(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
明日葉エキスを有効成分として含む、脈管内皮細胞賦活用組成物であって、
前記脈管が静脈である場合は、前記明日葉エキスが明日葉の地下部のエタノール抽出物であり、そして
前記脈管がリンパ管である場合は、前記明日葉エキスが明日葉の地上部のエタノール抽出物であることを特徴とする、前記脈管内皮細胞賦活用組成物。
【請求項２】
経口用である、請求項１に記載の脈管内皮細胞賦活用組成物。
【請求項３】
皮膚外用である、請求項１に記載の脈管内皮細胞賦活用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脈管内皮細胞賦活用組成物に関し、より詳細には特定の植物エキスを有効成分として脈管内細胞賦活組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚の真皮中には、血管系及びリンパ管系から構成される脈管が発達している。血管系は、血液を全身へ送るための通路となる管であり、酸素、栄養分、水分等を運ぶ。血管中の血液の流れる方向は一定であり、心臓から出る血液は、心臓から動脈を通って全身に行きわたり、静脈を通って心臓へと戻る。動脈と静脈のそれぞれの末端（細動脈と細静脈）をつなぐ血管が毛細血管である。リンパ管系は、血管系から漏出した血漿成分を循環血液中に回収、消化管から吸収された体液や栄養素の移送、細胞から放出・分泌されるホルモン、酵素などの生理活性物質の移送、組織間隙から高分子物質などの排除といった役割を担う物質移送管である。リンパ管内の液（リンパ液）はリンパ系の上流から下流へと移送され、最下流において静脈と合流する。リンパ循環ではリンパ管自体がポンプとなってリンパ液の輸送を行っている。
【０００３】
細胞組織において、血管を流れる血液とリンパ管を流れるリンパ液を除いた体液が間質液（組織液、細胞間液、組織間リンパ液とも呼ばれる）である。血液により運ばれた酸素やタンパク質等の栄養分は毛細管壁を介して間質液へ移動した後、間質液から組織の細胞へ移動する。間質液中の水分の多くは、血管に作用する膠質浸透圧によって静脈へ戻され、間質液中の水分の一部、タンパク質、老廃物や異物はリンパ管に回収される。体内の間質液の量は、静脈毛細管やリンパ毛細管を介して静脈へ戻されることでバランスが取られている。血液中の血漿やリンパ液が細胞間隙に過度に溜まると浮腫となって顕在化する。血管内と間質との間の体液移動は、血管内と間質における静水圧と膠質浸透圧とのバランスを示すスターリングの力によるとされている。スターリングの式によれば、毛細血管から間質への体液移動は、毛細血管内静水圧又は間質膠質浸透圧の上昇、毛細血管内膠質浸透圧又は間質静水圧の低下、又は血管透過性の亢進によって促進される。これらのパラメータの変動を誘引する基礎疾患には、心不全、リンパ浮腫等の循環器系疾患、腎炎などによるネフローゼ症候群のような腎臓疾患、肝硬変等の肝臓疾患、悪性腫瘍、感染症等が挙げられる。または、健常人、特に女性や高齢者は、長時間の立ち作業によって起立性浮腫が現れることがある。
【０００４】
浮腫の改善や予防には、基礎疾患の解消が根本的な解決方法であるが、基礎疾患の解消が困難な場合や起立性浮腫のような場合には、対症療法としてスターリングの式のパラメータのいずれかを毛細血管から間質への体液移動量が減じる方向へ誘導することも有効である。例えば、非特許文献１には、赤ブドウ葉由来のポリフェノール類に静脈内皮細胞の保護や修復作用があることが報告されている。特許文献１及び２は、赤ブドウ葉抽出物を含む、慢性静脈不全（CVI）に関連する不快感を予防又は軽減する組成物を開示する。これらの文献のin vitro試験結果から、赤ブドウ葉抽出物の主要活性成分であるケルセチン-3-0-β-Dグルクロニドが、血管透過性を抑制することによって浮腫を軽減するとされる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表2006-513263
【特許文献２】特表2007-523110
【特許文献３】特許第2896974
【特許文献４】特許第2896975
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Nees S. et. al., ”Protective Effects of Flavonoids Contained in the Red Vine Leaf on Venular Endothelium against the Attack of Activated Blood Components in vitro”, Arzneimittelforschung 2003; 53(5): 330-341
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
赤ブドウ葉エキスのように、静脈を含む脈管内皮細胞の保護や修復作用を有する新規な有効成分が求められている。そこで、本発明の目的は、脈管内皮細胞賦活化作用を有する植物由来の新規な有効成分を含む脈管内皮細胞賦活用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、上記課題を鋭意検討した結果、明日葉の抽出エキスには、静脈だけでなくリンパ管も含めた脈管の内皮細胞を賦活化する作用があることを発見し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、明日葉エキスを有効成分として含む、脈管内皮細胞賦活用組成物を提供する。明日葉には、キサントアンゲロール、4-ヒドロキシデリシン等のカルコン類、クマリン類の機能性成分が含まれていることが知られている。カルコン類は、抗菌、抗潰瘍（胃酸分泌抑制作用による）、抗血栓（TXA2生成阻害→血小板の凝集・粘着防止→血栓予防作用による）、抗高血圧（血管弛緩作用による）、抗ガン・転移防止（血管新生抑制作用による）、抗アレルギー（ヒスタミン遊離抑制作用による）などの作用効果が知られている。クマリン類は、認知症予防（神経成長因子（NGF）活性化作用による）、鎮静、催眠、抗痙攣、体温降下、降圧、抗凝結、セルライト除去などの作用効果が知られている。しかし、明日葉エキスが脈管内皮細胞の賦活化作用を有することは、従来技術に知られていなかった。
【０００９】
前記明日葉エキスは、明日葉のエタノール及び／又は水抽出物であることが好ましい。
【００１０】
本発明は、また、特に明日葉エキスが明日葉の地上部の水抽出物及び／又は地下部のエタノール抽出物であり、そして脈管が血管である、脈管内皮細胞賦活用組成物を提供する。
【００１１】
本発明は、また、特に明日葉エキスが明日葉の地下部の水及び／又はエタノール抽出物であり、そして浮腫の改善又は予防用である、脈管内皮細胞賦活用組成物を提供する。
【００１２】
本発明は、また、特に明日葉エキスが明日葉のエタノール抽出物であり、そして脈管がリンパ管である、脈管内皮細胞賦活用組成物を提供する。
【００１３】
本発明の脈管内皮細胞賦活用組成物は、経口用又は皮膚外用であり得る。
【発明の効果】
【００１４】
明日葉エキス、好ましくは明日葉のエタノール及び／又は水抽出物を有効成分として含む本発明の脈管内皮細胞賦活用組成物によれば、脈管内皮細胞を賦活化し、その結果として、脈管の内皮細胞の異常に基づく疾患を予防又は治癒することが期待される。
【００１５】
明日葉エキスが明日葉の地上部の水抽出物及び／又は地下部のエタノール抽出物を有効成分とする本発明の脈管内皮細胞賦活用組成物は、特に血管の賦活化に有効であり、その結果として、血管の異常による疾患や不快感を緩和又は治癒可能である。
【００１６】
明日葉エキスのエタノール抽出物、好ましくは明日葉の地下部のエタノール抽出物を有効成分とする本発明の脈管内皮細胞賦活用組成物は、特にリンパ管の賦活化に有効であり、その結果として、リンパ管の異常による疾患や不快感を緩和又は治癒可能である。特にリンパ浮腫は、全身の水分が多いわけではなく、下肢や腕の皮下組織に過剰に貯まっている。利尿剤は、全身の水分を尿として強制的に排出するので、局所的に発生するリンパ浮腫には原則として適用されない。リンパ浮腫に効く薬剤がほとんど無いのが実情であるところ、本発明の脈管内皮細胞賦活用組成物、好ましくは皮膚外用の組成物をリンパ浮腫に局所適用することによって、リンパ浮腫の治癒が多いに期待される。
【００１７】
明日葉に利尿作用があることが例えば特許文献３及び４で知られている。本明細書中の実施例１〜３のin vitroの試験結果は、本発明の組成物の効果が明日葉の利尿作用に基づくものではないことは明らかである。すなわち、本発明の脈管細胞賦活用組成物の作用効果の一つである浮腫の予防・改善は、明日葉の利尿作用ではなく、静脈やリンパ管を作る内皮細胞を賦活化する、すなわち、脈管の機能を活性化することに基づいている。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下に、本発明の実施の形態を詳述する。本発明の脈管内皮細胞賦活用組成物（以下、本発明の組成物ということがある）は、明日葉エキスを有効成分として含む。明日葉は、セリ科シシウド属の大型多年草であり、学名は「アンゲリカ  ケイスケイ」であるが、別名として、トカンソウ、アシタグサ、アイダグサ、ハチジョウソウ等がある。明日葉は日本の温暖な海辺地域に自生又は栽培されている日本原産の植物である。明日葉は、根葉の葉柄が緑色で茎が太く、立直している八丈島種（青茎系）と、根葉の葉柄が赤みを帯び、茎は下方で分岐している大島種（赤茎系）とに大別される。本発明の組成物には、青茎系と赤茎系のいずれも使用可能であるが、好ましくは青茎系である。
【００１９】
明日葉エキスの調製方法を、以下に概説する。本発明の組成物に使用可能な明日葉の部位は、茎、葉、芽、花、果実、種のような地上部と、根、地下茎のような地下部に分かれる。明日葉の原料の必要部位を採取後、洗浄し、そして水分が通常、10％以下まで、好ましくは８％以下まで乾燥する。得られた乾燥物を、通常、８ｍｍ以下、好ましくは５ｍｍ以下、さらに好ましくは１ｍｍ以下に粉砕すると、以下のエキス抽出工程を効率よく進められる。
【００２０】
上記明日葉原料に、通常、100倍容以下の水性媒体を添加し、溶媒中で明日葉のエキスを抽出する。水性媒体の例は、水、エタノール等が挙げられる。明日葉中の水溶性の有効成分を抽出する場合には水が好ましく、主に疎水成分を抽出する場合には、エタノール水溶液が好ましい。エタノール水溶液のエタノール濃度は、通常、95〜99.5容量％、好ましくは98〜99.5容量％である。抽出温度は、通常、20〜30℃でよく、好ましくは℃である。抽出期間は、水性媒体や温度にもよるが、通常、１〜２日間でよい。
【００２１】
水性媒体中に抽出された明日葉エキスは、液状のまま、例えばエバポレーターを使用した濃縮、さらに、凍結乾燥等で乾燥固化してもよい。また、本発明の組成物には、市販の明日葉エキスを使用することができる。そのような例には、製品名：アシタバエキスＳＹ（有限会社島屋製）が挙げられる
【００２２】
本発明の組成物は、静脈内皮細胞賦活能が高い点で明日葉の地上部の水抽出物及び／又は地下部のエタノール抽出物が好ましく、明日葉の葉・茎の水抽出物及び／又は根のエタノール抽出物がさらに好ましい。
【００２３】
本発明の組成物は、また、静脈内皮細胞内の水分を引きつける能力が高い点で明日葉の地下部の水及び／又はエタノール抽出物が好ましく、明日葉の根の水及び／又はエタノール抽出物がさらに好ましい。
【００２４】
本発明の組成物は、さらにまた、リンパ管内皮細胞賦活能が高い点で明日葉のエタノール抽出物が好ましく、さらに明日葉の地上部のエタノール抽出物、さらに好ましくは明日葉の葉・茎のエタノール抽出物である。
【００２５】
本発明の脈管内皮細胞賦活用組成物の摂取方法は、経口又は皮膚外用である。全身の脈管内皮細胞賦活機能を高める点からは経口用組成物が好ましく、腕や下肢などの局所的部位の脈管内皮細胞賦活機能を高める点からは皮膚外用組成物が好ましい。
【００２６】
本発明の経口用組成物は、脈管内皮細胞を賦活化する機能を有する機能性食品が含まれる。この組成物には、上記の明日葉エキス以外に、汎用の食品添加物が添加される。例えば、経口投与の形態に応じて、汎用の賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、ビタミン、キサンチン誘導体、アミノ酸、ｐＨ調整剤、清涼化剤、懸濁化剤、粘稠剤、溶解補助剤、抗酸化剤、コーティング剤、可塑剤、界面活性剤、水、アルコール類、水溶性高分子、甘味料、矯味剤、酸味料、香料、着色剤等を発明の効果を損なわない質的及び量的範囲で添加することが可能である。
【００２７】
本発明の経口用組成物の形態は、例えば、散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤、チュアブル錠、ドロップ、水剤又はシロップなどである。
【００２８】
本発明の経口用組成物中の明日葉エキスの含有量（乾燥物換算）は、通常、100重量％以下でよく、好ましくは５〜50重量％であり、より好ましくは10〜30重量％である。
【００２９】
本発明の経口用組成物の１日当たりの摂取量は、明日葉エキスの摂取量（乾燥物換算）として、通常、10ｍｇ以上でよく、好ましくは、100〜1,000ｍｇ、さらに好ましくは300〜600ｍｇである。
【００３０】
本発明の皮膚外用組成物には、上記の明日葉エキス以外に、化粧品学的、皮膚病学的及び／又は薬学的に許容される添加剤として汎用されるものが添加される。例えば、水；エチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、１，４−ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、ペンチレングリコール、イソプレングリコール、グルコース、マルトース、フルクトース、キシリトール、ソルビトール、マルトトリオース、エリスリトール等の多価アルコール；メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブチルアルコール、イソブチルアルコール等の低級アルコール；オレイン酸、イソステアリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、ウンデシレン酸等の高級脂肪酸類；オリーブ油、トウモロコシ油、ツバキ油、マカデミアナッツ油、アボカド油、ナタネ油、ゴマ油、ヒマシ油、サフラワー油、綿実油、ホホバ油、ヤシ油、パーム油等の油脂；カルナバロウ、キャンデリラロウ、ミツロウ、ラノリン等のロウ類；ソルビトール、マンニトール、グルコース、ショ糖、ラクトース、トレハロース等の糖類；カラギーナン、キサンタンガム、ゼラチン、ペクチン、アガロース、アルギン酸塩、デキストリン、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシビニルポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、アラビアガム、カラヤガム、トラガントガム、タマリンドガム等の増粘剤；フェノキシエタノール、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、パラオキシ安息香酸エステル、安息香酸、サリチル酸とその塩類、ソルビン酸とその塩類、デヒドロ酢酸とその塩類、クロルクレゾール、ヘキサクロロフェン等の防腐剤；ラウロイル硫酸ナトリウム、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン等の非イオン界面活性剤、アルキルサルフェート塩、ノルマルドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等の陰イオン界面活性剤、ポリオキシエチレンドデシルモノメチルアンモニウムクロライド等の陽イオン界面活性剤；ステロイド系及び非ステロイド系抗炎症剤；ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＦ、ビタミンＫ等のビタミン類やジカプリル酸ピリドキシン、ジパルミチン酸ピリドキシン、ジパルミチン酸アスコルビル、モノパルミチン酸アスコルビル、モノステアリン酸アスコルビル等のビタミン誘導体；フラボノイド、カロテノイド等の抗酸化剤；スクワラン、スクワレン、流動パラフィン等の高級脂肪族炭化水素類；セラミド、セレブロシド、スフィンゴミエリン等のスフィンゴ脂質；コレステロール、フィトステロール等のステロール類；メチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、メチルシクロポリシロキサン、オクタメチルシクロテトラシロキサン、オクタメチルシクロペンタシロキサン、デカメチルシクロペンタシロキサン、メチルハイドロジェンポリシロキサン等のシリコーン類；パラアミノ安息香酸、パラアミノ安息香酸モノグリセリンエステル、アントラニル酸メチル、ホモメンチル−Ｎ−アセチルアントラニレート、パラメトキシケイ皮酸オクチル、エチル−４−イソプロピルシンナメート等の紫外線吸収剤；ベントナイト、スメクタイト、バイデライト、ノントロナイト、サポナイト、ヘクトライト、ソーコナイト、スチーブンサイト等の鉱物；ベンガラ、黄酸化鉄、黒酸化鉄、酸化コバルト、群青、紺青、酸化チタン、酸化亜鉛等の無機顔料；赤色202号、黄色４号、青色404号等の着色料；香料；香油等が挙げられる。
【００３１】
本発明の皮膚外用組成物の形態は、水剤、液剤、乳剤、乳液、エマルション、クリーム、粉体又は固形物である。脈管内皮細胞賦活化の即効性の観点から、水剤、液剤、乳剤、乳液、エマルション、クリーム又は粉体の形態が好ましい。
【００３２】
本発明の皮膚外用組成物には、化粧料や入浴料が含まれる。その具体的用途としては、美容液、保湿化粧水、柔軟化粧水、収れん化粧水等のスキンケア化粧品；ファーミング化粧品、アンチセルライト化粧品等のボディ化粧品；並びに、基礎化粧品（化粧水、乳液、クリーム）、ファンデーション、下地クリーム、フェイスパウダー、ウォータープルーフ等のメイクアップ化粧品；石鹸、シャンプー、リンス、入浴剤等の入浴料が挙げられる。
【００３３】
本発明の皮膚外用組成物中の明日葉エキスの含有量（乾燥物換算）は、通常、0.01〜50重量％でよく、好ましくは0.1〜30重量％であり、より好ましくは0.5〜10重量％である。
【００３４】
本発明の皮膚外用組成物の１日当たりの適用量は、明日葉エキスの適用量（乾燥物換算）として、通常、10ｍｇ以上でよく、好ましくは100ｍｇ以上であり、特に好ましくは300〜600ｍｇである。
【００３５】
本発明の脈管内皮細胞賦活用組成物の配合例を示す。しかし、本発明は、以下の配合例に限定されるものではない。
［配合例１］機能性食品（顆粒剤）
【表１】
0006977223.tif 000002
【００３６】
［配合例２］クリーム
【表２】
0006977223.tif 000003
【００３７】
［配合例３］化粧水
【表３】
0006977223.tif 000004
【００３８】
［配合例４］入浴剤
【表４】
0006977223.tif 000005
【００３９】
本発明の組成物は、脈管内皮細胞の賦活が必要な身体状況や疾患に適用することが期待される。そのような状態及び疾患には、抹消動脈疾患、閉塞性血栓性血管炎、血栓性静脈炎、慢性静脈不全、静脈瘤などの脈管系疾患；静脈性、リンパ性、炎症性、血管神経性などの局所性浮腫；腎性、心性、肝性、栄養障害性、薬剤性、内分泌性、特発性などの全身性浮腫などが挙げられる。本発明の組成物は、皮膚外用とすることで特に局所性浮腫に有用である。
【実施例】
【００４０】
以下に本発明の組成物の一実施の形態を、実施例を用いて説明する。しかし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４１】
〔調製例〕賦活化試験用試料の調製
(1)明日葉の葉・茎又は根の水抽出物の調製
八丈島産の明日葉から葉及び茎部又は根を採取、よく洗浄した後、水分がおよそ８％以下まで風乾した。この明日葉乾燥物を約５ｍｍ以下に裁断した後、さらに粒径200メッシュ以下まで粉砕した。上記明日葉粉砕物に100倍容の水を添加し、水中で明日葉エキスを抽出した。抽出温度は約25℃、そして抽出期間は１日間とし、振とう抽出した。得られた葉・茎又は根の明日葉エキスの水抽出液を、凍結乾燥機を用いて乾燥した。得られた乾燥物を水に再溶解することにより、明日葉（葉・茎又は根）の水抽出エキス試料を調製した。
【００４２】
(２)明日葉の葉・茎又は根のエタノール抽出物
上記（１）で得た明日葉粉砕物に100倍容のエタノール水溶液（濃度99.5％）を添加し、エタノール中で明日葉エキスを抽出した。抽出温度は約25℃、そして抽出期間は１日間とし、振とう抽出した。得られた葉・茎又は根の明日葉エキスのエタノール抽出液を、ロータリーエバポレーターを用いて乾燥した。得られた乾燥物をジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解することにより、明日葉（葉・茎又は根）のエタノール抽出エキス試料を調製した。
【００４３】
(3)赤ブドウ葉エキス
陽性対照として、赤ブドウ葉乾燥エキス（製品名：GMP266、アスク薬品株式会社製)を準備した。
【００４４】
〔実施例５〜６〕静脈内皮細胞賦活化試験（I）
培養した静脈内皮細胞に明日葉エキスを添加し、その細胞生存率を測定することによって、明日葉エキスの血管内皮内皮細胞賦活化作用を調べた。具体的には、以下に示す実験手順を行った。
【００４５】
１． 細胞培養
本試験に使用するモデル細胞として、ヒト伏在静脈内皮細胞(HSVEC:Human Saphenous Vein Endothelial Cells)をVEC Technologies Inc.(U.S.A.)より入手した。MCDB-131 COMPLETE培地(抗生物質及びウシ胎児血清(FBS)を含む)を添加した25cm2フラスコにHSVEC細胞を播種してコンフルエントになるまで前培養した。その後、96ウェルプレートに前培養液を1.0×105 cells/mLの濃度で播種しCO2インキュベーター(37℃,５％CO2)にてオーバーナイト培養した。
【００４６】
２．  試料の添加
Complete Classic medium培地(FBS及びCulture Boorst-Rを含む)に、表５に示す試料を表５記載の終濃度となるように添加した。この試料含有培地を、上記オーバーナイト培養後の培地と交換した。交換された培地をCO2インキュベーター(37℃,５％ＣＯ2)にて24時間培養した。
【００４７】
３．  MTT法による細胞生存率の測定 
上記培養後、上記96ウェルプレートから試料含有培地を除去し、プレートの各ウェルにComplete Classic medium培地(FBS及びCulture Boorst-Rを含む)を100μL加えた。次いで、各ウェルにMTT染色液(5mg/mL in PBS)を20μL添加し、CO2インキュベーターにて4時間、静置培養した。培地を除去し、各ウェルに塩酸-イソプロパノール溶液を100μLずつ加え、ピペッティングにてホルマザンを完全に溶解させた。マイクロプレートリーダーで570nmにおける吸光度を測定し、細胞生存率を算出した。なお、細胞生存率の算出の際、試料が水抽出物の場合は対照を水とし、そして試料がエタノール抽出物の場合は対照をDMSOとした。実験は３回繰り返し、その結果から平均値と標準偏差を算出した。結果を表５に示す。
【００４８】
【表５】
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【００４９】
表５に示すとおり、参考例１で赤ブドウ葉を添加したHSVEC細胞の24時間後生存率は、対照よりも向上する、すなわち、血管内皮細胞賦活化作用があることが確認された。比較例１〜４、実施例５〜６では、明日葉の葉・茎又は根の水抽出エキス又はエタノール抽出エキスを添加したHSVEC細胞の24時間後生存率は、対照1（水）又は対照２(DMSO)よりも高い細胞生存率を示した。したがって、明日葉の葉・茎及び根の水及びエタノール抽出エキスにも、血管内皮細胞賦活化作用があることが判明した。
【００５０】
比較例１と２との対比では、比較例１の明日葉の葉・茎の水抽出エキスは、比較例２の明日葉の根の水抽出エキスよりも高いHSVEC細胞生存率を示す点で、血管内皮細胞賦活用組成物としては、明日葉の根よりも明日葉の葉・茎の水抽出エキスの方が好ましいといえる。
【００５１】
比較例３〜実施例５〜６の対比では、実施例５〜６の明日葉の根のエタノールエキスは、比較例３〜４の明日葉の葉・茎のエタノール抽出エキスよりも高いHSVEC細胞生存率を示す。特に、明日葉の根のエタノール抽出エキスが0.1μg/mLという極めて低い濃度で細胞賦活化作用を示したことは全く意外なことである。よって、血管内皮細胞賦活用組成物としては、明日葉の葉・茎よりも明日葉の根のエタノール抽出エキスの方が好ましいといえる。
【００５２】
以上をまとめると、本発明の明日葉エキスを有効成分とする内皮細胞賦活用組成物、好ましくは明日葉の水及び／又はエタノールエキスを含む同組成物、さらに好ましくは明日葉の地上部の水抽出物及び／又は地下部のエタノール抽出物を含む同組成物によれば、血管内皮細胞を保護・修復することが期待される。
【００５３】
〔実施例９〜１０〕静脈内皮細胞内浸透圧調節試験
セルカルチャーインサート上で単層培養されたHSVECに明日葉の葉・茎又は根)の水又はエタノール抽出エキスを添加した際のHSVEC細胞の水分減少量を測定した。具体的には、以下に示す実験手順を行った。
【００５４】
１．   細胞培養
本試験に使用するモデル細胞として、比較例１と同様に、HSVECを用いた。MCDB-131 COMPLETE培地(抗生物質及びウシ胎児血清(FBS)を含む)を添加した25cm2フラスコにHSVEC細胞を播種してコンフルエントになるまで前培養した。その後、96ウェルプレートにセットしたセルカルチャーインサート(ポアサイズ:0.4μm)上に、前培養液を1.0×105 cells/mLの濃度で播種しCO2インキュベーター(37℃,５％CO2)内でコンフルエントになるまで培養した。
【００５５】
２．   試料の添加
Complete Classic medium培地(FBS及びCulture Boorst-Rを含む)に、表６に示す試料を表６記載の終濃度となるように添加した。この試料含有培地を、上記コンフルエント培養後の培地と交換し、CO2インキュベーター(37℃,５％CO2)にて48時間培養した。
【００５６】
３．   水分減少量の重量測定 
セルカルチャーインサートをディッシュ(φ10cm)に移し、試料添加直後（0時間）と試料添加48時間後とで重量を測定した。試料添加０時間の重量から48時間後の重量を引き算することにより、増減した水分量を算出した。実験は３回繰り返し、その結果から平均値と標準偏差を算出した。結果を表６に示す。
【００５７】
【表６】
0006977223.tif 000007
【００５８】
表６に示すとおり、参考例２の赤ブドウ葉には、HSVEC細胞の48時間後の細胞内水分を減少させる作用があることが確認された。一方、比較例７〜８、実施例９〜１０では、明日葉の葉・茎又は根の水抽出エキス又はエタノール抽出エキスを添加したセルカルチャーインサート上で単層培養したHSVEC細胞もまた、48時間後の細胞内水分量が減少することが判明した。
【００５９】
比較例７と８とを対比すると、実施例８の明日葉の根の水抽出エキスは、実施例７の明日葉の葉・茎の水抽出エキスよりも高い水分減少量を示す点で、明日葉の葉・茎よりも明日葉の根の水抽出エキスの方が、細胞内水分減少という点で好ましいといえる。
【００６０】
実施例９と１０とを対比すると、実施例１０の明日葉の根のエタノール抽出エキスは、実施例９の明日葉の葉・茎のエタノール抽出エキスよりも高い水分減少量を示す点で、明日葉の葉・茎よりも明日葉の根のエタノール抽出エキスの方が、細胞内水分減少という点で好ましいといえる。
【００６１】
本発明の組成物によってHSVEC細胞の細胞内水分量の減少が多くなった要因として、発明を限定する意図ではないが、以下のことが考えられる。生物には、体内の水分量を恒常的に保つために体液の浸透圧を一定に保つ浸透圧調節機構が備わっていることが知られている。細胞内液と細胞外液の濃度が同じ場合、細胞内外への水分移動は起こらない。細胞外液の濃度が細胞内液よりも低い(低張液)場合、水分が細胞内に入り、細胞が膨張、溶解(破裂)する。逆に、細胞外液の濃度が細胞内液よりも高い(高張液)場合、細胞内の水分が細胞外へ移動するため、細胞は金平糖状に細胞の形態が変化する。明日葉エキスを静脈内皮細胞周辺に添加することで、細胞外液の浸透圧が上昇(高張液化)し、浸透圧調節機構によって個々の細胞内の水分子が細胞の外へ移動した。明日葉エキスによって浸透圧調節作用が発現したことは、明日葉エキスに浸透圧調節物質が存在することを示唆する。
【００６２】
個々の内皮細胞がスリムになり、また比較例１で示したように個々の内皮細胞が賦活化したことで、HSVEC細胞のコンフルエント単層膜上にある水分子がコンフルエント単層膜の間隙を通過しや易くなったため、最終的にセルカルチャーインサートのフィルターを通過して96ウェルプレートの方へ移動した。
【００６３】
実施例９及び１０の結果をまとめると、明日葉のエキスには、血管内皮細胞の賦活化して血管を修復し、静脈内皮細胞を等張化して細胞を正常な形態へと変化させ、さらに静脈内に水分を引き寄せる作用によって細胞間液のバランスを正常化する作用効果があると推測される。これによって、血管内皮細胞の異常に基づく疾患、例えば浮腫を改善させる効果が期待できる。
【００６４】
〔実施例１３〕リンパ管内皮細胞賦活化試験
培養したリンパ管内皮細胞に明日葉エキスを添加し、その細胞生存率を測定することによって、明日葉エキスのリンパ管内皮内皮細胞賦活化作用を調べた。具体的には、以下に示す実験手順を行った。
【００６５】
１．   細胞培養
本試験に使用するモデル細胞として、ヒト皮膚リンパ管内皮細胞（Human Dermal Lymphatic Endothelial Cells、以下HDLECというHDLEC）をPromoCell GmbH (U.K.)より入手した。Endothelial Cell Basal Medium MV2培地（１％ペニシリン-ストレプトマイシン及びEndothelial Cell Growth Medium MV2 Supplement Mixを含む）を使用したφ10cmディッシュに、HDLEC細胞を播種してコンフルエントになるまで前培養した。その後、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、上記培地に再懸濁した。次いで、上記96ウェルプレートに前培養液を0.5×104cells/wellの濃度で播種し、CO2インキュベーター（37℃,５％CO2）内でオーバーナイト培養した。
【００６６】
２．   試料の添加
Endothelial Cell Basal Medium MV2培地（1%ペニシリン-ストレプトマイシン及びEndothelial Cell Growth Medium MV2 Supplement Mixを含む）に、表７に示す試料を表７記載の終濃度となるように添加した。上記試料含有培地を、上記オーバーナイト培養後の培地と交換し、CO2インキュベーター（37℃,５％CO2）内で24時間培養した。
【００６７】
３．   MTT法による細胞生存率の測定 
上記培養後、上記96ウェルプレートから試料含有培地を除去し、プレートの各ウェルにEndothelial Cell Basal Medium MV2培地（１％ペニシリン-ストレプトマイシン及びEndothelial Cell Growth Medium MV2 Supplement Mixを含む）を100μL加えた。次いで、各ウェルにMTT染色液（5 mg/ml in PBS）を20μL添加し、CO2インキュベーターにて4時間、静置培養した。培地を除去し、各ウェルに塩酸−イソプロパノール溶液を100μLずつ加え、ピペッティングにてホルマザンを完全に溶解させた。マイクロプレートリーダーで570nmにおける吸光度を測定し、細胞生存率を算出した。なお、細胞生存率の算出の際、試料が水抽出物の場合は対照を水とし、そして試料がエタノール抽出物の場合は対照をDMSOとした。実験は３回繰り返し、その結果から平均値と標準偏差を算出した。結果を表７に示す。
【００６８】
【表７】
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【００６９】
表７に示すとおり、参考例３の赤ブドウ葉エキスには、HDLEC細胞の24時間後生存率を向上させる作用があることが確認された。比較例１１又は１２では、明日葉の葉・茎又は根の水抽出エキスを添加したHDLEC細胞の24時間後生存率は、対照５(水)よりも若干高かった、実施例１３又は比較例１４において、明日葉の葉・茎又は根のエタノール抽出エキスを添加したHDLEC細胞の細胞生存率は、対照６(DMSO)よりも顕著に高い細胞生存率を示した。明日葉の葉・茎及び根のエタノール抽出物には、リンパ管内皮細胞を賦活化する作用があることが判明した。さらに、実施例１３と比較例１４とを対比すると、実施例１３の明日葉の葉・茎のエタノール抽出エキスは、比較例１４の明日葉の根のエタノール抽出エキスよりも高いHDLEC細胞生存率を示す点で、リンパ管内皮細胞賦活用組成物としては明日葉の葉・茎のエタノール抽出エキスの方が好ましいといえる。
【００７０】
以上をまとめると、本発明の明日葉エキスを有効成分とする内皮細胞賦活用組成物、好ましくは明日葉のエタノールエキスを含む同組成物、さらに好ましくは明日葉の葉・茎のエタノール抽出エキスを含む同組成物によれば、リンパ管内皮細胞を保護又は修復することが期待される。本発明の組成物によるリンパ管内皮細胞の保護・修復は、体内の過剰な水分や老廃物をリンパ管への排出を促し、リンパ浮腫を解消することが期待される。
【要約】
【課題】植物由来で静脈内皮細胞の保護や修復作用を有する新規な成分によって脈管内皮細胞を賦活化する組成物を提供する。
【解決手段】脈管内皮細胞賦活用組成物は、明日葉エキスを有効成分として含む。前記明日葉エキスは、明日葉のエタノール及び／又は水抽出物であるが好ましい。特に、前記明日葉エキスが明日葉の地上部の水抽出物及び／又は地下部のエタノール抽出物であり、そして前記脈管が血管である。さらに前記明日葉エキスが明日葉の地下部の水及び／又はエタノール抽出物であり、そして浮腫の改善又は予防用である。さらにまた、前記明日葉エキスが明日葉のエタノール抽出物であり、そして前記脈管がリンパ管である。
【選択図】なし