(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロース分解性菌として、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｍ−４菌株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２５３８)と、バチルス・ズブチルス(Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ)Ｍ−５菌株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２５３９)と、バチルス・ズブチルスの近縁種であるバチルス・スピーシーズ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ.）Ｍ−６菌株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２９４０)との少なくとも３種のバチルス属菌、及び、パエニバチルスシネリス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｎｅｒｉｓ）Ｍ−９菌株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０３３０４）の少なくとも１種のパニエバチルス属菌を含む非病原性菌類による米糠粉末の発酵物からなるインフルエンザウイルスの増殖抑制のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インフルエンザウイルスの増殖抑制のための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明者らは、腸内環境改善、高脂肪食摂取による体重増加抑制またはピロリ菌抑制のための組成物として、特許文献１に記載の発明を提案している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第６５９６１３５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ところで、近年、インフルエンザ対策として、生体に本来備わっている感染防御機能（免疫力）を人為的に高めるという方策の重要性が高まってきている。すなわち、インフルエンザウイルスは、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型に分類される。しかしながら、人に感染してインフルエンザを発症させるのはＡ型とＢ型である。両ウイルスの特徴は、８本に分節したマイナス鎖一本鎖ＲＮＡをゲノムとして持つＲＮＡウイルスである。中でもＡ型インフルエンザウイルスは、遺伝子とそれを包むタンパク質の殻からなるヌクレオカプシドと呼ばれる構造物のさらに外側にエンベロープ（外被とも呼ばれる）を持つウイルスで、エンベロープ上に血球凝集素（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ、ＨＡ）とノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ、ＮＡ）という特徴的な糖タンパク質がスパイク状に突き出ている。これらには、それぞれ１６種および９種の亜型があり、感染細胞内での遺伝子組換えが起こると、大変異したＡ型インフルエンザウイルスが出現することになる。その一例が、２００９年に大流行した新型豚インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１亜型）であり、このウイルスの遺伝子はブタ、トリ、およびヒトのインフルエンザウイルスの混合型である。
【０００５】
インフルエンザウイルスの増殖過程をみると、ウイルスが宿主細胞の表面に結合（吸着）した後、ウイルス粒子全体がエンドサイトーシスによって細胞内へ取り込まれる（この段階を侵入と呼ぶ）。その後、ウイルス粒子の膜が壊され、中から遺伝子（ＲＮＡ）が出てくる（脱殻）。この遺伝子の情報に基づいて子孫ウイルスの増殖（複製）に必要なタンパク質（酵素類）が合成され、さらに細胞内の糖質や脂質などの生体分子が利用されてウイルス粒子が形成される。新たに形成されたウイルス粒子は細胞内を移動し、宿主細胞表面に突き出た状態になると、細胞内で合成されたウイルス自体のノイラミニダーゼと呼ばれる酵素（ＮＡ）が作用してウイルス粒子が細胞膜から切り離される（放出される）。細胞外に放出された子孫ウイルスは近くの未感染細胞に吸着・侵入し、そこでさらに増殖を繰り返し、大量のウイルスが生産される。ウイルスが感染・増殖すると、これに対抗するために体内ではウイルスを異物と認識して排除する機能を有する免疫機構がはたらき始め、炎症反応や発熱反応などが起こる。インフルエンザの典型的な症状として、３８℃以上の発熱、鼻閉、関節痛、筋肉痛、全身倦怠感、食欲不振などが生じる。
【０００６】
現在、日本国で承認され、一般に臨床利用されている抗インフルエンザ薬としては、オセルタミビル（タミフル）、ザナミビル（リレンザ）、ラニナミビル（イナビル）、ぺラミビル（ラビアクタ）などのノイラミニダーゼ阻害薬とキャップ依存性エンドヌクレアーゼ選択的阻害薬であるバロキサビル（ゾフルーザ）がある。しかしながら、このようなウイルスの増殖に関与する酵素を標的にした化学合成薬を使用すれば、薬剤の効果を低下させる方向に変異を起こしたウイルス（薬剤耐性ウイルス）が生じてくるという大きな問題があり、このような阻害剤だけに頼るには限界がある。
【０００７】
一方、もう１つのインフルエンザ対策としてワクチンの接種という手段が開発されているが、ウイルス遺伝子が頻繁に変異し易いために、その都度ワクチンの製造を検討する必要があるという問題がある。ワクチン接種はインフルエンザウイルスに対する抗体を体内で作ることを目的としているが、例えば高齢者や基礎疾患を抱えている人達のように免疫力が低下している場合には、抗体を産生する機能が弱いために充分量の抗体を確保できない可能性もある。
【０００８】
それゆえ、インフルエンザ対策として、生体に本来備わっている感染防御機能（免疫力）を人為的に高めるという方策の重要性が高まってきている。
【０００９】
そこで、本発明者らは、インフルエンザウイルスの増殖抑制を技術的課題として、鋭意検討した結果、特許文献１に記載の発明を改良することで、インフルエンザウイルスの増殖抑制が可能であることを見出した。
【００１０】
すなわち、本発明は、インフルエンザウイルスの増殖を抑制することができるインフルエンザウイルスの増殖抑制のための組成物を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成するために、本発明の請求項１に係るインフルエンザウイルスの増殖抑制のための組成物は、セルロース分解性菌として、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｍ−４菌株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２５３８)と、バチルス・ズブチルス(Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ)Ｍ−５菌株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２５３９)と、バチルス・ズブチルスの近縁種であるバチルス・スピーシーズ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ.）Ｍ−６菌株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２９４０)との少なくとも３種のバチルス属菌、及び、パエニバチルスシネリス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｎｅｒｉｓ）Ｍ−９菌株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０３３０４）の少なくとも１種のパニエバチルス属菌を含む非病原性菌類による米糠粉末の発酵物からなることを特徴としている。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、インフルエンザウイルスの増殖を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明のインフルエンザウイルスの増殖抑制のための組成物における非病原性菌類に含まれるバチルス・アミロリケファシエンスＭ−４菌株を解析した１６Ｓ ｒＤＮＡ部分塩基配列に基づく簡易分子系統樹を示す模式図である。
【図２】同非病原性菌類に含まれるバチルス・ズブチルスＭ−５菌株を解析した同簡易分子系統樹を示す模式図である。
【図３】同非病原性菌類に含まれるバチルス・スピーシーズＭ−６菌株を解析した同簡易分子系統樹を示す模式図である。
【図４】同非病原性菌類に含まれるパエニバチルスシネリスＭ−９菌株を解析した同簡易分子系統樹を示す模式図である。
【図５】同インフルエンザウイルスの増殖抑制のための組成物の摂取及び非摂取のマウス群における体重増加量推移を示す体重−経過日数の相関図である。
【図６】同マウス群における感染３日後の肺のウイルス量を示すグラフ図である。
【図７】同マウス群における感染１４日後の気管支洗浄液中の中和抗体量を示すグラフ図である。
【図８】同マウス群における感染１４日後の血清中の中和抗体量を示すグラフ図である。
【図９】同マウス群における糞便中のＩｇＡ量を示すグラフ図である。
【図１０】同マウス群における気管支洗浄液中のＩｇＡ量を示すグラフ図である。
【図１１】同マウス群における血清中のＩＦＮ−γ量を示すグラフ図である。
【図１２】同マウス群における肺のＩＦＮ−γ量を示すグラフ図である。
【図１３】同マウス群における脾臓のＩＦＮ−γ量を示すグラフ図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のインフルエンザウイルスの増殖抑制のための組成物は、種々の微生物が持つ生物学的な特徴を充分に考慮し、米糠発酵物中で異種の菌類が最大限に各々の生物活性を発揮し、且つ微生物間で良好な相互作用を及ぼし合うことで、人や動物の健康を害する障害を取り除けるように、米糠粉末に加える微生物の種類と組合せを厳選したものである。すなわち、このインフルエンザウイルスの増殖抑制のための組成物は、米糠粉末が、セルロース分解性菌としてバチルス・アミロリクエフアシエンス(Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ)Ｍ−４菌株と、バチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｍ−５菌株と、バチルス・ズブチルスの近縁種であるバチルス・スピーシーズ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ.）Ｍ−６菌株と、パエニバチルスシネリス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｎｅｒｉｓ）Ｍ−９菌株との新規な４種を少なくとも含む非病原性菌類によって発酵処理された発酵物からなる。
【００１５】
上記４種のセルロース分解性菌であるバチルス・アミロリクエフアシエンスＭ−４菌株（以下、Ｍ−４菌株と略称する）、バチルス・ズブチルスＭ−５菌株（以下、Ｍ−５菌株と略称する）、バチルス・スピーシーズＭ−６菌株（以下、Ｍ−６菌株と略称する）、パエニバチルスシネリス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｎｅｒｉｓ）Ｍ−９菌株（以下、Ｍ−９菌株と略称する）は、いずれも本発明者らによって見出された新規な菌であり、独立行政法人製品評価技術基板機構（ＮＩＴＥ）・特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託し、Ｍ−４菌株は受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２５３８、Ｍ−５菌株は受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２５３９、Ｍ−６菌株は受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２５４０、Ｍ−９菌株は受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０３３０４）としてそれぞれ受託されている。
【００１６】
上記のＭ−４菌株、Ｍ−５菌株、及びＭ−６菌株が新規なバチルス属菌、さらに、Ｍ−９菌株が新規なパニエバチルス属菌であることは、いずれもＤＮＡ解析による同定方法によって確認されている。その同定方法は、次のとおりである。
ＤＮＡ抽出：アクロモペプチダーゼ（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｔｒｉｓｅｓ,Ｊａｐａｎ）
ＰＣＲ増幅：ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ,Ｊａｐａｎ)
サイクルシーエンス：ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ    Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ,ＵＳＡ）
塩基配列決定：ＣｈｒｏｍａｓＰｒｏ １．７（Ｔｅｃｈｎｅｌｙｓｉｕｍ,ＡＵＳ）
ソフトウェア：テクノスルガ・ラボ微生物同定システム（ＴｅｃｈｎｏＳｕｒｕｇａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ,Ｊａｐａｎ）
データベース：ＤＢ−ＢＡ１１．０（ＴｅｃｈｎｏＳｕｒｕｇａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）
国際塩基配列データベース（ＤＤＢＪ/ＥＮＡ（ＥＭＢＬ）/ＧｅｎＢａｎｋ）
同定判断：１６Ｓ ｒＤＮＡ部分塩基配列に基づく解析
【００１７】
上記同定方法により、上記３種のバチルス属菌、及び、上記１種のパニエバチルス属菌について１６Ｓ ｒＤＮＡ部分塩基配列に基づく解析を行ったところ、次の結果が得られた。
〔Ｍ−４菌株〕
〇同定種：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、バイオセーフティレベル１。
〇ＢＬＡＳＴ検索による最も高い相同性の種（基準株）：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ｓｕｂｓｐ.ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＮＢＲＣ １５５３５Ｔ株・・・相同率９９．８％。
〔Ｍ−５菌株〕
〇同定種：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓに近縁なＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ.、バイオセーフティレベル１
〇ＢＬＡＳＴ検索による最も高い相同性の種（基準株）：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｕｂｓｐ.ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＤＳＭ １０Ｔ株・・・相同率９９．６％
〔Ｍ−６菌株〕
〇同定種：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓに近縁なＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ.、バイオセーフティレベル１
〇ＢＬＡＳＴ検索による最も高い相同性の種（基準株）：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｕｂｓｐ.ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＤＳＭ １０Ｔ株・・・相同率９９．６％
〔Ｍ−９菌株〕
〇同定種：Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｎｅｒｉｓ、バイオセーフティレベル１。
〇ＢＬＡＳＴ検索による最も高い相同性の種（基準株）：Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆａｖｉｓｐｏｒｕｓ  ＧＭＰ０１Ｔ株、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｎｅｒｉｓ  ＬＭＧ  １８４３９Ｔ株、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｌｌｕｏｓｉｔｒｏｐｈｉｃｆｕｓ  Ｐ２−１Ｔ株・・・・相同率９９．６％
【００１８】
上記３種のバチルス属菌、及び、上記１種のパニエバチルス属菌について、各々の１６Ｓ ｒＤＮＡ部分塩基配列に基づく簡易分子系統樹を図１〜図４に示す。図１中のＳＩＩＤ１９２３８−０４がＭ−４菌株、図２中のＳＩＩＤ１９２３８−０５がＭ−５菌株、図３中のＳＩＩＤ１９２３８−０６がＭ−６菌株、図４中のＳＩＩＤ１９２３８−０９がＭ−９菌株である。なお、図１〜図４において、左上の線はスケールバー、系統枝の分岐に位置する数字はブートストラップ値、株名の末尾のＴはその種の基準株（Ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ）、をそれぞれ示す。
【００１９】
ところで、本発明のインフルエンザウイルスの増殖抑制のための組成物を製造するには、各々純粋培養で保管されている少なくとも前記４種の菌類を含む所要の生菌の培養液を用い、これら培養液を個別に又は混合した状態で常温下の米糠粉末にスプレー等で添加し、手操作又は機械的操作で該米糠粉末を充分に攪拌混合することで、全ての生菌を米糠全体に均一に行き渡らせ、次いで菌の栄養源としてグルコース溶液の如き糖液を適量加えて均一に攪拌混合した上で、発酵槽内で所定期間（通常１〜４カ月程度）保管して発酵させる。この保管中には、外部からの雑菌の侵入を防ぐために、発酵槽の開放部をビニールシート等のカバーで覆うと共に、発酵槽を設置した部屋についても不用意に汚染外気が入り込まぬように所要の遮蔽対策を講じることは言うまでもない。しかして、発酵の進行に伴って米糠の温度が次第に上がってゆくため、有用成分の変質や高温に弱い有用菌の死滅を防止するために、継続的に温度を計測して適温（例えば、５０℃以下）を保つように温度管理する。なお、降温の操作は、通常、カバーを外して室内空気に一定時間晒すことによる空冷方式で行える。
【００２０】
かくして、充分な発酵状態に達した米糠粉末は、降温後、粉砕機を通してから数週間自然乾燥し、所定の容器に充填して製品化する。この発酵米糠製品は、直接に口から摂取することも可能であるが、粉末形態であるため、ジュース等の飲料に加えたり、食物にふりかけたり、調理の際に料理に混ぜ込んだりすることで摂取が容易になる。また、人用の健康食品とする以外に、競走馬、家畜やペット動物等の健康を維持するための飼料用配合剤としても好適に利用できる。
【００２１】
しかして、このようなインフルエンザウイルスの増殖抑制のための組成物を経口摂取すれば、インフルエンザウイルスの増殖を抑制することができる。
【実施例】
【００２２】
ここで、発明者らは、本発明のインフルエンザウイルスの増殖抑制のための組成物が、インフルエンザウイルスの増殖を抑制することできるか否か以下の実験を行った。
【００２３】
〔実験条件〕
＜ウイルス株＞
Ａ型インフルエンザウイルス（Ａ/ＮＷＳ/３３、Ｈ１Ｎ１亜型）
＜実験動物＞
ＢＡＬＢ/ｃマウス（雌、６週齢）
各群１０匹とし、その内の５匹（Ａ区）は感染３日後に糞便、全血、肺、気管支洗浄液（ＢＡＬＦ）、脾臓を採取する。残りの５匹（Ｂ区）は、感染当日から１４日後までの間、毎日体重および死亡例を記録し、１４日後に全血、肺、気管支洗浄液、脾臓、糞便を採取する。
＜投与群＞
１．第１サンプル（蒸留水、投与期間：感染当日から１４日後まで）
２．第２サンプル（タミフル、投与量：０．２ｍｇ／０．４ｍＬ／日、投与期間：感染当日から１４日後まで）
３．第３サンプル（ＭＡＸ組成物（１カ月前投与群）、投与量：２０ｍｇ／０．４ｍＬ／日、投与期間：感染当日から１４日後まで）
４．第４サンプル（ＭＡＸ組成物（２カ月前投与群）、投与量：２０ｍｇ／０．４ｍＬ／日、投与期間：感染当日から１４日後まで）
＜飼料＞
第３サンプルと第４サンプルは、サンプル投与当日から実験最終日（感染１４日後）までの間、ＮＭＦ飼料（高繊維食〜繊維含量４．４％）(オリエンタル酵母工業社製)に切り替える。第１サンプルと第２サンプルには通常飼料（ＣＲＦ−１、オリエンタル酵母工業社製）を与える。
【００２４】
ところで、ＭＡＸ組成物は以下のように製造した。すなわち、接種菌として、いずれも株式会社松本微生物研究所において純粋培養して長期保存されている次の菌株を含むＭＡＸ元菌の混合物を用いた。これら接種菌の内、セルロース分解菌の４種の菌株は、既述した新規なバチルス属菌、及び、パニエバチルス属菌である。
〇セルロース分解性細菌・・・バチルス・アミロリクエフアシエンスＭ−４菌株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２５３８)、バチルス・ズブチルスＭ−５菌株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２５３９)、バチルス・スピーシーズＭ−６菌株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２５４０）、パエニバチルスシネリスＭ−９菌株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０３３０４）の４種
〇乳酸菌・・・ラクトバチルス・カゼイＮＢＲＣ１５８８３菌株
〇ビフィズス菌・・・ビフィドバクテリウム・ビフィダムＮＢＲＣ１０００１５菌株
〇麹菌・・・アスペルギルス・オリゼーＮＢＲＣ６２１５菌株
【００２５】
平均粒径１ｍｍ以下の米糠粉末３００ｋｇに、上記ＭＡＸ元菌混合物３０Ｋｇ（菌数：１ｇ当り１０の１０乗個程度、総菌数の約７０％がＭ−４菌株、Ｍ−５菌株、Ｍ−６菌株、Ｍ−９菌株）を添加しつつ、手操作で繰り返し混合し、米糠粉末全体に均一に菌を行き渡らせた。次いで、この菌を含む米糠粉末に、０．０６％濃度のグルコース溶液１１５Ｌを少量ずつに分けて加えつつ手操作で均一に攪拌混合し、発酵原料を調製した。そして、この発酵原料を上方に開放した容量１０００Ｌの発酵槽に充填し、上からビニールシートで覆った状態で原料温度が５０℃以下を維持するように継続的に温度管理しつつ約１カ月間保管して充分に発酵させたのち、得られた発酵米糠粉末を、粉砕機を通してから２週間自然乾燥し、ＭＡＸ組成物を製造した。
【００２６】
〔実験方法〕
（１）サンプルの経口投与開始の当日に、各群Ｂ区のマウスから採便し、ＩｇＡ定量に供する。その後に、サンプルの経口投与を開始する。
（２）ウイルス感染の２ヵ月前（第４サンプル）、１ヵ月前（第３サンプル）、または、感染当日（第１サンプル、第２サンプル）から１４日後までの間、ＢＡＬＢ/ｃマウス各群1０匹）にサンプルを、１日２回（午前９時、午後６時）、経口投与する。第３サンプル、及び、第４サンプルについては、経口投与開始と同時に、飼料をＮＭＦに切り替える。
（３）感染当日（０ｄ）にウイルス（２×１０４ＰＦＵ/５０μｌ/ｍｏｕｓｅ）を、麻酔下でマウスに経鼻接種する。なお、ＰＦＵは、プラーク形成単位を示すものである。
（４）感染後１４日間、体重および死亡例を記録する（Ｂ区のみ）。
（５）感染３日後に、各群（Ａ区）５匹のマウスから気道洗浄液（ウイルス量およびＩｇＡ量を測定）、肺（ウイルス量およびＩＦＮ−γ量を測定）、全血（血清を分離）と脾臓（ＩＦＮ−γ量を測定）を採取する。なお、ＩＦＮ−γは、インターフェロン−γを示すものである。
（６）感染１４日後に、各投与群（Ｂ区）の残りのマウス（５匹）から糞便（ＩｇＡ量を測定）、全血（血清を分離）、脾臓、気道洗浄液、肺を採取する。
（７）採便の時期
第１サンプル、第２サンプル：経口投与開始日、ウイルス感染当日および感染１４日後の２回
第３サンプル：経口投与開始時、ウイルス感染当日および感染１４日後の３回
第４サンプル：経口投与開始日（０日目）、投与１５日後、投与３０日後、 投与６０日後（ウイルス感染当日）、投与７４日後（ウイルス感染１４日後）の５回
【００２７】
〔測定項目および測定方法〕
（１）体重および死亡例の記録（感染当日〜感染１４日後）
（２）ウイルス量（プラークアッセイ法）：感染３日後の肺及び気管支洗浄液
＜プラークアッセイ法によるウイルス量の測定方法＞
サンプルをＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５倍に希釈し、３５−ｍｍ ディッシュに単層状に培養したＭＤＣＫ細胞（イヌ腎臓由来細胞）に１００μｌずつ加えて、室温で１時間感染させる。その後、プラーク用培地（０．５％ＭＥＡｇａｒｏｓｅ加ＭＥＭ培地）を重層する。３７℃のＣＯ２インキュベータで２日間培養し、プラークの出現していることを確認した後、クリスタルバイオレット液を加えて、細胞を固定・染色する。実体顕微鏡下でプラーク数を測定する。
（３）中和抗体価の測定：感染１４日後の血清、気管支洗浄液
＜測定方法＞
全血を遠心（３，０００ｒｐｍ、５分間ｍ４℃）して血清を分離し、また気道洗浄液は遠心（１，５００ｒｐｍ、５分間、４℃）後に上清を回収した後に、ＰＢＳで１〜５０，０００倍に希釈する。この希釈液１００μｌに、感染に用いた同じウイルス（２０００ ＰＦＵ/ｍｌ）１００μｌを混合する。対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）として、血清または気道洗浄液の代わりにＰＢＳを加える。混合液を３７℃、１時間処理した後、３５−ｍｍディッシュに単層状に培養したＭＤＣＫ細胞に、混合液を１００μｌずつ加え、室温で１時間感染させる。その後に、寒天培地を重層し、３７℃で２日間培養する。プラークの出現を確認した上で、培地を除去し、クリスタルバイオレット液で固定・染色する。顕微鏡下でプラーク数を測定する。Ｃｏｎｔｒｏｌのプラーク数を１００％とした時の各希釈液のプラーク数の％を計算する。プラーク形成を５０％阻害する血清希釈倍数をグラフ上で求め、その数値を中和抗体価とする。
（４）ＩｇＡ定量（ＥＬＩＳＡ法）：上記の時期に採取した糞便、３日後及び１４日後の気管支洗浄液
＜測定方法＞
市販の測定キット（Ｍｏｕｓｅ ＩｇＡ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ、Ｂｅｔｈｙｌ社製）を用いて、指示された手順に従って測定した。
（５）インターフェロン−γの定量（ＥＬＩＳＡ法）：感染３日後及び１４日後の血清、肺、脾臓
＜測定方法＞
市販の測定キット（ＩＦＮ−ＧＡＭＭＡ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ、ＰＧＩ Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ Ｇｒｏｕｐ社製）を用いて、指示された手順に従って測定した。
【００２８】
〔実験結果及び考察〕
かくして、以上のような実験条件及び実験方法、並びに、測定項目及び測定方法に基づいて実験を行った結果、図５〜図１３に示す結果を得た。
【００２９】
＜死亡例および体重の変化＞
全投与期間中、すべての投与群においてマウスの死亡例はなかった。図５に示すように、体重は、第１サンプルにおいて、感染１週間の間、徐々に減少し、感染８日後から緩やかな回復がみられて、感染２週間後にはほぼもとの体重にまで復帰した。また、第２サンプルでは、感染後の２週間にわたって体重減少はほとんどみられなかった。一方、第３サンプル及び第４サンプルでは、全体的に第１サンプルと比べて体重減少が抑制されていて、感染４日後から１１日後の間は有意に体重減少が抑制された。
【００３０】
しかして、２×１０４ＰＦＵのウイルス接種量ではマウスを死亡させることなく、感染が進行した。ウイルス接種の３日後には肺のウイルス量が最大となり、これ以降には肺の炎症に伴う食欲減退によって体重が減少した。マウスにインフルエンザウイルスを接種すると、くしゃみや鼻汁などの症状は発生せず、感染症の症状は体重の減少として発現された。
【００３１】
以上のことから、ＭＡＸ組成物で体重減少が抑制されたことは、インフルエンザ症状が軽度になっていることを意味するものと考えられる。
【００３２】
なお、第１サンプルの実験開始時（ウイルス接種の６０日前）のマウスの平均体重は１７．２ ｇであり、ウイルス接種時には２０．５ ｇとなり、体重は１９%増加した。これに対して、第３サンプルでは、実験開始時（ウイルス接種の６０日前）のマウスの平均体重は１７．３ ｇであり、ウイルス接種時には１９．０ｇとなり、体重増加は１０％であった。さらに、第４サンプルでは、同様に１７．２ｇが１９．４ｇとなり、１３％の増加にとどまった。しかるに、第３サンプル及び第４サンプルのマウスには異常が認められないことから、このような体重増加の抑制は、これまでに報告されているＭＡＸ組成物のダイエット効果を反映しているのかもしれない。
【００３３】
＜感染３日後の肺のウイルス量＞
インフルエンザウイルスを５０μＬの量でマウスに経鼻接種すると、ウイルスは肺で増殖し、その量は３日後に最大となる。そこで、感染３日後の肺のウイルス量を測定したところ、図６に示すように、第２サンプルは著しく増殖を抑制した。一方、第３サンプル、第４サンプルでは、第１サンプルに比べて有意のウイルス増殖抑制を示した。
【００３４】
以上のことから、ＭＡＸ組成物では、肺でのウイルス増殖が抑制され、結果的に症状が緩和され、もって、食欲低下を抑制することになったものと推察される。
【００３５】
＜感染１４日後の中和抗体量＞
インフルエンザウイルスに感染したマウスの体内では、ウイルスに対する抗体が産生され始め、感染２週間後から４週間後にかけて急速に抗体量の増加が見られる。この時に産生される抗体は、インフルエンザウイルスを構成する全てのタンパク質に対する抗体であるが、この中でウイルスが細胞に結合して感染を阻止する抗体を特に中和抗体と呼ぶ。中和抗体の主役は、ウイルスのエンベロープに存在するヘムアグルチニン（ＨＡ）に対する抗体である。本実験では、この中和抗体を測定する目的で、血清や気管支洗浄液を用いて、これらを適宜希釈してウイルス液と反応させ、感染力をまだ維持している（すなわち、抗体で感染力を阻止できなかった）ウイルス量を求めた。
【００３６】
その結果、図７に示す局所（気管支洗浄液）、図８に示す全身（血清）のいずれにおいても、ＭＡＸ組成物では、第１サンプル及び第２サンプルと比べて有意に高い中和抗体量を示した。なお、第２サンプルは、逆に有意に低い中和抗体量をもたらしたが、これは、図６で示した通り、体内のウイルス量が極端に少なかったために十分に抗体産生刺激をもたらすことができなかったためと推察される。これに対して、ＭＡＸ組成物には、体内のウイルス量をある程度抑えながらも、抗体産生は刺激するという効果が認められた。
【００３７】
＜糞便および気管支洗浄液中の総ＩｇＡ量＞
インフルエンザウイルスは、呼吸器系の粘膜で増殖することから、その増殖を抑制するには、粘膜から分泌されるＩｇＡという抗体が必要となる。そこで、ＭＡＸ組成物の経口投与によって刺激を受けると推測される腸管とウイルス増殖の場である気管支における分泌型ＩｇＡ量を測定した。
【００３８】
その結果、図９及び図１０に示すように、第３サンプル、第４サンプルでは、ウイルス感染前には第１サンプル及び第２サンプルと比べて有意のＩｇＡ量の変化はみられなかった。しかしながら、図９及び図１０に示すように、ウイルス感染２週間後（７４日目）になると有意にＩｇＡ量が高くなった。７４日目の第３サンプル及び第４サンプルのＩｇＡ量増加は、インフルエンザウイルスに対する特異的なＩｇＡ量の増加を反映していると考えられ、図７でみられた気管支中の中和抗体（ほとんど分泌型ＩｇＡとみなされる）の増加という結果と矛盾しない。
【００３９】
また、分泌型ＩｇＡが上昇していることから、この抗体が感染防御に寄与していることが知られているコロナウイルスやノロウイルスなど他のウイルスに対する感染防御の可能性も考えられる。
【００４０】
＜血清、肺および脾臓におけるＩＦＮ−γ量＞
全身と肺および脾臓におけるＩＦＮ−γ量をそれぞれ測定した。その結果が図１１〜図１３に示すものである。図１１に示すように、血清中のＩＦＮ−γ量は、ＭＡＸ組成物の投与によって増加したが、図１２及び図１３に示すように、臓器中では顕著な変化がみられなかった。
【００４１】
しかして、以上説明した実験結果によれば、セルロース分解菌の４種の菌株を含むＭＡＸ組成物を用いれば、インフルエンザウイルスの増殖を抑制できることが分かった。
【要約】
【課題】インフルエンザウイルスを抑制することができるインフルエンザウイルス抑制のための組成物を提供する。
【解決手段】セルロース分解性菌として、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｍ−４菌株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２５３８)と、バチルス・ズブチルス(Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ)Ｍ−５菌株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２５３９)と、バチルス・ズブチルスの近縁種であるバチルス・スピーシーズ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ.）Ｍ−６菌株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２９４０)との少なくとも３種のバチルス属菌、及び、パエニバチルスシネリス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｎｅｒｉｓ）Ｍ−９菌株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＡＰ−０３３０４）の少なくとも１種のパニエバチルス属菌を含む非病原性菌類による米糠粉末の発酵物からなる。
【選択図】なし【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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