(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍を治療するための医薬組成物であって、前記医薬組成物は、エポキシチグリアン（epoxytigliane）化合物またはその薬学的に許容される塩を含有し、かつ免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて使用するためのものであり、
ここで、前記エポキシチグリアン化合物は、式（Ｉ）：
【化１】
0006905075.tif 000012
｛式中、
Ｒ1は水素またはＣ1-6アルキルであり；
Ｒ2は−ＯＨまたは−ＯＲ9であり；
Ｒ3は−ＯＨまたは−ＯＲ9であり；
Ｒ4およびＲ5は独立して、水素およびＣ1-6アルキルから選択され；
Ｒ6は水素または−Ｒ10であり；
Ｒ7はヒドロキシまたは−ＯＲ10であり；
Ｒ8は水素またはＣ1-6アルキルであり；
Ｒ9は−Ｃ1-20アルキル、−Ｃ2-20アルケニル、−Ｃ2-20アルキニル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-20アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-20アルケニル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-20アルキニル、−Ｃ（Ｏ）シクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルシクロアルキル；−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルシクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルシクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルＣ（Ｏ）Ｒ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルＣ（Ｏ）Ｒ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルＣ（Ｏ）Ｒ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルＣＨ（ＯＲ11）（ＯＲ11）、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルＣＨ（ＯＲ11）（ＯＲ11）、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルＣＨ（ＯＲ11）（ＯＲ11）、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルＳＲ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルＳＲ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルＳＲ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルＣ（Ｏ）ＯＲ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルＣ（Ｏ）ＯＲ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルＣ（Ｏ）ＯＲ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルＣ（Ｏ）ＳＲ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルＣ（Ｏ）ＳＲ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルＣ（Ｏ）ＳＲ11、
【化２】
0006905075.tif 000013
であり；
Ｒ10は、−Ｃ1-6アルキル、−Ｃ2-6アルケニル、−Ｃ2-6アルキニル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-6アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-6アルケニル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-6アルキニル、−Ｃ（Ｏ）アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-6アルキルアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-6アルケニルアリール、または−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-6アルキニルアリールであり；および
Ｒ11は、水素、−Ｃ1-10アルキル、−Ｃ2-10アルケニル、−Ｃ2-10アルキニル、シクロアルキルまたはアリールであり；
ここで、各アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキルまたはアリール基は、任意に置換されている｝
の化合物、あるいは、その幾何異性体もしくは立体異性体、または薬学的に許容される塩であり、
ここで、前記免疫チェックポイント阻害剤は、抗プログラム細胞死（ＰＤ−１）抗体または抗細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）抗体である、
医薬組成物。
【請求項２】
対象の１もしくは複数のバイスタンダー腫瘍（bystander tumours）を治療または予防するための医薬組成物であって、エポキシチグリアン化合物またはその薬学的に許容される塩を含有し、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて使用するための医薬組成物であり、ここで、該エポキシチグリアン化合物が、該１もしくは複数のバイスタンダー腫瘍以外の腫瘍に対して局所的に投与され、
ここで、前記エポキシチグリアン化合物は、式（Ｉ）：
【化３】
0006905075.tif 000014
｛式中、
Ｒ1は水素またはＣ1-6アルキルであり；
Ｒ2は−ＯＨまたは−ＯＲ9であり；
Ｒ3は−ＯＨまたは−ＯＲ9であり；
Ｒ4およびＲ5は独立して、水素およびＣ1-6アルキルから選択され；
Ｒ6は水素または−Ｒ10であり；
Ｒ7はヒドロキシまたは−ＯＲ10であり；
Ｒ8は水素またはＣ1-6アルキルであり；
Ｒ9は−Ｃ1-20アルキル、−Ｃ2-20アルケニル、−Ｃ2-20アルキニル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-20アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-20アルケニル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-20アルキニル、−Ｃ（Ｏ）シクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルシクロアルキル；−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルシクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルシクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルＣ（Ｏ）Ｒ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルＣ（Ｏ）Ｒ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルＣ（Ｏ）Ｒ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルＣＨ（ＯＲ11）（ＯＲ11）、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルＣＨ（ＯＲ11）（ＯＲ11）、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルＣＨ（ＯＲ11）（ＯＲ11）、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルＳＲ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルＳＲ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルＳＲ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルＣ（Ｏ）ＯＲ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルＣ（Ｏ）ＯＲ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルＣ（Ｏ）ＯＲ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルＣ（Ｏ）ＳＲ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルＣ（Ｏ）ＳＲ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルＣ（Ｏ）ＳＲ11、
【化４】
0006905075.tif 000015
であり；
Ｒ10は、−Ｃ1-6アルキル、−Ｃ2-6アルケニル、−Ｃ2-6アルキニル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-6アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-6アルケニル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-6アルキニル、−Ｃ（Ｏ）アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-6アルキルアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-6アルケニルアリール、または−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-6アルキニルアリールであり；および
Ｒ11は、水素、−Ｃ1-10アルキル、−Ｃ2-10アルケニル、−Ｃ2-10アルキニル、シクロアルキルまたはアリールであり；
ここで、各アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキルまたはアリール基は、任意に置換されている｝
の化合物、あるいは、その幾何異性体もしくは立体異性体、または薬学的に許容される塩であり、
ここで、前記免疫チェックポイント阻害剤は、抗プログラム細胞死（ＰＤ−１）抗体または抗細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）抗体である、
医薬組成物。
【請求項３】
前記エポキシチグリアン化合物が、腫瘍に対して局所的に投与される、請求項１または請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記エポキシチグリアン化合物が、腫瘍内注射によって投与される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、全身的に投与される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、非経口注射によって投与される、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記Ｒ1が、−ＣＨ3である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記Ｒ2およびＲ3が、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ1-20アルキル、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-20アルケニル、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-20アルキニル、−ＯＣ（Ｏ）シクロアルキル、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルシクロアルキル；−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルシクロアルキル、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルシクロアルキル、−ＯＣ（Ｏ）アリール、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルアリール、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルアリール、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルアリール、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルＣ（Ｏ）Ｒ11、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルＣ（Ｏ）Ｒ11、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルＣ（Ｏ）Ｒ11、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルＣＨ（ＯＲ11）（ＯＲ11）、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルＣＨ（ＯＲ11）（ＯＲ11）、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルＣＨ（ＯＲ11）（ＯＲ11）、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルＳＲ11、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルＳＲ11、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルＳＲ11、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルＣ（Ｏ）ＯＲ11、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルＣ（Ｏ）ＯＲ11、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルＣ（Ｏ）ＯＲ11、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルＣ（Ｏ）ＳＲ11、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルＣ（Ｏ）ＳＲ11およびＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルＣ（Ｏ）ＳＲ11から独立して選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記Ｒ2およびＲ3が、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ1-20アルキル、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-20アルケニル、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-20アルキニル、−ＯＣ（Ｏ）シクロアルキル、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルシクロアルキル；−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルシクロアルキル、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルシクロアルキルおよび−ＯＣ（Ｏ）アリールから独立して選択される、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記Ｒ2およびＲ3が、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ1-20アルキル、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-20アルケニルおよびＯＣ（Ｏ）Ｃ2-20アルキニルから独立して選択される、請求項８または請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記Ｒ4およびＲ5が、Ｈおよび−ＣＨ3からそれぞれ独立して選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記Ｒ6が、水素、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-6アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-6アルケニル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-6アルキニルまたは−Ｃ（Ｏ）アリールである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記Ｒ7が、ヒドロキシル、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ1-6アルキル、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-6アルケニルまたは−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-6アルキニルである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記Ｒ8が、Ｈまたは−ＣＨ3である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記式（Ｉ）の化合物が、式（ＩＩ）
【化５】
0006905075.tif 000016
｛式中、Ｒ6、Ｒ7およびＲ9は、請求項１に記載のとおりである｝
の化合物、あるいは、その幾何異性体もしくは立体異性体、または薬学的に許容される塩である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記式（ＩＩ）のエポキシチグリアン化合物が、以下の化合物：
１２−チグロイル−１３−（２−メチルブタノイル）−６，７−エポキシ−４，５，９，１２，１３，２０−ヘキサヒドロキシ−１−チグリエン−３−オン；
１２，１３−ジ−（２−メチルブタノイル）−６，７−エポキシ−４，５，９，１２，１３，２０−ヘキサヒドロキシ−１−チグリエン−３−オン；
１２−ヘキサノイル−１３−（２−メチルブタノイル）−６，７−エポキシ−４，５，９，１２，１３，２０−ヘキサヒドロキシ−１−チグリエン−３−オン；
１２，１３−ジヘキサノイル−６，７−エポキシ−４，５，９，１２，１３，２０−ヘキサヒドロキシ−１−チグリエン−３−オン；
１２−ミリストイル−１３−（２−メチルブタノイル）−６，７−エポキシ−４，５，９，１２，１３，２０−ヘキサヒドロキシ−１−チグリエン−３−オン；
１２−チグロイル−１３−（２−メチルブタノイル）−６，７−エポキシ−４，５、９、１２，１３−ペンタヒドロキシ−２０−アセチルオキシ−１−チグリエン−３−オン；
１２−ミリストイル−１３−アセチルオキシ−６，７−エポキシ−４，５，９，１２，１３，２０−ヘキサヒドロキシ−１−チグリエン−３−オン；
１２−プロパノイル−１３−（２−メチルブタノイル）−６，７−エポキシ−４，５，９，１２，１３，２０−ヘキサヒドロキシ−１−チグリエン−３−オン；
１２，１３−ジチグロイル−６，７−エポキシ−４，５，９，１２，１３，２０−ヘキサヒドロキシ−１−チグリエン−３−オン；および
１２−（２−メチルブタノイル）−１３−チグロイル−６，７−エポキシ−４，５，９，１２，１３，２０−ヘキサヒドロキシ−１−チグリエン−３−オン、
または、その薬学的に許容される塩から選択される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、複数回投与で投与される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記複数回投与が、エポキシチグリアン化合物の投与の前に、それと同時に、および／またはそれに続いて投与される、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記免疫チェックポイント阻害剤の初回投与が、エポキシチグリアン化合物の投与前に投与される、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記免疫チェックポイント阻害剤の用量が、エポキシチグリアン化合物と同時に投与される、請求項１８または１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記免疫チェックポイント阻害剤の１もしくは複数の用量が、エポキシチグリアン化合物の投与に続いて投与される、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
腫瘍を治療するための医薬組成物であって、前記医薬組成物は、エポキシチグリアン化合物またはその薬学的に許容される塩、および免疫チェックポイント阻害剤、ならびに任意により医薬的に許容し得る担体を含有し、
ここで、前記エポキシチグリアン化合物は、式（Ｉ）：
【化６】
0006905075.tif 000017
｛式中、
Ｒ1は水素またはＣ1-6アルキルであり；
Ｒ2は−ＯＨまたは−ＯＲ9であり；
Ｒ3は−ＯＨまたは−ＯＲ9であり；
Ｒ4およびＲ5は独立して、水素およびＣ1-6アルキルから選択され；
Ｒ6は水素または−Ｒ10であり；
Ｒ7はヒドロキシまたは−ＯＲ10であり；
Ｒ8は水素またはＣ1-6アルキルであり；
Ｒ9は−Ｃ1-20アルキル、−Ｃ2-20アルケニル、−Ｃ2-20アルキニル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-20アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-20アルケニル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-20アルキニル、−Ｃ（Ｏ）シクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルシクロアルキル；−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルシクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルシクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルＣ（Ｏ）Ｒ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルＣ（Ｏ）Ｒ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルＣ（Ｏ）Ｒ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルＣＨ（ＯＲ11）（ＯＲ11）、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルＣＨ（ＯＲ11）（ＯＲ11）、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルＣＨ（ＯＲ11）（ＯＲ11）、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルＳＲ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルＳＲ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルＳＲ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルＣ（Ｏ）ＯＲ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルＣ（Ｏ）ＯＲ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルＣ（Ｏ）ＯＲ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルＣ（Ｏ）ＳＲ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルＣ（Ｏ）ＳＲ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルＣ（Ｏ）ＳＲ11、
【化７】
0006905075.tif 000018
であり；
Ｒ10は、−Ｃ1-6アルキル、−Ｃ2-6アルケニル、−Ｃ2-6アルキニル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-6アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-6アルケニル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-6アルキニル、−Ｃ（Ｏ）アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-6アルキルアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-6アルケニルアリール、または−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-6アルキニルアリールであり；および
Ｒ11は、水素、−Ｃ1-10アルキル、−Ｃ2-10アルケニル、−Ｃ2-10アルキニル、シクロアルキルまたはアリールであり；
ここで、各アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキルまたはアリール基は、任意に置換されている｝
の化合物、あるいは、その幾何異性体もしくは立体異性体、または薬学的に許容される塩であり、
ここで、前記免疫チェックポイント阻害剤は、抗プログラム細胞死（ＰＤ−１）抗体または抗細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）抗体である、
医薬組成物。
【請求項２３】
腫瘍を治療するためのキットであって、前記キットは、エポキシチグリアン化合物を含有する組成物と、免疫チェックポイント阻害剤を含有する組成物とを含み、
ここで、前記エポキシチグリアン化合物は、式（Ｉ）：
【化８】
0006905075.tif 000019
｛式中、
Ｒ1は水素またはＣ1-6アルキルであり；
Ｒ2は−ＯＨまたは−ＯＲ9であり；
Ｒ3は−ＯＨまたは−ＯＲ9であり；
Ｒ4およびＲ5は独立して、水素およびＣ1-6アルキルから選択され；
Ｒ6は水素または−Ｒ10であり；
Ｒ7はヒドロキシまたは−ＯＲ10であり；
Ｒ8は水素またはＣ1-6アルキルであり；
Ｒ9は−Ｃ1-20アルキル、−Ｃ2-20アルケニル、−Ｃ2-20アルキニル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-20アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-20アルケニル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-20アルキニル、−Ｃ（Ｏ）シクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルシクロアルキル；−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルシクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルシクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルＣ（Ｏ）Ｒ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルＣ（Ｏ）Ｒ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルＣ（Ｏ）Ｒ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルＣＨ（ＯＲ11）（ＯＲ11）、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルＣＨ（ＯＲ11）（ＯＲ11）、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルＣＨ（ＯＲ11）（ＯＲ11）、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルＳＲ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルＳＲ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルＳＲ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルＣ（Ｏ）ＯＲ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルＣ（Ｏ）ＯＲ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルＣ（Ｏ）ＯＲ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルＣ（Ｏ）ＳＲ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルＣ（Ｏ）ＳＲ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルＣ（Ｏ）ＳＲ11、
【化９】
0006905075.tif 000020
であり；
Ｒ10は、−Ｃ1-6アルキル、−Ｃ2-6アルケニル、−Ｃ2-6アルキニル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-6アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-6アルケニル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-6アルキニル、−Ｃ（Ｏ）アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-6アルキルアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-6アルケニルアリール、または−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-6アルキニルアリールであり；および
Ｒ11は、水素、−Ｃ1-10アルキル、−Ｃ2-10アルケニル、−Ｃ2-10アルキニル、シクロアルキルまたはアリールであり；
ここで、各アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキルまたはアリール基は、任意に置換されている｝
の化合物、あるいは、その幾何異性体もしくは立体異性体、または薬学的に許容される塩であり、
ここで、前記免疫チェックポイント阻害剤は、抗プログラム細胞死（ＰＤ−１）抗体または抗細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）抗体である、
キット。
【請求項２４】
エポキシチグリアン化合物の１もしくは複数の用量と、免疫チェックポイント阻害剤の１もしくは複数の用量とを含む、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
局所投与向けに製剤化された、エポキシチグリアン化合物の１もしくは複数の用量と、注射による投与向けに製剤化された、免疫チェックポイント阻害剤の１もしくは複数の用量とを含む、請求項２３または２４に記載のキット。
【請求項２６】
腫瘍内注射向けに製剤化された、エポキシチグリアン化合物の１つの用量と、注射による投与向けに製剤化された、免疫チェックポイント阻害剤の１もしくは複数の用量とを含む、請求項２３または２４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、エポキシチグリアン（epoxytigliane）化合物および免疫チェックポイント阻害剤の投与を含む、腫瘍に対する併用療法に関する。エポキシチグリアン化合物および免疫チェックポイント阻害剤を含有する医薬組成物およびキットもまた記載する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
エポキシチグリエノン化合物は、強力な抗腫瘍活性を有する。腫瘍内に投与されると、エポキシチグリエノンは、腫瘍血管系を直接乱すことによって、腫瘍塊の急激な出血性壊死を引き起こす（Boyle et al. 2014）。これまで、エポキシチグリエノン化合物の局限された投与が、バイスタンダーまたはより遠くの腫瘍に対する全身作用を有している証拠が存在しなかったので、腫瘍内送達されたエポキシチグリエノン化合物は、主として治療部位で作用すると考えられている。結果として、各腫瘍は、個別に治療されなければならない。
【０００３】
癌を治療するための免疫療法は、外来診療所で幅広い支持を得ている。特に、免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）は、進行性転移性黒色腫、非小細胞肺癌、腎臓癌、膀胱癌、ホジキンリンパ腫を含めたさまざまな悪性腫瘍において有望さを実証した。ＩＣＩは、腫瘍細胞が宿主免疫システム、特に腫瘍抗原に対して特異的であるＴ細胞を回避するか、抑制するかまたは抵抗することを可能にするタンパク質の作用を妨げる分子（典型的にはモノクローナル抗体）である。現在の承認されているＴ細胞チェックポイント阻害剤は、明らかに別個の作用機序によって抗腫瘍免疫応答を高める。例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）遮断は、免疫応答のプライミング相の間のＴ細胞活性化を主に高めるのに対して、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）遮断は、枯渇しているが、別の方法で活性化したエフェクターＴ細胞集団を放出し、調節されたＴ（Ｔｒｅｇ）細胞機能を低減するように見える。
【０００４】
ＩＣＩが進行性癌患者において顕著かつ長期間の応答を引き出し得る一方で、これらの陽性応答は、全患者集団のうちのわずかな割合に限られる（Hu-Lieskovan et al. 2017）。その結果、ＩＣＩと、宿主免疫反応を刺激する可能性がある他の治療法（例えば、放射線療法、化学療法、腫瘍溶解性ウイルス、癌ワクチン）とを組み合わせるアプローチが、癌の免疫療法に対する内因性および獲得耐性を克服するため、およびより幅広い範囲の患者に対して臨床的成功を潜在的に延長するために、魅力的かつ臨床的に実現可能なアプローチを提供する（Smyth et al. 2015）。
【０００５】
斯かるアプローチの１つは、（１）全体的な腫瘍の負担を低減することによって、（２）腫瘍壊死中に、新生抗原を晒すことによって抗腫瘍応答を高めることによって、および／または（３）腫瘍ストロマ細胞に直接作用することによって、免疫応答を調節し得る（全身にまたは腫瘍内に送達される）小分子化学療法剤と、ＩＣＩを組み合わせることである（Adams et al. 2015; Mahoney et al. 2015; O’Brien et al. 2014）。
【０００６】
本発明では、いくつかのエポキシチグリエン−３−オン化合物が、免疫チェックポイント遮断と共に相乗的に動作し得る免疫応答を刺激して、治療される腫瘍だけではなく、治療されるべき対象に存在し得る他の腫瘍の治療法を提供し得るという発見について、少なくともある程度、予測される。
【発明の概要】
【０００７】
一態様において、本発明は、対象の少なくとも１つの腫瘍を治療する方法であって、対象に、エポキシチグリアン化合物またはその薬学的に許容される塩、および免疫チェックポイント阻害剤を投与することを含む、方法に関する。
【０００８】
本発明の別の態様において、対象のバイスタンダー腫瘍（bystander tumours）を治療または予防する方法であって、それを必要とする対象に、エポキシチグリアン化合物またはその薬学的に許容される塩、および免疫チェックポイント阻害剤を投与すること含む、方法が提供され、ここで、該エポキシチグリアン化合物は、バイスタンダー腫瘍以外の腫瘍に対して局所的に投与される。
【０００９】
本発明の他の側面において、腫瘍を治療するための薬剤の製造におけるエポキシチグリアン化合物またはその薬学的に許容される塩、および免疫チェックポイント阻害剤の使用が提供される。
【００１０】
本発明の更に別の態様において、腫瘍を治療するための薬剤の製造におけるエポキシチグリアン化合物またはその薬学的に許容される塩の使用が提供され、ここで、該薬剤は、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせた投与のためのものである。
【００１１】
本発明の更なる態様において、腫瘍を治療するための薬剤の製造における免疫チェックポイント阻害剤の使用が提供され、ここで、該薬剤は、エポキシチグリアン化合物またはその薬学的に許容される塩と組み合わせた投与のためのものである。
【００１２】
本発明の他の側面において、バイスタンダー腫瘍を治療または予防するための薬剤の製造におけるエポキシチグリアン化合物またはその薬学的に許容される塩、および免疫チェックポイント阻害剤の使用が提供される。
【００１３】
本発明のより一層更なる態様において、バイスタンダー腫瘍を治療または予防するための薬剤の製造におけるエポキシチグリアン化合物またはその薬学的に許容される塩の使用が提供され、ここで、該薬剤は、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせた投与のためのものである。
【００１４】
本発明の別の態様において、バイスタンダー腫瘍を治療または予防するための薬剤の製造における免疫チェックポイント阻害剤の使用が提供され、ここで、該薬剤は、エポキシチグリアン化合物またはその薬学的に許容される塩と組み合わせた投与のためのものである。
【００１５】
本発明の更に別の態様において、腫瘍を治療するため、あるいはバイスタンダー腫瘍を治療または予防するための、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせた、エポキシチグリアン化合物またはその薬学的に許容される塩が提供される。
【００１６】
本発明の別の態様において、任意に１もしくは複数の医薬的に許容し得る担体と一緒に、エポキシチグリアン化合物またはその薬学的に許容される塩、および免疫チェックポイント阻害剤を含有する医薬組成物が提供される。
【００１７】
本発明の更なる態様において、エポキシチグリアン化合物またはその薬学的に許容される塩、および免疫チェックポイント阻害剤を含むキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】図１は以下のものを提供する。Ａ：ビヒクル（Ｖｅｈｃ．）または５００ｎＭの化合物１（Ｃｏｍｐ１）、化合物３（Ｃｏｍｐ３）およびＰＭＡでの治療後のＰＫＣ−α、−βＩＩ、−γ、−δおよび−θ移動の画像。これらの画像はまた、Ｂに示された定量化にも使用された。
【図１Ｂ】Ｂ：５００、５０および５ｎＭの化合物１、ならびに示した類似体に対応したＰＫＣアイソフォームの移動プロファイル（−α、−βＩ、−βＩＩ、−γ、−δ、−θ、−ηおよび−ζ−原形質膜へのＥＧＦＰの移動を示す細胞の平均％）を示すヒートマップ。生物学的反復毎に＞１５０個の細胞数であった。ｎ＝３。
【図２Ａ】図２は以下のものを提供する。Ａ：実験計画の図解。
【図２Ｂ】Ｂ：白血球動員の際に役割を有する選択宿主サイトカイン／ケモカインは、化合物１処理（３０μｇ）によって誘導される。示したサイトカイン／ケモカインの遺伝子発現の倍率変化が示される。
【図２Ｃ】Ｃ：ヒートマップは、ｔ＝８時間におけるビヒクルと化合物１の遺伝子発現様式の両方からの強度データの比較後に作り出された。続く遺伝子リストが、Ingenuity Pathway Analysis（IPA; Qiagen）によって分析されて、化合物１処理によって影響を受ける経路を同定した。
【図３Ａ】図３は以下のものを提供する。Ａ：化合物１で処理された癌細胞株からのＬＤＨ放出。Ａ４３１、ＭＭ６４９およびＢ１６−ＯＶＡを、示した濃度の化合物１またはビヒクル（Ｖｅｈｃ．）のみで処理し、そして、放出されたＬＤＨを、Pierce ＬＤＨ細胞毒性アッセイキットを使用して経時的にアッセイする。ｎ＝３。
【図３Ｂ】Ｂ．化合物１は、細胞内ＡＴＰレベルの有意な低減を引き起こす。その一方、細胞を、化合物１またはビヒクル（Ｖｅｈｃ．）で処理し、そして、細胞内ＡＴＰレベルを、示した時点でCellTiter-Glo2（登録商標）アッセイキットを使用してアッセイした、ｎ＝３。
【図４Ａ】図４は以下のものを提供する。Ａ．化合物１での処理に対応した癌細胞株からのＡＴＰ放出の測定。細胞を、化合物１またはビヒクル（Ｖｅｈｃ．）で処理し、そして、細胞培養上清からのＡＴＰ放出を、ＡＴＰアッセイキットに基づく生物発光（bioluminecsence）を使用してアッセイした。平均ＲＬＵ値＋／−Ｓ．Ｄ．を決定し、時間に対してプロットした。ｎ＝４。
【図４Ｂ】Ｂ．追加のエポキシチグリアン類似体（化合物２：Ｂｉ、化合物３：Ｂｉｉ、および化合物４：Ｂｉｉｉ）もまた、Ａ４３１、ＭＭ６４９およびＢ１６−ＯＶＡ細胞株からＡＴＰ放出を促進する。ｎ＝４。
【図４Ｃ】Ｃ．化合物１とエポキシチグリアン類似体で処理された癌細胞株からのＨＭＧＢ１放出の測定。エポキシチグリアンまたはビヒクル（Ｖｅｈｃ．）処理されたＡ４３１（Ｃｉ）、ＭＭ６４９（Ｃｉｉ）またはＢ１６−ＯＶＡ（Ｃｉｉｉ）からの細胞培養上清を、ＥＬＩＳＡによってＨＭＧＢ１放出について分析した。化合物１処理細胞からの値を、ビヒクル処理細胞に対して正規化して、ＨＭＧＢ１放出の増加倍数を決定した。Ａ４３１とＭＭ６４９についてｎ＝２、Ｂ１６−ＯＶＡについてｎ＝３。（Ｃｉｖ）ＨＭＧＢ１放出もまた、化合物２、３および４での処理に反応して生じた。ｎ＝３。
【図４Ｄ】Ｄ．化合物１は、さまざまな癌細胞株におけるカルレチクリンの細胞外化を促進する。Ａ４３１（Ｄｉ）、ＭＭ６４９（Ｄｉｉ）およびＢ１６−ＯＶＡ（Ｄｉｉｉ）を、示した時間の間だけ化合物１またはビヒクル（Ｖｅｈｃ．）で処理し、次に、フローサイトメトリー前に抗カルレチクリン／抗ウサギＡｌｅｘａ４８８で染色した。平均蛍光強度値（Ｅｘ：４８８ｎｍ、Ｅｍ：５３０／５３０ｎｍ）＋／−Ｓ．Ｄ．を各時点について示す。
【図５Ａ】図５は以下のものを提供する。ＡおよびＢ．エポキシチグリアン処理細胞を、インビトロにおいてＣＤ１１ｃ+ＢＭＤＣによって加工する。化合物１またはビヒクル（Ｖｅｈｃ．）で処理されたＣＭＦＤＡ標識Ｂ１６−ＯＶＡ細胞を、未成熟なＢＭＤＣと共に４時間インキュベートし、次に、フローサイトメトリー前に抗ＣＤ１１ｃ−ＡＰＣで染色した。灰色の実線の箱−ＣＤ１１ｃ+ＢＭＤＣ細胞。黒色の破線の箱−死滅したＢ１６−ＯＶＡ細胞片を取り込んだＣＤ１１ｃ+ＢＭＤＣ（ＣＤ１１ｃ+ＣＭＦＤＡmid）。ＣＤ１１ｃ+ＣＭＦＤＡmid細胞のパーセンテージを図５Ａに示し、そして４回の生物学的反復からのデータを図５Ｂに示す。ｎ＝４。
【図５Ｂ】図５は以下のものを提供する。ＡおよびＢ．エポキシチグリアン処理細胞を、インビトロにおいてＣＤ１１ｃ+ＢＭＤＣによって加工する。化合物１またはビヒクル（Ｖｅｈｃ．）で処理されたＣＭＦＤＡ標識Ｂ１６−ＯＶＡ細胞を、未成熟なＢＭＤＣと共に４時間インキュベートし、次に、フローサイトメトリー前に抗ＣＤ１１ｃ−ＡＰＣで染色した。灰色の実線の箱−ＣＤ１１ｃ+ＢＭＤＣ細胞。黒色の破線の箱−死滅したＢ１６−ＯＶＡ細胞片を取り込んだＣＤ１１ｃ+ＢＭＤＣ（ＣＤ１１ｃ+ＣＭＦＤＡmid）。ＣＤ１１ｃ+ＣＭＦＤＡmid細胞のパーセンテージを図５Ａに示し、そして４回の生物学的反復からのデータを図５Ｂに示す。ｎ＝４。
【図５Ｃ】Ｃ．エポキシチグリアン類似体もまた、ＣＤ１１ｃ+ＢＭＤＣによるＢ１６−ＯＶＡ細胞の取り込みを引き起こす。化合物２、３および４の使用から得られたデータを示す。ｎ＝３。
【図６Ａ】図６は以下のものを提供する。Ａ：化合物１とＩＣＩの組み合わせに対する実験的アプローチの図解。すべての腫瘍に、１５／３０μｇの化合物１またはビヒクル（Ｖｅｈｃ．）のいずれかを注射した。ＩＣＩ処理の投薬計画もまた示す。
【図６Ｂ】ＢおよびＣ．抗ＰＤ−１（図６Ｂ）または抗ＣＴＬＡ−４（図６Ｃ）のいずれかと共に、ＩＣＩの異なった処理条件下でサイズが１００ｍｍ3未満を維持する、処理腫瘍の％を示すカプラン−マイヤープロット。組み合わせに対応したマウス生存率もまた示す。
【図６Ｃ】ＢおよびＣ．抗ＰＤ−１（図６Ｂ）または抗ＣＴＬＡ−４（図６Ｃ）のいずれかと共に、ＩＣＩの異なった処理条件下でサイズが１００ｍｍ3未満を維持する、処理腫瘍の％を示すカプラン−マイヤープロット。組み合わせに対応したマウス生存率もまた示す。
【図７Ａ】図７は以下のものを提供する。Ａ：併用療法アプローチの概略図：指数およびバイスタンダー腫瘍を、投薬計画と一緒に示す。および
【図７Ｂ】Ｂ：併用療法の結果（腫瘍体積）のグラフ表示。処理（白丸）およびバイスタンダー（黒丸）腫瘍におけるアイソタイプ抗体＋化合物１（点線）、抗ＰＤ−１抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体＋ビヒクル（破線）および抗ＰＤ−１抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体＋化合物１（実線）。
【図８】図８は、ｗｔおよびＧＣＳＦノックアウトバックグラウンドの両方において準最適用量の化合物１（１５μｇ）を注射した腫瘍（％腫瘍＜１００ｍｍ3）の体積（左パネル）およびカプラン−マイヤー（右パネル）ベースの分析の両方を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
発明の詳細な説明
定義
特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書中に記載されたものと同様または同等のいかなる方法および材料も本発明の実施または試験に用いることができるが、好ましい方法および材料を記載する。本発明の目的のために、以下の用語を下記に定義する。
【００２０】
冠詞「１つの（a）」および「１つの（an）」は、冠詞の文法上の目的語の１つまたは２つ以上（即ち、少なくとも１つ）を指すために本明細書において使用される。例として、「１つの要素（an element）」は、１つの要素または２つ以上の要素を意味する。
【００２１】
本明細書において使用される場合、用語「約」は、参照の数量、レベル、値、寸法、サイズ、または量に対して３０％、２５％、２０％、１５％または１０％ほど異なる、数量、レベル、値、寸法、サイズ、または量を指す。
【００２２】
本明細書全体にわたって、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単語「含む（comprise）」、「含む（comprises）」および「含むこと（comprising）」は、記載される工程もしくは要素または工程もしくは要素のグループの包含を意味するが、任意の他の工程もしくは要素または工程もしくは要素のグループの排除を意味しないように理解される。
【００２３】
用語「アルキル」は、１〜２０個の炭素原子を有する、置換されていてもよい直鎖および分岐鎖の炭化水素基を指す。適切な場合には、アルキル基は、指定された数の炭素原子を有し得る；例えば、直鎖または分岐鎖の配置で１、２、３、４、５または６個の炭素原子を有するアルキル基を含む、−Ｃ1−Ｃ6アルキルである。アルキル基の非限定的な例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓ−およびｔ−ブチル、ペンチル、２−メチルブチル、３−メチルブチル、ヘキシル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、２−エチルブチル、３−エチルブチル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシルおよびペンタデシルが挙げられる。
【００２４】
用語「アルケニル」は、２〜２０個の炭素原子を有しかつ少なくとも１つの二重結合を有する、置換されていてもよい不飽和直鎖または分岐鎖の炭化水素を指す。適切な場合には、アルケニル基は、指定された数の炭素原子を有し得る；例えば、直鎖または分岐鎖の配置で２、３、４、５または６個の炭素原子を有するアルケニル基を含む、Ｃ2−Ｃ6アルケニルである。アルケニル基の非限定的な例としては、エテニル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニル、ｓ−およびｔ−ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプタ−１，３−ジエン、ヘキサ−１，３−ジエン、ノナ−１，３，５−トリエンなどが挙げられる。
【００２５】
用語「アルキニル」は、２〜２０個の炭素原子を有し、少なくとも１つの三重結合を有する、置換されていてもよい不飽和直鎖または分岐鎖の炭化水素を指す。適切な場合には、アルキニル基は、指定された数の炭素原子を有し得る；例えば、直鎖または分岐鎖の配置で２、３、４、５または６個の炭素原子を有するアルキニル基を含む、Ｃ2−Ｃ6アルキニルである。非限定的な例としては、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニルおよびヘキシニルが挙げられる。
【００２６】
用語「シクロアルキル」および「炭素環式」は、置換されていてもよい飽和または不飽和の単環、二環または三環の炭化水素基を指す。適切な場合には、シクロアルキル基は、指定された数の炭素原子を有し得、例えば、Ｃ3−Ｃ6シクロアルキルは、３、４、５または６個の炭素原子を有する炭素環式基である。非限定的な例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニルなどが挙げられ得る。
【００２７】
「アリール」は、各環に最大７個の原子を有し、少なくとも１個の環は芳香族である、Ｃ6−Ｃ14員の単環、二環または三環の炭素環系を意味する。アリール基の例は、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニルおよびビフェニルを含むが、これらに限定されるものではない。アリールは、１〜３個のベンゼン環を含んでよい。２個またはそれよりも多い芳香環が存在する場合、これらの環は共に縮合し、隣接環は共通の結合を共有することができる。
【００２８】
アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキルおよびアリールは各々、個々の実体かまたはより大きな実体の部分としてかに関係なく、以下からなる群より選択される１つまたは複数の任意の置換基で置換されていてもよい：Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニル、Ｃ3-6シクロアルキル、オキソ（＝Ｏ）、−ＯＨ、−ＳＨ、Ｃ1-6アルキルＯ−、Ｃ2-6アルケニルＯ−、Ｃ3-6シクロアルキルＯ−、Ｃ1-6アルキルＳ−、Ｃ2-6アルケニルＳ−、Ｃ3-6シクロアルキルＳ−、−ＣＯ2Ｈ、−ＣＯ2Ｃ1-6アルキル、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1-6アルキル）、−Ｎ（Ｃ1-6アルキル）2、−ＮＨ（フェニル）、−Ｎ（フェニル）2、−ＣＮ、−ＮＯ2、−ハロゲン、−ＣＦ3、−ＯＣＦ3、−ＳＣＦ3、−ＣＨＦ2、−ＯＣＨＦ2、−ＳＣＨＦ2、−フェニル、−Ｃ1-6アルキルフェニル、−Ｏフェニル、−Ｃ（Ｏ）フェニル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-6アルキル。好適な置換基の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ビニル、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、メチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、イソプロピルチオ、ブチルチオ、ヒドロキシ、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピル、ヒドロキシブチル、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、シアノ、ニトロ、−ＣＯ2Ｈ、−ＣＯ2ＣＨ3、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ3、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、トリフルオロメチルチオ、ジフルオロメチル、ジフルオロメトキシ、ジフルオロメチルチオ、モルホリノ、アミノ、メチルアミノ、ジメチルアミノ、フェニル、フェノキシ、フェニルカルボニル、ベンジルおよびアセチルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
エポキシチグリアン化合物は、薬学的に許容される塩の形態であってもよい。しかし、非薬学的に許容される塩も本発明の範囲内に入ることが認識され、何故ならば、これらは、薬学的に許容される塩の調製における中間体として有用であり得るか、または貯蔵もしくは輸送の間有用であり得るためである。好適な薬学的に許容される塩としては、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、炭酸、ホウ酸、スルファミン酸および臭化水素酸などの、薬学的に許容される無機酸の塩、または、酢酸、プロピオン酸、酪酸、酒石酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フマル酸、マレイン酸、クエン酸、乳酸、粘液酸、グルコン酸、安息香酸、コハク酸、シュウ酸、フェニル酢酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸（benezenesulphonic acid）、サリチル酸（salicyclic acid）、スルファニル酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、エデト酸、ステアリン酸、パルミチン酸、オレイン酸、ラウリン酸、パントテン酸、タンニン酸、アスコルビン酸、および吉草酸などの、薬学的に許容される有機酸の塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
塩基塩としては、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウムおよびアルキルアンモニウムなどの、薬学的に許容される陽イオンを用いて形成されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
塩基性窒素含有基は、メチル、エチル、プロピルおよびブチルの塩化物、臭化物およびヨウ化物のような低級アルキルハロゲン化物；ジメチルおよびジエチル硫酸のようなジアルキル硫酸などのような、薬剤を用いて四級化され得る。
【００３２】
エポキシチグリアン化合物は、不斉中心を有してよく、従って２つ以上の立体異性型で存在することが可能であることも認識される。従って、本発明は、１つまたは複数の不斉中心において実質的に純粋な異性体型、例えば、約９０％よりも大きいｅｅ、例えば約９５％もしくは９７％ｅｅ、または９９％よりも大きいｅｅの化合物、更にはそれらのラセミ混合物を含む混合物にも関する。このような異性体は、天然の供給源からの単離により、例えばキラル中間体を使用する不斉合成により、またはキラル分割により得ることができる。本発明の化合物は、幾何異性体として存在してもよい。本発明は、実質的に純粋なシス（Ｚ）もしくはトランス（Ｅ）型の化合物、またはそれらの混合物にも関する。
【００３３】
本発明の化合物は、植物もしくは植物部分からの単離、または単離された化合物の誘導体化、または関連する化合物の誘導体化によって得てもよい。単離手順および誘導化手順は、ＷＯ２００７／０７０９８５およびＷＯ２０１４／１６９３５６で見つけてもよい。
【００３４】
用語「エポキシチグリアン化合物」は、以下の基本の炭素環式構造を有する化合物を指す：
【化１】
0006905075.tif 000002
【００３５】
化合物は、６員環へ付加された縮合シクロプロパン環を有するトリシクロ［９．３．０．０］テトラデカン系を有する。エポキシドが、６，７位において７員環へ縮合されている。
【００３６】
エポキシチグリアン化合物の一例が、エポキシチグリエン−３−オン化合物である。用語「エポキシチグリエン−３−オン化合物」は、５員環が１，２−エン−３−オン構造を有する、上記に定義されるエポキシチグリアン構造を有する化合物を指す：
【化２】
0006905075.tif 000003
【００３７】
本明細書中で使用される場合、用語「バイスタンダー腫瘍（bystander tumour）」は、エポキシチグリアン化合物によって治療される腫瘍以外の腫瘍を指す。バイスタンダー腫瘍は、原発腫瘍または転移腫瘍であってもよい。
【００３８】
用語「と組み合わせて」は、本明細書中で使用される場合、単一の組成物で、または同時にもしくは連続して別々に投与されるエポキシチグリアン化合物とＩＣＩを指す。エポキシチグリアン化合物とＩＣＩは、様々な時間および様々な頻度で投与されてもよいが、組み合わせ状態で、それらは、同時期または重複した時期に生物学的効果を発揮する。例えば、ＩＣＩは、エポキシチグリアン化合物が投与されたとき、それが免疫応答に対して効果があるように投与される。
【００３９】
治療の方法
本発明は、バイスタンダー腫瘍を含めた腫瘍を治療する方法に関し、該方法は、免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）と組み合わせた、エポキシチグリアン化合物またはその薬学的に許容される塩の投与を含む。本発明はまた、ＩＣＩと組み合わせたエポキシチグリアン化合物またはその薬学的に許容される塩の投与を含む、バイスタンダー腫瘍を予防する方法にも関する。
【００４０】
いくつかの実施形態において、治療される腫瘍は、エポキシチグリアン化合物が直接該腫瘍に向けて局限された方法で送達され得る腫瘍である。特定の実施形態において、腫瘍は、皮膚腫瘍もしくは皮下腫瘍、または体外から接触可能な腫瘍、例えば、触診可能な腫瘍である。他の実施形態において、腫瘍は、内部腫瘍である。いくつかの実施形態において、腫瘍が内部で見つかった腫瘍である場合、局限された送達は、腫瘍が露出し、かつ、エポキシチグリアン化合物を注射できる外科手術中に達成される。他の実施形態において、腫瘍が内部で見つかり、そして、エポキシチグリアン化合物は、映像技術によって誘導される、例えば、超音波内視鏡によってまたは定位画像化によって誘導された注射によって送達される。
【００４１】
いくつかの実施形態において、エポキシチグリアン化合物は、全身的に１もしくは複数の腫瘍に送達される。
【００４２】
いくつかの実施形態において、腫瘍は良性腫瘍である。他の実施形態において、腫瘍は悪性腫瘍である。いくつかの実施形態において、腫瘍は原発腫瘍であり、そして、他の実施形態において、腫瘍は転移腫瘍である。皮膚腫瘍の例としては、脂漏性角化症、光線性角化症、基底細胞癌（basal cell carcinoma）（ＢＣＣ）（結節性ＢＣＣ、表在性ＢＣＣ、浸潤性ＢＣＣおよび小結節性ＢＣＣを含む）、扁平上皮癌、（ｉｎ−ｓｉｔｕ扁平上皮癌および侵襲性扁平上皮癌を含む）、黒色腫（表在性拡大型黒色腫、結節性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端性黒子性黒色腫（acral lentginous melanoma）、および線維形成性／神経向性黒色腫（neutropic melanoma）を含む）、皮膚Ｂ細胞リンパ腫、ならびに皮膚Ｔ細胞リンパ腫が挙げられる。
【００４３】
皮下腫瘍の例としては、被角血管腫、化膿性肉芽腫（pyogenic granuloma）、老人性血管腫（cherry angioma）、グロームス腫瘍、血管肉腫、カポジ肉腫（karposi sarcoma）、ユーイング肉腫、悪性線維性組織球腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、滑膜肉腫、間質性肉腫、胃腸の間質性肉腫、悪性末梢神経鞘腫瘍、原発神経外胚葉性腫瘍、神経線維腫、メルケル細胞癌、皮膚線維芽細胞、線維肉腫、類上皮肉腫、および肥満細胞腫（マスト細胞腫瘍）が挙げられる。
【００４４】
内部腫瘍は、外科手術中に注射することによって、もしくは誘導された注射によって接触可能ないずれかの腫瘍、または全身的に投与されたエポキシチグリアンで治療され得る腫瘍であってもよく、そして、脳、肺、結腸、類表皮、扁平上皮細胞、膀胱、胃、膵臓、乳房、頭部、頚部、腎臓系、腎臓、肝臓、卵巣、前立腺、子宮、食道、精巣、子宮頚部、膣、甲状腺または皮膚の腫瘍を含んでもよい。
【００４５】
バイスタンダー腫瘍は、エポキシチグリアン化合物によって治療される腫瘍以外のいずれの腫瘍であってもよい。例えば、バイスタンダー腫瘍は、二次性の皮膚もしくは皮下腫瘍であってもよく、またはそれは、別の臓器もしくは組織における腫瘍であってもよい。バイスタンダー腫瘍の例としては、脳、肺、結腸、類表皮、扁平上皮細胞、膀胱、胃、膵臓、乳房、頭部、頚部、腎臓系、腎臓、肝臓、卵巣、前立腺、子宮、食道、精巣、子宮頚部、膣、甲状腺または皮膚の腫瘍が挙げられる。
【００４６】
いくつかの実施形態において、バイスタンダー腫瘍は、追加の原発腫瘍であり、そして、他の実施形態において、バイスタンダー腫瘍は、転移腫瘍である。
【００４７】
いくつかの実施形態において、エポキシチグリアン化合物によって治療される腫瘍は、原発腫瘍であり、かつ、バイスタンダー腫瘍は、転移腫瘍である。いくつかの実施形態において、エポキシチグリアン化合物によって治療される腫瘍は、転移腫瘍であり、かつ、バイスタンダー腫瘍は、原発腫瘍である。いくつかの実施形態において、エポキシチグリアン化合物によって治療される腫瘍とバイスタンダー腫瘍の両方が原発腫瘍である。いくつかの実施形態において、エポキシチグリアン化合物によって治療される腫瘍とバイスタンダー腫瘍の両方が転移腫瘍である。
【００４８】
いくつかの実施形態において、併用療法は、バイスタンダー腫瘍が発生するのを予防するか、またはバイスタンダー腫瘍の発生を遅らせる。いくつかの実施形態において、併用療法は、バイスタンダー腫瘍のサイズを低減する。
【００４９】
エポキシチグリアン化合物
いくつかの実施形態において、エポキシチグリアン化合物は、６，７−エポキシチグリアン化合物である。いくつかの実施形態において、エポキシチグリアン化合物は、エポキシチグリ−１，２−エン−３−オン化合物である。いくつかの実施形態において、エポキシチグリアン化合物は、６，７−エポキシチグリ−１，２−エン−３−オン化合物である。
【００５０】
いくつかの実施形態において、エポキシチグリアン化合物は、式（Ｉ）の化合物、あるいは、その幾何異性体もしくは立体異性体、または薬学的に許容される塩である：
【化３】
0006905075.tif 000004
｛式中、
Ｒ1は水素またはＣ1-6アルキルであり；
Ｒ2は−ＯＨまたは−ＯＲ9であり；
Ｒ3は−ＯＨまたは−ＯＲ9であり；
Ｒ4およびＲ5は独立して、水素およびＣ1-6アルキルから選択され；
Ｒ6は水素または−Ｒ10であり；
Ｒ7はヒドロキシまたは−ＯＲ10であり；
Ｒ8は水素またはＣ1-6アルキルであり；
【００５１】
Ｒ9は−Ｃ1-20アルキル、−Ｃ2-20アルケニル、−Ｃ2-20アルキニル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-20アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-20アルケニル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-20アルキニル、−Ｃ（Ｏ）シクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルシクロアルキル；−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルシクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルシクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルＣ（Ｏ）Ｒ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルＣ（Ｏ）Ｒ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルＣ（Ｏ）Ｒ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルＣＨ（ＯＲ11）（ＯＲ11）、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルＣＨ（ＯＲ11）（ＯＲ11）、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルＣＨ（ＯＲ11）（ＯＲ11）、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルＳＲ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルＳＲ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルＳＲ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルＣ（Ｏ）ＯＲ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルＣ（Ｏ）ＯＲ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルＣ（Ｏ）ＯＲ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルＣ（Ｏ）ＳＲ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルＣ（Ｏ）ＳＲ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルＣ（Ｏ）ＳＲ11、
【００５２】
【化４】
0006905075.tif 000005
であり；
【００５３】
Ｒ10は、−Ｃ1-6アルキル、−Ｃ2-6アルケニル、−Ｃ2-6アルキニル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-6アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-6アルケニル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-6アルキニル、−Ｃ（Ｏ）アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-6アルキルアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-6アルケニルアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-6アルキニルアリールであり；および
【００５４】
Ｒ11は、水素、−Ｃ1-10アルキル、−Ｃ2-10アルケニル、−Ｃ2-10アルキニル、シクロアルキルまたはアリールであり；
ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキルまたはアリール基はそれぞれ、任意に置換されている｝。
【００５５】
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）のエポキシチグリアン化合物は、式（ＩＩ）の化合物、あるいは、その幾何異性体もしくは立体異性体、または薬学的に許容される塩である：
【化５】
0006905075.tif 000006
｛ここで、Ｒ6、Ｒ7およびＲ9は、式（Ｉ）について規定されるとおりである｝。
【００５６】
式（Ｉ）または（ＩＩ）の特定の実施形態において、次のうちの１もしくは複数が適用される：
Ｒ1は−Ｃ1-3アルキル、特に−ＣＨ3である；
【００５７】
Ｒ2は、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ1-20アルキル、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-20アルケニル、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-20アルキニル、−ＯＣ（Ｏ）シクロアルキル、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルシクロアルキル；−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルシクロアルキル、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルシクロアルキル、−ＯＣ（Ｏ）アリール、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルアリール、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルアリール、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルアリール、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルＣ（Ｏ）Ｒ11、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルＣ（Ｏ）Ｒ11、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルＣ（Ｏ）Ｒ11、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルＣＨ（ＯＲ11）（ＯＲ11）、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルＣＨ（ＯＲ11）（ＯＲ11）、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルＣＨ（ＯＲ11）（ＯＲ11）、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルＳＲ11、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルＳＲ11、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルＳＲ11、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルＣ（Ｏ）ＯＲ11、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルＣ（Ｏ）ＯＲ11、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルＣ（Ｏ）ＯＲ11、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルＣ（Ｏ）ＳＲ11、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルＣ（Ｏ）ＳＲ11またはＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルＣ（Ｏ）ＳＲ11；特に、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ1-20アルキル、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-20アルケニル、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-20アルキニル、−ＯＣ（Ｏ）シクロアルキル、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルシクロアルキル；−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルシクロアルキル、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルシクロアルキルまたは−ＯＣ（Ｏ）アリール；より特に、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ1-20アルキル、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-20アルケニルまたはＯＣ（Ｏ）Ｃ2-20アルキニルである；
【００５８】
Ｒ3は、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ1-20アルキル、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-20アルケニル、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-20アルキニル、−ＯＣ（Ｏ）シクロアルキル、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルシクロアルキル；−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルシクロアルキル、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルシクロアルキル、−ＯＣ（Ｏ）アリール、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルアリール、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルアリール、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルアリール、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルＣ（Ｏ）Ｒ11、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルＣ（Ｏ）Ｒ11、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルＣ（Ｏ）Ｒ11、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルＣＨ（ＯＲ11）（ＯＲ11）、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルＣＨ（ＯＲ11）（ＯＲ11）、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルＣＨ（ＯＲ11）（ＯＲ11）、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルＳＲ11、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルＳＲ11、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルＳＲ11、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルＣ（Ｏ）ＯＲ11、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルＣ（Ｏ）ＯＲ11、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルＣ（Ｏ）ＯＲ11、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルＣ（Ｏ）ＳＲ11、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルＣ（Ｏ）ＳＲ11またはＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルＣ（Ｏ）ＳＲ11；特に、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ1-20アルキル、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-20アルケニル、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-20アルキニル、−ＯＣ（Ｏ）シクロアルキル、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ1-10アルキルシクロアルキル；−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルケニルシクロアルキル、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-10アルキニルシクロアルキルまたは−ＯＣ（Ｏ）アリール；より特に、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ1-20アルキル、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-20アルケニルまたはＯＣ（Ｏ）Ｃ2-20アルキニルである；
【００５９】
Ｒ4およびＲ5は、−Ｃ1-3アルキルから独立して選択され、特に−ＣＨ3である；
Ｒ6は、水素、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-6アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-6アルケニル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-6アルキニルまたは−Ｃ（Ｏ）アリールであり；特に、水素、−Ｃ（Ｏ）Ｃ1-3アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-3アルケニルまたは−Ｃ（Ｏ）Ｃ2-3アルキニルであり、より特に、水素または−Ｃ（Ｏ）ＣＨ3である；
【００６０】
Ｒ7は、ヒドロキシル、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ1-6アルキル、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-6アルケニルまたは−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-6アルキニル、特に、ヒドロキシル、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ1-3アルキル、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-3アルケニルまたは−ＯＣ（Ｏ）Ｃ2-3アルキニルであり、より特に、ヒドロキシルまたは−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ3である；
Ｒ8は、−Ｃ1-3アルキル、特に−ＣＨ3である。
【００６１】
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）および／または（ＩＩ）の化合物は、以下の式（ＩＩＩ）で示されているような立体化学を有する：
【化６】
0006905075.tif 000007
【００６２】
いくつかの実施形態において、６，７位のエポキシドは、環系の面の上方に存在する。他の実施形態において、６，７位のエポキシドは、環系の面の下方に存在する。いくつかの実施形態において、１２位のＲ2基はＳであり、そして、他の実施形態において、１２位のＲ2基はＲである。
【００６３】
特定の実施形態において、エポキシチグリアン化合物は、以下から選択される：
１２−チグロイル−１３−（２−メチルブタノイル）−６，７−エポキシ−４，５，９，１２，１３，２０−ヘキサヒドロキシ−１−チグリエン−３−オン（化合物１）；
１２，１３−ジ−（２−メチルブタノイル）−６，７−エポキシ−４，５，９，１２，１３，２０−ヘキサヒドロキシ−１−チグリエン−３−オン（化合物２）；
１２−ヘキサノイル−１３−（２−メチルブタノイル）−６，７−エポキシ−４，５，９，１２，１３，２０−ヘキサヒドロキシ−１−チグリエン−３−オン（化合物３）；
１２，１３−ジヘキサノイル−６，７−エポキシ−４，５，９，１２，１３，２０−ヘキサヒドロキシ−１−チグリエン−３−オン（化合物４）；
【００６４】
１２−ミリストイル−１３−（２−メチルブタノイル）−６，７−エポキシ−４，５，９，１２，１３，２０−ヘキサヒドロキシ−１−チグリエン−３−オン（化合物５）；
１２−チグロイル−１３−（２−メチルブタノイル）−６，７−エポキシ−４，５、９、１２，１３−ペンタヒドロキシ−２０−アセチルオキシ−１−チグリエン−３−オン（化合物６）；
１２−ミリストイル−１３−アセチルオキシ−６，７−エポキシ−４，５，９，１２，１３，２０−ヘキサヒドロキシ−１−チグリエン−３−オン（化合物７）；
１２−プロパノイル−１３−（２−メチルブタノイル）−６，７−エポキシ−４，５，９，１２，１３，２０−ヘキサヒドロキシ−１−チグリエン−３−オン（化合物８）；
１２，１３−ジチグロイル−６，７−エポキシ−４，５，９，１２，１３，２０−ヘキサヒドロキシ−１−チグリエン−３−オン（化合物９）；および
１２−（２−メチルブタノイル）−１３−チグロイル−６，７−エポキシ−４，５，９，１２，１３，２０−ヘキサヒドロキシ−１−チグリエン−３−オン（化合物１０）。
【００６５】
免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）
ＩＣＩは、特に、免疫細胞がＴ細胞またはナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）である場合、免疫細胞における免疫応答を妨げる、免疫細胞または癌細胞タンパク質を阻害するいずれかの分子であってもよい。免疫細胞および腫瘍細胞タンパク質の例としては、腫瘍細胞のＰＤ−Ｌ１に結合して、その腫瘍細胞に対するＴ細胞の免疫応答を妨げる、Ｔ細胞上のプログラム細胞死１（ＰＤ−１）および癌細胞上のＢ７−１／Ｂ７−２タンパク質に結合して、その腫瘍細胞に対するＴ細胞の免疫応答を妨げる、Ｔ細胞上の細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）のタンパク質が挙げられる。そのため、ＩＣＩとしては、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１／ＰＤＬ２またはＣＴＬＡ−４とＢ７−１／Ｂ７−２に結合するか、またはそれらの相互作用を妨げる分子が挙げられる。免疫細胞の免疫応答を妨げる、それらの作用を妨げ得る他の免疫細胞タンパク質としては、アデノシンＡ２Ａ受容体、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ３）、ＩＧおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有−３（ＴＩＭ−３）、ＣＤ９６およびＴ細胞活性化のＶドメイン免疫グロブリン抑制因子（ＶＩＳＴＡ）が挙げられる。
【００６６】
ＩＣＩの例としては、これだけに限定されるものではないが、ＰＤ−１の拮抗薬、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−１／Ｂ７−２タンパク質、アデノシンＡ２Ａ受容体、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ−３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６およびＶＩＳＴＡ、特に、ＰＤ−１の拮抗薬、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４またはＢ７−１／Ｂ７−２タンパク質、より特にＰＤ−１の拮抗薬またはＣＴＬＡ−４が挙げられる。特定の実施形態において、拮抗薬は、免疫チェックポイントタンパク質に対する抗体、例えば、抗ＰＤ−１抗体または抗抗ＣＴＬＡ−４抗体である。他の実施形態において、特定の拮抗薬は、ＩＤＯの拮抗薬である。
【００６７】
組成物
エポキシチグリアン化合物またはその薬学的に許容される塩およびＩＣＩを未希釈で投与してもよいが、それぞれ、薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤と合わせた１もしくは複数の医薬組成物の形態でエポキシチグリアン化合物およびＩＣＩを投与することが、より好都合であり得る。
【００６８】
薬学的用途および組成物のための剤形および投薬率は、当業者により容易に決定される。
【００６９】
特定の実施形態において、エポキシチグリアン化合物は、治療される腫瘍へのまたは腫瘍中への直接投与のために製剤化される。いくつかの実施形態において、エポキシチグリアン化合物は、治療される腫瘍に直接適用され得るゲル、軟膏、ローション、クリームまたは経皮パッチの形態で局所投与のために製剤化される。他の実施形態において、エポキシチグリアン化合物は、注射、特に、該化合物が腫瘍中の１もしくは複数の場所に注射される腫瘍内注射のために製剤化される。
【００７０】
ＩＣＩは、分子を全身または局所に送達できる任意の手段で投与されてもよい。特定の実施形態において、ＩＣＩが抗体であるとき、分子は、好都合なことに、注射、例えば、静脈内、関節内、筋肉内、皮内、皮下または腹腔内注射によって送達される。ＩＣＩはまた、例えば、腫瘍内に、注射による局所送達のために製剤化されてもよい。医薬的に許容し得る担体および全身的または局所的投与のために許容される担体もまた、ＩＣＩの組成物に組み込まれてもよい。
【００７１】
いくつかの実施形態において、エポキシチグリアン化合物とＩＣＩは、同時または連続して、別々に送達される。他の実施形態において、エポキシチグリアン化合物とＩＣＩは、単一の組成物、例えば、腫瘍内送達に好適な単一の組成物または全身送達のために製剤化された単一の組成物で送達される。
【００７２】
本発明の別の態様において、任意に１もしくは複数の医薬的に許容し得る担体と一緒に、エポキシチグリアン化合物またはその薬学的に許容される塩および免疫チェックポイント阻害剤を含む医薬組成物が提供される。
【００７３】
好適には、（単数もしくは複数の）医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤または許容される賦形剤を含有する。「薬学的に許容される賦形剤」とは、安全に使用することができる、固形または液体の充填剤、希釈剤または封入物質を意味する。特定の投与経路に応じて、当技術分野において周知の様々な担体を使用してよい。これらの担体または賦形剤は、糖類、デンプン、セルロースおよびその誘導体、シクロデキストリン、麦芽、ゼラチンまたは他のゲル化剤、ポリマー、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、アルコールおよび／またはポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝液、乳化剤、等張生理食塩水、およびパイロジェンフリー水を含む群から選択されてよい。
【００７４】
液体形態の調製物は、液剤、懸濁剤、および乳剤、例えば水または水−プロピレングリコール溶液を含む。例えば、非経口注射用液体調製物は、緩衝液を伴うかまたは伴わない、水性１，２−プロパンジオール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、γシクロデキストリンもしくは２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンの水溶液、食塩水溶液またはポリエチレングリコール溶液中の液剤として製剤化することができる。好ましいｐＨ範囲は３．０〜４．５である。好適な緩衝液は調製物をｐＨ３．５〜４．５に緩衝し、これには酢酸緩衝液およびクエン酸緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７５】
従って、エポキシチグリアン化合物および／またはＩＣＩの組成物は、非経口的投与（例えば、ボーラス注射または連続注入などの注射による）のために製剤化されてよく、ならびに、アンプル、事前充填式シリンジ、小容量の輸液の単位剤形で、または保存剤が添加された複数回投与用容器で提供されてよい。これらの組成物は、油性または水性ビヒクル内の、懸濁剤、液剤、ゲル剤または乳剤などの形をとってよく、ならびに懸濁化剤、安定剤および／または分散剤などの製剤化剤（formulatory agent）を含んでよい。あるいは活性成分は、使用前の例えば滅菌されたパイロジェンフリー水などの好適なビヒクルによる構成のために、滅菌固形物の無菌的単離によるか、または溶液の凍結乾燥により得られた粉末形態であることができる。
【００７６】
投与に適したエポキシチグリアン化合物および／またはＩＣＩの医薬組成物は、本発明の薬学的活性化合物または抽出物を１種または複数種、予め決定された量で各々含有する注射器、バイアル、チューブまたはサシェのような個別の単位で、散剤もしくは顆粒剤として、または水性液体、シクロデキストリン溶液、非水性液体、水中油型エマルションもしくは油中水型エマルション中の液剤もしくは懸濁剤として、またはクリーム剤もしくはゲル剤中の液剤もしくは懸濁剤として、または、シリカもしくはポリラクチドマイクロ粒子もしくはナノ粒子を含むがこれらに限定されない、エポキシチグリアン化合物を組み込んでいるマイクロ粒子もしくはナノ粒子の懸濁剤として、提供されてよい。このような組成物は、任意の調剤法により調製されてよいが、全ての方法は、１種または複数種の本発明の薬学的活性化合物を、１種または複数種の必要な成分を構成する担体と会合させる工程を含む。一般に、これらの組成物は、本発明の作用物質を、液体担体もしくは微粉化された固形担体または両方と、均質かつ密に混合し、次に必要ならば所望の形状に製品を造形することにより、調製される。
【００７７】
表皮または他の器官への局所投与については、本発明の化合物は、ゲル剤、軟膏、乳剤、パスタ剤、クリーム剤もしくはローション剤として、または経皮貼付剤として製剤化されてもよい。ゲル剤は、好適な増粘剤を使用し、それらを化合物の水性／アルコール性組成物へ添加することによって、調製され得る。好適な増粘剤またはゲル化剤、例えば、ポリビニルカルボキシポリマー、Ｃａｒｂｏｍｅｒ ９４０は、当技術分野において公知である。軟膏およびクリーム剤は、好適な増粘剤および／またはゲル化剤の添加に加え、例えば水性または油性基剤と共に製剤化されてよい。ローション剤は、水性または油性基剤と共に製剤化されてよく、ならびに乳化剤、安定化剤、分散剤、懸濁化剤、増粘剤または着色剤の１種または複数種も通常含む。
【００７８】
局所投与に適した製剤はまた、浴溶液もしくは浸漬溶液またはスプレーの形態で局所投与され得るか、または包帯材中に吸収され得る液剤または懸濁剤を含む。
【００７９】
ＩＣＩが小分子であるとき、薬局の技術分野で知られている、経口、局所、直腸、非経口、舌下、頬側、静脈内、関節内、筋肉内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹腔内、脳室内、経皮などを含めた任意の好適な手段によって、それが送達されてもよい。
【００８０】
用法用量
いくつかの実施形態において、エポキシチグリアン化合物は、ＩＣＩと同じ組成物で送達される。しかしながら、特定の実施形態において、ＩＣＩは、エポキシチグリアン化合物とは別個の組成物で投与される。
【００８１】
いくつかの実施形態において、エポキシチグリアン化合物は、例えば、局所投与または腫瘍内注射によって腫瘍に直接投与される。
【００８２】
いくつかの実施形態において、エポキシチグリアン化合物は、腫瘍に一度投与される。他の実施形態において、治療される腫瘍は、観察され、そして、腫瘍が治療に対して十分に応答していない場合、エポキシチグリアン化合物の更なる投与が必要とされ得る。腫瘍が局所的に治療される実施形態において、エポキシチグリアン化合物は、一定期間にわたり何度も、例えば、１週間にわたり毎日、または４〜１０週間にわたり週一度、投与され得る。治療される対象を観察している当業者は、適切な投与計画を決定することができ、そしてそれは、治療に対する応答によって変動し得る。
【００８３】
いくつかの実施形態において、ＩＣＩは、エポキシチグリアン化合物の前に、またはそれと同時にもしくは連続して、少なくとも一度投与される。特定の実施形態において、ＩＣＩの複数回投与は、エポキシチグリアン化合物の投与前またはそれと一緒に始まり、その後、エポキシチグリアン化合物の投与後まで継続する期間にわたって投与される。
【００８４】
いくつかの実施形態において、ＩＣＩは、複数回、かつ、エポキシチグリアン化合物の投与前後に定期的に投与される。特定の実施形態において、ＩＣＩは、エポキシチグリアン化合物の投与前に投与され、エポキシチグリアン化合物の投与に連続してまたはそれと同時に投与され、およびエポキシチグリアン化合物の投与に続いて少なくとも一度投与される。例えば、ＩＣＩは、エポキシチグリアン化合物の投与の１週間から１日前、特に、エポキシチグリアン化合物の投与の１〜３日前、より特に、約２日前に投与されてもよく、その後、ＩＣＩは、エポキシチグリアン化合物の投与直前または直後のいずれかに、エポキシチグリアン化合物と連続してまたはそれと同時に投与され、その後、ＩＣＩは、エポキシチグリアン化合物の投与後の翌月にわたり１回もしくは複数回、例えば、１週間に１度、５日毎に１度、４日毎に１度、３日毎に１度、２日毎に１度または１日毎に１度、特に１〜３日毎、より特に、２日毎に投与される。それに続くＩＣＩの投与は、１〜１０の用量、特に１〜８の用量、１〜６の用量、１〜４の用量、１〜３の用量または１〜２の用量のＩＣＩが、エポキシチグリアン化合物の投与後に投与されるように、継続してもよい。
【００８５】
特定の実施形態において、ＩＣＩは、エポキシチグリアン化合物の投与２日前、エポキシチグリアン化合物（直前または直後）に続いて、その後、エポキシチグリアン化合物の投与に続いて６日間にわたり２日毎に投与される。
【００８６】
エポキシチグリアン化合物は、有効量で投与される。「有効量」は、少なくとも部分的に所望の反応を得るために、例えば、全体で、腫瘍のサイズを低減するためにまたは総合的に腫瘍を破壊するために必要な量を意味する。この量は、治療される個体の健康および身体状態、治療される個体の分類群、組成物の製剤、腫瘍のサイズ、医学的状況の評価、ならびに他の関連する因子に応じて変化する。量は、慣例的な試験によって決定することができる比較的広い範囲内に収まることが予想される。有効量は、例えば、約０．１ｎｇ／ｋｇ体重〜１ｇ／ｋｇ体重／投薬の範囲であり得る。投薬量は、好ましくは、１μｇ〜０．５ｇ／ｋｇ体重／投薬の範囲内であり、例えば、０．１μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／投薬の範囲内である。一実施形態において、投薬量が腫瘍内に投与される場合、投薬量は、５０ｎｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内にあり、例えば、０．１ｍｇ〜５ｍｇ／ｋｇ体重、０．１〜１ｍｇ／ｋｇ体重、例えば０．２５ｍｇ／ｋｇ体重などである。別の実施形態において、投薬量は、１投薬量あたり０．００１ｍｇ〜２０ｍｇ、例えば、１投薬量あたり０．００５ｍｇ〜１５ｍｇ、特に１投薬量あたり０．０５〜１０ｍｇ、より特に１投薬量あたり約０．１〜約５ｍｇの範囲内にある。投薬計画は、最適な治療反応を提供するように調整され得る。例えば、いくつかの実施形態において、投与が腫瘍内である場合、エポキシチグリアン化合物は一度投与され、そして、治療の経過が観察される。いくつかの実施形態において、腫瘍が完全に解消しない場合、または腫瘍が再発する場合、第２の用量が投与され得る。いくつかの実施形態において、投与が局部的である場合、局所化合物製剤が、ゲル、クリーム、軟膏またはローションの形態で、腫瘍部位に直接投与され得る。治療の頻度は、腫瘍、そのサイズ、治療される対象などに依存する。いくつかの実施形態において、局所製剤は、腫瘍が解消されるまで、毎週適用されてもよい。他の実施形態において、治療は、単回の治療であり、そして、第二の治療は、腫瘍が完全に解消されない場合にだけ投与され得る。
【００８７】
ＩＣＩはまた、有効量で投与されてもよい。また一方、有効であると考えられるＩＣＩの量は、治療される対象、彼らの健康および全身状態、存在するバイスタンダー腫瘍の数、組成物の製剤、および医療状況の評価に依存する。ＩＣＩの量が、結構広範な量の範囲内にあることが予想される。有効量は、約０．１ｎｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ体重、１００μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内にあり得る。別の実施形態において、実際の投薬量は、１μｇ〜１ｇ、例えば、１用量あたり１００μｇ〜７５０ｍｇの範囲内にあり得る。
【００８８】
併用療法で治療され得る対象は、哺乳類、鳥類、例えば魚類などの水生動物、または爬虫類である。いくつかの実施形態において、対象は、ヒト、例えばマウス、ラットまたはウサギなどの実験動物、例えばイヌまたはネコなどのコンパニオンアニマル、例えばウマやロバなどの作業動物、例えば雌ウシ、雄ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、シカ、ラマ、アルパカなどの家畜動物、あるいは、例えばライオン、ヒョウ、チータ、ゾウ、シマウマ、カモシカ、キリン、コアラ、カンガルーを含めた動物園またはサファリパーク内の動物などの飼育下にある野生動物、および、例えばワニ、トカゲなどの爬虫類、例えばセキセイインコまたはカナリア、コカトゥー、インコ、コンゴウインコ、オウムなど鳥類、特に飼育下にある鳥類、あるいは、例えば熱帯魚（ゼブラフィッシュ、グッピー、シャムトウギョ、カクレクマノミ、カージナルテトラなど）、イルカ、クジラなどの魚類、特に飼育下にある魚類である。特定の実施形態において、対象は、ヒトまたはコンパニオンアニマルである。
【００８９】
キット
エポキシチグリアン化合物とＩＣＩの組成物は、別々に製剤化され、そして、キットまたはパッケージの状態で一緒に販売されてもよい。各キットは、腫瘍の治療を達成し、かつ、１もしくは複数のバイスタンダー腫瘍を治療または予防するためのそれぞれの化合物の投薬量を含み得る。
【００９０】
いくつかの実施形態において、エポキシチグリアン組成物は、例えばゲル、ローション、クリームまたは軟膏などの状態で、局所投与のために製剤化されるか、または包帯材に含浸される。他の実施形態において、エポキシチグリアン化合物は、例えば腫瘍内注射などの注射向けに製剤化される。この実施形態において、エポキシチグリアン製剤は、シリンジ内への取り込みのために準備された液体として、または注射前に担体中に可溶化され得る粉末または固形製剤としてキット内に存在しても、あるいは、プレフィルドシリンジの状態でキット内に存在してもよい。
【００９１】
各キットは、エポキシチグリアン化合物の１もしくは複数の用量を含んでもよい。一実施形態において、キットは、腫瘍内注射に好適な製剤の状態で単回投与のエポキシチグリアン化合物を含む。別の実施形態において、キットは、腫瘍への適用のための複数回投与を含むエポキシチグリアン化合物の局所製剤を含む。
【００９２】
いくつかの実施形態において、ＩＣＩは、単回のボーラス投与量または複数回投与形態の非経口投与のために製剤化される。例えば、キットは、シリンジ内への取り込みのために準備されたバイアル内の液体として、またはシリンジ内への取り込み前の溶解のために準備された固形物としてプレフィルドシリンジ内にＩＣＩを含有してもよい。液体または固形製剤は、単回投与製剤であっても、または複数回投与製剤であってもよい。あるいは、キットは、シリンジ内への取り込みのために準備されたバイアル内の液体として、または溶解のために準備され、そして、シリンジ内に取り込まれる固形物として、充填済みシリンジ内にそれぞれ別々に製剤化された複数回投与のＩＣＩを含有してもよい。
【００９３】
キットは、必要であれば、各用量をどのように調製するか、各投薬量をどのように投与するか、および各投薬量をいつ投与するかを含めた、それぞれの製剤の使用説明書を伴った挿入物をさらに含んでもよい。
【実施例】
【００９４】
本発明の化合物は、植物もしくは植物部分からの単離、または単離された化合物の誘導体化、または関連する化合物の誘導体化によって得てもよい。単離手順および誘導化手順は、ＷＯ２００７／０７０９８５およびＷＯ２０１４／１６９３５６で見つけてもよい。
【００９５】
化合物６である、化合物１の２０アセチル誘導体は、ジクロロメタン中のトリエチルアミンの存在下で無水酢酸（１当量）を用いたアセチル化によって化合物１から作製され得る。これらの条件は、第二のヒドロキシル基のアセチル化なしにＣ−２０ヒドロキシ基の選択アセチル化を可能にする。
【００９６】
化合物１０は、ＷＯ２０１４／１６９３５６では特異的に合成されないが、ＷＯ２０１４／１６９３５６、６４〜７０頁の実施例１に提示された非対称性エステルを得るための一般的方法を使用して調製され得る。
【００９７】
実施例１：エポキシチグリアン類似体はＰＫＣアイソフォームを活性化する
プロテインキナーゼＣは、セリン／トレオニン残基にて基質が特異的にリン酸化されるシグナル伝達経路にかかわる主要酵素のファミリーである。ＰＫＣによるリン酸化は、例えば、増殖および遺伝子発現調節などのさまざまな細胞事象の調整において重要である。ＰＫＣアイソフォーム（−θ、−η、−α、−β、−δ、−ε）は、免疫細胞応答において直接関係し、そして、主要な免疫遺伝子の発現もまた促進され得る。しかしながら、これらのＰＫＣアイソフォームのそれぞれの発現様式およびレベルは、細胞型および状況に特異的である（Lim et al. 2015; Anel et al. 2012; Pfeifhofer et al. 2006）。
【００９８】
エポキシチグリアン化合物の特定のＰＫＣアイソフォーム活性化プロフィール（特異性および効力）を同定するために、ＨｅＬａ細胞を、Boyle et al. 2014に記載の方法に従ってLipofectamine2000（Invitrogen）を使用して、いろいろなＰＫＣ−ＥＧＦＰベクター（ＰＫＣ−α、ＰＫＣ−βＩ、ＰＫＣ−βＩＩ、ＰＫＣ−γ、ＰＫＣ−δ、ＰＫＣ−θ、ＰＫＣ−η、ＰＫＣ−ζ−社内で作製）を用いて一時的にトランスフェクトした。０．１６μｇのＰＫＣ−ＥＧＦＰおよび０．４８μＬのLipofectamineに相当する体積を、２５μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Invitrogen）と混合し、そして、ＲＴにて５分間インキュベートした。溶液を組み合わせ、そして、ＲＴにてもう２０分間インキュベートした（１：３比のＤＮＡ：Lipofectamine2000）。複合体（５０μｌ）を各ウェルに加え、そして３７℃にて３時間のインキュベーション後に、別の５０μｌのＲＰＭＩ−１６４０、１０％のＦＣＳを、１ウェルあたり１００μｌの全容積まで加えた。３７℃にて２４時間のインキュベーション後に、細胞を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、そして、５００、５０および５ｎＭのエポキシチグリアンで処理した。３つの化合物を、９６ウェルプレート毎に試験できた。５枚の９６ウェルプレートが、実験の実施毎に必要であった。１時間の処理後に、細胞を、１００μｌのＰＢＳで二度洗浄し、そして、ＰＢＳ中の５０μｌの２％ホルムアルデヒド／０．２％のグルタルアルデヒド（gluteraldehyde）で１０分間、固定した。固定化細胞を、それに続いて、１００μｌのＰＢＳで二度洗浄した。核を染色するために、Hoechst 3342を１：１００００希釈にて使用した。暗所内での７分間のインキュベーション後に、Hoechstを取り除き、そしてＰＢＳで細胞を洗浄した。最後に、細胞に、１００μｌのＰＢＳを重ね、そして、画像化まで４℃にて暗所内で保存した。画像化を、GE InCell Analyzer2000を使用して実施した。原形質膜または他の細胞内位置へのＰＫＣの移動を、Adobe Photoshop CS6を使用して手作業でカウントした。
【００９９】
エポキシチグリアン化合物である化合物１、化合物３ならびにＰＭＡ（フォルボール−１２−ミリステートー１３−アセテート）の存在下での細胞膜への選択したＰＫＣアイソフォーム−α、−βＩＩ、−γ、−δおよび−θの移動を示す画像を、図１Ａに示す。これらの画像は、さまざまなエポキシチグリアン化合物がさまざまなＰＫＣアイソフォームを活性化できることを示す。
【０１００】
化合物１〜１０ならびに陽性対照ＰＭＡの細胞質膜移動を示す細胞のパーセンテージを、５００、５０および５ｎＭのそれぞれの化合物に反応した、ＰＫＣアイソフォームの移動プロファイルを示すヒートマップに変換した。ヒートマップを、図１Ｂに示す。
【０１０１】
結果は、化合物１〜７がすべて（異なった程度まで）ＰＫＣ−θ、ＴおよびＮＫ細胞活性化に関与することが知られているＰＫＣアイソフォームを活性化すること、およびＴｒｅｇ発生の抑制を示す（Brezar et al., 2015; Anel et al., 2012）。すべてのエポキシチグリアン化合物は、ＰＫＣ−βを活性化し、そしてそれは、Ｂ細胞受容体シグナル伝達および抗原提示に重要である（例えば、Kang et al. 2001; Lim et al. 2015）。一部のまたはすべてのエポキシチグリアンによってより弱く活性化された他の３つのＰＫＣアイソフォーム（−η、−α、−δ）もまた、免疫細胞応答に直接関係した（Lim et al. 2015; Pfeifhofer et al. 2006）。
【０１０２】
実施例２：マウス腫瘍間質における遺伝子発現変化は、免疫細胞動員およびＴｈ−１／Ｍ１様抗腫瘍免疫応答の誘導と一致した
抗腫瘍免疫におけるＴｈ１／Ｍ−１様応答
Ｔｈ１／Ｍ１様免疫応答は、直接的な殺腫瘍活性を含めたさまざまな機構を通じた抗腫瘍細胞性免疫能の誘導、抗腫瘍性サイトカイン反応の修飾、および長期免疫メモリの相乗効果に関連した。例えば、いくつかの系列の証拠は、ＣＤ４＋Ｔヘルパータイプ１（Ｔｈ１）細胞（Ｔｈ１免疫の駆動因子）が、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）インターロイキン−２（ＩＬ−２）および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）を含めた様々なサイトカインの分泌を介して腫瘍細胞のクリアランスのサポートを補助し得ることを示した（Knutson et al. 2005; DeNardo et al. 2010; Burkholder et al. 2014）。これらのサイトカインは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、細胞毒性Ｔ細胞、ＮＫ細胞および様々な先天性の免疫細胞サブタイプを含めたいくつかの細胞型の活性を促進する（例えば、Cohen et al. 2000; Bos & Sherman 2010）。ＩＦＮ−γおよびＴＮＦもまた、腫瘍細胞生存に直接作用があることが知られている（Sugarman et al. 1985; Bayaert et al. 1994）。（Ｍ１マクロファージによって産生される）ＩＬ−１およびＩＬ−６は腫瘍発生に関連しているが、より最近の証拠は、それらが実際には、急性抗腫瘍免疫応答の重要成分であることが示唆している（Haabeth et al. 2011; Gabrilovich et al. 2012; Haabeth et al. 2016）。それらが、Ｂ細胞増殖および抗体産生を高め、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の活性を増強し、抗原特異的細胞傷害性細胞型の増殖を刺激し、およびＴｈ１細胞分化を促進することを示した（Haabeth et al. 2011; Burkholder et al. 2014）。Ｔｈ１とＭ１サイトカインの組み合わせもまた、腫瘍の免疫的監視で重要であることが示された。例えば、ＩＬ−１およびＩＦＮ−γの両方が、マクロファージの殺腫瘍活性を活性化するのにシナジーを与えた（Hori et al. 1989; Haabeth et al. 2016）。重要なことには、腫瘍におけるＭ１マクロファージおよびＴｈ１リンパ球の出現は、多くの癌において改善された予後および生存期間に明確に関連している（Pages et al. 2010; Fridman et al. 2012; Senovilla et al. 2012）。実際には、誘導Ｔｈ１／Ｍ１−タイプ炎症が、抗癌免疫療法ベースのアプローチを有意に改善することを提案した（Haabeth et al. 2012）。以下に、異種移植マウスモデルの間質中のＴｈ１／Ｍ１様抗腫瘍免疫応答を促進する化合物１の効果を記載した。
【０１０３】
マウスからのヒト腫瘍異種移植片におけるマウス間質
ＳＫ−ＭＥＬ−２８ヒト黒色腫細胞株を各ＢＡＬＢ／ｃ Ｆｏｘｎ１ｎｕマウスの側腹部の２部位へ皮下（ｓ．ｃ）注射し（２００万個の細胞／部位）、約７ｍｍ直径へ成長させた。次いで、各腫瘍に、化合物１を３０μｇ含有する２０％プロピレングリコール５０μＬ、または２０％プロピレングリコール５０μＬを注射した。注射後の異なる時点で、マウスを安楽死させ、腫瘍を採取し、皮膚カバーを除去し、インタクトな腫瘍を−８０℃で保存した。
【０１０４】
ＲＮＡ抽出
製造業者の説明書に従って、QiagenRNeasyPlus Mini Kitを使用して３０ｍｇの凍結腫瘍からＲＮＡを抽出し、次いで、ＮａｎｏＤｒｏｐ機器で定量化し、１ｋｂのＤＮＡマーカーを有する変性アガロースゲルにおいて完全性を確認し、臭化エチジウムで染色した。
【０１０５】
ＲＮＡ増幅および標識化
約５００ｎｇのトータル未標識ＲＮＡをヌクレアーゼフリー水で最終体積１１μＬへ調節した。ＲＮＡを、９μＬの逆転写酵素マスターミックス（１μＬのＴ７ Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）Ｐｒｉｍｅｒ、２μＬの１０Ｘ第１ストランドバッファー、４μＬのｄＮＴＰミックス、１μＬのＲＮａｓｅインヒビターおよび１μＬのＡｒｒａｙＳｃｒｉｐｔ）と共に４２℃で２時間インキュベートした。これに続いて、第２ストランドｃＤＮＡ合成ステップを行い、これは、８０μＬの第２ストランドマスターミックス（６３μＬのヌクレアーゼフリー水、１０μＬの１０Ｘ第２ストランドバッファー、４μＬのｄＮＴＰミックス、２μＬのＤＮＡポリメラーゼおよび１μＬのＲＮａｓｅ Ｈ）と共に１６℃で２時間さらにインキュベーションすることを含んだ。２５０μＬのｃＤＮＡ結合バッファーを含むcDNA Filter Cartridgeで濾過し、キット中に提供された５００μＬの洗浄バッファーで洗浄することによって、ｃＤＮＡを精製した。精製されたｃＤＮＡを、２０μＬの５５℃ヌクレアーゼフリー水で溶出した。各ｃＤＮＡサンプルを、７．５μＬのＩＶＴマスターミックス（２．５μＬのＴ７ １０×反応バッファー、２．５μＬのＴ７酵素ミックスおよび２．５μＬのビオチン−ＮＴＰミックス）と共に３７℃で１６時間インキュベートした。各ｃＲＮＡサンプルへ７５μＬのヌクレアーゼフリー水を添加することによって、反応を停止した。フィルター上へのローディング前に一緒に混合された３５０μＬのｃＲＮＡ結合バッファーおよび２５０μＬの１００％エタノールを含むcRNA Filter CartridgeでｃＲＮＡサンプルを濾過することによって、ビオチン化増幅ＲＮＡを精製した。結合されたＲＮＡを含むｃＲＮＡフィルターカートリッジを、次いで、６５０μＬの洗浄バッファーで洗浄し、その後、精製されたｃＲＮＡを２００μＬの５５℃ヌクレアーゼフリー水で溶出した。
【０１０６】
Illumina Expression BeadChipハイブリダイゼーション
ｃＲＮＡサンプルを６５℃で５分間加熱し、パルス遠心分離によって集めた。６５度で５分間加熱した後、約７５０ｎｇのｃＲＮＡサンプルを別個のチューブへ等分し、ここで、約５μＬのＲＮａｓｅフリー水および１０μＬのＨｙｂ  Ｍｉｘを添加した。約１５μＬの調製ｃＲＮＡミックスをIllumina Expression BeadChip上へローディングした。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の後続の工程を、Illuminaによって供給されるWhole-Genome Gene Expression Direct Hybridization Assay Guideに従って行った。
【０１０７】
Human HT-12 v4 Expression BeadChipは、ヒトトランスクリプトームにわたる４７，０００を超える転写物および公知のスプライス変異体をカバーする。MouseRef-8 v2.0 Expression BeadChipは、１９，０００超の特有の遺伝子を含む、約２５，６００の十分に注釈されたＲｅｆＳｅｑ（参照配列（Reference Sequence））転写物をカバーする。
【０１０８】
データ解析。BeadChipをiScan Systemによって読み取り、GenomeStudioによってGeneSpring GX v12.5（Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA）へ移した。デフォルト設定での分位点標準化を使用して、発現値を標準化した。実体を、GenomeStudioによって計算された検出スコアに基づいてフィルタリグし、ここで、ｐ≦０．０５を有意とみなした。
【０１０９】
結果を図２に示す。図２Ａは、免疫細胞の動員／活性化に重要であるいくつかの宿主サイトカイン／ケモカインが、化合物１処理に反応して腫瘍部位において上方制御されることを示す。注目すべきは、化合物１によって大いに上方制御されるＣｘｃｌ１では、好中球動員、およびその後の残留癌細胞の殺滅を促進すること知られている（Garg et al. 2017）。さらに、図２Ｂは、化合物１が、Ｔｈ−１／Ｍ様応答、すなわち、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、ＩＬ−６およびＩＬ−１β誘導、の発生に関連している宿主の遺伝子発現変化を引き起こすことを示している。データはまた、それらがＴＧＦベータシグナル伝達の下方制御が起こる可能性があり（図２Ｃ）、そしてそれが、公知の免疫抑制性シグナル伝達経路（Neuzillet et al. 2015）であることも示唆する。
【０１１０】
実施例３：化合物１および他のエポキシチグリアンの治療濃度が細胞腫瘍症を誘導することの証明
腫瘍症は、浸透バランスを維持するＡＴＰ駆動イオンポンプ活性の一部損失による細胞内小器官の膨張と断裂とそれに続く、原形質膜の透過化を特徴とした壊死細胞死滅の形態である。腫瘍症は、天然には免疫原性であることが示され、そして、いくつかの腫瘍溶解性ウイルスおよび抗癌剤として開発された小分子の有効性に関係している（例えば、Dyer et al. 2016）。
【０１１１】
細胞株、試薬および培地
Ａ４３１（ヒト類表皮癌Ａ４３１細胞）、ＭＭ６４９（ヒト黒色腫）、Ｂ１６−ＯＶＡ（ニワトリオボアルブミンで安定的にトランスフェクトしたＢ１６−Ｆ１０マウス黒色腫細胞株）、ＭＭ４１５（ヒト黒色腫）およびＦａＤｕ（ヒト下咽頭癌）細胞を、加湿インキュベータ内で３７℃、５％のＣＯ2にてＲＰＭＩ−１６４０、１０％のＦＣＳ（完全培地）中で培養した。この試験に使用したすべての細胞株を、MycoAlert（Lonza）を使用してマイコプラズマ陰性であると確認した。ＳＴＲプロファイリングもまた、使用したヒト細胞株の同一性を確認するために実施した。
【０１１２】
IncuCyte細胞毒性試験
４つの癌細胞株（Ａ４３１、ＭＭ６４９（ヒト黒色腫）、ＦａＤｕ（ＨＮＳＣＣ）およびＭＭ４１５（ヒト黒色腫））を、エポキシチグリアン処理へのそれらの応答について評価した。細胞を、透明な底面の黒色９６ウェルプレート（Corning, #3603）内で１ウェル（１００μｌの完全培地）あたり１０，０００細胞の密度で平板培養した。２４時間のインキュベーション後に、各ウェル内の培地を、吸引し、そして、１μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含む５０μｌの新しい培地で置換した。４つのエポキシチグリアン（化合物１、２、３および４）のストック溶液（エタノール中に２０ｍｇ／ｍｌ）を、同一培地中に２×最終アッセイ濃度（１ｍＭ）に希釈し、そして、移動に備えてＵ底面９６ウェルプレート内に導入した。５０μｌの希釈物を必要なウェルに加え、そして、得られたプレートを、画像化に備えてEssen Biosciences IncuCyteに導入した。画像を、合計２４時間にわたり、様々な時点（３０分、１時間および１時間間隔）で取得した。
【０１１３】
乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出試験
ＬＤＨの放出の計測は、原形質膜の透過化を評価し、そして、壊死による細胞死を検出するためのよく認識されたアッセイである（Chan et al. 2013）。３つの細胞株（Ａ４３１、ＭＭ６４９およびＢ１６−ＯＶＡ）をこれらのアッセイで使用した。細胞を、透明な９６ウェルプレート（Corning, #3595；１００μｌの完全培地）内で１ウェルあたり１０，０００細胞の密度で平板培養し、そして、得られたプレートを先に詳述したとおり一晩インキュベートした。翌日、培地を各ウェルから吸引し、そして、５０μｌの新しい培地を導入した。化合物１のストック溶液を、２×最終アッセイ濃度（１ｍＭと６００μＭ）に希釈し、そして、５０μｌのこれらの希釈物を必要なウェルに加えた。エタノールのみの対照溶液もまた、コンパイルし、そして、投与した。示した時点にて、５０μｌの培地を取り出し、そして、Pierce LDH細胞毒性試験キット（ThermoFisher Scientific）を使用してＬＤＨ放出についてアッセイした。ＯＤ４９０ｎｍおよびＯＤ６９０ｎｍ測定値を、Hybrid Synergy H4プレートリーダを使用して、各サンプルについて記録した。薬物処理サンプルからの吸光度測定値を、界面活性剤処理対照に対して正規化して、ウェル毎の％ＬＤＨ放出を決定した。
【０１１４】
細胞内ＡＴＰアッセイ
細胞内に存在するＡＴＰ量を定量する発光ベースのアッセイであるCellTiter-Glo（登録商標）2.0アッセイキット（Promega Corporation）を、２種類の濃度（３００μＭと５００μＭ）の化合物１に晒したＡ４３１およびＭＭ６４９の培養物における細胞内ＡＴＰ量を測定するのに使用した。また一方で、細胞を、透明な底面の黒色９６ウェルプレート（１００μｌの完全培地）内で１ウェルあたり１０，０００細胞の密度で平板培養し、３７℃、５％のＣＯ2にて一晩インキュベートした。アッセイ時点で、培地を各ウェルから吸引し、５０μｌの新しい培地を導入した。化合物１のストック溶液を、２×最終アッセイ濃度（１ｍＭと６００μＭ）に希釈し、そして、５０μｌのこれらの希釈物を必要なウェルに加えた。エタノールのみの対照溶液もまた、コンパイルし、そして、投与した。示した時点にて、確実に細胞を乱さないように穏やかに培地を取り出し、そして、１００μｌのCellTiter-Glo（登録商標）2.0試薬を加えた。得られたプレートを、オービタル振盪機により２分間混合して、細胞分解を引き起こした後に、それを暗所内で１０分間インキュベートした。これに続いて、各ウェルの発光シグナルを測定した。化合物処理ウェルからの発光シグナルを、ビヒクル処理ウェルに対して正規化し、そして、時間に対する％細胞内ＡＴＰとして表した。
【０１１５】
IncuCyteから取得した画像は、５００μＭの化合物１、２、３および４で処理した４つの細胞株すべて（Ａ４３１、ＦａＤｕ、ＭＭ６４９およびＭＭ４１５）の細胞の大部分で１２０分後に強い赤色染色を示した。ビヒクルだけで処理した細胞の染色は存在せず、原形質膜完全性の損失が、化合物１で処理した細胞に限られることを確認した。加えて、顕著な細胞質膨張および「水疱形成」もまた、さまざまな程度および様々な発症動態であるが、化合物１、２、３および４で処理したすべての細胞でも観察された。
【０１１６】
ＬＤＨの放出を評価し、および細胞内のＡＴＰ量を評価するためのアッセイからの結果を、図３Ａおよび３Ｂにそれぞれ示す。対照と比較し、試験した化合物１の両方の濃度（３００μＭと５００μＭ）にて処理した３つの癌細胞株のすべてからのＬＤＨの有意な放出があった（図３Ａ）。細胞内ＡＴＰ量は、５００μＭの化合物１で処理した後に非常に急速に減少し、そして、６０分後にほとんど検出できなかった（図３Ｂ）。３００μＭの化合物１では、細胞内のＡＴＰは、破滅的なほどではないが、５００μＭの濃度の化合物１に比べて、よりゆっくりと減少し、１２０分後に前処理レベルの約５０％であった（図３Ｂ）。ＡＴＰ減少は、すでに腫瘍症の誘導に関連している（Kim et al. 2003）。
【０１１７】
これらの結果は、エポキシチグリアン化合物が、治療関連濃度（すなわち、インビボにおける出血性壊死の誘導に有効な濃度）にて腫瘍症を誘発することを実証する。
【０１１８】
実施例４：化合物１および他のエポキシチグリアンによって誘導された腫瘍症は、免疫原性細胞死の特徴を示す
免疫原性細胞死（ＩＣＤ）は、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）と呼ばれる伝達物質の放出または細胞外化をもたらす特定のタイプの制御された細胞死であり、そしてそれは、樹状細胞／マクロファージによって発現される受容体と相互作用して、それらの動員を促進し、かつ、腫瘍抗原の取り込み／Ｔ細胞に対する提示を刺激する。ＩＣＤは、癌に対する免疫系の活性化のための代表的な経路である。ＩＣＤの生化学的に顕著な特徴としては、死滅細胞表面におけるカルレチクリン（ＣＡＬＲ）および他の小胞体／ミトコンドリアタンパク質の曝露、および細胞外環境へのＡＴＰおよび高移動度グループボックス１（ＨＭＧＢ１）の大量放出が挙げられる（Kroemer et al. 2013）。これらのパラメーターは、ＩＣＤを引き起こすための化学療法薬（ドキソルビシン、ミトキサントロン、オキサリプラチンおよびボルテゾミブを含む）の能力について精密予測するのに使用した（Kroemer et al. 2013; Galluzzi et al. 2017）。これらの特徴を誘導するエポキシチグリアンの能力を以下で詳述する。
【０１１９】
細胞株、試薬および培地
Ａ４３１（ヒト類表皮癌Ａ４３１細胞）、ＭＭ６４９（ヒト黒色腫）およびＢ１６−ＯＶＡ（ニワトリオボアルブミンで安定的にトランスフェクトしたＢ１６−Ｆ１０マウス黒色腫細胞株）を、加湿インキュベータ内で３７℃、５％のＣＯ2にてＲＰＭＩ−１６４０、１０％のＦＣＳ（完全培地）中で培養した。ＢＭＤＣをＲ１０培地（ＲＰＭＩ、１０％のＦＣＳ、２ｍＭのグルタミン、５０μＭのβ−メルカプトエタノール、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）中で培養した。この試験に使用したすべての細胞株を、MycoAlert（Lonza）を使用してマイコプラズマ陰性であると確認した。ＳＴＲプロファイリングもまた、使用したヒト細胞株の同一性を確認するために実施した。
【０１２０】
ＡＴＰ放出試験
細胞株を、透明な９６ウェルプレート（Corning, #3595；１００μｌの完全培地）内で１ウェルあたり１０，０００細胞の密度で平板培養し、そして、得られたプレートを先に詳述したとおり一晩インキュベートした。翌日、培地を各ウェルから吸引し、そして、５０μｌの新しい培地を導入した。化合物１、２、３および４のストック溶液を、２×最終アッセイ濃度（１ｍＭと６００μＭ）に希釈し、そして、５０μｌのこれらの希釈物を必要なウェルに加えた。エタノールのみの対照溶液もまた、コンパイルし、そして、投与した。示した時点にて、８０μｌの培地を取り出し、１，２００ｒｐｍにて４分間遠心分離して、細胞破片をペレット化し、そして、生物発光ベースのＡＴＰアッセイキット（FLAA, Sigma-Aldrich）を使用して、ＡＴＰについて、５０μｌをアッセイした。相対発光単位を、Hybrid Synergy H4プレートリーダ（BioTek）を使用して、各サンプルについて記録した。
【０１２１】
ＨＭＧＢ１放出アッセイ
細胞株（Ａ４３１、ＭＭ６４９およびＢ１６−ＯＶＡ）を、Ｔ７５ｃｍ2フラスコ（Nunc）内、１０ｍｌの完全培地中で平板培養し、そして、それらが９０％集密に達するまで、３７℃、５％のＣＯ2にて培養した。化合物１、２、３および４を、５ｍｌの同一培地中で５００および３００μＭの終濃度まで希釈し、次に、細胞に投与した。薬物処理に反応したＨＭＧＢ１放出の速度論的カーブが確立され得るように、数個のフラスコを調製した。エタノールのみの対照もまた作製した。必要な時点にて、培地を、フラスコから５分間氷上に置いた１０ｍｌのポリプロピレンチューブ内に取り出した。細胞培養上清を、１，２００ｒｐｍにて４分間遠心分離して、細胞残屑を取り除き、その後、４．５ｍｌの上清を、濃縮器スピンカラム（Amicon（登録商標）Ultra50kDa排除膜、Merck）に導入して、ＦＣＳを取り除いた。次に、このカラムからの流出物を、別の濃縮カラム（Amicon（登録商標）Ultra10kDa排除膜、Merck）に導入し、そして、３，５００ｒｐｍにて遠心分離して、ＥＬＩＳＡ（SEA399Hu/SEA399Mu, Cloud-Clone Corp）によるアッセイ前に、ＨＭＧＢ１を濃縮した。ＯＤ４５０ｎｍ値を、Hybrid Synergy H4プレートリーダ（BioTek）を使用して測定した。薬物処理サンプルからの吸光度値を、ビヒクル処理サンプルに対して正規化して、エポキシチグリアン処理に反応したＨＭＧＢ１放出の倍率増加を決定した。
【０１２２】
カルレチクリン細胞外化アッセイ
カルレチクリン細胞外化を、先に詳述したとおり決定した（Gomez-Cadena et al. 2016）。簡単に言えば、完全培地中で３７℃、５％のＣＯ2にて培養した細胞（Ａ４３１、ＭＭ６４９、Ｂ１６−ＯＶＡ）を、トリプシン処理によって剥離し、１，２００ｒｐｍにて遠心分離し、そして、新しい培地で２回洗浄した。さらに１ラウンドの遠心分離後に、得られた細胞ペレットを、１×１０6細胞／ｍｌの濃度にて再懸濁し、そしてその後、エポキシチグリアンを、５００または３００μＭの終濃度まで加えた。エタノールのみの対照もまた実施した。細胞懸濁液を、３７℃、５％のＣＯ2にてインキュベートし、そして、示した時点にて、２００μｌのサンプルを、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ定着性遠赤染色剤と共に氷上にて５分間インキュベートした。これに続いて、細胞を、１，２００ｒｐｍにて４分間ペレット化し、ＰＢＳで１回洗浄した。次に、５００μｌのＰＢＳ、０．２５％のホルムアルデヒドを各ペレットに加えて、原形質膜の完全性を損なうことなく光固定を実施した。これに続いて、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、そして、抗カルレチクリン（ab2907, Abcam、１：５０希釈）を含有した１００μｌのＰＢＳ、１％のＢＳＡ、２ｍＭのＥＤＴＡ（ＦＡＣバッファー）を加えた。室温にて１時間のインキュベーション後に、細胞を、１，２００ｒｐｍにて４分間遠心分離し、そして、１：７５０の抗ウサギＡｌｅｘａ４８８を含有した１００μｌのＦＡＣバッファーとの室温にて１時間のインキュベーション前に、ＦＡＣバッファーで１回洗浄した。細胞を、再びペレット化し、次に、フローサイトメトリーに備えて５００μｌのＦＡＣバッファー中に再懸濁した。
【０１２３】
サンプルを、最初にＦＳＣ−Ｈ対ＦＳＣ−Ａによってゲート選別して、単独細胞を同定し、そしてその後、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色（Ｅｘ：６４０ｎｍ、Ｅｍ：６７０／１４）陰性（無傷細胞）集団を、緑色蛍光（Ｅｘ：４８８ｎｍ、Ｅｍ：５３０／３０、カルレチクリン細胞外化）について分析した。平均蛍光強度値を、それに続いて決定し、そして、時間に対してグラフ化した。
【０１２４】
結果は、エポキシチグリアン化合物によって誘導された急性腫瘍症もまた、ＡＴＰ（図４Ａおよび４Ｂ）、ＨＭＢＧ１（図４Ｃ）およびカルレチクリン（図４Ｄ）を含めた重要なＤＡＭＰの放出／細胞外化を伴った免疫原性細胞死の特徴を引き起こした。両濃度の化合物１（図４Ａ）ならびに化合物２、３および４（図４Ｂ）で処理した３つの癌細胞株のすべてで６０分以内にＡＴＰの有意な遊離があった。これらの化合物もまた、癌細胞株からのＨＭＧＢ１の放出を促進した。処理細胞のＥＬＩＳＡアッセイ値をビヒクル処理細胞に対して正規化して、倍率増加を決定した後に、化合物１は、Ａ３４１およびＭＭ６４９細胞に関して最大４０％（図４Ｃｉと４Ｃｉｉ）およびＢ１６−ＯＶＡ細胞に関して３倍超（図４Ｃｉｉｉ）、１２０分以内にＨＭＢＧ１放出を増強することを示した。化合物２、３および４もまた、Ｂ１６−ＯＶＡ細胞に対してアッセイし、そして、１２０分後にこの細胞株からのＨＭＢＧ１放出の最小２倍の増大を示した（図４Ｃｉｖ）。化合物１での３つの細胞株の処理後のカルレチクリン細胞外化に関するデータは、処理の６０分以内の平均蛍光強度の有意な増大を示した（図４Ｄ）。斯かるＤＡＭＰの放出／細胞外化は、抗原提示細胞の動員を促進し、癌細胞関連抗原の効果的な取り込みを刺激し、およびＴ細胞サブセットに対する提示を刺激することが知られている（Kolaczkowska & Kubes, 2013）。
【０１２５】
実施例５：エポキシチグリアン処理した癌細胞からの断片は、ＣＤ１１ｃ+骨髄由来細胞集団によって取り込まれる
ＣＤ１１ｃは、ＤＣ／マクロファージの十分に説明されたマーカーである（Merad et al. 2013）。免疫原性応答の発生を促進する抗癌剤の能力（およびそれらが引き起こす関連死滅プロセス）を調査するための一つの方法は、それらがＣＤ１１ｃ+樹状細胞／マクロファージによる細胞成分の取り込み、ならびに本物の抗原提示細胞（ＡＰＣ）へのそれらのその後の成熟につながるかどうか決定するためのものである（Guermonprez et al. 2002）。ここで、我々は、化合物１および関連エポキシチグリアンによって誘導された腫瘍症が、斯かる細胞による死滅癌細胞成分の取り込みにつながることを実証する。
【０１２６】
骨髄由来細胞（ＢＭＤＣ）の分離と培養
最初に、４匹の７〜８週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウスからの脛骨および腓骨を、無菌条件下で外科的に取り出した。髄を、（５０ｍｌのポリプロピレンチューブ内の２７Ｇ針／シリンジを使用して）１０ｍｌの氷冷Ｒ１０培地で骨小腔からフラッシュした。細胞を、１，５００ｒｐｍにて５分間ペレット化し、そして、氷冷Ｒ１０培地で２回洗浄した。１０ｍｌの氷冷Ｒ１０培地中へのペレットの再懸濁後に、細胞を、改善した血球計算器を使用してカウントし、そして、２０ｎｇ／ｍｌのマウスＧＭ−ＣＳＦを補充した１０ｍｌのＲ１０中で、プレート（ペトリディッシュ）あたり２×１０6細胞の密度で平板培養した。すべてのプレートを、３７℃、５％のＣＯ2にてインキュベートし、そして、３日目に、２０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦを含む追加の１０ｍｌのＲ１０を加えた。細胞を、６日目に再び培養し、そして、７日目に下流のアッセイに使用した。
【０１２７】
ＢＭＤＣ取り込み実験
ＢＭＤＣとの同時インキュベーション前に、Ｂ１６−ＯＶＡ細胞を、トリプシン処理し、１，２００ｒｐｍにて４分間遠心分離して、細胞をペレット化し、そして、完全培地で２回洗浄した。次に、細胞を、完全培地中の２μＭのCell Tracker Greenで４５分間染色し、そしてその後、それらを、ペレット化し、そして、上述のとおり２回洗浄した。標識したＢ１６−ＯＶＡ細胞を、それに続いて、１×１０6細胞／ｍｌの密度にて、培地中で２つの濃度（５００または３００μＭ）の化合物１、２、３および４で３０および６０分間処理し、そしてその後、細胞を遠心分離によってペレット化し、上清を吸引によって取り除き、そして、細胞ペレットを、完全培地で１回洗浄した。洗浄後に、処理した細胞を、Ｒ１０培地中に再懸濁し、６ウェルプレート（Corning, #3471 超低接着表面）のウェルに導入し、そして、ＢＭＤＣを加えた。共培養物を、４時間インキュベートし、そしてその後、細胞懸濁液を、マイクロチューブに移し、１，５００ｒｐｍにて５分間遠心分離した。ペレットを、抗ＣＤ１１ｃ−ＡＰＣを含有する１００μｌのＦＡＣバッファー中に再懸濁し、４℃で１０分間インキュベートした。細胞を、再びペレット化し、ＦＡＣバッファーで１回洗浄し、次に、ＰＢＳ、１％のホルムアルデヒドを使用して１０分間、固定した。遠心分離および上清の除去後に、細胞を、フローサイトメトリーに備えて、５００μｌのＦＡＣバッファー中に再懸濁した。
【０１２８】
サンプルを、最初に、ＦＳＣ−Ｈ対ＦＳＣ−Ａ、次にＳＳＣ−Ｈ対ＳＳ−Ａによってゲート選別して、単独細胞を同定した。次に、ＣＭＦＤＡmid（Ｅｘ：４８８ｎｍ、Ｅｍ：５３０／３０）を有するＣＤ１１ｃ+細胞（Ｅｘ：６４０ｎｍ、Ｅｍ：６７０／１４）の割合を、全ＣＤ１１ｃ+細胞に対するパーセンテージとして、処理細胞および未処理細胞について決定した。
【０１２９】
結果（図５Ａおよび５Ｂ）は、化合物１によって引き起こされた腫瘍症が、ＣＤ１１ｃ+樹状細胞／マクロファージによる死滅癌細胞断片の取り込み（すなわち、有効な取り込み）を促進することを示す。この取り込みは、５００μＭの化合物１での、抗原取り込みは、３００μＭの使用と比較して、より短い処理時間後に、より大規模まで起こるといったように、化合物１の濃度および処理時間の両方に依存しているように思われる。これは実施例３で観察された腫瘍症の動態と一致している。図５Ｃは、化合物２、３および４もまた、インビトロにおいて免疫原性である細胞死反応を引き起こす、すなわち、ＣＤ１１ｃ+ＢＭＤＣによる取り込みを促進する、ことができることを実証する。
【０１３０】
実施例６：免疫チェックポイント阻害剤と化合物１の組み合わせ
免疫チェックポイント阻害剤療法、特にＴ細胞免疫抑制（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）またはプログラム死１（ＰＤ−１）およびそのリガンドＰＤ−Ｌ１）にかかわるそれらの受容体を標的化する治療法は、黒色腫、腎細胞癌、膀胱癌および頭頚部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含めた数タイプの後期癌において、大いに改善された患者転帰を有する（Msaouel & Massarelli 2016; Sharma & Allison 2015）。しかしながら、これらのＩＣＩ薬物に対する初代およびデノボ抵抗性は、大きな医療問題である。さらに、大規模な臨床経過観察は、一部の黒色腫患者が、治療に対する抵抗性を発症し、かつ、疾患再発を経験していることを示した（O’Donnell et al., 2017）。ＩＣＩと（特に、腫瘍実質部（tumour paracheyma）への免疫細胞浸潤および抗原の取り込み／提示の増強をもたらす）免疫原性細胞死を促進することよってアジュバントとして作用し得る化合物とを組み合わせる治療法は、ＩＣＩのいくつかの限界を克服し、かつ、総合的な臨床成果を改善することが期待できる（Workenhe et al. 2014; Ribas et al. 2017）。ここで、および実施例７では、データでは、ＩＣＩと化合物１の病巣内注入の組み合わせを検討する。
【０１３１】
実験的アプローチの図解を図６Ａに示す。簡単に言えば、６〜７週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに、Ｂ１６−Ｆ１０−ＯＶＡマウス黒色腫細胞（１００μｌ中に１部位あたり２×１０5細胞）を両側腹部に皮下（ｓ．ｃ．）注射した。腫瘍を、約５〜５０ｍｍ3まで増殖させ、そしてその後、２００μｇの抗ＰＤ−１（RMP1-14, BioXCell）、抗ＣＴＬＡ−４（9H10, BioXCell）またはアイソタイプ対照抗体（2A3およびSyrian Hamster IgG, BioXCell）を、マウス毎にｉ．ｐ．注射した（−２日目）。０日目に、両腫瘍に、化合物１（５０μＬ中に１５μｇ）またはビヒクル（Ｖｅｈｃ．）のみのいずれかをＩ．Ｔ．注射した。各マウスには、−２日目（再び２００μｇ）に投与したのと同じ抗体の追加のｉ．ｐ．注射を投与した。抗体を、２日毎にｉ．ｐ．注射によってさらに３回投与した。処理した腫瘍の体積を、以前に詳述したようにノギスを使用して計測し（Boyle et al. 2014）、およびマウス生存率を経時的に測定した。
【０１３２】
図６Ｂおよび６Ｃに示した結果は、化合物１は、抗のＰＤ−１と抗ＣＴＬＡ−４に組み合わせられて、腫瘍の増殖を制限し、そして、単剤処理に比べ、より大きな程度までマウス生存率を改善し得ることを示した。この効果は、それぞれの化合物１／ＩＣＩ組み合わせにおいて濃度依存であると思われる。例えば、抗ＰＤ−１と一緒の３０μｇの化合物１の注射は、３０μｇの化合物１単独の使用と比較して、改善した生存率／低減したの腫瘍増殖につながる（図６Ｂｉｉｉ、ｉｖ）。これは、１５μｇの化合物１が同じ組み合わせで使用されたときには、観察されなかった、すなわち、生存率または腫瘍増殖の改善がなかった（図６Ｂｉ、ｉｉ）。抗ＣＴＬＡ４が使用されたとき、状況が回復され、ここで、複合療法における１５μｇの化合物１（図６Ｃｉ、ｉｉ）が最適の応答をもたらし、３０μｇの化合物１はそれをもたらさない（図６Ｃｉｉｉ、ｉｖ）。
【０１３３】
実施例７：免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて化合物１を使用したときの未処理部位への効果（Abscopal Effects）の観察
実験的アプローチの図解を図７Ａに示す。簡単に言えば、６〜７週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに、Ｂ１６−Ｆ１０−ＯＶＡマウス黒色腫細胞（１００μｌ中に１部位あたり２×１０5細胞）を両側腹部にｓ．ｃ．注射した。腫瘍を、約５〜５０ｍｍ3まで増殖させ、そしてその後、２００μｇの抗ＰＤ−１（RMP1-14, BioXCell）、抗ＣＴＬＡ−４（9H10, BioXCell）またはアイソタイプ対照抗体（2A3, BioXCell）を、マウス毎にｉ．ｐ．注射した（−２日目）。０日目に、２つの腫瘍のうちの最大のもの（約５０〜７５ｍｍ3）を、化合物１（５０μＬ中に１５μｇ）またはビヒクル（Ｖｅｈｃ．）のみのいずれかをＩ．Ｔ．注射した。残った腫瘍を未処置のままにし、そして、各マウスには、−２日目（再び２００μｇ）に投与したのと同じ抗体の追加のｉ．ｐ．注射を投与した。抗体を、２日毎にｉ．ｐ．注射によってさらに３回投与した。処理および未処理の腫瘍の体積を、以前に詳述したように実験期間中に計測した。
【０１３４】
結果を図７Ｂに示す。結果は、抗体と化合物１の組み合わせで処理した腫瘍が効果的に縮小されるだけでなく、一部の未処理の隣接腫瘍もまた、いずれかの剤単独では観察されなかった併用療法に対する応答を示すことを示した。
【０１３５】
実施例８：骨髄由来サプレッサ細胞は、化合物１の低用量有効性に影響を及ぼし得る
骨髄由来サプレッサ細胞（ＭＤＳＣ）は、複数の経路を介して腫瘍に対する宿主免疫反応を抑制し得る未成熟骨髄細胞である（Qu et al. 2016）。我々は、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）ノックアウトＣ５７ＢＬ／６マウスを使用して、ＭＤＳＣ動員および機能に関係するタンパク質（例えば、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ））を阻害または遮断する分子と化合物１が関与する、可能性のある併用療法についてさらなる可能性を評価するためのモデルを提供する。好中球の産生および輸送の必須調節因子であるＧＣＳＦはまた、ＭＤＳＣの遊走および増殖における重要役割も担う（Li et al. 2016）。我々のＧＣＳＦＲノックアウトモデルを使用して、ＭＣ３８結腸直腸腺癌（colorectal adenocarincomas）に対する化合物１の（準最適用量での）単独療法の有効性を制限する際の顆粒球由来ＭＳＤＣの可能性のある役割を調査した。
【０１３６】
簡単に言えば、６〜７週齢のｗｔ Ｃ５７ＢＬ／６およびｇｃｓｆｒ-/-マウスに、ＭＣ３８マウス大腸癌細胞（１００μｌ中に１部位あたり１×１０6細胞）を両側腹部にｓ．ｃ．注射した。腫瘍を、約５〜５０ｍｍ3まで増殖させ、そしてその後、１５μｇの化合物１またはビヒクル（Ｖｅｈｃ．）をＩ．Ｔ．注射した（５０μｌ）。処理した腫瘍の体積を、実施例６および７で先に詳述したように観察した。野性型（ｗｔ）とＧＣＳＦＲノックアウトマウスにおける化合物１を注射した腫瘍の腫瘍サイズと生存率の比較を、図８に見ることができる。
【０１３７】
顆粒球動員におけるＧＣＳＦＲの役割を考えると、これらのデータは、斯かる免疫細胞浸潤が、既知の準最適用量（１５μｇ）での化合物１の抗癌有効性を制限している可能性があることを示唆している。これにより、斯かる免疫抑制細胞集団の発生を予防する化合物（例えば、ＩＤＯ阻害剤）と化合物１または類似体の組み合わせは、より良い抗癌有効性および患者生存率の改善につながり得る。
【０１３８】
本発明の要旨および範囲から逸脱することなく、多くの修飾がなされ得ることは、本発明の技術分野の当業者に理解されるであろう。
【０１３９】
参照文献
本明細書において、先行技術の文献が参照される場合、斯かる参照は、その刊行物が、オーストラリア又は他のいずれの国においても当該技術分野における一般常識の一部を形成することを承認する役割を担わない。
【０１４０】
【表１】
0006905075.tif 000008
【０１４１】
【表２】
0006905075.tif 000009
【０１４２】
【表３】
0006905075.tif 000010
【０１４３】
【表４】
0006905075.tif 000011
【図１Ａ】
0006905075.tif 000021
【図１Ｂ】
0006905075.tif 000022
【図２Ａ】
0006905075.tif 000023
【図２Ｂ】
0006905075.tif 000024
【図２Ｃ】
0006905075.tif 000025
【図３Ａ】
0006905075.tif 000026
【図３Ｂ】
0006905075.tif 000027
【図４Ａ】
0006905075.tif 000028
【図４Ｂ】
0006905075.tif 000029
【図４Ｃ】
0006905075.tif 000030
【図４Ｄ】
0006905075.tif 000031
【図５Ａ】
0006905075.tif 000032
【図５Ｂ】
0006905075.tif 000033
【図５Ｃ】
0006905075.tif 000034
【図６Ａ】
0006905075.tif 000035
【図６Ｂ】
0006905075.tif 000036
【図６Ｃ】
0006905075.tif 000037
【図７Ａ】
0006905075.tif 000038
【図７Ｂ】
0006905075.tif 000039
【図８】
0006905075.tif 000040