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、ケラチン（ｋｅｒａｔｉｎ）を含む脱毛防止又は発毛促進用注射用薬学組成物を提供する。
前記ケラチンは、髪の毛・羊毛・羽毛・角・爪・馬蹄などを構成する真性ケラチンであってもよく、皮膚・神経組織などに存在するケラチンであってもよい。
また、前記ケラチンは、グルタミン酸・アルギニン・シスチンなどのアミノ酸を含み、特に高含量のシスチンを含有していてもよい。
前記ケラチンは、商業的に利用可能な任意のケラチンであってもよく、水や水溶性溶媒に溶解できるように加工した形態であってもよく、好ましくは、人の髪の毛由来のケラチンであってもよく、分子量が４０，０００〜７０，０００ダルトン（Ｄａｌｔｏｎ）であってもよい。
【００１１】
前記ケラチンは、加水分解されたケラチン又は水溶性高分子に結合されたケラチンであってもよい。
前記加水分解されたケラチンは、ケラチンの性質を保ちながら、不溶性の天然ケラチンが分解されて水溶性を示すタンパク質であって、ケラチン由来のペプチドと混用されて使用されてもよい。前記加水分解されたケラチンは、ケラチンが酸、アルカリ、酸素又は加水分解酵素によって加水分解されて製造されてもよいが、これに限定されるものではなく、天然ケラチンから分子量が５００〜１０，０００ダルトンである、加水分解されたケラチンを製造する通常の方法により収得することができる。
【００１２】
前記加水分解されたケラチンは、Ｓ１）加水分解酵素とケラチンを反応させるステップと、Ｓ２）前記加水分解酵素を除去するステップとを含む、加水分解されたケラチンの製造方法を通じて製造することができる。
前記第Ｓ１）ステップは、加水分解酵素を利用して、ケラチンから加水分解されたケラチンを製造するステップである。
ここで加水分解酵素は、酵素を系統的に分類した時、加水分解反応を触媒する酵素として分類される一つのグループであって、作用対象によって９つの群に分類されている。
前記加水分解酵素は、ケラチンがタンパク質である特性上、天然ケラチンを加水分解することができる酵素であり、好ましくはペプチド結合に作用する酵素である。具体的には、前記ペプチド結合に作用する酵素は、ロイシルアミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、ペプシン、トリプシン、及びキモトリプシンを含むタンパク質分解酵素の中から選択されたいずれか一つであってもよい。さらに好ましくは、プロテイナーゼ−Ｋ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−Ｋ）だが、これに限定されるものではない。
前記加水分解されたケラチンの製造方法において、前記第Ｓ１）ステップが欠如していたり、まともに遂行されなかった場合、脱毛防止又は発毛促進効果を示す、加水分解されたケラチンの収得量が不十分となる可能性がある。
次に、前記第Ｓ２）ステップは、加水分解酵素と加水分解されたケラチンの混合物から加水分解されたケラチンだけを収得するステップである。前記加水分解酵素は、ビーズに固定されてもよい。前記ビーズの磁性の違いを利用したり、重量の差を利用したり、又は吸着するかどうかの違いなどを利用して、ビーズの物理的/化学的性質によって、加水分解されたケラチンから加水分解酵素を分離することができる。
前記ビーズは、ポリ−Ｌ−乳酸（ＰＬＬＡ）、ポリ−乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリウレタン（ＰＵ）、ポリメチルメタクリル（ＰＭＭＡ）、ポリエチレン（ＰＥ）及び磁鉄（Ｆｅｒｒｏｍａｇｎｅｔｉｔｅ）からなるグループから選択された１種以上であってもよいが、これに限定されるものではない。具体的には、前記ビーズはアガロースビーズであってもよい。
前記加水分解されたケラチンの製造方法において、前記第Ｓ２）ステップが欠如していたり、まともに遂行されなかった場合、発毛促進又は脱毛防止効果を示す、加水分解されたケラチンだけの純度が低下する可能性がある。
【００１３】
前記加水分解されたケラチンの製造方法は、前記第Ｓ２）ステップの後に、Ｓ３）加水分解酵素の活性を除去するステップをさらに含むことができる。
前記第Ｓ３）ステップは、加水分解酵素の活性を除去し、ケラチンの加水分解反応を止めるためのものであって、加水分解酵素がケラチンと反応しないよう、高い温度で数時間放置することができる。
前記加水分解されたケラチンの製造方法において、前記第Ｓ３）ステップを含む場合、加水分解されたケラチンの純度を高めることができ、均一な分子量を有する加水分解されたケラチンを得ることができる。
【００１４】
一例として、前記加水分解されたケラチンは、人の髪の毛をクロロホルムとメタノールを２：１の割合で混ぜた混合液に入れて脂質を除去し、２％の過酢酸溶液で１２時間撹拌した後、５％の２−メルカプトエタノール、５Ｍの尿素、２．６Ｍのチオ尿素及び２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８．５）に入れて、５０から７２時間反応させて収得することができるが、これに限定されるものではない。
【００１５】
本発明では、前記水溶性高分子は、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルギン酸（ａｌｇｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ペクチン（ｐｅｃｔｉｎ）、カラギーナン（ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ）、コンドロイチン硫酸（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）、デキストラン硫酸（ｄｅｘｔｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ） 、キトサン、ポリリシン（ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ）、コラーゲン、ゼラチン、カルボキシメチルキチン、フィブリン（ｆｉｂｒｉｎ）、デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）、アガロース（ａｇａｒｏｓｅ）、プルラン（ｐｕｌｌｕｌａｎ）、ポリアクリルアミド（ＰＡＡｍ）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリル酸）（Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＡＡｃ））、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−エチルメタクリレート）Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＥＭＡ）、ポリビニルアセテート／ポリビニルアルコール（ＰＶＡｃ／ＰＶＡ）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（メチルメタクリレート−ｃｏ−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｐ（ＭＭＡ−ｃｏ−ＨＥＭＡ））、ポリ（ポリエチレングリコール−ｃｏ−ペプチド（Ｐ（ＰＥＧ−ｃｏ−ｐｅｐｔｉｄｅ））、アルギネート−ｇ−（ポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシド−ポリエチレンオキシド）（ａｌｇｉｎａｔｅ−ｇ−（ＰＥＯＰＰＯ−ＰＥＯ））、ポリ（ポリ乳酸−ｃｏ−グリコール酸）−ｃｏ−セリン）（Ｐ（ＰＬＧＡ−ｃｏ−ｓｅｒｉｎｅ））、コラーゲン−アクリレート（ｃｏｌｌａｇｅｎａｃｒｙｌａｔｅ）、アルギネート−アクリレート（ａｌｇｉｎaｔｅ−ａｃｒｙｌａｔｅ）、ポリ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド−ｇ−ペプチド）（Ｐ（ＨＰＭＡ−ｇ−ｐｅｐｔｉｄｅ））、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート／マトリゲル）（Ｐ（ＨＥＭＡ／Ｍａｔｒｉｇｅｌ））、ヒアルロン酸−ｇ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＨＡ−ｇ−ＮＩＰＡＡｍ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシド共重合体（ＰＥＯ−ＰＰＯ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ｓｅｒｉｅｓ）、ポリエチレンオキシド−ポリ乳酸共重合体（ＰＥＯ−ＰＬＡ）、ポリエチレンオキシド−ポリ乳酸グリコール酸共重合体（ＰＥＯ−ＰＬＧＡ）、ポリエチレンオキシド−ポリカプロラクトン共重合体（ＰＥＯ−ＰＣＬ）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ａｌｋｙｌ  ｅｔｈｅｒｓ、Ｂｒｉｊ  Ｓｅｒｉｅｓ）、ポリオキシエチレンキャスターオイル誘導体類（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｃａｓｔｏｒ  ｏｉｌ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒｅｓ）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｓｏｒｂｉｔａｎ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｅｓｔｅｒｓ、Ｔｗｅｅｎ  Ｓｅｒｉｅｓ）、及びポリオキシエチレンステアレート類（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｓｔｅａｒａｔｅｓ）からなるグループから選択された１種以上であってもよい。好ましくは、ポリエチレングリコール又はヒアルロン酸だが、これに限定されるものではない。
【００１６】
本発明において、前記ポリエチレングリコールは、例えば、Ｏ−メチル−Ｏ`−スクシニルポリエチレングリコール、二塩基酸ポリエチレングリコール、α，ω−ビス（２−カルボキシエチル−ポリエチレングリコール、Ｏ，Ｏ`−ビス（２−ブロモエチル）ポリエチレングリコール、Ｏ，Ｏ`−ビス（２−クロロエチル）ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールジメシル酸、メトキシポリエチレングリコール酢酸、Ｏ−[２−（３−スクシニルアミノ）エチル] −Ｏ`−メチル−ポリエチレングリコール、Ｏ−（２−ブロモエチル）−０`−メチルポリエチレングリコール、Ｏ−（２−クロロエチル）−Ｏ`−メチルポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールモノメチルエーテルメシル酸（ｍｅｓｙｌａｔｅ）、アルデヒド官能化ポリエチレングリコール、グリシジルエーテ官能化ポリエチレングリコール、ニトロフェニルカーボネート官能化ポリエチレングリコール、メシル（Ｍｅｓｙｌ）官能化ポリエチレングリコール又はトシル（Ｔｏｓｙｌ）官能化ポリエチレングリコールであってもよく、好ましくは、Ｏ−メチル−Ｏ`−スクシニルポリエチレングリコールであってもよい。
【００１７】
前記水溶性高分子の分子量は、１０００Ｄａ〜４０００ｋＤａであってもよく、好ましくは、２０００Ｄａ〜３０００ｋＤａであってもよい。好ましい例としては、１０００ｋＤａ〜４０００ｋＤａのヒアルロン酸又は１０００Ｄａ〜２００００Ｄａのポリエチレングリコールを挙げることができる。
前記ケラチンは、毛髪再生を促進することができる。
具体的には、前記ケラチンは、ヒト外毛根鞘細胞又は毛根細胞の成長及び細胞の凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）を誘導して、毛髪再生を促進することができる。
【００１８】
本発明で触れている「発毛促進」は、「毛髪の成長」及び／又は「毛髪の再生」を促進するという意味であり、「毛髪再生」とは、ヒト外毛根鞘細胞又は毛根細胞の成長もしくは細胞の凝集を誘導して、究極的に毛髪が簡単に抜けないようにするということを意味し、毛髪成長の初期段階である成長期（ａｎａｇｅｎ  ｓｔａｇｅ）において、毛包の形成を促進して、新しい毛包の形成を誘導することにより、毛髪が再生されるようにするということを意味する。それに加えて、ヒト外毛根鞘細胞の移動及びクローンの活性又は幹細胞性に関与する発現因子が増加することを意味する。
【００１９】
本発明に係る薬学組成物は、ヒト外毛根鞘細胞又は毛根細胞の中に含まれている毛髪再生及び毛髪成長を誘導する遺伝子の発現量を増加させることができる。
前記遺伝子は、ベータカテニン（ｂｅｔａ  ｃａｔｅｎｉｎ）、 Ｓｏｘ−９、Ｓｏｘ−２、Ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＣＤ１３３、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０、ＢＭＰ６、Ｐ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＭＳＸ２、ＦＯＸＮ１及びＣＤ１０からなるグループから選択された１種以上であってもよい。
前記ベータカテニンは、ウィント（Ｗｎｔ）タンパク質のシグナルを受けて、細胞核の中に移動、細胞の増殖と分化に関わる標的遺伝子の発現を調節するシグナル伝達物質であり、毛髪に成長する幹細胞に含まれている物質であり、細胞の移動及びクローンの活性に関わる物質のことを意味する。
前記Ｓｏｘ−９は、幹細胞性（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）に関与する物質であり、毛髪の外毛根鞘（ｏｕｔｅｒ  ｒｏｏｔ  ｓｈｅａｔｈ、ＯＲＳ）と皮脂腺（ｓｅｂａｃｅｏｕｓ  ｇｌａｎｄ）細胞の核内で発現される遺伝子のことを意味する。
前記Ｓｏｘ−２は、胚性幹細胞から多く発現し、胚性幹細胞の分化全能性を保つ上で重要な役割を果たすだけでなく、人工多能性幹細胞を作る因子の一つであり、幹細胞としての性質を保つ上で重要な働きをする物質のことを意味する。
前記Ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅは、酵素の一種で、様々な同種の酵素で身体の様々な部位に存在する物質であり、毛髪が生成する過程の中でｈａｉｒ  ｍａｔｒｉｘ内の血管新生に関与する物質であり、発毛が行われる時活性が増加する物質のことを意味する。
前記ＣＤ１３３は、細胞外膜に存在し、細胞が成長していく時、発現が誘導されるタンパク質として知られており、ＣＤ（Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）系のタンパク質であり、毛包幹細胞の免疫学的特性を示せる物質のことを意味する。
前記ＦＧＦ７は角質細胞の成長因子であり、表皮の下にある真皮に浸透して角質細胞の成長と増殖を強力に促進する物質のことを意味する。
前記ＦＧＦ１０は繊維芽細胞の成長因子であり、表皮の下にある真皮に浸透して繊維芽細胞の成長と増殖を強力に促進する物質のことを意味する。
前記ＢＭＰ６は、神経細胞を含むいくつもの種類の細胞から生物学的活性を調節するタンパク質で、ヒト毛根細胞の凝集体形成を誘導して発毛を誘導する因子のことを意味する。
前記Ｐ−ｃａｄｈｅｒｉｎ及びＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎは、ｃａｄｇｅｒｉｎ系タンパク質であって、細胞を付着させるのに用いられ、アクチン細胞骨格に連結してこれらの組み立てを助ける機能を有しており、細胞の遺伝子発現を変化させるシグナル伝達分子として作用するタンパク質で、ヒト外毛根鞘細胞の移動及びＭａｔｒｉｘ  ｃｅｌｌへの分化に関わる因子のことを意味する。
前記ＭＳＸ２、ＦＯＸＮ１及びＣＤ１０は、ヒト外毛根鞘細胞のＭａｔｒｉｘ  ｃｅｌｌへの分化に関わる因子のことを意味する。
【００２０】
前記薬学組成物は、ヒト外毛根鞘細胞内のベータカテニン又はＳｏｘ−９を増加させ、ヒト外毛根鞘細胞の移動及びクローンの活性を誘導することができる。
前記薬学組成物は、ヒト毛根細胞の細胞凝集体（ｃｅｌｌ  ａｇｇｒｅｇａｔｅ）の形成を促進させることができ、細胞凝集体の形成が高まることにより、毛髪の成長を誘導し、毛髪再生効果を向上させることができる。
前記薬学組成物は、ヒト毛根細胞内のベータカテニン、Ｓｏｘ−２、Ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＣＤ１３３、ＦＧＦ７及びＦＧＦ１０の発現を増加させ、ヒト毛根細胞の幹細胞性を増加させることができる。
本発明の具体的な一実施例においては、身体機能が低下した老齢マウスの背中部分の毛を剃った後、ケラチン溶液を注射して毛の生えた密度と毛包の形成を分析した。その結果、ケラチンが毛包の形成及び毛髪の再生を促進することを確認した。したがって、ケラチンが脱毛防止又は発毛促進用注射用薬学組成物に使用することができることがわかった。
【００２１】
本発明において、用語「注射」は、注射器を使用して薬液を皮内、皮下、筋肉内、静脈内又は動脈内などに注入するものである。具体的には、本発明の薬学的組成物が脱毛防止又は発毛促進の効能を示す特性上、前記注射は皮下注射であってもよいが、これに限定されるものではない。前記注射器は、針を介して薬液の投与が可能な一般的な注射器だけでなく、本発明の薬学的組成物を皮下に投与するために使用される注射器であれば、制限なく使用可能である。
本発明において、前記注射用薬学組成物は、液剤又は乾燥粉末の形態であってもよい。前記注射用乾燥粉末は、患者に投与する際、注射用水、生理食塩水、ブドウ糖液、及びアミノ酸液からなるグループから選択された１種以上と再構成して、個体に投与することができる。
【００２２】
本発明の組成物に含まれる活性成分の量は、投与対象個体の状態、目的とする治療の程度などによって異なる。具体的には、本発明のケラチンは、注射用薬学組成物対比０．００１〜１０（ｗ／ｖ）％、具体的には、０．０１（ｗ／ｖ）％〜５（ｗ／ｖ）％、更に具体的には、０．０５〜２（ｗ／ｖ）％の濃度で含まれてもよい。
前記ケラチンの濃度が０．００１（ｗ／ｖ）％未満である場合、脱毛防止又は発毛促進効果が不十分である可能性があり、１０（ｗ／ｖ）％を超過する場合、体内の副作用を引き起こしかねない問題がある。
【００２３】
本発明において、前記組成物は、経皮吸収促進剤（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｒ）をさらに含むことができる。
前記薬学組成物は、脱毛部位又は毛髪の成長を促進しようとする部位に局所投与することができ、好ましくは、真皮層又は皮下組織に投与することができる。このとき、真皮層は表皮の下の最も厚い層で、血管系、神経系、リンパ系などが複雑に絡み合っており、毛包が発生し、成長する層であり、毛根を有しているもののことを意味する。
前記皮下組織は、真皮層の下に、筋肉と骨の間にある部分で、多量の脂肪を有する脂肪細胞があって、体を柔らかくし、輪郭を持たせ、エネルギーとして使用することができる。また、動脈とリンパ液が循環しているもののことを意味する。
前記経皮吸収促進剤は、スルホキシド（ｓｕｌｐｈｏｘｉｄｅ）、アゾン（ａｚｏｎｅ）、ピロリドン（ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）、脂肪酸、炭素数１〜４の低級アルコール、炭素数６以上の高級脂肪アルコール（ｆａｔｔｙ  ａｌｃｏｈｏｌ）、グリコール（ｇｌｙｃｏｌ）、尿素（ｕｒｅａ）、テルペン（ｔｅｒｐｅｎｅ）、テルペノイド（ｔｅｒｐｅｎｏｉｄ）、及びリン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）からなるグループから選択された１種以上であってもよい。ただし、これに限定されるものではなく、注射用薬学組成物に使用されて活性成分の経皮吸収を促進させる通常の促進剤を含むことができる。
前記スルホキシドは、ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ、ＤＭＳＯ）、ジメチルアセトアミド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｍｉｄｅ、ＤＭＡＣ）、ジメチルホルムアミド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、ＤＭＦ）、及びデシルメチルスルホキシド（ｄｅｃｙｌｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ、ＤＣＭＳ）からなるグループから選択された１種以上であってもよいが、これに限定されるものではない。
前記ピロリドン（ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）は、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）及び２−ピロリドン（２Ｐ）からなるグループから選択された１種以上であってもよいが、これに限定されるものではない。
前記アゾン（ａｚｏｎｅ）は、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン（１−ｄｏｄｅｃｙｌａｚａｃｙｃｌｏｈｅｐｔａｎ−２−ｏｎｅ）又はラウロカプラム（ｌａｕｒｏｃａｐｒａｍ）であってもよい。
前記経皮吸収促進剤は、使用種類に応じて注射用組成物に通常許容される量で含まれてもよい。
【００２４】
本発明の薬学組成物は、脱毛防止又は発毛促進のために単独、又はホルモン治療、化学治療、及び生物学的反応調節剤を使用する方法と併用して使用することができる。
【００２５】
本発明は、ケラチンを含む注射用薬学組成物を製造するステップと、前記注射用薬学組成物を個体に投与するステップとを含む、脱毛防止又は発毛促進方法を提供する。
前記「投与」とは、適切な方法で、個体に所定の物質を導入することを意味する。本発明において、前記組成物は、個体に注射して脱毛防止又は発毛促進効果を示す特性上、前記投与は、真皮層又は皮下組織の投与であってもよい。
【００２６】
本発明の薬学組成物は、使用された特定の化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康、性別、定食、投与時間、投与経路、排出率、薬物配合及び予防又は治療される特定の疾患の重症を含む、様々な要因によって多様に変化することができ、前記薬学組成物の投与量は、患者の状態、体重、病気の程度、薬物形態、投与経路及び期間によって異なるが、当業者によって適切に選択されてもよく、１日０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ又は０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇで投与することができる。投与は、一日に一回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。前記投与量は、いかなる面であっても、本発明の範囲を限定するものではない。また、人の発毛面積によって投与容量及び濃度が異なりうるし、好ましい組成物の濃度は、０．１〜１００ｍｇ／ｍｌだが、これに限定されるものではない。
前記「個体」とは、脱毛の症状が発生したり、あるいは発生する可能性のある人間を含むネズミ、マウス、家畜などのすべての動物のことを意味する。具体的には、人間を含む哺乳動物であってもよい。
以下、本発明の理解を助けるために好ましい製造例及び実施例を提示する。しかし、下記の製造例及び実施例は、本発明をより理解しやすくするために提供されるものであって、これにより本発明の内容が限定されるものではない。
【００２７】
［製造例１：ケラチンの収得］
人の髪の毛を、弱性洗剤を使用してきれいに洗浄した後、蒸留水で何度も洗った。脂質を除去するために、髪の毛をビーカーに入れ、クロロホルムとメタノールを２：１の割合で混ぜた混合液に髪の毛が浸るくらいまで入れた。２４時間後、脂質の除去に使用した溶液が、髪の毛に残っていないまで蒸留水で何度も洗浄した後、髪の毛を気乾（ａｉｒ−ｄｒｙ）させた。２％の過酢酸（Ｓｉｇｍａ  ａｌｄｒｉｃｈ）８００ｍＬに、気乾させた髪の毛２０ｇを入れ、３７℃で１２時間、３００ｒｐｍの速度で撹拌した。１２時間後、髪の毛をふるいにかけ、蒸留水で洗浄して残っている酸化物を除去した。髪の毛を４００ｍＬのシンダイ（Ｓｈｉｎｄａｉ）溶液（５％の２−メルカプトエタノール、５Ｍの尿素、２．６Ｍのチオ尿素（以上Ｓｉｇｍａ  ａｌｄｒｉｃｈ）及び２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８．５）に入れて、５０℃、４００ｒｐｍの条件で７２時間反応させた。その後、髪の毛の溶液を５０ｍＬのチューブに入れて３５００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上澄み液を集めて１２−１４ｋＤａカットオフＳｐｅｃｔｒａ／ＰｏｒＲ４透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）を利用して透析した。透析が終わったケラチン液体サンプルを凍結乾燥してケラチンパウダーを製造した。
【００２８】
［製造例２：加水分解されたケラチンの製造］
まず、スクリューキャップを有するポリエチレンテレフタレート（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ）材質の茶色バイアル（１０ｍｌ、２２＊４８）に、ｄＨ２Ｏを入れて、ｐＨ９．０、３０℃で、Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ  ａｌｂｕｍ由来のプロテイナーゼ−Ｋ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−Ｋ、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ（登録商標）Ｃに固定、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を２ｍｇ／ｍｌの濃度で２０ｍｇほど添加して溶かした。前記プロテイナーゼ−Ｋがすべて溶けた後、前記製造例１に従って製造されたケラチンパウダー４００ｍｇを微細部品単位計数測定のデジタルスケール（０．００１ｇ〜６２０ｇ、ＡＪ−６２０Ｅ）で測って、前記バイアルに入れた。前記バイアルをデジタル乾燥オーブン（Ｄｉｇｉｔａｌ  ｄｒｙｉｎｇ  ｏｖｅｎ）に入れた後、卵形状の白い５ｘ２ｍｍの磁気撹拌棒（［Ｂ００Ｃ３ＭＥ４ＺＡ］、１５７２５００  ＩＫＡＦＬＯＮ  ４０、ＩＫＡ）と移動式ＭＳ−Ｈ−Ｓ１０  １０−Ｃｈａｎｎｅｌ磁気撹拌機を用いて、３７℃で３００ｒｐｍの速度で１時間撹拌した。完全に加水分解されたケラチン（ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ  ｋｅｒａｔｉｎ）溶液を遠心分離機に入れて、２５０ｇで１０分間作動させ、プロテイナーゼ−Ｋが固定されたＥｕｐｅｒｇｉｔ（登録商標）Ｃを沈殿させた後除去した。上澄み液のみを収得した後、それぞれＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）ＰＣＲチューブに１０μｌずつ入れた。前記チューブをＣＦＸ９６  ＴｏｕｃｈＴＭ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ検出システム装備にて９９℃で１時間沸騰させ、プロテイナーゼ−Ｋの活性を除去した。加水分解されたケラチン液体サンプルを凍結乾燥して、加水分解されたケラチンパウダーを製造した。
【００２９】
［製造例３：ペギル化（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）されたケラチンの製造］
［製造例３−１：ペギル化されたケラチンの合成］
まず、前記製造例１から得られたケラチンパウダー０．５ｇを微細部品単位係数測定のデジタルスケール（０．００１ｇ〜６２０ｇ、ＡＪ−６２０Ｅ）で測り、５００ｍＬのパイレックス（登録商標）ビーカー（ＩＳＯＬＡＢ、ＹＬＳ、ドイツ）に入れた。ビーカーに三次水１００ｍＬを入れて、４０×８ｍｍの磁気撹拌棒（［Ｂ００Ｃ３ＭＥ４ＺＡ］、１５７２５００ＩＫＡＦＬＯＮ  ４０、ＩＫＡ）とＭＳ−Ｈ−Ｓ１０  １０−Ｃｈａｎｎｅｌ磁気撹拌機を用いて、３００ｒｐｍの速度で２４時間撹拌した。
メトキシポリエチレングリコールを変形させたＯ−メチル−Ｏ`−スクシニルポリエチレングリコール５０００（ｍＰＥＧ、１７９２９−５Ｇ−Ｆ、Ｌｏｔ＃Ｒ０６３７３７／２Ｖ Ｓｉｇｍａ  ａｌｄｒｉｃｈ）３００ｍｇを三次水２０ｍＬに１時間溶かした。ｍＰＥＧ溶液に４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メトキシモルホリニウムクロリド（ＤＭＴＭＭ）ｎ−水和物（３２７−５３７５２、ｗａｋｏ  ｃｈｅｍｉｃａｌ）１６ｍｇを入れて１時間撹拌した。ケラチン溶液とｍＰＥＧ及びＤＭＴＭＭの結合溶液を５００ｍＬのビーカーに入れ、４０×８ｍｍの磁気撹拌棒（１５７２５００ＩＫＡＦＬＯＮ  ４０、ＩＫＡ）とＭＳ−Ｈ−Ｓ１０  １０−Ｃｈａｎｎｅｌ磁気撹拌機を用いて、５００ｒｐｍの速度で、室温で３日間撹拌し、ＰＥＧとケラチンを反応させた。
【００３０】
［製造例３−２：ペギル化されたケラチンの精製］
製造例３−１の反応が終わった後、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ透過膜チューブ（直径１６ｍｍ、折径２５ｍｍ、ＭＷ１００００、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）に、ペギル化されたケラチン溶液を１チューブ当たり１００ｍＬずつ入れ、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  ＲＣ透析チュービングクロージャ（最大幅５５ｍｍ、Ｏｒａｎｇｅ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）を両方のチューブにパッキングした。５Ｌのプラスチックビーカー（直径１９７ｍｍ、高さ２６５ｍｍ）に三次水４Ｌを入れて、ペギル化されたケラチン溶液が入っているチューブを入れて磁気バーを入れて撹拌しながら透析した。このとき、１２時間ごとに新しい三次水に入れ替え、室温で３日間三次水に、計６回入れ替えながら透析した。最終的にペギル化されたケラチン溶液を５０ｍＬの遠心管（１７×１２０ｍｍ、ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）に４０ｍＬずつ分けて入れた後、超低温冷蔵庫（Ｎｉｈｏｎ  ｆｒｅｅｚｅｒ、Ｕｐｒｉｇｈｔ  ｔｙｐｅ、Ｓｉｎｇｌｅ  ｃｏｏｌｉｎｇ  ｔｙｐｅ、５４２１）で、−７０℃で２４時間完全に凍結させた。遠心管の蓋を開けて、凍結乾燥機（ＡＬＰＨＡ２−４ＬＳＣ  ＰＬＵＳ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｒｅｅｚｅ  ｄｒｙｅｒｓ、Ｃｈｒｉｓｔ）に入れて、−８５℃の真空状態で完全にパウダー形態になるよう３日間乾燥させた。その上、ペギル化されたケラチンをＮＭＲを通して分析した。その結果、図1に示すように、ペギル化されたケラチンからそれぞれケラチン及びＰＥＧで特異的に表れるピークが同時に存在することを確認した。
【００３１】
［製造例３−３：過酸化水素を有するペギル化されたケラチン溶液の製造］
製造例３−２で得られたペギル化されたケラチン２０ｍｇを微細部品単位係数測定のデジタルスケール（（０．００１ｇ〜６２０ｇ）ＡＪ−６２０Ｅ）を用いて測定した。そして、Ｈ２Ｏ２（過酸化水素３０％、分子量３４．０１、ＪＵＮＳＥＩ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ、７７２２−８４−１）１０２μｌを３次蒸留水８９８μｌに入れ、濃度１Ｍの１ｍＬを作った後、蒸留水で１００倍と２０倍に連続希釈（ｓｅｒｉａｌ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）して、最終的に５００μＭのＨ２Ｏ２溶液を作った。製造された５００ｕＭのＨ２Ｏ２溶液１ｍＬに２０ｍｇのペギル化されたケラチン（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ  Ｋｅｒａｔｉｎ）を加えて５分間ボルテックスして、５００μＭのＨ２Ｏ２が含まれたペギル化されたケラチン溶液を製造した。製造された溶液が入っているガラス瓶を空圧式真空包装機を用いて、ナイロン真空包装機１５０×２００ｍｍ（ＮＹ／ＰＥＬＬＤＰＥ）（８０μｍ）で密封して保管した。
【００３２】
［実験例１：動物実験における毛髪成長の効果］
［実験例１−１：動物モデルの用意］
ケラチンの毛髪成長効果を検証するための動物実験モデルとして、１２週齢の体重２０−２５ｇのＣ５７ＢＬ／６Ｊ老齢マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｃｏｒｐ．Ｉｎｃ．、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、スペイン）２４匹を使用した。前記マウスをイソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）で麻酔した後、マウスの背中部分をクリッパー（ｃｌｉｐｅｒ）で締め付け、休止期（ｔｅｌｏｇｅｎ  ｓｔａｇｅ）の毛根を残しておいて、髪の毛及び毛根を切り取った。ポビドン - ヨウ素（ｐｏｖｉｄｏｎｅ−ｉｏｄｉｎｅ）溶液で皮膚を消毒した後、６０％のアルコールで拭いた。
【００３３】
［実験例１−２：ケラチンの毛髪成長効果］
前記実験例１−１に従って用意されたマウスの背中部分に下記表１のように投与して用意した。正常対照群は、毛を剃った後、何も処理しないマウスを用いた。すべてのマウスを２週間飼育した後、２週間目に毛を剃った部位を実体顕微鏡（ＳＺＸ１６、Ｏｌｙｍｐｕｓ）で観察した。その結果を図２に示した。
【表１】
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【００３４】
その結果、前記実施例１〜６は、正常対照群に比べて、すべて発毛効果に非常に優れていることを示し、前記実施例１〜６は、均一に毛髪が成長しており、実施例１、実施例２及び実施例４は、密度が非常に密になって毛髪が成長したことを示した。これにより、ケラチンを皮下内に注射した場合、皮膚に塗布した時よりもさらに発毛効果に優れていることを確認し、本発明に係るケラチンを含む注射用薬学組成物は、脱毛防止及び発毛促進効果を有することを確認し、脱毛防止及び発毛促進効果が早く現れることを確認した。
また、本発明のケラチンを含む注射用薬学組成物は、通常の皮膚外用剤としての剤形で、肌に塗布したものよりも脱毛防止及び発毛促進効果が顕著に高く、剤形を注射剤にして皮下注射したものの方が、生体利用率が高かった。
一方、一般的に皮膚外用剤ではなく、注射剤に剤形を切り替えるにあたり、注射剤として使用する場合は、皮膚外用剤として使用する場合よりも、生体利用率が増加することに伴う毒性などの副作用も一緒に高くなるので、こうした副作用を解決することも重要である。したがって、本発明のケラチンを含む注射用薬学組成物は、前記図２を通じて、ケラチンを含む注射用薬学組成物を皮下注射する際に毒性が全くないことを確認し、皮下注射後の身体の中での血液又は水分と反応して生じる副作用も見られなかった。
【００３５】
［実験例１−３：ケラチンの毛髪成長効果に関する組織学的分析］
実験例１−２を終えてから実施例１〜６の溶液を投与したマウス、正常対照群及び陽性対照群をそれぞれ犠牲にして組織の試験片を取得した。これをヘマトキシリン−エオシン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ａｎｄ  ｅｏｓｉｎ、Ｈ＆Ｅ）で染色して観察して分析した結果を図３〜図５に示した。
その結果、前記実施例１〜実施例６のケラチン溶液を投与したマウスは、毛包（ｈａｉｒ  ｆｏｌｌｉｃｌｅ）の形成が正常対照群に比べて非常に高い頻度で発生することを確認した（図３）。特に、実施例１〜実施例４のケラチン及び加水分解されたケラチン溶液を投与したマウスは、実施例５〜６のペギル化されたケラチン溶液を投与したマウスに比べて毛包の大きさが増加することを確認した。具体的には、図４に示すように、毛髪成長の段階ごとに分析した結果で、毛髪成長の初期段階である成長期（ａｎａｇｅｎ  ｓｔａｇｅ）で、毛包の形成が促進される現象が現れ、そこから新しい毛包の形成が誘導されることを確認した（図４）。また、マウスに投与したケラチン溶液の濃度が高くなるにつれて、毛包の直径サイズが大きくなる傾向を示した（図５）。
【００３６】
［実験例２：加水分解されたケラチンの確認］
製造例２に従って加水分解されたケラチンが製造されたかどうかをＳＤＳ−ＰＡＧＥを通じて確認し、図６に示した。
具体的には、ＳｅｅＢｌｕｓ（登録商標）  ｐｌｕｓ２  Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（ｎｏｖｅｘ）のサイズマーカーを室温に出し、溶液が完全に混ざるようにボルテックスした。１０μｌのＢｏｌｔＴＭ  ＬＤＳ Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（４×）、４ｕｌのＢｏｌｔＴＭ  ＬＤＳ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ａｇｅｎｔ（１０×）及び２６ｕｌの４％加水分解されたケラチンを混合した計４０μｌサンプルをボルテックスした。加熱ブロック（ＨＹＳＣ_Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ_Ｈｅａｔｉｎｇ  Ｂｌｏｃｋ_２０１４）の温度を１００℃に設定し、１０分間加熱して加水分解されたケラチンサンプルを用意した。Ｂｏｌｔ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ４−１２％  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｍｉｎｉ  ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のｃｏｍｂ部分を除去した後、ウェルを１×ＭＥＳのランニングバッファーで洗浄し、カセットの最後の部分のカバーテープを除去した。サンプルをロードする前に、前記カセットのチャンバーを１×ＭＥＳのランニングバッファーで詰め、カセットクランプを用いて、バッファーが抜けないように締めた。サンプルをロードするウェルに１×ＭＥＳのランニングバッファーを詰めた。３０μｌの４％加水分解されたケラチンサンプルと１０μｌのＳｅｅＢｌｕｅ（登録商標）  ＰＬＵＳ２  Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（ｎｏｖｅｘ）のサイズマーカーをそれぞれロードした。０．０１２、０．０１５、０．０２０ｍｇ／６００μｌ  ＰＡＡのケラチンサンプルを対照群として使用した。カセットの外側の目盛まで１×ＭＥＳのランニングバッファーで詰め、サイズマーカーと４％加水分解されたケラチンサンプルをロードした後、１６５Ｖ、４０分間ＰｏｗｅｒＰａｃＴＭ  Ｂａｓｉｃ  Ｐｏｗｅｒ  Ｓｕｐｐｌｙ（Ｂｉｏ−ｒａｄ）でランニングした。ランニングした後、カセットクランプを緩めてロードされたゲルのみを得てＣｏｍａｓｓｉｅ  ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅ  Ｇ−２５０（Ｓｉｇｍａ）で２４時間染色した。脱色溶液（Ｄｅｓｔａｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ；１０％（ｖ／ｖ）酢酸、４０％（ｖ／ｖ）メタノール）でバンドが見えるまでウォッシングした後、サイズマーカーとタンパク質を確認した。
その結果、図６に示すように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果、抽出された天然ケラチンの場合、約５０ｋダルトン（ｄａｌｔｏｎ）の分子量レベルでタンパク質のバンドを示したが、加水分解されたケラチンの場合、３−６ｋダルトンの分子量レベルでｓｍｅａｒにバンドが現れることを確認した。これにより、加水分解されたケラチンが、様々な分子量の分解されたペプチドで構成されていることがわかった。
【００３７】
［実験例３：実験室段階（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でヒト毛根細胞（Ｄｅｍａｌ  Ｐａｐｉｌｌａ  Ｃｅｌｌ）に対するケラチンの細胞凝集体誘導及び毛髪成長に関与する因子の発現誘導］
ケラチンの毛髪再生効果を確認するために、毛髪の成長及び凝集と発毛誘導に関わる因子の発現を確認した。
ヒト毛根細胞を使用して製造されたケラチン溶液が細胞増殖に効能を示すかどうかを確認した。
具体的には、ヒト毛根細胞を２４ウェルプレートに２×１０４個ずつ接種し、２４時間後に培地を高濃度のＤＭＥＭ一般培地、又は１％（ｗ／ｖ）のケラチンが含まれている高濃度のＤＭＥＭ一般培地に交換した。再び１日、３日、５日間培養した後、細胞増殖の分析を行った。ＤＰＢＳでウェルを洗浄した後、それぞれのウェルに高濃度のＤＭＥＭ一般培地で１０倍希釈したＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８溶液（Ｄｏｊｉｎｄｏ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を入れて、アルミホイルで光を遮断した後、３７℃で１時間半インキュベーションした。インキュベーションした後、それぞれのウェルから１００μｌずつ９６ウェルプレートに移し、９６ウェルフォーマットプレートリーダー（ｆｏｒｍａｔ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ、ＥＬＸ  ８００  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ、Ｂｉｏ  Ｔｅｋ、Ｉｎｃ．）機器を用いて４５０ｎｍの波長（Ｏ．Ｄ  ４５０ｎｍ）で吸光度を測定した。その結果を図７に示した。
その結果、ケラチンを処理する際、ヒト毛根細胞の増殖が抑制されることが分かった（図７）。また、蛍光物質が複合化されたケラチンの処理後、細胞との相互作用を分析した結果、細胞表面にケラチンが接着されていることを確認し、時間が経つにつれ、細胞の移動に伴う細胞凝集体の形成がケラチンによって誘導されることを確認した（図８）。
【００３８】
こうした結果を、ｍＲＮＡ発現分析を通じて追加的に確認するためには、まずヒト毛根細胞を６ウェルプレートに２×１０５個ずつ接種し、２４時間後に高濃度のＤＭＥＭ一般培地、又は１％（ｗ／ｖ）のケラチンが含まれている高濃度のＤＭＥＭ一般培地に交換した。ケラチンを２４時間処理した後、ＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ分析のために、６ウェルプレートで培養した細胞の培養培地を除去し、ＤＰＢＳで洗浄した。ＲＮＡの抽出時、Ｈｙｂｒｉｄ−Ｒキット（Ｇｅｎｅ  Ａｌｌ）を使用し、ナノドロップ（ＭＩＣＲＯＰ  ＵＶ−Ｖｉｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ  Ｍ６００）を使用して抽出されたＲＮＡを定量した。１μｇのＲＮＡをマクロジェンに依頼してＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ分析を行った。
その結果、ケラチンを処理したヒト毛根細胞において、細胞の移動及び細胞凝集体の誘導に関わる細胞外基質の合成と細胞間の相互作用に関するｍＲＮＡの発現が大きく増加し、細胞の増殖に関わるｍＲＮＡの発現が抑制されることを確認した（図９）。 
【００３９】
また、ヒト毛根細胞を６ウェルプレートに２×１０５個ずつ接種し、２４時間後に高濃度のＤＭＥＭ一般培地、又は１％（ｗ／ｖ）のケラチンが含まれている高濃度のＤＭＥＭ一般培地に交換した。３日及び５日間培養した後、免疫化学的染色を通じて発毛を誘導する因子の発現程度を測定した。
【００４０】
上記のように、ヒト毛根細胞を培養した後、培地を除去し、ＤＰＢＳで洗浄した。４％のパラホルムアルデヒドを１０分間処理して固定させた後、再びＤＰＢＳで洗浄した。固定した後、０．１％のｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を３０分間処理して透過性化（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）させた後、１０％（ｗ／ｖ）の正常ヤギ血清（ｎｏｒｍａｌ  ｇｏａｔ  ｓｅｒｕｍ、ＮＧＳ）を１時間処理した。その後、１：２００に希釈したウサギの抗−ヒトベータ−カテニン抗体（ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、マウスの抗−ヒトＦＧＦ７抗体（ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＦＧＦ７  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ウサギの抗−ヒトＦＧＦ１０抗体（ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＦＧＦ１０  ａｎｔｉｂｏｄｙ）及びウサギの抗−ヒトＢＭＰ６抗体（ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＢＭＰ６  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を処理して、２４時間、４℃で反応させた。２４時間反応後、ＤＰＢＳで３回洗浄し、ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙとｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙを常温で１時間処理した。その後、ＤＰＢＳで３回洗浄し、４'，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）を処理した。その後、染色した細胞を蛍光顕微鏡（ＯｌｙｍｐｕｓＩ×７１）で観察した。その結果、ケラチンを処理したヒト毛根細胞で細胞凝集体の形成が誘導され、発毛を誘導する因子として知られているＦＧＦ７、ＦＧＦ１０およびＢＭＰ６の分子発現が大きく増加したことを確認した（図１０）。
【００４１】
［実験例４：実験室段階（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でヒト外毛根鞘（ｏｕｔｅｒ  ｒｏｏｔ  ｓｈｅａｔｈ、ＯＲＳ）に対するケラチンの毛髪成長関与因子の発現誘導］
ケラチンの毛髪再生効果を確認するために、毛髪の成長と発毛誘導に関わる因子の発現を確認した。
ヒト外毛根鞘細胞を使用して製造されたケラチン溶液が毛髪の成長と発毛誘導に関わる因子の発現を示すかどうかを確認した。
具体的には、ヒト外毛根鞘細胞を６ウェルプレートに５×１０４個ずつ接種し、２４時間後にＯＲＳ培地又は１％（ｗ／ｖ）のケラチンが含まれているＯＲＳ培地に交換した。３日間培養した後、免疫化学的染色とＲＴ−ＰＣＲ分析を通じて、ベータカテニン（ｂｅｔａ  ｃａｔｅｎｉｎ）、ＣＤ３４、Ｐ−ｃａｄｈｅｒｉｎ及びＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの発現程度及び転写因子に対する発現程度を測定した。
上記のように、ヒト外毛根鞘（ｏｕｔｅｒ  ｒｏｏｔ  ｓｈｅａｔｈ、ＯＲＳ）細胞を培養した後、培地を除去し、ＤＰＢＳで洗浄した。４％のパラホルムアルデヒドを１０分間処理して固定させた後、再びＤＰＢＳで洗浄した。固定した後、０．１％のｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を３０分間処理して透過性化（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）させた後、１０％（ｗ／ｖ）の正常ヤギ血清（ｎｏｒｍａｌ  ｇｏａｔ  ｓｅｒｕｍ、ＮＧＳ）を１時間処理した。その後、１：２００に希釈したウサギの抗−ヒトベータ−カテニン抗体（ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ウサギの抗−ヒトＣＤ３４抗体（ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ３４  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ウサギの抗−ヒトＰ−ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体（ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ｐ−ｃａｄｈｅｒｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ウサギの抗−ヒトＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体（ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）及びマウスの抗−ヒトｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｂｅｔａｌ抗体（ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｂｅｔａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を処理して２４時間、４℃で反応させた。２４時間反応後、ＤＰＢＳで３回洗浄し、ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ及びＰＥ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ｐａｌｌｏｉｄｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙを常温で１時間処理した。その後、ＤＰＢＳで３回洗浄し、４'，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）を処理した。その後、染色した細胞を蛍光顕微鏡（ＯｌｙｍｐｕｓＩ×７１）で観察した。ＲＴ−ＰＣＲ分析のために、６ウェルプレートで培養した細胞の培養培地を除去し、ＤＰＢＳで洗浄した。ＲＮＡの抽出時、Ｈｙｂｒｉｄ−Ｒキット（Ｇｅｎｅ  Ａｌｌ）を使用し、ナノドロップ（ＭＩＣＲＯＰ  ＵＶ−Ｖｉｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ  Ｍ６００）を使用して抽出されたＲＮＡを定量した。１μｇのＲＮＡをＡｃｃｕＰｏｗｅｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｐｒｅｍｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、大田、韓国）に加え、熱循環器（Ｔ１０６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてｃＤＮＡを作った。使用したプライマーの配列は下記の表２に示す。
【表２】
0006861298.tif 000003
【００４２】
それぞれの反応にＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍｉｘ１０μｌ、０．５ｐｍのプライマー（ｓｅｎｓｅとａｎｔｉｓｅｎｓｅ）と５０ｎｍの鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）を入れた。ＲＴ−ＰＣＲは、ＲＧ６０００  ５ｐｌｅｘ  ＨＲＭ（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）機器を使用し、９５℃で１５秒、アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）温度５７℃で４５秒、４０サイクルを設定した。閾値サイクル（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ、Ｃｔ）の値を測定するために、相対定量（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｃｔ（２−ΔΔCt））法を使用した。
その結果、ヒト外毛根鞘（ｏｕｔｅｒ  ｒｏｏｔ  ｓｈｅａｔｈ、ＯＲＳ）細胞の場合、ケラチンの処理時、毛髪再生と関連して外毛根鞘細胞の移動及びＭａｔｒｉｘ  ｃｅｌｌへの分化に関わる因子であるベータカテニン（ｂｅｔａ  ｃａｔｅｎｉｎ）及びＰ−ｃａｄｈｅｒｉｎの発現が増加することを確認し、分化時に発現が減少する分子として知られているＣＤ３４の発現が減少することを確認した（図１１）。
また、ケラチンの処理時、ヒト外毛根鞘（ｏｕｔｅｒ  ｒｏｏｔ  ｓｈｅａｔｈ、ＯＲＳ）細胞のＭａｔｒｉｘ  ｃｅｌｌへの分化に関わるＭＳＸ２、ＦＯＸＮ１及びＣＤ１０遺伝子の発現が増加することを確認し（図１２）、分化時に発現が減少することとして知られているＫＲＴ５及びＩＴＧＡ６遺伝子の発現は減少することを確認した（図１２）。
【００４３】
［実験例５：実験室段階（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でヒト外毛根鞘細胞に対する加水分解されたケラチンの毛髪成長関与因子の発現誘導］
加水分解されたケラチンの毛髪再生効果を確認するために、毛髪の成長と幹細胞性に関わる因子の発現を確認した。
ヒト外毛根鞘（ｏｕｔｅｒ  ｒｏｏｔ  ｓｈｅａｔｈ、ＯＲＳ）細胞を６ウェルプレートに５×１０４個ずつ接種し、２４時間後にＯＲＳ培地又は１％（ｗ／ｖ）の加水分解されたケラチンが含まれているＯＲＳ培地に交換した。１日、３日及び５日間培養した後、免疫化学的染色とＲＴ−ＰＣＲ分析を通じて、ベータカテニン（ｂｅｔａ  ｃａｔｅｎｉｎ）、Ｓｏｘ−９及びＣＤ４４の発現程度を測定した。
上記のように、ヒト外毛根鞘（ｏｕｔｅｒ  ｒｏｏｔ  ｓｈｅａｔｈ、ＯＲＳ）細胞を培養した後、培地を除去し、ＤＰＢＳで洗浄した。４％のパラホルムアルデヒドを１０分間処理して固定させた後、再びＤＰＢＳで洗浄した。固定した後、０．１％のｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を３０分間処理して透過性化（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）させた後、１０％（ｗ／ｖ）の正常ヤギ血清（ｎｏｒｍａｌ  ｇｏａｔ  ｓｅｒｕｍ、ＮＧＳ）を１時間処理した。その後、１：２００に希釈したウサギの抗−ヒトベータ−カテニン抗体（ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ウサギの抗−ヒトＳｏｘ−９抗体（ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ｓｏｘ−９  ａｎｔｉｂｏｄｙ）及びウサギの抗−ヒトＣＤ４４抗体（ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ４４  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を処理して、２４時間、４℃で反応させた。２４時間反応後、ＤＰＢＳで３回洗浄し、ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙとｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙを常温で１時間処理した。その後、ＤＰＢＳで３回洗浄し、４'，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）を処理した。その後、染色した細胞を蛍光顕微鏡（ＯｌｙｍｐｕｓＩ×７１）で観察した。ＲＴ−ＰＣＲ分析のために、６ウェルプレートで培養した細胞の培養培地を除去し、ＤＰＢＳで洗浄した。ＲＮＡの抽出時、Ｈｙｂｒｉｄ−Ｒキット（Ｇｅｎｅ  Ａｌｌ）を使用し、ナノドロップ（ＭＩＣＲＯＰ  ＵＶ−Ｖｉｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ  Ｍ６００）を使用して抽出されたＲＮＡを定量した。１μｇのＲＮＡをＡｃｃｕＰｏｗｅｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｐｒｅｍｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、大田、韓国）に加え、熱循環器（Ｔ１０６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてｃＤＮＡを作った。使用したプライマーの配列は下記の表３に示す。
【表３】
0006861298.tif 000004
【００４４】
それぞれの反応にＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍｉｘ１０μｌ、０．５ｐｍのプライマー（ｓｅｎｓｅとａｎｔｉｓｅｎｓｅ）と５０ｎｍの鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）を入れた。ＲＴ−ＰＣＲは、ＲＧ６０００  ５ｐｌｅｘ  ＨＲＭ（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）機器を使用し、９５℃で１５秒、アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）温度５７℃にて４５秒で、４０サイクルを設定した。閾値サイクル（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ、Ｃｔ）の値を測定するために、相対定量（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｃｔ（２−ΔΔCt））法を使用した。
上記のように、ヒト外毛根鞘（ｏｕｔｅｒ  ｒｏｏｔ  ｓｈｅａｔｈ、ＯＲＳ）細胞を培養した後、培地を除去し、 ＤＰＢＳで洗浄した。タンパク質溶解バッファー（Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０Ｘ）：ＲｉＰＡ  ｂｕｆｆｅｒ（ｂｉｏｒａｄ−８９９０１）＆Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ（１００Ｘ）、７８４４０）を０．３−１ｍｌ入れてスクレーパーで細胞を集めた後、ｅ−ｔｕｂｅに移した。遠心分離機（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５４２７Ｒ、ｅｆｆｅｎｄｏｒｆ  １０，０００ｘｇ）を利用し、４℃、３０分間分離してタンパク質を含む上澄み液を得た。タンパク質の定量は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ試薬を用いて行った。３０μｇのタンパク質サンプルに６×ｓａｍｐｌｅ  ｄｙｅ（ＤＴＴ、ｓｉｇｍａ  ４３８１５、ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ  ｓｉｇｍａ、ＢＲＯ２２２、Ｇｌｙｃｅｒｌ、ｂｉｏｓｈｏｐ、ＧＬＹ００１）を入れて１×になるように混合し、加熱ブロック（ＨＹＳＣ_Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ_Ｈｅａｔｉｎｇ  Ｂｌｏｃｋ_２０１４）にサンプルを入れて、９５℃で１０分間加熱した。軽くスピンダウン（ｓｐｉｎ  ｄｏｗｎ）してボルテックス（Ｓｔｕａｒｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＳＡ８  ｖｏｒｔｅｘ  ｍｉｘｅｒ  ＡＣ  ｉｎｐｕｔ  ９０／２３０Ｖ、５０−６０  Ｈｚ）した後、氷に挿しておいて、ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）  Ｔｅｔｒａ  Ｈａｎｄｃａｓｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｂｉｏ−ｒａｄ）を用意した。ゲルを作るために、手動鋳造用プレート（Ｐｌａｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｈａｎｄ  Ｃａｓｔｉｎｇ）にｓｈｏｒｔ  ｇｌａｓｓとｌｏｎｇ ｇｌａｓｓを組み立て、ガラス板を７０％のエタノール（ｍｅｒｋ）と蒸留水で洗浄した後、型に入れてゲルを固める板の底にグリース（ｇｒｅａｓｅ）を塗ってゲルが漏れないようにした。最終的に、２２ｍｌの分離ゲル（ｓｅｐｅｒａｔｉｎｇ  ｇｅｌ）（３０％のアクリルアミド（３０％Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ／Ｂｉｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、１９：１  ＃１６１０１５４）６ｍｌ、ｄＨ２Ｏ ５ｍｌ、１．５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｓｉｇｍａ、Ｔ１５０３）３．７５ｍｌ、１０％のＳＤＳ（ｓｉｇｍａ、ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆｉｔｅ、Ｌ３７７１）１５０μｌ、ＴＥＭＥＤ（ＵＳＢ、７６２３０）７．５μｌ、及び１０％の過硫酸アンモニウム（ｓｉｇｍａ、２１５５８９）７５μｌを含む）を作り、ガラス板に入れた後、７０％のエタノールを入れて水平をとった。３０分ほど経過した後、ガラス板を傾けてエタノールを除去した後、分離ゲルの上に最終的に１０ｍｌのスタッキングゲル（ｓｔａｃｋｉｎｇ  ｇｅｌ）（３０％のアクリルアミド（３０％Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ／Ｂｉｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、１９：１  ＃１６１０１５４）１．３ｍｌ、ｄＨ２Ｏ  ６．１ｍｌ、１．０ＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｓｉｇｍａ、Ｔ１５０３）２．５ｍｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｓｉｇｍａ、Ｔ１５０３）１００μｌ、ＴＥＭＥＤ（ＵＳＢ、７６２３０）１０μｌ及び１０％の過硫酸アンモニウム（ｓｉｇｍａ、２１５５８９）６０μｌを含む）を作った。スタッキングゲルを入れて、１．０ｍｍのｃｏｍｂを差し込んだ後、ゲル板を泳動槽にセ���ティングした。サンプルを各ウェルにロードし、５μｌのサイズマーカー（ｌａｄｄｅｒ）（タンパク質分子量マーカー１０−２４５  ｋＤａ  ａｂ１１６０２８−Ａｂｃａｍ）も入れた。Ｍｉｎｉ  ｇｅｌを５０Ｖで２０分間反応させた後、スタッキングゲルを通る時、１００Ｖに上げながら１時間−１．５時間、電気泳動した。電気泳動が終わった後、ゲルをゲル板から分離してトランスファーバッファー（ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｂｕｆｆｅｒ）に置いておいた。一方、前記トランスファーバッファーは、グリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ、ｓｉｇｍａ）１４．４ｇ、Ｔｒｉｚｍａ  ｂａｓｅ（ｓｉｇｍａ、Ｔ１５０３）３ｇ、メタノール（ｍｅｒｋ）２００ｍＬ及びｄＨ２Ｏ  ８００ｍｌを使用して製造した。ＰＶＤＦトランスファーメンブレン（ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）（ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ｃａｔ  Ｎｏ  ＩＳＥＱ  １０１００  １０ｃｍ×１０ｃｍ  ＰＶＤＦ）をメタノールで５分間、３次Ｈ２Ｏで３分間及びトランスファーバッファーにて３分間浸して振った後、以下のような順序でカセットサンドイッチを製造した：（−）黒い板−スポンジ−３Ｍペーパー−透明板トランスファー装置（Ｂｉｏ−ｒａｄ）。前記カセットを水槽の中に入れて、撹拌機（ｓｔｉｒｒｅｒ）上で２００Ｖにて９０分間トランスファーした。トランスファー終了後、ゲルとメンブレンを染色してバンドを確認した。ポンソＳ（ｐｏｎｃｅａｕ  Ｓ）２．５ｇと酢酸５ｍｌをｄＨ２Ｏに添加して５００ｍｌになるよう、試薬液を製造した後、前記メンブレン全体を試薬液で約５分間振った後、Ｈ２Ｏで２〜３回洗浄して、バンドを確認し、ラダーサイズを表示しておいた。１０ｇの脱脂乳（ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ）（ＢＤ、２３２２１００）と２００ｍｌのＴＢＳ（Ｔｒｉｓ  １２ｇ、ＮａＣ１  ９ｇ  ｉｎ ｄＨ２Ｏ）で遮断溶液（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を作り、メンブレンをプラスチック容器に入れた後、１０ｍｌの遮断溶液で１時間インキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した。前記１０ｍｌの遮断溶液に１：１０００に希釈したＢ−カテニン１次抗体（Ａｎｔｉ−ｂｅｔａ  Ｃａｔｅｎｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ［Ｅ２４７］（ａｂ３２５７２））とＢ−アクチン１次抗体（β−Ａｃｔｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃ４））を追加した後、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚインキュベーターで４℃にて２４時間インキュベーションした。ＴＢＳＴ（Ｔｒｉｓ  １２ｇ、ＮａＣｌ  ９ｇ  ｉｎ  ｄＨ２Ｏ、１％  ｔｗｅｅｎ  ２０）を加えて、５分間ずつ３回洗浄し、１０ｍｌの遮断溶液に１：１００００に希釈したＢ−カテニン２次抗体（ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ−ＨＲＰ：ｓｃ２００４）とＢ−アクチン２次抗体（ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ−ＨＲＰ）を２時間インキュベーションした。ＴＢＳＴ（Ｔｒｉｓ  １２ｇ、ＮａＣｌ  ９ｇ  ｉｎ  ｄＨ２Ｏ、１％  ｔｗｅｅｎ  ２０）を加えて、５分間ずつ３回洗浄した後、ＥＣＬ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（テミョン・サイエンス）を加えて、５分間インキュベーションした。暗室で現像用カセット（テミョン・サイエンス、高感度スクリーン）にメンブレンを乗せ、Ｘ−ｒａｙフィルム（テミョン・サイエンス８×１０ｉｎｃｈ）を５分間程度インキュベーシ��ンし、フィルムを取り出した後、自動現像機（ＳＡＥＫＩ、Ｐ＆Ｃ、ＡＴＬ−１５００）で現像した。
【００４５】
その結果、ヒト外毛根鞘（ｏｕｔｅｒ  ｒｏｏｔ  ｓｈｅａｔｈ、ＯＲＳ）細胞の場合、加水分解されたケラチンの処理時、毛髪再生と関連して外毛根鞘細胞の移動及びクローンの活性に関わる因子であるベータカテニン（ｂｅｔａ  ｃａｔｅｎｉｎ）分子及び幹細胞性（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）に関与するＳｏｘ−９分子の発現が増加することを確認した（図１３）。また、幹細胞性（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）に関与するＳｏｘ−９遺伝子及びベータカテニン（ｂｅｔａ  ｃａｔｅｎｉｎ）遺伝子の発現が増加することを確認した（図１４）。特に、ベータカテニンは、加水分解されたケラチンの処理時、４倍以上発現することを確認した（図１５）。
【００４６】
［実験例６：実験室段階（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でヒト毛根細胞に対する加水分解されたケラチンの毛髪成長関与因子の発現誘導］
ヒト毛根（ｄｅｒｍａｌ  ｐａｐｉｌｌａ、ＤＰ）細胞を、何も処理しない６ウェルプレートに２×１０５個ずつ接種し、２４時間後にＤＰ培地又は１％（ｗ／ｖ）の加水分解されたケラチンが含まれているＤＰ培地に交換した。１日、２日、及び３日間培養した後、細胞凝集体（Ｃｅｌｌ  ａｇｇｒｅｇａｔｅ）の形成程度とアルカリ性リン酸加水分解酵素（Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）の活性程度を分析し、免疫化学的染色を通じて、ベータカテニン（ｂｅｔａ  ｃａｔｅｎｉｎ）、Ｓｏｘ−２、ＣＤ１３３、アルカリ性リン酸加水分解酵素（Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、ＦＧＦ７及びＦＧＦ１０の発現程度を測定した。
上記のように、ヒト毛根（ｄｅｒｍａｌ  ｐａｐｉｌｌａ、ＤＰ）細胞の培養中に、光学顕微鏡を用いて加水分解されたケラチンの処理時に生成する細胞凝集体（Ｃｅｌｌ  ａｇｇｒｅｇａｔｅ）の数を測定した。
また、上記のように、ヒト毛根（ｄｅｒｍａｌ  ｐａｐｉｌｌａ、ＤＰ）細胞の培養後、４％のパラホルムアルデヒドを１〜２分間処理して固定させた後、アルカリ性リン酸加水分解酵素検出キット（Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ、Ｍｅｒｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＳＣＲ００４）にあるリンスバッファー（Ｒｉｎｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ）で洗浄し、Ｎａｐｈｔｈｏｌ  ＡＳ−ＢＩ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ  Ｖｉｏｌｅｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：蒸留水（ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ）が２：１：１で混合した反応溶液を１ｍｌ添加して１５分間、暗い条件と常温で反応させた。反応後、アルカリ性リン酸細胞が発現する加水分解酵素（Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）の活性によって染色した細胞を蛍光顕微鏡（ＯｌｙｍｐｕｓＩ×７１）で観察した。
【００４７】
また、上記のように、ヒト毛根（ｄｅｒｍａｌ  ｐａｐｉｌｌａ、ＤＰ）細胞の培養後、培地を除去し、ＤＰＢＳで洗浄した。４％のパラホルムアルデヒドを１０分間処理して固定させた後、再びＤＰＢＳで洗浄した。 固定した後、０．１％のｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を３０分間処理して透過性化（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）させた後、１０％（ｗ／ｖ）の正常ヤギ血清（ｎｏｒｍａｌ  ｇｏａｔ  ｓｅｒｕｍ）を１時間処理した。その後、１：２００に希釈したウサギの抗−ヒトベータ−カテニン抗体（ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、マウスの抗−ヒトＳｏｘ−２抗体（ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ｓｏｘ−２  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、マウスの抗−ヒトＡＬＰａｓｅ抗体（ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＡＬＰａｓｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ウサギの抗−ヒトＣＤ１３３抗体（ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ１３３  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、マウスの抗−ヒトＦＧＦ−７抗体（ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＦＧＦ−７  ａｎｔｉｂｏｄｙ）及びウサギの抗−ヒトＦＧＦ−１０抗体（ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＦＧＦ−１０  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を処理して、２４時間、４℃で反応させた。２４時間反応後、ＤＰＢＳで３回洗浄し、ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙとｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙを常温で１時間処理した。その後、ＤＰＢＳで３回洗浄し、４'，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）を処理した。染色した細胞を蛍光顕微鏡（ＯｌｙｍｐｕｓＩ×７１）で観察した。
【００４８】
その結果、ヒト毛根（ｄｅｒｍａｌ  ｐａｐｉｌｌａ、ＤＰ）細胞の場合、加水分解されたケラチンの処理時、毛根細胞の毛髪再生と幹細胞性（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）に関わる細胞凝集体（ｃｅｌｌ  ａｇｇｒｅｇａｔｅ）の形成が５倍以上増加し（図１６）、アルカリ性リン酸細胞が発現する加水分解酵素の活性が増加することを確認した（図１７）。さらに、毛根細胞の毛髪再生と幹細胞性（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）因子であるベータカテニン（ｂｅｔａ  ｃａｔｅｎｉｎ）、Ｓｏｘ−２、Ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＣＤ１３３、ＦＧＦ−７及びＦＧＦ−１０分子の発現が増加することを確認した（図１８）。
上記の実験例１及び６を通じて、ケラチンは毛髪の再生に関与する幹細胞の幹細胞性を増加させ、細胞の移動及び分化を誘導して細胞凝集体を発生させることにより、毛髪の再生を効果的に誘導することができることがわかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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