(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定遺伝子を標的として認識する標的配列を備えたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａを含み、細菌を増殖抑制及び殺菌させ、
前記特定遺伝子は、薬剤耐性遺伝子、病原遺伝子、又は前記細菌を判別するための遺伝子である
ことを特徴とする抗菌ファージ。
【請求項２】
前記標的配列は、
１４〜２８塩基のｃｒＲＮＡのスペーサー配列として設計された
ことを特徴とする請求項１に記載の抗菌ファージ。
【請求項３】
前記特定遺伝子を含む任意の前記細菌を抗菌対象とする
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の抗菌ファージ。
【請求項４】
前記特定遺伝子は、
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）、ペニシリン耐性肺炎球菌（ＰＲＳＰ）、多剤耐性緑膿菌（ＭＤＲＰ）、多剤耐性アシネトバクター属（ＭＤＲＡ）、カルバペネム耐性緑膿菌（ＣＲＰＡ）、カルバペネム耐性セラチア（ＣＲＳＡ）、第三世代セファロスポリン耐性肺炎桿菌（３ＧＣＲＫＰ）、第三世代セファロスポリン耐性大腸菌（３ＧＣＲＥＣ）、フルオロキノロン耐性大腸菌（ＦＱＲＥＣ）、コリスチンの耐性大腸菌（ＣｏｌＲ−ＥＣ）からなる群の一種又は任意の組み合わせを含む細菌のゲノム及び／又はプラスミドに含まれる
ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の抗菌ファージ。
【請求項５】
前記薬剤耐性遺伝子又は病原遺伝子は、
ｍｅｃＡ、ｖａｎＡ、ｖａｎＢ、ｖａｎＣ、ｖａｎＤ、ｖａｎＥ、ｖａｎＧ、ｖａｎＬ、ｖａｎＭ、ｖａｎＮ、ｐｂｐ１ａ、ｐｂｐ２ｂ、ｐｂｐ２ｘ、ｂｌａIMP、ｂｌａVIM、ｂｌａOXA、ｂｌａSHV、ｂｌａSME、ｂｌａNDM、ｂｌａIMI、ｂｌａTEM、ｂｌａCMY、ｂｌａGES、ｂｌａCTX-M、ｂｌａKPC、ａａｃ（６'）、ｐａｒＣ、ｇｙｒＡ、ｑｎｒＡ、ｍｃｒからなる群とその変異の一種又は任意の組み合わせを含む
ことを特徴とする請求項４に記載の抗菌ファージ。
【請求項６】
前記特定遺伝子は、毒素遺伝子又は病原遺伝子であり、
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、腸炎ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、Ａ群レンサ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、肺炎レンサ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からなる群の一種又は任意の組み合わせを含む細菌のゲノム及び／又はプラスミドに含まれる
ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の抗菌ファージ。
【請求項７】
前記毒素遺伝子は、
エンテロトキシン、ボツリヌス神経毒素、コレラ毒素、耐熱性エンテロトキシン、易熱性エンテロトキシン、耐熱性溶血毒、志賀毒素、破傷風毒素、α毒素、ロイコシジン、β毒素、毒素性ショック症候群毒素、ストレプトリジンＯ、発赤毒、α溶血毒素、細胞毒性壊死性因子Ｉ、Ａ毒素、Ｂ毒素、百日咳毒素、ジフテリア毒素、アドヘジン、分泌（透過）装置、溶解素、及びスーパー抗原を産生する遺伝子からなる群の一種又は任意の組み合わせを含む
ことを特徴とする請求項６に記載の抗菌ファージ。
【請求項８】
前記標的配列は、
標的遺伝子配列のうちの特定の１４〜２８塩基の配列である
ことを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項に記載の抗菌ファージ。
【請求項９】
前記標的配列は、
配列番号７、配列番号１７、配列番号２２、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２の配列である
ことを特徴とする請求項１乃至８のいずれか１項に記載の抗菌ファージ。
【請求項１０】
前記特定遺伝子は、
核酸獲得及び／又は核酸変異によって薬剤耐性を生じさせるものである
ことを特徴とする請求項１乃至９のいずれか１項に記載の抗菌ファージ。
【請求項１１】
前記標的配列は、
複数であり、複数の前記特定遺伝子を、それぞれ標的として認識する
ことを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の抗菌ファージ。
【請求項１２】
請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の抗菌ファージを含む
ことを特徴とする治療用組成物。
【請求項１３】
請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の抗菌ファージを含む
ことを特徴とする殺菌剤。
【請求項１４】
請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の抗菌ファージを含む
ことを特徴とする食品。
【請求項１５】
請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の抗菌ファージを含む
ことを特徴とする細菌判別キット。
【請求項１６】
特定遺伝子を標的として認識する標的配列を備えたＣＲＩＳＰＲ、Ｃａｓ１３ａ、及びパッケージング配列を含むファージミドと、ヘルパーファージとをファージ合成細菌にトランスフェクト及び／又は感染させ、溶菌及び／又は菌体外に放出させ、
コンストラクトされた、細菌を増殖抑制及び殺菌させる抗菌ファージを取得する
ことを特徴とする治療用組成物製造方法。
【請求項１７】
特定遺伝子を標的として認識する標的配列を備えたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａを含む抗菌ファージにより、
前記特定遺伝子を備えた細菌を殺菌させ、除去する
ことを特徴とする細菌除去方法。
【請求項１８】
前記細菌は、ヒト、動物、及び／又は環境中の細菌叢に存在し、
前記ヒトについては、ヒト体内での実施を除く
ことを特徴とする請求項１７に記載の細菌除去方法。
【請求項１９】
前記細菌は、食品内に存在する
ことを特徴とする請求項１７に記載の細菌除去方法。
【請求項２０】
特定遺伝子を標的として認識する標的配列を備えたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａを含む抗菌ファージを細菌に感染させ、
前記細菌を増殖抑制及び殺菌させ、前記特定遺伝子を備えるか否かを判別及び／又は検査し、
前記特定遺伝子は、薬剤耐性遺伝子、病原遺伝子、又は前記細菌を判別するための遺伝子である
ことを特徴とする細菌判別方法。
【請求項２１】
前記抗菌ファージは、抗生物質の耐性遺伝子の配列を含む
ことを特徴とする請求項２０に記載の細菌判別方法。
【請求項２２】
前記細菌は、ヒト、動物、食品内、若しくは環境中の細菌叢に存在する細菌、及び／又は遺伝子組み換え細菌である
ことを特徴とする請求項２０又は２１に記載の細菌判別方法。
【請求項２３】
特定遺伝子を標的として認識する標的配列を備えたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａを含む抗菌ファージにより、
ヒト以外の動物における前記特定遺伝子を備えた細菌を増殖抑制及び殺菌させ、前記細菌による感染症を治療する
ことを特徴とする動物治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に抗菌ファージ、治療用組成物、殺菌剤、食品、細菌判別キット、治療用組成物製造方法、細菌除去方法、細菌判別方法、及び動物治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、部位特異的なヌクレアーゼを利用して、標的ＤＮＡを改変するゲノム編集と呼ばれる技術が注目を集めている。
たとえば、特許文献１には、ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ）／Ｃａｓ９（Ｃｒｉｓｐｒ  ＡＳｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ９）を用いたゲノム編集の技術が記載されている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９では、ＤＮＡの標的部位と相補的な配列を含むガイドＲＮＡと、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを細胞内に注入する。すると、ガイドＲＮＡが標的部位に特異的に結合する。そして、ガイドＲＮＡとＤＮＡを覆うようにして、Ｃａｓ９タンパク質が結合し、ＤＮＡを切断する。【０００３】
一方、近年、抗菌薬の効かない薬剤耐性菌の出現とその急速な蔓延が問題になっている。すなわち、抗菌薬の開発を遥かに上回るスピードで耐性菌が現れるため、細菌感染症が再び人類の健康を脅かす世界的問題となってきている。
ここで、従来から、バクテリオファージ（ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ、以下、「ファージ」という。）を用いた抗菌治療法であるファージセラピーが知られている。ファージセラピーは、細菌に感染するウィルスであるファージの溶菌活性を利用して殺菌する治療法であり、１９１５年のファージの発見により試みられ、現在も一部東ヨーロッパでは臨床で応用されている。従来のファージは、抗菌薬に比べて殺菌効力が低いため、細菌感染症の治療品として限界がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１４／２０４７２６号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｈｍａｋｏｖ  Ｓ他、「Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉｖｅｒｓｅ  Ｃｌａｓｓ  ２  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ、２０１５年、Ｎｏｖ  ５、６０（３）、ｐ．３８５−３９７
【非特許文献２】Ａｂｕｄａｙｙｅｈ  ＯＯ他、「Ｃ２ｃ２  ｉｓ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ-ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ＲＮＡ-ｇｕｉｄｅｄ  ＲＮＡ-ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ．」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１６年、Ａｕｇ  ５、３５３（６２９９）、ａａｆ５５７３
【非特許文献３】Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ  ＪＳ他、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＣＲＩＳＰＲ-Ｃａｓ１３ａ／Ｃ２ｃ２．」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１７年、Ａｐｒ  ２８、３５６（６３３６）、ｐ．４３８−４４２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来のゲノム編集をファージに適用して耐性菌の治療に用いようとしても、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、菌のゲノムＤＮＡを切断するだけなので、細菌自身の遺伝子修復機構により殺菌効果が得られない場合や、菌の予期せぬ遺伝的進化を誘発することがあった。さらに、菌内の薬剤耐性遺伝子はプラスミド上にあることも多く、この場合、ゲノムＤＮＡを標的としたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９では殺菌効果がまったく得られなかった。
このため、薬剤耐性菌の治療等により効果的なファージが求められていた。【０００７】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、上述の課題を解消することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の抗菌ファージは、特定遺伝子を標的として認識する標的配列を備えたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａを含み、細菌を増殖抑制及び殺菌させ、前記特定遺伝子は、薬剤耐性遺伝子、病原遺伝子、又は前記細菌を判別するための遺伝子であることを特徴とする。
本発明の抗菌ファージは、前記標的配列は、１４〜２８塩基のｃｒＲＮＡのスペーサー配列として設計されたことを特徴とする。
本発明の抗菌ファージは、前記特定遺伝子を含む任意の細菌を抗菌対象とすることを特徴とする。
本発明の抗菌ファージは、前記特定遺伝子は、薬剤耐性遺伝子又は病原遺伝子であり、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）、ペニシリン耐性肺炎球菌（ＰＲＳＰ）、多剤耐性緑膿菌（ＭＤＲＰ）、多剤耐性アシネトバクター属（ＭＤＲＡ）、カルバペネム耐性緑膿菌（ＣＲＰＡ）、カルバペネム耐性セラチア（ＣＲＳＡ）、第三世代セファロスポリン耐性肺炎桿菌（３ＧＣＲＫＰ）、第三世代セファロスポリン耐性大腸菌（３ＧＣＲＥＣ）、フルオロキノロン耐性大腸菌（ＦＱＲＥＣ）、コリスチンの耐性大腸菌（ＣｏｌＲ−ＥＣ）からなる群の一種又は任意の組み合わせを含む細菌のゲノム及び／又はプラスミドに含まれることを特徴とする。
本発明の抗菌ファージは、前記薬剤耐性遺伝子又は病原遺伝子は、ｍｅｃＡ、ｖａｎＡ、ｖａｎＢ、ｖａｎＣ、ｖａｎＤ、ｖａｎＥ、ｖａｎＧ、ｖａｎＬ、ｖａｎＭ、ｖａｎＮ、ｐｂｐ１ａ、ｐｂｐ２ｂ、ｐｂｐ２ｘ、ｂｌａIMP、ｂｌａVIM、ｂｌａOXA、ｂｌａSHV、ｂｌａSME、ｂｌａNDM、ｂｌａIMI、ｂｌａTEM、ｂｌａCMY、ｂｌａGES、ｂｌａCTX-M、ｂｌａKPC、ａａｃ（６'）、ｐａｒＣ、ｇｙｒＡ、ｑｎｒＡ、ｍｃｒからなる群とその変異の一種又は任意の組み合わせを含むことを特徴とする。
本発明の抗菌ファージは、前記特定遺伝子は、毒素遺伝子又は病原遺伝子であり、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、腸炎ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、Ａ群レンサ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、肺炎レンサ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からなる群の一種又は任意の組み合わせを含む細菌のゲノム及び／又はプラスミドに含まれることを特徴とする。
本発明の抗菌ファージは、前記毒素遺伝子は、エンテロトキシン、ボツリヌス神経毒素、コレラ毒素、耐熱性エンテロトキシン、易熱性エンテロトキシン、耐熱性溶血毒、志賀毒素、破傷風毒素、α毒素、ロイコシジン、β毒素、毒素性ショック症候群毒素、ストレプトリジンＯ、発赤毒、α溶血毒素、細胞毒性壊死性因子Ｉ、Ａ毒素、Ｂ毒素、百日咳毒素、ジフテリア毒素、アドヘジン、分泌（透過）装置、溶解素、スーパー抗原を産生する遺伝子からなる群の一種又は任意の組み合わせを含むことを特徴とする。
本発明の抗菌ファージは、前記標的配列は、標的遺伝子配列のうちの特定の１４〜２８塩基の配列であることを特徴とする。
本発明の抗菌ファージは、前記標的配列は、配列番号７、配列番号１７、配列番号２２、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２の配列であることを特徴とする。
本発明の抗菌ファージは、前記特定遺伝子は、核酸獲得及び／又は核酸変異によって薬剤耐性を生じさせるものであることを特徴とする。
本発明の抗菌ファージは、前記標的配列は、複数であり、複数の前記特定遺伝子を、それぞれ標的として認識することを特徴とする。
本発明の治療用組成物は、前記抗菌ファージを含むことを特徴とする。
本発明の殺菌剤は、前記抗菌ファージを含むことを特徴とする。
本発明の食品は、前記抗菌ファージを含むことを特徴とする。
本発明の細菌判別キットは、前記抗菌ファージを含むことを特徴とする。
本発明の治療用組成物製造方法は、特定遺伝子を標的として認識する標的配列を備えたＣＲＩＳＰＲ、Ｃａｓ１３ａ、及びパッケージング配列を含むファージミドと、ヘルパーファージとをファージ合成細菌にトランスフェクト及び／又は感染させ、溶菌及び／又は菌体外に放出させ、コンストラクトされた、細菌を増殖抑制及び殺菌させる抗菌ファージを取得することを特徴とする。
本発明の細菌除去方法は、特定遺伝子を標的として認識する標的配列を備えたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａを含む抗菌ファージにより、前記特定遺伝子を備えた細菌を殺菌させ、除去することを特徴とする。
本発明の細菌除去方法は、前記細菌は、ヒト、動物、及び／又は環境中の細菌叢に存在し、前記ヒトについては、ヒト体内での実施を除くことを特徴とする。
本発明の細菌除去方法は、前記細菌は、食品内に存在することを特徴とする。
本発明の細菌判別方法は、特定遺伝子を標的として認識する標的配列を備えたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａを含む抗菌ファージを細菌に感染させ、前記細菌を増殖抑制及び殺菌させ、前記特定遺伝子を備えるか否かを判別及び／又は検査し、前記特定遺伝子は、薬剤耐性遺伝子、病原遺伝子、又は前記細菌を判別するための遺伝子であることを特徴とする。
本発明の細菌判別方法は、前記抗菌ファージは、抗生物質の耐性遺伝子の配列を含むことを特徴とする。
本発明の細菌判別方法は、前記細菌は、ヒト、動物、食品内、若しくは環境中の細菌叢に存在する細菌、及び／又は遺伝子組み換え細菌であることを特徴とする。
本発明の動物治療方法は、特定遺伝子を標的として認識する標的配列を備えたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａを含む抗菌ファージにより、ヒト以外の動物における前記特定遺伝子を備えた細菌を増殖抑制及び殺菌させ、前記細菌による感染症を治療することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、特定遺伝子を標的として認識する標的配列を備えたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａを含むように構成することで、薬剤耐性菌や毒素産生菌等を効果的に治療することを可能とする抗菌ファージを実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の第一実施形態に係る抗菌ファージによる抗菌治療方法の概念図である。
【図２】本発明の実施例１に係る特定遺伝子を有する細菌のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａによる殺菌効果を示す図及び写真である。
【図３】本発明の実施例１に係る抗菌ファージの合成及び実験の概念図である。
【図４】本発明の実施例１に係る抗菌ファージ感染による細菌の殺菌効果を示す写真である。
【図５】本発明の実施例１に係る抗菌ファージ感染による特定遺伝子保有大腸菌の発育抑制を示す図及び写真である。
【図６】本発明の実施例１に係る各標的配列の殺菌活性を示す写真である。
【図７】本発明の実施例１に係る強い殺菌活性が確認された標的配列のウェブロゴによる情報量を示す図である。
【図８】図６に示す写真のコロニー数をカウントしたグラフである。
【図９】本発明の実施例１に係るカルバペネム耐性遺伝子の判別結果を示す写真である。
【図１０】本発明の実施例１に係るコリスチン耐性遺伝子の判別結果を示す写真である。
【図１１】本発明の実施例２に係る抗菌ファージによる細菌叢改変の結果を示す図である。
【図１２】本発明の実施例２に係る抗菌ファージによる殺菌効果において、最適なＣＲＩＳＰＲ配列を調べる手法の概念図である。
【図１３】本発明の実施例２に係る抗菌ファージによる殺菌効果を示すグラフである。
【図１４】本発明の実施例２に係る特定遺伝子の検出の感度を上げた結果を示す図及び写真である。
【図１５】図１４に示す手法を用いてカルバペネム耐性遺伝子を判別した結果を示す写真である。
【図１６】本発明の実施例２に係る志賀毒素産生遺伝子及びカルバペネム耐性遺伝子の判別結果を示す写真である。
【図１７】本発明の実施例２に係る臨床分離大腸菌株のカルバペネム耐性遺伝子の判別結果を示す図及び写真である。
【図１８】本発明の実施例２に係る臨床分離大腸菌株を感染させた蛾の幼虫の抗菌ファージによる治療効果を示すグラフである。
【図１９】本発明の実施例２に係るメチシリン耐性黄色ブドウ球菌株の耐性遺伝子ｍｅｃＡを有する細菌の選択的殺菌、及びｍｅｃＡ陽性菌の判別結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
＜第一実施形態＞
抗菌薬開発と耐性菌変遷の歴史を鑑みると、耐性菌の出現は避けられそうになく、更に、新たな耐性菌が現れても対応できる進化適応型医薬品は存在しないことが危惧されている。しかしながら、特許文献１に記載されたようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、抗菌治療には適用することができなかった。
このため、本発明者らは、非特許文献１に記載された、ＲＮＡを標的とするＣＲＩＳＰＲシステムであるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａを用いることを考えた。非特許文献２に記載されるように、Ｃａｓ１３ａは、２０１５年に発見され、翌年にその機能が解明された。このＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａはＲＮＡを標的とするものの、Ｃａｓ１３ａ酵素は一度標的ＲＮＡを配列特異的に認識すると、速やかに様々なＲＮＡを配列非特異的に分解する酵素に変化する。このため、非特許文献３では、感染性の病原菌のＤＮＡを検出するために、Ｃａｓ１３ａで分解されたＲＮＡを検出する手法を示している。この手法はあくまでも菌から核酸を一度抽出した上で行う検出手法であり、抗菌治療とは無関係なものである。
ここで、非特許文献２のＣａｓ１３ａは、プラスミドを菌内にトランスフェクトする手法を用いているため、抗菌治療に適用することは不可能であった。
【００１２】
これに対して、本発明者らは、このＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａを細菌細胞内に導入して殺菌剤として使用できる可能性を考えた。具体的には、本発明者らは耐性遺伝子配列等を認識する標的配列（標的遺伝子認識配列）を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓｌ３ａを設計し、これをコードするＤＮＡをファージ内に含ませる（搭載させる）ことで、人工的に設計、製造された合成ファージである抗菌ファージを作製することを着想して、鋭意実験を繰り返し、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
図１は、本実施形態のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａを含む抗菌ファージによる抗菌治療方法の概念を示す。
本実施形態の抗菌ファージは、ＣＲＩＳＰＲの塩基配列認識の特異性とＣａｓ１３ａの塩基配列非特異的なＲＮＡ分解活性を利用する。本実施形態の抗菌ファージを目的とする細菌に感染させると、細菌内で合成されたＣａｓ１３ａが、染色体由来又はプラスミド由来の耐性遺伝子ｍＲＮＡを認識し、切断する。標的配列を取り込んだＣａｓ１３ａは非特異的ＲＮＡ分解酵素へと変化し、宿主細菌ＲＮＡの分解に伴った細胞死又は休眠を誘導する。すなわち、２０塩基前後の標的配列のＤＮＡ配列を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａ  ＤＮＡを抗菌ファージに搭載させることで、特定遺伝子を持つ特定の細菌のみを選択的に殺菌する抗菌治療が可能となる。
以下で、本実施形態の抗菌ファージ、治療用組成物、殺菌剤、食品、細菌判別キット、治療用組成物製造方法、細菌除去方法、細菌判別方法、及び動物治療方法について具体的且つ詳細に説明する。
【００１４】
本発明の第一実施形態に係る抗菌ファージは、特定遺伝子を標的として認識する標的配列を備えたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａを含むことを特徴とする。
ここで、本実施形態の特定遺伝子は、細菌を特定遺伝型に区別可能にする任意の遺伝子である。この特定遺伝型としては、例えば、同種の菌であっても、ゲノムＤＮＡ、含まれるプラスミド、その他の核外遺伝子等の遺伝子配列により特定可能であればよく、必ずしも表現型が異ならなくてもよい。また、本実施形態の特定遺伝子は、菌の遺伝子そのもの、組み換えられた遺伝子、ゲノムやプラスミド等に導入された遺伝子であってもよい。さらに、この特定遺伝子は、必ずしもタンパク質に翻訳されなくてもよい。
より具体的には、本実施形態の特定遺伝子は、例えば、薬剤の耐性菌の薬剤耐性遺伝子、各種の毒素遺伝子、弱毒化又は強毒化に関連するタンパク質をコードする遺伝子、特定の代謝産物を生成するための酵素遺伝子、菌を特定するための遺伝子、形質転換に用いたレポーター遺伝子、遺伝子組み換えに用いられた制限酵素や粘着末端を含む配列、リピート配列、その他の広義の遺伝型を示す「遺伝子」であってもよい。
すなわち、本実施形態の抗菌ファージは、設計する標的配列を変更すれば、特定病原因子を持つ菌等、どんな特定遺伝子を持つ細菌も標的とすることが可能である。
【００１５】
具体的な例として、この特定遺伝子が薬剤耐性遺伝子の場合、各種病原性の大腸菌株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、ＶＲＳＡ）、バンコマイシン耐性腸球菌（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ、ＶＲＥ）、ペニシリン耐性肺炎球菌（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、ＰＲＳＰ）、多剤耐性緑膿菌（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、ＭＤＲＰ）、多剤耐性アシネトバクター属（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｄｒｕｇ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、ＭＤＲＡ）、カルバペネム耐性緑膿菌（ｃａｒｂａｐｅｎｅｍ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、ＣＲＰＡ）、カルバペネム耐性セラチア（ｃａｒｂａｐｅｎｅｍ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｅｒｒａｔｉａ、ＣＲＳＡ）、第三世代セファロスポリン耐性肺炎桿菌（３ＧＣＲＫＰ）、第三世代セファロスポリン耐性大腸菌（３ｒｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｅ．  ｃｏｌｉ、３ＧＣＲＥＣ）、フルオロキノロン耐性大腸菌（ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｅ．  ｃｏｌｉ、ＦＱＲＥＣ）、コリスチンの耐性大腸菌（ＣｏｌＲ−ＥＣ）からなる群の一種又は任意の組み合わせを含む細菌のゲノム及び／又はプラスミドに含まれてもよい。
【００１６】
この場合、これらの薬剤耐性遺伝子は、ｍｅｃＡ、ｖａｎＡ、ｖａｎＢ、ｖａｎＣ、ｖａｎＤ、ｖａｎＥ、ｖａｎＧ、ｖａｎＬ、ｖａｎＭ、ｖａｎＮ、ｐｂｐ１ａ、ｐｂｐ２ｂ、ｐｂｐ２ｘ、ｂｌａIMP、ｂｌａVIM、ｂｌａOXA、ｂｌａSHV、ｂｌａSME、ｂｌａNDM、ｂｌａIMI、ｂｌａTEM、ｂｌａCMY、ｂｌａGES、ｂｌａCTX-M、ｂｌａKPC、ａａｃ（６'）、ｐａｒＣ、ｇｙｒＡ、ｑｎｒＡ、ｍｃｒからなる群とその変異の一種又は任意の組み合わせを含んでもよい。
これらの薬剤耐性菌（耐性菌の種類）、薬剤耐性遺伝子（標的ＲＮＡをコードする遺伝子名）、及び本実施形態で用いる抗菌ファージ用のファージ（バクテリオファージ）の例について、下記の表１にまとめて示す：
【００１７】
【表１】
0006923862.tif 000002
【００１８】
この表に示すように、薬剤耐性遺伝子は、それぞれの変異（バリエーション）を含む。
加えて、これらの薬剤耐性遺伝子は、他の種類の細菌に水平伝播されてもよく、細菌としての分類自体が異なってもよい。
【００１９】
また、特定遺伝子は、核酸取得及び／又は核酸変異によって薬剤耐性を生じさせるものであってもよい。
具体的には、耐性菌は、外来のＤＮＡ又はＲＮＡ（核酸）取得、及び／又は核酸変異によって生じることがあるため、この核酸変異を本実施形態の抗菌ファージが標的とする特定遺伝子としてもよい。この場合、本実施形態の抗菌ファージは、この変異に対応して標的配列を改変することで、薬剤耐性を生じた核酸変異を「特定遺伝子」として含む菌に対抗することが可能である。
【００２０】
また、本発明の第一実施形態に係る抗菌ファージの標的配列は、特定遺伝子を標的として認識するように設計された塩基配列であることを特徴とする。この上で、本実施形態の標的配列は、１４〜２８塩基のｃｒＲＮＡのスペーサー配列として設計された場合、抗菌ファージにパッケージングされる際のＤＮＡ塩基配列において１０塩基目の標的がＴであることが好適である。具体的には、この標的配列は、例えば、配列番号７、配列番号１７、配列番号２２、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３６であってもよい。
ここで、下記の実施例で示すように、本実施形態のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａを含む抗菌ファージにおいては、単純に特定遺伝子内からランダムな位置の箇所をｃｒＲＮＡの配列として選んでも、殺菌効果に差があった。このため、本発明者らが鋭意実験を行ったところ、特定遺伝子内のＤＮＡ塩基配列のうち、５’側から３’側において１０塩基目をＴ（ｔｈｙｍｉｎｅ）とするような配列を、１４〜２８塩基のｃｒＲＮＡのスペーサー配列とすることで、Ｃａｓ１３ａのＲＮＡを非特異的に分解して菌を細胞死に至らしめる効率を最適化可能であることを見いだした。このような配列の例として、下記の配列表で示す配列番号７、配列番号１７、配列番号２２、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３６の各塩基配列を示す。さらに、具体例としては、抗菌ファージ内に搭載されるｃｒＤＮＡの塩基配列は、下記の実施例で示すように、相補的配列として設計されてもよい。また、ｃｒＤＮＡが、転写されたＲＮＡを標的とする場合、当該ＲＮＡ内の標的はＵ（Ｕｒａｓｉｌ）となる。
さらに、後述する第二実施形態で示すように、これら以外の配列も抗菌ファージの標的配列として許容され得る。
【００２１】
加えて、標的配列は複数であり、複数の特定遺伝子を、それぞれ標的として認識するように構成してもよい。すなわち、本実施形態の抗菌ファージは、一つのファージ内に、複数の標的配列を含ませることが可能である。この際、ＣＲＩＳＰＲのスペーサー配列は１〜十数個程度を含ませることが可能であるので、ファージのカプシド内に含ませることが可能な範囲で、複数の標的配列を含ませてもよい。この複数の標的配列は、ｃｒＲＮＡの配列内に連続して又は複数の部位として並べても、ファージ内に標的配列の異なるｃｒＲＮＡ自体を複数含むように構成してもよい。これにより、一つの抗菌ファージを複数の耐性菌に適用可能となる。さらに、複数の耐性遺伝子を持つような多剤耐性菌の場合、ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ１３ａによる抗菌効率の向上させることが可能となる。
【００２２】
また、本発明の第一実施形態に係る抗菌ファージは、これを含む治療用組成物の用途にも用いることが可能である。
すなわち、本実施形態の抗菌ファージを治療用に投与させることで、特定遺伝型の細菌を選択的に殺菌する抗菌治療法に用いることが可能である。具体的には、標的ＲＮＡを特異的に認識するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａ  ＤＮＡを合成して抗菌ファージ内にパッケージング（カプシド内に含ませる）させ、標的（特定の遺伝子を持つ）細菌を選択的に殺菌する抗菌治療法を実現可能である。これにより、薬剤耐性菌の感染症を含む、抗菌薬で治療が難しい感染症の抗菌治療を可能にすることができる。
【００２３】
この治療用組成物製造方法は、特定遺伝子を標的として認識する標的配列を備えたＣＲＩＳＰＲ、Ｃａｓ１３ａ、及びパッケージング配列を含むファージミドと、ヘルパーファージとをファージ合成細菌にトランスフェクト及び／又は感染させ、溶菌及び／又は菌体外に放出させ、コンストラクトされた抗菌ファージを取得することを特徴とする。
具体的には、本実施形態の治療用組成物は、標的ＲＮＡを特異的に認識するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａ  ＤＮＡを合成して抗菌ファージ内に搭載（パッケージング、カプシド内に含ませる）させたものと、従来の抗菌ファージを用いた抗菌治療法（抗菌ファージセラピー）と同様の各種配合物を用いることが可能である。このファージ合成細菌としては、例えば、大腸菌等の一般的な細菌を用いることが可能である。
【００２４】
また、本発明の第一実施形態に係る治療用組成物は、任意の製剤上許容しうる担体（例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等が挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０等を挙げることができるが、それらに限定されない）と共に投与することが可能である。また、適切な賦形剤等を更に含んでもよい。
【００２５】
また、本実施形態の治療用組成物は、製剤上許容しうる担体を調製するために、適切な薬学的に許容可能なキャリアを含み得る。このキャリアとしては、シリコーン、コラーゲン、ゼラチン等の生体親和性材料を含んでもよい。あるいはまた、種々の乳濁液であってもよい。さらには、例えば、希釈剤、香料、防腐剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、乳化剤、可塑剤などから選択される１又は２以上の製剤用添加物を含有させてもよい。
【００２６】
本発明の第一実施形態に係る治療用組成物は、経口投与のための投与に適した投与形態において、当該分野で周知の製剤上許容しうる担体を用いて処方され得る。
本発明に係る医薬組成物の投与経路は、特に限定されず、経口的な投与又は非経口的に投与を行うことが可能である。非経口投与としては、例えば、静脈内、動脈内、皮下、真皮内、筋肉内、腹腔内の投与、又は、細菌叢や感染部位への直接投与が可能である。この投与方法は、従来のファージセラピーと同様に行ってもよい。
【００２７】
また、本発明の第一実施形態に係る治療用組成物を上述の治療に用いるためには、投与間隔および投与量は、疾患の状況、さらに対象の状態などの種々の条件に応じて適宜選択および変更することが可能である。
本発明の第一実施形態に係る治療用組成物の１回の投与量および投与回数は、投与の目的により、さらに患者の年齢および体重、症状および疾患の重篤度などの種々の条件に応じて適宜選択および変更することが可能である。
投与回数及び期間は、１回のみでもよいし、１日１回〜数回、数週間程度投与し、疾患の状態をモニターし、その状態により再度又は繰り返し投与を行ってもよい。
【００２８】
本発明の組成物は、他の組成物等と併用することも可能である。また、他の組成物と同時に本発明の組成物を投与してもよく、また間隔を空けて投与してもよいが、その投与順序は特に問わない。
また、本発明の第一実施形態において、疾患が改善又は軽減される期間は特に限定されないが、一時的な改善又は軽減であってもよいし、一定期間の改善又は軽減であってもよい。
【００２９】
また、本発明の第一実施形態の治療用組成物は、生物、生物の体内の一部分、又は生物より摘出又は排出されたその一部分について、治療用の対象とすることができる。
この生物は特に限定されず、例えば、動物、植物、及び菌類等であってもよい。この動物は、例えば、ヒト、家畜動物種、野生動物等を含む。
このため、本発明の第一実施形態に係る治療用組成物は、動物の治療を行う動物治療にも用いることが可能である。すなわち、本実施形態の抗菌ファージは、ヒト以外の各種動物を対象とした動物治療方法にも用いることが可能である。
【００３０】
具体的には、本実施形態の動物治療方法は、特定遺伝子を標的として認識する標的配列を備えたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａを含む抗菌ファージにより、ヒト以外の動物における特定遺伝子を備えた細菌による感染症を治療することが可能である。
この動物も、特に限定されるものではなく、脊椎動物及び無脊椎動物を広く含む。脊椎動物としては、魚類、両生類、は虫類、鳥類、及び哺乳類を含む。具体的には、例えば、哺乳類としては、げっ歯類、例えば、マウス、ラット、フェレット、ハムスター、モルモット、又はウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、又は非ヒューマンのトランスジェニック霊長類であってもよい。また、野生動物としては、哺乳類の他にも、魚類、家禽を含む鳥類、爬虫類等を含む。また、エビや昆虫等を含む甲殻類、その他のイカ等の無脊椎動物等も広く含む。
すなわち、本発明の第一実施形態に係る治療用組成物は、ヒトの治療の他に、動物の治療、家畜の発育増進等の方法にも用いることができる。
【００３１】
また、本発明の第一実施形態に係る細菌除去方法は、特定遺伝子を標的として認識する標的配列を備えたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａを含む抗菌ファージにより、特定遺伝子を備えた細菌を除去することを特徴とする。このため、本実施形態の抗菌ファージを含む組成物を、殺菌剤（増殖抑制剤）の用途に用いることが可能である。この殺菌剤も、上述のように適切な担体、溶液等に含ませておくことが可能である。また、細菌のペプチドグリカン、バイオフィルム等を除去するような補助剤を付加することも可能である。この殺菌剤は、例えば、手洗い溶液、うがい薬、マスクやナプキン、空気清浄機のフィルター等、各種の抗菌用品に含ませて提供されてもよい。
この本実施形態の殺菌剤を、塗布、散布等することで、病巣、細菌叢、及び環境中から特定遺伝型の細菌の除去及び増殖抑制を行うことが可能である。すなわち、ヒト、動物、及び／又は環境中の細菌叢に存在する、特定遺伝子を備えた細菌を減少させることができる。
【００３２】
また、本発明の第一実施形態に係る細菌除去方法においては、食品に存在する細菌を除去することも可能である。これは、本実施形態の抗菌ファージは、ヒトには感染しないためである。すなわち、本実施形態の抗菌ファージにより、食品内の特定遺伝子をもつ特定遺伝型の細菌を選択的に除去することが可能である。また、このように特定遺伝型の細菌を除去した食品を提供することも可能となる。これにより、例えば、毒素を産生する食中毒菌を確実に除去した安全な食品を提供することが可能となる。ここで、本実施形態の抗菌ファージは、各種野菜、食肉、魚介類、加工食品、乳製品等を含む栽培、養殖、採取等された任意の食品に含ませて用いることが可能である。
【００３３】
また、本発明の第一実施形態に係る細菌判別方法は、特定遺伝子を標的として認識する標的配列を備えたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａを含む抗菌ファージを細菌に感染させ、細菌が特定遺伝子を備えるか否かを判別及び／又は検査することを特徴とする。具体的には、特定遺伝子を標的にＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａを設計して本実施形態の抗菌ファージに搭載させ、特定遺伝子を有する細菌を選択的に殺菌することで、特定遺伝子をもつ特定遺伝型の細菌を簡便に検出することが可能となる。すなわち、本実施形態の抗菌ファージは、判別や検査の用途にも用いることが可能である。
具体的には、例えば、対象となる細菌と本実施形態の抗菌ファージとを同時に付加して細菌数の増加（発育）が抑制されるか、又は、プレート上で培養して、本実施形態の抗菌ファージを塗布し、溶菌を確認することで、当該細菌に当該特定遺伝子が有るか否かを容易に判別（検査）可能となる。この細菌判別方法で判別可能な特定遺伝子は、上述の細菌除去方法で対象とする特定遺伝子であってもよい。
この細菌判別方法で判別及び／又は検査する細菌は、上述のように、ヒト、動物、食品内、若しくは環境中の細菌叢に存在する細菌、及び／又は遺伝子組み換え細菌であってもよい。また、本実施形態の抗菌ファージを含む細菌判別キットを提供することも可能である。
【００３４】
以上のように構成することで、以下のような効果を得ることができる。
従来から、抗菌薬が細菌感染症の治療において最も重要な役割を果たしてきた。しかし、抗菌薬の効かない薬剤耐性菌の出現とその急速な蔓延により、既存の抗菌薬が無力化されつつある。このため、細菌感染症が再び人類の健康を脅かす世界的問題となってきている。具体的には、抗菌薬の開発を遥かに上回るスピードで耐性菌が現れることや、新規抗菌薬の開発が行き詰まっているため、耐性菌の問題が解決できなくなりつつあった。
これに対して、本発明の第一実施形態に係る抗菌ファージは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａを抗菌ファージに搭載することで、抗菌薬を用いずに、耐性菌等に対応可能となる。すなわち、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａの標的となる特定遺伝子は任意に決定可能であるため、どんな特定遺伝型の細菌も殺菌対象にできる。
また、本実施形態の抗菌ファージでは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａが転写されたＲＮＡを標的とするため、標的となる特定遺伝子の所在が染色体性かプラスミド性かに関わらず、効果的に殺菌することが可能である。
また、本実施形態の抗菌ファージは、ＲＮＡを標的とするため、選択圧がかかりにくく、原理的に耐性菌が生じにくい。さらに、特定遺伝型が異なるため殺菌されない細菌についても、この特定遺伝型の特定遺伝子に対応した抗菌ファージを設計して投与すればよい。このため、特定遺伝子を適切に選択して抗菌ファージを作製することで、確実に特定遺伝型の細菌を殺菌することが可能となる。すなわち、本発明の第一実施形態に係る抗菌ファージは、新たな耐性菌が生じた場合、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａの配列認識部分のみを再設計して対応できる進化適応型医薬品となりうる。また、遺伝子工学的技術を用いて搭載する抗菌ファージ自体を改変することも可能である。
【００３５】
また、抗菌薬を用いる抗菌治療法では、抗菌薬の抗菌域、すなわち殺菌効果を発揮する対象細菌の範囲が広く、選択性が低いという問題があった。このため、対象とした細菌以外の細菌にも抗菌作用があり、抗菌薬に耐性ある細菌を選択し、薬剤耐性の誘発等を招いていた。また、幅広い細菌を殺菌することで、宿主の正常細菌叢のバランスにも影響を及ぼしてしまっていた。
これに対して、本発明の第一実施形態に係る抗菌ファージにおいて、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａは、２０塩基程度の標的配列を認識でき、この認識には、ほぼ１００％の配列相同性が必要となる。この選択性により、対象細菌のみを殺菌する選択性の高い抗菌治療を可能にする。結果として、有用な常在菌等を殺菌することがなくなり、宿主の正常細菌叢のバランスを保つことが可能となる。加えて、感染する菌種が限定する抗菌ファージを介してＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａを感染細菌細胞内に導入することで、対象細菌の選択性を更に高めることができる。すなわち、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａが標的ＲＮＡ配列を認識して活性化するため、細菌叢から特定遺伝子型の細菌のみを選択的に除去できる「追尾ミサイル型」抗菌治療を可能にする。また、ヒト、動物、環境内の全ての細菌種に応用できる抗菌治療法の確立が可能となる。
【００３６】
また、本実施形態においては、自己増殖しない合成ファージである抗菌ファージを用いるため、抗菌ファージ自体の変異による副作用を抑えられる。また、抗菌ファージが自己増殖しないことで、投与された生物や環境中の細菌にプロファージが保持される可能性も極めて低くなる。さらに、原理的に、耐性菌が発生しにくい。これにより、安全性を高められる。さらには、たとえ標的遺伝子に変異が入ったとしてもその都度標的ＲＮＡを認識するプローブ（ｃｒＲＮＡ配列）を変更することで対応できる。加えて、自己増殖しない抗菌ファージであるので、投与用量を的確に見積もることが可能となる。
【００３７】
また、本発明の第一実施形態に係る抗菌ファージは、生体内の特定細胞において遺伝子発現の制御が可能となり、細胞の生理機能を明らかにすることに役立つだけでなく、ひいては病態の制御につながる可能性がある。このため、新たな治療法の開発につながる可能性がある。
【００３８】
また、本発明の第一実施形態に係る抗菌ファージは、特定遺伝子を持つ細菌しか殺菌せず、加えて、自然物由来であるので安全で環境負荷が低い。このため、安全で環境負荷が低い殺菌剤や食品を提供することも可能となる。
【００３９】
また、本発明の第一実施形態に係る抗菌ファージは、治療以外に、特定の遺伝子を高感度で検出（判別）する細菌判別方法にも適用可能である。これにより、例えば、臨床で分離された大腸菌等の細菌に、特定の耐性遺伝子が存在するか否かを確実に判別可能である。この際に、細菌が増殖しない又は溶菌することを目視するだけなので手間がかからず、又、核酸の増幅を必要としないことから、ＰＣＲ等の機器を用いる必要もないため安価に判別可能となる。
【００４０】
＜第二実施形態＞
次に、本発明の第二実施形態として、特定遺伝子として毒素遺伝子を認識する標的配列（標的遺伝子認識配列）を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓｌ３ａを設計し、これをコードするＤＮＡをファージ内に含ませる（搭載させる）ことで、人工的に設計、製造された合成ファージである抗菌ファージを作製する例について説明する。
【００４１】
具体的な例として、この特定遺伝子が毒素遺伝子の場合、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、腸炎ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、Ａ群レンサ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、肺炎レンサ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からなる群の一種又は任意の組み合わせを含む細菌のゲノム及び／又はプラスミドに含まれてもよい。
【００４２】
この場合、これらの毒素遺伝子は、エンテロトキシン、ボツリヌス神経毒素、コレラ毒素、耐熱性エンテロトキシン、易熱性エンテロトキシン、耐熱性溶血毒、志賀毒素、破傷風毒素、α毒素、ロイコシジン、β毒素、毒素性ショック症候群毒素、ストレプトリジンＯ、発赤毒、α溶血毒素、細胞毒性壊死性因子Ｉ、Ａ毒素、Ｂ毒素、百日咳毒素、ジフテリア毒素、アドヘジン、分泌（透過）装置、溶解素、及びスーパー抗原を産生する遺伝子からなる群の一種又は任意の組み合わせを含むことを特徴とする。
これらの毒素産生菌（菌の種類）、毒素遺伝子（標的ＲＮＡをコードする遺伝子名）、及び本実施形態で用いる抗菌ファージ用のファージ（バクテリオファージ）の種類について、下記の表２にまとめて示す：
【００４３】
【表２】
0006923862.tif 000003
【００４４】
この表に示すように、これらの毒素遺伝子は、それぞれ、遺伝的な変異（バリエーション）があってもよい。
加えて、これらの毒素遺伝子は、他の種類の細菌に水平伝播されてもよく、細菌としての分類自体が異なってもよい。
【００４５】
また、本実施形態の特定遺伝子は、核酸取得によって毒素を生じさせるような遺伝子であってもよい。
具体的には、毒素産生菌は、外来のＤＮＡ又はＲＮＡ（核酸）取得によって生じることがあるため、この核酸変異を本実施形態の抗菌ファージが標的とする特定遺伝子としてもよい。この場合、本実施形態の抗菌ファージは、この変異に対応して標的配列を改変することで、毒素を生じた核酸変異を「特定遺伝子」として含む菌に対抗することが可能である。
この毒素遺伝子を特定遺伝子とした抗菌ファージによる治療用組成物、治療用組成物、殺菌剤、食品、細菌判別キット、治療用組成物製造方法、細菌除去方法、細菌判別方法、及び動物治療方法は、上述の第一実施形態と同様に実現し、同様の効果を得ることが可能である。
たとえば、本実施形態の動物治療方法は、毒素遺伝子を特定遺伝子の標的として認識する標的配列を備えたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａを含む抗菌ファージにより、ヒト以外の動物における特定遺伝子を備えた細菌による感染症を治療することが可能である。
【００４６】
これに加え、本実施形態の抗菌ファージは、抗生物質の耐性遺伝子の配列を含んでいてもよい。この上で、抗生物質の耐性遺伝子を含む培地を用いて、細菌が特定遺伝子を備えるか否かを判別及び／又は検査することも可能である。
具体的には、後述の実施例２で示すように、抗菌ファージに抗生物質の耐性遺伝子を含有させ、この抗生物質を含有する及び／又はしないプレート上で培養を行うことで、細菌が特定遺伝子を備えるか否かを判別及び／又は検査することが可能である。抗菌ファージに抗生物質の耐性遺伝子を含有させることで、抗生物質を含むプレートで培養すると、抗菌ファージに感染し、特定遺伝子を含まない細菌のみが増殖する。一方、抗菌ファージに感染しなかった細菌は抗生物質のため増殖できず、及び抗菌ファージに感染しても特定電子を含む細菌は溶菌する。ここで、特定遺伝子として検出する薬剤耐性遺伝子、毒素遺伝子、又は病原遺伝子は、抗菌ファージに含ませる抗生物質の耐性遺伝子とは別の遺伝子をターゲットとする。
このように構成すると、抗生物質を含まない培地で培養するのと比較して、百倍程度以上、抗菌ファージによる特定遺伝子の検出感度を上げることが可能となる。
【００４７】
なお、上述の第一実施形態及び第二実施形態においては、特定遺伝子として薬剤耐性遺伝子又は毒素遺伝子を標的とする例について説明した。また、細菌についても、この薬剤耐性遺伝子をもつ細菌に適用する例について説明した。
しかしながら、特定遺伝子は、任意の遺伝子であり、特定遺伝子を含む任意の細菌を抗菌対象とすることが可能である。
すなわち、上述の特定遺伝型として区別可能とする任意の遺伝子を、本実施形態の特定遺伝子として標的とすることが可能である。加えて、この特定遺伝子を含む細菌であれば、この細菌を特定せずに標的とすることも可能である。
具体的には、一例として、同じベロ毒素の特定遺伝子をもつ赤痢菌（志賀赤痢菌、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａ）、腸管出血性大腸菌（ｅｎｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  Ｅ．  ｃｏｌｉ、ＥＨＥＣ）のいずれも抗菌対象とすることが可能である。このような場合、複数の菌を同時に対象とするようなファージとすることで、特定遺伝型をもつ細菌をすべて抗菌可能とすることができる。
さらに、特定遺伝子は、薬剤耐性遺伝子又は毒素遺伝子に付随して発現したり、発現制御されたり、関連したりするような遺伝子を含んでいてもよい。これに加え、特定遺伝子は、その他の病原性に関係がある病原遺伝子を含んでいてもよい。
【００４８】
また、本発明の第一実施形態及び第二実施形態に係るＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａの標的ＲＮＡを認識するプローブ（ｃｒＲＮＡ配列）は、塩基配列の一塩基の違いまで識別できる。このため、がん治療や遺伝性疾患の治療にも応用できる。この場合、必ずしも細菌用のＣａｓ１３ａではなく、真正細菌以外の細胞を非特異的ＲＮＡ分解作用によりアポトーシス等を誘導して細胞死に至らしめるような、同様の酵素を用いることも可能である。
【００４９】
さらに、本実施形態の特定遺伝子は、がん治療や遺伝性疾患の標的となる遺伝子変異の配列、一塩基置換、リピート等の広義の「遺伝子」であってもよい。この場合、細菌自体を、薬剤の運び手（キャリアー）として治療用に投与することも可能である。すなわち、この特定遺伝子の細胞に対応した薬剤を、対象の細菌の細胞質等に含ませておき、溶菌により組織や標的細胞周辺に散布するといった用途にも適用可能である。この場合、プロファージが含まれる細菌自体を提供することも可能である。また、特定の免疫反応により活性化されるようなプロファージを含んでもよい。
【００５０】
また、上述の第一実施形態及び第二実施形態においては、抗菌ファージとして一般的なバクテリオファージを用いる例について説明した。しかしながら、「抗菌ファージ」として、一般的なバクテリオファージとは異なる、細菌に感染するウィルス（Virus）、ＲＮＡウィルス、ファージミド等を用いることも可能である。また、抗菌ファージは、プロファージの状態で細菌のゲノムやプラスミドにインテグレートされた状態で提供されてもよい。また、ファージミドは、例えば、本実施形態の細菌判別方法では、エレクトロポレーション及びナノ粒子を用いたような任意の手法を介して細胞に導入することが可能である。
【００５１】
また、本実施形態の細菌判別方法では、必ずしも細菌の増殖抑制や完全な溶菌を必要としない検出を行ってもよい。この場合、例えば、ＣＡＳ１３ａが結合して非特異的なＲＮＡ分解活性が生じ、各種蛍光プローブと結合させたＲＮＡが切断されることで、蛍光等の各種レポーターを誘導して、特定遺伝子の有無やコピー数や発現量等を検出するようにしてもよい。この場合でも、本実施形態の細菌判別方法により検出された場合、検出された当該細菌を抗菌対象とすることが可能である。すなわち、本実施形態の抗菌ファージを、抗菌用途に用いることが可能である。
【００５２】
また、本発明の第一実施形態及び第二実施形態に係る抗菌ファージは、他の組成物等と併用することも可能である。さらに、複数の種類の抗菌ファージを含む「カクテル」として提供することも可能である。また、本発明の組成物を、他の組成物と同時に投与、散布、塗布等をしてもよい。
【実施例１】
【００５３】
以下で、本発明の第一実施形態に係る抗菌ファージによる殺菌（細菌除去）及び細菌判別方法について、具体的な実験を基にして、実施例としてさらに具体的に説明する。しかしながら、この実施例は一例にすぎず、これに限定されるものではない。【００５４】
〔ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａの特定遺伝子を有する細菌の殺菌効果〕
（テトラサイクリン誘導性ｂｌａIMP-1発現ベクターの作成）
テトラサイクリン依存的発現制御領域のシークエンスを、ｐＣ００８（Ｄｒ．Ｆ．Ｚｈａｎｇより入手）からＴｅｔＲｅｇ  ＳａｌＩ−ｆ，ＡＴＡＴＧＴＣＧＡＣＧＣＡＴＧＣＴＴＡＡＧＡＣＣＣＡＣＴＴＴＣとＴｅｔＲｅｇ  ＢａｍＨＩ−ｒ，ＡＴＡＴＧＧＡＴＣＣＴＴＴＣＴＣＣＴＣＴＴＴＡＧＡＴＣＴＴＴＴＧのプライマーにて増幅し、ｐＳＰ７２ベクターのＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ  ｓｉｔｅにサブクローニングした（以下、「ｐＳＰ７２  ａＴｃ−ｉｎｄｕｂｉｂｌｅ  ｖｅｃｔｏｒ」と呼ぶ。）。その後、ｂｌａIMP-1（カルバペネム耐性遺伝子）の配列を、多剤耐性大腸球菌からＩＭＰ−１  ｃｌｏ  ＢａｍＨＩ−ｆ，ＡＴＡＴＧＧＡＴＣＣ  ＡＴＧＡＧＣＡＡＧＴＴＡＴＣＴＧＴＡＴＴＣとＩＭＰ−１  ｃｌｏ  ＥｃｏＲＩ−ｒ，ＡＴＡＴＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＴＴＧＣＴＴＧＧＴＴＴＴＧＡＴＧのプライマーを用いて増幅し、ｐＳＰ７２  ａＴｃ−ｉｎｄｕｂｉｂｌｅ  ｖｅｃｔｏｒのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩサイトにクローニングした（「ｐＳＰ７２  ａＴｃ−ｉｎｄｕｂｉｂｌｅ  ＩＭＰ−１  ｖｅｃｔｏｒ」、以下、「テトラサイクリン誘導性ｂｌａIMP-1発現ベクター」と呼ぶ。）。【００５５】
（ｂｌａIMP-1遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａ発現ベクターの作製）
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａ発現ベクターであるｐＣ００３（Ｄｒ．Ｆ．Ｚｈａｎｇ提供）を、ｐＣ００３  ＰＣＲ−ｒ，ＣＣＡＧＣＴＧＴＴＡＡＡＣＧＡＧＣＴＴＴＡＡＴＧＣＧＧＴＡＧＴＴＴＡＴＣ、ｐＣ００３  ＰＣＲ−ｆ，ＧＡＡＧＧＧＧＡＣＴＡＡＡＡＣＧＧＡＧＡＣＣＧＡＧＡＴＴＧＧＴＣＴＣＧで増幅し、レプトトリキア・シャヒイ（ＤＳＭ  １９７５７）のゲノムＤＮＡからＣａｓ１３ａ、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２の領域をＬｓＣａｓ１３ａ  ｃｌｏ−ｆ，ＴＣＧＴＴＴＡＡＣＡＧＣＴＧＧＧＡＡＡＡＴＧ、ＬｓＣａｓ１３ａ  ｃｌｏ−ｒ，ＧＴＴＴＴＡＧＴＣＣＣＣＴＴＣＧＡＴＡＴＴＧＧで増幅し、二つのＤＮＡ断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔにて結合した（以下、これを「ｐＫＬＣ５  ｖｅｃｔｏｒ」と呼ぶ。）ｐＫＬＣ５  ｖｅｃｔｏｒを、ＢｓａＩ制限酵素で切断し、ｂｌａIMP-1を標的とするｃｒＲＮＡ配列を挿入した。標的配列は、配列表の配列番号１７に当たるＡＴＧＴＴＣＡＴＡＣＴＴＣＧＴＴＴＧＡＡＧＡＡＧＴＴＡＡ（相補配列）で、ｂｌａIMP-1の翻訳開始後１０４〜１３１塩基の領域である。二本のオリゴＤＮＡ（ｔａｔｃｃＡＴＧＴＴＣＡＴＡＣＴＴＣＧＴＴＴＧＡＡＧＡＡＧＴＴＡＡ，ａａａｃＴＴＡＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＡＣＧＡＡＧＴＡＴＧＡＡＣＡＴｇ）を合成、アニールし、ｐＫＬＣ５のＢｓａＩサイトに挿入した（「ｐＫＬＣ５  ＢｓａＩ  ＩＭＰ−１＿１０４  ｖｅｃｔｏｒ」、以下、「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａ発現ベクター」と呼ぶ。）。【００５６】
（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａプラスミドによる、特定遺伝子を有する細菌に対する殺菌効果）
図２により、上述の大腸菌に本実施例のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａの各プラスミドをトランスフェクトして形質転換させて培養した結果について説明する。大腸菌ＤＨ５α株を、テトラサイクリン誘導性ｂｌａIMP-1発現ベクター（アンピシリン耐性、ＣｏｌＥ１  ｏｒｉ）で形質転換した。この大腸菌を、さらにｂｌａIMP-1遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａ発現ベクター（クロラムフェニコール耐性、ｐ１５Ａ  ｏｒｉ）で形質転換した。得られた大腸菌をＬＢ液体培地（アンピシリン、クロファムフェニコール）で３７℃、１２時間培養後、ＯＤ６５０をＬＢ液体培地（アンピシリン、クロファムフェニコール）で０．０２に合わせた。１時間３７℃で震蘯培養後、氷テトラサイクリンを最終濃度１００ｎｇ／ｍｌになるように加えてｂｌａIMP-1遺伝子の発現を誘導した。【００５７】
図２（ａ）に、実験を行った大腸菌の系列について示す。系列１、２、４はコントロールの実験例、系列３は全てを導入した実験例を示す。実験項目の「ｂｌａIMP-1配列」では、「−」が「ｐＳＰ７２  ａＴｃ−ｉｎｄｕｂｉｂｌｅ  ｖｅｃｔｏｒ」のみを導入された大腸菌であり、「＋」がこれに加えテトラサイクリン誘導性ｂｌａIMP-1発現ベクターも導入された大腸菌であることを示す。「ＣＲＩＳＰＲが認識するｂｌａIMP-1配列」は、「−」がｐＫＬＣ５のみ導入された大腸菌であることを示し、「＋」が「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａ発現ベクター」を導入された大腸菌であることを示す。
図２（ｂ）は、経時的にＯＤ６５０を測定した結果を示すグラフである。横軸は、氷テトラサイクリンを加えてからの増殖時間（ｈ）、縦軸はＯＤ（６５０ｎｍ）を示す。
図２（ｃ）は、４時間後（４ｈ）、８時間後（８ｈ）に試験管内で培養した大腸菌を撮影した写真を示す。
これらの結果のように、ｂｌａIMP-1遺伝子を標的として認識するように設計したＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａは、標的とする特定遺伝子であるｂｌａIMP-1を有する大腸菌に対して増殖を抑制した。すなわち、設計したＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａが、特定遺伝子を有する大腸菌に対して、配列特異的に殺菌効果があることが確認できた。【００５８】
〔抗菌ファージによる、特定遺伝子を有する細菌に対する殺菌効果〕
次に、設計したＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａをファージへ搭載して、特定遺伝子を有する大腸菌に対する殺菌効果を検証した。
図３は、ｂｌａIMP-1遺伝子を標的としてＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａを搭載した合成ファージである抗菌ファージの合成の概念図と、これを感染させた際の反応の概念図とを示す。具体的には、ファージ合成菌に、下記で説明するファージミドとヘルパーファージを導入して、パッケージングさせて、標的配列を備えたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａを含む抗菌ファージ（以下、「ｂｌａIMP-1標的型合成ファージ」という。）を作成する。このｂｌａIMP-1標的型の合成ファージは、ｂｌａIMP-1を発現している大腸菌を選択的に殺菌する。一方、ｂｌａIMP-1標的型の合成ファージは、ｂｌａIMP-1を発現していない大腸菌は殺菌しない。【００５９】
（ｂｌａIMP-1を標的とするＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａ発現ベクターの作製）
上述の発現ベクターｐＫＬＣ５  ＢｓａＩ  ＩＭＰ−１＿１０４を下記のように改良した。ベクター上に存在するＣａｓ１／２はＣａｓ１３ａによる殺菌活性に関与しないため、削除した。この削除は、Ｃａｓ１Ｃａｓ２  ｄｅｌ  ＳａｃＩ−ｆ，ＡＴＡＴＧＡＧＣＴＣＡＴＧＧＧＡＧＡＡＡＡＡＡＴＴＴＣＡＣＡＡＡＡＣとＣａｓ１Ｃａｓ２  ｄｅｌ  ＳａｃＩ−ｒ，ＡＴＡＴＧＡＧＣＴＣＴＣＡＴＴＣＴＴＡＴＡＡＣＧＴＡＴＣＡＴＴＣＧでベクターのＰＣＲを行い、ＳａｌＩ制限酵素で切断後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ  ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ製）にてＬｉｇａｔｉｏｎすることにより行った。さらにこのベクターにｆ１  ｏｒｉとカナマイシン耐性を付与する作業をした。具体的には本ベクターをｔｅｍｐｌａｔｅとしてＩｎＦ１３  ＰＣＲ  ＳａｌＩ−ｆ，ｔｃｔｔｃａｃｃｃｔｇｔｃｇａｔｇｇｇａａａａｔｇｔｇｇａａｔｔｔｇと、ＩｎＦ１３  ＰＣＲ  ＳｍａＩ−ｒ，ｃａｇｇａｔｃｔｔｃｔｇｃｃｃａａｔｔａｇｇｃｔｃｔａｇｔｔａｇｃｃｔのプライマーにてＰＣＲを行い、また、ｐＲＣ３１９（Ｄｒ．Ｔｉｍｏｔｈｙ  Ｌｕから入手）のｆ１  ｏｒｉとカナマイシン耐性をＩｎＦ１３  ｐＲＣ３１９−ｆ，ｇｇｇｃａｇａａｇａｔｃｃｔｇｃａｇｇとＩｎＦ１３  ｐＲＣ３１９−ｒ，ｔｃｇａｃａｇｇｇｔｇａａｇａｃｇａａａｇで増幅し、二つのＤＮＡ断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔにて結合した（以下、これを「ｐＫＬＣ２１  ＢｓａＩ  ＩＭＰ−１＿１０４  ｖｅｃｔｏｒ」と呼ぶ。）。
また、コントロールとして、発現ベクターｐＫＬＣ５を同様に改良したコントロールベクターも作製した。【００６０】
（Ｍ１３ヘルパーファージ  プラスミドの作製）
ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７（ＮＥＢ  ｂｉｏｌａｂ製）を大腸菌ＮＥＢ５α  Ｆ'ｌq株（ＮＥＢ  ｂｉｏｌａｂ製）に感染させ、プラスミドを回収した。セルフパッケージングを防ぐため、Ｍ１３ＫＯ７のｆ１  ｏｒｉｇｉｎ配列を削除した。Ｍ１３ＫＯ７  ｐｌａｓｍｉｄをテンプレートとして、Ｍ１３ＫＯ７  ＰＣＲ  Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ−ｆ，ｃｃｔａｔｔｇｇｔｔａａａａａａｔｇａｇｃｔｇとＭ１３ＫＯ７  ＰＣＲ  Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ−ｒ，ａｃｔａｔｇｇｔｔｇｃｔｔｔｇａｃｇａｇのプライマーを用いてＰＣＲを行った。また、ｐＢＡＤ３３ベクターのｐ１５Ａ  ｏｒｉとクロラムフェニコール耐性遺伝子をｐＢＡＤ３３  ＰＣＲ  Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ−ｆ，ｃａａａｇｃａａｃｃａｔａｇｔｇｔａｇｃａｃｃａｇｇｃｇｔｔｔａａｇｇとｐＢＡＤ３３  ＰＣＲ  Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ−ｒ，  ｔｔｔｔｔａａｃｃａａｔａｇｇｃａｔｃａｃｃｇａｔｇｇｇｇａａｇａｔｃにて増幅し、二つの増幅サンプルをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ製）にて結合した（以下、「ｐＫＬＣ２５  ｖｅｃｔｏｒ」と呼ぶ。）。【００６１】
（ｂｌａIMP-1発現大腸菌（抗菌ファージの標的となる大腸菌）の作製）
ｐＢＡＤ３３ベクターの余分な配列（ｆ１  ｏｒｉ）を削除するため、ｐＢＡＤ３３ベクターを二つのプライマー、ｐＢＡＤ３３  ＰＣＲ  ＸｈｏＩ−ｆ，ｔｃａＣＴＣＧＡＧｃｇａａｔｔｔｇｃｔｔｔｃｇａａｔｔｔｃとｐＢＡＤ３３  ＰＣＲ  ＸｈｏＩ−ｒ，ｔｃａＣＴＣＧＡＧｃａａａａｇａｇｔｔｔｇｔａｇａａａｃｇｃにて増幅し、制限酵素ＸｈｏＩで切断後にＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ  ｖｅｒ．２にて結合した（以下、「ｐＫＬＣ２３  ｖｅｃｔｏｒ」と呼ぶ。）。ｐＫＬＣ２３  ＰＣＲ  Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ−ｆ２，ＧＡＡＴＴＣｇａｔｃｃｔｃｔａｇａｇｔｃとｐＫＬＣ２３  ＰＣＲ  Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ−ｒ２，ｔｇｃｔｔｃｇｔｃｃａｔｔｔｇａｃａｇの二つのプライマーでｐＫＬＣ２３を増幅した。また、ｎａｔｉｖｅのｂｌａIMP-1ｐｒｏｍｏｔｅｒ配列（人工合成、ｇｅｎｅｗｉｚ製、ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＡＢ７３３６４２．１、７１６ｂｐ〜１１６８ｂｐ）の配列からＩｎｔｌ１  ｐｒｏ  Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ−ｆ，ｃａａａｔｇｇａｃｇａａｇｃａＴＧＡＣＧＣＡＣＡＣＣＧＴＧＧＡＡＡＣとＩｎｔｌ１  ｐｒｏ  Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ−ｒ，ｔａｇａｇｇａｔｃＧＡＡＴＴＣＧＡＧＡＡＴＧＧＡＴＴＴＴＧＴＧＡＴＧＣにて増幅した。二つのＤＮＡ断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔにて結合した（ｐＫＬＣ２６  ｖｅｃｔｏｒ）。ｂｌａIMP-1配列を、ＩＭＰ−１  Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ−ｆ，ＡＣＡＡＡＡＴＣＣＡＴＴＣＴＣＡＴＧＡＧＣＡＡＧＴＴＡＴＣＴＧＴＡＴＴＣとＩＭＰ−１  Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ−ｒ，ｔａｇａｇｇａｔｃＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＴＴＧＣＴＴＧＧＴＴＴＴＧＡＴＧを用いてＰＣＲ増幅し、さらにｐＫＬＣ２６をｔｅｍｐｌａｔｅとしてｐＫＬＣ２６  Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ−ｆ，ＧＡＡＴＴＣｇａｔｃｃｔｃｔａｇａｇｔｃとｐＫＬＣ２６  Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ−ｒ，ＧＡＧＡＡＴＧＧＡＴＴＴＴＧＴＧＡＴＧＣのプライマーで増幅したものを作製した。二つのＤＮＡ断片はＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔにて結合した（以下、「ｐＫＬＣ２６  ＩＭＰ−１  ｖｅｃｔｏｒ」と呼ぶ。）。
このｐＫＬＣ２６  ＩＭＰ−１  ｖｅｃｔｏｒで形質転換した大腸菌ＮＥＢ５α  Ｆ'ｌq株（ｂｌａIMP-1発現大腸菌）、形質転換していないコントロール用の大腸菌ＮＥＢ５α  Ｆ'ｌq株（ｂｌａIMP-1非発現大腸菌）を用意した。【００６２】
（ｂｌａIMP-1標的型合成ファージの作製）
ｂｌａIMP-1を標的とするＣａｓ１３ａ搭載Ｍ１３ファージ（ファージミド）を作製した。具体的には、ヘルパーファージ合成用プラスミドｐＫＬＣ２５を大腸菌ＭＣ１０６１（ファージ合成細菌）にトランスフェクトし、クロラムフェニコールで選択した。この大腸菌にｂｌａIMP-1を標的とするＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａ発現ベクター（ｐＫＬＣ２１  ＢｓａＩ  ＩＭＰ−１＿１０４  ｖｅｃｔｏｒ）をトランスフェクトし、クロラムフェニコール＋カナマイシンで選択した。コロニーをＬＢ液体培地（クロラムフェニコール＋カナマイシン）で大腸菌が十分に増えるまで３７℃で震蘯培養した。８，０００×ｇで２０分遠心後、上清を０．２２μｍのフィルターに通した。同量のＰＥＧ  ｂｕｆｆｅｒ（５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０％ＰＥＧ６０００，１Ｍ  ＮａＣｌ（５８ｇ／Ｌ），５ｍＭ  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（１．２３ｇ／Ｌ））を加え、よく混ぜた後、４度で１時間放置した。４度１２，０００×ｇで１０分間遠心し、抗菌ファージのペレットを作り、上清を極力除いた後にＳＭ  Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５，０．１Ｍ  ＮａＣｌ，７ｍＭ  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ，０．０１％ゼラチン）に懸濁した。これを、ｂｌａIMP-1標的型合成ファージの溶液とした。
また、コントロールベクターを同様にトランスフェクトして、ｂｌａIMP-1非標的型合成ファージの溶液も作製した。【００６３】
（ＴＦＵ（Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ｃｏｌｏｎｉｅｓ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）の測定）
これらの抗菌ファージ（Ｃａｓ１３ａ搭載Ｍ１３ファージ）をＳＭ  Ｂｕｆｆｅｒで１０００倍希釈した。１ｍｌの大腸菌ＮＥＢ５α  Ｆ'ｌq株を予め液体培養しておき、ＯＤ６００が０．１程度になったところで、希釈した抗菌ファージを１０μｌ加え、３０分間３７℃で震蘯した。１００μｌの菌液をＬＢプレート、ＬＢプレート（クロラムフェニコール含有）、ＬＢプレート（カナマイシン含有）にプレーティングした。３７℃で一晩インキュベートし、ＬＢプレート（クロラムフェニコール含有）に大腸菌がないことを確認した後に、ＬＢプレート（カナマイシン含有）に生えているコロニー数をカウントし、ＴＦＵを計算した。【００６４】
（ファージミドインダクションアッセイ）
ＴＦＵを測定したファージミド（Ｃａｓ１３ａ搭載Ｍ１３ファージ）を１０倍ずつ段階希釈した。予め培養していた大腸菌ＮＥＢ５α  Ｆ'ｌq株がＯＤ６００＝０．５程度になったら、菌液１００μｌと３ｍＬの５０度に温めておいたＬＢ溶液（０．５％  ａｇａｒｏｓｅ）を混ぜてＬＢプレートに流し込んだ。ＬＢプレートが固まった後に、段階希釈した２μｌの抗菌ファージ溶液をプレートの上から加え、３７℃で培養した。【００６５】
図４は、それぞれ、ｂｌａIMP-1発現大腸菌又はｂｌａIMP-1非発現大腸菌に対して、ｂｌａIMP-1標的型合成ファージ又はｂｌａIMP-1非標的型合成ファージの溶液を、濃度を変えて加え、溶菌したかどうかの結果を示す。結果として、ｂｌａIMP-1標的型合成ファージは、ｂｌａIMP-1を発現している大腸菌を選択的に殺菌した。すなわち、配列特異的な抗菌活性が確認できた。また、ｂｌａIMP-1標的型合成ファージは、１０００倍希釈液でも殺菌効果が見られた。【００６６】
〔ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａ搭載ファージを用いた細菌判別〕
次に、特定遺伝子を標的にＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａを設計してＭ１３ファージに搭載させた抗菌ファージを作製し、特定遺伝子を有する細菌を選択的に殺菌することで、その細菌を簡便に検出する細菌判別方法について実験した。以下はその実験例である。本例では、耐性遺伝子を標的とした。【００６７】
（Ｃａｓ１３ａによる特定遺伝子保有大腸菌の発育抑制）
図５に、特定遺伝子保有大腸菌の発育抑制の例を示す。大腸菌株ＭＣ１０６１（Ｌｕｃｉｇｅｎ社製）に、ｉ）Ｃａｓ１３ａとｃｒＲＮＡを発現するプラスミドと、ｉｉ）ｃｒＲＮＡの特定遺伝子を発現するプラスミド（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｇｅｎｅの発現プラスミド）を同時に形質転換した。ｉ）のプラスミドはカナマイシン耐性遺伝子を、ｉｉ）のプラスミドはクロラムフェニコール耐性遺伝子をそれぞれ保有する。形質転換したＭＣ１０６１をＬＢプレート（カナマイシンとクロラムフェニコール含有）上で培養し、１２時間後にプレートの写真を撮影した。
ＩＭＰ−１を発現させた大腸菌にＣａｓ１３ａとＩＭＰ−１の３３９番目の塩基を認識するｃｒＲＮＡとを発現させると、大腸菌の発育が抑制された。【００６８】
予備実験より、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａの殺菌効果は、特定遺伝子の配列構造に多く左右されることが分かった。このため、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａの特定遺伝子配列の特殊性（規律性）について検討を行い、最適配列を抽出した。すなわち、本実施例において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａの特定遺伝子配列の最適化を行った。
本実施例では、非特許文献１のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓの論文を参考に、それぞれ特定遺伝子に対して３〜８配列を、標的部位の塩基配列として検討した。【００６９】
具体的には、１０種類の薬剤耐性遺伝子に対してＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａの標的配列を設計した。この１０種類の遺伝子は、ＩＭＰ−１（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：Ｓ７１９３２）、ＫＰＣ−２（ＡＹ０３４８４７）、ＮＤＭ−１（ＦＮ３９６８７６）、ＯＸＡ−４８（ＡＹ２３６０７３）、ＶＩＭ−２（ＡＦ１９１５６４）、ｍｃｒ−１（ＫＰ３４７１２７）、ｍｃｒ−２（ＬＴ５９８６５２）、ｍｃｒ−３（ＫＹ９２４９２８）、ｍｃｒ−４（ＭＦ５４３３５９）、ｍｃｒ−５（ＫＹ８０７９２１）を用いた。また、コントロールとしてＲＦＰ（Ｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＫＪ０２１０４２）の配列を用いた。
下記の表３に、配列表の配列番号（Ｎｏ．）、主に薬剤耐性遺伝子を対象とした配列の名称（Ｓｐａｃｅｒ  ｎａｍｅ）、及び選定した標的部位塩基配列（標的配列、Ｓｐａｃｅｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の関係を示す。【００７０】
【表３】
0006923862.tif 000004
【００７１】
これらの標的部位塩基配列に対するｃｒＲＮＡを設計してＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａの殺菌効果を評価した。
図６の写真は、表３の各標的配列に対してｃｒＲＮＡを設計し、それを用いてＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａの殺菌効果を評価した結果を示す。具体的には、大腸菌ＭＣ１０６１に、ｉ）Ｃａｓ１３ａと、各標的部位塩基配列に対応したｃｒＲＮＡを発現するプラスミドと、ｉｉ）ｃｒＲＮＡの特定遺伝子を発現するプラスミド（標的あり）を同時に形質転換した。ｉ）のプラスミドはカナマイシン耐性遺伝子を、ｉｉ）のプラスミドはクロラムフェニコール耐性遺伝子をそれぞれ保有する。図６は、形質転換したＭＣ１０６１を１２時間、３７℃で培養したＬＢプレート（カナマイシン及びクロラムフェニコール含有）に培養後、プレートの撮影した写真を示す。各配列番号について、標的配列に対するｃｒＤＮＡなし（標的なし）について、左から形質転換していない（薬剤耐性遺伝子なし）菌、形質転換した（薬剤耐性遺伝子あり）菌のプレートを示す。また、ｃｒＤＮＡあり（標的あり）についても、左から、薬剤耐性遺伝子なしの菌、薬剤耐性遺伝子ありの菌についてのプレートを示す。黒枠で囲った配列番号のプレートにおいて、標的あり、薬剤耐性遺伝子ありの大腸菌のプレートでは、コロニーが殆ど出現せず、Ｃａｓ１３ａによる強い殺菌活性（増殖抑制活性）が確認された。このように、標的配列により殺菌効果が異なっていた。また、強い殺菌活性（増殖抑制活性）が確認されたのは、配列番号７、配列番号１７、配列番号２２、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３６を標的配列としたｃｒＤＮＡを導入したものであった。【００７２】
図７は、図６において、黒枠で示されたプレートの配列番号の標的配列を、Ｗｅｂｌｏｇｏ（ＵＲＬ＜ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂｌｏｇｏ．ｂｅｒｋｅｌｅｙ．ｅｄｕ／＞）でアラインメントしたものである。１０番目のＴに代表されるように、偏りが見受けられた。すなわち、検討の結果、１４〜２８塩基のｃｒＲＮＡのスペーサー配列として設計された標的配列において、１０塩基目の標的がＴである場合、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａの殺菌活性が最適であった。【００７３】
図８は、図６で行った実験のプレート上のコロニーを目視でカウントした数を示すグラフである。ただし、小さなコロニーはカウントから除いている。ここでは、各薬剤耐性遺伝子のプレートについて、薬剤耐性遺伝子あり（耐性遺伝子保有）の大腸菌のプレート上のコロニー数を、薬剤耐性遺伝子なし（耐性遺伝子無し）の大腸菌のプレート上のコロニー数で割った相対コロニーカウントを示す。ｍｃｒ−３＿９９７以外のｃｒＲＮＡは全て標的となる薬剤耐性遺伝子を保有する大腸菌の発育を
阻害した。この上で、円で示した箇所は、上述の強い殺菌活性が認識されたものと、コントロールのＲＦＰ（ＲＦＰ＿１００）を示す。このように、耐性遺伝子保有菌を効率的に殺菌できることを示す。【００７４】
（抗菌ファージによる大腸菌のカルバペネム耐性遺伝子の判別）
図９は、Ｃａｓ１３ａ搭載の抗菌ファージにて、大腸菌のカルバペネム耐性遺伝子を識別した結果を示す。この実験においては、Ｍ１３ファージに、上述の強い殺菌活性が確認された標的配列に対するｃｒＲＮＡとＣａｓ１３ａとを搭載した。大腸菌ＮＥＢ５α  Ｆ'ｌq株の大腸菌にカルバペネム耐性遺伝子として、ＩＭＰ−１、ＯＸＡ−４８、ＶＩＭ−２、ＮＤＭ−１、ＫＰＣ−２のプラスミドを用いて、それぞれ形質転換した。作製した大腸菌に、上述のｂｌａIMP-1標的型合成ファージと同様にして、各標的配列のｃｒＲＮＡとＣａｓ１３ａを搭載して作製された抗菌ファージを感染させ、抗生物質を含んでいないＬＢ軟寒天培地上で培養し、大腸菌の増殖が阻害されることを確認した。すなわち、各耐性遺伝子を含む大腸菌に、各抗菌ファージを感染させた際に、発育が抑制された。これにより、大腸菌がカルバペネム耐性遺伝子を保有しているかの識別（判別）に用いることが可能であった。【００７５】
（抗菌ファージによる大腸菌のコリスチン耐性遺伝子の判別）
図１０は、Ｃａｓ１３ａ搭載の抗菌ファージにて、大腸菌のコリスチン耐性遺伝子を識別した結果を示す。この実験においては、Ｍ１３ファージに、上述の強い殺菌活性が確認された標的配列に対するｃｒＲＮＡとＣａｓ１３ａとを搭載した。ＮＥＢ  ５α  Ｆ'ｌｌq株の大腸菌にコリスチン耐性遺伝子として、ＭＣＲ−１、ＭＣＲ−２のプラスミドを用いて、形質転換した。作製した大腸菌に、上述と同様に作製された抗菌ファージを感染させ、抗生物質を含んでいないＬＢ軟寒天培地上で培養し、大腸菌の増殖阻害を確認した。こちらも、各耐性遺伝子を含む大腸菌に、各抗菌ファージを感染させた際に、発育が抑制されることが確認された。すなわち、大腸菌がコリスチン耐性遺伝子を保有しているかの識別（判別）に用いることが可能であった。
【実施例２】
【００７６】
（抗菌ファージによる大腸菌の細菌叢の改変）
図１１は、Ｃａｓ１３ａ搭載の抗菌ファージにて、大腸菌のカルバペネム耐性遺伝子ｂｌａIMP-1とコリスチン耐性遺伝子ＭＣＲ−２を保有する菌を選択的に除去した結果を示す。
本実施例においては、Ｍ１３ファージに、上述の実施例１で強い殺菌活性が確認された標的配列に対するｃｒＲＮＡとＣａｓ１３ａとを搭載した。ＮＥＢ  ５α  Ｆ’  ｌq株の大腸菌にカルバペネム耐性遺伝子ｂｌａIMP-1とコリスチン耐性遺伝子ＭＣＲ−２の発現プラスミドを用いて、形質転換した。作製した大腸菌に、実施例１と同様に作製された抗菌ファージを感染させ、６時間培養した。抗生物質を含んでいないＬＢ軟寒天培地上で培養し液体の希釈系列を作成し、それぞれのサンプルをＬＢプレート、アンピシリン含有ＬＢプレートと、コリスチン含有ＬＢプレートにプレーティングした。全てのプレートを１２時間３７℃で培養後、プレートに生えてきたコロニー数をカウントした。アンピシリン含有ＬＢプレートで生育した菌をｂｌａIMP-1発現株とし、コリスチン含有ＬＢプレートで生育した菌をＭＣＲ−２発現株、それ以外の菌をコントロール株とし、それぞれの菌株の割合を計算した。
ｂｌａIMP-1を標的とする抗菌ファージはｂｌａIMP-1発現株を、ＭＣＲ−２を標的とする抗菌ファージはＭＣＲ−２発現株の菌数をそれぞれ減らした。すなわち、Ｃａｓ１３ａ搭載の抗菌ファージは、特定の遺伝子を保有している大腸菌を減らすことに用いることが可能であった。【００７７】
（ｂｌａIMP-1遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａ発現ベクターの最適化）
図１２は、ｂｌａIMP-1遺伝子を有する細菌のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａによる殺菌効果において、最適なＣＲＩＳＰＲ配列を調べる手法の概念図である。
ｂｌａIMP-1を標的とする１２１個の異なるｓｐａｃｅｒをｐＫＬＣ２１に挿入したものを作製した。
下記の表４に、配列表の配列番号（Ｎｏ．）、ｂｌａIMP-1遺伝子を対象とした配列の名称（Ｓｐａｃｅｒ  ｎａｍｅ）、及び選定した標的部位塩基配列（標的配列、Ｓｐａｃｅｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の関係を示す。【００７８】
【表４】
0006923862.tif 000005
【００７９】
上述の１２１種類のｐｌａｓｍｉｄベクターを等量ずつ混合することでｐｌａｓｍｉｄを作製した。これらのｐｌａｓｍｉｄ  ｌｉｂｒａｒｙを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＣ１０６１  ｐＫＬＣ２６又はＭＣ１０６１  ｐＫＬＣ２６  ｂｌａIMP-1にトランスフォーメーションし、それぞれ２０枚のＬＢ  ｐｌａｔｅ（クロラムフェニコール及びカナマイシン入り）にプレーティングした。３７℃で１６時間培養後、コロニー数がそれぞれのプレート群で１０，０００以上あることを確認し、プレートに５ｍｌの培地を加えてスクレーパーで全てのコロニーを回収した。菌を遠心後、ｐｌａｓｍｉｄをＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて抽出し、塩基配列をＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑにて調べた。Ｎｅｘｔｅｒａ  ｍａｔｅ−ｐａｉｒ  ｓａｍｐｌｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ製）を用いてｍａｔｅ−ｐａｉｒのプラスミドライブラリーを作製し、ＭｉＳｅｑ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｋｉｔ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）にてシークエンシング後、それぞれのｓｐａｃｅｒ配列の個数をカウントした。【００８０】
図１３は、ｂｌａIMP-1遺伝子を有する大腸菌ＭＣ１０６１に対し、ｂｌａIMP-1のスペーサー配列を１２１種類別々に搭載したＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａの殺菌効果を示す図である。Ｓｐａｃｅｒ配列が、５６３番（ＧＡＣＴＴＴＧＧＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＴＡＴＴＴＧＣＧＴ）、５６６番（ＧＣＧＧＡＣＴＴＴＧＧＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＴＡＴＴＴＧ）、７０２番（ＴＴＴＴＧＡＴＧＧＴＴＴＴＴＴＡＣＴＴＴＣＧＴＴＴＡＡＣ）、５６２番（ＡＣＴＴＴＧＧＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＴＡＴＴＴＧＣＧＴＣ）、３７０番（ＴＧＧＣＴＴＧＡＡＣＣＴＴＡＣＣＧＴＣＴＴＴＴＴＴＡＡＧ）、５６５番（ＣＧＧＡＣＴＴＴＧＧＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＴＡＴＴＴＧＣ）、１９３番（ＴＡＴＣＴＴＴＡＧＣＣＧＴＡＡＡＴＧＧＡＧＴＧＴＣＡＡＴ）、２７４番（ＴＧＣＴＧＴＣＧＣＴＡＴＧＡＡＡＡＴＧＡＧＡＧＧＡＡＡＴ）、６４８番（ＴＴＴＣＡＡＧＡＧＴＧＡＴＧＣＧＴＣＴＣＣＡＡＣＴＴＣＡ）、１１番（ＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＴＡＴＡＡＡＧＡＡＴＡＣＡＧＡＴＡ）、６０９番（ＡＡＣＡＡＣＣＡＧＴＴＴＴＧＣＣＴＴＡＣＣＡＴＡＴＴＴＧ）、７０３番（ＧＴＴＴＴＧＡＴＧＧＴＴＴＴＴＴＡＣＴＴＴＣＧＴＴＴＡＡ）、２０８番だった場合（ＴＧＡＣＴＡＡＣＴＴＴＴＣＡＧＴＡＴＣＴＴＴＡＧＣＣＧＴ）、ｂｌａIMP-1保有菌株におけるシークエンスカウントがｂｌａIMP-1非保有菌株と比較し、１００倍以上少なくなっていた。以下の実験ではｂｌａIMP-1を標的とするスペーサー配列は、最も抑制効果の高かった５６３番を用いている。【００８１】
（抗菌ファージの遺伝子検出感度を上げる手法）
次に、本発明者らは、抗菌ファージの遺伝子検出感度を上げるため、抗菌ファージに抗生物質の耐性遺伝子を含有させて、遺伝子を検出する実験を行った。
図１４（ａ）は、抗菌ファージの遺伝子検出の感度を上げ方の概念図を示す。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａ配列とカナマイシン耐性遺伝子配列を保有しているＭ１３ベースの抗菌ファージを合成した。カナマイシンを含まないアガープレート（Ａｇａｒ  ｐｌａｔｅ）と、カナマイシン含有アガープレート（Ａｇａｒ  ｐｌａｔｅ（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ））とを用いて検出実験を行った。目的の細菌である（ＮＥＢ５α  Ｆ'  ｌq  ｐＫＬＣ２６  ｂｌａIMP-1）と軟寒天培地を混ぜた産物を注ぎ、固まるまで放置した。プレートが固まったらすぐに、抗菌ファージを上から添加し、３７℃で１２時間の培養を行った。
図１４（ｂ）は、カナマイシンを含まないアガープレートでの実験結果、図１４（ｃ）は、カナマイシン含有アガープレートでの実験結果を示す。それぞれ、コントロール（ｂｌａIMP-1非保有菌株）と、ｂｌａIMP-1保有菌株とについて、ターゲット遺伝子を導入したもの（ｂｌａIMP-1−ｔａｒｇｔｅｄ）と、導入しないもの（ＮＣ）について、ＴＦＵ毎の結果の写真を示す。【００８２】
本実験において、実施例１のようにファージが保有する耐性遺伝子に対する抗生物質を入れない（抗生物質を含まないアガープレート）で培養した場合、検出するために、抗菌ファージを１０4ＴＦＵから１０5ＴＦＵ程度、用いる必要があった。
これに対して、抗菌ファージに抗生物質の耐性遺伝子を含有させると、１０3ＴＦＵ程度でも十分に検出できることが確認できた。すなわち、遺伝子の検出感度を１００倍程度上昇させることができた。この手法は抗菌ファージに耐性遺伝子を保有させるだけであるので、Ｍ１３ファージのみならず、他の抗菌ファージ全てに適用可能である。【００８３】
（抗菌ファージによるカルバペネム耐性遺伝子の判別）
図１５は、図１４の手法を用いてカルバペネム耐性遺伝子ｂｌａIMP-1、ｂｌａOXA-48、ｂｌａVIM-2の判別を行った写真である。ｐＫＬＣ２６プラスミドから耐性遺伝子を発現させた大腸菌ＮＥＢ５α  Ｆ'  ｌq（ｐｌａｓｍｉｄ）、又は、ゲノム上から耐性遺伝子を発現させたＮＥＢ５α  Ｆ'  ｌq（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）を作製し、図１４と同様の手法で１０4ＴＦＵの抗菌ファージを添加し、３７℃で１２時間の培養を行った結果を示す。それぞれについて、カルバペネム耐性遺伝子を持たないコントロール、ｂｌａIMP-1、ｂｌａOXA-48、ｂｌａVIM-2について、ターゲットとなる遺伝子をそれぞれ付加したもの及び水のみのネガティブコントロール（−）についての結果を示す。
結果として、各遺伝子をもつ菌が選択的に溶菌されることが分かる。【００８４】
大腸菌ＮＥＢ５α  Ｆ'  ｌq株の染色体に耐性遺伝子を発現させる手法は下記のように行った。ＮＥＢ５α  Ｆ'  ｌqにｐＫＤ４６をトランスフォーメーションし、アンピシリン含有ＬＢプレート上で選択培養した。また、ｐＫＬＣ２６  ｖｅｃｔｏｒにコードさせた薬剤耐性遺伝子をＫ１２  ｇｅｎｏｍｅ−ｉｎ  ｐＫＬＣ２６−ｆ，ＣＣＣＴＴＣＡＡＣＣＴＴＡＧＣＡＧＴＡＧＣＧＴＧＧＧＡＴＧＡＴＴＴＣＡＣＡＡＴＴＡＧＡＡＡＧＡＣＣＴＴＧＡＣＧＣＡＣＡＣＣＧＴＧＧＡＡＡＣと、Ｋ１２  ｇｅｎｏｍｅ−ｉｎ  ｐＫＬＣ２６Ｃｍ−ｒ，ＴＧＴＣＣＴＧＣＡＣＧＡＣＧＣＣＴＴＧＣＧＴＣＡＣＴＡＧＣＣＴＣＴＴＣＴＣＴＡＧＣＴＣＡＴＣＡＴＧＣＴＧＡＧＡＣＧＴＴＧＡＴＣＧＧＣＡＣＧのｐｒｉｍｅｒで増幅した。増幅したＤＮＡには、目的の薬剤耐性遺伝子とクロラムフェニコール耐性遺伝子が含まれるよう、また挿入箇所は種間で保存されていない、ノンコーディング領域に設計した。ＮＥＢ５−ａｌｐｈａ  Ｆ'  ｌq  ｐＫＤ４６株、又はＭＣ１０６１  ｐＫＤ４６株をアンピシリン含有ＬＢ培地で培養し、ＯＤ６００が０．２になったところでＬ−ａｒａｂｉｎｏｓｅを終濃度０．３％となるように加え、４２℃で１５分間激しく振盪培養した。氷冷１０％グリセロールで３度洗った後に、増幅したＤＮＡ断片（５'末端と３'末端に大腸菌と相同配列を持つ）１００ｎｇを氷冷１ｍｍキュベットに移し、ＥＬＥＰＯ２１でエレクトロポレーション（Ｐｏｒｉｎｇ  Ｐｕｌｓｅ（電圧：２，０００  Ｖ，Ｐｕｌｓｅ幅：２．５  ｍｓｅｃ，Ｐｕｌｓｅ間隔：５０ｍｓ，回数：１，極性：＋），Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｐｕｌｓｅ（電圧：１５０Ｖ，Ｐｕｌｓｅ幅：５０ｍｓｅｃ，Ｐｕｌｓｅ間隔：５０ｍｓ，回数：５，極性：＋／−）を行った。すぐに１ｍＬ  ＳＯＣを加え、３７℃で振盪培養後、クロラムフェニコール含有ＬＢプレート上で選択培養した。作製した遺伝子改変大腸菌の改変周囲の配列は、サンガー法によるシークエンスにより確認した。【００８５】
（抗菌ファージによる毒素遺伝子の判別）
図１６は、抗菌ファージを用いて毒素遺伝子ｓｔｘ１、ｓｔｘ２の判別を行った写真である。具体的には、コントロールと、各毒素遺伝子（ｔｏｘｉｎ）ｓｔｘ１、ｓｔｘ２、及び耐性遺伝子（ＡＭＲ）について、抗菌ファージにより検出が可能であった。
なお、ｓｔｘ１、ｓｔｘ２は全長ではなく、一部の配列を用いている。ｐＫＬＣ２６プラスミドからｐＫＬＣ２６  ｓｔｘ１  ｐａｒｔｉａｌ  ＰＣＲ  ＳａｃＩ−ｒ，ＧＴＧＧＡＧＣＴＣＧＧＴＣＡＴＧＧＣＡＴＴＴＣＣＡＣＴＡＡＡＣＴＣＣＡＴＴＡＡＧＡＧＡＡＴＧＧＡＴＴＴＴＧＴＧＡＴＧＣとｐＫＬＣ２６  ｓｔｘ１  ｐａｒｔｉａｌ  ＰＣＲ  ＳａｃＩ  −ｆ，ＡＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＣＧＧＡＡＧＡＡＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＣＡＣＴＧＡＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣ、ｐＫＬＣ２６  ｓｔｘ２  ｐａｒｔｉａｌ  ＰＣＲ  ＳａｃＩ  −ｒ，ＧＣＧＧＡＧＣＴＣＧＧＴＣＡＴＴＧＴＡＴＴＡＣＣＡＣＴＧＡＡＣＴＣＣＡＴＴＡＡＧＡＧＡＡＴＧＧＡＴＴＴＴＧＴＧＡＴＧＣとｐＫＬＣ２６  ｓｔｘ２  ｐａｒｔｉａｌ  ＰＣＲ  ＳａｃＩ  −ｆ，ＡＣＣＧＡＧＣＴＣＣＧＣＣＧＧＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡＣＣＴＣＡＣＴＣＴＧＡＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣのプライマーを用いて増幅し、ＳａｃＩ（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ製）で処理後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｖｅｒ．  ２（ＴＯＹＯＢＯ製）で結合した。（以下、それぞれを「ｐＫＬＣ２６  ｓｔｘ１  ｖｅｃｔｏｒ」「ｐＫＬＣ２６  ｓｔｘ２  ｖｅｃｔｏｒと呼ぶ。）。また、ｐＫＬＣ２１のＢｓａＩ  ｓｉｔｅに、ｓｔｘ１  ４８８−ａｓ，ＴＡＴＣＣＴＡＡＴＧＧＡＧＴＴＴＡＧＴＧＧＡＡＡＴＧＣＣＡＴＧＡＣとｓｔｘ１  ４８８−ｓ，ＡＡＡＣＧＴＣＡＴＧＧＣＡＴＴＴＣＣＡＣＴＡＡＡＣＴＣＣＡＴＴＡＧをアニーリングした二本鎖ＤＮＡもしくは、ｓｔｘ２  ４８８−ａｓ，ＴＡＴＣＣＴＡＡＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＴＧＧＴＡＡＴＡＣＡＡＴＧＡＣとｓｔｘ２  ４８８−ｓ，ＡＡＡＣＧＴＣＡＴＴＧＴＡＴＴＡＣＣＡＣＴＧＡＡＣＴＣＣＡＴＴＡＧをアニーリングした二本鎖ＤＮＡを挿入し、「ｐＫＬＣ２１  ＢｓａＩ  ｓｔｘ１＿４８８  ｖｅｃｔｏｒ」と、「ｐＫＬＣ２１  ＢｓａＩ  ｓｔｘ２＿４８８  ｖｅｃｔｏｒ」を作製した。これらを用い、図１４で示したのと同様の手法で、毒素遺伝子ｓｔｘ１、ｓｔｘ２の検出を行った。【００８６】
（臨床分離株における抗菌ファージによるカルバペネム耐性遺伝子の判別）
図１７は、抗菌ファージが感染する臨床分離株（Ｅ．ｃｏｌｉ１、Ｅ．ｃｏｌｉ２）に対し、カルバペネム耐性遺伝子ｂｌａIMP-1、ｂｌａNDM-1の判別を行った写真である。この臨床分離株は、自治医科大で非特定の患者から取得され、維持されていたものである。
臨床分離株（Ｅ．ｃｏｌｉ１、Ｅ．ｃｏｌｉ２）のｂｌａIMP-1、ｂｌａNDM-1の発現は、ＩＭＰ  ｔｙｐｅ  ｄｅｔ  ２５５−ｆ，ＧＧＣＧＴＴＴＡＴＧＴＴＣＡＴＡＣＴＴＣＧとＩＭＰ  ｔｙｐｅ  ｄｅｔ  ２５５−ｒ，ＡＧＡＴＧＣＡＴＡＣＧＴＧＧＧＧＡＴＡＧ、ＮＤＭ  ｔｙｐｅ  ｄｅｔ  ２０９−ｆ，ＣＣＡＡＴＧＣＧＴＴＧＴＣＧＡＡＣＣＡＧとＮＤＭ  ｔｙｐｅ  ｄｅｔ  ２０９−ｒ，ＧＡＴＣＡＧＧＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＡＡＧのプライマーを用いたＰＣＲ反応により、確認を行った。【００８７】
（臨床分離大腸菌株を感染させた蛾の幼虫の抗菌ファージによる治療効果）
図１８は、臨床分離大腸菌株を感染させた蛾の幼虫の抗菌ファージによる治療効果を調べたグラフである。
Ｇａｌｌｅｒｉａ  ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａのＭサイズの幼虫を活き餌Ｆａｃｔｏｒｙから購入し、ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｓｓａｙに用いた。受取後、２４時間は暗所で研究室の環境に慣らし、その後４８時間以内にａｓｓａｙに使用した。また、動きが弱い、色が濃い、形状が一般的でない、サイズが他の幼虫と明らかに異なる幼虫は実験には用いなかった。注射器は、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｓｙｒｉｎｇｅ，  ｌｅｕｒ  ｔｉｐ  （７０１ＬＴ，  Ｈａｍｉｌｔｏｎ）にＫＦ７３１の針（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）を組み合わせたものを用いた。一晩ＬＢ培地で３７℃で培養した大腸菌を、ＬＢ培地に１／１００量入れ、ＯＤ６００が０．５程度になるまで３７℃で振盪培養した。その後、ＰＢＳで２度洗浄し、〜１×１０7ＣＦＵ／ｍｌの溶液を作った。２０匹のクリーム色の幼虫をとり、ＰＢＳもしくは細菌液を５μｌずつ左のｐｒｏｌｅｇに注射した。１時間後にＳＭ  ｂｕｆｆｅｒ又はは抗菌ファージを５μｌずつ右のｐｒｏｌｅｇに注射した。その後、幼虫を３７℃のインキュベーターに移動し、１２時間毎に経過を観察した。触っても反応しなくなった幼虫を死亡と判定した。
図１８のグラフによると、ｂｌａIMP-1を発現する臨床分離大腸菌を投与した幼虫は、４８時間後には８割が死んでいた。その一方で、ｂｌａIMP-1を標的とする抗菌ファージを投与した群での死亡率は５割程度でり、２群間の死病率に統計的に有意差があった。この結果から、作製したｂｌａIMP-1を標的とする抗菌ファージには、in vivoの実験系において、細菌感染症の治療効果があることが確認された。【００８８】
（抗菌ファージによる黄色ブドウ球菌のメチシリン耐性遺伝子の判別）
図１９は、黄色ブドウ球菌用に作製した抗菌ファージが、黄色ブドウ球菌のメチシリン耐性遺伝子ｍｅｃＡに対しても選択的殺菌効果があることを示した実験結果のグラフである。ｍｅｃＡを標的とするｍｅｃＡ  ｃｒＲＮＡ−４４６−ａｓ，ＴＡＴＣＣＣＡＡＡＧＣＡＴＡＣＡＴＡＴＴＧＡＡＡＡＴＴＴＡＡＡＡＴとｍｅｃＡ  ｃｒＲＮＡ−４４６−ｓ，ＡＡＡＣＡＴＴＴＴＡＡＡＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＧＴＡＴＧＣＴＴＴＧＧを合成し、アニーリング後、ｐＫＬＣ２１のＢｓａＩ  ｓｉｔｅに挿入した。ｐＫＬＣ２１  ＢｓａＩ  ｍｅｃＡのＣａｓ１３ａ  ｃｒＲＮＡ領域がファージＮＭ１にパッケージングされるように、パッケージング配列を繋ぎ合わせ、パッケージング配列が欠損したＮＭ１ファージが溶原化している黄色ブドウ球菌ＲＮ４２２０にトランスフォームした。その後、形質転換したＲＮ４２２０株をＴＳＢ培地で３７℃で培養し、ＯＤ６００が０．２になったところでマイトマイシンＣ（２μｇ／ｍｌ）を加えた。その後３０度で一晩８０ｒｐｍで振盪し、０．２２μｍのフィルターを通して抗菌ファージを得た。ｍｅｃＡを保有しないＲＮ４２２０、ｍｅｃＡを保有する臨床分離株ＵＳＡ３００、ｍｅｃＡを欠損させた臨床分離株ＵＳＡ３００ΔｍｅｃＡに対し、それぞれ図１４と同じ要領でｍｅｃＡを標的とする抗菌ファージを添加し、３７℃で１２時間培養後、耐性遺伝子ｍｅｃＡの判別を行った。
図１９の結果によると、ｍｅｃＡを保有するＵＳＡ３００は抗菌ファージによりコロニー形成が確認されなかったのに対し、ｍｅｃＡを保有しない黄色ブドウ球菌株（ＲＮ４２２０とＵＳＡ３００ΔｍｅｃＡ）からはコロニー形成が確認された。以上の結果から、グラム陰性の大腸菌だけでなく、グラム陽性の黄色ブドウ球菌においても抗菌ファージによる特定の遺伝子の検査が行えることが確認された。【００８９】
なお、上記実施の形態の構成及び動作は例であって、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更して実行することができることは言うまでもない。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明によれば、薬剤耐性遺伝子をもつ細菌を選択的に殺菌し、又は簡便に判別可能となる抗菌ファージを治療用組成物、殺菌剤、食品、細菌判別キット等として提供でき、これらの方法を実現可能であるため、産業上利用可能である。
【図１】
0006923862.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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