(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト体内類似培養条件下で栄養膜細胞を培養する段階であって、前記ヒト体内類似培養条件は３６．３℃〜３７．２℃の範囲内で変化される温度条件、１０ＰＲＭ〜３０ＲＰＭの範囲内で変化される振動培養条件、及び細胞外基質を含有する細胞培養プレートを用いる条件である段階；及び
前記培養された栄養膜細胞を継代培養する段階を含む、ＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現する栄養膜細胞の製造方法。
【請求項２】
前記温度条件が、基礎体温法に基づいた１５日周期の温度変化条件である、請求項１に記載の栄養膜細胞の製造方法。
【請求項３】
前記振動培養条件が、２４時間周期の振動培養条件である、請求項１に記載の栄養膜細胞の製造方法。
【請求項４】
前記細胞外基質が、コラーゲン、フィブロネクチン及びプロコラーゲンからなる群から選択される１つ以上である、請求項１に記載の栄養膜細胞の製造方法。
【請求項５】
前記細胞外基質が、
（ａ）線維芽細胞を１８，０００〜２２，０００細胞／ｃｍ２の密度で接種する段階；
（ｂ）前記線維芽細胞を無血清培地で培養する段階；及び
（ｃ）培養して１１４〜１２６時間経過した後に、線維芽細胞の培養液を収得する段階を介して製造されるものであって、
前記無血清培地が、ヒト間葉系幹細胞由来のタンパク質を１５〜２５％（ｖ／ｖ）で含むものである、請求項１に記載の栄養膜細胞の製造方法。
【請求項６】
前記ヒト間葉系幹細胞由来のタンパク質が、
（ａ）ヒト間葉系幹細胞を１８，０００〜２２，０００細胞／ｃｍ２の密度で接種する段階；
（ｂ）前記幹細胞を無血清培地で培養する段階；及び
（ｃ）培養して１１４〜１２６時間経過した後に、幹細胞の培養液を収得する段階を介して製造されるものである、請求項５に記載の栄養膜細胞の製造方法。
【請求項７】
前記継代培養が、５継代〜１５継代の間に継代培養されるものである、請求項１に記載の栄養膜細胞の製造方法。
【請求項８】
前記ＨＬＡ−Ｇタンパク質が、３０ｎｇ／ｍL以上に維持されるものである、請求項１に記載の栄養膜細胞の製造方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法によって製造されたＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現する栄養膜細胞及び幹細胞を共培養する段階；及び
前記培養された幹細胞を継代培養する段階を含む、
ＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現する幹細胞の製造方法。
【請求項１０】
前記幹細胞が、間葉系幹細胞である、請求項９に記載の幹細胞の製造方法。
【請求項１１】
前記間葉系幹細胞が、脂肪、臍帯血、羊水または羊膜由来である、請求項１０に記載の幹細胞の製造方法。
【請求項１２】
前記継代培養が、１０継代〜３０継代の間に継代培養されるものである、請求項９に記載の幹細胞の製造方法。
【請求項１３】
前記製造された幹細胞内のＨＬＡ−Ｇタンパク質が、培養上澄み液及び細胞外小胞体に存在するものである、請求項９に記載の幹細胞の製造方法。
【請求項１４】
前記製造された幹細胞内のＨＬＡ−Ｇタンパク質が、２０ｎｇ／ｍＬ以上に維持されるものである、請求項９に記載の幹細胞の製造方法。
【請求項１５】
前記共培養が、ヒト間葉系幹細胞由来のタンパク質及び植物抽出物が１：０．５〜１：１．５の比率で混合された混合物を含む培地で行われるものである、請求項９に記載の幹細胞の製造方法。
【請求項１６】
前記植物抽出物が、ルイボス葉の抽出物、ニオイヒバ葉の抽出物、ティーツリー葉の抽出物、ローズマリー葉の抽出物、ツボクサの抽出物、サルビア葉の抽出物、タチジャコウソウの抽出物、レモンバームの抽出物、ヒソップの抽出物、オレガノ葉の抽出物、甘草の根の抽出物、オニノダケの根の抽出物、センキュウの根の抽出物、シャクヤクの根の抽出物、シソ葉の抽出物、ドクダミの抽出物、緑茶の抽出物、ブクリョウの抽出物、高麗人参の根の抽出物、クワの皮の抽出物、ライム抽出物、レモン抽出物、ブドウ抽出物、メロン抽出物、ブルーベリー抽出物、梅抽出物、コーヒー豆の抽出物、ムクロジの実の抽出物、オレンジ抽出物、パインアップル抽出物またはこれらの組み合わせである、請求項１５に記載の幹細胞の製造方法。
【請求項１７】
請求項９に記載の製造方法でＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現する幹細胞を製造する段階；及び
前記幹細胞の製造時の継代培養の際に収得された幹細胞を、
（ａ）１８，０００〜２２，０００細胞／ｃｍ２の密度で接種する段階；及び
（ｂ）前記幹細胞を無血清培地で１１４〜１２６時間培養して培養上澄み液を収得する段階を含む、
ＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現する幹細胞の培養液の製造方法。
【請求項１８】
前記幹細胞が、間葉系幹細胞である、請求項１７に記載の幹細胞の培養液の製造方法。
【請求項１９】
前記ＨＬＡ−Ｇタンパク質が、ＨＬＡ−Ｇ５を含むものである、請求項１７に記載の幹細胞の培養液の製造方法。
【請求項２０】
前記製造された幹細胞の培養液が、細胞外小胞体を含有するものである、請求項１７に記載の幹細胞の培養液の製造方法。
【請求項２１】
前記細胞外小胞体が、アポトーシス小体（Apoptotic Body）、微細小胞体（Microvesicle）及びエキソソーム（Exosome）からなる群から選択される１つ以上のものである、請求項２０に記載の幹細胞の培養液の製造方法。
【請求項２２】
前記製造された幹細胞の培養液が、ＨＬＡ−Ｇを常に分泌発現しない幹細胞の培養液またはＨＬＡ−Ｇを常に分泌発現する栄養膜細胞と共培養されない間葉系幹細胞の培養液より、総タンパク質の含量が増加されたものであり、
前記タンパク質が、免疫寛容関連タンパク質、プロテアソーム機能正常化関連タンパク質、オートファジー機能正常化関連タンパク質、マクロファージ捕食機能正常化関連抗酸化タンパク質または細胞内信号伝達恒常性維持関連のタンパク質であり、
前記免疫寛容関連タンパク質が、ファシン（Fascin）、ガレクチン−３（Galectin-3）、ガレクチン−３−結合タンパク質（Galectic-3-binding Protein）、ぺプチジルプロリルシス−トランスイソメラーゼＢ（Peptidylprolyl cis-trans isomerase B）、フォークヘッドボックスＰ３（Forkhead box P3）、インターロイキン−１０（Interleukin-10）または形質転換成長因子β１（Transforming growth factor beta 1）であり、
前記プロテアソーム機能正常化関連タンパク質が、２６Ｓプロテアーゼ調節サブユニット８（26S protease regulatory subunit 8）、２６Ｓプロテアソーム非ＡＴＰアーゼ調節サブユニット２（26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 2）、２６Ｓプロテアソーム非ＡＴＰアーゼ調節サブユニット３、２６Ｓプロテアソーム非ＡＴＰアーゼ調節サブユニット６、熱ショック７０ｋＤａタンパク質１Ｌ（Heat shock 70kDa protein 1L）、２６Ｓプロテアーゼ調節サブユニットＳ１０Ｂ、Ｅ３ユビキチン-タンパク質リガーゼＢＲＥ１Ｂ（E3 ubiquitin-protein ligase BRE1B）、熱ショック７０ｋＤａタンパク質６（Heat shock 70kDa protein 6）、熱ショック７０ｋＤａタンパク質９０Ｂｂ（Heat shock 70kDa protein 90Bb）、熱ショックタンパク質β１（Heat shock 70kDa protein beta-1）、熱ショックタンパク質９０β、熱ショック関連７０ｋＤａタンパク質２（Heat shock-related 70kDa protein 2）、熱ショック関連７０ｋＤａタンパク質８（Heat shock-related 70kDa protein 8）、２６Ｓプロテアソーム非ＡＴＰアーゼ調節サブユニット１、プロテアソームサブユニットαタイプ１（Proteasome subunit alpha type-1）、プロテアソームサブユニットαタイプ２、プロテアソームサブユニットαタイプ５、プロテアソームサブユニットβタイプ４、プロテアソームサブユニットαタイプ６、プロテアソームサブユニットαタイプ７、プロテアソームサブユニットβタイプ５、プロテアソームサブユニットβタイプ８、プロテアソームサブユニットβタイプ１、プロテアソームサブユニットβタイプ２、プロテアソームサブユニットβタイプ３またはユビキチン様修飾活性化酵素１（Ubiquitin-like modifier Activating enzyme 1）であり、
前記オートファジー機能正常化関連タンパク質が、細胞死のＢｃｌ２関連アゴニスト（Bcl2-associated agonist of cell death）、ＮＦκＢ必須調節子（NF-kappa-B essential modulator）、インスリン（Insulin）、プロ表皮成長因子（Pro-epidermal growth factor）、ソマトトロピン（Somatotropin）、形質転換成長因子β２（Transforming growth factor beta-2）、インターロイキン１β（Interleukin-1 beta）、リソソーム関連膜タンパク質２（Lysosomal associated membrane protein 2）、オートファジー関連タンパク質１６−２（Autophagy-related protein 16-2）、オートファジー関連タンパク質９Ａまたはマンノース−６リン酸（Mannose-6-phosphate）であり、
前記マクロファージ捕食機能正常化関連抗酸化タンパク質が、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼオメガ１（Glutathione S-transferase omega-1）、グルタチオンレダクターゼ（Glutathione reductase）、ペルオキシレドキシン−１（Peroxiredoxin-1）、ペルオキシレドキシン−２、ペルオキシレドキシン−４、ペルオキシレドキシン−６またはスーパーオキシドジスムターゼ（Superoxide dismutase）であり、
前記細胞内信号伝達恒常性維持関連タンパク質が、ホスファターゼ・テンシン・ホモログ（Phosphatase and tensin homolog）、ＳＨ２含有イノシトールホスファターゼ−１（SH2（Src homology 2）-containing inositol phosphatase-1）またはグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（Glycogen synthase kinase 3 beta）である、請求項２０に記載の幹細胞の培養液の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現する細胞株及びその製造方法に関するもので、具体的には、ＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現する栄養膜細胞の製造方法；ＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現する幹細胞の製造方法；前記製造方法で製造されたＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現する幹細胞；ＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現する幹細胞の培養液の製造方法；前記製造方法で製造されたＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現する幹細胞の培養液；及び培養液を有効成分として含む抗老化または抗酸化用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞治療剤は患者本人または他人から採取した細胞を体外で操作及び培養して患者に注入することにより、損傷された細胞の機能及び組織を修復する根本的な治療法として活用できる。従って、神経疾患、肺疾患、肝疾患、がんのような既存の治療方法では治療が不可能であったり、難しい疾患に対して活発に開発が進められている。特に、自己複製能（self renewal）及び他の細胞への分化能（differentiation capability）を有する幹細胞（stem cell）を用いた臨床が全世界的に数千件以上が進められているほど多くの関心を集めている。
【０００３】
しかし、幹細胞は長期間の体外培養を介して確保され患者に注入されるため、このような過程でがん細胞への変異及び腫瘍形成の危険性、細胞の保管及び培養の過程で用いられるＦＢＳなどの異種タンパク質による危害性、主要組織適合性複合体（Major Histocompatibility Complex、ＭＨＣ）の不一致による免疫原性及びそれによる短期または長期間の追跡捜査が必要な免疫拒絶反応などの問題を抱えていて、これは幹細胞治療剤の商用化に最も大きい技術的な難題とも言える。また、細胞だけではなく、細胞から分泌されるエキソソーム（exosome）、微細小胞体（microvesicle）などのような細胞外小胞体（extracellular vesicle）などの移植においても、細胞治療剤のような免疫原性による免疫拒絶反応を解決するため、多様な免疫調節及び免疫抑制薬物が開発されているが、部分的な解決しかできていない状況である。
【０００４】
一方、幹細胞の培養液は、幹細胞から生産される多様な成長因子、サイトカインなどを含むことが知られており、医薬品及び化粧品材料としての商業的な利用価値が急上昇している。関連して、幹細胞培養液を含む頭皮改善化粧組成物（特許文献１）、優秀な組織再生能または優秀な疾患治癒作用または高い生理活性を有する間葉系幹細胞の培養上澄み液を製造する方法（特許文献２）などが開発されている。
しかし、現在の幹細胞培養液は人体の脂肪などから分離した幹細胞を一般的な培養法で培養して生産されており、前記培養液に含まれうる物質は制限的であり、これによる効果も多様ではない状況であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】韓国公開特許公報第１０−２０１７−０１３２４６０号
【特許文献２】韓国公開特許公報第１０−２０１７−０１２１２０５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者は、免疫原性による免疫拒絶反応を示さない新規幹細胞及びこれに由来する多様な有用成分を含む培養液を開発するために鋭意努力した結果、免疫寛容の特性を示すことが知られているＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現する新規幹細胞株を製造し、前記幹細胞株の培養液には多様な細胞外小胞体及びタンパク質が含まれているだけではなく、直接的に抗酸化及び抗老化などの効果を示すことを確認し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一つの目的は、ヒト体内類似培養条件下で栄養膜細胞を培養する段階；及び前記培養された栄養膜細胞を継代培養する段階を含む、ＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現する栄養膜細胞の製造方法を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、ＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現する栄養膜細胞及び幹細胞を共培養する段階；及び前記培養された幹細胞を継代培養する段階を含むＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現する幹細胞の製造方法を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、前記ＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現する幹細胞の製造方法で製造されたＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現する幹細胞を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、前記ＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現する幹細胞の培養液の製造方法を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、前記ＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現する幹細胞の培養液の製造方法で製造されたＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現する幹細胞の培養液を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、前記培養液を有効成分として含む抗老化または抗酸化用組成物を提供することにある。
【発明の効果】
【０００８】
本発明で確立した新規栄養膜細胞株、幹細胞株は、ＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現することによって免疫寛容の特性を示し、前記幹細胞の培養液には多様な生理活性機能を正常化させうるタンパク質、細胞外小胞体などが大量に含まれているため、新規細胞株またはその培養液は、医薬品、化粧品などの多様な産業で有利に活用されうる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現し、免疫寛容の特性を有する細胞を製造するために、培養する時に用いた温度条件を示すグラフである。人体類似環境に最適化された基礎体温法を適用した。
【図２】ＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現し、免疫寛容の特性を有する細胞を製造するために、培養する時に用いた微細振動条件を示すグラフである。人体の１日活動パターンを反映した。
【図３】栄養膜細胞の培養液に存在するＨＬＡ−Ｇタンパク質の濃度を示すグラフであって、対照群は既存の方法で培養した細胞の培養液であり、実験群は前記の温度及び振動条件などを反映して培養した細胞の培養液である。
【図４】ＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現し、免疫寛容の特性を有する新規幹細胞株（ＭＢＴＣ−ＣｅｌｌＴＭ）の培養液に存在するＨＬＡ−Ｇタンパク質の濃度を示すグラフであって、対照群は既存の方法で培養したヒト由来間葉系幹細胞の培養液であり、実験群はＭＢＴＣ−ＣｅｌｌＴＭ の培養液である。
【００１０】
【図５】ＭＢＴＣ−ＣｅｌｌＴＭ由来培養液の走査電子顕微鏡の写真であって、多様な大きさを有する微細小胞体及びエキソソームなどの細胞外小胞体（ＭＢＴＣ−ＥＶＴＭ）及びタンパク質などを示す。
【図６】ＭＢＴＣ−ＣｅｌｌＴＭ由来培養液に含まれたタンパク質の総量を示すグラフである。具体的には、ｈＡＭ−ＭＳＣ、ｈＢＭ−ＭＳＣ、ＨＵＭＳＣ、ｈＡＦ−ＭＳＣ及びｈＡＤＳＣのそれぞれは既存の方法で培養したヒト羊膜、骨髄、臍帯血、羊水及び脂肪由来の間葉系幹細胞を意味する。また、ｈＡＭ−ＭＳＣ由来ＭＢＴＣ−ＣｅｌｌＴＭ、ｈＢＭ−ＭＳＣ由来ＭＢＴＣ−ＣｅｌｌＴＭ、ＨＵＭＳＣ由来ＭＢＴＣ−ＣｅｌｌＴＭ、ｈＡＦ−ＭＳＣ由来ＭＢＴＣ−ＣｅｌｌＴＭ及びｈＡＤＳＣ由来ＭＢＴＣ−ＣｅｌｌＴＭのそれぞれは前記の温度及び振動条件などを反映して前記栄養膜細胞と共培養したヒト羊膜、骨髄、臍帯血、羊水及び脂肪由来の間葉系幹細胞を意味する。
【図７】ＭＢＴＣ−ＣｅｌｌＴＭ由来培養液に含まれたタンパク質の種類を定性分析したベン図である。
【図８】ＭＢＴＣ−ＣｅｌｌＴＭ由来培養液を投与したマウスの体重、飲水量及び給餌量の測定結果を比較したグラフである。対照群は０．９％食塩水、試験群１は既存の方法で培養したヒト由来間葉系幹細胞の培養液、試験群２は前記ＭＢＴＣ−ＣｅｌｌＴＭ由来培養液の投与群を意味する。
【００１１】
【図９】ＭＢＴＣ−ＣｅｌｌＴＭ由来培養液の抗老化効果を示すグラフであって、成長ホルモン（Growth Hormone）及びインスリン様成長因子１（Insulin-like Growth Factor 1: ＩＧＦ−１）の発現程度を比較した。対照群は０．９％食塩水、試験群１は既存の方法で培養したヒト由来間葉系幹細胞の培養液、試験群２は前記ＭＢＴＣ−ＣｅｌｌＴＭ由来の培養液投与群を意味する。
【図１０】ＭＢＴＣ−ＣｅｌｌＴＭ由来培養液の抗酸化効果を示すグラフであって、 ＧＳＨ／ＧＳＳＨ（glutathione/glutathione disulfide）比率を比較した。対照群は０．９％食塩水、試験群１は既存の方法で培養したヒト由来間葉系幹細胞の培養液、試験群２は前記ＭＢＴＣ−ＣｅｌｌＴＭ由来培養液の投与群を意味する。
【図１１】ＭＢＴＣ−ＣｅｌｌＴＭ由来培養液のマクロファージ捕食機能正常化の効果を示すグラフであって、血中内のＬＤＬコレステロールの濃度及びＨＤＬコレステロールの濃度を比較した。試験群１は既存の方法で培養したヒト由来間葉系幹細胞の培養液、試験群２は前記ＭＢＴＣ−ＣｅｌｌＴＭ由来培養液の投与群を意味する。
【図１２】栄養膜細胞の培養液に存在するＨＬＡ−Ｇ５タンパク質の濃度を示すグラフであって、対照群は既存の方法で培養した細胞の培養液、試験群１は前記図１及び図２の温度及び振動条件などを反映して培養した細胞の培養液である。
【図１３】ＨＬＡ−Ｇ５タンパク質を常に分泌発現し、免疫寛容の特性を有する新規幹細胞株（ＭＢＴＣ−ＣｅｌｌＴＭ）の培養液に存在するＨＬＡ−Ｇ５タンパク質の濃度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
前記目的を達成するために、本発明の一つの様態は、ヒト体内類似培養条件下で栄養膜細胞を培養する段階であって、前記ヒト体内類似培養条件は、３６．３℃〜３７．２℃の範囲内で変化する温度条件、１０ＲＰＭ〜３０ＲＰＭ範囲内で変化する振動培養条件、及び細胞外基質を含有する細胞培養プレートを用いる条件である段階；及び前記培養された栄養膜細胞を継代培養する段階を含む、ＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現する栄養膜細胞の製造方法を提供する。
本発明のＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現する新規栄養膜細胞は、人体内細胞の成長環境、温度変化、運動性などの多様な生理的な特性を反映して培養されることによって、免疫寛容の特性を示しうるＨＬＡ−Ｇタンパク質を持続的に分泌発現する特性を有しうる。
【００１３】
本発明の用語、「ＨＬＡ−Ｇタンパク質」は、ヒト白血球抗原Ｇ（human leukocyte antigen G）またはＨＬＡ−Ｇ組織的な合成抗原クラス、Ｇなどと呼ばれるタンパク質を意味する。ＨＬＡ−Ｇタンパク質は低い多形性、免疫細胞に作用する特異性により、免疫細胞の毒性を抑えて制御性Ｔ細胞の分化を促進させることによって免疫寛容の役割を果たす。活性化されたＴ細胞の活性を減少させると同時に制御性Ｔ細胞の増殖を促進させ、相対的にＴ細胞による免疫反応を減少させることになり、樹状細胞の成熟及びＮＫ細胞の活性を減少させ、Ｂ細胞の活性を抑制させるなど、すべての種類の免疫細胞の攻撃から保護されうる免疫寛容の中心的な役割を果たす。従って、ＨＬＡ−Ｇが発現された細胞、細胞外小胞体などは免疫寛容の特性を有することになり、人体に適用すれば局所的あるいは全身にわたって免疫拒絶反応を抑制して、患者の免疫体系を保護することができる。ＨＬＡ−Ｇタンパク質は７種類があり、そのうちＨＬＡ−Ｇ１／２／３／４タンパク質は細胞膜、細胞表面で発現され、ＨＬＡ−Ｇ５／６／７は細胞外に分泌される単一分子の形態である。本発明の一実施例において、前記ＨＬＡ−Ｇタンパク質はＨＬＡ−Ｇ５であってもよいが、これに制限されるものではない。
【００１４】
本発明の用語、「栄養膜細胞」（trophoblast）は、胎盤を形成する細胞の一種であって、発生初期の内部細胞塊（inner cell mass）に胚芽発生と関連した信号伝達及び栄養物質を提供し、着床初期に産婦の免疫体系から受精された胚芽を保護する免疫寛容を起して成功的な着床を誘導することにより、妊娠の維持及び胎児の発達に重要な役割を果たす細胞である。このような栄養膜細胞の役割はＨＬＡ−Ｇタンパク質の発現によるものであると知られている。本発明の一実施例において、前記ＨＬＡ−Ｇタンパク質はＨＬＡ−Ｇ５であってもよいが、これに制限されるものではない。
【００１５】
本発明において、前記ヒト体内類似培養条件は、３６．３℃〜３７．２℃の範囲内で変化する温度条件であり、前記温度条件は基礎体温法に基づいた１５日周期の温度変化条件であってもよい。
本発明の用語、「基礎体温法」は、女性の基礎体温を用いた妊娠調節法を意味する。基礎体温は呼吸以外のすべての活動が止まった瞬間の体温を意味し、一般的には朝目覚めてすぐに測った体温である。生理周期にしたがって基礎体温は低温期及び高温期が２週間隔で反復されるが、特に最も低い温度（３６．３℃）を示す排卵日以後の２週間高温期が維持され、生理が始まると再び体温が下がることになる。このような基礎体温は個人差があり、前記３６．３℃〜３７．２℃の範囲内で変化するものであれば、温度条件は当業者が適切に調節してもよい。
【００１６】
また、前記ヒト体内類似培養条件は、１０ＲＰＭ〜３０ＲＰＭの範囲内で変化する振動培養条件であり、前記振動培養条件は２４時間周期の振動培養条件であってもよい。これは、ヒトの１日活動パターンを反映したものであってもよく、このような活動パターンは個人差があり、前記１０ＲＰＭ〜３０ＲＰＭの範囲内で変化するこものであれば、振動培養条件は当業者が適切に調節してもよい。
【００１７】
また、前記ヒト体内類似培養条件は、細胞外基質を含有する細胞培養プレートを用いる条件であってもよい。具体的な実施様態として、前記細胞外基質は細胞培養プレート上にコーティングされたものであってもよい。
本発明の用語、「細胞外基質」は、細胞と組織の間の空間を詰めることで細胞を保護し支持する役割を果たす、細胞によって生成されるものである。具体的には、前記細胞外基質は、コラーゲン、フィブロネクチン及びプロコラーゲンからなる群から選択される１つ以上のものであってもよい。
具体的には、前記細胞外基質は、線維芽細胞を１８，０００〜２２，０００細胞／ｃｍ２の密度で接種する段階；（ｂ）前記線維芽細胞を無血清培地で培養する段階；及び（ｃ）培養して１１４〜１２６時間経過後に線維芽細胞の培養液を収得する段階を介して製造されるものであって、前記無血清培地はヒト間葉系幹細胞由来のタンパク質を１５〜２５％（ｖ／ｖ）で含むものであってもよい。前記の条件で線維芽細胞を培養する場合、細胞外基質を最大の生産量で収得することができる。
【００１８】
本発明の用語、「ヒト間葉系幹細胞由来のタンパク質」は、ヒト間葉系幹細胞から分泌されるタンパク質を意味し、具体的な実施様態として、ヒト間葉系幹細胞由来のタンパク質が含まれたヒト間葉系幹細胞由来の培養液であってもよい。本明細書で、前記ヒト間葉系幹細胞由来のタンパク質は、「ｈＰＣ」と混用して命名されてもよい。
具体的には、前記タンパク質は、ヒト間葉系幹細胞由来の成長因子またはサイトカインを含んでもよく、より具体的には、ＡＲ、ＢＤＮＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−７、ｂ−ＮＧＦ、ＥＧＦ−Ｒ、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、ＧＤＦ−１５、ＧＤＮＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＧＦＢＰ−６、ＩＧＦ−１、インスリン、ＭＣＳＦ、ＭＣＳＦ−Ｒ、ＮＧＦ−Ｒ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＯＰＧ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＩＧＦ、ＳＣＦ、ＳＣＦ−Ｒ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β１、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｒ３、ＩＣＡＭ−１、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１１、ＭＣＰ−１、ＭＩＧ、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−ｂ、ＭＩＰ−ｄ、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＴＮＦ−Ｒ１またはＴＮＦ−Ｒ１１を含んでもよいが、これに制限されない。
【００１９】
また、前記ヒト間葉系幹細胞由来のタンパク質は、（ａ）ヒト間葉系幹細胞を１８，０００〜２２，０００細胞／ｃｍ２の密度で接種する段階；（ｂ）前記幹細胞を無血清培地で培養する段階；及び（ｃ）培養して１１４〜１２６時間経過後の幹細胞培養液を収得する段階を介して製造されるものであってもよい。前記の条件でヒト間葉系幹細胞を培養する場合、ヒト間葉系幹細胞由来のタンパク質を最大の生産量で収得することができる。
【００２０】
本発明の目的上、前記継代培養は５継代以上継代培養されるものであってもよく、具体的には、５継代〜１５継代の間に継代培養されるものであってもよい。５継代以上継代培養される時、栄養膜細胞のＨＬＡ−Ｇタンパク質の分泌発現が著しく増加する効果を示す。
【００２１】
また、前述したような段階を介して製造された本発明のＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現する栄養膜細胞の培養液中で、前記ＨＬＡ−Ｇタンパク質は３０ｎｇ／ｍｌ以上に維持されるものであってもよい。この時、前記ＨＬＡ−Ｇタンパク質は栄養膜細胞の外部に分泌されてもよく、外部に分泌発現される場合、ＨＬＡ−Ｇ５であってもよいが、これに制限されるものではない。
【００２２】
本発明の具体的な一実施例では、ｈＰＣ ２０％を添加した培地を用いてヒト線維芽細胞を培養することによって、プロコラーゲン、フィブロネクチン、コラーゲンなどの細胞外基質を製造し、前記製造した細胞外基質でコーティングした培養プレートを用いて、ヒトの基礎体温法及び活動パターンを適用した条件で栄養膜細胞を培養した結果、５継代以上の継代培養を進行する場合、栄養膜細胞の培養液中のＨＬＡ−Ｇタンパク質の濃度の水準が増加して、その水準が３０ｎｇ／ｍｌ以上に維持されることを確認し、ＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現する新規栄養膜細胞株を確立した（図１〜３）。
また、前記方法によって製造された栄養膜細胞は、ＨＬＡ−Ｇ５タンパク質を分泌することを確認して、ＨＬＡ−Ｇタンパク質を細胞外部に分泌しうることを確認し、継代培養をすればするほどＨＬＡ−Ｇ５の量が増加することを確認して前記栄養膜細胞はＨＬＡ−Ｇ５を常に分泌発現することを確認できた（図１２）。
これは、前記栄養膜細胞株は、免疫寛容の特性を示すＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現するため、免疫寛容の特性が要求される細胞治療剤または新規細胞株の開発などに有利に活用できることを示唆する。
【００２３】
もう一つの様態は、ＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現する栄養膜細胞及び幹細胞を共培養する段階；及び前記培養された幹細胞を継代培養する段階を含む、ＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現する幹細胞の製造方法を提供する。
もう一つの様態は、前記ＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現する幹細胞の製造方法で製造された、ＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現する幹細胞を提供する。
ここで、前記「ＨＬＡ−Ｇタンパク質」及び「栄養膜細胞」に対する説明は前述した通りである。
【００２４】
本発明のＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現する新規幹細胞株（本明細書で「ＭＢＴＣ−ＣｅｌｌＴＭ」と命名される）は、ＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現する栄養膜細胞との共培養を介して培養されることによって、免疫寛容の特性を示しうるＨＬＡ−Ｇタンパク質を持続的に分泌発現する特性を有することができる。さらに、免疫寛容、プロテアソーム機能の正常化、オートファジー機能の正常化、マクロファージ捕食機能の正常化、細胞内信号伝達恒常性の維持と関連したタンパク質を多量に発現できるため、前記幹細胞またはその培養液は、前述した機能の不活性化による多様な疾患の治療などに免疫拒絶反応なく有利に活用されうる。
【００２５】
本発明で、前記幹細胞は間葉系幹細胞であってもよい。
本発明の用語、「間葉系幹細胞」は、軟骨、骨、脂肪、骨髄間質、筋肉、神経などを作るのに元になる細胞であって、成人には一般的に骨髄に留まっているが臍帯血、抹消血液、脂肪、羊水などのその他の組織などにも存在し、これらから収得できる幹細胞を意味する。具体的には、前記間葉系幹細胞は脂肪、骨髄、臍帯血、羊水または羊膜由来であってもよいが、これに制限されるものではない。また、前記間葉系幹細胞はヒトまたはヒトを含む哺乳類から由来したものであってもよい。
【００２６】
本発明の目的上、前記幹細胞はＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現する栄養膜細胞と共培養（co-culture）されるものであってもよい。共培養は互いに異なる２種類の細胞を１つの培養容器で培養することで、細胞が互いに接触することはないが、培養液を共有することにより各細胞から分泌された物質に影響を受けることになる。本発明の幹細胞もＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現する栄養膜細胞との共培養などを介して相互作用しながらＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に細胞外部に分泌発現する特性を有することができる。この時、前記ＨＬＡ−Ｇタンパク質はＨＬＡ−Ｇ５タンパク質であってもよいが、これに制限されるものではない。
前記共培養はヒト間葉系幹細胞由来のタンパク質及び植物抽出物が、１：０.５〜 １：１.５の比率で混合された混合物を含む培地で行われるものであってもよい。
この時、前記「ヒト間葉系幹細胞由来のタンパク質」に対する説明は、前述した通りである。
【００２７】
本発明で、前記植物抽出物は、 ルイボス葉の抽出物、ニオイヒバ葉の抽出物、ティーツリー葉の抽出物、ローズマリー葉の抽出物、ツボクサの抽出物、サルビア葉の抽出物、タチジャコウソウの抽出物、レモンバームの抽出物、ヒソップの抽出物、オレガノ葉の抽出物、甘草の根の抽出物、オニノダケの根の抽出物、センキュウの根の抽出物、シャクヤクの根の抽出物、シソ葉の抽出物、ドクダミの抽出物、緑茶の抽出物、ブクリョウの抽出物、高麗人参の根の抽出物、クワの皮の抽出物、ライム抽出物、レモン抽出物、ブドウ抽出物、メロン抽出物、ブルーベリー抽出物、梅抽出物、コーヒー豆の抽出物、ムクロジの実の抽出物、オレンジ抽出物、パインアップル抽出物またはこれらの組み合わせであってもよいが、これに制限されない。
また、前記混合物は、前記ヒト間葉系幹細胞由来のタンパク質及び植物抽出物が、１：０.５〜１：１.５の比率、具体的には、１：１の比率で混合されるものであってもよいが、これに制限されない。
【００２８】
本発明の目的上、前記継代培養は１０継代〜３０継代の間に継代培養されるものであってもよい。前記の範囲で継代培養される時に、幹細胞が健康な状態を維持することができ、ＨＬＡ−Ｇタンパク質の分泌発現も著しく増加する効果を示す。
【００２９】
また、前述したような段階を介して製造された幹細胞が分泌発現するＨＬＡ−Ｇタンパク質は培養上澄み液及び細胞外小胞体に存在するものであってもよく、ＨＬＡ−Ｇタンパク質はＨＬＡ−Ｇ５であってもよいが、これに制限されない。
また、前記ＨＬＡ−Ｇタンパク質は２０ｎｇ／ｍｌ以上に維持されるものであってもよく、具体的には、２０〜３０ｎｇ／ｍｌに維持されるものであってもよいが、これに制限されない。
【００３０】
本発明の具体的な一実施例では、ＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現する新規栄養膜細胞と間葉系幹細胞を共培養し、共培養の際に３０種の混合植物抽出物及びｈＰＣを１：１で混合したものを１．０〜１０重量％で添加して培養した結果、１０継代以上の継代培養を行う場合、ＨＬＡ−Ｇタンパク質の分泌量が増加して、その水準が２０ｎｇ／ｍｌ以上に維持されることを確認し、ＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現する新規幹細胞株を確立した（図４）。
また、本発明の一実施例で、前記幹細胞がＨＬＡ−Ｇ５を分泌することを確認し、細胞外部にＨＬＡ−Ｇタンパク質を分泌発現することを確認することができ、継代培養すればするほどＨＬＡ−Ｇ５タンパク質の量が増加することを確認して、前記幹細胞はＨＬＡ−Ｇ５タンパク質を常に分泌発現することが確認できた（図１３）。
これは、前記幹細胞株は免疫寛容の特性を示すＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現するため、免疫寛容の特性が要求される細胞治療剤または新規細胞株の開発、免疫寛容の特性を有する細胞外小胞体の治療剤及び免疫抑制剤の開発などに有利に活用されうることを示唆する。
【００３１】
本発明のもう一つの様態は、前記ＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現する幹細胞の製造方法であって、ＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現する幹細胞を製造する段階；及び前記幹細胞の製造時の継代培養の際に収得した幹細胞を（ａ）１８，０００〜２２，０００細胞／ｃｍ２の密度で接種する段階；及び（ｂ）前記幹細胞を無血清培地で１１４〜１２６時間培養して培養上澄み液を収得する段階を含む、ＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現する幹細胞の培養液の製造方法を提供する。
もう一つの様態は、前記ＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現する幹細胞培養液の製造方法で製造された、ＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現する幹細胞の培養液を提供する。
この時、前記「ヒト間葉系幹細胞由来のタンパク質」に関する説明は前述の通りである。
【００３２】
本発明で、前記製造された幹細胞培養液は細胞外小胞体を含有するものであってもよい。
本発明の用語、「培養液」（culture media）は、インビトロ（in vitro）上で細胞の成長及び生存を支持できるような培地を意味し、細胞培養に適切な当分野で用いる通常の培地をすべて含む。
本発明の一具体例において、前記製造された幹細胞の培養液は幹細胞から細胞外部に分泌発現されたＨＬＡ−Ｇタンパク質及びＨＬＡ−Ｇタンパク質を含有する細胞外小胞体を含んでもよく、この時、前記ＨＬＡ−Ｇタンパク質はＨＬＡ−Ｇ５タンパク質であってもよいが、これに制限されるものではない。
【００３３】
本発明の用語、「細胞外小胞体」（Extracellular Vesicle）は、細胞から分泌される多様な生理活性物質を二重リン脂質の膜内部に含んでいる異種グループ（heterogeneous group）であって、発生起源及び大きさに応じて多様な種類が存在する。ほとんどの細胞はこのような細胞外小胞体を介して活性タンパク質、脂質などの生理活性分子を保護及び運搬して他の細胞に伝達することによって、多様な生物学的反応に関与することになる。細胞外小胞体もその親細胞の細胞膜とほぼ同一の二重リン脂質の膜を有するため、その膜に存在する親細胞の外来性抗原が免疫原性として作用し、これによって免疫反応を起こしうる。しかし、本発明で製造された幹細胞培養液に含まれた前記細胞外小胞体は、このような免疫反応を調節しうるＨＬＡ−Ｇタンパク質も発現しているため、患者に適用した時に免疫寛容の機序を介して免疫反応を抑制させうるという利点がある。
【００３４】
具体的には、前記細胞外小胞体は、アポトーシス小体（Apoptotic Body）、微細小胞体（Microvesicle）及びエキソソーム（Exosome）からなる群から選択される１つ以上のものであってもよく、より好ましくは、微細小胞体及びエキソソームからなる群から選択される１つ以上のものであってもよいが、これに制限されない。
前記用語、「アポトーシス小体」は、直径１，０００nm以上であり、細胞のアポトーシスが起こる時、細胞の核の断片または小器官などが細胞膜に付いている形態で起こる小胞体である。
また、前記用語、「エキソソーム（Exosome）」は、直径３０〜１５０ｎｍ程度であり、細胞内で原形質膜と多胞性小体が結合されたエンドソームの形態が細胞膜との融合機序を介して細胞外部に分泌される小胞体である。
また、前記用語、「微細小胞体（Microvesicle）」は、直径５０〜１，０００ｎｍ程度であり、細胞の原形質膜の外側の方に直接分泌される小胞体である。
【００３５】
また、本発明で前記製造された幹細胞培養液は、総タンパク質の含量が増加されたものであってもよい。具体的には、前記製造された幹細胞培養液は、ＨＬＡ−Ｇを常に分泌発現しない幹細胞の培養液またはＨＬＡ−Ｇを常に分泌発現する栄養膜細胞と共培養されない間葉系幹細胞の培養液より、総タンパク質の含量が増加されたものであってもよい。
【００３６】
この時、前記タンパク質は、免疫寛容関連タンパク質、プロテアソーム機能正常化関連タンパク質、オートファジー機能正常化関連タンパク質、マクロファージ捕食機能正常化関連抗酸化タンパク質または細胞内信号伝達恒常性維持関連タンパク質であってもよい。
【００３７】
また、具体的には、前記免疫寛容関連タンパク質は、ファシン（Fascin）、ガレクチン−３（Galectin-3）、ガレクチン−３−結合タンパク質（Galectic-3-binding Protein）、ぺプチジルプロリルシス−トランスイソメラーゼＢ（Peptidylprolyl cis-trans isomerase B）、フォークヘッドボックスＰ３（Forkhead box P3）、インターロイキン−１０（Interleukin-10）または形質転換成長因子β１（Transforming growth factor beta 1）であってもよいが、免疫寛容の特性を示すタンパク質である限り、これに制限されない。
従って、本発明によって製造された幹細胞培養液は、免疫寛容の特性を示す前述したタンパク質を大量に含むため、前記培養液は自己免疫関連疾患の予防及び／または治療に有用に用いられてもよい。また、細胞、組織の機能復元、再生、治療などを目的で自家、他家の細胞、組織、臓器または細胞外小胞体などを移植する過程で発生する免疫拒絶反応を抑制するのに有利に用いられてもよい。
【００３８】
また、具体的には、前記プロテアソーム機能正常化関連タンパク質は、２６Ｓプロテアーゼ調節サブユニット８（26S protease regulatory subunit 8）、２６Ｓプロテアソーム非ＡＴＰアーゼ調節サブユニット２（26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 2）、２６Ｓプロテアソーム非ＡＴＰアーゼ調節サブユニット３、２６Ｓプロテアソーム非ＡＴＰアーゼ調節サブユニット６、熱ショック７０ｋＤａタンパク質１Ｌ（Heat shock 70kDa protein 1L）、２６Ｓプロテアーゼ調節サブユニットＳ１０Ｂ、Ｅ３ユビキチン-タンパク質リガーゼＢＲＥ１Ｂ（E3 ubiquitin-protein ligase BRE1B）、熱ショック７０ｋＤａタンパク質６（Heat shock 70kDa protein 6）、熱ショック７０ｋＤａタンパク質９０Ｂｂ（Heat shock 70kDa protein 90Bb）、熱ショックタンパク質β１（Heat shock 70kDa protein beta-1）、熱ショックタンパク質９０β、熱ショック関連７０ｋＤａタンパク質２（Heat shock-related 70kDa protein 2）、熱ショック関連７０ｋＤａタンパク質８（Heat shock-related 70kDa protein 8）、２６Ｓプロテアソーム非ＡＴＰアーゼ調節サブユニット１、プロテアソームサブユニットαタイプ１（Proteasome subunit alpha type-1）、プロテアソームサブユニットαタイプ２、プロテアソームサブユニットαタイプ５、プロテアソームサブユニットβタイプ４、プロテアソームサブユニットαタイプ６、プロテアソームサブユニットαタイプ７、プロテアソームサブユニットβタイプ５、プロテアソームサブユニットβタイプ８、プロテアソームサブユニットβタイプ１、プロテアソームサブユニットβタイプ２、プロテアソームサブユニットβタイプ３またはユビキチン様修飾活性化酵素１（Ubiquitin-like modifier Activating enzyme 1）であってもよいが、プロテアソーム機能正常化の特性を示すタンパク質である限り、これに制限されない。
従って、本発明によって製造された幹細胞培養液は、プロテアソーム機能正常化の特性を示す前述したタンパク質を大量に含んでいるため、前記培養液はプロテアソーム機能異常関連疾患の予防及び／または治療に有用に用いられてもよい。
【００３９】
また、具体的には、前記オートファジー機能正常化関連タンパク質は、細胞死のＢｃｌ２関連アゴニスト（Bcl2-associated agonist of cell death）、ＮＦκＢ必須調節子（NF-kappa-B essential modulator）、インスリン（Insulin）、プロ表皮成長因子（Pro-epidermal growth factor）、ソマトトロピン（Somatotropin）、形質転換成長因子β２（Transforming growth factor beta-2）、インターロイキン１β（Interleukin-1 beta）、リソソーム関連膜タンパク質２（Lysosomal associated membrane protein 2）、オートファジー関連タンパク質１６−２（Autophagy-related protein 16-2）、オートファジー関連タンパク質９Ａまたはマンノース−６リン酸（Mannose-6-phosphate）であってもよいが、オートファジー機能の正常化特性を示すタンパク質である限り、これに制限されない。
従って、本発明によって製造された幹細胞培養液は、オートファジー機能正常化の特性を示す前述したタンパク質を大量に含んでいるため、オートファジー機能異常関連疾患の予防及び／または治療に有用に用いられてもよい。
【００４０】
また、具体的には、前記マクロファージ捕食機能正常化関連抗酸化タンパク質は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼオメガ１（Glutathione S-transferase omega-1）、グルタチオンレダクターゼ（Glutathione reductase）、ペルオキシレドキシン−１（Peroxiredoxin-1）、ペルオキシレドキシン−２、ペルオキシレドキシン−４、ペルオキシレドキシン−６またはスーパーオキシドジスムターゼ（Superoxide dismutase）であってもよいが、マクロファージ捕食機能正常化の特性を示すタンパク質である限り、これに制限されない。
従って、本発明によって製造された幹細胞培養液は、マクロファージ捕食機能正常化の特性を示す前述したタンパク質を大量に含んでいるため、マクロファージ捕食機能異常関連疾患の予防及び／または治療に有用に用いられてもよい。また、前記マクロファージ捕食機能は活性酸素種／活性窒素種の除去にも関与するため、酸化的ストレス関連疾患の予防及び／または治療に有用に用いられてもよい。
【００４１】
また、具体的には、前記細胞内信号伝達恒常性維持関連タンパク質は、ホスファターゼ・テンシン・ホモログ（Phosphatase and tensin homolog）、ＳＨ２含有イノシトールホスファターゼ−１（SH2（Src homology 2）-containing inositol phosphatase-1）またはグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（Glycogen synthase kinase 3 beta）であってもよいが、細胞内信号伝達恒常性特性を示すタンパク質である限り、これに制限されない。
従って、本発明によって製造された幹細胞培養液は、細胞内信号伝達恒常性維持の特性を示す前述したタンパク質を大量に含んでいるため、前記培養液は細胞内信号伝達恒常性維持機能の異常または細胞内の過度な信号伝達に関連された疾患の予防及び／または治療に有用に用いられてもよい。
【００４２】
本発明の具体的な一実施例では、ＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現する幹細胞の培養液には、免疫寛容関連タンパク質、プロテアソーム機能正常化関連タンパク質、オートファジー機能正常化関連タンパク質、マクロファージ捕食機能正常化関連抗酸化タンパク質、または細胞内信号伝達恒常性維持関連タンパク質などが高い含量で含まれていて、微細小胞体、エキソソームなどの細胞外小胞体も多様に含まれていることを確認した（図５〜７、及び表５〜９）。
これは、前記培養液は多様な生体機能を正常化させるタンパク質を大量に含んでいるため、このような機能異常によって発病される疾患の治療に有利に用いられることを示唆する。
【００４３】
もう一つの様態は、前記培養液を有効成分として含む、抗老化または抗酸化用組成物を提供する。
この時、前記「培養液」に関する説明は前述の通りである。
本発明に係るＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現する幹細胞培養液は、免疫寛容の特性を示すＨＬＡ−Ｇタンパク質だけではなく、その他の免疫寛容関連タンパク質、プロテアソーム機能正常化関連タンパク質、オートファジー機能正常化関連タンパク質、マクロファージ捕食機能正常化関連抗酸化タンパク質、細胞内信号伝達恒常性維持関連タンパク質などを高い含量で含んでおり、同時に多様な細胞外小胞体も含むため、抗老化、抗酸化などのような有利な生理活性を示すことができる。
具体的には、前記抗老化または抗酸化用組成物は、健康機能食品、化粧料、医薬部外品または飼料組成物であってもよい。
【００４４】
本発明の用語、「健康機能食品」（functional food）は、特定保健用食品（food for special health use、ＦｏＳＨＵ）と同様の用語であって、栄養供給の他にも生体調節機能が効率的に現れるように加工された医学、医療効果が高い食品を意味する。本発明において、前記健康機能食品は健康食品または健康補助食品の両方に用いられる。
本発明の用語、「化粧料」は、人体を清潔、美化し魅力を重ね容貌を明るく変化させたり、皮膚、毛髪の健康を維持または増進するために人体に用いられる物品であって、人体に対する作用が軽微なものを意味する。皮膚の美白の助けになったり、皮膚のしわの改善に役に立ったり、肌をきれいに日焼けしたり、紫外線から肌を保護するのに役に立つ機能性化粧品の意味も含まれる。
本発明の用語、「医薬部外品」はヒトや動物の疾病を診断、治療、改善、軽減、処置または予防する目的で用いられる物品の中で、医薬品より作用が軽微な物品を意味する。例えば、薬事法に基づく医薬部外品は、医薬品の用途と用いられる物品を除くものであって、ヒト／動物の疾患治療や予防に用いる製品、人体に対する作用が軽微であったり直接作用しない製品などが含まれる。
本発明の用語、「飼料」は、動物が食べて、摂取し、消化するための、またはこれに適当な任意の天然または人工規定食、一食式などまたは前記一食式の成分を意味する。
【００４５】
本発明の具体的な一実施例では、ＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現する幹細胞の培養液をマウスに投与した結果、抗老化関連のバイオマーカーであるＧＦ及びＩＧＦ−１の発現が増加し、体表的な抗老化関連バイオマーカーである血中内のＧＳＨ／ＧＳＳＨの比率が増加し、血中内ＬＤＬコレステロールの濃度は減少させる反面、ＨＤＬコレステロールの濃度は増加させることを確認した（図８〜１１）。
これは、前記培養液を含む本発明の組成物は、優秀な抗老化、抗酸化などの効果を示すため、健康機能食品、化粧品、医薬部外品、飼料組成物などの形態で有利に活用できることを示唆する。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例を介して本発明の構成及び効果をさらに詳細に説明する。これらの実施例はただ本発明を例示するだけのもので、本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００４７】
実施例１：インビボ（in vivo）類似細胞培養環境を提供するための細胞外基質（Extracellular matrix）の製造
免疫寛容の特性が誘導された新規幹細胞株を製造するために、細胞の培養時にインビボと類似した環境を提供した。
具体的には、間葉系幹細胞から分泌されたタンパク質を用いてヒト線維芽細胞を培養し、前記ヒト線維芽細胞から細胞外基質（プロコラーゲン、フィブロネクチン、コラーゲン）を分泌させ直接製造して用いた。
【００４８】
より詳しい製造方法は次の通りである。まず、ヒト羊膜由来間葉系幹細胞（Human Amniotic Mesenchymal Stem Cell、SCIENCELL、Cat.# 7501）、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞（STEMPRO Human Adipose-Derived Stem Cells、INVITROGEN、Cat. # R7788-110）、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cell、SCIENCELL、Cat.# 7500）、ヒト臍帯血由来間葉系幹細胞（Human Umblical Mesenchymal Stem Cell、SCIENCELL、Cat.# 7530）及びヒト羊水由来間葉系幹細胞（Human amniotic fluid derived cell、ANGIOCRINE、cat.# hAmnio-01）のうち、１種の幹細胞を無血清培地であるＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２０，０００細胞／ｃｍ２で接種した後、３７℃、５％  ＣＯ２インキュベーターで１２０時間培養し、ヒト間葉系幹細胞由来タンパク質（Human Protein Complex from Human Mesenchymal Stem Cell、以下、ｈＰＣ）を回収した。その後、ヒト線維芽細胞（Human CCD-98sk、human fibroblast cell）を前記ｈＰＣが細胞毒性を示さない濃度（1.２５％、２．５％、５％、１０％、２０％）に添加されたＤＭＥＭ培養培地に２０，０００細胞／ｃｍ2で接種した後、３７℃、５％  ＣＯ２インキュベーターで１２０時間培養した。
培養完了後に、ｈＰＣ濃度に伴うそれぞれの培養上澄み液に対してプロコラーゲン（コラーゲン前駆物質）、フィブロネクチン（細胞付着性糖タンパク質）、コラーゲン（線維性タンパク質）の含有量を既存に公知された方法に沿って測定し、その結果は下記の表１〜３に示した。
【００４９】
【表１】
0006977051.tif 000002
【００５０】
【表２】
0006977051.tif 000003
【００５１】
【表３】
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【００５２】
前記表１〜３で見られるように、ヒト線維芽細胞から生成されるプロコラーゲンは培地に添加されたｈＰＣ濃度に比例して増加することを確認し、プロコラーゲン、コラーゲン及びフィブロネクチンは２０％ｈＰＣが含有された培養培地でヒト線維芽細胞を無血清培養する時、最も大量に生成されることを確認した。
従って、前記方法で製造した細胞外基質を以後の細胞培養に用いた。
【００５３】
実施例２：ＨＬＡ−Ｇを常に分泌発現する栄養膜細胞（Trophoblast）の製造方法。
免疫寛容の特性が誘導された新規幹細胞株を製造するために、ＨＬＡ−Ｇタンパク質を用いた。
ＨＬＡ−Ｇタンパク質は、ＮＫ細胞から細胞を保護し、抹消血液内のＴ細胞による同種免疫反応を媒介しないなどの免疫寛容及び免疫調節機能をするタンパク質である。胎盤を形成する栄養膜細胞（Trophoblast）で主に発現され、着床初期に産婦の免疫体系から受精された胚芽を保護する免疫寛容を起こし、成功的な着床誘導及び正常的な妊娠を維持させる役割を果たす。
従って、本発明者は、人体内で最も高い水準でＨＬＡ−Ｇタンパク質を分泌発現する栄養膜細胞の免疫寛容の特性及び多様な信号伝達の特性に注目し、持続的にＨＬＡ−Ｇタンパク質を分泌発現できる栄養膜細胞を製造するため、その培養条件を確立し、確立された前記栄養膜細胞株と幹細胞を共培養することにより、免疫寛容の特性が誘導されて、より向上された信号伝達能力を有する新しい幹細胞株を確立した。
まず、継代培養を介して免疫寛容の特性を有するようにするＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現する栄養膜細胞を製造した。
これは、基礎体温法を用いた。基礎体温は呼吸の他にすべての活動が止まった瞬間の体温を意味し、一般的に朝目覚めてすぐに測る体温である。基礎体温の変化測定を介して女性の排卵時期及び妊娠可否を分かることもあり、生理周期にしたがって基礎体温は低温期及び高温期が２週間隔で反復するが、特に最も低い温度（３６．４℃）を示す排卵日以後の２週間高温期が維持され、生理が始まると再び体温が下がることになる。本発明者はこのような基礎体温の変化が排卵と受精、妊娠及び着床、そしてこのような一連の過程で重要な役割を果たす栄養膜細胞及び体内免疫体系の特性にも密接な関連があることに着目した。
【００５４】
具体的には、対照群は一般の細胞培養用プレートを用いて培養した栄養膜細胞、実験群は前記実施例１で製造した細胞外基質（プロコラーゲン、コラーゲン、フィブロネクチン）でコーティングしたプレートで培養した。また、前記実験群には図１及び２に示したように、同様の基礎体温法及び微細振動培養（shaking incubating）条件を適用した。これを３日ごとに継代培養し、各継代培養の際に培養上澄み液をそれぞれ回収し、培養上澄み液内に存在するＨＬＡ−Ｇ分子の濃度をＨｕｍａｎＨＬＡ−Ｇ ＥＬＩＳＡキット（LifeSpan BioSciences、Cat. #LS-F5033）を用いした結果、対照群では３継代（passage）以後から回収された培養上澄み液に存在するＨＬＡ−Ｇタンパク質の濃度が徐々に減少し、１０継代以後にはほぼ発現できないことを確認した。反面、実験群では５継代以後の継代培養の時に回収した栄養膜細胞の培養上澄み液内に存在するＨＬＡ−Ｇ分子の濃度が３０ｎｇ／ｍｌ以上の水準で高く維持されることを確認した。
従って、培養時、基礎体温法に基盤する温度プロファイリング、微細振動培養条件及び細胞外基質を用いる場合、ＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現する栄養膜細胞を製造しうることが分かった。
【００５５】
実施例３：ＨＬＡ−Ｇを常に分泌発現する栄養膜細胞との共培養を介した免疫寛容の特性が誘導された幹細胞株の製造方法
前記実施例２を介してＨＬＡ−Ｇを常に分泌発現することにより免疫寛容の特性を有する栄養膜細胞を製造し、これを免疫寛容の特性が誘導された幹細胞株の製造に用いた。
まず、実施例１で製造した細胞外基質でコーティングした６ウェルプレートに栄養膜細胞を培養した。この時、培地条件としては無血清ＤＭＥＭ Ｌｏｗ培地を用い、これに表４のような総３０種の混合植物抽出物及びｈＰＣを１：１で混合した混合組成物（SigGrowTM、Stemmedicare Inc.、Korea）を全体培地に対して１．０〜１０重量％で添加して用いた。
【００５６】
【表４】
0006977051.tif 000005
【００５７】
同時に、ヒト羊膜由来間葉系幹細胞、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞、ヒト臍帯血由来間葉系幹細胞及びヒト羊水由来間葉系幹細胞などの幹細胞１種を３μｇの穴の大きさを有する６ウェルマルチディッシュ培養 ＮｕｎｃＴＭポリカーボネート細胞培養インサート（ThermoFisher Scientific Inc.、Rockford、IL USA、Cat. #140663）に分注し、栄養膜細胞が分注された前記６ウェルプレートに０．９ｍｍ間隔（Low Position）に位置させた。その後、実施例２で適用された温度プロファイリング及び振動培養条件で５％、ＣＯ２インキュベーターで３〜４日間培養し、プレートに７０〜９０％程度に細胞が増殖すると１：３の比率で継代培養を行った。
その後、前記のような継代培養時に回収されたヒト由来幹細胞からＨＬＡ−Ｇタンパク質が分泌発現されたかどうかを次のような方法で確認した。前記幹細胞をＤ−ＰＢＳで２〜３回洗濯した後に１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、すべての培地成分を除去した。新しいフラスコに無血清培地であるＤＭＥＭ／Ｆ１２を添加し、細胞密度を１８，０００〜２２，０００細胞／ｃｍ２で接種した後、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターで培養して、１２０時間後に培養上澄み液を回収した。実施例２のような方法でそれぞれの培養上澄み液内に存在するＨＬＡ−Ｇ分子の濃度をＨｕｍａｎＨＬＡ−Ｇ ＥＬＩＳＡキットを用いて定量した。
【００５８】
その結果、図４で見られるように、総３０回の継代培養の結果、前記栄養膜細胞との共培養ではない単独で継代培養したヒト由来幹細胞の培養上澄み液ではＨＬＡ−Ｇタンパク質が検出できないことを確認した。反面、前記栄養膜細胞と共培養されたヒト由来幹細胞培養上澄み液内では継代培養が進行すればするほどＨＬＡ−Ｇタンパク質の濃度が段々増加し、１０継代以後の継代培養時には回収したヒト由来幹細胞培養上澄み液内に存在するＨＬＡ−Ｇ分子の濃度が２０ｎｇ／ｍｌ以上の水準に維持することを確認した。さらに、２０継代以上まで持続的にＨＬＡ−Ｇ分子が存在することを確認した。
前記結果を介して、前記実施例２で製造されたＨＬＡ−Ｇ分子を常に分泌発現する栄養膜細胞と幹細胞を前記方法によって共培養する場合、ＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現し、免疫寛容の特性が誘導された新規幹細胞株（以下、ＭＢＴＣ−ＣｅｌｌTMと命名する）を製造できることが分かった。
【００５９】
実施例４：新規幹細胞株（ＭＢＴＣ−ＣｅｌｌＴＭ）由来培養液の製造方法
前記実施例３を介して製造したＨＬＡ−Ｇタンパク質を常に分泌発現し免疫寛容の特性が誘導された新規幹細胞株ＭＢＴＣ−ＣｅｌｌＴＭ由来の細胞外小胞体及びタンパク質組成物、すなわち、培養液を製造した。
細胞外小胞体（Extracellular Vesicle）は、幹細胞を始めとするほとんどの動植物の細胞から細胞外部に分泌できる膜小胞体であって、大きさ及び分泌機序によってアポトーシス小体（Apoptotic Body）、微細小胞体（Microvesicle）及びエキソソーム（Exosome）などに区分される。細胞外小胞体は親細胞の特性によって多様なｍｉＲＮＡ及びｍＲＮＡ、サイトカインなどを含有し、これを介して細胞間信号伝達及び代謝作用に重要な役割を果たすのと同時に、それ自体でも治療効果を有しているという研究結果が報告されてから、免疫拒絶反応という難題を解決できない細胞治療剤の代案として注目されている。しかし、未だに血液などに微量存在するエキソソームを用いた疾病の診断分野だけで制限的に活用されているなど、エキソソーム及び微細小胞体を用いた本格的な治療剤開発のための研究は実験室水準で制限された不備な実情である。また、臨床的に適用可能な水準の純度のエキソソームを分離するにはほぼ不可能であり、臨床的で活用可能な微細小胞体のみを分離できる方法は開発すらされてない状況である。また、治療目的で細胞外小胞体を適用する時にも親細胞の特性を保有している細胞外小胞体の膜に存在する多様な抗原表示因子による免疫拒絶反応が発生する可能性もあるため、これを解消するために本発明者は前記実施例３で製造した、新規幹細胞株から由来した培養液に含まれた細胞外小胞体の免疫寛容の特性を確認した。
【００６０】
具体的には、前記ＭＢＴＣ−ＣｅｌｌＴＭを無血清培地であるＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に１８，０００〜２２，０００細胞／ｃｍ２の密度で接種し、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターで１２０時間培養した後、培養上澄み液を回収した。回収した上澄み液を０．８μｍフィルター（MCE MF-MilliporeTM）でろ過し、細胞残骸及び死滅した細胞などをすべて除去することによって、ＭＢＴＣ−ＣｅｌｌＴＭ由来エキソソーム、微細小胞体などがすべて含まれた細胞外小胞体（MBTC-EVTM）及びタンパク質組成物を収得した。
この微生物及びウイルスなどの汚染有無を確認するために食品医薬品安全処の細胞治療剤の許可基準に適合する外来性ウイルス不定実験及び微生物残留検査（Adventitious Virus Test and Microbial Residual Test）を行った結果、前記ＭＢＴＣ−ＣｅｌｌＴＭ由来細胞外小胞体（MBTC-EVTM）及びタンパク質組成物に外来性ウイルス及び微生物が含まれないことを確認した。
また、図５で見られるように、前記ＭＢＴＣ−ＣｅｌｌＴＭ由来培養液を走査電子顕微鏡（Scanning Electron Microscope（ＳＥＭ）、Hitachi S-4800）で観察した結果、多様な大きさを有する微細小胞体及びエキソソームが共存することを確認した。
【００６１】
実施例５：ＭＢＴＣ−ＣｅｌｌＴＭ由来培養液に含まれるタンパク質の確認
前記実施例４を介して製造したＭＢＴＣ−ＣｅｌｌＴＭ由来培養液に含まれる成分をさらに詳しく確認するために、これに含まれたタンパク質に対して定量及び定性分析を行った。一方、対照群は前記ヒト由来間葉系幹細胞を単独で培養したものの培養液を用いた。
具体的には、対照群及び試験群に対してそれぞれＢＣＡ定量法を用いてタンパク質を定量し、１００μｇを取って凍結乾燥を行った後に質量分析を行った。質量分析を介して得られた結果は、ProteinLynx Global Server（ＰＬＧＳ） Ver. 3.0を用いてタンパク質同定及び絶対定量を行った。タンパク質同定はInternational Protein IndexのHuman Database（Ver. 3.87）を用いて行い、絶対定量は標準品ＢＳＡ（SwissProt P2769）の質量値の情報に基づいて行った。
【００６２】
その結果、図６に見られるように、ヒト羊膜由来間葉系幹細胞（ｈＡＭ−ＭＳＣ）、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＢＭ−ＭＳＣ）、ヒト臍帯血由来間葉系幹細胞（ＨＵＭＳＣ）、ヒト羊水由来間葉系幹細胞（ｈＡＦ−ＭＳＣ）及びヒト脂肪由来間葉系幹細胞（ｈＡＤＳＣ）を単独で培養して生産された培養液に含まれた総タンパク質の含量は、それぞれ２９．９１μｇ／ｍｌ、２３．３７μｇ／ｍｌ、１９．８９μｇ／ｍｌ、５１．３６μｇ／ｍｌ、２０．１６μｇ／ｍｌであることを確認した。一方、前記実施例４を介して製造した新規幹細胞株であるヒト羊膜由来間葉系幹細胞由来のＭＢＴＣ−ＣｅｌｌＴＭ（hAM-MSC derived MBTC-CellTM）、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞由来のＭＢＴＣ−ＣｅｌｌＴＭ（hBM-MSC derived MBTC-CellTM）、ヒト臍帯血由来間葉系幹細胞由来のＭＢＴＣ−ＣｅｌｌＴＭ（HUMSC derived MBTC-CellTM）、ヒト羊水由来間葉系幹細胞由来のＭＢＴＣ−ＣｅｌｌＴＭ（hAF-MSC derived MBTC-CellTM）及びヒト脂肪由来間葉系幹細胞由来のＭＢＴＣ−ＣｅｌｌＴＭ（hADSC derived MBTC-CellTM）から生産された培養液に含まれた総タンパク質の含量は、それぞれ２３６．３２μｇ／ｍｌ、１８９．１３μｇ／ｍｌ、１９５．２８μｇ／ｍｌ、２１１．７０μｇ／ｍｌ、１７８．５３μｇ／ｍｌであって、対照群に比べてそれぞれ７９０％、８０９％、９８２％、４１２％、８８６％増加したことを確認した。
また、図７で見られるように、各由来のＭＢＴＣ−ＣｅｌｌＴＭの培養液に対する定性分析を行った結果、同一のタンパク質成分が約５２０種含まれていて、それ以外の６００余種のタンパク質も互いに類似した種類であることを確認した。
前記結果を介して、ＭＢＴＣ−ＣｅｌｌＴＭ由来の培養液は、一般的な幹細胞培養液に比べて、これに含まれる総タンパク質の含量が著しく多く、幹細胞の由来が異なっ
ても互いに類似した種類のタンパク質を分泌することが分かった。
【００６３】
実施例６：ＭＢＴＣ−ＣｅｌｌＴＭ由来培養液に含まれたタンパク質の成分の分析
実施例６-１：免疫寛容関連タンパク質
前記実施例５で製造したＭＢＴＣ−ＣｅｌｌＴＭ由来培養液（試験群）に含まれた総タンパク質の中で、まず免疫寛容と関連したタンパク質が含まれているかどうかを確認した。一方、対照群は前記ヒト由来間葉系幹細胞を単独で培養したものの培養液を用いた。
具体的には、前記対照群及び試験群に対してそれぞれＢＣＡ定量法を用いてタンパク質を定量し、１００μｇを取って凍結乾燥を行った後、質量分析を行った。
その結果、下記表５で見られるように、対照群に比べて試験群に約４倍〜８倍のより高い含量で免疫寛容と関連したタンパク質が含有されていることを確認した。
【００６４】
免疫寛容と関連されたタンパク質の成分含量の比較
実施例６−２：プロテアソーム機能正常化関連タンパク質の分析
【表５】
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【００６５】
前記実施例５で製造したＭＢＴＣ−ＣｅｌｌＴＭ由来培養液（試験群）に含まれた総タンパク質の中で、プロテアソーム機能正常化と関連されたタンパク質が含まれているかどうかを確認した。一方、対照群は前記ヒト由来間葉系幹細胞を単独で培養したものの培養液を用いた。
具体的には、対照群及び試験群に対して、前記実施例６−１に沿った方法でタンパク質の質量分析を行った。
その結果、下記表６で見られるように、対照群に比べて試験群に約３倍〜１６倍のより高い含量でプロテアソーム機能正常化と関連されたタンパク質が含有されて、対照群には含有されないタンパク質も新しく発現されることを確認した。
【００６６】
【表６】
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【００６７】
実施例６−３：オートファジー機能正常化関連タンパク質の分析
前記実施例５で製造したＭＢＴＣ−ＣｅｌｌＴＭ由来培養液（試験群）に含まれたタンパク質の中で、オートファジー機能正常化と関連されたタンパク質が含まれているかどうかを確認した。一方、対照群は前記ヒト由来間葉系幹細胞を単独で培養したものの培養液を用いた。
具体的には、対照群及び試験群に対して、前記実施例６−１に沿った方法でタンパク質の質量分析を行った。
その結果、下記表７で見られるように、対照群に比べて試験群に約４倍  〜２７倍のより高い含量でオートファジー機能正常化と関連されたタンパク質が含有されていて、対照群には含有されないタンパク質も新しく発現されることを確認した。
【００６８】
【表７】
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【００６９】
実施例６−４：マクロファージ捕食機能正常化関連タンパク質の分析
前記実施例５で製造したＭＢＴＣ−ＣｅｌｌＴＭ由来培養液（試験群）に含まれたタンパク質の中で、マクロファージ捕食機能正常化と関連されたタンパク質が含まれているかどうかを確認した。一方、対照群は前記ヒト由来間葉系幹細胞を単独で培養したものの培養液を用いた。
具体的には、対照群及び試験群に対して、前記実施例６−１に沿った方法で質量分析を行った。
その結果、下記表８で見られるように、対照群に比べて試験群に約７倍〜４５倍のより高い含量でマクロファージ捕食機能正常化と関連されたタンパク質が含有されていて、対照群には含有されないタンパク質も新しく発現されることを確認した。
【００７０】
【表８】
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【００７１】
実施例６−５：細胞内の信号伝達恒常性維持関連タンパク質の分析
前記実施例５で製造したＭＢＴＣ−ＣｅｌｌＴＭ由来培養液（試験群）に含まれているタンパク質の中で、細胞内の信号伝達恒常性維持に関連するタンパク質が含まれているかどうかを確認した。一方、対照群は前記ヒト由来間葉系幹細胞を単独で培養されたものの培養液を用いた。
具体的には、対照群及び試験群に対して、前記実施例６−１に沿った方法でタンパク質の質量分析を行った。 
その結果、下記表９で見られるように、対照群に比べて試験群に約４９倍のより高い含量で細胞内の信号伝達恒常性維持に関連されるタンパク質が含まれていて、対照群には含有されないタンパク質も新しく発現されることを確認した。
【００７２】
【表９】
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【００７３】
実施例７：ＭＢＴＣ−ＣｅｌｌTM由来培養液の抗老化、抗酸化、マクロファージ捕食機能正常化効能の検証
実施例７−１：抗老化効能の検証
前記実施例５で製造したＭＢＴＣ−ＣｅｌｌTM由来培養液には免疫寛容、プロテアソーム機能正常化、オートファジー機能正常化、マクロファージ捕食機能正常化及び細胞内信号伝達恒常性維持の効能を示すタンパク質などが著しく大量に含まれていることを確認し、これを介して抗老化などの生理効果を示すかどうかを確認した。
具体的には、対照群としては、０．９％食塩水；実験群１としては、前記ヒト由来間葉系幹細胞を単独で培養したものの培養液；実験群２としては、ＭＢＴＣ−ＣｅｌｌTM由来培養液を用いた。各群当たり４匹のマウスを用い、マウス当たり試料を１００μｌずつ静脈投与した後３日間の体重、飲水量及び給餌量を測定し、３日後解部を介して肉眼検査及び血液検査により抗老化効能を確認した。
その結果、図８で見られるように、対照群及び試験群１、試験群２で試料投与による体重、飲水及び飼料摂取の有意な変化は観察されず、正常的な範囲内での増減が観察された。また、剖検の結果、前記対照群及び実験群の両方で異常症状は発見できなかった。
また、図９で見られるように、体表的な抗老化関連バイオマーカーである成長ホルモン（Growth Hormone）及びインスリン様成長因子１（Insulin-like Growth Factor 1: ＩＧＦ−１）の発現程度を比較した結果、対照群及び実験群１に比べ実験群２で約２０〜３０％の著しい増加が確認できた。
前記結果を介して、ＭＢＴＣ−ＣｅｌｌTM由来の培養液は優秀な抗老化効果を示すことが分かった。
【００７４】
実施例７−２：抗酸化効能の検証
また、前記ＭＢＴＣ−ＣｅｌｌＴＭ由来培養液の抗酸化効能を確認した。
具体的には、前記実施例７−１と同様の方法で、対照群、実験群１及び実験群２を設定し、これをマウスに投与した後に体表的な抗酸化関連バイオマーカーである血中内のＧＳＨ／ＧＳＳＨ比率を測定した。
その結果、図１０で見られるように、血中内のＧＳＨ／ＧＳＳＨ（glutathione/glutathione disulfide）の比率は対照群及び実験群１に比べて実験群２で約１０％の著しい増加が確認できた。
前記結果を介して、ＭＢＴＣ−ＣｅｌｌＴＭ由来の培養液は優秀な抗酸化効果を示すことが分かった。
【００７５】
実施例７−３：マクロファージ捕食機能正常化効能の検証
また、前記ＭＢＴＣ−ＣｅｌｌTM由来の培養液のマクロファージ捕食機能正常化効能を確認した。
具体的には、前記実施例７−１と同様の方法で、対照群、実験群１及び実験群２を設定し、これをマウスに投与した後に、体表的なマクロファージ捕食機能正常化関連バイオマーカーである血中内のＬＤＬコレステロール及びＨＤＬコレステロールの濃度を測定した。これは、 ＬＤＬコレステロール試薬（Bayer、USA）、ダイレクトＨＤＬコレステロール試薬（Bayer、USA）を用いて、自動血液分析機（ADVIA 1650、Bayer、Japan）で測定した。
その結果、図１１で見られるように、血中内ＬＤＬコレステロールの濃度は対照群及び実験群１に比べて実験群２でそれぞれ約２．８８及び２．５５ｍｇ／ｄＬで著しく減少し、ＨＤＬコレステロールの濃度は対照群及び実験群１に比べて実験群２でそれぞれ約３．８３及び３．１ｍｇ／ｄＬの著しく増加したことが確認できた。
前記結果を介して、ＭＢＴＣ−ＣｅｌｌＴＭ由来の培養液は血中コレステロールを有利に調節するなどのマクロファージの捕食機能正常化効能があることが分かった。
【００７６】
実施例８：栄養膜細胞の培養液に含有されたＨＬＡ−Ｇ５タンパク質の分泌特性の確認
本発明によって製造された栄養膜細胞の培養液に含有されたＨＬＡ−Ｇ５タンパク質の分泌特性を確認するために、前記実施例２と同様な方法によって栄養膜細胞を培養し、培養上澄み液に含まれているＨＬＡ−Ｇ５タンパク質をＥＬＩＳＡ分析方法によって分析した。また、栄養膜細胞の培養上澄み液は既存の方法で培養した細胞の培養液（対照群）と比較した。
この時、前記ＥＬＩＳＡ分析は細胞外に分泌発現されるＨＬＡ−Ｇ５タンパク質のみを選択的に検出できるように５Ａ６Ｇ７抗体を用いたＥＬＩＳＡキット（MBS267094、MyBiosource）を用い、その結果は図１２に図示した。
その結果、図１２で見られるように、通常的な培養方法で培養した栄養膜細胞の培養上澄み液に含有されたＨＬＡ−Ｇ５タンパク質の濃度は継代培養を進行すればするほど段々減少する反面、本願発明のヒト体内類似培養条件で培養した栄養膜細胞の培養上澄み液に含有されたＨＬＡ−Ｇ５タンパク質の濃度（試験群）は継代培養を 進行すればするほど段々増加することを確認することができた。
前記結果から本発明によって製造された栄養膜細胞の場合、栄養膜細胞の外部にＨＬＡ−Ｇ５タンパク質を分泌し、培養上澄み液には、継代培養をすればするほどタンパク質の量が増加することにより、ＨＬＡ−Ｇ５タンパク質を常に分泌発現することが確認できた。
【００７７】
実施例９：幹細胞培養液に含有されたＨＬＡ−Ｇ５タンパク質の分泌特性の確認
本発明のように、ヒト体内類似培養条件で培養された栄養膜細胞と共培養を介して免疫寛容の特性が誘導された幹細胞培養液に含有されたＨＬＡ−Ｇ５タンパク質の分泌特性を確認するために、前記実施例３と同様の方法によって間葉系幹細胞を培養し、培養上澄み液に含有されたＨＬＡ−Ｇ５タンパク質をＥＬＩＳＡ分析方法で分析した。この時、前記ＥＬＩＳＡ分析は細胞外部に分泌発現するＥＬＩＳＡタンパク質のみ選択的に検出できるように５Ａ６Ｇ７抗体を用いたＥＬＩＳＡキット（MBS267094、MyBiosource）を用い、その結果は図１３に図示した。
その結果、図１３で見られるように、継代培養を進行すればするほど培養上澄み液に含有されたＨＬＡ−Ｇ５タンパク質の量が段々増加することが確認できた。
即ち、前記結果によって、本発明に従って製造された幹細胞から発現分泌された前記ＨＬＡ−Ｇ５タンパク質は、細胞外部で分泌発現できる形態であってもよく、ＨＬＡ−Ｇ５タンパク質を持続的に常に分泌発現できる特性を有することを確認できた。
【００７８】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施されうることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、制限的なものではないものと理解しなければならない。本発明の範囲は、前記詳細な説明より、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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