(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ１に結合する結合分子であって、
前記結合分子は、
抗Ｌ１モノクローナル抗体、又は、前記抗Ｌ１モノクローナル抗体の抗原結合性フラグメントであり、または、
一本鎖抗体、抗体フラグメント、タンダブ（ＴａｎｄＡｂ）、フレキシボデー（Ｆｌｅｘｉｂｏｄｙ）、および、二重特異性抗体からなる群から選ばれ、
及び／又は、
キメラ抗体、ヒト化抗体、或いは、これら抗体の抗原結合性フラグメントであり、
前記結合分子は、相補性決定領域（ＣＤＲ）がKASQNVGTNVA (LCDR1; SEQ ID No: 5)、 STSYRYS (LCDR2; SEQ ID No: 6)、 QQYNTYPYT (LCDR3; SEQ ID No: 7)、 FNIKDYYMQ (HCDR1; SEQ ID No: 8)、 WIDPENGKTVFDPKFRG (HCDR2; SEQ ID No: 9)、 およびWNPLAF (HCDR3; SEQ ID No: 10)である、
ことを特徴とする結合分子。
【請求項２】
前記結合分子は、抗Ｌ１モノクローナル抗体又は前記抗Ｌ１モノクローナル抗体の抗原結合性フラグメントである、
ことを特徴とする、請求項１に記載する結合分子。
【請求項３】
前記結合分子は、Ｌ１を発現する哺乳類細胞で内部移行することを特徴とする、請求項１または請求項２の何れか１項に記載する結合分子。
【請求項４】
前記結合分子は前記モノクローナル抗体Ｌ１−ＯＶ５２．２４であって、
前記したＬ１−ＯＶ５２．２４の軽鎖の可変部がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．1の配列を有する、又は、前記軽鎖はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３でコードされ、及び、
前記したＬ１−ＯＶ５２．２４の重鎖の可変部がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２の配列を有する、又は、前記重鎖はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４でコードされる、
ことを特徴とする請求項１に記載する結合分子、
又は、その結合分子の抗原結合性フラグメント。
【請求項５】
前記Ｌ１と結合する結合分子は、
（i）一本鎖抗体がscFvおよび、二量体、三量体又は四量体のようなscFvの多量体から選択される、又は
（ii）前記抗体フラグメントはFabである、
ことを特徴とする請求項１に記載のＬ１に結合する結合分子。
【請求項６】
前記結合分子は、Ｌ１を発現する細胞がSKOV3ip細胞である、ことを特徴とする、請求項３に記載の結合分子。
【請求項７】
前記結合分子は、前記モノクローナル抗体Ｌ１−ＯＶ５２．２４であって、
前記Ｌ１−ＯＶ５２．２４の軽鎖の可変部がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．1の配列を有し、前記Ｌ１−ＯＶ５２．２４の重鎖の可変部がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２の配列を有する、
ことを特徴とする、請求項４に記載の結合分子、
又は、その結合分子の抗原結合性フラグメント。
【請求項８】
前記結合分子は、
（ａ）治療に有効な物質と結合し、及び／又は、
（ｂ）診断用化合物と結合する、
ことを特徴とする請求項１から請求項７の何れか１項に記載の結合分子。
【請求項９】
前記結合分子であり、
（i）前記治療に有効な物質が、化学療法剤、細胞毒性化合物、細胞増殖抑制化合物、サイトカイン、ナノ粒子、又は放射性核種であり、
（ii）前記診断用化合物が、放射性核種、化学発光化合物、蛍光化合物、色素、又は酵素から選ばれる、
ことを特徴とする請求項８に記載の結合分子。
【請求項１０】
前記結合分子であり、
（i）化学療法剤が、アルキル化剤、抗悪性腫瘍抗生物質、代謝抵抗物質、及び天然物誘導体から選ばれ、又は
（ii）化学療法剤、細胞毒性化合物又は細胞増殖性化合物はＤＮＡ損傷剤から選ばれる、
ことを特徴とする請求項９に記載の結合分子。
【請求項１１】
前記結合分子であり、
前記ＤＮＡ損傷剤が、アクチノマイシンＤ、マイトマイシンＣ、シスプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、ベラパミル、ポドフィロトキシン、５−ＦＵ、天然物誘導体およびタキサン、から選ばれる、
ことを特徴とする請求項１０に記載の結合分子。
【請求項１２】
前記結合分子は、（a）の前記治療に有効な物質、及び/又は、前記（b）の診断用化合
物に、随意リンカーを介して、共有結合をする、
ことを特徴とする請求項８に記載の結合分子。
【請求項１３】
請求項２、請求項４又は請求項７に記載する前記抗Ｌ１モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞。
【請求項１４】
核酸であり、
（ｉ）請求項１から請求項７の何れか１項に記載する結合分子をコードし、及び／又は、
（ｉｉ）請求項１から請求項７の何れか１項に記載する結合分子の少なくとも１本の鎖をコードし、及び／又は、
（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４の配列を有し、及び／又は、
（ｉｖ）相補性決定領域（ＣＤＲ）配列である、KASQNVGTNVA (LCDR1; SEQ ID No: 5)、 STSYRYS (LCDR2; SEQ ID No: 6)、 QQYNTYPYT (LCDR3; SEQ ID No: 7)、 FNIKDYYMQ (HCDR1; SEQ ID No: 8)、 WIDPENGKTVFDPKFRG (HCDR2; SEQ ID No: 9)、及び WNPLAF (HCDR3; SEQ ID No: 10)をコードする配列を有する、
ことを特徴とする核酸。
【請求項１５】
前記核酸はベクターの一部である、ことを特徴とする請求項１４に記載の核酸。
【請求項１６】
請求項１から請求項１２の何れか１項に記載する結合分子を、診断薬又は生物工学的薬剤として使用する方法。
【請求項１７】
腫瘍性疾患の治療又は予防に使用するための請求項１から請求項１２の何れか１項に記載する結合分子。
【請求項１８】
腫瘍性疾患の治療又は予防に使用するための請求項１７に記載する結合分子であって、前記腫瘍性疾患は、上皮腫瘍性疾患、及び／又は、星状細胞腫、乏突起膠細胞系腫瘍、髄膜腫、神経線維腫、膠芽腫、上衣腫、シュワン細胞腫、神経線維肉腫、髄芽腫、メラノーマ、膵臓癌、前立腺癌、頭頚部癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、子宮内膜癌、腎癌、神経芽細胞腫、扁平上皮癌、肝癌、大腸癌、中皮腫、及び類表皮癌からなる群から選ばれる、
ことを特徴とする結合分子。
【請求項１９】
請求項１から請求項１２の何れか１項に記載する結合分子と、１個以上の薬学的許容な担体と、を有する薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ１と結合する結合分子であって、モノクローナル抗体Ｌ１−ＯＶ５２．２４によって認識される同じＬ１エピトープと結合する、及び／又は、Ｌ１との結合においてモノクローナル抗体Ｌ１−ＯＶ５２．２４と拮抗する結合分子に係る。Ｌ１−ＯＶ５２．２４の軽鎖の可変部は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．1の配列をもつか、又は、前記軽鎖はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３によってコードされる。また、Ｌ１−ＯＶ５２．２４の重鎖の可変
部は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２の配列をもつか、又は、前記重鎖はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４によってコードされる。さらに、本発明は、前記結合分子をコードする核酸、その利用方法、並びに前記結合分子からなる薬学的組成物に係る。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体類は（ｍＡｂｓ）、癌治療における新規で重要な柱となっている［非特許文献１］。過去二十年間に、分子生物学によって主要な悪性疾患［非特許文献２］を治療するためにキメラ型抗体、ヒト化抗体又は完全なヒト抗体を調製する手段が提供されてきた。今日まで、数多くの抗体類及び抗体−複合体が、欧州及び米国で上市された癌治療薬として認可されている［非特許文献３及び４］。これらの薬には、非変性抗体、抗体薬複合体のみならず放射性核種との複合体や二重特異性抗体［非特許文献５］が含まれる。しかし、目的の癌抗原に対するモノクローナル抗体類は、癌細胞への標的能力に差異があることが周知である。
【０００３】
最近の研究において、本発明者らは、Ｌ１ＣＡＭ（Ｌ１とも称する）がヒト癌の優れた標的分子であることを明らかにした。Ｌ１ＣＡＭは、多くのヒト癌において過剰発現し、予後不良を起こし、細胞運動性、浸潤及び転移などを増大させる。ゼノグラフトモデル［非特許文献６］及びヒトＬ１ＣＡＭトランスジェニックマウスモデル［非特許文献７］の結果から、Ｌ１ＣＡＭ  ｍＡｂＬ１−９．３（ｍＡｂ９．３とも称する）が癌治療のために有望なツールとなる可能性が示唆された。このモノクローナル抗体は、Ｌ１ＣＡＭ分子の第１のＩｇ様ドメインと結合し、良好なＡＤＣＣ（機能を有する［非特許文献６］。最近の研究結果では、ＩｇＧ２ａバージョンのこの抗体が免疫系活性化に好適であり、免疫エフェクター細胞をリクルートして癌細胞を除去することが示された［非特許文献６及び７］。従って、モノクローナル抗体依存的腫瘍治療の重要な担い手となるＡＤＣＣ依存的エフェクター機構に対して、このモノクローナル抗体が特に好適であるという十分な証拠がある。
また、特許文献１は、Ｌ１の第１のＩｇドメイン内でエピトープと結合する抗Ｌ１抗体９．３を開示する。
【０００４】
抗体−薬物複合体の最近の進歩により、迅速に内部移行する機能を有するモノクローナル抗体が求められている。Ｌ１ＣＡＭ特異的抗体の結合が、Ｌ１ＣＡＭの内部移行を起こし、続いて標的分子の再利用又は分解が起きることが良く知られている［非特許文献８］。Ｌ１ＣＡＭ分子の内部移行の特徴は、多くの細胞表面分子と共通している。事実、Ｌ１ＣＡＭの内部移行は、Ｌ１ＣＡＭ介在細胞接着のシグナリング及び調節に必要なことが知られている［非特許文献９−１１］。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】WO 2008/151819
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Galluzzi L, Vacchelli E, Fridman WH, Galon J, Sautes-FridmanC, Tartour E, Zucman-Rossi J, Zitvogel L, Kroemer G: Trial Watch: Monoclonal antibodies in cancer therapy. Oncoimmunology 2012, 1(1):28-37.
【非特許文献２】Presta LG: Molecular engineering and design of therapeutic antibodies. Curr Opin Immunol 2008, 20(4):460-470.
【非特許文献３】Reichert JM: Marketed therapeutic antibodies compendium. MAbs 2012, 4(3).
【非特許文献４】Reichert JM: Antibodies to watch in 2014: mid-year update. mAbs 2014, 6(4):799-802.
【非特許文献５】Reichert JM: Antibody-based therapeutics to watch in 2011. MAbs 2011, 3(1):76-99.
【非特許文献６】Wolterink S, Moldenhauer G, Fogel M, Kiefel H, Pfeifer M, Luttgau S, Gouveia R, Costa J, Endell J, Moebius U et al: Therapeutic antibodies to human L1CAM: functional characterization and application in a mouse model for ovarian carcinoma. Cancer Res 2010, 70(6):2504-2515.
【非特許文献７】Doberstein K, Harter PN, Haberkorn U, Bretz NP, Arnold B, Carretero R, Moldenhauer G, Mittelbronn M, Altevogt P: Antibody therapy to human L1CAM in a transgenic mouse model blocks local tumor growth but induces EMT. International journal of cancer Journal international du cancer 2014.
【非特許文献８】Novak-Hofer I, Amstutz HP, Morgenthaler JJ, Schubiger PA: Internalization and degradation of monoclonal antibody chCE7 by human neuroblastoma cells. International journal of cancer Journal international du cancer 1994, 57(3):427-432.
【非特許文献９】Schaefer AW, Kamiguchi H, Wong EV, Beach CM, Landreth G, Lemmon V: Activation of the MAPK signal cascade by the neural cell adhesion molecule L1 requires L1 internalization. The Journal of biological chemistry 1999, 274(53):37965-37973.
【非特許文献１０】Long KE, Asou H, Snider MD, Lemmon V: The role of endocytosis in regulating L1-mediated adhesion. The Journal of biological chemistry 2001, 276(2):1285-1290.
【非特許文献１１】Schaefer AW, Kamei Y, Kamiguchi H, Wong EV, Rapoport I, Kirchhausen T, Beach CM, Landreth G, Lemmon SK, Lemmon V: L1 endocytosis is controlled by a phosphorylation-dephosphorylation cycle stimulated by outside-in signaling by L1. The Journal of cell biology 2002, 157(7):1223-1232.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
数報の文献で、Ｌ１ＣＡＭの抗体誘導性内部移行が報告されているが（ほとんどがポリクローナル抗体を使用）、モノクローナル抗体を用いた系統的研究は行われていない。従って、Ｌ１ＣＡＭ分子の異なるエピトープ類の関与が、異なる内部移行の割合になるかどうかについて、今のところ知られていない。今回本発明者らは、ＦＮＩＩＩ−４−５に結合する、Ｌ１ＣＡＭ特異的なモノクローナル抗体を作成し、これをｍＡｂ  Ｌ１−ＯＶ５２．２４（またはＯＶ５２．２４）と名付けた。このモノクローナル抗体は、先に同定されたｍＡｂ  Ｌ１−９．３よりもはるかに優れた内部移行率を有する、という驚くべきことを本発明者らは見出した。また、本発明者らは、ｍＡｂ  Ｌ１−ＯＶ５２．２４が、抗Ｌ１ＣＡＭモノクローナル抗体５Ｇ３及びＵＪ１２７．１１のそれぞれよりも、はるかに優れた内部移行率を有するという驚くべきことも見出した。Ｌ１−ＯＶ５２．２４のユニークな特徴により、癌細胞への薬物輸送の向上及び加速化を実現することが可能となる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の抗体Ｌ１−ＯＶ５２．２４が有する幾つかの特徴が一部既に開示されているとしても（例えば［非特許文献６］）、抗体自身、又は、本発明の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列は、非公表であり公開されてはいない。
多くの治療に有効な薬剤は、細胞内でのみ効果を発揮する。これは、治療に有効な薬剤が未修飾の形態で細胞内に入ることができない場合に問題となる。したがって、腫瘍細胞内に効率的に内部移行し、結合剤と結合した薬剤を腫瘍細胞に導入できるモノクローナル抗体類、或いは、これら抗体類の抗原結合性フラグメント類などの結合剤が求められている。
本発明者らは、驚くべきことに、モノクローナル抗体Ｌ１−ＯＶ５２．２４が、Ｌ１−
保有哺乳類細胞内に、迅速且つ効率的に内部移行することを見出した。この発見は、実施例に示すように、それぞれ４０、６０、７０又は９０分間、Ｌ１−ＯＶ５２．２４と培養した細胞を、顕微鏡的に分析、並びにイメージングフローサイトメトリーで同定したものである。
【０００９】
従って、このようなモノクローナル抗体、または、Ｌ１と結合し、Ｌ１−ＯＶ５２．２４によって認識される同じＬ１エピトープと結合するその他結合分子類は、生物工学的研究、診断又は治療の分野において、驚くべき利点を有する。特に、内部移行によって細胞内に取り込まれる本発明の結合分子と、有効薬剤とを結合させてもよい。こうすることで、これら有効薬剤は、細胞毒性効果又は細胞増殖抑制効果などの所望の効果を細胞内で発揮できる。
ある実施形態中、本発明は、モノクローナル抗体Ｌ１−ＯＶ５２．２４により認識される同じＬ１エピトープと結合できる、Ｌ１と結合する結合分子に係る。Ｌ１−ＯＶ５２．２４の軽鎖の可変部は、好適にはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の配列をもつか、又は、前記軽鎖はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３によってコードされることを特徴とする。また、Ｌ１−ＯＶ５２．２４の重鎖の可変部は、好適にはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２の配列をもつか、又は、前記重鎖はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４によってコードされることを特徴とする。
【００１０】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１はＶＪドメイン、つまり、Ｌ１−ＯＶ５２．２４の軽鎖の可変部に係る。前記軽鎖の定常ドメインは当技術分野で公知であり、そのマウスｃＤＮＡ配列を以下に記載する。
また、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２はＶＤＪドメイン、つまり、Ｌ１−ＯＶ５２．２４の重鎖の可変部に係る。前記重鎖の定常ドメインは当技術分野で公知であり、そのマウスｃＤＮＡ配列を以下に記載する。
Ｌ１或いはＬ１ＣＡＭとして知られるものは、膜貫通タンパク質であり、神経細胞接着分子であり、Ｌ１タンパク質ファミリーの一員であり、２００−２２０ｋＤａを有し、治療抵抗性癌と密接に関係する軸索誘導や細胞移動に関与する。本発明によれば、Ｌ１は哺乳類Ｌ１タンパク質として理解されることが好ましく、ヒト又はマウスＬ１タンパク質として理解されることがより好ましい。ヒトＬ１タンパク質のジェンバンク登録は、ＮＰ＿０００４１６であり、マウスＬ１タンパク質のジェンバンク登録は、ＮＰ＿０３２５０４である。Ｌ１ＣＡＭは、ＣＤ１７１とも称される。
【００１１】
また、エピトープとは、抗体又は関連する結合分子によって認識される抗原の一部のことである。例えば、エピトープは、抗体が結合する、抗原の特定部分である。また、エピトープ類は、立体構造エピトープ又は線型エピトープに分けられる。立体構造エピトープは、抗原のアミノ酸配列の不連続部分から構成される。このようなエピトープ類は、抗原の三次元的表面構造及び形状、又は、三次構造に基づいてパラトープと相互作用する。なお、エピトープ類において、構造エピトープが占める割合は知られていない。
【００１２】
Ｌ１−ＯＶ５２．２４が、Ｌ１のフィブロネクチンＩＩＩ４−５ドメイン内部のエピトープと結合して認識することを、実施例において示した。結合分子により結合され認識されるエピトープを決定する方法は、先行技術（Ｗｏｌｔｅｒｉｎｋ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２０１０），７０，２５０４−２５１５）及び実施例に記載される。実施例で示したように、認識されたエピトープは、各々異なるＩｇドメインを有する、Ｌ１−Ｆｃタンパク質シリーズを構成することにより、好適に決定されることができる。実施例のファインマッピング用に、例えば、Ｇｏｕｖｅｉａ等（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐr.Ｐｕｒｉｆ．（２００７），５２，１８２−１９３）に記載されるように、Ｖ５タグ付き組み替えＬ１フラグメントを使用することができる。この組換タンパク質を、エピトープマッピング用に、ＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロット分析において使用できる。モノクローナル抗体Ｌ１−ＯＶ５２．２４は、Ｌ１の４−５ＦＮＩＩＩドメインと反応する。通常、目的とす
る抗体のエピトープを決定する方法は当技術分野で知られており、目的とする領域の合成線型ペプチドを調製し、続いて、このペプチドに抗体が結合するか否かを試験することを含む（エピトープマッピング、実用方法、オクスフォード大学出版社、２００１、Ｏｌｗｙｎ  Ｗｅｓｔｗｏｏｄ及びＦｒａｎｋ  Ｈａｙ編集）。
或いは、目的の領域をカバーする様々な組換タンパク質を調製し、抗体との結合性を試験する（Ｏｌｅｓｚｅｗｓｋｉ，Ｍ．，Ｐ．ｖｏｎ  ｄｅｒ  Ｌｉｅｔｈ，Ｗ．Ｒａｕｃｈ，Ｕ．，Ａｌｔｅｖｏｇｔ，Ｐ．Ｌ１−ニューロカン結合部位の分析。Ｌ１−Ｌ１同種親和性結合の意味。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７５；３４４７８−３４４８５（２０００））。
【００１３】
また、別の実施形態中、本発明はＬ１と結合するモノクローナル抗体Ｌ１−ＯＶ５２．２４と拮抗する結合分子に係る。Ｌ１−ＯＶ５２．２４の軽鎖の可変部は、好適にはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の配列をもつか、又は、前記軽鎖はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３によりコードされる。一方、Ｌ１−ＯＶ５２．２４の重鎖の可変部は、好適にはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２の配列をもつか、又は、前記重鎖はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４によりコードされる。
なお、拮抗性は、競合結合アッセイなど、当業者に周知の試験により測定できる。
【００１４】
Ｌ１−ＯＶ５２．２４の軽鎖（定常ドメインを除くＶＪドメイン、つまり、可変領域）のタンパク質配列は以下の通りである。
1 DIVMTQSQKF MSTSVGDRVS VTCKASQNVG TNVAWYQQKP GHSPKALIYS
51 TSYRYSGVPD RFTGSGSGTD FTLTIRNVQS EDLAEYFCQQ YNTYPYTFGG
101 GTKLEIK (SEQ ID No: 1)
また、ＫａｂａｔによるＬ１−ＯＶ５２．２４の軽鎖（ＶＪドメイン）のＣＤＲ類の配列は以下の通りである。
CDR-L1 (or LCDR1): KASQNVGTNVA (SEQ ID No: 5)
CDR-L2 (or LCDR2): STSYRYS (SEQ ID No: 6)
CDR-L2 (or LCDR2): STSYRYS (SEQ ID No: 6)
さらに、Ｌ１−ＯＶ５２．２４の重鎖（定常ドメインを除くＶＤＪドメイン、つまり、可変領域）のタンパク質配列は以下の通りである。
1 EVQLQQSGAE LVRPGALVKL SCKASGFNIK DYYMQWVKQR PEQGLEWIGW
51 IDPENGKTVF DPKFRGKASI SADTSSNTAY LQLSSLTSED  TAVYYCARWN 
101 PLAFWGQGTL VTVSS (SEQ ID No: 2)
なお、ＫａｂａｔによるＣＤＲ類の配列を下線で示す。
次に、ＫａｂａｔによるＬ１−ＯＶ５２．２４の重鎖（ＶＤＪドメイン）のタＣＤＲ類の配列は以下の通りである。
CDR-H1 (or HCDR1): FNIKDYYMQ (SEQ ID No: 8)
CDR-H2 (or HCDR2): WIDPENGKTVFDPKFRG(SEQ ID No: 9)
CDR-H3 (or HCDR3: WNPLAF (SEQ ID No: 10)
【００１５】
Ｌ１−ＯＶ５２．２４モノクローナル抗体の免疫グロブリン遺伝子のｃＤＮＡ配列は以下の通りである。
コード：５’ＵＴＲ（一部、つまり配列している限り）、リーダー：IGKV/IGKJ or IGHV/IGHD/IGHJ, IGKC or IGHC
（重鎖）
CTGCCtCATGAATATGcAAACATGAGtCTGTGATTATAAATACAgagATATCCAtACCAAACAACtTATGAgCACTGTTTTCTCTACAGTCACTGAATCTCAAgGTCCTTACAATGcAATGCAGCTGGGTCATCTTCTTCCTGATGGCAGTGGTTACAGGGGTCAATTCAGAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTTAGTCAAGTTGTCCTGCAAAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTACTATATGCAGTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGATGGATTGATCCTGAGAATGGTAAAACAGTTTTTGACCCGAAGTTCCGGGGCAAGGCCAGTATATCAGCGGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGATGGAACCCCCTTGCCT
TCTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGGAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCCCTCGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGAACACGAATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAATGA (SEQ ID No: 4)
（軽鎖）
TTTGATGACTGCTTTGCATAGATCCCTAGAGGCCAGCCCAGCTGCCCATGATTTATAAACCAGGTCTTTGCAGTGAGATCTGAAATACATCAGATCAGCATGGGCATCAAGATGGAGTCACAGACTCAGGTCTTTGTATACATGTTGCTGTGGTTGTCTGGTGTTGATGGAGACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTAATGTGGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGTCACTCTCCTAAAGCACTGATTTACTCGACATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCCGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTACTTCTGTCAGCAATATAACACCTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAG (SEQ ID No: 3)
【００１６】
好適な実施形態では、結合分子は抗Ｌ１−モノクローナル抗体、又は前記抗体の抗原結合性フラグメントである。
ここで、結合分子とは、目的の標的と特異的に結合するポリペプチドであると理解できる。本発明によれば、標的はＬ１タンパク質である。従って、本発明の結合分子類は、特異的にＬ１と結合する。好適には、結合分子は、免疫グロブリン含有分子である。つまり、少なくとも１個のＩｇドメイン、又は抗Ｌ１抗体を有するものである。
なお、「特異的結合」とは、ウエスタンブロットやＥＬＩＳＡなどで測定したとき、結合分子のＬ１への結合が、アルブミンなどのコントロールタンパク質との結合よりも、少なくとも50倍、好適には少なくとも１００倍強いこと、として理解できる。
また、本明細書中使用する「抗Ｌ１抗体」の用語は、天然に存在する抗体と類似な構造をもち、Ｌ１と結合可能な任意のポリペプチドを意味する。なお、結合特異性は、前記ポリペプチドのＣＤＲ類によって決定される。したがって、「抗Ｌ１抗体」は、Ｌ１と結合する免疫グロブリン由来の構造を意図する。また、抗原結合性フラグメントとは、完全長の抗体の少なくとも一個の抗原結合性フラグメントを有するポリペプチドとして理解される。なお、抗原結合性フラグメントは、重鎖の可変ドメインおよび軽鎖の可変ドメインとから少なくとも構成され、両ドメインともに特定の抗原と結合できるように配置される。
【００１７】
モノクローナル抗体類は、全てが一つの親細胞のクローンである一種類の免疫細胞により生産されるため、同一の単一特異性抗体である。「モノクローナル抗体」及びモノクローナル抗体の生産は、最先端分野に属する。一般に、モノクローナル抗体は、例えば、公知のＷｉｎｔｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ法（Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ（１９９１）  Ｎａｔｕｒｅ，３４９，２９３−２９９）に従って生産できる。或いは、モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを用意する代わりに、目的のポリペプチドで組換
コンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）をスクリーニングすることで、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を、同定し単離することができる。ファージディスプレイライブラリーの作製用及びスクリーニング用キットは市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ,  カタログ番号２７−９４００−０１；及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕｒｆＺＡＰ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ
Ｋｉｔ，カタログ番号２４０６１２）。さらに、抗体ディスプレイライブラリーの作製用及びスクリーニング用に使用するに特に適した方法及び試薬の具体例は、例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；ＷＯ９２/１８６１９：ＷＯ９１/１７２７１；ＷＯ９２／２０７９１；ＷＯ９２/１５６７９；ＷＯ９３/０１２８８；ＷＯ９２/０１０４７；ＷＯ９２/０９６９０；ＷＯ９０/０２８０９；Ｆｕｃｈｓ等、１９９１、Ｂｉｏ/Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙ等、１９９２、Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５；Ｈｕｓｅ等、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ等、１９９３、ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４に見出すことができる。
【００１８】
「完全長」又は「完全」抗体とは、ジスルフィド結合で相互に結合した２個の重鎖（Ｈ）及び２個の軽鎖（Ｌ）を有するタンパク質を表す。前記タンパク質は、（１）重鎖については、可変領域、並びにＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３の３個のドメインを有する重鎖定常領域を有し、（２）軽鎖については、軽鎖可変領域、並びに、ＣＬの１領域を有する軽鎖定常領域を有する。また、「完全抗体」の用語については、変異、欠損又は挿入などの修飾を各ドメインが有していたとしても、全体のドメイン構造は変化しておらず、天然型抗体（つまり、３又は４個の定常ドメインからなる重鎖と、１個の定常ドメインとともにそれぞれの可変ドメインとからなる軽鎖とを有する）の典型的な全ドメイン構造をもつ任意の抗体のことを意味する。例えば、ｍＡｂ  Ｌ１−ＯＶ５２．２４は、完全長抗体である。
【００１９】
モノクローナル抗体の「抗原結合性フラグメント」とは、前記フラグメントが由来する完全モノクローナル抗体と同じ機能と特異性を本質的に示す、モノクローナル抗体のフラグメントのことである。パパインを用いる限定的タンパク質分解によって、Ｉｇプロトタイプを３個のフラグメントに切断する。同一アミノ酸末端をもつ２個のフラグメントは、各々が１個の完全なＬ鎖と約半分のＨ鎖を有しており、抗原結合性フラグメントである（Ｆａｂ）。一方、第３のフラグメントは、同様の大きさであり、鎖間ジスルフィド結合を有する２個の重鎖のカルボン酸末端を含み、結晶性フラグメント（Ｆｃ）である。このＦｃは炭水化物、相補的結合部位及びＦｃＲ結合部位を含有する。ペプシンの限定的分解によって、Ｆａｂフラグメント及びヒンジ領域の両方を有し、Ｈ−Ｈ鎖間ジスルフィド結合をもつ一個のＦ（ａｂ’）２フラグメントを産生する。Ｆ（ａｂ’）２は抗原結合において二価である。Ｆ（ａｂ’）２のジスルフィド結合は、Ｆａｂ’を得るために開裂される。また、重鎖及び軽鎖の可変領域は共に結合し、一本鎖可変領域フラグメントを形成する（ｓｃＦｖ）。
【００２０】
完全な大きさの抗体である第一世代抗体には幾つかの問題点があったために、多くの第二世代抗体は抗体のフラグメントだけを有している。可変領域（Ｆｖｓ）はＶＬ１個とＶＨ１個とからなる完全な抗体結合性ドメインをもつ最小の断片である。こうした断片は結合ドメインだけを有するが、酵素的手段を用い、又は、微生物細胞や真核性細胞で関連する遺伝子断片を発現させるなどして生産できる。様々な手段を使用できるが、例えば、ＦＶフラグメント単独、又は、ＦＶに加えて第１定常ドメインを有する“Ｙ”の上腕部分の１つをもつ‘Ｆａｂ’フラグメントの何れか一方を使用できる。２つの鎖の間にポリペプチド結合を導入することで一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が生産され、このようなフラグメントは通常安定する。或いは、ジスルフィド結合したＦｖ（ｄｓＦｖ）フラグメントを使用し
てもよい。完全長抗体を生産するために、フラグメントの結合ドメインを、任意の定常ドメインと結合、又は、その他のタンパク質及びポリペプチドと融合してもよい。
【００２１】
組換抗体のフラグメントは、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントである。通常、前記フラグメントは抗原に高い親和力をもち、多様なホストで発現できる。こうした特性及びその他の特性により、ｓｃＦＶフラグメントは医薬に応用できるばかりか、生物工学的応用も可能である。上記したように、ｓｃＦｖフラグメント中、ＶＨ及びＶＬドメインは親水的で柔軟なペプチドリンカーと結合しており、これによって発現効率及び折りたたみ効率が向上する。通常、約１５個のアミノ酸からなるリンカーが使用されるが、そのうち、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーが最も頻繁に使用される。使用するリンカーに応じて、ｓｃＦｖ分子は容易にタンパク分解してしまう。遺伝子工学技術の発達によって、機能と安定性の改善に焦点を当てた研究から、このような制約は実際に克服できるであろう。例えば、ＶＨ−ＶＬ二量体が鎖間ジスルフィド結合によって安定化したジスルフィド安定化（つまりジスルフィド結合）Ｆｖフラグメントの生産例が挙げられる。ＶＬドメインとＶＨドメインとの間の界面に、システイン類を導入し、これら２個のドメインを一緒に固定するジスルフィド架橋を形成する。
ｓｃＦｖが解離すると、モノマーのｓｃＦｖとなり、二量体（ジアボディ、diabody）、三量体（トリアボディ、triabody）、又は、タンダブ（ＴａｎｄＡｂ）やフレキシボディ（Ｆｌｅｘｉｂｏｄｙ）などのより大きな集合体になることができる。
【００２２】
結合ドメインをもつ抗体は、２個のｓｃＦｖを単純なポリペプチド結合で結合させる（（ｓｃＦｖ）２）、或いは２個の単量体の二量化（ジアボディ）の何れかにより生産できる。最も単純な設計物は、同一、類似（二価のジアボディ）、又は別個の抗原へ特異性を有する（二重特異性ジアボディ）、これら何れか一つである２個の機能的抗原結合ドメインを有するジアボディである。
他方、重鎖の４個の可変ドメインと、軽鎖の４個の可変ドメインとを有する抗体構成物の開発が行われてきた。こうした具体例には、四価の二重特異性抗体が挙げられる（ＴａｎｄＡｂ及びＦｌｅｘｉｂｏｄｙ、Ａｆｆｉｒｍｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ＡＧ、ハイデルベルグ、ドイツ）。二重特異性ジアボディとは対照的に、二重特異性ＴａｎｄＡｂは、１個のポリペプチドだけで構成されたホモ二量体である。２個の異なる鎖があるために、ジアボディは３個の異なる二量体を構築でき、この３個の内１個だけが機能する二量体を構築できる。従って、この同種産物を生産し、精製することが簡単かつ安価である。また通常、ＴａｎｄＡｂは、より良い結合特性（結合部位数の二倍所持）及びより良いインビボ安定性を示す。Ｆｌｅｘｉｂｏｄｙ類は、ｓｃＦｖとジアボディの多量体モチーフとの組み合わせなので、この結果、細胞表面で互いに非常に離れた場所に位置する２個の分子を結合させる高い柔軟性をもつ多価分子となる。仮に、３個以上の機能性抗原結合性ドメイン類が存在し、これらドメイン類が別個の抗原に対して特異性を有する場合、このような抗体は多特異性である。
【００２３】
以上まとめると、特定の開示配列あるいは代替物が挿入された特異的免疫グロブリンは、本発明の具体的実施形態を構成する次のような結合分子類の必須部分を形成する。本発明の具体的実施形態を構成する結合分子は、これに限定するものではないが、Ｆａｂ（軽鎖可変領域（ＶＬ）、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖定常領域（ＣＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ））を有する一価のフラグメント）；Ｆ（ａｂ’）２（ジスルフィド架橋で又はヒンジ領域で結合された２個のＦａｂフラグメントを有する二価のフラグメント）；Ｆｖ（ＶＬ及びＶＨドメイン）；ｓｃＦｖ（ＶＬとＶＨとがリンカー、例えば、ペプチドリンカーで結合した一本鎖Ｆｖ）；二重特異性抗体分子（抗体又は受容体リガンドなどの別のペプチド又はタンパク質を含む、抗体とは異なる結合特異性をもつ第２機能性部位に結合した、本明細書に開示されるポリペプチドを含む抗体分子）；二重特異性一本鎖Ｆｖ二量体；ジアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ（ＣＨ３に結合したｓｃＦｖ）等
である。
【００２４】
限定されないが、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ジアボディ、又はドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ）を含む、モノクローナル抗体の結合分子又は抗原結合性フラグメントは、ＶＨ及びＶＬドメインを並べるジスルフィド架橋を組み入れることにより、安定化される。なお、二重特異性抗体類は、従来技術、すなわち化学的又はハイブリッドハイブリドーマからの生産を含む特殊な方法、及びその他の技術、すなわちＢｉＴＥＴＭ技術（ペプチドリンカーをもち異なる特異性の抗原結合性領域をもつ分子）、及びノブ−イントゥ−ホール（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）技術等を用いて生産できる。
以上より、モノクローナル抗体の結合分子又は抗原結合性フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合のＦｖ、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、二価抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、ｄｉａｂｏｄｙ、ｔｒｉａｂｏｄｙ、ｔｅｔｒａｂｏｄｙ、又はミニボディ抗体である。
【００２５】
また、別の好適な実施形態では、結合分子はヒト抗体、キメラ抗体、又はヒト化抗体である。キメラ抗体とは、その免疫原性を下げるために、一つの種の免疫グロブリンの少なくとも一領域が遺伝子工学によって、別の種の免疫グロブリンの別の領域と融合した抗体である。例えば、マウスＶＬ及びＶＨ領域を、ヒト免疫グロブリンの残りの部分と融合できる。キメラ抗体の特有のタイプには、ヒト化抗体がある。ヒト化抗体は、非ヒト抗体のＣＤＲをコードするＤＮＡとヒト抗体産生ＤＮＡとを合体して調製する。こうして得られたＤＮＡコンストラクトは、ＣＤＲだけが非ヒト由来であるので、非ヒト非経口抗体又はキメラ抗体と同じ免疫反応を通常おこさない抗体を発現及び生産するのに使用できる。なお、この抗体はヒト抗体であってもよい。
ヒト抗体又は少なくともヒト化抗体の利用は、ヒトへの用途、例えば、インビボでの予防、治療又は診断などの用途に好適である。
本発明の好適な一実施形態中、結合分子、特にモノクローナル抗体は、ヒトＩｇＭ定常ドメイン、ヒトＩｇＧ１定常ドメイン、ヒトＩｇＧ２定常ドメイン、ヒトＩｇＧ３定常ドメイン、ヒトＩｇＧ４定常ドメイン、ヒトＩｇＥ定常ドメイン、及びヒトＩｇＡ定常ドメインからなる群から選ばれる、重鎖免疫グロブリン定常ドメインを有する。
【００２６】
結合分子、好適には本発明のモノクローナル抗体、の文脈において詳しく上記したように、天然型抗体の各重鎖は２つの領域、つまり、定常領域及び可変領域を有する。哺乳類の免疫グロブリン重鎖には、γ、δ、α、μ、及びεの５つのタイプがあり、それぞれ、免疫グロブリンの分類であるＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥを規定する。
なお、ヒトには４つのＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１、２、３及び４）が存在し、血清中の量の多さの順に命名されている（ＩｇＧ１が最も多い）。ＩｇＧサブクラスのＦｃ領域間では約９５％の相同性があるが、ヒンジ領域の構造は比較的相違している。この領域、すなわち、Ｆａｂアーム（抗原が結合するフラグメント）と、両方の重鎖の２個のカルボキシル末端ドメインであるＣＨ２及びＣＨ３、との間にあるこの領域が、前記分子の柔軟性を決定する。上部ヒンジ領域（アミノ末端に向かう）によって、Ｆａｂアーム間の角度可変性（Ｆａｂ−Ｆａｂ柔軟性）、並びに個々のＦａｂの回転柔軟性が可能となる。一方、下部ヒンジ領域（カルボキシル末端に向かう）の柔軟性によって、Ｆｃ領域からのＦａｂアームの位置（Ｆａｂ−Ｆｃ柔軟性）が直接決定される。ヒンジ依存的なＦａｂ−Ｆａｂ柔軟性、及びＦａｂ−Ｆｃ柔軟性は、相補的な活性化及びＦｃ受容体結合などの作動因子の機能を誘発する上で重要である。つまり、ヒンジ領域の構造によって、４個のＩｇＧサブクラスの各々にユニークな生物学的特徴が与えられる。
【００２７】
ヒンジ領域の長さ及び柔軟性は、ＩｇＧサブクラス間で異なる。ＩｇＧのヒンジ領域はアミノ酸２１６−２３１を含有し、また、束縛なく柔軟なので、Ｆａｂフラグメント類は対称軸の周りを回転し、２個の重鎖間ジスルフィド架橋の第１架橋を中心とした球体内で
動く。ＩｇＧ２は、ＩｇＧ１よりも短いヒンジを有し、このヒンジは１２アミノ酸残基と４個のジスルフィド架橋をもつ。ＩｇＧ２のヒンジ領域はグリシン残基を欠いており、その長さは比較的短く、硬くて曲がらないポリプロリン二重らせんを含有し、追加の重鎖間ジスルフィド架橋によって安定している。こうした特性により、ＩｇＧ２の柔軟性は制限される。また、ＩｇＧ３はそのユニークで長く伸びたヒンジ領域（ＩｇＧ１ヒンジの約４倍の長さ）により、他のＩｇＧサブクラスとは異なっている。前記ヒンジ領域は、６２個のアミノ酸を含み（２１個のプロリンと１１個のシステインを含む）、柔軟性のないポリプロリン二重らせんを形成する。ＩｇＧ３中のＦａｂフラグメントはＦｃフラグメントから比較的遠く離れて位置し、分子に大きな柔軟性を与えている。また、ＩｇＧ３の長いヒンジにより、他のＩｇＧサブクラスに比べて、大きな分子量を有する。一方、ＩｇＧ４のヒンジ領域はＩｇＧ1のヒンジ領域よりも短く、その柔軟性はＩｇＧ１とＩｇＧ２との中間である。
従って、より好適な実施形態では、結合分子は、一本鎖の抗体、ｓｃＦｖの多量体（好適にはｓｃＦｖ及びジアボディ、トリアボディ、又はテトラボディ）、と、抗体断片（好適にはＦａｂ、Ｔａｎｄａｂ、Ｆｌｅｘｉｂｏｄｙ、及び二重特異性抗体）、からなるグループから選ばれる。
さらに好適な実施形態では、結合分子はキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体であるか、或いは、これら抗体の抗原結合性フラグメントである。
【００２８】
また、実施例から分かるように、抗体Ｌ１−ＯＶ５２．２４のエピトープは、Ｌ１のフィブロネクチンドメインＩＩＩ４−５内に存在する。従って、結合分子のエピトープは、特に本発明のモノクローナル抗体やこれら抗体の抗原結合性断片のエピトープは、Ｌ１のフィブロネクチンドメインＩＩＩ４−５内に存在することが好ましい。
よって、好適な実施形態では、前記エピトープはＬ１のフィブロネクチンドメインＩＩＩ４−５（ＦＮＩＩＩ４−５）内に存在する。
Ｌ１−ＯＶ５２．２４は以下のＣＤＲ配列を有する。つまり、KASQNVGTNVA (LCDR1; SEQ ID No: 5), STSYRYS (LCDR2; SEQ ID No: 6), QQYNTYPYT (LCDR3; SEQ ID No: 7), FNIKDYYMQ (HCDR1; SEQ ID No: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (HCDR2; SEQ ID No: 9), 及び WNPLAF (HCDR3; SEQ ID No: 10)である。
上記した配列は、当技術分野で周知のＫａｂａｔの方法に従って決定された、モノクローナル抗体Ｌ１−ＯＶ５２．２４のＣＤＲである。
従って、好適な実施形態中、結合分子は、抗Ｌ１モノクローナル抗体、又は、前記抗体の抗原結合性フラグメントである。ここで、前記抗Ｌ１モノクローナル抗体、又は、前記抗体の抗原結合性フラグメントの相補性決定領域類（ＣＤＲ類）の少なくとも１個は、
ａ）KASQNVGTNVA (SEQ ID No: 5), STSYRYS (SEQ ID No: 6), QQYNTYPYT (SEQ ID No: 7), FNIKDYYMQ (SEQ ID No: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (SEQ ID No: 9), 及び WNPLAF (SEQID No: 10)から選ばれる配列の１つを有する。或いは、
ｂ）上記ａ）で記載した配列に比べて、少なくとも一つの保守的アミノ酸置換を有する。
【００２９】
本発明の、このようなモノクローナル抗体やこの抗体の抗体結合性フラグメントは、例えば、ＣＤＲグラフト技術、又はリコンビナント抗体産生により生産できる。このような方法は本技術分野で周知である（例えば、Ｑｕｅｅｎ等、米国特許第５，５８５，０８９号、Ｗｉｎｔｅｒ等、米国特許第５，２２５，５３９号、Ｃａｂｉｌｌｙ等、米国特許第４，８１６，５６７号参照）。
また、前記ＣＤＲ類の配列は変更してもよく、保守的アミノ酸置換になる変更が好ましい。
一般に、配列の変更は、ＣＤＲ領域同様にＦＲでの変換となり、アミノ酸残基の変換、削除、及び挿入を含む。また、こうした変更は、ランダム又は部位特異的変異導入により誘導されてもよい。また、先に述べたように、抗体ファージディスプレーシステムを、所
望の及び／又は改善した特徴を有する変異体の選別に用いてもよい。
好適な実施形態中、本発明の結合分子は、抗Ｌ１モノクローナル抗体、又はこの抗体の抗原結合性フラグメントであって、随意1箇所以上の保守的アミノ酸置換が存在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）QQYNTYPYT (SEQ ID No: 7) 及び WNPLAF (SEQ ID No: 10)を有することを特徴とする。
なお、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７は、Ｌ１−ＯＶ５２．２４のＬＣＤＲ３配列を表し、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０は、Ｌ１−ＯＶ５２．２４のＨＣＤＲ３配列を表す。ＬＣＤＲ３とＨＣＤＲ３は、抗体の結合特性に重要であることが知られている。
【００３０】
より好適な実施形態中、本発明の結合分子は、結合分子が、抗Ｌ１モノクローナル抗体、又はこの抗体の抗原結合性フラグメントであって、以下の相補性決定領域類（ＣＤＲ類）、つまり、KASQNVGTNVA(SEQ ID No: 5), STSYRYS (SEQ ID No: 6), QQYNTYPYT (SEQ ID
No: 7), FNIKDYYMQ (SEQ ID No: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (SEQ ID No: 9), 及び WNPLAF
(SEQ ID No: 10)を有し、ここで随意一箇所以上の保守的アミノ酸置換が存在する、ことを特徴とする。
ある好適な実施形態中、保守的アミノ酸置換は存在しない。
さらにより好適な実施形態中、本発明の結合分子は、結合分子が、抗Ｌ１モノクローナル抗体、又はこの抗体の抗原結合性フラグメントであって、以下の相補性決定領域類（ＣＤＲ類）、つまり、KASQNVGTNVA(LCDR1;SEQ ID No: 5), STSYRYS (LCDR2;SEQ ID No: 6),
QQYNTYPYT (LCDR3;SEQ ID No: 7), FNIKDYYMQ (HCDR1;SEQ ID No: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (HCDR2;SEQ ID No: 9), 及び WNPLAF (HCDR3;SEQ ID No: 10)を有し、ここで随意一箇所以上の保守的アミノ酸置換が存在する、ことを特徴とする。
他方、ある好適な実施形態では、保守的アミノ酸置換が存在しない。
更に又、より好適な実施形態では、前記の抗Ｌ１モノクローナル抗体、又はこの抗体の抗原結合性フラグメントは、ＩｇＧ１抗体又はＩｇＧ１抗体の抗原結合性フラグメントである。
【００３１】
また、別の好適な実施形態では、本発明の結合分子は、
ａ）KASQNVGTNVA (SEQ ID No: 5), STSYRYS (SEQ ID No: 6), QQYNTYPYT (SEQ ID No: 7), FNIKDYYMQ (SEQ ID No: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (SEQ ID No: 9), 及び WNPLAF (SEQID No: 10)  から選ばれる配列の少なくとも１個を有するか、或いは
ｂ）上記ａ）で記載した配列に比べて、少なくとも一箇所の保守的アミノ酸置換を有する。
更に好適な実施形態では、本発明の結合分子は、QQYNTYPYT (SEQ ID No: 7) 及び WNPLAF (SEQ ID No: 10)  の配列を有し、随意一箇所以上の保守的アミノ酸置換が存在することを特徴とする。
更により好適な実施形態中、本発明の結合分子は、KASQNVGTNVA (SEQ ID No: 5), STSYRYS (SEQ ID No: 6), QQYNTYPYT (SEQ ID No: 7), FNIKDYYMQ (SEQ ID No: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (SEQ ID No: 9), 及びWNPLAF (SEQ ID No: 10)  の配列を有し、随意一箇所以上の保守的アミノ酸置換が存在することを特徴とする。
他方、ある好適な実施形態では、保守的アミノ酸置換が存在しない。
【００３２】
また、ある好適な実施形態中、本発明の結合分子は、KASQNVGTNVA (SEQ ID No: 5), STSYRYS (SEQ ID No: 6), QQYNTYPYT (SEQ ID No: 7), FNIKDYYMQ (SEQ ID No: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (SEQ ID No: 9), 及び WNPLAF (SEQ ID No: 10)からなる相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する抗Ｌ１モノクローナル抗体であるか、或いは、その抗体の抗原結合性フラグメントである。
また、ある好適な実施形態中、本発明の結合分子は、相補性決定領域類（ＣＤＲ類）、KASQNVGTNVA (LCDR1; SEQ ID No: 5), STSYRYS (LCDR2; SEQ ID No: 6), QQYNTYPYT (LCDR3; SEQ ID No: 7), FNIKDYYMQ(HCDR1; SEQ ID No: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (HCDR2; SEQ
ID No: 9), 及び WNPLAF (HCDR3; SEQ ID No: 10)を有する抗Ｌ１モノクローナル抗体であるか、或いは、前記抗体の抗原結合性フラグメントである。
【００３３】
なお、本発明の結合分子は、Ｌ１に対して強い親和力を示すことが好ましい。Ｌ１−ＯＶ５２．２４はＬ１に対して、ＫＤ（Ｍ）＝２．４１＊１０−９の親和力を示すことを見出した。
Ｌ１に対する親和力は、本技術分野で周知の方法、例えば、表面プラズモン共鳴法により測定できる。Ｌ１−ＯＶ５２．２４の結合性分析は、ＣＭ５センサチップを備えたＢＩＡｃｏｒｅ３０００を用いて行った。簡単に述べると、ＥＤＣ／ＮＨＳでＢＩＡｃｏｒｅ
ＣＭ５チップを活性化し、様々なレベルのＬ１−Ｆｃを活性表面上で固定化した。残りの活性化部位は、エタノールアミン／ＨＣｌによってブロックした。Ｌ１−ＯＶ５２．２４はＬ１−Ｆｃ表面と結合し、経時的に解離することが可能となる。様々なＬ１−Ｆｃ密度のチップ表面のそれぞれへのそれぞれのインジェクションでの結合相と解離相をカイネティクス解析した。
従って、更に又好適な実施形態中、本発明の結合分子は、モノクローナル抗体又はこの抗体の抗原結合性フラグメントであることが好ましく、少なくとも１０−９Ｍの親和力（ＫＤ）、より好適には少なくとも１０−１０Ｍ又は１０−１１Ｍの親和力（ＫＤ）で、Ｌ１に結合することが好ましい。
【００３４】
驚くべきことに、実施例及び図で示すように、４０、６０、７０又は９０分間のインキュベート後、Ｌ１−ＯＶ５２．２４はＳＫＯＶ３ｉｐ細胞中に効率的に内部移行したが、他方、対照とした抗Ｌ１モノクローナル抗体９．３は、少ししか内部移行しないことを見出した。なお、内部移行は、蛍光化合物などの好適な診断用化合物と結合させた結合分子を用いて測定できる。例えば、蛍光色素としてＡｌｅｘａ４８８を使用した。実施例で述べたように、内部移行の定量化は顕微鏡解析及び計数化、又はイメージングフローサイトメトリーの何れかにより行える。両方の方法を用い、９．３抗体よりもＬ１−ＯＶ５２．２４の方が、測定した各点において少なくとも４倍効率的に内部移行することを見出した。また、驚くべきことに、市販の抗Ｌ１ＣＡＭモノクローナル抗体類５Ｇ３及びＵＪ１２７．１１に比べ、６０分及び９０分の測定時点において、Ｌ１−ＯＶ５２．２４はより効率的に内部移行することを見出した（図６参照）。実施例で測定した、こうしたＬ１−ＯＶ５２．２４の優れた，且つ驚くべき細胞内移行特性を、図７にまとめた。驚くべきことに、タイムポイント９０分でのＬ１−ＯＶ５２．２４の内部移行は、従来技術の抗Ｌ１ＣＡＭモノクローナル抗体、９．３、５Ｇ３及びＵＪ１２７．１１の内部移行のいずれよりも、それぞれｐ値０．０１以下（p＜０．０１）で
有意に多いことを見出した。従って、Ｌ１−ＯＶ５２．２４又はその抗原結合性フラグメント、つまり、Ｌ１−ＯＶ５２．２４と同じエピトープを認識する結合分子は、治療に有効な薬剤の輸送、或いは、画像化を目的とするような診断薬の輸送に特に好適である。
【００３５】
また、更に好適な実施形態では、本発明の結合分子は、Ｌ１を発現する哺乳類細胞で内部移行するものであって、好適には前記細胞はＬ１発現哺乳類腫瘍細胞であり、より好適にはＳＫＯＶ３ｉｐ細胞であることを特徴とする。
好適な実施形態中、Ｌ１発現哺乳類細胞、好適にはＳＫＯＶ３ｉｐ細胞での内部移行は、顕微鏡解析と定量、或いは、イメ−ジングフローサイトメトリーによって測定する。こうした測定方法は、実施例で記載したように行うことが好ましい。また、更に好適な実施形態では、ＷＯ２００８/１５１８１９に記載するように、４０、６０、７０又は９０分インキュベーション後に、モノクローナル抗体９．３の内部移行に比べて、少なくとも２倍、好適には少なくとも４倍、より好適には少なくとも７倍、最も好適には１０倍多く内部移行することが好ましい。また、更に好適な実施形態では、６０又は９０分インキュベーション後に、モノクローナル抗体５Ｇ３の内部移行に比べて、少なくとも２倍、より好適には少なくとも４倍多く内部移行することが好ましい。更にまた好適な実施形態では、
培養時間６０又は９０分後に、モノクローナル抗体ＵＪ１２７．１１の内部移行に比べて、少なくとも２倍、より好適には少なくとも４倍多く内部移行することが好ましい。
【００３６】
更にまた好適な実施形態では、本発明の結合分子は、モノクローナル抗体Ｌ１−ＯＶ５２．２４或いはその抗原結合性フラグメントであり、ここで、Ｌ１−ＯＶ５２．２４の軽鎖可変領域が、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の配列をもつか、又は、前記軽鎖がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３でコードされ、他方、Ｌ１−ＯＶ５２．２４の重鎖可変領域は、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２の配列をもつか、又は、前記重鎖がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３でコードされることを特徴とする。
また、ある好適な実施形態中、Ｌ１−ＯＶ５２．２４の軽鎖可変領域が、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の配列をもち、且つ、Ｌ１−ＯＶ５２．２４の重鎖可変領域が好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２の配列をもつことが好ましい。
なお、上記のように、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１及びＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２の配列は、ＶＪドメイン、つまり、Ｌ１−ＯＶ５２．２４の軽鎖可変領域と、ＶＤＪドメイン、つまりＬ１−ＯＶ５２．２４の重鎖可変領域に、それぞれに係る。
従って、ある実施形態中、本発明はモノクローナル抗体Ｌ１−ＯＶ５２．２４、又は、前記抗体の抗原結合性フラグメントに係る。モノクローナル抗体Ｌ１−ＯＶ５２．２４は、ここで、前記軽鎖及び重鎖の可変領域の各配列（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２及びＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１）によって明らかにされ、及び／又は、前記重鎖及び軽鎖をコードするｃＤＮＡによって明らかにされる（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３及びＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）。
【００３７】
特に好適な実施形態では、本発明の結合分子は治療に有効な物質と結合して、治療に有効な物質の内部移行を可能にする。
本発明の治療に有効な物質は、動物、好適には哺乳類、より好適にはヒトにおける治療効果又は予防効果を有する化合物として理解される。
より好適な実施形態中、前記治療に有効な物質は動物において治療効果又は予防効果を有し、腫瘍性疾患及び／又はＬ１発現に伴う疾患の治療又は予防に有用である。
ある好適な実施形態中、前記治療に有効な物質は化学療法に有用な化合物、つまり、化学療法化合物である。また、ある好適な実施形態中、前記治療に有効な物質は細胞毒性化合物又は細胞増殖抑制化合物である。
従って、一実施形態中、本発明は、治療に有効な物質に結合された本発明の結合分子に関し、
好適には、アルキル化剤、抗悪性腫瘍性抗生物質、抗代謝剤、及び天然物誘導体から選ばれる化学療法化合物や、細胞毒性化合物、細胞増殖抑制化合物、サイトカイン、ナノ粒子、或いは放射性核種に関する。
好適なサイトカイン類は、例えば、ＴＮＦアルファ、ＩＬ−２及びＩＬ−１２である。
また、好適な化学療法化合物は、本技術分野で周知である。こうした化合物は数種類に分類され、例えば、アルキル化剤、抗悪性腫瘍性抗生物質、抗代謝剤、及び天然物誘導体などに分類される。
【００３８】
本発明で使用できるアルキル化剤の例には、ブスルファン、カロプラチン、カルムスチン、クロランブシル、シスプラチン、シクロフォスファミド（つまりシトキサン）、ダカルバジン、イホスファミド、ロムスチン、メクロメタミン、メルファラン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、及びチオテパが挙げられる。
抗悪性腫瘍性抗生物質の例には、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、マイトマイシン（例えば、マイトマイシンＣ）、マイトキサントロン、ペントスタチン、及びプリカマイシンが挙げられる。
また、抗代謝剤の例には、フルオロデオキシウリジン、クラドリビン、シタラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、フルロウラシル、（例えば、５−フルロウラシル（５Ｆ
Ｕ））、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メルカトプリン、メトトレキセート、及びチオグアニンが挙げられる。
天然物誘導体の例には、ドセタキセル、エトポシド、イリノテカン、タキサン（例えば、パクリタキセル）、テニポシド、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、プレドニソン、及びタモキシフェンが挙げられる。
また、本発明に使用できる化学療法剤の追加例には、アスパラギナーゼ及びミトタンが挙げられる。
更に又、Ｃ２セラミドも使用できる。
【００３９】
本発明において「結合した」の用語は、共有結合及び非共有結合の両方を含むと理解されるが、好適には共有結合として理解される。共有結合で連結する場合の実施形態中、本発明の結合分子は、治療に有効な薬又は診断薬と直接結合でき、又は、好適なリンカーを介して結合される。本発明のより好適な実施形態では、結合分子は治療に有効な薬又は診断薬と、リンカーを介して結合する。好適なリンカーは本技術分野で周知である。
従って、ある好適な実施形態では、結合分子は治療に有効な薬及び／又は診断薬と共有結合し、随意リンカーを介して共有結合する。
好適な放射性核種には、６７／６４Ｃｕ、１３１Ｉ、１２４Ｉ又は９０Ｙが含まれる。こうした放射性核種は錯体形成部分を介して本発明の結合分子と、また、ヨウ素の場合には直接共有結合で、結合する。錯体形成部分は、好適には結合分子と共有結合で、或いは、リンカーを介して結合する。
このような抗体複合体は本技術分野で周知である（Ｗｕ  ＡＭ、Ｓｅｎｔｅｒ  ＰＤ．アーミング抗体：免疫複合体の展望と挑戦、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２３：  １１３７−１１４６，２００５；  Ｐａｓｔａｎ  Ｉ，  Ｈａｓｓａｎ  Ｒ，  ＦｉｔｓＧｅｒａｌｄ  ＤＪ，  Ｋｒｅｉｔｍａｎ  ＲＪ，  癌の免疫毒素治療、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．  ５８：２２１−２３７，２００７；ＷＯ９０/１２５９２，  ＷＯ２００７/０３０６４２；  ＷＯ２００４/０６７０３８；  ＷＯ２００４/００３１８３；  ＵＳ２００５/００７４４２６；  ＷＯ９４/０４１８９）。
より好適な実施形態中、治療に有効な物質は、化学療法剤、細胞毒性化合物又は細胞増殖抑制化合物であり、細胞増殖抑制化合物は、ＤＮＡ損傷剤、特にアクチノマイシン−Ｄ、ミトマイシンＣ、シスプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、ベラパミル、ポドフィロトキシン、５−ＦＵ、天然物誘導体とタキサン、好適にはパクリタキセル及びカルボプラチンから選ばれる。
【００４０】
また、本発明の結合分子を診断薬と結合することは有利である。
診断薬は直接又は間接的検出によって、シグナルを発することができる化合物である。ある好適な実施形態中、診断薬は哺乳類などの動物、より好適にはヒトへの投与に適する。本実施形態では、結合した結合分子はインビトロ及びインビボの両方で好適に使用できる。別の実施形態では、診断薬は哺乳類などの動物、或いはヒトへの投与に適さず、この実施形態では、結合した結合分子はインビトロで好適に使用できる。また、診断薬は直接又は間接的に検出される。直接検出する場合、本発明で好適に使用できる診断薬は、色素原類、蛍光群、化学発光群（例えば、アクリジニウムエステル又はジオキソエタン）、電気化学発光群、触媒、酵素、酵素基質、色素、蛍光色素、（例えば、フルオレセイン、クマリン、ローダミン、オキサジン、レゾルフィン、シアニン、及びこれらの誘導体）、コロイド状金属及び非金属粒子、有機ポリマーラテックス粒子などの、検出可能なマーカー群から選ぶことができる。診断薬の他の例として、ルテニウム又はユーロピウム錯体などの発光金属錯体及び放射性同位体が挙げられる。
【００４１】
また、間接的検出システムとしては、例えば、バイオアフィニティ結合対のパートナーが含まれる。好適な結合対の例としては、ハプテン又は抗原と抗体の対、ビオチン又はアミノビオチン、イミノビオチンやデスチオビオチンのようなビオチン類似体とアビジン又
はストレプトアビジンの対、糖とレクチンの対、核酸や核酸類似体と相補的核酸の対、及びステロイドホルモン受容体とステロイドホルモンのような受容体とリガンドの対、が挙げられる。
よって、更なる実施形態では、本発明は、放射性核種、化学発光化合物、蛍光化合物、色素又は酵素から選ばれることが好ましい診断薬と結合した、本発明の結合分子に係る。
実施例に示したように、Ｌ１−ＯＶ５２．２４モノクローナル抗体は、蛍光化合物又は蛍光色素、つまりＡｌｅｘａ色素（Ａｌｅｘａ４８８）と良好に結合した。
また、別の実施形態では、本発明の抗Ｌ１モノクローナル抗体を生産する融合細胞（ハイブリドーマ）に本発明は係る。
【００４２】
別の実施形態中、本発明は核酸に係り、この核酸は、
（ｉ）本発明の結合分子をコードする核酸、及び／又は
（ｉｉ）本発明の結合分子の少なくとも１個の鎖をコードする核酸、及び／又は
（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３の配列、及び／又は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４の配列を有する核酸、及び／又は
（ｉｖ）KASQNVGTNVA (SEQ ID No: 5), STSYRYS (SEQ ID No: 6), QQYNTYPYT (SEQ ID No: 7), FNIKDYYMQ (SEQ ID No: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (SEQ ID No: 9), 及び WNPLAF (SEQ ID No: 10)から選ばれる少なくとも１個の配列をコードする配列（類）を有する核酸，
である。
更にある好適な実施形態では、本発明の核酸はベクターの一部分である。このようなベクターは、大腸菌などのバクテリア、イースト菌細胞、昆虫細胞又は哺乳類細胞における発現用ベクターであることが好ましい。また、本発明の核酸は、好適にはベクター中のプロモーターやエンハンサーなどの好適な制御配列によって制御されるので、ホスト細胞で発現できる。これらベクターは、ホスト細胞中で複製できる配列をもつことが好ましい。
【００４３】
また、好適には、診断薬と結合した結合分子は、インビトロの診断目的に使用可能であり、生物工学的研究用の重要なツールに係る。例えば、患者の生検又は体標本一般を、本発明の結合分子を使用して分析できる。よって、更なる実施形態では、本発明は、インビトロ診断薬又はインビトロ生物工学的試薬として、本発明の結合分子を用いることに係る。更に又好適な実施形態では、本発明は、インビトロ診断薬又はインビトロ生物工学的試薬として、診断薬と結合させた本発明の結合分子の利用方法に係る。また、別の実施形態では、治療に有効な物質と結合した本発明の結合分子を、インビトロ生物工学的試薬として利用する方法に係る。
更に別の実施形態中、本発明は、医薬又は診断薬として利用できる、本発明の結合分子に係る。
特に好適な実施形態では、医薬品として使用する結合分子は、上記のように、治療に有効な物質と結合した結合分子である。前記結合分子は、前記治療に有効な物質を腫瘍細胞内に輸送し、この腫瘍細胞中で、前記結合分子に結合した治療に有効な物質が治療効果を発揮できる。
好適な実施形態中、前記治療に有効な物質は治療有効量で投与される。
さらに、ある好適な実施形態中、診断用に用いる結合分子は、診断薬と結合させた結合分子である。この結果、患者の画像化診断が可能となるので、本発明の結合分子によって、治療の予後又はモニタリングなどの診断が可能となる。従って、診断薬と結合させた本発明の結合分子は、本発明の治療に有効な物質と結合させた結合分子のためのコンパニオン診断薬であることが好ましい。
【００４４】
また、本発明の結合分子は、薬学的組成物に含まれることが好ましい。
ある化合物が、診断薬及び治療に有効な物質の両者を兼ね備えることは可能である。例えば、１３１Ｉなどの放射性核種は、インビボの画像化及び腫瘍治療の両方に好適に使用
できる。
一般に、本発明の薬学的組成物は、本発明の結合化合物を治療有効量有し、１個以上の薬学的に許容な担体を随意含有する。また、特定の実施形態中、「薬学的に許容」の用語は、動物、より好適にはヒトへの使用が連邦政府又は州政府の規制当局に承認されている、或いは、米国薬局方又は一般に認められた薬局方に記載されていることを意味する。
また、「担体」の用語は、治療剤と一緒に投与される、希釈剤、補助剤、賦形剤、又は、ビークルを表す。こうした薬学的担体には水や油類などの無菌液があり、例えば、石油性、動物性、植物性、合成由来の油類がある。以下に限定されるものではないが、ピーナッツオイル、大豆オイル、鉱油、ごま油などがこれに含まれる。なお、薬学的組成物を経口投与する場合、水が好適な担体となる。一方、薬学的組成物を静注投与する場合、生理食塩水及びブドウ糖水溶液が好適な担体となる。また、生理食塩水、ブドウ糖水溶液及びグリセリン水溶液は、注射液用の液体担体として好適に使用される。好適な薬学的賦形剤としては、でんぷん、ブドウ糖、乳糖、ショ糖、ゼラチン、モルト、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセリンモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセリン、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。
【００４５】
所望に応じ、前記組成物は、少量の湿潤剤、乳化剤、又はｐＨ調整剤も含有できる。こうした組成物は、溶液、懸濁液、乳化液、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、徐放性製剤などの剤形をとることができる。また、こうした組成物は、従来の結合剤やトリグリセリド類などの担体を用いた坐薬として製剤化できる。経口剤には、医薬品等級のマンニトール、乳糖、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的担体が含有される。また、好適な薬学的担体の具体例は、Ｅ．Ｗ.Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」に記載される。こうした組成物は、患者に適切に投与するための形状を提供するように、適した量の担体とともに、好適には精製された形状の、治療に有効な量の治療剤を含む。剤形は投与方法に適した形態であるべきである。
【００４６】
ある好適な実施形態では、ヒトへの静注投与に適した薬学的組成物として常法に従って組成物を製剤化する。通常、静注投与用の組成物は、無菌の等張水溶性バッファーの溶液である。必要に応じて、この組成物は、溶解剤と、注射部位の痛みを緩和するためにリドカインなどの局所麻酔剤とを含有してもよい。一般に、薬剤成分は個別に、或いは、単一投与形態中一緒に混合し、の何れかによって供給される。例えば、有効剤の量を示したアンプルや小袋などの密封容器に入れた凍結乾燥粉末や、水分を含まない濃縮液として提供される。また、組成物を点滴投与する場合、無菌の医薬品等級の水又は生理食塩水を含有する点滴用ボトルを用いて投与する。また、組成物を注射投与する場合、投与前に成分を混合できるように、注射用無菌水又は生理食塩水のアンプルを供給することができる。
本発明の治療薬は、そのままの形態又は塩の形態として製剤化できる。薬学的に許容される塩類には、塩酸、リン酸や、酢酸、シュウ酸、酒石酸などの遊離カルボキシ基で形成される塩類、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの遊離アミノ基で形成される塩類、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄などに由来する塩類、がある。
【００４７】
本発明の治療薬の量は、特定の疾患や病状を治療するのに有効であって、前記疾患や病状の性質に応じて、標準的臨床技術によって決定される。また、最適な投与量の範囲を決める一助として、インビトロ試験を随意使用してもよい。剤形中で使用できる正確な投与量は、投与経路や疾患又は病気の重さにも依存するが、医者の判断並びに個々の患者の状態に応じて決定されるべきものである。しかし、静注投与の好適な投与量の範囲は、一般に、ｋｇ体重当たり、有効成分約２０〜約５００μｇである。また、鼻腔内投与の好適な投与量の範囲は、一般に、体重当たり約０．０１ｐｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇである。なお
、有効投与量は、インビトロ、或いは動物モデルの試験系による、用量反応曲線から推定できる。一般に、坐薬は０．５重量％〜１０重量％の範囲で有効成分を含有し、経口剤では１０％〜９５％の活性成分を含有するのが好ましい。
【００４８】
様々な薬物輸送システムが知られており、本発明の治療薬の投与に使用できる。例えば、リポソーム、マイクロパーティクル、及びマイクロカプセルでの封入；治療薬を発現する組換細胞の使用；受容体介在型エンドサイトーシスの使用（Ｗｕ及びＷｕ、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２、４４２９−４４３２）；レトロウイルス又は他のベクターの一部としての治療用核酸の構築、などが挙げられる。以下に限定されるものではないが、投与方法としては、皮内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、静脈内投与、皮下投与、鼻腔内投与、硬膜外投与及び経口投与などが挙げられる。また、薬剤は任意の使いやすい経路で投与可能であり、例えば、点滴、ボーラス注射、上皮内吸収又は皮膚粘膜内吸収（例えば、口腔、直腸、腸粘膜など）が挙げられ、他の生理活性薬剤と一緒に投与してもよい。また、全身投与又は局所投与もできる。更に、本発明の薬学的組成物を、任意の好適な経路、すなわち脳室内及びくも膜下注入など、で中枢神経系に投与してもよい。脳室内注入は脳室内カテーテルで実施でき、例えば、オマヤレザバー（Ommaya reservoir）などのレザバーに装着して実施できる。また肺投与も利用可能であり、例えば、吸入器やネブライザーを用いたり、エアゾール剤を用いた処方も利用できる。
【００４９】
具体的な実施形態では、本発明の薬学的組成物を、治療に必要な領域に局所的に投与することが好ましい。例えば、以下に限定されるものではないが、術中の局所的点滴、局所投与、例えば、術後の創傷被覆材と併せた局所投与、注射による投与、カテーテルによる投与、坐薬による投与、移植片によるものが挙げられる。ここで、移植片は、多孔性、非多孔性又はゼラチン状の材料からなり、シリコン剤の膜や繊維などの膜状物が含まれる。ある実施形態中、悪性腫瘍、新生物性又は前がん病変部組織の部位（またはその病痕）に直接注入投与してもよい。
別の実施形態では、ベシクル、具体的にはリポソームで治療薬を輸送可能であり（Ｌａｎｇｅｒ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３）、より具体的には陽イオン性リポソーム（ＷＯ９８/４００５２）が挙げられる。
更に又別の実施形態では、放出制御システムによって治療薬を輸送できる。ある実施形態では、ポンプを用いてもよい（Ｌａｎｇｅｒ、上記論文）。また、別の実施形態では、治療ターゲットの近傍に放出制御システムを設置してもよく、この場合、全身投与量の一部だけですむ。
本発明のこの態様において、本発明は、患者の腫瘍疾患を治療又は予防する方法も含んでいる。この方法は、治療有効量の結合分子、好適には、本発明のモノクローナル抗体又はこの抗体の抗原結合性フラグメントを、この患者に投与することを含む。
【００５０】
本発明を通して、「有効量」の用語は、与えられた分子又は化合物が所望の治療効果を奏するのに十分量を投与されることを意味する。本発明を通して、２個の化合物が治療有効量で投与された場合、化合物の１個又は各々が、治療量以下の量で投与されることを含む。つまり、各化合物の量は単独で治療効果を発揮するのには十分な量ではないが、化合物を組み合わせることで所望の治療効果を得られることを含む。他方、本発明においては、単独の化合物の各々が治療有効量投与されることも含む。
本発明によれば、「腫瘍性疾患の治療」の用語は、腫瘍細胞を死滅させること、腫瘍細胞の増殖を減少させること（例えば、少なくとも３０％、少なくとも５０％又は少なくとも９０％まで）の両方を意味するのみならず、腫瘍性疾患を患う患者の腫瘍細胞の増殖を完全に阻害することも意味する。更に、前記用語は、腫瘍原性疾患の予防を意味し、例えば、将来腫瘍細胞になる、又はなり易い細胞を死滅させること、並びに腫瘍転移の予防も意味する。
また、本発明において適用される個々の治療が、患者の健康状態や疾患の重症度などに
依存し、このために、ケースバイケースで調整せねばならないことを、当業者は理解するであろう。
また、本発明はモノクローナル抗体又はこの抗体の抗原結合性フラグメント、或いは本発明の結合分子からなる薬学的組成物に係る。前記薬学的組成物は、先に述べた実施形態全てに適用される。
【００５１】
また、ある実施形態では、本発明は本発明の結合分子、好適にはモノクローナル抗体又はこの抗体の抗原結合性フラグメントに係り、腫瘍性疾患の治療又は予防に利用する。好適には、腫瘍性疾患は、上皮腫瘍性疾患、及び／又は、星状細胞腫、乏突起膠細胞系腫瘍、髄膜腫、神経線維腫、膠芽腫、上衣腫、シュワン細胞腫、神経線維肉腫、髄芽腫、メラノーマ、膵臓癌、前立腺癌、頭頚部癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、子宮内膜癌、腎癌、神経芽細胞腫、扁平上皮癌、髄芽細胞腫、肝癌、大腸癌、中皮腫、及び類上皮腫、からなる群から選ばれる疾患、であることを特徴とする。
更に、ある実施形態では、本発明は上記したように、本発明の結合分子と、随意１個以上の薬学的に許容な担体と、を含有する薬学的組成物に係る。
【００５２】
別の実施形態では、本発明は、Ｌ１と結合する結合分子に係り、前記結合分子は抗Ｌ１モノクローナル抗体、又はその抗体の抗原結合性フラグメントである。前記抗Ｌ１モノクローナル抗体、又はこの抗体の抗原結合性フラグメントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも１個は、
（ａ）KASQNVGTNVA (SEQ ID No: 5), STSYRYS (SEQ ID No: 6), QQYNTYPYT (SEQ ID No: 7), FNIKDYYMQ (SEQ ID No: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (SEQ ID No: 9), 及び WNPLAF (SEQ ID No: 10)から選ばれる配列の１個を有し、
（ｂ）上記（ａ）の配列と比較して、少なくとも一箇所の保守的アミノ酸置換を有することを特徴とする。
また、別の実施形態では、本発明はＬ１と結合する結合分子に係り、前記結合分子は、
（ａ）KASQNVGTNVA (SEQ ID No: 5), STSYRYS (SEQ ID No: 6), QQYNTYPYT (SEQ ID No: 7), FNIKDYYMQ (SEQ ID No: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (SEQ ID No: 9), 及び WNPLAF (SEQ ID No: 10)から選ばれる配列の少なくとも１個を有し、
（ｂ）上記（ａ）の配列と比較して、少なくとも一箇所の保守的アミノ酸置換を有することを特徴とする。
【００５３】
このようなモノクローナル抗体、又はこの抗体の抗原結合性フラグメント、或いは本発明の結合分子は、例えば、ＣＤＲグラフト技術又は前記抗体を組換産生することで生産できる。このような方法は、本技術分野で周知である（Ｑｕｅｅｎ，米国特許第５，５８５，０８９号、及びＷｉｎｔｅｒ，米国特許第５，２２５，５３９号、Ｃａｂｉｌｌｙ，米国特許第４，８１６，５６７参照）。
ここに記載した本発明の好適な実施形態は、本発明の全ての結合分子類、モノクローナル抗体類及びこれら抗体類の抗原結合性フラグメント類に適用される。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】Ｓｋｏｖ３ｉｐ細胞における、モノクローナル抗体  Ｌ１ＣＡＭ  ｍＡｂ９．３の細胞内取込測定  Ｓｋｏｖ３ｉｐ細胞を、Ａｌｅｘａ４８８結合Ｌ１ＣＡＭ  ｍＡｂ  Ｌ１−９．３と共に異なる時間インキュベートした。試料を固定化し、細胞表面結合抗体を、Ａｌｅｘａ６４７と結合したヤギ抗マウス二次抗体を用いて検出した。タイムポイント０分の細胞は、抗体の内部移行を避けるために氷の上でインキュベートした。ＡｍｎｉｓＩＳＸイメージングフローサイトメーターで試料を測定し、３０００個の細胞を採取し、Ａｍｎｉｓ  ＩＤＥＡＳソフトウエアを用いて分析した。（Ａ）はタイムポイント０分で採取した細胞の画像であり、（Ｂ）はタイムポイント６０分、（Ｃ）はタイムポイント９０分の画像である。直下のグラフは、試料の各測定値を示す。（Ｄ）はタイムポイント０分を示し、（Ｅ）はタイムポイント６０分、（Ｆ）はタイムポイント９０分を示す。ｙ軸は正規化細胞存在比率を示し、ｘ軸は細胞の全蛍光強度に対するＡｌｅｘａ４８８結合Ｌ１ＣＡＭ  ｍＡｂ９．３の細胞内蛍光強度を示す。グラフの下にある表は、分析（計数）した細胞数と、グラフの平均値を示す。この実験は３回繰り返して行い、代表的結果を示した。
【図２】Ｓｋｏｖ３ｉｐ細胞における、抗体Ｌ１ＣＡＭ  ｍＡｂ  ＯＶ５２．２４の細胞内取込測定  Ｓｋｏｖ３ｉｐ細胞を、Ａｌｅｘａ４８８結合Ｌ１  ｍＡｂ  ＯＶ５２．２４と共に異なる時間インキュベートした。試料を固定化し、細胞表面結合抗体を、Ａｌｅｘａ６４７と結合したヤギ抗マウス二次抗体を用いて検出した。タイムポイント０分の細胞は、抗体の内部移行を避けるために氷の上でインキュベートした。ＡｍｎｉｓＩＳＸイメージングフローサイトメーターで試料を測定し、３０００個の細胞を採取し、Ａｍｎｉｓ  ＩＤＥＡＳソフトウエアを用いて分析した。（Ａ）はタイムポイント０分で採取した細胞の画像であり、（Ｂ）はタイムポイント６０分、（Ｃ）はタイムポイント９０分の画像である。直下のグラフは、試料定量化を示す。（Ｄ）はタイムポイント０分を示し、（Ｅ）はタイムポイント６０分、（Ｆ）はタイムポイント９０分を示す。ｙ軸は正規化細胞存在比率を示し、ｘ軸は細胞の全蛍光強度に対するＡｌｅｘａ４８８結合Ｌ１  ｍＡｂ  ＯＶ５２．２４の細胞内蛍光強度を示す。グラフの下にある表は、分析（計数）した細胞数と、グラフの平均値を示す。この実験は３回繰り返して行い、代表的結果を示した。
【図３】Ｓｋｏｖ３ｉｐ細胞における、Ｌ１ＣＡＭ  ｍＡｂ  ９．３及びｍＡｂ  ＯＶ５２．２４の細胞内取込  この図は、図１及び図２で得られた結果の概要を示す。上段はＬ１ＣＡＭ  ｍＡｂ  ９．３の、下段はＬ１ＣＡＭ  ｍＡｂ  ＯＶ５２．２４の、タイムポイント０分、６０分、９０分のグラフを表す。
【図４Ａ】共焦点レーザー走査顕微鏡を使用した、Ｓｋｏｖ３ｉｐ細胞における、Ｌ１ＣＡＭ  ｍＡｂ  ９．３及びｍＡｂ  ＯＶ５２．２４の細胞内取込測定  Ｓｋｏｖ３ｉｐ細胞を、Ａｌｅｘａ４８８結合Ｌ１ＣＡＭ  ｍＡｂ  ９．３、又はｍＡｂ  ＯＶ５２．２４と共に７０分間インキュベートした。試料を固定化し、細胞表面に結合した抗体を、Ａｌｅｘａ６４７と結合したヤギ抗マウス二次抗体を用いて検出した。次に、Ｌｅｉｃａ  ＳＰ５  ＩＩ共焦点レーザー走査顕微鏡で、試料を視覚化した。Ｚ切片は類似ｚ位置で得た。各抗体について、ｎ＝３０の細胞を採取して定量化した。
【図４Ｂ】共焦点レーザー走査顕微鏡を使用した、Ｓｋｏｖ３ｉｐ細胞における、Ｌ１ＣＡＭ  ｍＡｂ  ９．３及びｍＡｂ  ＯＶ５２．２４の細胞内取込測定  Ｆｉｊｉ（ＩｍａｇｅＪ）を使用して画像を分析し、細胞の全蛍光強度に対するＡｌｅｘａ４８８結合Ｌ１  ｍＡｂ  ９．３及びｍＡｂ  ＯＶ５２．２４の細胞内蛍光強度を、棒グラフとして表した。この実験は３回繰り返して行い、代表的結果を示した。４０分及び７０分における左側のバーは、それぞれｍＡｂ  ９．３の結果を示す。一方、４０分及び７０分における右側のバーは、それぞれｍＡｂ  ＯＶ５２．２４の結果を示す。
【図５】共焦点レーザー走査顕微鏡を使用した、Ｓｋｏｖ３ｉｐ細胞における、Ｌ１ＣＡＭ  ｍＡｂ  ５Ｇ３及びｍＡｂ  ＵＪ１２７．１１の細胞内取込測定  Ｓｋｏｖ３ｉｐ細胞を、Ａｌｅｘａ４８８結合Ｌ１ＣＡＭ  ｍＡｂ  ５Ｇ３又はｍＡｂ  ＵＪ１２７．１１とともに７０分間培養した。試料を固定化し、細胞表面に結合した抗体を、Ａｌｅｘａ６４７と結合したヤギ抗マウス二次抗体を用いて検出した。次に、Ｌｅｉｃａ  ＳＰ５  ＩＩ共焦点レーザー走査顕微鏡で、試料を視覚化した。Ｚ切片は類似ｚ位置で得た。各抗体について、ｎ＝３０の細胞を採取した。図は代表的結果を示す。
【図６】Ｓｋｏｖ３ｉｐ細胞における、Ｌ１ＣＡＭ  ｍＡｂ  ９．３、ｍＡｂ  ＯＶ５２．２４、ｍＡｂ  ５Ｇ３及びｍＡｂ  ＵＪ１２７．１１の細胞内取込測定  Ｓｋｏｖ３ｉｐ細胞を、Ａｌｅｘａ４８８結合Ｌ１ＣＡＭ  ｍＡｂ類とともに異なる時間培養した。試料を固定化し、細胞表面に結合した抗体を、Ａｌｅｘａ６４７と結合したヤギ抗マウス二次抗体を用いて検出した。タイムポイント０分の細胞は、抗体の内部移行を避けるために氷の上でインキュベートした。ＡｍｎｉｓＩＳＸイメージングフローサイトメーターで試料を測定し、５０００個の細胞を採取し、Ａｍｎｉｓ  ＩＤＥＡＳソフトウエアを用いて分析した。左側のグラフはタイムポイント０分の画像を示し、中央のグラフはタイムポイント６０分、右側のグラフはタイムポイント９０分の画像である。ｙ軸は正規化細胞存在率を示し、ｘ軸は細胞の全蛍光強度に対するＡｌｅｘａ４８８結合Ｌ１  ｍＡｂ類の細胞内蛍光強度を示す。各条件における相対的な細胞内蛍光強度の平均値を、グラフに示した。この実験は３回繰り返して行い、代表的結果を示した。
【図７】Ｓｋｏｖ３ｉｐ細胞における、Ｌ１ＣＡＭ  ｍＡｂ  ９．３、ｍＡｂ  ＯＶ５２．２４、ｍＡｂ  ５Ｇ３及びｍＡｂ  ＵＪ１２７．１１の細胞内取込測定  図７は図６の代表的分析結果をまとめたものである。３つの個別に異なる実験結果を、各Ｌ１ＣＡＭ  ｍＡｂ実験における相対的な平均細胞内蛍光強度に基づいてグラフに表した。強度の値は、平均±標準偏差として棒グラフで表示した。また、異なるＬ１ＣＡＭ  ｍＡｂ類の内部移行における統計的に有意な増加或いは減少の確率を決定するために、両側検定、独立スチューデントｔ−検定により、３つの個別の実験結果を分析した。ｐ値＜０．０５のとき統計的に有意と考える。また、アステリスクは以下を表す：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
以下に実施例を示す。
【実施例１】
【００５６】
［材料及び方法］
（細胞株）
ヒト卵巣癌細胞ＳＫＯＶ３ｉｐを、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（米国、バージニア州、マナサス）から入手した。この細胞株はＧｅｒｍａｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌ（ブラウンシュウェイグ、ドイツ）により認証を受け、全培養を通して通常の細胞形態であることを評価した。マイコプラズマ非検出培養であることを毎週試験して確認した。１０％の熱失活処理したウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｂｉｏｃｈｅｍ、ベルリン、ドイツ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスルーヘ、ドイツ）及び１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えたＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ダイゼンホッフェン、ドイツ）で、細胞を培養した。全細胞は、３７℃及び５％ＣＯ２の加湿雰囲気下で培養された。
（モノクローナル抗体類）
ヒトＬ１ＣＡＭに対するモノクローナル抗体、ｍＡｂ-Ｌ１−９．３は、先に説明されている（非特許文献６、特許文献１）。
Ｌ１−ＯＶ５２．２４は、Ｌ１の外部ドメインを有するヒトＬ１−Ｆｃタンパク質でマウスを免疫して、又はＳＫＯＶ３ｉｐ細胞を免疫に使用して、生産した。
Ｌ１−ＯＶ５２．２４モノクローナル抗体の免疫グロブリン遺伝子のｃＤＮＡ配列を決定し、先に上記した（軽鎖：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３及び重鎖：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）。
【００５７】
また、Ｌ１−ＯＶ５２．２４の重鎖及び軽鎖（定常ドメインを除く、ＶＤＪ又はＶＪドメイン）のタンパク質配列を、それぞれ決定した（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２及びＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１）。更に、カバット番号付けシステムによりＬ１−ＯＶ５２．２４のＣＤＲ配列を決定した。Ｌ１−ＯＶ５２．２４のＣＤＲ配列は、KASQNVGTNVA (LCDR1; SEQ ID
No: 5), STSYRYS (LCDR2; SEQ ID No: 6), QQYNTYPYT (LCDR3; SEQ ID No: 7), FNIKDYYMQ (HCDR1; SEQ ID No: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (HCDR2; SEQ ID No: 9), 及び WNPLAF (HCDR3;  SEQ ID No: 10)である。
両方のモノクローナル抗体はＩｇＧ１アイソタイプである。
アイソタイプ・コントロールモノクローナル抗体は、Ｂｉｏ  Ｘ  Ｃｅｌｌ（Ｗｅｓｔ
Ｌｅｂａｎｏｎ、ニューハンプシャー州、米国）から入手した。Ｌ１ＣＡＭ  モノクローナル抗体は、メーカーの説明書に従い標識化キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＡｌｅｘａ４８８と結合した。簡単にいえば、１００μｇの抗体を１バイアルの標識化試薬と混合し、１時間インキュベートし、その後、カラムで精製した。類似した標識効力をもつことを確かめるために、標識化の程度を測定した。
【００５８】
［結合定数］
（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）平衡分析）
結合分析は、ＣＭ５センサチップを備えたＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００を用いて行った。簡単にいえば、ＢＩＡｃｏｒｅＣＭ５チップをＥＤＣ／ＮＨＳで活性化し、様々なレベルのＬ１−Ｆｃを、活性化した表面上に固定化した。残った活性部位は、エタノールアミン／ＨＣｌでブロックした。Ｌ１モノクローナル抗体（Ｌ１−ｍＡｂ）はＬ１−Ｆｃ表面と結合し、経時的に解離することができる。様々なＬ１−Ｆｃ密度のチップ表面のそれぞれへのそれぞれのインジェクションでの結合相と解離相をカイネティクス解析した。
［エピトープ認識化］
エピトープ特異性を測定するために、異なるＩｇドメインを有する一連のＬ１−Ｆｃタンパク質を構築した（非特許文献６参照）。ファインマッピングのために、最近発表されたＶ５タグ付組み換えＬ１フラグメントを使用した（Ｇｏｕｖｅｉａ  ＲＭ，  Ｍｏｒａｓ  ＶＡ，  Ｐｅｉｘｏｔｏ  Ｃ．等、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  （シマジロクサヨトウ）Ｓｆ９細胞由来の、ヒト組換Ｌ１細胞接着糖タンパクの含機能トランケート型ソリュブルフォームの産生と精製、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ
２００７、５２：１８２−９３参照）。エピトープマッピング用に、ＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロット分析において組換タンパク質を使用した。
【００５９】
［抗体取込アッセイ］
（イメージングフローサイトメトリー用（ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ（登録商標））
Ｓｋｏｖ３ｉｐ細胞をトリプシン／ＥＤＴＡではがし、培養培地中で再び懸濁し、計数し、等細胞数の試料に分配した（２００，０００個の細胞）。標識化抗体（１０μｇ／ｍＬ）の存在下、異なるタイムポイント、３７℃で細胞をインキュベートした。また、タイムポイント０分では氷の上でインキュベートした。それぞれのタイムポイント毎に８００×ｇで細胞を沈降させ、氷冷ＰＢＳで一回洗浄し、４％ＰＦＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ）を用い、氷の上で１５分間固定した。固定した細胞はＰＢＳで二回洗浄し、２５μｇ/ｍＬのヤギ抗マウスＡｌｅｘａ６４７二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスルーヘ、ドイツ）と共に２０分間インキュベートし、その後ＰＢＳにて二回洗浄した。
（共焦点レーザー走査顕微鏡用）
２５，０００個の細胞を８ウェルマイクロスライド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ミュンヘン、ドイツ）にまき、２４時間生育した。標識化抗体（１０μｇ／ｍＬ）の存在下、異なるタイムポイントにおいて３７℃で細胞をインキュベートした。それぞれのタイムポイント毎に細胞を氷冷ＰＢＳで一回洗浄し、４％ＰＦＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ）を用い、氷の上で１５分間固定した。固定した細胞はＰＢＳで二回洗浄し、２５μｇ/ｍＬのヤギ抗マウスＡｌｅｘａ６４７二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスルーヘ、ドイツ）と共に２０分間インキュベートし、その後ＰＢＳにて二回洗浄した。
【００６０】
［イメージングフローサイトメトリーと解析］
６０×対物と拡張被写界深度（ＥＤＦ）作動を選択し、１００％設定の４８８ｎｍレーザー及び８０％設定の５６１ｎｍレーザーを用い、Ａｍｎｉｓ  ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍＸ（ＩＳＸ）（Ａｍｎｉｓ  Ｃｏｒｐ．，シアトル、米国）にて、試料を測定した。チャンネル２及び５、同様にチャンネル１の明視野画像を記録し、試料毎に４０００個の細胞を採取した。Ａｌｅｘａ４８８結合Ｌ１ＣＡＭモノクローナル抗体のコンペンセーション
コントロールとして、各抗体用の細胞の一部を、固定後かつ抗マウスＡｌｅｘａ６４７で対比染色する前に、とりわけた。結合した抗体と同濃度で、それぞれの非結合Ｌ１モノクローナル抗体で、氷の上で細胞を染色した。更に、抗マウスＡｌｅｘａ６４７抗体で対比染色用のコンペンセーションコントロールとして、同じ抗マウスＡｌｅｘａ６４７二次抗体で細胞を対比染色した。コンペンセーションコントロールはＩＳＸのそれぞれの補正設定に用いた。
【００６１】
ＩＳＸデータの解析はＩＤＥＡＳソフトウエアを用いて行った（Ａｍｎｉｓ  Ｃｏｒｐ．，シアトル、米国）。生画像ファイルを開き、それぞれのコンペンセーションファイルを使用してコンペンセーションマトリックスを作製した。注目細胞とその後ゲーティングをコントロールする明視野画像に使用する一つの細胞のために、得られた細胞はゲーティングされた。チャンネル５の画像を用いて、「細胞表面マスク」を作製した。このとき、バックグランドを除き、シグナルを最適化するために、強度の下限を２００に、上限はそのまま変えず４０９５に設定した。一方、チャンネル２では、強度の下限を１５０、上限はそのまま変えずに４０９５に設定し、「チャンネル２」と名付けた。両方の設定とも、Ｌ１ＣＡＭ  モノクローナル抗体用アイソタイプコントロール、又は二次抗体のみ用アイソタイプコントロールで染色したコントロールを元にして行った。また、前記「細胞表面マスク」はチャンネル２での隣接ピクセルを含む一ピクセルによって広げられた。更に、「チャンネル２であり非細胞表面マスク」と定義される「細胞内シグナル」と名付けた別のマスクを作製した。最後に、「細胞内シグナル／（強度＿ＭＣ＿Ｃｈ０２＊１００）」という定義で、「相対的細胞内強度」と名付けた合体した特徴を作製した。個々のヒストグラムをプロットして平均値を決定した。同じ方法を測定した全試料に適用した。
【００６２】
［共焦点レーザー走査顕微鏡測定と解析］
ＨｙＤ検出器を備えたＬｅｉｃａ  ＳＰ５  ＩＩ（Ｌｅｉｃａ  ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、ウェルツラー、ドイツ）共焦点レーザー走査顕微鏡で試料を測定した。４８８ｎｍのアルゴンレーザーを使用してＡｌｅｘａ−４８８結合Ｌ１  モノクローナル抗体を励起し、６３３ｎｍのＨｅＮeレーザーラインを使用してＡｌｅｘａ−６４７を励起した。Ｚ切片は、類似ｚ位置で獲得した。全ての抗体について、ｎ＝３０の細胞を獲得して定量化した。Ｆｉｊi（ＩｍａｇｅＪ，ＮＩＨ，ベセスダ、米国）を使用して画像を解析した。マウスＡｌｅｘａ−６４７で対比染色した細胞表面のシグナルを用いて、一つの細胞の境界と細胞内傾向強度を区分、同定し、続いて、全細胞蛍光強度を決定した。結果を、Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ、レッドモンド、米国）を用いて、細胞の全蛍光強度に対するＡｌｅｘａ４８８結合モノクローナル抗体  Ｌ１−９．３及びＬ１−ＯＶ５２．５４の細胞内蛍光強度を示す棒グラフとしてプロットした。
【００６３】
［結果］
ｍＡｂ  Ｌ１−９．３及びｍＡｂ  Ｌ１−ＯＶ５２．２４は、Ｌ１ＣＡＭ細胞表面分子の別々の細胞表面エピトープと結合した。ｍＡｂ９．３は、第１のＩｇドメイン（１．Ｉｇ−Ｌ１−Ｆｃ［特許文献１参照］）から構成される融合タンパク質と明らかに反応した。ウエスタンブロット解析で、ｍＡｂ  Ｌ１−ＯＶ５２．２４はＬ１の４−５ＦＮＩＩＩドメインを認識することを確認した。ｍＡｂ  Ｌ１−９．３は、第１Ｉｇドメインに結合し、他方、Ｌ１−ＯＶ５２．２４は４−５ＦＮＩＩＩドメインのエピトープと結合した。ｍＡｂ  ９．３はＫＤ（Ｍ）＝８．５＊１０−１１［非特許文献６参照］のＬ１への親和力を有し、他方、ｍＡｂ  Ｌ１−ＯＶ５２．２４はＫＤ（Ｍ）＝２．４１＊１０−９のＬ１への親和力を有した。Ｌ１−ＯＶ５２．２４は、ウエスタンブロット及びＦＡＣＳ分析実験で優れており、免疫組織化学（ＩＨＣ）実験でも良好であった。
本発明者らは、上記の材料及び方法の項目で概略したように、Ａｌｅｘａ−４８８結合モノクローナル抗体を用い、ＳＫＯＶ３ｉｐ細胞への内部移行アッセイを行った。内部移行は、ＦＡＣＳと蛍光分析を組み合わせた、数千個の細胞を定量できるＩｍａｇｅＳｔｒ
ｅａｍＸ  分析で測定した。データは、ＩＤＥＡＳソフトウエアで解析した。Ｌ１−９．３の分析から、タイムポイント０分、６０分及び９０分で、ゆっくりとした内部移行を示し（図１のＡ−Ｆ）、最終タイムポイントでは平均値７．８％であった。これに対し、ｍＡｂ  Ｌ１−ＯＶ５２．２４はずっと速く内部移行し、最終タイムポイントでは平均値４０％にまで達した（図２のＡ−Ｆ）。これらデータを図３で直接比較した。
【００６４】
以上のデータが正しいことを確認するために、付着細胞を使用して同様の分析を行った。ＳＫＯＶ３ｉｐ細胞をカバーグラス上で生育し、Ａｌｅｘａ結合抗体を用いて内部移行させた。また、レーザー走査顕微鏡と細胞の視覚計数によって、定量化を行った。染色例を図４Ａに示し、結果を図４Ｂにまとめた。これらの結果から、ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍＸ  分析で得られたデータが確認され、ｍＡｂ  Ｌ１−ＯＶ５２．２４が１０倍近く高い内部移行率を引き起こすことが示された。こうした結果は予想外であり、ｍＡｂ  Ｌ１−ＯＶ５２．２４が抗体−薬物複合体の輸送に好適であることを示唆する。
【実施例２】
【００６５】
［材料及び方法］
（細胞株）
ヒト卵巣癌細胞ＳＫＯＶ３ｉｐを、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（マナサス、バージニア州、米国）から入手した。この細胞株はＧｅｒｍａｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌ（ブラウンシュウェイグ、ドイツ）により認証を受け、全培養を通して通常の細胞形態であることを評価した。マイコプラズマ非検出培養液であることを毎週試験して確認した。１０％の熱失活処理したウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｂｉｏｃｈｅｍ、ベルリンドイツ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスルーヘ、ドイツ）及び１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えたＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ダイゼンホッフェン、ドイツ）で、細胞を培養した。３７℃及び５％ＣＯ２の加湿雰囲気下で、全細胞を培養した。
（モノクローナル抗体）
ヒトＬ１ＣＡＭに対するモノクローナル抗体、ｍＡｂＬ１−９．３及びｍＡｂ  ＵＪ１２７．１１は、先に説明した通りである（非特許文献６）。
Ｌ１−ＯＶ５２．２４は、Ｌ１の外部ドメインを有するヒトＬ１−Ｆｃタンパク質でマウスに免疫して、又はＳＫＯＶ３ｉｐ細胞を免疫に使用して生産した。
Ｌ１−ＯＶ５２．２４モノクローナル抗体の免疫グロブリン遺伝子のｃＤＮＡ配列を決定し、上記した（軽鎖：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３及び重鎖：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）。
【００６６】
また、Ｌ１−ＯＶ５２．２４の重鎖及び軽鎖（定常ドメインを除く、ＶＤＪ又はＶＪドメイン）のタンパク質配列を、それぞれ決定した（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２及びＳＥＱ
ＩＤ  Ｎｏ．１）。更に、カバット番号付けシステムによりＬ１−ＯＶ５２．２４のＣＤＲ配列類を決定した。Ｌ１−ＯＶ５２．２４のＣＤＲ配列類は、KASQNVGTNVA (LCDR1; SEQ ID No:5), STSYRYS (LCDR2; SEQ ID No: 6), QQYNTYPYT (LCDR3; SEQ ID No: 7), FNIKDYYMQ (HCDR1; SEQ ID No: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (HCDR2; SEQ ID No: 9), 及び WNPLAF (HCDR3; SEQ ID No: 10)である。
また、モノクローナル抗体、ｍＡｂＬ１−９．３、ｍＡｂＬ１−ＯＶ５２．２４、ｍＡｂＵＪ１２７．１１は、ＩｇＧ１のアイソタイプである。モノクローナル抗体、ｍＡｂ５Ｇ３はＩｇＧ２ａのアイソタイプである。また、対応するアイソタイプコントロールモノクローナル抗体は、Ｂｉｏ  Ｘ  Ｃｅｌl（ウエスト  レバノン、ニューハンプシャー州）から入手した。Ｌ１ＣＡＭ  モノクローナル抗体は、メーカーの説明書に従い標識化キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＡｌｅｘａ４８８と結合した。簡単にいえば、１００μｇの抗体を１バイアルビンの標識化試薬と混合し、１時間インキュベートし、その後、カラムで精製した。類似した標識効力をもつことを確かめるために、標識化の程度を
測定した。Ａｌｅｘａ４８８と結合したｍＡｂ５Ｇ３は、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（リットルトン、米国）から購入した。
【００６７】
［抗体取込アッセイ］
（イメージングフローサイトメトリー用（Ｉｍａｇｅｓｔｒｅａｍ））
Ｓｋｏｖ３ｉｐ細胞をトリプシン／ＥＤＴＡではがし、培養培地中で再懸濁し、計数し、等細胞数の試料に分配した（２００，０００個の細胞）。標識化抗体（１０μｇ／ｍＬ）の存在下、異なるタイムポイント、３７℃で細胞をインキュベートした。また、タイムポイント０分では氷の上でインキュベートした。それぞれのタイムポイント毎に８００×ｇで細胞を沈降させ、氷冷ＰＢＳで一回洗浄し、４％ＰＦＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ）を用い、氷の上で１５分間固定した。固定した細胞はＰＢＳで二回洗浄し、２５μｇ/ｍＬのヤギ抗マウスＡｌｅｘａ６４７二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスルーヘ、ドイツ）と共に２０分間インキュベートし、その後ＰＢＳにて二回洗浄した。
（共焦点レーザー走査顕微鏡用）
２５，０００個の細胞を８ウェルマイクロスライド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ミュンヘン、ドイツ）にまき、２４時間生育した。標識化抗体（１０μｇ／ｍＬ）の存在下、異なるタイムポイントにおいて３７℃で細胞をインキュベートした。それぞれのタイムポイント毎に細胞を氷冷ＰＢＳで一回洗浄し、４％ＰＦＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ）を用い、氷の上で１５分間固定した。固定した細胞はＰＢＳで二回洗浄し、２５μｇ/ｍＬのヤギ抗マウスＡｌｅｘａ６４７二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスルーヘ、ドイツ）と共に２０分間インキュベートし、その後ＰＢＳにて二回洗浄した。
【００６８】
［イメージングフローサイトメトリーと解析］
６０×対物と拡張被写界深度（ＥＤＦ）作動を選択し、１００％設定の４８８ｎｍレーザー及び８０％設定の５６１ｎｍレーザーを用い、Ａｍｎｉｓ  ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍＸ（ＩＳＸ）（Ａｍｎｉｓ  Ｃｏｒｐ．，シアトル、米国）にて、試料を測定した。チャンネル２及び５、同様にチャンネル１の明視野画像を記録し、試料毎に１００００個の細胞を採取した。Ａｌｅｘａ４８８結合Ｌ１モノクローナル抗体のコンペンセーションコントロールとして、各抗体用の細胞の一部を、固定後かつ抗マウスＡｌｅｘａ６４７で対比染色する前に、とりわけた。細胞を結合した抗体と同濃度で、それぞれの非結合Ｌ１モノクローナル抗体で、氷の上で染色した。更に、抗マウスＡｌｅｘａ６４７抗体での対比染色用のコンペンセーションコントロールとして、同じ抗マウスＡｌｅｘａ６４７二次抗体で、細胞を対比染色した。コンペンセーションコントロールはＩＳＸのそれぞれの補正設定に用いた。
【００６９】
ＩＳＸデータの解析はＩＤＥＡＳソフトウエアを用いて行った（Ａｍｎｉｓ  Ｃｏｒｐ．，シアトル、米国）。生画像ファイルを開き、それぞれのコンペンセーションファイルを使用してコンペンセーションマトリックスを作製した。注目細胞とその後ゲーティングをコントロールする明視野画像に使用する一つの細胞のために、得られた細胞はゲーティングされた。チャンネル５の画像を用いて、「細胞表面マスク」を作製した。このとき、バックグランドを除き、シグナルを最適化するために、強度の下限を２００に、上限はそのまま変えず４０９５に設定した。一方、チャンネル２では、強度の下限を１５０、上限はそのまま変えずに４０９５に設定し、「チャンネル２」と名付けた。両方の設定とも、Ｌ１  モノクローナル抗体用アイソタイプコントロール、又は二次抗体のみ用アイソタイプコントロールで染色したコントロールを元にして行った。また、前記「細胞表面マスク」はチャンネル２での隣接ピクセルを含む一ピクセルによって広げられた。更に、「チャンネル２であり非細胞表面マスク」と定義される「細胞内シグナル」と名付けた別のマスクを作製した。最後に、「細胞内シグナル／（強度＿ＭＣ＿Ｃｈ０２＊１００）」という定義で、「相対的細胞内強度」と名付けた合体した特徴を作製した。個々のヒストグラムをプロットして平均値を決定した。同じ方法を測定した全試料に適用した。
【００７０】
［共焦点レーザー走査顕微鏡測定と解析］
ＨｙＤ検出器を備えたＬｅｉｃａ  ＳＰ５  ＩＩ（Ｌｅｉｃａ  ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、ウェルツラー、ドイツ）共焦点レーザー走査顕微鏡で試料を測定した。４８８ｎｍのアルゴンレーザーを使用してＡｌｅｘａ−４８８結合Ｌ１  モノクローナル抗体を励起し、６３３ｎｍのＨｅＮeレーザーラインを使用してＡｌｅｘａ−６４７を励起した。Ｚ切片は、類似ｚ位置で獲得した。全ての抗体について、ｎ＝３０の細胞を獲得して定量化した。代表的画像を示す。
［統計解析］  
少なくとも３つの個別の実験条件間で、統計的に有意な増加または減少の確立をスチューデントのｔ−検定を用いて決定した。両側検定、独立ｔ−検定を行った。値は、平均±標準偏差として棒グラフで表示した。ｐ値＜０．０５のとき統計的に有意であると考えた。グラフ中、優位性はアステリスクを用いて表示した。また、アステリスクは以下を表す：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
［結果］  
実施例２の結果を図５から図７に示す。本発明者らは、上記の材料及び方法の項目で概略したように、Ａｌｅｘａ−４８８結合モノクローナル抗体を用い、ＳＫＯＶ３ｉｐ細胞への内部移行アッセイを行った。内部移行は、ＦＡＣＳと蛍光分析とを組み合わせた数千個の細胞を定量できる、ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍＸ  分析で測定した。データは、ＩＤＥＡＳソフトウエアで解析した。解析結果は、従来技術のモノクローナル抗体類、Ｌ１−９．３、５Ｇ３及びＵＪ１２７．１１が、タイムポイント０分、６０分及び９０分で、ゆっくりとした内部移行を行うことを示した。（図６）。これに対し、本発明のモノクローナル抗体、ｍＡｂ  Ｌ１−ＯＶ５２．２４はずっと速く内部移行し、最終タイムポイントでは平均値４１．７％にまで達した（図６）。これらのデータを図７にまとめた。驚くべきことに、９０分でのＬ１−ＯＶ５２．２４の内部移行は、先行技術の抗Ｌ１モノクローナル抗体類、９．３、５Ｇ３、ＵＪ１２７．１１の如何なる抗体よりも統計的に速いことを見出した。それぞれｐ値＜０．０１である。
【００７１】
以上のデータの正しさを確認するために、付着細胞を使用して同様の分析を行った。ＳＫＯＶ３ｉｐ細胞をカバーグラス上で生育し、Ａｌｅｘａ結合抗体を用いて内部移行させた。また、レーザー走査顕微鏡と細胞の目視計数によって、定量した。染色例を図５に示す。これらの結果から、ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍＸ  分析で得られたデータが確認され、ｍＡｂ  Ｌ１−ＯＶ５２．２４が従来のＬ１ＣＡＭに対する抗体類と比較して、驚くほど高い内部移行率を引き起こすことが示された。こうした結果は予想外であり、ｍＡｂ  Ｌ１−ＯＶ５２．２４が抗体−薬物複合体の輸送に好適であることを示唆する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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