(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ヒトＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体、および、
（ｂ）配列番号３に示される配列を有する野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型ヒトＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体、
から選択される、変異型ヒトＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体。
【請求項２】
ヒツジモノクローナル抗体などのモノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
（ｉ）４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む前記変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む、もしくは、
（ｉｉ）４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む前記変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰが、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む、
請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに結合しない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５】
ｉ）４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合し、軽鎖可変ドメインが、配列ＬＬＤＤＡＹ（配列番号１６）を有するＣＤＲ１、配列ＫＤＳを有するＣＤＲ２、および配列ＬＳＶＤＳＳＥＹＳＶ（配列番号１７）を有するＣＤＲ３を含むこと、ならびに重鎖可変ドメインが、配列ＧＦＳＬＩＧＥＹ（配列番号１８）を有するＣＤＲ１、配列ＭＡＳＧＧＴＩ（配列番号１９）を有するＣＤＲ２、および配列ＶＲＳＳＶＳＰＧＤＤＲＤＶ（配列番号２０）を有するＣＤＲ３を含むことを特徴とする、または、
ｉｉ）４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合し、軽鎖可変ドメインが、配列ＳＳＮＶＧＹＧＮＹ（配列番号２１）を有するＣＤＲ１、配列ＳＡＴを有するＣＤＲ２、および配列ＶＳＹＤＳＳＳＫＦＧＶ（配列番号２２）を有するＣＤＲ３を含むこと、ならびに重鎖可変ドメインが、配列ＧＦＳＶＴＮＳＧ（配列番号２３）を有するＣＤＲ１、配列ＩＮＮＤＧＶＡ（配列番号２４）を有するＣＤＲ２、および配列ＧＴＲＤＬＰＳＤＶＲＹＧＮＭＹＩＮＹ（配列番号２５）を有するＣＤＲ３を含むことを特徴とする、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項６】
Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｃｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ断片、およびＦｖ断片からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体の抗原結合断片。
【請求項７】
検出可能な標識に連結している、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体、または請求項６に記載の抗原結合断片。
【請求項８】
前記検出可能な標識が、酵素、ビオチン、放射性標識、蛍光標識、化学発光標識、電気化学発光標識、金標識、または磁気標識である、請求項７に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項９】
前記検出可能な標識が、ルテニウムを含む電気化学発光標識である、請求項８に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１０】
ａ）ｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ヒトＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片；およびｉｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、または、
ｂ）ｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ヒトＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片；およびｉｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体であって、前記野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのアミノ酸残基４２〜４６を含む野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの領域に特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、または、
ｃ）ｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型ヒトＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片；およびｉｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体であって、前記野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのアミノ酸残基４２〜４６を含む野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの領域に特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、または、
ｄ）ｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ヒトＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片；およびｉｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型ヒトＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片；およびｉｉｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体であって、前記野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのアミノ酸残基４２〜４６を含む野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの領域に特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、
を含むキットまたは組成物であって、
任意選択で、ａ）、ｂ）、ｃ）、またはｄ）の下に規定された前記キットまたは組成物が、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ中の異なるエピトープに結合する抗体をさらに含む、
前記キットまたは組成物。
【請求項１１】
前記ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ中の異なるエピトープに結合する抗体が、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのアミノ酸１〜３５に存在するエピトープに結合する抗体である、請求項１０に記載のキットまたは組成物。
【請求項１２】
ｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異、もしくは、
ｉｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異、
を含む変異型ヒトＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、
または、
ｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの前記４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異、もしくは、
ｉｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの前記４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異
を含む、前記変異型ヒトＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの断片。
【請求項１３】
前記変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたは断片が、精製タグまたは担体タンパク質に作動可能に連結している、請求項１２記載の変異型ヒトＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはその断片。
【請求項１４】
請求項１２に記載の変異型ヒトＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはその断片をコードするポリヌクレオチドであって、
前記断片が、
ｉ）前記４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異、または、
ｉｉ）前記４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異、
を含む、
ポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記ポリヌクレオチドが異種プロモーターに作動可能に連結している、請求項１４記載の変異型ヒトＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはその断片をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１〜５、７、および８のいずれか１項に記載の抗体、もしくは請求項６〜８のいずれか１項に記載の抗原結合断片を産生する、
宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１２に記載の変異型ヒトＮＴ−ｐｒｏＢＮＰもしくは請求項１２に記載の断片、請求項１４に記載のポリヌクレオチド、もしくは前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１８】
イムノアジュバントと、請求項１２に記載の変異型ヒトＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたは請求項１２に記載の断片とを含む組成物。
【請求項１９】
非ヒト動物を使用した抗体の産生のための、請求項１２に記載の変異型ヒトＮＴ−ｐｒｏＢＮＰもしくは請求項１２に記載の断片、または請求項１８に記載の組成物の使用。
【請求項２０】
（ｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ヒトＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、もしくはその断片であって、前記断片が４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含むものである、または、
（ｉｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型ヒトＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、もしくはその断片であって、前記断片が４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含むものである、または、
（ｉｉｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ヒトＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、もしくはその断片であって、前記断片が４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含むものである、および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型ヒトＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、もしくはその断片であって、前記断片が４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含むものである、
を含むキットまたは組成物であって、
任意選択で、前記キットまたは組成物が、野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰもしくはその断片をさらに含み、前記断片が、前記野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの少なくともアミノ酸残基４２〜４６を含む、
前記キットまたは組成物。
【請求項２１】
対象における心不全を診断するための指標を提供する方法であって、
ａ）対象由来の血液、血清、または血漿の試料中のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの量を決定するステップと、
ｂ）ステップａ）で決定されたＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの量を参照量と比較し、それによって心不全を診断するための指標を提供するステップと
を含み、
ステップａ）における前記ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの量の決定は、前記試料を少なくとも、
（ｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ヒトＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、および野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体であって、前記野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのアミノ酸残基４２〜４６を含む野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの領域に特異的に結合する抗体、もしくは前記抗体の抗原結合断片、または、
（ｉｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型ヒトＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、および野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体であって、前記野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのアミノ酸残基４２〜４６を含む野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの領域に特異的に結合する抗体、もしくは前記抗体の抗原結合断片、または、
（ｉｉｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ヒトＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片；および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型ヒトＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片；および野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体であって、前記野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのアミノ酸残基４２〜４６を含む野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの領域に特異的に結合する抗体、もしくは前記抗体の抗原結合断片、
と接触させるステップを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｉ）４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体、およびｉｉ）４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体に関する。さらに、本発明は、変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに関する。さらに、本発明によって想定されるのは、本発明の抗体、または本発明の変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを含むキットである。本発明はまた、心不全を診断するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
心不全（ＨＦ）は、世界中の数多くの国の罹患および死亡の主因の一つである。Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）またはそのアミノ末端断片であるＮ末端ｐｒｏＢＮＰ（ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）などのナトリウム利尿ペプチドマーカーの測定は、ＨＦの患者の診断およびリスク階層化のための重要なツールとして台頭しつつある。
【０００３】
脳ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）は、３２アミノ酸のポリペプチドである。ＢＮＰは、１３４アミノ酸のプレプロホルモン（「ｐｒｅ−ｐｒｏＢＮＰ」）として合成される。２６アミノ酸の長さを有するＮ末端シグナルペプチドが除去されることによって、プロホルモン（「ｐｒｏＢＮＰ」、１０８アミノ酸長）が生成する。このプロホルモンは、続いてＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（プロホルモン脳ナトリウム利尿ペプチドのＮ末端、７６アミノ酸長）と、生物活性の脳ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）とに切断される。ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰおよびＢＮＰは、等モル量で産生される。複数の研究において、ＢＮＰおよびＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのアッセイが、高い信頼性で心不全の診断に使用できることが示された（例えば、Ｐｒｏｎｔｅｒａら、Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ、４００（２００９）７０〜７３を参照されたい）。
【０００４】
ＢＮＰは、血液中で代謝される。ＢＮＰは、ｉｎ  ｖｉｖｏでもｉｎ  ｖｉｔｒｏでも分解速度が速いために半減期が短い。ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰは、血液中に未分解の分子のまま循環し、それゆえに腎臓で排出される。ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰは、活性ペプチドＢＮＰよりも半減期が長く、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで安定である。そのため、分析前工程はＮＴ−ｐｒｏＢＮＰではよりロバストであり、中央検査室への試料の運搬を容易なものとする（Ｍｕｅｌｌｅｒ、２００４、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ、４２：９４２〜４）。血液試料は、何日もの間、室温で保管でき、または回収損失なく郵送もしくは運送される場合がある。これに対し、ＢＮＰを室温または摂氏４度で４８時間保管すると、少なくとも２０％の濃度の損失を生じる（Ｍｕｅｌｌｅｒ同上；Ｗｕ、２００４、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、５０：８６７〜７３）。
【０００５】
ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの利点により、生物学的に不活性なペプチドＮＴ−ｐｒｏＢＮＰは、現状、心不全の診断のための好適なマーカーである。このマーカーは、臨床検査で常法として使用されるが、ポイントオブケアの状況でも使用される。
【０００６】
現在上市されている全てのＮＴ−ｐｒｏＢＮＰアッセイは、捕捉抗体およびシグナル抗体を用いるサンドイッチイムノアッセイである。現在上市されているＮＴ−ｐｒｏＢＮＰアッセイのいくつかは、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのアミノ酸４２〜４６を含むエピトープに結合する抗体を含有する［Ｓａｅｎｇｅｒら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、６３：１、３５１〜３５８（２０１７）、例えば補遺の表２、またはＣｌｅｒｉｃｏら、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ  Ｓｃｉ、２０１５；５２（２）：５６〜６９を参照されたい］。
【０００７】
本発明の根幹をなす研究では、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのアミノ酸配列中に点変異が特定された（Ａｒｇ４６Ｈｉｓ、Ｒ４６Ｈ）。この点変異は、様々なＮＴ−ｐｒｏＢＮＰアッセイのシグナル抗体のエピトープ内にある。この点変異は、Ｅｎｓｅｍｂｌデータベースに見出すことができる（Ｙａｔｅｓら、Ｅｎｓｅｍｂｌ  ２０１６、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２０１６、４４、Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ：Ｄ７１０−６、ｒｅｌｅａｓｅ  ８７、２０１６年１２月、ｄｂＳＮＰ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＤ：ｒｓ６１７６１９９１）。データベースの検索により、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのアミノ酸４２〜４６内にある第２の点変異Ｇｌｕ４３Ａｓｐ（Ｅ４３Ｄ）が明らかになった（ｄｂＳＮＰクラスターＩＤ：ｒｓ７４６１３２２７）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのアミノ酸配列に変異を有する対象における心不全を診断するための手段および方法を提供することである。技術的な課題は、特許請求の範囲および本明細書中の下記にて特徴を明らかにされた実施形態によって解決される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、本発明は、４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体に関する。さらに、本発明は、４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１−１】図１は、抗体Ｓ−２３．４．６６および抗体ｒＳ−２２．２．１９５についての濃度依存的な抗体のカイネティクスを示す図である（実施例３を参照）。
【図１−２】図１は、抗体Ｓ−２３．４．６６および抗体ｒＳ−２２．２．１９５についての濃度依存的な抗体のカイネティクスを示す図である（実施例３を参照）。
【図２−１】図２は、組換えｐｒｏＢＮＰ、および一次抗体としてＭ−１８．４．３４−ＩｇＧ、および二次抗体としてＳ−２３．４．６６−ＩｇＧまたはｒＳ−２２．２．１９５−ＩｇＧを用いた、抗体サンドイッチ実験を示す図である。Ｍ−１８．４．３４−ＩｇＧは、同属の二次抗体対照として適用された（実施例４を参照）。
【図２−２】図２は、組換えｐｒｏＢＮＰ、および一次抗体としてＭ−１８．４．３４−ＩｇＧ、および二次抗体としてＳ−２３．４．６６−ＩｇＧまたはｒＳ−２２．２．１９５−ＩｇＧを用いた、抗体サンドイッチ実験を示す図である。Ｍ−１８．４．３４−ＩｇＧは、同属の二次抗体対照として適用された（実施例４を参照）。
【図３】図３は、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ−Ｒ４６Ｈに対する抗体ｒＳ−２２．２．１９５の特異性を示す図である。
【図４】図４は、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ−Ｅ４３Ｄに対する抗体Ｓ−２３．４．６６の特異性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
用語「ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ」（プロ脳ナトリウム利尿ペプチドのＮ末端断片）は、当技術分野において周知である。本明細書に使用される際に、この用語は、切断後に心臓ホルモンとして機能する分泌タンパク質である、プロ脳ナトリウム利尿ペプチド（ｐｒｏＢＮＰ）の７６アミノ酸のＮ末端断片に関する。好ましくは、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰは、ヒトＮＴ−ｐｒｏＢＮＰである。それゆえ、前記変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰは、変異型ヒトＮＴ−ｐｒｏＢＮＰであり得る。
【００１２】
野生型ヒトＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（本明細書では「無変異型」ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰともよばれる）の配列は、当技術分野において周知であり、既に詳細に先行文献、例えばＷＯ０２／０８９６５７、ＷＯ０２／０８３９１３、Ｂｏｎｏｗ、１９９６、Ｎｅｗ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｃａｒｄｉａｃ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９３：１９４６〜１９５０に記載されている。好ましくは、野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰは、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する。
【００１３】
本発明の抗体は、変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合し得る。それゆえ、本発明の抗体が特異的に結合するＮＴ−ｐｒｏＢＮＰは、野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに比べて変異を含み得る。
【００１４】
一実施形態では、本発明の抗体は、４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合し得る。したがって、野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの４６位のアルギニンがヒスチジンに置換されたものであり得る（言い換えればこの変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰは、４６位にヒスチジンを含む）。この変異は、本明細書では「Ａｒｇ４６Ｈｉｓ」または「Ｒ４６Ｈ」変異ともよばれる。
【００１５】
別の実施形態では、本発明の抗体は、４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する。したがって、野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの４３位のグルタミン酸は、アスパラギン酸に置換されたものであり得る（言い換えればこの変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰは、４３位にアスパラギン酸を含む）。この変異は、本明細書では「Ｇｌｕ４３Ａｓｐ」または「Ｅ４３Ｄ」変異ともよばれる。
【００１６】
本明細書に示される変異の位置は、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの配列の、特に、配列番号３に示される配列を有する野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの、アミノ酸の位置である。したがって、Ｒ４６Ｈ変異は、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの４６位にある。さらに長い前駆体ポリペプチドであるｐｒｅ−ｐｒｏＢＮＰでは、対応する変異は、７２位にある。そのため、Ｒ４６Ｈ変異は、本明細書では、例えば実施例の項では、Ｒ７２Ｈ変異ともよばれ、Ｅ４３Ｄ変異は、Ｅ６９Ｄ変異ともよばれる。
【００１７】
上記に言及された変異は置換である。この変異／置換は、野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに比べた際の、特に、配列番号３に示される配列を有する野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに比べた際の、変異／置換であることが理解されよう。例えば、野生型ヒトＮＴ−ｐｒｏＢＮＰは、４６位にアルギニン残基を含むのに対して、４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰは、この位置にヒスチジン残基を含む。
【００１８】
１つまたは複数のさらに別の変異が、変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに存在することがある。しかし、これらの１つまたは複数の変異は、本発明の抗体が特異的に結合するエピトープには位置しなくてもよい。
【００１９】
本発明の一実施形態では、４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む。この配列は、表Ａにも示されている。４６位のヒスチジン残基は、太字で表示されている。
【００２０】
一実施形態では、４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む。この配列は、表Ａにも示されている。４３位のアスパラギン酸残基は、太字で表示されている。
【００２１】
用語「抗体」は、当技術分野において公知である。本明細書に使用される際に、この用語は、４本のポリペプチド鎖、すなわち２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖から構成される、任意の免疫グロブリン（Ｉｇ）分子を指す。本明細書に使用される際に、用語「抗体」は、抗体の抗原結合断片をも含む。用語「抗原結合断片」は、本明細書中の他の箇所に説明されている。この定義はしかるべく適用される。
【００２２】
本発明に従う抗体は、ポリクローナル抗体とすることもモノクローナル抗体とすることもできる。好適な一実施形態では、本抗体は、モノクローナル抗体である。用語「モノクローナル抗体」は、当技術分野において周知である。本明細書に使用される際に、この用語は、好ましくは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す。すなわち、集団を構成する個々の抗体が、同一である、および／または同じエピトープを結合する。但しここでは、モノクローナル抗体の産生の間に発生することがあり得るバリアントは除かれるが、そのようなバリアントは少量で存在する。本発明のモノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）によって記載された周知のハイブリドーマ法によって作製できるか、または組換えＤＮＡ法によって作製できる。
【００２３】
本発明の好適な一実施形態では、本抗体は、本発明の変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたは断片（本明細書中の他の箇所にさらに詳細に記載される）を哺乳動物に、好ましくはマウスに、さらに好ましくはヒツジに適用することによって調製される。特に、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはその断片は、担体タンパク質を含む（したがってそれに作動可能に連結している）ことが想定される（用語「担体タンパク質」の定義については本明細書中の他の箇所を参照されたい）。宿主の種に応じて、様々なアジュバントを使用して、免疫学的応答を増加させることができる。そのようなアジュバントは、好ましくは、フロイントアジュバント、ミネラルゲル、例えば水酸化アルミニウム、および表面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、スカシ貝ヘモシアニン、およびジニトロフェノールを包含する。本発明によるモノクローナル抗体は、続いて、周知のハイブリドーマ手法を用いて調製することができる。本発明の抗体の調製に関するさらなる詳細は、下記の添付の実施例に記載される。
【００２４】
好適な本発明の抗体は、ＩｇＧ抗体である。
【００２５】
一実施形態では、本発明の抗体は、単離された抗体である。それゆえ、本抗体は、精製されている抗体であり得る。抗体の精製は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）などの当技術分野において周知の方法によって達成することができる。したがって、本抗体は、抗体が産生された細胞から単離され得る。一部の実施形態では、単離された抗体は、例えばローリー法によって決定される場合、抗体重量にして７０％超に精製され、一部の実施形態では、重量にして８０％超、９０％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、または９９％超に精製される。好適な一実施形態では、本発明による単離された抗体は、タンパク質検出にクーマシーブルー染色を用いた還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定される場合、純度９０％超に精製される。
【００２６】
好ましくは、本明細書に記載されるモノクローナル抗体は、ヒツジモノクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体、ウサギモノクローナル抗体、ヤギモノクローナル抗体、ウマモノクローナル抗体、ニワトリモノクローナル抗体からなる群から選択される。さらに好ましくは、このモノクローナル抗体は、マウスモノクローナル抗体である。最も好ましくは、このモノクローナル抗体は、ヒツジ抗体である。
【００２７】
本発明の抗体は、サンドイッチアッセイにおいて、捕捉または検出（シグナル）抗体として、異なるすなわち第２のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰエピトープに結合する少なくとも１種の他の抗体と組み合わせて、使用することができる。好ましくは、二次抗体は、本発明の抗体が取得されている種とは異なる種に由来する。例えば、本発明の抗体がヒツジ抗体である場合、二次抗体をマウス抗体とすることができよう。
【００２８】
シグナル抗体および捕捉抗体は、サンドイッチアッセイで使用することができる。サンドイッチアッセイは、最も有用でありかつ一般に使用されるアッセイに含まれ、いくつかのバリエーションのサンドイッチアッセイ手法に及ぶ。例えば、典型的なアッセイでは、未標識の（捕捉）結合剤を固定化するか、または固体基材上に固定化することができ、供試する試料を捕捉結合剤に接触させる。結合剤−バイオマーカー複合体を形成させるのに十分な時間として適したインキュベーション時間の後、次いで、検出可能なシグナルを産生できるレポーター分子により標識された二次（検出）結合剤を添加し、インキュベーションして、結合剤−バイオマーカー−標識された結合剤の別の複合体を形成するのに十分な時間をもたせる。任意の未反応の材料を洗浄してもよく、検出結合剤に結合したレポーター分子により産生されるシグナルを観察することによって、バイオマーカーの存在を決定する。この結果は、可視シグナルの単純な観察による定性的なものであっても、または、例えば既知量の変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（本明細書中の他の箇所に記載される標準物質または較正物質）を含有する対照試料との比較による定量的なものであっても、どちらでもよい。
【００２９】
典型的なサンドイッチアッセイのインキュベーションステップは、必要および適切な場合に変えることができる。そのようなバリエーションとしては、例えば同時インキュベーションが挙げられ、その場合、２種以上の結合剤およびバイオマーカーを、共にインキュベーションする。例えば、分析される試料と標識された結合剤との両方を、固定化された捕捉結合剤に同時に添加する。また、分析される試料と標識された結合剤とをまずインキュベーションし、その後、固相に結合しているかまたは固相に結合できる抗体を添加することもできる。
【００３０】
特異的な結合剤とバイオマーカーとの間で形成された複合体は、試料中に存在するバイオマーカーの量に比例し得る。適用される結合剤の特異性および／または感度によって、試料中に含まれる特異的に結合できる少なくとも１種のマーカーの割合の程度が画定されることを理解されたい。測定をどのように実施できるかに関するさらなる詳細も、本明細書中の他の箇所に見出される。形成された複合体の量は、試料中に実際に存在する量を反映するバイオマーカーの量に変換され得る。
【００３１】
本明細書に規定される抗体は、テストストリップに含まれていてもよい。
【００３２】
本発明の抗体（またはその抗原結合断片）は、変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（プロ脳ナトリウム利尿ペプチドのＮ末端断片）に特異的に結合することが可能であり得る。それゆえ、本発明の抗体（またはその抗原結合断片）は、変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに含まれるエピトープに特異的に結合することが可能であり得る。用語「エピトープ」は、当技術分野において周知である。本明細書に使用される際に、この用語は、好ましくは、本発明の抗体により特異的に結合できる変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの一部分を指す。しかし、本発明に従うエピトープはまた、ある特定の３次元構造によって形成されることがあり、そのような構造的なエピトープもまた、本明細書で想定される。一実施形態では、このエピトープは、少なくとも５アミノ酸であって５０アミノ酸以下であり、特に２０アミノ酸以下の長さを有する。
【００３３】
このエピトープは、本明細書に言及される変異、すなわち変異型アミノ酸残基を含み得ることが理解されよう。そのため、本発明の抗体は、上記変異（それゆえにＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの４６位のヒスチジン残基またはＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの４３位のアスパラギン酸残基）を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ中のエピトープに結合し得る。
【００３４】
本明細書に記載される抗体またはその抗原結合断片は、対応する抗原（例えば、本明細書中の他の箇所に定義される変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、またはその断片）に特異的に結合し得る。抗原に「結合する」または「特異的に結合する」抗体は、それゆえ、その抗原に特異的に結合する抗体（またはその抗原結合断片）を指すことを意図される。「特異的な結合」または「特異的に結合する」という表現は、抗体（またはその抗原結合断片）が他の生体分子に著しくは結合しないことを示すものとよく理解され、そのように使用される。特に、本明細書に規定される変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体（もしくはその断片）は、好ましくは、野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（それゆえ４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異および／または４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含まないＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）に結合しない。「抗体が野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを結合しない」または「抗体の断片が野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを結合しない」という表現は、抗体（もしくはその断片）が著しくは野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを結合しないことを意味する。例えば、本明細書で下記に記載されるように、本発明の抗体の（またはその断片の）野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰとのＫＤは、本明細書に言及される変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰとのそのＫＤの少なくとも１００分の１であることが想定される。
【００３５】
したがって、野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰとの結合のレベルは、結果として、ＥＬＩＳＡまたは例えばＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００機器を用いた親和性の決定による、ごく僅かな結合親和性を生じる。実施例に示されるように、カイネティック測定では、高い分析物濃度であっても、野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに対しそのような抗体の決定可能な会合速度定数ｋａ（１Ｍｓ）が示されない。
【００３６】
ＫＤとは、表面プラズモン共鳴手法（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ウプサラ、スウェーデン）などの結合アッセイにより決定することができる解離定数である。実施例の項に記載されるように、Ｓ−２２．２．１９５およびＳ−２３．４．６６と名付けられた２種のモノクローナル抗体を作製し、本発明の根幹をなす研究にて供試した。抗体Ｓ−２２．２．１９５は、Ｒ４６Ｈ変異を有するＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに結合する。抗体Ｓ−２３．４．６６は、Ｅ４３Ｄ変異を有するＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに結合する。野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、Ｒ４６Ｈ変異を有するＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、およびＥ４３Ｄ変異を有するＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに対するこれらの抗体のＫＤ値、ｋａ値、およびｋｄ値は、実施例の項の実施例３において決定された。
【００３７】
特に、本明細書に言及される変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ  Ｒ４６Ｈに特異的に結合する抗体（またはその抗原結合断片）は、好ましくは、抗原（すなわち、４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含むＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）について、１３℃で０．０５ｎＭ以下の、特に２５℃で０．０８ｎＭ以下および／または３７℃で０．１５ｎＭ以下の、ＫＤ値を有する。
【００３８】
特に、本明細書に言及される変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ  Ｅ４３Ｄに特異的に結合する本発明の抗体（またはその抗原結合断片）は、好ましくは、抗原（４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含むＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）について、１３℃で０．４ｎＭ以下の、特に２５℃で３ｎＭ以下および／または３７℃で２０ｎＭ以下の、ＫＤ値を有する。
【００３９】
本発明の抗体（または抗原結合断片）は、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）を用いて検討された際に、その真正の抗原に特異的に結合し、検出可能なオフターゲット相互作用を示さないことが、特に想定される。
【００４０】
好ましくは、本発明の抗体（またはその抗原結合断片）は、認識する野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに対して、（その抗原、すなわち変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに対する相互作用に比べて、）より低い親和性の相互作用を示す。さらに好ましくは、前記抗体またはその断片の野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰとの親和性ＫＤは、抗原（すなわち変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）とのその結合の少なくとも１００倍分の１、特に少なくとも３００分の１である。
【００４１】
抗体のその抗原とのカイネティック結合属性を記載するための別の手段は、会合速度定数ｋａおよび解離速度定数ｋｄがある際に、解離定数をそのカイネティック速度の寄与に分解することである。会合速度定数ｋａは、抗体／抗原複合体の形成の相対速度を特徴付けるものであり、時間および濃度依存的である。
【００４２】
好ましくは、本明細書に言及される変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ  Ｒ４６Ｈに特異的に結合する抗体（またはその抗原結合断片）の会合速度定数は、好ましくは１３℃で４．０Ｅ＋０５  １／Ｍｓ超の（その抗原に対する）ｋａ値、特に２５℃で７．５Ｅ＋０５  １／Ｍｓ超および／または３７℃で１．０Ｅ＋０６  １／Ｍｓ超を有する。
【００４３】
好ましくは、本明細書に言及される変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ  Ｅ４３Ｄに特異的に結合する抗体（またはその抗原結合断片）の会合速度定数は、好ましくは１３℃で６．０Ｅ＋０４  １／Ｍｓ超のｋａ値、特に２５℃で５．５Ｅ＋０４  １／Ｍｓ超および／または３７℃で１．０Ｅ＋０５  １／Ｍｓ超を有する。
【００４４】
本明細書に言及される変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体は、好ましくは、２５℃で、野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに対して少なくとも１．６倍遅い会合速度定数を示す。
【００４５】
解離速度定数とは、その抗原からの抗体の解離速度を示す。それゆえ、解離速度定数は、複合体が単位時間内にばらばらになる確率を示す。解離速度定数が低いほど、抗体はその抗原ときつく結合している。
【００４６】
好ましくは、本明細書に言及される変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ  Ｒ４６Ｈに特異的に結合する抗体（またはその抗原結合断片）の解離速度定数は、好ましくは、１３℃で１．０Ｅ−０５  １／ｓ未満、特に、２５℃で３Ｅ−０５  １／ｓ未満および３７℃で９Ｅ−０５  １／ｓ未満のｋｄ値を有する。
【００４７】
好ましくは、本明細書に言及される変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ  Ｅ４３Ｄに特異的に結合する抗体（またはその抗原結合断片）の解離速度定数は、好ましくは、１３℃で１．０Ｅ−０５  １／ｓ未満、特に、２５℃で１．５Ｅ−０４  １／ｓ未満および／または３７℃で２．０Ｅ−０３  １／ｓ未満のｋｄ値を有する。
【００４８】
本明細書に言及される変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体は、好ましくは、２５℃で、野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに対して少なくとも１００倍速い解離速度定数（変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに対する解離速度定数に比べた際に）を示す。
【００４９】
カイネティック速度定数は、温度勾配で変化している。１３℃および３７℃での温度依存的な結合カイネティクスを使用して、抗体抗原相互作用を特徴付けることができる。ｋａ３７℃およびｋａ１３℃での会合速度の相対速度の比率［速度因子（Ｖｅｌｏｃｉｔｙ      
【００５０】
Ｆａｃｔｏｒ）、米国特許出願公開第２０１４０２５６９１５号］は、抗体相互作用を特徴付けるための手段である。この比率が値１０を下回る場合、抗体抗原結合がエンタルピー優位であるのに対し、速度因子ＶＦ＞１０は、エントロピー駆動カイネティックの可能性を増加させる。
【００５１】
好ましくは、野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはその断片またはムテインに特異的に結合する抗体（またはその抗原結合断片）のこの比率は、１０を下回る。
【００５２】
本発明の抗体は、少なくとも１種の軽鎖、特に２本の軽鎖と、少なくとも１種の重鎖、特に２本の重鎖とを含み得る。
【００５３】
本発明の好適な一実施形態では、本抗体は、４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを結合する。好ましくは、前記抗体の軽鎖（特に両方の軽鎖）は、配列番号４のアミノ酸配列を含み、前記抗体の重鎖（特に両方の重鎖）は、配列番号５のアミノ酸配列を含む。
【００５４】
配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖は、好ましくは、配列番号１０に示される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖は、好ましくは、配列番号１１に示される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
【００５５】
本発明の別の好適な実施形態では、本抗体は、４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに結合する。好ましくは、前記抗体の軽鎖（特に両方の軽鎖）は、配列番号１２のアミノ酸配列を含み、前記抗体の重鎖（特に両方の重鎖）は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。
【００５６】
配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖は、好ましくは、配列番号１４に示される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖は、好ましくは、配列番号１５に示される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
【００５７】
上記の軽鎖および重鎖を含む抗体は、本発明の根幹をなす研究で産生された：
【００５８】
抗体Ｓ−２２．２．１９５は、Ｒ４６Ｈ変異を有するＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する。この抗体は、配列番号４に示される配列を有する軽鎖と、配列番号５に示される配列を有する重鎖とを含む。
【００５９】
抗体Ｓ−２３．４．６６は、Ｅ４３Ｄ変異を有するＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する。この抗体は、配列番号１２に示される配列を有する軽鎖と、配列番号１３に示される配列を有する重鎖とを含む。
【００６０】
産生された抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は、表Ａにも示されている。
【００６１】
表Ａは、抗体の結合親和性を主に担う相補性決定領域（ＣＤＲ）をさらに示す。各軽鎖および重鎖は、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を有する。そのため、各抗体は、総計６つの異なるＣＤＲを有する。
【００６２】
本発明の研究で作製された２種の抗体の重鎖および軽鎖のＣＤＲは、下記の表Ａに太字で示されている（Ｎ末端からＣ末端までの順に）。このＣＤＲは、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでアノテートされた（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．、ＩＭＧＴ、Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｒｏｔｏｃ．２０１１年６月１日；２０１１（６））。
【００６３】
好適な一実施形態では、本発明の抗体（またはその抗原結合断片）は、Ｓ−２２．２．１９５に含まれる６つのＣＤＲまたはＳ−２３．４．６６に含まれる６つのＣＤＲを含む（好ましくはそれぞれの抗体の軽鎖／重鎖と同じ順番である）。
【００６４】
したがって、本抗体（またはその抗原結合断片）は、
軽鎖に（好ましくは両方の軽鎖に）、
配列ＬＬＤＤＡＹ（配列番号１６に示される）を有するＣＤＲ１、
配列ＫＤＳを有するＣＤＲ２、および
配列ＬＳＶＤＳＳＥＹＳＶ（配列番号１７に示される）を有するＣＤＲ３、
ならびに
重鎖に（好ましくは両方の重鎖に）、
配列ＧＦＳＬＩＧＥＹ（配列番号１８に示される）を有するＣＤＲ１、
配列ＭＡＳＧＧＴＩ（配列番号１９に示される）を有するＣＤＲ２、
配列ＶＲＳＳＶＳＰＧＤＤＲＤＶ（配列番号２０に示される）を有するＣＤＲ３
を含むことが想定される。
【００６５】
上記の抗体は、Ｒ４６Ｈ変異を有するＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する。それゆえ、Ｒ４６Ｈ変異を有するＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体は、軽鎖可変ドメインが、配列ＬＬＤＤＡＹ（配列番号１６）を有するＣＤＲ１、配列ＫＤＳを有するＣＤＲ２、および配列ＬＳＶＤＳＳＥＹＳＶ（配列番号１７）を有するＣＤＲ３を含むこと、ならびに重鎖可変ドメインが、配列ＧＦＳＬＩＧＥＹ（配列番号１８）を有するＣＤＲ１、配列ＭＡＳＧＧＴＩ（配列番号１９）を有するＣＤＲ２、および配列ＶＲＳＳＶＳＰＧＤＤＲＤＶ（配列番号２０）を有するＣＤＲ３を含むことを特徴とする。
【００６６】
さらに、本発明の抗体（またはその抗原結合断片）は、
軽鎖に（好ましくは両方の軽鎖に）、
配列ＳＳＮＶＧＹＧＮＹ（配列番号２１に示される）を有するＣＤＲ１、
配列ＳＡＴを有するＣＤＲ２、および
配列ＶＳＹＤＳＳＳＫＦＧＶ（配列番号２２に示される）を有するＣＤＲ３、
ならびに
重鎖に（好ましくは両方の重鎖に）、
配列ＧＦＳＶＴＮＳＧ（配列番号２３に示される）を有するＣＤＲ１、
配列ＩＮＮＤＧＶＡ（配列番号２４に示される）を有するＣＤＲ２、および
配列ＧＴＲＤＬＰＳＤＶＲＹＧＮＭＹＩＮＹ（配列番号２５に示される）を有するＣＤＲ３
を含むことが想定される。
【００６７】
上記の抗体は、Ｅ４３Ｄ変異を有するＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する。それゆえ、Ｅ４３Ｄ変異を有するＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体は、軽鎖可変ドメインが、配列ＳＳＮＶＧＹＧＮＹ（配列番号２１）を有するＣＤＲ１、配列ＳＡＴを有するＣＤＲ２、および配列ＶＳＹＤＳＳＳＫＦＧＶ（配列番号２２）を有するＣＤＲ３を含むこと、ならびに重鎖可変ドメインが、配列ＧＦＳＶＴＮＳＧ（配列番号２３）を有するＣＤＲ１、配列ＩＮＮＤＧＶＡ（配列番号２４）を有するＣＤＲ２、および配列ＧＴＲＤＬＰＳＤＶＲＹＧＮＭＹＩＮＹ（配列番号２５）を有するＣＤＲ３を含むことを特徴とする。
【００６８】
上記に言及されたＣＤＲは、それぞれの長鎖または短鎖の可変領域に、好ましくは表Ａに示される順番で、含まれ得る。
【００６９】
本発明はまた、本発明の抗体の抗原結合断片（本明細書では「抗体断片」ともよばれる）に関する。本明細書に使用される際に、抗体の抗原結合断片は、抗原に（特に、上記に記載される変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、すなわち４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたは４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに）特異的に結合することが可能であり得る。それゆえ、抗体の抗原結合断片は、（全長）抗体を抗原（例えば変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）に特異的に結合する能力を保持する断片である。
【００７０】
抗体断片は、好ましくは全長抗体の一部を、好ましくはその可変ドメイン、または少なくともその抗原結合部位を含む。一実施形態では、抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｃｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ断片、およびＦｖ断片からなる群から選択される。例えば、抗原結合断片は、Ｆ（ａｂ’）２断片である。
【００７１】
抗原結合断片をどのように産生するかは、当技術分野において周知である。例えば、断片は、本発明の抗体の酵素切断によって産生することができる。さらに、断片は、合成手法または組換え手法によって生成することができる。Ｆａｂ断片は、好ましくは抗体のパパイン消化によって生成され、Ｆａｂ’断片は、ペプシン消化および部分還元によって生成され、Ｆ（ａｂ’）２断片は、ペプシン消化によって生成され、Ｆａｃｂ断片は、プラスミン消化によって生成される。Ｆｖ断片またはｓｃＦｖ断片は、好ましくは分子生物学的手法によって産生される。
【００７２】
抗体の抗原結合断片は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片であるダイアボディであってもよい。ダイアボディは、好ましくは、同じポリペプチド鎖中で軽鎖可変ドメインに接続された重鎖可変ドメインを含む。
【００７３】
本発明の一実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片は、シグナル抗体またはシグナル断片（本明細書では検出抗体または検出断片ともよばれる）として使用される。シグナル抗体またはシグナル断片という用語は、直接的に、または検出手段により増幅される標識を通じるかのどちらかで、検出することができる抗体または断片を指す。本発明の代替の一実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片は、捕捉抗体または捕捉断片として使用される。
【００７４】
好適な一実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片は、検出可能な標識に連結している。本明細書に記載された検出可能な標識は、好ましくは、天然では抗体またはその抗原結合断片に連結されていない標識である。それゆえ、検出可能な標識は、好ましくは抗体について異種である。適した標識は、適切な検出方法によって検出可能な任意の標識である。一実施形態では、前記検出可能な標識は、酵素、ビオチン、放射性標識、蛍光標識、化学発光標識、電気化学発光標識、金標識、または磁気標識である。好適な一実施形態では、この標識は、電気化学発光標識である。
【００７５】
酵素標識としては、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、およびルシフェラーゼが挙げられる。これらの酵素の基質は、当技術分野において周知である。検出に適した基質としては、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、３，３’−５，５’−テトラメチルベンジジン、ＮＢＴ−ＢＣＩＰ（４−ニトロブルーテトラゾリウム塩化物および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−リン酸塩）が挙げられる。適した酵素−基質の組合せは、結果として呈色反応産物、蛍光、または化学蛍光を生じる場合があり、それらは、当技術分野において公知の方法に従って測定することができる。蛍光標識としては、例えば、５−カルボキシフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、テトラメチルローダミン、Ｃｙ２、Ｃｙ３、およびＣｙ５、蛍光タンパク質、例えばＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、およびＡｌｅｘａ染料などが挙げられる。放射性標識としては、例えば、ヨウ素、コバルト、セレン、トリチウム、炭素、硫黄、およびリンの放射活性同位体が挙げられる。放射性標識は、任意の公知かつ適切な方法、例えば感光フィルムまたはホスフォイメージャーによって、検出することができる。磁気標識としては、例えば、常磁性標識および超常磁性標識が挙げられる。使用される化学発光標識としては、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、またはシュウ酸エステルが挙げられ得る。
【００７６】
特に、本明細書に記載された抗体は、電気化学発光標識を含む（特にシグナル抗体である）ことが想定される。
【００７７】
最も一般に使用される電気化学発光化合物は、ルテニウムである。それゆえ、電気化学発光標識は、好ましくはルテニウムを含む。特に、電気化学発光標識は、ビピリジン−ルテニウム（ＩＩ）複合体を含み得る。そのため、特に、本抗体はルテニウム化抗体であることが想定される。抗体をどのようにルテニウム化するかは、例えば実施例の項に記載されている。
【００７８】
本発明はまた、本発明の抗体またはその抗原結合断片を産生する宿主細胞に関する。好適な一実施形態では、本発明の抗体を産生する宿主は、ハイブリドーマ細胞である。さらに、宿主細胞は、現行の発明による抗体を生成するために遺伝子改変することができる任意の種類の細胞系であり得る。例えば、宿主細胞は、動物細胞、特に哺乳類細胞であり得る。一実施形態では、ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞が、宿主細胞として使用される。別の実施形態では、宿主細胞は、非ヒト動物または哺乳類の細胞である。
【００７９】
例えば、本発明の根幹をなす研究で作製された抗体Ｓ−２３．４．６６は、ハイブリドーマによって産生された。抗体ｒＳ−２２．２．１９５は、ハイブリドーマによって、および本抗体が組換えにより発現されるＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）のプールによって、産生された。続いて、この抗体の大規模生産用に、安定なＣＨＯ株が作製された。
【００８０】
本発明に従う宿主細胞は、単離された細胞であり得る。それゆえ、宿主細胞は、細胞培養中に、言い換えれば生物体外に存在し得る。
【００８１】
宿主細胞は、好ましくは、本発明の抗体の軽鎖をコードする少なくとも１種のポリヌクレオチドと、本発明の抗体の重鎖をコードする少なくとも１種のポリヌクレオチドとを含む。前記ポリヌクレオチドは、適したプロモーターに作動可能に連結していてもよい。
【００８２】
本発明に従って、４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体（またはその抗原結合断片）を、４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体（またはその抗原結合断片）と組み合わせて使用することが、さらに想定される。これらの抗体を組み合わせた使用によって、Ｒ４６Ｈ変異を含む対象中の、およびＥ４３Ｄ変異を含む対象中の、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの検出が可能となる。
【００８３】
さらに、Ｒ４６Ｈ抗体（もしくはその抗原結合断片）、またはＥ４３Ｄ抗体（もしくはその抗原結合断片）、またはＲ４６Ｈ抗体とＥ４３Ｄ抗体（もしくはその抗原結合断片）の両方を、野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体（もしくはその抗原結合断片）と組み合わせて使用することが想定される。本明細書に使用される際に、「野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体」は、好ましくは、野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのアミノ酸残基４２〜４６を含む野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの領域に特異的に結合する。したがって、前記抗体は、野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのアミノ酸４２〜４６内に含まれるエピトープを結合し得る。したがって、この抗体のエピトープは、Ｅ４３Ｄ変異およびＲ４６Ｈ変異を含まなくてもよい。好ましくは、野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体は、Ｅ４３Ｄ変異またはＲ４６Ｈ変異を有する変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを著しくは結合しない。
【００８４】
ゆえに、本発明はまた、
ａ）ｉ）４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、およびｉｉ）４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、または
ｂ）ｉ）４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、およびｉｉ）野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体であって、野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのアミノ酸残基４２〜４６を含む野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの領域に特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、または
ｃ）ｉ）４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、およびｉｉ）野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体であって、野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのアミノ酸残基４２〜４６を含む野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの領域に特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、
ｄ）ｉ）４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、およびｉｉ）４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、およびｉｉｉ）野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体であって、野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのアミノ酸残基４２〜４６を含む野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの領域に特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、
ｅ）４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、または
ｆ）４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片
を含むキットまたは組成物に関する。
【００８５】
好ましくは、本キットに含まれる抗体は、モノクローナル抗体である。一実施形態では、本抗体は、ヒツジモノクローナル抗体である。
【００８６】
好ましくは、キットまたは組成物のａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、またはｆ）の下に言及された抗体（またはその抗原結合断片）は、検出可能な標識（この用語の定義については本明細書中の他の箇所を参照されたい）を含み得る。それゆえ、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、またはｆ）の下に規定された抗体（またはその抗原結合断片）のそれぞれは、検出可能な標識に作動可能に連結していてもよい。特に、本抗体は、同一の標識に結合していることが想定される。好ましくは、抗体（またはその抗原結合断片）のそれぞれは、ルテニウム化されている。
【００８７】
好ましくは、本発明のキットまたは組成物は、変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰと野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの両方を結合するさらに別の抗体、またはその抗原結合断片を含む。それゆえ、前記抗体（またはその抗原結合断片）は、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ中の異なる領域に、特にＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのアミノ酸４２〜４６を含まない領域に、特異的に結合し得る。好ましくは、前記さらに別の抗体（またはその抗原結合断片）は、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（特に配列番号３に示される配列を有するＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）のアミノ酸１〜３５に存在するエピトープに特異的に結合する。さらに好ましくは、前記さらに別の抗体（またはその抗原結合断片）は、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（特に配列番号３に示される配列を有するＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）のアミノ酸２７〜３１内に含まれるエピトープに結合する。前記抗体は、モノクローナル抗体とすることもポリクローナル抗体とすることもできる。しかし、好ましくは、前記抗体は、モノクローナル抗体である。一実施形態では、この段落に記載されるさらに別の抗体は、マウスモノクローナル抗体である。
【００８８】
これより前に記載されたさらに別の抗体（またはその抗原結合断片）は、好ましくは、捕捉抗体（断片）として使用される。前記抗体（またはその抗原結合断片）は、固体の支持物（例えばプレート、ビーズ、またはチューブなど）上に固定化することが可能であり得る。好ましくは、前記さらに別の抗体は、変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（複数可）（本明細書中の他の箇所に規定される）および野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを捕捉し得る。好適な一実施形態では、このさらに別の抗体（またはその断片）は、ビオチン化されている。それによって、抗体（またはその断片）は、アビジンまたはストレプトアビジンを含む固体の支持物に結合していてもよい。
【００８９】
本明細書で上記に示される定義および説明は、別段に述べる場合を除いて、必要な変更を加えて以下に適用される。
【００９０】
さらに、本発明は、上記に規定される変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、またはその断片に関する。この変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰは、本発明の抗体に関連して、本明細書で上記に定義されている。
【００９１】
一実施形態では、本発明は、４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、またはその断片に関する。前記断片は、４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含み得る。したがって、前記断片は、配列番号１の４６位（または配列番号３の４６位）に対応する位置に、ヒスチジンを含み得る。好ましくは、この段落で参照される変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む。
【００９２】
さらに代替の実施形態では、本発明は、４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、またはその断片に関する。前記断片は、４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含み得る。したがって、前記断片は、配列番号２の４３位（または配列番号３の４３位）に対応する位置に、アスパラギン酸を含み得る。好ましくは、この段落で参照される変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む。
【００９３】
本発明の変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、またはその断片は、例えば、本発明の抗体を生成するために使用することができる。さらに、変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、またはその断片は、アッセイのための標準物質または較正物質として使用することができ、そのアッセイでは、本発明の抗体（またはその断片）が、本明細書に言及される変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの量を決定するために使用される。したがって、上述の本発明のキットは、ａ）４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、もしくはその断片、またはｂ）４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、もしくはその断片を、さらに含むことがある。
【００９４】
本発明の断片に含まれる変異は、その断片が変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰよりも短いことから、通常は断片の４３位または４６位にはないものとなることが理解されよう。正確には、断片に含まれる変異とは、４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異または４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異に対応する変異であり得る。それゆえ、この断片は、野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの４６位に対応する位置にヒスチジン残基を、または野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの４３位に対応する位置にアスパラギン酸残基を含み得る。
【００９５】
好ましくは、本発明の断片は、少なくとも７アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１０アミノ酸、そして最も好ましくは少なくとも１５アミノ酸の長さを有する。また好ましくは、前記断片は、少なくとも２０アミノ酸の長さを有し得る。
【００９６】
この断片は、上記に言及された変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰよりも短い、すなわち７６アミノ酸よりも短くてもよい。
【００９７】
好適な一実施形態では、前記変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの断片は、７５アミノ酸以下の、または特に７０アミノ酸以下の長さを有する。別の好適な実施形態では、この断片は、５０アミノ酸以下の長さを有する。前記断片は、３０アミノ酸以下の長さを有することが、さらに想定される。それゆえ、前記断片は、好ましくは、７〜７０アミノ酸（もしくは７〜７５アミノ酸）、１０〜７０アミノ酸（もしくは１０〜７５アミノ酸）、または２０〜７０アミノ酸（もしくは２０〜７５アミノ酸）の長さを有する。また好ましくは、前記断片は、１０〜３０アミノ酸の長さを有する。
【００９８】
この変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはその断片は、本発明の抗体の産生のための抗原として、有利に使用することができる。さらに、この変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたは断片は、本発明のキット（上記を参照）の陽性対照として使用することができる。
【００９９】
好適な一実施形態では、４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む断片は、配列番号６に示される配列を含むかまたはそれからなる。別の好適な実施形態では、４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む断片は、配列番号７に示される配列を含むかまたはそれからなる。
【０１００】
好適な一実施形態では、４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む断片は、配列番号８に示される配列を含むかまたはそれからなる。別の好適な実施形態では、４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む断片は、配列番号９に示される配列を含むかまたはそれからなる。
【０１０１】
本発明の一実施形態では、変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはその断片は、精製タグをさらに含む。このタグは、変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはその断片に作動可能に連結していてもよい。
【０１０２】
このタグは、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはその断片の精製を可能にし得る。そのようなタグは、当技術分野において周知である。本明細書に使用される際の用語「精製タグ」は、好ましくは、本発明の変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはその断片の精製を可能にする追加のアミノ酸配列（ポリペプチドのペプチド）を指す。一実施形態では、精製タグは、天然では変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはその断片に連結されていないペプチドまたはポリペプチドである。それゆえ、精製タグは、変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはその断片について異種であり得る。
【０１０３】
好ましくは、精製タグは、ポリヒスチジンタグ、ポリアルギニンタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、インフルエンザウイルスＨＡタグ、チオレドキシン、ブドウ球菌タンパク質Ａタグ、ＦＬＡＧ（商標）エピトープ、およびｃ−ｍｙｃエピトープからなる群から選択される。好適な一実施形態では、精製タグは、ポリヒスチジンタグである。好ましくは、前記ポリヒスチジンタグは、少なくとも６個の連続したヒスチジン残基を含む。
【０１０４】
本発明の一実施形態では、変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはその断片は、担体タンパク質をさらに含む。この担体タンパク質は、変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはその断片に作動可能に連結していてもよい。
【０１０５】
担体タンパク質は、好ましくは、変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはその断片について異種である。担体タンパク質は、望ましくは、免疫応答を惹起するタンパク質である。それゆえ、担体タンパク質は、高度な免疫原性を有し得る。そのような担体タンパク質は、当技術分野において周知である。好ましくは、担体タンパク質は、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、破傷風トキソイド、およびジフテリア毒素、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オバルブミン、およびチログロブリンからなる群から選択され、特にＫＬＨである。
【０１０６】
本発明はまた、組成物に関し、前記組成物は、ｉ）本発明の変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはｉｉ）本発明の断片を含み、イムノアジュバントをさらに含む。本明細書に使用される際の用語「イムノアジュバント」は、抗原性物質と共に生物に投与された際に抗原性物質への免疫応答を増強できる物質または組成物を指す。好適なアジュバントは、上記に記載されている。一実施形態では、イムノアジュバントは、ミョウバン、フロイント不完全アジュバントから選択され、特にフロイント完全アジュバントである。
【０１０７】
さらに、本発明は、本発明の抗体の産生のための、本発明の変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはその断片の使用に関する。好ましくは、前記抗体は、本明細書中の他の箇所に定義される変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合し得る。一実施形態では、前記抗体は、モノクローナル抗体である。あるいは、これより前の段落で定義された組成物は、抗体の生成のために使用される。
【０１０８】
本発明はさらに、本発明の変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたは本発明の断片をコードするポリヌクレオチドに関する。
【０１０９】
本明細書に使用される際の用語「ポリヌクレオチド」は、線状または環状の核酸分子を指す。それは、ＤＮＡ分子ならびにＲＮＡ分子を包含する。本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、単離されたポリヌクレオチド（すなわちその天然の状況から単離された）として、または遺伝子修飾された形態でのどちらかで提供され得る。この用語は、単鎖ポリヌクレオチドならびに二重鎖ポリヌクレオチドを包含する。さらにまた、含まれるのは、化学修飾されたポリヌクレオチドであり、そのようなものとしては、天然に発生した修飾ポリヌクレオチド、例えばグリコシル化もしくはメチル化されたポリヌクレオチドなど、または人工修飾物、例えばビオチン化されたポリヌクレオチドが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドは、それが上記に言及されたポリペプチドをコードし得るという特徴がある。遺伝コードの冗長性に起因して、上記に挙げられた特異的なアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが包含される。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、イントロン配列を含まない。
【０１１０】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結している。前記プロモーターは、このポリヌクレオチドの発現を可能にし得る。一実施形態では、前記プロモーターは、異種プロモーターである。さらに、本発明のポリヌクレオチドは、ターミネーターに連結していてもよい。
【０１１１】
本発明はまた、上述の本発明のポリヌクレオチドのうち１つを含むベクターを企図する。一実施形態では、前記ベクターは、発現ベクターであり、そこでは、本発明のポリヌクレオチドは、プロモーターに、特に異種プロモーターに作動可能に連結している。
【０１１２】
用語「ベクター」は、好ましくは、ファージ、プラスミド、ウイルス、またレトロウイルスのベクター、ならびに人工染色体、例えば細菌または酵母の人工染色体などを包含する。さらに好ましくは、本発明のベクターは、発現ベクターである。そのような発現ベクターでは、ポリヌクレオチドは、真核細胞またはその単離された画分での発現を可能にする、上記に特定された発現カセットを含む。発現ベクターはまた、本発明のポリヌクレオチドに加えて、転写エンハンサーならびに翻訳エンハンサーを含めた調節因子を、さらに含むことがある。好ましくは、発現ベクターはまた、遺伝子導入ベクターまたは遺伝子ターゲティングベクターである。レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、またはウシパピローマウイルスなど、ウイルスに由来する発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドを標的細胞集団内に送達するために使用されることがある。当業者に周知の方法を使用して、組換えウイルスベクターを構築することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）Ｎ．Ｙ．  ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９９４）に記載された手法を参照されたい。
【０１１３】
本発明はまた、本発明の変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰもしくはその断片、本発明のポリヌクレオチド、または本発明のベクターを含む宿主細胞に関する。
【０１１４】
先の段落に言及された用語「宿主細胞」とは、原核細胞または真核細胞であり得る。真核細胞としては、原生生物、真菌、植物、および動物の細胞が挙げられる。別の実施形態では、宿主細胞としては、以下に限定されないが、原核細胞株である大腸菌；哺乳類細胞株であるＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、ＮＳＯ、ＳＰ２、およびＰＥＲ．Ｃ６；昆虫細胞株であるＳｆ９；および真菌細胞である出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられる。本発明に関連して、また、宿主細胞が非ヒト宿主細胞であることも想定される。一実施形態では、本発明の宿主細胞に含まれる変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、断片、ポリヌクレオチド、またはベクターは、宿主細胞については異種である。例えば、宿主細胞が本発明のポリヌクレオチドを用いてトランスフェクションされていることが想定される。
【０１１５】
さらに、本発明は、
（ｉ）４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、もしくはその断片、または
（ｉｉ）４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、もしくはその断片、または
（ｉｉｉ）４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、もしくはその断片、および４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、もしくはその断片
を含むキットまたは組成物に関する。
【０１１６】
用語「断片」は、本明細書中の他の箇所で説明されている。その定義および説明はしかるべく適用される。
【０１１７】
上述のキット（または組成物）の一実施形態では、本キット（または組成物）は、野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰもしくはその断片をさらに含む。好ましくは、前記断片は、野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの少なくともアミノ酸残基４２〜４６を含む。一実施形態では、断片は、少なくとも１０アミノ酸の長さを有する。
【０１１８】
さらに、本発明は、対象における心不全を診断する方法であって、
ａ）対象由来の試料中のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの量を決定するステップと、
ｂ）ステップａ）で決定されたＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの量を参照量と比較し、それによって心不全を診断するステップと
を含む方法に関する。
【０１１９】
上述の方法の好適な一実施形態では、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの量の決定は、試料を本発明の少なくとも１種の抗体（または少なくとも１種の抗体の抗原結合断片）に接触させるステップを含む。特に、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの決定は、試料を少なくとも、
（ｉ）４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、または
（ｉｉ）４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、または
（ｉｉｉ）４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、および４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片
と接触させるステップを含む。
【０１２０】
上述の方法のステップａ）の一実施形態では、試料を、野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体であって、野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのアミノ酸残基４２〜４６を含む野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの領域に特異的に結合する抗体、または前記抗体の抗原結合断片とさらに接触させる。
【０１２１】
そのため、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの決定は、試料を少なくとも、
（ｉ）４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、および野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体であって、前記野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのアミノ酸残基４２〜４６を含む野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの領域に特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、または
（ｉｉ）４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、および野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体であって、前記野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのアミノ酸残基４２〜４６を含む野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの領域に特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、または
（ｉｉｉ）４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、および４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、および野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体であって、前記野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのアミノ酸残基４２〜４６を含む野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの領域に特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片
に接触させるステップを含む。
【０１２２】
本発明の方法に従う対象は、好ましくはヒトである。
【０１２３】
一実施形態では、対象は、４６位のアルギニンがヒスチジンに置換されたＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの変異について、ヘテロ接合性であるかまたは特にホモ接合性である。好ましくは、上記に規定されたｉ）またはｉｉｉ）の本抗体／抗原結合断片が使用される。
【０１２４】
代替の一実施形態では、対象は、４３位のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換されたＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの変異について、ヘテロ接合性であるかまたは特にホモ接合性である。好ましくは、上記に規定されたｉｉ）またはｉｉｉ）の本抗体／抗原結合断片が使用される。
【０１２５】
本発明の一実施形態では、試料は、血液、血清、または血漿の試料である。例えば、血液試料、すなわち全血試料を、ポイントオブケア設定でのＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの決定に使用することができる。最も好適な試料は、血漿および血清である、そのようなタイプの試料は、臨床検査に日常的に使用される。
【０１２６】
さらに、本発明は、心不全を診断するための、対象（本明細書で上記に定義された）の試料における本発明の少なくとも１種の抗体（または少なくとも１種のその抗原結合断片）の使用に関する。好ましくは、心不全を診断する方法のステップａ）に関連してｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）に規定された抗体（または複数の抗体）が使用される。前記抗体（複数の抗体）またはその抗原結合断片に加えて、野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体であって、野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのアミノ酸残基４２〜４６を含む野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの領域に特異的に結合する抗体、または前記抗体の抗原結合断片が使用されることが想定される。
【０１２７】
本発明の使用または方法に適用される抗体または抗原結合断片は、他の箇所に記載された検出可能な標識を含むことがある。
【０１２８】
以下に、本発明の好適な実施形態の概要を述べる。上記の記載および特許請求の範囲に示される定義は、しかるべく適用される。
【０１２９】
１．  （ａ）４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体、および
（ｂ）４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体
から選択される、変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体。
２．  モノクローナル抗体である、実施形態１に記載の抗体。
３．  ヒツジ抗体である、実施形態１または２に記載の抗体。
４．  前記ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰが変異型ヒトＮＴ−ｐｒｏＢＮＰである、実施形態１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
５．  （ｉ）４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む前記変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む、または
（ｉｉ）４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む前記変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰが、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む、
実施形態１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
６．  野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに著しくは結合しない、実施形態１〜５のいずれか１項に記載の抗体。
７．  ｉ）抗体が、４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合し、前記抗体の軽鎖が、配列番号４のアミノ酸配列を含み、前記抗体の重鎖が、配列番号５のアミノ酸配列を含む、または
ｉｉ）抗体が、４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合し、前記抗体の軽鎖が、配列番号１２のアミノ酸配列を含み、前記抗体の重鎖が、配列番号１３のアミノ酸配列を含む、
実施形態１〜６のいずれか１項に記載の抗体。
８．  実施形態１〜７のいずれか１項に記載の抗体の抗原結合断片。
９．  Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｃｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ断片、およびＦｖ断片からなる群から選択される、実施形態８に記載の抗原結合断片。
１０．  検出可能な標識に連結している、実施形態１〜７のいずれか１項に記載の抗体、または実施形態８または９に記載の抗原結合断片。
１１．  前記検出可能な標識が、酵素、ビオチン、放射性標識、蛍光標識、化学発光標識、電気化学発光標識、金標識、または磁気標識であり、特に、前記検出可能な標識が、電気化学発光標識である、実施形態１０に記載の抗体または抗原結合断片。
１２．  前記検出可能な標識がルテニウムを含む、実施形態１０または１１に記載の抗体または抗原結合断片。
１３．  実施形態１〜７のいずれか１項に記載の抗体、または実施形態８および９に記載の抗原結合断片を産生する宿主細胞。
１４．  ａ）ｉ）４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片；およびｉｉ）４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、または
ｂ）ｉ）４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片；およびｉｉ）野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体であって、前記野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのアミノ酸残基４２〜４６を含む野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの領域に特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、または
ｃ）ｉ）４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片；およびｉｉ）野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体であって、前記野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのアミノ酸残基４２〜４６を含む野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの領域に特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、または
ｄ）ｉ）４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片；およびｉｉ）４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片；およびｉｉｉ）野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体であって、前記野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのアミノ酸残基４２〜４６を含む野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの領域に特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片
を含むキットまたは組成物。
１５．  ａ）、ｂ）、ｃ）、またはｄ）の下に言及された抗体が、検出可能な標識に、好ましくは電気化学発光標識に結合しており、特に前記抗体がルテニウム化されている、実施形態１４に記載のキットまたは組成物。
１６．  ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ中の異なるエピトープに結合する抗体をさらに含み、特に、前記抗体が、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのアミノ酸１〜３５に存在するエピトープに結合する、実施形態１３〜１５のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
１７．  ｉ）４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異、もしくは
ｉｉ）４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異、
を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、
または
ｉ）前記４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異、もしくは
ｉｉ）前記４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異
を含む、前記変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの断片。
１８．  前記変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰが、配列番号１または配列番号２に示される配列を含む、実施形態１７に記載の変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはその断片。
１９．  精製タグまたは担体タンパク質に作動可能に連結している、実施形態１７または１８に記載の変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはその断片。
２０．  実施形態１７〜１９のいずれか１項に記載の変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはその断片をコードするポリヌクレオチド。
２１．  実施形態２０に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
２２．  実施形態１７〜１９のいずれか１項に記載の変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはその断片、実施形態２０に記載のポリヌクレオチド、または実施形態２１に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
２３．  イムノアジュバントと、実施形態１７〜１９のいずれか１項に記載の変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはその断片とを含む組成物。
２４．  抗体の産生のための、実施形態１７〜１９のいずれか１項に記載の変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰもしくはその断片、または実施形態２３に記載の組成物の使用。
２５．  （ｉ）４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、もしくはその断片、または
（ｉｉ）４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、もしくはその断片、または
（ｉｉｉ）４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、もしくはその断片；および４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、もしくはその断片
を含むキットまたは組成物。
２６．  前記野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰまたはその断片をさらに含み、前記断片が、前記野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの少なくともアミノ酸残基４２〜４６を含む、実施形態２５に記載のキットまたは実施形態。
２７．  対象における心不全を診断する方法であって、
ａ）対象由来の試料中のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの量を決定するステップと、
ｂ）ステップａ）で決定されたＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの量を参照量と比較し、それによって心不全を診断するステップと
を含み、
前記ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの量の決定は、少なくとも、
（ｉ）４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、または
（ｉｉ）４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、または
（ｉｉｉ）４６位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片；および４３位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片
に前記試料を接触させるステップを含む方法。
２８．  前記試料を、野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的に結合する抗体であって、前記野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのアミノ酸残基４２〜４６を含む野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの領域に特異的に結合する抗体、または前記抗体の抗原結合断片とさらに接触させる、実施形態２７に記載の方法。
【０１３０】
上記に言及された全ての参考文献は、その全体の開示内容、ならびに上記の記載に明示的に言及されたその特異的な開示内容に関して、ここに参照により組み込まれる。
【０１３１】
図１および図２ならびに以下の実施例の項では、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰにおける変異Ｒ７２ＨおよびＥ６９Ｄに対し言及される。本明細書中の他の箇所に記載されるように、Ｒ７２Ｈ変異は、Ｒ４６Ｈ変異と同じ変異であり、Ｅ６９Ｄ変異は、Ｅ４６Ｄ変異と同じ変異である。
【実施例】
【０１３２】
以下の実施例は、本発明を説明するものとする。しかし、それらは、本発明の範囲を限定するものと解されないものとする。
【０１３３】
実施例１
組換えＮ末端ｐｒｏＢＮＰ（１〜７６）ムテインＮＴｐｒｏＢＮＰ（１〜７６）ムテイン［Ｒ７２Ｈ］（すなわちＲ４６Ｈ置換を含むムテイン）およびＮＴｐｒｏＢＮＰ（１〜７６）ムテイン［Ｅ６９Ｄ］（すなわちＥ４３Ｄ置換を含むムテイン）の産生
Ｎ末端ｐｒｏＢＮＰ（アミノ酸配列１〜７６）のヌクレオチド配列を、ＰＣＲを介した遺伝子合成によって産生し、Ｃ末端ヒスチジン−Ｔａｇを伴う発現を可能にする適した発現ベクター（ｐＱＥ８０）に、増幅した遺伝子をクローニングした。遺伝子の最適な発現を得るために、ＤＮＡ配列を、大腸菌で最も高頻度で使用されるコドンに適合させた。翻訳されたタンパク質配列は、９２アミノ酸〜なり、それは、Ｎ末端の４アミノ酸配列ＭＲＧＳ（配列番号２９）を含み、ＮＴｐｒｏＢＮＰ（１〜７６）、アミノ酸ＧＧＧＳ（配列番号３０）、および８個のヒスチジンが続く。
【０１３４】
ＮＴｐｒｏＢＮＰ（１〜７６）ムテイン［Ｒ７２Ｈ］：ＭＲＧＳ−ＮＴｐｒｏＢＮＰ（１〜７６）［Ｒ７２Ｈ］−ＧＧＧＳＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号２７を参照）
【０１３５】
ＮＴｐｒｏＢＮＰ（１〜７６）ムテイン［Ｅ６９Ｄ］：ＭＲＧＳ−ＮＴｐｒｏＢＮＰ（１〜７６）［Ｅ６９Ｄ］−ＧＧＧＳＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号２８を参照）
【０１３６】
プラスミドを大腸菌で形質転換した。組換え大腸菌クローンを、Ｓｕｐｅｒ  Ｂｒｏｔｈ（１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含む）に０．２のＯＤ６００で接種し、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド；最終濃度０．５ｍＭ）を用いて１．０〜１．５のＯＤ６００で誘導した。誘導後、培養物を３７℃で３時間、さらにインキュベーションした。次いで、培養物を遠心分離し、細胞ペレットを２０ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液、ｐＨ７．５、５００ｍＭ  ＮａＣｌ中に集めた。高圧を介して細胞懸濁液を分解した後、懸濁液を遠心分離し、上清をＮｉ−ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）カラムにアプライした。５０ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液、ｐＨ７．５、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾールを用いた洗浄ステップの後、５０ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液、ｐＨ７．５、５００ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液中、イミダゾールの濃度を（２０ｍＭから５００ｍＭまで）増加させた線形勾配を用いて、ヒスチジンタグＮＴ−ｐｒｏＢＮＰタンパク質を溶出した。
【０１３７】
実施例２
ＮＴｐｒｏＢＮＰ（１〜７６）ムテイン［Ｒ７２Ｈ］およびＮＴｐｒｏＢＮＰ（１〜７６）ムテイン［Ｅ６９Ｄ］に対するモノクローナル抗体の産生およびスクリーニング
組換えＮＴｐｒｏＢＮＰ（１〜７６）ムテイン［Ｒ７２Ｈ］および組換えＮＴｐｒｏＢＮＰ（１〜７６）ムテイン［Ｅ６９Ｄ］を用いて、ヒツジを免疫した。フロイント完全をアジュバントとして使用した。４回の初発免疫の後、１か月間隔で免疫を繰り返した。陽性反応の力価を有したヒツジのリンパ節を、全身麻酔および鎮痛剤の下で１つ取り出した。外科的な除去の後、リンパ節組織外で単細胞の調製を行った。リンパ節のリンパ球と永久ミエローマ細胞株１Ｃ１０（Ｂｉｏｖｅｎｔｉｘ）とを、比率２：１でＰＥＧを用いて融合し、４．５ｍｇ／ｍＬグルコース、１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μｍｏｌ／Ｌ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、５．７μＭアザセリン／１００μＭヒポキサンチン（Ｓｉｇｍａ）、５０Ｕ／ｍＬヒトインターロイキン−６（Ｒｏｃｈｅ）、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン／１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地中で培養した。融合は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ、２５６、１９７５、ｐ．４９５〜４９７）の周知の方法に従って実施した。それらのそれぞれの免疫原配列に特異的な抗体を分泌するハイブリドーマを、ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩＩを用いた単細胞堆積により最終的にクローニングした。
【０１３８】
ハイブリドーマ細胞の培養上清中のＮＴｐｒｏＢＮＰ（１〜７６）ムテイン［Ｒ７２Ｈ］またはＮＴｐｒｏＢＮＰ（１〜７６）ムテイン［Ｅ６９Ｄ］に対する抗体の存在および特異性を特定するために、以下の試験の原理に従ってＥＬＩＳＡを用いて、クローンを評価した。
【０１３９】
ａ）ＮＴｐｒｏＢＮＰ（１〜７６）ムテイン［Ｒ７２Ｈ］との反応性
ストレプトアビジンを被覆した３８４ウェルマイクロタイタ−プレート（Ｍｉｃｒｏｃｏａｔ）を、インキュベーション緩衝液（ＰＢＳ緩衝液＋０，５％Ｂｙｃｏ  Ｃ）中、１μｇ／ｍＬビオチン化ＭＡＫ＜ＮＴｐｒｏＢＮＰ＞Ｍ−１８．４．３４  ＩｇＧ−Ｂｉ  ｍｏｎｏ（Ｒｏｃｈｅ）により、室温で１時間被覆した。Ｍ−１８．４．３４は、配列番号３のアミノ酸２７〜３１を含む領域に結合する。例えば、本抗体は、本明細書に規定された変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰおよび野生型に結合する。洗浄溶液（０．９％ＮａＣｌ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）による洗浄後、インキュベーション緩衝液中１００ｎｇ／ｍＬに希釈した抗原ＮＴｐｒｏＢＮＰ（１〜７６）ムテイン［Ｒ７２Ｈ］の共存下、さらに別のインキュベーションを、室温で１時間実施した。洗浄溶液によるさらに別の洗浄ステップの後、抗体試料のインキュベーション（ハイブリドーマの上清）を、５０μＬ／ウェルで１時間、室温で実施した。洗浄緩衝液によるさらに１回の洗浄ステップの後、インキュベーション緩衝液中１：１５，０００に希釈したペルオキシダーゼコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅロバ抗ヒツジＩｇＧ（Ｈ＋Ｉ）検出抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ）共存下のインキュベーションを、室温で１時間実施した。洗浄緩衝液によるさらに１回の洗浄ステップの後、ペルオキシダーゼ活性を、ＡＢＴＳ（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ溶液、Ｒｏｃｈｅ）共存下、室温での２０分間のインキュベーションによって検出し、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて、消光の差異を４０５ｎｍでのｍＵで読み取った。
【０１４０】
陽性反応を示したハイブリドーマ上清、次いで、ＮＴｐｒｏＢＮＰ（１〜７６）ムテイン［Ｅ６９Ｄ］および野生型ＮＴｐｒｏＢＮＰ（１〜７６）に対する交差反応性について、同様にスクリーニングした。
【０１４１】
ｂ）ＮＴｐｒｏＢＮＰ（１〜７６）ムテイン［Ｅ６９Ｄ］との反応性
ＮＴｐｒｏＢＮＰ（１〜７６）ムテイン［Ｅ６９Ｄ］を抗原として用いて、上記の記載と同様に、初発のＥＬＩＳＡスクリーニングを実施した。陽性反応を示したハイブリドーマ上清を、次いで、ＮＴｐｒｏＢＮＰ（１〜７６）ムテイン［Ｒ７２Ｈ］および野生型ＮＴｐｒｏＢＮＰ（１〜７６）に対する交差反応性についてスクリーニングした。
【０１４２】
実施例３
モノクローナル抗体のカイネティック属性の特性解析
Ｔ２００機器にＢｉａｃｏｒｅシリーズＳセンサーチップＣＭ５を装填した。系緩衝液を１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４  ｐＨ７．４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０とした。速度因子を決定するために、系を１３℃および３７℃でインキュベーションした。試料緩衝液を系緩衝液とし、追加的に１ｍｇ／ｍＬ  ＣＭＤ（カルボキシメチルデキストラン、Ｆｌｕｋａ）を補充した。抗体捕捉系を確立した。５０００ＲＵのウサギ抗ヒツジポリクローナル抗体（Ｉｄ．：３１３−００５−０４５、Ｄｉａｎｏｖａ）を、製造業者による記載の通りに、２５℃、１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０中３０μｇ／ｍＬで、ＥＤＣ／ＮＨＳカップリングによって固定化した。捕捉系は、２０μＬ／分で１５秒の濃縮ＨＢＳ緩衝液［１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０］を用いた洗浄と、２０μＬ／分で３０秒の１００ｍＭ  ＨＣｌの注入に続いて、２０μＬ／分で１分間の１０ｍＭグリシン緩衝液ｐＨ１．５の注入により、再生した。捕捉される抗体を、それぞれの系緩衝液ｐＨ７．４中に４０ｎＭの濃度で希釈し、１０μＬ／分で１分間注入した。抗体の捕捉後、２．５倍濃縮した系緩衝液によって６０μＬ／分で３０秒、系を洗浄した後、２分間、ベースラインを安定化した。濃度依存的な分析物のシリーズを、０．４ｎＭ、１．１ｎＭ、３．３ｎＭから１：３希釈ステップで注入し、１０ｎＭ、３０ｎＭ、および９０ｎＭでは２回注入した。別の実施形態では、分析物ＮＴｐｒｏＢＮＰＥ６９Ｄを、１．１ｎＭ、３．３ｎＭ、１０ｎＭからの濃度シリーズで注入し、３０ｎＭ、９０ｎＭ、および２７０ｎＭでは２回注入した。分析物接触時間を５分とし、解離時間を１０分とした。分析物カイネティクスを６０μＬ／分で実施した。ヒツジ抗体をセンサー表面上にリガンドとして捕捉した：ｍＡｂ＜ＮＴｐｒｏＢＮＰ（Ｅ６９Ｄ）＞Ｓ−２３．４．６６−ＩｇＧ、ｍＡｂ＜ＮＴｐｒｏＢＮＰ（Ｒ７２Ｈ）＞ｒＳ−２２．２．１９５−ＩｇＧ。Ｒｏｃｈｅ製の分析物を溶液中に注入した：ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（アミノ酸１〜７６）（ＭＷ８．５ｋＤａ）；ｐｒｏＢＮＰ（アミノ酸２７〜１０２）（ＭＷ９．９ｋＤａ）；ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ  Ｅ６９Ｄ（ＭＷ１０．２ｋＤａ）；ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ  Ｒ７２Ｈ（ＭＷ１０．２ｋＤａ）；対照として系緩衝液；０−血清ＳＢ１５０６１０−００１。製造業者ＧＥＨＣの説明書に従って、ＢｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアＶ．３．０を使用した。ＲＭＡＸ  ｌｏｃａｌを伴う１：１結合モデルを適用して、カイネティック速度を決定した。
【０１４３】
図１は、３７℃で実施された濃度依存的な抗体カイネティクスを示す。抗体Ｓ−２３．４．６６は、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰＥ６９Ｄを結合するが、全長の野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（アミノ酸１〜７６）、野生型ｐｒｏＢＮＰ（アミノ酸２７〜１０２）、およびＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ  Ｒ７２Ｈとは、検出可能な相互作用を何ら示さなかった。組換えヒツジ抗体ｒＳ−２２．２．１９５は、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（アミノ酸１〜７６）、ｐｒｏＢＮＰ（アミノ酸２７〜１０２）、およびＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ  Ｅ６９Ｄに対して測定可能な相互作用を示さないが、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰＲ７２Ｈに特異的に結合する。カイネティックデータの概要を表１に示す。
【０１４４】
【表１】
0006889780.tif 000002
【０１４５】
ヒツジ抗体の熱力学的結合属性を見積もるために、１３℃および３７℃での温度依存的な結合カイネティックデータを使用して、速度因子（米国特許出願公開第２０１４０２５６９１５号、表２）を算出した。一言で言えば、速度因子とは、ｋａ３７℃とｋａ１３℃における会合速度の相対速度の比率である。この比率が値１０を下回ってＶＦ＜１０である場合、抗体抗原結合がエンタルピー優位であるのに対し、速度因子ＶＦ＞１０は、エントロピー駆動カイネティックの可能性を高める。特異性および生物物理学的安定性の事項については、好ましくは、エンタルピー優位の抗体結合相互作用を、免疫学的試験におけるＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ野生型およびＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ変異体の検出のために使用する。
【０１４６】
【表２】
0006889780.tif 000003
【０１４７】
実施例４
抗体のサンドイッチ特性解析
抗体サンドイッチＳＰＲ測定を２５℃で実施した。実施例３に記載されたように、Ｔ２００機器を、同じ緩衝液条件およびセンサー器材の下で使用した。１２０００ＲＵのＲｂＡＭＦｃｇ（ウサギ抗マウスＦｃガンマ、ＰＡＫ＜Ｍ−Ｆｃｇ＞Ｒｂ−ＩｇＧ（ＩＳ）、コード：３１５−００５−０４６、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を、製造業者による記載の通りに、２５℃、１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０中４０μｇ／ｍＬで、ＥＤＣ／ＮＨＳカップリングによって固定化した。捕捉系は、２０μＬ／分で１５秒の濃縮ＨＢＳ緩衝液［１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０］を用いた洗浄と、２０μＬ／分で１分間の１０ｍＭグリシン緩衝液ｐＨ１．５の注入に続いて、２０μＬ／分で１分間の１０ｍＭグリシン緩衝液ｐＨ１．７の注入により、再生した。１５０ｎＭの一次マウス抗ｐｒｏＢＮＰ抗体Ｍ−１８．４．３４（２７〜３１）を、１０μＬ／分で１分間捕捉した。捕捉系のフリーの結合価を、ブロッキング溶液によって飽和させた。ブロッキング溶液を３０μＬ／分で３分間注入した後、２分間、ベースラインを安定化した。分析物のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（アミノ酸１〜７６）（ＭＷ８．５ｋＤａ）；ｐｒｏＢＮＰ（アミノ酸２７〜１０２）（ＭＷ９．９ｋＤａ）、およびＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ  Ｒ７２Ｈ（ＭＷ１０．２ｋＤａ）を９０ｎＭで、３分間、３０μＬ／分で注入した。分析物ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ  Ｅ６９Ｄ（ＭＷ１０．２ｋＤａ）を１８０ｎＭで、３分間、３０μＬ／分で注入した。別の実施形態では、組換えｐｒｏＢＮＰ分析物の代わりに、ヒト血清を、溶液中で分析物として適用した。血清を試料緩衝液で１：５に希釈して、５μＬ／分で２０分間注入し、それにより、提示された一次抗体Ｍ−１８．４．３４（２７〜３１）が患者血清由来の生来のｐｒｏＢＮＰ抗原誘導体によって飽和するようにした。血清分析物は、：０−血清ＳＢ１５０６１０−００１；ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ  Ｒ７２Ｈ血清；２７．３９ｎｇ／ｍＬ  ｐｒｏＢＮＰを含むＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ野生型血清ＳＥ  １０５３  ＤＩ  ０５８０とした。サンドイッチの性能を評価するために、２５０ｎＭの各二次抗体ｍＡｂ＜ＮＴｐｒｏＢＮＰ（Ｅ６９Ｄ）＞Ｓ−２３．４．６６−ＩｇＧおよびｍＡｂ＜ＮＴｐｒｏＢＮＰ（Ｒ７２Ｈ）＞ｒＳ−２２．２．１９５−ＩｇＧ  ＳＰ／Ｑ）を、３０μＬ／分で、３分間の会合時間および３分間の解離時間で注入した。製造業者ＧＥＨＣの説明書に従って、ＢｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアＶ．３．０を使用した。
【０１４８】
一次抗体として組換えｐｒｏＢＮＰおよびＭ−１８．４．３４−ＩｇＧ、ならびに二次抗体としてＳ−２３．４．６６−ＩｇＧまたはｒＳ−２２．２．１９５−ＩｇＧを用いた、抗体サンドイッチ実験を図２に示す。Ｍ−１８．４．３４−ＩｇＧを、同属の二次抗体対照として適用した。全てのセンサグラムが、一次抗体Ｍ−１８．４．３４−ＩｇＧの分析物飽和の後、二次抗体の注入を示す。一次抗体は、高い複合体安定性を伴い抗原を結合する。ｒＳ−２２．２．１９５−ＩｇＧは、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ  Ｒ７２Ｈとの特異的な複合体の形成を示す。抗体Ｓ−２３．４．６６−ＩｇＧは、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ  Ｅ６９Ｄ上に特異的な複合体の形成を示す。
【０１４９】
組換え分析物の代わりにヒト血清を用いて、同様の実験を実施した。図２は、オーバーレイデータとして、二次抗体の注入に焦点を当てた。陰性の血清（０−血清ＳＢ１５０６１０−００１）を参照とした。抗体ｒＳ−２２．２．１９５−ＩｇＧは、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ  Ｒ７２Ｈ血清と特異的に、抗体サンドイッチ複合体を形成し、野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ血清とは複合体を形成しない。Ｓ−２３．４．６６−ＩｇＧは、血清試料内で複合体の形成を示さなかった（ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ  Ｅ６９Ｄ血清は利用できず）。
【０１５０】
実施例５
モノクローナル抗体ｒＳ−２２．２．１９５およびＳ−２３．４．６６の精製およびルテニウム化
【０１５１】
ＭＡＫ＜ＮＴｐｒｏＢＮＰ＞Ｓ−２３．４．６６−ＩｇＧの精製
細胞不含のヒツジハイブリドーマの培養上清（ＣＥＬＬｉｎｅ、ＩＮＴＥＧＲＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＧ）をｐＨ４．７５に調整して、ＲＴで３０分インキュベーションする。遠心分離後、ＩｇＧを含有する上清に０．５Ｍ硫酸アンモニウムおよび１５０ｍＭ  ＮａＣｌを補い、ｐＨを８．５に上げる。溶液をプロテインＡカラム［ＰｒｏＳｅｐ（登録商標）Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ］にアプライし、結合したＩｇＧを１００ｍＭクエン酸塩、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．５で溶出する。５０ｍＭリン酸Ｋ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．５に対する透析の後、ウシＩｇＧを特異的に結合する免疫アフィニティーレジンを用いて、培養培地のＦＣＳに由来する痕跡量のウシＩｇＧを除去する。最終産物を濃縮し（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−３０、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、濾過して（０．２２μｍ）−８０℃で保管する。
【０１５２】
ＭＡＫ＜ＮＴｐｒｏＢＮＰ＞ｒＳ−２２．２．１９５−ＩｇＧの精製
組換え抗体を発現するＣＨＯ細胞株の細胞不含の培養上清を、ｐＨ４．７５に調整して、ＲＴで３０分インキュベーションする。遠心分離後、ＩｇＧを含有する上清に０．５Ｍ硫酸アンモニウムおよび１５０ｍＭ  ＮａＣｌを補い、ｐＨを８．５に上げる。溶液をプロテインＡカラム［ＰｒｏＳｅｐ（登録商標）Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ］にアプライし、結合したＩｇＧを１００ｍＭクエン酸塩、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．５で溶出した。５０ｍＭ  リン酸Ｋ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．５に対する透析の後、最終産物を濃縮し（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−３０、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、濾過して（０．２２μｍ）−８０℃で保管する。
【０１５３】
ＭＡＫ＜ＮＴｐｒｏＢＮＰ＞Ｓ−２３．４．６６−ＩｇＧおよびＭＡＫ＜ＮＴｐｒｏＢＮＰ＞ｒＳ−２２．２．１９５のルテニウム化
プロテインＡにより精製された抗体を、ルテニウム化緩衝液（１００ｍＭリン酸Ｋ  ｐＨ８．５）に対して透析し、次いで、溶液をタンパク質濃度１ｍｇ／ｍＬに調整する。ルテニウム（ＩＩ）トリス（ビピリジル）−ＵＥＥＫ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを、濃度＞５ｍｇ／ｍＬでＤＭＳＯに溶解する。１５倍モル過剰のＢＰＲｕ−ＵＥＥＫ−ＤＤＳをＩｇＧ溶液に添加し、勢いよく混合しながら反応を２５℃で４５分間実施する。Ｌ−リジンを最終濃度１０ｍＭで添加することによって、反応を停止した。ゲル浸透クロマトグラフィーによって、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で、１００ｍＭリン酸Ｋ、１５０ｍＭ  ＫＣｌ  ｐＨ７．５をランニング緩衝液として用いて、過剰の標識化試薬を除去する。コンジュゲートされたＩｇＧを含有する画分をプールし、６．５％サッカロースを用いて最終産物を安定化し、−８０℃で保管する。
【０１５４】
実施例６
変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを検出するための方法
ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを検出するための１つの方法は、電気化学発光に基づくよく確立されたＲｏｃｈｅ  Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）アッセイ技術である。Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）アッセイは、不均一なイムノアッセイであり、サンドイッチの原理に従って機能する。すなわち、分析物である異なるエピトープに対し発生させた捕捉抗体および検出（シグナル）抗体を使用することによって、抗体−抗原−抗体複合体を形成する。変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを検出するためのＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）アッセイは、以下のステップおよび構成要素を含む。
ａ）リン酸により緩衝された（１００ｍＭ、ｐＨ５．８）マトリックス含有保存剤（Ｏｘｙ−Ｐｙｒｉｏｎ  ０．１％、Ｎ−メチルイソチアゾロン０．１％）、界面活性剤（０．１％）、安定化および干渉回避タンパク質（例えばアルブミン、ストレプトアビジン−ポリ）中、モノクローナル捕捉抗体、例えばＭ−１８．４．３４と共に、およびモノクローナルシグナル抗体としてｒＳ−２２．２．１９５またはＳ−２３．４．６６またはその両方と共に、試料をインキュベーションする。
ｂ）ビオチン化された捕捉抗体（例えばＭ−１８．４．３４）と、ルテニウム標識された検出抗体であるＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ−Ｒ４６Ｈに特異的なｒＳ−２２．２．１９５またはＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ−Ｅ４３Ｄに特異的なＳ−２３．４．６６のうち１つとが、分析物と共にサンドイッチ複合体を形成する。
ｃ）サンドイッチ複合体を、ストレプトアビジン被覆微粒子に結合し、次いで、電極の表面上に磁気により捕捉する。
ｄ）ＰｒｏＣｅｌｌを用いて未結合の基質を除去する。
ｅ）電圧を電極に印加することによって化学発光の放出を誘導し、光電子増倍管によって測定する。
ｆ）機器特異的な較正曲線を介して、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ値を算出する。
【０１５５】
Ｅｌｅｃｓｙｓアッセイが、変異型および野生型のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを検出するべきものとする場合、野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに特異的な追加のシグナル抗体、例えばＳ−１．２１．３を、アッセイ混合物に含めることができる。
【０１５６】
実施例７
抗体ｒＳ−２２．２．１９５およびＳ−２３．４．６６は、変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに対し特異性が高い。
新たに作製された２種の抗体ｒＳ−２２．２．１９５およびＳ−２３．４．６６の特異性を、実施例５に記載されるように、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ−特異的なＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）アッセイを用いて評価した。心不全患者に観察されるＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ濃度の範囲をカバーするように組換えの野生型ペプチドおよび変異型ペプチドのシリーズを用いて、ヒトＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ不含の血清をスパイクした。次いで、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ−Ｒ４６Ｈに特異的なｒＳ−２２．２．１９５（図３）またはＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ−Ｅ４３Ｄに特異的なＳ−２３．４．６６（図４）のどちらかを用いて、試料中のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを検出した。
【０１５７】
図３および図４の結果は、ｒＳ−２２．２．１９５およびＳ−２３．４．６６の両抗体が野生型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに全く結合しないが、変異型ペプチドを高い強度で認識することを示す。さらに、両抗体は、シグナル対分析物濃度について広範囲の線形の相関を示すことから、心不全患者に一般に見られる全濃度範囲にわたってＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの定量を可能にする。
【０１５８】
実施例８
患者試料中の変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（Ｒ４６Ｈ）との反応性
生来の変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰとの新しい抗体の反応性を、明瞭な心不全の症状を示すことが既知であった８名の患者由来の血清または血漿の試料中で評価した（表４、患者１〜８）。Ｒ４６Ｈ変異を有する患者のみを利用することができた。３名の患者について、Ｒ４６Ｈ変異の存在をシークエンシングでも確認した。ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ−Ｒ４６Ｈに特異的なｒＳ−２２．２．１９５をシグナル抗体として、およびＭ−１８．４．３４を捕捉抗体として用いて、実施例５に記載されたＥｌｅｃｓｙ（登録商標）アッセイ系を使用して、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを定量した。比較のために、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ−Ｅ４３Ｄに特異的なＳ−２３．４．６６をシグナル抗体として、およびＭ−１８．４．３４を捕捉抗体として含有するＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）キットを用いて、同じ患者試料を測定した。組換え変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（それぞれＲ４６ＨまたはＥ４３Ｄ）に基づく較正物質を用いて、両アッセイ系の較正を行った。
【０１５９】
【表３】
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【０１６０】
ｒＳ−２２．２．１９５抗体を含有するアッセイキットは、全ての患者試料においてＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ−Ｒ４６Ｈを明瞭に検出した。Ｓ−２３．４．６６をシグナル抗体として用いた対照キットは、有意量のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（≦７ｐｇ／ｍＬ）を検出しなかった。この結果はさらに、２つの点変異Ｒ４６ＨおよびＥ４３Ｄそれぞれに対するｒＳ−２２．２．１９５およびＳ−２３．４．６６の高い特異性を示すが、今回は生来の試料を用いても示している。ｒＳ−２２．２．１９５を用いて定量されたＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの濃度は、２０２〜２２３２１ｐｇ／ｍＬまでに及ぶ。従来、心機能不全を診断するための判定閾値は、１２５ｐｇ／ｍＬの（野生型）ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ［ＲｏｃｈｅＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）ｐｒｏＢＮＰＩＩアッセイ］であるものと決定されていた。そのため、測定された変異型ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの濃度が全て＞１２５ｐｇ／ｍＬであることは、患者の心不全の症状を反映する可能性がある。
【０１６１】
本明細書に言及された配列を配列表および以下の表に示す。
【０１６２】
【表４−１】
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【０１６３】
【表４−２】
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【０１６４】
【表４−３】
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【０１６５】
【表４−４】
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【０１６６】
【表４−５】
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【図１−１】
0006889780.tif 000010
【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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