(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔質マトリックスと、
非多孔質微小球と、
を含むクロマトグラフィー媒体であって、
前記非多孔質微小球は、前記多孔質マトリックスの内表面及び外表面上に共有結合的手段により結合されており、かつ、
前記微小球の平均半径は、前記多孔質マトリックスの平均細孔径の３０％以下である、クロマトグラフィー媒体。
【請求項２】
前記クロマトグラフィー媒体の透過性は、微小球が結合していない多孔質マトリックスの透過性の少なくとも４０％である、請求項１に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項３】
前記非多孔質微小球は、グリシジル（メタ）アクリレート、置換又は非置換のアルキル（メタ）アクリレート及びそれらの誘導体、スチレン及びその誘導体、２−ビニル−４，４−ジメチルアズラクトン、置換又は非置換のＮ−アルキル（メタ）アクリルアミド及びそれらの誘導体、並びに置換又は非置換のＮ，Ｎ’−ジアルキル（メタ）アクリルアミド及びそれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１種のモノマーから構成される実質的に球形のオリゴマー及び／又はポリマーである、請求項１又は２に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項４】
前記クロマトグラフィー媒体のグラフト度Ｐは、２５％〜４０％であり、
【数１】
0006889265.tif 000018
（式中、ｍｍは、クロマトグラフィー媒体の質量であり、かつｍ０は、微小球を有しない多孔質マトリックスの質量である）により示される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項５】
前記クロマトグラフィー媒体の相対グラフト度Ｐｒｅｌは、０．２５ｇ／ｃｍ３以下であり、
【数２】
0006889265.tif 000019
（式中、Ｐは、クロマトグラフィー媒体のグラフト度（％）であり、ρは、微小球を有しない多孔質マトリックスの密度（ｇ／ｃｍ３）であり、かつＰｏｒは、微小球を有しない多孔質マトリックスの多孔率（％）である）により示される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項６】
前記非多孔質微小球は、その微小球に結合されているか、又はその微小球上に固定化されている追加のクロマトグラフィー活性中心又はリガンドを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体の製造方法であって、
多孔質出発マトリックスを準備することと、
少なくとも１種のモノマー、二官能性、三官能性、又は多官能性の架橋剤、重合開始剤、及び溶剤又は溶剤混合物を含み、前記少なくとも１種のモノマー、前記二官能性、三官能性、又は多官能性の架橋剤、及び前記重合開始剤が、前記溶剤又は溶剤混合物中に完全に可溶性である重合溶液を準備することと、
前記重合溶液における重合を前記多孔質出発マトリックスの存在下で開始させることで、前記溶剤又は溶剤混合物中に不溶性であり、かつ前記多孔質出発マトリックスの内表面及び外表面へと結合されている非多孔質微小球を形成することと、
を含み、前記微小球の平均半径が、前記多孔質出発マトリックスの平均細孔径の３０％以下である、方法。
【請求項８】
前記少なくとも１種のモノマーは、グリシジル（メタ）アクリレート、置換又は非置換のアルキル（メタ）アクリレート及びそれらの誘導体、スチレン及びその誘導体、２−ビニル−４，４−ジメチルアズラクトン、置換又は非置換のＮ−アルキル（メタ）アクリルアミド及びそれらの誘導体、並びに置換又は非置換のＮ，Ｎ’−ジアルキル（メタ）アクリルアミド及びそれらの誘導体からなる群より選択される、請求項７に記載のクロマトグラフィー媒体の製造方法。
【請求項９】
前記二官能性、三官能性、又は多官能性の架橋剤は、エチレングリコールジメタクリレート、トリメチルプロパントリメタクリレート、ジビニルベンゼン、及びＮ，Ｎ−メチレンビスアクリルアミドからなる群より選択される、請求項７又は８に記載のクロマトグラフィー媒体の製造方法。
【請求項１０】
前記重合開始剤は、２−ヒドロキシ−４−（２−ヒドロキシエトキシ）−２−メチルプロピオフェノン、アゾビス（イソブチロニトリル）、４，４−アゾビス（４−シアノ吉草酸）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサンカルボニトリル）、ベンゾイルペルオキシド、２，２−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシ）ブタン、１，１−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシ）シクロヘキサン、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド、ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシイソプロピルカーボネート、シクロヘキサノンペルオキシド、及び２，４−ペンタンジオンペルオキシドからなる群より選択される、請求項７〜９のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体の製造方法。
【請求項１１】
前記溶剤又は溶剤混合物は、シクロヘキサノール／ドデカン−１−オール、オクタン−２−オン、ｎ−ブチルアセテート、ｐ−キシレン、トルエン、エチルアセテート、ベンゾニトリル、シクロヘキサノン、ドデカン−１−オール、アセトニトリル／エタノール／水、デカン−１−オール、及びイソプロパノール／デカン−１−オールからなる群より選択される、請求項７〜１０のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体の製造方法。
【請求項１２】
前記重合溶液の全容量に対するモノマー及び架橋剤の全容量が、２０容量％以下である、請求項７〜１１のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体の製造方法。
【請求項１３】
前記重合溶液の全容量に対する架橋剤の全容量が、６容量％以下である、請求項７〜１２のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体の製造方法。
【請求項１４】
前記重合溶液中の重合開始剤の濃度が、１重量％〜３重量％である、請求項７〜１３のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体の製造方法。
【請求項１５】
巨視的に確認可能な相分離が、最大３０秒後に起こる、請求項７〜１４のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アフィニティークロマトグラフィーにおいて使用することができるクロマトグラフィー媒体、及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
下流処理において、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーは、高い効率のゆえに抗体の精製のために重要な方法である。単一工程で高純度の抗体が達成されることから、この方法は、経済的にも環境的にもその他の精製法とは区別される。製造目的のあらゆるクロマトグラフィー法の場合と同様に、クロマトグラフィー媒体の生産性は決定的に重要である。特に生産性は、該媒体が可能にする流速（透過性）と動的結合容量とから構成される。しかしながら、従来技術においてこれまで知られているクロマトグラフィー媒体は、低い流速若しくは低い透過性（例えば、プロテインＡゲルカラム）を示すか、又は低い動的結合容量（例えば、プロテインＡメンブレン吸着剤）を示す。
【０００３】
従来技術においては、多孔質マトリックスがその細孔中にマクロ多孔質の（非）架橋（ヒドロ）ゲルを有するように変性されたクロマトグラフィー媒体が知られている（例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、及び特許文献５を参照、以下において「従来技術文献１〜５」とも称される）。非特許文献１、非特許文献２の定義によれば、ポリマーゲルは、三次元架橋された網目構造からなり、溶剤中で或る限度まで膨潤するが、それ自体はそのポリマー自体についての良溶剤中では溶けない。非特許文献３からの定義によれば、ヒドロゲルは、含水であるが水不溶性のポリマーであり、その分子が化学的に、例えば共有結合若しくはイオン結合によって、又は物理的に、例えばポリマー鎖の絡み合いにより結合されて、三次元網目構造を形成している。導入された親水性ポリマー成分のため、ヒドロゲルは水中で膨潤して体積がかなり増大するが、それらの材料的な結びつきは失われない。
【０００４】
しかしながらまた、従来技術において知られているこれらのクロマトグラフィー媒体は、低い流速若しくは低い透過性を示すか、又は低い動的結合容量を示す。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第８，６５２，８４９号
【特許文献２】米国特許第７，３１６，９１９号
【特許文献３】米国特許第８，１３３，８４０号
【特許文献４】米国特許第７，２４７，３７０号
【特許文献５】欧州特許第１７７６１７６号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】"Dictionary of Polymers", Katsuyoshi Nishinari, Progr. Colloid Polym. Sci. (2009) 136: 87-94
【非特許文献２】Katsuyoshi Nishinari, "Some Thoughts on the Definition of a Gel"及び“Gels: Structures, Properties, and Functions: Fundamentals and Applications"（Springer Verlag Berlin Heidelberg 2009）
【非特許文献３】Roempp Online 2014
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明の課題は、高い流速を可能にすると共に高い動的結合容量を有するクロマトグラフィー媒体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題は、特許請求の範囲において特徴が示される本発明の実施の形態により解決される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明による変性２による本発明によるクロマトグラフィー媒体のＳＥＭ像（上部／中央）、及び変性前の多孔質出発マトリックスのＳＥＭ像（下部）を示す図である。
【図２】従来技術文献２（左上）、従来技術文献５（右上）、従来技術文献１（左下）、及び従来技術文献４（右下）の変性プロトコルによるクロマトグラフィー媒体のＳＥＭ像を示す図である。
【図３】実施例３による透過性の減少を示す図である。
【図４】動的結合容量ＤＢＣに対する破過パーセントとしてプロットされた、本発明によるクロマトグラフィー媒体及びＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ａの破過曲線を示す図である。
【図５】本発明による変性後及び変性前の比表面積をプロットした図である。
【図６】本発明によるクロマトグラフィー媒体のそれらの比表面積に対する動的容量をプロットした図である。
【図７】本発明によるクロマトグラフィー媒体及び未変性の出発マトリックスの細孔サイズ分布（上部）、トレーサー分子の流体力学的直径に対する、本発明によるクロマトグラフィー媒体の多孔率をプロットした図（下部）である。
【図８】変性の重合時間に対する、透過性（流速）、グラフト度、及び動的結合容量をプロットした図である。
【図９】相対グラフト度に対する透過性をプロットした図である。
【図１０】実施例９のための検量線を示す図である。
【図１１】本発明によるクロマトグラフィー媒体のそれぞれの比表面積に対する、動的リガンド利用をプロットした図である。
【図１２】本発明によるクロマトグラフィー媒体のそれぞれの比表面積に対する、静的リガンド利用をプロットした図である。
【図１３】本発明によるクロマトグラフィー媒体のそれぞれの比表面積に対する、固定化されたリガンドの量をプロットした図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
特に、本発明によれば、
多孔質マトリックスと、
非多孔質微小球と、
を含むクロマトグラフィー媒体であって、
非多孔質微小球は、多孔質マトリックスの内表面及び外表面上に結合されており、かつ、
微小球の平均半径は、多孔質マトリックスの平均細孔径の３０％以下である、クロマトグラフィー媒体が提供される。
【００１１】
本発明の文脈においては、用語「多孔質マトリックス」は、クロマトグラフィー法のための固定相として使用することができる任意の多孔質材料を意味すると理解される。本発明の多孔質マトリックス（本発明による方法において「出発マトリックス」と称される）は、該マトリックスが細孔を含むのであれば、特に何ら限定されない。該マトリックスの細孔の平均サイズ又は平均直径は、特に何ら限定されず、例えば０．０１μｍ〜２０μｍ、好ましくは０．１μｍ〜１０μｍ、より好ましくは０．２μｍ〜４μｍの平均細孔径を有するマトリックスを使用することが可能である。
【００１２】
上記マトリックスの更なる構造は、特に何ら限定されない。したがって、本発明によれば、多孔質マトリックスは、例えばメンブレン（中空糸膜を含む）、フィラメント、スプリットファイバ、ナノファイバ若しくは中空繊維、ショートカットファイバから構成される不織布、又はモノリスであることが可能である。多孔質マトリックスの材料も、特に何ら限定されず、本発明によれば、例えばセルロース水和物／セルロースエステル／酢酸セルロース、セルロースナノファイバ、ナイロンナノファイバ、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリ（オキシ−１，４−フェニルスルホニル−１，４−フェニル）、ポリアミド、ポリエステル、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリエチレン（ＰＥ）、及び／又はポリプロピレン（ＰＰ）から構成されるメンブレン又は不織布を使用することが可能である。
【００１３】
本発明によれば、フリーラジカル重合が可能な基を元々有する多孔質マトリックスか、又は当業者に既知の表面変性により官能基が挿入された多孔質マトリックスのいずれかが使用される。この文脈において、既知の表面変性は、例えば、官能基を有するモノマーのグラフト重合（「グラフトスルー」重合）、プラズマ処理、電子線処理、ガンマ照射による活性化、加水分解、アミノ分解、酸化、還元、官能性カルベン類及び／又はニトレン類との反応等である。その一方で、多孔質マトリックスは、フリーラジカル重合が可能な基が存在しなくても使用することができる。
【００１４】
本発明によれば、非多孔質微小球（ミクロスフェア）は、多孔質マトリックスの内表面及び外表面上に物理的手段、例えば付着性相互作用により、又は共有結合的手段、例えば、特に好ましい実施の形態においてはグラフト化により結合される。本発明の文脈においては、用語「非多孔質微小球」は、実質的に球状の構造を意味すると理解され、すなわち微小球の最小直径と最大直径との比率は、通常は好ましくは１：２〜１：１の範囲内である。本発明によれば、微小球の平均半径は、多孔質マトリックス（すなわち、微小球が結合していない多孔質マトリックス）の平均細孔径の３０％以下である。したがって、本発明によれば、微小球は、好ましくは約６μｍ以下の、より好ましくは３μｍ以下の、最も好ましくは１．２μｍ以下の平均半径を有する。本発明によれば、微小球又は細孔の直径又は半径は、微小球又は細孔の最大直径又は最大半径を意味すると理解される。多孔質マトリックスの細孔の直径又は半径と微小球の直径又は半径との両方は、例えば走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）により測定され得る。
【００１５】
本発明によるクロマトグラフィー媒体の微小球は、ゲル又はヒドロゲルではない。それというのも、それらの微小球は、あるとしても、親水性溶剤、例えば水及びアセトン中で非常に僅かしか膨潤しないからである。結果的に、該微小球は、従来技術文献１〜５の（ヒドロ）ゲルとは大きく異なる。
【００１６】
非多孔質マトリックスの内表面及び外表面上での非多孔質微小球の形成は、非多孔質微小球の実質的に球形の構造のため、多孔質マトリックスのみから構成されているクロマトグラフィー媒体と比較して、クロマトグラフィー媒体の比表面積を大幅に高める。本発明のクロマトグラフィー媒体の大幅に高められた表面積は、有利にはより多数のクロマトグラフィー活性中心を可能にし、こうして本発明によるクロマトグラフィー媒体は、高められた動的結合容量を有する。本発明によれば、用語「クロマトグラフィー活性中心」は、この関連においては、流体の或る特定の成分と選択的に結合を形成することができる表面官能基を意味するように示され、上記クロマトグラフィー活性中心は、微小球中に既に元々存在するか、しかしまた、該活性中心は、追加の変性によって微小球上に固定化されてもよい。
【００１７】
微小球の平均半径は、本発明によれば、多孔質マトリックスの平均細孔径の３０％以下であるので、多孔質マトリックスの細孔構造はかなり広く保たれており、こうして本発明によるクロマトグラフィー媒体の透過性の低下は、多孔質マトリックスのみから構成されているクロマトグラフィー媒体と比較しても殆ど起こらないことが有利である。したがって、本発明によるクロマトグラフィー媒体は、有利には高い流速（透過性）を可能にし、さらには高い動的結合容量を有する。本発明の好ましい実施の形態によれば、クロマトグラフィー媒体の透過性は、出発マトリックス（すなわち、微小球が結合していないクロマトグラフィー媒体の多孔質マトリックス）の透過性の少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、最も好ましくは少なくとも７０％である。
【００１８】
さらに、微小球は、アフィニティークロマトグラフィー用途に関して多孔質マトリックスの細孔サイズを最適化することを可能にする。すなわち、特に非多孔質微小球が存在しない場合に大きすぎる細孔サイズを有することとなる多孔質マトリックスの細孔を、標的分子がクロマトグラフィー過程において上記細孔中を対流的に流過するが、その場合に表面との相互作用を示さないように最適化することを可能にする。
【００１９】
本発明によれば、微小球は非多孔質であり、すなわち微小球は細孔を一切有しない。非多孔質微小球のため、有利には拡散によってのみ到達可能な細孔は存在しない。これにより、動的結合容量の滞留時間に対する依存性が最小となる。それというのも、この場合の動的結合容量は、クロマトグラフィー標的分子のクロマトグラフィー活性中心への拡散だけに依存するからである。さらに、これにより動的な分離過程におけるクロマトグラフィー活性中心への出入り可能性が増大するので、特に、クロマトグラフィー媒体へと後に導入されるクロマトグラフィー活性中心、例えば（アフィニティー）リガンド等の消費を最小にすることが可能となる。それというのも、リガンドは、固定化（導入）過程の間に、クロマトグラフィー標的分子が出入りすることができない細孔中には固定化されないからである。
【００２０】
本発明によるクロマトグラフィー媒体の微小球は、それらの平均半径が多孔質（出発）マトリックスの平均細孔径の３０％以下である限りは、特に何ら限定されない。微小球の材料も、特に何ら限定されない。好ましい実施の形態によれば、非多孔質微小球は、実質的に球形のオリゴマー及び／又はポリマー、特にグリシジル（メタ）アクリレート、置換又は非置換のアルキル（メタ）アクリレート及びそれらの誘導体（特に好ましくは、メチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、又はヒドロキシエチル（メタ）アクリレート）、スチレン及びその誘導体（特に好ましくは、クロロメチルスチレン又は４−アセトキシスチレン）、２−ビニル−４，４−ジメチルアズラクトン、置換又は非置換のＮ−アルキル（メタ）アクリルアミド及びそれらの誘導体、並びに置換又は非置換のＮ，Ｎ’−ジアルキル（メタ）アクリルアミド及びそれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１種のモノマーから構成されるオリゴマー及び／又はポリマーである。それというのも、これらは、以下に記載のように適切に合成により得ることができるからである。好ましい実施の形態によれば、上記少なくとも１種のモノマーは、エポキシ官能基を有する。それというのも、更なるクロマトグラフィー活性中心、例えば（アフィニティー）リガンド等は、上記官能基を介して合成により容易に達成可能な様式で導入することができ、及び／又は微小球は、上記官能基を介して容易に多孔質マトリックスへと結合され得るからである。本発明の更なる実施の形態によれば、微小球は単一のモノマーだけから構成されている。
【００２１】
本発明の好ましい実施の形態によれば、非多孔質微小球は、多孔質マトリックスの内表面及び外表面上に単層で結合される。それに対して、非多孔質微小球が多孔質マトリックス上に多層で結合される場合に、多孔質マトリックスの細孔が塞がれる危険性があり、これにより本発明によるクロマトグラフィー媒体の透過性に悪影響が及ぼされる場合がある。
【００２２】
本発明の好ましい実施の形態によれば、クロマトグラフィー媒体のグラフト度Ｐは、２５％〜４０％である。グラフト度Ｐは、
【数１】
0006889265.tif 000002
（式中、ｍｍは、本発明によるクロマトグラフィー媒体の質量であり、かつｍ０は、多孔質マトリックス（微小球が結合していない）の質量である）により示される。グラフト度Ｐが４０％より高い場合に、クロマトグラフィー媒体の透過性は減少し得る。それに対して、グラフト度が２５％未満である場合に、クロマトグラフィー媒体の表面積は、多孔質（出発）マトリックスと比べて相対的にわずかな程度しか増大し得ない。
【００２３】
本発明の好ましい実施の形態によれば、クロマトグラフィー媒体の相対グラフト度Ｐｒｅｌは、０．２５ｇ／ｃｍ３以下である。相対グラフト度Ｐｒｅｌは、
【数２】
0006889265.tif 000003
（式中、Ｐは、クロマトグラフィー媒体の上記定義のグラフト度（％）であり、ρは、多孔質マトリックス（微小球を有しない）の密度（ｇ／ｃｍ３）であり、かつＰｏｒは、多孔質マトリックス（微小球を有しない）の多孔率（％）である）により示される。クロマトグラフィー媒体の相対グラフト度が、従来技術文献１〜５と同様に０．２５ｇ／ｃｍ３より高い場合に、クロマトグラフィー媒体の透過性は減少し得る。
【００２４】
本発明の１つの実施の形態によれば、非多孔質微小球は、その微小球に結合されているか、又はその微小球上に固定化されている追加のクロマトグラフィー活性中心又はリガンドを含む。追加のクロマトグラフィー活性中心又はリガンドは、クロマトグラフィー過程において流体の或る特定の成分と選択的に結合を形成することが可能である。
【００２５】
例えば、挙げることができるクロマトグラフィー活性中心又はリガンドは、イオン交換体、キレート剤及び重金属キレート、様々な鎖長及び配置のチオフィリックな疎水性リガンド、逆相系、色素リガンド、アフィニティーリガンド、アミノ酸、補酵素、補因子及びその類似体、基質及びその類似体、内分泌物質及び外分泌物質、例えばホルモン及びホルモン様作用を有する物質、エフェクター及びその類似体、酵素基質、酵素インヒビター及びその類似体、脂肪酸、脂肪酸誘導体、共役脂肪酸及びその類似体、核酸、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ並びにその類似体及び誘導体（一本鎖、二本鎖、及び／又は多重鎖）、さらにまたペプチド核酸及びその誘導体、ウイルス、ウイルス粒子、モノマー並びにその類似体及び誘導体、オリゴマーないしポリマー並びにその類似体及び誘導体、線状又は分岐状であり得る高分子量炭水化物、非置換又は置換された高分子複合糖質、例えばヘパリン、アミロース、セルロース、キチン、キトサン並びにそのモノマー及びオリゴマー並びにその誘導体及び類似体、リグニン並びにその誘導体及び類似体、その他の生物学的／化学的リガンド、例えばオリゴペプチド及びポリペプチド、例えばタンパク質並びにそれらのオリゴマー、マルチマー、サブユニット、さらにまたその部分、特にレクチン、抗体、融合タンパク質、ヘプテン、酵素並びにそのサブユニット、さらにまたその部分、構造タンパク質、受容体及びエフェクター、さらにまたその部分、加えて生体異物、医薬品、及び有効医薬成分、アルカロイド、抗生物質、バイオミメティック等である。本発明の１つの実施の形態によれば、追加のクロマトグラフィー活性中心又はリガンドは、アニオン性基及びカチオン性基、疎水性基、アフィニティーリガンド、金属キレート、並びに反応性エポキシド基、アルデヒド基、アズラクトン基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、及び／又はカルボジイミド基からなる群より選択される。本発明の特に好ましい実施の形態によれば、追加のクロマトグラフィー活性中心又はリガンドは、プロテインＡ又はプロテインＢである。
【００２６】
本発明の更なる態様は、本発明によるクロマトグラフィー媒体の製造方法であって、
多孔質出発マトリックスを準備することと、
少なくとも１種のモノマー、二官能性、三官能性、又は多官能性の架橋剤、重合開始剤、及び溶剤又は溶剤混合物を含み、少なくとも１種のモノマー、二官能性、三官能性、又は多官能性の架橋剤、及び重合開始剤が、溶剤又は溶剤混合物中に完全に可溶性である重合溶液を準備することと、
重合溶液における重合を多孔質出発マトリックスの存在下で開始させることで、溶剤又は溶剤混合物中に不溶性であり、かつ多孔質出発マトリックスの内表面及び外表面へと結合されている非多孔質微小球を形成することと、
を含み、微小球の平均半径が、多孔質出発マトリックスの平均細孔径の３０％以下である、方法に関する。
【００２７】
本発明によるクロマトグラフィー媒体に関する全ての上記特記事項は、本発明によるクロマトグラフィー媒体を製造するための本発明による方法にも当てはまる。
【００２８】
本発明による方法の第１の工程においては、多孔質出発マトリックスが準備される。多孔質出発マトリックスは、特に何ら限定されず、例えば本発明によるクロマトグラフィー媒体について上記の多孔質マトリックスを使用することが可能である。そのような多孔質出発マトリックスは、市販されているか、又は当業者に既知の方法により製造することができる。
【００２９】
本発明による方法の第２の工程においては、少なくとも１種のモノマー、二官能性、三官能性、又は多官能性の架橋剤、重合開始剤、及び溶剤又は溶剤混合物を含み、上記少なくとも１種のモノマー、上記二官能性、三官能性、又は多官能性の架橋剤、及び上記重合開始剤が上記溶剤又は溶剤混合物中に完全に可溶性である重合溶液が準備される。
【００３０】
本発明によれば、単一のモノマー、又は２種以上の異なるモノマーの混合物のいずれかを使用することが可能である。上記少なくとも１種のモノマーは、それが使用される溶剤又は溶剤混合物中に完全に可溶性である限りは、特に何ら限定されない。好ましい実施の形態によれば、上記少なくとも１種のモノマーは、グリシジル（メタ）アクリレート、置換又は非置換のアルキル（メタ）アクリレート及びそれらの誘導体（特に好ましくは、メチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、又はブチル（メタ）アクリレート）、スチレン及びその誘導体（特に好ましくは、クロロメチルスチレン又は４−アセトキシスチレン）、２−ビニル−４，４−ジメチルアズラクトン、置換又は非置換のＮ−アルキル（メタ）アクリルアミド及びそれらの誘導体、並びに置換又は非置換のＮ，Ｎ’−ジアルキル（メタ）アクリルアミド及びそれらの誘導体からなる群より選択される。好ましい実施の形態によれば、上記少なくとも１種のモノマーは、エポキシ官能基を有する。それというのも、更なるクロマトグラフィー活性中心、例えば（アフィニティー）リガンド等は、上記官能基を介して合成により容易に達成可能な様式で導入することができ、及び／又は微小球は、上記官能基を介して容易に多孔質マトリックスへと結合され得るからである。
【００３１】
さらに、本発明による方法における重合溶液は、二官能性、三官能性、又は多官能性の架橋剤を含む。本発明によれば、用語「架橋剤」は、得られた微小球を多孔質出発マトリックスの内表面及び外表面に架橋することが可能な、特に上記オリゴマー又はポリマーを互いに架橋させることで、本発明による非多孔質微小球構造を得ることが可能な試薬を意味すると理解される。本発明による方法における架橋剤は、それが使用される溶剤又は溶剤混合物中に完全に可溶性であり、かつ二官能性、三官能性、又は多官能性である、すなわち形成されるべき三次元網目構造がそれを介して結合される２個、３個、又はそれより多くの官能基を有する限りは、特に何ら限定されない。本発明によれば、単一の架橋剤、又は２種以上の架橋剤の混合物のいずれかを使用することが可能である。好ましい実施の形態によれば、二官能性、三官能性、又は多官能性の架橋剤は、エチレングリコールジメタクリレート、トリメチルプロパントリメタクリレート、ジビニルベンゼン、及びＮ，Ｎ−メチレンビスアクリルアミドからなる群より選択される。
【００３２】
さらに、本発明による方法における重合溶液は、重合開始剤を含む。本発明によれば、用語「重合開始剤」は、フリーラジカル重合を、例えばＵＶ照射又は熱エネルギー入力により惹起可能な試薬を意味すると理解される。本発明による方法における重合開始剤は、それが使用される溶剤又は溶剤混合物中に完全に可溶性である限りは、特に何ら限定されない。本発明によれば、単一の重合開始剤、又は２種以上の重合開始剤の混合物のいずれかを使用することが可能である。好ましい実施の形態によれば、重合開始剤は、２−ヒドロキシ−４−（２−ヒドロキシエトキシ）−２−メチルプロピオフェノン、アゾビス（イソブチロニトリル）、４，４−アゾビス（４−シアノ吉草酸）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサンカルボニトリル）、ベンゾイルペルオキシド、２，２−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシ）ブタン、１，１−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシ）シクロヘキサン、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド、ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシイソプロピルカーボネート、シクロヘキサノンペルオキシド、及び２，４−ペンタンジオンペルオキシドからなる群より選択される。
【００３３】
本発明による方法の第３の工程においては、重合溶液における重合を多孔質出発マトリックスの存在下で開始させることで、溶剤又は溶剤混合物中に不溶性であり、かつ多孔質出発マトリックスの内表面及び外表面へと結合されている非多孔質微小球が形成される。重合の開始は、特に何ら限定されず、例えばＵＶ照射及び／又は熱的手段により行うことができる。
【００３４】
重合において、非多孔質微小球が形成され、その際、該非多孔質微小球は、多孔質出発マトリックスの内表面及び外表面に物理的手段により（例えば、付着により）又は共有結合的手段（例えばグラフト重合により）結合される。非多孔質微小球は、使用される溶剤又は溶剤混合物中に不溶性であり、すなわち検出可能な範囲内での溶解は起こらない。
【００３５】
本発明による方法の第２工程及び第３工程における溶剤又は溶剤混合物は、少なくとも１種のモノマー、二官能性、三官能性、又は多官能性の架橋剤、及び重合開始剤がその溶剤又は溶剤混合物中に完全に可溶性である、すなわち均質な重合溶液が存在する一方で、第３工程で生ずる微小球が上記溶剤又は溶剤混合物中に完全に不溶性である限りは、特に何ら限定されない。したがって、好ましい実施の形態によれば、シクロヘキサノール／ドデカン−１−オール、オクタン−２−オン、ｎ−ブチルアセテート、ｐ−キシレン、トルエン、エチルアセテート、ベンゾニトリル、シクロヘキサノン、ドデカン−１−オール、アセトニトリル／エタノール／水、デカン−１−オール、及びイソプロパノール／デカン−１−オールからなる群より選択される溶剤又は溶剤混合物が使用される。
【００３６】
本発明による方法の第３工程において生ずる微小球の平均半径は、多孔質出発マトリックス（すなわち、微小球を有しない多孔質出発マトリックス）の平均細孔径の３０％以下である。これは、少なくとも１種のモノマーと迅速に反応してオリゴマー及びポリマーを形成する重合開始剤の迅速な分解に基づく重合の間に生ずる非多孔質微小球により達成される。成長しているポリマー鎖が溶けない溶剤又は溶剤混合物において、迅速に、好ましくは最大３０秒の範囲内で生ずる巨視的に確認可能な相分離は、非多孔質微小球の形成をもたらす。反応溶液の全容量に対するモノマー及び架橋剤の使用される比率による表面との相互作用の結果として、かつ非常に短い反応時間の結果として、非多孔質微小球は、多孔質出発マトリックスの内表面及び外表面上にのみ形成し、多孔質出発マトリックスの細孔空間を埋める連結した網目構造を形成せず、したがって特有の多孔性を形成する。結果として、多孔質出発マトリックスの細孔構造はかなり広く保たれており、こうして従来技術文献１〜５のように細孔が完全に充填される場合に該当するようなクロマトグラフィー媒体の透過性の低下は明確に緩和され得る。
【００３７】
上記の球の形成を達成するために、重合溶液の全容量に対するモノマー及び架橋剤の全容量が２０容量％以下である重合溶液を使用することが好ましい。さらに、重合溶液の全容量に対する架橋剤の全容量は、好ましくは６容量％以下である。さらに、重合溶液中での重合開始剤の濃度は、好ましくは１重量％〜３重量％である。上述の好ましい条件及び重合溶液の成分を調整することによって、巨視的に確認可能な相分離が、最大３０秒後に、好ましくは最大２０秒後に起こることを保証することが可能であり、こうして多孔質出発マトリックスの内表面及び外表面に物理的に結合された又は共有結合された微小球であって、その平均半径が多孔質出発マトリックスの平均細孔径の３０％以下である微小球が生ずる。本発明によれば、「巨視的に確認可能な相分離」は、単相では均質な状態で存在していた重合溶液が不均質な二相又は多相の状態に達することを意味すると理解される。重合の間に、微小球構造の凝集は非常にわずかしか起こらず、すなわち、微小球の互いの架橋は、それらが発生する間に非常にわずかしか起こらず、こうして多孔質出発マトリックスの細孔の充填は、従来技術文献１〜５から既知のクロマトグラフィー媒体とは対照的にかなり大幅に妨げられる。
【００３８】
本発明によるクロマトグラフィー媒体の多孔質マトリックスの内表面及び外表面上の非多孔質微小球のため、該クロマトグラフィー媒体の比表面積は、有利には多孔質マトリックスのみから構成されているクロマトグラフィー媒体と比較して大幅に高められる。これは、有利にはより多数のクロマトグラフィー活性中心を可能にし、こうして本発明によるクロマトグラフィー媒体は、高められた動的結合容量を有する。同時に、多孔質マトリックスの細孔構造はかなり広く保たれており、こうして本発明によるクロマトグラフィー媒体の透過性の低下は、多孔質マトリックスのみから構成されているクロマトグラフィー媒体と比較して殆ど起こらないことが有利である。したがって、本発明によるクロマトグラフィー媒体は、有利には高い流速を可能にし、さらには高い動的結合容量を有する。さらに、微小球は、有利にはアフィニティークロマトグラフィー用途に関して多孔質マトリックスの細孔サイズを最適化することを可能にする。すなわち、特に非多孔質微小球が存在しない場合に大きすぎる細孔サイズを有することとなる多孔質マトリックスの細孔を、標的分子がクロマトグラフィー過程において上記細孔中を対流的に流過するが、その場合に表面との相互作用を示さないように最適化することを可能にする。非多孔質微小球のため、有利には拡散によってのみ到達可能な細孔は存在しない。これは有利には、動的結合容量の滞留時間に対する依存性を最小にする。さらに、これにより動的な分離過程におけるクロマトグラフィー活性中心への出入り可能性が増大するので、特に、クロマトグラフィー媒体へと後に導入されるクロマトグラフィー活性中心、例えば（アフィニティー）リガンド等の消費を最小にすることが可能となる。それというのも、該リガンドは、それらが固定化（導入）される間に、クロマトグラフィー標的分子が出入りすることができない細孔中には固定化されないからである。したがって、本発明によるクロマトグラフィー媒体は、アフィニティークロマトグラフィーにおいて使用するために、特にプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー又はプロテインＢアフィニティークロマトグラフィーのために極めて適している。
【００３９】
本発明を、以下の実施例に基づいてより具体的に説明するが、これらの実施例は限定的な効力を有するものではない。
【実施例】
【００４０】
多孔質出発マトリックス：
本発明による方法において出発マトリックスとして使用される０．０１μｍ〜２０μｍ、好ましくは０．１μｍ〜１０μｍ、より好ましくは０．２μｍ〜４μｍの細孔サイズを有する多孔質マトリックスを、当業者に既知の慣例的な製造方法により製造した。細孔サイズは、キャピラリーフローポロメトリー試験の実施により測定した。その測定のための詳細は、対応する作業説明書（Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｆｌｏｗ  Ｐｏｒｏｍｅｔｅｒ  ６．０、ＣＡＰＷＩＮ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍ、Porous Materials Inc.社）から集めることができる。
【００４１】
実施例１：表面の前処理
【化１】
0006889265.tif 000004
【００４２】
典型的な反応においては、出発材料、つまり再生され安定化されたセルロースを、水酸化ナトリウムを使用してｐＨ１３に調整された２０重量％のグリシジルメタクリレート水溶液中に一晩含浸させ、その後に逆浸透水（「ＲＯ水」）で１５分間すすいだ。その後に、処理されたメンブレンを８０℃で３０分間乾燥させた。
【００４３】
実施例２：処理された表面上でのグラフトポリマーの作製
典型的な重合溶液のために、例えば１．７ｍＬ（１．８２ｇ、１２．７９ｍｍｏｌ、０．１０当量）のグリシジルメタクリレート（モノマー）、０．１６ｇ（０．７１ｍｍｏｌ、７×１０−３当量）の２−ヒドロキシ−４−（２−ヒドロキシエトキシ）−２−メチルプロピオフェノン（重合開始剤）、０．３３ｍＬ（０．３４７ｇ、１．７５ｍｍｏｌ、０．０１３当量）のエチレングリコールジメタクリレート（架橋剤）、０．３４ｍＬ（０．２８ｇ、１．７８ｍｍｏｌ、０．０１４当量）の１−デカノール、及び１３．３６ｍＬ（１２．８５ｇ、１２８．３２ｍｍｏｌ、１．００当量）のシクロヘキサノール（溶剤混合物）を秤量又は量り、そして完全に溶解するまで３０分間にわたり超音波浴中で処理した。その後に、重合溶液で濡らした試料に、不活性条件（Ｎ２雰囲気）下でＵＶ光（紫外光、２５４ｎｍ、４０Ｗ）（５分間）を照射した。ここで行われるＵＶで開始される慣用のフリーラジカル重合のために、製造業者LLG社製のＢＬＸ−Ｅ２５４  ＢＩＯ−Ｌｉｎｋ  ＵＶ架橋剤を使用した。次いで重合されたメンブレンを、流れているＲＯ水のもとで１０分間すすぎ、その後にアセトン中で２０分間にわたり振盪し、風乾させた。
【００４４】
【化２】
0006889265.tif 000005
【００４５】
使用される化学物質並びにそれぞれの場合に使用される容量％及び重量％での量を示す以下の具体的な例示的な実施の形態を実施した。
【００４６】
【表１】
0006889265.tif 000006
【００４７】
図１は、本発明による変性２による本発明によるクロマトグラフィー媒体のＳＥＭ像（上部／中央）、及び変性前の多孔質出発マトリックスのＳＥＭ像（下部）を示す。図１は、微小球が出発マトリックスの表面上にのみグラフトされており、出発マトリックスの実際の細孔構造は事実上保たれていることを明らかに示している。さらに、微小球自体が多孔性を示さないことは明白である。
【００４８】
それに対して、図２は、同じ出発マトリックスを用いて従来技術文献２（左上）、従来技術文献５（右上）、従来技術文献１（左下）、及び従来技術文献４（右下）の変性プロトコルに従って変性されたクロマトグラフィー媒体のＳＥＭ像を示す。これらの変性条件下では、細分化された微小球構造は現れず、多孔質出発マトリックスの細孔は、完全に充填され、そして球状構造は、存在するとしても非常に高度に凝集されていることを容易に認識することができ、こうして有効表面積は大幅に低減され、モノマーにより生成された更なる多孔性が出発マトリックスの細孔中に生ずる。
【００４９】
実施例３：クロマトグラフィー媒体の透過性の測定
丸形パンチを使用して、４７ｍｍの円形のブランクを実施例２によるクロマトグラフィー媒体から打ち抜いた。得られた４７ｍｍの打ち抜き物を逆浸透水で濡らし、流れている逆浸透水のもと５分間すすいだ。各々の打ち抜き物を、Sartorius社のモデル１６２４９のトップフィード型濾過ハウジング内に取り付けた。
【００５０】
各々の測定は、２０℃〜２５℃及び０．１０ｂａｒの正圧で行った。１００．０ｇの媒体がクロマトグラフィー媒体を流過するために要する時間を測定した。こうして求められた流速の示される単位は、ｍｌ／ｃｍ２×分×ｂａｒである。使用される媒体は、逆浸透水及び７．５のｐＨを有するリン酸緩衝生理食塩溶液の両方である。流速の測定後に、それらの打ち抜き物を、更なる分析のために使用することが可能であった。
【００５１】
図３は、出発マトリックスの内表面及び外表面上での微小球の形成を介した多孔質出発マトリックスの本発明による変性２（「Ｉｎｖ．Ｍｏｄ．２」）の結果として、透過性は、未変性の出発マトリックスの透過性の少なくとも４０％であることを示している。それに対して、出発マトリックスが従来技術文献１〜５の変性プロトコル（「Ｍｏｄ．ＰＡ  １〜Ｍｏｄ．ＰＡ  ５」）に従って変性されると、変性されたクロマトグラフィー媒体の透過性は、未変性の出発マトリックスの透過性の２６％以下であり、それどころか、殆どの場合に出発透過性の２０％を大きく下回る。
【００５２】
実施例４：タンパク質の固定化
タンパク質（リガンド）を、本発明によるクロマトグラフィー媒体の微小球のエポキシ官能基（epoxide functionalities）をアルデヒド官能基へと変換することにより固定化した。タンパク質（リガンド）を、直接的にそこに固定化することが可能であった。このために、本発明により変性されたクロマトグラフィー媒体を、ＲＯ水中の３％（重量％）の過ヨウ素酸ナトリウム溶液中に入れて、引き続き、流れているＲＯ水のもと１０分間すすぎ、空気中でアセトンから乾燥させた。その後に、こうして製造されたクロマトグラフィー媒体を、リン酸水素カリウム緩衝液（ｐＨ８）中の２．５％（重量％）のシアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液中に２時間入れて、そこに４．９５８μＬ／ｃｍ２の組み換えタンパク質溶液（１ｍＬは５０．４ｍｇのタンパク質と定義する）を添加することで、７．２ｍｇ／ｍＬの濃度を達成した。その後に、該クロマトグラフィー媒体を再びＲＯ水ですすぎ、ＲＯ水中の０．０１％（重量％）の水素化ホウ素ナトリウム溶液中に１０分間入れた。その後に、該クロマトグラフィー媒体を、１×ＰＢＳ緩衝液（リン酸緩衝食塩溶液）で洗浄し、引き続き２０％のエタノール／ＰＢＳ溶液中で貯蔵した。
【００５３】
実施例５：免疫グロブリンＧに関する結合容量の測定
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の結合を、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．５）中の適切なタンパク質溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を使用することにより測定した。実施例２により本発明に従って変性されて、実施例４によりプロテインＡで官能化された３層のメンブレンを、メンブレンホルダー中に張着させた。その積層メンブレンは、該メンブレンホルダー中で１５ｃｍ２のメンブレン面積、５ｃｍ２の流入面積、及び５００μｍのベッド高さ（積層メンブレンの厚さ）を有していた。メンブレンホルダー中のメンブレンに１×ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．５）を注入して、空気を排除し、その後にGeneral Electric Health Care社製のＡｅｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００  ＦＰＬＣシステムに接続した。
【００５４】
次いで、上記メンブレン又は積層メンブレンを、４つの工程を含む試験プログラムを使用してＩｇＧ結合に関して分析した。その試験プログラムの４つの工程を、以下に示す：
１．  メンブレンを２５ｍＬの１×ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．５）で平衡化する工程、
２．  メンブレンに５０ｍＬのＩｇＧ溶液をロードする工程、
３．  ２０ｍＬの１×ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．５）で洗浄する工程、及び、
４．  ０．１％のグリシン溶液（ｐＨ＝３．５）で溶出させる工程。
【００５５】
全ての工程は、５メンブレン容量／分の流速で実施した。全ての工程において、２８０ｎｍでの吸収をメンブレンユニットの後方の検出器において測定した。
【００５６】
図４は、動的結合容量ＤＢＣに対する破過パーセントとしてプロットされた、本発明による変性１による本発明に従って製造されたクロマトグラフィー媒体の破過曲線を示す。参照として、市販のプロテインＡメンブレン吸着剤（Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ａ）の破過曲線がプロットされている。図４は、本発明によるクロマトグラフィー媒体の比表面積が、本発明による変性の結果として、すなわち微小球の形成の結果として大幅に高まり、これにより、有利には明らかにより高い動的結合容量がもたらされることを明確に示している。
【００５７】
実施例６：実施例２により変性されたメンブレンの比表面積の測定
行われる表面積測定は、micromeritics社製のＧｅｍｉｎｉ  Ｖを用いて実施された。測定されるべき試料を事前に秤量し、試料チャンバー中に入れた。それを引き続き７０℃及び２ｍｂａｒ（micromeritics社製のＶａｃＰｒｅｐ  ０６１により発生された負圧）で２時間にわたり全体的に加熱した。その後に、試料チャンバーを窒素でフラッシングし、再び７０℃及び２ｍｂａｒで１時間にわたり全体的に加熱した。実際の測定のために、窒素を、分析されるべき材料に導通させた。液体窒素による冷却（−１９６℃）に基づいて、標準的な圧力測定機器を使用して窒素の飽和蒸気圧未満で、吸着された量を測定することが可能であった（吸着）。引き続いての該装置内の圧力の減少により、吸着されたガス量の一部が表面から引き離された（脱着）。結果として、吸脱着等温線を求めることが可能であった。０．０５ｍｂａｒから０．３ｍｂａｒまでの相対圧力範囲内では、この関連において測定される吸着されたガスの量又は放出されたガスの量は、表面積に比例している。それらの結果は、直接的にｍ２／ｇで出力された。
【００５８】
図５は、本発明による変性後及び変性前（すなわち、微小球を有しない多孔質出発マトリックス）の比表面積をプロットした図（a plot）を示している。出発マトリックスの比表面積にかかわらず、本発明によるクロマトグラフィー媒体の比表面積は、微小球構造の形成の結果として変性前よりも常に大きい。図６から明らかなように、その他は同じ条件下で、本発明による変性は、有利にはプロテインＡメンブレン吸着剤への高められたＩｇＧの動的結合容量をもたらす（実施例４による固定化）。
【００５９】
実施例７：本発明によるクロマトグラフィー媒体の細孔サイズの測定、及び逆サイズ排除クロマトグラフィー（ＩＳＥＣ）による多孔率の測定
細孔サイズは、キャピラリーフローポロメトリー試験の実施により測定した。詳細は、対応する作業説明書（Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｆｌｏｗ  Ｐｏｒｏｍｅｔｅｒ  ６．０、ＣＡＰＷＩＮ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍ、Porous Materials Inc.社）から集めることができる。
【００６０】
全ての多孔率測定実験は、脱ガス装置を備えるクォータナリポンプと、温度調節されるオートサンプラーと、ダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）と、屈折率（ＲＩ）検出器とからなるＳｔａｎｄａｒｄ  Ａｇｉｌｅｎｔ  ＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍ（Agilent Technologies社）で実施した。アセトントレーサーシグナルは、ＤＡＤを使用して２８０ｎｍの波長で記録した。プルラントレーサーシグナルは、ＲＩ検出器を使用して追跡した。全ての記録されたシグナルについて、第１及び第２の統計モーメントを測定し、Haynes及びSarmaら（AlChE Journal, Volume 19, No. 5, pp. 1043-1046）により提案されたように計算した。こうして得られた値を、ＨＰＬＣシステムの影響を考慮に入れるために更に補正した：
【数３】
0006889265.tif 000007
（式中、μｐ及びσｐ２は、トレーサーシグナルの第１及び第２の統計モーメントを表し、μｐ，ｏｂｓ及びσｐ，ｏｂｓ２は、システム全体に関連し、一方で、μＨＰＬＣ及びσＨＰＬＣ２は、ＨＰＬＣシステムの影響だけを記載している。Ｃｉ（Ｌ，ｔ）は、時点ｔでの検出器におけるトレーサー物質ｉの濃度を表している）。
【００６１】
トレーサーの分子サイズに対する特定のクロマトグラフィー媒体の多孔率を測定するために、トレーサー物質として様々なモル質量を有するプルラン分子を使用した。それらの流体力学的半径を、Segreら（Biomacromolecules 2003, 4, 1843-1847）により提案されたようにモル質量に基づいて計算した。分子サイズに対するクロマトグラフィーベッド中の出入りすることができる容積割合を、以下の通りに計算した：
【数４】
0006889265.tif 000008
（式中、εは、出入りすることができる容積割合（多孔率）を表し、Ｖは、カラム体積を表し、そしてＦは、体積流速を表す）。
【００６２】
図７は、使用された多孔質出発マトリックスと比較した本発明によるクロマトグラフィー媒体（本発明による変性１による）の細孔サイズ分布（上部）と、出発マトリックス及び本発明により変性されたクロマトグラフィー媒体についての、ＩＳＥＣを介して求められたトレーサー分子の流体力学的直径に対する多孔率をプロットした図（下部）とを示している。図７から明らかなように、本発明によれば、出発マトリックスの細孔サイズを用途に応じて調節することが可能であり、そして本発明による変性後には、そのクロマトグラフィー媒体は、いずれの場合においても出発マトリックスよりも小さい細孔サイズを有する。これは、非多孔質微小球のグラフト化による出発マトリックスの既存の細孔のサイズ減少の結果としてのみ起こるにすぎない。さらに、図７は、同じ変性を伴う様々な出発マトリックスの比較測定により、微小球の多孔性は除外され得ることを示している。もし微小球が、すなわち多孔質であるか、又は出発マトリックスの細孔が、架橋されたマクロ多孔質ゲルにより塞がれたのであれば、同じ変性を伴う様々な出発材料にもかかわらず、細孔分布の重複が起こっていなければならないが、その場合には該当しない。
【００６３】
実施例８：本発明によるクロマトグラフィー媒体の膨潤度及びグラフト度の測定
膨潤度は、溶剤中での膨潤に際してのポリマーメンブレンの相対的な体積増加を表す。実用的な理由から、膨潤度を、ＰＢＳ緩衝液中でプロテインＡアフィニティー吸着剤について測定した。このために、まずは乾燥状態でのクロマトグラフィー媒体の体積（Ｖ０）を測定し、次に湿潤状態での体積（ＶＱ）を測定した。含水量による測定誤差をできる限り排除するために、乾燥体積の測定は、乾燥棚において８０℃（３０分）で乾燥させた後に実施した。膨潤度Ｑは、以下の式を介して測定した：
【数５】
0006889265.tif 000009
【００６４】
以下の表は、本発明による変性１によるクロマトグラフィー媒体及び変性されていない多孔質出発マトリックス（セルロースメンブレン）に対して測定された、実施例３及び実施例８による水及びアセトンでの膨潤測定及び流速測定からの結果を示している。
【００６５】
【表２】
0006889265.tif 000010
【００６６】
その親水性構造のため出発材料により示される親水性溶剤としての水中での膨潤は、グラフト化された微小球によりかなり大幅に妨げられている一方で、非プロトン性溶剤としてのアセトン中では、主に出発マトリックスにより引き起こされる非常に僅かな膨潤が起こるにすぎない。透過性についても、２つの溶剤において大きな違いは示されない。このことが更に膨潤を除外する。定義上、こうしてグラフトされた微小球は、従来技術文献１〜５からのポリマーとは異なり、ポリマーゲル／ヒドロゲルであるとみなすことはできない。
【００６７】
グラフト度は、変性後の出発マトリックスの相対的な質量増加を表す。このために、まずは変性前の出発マトリックスの質量（ｍ０）を測定し、次に変性後の質量（ｍｍ）を測定した。含水量による測定誤差をできる限り排除するために、質量の測定は、乾燥棚において８０℃（３０分）で乾燥させた後に実施した。グラフト度Ｐは、以下の式を介して計算した：
【数６】
0006889265.tif 000011
【００６８】
図８は、出発マトリックスの変性の重合時間に対する、透過性（流速）、グラフト度Ｐ、及びＩｇＧについてのプロテインＡメンブレン吸着剤の動的結合容量をプロットした図を示している。グラフト度は、この関連において、変性のための成分の選択と反応期間との両方を介して調節することができる。図８から、本発明による組成物が、本発明による構造的特徴をもたらす非常に迅速な反応時間を可能にすることが明らかである。重合時間の増加に伴って、グラフト度は、水についての透過性及びＩｇＧについての動的結合容量が減少するのと同時に増加する。本発明による場合においては、高いグラフト度は最大値を示し、それを超過するとクロマトグラフィー媒体のより粗悪な性能がもたらされる。特に、従来技術文献に開示される１２０分間の長い重合時間は、クロマトグラフィー媒体の性能にもっぱら悪影響を及ぼす（実施例９も参照のこと）。
【００６９】
先に説明されたように、グラフト度は、以下の等式を介して相対グラフト度としても記載することができる：
【数７】
0006889265.tif 000012
（式中、Ｐは、クロマトグラフィー媒体の上記定義のグラフト度（％）であり、ρは、微小球を有しない多孔質マトリックスの密度（ｇ／ｃｍ３）であり、かつＰｏｒは、微小球を有しない多孔質マトリックスの多孔率（％）である）。
【００７０】
図９は、それぞれの相対グラフト度に対する、本発明によるクロマトグラフィー媒体（菱形）及び引用された従来技術文献１〜５からのクロマトグラフィー媒体（正方形）の透過性をプロットした図を示している。引用された従来技術文献１〜５におけるクロマトグラフィー媒体の相対グラフト度は、０．２５ｇ／ｃｍ３より高く、これは、クロマトグラフィー媒体の透過性の明らかな低下をもたらす。それに対して、本発明によるクロマトグラフィー媒体は、有利には、そのより低いグラフト度のためより高い透過性を示す。
【００７１】
さらに、透過性と相対グラフト度との間の相関は、非多孔質微小球が本発明によるクロマトグラフィー媒体の出発マトリックスの細孔を狭めるにすぎないことを非常に明確に示している。それというのも線形相関が見出されるからである。さらに、例としては、上記線形相関の第２の測定点に基づき、求められた細孔サイズと流速（透過性）との間でハーゲン・ポアズイユの挙動を示し得る。
【００７２】
ハーゲン・ポアズイユの式は、一般的に流体及びその特性が不変のままである場合の、管の半径及び長さの変化に伴う管を通じた定常層流の場合における体積流速の変化を表している。本発明によれば、メンブレンの長さは不変のままであり、そして細孔径は微小球による変性の結果として狭まるにすぎないので、ここでは、本発明によるクロマトグラフィー媒体の仮定される挙動、及びそれと関連する本発明により仮定される構造的性質（出発マトリックスの細孔を狭めるだけで、細孔を塞がない非多孔質微小球）が当てはまることが想定され得る。
【００７３】
【表３】
0006889265.tif 000013
【００７４】
【数８】
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【００７５】
上記表により示されるように、計算された流速と実験に基づく流速とは、本発明によるクロマトグラフィー媒体の場合には非常によく一致しているが、一方で、従来技術文献からのクロマトグラフィー媒体の場合にはこれは観察され得ない。これにより、本発明による変性の場合に、出発マトリックスの細孔はグラフト度の増大に伴って益々狭められると推論され得る一方で、従来技術文献からのクロマトグラフィー媒体においてマクロ多孔質ゲルは、細孔を完全に充填するため、その流速はマクロ多孔質ゲルの多孔率により決定される。それというのも、ここでは線形の挙動は観察され得ないからである。さらに、従来技術文献におけるクロマトグラフィー媒体の流速（透過性）は、本発明によるクロマトグラフィー媒体の流速より小さい。
【００７６】
実施例９：アフィニティー吸着剤上の固定化されたクロマトグラフィー活性中心（リガンド）の測定
メンブレン面積当たりのクロマトグラフィー活性中心（リガンド）としての固定化されたタンパク質の測定のために、ＢＣＡ（ビシンコニン酸）アッセイを使用した。このために、本発明によるクロマトグラフィー媒体から打ち抜き物（ｄ＝１３ｍｍ）を打ち抜き、それらを最初にペトリ皿（３ｍＬ容）中に入れて、ＢＣＡ試薬（２ｍＬ）で濡らした。ＢＣＡ試薬は、比率５０：１でＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ａ（Pierce社の製品番号２３２２１）とＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｂ（Pierce社の製品番号２３２２４）とからなっていた。その後に、こうして製造された試料を、振盪プラットフォーム（８０ｒｐｍ）上で６０分間にわたり揺り動かした。
【００７７】
ＢＣＡ試薬の酸化により得られる色の変化を、メンブレン試料を有しないＢＣＡ試薬の参照溶液と比較して吸光度（５６２ｎｍ）として測定した。測光測定は、Analytik Jena社製のＳｐｅｃｏｒｄ  ２００  ＰＬＵＳ  ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計において行った。図１０の検量線により以下の等式が得られ、それにより吸光度をタンパク質質量（μｇ）へと変換することができた。
【００７８】
引き続きこの値を、打ち抜き物の体積に関連付け、１ｍＬのメンブレン体積（ＶＭ）当たりのタンパク質のμｇ数で特定した。
【数９】
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【００７９】
図１１〜図１３は、本発明によるクロマトグラフィー媒体のそれぞれの比表面積に対する、動的リガンド利用をプロットした図（図１１）、及び静的リガンド利用をプロットした図（図１２）、及び固定化されたリガンドの量をプロットした図（図１３）を示している。
【００８０】
図１１〜図１３から分かるように、微小球により生成された本発明によるクロマトグラフィー媒体のより大きな比表面積は、多数の結合されたリガンドをもたらし、驚くべきことにより良好なリガンド利用をもたらす。
【００８１】
クロマトグラフィー媒体の性能「Ｐｅｒ」が以下の通りに定義される場合に、以下の表により示されるように、市販のアフィニティー吸着剤及び引用された従来技術文献１〜５からのアフィニティー吸着剤と比較して明らかな性能の増大がもたらされる。
【数１０】
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【００８２】
【表４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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