(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
油滴（ｌｉｐｉｄ  ｄｒｏｐｌｅｔ）に結合可能なアミノ酸配列（第１アミノ酸配列）と、疎水性化合物を合成する酵素活性を有するアミノ酸配列（第２アミノ酸配列）とを有し、前記第１アミノ酸配列と第２アミノ酸配列とがリンカー配列（第３アミノ酸配列）を介して融合しており、第２アミノ酸配列の酵素活性が保持されており、
前記第２アミノ酸配列が、プレニルトランスフェラーゼｆａｍｉｌｙに属するタンパク質由来のアミノ酸配列であり、
前記第１アミノ酸配列が、油滴に結合可能なタンパク質かつ、ＣｌａｓｓＩＩに属するタンパク質由来のアミノ酸配列である融合タンパク質。
【請求項２】
前記第１アミノ酸配列が、ｌｉｐｉｄ−ｄｒｏｐｌｅｔ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＬＤＡＰ）／ｓｍａｌｌ  ｒｕｂｂｅｒ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＲＰＰ）ｆａｍｉｌｙに属するタンパク質由来のアミノ酸配列である請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記第１アミノ酸配列が、植物由来のＬＤＡＰ／ＳＲＰＰｆａｍｉｌｙに属するタンパク質由来のアミノ酸配列である請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記第１アミノ酸配列が、Ｐｅｒｓｅａ属、Ｈｅｖｅａ属、及びＴａｒａｘａｃｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物由来のＬＤＡＰ／ＳＲＰＰｆａｍｉｌｙに属するタンパク質由来のアミノ酸配列である請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記第１アミノ酸配列が、アボカド、パラゴムノキ、及びロシアンタンポポからなる群より選択される少なくとも１種の植物由来のＬＤＡＰ／ＳＲＰＰｆａｍｉｌｙに属するタンパク質由来のアミノ酸配列である請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記第２アミノ酸配列が、シス型プレニルトランスフェラーゼｆａｍｉｌｙに属するタンパク質由来のアミノ酸配列である請求項１〜５のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記第２アミノ酸配列が、Ｈｅｖｅａ属又はＴａｒａｘａｃｕｍ属に属する植物由来のシス型プレニルトランスフェラーゼｆａｍｉｌｙに属するタンパク質由来のアミノ酸配列である請求項１〜５のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記第３アミノ酸配列が、４個以上のアミノ酸からなる配列である請求項１〜７のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記第３アミノ酸配列が、２０〜３０個のアミノ酸からなる配列である請求項１〜７のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記第３アミノ酸配列が、下記［１］〜［３］のいずれかのアミノ酸配列である請求項１〜７のいずれかに記載の融合タンパク質。
［１］配列番号５で表されるアミノ酸配列
［２］配列番号５で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列
［３］配列番号５で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
【請求項１１】
前記第３アミノ酸配列が、切断される予定のない配列である請求項１〜７のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の融合タンパク質を油滴（ｌｉｐｉｄ  ｄｒｏｐｌｅｔ）に結合させ、第２アミノ酸配列が有する酵素活性により生成物を油滴内に蓄積させる物質製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする遺伝子を導入したベクター。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換細胞。
【請求項１５】
請求項１４記載の形質転換細胞を使用して、第２アミノ酸配列が有する酵素活性により生成物を細胞内の油滴内に蓄積させる物質製造方法。
【請求項１６】
請求項１２又は１５に記載の物質製造方法によりポリイソプレノイドを製造するポリイソプレノイド製造工程、得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び前記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法。
【請求項１７】
請求項１２又は１５に記載の物質製造方法によりポリイソプレノイドを製造するポリイソプレノイド製造工程、得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び前記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、融合タンパク質、物質製造方法、ベクター、形質転換細胞、空気入りタイヤの製造方法、及びゴム製品の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、工業用ゴム製品に用いられている天然ゴム（ポリイソプレノイドの１種）は、トウダイグサ科のパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）や桑科植物のインドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ  ｅｌａｓｔｉｃａ）などのゴム産生植物を栽培し、その植物体が有する乳管細胞で天然ゴムを生合成させ、該天然ゴムを植物から手作業により採取することにより得られる。
【０００３】
現在、工業用ゴム製品に用いられている天然ゴムは、パラゴムノキをほぼ唯一の採取源としている。パラゴムノキは東南アジアや南米などの限られた地域でのみ生育可能な植物である。更に、パラゴムノキは、植樹からゴムの採取が可能な成木になるまでに７年程度を要し、また、天然ゴムを採取できる期間は２０〜３０年に限られる。今後、開発途上国を中心に天然ゴムの需要の増大が見込まれているが、上述の理由によりパラゴムノキによる天然ゴムの大幅な増産は困難である。そのため、天然ゴム資源の枯渇が懸念されており、パラゴムノキの成木以外の安定的な天然ゴムの供給源やパラゴムノキにおける天然ゴムの生産効率の改善が望まれている。
【０００４】
天然ゴムは、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）を基本単位とし、シス−１，４−ポリイソプレン構造をとっており、天然ゴムの生合成にはその構造からシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）が関係していると考えられている。例えば、パラゴムノキでは複数のＣＰＴの存在が確認されており、Ｈｅｖｅａ  Ｒｕｂｂｅｒ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  １（ＨＲＴ１）、Ｈｅｖｅａ  Ｒｕｂｂｅｒ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ２（ＨＲＴ２）などが知られている（例えば、非特許文献１、２参照。）。また、タンポポの一種であるゴムタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ）ではＣＰＴの発現量を抑えることにより、ゴムの合成量が低下することが知られている（例えば、非特許文献３参照。）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｒａｈａｍａｎ他、ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２０１３年、第１４巻
【非特許文献２】Ａｓａｗａｔｒｅｒａｔａｎａｋｕｌ他、ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００３年、第２７０巻、４６７１〜４６８０ページ
【非特許文献３】Ｐｏｓｔ他、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２０１２年、第１５８巻、１４０６〜１４１７ページ
【非特許文献４】Ｋａｒｉｎｅ他、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １８３８  （２０１４）  ２８７−２９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述のように、パラゴムノキの成木以外の安定的な天然ゴムの供給源の開発やパラゴムノキにおける天然ゴムの生産効率の改善が望まれている。
そのような課題を解決する手段の１つとして、本発明者らは、ゴム合成酵素であるシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ｆａｍｉｌｙに属するタンパク質をゴム粒子に結合させ、酵素反応を行うことにより、ゴム粒子内にポリイソプレノイド（天然ゴム）を蓄積できることを見出した（例えば、ＷＯ２０１７／００２８１８参照）。
【０００７】
本発明者らは、本手法について鋭意検討した結果、本手法では、ゴム粒子を使用するため、細胞でのゴム合成を考えた場合、ゴム粒子を作成できる細胞（植物）が限定されており、その結果、利用範囲が限られるという問題があることが判明した。
そこで、本発明者らが鋭意検討した結果、特殊な植物のみが保持しているゴム粒子の代わりとして、全ての植物が有する油滴（ｌｉｐｉｄ  ｄｒｏｐｌｅｔ）を使用することに想到した。
図１に示すように、油滴はリン脂質と膜タンパク質（例えば、オレオシンやｌｉｐｉｄ−ｄｒｏｐｌｅｔ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＬＤＡＰ）／ｓｍａｌｌ  ｒｕｂｂｅｒ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＲＰＰ）ｆａｍｉｌｙに属するタンパク質）により構成された膜構造を有し、内部にトリアシルグリセロールが貯蔵されている。
ゴム粒子と油滴の類似点としては、膜が脂質一重膜で構成されていること、内部に疎水性の物質が貯蔵されていること、膜上に複数のタンパク質が存在することが挙げられる。そのため、ゴム粒子に結合するような酵素であれば、油滴にも同様に結合するのではないかと考えていたが、実際は、ゴム粒子に結合する酵素であっても油滴には結合しないことが判明した。
【０００８】
本発明は、本発明者らが新たに見出した前記課題を解決し、疎水性化合物を合成する酵素活性を有しつつ、油滴に結合可能な融合タンパク質、該融合タンパク質を用いて、疎水性化合物を油滴内に蓄積させる物質製造方法、遺伝子組換え技術により細胞に導入することで疎水性化合物の生産量を向上させることができるベクター、該ベクター若しくは該融合タンパク質をコードする遺伝子が導入された形質転換細胞を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ゴム合成酵素など、ゴム粒子に結合する酵素であっても油滴には結合しない原因について鋭意検討した結果、ゴム粒子と油滴では、膜を構成する脂質の種類が異なるためであるとの仮説に想到した。すなわち、ゴム粒子と、油滴では膜を構成する脂質の種類が異なるため、ゴム合成酵素などが油滴に結合しにくいのではないかとの仮説に想到した。
ゴム粒子に結合する能力を有するＲｕｂｂｅｒ  Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）は脂質によって結合する能力が異なることが報告されている（非特許文献４）。
そこで、ゴム合成酵素など、疎水性化合物を合成する酵素活性を有し、かつ、それ自体に本来油滴に結合する能力を有しない酵素の油滴への結合能力を向上させるために、疎水性化合物を合成する酵素活性を有するアミノ酸配列と、アンカーとなるような油滴に結合可能なアミノ酸配列（例えば、油滴に元々存在しているタンパク質由来のアミノ酸配列）とを融合させることとした。
しかしながら、疎水性化合物を合成する酵素活性を有するアミノ酸配列と、油滴に結合可能なアミノ酸配列とを融合した場合であっても、使用する油滴結合タンパク質の種類によっては油滴への結合ができない場合や融合の方法によっては油滴上において十分な酵素活性は得られなかった。
使用する油滴結合タンパク質によって、油滴に結合しない場合がある原因について、鋭意検討した結果、油滴結合タンパク質には、油滴形成時に元々膜に結合しているＣｌａｓｓＩタンパク質と油滴形成後に結合するＣｌａｓｓＩＩタンパク質に分類され、ＣｌａｓｓＩタンパク質では油滴形成後にタンパク質を油滴に結合させることはできず、形成後の油滴にタンパク質を結合させるためにはＣｌａｓｓＩＩタンパク質を使用する必要があることが分かった。
また、融合タンパクにおいて酵素活性が失活する原因について、鋭意検討した結果、両アミノ酸配列の間にリンカー配列を配することにより、具体的には、図２に示す構造を有する融合タンパク質とすることにより、油滴上において十分な酵素活性が得られることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、油滴（ｌｉｐｉｄ  ｄｒｏｐｌｅｔ）に結合可能なアミノ酸配列（第１アミノ酸配列）と、疎水性化合物を合成する酵素活性を有するアミノ酸配列（第２アミノ酸配列）とを有し、前記第１アミノ酸配列と第２アミノ酸配列とがリンカー配列（第３アミノ酸配列）を介して融合しており、第２アミノ酸配列の酵素活性が保持されている融合タンパク質に関する。
【００１０】
前記第１アミノ酸配列が、油滴に結合可能なタンパク質かつ、ＣｌａｓｓＩＩに属するタンパク質由来のアミノ酸配列であることが好ましい。
【００１１】
前記第２アミノ酸配列が、疎水性化合物を合成する酵素活性を有し、それ自体に油滴に結合する能力を有しない酵素由来のアミノ酸配列であることが好ましい。
【００１２】
前記第１アミノ酸配列が、ｌｉｐｉｄ−ｄｒｏｐｌｅｔ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＬＤＡＰ）／ｓｍａｌｌ  ｒｕｂｂｅｒ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＲＰＰ）ｆａｍｉｌｙに属するタンパク質由来のアミノ酸配列であることが好ましい。
【００１３】
前記第１アミノ酸配列が、植物由来のＬＤＡＰ／ＳＲＰＰｆａｍｉｌｙに属するタンパク質由来のアミノ酸配列であることが好ましい。
【００１４】
前記第１アミノ酸配列が、Ｐｅｒｓｅａ属、Ｈｅｖｅａ属、及びＴａｒａｘａｃｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物由来のＬＤＡＰ／ＳＲＰＰｆａｍｉｌｙに属するタンパク質由来のアミノ酸配列であることが好ましい。
【００１５】
前記第１アミノ酸配列が、アボカド、パラゴムノキ、及びロシアンタンポポからなる群より選択される少なくとも１種の植物由来のＬＤＡＰ／ＳＲＰＰｆａｍｉｌｙに属するタンパク質由来のアミノ酸配列であることが好ましい。
【００１６】
前記第２アミノ酸配列が、プレニルトランスフェラーゼｆａｍｉｌｙに属するタンパク質由来のアミノ酸配列であることが好ましい。
【００１７】
前記第２アミノ酸配列が、シス型プレニルトランスフェラーゼｆａｍｉｌｙに属するタンパク質由来のアミノ酸配列であることが好ましい。
【００１８】
前記第２アミノ酸配列が、Ｈｅｖｅａ属又はＴａｒａｘａｃｕｍ属に属する植物由来のシス型プレニルトランスフェラーゼｆａｍｉｌｙに属するタンパク質由来のアミノ酸配列であることが好ましい。
【００１９】
前記第３アミノ酸配列が、４個以上のアミノ酸からなる配列であることが好ましい。
【００２０】
前記第３アミノ酸配列が、２０〜３０個のアミノ酸からなる配列であることが好ましい。
【００２１】
前記第３アミノ酸配列が、下記［１］〜［３］のいずれかのアミノ酸配列であることが好ましい。
［１］配列番号５で表されるアミノ酸配列
［２］配列番号５で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列
［３］配列番号５で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
【００２２】
本発明はまた、前記融合タンパク質を油滴（ｌｉｐｉｄ  ｄｒｏｐｌｅｔ）に結合させ、第２アミノ酸配列が有する酵素活性により生成物を油滴内に蓄積させる物質製造方法に関する。
【００２３】
本発明はまた、前記融合タンパク質をコードする遺伝子を導入したベクターに関する。
【００２４】
本発明はまた、前記融合タンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換細胞に関する。
【００２５】
本発明はまた、前記形質転換細胞を使用して、第２アミノ酸配列が有する酵素活性により生成物を細胞内の油滴内に蓄積させる物質製造方法に関する。
【００２６】
本発明はまた、前記物質製造方法によりポリイソプレノイドを製造するポリイソプレノイド製造工程、得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び前記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法に関する。
【００２７】
本発明はまた、前記物質製造方法によりポリイソプレノイドを製造するポリイソプレノイド製造工程、得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び前記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法に関する。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、油滴（ｌｉｐｉｄ  ｄｒｏｐｌｅｔ）に結合可能なアミノ酸配列（第１アミノ酸配列）と、疎水性化合物を合成する酵素活性を有するアミノ酸配列（第２アミノ酸配列）とを有し、前記第１アミノ酸配列と第２アミノ酸配列とがリンカー配列（第３アミノ酸配列）を介して融合しており、第２アミノ酸配列の酵素活性が保持されている融合タンパク質であるので、疎水性化合物を合成する酵素活性を有しつつ、油滴に結合可能である。第２アミノ酸配列が酵素活性を示すのに補助因子が必要な場合でも、融合した第１アミノ酸配列、第３アミノ酸配列がその活性化補助を阻害することもない。
そのため、該融合タンパク質を油滴と共に用いることにより、該融合タンパク質は油滴に結合し、該融合タンパク質により合成された疎水性化合物を油滴内に蓄積させることが可能となる。
そして、該融合タンパク質は油滴を有する細胞において好適に使用可能なタンパク質であるが、油滴は、原核生物にも真核生物にも存在するため、該融合タンパク質は幅広い細胞において使用することができ、幅広い細胞において疎水性化合物の生産量を向上できる。
また、該融合タンパク質をコードする遺伝子を導入したベクターは、遺伝子組換え技術により細胞に導入することで疎水性化合物の生産量を向上させることができ、該ベクター若しくは該融合タンパク質をコードする遺伝子が導入された形質転換細胞では、疎水性化合物の生産量を向上させることができる。
【００２９】
本発明の空気入りタイヤの製造方法は、本発明の物質製造方法によりポリイソプレノイドを製造するポリイソプレノイド製造工程、得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び前記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法であるので、ポリイソプレノイド製造時の製造効率が高い手法で得られたポリイソプレノイドから空気入りタイヤを製造するため、植物資源を有効に利用でき、環境に配慮して空気入りタイヤを製造することができる。
【００３０】
本発明のゴム製品の製造方法は、本発明の物質製造方法によりポリイソプレノイドを製造するポリイソプレノイド製造工程、得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び前記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法であるので、ポリイソプレノイド製造時の製造効率が高い手法で得られたポリイソプレノイドからゴム製品を製造するため、植物資源を有効に利用でき、環境に配慮してゴム製品を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ゴム粒子、油滴の構造を模式的に示す図である。
【図２】本発明の融合タンパク質の一例を示す模式図である。
【図３】ポリイソプレノイドの生合成経路の一部を示す模式図である。
【図４】種々の生物由来のＣＰＴｆａｍｉｌｙに属するタンパク質のマルチプルシーケンスアライメントを行った様子を示す概略図である。
【図５】油滴の調製方法の一例の概要を示す図である。
【図６】ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果の一例を示す図である。
【図７】ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果の一例を示す図である。
【図８】ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
＜融合タンパク質＞
本発明の融合タンパク質は、油滴（ｌｉｐｉｄ  ｄｒｏｐｌｅｔ）に結合可能なアミノ酸配列（第１アミノ酸配列）と、疎水性化合物を合成する酵素活性を有するアミノ酸配列（第２アミノ酸配列）とを有し、前記第１アミノ酸配列と第２アミノ酸配列とがリンカー配列（第３アミノ酸配列）を介して融合しており、第２アミノ酸配列の酵素活性が保持されている。
前記の通り、本発明の融合タンパク質は、図２に示す構造を有するため、疎水性化合物を合成する酵素活性を有しつつ、油滴に結合可能であり、油滴上において十分な酵素活性が得られる。これにより、本来は油滴上で行うことができない酵素反応を油滴上で行うことができるようになる。
ここで、本発明の融合タンパク質は、図２に示す通り、Ｎ末端側から、第１アミノ酸配列、第３アミノ酸配列、第２アミノ酸配列をこの順で有していても、Ｃ末端側から、第１アミノ酸配列、第３アミノ酸配列、第２アミノ酸配列をこの順で有していてもよい。
【００３３】
まず、第１アミノ酸配列、第２アミノ酸配列、第３アミノ酸配列について説明するが、まず、酵素活性を有する配列である第２アミノ酸配列から説明する。
【００３４】
（第２アミノ酸配列）
第２アミノ酸配列は、疎水性化合物を合成する酵素活性を有するアミノ酸配列である。
【００３５】
疎水性化合物を合成する酵素活性を有するアミノ酸配列は、疎水性化合物を合成する酵素活性を有する限り特に限定されないが、疎水性化合物を合成する酵素活性を有する酵素由来のアミノ酸配列であることが好ましく、疎水性化合物を合成する酵素活性を有し、かつ、それ自体に油滴に結合する能力を有しない酵素由来のアミノ酸配列であることがより好ましい。ここで、疎水性化合物を合成する酵素活性を有する酵素由来のアミノ酸配列としては、酵素活性を有していればよいため、疎水性化合物を合成する酵素活性を有する酵素のアミノ酸配列の全部であってもよく、輸送シグナル配列を除去したような一部であってもよい。
【００３６】
疎水性化合物としては、油滴内に貯蔵可能な化合物であれば特に限定されず、イソプレノイド化合物、脂肪酸、脂溶性ビタミン、疎水性ポリマー（イソプレノイド化合物を除く）等が挙げられる。なかでも、イソプレノイド化合物が好ましく、ポリイソプレノイド（天然ゴム）がより好ましい。
前記で例示した疎水性化合物に対応する酵素（疎水性化合物を合成する酵素活性を有する酵素）としては、特に限定されないが、ゴム合成酵素、リコペンシクラーゼ、ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）合成酵素等が挙げられる。なかでも、ゴム合成酵素が好ましい。
ゴム合成酵素は、通常、それ自体に油滴に結合する能力を有しないため、疎水性化合物を合成する酵素活性を有し、それ自体に油滴に結合する能力を有しない酵素に該当する。
【００３７】
ゴム合成酵素としては、プレニルトランスフェラーゼｆａｍｉｌｙに属するタンパク質が好ましい。プレニルトランスフェラーゼｆａｍｉｌｙに属するタンパク質には、シス型プレニルトランスフェラーゼｆａｍｉｌｙに属するタンパク質、トランス型プレニルトランスフェラーゼｆａｍｉｌｙに属するタンパク質が存在するが、シス型プレニルトランスフェラーゼｆａｍｉｌｙに属するタンパク質が好ましい。すなわち、第２アミノ酸配列が、プレニルトランスフェラーゼｆａｍｉｌｙに属するタンパク質由来のアミノ酸配列であることが好ましく、シス型プレニルトランスフェラーゼｆａｍｉｌｙに属するタンパク質由来のアミノ酸配列であることがより好ましい。
【００３８】
プレニルトランスフェラーゼｆａｍｉｌｙに属するタンパク質をコードする遺伝子、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ｆａｍｉｌｙに属するタンパク質をコードする遺伝子は、その由来は特に制限されず、微生物由来であっても、動物由来であっても、植物由来であってもよいが、植物由来であることが好ましく、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、及びＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物由来であることがより好ましく、Ｈｅｖｅａ属又はＴａｒａｘａｃｕｍ属に属する植物由来であることが更に好ましく、パラゴムノキ又はロシアンタンポポ由来であることが特に好ましく、最も好ましくは、パラゴムノキ由来であることである。
【００３９】
前記植物としては、特に限定されず、例えば、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のＨｅｖｅａ属；ノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ｏｌｅｒａｃｅｕｓ）、オニノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ａｓｐｅｒ）、ハチジョウナ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ｂｒａｃｈｙｏｔｕｓ）等のＳｏｎｃｈｕｓ属；セイタカアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ａｌｔｉｓｓｉｍａ）、アキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ａｓｉａｔｉｃａ）、ミヤマアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ｌｅｉｐｃａｒｐａ）、キリガミネアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ｌｅｉｐｃａｒｐａ  ｆ．  ｐａｌｕｄｏｓａ）、オオアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ｇｉｇａｎｔｅａ）、オオアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｇｉｇａｎｔｅａ  Ａｉｔ．  ｖａｒ．  ｌｅｉｏｐｈｙｌｌａ  Ｆｅｒｎａｌｄ）等のＳｏｌｉｄａｇｏ属；ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、シロタエヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｒｇｏｐｈｙｌｌｕｓ）、ヘリアンサス・アトロルベンス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｔｒｏｒｕｂｅｎｓ）、ヒメヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｄｅｂｉｌｉｓ）、コヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｄｅｃａｐｅｔａｌｕｓ）、ジャイアントサンフラワー（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）等のＨｅｌｉａｎｔｈｕｓ属；タンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ）、エゾタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｖｅｎｕｓｔｕｍ  Ｈ．Ｋｏｉｄｚ）、シナノタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｈｏｎｄｏｅｎｓｅ  Ｎａｋａｉ）、カントウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｐｌａｔｙｃａｒｐｕｍ  Ｄａｈｌｓｔ）、カンサイタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、セイヨウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ  Ｗｅｂｅｒ）、ロシアンタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｋｏｋｓａｇｈｙｚ）、Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ等のＴａｒａｘａｃｕｍ属；イチジク（Ｆｉｃｕｓ  ｃａｒｉｃａ）、インドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ  ｅｌａｓｔｉｃａ）、オオイタビ（Ｆｉｃｕｓ  ｐｕｍｉｌａ  Ｌ．）、イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｅｒｅｃｔａ  Ｔｈｕｍｂ．）、ホソバムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ａｍｐｅｌａｓ  Ｂｕｒｍ．ｆ．）、コウトウイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｂｅｎｇｕｅｔｅｎｓｉｓ  Ｍｅｒｒ．）、ムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｉｒｉｓａｎａ  Ｅｌｍ．）、ガジュマル（Ｆｉｃｕｓ  ｍｉｃｒｏｃａｒｐａ  Ｌ．ｆ．）、オオバイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｓｅｐｔｉｃａ  Ｂｕｒｍ．ｆ．）、ベンガルボダイジュ（Ｆｉｃｕｓ  ｂｅｎｇｈａｌｅｎｓｉｓ）等のＦｉｃｕｓ属；グアユール（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、アメリカブクリョウサイ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ｈｙｓｔｅｒｏｐｈｏｒｕｓ）、ブタクサ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ｈｙｓｔｅｒｏｐｈｏｒｕｓ）等のＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属；レタス（Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）、ベンガルボダイジュ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）等が挙げられる。
【００４０】
なお、本明細書において、プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ｆａｍｉｌｙに属するタンパク質は、イソプレノイド化合物の鎖長を延長する反応を触媒する酵素である。
また、本明細書において、トランス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ｆａｍｉｌｙに属するタンパク質は、イソプレノイド化合物の鎖長をｔｒａｎｓ型に延長する反応を触媒する酵素である。
また、本明細書において、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ｆａｍｉｌｙに属するタンパク質は、イソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素である。
具体的には、例えば、植物では、図３に示すようなポリイソプレノイド生合成経路によってポリイソプレノイドが生合成されるが、当該経路のうち、ＣＰＴｆａｍｉｌｙに属するタンパク質は、図３中の点線の枠で囲まれた部分の反応を触媒する酵素と考えられている。ＣＰＴｆａｍｉｌｙに属するタンパク質の特徴としては、Ｃｉｓ  ＩＰＰＳ  ｄｏｍａｉｎ（ＮＣＢＩ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ｃｄ００４７５）に含まれるアミノ酸配列を有することである。
【００４１】
本明細書において、イソプレノイド化合物とは、イソプレン単位（Ｃ５Ｈ８）を有する化合物を意味する。また、ｃｉｓ型イソプレノイドは、イソプレン単位がシス型に結合したイソプレノイド化合物を有する化合物であり、例えば、ｃｉｓ−ファルネシル二リン酸、ウンデカプレニル二リン酸、天然ゴムなどが挙げられる。
【００４２】
ここで、種々の生物由来のＣＰＴｆａｍｉｌｙに属するタンパク質のマルチプルシーケンスアライメントを行った様子を示す概略図を図４に示すが、Ｓｈｏｔａ  Ｅｎｄｏ  ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，Ｎｏ．１６２５（２００３）ｐ．２９１−２９５や、Ｍａｓａｈｉｒｏ  Ｆｕｊｉｈａｓｈｉ  ｅｔ．ａｌ．，ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ．９８，Ｎｏ．８（２００１）ｐ．４３３７−４３４２等の文献から、図４中の囲みＡ（配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１においては、４１位から４９位に相当）、囲みＢ（配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１においては、８１位から９７位に相当）が種々の生物由来のＣＰＴｆａｍｉｌｙに属するタンパク質で保存性の高い保存領域の一部であり、保存領域とは、同様の配列（構造）を有する部位を意味し、タンパク質において同様の機能を有する部位であると推察される領域である。そして特に、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における４１位に相当する位置はアスパラギン酸残基が保存され（図４中の（１））、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における４２位に相当する位置はグリシン残基が保存され（図４中の（２））、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における４５位に相当する位置はアルギニン残基が保存され（図４中の（３））、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における８９位に相当する位置はアスパラギン残基が保存されており（図４中の（４））、これらのアミノ酸が、ＣＰＴｆａｍｉｌｙに属するタンパク質の酵素反応に必須のアミノ酸であり、当該位置にこれらのアミノ酸を有するタンパク質であればＣＰＴｆａｍｉｌｙに属するタンパク質としての機能を有すると考えられる。
なお、前記マルチプルシーケンスアライメントは、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の方法により実施できる。
【００４３】
すなわち、前記ＣＰＴｆａｍｉｌｙに属するタンパク質は、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における４１位、及びこれに相当する位置にアスパラギン酸残基を、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における４２位、及びこれに相当する位置にグリシン残基を、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における４５位、及びこれに相当する位置にアルギニン残基を、並びに、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における８９位、及びこれに相当する位置にアスパラギン残基を、有するものであることが好ましい。上述したように、前記ＣＰＴｆａｍｉｌｙに属するタンパク質がこのような配列を有していれば、ＣＰＴｆａｍｉｌｙに属するタンパク質としての機能を有すると考えられ、イソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素として機能することができる。
【００４４】
前記ＣＰＴｆａｍｉｌｙに属するタンパク質は、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における４１位から４９位、及びこれに相当する位置のアミノ酸配列が、以下のアミノ酸配列（Ａ）：
ＤＧＮＸ１ＲＸ２ＡＫＫ      （Ａ）
（前記アミノ酸配列（Ａ）中、Ｘ１及びＸ２は同一又は異なって任意のアミノ酸残基を表す。）、又は、該アミノ酸配列（Ａ）と、Ｘ１及びＸ２を除く７アミノ酸残基のうちの５アミノ酸残基以上が同一である配列同一性を有するアミノ酸配列であることがより好ましい。更に好ましくは、前記アミノ酸配列（Ａ）中、Ｘ１がＨ、ＧもしくはＲを表し、また、Ｘ２がＷ、Ｆ、もしくはＹを表すことである。
【００４５】
前記アミノ酸配列（Ａ）と、Ｘ１及びＸ２を除く７アミノ酸残基のうちの５アミノ酸残基以上が同一である配列同一性を有するアミノ酸配列は、Ｘ１及びＸ２を除く７アミノ酸残基のうちの６アミノ酸残基以上が同一であることがより好ましい。
【００４６】
また、前記ＣＰＴｆａｍｉｌｙに属するタンパク質は、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における８１位から９７位、及びこれに相当する位置のアミノ酸配列が、以下のアミノ酸配列（Ｂ）：
ＴＸ１１Ｘ１２ＡＦＳＸ１３Ｘ１４ＮＸ１５Ｘ１６ＲＸ１７Ｘ１８Ｘ１９ＥＶ      （Ｂ）
（前記アミノ酸配列（Ｂ）中、Ｘ１１〜Ｘ１９は同一又は異なって任意のアミノ酸残基を表す。）、又は、該アミノ酸配列（Ｂ）と、Ｘ１１〜Ｘ１９を除く８アミノ酸残基のうちの５アミノ酸残基以上が同一である配列同一性を有するアミノ酸配列であることがより好ましい。
更に好ましくは、前記アミノ酸配列（Ｂ）中、Ｘ１１がＬ、Ｖ、Ａ、もしくはＩを表し、また、Ｘ１２がＹ、Ｆ、もしくはＨを表し、また、Ｘ１３がＳ、Ｔ、Ｉ、Ｍ、もしくはＬを表し、また、Ｘ１４がＥ、Ｄ、もしくはＨを表し、また、Ｘ１５がＷもしくはＦを表し、また、Ｘ１６がＮ、Ｓ、Ｋ、Ｇ、もしくはＲを表し、また、Ｘ１７がＰ、Ｓ、Ｈ、Ｇ、Ｒ、Ｋ、もしくはＱを表し、また、Ｘ１８がＡ、Ｋ、Ｓ、もしくはＰを表し、また、Ｘ１９がＱ、Ｄ、Ｒ、Ｉ、Ｅ、Ｈ、もしくはＳを表すことである。
【００４７】
前記アミノ酸配列（Ｂ）と、Ｘ１１〜Ｘ１９を除く８アミノ酸残基のうちの５アミノ酸残基以上が同一である配列同一性を有するアミノ酸配列は、Ｘ１１〜Ｘ１９を除く８アミノ酸残基のうちの６アミノ酸残基以上が同一であることがより好ましく、７アミノ酸残基以上が同一であることが更に好ましい。
【００４８】
更に、ＣＰＴｆａｍｉｌｙに属するタンパク質は、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における４１位から４９位、及びこれに相当する位置のアミノ酸配列が、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における４１位から４９位のアミノ酸配列（ＤＧＮＲＲＦＡＫＫ）と、９アミノ酸残基のうちの６アミノ酸残基以上が同一である配列同一性を有することが特に好ましい。当該配列同一性としては、９アミノ酸残基のうちの７アミノ酸残基以上が同一であることがより好ましく、８アミノ酸残基以上が同一であることが更に好ましい。
【００４９】
更に、ＣＰＴｆａｍｉｌｙに属するタンパク質は、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における８１位から９７位、及びこれに相当する位置のアミノ酸配列が、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における８１位から９７位のアミノ酸配列（ＴＩＹＡＦＳＩＤＮＦＲＲＫＰＨＥＶ）と、１７アミノ酸残基のうちの１４アミノ酸残基以上が同一である配列同一性を有することが特に好ましい。当該配列同一性としては、１７アミノ酸残基のうちの１５アミノ酸残基以上が同一であることがより好ましく、１６アミノ酸残基以上が同一であることが更に好ましい。
【００５０】
具体的には、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１において４１位から４９位に相当する保存領域は、例えば、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４５で示される大腸菌由来のウンデカプレニルリン酸合成酵素（ＵＰＰＳ）では２５位から３３位に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４６で示されるマイクロコッカス属菌由来のウンデカプレニル二リン酸合成酵素（ＵＰＳ）では２９位から３７位に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４７で示される酵母由来のＳＲＴ１では７５位から８３位に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４４で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ５では７９位から８７位に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号２２で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ８では４３位から５１位に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４８で示されるタバコ由来のＤＤＰＳでは４２位から５０位に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号３２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ２では４１位から４９位に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号３６で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ３では４１位から４９位に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号３７で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ４では４２位から５０位に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４１で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ５では４１位から４９位に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号１４で示されるレタス由来のＬｓＣＰＴ３では５８位から６６位に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４３で示されるＴａｒａｘａｃｕｍ  ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ由来のＴｂＣＰＴ１では５８位から６６位に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４９で示されるマウス由来のＤＤＰＳでは３４位から４２位に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号５０で示されるヒト由来のＨＤＳでは３４位から４２位に相当する。
【００５１】
また、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１において８１位から９７位に相当する保存領域は、例えば、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４５で示される大腸菌由来のウンデカプレニルリン酸合成酵素（ＵＰＰＳ）では６５位から８１位に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４６で示されるマイクロコッカス属菌由来のウンデカプレニル二リン酸合成酵素（ＵＰＳ）では６９位から８５位に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４７で示される酵母由来のＳＲＴ１では１１５位から１３１位に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４４で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ５では１１９位から１３５位に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号２２で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ８では８４位から１００位に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４８で示されるタバコ由来のＤＤＰＳでは８２位から９８位に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号３２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ２では８１位から９７位に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号３６で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ３では８１位から９７位に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号３７で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ４では８２位から９８位に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４１で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ５では８１位から９７位に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号１４で示されるレタス由来のＬｓＣＰＴ３では９８位から１１４位に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４３で示されるＴａｒａｘａｃｕｍ  ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ由来のＴｂＣＰＴ１では９８位から１１４位に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４９で示されるマウス由来のＤＤＰＳでは７４位から９０位に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号５０で示されるヒト由来のＨＤＳでは７４位から９０位に相当する。
【００５２】
また、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１において４１位に相当するアスパラギン酸残基は、例えば、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４５で示される大腸菌由来のウンデカプレニルリン酸合成酵素（ＵＰＰＳ）では２５位のアスパラギン酸残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４６で示されるマイクロコッカス属菌由来のウンデカプレニル二リン酸合成酵素（ＵＰＳ）では２９位のアスパラギン酸残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４７で示される酵母由来のＳＲＴ１では７５位のアスパラギン酸残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４４で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ５では７９位のアスパラギン酸残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号２２で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ８では４３位のアスパラギン酸残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４８で示されるタバコ由来のＤＤＰＳでは４２位のアスパラギン酸残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号３２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ２では４１位のアスパラギン酸残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号３６で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ３では４１位のアスパラギン酸残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号３７で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ４では４２位のアスパラギン酸残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４１で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ５では４１位のアスパラギン酸残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号１４で示されるレタス由来のＬｓＣＰＴ３では５８位のアスパラギン酸残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４３で示されるＴａｒａｘａｃｕｍ  ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ由来のＴｂＣＰＴ１では５８位のアスパラギン酸残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４９で示されるマウス由来のＤＤＰＳでは３４位のアスパラギン酸残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号５０で示されるヒト由来のＨＤＳでは３４位のアスパラギン酸残基に相当する。
【００５３】
また、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１において４２位に相当するグリシン残基は、例えば、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４５で示される大腸菌由来のウンデカプレニルリン酸合成酵素（ＵＰＰＳ）では２６位のグリシン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４６で示されるマイクロコッカス属菌由来のウンデカプレニル二リン酸合成酵素（ＵＰＳ）では３０位のグリシン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４７で示される酵母由来のＳＲＴ１では７６位のグリシン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４４で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ５では８０位のグリシン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号２２で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ８では４４位のグリシン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４８で示されるタバコ由来のＤＤＰＳでは４３位のグリシン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号３２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ２では４２位のグリシン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号３６で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ３では４２位のグリシン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号３７で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ４では４３位のグリシン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４１で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ５では４２位のグリシン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号１４で示されるレタス由来のＬｓＣＰＴ３では５９位のグリシン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４３で示されるＴａｒａｘａｃｕｍ  ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ由来のＴｂＣＰＴ１では５９位のグリシン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４９で示されるマウス由来のＤＤＰＳでは３５位のグリシン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号５０で示されるヒト由来のＨＤＳでは３５位のグリシン残基に相当する。
【００５４】
また、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１において４５位に相当するアルギニン残基は、例えば、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４５で示される大腸菌由来のウンデカプレニルリン酸合成酵素（ＵＰＰＳ）では２９位のアルギニン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４６で示されるマイクロコッカス属菌由来のウンデカプレニル二リン酸合成酵素（ＵＰＳ）では３３位のアルギニン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４７で示される酵母由来のＳＲＴ１では７９位のアルギニン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４４で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ５では８３位のアルギニン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号２２で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ８では４７位のアルギニン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４８で示されるタバコ由来のＤＤＰＳでは４６位のアルギニン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号３２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ２では４５位のアルギニン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号３６で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ３では４５位のアルギニン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号３７で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ４では４６位のアルギニン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４１で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ５では４５位のアルギニン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号１４で示されるレタス由来のＬｓＣＰＴ３では６２位のアルギニン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４３で示されるＴａｒａｘａｃｕｍ  ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ由来のＴｂＣＰＴ１では６２位のアルギニン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４９で示されるマウス由来のＤＤＰＳでは３８位のアルギニン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号５０で示されるヒト由来のＨＤＳでは３８位のアルギニン残基に相当する。
【００５５】
また、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１において８９位に相当するアスパラギン残基は、例えば、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４５で示される大腸菌由来のウンデカプレニルリン酸合成酵素（ＵＰＰＳ）では７３位のアスパラギン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４６で示されるマイクロコッカス属菌由来のウンデカプレニル二リン酸合成酵素（ＵＰＳ）では７７位のアスパラギン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４７で示される酵母由来のＳＲＴ１では１２３位のアスパラギン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４４で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ５では１２７位のアスパラギン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号２２で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ８では９２位のアスパラギン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４８で示されるタバコ由来のＤＤＰＳでは９０位のアスパラギン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号３２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ２では８９位のアスパラギン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号３６で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ３では８９位のアスパラギン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号３７で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ４では９０位のアスパラギン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４１で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ５では８９位のアスパラギン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号１４で示されるレタス由来のＬｓＣＰＴ３では１０６位のアスパラギン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４３で示されるＴａｒａｘａｃｕｍ  ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ由来のＴｂＣＰＴ１では１０６位のアスパラギン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４９で示されるマウス由来のＤＤＰＳでは８２位のアスパラギン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号５０で示されるヒト由来のＨＤＳでは８２位のアスパラギン残基に相当する。
【００５６】
前記ＣＰＴｆａｍｉｌｙに属するタンパク質としては、パラゴムノキ由来のＣＰＴ（ＨＲＴ１、ＨＲＴ２、ＣＰＴ３〜５）、シロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ１〜９、レタス由来のＣＰＴ１〜３、Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ由来のＣＰＴ１〜３、大腸菌由来のウンデカプレニルリン酸合成酵素（ＵＰＰＳ）、マイクロコッカス属菌由来のウンデカプレニル二リン酸合成酵素（ＵＰＳ）、酵母由来のＳＲＴ１、タバコ由来のＤＤＰＳ、マウス由来のＤＤＰＳ、ヒト由来のＨＤＳなどが挙げられる。
【００５７】
前記ＣＰＴｆａｍｉｌｙに属するタンパク質の具体例としては、下記［１１］が挙げられる。
［１１］配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
【００５８】
また、タンパク質は、元のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含む場合であっても本来持つ機能を有する場合があることが知られている。従って、前記ＣＰＴｆａｍｉｌｙに属するタンパク質の具体例としては、下記［１２］も挙げられる。
［１２］配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有するタンパク質
【００５９】
なお、前記ＣＰＴｆａｍｉｌｙに属するタンパク質としての機能を維持するためには、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、好ましくは１若しくは複数個のアミノ酸、より好ましくは１〜５８個のアミノ酸、更に好ましくは１〜４４個のアミノ酸、更により好ましくは１〜２９個のアミノ酸、特に好ましくは１〜１５個のアミノ酸、最も好ましくは１〜６個のアミノ酸、より最も好ましくは１〜３個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列であることが好ましい。
【００６０】
本明細書において、アミノ酸置換の例としては、保存的置換が好ましく、具体的には以下のカッコ内のグループ内での置換が挙げられる。例えば、（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）である。
【００６１】
また、タンパク質は、元のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列を有するタンパク質も同様の機能を有する場合があることが知られている。従って、前記ＣＰＴｆａｍｉｌｙに属するタンパク質の具体例としては、下記［１３］も挙げられる。
［１３］配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有するタンパク質
【００６２】
なお、前記ＣＰＴｆａｍｉｌｙに属するタンパク質としての機能を維持するためには、配列番号２で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。
【００６３】
前記ＣＰＴｆａｍｉｌｙに属するタンパク質の具体例としてはまた、下記［１４］〜［１６］が挙げられる。
［１４］配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
【００６４】
［１５］配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有するタンパク質
なお、前記ＣＰＴｆａｍｉｌｙに属するタンパク質としての機能を維持するためには、配列番号３で表されるアミノ酸配列において、好ましくは１若しくは複数個のアミノ酸、より好ましくは１〜６０個のアミノ酸、更に好ましくは１〜４５個のアミノ酸、特に好ましくは１〜３０個のアミノ酸、最も好ましくは１〜１５個のアミノ酸、より最も好ましくは１〜６個のアミノ酸、更に最も好ましくは１〜３個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列であることが好ましい。
【００６５】
［１６］配列番号３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有するタンパク質
【００６６】
なお、前記ＣＰＴｆａｍｉｌｙに属するタンパク質としての機能を維持するためには、配列番号３で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。
【００６７】
本明細書において、アミノ酸配列や塩基配列の配列同一性は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０）］を用いて決定することができる。
【００６８】
前記酵素活性を有するタンパク質であることを確認する方法としては、例えば、従来公知の方法を用いることができ、例えば、大腸菌などを用いて、目的のタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体により、目的タンパク質を発現させ、目的タンパク質の機能の有無をそれぞれの活性測定法により、活性測定等を行う方法が挙げられる。
【００６９】
第２アミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子は、第２アミノ酸配列からなるタンパク質をコードし、発現させて第２アミノ酸配列からなるタンパク質を産出できるものであれば特に制限されない。
【００７０】
前記ＣＰＴｆａｍｉｌｙに属するタンパク質をコードする遺伝子は、ＣＰＴｆａｍｉｌｙに属するタンパク質をコードし、発現させてＣＰＴｆａｍｉｌｙに属するタンパク質を産出できるものであれば特に制限されないが、該遺伝子としては、具体的には、下記［１１］又は［１２］が挙げられる。
［１１］配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［１２］配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００７１】
本明細書において、「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズする工程である。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部の塩基配列は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、またはＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。プローブとして用いるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができるが、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡであってもよい。
【００７２】
ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｍａｎｕａｌ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。
【００７３】
本明細書において、ストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩、インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件をあげることができるが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェントな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば６×ＳＳＣＥ（２０×ＳＳＣＥは、３ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム、０．２ｍｏｌ／ｌのリン酸二水素ナトリウム、０．０２ｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％のＳＤＳ、３０％のホルムアミド、１００μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、３７℃で一晩インキュベートした後、５０℃の１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、前記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば５×ＳＳＣ）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。
【００７４】
前記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。前記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
【００７５】
前記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて、前記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号１で表される塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。
【００７６】
前記したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、所定の酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであることを確認する方法としては、従来公知の方法を用いることができ、例えば、大腸菌などを用いて、目的のタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体により、目的タンパク質を発現させ、目的タンパク質の機能の有無をそれぞれの活性測定法により、活性測定等を行う方法が挙げられる。
【００７７】
また、前記タンパク質のアミノ酸配列及び塩基配列を同定する方法は、従来公知の方法を用いることができ、例えば、生育する植物から、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、必要に応じてｍＲＮＡを精製し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する。次に目的タンパク質に相当する既知のタンパク質のアミノ酸配列をもとに、縮重プライマーを設計し、ＲＴ−ＰＣＲを行い、部分的にＤＮＡ断片の増幅を行い、部分的に配列を同定する。次いで、ＲＡＣＥ法などを行い、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定する。ＲＡＣＥ法（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ法）とは、ｃＤＮＡの塩基配列が部分的に把握されているときに、その既知領域の塩基配列情報を基にＰＣＲを行って、ｃＤＮＡ末端までの未知領域をクローニングする方法で、ｃＤＮＡライブラリーの作製を経ずに、ＰＣＲ法によって全長のｃＤＮＡをクローニングすることができる方法である。
なお、縮重プライマーは、前記目的タンパク質と共通性の高い配列部位を有する植物由来の配列から作製することが好ましい。
また、前記タンパク質をコードする塩基配列が既知の場合には、その知られている塩基配列から開始コドンを含むプライマー及び終止コドンを含むプライマーを設計し、合成したｃＤＮＡを鋳型にしてＲＴ−ＰＣＲを行うことで全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定することができる。
【００７８】
（第１アミノ酸配列）
第１アミノ酸配列は、油滴（ｌｉｐｉｄ  ｄｒｏｐｌｅｔ）に結合可能なアミノ酸配列である。
【００７９】
本明細書において、油滴にタンパク質が結合するとは、タンパク質の全部又は一部が油滴中に取り込まれる又は油滴の膜構造に挿入される、といったことを意味するが、これに限らず、油滴表面又は内部に局在する等の場合をも意味する。また更には、油滴に結合しているタンパク質と複合体を形成し、複合体として油滴上に存在する場合も油滴に結合しているとの概念範囲に含まれる。
【００８０】
油滴に結合可能なアミノ酸配列は、油滴に結合可能である限り特に限定されないが、油滴に結合可能なタンパク質由来のアミノ酸配列であることが好ましく、油滴に結合可能なタンパク質かつ、ＣｌａｓｓＩＩに属するタンパク質由来のアミノ酸配列であることがより好ましい。ここで、油滴に結合可能なタンパク質由来のアミノ酸配列としては、油滴への結合能を有していればよいため、油滴に結合可能なタンパク質のアミノ酸配列の全部であってもよく、一部であってもよい。なお、油滴に結合可能なアミノ酸配列は特に限定されないが、自然界で本来油滴に結合しているタンパク質が持つ膜貫通領域のアミノ酸配列であることが望ましい。
ここで、ＣｌａｓｓＩＩに属するタンパク質とは、油滴結合能を有しながらも、細胞中に油滴非存在時はサイトゾルに局在する特徴を有する油滴結合タンパク質を意味する（Ｇｉｄｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ！，  Ａｐｒｉｌ  ２０１６，  Ｖｏｌ．  １７０，  ｐｐ．  ２０５２−２０７１参照）。ＣｌａｓｓＩに属するタンパク質は、油滴非存在時はＥＲ画分に局在するタンパク質であるのに対して、ＣｌａｓｓＩＩに属するタンパク質は、サイトゾルと油滴との移行が可能である。
【００８１】
油滴に結合可能なタンパク質かつ、ＣｌａｓｓＩＩに属するタンパク質としては、特に限定されないが、ｌｉｐｉｄ−ｄｒｏｐｌｅｔ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＬＤＡＰ）／ｓｍａｌｌ  ｒｕｂｂｅｒ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＲＰＰ）ｆａｍｉｌｙに属するタンパク質等が挙げられる。なかでも、ｌｉｐｉｄ−ｄｒｏｐｌｅｔ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＬＤＡＰ）／ｓｍａｌｌ  ｒｕｂｂｅｒ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＲＰＰ）ｆａｍｉｌｙに属するタンパク質が好ましい。
すなわち、第１アミノ酸配列が、ｌｉｐｉｄ−ｄｒｏｐｌｅｔ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＬＤＡＰ）／ｓｍａｌｌ  ｒｕｂｂｅｒ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＲＰＰ）ｆａｍｉｌｙに属するタンパク質由来のアミノ酸配列であることが好ましい。
【００８２】
ＬＤＡＰ／ＳＲＰＰｆａｍｉｌｙに属するタンパク質をコードする遺伝子は、その由来は特に制限されず、微生物由来であっても、動物由来であっても、植物由来であってもよいが、植物由来であることが好ましい。
植物としては、上述の植物と同様の植物の他、アボカド（Ｐｅｒｓｅａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）等のＰｅｒｓｅａ属に属する植物、ゴマ（Ｓｅｓａｍｕｍ  ｉｎｄｉｃｕｍ）等のＳｅｓａｍｕｍ属に属する植物、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）等のＢｒａｓｓｉｃａ属に属する植物、ツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）等のＣａｍｅｌｌｉａ属に属する植物等が挙げられる。
【００８３】
ＬＤＡＰ／ＳＲＰＰｆａｍｉｌｙに属するタンパク質をコードする遺伝子は、植物由来であることが好ましく、Ｐｅｒｓｅａ属、Ｓｅｓａｍｕｍ属、Ｂｒａｓｓｉｃａ属、Ｃａｍｅｌｌｉａ属、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、及びＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物由来であることがより好ましく、Ｐｅｒｓｅａ属、Ｈｅｖｅａ属、及びＴａｒａｘａｃｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物由来であることが更に好ましく、アボカド、パラゴムノキ及びロシアンタンポポからなる群より選択される少なくとも１種の植物由来であることが特に好ましく、アボカド又はパラゴムノキ由来であることが最も好ましい。
すなわち、第１アミノ酸配列が、植物由来のＬＤＡＰ／ＳＲＰＰｆａｍｉｌｙに属するタンパク質由来のアミノ酸配列であることが好ましく、Ｐｅｒｓｅａ属、Ｓｅｓａｍｕｍ属、Ｂｒａｓｓｉｃａ属、Ｃａｍｅｌｌｉａ属、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、及びＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物由来のＬＤＡＰ／ＳＲＰＰｆａｍｉｌｙに属するタンパク質由来のアミノ酸配列であることがより好ましく、Ｐｅｒｓｅａ属、Ｈｅｖｅａ属、及びＴａｒａｘａｃｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物由来のＬＤＡＰ／ＳＲＰＰｆａｍｉｌｙに属するタンパク質由来のアミノ酸配列であることが更に好ましく、アボカド、パラゴムノキ及びロシアンタンポポからなる群より選択される少なくとも１種の植物由来のＬＤＡＰ／ＳＲＰＰｆａｍｉｌｙに属するタンパク質由来のアミノ酸配列であることが特に好ましく、アボカド又はパラゴムノキ由来のＬＤＡＰ／ＳＲＰＰｆａｍｉｌｙに属するタンパク質由来のアミノ酸配列であることが最も好ましい。
【００８４】
ＬＤＡＰ／ＳＲＰＰｆａｍｉｌｙに属するタンパク質としては、アボカド由来のＬＤＡＰ（ＬＤＡＰ１、ＬＤＡＰ２）、パラゴムノキ由来のＳＲＰＰ、ＲＥＦ、ロシアンタンポポ由来のＳＲＰＰ、Ｆｉｃｕｓ属に属する植物由来のＲＥＦ、ＳＲＰＰなどが挙げられる。
【００８５】
ＬＤＡＰ／ＳＲＰＰｆａｍｉｌｙに属するタンパク質の具体例としては、下記［１０１］〜［１０３］が挙げられる。
［１０１］配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
［１０２］配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
［１０３］配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
【００８６】
また、タンパク質は、元のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列を有するタンパク質も同様の機能を有する場合があることが知られている。従って、前記ＬＤＡＰ／ＳＲＰＰｆａｍｉｌｙに属するタンパク質の具体例としては、下記［１０４］〜［１０６］も挙げられる。
［１０４］配列番号４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ油滴への結合能力を有するタンパク質
［１０５］配列番号１０で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ油滴への結合能力を有するタンパク質
［１０６］配列番号１１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ油滴への結合能力を有するタンパク質
【００８７】
なお、前記ＬＤＡＰ／ＳＲＰＰｆａｍｉｌｙに属するタンパク質としての機能を維持するためには、配列番号４、１０、又は１１で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。
【００８８】
油滴への結合能力を有するタンパク質であることを確認する方法としては、例えば、従来公知の方法を用いることができ、例えば、大腸菌などを用いて、目的のタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体により、目的タンパク質を発現させ、目的タンパク質の機能の有無を確認する方法が挙げられる。
【００８９】
第１アミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子は、第１アミノ酸配列からなるタンパク質をコードし、発現させて第１アミノ酸配列からなるタンパク質を産出できるものであれば特に制限されない。
【００９０】
（第３アミノ酸配列）
第３アミノ酸配列は、第１アミノ酸配列と第２アミノ酸配列との間に配されるリンカー配列である。前記融合タンパク質は、このリンカー配列の存在により、第１アミノ酸配列の油滴への結合能及び第２アミノ酸配列の酵素活性が保持されている。そして、このリンカー配列は、配列を構成するアミノ酸の種類に特徴があるのではなく、配列を構成するアミノ酸の数に特徴がある。すなわち、第１アミノ酸配列と第２アミノ酸配列との距離を一定以上遠ざけることにより、第１アミノ酸配列の油滴への結合能及び第２アミノ酸配列の酵素活性が保持される。
【００９１】
第３アミノ酸配列は、第１アミノ酸配列の油滴への結合能及び第２アミノ酸配列の酵素活性を保持できる配列である限り特に限定されないが、４個以上のアミノ酸からなる配列であることが好ましく、８個以上のアミノ酸からなる配列であることがより好ましく、１０個以上のアミノ酸からなる配列であることが更に好ましく、１５個以上のアミノ酸からなる配列であることが特に好ましく、２０個以上のアミノ酸からなる配列であることが最も好ましく、上限は特に限定されないが、５０個以下のアミノ酸からなる配列であることが好ましく、４５個以下のアミノ酸からなる配列であることがより好ましく、４０個以下のアミノ酸からなる配列であることが更に好ましく、３５個以下のアミノ酸からなる配列であることが特に好ましく、３０個以下のアミノ酸からなる配列であることが最も好ましい。
【００９２】
第３アミノ酸配列の由来は特に制限されず、微生物由来であっても、動物由来であっても、植物由来であってもよいが、植物由来であることが好ましい。また、人工的に作成したアミノ酸配列であってもよい。
植物としては、ＬＤＡＰ／ＳＲＰＰｆａｍｉｌｙに属するタンパク質をコードする遺伝子の由来について説明した際の植物と同様の植物等が挙げられる。
【００９３】
第３アミノ酸配列の具体例としては、下記［１］〜［３］のいずれかのアミノ酸配列が挙げられる。
［１］配列番号５で表されるアミノ酸配列
【００９４】
［２］配列番号５で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列
なお、配列番号５で表されるアミノ酸配列において、好ましくは１若しくは複数個のアミノ酸、より好ましくは１〜５個のアミノ酸、更に好ましくは１〜４個のアミノ酸、特に好ましくは１〜３個のアミノ酸、最も好ましくは１〜２個のアミノ酸、より最も好ましくは１個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列であることが好ましい。
【００９５】
［３］配列番号５で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
なお、配列番号５で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。
【００９６】
第３アミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子は、第３アミノ酸配列からなるタンパク質をコードし、発現させて第３アミノ酸配列からなるタンパク質を産出できるものであれば特に制限されない。
【００９７】
（融合タンパク質）
本発明の融合タンパク質は、第１アミノ酸配列と、第２アミノ酸配列とを有し、第１アミノ酸配列と第２アミノ酸配列とが第３アミノ酸配列を介して融合している。そして、該融合タンパク質は、第３アミノ酸配列（リンカー配列）の存在により、第１アミノ酸配列の油滴への結合能及び第２アミノ酸配列の酵素活性が保持されている。
第１アミノ酸配列〜第３アミノ酸配列の配列を決定すれば、当業者であれば、公知の手法を使用して、融合タンパク質を製造できる。
融合タンパク質の製造方法としては、第１アミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、第２アミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、及び第３アミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ断片を結合し、融合タンパク質をコードする遺伝子を調製する遺伝子調製工程を含むことが好ましい。
そして、無細胞タンパク合成により融合タンパク質を製造する場合は、遺伝子調製工程に加えて更に、融合タンパク質をコードする遺伝子を基にｍＲＮＡを調製する工程、融合タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞タンパク合成溶液を用いてタンパク質合成を行うことにより、融合タンパク質を製造する工程を含むことが好ましい。
形質転換細胞を使用して融合タンパク質を製造する場合は、遺伝子調製工程に加えて更に、
融合タンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換細胞を調製する工程、
形質転換細胞を培養することにより、融合タンパク質を製造する工程を含むことが好ましい。
【００９８】
融合タンパク質は、第１アミノ酸配列、第２アミノ酸配列、第３アミノ酸配列以外のアミノ酸配列を含んでいてもよいが、融合タンパク質を構成する全アミノ酸のうち、第１アミノ酸配列、第２アミノ酸配列、及び第３アミノ酸配列のアミノ酸の割合は、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。
【００９９】
＜物質製造方法＞
本発明の物質（疎水性化合物）製造方法は、前記融合タンパク質を油滴（ｌｉｐｉｄ  ｄｒｏｐｌｅｔ）に結合させ、第２アミノ酸配列が有する酵素活性により生成物（疎水性化合物）を油滴内に蓄積させる方法である。
前記融合タンパク質は、第１アミノ酸配列の油滴への結合能及び第２アミノ酸配列の酵素活性が保持されているため、油滴に結合し、油滴上で、第２アミノ酸配列が有する酵素活性により酵素反応を触媒し、生成した生成物（疎水性化合物）は油滴内に蓄積される。
【０１００】
本明細書において、油滴に前記融合タンパク質が結合するとは、前記融合タンパク質の全部又は一部が油滴中に取り込まれる又は油滴の膜構造に挿入される、といったことを意味するが、これに限らず、油滴表面又は内部に局在する等の場合をも意味する。また更には、油滴に結合しているタンパク質と前記融合タンパク質が複合体を形成し、複合体として油滴上に存在する場合も油滴に結合しているとの概念範囲に含まれる。
【０１０１】
本明細書において、油滴とは、図１に示すように、リン脂質と膜タンパク質（例えば、オレオシンやｌｉｐｉｄ−ｄｒｏｐｌｅｔ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＬＤＡＰ）／ｓｍａｌｌ  ｒｕｂｂｅｒ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＲＰＰ）ｆａｍｉｌｙに属するタンパク質）により構成された膜構造を有し、内部にトリアシルグリセロールが貯蔵されている封入体又は細胞小器官であり、原核生物にも真核生物にも存在し、全ての植物において存在する。
また、油滴は、脂質滴、脂肪滴、油体（ｏｉｌ  ｂｏｄｙ、ｏｉｌ  ｂｏｄｉｅｓ）、ＬＤとも言う。
【０１０２】
油滴の由来は特に限定されないが、油滴は、植物由来であることが好ましい。
植物としては、ＬＤＡＰ／ＳＲＰＰｆａｍｉｌｙに属するタンパク質をコードする遺伝子の由来について説明した際の植物と同様の植物等が挙げられる。
なかでも、Ｐｅｒｓｅａ属、Ｓｅｓａｍｕｍ属、Ｂｒａｓｓｉｃａ属、及びＣａｍｅｌｌｉａ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物由来であることがより好ましく、Ｐｅｒｓｅａ属に属する植物由来であることが更に好ましく、アボカド由来であることが特に好ましい。また、第１アミノ酸配列の由来と、油滴の由来が同種であることが好ましい。
【０１０３】
油滴の調製方法は特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、植物片を緩衝液中で破砕し、ろ過、遠心分離を行い、脂肪体（Ｆａｔ  ｐａｄ）を回収すればよい。また、必要に応じて脂肪体を洗浄してもよい。そして、脂肪体から遠心分離により油滴を分離すればよい。油滴の調製方法の一例の概要を図５に示す。
遠心分離処理では、例えば、１５，０００〜２０，０００×ｇ、１５分〜６０分の処理を行えばよい。
また、遠心分離処理の処理温度としては、０〜１０℃が好ましく、２〜８℃がより好ましく、４℃が特に好ましい。
【０１０４】
融合タンパク質の油滴への結合は、油滴に融合タンパク質を結合させることができればその手段は特に制限されず、例えば、融合タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞タンパク合成溶液と油滴とを共存させてタンパク質合成を行い、油滴に融合タンパク質を結合させる方法などが挙げられる。
すなわち、融合タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞タンパク合成溶液と油滴とを共存させて（より具体的には、融合タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞タンパク合成溶液と油滴とを混合して）タンパク質合成を行うことで、融合タンパク質が結合した油滴を得ることが好ましい。
【０１０５】
ここで、前記無細胞タンパク合成溶液と油滴との共存下、タンパク質合成を行うことで、油滴に融合タンパク質が結合するとは、当該タンパク質合成により合成された融合タンパク質の全部又は一部が油滴中に取り込まれる又は油滴の膜構造に挿入される、といったことを意味するが、これに限らず、油滴表面又は内部に局在する等の場合をも意味する。また更には、上述のように油滴に結合しているタンパク質と複合体を形成し、複合体として油滴上に存在する場合も油滴に結合しているとの概念範囲に含まれる。
【０１０６】
融合タンパク質をコードするｍＲＮＡは、翻訳されて融合タンパク質を合成しうる翻訳鋳型である。そして、融合タンパク質をコードするｍＲＮＡは、翻訳されて融合タンパク質を合成しうる翻訳鋳型であればその調製方法は特に制限されないが、例えば、融合タンパク質のアミノ酸配列の情報を基に融合タンパク質をコードする塩基配列を決定し、決定した塩基配列情報を基に融合タンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ断片を取得して、該ＤＮＡ断片を基に通常行われるインビトロでの転写反応を行うことによりｍＲＮＡを調製すればよい。
また、第１アミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、第２アミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、及び第３アミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ断片を結合し、結合したＤＮＡ断片の塩基配列情報を基に融合タンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ断片を取得して、該ＤＮＡ断片を基に通常行われるインビトロでの転写反応を行うことによりｍＲＮＡを調製してもよい。
【０１０７】
前記無細胞タンパク合成溶液は、融合タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む限り、その他のタンパク質をコードするｍＲＮＡを含んでいてもよい。
前記その他のタンパク質をコードするｍＲＮＡとしては、翻訳されてその他のタンパク質を発現することができるものを用いることができる。
【０１０８】
前記無細胞タンパク合成溶液は、融合タンパク質をコードするｍＲＮＡ（翻訳鋳型）に加え、タンパク質合成に必須の成分であるＡＴＰ、ＧＴＰ、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、Ｌ型アミノ酸、カリウムイオン及びマグネシウムイオン等を含有し、更には必要に応じて活性増強物質を含むことが好ましく、このような無細胞タンパク合成溶液を用いることにより無細胞タンパク合成反応系とすることができる。
【０１０９】
前記無細胞タンパク合成におけるタンパク質合成のための反応システムまたは装置としては、バッチ（回分）法（Ｐｒａｔｔ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ，Ｈａｍｅｓ，１７９−２０９，Ｂ．Ｄ．＆Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８４））や、アミノ酸、エネルギー源等を連続的に反応系に供給する連続式無細胞タンパク質合成システム（Ｓｐｉｒｉｎ，Ａ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１１６４（１９８８））、透析法（木川等、第２１回日本分子生物学会、ＷＩＤ６）、重層法（ＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ  Ｗｈｅａｔ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｃｏｒｅ  ｋｉｔ取扱説明書：ＴＯＹＯＢＯ社製）等が挙げられる。その他、タンパク質合成反応系に、鋳型のＲＮＡ、アミノ酸、エネルギー源等を必要時に供給し、合成物や分解物を必要時に排出する方法等も用いることができる。
【０１１０】
前記無細胞タンパク合成溶液と油滴との共存下におけるタンパク質の合成は、当業者であれば、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の方法等を参考に実施できる。
【０１１１】
本発明の製造方法においては、融合タンパク質を油滴に結合させる結合工程を行った後、必要に応じて、融合タンパク質が結合した油滴を回収する工程を行ってもよい。
【０１１２】
前記油滴回収工程は、油滴を回収することができればその手法は特に制限されず、油滴を回収する通常行われる方法により行うことができる。具体的には、例えば、遠心分離により行う方法などが挙げられる。当該遠心分離により油滴を回収する場合、その遠心力や、遠心分離処理時間、遠心分離処理温度は油滴を回収できるよう適宜設定することができる。
遠心分離処理では、例えば、１５，０００〜２０，０００×ｇ、１５分〜６０分の処理を行えばよい。
また、遠心分離処理温度としては、油滴に結合した融合タンパク質のタンパク活性を維持するという観点から、０〜１０℃が好ましく、２〜８℃がより好ましく、４℃が特に好ましい。
【０１１３】
例えば、前記無細胞タンパク合成を行った場合には、前記遠心分離処理を行うと、油滴が上層に、無細胞タンパク合成溶液が下層に分離される。その後、上層の油滴層を回収することで、融合タンパク質を結合させた油滴を回収することができる。回収した油滴はｐＨが中性の適当な緩衝液に再懸濁することで保存することができる。
【０１１４】
そして、融合タンパク質を結合させた油滴を用いて、疎水性化合物（例えば、ポリイソプレノイド）を合成できる。具体的には、融合タンパク質を結合させた油滴に、第２アミノ酸配列が有する酵素活性に対応した基質を加えることにより、酵素反応が進行し、疎水性化合物を合成できる。例えば、第２アミノ酸配列として、シス型プレニルトランスフェラーゼｆａｍｉｌｙに属するタンパク質由来のアミノ酸配列を使用した場合、基質としてイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）を（必要に応じてファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）も）加えることにより、ポリイソプレノイド（天然ゴム）を合成できる。そして、合成された疎水性化合物は油滴内に蓄積される。
以上の通り、本発明の物質（疎水性化合物）製造方法は、前記融合タンパク質を油滴に結合させ、第２アミノ酸配列が有する酵素活性により生成物（疎水性化合物）を油滴内に蓄積させる方法である。
【０１１５】
更に、本発明の製造方法により得られたポリイソプレノイド（天然ゴム）等の疎水性化合物は、例えば、前記油滴を以下の固化工程に供することで回収することができる。
【０１１６】
固化工程において、固化する方法としては、特に限定されず、エタノール、メタノール、アセトン等のポリイソプレノイド（天然ゴム）を溶解しない溶媒に油滴を添加する方法や油滴に酸を添加する方法等が挙げられる。固化工程を行うことにより、油滴からゴム（天然ゴム）を固形分として回収できる。得られたゴム（天然ゴム）は、必要に応じて乾燥してから使用すればよい。
【０１１７】
なお、本明細書において、ポリイソプレノイドは、イソプレン単位（Ｃ５Ｈ８）で構成された重合体の総称である。ポリイソプレノイドとしては、例えばセスタテルペン（Ｃ２５）、トリテルペン（Ｃ３０）、テトラテルペン（Ｃ４０）、天然ゴムなどの重合体が挙げられる。また、本明細書において、イソプレノイドは、イソプレン単位（Ｃ５Ｈ８）を有する化合物を意味し、ポリイソプレノイドをも含む概念である。
【０１１８】
ポリイソプレノイドの重量平均分子量（Ｍｗ）は、好ましくは１０００以上、より好ましくは１００００以上、更に好ましくは１０００００以上であり、上限は特に限定されない。
なお、上記重量平均分子量（Ｍｗ）は、下記の条件（１）〜（７）でゲルパーミエーションクロマトグラフ（ＧＰＣ）法により測定される。
（１）装置：東ソー社製ＨＬＣ−８０２０
（２）分離カラム：東ソー社製ＧＭＨ−ＸＬ
（３）測定温度：４０℃
（４）キャリア：テトラヒドロフラン
（５）流量：０．６ｍｌ／分
（６）検出器：示差屈折、ＵＶ
（７）分子量標準：標準ポリスチレン
【０１１９】
ここで、本発明者らの検討の結果、第２アミノ酸配列として、一部のＣＰＴｆａｍｉｌｙに属するタンパク質由来のアミノ酸配列を使用した場合、融合タンパク質を油滴に結合させた場合であっても、十分に酵素活性が得られない場合があることが判明した。
この場合、更に、補助酵素を添加することにより、融合タンパク質の酵素活性を増強できることが判明した。
【０１２０】
補助酵素としては、特に限定されないが、Ｎｏｇｏ−Ｂ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ｆａｍｉｌｙに属するタンパク質等が挙げられる。
【０１２１】
Ｎｏｇｏ−Ｂ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ｆａｍｉｌｙに属するタンパク質は、Ｎ末端側に有する１つ又は複数の膜貫通領域で膜に結合し、Ｃ末端側でＣＰＴｆａｍｉｌｙに属するタンパク質又は他のタンパク質と相互作用する機能を有するタンパク質であり、ＣＰＴｆａｍｉｌｙに属するタンパク質を膜上に保持することにより機能を補助する。前記ＮｇＢＲｆａｍｉｌｙに属するタンパク質の特徴としては、Ｎ末端側に膜貫通ドメインを有し、Ｃ末端側にＣｉｓ  ＩＰＰＳ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｄｏｍａｉｎ（ＮＣＢＩ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＣＯＧ００２０）に含まれるアミノ酸配列を有することである。
【０１２２】
ＮｇＢＲｆａｍｉｌｙに属するタンパク質をコードする遺伝子は、その由来は特に制限されず、微生物由来であっても、動物由来であっても、植物由来であってもよいが、植物由来であることが好ましく、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、及びＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物由来であることがより好ましく、Ｈｅｖｅａ属又はＴａｒａｘａｃｕｍ属に属する植物由来であることが更に好ましく、パラゴムノキ又はロシアンタンポポ由来であることが特に好ましく、最も好ましくは、パラゴムノキ由来であることである。
また、第２アミノ酸配列をコードする遺伝子の由来と、ＮｇＢＲｆａｍｉｌｙに属するタンパク質をコードする遺伝子の由来が同種であることが好ましい。
【０１２３】
前記ＮｇＢＲｆａｍｉｌｙに属するタンパク質としては、パラゴムノキ由来のＮｇＢＲ（ＨＲＢＰ）、シロイヌナズナ由来のＡｔＬＥＷ１、レタス由来のＬｓＣＰＴＬ１〜２、タンポポ由来のＴｂＲＴＡなどが挙げられる。
【０１２４】
前記ＮｇＢＲｆａｍｉｌｙに属するタンパク質の具体例としては、下記［２０１］が挙げられる。
［２０１］配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
【０１２５】
また、タンパク質は、元のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含む場合であっても本来持つ機能を有する場合があることが知られている。従って、前記ＮｇＢＲｆａｍｉｌｙに属するタンパク質の具体例としては、下記［２０２］も挙げられる。
［２０２］配列番号６で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつＮ末端側に有する１つ又は複数の膜貫通領域で膜に結合し、Ｃ末端側で他のタンパク質と相互作用する機能を有するタンパク質
【０１２６】
なお、前記ＮｇＢＲｆａｍｉｌｙに属するタンパク質としての機能を維持するためには、配列番号６で表されるアミノ酸配列において、好ましくは１若しくは複数個のアミノ酸、より好ましくは１〜５２個のアミノ酸、更に好ましくは１〜３９個のアミノ酸、更により好ましくは１〜２６個のアミノ酸、特に好ましくは１〜１３個のアミノ酸、最も好ましくは１〜６個のアミノ酸、より最も好ましくは１〜３個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列であることが好ましい。
【０１２７】
また、上述したように、タンパク質は、元のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列を有するタンパク質も同様の機能を有する場合があることが知られている。従って、前記ＮｇＢＲｆａｍｉｌｙに属するタンパク質の具体例としては、下記［２０３］も挙げられる。
［２０３］配列番号６で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＮ末端側に有する１つ又は複数の膜貫通領域で膜に結合し、Ｃ末端側で他のタンパク質と相互作用する機能を有するタンパク質
【０１２８】
なお、前記ＮｇＢＲｆａｍｉｌｙに属するタンパク質としての機能を維持するためには、配列番号６で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。
【０１２９】
ここで、補助酵素としては、Ｎ末端側に有する１つ又は複数の膜貫通領域で膜に結合し、Ｃ末端側でＣＰＴｆａｍｉｌｙに属するタンパク質又は他のタンパク質と相互作用する機能を有していればよいため、ＮｇＢＲｆａｍｉｌｙに属するタンパク質の全部であってもよく、一部であってもよい。
補助酵素としては、融合タンパク質の酵素活性をより増強できるという理由から、下記［２０４］〜［２０６］が好ましい。
［２０４］配列番号６で表されるアミノ酸配列における１位から８１位のアミノ酸配列からなるタンパク質
【０１３０】
［２０５］配列番号６で表されるアミノ酸配列における１位から８１位のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつＮ末端側に有する１つ又は複数の膜貫通領域で膜に結合し、Ｃ末端側で他のタンパク質と相互作用する機能を有するタンパク質
なお、前記機能を維持するためには、配列番号６で表されるアミノ酸配列における１位から８１位のアミノ酸配列において、好ましくは１若しくは複数個のアミノ酸、より好ましくは１〜１６個のアミノ酸、更に好ましくは１〜１２個のアミノ酸、特に好ましくは１〜８個のアミノ酸、最も好ましくは１〜４個のアミノ酸、より最も好ましくは１〜２個のアミノ酸、更に最も好ましくは１個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列であることが好ましい。
【０１３１】
［２０６］配列番号６で表されるアミノ酸配列における１位から８１位のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＮ末端側に有する１つ又は複数の膜貫通領域で膜に結合し、Ｃ末端側で他のタンパク質と相互作用する機能を有するタンパク質
なお、前記機能を維持するためには、配列番号６で表されるアミノ酸配列における１位から８１位のアミノ酸配列との配列同一性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。
【０１３２】
前記ＮｇＢＲｆａｍｉｌｙに属するタンパク質であることを確認する方法としては、従来公知の方法を用いることができ、例えば、アミノ酸配列を同定し、Ｃｉｓ  ＩＰＰＳ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｄｏｍａｉｎ（ＮＣＢＩ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＣＯＧ００２０）に含まれるアミノ酸配列を有しているかどうかを確認する方法が挙げられる。
【０１３３】
前記ＮｇＢＲｆａｍｉｌｙに属するタンパク質をコードする遺伝子は、ＮｇＢＲｆａｍｉｌｙに属するタンパク質をコードし、発現させてＮｇＢＲｆａｍｉｌｙに属するタンパク質を産出できるものであれば特に制限されない。
【０１３４】
＜ゴム製品の製造方法＞
本発明のゴム製品の製造方法は、前記物質製造方法により（融合タンパク質を結合させた油滴を用いて）ポリイソプレノイドを製造するポリイソプレノイド製造工程、得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び前記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法である。
【０１３５】
ゴム製品としては、ゴム（好ましくは天然ゴム）を使用して製造できるゴム製品であれば特に限定されず、例えば、空気入りタイヤ、ゴムローラ、ゴム防舷材、手袋、医療用ゴムチューブ等が挙げられる。
【０１３６】
ゴム製品が空気入りタイヤの場合、すなわち、本発明のゴム製品の製造方法が本発明の空気入りタイヤの製造方法の場合、前記生ゴム製品成形工程は、前記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程に、前記加硫工程は、前記生タイヤを加硫する加硫工程に相当する。すなわち、本発明の空気入りタイヤの製造方法は、前記ポリイソプレノイドを製造するポリイソプレノイド製造工程、得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び前記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法である。
【０１３７】
（混練工程）
混練工程では、前記製造方法により（融合タンパク質を結合させた油滴を用いて）得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る。
【０１３８】
添加剤としては特に限定されず、ゴム製品の製造に用いられる添加剤を使用できる。例えば、ゴム製品が空気入りタイヤの場合、例えば、前記ポリイソプレノイド以外のゴム成分、カーボンブラック、シリカ、炭酸カルシウム、アルミナ、クレー、タルクなどの補強用充填剤、シランカップリング剤、酸化亜鉛、ステアリン酸、加工助剤、各種老化防止剤、オイルなどの軟化剤、ワックス、硫黄などの加硫剤、加硫促進剤等が挙げられる。
【０１３９】
混練工程における混練は、オープンロール、バンバリーミキサー、密閉式混練機などのゴム混練装置を用いて行えばよい。
【０１４０】
（生ゴム製品成形工程（タイヤの場合は生タイヤ成形工程））
生ゴム製品成形工程では、混練工程により得られた混練物から生ゴム製品（タイヤの場合は生タイヤ）を成形する。
生ゴム製品の成形方法としては特に限定されず、生ゴム製品の成形に用いられる方法を適宜適用すればよい。例えば、ゴム製品が空気入りタイヤの場合、混練工程により得られた混練物を、各タイヤ部材の形状に合わせて押し出し加工し、タイヤ成型機上にて通常の方法にて成形し、各タイヤ部材を貼り合わせ、生タイヤ（未加硫タイヤ）を成形すればよい。
【０１４１】
（加硫工程）
加硫工程では、生ゴム製品成形工程により得られた生ゴム製品を加硫することにより、ゴム製品が得られる。
生ゴム製品を加硫する方法としては特に限定されず、生ゴム製品の加硫に用いられる方法を適宜適用すればよい。例えば、ゴム製品が空気入りタイヤの場合、生ゴム製品成形工程により得られた生タイヤ（未加硫タイヤ）を加硫機中で加熱加圧して加硫することにより空気入りタイヤが得られる。
【０１４２】
＜ベクター＞
本発明のベクターは、前記融合タンパク質をコードする遺伝子を導入したベクターである。
このようなベクターを細胞に導入して形質転換を行うことにより、当該ベクターに含まれる、融合タンパク質をコードする遺伝子が発現し、当該細胞におけるポリイソプレノイド等の疎水性化合物の生産量を向上させることが可能となる。
【０１４３】
本発明のベクターは、一般的に形質転換用ベクターとして知られているベクターに、融合タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列（好ましくはプロモーターの塩基配列、及び、融合タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列）を従来公知の方法により挿入することで作製することができる。
【０１４４】
本発明のベクターを作製するために使用することができるベクターとしては、例えば、ｐＢＩ系のベクターや、ｐＧＡ４８２、ｐＧＡＨ、ｐＢＩＧなどのバイナリーベクター、ｐＬＧＶ２３Ｎｅｏ、ｐＮＣＡＴ、ｐＭＯＮ２００などの中間系プラスミド、ＧＡＴＥＷＡＹカセットを含むｐＨ３５ＧＳなどが挙げられる。
【０１４５】
本発明のベクターを作製するために使用することができるプロモーターとしては、例えば、  ＣａＭＶ３５ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ＮＯＳ ｐｒｏｍｏｔｅｒ等の遺伝子組み換えに係る分野において汎用されているプロモーターなどが挙げられる。
【０１４６】
本発明のベクターは、融合タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を含む限り、その他の塩基配列を含んでいてもよい。通常、ベクターにはこれらの塩基配列に加えて、ベクター由来の配列が含まれており、更に、制限酵素認識配列、スペーサ―配列、マーカー遺伝子の配列、レポーター遺伝子の配列などが含まれる。
また、本発明のベクターは、必要に応じて、補助酵素をコードする遺伝子の塩基配列を含んでいてもよい。
【０１４７】
前記マーカー遺伝子としては、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。また、前記レポーター遺伝子は、植物体中での発現部位を確認するために導入するものであり、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、ＧＵＳ（βグルクロニダーゼ）遺伝子、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）等が挙げられる。
【０１４８】
＜形質転換細胞、該形質転換細胞を使用した物質製造方法＞
例えば、本発明のベクターを植物等の細胞に導入することにより、前記融合タンパク質を発現するように形質転換された形質転換細胞が得られる。すなわち、前記融合タンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換細胞が得られる。そして、当該形質転換細胞では、前記融合タンパク質が発現することにより、前記融合タンパク質をコードする遺伝子が導入された細胞内で新たに該タンパク質が有する所定の酵素活性等の機能が発揮されて、融合タンパク質は細胞内に存在する油滴に結合し、疎水性化合物（例えば、ポリイソプレノイド）を合成でき、結果的に当該細胞におけるポリイソプレノイド等の疎水性化合物の生産量を向上させることができる。例えば、第２アミノ酸配列として、シス型プレニルトランスフェラーゼｆａｍｉｌｙに属するタンパク質由来のアミノ酸配列を使用した場合、ポリイソプレノイド（天然ゴム）の生産量を向上させることができる。そして、合成された疎水性化合物は細胞内の油滴内に蓄積する。
また、必要に応じて、本発明のベクターと共に、補助酵素をコードする遺伝子の塩基配列を含むベクターを植物等の細胞に導入してもよい。なお、もちろん、本発明のベクターとして、補助酵素をコードする遺伝子の塩基配列を含むベクターを使用してもよい。
【０１４９】
前記融合タンパク質をコードする遺伝子が導入される宿主としては油滴を有する生物であれば特に限定されないが、微生物（藻類や微細藻類を含む）、植物、及び動物が挙げられる。なかでも、宿主は微生物又は植物であることが好ましく、微生物であることがより好ましく、微細藻類であることがさらに好ましい。
一般的に生物を用いた疎水性化合物の合成は困難であるが、前記宿主に前記融合タンパク質をコードする遺伝子を導入することにより、容易に疎水性化合物の合成を行うことができるようになる。
【０１５０】
前記微生物は原核生物、真核生物のいずれであってもよく、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の微生物やバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の微生物、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）属の微生物、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属の微生物等の原核生物、又は酵母や糸状菌等の真核微生物を用いることができる。なかでも、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、赤色酵母（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、又はモルチエレラ・エスピー（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｓｐ．）が好ましく、大腸菌がより好ましい。
【０１５１】
前記藻類や微細藻類としては、遺伝子組換え手法が確立している観点から、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）属の藻類、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属の藻類、ファエオダクティラム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）属の藻類、又はナンノクロロプシス属の藻類が好ましく、ナンノクロロプシス属の藻類がより好ましい。ナンノクロロプシス属の藻類の具体例としては、ナンノクロロプシス・オキュラータ、ナンノクロロプシス・ガディタナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｇａｄｉｔａｎａ）、ナンノクロロプシス・サリナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓａｌｉｎａ）、ナンノクロロプシス・オセアニカ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｏｃｅａｎｉｃａ）、ナンノクロロプシス・アトムス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ａｔｏｍｕｓ）、ナンノクロロプシス・マキュラタ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｍａｃｕｌａｔａ）、ナンノクロロプシス・グラニュラータ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｇｒａｎｕｌａｔａ）、ナンノクロロプシス・エスピー（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．）等が挙げられる。なかでも、ナンノクロロプシス・オキュラータ、又はナンノクロロプシス・ガディタナが好ましく、ナンノクロロプシス・オキュラータがより好ましい。
【０１５２】
前記植物としては、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、西洋アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ）、ココヤシ（Ｃｏｃｏｓ  ｎｕｃｉｆｅｒａ）、パーム（Ｅｌａｅｉｓ  ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ）、クフェア、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、クスノキ（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｍｐｈｏｒａ）、又はヤトロファ（Ｊａｔｒｏｐｈａ  ｃｕｒｃａｓ）が好ましく、シロイヌナズナがより好ましい。
【０１５３】
次に、前記形質転換細胞の作製方法について簡単に説明するが、このような形質転換細胞は従来公知の方法により作製することができる。
【０１５４】
本発明のベクターを植物（カルスや、培養細胞、スフェロプラスト、プロトプラストといった植物細胞を含む）に導入する方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いる方法（特開昭５９−１４０８８５号公報、特開昭６０−７００８０号公報、国際公開第９４／００９７７号）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７号公報）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６号、特許第２５１７８１３号）等を挙げることができる。
なお更には、本発明のベクターを、前記ＤＮＡを導入する方法などにより、微生物、酵母、動物細胞、昆虫細胞等の、生物体、生物体の一部、器官、組織や培養細胞、スフェロプラスト、プロトプラストなどに導入することによって、形質転換細胞を調製することも可能である。
【０１５５】
以上の方法等により、前記形質転換細胞が得られる。ここで、前記形質転換細胞は、形質転換された細胞を含む限りその形態は限定されず、細胞単独でもよく、細胞が合わさった組織や形質転換体であってもよい。なお、前記形質転換細胞は、上述の方法で得られた形質転換細胞のみならず、その子孫又はクローン、さらにそれらを継代させて得られる子孫生物の全てを含む概念である。
【０１５６】
例えば、一旦、本発明のベクターが導入された形質転換植物細胞が得られれば、該形質転換植物細胞から有性生殖、無性生殖、組織培養、細胞培養、細胞融合等により子孫又はクローンを得ることが可能である。また、該形質転換植物細胞やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、不定芽、不定胚、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該形質転換植物を量産することも可能である。
【０１５７】
形質転換植物細胞から植物体（形質転換植物）を再生する方法としては、例えば、ユーカリでは土肥らの方法（特願平１１−１２７０２５号公報）、イネではＦｕｊｉｍｕｒａらの方法（Ｆｕｊｉｍｕｒａら（１９９５），  Ｐｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ．２：ｐ７４−）、トウモロコシではＳｈｉｌｌｉｔｏらの方法（Ｓｈｉｌｌｉｔｏら（１９８９），  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．７：ｐ５８１−）、ジャガイモではＶｉｓｓｅｒらの方法（Ｖｉｓｓｅｒら（１９８９），  Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，ｖｏｌ．７８：ｐ５８９−）、シロイヌナズナではＡｋａｍａらの方法（Ａｋａｍａら（１９９２），  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，ｖｏｌ．１２：ｐ７−）が知られており、当業者であれば、これらを参照して形質転換植物細胞から植物体を再生できる。
【０１５８】
再生した植物体において、周知の手法を用いることで、目的のタンパク質遺伝子の発現を確認することが出来る。例えば、目的のタンパク質の発現をウエスタンブロット解析すればよい。
【０１５９】
前記形質転換植物から種子を得る方法としては、例えば、形質転換植物を適当な培地において発根させ、その発根体を水分含有の土を入れたポットに移植する。適当な栽培条件下で生育させ、最終的に種子を形成させて、該種子を得る。また、種子から植物体を得る方法としては、例えば、前記のようにして得られた形質転換植物由来の種子を、水分含有の土に播種し、適当な栽培条件下で生育させることにより植物体を得ることができる。
【０１６０】
本発明では、本発明のベクターを植物等の細胞に導入することにより、該ベクターに含まれる融合タンパク質をコードする遺伝子が発現し、当該細胞における疎水性化合物（例えば、ポリイソプレノイド）の生産量を向上させることができる。具体的には、上述の方法で得られた形質転換細胞、形質転換植物細胞から得られたカルス、該カルスから再分化した細胞等を適当な培地で培養したり、形質転換植物細胞から再分化した形質転換植物、該形質転換植物から得られた種子から得られた植物体等を適当な栽培条件下で生育させたりすることにより、疎水性化合物（例えば、ポリイソプレノイド）を製造することができる。
【０１６１】
このように、本発明のベクターを植物等の細胞に導入することにより、該細胞における疎水性化合物（例えば、ポリイソプレノイド）の生産量を向上させる方法もまた、本発明の１つである。
【０１６２】
（ゴム製品の製造方法）
本発明のゴム製品の製造方法は、前記物質製造方法により（前記融合タンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換細胞を用いて）ポリイソプレノイドを製造するポリイソプレノイド製造工程、得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び前記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法である。
【０１６３】
ゴム製品としては、本発明において上述したものと同様である。
【０１６４】
ゴム製品が空気入りタイヤの場合、すなわち、本発明のゴム製品の製造方法が本発明の空気入りタイヤの製造方法の場合、前記生ゴム製品成形工程は、前記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程に、前記加硫工程は、前記生タイヤを加硫する加硫工程に相当する。すなわち、本発明の空気入りタイヤの製造方法は、前記物質製造方法により（前記融合タンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換細胞を用いて）ポリイソプレノイドを製造するポリイソプレノイド製造工程、得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び前記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法である。
【０１６５】
＜混練工程＞
混練工程では、前記物質製造方法により（前記融合タンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換細胞を用いて）得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る。
【０１６６】
前記融合タンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換細胞から得られるポリイソプレノイドは、前記形質転換細胞から油滴を採取し、採取した油滴を以下の固化工程に供することにより得られる。
なお、前記形質転換細胞からの油滴の採取方法は特に制限されず、通常行われる方法を採用することができるが、例えば、形質転換細胞の一部を切断し、切断した組織を粉砕し、有機溶媒を用いて抽出して採取したりすることができる。
【０１６７】
＜固化工程＞
前記採取された油滴は、固化工程に供される。固化する方法としては、特に限定されず、エタノール、メタノール、アセトン等のポリイソプレノイド（天然ゴム）を溶解しない溶媒に油滴を添加する方法や油滴に酸を添加する方法等が挙げられる。固化工程を行うことにより、油滴からゴム（天然ゴム）を固形分として回収できる。得られたゴム（天然ゴム）は、必要に応じて乾燥してから使用すればよい。
【０１６８】
添加剤としては特に限定されず、ゴム製品の製造に用いられる添加剤を使用できる。例えば、ゴム製品が空気入りタイヤの場合、例えば、前記油滴から得られたゴム以外のゴム成分、カーボンブラック、シリカ、炭酸カルシウム、アルミナ、クレー、タルクなどの補強用充填剤、シランカップリング剤、酸化亜鉛、ステアリン酸、加工助剤、各種老化防止剤、オイルなどの軟化剤、ワックス、硫黄などの加硫剤、加硫促進剤等が挙げられる。
【０１６９】
混練工程における混練は、オープンロール、バンバリーミキサー、密閉式混練機などのゴム混練装置を用いて行えばよい。
【０１７０】
＜生ゴム製品成形工程（タイヤの場合は生タイヤ成形工程）＞
生ゴム製品成形工程では、本発明において上述した工程と同様である。
【０１７１】
＜加硫工程＞
加硫工程は、本発明において上述した工程と同様である。
【実施例】
【０１７２】
実施例に基づいて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
【０１７３】
〔ＨｅｖｅａラテックスからのＴｏｔａｌ  ＲＮＡ抽出〕
パラゴムノキのラテックスからホットフェノール法により、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。ラテックス６ｍＬに１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液６ｍＬ、１０％ＳＤＳ溶液１ｍＬを添加し、さらに６５℃で予温しておいた水飽和フェノールを１２ｍＬ添加した。６５℃で５分間インキュベートしたのち、ボルテックスで撹拌し、室温、７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った。遠心後、上清を新しいチューブに移し、フェノール：クロロホルム（１：１）溶液１２ｍＬを添加し、２分間振盪撹拌した。撹拌後、再度、室温、７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った後、上清を新しいチューブに移し、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）溶液１２ｍＬを添加し、２分間振盪撹拌した。撹拌後、再度、室温、７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った後、上清を新しいチューブに移し、３Ｍ酢酸ナトリウム溶液１．２ｍＬとイソプロパノール１３ｍＬを添加し、ボルテックスで撹拌した。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを沈殿させるために、−２０℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を取除くことでＴｏｔａｌ  ＲＮＡの沈殿を回収した。回収したＴｏｔａｌ  ＲＮＡは７０％エタノールで２度洗浄したのち、ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅの水で溶解させた。
【０１７４】
〔Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡからｃＤＮＡの合成〕
回収したＴｏｔａｌ  ＲＮＡをもとに、ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡの合成はＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  １ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒa）の説明書に従って行った。
【０１７５】
〔ｃＤＮＡからＣＰＴ、ＮｇＢＲ及びＳＲＰＰ遺伝子の取得〕
作製した１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを鋳型にＣＰＴ、ＮｇＢＲ及びＳＲＰＰ遺伝子の取得を行った。ＰＣＲはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用し、説明書に従って行った。ＰＣＲは、９８℃で１０秒、５８℃で３０秒、６８℃で１分を１サイクルとして、３５サイクル行った。
ＣＰＴ遺伝子の取得は、プライマーとして、
プライマー１：５’−  ｔｔｔｇｇａｔｃｃｇａｔｇｇａａｔｔａｔａｃａａｃｇｇｔｇａｇａｇｇ−３’
プライマー２：５’−  ｔｔｔｇｃｇｇｃｃｇｃｔｔａｔｔｔｔａａｇｔａｔｔｃｃｔｔａｔｇｔｔｔｃｔｃｃ−３’
を使用した。
ＮｇＢＲ遺伝子の取得は、プライマーとして、
プライマー３：５’−  ｔｔｔｃｔｃｇａｇａｔｇｇａｔｔｔｇａａａｃｃｔｇｇａｇｃｔｇ  −３’
プライマー４：５’−  ｔｔｔｃｔｃｇａｇｔｃａｔｇｔａｃｃａｔａａｔｔｔｔｇｃｔｇｃａｃ  −３’
を使用した。
更にＮｇＢＲの１−８１アミノ酸部分の遺伝子の取得は、先に取得したＮｇＢｒ遺伝子を鋳型にプライマーとして、
プライマー３３：５’−  ａａａａｃｔｃｇａｇａｔｇｇａｔｔｔｇａａａｃｃｔｇｇａｇｃ  −３’
プライマー３４：５’−  ｔｔａｃｔａｇｔｔｃａａｇｃｔｔｃｔｔｃｃａｃｔａｔｃｔａｃｃａｃａ−３’
を使用して取得した。
ＳＲＰＰ遺伝子の取得は、プライマーとして、
プライマー５：５’−  ｔｔｔｃｔｃｇａｇａｔｇｇｃｔｇａａｇａｇｇｔｇｇａｇ−３’
プライマー６：５’−  ｔｔｔｇｇａｔｃｃｔｔａｔｇａｔｇｃｃｔｃａｔｃｔｃｃ−３’
を使用した。
【０１７６】
上述の方法により、ＣＰＴ遺伝子（ＨＲＴ１）、ＮｇＢＲ遺伝子（ＨＲＢＰ遺伝子）及びＳＲＰＰ遺伝子が得られた。得られた遺伝子について、その配列を同定し、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定した。ＨＲＴ１の塩基配列を配列番号１に示した。ＨＲＴ１のアミノ酸配列を配列番号２に示した。また、ＨＲＢＰの塩基配列を配列番号７に示した。ＨＲＢＰのアミノ酸配列を配列番号６に示した。また、ＳＲＰＰの塩基配列を配列番号１２に示した。ＳＲＰＰのアミノ酸配列を配列番号１１に示した。
【０１７７】
更に、配列番号６で表されるアミノ酸配列（ＨＲＢＰ）における１位から８１位のアミノ酸配列（ＨＲＢＰ（１−８１））に対応する塩基配列を有する遺伝子も取得した。
【０１７８】
〔アボカドのｃＤＮＡ合成〕
株式会社庄定から購入したメキシコ産のアボカド（Ｈａｓｓ）を用いた。このアボカドは−８０℃で保存していた。アボカドを液体窒素中で破砕し、ＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。続いて糖沈殿を行った。１００μｌのＲＮＡ溶液に１０μｌの３Ｍ  ＮａＯＡｃを添加し、氷上で１時間静置した。その後、１３，０００×ｇ、４℃で１５分遠心し、上清を回収した。上清に２５０μｌの１００％エタノールを添加し、−３０℃で１時間静置した。再び１３，０００×ｇ、４℃で１０分遠心し、上清を回収したのち７０％エタノールを添加し、１３，０００×ｇ、４℃で５分遠心した。上清を捨て、乾燥させたのちにＤＥＰＣを５０μｌ添加した。このＲＮＡをＦａｓｔ  Ｇｅｎｅ  Ｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ＩＩ（ＮＩＰＰＯＮ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ＥＵＲＯＰＥ）を使用してｃＤＮＡを合成した。
【０１７９】
〔ＬＤＡＰ１、ＬＤＡＰ２のクローニング〕
得られたｃＤＮＡを鋳型にＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）によるＰＣＲを行い、ＬＤＡＰ１、ＬＤＡＰ２のＤＮＡ断片を増幅した。プライマーは下記の組み合わせで行った。
ＬＤＡＰ１遺伝子の場合は、プライマーとして、
プライマー７：５’−  ｔｃｇａｇｇａｔｃｃｃａｔｇｇｃａｇａａｇｃａｇａｔｇｃａａａａｃｔｇｃ−３’
プライマー８：５’−  ｇｃａｔａｃｔａｇｔｔｃａａｔｔｇａｃｔａｃｃｔｃｇｇａｔｇｔｇｇｔｃ−３’
を使用した。
ＬＤＡＰ２遺伝子の場合は、プライマーとして、
プライマー９：５’−  ｔｃｇａｇｇａｔｃｃｃａｔｇｇｃｇｇａａａａａｇａａｇｇａａｇｇｃ−３’
プライマー１０：５’−  ｇｃａｔａｃｔａｇｔｔｃａｔｔｃａｇｃｔｇｃａａｃｔｇｃａａｃｇ−３’
を使用した。
【０１８０】
ＰＣＲ増幅産物を０．８％アガロースゲル電気泳動により分離し、ゲルを切り出した後、Ｆａｓｔ  Ｇｅｎｅ  ＴＭ  ゲル／ＰＣＲ抽出キット（Ｎｉｐｐｏｎ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ）を用いて精製した。精製したＤＮＡ断片に対し、ＴＡクローニングを行うことでｐＧＥＭ−Ｔ  ＥＡＳＹ  Ｖｅｃｔｏｒに挿入した。続いて、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した後、ＬＢ寒天培地に塗布して３７℃で一晩培養し、青白判定を行った。白色コロニーを複数個選抜することで目的配列が導入されたシングルコロニーを単離し、Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ  （Ａｍｐ）入りのＬＢ液体培地（５０μｇ／ｍＬ  Ａｍｐ）にて３７℃で１６時間培養した。培養後の菌体を集菌し、Ｆａｓｔ  ＧｅｎｅＴＭ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＧＥＮＥＴＩＣＳ）を用いてプラスミドを回収した。最後にＤＮＡシークエンシングにより、塩基配列を確認した。
【０１８１】
上述の方法により、ＬＤＡＰ遺伝子（ＬＤＡＰ１、ＬＤＡＰ２）が得られた。得られた遺伝子について、その配列を同定し、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定した。ＬＤＡＰ１の塩基配列を配列番号８に示した。ＬＤＡＰ１のアミノ酸配列を配列番号４に示した。ＬＤＡＰ２の塩基配列を配列番号１３に示した。ＬＤＡＰ２のアミノ酸配列を配列番号１０に示した。
【０１８２】
〔シロイヌナズナからのＣＰＴ遺伝子の取得〕
上述の方法と同様の手法により、シロイヌナズナから、ＣＰＴ遺伝子（ＡｔＣＰＴ５）が得られた。得られた遺伝子について、その配列を同定し、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定した。ＡｔＣＰＴ５の塩基配列を配列番号９に示した。ＡｔＣＰＴ５のアミノ酸配列を配列番号３に示した。
【０１８３】
〔コンストラクトの作製〕
〔〔無細胞系発現用ＬＤＡＰ１、ＬＤＡＰ２、ＳＲＰＰコンストラクトの作製〕〕
前述で得られたＬＤＡＰ１＆２遺伝子、ＳＲＰＰ遺伝子を無細胞発現用プラスミドｐＥＵ−Ｅ０１−Ｈｉｓ−ＴＥＶ−ＭＣＳ−Ｎ２  Ｖｅｃｔｏｒ  （ＣｅｌｌＦｒｅｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｔｓｕｙａｍａ，Ｊａｐａｎ）に導入した。ＬＤＡＰ１＆２遺伝子は、マルチクローニングサイトのＢａｍＨＩ―ＳｐｅＩサイトに、ＳＲＰＰ遺伝子は、ＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩサイトに導入した。
【０１８４】
〔〔無細胞発現用ＨＲＴ１、ＨＲＢＰ（１−８１）コンストラクトの作製〕〕
前述で得られたＨＲＴ１、ＨＲＢＰ（１−８１）遺伝子を無細胞発現用プラスミドｐＥＵ−Ｅ０１−Ｈｉｓ−ＴＥＶ−ＭＣＳ−Ｎ２  Ｖｅｃｔｏｒに導入した。ＨＲＴ１遺伝子は、マルチクローニングサイトのＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩサイトに、ＨＲＢＰ（１−８１）はＸｈｏＩ−ＳｐｅＩサイトに導入した。
【０１８５】
〔〔無細胞系発現用ＬＤＡＰ１−ＨＲＴ１、ＬＤＡＰ２−ＨＲＴ１、ＳＲＰＰ−ＨＲＴ１コンストラクトの作製〕〕
ＨＲＴ１のＮ末端側に油滴結合タンパク質を融合させた融合タンパク質のためのコンストラクトを作製するために、ＬＤＡＰ１＆２とＳＲＰＰを以下のプライマーを用いてＰＣＲをし直し、前述したｐＥＵ−Ｅ０１−Ｈｉｓ−ＴＥＶ−ＭＣＳ−Ｎ２  ＶｅｃｔｏｒにＨＲＴ１を導入したｐＥＵ−Ｈｉｓ−Ｎ２−ＨＲＴ１コンストラクトに導入した。ＬＤＡＰ１とＳＲＰＰはマルチクローニングサイトのＥｃｏＲＶ−ＢａｍＨＩサイトに、ＬＤＡＰ２はＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩサイトに導入した。これにより、ＨＲＴ１のＮ末端側に油滴結合タンパク質を融合させた融合タンパク質のためのコンストラクトを作製できた。
ＨＲＴ１と融合させるためのＬＤＡＰ１遺伝子増幅の場合は、プライマーとして、
プライマー１１：５’−  ａｇｔｃａｇａｔａｔｃｔｃａｔｇｇｃａｇａａｇｃａｇａｔｇｃａａａａｃ−３’
プライマー１２：５’−  ｔｇａｃｔｇｇａｔｃｃｔｃａｔｔｇａｃｔａｃｃｔｃｇｇａｔｇｔｇｇｔｃ−３’
を使用した。
ＨＲＴ１と融合させるためのＬＤＡＰ２遺伝子増幅の場合は、プライマーとして、
プライマー１３：５’−  ａｇｔｃａｃｔｃｇａｇａｔｇｇｃｇｇａａａａａｇａａｇｇａａｇｇ−３’
プライマー１４：５’−  ｔｇａｃｔｇｇａｔｃｃｔｃｔｔｃａｇｃｔｇｃａａｃｔｇｃａａｃｇｔｃ−３’
を使用した。
ＨＲＴ１と融合させるためのＳＲＰＰ遺伝子増幅の場合は、プライマーとして、
プライマー１５：５’−  ａｇｔｃａｇａｔａｔｃｔｃａｔｇｇｃｔｇａａｇａｇｇｔｇｇａｇｇａａｇ−３’
プライマー１６：５’−  ｔｇａｃｔｇｇａｔｃｃｔｃｔｇａｔｇｃｃｔｃａｔｃｔｃｃａａａｃａｃｃ−３’
を使用した。
【０１８６】
〔〔無細胞発現用ＬＤＡＰ１−ＡｔＣＰＴ５、ＡｔＣＰＴ５−ＬＤＡＰ１コンストラクトの作製〕〕
前述したＬＤＡＰ１をｐＥＵ−Ｈｉｓ−Ｎ２−ＨＲＴ１に導入したｐＥＵ−Ｈｉｓ−Ｎ２−ＬＤＡＰ１−ＨＲＴ１をもとに、前述で獲得したＡｔＣＰＴ５遺伝子を以下のプライマーを用いてＰＣＲし直し、ＢａｍＨＩとＮｏｔＩで処理し、同様の酵素処理によりＨＲＴ１遺伝子を抜いたベクターに導入することで、ＬＤＡＰ１のＣ末端側にＡｔＣＰＴ５を導入した。（ＬＤＡＰ１−ＡｔＣＰＴ５）
ＬＤＡＰ１と融合させるためのＡｔＣＰＴ５遺伝子増幅（ＬＤＡＰ１−ＡｔＣＰＴ５順）の場合は、プライマーとして、
プライマー１７：５’−  ＡＧＴＣＡＧＧＡＴＣＣＣＡＴＧＴＴＧＴＣＡＴＴＣＴＣＴＣＴＴＣＴＣ−３’
プライマー１８：５’−  ＴＧＡＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＣＡＡＡＣＣＣＧＡＣＡＧＣＣＡＡＡＴＣ−３’
を使用した。
【０１８７】
また、ＡｔＣＰＴ５遺伝子の端にＥｃｏＲＶとＢａｍＨＩのサイトが、ＬＤＡＰ１遺伝子の端にＢａｍＨＩとＳｐｅＩサイトが来るように以下のプライマーを用いてＰＣＲし直し、同様の酵素処理したベクターに導入することで、ＬＤＡＰ１のＮ末端側にＡｔＣＰＴ５を導入した。（ＡｔＣＰＴ５−ＬＤＡＰ１）
ＬＤＡＰ１と融合させるためのＡｔＣＰＴ５獲得時（ＡｔＣＰＴ５‐ＬＤＡＰ１順）ＡｔＣＰＴ５用には、プライマーとして、
プライマー１９：５’−  ａｇｔｃａｇａｔａｔｃｔｃａｔｇｔｔｇｔｃｔａｔｔｃｔｃｔｃｔｔｃｔｃｔｔｔｔａｔ−３’
プライマー２０：５’−  ｔｇａｃｔｇｇａｔｃｃｔｃａａｃｃｃｇａｃａｇｃｃａａａｔｃｇ−３’
を使用した。
ＬＤＡＰ１用には、上記プライマー７、プライマー８を使用した。
【０１８８】
〔〔ＬＤＡＰ１−リンカー−ＡｔＣＰＴ５、ＡｔＣＰＴ５−リンカー−ＬＤＡＰ１コンストラクトの作製〕〕
東京工業大学大学院生命理工学研究科生体システム専攻の太田啓之教授よりＮｏｂｕｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）３にて使用されたｐＧＦＰ−Ｌ４ＨＰＢのプラスミドを戴き、そこに含まれるリンカー配列をＰＣＲの鋳型として使用した。
ここで、そのリンカーはｐｈｍＡＧ１−ＭＣＬｉｎｋｅｒ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｍｅｄｉｃａｌ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に含まれていた配列を流用したものである。
ＬＤＡＰ１とリンカー配列は、Ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲ法を利用し、以下のプライマーを用いて結合させた（ＬＤＡＰ１−リンカー、リンカー−ＬＤＡＰ１）。
ＬＤＡＰ１−リンカー融合用（オーバーラップＰＣＲ）の場合、
ＬＤＡＰ１側では、プライマーとして、
プライマー２１：５’−  ｔｃｇａｇｇａｔｃｃｃａｔｇｇｃａｇａａｇｃａｇａｔｇｃａａａａｃｔｇｃ−３’
プライマー２２：５’−  ｃｇｇａａｔｔａｃｃｇｇｔａｔｔｇａｃｔａｃｃｔｃ−３’
を使用し、
リンカー側では、プライマーとして、
プライマー２３：５’−  ｇａｇｇｔａｇｔｃａａｔａｃｃｇｇｔａａｔｔｃｃｇ−３’
プライマー２４：５’−  ｔｇａｃｔｇｃｇｇｃｃｇｃｇｃｃｃｃｔｔｇｇｇｔｃｇａｔｃｃｔｃｃ−３’
を使用し、ＬＤＡＰ１−リンカー融合配列を得た。
リンカー−ＬＤＡＰ１融合用（オーバーラップＰＣＲ）の場合、
ＬＤＡＰ１側では、プライマーとして、
プライマー２５：５’−  ｇａｃｃｃａａｇｇｇａｔｇｇｃａｇａａｇ−３’
プライマー２６：５’−  ｇｃａｔａｃｔａｇｔｔｃａａｔｔｇａｃｔａｃｃｔｃｇｇａｔｇｔｇｇｔｃ−３’
を使用し、
リンカー側では、プライマーとして、
プライマー２７：５’−  ａｇｔｃａｇｃｇｇｃｃｇｃａｃｃｇｇｔａａｔｔｃｃｇｃｔｇａｃｇ−３’
プライマー２８：５’−  ｃｔｔｃｔｇｃｃａｔｃｃｃｔｔｇｇｇｔｃ−３’
を使用し、リンカー−ＬＤＡＰ１融合配列を得た。
【０１８９】
ＬＤＡＰ１−リンカー−ＡｔＣＰＴ５の順で結合する際は、前述したオーバーラップＰＣＲで得たＬＤＡＰ１−リンカー融合配列をｐＥＵ−Ｅ０１−Ｈｉｓ−ＴＥＶ−ＭＣＳ−Ｎ２  ＶｅｃｔｏｒのＢａｍＨＩとＮｏｔＩのサイトに導入し、さらに、ＡｔＣＰＴ５を以下のプライマーを用いてＰＣＲし直し、ＡｔＣＰＴ５をＮｏｔＩとＳｐｅＩのサイトに導入した。
ＡｔＣＰＴ５−リンカーＬＤＡＰ１−の順で結合する際は、前述したオーバーラップＰＣＲで得たリンカー‐ＬＤＡＰ１融合配列をｐＥＵ−Ｅ０１−Ｈｉｓ−ＴＥＶ−ＭＣＳ−Ｎ２  ＶｅｃｔｏｒのＮｏｔＩとＳｐｅＩのサイトに導入し、プライマー１７と１８を使用して増幅したＡｔＣＰＴ５をＢａｍＨＩとＮｏｔＩのサイトに導入した。
リンカー‐ＬＤＡＰ１にＡｔＣＰＴ５融合時にＡｔＣＰＴ５遺伝子を増幅する場合は、プライマーとして、
プライマー２９：５’−  ａｇｔｃａｇｃｇｇｃｃｇｃａｔｇｔｔｇｔｃｔａｔｔｃｔｃｔｃｔｔｃｃｔｃｔｔｔｔａｔｃ−３’
プライマー３０：５’−  ｔｇａｃｔａｃｔａｇｔｔｃａａａｃｃｃｇａｃａｇｃｃａａａｔｃ−３’
を使用した。
【０１９０】
〔〔ＬＤＡＰ１−リンカー−ＨＲＴ１、ＨＲＴ１−リンカー−ＬＤＡＰ１コンストラクトの作製〕〕
これらは前述の方法と同様のやり方で作製した。なお、ＨＲＴ１は以下のプライマーを用いてＰＣＲし直して用いた。
ＬＤＡＰ１−リンカーにＨＲＴ１融合時にＨＲＴ１遺伝子を増幅する場合は、プライマーとして、
プライマー３１：５’−  ａｇｔｃａｇｃｇｇｃｃｇｃａｔｇｇａａｔｔａｔａｃａａｃｇｇｔｇａｇａｇｇ−３’
プライマー３２：５’−  ｔｇａｃｔａｃｔａｇｔｔｔａｔｔｔｔａａｇｔａｔｔｃｃｔｔａｔｇｔｔｔｃｔｃｃ−３’
を使用した。
リンカー−ＬＤＡＰ１と融合する際はｐＥＵ−Ｅ０１−Ｈｉｓ−ＴＥＶ−ＭＣＳ−Ｎ２  ＶｅｃｔｏｒのＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩにＨＲＴ１遺伝子を導入した前記ベクターのＮｏｔＩとＳｐｅＩのサイトに前述したオーバーラップＰＣＲで得たリンカー−ＬＤＡＰ１融合配列を融合することで作製した。
【０１９１】
なお、リンカー配列としては、配列番号５で表されるアミノ酸配列を使用し、該アミノ酸配列に対応する塩基配列の遺伝子を使用した。
なお、作製した各コンストラクトにより、表６等に示すアミノ酸配列の組み合わせの各タンパク質を合成できることを確認した。
【０１９２】
〔Ｌｉｐｉｄ  Ｄｒｏｐｌｅｔ（ＬＤ、油滴）の調製〕
アボカド中果皮から油滴（ＬＤ）を抽出した。まず、アボカド（Ｐｅｒｓｅａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）の中果皮１０ｇをＢｕｆｆｅｒ  Ａ  ２０ｍＬ（アボカドの２倍量）（下表）とともにブレンダーで破砕し、乳鉢を用いてさらに破砕した。破砕溶液をＭｉｒａｃｌｏｔｈでろ過し、ろ液を１５，０００×ｇ、４℃で３０分遠心分離した。上層に浮遊したＦａｔ  ｐａｄを回収し、再懸濁してＢｕｆｆｅｒ  Ｂ（下表）を５ｍＬ加え、１５，０００×ｇ、４℃で３０分遠心分離した。再度、Ｆａｔ  ｐａｄを回収し、Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂを加えて１５，０００×ｇ、４℃で３０分遠心分離した。続いて、ＬＤの粒子径で分離するため、Ｆａｔ  ｐａｄを回収し、１，０００×ｇ、４℃で１０分遠心分離した後、シリンジを用いて、下層の溶液を回収した。この溶液を１５，０００×ｇ、４℃で３０分遠心分離し、下層を除去したのち、ＴＤ  Ｂｕｆｆｅｒ（下表）を６０μＬ添加し、ＬＤ溶液とした。
【０１９３】
【表１】
0006923166.tif 000002
【０１９４】
〔無細胞発現系によるｍＲＮＡ合成および抽出〕
ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＥＮＤＥＸＴ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ＣｅｌｌＦｒｅｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、前記方法で作製したコンストラクトからｍＲＮＡを合成した。以下の組成で３７℃、３時間反応させた。
【０１９５】
【表２】
0006923166.tif 000003
【０１９６】
反応後、エタノール沈殿を行った。最後は常温の１×ＤＢ  Ｂｕｆｆｅｒ（下表）を２５  μＬ添加し、溶解させた。回収したｍＲＮＡは−８０℃で保存した。
【０１９７】
【表３】
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４×ＤＢ組成
【０１９８】
〔無細胞発現系による翻訳反応による精製ＬＤ作製〕
前記方法で作製したｍＲＮＡを用いて各タンパク質を、前記方法で精製したＬＤ上で発現させるため、コムギ胚芽由来無細胞タンパク質発現キットＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＥＮＤＥＸＴ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ＣｅｌｌＦｒｅｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて翻訳反応を行った。
はじめに前記方法で作製したｍＲＮＡ  ７．５μＬに１×ＤＢ  １５μＬを加え、ｍＲＮＡ  Ｐｒｅｍｉｘを調製した。その後、以下の組成で翻訳反応溶液を調製した。
ここで、表６において補助酵素を使用した例では、補助酵素のｍＲＮＡも添加した。
【０１９９】
【表４】
0006923166.tif 000005
翻訳反応組成
Ｘ：ＬＤは１２．５  μｇ分を調製
【０２００】
プラスチックチューブ（ＰＰ容器、４．５ｍＬ、５−０９４−０２、アズワン）にＳＤＷを６５０μＬ加え、その中に透析用カップ（ＭＷＣＯ１２０００、コスモ・バイオ株式会社）を透析膜に空気が入り込まないように入れ、１０分以上静置した。その後、チューブ内のＳＤＷを捨て、外液として１×ＤＢ  Ｂｕｆｆｅｒを６５０μＬ、内液として透析カップ内に調製した翻訳反応用液を５０μＬ加え、透析膜に空気が入り込まないように透析カップをプラスチックチューブに入れ、パラフィルムでカップを覆い、２６℃で５時間反応させた。反応後、外液を新たな１×ＤＢに入れ替え、内液にｍＲＮＡ  Ｐｒｅｍｉｘ  ５μＬ追加し、さらに１３時間反応を行った。反応終了後、反応溶液を回収し、そのうち５０μＬを１．５ｍＬ用チューブに移し、１×ＤＢを５０μＬ加え、１５，０００×ｇ、４℃で２０分遠心分離した。遠心分離により分離したＬＤ層と水層を新たなチューブに移し、そこに、１×ＤＢを５０μＬ加え、１５，０００×ｇ、４℃で２０分遠心分離した。遠心分離溶液のうち、水層を注射器（テルモ注射針ＮＮ−２７１９Ｓ、ＴＥＲＵＭＯ、１ｍＬ  ツベルクリン用テルモシリンジ、ＳＳ−０１Ｔ、ＴＥＲＵＭＯ）で抜き取り、残りのＬＤ層をＴＤ  Ｂｕｆｆｅｒ  １００μＬで希釈し、これを精製ＬＤ溶液とした。また、ＬＤ層と水層を抜いたチューブにＢｕｆｆｅｒ  １００μＬを加え再懸濁し、これをＰｅｌｌｅｔ溶液とした。
【０２０１】
〔プレニル鎖延長酵素活性測定〕
前記方法で作製した精製ＬＤ溶液を［４−１４Ｃ］ＩＰＰ（ＮＥＣ７７３、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を含む以下に示す反応組成で３０℃、１８時間浴槽内にて振とうした。ただし、精製ＬＤ溶液のアッセイに持ち込む量をそろえるため、Ｇｅｎｅ  Ｓｐｅｃを用いてＢｒａｄｆｏｒｄ法によりタンパク質濃度を測定し、タンパク質２μｇ相当分を持ち込んだ。また、バックグランドを測定するために精製ＬＤ溶液の代わりに超純水を加えたサンプルも調製し、同様に振とうした。
【０２０２】
【表５】
0006923166.tif 000006
プレニル鎖延長酵素活性測定の反応組成
Ｘ：精製ＬＤは２μｇ分を調製
【０２０３】
反応後、飽和食塩水を２００μＬ添加し撹拌することで、反応を停止した。飽和食塩水飽和ｎ−ブタノールを１ｍＬ加え、１分間ボルテックスにより撹拌し、１５，０００ｒｐｍ、室温で１分間遠心後に上層のブタノール層を回収することで、ポリイソプレノイドを抽出した。抽出液５０μＬをクリアゾル３ｍＬに加え、液体シンチレーションカウンター（ＬＤ６５００、ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ）で放射活性を測定した。測定した値からバックグラウンドの値を引き、１ｍＬのうち５０μＬを測定したため２０倍することで、抽出物全体のカウント数を計算した。放射活性（ｄｐｍ）が高いほど、ポリイソプレノイド（天然ゴム）が多く生産されており、ゴム合成活性が高いことを示す。
結果を表６に示す。
【０２０４】
【表６】
0006923166.tif 000007
【０２０５】
表６の上表より、リンカー配列を有する融合タンパク質は、リンカー配列を有さない融合タンパク質に比べて、活性が保持されることが分かった。
表６の下表より、単独では活性を示さず、ＨＲＢＰと相互作用することで活性を示すＨＲＴ１においても油滴結合タンパク質との融合状態でもその性質を失わないことが分かった。すなわち、ＨＲＴ１の活性発現に必要なＨＲＢＰの作用が、融合タンパク質の状態でも阻害されないこと、補助因子が必要な酵素であっても、融合タンパク質の状態でも活性を発現できることが分かった。
【０２０６】
〔電気泳動試験〕
タンパク質発現後の反応溶液、その反応溶液を分画して得られた油滴画分に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動を行うことで、タンパク質の発現および精製ＬＤ上でタンパク質が発現していたかを確認した。サンプル２μＬを２×ＳＤＳサンプルバッファー１０μＬ、水８μＬと混合したものを２０μＬずつアプライした。分離ゲルのアクリルアミド濃度は１２％（ｗ／ｖ）もしくは１５％（ｗ／ｖ）とし、染色にはＣｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅ  Ｒ−２５０を用いた。
結果を図６〜８に示す。
【０２０７】
図６に示すＬＤＡＰ１、ＬＤＡＰ２、ＳＲＰＰの油滴結合力試験の結果より、ＬＤＡＰ１、ＬＤＡＰ２、ＳＲＰＰが油滴に結合することが確認できた。
【０２０８】
図７に示すＬＤＡＰ１、ＬＤＡＰ２、ＳＲＰＰ融合タンパク質の油滴結合能力試験の結果より、ＬＤＡＰ１−ＨＲＴ１、ＬＤＡＰ２−ＨＲＴ１、ＳＲＰＰ−ＨＲＴ１いずれの融合タンパク質も変わらず、油滴結合力を示すことが確認できた。これにより、いずれのＬＤＡＰ１／ＳＲＰＰ  Ｆａｍｉｌｙのタンパク質も他のタンパク質と融合した融合タンパク質の状態でも油滴に結合することが分かった。
【０２０９】
図８に示すＬＤＡＰ１−ＡｔｃＰＴ５、ＬＤＡＰ１−リンカー−ＡｔＣＰＴ５、ＡｔＣＰＴ５−ＬＤＡＰ１、ＡｔＣＰＴ５−ＬＤＡＰ１の油滴結合試験の結果より、ＬＤＡＰ１にＨＲＴ１以外のタンパク質（ＡｔＣＰＴ５）を融合させても、油滴結合能力は保持されており、それはリンカーの存在や融合の向きによって失われることがないことが確認された。これによりＬＤＡＰ１（油滴結合タンパク質）に結合する酵素（第２アミノ酸）配列は限定されず、また融合の向きも限定されないことが分かった。一方、ＬＤＡＰ１と融合していないＡｔＣＰＴ５は油滴と結合していないことが分かった。
【０２１０】
上記結果より、油滴（ｌｉｐｉｄ  ｄｒｏｐｌｅｔ）に結合可能なアミノ酸配列（第１アミノ酸配列）と、疎水性化合物を合成する酵素活性を有するアミノ酸配列（第２アミノ酸配列）とを有し、前記第１アミノ酸配列と第２アミノ酸配列とがリンカー配列（第３アミノ酸配列）を介して融合しており、第２アミノ酸配列の酵素活性が保持されている融合タンパク質は、第２アミノ酸配列が有する酵素活性により疎水性化合物（例えば、ポリイソプレノイド）を油滴内に蓄積させることができることが分かった。
また、精製ＬＤ溶液を用いた反応試験により酵素活性が得られていることから、また、電気泳動の結果からも、油滴に融合タンパク質が結合していることも裏付けられた。
【０２１１】
（配列表フリーテキスト）
配列番号１：パラゴムノキ由来のＨＲＴ１をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号２：パラゴムノキ由来のＨＲＴ１のアミノ酸配列
配列番号３：シロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ５のアミノ酸配列
配列番号４：アボカド由来のＬＤＡＰ１のアミノ酸配列
配列番号５：リンカー配列のアミノ酸配列
配列番号６：パラゴムノキ由来のＨＲＢＰのアミノ酸配列
配列番号７：パラゴムノキ由来のＨＲＢＰをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号８：アボカド由来のＬＤＡＰ１をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号９：シロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ５をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号１０：アボカド由来のＬＤＡＰ２のアミノ酸配列
配列番号１１：パラゴムノキ由来のＳＲＰＰのアミノ酸配列
配列番号１２：パラゴムノキ由来のＳＲＰＰをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号１３：アボカド由来のＬＤＡＰ２をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号１４：プライマー１
配列番号１５：プライマー２
配列番号１６：プライマー３
配列番号１７：プライマー４
配列番号１８：プライマー５
配列番号１９：プライマー６
配列番号２０：プライマー７
配列番号２１：プライマー８
配列番号２２：プライマー９
配列番号２３：プライマー１０
配列番号２４：プライマー１１
配列番号２５：プライマー１２
配列番号２６：プライマー１３
配列番号２７：プライマー１４
配列番号２８：プライマー１５
配列番号２９：プライマー１６
配列番号３０：プライマー１７
配列番号３１：プライマー１８
配列番号３２：プライマー１９
配列番号３３：プライマー２０
配列番号３４：プライマー２１
配列番号３５：プライマー２２
配列番号３６：プライマー２３
配列番号３７：プライマー２４
配列番号３８：プライマー２５
配列番号３９：プライマー２６
配列番号４０：プライマー２７
配列番号４１：プライマー２８
配列番号４２：プライマー２９
配列番号４３：プライマー３０
配列番号４４：プライマー３１
配列番号４５：プライマー３２
配列番号４６：プライマー３３
配列番号４７：プライマー３４
【図１】
0006923166.tif 000008
【図２】
0006923166.tif 000009
【図３】
0006923166.tif 000010
【図４】
0006923166.tif 000011
【図５】
0006923166.tif 000012
【図６】
0006923166.tif 000013
【図７】
0006923166.tif 000014
【図８】
0006923166.tif 000015
【配列表】
0006923166000001.app