(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
高移動度グループボックス1(HMGB1)ポリペプチドであって、前記HMGB1ポリペプチドにおいて、配列番号１のアミノ酸位置22、57、68、及び75に対応する位置にある4個全てのチロシン残基がグルタミン酸残基に置換されているか、又は前記位置にある4個全てのチロシン残基がグルタミン残基に置換されている、前記ポリペプチド。
【請求項２】
前記HMGB1ポリペプチドが、配列番号１に対して少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ/又は、配列番号３に対して少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１記載のHMGB1ポリペプチド。
【請求項３】
前記HMGB1ポリペプチドが、配列番号５〜８の少なくとも1つに対して、好ましくは配列番号６又は８に対して少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１又は２記載のHMGB1ポリペプチド。
【請求項４】
前記HMGB1ポリペプチドがヒトHMGB1ポリペプチドに由来する、請求項１〜３のいずれか１項記載のHMGB1ポリペプチド。
【請求項５】
前記HMGB1ポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれから成るポリペプチドと比較して、0.8μMの濃度において、培養SW480細胞における細胞死の増加を誘導する、請求項１〜４のいずれか１項記載のHMGB1ポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項記載のポリペプチド、請求項６記載のポリヌクレオチド、及び/又は請求項７記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項記載のポリペプチド、請求項６記載のポリヌクレオチド、請求項７記載のベクター、及び/又は請求項８記載の宿主細胞を含む、医薬組成物。
【請求項１０】
癌の治療及び/又は免疫調節のための、請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記癌の治療及び/又は免疫調節が、細胞性癌免疫療法を含む、請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記癌の治療及び/又は免疫調節が、NK細胞によるTNF-アルファの分泌を誘導することを含む、請求項１０又は１１記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記癌の治療及び/又は免疫調節が、NK細胞の成熟を誘導することである、請求項１０又は１１記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記癌の治療及び/又は免疫調節が、有害事象の誘発を回避することを含み、好ましくは、サイトカイン放出症候群(CRS)の誘発を回避することを含む、請求項１０〜１３のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１５】
収納容器中に請求項１〜５のいずれか１項記載のポリペプチド、請求項６記載のポリヌクレオチド、請求項７記載のベクター、及び/又は請求項８記載の宿主細胞を含むキット。
【請求項１６】
前記キットが、ナチュラルキラー細胞(NK細胞)及び/又はその単離のための手段をさらに含む、請求項１５記載のキット。
【請求項１７】
前記キラー細胞が腫瘍認識性NK細胞である、請求項１６記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高移動度グループボックス1(HMGB1)ポリペプチドであって、前記HMGB1ポリペプチドにおいて、ヒトHMGB1のアミノ酸位置Y109、Y144、Y155及び/又はY162に対応する位置にある少なくとも1個、好ましくは2個、より好ましくは3個、最も好ましくは4個全てのチロシン残基が、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、ホモグルタミン酸(2-アミノヘキサン二酸)、及びホモグルタミン(2,6-ジアミノ-6-オキソヘキサン酸)から独立して選択されるアミノ酸残基に置換されているポリペプチドに関する。本発明はさらに、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、並びに前記ポリペプチド、前記ポリヌクレオチド及び/又は前記ベクターを含む宿主細胞に関する。また、本発明はそれに関連する方法、キット、及び使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
高移動度グループボックス1(HMGB1)タンパク質は、核タンパク質の高移動度グループ(HMG)ファミリーに属し、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)におけるそのメンバーの異常な高移動性に基づいて命名された。これらのタンパク質は、クロマチンに付随している最も豊富に存在するタンパク質のうち、ヒストンに次ぐものであり、DNAの構造を屈曲させ、変形させ、さもなければ改変し、それにより転写因子のDNAへの結合を改変するという点で真核細胞の核において構築的な役割を果たしている。HMGタンパク質は、いくつかの種類の良性腫瘍及び自己免疫性疾患などの様々な障害の発生に関係している。更に、多量のHMGB1の放出、特にNK細胞からの放出は、樹状細胞活性化(Saidi et al. (2008), PloS one 3, e3601)及び走化性(Yang et al. (2007), Journal of leukocyte biology 81, 59-66)にとって極めて重要である。加えて、HMGB1は著しい抗菌活性を示し、細菌を速やかに死滅させる(Zetterstrom et al., (2002), Pediatric research 52, 148-154)。
【０００３】
内因性HMGB1はまた、細胞及び器官のエネルギー代謝にも複雑に関係している。HMGB1ノックアウトマウスは、肝細胞のグリコーゲン貯蔵プールを利用することができず、周産期低血糖症により死亡する。グルコースは一時的に動物を救うが、マウスは、内部器官、筋肉及び脂肪組織の重度の萎縮が原因で数日後に死亡する(Calogero et al. (1999), Nature genetics 22, 276-280)。HMGB1とのマウス筋組織のEx vivoインキュベーションは筋繊維を急速に消耗させ、またHMGB1濃度の上昇は、多発性筋炎に罹患している患者の筋繊維質で見つかっている(Grundtman et al. (2010), The FASEB journal 24, 570-578)。要約すると、HMGB1の欠乏及び過剰は両方とも細胞エネルギー代謝に著しい影響を及ぼす。
【０００４】
細胞外HMGB1は強力なサイトカインであって、マクロファージ及び免疫系の他の細胞に対する強い活性化因子であり、広範囲の炎症反応をもたらす。この理由から、HMGB1は、自己免疫性疾患、例えば全身性エリテマトーデス及び慢性関節リウマチなどに関係している。しかし、多量の血中HMGB1はまた、敗血症のような重篤な又は生命に危険を及ぼす炎症状態を示すことが分かっている。このようなHMGB1関連病理に対抗するために、HMGB1機能の阻害剤、例えば阻害抗体又はそのフラグメント、ボックスAに変異を含むHMGB1の変異体、又はボックスAドメインのポリマーコンジュゲートが開示されている(米国特許第6,468,533号、WO 02/074337、米国特許出願公開第2003/0144201号、WO 2006024547、及びWO 2008031612)。一方、HMGB1は抗がん剤として提案された(米国特許出願公開第2011/0123483 A1号、Gdynia et al. (2016), Nature Communications 7:10764. doi: 10.1038/ncomms10764)。
【０００５】
HMGB1タンパク質について、いくつかの構造モチーフ:2つのDNA結合ドメイン(ボックスA及びボックスB)、2つの核局在化配列、及びC末端酸性ドメインが開示されている。HMGB1タンパク質は、アセチル化、メチル化、ADPリボシル化、リン酸化又はグリコシル化によって広範囲に翻訳後修飾され得る。核局在化部位のアセチル化は、免疫系の活性化細胞から能動的にHMGB1タンパク質を分泌させるシグナルである。能動的分泌に加えて、HMGB1はまた、壊死細胞からも受動的に放出される。
【０００６】
がんの治療は、腫瘍組織の外科切除に加えて、本質的に、活発に分裂する細胞に有害の機能を及ぼす医薬及び/又は治療の適用に頼っている。その性質のため、こうした治療はまた、人体内の細胞分裂をしている非腫瘍細胞及び組織をも傷つけ、よく知られた深刻に心配される多くの化学療法及び放射線療法の副作用、例えば悪心、消化不全(digestive distortion)、疲労、脱毛等が誘発される。したがって、これまで知られていない作用経路を介して効果的であり、それにより化学療法及び/又は放射線療法における用量を低減することができ、副作用が緩和される新規の治療薬を手にすることが望まれている。また、がん細胞の新たな死滅経路を使用するそのような薬剤の提供は、休止状態に入ることにより化学療法に対して生存し、全ての再発及び転移の少なくとも一部に関与することが最近判明したがん幹細胞の除去にも効果的に寄与することができる。
【０００７】
近年、NK細胞ががん治療において潜在的に有用であることが見出された。NK細胞の主な利点は、それらが自然免疫系の一部であり、抗原特異的活性化を必要としないことである。NK細胞は、感受性のある標的細胞に結合し、殺傷するそれらの能力に基づいて、3つの主要なサブセット(遊離、結合性、及び殺傷性NK細胞)に分けられ得る(Jewett et al. (1996), J Clin Immunol. 16(1):46-54)。非結合性、非殺傷性NK細胞は最も未成熟であり、結合性及び殺傷性になるように活性化することができ、そして、TNF-アルファを分泌するNK細胞の能力は、NK細胞の成熟の機能的段階と相関することが見出された(Jewett et al.、上記引用文中)。
【０００８】
しかしながら、がんに対する免疫に基づく療法がより強力、より効果的、そしてより広く利用可能になるにつれて、それらの潜在的毒性の最適な管理が、ますます重要となる(Lee et al. (2014), Blood 124(2):188)。特に、サイトカイン放出症候群(CRS)は、サイトカインの循環レベルの上昇に関連した症候群であり、天然及び二重特異性抗体の投与後、さらに最近ではがんに対するT細胞療法又はNK細胞療法後に観察される、潜在的に致命的な毒性である(Lee et al.、上記引用文中)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第6,468,533号
【特許文献２】WO 02/074337
【特許文献３】米国特許出願公開第2003/0144201号
【特許文献４】WO 2006024547
【特許文献５】WO 2008031612
【特許文献６】米国特許出願公開第2011/0123483 A1号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Saidi et al. (2008), PloS one 3, e3601
【非特許文献２】Yang et al. (2007), Journal of leukocyte biology 81, 59-66
【非特許文献３】Zetterstrom et al., (2002), Pediatric research 52, 148-154)
【非特許文献４】Calogero et al. (1999), Nature genetics 22, 276-280
【非特許文献５】Grundtman et al. (2010), The FASEB journal 24, 570-578
【非特許文献６】Gdynia et al. (2016), Nature Communications 7:10764. doi: 10.1038/ncomms10764
【非特許文献７】Jewett et al. (1996), J Clin Immunol. 16(1):46-54
【非特許文献８】Lee et al. (2014), Blood 124(2):188
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、がん治療の方法の改善に対するニーズがある。この問題は、以下に本明細書において開示されるような手段及び方法によって解決される。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
よって、本発明は、高移動度グループボックス1(HMGB1)ポリペプチドであって、前記HMGB1ポリペプチドにおいて、配列番号1のアミノ酸位置22、57、68、及び75に対応する位置にある少なくとも1個、好ましくは2個、より好ましくは3個、最も好ましくは4個全てのチロシン残基が、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、ホモグルタミン酸(2-アミノヘキサン二酸)、及びホモグルタミン(2,6-ジアミノ-6-オキソヘキサン酸)から独立して選択されるアミノ酸残基に置換されている、ポリペプチドに関する。
【００１３】
下記で使用される場合、用語「有する(have)」、「含む(comprise)」又は「含む(include)」又はそれらの任意の文法的な変化形は、非排他的な方法で使用される。したがって、これらの用語は、これらの用語により導入される特徴に加えて、さらなる特徴がこの文脈において説明された実体に存在しない状況、及び1つ以上のさらなる特徴が存在する状況の両方を意味し得る。一例として、「AはBを有する」、「AはBを含む(comprise)」及び「AはBを含む(include)」という表現は、全て、Bに加えて、Aに他の要素が存在しない状況(すなわち、単独的及び排他的にBからなる状況)、並びに、Bに加えて、実体Aに1つ以上のさらなる要素、例えば要素C、要素C及び要素D又はさらなる要素が存在する状況を意味し得る。
【００１４】
更に、下記で使用される場合、用語「好ましくは」「より好ましくは」「最も好ましくは」、「特に」、「より特に」、「詳しくは」「より詳しくは」、又は同類の用語は、任意選択的な特徴と併せて使用され、さらなる可能性を限定するものではない。したがって、これらの用語によって導入される特徴は、任意選択的な特徴であり、いかなる場合も特許請求の範囲を限定することを意図するものでない。本発明は、当業者が認識するように、代替的な特徴を使用することにより実施される。同様に、「本発明の実施形態において」又は同様の表現により導入される特徴は、任意選択的な特徴であるものとし、本発明のさらなる実施形態に関するいかなる限定もなく、本発明の範囲に関するいかなる限定もなく、またこうして導入された特徴を本発明の他の任意選択的特徴又は非任意選択的特徴と組み合わせる可能性に関するいかなる限定もない。更に、別段の記載がない限り、用語「約」は表示値±20%に関する。
【００１５】
本明細書で使用される場合、用語「高移動度グループボックス1ポリペプチド」(HMGB1ポリペプチド)は、以下に特定されるような部分配列又はその誘導体を含む、特許請求の範囲に特定されるような修飾を有する、当業者に公知の高移動度グループのメンバーであるポリペプチドに関する。したがって、本発明のHMGB1ポリペプチドは、好ましくは、天然に存在するHMGB1ポリペプチドではない。また好ましくは、本発明のHMGB1ポリペプチドは、ヒトHMGB1ではなく、そしてアミノ酸Y109、Y144、Y155及び/又はY162でリン酸化されたヒトHMGB1ではない。好ましくは、本発明のHMGB1ポリペプチドは、本明細書の他の箇所で特定されるような活性、好ましくは細胞傷害活性及び/又は活性化NK細胞の活性、好ましくは本明細書の実施例で特定されるような活性を有する。好ましくは、HMGB1ポリペプチドはヒトHMGB1ポリペプチド(Genbank ACC番号:NP_002119.1 GI:4504425、配列番号3)の誘導体である。前述の活性を測定するための適切なアッセイは、付随する実施例に記載されている。HMGB1ポリペプチドは、細胞又は組織から精製されてもよく、或いは、それは化学的に合成されてもよく、又は好ましくは、組換え的に製造されてもよい。HMGB1ポリペプチドは、精製又は検出のためのタグとして働き得るさらなるアミノ酸を含んでいてもよく、且つ/又は、HMGB1ポリペプチドは、本明細書の他の箇所で特定されるような融合ポリペプチドによって含まれていてもよい。
【００１６】
したがって、本発明のポリペプチド又はペプチドの好ましい実施形態において、ポリペプチド又はペプチドは、検出可能なタグをさらに含む。用語「検出可能なタグ」は、ポリペプチド又はペプチドに付加されるか、又は導入される一連のアミノ酸を指す。好ましくは、タグはポリペプチド又はペプチドのC末端又はN末端に付加される。前記一連のアミノ酸は、例えば、タグを特異的に認識する抗体によるポリペプチド又はペプチドの検出を可能にし得るか、又はキレーターのように機能的コンフォメーションの形成を可能にし得るか、又は、蛍光タグによる可視化を可能にする。好ましいタグは、Mycタグ、FLAGタグ、6-Hisタグ、HAタグ、GSTタグ又はGFPタグである。これらのタグは全て、当技術分野においてよく知られている。
【００１７】
HMGB1ポリペプチドの好ましい実施形態は、HMGB1ポリペプチドのBボックスモチーフを含み、好ましくはヒトHMGB1のボックスBを含み、より好ましくは本明細書において特定されるような変異を有する配列番号1の誘導体を含み、より好ましくは、好ましくは本明細書において以下に特定されるような、ヒトHMGB1の変異型ボックスBを含む、ポリペプチドである。
【００１８】
本発明のHMGB1ポリペプチドにおいては、配列番号1のアミノ酸位置22、57、68、及び75に対応する位置にある少なくとも1個、好ましくは2個、より好ましくは3個、最も好ましくは4個全てのチロシン残基が、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、ホモグルタミン酸(2-アミノヘキサン二酸)、及びホモグルタミン(2,6-ジアミノ-6-オキソヘキサン酸)から独立して選択されるアミノ酸残基に置換されている。当業者によって理解されるように、前述のアミノ酸位置は、ヒトHMGB1(配列番号3)のアミノ酸Y109、Y144、Y155及びY162に対応する。好ましくは、前記HMGB1ポリペプチドにおいて、前記位置にある少なくとも1個、好ましくは2個、より好ましくは3個、最も好ましくは4個全てのチロシン残基が、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、及びアスパラギンから独立して選択されるアミノ酸残基に置換されている。より好ましくは、前記HMGB1ポリペプチドにおいて、前記位置にある少なくとも1個、好ましくは2個、より好ましくは3個、最も好ましくは4個全てのチロシン残基が、グルタミン酸残基に置換されているか、又はグルタミン残基に置換されている。さらに好ましくは、前記HMGB1ポリペプチドにおいて、前記位置にある少なくとも1個、好ましくは2個、より好ましくは3個、最も好ましくは4個全てのチロシン残基が、グルタミン残基に置換されている。したがって、好ましくは、HMGB1ポリペプチドは、好ましくは配列番号5のアミノ酸配列を含み、より好ましくは配列番号6のアミノ酸配列を含む。最も好ましくは、前記HMGB1ポリペプチドにおいて、前記位置にある少なくとも1個、好ましくは2個、より好ましくは3個、最も好ましくは4個全てのチロシン残基がグルタミン酸残基に置換されている。したがって、好ましくは、HMGB1ポリペプチドは、好ましくは配列番号7のアミノ酸配列を含み、より好ましくは配列番号8のアミノ酸配列を含む。
【００１９】
1つの実施形態では、HMGB1ポリペプチド又はその誘導体は、オリゴリン酸化HMGB1ポリペプチド、すなわち、少なくとも1個、好ましくは2個、より好ましくは3個、最も好ましくは4個全てのチロシン残基が、グルタミン、アスパラギン、又はホモグルタミン残基と置換されているHMGB1ポリペプチドである。より好ましい実施形態において、HMGB1ポリペプチド又はその誘導体は、HMGB1ポリペプチドのホスホミミック、すなわち、少なくとも1個、好ましくは2個、より好ましくは3個、最も好ましくは4個全てのチロシン残基が、グルタミン酸、アスパラギン酸、又はホモグルタミン酸残基と置換されているHMGB1ポリペプチドである。
【００２０】
好ましくは、HMGB1ポリペプチド又はその誘導体は、本明細書で上に特定されるようなHMGB1ポリペプチドである。この用語は、好ましくは、本明細書で特定されるようなHMGB1ポリペプチド又はHMGB1ポリペプチドのボックスBと少なくとも70%同一のアミノ酸配列を有し、がん細胞における、例えばSW480細胞における、細胞死の増加を誘導する活性を有するポリペプチドをさらに含む。したがって、好ましくは、HMGB1ポリペプチドは、配列番号3のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるポリペプチドと比較して、0.8μMの濃度において、培養SW480細胞における細胞死の増加を誘導する活性を有する。より好ましくは、前記HMGB1ポリペプチドは、配列番号6のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるポリペプチドと比較して、0.8μMの濃度において、培養SW480細胞における細胞死の増加を誘導する。また好ましくは、この用語は、好ましくは、本明細書で特定されるようなHMGB1ポリペプチド又はHMGB1ポリペプチドのボックスBと少なくとも70%同一のアミノ酸配列を有し、そしてNK細胞によるがん細胞の殺傷の増加を誘導する活性を有するポリペプチドをさらに含み、より好ましくは、配列番号3のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるポリペプチドと比較して、0.8μMの濃度において、NK-92 CI細胞による培養SW480細胞の殺傷の増加を誘導し、より好ましくは、配列番号6のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるポリペプチドと比較して、0.8μMの濃度において、NK-92 CI細胞による培養SW480細胞の殺傷の増加を誘導する。また好ましくは、この用語は、好ましくは、本明細書で特定されるようなHMGB1ポリペプチド又はHMGB1ポリペプチドのボックスBと少なくとも70%同一のアミノ酸配列を有し、NK細胞の成熟を誘導する活性を有するポリペプチドをさらに含み、好ましくは、配列番号3のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるポリペプチドと比較して、0.8μMの濃度において、培養NK-92 CI細胞による腫瘍壊死因子アルファ(TNF-アルファ)の分泌を増加させる。より好ましくは、前記HMGB1ポリペプチドは、配列番号6のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるポリペプチドと比較して、0.8μMの濃度において、培養NK-92 CI細胞による腫瘍壊死因子アルファ(TNF-アルファ)の分泌を増加させる。
【００２１】
用語「TNF-アルファ」又は「腫瘍壊死因子アルファ」は、全身性の炎症、特に急性期反応に関与するサイトカインとして当業者に知られている。好ましくは、TNF-アルファはヒトTNF-アルファである。
【００２２】
好ましくは、HMGB1ポリペプチドは、配列番号1に対して少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは95%、最も好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有する核酸配列を含み、且つ/又は、配列番号3に対して少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは95%、最も好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有する核酸配列を含み、そして、より好ましくは、上記活性のうちの少なくとも1つ、より好ましくは少なくとも2つ、最も好ましくは3つ全てを有する。より好ましくは、HMGB1ポリペプチドは、配列番号5〜8に対して、好ましくは配列番号6又は8に対して少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは95%、最も好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有する核酸配列を含み、そして、より好ましくは、上記活性のうちの少なくとも1つ、より好ましくは少なくとも2つ、最も好ましくは3つ全てを有する。
【００２３】
本明細書で使用される「HMGB1ポリペプチドを提供する薬剤」という用語は、本明細書で特定されるようなHMGB1ポリペプチドを生物学的系に提供又は放出する能力を有する任意の薬剤又は組成物に関する。好ましくは、HMGB1ポリペプチドを提供する薬剤は、1nM〜5μM、より好ましくは10nM〜1μM、最も好ましくは50nM〜900nMの血漿濃度を誘導する用量で使用される。好ましくは、この用語はまた、HMGB1ポリペプチドを含む腫瘍細胞に特異的に結合する薬剤にも関する。好ましくは、腫瘍細胞に特異的に結合する前記薬剤は、抗体、アプタマー、レクチン等である。また好ましくは、HMGB1ポリペプチドを提供する薬剤という用語は、HMGB1ポリペプチドを分泌するように誘導されたHMGB1分泌細胞に関する。HMGB1を分泌するように誘導され得る細胞及びそのようにするための方法は、当技術分野において公知であり、好ましくは、実施例に示されるような方法を含む。HMGB1を分泌するように誘導され得る好ましい細胞は、マクロファージ及びNK細胞である。また好ましくは、HMGB1ポリペプチドを提供する薬剤という用語は、HMGB1ポリペプチドをコードする発現可能なポリヌクレオチドに関する。当業者によって理解されるように、前記ポリヌクレオチドは、好ましくは、本明細書で以下に特定されるように、ベクター又は宿主細胞中に含まれる。
【００２４】
用語「誘導体」は、本発明の化学化合物の文脈において使用される場合、本発明の前記化学化合物に関連する構造を有する化学分子に関する。好ましくは、誘導体は、3つ以下、より好ましく2つ以下、最も好ましくは1つ以下の化学誘導体化反応により本発明の化学化合物から製造することができる。好ましくは、誘導体は、哺乳動物、好ましくはヒト体内で本発明の化学化合物に代謝される化合物である。また好ましくは、誘導体は、本発明の化学化合物から加水分解によって得ることができる化合物である。化学化合物がペプチド又はポリペプチドである場合、誘導体は、好ましくは、それが由来する化合物に本明細書の下記で指定した類似度を少なくとも有する化合物である。本明細書で使用される場合、本明細書の下記で指定した高移動度グループボックス1(HMGB1)ポリペプチドの誘導体は、本明細書の上記で特定したがん細胞を阻害する活性を少なくとも有する。
【００２５】
好ましくは、ポリペプチド又はペプチドに関係する用語「誘導体」は、前記ポリペプチド又はペプチドのアミノ酸配列の変異体を含み、前記変異体は、ポリペプチド又はペプチドのアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を有しており、また前記変異体は、本明細書で特定されているポリペプチド又はペプチドの機能を保持している。同一性パーセント値は、好ましくは、アミノ酸配列領域全体にわたって計算される。異なる配列を比較するための様々なアルゴリズムに基づいた一連のプログラムを当業者は利用することができる。この文脈において、Needleman及びWunsch又はSmith及びWatermanのアルゴリズムにより信頼性の高い結果が得られる。配列アラインメントを実施するには、GCGソフトウェアパケット(Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991))の一部である、プログラムPileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153)、又はプログラムGap and BestFit (Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970))、及びSmith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981))を使用する。上記においてパーセント(%)で列挙した配列同一性値は、好ましくは、以下の設定:ギャップウェイト:50、レングスウェイト:3、アベレージマッチ:10.000、及びアベレージミスマッチ:0.000で、配列領域全体に対してプログラムGAPを使用して決定される。
【００２６】
更に、ポリペプチド又はペプチドの誘導体は、特定のポリペプチド又はペプチドのオーソログ、パラログ又は他のホモログを表し得る前述の特定のアミノ酸配列の変異体を更に包含する。変異体は、好ましくは、配列が少なくとも1つのアミノ酸の置換及び/又は付加及び/又は欠失によって上述したポリペプチド又はペプチドの前述の配列から誘導され得ることを特徴とするアミノ酸配列を含む。
【００２７】
用語「誘導体」はまた、化学的に修飾されたポリペプチドを含み、例えば、修飾アミノ酸を含有するポリペプチド、又は、例えば、ビオチン化された、若しくはフルオロフォア、例えばフルオレセイン、又はCy 3に結合されたポリペプチド、例えばジスルフィド結合若しくはステープリングする(stapling)ことによって(Walensky 2004, Science 305(5689): 1466-1470)構造的に制限されたペプチド、又は細胞透過ポリペプチド若しくはタンパク質形質導入ドメイン(Snyder 2004, Pharm Res 21(3): 389-393)に連結されたポリペプチドを含む。そのような修飾は、ポリペプチドの生物学的特性、例えば、細胞透過性、結合性、安定性を改善し得るか、又は検出標識として使用することができる。
【００２８】
好ましくは、HMGB1ポリペプチドは、薬学的に適合性のある調製物として提供される。用語「薬学的に適合性のある調製物」及び「医薬組成物」は、本明細書で使用される場合、少なくとも1つの本発明の化合物、及び任意選択により1つ以上の薬学的に許容される担体を含む組成物に関する。本発明の化合物は、薬学的に許容される塩として製剤化することができる。好ましい許容される塩は、酢酸塩、メチルエステル、HCl、硫酸塩、塩化物等である。医薬組成物は、好ましくは局所的に投与され、より好ましくは全身投与される。薬物投与に通常使用される適切な投与経路は、経口投与、静脈内投与、非経口投与、並びに吸入である。しかし、化合物の性質及び作用機序に応じて、医薬組成物は、他の経路によって同様に投与され得る。更に、化合物は、通常の医薬組成物中で、又は本明細書の別の箇所で指定した個別の医薬組成物として、他の薬剤と組み合わせて投与することができ、前記個別の医薬組成物はパーツのキット形態で提供することができる。
【００２９】
化合物は、好ましくは、従来の手順に従って、標準の医薬担体と薬剤とを組み合わせることによって調製された従来の剤形で投与される。これらの手順は、所望の調製物に適切な成分を混合、造粒、圧縮又は溶解することを含み得る。薬学的に許容される担体又は希釈剤の形態及び特性は、それが組み合わせられる有効成分の量、投与経路及び他の周知の変動要因によって決定されることは理解されよう。
【００３０】
担体は、製剤の他の成分と適合性があり、その受容者に有害でないという意味において許容されなければならない。使用される医薬担体は、例えば、固体、ゲル又は液体であり得る。固体担体の例は、ラクトース、白土、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸等である。液体担体の例は、リン酸緩衝生理食塩水、シロップ、落花生油及びオリーブ油等の油、水、乳剤、様々なタイプの湿潤剤、滅菌溶液等である。同様に、担体又は希釈剤は、当技術分野で周知の時間遅延材料、例えば、グリセリルモノステアレート又はグリセリルジステアレート等を単独で、又はワックスと共に含んでいてもよい。前記適切な担体は、上記のもの及び当技術分野で周知のものを含むが、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvaniaを参照されたい。
【００３１】
希釈剤は、1つ以上の化合物の生物活性に影響を及ぼさないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、生理的塩類、リンガー液、デキストロース溶液及びハンクス溶液である。更に、医薬組成物又は製剤はまた、他の担体、アジュバント、又は非毒性、非治療的、非免疫原性の安定剤等を含んでいてもよい。
【００３２】
治療上有効量は、本明細書で言及されている疾患又は症状に伴う徴候を予防、改善又は治療する、本発明の医薬組成物中で使用される化合物の量を意味する。そのような化合物の治療有効性及び毒性は、細胞培養又は実験動物における標準の製薬手順、例えばED50(集団の50%で治療上有効な用量)及びLD50(集団の50%に対する致死用量)によって決定することができる。治療効果と毒性作用との間の用量比は治療指数であり、LD50/ED50の比率として表すことができる。
【００３３】
投与計画は、主治医及び他の臨床学的要因によって、好ましくは上記の方法のいずれか1つに従って決定される。医学分野において周知であるように、任意のある患者のための投与量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間及び経路、一般的な健康状態、並びに同時に投与される他の薬剤を含めた、多くの要因に依存する。経過は、定期的評価によってモニターすることができる。典型的な用量は、例えば、1〜1000μgの範囲であり得る。しかし、この例示範囲の下方又は上方の用量が特に前述の要因を考慮して予測される。一般に、医薬組成物の規則的投与としての投与計画は、1日当たり1μg〜10mg単位の範囲内であるものとする。投与計画が持続注入である場合はまた、毎分体重1キログラム当たり1μg〜10mg単位の範囲にそれぞれあるものとする。経過は、定期的評価によってモニターすることができる。本発明の化合物の好ましい用量及び濃度は、本明細書の他の箇所で特定されている。
【００３４】
本明細書で言及されている医薬組成物及び製剤は、好ましくは、本明細書で挙げた疾患又は症状を治療又は改善又は予防するために少なくとも1回投与される。しかし、前記医薬組成物は、1回以上、例えば、毎日1〜4回を非限定的な日数まで投与することができる。
【００３５】
特定の医薬組成物は、製薬分野において周知の方法で調製され、本明細書の上記で言及した少なくとも1つの活性化合物を、混合物中で、又は薬学的に許容される担体若しくは希釈剤と組み合わせて含む。これらの特定の医薬組成物の製造については、活性化合物(複数可)は、通常、担体若しくは希釈剤と混合されるか、又は、カプセル、サッシェ、カシェ、ペーパー若しくは他の適切な容器若しくはビヒクルに封入若しくはカプセル化される。得られた製剤は投与様式、すなわち錠剤、カプセル剤、坐剤、溶液、懸濁液等の形態での投与に適合させることになる。推奨投与量は、考慮された受容者に応じて投与量の調整を推測するために、処方者又は使用者の指示書に表示されるものとする。
【００３６】
有利なことに、本発明の根底にある研究において、本発明の変異HMGB1ポリペプチドが、野生型HMGB1と比べて増加した活性を有すること、Glu-HMGB1がGln-HMGB1よりもなお活性であることが見出された。さらに、HMGB1の異なる変異体を用いることによって、がん細胞に対する細胞毒性の、及び免疫系の活性化のレベルが、必要に応じて調整され得ることが見出された。
【００３７】
上述した定義は、下記に必要な変更を加えて適用する。下記で更に述べた追加の定義及び説明はまた、本明細書に記載した全ての実施形態についても同様に準用される。
【００３８】
本発明はまた、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
【００３９】
用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、上述の生物活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含み、好ましくは配列番号5及び/又は8のアミノ酸配列を含むポリペプチド又は本明細書の上記で特定されているようなその誘導体をコードしているポリヌクレオチドである。上記で詳述されているアミノ酸配列を有するポリペプチドは、縮重遺伝子コードに起因して、2種以上のポリヌクレオチドによってコードされ得ることを理解されたい。更に、本発明に従って使用される場合の用語「ポリヌクレオチド」は、前述の特定のポリヌクレオチドの変異体を更に包含する。前記変異体は、本発明のポリヌクレオチドのオルソログ、パラログ又は他のホモログを示し得る。ポリヌクレオチド変異体は、好ましくは、配列が少なくとも1つのヌクレオチド置換、付加及び/又は欠失によって前述の特定の核酸配列から誘導され、変異体核酸配列が上記で特定したような変異及び活性を有するポリペプチドをなおもコードし得ることを特徴とする核酸配列を含む。変異体はまた、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、前述の特定の核酸配列にハイブリダイズすることが可能な核酸配列を含むポリヌクレオチドを包含する。これらのストリンジェントな条件は当業者には公知であり、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6で確認することができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に関する好ましい例は、約45℃での6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(=SSC)中のハイブリダイゼーション条件、続いて0.2×SSC、0.1% SDS、50〜65℃での1回以上の洗浄ステップである。これらのハイブリダイゼーション条件は、核酸の種類に応じて、例えば、有機溶媒が存在する場合、緩衝液の温度及び濃度に関して異なることは、当業者には理解される。例えば、「標準ハイブリダイゼーション条件」下では、温度は、核酸の種類に応じて、0.1〜5×SSC(pH7.2)の濃度を有する水性緩衝液中42℃から58℃の間で異なる。有機溶媒が上述の緩衝液、例えば50%ホルムアミド中に存在する場合、標準条件下の温度は約42℃である。DNA:DNAハイブリッドのハイブリダイゼーション条件は、好ましくは、例えば0.1×SSC及び20℃〜45℃、好ましくは30℃から45℃の間である。DNA:RNAハイブリッドのハイブリダイゼーション条件は、好ましくは、例えば0.1×SSC及び30℃〜55℃、好ましくは45℃から55℃の間である。上述のハイブリダイゼーション温度は、例えば、長さが約100bp(=塩基対)であり、ホルムアミドの非存在下で50%のG+C含有量を有する核酸について決定される。当業者は、教科書、例えば上記で言及した教科書等を参照することにより、必要とされるハイブリダイゼーション条件をどのように決定するかが分かる。
【００４０】
或いは、ポリヌクレオチド変異体は、PCRに基づく技術、例えば、DNAの混合オリゴヌクレオチドプライマーに基づく増幅により、すなわち本発明のポリペプチドの保存ドメインに対する縮重プライマーを使用して得ることができる。本発明のポリペプチドの保存ドメインは、ポリヌクレオチドの核酸配列、又は上記で特定されているようなポリペプチドのアミノ酸配列の配列比較により同定することができる。適切なPCR条件は、当技術分野において周知である。鋳型として、AAV由来のDNA又はcDNAを使用することができる。更に変異体は、上記で詳述した核酸配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%又は少なくとも99%同一である核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む。同一性パーセント値は、好ましくは、上述したように計算される。
【００４１】
前述の核酸配列のいずれかの断片を含むポリヌクレオチドも、本発明のポリヌクレオチドとして包含される。断片は、上記で特定されているような生物活性を依然として有するポリペプチドをコードするものとする。したがって、ポリペプチドは、前記生物活性を付与する本発明のポリペプチドのドメインを含み得るか、又はそれからなり得る。本明細書で意味する場合の断片は、好ましくは、前述の核酸配列のいずれか1つの少なくとも50、少なくとも100、少なくとも250又は少なくとも500個の連続するヌクレオチドを含むか、又は前述のアミノ酸配列のいずれか1つの少なくとも20、少なくとも30、少なくとも50、少なくとも80、少なくとも100又は少なくとも150個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする。
【００４２】
本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、単離されたポリヌクレオチド(すなわち、その天然の文脈から単離されたもの)として、又は遺伝子的に修飾された形態でのいずれかで提供されるものとする。ポリヌクレオチドは、好ましくは、cDNAを含むDNA又はRNAである。この用語は、一本鎖ポリヌクレオチド、並びに二本鎖ポリヌクレオチドを包含する。更に、天然に存在する修飾ポリヌクレオチドを含む化学的に修飾されたポリヌクレオチド、例えばグリコシル化ポリヌクレオチド若しくはメチル化ポリヌクレオチド、又は人工修飾されたもの、例えばビオチン化ポリヌクレオチドも含まれる。
【００４３】
本発明のポリヌクレオチドは、上記核酸配列から本質的になるか、或いは上記核酸配列を含む。したがって、それらは更なる核酸配列を同様に含み得る。具体的には、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターにも関する。
【００４４】
本発明はさらに、本発明に係るポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００４５】
用語「ベクター」は、好ましくは、ファージ、プラスミド、ウイルス又はレトロウイルスベクター、並びに人工染色体、例えば、細菌又は酵母人工染色体を包含する。より好ましくは、この用語は、ウイルス由来のベクター、好ましくは腫瘍細胞に優先的に感染するウイルス(腫瘍指向性ウイルス)、又はがん細胞を優先的に溶解するウイルス(腫瘍溶解性ウイルス)に由来のベクターに関する。更にこの用語はまた、ターゲティング構築物のゲノムDNAへのランダム又は部位特異的組込みを可能にするターゲティング構築物に関する。そのようなターゲティング構築物は、好ましくは、相同組換え又は異種組換えのいずれかにとって十分な長さのDNAを含む。本発明のポリヌクレオチドを包含するベクターは、好ましくは、宿主における増殖及び/又は選択のための選択マーカーを更に含む。ベクターは、当技術分野において周知の様々な技術により宿主細胞に組み込まれ得る。例えば、プラスミドベクターは、沈澱物、例えば、リン酸カルシウム沈澱物若しくは塩化ルビジウム沈澱物に、又は帯電した脂質との複合体に、又は炭素系クラスター、例えばフラーレンに導入することができる。或いは、プラスミドベクターは、熱ショック又はエレクトロポレーションの技術により導入され得る。ベクターがウイルスであるならば、宿主細胞への適用前に、適切なパッケージング細胞株を使用してin vitroでパッケージングしてもよい。ウイルスベクターは、複製コンピテント又は複製欠損であってもよい。
【００４６】
好ましくは、本発明のベクターにおいて、本発明のポリヌクレオチドは、原核細胞若しくは真核細胞、又は単離されたその画分における発現を可能にする発現調節配列に作動的に連結される。前記ポリヌクレオチドの発現は、好ましくは翻訳可能なmRNAへの、ポリヌクレオチドの転写を含む。真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞における発現を確実にする調節エレメントは、当技術分野において周知である。それらは、好ましくは、転写の開始を確実にする調節配列を含み、任意選択で、転写の終止及び転写物の安定化を確実にするポリ-Aシグナルを含む。追加の調節エレメントとしては、転写エンハンサー、並びに翻訳エンハンサーを挙げることができる。原核宿主細胞における発現を許可する可能性のある調節エレメントは、例えば、大腸菌(E.coli)におけるlac、trp又はtacプロモーターを含み、また真核宿主細胞における発現を許可する調節エレメントの例は、酵母におけるAOX1又はGAL1プロモーター、又はCMV-、SV40-、RSV-プロモーター(ラウス肉腫ウイルス)、CMV-エンハンサー、SV40-エンハンサー又は哺乳動物及び他の動物細胞におけるグロビンイントロンである。更に、誘導性発現調節配列は、本発明に包含される発現ベクターにおいて使用され得る。そのような誘導性ベクターは、好ましくは、tet若しくはlacオペレーター配列、又は熱ショック若しくは他の環境因子によって誘導され得る配列を含み得る。適切な発現調節配列は、当技術分野において周知である。転写開始を担うエレメントに加えて、そのような調節エレメントはまた、ポリヌクレオチドの下流にある、転写終結シグナル、例えば、SV40-poly-A部位又はtk-poly-A部位を含み得る。この文脈において、適切な発現ベクターは当技術分野において公知であり、例えば、Okayama-Berg cDNA発現ベクターpcDV1(Pharmacia社)、pBluescript(Stratagene社)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(InVitrogene社)又はpSPORT1(GIBCO BRL社)等である。ウイルス由来の発現ベクター、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス又はウシパピローマウィルスは、本発明のポリヌクレオチド又はベクターを標的細胞集団に送達するのに使用することができる。当業者に周知の方法を使用して組換えウイルスベクターを構築することができる。例えば、Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.、及びAusubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994)に記載されている技術を参照されたい。
【００４７】
本発明はさらに、本発明に係るポリペプチド、ポリヌクレオチド及び/又はベクターを含む宿主細胞に関する。
【００４８】
用語「宿主細胞」は、好ましくは、対象に投与することに適合性のある細胞に関する。より好ましくは、前記細胞は、対象と免疫学的に適合性である。最も好ましくは、細胞は、前記対象から得られた細胞である。本発明の宿主細胞は、好ましくは、がん細胞の近傍に移動する傾向のある細胞である。より好ましくは、宿主細胞は免疫細胞であり、最も好ましくは、腫瘍特異抗原を特異的に認識する免疫系細胞、例えば、腫瘍抗原特異的T細胞である。
【００４９】
さらに、本発明のポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞は、好ましくは本発明のHMGB1ポリペプチドを産生することができる細胞、例えば、細菌、酵母、昆虫、又は哺乳動物細胞である。
【００５０】
本発明はさらに、医薬としての使用のための、本発明に係るポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、及び/又は宿主細胞に関する。
【００５１】
また、本発明は、がんの治療及び/又は免疫調節における使用のための、本発明に係るポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、及び/又は宿主細胞に関する。
【００５２】
用語「がん」とは、本明細書で使用される場合、体細胞群による不適切及び/又は制御不能な増殖を特徴とする動物、好ましくはヒトの疾患を意味する。この制御不能な増殖は、周囲組織への浸潤及び破壊、またおそらくは、身体の他の部位への不適切な増殖細胞の拡散を伴い得る。したがって、好ましくは、本発明に係るポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、及び/又は宿主細胞は、がんの治療における使用のためのものである。
【００５３】
好ましくは、がんは、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄白血病、副腎皮質がん、エイズ関連リンパ腫、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、非定型奇形腫、基底細胞がん、胆管がん、膀胱がん、脳幹グリオーマ、乳がん、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、小脳星状細胞腫、子宮頸がん、脊索腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸がん、結腸直腸がん、頭蓋咽頭腫、子宮内膜がん、上衣芽細胞腫、脳室上衣腫、食道がん、頭蓋外胚細胞腫、性腺外胚細胞腫、肝臓外胆管がん、胆嚢がん、胃がん、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛性腫瘍、有毛細胞白血病、頭頸部がん、肝細胞がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、視床下部視神経膠腫、眼内メラノーマ、カポジ肉腫、喉頭がん、髄芽細胞腫、髄様上皮腫、メラノーマ、メルケル細胞がん、中皮腫、口腔がん、多発性内分泌腺腫症候群、多発性骨髄腫、菌状息肉腫、鼻腔及び副鼻腔がん、鼻咽腔がん、神経芽細胞腫、神経内分泌腫瘍(NET)/がん、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、口腔がん、口腔咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、卵巣上皮がん、卵巣胚細胞腫、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓がん、乳頭腫症、副鼻腔及び鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、クロム親和細胞腫、下垂体部腫瘍、胸膜肺芽腫、中枢神経系原発リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、セザリー症候群、小細胞肺がん、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平上皮がん、扁平上皮頚部がん、睾丸がん、喉頭がん、胸腺がん、胸腺腫、甲状腺がん、尿道がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、及びウィルムス腫瘍からなるリストから選択される。
【００５４】
より好ましくは、がんは、白血病、リンパ腫、HPV関連がん、結腸直腸がん、胃がん、膵臓がん、肺がん、脳がん又は乳がんである。好ましい結腸直腸がんは、結腸がんである。更により好ましくは、がんは白血病であり、最も好ましくは慢性リンパ性白血病(CLL)である。
【００５５】
「がん療法」という用語は、がんの治療に適していると当業者に知られている全ての手段及び方法を含む。好ましくは、この用語は、ヒトにおけるがん治療のために承認された療法に関する。「細胞性がん免疫療法」という用語は、好ましくは、細胞、好ましくは自己の細胞、例えば好ましくは、B細胞、T細胞、及び/若しくはNK細胞、又はそれらの前駆細胞、例えば造血幹細胞の対象への投与を含むがん治療の方法に関する。好ましくは、投与される前記細胞は、NK細胞又はその前駆細胞である。より好ましくは、前記細胞は、腫瘍認識性NK細胞又はその前駆細胞である。さらに好ましくは、前記細胞は、腫瘍認識性NK細胞であり、最も好ましくは、自己の腫瘍認識性NK細胞である。
【００５６】
好ましくは、がんの治療及び免疫調節は、細胞性がん免疫療法を含む。また好ましくは、がんの治療及び/又は免疫調節は、NK細胞によるTNF-アルファの分泌を誘導することを含み、好ましくは、NK細胞の成熟を誘導することである。また好ましくは、がんの治療及び/又は免疫調節は、有害事象の誘発を回避することを含み、より好ましくは、サイトカイン放出症候群(CRS)の誘発を回避することを含む。
【００５７】
「ナチュラルキラー細胞」及び「NK細胞」という用語は、自然免疫系の一部であり、そしてNKG2D、NKp44、NKp46、NKp30、及びその他を含む受容体によって、典型的に腫瘍細胞上に発現されているULBP及びMICAを含む多数のリガンドを認識する細胞傷害性リンパ球に関することが当業者に知られている。「NK細胞の成熟」という用語は、当業者によって理解されている。好ましくは、NK細胞の成熟は、NK細胞の全画分中における、腫瘍細胞に結合する、及び/又はそれを殺傷するNK細胞の画分の増加である。
【００５８】
HMGB1治療及び細胞性免疫療法に関連する「有害事象」、並びにそのマーカー及び症状及び適切な治療は、当業者に知られている(例えば、Tey, S-K (2014), Clinical and Translational Immunology 3, e17; doi:10.1038/cti.2014.11に概説されている)。有害事象は、好ましくは、神経毒性(例えば、聴力損失、発作、又は昏睡を引き起こす)、白斑、大腸炎、肝酵素上昇、急性肺浸潤、B細胞枯渇、低ガンマグロブリン血症、及びサイトカイン放出症候群を含む。「サイトカイン放出症候群」という用語並びにその症状及びマーカーは、例えばLee et al.から当業者には公知である(上記引用文献中)。好ましくは、CRSの優勢な、又はそれを妨げるためのマーカーは、C反応性タンパク質、IL-6、及び/又はTNF-アルファであり、このマーカーは、好ましくはTNF-アルファである。
【００５９】
さらに、本発明は、対象におけるがんを治療する方法及び/又は免疫調節を誘導する方法であって、
a)前記対象に、実施形態1〜18のいずれか1つに記載のポリペプチド、実施形態19に記載のポリヌクレオチド、実施形態20に記載のベクター、及び/又は実施形態21に記載の宿主細胞を接触させる工程、並びに、それにより
b)前記対象におけるがんを治療する及び/又は免疫調節を誘導する工程
を含む方法に関する。
【００６０】
本発明の方法は、好ましくは、インビボの方法である。さらに、それらは上に明示的に述べられたものに加えた工程を含んでいてもよい。例えば、がんを治療する方法及び/又は免疫調節を誘導する方法のさらなる工程は、例えば、前記薬学的に活性な化合物の投与の前又は後に、腫瘍組織を外科的に除去することに関し得る。好ましくは、方法は、示された順序で実施される工程により実施される。さらに、1つ以上の前記工程は、自動化された装置によって実施されてもよい。
【００６１】
本明細書で使用される「対象」という用語は、動物、好ましくは家畜又はコンパニオンアニマル、より好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトに関する。好ましくは、対象はがんに罹患している対象であり、より好ましくは、上に特定される通りである。
【００６２】
用語「治療する」とは、本明細書で言及された疾患又は障害又はそれに伴う症状を有意な程度改善することを意味する。また本明細書で使用される場合の前記治療するには、好ましくは、本明細書で言及された疾患又は障害に関した健康の完全回復も含む。本発明に従って使用される場合の治療は、治療される全ての対象において有効でない場合があることを理解されたい。しかし、この用語は、好ましくは、本明細書で言及された疾患又は障害に罹患している対象の統計学的に有意な部分が成功裏に治療され得ることを必要とする。ある部分が統計的に有意であるかどうかは、様々な周知の統計用評価ツール、例えば、信頼区間の決定、p値決定、スチューデントt検定、マンホイットニー検定を使用し、それ以上作業することなく当業者によって決定され得る。好ましい信頼区間は、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%である。p値は、好ましくは、0.1、0.05、0.01、0.005、又は0.0001である。好ましくは、治療は、所定のコホート又は集団の対象の少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%又は少なくとも90%に有効であるものとする。
【００６３】
本明細書で使用される「免疫調節」という用語は、対象の免疫系が抗原に反応する程度の変化を誘導することに関する。好ましくは、免疫調節は活性化である。好ましくは、抗原は腫瘍抗原、より好ましくは腫瘍特異的抗原、すなわち、好ましくは対象の腫瘍細胞によってのみ発現及び/又は提示される抗原である。より好ましくは、対象の免疫応答を調節することは、NK細胞によるTNF-アルファ分泌を誘導すること、最も好ましくは、上に特定されるようにNK細胞の成熟を誘導することである。
【００６４】
本発明はさらに、有害事象の誘発を回避する、好ましくはサイトカイン放出症候群(CRS)の誘発を回避する、HMGB1治療を対象に提供する方法であって、
a)HMGB1を提供する薬剤を前記対象に投与する工程、
b)前記患者の試料中の有害事象、好ましくはCRSの少なくとも1つのパラメーターを決定する工程、
c)HMGB1を提供する代替的な薬剤と共にHMGB1を提供する薬剤の投与を継続する工程であって、
HMGB1を提供する前記代替的な薬剤は、工程b)において決定された前記パラメーターが有害事象、好ましくはCRSの確率の増加を示す場合には、TNF-アルファの分泌の誘導における活性が低下した、及び/又はNK細胞による細胞の殺傷の誘導における活性が低下したHMGB1ポリペプチドを提供し、且つ/又は
HMGB1を提供する前記代替的な薬剤は、工程b)において決定された前記パラメーターが有害事象、好ましくはCRSの低い確率を示す場合には、TNF-アルファの分泌の誘導における活性が増加した、及び/又はNK細胞による細胞の殺傷の誘導における活性が低下したHMGB1ポリペプチドを提供する、工程、
d)それによって、有害事象を回避する、好ましくはCRSの誘発を回避する、HMGB1治療を対象に提供する工程
を含む方法に関する。
【００６５】
好ましくは、TNF-アルファの分泌の誘導における活性が低下した、及び/又はNK細胞による細胞の殺傷の誘導における活性が低下したHMGB1ポリペプチドは、実施形態5のHMGB1ポリペプチド、好ましくは配列番号5又は6のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また好ましくは、TNF-アルファの分泌の誘導における活性が増加した、及び/又はNK細胞による細胞の殺傷の誘導における活性が増加したHMGB1ポリペプチドは、実施形態4のHMGB1ポリペプチド、好ましくは配列番号7又は8のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。好ましくは、CRSのパラメーターは、TNF-アルファの濃度である。
【００６６】
さらに、本発明は、対象の免疫応答を調節する方法であって、
a)HMGB1ポリペプチドを提供する薬剤を前記対象に投与する工程であって、前記HMGB1ポリペプチドは本発明に係るポリペプチドである、工程、及び、それにより
b)前記対象の免疫応答を調節する工程
を含む方法に関する。
【００６７】
好ましくは、前記対象の免疫応答を調節することは、NK細胞によるTNF-アルファの分泌を誘導すること、好ましくは、NK細胞の成熟を、好ましくは本明細書で上に特定されるように誘導することである。
【００６８】
また、本発明は、収納容器中に本発明に係るポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、及び/又は宿主細胞を含むキットに関する。
【００６９】
本明細書で使用される「キット」という用語は、別々に又は組み合わせて、好ましくは単一の容器内に提供される、少なくとも前述の手段を含む集合物を指す。容器はまた、好ましくは、本発明の方法を実施するための説明書をさらに含む。キットの構成要素は、好ましくは、例えば濃度が適宜調整されているなど、「すぐに使える」様式で提供される。好ましくは、ナチュラルキラー細胞(NK細胞)及び/又はその単離のための手段をさらに含む。NK細胞の単離のための手段は、NK細胞の単離における特定の使用のための手段であり、特にNK細胞に特異的に結合する抗体を含む。
【００７０】
上記を考慮すると、以下の実施形態が好ましい:
【００７１】
1.  高移動度グループボックス1(HMGB1)ポリペプチドであって、前記HMGB1ポリペプチドにおいて、配列番号1のアミノ酸位置22、57、68、及び75に対応する位置にある少なくとも1個、好ましくは2個、より好ましくは3個、最も好ましくは4個全てのチロシン残基が、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、ホモグルタミン酸(2-アミノヘキサン二酸)、及びホモグルタミン(2,6-ジアミノ-6-オキソヘキサン酸)から独立して選択されるアミノ酸残基に置換されている、ポリペプチド。
【００７２】
2.  前記HMGB1ポリペプチドにおいて、前記位置にある少なくとも1個、好ましくは2個、より好ましくは3個、最も好ましくは4個全てのチロシン残基が、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、及びアスパラギンから独立して選択されるアミノ酸残基に置換されている、実施形態1のHMGB1ポリペプチド。
【００７３】
3.  前記HMGB1ポリペプチドにおいて、前記位置にある少なくとも1個、好ましくは2個、より好ましくは3個、最も好ましくは4個全てのチロシン残基が、グルタミン酸残基に置換されているか、又はグルタミン残基に置換されている、実施形態1又は2のHMGB1ポリペプチド。
【００７４】
4.  前記HMGB1ポリペプチドにおいて、前記位置にある少なくとも1個、好ましくは2個、より好ましくは3個、最も好ましくは4個全てのチロシン残基が、グルタミン酸残基に置換されている、実施形態1〜3のいずれか1つのHMGB1ポリペプチド。
【００７５】
5.  前記HMGB1ポリペプチドにおいて、前記位置にある少なくとも1個、好ましくは2個、より好ましくは3個、最も好ましくは4個全てのチロシン残基が、グルタミン残基に置換されている、実施形態1〜4のいずれか1つのHMGB1ポリペプチド。
【００７６】
6.  前記HMGB1ポリペプチドが、配列番号1に対して少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは95%、最も好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有する核酸配列を含み、且つ/又は配列番号3に対して少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは95%、最も好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有する核酸配列を含む、実施形態1〜5のいずれか1つのHMGB1ポリペプチド。
【００７７】
7.  前記HMGB1ポリペプチドが、配列番号5〜8に対して、好ましくは配列番号6又は8に対して少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは95%、最も好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有する核酸配列を含み、好ましくは、配列番号5〜8、好ましくは配列番号6又は8の核酸配列を含む、実施形態1〜6のいずれか1つのHMGB1ポリペプチド。
【００７８】
8.  前記HMGB1ポリペプチドがヒトHMGB1ポリペプチドに由来する、実施形態1〜7のいずれか1つのHMGB1ポリペプチド。
【００７９】
9.  前記HMGB1ポリペプチドが天然に存在しない、実施形態1〜8のいずれか1つのHMGB1ポリペプチド。
【００８０】
10.  前記HMGB1ポリペプチドが、配列番号3のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるポリペプチドと比較して、0.8μMの濃度において、培養SW480細胞における細胞死の増加を誘導する、実施形態1〜9のいずれか1つのHMGB1ポリペプチド。
【００８１】
11.  前記HMGB1ポリペプチドが、配列番号6のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるポリペプチドと比較して、0.8μMの濃度において、培養SW480細胞における細胞死の増加を誘導する、実施形態1〜10のいずれか1つのHMGB1ポリペプチド。
【００８２】
12.  前記細胞死が、少なくとも10%、好ましくは少なくとも20%、より好ましくは少なくとも30%、より好ましくは少なくとも40%増加する、実施形態1〜11のいずれか1つのHMGB1ポリペプチド。
【００８３】
13.  前記HMGB1ポリペプチドが、配列番号3のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるポリペプチドと比較して、0.8μMの濃度において、NK-92 CI細胞による培養SW480細胞の殺傷の増加を誘導する、実施形態1〜12のいずれか1つのHMGB1ポリペプチド。
【００８４】
14.  前記HMGB1ポリペプチドが、配列番号6のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるポリペプチドと比較して、0.8μMの濃度において、NK-92 CI細胞による培養SW480細胞の殺傷の増加を誘導する、実施形態1〜13のいずれか1つのHMGB1ポリペプチド。
【００８５】
15.  前記殺傷が、少なくとも5%、好ましくは少なくとも10%、より好ましくは少なくとも15%、最も好ましくは少なくとも20%増加する、実施形態1〜14のいずれか1つのHMGB1ポリペプチド。
【００８６】
16.  前記HMGB1ポリペプチドが、配列番号3のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるポリペプチドと比較して、0.8μMの濃度において、培養NK-92 CI細胞による腫瘍壊死因子アルファ(TNF-アルファ)の分泌を増加させる、実施形態1〜15のいずれか1つのHMGB1ポリペプチド。
【００８７】
17.  前記HMGB1ポリペプチドが、配列番号6のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるポリペプチドと比較して、0.8μMの濃度において、培養NK-92 CI細胞による腫瘍壊死因子アルファ(TNF-アルファ)の分泌を増加させる、実施形態1〜16のいずれか1つのHMGB1ポリペプチド。
【００８８】
18.  前記TNF-アルファの分泌が、少なくとも10%、好ましくは少なくとも20%、より好ましくは少なくとも30%、さらに好ましくは少なくとも40%、最も好ましくは少なくとも50%増加する、実施形態1〜17のいずれか1つのHMGB1ポリペプチド。
【００８９】
19.  実施形態2〜18のいずれか1つに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００９０】
20.  実施形態19に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【００９１】
21.  実施形態1〜18のいずれか1つに記載のポリペプチド、実施形態19に記載のポリヌクレオチド、及び/又は実施形態20に記載のベクターを含む宿主細胞。
【００９２】
22.  医薬としての使用のための、実施形態1〜18のいずれか1つに記載のポリペプチド、実施形態19に記載のポリヌクレオチド、実施形態20に記載のベクター、及び/又は実施形態21に記載の宿主細胞。
【００９３】
23.  がんの治療及び/又は免疫調節における使用のための、実施形態1〜18のいずれか1つに記載のポリペプチド、実施形態19に記載のポリヌクレオチド、実施形態20に記載のベクター、及び/又は実施形態21に記載の宿主細胞。
【００９４】
24.  がんの治療及び免疫調節における前記使用が、細胞性がん免疫療法を含む、実施形態23のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、及び/又は宿主細胞。
【００９５】
25.  がんの治療及び/又は免疫調節における前記使用が、NK細胞によるTNF-アルファ分泌を誘導することを含み、好ましくはNK細胞の成熟を誘導することである、実施形態23のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、及び/又は宿主細胞。
【００９６】
26.  がんの治療及び/又は免疫調節における前記使用が、有害事象の誘発を回避することを含み、好ましくは、サイトカイン放出症候群(CRS)の誘発を回避することを含む、実施形態23のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、及び/又は宿主細胞。
【００９７】
27.  対象におけるがんを治療する方法及び/又は免疫調節を誘導する方法であって、
a)前記対象に、実施形態1〜18のいずれか1つに記載のポリペプチド、実施形態19に記載のポリヌクレオチド、実施形態20に記載のベクター、及び/又は実施形態21に記載の宿主細胞を接触させる工程、並びに、それにより
b)前記対象におけるがんを治療する及び/又は免疫調節を誘導する工程
を含む方法。
【００９８】
28.  有害事象の誘発を回避する、好ましくはサイトカイン放出症候群(CRS)の誘発を回避する、HMGB1治療を対象に提供する方法であって、
a)HMGB1を提供する薬剤を前記対象に投与する工程、
b)前記患者の試料中の有害事象、好ましくはCRSの少なくとも1つのパラメーターを決定する工程、
c)HMGB1を提供する代替的な薬剤と共にHMGB1を提供する薬剤の投与を継続する工程であって、
HMGB1を提供する前記代替的な薬剤は、工程b)において決定された前記パラメーターが有害事象、好ましくはCRSの確率の増加を示す場合には、TNF-アルファの分泌の誘導における活性が低下した、及び/又はNK細胞による細胞の殺傷の誘導における活性が低下したHMGB1ポリペプチドを提供し、且つ/又は
HMGB1を提供する前記代替的な薬剤は、工程b)において決定された前記パラメーターが有害事象、好ましくはCRSの低い確率を示す場合には、TNF-アルファの分泌の誘導における活性が増加した、及び/又はNK細胞による細胞の殺傷の誘導における活性が低下したHMGB1ポリペプチドを提供する、工程、
d)それによって、有害事象を回避して、好ましくはCRSの誘発を回避して、HMGB1治療を対象に提供する工程
を含む方法。
【００９９】
29.  TNF-アルファの分泌の誘導における活性が低下した、及び/又はNK細胞による細胞の殺傷の誘導における活性が低下した前記HMGB1ポリペプチドが、実施形態5のHMGB1ポリペプチドである、実施形態28の方法。
【０１００】
30.  TNF-アルファの分泌の誘導における活性が増加した、及び/又はNK細胞による細胞の殺傷の誘導における活性が増加した前記HMGB1ポリペプチドが、実施形態4のHMGB1ポリペプチドである、実施形態28又は29の方法。
【０１０１】
31.  CRSの前記パラメーターがTNF-アルファの濃度である、実施形態28〜30のいずれか1つの方法。
【０１０２】
32.  対象の免疫応答を調節する方法であって、
a)HMGB1ポリペプチドを提供する薬剤を前記対象に投与する工程であって、前記HMGB1ポリペプチドは実施形態1〜18のいずれか1つに記載のポリペプチドである、工程、及び、それにより
b)前記対象の免疫応答を調節する工程
を含む方法。
【０１０３】
33.  前記対象の免疫応答を調節することが、NK細胞によるTNF-アルファの分泌を誘導すること、好ましくは、NK細胞の成熟を誘導することである、実施形態32の方法。
【０１０４】
34.  収納容器中に実施形態1〜18のいずれか1つに記載のポリペプチド、実施形態19に記載のポリヌクレオチド、実施形態20に記載のベクター、及び/又は実施形態21に記載の宿主細胞を含むキット。
【０１０５】
35.  前記キットが、ナチュラルキラー細胞(NK細胞)及び/又はその単離のための手段をさらに含む、実施形態34のキット。
【０１０６】
36.  前記キラー細胞が腫瘍認識性NK細胞である、実施形態34又は35のキット。
【０１０７】
37.  医薬、好ましくはがんの治療のための、及び/又は免疫調節のための医薬の製造のための、実施形態1〜18のいずれか1つに記載のポリペプチド、実施形態19に記載のポリヌクレオチド、実施形態20に記載のベクター、及び/又は実施形態21に記載の宿主細胞の使用。
【０１０８】
本明細書において引用された全ての参考文献は、それらの全開示内容及び本明細書において具体的に言及された開示内容に関して、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の様々な実施形態を以下に示す。
１．高移動度グループボックス1(HMGB1)ポリペプチドであって、前記HMGB1ポリペプチドにおいて、配列番号1のアミノ酸位置22、57、68、及び75に対応する位置にある少なくとも1個、好ましくは2個、より好ましくは3個、最も好ましくは4個全てのチロシン残基が、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、ホモグルタミン酸(2-アミノヘキサン二酸)、及びホモグルタミン(2,6-ジアミノ-6-オキソヘキサン酸)から独立して選択されるアミノ酸残基に置換されている、ポリペプチド。
２．前記HMGB1ポリペプチドにおいて、前記位置にある少なくとも1個、好ましくは2個、より好ましくは3個、最も好ましくは4個全てのチロシン残基が、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、及びアスパラギンから独立して選択されるアミノ酸残基に置換されている、上記1に記載のHMGB1ポリペプチド。
３．前記HMGB1ポリペプチドにおいて、前記位置にある少なくとも1個、好ましくは2個、より好ましくは3個、最も好ましくは4個全てのチロシン残基が、グルタミン酸残基に置換されているか、又はグルタミン残基に置換されている、上記1又は2に記載のHMGB1ポリペプチド。
４．前記HMGB1ポリペプチドにおいて、前記位置にある少なくとも1個、好ましくは2個、より好ましくは3個、最も好ましくは4個全てのチロシン残基が、グルタミン酸残基に置換されている、上記1〜3のいずれかに記載のHMGB1ポリペプチド。
５．前記HMGB1ポリペプチドにおいて、前記位置にある少なくとも1個、好ましくは2個、より好ましくは3個、最も好ましくは4個全てのチロシン残基が、グルタミン残基に置換されている、上記1〜4のいずれかに記載のHMGB1ポリペプチド。
６．前記HMGB1ポリペプチドが、配列番号1に対して少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは95%、最も好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有する核酸配列を含み、且つ/又は、配列番号3に対して少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは95%、最も好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有する核酸配列を含む、上記1〜5のいずれか一項に記載のHMGB1ポリペプチド。
７．前記HMGB1ポリペプチドが、配列番号5〜8の少なくとも1つに対して、好ましくは配列番号6又は8に対して少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは95%、最も好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有する核酸配列を含む、上記1〜6のいずれかに記載のHMGB1ポリペプチド。
８．前記HMGB1ポリペプチドがヒトHMGB1ポリペプチドに由来する、上記1〜7のいずれかに記載のHMGB1ポリペプチド。
９．前記HMGB1ポリペプチドが天然に存在しない、上記1〜8のいずれかに記載のHMGB1ポリペプチド。
１０．前記HMGB1ポリペプチドが、配列番号3のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるポリペプチドと比較して、0.8μMの濃度において、培養SW480細胞における細胞死の増加を誘導する、上記1〜9のいずれかに記載のHMGB1ポリペプチド。
１１．上記2〜10のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
１２．上記11に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
１３．上記1〜10のいずれかに記載のポリペプチド、上記11に記載のポリヌクレオチド、及び/又は上記12に記載のベクターを含む宿主細胞。
１４．医薬としての使用のための、上記1〜10のいずれかに記載のポリペプチド、上記11に記載のポリヌクレオチド、上記12に記載のベクター、及び/又は上記13に記載の宿主細胞。
１５．がんの治療及び/又は免疫調節における使用のための、上記1〜10のいずれかに記載のポリペプチド、上記11に記載のポリヌクレオチド、上記12に記載のベクター、及び/又は上記13に記載の宿主細胞。
１６．がんの治療及び免疫調節における前記使用が、細胞性がん免疫療法を含む、上記15に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、及び/又は宿主細胞。
１７．がんの治療及び/又は免疫調節における前記使用が、NK細胞によるTNF-アルファの分泌を誘導することを含み、好ましくはNK細胞の成熟を誘導することである、上記15又は16に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、及び/又は宿主細胞。
１８．がんの治療及び/又は免疫調節における前記使用が、有害事象の誘発を回避することを含み、好ましくは、サイトカイン放出症候群(CRS)の誘発を回避することを含む、上記15〜17のいずれかに記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、及び/又は宿主細胞。
１９．収納容器中に上記1〜10のいずれか1項に記載のポリペプチド、上記11に記載のポリヌクレオチド、上記12に記載のベクター、及び/又は上記13に記載の宿主細胞を含むキット。
２０．前記キットが、ナチュラルキラー細胞(NK細胞)及び/又はその単離のための手段をさらに含む、上記19に記載のキット。
２１．前記キラー細胞が腫瘍認識性NK細胞である、上記19又は20に記載のキット。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】Glu-HMGB1によるナチュラルキラー細胞(NK-92 CI)の強力な活性化(n=3、p<0.05)。WT=HMGB1 WT、E-変異体=Glu-HMGB1(配列番号8)、Q-変異体=Gln-HMGB1(配列番号6)。
【発明を実施するための形態】
【０１１０】
以下の実施例は、単に本発明を例証するものである。それらは決して、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１１１】
[実施例1]
方法
Cr-51放出アッセイ
SW480結腸がん細胞を96ウェルプレート(20000細胞/ウェル)中で培養し、51Cr(25μCi/ウェル)で2時間標識した。次いで、細胞をHMGB1及びNK細胞で24時間処理した。培地を除去し、放射能についてカウントした(cpm1)。細胞を培地で4回洗浄し、100μlの0.5N NaOHで可溶化した。溶解物の放射能をカウントした(cpm2)。
【０１１２】
放射能カウント
試料を10mlのUltimaGoldと混合し、液体シンチレーションカウンターでカウントした。
【数１】
0006923650.tif 000002
【０１１３】
GluHMGB1、GlnHMGB1及び野生型HMGB1の作製
4個全てのBボックスドメインのチロシン残基がグルタミン酸残基又はグルタミン残基によってそれぞれ置換されたHMGB1ポリペプチドをコードするプラスミドをHEK細胞にトランスフェクトした(無血清懸濁細胞培養、1,000ml(約2.5×106個細胞/ml)、次いでバルプロ酸を補充)。野生型HMGB1の作製では、Bボックスドメインはそのチロシン残基が修飾されていなかった。細胞ペレットを均質化し、IMAC及びTALON(Clontech)樹脂を介して精製し、イミダゾールを使用して溶出した。15の溶出液をSDS-PAGE(クマシー染色)により分析した。陽性の溶出液をプールした後、タンパク質をゲル濾過し(Superdex)、最後にSDS-PAGEにより分析した。実験には800nMの精製タンパク質を使用した。
【０１１４】
NK細胞の活性化
ナチュラルキラー細胞株NK-92 CIの活性化を、800nMの示したHMGB1タンパク質で24時間刺激した400,000個のNK細胞を使用して、上清中へのTNF-アルファの放出を検出することにより測定した。TNF-アルファの検出は、製造業者の指示にしたがってELISAキット(Avia Systems Biology、カタログ番号OKAA00027_96W)を用いて行った。
【０１１５】
[実施例2]
結果及び考察
異なるHMGB1形態は、がん細胞に対する別個の細胞傷害性と、がん細胞に対するナチュラルキラー細胞傷害性の増強及びNK細胞の活性化における相違の両方を示す
24時間のHMGB1細胞傷害性の非常に短い期間の評価と、高感度な51Cr(クロム51)放出のゴールドスタンダードアッセイによる細胞死の検出の両方を用いて、本発明者らは、それらのBボックスドメイン上で修飾された異なるHMGB1形態の驚くべき新たな細胞傷害性プロファイルを明らかにした。Gln-HMGB1は、野生型HMGB1と比較してがん細胞に対して43%多い細胞死を示したのに対し、Glu-HMGB1は野生型HMGB1と比較して83%も多い細胞死を示した(表1)。
【０１１６】
次に、エフェクター(E)細胞(NK-92 CIナチュラルキラー細胞株)を51Cr標識標的(T)細胞(SW480結腸がん細胞)と共に様々なE:Tの比、5:1、10:1及び20:1でインキュベートした(表1)。Gln-HMGB1+NK細胞は、刺激無しでのNK細胞溶解活性と比較してがん細胞に対して最大55%多い細胞死を示したのに対し、Glu-HMGB1は刺激無しでのNK細胞溶解活性と比較してがん細胞に対して最大94%多い細胞死を示した(E:Tはそれぞれ5:1)(表1)。さらに、Gln-HMGB1+NK細胞は、野生型HMGB1での刺激後のNK細胞溶解活性と比較してがん細胞に対して最大13%多い細胞死を示したのに対し、Glu-HMGB1は野生型HMGB1での刺激後のNK細胞溶解活性と比較してがん細胞に対して最大25%多い細胞死を示した(E:Tはそれぞれ5:1)(表1)。
【０１１７】
まとめると、3つの異なるHMGB1アイソフォームは、別個の細胞傷害性プロファイルを示す。Glu-HMGB1は、がん細胞に対する細胞傷害性に関して及びがん細胞に対するNK細胞溶解活性の増強に関して、野生型HMGB1及びGln-HMGB1のどちらよりも優れている。Gln-HMGB1は、がん細胞に対する細胞傷害性に関して及びがん細胞に対するNK細胞溶解活性の増強に関して、野生型HMGB1よりも優れている。したがって、野生型HMGB1は、Glu-HMGB1及びGln-HMGB1と比較して最も乏しい細胞傷害性プロファイルを示す。Gln-HMGB1は、がん細胞に対して(Glu-HMGB1よりは低いが)依然として強い細胞傷害性を発揮し、NK細胞溶解活性の中程度の増強を示す(野生型HMGB1(低NK細胞溶解活性)とGlu-HMGB1(高NK細胞溶解活性)の間の範囲)。
【０１１８】
さらに、3つの異なるHMGB1アイソフォームは、NK細胞の活性化において別個の活性を示す。本発明者らは、HMGB1刺激による活性化後のNK-92 CI細胞による腫瘍壊死因子アルファ(TNF-アルファ)の分泌を測定した。Glu-HMGB1は最も強力にTNF-アルファの分泌を刺激し、したがって最も強力にNK細胞を結合性及び殺傷性となるように活性化した。
【０１１９】
よって、がん療法において、HMGB1、Glu-HMGB1及びGln-HMGB1の異なる形態の適用によって、(i)がん細胞に対する直接的な細胞傷害性、(ii)腫瘍の近傍にあるがん細胞に対するNK細胞の細胞傷害性、及び(iii)循環NK細胞の全体的な活性化(それらを結合性及び殺傷性に切り替える)を調節し、よって、腫瘍へのNK細胞の動員を促進することが可能である。本明細書中に示されている結果は、Glu-HMGB1及びGln-HMGB1が、単独で、又は細胞性免疫療法(例えばNK細胞)と組み合わせて、野生型HMGB1と比較してがん細胞に対して増強された細胞傷害性を示すことを実証している。
【０１２０】
GluHMGB1及びGlnHMGB1により、臨床医は、HMGB1に基づくがん療法中に、免疫系の一般的な活性化(例えば、異なるサイトカイン、例えばTNF-アルファを分泌するNK細胞の活性化)を調節できるツールを有する。所望の活性化状態又は所望のサイトカイン血漿レベル(例えばTNF-アルファ)に応じて、Glu-HMGB1は、免疫系の強力な活性化及びサイトカイン放出の増強のために使用され得、Gln-HMGB1は、免疫系の中程度の活性化及び(例えばNK細胞からの)中程度のサイトカイン放出のために使用され得るであろう。Glu-HMGB1とGln-HMGB1の両方を組み合わせることにより、野生型HMGB1と比較して、常にがん細胞に対する直接的な細胞傷害性、及び腫瘍の近傍にあるがん細胞に対するNK細胞の細胞傷害性を高めながら、サイトカインの放出を増強又は減少させることができるであろう。
【表１】
0006923650.tif 000003
【図１】
0006923650.tif 000004
【配列表】
0006923650000001.app