(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(ａ)から(ｃ)のいずれかのタンパク質を有効成分として含む、糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤であって、前記糖がグルコース、マンノース、タロースおよびガラクトースからなる群から選択されるいずれかである、糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤。
(ａ) 配列番号１または３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
(ｂ) 配列番号１または３に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質；
(ｃ) 配列番号１または３に記載のアミノ酸配列において、１から２０個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質。
【請求項２】
以下の（ｄ）または（ｆ）のポリヌクレオチドが導入された形質転換細胞の培養上清を有効成分として含む、糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤であって、前記糖がグルコース、マンノース、タロースおよびガラクトースからなる群から選択されるいずれかである、糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤。
（ｄ）配列番号２または４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２または４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して９０%以上の塩基配列同一性を有するポリヌクレオチドであって、かつ糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
糖基質に、請求項１または２に記載の酵素剤を作用させて、糖のエピメリ化反応生成物を得る工程を含む、糖のエピメリ化反応生成物の製造方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法を実施して糖のエピメリ化反応生成物を得る工程、および食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品を得る工程を含む、食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤、当該酵素剤を作用させて、エピメリ化反応生成物を得る工程を含む、エピメリ化反応生成物の製造方法および当該製造方法で得られるエピメリ化反応生成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
マンノースはグルコースの異性体であり、コンニャクなどから抽出されるグルコマンナン、ヘミセルロース、あるいは細胞表面などに存在する糖鎖の構成糖として良く知られている。また、マンノースそのものはクランベリーに含まれることが知られている。
【０００３】
マンノースの生体利用性は低く、経口摂取したマンノースのほとんどは速やかに尿中に排出される。尿路感染症の原因菌は、当該菌が有するマンノース結合レクチンと、尿路表面細胞に存在する糖鎖の結合を介して尿路表面へ付着し感染すると考えられている。経口摂取したマンノースは尿中に速やかに排出されるため、排出されたマンノースは当該菌のマンノース結合レクチンと細胞表面糖鎖への結合を阻害することで、尿路感染症を予防する効果が期待されている（非特許文献１）。
【０００４】
特許文献１にはマンノース含有糖組成物を有効成分とする有害菌感染抑制剤または有害菌感染防止用飼料に関わる技術が開示されている。特許文献２にはマンノースを有効成分とする飲食品の食感改良剤についての記述がある。
【０００５】
マンノースの調製法としては、化学反応法および酵素法が複数知られている。以下に、各調製法について検討する。
第一の化学反応法は、蔗糖を還元することでソルビトールとマンニトールを生成し、マンニトールを分取し、さらにマンニトールを酸化することでマンノースを調製する方法である。しかし、この方法は多段階のステップおよび高温高圧での触媒反応を必要とするため、効率面で問題がある。
【０００６】
第二の化学反応法は、グルコマンナンやマンナンを加水分解することでマンノースを調製する方法である。しかし、この方法は、基質が高価でありかつ基質の調製に労力を要するという問題がある。
【０００７】
第三の化学反応法は、コプラミールなどのヘミセルロースを加水分解する手法である。しかし、この方法は、構成糖が多様であるためマンノースの収率が悪く、酸加水分解の場合はさらに収率が悪化し精製負荷が大きくなるという問題がある。
【０００８】
第四の化学反応法は、グルコースをアルカリ条件下で異性化することでマンノースを調製する方法である。しかし、この方法は、糖の分解が生じるため収率が悪く、精製負荷が大きいという問題がある。
【０００９】
第五の化学反応法は、同じくフルクトースをアルカリ条件下で異性化することでマンノースを調製する方法である。しかし、この方法は、第四の化学反応法と同様に収率および精製負荷の点で問題があり、またフルクトースがグルコースに比べて比較的高価である点およびフルクトースが反応系に残存してしまいマンノースとの分離が困難である点も問題がある。
【００１０】
第一の酵素法としては、フルクトースにマンノースイソメラーゼを作用させることでマンノースを調製する方法である。しかし、原料となるフルクトースの価格面および反応系に残存するフルクトースの分離の点で問題がある。
【００１１】
第二の酵素法としては、グルコースあるいはフルクトースに対してアルドース―ケトースイソメラーゼ（Ａｌｄｏｓｅ−ｋｅｔｏｓｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ、以下「ＡＫＩ」と記載する）を作用させることでマンノースを調製する方法である。しかし、この方法は、反応系に残存するフルクトースの分離の点でやはり問題がある。
【００１２】
また、セロビオースなどの還元末端糖残基がβ−１，４結合で結合している２つ以上の糖残基からなる糖について、前記還元末端糖残基の２位の水酸基を２−エピメリ化（異性化）する反応、またはその逆反応を触媒する酵素として、セロビオース  ２−エピメラーゼ（Ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ  ２−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ、以下「ＣＥ」と記載する）が知られている（特許文献３、特許文献４）。当該酵素により、グルコースがβ−１，４結合したセロビオースを４−O−β−グルコシルマンノースへ変換、またはその逆反応を触媒することができる。また、特許文献４には当該ＣＥをグルコースに作用させると、マンノースが得られたことが記載されている（第三の酵素法）。しかし、特許文献４に記載のＣＥを用いる第三の酵素法では、ＣＥがエピメリ化反応に加えアルドース−ケトース異性化反応も触媒する。そのため、マンノースと共にフルクトースも生成してしまい、副生するフルクトースの分離の点で問題がある。
【００１３】
第四の酵素法としては、グルコース、マンノース、ガラクトースおよびタロースの２位の水酸基をエピメリ化する反応を触媒する酵素を用いる方法である（特許文献５、６）。当該方法では、フルクトースおよびタガトースがほとんど副生されない点が第一から第三の酵素法より優れている（特許文献５、６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特許４６９４６６７号
【特許文献２】特開２００１−２７５５８３号
【特許文献３】特許５０９２０４９号
【特許文献４】国際公開２０１０／０９００９５号
【特許文献５】特開２０１９−０３３７０２号
【特許文献６】特許６６５７４５３号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Sharma V, Ichikawa M, Freeze HH. Mannose metabolism: more than meets the eye. Biochem Biophys Res Commun. 2014;453(2):220‐228. doi:10.1016/j.bbrc.2014.06.021
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
酵素法によるエピメリ化反応生成物の生産効率は、使用する酵素の特性に依る部分が大きい。工業的規模での利用に適した、基質をより効率的にエピメリ化反応を触媒する酵素剤が求められていた。さらに、副生成物は、目的反応生成物の収率を下げるばかりでなく、分離の手間を要するため、生産効率を下げるという問題があった。
【００１７】
本発明は、副生成物が少なく、効率的にエピメリ化反応を触媒する酵素剤を提供することを解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、マンノースに対するエピメリ化酵素の探索を企図し、種々のタンパク質をコードする遺伝子について発現と諸性質の解析を行ってきた。その中で、ルナティモナス・ロナレンシス（Ｌｕｎａｔｉｍｏｎａｓ  ｌｏｎａｒｅｎｓｉｓ）のゲノム上に存在し、Ｎ−ａｃｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ２−ｅｐｉｍｅｒａｓｅと推定されるタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ：ＷＰ#０１０８５３２８１．１）をコードする遺伝子に着目して発現解析を行った。その結果、当該タンパク質はマンノースとグルコース、ガラクトースとタロースをそれぞれ相互に変換する２−エピメリ化活性を有することを見出した。
【００１９】
また本発明者らは、当該タンパク質を用いると効率的にマンノースを製造できることを解明し、本発明の完成に至った。
【００２０】
本発明は以下の通りである。
［１］  以下の(ａ)から(ｃ)のいずれかのタンパク質を含む、糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤であって、前記糖がグルコース、マンノース、タロースおよびガラクトースからなる群から選択されるいずれかである、糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤。
(ａ) 配列番号１または３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
(ｂ) 配列番号１または３に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質；
(ｃ) 配列番号１または３に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質。
［２］  以下の（ｄ）から（ｆ）のいずれかのポリヌクレオチドが導入された形質転換細胞の培養上清を含む、糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤であって、前記糖がグルコース、マンノース、タロースおよびガラクトースからなる群から選択されるいずれかである、糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質。
（ｄ）配列番号２または４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２または４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２または４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して９０%以上の塩基配列同一性を有するポリヌクレオチドであって、かつ糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［３］  糖基質に、［１］または［２］に記載の酵素剤を作用させて、糖のエピメリ化反応生成物を得る工程を含む、糖のエピメリ化反応生成物の製造方法。
［４］  ［３］に記載の方法を実施して得られた糖のエピメリ化反応生成物を用いて食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品を得る工程を含む、食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品の製造方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、エピメリ化活性を有する新規な酵素剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】図１Ａは、ルナティモナス・ロナレンシス由来の仮想タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）である。下線を付した領域は、シグナルペプチド配列と推定された部分である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ルナティモナス・ロナレンシス由来の仮想タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号２）である。下線を付した領域はシグナルペプチド配列に対応する塩基配列である。配列番号２の塩基配列から、シグナルペプチド配列に対応する塩基配列を削除した配列は、配列番号４の塩基配列である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ルナティモナス・ロナレンシス由来の仮想タンパク質のアミノ酸配列（配列番号３）である。配列番号３に示すアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列からシグナルペプチドと推定された部分を削った配列である。
【図２Ａ】図２Ａは、比較例として使用したメリオリバクター・ロセウス由来のタンパク質のアミノ酸配列（配列番号９）である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、比較例として使用したメリオリバクター・ロセウス由来のタンパク質をコードする塩基配列（配列番号１０）である。
【図３】図３は、実施例１で培養して得られたルナティモナス・ロナレンシス由来のタンパク質（培養上清をフィルターろ過したもの）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。ルナティモナス・ロナレンシス由来のタンパク質のバンドを矢印で示す。
【図４】図４は、実施例２で培養して得られたルナティモナス・ロナレンシス由来のタンパク質（培養上清をフィルターろ過したもの）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。ルナティモナス・ロナレンシス由来のタンパク質のバンドを矢印で示す。
【図５】図５は、酵素反応生成物のＴＬＣ分析である。以下に、略称の説明を記載する。Ｇｌｃ：グルコース、Ｍａｎ：マンノース、Ｍａｌ：マルトース、Ｇａl：ガラクトース、Ｔａｌ：タロース、Ｂ：酵素反応前、Ｒ：酵素反応後。黒い丸（●）は反応生成物を示す。
【図６】図６は、グルコースに対して、本酵素溶液１、比較用酵素溶液および空ベクター対照を、ｐＨ６．０条件下で７２時間作用させたときの反応生成物中のマンノース含有率およびフルクトース含有率を示すグラフである。酵素添加量は、１０．３、２０．６、４１．３、８２．５、１６５．０および３３０．０μＬ／ｇ−ｄｓである。
【図７】図７は、グルコースに対して、本酵素溶液１、比較用酵素溶液および空ベクター対照を、ｐＨ６．０条件下で作用させたときの反応生成物中のマンノース含有率およびフルクトース含有率の経時変化を示すグラフである。酵素添加量は３３０．０μＬ／ｇ−ｄｓである。
【図８】図８は、グルコースに対して、本酵素溶液１、比較用酵素溶液および空ベクター対照を、ｐＨ７．０条件下で７２時間作用させたときの反応生成物中のマンノース含有率およびフルクトース含有率を示すグラフである。酵素添加量は、１０．３、２０．６、４１．３、８２．５、１６５．０および３３０．０μＬ／ｇ−ｄｓである。
【図９】図９は、グルコースに対して、本酵素溶液１、比較用酵素溶液および空ベクター対照を、ｐＨ７．０条件下で作用させたときの反応生成物中のマンノース含有率およびフルクトース含有率の経時変化を示すグラフである。酵素添加量は３３０．０μＬ／ｇ−ｄｓである。
【図１０】図１０は、グルコースに対して、本酵素溶液１、比較用酵素溶液および空ベクター対照を、ｐＨ８．０条件下で７２時間作用させたときの反応生成物中のマンノース含有率およびフルクトース含有率を示すグラフである。酵素添加量は、１０．３、２０．６、４１．３、８２．５、１６５．０および３３０．０μＬ／ｇ−ｄｓである。
【図１１】図１１は、グルコースに対して、本酵素溶液１、比較用酵素溶液および空ベクター対照を、ｐＨ８．０条件下で作用させたときの反応生成物中のマンノース含有率およびフルクトース含有率の経時変化を示すグラフである。酵素添加量は３３０．０μＬ／ｇ−ｄｓである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下に記載する本発明の説明は、代表的な実施形態や具体例に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に限定されるものではない。なお、本明細書について、糖質の記載は特に明記しない場合はＤ体を表す。また、「〜」を用いて表される数値範囲は「〜」の前後に記載される数値を下限値および上限値として含む範囲を意味する。本明細書では、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±１０％の範囲を含むことを意図する。
【００２４】
本発明の酵素による反応生成物の糖組成（％）は、ＨＰＬＣで検出されたピークの総面積を１００とした場合の、各糖類に対応するピークの面積比率（％）として算出したものである。
【００２５】
（酵素剤）
本発明は、以下の(ａ)から(ｃ)のいずれかのタンパク質を含む、糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤を提供する。
(ａ) 配列番号１または３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
(ｂ) 配列番号１または３に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質；
(ｃ) 配列番号１または３に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質。
なお、本明細書中において、上記(ａ)から(ｃ)のいずれかのタンパク質を、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質、または本タンパク質ということがある。
【００２６】
「糖のエピメリ化」または「糖に対するエピメリ化」とは、糖の複数ある不斉炭素のうち、１つの不斉炭素上の立体を反転させる反応であり、具体的には、一例として、糖の２位の水酸基をエピメリ化（異性化）する反応、またはその逆反応を挙げることができる。
【００２７】
エピメリ化を触媒する酵素を、通常、エピメラーゼといい、例えば、よく研究されているエピメラーゼとして、セロビオース  ２−エピメラーゼ（ＣＥ）を挙げることができる。ＣＥは、セロビオースの還元末端グルコース残基をマンノース残基に異性化する反応を触媒する。
【００２８】
配列番号１に記載のアミノ酸配列は、ルナティモナス・ロナレンシス（Ｌｕｎａｔｉｍｏｎａｓ  ｌｏｎａｒｅｎｓｉｓ）のゲノム情報から取得したアミノ酸配列（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：ＷＰ#０１０８５３２８１．１）である。ここで、配列番号１に記載のアミノ酸配列は、Ｎ−アシルグルコサミン  ２−エピメラーゼファミリーとアノテーションされているものの、タンパク質として発現させた場合の具体的性質は、本願出願時において知られていなかった。
【００２９】
本発明者らは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を、枯草菌発現系による組換えタンパク質として発現させ、その酵素活性を解析したところ、当該タンパク質は、少なくともグルコースに作用しマンノースを、ガラクトースに作用しタロースをそれぞれ生成することを発見した。すなわち、本発明者らは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質は、グルコース、マンノース、タロースおよびガラクトース等の単糖における２位の炭素に結合した水酸基に対しエピメリ化を触媒する酵素であることを見出した。配列番号３のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列からシグナルペプチドと推定された部分を削った配列である。
【００３０】
ルナティモナス・ロナレンシス由来の配列番号１に記載のアミノ酸配列は、既知のＣＥが有するアミノ酸配列に対して、一次アミノ酸配列同一性は５０％程度であった。具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列は、メリオリバクター・ロセウス（Ｍｅｌｉｏｒｉｂａｃｔｅｒ  ｒｏｓｅｕｓ）由来ＣＥ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦＮ７３７４９．１）に対して５０％一次アミノ酸配列同一性を有する（同一性はＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｌａｒｋｉｎ  Ｍ. Ａ. ｅｔ  ａｌ.,  ２００７, Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ, ２００７；  ２３：２９４７−２９４８）を用いて評価した）。
【００３１】
本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は、配列番号１または３に記載のアミノ酸配列に対して、９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ糖のエピメリ化活性を示すタンパク質であってもよい。一実施態様では、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は、配列番号１または３に記載のアミノ酸配列に対して、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ糖のエピメリ化活性を示すタンパク質であってもよい。
【００３２】
アミノ酸配列同一性は、比較する２本のアミノ酸配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならばギャップを導入した後、２本のアミノ酸配列間で同一であるアミノ酸残基のパーセントとして定義される。アミノ酸配列同一性は、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより決定することができる。
【００３３】
さらには、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は、配列番号１または３に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質からなり、かつ糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質であってもよい。本明細書で言う「１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列」における「１もしく数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
本発明の酵素剤に含まれるタンパク質の製造方法については、後述の＜タンパク質の製造＞を参照されたい。
【００３４】
本発明は、以下の（ｄ）から（ｆ）のいずれかのポリヌクレオチドが導入された形質転換細胞の培養上清を含む、糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤であって、前記糖がグルコース、マンノース、タロースおよびガラクトースからなる群から選択されるいずれかである、糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤を提供する。
（ｄ）配列番号２または４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２または４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２または４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して９０%以上の塩基配列同一性を有するポリヌクレオチドであって、かつ糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００３５】
配列番号２に示す塩基配列は、ルナティモナス・ロナレンシス（Ｌｕｎａｔｉｍｏｎａｓ  ｌｏｎａｒｅｎｓｉｓ）のゲノム情報から取得した配列番号１のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：ＷＰ#０１０８５３２８１．１）をコードする塩基配列である。配列番号４に示す塩基配列は、配列番号２の塩基配列からシグナルペプチドと推定された部分をコードする塩基配列を削った配列である。
【００３６】
配列番号２または４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入された形質転換細胞の培養上清も、本発明に含まれる。「配列番号２または４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、配列番号２または４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖をプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法等を採用することにより取得できるポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）を意味する。「ストリンジェントな条件」は、例えば、０．７〜１．０Ｍ塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜５×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣの組成：１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を使用し、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等が挙げられる（Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed (Sambrook、 Maniatisら、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))）。
【００３７】
また、配列番号２または４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、ポリヌクレオチドの塩基配列が９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の塩基配列同一性を有するポリヌクレオチドであり、かつエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入された形質転換細胞の培養上清も、本発明に含まれる。塩基配列同一性は、比較する２本の塩基配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならばギャップを導入した後、２本の塩基配列間で同一である塩基のパーセントとして定義される。塩基配列同一性は、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより決定することができる。
【００３８】
上記形質転換細胞は、枯草菌（バチルス・スブチリス、Bacillus subtilis）であることが好ましい。また、本発明の培養上清は、細胞を実質的に含まないものであり、細胞はフィルターや遠心分離により除去される。
【００３９】
本発明の培養上清は、上記(ｄ)から(ｆ)のポリヌクレオチドの発現産物であるタンパク質を含む。本明細書中において、本発明の培養上清に含まれる、上記(ｄ)から(ｆ)のポリヌクレオチドの発現産物であるタンパク質を、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質、または本タンパク質ということがある。
【００４０】
本発明の酵素剤に含まれるタンパク質のエピメリ化活性の評価は、グルコース、マンノース、タロースおよびガラクトースから選択される何れかを基質として、本発明のタンパク質を作用させ、得られたエピメリ化反応生成物を検出することにより行なわれる。
【００４１】
反応生成物は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用い、ＲＩ検出器や荷電化粒子検出器などで検出することができる。検出は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）および高性能イオン交換クロマトグラフィー／パルスドアンペロメトリ検出法（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）を用いて行うこともできる。
【００４２】
グルコースのエピメリ化によりマンノースが生成され、マンノースのエピメリ化によりグルコースが生成され、タロースのエピメリ化によりガラクトースが生成され、およびガラクトースのエピメリ化によりタロースが生成される。
【００４３】
本発明の糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤は、単糖または二糖の還元性糖残基における２位の炭素に結合した水酸基に対しエピメリ化を触媒するために用いることができる。本発明の一実施態様において、本発明の糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤は、これらに限定されないが、少なくともグルコース、マンノース、ガラクトースおよびタロースから選択されるいずれかの糖のエピメリ化反応を触媒するために用いることができる。本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は、少なくともグルコース、マンノースおよびガラクトースに作用するためである。本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は、単糖の２位の水酸基をエピメリ化することができる。
【００４４】
本発明の糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤は、糖のエピメリ化反応生成物の製造に用いることができる。具体的には、本発明の糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤は、グルコースを基質としてマンノースを製造するために使用することができ、またマンノースを基質としてグルコースを製造するために使用することができる。本発明の一実施態様において、本酵素剤は、グルコースを基質としてマンノースを製造するために使用することが好ましい。グルコースは、工業的に大量生産され安価であることから、工業的製造法に課題のあるマンノースを製造するために、容易に調達できるためである。
【００４５】
本発明の糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤は、ガラクトースを基質としてタロースを製造するために使用することができ、またタロースを基質としてガラクトースを製造するために使用することができる。本発明の一実施態様において、本酵素剤は、ガラクトースを基質としてタロースを製造するために使用することが好ましい。ガラクトースは、自然界に豊富に存在するラクトースの加水分解等によりに得られることから、希少糖の一つであるタロースを製造するために、容易に調達できるためである。
【００４６】
本発明の糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤は、Ｎ−アシルグルコサミンを基質としてもよいし、実質的に基質としなくてもよいが、好ましくは実質的に基質としない。本明細書において、特定の糖を実質的に基質にしないとは、例えば、マンノースを基質とした活性を１００％とした場合に、上記特定の糖を基質とした相対活性が５％以下であることを意味し、好ましくは１％以下であり、より好ましくは０％であり、さらに好ましくは、上記特定の糖を基質とする活性が測定不可であり、特に好ましくは、上記特定の糖を基質とする触媒反応が完全に生じないことを意味する。
【００４７】
本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定される分子量が４５〜５５ｋＤａの範囲であるか、または約５０ｋＤａである。なお、ここで示す本タンパク質の分子量は、プラスミドに本タンパク質をコードするＤＮＡを挿入し、枯草菌を宿主細胞として発現させたタンパク質の分子量である。実施例１および２において４５〜５５ｋＤａの範囲又は約５０ｋＤａと測定された本タンパク質の分子量の理論値は、５０．０ｋＤａである。
【００４８】
本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は、これらに限定されないが、少なくとも、グルコース、マンノース、タロースおよびガラクトースに作用し、これらの糖のエピメリ化反応を触媒することができる。
【００４９】
従来のセロビオース  ２−エピメラーゼには、グルコースからマンノースおよびフルクトースを生成するものがある（特許文献３、特許文献４）。しかし、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は、グルコースを主にマンノースに変換することができる。本タンパク質を用いた反応系においては、グルコースから、わずかにフルクトースが生成されることがあるが、微量である。
【００５０】
本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は、従来のセロビオース  ２−エピメラーゼに比較して、グルコースからマンノースを効率よく製造することができる。具体的には、実施例記載の同条件で基質グルコースに作用させた場合に、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は、特許文献６に記載のメリオリバクター・ロセウス（Ｍｅｌｉｏｒｉｂａｃｔｅｒ  ｒｏｓｅｕｓ）由来のＣＥに比較して、反応生成物中に１．３倍以上の含有率でマンノースを生成することができ、さらには１．４倍以上、１．５倍以上、１．６倍以上、１．７倍以上、１．８倍以上、１．９倍以上または２．０倍以上の含有率でマンノースを生成することができる。
【００５１】
本発明の酵素剤は、上記の糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質以外に、糖のエピメリ化反応を阻害しないものであれば、さらなる成分を含むことができる。これらは、例えば、緩衝液、安定化剤、賦形剤など、通常の酵素製剤に用いる成分であってもよい。このようなさらなる成分は、先行技術より公知であり、また当業者によく知られている。また、本発明の酵素剤は、その形状も特に制限は無く、固体（たとえば、粉末状）や液体であり得る。本発明の酵素剤は、例えば、固体や液体のものを、糖基質の溶液に添加することにより使用することができる。
【００５２】
本発明の酵素剤は、例えば、本発明の糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質が固定化担体に固定された酵素剤として提供することができる。固定化された酵素剤とすることで、例えば、高基質濃度および高温において、反応生成物の製造を行うことができ、また、バイオリアクター方式による反応生成物の製造を行うこともできる。
【００５３】
上記固定化担体は、特に制限されず、例えば、糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質が吸着または架橋結合され、本タンパク質の活性が保持されるものであれば使用できる。
【００５４】
上記固定化担体は、例えば、陰イオン交換担体、陽イオン交換担体、疎水性担体等があげられる。上記固定化担体の具体例は、例えば、イオン交換ゲルである。上記イオン交換ゲルは、例えば、ダイヤイオン（登録商標）ＳＫ１Ｂ、ダイヤイオン（登録商標）ＰＫ２１２、ダイヤイオン（登録商標）ＨＰＡ２５、ダイヤイオン（登録商標）ＵＢＫ５５５等のダイヤイオン（登録商標）シリーズ（三菱ケミカル社製）；セパビーズ（登録商標）ＳＰ−２０７、セパビーズ（登録商標）ＳＰ−８５０等のセパビーズ（登録商標）シリーズ（三菱ケミカル社製）；デュオライトＡ５６８、デュオライトＰＷＡ７、デュオライトＸＡＤ７６１等のデュオライトシリーズ（住化ケムテックス社製）等があげられる。
【００５５】
グルコース、マンノース、タロースおよびガラクトース以外の糖であっても、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質がエピメリ化を触媒できるものであれば、本発明の酵素剤を用いることができる。
上記固定化担体の形状は、特に制限されず、例えば、膜、ビーズ、プレート等があげられる。
【００５６】
糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質の上記固定化担体への固定方法は、特に制限されず、例えば、緩衝液等の溶媒に本タンパク質と上記固定化担体とを添加し、この混合液を振とうすることで行うことができる。
【００５７】
（糖のエピメリ化反応生成物の製造方法）
本発明は、糖基質に、本発明の糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤を作用させて、糖のエピメリ化反応生成物を得る工程を含む、糖のエピメリ化反応生成物の製造方法を提供する。
【００５８】
糖基質に、本発明の酵素剤を作用させることは、例えば、糖基質の水溶液を調製し、必要に応じてｐＨを調整した後、当該水溶液に本発明の酵素剤を添加することにより実施することができる。さらには、本発明の糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質を担体に固定して酵素剤とし、当該酵素剤に糖基質の水溶液を接触させることにより実施することができる。本発明の酵素剤を用いた糖のエピメリ化反応は、反応液中で実施することができるためである。
【００５９】
糖のエピメリ化反応生成物の製造方法に用いることができる糖基質は、グルコース、マンノース、ガラクトースおよびタロースから選択されるいずれかであってもよいが、これらに限定されず、これ以外の糖であっても本発明の酵素剤に含まれるタンパク質がエピメリ化を触媒できるものであれば、糖基質として使用することができる。上記糖基質としては、純品を用いても良いが、コスト等の点から他の糖質が含まれる糖組成物を用いてもよい。具体的には、例えば、グルコースを主な基質に用いる場合、グルコースに加えて澱粉の分解で生じるマルトースやマルトトリオースなどを含む糖組成物でもよい。
【００６０】
糖基質に、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質を作用させる際の反応温度は、酵素活性が発現する温度域であれば、特に制限はない。本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は、実施例記載の通り、ｐＨ６．０で反応した場合、温度が５３℃以下で反応可能である。従来のエピメラーゼの中には、熱安定性の点から工業的規模での使用について制限があるものがあった。しかし、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は、高い耐熱性を示し、工業的規模での使用に適した熱安定性を有している。
【００６１】
よって、本発明の酵素剤を作用させる際の反応温度（反応液の液温）を、３５〜５５℃といった幅広い温度域に設定することができる。工業的規模の反応系では正確な温度管理が難しい場合があるが、本タンパク質は、幅広い温度域で安定的に使用できる点で有利である。
【００６２】
上記反応温度は、３５〜５５℃の範囲に設定することができるが、４５〜５３℃の範囲に設定することが好ましい。反応温度が４５℃以上であれば、糖を栄養分とする混入菌が繁殖しにくく、５３℃以下で、本タンパク質は温度安定性を示すためである。
【００６３】
糖のエピメリ化反応生成物の製造方法においては、後述の通り、本発明の酵素剤と、その他の酵素を併用することができる。その他の酵素を併用する場合には、上記反応温度は、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質が安定に作用する温度域であればよい。上記の通り、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は幅広い温度域で安定性を有するため、併用するその他の酵素が安定に活性化する温度を勘案して、反応系で使用するすべての酵素の活性が十分に利用できる範囲に、温度設定ができる場合が多い。
【００６４】
反応温度は、反応時間の全体を通して一定である必要はなく、反応時間の初期に併用するその他の酵素の活性を高めることが望ましい場合には、その酵素の活性が高くなる温度域に、反応初期の温度を設定し、反応時間の中期や後期には、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質の活性が高くなる温度域に温度を設定するなど、適宜調整することができる。
【００６５】
糖基質に、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質を作用させる際の反応液のｐＨは、酵素活性が発現するｐＨ域であれば、特に制限はないが、ｐＨ５．５〜８．５の範囲に設定することができる。本発明の酵素剤に含まれるタンパク質は、実施例記載の通り、少なくともｐＨ６．０〜８．０の範囲で反応が可能であるためである。効率よく糖のエピメリ化反応生成物を得るには、本発明の酵素剤に含まれるタンパク質を作用させる際の反応液のｐＨを、ｐＨ６．０〜８．０の範囲に設定することが好ましい。反応液のｐＨの調整は、必要に応じ、酸又はアルカリの添加により行うことができる。
【００６６】
糖のエピメリ化反応生成物の製造方法における基質と本発明の酵素剤に含まれるタンパク質の反応時間は、反応温度や基質の濃度、その他の酵素を併用する場合には使用する酵素の特性等を考慮して適宜決定できる。また、本分野の従来技術に基づいて、効率よくエピメリ化反応生成物を製造するための、好適な反応時間を適宜決定することができる。具体的な反応時間の例としては、１０分から７２時間を挙げることができるが、これに限定する意図はない。反応中、本発明の酵素剤を、適宜添加することができる。
【００６７】
反応液中の基質濃度は、特に制限されず、例えば、上記酵素反応が進行可能な範囲において、基質濃度が高いほど経済的に有利である。基質としてグルコースを使用する場合、グルコース濃度は、溶媒１００ｇあたり０．１ｇ〜３００ｇの範囲である。上記反応液の溶媒は、特に制限されず、例えば、水、緩衝液等があげられる。なお、選択した基質の溶媒への溶解度が低い場合、例えば、所望の濃度で完全に溶解されない場合がある。バッチ式で酵素反応を行う場合、例えば、反応初期において基質が完全に溶解された状態である必要はなく、酵素反応の終了時に溶解される基質濃度を選択すればよい。一方、固定化された酵素剤を充填したカラムを酵素反応に使用する場合、例えば、カラムの目詰まりによる圧力損失を避けるために、基質が完全に溶解された状態であることが好ましい。また、固定化された酵素剤を充填したカラムを酵素反応に使用する場合、例えば、基質溶液を、上記カラムに還流させて、連続的に通液するのが好ましい。また、本発明の酵素剤を用いて、グルコースを基質としてマンノースを生成する場合、水飴、粉飴、ハイドロール（結晶グルコース製造の際に生ずる分蜜液）などを用いることができる。さらに、例えばデキストリン、澱粉等のグルコースを構成糖として含む糖質を原料とし、本発明の酵素剤と共に加水分解酵素を添加し、原料より基質となるグルコースを生成しつつグルコースからマンノースを製造することができる。
【００６８】
本発明の酵素剤を用いるエピメリ化反応生成物の製造は、具体的な例として、基質としてグルコースを用いる場合、固形分濃度１〜６５％程度のグルコース水溶液を調製し、必要に応じて酸またはアルカリを用いて当該水溶液のｐＨを６．０〜８．０程度に調整し、当該水溶液に本発明の酵素剤を添加し、温度３０〜５３℃の範囲で、約１〜７２時間保持することでマンノースを製造することができる。
【００６９】
また、糖のエピメリ化反応生成物の製造方法において、本発明の酵素剤と、その他の酵素を併用することができる。その他の酵素は、これに制限されないが、本発明の糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有する酵素の基質となりうる糖を生成するものであってもよい。例えば、その他の酵素として、乳糖等のガラクトースを構成糖として含む糖質を加水分解する酵素を用いることができる。本発明の酵素剤（すなわち、糖のエピメリ化反応触媒用酵素剤）と、当該加水分解酵素をその他の酵素として併用することにより、乳糖等のガラクトースを構成糖として含む糖質から、加水分解によりガラクトースを生成しつつ、エピメリ化によりガラクトースからタロースを生成することができる。
【００７０】
上記製造方法により、エピメリ化反応生成物を含む糖水溶液が得られる。このエピメリ化反応生成物を含む糖水溶液に対し、必要に応じて常法を用いて脱色、脱塩、精製処理などを施すことができる。また、エピメリ化反応生成物を含む糖水溶液に、樹脂分画処理、エタノール等を用いた有機溶媒による沈殿法、クロマト分画法や限外濾過膜による処理等を施すことにより、未反応の基質等を除去し、エピメリ化反応生成物の純度を高めることができる。精製処理は、単独の操作によって、またはいくつかの操作を組み合わせることにより、より効率的にエピメリ化反応生成物を精製することができる。
【００７１】
別の実施態様において、本発明は、糖基質に、本発明の糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤をｐＨ５．５〜７．０条件下で作用させて、糖のエピメリ化反応生成物を得る工程を含む、反応生成物中の副生が、目的エピメリ化反応生成物の５％以下に抑制された、糖のエピメリ化反応生成物の製造方法を提供する。例えば、グルコースに本発明の糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤をｐＨ５．５〜７．０条件下で作用させてマンノースを製造することができ、当該方法では反応生成物中のフルクトース副生をマンノースの５％以下に抑制することができる。上記ｐＨ条件は、ｐＨ５．５〜６．５の範囲であることが好ましい。反応生成物中の副生は、目的エピメリ化反応生成物の４．５％以下、４．０％以下、３．５％以下、３．０％以下、２．５％以下、２．０％以下、１．５％以下、１．０％以下または０．５％以下に抑制することが好ましい。
【００７２】
本発明は、糖のエピメリ化反応生成物の製造方法を実施して得られた糖のエピメリ化反応生成物を用いて食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品を得る工程を含む、食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品の製造方法を提供する。
【００７３】
糖のエピメリ化反応生成物は、上述の糖のエピメリ化反応生成物の製造方法を実施して得ることができる。
【００７４】
糖のエピメリ化反応生成物の製造方法を実施して得られた糖のエピメリ化反応生成物を用いて食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品を得る工程では、エピメリ化反応生成物を原料の一つとして、食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品を製造すること、またはエピメリ化反応生成物そのものを適当な形態（粉末、液体など）に調製し、食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品として提供することができる。
【００７５】
本発明の方法で製造される食品の例には、限定されるものではないが、各種炭水化物類（パン、麺、米飯、もち）、各種和菓子類（せんべい、あられ、おこし、求肥、もち類、まんじゅう、どら焼き、ういろう、餡類、羊羹、水羊羹、錦玉、カステラ、飴玉）、各種洋菓子類（パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、ドーナツ、蒸しケーキ、プリン、ゼリー、ムース、ババロア、カスタードクリーム、シュークリーム、ワッフル、スポンジケーキ、チョコレート、チューインガム、キャラメル、ヌガー、キャンディー、シロップ類）、各種氷菓（アイスクリーム、シャーベット、ジェラート、かき氷）、各種ペースト状食品（フラワーペースト、ピーナッツペースト、マーガリン、フルーツペースト）、各種飲料（果汁含有飲料、果汁ジュース、野菜ジュース、サイダー、ジンジャーエール、アイソトニック飲料、アミノ酸飲料、ゼリー飲料、コーヒー飲料、緑茶、紅茶、ウーロン茶、麦茶、乳飲料、乳酸菌飲料、ココア、ビール、発泡酒、第三のビール、ノンアルコール飲料、ビール風味飲料、リキュール、チューハイ、清酒、果実酒、蒸留酒、栄養ドリンク、健康飲料、粉末飲料）、果物・野菜加工品（ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖果、漬物）、各種乳製品（チーズ、ヨーグルト、バター、練乳、粉乳）、粉末食品（粉末スープ、粉末ムース、粉末ゼリー、粉末甘味料）、栄養食、ダイエット食、スポーツ用栄養食、流動食、半固形流動食、介護食、嚥下食等が挙げられる。
【００７６】
本発明の方法で製造される飼料および餌料の例には、限定されるものではないが、家畜、家禽、魚介類、昆虫（ミツバチ、蚕など）用飼料および餌料を挙げることができる。その形態としては、粉体、ペレット、錠剤、練り餌、カプセルなどである。
【００７７】
本発明の方法で製造される化粧料の例には、限定されるものではないが、保湿剤および美容剤などを挙げることができる。それらの形態としては、乳液、クリームおよびエマルジョンなどである。
【００７８】
本発明の方法で製造される医薬品の例には、限定されるものではないが、例えば抗肥満剤、血糖値上昇抑制剤などを挙げることができ、それらの形態としては、錠剤、粉剤、液剤、カプセル剤などである。
【００７９】
＜タンパク質の製造＞
本発明の酵素剤に含まれるタンパク質の取得方法は、特に制限されず、化学合成により合成したタンパク質であってもよいし、遺伝子組換え技術により作製した組換えタンパク質であってもよい。以下に、組換えタンパク質を作製する場合について説明する。
【００８０】
配列番号１または３に示されるアミノ酸配列、または配列番号１または３に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、および配列番号１または３に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質は、遺伝子工学的手法によって調製することができる。例えば、配列番号１または３のアミノ酸配列をコードする遺伝子は、宿主細胞内で複製可能であるか、あるいは染色体に組み込まれかつ同遺伝子を発現可能な状態で含むＤＮＡ分子として、特に発現ベクターに挿入された形態で宿主細胞の形質転換を行い、宿主細胞を培養することでタンパク質を産生させることができる。このＤＮＡ分子は、配列番号１または３に示されるアミノ酸配列、配列番号１または３に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号１または３に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片をベクター分子に組み込むことによって得ることができる。本発明の好ましい態様によれば、このベクターはプラスミドである。本発明におけるＤＮＡ分子の作製は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌに記載の方法に準じて行なうことができる。
【００８１】
本発明において利用できるベクターは、使用する宿主細胞の種類を勘案しながら、ウイルス、プラスミド、コスミドベクターなどから適宜選択できる。例えば、宿主細胞が枯草菌の場合はｐＪＥＸＯＰＴ２系（特許５１２６８７９号を参照）、ｐＨＴ系のプラスミド、大腸菌の場合はλファージ系のバクテリオファージ、ｐＥＴ系、ｐＵＣ系、ｐＣｏｌｄ系、ｐＧＥＸ系のプラスミド、酵母の場合はＹＥｐ、ＹＣｐ系、ＹＩｐ系のベクター、あるいはｐＬｅｕ４、ｐＰＰＬｅｕ４、ｐＪＰＬｅｕ４系（特開平４−２１８３８２号公報に記載）などが挙げられるが、これらに限定されない。このプラスミドは形質転換体を選択するためのマーカーを含んでいてもよく、該選択マーカーとしては薬剤耐性マーカーや栄養要求マーカー遺伝子を使用することができるが、これらに限定されない。
【００８２】
さらに、本発明で利用できる発現ベクターは、酵素遺伝子の発現に必要なＤＮＡ配列、例えばプロモーター、ターミネーター、リボゾーム結合部位、転写終結シグナルなどの転写調節信号、翻訳調節信号などを有することができる。該プロモーターとしては、枯草菌においてはズブチリシン、ＳＰＡＣ等のプロモーター、酵母ではアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、酸性フォスファターゼ（ＰＨＯ）、ガラクトース遺伝子（ＧＡＬ）、グリセルアルデビド３リン酸脱水素酵素遺伝子（ＧＡＰ）等のプロモーターを用いることができるが、これらに限定されない。シグナルペプチドの付与は、目的酵素が培養上清中に分泌され、精製が容易になるという利点があるので使用することが好ましい。また、シグナルペプチドを枯草菌や酵母由来のもの（例えば、インベルターゼシグナル、酸性フォスファターゼシグナル、λ−ファクターシグナルなど）に置き換えることができる。また、大腸菌においては、一般に慣用されるｌａｃプロモーターやＴ７プロモーターのほかに、ｃｓｐＡプロモーター等を用いて分子シャペロンを同時に発現させるなど、発現をより効率化する工夫を行うことができる
【００８３】
形質転換を行なった宿主細胞の培養は、使用する宿主細胞に関して一般的な方法を用いることができる。通常は、１〜４日程度の培養により細胞内または細胞外の培養物中に酵素が生成され蓄積される。培養条件（培地、ｐＨ、温度等）に関しては、例えば、細菌では２５〜３７℃、酵母では２５〜３０℃、真核細胞では３７℃程度が一般的である。培養条件については、遺伝子発現実験マニュアル（講談社）等を参照することができる。
【００８４】
宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌等の細菌、カンディダ・ウチリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）等の酵母以外に、リゾープス・ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｎｉｖｅｕｓ）、リゾープス・デルマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ）や高等真核生物（例えばＣＨＯ細胞など）を用いることができる。枯草菌としてはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物を用いることが好ましい。バチルス属にはタンパク質を菌体外へ分泌する株（例えば、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）など）が存在することが知られている。またプロテアーゼを殆ど分泌しない株も知られており、このような株を宿主として用いることも好ましい。本発明においては、宿主細胞として酵母、糸状菌または細菌が好ましいが、細菌がより好ましく、特に大腸菌やバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が好ましい。
【００８５】
形質転換体が産生したタンパク質の単離・精製は、公知の分離方法や精製方法を適当に組み合わせて行なうことができる。これらの分離・精製方法としては例えば塩沈殿、溶媒沈殿のような溶解性の差を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過およびＳＤＳ−ポリアクリル電気泳動のような分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーのような電荷の差を利用する方法、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーのような疎水性の差を利用する方法、さらに等電点電気泳動のような等電点の差を利用する方法、このほかにアフィニティークロマトグラフィー等が挙げられる。実施例に記載した精製方法のほかに、一般的な分離・精製法に関しては、例えば蛋白質・酵素の基礎実験法（南江堂）等を参照することができる。
【実施例】
【００８６】
以下の例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。なお、本明細書において、特に記載しない限り、「％」は質量基準であり、数値範囲はその端点を含むものとして記載される。また、操作手順は特に記載しない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ(１９８９))に記載の方法に従った。
【００８７】
本実施例では、ルナティモナス・ロナレンシス（Ｌｕｎａｔｉｍｏｎａｓ  ｌｏｎａｒｅｎｓｉｓ）からＮ−アシルグルコサミン  ２−エピメラーゼ（ＡＧＥ）と推定される機能未確認のタンパク質（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：ＷＰ＿０１０８５３２８１．１）をコードする遺伝子をクローニングして組換えタンパク質を得て、その酵素活性に関し特性評価を行った。
【００８８】
実施例１：枯草菌を宿主とした本酵素の菌体外発現（１）
１−１．発現プラスミドの構築
種々の微生物について新規酵素探索を行い、ルナティモナス・ロナレンシス（Ｌｕｎａｔｉｍｏｎａｓ  ｌｏｎａｒｅｎｓｉｓ）由来アミノ酸配列（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：ＷＰ#０１０８５３２８１．１）を選出し、機能解析を行った。このアミノ酸配列（配列番号１）およびアミノ酸配列をコードする遺伝子（以下、目的遺伝子１という）の塩基配列（配列番号２）を、それぞれ図１ＡおよびＢに示す。図１Ｃに示す配列番号３のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列からシグナルペプチドと推定された部分を削った配列である。配列番号２および４に示す塩基配列は、枯草菌での良好な発現を企図して、コドン最適化が行われている。
【００８９】
目的遺伝子１を枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）で発現させるための発現プラスミドを構築した。まず、ｐＵＣ５７ベクターに配列番号２に記載の塩基配列が挿入されたプラスミドを鋳型として、センス鎖増幅についてはベクターのシグナルペプチド配列の末端と相同な塩基配列を付加したプライマーを用いて、アンチセンス鎖増幅についてはターミネーター配列の一部を付加したプライマーを用いて、目的遺伝子をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ増幅用の反応液の組成を以下に示す。
２×Ｐｒｉｍｅｓｔａｒ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）  ５０μＬ
１０μＭ  プライマー（ＬｌＡＧＥ−Ｆｗ）                        ２μＬ
１０μＭ  プライマー（ＬｌＡＧＥ−Ｒｖ）                        ２μＬ
１ｎｇ／μＬ  テンプレート                                      ２μＬ
Ｈ2Ｏ                                                         ４４μＬ
【００９０】
使用プライマーを表１に示す。
【表１】
0006959411.tif 000002
【００９１】
ＰＣＲ増幅反応のプログラムは、まず、９６℃に１分間保持した後、９８℃で１０秒間→５５℃で５秒間→７２℃で１０秒間を１サイクルとして３５サイクル行った後にさらに７２℃で５分間保持した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、増幅断片（1、２９９ｂｐ）に相当するバンドをゲルから切り出し、ｉｌｌｕｓｔｒａTM  ＧＦＸTM  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア）を用いて抽出し精製した。
【００９２】
Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）クローニング反応で用いる線状化プラスミドの調製のため、ベクターｐＪＥＸＯＰＴ２（特許５１２６８７９号を参照）を本実施例に最適化するために改変したプラスミドを鋳型として、表２に示したプライマーを用いてＰＣＲを行った。アンチセンス鎖の増幅についてはベクターのシグナルペプチド配列の末端から増幅するように組んだプライマーを用いた。
【００９３】
使用プライマーを表２に示す。
【表２】
0006959411.tif 000003
【００９４】
ＰＣＲ増幅の反応液の組成は、プライマーおよび鋳型以外は目的遺伝子１の増幅に使用したものと同じであった。ＰＣＲ増幅反応のプログラムは、まず、９６℃に１分間保持した後、９８℃で１０秒間→５５℃で５秒間→７２℃で３５秒間を１サイクルとして３５サイクル行った後にさらに７２℃で５分間保持した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、増幅断片（６、９３５ｂｐ）に相当するバンドをゲルから切り出し、ｉｌｌｕｓｔｒａTM  ＧＦＸTM  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア）を用いて抽出し精製した。目的遺伝子１の増幅ＤＮＡ断片およびベクターｐＪＥＸＯＰＴ２の増幅断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて連結した。連結反応は５０℃にて１５分間保持することで行った。
【００９５】
連結反応溶液を２．５μＬ用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換し、培養した培養液からｉｌｌｕｓｔｒａTM  ｐｌａｓｍｉｄＰｒｅｐ  Ｍｉｎｉ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア）によりプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドを「本酵素発現用プラスミド」とした。
【００９６】
１−２．組換えタンパク質の発現
上記の本酵素発現用プラスミドをプロトプラスト化した枯草菌ＩＳＷ１２１４（タカラバイオ）に導入し、７．５μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含むＤＭ３再生寒天培地（組成：８．１％コハク酸ナトリウム、１％寒天、０．５％カザミノ酸、０．５％酵母エキス、０．１５％リン酸２水素カリウム、０．３５％リン酸水素２カリウム、０．５％グルコース、０．４％塩化マグネシウム、０．０１％ウシ血清アルブミン、０．００１％メチオニン、および０．００１％ロイシン）にて３０℃で２日間培養した。得られたコロニーを用い、前培養を経た後、本培養を７２時間培養した（特許５１２６８７９号に記載の通り培養したが、培地の組成は改変したものを使用した）。遠心分離（５，０００×ｇ、４℃、５分間）行い、上清をポアサイズが０．４５μｍのフィルター（メルク）で濾過したものを本酵素溶液１とした。この本酵素溶液１をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、目的のサイズ（５０，０００）付近にバンドが出ていることを確認した（図３）。
【００９７】
実施例２：枯草菌を宿主とした本酵素の菌体外発現（２）
実施例１−１にて構築した本酵素発現用プラスミドを用い、実施例２を行った。
２−１．組換えタンパク質の発現
実施例１−２と同様の方法で枯草菌ＩＳＷ１２１４（タカラバイオ）への本酵素発現用プラスミドの導入および培養を実施した。得られた培養液について、遠心分離（５，０００×ｇ、４℃、５分間）行い、上清をポアサイズが０．４５μｍのフィルター（メルク）で濾過したものを培養上清とした。この培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、目的のサイズ（５０，０００）付近にバンドが出ていることを確認した（図４）。さらに、この培養上清をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心式フィルターユニット（メルク）を用い、１０倍程度濃縮し、本酵素溶液２とした。
【００９８】
比較例１：比較用酵素溶液の調製
１．発現プラスミドの構築
実施例１に記載のルナティモナス・ロナレンシス由来エピメリ化酵素と機能の比較を行うため、特許文献６に記載のメリオリバクター・ロセウス（Ｍｅｌｉｏｒｉｂａｃｔｅｒ  ｒｏｓｅｕｓ）由来のＣＥ（アミノ酸配列のＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ：ＡＦＮ７３７４９．１）について、枯草菌での菌体外発現を行った。このアミノ酸配列（配列番号９）およびアミノ酸配列をコードする遺伝子（以下、比較用遺伝子という）の塩基配列（配列番号１０）を、それぞれ図２ＡおよびＢに示す。配列番号１０に示す塩基配列は、枯草菌での良好な発現を企図してコドン最適化が行われている。
【００９９】
比較用遺伝子を枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）で発現させるための発現プラスミドを構築した。まず、ｐＵＣ５７ベクターに配列番号１０に記載の塩基配列が挿入されたプラスミドを鋳型として、センス鎖増幅についてはベクターのシグナルペプチド配列の末端と相同な塩基配列を付加したプライマーを用いて、アンチセンス鎖増幅についてはターミネーター配列の一部を付加したプライマーを用いて、比較用遺伝子をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ増幅用の反応液の組成を以下に示す。
２×Ｐｒｉｍｅｓｔａｒ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）  ５０μＬ
１０μＭ  プライマー（ＭＲＯＳＣＥ−Ｆｗ）                      ２μＬ
１０μＭ  プライマー（ＭＲＯＳＣＥ−Ｒｖ）                      ２μＬ
１ｎｇ／μＬ  テンプレート                                      ２μＬ
Ｈ2Ｏ                                                         ４４μＬ
【０１００】
使用プライマーを表３に示す。
【表３】
0006959411.tif 000004
【０１０１】
ＰＣＲ増幅反応のプログラムは、まず、９６℃に１分間保持した後、９８℃で１０秒間→５５℃で５秒間→７２℃で１０秒間を１サイクルとして３５サイクル行った後にさらに７２℃で５分間保持した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、増幅断片（1，３８３ｂｐ）に相当するバンドをゲルから切り出し、ｉｌｌｕｓｔｒａTM  ＧＦＸTM  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア）を用いて抽出し精製した。
【０１０２】
Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）クローニング反応で用いる線状化プラスミドの調製は、実施例１−１と同様の操作を行い、比較用遺伝子の増幅ＤＮＡ断片およびベクターｐＪＥＸＯＰＴ２（特許５１２６８７９号を参照）を本実施例に最適化するために改変したプラスミドの増幅断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて連結した。連結反応は５０℃にて１５分間保持することで行った。
【０１０３】
連結反応溶液を２．５μＬ用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換し、培養した培養液からｉｌｌｕｓｔｒａTM  ｐｌａｓｍｉｄＰｒｅｐ  Ｍｉｎｉ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア）によりプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドを「比較酵素発現用プラスミド」とした。
【０１０４】
２．組換えタンパク質の発現
上記の比較酵素発現用プラスミドをプロトプラスト化した枯草菌ＩＳＷ１２１４（タカラバイオ）に導入し、７．５μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含む再生寒天培地（組成：８．１％コハク酸ナトリウム、１％寒天、０．５％カザミノ酸、０．５％酵母エキス、０．１５％リン酸２水素カリウム、０．３５％リン酸水素２カリウム、０．５％グルコース、０．４％塩化マグネシウム、０．０１％ウシ血清アルブミン、０．００１％メチオニン、および０．００１％ロイシン）にて３０℃で２日間培養した。得られたコロニーを用い、実施例１−２と同様に前培養および本培養を行った。得られた培養液を遠心分離（５，０００×ｇ、４℃、５分間）し、上清をポアサイズが０．４５μｍのフィルター（メルク）で濾過したものを比較用酵素溶液とした。
【０１０５】
比較例２：空ベクター対照（陰性対照）の調製
陰性対照として空ベクターで形質転換した細胞の培養上清を調製した。ベクターｐＪＥＸＯＰＴ２（特許５１２６８７９号を参照）を本実施例に最適化するために改変したプラスミドをプロトプラスト化した枯草菌ＩＳＷ１２１４（タカラバイオ）に導入し、７．５μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含む再生寒天培地（組成：８．１％コハク酸ナトリウム、１％寒天、０．５％カザミノ酸、０．５％酵母エキス、０．１５％リン酸２水素カリウム、０．３５％リン酸水素２カリウム、０．５％グルコース、０．４％塩化マグネシウム、０．０１％ウシ血清アルブミン、０．００１％メチオニン、および０．００１％ロイシン）にて３０℃で２日間培養した。得られたコロニーを用い、実施例１−２と同様に前培養および本培養を行った。得られた培養液を遠心分離（５，０００×ｇ、４℃、５分間）し、上清をポアサイズが０．４５μｍのフィルター（メルク）で濾過したものを空ベクター対照（陰性対照）とした。
【０１０６】
実施例３：酵素反応生成物のＴＬＣ分析
本実施例では、本酵素が作用する基質を検証した。酵素反応の基質には、マンノースおよびガラクトースを用いた。
５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）１０μＬ、５００ｍＭ  各種基質１０μＬ、本酵素溶液１を１０μＬおよび超純水７０μＬからなる、反応液１００μＬを３７℃にて２４時間保持し、このうち０．５μＬを薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）に供した。
【０１０７】
展開溶媒は、２−プロパノール／１−ブタノール／水の混合液（順に２：２：１の混合比（すべて体積比））を用いた。
糖の検出は、呈色剤としてアニスアルデヒド／硫酸／酢酸の混合液（順に１：２：９７の混合比（すべて体積比））をＴＬＣプレートに噴霧後、加熱することにより実施した。
【０１０８】
その結果を図５に示す。両基質において、酵素反応前の糖（基質）と反応後の糖の移動距離に違いが観察された。マンノースを基質とした分析では、反応後のサンプル中にグルコースの移動度と一致するスポットが認められた。また、ガラクトースを基質とした分析では、反応後のサンプル中にタロースの移動度と一致するスポットが認められた。ルナティモナス・ロナレンシス由来の本酵素は、少なくともマンノースおよびガラクトースに作用することが明らかとなった。
【０１０９】
実施例４：マンノース合成試験
４−１．方法
本酵素溶液１および比較用酵素溶液について、グルコースを基質としたマンノースの合成試験を実施した。すなわち、１０．３〜３３０．０μＬ／ｇ−ｄｓの酵素（本酵素溶液１または比較用酵素溶液）、５０％  グルコース、４０ｍＭ  各緩衝液（ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液 (ｐＨ６．０)、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）またはＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．０））、および０．０２％アジ化ナトリウムからなる、反応液１ｍＬを５０℃にて２４〜７２時間保持した。また、共存する緩衝液成分等による異性化を調査するために、空ベクター対照を用いた反応液についても上記同様に調製、保持した。各反応時間にて採取した反応液を、ｐＨを４．０以下とし、１０分間煮沸することで反応を停止した。その後、反応液１０μＬと純水８００μＬを混合し希釈した。
【０１１０】
グルコースを基質とした本酵素の生成物の糖組成をＨＰＬＣで分析した。分析条件はカラム：ＨＩＬＩＣｐａｋ  ＶＧ−５０  ４Ｅ（Ｓｈｏｄｅｘ）、ＨＩＬＩＣｐａｋ  ＶＧ−５０Ｇ  ４Ａ（Ｓｈｏｄｅｘ）、溶離液：８０％アセトニトリル、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：４０℃、検出器：荷電化粒子検出器とした。
【０１１１】
４−２．結果
グルコースに対して上記の通り酵素を作用させたときの反応生成物について、その糖組成分析の結果を図６〜１１に示す。反応生成物中のマンノース含有率およびフルクトース含有率はＨＰＬＣ分析のピーク面積比より算出した。
【０１１２】
本酵素溶液１添加区および比較用酵素溶液添加区では、ｐＨ６．０、７．０および８．０の全ての試験区において、グルコースからマンノースが生成された。本酵素溶液１添加区と比較用酵素溶液添加区との反応生成物中のマンノース含有率を比較すると、すべての試験区において本酵素溶液１の方が、約１．３〜２．０倍高いマンノース含有率を示した。一方で、空ベクター対照を添加した試験区では、試験した何れのｐＨにおいても、マンノースは生成されなかった。
【０１１３】
本酵素溶液１を３３０．０μＬ／ｇ−ｄｓ添加し、反応温度５０℃、７２時間保持した条件において、マンノースの含有率は最大でｐＨ６．０では２８．７％、ｐＨ７．０では２７．２％、ｐＨ８．０では２９．６％であった。これは、同条件で比較用酵素を用いた場合の約１．３倍であった。
【０１１４】
ｐＨ６．０の試験区では、本酵素溶液１、比較用酵素溶液および空ベクター対照のいずれを用いた場合も、フルクトースはほとんど検出されなかった。一方、ｐＨ７．０および８．０の試験区では、本酵素溶液１、比較用酵素溶液および空ベクター対照のいずれを用いた場合もフルクトースの生成が確認された。ｐＨ７．０で７２時間作用させた場合、本酵素溶液１、比較用酵素溶液および空ベクター対照のいずれを用いた場合も、フルクトースの含有率は１．１〜１．６％であった。ｐＨ８．０で７２時間作用させた場合、本酵素溶液１、比較用酵素溶液および空ベクター対照のいずれを用いた場合も、フルクトースの含有率は３．２〜７．２％であった。ｐＨ７．０およびｐＨ８．０ともに、酵素添加量が多くなると、反応生成物中のフルクトース含有率は低下する傾向がみられた。
【０１１５】
本酵素溶液１を３３０．０μＬ／ｇ−ｄｓ添加し、ｐＨ８．０で７２時間作用させた場合、反応生成物中のマンノース含有率は２９．６％であり、フルクトース含有率は３．４％であり、反応生成物中のフルクトース副生が、マンノースの約１１．４％に相当した。また、本酵素溶液１を３３０．０μＬ／ｇ−ｄｓ添加し、ｐＨ７．０で７２時間作用させた場合、反応生成物中のマンノース含有率は２７．２％であり、フルクトース含有率は１．２％であり、反応生成物中のフルクトース副生が、マンノースの約４．４％に相当した。一方で、本酵素溶液１を３３０．０μＬ／ｇ−ｄｓ添加し、ｐＨ６．０で７２時間作用させた場合、反応生成物中のマンノース含有率は２８．７％であり、フルクトース含有率は０．９％であり、反応生成物中のフルクトース副生が、マンノースの約３．１％相当であった。
【０１１６】
これらの結果から、フルクトースは非酵素的な反応（例えば、緩衝液やｐＨの影響によるグルコースからフルクトースへの異性化等）若しくは夾雑酵素の反応（異性化酵素によるグルコースからフルクトースへの変換）によって生成されたものであることが示唆された。さらにｐＨ７．０以下、特にｐＨ６．０にて反応を行うことで、フルクトースの生成を抑制することができることが明らかとなった。
【０１１７】
実施例５：タロースの合成試験
１．方法
本酵素溶液２について、ガラクトースを基質としたタロースの合成試験を実施した。すなわち、ガラクトース１ｋｇを水に溶解した後に、１７８．５ｇの本酵素溶液２を添加、更にｐＨを６．０に調整して、反応液の重量が２ｋｇとなるように水を添加し、混合した。当該反応液を５３℃にて２４〜７２時間反応させた。各反応時間にて採取した反応液を、ｐＨ４．０以下に調整し、１０分間煮沸することで反応停止させた。その後、反応液１０μＬと純水８００μＬを混合させ、希釈した。
【０１１８】
得られた反応希釈液中のガラクトース、タロースおよびガラクトースの糖組成をＨＰＬＣで分析した。分析条件はカラム：ＨＩＬＩＣｐａｋ  ＶＧ−５０  ４Ｅ（Ｓｈｏｄｅｘ）、ＨＩＬＩＣｐａｋ  ＶＧ−５０Ｇ  ４Ａ（Ｓｈｏｄｅｘ）、溶離液：８０％アセトニトリル、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：４０℃、検出器：荷電化粒子検出器とした。
【０１１９】
２．結果
ガラクトースに対して本酵素溶液２を作用させたときの反応生成物について、糖組成分析結果を表４に示す。
【表４】
0006959411.tif 000005
＊ＨＰＬＣ分析のピーク面積比より算出した。
【０１２０】
本酵素は反応温度５３℃にて反応可能であり、ガラクトースからタロースおよびタガトースが生成した。タロース含有率は最大１７．５％であった。
【配列表フリーテキスト】
【０１２１】
配列番号１：ルナティモナス・ロナレンシス由来のタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２：ルナティモナス・ロナレンシス由来のタンパク質をコードする塩基配列
配列番号３：ルナティモナス・ロナレンシス由来のタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４：ルナティモナス・ロナレンシス由来のタンパク質をコードする塩基配列
配列番号５〜８：プライマー配列
配列番号９：メリオリバクター・ロセウス由来のタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１０：メリオリバクター・ロセウス由来のタンパク質をコードする塩基配列
配列番号１１〜１２：プライマー配列
【要約】      （修正有）【課題】副生成物が少なく、効率的にエピメリ化反応を触媒する酵素剤を提供する。【解決手段】以下の(ａ)から(ｃ)のいずれかのタンパク質を含む、糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤であって、前記糖がグルコース、マンノース、タロースおよびガラクトースからなる群から選択されるいずれかである、糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤を開示する。(ａ)ルナティモナス・ロナレンシス由来の特定のアミノ酸配列からなるタンパク質；(ｂ）(ａ)のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質；(ｃ)（ａ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質。【選択図】なし【図１Ａ】
0006959411.tif 000006
【図１Ｂ】
0006959411.tif 000007
【図１Ｃ】
0006959411.tif 000008
【図２Ａ】
0006959411.tif 000009
【図２Ｂ】
0006959411.tif 000010
【図３】
0006959411.tif 000011
【図４】
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【図５】
0006959411.tif 000013
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
0006959411000001.app