(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍を治療および／または予防する薬物の調製におけるカリマイシンまたはその薬学的に許容可能な塩の使用であって、前記カリマイシンは主要な活性成分としてイソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩおよびイソバレリルスピラマイシンＩＩＩを含み、イソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩおよびイソバレリルスピラマイシンＩＩＩの総量は６０％以上であり、前記腫瘍は、乳腺癌、肝癌、肺癌、腎癌、脳腫瘍、子宮頸癌、前立腺癌、膵臓腺癌、食道癌、胃癌、結腸癌、リンパ腫または白血病を含む、使用。
【請求項２】
前記脳腫瘍が神経膠腫または髄膜腫であり、前記胃癌が胃腺癌であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記薬物が、カリマイシンおよびその薬学的に許容可能な塩、ならびに薬学的に許容可能な添加剤で作製した各種剤形であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記薬物が、カリマイシンおよびその薬学的に許容可能な塩、抗腫瘍薬、ならびに薬学的に許容可能な添加剤で作製した各種剤形であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
前記薬物が、カリマイシンおよびその薬学的に許容可能な塩を含む第１薬剤と、抗腫瘍薬を含む第２薬剤との組合せであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
前記抗腫瘍薬が、化学療法、放射線療法、標的療法および／または免疫療法薬であることを特徴とする、請求項４または５に記載の使用。
【請求項７】
前記薬物の用量が５〜１５００ｍｇであることを特徴とする、請求項３または４に記載の使用。
【請求項８】
前記薬物の用量が５０〜１０００ｍｇであることを特徴とする、請求項３または４に記載の使用。
【請求項９】
前記薬物の用量が１００〜４００ｍｇであることを特徴とする、請求項３または４に記載の使用。
【請求項１０】
前記第１薬剤の用量が５〜１５００ｍｇであることを特徴とする、請求項５に記載の使用。
【請求項１１】
前記第１薬剤の用量が５０〜１０００ｍｇであることを特徴とする、請求項５に記載の使用。
【請求項１２】
前記第１薬剤の用量が１００〜４００ｍｇであることを特徴とする、請求項５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は薬物の応用分野に属し、具体的に、腫瘍を治療および／または予防する薬物の調製におけるカリマイシンおよびその薬学的に許容可能な塩の応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍はよく見られ、多発している疾患であり、内外の各種発癌性因子の長期的作用下で、人体の組織細胞に遺伝子の突然変異が生じて、その成長および分化に対する正常な制御を失い、クローン性異常増殖および分化が生じて形成される新生物または病的増殖物である。腫瘍は良性腫瘍および悪性腫瘍に分けられ、悪性腫瘍はさらに上皮組織由来の癌、間葉組織由来の肉腫および癌肉腫の３種に細分される。通常、人々が言う「癌」は、一般的にすべての悪性腫瘍を指す。
【０００３】
悪性腫瘍は人々の健康を脅かす主要な悪性疾患の１つであり、現在、全世界で死因第１位である。最新データでは、２００７年、全世界で総死亡数の１３％を占める約７９０万人が各種癌で亡くなり、１２００万を超える腫瘍症例が診断され、このうち７２％以上の腫瘍患者および致死症例はいずれも発展途上国で発生しており、上昇し続ける傾向を呈している。２０１５年、全世界の腫瘍による致死数は９００万人まで増加し、２０３０年に１２００万人を超えると推定される。現在、中国では毎年癌発症数が約２８０万で、死亡数は４０万人を超え、中国の各種疾病による致死原因の１位となっており、さらに上昇し続ける傾向を呈している。社会の生活リズムが速くなるのに伴い、競争のストレスは増大し、さらに人々の生活方式および環境の変化により、腫瘍発症率および死亡数は年々増加し、すでに現代社会でよく見られ、発症率が高い疾患となっている。患者の生活の質に深刻な影響を及ぼすだけでなく、家庭および社会に重い経済的および精神的負担をもたらし、さらに全世界を悩ます重大な社会問題でもあり、癌の治療および予防は一貫して全世界で最も切実な問題の１つである。現在、化学療法は腫瘍に抵抗する主要な手段であり、比較的良好な治療効果を有するが、たびたび骨髄抑制、免疫機能低下などの副作用を引き起こし、患者は治療を続けることが難しく、さらに化学療法薬に治療過程で出現する薬剤耐性は、現在、すでに臨床治療における難題の１つとなっている。近年、全世界の抗腫瘍薬市場は急速に成長しており、米国ＦＤＡの統計データに基づくと、全世界の抗癌剤市場の売上総額は２００４年の２４０億米ドルから、２００７年の３９６億米ドルに激増している。世界で毎年新規の抗腫瘍薬が発売されているが、現在でも依然として癌に打ち勝つ有効な手段はない。同時に、新しい癌の種類が絶えず発見され、さらに腫瘍の薬剤抵抗性／薬剤耐性の発生および増強により、新規の効果的な抗癌剤を発見する必要性は、明らかに差し迫っている。
【０００４】
カリマイシン（Ｃａｒｒｉｍｙｃｉｎ）は、遺伝子組み換え技術によりカルボマイシン産生菌の４’’イソバレリルトランスフェラーゼ遺伝子（４’’−ｏ−ａｃｙｌ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）をスピラマイシン産生菌中にクローニングし、スピラマイシンの４’’−ＯＨを一定方向でアシル化し、４’’位にイソバレリル基側鎖を付加して形成される、４’’イソバレリルスピラマイシンを主要成分とした新規の抗生物質である。
【０００５】
カリマイシンは、数種のスピラマイシン誘導体からなり、主要な活性成分のイソバレリルスピラマイシン（Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ）の総含量は６０％以上であり、薬学的に許容可能な薬物組成物である。中心構造は１６員環ラクトン環で、１分子のホロサミン、１分子のミカミノースおよび１分子のミカロースと接続してなる。その主要成分のイソバレリルスピラマイシンＩ、ＩＩ、ＩＩＩが、スピラマイシンの構造と異なる部分は、ミカロースの４’’位に接続するのがイソバレリル基であり、ヒドロキシ基でないことである。該薬は、瀋陽同聯などが１．１類新薬に共同で申請している。
【０００６】
カリマイシンの主成分の化学構造は、式（１）に示す通りである。
【０００７】
【化１】
0006959355.tif 000002
【０００８】
式中、Ｒ＝Ｈ、Ｒ’＝ＣＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２のとき、イソバレリルスピラマイシンＩである。
【０００９】
Ｒ＝ＣＯＣＨ３、Ｒ’＝ＣＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２のとき、イソバレリルスピラマイシンＩＩである。
【００１０】
Ｒ＝ＣＯＣＨ２ＣＨ３、Ｒ’＝ＣＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２のとき、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩである。
【００１１】
カリマイシンは１６員環マクロライド系抗生物質に属し、活性基のカルボキシル基、アルコキシ基、エポキシ基、ケトン基およびアルデヒド基、ならびに１対の共役したＣ＝Ｃを有し、分子量は約８８４〜９８２である。似た化学構造を有するため、カリマイシンおよびマクロライド系抗生物質は多くの共通性を有する。つまり、エステル類、アセトン、クロロホルム、アルコール類など多くの有機溶媒に易溶であり、石油エーテルに微溶であり、水に難溶である。分子構造中に２つのジメチルアミン基を含んで弱アルカリ性を呈し、酸性水溶液に易溶である。溶解度が温度の上昇に伴って低下する「負の溶解性」の性質を有する。カリマイシンの主要成分であるイソバレリルスピラマイシンの４’’位の炭素鎖は比較的長く、親水性が劣るため、水への溶解度はスピラマイシンおよび４’’−アセチルスピラマイシンより低い。
【００１２】
カリマイシンは白色の非結晶粉末であり、吸湿性を少し有し、比旋光度は約−８０．８°、紫外線の最大吸収波長は２３１〜２３２ｎｍである。それ自体に弱い蛍光発色基を持ち、濃硫酸または塩酸で紫色を呈し、強い紫色の蛍光を示す。２３１〜２３２ｎｍ部分に最大吸光度を有する。
【００１３】
該薬は親油性が良好で、組織浸透力が高く、内服吸収が速く、体内維持時間が長く、持続的な抗生物質持続効果を有する。薬効および化学的立体配座の関係に基づくと、マクロライド系抗生物質の４’’位をアシル化すると、その親油性および体内活性が上昇し、体内の抗菌活性および臨床治療効果は顕著に上昇する。さらに抗生物質の体内における安定性は、４’’ヒドロキシエステルの炭素鎖の伸長に伴って高くなり、すなわちイソバレリルスピラマイシン＞ブチリルスピラマイシン＞プロピオニルスピラマイシン＞アセチルスピラマイシンである。
【００１４】
予備的な体内外での薬力学試験は、該薬が多くのＧ陽性菌に対して比較的良好な抗菌活性を有するだけでなく、一部のＧ陰性菌にも一定の作用を有することを明確に示す。各技術指標はアジスロマイシン、エリスロマイシン、アセチルスピラマイシン、ミデカマイシンより明らかに優れており、特に肺炎マイコプラズマに対する抗菌活性が最も高い。エリスロマイシン耐性菌、淋菌、肺炎球菌、黄色ブドウ球菌、緑膿菌、インフルエンザ菌、インフルエンザ菌、バクテロイデスフラジリス、レジオネラ菌、不活性の桿菌およびウェルシュ菌に対しても一定の抗菌活性を有し、臨床のエリスロマイシン耐性黄色ブドウ球菌に対してわずかな交差耐性を有する。カリマイシンは、主にグラム陽性菌感染症、特に上気道感染症の治療に用いられ、泌尿器系の感染などに用いられ得る。
【００１５】
本出願人は最近の一研究において、ヒト乳腺癌細胞ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ヒト肝癌細胞ＨｅｐＧ２またはマウス肝癌細胞Ｈ２２、ヒト非小細胞肺癌細胞Ａ５４９、Ｌｅｗｉｓ肺癌細胞、ヒト大細胞肺癌細胞Ｈ４６０およびＨ１２９９、ヒト腎淡明細胞癌細胞７８６−Ｏ、ヒト腎細胞癌細胞７６９−Ｐ、ヒト神経膠腫細胞Ｕ２５１、ヒト神経膠芽腫細胞Ａ１７２、ヒト組織リンパ腫細胞Ｕ９３７、ヒト子宮頸癌細胞ＨｅＬａ、ヒト前立腺癌細胞ＰＣ３、ヒト膵臓腺癌細胞ＰＡＮＣ−１、ヒト食道癌細胞ＴＥ−１、ヒト胃腺癌細胞ＳＧＣ７９０１、ヒト結腸癌細胞ＨＴ−２９、ヒト前骨髄球性白血病細胞ＨＬ−６０を用いて、カリマイシンに対して行った体外での増殖抑制活性評価で、試料は測定した細胞に対して、いずれも良好な増殖抑制活性を示すことを発見した。カリマイシンが腫瘍治療の新しい薬物となる可能性があることを明確に示し、これにより本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の目的は、腫瘍を治療および／または予防する薬物の調製におけるカリマイシンおよびその薬学的に許容可能な塩の応用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記目的を実現するため、本発明は以下の技術案を採用する。
【００１８】
本発明は、腫瘍を治療および／または予防する薬物の調製におけるカリマイシンおよびその薬学的に許容可能な塩の応用に関する。
【００１９】
本発明において、前記腫瘍は固形腫瘍および非固形腫瘍を含む。
【００２０】
具体的に、前記固形腫瘍は良性固形腫瘍および悪性固形腫瘍を含む。
【００２１】
前記非固形腫瘍は、リンパ腫または白血病である。
【００２２】
さらに、前記悪性固形腫瘍は、乳腺癌、肝癌、肺癌、腎癌、脳腫瘍、子宮頸癌、前立腺癌、膵臓腺癌、食道癌、胃癌、結腸癌である。
【００２３】
前記脳腫瘍は神経膠腫または髄膜腫であり、前記胃癌は胃腺癌である。
【００２４】
本発明において、前記薬物は、カリマイシンおよびその薬学的に許容可能な塩、ならびに薬学的に許容可能な添加剤で作製した各種剤形でよい。
【００２５】
本発明において、前記薬物は、カリマイシンおよびその薬学的に許容可能な塩、抗腫瘍薬、ならびに薬学的に許容可能な添加剤で作製した各種剤形でもよい。
【００２６】
本発明において、カリマイシンおよびその薬学的に許容可能な塩、ならびに既存技術におけるオキサリプラチンなどの抗腫瘍薬を用いて、薬学的に許容可能な添加剤と共に各種配合剤を作製することができる。
【００２７】
本発明において、前記薬物は、カリマイシンおよびその薬学的に許容可能な塩を含む第１薬剤と、抗腫瘍薬を含む第２薬剤との組合せでもよい。
【００２８】
本発明において、前記抗腫瘍薬は既存技術で既知の抗腫瘍薬であり、腫瘍を治療するとき、カリマイシンおよびその薬学的に許容可能な塩を含む第１薬剤を、これらの抗腫瘍薬と共に応用することができる。腫瘍を共に治療するとき、先にカリマイシンおよびその薬学的に許容可能な塩を含む第１薬剤を使用することも、先に既存技術で既知の抗腫瘍薬を含む第２薬剤を使用することも、両者を同時に使用することもできる。
【００２９】
本発明において、前記抗腫瘍薬は、化学療法、放射線療法、標的療法および／または免疫療法薬である。
【００３０】
本発明は、カリマイシンおよびその薬学的に許容可能な塩を含む第１薬剤が、肺癌、肝癌、子宮頸癌などを含む数種の癌に対して良好な治療作用を有し、カリマイシンおよびその薬学的に許容可能な塩を含む第１薬剤を、シクロホフファミド、クロラムブシル、ニトロカファン、ロムスチン、チオテパ、ブスルファン、シスプラチンなどの既存技術で既知の抗腫瘍薬と共に使用すると、相乗効果を生むことができ、腫瘍患者はより良好な治療効果を有することを明確に示す。
【００３１】
悪性腫瘍患者は、放射線、化学療法、手術、免疫剤による治療を繰り返し受けるため、各種侵襲的操作および抗腫瘍薬などの多重の打撃を受け、身体の免疫力全体が低下し、院内感染の高リスク群となり、各種感染が極めて容易に生じる。分析により、腫瘍患者の院内感染発生率が病院全体の同時期における退院患者の院内感染率より明らかに高く、腫瘍患者の院内感染を誘発する危険因子は主に高齢、長期入院、侵襲的操作および放射線、化学療法などであり、このうち放射線、化学療法は腫瘍患者の免疫力を損なう重要な特殊因子であることを発見した。老齢患者の人体は、組織、臓器の退行性変化のため、人体の免疫防御機能が低下し、抵抗力が劣り、数種の基礎疾患と共に、比較的容易に院内感染が発生する。入院期間および院内感染の相互の因果関係については、入院期間の延長に伴い、感染機会が増加する。
【００３２】
すべての感染のうち、呼吸器感染症を合併することが最も多く、次が皮膚感染、消化管感染および尿路感染であり、血行感染は比較的少ないが、比較的危険であり、死亡率が高い。腫瘍発生部位および感染率の関係について、肺部、胃部および血液腫瘍の発症率は高いが、感染率は最高とは言えず、２０％前後である。膵臓、食道、肝胆道、耳鼻咽喉などの腫瘍は、患者は比較的少ないが、感染率は比較的高く、４０％以上を占める。乳腺癌、甲状腺などはいずれも１０％前後である。感染率が最も低いのは、泌尿器系腫瘍であり、５％前後しかない。
【００３３】
感染の病原菌は、主にグラム陰性菌感染（４５〜５５％前後）および真菌類（３０％以上）感染を主とし（咽頭スワブ、痰標本などを主な標本とした結果）、グラム陰性菌は、大腸菌、肺炎桿菌、緑膿菌およびアシネトバクターバウマニを主とする。一部の真菌は、院内感染の第一位にさえなっている。悪性腫瘍自体が消耗性疾患であり、これに加えて放射線、化学療法および侵襲的操作が骨髄造血機能を抑制するため、人体の単核性食細胞系の防御能力を弱め、人体の免疫学的障壁が破壊される可能性がある。他に、広域スペクトル抗菌薬、免疫抑制剤の大量使用は、人体のタンパク代謝に影響を及ぼし、さらには肝腎および骨髄などの組織機能を害し、真菌が宿主の防御を回避または妨害するのを可能とするため、これらは悪性腫瘍患者に真菌などの感染を引き起こす重要な原因である。
【００３４】
本発明のカリマイシンは優れた抗感染効果を有し、患者を感染から守るのに有利であり、人体の免疫機能を回復させる。これにより本発明のカリマイシンを抗腫瘍薬と共に使用したとき、より良好な治療効果を達成する。
【００３５】
本発明において、カリマイシンおよびその薬学的に許容可能な塩を含む第１薬剤は、カリマイシンおよび薬学的に許容可能な添加剤を用いて、薬学的に許容可能な剤形、例えば錠剤、カプセル、腸溶性製剤、注射剤などを作製したものである。
【００３６】
用いる添加剤および各剤形の調製方法は、既存技術を参照して行うことができる。
【００３７】
さらに、前記薬物の用量は５〜１５００ｍｇ；好ましくは５０〜１０００ｍｇ；より好ましくは１００〜４００ｍｇである。
【００３８】
あるいは、前記第１薬剤の用量は５〜１５００ｍｇ、好ましくは５０〜１０００ｍｇ、より好ましくは１００〜４００ｍｇである。
【００３９】
本発明は、試験により、カリマイシンおよびその薬学的に許容可能な塩が、ヒト乳腺癌細胞ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ヒト肝癌細胞ＨｅｐＧ２またはマウス肝癌細胞Ｈ２２、ヒト非小細胞肺癌細胞Ａ５４９、ヒト大細胞肺癌細胞Ｈ４６０およびＨ１２９９、ヒト腎淡明細胞癌細胞７８６−Ｏ、ヒト腎細胞癌細胞７６９−Ｐ、ヒト神経膠腫細胞Ｕ２５１、ヒト神経膠芽腫細胞Ａ１７２、ヒト組織リンパ腫細胞Ｕ９３７、ヒト子宮頸癌細胞ＨｅＬａ、ヒト前立腺癌細胞ＰＣ３、ヒト膵臓腺癌細胞ＰＡＮＣ−１、ヒト食道癌細胞ＴＥ−１、ヒト胃腺癌細胞ＳＧＣ７９０１、ヒト結腸癌細胞ＨＴ−２９、ヒト前骨髄球性白血病細胞ＨＴ−６０に対して、良好な増殖抑制活性を示すことを明確に示す。これにより、これらの細胞が引き起こす腫瘍または癌疾患の治療に、カリマイシンを用いることができることを実証している。
【００４０】
本発明は、さらに体内試験により、カリマイシンおよびその薬学的に許容可能な塩が、ヒト乳腺癌細胞ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ヒト肝癌細胞ＨｅｐＧ２またはマウス肝癌細胞Ｈ２２、ヒト非小細胞肺癌細胞Ａ５４９、ヒト大細胞肺癌細胞Ｈ４６０およびＨ１２９９、ヒト腎淡明細胞癌細胞７８６−Ｏ、ヒト腎細胞癌細胞７６９−Ｐ、ヒト神経膠腫細胞Ｕ２５１、ヒト神経膠芽腫細胞Ａ１７２、ヒト組織リンパ腫細胞Ｕ９３７、ヒト子宮頸癌細胞ＨｅＬａ、ヒト前立腺癌細胞ＰＣ３、ヒト膵臓腺癌細胞ＰＡＮＣ−１、ヒト食道癌細胞ＴＥ−１、ヒト胃腺癌細胞ＳＧＣ７９０１、ヒト結腸癌細胞ＨＴ−２９、ヒト前骨髄球性白血病細胞ＨＴ−６０の成長に対して、顕著な抑制作用を有することを明確に示す。
【００４１】
同時に、各種腫瘍または癌を患う数名の患者に試用し、カリマイシンおよびその薬学的に許容可能な塩が、肺癌、子宮頸癌、子宮癌など数種の腫瘍または癌に対して、比較的良好な治療効果を有することを明確に示す。
【００４２】
本発明において、前記薬物を、本分野で通常の方法を採用して、薬学的に許容可能な各種剤形、例えば錠剤、カプセルなどに調製することができる。
【００４３】
本発明において、前記カリマイシンは、数種のスピラマイシン誘導体からなり、主要な活性成分はイソバレリルスピラマイシンＩ、ＩＩおよびＩＩＩである。イソバレリルスピラマイシン（Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ）は、６０％以上でなければならない。
【００４４】
さらに、本発明のカリマイシンにおいて、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩは３０％以上でなければならない。
【００４５】
よりさらに、本発明のカリマイシンにおいて、アシル化スピラマイシンの総含量は８０％以上でなければならない。
【００４６】
よりさらに、その他の未知の成分の総和は５．０％以下でなければならない。
【００４７】
よりさらに、本発明のカリマイシンにおいて、スピラマイシンＩＩＩの量は１．０％以下でなければならない。
【００４８】
カリマイシンの典型的なクロマトグラムに、イソバレリルスピラマイシンＩ、ＩＩおよびＩＩＩ以外に、（イソ）ブチリルスピラマイシンＩＩおよび／または（イソ）ブチリルスピラマイシンＩＩＩのピークを少なくとも含む。
【００４９】
好ましくは、カリマイシンの典型的なクロマトグラムに、スピラマイシンＩＩＩ、モノアセチルスピラマイシンＩＩ、モノアセチルスピラマイシンＩＩＩ、プロピオニルスピラマイシンＩＩ、プロピオニルスピラマイシンＩＩＩ、（イソ）ブチリルスピラマイシンＩＩ、（イソ）ブチリルスピラマイシンＩＩＩのピークから選択される１つまたは複数をさらに含む。
【発明の効果】
【００５０】
本発明の有益な効果は次の通りである。本発明は、カリマイシンおよびその薬学的に許容可能な塩が、比較的良好な抗腫瘍作用を有することを証明しており、特に乳腺癌、肝癌、肺癌、腎淡明細胞癌、腎細胞癌、脳腫瘍、子宮頸癌、前立腺癌、膵臓腺癌、食道癌、胃腺癌、結腸癌、リンパ腫または白血病など数種の腫瘍に対して、比較的良好な治療効果を有する。抗腫瘍薬の調製におけるカリマイシンおよびその薬学的に許容可能な塩の応用、ならびにその臨床における普及のために理論的根拠を提供するだけでなく、重要な経済的効果および社会的効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は、ヒト非小細胞肺癌ヌードマウスモデルに対するカリマイシンの抑制作用の体内試験における各投与群の腫瘍写真である。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
本発明の実施例の目的、技術案および利点をより明確にするため、以下に本発明の実施例を組み合わせて、実施例中の技術案について明確、完全に説明する。以下の実施例は本発明を説明するものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
【００５３】
以下の実施例において、用いるカリマイシンは数種のスピラマイシン誘導体からなり、主要な活性成分はイソバレリルスピラマイシンＩ、ＩＩおよびＩＩＩである。イソバレリルスピラマイシン（Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ）は、６０％以上でなければならない。
【００５４】
さらに、本発明のカリマイシンにおいて、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩは３０％以上でなければならない。
【００５５】
よりさらに、本発明のカリマイシンにおいて、アシル化スピラマイシンの総含量は８０％以上でなければならない。
【００５６】
よりさらに、その他の未知の成分の総和は５．０％以下でなければならない。
【００５７】
よりさらに、本発明のカリマイシンにおいて、スピラマイシンＩＩＩの量は１．０％以下でなければならない。
【００５８】
カリマイシンの典型的なクロマトグラムに、イソバレリルスピラマイシンＩ、ＩＩおよびＩＩＩ以外に、（イソ）ブチリルスピラマイシンＩＩおよび／または（イソ）ブチリルスピラマイシンＩＩＩのピークを少なくとも含む。
【００５９】
好ましくは、カリマイシンの典型的なクロマトグラムに、スピラマイシンＩＩＩ、モノアセチルスピラマイシンＩＩ、モノアセチルスピラマイシンＩＩＩ、プロピオニルスピラマイシンＩＩ、プロピオニルスピラマイシンＩＩＩ、（イソ）ブチリルスピラマイシンＩＩ、（イソ）ブチリルスピラマイシンＩＩＩのピークから選択される１つまたは複数をさらに含む。
【００６０】
様々なロットのカリマイシンに対して以下の試験を行ったが、似た結果が得られた。
【００６１】
実施例１、カリマイシン錠
規格：２００ｍｇ／３５０ｍｇ
核錠の処方：
カリマイシン                            ２００ｇ
微結晶セルロース                        １１０ｇ
カルボキシメチルデンプンナトリウム      ２２ｇ
ポビドンＫ３０（５％）                    １５ｇ
ステアリン酸マグネシウム                ３ｇ        
製造                                  １０００錠
コーティング液の処方：
オパドライＩＩ  ２１ｇ
蒸留水          適量      
製造      １０５ｍｌ
【００６２】
調製工程：
核錠の調製：主薬および添加剤をそれぞれ１００メッシュに通し、処方量のカリマイシン、微結晶セルロースおよび処方の１／２量のカルボキシメチルデンプンナトリウムを均一に混合する。その後５％ポビドンＫ３０水溶液を添加して軟質材料を作製し、１８メッシュで造粒し、湿った顆粒を６０℃の通風条件下で２ｈ乾燥させる。乾燥後１８メッシュで整粒し、さらに処方の１／２量のカルボキシメチルデンプンナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムを添加して均一に混合した後、直径１１ｍｍの臼で打錠すると、重量が３５０ｍｇ、硬度が６．５ｋｇの薬物含有核錠が得られる。
【００６３】
コーティング液の調製：調製容器中に必要なオパドライＩＩ（白色）を量り、必要量の水を添加する。何回かに分けて添加し、すべて添加した後、撹拌速度を低下させて、渦を消失させ、引き続き３０ｍｉｎ撹拌して得られる。
【００６４】
フィルムコーティング錠の調製：核錠をコーティングパン内に入れる。コーティング条件を確定し、主機の速度２０ｒ／ｍｉｎ、給気温度４０℃、排気温度３０℃、噴霧圧力０．０２ＭＰａ、噴霧流量１ｍｌ／ｍｉｎでコーティングを行う。安定すると、錠剤表面が滑らかで、色合いが均等になるまで噴霧コーティングを１．５ｈ続ける。フィルムコーティングの検査基準に符合すると合格である。コーティングで重量が５％前後増す。
【００６５】
実施例２、カリマイシン素錠（１００００錠で計算する）
処方：
カリマイシン原料粉末                          １０００ｇ
低置換度ヒドロキシプロピルセルロース（５％）  ９２．５ｇ
カルボキシメチルデンプンナトリウム（３％）    ５５．５ｇ
ステアリン酸マグネシウム（１％）              １８．５ｇ
デンプン                                総重量−その他の原料、添加剤の重量
総重量                                        １８５０ｇ
【００６６】
調製工程：適量のデンプンを秤取し、１５％濃度まで希釈し、糊状になるまで加熱して接着剤を作製する。主原料のカリマイシン、添加剤のデンプン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルデンプンナトリウム、ステアリン酸マグネシウムをそれぞれ１００メッシュに通し、処方量に応じて、必要な主原料および添加剤を秤取する。カリマイシン、デンプン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロースを均一になるまで十分に混合した後、１５％デンプン濃度のデンプン糊で軟質材料を作製する。１４メッシュで造粒し、５０〜６０℃で乾燥させて、水分を３〜５％に制御し、１４メッシュで整粒する。カルボキシメチルデンプンナトリウム、ステアリン酸マグネシウムを加えて混合し、顆粒の含有量を測定する。顆粒の含有量に基づいて錠剤の重量を計算し、打錠（Φ９ｍｍの臼）して、錠剤重量の差を測定する。検査に合格すると包装する。
【００６７】
実施例３、カリマイシンカプセル剤（１００００粒で計算する）
処方：
カリマイシン原料粉末  １０００ｇ
デンプン（薬用）      １０８０−カリマイシン原料粉末の重量
薬用３号カプセル      １０００粒
流動パラフィン        ５０ｍｌ
【００６８】
調製工程：主原料のカリマイシン、添加剤の薬用デンプンを工程の処方量に応じてそれぞれ秤取した後、混合器に入れて１．５〜２時間十分に混合する。サンプリングし、含有量を測定して得られたデータは、理論データと基本的に一致するべきである（各カプセルに詰める重量は約０．１０５ｇである）。検査に合格した薬用３号カプセルおよび混合した原料を全自動カプセル充填機の操作の要求に応じ、それぞれローディング装置に入れて充填し、充填したカプセルに対して有意検定を行う（±１０％以内、＜０．３ｇ）。溶出度が要求に符合し、検定の要求に符合するカプセルを光沢機内に入れ、流動パラフィンを添加して１５〜２０分間光沢を出した後、取り出して完成品の包装および検査を行う。
【００６９】
実施例４、カリマイシンドライシロップ（１００００袋で計算する）
処方：
カリマイシン原料粉末  １２５０ｇ
クエン酸（０．５％）  １５ｇ
スクロース            総重量−その他の原料、添加剤
総重量約              ５００ｇ
色素（クルクミン）    約１ｇ
【００７０】
調製工程：カリマイシン原料粉末、クエン酸、スクロースをそれぞれ高速気流粉砕機で粉砕し、顆粒の８５％が３００メッシュを、１５％が１８０メッシュを通るようにする。その後粉砕後の微粉を処方量に応じて秤取してから１〜１．５時間十分に混合し、その含有量を測定し、容量（理論容量は各袋５００ｍｇ）を計算する。その後混合物を包装機中に入れ、アルミ箔を取り付け、包装機の操作の要求に応じて包装する。容量の差は±５％以内であり、包装後、検査に合格したものの外部包装を行う。
【００７１】
実施例５、カリマイシン顆粒剤（１００００袋で計算する）
処方：
カリマイシン原料粉末  １２５０ｇ
粉砂糖                ２００００ｇ
デキストリン          ９０００ｇ
５％ＰＶＰ−Ｋ３０      適量
【００７２】
調製工程：カリマイシン原料粉末、粉砂糖、デキストリンを１２０メッシュに通し、処方量に応じてカリマイシン、粉砂糖、デキストリンを秤取して均一に混合する。均一に混合した上記材料から、５％ＰＶＰ−Ｋ３０ゴム液を用いて軟質材料を作製し、振動造粒機で造粒し、７０℃で乾燥させ、整粒する。検査に合格すると包装する。
【００７３】
実施例６、カリマイシン凍結乾燥粉末注射剤
カリマイシン原料粉末５００ｍｇおよび等モルのプロピレングリコールを秤取して均一に混合した後、５ｍｌ水中に溶解すると、淡黄色の透明な溶液が得られ、ｐＨは４．６〜５．６の間である。さらに凍結乾燥支持剤としてマンニトール４０ｍｇを添加し、低温で９ｈ急速冷凍させた後、凍結乾燥させると、淡黄色の軟らかな塊が得られる。使用前に１０ｍｌの滅菌水で溶解する。
【００７４】
試験例１、抗腫瘍活性のバイオアッセイ
測定の目的は、測定試料の体外での細胞増殖抑制作用または細胞毒性活性を評価することである。
【００７５】
細胞株：
ヒト乳腺癌細胞ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ヒト肝癌細胞ＨｅｐＧ２、ヒト非小細胞肺癌細胞Ａ５４９、ヒト大細胞肺癌細胞Ｈ４６０およびＨ１２９９、ヒト腎淡明細胞癌細胞７８６−Ｏ、ヒト腎細胞癌細胞７６９−Ｐ、ヒト神経膠腫細胞Ｕ２５１、ヒト神経膠芽腫細胞Ａ１７２、ヒト組織リンパ腫細胞Ｕ９３７、ヒト子宮頸癌細胞ＨｅＬａ、ヒト前立腺癌細胞ＰＣ３、ヒト膵臓腺癌細胞ＰＡＮＣ−１、ヒト食道癌細胞ＴＥ−１、ヒト胃腺癌細胞ＳＧＣ７９０１、ヒト結腸癌細胞ＨＴ−２９、ヒト前骨髄球性白血病細胞ＨＬ−６０。
【００７６】
試薬：
ＲＰＭＩ１６４０培地、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ低グルコース培地、ウシ胎児血清は米国Ｇｉｂｃｏ社から購入し、トリプシン、グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メチルチアゾリルテトラゾリウム（ＭＴＴ）は、米国Ｓｉｇｍａ社から購入した。
【００７７】
機器：
炭酸ガスインキュベータ（Ｓａｎｙｏ、Ｊａｐａｎ）、酵素免疫測定装置（Ｔｅｃａｎ、Ａｕｓｔｒｉａ）、９６ウェル培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＵＳＡ）、倒立顕微鏡（Ｍｏｔｉｃ、Ｃｈｉｎａ）。
【００７８】
操作の工程は以下の通りである。
接着細胞：
ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨｅｐＧ２、Ａ５４９、Ｈ４６０、Ｈ１２９９、７８６−Ｏ、７６９−Ｐ、Ｕ２５１、Ａ１７２、ＨｅＬａ、ＰＣ３、ＰＡＮＣ−１、ＴＥ−１、ＳＧＣ７９０１、ＨＴ−２９は接着細胞である。対数期の接着腫瘍細胞を選択し、パンクレアチンで消化した後、１０％ウシ胎児血清を含む培地で４〜５×１０４／ｍｌの細胞懸濁液を調製する。９６ウェル細胞プレート中に各ウェル１００μｌで接種し、３７℃、５％ＣＯ２で２４ｈ培養する。実験群は異なる濃度の測定試料カリマイシンを含む新しい培地に交換し、対照群は同体積の溶媒を含む培地に交換する。各群に３つの平行ウェルを設定し、３７℃、５％ＣＯ２で４８ｈ培養する。上清液を捨て、ＰＢＳで慎重に３回洗浄し、各ウェルに０．５ｍｇ／ｍｌＭＴＴを含む新しく調製した培地を１００μＬ添加し、３７℃で続けて４ｈ培養する。慎重に上清を除去し、１５０μＬＤＭＳＯを添加し、小型振盪器で１０ｍｉｎ均一に混合した後、マイクロプレートリーダを用いて４９２ｎｍ部分の光学密度値を測定する。
【００７９】
浮遊細胞：
Ｕ９３７、ＨＬ−６０は浮遊細胞である。対数期の細胞を選択し、１０％仔牛血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で２×１０５／ｍｌの細胞懸濁液を調製する。９６ウェル培養プレート中に各ウェル５０μｌで接種し、３７℃、５％ＣＯ２で２４ｈ培養する。実験群に異なる濃度の測定試料カリマイシンを含む培地５０μＬを添加し、対照群は同体積の溶媒を含む培地を添加する。各群に３つの平行ウェルを設定し、３７℃、５％ＣＯ２で４８ｈ培養する。各ウェルに５ｍｇ／ｍｌＭＴＴを含む新しく調製した培地を１０μＬ添加し、３７℃で続けて４ｈ培養する。溶解液（ＳＤＳ１０ｇ、０．１ｍＬの１０ＭＨＣｌ、イソブタノール５ｍＬを蒸留水で１００ｍＬに希釈する）１００μＬで結晶を溶解し、３７℃で１２ｈ培養する。マイクロプレートリーダを用いて４９２ｎｍ部分の光学密度値を測定する。
【００８０】
結果の評価：
下式により、腫瘍細胞の成長に対する薬物の抑制率を計算する。
腫瘍細胞成長抑制率（％）＝[Ａ４９２（陰性対照）−Ａ４９２（投与群）]／Ａ４９２（陰性対照）×１００％
これから試料の半数阻害濃度（ＩＣ５０）を求める。
【００８１】
結果：
ヒト乳腺癌細胞ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ヒト肝癌細胞ＨｅｐＧ２、ヒト非小細胞肺癌細胞Ａ５４９、ヒト大細胞肺癌細胞Ｈ４６０およびＨ１２９９、ヒト腎淡明細胞癌細胞７８６−Ｏ、ヒト腎細胞癌細胞７６９−Ｐ、ヒト神経膠腫細胞Ｕ２５１、ヒト神経膠芽腫細胞Ａ１７２、ヒト組織リンパ腫細胞Ｕ９３７、ヒト子宮頸癌細胞ＨｅＬａ、ヒト前立腺癌細胞ＰＣ３、ヒト膵臓腺癌細胞ＰＡＮＣ−１、ヒト食道癌細胞ＴＥ−１、ヒト胃腺癌細胞ＳＧＣ−７９０１、ヒト結腸癌細胞ＨＴ−２９、ヒト前骨髄球性白血病細胞ＨＬ−６０を用いる。
【００８２】
試料に対して行う体外での増殖抑制活性の評価結果は、以下の表１の通りである。
【００８３】
【表１】
0006959355.tif 000003
【００８４】
結果は、測定した細胞に対して、試料が良好な増殖抑制活性を示すことを示している。
【００８５】
試験例２、体内試験
１、ヒト非小細胞肺癌ヌードマウスモデルに対するカリマイシンの抑制作用
マウス固形腫瘍モデルの構築
対数期のＡ５４９細胞で、トリパンブルー染色実験により生細胞＞９５％のものを用いる。トリプシン消化し、遠心分離して上清を除去し、ｍａｔｒｉｇｅｌで細胞濃度を１×１０７／ｍｌに調整する。細胞をヌードマウスの右わき下皮下に０．２ｍｌ／匹で接種し、接種１日目と記す。腫瘍が≧１００ｍｍ３まで成長すると、動物を無作為に各群６匹で５群に分け、カリマイシン１２．５、２５および５０ｍｇ／ｋｇの３つの用量群である。各群の動物に連続して３０日間胃内投与し、投与体積は２０ｍｌ／ｋｇである。投与停止の翌日にマウスを屠殺し、指標を測定する。ヌードマウスへの投与開始から屠殺するまでの期間、２日ごとに腫瘍の長径、短径および体重を記録する。
【００８６】
腫瘍体積および相対腫瘍増殖率の計算
２ｄごとにヌードマウスの体重および移植腫瘍の長径（ａ）、短径（ｂ）を測定し、下記の公式により、腫瘍体積（ｖ）、相対腫瘍体積（ＲＴＶ）および相対腫瘍増殖率（Ｔ／Ｃ）をそれぞれ計算する。このうちＶ＝ａ×ｂ２／２；ＲＴＶ＝Ｖ／Ｖ０（Ｖ０は投与前の腫瘍体積、Ｖは屠殺前の腫瘍体積）、Ｔ／Ｃ（％）＝治療群ＲＴＶ／モデル対照群ＲＴＶ×１００％である。
【００８７】
腫瘍成長抑制率の計算
マウスの重さを量ってから屠殺し、腫瘍を完全に剥離し、血痕、脂肪など非腫瘍組織を除去して腫瘍重量を量り、腫瘍成長抑制率を計算する。各群マウスの平均腫瘍重量を治療効果の指標とする。腫瘍成長抑制率（％）＝（１−治療群の平均腫瘍重量／モデル群の平均腫瘍重量）×１００％。
【００８８】
試験結果は、対照群と比較して、各投与群が腫瘍成長抑制率、腫瘍体積、相対腫瘍体積および相対腫瘍増殖率に対して、一定程度の抑制作用を有することを明確に示す（図１、表２、表３）。
【００８９】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の腫瘍成長抑制率は、それぞれ５４．４６％、６６．０７％および７５．８９％である。
【００９０】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の腫瘍体積および相対腫瘍体積は、モデル群より明らかに低い（Ｐ＜０．０５）。
【００９１】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の相対腫瘍増殖率は、それぞれ５４．５５％、４５．５７％および２９．２１％である。
【００９２】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群における動物の体重は、モデル群と比較していずれも明らかな変化はない。
【００９３】
【表２】
0006959355.tif 000004
【００９４】
【表３】
0006959355.tif 000005
【００９５】
２、ヒト乳腺癌ヌードマウスモデルに対するカリマイシンの抑制作用
マウス固形腫瘍モデルの構築
対数期のＭＣＦ−７細胞で、トリパンブルー染色実験により生細胞＞９５％のものを用いる。トリプシン消化し、遠心分離して上清を除去し、ｍａｔｒｉｇｅｌで細胞濃度を１×１０７／ｍｌに調整する。細胞をヌードマウスの右わき下皮下に０．２ｍｌ／匹で接種し、接種１日目と記す。腫瘍が≧１００ｍｍ３まで成長すると、動物を無作為に各群６匹で５群に分け、モデル群、シクロホスファミド群、カリマイシン１２．５、２５および５０ｍｇ／ｋｇの３つの用量群である。各群の動物に連続して３０日間胃内投与し、投与体積は２０ｍｌ／ｋｇである。投与停止の翌日にマウスを屠殺し、指標を測定する。ヌードマウスへの投与開始から屠殺するまでの期間、２日ごとに腫瘍の長径、短径および体重を記録する。
【００９６】
腫瘍体積および相対腫瘍増殖率の計算
２ｄごとにヌードマウスの体重および移植腫瘍の長径（ａ）、短径（ｂ）を測定し、下記の公式により、腫瘍体積（ｖ）、相対腫瘍体積（ＲＴＶ）および相対腫瘍増殖率（Ｔ／Ｃ）をそれぞれ計算する。このうちＶ＝ａ×ｂ２／２；ＲＴＶ＝Ｖ／Ｖ０（Ｖ０は投与前の腫瘍体積、Ｖは屠殺前の腫瘍体積）、Ｔ／Ｃ（％）＝治療群ＲＴＶ／モデル対照群ＲＴＶ×１００％である。
【００９７】
腫瘍成長抑制率の計算
マウスの重さを量ってから屠殺し、腫瘍を完全に剥離し、血痕、脂肪など非腫瘍組織を除去して腫瘍重量を量り、腫瘍成長抑制率を計算する。各群マウスの平均腫瘍重量を治療効果の指標とする。腫瘍成長抑制率（％）＝（１−治療群の平均腫瘍重量／モデル群の平均腫瘍重量）×１００％。
【００９８】
試験結果は、対照群と比較して、各投与群が腫瘍成長抑制率、腫瘍体積、相対腫瘍体積および相対腫瘍増殖率に対して、一定程度の抑制作用を有することを明確に示す（表４、表５）。
【００９９】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の腫瘍成長抑制率は、それぞれ１１．７３％、２５．１３％および４５．５５％である。
【０１００】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の腫瘍体積および相対腫瘍体積は、モデル群より明らかに低い（ｐ＜０．０５）。
【０１０１】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の相対腫瘍増殖率は、それぞれ５７．３７％、４７．６５％および３３．４６％である。
【０１０２】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群における動物の体重は、モデル群と比較していずれも明らかな変化はない。
【０１０３】
【表４】
0006959355.tif 000006
【０１０４】
【表５】
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【０１０５】
３、ヒトリンパ腫ヌードマウスモデルに対するカリマイシンの抑制作用
マウス固形腫瘍モデルの構築
対数期のＵ９３７細胞で、トリパンブルー染色実験により生細胞＞９５％のものを用いる。トリプシン消化し、遠心分離して上清を除去し、ｍａｔｒｉｇｅｌで細胞濃度を１×１０７／ｍｌに調整する。細胞をヌードマウスの右わき下皮下に０．２ｍｌ／匹で接種し、接種１日目と記す。腫瘍が≧１００ｍｍ３まで成長すると、動物を無作為に各群６匹で５群に分け、モデル群、シクロホスファミド群、カリマイシン１２．５、２５および５０ｍｇ／ｋｇの３つの用量群である。各群の動物に連続して３０日間胃内投与し、投与体積は２０ｍｌ／ｋｇである。投与停止の翌日にマウスを屠殺し、指標を測定する。ヌードマウスへの投与開始から屠殺するまでの期間、２日ごとに腫瘍の長径、短径および体重を記録する。
【０１０６】
腫瘍体積および相対腫瘍増殖率の計算
２ｄごとにヌードマウスの体重および移植腫瘍の長径（ａ）、短径（ｂ）を測定し、下記の公式により、腫瘍体積（ｖ）、相対腫瘍体積（ＲＴＶ）および相対腫瘍増殖率（Ｔ／Ｃ）をそれぞれ計算する。このうちＶ＝ａ×ｂ２／２；ＲＴＶ＝Ｖ／Ｖ０（Ｖ０は投与前の腫瘍体積、Ｖは屠殺前の腫瘍体積）、Ｔ／Ｃ（％）＝治療群ＲＴＶ／モデル対照群ＲＴＶ×１００％である。
【０１０７】
腫瘍成長抑制率の計算
マウスの重さを量ってから屠殺し、腫瘍を完全に剥離し、血痕、脂肪など非腫瘍組織を除去して腫瘍重量を量り、腫瘍成長抑制率を計算する。各群マウスの平均腫瘍重量を治療効果の指標とする。腫瘍成長抑制率（％）＝（１−治療群の平均腫瘍重量／モデル群の平均腫瘍重量）×１００％。
【０１０８】
試験結果は、対照群と比較して、各投与群が腫瘍成長抑制率、腫瘍体積、相対腫瘍体積および相対腫瘍増殖率に対して、一定程度の抑制作用を有することを明確に示す（表６、表７）。
【０１０９】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の腫瘍成長抑制率は、それぞれ６１．０８％、６５．９４％および７０．５０％である。
【０１１０】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の腫瘍体積および相対腫瘍体積は、モデル群より明らかに低い（Ｐ＜０．０５）。
【０１１１】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の相対腫瘍増殖率は、それぞれ５２．３７％、４７．３１％および３９．９５％である。
【０１１２】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群における動物の体重は、モデル群と比較していずれも明らかな変化はない。
【０１１３】
【表６】
0006959355.tif 000008
【０１１４】
【表７】
0006959355.tif 000009
【０１１５】
４、ヒト子宮頸癌ヌードマウスモデルに対するカリマイシンの抑制作用
マウス固形腫瘍モデルの構築
対数期のＨｅＬａ細胞で、トリパンブルー染色実験により生細胞＞９５％のものを用いる。トリプシン消化し、遠心分離して上清を除去し、ｍａｔｒｉｇｅｌで細胞濃度を１×１０７／ｍｌに調整する。細胞をヌードマウスの右わき下皮下に０．２ｍｌ／匹で接種し、接種１日目と記す。腫瘍が≧１００ｍｍ３まで成長すると、動物を無作為に各群６匹で５群に分け、モデル群、シクロホスファミド群、カリマイシン１２．５、２５および５０ｍｇ／ｋｇの３つの用量群である。各群の動物に連続して３０日間胃内投与し、投与体積は２０ｍｌ／ｋｇである。投与停止の翌日にマウスを屠殺し、指標を測定する。ヌードマウスへの投与開始から屠殺するまでの期間、２日ごとに腫瘍の長径、短径および体重を記録する。
【０１１６】
腫瘍体積および相対腫瘍増殖率の計算
２ｄごとにヌードマウスの体重および移植腫瘍の長径（ａ）、短径（ｂ）を測定し、下記の公式により、腫瘍体積（ｖ）、相対腫瘍体積（ＲＴＶ）および相対腫瘍増殖率（Ｔ／Ｃ）をそれぞれ計算する。このうちＶ＝ａ×ｂ２／２；ＲＴＶ＝Ｖ／Ｖ０（Ｖ０は投与前の腫瘍体積、Ｖは屠殺前の腫瘍体積）、Ｔ／Ｃ（％）＝治療群ＲＴＶ／モデル対照群ＲＴＶ×１００％である。
【０１１７】
腫瘍成長抑制率の計算
マウスの重さを量ってから屠殺し、腫瘍を完全に剥離し、血痕、脂肪など非腫瘍組織を除去して腫瘍重量を量り、腫瘍成長抑制率を計算する。各群マウスの平均腫瘍重量を治療効果の指標とする。腫瘍成長抑制率（％）＝（１−治療群の平均腫瘍重量／モデル群の平均腫瘍重量）×１００％。
【０１１８】
試験結果は、対照群と比較して、各投与群が腫瘍成長抑制率、腫瘍体積、相対腫瘍体積および相対腫瘍増殖率に対して、一定程度の抑制作用を有することを明確に示す（表８、表９）。
【０１１９】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の腫瘍成長抑制率は、それぞれ２８．７５％、４６．２８および５６．１８である。
【０１２０】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の腫瘍体積および相対腫瘍体積は、モデル群より明らかに低い（Ｐ＜０．０５）。
【０１２１】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の相対腫瘍増殖率は、それぞれ６１．０４、５３．２７および４０．４０である。
【０１２２】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群における動物の体重は、モデル群と比較していずれも明らかな変化はない。
【０１２３】
【表８】
0006959355.tif 000010
【０１２４】
【表９】
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【０１２５】
５、ヒト前立腺癌ヌードマウスモデルに対するカリマイシンの抑制作用
マウス固形腫瘍モデルの構築
対数期のＰＣ３細胞で、トリパンブルー染色実験により生細胞＞９５％のものを用いる。トリプシン消化し、遠心分離して上清を除去し、ｍａｔｒｉｇｅｌで細胞濃度を１×１０７／ｍｌに調整する。細胞をヌードマウスの右わき下皮下に０．２ｍｌ／匹で接種し、接種１日目と記す。腫瘍が≧１００ｍｍ３まで成長すると、動物を無作為に各群６匹で５群に分け、モデル群、シクロホスファミド群、カリマイシン１２．５、２５および５０ｍｇ／ｋｇの３つの用量群である。各群の動物に連続して３０日間胃内投与し、投与体積は２０ｍｌ／ｋｇである。投与停止の翌日にマウスを屠殺し、指標を測定する。ヌードマウスへの投与開始から屠殺するまでの期間、２日ごとに腫瘍の長径、短径および体重を記録する。
【０１２６】
腫瘍体積および相対腫瘍増殖率の計算
２ｄごとにヌードマウスの体重および移植腫瘍の長径（ａ）、短径（ｂ）を測定し、下記の公式により、腫瘍体積（ｖ）、相対腫瘍体積（ＲＴＶ）および相対腫瘍増殖率（Ｔ／Ｃ）をそれぞれ計算する。このうちＶ＝ａ×ｂ２／２；ＲＴＶ＝Ｖ／Ｖ０（Ｖ０は投与前の腫瘍体積、Ｖは屠殺前の腫瘍体積）、Ｔ／Ｃ（％）＝治療群ＲＴＶ／モデル対照群ＲＴＶ×１００％である。
【０１２７】
腫瘍成長抑制率の計算
マウスの重さを量ってから屠殺し、腫瘍を完全に剥離し、血痕、脂肪など非腫瘍組織を除去して腫瘍重量を量り、腫瘍成長抑制率を計算する。各群マウスの平均腫瘍重量を治療効果の指標とする。腫瘍成長抑制率（％）＝（１−治療群の平均腫瘍重量／モデル群の平均腫瘍重量）×１００％。
【０１２８】
試験結果は、対照群と比較して、各投与群が腫瘍成長抑制率、腫瘍体積、相対腫瘍体積および相対腫瘍増殖率に対して、一定程度の抑制作用を有することを明確に示す（表１０、表１１）。
【０１２９】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の腫瘍成長抑制率は、それぞれ２５．９２％、３４．６７％および６０．３２％である。
【０１３０】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の腫瘍体積および相対腫瘍体積は、モデル群より明らかに低い（Ｐ＜０．０５）。
【０１３１】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の相対腫瘍増殖率は、それぞれ５５．９３％、４３．４５％および３０．０２％である。
【０１３２】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群における動物の体重は、モデル群と比較していずれも明らかな変化はない。
【０１３３】
【表１０】
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【０１３４】
【表１１】
0006959355.tif 000013
【０１３５】
６、ヒト結腸癌ヌードマウスモデルに対するカリマイシンの抑制作用
マウス固形腫瘍モデルの構築
対数期のＨＴ−２９細胞で、トリパンブルー染色実験により生細胞＞９５％のものを用いる。トリプシン消化し、遠心分離して上清を除去し、ｍａｔｒｉｇｅｌで細胞濃度を１×１０７／ｍｌに調整する。細胞をヌードマウスの右わき下皮下に０．２ｍｌ／匹で接種し、接種１日目と記す。腫瘍が≧１００ｍｍ３まで成長すると、動物を無作為に各群６匹で５群に分け、モデル群、シクロホスファミド群、カリマイシン１２．５、２５および５０ｍｇ／ｋｇの３つの用量群である。各群の動物に連続して３０日間胃内投与し、投与体積は２０ｍｌ／ｋｇである。投与停止の翌日にマウスを屠殺し、指標を測定する。ヌードマウスへの投与開始から屠殺するまでの期間、２日ごとに腫瘍の長径、短径および体重を記録する。
【０１３６】
腫瘍体積および相対腫瘍増殖率の計算
２ｄごとにヌードマウスの体重および移植腫瘍の長径（ａ）、短径（ｂ）を測定し、下記の公式により、腫瘍体積（ｖ）、相対腫瘍体積（ＲＴＶ）および相対腫瘍増殖率（Ｔ／Ｃ）をそれぞれ計算する。このうちＶ＝ａ×ｂ２／２；ＲＴＶ＝Ｖ／Ｖ０（Ｖ０は投与前の腫瘍体積、Ｖは屠殺前の腫瘍体積）、Ｔ／Ｃ（％）＝治療群ＲＴＶ／モデル対照群ＲＴＶ×１００％である。
【０１３７】
腫瘍成長抑制率の計算
マウスの重さを量ってから屠殺し、腫瘍を完全に剥離し、血痕、脂肪など非腫瘍組織を除去して腫瘍重量を量り、腫瘍成長抑制率を計算する。各群マウスの平均腫瘍重量を治療効果の指標とする。腫瘍成長抑制率（％）＝（１−治療群の平均腫瘍重量／モデル群の平均腫瘍重量）×１００％。
【０１３８】
試験結果は、対照群と比較して、各投与群が腫瘍成長抑制率、腫瘍体積、相対腫瘍体積および相対腫瘍増殖率に対して、一定程度の抑制作用を有することを明確に示す（表１２、表１３）。
【０１３９】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の腫瘍成長抑制率は、それぞれ４０．５５％、６０．６８％および７３．１６％である。
【０１４０】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の腫瘍体積および相対腫瘍体積は、モデル群より明らかに低い（Ｐ＜０．０５）。
【０１４１】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の相対腫瘍増殖率は、それぞれ４９．３１％、４２．３０％および３０．９６％である。
【０１４２】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群における動物の体重は、モデル群と比較していずれも明らかな変化はない。
【０１４３】
【表１２】
0006959355.tif 000014
【０１４４】
【表１３】
0006959355.tif 000015
【０１４５】
７、ヒト白血病ヌードマウスモデルに対するカリマイシンの抑制作用
マウス固形腫瘍モデルの構築
対数期のＨＬ−６０細胞で、トリパンブルー染色実験により生細胞＞９５％のものを用いる。トリプシン消化し、遠心分離して上清を除去し、ｍａｔｒｉｇｅｌで細胞濃度を１×１０７／ｍｌに調整する。細胞をヌードマウスの右わき下皮下に０．２ｍｌ／匹で接種し、接種１日目と記す。腫瘍が≧１００ｍｍ３まで成長すると、動物を無作為に各群６匹で５群に分け、モデル群、シクロホスファミド群、カリマイシン１２．５、２５および５０ｍｇ／ｋｇの３つの用量群である。各群の動物に連続して３０日間胃内投与し、投与体積は２０ｍｌ／ｋｇである。投与停止の翌日にマウスを屠殺し、指標を測定する。ヌードマウスへの投与開始から屠殺するまでの期間、２日ごとに腫瘍の長径、短径および体重を記録する。
【０１４６】
腫瘍体積および相対腫瘍増殖率の計算
２ｄごとにヌードマウスの体重および移植腫瘍の長径（ａ）、短径（ｂ）を測定し、下記の公式により、腫瘍体積（ｖ）、相対腫瘍体積（ＲＴＶ）および相対腫瘍増殖率（Ｔ／Ｃ）をそれぞれ計算する。このうちＶ＝ａ×ｂ２／２；ＲＴＶ＝Ｖ／Ｖ０（Ｖ０は投与前の腫瘍体積、Ｖは屠殺前の腫瘍体積）、Ｔ／Ｃ（％）＝治療群ＲＴＶ／モデル対照群ＲＴＶ×１００％である。
【０１４７】
腫瘍成長抑制率の計算
マウスの重さを量ってから屠殺し、腫瘍を完全に剥離し、血痕、脂肪など非腫瘍組織を除去して腫瘍重量を量り、腫瘍成長抑制率を計算する。各群マウスの平均腫瘍重量を治療効果の指標とする。腫瘍成長抑制率（％）＝（１−治療群の平均腫瘍重量／モデル群の平均腫瘍重量）×１００％。
【０１４８】
試験結果は、対照群と比較して、各投与群が腫瘍成長抑制率、腫瘍体積、相対腫瘍体積および相対腫瘍増殖率に対して、一定程度の抑制作用を有することを明確に示す（表１４、表１５）。
【０１４９】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の腫瘍成長抑制率は、それぞれ４０．２６％、７０．９２％および８３．３５％である。
【０１５０】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の腫瘍体積および相対腫瘍体積は、モデル群より明らかに低い（Ｐ＜０．０５）。
【０１５１】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の相対腫瘍増殖率は、それぞれ５８．６３％、４９．２６％および３８．３３％である。
【０１５２】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群における動物の体重は、モデル群と比較していずれも明らかな変化はない。
【０１５３】
【表１４】
0006959355.tif 000016
【０１５４】
【表１５】
0006959355.tif 000017
【０１５５】
８、ヒト肝癌ヌードマウスモデルに対するカリマイシンの抑制作用
マウス固形腫瘍モデルの構築
対数期のＨｅｐＧ−２細胞で、トリパンブルー染色実験により生細胞＞９５％のものを用いる。トリプシン消化し、遠心分離して上清を除去し、ｍａｔｒｉｇｅｌで細胞濃度を１×１０７／ｍｌに調整する。細胞をヌードマウスの右わき下皮下に０．２ｍｌ／匹で接種し、接種１日目と記す。腫瘍が≧１００ｍｍ３まで成長すると、動物を無作為に各群６匹で５群に分け、モデル群、シクロホスファミド群、カリマイシン１２．５、２５および５０ｍｇ／ｋｇの３つの用量群である。各群の動物に連続して３０日間胃内投与し、投与体積は２０ｍｌ／ｋｇである。投与停止の翌日にマウスを屠殺し、指標を測定する。ヌードマウスへの投与開始から屠殺するまでの期間、２日ごとに腫瘍の長径、短径および体重を記録する。
【０１５６】
腫瘍体積および相対腫瘍増殖率の計算
２ｄごとにヌードマウスの体重および移植腫瘍の長径（ａ）、短径（ｂ）を測定し、下記の公式により、腫瘍体積（ｖ）、相対腫瘍体積（ＲＴＶ）および相対腫瘍増殖率（Ｔ／Ｃ）をそれぞれ計算する。このうちＶ＝ａ×ｂ２／２；ＲＴＶ＝Ｖ／Ｖ０（Ｖ０は投与前の腫瘍体積、Ｖは屠殺前の腫瘍体積）、Ｔ／Ｃ（％）＝治療群ＲＴＶ／モデル対照群ＲＴＶ×１００％である。
【０１５７】
腫瘍成長抑制率の計算
マウスの重さを量ってから屠殺し、腫瘍を完全に剥離し、血痕、脂肪など非腫瘍組織を除去して腫瘍重量を量り、腫瘍成長抑制率を計算する。各群マウスの平均腫瘍重量を治療効果の指標とする。腫瘍成長抑制率（％）＝（１−治療群の平均腫瘍重量／モデル群の平均腫瘍重量）×１００％。
【０１５８】
試験結果は、対照群と比較して、各投与群が腫瘍成長抑制率、腫瘍体積、相対腫瘍体積および相対腫瘍増殖率に対して、一定程度の抑制作用を有することを明確に示す（表１６、表１７）。
【０１５９】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の腫瘍成長抑制率は、それぞれ３７．７９％、５１．９２％および６１．１１％である。
【０１６０】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の腫瘍体積および相対腫瘍体積は、モデル群より明らかに低い（Ｐ＜０．０５）。
【０１６１】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の相対腫瘍増殖率は、それぞれ６５．５５％、５３．５８％および３９．３３％である。
【０１６２】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群における動物の体重は、モデル群と比較していずれも明らかな変化はない。
【０１６３】
【表１６】
0006959355.tif 000018
【０１６４】
【表１７】
0006959355.tif 000019
【０１６５】
９、ヒト乳腺癌ヌードマウスモデルに対するカリマイシンの抑制作用
マウス固形腫瘍モデルの構築
対数期のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞で、トリパンブルー染色実験により生細胞＞９５％のものを用いる。トリプシン消化し、遠心分離して上清を除去し、ｍａｔｒｉｇｅｌで細胞濃度を１×１０７／ｍｌに調整する。細胞をヌードマウスの右わき下皮下に０．２ｍｌ／匹で接種し、接種１日目と記す。腫瘍が≧１００ｍｍ３まで成長すると、動物を無作為に各群６匹で５群に分け、モデル群、シクロホスファミド群、カリマイシン１２．５、２５および５０ｍｇ／ｋｇの３つの用量群である。各群の動物に連続して３０日間胃内投与し、投与体積は２０ｍｌ／ｋｇである。投与停止の翌日にマウスを屠殺し、指標を測定する。ヌードマウスへの投与開始から屠殺するまでの期間、２日ごとに腫瘍の長径、短径および体重を記録する。
【０１６６】
腫瘍体積および相対腫瘍増殖率の計算
２ｄごとにヌードマウスの体重および移植腫瘍の長径（ａ）、短径（ｂ）を測定し、下記の公式により、腫瘍体積（ｖ）、相対腫瘍体積（ＲＴＶ）および相対腫瘍増殖率（Ｔ／Ｃ）をそれぞれ計算する。このうちＶ＝ａ×ｂ２／２；ＲＴＶ＝Ｖ／Ｖ０（Ｖ０は投与前の腫瘍体積、Ｖは屠殺前の腫瘍体積）、Ｔ／Ｃ（％）＝治療群ＲＴＶ／モデル対照群ＲＴＶ×１００％である。
【０１６７】
腫瘍成長抑制率の計算
マウスの重さを量ってから屠殺し、腫瘍を完全に剥離し、血痕、脂肪など非腫瘍組織を除去して腫瘍重量を量り、腫瘍成長抑制率を計算する。各群マウスの平均腫瘍重量を治療効果の指標とする。腫瘍成長抑制率（％）＝（１−治療群の平均腫瘍重量／モデル群の平均腫瘍重量）×１００％。
【０１６８】
試験結果は、対照群と比較して、各投与群が腫瘍成長抑制率、腫瘍体積、相対腫瘍体積および相対腫瘍増殖率に対して、一定程度の抑制作用を有することを明確に示す（表１８、表１９）。
【０１６９】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の腫瘍成長抑制率は、それぞれ４６．９６％、５８．８８％および７２．５５％である。
【０１７０】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の腫瘍体積および相対腫瘍体積は、モデル群より明らかに低い（Ｐ＜０．０５）。
【０１７１】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の相対腫瘍増殖率は、それぞれ５９．４２％、４８．６９％および３５．７８％である。
【０１７２】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群における動物の体重は、モデル群と比較していずれも明らかな変化はない。
【０１７３】
【表１８】
0006959355.tif 000020
【０１７４】
【表１９】
0006959355.tif 000021
【０１７５】
１０、ヒト大細胞肺癌ヌードマウスモデルに対するカリマイシンの抑制作用
マウス固形腫瘍モデルの構築
対数期のＨ４６０細胞で、トリパンブルー染色実験により生細胞＞９５％のものを用いる。トリプシン消化し、遠心分離して上清を除去し、ｍａｔｒｉｇｅｌで細胞濃度を１×１０７／ｍｌに調整する。細胞をヌードマウスの右わき下皮下に０．２ｍｌ／匹で接種し、接種１日目と記す。腫瘍が≧１００ｍｍ３まで成長すると、動物を無作為に各群６匹で５群に分け、モデル群、シクロホスファミド群、カリマイシン１２．５、２５および５０ｍｇ／ｋｇの３つの用量群である。各群の動物に連続して３０日間胃内投与し、投与体積は２０ｍｌ／ｋｇである。投与停止の翌日にマウスを屠殺し、指標を測定する。ヌードマウスへの投与開始から屠殺するまでの期間、２日ごとに腫瘍の長径、短径および体重を記録する。
【０１７６】
腫瘍体積および相対腫瘍増殖率の計算
２ｄごとにヌードマウスの体重および移植腫瘍の長径（ａ）、短径（ｂ）を測定し、下記の公式により、腫瘍体積（ｖ）、相対腫瘍体積（ＲＴＶ）および相対腫瘍増殖率（Ｔ／Ｃ）をそれぞれ計算する。このうちＶ＝ａ×ｂ２／２；ＲＴＶ＝Ｖ／Ｖ０（Ｖ０は投与前の腫瘍体積、Ｖは屠殺前の腫瘍体積）、Ｔ／Ｃ（％）＝治療群ＲＴＶ／モデル対照群ＲＴＶ×１００％である。
【０１７７】
腫瘍成長抑制率の計算
マウスの重さを量ってから屠殺し、腫瘍を完全に剥離し、血痕、脂肪など非腫瘍組織を除去して腫瘍重量を量り、腫瘍成長抑制率を計算する。各群マウスの平均腫瘍重量を治療効果の指標とする。腫瘍成長抑制率（％）＝（１−治療群の平均腫瘍重量／モデル群の平均腫瘍重量）×１００％。
【０１７８】
試験結果は、対照群と比較して、各投与群が腫瘍成長抑制率、腫瘍体積、相対腫瘍体積および相対腫瘍増殖率に対して、一定程度の抑制作用を有することを明確に示す（表２０、表２１）。
【０１７９】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の腫瘍成長抑制率は、それぞれ３７．７９％、５１．９２％および６１．１１％である。
【０１８０】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の腫瘍体積および相対腫瘍体積は、モデル群より明らかに低い（Ｐ＜０．０５）。
【０１８１】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の相対腫瘍増殖率は、それぞれ７３．８３％、６１．８３％および４９．８２％である。
【０１８２】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群における動物の体重は、モデル群と比較していずれも明らかな変化はない。
【０１８３】
【表２０】
0006959355.tif 000022
【０１８４】
【表２１】
0006959355.tif 000023
【０１８５】
１１、ヒト大細胞肺癌ヌードマウスモデルに対するカリマイシンの抑制作用
マウス固形腫瘍モデルの構築
対数期のＨ１２９９細胞で、トリパンブルー染色実験により生細胞＞９５％のものを用いる。トリプシン消化し、遠心分離して上清を除去し、ｍａｔｒｉｇｅｌで細胞濃度を１×１０７／ｍｌに調整する。細胞をヌードマウスの右わき下皮下に０．２ｍｌ／匹で接種し、接種１日目と記す。腫瘍が≧１００ｍｍ３まで成長すると、動物を無作為に各群６匹で５群に分け、モデル群、シクロホスファミド群、カリマイシン１２．５、２５および５０ｍｇ／ｋｇの３つの用量群である。各群の動物に連続して３０日間胃内投与し、投与体積は２０ｍｌ／ｋｇである。投与停止の翌日にマウスを屠殺し、指標を測定する。ヌードマウスへの投与開始から屠殺するまでの期間、２日ごとに腫瘍の長径、短径および体重を記録する。
【０１８６】
腫瘍体積および相対腫瘍増殖率の計算
２ｄごとにヌードマウスの体重および移植腫瘍の長径（ａ）、短径（ｂ）を測定し、下記の公式により、腫瘍体積（ｖ）、相対腫瘍体積（ＲＴＶ）および相対腫瘍増殖率（Ｔ／Ｃ）をそれぞれ計算する。このうちＶ＝ａ×ｂ２／２；ＲＴＶ＝Ｖ／Ｖ０（Ｖ０は投与前の腫瘍体積、Ｖは屠殺前の腫瘍体積）、Ｔ／Ｃ（％）＝治療群ＲＴＶ／モデル対照群ＲＴＶ×１００％である。
【０１８７】
腫瘍成長抑制率の計算
マウスの重さを量ってから屠殺し、腫瘍を完全に剥離し、血痕、脂肪など非腫瘍組織を除去して腫瘍重量を量り、腫瘍成長抑制率を計算する。各群マウスの平均腫瘍重量を治療効果の指標とする。腫瘍成長抑制率（％）＝（１−治療群の平均腫瘍重量／モデル群の平均腫瘍重量）×１００％。
【０１８８】
試験結果は、対照群と比較して、各投与群が腫瘍成長抑制率、腫瘍体積、相対腫瘍体積および相対腫瘍増殖率に対して、一定程度の抑制作用を有することを明確に示す（表２２、表２３）。
【０１８９】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の腫瘍成長抑制率は、それぞれ１９．５７％、４９．５８％および５９．６５％である。
【０１９０】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の腫瘍体積および相対腫瘍体積は、モデル群より明らかに低い（Ｐ＜０．０５）。
【０１９１】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の相対腫瘍増殖率は、それぞれ７８．５７％、６３．６２％および４９．７１％である。
【０１９２】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群における動物の体重は、モデル群と比較していずれも明らかな変化はない。
【０１９３】
【表２２】
0006959355.tif 000024
【０１９４】
【表２３】
0006959355.tif 000025
【０１９５】
１２、ヒト腎淡明細胞癌ヌードマウスモデルに対するカリマイシンの抑制作用
マウス固形腫瘍モデルの構築
対数期の７８６−Ｏ細胞で、トリパンブルー染色実験により生細胞＞９５％のものを用いる。トリプシン消化し、遠心分離して上清を除去し、ｍａｔｒｉｇｅｌで細胞濃度を１×１０７／ｍｌに調整する。細胞をヌードマウスの右わき下皮下に０．２ｍｌ／匹で接種し、接種１日目と記す。腫瘍が≧１００ｍｍ３まで成長すると、動物を無作為に各群６匹で５群に分け、モデル群、シクロホスファミド群、カリマイシン１２．５、２５および５０ｍｇ／ｋｇの３つの用量群である。各群の動物に連続して３０日間胃内投与し、投与体積は２０ｍｌ／ｋｇである。投与停止の翌日にマウスを屠殺し、指標を測定する。ヌードマウスへの投与開始から屠殺するまでの期間、２日ごとに腫瘍の長径、短径および体重を記録する。
【０１９６】
腫瘍体積および相対腫瘍増殖率の計算
２ｄごとにヌードマウスの体重および移植腫瘍の長径（ａ）、短径（ｂ）を測定し、下記の公式により、腫瘍体積（ｖ）、相対腫瘍体積（ＲＴＶ）および相対腫瘍増殖率（Ｔ／Ｃ）をそれぞれ計算する。このうちＶ＝ａ×ｂ２／２；ＲＴＶ＝Ｖ／Ｖ０（Ｖ０は投与前の腫瘍体積、Ｖは屠殺前の腫瘍体積）、Ｔ／Ｃ（％）＝治療群ＲＴＶ／モデル対照群ＲＴＶ×１００％である。
【０１９７】
腫瘍成長抑制率の計算
マウスの重さを量ってから屠殺し、腫瘍を完全に剥離し、血痕、脂肪など非腫瘍組織を除去して腫瘍重量を量り、腫瘍成長抑制率を計算する。各群マウスの平均腫瘍重量を治療効果の指標とする。腫瘍成長抑制率（％）＝（１−治療群の平均腫瘍重量／モデル群の平均腫瘍重量）×１００％。
【０１９８】
試験結果は、対照群と比較して、各投与群が腫瘍成長抑制率、腫瘍体積、相対腫瘍体積および相対腫瘍増殖率に対して、一定程度の抑制作用を有することを明確に示す（表２４、表２５）。
【０１９９】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の腫瘍成長抑制率は、それぞれ３０．３２％、４７．２４％および６３．７１％である。
【０２００】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の腫瘍体積および相対腫瘍体積は、モデル群より明らかに低い（Ｐ＜０．０５）。
【０２０１】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の相対腫瘍増殖率は、それぞれ８０．８１％、６７．１６％および４２．８２％である。
【０２０２】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群における動物の体重は、モデル群と比較していずれも明らかな変化はない。
【０２０３】
【表２４】
0006959355.tif 000026
【０２０４】
【表２５】
0006959355.tif 000027
【０２０５】
１３、ヒト腎細胞癌ヌードマウスモデルに対するカリマイシンの抑制作用
マウス固形腫瘍モデルの構築
対数期の７６９−Ｐ細胞で、トリパンブルー染色実験により生細胞＞９５％のものを用いる。トリプシン消化し、遠心分離して上清を除去し、ｍａｔｒｉｇｅｌで細胞濃度を１×１０７／ｍｌに調整する。細胞をヌードマウスの右わき下皮下に０．２ｍｌ／匹で接種し、接種１日目と記す。腫瘍が≧１００ｍｍ３まで成長すると、動物を無作為に各群６匹で５群に分け、モデル群、シクロホスファミド群、カリマイシン１２．５、２５および５０ｍｇ／ｋｇの３つの用量群である。各群の動物に連続して３０日間胃内投与し、投与体積は２０ｍｌ／ｋｇである。投与停止の翌日にマウスを屠殺し、指標を測定する。ヌードマウスへの投与開始から屠殺するまでの期間、２日ごとに腫瘍の長径、短径および体重を記録する。
【０２０６】
腫瘍体積および相対腫瘍増殖率の計算
２ｄごとにヌードマウスの体重および移植腫瘍の長径（ａ）、短径（ｂ）を測定し、下記の公式により、腫瘍体積（ｖ）、相対腫瘍体積（ＲＴＶ）および相対腫瘍増殖率（Ｔ／Ｃ）をそれぞれ計算する。このうちＶ＝ａ×ｂ２／２；ＲＴＶ＝Ｖ／Ｖ０（Ｖ０は投与前の腫瘍体積、Ｖは屠殺前の腫瘍体積）、Ｔ／Ｃ（％）＝治療群ＲＴＶ／モデル対照群ＲＴＶ×１００％である。
【０２０７】
腫瘍成長抑制率の計算
マウスの重さを量ってから屠殺し、腫瘍を完全に剥離し、血痕、脂肪など非腫瘍組織を除去して腫瘍重量を量り、腫瘍成長抑制率を計算する。各群マウスの平均腫瘍重量を治療効果の指標とする。腫瘍成長抑制率（％）＝（１−治療群の平均腫瘍重量／モデル群の平均腫瘍重量）×１００％。
【０２０８】
試験結果は、対照群と比較して、各投与群が腫瘍成長抑制率、腫瘍体積、相対腫瘍体積および相対腫瘍増殖率に対して、一定程度の抑制作用を有することを明確に示す（表２６、表２７）。
【０２０９】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の腫瘍成長抑制率は、それぞれ３８．４０％、５３．６７％および６９．５３％である。
【０２１０】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の腫瘍体積および相対腫瘍体積は、モデル群より明らかに低い（Ｐ＜０．０５）。
【０２１１】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の相対腫瘍増殖率は、それぞれ６２．２９％、４３．１６％および３１．３４％である。
【０２１２】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群における動物の体重は、モデル群と比較していずれも明らかな変化はない。
【０２１３】
【表２６】
0006959355.tif 000028
【０２１４】
【表２７】
0006959355.tif 000029
【０２１５】
１４、ヒト神経膠腫ヌードマウスモデルに対するカリマイシンの抑制作用
マウス固形腫瘍モデルの構築
対数期のＵ２５１細胞で、トリパンブルー染色実験により生細胞＞９５％のものを用いる。トリプシン消化し、遠心分離して上清を除去し、ｍａｔｒｉｇｅｌで細胞濃度を１×１０７／ｍｌに調整する。細胞をヌードマウスの右わき下皮下に０．２ｍｌ／匹で接種し、接種１日目と記す。腫瘍が≧１００ｍｍ３まで成長すると、動物を無作為に各群６匹で５群に分け、モデル群、シクロホスファミド群、カリマイシン１２．５、２５および５０ｍｇ／ｋｇの３つの用量群である。各群の動物に連続して３０日間胃内投与し、投与体積は２０ｍｌ／ｋｇである。投与停止の翌日にマウスを屠殺し、指標を測定する。ヌードマウスへの投与開始から屠殺するまでの期間、２日ごとに腫瘍の長径、短径および体重を記録する。
【０２１６】
腫瘍体積および相対腫瘍増殖率の計算
２ｄごとにヌードマウスの体重および移植腫瘍の長径（ａ）、短径（ｂ）を測定し、下記の公式により、腫瘍体積（ｖ）、相対腫瘍体積（ＲＴＶ）および相対腫瘍増殖率（Ｔ／Ｃ）をそれぞれ計算する。このうちＶ＝ａ×ｂ２／２；ＲＴＶ＝Ｖ／Ｖ０（Ｖ０は投与前の腫瘍体積、Ｖは屠殺前の腫瘍体積）、Ｔ／Ｃ（％）＝治療群ＲＴＶ／モデル対照群ＲＴＶ×１００％である。
【０２１７】
腫瘍成長抑制率の計算
マウスの重さを量ってから屠殺し、腫瘍を完全に剥離し、血痕、脂肪など非腫瘍組織を除去して腫瘍重量を量り、腫瘍成長抑制率を計算する。各群マウスの平均腫瘍重量を治療効果の指標とする。腫瘍成長抑制率（％）＝（１−治療群の平均腫瘍重量／モデル群の平均腫瘍重量）×１００％。
【０２１８】
試験結果は、対照群と比較して、各投与群が腫瘍成長抑制率、腫瘍体積、相対腫瘍体積および相対腫瘍増殖率に対して、一定程度の抑制作用を有することを明確に示す（表２８、表２９）。
【０２１９】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の腫瘍成長抑制率は、それぞれ６６．５１％、７９．５９％および８１．８２％である。
【０２２０】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の腫瘍体積および相対腫瘍体積は、モデル群より明らかに低い（Ｐ＜０．０５）。
【０２２１】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の相対腫瘍増殖率は、それぞれ８４．８１％、５６．３０％および３５．９０％である。
【０２２２】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群における動物の体重は、モデル群と比較していずれも明らかな変化はない。
【０２２３】
【表２８】
0006959355.tif 000030
【０２２４】
【表２９】
0006959355.tif 000031
【０２２５】
１５、ヒト神経膠芽腫ヌードマウスモデルに対するカリマイシンの抑制作用
マウス固形腫瘍モデルの構築
対数期のＡ１７２細胞で、トリパンブルー染色実験により生細胞＞９５％のものを用いる。トリプシン消化し、遠心分離して上清を除去し、ｍａｔｒｉｇｅｌで細胞濃度を１×１０７／ｍｌに調整する。細胞をヌードマウスの右わき下皮下に０．２ｍｌ／匹で接種し、接種１日目と記す。腫瘍が≧１００ｍｍ３まで成長すると、動物を無作為に各群６匹で５群に分け、モデル群、シクロホスファミド群、カリマイシン１２．５、２５および５０ｍｇ／ｋｇの３つの用量群である。各群の動物に連続して３０日間胃内投与し、投与体積は２０ｍｌ／ｋｇである。投与停止の翌日にマウスを屠殺し、指標を測定する。ヌードマウスへの投与開始から屠殺するまでの期間、２日ごとに腫瘍の長径、短径および体重を記録する。
【０２２６】
腫瘍体積および相対腫瘍増殖率の計算
２ｄごとにヌードマウスの体重および移植腫瘍の長径（ａ）、短径（ｂ）を測定し、下記の公式により、腫瘍体積（ｖ）、相対腫瘍体積（ＲＴＶ）および相対腫瘍増殖率（Ｔ／Ｃ）をそれぞれ計算する。このうちＶ＝ａ×ｂ２／２；ＲＴＶ＝Ｖ／Ｖ０（Ｖ０は投与前の腫瘍体積、Ｖは屠殺前の腫瘍体積）、Ｔ／Ｃ（％）＝治療群ＲＴＶ／モデル対照群ＲＴＶ×１００％である。
【０２２７】
腫瘍成長抑制率の計算
マウスの重さを量ってから屠殺し、腫瘍を完全に剥離し、血痕、脂肪など非腫瘍組織を除去して腫瘍重量を量り、腫瘍成長抑制率を計算する。各群マウスの平均腫瘍重量を治療効果の指標とする。腫瘍成長抑制率（％）＝（１−治療群の平均腫瘍重量／モデル群の平均腫瘍重量）×１００％。
【０２２８】
試験結果は、対照群と比較して、各投与群が腫瘍成長抑制率、腫瘍体積、相対腫瘍体積および相対腫瘍増殖率に対して、一定程度の抑制作用を有することを明確に示す（表３０、表３１）。
【０２２９】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の腫瘍成長抑制率は、それぞれ４６．９５％、６６．８４％および７６．２６％である。
【０２３０】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の腫瘍体積および相対腫瘍体積は、モデル群より明らかに低い（Ｐ＜０．０５）。
【０２３１】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の相対腫瘍増殖率は、それぞれ６８．６２％、５５．９１％および３８．５３％である。
【０２３２】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群における動物の体重は、モデル群と比較していずれも明らかな変化はない。
【０２３３】
【表３０】
0006959355.tif 000032
【０２３４】
【表３１】
0006959355.tif 000033
【０２３５】
１６、ヒト膵臓腺癌ヌードマウスモデルに対するカリマイシンの抑制作用
マウス固形腫瘍モデルの構築
対数期のＰＡＮＣ−１細胞で、トリパンブルー染色実験により生細胞＞９５％のものを用いる。トリプシン消化し、遠心分離して上清を除去し、ｍａｔｒｉｇｅｌで細胞濃度を１×１０７／ｍｌに調整する。細胞をヌードマウスの右わき下皮下に０．２ｍｌ／匹で接種し、接種１日目と記す。腫瘍が≧１００ｍｍ３まで成長すると、動物を無作為に各群６匹で５群に分け、モデル群、シクロホスファミド群、カリマイシン１２．５、２５および５０ｍｇ／ｋｇの３つの用量群である。各群の動物に連続して３０日間胃内投与し、投与体積は２０ｍｌ／ｋｇである。投与停止の翌日にマウスを屠殺し、指標を測定する。ヌードマウスへの投与開始から屠殺するまでの期間、２日ごとに腫瘍の長径、短径および体重を記録する。
【０２３６】
腫瘍体積および相対腫瘍増殖率の計算
２ｄごとにヌードマウスの体重および移植腫瘍の長径（ａ）、短径（ｂ）を測定し、下記の公式により、腫瘍体積（ｖ）、相対腫瘍体積（ＲＴＶ）および相対腫瘍増殖率（Ｔ／Ｃ）をそれぞれ計算する。このうちＶ＝ａ×ｂ２／２；ＲＴＶ＝Ｖ／Ｖ０（Ｖ０は投与前の腫瘍体積、Ｖは屠殺前の腫瘍体積）、Ｔ／Ｃ（％）＝治療群ＲＴＶ／モデル対照群ＲＴＶ×１００％である。
【０２３７】
腫瘍成長抑制率の計算
マウスの重さを量ってから屠殺し、腫瘍を完全に剥離し、血痕、脂肪など非腫瘍組織を除去して腫瘍重量を量り、腫瘍成長抑制率を計算する。各群マウスの平均腫瘍重量を治療効果の指標とする。腫瘍成長抑制率（％）＝（１−治療群の平均腫瘍重量／モデル群の平均腫瘍重量）×１００％。
【０２３８】
試験結果は、対照群と比較して、各投与群が腫瘍成長抑制率、腫瘍体積、相対腫瘍体積および相対腫瘍増殖率に対して、一定程度の抑制作用を有することを明確に示す（表３２、表３３）。
【０２３９】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の腫瘍成長抑制率は、それぞれ５６．２７％６２．６６％および７５．９４％である。
【０２４０】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の腫瘍体積および相対腫瘍体積は、モデル群より明らかに低い（Ｐ＜０．０５）。
【０２４１】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の相対腫瘍増殖率は、それぞれ７４．１０％、４７．０１％および３５．５５％である。
【０２４２】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群における動物の体重は、モデル群と比較していずれも明らかな変化はない。
【０２４３】
【表３２】
0006959355.tif 000034
【０２４４】
【表３３】
0006959355.tif 000035
【０２４５】
１７、ヒト食道癌ヌードマウスモデルに対するカリマイシンの抑制作用
マウス固形腫瘍モデルの構築
対数期のＴＥ−１細胞で、トリパンブルー染色実験により生細胞＞９５％のものを用いる。トリプシン消化し、遠心分離して上清を除去し、ｍａｔｒｉｇｅｌで細胞濃度を１×１０７／ｍｌに調整する。細胞をヌードマウスの右わき下皮下に０．２ｍｌ／匹で接種し、接種１日目と記す。腫瘍が≧１００ｍｍ３まで成長すると、動物を無作為に各群６匹で５群に分け、モデル群、シクロホスファミド群、カリマイシン１２．５、２５および５０ｍｇ／ｋｇの３つの用量群である。各群の動物に連続して３０日間胃内投与し、投与体積は２０ｍｌ／ｋｇである。投与停止の翌日にマウスを屠殺し、指標を測定する。ヌードマウスへの投与開始から屠殺するまでの期間、２日ごとに腫瘍の長径、短径および体重を記録する。
【０２４６】
腫瘍体積および相対腫瘍増殖率の計算
２ｄごとにヌードマウスの体重および移植腫瘍の長径（ａ）、短径（ｂ）を測定し、下記の公式により、腫瘍体積（ｖ）、相対腫瘍体積（ＲＴＶ）および相対腫瘍増殖率（Ｔ／Ｃ）をそれぞれ計算する。このうちＶ＝ａ×ｂ２／２；ＲＴＶ＝Ｖ／Ｖ０（Ｖ０は投与前の腫瘍体積、Ｖは屠殺前の腫瘍体積）、Ｔ／Ｃ（％）＝治療群ＲＴＶ／モデル対照群ＲＴＶ×１００％である。
【０２４７】
腫瘍成長抑制率の計算
マウスの重さを量ってから屠殺し、腫瘍を完全に剥離し、血痕、脂肪など非腫瘍組織を除去して腫瘍重量を量り、腫瘍成長抑制率を計算する。各群マウスの平均腫瘍重量を治療効果の指標とする。腫瘍成長抑制率（％）＝（１−治療群の平均腫瘍重量／モデル群の平均腫瘍重量）×１００％。
【０２４８】
試験結果は、モデル群と比較して、各投与群が腫瘍成長抑制率、腫瘍体積、相対腫瘍体積および相対腫瘍増殖率に対して、一定程度の抑制作用を有することを明確に示す（表３４、表３５）。
【０２４９】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の腫瘍成長抑制率は、それぞれ４６．７１％、６１．４８％および７０．４１％である。
【０２５０】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の腫瘍体積および相対腫瘍体積は、モデル群より明らかに低い（Ｐ＜０．０５）。
【０２５１】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の相対腫瘍増殖率は、それぞれ６４．７９％、４６．０３％および３７．０２％である。
【０２５２】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群における動物の体重は、モデル群と比較していずれも明らかな変化はない。
【０２５３】
【表３４】
0006959355.tif 000036
【０２５４】
【表３５】
0006959355.tif 000037
【０２５５】
１８、ヒト胃腺癌ヌードマウスモデルに対するカリマイシンの抑制作用
マウス固形腫瘍モデルの構築
対数期のＳＧＣ７９０１細胞で、トリパンブルー染色実験により生細胞＞９５％のものを用いる。トリプシン消化し、遠心分離して上清を除去し、ｍａｔｒｉｇｅｌで細胞濃度を１×１０７／ｍｌに調整する。細胞をヌードマウスの右わき下皮下に０．２ｍｌ／匹で接種し、接種１日目と記す。腫瘍が≧１００ｍｍ３まで成長すると、動物を無作為に各群６匹で５群に分け、モデル群、シクロホスファミド群、カリマイシン１２．５、２５および５０ｍｇ／ｋｇの３つの用量群である。各群の動物に連続して３０日間胃内投与し、投与体積は２０ｍｌ／ｋｇである。投与停止の翌日にマウスを屠殺し、指標を測定する。ヌードマウスへの投与開始から屠殺するまでの期間、２日ごとに腫瘍の長径、短径および体重を記録する。
【０２５６】
腫瘍体積および相対腫瘍増殖率の計算
２ｄごとにヌードマウスの体重および移植腫瘍の長径（ａ）、短径（ｂ）を測定し、下記の公式により、腫瘍体積（ｖ）、相対腫瘍体積（ＲＴＶ）および相対腫瘍増殖率（Ｔ／Ｃ）をそれぞれ計算する。このうちＶ＝ａ×ｂ２／２；ＲＴＶ＝Ｖ／Ｖ０（Ｖ０は投与前の腫瘍体積、Ｖは屠殺前の腫瘍体積）、Ｔ／Ｃ（％）＝治療群ＲＴＶ／モデル対照群ＲＴＶ×１００％である。
【０２５７】
腫瘍成長抑制率の計算
マウスの重さを量ってから屠殺し、腫瘍を完全に剥離し、血痕、脂肪など非腫瘍組織を除去して腫瘍重量を量り、腫瘍成長抑制率を計算する。各群マウスの平均腫瘍重量を治療効果の指標とする。腫瘍成長抑制率（％）＝（１−治療群の平均腫瘍重量／モデル群の平均腫瘍重量）×１００％。
【０２５８】
試験結果は、対照群と比較して、各投与群が腫瘍成長抑制率、腫瘍体積、相対腫瘍体積および相対腫瘍増殖率に対して、一定程度の抑制作用を有することを明確に示す（表３６、表３７）。
【０２５９】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の腫瘍成長抑制率は、それぞれ４２．５１％、６８．９２％および７４．４９％である。
【０２６０】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の腫瘍体積および相対腫瘍体積は、モデル群より明らかに低い（Ｐ＜０．０５）。
【０２６１】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群の相対腫瘍増殖率は、それぞれ６９．１２％、４７．８８％および３８．３５％である。
【０２６２】
カリマイシンの低、中、高３つの用量群における動物の体重は、モデル群と比較していずれも明らかな変化はない。
【０２６３】
【表３６】
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【０２６４】
【表３７】
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【０２６５】
１９、マウスＨ２２肝癌およびマウスＬｅｗｉｓ肺癌移植腫瘍に対する抑制作用
マウス固形腫瘍モデルの構築
液体窒素で凍結保存したＨ２２細胞株を昆明マウス体内で起こし、３代後腹水を採取する。５０ｍｌ遠沈管に入れ、１０ｍｌの０．９％生理食塩水を添加し、１０００ｒｐｍ、室温で５ｍｉｎ遠心分離して、上清を捨てる。１０ｍｌの０．９％生理食塩水を添加し、ピペットで吹き付けて均一に混合し、カウント後、生理食塩水で５×１０６生細胞／ｍｌに希釈する。氷水中で保存し、７５％エタノールでマウスの右わき下皮膚を消毒する。昆明マウスの右前足のわき下皮下に、各匹０．２ｍｌを迅速に接種する。
【０２６６】
Ｌｅｗｉｓ肺癌細胞を、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養する。対数期の細胞を用い、０．２５％パンクレアチンで消化し、細胞を集め、遠心分離して上清を除去し、滅菌生理食塩水で２回洗浄する。細胞を生理食塩水中に懸濁させ、トリパンブルー染色で細胞活力を測定し、９５％より高いと細胞のカウントを行う。Ｌｅｗｉｓ細胞の濃度を１×１０７／ｍＬに調整し、氷水中で保存する。７５％エタノールでマウスの右わき下皮膚を消毒し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右わき部に０．２ｍＬを皮下注射で迅速に接種する。
【０２６７】
動物の群分けおよび投与方法
Ｈ２２肝癌モデルにおいて、接種の翌日、腫瘍を接種したマウスを無作為に各群１０匹で群分けする。モデル対照群、陽性薬シクロホスファミド対照群（ＣＴＸ、２６ｍｇ／ｋｇ）、カリマイシン１３、２６および５３ｍｇ／ｋｇの３つの用量群を含む。各群動物に連続して７日間胃内投与し、投与体積は２０ｍｌ／ｋｇである。
【０２６８】
Ｌｅｗｉｓ肺癌モデルにおいて、接種の翌日、腫瘍を接種したマウスを無作為に各群１０匹で群分けする。モデル対照群、陽性薬シクロホスファミド対照群（ＣＴＸ、３０ｍｇ／ｋｇ）、カリマイシン１３、２６および５２ｍｇ／ｋｇの３つの用量群を含む。各群の動物に連続して１５日間胃内投与し、投与体積は２０ｍｌ／ｋｇである。
【０２６９】
腫瘍抑制率の計算：
担癌マウスに最後の投与を行った翌日、重さを量ってから屠殺し、皮下腫瘍を解剖して重さを量り、各群の平均腫瘍重量をそれぞれ計算し、腫瘍抑制率を計算する。
腫瘍抑制率＝（１−Ｔ／Ｃ）×１００％
Ｔ：投与群の平均腫瘍重量；Ｃ：ブランク対照群の平均腫瘍重量。
【０２７０】
結果：
１．マウスＨ２２肝癌移植腫瘍に対するカリマイシンの抑制作用
表３８の結果から、昆明マウスＨ２２肝癌に対する陽性対照薬シクロホスファミドの腫瘍抑制率は４７．２５％であることがわかる。カリマイシン２６および５２ｍｇ／ｋｇは、マウスＨ２２肝癌の成長に対して明らかな抑制作用を有し、腫瘍抑制率はそれぞれ５０．６７％および７９．５０％であるが、カリマイシン５２ｍｇ／ｋｇ用量群の腫瘍抑制率は、陽性対照群より明らかに低い（Ｐ＜０．０５）。
【０２７１】
陽性薬シクロホスファミド群は正常対照群と比較して、体重がやや低下する。カリマイシンの各投与群における動物の体重は、投与前と比較していずれも幾分増加し、モデル対照群と比較して明らかな差はない。
【０２７２】
【表３８】
0006959355.tif 000040
【０２７３】
２．マウスＬｅｗｉｓ肺癌移植腫瘍に対するカリマイシンの抑制作用
表３９の結果から、マウスＬｅｗｉｓ肺癌に対する陽性対照薬シクロホスファミドの腫瘍抑制率は４９．１４％であることがわかる。カリマイシン１３、２６および５２ｍｇ／ｋｇは、マウスＬｅｗｉｓ肺癌の成長に対して明らかな抑制作用を有し、腫瘍抑制率はそれぞれ５０．３０％、５５．８８％および７６．２３％であり、カリマイシン５２ｍｇ／ｋｇ用量群の腫瘍抑制率は陽性対照群より明らかに低い（Ｐ＜０．０５）。カリマイシンの各投与群における動物の体重は、投与前と比較していずれも幾分増加し、モデル対照群と比較して明らかな差はない。
【０２７４】
【表３９】
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【０２７５】
２０、担癌マウスの免疫機能に対するカリマイシンの影響
方法
１、担癌マウスの胸腺インデックスおよび脾臓インデックスに対する影響
担癌マウスを屠殺後、脾臓および胸腺を採取して重さを量り、脾臓インデックスおよび胸腺インデックスを計算する。
【０２７６】
２、担癌マウスのリンパ細胞増殖活性およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性に対する影響
２．１  脾リンパ細胞の調製
シャーレに無血清のＲＰＭＩ１６４０培地を入れ、氷上に置く。無菌で脾臓を採取し、滅菌スライドガラスで脾臓を軽くすり潰し、細胞懸濁液を作製する。２層滅菌ガーゼでろ過し、無血清のＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄し、１５００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離して上清液を除去する。赤血球溶解液を２ｍＬ添加し、２ｍｉｎ静置し、ＲＰＭＩ１６４０培地を８ｍＬ添加する。１５００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離して上清液を除去し、ＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄する。トリパンブルー染色で生細胞をカウントすると、生細胞＞９５％である。体積で１０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で細胞懸濁液を作製する。
【０２７７】
２．２  脾リンパ細胞の増殖活性測定
脾細胞懸濁液を用い、細胞密度を１×１０７／ｍＬに調整する。各マウスに、Ａ．対照ウェル：ＲＰＭＩ１６４０培地１００μｌを添加；Ｂ．コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）刺激ウェル：コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）溶液１００μＬ（１０ｍｇ／Ｌ）を添加；Ｃ．細菌内毒素（ＬＰＳ）刺激ウェル：細菌内毒素（ＬＰＳ）溶液を１００μＬ（２０ｍｇ／Ｌ）添加、を設定する。上記細胞を９６ウェルプレート中に添加し、その後以上の各ウェルに１００μＬの脾細胞懸濁液を添加する。培養プレートを体積で５％のＣＯ２、３７℃、飽和湿度条件下に移し、７２ｈ培養した後、各ウェルにＭＴＴ溶液（５ｇ／Ｌ）を１０μＬ添加し、同様の条件で引き続き４ｈ培養してから培養を終了する。溶解液（ＳＤＳ１０ｇ、０．１ｍＬの１０ＭＨＣｌ、イソブタノール５ｍＬを蒸留水で１００ｍＬに希釈する）を１００μｌ添加し、１０ｍｉｎ振盪させ、結晶を充分に溶解させて５７０ｎｍ部分の各ウェルの吸光度（ＯＤ）値を測定し、リンパ細胞増殖率を計算する。リンパ細胞増殖率（％）＝［（Ｔ−Ｃ）／Ｃ］×１００％、式中Ｔは刺激ウェルの吸光度値、Ｃは対照ウェルの吸光度値である。
【０２７８】
２．３  ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性測定
脾細胞懸濁液を用い、細胞密度を１×１０７／ｍＬ（エフェクター細胞）に調整する。Ｋ５６２細胞懸濁液を調製し、細胞密度は１×１０５／ｍＬ（標的細胞）である。各マウスに、Ａ．エフェクター細胞：標的細胞のウェル（数量比は２０：１）、脾細胞懸濁液２０μＬおよびＫ５６２細胞懸濁液１００μＬを添加；Ｂ．エフェクター細胞対照ウェル、脾細胞懸濁液１００μＬおよびＲＰＭＩ１６４０培地１００μＬを添加；Ｃ．標的細胞対照ウェル、Ｋ５６２細胞懸濁液１００μＬおよびＲＰＭＩ１６４０培地１００μＬを添加、を設定する。上記細胞を９６ウェルプレートに添加し、培養プレートを体積で５％のＣＯ２、３７℃、飽和湿度条件下に移して２２ｈ培養した後、各ウェルにＭＴＴ溶液（５ｇ／Ｌ）を１０μＬ添加し、同様の条件で引き続き４ｈ培養してから培養を終了する。溶解液（ＳＤＳ１０ｇ、０．１ｍＬの１０ＭＨＣｌ、イソブタノール５ｍＬを蒸留水で１００ｍＬに希釈する）を１００μｌ添加し、１０ｍｉｎ振盪させ、結晶を充分に溶解させて４９０ｎｍ部分の各ウェルの吸光度値を測定し、ＮＫ細胞活性を計算する。ＮＫ細胞活性（％）＝［ＴＯ−（Ｓ−Ｅ）］／ＴＯ×１００％、式中ＴＯは標的細胞対照ウェルの吸光度値、Ｓはエフェクター細胞対照ウェルの吸光度値、Ｅはエフェクター細胞の吸光度値である。
【０２７９】
結果
１、Ｈ２２肝癌担癌マウスの胸腺インデックスおよび脾臓インデックスに対する影響
表４０の結果から、陽性対照薬シクロホスファミド群の動物の胸腺インデックスおよび脾臓インデックスは、対照群と比較して顕著に低下する（Ｐ＜０．０１）ことがわかる。カリマイシン１３、２６および５２ｍｇ／ｋｇ群の動物の胸腺インデックスは、対照群と比較して明らかな変化はなく、５２ｍｇ／ｋｇ群の動物の脾臓インデックスは、対照群と比較して明らかに増加する（Ｐ＜０．０５）。
【０２８０】
【表４０】
0006959355.tif 000042
【０２８１】
２、Ｌｅｗｉｓ肺癌担癌マウスの胸腺インデックスおよび脾臓インデックスに対する影響
表４１の結果から、陽性対照薬シクロホスファミド群の動物の脾臓インデックスは、対照群と比較して顕著に低下する（Ｐ＜０．０１）ことがわかる。カリマイシン１３、２６および５２ｍｇ／ｋｇ群の動物の脾臓インデックスおよび胸腺インデックスは、対照群と比較して明らかな変化はない。
【０２８２】
【表４１】
0006959355.tif 000043
【０２８３】
３、Ｌｅｗｉｓ肺癌担癌マウスのＮＫ細胞活性に対する影響
表４２の結果から、陽性対照薬シクロホスファミド群の動物のＮＫ細胞活性は、対照群と比較して顕著に低下する（Ｐ＜０．０５）ことがわかる。カリマイシン１３、２６ｍｇ／ｋｇ群の動物のＮＫ細胞活性は、対照群と比較して明らかに増加する（Ｐ＜０．０１）。
【０２８４】
【表４２】
0006959355.tif 000044
【０２８５】
４、Ｌｅｗｉｓ肺癌担癌マウスのリンパ細胞増殖活性に対する影響
表４３の結果から、陽性対照薬シクロホスファミド群の動物のリンパ細胞活性は、明らかに抑制される（Ｐ＜０．０５）ことがわかる。カリマイシン１３、２６ｍｇ／ｋｇ群の動物のリンパ細胞活性は、対照群と比較して明らかに増加する（Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０１）。
【０２８６】
【表４３】
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【０２８７】
５、Ａ５４９肺癌担癌マウスの脾臓インデックスに対する影響
表４４の結果から、陽性対照薬シクロホスファミド群の動物の脾臓インデックスは、対照群と比較して顕著に低下する（Ｐ＜０．０１）ことがわかる。カリマイシン１３、２６および５２ｍｇ／ｋｇ群の動物の脾臓インデックスは、対照群と比較して明らかな変化はない。
【０２８８】
【表４４】
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【０２８９】
試験例３、臨床試験
本発明は、臨床症例を複数集めている。乳腺癌を患うある患者は、疼痛症状が重い。カリマイシン錠（実施例１で調製）を２クール（３０日を１クール、毎日２錠内服する）服用すると、主治医は腫瘤が小さくなったと診断した。患者本人も疼痛が軽減したと感じ、精神状態は良好である。
【０２９０】
腎淡明細胞癌を患うある患者は、画像により腎部に影があり、腎部の腫瘍は左腎面積の三分の二を占めると診断され、病理結果は早期の腎淡明細胞癌である。カリマイシン錠（実施例１で調製）を２クール（３０日を１クール、毎日２錠内服する）服用すると、主治医は腎部の腫瘍面積が小さくなったと診断し、明らかに好転した。
【０２９１】
神経膠腫を患うある患者は、脳組織が浸潤により破壊され、周囲の脳浮腫も顕著であり、頭痛、視力減退などの症状を有する。カリマイシン錠（実施例１で調製）を２クール（３０日を１クール、毎日２錠内服する）服用すると、主治医は水腫が軽減したと診断し、患者も症状が軽減したと感じ、明らかに好転した。
【０２９２】
リンパ腫を患うある患者は、頚部リンパ節腫脹と診断され、ナツメのような大きさで、中程度の硬さで、比較的膨満している。カリマイシン錠（実施例１で調製）を３クール（３０日を１クール、毎日２錠内服する）服用すると、主治医はリンパ節腫脹が軽減したと診断し、大豆大に変化した。患者も症状が軽減したと感じ、硬いと感じず、明らかに好転した。
【０２９３】
結腸癌を患うある患者は、腫瘍であるか、または網膜、末梢組織に浸潤した腫瘤であると診断され、硬く、形体は不規則である。カリマイシン錠（実施例１で調製）を１クール（３０日を１クール、毎日２錠を内服する）服用すると、主治医は腫瘤が軽減したと判断し、患者は明らかに好転したと感じる。
【０２９４】
白血病を患うある患者は、様々な程度の貧血、出血、感染性発熱、さらに肝臓、脾臓、リンパ節腫脹および骨格疼痛を有する。カリマイシン錠（実施例１で調製）を３クール（３０日を１クール、毎日２錠内服する）服用すると、主治医は症状が軽減したと診断し、患者は明らかに好転したと感じる。
【０２９５】
胃腺癌を患うある患者は、胃が何となく痛み、胃内で物が発酵しているようで、膨張を感じる。さらに胃酸が時々咽喉に流れることにより、喉が熱く吐き気を催し、身体が発熱して冷や汗が吹き出すため、病院で検査すると、胃腺癌を発症していた。カリマイシン錠（実施例１で調製）を３クール（３０日を１クール、毎日２錠内服する）服用すると、主治医は症状が軽減したと診断し、患者は明らかに好転したと感じる。
【０２９６】
食道癌を患うある患者は、食道バリウムミールＸ線により食道が狭く、食道壁が滑らかでなく、粘膜が破壊されていることを確認することができ、患者は進行性嚥下障害を感じる。カリマイシン錠（実施例１で調製）を２クール（３０日を１クール、毎日２錠を内服する）服用すると、主治医は症状が軽減したと診断し、患者は明らかに好転したと感じる。
【０２９７】
膵臓腺癌を患っていると診断されたある患者は、四肢の力が無く、食欲不振で吐き気、嘔吐、下痢を伴う。カリマイシン錠（実施例１で調製）を２クール（３０日を１クール、毎日２錠内服する）服用すると、主治医は症状が軽減したと判断し、患者は明らかに好転したと感じる。
【０２９８】
前立腺癌を患っていると診断されたある患者には、次第に増大する前立腺の腺体が患者の尿道を圧迫して進行性の排尿障害が生じている。尿が細い、射程が短い、尿流が遅い、尿流が途切れる、排尿後尿滴下、膀胱テネスムス、排尿に力がいる、などが現れ、このほか頻尿、尿切迫感、夜間頻尿、さらには尿失禁などもある。腫瘍が直腸を圧迫して、大便障害または腸閉塞が生じている。カリマイシン錠（実施例１で調製）を２クール服用すると、主治医は症状が軽減したと診断し、患者は明らかに好転したと感じる。
【０２９９】
肺癌、肝癌、転移した骨肉腫末期のある患者は、嘔吐、咳、骨痛により入院した。カリマイシン錠（実施例１で調製）を４箱服用すると、検査により肺の腫瘍が石灰化し、肺腫瘍が消失したことがわかった。
【０３００】
肺癌を患うある患者は、右肺上葉に末梢型の占拠性病変があり、呼吸困難、激しい咳により診察を受けた。ＣＴ検査によると、右肺上葉の末梢型病変が４．３×４．６の類円形の塊の影であり、その後さらに造影ＣＴを行うと、塊は４．０×４．４で、その他の変化は大きくない。カリマイシンを服用し、カリマイシン２錠（実施例１で調製）／日×１４日、その後１錠／日で現在まで続け、補助的に仔ウシ胸腺ペプチド６粒／日も加えた。ＣＴ検査によると、類円形の塊の影は明らかに小さくなったことが確認でき、患者の精神状態は良好で、不快感はない。
【０３０１】
子宮頸癌を患うある患者は、すでに肺、骨、腸のその他の部位に転移し、ＣＴ検査で肺部に胸水および複数の結節が確認され、呼吸困難、発熱がある。すでに化学、放射線療法を行っており、後にカリマイシン錠（実施例１で調製）を２クール服用すると、ＣＴによる再検査で胸水は消失し、結節は小さくなった。
【０３０２】
試験例４、毒性試験
１、急性毒性試験
１．１  試験の目的
イヌにカリマイシンを１度強制投与して、毒性反応の程度、死亡状況および半数致死量ＬＤ５０を測定し、慢性毒性試験の参考とする。
【０３０３】
１．２  試験薬物
名称：カリマイシン
力価：９２７Ｕ／ｍｇ
調製方法：適量を秤取して粉末になるまで磨砕し、適量の０．５％カルボキシメチルセルロース溶液を添加する。続けて撹拌して均一に混合し、１００ｍｇ／ｍｌに調製したものを内服投与する。
溶媒：０．５％カルボキシメチルセルロース
【０３０４】
１．３  動物：イヌ
供給源：中国医学科学院阜外心血管病医院動物飼育場
種属：交雑種
合格証番号：京動管犬字（９６）第０２４号
体重：１５〜２０キログラム
性別：オス
絶食期間：１２時間
各群の動物数：１〜２匹
【０３０５】
１．４  試験方法
暫定的な予備試験で、イヌに２０００ｍｇ／ｋｇおよび３０００ｍｇ／ｋｇを内服により胃内投与しても動物は死亡せず、深刻な毒性反応もない。新薬のガイドラインに応じて、薬量を５０％増加させ、すなわち４５００ｍｇ／ｋｇに増やす。体重に応じてカリマイシンの使用量を秤取し、０．５％ＣＭＣと十分に混合し、胃管を用いて胃内に内服投与（試験前は一晩絶食する）する。投与後、毒性反応および死亡状況を観察する。
【０３０６】
１．５  イヌの内服による急性毒性
１．５．１  毒性反応
予備試験の用量は２０００ｍｇ／ｋｇおよび３０００ｍｇ／ｋｇであり、一度胃内投与すると、一時的な嘔吐反応のみが現れ、薬液の残渣、胃液および食物残渣を吐出した。嘔吐反応以外に、その他の毒性反応はない。本試験時、２匹の犬にそれぞれ４５００ｍｇ／ｋｇを内服させると、毒性反応は依然として嘔吐など消化管症状が現れ、下痢または軟便はない。さらに嘔吐反応後、その他の明らかな毒性症状はない。
【０３０７】
１．５．２  半数致死量
２回の予備試験での胃内投与用量は２０００ｍｇ／ｋｇおよび３０００ｍｇ／ｋｇであり、嘔吐などの消化管症状のみが現れた。新薬審査認可のガイドラインに基づくと、５０％漸増法の要求に応じて、本試験の用量は４５００ｍｇ／ｋｇである。胃内投与後の２匹の犬に嘔吐反応が現れ、その他の毒性反応はない。イヌへのカリマイシンの内服投与において、ＬＤ５０＞４５００ｍｇ／ｋｇである。
【０３０８】
【表４５】
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【０３０９】
２、げっ歯類動物に対するカリマイシンの小核試験
２．１  試験の目的
測定薬物の哺乳動物体細胞に対する突然変異の潜在性は、臨床薬に根拠を提供する。
【０３１０】
２．２  試験薬物
名称：カリマイシン
含有量：力価９２７Ｕ／ｍｇ
調製方法：用量に応じて、適量のカリマイシン微粉を乳鉢に秤取して磨砕し、適量の０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム溶液を添加して懸濁液を作製し、４℃の冷蔵庫で保存する。陰性対照は同量の０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム溶液を用いる。陽性対照は適量の注射用シクロホスファミドを秤取し、使用する際に生理食塩水中に溶解し、６０ｍｇ／ｋｇの溶液を調製する。
溶媒、賦形剤：生理食塩水、０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム溶液
対照品：陽性対照：６０ｍｇ／ｋｇシクロホスファミド溶液
陰性対照：０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム
【０３１１】
２．３  動物
成体オスＮＩＨマウスを用いる。中国薬品生物製品検定所から提供されたもの。
【０３１２】
２．４  試験方法
各群６匹のマウスを用いる。予備実験で用量、投与回数、骨髄のサンプリング時間を選択する。
【０３１３】
【表４６】
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【０３１４】
用量は１／２ＬＤ５０を基準として漸減させる。投与回数は１回であり、予備試験結果に基づいて、骨髄のサンプリング時間は２４時間を選択する。
【０３１５】
２．４．１  用量
少なくとも３つの用量群であり、それぞれ２０００ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇである。
用量比：０．５
投与回数：１度経口投与する。
【０３１６】
２．４．２  手段
内服（胃内）投与。
【０３１７】
２．４．３  骨髄のサンプリング時間：投与後２４時間。
【０３１８】
２．４．４  標本の作製：動物を屠殺し、塗抹、固定、染色する。
【０３１９】
２．４．５  方法：
頸椎脱臼法で動物を屠殺し、胸骨を採取して、筋肉をきれいにそぎ落とし、ガーゼで付着物をきれいに拭う。骨髄を直接塗抹標本とすることを採用する。胸骨を切り、骨髄腔を露出させ、事前に仔牛血清を一滴落としたスライドグラスに骨髄を押し出して混合し、引きガラス法で塗抹する。乾かした後、メタノール中で１０分間固定し、乾かした後、Ｇｉｅｍｓａ染色を行う。各マウスで赤血球の輪郭が完全な１０００個前後の多染性赤血球を顕微鏡観察し、小核が出現した頻度および多染性赤血球の赤血球に占める割合を計算する。
【０３２０】
２．５  カリマイシンのマウス多染性赤血球小核試験についての結果を下表に示す
２．５．１  多染性赤血球の小核出現率
【０３２１】
【表４７】
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【０３２２】
２．５．２  多染性赤血球および正常赤血球の比率
【０３２３】
【表４８】
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【０３２４】
２．５．３  マウス骨髄多染性赤血球の小核に対するカリマイシンの影響
【０３２５】
【表４９】
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【０３２６】
Ｈｅｄｄｌｅらは、１６種のマウス骨髄多染性赤血球の小核出現率が３．１％であると報告している。本発明の研究において、陰性対照群の平均値は２．６３‰であり、カリマイシン薬物の３つの用量群については、陰性対照群と比較して、多染性赤血球の小核率は明らかな増加はない（Ｐ＞０．０５）。多染性赤血球および正常赤血球の比率は明らかな減少はなく、変動は正常範囲である。シクロホスファミド陽性対照群は陰性対照群と比較して、多染性赤血球の小核が非常に顕著に増加し（Ｐ＜０．０１）、その小核率は陰性対照群の１６．８５倍である。
【０３２７】
２．６  結論
以上の結果は、カリマイシンが染色体異常誘発剤でないことを明確に示す。使用する用量では、細胞の正常な有糸分裂に影響を及ぼさず、骨髄に対する抑制作用はない。
【０３２８】
以上の記載は本発明の好ましい実施例に過ぎず、本発明をどのような形式でも制限しない。本発明を好ましい実施例により上記のように開示したが、本発明を限定するものではない。当業者は本発明の技術案を逸脱しない範囲内で、上記の開示した技術内容を利用して、同等に変化した同等の実施例に変更または修正することができるが、いずれも本発明の技術案の内容を逸脱しない。本発明の技術的本質に基づき、以上の実施例に対して行う簡単な修正、同等な変化および修飾は、いずれも依然として本発明案の範囲内に属する。
【図１】
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