(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
RPB1遺伝子における、該遺伝子によりコードされるRPB1タンパク質のアミノ酸残基K1268のユビキチン化を抑制させる変異を、対の染色体の両方において有し、前記変異が前記アミノ酸残基K1268をコードするコドンの変異であり、且つ前記コドンの変異が前記アミノ酸残基K1268のアミノ酸残基置換又は欠失を引き起こす変異である、老化及び／又は神経変性モデル動物。
【請求項２】
前記コドンの変異が前記アミノ酸残基K1268のアミノ酸残基置換を引き起こす変異である、請求項１に記載のモデル動物。
【請求項３】
前記アミノ酸残基置換後のアミノ酸残基が、リシン残基以外の塩基性アミノ酸残基である、請求項２に記載のモデル動物。
【請求項４】
さらに、DNA修復遺伝子の変異を有する、請求項１〜３のいずれかに記載のモデル動物。
【請求項５】
コケイン症候群やトリコチオジストロフィー、色素性乾皮症を含む、早期老化、神経変性、全身性の発育発達異常などを発症する、転写と共役したヌクレオチド除去修復の異常を示す疾患からなる群より選択される少なくとも1種の疾患のモデル動物である、請求項１〜５のいずれかに記載のモデル動物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のモデル動物に発生する、受精卵又は胚。
【請求項７】
RPB1遺伝子における、該遺伝子によりコードされるRPB1タンパク質のアミノ酸残基K1268のユビキチン化を抑制させる変異を、対の染色体の両方において有し、前記変異が前記アミノ酸残基K1268をコードするコドンの変異であり、且つ前記コドンの変異が前記アミノ酸残基K1268のアミノ酸残基置換又は欠失を引き起こす変異である、細胞。
【請求項８】
RPB1遺伝子の少なくとも1部を含み、且つ該遺伝子によりコードされるRPB1タンパク質のアミノ酸残基K1268のユビキチン化を抑制させる変異を有するドナーDNAを含み、前記変異が前記アミノ酸残基K1268をコードするコドンの変異であり、且つ前記コドンの変異が前記アミノ酸残基K1268のアミノ酸残基置換又は欠失を引き起こす変異である、老化及び／又は神経変性モデル動物製造用組成物。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれかに記載のモデル動物、請求項６に記載の受精卵若しくは胚、又は請求項７に記載の細胞を用いた、老化及び／又は神経変性の予防剤、改善剤、又は増悪原因物質のスクリーニング方法。
【請求項１０】
（a）請求項１〜５のいずれかに記載のモデル動物、請求項６に記載の受精卵若しくは胚、又は請求項７に記載の細胞に被検物質を投与する又は接触させる工程、
（b）被検物質が投与又は接触された前記モデル動物、前記受精卵若しくは胚、又は前記細胞の、老化及び／又は神経変性の表現型を評価する工程、及び
（c1）老化及び／又は神経変性の表現型が治癒又は緩和していた場合に、前記被検物質を老化及び／又は神経変性の予防剤又は改善剤として選別する工程、又は
（c2）老化及び／又は神経変性の表現型が悪化していた場合に、前記被検物質を老化及び／又は神経変性の増悪原因物質として選別する工程、
を含む、請求項９に記載のスクリーニング方法。  
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、老化及び／又は神経変性モデル動物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
高齢化の進展と共に、老化疾患や神経変性疾患の患者数は増大の一途を辿っている。これらの疾患の病態解析、予防法開発、治療法開発等においては、モデル動物の開発が重要である。
【０００３】
転写共役ヌクレオチド除去修復 (TC-NER)は、転写領域に存在するDNA 損傷を効率的に除去するメカニズムである。ヒトではTC-NER が欠損するとコケイン症候群やトリコチオジストロフィーなど、発育発達異常や早期老化などを伴う全身性の重篤な遺伝性疾患を発症する（非特許文献１）。これは、修復されていないDNA 損傷がRNA polymerase II (RNA pol IIo)の転写と正常な遺伝子発現を阻害していることによると考えられる。TC-NER は、DNA 損傷箇所で停止したRNA pol IIo を認識し処理することで開始すると考えられている。この反応には、コケイン症候群原因遺伝子産物のCSA/CSB、紫外線感受性症候群遺伝子産物のUVSSAが関与し、RNA pol IIo を除去し、基本転写因子TFIIH を損傷箇所にリクルートすることで、損傷の除去、DNA 修復合成とギャップの結合、転写の再開が起こると理解されている。これらTC-NER のコンセプトが発表されてから30 年ほど経つが、TC-NER 開始反応の詳細な分子機構は明らかにされていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】DNA repair-deficient diseases, xeroderma pigmentosum, Cockayne syndrome and trichothiodystrophy. Lehmann AR. Biochimie 85 (11): 1101-11 (2003).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、老化及び／又は神経変性モデル動物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は上記課題に鑑みて鋭意研究を進めた結果、RPB1遺伝子において、該遺伝子によりコードされるRPB1タンパク質のアミノ酸残基K1268のユビキチン化を抑制させる変異を導入することにより、老化や神経変性の表現型を呈することを見出した。本発明者は、この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明を完成させた。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
【０００７】
項１．  RPB1遺伝子において、該遺伝子によりコードされるRPB1タンパク質のアミノ酸残基K1268のユビキチン化を抑制させる変異を有する、老化及び／又は神経変性モデル動物。
【０００８】
項２．  前記変異が前記アミノ酸残基K1268をコードするコドンの変異である、項１に記載のモデル動物。
【０００９】
項３．  前記コドンの変異が前記アミノ酸残基K1268のアミノ酸残基置換又は欠失を引き起こす変異である、項２に記載のモデル動物。
【００１０】
項４．  前記コドンの変異が前記アミノ酸残基K1268のアミノ酸残基置換を引き起こす変異である、項２又は３に記載のモデル動物。
【００１１】
項５．  前記アミノ酸残基置換後のアミノ酸残基が、リシン残基以外の塩基性アミノ酸残基である、項４に記載のモデル動物。
【００１２】
項６．  対の染色体の片方あるいは両方において前記変異を有する、項１〜５のいずれかに記載のモデル動物。
【００１３】
項７．  さらに、DNA修復遺伝子の変異を有する、項１〜６のいずれかに記載のモデル動物。
【００１４】
項８．  コケイン症候群やトリコチオジストロフィー、色素性乾皮症を含む、早期老化、神経変性、全身性の発育発達異常などを発症する、転写と共役したヌクレオチド除去修復の異常を示す疾患からなる群より選択される少なくとも1種の疾患のモデル動物である、項１〜７のいずれかに記載のモデル動物。
【００１５】
項９．  項１〜８のいずれかに記載のモデル動物に発生する、受精卵又は凍結胚。
【００１６】
項１０．RPB1遺伝子において、該遺伝子によりコードされるRPB1タンパク質のアミノ酸残基K1268のユビキチン化を抑制させる変異を有する、細胞。
【００１７】
項１１．  RPB1遺伝子の少なくとも1部を含み、且つ該遺伝子によりコードされるRPB1タンパク質のアミノ酸残基K1268のユビキチン化を抑制させる変異を有するドナーDNAを含む、老化及び／又は神経変性モデル動物製造用組成物。
【００１８】
項１２．  項１〜８のいずれかに記載のモデル動物、項９に記載の受精卵若しくは胚、又は項１０に記載の細胞を用いた、老化及び／又は神経変性の予防剤、改善剤、又は増悪原因物質のスクリーニング方法。
【００１９】
項１３．  （a）項１〜８のいずれかに記載のモデル動物、項９に記載の受精卵若しくは胚、又は項１０に記載の細胞に被検物質を投与する又は接触させる工程、
（b）被検物質が投与又は接触された前記モデル動物、前記受精卵若しくは胚、又は前記細胞の、老化及び／又は神経変性の表現型を評価する工程、及び
（c1）老化及び／又は神経変性の表現型が治癒又は緩和していた場合に、前記被検物質を老化及び／又は神経変性の予防剤又は改善剤として選別する工程、又は
（c2）老化及び／又は神経変性の表現型が悪化していた場合に、前記被検物質を老化及び／又は神経変性の増悪原因物質として選別する工程、
を含む、項１２に記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、老化及び／又は神経変性モデル動物を提供することができる。また、該モデル動物を作製するためのツール、該モデル動物を利用した、予防剤、改善剤、又は増悪原因物質のスクリーニング方法等を提供することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】Polr2aK1268R / K1268R / Xpa-/-二重変異（DM）マウスの体重分布と成長曲線（代表写真左：♂、コントロール、Poll2aWT / WT / Xpa-/-、ID53、144日目、♂、DM、ID55、 144日目;右：♀、コントロール、Poll2aWT / WT / Xpa-/-、ID47、144日目;♀、DM、ID45、144日目）を示す。 体重の減少は、生後3か月からDMマウスでのみ観察された。 Xpa-/-遺伝子型を持つ動物の体重は、1週間ごとにスケーリングされた。 KR / KR（DM）、Poll2aK1268R / K1268R / Xpa-/-; WT / KR、Poll2aWT / K1268R / Xpa-/-; WT / WT、Poll2aWT / WT / Xpa-/-。
【図２】DMマウスで観察される代表的な早老化表現型を示す。 DMマウス（ID48、139日目）における脊柱後弯（1）、歩行異常（2）、および痩身（3）。 DMマウス（ID55、144日目）における後肢ジストニア（4）、および正常（5）Polr2aWT / K1268R / Xpa-/-同腹子（ID51、144日目）。 DMマウスでの色素脱失（6）（ID48、139日目）。 DMマウスの白内障（7; 8、拡大図）（ID45、153日目）。
【図３】コンピューター断層撮影（CT）画像を示す。DMマウスで重度の脊柱後弯を検出した（♂、ID116、180日目）。 通常の同腹子コントロールが示される（♂、ID118、Poll2aWT / WT / Xpa +/- 180日目）。 CT撮影は麻酔下で行われた。
【図４】大脳皮質の面性染色画像を示す。大脳皮質の星状細胞の活性化が、正常コントロール（Polr2aWT / K1268R/ Xpa +/-、ID58、153日目）と比較して、末期のDMマウス（ID59、153日目）で観察された。 星状細胞及びグリア線維性酸性タンパク質（GFAP）を赤で示す。
【図５】野生型（C57BL / 6）、コントロール（Polr2aWT / K1268R / Xpa-/-、ID136、181日目）、DM（ID127、163日目）のマウスからのトルイジンブルー染色腰椎第5腹根の代表的な画像 末端表現型を示す。 軸索の変性および無傷の軸索の数の減少が観察された。
【図６】軸索変性が、最終表現型を示すDMマウスで観察された。 腰椎第5運動軸索の平均数がプロットされている（n = 3：野生型、C67BL / 6（3）;対照、Poll2aWT / K1268R / Xpa-/-、ID111、129、136; DM、ID109、120、127）。 データは、平均±標準偏差として表示される。P値は一元配置分散分析及びTukey-Kramer post hoc検定でで計算された。
【図７】腰髄切片の代表的な免疫蛍光画像を示す。運動ニューロンの喪失、ならびにミクログリアおよび反応性星状細胞の数の増加が、コントロールPolr2aWT / K1268R / Xpa-/-（ID111、166日目）マウスと比較して、末期（ID120、166日目）のDMマウスの腰髄（ボックス領域）で観察された。 運動ニューロン及びコリンアセチルトランスフェラーゼ（ChAT）が緑色で示され; ミクログリア及びイオン化カルシウム結合アダプター分子1（Iba-1）が赤色で示され; 星状細胞及びグリア線維性酸性タンパク質（GFAP）が白で示される。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
【００２３】
1．定義
本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
【００２４】
アミノ酸配列の「同一性」とは、2以上の対比可能なアミノ酸配列の、お互いに対するアミノ酸配列の一致の程度をいう。従って、ある2つのアミノ酸配列の一致性が高いほど、それらの配列の同一性又は類似性は高い。アミノ酸配列の同一性のレベルは、例えば、配列分析用ツールであるFASTAを用い、デフォルトパラメータを用いて決定される。若しくは、Karlin及びAltschulによるアルゴリズムBLAST（KarlinS，Altschul SF．“Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoringschemes”Proc Natl Acad Sci USA．87:2264−2268（1990）、KarlinS，Altschul SF．“Applications and statistics for multiple high−scoring segments in molecular sequences．”Proc Natl Acad Sci USA．90:5873−7（1993））を用いて決定できる。このようなBLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、National Center of Biotechnology Information（NCBI）のウェエブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を参照すればよい。また、塩基配列の『同一性』も上記に準じて定義される。
【００２５】
本明細書中において、「保存的置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；スレオニン、バリン、イソロイシンといったβ−分枝側鎖を有するアミノ酸残基；チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換にあたる。
【００２６】
2．モデル動物、細胞
本発明は、その一態様において、RPB1遺伝子において、該遺伝子によりコードされるRPB1タンパク質のアミノ酸残基K1268のユビキチン化を抑制させる変異を有する、老化及び／又は神経変性モデル動物（本明細書において、「本発明のモデル動物」と示すこともある。）に関する。以下に、これについて説明する。
【００２７】
動物としては、特に制限されず、例えばヒト、サル、マウス（ハツカネズミ属動物）、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカ等の哺乳類動物が挙げられる。これらの中でも、実験動物として使用し得る動物が好ましく、ハツカネズミ属動物がより好ましく、Mus musculusがさらに好ましい。また、哺乳類動物は、系統種であってもよく、雑種であってもよい。また、系統種としては、マウスの場合であれば、例えばC57BL／6、C3H、ICR、BALB／cが挙げられるが、好ましくはC57BL／6である。ヒトをモデル動物とする場合には、健常人あるいは疾患患者に由来する細胞や、iPS細胞などの使用が想定される。
【００２８】
本発明が対象とするRPB1遺伝子（＝Polr2a遺伝子）は、RNAポリメラーゼIIを構成するサブユニットの中で最大のサブユニットであるRPB1タンパク質をコードする遺伝子である。各種動物において、RPB1遺伝子の塩基配列は公知である、或いはヒト、マウス等のRPB1遺伝子の塩基配列又はRPB1タンパク質のアミノ酸配列に基づいて（例えば、これらとの同一性解析等により）容易に決定することができる。一例として、マウスのRPB1のmRNA配列はNCBI Reference Sequence: NM_001291068.1（配列番号1）であり、RPB1のアミノ酸配列はNCBI Reference Sequence: NP_001277997.1（配列番号2）である。また、本発明が対象とするRPB1遺伝子は、内在性のRPB1遺伝子であってもよいし、外来性のRPB1遺伝子であってもよい。
【００２９】
本発明が対象とするRPB1遺伝子は、その産物（RPB1タンパク質）がその活性（すなわち、RNAポリメラーゼIIを構成した際の該ポリメラーゼのRNA合成活性）が著しく損なわれない限りにおいて、置換、欠失、付加、挿入等の塩基変異を有していてもよい。変異としては、該遺伝子から翻訳されるタンパク質においてアミノ酸置換が生じない変異やアミノ酸の保存的置換が生じる変異が好ましい。
【００３０】
本発明が対象とするRPB1遺伝子は、例えば、それによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列が、同種動物の野生型RPB1遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列と、例えば95％以上、好ましくは98％以上、より好ましくは99％以上の同一性を有する、遺伝子である。また、本発明が対象とするRPB1遺伝子は、例えば、それによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列が、同種動物の野生型RPB1遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列と同一であるか又は該アミノ酸配列に対して1もしくは複数個（例えば2〜10、好ましくは2〜5、より好ましくは2〜3個、さらに好ましくは2個）が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列である、遺伝子である。
【００３１】
本発明のモデル動物においては、上記した本発明が対象とするRPB1遺伝子において、さらに、該遺伝子によりコードされるRPB1タンパク質のアミノ酸残基K1268のユビキチン化を抑制させる変異を有する。
【００３２】
アミノ酸残基K1268は、RPB1タンパク質においてユビキチン化される複数のアミノ酸残基の内の1つであり、マウスであれば、RPB1タンパク質（配列番号2）のN末端から1268番目のアミノ酸残基（リシン残基）である。RPB1タンパク質のアミノ酸配列は、生物種間で高度に保存されているので、マウス以外の生物種におけるアミノ酸残基K1268は、マウスにおけるアミノ酸残基K1268に対応するリシン残基として、例えばマウスRPB1タンパク質のアミノ酸配列との同一性解析により、容易に同定することができる。より具体的には、例えばマウスRPB1タンパク質のアミノ酸配列（アミノ酸配列1）とマウス以外の生物種におけるアミノ酸配列（アミノ酸配列2）とを比較して、同一性が最大となるように両者を並列に並べた場合に、アミノ酸配列2における、アミノ酸配列1中のアミノ酸残基K1268に対応するリシン残基を、アミノ酸残基K1268と決定することができる。また、この際に、各種生物種のRPB1タンパク質におけるユビキチン化サイトの情報も参照することができる。
【００３３】
「ユビキチン化を抑制」とは、変異前（例えば野生型）のRPB1タンパク質におけるアミノ酸残基K1268のユビキチン化量100％に対して、変異後のRPB1タンパク質におけるアミノ酸残基K1268のユビキチン化量が、例えば50％以下、30％以下、20％以下、10％以下、5％以下、1％以下、又は0％であることを意味する。
【００３４】
本明細書において、アミノ酸残基K1268のユビキチン化量は、公知の方法に従って、例えばアミノ酸残基K1268のユビキチン化に対する特異的抗体によるウェスタンブロッティング又はELISA法により、測定することができる。
【００３５】
アミノ酸残基K1268のユビキチン化を抑制させる変異は、好ましくは、アミノ酸残基K1268をコードするコドンの変異である。ユビキチン化は通常はリシン残基において起こるので、該コドンの変異によって、アミノ酸残基K1268のアミノ酸残基置換又は欠失（好ましくはアミノ酸残基置換）を引き起こすことにより、アミノ酸残基K1268のユビキチン化を抑制することができる。アミノ酸残基置換の場合、RPB1タンパク質の構造や機能への影響をより軽減する観点から、置換後のアミノ酸算基はリシン残基以外の塩基性アミノ酸残基（例えばアルギニン、ヒスチジン等、好ましくはアルギニン）であることが好ましい。また、アミノ酸残基K1268のユビキチン化の抑制は、上記以外にも、アミノ酸残基K1268をコードするコドン以外の変異によっても、引き起こすことが可能である。例えば、RPB1タンパク質において、アミノ酸残基K1268のユビキチン化酵素が相互作用する部位のアミノ酸残基を変異させることによっても、アミノ酸残基K1268のユビキチン化を抑制することが可能である。
【００３６】
本発明のモデル動物においては、アミノ酸残基K1268のユビキチン化を抑制させる変異を、対の染色体の片方あるいは両方において有する。
【００３７】
本発明のモデル動物におけるRPB1タンパク質（変異型及び野生型全て含む）のアミノ酸残基K1268のユビキチン化量は、野生型動物におけるRPB1タンパク質のアミノ酸残基K1268のユビキチン化量100％に対して、例えば50％以下、30％以下、20％以下、10％以下、5％以下、1％以下、又は0％である。
【００３８】
本発明のモデル動物は、さらに、DNA修復遺伝子の変異を有すること、具体的には例えばDNA修復遺伝子の機能及び／又は発現が欠損又は低下していること、すなわち、DNA修復遺伝子の機能及び／又は発現が欠損又は低下するように、該DNA修復遺伝子に変異が導入されていることが好ましい。これにより、マウスのように寿命が短い動物においても老化／神経変性表現型をより観察し易くすることができる。
【００３９】
DNA修復遺伝子としては、特に制限されないが、例えばXpa-Xpg (NER経路)、Fanca-Fancw (FA経路)、Brca1/2 (HR経路)、Ogg1 (BER経路)等が挙げられる。
【００４０】
DNA修復遺伝子の「機能」は、DNA修復タンパク質の本来の活性を示す。また、DNA修復遺伝子の「発現」は、DNA修復mRNAの発現、及びDNA修復タンパク質の発現の両方を包含するが、好ましくはDNA修復タンパク質の発現である。「欠損」とは、本発明のモデル動物から得られたサンプルについて、DNA修復遺伝子の活性及び／又は発現量が検出限界以下であることを示す。また、「低下」とは、本発明のモデル動物から得られたサンプルについて、DNA修復遺伝子の活性及び／又は発現量が、変異導入前のDNA修復遺伝子（本発明が対象とするDNA修復遺伝子）の活性及び／又は発現量よりも低い（例えば1／2、1／5、1／10、1／20、1／50、1／100、1／200、1／500、1／1000、1／2000、1／5000、1／10000以下である）ことを示す。なお、DNA修復遺伝子の活性及び／又は発現量は、公知の方法に従って測定することが可能である。
【００４１】
DNA修復遺伝子に導入される変異としては、DNA修復遺伝子の機能及び／又は発現が欠損又は低下する変異である限り特に制限されるものではない。当該変異としては、例えばタンパク質コード領域における変異、スプライシング調節領域における変異、発現制御領域（例えば、プロモーター、アクチベーター、エンハンサー等）における変異等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはタンパク質コード領域における変異が挙げられる。また、当該変異は、好ましくはアミノ酸の欠失、付加、及び挿入からなる群より選択される少なくとも1種を生じさせる変異である。また、本発明のモデル動物においては、当該変異を、対の染色体の両方において有することが好ましい。
【００４２】
本発明のモデル動物は、老化及び／又は神経変性の表現型の少なくとも1種を有する。該表現型としては、例えば成長遅延、低体重、ジストニア、脊柱後弯、異常歩行、骨格異常、色素脱失、白内障、大脳皮質のニューロン損傷、軸索変性、運動ニューロンの減少、ミクログリア活性化、星状細胞活性化等が挙げられる。
【００４３】
本発明のモデル動物は、老化及び／又は神経変性疾患のモデル動物として、使用することができる。当該疾患としては、例えばコケイン症候群、トリコチオジストロフィーなどの遺伝性早老症の他、アルツハイマーなどの老化関連神経変性症が挙げられる。
【００４４】
また、本発明は、その一態様において、RPB1遺伝子において、該遺伝子によりコードされるRPB1タンパク質のアミノ酸残基K1268のユビキチン化を抑制させる変異を有する、細胞（本明細書において、「本発明の細胞」と示すこともある。）、にも関する。
【００４５】
本発明の細胞は、老化及び／又は神経変性疾患モデル細胞として、例えば該疾患の解析、治療薬のスクリーニングなどに使用することができる。細胞としては、初代培養細胞であっても、細胞株であっても特に制限されず、例えば神経細胞、血液細胞、造血幹細胞・前駆細胞、配偶子（精子、卵子）、線維芽細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、肝細胞、ケラチン生成細胞、筋細胞、表皮細胞、内分泌細胞、ES細胞、iPS細胞、組織幹細胞、がん細胞等が挙げられる。また、細胞の由来生物も特に制限されず、例えばヒト、サル、マウス（ハツカネズミ属動物）、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカ等の哺乳類動物が挙げられる。
【００４６】
3．モデル動物、細胞の作製方法
本発明のモデル動物及び本発明の細胞の作製方法は、特に制限されず、公知の遺伝子変異動物作製技術を各種利用することができる。一例として、以下の方法が挙げられる。
【００４７】
本発明は、その一態様において、動物の細胞において、RPB1遺伝子において、該遺伝子によりコードされるRPB1タンパク質のアミノ酸残基K1268のユビキチン化を抑制させる変異を導入することを含む、老化及び／又は神経変性モデル動物の作製方法（本明細書において、「本発明の製造方法」と示すこともある。）に関する。
【００４８】
変異導入対象の細胞は、特に制限されないが、老化及び／又は神経変性モデル動物作製の効率の観点から、受精卵であることが好ましい。
【００４９】
変異の導入方法は、特に制限されないが、老化及び／又は神経変性モデル動物作製の効率の観点から、標的特異的ヌクレアーゼ、該ヌクレアーゼの発現カセット、及び該ヌクレアーゼのmRNAからなる群より選択される少なくとも1種、並びにドナーDNAを含む導入物を細胞に導入する方法が挙げられる。
【００５０】
標的特異的ヌクレアーゼは、ゲノムDNA上の特定部位を特異的に切断して、変異を誘導できるヌクレアーゼである限り特に制限されない。標的特異的ヌクレアーゼとしては、例えばCasタンパク質、TALENタンパク質、ZFNタンパク質などが挙げられる。
【００５１】
Casタンパク質を用いるCRISPR/Casシステムは、ヌクレアーゼ（RGN；RNA-guided nuclease）であるCasタンパク質とガイドRNAを使用する。該システムを細胞内に導入することにより、ガイドRNAが標的部位に結合し、該結合部位に呼び込まれたCasタンパク質によってDNAを切断することができる。
【００５２】
TALENタンパク質を用いるTALENシステムは、DNA切断ドメイン（例えばFokIドメイン）に加えて転写活性化因子様（TAL）エフェクターのDNA結合ドメインを含む人工ヌクレアーゼ（TALEN）を使用する。該システムを細胞内に導入することにより、TALENがDNA結合ドメインを介して標的部位に結合し、そこでDNAを切断する。標的部位に結合するDNA結合ドメインは、公知のスキーム（例えばZhang F et al. (2011) Nature Biotechnology 29 (2)；この論文は、本明細書に参考として援用される）に従って設計することができる。
【００５３】
ZFNタンパク質を用いるZFNシステムは、ジンクフィンガーアレイを含むDNA結合ドメインにコンジュゲートした核酸切断ドメインを含む人工ヌクレアーゼ（ZFN）を使用する。該システムを細胞内に導入することにより、ZFNがDNA結合ドメインを介して標的部位に結合し、そこでDNAを切断する。標的部位に結合するDNA結合ドメインは、公知のスキームに従って設計することができる。
【００５４】
標的特異的ヌクレアーゼの中でも、切断部位をより自由に決定できるという観点から、Casタンパク質が好ましい。Casタンパク質としては好ましくはCas9タンパク質が挙げられる。
【００５５】
標的特異的ヌクレアーゼ発現カセットは、本発明の製造方法の対象物の細胞内で標的特異的ヌクレアーゼを発現可能なDNAである限り特に制限されない。標的特異的ヌクレアーゼ発現カセットの典型例としては、プロモーター、及びそのプロモーターの制御下に配置された標的特異的ヌクレアーゼコード配列を含むDNAが挙げられる。また、標的特異的ヌクレアーゼ発現カセットは、これのみで、或いは他の配列（例えば薬剤耐性遺伝子、複製起点等）と共にベクターを構成していてもよい。ベクターの種類は、特に制限されない。
【００５６】
標的特異的ヌクレアーゼがCasタンパク質である場合、本発明の製造方法における導入物は、さらに、ガイドRNA発現カセット及びガイドRNAからなる群より選択される少なくとも1種を含む。
【００５７】
ガイドRNAは、CRISPR/Casシステムにおいて用いられるものであれば特に制限されず、例えばゲノムDNAの標的部位に結合し、且つCasタンパク質と結合することにより、Casタンパク質をゲノムDNAの標的部位に誘導可能なものを各種使用することができる。
【００５８】
標的特異的ヌクレアーゼは、ゲノムDNA上の特定部位を特異的に切断して、変異を誘導できるヌクレアーゼである限り特に制限されない。標的特異的ヌクレアーゼとしては、例えばCasタンパク質、TALENタンパク質、ZFNタンパク質などが挙げられる。
【００５９】
Casタンパク質を用いるCRISPR/Casシステムは、ヌクレアーゼ（RGN；RNA-guided nuclease）であるCasタンパク質とガイドRNAを使用する。該システムを細胞内に導入することにより、ガイドRNAが標的部位に結合し、該結合部位に呼び込まれたCasタンパク質によってDNAを切断することができる。
【００６０】
TALENタンパク質を用いるTALENシステムは、DNA切断ドメイン（例えばFokIドメイン）に加えて転写活性化因子様（TAL）エフェクターのDNA結合ドメインを含む人工ヌクレアーゼ（TALEN）を使用する。該システムを細胞内に導入することにより、TALENがDNA結合ドメインを介して標的部位に結合し、そこでDNAを切断する。標的部位に結合するDNA結合ドメインは、公知のスキーム（例えばZhang F et al. (2011) Nature Biotechnology 29 (2)；この論文は、本明細書に参考として援用される）に従って設計することができる。
【００６１】
ZFNタンパク質を用いるZFNシステムは、ジンクフィンガーアレイを含むDNA結合ドメインにコンジュゲートした核酸切断ドメインを含む人工ヌクレアーゼ（ZFN）を使用する。該システムを細胞内に導入することにより、ZFNがDNA結合ドメインを介して標的部位に結合し、そこでDNAを切断する。標的部位に結合するDNA結合ドメインは、公知のスキームに従って設計することができる。
【００６２】
標的特異的ヌクレアーゼの中でも、切断部位をより自由に決定できるという観点から、Casタンパク質が好ましい。Casタンパク質としては好ましくはCas9タンパク質が挙げられる。
【００６３】
標的特異的ヌクレアーゼ発現カセットは、本発明の製造方法の対象物の細胞内で標的特異的ヌクレアーゼを発現可能なDNAである限り特に制限されない。標的特異的ヌクレアーゼ発現カセットの典型例としては、プロモーター、及びそのプロモーターの制御下に配置された標的特異的ヌクレアーゼコード配列を含むDNAが挙げられる。また、標的特異的ヌクレアーゼ発現カセットは、これのみで、或いは他の配列（例えば薬剤耐性遺伝子、複製起点等）と共にベクターを構成していてもよい。ベクターの種類は、特に制限されない。
【００６４】
標的特異的ヌクレアーゼがCasタンパク質である場合、本発明の製造方法における導入物は、さらに、ガイドRNA発現カセット及びガイドRNAからなる群より選択される少なくとも1種を含む。
【００６５】
ガイドRNAは、CRISPR/Casシステムにおいて用いられるものであれば特に制限されず、例えばゲノムDNAの標的部位に結合し、且つCasタンパク質と結合することにより、Casタンパク質をゲノムDNAの標的部位に誘導可能なものを各種使用することができる。
【００６６】
標的特異的ヌクレアーゼの標的部位は、ドナーDNAによる相同組換えを起こし、これにより、RPB1遺伝子において、該遺伝子によりコードされるRPB1タンパク質のアミノ酸残基K1268のユビキチン化を抑制させる変異を導入することができる部位である限り、特に制限されない。該標的部位は、通常、RPB1遺伝子領域内である。
【００６７】
本発明の製造方法で使用されるドナーDNAは、例えば、RPB1遺伝子の少なくとも1部を含み、且つ該遺伝子によりコードされるRPB1タンパク質のアミノ酸残基K1268のユビキチン化を抑制させる変異を有するドナーDNAである。
【００６８】
ドナーDNAは、5´側から、5´側ホモロジーアーム配列、ドナーDNA配列、3´側ホモロジーアーム配列の順で配置されてなる塩基配列を含む、一本鎖DNAである。
【００６９】
ドナーDNA配列は、任意の塩基配列を採用することができる。ドナーDNA配列は、好ましくはアミノ酸残基K1268をコードするコドンの周辺領域を含み、且つ該コドンが変異してなるドナーDNA配列である。
【００７０】
5´側ホモロジーアーム配列は、標的特異的ヌクレアーゼの標的部位外側5’側の塩基配列の相同配列であり、3´側ホモロジーアーム配列は、標的特異的ヌクレアーゼの標的部位外側3’側の塩基配列の相同配列である。
【００７１】
導入物の細胞への導入方法は、特に制限されず、公知の方法、例えばマイクロインジェクション法、レンチウイルス法、レトロウィルス法等を採用することができる。
【００７２】
変異が導入された細胞は、必要に応じて胚へと発生させ、仮親に移植して、産仔を得ることにより、本発明のモデル動物を得ることができる。
【００７３】
上記本発明の製造方法の過程で得られた受精卵、及び胚（例えば凍結胚）は、本発明のモデル動物に発生し得るものであり、これらも本発明の一態様である。また、本発明のモデル動物の精子及び／又は卵子を受精させて得られる受精卵も、本発明のモデル動物に発生し得る受精卵であり、このような受精卵も本発明の一態様である。これらの受精卵としては、凍結保存状態から生体に発生させることができる限り特に限定されず、受精直後の卵、前核期胚、初期胚、又は胚盤胞等が挙げられる。
【００７４】
また、本発明は、その一態様において、上記本発明の製造方法で使用されるドナーDNA、例えば、RPB1遺伝子の少なくとも1部を含み、且つ該遺伝子によりコードされるRPB1タンパク質のアミノ酸残基K1268のユビキチン化を抑制させる変異を有するドナーDNAを含む、老化及び／又は神経変性モデル動物製造用組成物に関する。当該組成物は、老化及び／又は神経変性モデル動物の作製に使用する他の試薬や器具等を含む、キットの形態であってもよい。
【００７５】
上記説明以外の事項については、「2．モデル動物」における説明と同様である。
【００７６】
4．モデル動物、細胞の用途
本発明のモデル動物及びこれに発生する受精卵及び胚、並びに本発明の細胞は、老化及び／又は神経変性の病態解析、予防法開発、治療法開発等に利用することができる。また、老化及び／又は神経変性の症状（例えば、成長遅延、低体重、ジストニア、脊柱後弯、異常歩行、骨格異常、色素脱失、白内障、大脳皮質のニューロン損傷、軸索変性、運動ニューロンの減少、ミクログリア活性化、星状細胞活性化等）の病態解析、予防法開発、治療法開発等にも利用することができる。
【００７７】
老化としては、例えば老化関連現象及び／又は疾患が挙げられ、具体的には例えば加齢黄斑変性症（AMD）、皮膚の老化、皮膚のＵＶ損傷、薄毛（thinning）、たるみ、しわ、年齢によるしみの出現、血管損傷／乾燥部位、脂漏性角化症、日光性角化症、キンドラー症候群、ボーエン病、皮膚癌、関節炎、強直性脊椎炎、炎症性多発性関節症、膝関節炎、流行性多発性関節炎、乾癬性関節炎、白内障、難聴、癌、転移、転移プロセス阻止、肝疾患、移植、腫瘍および抗腫瘍薬または免疫抑制薬および化学物質の毒性、骨粗鬆症、多形皮膚萎縮症、肢端早老症、遺伝性硬化性ポイキロデルマ、先天性角化異常症、色素性乾皮症、ブルーム症候群、ファンコニー貧血、コケイン症候群、公害病等が挙げられる。
【００７８】
神経変性としては、例えば神経関連現象及び／又は疾患としては、具体的には例えば認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病および老化、ハンチントン病、フリードライヒ運動失調症、ウィルソン病、リー症候群、キーンズ・セイアー症候群、レーベル遺伝性視神経症、認知障害、気分障害、運動障害、遅発性ジスキネジー、脳損傷、アポトーシス、認知症、てんかん、てんかん性認知症、初老期認知症、外傷後認知症、老人性認知症、血管性認知症、HIV-1関連認知症、脳卒中後認知症、統合失調症、ダウン症候群、運動ニューロン疾患、アミロイドーシス、2型糖尿病関連アミロイド、クロイツフェルト・ヤコブ病、壊死性細胞死、ゲルストマン・ストロイスラー症候群、クールー病・動物スクレイピー、長期血液透析関連アミロイド、老人性心臓アミロイドおよび家族性アミロイドポリニューロパチー、脳疾患、内臓神経障害、記憶喪失、アルミニウム中毒、生体細胞中の鉄レベルの減少、哺乳類における遊離遷移金属イオンレベルの減少、体または特定の体区画に毒性量の金属を有する患者、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、視覚性運動盲、アルコール関連認知症、主要な加齢性タウオパチー、健忘失語症、疾病失認、失行症、発語失行、聴覚型言語失認（auditory verbal agnosia）、前頭側頭型認知症、前頭側頭葉変性症、ロゴペニック型進行性失語、神経原線維変化、声失認）、ピック病、主要な進行性失語症、進行性非流暢性失語症、意味性認知症、ステロイド認知症症候群、視空間失認（visuospatial dysgnosia）、アミノグリコシドの耳毒性副作用およびコカイン毒性等が挙げられる。
【００７９】
本発明は、その一態様において、本発明のモデル動物、これに発生する受精卵若しくは胚、又は本発明の細胞を用いた、老化及び／又は神経変性の予防剤、改善剤、又は増悪原因物質のスクリーニング方法に関する。
【００８０】
スクリーニング方法は、本発明のモデル動物又は本発明の細胞を用いている限り特に限定されないが、例えば工程（a）、（b）、及び（c1）又は（c2）：
（a）本発明のモデル動物、これに発生する受精卵若しくは胚、又は本発明の細胞に被検物質を投与する又は接触させる工程、
（b）被検物質が投与又は接触された前記モデル動物、前記受精卵若しくは胚、又は前記細胞の、老化及び／又は神経変性の表現型を評価する工程、及び
（c1）老化及び／又は神経変性の表現型が治癒又は緩和していた場合に、前記被検物質を老化及び／又は神経変性の予防剤又は改善剤として選別する工程、又は
（c2）老化及び／又は神経変性の表現型が悪化していた場合に、前記被検物質を老化及び／又は神経変性の増悪原因物質として選別する工程、
を含む。
【００８１】
被検物質の種類は治療薬の候補になり得る限り特に限定されない。例えば、タンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物（ヌクレオチド、アミン、糖質、脂質等）、有機低分子化合物、無機低分子化合物、醗酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液等が挙げられる。
【００８２】
投与は、公知の方法に従って行うことができる。例えば経口投与、経管栄養、注腸投与等の経腸投与；  経静脈投与、経動脈投与、筋肉内投与、心臓内投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与等の非経口投与等が挙げられる。
【００８３】
選別された被検物質を治療候補物質として、さらなる解析を進めることにより、有用な治療薬を選別することができる。
【００８４】
上記説明以外の事項については、「2．モデル動物」における説明と同様である。
【実施例】
【００８５】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００８６】
実施例1．RPB1遺伝子変異マウスの作製
Polr2a（RPB1）遺伝子において、該遺伝子によりコードされるRPB1タンパク質のアミノ酸残基K1268のユビキチン化を抑制させる変異を導入したマウスを作製した。具体的には、以下のようにして行った。
【００８７】
次の試薬を購入した: recombinant Cas9, Alt-R S.p.Cas9 Nucleases 3NLS (Integrated DNA Technologies, IDT社); guide RNA (gRNA), GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit (target sequence, 5'- TGATGAAAACAAGATGCAAG-3'（配列番号3）) (Thermo Scientific社). ssODN (IDT社) 4nmol Ultramer DNA Oligo (ssODN, 5'-A TGCAGAGAAGCTGGTCCTTCGAA TCCGCA TCA TGAACAGTGA TGAAAAC A[G*]GATGCA[g**]GAGGTAAATGGTCTGAGACCCGGGGGAAATAAAATAG AATGGGA-3'（配列番号4）) (IDT). *Polr2a-K1268R target mutation; **silent mutation。野生型マウスに対して、これらの試薬を用いたCRISPR/Cas法による遺伝子導入を行うことにより、変異導入マウスを作製した。
【００８８】
得られたPolr2aWT/K1268Rヘテロ接合性マウスの戻し交配及び近親交配により、Polr2a K1268R /K1268Rホモ接合性マウスを得た。
【００８９】
マウスのように寿命が短い動物においても老化／神経変性表現型をより観察し易くするために、Polr2a遺伝子変異に加えて、さらにDNA修復遺伝子変異が導入されたマウスを作製した。具体的には、野生型マウスに代えてXpa-/-マウス（Nakane, H., Takeuchi, S., Yuba, S., Saijo, M., Nakatsu, Y., Murai, H., Nakatsuru, Y., Ishikawa, T., Hirota, S., Kitamura, Y., et al. (1995). High incidence of ultraviolet-B-or chemical-carcinogen-induced skin tumours in mice lacking the xeroderma pigmentosum group A gene. Nature 377, 165- 168.）を使用する以外は上記と同様にして、作製した。
【００９０】
実施例2．表現型の評価1
RPB1遺伝子変異マウスの体重を測定し、外観及びCT画像から観察される異常を観察した。結果を図１〜３に示す。
【００９１】
図１に示されるように、Polr2aK1268R / K1268R / Xpa-/-二重変異（DM）マウスは顕著な成長遅延及び低体重を示した。3ヶ月後、DMマウスは徐々に体重が減少し、最終的に5〜6ヶ月齢で死亡した。
【００９２】
また、図２及び３に示されるように、生後4〜5ヶ月で、後肢ジストニアによる脊柱後弯や異常歩行などの骨格異常がDMマウスで非常に顕著であり、その一部はヒトコケイン症候群患者と同様に色素脱失と白内障を示した。
【００９３】
実施例3．表現型の評価2
RPB1遺伝子変異マウスの大脳皮質のグリア線維性酸性タンパク質（GFAP）（星状細胞マーカー）を免疫染色し、腰椎第5腹根をトルイジンブルー染色し、腰髄切片のコリンアセチルトランスフェラーゼ（ChAT）（運動ニューロンマーカー）、イオン化カルシウム結合アダプター分子1（Iba-1）（ミクログリアマーカー）、及びGFAP（星状細胞マーカー）を免疫染色した。結果を図４〜７に示す。
【００９４】
図４に示されるように、アストロサイトの有意な活性化がDMマウスで観察された。このことから、大脳皮質のニューロン損傷の可能性が示唆された。
【００９５】
また、図５及び６に示されるように、DMマウスでは変性軸索の数の顕著な増加が観察されたが（図５）、軸索の総数は対照マウスと比較してわずかな減少を示した（図６）。
【００９６】
さらに、図７に示されるように、DMマウスの脊髄の免疫染色では、運動ニューロンの喪失（緑）、ミクログリア（赤）および星状細胞（白）の活性化が検出された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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