(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）及びＴＭＰＲＳＳ２の発現を阻害するための組成物であって、
前記組成物は、ＦｏｘＯ１阻害剤を含む、組成物であり、
前記ＦｏｘＯ１阻害剤は、インスリン系化合物、成長因子及び／又はこれをコードする核酸、ＦｏｘＯ１の遺伝子発現抑制剤から選択される１種以上である、組成物であって、
前記成長因子は、以下から選択されるいずれかと、９０％以上同一のアミノ酸配列を有し：ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＥＧＦ、ＦＧＦ２、ＦＧＦ１４、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ
前記ＦｏｘＯ１の遺伝子発現抑制剤は、ＦｏｘＯ１のアンチセンス核酸、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡから選択される１種以上であり、
前記インスリン系化合物は、野生型インスリン及び改変型インスリンから選択される１種以上である、
組成物（ただし、投与対象として糖尿病患者を除く）。
【請求項２】
前記改変型インスリンが、超速効型インスリン、速効型インスリン、中間型インスリン、持効型溶解性インスリン、混合型インスリン、及び配合溶解性インスリンから選択される１種以上である、請求項１の組成物。
【請求項３】
前記改変型インスリンが、ヒト野生型インスリンと９０％以上同一のアミノ酸配列を有する、請求項１の組成物。
【請求項４】
前記改変型インスリンが、ヒト野生型インスリンと９５％以上同一のアミノ酸配列を有する、請求項３の組成物。
【請求項５】
前記改変型インスリンのＡ鎖が、ヒト野生型インスリンのＡ鎖と１００％同一のアミノ酸配列を有する、請求項３又は４の組成物。
【請求項６】
前記成長因子が、以下から選択されるいずれかと、９５％以上同一のアミノ酸配列を有する、請求項１の組成物：
ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＥＧＦ、ＦＧＦ２、ＦＧＦ１４、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ。
【請求項７】
前記成長因子が、以下から選択されるいずれかと、１００％同一のアミノ酸配列を有する、請求項６の組成物：
ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＥＧＦ、ＦＧＦ２、ＦＧＦ１４、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ。
【請求項８】
コロナウィルス感染症を治療又は予防するための組成物である、請求項１〜７いずれか１項に記載の組成物（ただし、投与対象として糖尿病患者を除く）であり、前記ＦｏｘＯ１阻害剤は、インスリン系化合物、ＦｏｘＯ１の遺伝子発現抑制剤から選択される１種以上である、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、アンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）及び／又はＴＭＰＲＳＳ２（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅａｓｅ，  ｓｅｒｉｎｅ  ２）の発現を抑制するための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
２０１９年の終わりから人への感染が始まったとされる新型コロナウィルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２）による感染症（ＣＯＶＩＤ−１９）は世界中で猛威を振るい、その治療薬並びにウイルスに対するワクチンの研究開発が各国で盛んに行われている。ＣＯＶＩＤ−１９は発症するとサイトカインストームと呼ばれる過剰な炎症反応が引き起こされ、当初は異常な肺炎症状を引き起こすことにより死に至らしめると考えられていた。その後、肺のみならず、血管、脳神経系、肝臓、腎臓など全身に症状が見られることが明らかになりつつある。これまでの研究成果から、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２は全ての細胞に感染するというより、アンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）を細胞表面に発現している細胞に特異的に感染することが示唆されている。さらに最近ではＴＭＰＲＳＳ２（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ，  Ｓｅｒｉｎｅ２）というタンパク質分解酵素によって、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２の表面にあるスパイクタンパク質（Ｓｐｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が切断されることでさらに感染力が高まる、などの報告も相次いでいる。非特許文献１では、これまでのＳＡＲＳ−ＣｏＶ２に関する知見に関してまとめられている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】https://www.nature.com/articles/d41586-020-00502-w
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２の感染拡大に伴い、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２に対する治療法及び予防法の開発が全世界で期待されている。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２はＡＣＥ２を介して感染することは広く知られており、このＡＣＥ２に対する中和抗体の作成などが急ピッチで進められているものの、いまだ実用化に至ってはいない。そこで、本開示は、ＣＯＶＩＤ−１９の治療・予防にも関係する、ＡＣＥ２及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の遺伝子発現量（ｍＲＮＡ量）を抑制するための組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明者が鋭意検討したところ、ＦｏｘＯ１のシグナル経路を調節することで、ＡＣＥ２並びにＴＭＰＲＳＳ２のｍＲＮＡ量を減少させることを明らかにした。具体的には、間葉系幹細胞の培養上清、ＦｏｘＯ１に直接作用する阻害剤、ＦｏｘＯ１の上流に存在するＰＤＫ１に直接作用する阻害剤、インスリン系化合物（受容体のリガンドであり、下流にシグナル経路でＦｏｘＯ１に影響を及ぼす）、成長因子（受容体のリガンドであり、下流にシグナル経路でＦｏｘＯ１に影響を及ぼす）などで処理することで、ＡＣＥ２、及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の発現量に有意な変化が起こることを見出した。
【０００６】
さらに、上述のＡＣＥ２及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の発現量の減少が、新型コロナウィルスのスパイクタンパク質の細胞内の取り込みの減少につながることを見出した。
【０００７】
本開示の発明は、上記知見に基づいて完成され、一側面において、以下の発明を包含する。
（発明１）
アンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の発現を阻害するための組成物であって、
前記組成物は、ＦｏｘＯ１阻害剤を含む、組成物。
（発明２）
前記ＦｏｘＯ１阻害剤は、インスリン系化合物である、発明１の組成物。
（発明３）
前記インスリン系化合物が、野生型インスリンである、発明２の組成物。
（発明４）
前記インスリン系化合物が、改変型インスリンである、発明２の組成物。
（発明５）
前記改変型インスリンが、超速効型インスリン、速効型インスリン、中間型インスリン、持効型溶解性インスリン、混合型インスリン、及び配合溶解性インスリンから選択される１種以上である、発明４の組成物。
（発明６）
前記改変型インスリンが、ヒト野生型インスリンと９０％以上同一のアミノ酸配列を有する、発明４の組成物。
（発明７）
前記改変型インスリンが、ヒト野生型インスリンと９５％以上同一のアミノ酸配列を有する、発明６の組成物。
（発明８）
前記改変型インスリンのＡ鎖が、ヒト野生型インスリンのＡ鎖と１００％同一のアミノ酸配列を有する、発明６又は７の組成物。
（発明９）
前記ＦｏｘＯ１阻害剤は、成長因子及び／又はこれをコードする核酸である、発明１の組成物。
（発明１０）
前記成長因子が、以下から選択されるいずれかと、９０％以上同一のアミノ酸配列を有する、発明９の組成物：
ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＥＧＦ、ＦＧＦ２、ＦＧＦ１４、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ。
（発明１１）
前記成長因子が、以下から選択されるいずれかと、９５％以上同一のアミノ酸配列を有する、発明１０の組成物：
ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＥＧＦ、ＦＧＦ２、ＦＧＦ１４、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ。
（発明１２）
前記成長因子が、以下から選択されるいずれかと、１００％以上同一のアミノ酸配列を有する、発明１１の組成物：
ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＥＧＦ、ＦＧＦ２、ＦＧＦ１４、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ。
（発明１３）
前記ＦｏｘＯ１阻害剤は、ＦｏｘＯ１作用型阻害剤である、発明１の組成物。
（発明１４）
前記ＦｏｘＯ１阻害剤は、ＰＩ３Ｋ／ＰＤＫ１／Ａｋｔ作用型阻害剤である、発明１の組成物。
（発明１５）
前記ＦｏｘＯ１阻害剤は、ＦｏｘＯ１の遺伝子発現抑制剤である、発明１の組成物。
（発明１６）
コロナウィルス感染症を治療するための組成物である、発明１〜１５いずれか１つに記載の組成物。
（発明１７）
コロナウィルス感染症を予防するための組成物である、発明１〜１５いずれか１つに記載の組成物。
（発明１８）
コロナウィルス感染症を予防又は治療するための組成物であって、ＦｏｘＯ１阻害剤を含む、組成物。
【発明の効果】
【０００８】
本開示の組成物は、ＦｏｘＯ１阻害剤を含む。これによって、ＡＣＥ２及び／又はＴＭＰＲＳＳ２遺伝子の発現量を減少させることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】野生型インスリンの添加によるＨｅｐＧ２細胞におけるＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２遺伝子の発現量を相対化したグラフである。
【図２】改変型インスリンの添加によるＨｅｐＧ２細胞におけるＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２遺伝子の発現量を相対化したグラフである。
【図３】ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２表面タンパク質であるスパイクタンパク質中の、Ｓ１ドメイン（Ｓ１−ｍＦｃ）、あるいはＡＣＥ２結合領域（ＲＢＤ）の組換えタンパク質（ＲＢＤ−ｍＦｃ）の細胞内への取り込みアッセイの模式図である。Ｓ１及びＲＢＤにはマウスＩｇＧ由来のＦｃ配列（ｍＦｃ）が融合しており、マウスＩｇＧを認識する蛍光標識抗体を用いた免疫染色法により、細胞内に取り込まれたＳ１又はＲＢＤの量を定量化することが可能である。
【図４】取り込まれたＳ１およびＲＢＤタンパク質を、フローサイトメトリーを用いて定量し、平均蛍光強度を相対化したグラフである。
【図５】インスリンによるＡＣＥ２及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の発現抑制と、スパイクタンパク質との結合・取り込み抑制の関係を表した模式図である。
【図６】各種成長因子の添加によるＨｅｐＧ２細胞におけるＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２遺伝子の発現量を相対化したグラフである。
【図７】フォークヘッド型転写因子ＦｏｘＯ１阻害剤ＡＳ１８４２８５６（濃度はグラフ下に示す）の添加によるＨｅｐＧ２細胞におけるＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２遺伝子の発現量を相対化したグラフである。更には、ＦｏｘＯ１によるＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２遺伝子の発現誘導メカニズムの模式図である。
【図８】ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２表面タンパク質であるスパイクタンパク質中の、ＡＣＥ２結合領域（ＲＢＤ）の組換えタンパク質（ＲＢＤ−ｍＦｃ）の細胞内への取り込みアッセイの模式図である。ＲＢＤにはマウスＩｇＧ由来のＦｃ配列（ｍＦｃ）が融合しており、マウスＩｇＧを認識する蛍光標識抗体を用いた免疫染色法により、細胞内に取り込まれたＲＢＤの量を定量化することが可能である。
【図９】ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２表面タンパク質であるスパイクタンパク質中の、ＡＣＥ２結合領域（ＲＢＤ）の組換えタンパク質（ＲＢＤ−ｍＦｃ）のＨｅｐＧ２細胞内への取り込みアッセイにおける、実際に取り込まれたＲＢＤタンパク質の典型的な顕微鏡画像である。
【図１０】取り込まれたＲＢＤタンパク質を、フローサイトメトリーを用いて定量し、平均蛍光強度を相対化したグラフである。
【図１１】ヒト臍帯及び／又はヒト脂肪由来間葉系幹細胞の非接触型共培養の模式図、及び共培養によるＨｅｐＧ２細胞におけるＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２遺伝子の発現量を相対化したグラフである。
【図１２】間葉系幹細胞上清によるＨｅｐＧ２細胞におけるＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２遺伝子の発現量の抑制効果が、ＰＤＫ１阻害剤によりキャンセルされたことを示すグラフである。
【図１３】ＨＧＦの添加によるＨｅｐＧ２細胞におけるＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２遺伝子の発現量を相対化したグラフである。
【図１４】ｓｉＲＮＡの添加によるＨｅｐＧ２細胞におけるＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２遺伝子の発現量を相対化したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本開示の発明を実施するための具体的な実施形態について説明する。以下の説明は、発明の理解を促進するためのものである。即ち、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００１１】
１．定義
本明細書で記載される用語「アンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の発現を阻害するため」は、ＡＣＥ２及び／又はＴＭＰＲＳＳ２に関する特定の疾患を改善するという目的を包含する。更には、当該用語は、治療目的に限定されない。例えば、当該用語は、特定の疾患を有さないとしても、その疾患を発症することを予防する目的を包含する。
【００１２】
本明細書で記載される用語「ＦｏｘＯ１阻害剤」は、広義の意味と狭義の意味を有するが、特記しない限り前者の意味で解釈する。
【００１３】
狭義の意味の場合には、上記用語は、ＦｏｘＯ１に直接結合して作用する阻害剤を意味する（本明細書においては、狭義の意味の場合には、「ＦｏｘＯ１作用型阻害剤」とも称する）。一方で、広義の意味の場合には、上記用語は、直接又は間接的にＦｏｘＯ１に作用して、ＦｏｘＯ１の転写因子としての活性を阻害する阻害剤を意味する。間接的に作用する場合には、上記用語は、ＦｏｘＯ１の上流のシグナル経路に作用する阻害剤を包含する。一例としては、ＦｏｘＯ１の上流にあるＡｋｔやＰＤＫ１に直接作用してこれらを活性化させる薬剤が挙げられる。別の例としては、ＦｏｘＯ１の活性に影響を及ぼす（より具体的には、ＦｏｘＯ１の活性を抑制するシグナル経路のトリガーとなる）受容体のリガンドが挙げられる。受容体としては、インスリン受容体、成長因子受容体などが挙げられる。換言すれば、上記用語は、インスリン受容体のリガンド、成長因子受容体のリガンドを包含する。また、広義の意味の場合には、上記用語は、更に、「ＦｏｘＯ１」自体の発現を阻害する物質も含む。典型的な例としては、核酸を含み、例えば、アンチセンス核酸、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等が挙げられる。
【００１４】
ただし、本明細書で記載される用語「ＦｏｘＯ１阻害剤」は、広義の意味及び狭義の意味のいずれにおいても、以下の式Ｉで表される化合物及びその塩は包含しない。
【００１５】
【化１】
0006953047.tif 000002
式Ｉ
｛ただし、
Ｒ1は、ＮＨ又はＣＨ2であり、
Ｒ2は、Ｎ−Ｒ8又はＣＨ−Ｒ8  （Ｒ8：Ｃ１〜Ｃ３までのアルキル基）であり、
Ｒ3は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり、
Ｒ4は、それぞれ独立して、Ｈ又はＣＨ3であり、
Ｒ5は、Ｓ又はＯであり、
Ｒ6は、カルボキシル基であり、
Ｒ7は、ＮＨ2、又はＣＨ3であり、
ｎは、１−１１である。
｝
【００１６】
好ましい実施形態においては、本明細書で記載される用語「ＦｏｘＯ１阻害剤」は、細胞由来のエクソソームを含まない。より好ましくは、本明細書で記載される用語「ＦｏｘＯ１阻害剤」は、間葉系幹細胞の培養上清を含まない。
【００１７】
２．用いたアンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の発現量を抑制するための組成物
一実施形態において、本開示は、アンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の発現を阻害するための組成物であって、前記組成物は、ＦｏｘＯ１阻害剤を含む、組成物に関する。
【００１８】
更なる一実施形態において、ＦｏｘＯ１阻害剤として、以下のいずれか１種以上が上記組成物内に有効成分として含まれてもよい。
・インスリン系化合物
・成長因子又はこれをコードする核酸
・ＦｏｘＯ１作用型阻害剤、及び／又は、ＰＩ３Ｋ／ＰＤＫ１／Ａｋｔ作用型阻害剤
・ＦｏｘＯ１の遺伝子発現抑制剤
以下では、各々の阻害剤について詳述する。
【００１９】
２−１．インスリン系化合物を用いたアンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の発現量を抑制するための組成物
一実施形態においては、こうした組成物は、インスリン系化合物（例えば、ヒトインスリン）を含む。これにより、ＡＣＥ２及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の遺伝子の転写が阻害され、ｍＲＮＡ量が減少する。
【００２０】
また、本明細書で記載される「インスリン系化合物」は、細胞内部でインスリンシグナル伝達経路を活性化する剤を意味する。従って、本明細書で記載される「インスリン系化合物」は、ヒト生体内で発現している、いわゆる「野生型インスリン」だけではなく、遺伝子改変技術を用いて製造された「改変型インスリン」を含むことができ、更には、生体内で膵臓のβ細胞に作用してインスリンの発現を促進する剤を含むことができる。好ましい「インスリン系化合物」は、野生型インスリンあるいは改変型インスリンである。改変型インスリンの例として、超速効型インスリン、速効型インスリン、中間型インスリン、持効型溶解性インスリン、混合型インスリン、配合溶解性インスリンが挙げられる。
【００２１】
また、改変型インスリンは、ヒト野生型インスリンとある程度同一のアミノ酸配列を有してもよい。例えば、９０％以上であり、好ましくは、９５％以上である（例えば、ｂｌａｓｔｐなどを利用して判定された同一性）。なお、野生型インスリンは、Ａ鎖とＢ鎖のヘテロダイマーである。従って、ここで述べる同一性は、Ａ鎖とＢ鎖を連結して１つのアミノ酸配列として比較したときの同一性を意味する。更に好ましくは、改変型インスリンのＡ鎖が、ヒト野生型インスリンのＡ鎖と１００％同一のアミノ酸配列を有する。
【００２２】
インスリンは、アンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の遺伝子の転写を阻害する因子として作用する。従って、インスリンを添加することで、これらの遺伝子の発現を抑制することができる。これによって、ウイルスがスパイクタンパク質を利用して細胞内に取り込まれることを低減することができる。
【００２３】
２−２．成長因子を用いたアンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の発現量を抑制するための組成物
一実施形態においては、組成物は、成長因子を含む。これにより、ＡＣＥ２及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の遺伝子の転写が阻害され、ｍＲＮＡ量が減少する。
【００２４】
本明細書で記載される用語「成長因子」は、以下の条件をすべて満たす物を意味する。
・ペプチド又はタンパク質を少なくとも部分的に含むこと
・細胞内のＦｏｘＯ１の転写因子の活性を抑制すること
【００２５】
上述した「ペプチド又はタンパク質を少なくとも部分的に含むこと」について、ペプチド又はタンパク質は天然に存在する物であってもよく、人工的に作られた物であってもよい。例えば、天然に存在するタンパク質又はペプチドに化学修飾された物も包含される。ペプチド又はタンパク質は、モノマー形態だけではなく、２量体以上の形態であってもよい。ペプチド又はタンパク質は、直鎖上ではなく、例えば、環状であってもよい。また、２量体以上の形態である場合には適宜人工的なリンカーを設けてもよい。例えば、Kenichiro Itoら（Nat Commun. 2015 Mar 11;6:6373.doi: 10.1038/ncomms7373.）の論文によれば、環状のアミノ酸配列２つをリンカーで結合したユニークな構造を有する物質が、ＨＧＦ受容体のアゴニストとして機能することを報告している。
【００２６】
本件の出願日以降も、従来存在しなかった様々なタイプの新たな成長因子受容体のアゴニストが開発される可能性があるが、上述した条件を充足する限りは、こうした成長因子受容体のアゴニストも、本明細書で記載される用語「成長因子」に含まれることを意図する。
【００２７】
なお、ＦｏｘＯ１の転写因子の活性を抑制するかどうかについては、当分野で公知の解析手法よって判別することができる。例えば、ルシフェラーゼアッセイを実施して、蛍光強度などで有意な差が生じるかどうかに基づいて判別することができる。
【００２８】
また、成長因子の種（ｓｐｅｃｉｅｓ）については特に限定されないが、好ましくはヒト型である。
【００２９】
限定されるものではないが、成長因子の一例として以下のいずれか１種以上が挙げられる：ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＥＧＦ、ＦＧＦ２、ＦＧＦ１４、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ。
【００３０】
さらには、別の成長因子は、上記列挙した成長因子のいずれかとある程度同一のアミノ酸配列を有してもよい。例えば、９０％以上であり、好ましくは、９５％以上であり、最も好ましくは１００％である（例えば、ｂｌａｓｔｐなどを利用して判定された同一性）。
【００３１】
さらには、上記のＨＧＦは、環状ペプチドを用いた代替ペプチドが開発されており（https://www.nature.com/articles/ncomms7373）、ＨＧＦの機能と同様の機能を有していることが報告されている。このような、成長因子の機能を代替するようにして開発された中〜高分子化合物も、今回の目的に使用することは十分に可能である。
【００３２】
また、上記成長因子に加えて、或いは、これに代えて、上述した成長因子（上述した同一性のアミノ酸配列を有する物も含む）をコードする核酸が、組成物に配合されてもよい。核酸は、ＤＮＡであってもよく、そして、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）であってもよい。好ましくは、本開示の組成物は、上述したＤＮＡを任意の形態で含むことができる。例えば、上述したＤＮＡのコーティング領域は、プラスミド、ベクター等に組み込んでもよい。これらの核酸は最終的に成長因子を産生し、上述した作用により、ＡＣＥ２及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の遺伝子の転写が阻害され、ｍＲＮＡ量が減少する。
【００３３】
２−３．ＦｏｘＯ１作用型阻害剤、及び／又は、ＰＩ３Ｋ／ＰＤＫ１／Ａｋｔ作用型阻害剤を用いたアンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の発現量を抑制するための組成物
一実施形態においては、組成物は、ＦｏｘＯ１作用型阻害剤、及び／又は、ＰＩ３Ｋ／ＰＤＫ１／Ａｋｔ作用型阻害剤を含む。これにより、ＡＣＥ２及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の遺伝子の転写が阻害され、ｍＲＮＡ量が減少する。
【００３４】
本明細書で記載される用語「ＦｏｘＯ１作用型阻害剤」の意味については、上述した狭義の「ＦｏｘＯ１阻害剤」で説明したとおりである。また、本明細書で記載される用語「ＰＩ３Ｋ／ＰＤＫ１／Ａｋｔ作用型阻害剤」は、以下の３つの条件をすべて満たす物を意味する。
・細胞膜を透過して、細胞内のＰＩＰ3を増加させるか、及び／又は、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、Ａｋｔのうち少なくともいずれか１つに直接作用すること
・作用した結果、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１及びＡｋｔのうち少なくともいずれか１つの活性を変化させること
・活性を変化させた結果、細胞内のＦｏｘＯ１の転写因子の活性を抑制すること
【００３５】
従って、語弊を避けるために補足すると、用語「ＰＩ３Ｋ／ＰＤＫ１／Ａｋｔ作用型阻害剤」は、「阻害剤」と称するものの、ＰＩ３Ｋ／ＰＤＫ１／Ａｋｔに対して活性化作用を示す物を意味する。そして、結果的にＦｏｘＯ１の活性を抑制するという意味で、「阻害剤」と称している。
【００３６】
なお、ＦｏｘＯ１の転写因子の活性を抑制するかどうかについては、上記「２−２」の記載と同様に判別可能である。
【００３７】
ＰＩＰ3は、受容体とリガンドの結合をトリガーとするシグナルにより生成されるセカンドメッセンジャーである。ＰＩ３ＫによってＰＩＰ3が生成される。生成されたＰＩＰ3は、ＰＤＫ１を活性化させる。また、活性化されたＰＤＫ１は、Ａｋｔを活性化させる。活性化されたＡｋｔは、ＦｏｘＯ１の活性を阻害する。従って、細胞内のＰＩＰ3を増加させるか、及び／又は、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、Ａｋｔのうち少なくともいずれか１つに直接作用して活性化させることで、ＦｏｘＯ１の転写因子としての活性を阻害することができる。これにより、ＡＣＥ２及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の遺伝子の転写が阻害され、ｍＲＮＡ量が減少する。
【００３８】
また、ＦｏｘＯ１に直接抑制的に作用する場合であれば、当該作用によって、ＡＣＥ２及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の遺伝子の転写が阻害され、ｍＲＮＡ量が減少する。
【００３９】
こうした観点から、ＦｏｘＯ１作用型阻害剤、及び／又は、ＰＩ３Ｋ／ＰＤＫ１／Ａｋｔ作用型阻害剤は、各々に対して以下の様に作用することが好ましい。
・ＦｏｘＯ１に対して活性を阻害する作用
・ＰＩＰ3を増加させる作用、
・ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、Ａｋｔのうち少なくともいずれか１つに対して活性を促進する作用
【００４０】
ＦｏｘＯ１に対して活性を阻害する作用を有する薬剤としては、ＫＩＳ−１５４、ＡＳ１８４２８５６又はＡＳ１７０８７２７が挙げられる。ただし、ＡＳ１８４２８５６は、上記式Ｉに包含されるため、本開示のＦｏｘＯ１阻害剤からは除外される。
【００４１】
また、ＦｏｘＯ１に対して活性を阻害する作用を有する薬剤としては、ＫＩＳ−１５４、カルコン類、トリテルペン類、フラボン類、モノテルペノイド類、リグナン類、クマリン類、及びフィトケミカル類からなるＦＯＸＯ１活性阻害剤（再表２０１８／０７９７１５）などが挙げられる。
【００４２】
具体例としては、再表２０１８／０７９７１５の００１６等に記載の通りである。例えば、以下の化合物が挙げられる。
【００４３】
trans-カルコン（trans-Chalcone）、2',6'-ジヒドロキシ-4,4'-ジメトキシカルコン（2',6'-Dihydroxy-4,4'-dimethoxychalcone）、アカセチン（Acacetin）、アクテオシド（Acteoside）、アンドログラホリド（Andrographolide）、アピゲニン（Apigenin）、バイカリン（Baicalin）、クリシン（Chrysin）、シアニジンクロリド（Cyanidin chloride）、シアニン（Cyanin）、ダイゼイン（Daidzein）、デルフィン（Delphin）、デルフィニジンクロリド（Delphinidin Chloride）、δ-(3,4-ジヒドロキシフェニル)-γ-バレロラクトン（δ-(3,4-Dihydroxyphenyl)-γ-valerolactone）、ジオスメチン（Diosmetin）、ジオスミン（Diosmin）、エラグ酸（Ellagic acid）、エリオジクチオール（Eriodictyol）、フィセチン（Fisetin）、サンギソルビン酸（Sanguisorbic acid）、ヘスペレチン（Hesperetin）、イソリクイリチゲニン（Isoliquiritigenin）、ケンペロール（Kaempferol）、リポ酸（Lipoic acid）、マハニン（Mahanine）、ミリセチン（Myricetin）、プロトカテク酸（Protocatechuic acid）、プロシアニジンB2（Procyanidin B2）、クェルセチン二水和物（Quercetin dihydrate）、セサミン（Sesamin）、エピセサミン（Episesamin）、テリマグランジン１（Tellimagrandin 1）、テリマグランジン２（Tellimagrandin 2）、テオブロミン（Theobromine）、テオフィリン（Theophylline）、オウゴニン（Wogonin）、β−ナフトフラボン（β-Naphthoflavone）、シリビニン（Silibinin）、ロットレリン（Rottlerin）、６-ヒドロキシフラボン（6-Hydroxyflavone）、７-ヒドロキシフラボン（7-Hydroxyflavone）、イソラムネチン（Isorhamnetin）、モリン（Morin）、クリソエリオール（Chrysoeriol）、ホルモノネチン（Formononetin）、ペオニジンクロリド（Peonidin Chloride）、クプレスフラボン（Cupressuflavone）、7,4’-ジヒドロキシフラボン（7,4'-Dihydroxyflavone）、7,8-ジヒドロキシフラボン（7,8-Dihydroxyflavone）、6,7-ジヒドロキシフラボン（6,7-Dihydroxyflavone）、3',4'-ジメトキシフラボン（3',4'-Dimethoxyflavone）、3-ヒドロキシフラボン（3-Hydroxyflavone）、イプリフラボン（Ipriflavone）、2'-メトキシフラボン（2'-Methoxyflavone）、5-メトキシフラボン（5-Methoxyflavone）、3',4',5',5,7-ペンタメトキシフラボン（3',4',5',5,7-Pentamethoxyflavone）、3',4',7,8-テトラヒドロキシフラボン（3',4',7,8-Tetrahydroxyflavone）、4',6,7-トリヒドロキシイソフラボン（4',6,7-Trihydroxyisoflavone）、7-ヒドロキシフラボノール（7-Hydroxyflavonol）、7-メトキシフラボノール（7-Methoxyflavonol）、6-メトキシフラボノール（6-Methoxyflavonol）、5,7-ジヒドロキシ-3',4',5'-トリメトキシフラバノン（5,7-Dihydroxy-3',4',5'-trimethoxyflavanone）、フラバノン（Flavanone）、フラバノンジアセチルヒドラゾン（Flavanone diacetyl hydrazone）、フラバノンヒドラゾン（Flavanone hydrazone）、2'-ヒドロキシフラバノン（2'-Hydroxyflavanone）、4'-ヒドロキシフラバノン（4'-Hydroxyflavanone）、3'-ヒドロキシフラバノン（3'-Hydroxyflavanone）、α-ナフトフラボン（α-Naphthoflavone）、5-メトキシフラバノン（5-Methoxyflavanone）、6-メトキシフラバノン（6-Methoxyflavanone）、2',6'-ジヒドロキシ-4,4'-ジメトキシジヒドロカルコン（2',6'-Dihydroxy-4,4'-dimethoxydihydrochalcone）、2',6'-ジヒドロキシ-4'-メトキシカルコン（2',6'-Dihydroxy-4'-methoxychalcone）、2,3-ジメトキシ-2'-ヒドロキシカルコン（2,3-Dimethoxy-2'-hydroxychalcone）、セサミノール（Sesaminol）、ナリルチン（Narirutin）、クェルセチン-3,5,7,3',4'-ペンタメチルエーテル（Quercetin-3,5,7,3',4'-pentamethylether）、クェルセチン-3,7,3',4'-テトラメチルエーテル（Quercetin-3,7,3',4'-tetramethylether）、フィセチニジンクロリド（Fisetinidin chloride）、ルテオリニジンクロリド（Luteolinidin chloride）、3',4',7,8-テトラメトキシフラボン（3',4',7,8-Tetramethoxyflavone）、O-アセチルコルンビアネチン（O-Acetylcolumbianetin）、3-アセチルクマリン（3-Acetylcoumarin）、8-アセチル-6,7-ジメトキシクマリン（8-Acetyl-6,7-dimethoxycoumarin）、8-アセチル-7-ヒドロキシクマリン（8-Acetyl-7-hydroxycoumarin）、8-アセチル-6-ヒドロキシ-7-メトキシクマリン（8-Acetyl-6-hydroxy-7-methoxycoumarin）、8-アセチル-7-メトキシクマリン（8-Acetyl-7-methoxycoumarin）、3-アミノクマリン（3-Aminocoumarin）、ベルガモチン（Bergamotin）、ベルガプテン（Bergapten）、ベルガプトール（Bergaptol）、シトロプテン（Citropten）、2-クマル酸（2-Coumaric acid）、3-クマル酸（3-Coumaric acid）、クマリン（Coumarin）、クマル酸（Coumaric acid）、クメストロール（Coumestrol）、ダフネチン（Daphnetin）、ダフネチン-7-メチルエーテル（Daphnetin-7-methylether）、3,4-ジヒドロクマリン（3,4-Dihydrocoumarin）、5,7-ジヒドロキシ-4-メチルクマリン（5,7-Dihydroxy-4-methylcoumarin）、エスクレチンジベンジルエーテル（Esculetin dibenzylether）、4-エトキシクマリン（4-Ethoxycoumarin）、7-エトキシクマリン（7-Ethoxycoumarin）、フラキセチン（Fraxetin）、フラキシジン（Fraxidin）、ヘルニアリン（Herniarin）、3-ヒドロキシクマリン（3-Hydroxycoumarin）、4-ヒドロキシクマリン（4-Hydroxycoumarin）、インペラトリン（Imperatorin）、イソベルガプテン（Isobergapten）、イソピムピネリン（Isopimpinellin）、イソスコポレチン（Isoscopoletin）、6-メチルクマリン（6-Methylcoumarin）、ウンベリフェロン（Umbelliferone）、3-アセチル-α-ボスウェル酸（3-Acetyl-α-boswellic acid）、3-アセチル-β-ボスウェル酸（3-Acetyl-β-boswellic acid）、α-アミリン（α-Amyrin）、β-アミリン（β-Amyrin）、アルテミシニン（Artemisinin）、ベツリン（Betulin）、ベツリン酸（Betulinic acid）、ベツリン酸メチルエステル（Betulinic acid methyl ester）、ビロバリド（Bilobalide）、カフェストール（Cafestol）、(-)-カルベオール（(-)-Carveol）、(+)-カルボン（(+)-Carvone）、(-)-カルボン（(-)-Carvone）、カウロフィロゲニン（Caulophyllogenin）、デオキシアクテイン（Deoxyactein）、エリトロジオール（Erythrodiol）、ガノデリン酸A（Ganoderic acid A）、ヘデラゲニン（Hederagenin）、d-イソメントール（d-Isomenthol）、(±)イソメントン（(±)Isomenthone）、オレアノール酸（Oleanolic acid）、アリザリン（Alizarin）、アルカンニン（Alkannin）、アントラキノン（Anthraquinone）、1,4-ベンゾキノン（1,4-Benzoquinone）、2-tert-ブチル-p-キノン（2-Tert-butyl-p-quinone）、1,4-ジメチルアントラキノン（1,4-Dimethylanthraquinone）、エモジン（Emodin）、フィシオン（Physcion）、レイン（Rhein）、リオニレシノール（Lyoniresinol）、ウロリチン（Urolithin）、アマロゲンチン（Amarogentin）、6-メチルフラボン（6-Methylflavone）、4-ヒドロキシカルコン（4-Hydroxychalcone）、4'-ヒドロキシカルコン（4'-Hydroxychalcone）、クマリン酸（Coumalic acid）、レスベラトロール（Resveratrol）、コウジ酸（Kojic acid）、パルテノリド（Parthenolide）、イカリイン（Icariin）、ギンセノシドRb1（Ginsenoside Rb 1）、ギンゲロール（Gingerol）、10-ヒドロキシ-2-デセン酸（10-hydroxy-2-decenoic acid）、エピピノレジノールグルコシド（Epipinoresinol-Glc）、フィリリン（Phillyrin）、ピノレジノール（Pinoresinol）、エピピノレシオール（Epipinoresinol）、フィリゲニン（Phillygenin）、クルクミン１（Curcumin 1）、クルクミン２（Curcumin 2）、クルクミン３（Curcumin 3）、ジアセサミン（Diasesamin）、ホノキオール（Honokiol）、センニジンＡ（Sennidine A）、エスクレチン（Esculetin）、セサモール（Sesamol）、スコポレチン（Scopoletin）、ノルジヒドログアイアレチン酸（Nordihydroguaiaretic acid）、バニリン酸（Vanillic acid）、trans-けい皮酸（trans-Cinnamic acid）、アラントイン（Allantoin）、α-アサロン（α-Asarone）、(±)-シネフリン（(±)-Synephrine）、イタコン酸（Itaconic acid）、アシアチン酸（Asiatic acid）、ボルジン（Boldine）、シキミ酸（Shikimic acid）、チロソール（Tyrosol）、コロソリン酸（Corosolic acid）、ピセイン（Picein）、ロスマリン酸（Rosmarinic acid）、イソステビオール（Isosteviol）、アルテピリンC（Artepillin C）、アピオール（Apiole）、アズレン（Azulene）、マルビイン（Marrubiin）、(-)-ペリル酸（(-)-Perillic acid）、マデカシン酸（Madecassic acid）、マンギフェリン（Mangiferin）、リナロール（Linalool）、2-アニスアルデヒド（2-Anisaldehyde）、3-アニスアルデヒド（3-Anisaldehyde）、4-アニス酸（4-Anisic acid）、ウロカニン酸（Urocanic acid）、α-(-)-ビサボロール（α-(-)-Bisabolol）、(-)-transカリオフィレン（(-)-trans-Caryophyllene）、カリオフィレンオキシド（Caryophyllene oxide）、ハマメリタンニン（Hamamelitannin）、ペリルアルデヒド（Perillaldehyde）、ババキニンA（Bavachinin A）、ベトニシン（Betonicine）、(+)-クパレン（(+)-Cuparene）、ノートカトン（Nootkatone）、(-)-ペリリルアルコール（(-)-Perillylalcohol）、ピペルロングミン（Piperlongumine）、カマズレン（Chamazulen）、(-)-アサリニン（(-)-Asarinin）、(-)-セサミン（(-)-Sesamin）、2',4,4',6'-テトラヒドロキシカルコン（2',4,4',6'-Tetrahydroxychalcone）、ヒノキチオール（Hinokitiol）、フコキサンチン（Fucoxanthine）、エンテロジオール（Enterodiol）、マタイレシノール（Matairesinol）、トリゴネリン一水和物（Trigonelline monohydrate）、フラキシン（Fraxin）、ルペオール（Lupeol）、トラケロゲニン（Trachelogenin）、グリチルレチン酸（Glycyrrhetic acid）、グリチルリチン酸（Glycyrrhizic acid）、6-ヒドロキシ-4'-メトキシフラボン（6-Hydroxy-4'-methoxyflavone）、ジヒドロミリセチン（Dihydromyricetin）、2'-ヒドロキシカルコン（2'-Hydroxychalcone）、ゼルンボン（zerumbone）、オレアセイン（oleacein）、クロセチン（Crocetin）、二硝酸イソソルビド（Isosorbide Dinitrate）、ホモプロトカテク酸（Homoprotocatechuic acid）、グルタチオン（Glutathione）、コリラギン（Corilagin）、セサモリン（sesamolin）、オレウロペイン（Oleuropein）、ククルビタシンB（Cucurbitacin B）、ククルビタシンD（Cucurbitacin D）、ルチン三水和物（Rutin trihydrate）、ビテキシン（Vitexin）、オリエンチン（Orientin）、イソビテキシン（Isovitexin）、ビオランチン（Violanthin）、ナリンギン（Naringin）、サポナリン（Saponarin）、リモニン（Limonin）、チャフロシドB（Chafuroside B）、チャフロシドA（Chafuroside A）、シネンセチン（Sinensetin）、3',4',5,5',6,7,8-ヘプタメトキシフラボン（3',4',5,5',6,7,8-Heptamethoxyflavone）
【００４４】
一方で、ＰＩ３Ｋ／ＰＤＫ１／Ａｋｔに対して活性を促進する作用を有する薬剤としては、例えば、以下の化合物が挙げられる。
ＶＯ−Ｏｈｐｉｃ  ｔｒｉｈｙｄｒａｔｅ
ＳＦ１６７０
ｂｐＶ（ＨＯｐｉｃ）
これらの化合物は、ＰＩ３Ｋと逆の作用をするＰＴＥＮを阻害することで、間接的にＰＩ３Ｋ／ＰＤＫ１／Ａｋｔに対して活性を促進する効果があることが知られている。
【００４５】
２−４．ＦｏｘＯ１遺伝子発現抑制剤を用いたアンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の発現量を抑制するための組成物
一実施形態においては、組成物は、ＦｏｘＯ１遺伝子発現抑制剤を含む。これにより、ＦｏｘＯ１自体の発現量が減少する。そして、ＡＣＥ２及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の遺伝子の転写が減少し、ｍＲＮＡ量が減少する。典型的には、ＦｏｘＯ１遺伝子発現抑制剤の例として、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ）、あるいはｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）などを用いたＦｏｘＯ１遺伝子発現の阻害が挙げられる。
【００４６】
３．用途
一実施形態において、本開示の組成物は、アンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）及び／又はＴＭＰＲＳＳ２が関与する疾患の治療及び／又は予防に利用することができる。具体的には、これらが関与する感染症の治療及び／又は予防に利用することができる。感染症の例としては、コロナウィルス感染症、例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ又はＳＡＲＳ−ＣｏＶ２などのウイルスによる感染症が挙げられる。好ましくは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２による感染症（ＣＯＶＩＤ１９）である。これらのウイルスは、ヒト細胞のＡＣＥ２受容体に、自身のスパイクタンパク質を結合させ、これを足掛かりとして細胞内に侵入する。また、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２は、ヒト細胞の表面のＡＣＥ２と結合した後、ヒト細胞のＴＭＰＲＳＳ２の酵素処理によって、細胞内への侵入効率が増強される。従って、ＡＣＥ２及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の発現を抑制することで、こうしたウイルスによる細胞の侵入を抑制することができる。これによって感染を抑制することができる。
【００４７】
こうしたアプローチのメリットは、ウイルス側の変異による影響を受けにくい点にある。一般にＳＡＲＳ−ＣＶ２をはじめとするＲＮＡ型ウイルスは、変異を起こしやすい。そして、ウイルス表面のタンパク質（例えば、スパイクタンパク質）は、ワクチンのターゲットとされるものの、このタンパク質に変異が起こることにより、ワクチンによる効果が回避されてしまう問題があった。しかし、このアプローチでは、変異による直接的な影響は受けにくいという点で、有利である。
【００４８】
また、特筆すべきは、本開示の組成物は、感染の治療のみならず、感染の予防にも寄与することができる。例えば、感染の治療には、抗炎症作用などに基づいたアプローチがあるが、こうしたアプローチは、感染が起こった後での対処法となるため、予防には寄与できない。しかし、本開示の組成物は、いったん感染が起こってウイルスが増殖した後でも、他の細胞への更なる感染を防ぐという意味では、治療薬としても寄与できる。しかし、それだけではなく、感染する前の状態であっても、予め投与することで、ウイルスが感染する際の足掛かりとなる遺伝子の発現を抑制することで、細胞への感染を防ぐという意味で予防薬としても寄与できる。
【００４９】
従って、一実施形態において、本開示の組成物は、投与形態に応じて、適切な追加成分を配合してもよい。例えば、本開示の組成物は、医薬品に一般的に含まれる成分を含んでもよい。当該成分の例として、保存料、防腐剤、香料、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、防カビ剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤などが挙げられる。
【実施例】
【００５０】
４．実施例
４−１．実施例１（ＨｅｐＧ２細胞の培養）
ＨｅｐＧ２細胞はＡＴＣＣ（登録商標）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＨＢ−８０６５）から購入した。当該細胞はＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ，Ｄ８９００）＋１０％ＦＢＳ（ＳＩＧＭＡ，Ｆ７５２４）の血清培地を用いて継代・維持した。
【００５１】
４−２．実施例２（インスリンの効果）
ＨｅｐＧ２細胞を１２  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標），３３３６）の各ウェルに５０，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2で播種し、一晩培養した。翌日（播種後１６〜２４時間）、野生型および改変型インスリンを１０μｇ／ｍｌで添加し、又はコントロールとしてＰＢＳ（−）を加え、３日（約７２時間）培養した。培養後、ＲｅｌｉａＰｒｅｐ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標），  Ｚ６０１２）を用いてＨｅｐＧ２細胞からＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。抽出後、５００ｎｇのＲＮＡを用いてｃＤＮＡ合成（ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ；  Ｔａｋａｒａ（登録商標），  ＲＲ０３６Ａ）を行い、更に、定量的ＰＣＲ（Ｔｈｕｎｄｅｒｂｉｒｄ（登録商標）  Ｓｙｂｒ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ；  ＴＯＹＯＢＯ（登録商標），  ＱＰＳ−２０１Ｘ５）を行った。
【００５２】
ｃＤＮＡ合成のためのミクスチャは以下の組成に従って調製した。
５ｘＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ２μｌ（最終濃度  １ｘ）
Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ                                          ５００  ｎｇ
ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  Ｈ2Ｏ                            合計１０  μｌに調整
【００５３】
上記ミクスチャを、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）社のＶｅｒｉｔｉ  ９６  ｗｅｌｌ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒを用いて、以下の条件で処理した。
３７℃  １５分
↓
８５℃  ５秒
↓
４℃  ∞
【００５４】
合成したｃＤＮＡ（１０  μｌ）は９０μｌのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０  ＋  １ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０）を用いて１０倍に希釈した。当該希釈物を、定量ＰＣＲに供した。
【００５５】
４−３．実施例３（ＨｅｐＧ２細胞におけるＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２遺伝子発現の解析）
より具体的には、当該希釈物を、以下の条件で混合した。
２×ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（登録商標）  Ｐｒｏｂｅ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ              １０μｌ
５ｍＭ  Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ                                ０．４μｌ
５ｍＭ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ                                ０．４μｌ
Ｈ2Ｏ                                                                ８．２μｌ
ｃＤＮＡ（１０倍希釈）                                                １  μｌ
【００５６】
上記混合物を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）社のＣＦＸ−Ｃｏｎｎｅｃｔを用いて、ｃＤＮＡを増幅させた。ＰＣＲサイクルの条件は以下の通りであった。
１．９５℃  １分    （初期変性）
２．９５℃  １５秒  （変性）
３．６０℃  ３０秒  （伸長）
（２−３のステップを４０回繰り返し、ステップ３が終わるたびに蛍光シグナルを検出）
４．６５  ℃  〜  ９５  ℃まで０．５  ℃刻みで温度を上昇させ、５秒ずつ温度を保持してから蛍光シグナルを検出
【００５７】
上記サイクルにて、ＰＣＲ産物の検出を行い、併せて、Ｍｅｌｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅによるＰＣＲ産物の単一性の確認を行った。
【００５８】
内部標準（すべての細胞・条件において同じ発現をしているハウスキーピング遺伝子）として、ＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を用いた。
各遺伝子を検出するためのプライマー配列は以下の通りであった。
GAPDH Forward primer: 5’ - agccacatcgctcagacac - 3’
GAPDH Reverse primer: 5’ - gcctaatacgaccaaatcc - 3’
ACE2 Forward primer: 5’ - ttctgtcacccgattttcaa - 3’
ACE2 Reverse primer: 5’ - tcccaacaatcgtgagtgc - 3’
TMPRSS2 Forward primer: 5’ - cgctggcctactctggaa - 3’
TMPRSS2 Reverse primer: 5’ - ctgaggagtcgcactctatcc - 3’
【００５９】
全てのプライマーは株式会社ファスマック（登録商標）から購入した（逆相カラム精製グレード）。
各遺伝子の発現量は、定量ＰＣＲで得られた各遺伝子の発現量を、さらにＧＡＰＤＨの発現量で割って標準化したものを示している。さらに、インスリンで処理をしていないコントロール条件（ＰＢＳ（−）処理）での発現量を「１」になるように標準化している。以上のプライマーを用いて増幅したＰＣＲ産物は全て単一のものであること（つまり、同一のプライマーで、複数種類の配列が増幅されていないこと）をＭｅｌｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅによって確認した。
【００６０】
結果を図１に示す。コントロールのＰＢＳ（−）処理と比較すると、野生型インスリンを加えると、ＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２のｍＲＮＡの発現が減少することが観察された（多重比較検定（Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法））。この結果は、インスリンとその下流のシグナル伝達経路がＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２のｍＲＮＡの発現を抑制することを示している。
【００６１】
インスリンは、遺伝子工学によってアミノ酸に変異が導入され、その効果が投与後いつ現れるか、そしてどの程度持続するか、によって、超速効型インスリン、速効型インスリン、中間型インスリン、などの改変型インスリンが製造され、糖尿病患者の病態によって使い分けがなされている。そこで、これらの改変型インスリンを用いて、野生型のインスリンによるＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２のｍＲＮＡの発現の減少が観察されるか、検討した。
【００６２】
具体的には、以下の改変型インスリンを使用した。
商品名：リスプロ（インスリン  リスプロ）（超速効型）
商品名：ノボラピッド（登録商標）（インスリン  アスパルト）（超速効型）
商品名：アピドラ（登録商標）（インスリン  グルリジン）（超速効型）
商品名：ヒューマリン（登録商標）Ｒ（レギュラーインスリン）（速効型）
商品名：ヒューマリン（登録商標）Ｎ（イソフェンインスリン）（中間型）
商品名：ノボリン（登録商標）Ｎ（イソフェンインスリン）（中間型）
商品名：ノボラピッド（登録商標）３０ミックス（インスリンアスパルト（超速効型）とプロタミン結晶性インスリンアスパルト（中間型）を３：７で混合したもの）（混合型）
商品名：レベミル（登録商標）（インスリン  デテミル）（持効型溶解性）
商品名：ライゾデグ（登録商標）（インスリンアスパルト（超速効型）とインスリンデグルデク（持効型）を３：７で混合したもの）（配合溶解性）
【００６３】
野生型インスリンは、Ａ鎖とＢ鎖が結合した合計５１個のアミノ酸配列から構成される。以下に、上述したインスリンのアミノ酸配列を示す。
【００６４】
Ａ鎖（全て共通）
Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｃｙｓ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ａｓｎ  
【００６５】
Ｂ鎖（下線部は、相互に相違するアミノ酸部分を示す）
Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ（ヒト野生型、レギュラーインスリン）
Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ（アスパルト）
Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ（リスプロ）
Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｇｌｎ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｔｈｒ（グルリジン）
Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  −Ｍｙｒｉｓｔｉｃ  Ａｃｉｄ（デテミル）
Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  −γ−Ｇｌｕ−Ｎε−ｈｅｘａｄｅｃａｎｄｉｏｙｌ（デグルデク）
【００６６】
イソフェンインスリンは別名ＮＰＨインスリンとも呼ばれ、野生型（レギュラー）インスリンとプロタミンが結合・結晶化したものである。プロタミン結晶性インスリンアスパルトはプロタミンとインスリンアスパルトが結合・結晶化したものである。
【００６７】
結果を図２に示す。コントロールのＰＢＳ（−）処理と比較すると、どの改変型インスリンを加えても、野生型インスリンと同程度のＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２のｍＲＮＡの発現減少が観察された。この結果は、どのタイプのインスリン製剤であっても、インスリンの下流のシグナル伝達経路を活性化する限りは、ＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２のｍＲＮＡの発現を抑制できることを示している。
【００６８】
４−４．実施例４（スパイクタンパク質の細胞内への取り込みへの影響）
次に、インスリンによるＡＣＥ２の発現抑制が、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２とホスト細胞の結合及び細胞内への取り込みを阻害できるか検討した。この目的で、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２のスパイクタンパク質のＳ１ドメイン、さらにＳ１の中でＡＣＥ２に結合するために必要十分な領域ＲＢＤ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎ、Ｒ３１９〜Ｆ５４１）にマウスＩｇＧのＦｃ領域が融合されたリコンビナントタンパク質Ｓ１−ｍＦｃ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、４０５９２−Ｖ０５Ｈ１）、及びＲＢＤ−ｍＦｃ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、４０５９２−Ｖ０５Ｈ２）を準備した。実験の模式図を図３に示す。
【００６９】
ＨｅｐＧ２細胞を６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（ＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）；  Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標），  ３３３５）の各ウェルに１００，０００  個を播種し、一晩培養した。翌日（播種後１６〜２４時間）、野生型インスリンを１０μｇ／ｍｌの濃度で添加、又はＰＢＳ（−）をコントロールとして加え、３日間培養した（約７２時間）。培養後、最終濃度が１００ｎＭとなるようにＲＢＤ−ｍＦｃ、またはコントロールとして何も融合していないマウスＩｇＧ由来Ｆｃ領域（ｍＦｃ；Ａｂｃａｍ（登録商標），ａｂ１７９９８２）を添加し、さらに３時間培養した。その後、ＰＢＳ（−）で細胞を洗浄後、剥離し細胞を回収した。回収した細胞は４％  パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）（富士フィルム和光純薬、  １６３−２０４１１５）で１５分間室温で固定した。固定後、ＰＢＳ（−）で洗浄し、マウスＩｇＧを認識する抗体にＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ４８８蛍光色素が共有結合した二次抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，７１５−５４５−１５０）で細胞表面や細胞内に取り込まれたｍＦｃを染色し、フローサイトメトリー（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ（登録商標），ＦＣ５００）を用いて一細胞あたりのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ４８８の蛍光強度を測定し、定量した。解析にはＫａｌｕｚａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ２．１（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ（登録商標））を用いた。
【００７０】
まず、ネガティブコントロールであるｍＦｃを添加した際の細胞の示す蛍光強度は、ＡＣＥ２を介さずにｍＦｃのみで取り込まれてしまったもの、二次抗体が非特異的に結合してしまったもの、及び細胞のもつ自家蛍光、の３つに由来し、これはバックグラウンドシグナルと考えられる。従って、ｍＦｃでの蛍光強度を引くことで、より正確に取り込まれたＳ１、及びＲＢＤ由来のシグナルの差を正確に比較することが可能になる。そこで、ｍＦｃでの蛍光強度を引いたうえで、コントロールのＰＢＳ（−）を添加した際のＳ１、及びＲＢＤの蛍光シグナルと比較すると、インスリンで予め処理することで、Ｓ１、及びＲＢＤ由来の蛍光シグナルの強度が有意に減少した（図４参照、多重比較検定（Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法））。すなわち、この結果はインスリンによってＳ１、及びＲＢＤのＨｅｐＧ２細胞への取り込みが抑制されたことを示しており、インスリンによるＡＣＥ２等のｍＲＮＡ発現量の抑制が、Ｓ１、及びＲＢＤのＨｅｐＧ２細胞への取り込みを抑制できるレベルまで抑えていることを示唆している。
【００７１】
さらに、この結果はインスリンによって、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２がホスト細胞に結合し感染する（取り込まれる）ことが抑制されることを示唆している。
【００７２】
以上の実験結果から示される、一実施形態における本開示のインスリン系化合物の新型コロナウィルスの細胞内への取り込みが阻害される作用機序を図５にまとめた。インスリン系化合物は細胞に作用して、ＡＣＥ２及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の遺伝子の発現を抑制する。これによって、細胞表面のＡＣＥ２及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の量が減少する。そして、ウイルス表面に存在するスパイクタンパク質とＡＣＥ２との結合が阻害される。また、ＴＭＰＲＳＳ２によるウイルスの細胞内への侵入の促進効果も抑制される。そしてその結果として、ＡＣＥ２及び／又はＴＭＰＲＳＳ２によって介在される感染症、特にコロナウィルスや、その他の疾患の予防又は治療効果をもたらす。
【００７３】
４−５．実施例５（成長因子による効果）
実施例１〜３と同様の実験を行った。ただし、各種インスリン化合物に代えて、以下の成長因子を１０ｎｇ／ｍｌの濃度で使用した。これらは、シグナル経路の下流として、ＦｏｘＯ１を抑制することが知られている。
ＩＧＦ１（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社、製品番号ＡＦ−１００−１１）、
ＩＧＦ２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社、製品番号ＡＦ−１００−１２）、
ＥＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社、製品番号ＡＦ−１００−１５）、
ＦＧＦ２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社、製品番号ＡＦ−１００−１８Ｂ）、
ＦＧＦ１４（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ（登録商標）社、製品番号７３４７）、
ＶＥＧＦ１６５（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社、製品番号ＡＦ−１００−２０）、
【００７４】
上記の成長因子のアミノ酸配列は以下のとおりである。
【００７５】
ＩＧＦ１
https://www.peprotech.com/gb/recombinant-human-igf-i-2
Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｎ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｍｅｔ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ａｌａ
【００７６】
ＩＧＦ２
https://www.peprotech.com/en/recombinant-human-igf-ii-2
Ａｌａ  Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ
【００７７】
ＥＧＦ
https://www.peprotech.com/en/recombinant-human-egf
Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ｌｅｕ  Ｈｉｓ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ  Ｍｅｔ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｃｙｓ  Ａｓｎ  Ｃｙｓ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｃｙｓ  Ｇｌｎ  Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｔｒｐ  Ｔｒｐ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ
【００７８】
ＦＧＦ２
https://www.peprotech.com/en/recombinant-human-fgf-basic-154-aa-2
Ａｌａ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｈｉｓ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｉｌｅ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｈｉｓ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｍｅｔ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｃｙｓ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｔｒｐ  Ｔｙｒ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｔｙｒ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｍｅｔ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ
【００７９】
ＦＧＦ１４
https://www.biovision.com/fgf14-human-recombinant.html
Ｍｅｔ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｍｅｔ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｍｅｔ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ｈｉｓ  Ｔｒｐ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｍｅｔ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｍｅｔ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｍｅｔ  Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ
【００８０】
ＶＥＧＦ  １６５
https://www.peprotech.com/en/recombinant-human-vegfsub165sub-2
Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｍｅｔ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｇｌｎ  Ｇｌｕ  Ｔｙｒ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｇｌｕ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ａｒｇ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｃｙｓ  Ａｓｎ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｍｅｔ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｍｅｔ  Ａｒｇ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｈｉｓ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｈｉｓ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｍｅｔ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｈｉｓ  Ａｓｎ  Ｌｙｓ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｇｌｎ  Ｔｈｒ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｃｙｓ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ｃｙｓ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ａｒｇ
【００８１】
結果を図６に示す。いずれの成長因子もコントロールと比べて、ＡＣＥ２及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の発現量について有意な差をもたらす結果となった。このことは、上記インスリン系化合物と同様に、成長因子がＡＣＥ２及び／又はＴＭＰＲＳＳ２によって介在される感染症、特にコロナウィルスや、その他の疾患の予防又は治療効果をもたらすことを示す。
【００８２】
４−６．参考例１（ＡＳ１８４２８５６による効果）
ＡＳ１８４２８５６は、ＦｏｘＯ１に直接結合して、ＦｏｘＯ１の転写因子の活性を阻害することが知られている（ただし、上述の定義にある通り、本明細書で規定する「ＦｏｘＯ１阻害剤」には含まれない）。参考例としてＡＳ１８４２８５６を用いて以下の実験を行った。
【００８３】
４−６−１．ＨｅｐＧ２細胞の培養
ＨｅｐＧ２細胞はＡＴＣＣ（登録商標）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＨＢ−８０６５）から購入した。当該細胞はＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ，Ｄ８９００）＋１０％ＦＢＳ（ＳＩＧＭＡ，Ｆ７５２４）の血清培地を用いて継代・維持した。
【００８４】
４−６−２．ＦｏｘＯ１阻害剤の効果
ＨｅｐＧ２細胞を１２  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標），３３３６）の各ウェルに５０，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2で播種し、一晩培養した。翌日（播種後１６〜２４時間）、ＦｏｘＯ１阻害剤ＡＳ１８４２８５６を複数の濃度で添加（１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ）し、又はその溶媒として用いたＤＭＳＯをコントロールとして加え、１日（約２４時間）培養した。培養後、ＲｅｌｉａＰｒｅｐ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標），  Ｚ６０１２）を用いてＨｅｐＧ２細胞からＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。抽出後、５００ｎｇのＲＮＡを用いてｃＤＮＡ合成（ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ；  Ｔａｋａｒａ（登録商標），  ＲＲ０３６Ａ）を行い、更に、定量的ＰＣＲ（Ｔｈｕｎｄｅｒｂｉｒｄ（登録商標）  Ｓｙｂｒ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ；  ＴＯＹＯＢＯ（登録商標），  ＱＰＳ−２０１Ｘ５）を行った。
【００８５】
ｃＤＮＡ合成のためのミクスチャは以下の組成に従って調製した。
５ｘＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ２  μｌ（最終濃度  １  ｘ）
Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ                                          ５００  ｎｇ
ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  Ｈ2Ｏ                            合計１０  μｌに調整
【００８６】
上記ミクスチャを、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）社のＶｅｒｉｔｉ  ９６  ｗｅｌｌ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒを用いて、以下の条件で処理した。
３７℃  １５分
↓
８５℃  ５秒
↓
４℃  ∞
【００８７】
合成したｃＤＮＡ（１０  μｌ）は９０μｌのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０  ＋  １ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０）を用いて１０倍に希釈した。当該希釈物を、定量ＰＣＲに供した。
【００８８】
４−６−３．ＨｅｐＧ２細胞におけるＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２遺伝子発現の解析
より具体的には、当該希釈物を、以下の条件で混合した。
２×ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（登録商標）  Ｐｒｏｂｅ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ              １０μｌ
５ｍＭ  Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ                                ０．４μｌ
５ｍＭ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ                                ０．４μｌ
Ｈ2Ｏ                                                               ８．２μｌ
ｃＤＮＡ（１０倍希釈）                                                １  μｌ
【００８９】
上記混合物を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）社のＣＦＸ−Ｃｏｎｎｅｃｔを用いて、ｃＤＮＡを増幅させた。ＰＣＲサイクルの条件は以下の通りであった。
１．９５℃  １分    （初期変性）
２．９５℃  １５秒  （変性）
３．６０℃  ３０秒  （伸長）
（２−３のステップを４０回繰り返し、ステップ３が終わるたびに蛍光シグナルを検出）
４．６５  ℃  〜  ９５  ℃まで０．５  ℃刻みで温度を上昇させ、５秒ずつ温度を保持してから蛍光シグナルを検出
【００９０】
上記サイクルにて、ＰＣＲ産物の検出を行い、併せて、Ｍｅｌｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅによるＰＣＲ産物の単一性の確認を行った。
【００９１】
内部標準（すべての細胞・条件において同じ発現をしているハウスキーピング遺伝子）として、ＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を用いた。
各遺伝子を検出するためのプライマー配列は以下の通りであった。
GAPDH Forward primer: 5’ - agccacatcgctcagacac - 3’
GAPDH Reverse primer: 5’ - gcctaatacgaccaaatcc - 3’
ACE2 Forward primer: 5’ - ttctgtcacccgattttcaa - 3’
ACE2 Reverse primer: 5’ - tcccaacaatcgtgagtgc - 3’
TMPRSS2 Forward primer: 5’ - cgctggcctactctggaa - 3’
TMPRSS2 Reverse primer: 5’ - ctgaggagtcgcactctatcc - 3’
【００９２】
全てのプライマーは株式会社ファスマック（登録商標）から購入した（逆相カラム精製グレード）。
各遺伝子の発現量は、定量ＰＣＲで得られた各遺伝子の発現量を、さらにＧＡＰＤＨの発現量で割って標準化したものを示している。さらに、ＦｏｘＯ１阻害剤で処理をしていないコントロール条件（ＤＭＳＯ処理）での発現量を「１」になるように標準化している。以上のプライマーを用いて増幅したＰＣＲ産物は全て単一のものであること（つまり、同一のプライマーで、複数種類の配列が増幅されていないこと）をＭｅｌｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅによって確認した。
【００９３】
結果を図７に示す。コントロールのＤＭＳＯ処理と比較すると、ＦｏｘＯ１阻害剤ＡＳ１８４２８５６を加えると、その濃度依存的にＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２のｍＲＮＡの発現が減少することが観察された（多重比較検定（Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法））。この結果は、ＦｏｘＯ１がＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２のｍＲＮＡの発現に必要であることを示している。
【００９４】
４−６−４．スパイクタンパク質の細胞内への取り込みへの影響
次に、ＦｏｘＯ１阻害剤によるＡＣＥ２の発現抑制が、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２とホスト細胞の結合及び細胞内への取り込みを阻害できるか検討した。この目的で、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２のスパイクタンパク質のＳ１の中でＡＣＥ２に結合するために必要十分な領域ＲＢＤ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎ、Ｒ３１９〜Ｆ５４１）にマウスＩｇＧのＦｃ領域が融合されたリコンビナントタンパク質ＲＢＤ−ｍＦｃ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、４０５９２−Ｖ０５Ｈ２）を準備した。実験の模式図を図８に示す。
【００９５】
ＨｅｐＧ２細胞を６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（ＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）；  Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標），  ３３３５）の各ウェルに１００，０００  個を播種し、一晩培養した。翌日（播種後１６〜２４時間）、ＦｏｘＯ１阻害剤ＡＳ１８４２８５６を１μＭの濃度で添加、又はその溶媒として用いたＤＭＳＯをコントロールとして加え、３日間培養した（約７２時間）。培養後、最終濃度が１００ｎＭとなるようにＲＢＤ−ｍＦｃ、またはコントロールとして何も融合していないマウスＩｇＧ由来Ｆｃ領域（ｍＦｃ；Ａｂｃａｍ（登録商標），ａｂ１７９９８２）を添加し、さらに３時間培養した。その後、ＰＢＳ（−）で細胞を洗浄後、剥離し細胞を回収した。回収した細胞は４％  パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）（富士フィルム和光純薬、  １６３−２０４１１５）で１５分間室温で固定した。固定後、ＰＢＳ（−）で洗浄し、マウスＩｇＧを認識する抗体にＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ４８８蛍光色素が共有結合した二次抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，７１５−５４５−１５０）で細胞表面や細胞内に取り込まれたｍＦｃを染色し、フローサイトメトリー（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ（登録商標），ＦＣ５００）を用いて一細胞あたりのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ４８８の蛍光強度を測定し、定量した。解析にはＫａｌｕｚａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ２．１（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ（登録商標））を用いた。典型的な細胞の写真は、蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ、ＢＸ−７００）を用いて撮影した。
【００９６】
結果を図９に示す。まず、Ｓ１及びＲＢＤがＨｅｐＧ２細胞に取り込まれ得るのか、免疫染色法及び蛍光顕微鏡を用いて観察した。コントロールのｍＦｃを添加した場合には、全くほとんど蛍光シグナルが検出されなかったのに対し、ＲＢＤ−ｍＦｃは５０％近くの細胞で観察された。これらの結果から、ＨｅｐＧ２細胞はＲＢＤを取り込むことが示唆された。
【００９７】
次に、ＦｏｘＯ１阻害剤ＡＳ１８４２８５６を用いて、あらかじめＡＣＥ２の発現を抑制した時、取り込まれるＲＢＤの量が抑制されるかフローサイトメトリーを用いて検討した。蛍光強度の違いを図１０に示す。まず、ネガティブコントロールであるｍＦｃを添加した際の細胞の示す蛍光強度は、ＡＣＥ２を介さずにｍＦｃのみで取り込まれてしまったもの、二次抗体が非特異的に結合してしまったもの、及び細胞のもつ自家蛍光、の３つに由来し、これはバックグラウンドシグナルと考えられる。従って、ｍＦｃでの蛍光強度を引くことで、より正確に取り込まれたＲＢＤ由来のシグナルの差を正確に比較することが可能になる。すると、コントロールのＤＭＳＯを添加した際のＲＢＤの蛍光シグナルと比較すると、ＦｏｘＯ１阻害剤ＡＳ１８４２８５６で予め処理することで、ＲＢＤ由来の蛍光シグナルの強度が有意に減少した（Ｔ検定；ｐ＜０．０００５）。すなわち、この結果はＦｏｘＯ１阻害剤によってＲＢＤのＨｅｐＧ２細胞への取り込みが抑制されたことを示しており、ＦｏｘＯ１阻害剤によるＡＣＥ２等のｍＲＮＡ発現量の抑制が、ＲＢＤのＨｅｐＧ２細胞への取り込みを抑制できるレベルまで抑えていることを示唆している。
【００９８】
さらに、この結果はＦｏｘＯ１阻害剤によって、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２がホスト細胞に結合し感染する（取り込まれる）ことが抑制されることを示唆している。
【００９９】
４−７．参考例２（培養上清による効果）
４−７−１．間葉系幹細胞の初代培養
はじめに、脂肪組織由来間葉系幹細胞（ＡＤ−ＭＳＣ）を準備した。具体的には、脂肪組織由来間葉系幹細胞を用いた再生医療を受ける予定の患者より、皮下脂肪組織を分取した。当該皮下脂肪組織は、投与用細胞の調製に必要な原料となる。当該皮下脂肪組織を分取した後の剰余を、初代培養に供した。なお、予め、患者から研究利用に関する同意を取得した。
【０１００】
皮下脂肪組織を遠心分離（４００×ｇで５分間）に供し、３層に分離した。具体的には、上層から順に脂質画分、脂肪組織画分、及び水性画分の３層に分離した。中層の脂肪組織画分を残して、上層と下層を破棄した。残した脂肪組織画分に対して、組織重量当たり４倍量の０．１５％コラゲナーゼ酵素溶液を添加した。３７℃で１時間浸透させ、酵素処理を行った。脂肪組織が酵素処理によって分散された後、当該脂肪組織を、遠心分離（４００×ｇで５分間）に供した。間葉系幹細胞を含む間質血管細胞画分として、沈殿画分を３０ｍＬのＰＢＳ（−）溶液で懸濁した。その後、セルストレーナー（メッシュサイズ７０μｍ径）に懸濁液を通液し、セルストレーナーに捕捉された組織残渣等は破棄した。そして、通液画分を再度遠心分離（４００×ｇで５分間）に供し、沈殿画分を６ｍＬの無血清培養液ｓｆ−ＤＯＴ（バイオミメティクスシンパシーズ社）で懸濁した。細胞懸濁液全量を、Ｔ２５フラスコ（ＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）；  Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標），  ３２８９）に播種し、インキュベータ内（３７℃，５％ＣＯ2）に静置して初代培養を開始した。又、臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ−ＭＳＣ）も、同様に、妊婦から研究利用に関する同意を得たのちに、医院から組織の提供を受け、脂肪組織と同様の下記掲載の酵素処理工程を経て初代培養を開始した。
【０１０１】
４−７−２．継代培養
３日に１回の頻度で培地全交換を実施した。上澄みは破棄して、フラスコ底面上で増殖する細胞を選択的に増殖させた。セミコンフルエントまで増殖したＴ−２５フラスコ内の細胞に対して、２ｍＬの酵素溶液（ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ；  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１２６０４０２１）を添加し、細胞をフラスコの底面から剥離した（３７℃、５分間静置）。細胞をＰＢＳ（−）で希釈し、遠心分離（４００×ｇで５分間）に供した。沈殿した細胞を培養液ｓｆ−ＤＯＴで懸濁し、一部を分取してトリパンブルー染色法による細胞数計測を行なった。新たなＴ７５フラスコ（ＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）；  Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標），  ３２９０）にｓｆ−ＤＯＴで懸濁した細胞を播種し、インキュベータ内（３７℃，５％ＣＯ2）に静置して継代培養を行った（Ｐ０→Ｐ１）。その後も同様の手順で継代培養を行い、必要な細胞数を得た。
【０１０２】
４−７−３．ＨｅｐＧ２細胞の培養
ＨｅｐＧ２細胞はＡＴＣＣ（登録商標）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＨＢ−８０６５）から購入した。当該細胞はＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ，Ｄ８９００）＋１０％ＦＢＳ（ＳＩＧＭＡ，Ｆ７５２４）の血清培地を用いて継代・維持した。
【０１０３】
４−７−４．ＨｅｐＧ２細胞と間葉系幹細胞の非接触型共培養
ＨｅｐＧ２細胞を６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（ＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）；  Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標），  ３３３５）の各ウェルに１００，０００個の細胞を播種した。そこに、トランスウェル（６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ用２４ｍｍインサート，０．４μｍ  ｐｏｒｅサイズ；Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標），  ３４１２）を載せた。トランスウェル内にもＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを適量注ぎ、さらにそこに何も細胞を播種しないコントロール（ＨｅｐＧ２細胞のみ）、脂肪由来間葉系幹細胞を播種（ＨｅｐＧ２とＡＤ−ＭＳＣの共培養）、及び臍帯由来間葉系幹細胞を播種した（ＨｅｐＧ２とＵＣ−ＭＳＣの共培養）ものを用意した。播種したＡＤ−ＭＳＣ及びＵＣ−ＭＳＣはともに１００，０００個である。尚、用いたトランスウェルはあらかじめＰＬＬ（Ｐｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ；Ｃｕｌｔｒｅｘ，３４３８−１００−０１）でコーティングすることで、間葉系幹細胞がトランスウェルに張り付くことを可能にしている。コーティングは一晩かけて３７℃で行った。そして余分なＰＬＬは滅菌水で洗浄・除去した。トランスウェルを介してＨｅｐＧ２細胞と間葉系幹細胞を３日間共培養した（約７２時間）。培養後、ＲｅｌｉａＰｒｅｐ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標），  Ｚ６０１２）を用いてＨｅｐＧ２細胞からＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。抽出後、５００ｎｇのＲＮＡを用いてｃＤＮＡ合成（ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ；  Ｔａｋａｒａ（登録商標），  ＲＲ０３６Ａ）を行い、更に、定量的ＰＣＲ（Ｔｈｕｎｄｅｒｂｉｒｄ（登録商標）  Ｓｙｂｒ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ；  ＴＯＹＯＢＯ（登録商標），  ＱＰＳ−２０１Ｘ５）を行った。
【０１０４】
ｃＤＮＡ合成のためのミクスチャは以下の組成に従って調製した。
５ｘＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ２  μｌ（最終濃度  １  ｘ）
Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ                                          ５００  ｎｇ
ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  Ｈ2Ｏ                            合計１０  μｌに調整
【０１０５】
上記ミクスチャを、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）社のＶｅｒｉｔｉ  ９６  ｗｅｌｌ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒを用いて、以下の条件で処理した。
３７℃  １５分
↓
８５℃  ５秒
↓
４℃  ∞
【０１０６】
合成したｃＤＮＡ（１０  μｌ）は９０μｌのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０  ＋  １ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０）を用いて１０倍に希釈した。当該希釈物を、定量ＰＣＲに供した。
【０１０７】
４−７−５．ＨｅｐＧ２細胞におけるＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２遺伝子発現の解析
より具体的には、当該希釈物を、以下の条件で混合した。
２×ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（登録商標）  Ｐｒｏｂｅ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ              １０μｌ
５ｍＭ  Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ                                ０．４μｌ
５ｍＭ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ                                ０．４μｌ
Ｈ2Ｏ                                                                ８．２μｌ
ｃＤＮＡ（１０倍希釈）                                                １  μｌ
【０１０８】
上記混合物を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）社のＣＦＸ−Ｃｏｎｎｅｃｔを用いて、ｃＤＮＡを増幅させた。ＰＣＲサイクルの条件は以下の通りであった。
１．９５℃  １分    （初期変性）
２．９５℃  １５秒  （変性）
３．６０℃  ３０秒  （伸長）
（２−３のステップを４０回繰り返し、ステップ３が終わるたびに蛍光シグナルを検出）
４．６５  ℃  〜  ９５  ℃まで０．５  ℃刻みで温度を上昇させ、５秒ずつ温度を保持してから蛍光シグナルを検出
【０１０９】
上記サイクルにて、ＰＣＲ産物の検出を行い、併せて、Ｍｅｌｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅによるＰＣＲ産物の単一性の確認を行った。
【０１１０】
内部標準（すべての細胞・条件において同じ発現をしているハウスキーピング遺伝子）として、ＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を用いた。
各遺伝子を検出するためのプライマー配列は以下の通りであった。
GAPDH Forward primer: 5’ - agccacatcgctcagacac - 3’
GAPDH Reverse primer: 5’ - gcctaatacgaccaaatcc - 3’
ACE2 Forward primer: 5’ - ttctgtcacccgattttcaa - 3’
ACE2 Reverse primer: 5’ - tcccaacaatcgtgagtgc - 3’
TMPRSS2 Forward primer: 5’ - cgctggcctactctggaa - 3’
TMPRSS2 Reverse primer: 5’ - ctgaggagtcgcactctatcc - 3’
【０１１１】
全てのプライマーは株式会社ファスマック（登録商標）から購入した（逆相カラム精製グレード）。
各遺伝子の発現量は、定量ＰＣＲで得られた各遺伝子の発現量を、さらにＧＡＰＤＨの発現量で割って標準化したものを示している。さらに、共培養していないコントロール条件での発現量を「１」になるように標準化している。以上のプライマーを用いて増幅したＰＣＲ産物は全て単一のものであること（つまり、同一のプライマーで、複数種類の配列が増幅されていないこと）をＭｅｌｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅによって確認した。
【０１１２】
結果を図１１に示す。コントロールである、ＨｅｐＧ２細胞のみにおける、ＨｅｐＧ２細胞のＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２のｍＲＮＡ発現量と比較して、ＡＤ−ＭＳＣ及びＵＣ−ＭＳＣと共培養したＨｅｐＧ２細胞ではＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２のｍＲＮＡ発現量が有意に減少していることが観察された（多重比較検定（Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法）、以降でも同じ）。この結果から、上層で培養したＡＤ−ＭＳＣ及びＵＣ−ＭＳＣから分泌された何らかの因子がトランスウェルの穴（０．４μｍ  ｐｏｒｅサイズ）を通じて下層のＨｅｐＧ２細胞に影響を及ぼし、ＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２のｍＲＮＡ発現量を低下させたと考えられ、間葉系幹細胞がＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２のｍＲＮＡ発現量を抑制する可能性が示唆された。
【０１１３】
次に、「４−７−１」〜「４−７−５」に示す手順と同様の実験を行った。ただし、ＨＨｅｐＧ２細胞には、培養上清だけでなく、ＰＤＫ１に直接作用する阻害剤であるＢＸ−７９５を１０μＭ投与した。結果を図１２に示す。図１１の結果と一致して、培養上清は、ＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２にｍＲＮＡ発現量を抑制したが、その効果は、ＢＸ−７９５によってキャンセルされてしまった。ＰＤＫ１は、ＦｏｘＯ１に対して抑制的に作用するため、ＢＸ−７９５は、間接的にＦｏｘＯ１を活性化させることとなる。従って、培養上清による効果は、ＦｏｘＯ１のシグナル経路に関与していることが示唆される。
【０１１４】
以上に示す参考例１〜２では、ＦｏｘＯ１のシグナル経路に関与する剤であって、結果的のＦｏｘＯ１の活性を抑制する物であれば、いずれもＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２にｍＲＮＡ発現量の抑制に有効に働くことを示す。換言すれば、上記の実施例等に記載されるような具体的なインスリン系化合物及び／又は成長因子並びにこれらに類する物質でしか効果が得られないという疑義を払拭するものである。
【０１１５】
４−８．実施例６（ＨＧＦによる効果）
実施例１〜３と同様の実験を行った。ただし、各種インスリン化合物に代えて、ＨＧＦ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社、製品番号２９４−ＨＧＮ−００５／ＣＦ）を使用した。ＨＧＦは、受容体に結合後、細胞内シグナル経路の下流として、ＦｏｘＯ１を抑制することは広く知られている。
【０１１６】
結果を図１３に示す。コントロールと比べて、ＨＧＦが１ｎｇ／ｍｌ以上の濃度において、ＡＣＥ２及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の発現量について有意な差をもたらす結果となった。しかも、ＨＧＦによる抑制度合いは、１０ｎｇ／ｍｌ以上では、上記インスリン系化合物、他の成長因子と比べて、優れていた。このことは、ＨＧＦが、ＡＣＥ２及び／又はＴＭＰＲＳＳ２によって介在される感染症、特にコロナウィルスや、その他の疾患の予防又は治療に対してきわめてすぐれた効果をもたらすことを示す。
【０１１７】
ＨＧＦのアミノ酸配列は以下のとおりである。
https://www.uniprot.org/uniprot/P14210
Ｍｅｔ  Ｔｒｐ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｈｉｓ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｈｉｓ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｌｅｕ  Ｔｒｐ  Ｐｈｅ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｍｅｔ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｈｉｓ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ｃｙｓ  Ｉｌｅ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ｃｙｓ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｍｅｔ  Ｉｌｅ  Ｐｒｏ  Ｈｉｓ  Ｇｌｕ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｔｒｐ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ｔｙｒ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｐｒｏ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｍｅｔ  Ｔｈｒ  Ｃｙｓ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｈｉｓ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ  Ｃｙｓ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ｔｒｐ  Ａｓｐ  Ｈｉｓ  Ｇｌｎ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｈｉｓ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｔｙｒ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｔｒｐ  Ｃｙｓ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｈｉｓ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｔｒｐ  Ｇｌｕ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｉｌｅ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｔｒｐ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ｔｒｐ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｔｙｒ  Ｐｒｏ  Ｈｉｓ  Ｇｌｕ  Ｈｉｓ  Ａｓｐ  Ｍｅｔ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｔｒｐ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｐｒｏ  Ａｓｎ  Ｃｙｓ  Ａｓｐ  Ｍｅｔ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ａｓｐ  Ｃｙｓ  Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ｍｅｔ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｃｙｓ  Ｓｅｒ  Ｍｅｔ  Ｔｒｐ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｍｅｔ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ｈｉｓ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｔｒｐ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｔｒｐ  Ｃｙｓ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｐｒｏ  Ｔｒｐ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｔｒｐ  Ｍｅｔ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ｌｙｓ  Ｈｉｓ  Ｉｌｅ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｔｒｐ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｈｉｓ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｇｌｎ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ｍｅｔ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｃｙｓ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ａｒｇ  Ｍｅｔ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｐｒｏ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｔｒｐ  Ｉｌｅ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ
【０１１８】
４−９．実施例７（ｓｉＲＮＡによる効果）
実施例１〜３と同様の実験を行った。ただし、ＦｏｘＯ１の遺伝子発現抑制のために、ｓｉＲＮＡを使用した。ｓｉＲＮＡはコントロールとして何も抑制しないもの（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（登録商標）社，製品番号６５６８Ｓ）、及びヒトＦｏｘＯ１遺伝子をターゲットとしたもの（＃１；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（登録商標）社，製品番号６２４２Ｓ、及び＃２；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（登録商標）社，製品番号６２５６Ｓ、配列情報はコントロールも含め非公開）を用いた。ｓｉＲＮＡの細胞内への導入にはトランスフェクション試薬（Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社，ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ１，製品番号Ｔ２００１−０１）を使用した。各種ｓｉＲＮＡを導入し、３日後（約７２時間後）に細胞を回収し、上記のようにｑＰＣＲで定量した。
【０１１９】
結果を図１４に示す。コントロールのｓｉＲＮＡを導入した細胞と比べて、ＦｏｘＯ１をターゲットとするｓｉＲＮＡを導入した細胞では、確かにＦｏｘＯ１  ｍＲＮＡの発現が減少している。この時、同時にＡＣＥ２及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の発現量についても有意な差をもたらす結果となった。この結果は、ＦｏｘＯ１が確かにＡＣＥ２及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の遺伝子発現に必要であることを示している。言い換えると、ＦｏｘＯ１の活性や遺伝子発現量を抑制することで、確かにＡＣＥ２及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の遺伝子発現を阻害できる、というこれまでの実験結果を支持するものである。
【０１２０】
以上の実験結果から、ＦｏｘＯ１阻害剤一般について、シグナル伝達経路を介する場合、あるいは直接阻害の場合（阻害剤あるいはｓｉＲＮＡなど）など、その阻害方法が大きく異なるといえども、ＦｏｘＯ１阻害剤として機能する化合物の含有量に応じて、ＡＣＥ２又はＴＭＰＲＳＳ２の発現阻害剤又はコロナウィルス感染抑制剤として有効であることが示されている。
【０１２１】
以上、具体的な実施形態について説明してきた。上記実施形態は、具体例に過ぎず、本発明は上記実施形態に限定されない。例えば、上述の実施形態の１つに開示された技術的特徴は、他の実施形態に適用することができる。また、特記しない限り、特定の方法については、一部の工程を他の工程の順序と入れ替えることも可能であり、特定の２つの工程の間に更なる工程を追加してもよい。本発明の範囲は、特許請求の範囲によって規定される。
【要約】
【課題】アンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の発現を阻害するための組成物を提供すること。
【解決手段】アンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）及び／又はＴＭＰＲＳＳ２の発現を阻害するための組成物であって、
前記組成物は、ＦｏｘＯ１阻害剤を含む、組成物。
【選択図】なし【図１】
0006953047.tif 000003
【図２】
0006953047.tif 000004
【図３】
0006953047.tif 000005
【図４】
0006953047.tif 000006
【図５】
0006953047.tif 000007
【図６】
0006953047.tif 000008
【図７】
0006953047.tif 000009
【図８】
0006953047.tif 000010
【図９】
0006953047.tif 000011
【図１０】
0006953047.tif 000012
【図１１】
0006953047.tif 000013
【図１２】
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【図１３】
0006953047.tif 000015
【図１４】
0006953047.tif 000016
【配列表】
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