(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下水処理バイオフィルムの最適な保管保存温度を決定する方法であって、前記方法は、フローサイトメトリーに基づいて下水処理バイオフィルムの細胞活性状態を測定し、異なる温度で保存されたバイオフィルムと保存前のバイオフィルム細胞の活性状態に対する測定結果を比較し、保存前のバイオフィルム細胞の活性状態に最も近い保存温度を最適な保管保存温度とし、前記バイオフィルムの細胞活性状態の測定は、生細胞、初期アポトーシス細胞、後期アポトーシス細胞、および死細胞の含有量の測定を含み、
前記フローサイトメトリーにより最適温度を決定するステップは、
（１）下水処理バイオフィルム試験サンプルの調製：バイオフィルムサンプルを緩衝液で希釈し、均一に振って、濾過し、遠心分離し、上澄み液を残し、事前に冷却したリン酸緩衝液で細胞を洗浄し、遠心分離と洗浄を２回繰り返し、続いて、上澄み液を取ってサンプルとし、適切な量の１０ｘ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒと均一に混合して調製するステップと、
（２）フローサイトメーターに置いて各サンプルの細胞活性状態を測定するステップと、を含む、ことを特徴とする、
下水処理バイオフィルムの最適な保管保存温度を決定する方法。
【請求項２】
前記バイオフィルムが好気性粒状スラッジである場合、５〜１５μｍの孔径のナイロン膜で濾過する、ことを特徴とする、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記バイオフィルムが硝化脱窒バイオフィルムである場合、６〜８μｍの孔径のナイロン膜で濾過する、ことを特徴とする、
請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記バイオフィルムが好気性粒状スラッジである場合、試験サンプルの調製は、ｐＨ７．０〜８．０の緩衝液で好気性粒状スラッジを希釈することにより調製される、ことを特徴とする、
請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記バイオフィルムが硝化脱窒バイオフィルムである場合、その試験サンプルの調製は、ｐＨ６．６〜７．０の緩衝液で硝化脱窒バイオフィルムを希釈することにより調製される、ことを特徴とする、
請求項１に記載の方法。
【請求項６】
緩衝液とバイオフィルムの希釈体積比は、８〜１０：１である、ことを特徴とする、
請求項１に記載の方法。
【請求項７】
バイオフィルムエンジニアリングを迅速に開始する方法であって、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法を使用してバイオフィルムの最適な保存温度を決定し、それは、バイオフィルムを予備培養し、その後、保存マトリックスにおいて最適な保存温度で保存し、活性回復後にエンジニアリングアプリケーションを行うことができる、ことを特徴とする、
バイオフィルムエンジニアリングを迅速に開始する方法。
【請求項８】
前記好気性粒状スラッジの保存マトリックスにおいて、２５０〜３５０ｍｇ／ＬのＣＯＤ、５５〜６５ｍｇ／ＬのＮＨ４＋−Ｎ、および６〜１０ｍｇ／ＬのＰＯ４３−−Ｐがある、ことを特徴とする、
請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記好気性粒状スラッジの活性回復は、好気性粒状スラッジをシーケンスバッチ反応器に接種することであり、排水率は４５〜６０％、反応期間は２．５〜４時間であり、静的流入期間は１〜１．５時間であり、曝気反応時間は１．５〜２．５時間であり、スラッジ沈殿期間は２〜６分間であり、急速排水期間は２〜６分間である、ことを特徴とする、
請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
シーケンスバッチ反応器が、流入部の嫌気性状態と反応部の好気性状態を確保するように、リアルタイム制御システムによって空気と窒素の含有量と割合を制御する、ことを特徴とする、
請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記硝化脱窒バイオフィルムの保存マトリックスにおいて、１８０〜２２０ｍｇ／ＬのＣＯＤ、２５〜３５ｍｇ／ＬのＮＨ４＋−Ｎ、１８〜２５ｍｇ／ＬのＮＯ３−−Ｎ、および６〜１０ｍｇ／ＬのＰＯ４３−−Ｐがある、ことを特徴とする、
請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記硝化脱窒バイオフィルムの活性回復は、硝化脱窒バイオフィルムをバイオリアクターに接種することであり、無酸素−好気性プロセスに基づいて、ＨＲＴを１０〜１５時間に設定し、硝化脱窒バイオフィルムの充填率は４０％〜６０％であり、硝化液還流率は７０％〜８５％である、ことを特徴とする、
請求項７または１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、下水処理バイオフィルムの最適な保存温度を決定する方法に関し、環境工学の技術分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
下水処理場の有機汚染物質の含有量が低いことは、常に全窒素の排出を制限するための技術的困難であり、同時に、下水処理と排出基準の改善により、拡張と構築プロジェクトにより多くの土地が占有され、大量の有機炭素源材料とリン除去化学物質が水域に追加されるため、投資の建設と運用コストが大幅に増加し、従来の活性スラッジプロセスは汚染物質排出の要件を満たすことができず、さらに下水処理場の省エネルギー効果に深刻な影響を及ぼす。そのため、土地節約目標と低炭素源に基づく下水脱窒技術が注目を集める。下水処理プロセスにおけるより効果的な下水処理プロセスには、好気性粒状スラッジおよび硝化脱窒バイオフィルムプロセスなどが含まれ、ここで、好気性粒状スラッジプロセスは、優れた沈降性能、低い運用コスト、高いバイオマスと処理効率を持ち、大きな開発の可能性を有し、硝化と脱窒のバイオフィルムプロセスは、硝化と脱窒を同時に達成することができ、下水中のアンモニア態窒素と全窒素の除去にも重要である。
【０００３】
しかし、工学の例では、硝化脱窒バイオフィルムの膜形成期間は約３０〜４０日であり、好気性粒状スラッジの培養期間は７０〜１２０日であり、かつ、培養条件は比較的過酷である。好気性粒状スラッジおよび硝化脱窒バイオフィルムを成熟させて保存できれば、流入する炭素源を低く抑えるのに効果的であり、土地資源が不足している下水処理場は、短期間で動作し始め、汚染物質が標準に達するまで排出させる。温度は、バイオフィルムの活性に影響を与える重要なパラメータであり、好気性粒状スラッジおよび硝化脱窒バイオフィルムなどのバイオフィルムの保存に最適な温度を決定し、その活性回復プロセスの簡素化に役立ち、エンジニアリングアプリケーションの起動時間を短縮し、省エネルギーの効果を達成する。しかしながら、従来の方法では、最適な保存温度の決定について、好気性粒状スラッジおよび硝化脱窒バイオフィルムをバイオリアクターに再接種する必要があり、好気性粒状スラッジおよび硝化脱窒バイオフィルムの活性回復効果を決定するのに約８〜３５日かかり、これは時間がかかり、エンジニアリングアプリケーションを制限する鍵になる。
【発明の概要】
【０００４】
好気性粒状スラッジおよび硝化脱窒バイオフィルムなどのバイオフィルム活性の回復プロセスを簡素化するために、下水処理場の汚染物質を短期間で基準に達成させて排出し、同時に、土地の節約と省エネルギーの効果が達成する。本発明は、フローサイトメトリーに基づいて、異なる温度条件下で保存されたバイオフィルム中の細胞の活性状態を特徴付け、かつ、バイオフィルム活性の回復後の細胞活性状態および汚染物質に対する除去効果に従って、フローサイトメトリーの特徴付け結果を検証し、最後に、バイオフィルムの最適な保管保存温度を決定するフローサイトメトリーに基づく方法が提供され、下水処理場の高水準の汚染物質排出と省エネルギーの運転のための技術サポートを提供する。
【０００５】
本発明の第一目的は、下水処理バイオフィルムの最適な保管保存温度を決定する方法を提供することであり、前記方法は、フローサイトメトリーに基づいて下水処理バイオフィルムの細胞活性状態を測定し、異なる温度で保存されたバイオフィルムと保存前のバイオフィルム細胞の活性状態に対する測定結果を比較し、保存前のバイオフィルム細胞の活性状態に最も近い保存温度を最適な保管保存温度とする。
【０００６】
本発明の一実施形態では、前記バイオフィルムの細胞活性状態の測定は、生細胞、初期アポトーシス細胞、後期アポトーシス細胞、および死細胞の含有量の測定を含む。
【０００７】
本発明の一実施形態では、前記バイオフィルムは、好気性粒状スラッジおよび硝化脱窒バイオフィルムを含む。
【０００８】
本発明の一実施形態では、前記フローサイトメトリーにより最適温度を決定するステップは、
（１）バイオフィルム試験サンプルの調製：バイオフィルムサンプルを緩衝液で希釈し、均一に振って、濾過し、遠心分離し、上澄み液を残し、事前に冷却したリン酸緩衝液で細胞を洗浄し、遠心分離と洗浄を２回繰り返し、続いて、上澄み液を取ってサンプルとし、適切な量の１０ｘ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒと均一に混合して調製するステップと、
（２）フローサイトメトリーに置いて各サンプルの細胞活性状態を測定するステップと、を含む。
【０００９】
本発明の一実施形態では、リン酸緩衝液を緩衝液として希釈する。
本発明の一実施形態では、前記リン酸緩衝液は、リン酸二水素ナトリウムおよびリン酸水素二ナトリウムを含む。
【００１０】
本発明の一実施形態では、前記バイオフィルムが好気性粒状スラッジである場合、その試験サンプルの調製は、ｐＨ７．０〜８．０の緩衝液で好気性粒状スラッジを希釈することにより調製される。
【００１１】
本発明の一実施形態では、前記バイオフィルムが硝化脱窒バイオフィルムである場合、その試験サンプルの調製は、ｐＨ６．６〜７．０の緩衝液で硝化脱窒バイオフィルムを希釈することにより調製される。
【００１２】
本発明の一実施形態では、前記緩衝液とバイオフィルムの希釈体積比は、８〜１０：１である。
【００１３】
本発明の一実施形態では、前記バイオフィルムが好気性粒状スラッジである場合、５〜１５μｍの孔径を有するナイロン膜で濾過する。
【００１４】
本発明の一実施形態では、前記バイオフィルムが硝化脱窒バイオフィルムである場合、６〜８μｍの孔径を有するナイロン膜で濾過する。
【００１５】
本発明の一実施形態では、前記遠心分離速度は５０００〜１００００ｒｐｍである。
【００１６】
本発明の一実施形態では、前記サンプル上澄み液と１０ｘ ＡｎｎｅｘｉｎＶ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒの混合体積比は１：２〜４である。
【００１７】
本発明の一実施形態では、前記フローサイトメトリーによる各サンプルの細胞活性状態の測定は、対照ＦＩＴＣ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖグループに０．５μLのＰＩ染色剤を加え、対照ＰＩグループに０．５μLのＦＩＴＣ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖを加え、試験グループに０．５μLのＦＩＴＣ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖと０．５μLのＰＩを加え、均一に混合した後に室温かつ暗所でインキュベートし、その後、フローサイトメーターで試験する。
【００１８】
本発明の一実施形態では、前記インキュベーション時間は１０〜２０分間である。
【００１９】
本発明の第二目的は、下水処理のバイオフィルムエンジニアリングを迅速に開始する方法を提供することであり、前記方法は、バイオフィルムを予備培養し、それを保存マトリックスに入れ、最適な保存温度で保存し、活性が回復した後に下水処理に使用することができ、前記最適な温度は上記方法で決定される。
【００２０】
本発明の一実施形態では、前記好気性粒状スラッジの保存マトリックスにおいて、２５０〜３５０ｍｇ／ＬのＣＯＤ、５５〜６５ｍｇ／ＬのＮＨ４＋−Ｎ−、および６〜１０ｍｇ／ＬのＰＯ４３−−Ｐを有する。
【００２１】
本発明の一実施形態では、前記好気性粒状スラッジの活性回復は、好気性粒状スラッジをシーケンシングバッチ反応器（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｂａｔｃｈ Ｒｅａｃｔｏｒ，ＳＢＲ）に接種することであり、ＳＢＲの有効体積は１０．０Ｌであり、排水率は４５〜６０％であり、反応周期は２．５〜時間であり、静的流入期間は１〜１．５時間であり、曝気反応期間は１．５〜２．５時間であり、スラッジ沈殿期間は２〜６分間であり、急速排水期間は２〜６分間であり、流入部の嫌気性状態と反応部の好気性状態を確保するように、リアルタイム制御システムによって空気と窒素の含有量と割合を制御し、ＳＲＴは２５日間制御される。
【００２２】
本発明の一実施形態では、前記硝化脱窒バイオフィルムの保存マトリックスにおいて、１８０〜２２０ｍｇ／ＬのＣＯＤ、２５〜３５ｍｇ／ＬのＮＨ４＋−Ｎ、１８〜２５ｍｇ／ＬのＮＯ３−−Ｎ、および６〜１０ｍｇ／ＬのＰＯ４３−−Ｐがある。
【００２３】
本発明の一実施形態では、前記硝化脱窒バイオフィルムの活性回復は、硝化脱窒バイオフィルムをバイオリアクターに接種することであり、無酸素−好気性プロセスに基づいて、ＨＲＴを１０〜１５時間に設定し、硝化と脱窒充填率は４０％〜６０％であり、硝化液還流率は７０％〜８５％である。
【００２４】
本発明の第三目的は、上記方法を下水処理に適用することである。
【００２５】
本発明の有益な効果
本発明は、フローサイトメトリーにより複数のバイオフィルム生細胞、初期アポトーシス細胞、後期アポトーシス細胞および死細胞の割合を特徴付け、数時間以内において最適な保存温度を決定し、かつ、バイオフィルム活性回復プロセスの特徴的な指標に対する関連性分析を実施し、フローサイトメトリーに基づいてバイオフィルムの最適な保存温度を決定する方法が確立された。この方法を使用することにより、バイオフィルムの活性回復のステップを省略することができ、バイオフィルムのプロセス技術を使用して、汚染物質（アンモニア態窒素、全窒素、全リンなど）が標準に達するまで排出されて土地の節約と省エネルギーの動作を達成することに役立ち、同時に、バイオフィルムプロセスエンジニアリングアプリケーションの起動時間を効果的に短縮し、バイオフィルムプロセスの長期安定動作を維持し、高い産業的実現可能性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は好気性粒状スラッジの沈降性能（スラッジ体積指標ＳＶＩ）である。
【図２】図２は好気性粒状スラッジにおける細胞外ポリマー（ＰＮ／ＰＳ）の変化である。
【図３】図３は好気性粒状スラッジにおける全窒素（ＴＮ）の除去率である。
【図４】図４は好気性粒状スラッジにおける総リン（ＴＰ）の除去率である。
【図５】図５は硝化脱窒バイオフィルムの細胞外ポリマーにおけるＰＮ／ＰＳの変化である。
【図６】図６は硝化脱窒バイオフィルムアンモニア態窒素（ＡＮ）の除去率である。
【図７】図７は硝化脱窒バイオフィルムの全窒素（ＴＮ）の除去率である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の下水処理場の下水には、上流の住宅地における生活用水と工業下水の一部が含まれ、流入水の年間平均は、２３６ｍｇ／ＬのＣＯＤ、３０．１ｍｇ／Ｌのアンモニア態窒素、３７．８ｍｇ／Ｌの全窒素、および４．５ｍｇ／Ｌの全リンであり、硝酸態窒素含有量は１．０ｍｇ／Ｌ未満である。
【００２８】
実施例１：好気性粒状スラッジの最適な保存温度の決定
好気性粒状スラッジの保存条件：
好気性粒状スラッジの保存温度は、−２０℃、４℃、および２０℃に設定された。好気性粒状スラッジのパイロットプラント内から９００ｍｌの泥水混合物を取り、３つの等しい部分に分割し、それぞれ５００ｍLの保存マトリックスを含む１０００ｍLの血清ボトルに入れ、保存マトリックスの成分は、４２００ｍｇ／ＬのＮａＡｃ、１１００ｍｇ／ＬのＮＨ４Ｃｌ、３７０ｍｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、１４０ｍｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、４４０ｍｇ／ＬのＭｇＳＯ４、１７０ｍｇ／ＬのＫＣｌ、１ｍｌ／Ｌの微量元素溶液であり、微量元素溶液の成分は、１．５ｇ／ＬのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、０．１５ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３、０．０３ｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０３ｇ／ＬのＫＩ、０．１２ｇ／ＬのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．０６ｇ／ＬのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．１２ｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１５ｇ／ＬのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏである。保存マトリックスは、３００ｍｇ／ＬのＣＯＤ、６０ｍｇ／ＬのＮＨ４＋−Ｎ、８ｍｇ／ＬのＰＯ４３−−Ｐである。血清ボトル（各保存温度で３つの並行サンプル）をそれぞれ−２０℃、４℃、および２０℃に配置し、３か月間、静的かつ遮光で保存した。
【００２９】
保存された好気性粒状スラッジの細胞状態の特徴付け：
フローサイトメトリーの細胞状態の試験条件は以下のとおりである、
（１）１０ｍLのパイロットシステムにおいて各温度で３か月間保存された好気性粒状スラッジの混合物を取り、ｐＨ７．２のリン酸緩衝液で１００ｍLに希釈し、ボルテックスで２分間乱流し、スラッジをフロックに分解し、かつ均一な分布を確保した、
（２）破砕したサンプルを１０μｍの孔径のナイロン膜で濾過し、１．５ｍLを取って先端が１．５ｍｌの遠心チューブに入れた、
（３）サンプルを８０００ｒｐｍで５分間遠心分離した、
（４）遠心分離したサンプル上澄み液をピペットで吸引し、約０．１ｍLのサンプルを残し、細胞を事前に冷却したリン酸緩衝液で洗浄し、遠心分離と洗浄を２回繰り返した、
（５）遠心分離したサンプルに上澄み液をピペットで吸引し、約０．１ｍLのサンプルを残し、０．３ｍLの１０ｘ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで均一に混合した、
（６）０．５μLのＰＩ染色液をＦＩＴＣ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖグループに加え、０．５μLのＦＩＴＣ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖを対照ＰＩグループに加え、０．５μLのＦＩＴＣ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖと０．５μLのＰＩを試験グループに加え、均一に混合した後に室温で１５分間、暗所でインキュベートし、その後、フローサイトメーターで試験した。
【００３０】
好気性粒状スラッジの細胞状態の結果を表１に示し、パイロットシステムでの好気性粒状スラッジ生細胞の割合は高く、パイロットシステムが正常に機能していることを示す。−２０℃で保存された好気性粒状スラッジの生細胞含有量が最も低く、死細胞含有量が最も高く、−２０℃で好気性粒状スラッジを保存するのに適していないことを示す。４℃で保存された好気性粒状スラッジは、後期アポトーシス細胞と死細胞の割合が約２５．２％であり、４℃条件が好気性粒状スラッジの保存に使用できることを証明する。しかしながら、保存温度が２０℃の場合、好気性粒状スラッジ中の生細胞の割合は６８．５％と高く、パイロットシステムの好気性粒状スラッジよりもわずか２０．０％低いのみであり、これは、２０℃の保存条件が好気性粒状スラッジの保存に適していることを示し、４℃の低温条件を制御および維持するためにより多くのエネルギーを消費する必要があるため、２０℃が好気性粒状スラッジの保存に最適な温度であることが事前に決定される。
【００３１】
表１ ９０日間保存された好気性粒状スラッジの細胞活性状態（％）
0006905088.tif 000002
【００３２】
実施例２：好気性粒状スラッジの試験結果の検証
保存された好気性粒状スラッジの活性回復条件：
様々な血清ボトルに由来する好気性粒状スラッジを取って、好気性粒状スラッジの活性を回復するためにシーケンスバッチリアクター（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｂａｔｃｈ Ｒｅａｃｔｏｒ，ＳＢＲ）に接種し、−２０℃、４℃、および２０℃で保存された好気性粒状スラッジは、それぞれＲ１、Ｒ２、およびＲ３に置かれる。ＳＢＲの有効体積は１０．０Ｌであり、排水率は５０％であり、反応期間は３時間であり、静的流入期間は６０分間であり、曝気反応期間は１１２分間であり、スラッジ沈殿時間は３分間であり、急速排水時間は５分間である。流入部の嫌気性状態と反応部の好気性状態を確保するように、リアルタイム制御システムによって空気と窒素の含有量と割合を制御し、ＳＲＴは２５日間制御される。
【００３３】
活性回復後の好気性粒状スラッジの特徴：
活性回復後、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３中の好気性粒状スラッジの性能が優れる。表２に示すとおり、好気性粒状スラッジの活性回復後、異なる保存温度での好気性粒状スラッジの密度と粒子サイズは、保存前の好気性粒状スラッジの密度と粒子サイズに近い。異なる保存温度での好気性粒状スラッジのバイオマス（ＭＬＳＳ）は保存前の９１％のみであるが、このバイオマスは保存後の好気性粒状スラッジのバイオマスより平均３７．９％高く、好気性粒状スラッジが環境に再適応し、バイオマスが安定して増加していることを示す。一般的に、下水処理場の活性スラッジの平均脱窒率とリン放出率は、それぞれ３．０ｍｇ／ｇ ＭＬＳＳ・ｈと２．２ｍｇ／ｇ ＭＬＳＳ・ｈであり、パイロットプラントで好気性粒状スラッジを同じ脱窒率とリン放出率に順応させるのに必要な時間は、それぞれ２５日と２９日である。保存された好気性粒状スラッジが回復された後、Ｒ１中の好気性粒状スラッジが同じ脱窒率とリン放出率に達するのに必要な時間は、それぞれ１２日と１３日であり、Ｒ２中の好気性粒状スラッジが同じ脱窒率とリン放出率に達するのに必要な時間は、それぞれ１０日と１１日であり、Ｒ３中の好気性粒状スラッジが同じ脱窒率とリン放出率に達するのに必要な時間は、それぞれ８日と７日である。活性回復後の好気性粒状スラッジは、窒素とリンの除去効果がより優れていることを示し、ここで、２０℃で保存された好気性粒状スラッジは、回復時間が最短であり、好気性粒状スラッジの保存に適している。
【００３４】
表２ 保存と活性回復後の好気性粒状スラッジの特性
0006905088.tif 000003
【００３５】
活性回復後の好気性粒状スラッジの沈降性能と安定性：
活性回復後、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３中の好気性粒状スラッジはいずれも優れた沈降性能を持ち、図１に示すとおり、活動回復の１０日目に、異なる保存温度での好気性粒状スラッジの体積指数ＳＶＩは５０．０ｍL／ｇ未満である。その後、好気性粒状スラッジＳＶＩはわずかに減少し、最終的に４６．１〜４７．８ｍL／ｇの間で安定する。細胞外ポリマーは、好気性粒状スラッジの形成における重要な要因であり、細胞外ポリマー中の多糖類（ＰＳ）物質に対するタンパク質（ＰＮ）物質の比率（ＰＮ／ＰＳ）は、好気性粒状スラッジの構造安定性を測定する重要な指標である。好気性粒状スラッジ活性の回復過程における細胞外ポリマーのＰＮ／ＰＳの変化を図２に示すとおりである。異なる保存温度で、ＰＮ／ＰＳの差は大きく、Ｒ１中の好気性粒状スラッジＰＮ／ＰＳは減少傾向を示し、−２０℃で保存された好気性粒状スラッジは安定性が低く、好気性粒状スラッジの保存に適していないことを示し、Ｒ２中の好気性粒状スラッジＰＮ／ＰＳはわずかに増加し、４℃で保存された好気性粒状スラッジは保存前の安定状態を維持できることを示し、Ｒ３中の好気性粒状スラッジＰＮ／ＰＳは大幅に増加し、かつ安定化傾向があり、２０℃で保存された好気性粒状スラッジは、活性回復後に安定性が徐々に増加し、好気性粒状スラッジの保存温度として適していることを示す。
【００３６】
活性回復後の好気性粒状スラッジによる汚染物質の除去効果：
活動回復プロセスの後、異なる保存温度での好気性粒状スラッジによる総窒素と総リンの除去率は徐々に増加し（図３と図４）、総窒素（ＴＮ）と総リン（ＴＰ）に対する除去率は７０％以上である。活動回復後１０日目に、Ｒ３中の好気性粒状スラッジはＴＮおよびＴＰに対して最高の除去効果を示し、かつ、ＴＮとＴＰ除去率は安定化増加傾向を示し、この結果は、表２におけるＲ３中の好気性粒状スラッジの脱窒率とリン放出率が高いまでの迅速回復に対応して、２０℃の条件が好気性粒状スラッジの保存に適し、実際の適用で非常に実現可能であることを示す。
【００３７】
活性回復後の好気性粒状スラッジの特性とスラッジ細胞状態との関連性：
３０日間の好気性粒状スラッジの活性回復後、フローサイトメトリーを使用して、好気性粒状スラッジの細胞状態を分析し（表３に示すとおり）、異なる保存温度での好気性粒状スラッジ中の生細胞の含有量はイロットシステムにおける好気性粒状スラッジ中の生細胞の含有量と基本的に同じであり、活性回復後、好気性粒状スラッジが汚染物質除去の役割を果たすことができることを示す。ここで、Ｒ３中の好気性粒状スラッジの生細胞の割合は最も高く（８６．５％±３．５％）、かつ、後期アポトーシス細胞の割合（３．８％±１．０％）と死細胞の割合（３．３％±０．３％）は最も低く、２０℃の保存条件で好気性粒状スラッジの細胞活性は最も高く、好気性粒状スラッジを保存するための条件としてより適していることを示す。
【００３８】
表３ 活動回復（３０日）後の好気性粒状スラッジの活性回復（％）
0006905088.tif 000004
【００３９】
Ｃｏｒｒｅｌ関連性分析によると、好気性粒状スラッジの脱窒率は、リン放出率および好気性粒状スラッジ生細胞の割合と非常に高い関連性があり（表４に示すとおり）、関連係数はそれぞれ０．９９４０と０．９９５４であり、好気性粒状スラッジの活性を評価する方法として好気性粒状スラッジ生細胞の割合を使用することは非常に実現可能であることを示す。同時に、好気性粒状スラッジの保存により、好気性粒状スラッジ生細胞の割合は、２０℃の保存条件下で最も高く、活性回復後のＲ３中の好気性粒状スラッジの生細胞の割合と一致する。
【００４０】
表４ 活性回復後の好気性粒状スラッジ特性と細胞活性状態との関連性
0006905088.tif 000005
【００４１】
したがって、２０℃が好気性粒状スラッジの保存に最も適した条件であると決定し、フローサイトメトリーを使用して好気性粒状スラッジの最適な保存温度を決定するための基礎とする。フローサイトメトリーは動作しやすく、データは迅速かつ簡単に取得でき、正確で信頼性が高く、好気性粒状スラッジの活性回復プロセスを省略することもでき、好気性粒状スラッジの保存と活性回復に非常に重要である。
【００４２】
実施例３：硝化脱窒バイオフィルムの最適な保存温度の決定
硝化脱窒バイオフィルムの保存培養：
硝化脱窒バイオフィルムの保存温度は、−２０℃、４℃、および２０℃に設定された。下水処理場の生化学反応タンクから１８０個の硝化脱窒バイオフィルムを取り、３つの等しい部分に分割し、それぞれ５００ｍLの保存マトリックスを含む１０００ｍLの血清ボトルに入れ、バイオフィルムの硝化と脱窒能力を維持するために、保存マトリックスの成分は、２４０ｍｇ／ＬのＮａＡｃ、１１０ｍｇ／ＬのＮＨ４Ｃｌ、８０ｍｇ／ＬのＫＮＯ３、３０ｍｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、１５ｍｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、４０ｍｇ／ＬのＭｇＳＯ４、７０ｍｇ／ＬのＫＣｌである。保存マトリックスには、２００ｍｇ／ＬのＣＯＤ、３０ｍｇ／ＬのＮＨ４＋−Ｎ、２０ｍｇ／ＬのＮＯ３−−Ｎ、８ｍｇ／ＬのＰＯ４３−−Ｐがある。血清ボトル（各保存温度で３つの並行サンプル）をそれぞれ−２０℃、４℃、および２０℃に配置し、静的かつ遮光で保存した。
【００４３】
保存された硝化脱窒バイオフィルムの細胞状態の試験：
−２０℃、４℃、および２０℃で保存された硝化脱窒バイオフィルムを使用して、１２０日以上保存した後、硝化脱窒バイオフィルムの細胞状態を測定し、フローサイトメトリーの細胞状態の試験条件は以下のとおりである、
（１）１０ｍLの硝化脱窒バイオフィルムを取り、ｐＨ７．０のリン酸緩衝液で１００ｍLに希釈し、ボルテックスで２分間乱流し、バイオフィルムをフロックに分解し、かつ均一な分布を確保した、
（２）破砕したサンプルを６μｍの孔径のナイロン膜で濾過し、１．５ｍLを取って先端が１．５ ｍLの遠心チューブに入れた、
（３）サンプルを８０００ｒｐｍで５分間遠心分離した、
（４）遠心分離したサンプル上澄み液をピペットで吸引し、約０．１ｍLのサンプルを残し、細胞を事前に冷却したリン酸緩衝液で洗浄し、遠心分離と洗浄を２回繰り返した、
（５）遠心分離したサンプルに上澄み液をピペットで吸引し、約０．１ｍLのサンプルを残し、０．３ｍLの１０ｘ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで均一に混合した、
（６）０．５μLのＰＩ染色液をＦＩＴＣ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖグループに加え、０．５μLのＦＩＴＣ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖを対照ＰＩグループに加え、０．５μLのＦＩＴＣ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖと０．５μLのＰＩを試験グループに加え、均一に混合した後に室温で１５分間、暗所でインキュベートし、その後、フローサイトメーターで試験した。
【００４４】
サンプルの調製にフィルターの孔径の選択が特に重要であり、孔径が大きすぎると、より多くの生物学的フロックが導入され、不均一な染色を引き起こし、最終結果に影響を与える可能性があり、孔径が小さすぎると、生物学的フロックを効果的に取得することができない。
【００４５】
硝化脱窒バイオフィルムの細胞状態の試験結果を表５に示すとおりである。下水処理場の生化学反応タンク内の硝化脱窒バイオフィルムの生細胞の割合は高く、下水処理場が良好な運転効果を持っていることを示す。−２０°Ｃで保存された硝化と脱窒の測定のためのバイオフィルムの細胞含有量が最も低く、死細胞含有量が最も高く、−２０℃で硝化脱窒バイオフィルムを保存するのに適していないことを示す。４℃で保存された硝化脱窒バイオフィルムの生細胞の割合は６８．０％まで高く、後期アポトーシス細胞と死細胞の割合が約１９．８％であり、４℃の条件が硝化脱窒バイオフィルムの保存に使用できることを証明する。保存温度が２０°Ｃの場合、硝化脱窒バイオフィルム中の生細胞の割合は５９．４％と高く、４℃で保存された硝化脱窒バイオフィルムの生細胞の割合よりもわずか１２．６％低いであるが、その硝化脱窒バイオフィルムにおける後期アポトーシス細胞と死細胞の割合は約３１．６％であり、２０℃での保存条件も硝化脱窒バイオフィルムの保存に適していないことを示す。そのため、４℃が硝化脱窒バイオフィルムの保存に最適な温度であることが事前に決定される。
【００４６】
表５ １２０日間保存された硝化脱窒バイオフィルムの細胞活性状態（％）
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【００４７】
実施例４：硝化脱窒バイオフィルム試験結果の検証
保存された硝化脱窒バイオフィルムの活性回復条件：
シーケンシングバッチ反応器の動作方式：異なる血清ボトルからの硝化脱窒バイオフィルムを取り、バイオリアクター（有効量１０．０Ｌ）に接種し、硝化脱窒バイオフィルムの活性を回復させる。−２０℃、４℃、および２０°Ｃで保存された硝化脱窒バイオフィルムは、それぞれＲ１、Ｒ２、およびＲ３に置かれる。バイオリアクターは、ａｎｏｘｉｃ−ｏｘｉｃ（ＡＯ）プロセスに基づいて、シーケンスバッチ反応で同時に硝化と脱窒を達成し、ＨＲＴは１２時間に設定され、硝化と脱窒の充填率は５０％であり、硝化液の還流率は８０％である。
【００４８】
活性回復後の硝化脱窒バイオフィルムの特性：
活動回復後、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３の硝化脱窒バイオフィルムは優れたパフォーマンスを持った。図６に示すとおり、硝化脱窒バイオフィルムの活性が回復した後、４℃および２０℃で保存された硝化脱窒バイオフィルムの密度と厚さは、保存前の硝化脱窒バイオフィルムと近く、−２０℃で保存された硝化脱窒バイオフィルムの密度と厚さのみがわずかに減少した。硝化脱窒バイオフィルムのバイオマスは異なる保存温度で減少したが、活性が回復した後、４℃と２０℃で保存された硝化脱窒バイオフィルムのバイオマスは保存前の硝化脱窒バイオフィルムのバイオマスレベルに達し、硝化脱窒バイオフィルムが環境に再適応し、バイオマスが安定して増加した。一般的に、下水処理場のバイオフィルムの平均脱窒率とリン放出率は、それぞれ４．５と５．０ｇＮＯ３−−Ｎ／ｍ２・ｄであり、下水処理場で硝化脱窒バイオフィルムを同じ脱窒率とリン放出率に順応させるのに必要な時間は、それぞれ２５日と２１日である。保存された硝化脱窒バイオフィルムを活性回復させた後、Ｒ１中の硝化脱窒バイオフィルムが同じ脱窒率とリン放出率に達するのに必要な時間は、それぞれ１９日と１７日であり、Ｒ２中の硝化脱窒バイオフィルムが同じ脱窒率とリン放出率に達するのに必要な時間は、それぞれ８日と６日であり、Ｒ３中の硝化脱窒バイオフィルムが同じ脱窒率とリン放出率に達するのに必要な時間は、それぞれ１３日と１０日である。かつ、Ｒ１のバイオフィルムの厚さＬは、活性回復の前後で大幅に減少したが、Ｒ２とＲ３の両方で高い厚さを維持することができ、酸素はバイオフィルムに濃度勾配を形成し、脱窒に役立つ。活性回復後の硝化脱窒バイオフィルムは、いずれも優れた脱窒効果があり、ここで、４℃で保存された硝化脱窒バイオフィルムは、回復時間が最短であり、硝化脱窒バイオフィルムの保存に適していることを示す。
【００４９】
表６ 保存と活性回復後の硝化脱窒バイオフィルムの特性
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【００５０】
活性回復後の硝化脱窒バイオフィルムの安定性
細胞外ポリマーは、硝化脱窒バイオフィルムの形成における重要な要因であり、細胞外ポリマー中の多糖類（ＰＳ）物質に対するタンパク質（ＰＮ）物質の比率（ＰＮ／ＰＳ）は、硝化脱窒バイオフィルムの構造安定性を測定する重要な指標である。硝化脱窒バイオフィルムの活性回復過程における細胞外ポリマーのＰＮ／ＰＳの変化を図５に示すとおりである。異なる保存温度で、ＰＮ／ＰＳの差は大きく、Ｒ１中の硝化脱窒バイオフィルムＰＮ／ＰＳは減少傾向を示し、−２０℃で保存された硝化脱窒バイオフィルムは安定性が低く、硝化脱窒バイオフィルムの保存に適していないことを示し、Ｒ３中の硝化脱窒バイオフィルムＰＮ／ＰＳはわずかに増加し、２０℃で保存された硝化脱窒バイオフィルムは保存前の安定状態を維持できることを示し、Ｒ２中の硝化脱窒バイオフィルムＰＮ／ＰＳは大幅に増加し、４．２以上に達することができ、かつ安定化傾向があり、４℃で保存された硝化脱窒バイオフィルムは、活性回復後に安定性が徐々に増加し、硝化脱窒バイオフィルムの保存温度として適していることを示す。
【００５１】
活性回復後の硝化脱窒バイオフィルムによる汚染物質の除去効果：
活動回復プロセスの後、異なる保存温度での硝化脱窒バイオフィルムによる総窒素と総リンの除去率は徐々に増加し（図６と図７）、総窒素（ＴＮ）と総リン（ＴＰ）に対する除去率はそれぞれ９０％と８０％以上である。活動回復後８日目に、Ｒ２中の硝化脱窒バイオフィルムはアンモニア態窒素と全窒素に対して最高の除去効果を示し、かつ、アンモニア態窒素と全窒素の除去率は安定化増加傾向を示し、この結果は、表６におけるＲ２中の硝化脱窒バイオフィルムの脱窒率とリン放出率が高いまでの迅速回復に対応して、４℃の条件が硝化脱窒バイオフィルムの保存に適し、実際の適用で非常に実現可能であることを示す。
【００５２】
活性回復後の硝化脱窒バイオフィルムの特性とスラッジ細胞状態との関連性：
硝化脱窒バイオフィルムの活性回復後、フローサイトメトリーを使用して、硝化脱窒バイオフィルムの細胞状態を分析し、結果は表７に示す。異なる保存温度での硝化脱窒バイオフィルム中の生細胞の含有量は下水処理場における硝化脱窒バイオフィルム中の生細胞の含有量と基本的に同じであり、活性回復後、硝化脱窒バイオフィルムが汚染物質除去の役割を果たすことができることを示す。ここで、Ｒ２中の硝化脱窒バイオフィルムの生細胞の割合は最も高く（８４．０％±３．０％）、かつ、後期アポトーシス細胞の割合（６．２％±１．５％）と死細胞の割合（４．３％±０．３％）は最も低く、４℃の保存条件で硝化脱窒バイオフィルムの細胞活性は最も高く、硝化脱窒バイオフィルムを保存するための条件としてより適していることを示す。
【００５３】
表７ 活動回復後の硝化脱窒バイオフィルムの活性回復（％）
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【００５４】
Ｃｏｒｒｅｌ関連性分析によると、図８に示すとおり、硝化脱窒バイオフィルムの硝化率は、脱窒率および硝化脱窒バイオフィルムの生細胞比の割合と非常に高い相関があり、それぞれ相関係数は０．９２８６および０．９８１９であり、硝化脱窒バイオフィルムの活性を評価する方法として硝化脱窒バイオフィルムの生細胞の割合を使用することは非常に実現可能であることを示す。同時に、硝化脱窒バイオフィルムの保存により、硝化脱窒バイオフィルムの生細胞の割合は、４℃の保存条件下で最も高く、活性回復後のＲ２中の硝化脱窒バイオフィルムの生細胞の割合と一致する。
【００５５】
表８ 活性回復後の硝化脱窒バイオフィルム特性と細胞活性状態との関連性
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【００５６】
したがって、４℃は硝化脱窒バイオフィルムの保存に最も適した条件であると決定し、フローサイトメトリーを使用して硝化脱窒バイオフィルムの最適な保存温度を決定するための基礎とする。フローサイトメトリーは動作しやすく、データは迅速かつ簡単に取得でき、正確で信頼性が高く、硝化脱窒バイオフィルムの活性回復プロセスを省略することもでき、硝化脱窒バイオフィルムの保存と活性回復に非常に重要である。
【００５７】
実施例５：異なるｐＨ環境における硝化脱窒バイオフィルムの最適な保存温度の決定
硝化脱窒バイオフィルムの保存培養：
硝化脱窒バイオフィルムの保存温度は、−２０℃、４℃、および２０℃に設定された。下水処理場の生化学反応タンクから１８０個の硝化脱窒バイオフィルムを取り、３つの等しい部分に分割し、それぞれ５００ｍｌの保存マトリックスを含む１０００ｍｌの血清ボトルに入れ、保存マトリックスの成分は、２４０ｍｇ／ＬのＮａＡｃ、１１０ｍｇ／ＬのＮＨ４Ｃｌ、８０ｍｇ／ＬのＫＮＯ３、３０ｍｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、１５ｍｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、４０ｍｇ／ＬのＭｇＳＯ４、７０ｍｇ／ＬのＫＣｌである。保存マトリックスには、２００ｍｇ／ＬのＣＯＤ、３０ｍｇ／ＬのＮＨ４＋−Ｎ、２０ｍｇ／ＬのＮＯ３−−Ｎ、８ｍｇ／ＬのＰＯ４３−−Ｐがある。血清ボトル（各保存温度で３つの並行サンプル）をそれぞれ−２０°Ｃ、４°Ｃ、および２０°Ｃに配置し、静的かつ遮光で保存した。
【００５８】
保存された硝化脱窒バイオフィルムの細胞状態の試験：
−２０℃、４℃、および２０℃で保存された硝化脱窒バイオフィルムを使用して、１２０日以上保存した後、硝化脱窒バイオフィルムの細胞状態を測定し、フローサイトメトリーの細胞状態の試験条件は以下のとおりである、
（１）１０ｍの硝化脱窒バイオフィルムを取り、ｐＨ７．２のリン酸緩衝液で１００  ｍLに希釈し、ボルテックスで２分間乱流し、バイオフィルムをフロックに分解し、かつ均一な分布を確保した、
（２）破砕したサンプルを６μｍの孔径のナイロン膜で濾過し、１．５ｍLを取って先端が１．５ｍLの遠心チューブに入れた、
（３）サンプルを８０００ｒｐｍで５分間遠心分離した、
（４）遠心分離したサンプル上澄み液をピペットで吸引し、約０．１ｍLのサンプルを残し、細胞を事前に冷却したリン酸緩衝液で洗浄し、遠心分離と洗浄を２回繰り返した、
（５）遠心分離したサンプルに上澄み液をピペットで吸引し、約０．１ｍLのサンプルを残し、０．３ｍLの１０ｘ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで均一に混合した、
（６）０．５μLのＰＩ染色液をＦＩＴＣ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖグループに加え、０．５μLのＦＩＴＣ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖを対照ＰＩグループに加え、０．５μLのＦＩＴＣ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖと０．５μLのＰＩを試験グループに加え、均一に混合した後に室温で１５分間、暗所でインキュベートし、その後、フローサイトメーターで試験した。
【００５９】
硝化脱窒バイオフィルムの細胞状態試験の結果を表９に示す。
表９ １２０日間保存された硝化脱窒バイオフィルムの細胞活性状態（ｐＨ７．２，％）
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【００６０】
表９の結果から、ｐＨ７．２のリン酸緩衝液を使用して調製されたサンプルを試験し、各保存温度の生存状態での細胞状態の割合が比較的近く、分析のために有益な結果が得られず、データの信頼性が低いことがわかる。
【００６１】
さらに、発明者らは、サンプル検出に対する汚染物質に対するフィルターの孔径の影響も調査した：孔径８μｍと１０μｍで調製された硝化脱窒バイオフィルムサンプルをそれぞれ使用し、孔径８μｍで調製されたサンプル分析結果が検証実験と一致し、データの信頼性が高いことを発見したが、１０μｍに対応するデータは分析力がなく、最適な保存温度を決定するために使用することができない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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