(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＯＭＥ加水分解物を含む培地を使用する、オーランチオキトリウム属（Aurantiochytrium）に属する藻類の培養方法であって、
前記ＰＯＭＥ加水分解物は、酸又はアルカリを用いる化学的処理、熱及び／又は圧力を用いる物理学的処理、及び／又はペプチダーゼを用いる生物学的処理によるＰＯＭＥ加水分解物である、前記培養方法。
【請求項２】
前記酸は、硫酸、塩酸、及び／又はリン酸である、請求項１に記載の培養方法。
【請求項３】
前記アルカリは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、及び／又はアンモニアである、請求項１に記載の培養方法。
【請求項４】
前記オーランチオキトリウム属に属する藻類がω―３多価不飽和脂肪酸を産生する藻類である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項５】
ω―３多価不飽和脂肪酸は、ＤＨＡである、請求項４に記載の培養方法。
【請求項６】
前記オーランチオキトリウム属の藻類がオーランチオキトリウム  リマシナム（Aurantiochytrium limacinum）に属する培養株である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項７】
前記オーランチオキトリウム属の藻類がオーランチオキトリウム  マングローベイ（Aurantiochytrium mangrovei）に属する培養株である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項８】
前記オーランチオキトリウム  リマシナムの培養株が４Ｗ−１ｂ株、オーランチオキトリウム  リマシナムＳＲ−２１株、又はオーランチオキトリウム  リマシナムＮＩＥＳ３７３７株から選択されるいずれかの株である、請求項６に記載の培養方法。
【請求項９】
前記オーランチオキトリウム  マングローベイの培養株がオーランチオキトリウム  マングローベイ１８Ｗ−１３ａ株である、請求項７に記載の培養方法。
【請求項１０】
前記ＰＯＭＥ加水分解物は遠心分離及び／又はろ過により固形分が除去されている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項１１】
前記培地は、糖成分を更に含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項１２】
前記糖成分はグルコース、ガラクトース、フルクトース、マルトース、シュクロース、ラクトース、オリゴ糖、及びグリセロール等の糖アルコール、等から選択される1又は複数の糖類である、請求項１１に記載の培養方法。
【請求項１３】
前記糖成分の添加量は、合計として１０〜３０ｇ／培地Ｌである、請求項１１又は１２に記載の培養方法。
【請求項１４】
前記培地は、ミネラル成分を更に含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項１５】
前記ミネラル成分は、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸アンモニウム、硫酸銅、硫酸ニッケル、硫酸亜鉛等の硫酸塩；リン酸カリウム等のリン酸塩；炭酸カルシウム等の炭酸塩；塩化コバルト、塩化マンガン、塩化ナトリウム、塩化カルシウム等の塩化物；モリブデン酸ナトリウム、亜セレン酸ナトリウム等の亜セレン酸塩及びモリブデン酸塩；臭化カリウム、ヨウ化カリウム等のハロゲン化物；天然海水塩類；並びに人工海水塩類から選択される単一又は複数の塩類である、請求項１４に記載の培養方法。
【請求項１６】
前記ミネラル成分の添加量は、合計として５〜３５ｇ／培地Ｌである、請求項１４又は１５に記載の培養方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の培養方法で培養した従属栄養性微細藻類を回収することと、当該回収された藻類からＤＨＡを抽出することを含む、ＤＨＡ製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パームオイル工場排出液(Palm Oil Mill Effluent: POME)を培地として使用する従属栄養性微細藻類の培養方法とDHA製造方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
インドネシアやマレーシア等、油椰子（オイルパーム）果実から抽出するパームオイル製造が基幹産業となっている国では、パームオイル工場排液（以下ＰＯＭＥと称す）が大きな環境・経済問題となっている。例えば、インドネシアでは、パームオイル製造工場から、約455,000t/日のＰＯＭＥがラグーンに放流され酸化池処理→嫌気性処理→好気性処理されている。この過程で、発酵ガスによる悪臭や害虫・害獣被害、水質汚濁等を引き起こし、嫌気処理により発生するメタンガスは大気へ放出されている状況である。メタンの地球温暖化係数は二酸化炭素に比べて21倍と非常に大きく、地球温暖化に悪影響を及ぼしている。このようにＰＯＭＥは、温暖化物質の放出と水質汚濁をひきおこし、地球温暖化や生活環境悪化や野生生物への悪影響等広範でかつ深刻な環境問題を引き起こしている。例えば、パームオイル生産産業は、インドネシア、マレーシア等の基幹産業となっていることから、ＰＯＭＥの環境問題の解決は、インドネシアやマレーシア等パームオイル産業が盛んな国家社会の持続的発展のために重大な課題となっている。【０００３】
ＰＯＭＥの環境問題解決法として、上述のように嫌気状態でメタンガスが発生することから、これらを回収し、バイオガス発電を行う方法が知られている（特許文献１、２）。しかし、バイオガス発電量がそれ程高くないことから、採算性が悪く、ほとんどが事業として成立しない。その為、現地では依然としてＰＯＭＥの新たな利用方法へのニーズが高い。【０００４】
従来から、微細藻類を増殖させ、微細藻類の細胞内に燃料、飼料、健康食品などの原料となる脂質、又は、タンパク質やビタミン等の有価物を生産・貯蔵させ、貯蔵した有価物を利用して燃料や食品等に利用することが行われている。特にω-3多価不飽和脂肪酸等高付加価値有価物の産生・貯蔵については、即産業化可能成分として注目されている。【０００５】
この微細藻類の増殖は、下水・産業排水の浄化といった排水処理（特許文献３）や二酸化炭素の吸収・利用を目的とした排ガス処理（特許文献４）などにも利用されている。しかし、微細藻類が効率的に増殖しないと細胞内における有価物の貯蔵量が必ずしも十分なものとならないため、前記有価物の有効利用が困難になるおそれを有する。クロレラ等微細藻類はＰＯＭＥを利用して増殖することが報告されている（非特許文献１−５）が、藻体バイオマス生産性や脂質生産性が低く、ＰＯＭＥ利用効率が悪いことから、微細藻類からの高付加価値有価物の生産法は確立されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】： 再公表2017-026370号公報
【特許文献２】： 特許第6049937号公報
【特許文献３】： 特開平05-301097号公報
【特許文献４】： 特開2010-022331号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】HABIB et. al. “Growth and Nutritional Values of Moina micrura Fed on Chlorella vulgaris Grown in Digested Palm Oil Mill Effluent”, Asian Fisheries Science, 16, 107-119, 2003
【非特許文献２】Putri et. al. “Investigation of Microalgae for High Lipid Content using Palm Oil Mill Effluent (Pome) as Carbon Source”, 2011 International Conference on Environment and Industrial Innovation, IPCBEE,12, 85-89, 2011
【非特許文献３】Nwuche et. al. “Use of Palm Oil Mill Effluent as Medium for Cultivation of Chlorella sorokiniana”, British Biotechnology Journal, 4(3): 305-316, 2014
【非特許文献４】Nur et. al. “Enhancement of Chlorella vulgaris Biomass Cultivated in POME Medium as Biofuel Feedstock under Mixotrophic Conditions”, Journal of Engineering and Technology Sciences, 47(5), 487-497, 2015
【非特許文献５】Cheah et. al. “Enhancing biomass and lipid productions of microalgae in palm oil mill effluent using carbon and nutrient supplementation”, Energy Conversion and Management, 164, 188-197, 2018
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記の問題点等に鑑み、パームオイル製造工程から排出されるＰＯＭＥを用いて微細藻類を効率的に増殖させることができる培養方法と微細藻類から高付加価値有価物を効率的に生産する方法を提供することを課題とする。【０００９】
本発明者は、ＰＯＭＥの利用効率を改善するために鋭意検討を行ったところ、ＰＯＭＥ加水分解物を用いることで、ＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）といったω-3多価不飽和脂肪酸を産生する従属栄養性微細藻類が効率良く良好に増殖されること、ＤＨＡの生産量が向上すること等を見出して本発明を完成させるにいたった。【００１０】
本発明は、ＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）といったω-3多価不飽和脂肪酸を産生する従属栄養性微細藻類をＰＯＭＥ加水分解物を用いることで効率的に増殖させることができる培養方法とＤＨＡ製造法を提供する。【００１１】
即ち、上記課題を解決するための本発明に係る従属栄養性微細藻類の培養方法は、パームオイル製造過程でパーム果実からオイルをしぼりだした搾り汁を成分とするＰＯＭＥを加水分解したＰＯＭＥ加水分解物を用いて、高付加価値成分を産生する微細藻類を従属栄養培養することを特徴とする。【００１２】
本発明に係る当該微細藻類の培養方法においてはＰＯＭＥ加水分解物を供給することを特徴とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
従って、本願は、以下の発明を提供する。
（１）ＰＯＭＥ加水分解物を含む培地を使用する、従属栄養性微細藻類の培養方法。
（２）前記ＰＯＭＥ加水分解物は、化学的、物理学的、及び／又は生物学的処理によるＰＯＭＥ加水分解物である、（１）に記載の培養方法。
（３）前記化学的処理によるＰＯＭＥ加水分解物は、酸又はアルカリによるＰＯＭＥ加水分解物である、（２）に記載の培養方法。
（４）前記酸は、硫酸、塩酸、及び／又はリン酸である、（３）に記載の培養方法。
（５）前記アルカリは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、及び／又はアンモニアである、（３）に記載の培養方法。
（６）前記物理学的処理によるＰＯＭＥ加水分解物は、熱及び／又は圧力によるＰＯＭＥ加水分解物である、（２）に記載の培養方法。
（７）前記生物学的処理によるＰＯＭＥ加水分解物は、ペプチダーゼ又はアミラーゼによるＰＯＭＥ加水分解物である、（２）に記載の培養方法。
（８）前記従属栄養性微細藻類がω―３多価不飽和脂肪酸を産生する藻類である、（１）〜（７）のいずれか１項に記載の培養方法。
（９）ω―３多価不飽和脂肪酸は、ＤＨＡである、（８）に記載の培養方法。
（１０）前記藻類が、ヤブレツボカビ類（Thraustochytriales）に属する藻類の株である、（１）〜（９）のいずれか１項に記載の培養方法。
（１１）前記ヤブレツボカビ類が、オーランチオキトリウム属（Aurantiochytrium）に属する種である（１０）に記載の培養方法。
（１２）前記オーランチオキトリウム属の藻類がオーランチオキトリウム  リマシナム（Aurantiochytrium limacinum）に属する培養株である（１１）に記載の培養方法。
（１３）前記オーランチオキトリウム属の藻類がオーランチオキトリウム  マングローベイ（Aurantiochytrium mangrovei）に属する培養株である（１１）に記載の培養方法。
（１４）前記オーランチオキトリウム  リマシナムの培養株が４Ｗ−１ｂ株、オーランチオキトリウム  リマシナムＳＲ−２１株、又はオーランチオキトリウム  リマシナムＮＩＥＳ３７３７株から選択されるいずれかの株である（１２）に記載の培養方法。
（１５）前記オーランチオキトリウム  マングローベイの培養株がオーランチオキトリウム  マングローベイ１８Ｗ−１３ａ株である（１３）に記載の培養方法。
（１６）前記ＰＯＭＥ加水分解物は遠心分離及び／又はろ過により固形分が除去されている、（１）〜（１５）のいずれか１項に記載の培養方法。
（１７）前記培地は、糖成分を更に含む、（１）〜（１６）のいずれか１項に記載の培養方法。
（１８）前記糖成分はグルコース、ガラクトース、フルクトース、マルトース、シュクロース、ラクトース、オリゴ糖、及びグリセロール等の糖アルコール、等から選択される1又は複数の糖類である、（１７）に記載の培養方法。
（１９）前記糖成分の添加量は、合計として１０〜３０ｇ／培地Ｌである、（１７）又は（１８）に記載の培養方法。
（２０）前記培地は、ミネラル成分を更に含む、（１）〜（１９）のいずれか１項に記載の培養方法。
（２１）前記ミネラル成分は、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸アンモニウム、硫酸銅、硫酸ニッケル、硫酸亜鉛等の硫酸塩；リン酸カリウム等のリン酸塩；炭酸カルシウム等の炭酸塩；塩化コバルト、塩化マンガン、塩化ナトリウム、塩化カルシウム等の塩化物；モリブデン酸ナトリウム、亜セレン酸ナトリウム等の亜セレン酸塩及びモリブデン酸塩；臭化カリウム、ヨウ化カリウム等のハロゲン化物；天然海水塩類；並びに人工海水塩類から選択される単一又は複数の塩類である、（２０）に記載の培養方法。
（２２）前記ミネラル成分の添加量は、合計として５〜３５ｇ／培地Ｌである（２０）又は（２１）に記載の培養方法。
（２３）（１）〜（２２）のいずれか１項に記載の培養方法で培養した従属栄養性微細藻類を回収することと、当該回収された藻類からＤＨＡを抽出することを含む、ＤＨＡ製造方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、ＰＯＭＥの有効利用が図れるとともに、従属栄養性微細藻類の培養を効率的に行うことにより有価物としてＤＨＡを製造することができる。【００１５】
驚くべきことに、ＰＯＭＥ加水分解物を含む培地を使用する場合、ＰＯＭＥ非加水分解物のみを含む培地を使用する場合に比べて早い増殖速度でオーランチオキトリウム リマシナム４Ｗ−１ｂ株を良好に増殖させ、高濃度のＤＨＡ生産を達成した。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、５０％ＰＯＭＥの硫酸及び加熱による加水分解物、５０％ＰＯＭＥの加熱による加水分解物、および加水分解を行わない５０％ＰＯＭＥ（コントロール）を添加した培地を用いた場合のオーランチオキトリウム  リマシナム４Ｗ−１ｂ株の藻体濃度を示す（ＯＤ６６０）。
【図２】図２は、５０％ＰＯＭＥの硫酸及び加熱による加水分解物、５０％ＰＯＭＥの加熱による加水分解物、および加水分解を行わない５０％ＰＯＭＥ（コントロール）を添加した培地を用いた場合のオーランチオキトリウム  リマシナム ４Ｗ−１ｂ株の総脂質濃度およびＤＨＡ濃度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
一般に、パームオイルの製造工程は、パーム果房（Fresh Fruit Bunch：FFB）の不活化のためのスチーム処理、パーム果実とパーム空房（Empty Fruit Bunch：EFB）の分離、パーム果実からの果実部（メソカ）と種部の分離という前処理工程を経る。果実部からのクルードパームオイル抽出、分離精製へと進み、純度の高いパームオイルが製造される。本発明におけるＰＯＭＥとは、このパ−ムオイルの製造過程において生じる、使用済みスチーム水、オイル絞り汁と未回収オイルの混合排出液、及び／又は、上記の混合液を遠心分離により未回収オイルを除去または回収した排出液（温度が70-90℃）、および、それらが冷却後に酸化池処理→嫌気性処理→好気性処理を経て、放流される排液をいう。ＰＯＭＥは、原材料に由来する、糖質、有機酸、ビタミン、アミノ酸、ペプチド、タンパク質及びミネラル等を豊富に含有する。藻類の培養に使用するＰＯＭＥは、酸化池処理、嫌気性処理、又は好気性処理を行う前のものであっても処理後のものであってもよい。ある実施形態では、これら酸化池処理、嫌気性処理、及び好気性処理を行う前のＰＯＭＥを使用することが好ましい。
【００１８】
ＰＯＭＥは、原材料由来の様々な固形物を含有する。ＤＨＡ産生藻類の培養に際して、固形物を含有するＰＯＭＥを使用してＰＯＭＥ加水分解物を調製し直接培地に使用してもよい。あるいは、ＰＯＭＥは加水分解されたのち、遠心分離や濾過等、公知の手段により固形物を除去したものを使用してもよい。あるいは、ＰＯＭＥから遠心分離や濾過等、公知の手段により固形分を除去して、その固形分を加水分解したものを上清ＰＯＭＥに添加した形態で培地に使用してもよい。しかし、ＰＯＭＥ加水分解物は非加水分解固形分等の固形物を含有していてもいなくてもよく、限定されない。
【００１９】
ＰＯＭＥ加水分解物は、任意の手段によって調製され得る。例えば、硫酸、塩酸、リン酸等の酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、又はアンモニア等のアルカリによる化学的処理；熱、圧力等による物理学的処理；ペプチダーゼ、アミラーゼ等の酵素による生物学的処理等の加水分解などが挙げられるがこれらに限定されない。本願において、用語「ペプチダーゼ」は、ペプチド結合の加水分解反応を触媒する酵素を指し、「プロテアーゼ」と同義であり互換可能に用いられる。
【００２０】
加水分解は、化学的処理、物理学的処理、生物学的処理等を任意に組み合わせて行ってもよい。例えば、酸又はアルカリによる化学的処理と加熱等による物理学的処理を組み合わせてＰＯＭＥの加水分解を行ってもよい。例えば、ある実施形態では、硫酸及び／又は加熱によるＰＯＭＥ加水分解物を含む培地が使用される。ＰＯＭＥを酸又はアルカリによる化学的処理により加水分解する場合、使用する酸又はアルカリの濃度は限定されないものの、例えば、容量１％、２％、３％、５％、１０％等が挙げられる。ある実施形態では、酸又はアルカリの濃度が、容量０．１〜１０％、０．３〜８％、０．５〜５％、１〜３％等の範囲内にあってもよい。ＰＯＭＥを加熱により加水分解する場合、加熱温度は限定されないものの、例えば、少なくとも４０〜３７４℃、４０〜３００℃、４５〜２５０℃、５０〜２００℃、６０〜１８０℃、７０〜１７０℃、８０〜１６０℃、９０〜１５０℃、１００〜１４０℃、１１０〜１３０℃、１１５〜１２５℃等が挙げられる。ＰＯＭＥを圧力により加水分解する場合、加える圧力は限定されないものの、例えば、少なくとも１．０ａｔｍ〜５．０ａｔｍ、１．５ａｔｍ〜４．０ａｔｍ、２．０ａｔｍ〜３．０ａｔｍ、５．０ａｔｍ〜５０ａｔｍ、５０ａｔｍ〜１００ａｔｍ、１００ａｔｍ〜１５０ａｔｍ、１５０ａｔｍ〜２００ａｔｍ、２００ａｔｍ〜２１８．０ａｔｍ等が挙げられる。ペプチダーゼ等の酵素による生物学的処理により加水分解する場合、限定されないものの、１００〜１０００Ｕｎｉｔ、３００〜８００Ｕｎｉｔ、４００〜７００Ｕｎｉｔ等の濃度にて、例えば、６０〜２０℃、５０〜３０℃、４０〜３５℃、３７℃等といった酵素が活性化するような温度で行ってもよい。また、ＰＯＭＥを加水分解する処理時間は限定されないものの、１〜４週間、１〜７日、１〜２４時間、２０〜１００分、３０〜９０分、４０〜８０分、５０〜７０分、５５〜６５分等が挙げられる。例えば、生物学的処理の時間を長めに設定するなど、加水分解処理に応じて任意に設定できる。上記処理を組み合わせる場合、これらの処理は同時に行ってもよいし任意の順番で行ってもよい。しかし、加水分解処理の方法、順序、温度、時間等の条件は、ＰＯＭＥが加水分解できれば任意であり上記範囲に限定されない。
【００２１】
例えば、ある実施形態では、容量５０％ＰＯＭＥを１２１℃にて６０分の加熱による加水分解処理、あるいは、容量１％、２％、３％硫酸の添加による、あるいは、容量１％、２％、３％等の硫酸を添加した後１２１℃にて６０分の加熱による加水分解処理することにより培地を作成してもよい。
【００２２】
本発明において、ＰＯＭＥ加水分解物を含む培地は、濾過滅菌、オートクレーブ滅菌、煮沸滅菌、及び放射線滅菌等、公知の手段で滅菌されてもよく、次亜塩素酸ソーダやオゾン処理等、公知の手段で殺菌されてもよい。
【００２３】
本発明において、「ＰＯＭＥ加水分解物を含む培地を使用する」とは、ＰＯＭＥ加水分解物を培地に使用する限り、ＰＯＭＥ非加水分解物の使用を排除するものではない。例えば、ＰＯＭＥ加水分解物を含まずＰＯＭＥ非加水分解物のみを含む培地を作成し一定時間、例えば、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間培養し、その後ＰＯＭＥ加水分解物を添加して一定時間、例えば、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間培養を継続しても、その逆であってもよい。あるいは、培地におけるＰＯＭＥの一部又は全部を加水分解してもよい。ＰＯＭＥ加水分解物を含む培地におけるＰＯＭＥ加水分解物とＰＯＭＥ非加水分解物の割合は任意であり、例えば、ＰＯＭＥ全体量（ＰＯＭＥ加水分解物とＰＯＭＥ非加水分解物との合計）に対し、ＰＯＭＥ加水分解物の割合が少なくとも１％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、１００％（容量％）であってもよい。ある実施形態では、ＰＯＭＥ全体量に対するＰＯＭＥ加水分解物の割合が、１〜１００％、１０〜９０％、２０〜８０％、２５〜７５％（容量％）等の範囲内にあってもよい。また、本発明において、当該従属栄養性微細藻類の培地におけるＰＯＭＥの含有量（ＰＯＭＥ加水分解物とＰＯＭＥ非加水分解物を含むＰＯＭＥ全体量）は限定されないものの、例えば、培地において少なくとも１％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、１００％（容量％）の濃度であってもよい。ある実施形態では、培地におけるＰＯＭＥの含有量（ＰＯＭＥ全体量）が、１〜１００％、１０〜９０％、２０〜８０％、２５〜７５％（容量％）等の範囲内にあってもよい。
【００２４】
本発明において、ＰＯＭＥ加水分解物を含む培地に様々な添加物を添加することにより、当該培地が、ＤＨＡ産生藻類の培養に適した組成となるように調製されてもよい。当該添加物として、糖類、有機酸、無機酸、有機塩基、無機塩基、ビタミン、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ミネラル（天然海水、人工海水等も含む）が挙げられる。ある実施形態では、糖類及び／又はミネラルを添加することが好ましい場合がある。ある実施形態では、ミネラルを添加しないことが好ましい場合がある。ミネラルを添加しないと装置の金属腐食を防止できる、培養後の排水処理や放流が容易になる、培地コストを低く抑えるという利点がある。更に、必要であれば適当な酸又は塩基を加えることにより適宜ｐＨを調整できる。培地の好適なｐＨは培養するＤＨＡ産生藻類の種類に依存し、例えば、ｐＨ６〜ｐＨ７に調整してもよい。
【００２５】
ミネラル成分としては、限定されないが、化学的に定義された無機塩、例えばアルカリ及びアルカリ土類金属塩、並びに他の金属の塩であってよい。このような無機塩として、例えば、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸アンモニウム、又は硫酸銅、硫酸ニッケル、硫酸亜鉛等の硫酸塩；リン酸カリウム等のリン酸塩；炭酸カルシウム等の炭酸塩；塩化コバルト、塩化マンガン、塩化ナトリウム、塩化カルシウム等の塩化物；アルカリ金属酸化物；モリブデン酸ナトリウム及び亜セレン酸ナトリウム等の亜セレン酸塩及びモリブデン酸塩；臭化カリウム又はヨウ化カリウム等のハロゲン化物；天然海水塩類；並びにＲｅｄ Ｓｅａ Ｓａｌｔ（レッドシー塩）といった人工海水塩類；から選択される単一又は複数の塩類が挙げられる。前記塩類は、合計で０．０１〜５．０、５〜４０、５〜３５、１０〜３０、又は１０〜２５‰（ｇ／培地Ｌ）の量で添加されてもよい。例えば、ある実施形態では、前記塩類は、合計で１９．４‰（１９．４ｇ／培地Ｌ）の量で添加される。
【００２６】
ある実施形態では、追加的なミネラル成分、例えば、塩化物等の塩類を培地に添加しない。かかる実施形態では、培地はＰＯＭＥ加水分解物に元々含まれていた以外に追加的なミネラル成分を含まない。ＰＯＭＥ加水分解物を用いる本願発明の培地にミネラル成分を添加せずヤブレツボカビ類（Thraustochytriales）等のＤＨＡ産生藻類を培養するとＤＨＡ生産性が増加することがある。ＰＯＭＥ等に元々含まれていた以外に追加的なミネラル成分を含まない培地の場合、かかる培地におけるミネラルの濃度は、例えば、ＮａＣｌ量換算で合計６．０‰、５．０‰、４．０‰、３．０‰、２．０‰、１．０‰（ｇ／培地Ｌ）未満、Ｃｌ量換算で合計３．０‰、２．０‰、１．０‰（ｇ／培地Ｌ）未満であり得る。
【００２７】
ある実施形態では、ＰＯＭＥ加水分解物とともに糖類を培養液に含有させることで、該従属栄養性微細藻類の増殖が促進される場合がある。糖類は、従属栄養性微細藻類の炭素源となるものであるが、ＰＯＭＥ加水分解物に微細藻類が利用可能な糖類が十分に含有されていない場合や、該従属栄養性微細藻類の増殖を促進したい場合には、何等かの形で微細藻類が利用可能な糖類を培養液に添加してもよい。
【００２８】
糖類としては、限定されないが、例えば、グルコース、ガラクトース、フルクトース、マルトース、シュクロース、ラクトース、オリゴ糖、及びグリセロール等の糖アルコール、から選択される1又は複数の糖類が挙げられる。前記糖類は、合計で５〜４０、１０〜３０、１５〜２５（ｇ／培地Ｌ）の量で添加されてもよい。例えば、ある実施形態では、前記糖類は、合計で２０‰（２０ｇ／培地Ｌ）の量で添加される。
【００２９】
本発明で使用する微細藻類としては、特にＤＨＡ等ω-３多価不飽和脂肪酸を産生する藻類（以下ＤＨＡ等産生藻類と称す）であってもよい。ＤＨＡ等産生藻類としては、ヤブレツボカビ類（Thraustochytriales）に属する生物であるオーランチオキトリウム属（Aurantiochytrium）、シゾキトリウム属（Schizochytrium）、スラウストキトリウム属（Thraustochytrium）、パリエティキトリウム属(Parietichytrium)、又はウルケニア属(Ulkenia)に属する生物、あるいはオブロンギキトリウム属(Oblongichytrium)に属する生物などが挙げられる。
前記オーランチオキトリウム属（Aurantiochytrium）に属する生物としては、例えば、オーランチオキトリウム  リマシナム（Aurantiochytrium limacinum）、オーランチオキトリウム  マングローベイ（Aurantiochytrium mangrovei）などが挙げられる。
前記シゾキトリウム属（Schizochytrium）に属する生物としては、例えば、Schizochytrium aggregatumなどが挙げられる。例えば、Schizochytrium sp. Maku-1等の株が使用できる。
前記スラウストキトリウム属（Thraustochytrium）に属する生物としては、例えば、Thraustochytrium aureum、Thraustochytrium pachydermum、Thraustochytrium aggregatumなどが挙げられる。
前記パリエティキトリウム属(Parietichytrium)に属する生物としては、例えば、Parietichytrium sarkarianumなどが挙げられる。例えば、Parietichytrium sp. 6F-10b等の株が使用できる。
前記ウルケニア属(Ulkenia)に属する生物としては、例えば、Ulkenia visurgensis、又は、Ulkenia profundaなどが挙げられる。例えば、Ulkenia sp. Yonez6-9等の株が使用できる。
前記オブロンギキトリウム属(Oblongichytrium)に属する生物としては、例えば、Oblongichytrium multirudimentale、Oblongichytrium minutumなどが挙げられる。例えば、Oblongichytrium sp. H9等の株が使用できる。
特に好ましいのはオーランチオキトリウム属の藻類であり、例えば、オーランチオキトリウム  リマシナム４Ｗ−１ｂ株、オーランチオキトリウム  リマシナムＳＲ−２１株、及びオーランチオキトリウム  リマシナムＮＩＥＳ３７３７株などのオーランチオキトリウム  リマシナムの株、並びにオーランチオキトリウム  マングローベイ１８Ｗ−１３ａ株などのオーランチオキトリウム  マングローベイの株等が使用できる。
【００３０】
本発明におけるＤＨＡ等産生藻類の培養は、当該藻類を上記のように調製されたＰＯＭＥ加水分解物を含む培地に播種し、定法にしたがって培養することにより行われる。あるいは上述のように、ＰＯＭＥ非加水分解物のみを含む培地で一定時間培養し、その後ＰＯＭＥ加水分解物を含む培地にて一定時間培養を継続しても、その逆であってもよい。培養条件は培養するＤＨＡ等産生藻類の種類に依存し、温度は５〜４０℃、好ましくは１０〜３５℃、特に好ましいのは２０〜２５℃、より好ましくは２５℃±１℃にて、通常１〜１０日間、好ましくは２〜８日間、例えば３〜７日間、例えば４〜５日間培養を行い、通気攪拌培養、振とう培養又は静置培養で行うことができる。
【００３１】
本発明に使用するＤＨＡ等産生藻類は、適当な細胞培養手段を有する培養装置で培養してよい。「細胞培養手段」とは、細胞を培養するためのあらゆる機能を有する手段を意味し、例えば、培養槽であり、当該培養槽は、攪拌装置、振動装置、温度制御装置、ｐＨ調節装置、濁度測定装置、光制御装置、Ｏ２、ＣＯ２等の特定気体濃度測定装置及び圧力測定装置から選択される１又は複数の装置を有してもよい。当該培養槽は濃縮・分離槽と同一の槽であっても、濃縮・分離槽とは別の槽であってもよい。濃縮・分離槽と別の槽である場合、適切な手段、例えば流路等により連結されていてもよい。
【００３２】
培養方法としては、ＰＯＭＥ加水分解物を含む培地を使用すれば限定されない。例えば、硫酸等による化学的処理及び加熱等の物理学的処理によるＰＯＭＥ加水分解物を含む培地を使用して増殖を行った後、物理学的処理のみによるＰＯＭＥ加水分解物を含むが化学的処理で用いた硫酸等の物質を含まない培地を使用して増殖を行ってもよい。あるいは、化学的処理によるＰＯＭＥ加水分解物を含む培地を使用して増殖を行った後、物理学的処理のみによるＰＯＭＥ加水分解物を含むが化学的処理で用いた物質を含まない培地を使用して増殖を行ってもよい。あるいは、化学的処理、物理学的処理、生物学的処理等によるＰＯＭＥ加水分解物を含む培地を使用して増殖を行った後、ＰＯＭＥ加水分解物を含まない培地を使用して増殖を行ってもその逆であってもよい。
【００３３】
本発明はさらに、ＰＯＭＥ加水分解物を含む培地を使用し上記培養方法で培養したＤＨＡ産生藻類を回収し、当該回収されたＤＨＡ等産生藻類からＤＨＡを抽出する、ＤＨＡ製造方法を提供する。本発明のＤＨＡ製造方法は、ＰＯＭＥ加水分解物を含む培地を使用してＤＨＡ等産生藻類を培養することにより、当該ＤＨＡ等産生藻類にＤＨＡを産生させることを特徴とする。
【００３４】
本発明のＤＨＡ等産生藻類が産生するＤＨＡは、当業者に既知の方法で抽出及び分析することができる。例えば、上記の通りＤＨＡ産生藻類を培養して増殖させ、得られた培養液からＤＨＡ産生藻類を回収する場合は、遠心分離又は濾過等既存の方法で回収することができる。回収したＤＨＡ産生藻類のペレットを、凍結乾燥又は加温による乾燥等により乾燥させた藻体、または、ＤＨＡ産生藻類培養を濃縮したのち乾燥していない湿潤の藻体をＤＨＡの抽出ステップに用いてもよい。
【００３５】
得られた乾燥藻体、又は湿潤藻体から、ＤＨＡを抽出できる。抽出方法は、特に限定されず、有機溶媒抽出や圧搾、超臨界抽出等既知の方法で行うことができる。有機溶媒抽出法に用いられる有機溶媒としては、例えばヘキサン、アセトン、クロロホルム、メタノール、エタノール、ジエチルエーテル等が挙げられ、単体で用いてもよく、又は極性溶媒と無極性溶媒の２液以上の混合液を用いることもできる。抽出前に藻体を破砕してもよく、以下に限定されないが、アルカリや酸による化学的破砕、ホモジナイザーや超音波、ビーズミル等の機械的破砕、酵素による生物的破砕等、既知の方法で行っても良い。上記抽出後に、得られた抽出液を、当業者に既知の方法でＤＨＡを濃縮・精製してもよく、例えば、シリカゲルや酸性白土を用いたカラムクロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィ、液液分配、尿素付加法等既知の方法を用いて、濃縮・精製してもよい。
【００３６】
前記ＤＨＡ等産生藻類は、その乾燥重量当たり、少なくとも５％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％（重量％）のＤＨＡを含有することがある。
【実施例】
【００３７】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）５０％ＰＯＭＥ加水分解物にグルコースと塩類を添加した培地におけるオーランチオキトリウム  リマシナム４Ｗ−１ｂ株の増殖、総脂質とＤＨＡの生産
（種藻）
下記培地にて、筑波大学から提供されたヤブレツボカビ類に属するオーランチオキトリウム  リマシナム４Ｗ−１ｂ株をＧＴＹ培地（1/2希釈海水１Ｌにグルコース２０ｇ、酵母エキス５ｇ、トリプトン１０ｇ含有）で３日間培養し、種藻とした。【００３８】
２０１８年４月にインドネシアのリアウ州にあるパームオイル工場から提供された高温のＰＯＭＥを速やかに冷蔵庫で冷却して３日間保存したのち、１２１℃で６０分間加熱処理することにより加水分解したもの、１％となるように硫酸を添加して同様の加熱処理（１２１℃で６０分間）により加水分解をおこなったもの、全く加水分解をおこなわないもの、それぞれについてＮａＯＨをつかってｐＨ７．０に調整し、４０００ｒｐｍ（２，７００ｇ）で１５分間遠心分離して得られた加水分解上清液を５０％（容量％）となるように合計１９．４ｇ／Ｌの塩類（１５．５ｇ／ＬのＮａ２ＳＯ４、０．６９ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、５．７４ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５９ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４）と２０ｇ／Ｌのグルコースを含む人工海水で希釈したものを培地として使用した。【００３９】
上記各培地を、５００ｍｌ容積の三角フラスコに２００ｍｌ注ぎ、オートクレーブで１２０℃、２０分間滅菌した。培地冷却後にオーランチオキトリウム  リマシナム４Ｗ−１ｂ株の種藻を滅菌海水で洗浄したのち、培地に播種した。フラスコの口をシリコ栓で封じ、２５℃で往復振盪培養した（１００ストローク／分）。【００４０】
培養中の培養液１ｍｌを所定のタイムポイントで回収し、紫外可視吸光度計により６６０ｎｍの光学濁度を計測することで、増殖曲線を得た。培養は、全ての培養で増殖がプラトーに達するまで、最長で６０時間実施された。培養終了後の培養液を５０〜１００ｍＬ回収し、高速冷却遠心分離機で３９００ｒｐｍ、１５分遠心分離した。その後、上清を捨て、ペレットを蒸留水で洗浄し、再度遠心分離を行った。その後、試料を−８０℃で凍結し、これらを凍結乾燥機で乾燥させることで、乾燥藻体を得た。乾燥藻体重量を微量天秤により計量し、培養液１Ｌ当たりの藻体量を算出した。【００４１】
上記藻類培養液１０ｍＬから遠心分離により藻体を回収した。得られた藻体ペレットを超音波破砕し、クロロホルム／メタノール（体積比２：１）混合溶液２０ｍＬを添加後、よく混合した。０．９％塩化ナトリウム水溶液４ｍＬを加えてよく混合し、遠心分離後、クロロホルム層をろ紙でろ過しながら回収した。当該濾液を濃縮乾固して、脂質量を測定した。当該脂質に内部標準物質としてトリコサンメチルエステルを０．２ｍｇ加え、０．５Ｍ  ＮａＯＨメタノール溶液０．５ｍＬを添加し、１００℃、９分間でけん化反応を行った後、14％三フッ化ほう素メタノール溶液０．７ｍＬを加え、１００℃、7分間でメチルエステル化反応を行った。当該試料に飽和食塩水３ｍＬとヘキサン３ｍＬを加えてよく混合し、遠心分離後ヘキサン層をＧＣ（ガスクロマトグラフィー）分析によりＤＨＡ含有量を測定した。【００４２】
以上の結果を図１、図２に示す。
図１は、容量５０％のＰＯＭＥを容量１％の硫酸処理および１２１℃の加熱処理により加水分解した培地、１２１℃の加熱処理だけで加水分解した培地、並びに対照として加水分解を行わない容量５０％ＰＯＭＥ培地（以下コントロール培地）で培養したオーランチオキトリウム  リマシナム４Ｗ−１ｂの藻体濃度の経時変化を示す（ＯＤ６６０）。すべての培地で当該株は増殖したが、加水分解処理した培地のほうがコントロール培地よりも明らかに良好な増殖を示した。さらには、ＰＯＭＥを加熱のみにより加水分解した培地より、硫酸及び加熱により加水分解処理した培地のほうが良好な増殖を示した。
図２は培養４８時間後の総脂質とＤＨＡの生産量を示す。すべての培地で脂質およびＤＨＡが産生されたが、脂質生産量では、１％硫酸及び加熱による加水分解培地がコントロールと比べて１．３倍程度高かった。ＤＨＡ産生量については、１％硫酸及び加熱による加水分解培地と加熱のみによる加水分解培地はコントロールより明らかに増加していた。
表１に各培地における当該株を４８時間増殖させた後の増殖量（ｇ／Ｌ）、藻体生産性（ｍｇ／Ｌ／日）、総脂質含有量（％）、総脂質量（ｍｇ／Ｌ）、脂質生産性（ｍｇ／Ｌ／日）、ＤＨＡ含有量（％）、ＤＨＡ生産量（ｍｇ／Ｌ）、およびＤＨＡ生産性（ｍｇ／Ｌ／日）をまとめた表を示す。生産性は、４８時間増殖後の藻体量、総脂質量、およびＤＨＡ量をそれぞれ１日当たりに換算した値である。総脂質含有量及びＤＨＡ含有量は、それぞれ藻体量に対する割合を示す（重量％）。
【表１】
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【００４３】
藻体生産性および脂質生産性は、硫酸+加熱による加水分解ＰＯＭＥ培地が最も高く、一方、ＤＨＡ生産性は、加熱による加水分解培地が最も高く、ついで硫酸+加熱による加水分解培地が高く、そしてコントロール培地が最も低かった。【００４４】
（実施例２）各種方法にて加水分解処理した１００％ＰＯＭＥを用いて調製した培地におけるオーランチオキトリウム  リマシナム４Ｗ−１ｂ株の増殖、総脂質とＤＨＡの生産
様々な加水分解条件を設定してオーランチオキトリウム  リマシナム４Ｗ−１ｂ株の増殖、総脂質とＤＨＡの生産を調べた。
種株は、実施例１と同じオーランチオキトリウム  リマシナム４Ｗ−１ｂ株を用いた。ＰＯＭＥは、インドネシアの北スマトラ州にあるパームオイル工場から提供された高温のＰＯＭＥを速やかに冷却して冷凍保存したものを実験開始時に解凍して使用した。
ＰＯＭＥ加水分解物は、解凍したＰＯＭＥを下記の表２に記載の各条件（表２の実験番号２〜４）で処理することにより加水分解を行い、酸又はアルカリでｐＨ７．０に調整した後、４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して得られた加水分解ＰＯＭＥ上清液（容量１００％）を使用した。コントロール（ＰＯＭＥ非加水分解物）として、全く加水分解をおこなわずフィルター（0.45μm）でろ過のみを行い（表２の実験番号１）、同様にｐＨ７．０に調整した後、４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して得られた非加水分解ＰＯＭＥ上清液（容量１００％）を使用した。
培養は、解凍したＰＯＭＥを４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して得られたＰＯＭＥ上清液（容量１００％：ＰＯＭＥ非加水分解物）を初期培地として使用し、実施例１と同様に５００ｍｌ容積の三角フラスコに２００ｍｌ注ぎ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し冷却後、種株を培地に播種し、フラスコの口をシリコ栓で封じ、２５℃で往復振盪培養（１００ストローク/分）することにより３６時間培養後、上記各種ＰＯＭＥ加水分解物又はコントロール５０ｍｌを培養物に添加し、培養を継続した。
【表２】
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【００４５】
培養開始から６０時間後に実施例１と同様に５０〜１００ｍＬ回収し、増殖量（ｇ／Ｌ）、藻体生産性（ｍｇ／Ｌ／日）、総脂質含有量（％）、総脂質量（ｍｇ／Ｌ）、脂質生産性（ｍｇ／Ｌ／日）、ＤＨＡ含有量（％）、ＤＨＡ生産量（ｍｇ／Ｌ）、およびＤＨＡ生産性（ｍｇ／Ｌ／日）を求めた。【００４６】
結果を表３〜６に示す。表３は、実験番号１に対する実験番号２（１）及び（２）を比較した物理学的処理（熱及び圧力による加水分解）による影響を示す。表４は、実験番号１に対する実験番号３−１（１）、（２）及び（３）を比較した化学的処理（酸による加水分解）による影響を示す。表５は、実験番号１に対する実験番号３−２（１）及び（２）を比較した化学的処理（アルカリによる加水分解）による影響を示す。表６は、実験番号１に対する実験番号４（１）及び（２）を比較した生物学的処理（酵素による加水分解）による影響を示す。いずれの実験でも、ＰＯＭＥ加水分解物を含む培地を使用した場合、ＰＯＭＥ非加水分解物のみを含むコントロール培地を使用した場合に比べて藻体、脂質、DHAの生産量及び生産性が向上した。
【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【００４７】
以上の結果より、オーランチオキトリウム リマシナム４Ｗ−１ｂ株をはじめとする従属栄養性微細藻類の増殖や脂質・ＤＨＡの生産には、ＰＯＭＥ加水分解物を含む培地を用いることが好ましいことが示された。
【図１】
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【図２】
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