(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己誘導物質によって引き起こされる免疫系疾患を治療するための医薬品の調製における
ＴＮＦＲ１−ＦＡＤＤ−ｃａｓｐａｓｅ８−ｃａｓｐａｓｅ３経路阻害剤の使用であって
、
前記免疫系疾患は緑膿菌感染疾患であり、
前記ＴＮＦＲ１−ＦＡＤＤ−ｃａｓｐａｓｅ８−ｃａｓｐａｓｅ３経路阻害剤は、ｃａｓ
ｐａｓｅ阻害剤であり、
前記ｃａｓｐａｓｅ阻害剤は、Ｅｍｒｉｃａｓａｎであり、
前記自己誘導物質は、Ｃ１２アルキルアシルホモセリンラクトンである、
阻害剤の使用。
【請求項２】
ヒトを除く自己誘導物質によって引き起こされる免疫系疾患の治療方法であって、
ＴＮＦＲ１−ＦＡＤＤ−ｃａｓｐａｓｅ８−ｃａｓｐａｓｅ３経路阻害剤を、治療を必要
とする対象に投与することを含み、
前記免疫系疾患は、緑膿菌感染疾患であり、
前記ＴＮＦＲ１−ＦＡＤＤ−ｃａｓｐａｓｅ８−ｃａｓｐａｓｅ３経路阻害剤は、ｃａｓ
ｐａｓｅ阻害剤であり、
前記ｃａｓｐａｓｅ阻害剤は、Ｅｍｒｉｃａｓａｎであり、
前記自己誘導物質は、Ｃ１２アルキルアシルホモセリンラクトンである、
自己誘導物質によって引き起こされる免疫系疾患の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオ医薬に関し、より具体的には、自己誘導物質によって引き起こされる免
疫系関連疾患を治療するための医薬品の調製におけるＴＮＦＲ１−ＦＡＤＤ−ｃａｓｐａ
ｓｅ８−ｃａｓｐａｓｅ３経路阻害剤の用途、自己誘導物質によって引き起こされる免疫
系関連疾患を治療するための医薬品のスクリーニング方法、及び自己誘導物質によって引
き起こされる免疫系関連疾患の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クオラムセンシング（ＱＳ）は、原核生物における化学に基づく通信メカニズムである。
特定の個体によって放出されたＱＳ自己誘導物質は、コミュニティの他のメンバーの細胞
内受容体によって感知され、コミュニティの集合的な同質遺伝子的な自己誘導物質の合成
、宿主と共生する同期的な活動、病原性、及びバイオフィルムの形成を引き起こす。緑膿
菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、単にＰＡ）は、重度の日和見感染
の原因となる病原体である。ＰＡでは、ＬａｓＲ−ＬａｓＩ  ＱＳ回路は、Ｎ−（３−オ
キソ−ドデカノイル）ホモセリンラクトン（３ＯＣ１２  ＨＳＬ又は３ＯＣ）を自己誘導
物質として用い、この自己誘導物質は、多くのメンバーを有する自己誘導物質ファミリー
を表し、アシル鎖の長さが異なることを主な相違点とする。ＱＳは、独立した微生物回路
設計として設計されるが、細胞死の誘導、転写制御、免疫調節から炎症や免疫細胞死に至
るまで、哺乳動物宿主に広範囲の影響を及ぼす。
【０００３】
ＴＬＲとＮＬＲがそのシグナル伝達に関与していないため、ＱＳ分子がどのように多様な
宿主応答を媒介するかはまだ不明である。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の実施形態は、従来技術に存在する問題の少なくとも１種を少なくともある程度解
決すること、又は消費者に有用な商業的選択肢を提供することを目指している。
【０００５】
ここで、本発明者は、真核生物膜に特有の秩序化脂質ドメインがＨＳＬの存在下で溶解可
能であるという予想外のメカニズムを見出した。これにより、ＴＮＦ受容体１（ＴＮＦＲ
１）が細胞膜の無秩序相に強制的に排出される。位置が変化するＴＮＦＲ１は、生細胞膜
上でより速い運動速度と拡張された移動軌跡を示し、外部リガンドを必要とせずにより高
度の自発的三量化とＴＮＦＲ１シグナル伝達をもたらす。この分布変化は、ｃａｓｐａｓ
ｅ８−ｃａｓｐａｓｅ３軸の活性化とアポトーシス細胞死のプロセス全体を駆動する。こ
れらの発見は、真核細胞が微生物の代謝産物をどのように感知するかについての、これま
で知られていなかったメカニズムを提案している。
【０００６】
本発明の第１態様の実施形態によれば、自己誘導物質によって引き起こされる免疫系関連
疾患を治療するための医薬品の調製におけるＴＮＦＲ１−ＦＡＤＤ−ｃａｓｐａｓｅ８−
ｃａｓｐａｓｅ３経路阻害剤の用途が提供される。これらの実施形態によれば、３０Ｃ１
２  ＨＳＬなどの自己誘導物質は、免疫細胞ＴＮＦＲ１−ＦＡＤＤ−ｃａｓｐａｓｅ８−
ｃａｓｐａｓｅ３経路を活性化し、次いで免疫細胞のアポトーシスを誘導し、免疫系関連
疾患を引き起こし得る。さらに、本発明者は、ＴＮＦＲ１−ＦＡＤＤ−ｃａｓｐａｓｅ８
−ｃａｓｐａｓｅ３経路阻害剤が、自己誘導物質によって引き起こされる免疫系関連疾患
の治療において顕著な治療効果を示すことを見出した。
【０００７】
本発明の実施形態によれば、上述の用途は、以下の付加的な特徴のうちの少なくとも１つ
を有してもよい。
本発明の実施形態によれば、前記自己誘導物質は、緑膿菌に由来する。これらの実施形態
によれば、本発明者は、ＴＮＦＲ１−ＦＡＤＤ−ｃａｓｐａｓｅ８−ｃａｓｐａｓｅ３経
路阻害剤が、緑膿菌由来の自己誘導物質により引き起こされる免疫系関連疾患の治療にお
いてより顕著な治療効果を示すことを見出した。
【０００８】
本発明の実施形態によれば、前記免疫系関連疾患は、緑膿菌感染関連疾患である。実験し
た結果、ＴＮＦＲ１−ＦＡＤＤ−ｃａｓｐａｓｅ８−ｃａｓｐａｓｅ３経路阻害剤は、緑
膿菌感染関連疾患の治療においてより顕著な治療効果を示した。
【０００９】
本発明の実施形態によれば、前記ＴＮＦＲ１−ＦＡＤＤ−ｃａｓｐａｓｅ８−ｃａｓｐａ
ｓｅ３経路阻害剤は、ＴＮＦＲ１阻害剤、ＴＮＦＲ１三量化阻害剤、ＦＡＤＤ阻害剤、ｃ
ａｓｐａｓｅ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種である。本発明者は、ＴＮ
ＦＲ１阻害剤、ＴＮＦＲ１三量化阻害剤、ＦＡＤＤ阻害剤、ｃａｓｐａｓｅ阻害剤が、自
己誘導物質によって活性化されたＴＮＦＲ１−ＦＡＤＤ−ｃａｓｐａｓｅ８−ｃａｓｐａ
ｓｅ３経路を効果的にブロックできることを見出した。ＴＮＦＲ１阻害剤、ＴＮＦＲ１三
量化阻害剤、ＦＡＤＤ阻害剤、ｃａｓｐａｓｅ阻害剤は、自己誘導物質によって引き起こ
される免疫系関連疾患の治療においてより顕著な治療効果を示した。
【００１０】
本発明の実施形態によれば、前記ＴＮＦＲ１三量化阻害剤は、（ａ）ＴＮＦＲ１に対する
競合的阻害剤ペプチド、又は（ｂ）（ａ）を発現する核酸又は構築物を含む。ＴＮＦＲ１
三量化をブロックすると、ＴＮＦＲ１の活性化を効果的に阻害できることが発見されてい
る。また、ＴＮＦＲ１に対する競合的阻害剤ペプチド又はこのペプチドを発現する核酸又
は構築物が有効なＴＮＦＲ１三量化阻害剤であることが発見された。ＴＮＦＲ１に対する
競合的阻害剤ペプチド又はこのペプチドを発現する核酸又は構築物は、自己誘導物質によ
って引き起こされる免疫系関連疾患の治療において顕著な治療効果を示した。
【００１１】
本発明の実施形態によれば、前記ＴＮＦＲ１に対する競合的阻害剤ペプチドは、ＴＮＦＲ
様Ｔ２（ＴＮＦＲ−ｌｉｋｅ  Ｔ２）である。実験した結果、ＴＮＦＲ様Ｔ２がＴＮＦＲ
１三量化の阻害においてより顕著な効果を示した。
【００１２】
本発明の実施形態によれば、前記ＴＮＦＲ１阻害剤は、ＴＮＦＲ１発現阻害剤、ＴＮＦＲ
１突然変異誘導剤、ＴＮＦＲ１機能的阻害剤、ＴＮＦＲ１機能的類似体からなる群から選
択される少なくとも１種を含む。上記のＴＮＦＲ１阻害剤は、ＴＮＦＲ１の発現を阻害す
るか、ＴＮＦＲ１の活性化を阻害することで、自己誘導物質によって引き起こされるアポ
トーシスを効果的に防止することができる。
【００１３】
本発明の実施形態によれば、前記ＦＡＤＤ阻害剤は、ＦＡＤＤ発現阻害剤、ＦＡＤＤ突然
変異誘導剤、ＦＡＤＤ機能的阻害剤、ＦＡＤＤ機能的類似体からなる群から選択される少
なくとも１種を含む。上記のＦＡＤＤ阻害剤は、ＦＡＤＤの発現を阻害するか、ＦＡＤＤ
の活性化を阻害することで、自己誘導物質によって引き起こされるアポトーシスを効果的
に防止することができる。
【００１４】
本発明の実施形態によれば、前記ｃａｓｐａｓｅ阻害剤は、Ｚ−ＶＡＤ、Ｚ−ＤＥＶＤ、
Ｚ−ＩＥＴＤ、Ｅｍｒｉｃａｓａｎ、ｃａｓｐａｓｅに特異的なｓｈＲＮＡ、ＲＩＰ１を
活性化することによりｃａｓｐａｓｅ経路からの逸脱を誘発する物質からなる群から選択
される少なくとも１種を含む。上記のｃａｓｐａｓｅ阻害剤は、ｃａｓｐａｓｅの発現を
阻害するか、ｃａｓｐａｓｅの活性化を阻害することで、自己誘導物質によって引き起こ
されるアポトーシスを効果的に防止することができる。
【００１５】
本発明の実施形態によれば、前記自己誘導物質は、Ｃ８〜１２アルキルアシルホモセリン
ラクトン又はその誘導体である。実験した結果、Ｃ８〜１２アルキルアシルホモセリンラ
クトン又はその誘導体が免疫細胞のアポトーシスを誘導し、免疫系関連疾患を深刻に引き
起こし得る。ＴＮＦＲ１−ＦＡＤＤ−ｃａｓｐａｓｅ８−ｃａｓｐａｓｅ３経路阻害剤は
、Ｃ８〜１２アルキルアシルホモセリンラクトン又はその誘導体によって引き起こされる
免疫系関連疾患の治療において顕著な治療効果を示した。
【００１６】
本発明の実施形態によれば、前記誘導物質は、Ｃ１２アルキルアシルホモセリンラクトン
又はその誘導体である。本発明者は、ＴＮＦＲ１−ＦＡＤＤ−ｃａｓｐａｓｅ８−ｃａｓ
ｐａｓｅ３経路阻害剤が、Ｃ１２アルキルアシルホモセリンラクトン又はその誘導体によ
って引き起こされる免疫系関連疾患の治療においてより顕著な治療効果を示すことを見出
した。
【００１７】
本発明の第２態様の実施形態によれば、自己誘導物質によって引き起こされる免疫系関連
疾患を治療するための医薬品のスクリーニング方法であって、（１）候補化合物を免疫細
胞と接触させることと、（２）接触前後に、（ａ）細胞表面ＴＮＦＲ１の三量化レベル、
（ｂ）ＴＮＦＲ１−ＦＡＤＤ−ｃａｓｐａｓｅ８−ｃａｓｐａｓｅ３経路の活性化レベル
のうちの少なくとも１つを決定することを含む方法を提供し、前記細胞表面ＴＮＦＲ１の
三量化レベルの低下又は前記ＴＮＦＲ１−ＦＡＤＤ−ｃａｓｐａｓｅ８−ｃａｓｐａｓｅ
３経路の活性化レベルの低下は、前記候補化合物が、自己誘導物質によって引き起こされ
る免疫系関連疾患を治療するための医薬品であることを示す。これらの実施形態によれば
、上記の方法は、自己誘導物質によって引き起こされる免疫系関連疾患を治療するための
医薬品を効果的にスクリーニングすることができる。
【００１８】
本発明の実施形態によれば、上述の方法は、以下の付加的な特徴のうちの少なくとも１つ
を有してもよい。
本発明の実施形態によれば、前記自己誘導物質は、Ｃ８〜１２アルキルアシルホモセリン
ラクトン又はその誘導体である。実験した結果、Ｃ８〜１２アルキルアシルホモセリンラ
クトン又はその誘導体がＴＮＦＲ１の三量化を著しく誘導し、ＴＮＦＲ１−ＦＡＤＤ−ｃ
ａｓｐａｓｅ８−ｃａｓｐａｓｅ３経路を活性化することができる。自己誘導物質（特に
Ｃ８〜１２アルキルアシルホモセリンラクトン又はその誘導体）によって引き起こされる
免疫系関連疾患を治療するための医薬品のスクリーニング方法による結果は、より確実で
ある。この方法は、より高感度である。
【００１９】
本発明の実施形態によれば、前記自己誘導物質は、Ｃ１２アルキルアシルホモセリンラク
トン又はその誘導体である。Ｃ１２アルキルアシルホモセリンラクトン又はその誘導体に
よって引き起こされる免疫系関連疾患を治療するための医薬品をスクリーニングする方法
による結果は、はるかに確実であることがわかった。この方法は、はるかに高感度である
ことが発見された。
【００２０】
本発明の第３態様の実施形態によれば、自己誘導物質によって引き起こされる免疫系関連
疾患を治療するための方法の用途が提供され、ＴＮＦＲ１−ＦＡＤＤ−ｃａｓｐａｓｅ８
−ｃａｓｐａｓｅ３経路阻害剤を、治療を必要とする対象に投与することを含む。これら
の実施形態によれば、３０Ｃ１２  ＨＳＬなどの自己誘導物質は、免疫細胞ＴＮＦＲ１−
ＦＡＤＤ−ｃａｓｐａｓｅ８−ｃａｓｐａｓｅ３経路を活性化し、次いで免疫細胞アポト
ーシスを誘導し、免疫系関連疾患を引き起こし得る。さらに、本発明者は、ＴＮＦＲ１−
ＦＡＤＤ−ｃａｓｐａｓｅ８−ｃａｓｐａｓｅ３経路阻害剤を、治療を必要とする対象に
投与すると、自己誘導物質によって引き起こされる免疫系関連疾患の治療において顕著な
治療効果を示すことを見出した。
【００２１】
本発明の実施形態によれば、上述の用途は、以下の付加的な特徴のうちの少なくとも１つ
を有してもよい。
本発明の実施形態によれば、前記自己誘導物質は、緑膿菌に由来する。これらの実施形態
によれば、本発明者は、ＴＮＦＲ１−ＦＡＤＤ−ｃａｓｐａｓｅ８−ｃａｓｐａｓｅ３経
路阻害剤が、緑膿菌由来の自己誘導物質により引き起こされる免疫系関連疾患の治療にお
いてより顕著な治療効果を示すことを見出した。
【００２２】
本発明の実施形態によれば、前記免疫系関連疾患は、緑膿菌感染関連疾患である。実験し
た結果、ＴＮＦＲ１−ＦＡＤＤ−ｃａｓｐａｓｅ８−ｃａｓｐａｓｅ３経路阻害剤は、緑
膿菌感染関連疾患の治療においてより顕著な治療効果を示した。
【００２３】
本発明の実施形態によれば、前記ＴＮＦＲ１−ＦＡＤＤ−ｃａｓｐａｓｅ８−ｃａｓｐａ
ｓｅ３経路阻害剤は、ＴＮＦＲ１阻害剤、ＴＮＦＲ１三量化阻害剤、ＦＡＤＤ阻害剤、ｃ
ａｓｐａｓｅ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種である。本発明者は、ＴＮ
ＦＲ１阻害剤、ＴＮＦＲ１三量化阻害剤、ＦＡＤＤ阻害剤、ｃａｓｐａｓｅ阻害剤が、自
己誘導物質によって活性化されたＴＮＦＲ１−ＦＡＤＤ−ｃａｓｐａｓｅ８−ｃａｓｐａ
ｓｅ３経路を効果的にブロックできることを見出した。ＴＮＦＲ１阻害剤、ＴＮＦＲ１三
量化阻害剤、ＦＡＤＤ阻害剤、ｃａｓｐａｓｅ阻害剤は、自己誘導物質によって引き起こ
される免疫系関連疾患の治療においてより顕著な治療効果を示した。
【００２４】
本発明の実施形態によれば、前記ＴＮＦＲ１三量化阻害剤は、（ａ）ＴＮＦＲ１に対する
競合的阻害剤ペプチド、又は（ｂ）（ａ）を発現する核酸又は構築物を含む。ＴＮＦＲ１
三量化をブロックすると、ＴＮＦＲ１の活性化を効果的に阻害できることが発見されてい
る。また、ＴＮＦＲ１に対する競合的阻害剤ペプチド又はこのペプチドを発現する核酸又
は構築物が有効なＴＮＦＲ１三量化阻害剤であることが発見された。ＴＮＦＲ１に対する
競合的阻害剤ペプチド又はこのペプチドを発現する核酸又は構築物は、自己誘導物質によ
って引き起こされる免疫系関連疾患の治療において顕著な治療効果を示した。
【００２５】
本発明の実施形態によれば、前記ＴＮＦＲ１に対する競合的阻害剤ペプチドはＴＮＦＲ様
Ｔ２である。実験した結果、ＴＮＦＲ様Ｔ２がＴＮＦＲ１三量化の阻害においてより顕著
な効果を示した。
【００２６】
本発明の実施形態によれば、前記ＴＮＦＲ１阻害剤は、ＴＮＦＲ１発現阻害剤、ＴＮＦＲ
１突然変異誘導剤、ＴＮＦＲ１機能的阻害剤、ＴＮＦＲ１機能的類似体からなる群から選
択される少なくとも１種を含む。上記のＴＮＦＲ１阻害剤は、ＴＮＦＲ１の発現を阻害す
るか、ＴＮＦＲ１の活性化を阻害することで、自己誘導物質によって引き起こされるアポ
トーシスを効果的に防止することができる。
【００２７】
本発明の実施形態によれば、前記ＦＡＤＤ阻害剤は、ＦＡＤＤ発現阻害剤、ＦＡＤＤ突然
変異誘導剤、ＦＡＤＤ機能的阻害剤、ＦＡＤＤ機能的類似体からなる群から選択される少
なくとも１種を含む。上記のＦＡＤＤ阻害剤は、ＦＡＤＤの発現を阻害するか、ＦＡＤＤ
の活性化を阻害することで、自己誘導物質によって引き起こされるアポトーシスを効果的
に防止することができる。
【００２８】
本発明の実施形態によれば、前記ｃａｓｐａｓｅ阻害剤は、Ｚ−ＶＡＤ、Ｚ−ＤＥＶＤ、
Ｚ−ＩＥＴＤ、Ｅｍｒｉｃａｓａｎ、ｃａｓｐａｓｅに特異的なｓｈＲＮＡ、ＲＩＰ１を
活性化することによりｃａｓｐａｓｅ経路からの逸脱を誘発する物質からなる群から選択
される少なくとも１種を含む。上記のｃａｓｐａｓｅ阻害剤は、ｃａｓｐａｓｅの発現を
阻害するか、ｃａｓｐａｓｅの活性化を阻害することで、自己誘導物質によって引き起こ
されるアポトーシスを効果的に防止することができる。
【００２９】
本発明の実施形態によれば、前記自己誘導物質は、Ｃ８〜１２アルキルアシルホモセリン
ラクトン又はその誘導体である。実験した結果、Ｃ８〜１２アルキルアシルホモセリンラ
クトン又はその誘導体が免疫細胞のアポトーシスを誘導し、免疫系関連疾患を深刻に引き
起こし得る。ＴＮＦＲ１−ＦＡＤＤ−ｃａｓｐａｓｅ８−ｃａｓｐａｓｅ３経路阻害剤は
、Ｃ８〜１２アルキルアシルホモセリンラクトン又はその誘導体によって引き起こされる
免疫系関連疾患の治療において顕著な治療効果を示した。
【００３０】
現在開示されている実施形態によれば、前記自己誘導物質は、Ｃ１２アルキルアシルホモ
セリンラクトン又はその誘導体である。本発明者は、ＴＮＦＲ１−ＦＡＤＤ−ｃａｓｐａ
ｓｅ８−ｃａｓｐａｓｅ３経路阻害剤が、Ｃ１２アルキルアシルホモセリンラクトン又は
その誘導体によって引き起こされる免疫系関連疾患の治療においてより顕著な治療効果を
示すことを見出した。
【００３１】
上記本発明の概要は、本発明の開示された各実施形態又は各実施様態を説明することを意
図したものではない。以下の図面及び発明を実施するための形態の部分において、より具
体的な例を挙げて実施形態を説明する。
【００３２】
本発明の実施形態のほかの態様及び利点については、一部は、以下の説明で提供され、一
部は、以下の説明から明らかになり又は本発明の実施形態の実施から得られる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
本発明の実施形態のこれらと他の態様及び利点は、以下の図面を参照して説明することに
よって明らかになり、より容易に理解できるようになり、図面において、
【図１−１】３ＯＣ１２  ＨＳＬがＴ細胞の活性化を阻害する（アポトーシスの結果として）ことを示している。
【図１−２】３ＯＣ１２  ＨＳＬがＴ細胞の活性化を阻害する（アポトーシスの結果として）ことを示している。
【図２ａ−１】３ＯＣ１２  ＨＳＬが哺乳動物細胞の外因性アポトーシスを誘導することを示している。
【図２ａ−２】３ＯＣ１２  ＨＳＬが哺乳動物細胞の外因性アポトーシスを誘導することを示している。
【図２ｂ】３ＯＣ１２  ＨＳＬが哺乳動物細胞の外因性アポトーシスを誘導することを示している。
【図２ｃ】３ＯＣ１２  ＨＳＬが哺乳動物細胞の外因性アポトーシスを誘導することを示している。
【図２ｄ−１】３ＯＣ１２  ＨＳＬが哺乳動物細胞の外因性アポトーシスを誘導することを示している。
【図２ｄ−２】３ＯＣ１２  ＨＳＬが哺乳動物細胞の外因性アポトーシスを誘導することを示している。
【図２ｅ】３ＯＣ１２  ＨＳＬが哺乳動物細胞の外因性アポトーシスを誘導することを示している。
【図２ｆ】３ＯＣ１２  ＨＳＬが哺乳動物細胞の外因性アポトーシスを誘導することを示している。
【図２ｇ】３ＯＣ１２  ＨＳＬが哺乳動物細胞の外因性アポトーシスを誘導することを示している。
【図３】３ＯＣ１２  ＨＳＬがヒト細胞におけるｃａｓｐａｓｅ  ８及びｃａｓｐａｓｅ  ３の切断を誘導することを示している。
【図４−１】ＦＡＤＤが３ＯＣ１２  ＨＳＬ誘導アポトーシスに不可欠であることを示している。
【図４−２】ＦＡＤＤが３ＯＣ１２  ＨＳＬ誘導アポトーシスに不可欠であることを示している。
【図５−１】ｃａｓｐａｓｅ  ８又はＴＮＦＲ１欠損が３ＯＣ１２  ＨＳＬ誘導アポトーシスを部分的に救済することを示している。
【図５−２】ｃａｓｐａｓｅ  ８又はＴＮＦＲ１欠損が３ＯＣ１２  ＨＳＬ誘導アポトーシスを部分的に救済することを示している。
【図６−１】３ＯＣ１２  ＨＳＬがアポトーシス耐性細胞におけるＮＦκｂ活性化を引き起こすことを示している。
【図６−２】３ＯＣ１２  ＨＳＬがアポトーシス耐性細胞におけるＮＦκｂ活性化を引き起こすことを示している。
【図７ａ】３ＯＣ１２  ＨＳＬが原形質膜に濃縮されていることを示している。
【図７ｂ】３ＯＣ１２  ＨＳＬが原形質膜に濃縮されていることを示している。
【図７ｃ】３ＯＣ１２  ＨＳＬが原形質膜に濃縮されていることを示している。
【図７ｄ】３ＯＣ１２  ＨＳＬが原形質膜に濃縮されていることを示している。
【図７ｅ】３ＯＣ１２  ＨＳＬが原形質膜に濃縮されていることを示している。
【図８ａ】３ＯＣ１２  ＨＳＬが原形質膜の構造を破壊してＴＮＦＲ１の自動三量化を誘導することを示している。
【図８ｂ】３ＯＣ１２  ＨＳＬが原形質膜の構造を破壊してＴＮＦＲ１の自動三量化を誘導することを示している。
【図８ｃ】３ＯＣ１２  ＨＳＬが原形質膜の構造を破壊してＴＮＦＲ１の自動三量化を誘導することを示している。
【図８ｄ】３ＯＣ１２  ＨＳＬが原形質膜の構造を破壊してＴＮＦＲ１の自動三量化を誘導することを示している。
【図８ｅ】３ＯＣ１２  ＨＳＬが原形質膜の構造を破壊してＴＮＦＲ１の自動三量化を誘導することを示している。
【図８ｆ】３ＯＣ１２  ＨＳＬが原形質膜の構造を破壊してＴＮＦＲ１の自動三量化を誘導することを示している。
【図８ｇ】３ＯＣ１２  ＨＳＬが原形質膜の構造を破壊してＴＮＦＲ１の自動三量化を誘導することを示している。
【図８ｈ】３ＯＣ１２  ＨＳＬが原形質膜の構造を破壊してＴＮＦＲ１の自動三量化を誘導することを示している。
【図９】３ＯＣ１２  ＨＳＬがＴＮＦＲ１三量化を促進するが、ＦＡＳ三量化を促進しないことを示している。
【図１０ａ】ヒトＴＮＦＲ１ドメインの図を示している。
【図１０ｂ】ヒトＴＮＦＲ１ドメインの図を示している。
【図１１】非脂質ラフト領域に移行するように３ＯＣ１２  ＨＳＬがＴＮＦＲ１を誘導することを示している。
【図１２ａ】３ＯＣ１２  ＨＳＬ誘導ＴＮＦＲ１三量化に対するＴＮＦＲ１細胞外ドメインの重要なアミノ酸の突然変異の影響を示している。
【図１２ｂ】３ＯＣ１２  ＨＳＬ誘導ＴＮＦＲ１三量化に対するＴＮＦＲ１細胞外ドメインの重要なアミノ酸の突然変異の影響を示している。
【図１３ａ】３ＯＣ１２  ＨＳＬの存在下での脂質ドメインを示している。
【図１３ｂ】３ＯＣ１２  ＨＳＬの存在下での脂質ドメインを示している。
【図１４ａ−１】ＭβＣＤが原形質膜上のＴＮＦＲ１の挙動に対して３ＯＣ１２  ＨＳＬと類似した影響があることを示している。
【図１４ａ−２】ＭβＣＤが原形質膜上のＴＮＦＲ１の挙動に対して３ＯＣ１２  ＨＳＬと類似した影響があることを示している。
【図１４ａ−３】ＭβＣＤが原形質膜上のＴＮＦＲ１の挙動に対して３ＯＣ１２  ＨＳＬと類似した影響があることを示している。
【図１４ｂ−１】ＭβＣＤが原形質膜上のＴＮＦＲ１の挙動に対して３ＯＣ１２  ＨＳＬと類似した影響があることを示している。
【図１４ｂ−２】ＭβＣＤが原形質膜上のＴＮＦＲ１の挙動に対して３ＯＣ１２  ＨＳＬと類似した影響があることを示している。
【図１４ｂ−３】ＭβＣＤが原形質膜上のＴＮＦＲ１の挙動に対して３ＯＣ１２  ＨＳＬと類似した影響があることを示している。
【図１５ａ】３ＯＣ１２  ＨＳＬ誘導外因性アポトーシスがＰＡ感染を促進し、原形質膜上の他の受容体の挙動を変化させることを示している。
【図１５ｂ】３ＯＣ１２  ＨＳＬ誘導外因性アポトーシスがＰＡ感染を促進し、原形質膜上の他の受容体の挙動を変化させることを示している。
【図１５ｃ】３ＯＣ１２  ＨＳＬ誘導外因性アポトーシスがＰＡ感染を促進し、原形質膜上の他の受容体の挙動を変化させることを示している。
【図１５ｄ】３ＯＣ１２  ＨＳＬ誘導外因性アポトーシスがＰＡ感染を促進し、原形質膜上の他の受容体の挙動を変化させることを示している。
【図１５ｅ】３ＯＣ１２  ＨＳＬ誘導外因性アポトーシスがＰＡ感染を促進し、原形質膜上の他の受容体の挙動を変化させることを示している。
【図１５ｆ】３ＯＣ１２  ＨＳＬ誘導外因性アポトーシスがＰＡ感染を促進し、原形質膜上の他の受容体の挙動を変化させることを示している。
【図１５ｇ】３ＯＣ１２  ＨＳＬ誘導外因性アポトーシスがＰＡ感染を促進し、原形質膜上の他の受容体の挙動を変化させることを示している。
【図１５ｈ】３ＯＣ１２  ＨＳＬ誘導外因性アポトーシスがＰＡ感染を促進し、原形質膜上の他の受容体の挙動を変化させることを示している。
【図１５ｉ】３ＯＣ１２  ＨＳＬ誘導外因性アポトーシスがＰＡ感染を促進し、原形質膜上の他の受容体の挙動を変化させることを示している。
【図１５ｊ】３ＯＣ１２  ＨＳＬ誘導外因性アポトーシスがＰＡ感染を促進し、原形質膜上の他の受容体の挙動を変化させることを示している。
【図１５ｋ】３ＯＣ１２  ＨＳＬ誘導外因性アポトーシスがＰＡ感染を促進し、原形質膜上の他の受容体の挙動を変化させることを示している。
【図１６ａ】３ＯＣ１２  ＨＳＬの非存在下でＴＮＦＲ１シグナル伝達経路が急性ＰＡ感染の重症度にとって必ずしも必要でないことを示している。
【図１６ｂ】３ＯＣ１２  ＨＳＬの非存在下でＴＮＦＲ１シグナル伝達経路が急性ＰＡ感染の重症度にとって必ずしも必要でないことを示している。
【図１７ａ】ＥｍｒｉｃａｓａｎがヒトＴＨＰ−１細胞株及びマウス脾細胞における３ＯＣ１２−ＨＳＬのアポトーシス作用をブロックすることを示している。
【図１７ｂ】ＥｍｒｉｃａｓａｎがヒトＴＨＰ−１細胞株及びマウス脾細胞における３ＯＣ１２−ＨＳＬのアポトーシス作用をブロックすることを示している。
【図１７ｃ】ＥｍｒｉｃａｓａｎがヒトＴＨＰ−１細胞株及びマウス脾細胞における３ＯＣ１２−ＨＳＬのアポトーシス作用をブロックすることを示している。
【図１７ｄ】ＥｍｒｉｃａｓａｎがヒトＴＨＰ−１細胞株及びマウス脾細胞における３ＯＣ１２−ＨＳＬのアポトーシス作用をブロックすることを示している。
【図１７ｅ】ＥｍｒｉｃａｓａｎがヒトＴＨＰ−１細胞株及びマウス脾細胞における３ＯＣ１２−ＨＳＬのアポトーシス作用をブロックすることを示している。
【図１７ｆ】ＥｍｒｉｃａｓａｎがヒトＴＨＰ−１細胞株及びマウス脾細胞における３ＯＣ１２−ＨＳＬのアポトーシス作用をブロックすることを示している。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下、本発明の実施形態を参照しながら本発明を詳細に説明する。ここで図面を参照して
説明する実施形態は、説明的で例示的なものであり、本発明を一般的に理解するために使
用される。実施形態は、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。同一又は類似
の要素及び同一又は類似の機能を有する要素は、明細書全体を通して同じ符号で示される
。
【００３５】
さらに、本明細書に使用されている「第１」及び「第２」などの用語は、説明の便宜上の
ためであり、相対的な重要性又は意義を指示又は示唆することを意図していない。
【００３６】
ＴＮＦＲ１−ＦＡＤＤ−ｃａｓｐａｓｅ８−ｃａｓｐａｓｅ３経路阻害剤の用途
本発明の第１態様の実施形態によれば、自己誘導物質によって引き起こされる免疫系関連
疾患を治療するための医薬品の調製におけるＴＮＦＲ１−ＦＡＤＤ−ｃａｓｐａｓｅ８−
ｃａｓｐａｓｅ３経路阻害剤の用途が提供される。
【００３７】
ＴＮＦＲ１−ＦＡＤＤ−ｃａｓｐａｓｅ８−ｃａｓｐａｓｅ３経路とは、ＴＮＦＲ１が活
性化されることによりＦＡＤＤが内細胞膜に動員されてＴＮＦＲ１の細胞内ドメインに関
連付けられることを意味する。ＦＡＤＤはまたＣａｓｐａｓｅ−８に関連付けられて、Ｃ
ａｓｐａｓｅ−８を活性化する。次に、活性化されたＣａｓｐａｓｅ−８はｐｒｏ−Ｃａ
ｓｐａｓｅ−３を切断し、下流のアポトーシス細胞死に用いられる成熟したＣａｓｐａｓ
ｅ−３を生成する。これらの実施形態によれば、３０Ｃ１２  ＨＳＬなどの自己誘導物質
は、免疫細胞ＴＮＦＲ１−ＦＡＤＤ−ｃａｓｐａｓｅ８−ｃａｓｐａｓｅ３経路を活性化
し、次いで免疫細胞アポトーシスを誘導し、免疫系関連疾患を引き起こし得る。さらに、
本発明者は、ＴＮＦＲ１−ＦＡＤＤ−ｃａｓｐａｓｅ８−ｃａｓｐａｓｅ３経路阻害剤が
、自己誘導物質によって引き起こされる免疫系関連疾患の治療において顕著な治療効果を
示すことを見出した。
【００３８】
本発明の実施形態によれば、自己誘導物質は、緑膿菌に由来する。緑膿菌（ＰＡ）は、重
度の日和見感染の原因となる病原体である。ＰＡでは、ＬａｓＲ−ＬａｓＩ  ＱＳ回路は
、Ｎ−（３−オキソ−ドデカノイル）ホモセリンラクトン（３ＯＣ１２  ＨＳＬ又は３Ｏ
Ｃ）を自己誘導物質として用い、この自己誘導物質は、多くのメンバーを有する自己誘導
物質ファミリーを表し、アシル鎖の長さが異なることを主な相違点とする。これらの実施
形態によれば、本発明者は、緑膿菌（ＰＡ）によりＴＮＦ受容体１（ＴＮＦＲ１）が細胞
膜の無秩序相に強制的に排出されることを引き起こすことを見出した。位置が変化するＴ
ＮＦＲ１は、生細胞膜上でより速い運動速度と拡張された移動軌跡を示し、外部リガンド
を必要とせずに高度の自発的三量化とＴＮＦＲ１シグナル伝達をもたらす。この分布変化
は、ｃａｓｐａｓｅ８−ｃａｓｐａｓｅ３軸の活性化とアポトーシス細胞死のプロセス全
体を駆動する。本発明者は、緑膿菌に由来する自己誘導物質によって引き起こされる免疫
系関連疾患及び緑膿菌感染関連疾患の治療においてＴＮＦＲ１−ＦＡＤＤ−ｃａｓｐａｓ
ｅ８−ｃａｓｐａｓｅ３経路阻害剤がより顕著な治療効果を示すことを見出した。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＴＮＦＲ１−ＦＡＤＤ−ｃａｓｐａｓｅ８−ｃａ
ｓｐａｓｅ３経路阻害剤は、ＴＮＦＲ１阻害剤、ＴＮＦＲ１三量化阻害剤、ＦＡＤＤ阻害
剤、ｃａｓｐａｓｅ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種である。
【００４０】
本発明の一実施形態によれば、ＴＮＦＲ１三量化阻害剤は、（ａ）ＴＮＦＲ様Ｔ２などの
ＴＮＦＲ１に対する競合的阻害剤ペプチド、又は（ｂ）（ａ）を発現する核酸又は構築物
を含む。ＴＮＦＲ１に対する競合的阻害剤ペプチドは、ＴＮＦＲ１へのＴＮＦαの結合を
妨げることでＴＮＦＲ−１リガンドにより誘導される三量化を減少できる合成又は組換え
ポリペプチドである。また、ＴＮＦＲ１に対する競合的阻害剤ペプチド又はこのペプチド
を発現する核酸又は構築物が有効なＴＮＦＲ１三量化阻害剤であることが発見された。Ｔ
ＮＦＲ１に対する競合的阻害剤ペプチド又はこのペプチドを発現する核酸又は構築物は、
自己誘導物質によって引き起こされる免疫系関連疾患の治療において顕著な治療効果を示
した。
【００４１】
本発明の一実施形態によれば、ＴＮＦＲ１阻害剤は、ＴＮＦＲ１発現阻害剤、ＴＮＦＲ１
突然変異誘導剤、ＴＮＦＲ１機能的阻害剤、ＴＮＦＲ１機能的類似体からなる群から選択
される少なくとも１種を含む。この中でも、ＴＮＦＲ１発現阻害剤は、ＴＮＦＲ１発現を
阻害するための物質であり、ＮＦκｂ経路阻害剤を含むが、これに限定されない。ＴＮＦ
Ｒ１突然変異誘導剤は、ＴＮＦＲ１機能喪失突然変異を誘導するための物質であり、ＴＮ
ＦＲ１パルミトイル化を誘導する物質を含むが、これらに限定されない。ＴＮＦＲ１機能
的阻害剤は、ＴＮＦＲ１の活性化を阻害する物質であり、ＴＮＦＲ１に特異的な抗体を含
むが、これに限定されない。ＴＮＦＲ１機能的類似体は、ＴＮＦＲ１の競合的拮抗薬であ
る。上記のＴＮＦＲ１阻害剤は、ＴＮＦＲ１の発現を阻害するか、ＴＮＦＲ１の活性化を
阻害することで、自己誘導物質によって引き起こされるアポトーシスを効果的に防止する
ことができる。
【００４２】
本発明の別の実施形態によれば、ＦＡＤＤ阻害剤は、ＦＡＤＤ発現阻害剤、ＦＡＤＤ突然
変異誘導剤、ＦＡＤＤ機能的阻害剤、ＦＡＤＤ機能的類似体からなる群から選択される少
なくとも１種を含む。その中でも、ＦＡＤＤ発現阻害剤は、ＦＡＤＤ発現を阻害するため
の物質である。ＦＡＤＤ突然変異誘導剤は、ＦＡＤＤ機能喪失突然変異を誘導するための
物質である。ＦＡＤＤ機能的阻害剤は、ＦＡＤＤの活性化を阻害する物質であり、ドミナ
ントネガティブＦＡＤＤ及びＮＳＣ  ４７１４７（小分子阻害剤）の発現を含むが、これ
に限定されない。ＦＡＤＤ機能的類似体は、ＦＡＤＤの競合的拮抗薬である。上記のＦＡ
ＤＤ阻害剤は、ＦＡＤＤの発現を阻害するか、ＦＡＤＤの活性化を阻害することで、自己
誘導物質によって引き起こされるアポトーシスを効果的に防止することができる。
【００４３】
本発明の別の実施形態によれば、ｃａｓｐａｓｅ阻害剤は、Ｚ−ＶＡＤ、Ｚ−ＤＥＶＤ、
Ｚ−ＩＥＴＤ、Ｅｍｒｉｃａｓａｎ、ｃａｓｐａｓｅに特異的なｓｈＲＮＡ、ＲＩＰ１を
活性化することによりｃａｓｐａｓｅ経路からの逸脱を誘発する物質からなる群から選択
される少なくとも１種を含む。ＲＩＰ１を活性化することによりｃａｓｐａｓｅ経路から
逸脱するとは、細胞タイプに応じて、ＲＩＰ１の活性化により、細胞死に関連する従来の
アポトーシスシグナル伝達ではなく、ＮＦｋｂに関する細胞シグナル伝達及び活性化処理
後の細胞のＭＡＰＫシグナル伝達がもたらされることを意味する。上記のｃａｓｐａｓｅ
阻害剤は、ｃａｓｐａｓｅの発現を阻害するか、ｃａｓｐａｓｅの活性化を阻害すること
で、自己誘導物質によって引き起こされるアポトーシスを効果的に防止することができる
。
【００４４】
本発明の実施形態によれば、自己誘導物質は、Ｃ８〜１２アルキルアシルホモセリンラク
トン又はその誘導体である。実験した結果、Ｃ８〜１２、特にＣ１２アルキルアシルホモ
セリンラクトン又はその誘導体は、免疫細胞のアポトーシスを誘導し、免疫系関連疾患を
深刻に引き起こし得る。ＴＮＦＲ１−ＦＡＤＤ−ｃａｓｐａｓｅ８−ｃａｓｐａｓｅ３経
路阻害剤は、Ｃ８〜１２アルキルアシルホモセリンラクトン又はその誘導体（特にＣ８ア
ルキルアシルホモセリンラクトン又はその誘導体）によって引き起こされる免疫系関連疾
患の治療において顕著な治療効果を示した。
【００４５】
さらに、本発明の別の広範な態様の実施形態によれば、自己誘導物質によって引き起こさ
れる免疫系関連疾患を治療するための方法の用途が提供され、ＴＮＦＲ１−ＦＡＤＤ−ｃ
ａｓｐａｓｅ８−ｃａｓｐａｓｅ３経路阻害剤を、治療を必要とする対象に投与すること
を含む。上記のように、３ＯＣ１２  ＨＳＬなどの自己誘導物質は、免疫細胞ＴＮＦＲ１
−ＦＡＤＤ−ｃａｓｐａｓｅ８−ｃａｓｐａｓｅ３経路を活性化し、次いで免疫細胞アポ
トーシスを誘導し、免疫系関連疾患を引き起こし得る。さらに、本発明者は、また、ＴＮ
ＦＲ１−ＦＡＤＤ−ｃａｓｐａｓｅ８−ｃａｓｐａｓｅ３経路阻害剤を、治療を必要とす
る対象に投与すると、自己誘導物質によって引き起こされる免疫系関連疾患の治療におい
て顕著な治療効果を示すことも見出した。
【００４６】
前記自己誘導物質、前記免疫系関連疾患及び前記ＴＮＦＲ１−ＦＡＤＤ−ｃａｓｐａｓｅ
８−ｃａｓｐａｓｅ３経路阻害剤は、すべて上記のとおりである。
【００４７】
本明細書で使用される「対象」という用語は、動物を指す。通常、前記動物は哺乳動物で
ある。対象は、また、たとえば、霊長類動物（たとえば、ヒト、男性又は女性）、ウシ、
ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、魚、鳥などを指す。いくつ
かの実施形態では、対象は、霊長類動物である。別の実施形態では、対象は、ヒトである
。
【００４８】
本明細書で使用される任意の疾患又は障害の「治療」という用語は、疾患又は障害の進行
について緩慢化、中断、中止、制御又は停止の効果を示すが、必ずしもすべての疾患の症
状を完全に解消するとは限らないすべてのプロセス、及び特にそのような疾患又は障害に
罹患しやすい患者に対する上記状況の予防性治療を意味する。いくつかの実施形態では、
「治療」とは、疾患又は障害を改善することを指す（すなわち、疾患の発展又はその臨床
的症状の少なくとも１つの緩慢化、中止又は減少）。他の実施形態では、「治療」とは、
患者が認識できない可能性があるものを含む少なくとも１種の身体パラメーターを緩和又
は改善することを指す。他の実施形態では、「治療」とは、身体的に（たとえば、識別可
能な症状の安定化）、生理学的に（たとえば、身体パラメータの安定化）又はその両方に
おいて疾患又は障害を調節することを指す。他の実施形態では、「治療」とは、疾患又は
障害の発症、発展又は進行を予防又は遅延させることを指す。
【００４９】
本明細書で使用される「治療有効量」又は「治療有効用量」という用語とは、個体の生物
学的又は医学的反応を誘発できる本発明の化合物の量を指す（たとえば、酵素又はタンパ
ク質の活性の低下又は阻害、又は症状の改善、症状の低減、疾患の発展の緩慢化又は遅延
、又は疾患の予防など）。非限定的な一実施形態では、「治療有効量」という用語は、本
発明の化合物が対象に投与される場合のことである。他の実施形態では、「治療有効量」
という用語は、細胞、器官、非細胞生物学的材料又は媒体に投与される場合、ＴＮＦＲ１
−ＦＡＤＤ−ｃａｓｐａｓｅ８−ｃａｓｐａｓｅ３経路の活性化を少なくとも部分的に低
減又は阻害し、又はＴＮＦＲ１三量化を少なくとも部分的に低下又は阻害することができ
る本発明の化合物の有効量を指す。
【００５０】
本明細書で使用される化合物の「投与」及び「投与する」という用語は、本発明の阻害剤
の化合物又は化合物のプロドラッグを、治療を必要とする個体に提供することを意味する
と理解される。なお、当業者は、免疫系関連疾患に罹患している患者を有効量の阻害剤の
化合物で治療できる。
【００５１】
本明細書で使用される「組成物」という用語は、特定量の特定成分を含む製品、及び特定
量の特定成分の組み合わせから直接又は間接的に得られる任意の製品を含むことを意図す
る。医薬組成物に対しては、この用語は、活性成分及び担体を構成する不活性成分を含む
製品、及び任意の２つ以上の成分の組み合わせ、錯化又は凝集、又は１つ以上の成分の解
離、又は１つ以上の成分の他のタイプの反応又は相互作用から直接又は間接的に得られる
任意の製品を包含することを意図する。したがって、本発明の医薬組成物は、化合物と薬
学的に許容される担体とを混合することにより製造される任意の組成物を包含する。
【００５２】
医薬品のスクリーニング方法
本発明の別の広範な態様の実施形態によれば、自己誘導物質によって引き起こされる免疫
系関連疾患を治療するための医薬品のスクリーニング方法であって、（１）候補化合物を
免疫細胞と接触させることと、（２）接触前後に、（ａ）細胞表面ＴＮＦＲ１の三量化レ
ベル、（ｂ）ＴＮＦＲ１−ＦＡＤＤ−ｃａｓｐａｓｅ８−ｃａｓｐａｓｅ３経路の活性化
レベルのうちの少なくとも１つを決定することを含む方法を提供し、前記細胞表面ＴＮＦ
Ｒ１の三量化レベルの低下又は前記ＴＮＦＲ１−ＦＡＤＤ−ｃａｓｐａｓｅ８−ｃａｓｐ
ａｓｅ３経路の活性化レベルの低下は、前記候補化合物が自己誘導物質によって引き起こ
される免疫系関連疾患を治療するための医薬品であることを示す。これらの実施形態によ
れば、上記の方法は、自己誘導物質によって引き起こされる免疫系関連疾患を治療するた
めの医薬品を効果的にスクリーニングすることができる。
【００５３】
本発明の実施形態によれば、自己誘導物質は、Ｃ８〜１２アルキルアシルホモセリンラク
トン又はその誘導体である。実験した結果、Ｃ８〜１２、特にＣ８アルキルアシルホモセ
リンラクトン又はその誘導体は、ＴＮＦＲ１三量化を著しく誘導し、ＴＮＦＲ１−ＦＡＤ
Ｄ−ｃａｓｐａｓｅ８−ｃａｓｐａｓｅ３経路を活性化することができる。自己誘導物質
（特にＣ８〜１２、特にＣ８アルキルアシルホモセリンラクトン又はその誘導体）によっ
て引き起こされる免疫系関連疾患を治療するための医薬品をスクリーニングする方法によ
る結果は、より確実できる。この方法は、より高感度である。
【００５４】
化合物又は医薬組成物
本発明は、上記方法でスクリーニングされる化合物を含む医薬組成物をさらに提供する。
本発明の特定の実施例によれば、この医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤、担体、
アジュバント、溶媒、及びそれらの組み合わせをさらに含んでもよい。
【００５５】
本発明は、化合物及び１つ以上の治療活性剤を含む薬物の組み合わせを安全で有効な量で
投与することを含む、疾患又は障害を治療、予防又は改善する方法を提供する。ここで、
薬物の組み合わせは、自己誘導物質によって引き起こされる免疫系関連疾患（特に緑膿菌
感染関連疾患）を治療するための１つ以上の追加的な医薬品を含む。
【００５６】
自己誘導物質によって引き起こされる免疫系関連疾患（特に緑膿菌感染関連疾患）を治療
するための他の医薬品には、アミノグリコシド類（ゲンタマイシン、アミカシン、及びト
ブラマイシン）、キノロン類（シプロフロキサシン及びレボフロキサシン）、及びセファ
ロスポリン類（セフタジジム、セフェピム、セフォペラゾン、セフピローム及びセフトビ
プロール）が含まれるが、これらに限定されない。
【００５７】
本明細書に開示される医薬組成物の化合物の量とは、ＴＮＦＲ１−ＦＡＤＤ−ｃａｓｐａ
ｓｅ８−ｃａｓｐａｓｅ３経路又はＴＮＦＲ１三量化を効果的に阻害できる量を指す。本
発明の組成物中の活性成分の用量は変化可能であるが、活性成分の量は、適切な剤形が得
られるようなものであることが必要である。活性成分は、そのような治療を必要とする患
者（動物又はヒト）に、最適な薬学的有効性を提供する用量で投与することができる。選
択される用量は、所望の治療効果、投与経路、及び治療の持続時間により決まる。用量は
、疾患の性質及び重症度、患者の体重、患者の後での特別な食事、併用する医薬品、及び
当業者が知られているほかの要因に応じて、患者ごとに異なる。用量範囲は、一般に、患
者１人あたり１日約０．５ｍｇ〜１．０ｇであり、単回投与又は複数回投与で投与されて
もよい。一実施形態では、用量範囲は、患者１人あたり１日約０．５ｍｇ〜５００ｍｇで
あり、別の実施形態では、患者１人あたり１日約０．５ｍｇ〜２００ｍｇであり、さらに
別の実施形態では、患者１人あたり１日約５ｍｇ〜５０ｍｇである。
【００５８】
また、なお、本発明の特定の化合物は、遊離形態で存在して治療に用いられるか、又は適
切な場合その薬学的に許容される誘導体又はそのプロドラッグとすることができる。薬学
的に許容される誘導体には、薬学的に許容される塩、エステル、そのようなエステルの塩
、又は任意の他の付加物又は誘導体が含まれ、治療を必要とする患者への投与時に本明細
書に別に記載の化合物、又は代謝産物やその残渣を直接又は間接的に提供することができ
る。
【００５９】
本発明の医薬組成物は、本明細書に開示される式（Ｉ）の化合物の安全かつ有効な量を抽
出し、粉末又はシロップなどの形式で患者に与えることができるバルク形態で調製及び包
装することができる。通常、ＴＮＦＲ１受容体又はＴＮＦＲ１−ＦＡＤＤ−ｃａｓｐａｓ
ｅ８−ｃａｓｐａｓｅ３経路を効果的に拮抗するために、毎日０．０００１〜１０ｍｇ／
ｋｇ体重の用量レベルで患者に投与する。本発明の医薬組成物は、各物理的に別個の単位
が本明細書に開示される式（Ｉ）の化合物の安全かつ有効な量を含む単位用量の形式で調
製及び包装することができる。単位用量の形式で調製される場合、本発明の医薬組成物は
、通常、約０．５ｍｇ〜１ｇ、又は１ｍｇ〜７００ｍｇ、又は５ｍｇ〜１００ｍｇのこの
化合物を含む。
【００６０】
本発明の医薬組成物が、本発明の化合物に加えて、１つ以上の他の活性成分を含む場合、
本発明の化合物と第２活性成分との重量比が変化でき、各成分の有効用量に依存する。通
常、それぞれの成分の有効用量が使用される。したがって、たとえば、本発明の化合物を
別の物質と組み合わせる場合、本発明の化合物と他の物質との重量比は、通常、約２００
：１〜１：２００など、約１０００：１〜約１：１０００の範囲である。本発明の化合物
と他の活性成分との組み合わせも一般に上述の範囲内であるが、各場合において各活性成
分の有効用量が使用されるべきである。
【００６１】
本明細書で使用される「薬学的に許容される賦形剤」とは、前記医薬組成物に形態又は一
致性を付与することに関与する薬学的に許容される材料、成分又は担体を意味する。対象
に投与されるときに本発明の化合物の効力を大幅に低下させる相互作用、及び医薬的に許
容されない医薬品の成分の相互作用の発生を回避するように、各賦形剤は、混合されると
きに前記医薬組成物の他の成分と適合しなければならない。さらに、もちろん、各賦形剤
は薬学的に許容されるように十分に高い純度を持たなければならない。
【００６２】
適切な薬学的に許容される賦形剤は、選択された特定の剤形に応じて異なる。さらに、適
切な薬学的に許容される賦形剤は、それらが組成物に果たす特定の機能に応じて選択され
てもよい。たとえば、薬学的に許容される賦形剤の一部は、均一な剤形の製造を促進する
能力を有するために選択されてもよい。薬学的に許容される賦形剤の一部は、安定な剤形
の製造を促進する能力を有するために選択されてもよい。薬学的に許容される賦形剤の一
部は、患者に一回投与される本発明の化合物を、１つの器官又は生体の一部から別の器官
又は生体の一部へ送達又は運搬することを促進する能力を有するために選択されてもよい
。薬学的に許容される賦形剤の一部は、患者のコンプライアンスを向上させる能力を有す
るために選択されてもよい。
【００６３】
適切な薬学的に許容される賦形剤には、希釈剤、充填剤、粘着剤、崩壊剤、潤滑剤、流動
促進剤、造粒剤、コーティング剤、湿潤剤、溶媒、共溶媒、懸濁剤、乳化剤、甘味剤、香
味剤、矯味剤、着色剤、固化防止剤、保湿剤、キレート剤、可塑剤、増粘剤、抗酸化剤、
防腐剤、安定剤、界面活性剤、及び緩衝剤が含まれる。当業者であれば、特定の薬学的に
許容される賦形剤は、２つ以上の機能を果たすだけでなく、製剤中に存在する賦形剤の量
及び製剤中に存在する他の成分に応じて代替的機能を果たし得ることを理解できる。
【００６４】
当業者は、当技術分野の知識及び技能を有するため、適量の適切な薬学的に許容される賦
形剤を本発明に用いることができる。さらに、当業者であれば、薬学的に許容される賦形
剤を説明し、適切な薬学的に許容される賦形剤を選択するのに有用である多くのリソース
を利用できる。例として、『レミントンの製薬科学』（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ出版会社）、『医薬添加剤のハン
ドブック』（Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｄｄ
ｉｔｉｖｅｓ、Ｇｏｗｅｒ出版株式会社）、及び『医薬品賦形剤のハンドブック』（Ｔｈ
ｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、
米国薬剤師会及び製薬プレス）が含まれる。
【００６５】
『レミントン：薬学の科学と実践』（Ｉｎ  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、２１版  ２００５年版、Ｄ．
Ｂ．Ｔｒｏｙ編集、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ出版
社、フィラデルフィア）及び『製薬技術百科事典』（Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｊ．  Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ  ａ
ｎｄ  Ｊ．  Ｃ．  Ｂｏｙｌａｎ編集、１９８８−１９９９、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅ
ｒ出版社、ニューヨーク）には、薬学的に許容される組成物を調製するための様々な担体
及びそれらの調製のための周知の技術が開示されており、その内容は引用により本明細書
に組み込まれる。任意の望ましくない生物学的効果を生じるか、薬学的に許容される組成
物の他の任意の成分と有害な方式で相互作用するなどにより本発明の化合物と適合しない
場合を除き、任意の一般的な担体媒体の使用も本発明の範囲内である。
【００６６】
本発明の医薬組成物は、当業者に公知の技術及び方法を使用して調製される。当該技術分
野で一般的に使用される方法のいくつかは、『レミントンの製薬科学』（Ｍａｃｋ出版会
社）に記載されている。
【００６７】
したがって、本発明の別の態様は、医薬組成物を調製する方法に関する。該医薬組成物は
、本明細書に開示される化合物及び薬学的に許容される賦形剤、担体、アジュバント、ビ
ヒクル又はそれらの組み合わせを含み、該方法は、様々な成分を混合することを含む。本
明細書に開示される化合物を含む医薬組成物は、たとえば環境温度、大気圧下で調製する
ことができる。
【００６８】
本発明の化合物は、通常、所望の投与経路で患者へ投与することに適した剤形に調製され
る。たとえば、剤形には、（１）錠剤、カプセル、カプレット、丸薬、トローチ、粉末、
シロップ、エリキシル剤、懸濁剤、溶液剤、乳剤、袋剤、及びカシェ剤など、経口投与に
適したもの、（２）無菌溶液、懸濁剤及び再調製用の粉末など、非経口投与に適したもの
、（３）経皮パッチなど、経皮投与に適したもの、（４）座薬など、直腸投与に適したも
の、（５）エアロゾル、溶液剤及び乾燥粉末剤など、吸入投与に適したもの、（６）クリ
ーム剤、軟膏剤、ローション、溶液剤、ペースト剤、スプレー剤、フォーム剤、ゲルなど
、局所投与に適したものが含まれる。
【００６９】
一実施形態では、本明細書に開示される化合物は、経口投与剤形に調製することができる
。他の実施形態では、本明細書に開示される化合物は、吸入投与剤形に調製することがで
きる。さらに別の実施形態では、本明細書に開示される化合物は、経鼻投与剤形に調製す
ることができる。さらに別の実施形態では、本明細書に開示される化合物は、経皮投与剤
形に調製することができる。さらに別のいくつかの実施形態では、本明細書に開示される
化合物は、局所投与剤形に調製することができる。
【００７０】
本明細書で提供される医薬組成物は、圧縮錠剤、湿製錠（ｔａｂｌｅｔ  ｔｒｉｔｕｒａ
ｔｅｓ）、チュアブル錠、急速溶解錠剤、マルチ圧縮錠剤、又は腸溶コーティング錠剤、
糖衣錠、又はフィルムコーティング錠として提供され得る。腸溶性コーティング錠は、胃
酸の作用には抵抗するが、腸内で溶解又は崩壊することで胃の酸性環境から活性成分を保
護する物質をコーティングした圧縮錠剤である。腸溶性コーティングには、脂肪酸、脂肪
、サリチル酸フェニル、ワックス、シェラック、アンモニア化シェラック、及び酢酸フタ
ル酸セルロースが含まれるが、これらに限定されない。糖衣錠は、糖衣で被覆された圧縮
錠剤であり、糖衣を被覆することにより不快な味や臭いを隠し、錠剤を酸化から保護する
ことに役立つ。フィルムコーティング錠は、水溶性材料の薄層又はフィルムで被覆された
圧縮錠剤である。フィルムコーティングには、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシ
メチルセルロースナトリウム、ポリエチレングリコール４０００、及び酢酸フタル酸セル
ロースが含まれるが、これらに限定されない。フィルムコーティングは、糖衣と同じ一般
的な特性を付与する。マルチ圧縮錠剤は、複数の圧縮サイクルでプレス成形された圧縮錠
剤であり、多層錠剤、プレスコーティング錠又はドライコーティング錠を含む。
【００７１】
錠剤の剤形は、粉末、結晶、又は顆粒形態の活性成分単独で又は本明細書に記載の１つ以
上の担体又は賦形剤（粘着剤、崩壊剤、放出制御重合体、潤滑剤、希釈剤及び／又は着色
剤を含む）と組み合わせて調製することができる。香味剤及び甘味剤は、チュアブル錠及
びロゼンジの調製に特に有用である。
【００７２】
本明細書で提供される医薬組成物は、ソフト又はハードカプセルとして提供されてもよく
、ソフト又はハードカプセルは、ゼラチン、メチルセルロース、デンプン、又はアルギン
酸カルシウムで製造できる。乾燥充填カプセル（ｄｒｙ−ｆｉｌｌｅｄ  ｃａｐｓｕｌｅ
、ＤＦＣ）としても知られているハードゼラチンカプセルは、２つのセクションから構成
され、一方が他方に套設されることで活性成分を完全に封入する。ソフト弾性カプセル（
ｓｏｆｔ  ｅｌａｓｔｉｃ  ｃａｐｓｕｌｅ、ＳＥＣ）は、グリセリン、ソルビトール、
又は類似したポリオールを添加して可塑化してなるゼラチンシェルなどの柔らかい球状シ
ェルである。ソフトゼラチンシェルには、微生物の成長を防ぐための防腐剤が含まれても
よい。適切な防腐剤は、メチルパラベン、プロピルパラベン、及びソルビン酸を含む、本
明細書に記載されているものである。本明細書で提供される液体剤形、半固体剤形、及び
固体剤形は、カプセルにカプセル化することができる。適切な液体剤形及び半固体剤形と
して、炭酸プロピレン、植物油、又はトリグリセリド中の溶液剤及び懸濁剤が含まれる。
そのような溶液を含有するカプセルは、米国特許第４,３２８,２４５、４,４０９,２３９
及び４，４１０,５４５号に記載されている方法により調製することができる。これらの
カプセルは、また、活性成分の溶出を変化又は長期間に維持するために、当業者に公知の
方法によりコーティングされてもよい。
【００７３】
本明細書で提供される医薬組成物は、乳剤、溶液剤、懸濁剤、エリキシル剤、及びシロッ
プを含む液体剤形及び半固体剤形として提供されてもよい。乳剤は、２相系であり、１つ
の液体が小さな液滴の形で別の液体に分散されており、これは、水中油又は油中水の形態
でありうる。乳剤は、薬学的に許容される非水性液体又は溶媒、乳化剤、及び防腐剤を含
んでもよい。懸濁剤には、薬学的に許容される懸濁化剤及び防腐剤が含まれてもよい。水
性アルコール溶液剤は、低級アルキルアルデヒドのジ（低級アルキル）アセタール、たと
えばアセトアルデヒドジエチルアセタールなどの薬学的に許容されるアセタール、たとえ
ばプロピレングリコール及びエタノールなど、１つ以上のヒドロキシ基を有する水混和性
溶媒を含み得る。エリキシル剤は、透明で甘味を有する水性アルコール溶液である。シロ
ップは、糖（たとえばショ糖）の濃縮水溶液剤であり、防腐剤を含んでもよい。液体剤形
の場合、たとえば、ポリエチレングリコール中の溶液剤は、投与の利便性のために十分な
量の薬学的に許容される液体担体（たとえば水）で希釈されてもよい。
【００７４】
他の有用な液体剤形及び半固体剤形には、本明細書で提供される活性成分と、ジアルキル
化のモノ又はポリアルキレングリコール（１,２−ジメトキシメタン、ジグリム、トリグ
リム、テトラグリム、ポリエチレングリコール−３５０−ジメチルエーテル、ポリエチレ
ングリコール−５５０−ジメチルエーテル、ポリエチレングリコール−７５０−ジメチル
エーテルを含む。ここで、３５０、５５０、及び７５０は、ポリエチレングリコールのお
およその平均分子量を指す。）とを含有する剤形を含む、これらに限定されない。これら
の製剤は、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ
）、没食子酸プロピル、ビタミンＥ、ハイドロキノン、ヒドロキシクマリン、エタノール
アミン、レシチン、セファリン、アスコルビン酸、リンゴ酸、ソルビトール、リン酸、重
亜硫酸塩、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオジプロピオン酸とそのエステル、及びジチオカ
ルバメートなどの１つ以上の抗酸化剤をさらに含んでもよい。
【００７５】
適切な場合、経口投与用の用量単位製剤は、マイクロカプセル化することができる。該製
剤は、たとえば、コーティングする又は粒子材料を重合体、ワックス又は類似したものに
埋め込むことにより放出を延長又は持続するようにしてもよい。
【００７６】
本明細書で提供される経口投与用の医薬組成物は、リポソーム、ミセル（ｍｉｃｅｌｌ）
、ミクロスフェア、又はナノシステムの形態として提供されてもよい。ミセル剤形は、米
国特許第６,３５０,４５８号に記載されている方法により調製することができる。
【００７７】
本明細書で提供される医薬組成物は、非発泡性又は発泡性の顆粒剤及び粉末剤（液体剤形
に再調製する必要がある）として提供されてもよい。前記非発泡性の顆粒剤又は粉末剤に
使用される薬学的に許容される担体及び賦形剤には、希釈剤、甘味剤及び湿潤剤が含まれ
てもよい。前記発泡性の顆粒剤又は粉末剤に使用される薬学的に許容される担体及び賦形
剤には、有機酸及び二酸化炭素源が含まれてもよい。
【００７８】
上記の剤形のすべてには、着色剤及び香味剤が使用可能である。
【００７９】
本明細書に開示される化合物は、また、可溶性重合体と結合されて標的薬物担体とするこ
ともできる。そのような重合体は、ポリビニルピロリドン、ピランコ重合体、ポリヒドロ
キシプロピルメタクリルアミドフェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルトアミドフェ
ノール又はパルミトイル基により置換されたポリエチレンオキシドポリリジンを含み得る
。前記化合物は、さらに医薬品の制御放出を達成するのに適した生分解性重合体、たとえ
ばポリ乳酸、ポリε−カプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ
アセタール、ポリジヒドロキシピラン、ポリシアノアクリレート及びヒドロゲルの架橋又
は両親媒性ブロックコ重合体に結合させてもよい。
【００８０】
本明細書で提供される医薬組成物は、遅延放出剤形、持続放出剤形、パルス放出剤形、放
出制御剤形、標的放出剤形、及びプログラム放出剤形を含む即時放出剤形又は調節放出剤
形として調製することができる。
【００８１】
本明細書で提供される医薬組成物は、所望の治療作用を損なわない他の活性成分、又は所
望の作用を補足する物質と共製剤化することができる。
【００８２】
本明細書で提供される医薬組成物は、局所投与又は全身投与のために、注射、注入又は移
植により非経口投与することができる。本明細書で使用される非経口投与には、静脈内、
動脈内、腹腔内、髄腔内、脳室内、尿道内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内、滑膜内及び皮下投
与が含まれる。
【００８３】
本明細書で提供される医薬組成物は、溶液剤、懸濁剤、乳剤、ミセル、リポソーム、ミク
ロスフェア、ナノシステム、及び注射前に液体状の溶液又は懸濁液に調製することに適し
た固体剤形を含む、非経口投与に適した任意の剤形に調製することができる。そのような
剤形は、製薬科学分野の当業者に公知の従来の方法に従って調製することができる（『レ
ミントン：薬学の科学と実践』参照、同上）。
【００８４】
非経口投与用の医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体及び賦形剤を含んでも
よく、水性担体、水混和性担体、非水性担体、微生物の成長を抑制する抗微生物剤又は防
腐剤、安定剤、可溶化剤、等張剤、緩衝剤、抗酸化剤、局所麻酔薬、懸濁分散剤、湿潤剤
又は乳化剤、錯化剤、隠蔽剤又はキレート剤、凍結保護剤（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎ
ｔ）、凍結乾燥保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）、増粘剤、ｐＨ調整剤、及び不活
性ガスを含むが、これらに限定されない。
【００８５】
適切な水性担体には、水、塩水、生理食塩水又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、塩化
ナトリウム注射液、リンゲル注射液、等張デキストロース注射液、滅菌水注射液、デキス
トロース及び乳酸塩のリンゲル注射液が含まれるが、これらに限定されない。非水性担体
には、植物起源の固定油、ヒマシ油、コーン油、綿実油、オリーブ油、落花生油、ペパー
ミント油、ベニバナ油、ゴマ油、大豆油、硬化植物油、硬化大豆油、ココナッツ油の中鎖
トリグリセリド、及びヤシ種子油が含まれるが、これらに限定されない。適切な水混和性
担体には、エタノール、１,３−ブタンジオール、液体ポリエチレングリコール（たとえ
ば、ポリエチレングリコール３００及びポリエチレングリコール４００）、プロピレング
リコール、グリセリン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ,Ｎ−ジメチルアセトアミド、
及びジメチルスルホキシドが含まれるが、これらに限定されない。
【００８６】
適切な抗微生物剤又は防腐剤には、フェノール、クレゾール、水銀、ベンジルアルコール
、クロロブタノール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル及びｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピ
ル、チメロサール、塩化ベンザルコニウム（たとえば、塩化ベンゼトニウム）、メチルパ
ラベン、プロピルパラベン、及びソルビン酸が含まれるが、これらに限定されない。適切
な等張剤には、塩化ナトリウム、グリセリン、及びデキストロースが含まれるが、これら
に限定されない。適切な緩衝剤には、リン酸塩及びクエン酸塩が含まれるが、これらに限
定されない。適切な抗酸化剤は、本明細書に記載されているものであり、重亜硫酸塩及び
メタ重亜硫酸ナトリウムが含まれる。適切な局所麻酔薬には、プロカイン塩酸塩が含まれ
るが、これに限定されない。適切な懸濁分散剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウ
ム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びポリビニルピロリドンを含む、本明細書
に記載されているものである。適切な乳化剤には、ポリオキシエチレンソルビタンモノラ
ウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート８０及びトリエタノールアミン
オレエートを含む、本明細書に記載のものである。適切な隠蔽剤又はキレート剤には、Ｅ
ＤＴＡが含まれるが、これに限定されない。適切なｐＨ調整剤には、水酸化ナトリウム、
塩酸、クエン酸、及び乳酸が含まれるが、これらに限定されない。適切な錯化剤には、α
−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキ
ストリン、スルホブチルエーテル−β−シクロデキストリン、及びスルホブチルエーテル
７−β−シクロデキストリン（ＣＡＰＴＩＳＯＬR，ＣｙＤｅｘ社、Ｌｅｎｅｘａ、米国
のカンザス）を含むシクロデキストリンが含まれるが、これらに限定されない。
【００８７】
本明細書で提供される医薬組成物は、単回用量又は複数回用量で投与するように調製する
ことができる。単回用量製剤は、アンプル、バイアル又はシリンジにパッケージされてい
る。複数回用量非経口製剤は、細菌又は真菌の濃度を抑制する抗微生物剤を含まなければ
ならない。すべての非経口製剤は、当技術分野における知見及び実践から分かるように、
無菌でなければならない。
【００８８】
一実施形態では、前記医薬組成物は、即時使用型の滅菌溶液剤として提供される。別の実
施形態では、医薬組成物は、使用前に担体で再調製する凍結乾燥粉末剤及び皮下注射用錠
剤を含む滅菌乾燥可溶性製品として提供される。さらに別の実施形態では、前記医薬組成
物は、即時使用型の滅菌懸濁剤として提供される。さらに別の実施形態では、医薬組成物
は、使用前に担体で再調製する滅菌乾燥不溶性製品として提供される。さらに別の実施形
態では、前記医薬組成物は、即時使用型の滅菌乳剤として提供される。
【００８９】
医薬組成物は、懸濁剤、固体、半固体又は揺変性液体として調製されて、埋め込みデポー
として投与することができる。一実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物は、体
液に不溶性であるが医薬組成物中の活性成分が拡散する外層重合体膜に囲まれた固体内部
マトリックス（ｓｏｌｉｄ  ｉｎｎｅｒ  ｍａｔｒｉｘ）に分散される。
【００９０】
適切な内部マトリックスには、ポリメチルメタクリレート、ポリブチルメタクリレート、
可塑化又は非可塑化のポリ塩化ビニル、可塑化ナイロン、可塑化ポリエチレンテレフタレ
ート、天然ゴム、ポリイソプレン、ポリイソブチレン、ポリブタジエン、ポリエチレン、
エチレン−酢酸ビニル共重合体、シリコーンゴム、ポリジメチルシロキサン、シリコーン
カーボネートコ重合体、親水性重合体、たとえばアクリル酸とメタクリル酸のエステルの
ヒドロゲル、コラーゲン、架橋ポリビニルアルコール、及び架橋した部分加水分解ポリ酢
酸ビニルなどが含まれる。
【００９１】
適切な外部重合体膜には、ポリエチレン、ポリプロピレン、エチレン／プロピレン共重合
体、エチレン／アクリル酸エチル共重合体、エチレン／酢酸ビニル共重合体、シリコーン
ゴム、ポリジメチルシロキサン、ネオプレンゴム、塩素化ポリエチレン、ポリ塩化ビニル
、塩化ビニルと酢酸ビニルの共重合体、塩化ビニリデン、エチレンとプロピレン、アイオ
ノマーポリエチレンテレフタレート、ブチルゴムエピクロロヒドリンゴム類、エチレン／
ビニルアルコール共重合体、エチレン／酢酸ビニル／ビニルアルコール三元共重合体、及
びエチレン／ビニルオキシエタノール共重合体が含まれる。
【００９２】
他の態様では、本発明の医薬組成物は、たとえば乾燥粉末、エアロゾル、懸濁剤、又は溶
液組成物など、患者への吸入投与に適合した剤形に調製される。一実施形態では、本発明
は、患者への吸入投与に適合した乾燥粉末剤形に関する。一実施形態では、本発明は、患
者への吸入投与に適合した乾燥粉末剤形に関する。吸入により肺へ送達する乾燥粉末組成
物は、通常、本明細書に開示される微粉としての化合物又はその薬学的に許容される塩、
及び微粉としての１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む。特に乾燥粉末に適した薬
学的に許容される賦形剤は、当業者に公知のものであり、ラクトース、デンプン、マンニ
トール、及び単糖、二糖、及び多糖が含まれる。微粉は、たとえば、微粉化及び粉砕によ
り調製され得る。一般には、サイズが減少された（たとえば微粉化された）化合物は、約
１μｍ〜約１０μｍのＤ５０値で定義することができる（たとえば、レーザー回折を使用
して測定）。
【００９３】
エアロゾルは、本明細書に開示されている化合物又はその薬学的に許容される塩を液化噴
射剤に懸濁又は溶解することにより形成され得る。適切な噴射剤には、ハロカーボン、炭
化水素類、及び他の液化ガスが含まれる。噴射剤の代表例として、トリクロロフルオロメ
タン（噴射剤１１）、ジクロロフルオロメタン（噴射剤１２）、ジクロロテトラフルオロ
エタン（噴射剤１１４）、テトラフルオロエタン（ＨＦＡ−１３４ａ）、１,１−ジフル
オロエタン（ＨＦＡ−１５２ａ）、ジフルオロメタン（ＨＦＡ−３２）、ペンタフルオロ
エタン（ＨＦＡ−１２）、ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ−２２７ａ）、ペルフルオロ
プロパン、ペルフルオロブタン、ペルフルオロペンタン、ブタン、イソブタン、及びペン
タンが含まれる。式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容される塩を含むエアロゾルは、
通常、定量吸入器（ＭＤＩ）を介して患者に投与される。このような装置は、当業者が周
知するものである。
【００９４】
エアロゾルは、製剤の物理的安定性、バルブ性能、溶解性を向上させる又は味を改善する
ために、界面活性剤、潤滑剤、可溶化剤及び他の賦形剤など、通常ＭＤＩとともに使用さ
れる別の薬学的に許容される賦形剤を含んでもよい。
【００９５】
経皮投与に適した医薬組成物は、より長期間にわたって患者の表皮と密接に接触し続ける
ための個別のパッチとしてもよい。たとえば、活性成分は、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ
ｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（薬学研究）、３（６）、３１８（１９８６）に一般的に記載され
ているように、イオン導入によりパッチから送達され得る。
【００９６】
局所投与に適した医薬組成物は、軟膏剤、クリーム剤、懸濁剤、ローション、粉末剤、溶
液剤、ペースト剤、ゲル剤、スプレー剤、エアロゾル又は油剤として調製することができ
る。軟膏剤、クリーム剤及びゲル剤は、たとえば、水性又は油性基剤に適切な増粘剤及び
／又はゲル化剤及び／又は溶媒を添加したものとして調製することができる。このため、
そのような基剤は、たとえば、水及び／又は、液体パラフィン又は落花生油もしくはヒマ
シ油などの植物油である油、又はパリエチレングリコールなどの溶媒を含んでもよい。基
剤の性質に応じて使用できる増粘剤及びゲル化剤には、軟パラフィン、ステアリン酸アル
ミニウム、セトステアリルアルコール、ポリエチレングリコール、羊毛脂、蜜蝋、カルボ
キシポリメチレン及びセルロース誘導体、及び／又はモノステアリン酸グリセリン及び／
又は非イオン性乳化剤が含まれる。
【００９７】
ローションは、水性又は油性基剤で調製することができ、且つ、一般に１つ以上の乳化剤
、安定剤、分散剤、懸濁剤又は増粘剤も含む。
【００９８】
外用粉末剤は、（たとえば、タルク、ラクトース又はデンプンなど）の任意の適切な粉末
基剤の補助下で形成することができる。ドロップ剤は、水性又は非水性基剤で調製するこ
とができ、１つ以上の分散剤、可溶化剤、懸濁剤又は防腐剤も含む。
【００９９】
局所製剤は、感染部位に１日１回又は複数回使用することにより投与でき、皮膚領域上に
閉塞性包帯を好適に使用することができる。接着剤リザーバーシステム（ａｄｈｅｓｉｖ
ｅ  ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ  ｓｙｓｔｅｍ）により、連続的又は長時間の送達を実現できる
。
【０１００】
一実施形態において、本明細書に開示される治療方法は、前記化合物又は前記化合物を含
有する医薬組成物を安全かつ有効な量で治療を必要とする患者に投与することを含む。本
明細書に開示される各実施例は、前記疾患を治療する方法を含み、該方法は、前記阻害剤
の化合物又は前記阻害剤の化合物を含有する医薬組成物を安全で有効な量で治療を必要と
する患者に投与することを含む。
【０１０１】
一実施形態において、本発明の化合物又はその医薬組成物は、全身投与及び局所投与を含
む任意の適切な投与経路により投与され得る。全身投与には、経口投与、非経口投与、経
皮投与及び直腸投与が含まれる。非経口投与とは、経腸又は経皮以外の投与経路であり、
通常は注射又は注入を利用する。非経口投与には、静脈内、筋肉内、及び皮下注射又は注
入が含まれる。局所投与には、皮膚、眼内、耳、膣内への応用、吸入及び鼻腔内投与が含
まれる。一実施形態では、本発明の化合物又はその医薬組成物は経口投与することができ
る。別の実施形態では、本発明の化合物又はその医薬組成物は、吸入投与することができ
る。さらに別の実施形態では、本発明の化合物又はその医薬組成物は、鼻腔内に投与する
ことができる。
【０１０２】
一実施形態では、本発明の化合物又はその医薬組成物は、１回投与するか、投与レジメン
（所定の期間においてさまざまな時間間隔で複数回投与する）に従って投与することがで
きる。たとえば、１日に１、２、３、又は４回投与されてもよい。一実施形態では、１日
に１回投与される。別の実施形態では、１日に２回投与される。所望の治療効果が達成さ
れる又は無期限に所望の治療効果が保持されるまで、持続的に投与することができる。本
発明の化合物又はその医薬組成物に用いる適切な投与レジメンは、吸収、分布及び半減期
など、この化合物の薬物動態特性に依存し、これは、当業者によって決定され得る。さら
に、本発明の化合物又はその医薬組成物用の適切な投与レジメンは、このようなレジメン
で投与される持続期間を含み、治療される障害、治療される障害の重症度、治療される患
者の年齢及び身体状態、治療される患者の病歴、同時に行われる治療の性質、所望の治療
効果などに依存し、当業者の知識及び経験の範囲に属する要素である。さらに、そのよう
な当業者が理解できるように、投与レジメンに対する個々の患者の反応を考慮して、又は
個々の患者が経時間的に変化する必要がある場合に、適切な投与レジメンを調整する必要
がある。
【０１０３】
本発明の化合物は、１つ以上の他の治療薬と同時に、又は１つ以上の他の治療薬の前後に
投与することができる。本発明の化合物は、同じ又は異なる投与経路によって別々に投与
し、又は同じ医薬組成物においてほかの医薬品と一緒に投与することができる。
【０１０４】
本発明の医薬組成物又は組み合わせの単位用量には、約５０〜７０ｋｇの対象に対して、
活性成分は、約１〜１０００ｍｇ、好ましくは約１〜５００ｍｇ、約１〜２５０ｍｇ、約
１〜１５０ｍｇ、約０．５−１００ｍｇ、又は約１−５０ｍｇであってもよい。前記医薬
組成物又は組み合わせの治療有効用量は、対象の種、体重、年齢、及び個人の状況、治療
される障害又は疾患又はその重症度に依存する。通常の技能を有する医師、臨床医又は獣
医は、前記障害又は疾患の進行を予防、治療又は阻害するために必要な各活性成分の有効
量を容易に決定することができる。
【０１０５】
上記に引用した用量特性は、好ましくは、哺乳動物（たとえば、マウス、ラット、イヌ、
サル、又は摘出した器官、組織、及びそれらの製品）を用いてインビトロ及びインビボ試
験で実証可能である。本発明の化合物は、インビトロでは、溶液（たとえば、好ましくは
水性溶液）の形態で適用でき、且つ、インビボ（経腸的又は非経口的を問わず、好ましく
は静脈内）で懸濁液又は水性溶液の形態として適用することができる。
【０１０６】
一実施形態では、本明細書に開示される化合物の治療有効用量は、１日あたり約０．１ｍ
ｇ〜約２，０００ｍｇである。前記医薬組成物は、約０．１ｍｇ〜約２０００ｍｇの用量
の化合物を提供する必要がある。特定の実施形態では、医薬品は、単位剤形に調製され、
各単位剤形は、約１ｍｇ〜約２,０００ｍｇ、約１０ｍｇ〜約１,０００ｍｇ、約２０ｍｇ
〜約５００ｍｇ、又は約２５ｍｇ〜約２５０ｍｇの活性成分又は必須な成分の組み合わせ
を提供する。特定の実施形態において、医薬品の単位剤形は、約１０ｍｇ、２０ｍｇ、２
５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２５０ｍｇ、５００ｍｇ、１０００ｍｇ又は２０００ｍ
ｇの活性成分を提供するように調製される。
【０１０７】
また、本発明の化合物は、プロドラッグとして投与できる。本明細書で使用される本発明
の化合物の「プロドラッグ」とは、患者への投与時に最終的に本発明の化合物をインビボ
で放出する該化合物の機能的誘導体である。本発明の化合物をプロドラッグとして投与す
ると、当業者は、以下の１つ以上を行うことができる。（ａ）前記化合物がインビボで作
用し始める時間を変化させる。（ｂ）前記化合物がインビボで作用する持続時間を変化さ
せる。（ｃ）前記化合物のインビボでの輸送又は分布を変化させる。（ｄ）前記化合物の
インビボでの溶解度を変化させる。及び（ｅ）前記化合物の副作用又はほかの発生する困
難を克服する。プロドラッグの調製に使用される一般的な機能的誘導体は、インビボで化
学的又は酵素的に切断される化合物の修飾を含む。このような修飾は、リン酸塩、アミド
、エステル、チオエステル、炭酸エステル、及びカルバメートの調製を含み、当業者に周
知のことである。
【０１０８】
以下の実施例は、本発明がより完全に理解されるように提供されている。ただし、これら
の実施形態は、単に本発明を実施する方法を提供するに過ぎず、本発明は、これらの実施
形態に限定されないことを理解すべきである。
【０１０９】
関連方法は、以下のように説明する。
【０１１０】
マウス、細胞及び試薬
Ｃ５７ＢＬ／６、ＯＴ−Ｉ及びＯＴ−ＩＩマウスは、ジャクソン研究所から入手した。承
認されたプロトコルに従ってこれらのマウス及びＣａｓｐ８−／−、Ｒｉｐｋ３−／−及
びＴｎｆｒｓｆ１ａ−／−マウスを清華大学動物施設で収容して飼育した。
【０１１１】
Ｎ−３−オキソ−ドデカノイル−ホモセリンラクトン（３ＯＣ１２  ＨＳＬ）、Ｎ−ドデ
カノイル−ホモセリンラクトン（Ｃ１２  ＨＳＬ）、Ｎ−ブチリル−ホモセリンラクトン
（Ｃ４  ＨＳＬ）、Ｎ−ヘキサノイル−ホモセリンラクトン（Ｃ６  ＨＳＬ）、Ｎ−オク
タノイル−ホモセリンラクトン（Ｃ８  ＨＳＬ）、Ｎ−３−オキソ−オクタノイル−ホモ
セリンラクトン（３ＯＣ８  ＨＳＬ）、Ｎ−デカノイル−ホモセリンラクトン（Ｃ１０  
ＨＳＬ）、Ｎ−トラデカノイル−ホモセリンラクトン（Ｃ１４  ＨＳＬ）、Ｎ−ヘキサデ
カノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン（Ｃ６  ＨＳＬ）は、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ社製のものである。卵由来スフィンゴミエリン（８６００６１）、１,２−ジオレオイ
ル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）（８５０３７５）、１,２−ジパル
ミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）（８５０３５５）及びコレス
テロールは、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社製のものである。Ａｎｎｅｘｉ
ｎ（アネキシン）Ｖ−ＦＩＴＣ／ＰＩアポトーシス検出キット（Ｎｏ．ＦＸＰ０１８−１
００）は、４Ａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．社製のものである。ＯＴ−Ｉペプチド（ａａ２
５７−２６４）及びＯＴ−ＩＩペプチド（ａａ３２３−３３９）は、北京中科亜光生物科
技術公司（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｓｃｉｌｉｇｈｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）により合
成された。ＰＭＡとイオノマイシン（ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ）の混合物（ｎｏ．ＣＳ１００
１）は、Ｍｕｌｔｉ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製のものである。組換えヒト
ＴＮＦα（ｎｏ．３００−０１Ａ）は、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社から購入した。シクロヘキ
シミド（ｎｏ．Ｃ７６９８）は、Ｓｉｇｍａ社製のものである。リポフェクタミン２００
０（ｎｏ．１１６６８０１９）及びＤＴＳＳＰ（ｎｏ．２１５７８）、量子ドット６０５
ストレプトアビジンコンジュゲート（ｎｏ．Ｑ１０１０３ＭＰ）は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓ
ｈｅｒ社製のものである。ｃａｓｐａｓｅ阻害剤は、Ｅｎｚｏ  ｌｉＦｅ  ｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ社製のものである。タンパク質Ａ＋Ｇアガロース（ｎｏ．Ｐ２０１２）及びＯＮＰＧ
（ｎｏ．ＳＴ４２９）は、Ｂｅｙｏｔｉｍｅ  Ｂｉｏｔｈｃｈｎｏｌｏｇｙ社製のもので
ある。マウスＣＤ４＋Ｔ細胞予備濃縮キット（ｎｏ．１９７７２）は、ＳｔｅｍＣｅｌｌ
製のものである。マウスＩＬ−１β用のＥｌｉｓａ検出キット（８８−７０１３−８８）
、マウスＴＮＦα（８８−７３２４−８８）及びマウスＩＬ−２（ｎｏ．８８−７０２４
−８８）は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製のものであった。
【０１１２】
ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ）実験では、Ｉκｂα（ｎｏ．９２４２
）、Ｃａｓｐａｓｅ−３（８Ｇ１０、ｎｏ．９６６５）、ｃａｓｐａｓｅ  ８（Ｄ３５Ｇ
２、ｎｏ．４７９０）、切断されたｃａｓｐａｓｅ  ８（Ａｓｐ３８７、ｎｏ．９４２９
）、ＴＮＦＲ１（Ｃ２５Ｃ１、ｎｏ．３７３６）、ＥＧＦＲ（２２３２）、ｐＥＧＦＲ（
４４０７）は、ＣＳＴ社製のものである。ＧＡＰＤＨ（ＡＧ０１９）は、Ｂｅｙｏｔｉｍ
ｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製のものである。ＴＮＦＲ１（５０４９６−ＲＰ０２
）は、北京義キョウ神州科技公司（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）社製のものである
。Ｆａｓ（Ａ−２０、ｓｃ−１０２３）はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製のものである。免疫
沈降では、ＦＡＤＤ（Ｈ−１８１、ｓｃ−５５５９）及びｃａｓｐａｓｅ  ８  ｐ１８（
Ｃ−２０、ｓｃ−６１３６）は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製のものである。フローサイト
メトリーでは、抗マウスＣＤ６９−ＦＩＴＣ（ｎｏ．１１−０６９１）、抗マウスＣＤ４
−ＰＥ（ｎｏ．１２−００４１）、抗マウスＣＤ８ａ−ＰＥ（ｎｏ．１２−００８１）は
、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製のものである。単一粒子追跡では、抗マウスＴＮＦＲ１
（ＰＡ１−４０２８２）はＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のものであり、マウ
ス抗ウシ血清アルブミンモノクローナル抗体（ａｎｔｉ−ＢＳＡ  ｍｏｕｅ  Ａｂ）は、
Ｓｉｇｍａ社製のものであった。
【０１１３】
ｐｃＤＮＡ３．１（＋）、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｎ−ＦＬＡＧ、ｐｅＧＦＰ−Ｎ１は、清華
大学の李ゆ博士からの贈り物である。ヒトＥＧＦＲ−ｐｅＧＦＰ−Ｎ１は、中国科学院化
学研究所の方暁紅博士からの贈り物である。ヒトＴＮＦＲ１  ｃＤＮＡクローン（ＨＧ１
０８７２−Ｍ）は北京義キョウ神州科技公司から購入した。ヒトＴＮＦＲ１（１−２９３
）突然変異体は、特異的プライマーを用いてヒトＴＮＦＲ１から増幅されてｐｅＧＦＰ−
Ｎ１ベクターにクローニングされた。ｈｕＦＡＤＤ−ＤＮ  ｃＤＮＡは、特異的プライマ
ーを用いて白血病細胞（Ｊｕｒｋａｔ）ｃＤＮＡライブラリーから増幅されてｐｃＤＮＡ
３．１−Ｎ−ｆｌａｇにクローニングされた。ヒトＦｃγＲＩＩａｃＤＮＡは、ＴＨＰ−
１  ｃＤＮＡライブラリーから増幅されてｐｅＧＦＰ−Ｎ１にクローニングされたた。す
べてのプラスミドは、配列決定によって検証された。ＱＳ分子バイオアッセイ株であるア
グロバクテリウム・ツメファシエンス（ＪＺＡ１）１及び野生型株（ＰＡＯ１）、Ｌａｓ
Ｉ欠損型（ΔＬａｓＩ）及びＬａｓＲ欠損型（ΔＬａｓＲ）突然変異体２は、前述のとお
りであった。
【０１１４】
ＨＥＫ  ２９３、ＲＡＷ２６４．７、ＤＣ２．４、ＴＨＰ−１、ＥＬ−４、Ａ２０細胞は
、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを
添加したＤＭＥＭ（ＨｙＣｌｏｎｅ）で成長させた。Ｃｏｓ−１細胞は、北京協和細胞資
源センター（Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ，  ＩＢＭＳ，  ＣＡＭＳ／Ｐ
ＵＭＣ）からのものであった。ＨＥＬＡ細胞は中国科学院化学研究所の方暁紅博士からの
贈り物であり、Ｈ９細胞は中国典型培養物寄託センター（Ｃｈｉｎａ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆ
ｏｒ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手した。これらの細胞
は、すべて１０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び５０μＭβ−メルカプトエタノールを加えた同じ
培養培地で成長させた。
【０１１５】
細胞アッセイ
Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ／ＰＩアポトーシス検出キットで細胞のアポトーシスを検出した。簡
単に言えば、細胞をＨＳＬで刺激するか、未処理のままにした。６時間後、細胞を収集し
、室温でＡｎｎｅｘｉｎ  ＶＦＩＴＣ及びＰＩで１５分間染色し、次に、フローサイトメ
トリーでアポトーシス効果を測定した。ＯＴ−Ｉ又はＯＴ−ＩＩ脾細胞を、特定のペプチ
ド、又はＨＳＬを含む又は含まないＰＭＡとイオノマイシンの混合物、又はＴＮＦαとシ
クロヘキシミドで衝撃した。２４時間後、細胞と上清を別々に収集した。ＯＴ−Ｉ活性化
では、細胞をＣＤ６９及びＣＤ８で染色した。ＯＴ−ＩＩ活性化では、細胞をＣＤ６９及
びＣＤ４で染色した。細胞活性化は、フローサイトメトリーで測定した。すべての上清に
ついてＥＬＩＳＡによりＩＬ−２分泌を検出した。
【０１１６】
骨髄細胞−ＰＡの共培養アッセイには、骨髄細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスから分離し、Ｗ
Ｔの上清を用いて接種し、ＬａｓＩ又はＬａｓＲ欠損ＰＡを６時間培養した。サンプルを
ＬＹ６Ｇで染色し、フローサイトメーターにより好中球数をカウントした。
【０１１７】
共免疫沈降、架橋、脂質ラフトの分離、及びウエスタンブロット
ＦＡＤＤ免疫沈降には、４μｇの抗マウスＦＡＤＤポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃ
ｒｕｚ社、Ｈ−１８１）を１００μｌのタンパク質Ａ／Ｇアガロースとともに室温で２時
間インキュベートした。３００万／ｍｌの精製ＣＤ４  Ｔ細胞をＨＳＬで刺激するか、未
処理のままにした。その後、細胞を収集し、ＩＰ溶解バッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ
ｐＨ  ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  
ＰＭＳＦ、１ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  ＮａＶＯ３及びプロテアーゼ阻害剤混合物）で溶解
した。細胞溶解物を抗体−ビーズ混合物に入れて４℃で３時間放置した。次に、ビーズを
低速遠心分離（１０００ｇ、５分間）で収集し、ＩＰ溶解バッファー（３００  ｍＭ  Ｎ
ａＣｌを添加）で４回洗浄した。最後の洗浄後、沈殿を７０ｕｌ  ２Ｘ  ＳＤＳローディ
ングバッファーで懸濁させ、５分間沸騰させた。ｃａｓｐａｓｅ  ８免疫沈降には、４μ
ｇの抗ｃａｓｐａｓｅ  ８  ポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製、Ｃ−２０
）を１００μｌのタンパク質Ａ／Ｇアガロースとともに室温で１時間インキュベートした
。３００万／ｍｌの精製Ｈ９細胞をＨＳＬで処理するか、未処理のままにした。サンプル
をＦＡＤＤ  ＩＰと同様に処理した。架橋アッセイのために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾
臓又はヒトＴＨＰ−１細胞から分離されたＣＤ４＋Ｔ細胞をＨＳＬで刺激し、次に、細胞
を収集して１０  ｍＭ  ＤＴＳを用いて室温で３０分間架橋し、１  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．５）で１５分間クエンチした。次に、細胞をＢｙｔｏｔｉｍｅバイオテク
ノロジー社製のＲＩＰＡバッファー（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．４）、１５０  
ｍＭ  ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０
．１％ＳＤＳ、１  ｍＭ  ＥＤＴＡ、１  ｍＭ  ＰＭＳＦ、１  ｍＭ  ＮａＦ、１  ｍＭ
ＮａＶＯ３及びプロテアーゼ阻害剤混合物）で溶解し、非還元性ＳＤＳローディングバ
ッファーと混合した。前の３と同様に脂質ラフトを分離した。簡単に言えば、ＴＨＰ−１
細胞を１ｍｌのＭＮバッファー（２５ｍＭ  ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、
１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ  ６．５）の１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に入れて、氷上
で２０分間溶解した。細胞溶解液をルースフィットダウンス型（Ｄｏｕｎｃｅ）ホモジナ
イザーでホモジナイズし（１０ストローク）、次に、４℃で５００ｇを７分間回転させた
。脱核後上清を、まず４℃で７０００ｇ１２分間、次に４℃で１００,０００ｇ５０分間
遠心分離した。沈殿を２００−オクチルグルコピラノシドバッファーに再懸濁させて、Ｄ
ＩＧ画分とした。ウエスタンブロッティング分析の前に、すべてのサンプルを３Ｘ  ＳＤ
Ｓローディングバッファーと混合して５分間沸騰させた。
【０１１８】
クオラムセンシング分子分布アッセイ
前述のように、ＪＺＡ１システムは、野生型から形質転化されたものである。このアッセ
イには、まず、ＪＺＡ１を事前誘導した。簡単に説明すると、ＪＺＡ１を、１μｇ／ｍｌ
テトラサイクリン、１００μｇ／ｍｌスペクチノマイシン、及び１００μｇ／ｍｌゲンタ
マイシンを含むＬＢ液体培地で、対数成長後期まで２８℃で成長させた。対数成長中期に
入るまで、１ｍｌの培養液を抗生物質を含む１００ｍｌのＡＴ培地に２８℃で加えた。次
に、細菌を遠心分離（１２０００ｇ、１０分）によって収集し、１５％滅菌グリセロール
に再懸濁させて凍結した。細胞膜保持アッセイを行うために、Ｈ９細胞を３７℃でＨＳＬ
を用いて接種した。次に、遠心分離（１５００ｒｐｍ、５分）により細胞と上清を別々に
収集した。細胞を氷上でバッファー＃１（２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２  ｍＭ  Ｅ
ＤＴＡ、１  ｍＭ  ＤＴＴ、１０％グリセロール）で処理して、細胞膜を破壊した。細胞
質ゾルと細胞膜の断片を超遠心分離（１７９０００ｇ、２４分、４℃）で分離した。細胞
膜の断片をバッファー＃２（バッファー＃１に１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を添加）に溶
解した。画分におけるＨＳＬを酢酸エチルで抽出し、室温で風乾した。次に、サンプルを
ＤＭＳＯに溶解し、２ｍｌの事前誘導ＪＺＡ１菌株とともに２ｍｌのＡＴ媒体において２
８℃で２０時間培養した。ＯＤ  ６００  ｎｍが０．２−１に達したとき、２００μｌの
細胞培養液を２００μｌのＺバッファー４、１０μｌの０．０５％ＳＤＳ、及び１５μｌ
のクロロホルムと混合することにより細菌を溶解した。１００μｌのＯＮＰＧ（４ｍｇ／
ｍｌ）を各サンプルに添加し、時間Ｔ０を記録した。６００μｌの１Ｍ  ＮａＣＯ３を加
えることにより反応を終了させ、時間Ｔｓを記録した。ミラーユニットを決定するために
、これらのＯＤ  ４２０  ｎｍを測定した。
【０１１９】
脂質結合アッセイ
１ｍｇ／ｍｌの各脂質種のクロロホルム溶液を蒸発により丸いガラススライド上にコーテ
ィングした。次に、ガラス切片を、ＰＢＳ中のＤＭＳＯに溶解した１００μＭ３ＯＣ１２
ＨＳＬとともに３７℃でインキュベートした。インキュベート後、ガラス切片をＰＢＳ
で慎重に４〜５回洗浄し、脂質をＤＭＳＯで溶解した。上記のように、各サンプルにおけ
る３ＯＣ１２  ＨＳＬの量をＱＳバイオアッセイによって測定した。
【０１２０】
単一分子蛍光イメージング
光学的設定：単一分子蛍光検出は、倒立顕微鏡Ａ１ｓｔａｎｄに基づく自作の対物レンズ
型全反射照明蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦＭ）で実行された。簡単に説明すると、４つの単一波
長連続レーザー（４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、５６１ｎｍ、及び６４０ｎｍ）（コヒーレン
ト）を含むレーザーコンバイナーを励起光源として使用した。励起光を、偏光保存された
シングルモード光ファイバと反射コリメータを介して励起経路に導入した。光を、まず音
響光学チューナブルフィルター（ＡＯＴＦ）によってゲートし、次に、１対のレンズで５
回消費し、最後に、可変入射角を実現するために光軸に垂直に水平移動可能なレンズ（ｆ
＝１５０ｍｍ）付きのＯｌｙｍｐｕｓ製ＴＩＲＦ対物レンズ（１００ｘ、ＮＡ  １．４９
）の後焦点面に焦点を合わせた。蛍光信号は、同じ対物レンズで収集され、次に、フィル
ター処理されてＯｐｔｏｓｐｌｉｔ  ＩＩ（Ｃａｉｒｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）でスペク
トル分離された後、電子増倍電荷結合デバイス（ＥＭＣＣＤ）カメラ（Ａｎｄｏｒ  ＩＸ
ＯＮ  ＤＵ−８９７Ｕ  ＢＶ）に投影された。ＡＯＴＦとＥＭＣＣＤカメラを駆動するＭ
ｉｃｒｏ−Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアによってデータ収集を制御した。
【０１２１】
単一分子光漂白ステップのカウント：０．５μｇのＴＮＦＲ１（１−２９３）−ｐｅＧＦ
Ｐ−Ｎ１プラスミド又は０．５μｇのＥＧＦＲ−ｐｅＧＦＰ−Ｎ１プラスミドをＨｅＬａ
細胞にトランスフェクトし、５−６時間培養した。次に、細胞をＨＳＬ、ＴＮＦαで刺激
するか、未処理のままにし、ＰＢＳで２回洗浄し、イメージング前に４％パラホルムアル
デヒドで固定した。ＧＦＰを、４８８ｎｍ、５ｍＷのレーザー出力（レーザーが対物レン
ズを通過した後に測定された）で励起した。収集された蛍光シグナルを、バンドパスフィ
ルターＨＱ  ５２５／５０（Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）によってゲートし
た。ＥＭＣＣＤカメラのＥＭゲインを３００に設定した。１０Ｈｚのフルフレームレート
で各サンプルに対して４００フレームの映像を取得した。画像解析には、まず、Ｉｍａｇ
ｅ  Ｊソフトウェアのローリングボール法を使用して、固定された細胞から取得した映像
からバックグラウンド蛍光を差し引き、映像における関心領域を細胞のアウトラインに従
って手動で選択した。漂白ステップを分析するために、まず、各蛍光スポットの蛍光タイ
ムコースを、Ｉｍａｇｅ  Ｊプラグインで作成し、次に、漂白ステップを手動でカウント
した。
【０１２２】
量子ドットに基づく単一粒子追跡
細胞膜上の個々のＴＮＦＲ１を追跡するために、まず、抗ＴＮＦＲ１  ＩｇＧをパパイン
で消化してＦａｂフラグメントを生成した。その後、ＦａｂをそのＣ末端のユニークな−
ＳＨを介してビオチンと結合した。抗ＴＮＦＲ１  Ｆａｂ  ＱＤコンジュゲートを調製す
るために、１ｍｌのＤＭＥＭに０．７  ｎＭ抗ＴＮＦＲ１&#8211;Ｆａｂビオチンを含む
溶液を、１ｍｌの２  ｎＭ  ＱＤ  ６０５−ストレプトアビジンコンジュゲートに１滴ず
つ添加した。以前に１時間血清飢餓処理を行われた細胞単層（５０％コンフルエント）を
３ＯＣ１２  ＨＳＬで処理するか、未処理のままにし、５００  ｍｌの抗ＴＮＦＲ１−Ｆ
ａｂ−ＱＤの最終溶液を用いて２５℃で２分間インキュベートした。次に、細胞を２５℃
でＰＢＳを用いて２回洗浄し、無血清培地に入れて、ロードしてイメージングした。単一
ＦｃＲγＩＩＡの追跡では、抗ＢＳＡ  ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）をパパ
インで消化してＦｃフラグメントを得た。前述のように、Ｆｃ−ＱＤコンジュゲートを調
製した。Ｃｏｓ−１細胞にＦｃγＲＩＩＡプラスミドを一時的にトランスフェクトし、２
４時間後、細胞を３ＯＣ１２  ＨＳＬで刺激するか、未処理のままにし、５００ｍｌのＦ
ｃ−ＱＤの最終溶液を用いて２５℃で２分間インキュベートした。量子ドット標識細胞を
ＴＩＲＦモードでイメージングした。蛍光は４８８  ｎｍで励起され、バンドパスフィル
ター（５７５−６４０、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社）によってゲートされた。対物レンズの
後の測定には励起電力は、約２ｍＷであった。各サンプルについて、１７  Ｈｚのフルフ
レームレートで４００フレームの映像を取得した。個々の軌道をＭａｔｌａｂで作成され
たＵｔｒａｃｋによって作成した。拡散係数とプロット面積（ｐｌｏｔ  ａｒｅａ）をＭ
ａｔｌａｂで作成されたカスタマイズプログラムによって計算した。ＭＳＤ−ｔ  ａｎａ
ｌｙｓｉｓ  ５で運動モードを決定する場合、線形で単純なブラウン拡散モード、オープ
ンアップ放物線式の定方向拡散モード、オープンダウン放物線式の強制拡散モード、及び
ゼロに近い静的モードである。
【０１２３】
ＰＡ肺感染
軽度の麻酔下、２×１０６又は１×１０７  ＣＦＵのＰＡＯ１、ΔＬａｓＩ及びΔＬａｓ
ＲＰＡを用いて、６−８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを気管内（ｉ．ｔ．）で感染させた
。２４時間後、感染させたマウスの肺を摘出してホモジナイズして、細菌数の計算に供し
た。低速遠心分離により上清を回収し、サイトカインを分測定した。肺組織懸濁液からフ
ローサイトメトリーにより好中球数を検出した。
【０１２４】
骨髄キメラ
５週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを５．５  Ｇｙ用量のγ線で２回照射し、３時間後、静脈
内経路（ＷＴからＷＴ、Ｃａｓｐ８−／−Ｒｉｐｋ３−／−からＷＴ、Ｔｎｆｒｓｆ１ａ
−／−からＷＴ）により骨髄細胞を交叉移植した。マウスに抗生物質（ネオマイシン１ｍ
ｇ／ｍｌ、ポリマイシン０．１ｍｇ／ｍｌ）を３週間飼育した。１×１０７ＣＦＵのＰＡ
Ｏ１細菌により再構築の６週間後に感染させた。ＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２キメラ移植
には、５週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを５．５Ｇｙのγ線で２回照射し、３時間後、静脈
内経路により骨髄細胞（ＣＤ４５．１：ＣＤ４５．２＝１：１）について混合と交叉移植
を行い、４週間後、前述のように、マウスに１×１０７  ＣＦＵのＰ．Ａ細菌を感染させ
た。
【０１２５】
貪食アッセイ
貪食アッセイには、商業的方法によりポリスチレンビーズをＢＳＡとマウス抗ＢＳＡ  Ａ
ｂでコーティングした。実験前に、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地を用いて２４穴プレートのきれ
いなガラス切片においてＲＡＷ２６４．７細胞を培養した。細胞をコーティングされたビ
ーズと共培養し、９００ｇ、４℃で５分間遠心分離し、３７℃で４５分間培養した。次に
、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、４８８ｎｍの抗マウス蛍光抗体で染色し、
免疫蛍光イメージングに供した。分析のために、各細胞上のビーズの総数を明視野下で計
算し、貪食されなかったビーズの数を蛍光灯下で計算した。
【０１２６】
原子間力顕微鏡
小型脂質単層小胞（ＳＵＶ）を調製するために、脂質のクロロホルム溶液（ＤＯＰＣ：Ｄ
ＰＰＣ＝１：１、ＤＯＰＣ：ＳＭ：ｃｈｏｌ＝３：６：１）をガラスバイアルで混合し、
窒素ガス流下で乾燥させた。乾燥脂質フィルムを４ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（１５０
ｍＭ  ＮａＣｌを含む）で再懸濁させてＳＵＶを生成した。小胞溶液（１００μｌ）を
、ＡＦＭヒーターヘッド上の流体セルに固定された新たに切断された雲母に加えた。５５
℃で３０分間インキュベートした後、室温で３０分間放置し、その後、二重層をＨＥＰＥ
Ｓバッファーで十分に洗浄して、過剰な小胞を除去した。
【０１２７】
ＮａｎｏＳｃｏｐｅ  Ｖ  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ走査プローブ顕微鏡（デジタル機器、米国
カリフォルニア州サンタバーバラのＶｅｅｃｏ社）において、バネ定数が約０．３５Ｎ／
ｍで、水溶液中の共振周波数が８〜１０ｋＨｚであるＶ字型Ｓｉ３Ｎ４チップ（モデルＤ
ＮＬ−１０）を使用したタッピングモードで、ＡＦＭ画像を室温で得た。すべての実験は
、Ｏリングでシールされた市販の流体セルを使用して、Ｈｅｐｅｓバッファーで行われた
。Ｊスキャナー（１２５μｍ×１２５μｍ）を使用し、走査速度は、１行あたり０．８〜
２Ｈｚであった。
【０１２８】
透過型電子顕微鏡
ＴＥＭ分析には、培養細胞について固定、脱水、培養皿への浸透及び埋め込みの処理を現
位置で行った。室温で細胞を０．１Ｍリン酸塩バッファー（ｐＨ７．２）において２．５
％グルタルアルデヒドで２時間固定し、カコジル酸塩で緩衝した１％四酸化オスミウムで
１時間固定した。次いで、細胞を段階的にエタノールで脱水し、エポン混合物に包埋した
。重合後、包埋した細胞を含む硬化したエポン層をプラスチック培養皿から分離した。光
学顕微鏡の下で代表領域を選択してトリミングし、樹脂スタブに貼り付けて切片した。ｕ
ｌｔｒａｍｉｃｒｏｔｏｍｅ（ＥＭ  ＵＣ６，  Ｌｅｉｃａ社）においてダイヤモンドナ
イフで超薄切片を切断し、銅支持フィルム付きの単一穴グリッドに収集した。切片を水性
酢酸ウラニルとＲｅｙｎｏｌｄｓクエン酸鉛で染色し、日立  Ｈ７６５０  ＴＥＭを用い
て８０  ｋＶで観察した。画像は、顕微鏡に取り付けられたＭｏｒａｄａ  Ｇ２（オリン
パス）デジタルカメラで取得した。ＳＥＭイメージング用のサンプルを２．５％グルタル
アルデヒド溶液で調製して固定した後、エタノールとＨＭＤＳを用いて勾配脱水又は臨界
点乾燥を行った。サンプルには、金（ＪＥＣ−３０００ＦＣ、日本電子株式会社）がスパ
ッタコーティングされた。その後、サンプルを電子顕微鏡（ＪＳＭ−７００Ｆ、日本電子
株式会社）で検査した。
【０１２９】
統計
すべてのアッセイについて、各条件で最低５匹のマウスを使用し、すべての実験を少なく
とも３回繰り返した。すべてのプロットグラフは、ＳＥＭによる平均値を示している。そ
れぞれ独立した実験の統計分析は、ペアになっていないスチューデントのｔ検定を使用し
て実行された。０．０５未満のｐ値は、有意とみなされた。＊：＜０．０５；＊＊：＜０
．０１；＊＊＊：＜０．００１；  Ｎ．Ｓ．：非有意。
【０１３０】
実施例
哺乳動物細胞におけるシグナル伝達経路を検索するために、本発明者は、３ＯＣ１２  Ｈ
ＳＬが相同ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ制限抗原又はＰＭＡ−イオノフォアによって誘
導されたプライマリＴ細胞及びＴ細胞株の活性化を阻害できるという以前の報告を最初に
確認し、たとえば、ＩＬ−２放出量及びＣＤ６９発現（図１ａ及びｂ）により測定した。
培養物から回収した生細胞では、ＺＡＰ７０のリン酸化はほとんど影響を受けず、このこ
とから、ＴＣＲ由来のシグナルが生存細胞において有意な影響を受けなかったことが示さ
れている（図１ｃ）。しかし、１０及び２０μＭの適度な濃度では、３ＯＣ１２  ＨＳＬ
は、シクロヘキシミドとＴＮＦαの標準プロトコルと同様に、有意なＴ細胞死を引き起こ
した（図２ａ）。したがって、免疫抑制効果は、細胞損失の結果として少なくとも部分的
に解釈できる。したがって、我々は、細胞死誘導におけるその役割からシグナル伝達メカ
ニズムを検索することを決めた。３ＯＣ１２  ＨＳＬの類似体のうち、炭素数１０及び１
２のアシル鎖を持つものによってアポトーシスが誘導された（図２ｂ）。図１ｃは、ほと
んどの免疫細胞タイプ（胸腺腫細胞株ＥＬ４、形質転換ＤＣ株ＤＣ２．４、細網腫Ａ２０
、単球ＲＡＷ２６４．７、及び白血病細胞株ＴＨＰ−１を含む）が３ＯＣ１２  ＨＳＬに
対して感受性であったことが明らかになり、ヒトリンパ芽球Ｈ９及びチオグリコレート誘
導マクロファージは、比較的耐性であった。
【０１３１】
拡張データである図２ｃから明らかなように、尿酸一ナトリウム結晶で処理された細胞に
おける細胞質の膨張とは対照的に、３ＯＣ１２  ＨＳＬで処理された細胞には、典型的な
アポトーシス細胞膜のシワや核凝縮が認められた。報告されている多くの細胞効果のうち
、３ＯＣ１２  ＨＳＬは、メカニズムを確立する試みは行われていないが、ｃａｓｐａｓ
ｅ  ８の活性化をトリガーすることもできる。３ＯＣ１２  ＨＳＬで処理されたＣＤ４  
Ｔ細胞では、ｃａｓｐａｓｅ  ８及びｃａｓｐａｓｅ  ３は、用量及び時間依存的に切断
された（図２ｄは、マウス、図３  ａ及びｂはヒトである）。ｃａｓｐａｓｅ阻害剤のう
ち、パンｃａｓｐａｓｅ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ、ｃａｓｐａｓｅ  ３阻害剤Ｚ−ＤＥＶＤ、及
びｃａｓｐａｓｅ  ８阻害剤Ｚ−ＩＥＴＤのみは、３ＯＣ１２  ＨＳＬ単独で処理した場
合と比較して、細胞傷害性を低下させ（図２ｅ）、このことから、細胞死はｃａｓｐａｓ
ｅ  ８／３経路の下流で生じることを示した。免疫沈降アッセイには、処理後に、ＦＡＤ
Ｄ（Ｆａｓ関連デスドメインタンパク質）がｃａｓｐａｓｅ  ８と複合体を形成したこと
が発見され、ｃａｓｐａｓｅ  ８が消化されるに従って、関連性が強くなった（図２ｆ及
び図４ａ）。ＦＡＤＤのドミナントネガティブバージョンも、３ＯＣ１２  ＨＳＬにより
誘導された細胞死（図４ｂ）とｃａｓｐａｓｅ  ３の切断（図４ｃ）を減少させ、このこ
とから、３ＯＣ１２  ＨＳＬの存在下では、アポトーシスの誘発が原形質膜に由来するこ
とが示されている。
【０１３２】
ｃａｓｐａｓｅ  ８の上流では、多面的ＴＮＦＲファミリーのメンバーが生存促進性ＮＦ
κｂの活性化を媒介するとともに、アポトーシスプログラミングを媒介する。実際には、
Ｃａｓｐ８−／−Ｒｉｐｋ３−／−マクロファージは、３ＯＣ１２  ＨＳＬを媒介した細
胞死に対してより耐性であり、且つＴｎｆｒｓｆ１ａ−／−脾細胞で表現型（図２ｇ）を
共有し、２〜８時間でこれらの差がより顕著になった（図５ａ）。これらの突然変異体に
おけるより弱いシグナル伝達は、ｃａｓｐａｓｅ  ８突然変異体及びＴＮＦＲ１における
ｃａｓｐａｓｅ  ３切断の減少によって確認された（図５ｂ）。本発明者は、３ＯＣ１２
ＨＳＬで処理された非アポトーシスＪｕｒｋａｔ細胞には、Ｉκｂαが分解されること
を見出した。それに比べて、同じ細胞株のＲｉｐｋ１−／−バージョンでは、Ｉκｂαが
完全に保持された（図６ａ及びｂ）。これらの結果から、３ＯＣ１２  ＨＳＬがＦＡＤＤ
を介してシグナルを伝達する表面構造を活性化し、細胞タイプに応じて、ＮＦκｂ活性化
では、ＲＩＰ１を介してシグナルを伝達し、又はアポトーシスでは、ｃａｓｐａｓｅ  ８
を介してシグナルを伝達することが示されている。これは、リガンド結合時のＴＮＦＲフ
ァミリーメンバーの典型的な挙動であり、本発明者による条件において明らかになかった
。
【０１３３】
本発明者は、増加した疎水性が、原形質膜に保持されるそれらの能力に関連するかどうか
を確認したかった。３ＯＣ１２  ＨＳＬを軽度のアポトーシス耐性Ｈ９細胞培養物に添加
し（図７ａ）、原形質膜を示差遠心分離で抽出した。炭素数６〜１４のアシル鎖を持つ類
似体をコントロールとして使用した。定量には、β−ガラクトシダーゼレポーターに基づ
く自己誘導物質検出用の洗練された超高感度システムを使用した（図７ａ）。同じ開始細
胞数の各画分で検出されたミラーユニットの百分率で測定したところ、原形質膜の画分で
は、３ＯＣ１２  ＨＳＬ及びＣ１２  ＨＳＬの含有量がより高く、細胞質ゾルでは含有量
がより低かった（図７ａ）。比較すると、この原形質膜の濃縮は、Ｃ６、Ｃ８、３−オキ
ソ−Ｃ８、Ｃ１０及びＣ１４類似体ほど明らかではなかった（図７ｂ）。３ＯＣ１２  Ｈ
ＳＬの場合、この分布モードは、経時的に変化することがなかった（図７ｃ）。細菌膜で
は、ＨＳＬに基づく自己誘導物質は、外部エンクロージャー２０を介して自由に拡散でき
る。３ＯＣ１２ＨＳＬを保持するために必要な真核膜成分を同定するために、ジオレオイ
ルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）及びジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰ
Ｃ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、コレステロール及びスフィンゴミエリ
ンの各々又はこれらの組み合わせとクロロホルムとの混合液をガラスディスク上にコーテ
ィングし、空気において乾燥させた。その後、このガラスディスクを３ＯＣ１２  ＨＳＬ
溶液で被覆した。洗浄後、対応するガラスディスクをＤＭＳＯで溶出した。図７ｄから明
らかなように、コレステロール、スフィンゴミエリン、及びＤＯＰＣを含む脂質成分のみ
が３ＯＣ１２  ＨＳＬを効率的に保持できた。さらに、コレステロールを除去するために
ＭβＣＤで処理されることにより秩序化脂質ドメインが破壊されたＨ９細胞では、保持が
著しく低下した（図７ｅ）。この結果から明らかなように、膜におけるＨＳＬ保持が側鎖
長と脂質ドメインの両方に依存しており、且つ、この膜の閉じ込め効果が、アポトーシス
誘導に必要な側鎖長を反映している（図２ｂ）。
【０１３４】
細胞死誘導性シグナル伝達複合体（ＤＩＳＣ）では、ＦＡＤＤは、ＴＮＦＲファミリーメ
ンバーと細胞内ｃａｓｐａｓｅ  ８の細胞質尾部領域とを橋渡しするためのアダプターで
ある。このシグナル伝達カスケードは、これらの受容体の三量化時に活性化されている。
一般に、ＴＮＦＲ１がリガンド結合時に秩序化脂質ドメインから出てアポトーシスシグナ
ルを発すると考えられ、それは、ＦａｓＬ結合後に脂質秩序化ドメイン内に移動するＦａ
ｓとは反対である。本発明者は、３ＯＣ１２  ＨＳＬの存在がＴＮＦＲ１及びＦａｓのオ
リゴマー化を変化させるかどうかを最初に研究した。架橋剤ＤＴＳＳＰの存在、及び非還
元の条件下で実行すると、３ＯＣ１２  ＨＳＬはＴＮＦＲ１単量体の分子量の約３倍でバ
ンドの量を急速に増加させた（図８ａ及び図９ａ）。しかし、長時間インキュベートした
後でも、Ｆａｓは有意な変化を示さなかった（図９ｂ）。ベースラインＴＮＦＲ１三量化
は、この受容体の一部がその細胞外三量化ドメインによって誘導される自発的な凝集を経
たという以前の報告と一致している。
【０１３５】
３ＯＣ１２  ＨＳＬが抽出条件を変更することによりＴＮＦＲ１の人工凝集を引き起こす
ことを除外するために、多段階蛍光消光（ＭＳＦＱ）アッセイを実行して、その膜上の天
然状態でＴＮＦＲ１を分析した（図８ｂ）。３ＯＣ１２  ＨＳＬの添加によりＴＮＦＲ１
依存的な細胞死を引き起こすため、ＤＤドメインを削除しその細胞質の末端にｅＧＦＰ又
はｍＣｈｅｒｒｙ配列を追加した突然変異体ＴＮＦＲ１をＨＥＬＡ細胞にトランスフェク
トした（図１０ａ）。適度な蛍光シグナルを持つトランスフェクタントが選択された（Ｍ
ＳＦＱ最適化のため、図１０ｂ）。３ＯＣ１２  ＨＳＬを添加することにより３ステップ
のクエンチモードの百分率が増加し、三量化が誘導されたことが確認された。統計分析か
ら明らかなように、１ステップの漂白周波数は、６０．０＋／−２．４％から４７．１％
＋／−１．９％（ｐ＜０．００１）に変化し、３ステップでは、７．１＋／−１．４％か
ら１７．０＋／−１．３％に増加した（ｐ＜０．００１）（図８ｃ）。この三量化もＴＮ
Ｆαの存在下で生じたが、３ＯＣ８  ＨＳＬ（非細胞死誘導類似体）のために増加するこ
とがなく、それは、３ＯＣ１２  ＨＳＬ処理によるリガンド結合同等性を確認した（図８
ｃ）。本発明者は、ヒト及びマウスのＴ細胞において、３ＯＣ１２  ＨＳＬの存在下では
、脂質ラフトに関連するＴＮＦＲ１（洗剤耐性ドメインの数で表される）が減少すること
を見出した（図１１）。
【０１３６】
ＴＮＦαのベースライン三量化をそのシグナル伝達の閾値設定物とすることが提案されて
おり、これは、ＣＲＤ１ドメインに関連する特徴である。ただし、リガンドによって誘導
される三量化は、隣接するＣＲＤ２によって媒介される。３ＯＣ１２  ＨＳＬを媒介した
三量化がこれらのドメインのいずれかを必要とするかどうかを判断するため、ＣＲＤ１（
ＫＹ４８／４９ＡＡ及びＫ６１Ａ）及びＣＲＤ２（Ｅ８５Ａ及びＮ９４Ａ）における重要
な残基を突然変異し（図１２ａ）、且つＭＳＦＱを実行してそれらの関連性を判定する。
興味深いことに、３ＯＣ１２  ＨＳＬ（図１２ｂ）に関連する多量化に対しては、これら
の４つの突然変異体のいずれも単独で必須ではなかった。ＣＲＤ１全体が削除された場合
にのみ、３ＯＣ１２  ＨＳＬ処理による影響はわずかになった（図１２ｂ）。
【０１３７】
大きな脂質ラフトは、膜脂質２６からの抽出物で再構築できる。３ＯＣ１２ＨＳＬの存在
下でこれらのドメインの形態を研究した。ガラス基板において、水相下で秩序化脂質ドメ
イン（原子間力顕微鏡の走査モードで周囲の細胞膜よりも少なくとも１ｎｍ高いことを決
定する）が安定している（図８ｄ）。３ＯＣ１２  ＨＳＬは、これらのドメインの外観を
劇的に変化させ、隆起した平野が明確に溶解した（図８ｄ）。この溶解は、ドメインの中
心から始まり、多孔性構造が経時的に増加した（図８ｅ）。逆には、ＤＯＰＣとＤＰＰＧ
の混合物で形成された、脂質ラフトとは無関係のより小さなドメインへの影響は最小であ
り（図１３ａ）、それは、３ＯＣ１２  ＨＳＬがコレステロールとスフィンゴ脂質の存在
下で形成されたドメインを特異的に標的とすることを示している。
【０１３８】
近年、新しい提案は、脂質無秩序相が皮質細胞骨格とさらに絡み合って、秩序化ドメイン
を閉じ込めるための物理的バリアを形成することを示唆している。このモデルは、ＳＴＥ
Ｄに基づくイメージング技術３０により実験的に検証された。この制約下の膜貫通タンパ
ク質が示す運動軌跡については、単純、定方向、静的及び強制のモードが特徴付けられる
。３ＯＣ１２  ＨＳＬを媒介したドメインが破壊された場合のＴＮＦＲ１の運動モードを
決定するために、細胞外ＴＮＦＲ１特異的抗体をパパインで消化して、Ｆａｂフラグメン
トを生成し、受容体の架橋を回避した。発光波長６０５ｎｍのストレプトアビジン結合量
子ドットと精製Ｆａｂを融合した。一連の映像からＴＮＦＲ１運動モードを誘導した。各
レベルの運動軌跡は、平均二乗分布（ＭＳＤ）分析に供した（図１３ｂ）。得られた４つ
のモードは、予想どおりであった（図８ｆ）。３ＯＣ１２  ＨＳＬの存在下では、ＴＮＦ
Ｒ１は、単純な運動モードに入る可能性が高く、一方、強制モードと静的モードがその分
減少する（図８ｆ）。したがって、拡散係数も大幅に増加し（図８ｇ）、それは、「ドメ
インレス」原形質膜ではＴＮＦＲ１の拡散性がより高いことを示している。処理された原
形質膜では、各ＴＮＲＦ１は、高いｘ−ｙ表面積被覆率を示した（図８ｈ）。本発明者は
、このより高い拡散性をＭβＣＤで近似することを試みた（図８ｄの最後の行）。予想ど
おり、ＭβＣＤ処理は、３ＯＣ１２  ＨＳＬの本質を定性的に再現し、ＴＮＦＲ１により
高い拡散係数とより大きな面積被覆率を付与した（図１４ａ及びｂ）。
【０１３９】
ＨＳＬは、細菌集団活動３３を介した病原性因子と見なされた。本発明者の結果は、３Ｏ
Ｃ１２  ＨＳＬに対する明確な宿主応答を提案しており、本発明者は、その病原性が免疫
抑制を介して宿主防御を低下させることによってさらに解釈できるかどうかを確認したか
った。本発明者は、野生型（ＰＡＯ１）、ＬａｓＩ欠損型（ΔＬａｓＩ）及びＬａｓＲ欠
損型（ΔＬａｓＲ）のＰＡ培養物の上清を用いて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから好中球を培
養した。図１５ａに示すように、２種のＬａｓ回路欠損型のいずれも、細胞損失の有意な
減少を引き起こした。この結果をさらに確認するために、本発明者は、ＰＡＯ１、及びΔ
ＬａｓＩ及びΔＬａｓＲ  ＰＡを気管内でＣ５７ＢＬ／６マウスに接種した。突然変異に
より感染させたマウスからの肺抽出物には、ＰＡ  ＣＦＵの減少を示した（図１５ｂ）。
その結果から明らかなように、３ＯＣ１２  ＨＳＬは、宿主自身のＴＮＦＲ１経路を使用
して宿主の免疫応答を直接抑制する病原性因子であった。ＱＳ自体におけるその役割から
この可能性を分離するために、ＣＤ４５．１（野生型）とＣＤ４５．２（野生型又はＣａ
ｓｐ８−／−又はＴｎｆｒｓｆ１ａ−／−）とから作成されるハイブリッド骨髄細胞を用
いて、γ線で照射されたＣＤ４５．２  Ｃ５７ＢＬ／６マウスを再構築し、且つＰＡＯ１
株で受容体をチャレンジした。図１５ｃは、Ｃａｓｐ８−／−及びＴｎｆｒｓｆ１ａ−／
−好中球が野生型好中球よりも３ＯＣ１２  ＨＳＬ誘導アポトーシスに対して高い耐性を
示すことを示している。したがって、肺抽出物中のＣＦＵによって測定されたように（図
１５ｄ）、突然変異受容体は、より良い感染クリアランスを示した。図１５ｅ及びｆは、
これらのマウスにおける３ＯＣ１２  ＨＳＬを媒介したアポトーシスの欠如が好中球浸潤
及びＴＮＦαとＩＬ−１βの産生を有意に減少させたことを示し、より効率的な応答を示
している。ＬａｓＩ欠損型ＰＡ菌株の接種では、野生型とＣａｓｐ８−／−又はＴｎｆｒ
ｓｆ１ａ−／−骨髄再建マウスにおいて好中球数にほとんど差がなく（図１６ａ）、且つ
ＰＡ  ＣＦＵ数の差は、ＰＡＯ１接種の場合と比較して、小さくなり（図１６ｂ）、イン
ビボＴＮＦＲ１経路の３ＯＣ１２  ＨＳＬによる特異的標的化を強化させた。
【０１４０】
進行中の結果は、哺乳動物の原形質膜において３ＯＣ１２  ＨＳＬの混合がＴＮＦＲ１シ
グナル伝達に対して顕著な効果をもたらすことを示している。３ＯＣ１２  ＨＳＬが、特
にＴＮＦＲ１陰性細胞又は優先的な生存促進性シグナル伝達を有する細胞において、処理
された原形質膜の他の表面受容体の挙動を調節できるかどうかという問題が生じた。本発
明者は、まず、内因性細胞質ＩＴＡＭドメイン３４を有する低親和性Ｆｃγ受容体である
ヒトＦｃγＲＩＩａを分析した。ＦｃγＲＩＩａでトランスフェクトしたＣｏｓ−１細胞
において、量子ドットに基づく単一粒子追跡を行った。その結果、３ＯＣ１２  ＨＳＬで
処理された後、単純運動モード及び定方向運動モードのＦｃγＲＩＩａの百分率がより高
くなり、一方、静的モードでのＦｃγＲＩＩａの百分率が低下した（図１５ｇ）。３ＯＣ
１２  ＨＳＬが存在した場合にも、該受容体は、より高い拡散係数（０．１０５６＋／−
０．００６ｖｓ０．１５６４  ＋／−０．００６、ｐ＜０．００１）を示し、且つその運
動軌道でカバーされる面積がより大きくなった（０．６４６７＋／−０．０４２  ｖｓ  
０．９３１０＋／−０．０４５、１０ｐ＜０．００１）（図１５ｈ）。ＦｃγＲシグナル
伝達も膜ドメイン結合によって調節されるため、本発明者は、細胞への付着が類似してい
るが、３ＯＣ１２  ＨＳＬが抗体コーティングラテックスビーズの食作用を低減させたが
（４．６＋／−０．３％  ｖｓ  ２．６＋／−０．２％、ｐ＜０．００１）、これらの細
胞へのビーズの付着が影響を受けなかったことを見出した（図１５ｉ）。ＥＧＦＲ（シグ
ナル伝達が脂質ドメイン結合３５に依存する非免疫膜受容体）の場合、ＭＳＦＱを実行し
て、３ＯＣ１２  ＨＳＬがその二量化の基本周波数を変更したかどうかを判断した。図１
５ｊから明らかなように、担体処理と比較して、３ＯＣ１２  ＨＳＬは二量化を増加させ
た。その結果、リガンドの非存在下では、ＥＧＦＲリン酸化が検出可能になった（図１５
ｋ）。要するに、これらのデータは、原形質膜における３ＯＣ１２  ＨＳＬの単純な存在
により宿主細胞の表面受容体のシグナル伝達が一般的に破壊される（ｇｅｎｅｒｉｃ  ｄ
ｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）ことを示している。
【０１４１】
ＴＮＦＲ１−ＦＡＤＤ−ｃａｓｐａｓｅ８−ｃａｓｐａｓｅ３経路阻害剤が臨床的に３Ｏ
Ｃ１２−ＨＳＬによって引き起こされる免疫細胞アポトーシスをブロックできることを検
証するために、本発明者は、臨床版のｃａｓｐａｓｅ阻害剤であるＥｍｒｉｃａｓａｎを
用いて試験した。標準のＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ及びＰＩ染色実験を通じて、本発明者は、驚
くべきことに、ｃａｓｐａｓｅ阻害剤の臨床版であるＥｍｒｉｃａｓａｎがマウス脾細胞
及びヒトＴＨＰ−１細胞株における３ＯＣ１２−ＨＳＬのアポトーシスのブロックにおい
て優れた効果を発揮することを見出した。結果を図１７ａ〜図１７ｆに示した。ここで、
図１７ａは、ＴＨＰ−１細胞株におけるアポトーシス染色のフローサイトメトリー分析を
示している。具体的には、１２穴プレートにおいてＴＨＰ−１細胞を指定濃度の３ＯＣ及
びＥｍｒｉｃａｓａｎと一緒に培養した。１時間後、細胞膜を収集してＡｎｎｅｘｉｎ  
Ｖ及びＰＩのフローサイトメトリー分析に供した。図１７ａは、Ｅｍｒｉｃａｓａｎがヒ
トＴＨＰ−１細胞株における３ＯＣ１２−ＨＳＬのアポトーシスのブロックにおいて優れ
た効果を発揮することを示している。図１７ｂは、図１７ａのアポトーシス染色のフロー
サイトメトリー分析の統計結果を示している。図１７ｂでは、異なる処理での生細胞の百
分率がフローサイトメトリーによってカウントされた。生細胞の百分率の棒グラフは、平
均±ＳＥＭで表された。次に、図１７ａ及び図１７ｂのようにサンプルを調製し、ｃａｓ
ｐａｓｅ  ８及びｃａｓｐａｓｅ  ３の活性化（切断）のＷＢ分析に供した。結果を図１
７ｃに示した。図１７ｃでは、左パネルのインキュベート時間は、１時間、左パネルは２
時間であった。Ｃａｓｐ  ８は、Ｃａｓｐａｓｅ  ８、Ｃｌｄ  Ｃａｓｐ  ８は、切断Ｃ
ａｓｐａｓｅ  ８、Ｃａｓｐ  ３は、Ｃａｓｐａｓｅ  ３、Ｃｌｄ  Ｃａｓｐ  ３は、切
断Ｃａｓｐａｓｅ  ３）を示した。図１７ｃは、ヒトＴＨＰ−１細胞株において、Ｅｍｒ
ｉｃａｓａｎが、ｃａｓｐａｓｅを媒介した３ＯＣ１２−ＨＳＬのアポトーシスをブロッ
クする効果を有することを示している。さらに、本発明者は、Ｂ６脾細胞（Ｃ５７ＢＬ／
６脾臓から分離）を使用して試験した。結果を図１７ｄ〜図１７ｆに示した。図１７ｄ〜
図１７ｆは、Ｅｍｒｉｃａｓａｎ  がＢ６脾細胞の３ＯＣ１２−ＨＳＬによるアポトーシ
スのブロックにも良い効果を有することを示している。
【０１４２】
Ｘボックス結合タンパク質１、ＰＰＡＲβ／δ及びＰＰＡＲγが３ＯＣ１２  ＨＳＬに対
してより高活性であることが提案されてきた。二次シグナル伝達イベントである可能性が
高く、これらの分子が自己誘導物質の直接の標的として機能することは、知られていない
。この報告では、本発明者は、該細菌代謝産物の感知が膜の乱れによるものであり、した
がって、哺乳動物の細胞表面を広く変化させ、一部の細胞ではアポトーシスが最も視認可
能な結果であることを示している。
【０１４３】
原核系と真核系の分割は、いくつかの普遍的な特徴によって定義されている。真核細胞は
、膜ドメインが細菌界に存在しないスフィンゴ脂質とコレステロールのミニチュア結晶の
ような凝集体によって支持される特徴を有する。さらに、動的脂質ドメインは、底層の皮
質細胞骨格への長鎖リン脂質の付着によって制約されるピケットフェンスのような配置を
形成する。受容体とこれらのドメインとの動的な結合は、これらの分子を介して送信され
る信号を制御する調節メカニズムである。この特徴により真核細胞膜が脂質ドメインの破
壊に対して特に高感度になり、細菌膜とは対照的に、細菌膜には、２つのＳｉｎｇｅｒ−
Ｎｉｃｏｌｓｏｎ二重層（コレステロールなどのステロールが欠如したことを特徴とする
）に挟まれた比較的固定されたペプチドグリカンベースの細胞壁を持つ。
【０１４４】
この研究のもう１つの驚くべき発見は、ＰＡが３ＯＣ１２  ＨＳＬを使用して宿主自身の
ＴＮＦＲ１シグナルを直接トリガーすることにより免疫機能を解除し、それにより早期に
応答する好中球のアポトーシスを引き起こし、細菌の生存に寄与することである。この結
果は、宿主細胞防御におけるシグナル伝達に直接関連する、自己誘導物質の免疫調節メカ
ニズムを開示した。細菌の自己誘導物質がこれまで知られていなかったインターキングダ
ム通信方法を使用して宿主の先天性免疫を調節するという発見及び開示は、新しい先天性
感知機構、及びシュードモナス感染を臨床的に制御するための定義可能な標的に関する重
要な思考を提供した。
【０１４５】
本明細書全体を通じて、「実施形態」、「いくつかの実施形態」、「一実施形態」、「別
の実施例」、「実施例」、「特定の実施例」又は「いくつかの実施例」という用語は、こ
の実施形態及び例を参照しながら説明する特定の特徴、構造、材料又は特性が、本発明の
少なくとも１つの実施形態又は実施例に含まれることを意味する。したがって、「一部の
実施形態では」、「一実施形態では」、「実施形態では」、「別の実施例では」、「実施
例では」、「特定の実施例では」、又は「いくつかの実施例では」のようなフレーズが本
明細書における様々な場所に記載される場合、必ずしも同じ実施形態又は実施例に関する
わけではない。且つ、特定の特徴、構造、材料、又は特性は、１つ以上の実施形態又は例
において任意の適切な方法で組み合わせることができる。
【０１４６】
本発明の実施形態を示して説明したが、当業者であれば、上記実施形態が本発明を限定す
るものと解釈されることができず、本発明の精神、原理及び範囲から逸脱せずに実施形態
について変化、置換及び修正を行えることを理解できる。
【図１−１】
0006963164.tif 000002
【図１−２】
0006963164.tif 000003
【図２ａ−１】
0006963164.tif 000004
【図２ａ−２】
0006963164.tif 000005
【図２ｂ】
0006963164.tif 000006
【図２ｃ】
0006963164.tif 000007
【図２ｄ−１】
0006963164.tif 000008
【図２ｄ−２】
0006963164.tif 000009
【図２ｅ】
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【図２ｆ】
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【図２ｇ】
0006963164.tif 000012
【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
0006963164.tif 000018
【図６−２】
0006963164.tif 000019
【図７ａ】
0006963164.tif 000020
【図７ｂ】
0006963164.tif 000021
【図７ｃ】
0006963164.tif 000022
【図７ｄ】
0006963164.tif 000023
【図７ｅ】
0006963164.tif 000024
【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図８ｄ】
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【図８ｅ】
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【図８ｆ】
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【図８ｇ】
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【図８ｈ】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１４ａ−１】
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【図１４ａ−２】
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【図１４ａ−３】
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【図１４ｂ−１】
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【図１４ｂ−２】
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【図１４ｂ−３】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１５ｃ】
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【図１５ｄ】
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【図１５ｅ】
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【図１５ｆ】
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【図１５ｇ】
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【図１５ｈ】
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【図１５ｉ】
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【図１５ｊ】
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【図１５ｋ】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１７ｃ】
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【図１７ｄ】
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【図１７ｅ】
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【図１７ｆ】
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