(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
キシロオリゴ糖、アラビノガラクタン、イヌリン、Ganoderma lucidumベータグルカン、不溶性酵母β（１，３／１，６）−グルカン、オートムギβ（１，３／１，４）−グルカン、不溶性乾燥Saccharomyces cerevisiae発酵物、およびBacillus coagulansを含む、組成物。
【請求項２】
酵母が、Saccharomyces cerevisiaeを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
少なくとも１つの賦形剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
組成物が、食品、食事サプリメント、食料品の医療用食品、医薬製品、または栄養製品を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
キシロオリゴ糖、アラビノガラクタン、イヌリン、Ganoderma lucidumベータグルカン、不溶性酵母β（１，３／１，６）−グルカン、オートムギβ（１，３／１，４）−グルカン、不溶性乾燥Saccharomyces cerevisiae発酵物、およびBacillus coagulansから本質的になる、組成物。
【請求項６】
消化器の健康、免疫、体重およびグルコースバランスが改善または維持するために使用するための、キシロオリゴ糖、アラビノガラクタン、イヌリン、Ganoderma lucidumベータグルカン、不溶性酵母β（１，３／１，６）−グルカン、オートムギβ（１，３／１，４）−グルカン、不溶性乾燥Saccharomyces cerevisiae発酵物、およびBacillus coagulansを含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景
ストレス、食事、ライフスタイルの選択、ならびに抗生物質および他の薬物の常用は、身体が、健康的な消化を維持し、疾病および疾患を撃退し、身体が必要とするすべての栄養を確実に摂取するのに必要なマイクロフローラの変更に貢献する。
【０００２】
プレバイオティクスは、「宿主の幸福と健康に利益をもたらす、胃腸内フローラの組成および／または活性の両方において特定の変化を可能にする選択的に発酵された成分」と定義されている（Roberfroid (2007) J. Nutr. 137(3 Suppl. 2):830S-7S; Gibson & Roberfroid (1995) J. Nutr. 125:1401-12）。プレバイオティクスは、様々な食品、特に特定の果物、野菜、穀物を含む高繊維食品において自然に発生する。プレバイオティクスは、時折、発酵性繊維としても知られている。それらは主にオリゴ糖、糖分子および可溶性繊維から構成されている。
【０００３】
すべての食事性炭水化物がプレバイオティクスではない。プレバイオティクスとして分類するための基準は、胃の酸性度、哺乳動物の酵素による加水分解、および胃腸吸収に対する耐性；腸内マイクロフローラによる発酵；および健康と幸福に寄与するそれらの腸内細菌の増殖および／または活性の選択的刺激が含まれる（Gibson & Roberfroid (1995)同上）。
【０００４】
食物繊維の健康上の利点は、今では十分に確立されている。繊維は腸の健康に役割を果たす。摂取量の増加は、体重の低下、炎症の軽減、および血中コレステロールレベルの低下などの健康上の利点に関連している。食物繊維が腸内マイクロバイオータによって代謝されると、マクロファージと樹状細胞（ＤＣ）の炎症経路を減衰させ、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の発達を促進し、腸の完全性と健康を維持することができる短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）が生成される。生成されたＳＣＦＡは、糞便および結腸のｐＨを低下させ、結腸細胞にエネルギーを提供し、腸内マイクロバイオータを調節する。
【０００５】
プレバイオティクス食物繊維の有益な効果に加えて、プロバイオティクスは胃腸の健康を促進することも示されている（Pandey, et al. (2016) J. Food. Sci. Technol. 52:7577-7587; Li, et al. (2016) Biotechnol. Adv. 34:1210-1224）。その結果として、最近の研究では、全体的な健康に関してプレバイオティクスとプロバイオティクスとの連携した役割が検討されている。ＳＣＦＡの産生および増加した繊維摂取の潜在的な直接的な利点に加えて、腸内マイクロバイオームの組成は、プレバイオティクスによって調節されることが示されている（Pandey, et al. (2016) J. Food. Sci. Technol. 52:7577-7587; Li, et al. (2016) Biotechnol. Adv. 34:1210-1224）。結腸に常在する２つの主要な細菌群であるラクトバチルス属とビフィドバクテリウム属は、プロバイオティクスであると考えられており、ヒトの健康に有益であることが知られている。しかしながら、最近の研究は、自閉症や様々な気分障害などの神経疾患と、腸内マイクロバイオームとの関連を含む、腸と消化器の健康を超えたそれらの役割を示唆している（Li, et al. (2016) Biotechnol. Adv. 34:1210-1224）。第２に、我々は高齢になるにつれ、ビフィドバクテリウム属集団は我々の腸内で減少し、したがって、補充される必要がある。これらの有益な微生物のレベルを十分な数に維持して、全体的な良好な健康を促進することが重要である。
【０００６】
キシロオリゴ糖は、植物のヘミセルロースに由来するキシランの可溶性オリゴマーである。擬似結腸システムを使用した研究において、プレバイオティクスであるキシロオリゴ糖の存在下でビフィドバクテリウム属の増殖が増加した（Makelainen, et al. (2010) Benefic. Microbes 1(1):81-91）。同様に、キシロオリゴ糖のヒト対象への供給は、腸内のビフィドバクテリウム属集団が増加させることが見出されている（Kobayashi, et al. (1991) Nippon Nogeikagaku Kaishi 65:1651-1653）。キシロオリゴ糖が添加された場合、糞便培養においてラクトバチルス属およびビフィドバクテリウム属のコロニーの増加が報告された（Muralikrishna, et al. (2011) Eur. Food Res. Technol. 232:601-61）。これらの研究は、キシロオリゴ糖が腸内マイクロバイオームに有益な効果を有することを示す。
【０００７】
アラビノガラクタンは、ニンジン、コムギ、ラディッシュおよびエンドウマメのような多種多様な植物に存在する天然の可溶性多糖類である。アラビノガラクタンは腸内マイクロバイオームによって発酵可能であり、プレバイオティクス食物繊維であると考えられている（Robinson, et al. (2001) J. Am. Coll. Nutr. 20:279-285; Grieshop, et al. (2002) J. Nutr. 132:478-482）。アラビノガラクタンは免疫調節活性を有することが示されている。ヒト末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）を活性化して、ナチュラルキラー細胞の活性を刺激するガンマインターフェロンを放出し、上気道感染症の発生を減少させることが示された。
【０００８】
イヌリンは、チコリ、ネギ、ゴボウ、キクイモおよびタマネギなどの多数の植物に存在する天然の貯蔵炭水化物である。結腸において、イヌリンは常在する微生物により急速に発酵され、結腸の健康に有益であるＳＣＦＡを形成する。イヌリンは、ラクトバチルス属およびビフィドバクテリウム属の増殖を刺激し、病原性細菌の数を減少させるプレバイオティクス活性を有している。糖尿病ラットを用いた研究は、経口投与した場合、イヌリンが血中の脂質とグルコースを減少させることができることを示した（Byung-Sung, et al. (2011) J. Anim. Vet. Adv. 10:2501-2507）。イヌリンはまた、ヒトの研究において抗コレステロール効果も示しており、結腸がんのリスクを減少させることに関連している。イヌリンのようなプレバイオティクスおよびプロバイオティクスを使用した肥満における腸内マイクロバイオータの調節もまた研究されている（Backhed, et al. (2011) Nat. Rev. Endocrinol. 7:639-646）。
【０００９】
オートムギふすまは、よく知られている食物繊維である。オートムギ由来のベータグルカンは、そのコレステロールを低下させる能力について試験されている（Othman, et al. (2011) Nutr. Rev. 69:299-309）。オートムギふすまは、糖尿病、心血管疾患および免疫における有益な効果に関連している（Cheickna & Zhang (2012) Compre. Rev. Food Sci. Food Safety 11:355-365）。
【００１０】
ベータグルカンは、免疫を強化するその役割、特に薬用キノコに由来するものにおいて顕著である。ベータグルカンはグルコースポリマーであり、酵母とキノコの細胞壁を構成する。ベータグルカンはマクロファージを活性化して免疫を強化し、それらの免疫刺激特性と潜在的な抗発癌効果についてよく研究されている（Huang & Ning (2010) Int. J. Biol. Macromol. 47:336-341; Thyagarajan, et al. (2006) Int. J. Mol. Med. 18:657-64; Yu, et al. (2007) J. Food Sci. 72:S435-442）。３つの異なるビヒドバクテリウム属種であるB. infantis、B. longumおよびB. adolescentisは、ベータグルカン上で増殖し、ＳＣＦＡを産生し得ることが報告されている。ヒトの研究において、Agaricusキノコからのベータグルカンは、潰瘍性大腸炎とクローン病の患者において炎症性サイトカインのレベルを低下させた。
【００１１】
パン酵母（Saccharomyces cerevisiae）の全細胞は、免疫を支持する多くの化合物と代謝物を含有する。それはホールフード（whole food）であり、様々なヒト試験は、この酵母が免疫強化特性を有することを示している（Moyad, et al. (2010) J. Alternat. Comple. Med. 16:213-218; Moyad, et al. (2009) Adv. Ther. 26:795-804; Jensen, et al. (2011) J. Medic. Food 14:1002-1010）。ラットの免疫モデルにおいては、酵母の発酵物の投与は、炎症を予防し、軽減した。
【００１２】
Bacillus coagulansは、注目を集めている別のプロバイオティクス生物であり、市販されている製品に一般に見出される。B. coagulansの投与は、Clostrisdium difficile関連疾患の患者に有益な効果を有することが示されている。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、Lactobacillus acidophilusおよびBifidobacterium longumのin vitro増殖に関する本発明のマルチ繊維処方物の効果を示す。
【００１４】
【図２】図２は、好気性または嫌気性増殖条件のいずれかにおける、Bacillus coagulansのin vitro増殖に関する本発明のマルチ繊維処方物の効果を示す。
【００１５】
【図３】図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃは、構成成分としてB. coagulansを含む本発明のマルチ繊維組成物で処置された、上行結腸リアクター（図３Ａ）、横行結腸（図３Ｂ）および下行結腸（図３Ｃ）における、酢酸（ＡＡ）、プロピオン酸（ＰＡ）、ブチル酸（ＢＡ）、および総ＳＣＦＡ（合計）の絶対値（上パネル）、比例値（中央パネル）、および正規化値（下パネル）を示す。２つの対照週間および３つの処置週間にわたって採取された３つのサンプルの結果が示される。
【００１６】
【図４】図４は、上行（ＡＣ；上）、横行結腸（ＴＣ；中央）、および下行結腸（ＤＣ；下）における酢酸産生に関する本発明のマルチ繊維組成物の効果を示す。左：対照週間または処置週間（ｎ＝３）における週あたりの平均酢酸産生、右：対照期間（ｎ＝６）および処置期間（ｎ＝９）にわたる平均酢酸産生（＊は、統計学的有意差を示す）。
【００１７】
【図５】図５は、上行（ＡＣ；上）、横行結腸（ＴＣ；中央）、および下行結腸（ＤＣ；下）におけるプロピオン酸産生に関する本発明のマルチ繊維組成物の効果を示す。左：対照週間または処置週間（ｎ＝３）における週あたりの平均プロピオン酸産生、右：対照期間（ｎ＝６）および処置期間（ｎ＝９）にわたる平均プロピオン酸産生（＊は、統計学的有意差を示す）。
【００１８】
【図６】図６は、上行（ＡＣ；上）、横行結腸（ＴＣ；中央）、および下行結腸（ＤＣ；下）におけるブチル酸産生に関する本発明のマルチ繊維組成物の効果を示す。左：対照週間または処置週間（ｎ＝３）における週あたりの平均ブチル酸産生、右：対照期間（ｎ＝６）および処置期間（ｎ＝９）にわたる平均ブチル酸産生（＊は、統計学的有意差を示す）。
【００１９】
【図７】図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃは、構成成分としてB. coagulansを添加しない本発明のマルチ繊維組成物で処置された、上行結腸リアクター（図７Ａ）、横行結腸（図７Ｂ）および下行結腸（図７Ｃ）における、酢酸（ＡＡ）、プロピオン酸（ＰＡ）、ブチル酸（ＢＡ）、および総ＳＣＦＡ（合計）の絶対値、比例値、および正規化値を示す。２つの対照週間および３つの処置週間において採取された３つのサンプルの結果が示される。
【００２０】
【図８】図８は、上行（ＡＣ；上）、横行結腸（ＴＣ；中央）、および下行結腸（ＤＣ；下）における分岐ＳＣＦＡ産生に関する本発明のマルチ繊維組成物の効果を示す。左：対照週間または処置週間（ｎ＝３）における週あたりの平均分岐ＳＣＦＡ産生、右：対照期間（ｎ＝６）および処置期間（ｎ＝９）にわたる平均分岐ＳＣＦＡ産生（＊は、統計学的有意差を示す）。
【００２１】
【図９】図９Ａ、９Ｂおよび９Ｃは、ｑＰＣＲで査定された、上行結腸（ＡＣ；図９Ａ）、横行結腸（ＴＣ；図９Ｂ）、および下行結腸（ＤＣ；図９Ｃ）における７つの微生物集団に関する本発明のマルチ繊維組成物の効果を示す。各バーは、対照期間および処置期間にわたる、平均コピー数を表す。
【００２２】
【図１０】図１０は、Ｃａｃｏ−２／ＴＨＰ１−Ｂｌｕｅ共培養物上の経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ、上パネル）ルシファーイエロー（ＬＹ）のおよび傍細胞輸送（下パネル）に関するＳＨＩＭＥ収集サンプルの効果を示す。ＴＥＥＲは共培養の前処置の２４時間後に測定し、各２４時間の値をその対応する０時間の値に対して正規化し、初期値のパーセンテージとして示す。上部の点線は１００％（初期値）を表す。ＬＹの輸送は、共培養の４８時間（２４時間の前処置＋２４時間のＬＹ）後に測定される。両方のプロットに描かれている下部の破線は、実験対照ＣＭ（完全培地）に対応する。（＊）は、各製品内のＣとＴとの間の統計的な有意差を表す。（＄）は、本発明のマルチ繊維組成物間の統計学的有意差を表す。Ｃ：ＳＨＩＭＥ対照サンプル；Ｔ：ＳＨＩＭＥ処置サンプル。
【００２３】
【図１１】図１１は、ＴＨＰ１−Ｂｌｕｅ細胞のＮＦ−κＢ活性に関するＳＨＩＭＥ収集サンプルの効果を示す。ＮＦ−κＢ活性レベルは、ＳＨＩＭＥ収集サンプルで最初に２４時間前処置した共培養物のＬＰＳ処置６時間後に測定した。赤い破線は、実験対照ＬＰＳ＋に対応する。（＊）は、各製品内のＣとＴとの間の統計学的有意差を表す。本発明の２つのマルチ繊維組成物間において、統計的有意差は見られなかった。Ｃ：ＳＨＩＭＥ対照サンプル；Ｔ：ＳＨＩＭＥ処置サンプル。
【００２４】
【図１２】図１２は、ＩＬ−６（上パネル）およびＩＬ−１０（下パネル）レベルに関するＳＨＩＭＥ収集サンプルの効果を示す。サイトカインレベルは、ＳＨＩＭＥ収集サンプルで最初に２４時間前処置した共培養物のＬＰＳ処置６時間後に測定した。破線は、実験対照ＬＰＳ＋に対応する。（＊）は、各製品内のＣとＴとの間の統計学的有意差を表す。（＄）は、本発明のマルチ繊維組成物間の統計学的有意差を表す。Ｃ：ＳＨＩＭＥ対照サンプル；Ｔ：ＳＨＩＭＥ処置サンプル。
【図１３】図１３は、観測値間の類似性と変数間の相関とを示す、ジョイント（joint）ＰＣＡ／相関バイプロットを示す。バイプロットは、変数をベクトルとして、観測値をシンボルとしてプロットする。バイプロット１）において、対照完全培地（ＣＭ）およびＬＰＳ＋は１．０まで減少し、１つの単一の点（「＋」、Ｃｔｒｌｓ）として描かれる；２）ＮａＢ（「ｘ」）；３）B. coagulansを含まないマルチ繊維組成物の対照期間（丸）；４）B. coagulansを含むマルチ繊維組成物の対照期間（三角形）；５）B. coagulansを含まないマルチ繊維組成物の処置期間（四角）；および６）B. coagulansを含むマルチ繊維組成物の処置期間(菱形)。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
発明の概要
本発明は、キシロオリゴ糖、アラビノガラクタン、イヌリン、Ganoderma lucidumベータグルカン、不溶性酵母β（１，３／１，６）−グルカン（例えば、S. cerevisiae β（１，３／１，６）−グルカン）、オートムギβ（１，３／１，４）−グルカン、不溶性乾燥Saccharomyces cerevisiae発酵物、およびプロバイオティクスであるBacillus coagulansを含む、またはそれらから本質的になる組成物である。さらに他の態様において、処方物は、少なくとも１つの賦形剤を含む。いくつかの態様において、組成物は、食品、食事サプリメント、食料品の医療用食品、医薬製品、または栄養製品の形態をとる。前記組成物を使用して消化器の健康、体重、グルコースバランス改善または維持し、免疫を強化するための方法がまた提供される。
【００２６】
発明の詳細な説明
ライフスタイルや食習慣の変化による懸念である消化器の健康とは別に生ずる、他のヒトの健康上の懸念としては、免疫の低下、肥満、高コレステロールレベル、およびその他の代謝障害が含まれる。少ない食物繊維の摂取はなかでも、肥満、心血管疾患、および２型糖尿病などのリスクの増加に関連する（Cho, et al. (2013) Am. J. Clin. Nutr. 98:594-619; Liu, et al. (2003) Am. J. Clin. Nutr. 78:920-927; Trock, et al. (1990) J. Natl. Cancer Inst. 82:650-61; Ludwig, et al. (1999) JAMA 282:1539-1546）。ディスバイオシスまたはマイクロバイオームのアンバランスは、腸内細菌により産生される代謝物を変更し、それは、その後、自然および適応免疫応答を調節不全にし、最終的に炎症および／または感染に対する保護の喪失を導く可能性があると考えられている。特定の腸内細菌は、アンモニア、Ｄ−乳酸、エンドトキシン（リポ多糖）、および外毒素（エンテロトキシン）などの毒素を産生し得、これは腸の病変をさらに悪化させ得る。糞便サンプルの全ゲノム配列決定は、繊維消費に伴うバクテロイデス門：ファーミキューテス門の比のシフトが存在することを明らかにし（Holscher, et al. (2015) Am. J. Clin. Nutr. 101:55-64）、健康な成人の糞便マイクロバイオームの系統学的な構造と機能的能力に関する食物繊維の影響を示す。
【００２７】
いくつかの食物繊維はまた、「プレバイオティクス」活性としても知られている、結腸内の有益な細菌（プロバイオティクス細菌）の増殖を刺激する能力も有する。市販の繊維は主に消化器の健康のために処方されており、BENEFIBER（登録商標）（食物繊維サプリメント；Novartis AG）、METAMUCIL（登録商標）（食事サプリメント；Proctor & Gamble Co.）およびGlaxo Smith Klineから入手可能な食物繊維であるCITRUCEL（登録商標）（緩下剤；Merrell Dow Pharmaceuticals, Inc.）などの製品を含む。しかしながら、これらの市販の製品は、１種類の繊維のみから構成されている。本発明において、様々な健康上の懸念に対処し、プレバイオティクスとして働くことにより腸内マイクロフローラのバランスを回復するために使用することができる複数の繊維（可溶性および不溶性の両方）製品が開発された。
【００２８】
経口処方物中のプレバイオティクス構成成分とプロバイオティクス構成成分との混合物は、消化器の健康の改善と維持、健康的な体重の維持、グルコース管理の改善、および免疫の強化を含む、有益な健康効果を有することが現在見出されている。より具体的には、ヒトの腸に本来備わっている有益な微生物（例えば、ラクトバチルス属およびビヒドバクテリウム属種）の増殖を増強し、健康を改善するためのプラスの効果を提供するために使用するための、可溶性および不溶性プレバイオティクスの特定の組み合わせが現在同定されている。ヒトの健康における腸内マイクロバイオータの有益な役割と、自己免疫疾患、結腸がん、胃潰瘍、心血管疾患、慢性腎疾患、機能性腸疾患および肥満を含む疾患の予防可能性を考慮すると、本組成物は、消化器の健康、体重管理およびグルコースバランスの維持に用途が見出される。加えて、可溶性プレバイオティクスと不溶性プレバイオティクスとの組み合わせは、プロバイオティクスであるB. coagulansと組み合わせられ、ヒトの腸に本来備わっている有益な微生物（例えば、ラクトバチルス属およびビフィドバクテリウム属種）の増殖を増強するためのみならず、対象の免疫を強化するための組成物を提供する。本発明の組成物は、キシロオリゴ糖、アラビノガラクタン、イヌリン、Ganoderma lucidumベータグルカン、不溶性酵母β（１，３／１，６）−グルカン、オートムギβ（１，３／１，４）−グルカン、不溶性乾燥S. cerevisiae発酵物、およびB. coagulansを含むか、またはそれらからなる。
【００２９】
本発明の組成物は、腸のｐＨのバランスをとり、毒性廃棄物を除去する可溶性繊維と、脂肪酸に結合し、総コレステロールを低下させ、血糖を調整する不溶性繊維の両方を含むことを考慮すると、この発明の組成物は、抗発癌、抗微生物、脂質低下、免疫強化、およびグルコース調節活性を含む様々な活性を有する。さらに、このプレバイオティクス組成物は、ミネラルの吸収とバランスを改善し、ビヒドバクテリウム属およびラクトバチルス属ファミリーに属する細菌の増殖を刺激することができる。薬物動態学的に、この発明のプレバイオティクス構成成分およびプロバイオティクス構成成分は、ほぼ無傷で結腸に到達する。
【００３０】
キシロオリゴ糖、またはＸＯＳは、β（１，４）グリコシド結合で結合された、２〜７個のキシロース分子から構成される可溶性の非消化性糖ポリマーを指す。キシロオリゴ糖は、果物、野菜、竹、蜂蜜および牛乳中に存在し、トウモロコシの穂軸、トウモロコシふすま、米糠、コムギふすま、およびサイリウムなどのキシランが豊富な食物成分のエンドキシラナーゼによる酵素加水分解により生産される。したがって、この発明のキシロオリゴ糖は、より大きな炭水化物分子の酵素消化により得られる。キシロオリゴ糖は、商業的な供給元（たとえば、Hangzhou, China）からも得ることができる。
【００３１】
キシロオリゴ糖は上部胃腸管での消化に抵抗するため、それらは、大腸で機能してビヒドバクテリウム属種の増殖を増加させ（JP 2003048901）、したがって胃の機能を改善することができる。加えて、キシロオリゴ糖は、血糖レベルと脂肪代謝を改善し、抗生物質、化学療法、または放射線療法後の正常な腸内フローラを回復し、ミネラル吸収とビタミンＢ産生を増加させ、腸内の腐敗を減少させる可能性を有する。動物モデルにおいて、ＸＯＳはトリグリセリドを減少させることも示されている（Beylot (2005) Br. J. Nutr. 93(suppl 1) S163-8）。ＸＯＳは、ＦＯＳとともに、１，２−ジメチルヒドラジン処置をした雄性Sprague-Dawleyラットの結腸において異常陰窩巣の数を減少させることが示された（Hsu, et al. (2004) J. Nutr. 134:1523-8）。擬似結腸システムを使用した研究は、プレバイオティクスとしてＸＯＳを使用してビフィドバクテリウム属の増殖を増加させることが可能であることを示している（Makelainen, et al. (2010) Beneficial Microbes 1:81-91）。ＸＯＳのヒト対象へのその供給は、結腸中のビフィドバクテリウム属集団を増加させることが報告されている（Okazaki, et al. (1990) Bifidobacteria Microflola 9:77-86）。同様の結果は、日本人男性の集団においても報告された（Kobayashi, et al. (1991) Nippon Nogeikagaku Kaishi 65:1651-1653）。ラクトバチルス属とビフィドバクテリウム属の増加したレベルは、添加されたＸＯＳを含む、糞便培養物において観察された（Muralikrishna, et al. (2011) Eur. Food Res. Technol. 232:601-61）。一緒に考えると、これらの研究は、ＸＯＳ曝露が有益な微生物の増殖にプラスの影響を有したことを実証した。ヒトにおける使用に対するＸＯＳの安全性は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）による、一般に安全と認められている（ＧＲＡＳ）物質としてのその認識により実証されている。
【００３２】
アラビノガラクタンは、１：６の比でアラビノースとガラクトースから構成されている水溶性β（３，６）−Ｄ−ガラクタンである。ニンジン、コムギ、ラディッシュ、エンドウマメのような多種多様な植物に存在している。アラビノガラクタンは免疫調節剤であり、ヒト末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）を活性化して炎症誘導性サイトカインを放出し、ＮＫ細胞活性を刺激することが示されている（Hauer & Anderer (1993) Cancer Immunol. Immunother. 36:237-44; Riede, et al. (2013) Curr. Med. Res. Opin. 29:251-8）。アラビノガラクタンは、免疫系にプラスの様式で影響を与える、すなわち、免疫を強化することが示されている（Riede, et al. (2013) Curr. Med. Res. Opin. 29: 251-258）。
【００３３】
食事消費のために、アラビノガラクタンは、カラマツの木（カラマツ属種）の木材から単離され、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって食物繊維としての使用が承認されている。腸内細菌により発酵可能なカラマツアラビノガラクタン（Robinson, et al. (2001) J. Am. Coll. Nutr. 20:279-85; Grieshop, et al. (2002) J. Nutr. 132:478-82）は、おおよそ９８％は、β（１，３）連結ならびにガラクトースβ（１，６）およびアラビノースβ（１，６および１，３）糖側鎖を特徴とする、ガラクタン骨格を有するアラビノガラクタンである。
【００３４】
アラビノガラクタンは、従来の方法により単離および／または精製することができる。例えば、アラビノガラクタンは、Larix occidentalisおよびL. laricinaとしてそれぞれ知られている、セイヨウカラマツおよび東カラマツ（Western and Eastern Larch）の木に見出される細部の内腔から、水性媒体（例えば、純水、または抽出を促進する有機酸または界面活性剤などの少量の溶解化合物を含む水）で抽出され得る。例えば、US 3,509,126を参照のこと。アラビノガラクタンの別の供給源は、インド原産の無毛で多肉の登山低木（climbing shrub）であるTinospora cordifoliaからである。あるいは、アラビノガラクタンは、商業的供給源（例えば、MAYPRO INDUSTRIES, Purchase, NY）から得ることができる。
【００３５】
イヌリンは、末端グルコース分子を含むオリゴフルクトースから構成される水溶性食物繊維である。それは、キクイモ（Helianthus tuberosus）、チコリの根およびリュウゼツランから得られる。キクイモからイヌリンを抽出するためのいくつかの方法は開発されている。例えば、キクイモの塊茎は、１０〜１５分間の沸騰水抽出を含む前処理ステップの含む、または含まずに（US 5,968,365）、熱湯と混合され得る（Yamazaki, et al. (1994) J. Sci. Food Agri. 64:461-5）。イヌリンは、商業的供給源、例えば、少なくとも９０％のイヌリン、７％未満のフルクトース、３％未満のグルコース、２％未満のスクロース、および１％未満の他の炭水化物から構成される有機粉末である、MAYPRO INDUSTRIES（Purchase, NY）から得ることができる。
【００３６】
イヌリンは、ラクトバチルス属およびビフィドバクテリウム属の増殖を支持するプレバイオティクスであり（Garcia-Peris, et al. (2012) Nutr. Hosp. 27:1908-15）、血中脂質およびグルコースを低下させる（Byung-Sung, et al. (2011) J. Anim. Vet. Advance 10:2501-7）。イヌリンはまた、ヒト研究において、抗コレステロール効果を示し（Letexier, et al. (2003) Am. J. Clin. Nutr. 77:559-64）、結腸がんの減少において役割を示した（Pool-Zobel, et al. (2005) Br. J. Nutr. 93:s73-s90)）。
【００３７】
Ganoderma lucidumベータグルカンは、Ganoderma lucidumの菌糸体に由来する水溶性炭水化物ポリマーを指すために本明細書において使用される。特に、この発明のG. lucidumベータグルカンは、β（１，３）骨格から生じる（coming off）短いβ（１，６）分岐である。ある態様において、ベータグルカンは、３５０００〜２００００００Ｄａの範囲の分子量を有する。研究は、このキノコベータグルカンが、最前線の免疫細胞を活性化することにより免疫系を効果的に支持し、それを過剰刺激することなく健康的で堅牢な免疫応答を支持することを実証している。ベータグルカンは、他の潜在的な脅威に対処するために、外来の侵入物を消費し、顆粒球（好中球、好酸球および好塩基球）、Ｂ細胞およびＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む免疫系の他の構成成分を「トリガー」する、マクロファージを活性化することにより免疫応答を増強する。ベータグルカンは、知られている方法（例えば、US 2009/0098619を参照のこと）に従って、トレハロースおよびマンノース中でG. lucidumを培養し、続いて、従来の方法、例えば、沸騰水抽出またはエタノール沈殿（例えば、US 2014/0031542を参照のこと）により、ベータグルカンを抽出および精製することにより得ることができる。あるいは、精製されたG. lucidumベータグルカンは、商業的供給源から得ることができる。例示的なキノコベータグルカンは、Super Beta Glucan Inc.（Irvine, CA）から入手可能であるIMMUNLINK MBG（キノコベータグルカンを含有する炭水化物ポリマー）である。
【００３８】
不溶性酵母β（１，３／１，６）−グルカンは、β（１，６）連結を介して連結される周期的なβ（１，３）分岐を有するβ（１，３）連結グルコース分子で主に構成される、酵母からの不溶性ベータグルカンを指すために本明細書で使用され、より正式にはポリ−（１，６）−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１，３）−β−Ｄ−グルコピラノースとして知られている。不溶性酵母β（１，３／１，６）−グルカンの供給源は、例えば、Saccharomyces cerevisiae、S. delbrueckii、S. rosei、S. microellipsodes、S. carlsbergensis、S. bisporus、S. fermentati、S. rouxii、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces polysporus、Candida albicans、C. cloacae、C. tropicalis、C. utilis、Hansenula wingei、H. arni、H. henricii、H. americana、H. canadiensis、H. capsulata、H. polymorpha、Pichia kluyveri、P. pastoris、P. polymorpha、P. rhodanensis、P ohmeri、Torulopsis bovin、およびT. glabrataを含む酵母の任意の株の酵母細胞からであり得る。酵母細胞は、当該技術分野で知られている方法により培養されてもよい。典型的な増殖培地は、例えば、グルコース、ペプトンおよび酵母抽出物を含む。酵母細胞は、バイオマスを液体培地から分離するために典型的に適用される方法によって増殖培地から収穫および分離されてもよい。そのような方法は、典型的には、濾過または遠心分離などの固液分離プロセスを採用する。好ましくは、細胞は、酵母細胞中のグリコーゲンおよびキチンの量を最小化するために、中期から後期の対数増殖期で収穫される。この点で、不溶性酵母のβ（１，３／１，６）−グルカンは、５０％グルカンを超えるグルカン含有量を有する。この点において、不溶性酵母β（１，３／１，６）−グルカンは、５０％グルカンを超えるグルカン含有量を有する。ある態様において、残りは、細胞内脂質および／またはグリコーゲンから構成され得る。
【００３９】
不溶性酵母ベータグルカンの調製は、酵母を好適な濃度のアルカリ水溶液で処理することを含み、酵母の一部は可溶化し、主にβ（１，６）とβ（１，３）連結を有するアルカリ水酸化物不溶性ベータグルカン調製物を形成する。一般的に採用されるアルカリは、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムなどのアルカリ金属水酸化物または同等物である。ある態様において、例えば、弱酸処理により、実質的にすべてのタンパク質材料を細胞から除去することが望ましい。そのような除去は、タンパク質の１パーセント未満が不溶性ベータグルカンとともに残る程度まで行われる。不溶性ベータグルカンは、必要に応じて、または望ましい場合、タンパク質およびコンタミナントのレベルを下げるために、さらに洗浄および抽出に供され得る。処理後、製品のｐＨは約６．０〜約７．８の範囲に調整され得る。抽出方法については、例えば、US 2006/0009419およびUS 5,849,720を参照のこと。不溶性酵母ベータグルカンはまた、例えば、MAYPRO Beta Clucan（MAYPRO INDUSTRIES, Purchase, NY）などの商業的供給源から得ることもできる。いくつかの態様において、ベータグルカンは、β（１，６）連結の量を減少させるために酸（例えば、酢酸）での化学的処理によって修飾され、したがって、これらの修飾されたグルカンの水溶液の粘度の増加により証明されるように、前記グルカンの流体力学的特性は変化する。
【００４０】
可溶性オートムギβ（１，３／１，４）−グルカンは、一般的なオートムギ（Avena sativa）から得られる、主に（１，３）連結セロトリオシルおよびセロテトラオシル単位（＞９０％）から構成される線状の多糖を指す。オートムギβ（１，３／１，４）−グルカンはコレステロール低下活性を有すること（Othman, et al. (2011) Nutr. Rev. 69(6):299-309）、および糖尿病、心血管疾患、および免疫に有益な役割を提供すること（Daou & Zhang (2012) Comp. Rev. Food Sci. Food Safety 11:355-365）が示されている。オートムギβ（１，３／１，４）−グルカンを得るための抽出方法は、熱水およびアルカリ溶液中のβ−グルカンの溶解度、等電沈殿による溶解タンパク質の分離、および硫酸アンモニウム、２−プロパノール、またはエタノールによるβ−グルカンの沈殿に基づく（Wood, et al. (1978) Cereal Chem. 55:1038-49）。オートムギふすまからの収率はより高く、６１％であり、分離された画分は８４％のベータグルカンを含有した。その後透析、限外濾過、またはアルコール沈殿による精製を伴う同様の方法は、オートムギベータグルカンを抽出するために使用されている（Beer, et al. (1996) Cereal Chem. 73:58-62）。上記の方法を使用して、６０〜６５％のベータグルカン含有量を有する調製物を生産することが可能であった。ある態様において、本発明に従って使用されるオートムギベータグルカンは、２０％〜４０％のベータグルカンを含む。オートムギβ（１，３／１，４）−グルカンはまた、商業的な供給源、例えば、２１〜２３％がベータ−グルカンから構成される、OATWELL 22 oat beta glucan（DSM Nutritional Products, Inc., Heerlen, The Netherlands）からも得ることができる。
【００４１】
不溶性乾燥S. cerevisiae発酵物は、S. cerevisiaeの不活性な酵母細胞全体と、酵母細胞の発酵によって作り出される、天然の発酵副産物を指す。したがって、乾燥発酵物は、醸造用酵母、活性酵母、または単離されたベータグルカンのみではない。乾燥発酵物は、水、窒素源、炭素源、微量栄養素を含有する培地中で、S. cerevisiaeの食品グレードの酵母株を要求する、従来の発酵によって得ることができる。所定の発酵期間の後、湿った製品全体（すなわち、培地中の酵母細胞）は脱水のために乾燥機に置かれる。脱水は、酵母細胞を死滅させるのに必要な温度で行われる。その後、製品は粉砕され、本組成物に使用される。乾燥S. cerevisiae発酵物はまた、商業的供給源、例えば、EPICOR dried S. cerevisiae farentate（Embria Health Sciences, Ankeny, IA）からも得ることができる。
【００４２】
ベータグルカンは、様々なベータ連結（例えば、１，３；１，４；１，６）から構成されるグルコースポリマーであり、酵母（例えば、S. cerevisiae）、酵母様真菌（例えば、Aureobasidium pullulans）およびキノコ（例えば、Lentinula edodes（Shiitake）、G. lucidum（Reishi））の細胞壁を構成する。これらは、補体系を活性化し、マクロファージおよびナチュラルキラー細胞を増強し、したがって、免疫を強化する。３つの異なるビヒドバクテリウム属種による、例えば、キノコおよびオオムギからのベータグルカンの発酵は査定され（Zhao & Cheung (2011) J. Agric. Food. Chem. 59:5986-5692）、B infantis、B longumおよびB adolescentisが、これらのベータグルカン上で増殖し、短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）を産生することができたことを見出した。さらに、酵母由来ベータグルカンは、ヒトの研究において、総血漿コレステロールを低下させることができることが実証されている（Nicolosi, et al. (1999) Am. J. Clin. Nutr. 70:208-212）。他のヒトの臨床試験は、アレルギー性鼻炎（Kirmaz, et al. (2005) Eur. Cyto. Network 16:128-134）、乳がん（Demir, et al. (2007) Int. Immunopharmacol. 7:113-116）および過体重のヒトにおけるＩＬ−１０レベル（Kohl, et al. (2009) Nutr. Res. 29:248-254）において、酵母ベータグルカン消費の有益な効果を示す。
【００４３】
可溶性繊維成分および不溶性繊維構成成分に加えて、プレバイオティクス組成物はそれにプロバイオティクス生物であるB. coagulansが添加されている。プロバイオティクス細菌のほとんどは、ラクトバチルス属およびビフィドバクテリウム属のクラスに属する。これらの細菌は温度に敏感であり、これらの生物を含有する製品またはサプリメントは、冷蔵条件下で保存しなければならない。この問題は、Bacillus coagulansと改名された胞子形成ラクトバチルス属を使用することにより克服することができる。これはよく研究され、特徴付けられており、一般に安全と認められている（ＧＲＡＳ）ステータスを保持していると考えられている。ヒトの研究は、B. coagulansが、ウイルス感染を減少させ（Baron, (2009) Postgrad. Med. 121:114-118）、過敏性腸症候群の患者を助け（Hun (2009) Postgrad. Med. 121:119-124）、そして炎症を軽減する（Jenson, et al. (2010) BMC Immunol. 11:15）ことができることを示している。B. coagulants組成物は、１０億〜５０億ＣＦＵ／ｇｍであった（Nebraska cultures, Walnut Creek, CA）。
【００４４】
本発明の組成物は、食品、食事サプリメント、食料品の医療用食品、医薬製品、または栄養製品として調製され得る。本発明の目的のために、食品は、これらに限定されることなく、ヘルスバー（health bar）、健康飲料、ヨーグルト、ダヒ（dahi）、アイスクリーム、フローズンヨーグルトまたは他の冷凍食品を含む。ある態様において、プレバイオティクス組成物の繊維は、微粒子または粉末形態として提供される。前記製品の摂取は、腸に即時のプレバイオティクスを提供し、それにより、ヒトの腸に本来備わっている有益な微生物（例えば、ラクトバチルス属およびビフィドバクテリウム属種）の増殖を増強する。この点において、本製品の繰り返し摂取は、健康的な腸内微小環境を促進することが知られている微生物の大腸内への局在化および生着により、腸内マイクロフローラに高度に有益な効果を有するであろう。
【００４５】
プレバイオティクスとプロバイオティクスに加えて、本発明の組成物は、様々な賦形剤、増量剤、結合剤、甘味料、フレーバーおよび／または添加物をさらに含有し得る。本組成物の任意の賦形剤は、限定することなく、ステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸、またはタルクなどの潤滑剤；デンプンまたは糖などの結合剤；脂肪、抗酸化剤、アミノ酸、タンパク質、核酸、電解質、ビタミン、それらの誘導体またはそれらの組み合わせを含む。１つの態様において、本製品の添加物は、イナゴマメ粉、例えば、ローカストビーンガムである。別の態様において、添加物は、Agaricus bisporusからのキノコ抽出物である。特定の態様において、製品は、ステアリン酸マグネシウムおよび／またはステアリン酸などの賦形剤を含有する。
【００４６】
さらに、この発明の組成物の嗜好性を増加させるために、フレーバー、甘味剤、結合剤または増量剤を添加することが望ましい可能性がある。本組成物に任意に添加することができるフレーバーは、当該技術分野においてよく知られている。例は、これらに限定されないが、合成フレーバー油および／または植物の葉、花、果実などからの油を含み、それらの組み合わせは有用である。フレーバー油の例は、これらに限定されないが、スペアミント油、ペパーミント油、シナモン油、およびウィンターグリーンの油（サリチル酸メチル）を含む。レモン、オレンジ、ブドウ、ライムおよびグレープフルーツなどの柑橘油およびリンゴ、イチゴ、サクランボ、パイナップルなどの果実エッセンスなどの人工の、天然のまたは合成の果実フレーバーもまた有用である。甘味剤は、限定することなくそれらの塩およびそれらの混合物を含む、水溶性甘味剤、水溶性人工甘味剤およびジペプチドベースの甘味剤などの広範な材料から選択され得る。
【００４７】
結合剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、または他の好適なセルロース誘導体、アクリル酸およびメタクリル酸のコポリマー、薬学的グレーズ（pharmaceutical glaze）、ガム（例えばガムトラガカント）、乳誘導体（例えばホエー）、デンプン（例えばコーンスターチ）またはゼラチン、および誘導体、ならびに当業者によく知られている他の従来の結合剤などの広範な材料から選択することができる。増量物質の例は、これらに限定されないが、糖、ラクトース、ゼラチン、デンプンおよび二酸化ケイ素を含む。
【００４８】
上記の添加物が本発明の製品に含まれる場合、それらは一般的に総製品重量の１５％未満である。特定の態様において、それらは総製品重量の５〜１０％未満である。本発明の各構成成分の量は、本組成物の総重量の５％〜３５％の範囲にある。ある態様において、キシロオリゴ糖、アラビノガラクタン、G. lucidumベータグルカン、不溶性酵母β（１，３／１，６）−グルカン、および不溶性乾燥S. cerevisiae発酵物は、本組成物の総重量の５％〜８％の範囲でそれぞれ存在し；そしてイヌリンおよびオートムギβ（１，３／１，４）−グルカンは、本組成物の総重量の２５％〜３２％の範囲でそれぞれ存在する。本組成物のB. coagulans構成成分は、本組成物の総重量の２〜１０％の、１０〜５０億の範囲でそれぞれ存在し得る。
【００４９】
本発明の組成物は、錠剤、カプセル、小袋、粉末、丸薬、ソフトジェル、ジェルキャップ、液体として、またはバー（例えば、栄養バーまたはシリアルバー）のような固形食品、粉末飲料、乳製品、朝食用シリアル、ミューズリー、キャンディー、菓子、クッキー、ビスケット、クラッカー、チョコレート、チューインガム、デザートなど；またはソフトドリンク、ジュース、スポーツドリンク、ミルクドリンク、ミルクシェイク、ヨーグルトドリンクまたはスープなどの液体食料品、ならびにペット用おやつ、ペットフードなどの食品または飲料製品として、処方化することができる。
【００５０】
本発明の組成物は、乳化剤、安定剤、甘味料、フレーバリング剤、着色剤、保存剤、キレート剤、浸透圧剤、緩衝剤またはｐＨ調整剤、増粘剤、テキスチャリング剤などの従来の食品添加物を任意に含むことができる。１つの態様において、組成物は、フレーバリング剤、例えばオレンジまたは柑橘類のフレーバーを含む。
【００５１】
製品がヒトの成人、小児または動物（例えば、愛玩動物または家畜）により消費されるかどうかによって、意図されたレシピエントにとって好適な様々なサイズおよび様々な成分でそれは生産され得る。さらに、本発明の組成物は一般的に安全であると認識されるため、それらは毎日１回、２回または３回以上で消費され得る。この発明の製品の繰り返し摂取は、健康的な腸内微小環境を促進することが知られている微生物の大腸内への局在化および生着により、腸内マイクロフローラに高度に有益な効果を有するであろう。
【００５２】
好ましくは、本発明の組成物の１日あたりの用量は、１日あたり１回または２回用量であり、各用量は２〜４グラムの繊維を含有する。ある態様において、組成物は、１日２回提供される２グラムの繊維を含有する錠剤として提供される。別の態様において、組成物は、１日２回投与される粉末として提供される（用量あたり４グラムの繊維）。
【００５３】
本組成物の活性を考慮すると、本発明はまた、消化器の健康、体重およびグルコースバランスを改善または維持するための方法にも関する。この方法は、消化器の健康が改善または維持され、体重が維持されまたは減少し、グルコースレベルが望ましくは正常範囲に維持されまたは低下するように、キシロオリゴ糖、アラビノガラクタン、イヌリン、Ganoderma lucidumベータグルカン、不溶性酵母β（１，３／１，６）−グルカン、オートムギβ（１，３／１，４）−グルカン、および不溶性乾燥S. cerevisiae発酵物から構成される本発明の製品の有効量を投与することを含む。例えば、正常で健康的な体重を有する対象は、１８．５〜２４．９の範囲の体格指数（ＢＭＩ）を有する一方で、過体重の対象は、２５〜２９．９の範囲のＢＭＩを有し、肥満の対象は、３０以上のＢＭＩを有する。さらに、正常な糖レベルは空腹時に１００ｍｇ／ｄＬ未満、食後２時間で１４０ｍｇ／ｄＬ未満であるとみなされる。しかしながら、ほとんどの健康な人では、糖レベルはさらに低くなる。この発明の組成物の投与は、正常なＢＭＩを維持し、またはＢＭＩを正常な範囲まで低下させ、および／または糖レベルを正常な範囲に維持または低下させるだろう。
【００５４】
望ましくは、この発明の組成物の有効量は、臨床結果を含む、有益なまたは望ましい結果に影響を及ぼすのに十分な量である。そのようなものとして、本発明の組成物の有効量は、自己免疫疾患、結腸がん、胃潰瘍、心血管疾患、慢性腎疾患、機能性腸疾患および肥満を含む疾患の１以上の症状の緩和または回復をもたらすものであり、それは腸内マイクロバイオータにより仲介される。本組成物の投与は、疾患の程度を消滅させ、健康な腸機能を支持することにより疾患の状態を安定させ（すなわち悪化しない）、疾患の進行の遅延または減速させ、あるいは疾患状態の回復または緩和させ得る。回復はまた、処置を受けない場合の予測生存と比較した延長された生存を意味し得る。特定の態様において、本組成物は、肥満の対象に投与される。本発明の組成物は、がん治療を受けた対象において、エネルギー、ならびに全体的な健康および幸福の提供においてさらに有用性を有する可能性があることがさらに企図される。
【００５５】
投与される本発明の組成物の量および投与計画は、投与の目的（例えば、予防、緩和または処置）、個々の対照の年齢、性別および体重、ならびに／または対象の症状の重症度を含む様々な関連因子に照らして決定される。この点において、本発明の組成物は、医療専門家の監督下で投与、または自己投与され得る。
【００５６】
以下の非限定的な例は、本発明をさらに例証するために提供される。
【実施例】
【００５７】
例１：マルチ繊維組成物（KIBOW FORTIS（登録商標））による増強された微生物増殖
７つの異なる成分を含む本発明のマルチ繊維製品を、L. acidophilusおよびB. longumに対するその全体的な増殖促進活性について試験した。KIBOW FORTIS（登録商標）として知られている本発明の７つの成分製品は、in vitroで両方の有益な種の増殖を支持した（図１）。
【００５８】
本発明のマルチ繊維処方物が別の有益な微生物であるB. coagulansの増殖を支持することができるかどうかを試験するために、B. coagulansのin vitroでの増殖が、個々の可溶性繊維、および本発明の７成分マルチ繊維製品（KIBOW FORTIS（登録商標））の存在下において調査される実験を行った。B. coagulansの株は、好気性条件と嫌気性条件の両方で評価された。結果は、B. coagulansが、酸素の存在下および非存在下の両方において、個々の繊維のすべての存在下、ならびに本発明の７マルチ繊維製品の存在下において、よく増殖できたことを示した（図２）。
【００５９】
例２：７成分マルチ繊維製品（KIBOW FORTIS（登録商標））と市販製品との比較
マルチ繊維製品であるKIBOW FORTIS（登録商標）は、粉末（サンプル１、表１を参照のこと）または錠剤（サンプル２、表１を参照のこと）として望ましくは１日１回または２回消費され、ここで各用量は２〜４グラムの繊維を含有する。それゆえ、製品は、可溶性繊維と不溶性繊維の両方を含有し、１日あたり少なくとも４グラムの繊維を提供するので、市販の繊維サプリメントに比べて大きな利点を提供する（表１）。
【表１】
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【００６０】
KIBOW FORTIS（登録商標）のプレバイオティクス活性を、他の知られている食物繊維製品である（BENEFIBER（登録商標）（食物繊維サプリメント；Novartis AG）、Glaxo Smith Klineから入手可能である食物繊維であるCITRUCEL（登録商標）（（緩下剤；Merrell Dow Pharmaceuticals, Inc）およびMETAMUCIL（登録商標）（食事サプリメント；Proctor & Gamble Co.）のそれと比較した。一般的な腸の健康を意図した製品であるBENEFIBER（登録商標）（食物繊維サプリメント；Novartis AG）は、コムギデキストリンに由来するオリゴ糖であり、これは容易に糖に加水分解される。METAMUCIL（登録商標）（食事サプリメント；Proctor & Gamble Co.）は、満腹感を提供し、カロリー摂取量を低減するサイリウムハスクを有し、一般顧客にアピールするために糖とフレーバーが添加されており；Glaxo Smith Klineから入手可能な食物繊維であるCITRUCEL（登録商標）（緩下剤；Merrell Dow Pharmaceuticals, Inc.）は、バルク形成繊維緩下剤であるメチルセルロースを含有する。それゆえ、KIBOW FORTISは、BENEFIBER（登録商標）（食物繊維サプリメント；Novartis AG）、CITRUCEL（登録商標）（緩下剤；Merrell Dow Pharmaceuticals, Inc.）およびMETAMUCIL（登録商標）（食事サプリメント；Proctor & Gamble Co.）と比較された。プロバイオティクス細菌であるL. acidophilusおよびB. longumは、通常の供給源である糖の代わりに、増殖のための「炭素」の唯一の供給源としてこれらのマルチ繊維を含有する固体寒天培地上で増殖した。
【００６１】
ビフィドバクテリウム属のカウントは、製品間で類似していたが；しかしながら、コロニーサイズにより見られるような豊富な増殖は、BENEFIBER（登録商標）（食物繊維サプリメント；Novartis AG）がビフィドバクテリウム属の増殖を最も支持しなかったことを示した。METAMUCIL（登録商標）（食事サプリメント；Proctor & Gamble Co.）およびGlaxo Smith Klineから入手可能な食物繊維であるCITRUCEL（登録商標）（緩下剤；Merrell Dow Pharmaceuticals, Inc.）は、製品中の添加された糖の存在により小さなコロニーを示した。糖はすべての細菌、さらには病原性生物によって容易に同化される。しかしながら、繊維は、ラクトバチルス属やビフィドバクテリウム属のようなプロバイオティクス細菌によってのみ発酵または代謝される。最大の増殖は、KIBOW FORTIS（登録商標）製品で見られ、これは、その７つのマルチ繊維成分が本発明の組成物内に見出される、７成分マルチ繊維製品である。
【００６２】
例３：肥満の回復および潜在的な体重減少の増強
肥満は現在、高カロリーの加工食品の消費とセデンタリー・ライフスタイルによって推進されている先進国において蔓延している。これは普遍的な問題であり、多くのグループが原因の理解とこの蔓延の軽減に取り組んでいる。多数のプロバイオティクス処方物は、消化器の健康のために市場で入手可能である。主にラクトバチルス属およびビフィドバクテリウム属であるプロバイオティクス細菌は、それらが効果的であるためには大量に消費される必要がある。研究は、ヒトの腸内マイクロバイオータを、バクテロイデス属、プレボテラ属またはルミノコッカス属に富む３つの異なるグループ／クラスターまたはエンテロタイプに分類した（Arumugam, et al. (2011) Nature 473:174-180）。タイプ１はバクテロイデス属に富んでおり、炭水化物とタンパク質からエネルギーを引き出し；エンテロタイプ２はムチン分解者（degrader）であるプレボテラ属に富んでおり、そしてエンテロタイプ３は、主に、ムチンと糖をエネルギーのために分解するルミノコッカス属である。マウスの肥満モデル（ｏｂ／ｏｂマウス）は、５０％少ないバクテロイデス属とファーミキューテス門の比例的な増加を有することが示されており、これは腸内マイクロバイオータの性質が肥満において非常に重要な役割を有していることを示唆する（Ley, et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:11070-5）。さらに、肥満および過体重の小児において、有益な細菌の不足、およびファーミキューテス門であるStaphylococcus aureusの増加が示された（Kalliomaki, et al. (2008) Am. J. Clin. Nutr. 87:534-538）。さらに、最近の研究は、炎症が肥満おいて大きな役割を有することが明らかになっている。データは、この炎症が腸内細菌によって引き起こされ、これらの細菌はまた、肥満の発症にも影響するという証拠を現在、提供している（Cani & Delzenne (2009) Curr. Pharm. Des. 15:1546-58; Ley (2010) Curr. Opin. Gastroenterol. 26:5-11; Vrieze, et al. (2010) Diabetologia 53:606-13）。
【００６３】
プロバイオティクスは、マウスおよびラットにおいて肥満についての様々な臨床試験で使用されている。ラットでの研究の多くは、最大１００億ＣＦＵ／日の用量でプロバイオティクス細菌の単一株を使用して実施され、体重と脂肪細胞サイズの減少が見られた。Sprague-Dawleyラットはまた、L. plantarumが供給された場合にレプチンの減少も示した。さらに、S. boulardiiの投与は、インターロイキン−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−４およびＴＮＦ−αなどの低度の全身および肝臓の炎症マーカーの減少をもたらす。しかしながら、プロバイオティクスが効果的であるためには、数兆の本来備わっている腸の微生物と競合するために、それらは大量（数十億）に消費されなければならない。
【００６４】
あるいは、腸内マイクロフローラの増殖は、プレバイオティクスを使用して増強することができる。しかしながら、食物の摂取から得られるプレバイオティクスは、典型的には、消化されずに体から排出される。加えて、食物から有効量のプレバイオティクスを得るためには、毎日大量の食物（２５〜３５グラム）を消費する必要がある。
【００６５】
細菌増殖培地の糖の純粋な繊維での置き換えは、数千億のラクトバチルス属およびビフィドバクテリウム属の増強された増殖を導くことが、現在示されている。これは、消費者製品（例えば、微粒子または粉末形態）におけるこれらの純粋な食物繊維を消費することにより、腸内マイクロフローラを回復することができることを示す。選択された、可溶性と不溶性の両方のプレバイオティクス食物繊維は、免疫刺激、満腹感（satiety）、コレステロール低下、および、有益なラクトバチルス属およびビフィドバクテリウム属のはるかに大きな増殖を促進する能力をもまた含む、他の有益な特性を有する。データは、増殖培地中のたった１グラムの繊維で、ラクトバチルス属およびビフィドバクテリウム属のカウントが、それぞれ３，０００億を超えて増加したことを明らかにした。結果は、炭素源としてプレバイオティクスを有するプロバイオティクス細菌種の増殖が対数的に増加することを示した。繊維の純粋な微粒子または粉末形態４〜８ｇ／日のヒトの消費は、２．４兆〜４．８兆の有益な微生物を提供することが予測され、それによって肥満に関連するディスバイオシスを相殺する大きな可能性を有する。
【００６６】
肥満の処置における本組成物の効果を分析するために、肥満傾向ラット（ＯＰ−ＣＤ）が採用される。Ｃｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）ラットの系統から開発されたＯＰ−ＣＤラットは、加速的な体重増加を有する将来のブリーダーを選択することにより得られた。この非近交系群体から、ＯＰ−ＣＤ（肥満傾向）およびＯＲ−ＣＤ（肥満抵抗性）の２つの系統が開発される。ＯＰ−ＣＤは、非応答者（non-responder）のサブ集団を排除し、高脂肪食を供給すると肥満になる。完全に機能するレプチン受容体を有しているにもかかわらず、多遺伝子性肥満は発生する。比較すると、ＯＲ−ＣＤラットは、高脂肪食を供給しても肥満にならない（非応答者）。
【００６７】
ラット（ｎ＝６）は、標準的なラット用飼料中可溶性および不溶性のマルチ繊維プレバイオティクス（１０％ｗ／ｗ）およびB. coagulansの処方物が自由に供給された。対照ラット（ｎ＝６）は、マルチ繊維／B. coagulans処方物を含まない通常のラット用飼料が供給された。体重、ＢＭＩ、血圧、ならびに血液学的（ＣＢＣ）および基本的な代謝マーカー（ＣＲＰ、コレステロール、およびトリグリセリドのプロファイル）は、ベースライン、４週間、８週間、および１２週間の期間、測定される。二次エンドポイントは、生化学的パラメーター（レプチン、グレリン、およびフェチュイン）、尿の採取、および糞便分析を含む。ＮＦ−κＢ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６などの炎症性バイオマーカーも試験される。
【００６８】
本発明のマルチ繊維プレバイオティクス組成物は、ラットの腸内マイクロバイオームを調節し、それによって肥満傾向にあるラットの肥満を回復または処置することが期待される。
【００６９】
例４：ヘルスバー
ヘルスバーは、この発明のプロバイオティック繊維（すなわち、キシロオリゴ糖、アラビノガラクタン、イヌリン、Ganoderma lucidumベータグルカン、不溶性酵母β（１，３／１，６）−グルカン、可溶性オートムギβ（１，３／１，４）−グルカン、および不溶性乾燥Saccharomyces cerevisiae発酵物）と共に、結合剤、添加物、フレーバリング剤、着色剤などの様々な賦形剤を組み合わせ、可塑性の塊の堅さとなるまで混合することにより調製され得る。その後、塊を押し出すか型に入れて、「キャンディバー」の形に形成し、その後乾燥または固化させて最終製品を形成する。
【００７０】
例５：医療食品
医療食品は、ロールドオートムギ、乾燥リンゴ、蜂蜜、イナゴマメ粉、シナモン、糖、バニラ抽出物、およびプレバイオティクス繊維（すなわち、キシロオリゴ糖、アラビノガラクタン、イヌリン、Ganoderma lucidumベータグルカン、不溶性酵母β（１，３／１，６）−グルカン、可溶性オートムギβ（１，３／１，４）−グルカン、および不溶性乾燥Saccharomyces cerevisiae発酵物）を組み合わせることにより調製され得る。これらの成分は適切な比率で混合され、長さおよそ１２．５〜１５センチメートル、幅３〜４センチメートルおよび高さ１センチメートルの長方形のバーに形成され、滅菌真空オーブン中に１２〜２４時間置かれ、所望の堅さの可食性食品を得る。
【００７１】
例６：クオラムセンシング阻害（ＱＳＩ）
多くのラクトバチルス属は、Pseudomonas aeruginosa、Escherichia coli、Salmonella typhi、シゲラ属などの腸内病原体の病毒性または病原性特性を妨げることができる抗微生物化合物を産生することが示されている（Servin (2004) FEMS Microbiol. Rev. 28:405-440; Varma, et al. (2010) J. Food Sci. 75:M546-M551）。したがって、病毒性を弱めるための１つの戦略は、プロバイオティクス株によって産生される特定の代謝物の産生に基づく。例えば、可溶性分子は、Lactobacillus paracasei subsp paracasei CMGB 18の上清に蓄積することが見出されており、それは、多剤耐性P. aeruginosaおよびクオラムセンシング（ＱＳ）遺伝子発現に対して阻害特性を有する（Cotar, et al. (2010) Roum Arch. Microbiol. Immunol. 69:213-223; Cotar, et al. (2013) Curr. Organic Chem. 17:155-161）。このような化合物は、クオラムセンシングインヒビター（ＱＳＩ）と名付けられている。
【００７２】
Staphylococcus aureusは外毒素を産生し、月経関連トキシックショック症候群を引き起こす。培養において、ヒト膣分離株L. reuterii RC-14は、環状ジペプチドであるシクロ（Ｌ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｐｒｏ）およびシクロ（Ｌ−Ｔｙｒ−Ｌ−Ｐｒｏ）を産生し、これは病原性遺伝子の重要なレギュレーターである、staphylococcalのクオラムセンシングシステムａｇｒを妨げ、かつ、S. aureus MN8における毒素の発現を抑制することが示唆されている（Li, et al. (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108:3360-3365）。
【００７３】
プレバイオティクスは、プロバイオティクスであるラクトバチルス属とビフィドバクテリウム属の増殖を促進する。本組成物がプレバイオティクス特性を有することを考慮すると、これは、有益な細菌および本来備わっているプロバイオティクス株の増殖を増加させるのに有用である。これらの有益な微生物の数兆のレベルまでの増加した増殖は、ＱＳＩとして作用することができる代謝物の産生を導き、これにより、悪性の病原性細菌の増殖を防ぎ、感染と炎症を軽減する。これらの有益な微生物の増加した増殖はまた、毒性代謝物の産生の減少も導く。このように、腸のディスバイオシスは修正され、バランスのとれた腸内マイクロバイオームはヒト対象の健康を回復する。
【００７４】
例７：In VitroでのB. coagulansを含むおよび含まないマルチ繊維処方物の効果
実験を行い、ヒト腸内微生物エコシステムのシミュレーター（Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem）（ＳＨＩＭＥ（登録商標）；Molly, et al. (1994) Microbial Ecol. Health Dis. 7:191-200; Ranganathan, et al. (2006) ASAIO J. 52:70-79）として知られる、ヒト胃腸管の連続モデルを用いた長期投与研究において、２つの繊維混合物を比較した。このモデルは、様々な腸内領域の代表的な条件下で、長期間にわたって複雑な腸内マイクロバイオータの培養を可能にする。それゆえ、ＳＨＩＭＥモデルは、プロバイオティクスおよび／またはプレバイオティクス処方物の発酵プロファイルに関する詳細な情報の収集、ならびに処置によって影響を受ける腸内発酵活性の局在化に関する情報の収集が可能になる。実験は実行され、B. coagulans（KIBOW FORTIS（登録商標））を添加した場合とB. coagulansを添加しない場合の両方で、本マルチ繊維プレバイオティクス処方物の活性を並べて比較した。
【００７５】
使用されるＳＨＩＭＥ（登録商標）の各ユニットは、上行、横行および下行結腸領域から構成された。簡単に言えば、２週間の対照期間中に、微生物活性（例えば、ＳＣＦＡ、乳酸、アンモニウム）についてのベースライン値および微生物組成は確立された。対照期間後、３週間の処置期間が開始され、その間に各製品は対照食に補充された。ＳＨＩＭＥ（登録商標）の各セグメントは、胃腸管の様々な部分（すなわち、胃および小腸；上行結腸；横行結腸；下行結腸）を摸倣する４つの連続するリアクターからなった。結腸のリアクター区画は、一定の容積とｐＨ制御を備えた連続攪拌リアクターであった。２つのベッセルを使用して、胃と小腸を摸倣し、５つの結腸ベッセルは、２つのマルチ繊維組成物の効果を査定するために使用された。結腸ベッセルにおいて、各ユニットは、上行（ｐＨ５．６〜５．９；容積５００ｍｌ）、横行（ｐＨ６．１５〜６．４；容積８００ｍｌ）および下行（ｐＨ６．６〜６．９；容積６００ｍｌ）結腸区画からなった。実験は３つの段階：１）安定化期間；２）対照期間；および３）処置期間からなった。安定化期間の間、新鮮な糞便サンプルで結腸リアクターを接種した後、２週間の安定化期間は、微生物コミュニティーが局所環境条件に応じて異なるリアクターで差異が生じることを可能にする。この期間の間、糞便接種物中に元々存在していた腸内マイクロバイオータの多様性を最大限に支持するために、基本的な栄養マトリックスが提供された。対照期間（２週間の参照期間）の間、標準的なＳＨＩＭＥ栄養マトリックスは、１４日の期間、モデルにさらに投与された。この期間中のサンプルの分析は、異なるリアクター中のベースライン微生物コミュニティーの組成および活性の決定を可能にし、これは、マルチ繊維処置からの結果と比較するための参照として使用される。処置期間（３週間）の間、ＳＨＩＭＥ（登録商標）リアクターは、通常の条件であるが、通常の組成物に加えてマルチ繊維プレバイオティクス製品で補充された食事で操作された。
【００７６】
安定化期間の間の効果。安定化期間の間、モニタリングされる活性は、ｐＨの低下と総ガス産生（発酵活性の指標）を含んだ。ＳＨＩＭＥ（登録商標）実験の対照部分および処置部分の間、モニタリングされるエンドポイントは、酸／塩基消費、微生物コミュニティー活性（週に２回）、微生物コミュニティー組成（週に１回）、および腸バリア活性を含んだ。
【００７７】
酸／塩基の消費については、結腸リアクター中の微生物代謝物の産生は、ｐＨを変更することが知られている。（酸または塩基の添加による）連続的なｐＨ制御がない場合、ｐＨは固定間隔を超える。それゆえ、酸／塩基の消費は、ＳＨＩＭＥ（登録商標）実験の間に連続的にモニタリングされる。微生物コミュニティー活性に関して、短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）濃度、乳酸レベル、およびアンモニウムイオンと分岐ＳＣＦＡのレベルの両方が測定された。モニタリングされたＳＣＦＡは、酢酸、プロピオン酸、およびブチル酸の濃度を含んだ。乳酸に関して、ヒトの腸は、乳酸産生細菌と乳酸利用細菌の両方を宿している。乳酸は乳酸菌によって産生され、環境のｐＨを低下させ、抗微生物剤としても作用する。また、それは、他の微生物によって、酢酸、ブチル酸、プロピオン酸に迅速に変換され得る。アンモニウムおよび分岐ＳＣＦＡ（イソブチル酸、イソ吉草酸、イソカプロン酸）はタンパク質分解発酵のマーカーであり、宿主の健康に悪影響を与え得る。本発明のマルチ繊維組成物への曝露の前、最中および後に見出される微生物コミュニティーの組成に関して、以下の群がｑＰＣＲにより内腔で定量化された：１）ヒト腸内マイクロバイオームの２つの主要な細菌門、すなわちファーミキューテス門とバクテロイデス門；２）２つの有益なプロバイオティクス細菌であるビフィドバクテリウム属とラクトバチルス属；および３）Akkermansia muciniphila、Blautia coccoidesおよびEubacterium rectale、およびFaecalibacterium prausnitzii。腸壁機能の調節に関して、宿主に対する本発明の組成物の効果は、腸バリア活性（ＴＥＥＲおよびＬＹ透過）、ならびに炎症誘導性および抗炎症誘導性サイトカイン（すなわち、ＮＦ−ｋＢ、ＴＮＦ−α、ＩＬ８、ＩＬ６、およびＩＬ１０）の産生に関して評価された。
【００７８】
ガス圧は、両方のマルチ繊維製品について対照と比較して大幅に増加し、これは、両方の組成物が結腸マイクロバイオータによって発酵されたことを示す。両方のプレバイオティクス混合物は、インキュベーション期間（４８時間）の終了時に同様のガス産生を生じた（すなわち、B. coagulansを含む組成物では８９．７ｋＰａ、B. coagulansを含まない組成物では９０．４ｋＰａ）。両方の製品が、４時間のインキュベーション後に著しいガス産生を示し、測定は、６時間〜２４時間のインキュベーションの間のガス産生の量は、類似していたことを示した。おそらく製品の枯渇に起因して、２４時間のインキュベーション後に有意なガス生産はなかった。
【００７９】
結腸インキュベーションの間のｐＨのモニタリングは、ＳＣＦＡおよびアンモニウムイオン（ＮＨ４＋）の産生の最初の兆候を提供した。一般に、ＳＣＦＡと乳酸の形成に起因して、インキュベーションの最初の２４時間の間にｐＨの低下が観察される。このｐＨ低下に続いて、しばしば、タンパク質分解発酵に起因して最後の２４時間のインキュベーションの間ｐＨは上昇し、なかでもＮＨ４＋の産生がもたらされる。対照と比較して、大幅なｐＨ低下は両方の製品の発酵に関連しており（少なくとも０．５ｐＨ単位の減少）、これは両方のマルチ繊維組成物が結腸マイクロバイオータによって発酵されたことを示す。ｐＨの低下は両方の製品で類似しており、インキュベーションの最初の２４時間の間に最も顕著であり、ガス産生測定で得られた結果を確認した。しかしながら、インキュベーションの２番目の２４時間の間、おそらく繊維の枯渇とそれに続く細菌代謝のタンパク質分解発酵への切り替えに起因して、わずかなｐＨ上昇が見られた。これらのデータは、大幅なｐＨの低下と組み合わされるガス生産の著しい増加は、両方の製品がヒトの腸内マイクロバイオームによって容易に発酵されることを示し、ＳＣＦＡや乳酸などの健康に関連する可能性のあるいくつかの代謝物の形成がもたらされることを示す。
【００８０】
対照期間の間の効果。対照期間の間、ＳＣＦＡレベルは非常に安定しており（対照期間の連続する時点の間で平均９４．０％類似）、２つのＳＨＩＭＥユニットのそれぞれの間で再現可能であった（平均９１．５％類似）。これは、微生物コミュニティーが活性と組成の点で安定的であることを示した。この高い安定性は、処置の間に観察されるいずれかの効果が投与されたマルチ繊維組成物からもたらされる一方で、両ユニット間の高い再現性が組成物間の直接比較を可能にすることを示すので、データ解釈の観点から重要であった。
【００８１】
酸と塩基の消費は、ＳＨＩＭＥ（登録商標）実験を通して微生物活性全体を反映する。最適な環境条件を確実に維持するために、ＳＨＩＭＥ（登録商標）システムのｐＨは、ｐＨ制御装置によって上行結腸で５．６〜５．９、横行結腸で６．１５〜６．４、下行結腸で６．６〜６．９の間で制御される。異なるリアクター中の微生物コミュニティーが安定化すると（接種後２週間から開始）、塩基−酸の消費は一般的に低くなる。しかしながら、処置の間、細菌は、ＳＣＦＡの増加した量を産生する可能性がある。結果として、リアクター中の環境は酸性化し、それぞれのリアクターを事前に設定されたｐＨ範囲に保つために、塩基をそれに投与することが要求される。結果として、酸／塩基の消費量が増加する。実験を通して酸／塩基の消費を測定することにより、マルチ繊維製品の潜在的な発酵は推定される。
【００８２】
両方のマルチ繊維製品は、それらが処置の投与直後の増加した塩基消費に関連したため、十分に発酵した。両方の組成物は、３つの結腸区画すべてにおいて、同様のレベルの酸性化（そして、したがって増加した塩基消費）をもたらし、上行結腸においてB. coagulansを含まない製品について、最初に大きい増加を伴った。観察された酸性化（塩基の添加により補償される）は、ベッセル中の増加したＳＣＦＡおよび／または乳酸のレベルに起因した。上行結腸および横行結腸と比較して、下行結腸中の両方の製品について塩基消費は比較的低かった。下行結腸における低い発酵は、先行する上行および横行結腸ベッセルにおける繊維の完全な分解に関連すると考えられる。
【００８３】
マルチ繊維組成物での処置の間の効果。次に、ＳＨＩＭＥ（登録商標）におけるＳＣＦＡ生産に対するB. coagulansを含む、および、含まない、マルチ繊維組成物の効果を調査した。ＳＣＦＡ生産は、結腸における炭水化物代謝をもたらし、様々な健康効果に関連する。最も豊富なＳＣＦＡは、酢酸、プロピオン酸、およびブチル酸である。ＳＣＦＡは、腸内の健康に重要な役割を果たすことがよく知られている。酢酸は、宿主のエネルギー源として、および体内での脂質合成のための潜在的な基質として使用され得る。さらに、それはブチル酸の合成における重要な副産物である。しかしながら、ＳＣＦＡの健康促進効果は、主にプロピオン酸とブチル酸に起因し、これらは、腸上皮の主なエネルギー源として作用し（Cummings & Englyst (1987) Am. J. Clin. Nutr. 45:1243-1255）、炎症と結腸がんに対する保護効果を示している。プロピオン酸は、肝臓に輸送されることが知られており、そこでそれは血漿中のコレステロール低下効果を有し（Wright, et al. (1990) Exp. Biol. Med. 195:26-29; Demigne, et al. (1995) Br. J. Nutr. 74:209-219）、血糖管理にプラスの影響を与える（Wong, et al. (2006) J. Clin. Gastroenerology 40:235-243）。結腸が、構成成分としてB. coagulansを含むマルチ繊維組成物で処置された実験の結果は、図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃならびに図４〜６に示す。B. coagulansを含有するマルチ繊維組成物による処置は、１）試験された３つの結腸領域すべてにわたるプロピオン酸の増加した産生に主に起因する、総ＳＣＦＡ産生の即時の増加；２）上行結腸ベッセルにおける酢酸およびブチル酸のレベルの増加はなく、横行および下行結腸ベッセルにおける酢酸およびブチル酸のレベルのわずかな増加；３）酢酸優位プロファイルからプロピオン酸優位プロファイルへのＳＣＦＡレベルにおける移行；４）上行結腸における全処置期間の間の、絶対ＳＣＦＡレベルと比例ＳＣＦＡレベルの両方での一定レベル；および５）横行および下行結腸ベッセルについての第１週の最後のサンプリングポイントでの絶対ＳＣＦＡレベルおよび比例ＳＣＦＡレベルの安定化；に関連していた。上行結腸における製品の補充に対する即時の応答を考慮すると、マルチ繊維組成物の大部分は上行結腸で変換され、プロピオン酸の生産をもたらす可能性が高い。したがって、マルチ繊維組成物の少用量のみが、すべての供給サイクルで横行結腸および下行結腸に到達する可能性が高い。これらの遠位領域における、上行結腸と比べての、プロピオン酸（したがって総ＳＣＦＡ）レベルの段階的な増加は、上行結腸からのこれらのＳＣＦＡの洗い流しによるものであった一方で、少量の追加の酢酸、プロピオン酸、およびブチル酸は産生された。
【００８４】
処置がB. coagulansを含まないマルチ繊維組成物でされた実験の結果を図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃならびに図４〜６に示す。添加されるB. coagulansを含まないマルチ繊維組成物によるＳＨＩＭＥ（登録商標）処置は、１）試験された３つの結腸領域すべてにわたる、酢酸およびブチル酸の増加した産生、およびわずかな程度のプロピオン酸に主に起因する、総ＳＣＦＡ産生の即時の増加；２）酢酸を犠牲にしたブチル酸の産生（比例産生レベル）；および３）上行結腸における全処置期間の間の、一定の絶対ＳＣＦＡレベルおよび比例ＳＣＦＡレベル、横行および下行結腸ベッセルの第１週の最後のサンプリングポイントで安定的になる；に関連した。B. coagulansを含むマルチ繊維組成物を用いたＳＨＩＭＥ処置で観察された結果と同様に、上行結腸と比較して、ＳＣＦＡレベルのより段階的な増加は横行結腸および下行結腸において観察され、これは、上行結腸からのこれらの洗い流し効果によるものである可能性が高い。上行結腸における製品の補充に対する即時の応答を考慮すると、マルチ繊維組成物の大部分が上行結腸で変換され、その結果、低い用量が横行結腸に到達する。
【００８５】
ヒトの腸は、乳酸産生細菌と乳酸利用細菌の両方を宿している。乳酸は乳酸菌によって産生され、環境のｐＨを低下させる。特に、低ｐＨ値において、乳酸は病原体に対して強力な抗微生物効果を発揮し得る。乳酸の別の有益な効果は、Anaerostipes caccae、Anaerostipes hadrusまたはEubacterium halliiなどの特定の乳酸利用、ブチル酸産生微生物によるブチル酸へのその変換から生ずる。様々な微生物種が乳酸を産生および変換するので、乳酸濃度の増加は、増加する産生と変換の減少する変換から生じ得る。
【００８６】
対照期間の間（上記）、乳酸レベルは、処置期間の間に達成されるレベルと比較して、両方の製品について、すべての結腸区画で高かった。しかし、B. coagulansを含まないマルチ繊維組成物での処置の結果をすべてのベッセルにわたる対照期間と比較した場合にのみ、差は統計的に有意であった。乳酸は交差供給（cross-feeding）によりブチル酸に変換され得ることを考慮すると、B. coagulansを含まないこの組成物で処置するとブチル酸レベルが増加するので、乳酸濃度の低下は、おそらく、混合物へのB. coagulansの添加を伴う、ブチル酸へのより効率的な変換に寄与していた。
【００８７】
アンモニウム（ＮＨ４＋）および分岐ＳＣＦＡ（イソブチル酸、イソ吉草酸、およびイソカプロン酸の合計）の産生は、典型的には、腸内のタンパク質分解から生じ、腸内マイクロバイオータのタンパク質分解活性を反映する。このような増加した活性は、直接的および間接的な有害な健康への影響（すなわち、結腸発癌）に関連付けられている一方で、アンモニウムイオンおよびＳＣＦＡ産生の減少は有益であると考えられている。結果を図８に示す。現在の実験において、１）すべての腸内領域でB. coagulansを含むマルチ繊維組成物による処置の間に、ＳＣＦＡとアンモニウムの産生は著しく減少し、処置期間を通じて維持されたこと；２）B. coagulansを含まないマルチ繊維での処置は、横行結腸領域および下行結腸領域でのみアンモニウムイオンの減少したレベルと関連する一方で、ＳＣＦＡのレベルは下行結腸領域でのみ低下したこと；が示された。B. coagulansを含む製品によるすべての腸内領域におけるアンモニウムイオンと分岐ＳＣＦＡ濃度の減少は、この組成物がタンパク質分解発酵にプラスの効果を有することを示した。同様に、B. coagulansを含まないマルチ繊維組成物は、横行結腸ベッセルおよび下行結腸ベッセルにおけるアンモニウムイオン濃度を有意に減少させる一方で、分岐ＳＣＦＡ産生は下行結腸ベッセルで有意に減少した。一緒に考えると、これらの結果は、両方のプレバイオティクス組成物が、結腸において減少したタンパク質分解発酵を産生したことを示し、試験された製品が、繊維について他のものより報告されている効果と一致する健康促進効果を生み出すことができたことを実証する。
【００８８】
マイクロバイオーム生物集団に対する効果の分析。定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、増幅により特定の細菌配列（１６ ＳｒＲＮＡ遺伝子）の定量に基づく分子技術である。選択的プライマーの注意深い選択により、ｑＰＣＲは、微生物エコシステムにおいて関心のある分類群の直接的な標的化された定量を可能にする。上行、横行および下行結腸ベッセルにおける７つの微生物集団に対する本発明のマルチ繊維組成物の効果。効果を、対照期間からのＤＮＡコピー数と処置期間のＤＮＡコピー数とを比較することにより査定した。ラクトバチルス属のレベルをモニタリングすることに関して、これらの細菌は、高濃度の乳酸を産生することができる有益な糖分解細菌とみなされている。乳酸は、その抗微生物菌特性のためにヒトの結腸環境における重要な代謝物であるが、他の細菌との一連の栄養的相互作用のドライバーでもあるので、下流の代謝物の生産をもたらす。結果は、試験されたマルチ繊維組成物の両方による結腸領域の処置が、３つの結腸領域のそれぞれにおいて、ラクトバチルス属種の増殖を刺激することを示した。ラクトバチルス属のように、ビフィドバクテリウム属は乳酸を産生するが、それらはまた、主たる酢酸生産者（producer）の１つでもあり；この細菌集団に対する効果は、しばしば酢酸産生レベルに反映される。それらは、ブチル酸それ自体を産生することはできない一方で、ビフィドバクテリウム属は、交差供給相互作用を介してブチル酸産生をしばしば刺激し得る。これらの実験の結果は、図９Ａ、９Ｂおよび９Ｃに示される。結果は、B. coagulansを含まないマルチ繊維組成物での処置が、すべての腸内領域で強いビフィドジェニック（bifidogenic）効果を有した一方で、B. coagulansを含む組成物での処置は上行結腸でのみ増殖を刺激したことを示した。これらの結果は、B. coagulansを含まないマルチ繊維組成物がすべての腸内領域で酢酸およびブチル酸産生を刺激することが見出された一方で、B. coagulansを含む組成物は小さな効果のみを有したことを示す、酢酸およびブチル酸産生データ（上記）と一致した。バクテロイデス門は、最も豊富なプロピオン酸生産者を含む。したがって、いくつかの場合において、プロピオン酸の濃度とこれらの生物の豊富さとの関係が見出され得る。結果は、B. coagulansを含むマルチ繊維組成物が強いプロピオジェニック（propiogenic）効果を有することを示した。しかし、両方の組成物は、バクテロイデス門集団の増殖を弱く刺激したが、B. coagulans構成成分を含む組成物の効果はより大きかった。ファーミキューテス門は、クロストリジウム属クラスターＩＶおよびＸＩＶａを含み、これは重要なブチル酸産生生物を含むことが知られている。Faecalibacterium prausnitziiはクラスターＩＶに属する一方で、Clostridium coccoides（最近Blautia coccoidesとして再分類される）とEubacterium rectaleは両方ともクロストリジウム属クラスターＸＩＶａのメンバーである。両方のマルチ繊維プレバイオティクス製品は、ファーミキューテス門の増殖を刺激し、これは、観察されたブチル酸産生の増加に関連している可能性がある（上記）。両方の組成物は、F. prausnitziiの増殖を同様のレベルまで刺激し、これはおそらくブチル酸産生の増加に関連している。さらに、F. prausnitziiは腸内健康の指標であり（Miquel, et al. (2013) Curr. Opin. Microbiol. 16:255-61）、抗炎症効果が実証されている。F. prausnitziiの豊富さの減少は、ディスバイオシスとも関連している。試験した組成物のいずれも、B. coccoidesとE. rectaleの豊富さを変更しなかった。両方の組成物は、上行結腸でのA. muciniphilaの増殖を刺激したが、横行および遠位結腸ベッセルのコピー数のわずかな減少を導いた。
【００８９】
腸壁機能に対する効果。実施された最後の一連のin vitro研究は、腸の機能性に関する２つのマルチ繊維組成物の効果を調べることに向けられた。細菌は腸壁と密接に相互作用するため、マルチ繊維プレバイオティクスによる微生物活動と豊富さの調節は、腸壁機能に影響を与える可能性がある。これは、in vitroでの腸上皮透過性と特定の免疫マーカーを評価することにより査定された。ＳＨＩＭＥ実験から収集したサンプルを使用して、腸上皮バリア機能と免疫マーカーに対する発酵製品の効果をin vitroで評価した。これらは、両方の試験組成物（B. coagulansを含むおよび含まないマルチ繊維混合物）について、対照期間および処置期間の終わりに収集された上行、横行、および下行結腸ベッセルからのサンプルを含んだ。
【００９０】
Ｃａｃｏ−２共培養実験を、以前に記載されているように実施した（Daguet, et al. (2016) J. Functional Foods 20:369-379）。簡単に言えば、Ｃａｃｏ−２細胞（HTB-37；American Type Culture Collection）を１×１０５／インサートの密度で２４ウェル半透過性インサート（０．４μｍ孔径）に播種した。Ｃａｃｏ−２細胞単層は、３００Ω／ｃｍ２を超える経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を有する機能的細胞単層が得られるまで、週に３回の培地交換で１４日間培養された。細胞は、２５ｍＭグルコースと４ｍＭグルタミンを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で維持され、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳと２０％（ｖ／ｖ）熱不活性化（ＨＩ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）で補充された。ＴＨＰ１−Ｂｌｕｅ（InvivoGen）細胞は、１１ｍＭグルコースと２ｍＭグルタミンを含有するRoswell Park Memorial Institute（ＲＰＭＩ）1640培地で維持され、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび１０％（ｖ／ｖ）ＨＩ−ＦＢＳで補充された。ＴＨＰ１−Ｂｌｕｅは、転写因子ＮＦ−κＢによって誘導可能なプロモーターの制御下で、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）遺伝子を発現するレポーターコンストラクトで安定にトランスフェクトされたＴＨＰ１ヒト単球である。（グラム陰性菌から単離された）ＬＰＳなどの分子によるＴＬＲの活性化により、ＮＦ−κＢが活性化され、ＳＥＡＰの発現と分泌が誘導される。これは、その後、ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ試薬（InvivoGen）を使用することにより、上清において測定される。ＴＨＰ１−Ｂｌｕｅ細胞を２４ウェルプレートに５ｘ１０５細胞／ウェルの密度で播種し、１００ｎｇ／ｍＬのＰＭＡで４８時間処置した。ＰＭＡは、付着する能力がありかつＴＬＲシグナル伝達の準備刺激を受けた、マクロファージ様細胞への細胞の分化を誘導する。
【００９１】
共培養の前に、Ｃａｃｏ−２単層のＴＥＥＲを、上皮ボルト／オームメーター（Epithelial Volt/Ohm Meter）を使用して測定した。空のインサートのＴＥＥＲは、インサートの残留電気抵抗を考慮するためすべての読み取り値から差し引かれた。次に、既に記載されるように（Possemiers, et al. (2013) J. Agric. Food Chem. 61:9380-9390); Daguet、同上）、さらなる実験のために、Ｃａｃｏ−２を含むインサートをＰＭＡで分化したＴＨＰ１−Ｂｌｕｅ細胞の上に置いた。先端区画（Ｃａｃｏ−２細胞を含有する）を、滅菌ろ過（０．２２μｍ）した結腸ＳＨＩＭＥ懸濁液（Ｃａｃｏ−２完全培地で１：５（ｖ／ｖ）に希釈）で充填した。細胞をまた、陽性対照としてブチル酸ナトリウム（ＮａＢ；１２ｍＭ）で先端に処置した。基底区画（ＴＨＰ１−Ｂｌｕｅ細胞を含有する）をＣａｃｏ−２完全培地で充填した。細胞を、対照として両方のチャンバー中でＣａｃｏ−２完全培地にも曝露した。細胞を２４時間処置し、その後ＴＥＥＲを測定した。空のインサートのＴＥＥＲを差し引いた後、すべての２４時間の値を（異なるインサートのＴＥＥＲの差異を考慮して）それら自体の値に対して正規化し、初期値のパーセンテージとして提示した。その後、基底上清を廃棄し、細胞を、５００ｎｇ／ｍＬの超高純度ＬＰＳ（Escherichia coli K12, InvivoGen）を含有するＣａｃｏ−２完全培地で基底に刺激した。細胞をまた、ＬＰＳおよびヒドロコルチゾン（ＨＣ；１μＭ）で、ならびに対照としてＬＰＳを含まない培地（ＬＰＳ−）で基底を刺激した。ＬＰＳ刺激の６時間後、製造業者の指示に従ってLuminex multiplex（Affymetrix-eBioscience）による、サイトカイン（ヒトＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、ＣＸＣＬ１０およびＭＣＰ−１）の測定のために、およびＮＦ−κＢ活性を査定するために、基底上清を収集した。すべての処置を３回繰り返した。空気／ＣＯ２（９５：５、ｖ／ｖ）の加湿雰囲気で、３７℃にて細胞をインキュベートした。
【００９２】
ルシファーイエロー（ＬＹ；ＭＷ４５７）の傍細胞（細胞間）輸送を、サイトカイン測定について上で記載したのと同じ条件下で行い；２つの実験の違いは、２４時間の前処置の後に生じ；その後、ＬＰＳの代わりに、頂端側において、細胞にＬＹを与えた。簡単に言えば、ＳＨＩＭＥ（登録商標）懸濁液とＮａＢ（１２ｍＭ）での２４時間の前処置後、頂端側および基底側の両方の上清を廃棄し、細胞を洗浄し、３７℃で３０分間、輸送培地（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳで補充されたハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）間で平衡化した。その後、頂端チャンバーを、輸送培地で希釈した１００μＭ ＬＹ／インサートで充填した。基底チャンバーは、輸送培地のみで充填された。Ｃａｃｏ−２細胞の単層を横切るＬＹの輸送を、２４時間後に基底側で測定した（蛍光を４８５ｎｍ励起／５２８ｎｍ放射で測定した）。
【００９３】
透過性マーカー（ＴＥＥＲおよびＬＹ傍細胞輸送）に対する対照（ＣＭおよびＮａＢ）について得られた結果は、２４時間の共培養インキュベーション後、完全培地（ＣＭ）対照が、Ｃａｃｏ−２細胞に関してＰＭＡ活性化ＴＨＰ１細胞により誘導される損傷に起因して、ＴＥＥＲが５０％近くの減少を示したことを示した。予想されるように、ブチル酸ナトリウム（ＮａＢ；陽性対照）は、Ｃａｃｏ−２細胞をこの損傷から保護することができた。しかしながら、処置間におけるこの違いは、ＬＹ輸送実験の見られず、これはおそらくは、ＣＭ対照において観察されたＴＥＥＲの減少にもかかわらず、小分子の輸送はまだ大きな影響を受けていなかったためである。
【００９４】
異なる免疫マーカーについて対照において得られた結果は、予想されるとおり、ＬＰＳがすべての免疫マーカーの分泌を増加させることができたことを示した。対照的に、ヒドロコルチゾン（ＨＣ）は、ＬＰＳ誘導性サイトカインおよびケモカインのレベルを弱めることにより、またＮＦ−κＢのＬＰＳ誘導性転写活性を阻害することにより、広範な免疫抑制剤として作用した。対照的に、ＮａＢはマーカー依存的な効果を有した。ＮａＢはＮＦ−κＢの転写活性を増加させたが、それは、ＩＬ−１βやＴＮＦ−αなどのいくつかの免疫メディエーターに対する明らかな選択的転写後阻害活性を有した。したがって、対照であるＮａＢは、ＬＰＳ誘導性ＩＬ−１０およびＩＬ−６（免疫恒常性に関与）を選択的に増加させ、ＬＰＳ誘導性ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−α（炎症誘導性サイトカイン）ならびにＣＸＣＬ１０、ＭＣＰ−１およびＩＬ−８（免疫細胞の動員に関与するケモカイン）を選択的に阻害することを示した。これらの対照結果は、併せて考慮すると、本発明のマルチ繊維混合物の効果を調べるのに使用するための試験システムを検証した。
【００９５】
すべての結腸ベッセルから対照および処置の最後の週から収集されたサンプルを、濾過後にＣａｃｏ−２完全培地で希釈し、２４時間の共培養に頂端側に与えた。完全培地（ＣＭ）対照の結果と比較すると、ＳＨＩＭＥ対照を含むすべてのサンプルはＴＥＥＲを維持することができる。しかしながら、マルチ繊維処置サンプルはより効果的であり、ＴＥＥＲを１００％に近いまたはそれ以上のレベルに維持することを示した（図１０）。この結果は、すべての結腸ベッセルについて、両方のマルチ繊維組成物で統計的に有意であった。２つの組成物を比較すると、上行結腸サンプルのみがB. coagulansを含む組成物とB. coagulansを含まない組成物との間で有意に異なり、ＴＥＥＲはB. coagulansを含有する組成物処置でより高くなることが示された。ＬＹの輸送に関して、結果は、小分子の受動的輸送がいずれの処置によっても大きく影響されないことを示した（図１０）。しかしながら、それぞれの対照と比較すると、処置の間に収集された上行および下行結腸サンプルの両方が、ＬＹの輸送をわずかに減少させたように見えたが、その変化は統計的に有意ではなかった。
【００９６】
ＳＨＩＭＥ（登録商標）サンプルでのＣａｃｏ−２／ＴＨＰ１−Ｂｌｕｅ共培養の前処置の２４時間後、基底上清を廃棄し、細胞をＬＰＳで刺激した。刺激の６時間後、基底上清を収集し、サイトカインとケモカインを測定し、ＮＦ−κＢ活性レベルを決定した。ＬＰＳ＋対照と比較した場合、対照を含むすべてのサンプルは、ＬＰＳ誘導性ＮＦ−κＢ転写活性を増加または増強した。しかしながら、すべてのベッセルおよび両方の組成物について見られたこの増加は、対照サンプルと比較した場合、処置されたＳＨＩＭＥ（登録商標）サンプルにおいて有意に高かった（図１１）。試験された２つのマルチ繊維組成物の間に有意差はなかった。
【００９７】
ＮＦ−κＢ活性について観察された結果は、ＩＬ−６およびＩＬ−１０レベルについて得られた結果に反映された（図１２）。ＮＦ−κＢ活性について得られた結果と同様に、ＳＨＩＭＥ（登録商標）で収集されたすべてのサンプル（対照と処置の両方）は、ＬＰＳ誘導性ＩＬ−６およびＩＬ−１０レベルを増加または増強した。しかしながら、この増加は、マルチ繊維組成物で処置されたものに暴露された細胞においてより顕著であった。それぞれの対照と比較すると、ＳＨＩＭＥ（登録商標）から収集されたマルチ繊維処置されたサンプルは、ＩＬ−６およびＩＬ−１０のレベルを大幅に増加させ、効果は、３つの結腸ベッセルすべてにおいて観察された。しかしながら、２つのマルチ繊維組成の間で効果の大きさに違いがあり；結腸ベッセルのすべてにおいて、構成成分としてB. coagulansを含有するマルチ繊維混合物で処置した結腸ベッセルで観察されたサイトカインの高いレベルが存在した。対照を含むすべてのＳＨＩＭＥ（登録商標）サンプルは、ＬＰＳ誘導ＩＬ−１βを増加または増強するように見えた一方で、ＬＰＳ誘導性ＴＮＦ−αレベルを阻害した。それぞれのＳＨＩＭＥ対照と比較した場合、マルチ繊維組成物で処置されたサンプルは、ＩＬ−１βレベルのわずかな増加を誘導し、ＴＮＦ−αレベルを大幅に阻害するように見えた。ＩＬ−１βに関してB. coagulansを含まないマルチ繊維組成物で処置された横行結腸サンプルにおいて、および、ＴＮＦ−αに関してB. coagulans構成成分で処置された横行結腸サンプルにおいて、より大きな活性が見られた。
【００９８】
対照を含むすべてのＳＨＩＭＥ（登録商標）サンプルは、ＬＰＳ誘導性ＣＸＣＬ１０を阻害し、この効果は、本発明の組成物で処置されたサンプルでより顕著であるように思われた。ＩＬ−８レベルに関しては、効果は弱かった。
【００９９】
これらの実験で試験された測定変数とサンプルの数は比較的多かったため、複雑さを減少させる分析は結果の解釈に役立ち得る。それゆえ、ジョイントＰＣＡ／相関バイプロットが作成された（図１３）。
【０１００】
データは、２つの構成成分に減少させた場合、第１の２つの構成成分よっておおよそ６９％説明され、第１の構成成分は、元の９つの変数の分散の５１％近くを占める。第１の構成成分に主に寄与する変数は、ＴＥＥＲ、ＮＦ−κＢ、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、およびＣＸＣＬ１０である一方で、ＬＹ、ＩＬ−１β、およびＩＬ−８は、主に第２の構成成分に寄与する。
【０１０１】
併せて考慮すると、ＳＨＩＭＥ（登録商標）の実験データは、両方のマルチ繊維製品がヒトの結腸環境中で容易に発酵され、ヒトの腸内環境にプラスの影響を与えると予想される最終製品を形成がもたらされることを実証した。加えて、さらに、構成成分としてB. coagulansを含む、および、含まないマルチ繊維製品の両方が、ヒトの健康に対して有益な効果と一致する活性を示した。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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