(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物。
【化１】
0006923100.tif 000007
【請求項２】
下記式（Ｉ）で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を含有する皮膚バリア機能改善剤。
【化２】
0006923100.tif 000008
【請求項３】
下記式（Ｉ）で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を含有するアクアポリン３産生促進剤。
【化３】
0006923100.tif 000009
【請求項４】
下記式（Ｉ）で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を含有するフィラグリン２産生促進剤。
【化４】
0006923100.tif 000010
【請求項５】
下記式（Ｉ）で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を含有する抗炎症剤。
【化５】
0006923100.tif 000011
【請求項６】
前記式（Ｉ）で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物の濃度が０．００１ｍＭ〜１ｍＭである請求項２〜５のいずれか１項に記載の剤。
【請求項７】
皮膚外用剤である請求項２〜６のいずれか１項に記載の剤。
【請求項８】
化粧料である、請求項２〜７のいずれか１項に記載の剤。
【請求項９】
下記式（Ｉ）で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を含有する皮膚バリア機能改善用飲食品組成物。
【化６】
0006923100.tif 000012
【請求項１０】
下記式（Ｉ）で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を含有する抗炎症用飲食品組成物。
【化７】
0006923100.tif 000013
【請求項１１】
イナゴマメ（Ｃｅｒａｔｏｎｉａ  ｓｉｌｉｑｕａ）の莢果の含水アルコール抽出物を得る工程、
前記含水アルコール抽出物を、石油エーテル、酢酸エチルの順に液液抽出を行い、酢酸エチル画分を回収する工程、及び、
前記酢酸エチル画分から式（Ｉ）で表される化合物を分離する工程、を有することを特徴とする該化合物の製造方法。
【化８】
0006923100.tif 000014
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マメ科植物であるイナゴマメ（Ｃｅｒａｔｏｎｉａ  ｓｉｌｉｑｕａ  Ｌ．）から分離、精製して得られる新規なイソフラボン化合物及びその用途に関し、さらに、この化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イナゴマメ（Ｃｅｒａｔｏｎｉａ  ｓｉｌｉｑｕａ  Ｌ．）は、主に地中海地方を原産とするマメ科植物である。イナゴマメの莢果、すなわち、イナゴマメの莢及び果肉はキャロブ（ｃａｒｏｂ）と呼ばれ、古くから食用又は食品原料として利用されてきた。成熟した莢果は長さ１０〜２５ｃｍ程度で、甘味を呈する。イナゴマメの莢果には、多糖類、セルロース及びミネラル類が多く含まれ、タンパク質や非炭水化物系の低分子化合物等が少量含まれている。近年、イナゴマメの新たな機能に関する研究が進められており、イナゴマメの莢果（ｐｏｄ）の水抽出物が、消化管における止瀉、抗酸化、抗菌、抗潰瘍及び抗炎症作用等の複数の薬理作用を有しており、潰瘍性大腸炎や胃潰瘍などの消化器疾患の予防及び治療効果を有することが報告されている（非特許文献１、２）。また、特許文献１には、イナゴマメの種子抽出物にα−グルコシダーゼ阻害活性があり、体重増加の抑制効果を有することが記載され、特許文献２には、イナゴマメの種子から抽出されたペプチドがアクアポリンの発現を活性化することが記載されている。
【０００３】
炎症は非常に一般的で重要な病理学的プロセスであり、神経変性疾患、癌、心血管疾患、関節リウマチ、呼吸器疾患、糖尿病、筋肉や軟部組織の損傷等のほとんどの病気と密接に関連し、多くの急性及び慢性疾患の重要な病原性因子の１つとされている。ＩＬ−６（インターロイキン−６）は、分子量が２１〜２８ｋＤａの糖タンパク質であり、急性炎症、組織損傷や免疫応答等の生物学的プロセスに関与する炎症性サイトカインの一つである。ＩＬ−６は、主にＴＮＦ−αとＩＬ−１が単球を誘導した際に産生され、炎症細胞を活性化するだけでなく、急性期タンパク質の発現を誘導し、炎症反応と毒性作用を触媒・増幅させ、組織細胞に損傷を与える。それゆえ、ＩＬ−６産生抑制アッセイが抗炎症剤をスクリーニングする手段として用いられている。多くの炎症性疾患の臨床治療薬にはさまざまな副作用と薬剤耐性があることから、臨床での適用には制限がある。そのため、治療効果が高く、副作用は少なく、高い安全性をも備えた新たな抗炎症剤が依然として期待されている。
【０００４】
他方、アクアポリン３（Ａｑｕａｐｏｒｉｎ  ３：ＡＱＰ３）は、人間の皮膚で最も発現しているアクアポリンのアイソフォームの一つである。アクアポリン３は細胞膜上に存在し、膜を通して水等の小分子を輸送するトランスポーターであり、細胞膜に「細孔（ｐｏｒｅ）」を形成することにより、生体内の水、グリセロール、尿素等の小分子の膜輸送を仲介し、水のバランスを調整する作用を有している。アクアポリン３は、肌のうるおい、肌のバリア機能、創傷治癒に関与し、皮膚の形態や機能を正常に維持する機能を有し、ケラチノサイトの増殖や遊走、さらには初期分化、アトピー性皮膚炎、白斑、皮膚腫瘍、乾癬などの多くの皮膚疾患に関連している。また、アクアポリン３の発現量が低下（ダウンレギュレーション）することにより、非露光部皮膚の自然老化を引き起こすことが知られている。
【０００５】
また、フィラグリン２（Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ−２：ＦＬＧ２）は、Ｓ１００  ｆｕｓｅｄ−ｔｙｐｅタンパク質ファミリーのメンバーであり、表皮分化複合体（ＥＤＣ）に存在する。フィラグリン２タンパク質及びフィラグリン２のｍＲＮＡは、主に角質化した上皮、特に皮膚に局在している。フィラグリン２の発現パターンは顆粒層の上側と角質層に限定されており、フィラグリンの発現パターンと類似し、構造的にもフィラグリンと密接に関連している。フィラグリン２は上皮の恒常性に関与しているほか、皮膚の角化に必要であり、肌バリアを保護する機能も有する。また、フィラグリン２遺伝子の欠陥は皮膚疾患の発症にも関連している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−１１９９９９号公報
【特許文献２】特表２０１３−５１５７０４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Rtibi K, Jabri M A, Selmi S, et al., “Preventive effect of carob (Ceratonia siliqua L.) in dextran sulfate sodium-induced ulcerative colitis in rat”, RSC Advances, 2016年, Vol. 6, p.19992-20000.
【非特許文献２】Rtibi K, Selmi S, Grami D, et al., “Chemical constituents and pharmacological actions of carob pods and leaves (Ceratonia siliqua L.) on the gastrointestinal tract: A review“, Biomedicine & Pharmacotherapy, 2017年, Vol. 93, p.522-528.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、上述した非特許文献１，２では、イナゴマメの莢果抽出物が、消化管における止瀉、抗酸化、抗菌、抗潰瘍及び抗炎症作用等の薬理作用を有し、消化器疾患の治療効果を有すること、並びに特許文献１，２では、イナゴマメの種子抽出物に体重増加の抑制効果を有すること、及びアクアポリンの発現を活性化するペプチドが含まれていることが報告されているが、具体的な活性成分の特定にはまだ至っていない。
【０００９】
また、イナゴマメの種子（豆）ではなく、イナゴマメの莢果をアクアポリン３遺伝子又はフィラグリン２遺伝子の発現亢進を介した皮膚のバリア機能改善のために用いることについての検討はこれまでなされておらず、その有効性はまったく不明であった。
【００１０】
したがって、本発明は上述した点に鑑みてなされたもので、その目的は、イナゴマメ由来の新規な活性成分及びその用途を提供することにある。
【００１１】
また、本発明の他の目的は、ＩＬ−６産生を抑制することができる、新たな抗炎症剤であって、イナゴマメ由来のものを提供することにある。さらに、この抗炎症剤を含む皮膚外用剤、化粧料及び抗炎症用飲食品組成物を提供することを目的とする。
【００１２】
また、本発明の他の目的は、アクアポリン３遺伝子及び／又はフィラグリン２遺伝子の発現を亢進することができる、新たな皮膚のバリア機能改善剤であって、イナゴマメ由来のものを提供することにある。さらに、この皮膚のバリア機能改善剤を含む皮膚外用剤、化粧料及び皮膚バリア機能改善用飲食品組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、イナゴマメの莢果抽出物から新規なイソフラボン化合物を分離し、この新規化合物が抗炎症作用及び、アクアポリン３遺伝子及びフィラグリン２遺伝子の発現促進作用を有することを見出した。この知見に基づき、本発明を完成するに至った。
【００１４】
上記課題を解決するため、本発明は、下記式（Ｉ）で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物である。
【００１５】
【化１】
0006923100.tif 000002
【００１６】
式（Ｉ）で表される化合物は、イナゴマメ（Ｃｅｒａｔｏｎｉａ  ｓｉｌｉｑｕａ）の莢果抽出物から分離、精製された新規イソフラボン化合物であり、アクアポリン３産生促進作用及びフィラグリン２産生促進作用を備え、皮膚バリア機能改善効果を有すると共に抗炎症作用を有する。
【００１７】
また、本発明の皮膚バリア機能改善剤は、上述した式（Ｉ）で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を含有する。式（Ｉ）で表される化合物を投与することにより、アクアポリン３遺伝子及びフィラグリン２遺伝子の発現が促進され、皮膚のバリア機能を適切な状態に保つ機能を担うアクアポリン３及びフィラグリン２の産生が促進されるため、皮膚バリア機能の改善効果が発揮される。
【００１８】
また、本発明のアクアポリン３産生促進剤は、上述した式（Ｉ）で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を含有する。式（Ｉ）で表される化合物を投与することにより、アクアポリン３遺伝子の発現が促進され、アクアポリン３の産生が促進される。
【００１９】
また、本発明のフィラグリン２産生促進剤は、上述した式（Ｉ）で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を含有する。式（Ｉ）で表される化合物を投与することにより、フィラグリン２遺伝子の発現が促進され、フィラグリン２の産生が促進される。
【００２０】
また、本発明の抗炎症剤は、上述した式（Ｉ）で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を含有する。式（Ｉ）で表される化合物を投与することにより、炎症因子であるＩＬ−６の産生が抑制され、炎症反応が低減される。
【００２１】
また、本発明の皮膚バリア機能改善剤、アクアポリン３産生促進剤、フィラグリン２産生促進剤及び抗炎症剤は、上述した式（Ｉ）で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物の濃度が０．００１ｍＭ〜１ｍＭであることも好ましい。これにより、効果に優れる活性成分の濃度が選択される。
【００２２】
また、本発明の皮膚バリア機能改善剤、アクアポリン３産生促進剤、フィラグリン２産生促進剤及び抗炎症剤は、皮膚外用剤又は化粧料であることも好ましい。これにより、皮膚バリア機能の改善効果、アクアポリン３産生促進作用、フィラグリン２産生促進作用及び抗炎症作用を有する皮膚外用剤又は化粧料が得られる。
【００２３】
また、本発明の皮膚バリア機能改善用飲食品組成物は、上述した式（Ｉ）で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を含有する。アクアポリン３遺伝子及びフィラグリン２遺伝子の発現が亢進し、アクアポリン３及びフィラグリン２の産生が促進されることにより、皮膚バリア機能の改善効果が発揮される飲食品組成物が得られる。
【００２４】
また、本発明の抗炎症用飲食品組成物は、上述した式（Ｉ）で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を含有する。炎症因子であるＩＬ−６産生が抑制されることにより、抗炎症作用が発揮される飲食品組成物が得られる。
【００２５】
また、本発明の上述した式（Ｉ）で表される化合物の製造方法は、イナゴマメ（Ｃｅｒａｔｏｎｉａ  ｓｉｌｉｑｕａ）の莢果の含水アルコール抽出物を得る工程、この含水アルコール抽出物を石油エーテル、酢酸エチルの順に液液抽出を行い、酢酸エチル画分を回収する工程、及び、回収された酢酸エチル画分から式（Ｉ）で表される化合物を分離する工程、を有している。これにより、アクアポリン３産生促進作用及びフィラグリン２産生促進作用を備え、皮膚バリア機能改善効果を有すると共に抗炎症作用を有する、新規なイソフラボン化合物が得られる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、以下のような優れた効果を有する新規イソフラボン化合物並びにこれを含有する皮膚バリア機能改善剤、アクアポリン３産生促進剤、フィラグリン２産生促進剤、抗炎症剤、皮膚外用剤、化粧料及び飲食品組成物を提供することができる。
（１）アクアポリン３遺伝子の発現を亢進させ、アクアポリン３の産生を促進することができる。
（２）フィラグリン２遺伝子の発現を亢進させ、フィラグリン２の産生を促進することができる。
（３）アクアポリン３産生促進作用及びフィラグリン２産生促進作用を備え、相乗的な皮膚バリア機能改善効果を有する。
（４）ＩＬ−６産生を抑制し、抗炎症作用を有する。
（５）古来から食用とされているイナゴマメの莢果由来の化合物を有効成分とするものであるため、人体に対する安全性が高い。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明の化合物の高分解能ＥＳＩマススペクトルを示す図である。
【図２】本発明の化合物の紫外吸収スペクトルを示す図である。
【図３】本発明の化合物の赤外吸収スペクトルを示す図である。
【図４】本発明の化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤ３ＯＤ、６００ＭＨｚ）を示す図である。
【図５】本発明の化合物の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤ３ＯＤ、１５０ＭＨｚ）を示す図である。
【図６】本発明の化合物のＨＳＱＣスペクトルを示す図である。
【図７】本発明の化合物のＨＭＢＣスペクトルを示す図である。
【図８】本発明の化合物のＮＯＥＳＹスペクトルを示す図である。
【図９】本発明の化合物の１Ｈ−ＮＭＲシグナル及び１３Ｃ−ＮＭＲシグナルを一覧にまとめた図である。
【図１０】本発明の化合物のＨＭＢＣ相関及びＮＯＥＳＹ相関を示す図である。
【図１１】実施例４における、ＬＰＳ誘発ＩＬ−６の産生量を示すグラフである。
【図１２】実施例５における、アクアポリン３遺伝子（ＡＱＰ３）のｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。
【図１３】実施例５における、フィラグリン２遺伝子（ＦＬＧ２）のｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明の新規イソフラボン化合物及びこれを含む皮膚バリア機能改善剤、アクアポリン３産生促進剤、フィラグリン２産生促進剤、抗炎症剤、皮膚外用剤、化粧料、皮膚バリア機能改善用飲食品組成物、抗炎症用飲食品組成物並びにこの化合物の製造方法について説明する。
【００２９】
本発明に係る下記式（Ｉ）で表される新規イソフラボン化合物は、イソフラボン化合物とグルコースとがエステル結合したイソフラボン配糖体である。
【００３０】
【化２】
0006923100.tif 000003
【００３１】
本発明に係る新規イソフラボン化合物は塩であってもよく、薬理学的に許容される塩であることが好ましい。この新規イソフラボン化合物の薬理学的に許容される塩としては、酸又は塩基と形成される塩であればよく、特に限定されない。また、この新規イソフラボン化合物又はその塩は、溶媒和物であってもよく、特に限定されないが、例えば、水和物、エタノール等の有機溶媒和物が挙げられる。
【００３２】
本発明に係る新規イソフラボン化合物は、優れたアクアポリン３産生促進作用と、フィラグリン２産生促進作用とを併せ持つことから、複数のメカニズムによる皮膚バリアの正常化・バリア機能の保持効果が得られる皮膚バリア機能改善剤として用いることができる。さらに、本発明の化合物は、ＩＬ−６産生抑制活性を有しており、抗炎症剤として用いることができる。
【００３３】
本発明において、アクアポリン３産生促進とは、アクアポリン３遺伝子の発現促進又はアクアポリン３（タンパク質）の発現促進のことをいい、本発明の新規イソフラボン化合物を添加又は投与されない状態のコントロールと比較して、アクアポリン３遺伝子又はアクアポリン３の発現が亢進していることを意味する。より具体的には、アクアポリン３遺伝子の発現レベルがコントロールの１．５倍以上であることが好ましく、１．７倍以上であることがより好ましく、２倍以上であることが特に好ましい。また、フィラグリン２産生促進とは、フィラグリン２遺伝子の発現促進又はフィラグリン２（タンパク質）の発現促進のことをいい、本発明の新規イソフラボン化合物を添加又は投与されない状態のコントロールと比較して、フィラグリン２遺伝子又はフィラグリン２の発現が亢進していることを意味する。より具体的には、フィラグリン２遺伝子の発現レベルがコントロールの１．１倍以上であることが好ましく、１．２倍以上であることがより好ましく、１．３倍以上であることが特に好ましい。これらの遺伝子の発現レベルは、例えば、リアルタイムＰＣＲ（ＱＰＣＲ）やマイクロアレイ等の公知の方法で測定でき、タンパク質の発現レベルは、例えば、免疫染色、ウエスタンブロッティング等の公知の方法で測定され得る。
【００３４】
また、本発明において、抗炎症作用とは、本発明の新規イソフラボン化合物を添加又は投与されない状態のコントロールと比較して、例えば、ＬＰＳにより誘発されたＩＬ−６産生量を低減させる作用を意味する。
【００３５】
本発明の新規イソフラボン化合物は、イナゴマメの莢果から分離、精製することにより得ることができる。本発明で用いられるイナゴマメとは、学名をＣｅｒａｔｏｎｉａ  ｓｉｌｉｑｕａといい、マメ科ジャケツイバラ亜科イナゴマメ属の植物である。地中海沿岸地方を原産とする植物であるが、本発明においては、産地や栽培環境は特に限定されず、あらゆる産地及び栽培環境のイナゴマメを用いることができる。
【００３６】
本発明の新規イソフラボン化合物のイナゴマメからの分離方法について説明する。まず、イナゴマメの莢果から含水アルコール抽出物を得る。本発明におけるイナゴマメ莢果の含水アルコール抽出物とは、イナゴマメの莢果に抽出溶媒として含水アルコールを加え、抽出処理を施すことによって得られた抽出物をいう。イナゴマメの莢果とは、イナゴマメの莢付果実の莢と果肉のことを意味し、莢又は果肉のいずれか一方を抽出材料として用いることも可能であるが、莢及び果肉を用いることがより好ましい。抽出処理は、採取された状態、すなわち、生の状態のイナゴマメ莢果、又は乾燥状態のイナゴマメ莢果に対して行われるが、抽出効率の向上を図るため、又は取り扱いを容易とするために種々の前処理が施されたイナゴマメ莢果に対して抽出処理を施すことも可能である。前処理としては、特に限定されないが、乾燥処理、破砕処理又は粉砕処理等が挙げられ、これら前処理が施されたイナゴマメの莢果に抽出処理を施して抽出物を得てもよい。
【００３７】
抽出溶媒として用いられる含水アルコールを構成するアルコールとしては、本発明のイソフラボン化合物を抽出できるものであれば特に限定されず、例えば、エタノール、メタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール又はイソブタノール等が挙げられる。このうち、人体への安全性及び抽出効率等の観点から、抽出溶媒としては、含水エタノールが好適に選択される。また、含水アルコールのアルコール濃度としては、５０〜９９％が好ましく、６０〜９７％がより好ましく、７０〜９５％が特に好ましい。また、抽出溶媒には、本発明の化合物の抽出を妨げない範囲において、他の成分を含有させることも可能である。
【００３８】
含水アルコールによる抽出方法としては、イナゴマメの莢果に抽出溶媒である含水アルコールを加えて浸漬させ、抽出を行う。例えば、イナゴマメ莢果を含水率１０％未満の乾燥破砕物とした場合には、植物体１重量部に対し、抽出溶媒を５〜１０重量部用いることが好ましい。また、抽出方法としては、室温での抽出、加熱抽出、加圧加熱抽出又は亜臨界抽出等のいずれの方法でも行うことが可能であるが、抽出効率の観点から、還流操作による加熱抽出が好ましい。また、抽出効率を高めるため、抽出操作は複数回行うことが好ましく、抽出溶媒中のアルコール濃度を変えて複数回の抽出操作を行うことがさらに好ましい。特に限定されないが、具体的には、９５％エタノールによる還流抽出を１〜５回行い、引き続いて、７０％エタノールによる還流抽出を１〜５回行うといった抽出方法が挙げられる。抽出時間は、抽出方法、抽出材料の態様、抽出溶媒の種類又は抽出温度等に応じて種々設定されるが、例えば、７０〜９５％のエタノールを用いて還流抽出を行う場合には、１回の抽出時間として１〜３時間程度とすることが好ましく、１．５時間程度とすることが特に好ましい。上述した抽出処理後、残渣をデカンテーション、遠心分離又はろ過等により取り除くことによりイナゴマメの莢果の含水アルコール抽出物が得られる。得られた抽出物には減圧蒸留等の処理を施すことにより、濃縮液や固形物としたものも含まれる。
【００３９】
上述のようにして得られたイナゴマメの莢果の含水アルコール抽出物については、イナゴマメの莢果に多量に含まれている糖類等が存在すると考えられるため、これら不要な成分を除去することを目的として、イオン交換樹脂による分離操作を行ってもよい。具体的には、イナゴマメの莢果の含水アルコール抽出物１重量部に対し、１〜１０重量部の水を加えて分散させ、マクロポーラス吸着樹脂等のイオン交換樹脂を詰めたカラムに通し、本発明のイソフラボン化合物を吸着させて、糖類などの不要成分を流出除去させる。その後、９５％エタノール等で溶出させることにより、本発明のイソフラボン化合物を含む画分が回収される。
【００４０】
引き続いて、イナゴマメの莢果の含水アルコール抽出物又は上述したイオン交換樹脂により分離された回収画分のさらなる分離操作について説明する。含水アルコール抽出物又は回収画分を水系溶媒に分散させ、石油エーテル、酢酸エチルの順に溶媒抽出を行う。水系溶媒としては、本発明のイソフラボン化合物を分散できるものであれば特に限定されないが、５０％含水メタノールが好適に用いられる。石油エーテル／水系溶媒での液液抽出を複数回行った後、酢酸エチル／水系溶媒での液液抽出を複数回行う。この溶媒抽出操作により回収された酢酸エチル画分に本発明の新規なイソフラボン化合物が含まれる。各溶媒系での液液抽出の回数は２〜１０回程度が好ましく、５回程度が特に好ましい。
【００４１】
上述のようにして得られた酢酸メチル画分から常法に基づき精製することにより、本発明の新規イソフラボン化合物が単離され得る。精製方法としては、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー及び高速液体クロマトグラフィー等を挙げることができ、これらのうちの１種又は複数を組み合わせて精製することが可能である。各種クロマトグラフィーに用いられる担体や溶出溶媒等は、各種クロマトグラフィーに対応して適宣選択することができる。
【００４２】
なお、上述のようにしてイナゴマメの莢果から分離、精製された本発明のイソフラボン化合物は、完全な純物質として単離されていなくてもよく、イナゴマメ原料由来の他の成分が一部含まれていてもよい。
【００４３】
さらに、本発明の新規イソフラボン化合物は、公知の方法で合成して得られた合成品であってもよい。
【００４４】
本発明の新規イソフラボン化合物は、優れたアクアポリン３産生促進作用と、フィラグリン２産生促進作用とを併せ持つことから、複数のメカニズムによる皮膚バリア機能改善剤として用いることができる。また、本発明の新規イソフラボン化合物は、アクアポリン３産生促進剤又はフィラグリン２産生促進剤として用いることができる。さらに、本発明の新規イソフラボン化合物は、ＩＬ−６産生抑制活性を有していることから、抗炎症剤として用いることができる。また、本発明の新規イソフラボン化合物はＩＬ−６産生抑制剤として用いることができる。
【００４５】
本発明の新規イソフラボン化合物を含有する皮膚バリア機能改善剤、アクアポリン３産生促進剤及びフィラグリン２産生促進剤は、皮膚細胞に含まれるアクアポリン３及びフィラグリン２を増加させ、皮膚バリア機能を改善し、皮膚の老化を改善し、皮膚を安定した状態に保つための皮膚外用剤として用いることができる。また、本発明の皮膚バリア機能改善剤、アクアポリン３産生促進剤及びフィラグリン２産生促進剤は、皮膚細胞に含まれるアクアポリン３及びフィラグリン２を増加させ、皮膚のうるおいを保ち、皮膚を健やかに保つ作用を有する化粧料として用いることができる。さらに、本発明の新規イソフラボン化合物を含有する抗炎症剤は、炎症因子の産生を抑制し、皮膚における炎症を予防又は改善し、皮膚を安定した状態に保つための皮膚外用剤として用いることができる。また、本発明の抗炎症剤は、炎症因子の産生を抑制し、皮膚を健やかに保つ作用を有する化粧料として用いることができる。
【００４６】
本発明の皮膚バリア機能改善剤、アクアポリン３産生促進剤、フィラグリン２産生促進剤及び抗炎症剤の投与量は、目標とする効果、予防又は治療効果、投与方法又は年齢などによって変化するので一概には規定できないが、外用剤として用いた場合における、通常一日の非経口的な投与量は、本発明のイソフラボン化合物として、０．２μｇ〜３０ｍｇとすることが好ましく、１μｇ〜３ｍｇとすることがより好ましく、５μｇ〜５００μｇとすることがさらに好ましい。また、内用剤として用いた場合における、経口的な投与量としては、本発明のイソフラボン化合物として、通常一日１μｇ〜１０００ｍｇとすることが好ましく、５μｇ〜５００ｍｇとすることがより好ましい。
【００４７】
本発明の皮膚バリア機能改善剤、アクアポリン３産生促進剤、フィラグリン２産生促進剤及び抗炎症剤並びに皮膚外用剤及び化粧料の剤形は、特に限定されず、例えば、低粘度液体、ローション等の液剤、乳液、ゲル、ペースト、クリーム、フォーム、パック、軟膏、粉剤、エアゾール又は貼付剤等、並びに錠剤、顆粒剤、カプセル剤又は内服用液剤等が挙げられる。なお、本発明に係る皮膚バリア機能改善剤、アクアポリン３産生促進剤、フィラグリン２産生促進剤及び抗炎症剤は、化粧品、医薬部外品又は医薬品のいずれにも適用することができる。具体的な製品としては、特に限定されないが、化粧水、化粧クリーム、化粧乳液、美容液、化粧パック、化粧洗浄料、石鹸、ヘアケア剤、浴用剤又はメーキャップ化粧料、抗ニキビスキンケア化粧料等が挙げられる。
【００４８】
本発明の皮膚バリア機能改善剤、アクアポリン３産生促進剤、フィラグリン２産生促進剤及び抗炎症剤並びに皮膚外用剤及び化粧料中において、本発明の新規イソフラボン化合物の配合濃度は、好ましくは０．００１ｍＭ〜１ｍＭであり、より好ましくは５μＭ〜１００μＭであり、さらに好ましくは１０μＭ〜３０μＭである。新規イソフラボン化合物の配合量をこの範囲内とすることにより、本化合物を安定に配合することができ、皮膚への安全性も高く、高い皮膚バリア機能改善効果、アクアポリン３産生促進効果、フィラグリン２産生促進効果及び抗炎症効果を発揮することができる。
【００４９】
本発明の皮膚バリア機能改善剤、アクアポリン３産生促進剤、フィラグリン２産生促進剤及び抗炎症剤は、従来慣用されている方法により種々の形態に調製することができる。この場合、通常製剤用の担体や賦形剤など、医薬品の添加剤として許容されている添加剤を用いて製剤化することができる。また、本化合物のバイオアベイラビリティーや安定性を向上させるために、マイクロカプセル、微粉末化、シクロデキストリン等を用いた包接化などの製剤技術を含むドラッグデリバリーシステムを用いることもできる。
【００５０】
また、本発明の皮膚バリア機能改善剤、アクアポリン３産生促進剤、フィラグリン２産生促進剤及び抗炎症剤並びに皮膚外用剤及び化粧料には、皮膚外用剤及び化粧料に通常用いられる成分である水、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、高級アルコール類、エステル類、植物抽出エキス類、ビタミン類、水溶性高分子、界面活性剤、金属石鹸、アルコール、多価アルコール、ｐＨ調整剤、防腐剤、香料、粉体、増粘剤、色素又はキレート剤等の成分を適宜配合することができる。さらに、本発明の作用効果を損なわない範囲において、通常用いられる各種の機能性成分、例えば、保湿剤、美白剤、抗酸化剤、細胞賦活剤、紫外線防御剤、血行促進剤及び他の抗炎症剤等から選ばれる機能性成分の一種または二種以上と併用することができる。
【００５１】
さらに、本発明の皮膚バリア機能改善用飲食品組成物及び抗炎症用飲食品組成物は、本発明の新規イソフラボン化合物を活性成分として含有している。本発明に係る飲食品組成物は、錠剤やカプセル剤、顆粒剤、シロップ剤などのサプリメント形態、清涼飲料、果汁飲料、アルコール飲料などの飲料、アメやガム、クッキー、ビスケット、チョコレート等の菓子、パン、粥、シリアル、麺類、ゼリー、スープ、乳製品、調味料等のあらゆる形態とすることができる。このように飲食品として用いる際には、本発明の有効成分の効能に影響を与えない範囲において、他の有効成分や、ビタミン、ミネラル若しくはアミノ酸等の栄養素等を種々組み合わせることも可能である。本発明の飲食品には、サプリメント、健康食品、機能性食品、特定保健用食品等が含まれる。また、本発明の飲食品の１日あたりの摂取量は、本発明のイソフラボン化合物として、通常一日１μｇ〜１０００ｍｇとすることが好ましく、５μｇ〜２００ｍｇとすることがより好ましい。
【００５２】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によってなんら限定されるものではない。
【実施例】
【００５３】
［実施例１］
１．イナゴマメ莢果の含水アルコール抽出物の調製
採取後、乾燥処理されたイナゴマメ（Ｃｅｒａｔｏｎｉａ  ｓｉｌｉｑｕａ）の莢付果実から種を取り除いた。このイナゴマメの莢果を粉砕機で粉砕して粒径２ｍｍ以下の粉砕物を得た。２０ｋｇの粉砕物に対し、１４０ｋｇ（７倍量）の含水９５％エタノールを加え、１．５時間還流抽出する操作を２回行った後、残渣をさらに１４０ｋｇ（７倍量）の含水７０％エタノールで１．５時間還流抽出した。得られた還流抽出液を合わせた後、溶媒を減圧留去してイナゴマメ莢果の含水エタノール抽出物１２．４ｋｇを得た。
【００５４】
［実施例２］
２．イナゴマメ莢果の含水アルコール抽出物の分離及び精製
実施例１で得られたイナゴマメ莢果の含水エタノール抽出物を１〜１０倍量の水に分散させ、イオン交換樹脂（マクロポーラス吸着樹脂Ｄ１０１、Cangzhou Bon Adsorber Technology Co., Ltd.）に吸着させた。カラム容量の３倍量の蒸留水で溶出して糖類等の不純物を除去した後、カラム容量の３倍量の含水９５％エタノールで溶出させ、溶媒を減圧留去し、４６２．７ｇのエタノール溶出画分（非炭水化物系低分子化合物画分）を得た。次に、得られたエタノール溶出画分を１．０Ｌの含水５０％メタノールに分散させ、石油エーテル、酢酸エチルの順に、それぞれ５回ずつ液液抽出を行った。各溶媒を減圧留去して、石油エーテル画分２８．４ｇ、酢酸エチル画分１３９．４ｇ及び水系画分２９０．２ｇをそれぞれ得た。
【００５５】
次に、１３５．０ｇの酢酸エチル画分について、順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（カラム充填材：２００〜３００メッシュ、青島海洋化工場製品）に供し、石油エーテル（Ｐ）／酢酸エチル（Ｅ）及びジクロロメタン（Ｃ）／メタノール（Ｍ）の２つの展開溶媒を用いて溶出させ、分画を行った。この結果、１０８個の溶出画分が得られた。得られた１０８個の溶出画分について、薄層クロマトグラフィー（シリカゲルＧＦ２５４プレート、青島海洋化工場製品）による同定を行い、類似する画分を合わせて１０個の溶出画分Ａ〜Ｊを得た。
【００５６】
次に、溶出画分Ｉ（２０．０ｇ）について、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー（カラム充填材：４０〜６３μｍ、メルク社製品）に供し、メタノール：水＝１５：８５→１００：０の勾配溶出により分画を行った。得られた溶出画分について、薄層クロマトグラフィー（シリカゲルＧＦ２５４プレート、青島海洋化工場製品）による同定を行い、類似する画分を合わせて５つの溶出画分Ｉ１〜Ｉ５を得た。
【００５７】
次に、溶出画分Ｉ５（２．７ｇ）について、ゲルろ過クロマトグラフィー（カラム充填材：Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０）に供し、ジクロロメタン：メタノール＝１：１で溶出させ、５つの溶出画分Ｉ５ａ〜Ｉ５ｅを得た。
【００５８】
次に、溶出画分Ｉ５ｃ（０．３ｇ）をセミ分取ＨＰＬＣ（カラムＩ：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ、２５０×２０ｍｍ、５μｍ）に供し、メタノール：水＝５５：４５、検出波長２６７ｎｍで分離し、画分Ｉ５ｃ１を得た。この画分Ｉ５ｃ１をセミ分取ＨＰＬＣ（カラムＩＩ：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ、２５０×１０ｍｍ、５μｍ）に供し、メタノール：水＝４９：５１、検出波長２６７ｎｍで分離して、本発明の化合物（以下、「Ｃｅｒａｔｏｎｉａ  ｓｉｌｉｑｕａ  Ｃ」という。）３．３ｍｇを得た（保持時間ｔＲ＝５６．４２分）。
【００５９】
［実施例３］
３．化合物（Ｃｅｒａｔｏｎｉａ  ｓｉｌｉｑｕａ  Ｃ）の構造解析
実施例２で得られた化合物、「Ｃｅｒａｔｏｎｉａ  ｓｉｌｉｑｕａ  Ｃ」の構造解析を行った。構造解析にあたり、高分解能質量分析（ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ；正イオンモード）、紫外吸収スペクトル分析、赤外吸収スペクトル分析、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＨＭＢＣ、ＨＳＱＣ及びＮＯＥＳＹ分析を行った。これらの分析に用いた装置は次のとおりである。
・高分解能質量分析：エレクトロスプレーイオン化四重極飛行時間型質量分析装置（Bruker Daltonics社製品）
・紫外吸収スペクトル分析：紫外可視分光光度計（ＵＶ−２４０１ＰＣ、株式会社島津製作所製品）
・赤外吸収スペクトル分析：ＦＴ−ＩＲ（ＮＥＸＵＳ４７０、Thermo nicolet社製品）
・ＮＭＲ分析：６００ＭＨｚ核磁気共鳴装置（ＡＶＡＮＣＥ  ＩＩＩ  ６００、Bruker社製品）
【００６０】
Ｃｅｒａｔｏｎｉａ  ｓｉｌｉｑｕａ  Ｃの物理的性質は以下のとおりである。高分解能質量分析（ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ）のスペクトルを図１に、紫外吸収スペクトル分析の結果を図２に、赤外吸収スペクトル分析の結果を図３にそれぞれ示す。
・性状：黄色粉末
・ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）  ｍ／ｚ：４９９．１２６６［Ｍ＋Ｎａ］＋
・紫外吸収スペクトル：λｍａｘ（ＭｅＯＨ）ｎｍ  （ｌｏｇε）：２０４．６（４．０７），２６４．２（４．０２）
・赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ、ｃｍ−１）：νｍａｘ：３４２２．３０，１６５１．４０，１６１３．９５，１５８７．９１，１５１６．４６，１４９４．５５，１４４１．２１，１３６６．５２，１３２３．４１，１２７９．５６，１２６５．０５，１２５３．９９，１２１９．５３，１１８２．６６，１１１２．３６，１０７１．８３，１０５５．９０，１０２９．９１，１０１２．４１，８３０．５７
【００６１】
高分解能質量分析（図１）の結果、準分子イオンピークが、ｍ／ｚ  ４９９．１２６６［Ｍ＋Ｎａ］＋であることから、組成式はＣ２３Ｈ２４Ｏ１１、不飽和度は１２と推定された。また、紫外吸収スペクトル（図２）からは、２０４ｎｍ及び２６４ｎｍに最大吸収があることから、Ｃｅｒａｔｏｎｉａ  ｓｉｌｉｑｕａ  Ｃはフラボノイド系化合物である可能性が示唆された。また、赤外吸収スペクトル（図３）からは、分子構造に、水酸基（３４２２．３０ｃｍ−１）、ベンゼン環（１６１３．９５ｃｍ−１、１４９４．５５ｃｍ−１）及びケトカルボニル基（１６５１．４０ｃｍ−１）等の官能基が含まれることが示された。
【００６２】
さらに、１Ｈ−ＮＭＲ分析（溶媒：ＣＤ３ＯＤ、観測周波数：６００ＭＨｚ）により得られたスペクトル（図４）からは、２つの芳香族シングレットシグナル［δＨ：８．２４（１Ｈ，ｓ，Ｈ−２），６．６９（１Ｈ，ｓ，Ｈ−５］、１組のＡＡＢＢ系プロトンシグナル［δＨ：７．５０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，Ｈ−２′，Ｈ−６′），７．００（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，Ｈ−３′，Ｈ−５′）］、２つのメトキシ基シグナル［δＨ：３．９１（３Ｈ，ｓ，ＯＣＨ３−８）、３．８３（３Ｈ，ｓ，ＯＣＨ３−４′）］、１組のグルコース残基のプロトンシグナル［δＨ：５．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｈ−１″）、３．９１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，Ｈ−６α″）、３．７３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，Ｈ−６β″）、３．５５（１Ｈ，ｍ，Ｈ−２″）、３．５０（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３″，Ｈ−５″）、３．４３（１Ｈ，ｍ，Ｈ−４″）］が確認された（図９）。また、１３Ｃ−ＮＭＲ分析（溶媒：ＣＤ３ＯＤ、観測周波数：１５０ＭＨｚ）により得られたスペクトル（図５）からは、１つのケトカルボニル基の炭素シグナル（δＣ：１８２．５）、１４個の芳香族又はオレフィンの炭素シグナル（δＣ：１６１．４，１５８．７，１５７．７，１５５．５，１５１．４，１３１．４×２，１３０．７，１２４．７，１２４．２，１１４．９×２，１０７．７，１００．２）、２つのメトキシ基シグナル（δＣ：６２．４、５５．８）、１組のグルコース残基の炭素シグナル（δＣ：１０２．０，７８．４，７８．０，７４．８，７１．１，６２．３）を含む２３個の炭素シグナルが観察された（図９）。これらの解析結果より、本化合物は、フラボノイド配糖体であると推定された。
加えて、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの低磁場領域に、イソフラボンに特徴的な芳香族プロトンシグナル［δＨ：８．２４（１Ｈ，ｓ，Ｈ−２）］が認められることから、本化合物はイソフラボン化合物であることが推定された。
【００６３】
そして、ＨＭＢＣ分析により得られたスペクトル（図７）からは、Ｈ−２とＣ−４／Ｃ−９／Ｃ−１′及びＨ−２′／Ｈ−６′とＣ−３のロングレンジ相関シグナルが観察された。この結果より、本化合物はイソフラボン化合物であることが示された。Ｈ−２′／Ｈ−６′とＣ−４′、ＯＣＨ３−４′のロングレンジ相関シグナルは、ＯＣＨ３−４′がＣ−４′位に結合していることを示しており、このことは、ＮＯＥＳＹスペクトル（図８）で観察されたＨ−３′／Ｈ−５′とＯＣＨ３−４′の相関シグナルによっても確認された。また、ＨＭＢＣスペクトルからは、Ｈ−５とＣ−４／Ｃ−６／Ｃ−７／Ｃ−８／Ｃ−９のロングレンジ相関シグナルが観察され、Ｈ−５位は置換基で置換されていないことが明らかとなった。一方、Ｈ−１″とＣ−６のロングレンジ相関シグナルはグルコース残基がＣ−６位に結合していることを示しており、このことは、ＮＯＥＳＹスペクトルのＨ−１″とＨ−５の相関シグナルによっても確認された。また、ＨＭＢＣスペクトルからは、ＯＣＨ３−８及び化学シフト値δＣ：１３０．７の炭素にロングレンジ相関シグナルが観察されたが、Ｈ−５とＣ−７／Ｃ−８にもロングレンジ相関シグナルが観察された。それゆえ、ＨＭＢＣスペクトルではＯＣＨ３−８の結合位置は確認できなかった。そこで、フラボノイド化合物に関する文献（Yang G Y, Miao M M, Wang Y, et al., “Flavonoids from the leaves of Sun Cured Tobacco and their anti‐tobacco mosaic virus activity”, Cheminform., 2015年, Vol.46, No.6, p.1198-1203）を参照し、本化合物の構造とＮＭＲデータを検討したところ、フラボノイド化合物のＣ−８位をメトキシ基で置換した場合の化学シフト値δＣは約１３０．０であり、Ｃ−７位をメトキシ基で置換した場合の化学シフト値δＣは１５０．０より大きいことがわかった。したがって、ＯＣＨ３−８がＣ−７位ではなくＣ−８位に結合されていることが同定された。グルコース末端のプロトンの結合定数は７．８Ｈｚであり、グルコースの末端の相対配置はβ型であることがわかった。これらの解析結果から本化合物、Ｃｅｒａｔｏｎｉａ  ｓｉｌｉｑｕａ  Ｃの構造を以下式（Ｉ）のとおり決定した。図９に、ＨＳＱＣスペクトル及びＨＭＢＣスペクトル分析に基づく、１Ｈ−ＮＭＲのδＨ及び１３Ｃ−ＮＭＲのδＣをまとめた帰属表を示す。また、図１０にＣｅｒａｔｏｎｉａ  ｓｉｌｉｑｕａ  ＣのＮＯＥＳＹ及びＨＭＢＣの解析結果を示す。
【００６４】
【化３】
0006923100.tif 000004
【００６５】
［実施例４］
４．Ｃｅｒａｔｏｎｉａ  ｓｉｌｉｑｕａ  Ｃの抗炎症作用
実施例２で得たＣｅｒａｔｏｎｉａ  ｓｉｌｉｑｕａ  Ｃを用いて、Ｃｅｒａｔｏｎｉａ  ｓｉｌｉｑｕａ  Ｃが炎症性サイトカインであるＩＬ−６の産生に与える影響を調べた。
【００６６】
本試験においては、マウスマクロファージ由来細胞株であるＲＡＷ２６４．７細胞を用いた。ＲＡＷ２６４．７細胞は、ＤＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１００μＭ／ｍＬストレプトマイシンを含む）で３７℃、５％ＣＯ２存在下、飽和湿度条件下で培養した。
【００６７】
９６ウェルプレートの各ウェルに、８×１０３個のＲＡＷ２６４．７細胞をそれぞれ播種し、ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した。これをブランクコントロール群、陽性対照群及び試験群に分け、ブランクコントロール群にはＤＭＥＭ培地を１００μＬ添加し、陽性対照群にはデキサメタゾン（ＤＸＭ）をＤＭＥＭ培地に溶解させた溶液を１００μＬ添加し（デキサメタゾンの最終濃度：２０μＭ）、試験群にはＣｅｒａｔｏｎｉａ  ｓｉｌｉｑｕａ  ＣをＤＭＥＭ培地で適宜希釈した溶液を異なる濃度（最終濃度：１μＭ、５μＭ、１０μＭ、５０μＭ及び１００μＭ）となるように１００μＬずつ添加した。３時間後、ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）を添加して炎症を誘発した。２４時間後、上清を回収し、ＩＬ−６定量ＥＬＩＳＡキットを用いて上清中のＩＬ−６含有量を測定した。試験はブランクコントロール群、陽性対照群及び試験群における各濃度のサンプル液について、３回（３ウェル）ずつ行った（ｎ＝３）。
【００６８】
結果を図１１に示す。ＬＰＳはブランクコントロールを、ＤＸＭは陽性対照（デキサメタゾン：２０μＭ）を示している。本発明の化合物であるＣｅｒａｔｏｎｉａ  ｓｉｌｉｑｕａ  Ｃは、濃度依存的にＩＬ−６の産生を抑制することがわかった。このことから、本発明の新規イソフラボン化合物には抗炎症作用を有することが示された。
【００６９】
［実施例５］
５．Ｃｅｒａｔｏｎｉａ  ｓｉｌｉｑｕａ  Ｃの皮膚バリア機能関連遺伝子の発現促進作用
実施例２で得たＣｅｒａｔｏｎｉａ  ｓｉｌｉｑｕａ  Ｃを用いて、ヒト表皮由来角化細胞株であるＨａＣａＴ細胞におけるＣｅｒａｔｏｎｉａ  ｓｉｌｉｑｕａ  Ｃのアクアポリン３（ＡＱＰ３）及びフィラグリン２（ＦＬＧ２）の遺伝子発現に与える影響を調べた。
【００７０】
まず、ＨａＣａＴ細胞を、ＤＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ及び１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｍ／ｍＬストレプトマイシンを含む）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２及び飽和湿度条件下で培養した。次に、６ウェル細胞培養プレートの各ウェルに、５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように細胞濃度を調整したＨａＣａＴ細胞を播種し、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２、３７℃）で２４時間培養した。その後、実施例２で単離したＣｅｒａｔｏｎｉａ  ｓｉｌｉｑｕａ  Ｃを各ウェルに異なる最終濃度となるように添加した。具体的には、ＨａＣａＴ細胞培養液中のＣｅｒａｔｏｎｉａ  ｓｉｌｉｑｕａ  Ｃの最終濃度がそれぞれ、１μＭ、５μＭ、１０μＭ、５０μＭ及び１００μＭとなるようにした。また、Ｃｅｒａｔｏｎｉａ  ｓｉｌｉｑｕａ  Ｃを添加しないウェルを対照（０μＭ）とした。添加後、２４時間培養を行った。
【００７１】
培養終了後、各ウェルからＨａＣａＴ細胞を回収し、ＲＮＡ抽出試薬（ＲＮＡｚｏｌ（登録商標）、モレキュラーリサーチセンター社製品）を用いて、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。超微量分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製品）を用い、抽出して得られたｔｏｔａｌ  ＲＮＡの濃度を確認した。このｔｏｔａｌ  ＲＮＡに、オリゴｄＴプライマー、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ、５×１ｓｔストランドバッファー、ＲＮａｓｅ阻害剤、ＤＴＴ及びＭ−ＭＬＶ逆転写酵素を添加し、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを用い、リアルタイムＰＣＲ（ＱＰＣＲ）によりアクアポリン３遺伝子及びフィラグリン２遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定した。
【００７２】
ＱＰＣＲは、市販のＱＰＣＲ試薬キットとＱＰＣＲ測定装置（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製品）を用いて行い、検出には２本鎖ＤＮＡ結合蛍光色素であるＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎを用いた。アクアポリン３のＱＰＣＲ用プライマーは下記表１に示す配列番号１、２のプライマーを用いた。フィラグリン２のＱＰＣＲ用プライマーは下記表２に示す配列番号３，４のプライマーを用いた。
【００７３】
【表１】
0006923100.tif 000005
【００７４】
【表２】
0006923100.tif 000006
【００７５】
アクアポリン３の結果を図１２に、フィラグリン２の結果を図１３に示す。アクアポリン３のｍＲＮＡ発現量は、対照（コントロール）の発現量を１００としたときの相対値として示している。また、フィラグリン２のｍＲＮＡ発現量は、対照（コントロール）の発現量に対する増加率（％）として示している。図１２及び図１３に示すように、本発明の化合物、Ｃｅｒａｔｏｎｉａ  ｓｉｌｉｑｕａ  Ｃを添加することにより、未添加の対照と比較して、アクアポリン３及びフィラグリン２のｍＲＮＡ発現量が大きく増加することが明らかとなった。Ｃｅｒａｔｏｎｉａ  ｓｉｌｉｑｕａ  Ｃの濃度が１０μＭのときに最も高い発現促進効果が確認され、アクアポリン３のｍＲＮＡ発現量は２．５倍にまで増加し、フィラグリン２のｍＲＮＡ発現量も１．３５倍に増加した。
【００７６】
本発明は、上記の実施形態又は実施例に限定されるものでなく、特許請求の範囲に記載された発明の要旨を逸脱しない範囲内での種々、設計変更した形態も技術的範囲に含むものである。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明の新規イソフラボン化合物は、皮膚バリア機能改善剤、アクアポリン３産生促進剤、フィラグリン２産生促進剤、抗炎症剤、皮膚外用剤及び化粧品として使用され、医療や美容の分野において幅広く利用されるものである。
【要約】
【課題】イナゴマメ由来の新規な活性成分及びその用途を提供すること。
【解決手段】本発明は、下記式（Ｉ）で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物である。
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【選択図】なし【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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