(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）被検者サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１及び配列番号２のプライマー対を用いてＰＣＲを行う段階；及び
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列解析により正常人由来サンプルと細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階を含み、
前記被検者サンプルは、血液、尿、又は大便であり、
前記（ｃ）段階で、正常人由来サンプルと比較して、
被検者尿サンプルから分離したシアノバクテリア （Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来細胞外小胞、
被検者尿サンプルから分離したクロロプラスト（Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ）綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞、
被検者尿サンプルから分離したスフィンゴモナダレス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）、ビフィドバクテリアレス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、ストレプトファイタ（Ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｔａ）、エロモナダレス（Ａｅｒｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）からなる群から選択される１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞、
被検者尿サンプルから分離したスフィンゴモナダシエ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、ビフィドバクテリアシエ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、メチロバクテリアシエ（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、プラノコッカシエ（Ｐｌａｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、及びコマモナダシエ（Ｃｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ）からなる群から選択される１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞、
被検者尿サンプルから分離したビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、コプロコッカス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、及びシトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）からなる群から選択される１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞、
被検者血液サンプルから分離したリューコノストカシエ（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃａｃｅａｅ）科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞、または
被検者血液サンプルから分離したデルフチア（Ｄｅｌｆｔｉａ）、ワイセラ（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、及びシトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）からなる群から選択される１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含量が増加しているか、
被検者大便サンプルから分離したテネリクテス（Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ）またはシアノバクテリア（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来細胞外小胞、
被検者大便サンプルから分離したモリクテス（Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ）綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞、
被検者大便サンプルから分離したナイセリアレス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌｅｓ）、及びエンテロバクテリアレス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）からなる群から選択される１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞、
被検者大便サンプルから分離したペプトストレプトコッカシエ（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ナイセリアシエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ）、エンテロバクテリアシエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、スタフィロコッカシエ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、オキサロバクテラシエ（Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、モラクセラシエ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃｅａｅ）、及びプラノコッカシエ（Ｐｌａｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）からなる群から選択される１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞、
被検者大便サンプルから分離したカプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、及びアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）からなる群から選択される１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞、
被検者尿サンプルから分離したウェルコミクロビア（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来細胞外小胞、
被検者尿サンプルから分離したウェルコミクロビアエ（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｅ）綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞、
被検者尿サンプルから分離したストラメノピレス（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）、及びウェルコミクロビアレス（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ）からなる群から選択される１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞、
被検者尿サンプルから分離したエグジゴバクテラシエ（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ポルフィロモナダシエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、プレボテラセエ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ）、及びウェルコミクロビアシエ（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ）からなる群から選択される１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞、
被検者尿サンプルから分離したモルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、エグジゴバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、パラバクテロイデス（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、アドレクラウチア（Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ）、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アッカーマンシア（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ）、及びオシロスピラ（Ｏｓｃｉｌｌｏｓｐｉｒａ）からなる群から選択される１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞、
被検者血液サンプルから分離したカーディオバクテリアレス（Ｃａｒｄｉｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞、
被検者血液サンプルから分離したメチロシスタシエ（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔａｃｅａｅ）、エグシグオバクテラシエ（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ペプトストレプトコッカシエ（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ブレビバクテラシエ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、モギバクテラシエ（Ｍｏｇｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、及び、アセトバクテラシエ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、リケネルラシエ（Ｒｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ）からなる群から選択される１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞、または
被検者血液サンプルから分離したアトポビウム（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ）、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、オドリバクター（Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ）、フィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ベイロネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）からなる群から選択される１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含量が減少している場合、胃癌と判定することを特徴とする、
メタゲノム解析を通した胃癌判定のための情報提供方法。
【請求項２】
前記血液は、全血、血清、または血漿であることを特徴とする、請求項１に記載の情報提供方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌メタゲノム解析により胃癌診断に対する情報提供方法に関し、より詳しくは被検者由来サンプルから分離した小胞に存在する遺伝体に対して細菌メタゲノム解析を行って特定細菌由来細胞外小胞の含量増減を分析することで胃癌の発病危険度の予測及び胃癌を診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）は、全世界で大韓民国、中国、日本などの東アジア地域で発生率が高く、アメリカ、ヨーロッパなどの西欧では相対的に発生率が低い癌である。大韓民国で胃癌は男女共に発生率１位、死亡率は肺癌に続いて２位を占めており、６０代で最も多い発病率を示す。胃癌は胃の粘膜上皮に発生する胃腺癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）と粘膜下層に発生する悪性リンパ腫、軟部肉腫、及び間質性腫瘍などがあるが、胃腺癌が全体胃癌の９５％を占める。胃は食べ物が口から入ってから長時間接触する臓器であるので、食べ物に入っている因子が胃癌の原因となる確率が高いものと予想しており、動物実験により食べ物に入っている発癌物質が胃癌の最も重要な要因として知られている。ウイルス、細菌などの生物学的因子による慢性炎症が癌を引き起こすとの事実は以前から知られていた。最近臓内に生息する細菌から由来した毒素によるＴｈ１７免疫反応及びこれによる炎症反応によって大腸癌が発生することが報告されており（Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２０１５  Ａｐｒ  ２４；  ６：６９５６）、胃に共生することが知られているヘリコバクターピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）により胃癌が発生することが知られている。
【０００３】
胃癌は、内視鏡などの定期検診により早期検出することができ、早期胃癌は適切な治療によって９０％程度の完治を期待することができるが、現在においても胃癌が既に進行した後に発見される場合が多く死亡率も高い癌として分類される実情である。したがって胃癌の発病可否を事前に予測可能にすることで、早期診断及び治療に対する対応方法を差別化させることが重要であって、これに対する研究及び技術開発が要求されている。
【０００４】
一方、人体に共生する微生物は１００兆に至っており人間細胞よりも１０倍多く、微生物の遺伝子数は人間遺伝子数の１００倍を上回ることが知られている。微生物叢（ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａあるいはｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ）は与えられた居住地に存在する細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）、古細菌（ａｒｃｈａｅａ）、真核生物（ｅｕｋａｒｙａ）を含む微生物群（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ）をいい、臓内の微生物叢は人の生理現象に重要な役割をし、人体細胞と相互作用によって人間の健康と疾病に大きな影響を及ぼすものとして知られている。人体に共生する細菌は他の細胞への遺伝子、蛋白質などの情報を交換するためにナノメータ大きさの小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ）を分泌する。粘膜は２００ナノメータ（ｎｍ）大きさ以上の粒子は通過することができない物理的防御膜を形成して粘膜に共生する細菌の場合は粘膜を通過することができないが、細菌由来小胞は大きさがおおよそ１００ナノメータ以下であるので、比較的に自由に粘膜を通過して人体に吸収される。
【０００５】
環境遺伝体学と呼ばれるメタゲノム学は環境から採取したサンプルから得たメタゲノム情報を解析する学問ともいえる。最近１６ｓリボソームＲＮＡ（ｌ６ｓｒＲＮＡ）塩基配列を基盤とする方法で人間の微生物叢の細菌構成を系列化することが可能となり、シークエンシング技術の発展で、最近では１６ｓリボソームＲＮＡを次世代塩基配列解析（ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＮＧＳ）プラットホームを用いて配列を解析する。しかし胃癌発病において、血液、大便、または尿などの人体由来物から細菌由来小胞に存在するメタゲノム解析により胃癌の原因因子を同定して胃癌を診断する方法については報告されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者は胃癌を診断するために、被検者由来サンプルである血液、尿、及び大便に存在する小胞から遺伝子を抽出し、これに対して細菌メタゲノム解析を行い、その結果、胃癌患者由来サンプルで有意に増加または減少して胃癌の原因因子及び診断バイオマーカとして作用することができる細菌由来細胞外小胞を同定したのち、これを基礎として本発明を完成した。
【０００７】
ここで、本発明は、細菌由来細胞外小胞に存在する遺伝子に対するメタゲノム解析により胃癌診断のための情報提供方法を提供することを目的とする。
【０００８】
しかし本発明が達成しようとする技術的課題は以上に言及した課題に制限されず、言及しないまた他の課題は下記の記載から当業者に明確に理解されるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記のような本発明の目的を達成するために、本発明は下記の段階を含む、胃癌診断のための情報提供方法を提供する：
（ａ）被検者サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１及び配列番号２のプライマー対を用いてＰＣＲを行う段階；及び
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列解析により正常人由来サンプルと細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階。
【００１０】
そして、本発明は下記の段階を含む、胃癌診断方法を提供する：
（ａ）被検者サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１及び配列番号２のプライマー対を利用してＰＣＲを行う段階；及び
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列解析により正常人由来サンプルと細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階。
【００１１】
また、本発明は下記の段階を含む、胃癌の発病危険度の予測方法を提供する：
（ａ）被検者サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１及び配列番号２のプライマー対を用いてＰＣＲを行う段階；及び
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列解析により正常人由来サンプルと細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階。
【００１２】
本発明の一実施形態において、上記（ｃ）段階で被検者尿サンプルから分離したＶｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ、及びＣｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、被検者大便サンプルから分離したＴｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ、及びＣｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａからなる群から選択される１種以上の門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較してもよい。
【００１３】
本発明の一実施形態において、上記（ｃ）段階で被検者尿サンプルから分離したＶｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｅ、及びＣｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ、被検者大便サンプルから分離したＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓからなる群から選択される１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較してもよい。
【００１４】
本発明の一実施形態において、上記（ｃ）段階で被検者血液サンプルから分離したＣａｒｄｉｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、被検者尿サンプルから分離したＲＦ３９，Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ，Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ，Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｌｅｓ，Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｔａ，及びＡｅｒｏｍｏｎａｄａｌｅｓ，被検者大便サンプルから分離したＲＦ３９，Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌｅｓ，及びＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓからなる群から選択される１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較してもよい。
【００１５】
本発明の一実施形態において、上記（ｃ）段階で被検者血液サンプルから分離したＭｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔａｃｅａｅ，Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ，Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ，Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ，Ｍｏｇｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ，Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ，Ｒｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ及びＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃａｃｅａｅ被検者尿サンプルから分離したＥｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ，Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ，Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ，Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ，Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ，Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ，Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ，Ｐｌａｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ及びＣｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ，被検者大便サンプルから分離したＰｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ，Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ，Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｃｅａｅ，Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ，Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃｅａｅ及びＰｌａｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅからなる群から選択される１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較してもよい。
【００１６】
本発明の一実施形態において、上記（ｃ）段階で被検者血液サンプルから分離したＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ，Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ，Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ，Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ，Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ，Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ，Ｄｅｌｆｔｉａ，Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ及びＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ，被検者尿サンプルから分離したＭｏｒｇａｎｅｌｌａ，Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ，Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｐｒｏｔｅｕｓ，Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ，Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ，Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ，Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ，Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ，Ｏｓｃｉｌｌｏｓｐｉｒａ，Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ，Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ，Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ及びＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ，被検者大便サンプルから分離したＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ，Ｐｒｏｔｅｕｓ，Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ及びＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒからなる群から選択される１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較してもよい。
【００１７】
本発明の一実施形態において、前記被検者サンプルは血液、尿、または大便であってもよい。
【００１８】
本発明の一実施形態において、前記血液は、全血、血清、血漿、または血液蛋白球であってもよい。
【発明の効果】
【００１９】
環境に存在する細菌から分泌する細胞外小胞は、体内に吸収されて癌発生に直接的な影響を及ぼすものであって、胃癌は国内で発病率及び死亡率が最も高い癌であって発病予測により予防及び早期診断が最も重要であるので、本発明による人体由来サンプルに存在する小胞内の遺伝体に対する細菌メタゲノム解析により胃癌発病の危険度を事前に予測することで胃癌の危険群を早期に診断及び予測して適切な管理によって発病時期を遅らせるか発病を予防することができ、発病後にも早期診断できて胃癌の発病率を低下させ、治療効果を高めることができる。また、胃癌と診断された患者に対してメタゲノム解析により原因因子の露出を避けることで胃癌の経過を良くしたり再発を防止することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１ａ】体内で細菌由来細胞外小胞の分布様相を評価するためのものであって、マウスに臓内細菌（Ｂａｃｔｅｒｉａ）及び細菌由来小胞（ＥＶ）を口腔に投与した後、時間別（０ｈ、５ｍｉｎ、３ｈ、６ｈ、及び１２ｈ）にこれらの分布様相を撮影した写真である。
【図１ｂ】体内で細菌由来細胞外小胞の分布様相を評価するためのものであって、マウスに臓内細菌（Ｂａｃｔｅｒｉａ）及び細菌由来細胞外小胞（ＥＶ）を口腔に投与し、１２時間後に血液及び多様な臓器（心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、脂肪組織、及び筋肉）を摘出して前記細菌及び細胞外小胞の分布様相を撮影した写真である。
【図２】胃癌患者及び正常人の血液から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム解析を行って目（ｏｒｄｅｒ）水準で診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示す結果である。
【図３】胃癌患者及び正常人の血液から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム解析を行って科（ｆａｍｉｌｙ）水準で診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示す結果である。
【図４】胃癌患者及び正常人の血液から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム解析を行って属（ｇｅｎｕｓ）水準で診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示す結果である。
【図５】胃癌患者及び正常人の尿から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム解析を行って門（ｐｈｙｌｕｍ）水準で診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示す結果である。
【図６】胃癌患者及び正常人の尿から細菌由来細胞外小胞を分離した後、メタゲノム解析を行って綱（ｃｌａｓｓ）水準で診断的性能が有意な細菌由来細小胞（ＥＶｓ）の分布を示す結果である。
【図７】胃癌患者及び正常人の尿から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム解析を行って目（ｏｒｄｅｒ）水準で診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示す結果である。
【図８】胃癌患者及び正常人の尿から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム解析を行って科（ｆａｍｉｌｙ）水準で診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示す結果である。
【図９】胃癌患者及び正常人の尿から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム解析を行って属（ｇｅｎｕｓ）水準で診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示す結果である。
【図１０】胃癌患者及び正常人の大便から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム解析を行って門（ｐｈｙｌｕｍ）水準で診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示す結果である。
【図１１】胃癌患者及び正常人の大便から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム解析を行って綱（ｃｌａｓｓ）水準で診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示す結果である。
【図１２】胃癌患者及び正常人の大便から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム解析を行って目（ｏｒｄｅｒ）水準で診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示す結果である。
【図１３】胃癌患者及び正常人の大便から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム解析を行って科（ｆａｍｉｌｙ）水準で診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示す結果である。
【図１４】胃癌患者及び正常人の大便から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム解析を行って属（ｇｅｎｕｓ）水準で診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示す結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、細菌メタゲノム解析による胃癌診断方法に関し、本発明者は血液、尿、及び大便などの被検者由来サンプルに存在する小胞から遺伝子を抽出し、これに対して細菌メタゲノム解析を行い、胃癌の原因因子として作用することができる細菌由来細胞外小胞を同定した。
【００２２】
ここで、本発明は、（ａ）被検者サンプルから分離した小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１及び配列番号２のプライマー対を用いてＰＣＲを行う段階；及び
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列解析により正常人由来サンプルと細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階を含む胃癌診断のための情報提供方法を提供する。
【００２３】
本発明に用いる用語の「胃癌診断」は、患者に対して胃癌が発病する可能性があるか、胃癌が発病する可能性が相対的に高いか、または胃癌が既に発病したかの可否を判別することを意味する。本発明の方法は、任意の特定患者に対する胃癌発病危険度が高い患者であって、特別かつ適切な管理により発病時期を遅らせるか発病しないようにすることに用いられる。また、本発明の方法は、胃癌を早期に診断して最も適切な治療方式を選択することで、治療を決定するために臨床的に用いられる。
【００２４】
本発明に用いる用語の「メタゲノム（ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ）」は、群遺伝体ともいい、土、動物の臓など孤立した地域内のすべてのウイルス、細菌、かびなどを含む遺伝体の総合を意味するもので、主に培養されない微生物を分析するために配列解析器を用いて一括で多くの微生物を同定することを説明する遺伝体の概念として用いられる。特に、メタゲノムは、一種のゲノムまたは遺伝体をいうのではなく、一環境単位のあらゆる種の遺伝体として一種の混合遺伝体をいう。これはオーミクス的に生物学が発展する過程において一種を定義する際に機能的に既存の一種だけでなく、多様な種が互いに相互作用して完全な種を作るという観点からの用語である。技術的には早い配列解析法を用いて、種に関係なくすべてのＤＮＡ、ＲＮＡを分析して、一環境内でのあらゆる種を同定し、相互作用、代謝作用を糾明する技法の対象である。本発明においては、好ましく血液及び尿から分離した小胞を用いて細菌メタゲノム解析を実施した。
【００２５】
本発明に用いる用語の「細菌由来小胞」は、細菌及び古細菌が分泌する膜で形成されたナノ大きさの物質として、小胞に細菌から由来する遺伝子を有している物質を総称する。
【００２６】
本発明において、前記被検者サンプルは血液、尿、または大便であってもよく、前記血液は、好ましくは全血、血清、血漿、または血液蛋白球であってもよいが、これに制限されない。
【００２７】
本発明の実施形態においては、前記細菌由来細胞外小胞に対するメタゲノム解析を実施し、門（ｐｈｙｌｕｍ）、綱（ｃｌａｓｓ）、目（ｏｒｄｅｒ）、科（ｆａｍｉｌｙ）、及び属（ｇｅｎｕｓ）水準でそれぞれ分析して実際に胃癌発生の原因因子あるいは抑制因子として作用することができる細菌由来小胞を同定した。
【００２８】
より詳しく本発明の一実施形態においては、被検者由来血液サンプルに存在する小胞に対して細菌メタゲノムを目水準で分析した結果、Ｃａｒｄｉｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ目細菌由来細胞外小胞の含量が胃癌患者と正常人の間で有意な差があった（実施例４参照）。
【００２９】
より詳しく本発明の一実施形態においては、被検者由来血液サンプルに存在する小胞に対して細菌メタゲノムを科水準で分析した結果、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔａｃｅａｅ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｍｏｇｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｒｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ、及びＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃａｃｅａｅ科の細菌由来細胞外小胞の含量が胃癌患者と正常人の間で有意な差があった（実施例４参照）。
【００３０】
より詳しく本発明の一実施形態においては、被検者由来血液サンプルに存在する小胞に対して細菌メタゲノムを属水準で分析した結果、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｄｅｌｆｔｉａ、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ、及びＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属の細菌由来細胞外小胞の含量が胃癌患者と正常人の間で有意な差があった（実施例４参照）。
【００３１】
より詳しく本発明の一実施形態においては、被検者由来尿サンプルに存在する小胞に対して細菌メタゲノムを門水準で分析した結果、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ、及びＣｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ門の細菌由来細胞外小胞の含量が胃癌患者と正常人の間で有意な差があった（実施例５参照）。
【００３２】
より詳しく本発明の一実施形態においては、被検者由来尿サンプルに存在する小胞に対して細菌メタゲノムを綱水準で分析した結果、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｅ、及びＣｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ綱の細菌由来細胞外小胞の含量が胃癌患者と正常人の間で有意な差があった（実施例５参照）。
【００３３】
より詳しく本発明の一実施形態においては、被検者由来尿サンプルに存在する小胞に対して細菌メタゲノムを目水準で分析した結果、ＲＦ３９、Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｔａ、及びＡｅｒｏｍｏｎａｄａｌｅｓ目の細菌由来細胞外小胞の含量が胃癌患者と正常人の間で有意な差があった（実施例５参照）。
【００３４】
より詳しく本発明の一実施形態においては、被検者由来尿サンプルに存在する小胞に対して細菌メタゲノムを科水準で分析した結果、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｐｌａｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、及びＣｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ科の細菌由来細胞外小胞の含量が胃癌患者と正常人の間で有意な差があった（実施例５参照）。
【００３５】
より詳しく本発明の一実施形態においては、被検者由来尿サンプルに存在する小胞に対して細菌メタゲノムを属水準で分析した結果、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ、Ｏｓｃｉｌｌｏｓｐｉｒａ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ、及びＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属の細菌由来細胞外小胞の含量が胃癌患者と正常人の間で有意な差があった（実施例５参照）。
【００３６】
より詳しく本発明の一実施形態においては、被検者由来大便サンプルに存在する小胞に対して細菌メタゲノムを門水準で分析した結果、Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ、及びＣｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ門の細菌由来細胞外小胞の含量が胃癌患者と正常人の間で有意な差があった（実施例６参照）。
【００３７】
より詳しく本発明の一実施形態においては、被検者由来大便サンプルに存在する小胞に対して細菌メタゲノムを綱水準で分析した結果、Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ綱の細菌由来細胞外小胞の含量が胃癌患者と正常人の間で有意な差があった（実施例６参照）。
【００３８】
より詳しく本発明の一実施形態においては、被検者由来大便サンプルに存在する小胞に対して細菌メタゲノムを目水準で分析した結果、ＲＦ３９、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌｅｓ、及びＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ目の細菌由来細胞外小胞の含量が胃癌患者と正常人の間で有意な差があった（実施例６参照）。
【００３９】
より詳しく本発明の一実施形態においては、被検者由来大便サンプルに存在する小胞に対して細菌メタゲノムを科水準で分析した結果、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃｅａｅ、及びＰｌａｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ科の細菌由来細胞外小胞の含量が胃癌患者と正常人の間で有意な差があった（実施例６参照）。
【００４０】
より詳しく本発明の一実施形態においては、被検者由来大便サンプルに存在する小胞に対して細菌メタゲノムを属水準で分析した結果、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、及びＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属の細菌由来細胞外小胞の含量が胃癌患者と正常人の間で有意な差があった（実施例６参照）。
【００４１】
本発明は、上記のような実施例の結果により、被検者由来血液、大便、及び尿から分離した小胞に存在する遺伝子に対して細菌メタゲノム解析を実施することで正常人と比較して胃癌患者から含量が有意に変化した細菌由来小胞を同定しており、メタゲノム解析により前記各水準で細菌由来小胞の含量増減を分析することで胃癌の診断が可能であることを確認した。
【００４２】
以下に本発明の理解を深めるために好ましい実施例を提示する。しかし下記の実施例は本発明をより理解し易くするために提供するものであって、下記の実施例によって本発明の内容が限定されるのではない。
【実施例】
【００４３】
実施例１．臓内細菌及び細菌由来小胞の体内吸収、分布、及び排泄様相分析
【００４４】
臓内細菌と細菌由来小胞が胃腸管を介して全身的に吸収されるかを評価するために次のような方法で実験を行った。マウスの胃腸に蛍光で表示した臓内細菌と臓内細菌由来小胞をそれぞれ５０μｇの容量で胃腸管に投与し、０分、５分、３時間、６時間、１２時間後に蛍光を測定した。マウスの全体イメージを観察した結果、図１ａに示すように、前記細菌（Ｂａｃｔｅｒｉａ）の場合は全身的に吸収されなかったが、細菌由来小胞（ＥＶ）の場合は投与後５分に全身的に吸収され、投与３時間後には膀胱に蛍光が濃く観察されて小胞が泌尿器系に排泄されたことがわかった。また、小胞は投与１２時間まで体内に存在することがわかった。
【００４５】
臓内細菌と臓内細菌由来小胞が全身的に吸収された後、あらゆる臓器に浸潤された様相を評価するために、蛍光で表示した５０μｇの細菌と細菌由来小胞を上記方法のように投与した後１２時間目にマウスから血液（Ｂｌｏｏｄ）、心臓（Ｈｅａｒｔ）、肺（Ｌｕｎｇ）、肝臓（Ｌｉｖｅｒ）、腎臓（Ｋｉｄｎｅｙ）、脾臓（Ｓｐｌｅｅｎ）、脂肪組織（Ａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅ）、及び筋肉（Ｍｕｓｃｌｅ）を摘出した。前記摘出した組織から蛍光を観察した結果、図１ｂに示すように、前記臓内の細菌（Ｂａｃｔｅｒｉａ）は各臓器に吸収されない一方、前記臓内細菌由来細胞外小胞（ＥＶ）は血液、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、脂肪組織、及び筋肉に分布していることを確認した。
実施例２．血液、大便、及び尿から小胞分離及びＤＮＡ抽出
【００４６】
血液、大便、及び尿から小胞を分離してＤＮＡを抽出するために、まずは１０ｍlチューブに血液、大便、または尿を注入し、遠心分離機（３，５００ｘｇ、１Ｏｍｉｎ、４℃）を実施して浮遊物を沈めて上澄液だけを回収した後、新しい１０ｍlチューブに移した。０．２２μｍフィルターを使用して前記回収した上澄液から細菌及び異物を除去した後、セントリプレップチューブ（ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｉｇｕｇａｌ  ｆｉｌｔｅｒｓ  ５０ｋＤ）に移し、１５００ｘｇ、４℃から１５分間遠心分離して５０ｋＤよりも小さい物質は捨てて１０ｍlまで濃縮させた。再び０．２２μｍフィルターを使用してバクテリア及び異物を除去した後、Ｔｙｐｅ  ９０ｔｉロータで１５０，０００ｘｇ、４℃で３時間、超高速遠心分離方法を使用して上澄液を捨てて固まったｐｅｌｌｅｔを生理食塩水（ＰＢＳ）で融かして小胞を収得した。
【００４７】
上記方法によって血液、大便、及び尿から分離した小胞１００μlを１００゜Ｃで沸かして内部のＤＮＡを脂質外に出るようにした後、氷で５分間冷やした。次に、残った浮遊物を除去するために１０，０００ｘｇ、４℃で３０分間遠心分離し、上澄液だけを集めた後、Ｎａｎｏｄｒｏｐを用いてＤＮＡ量を定量した。その後に、前記抽出したＤＮＡに細菌由来ＤＮＡが存在するかを確認するために下記表１に示した１６ｓ  ｒＤＮＡ  ｐｒｉｍｅｒでＰＣＲを行って前記抽出した遺伝子に細菌由来遺伝子が存在することを確認した。
【００４８】
【表１】
0006846833.tif 000002
実施例３．血液、大便、及び尿から抽出したＤＮＡを利用したメタゲノム解析
【００４９】
上記の実施例２の方法により遺伝子を抽出した後、上記１に示した１６Ｓ  ｒＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲを実施して遺伝子を増幅させ、シークエンシング（Ｉｌｌuｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）を行った。結果をＳｔａｎｄａｒｄ  Ｆｌｏｗｇｒａｍ  Ｆｏｒｍａｔ（ＳＦＦ）ファイルで出力し、ＧＳ  ＦＬＸ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ２．９）を用いてＳＦＦファイルをｓｅｑｕｅｎｃｅファイル（．ｆａｓｔａ）とｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｓｃｏｒｅファイルに変換した後、リードの信用度評価を確認し、ｗｉｎｄｏｗ（２０ｂｐｓ）平均ｂａｓｅ  ｃａｌｌ  ａｃｃｕｒａｃｙが９９％未満（Ｐｈｒｅｄ  ｓｃｏｒｅ＜２０）である部分を除去した。質の低い部分を除去した後、リード長が３００ｂｐｓ以上のものだけを用いていて（Ｓｉｃｋｌｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．３３）、結果分析のためにＯｐｅｒａｔｉｏｎａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  Ｕｎｉｔ（ＯＴＵ）は、ＵＣＬＵＳＴとＵＳＥＡＲＣＨを用いてシークエンス類似度によりクロスターリングを行った。詳しくは、属（ｇｅｎｕｓ）は９４％、科（ｆａｍｉｌｙ）は９０％、目（ｏｒｄｅｒ）は８５％、綱（ｃｌａｓｓ）は８０％、門（ｐｈｙｌｕｍ）は７５％シークエンス類似度を基準としてクロスターリングをし、各ＯＴＵの門、綱、目、科、属レベルの分類を行い、ＢＬＡＳＴＮとＧｒｅｅｎＧｅｎｅｓの１６Ｓ  ＤＮＡシークエンスデータベース（１０８，４５３シークエンス）を用いて９７％以上のシークエンス類似度を有する細菌を分析した（ＱＩＩＭＥ）。
実施例４．血液から分離した細菌由来小胞メタゲノム解析基盤の胃癌診断模型
【００５０】
上記の実施例３の方法において、胃癌患者６６人と年と性別をマッチングした正常人１９８人の血液から小胞を分離した後、メタゲノムシークエンシングを行った。診断模型開発は、まずｔ−ｔｅｓｔで２つの群の間のｐ値が０．０５以下であり、２つの群の間に２倍以上の差がある菌株を選定した後に、ｌｏｇｉｓｔｉｃ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ方法で診断的性能指標であるＡＵＣ（ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｃｕｒｖｅ）、敏感度、及び特異度を算出した。
【００５１】
血液内の細菌由来小胞を目（ｏｒｄｅｒ）水準で分析した結果、Ｃａｒｄｉｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ目細菌バイオマーカで診断模型を開発したところ、胃癌に対する診断的性能が有意なものとして示された（表２及び図２参照）。
【００５２】
【表２】
0006846833.tif 000003
【００５３】
血液内の細菌由来小胞を科（ｆａｍｉｌｙ）水準で分析した結果、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔａｃｅａｅ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｍｏｇｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｒｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ、及びＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃａｃｅａｅ科細菌から選択される一つ以上のバイオマーカで診断模型を開発したところ、胃癌に対する診断的性能が有意なものとして示された（表３及び図３参照）。
【００５４】
【表３】
0006846833.tif 000004
【００５５】
血液内の細菌由来小胞を属（ｇｅｎｕｓ）水準で分析した結果、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｄｅｌｆｔｉａ、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ、及びＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属細菌から選択される一つ以上のバイオマーカで診断模型を開発したところ、胃癌に対する診断的性能が有意なものとして示された（表４及び図４参照）。
【００５６】
【表４】
0006846833.tif 000005
実施例５．尿から分離した細菌由来小胞メタゲノム解析基盤の胃癌診断模型
【００５７】
上記の実施例３の方法において、胃癌患者６１人と年と性別をマッチングした正常人１２０人の尿から小胞を分離した後、メタゲノムシークエンシングを行った。診断模型開発は、まずｔ−ｔｅｓｔで２つの群の間のｐ値が０．０５以下であり、２つの群の間に２倍以上の差がある菌株を選定した後に、ｌｏｇｉｓｔｉｃ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ方法で診断的性能指標であるＡＵＣ（ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｃｕｒｖｅ）、敏感度、及び特異度を算出した。
【００５８】
尿内の細菌由来小胞を門（ｐｈｙｌｕｍ）水準で分析した結果、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ、及びＣｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ門細菌から選択される一つ以上のバイオマーカで診断模型を開発したところ、胃癌に対する診断的性能が有意なものとして示された（表５及び図５参照）。
【００５９】
【表５】
0006846833.tif 000006
【００６０】
尿内の細菌由来小胞を綱（ｃｌａｓｓ）水準で分析した結果、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｅ、及びＣｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ綱細菌から選択される一つ以上のバイオマーカで診断模型を開発したところ、胃癌に対する診断的性能が有意なものとして示された（表６及び図６参照）。
【００６１】
【表６】
0006846833.tif 000007
【００６２】
尿内の細菌由来小胞を目（ｏｒｄｅｒ）水準で分析した結果、ＲＦ３９、Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｔａ、及びＡｅｒｏｍｏｎａｄａｌｅｓ目細菌から選択される一つ以上のバイオマーカで診断模型を開発したところ、胃癌に対する診断的性能が有意なものとして示された（表７及び図７参照）。
【００６３】
【表７】
0006846833.tif 000008
【００６４】
尿内の細菌由来小胞を科（ｆａｍｉｌｙ）水準で分析した結果、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｐｌａｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、及びＣｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌から選択される一つ以上のバイオマーカで診断模型を開発したところ、胃癌に対する診断的性能が有意なものとして示された（表８及び図８参照）。
【００６５】
【表８】
0006846833.tif 000009
【００６６】
尿内の細菌由来小胞を属（ｇｅｎｕｓ）水準で分析した結果、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ、Ｏｓｃｉｌｌｏｓｐｉｒａ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ、及びＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌から選択される一つ以上のバイオマーカで診断模型を開発したところ、胃癌に対する診断的性能が有意なものとして示された（表９及び図９参照）。
【００６７】
【表９】
0006846833.tif 000010
0006846833.tif 000011
実施例６．大便から分離した細菌由来小胞メタゲノム解析基盤の胃癌診断模型
【００６８】
上記の実施例３の方法において、胃癌患者６３人と年と性別をマッチングした正常人１２６人の大便から小胞を分離した後、メタゲノムシークエンシングを行った。診断模型開発は、まずｔ−ｔｅｓｔで２つの群の間のｐ値が０．０５以下であり、２つの群の間に２倍以上の差がある菌株を選定した後、ｌｏｇｉｓｔｉｃ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ方法で診断的性能指標であるＡＵＣ（ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｃｕｒｖｅ）、敏感度、及び特異度を算出した。
【００６９】
大便内の細菌由来小胞を門（ｐｈｙｌｕｍ）水準で分析した結果、Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ、及びＣｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ門細菌から選択される一つ以上のバイオマーカで診断模型を開発したところ、胃癌に対する診断的性能が有意なものとして示された（表１０及び図１０参照）。
【００７０】
【表１０】
0006846833.tif 000012
【００７１】
大便内の細菌由来小胞を綱（ｃｌａｓｓ）水準で分析した結果、Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ綱細菌から選択される一つ以上のバイオマーカで診断模型を開発したところ、胃癌に対する診断的性能が有意なものとして示された（表１１及び図１１参照）。
【００７２】
【表１１】
0006846833.tif 000013
【００７３】
大便内の細菌由来小胞を目（ｏｒｄｅｒ）水準で分析した結果、ＲＦ３９、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌｅｓ、及びＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ目細菌から選択される一つ以上のバイオマーカで診断模型を開発したところ、胃癌に対する診断的性能が有意なものとして示された（表１２及び図１２参照）。
【００７４】
【表１２】
0006846833.tif 000014
【００７５】
大便内の細菌由来小胞を科（ｆａｍｉｌｙ）水準で分析した結果、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃｅａｅ、及びＰｌａｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ科細菌から選択される一つ以上のバイオマーカで診断模型を開発したところ、胃癌に対する診断的性能が有意なものとして示された（表１３及び図１３参照）。
【００７６】
【表１３】
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【００７７】
大便内の細菌由来小胞を属（ｇｅｎｕｓ）水準で分析した結果、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、及びＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属細菌から選択される一つ以上のバイオマーカで診断模型を開発したところ、胃癌に対する診断的性能が有意なものとして示された（表１４及び図１４参照）。
【００７８】
【表１４】
0006846833.tif 000016
【００７９】
上述した本発明の説明は例示のためのものであって、本発明が属する技術分野の通常の知識を有する者は本発明の技術的思想や必須な特徴を変更しなくても他の詳しい形態に容易に変形可能であることを理解できるであろう。したがって、以上に記述した実施例はすべての面から例示的なものであって、限定的ではないものとして理解すべきである。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明による細菌メタゲノム解析により胃癌診断に対する情報を提供する方法は、被検者来由サンプルから分離した小胞に存在する遺伝体に対して細菌メタゲノム解析を行って特定細菌来由細胞外小胞の含量増減を分析することで胃癌の発病危険度を予測し、胃癌を診断することに用いられる。環境に存在する細菌から分泌する細胞外小胞は体内に吸収されて癌発生に直接的な影響を及ぼすものであって、胃癌は国内で発病率及び死亡率が最も高い癌として発病予測を介した予防及び早期診断が最も重要であるので、本発明による人体来由サンプルに存在する小胞内の遺伝体に対する細菌メタゲノム解析により胃癌発病の危険度を事前に予測することで胃癌の危険群を早期に診断及び予測して適切な管理によって胃癌の発病時期を遅らせるか発病を予防することができ、胃癌の発病後にも早期診断できて胃癌の発病率を低下させて治療効果を高めることができる。また、胃癌として診断された患者において、本発明による細菌メタゲノム解析は原因因子露出を避けられるようにことで胃癌の経過を良くしたり再発を防止するものとして用いられる。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0006846833.tif 000025
【図９】
0006846833.tif 000026
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
0006846833.tif 000029
【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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