(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料溶液中に分散しランダムに運動する発光粒子を、前記試料溶液を走査して検出する光学系と、
前記光学系による前記発光粒子の検出結果である光検出データが入力される光検出データ入力部と、
前記光検出データから時系列光強度データを生成する信号処理部と、
測定条件が異なる複数の時系列光強度データと発光粒子の濃度との関係に関して学習した学習済みモデルに基づき、前記信号処理部が生成した前記時系列光強度データから、前記光学系が検出した前記発光粒子の濃度を算出する濃度算出部と、
前記濃度算出部の算出結果を出力する濃度出力部と、を備え、
前記信号処理部は、前記時系列光強度データから、一次元方向において時間順に、二次元方向において周期順に配列した二次元の前記時系列光強度データを生成し、
前記濃度算出部の前記学習済みモデルは、二次元の前記時系列光強度データを入力とする
光分析装置。
【請求項２】
前記学習済みモデルはニューラルネットワークで構成され、前記ニューラルネットワークの入力は前記時系列光強度データであり、前記ニューラルネットワークの出力は前記発光粒子の濃度である、
請求項１に記載の光分析装置。
【請求項３】
前記ニューラルネットワークは、畳み込みニューラルネットワークであり、
二次元の前記時系列光強度データは画像として前記畳み込みニューラルネットワークに入力される、
請求項２に記載の光分析装置。
【請求項４】
前記光検出データが検出された際の測定条件を入力する測定条件入力部をさらに備え、
前記学習済みモデルは、前記時系列光強度データと前記測定条件と前記発光粒子の濃度との関係に関して学習済みであり、
前記濃度算出部は、前記学習済みモデルに基づき、前記時系列光強度データおよび前記測定条件から前記発光粒子の濃度を算出する、
請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の光分析装置。
【請求項５】
前記測定条件は、分子種の拡散時間、明るさ、非分析対象物の有無、走査周期、励起波長、励起強度、観測波長のうち少なくとも一つである、
請求項４に記載の光分析装置。
【請求項６】
試料溶液中に分散しランダムに運動する発光粒子を、光学系を走査させることで検出する走査検出工程と、
前記発光粒子の検出結果である光検出データから時系列光強度データを生成する時系列光強度データ生成工程と、
前記時系列光強度データから、一次元方向において時間順に、二次元方向において周期順に配列した二次元の前記時系列光強度データを生成する時系列光強度データ二次元化工程と、
測定条件が異なる複数の前記時系列光強度データと前記発光粒子の濃度との関係に関して学習した学習済みモデルに基づき、前記時系列光強度データから前記発光粒子の濃度を算出する濃度算出工程と、を備える、
光分析方法。
【請求項７】
前記光検出データが検出された際の測定条件が入力される測定条件入力工程をさらに備え、
前記学習済みモデルは、前記時系列光強度データと前記測定条件と前記発光粒子の濃度との関係に関して学習済みであり、
前記濃度算出工程は、前記学習済みモデルに基づき、前記時系列光強度データおよび前記測定条件から前記発光粒子の濃度を算出する、
請求項６に記載の光分析方法。
【請求項８】
発光粒子の時系列光強度データに基づいて、前記発光粒子の濃度を出力するよう、コンピュータを機能させるための学習済みモデルであって、
畳み込みニューラルネットワークから構成され、
前記時系列光強度データから生成した、一次元方向において時間順に、二次元方向において周期順に配列した二次元の前記時系列光強度データが、画像として前記畳み込みニューラルネットワークの入力層に入力され、前記畳み込みニューラルネットワークの出力層から前記発光粒子の濃度を出力するようコンピュータを機能させるための
学習済みモデル。
【請求項９】
二次元の前記時系列光強度データに加えて、前記発光粒子の測定条件を前記入力層に入力し、前記出力層から前記発光粒子の濃度を出力するようコンピュータを機能させるための請求項８に記載の学習済みモデル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はこれらの凝集体（以下、これらを「粒子」と称する。）、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の対象物、或いは、非生物学的な粒子からの光を検出して、それらの状態（相互作用、結合・解離状態など）の分析又は解析において有用な情報を取得することが可能な光分析技術に係り、より詳細には、上記のような光学系を用いて単一の発光する粒子からの光を個別に検出して種々の光分析を可能にする光分析装置、光分析方法および学習済みモデルに係る。なお、本明細書において、光を発する粒子（以下、「発光粒子」と称する。）は、それ自身が光を発する粒子、又は、任意の発光標識若しくは発光プローブが付加された粒子のいずれであってもよく、発光粒子から発せられる光は、蛍光、りん光、化学発光、生物発光、散乱光等であってよい。
【背景技術】
【０００２】
近年の光計測技術の発展により、共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）も可能な超高感度の光検出技術とを用いて、一光子又は蛍光一分子レベルの微弱光の検出・測定が可能となっている。そこで、そのような微弱光の計測技術を用いて、生体分子等の特性、分子間相互作用又は結合・解離反応の検出を行う装置又は方法が種々提案されている。【０００３】
特に、蛍光相関分光分析（Fluorescence  Correlation  Spectroscopy：ＦＣＳ）や蛍光強度分布分析（Fluorescence-Intensity  Distribution  Analysis：ＦＩＤＡ）等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術とを用いた微小領域の蛍光測定技術を用いた方法によれば、測定に必要な試料は、従前に比して極めて低濃度且微量でよく（一回の測定で使用される量は、たかだか数十μＬ程度）、測定時間も大幅に短縮される（一回の測定で秒オーダーの時間の計測が数回繰り返される）。従って、これらの技術は、特に、医学・生物学の研究開発の分野でしばしば使用される希少な或いは高価な試料についての分析を行う場合や、病気の臨床診断や生理活性物質のスクリーニングなど、検体数が多い場合に、従前の生化学的方法に比して、低廉に、或いは、迅速に実験又は検査が実行できる強力なツールとなることが期待されている。【０００４】
特許文献１には、観測対象となる発光粒子の濃度又は数密度が、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の統計的処理を含む光分析技術で取り扱われるレベルよりも低い試料溶液中の発光粒子の状態又は特性を定量的に観測することを可能にする原理に基づく光分析技術が記載されている。特許文献１に記載の光分析技術は、端的に述べれば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等と同様に共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用い、試料溶液内において光の検出領域である微小領域（以下、「光検出領域」と称する。）の位置を移動させながら、光検出領域により試料溶液内を走査する。さらに、特許文献１に記載の光分析技術は、光検出領域が試料溶液中に分散してランダムに運動する発光粒子を包含したときに、その発光粒子から発せられる光を検出し、これにより、試料溶液中の発光粒子の一つ一つを個別に検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報を取得する。この光分析技術（以下、「走査分子計数法」と称する。）によれば、測定に必要な試料がＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術と同様に微量（例えば、数十μＬ程度）であってもよい。また、走査分子計数法は、測定時間が短く、しかも、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合に比して、より低い濃度又は数密度の発光粒子の存在を検出し、その濃度、数密度又はその他の特性を定量的に検出することが可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１１−１０８３７１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しがしながら、上記の走査分子計数法では、試料溶液内にて光検出領域の位置を移動しながら計測された光強度値（若しくはフォトンカウント値）の時系列のデータにおいて、発光粒子からの光に相当する光強度の増大（典型的には、釣鐘状のプロファイル）が観測されたときに、一つの発光粒子が光検出領域内に包含されたと判定し、これにより、一つの発光粒子の存在の検出が為される。この構成において、実際の時系列の光強度データには、発光粒子からの光の他に、ノイズ（光検出器の熱ノイズ、背景光）が存在するので、ノイズを排除して、発光粒子からの光を表す信号（発光粒子の信号）の存在を検出する必要がある。そこで、典型的には、発光粒子の信号の特性、例えば、強度の大きさ、信号の形状等を参照して、発光粒子の信号の抽出が試みられる。この点に関し、発光粒子の信号の特性やノイズの大きさや形状は、測定条件（分子種の拡散時間、明るさ、非分析対象物の有無、走査周期、励起波長、励起強度、観測波長など）によって異なる。そのため、測定条件によって光子カウントシグナルの識別条件が異なるため、その測定条件に応じて解析パラメーターを設定する必要があった。【０００７】
特に、ゴミの混入や励起強度や暗電流の変動、自家蛍光の容器間差などの測定条件はコントロールが難しいため、このような測定条件下においてＳ／Ｎ識別能を高めると、再現性不良となりやすい。そのため、このような測定条件においても発光粒子の信号を好適に検出できるよう、Ｓ／Ｎ識別能が高く、かつ、再現性を確保できるロバストな光分析装置、光分析手法および学習済みモデルが望まれている。【０００８】
上記事情を踏まえ、本発明は、走査分子計数法において、Ｓ／Ｎ識別能が高く、かつ、ロバストな光分析装置、光分析手法および学習済みモデルを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、この発明は以下の手段を提案している。
本発明の第一の態様に係る光分析装置は、試料溶液中に分散しランダムに運動する発光粒子を、前記試料溶液を走査して検出する光学系と、前記光学系による前記発光粒子の検出結果である光検出データが入力される光検出データ入力部と、前記光検出データから時系列光強度データを生成する信号処理部と、測定条件が異なる複数の時系列光強度データと発光粒子の濃度との関係に関して学習した学習済みモデルに基づき、前記信号処理部が生成した前記時系列光強度データから、前記光学系が検出した前記発光粒子の濃度を算出する濃度算出部と、前記濃度算出部の算出結果を出力する濃度出力部と、を備え、前記信号処理部は、前記時系列光強度データから、一次元方向において時間順に、二次元方向において周期順に配列した二次元の前記時系列光強度データを生成し、前記濃度算出部の前記学習済みモデルは、二次元の前記時系列光強度データを入力とする。
【００１１】
本発明の第二の態様によれば、第一の態様に係る光分析装置では、前記学習済みモデルはニューラルネットワークで構成され、前記ニューラルネットワークの入力は前記時系列光強度データであり、前記ニューラルネットワークの出力は前記発光粒子の濃度であってもよい。
【００１２】
本発明の第三の態様によれば、第二の態様に係る光分析装置では、前記ニューラルネットワークは、畳み込みニューラルネットワークであり、二次元の前記時系列光強度データは画像として前記畳み込みニューラルネットワークに入力されてもよい。
【００１３】
本発明の第四の態様によれば、第一から第三のいずれかの態様に係る光分析装置では、前記光検出データが検出された際の測定条件を入力する測定条件入力部をさらに備え、前記学習済みモデルは、前記時系列光強度データと前記測定条件と前記発光粒子の濃度との関係に関して学習済みであり、前記濃度算出部は、前記学習済みモデルに基づき、前記時系列光強度データおよび前記測定条件から前記発光粒子の濃度を算出してもよい。
【００１４】
本発明の第五の態様によれば、第四の態様に係る光分析装置では、前記測定条件は、分子種の拡散時間、明るさ、非分析対象物の有無、走査周期、励起波長、励起強度、観測波長のうち少なくとも一つであってもよい。
【００１５】
本発明の第六の態様に係る光分析方法は、試料溶液中に分散しランダムに運動する発光粒子を、光学系を走査させることで検出する走査検出工程と、前記発光粒子の検出結果である光検出データから時系列光強度データを生成する時系列光強度データ生成工程と、前記時系列光強度データから、一次元方向において時間順に、二次元方向において周期順に配列した二次元の前記時系列光強度データを生成する時系列光強度データ二次元化工程と、測定条件が異なる複数の前記時系列光強度データと前記発光粒子の濃度との関係に関して学習した学習済みモデルに基づき、前記時系列光強度データから前記発光粒子の濃度を算出する濃度算出工程と、を備える。
【００１６】
本発明の第七の態様によれば、第六の態様に係る光分析方法では、前記光検出データが検出された際の測定条件が入力される測定条件入力工程をさらに備え、前記学習済みモデルは、前記時系列光強度データと前記測定条件と前記発光粒子の濃度との関係に関して学習済みであり、前記濃度算出工程は、前記学習済みモデルに基づき、前記時系列光強度データおよび前記測定条件から前記発光粒子の濃度を算出してもよい。
【００１７】
本発明の第八の態様に係る学習済みモデルは、発光粒子の時系列光強度データに基づいて、前記発光粒子の濃度を出力するよう、コンピュータを機能させるための学習済みモデルであって、畳み込みニューラルネットワークから構成され、前記時系列光強度データから生成した、一次元方向において時間順に、二次元方向において周期順に配列した二次元の前記時系列光強度データが、画像として前記畳み込みニューラルネットワークの入力層に入力され、前記畳み込みニューラルネットワークの出力層から前記発光粒子の濃度を出力するようコンピュータを機能させる。
【００１８】
本発明の第九の態様によれば、第八の態様に係る学習済みモデルでは、二次元の前記時系列光強度データに加えて、前記発光粒子の測定条件を前記入力層に入力し、前記出力層から前記発光粒子の濃度を出力するようコンピュータを機能させてもよい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の光分析装置、光分析方法および学習済みモデルによれば、走査分子計数法において、Ｓ／Ｎ識別能が高く、かつ、ロバストな発光粒子の信号の検出が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の第一実施形態に係る光分析装置の全体構成を示す図である。
【図２】同光分析装置が実施する走査分子計数法における光検出の原理を説明する模式図及び計測される光強度の時間変化の模式図である。
【図３】同光分析装置のコンピュータの機能ブロック図である。
【図４】同光分析装置の信号処理部が生成した時系列光強度データである。
【図５】図４に示す一次元の時系列光強度データを変換した二次元の時系列光強度データである。
【図６】同光分析装置のコンピュータの学習済みモデルの構成概念図である。
【図７】本発明の第二実施形態に係る光分析装置のコンピュータの機能ブロック図である。
【図８】実施例における実施例１による測定結果を示している。
【図９】実施例における比較例１による測定結果を示している。
【図１０】実施例における実施例２による測定結果を示している。
【図１１】実施例における比較例２による測定結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（第一実施形態）
本発明の第一実施形態について、図１から図６を参照して説明する。
図１は、本実施形態に係る光分析装置１００の全体構成を示す図である。
【００２２】
［光分析装置１００の構成］
光分析装置１００は、基本的な構成において、図１（Ａ）に模式的に例示されるように、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる装置であり、走査分子計数法により光分析を行う装置である。光分析装置１００は、光学系２〜１７と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するコンピュータ１８と、を備えている。
【００２３】
光分析装置１００の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、光源２から放射されシングルモードファイバー３内を伝播したレーザー光（Ｅｘ）が、ファイバーの出射端において固有のＮＡにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター４によって平行光となり、ダイクロイックミラー５、反射ミラー６，７にて反射され、対物レンズ８へ入射される。
【００２４】
対物レンズ８の上方には、典型的には、１〜数十μＬの試料溶液が分注される試料容器又はウェル１０が配列されたマイクロプレート９が配置されており、対物レンズ８から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル１０内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域（励起領域）が形成される。試料溶液中には、観測対象物である発光粒子、典型的には、蛍光性粒子又は蛍光色素等の発光標識が付加された粒子が分散又は溶解されており、かかる発光粒子が励起領域に進入すると、その間、発光粒子が励起され光が放出される。
【００２５】
放出された光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射してコンデンサーレンズ１２にて集光され、ピンホール１３を通過し、バリアフィルター１４を透過して（ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される）、マルチモードファイバー１５に導入されて、光検出器１６に到達し、時系列の電気信号（光検出データ）に変換された後、コンピュータ１８へ入力される。
【００２６】
コンピュータ１８は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）と、メモリと、記憶部と、入出力制御部と、を備えるプログラム実行可能な装置である。所定のプログラムを実行することにより、後述する濃度算出部２３等の複数の機能ブロックとして機能する。コンピュータ１８は、キーボードやマウス等の入力部（不図示）と、ＬＣＤモニタ等の表示部１８ｄと、に接続されている。
【００２７】
なお、当業者において知られているように、上記の構成において、ピンホール１３は、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図１（Ｂ）に模式的に示されているレーザー光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール１３を通過し、励起領域以外からの光は遮断される。図１（Ｂ）に例示されたレーザー光の焦点領域は、通常、１〜１０ｆＬ程度の実効体積を有する本光分析装置における光検出領域であり（典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス様分布となり、実効体積は光強度が１／ｅ２となる面を境界とする略楕円球体の体積である）、コンフォーカル・ボリュームと称される。
【００２８】
光分析装置１００では、１つの発光粒子からの光、例えば、一つの蛍光色素分子からの微弱光が検出されるので、光検出器１６は、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられる。
【００２９】
光分析装置１００の光学系においては、試料溶液内を光検出領域により走査する、即ち、試料溶液内において光検出領域の位置を移動するための機構が設けられる。かかる光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図１（Ｃ）に模式的に例示されているように、反射ミラー７の向きを変更するミラー偏向器１７が採用されてよい（光検出領域の絶対的な位置を移動する方式）。かかるミラー偏向器１７は、通常のレーザー走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様であってよい。或いは、別の態様として、図１（Ｄ）に例示されているように、試料溶液が注入されている容器１０（マイクロプレート９）の水平方向の位置を移動し、試料溶液内における光検出領域の相対的な位置を移動するべくステージ位置変更装置１７ａが作動されてもよい（試料溶液の絶対的な位置を移動する方式）。いずれの方式による場合も、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するべく、ミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａは、コンピュータ１８の制御の下、光検出器１６による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の移動軌跡は、円形、楕円形、矩形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよい（コンピュータ１８において実行されるプログラムにおいて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい）。なお、図示していないが、対物レンズ８又はステージを上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されるようになっていてもよい。
【００３０】
光分析装置１００は、光検出領域を一定の走査周期で移動させる。走査周期ごとに光検出領域の移動パターンは同じである。
【００３１】
観測対象物となる発光粒子が多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域（光検出領域）のみで光の放出があるので、ピンホール１３は、除去されてよい。また、観測対象物となる発光粒子が化学発光や生物発光現象により励起光によらず発光する場合には、励起光を生成するための光学系２〜５が省略されてよい。発光粒子がりん光又は散乱により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。更に、光分析装置１００においては、図１に示すように、複数の光源２が設けられていてよく、発光粒子の励起波長によって適宜、励起光の波長が選択できるようになっていてよい。同様に、光検出器１６も複数個備えられていてよく、試料中に波長の異なる複数種の発光粒子が含まれている場合に、それらから光をその波長によって別々に検出できるようになっていてよい。さらに、光の検出に関して、励起光として所定の方向に偏光した光が用いられ、検出光として励起光の偏光方向と垂直な方向の成分が選択されてよい。その場合、励起光光路には、ポーラライザ（図示せず）が挿入され、検出光光路に偏光ビームスプリッタ１４ａが挿入される。かかる構成によれば、検出光における背景光を大幅に低減することが可能となる。
【００３２】
［走査分子計数法］
走査分子計数法により光分析を行う光分析装置１００は、端的に述べれば、光検出領域の位置を移動するための機構（ミラー偏向器１７またはステージ位置変更装置１７ａ）を駆動して光路を変更し、或いは、試料溶液が注入されている容器１０（マイクロプレート９）の水平方向の位置を移動して、図２（Ａ）にて模式的に描かれているように、試料溶液内において光検出領域ＣＶの位置を移動しながら、即ち、光検出領域ＣＶにより試料溶液内を走査しながら、光検出を実行する（走査検出工程）。例えば、光検出領域ＣＶが移動する間（図中、時間ｔ０〜ｔ２）において１つの発光粒子の存在する領域を通過する際（ｔ１）には、発光粒子から光が放出され、図２（Ｂ）に描かれているような時系列の光強度データ上に有意な光強度（Ｅｍ）のパルス状の信号が出現する。
【００３３】
先行技術文献の特許文献１に記載の装置は、上記の光検出領域ＣＶの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図２（Ｂ）に例示されているようなパルス状の信号（有意な光強度）を一つずつ検出する。検出されたパルス状の信号から、発光粒子が個別に検出され、その数をカウントすることにより、計測された領域内に存在する発光粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報が取得される。かかる走査分子計数法の原理においては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き統計的な演算処理は行われず、発光粒子が一つずつ検出されるので、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料溶液でも、粒子の濃度若しくは数密度に関する情報が取得可能である。
【００３４】
本実施形態の光分析装置１００は、図２（Ｂ）に例示されているようなパルス状の信号の検出することなく、次に示す新たな光分析方法により光分析を実施する。
【００３５】
［光分析方法］
次に、光分析装置１００が実行する光検出データの光分析方法に関して説明する。
【００３６】
図３は、コンピュータ１８の機能ブロック図である。
コンピュータ１８は、光検出データ入力部２１と、信号処理部２２と、濃度算出部２３と、濃度出力部２４と、を備える。コンピュータ１８の機能は、コンピュータ１８に提供された光分析プログラムをコンピュータ１８が実行することにより実現される。
【００３７】
光検出データ入力部２１には、放出された光（Ｅｍ）の検出結果である光検出データが光検出器１６から入力される。光検出データ入力部２１は、所定期間の光検出データ、例えば走査分子計数法における１周期の走査で取得できる光検出データを複数周期分だけ一時記憶し、記憶した複数周期分の光検出データを、信号処理部２２に出力する。
【００３８】
信号処理部２２は、光検出データ入力部２１に入力された光検出データから、時系列の光強度データ（時系列光強度データ）を生成する（時系列光強度データ生成工程）。光検出器１６の光の検出がフォトンカウンティングである場合、光検出器１６による測定は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間（ＢＩＮ  ＴＩＭＥ）に、光検出器１６に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行される。この場合、信号処理部２２にて生成する時系列の光強度データは、時系列のフォトンカウントデータとなる。
【００３９】
図４は、信号処理部２２が生成した時系列光強度データである。黒色で示された光強度データは光を検出したこと示し、白色で示された光強度データは光を検出していないことを示している。
【００４０】
時系列光強度データ上には、発光粒子からの光の他に、ノイズ（光検出器の熱ノイズ、背景光）が存在する。発光粒子の信号の特性やノイズの大きさや形状は、測定条件（分子種の拡散時間、明るさ、非分析対象物の有無、走査周期、励起波長、励起強度、観測波長など）によって異なる。図４に示す光強度データにおいて、黒色で示された光強度データにノイズが含まれている可能性がある。
【００４１】
信号処理部２２は、生成した時系列光強度データ（一次元）を二次元の時系列光強度データに変換する（時系列光強度データ二次元化工程）。図５は、図４に示す一次元の時系列光強度データを変換した二次元の時系列光強度データである。二次元の時系列光強度データは、試料溶液を走査しながら検出した一次元の時系列光強度データを、走査周期ごとに分割し、分割した光強度データを二次元方向に並べて二次元化したものである。二次元の時系列光強度データにおいて、一次元方向は時間軸を示し、二次元方向は周期数を示している。すなわち、二次元の時系列光強度データは、光強度データが一次元方向において時間順に、二次元方向において周期順に配列している。二次元方向に隣り合う一次元方向の光強度データは、連続する周期の光強度データである。信号処理部２２は、生成した時系列光強度データを濃度算出部２３に出力する。
【００４２】
例えば、６．６６ｍｓの走査周期（走査速度９０００ＲＰＭ）で試料溶液内を走査した１秒間の光検出データから、ＢＩＮ  ＴＩＭＥが１０ｕｓの二次元の時系列光強度データを生成した場合、二次元の時系列光強度データは、一次元方向に６６６個の光強度データが配列し、二次元方向に１５０周期分の時系列光強度データが配列する。二次元方向に隣り合う光強度データは、連続する周期において同じ光検出領域において検出された光強度データとなる。
【００４３】
濃度算出部２３は、「学習済みモデルＭ」に基づき、時系列光強度データから発光粒子の濃度を算出する（濃度算出工程）。学習済みモデルＭは、信号処理部２２から入力される二次元の時系列光強度データが、画像（例えば、グレースケール画像）として入力され、発光粒子の濃度を出力する畳み込みニューラルネットワーク（Convolutional Neural Network:ＣＮＮ）である。学習済みモデルＭは、光分析装置１００のコンピュータ１８で実行される光分析プログラムの一部のプログラムモジュールとして利用される。なお、コンピュータ１８は、学習済みモデルＭを実行する専用の論理回路等を有していてもよい。
【００４４】
図６は、学習済みモデルＭの構成概念図である。
学習済みモデルＭは、入力層３１と、コンボリューション層３２と、全結合層３３と、出力層３４と、を備えている。
【００４５】
入力層３１は、信号処理部２２から入力される時系列光強度データを受けとる。入力層３１は、二次元化された時系列光強度データを、画像として受けとり、コンボリューション層３２に出力する。複数の二次元の時系列光強度データは、順次、コンボリューション層３２に入力される。
【００４６】
コンボリューション層３２は、フィルター層およびプーリング層を複数備えている。フィルター層は、学習により得られた学習済みのフィルター処理により画像の畳み込み演算を実施する。フィルター層のノードの活性化関数は、ＲｅＬＵ（Rectified Linear Unit）関数やＬｅａｋｙ  ＲｅＬＵ関数である。プーリング層は、解像度を削減するフィルター処理を実施する。プーリング層は特徴を残しながら情報量を削減する次元削減の機能を有する。コンボリューション層３２は、フィルター層とプーリング層とを交互に繰り返すことで、画像から発光粒子の特徴を空間的に抽出することができる。
【００４７】
全結合層３３は、複数の層を備え、前後の層のノードが相互に全て結合したニューラルネットワークである。全結合層３３には、コンボリューション層３２の出力が結合されており、学習済みの重み付け係数や活性化関数等に基づく演算を行い、一つのノードである出力層３４に演算結果を出力する。全結合層３３のノードの活性化関数は、ＲｅＬＵ関数やＬｅａｋｙ  ＲｅＬＵ関数である。
【００４８】
出力層３４は、全結合層３３から入力される演算結果から、学習済みの関数に基づいて、濃度（スカラー値）を算出する。出力層３４のノードの活性化関数は、ＲｅＬＵ関数である。出力層３４は、算出した濃度を濃度出力部２４に出力する。
【００４９】
濃度出力部２４は、出力層３４から入力された濃度を、表示部１８ｄに出力する。表示部１８ｄは、入力された濃度を表示する。
【００５０】
［学習済みモデルの生成］
学習済みモデルＭは、後述する教師データに基づいて、事前の学習により生成する。学習済みモデルＭの生成は、光分析装置１００のコンピュータ１８により実施してもよいし、コンピュータ１８より演算能力が高い他のコンピュータを用いて実施してもよい。
【００５１】
学習済みモデルＭの生成は、周知の技術である誤差逆伝播法（バックプロパゲーション）による教師あり学習によって行われ、フィルター層のフィルター構成やニューロン（ノード）間の重み付け係数が更新される。
【００５２】
本実施形態においては、濃度が既知である試料溶液を走査分子計数法により検出した光検出データから、信号処理部２２が実施する方法と同様の方法で二次元の時系列光強度データを生成する。生成された二次元の時系列光強度データと、既知である濃度と、の組み合わせが、教師データである。
【００５３】
教師データは、濃度および測定条件（分子種の拡散時間、明るさ、非分析対象物の有無、走査周期、励起波長、励起強度、観測波長など）を変えて、可能な限り多様なものを用意することが望ましい。特に多様な測定条件の教師データを用意することで、様々な測定条件において発生するノイズに対してＳ／Ｎ識別能が高く、かつ、ロバストな濃度算出が可能な学習済みモデルＭを生成することができる。
【００５４】
コンピュータ１８は、教師データの二次元の時系列光強度データを入力層３１に入力し、入力した教師データの濃度が出力層３４から出力されるべく、教師データの濃度と出力層の出力濃度との平均二乗誤差が小さくなるように、フィルター層のフィルター構成やニューロン（ノード）間の重み付け係数の学習を行う。
【００５５】
本実施形態の光分析装置１００によれば、走査分子計数法において、Ｓ／Ｎ識別能が高く、かつ、ロバストな発光粒子の信号の検出が可能である。
【００５６】
本実施形態の光分析装置１００によれば、学習済みモデルＭに畳み込みニューラルネットワークを用い、学習済みモデルＭの入力に、二次元の時系列光強度データを用いている。二次元の時系列光強度データは、一次元方向において時間順に、二次元方向において周期順に配列している。そのため、光分析装置１００は発光粒子の特徴を空間的に抽出しやすい。また、発光粒子の空間的特徴は、畳み込みニューラルネットワークによって好適に抽出しやすい。
【００５７】
また、光分析装置１００は、時系列光強度データに含まれるノイズの空間的特徴も抽出しやすい。例えば、試料溶液に非分析対象物が含まれている場合、非分析対象物に起因するノイズは、走査によって取得した時系列光強度データにおいて周期的に発生する可能性が高い。そのような周期的なノイズは、二次元の時系列光強度データにおいて空間的特徴として抽出しやすい。そのため、光分析装置１００は、そのようなノイズの影響を排除しやすい。その結果、光分析装置１００は発光粒子の空間的特徴を抽出しやすくなる。
【００５８】
以上、本発明の第一実施形態について図面を参照して詳述したが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。また、上述の第一実施形態および以下で示す変形例において示した構成要素は適宜に組み合わせて構成することが可能である。
【００５９】
（変形例１）
例えば、上記実施形態では、光検出データ入力部２１と、信号処理部２２と、濃度算出部２３と、濃度出力部２４とは、コンピュータ１８で動作するソフトウェアの機能によって実現されていたが、これらの機能ブロックの構成はこれに限定されない。例えば、少なくとも一部の機能ブロックが専用のハードウェアで構成されていてもよい。
【００６０】
（変形例２）
例えば、上記実施形態では、学習済みモデルＭは、入力層３１と、コンボリューション層３２と、全結合層３３、出力層３４とを有する畳み込みニューラルネットワークであったが、学習済みモデルＭの態様はこれに限定されない。例えば、学習済みモデルＭは、全結合層３３の代わりに非全結合層を有していてもよい。また、出力層は、ソフトマックス関数を活性化関数とし、濃度をクラスタリングする態様であってもよい。
【００６１】
（変形例３）
例えば、上記実施形態では、学習済みモデルＭは事前学習により生成していたが、学習済みモデルＭの生成方法はこれに限定されない。学習モデルは学習後も随時更新を行ってもよい。学習済みモデルは、新たに得られたデータを教師データとして追加学習を行ってもよい。
【００６２】
（変形例４）
例えば、上記実施形態では、時系列光強度データはデータであり、二次元の時系列光強度データは画像であったが、時系列光強度データのフォーマットはこれに限定されない。例えば、光強度データはフォトンカウント値に対応するスカラー値であって、スカラー値から生成される二次元の時系列光強度データはグレースケール画像であってもよい。
【００６３】
（変形例５）
例えば、上記実施形態では、学習済みモデルＭはニューラルネットワークであったが、学習済みモデルの態様はこれに限定されない。学習済みモデルは、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）線形回帰、ロジスティック回帰、決定木、回帰木、ランダムフォレストなどの教師あり機械学習により学習されるモデルであってもよい。
【００６４】
（第二実施形態）
本発明の第二実施形態について、図７を参照して説明する。以降の説明において、既に説明したものと共通する構成については、同一の符号を付して重複する説明を省略する。
第二実施形態に係る光分析装置１００Ｂは、第一実施形態に係る光分析装置１００と比較して、コンピュータの機能構成が異なる。
【００６５】
光分析装置１００Ｂは、コンピュータ１８がコンピュータ１８Ｂに置き換わっている点を除いて、第一実施形態の光分析装置１００と同じである。
【００６６】
図７は、コンピュータ１８Ｂの機能ブロック図である。
コンピュータ１８Ｂは、光検出データ入力部２１と、信号処理部２２と、濃度算出部２３Ｂと、濃度出力部２４と、測定条件入力部２５Ｂと、を備える。コンピュータ１８Ｂの機能は、コンピュータ１８Ｂに提供された光分析プログラムをコンピュータ１８Ｂが実行することにより実現される。
【００６７】
コンピュータ１８Ｂは、ＣＰＵ（Central Processing Unit）と、メモリと、記憶部と、入出力制御部と、を備えるプログラム実行可能な装置である。所定のプログラムを実行することにより、濃度算出部２３等の複数の機能ブロックとして機能する。コンピュータ１８は、図７に示すように、キーボードやマウス等の入力部１８ｃと、ＬＣＤモニタ等の表示部１８ｄと接続されている。
【００６８】
測定条件入力部２５Ｂには、光検出データ入力部２１に入力される光検出データが取得された測定条件が、使用者によって入力部１８ｃから入力される（測定条件入力工程）。入力される測定条件は、分子種の拡散時間、明るさ、非分析対象物の有無、走査周期、励起波長、励起強度、観測波長などである。測定条件入力部２５Ｂは、入力された測定条件を濃度算出部２３Ｂに出力する。
【００６９】
濃度算出部２３Ｂは、「学習済みモデルＭＢ」に基づき、時系列光強度データおよび測定条件から発光粒子の濃度を算出する（濃度算出工程）。学習済みモデルＭＢは、信号処理部２２から入力される二次元の光強度データが、画像として入力され、さらに測定条件入力部２５Ｂから入力される測定条件が入力され、発光粒子の濃度を出力する畳み込みニューラルネットワークである。学習済みモデルＭＢは、光分析装置１００Ｂのコンピュータ１８Ｂで実行される光分析プログラムの一部のプログラムモジュールとして利用される。
【００７０】
学習済みモデルＭＢは、信号処理部２２から入力される時系列光強度データだけではなく、測定条件入力部２５Ｂから入力される測定条件も入力とする畳み込みニューラルネットワークである。測定条件を入力することで、測定条件ごとの発光粒子の特徴を抽出しやすくなる。
【００７１】
学習済みモデルＭＢの生成は、第一実施形態の学習済みモデルＭと同様、誤差逆伝播法（バックプロパゲーション）による教師あり学習によって行われる。
本実施形態においては、濃度が既知である試料溶液を走査分子計数法により検出した光検出データから、信号処理部２２が実施する方法と同様の方法で二次元の時系列光強度データを生成する。生成された二次元の時系列光強度データと、既知である濃度と、光検出データ取得時の測定条件と、の組み合わせが、教師データである。
【００７２】
本実施形態の光分析装置１００Ｂによれば、走査分子計数法において、Ｓ／Ｎ識別能が高く、かつ、ロバストな発光粒子の信号の検出が可能である。
【００７３】
本実施形態の光分析装置１００Ｂによれば、学習済みモデルＭＢに畳み込みニューラルネットワークを用い、学習済みモデルＭＢの入力に、二次元の時系列光強度データと測定条件を用いている。二次元の時系列光強度データは、一次元方向において時間順、二次元方向において周期順に配列している。そのため、光分析装置１００は測定条件ごとに発光粒子の特徴を空間的に抽出しやすい。また、発光粒子の空間的特徴は、畳み込みニューラルネットワークによって好適に抽出しやすい。
【００７４】
また、光分析装置１００Ｂは、時系列光強度データに含まれるノイズの空間的特徴も抽出しやすい。例えば、測定条件に起因するノイズは、走査によって取得した時系列光強度データにおいて周期的に発生する可能性が高い。そのような周期的なノイズは、二次元の時系列光強度データにおいて空間的特徴として抽出しやすい。そのため、光分析装置１００Ｂは、そのような測定条件に起因するノイズの影響を排除しやすい。その結果、光分析装置１００Ｂは発光粒子の空間的特徴を抽出しやすくなる。
【００７５】
以上、本発明の第二実施形態について図面を参照して詳述したが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。また、上述の第二実施形態および第一実施形態の変形例において示した構成要素は適宜に組み合わせて構成することが可能である。
【実施例】
【００７６】
以下、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明の技術範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。【００７７】
＜実施例１＞
実施例１は、第一実施形態の光分析装置１００である。光分析装置１００は、励起波長６４２ｎｍ、励起強度１ｍＷ、観測波長６６０ｎｍ−７１０ｎｍ、６．６６ｍｓの走査周期（走査速度９０００ＲＰＭ）で動作するように設定されている。また、光分析装置１００は、ＢＩＮ  ＴＩＭＥが１０ｕｓに設定されており、１秒ごとの光強度データから、一次元方向に６６６個、二次元方向に１５０周期が配列する二次元の時系列光強度データが生成されるように設定されている。【００７８】
（学習済みモデルＭ）
光分析装置１００の学習済みモデルＭのコンボリューション層３２は、フィルター層およびプーリング層をそれぞれ２層備えており、フィルター層およびプーリング層が交互に配置されている。ノードの活性化関数は、Ｌｅａｋｙ  ＲｅＬＵ関数である。フィルター層では入力される画像に対してフィルター処理し、１６種類の画像を生成している。フィルター処理のストライド幅は１画素とした。【００７９】
学習済みモデルＭの全結合層３３は、６層で構成されており、活性化関数はＬｅａｋｙ  ＲｅＬＵ関数である。出力層３４の活性化関数はＲｅＬＵ関数であり、濃度（スカラー値）が出力される。【００８０】
（教師データ）
教師データとして、ＡＴＴＯ６４７Ｎを、１０ｍＭ，Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ０．０５％，ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７を用いて１０ｆＭ，３２ｆＭ，１００ｆＭに希釈した３サンプル作成した。また、濃度０Ｍの教師データとして、１０ｍＭ，Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ０．０５％，ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７を各３サンプル（９サンプル）を作成した（計１２サンプル）。【００８１】
上記の１２サンプルそれぞれに対して、光分析装置１００により、２００秒の測定を行った。各サンプルの２００秒の時系列光強度データを1秒ごとの２００個の時系列光強度データに分割した。１００個の時系列光強度データを教師データとし、残り１００個を検証用データとした。【００８２】
（学習済みモデルＭの学習）
上記の教師データを用いて、学習済みモデルＭの学習が事前に実施された。バッチサイズは３２に設定され、誤差関数として平均二乗誤差、最適化アルゴリズムとしてＡｄａｍが用いられた。【００８３】
＜比較例１＞
比較例１は、先行技術文献の特許文献１に記載の装置である。この装置は、コンピュータによる光分析方法を除いて、光分析装置１００と同様に動作するように設定されている。【００８４】
＜検証結果＞
上記の検証データを用いて、実施例１および比較例１で濃度の測定検証を行った。図８は、実施例１による測定結果を示している。図９は比較例１による測定結果を示している。実施例１による測定結果は、高い線形性を示しており、比較例１の測定結果と比較して、１０ｆＭにおける標準偏差が小さくなっており、測定の再現性が高いことが確認できた。【００８５】
＜実施例２＞
実施例２は、第一実施形態の光分析装置１００である。光分析装置１００は、励起波長６４２ｎｍ、励起強度１ｍＷおよび０．９ｍＷ、観測波長６６０ｎｍ−７１０ｎｍ、６．６６ｍｓの走査周期（走査速度９０００ＲＰＭ）で動作するように設定されている。また、光分析装置１００は、ＢＩＮ  ＴＩＭＥが１０ｕｓに設定されており、１秒ごとの光強度データから、一次元方向に６６６個、二次元方向に１５０周期が配列する二次元の時系列光強度データが生成されるように設定されている。【００８６】
（学習済みモデルＭ）
光分析装置１００の学習済みモデルＭのコンボリューション層３２は、フィルター層が3層の後、プーリング層が1層、続いてフィルター層が2層の後、プーリング層が1層配置されている。ノードの活性化関数は、Ｌｅａｋｙ  ＲｅＬＵ関数である。フィルター層では入力される画像に対してフィルター処理し、１６種類の画像を生成している。フィルター処理のストライド幅は１画素とした。【００８７】
学習済みモデルＭの全結合層３３は、６層で構成されており、活性化関数はＬｅａｋｙ  ＲｅＬＵ関数である。出力層３４の活性化関数はＲｅＬＵ関数であり、濃度（スカラー値）が出力される。【００８８】
（教師データ）
教師データとして、ＡＴＴＯ６４７Ｎを、１０ｍＭ，Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ０．０５％，ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７を用いて１００aＭ, ３２０aＭ, １ｆＭ，３.２ｆＭ，１０ｆＭ，３２ｆＭ，１００ｆＭに希釈した7サンプル作製し、それぞれ３サンプルずつ分割し２１サンプル作製した。また、濃度０Ｍの教師データとして、１０ｍＭ，Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ０．０５％，ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７を５サンプル作製し、合計２６サンプルを測定に用いた。【００８９】
上記の２６サンプルそれぞれに対して、光分析装置１００により、励起強度１ｍＷおよび０．９ｍＷで各６００秒の測定を行った。各サンプルの６００秒の時系列光強度データを1秒ごとの３００個の時系列光強度データに分割した。３００個の時系列光強度データを教師データとし、残り３００個を検証用データとした。【００９０】
（学習済みモデルＭの学習）
上記の教師データを用いて、学習済みモデルＭの学習が事前に実施された。バッチサイズは３２に設定され、誤差関数として平均二乗誤差、最適化アルゴリズムとしてＡｄａｍが用いられた。【００９１】
＜比較例２＞
比較例２は、先行技術文献の特許文献１に記載の装置である。この装置は、コンピュータによる光分析方法を除いて、光分析装置１００と同様に動作するように設定されている。【００９２】
＜検証結果＞
上記の検証データを用いて、実施例２および比較例２で濃度の測定検証を行った。図１０は、実施例２による測定結果を示している。図１１は比較例２による測定結果を示している。実施例２による測定結果は、励起強度１ｍＷおよび０．９ｍＷで傾きの差が小さく励起強度が９０％まで低下してもシグナルの量が９９％（０．７０／０．７１）維持された。一方で比較例２ではシグナルの量が９２％（４６０／５００）まで低下した。実施例２では比較例２の測定結果と比較して、励起強度の変動に強いロバストな測定であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明は、走査による分析を行う装置に適用することができる。
【符号の説明】
【００９４】
１００，１００Ｂ  光分析装置
２      光源
３      シングルモードファイバー
４      コリメーター
５      ダイクロイックミラー
６      反射ミラー
７      反射ミラー
８      対物レンズ
９      マイクロプレート
１０    容器又はウェル
１１    ミラー
１２    コンデンサーレンズ
１３    ピンホール
１４    バリアフィルター
１４ａ  偏光ビームスプリッタ
１５    マルチモードファイバー
１６    光検出器
１７    ミラー偏向器
１７ａ  ステージ位置変更装置
１８，１８Ｂ  コンピュータ
２１    光検出データ入力部
２２    信号処理部
２３，２３Ｂ  濃度算出部
２４    濃度出力部
２５Ｂ  測定条件入力部
３１    入力層
３２    コンボリューション層
３３    全結合層
３４    出力層
Ｍ，ＭＢ  学習済みモデル
【図１】
0006953632.tif 000002
【図２】
0006953632.tif 000003
【図３】
0006953632.tif 000004
【図４】
0006953632.tif 000005
【図５】
0006953632.tif 000006
【図６】
0006953632.tif 000007
【図７】
0006953632.tif 000008
【図８】
0006953632.tif 000009
【図９】
0006953632.tif 000010
【図１０】
0006953632.tif 000011
【図１１】
0006953632.tif 000012