(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料内の生物学的細胞を溶解して前記生物学的細胞からゲノムＤＮＡを放出する方法であって、
ａ）前記試料からの前記生物学的細胞を含有する水溶液を、（ｉ）ある量のイオン性界面活性剤及び（ｉｉ）ある量の塩基と混合させることにより混合溶液を生成することであって、前記混合溶液中の前記イオン性界面活性剤及び前記塩基は、前記イオン性界面活性剤が混合溶液に溶解された後に前記細胞を溶解することにより、前記細胞からのゲノムＤＮＡを放出するのに有効な濃度であり、前記イオン性界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）であり、前記塩基が水酸化カリウム（ＫＯＨ）である、生成することと、
ｂ）前記イオン性界面活性剤が前記混合溶液に溶解されるように、前記混合溶液を少なくとも５０℃まで加熱することと、
ｃ）前記イオン性界面活性剤を沈殿させるのに有効な時間、前記混合溶液を４０℃以下まで冷却し、これにより、前記イオン性界面活性剤を含む沈殿物を生成することと、
ｄ）前記混合溶液から前記イオン性界面活性剤を含む前記沈殿物を分離する（ここで、前記生物学的細胞から放出された前記ゲノムＤＮＡは、前記混合溶液から前記イオン性界面活性剤を含む前記沈殿物を分離することにより生成する溶液に存在する）ことと、
からなる一連の工程を備え、
ここで、前記生物学的細胞から放出されたＤＮＡは、分析、ＰＣＲ増幅、シーケンス、精製、又は保存の準備ができている、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
ステップｂ）における前記混合溶液の前記イオン性界面活性剤は、０．１重量％から１０重量％である、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、
ステップｂ）における前記混合溶液の前記イオン性界面活性剤は、１重量％である、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、
ステップｂ）における前記混合溶液の前記塩基は、０．０５モル濃度から１モル濃度である、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、
ステップｂ）における前記混合溶液の前記塩基は、０．２モル濃度である、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、
ステップｂ）における前記混合溶液の前記イオン性界面活性剤は、１重量％であり、ステップｂ）における前記混合溶液の前記塩基は、０．２モル濃度である、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、
前記少なくとも５０℃とは、５０℃から１００℃の温度範囲である、方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、
前記加熱のステップは、９５℃の温度で行われる、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、
前記加熱のステップは、少なくとも０．２５分間行われる、方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、
前記４０℃以下とは、４℃から４０℃の温度範囲である、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、
４℃から４０℃の前記温度範囲とは、２０℃から２５℃である、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、
前記冷却のステップは、少なくとも０．２５分間行われる、方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法であって、
前記分離のステップは、前記混合溶液の遠心分離、前記混合溶液のろ過、及び前記混合溶液の重力沈降からなる群から選択される方法によって行われる、方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、
前記試料は、ヒト、動物、植物若しくは環境試料、生試料、複合試料、試料の混合物、及びマイクロバイオーム試料から得られた糞便、細胞溶解物、組織、血液、腫瘍、舌、歯、口腔スワブ、痰、粘液、創傷スワブ、皮膚スワブ、膣スワブ、又はその他の生物物質若しくは生物体液からなる群から選択される、方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法であって、
前記試料は、多細胞生物、単細胞生物、原核生物、真核生物、微生物、細菌、古細菌、原生動物、藻類、真菌、及びウイルスからなる群から選択される生物に由来する、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
細胞の内部からゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を放出する又は抽出するために細胞を溶解する方法を開示する。本開示方法によれば、熱と、界面活性剤と、塩基とを単一の試験管で併用し、数分で処理を完了することができる。本方法は、通常は不適合である界面活性剤と塩基とを併用し、追加的な工程を要することなく、溶解後に容易に界面活性剤を除去することができる。また、併用することで、連続式の処理プロトコルに欠如した、予期せぬ相乗効果が生み出される。すなわち、工程数や実施時間を大幅に削減する一方で、マイクロバイオーム試料内の例えば溶解困難な細菌から、より多くのｇＤＮＡを得ることができる。
【０００２】
［背景技術］
細胞やＤＮＡをベースとした分析方法の多くは、細胞内からＤＮＡを放出して分析を促進する必要がある。ＤＮＡを放出するために細胞を開くことを「溶解」と呼ぶ。例えば、ＤＮＡシーケンシング技術を用いてマイクロバイオームを研究する方法においては、ＤＮＡを抽出できるように、まず微生物を溶解する必要がある。多くのマイクロバイオームは、溶解技術への感受性が大きく相違する細菌、古細菌、及び真菌の集まりである。溶解するのが最も困難な細菌（通常、グラム陽性菌）と溶解するのが最も簡単な細菌（通常、グラム陰性菌）とを、元の試料内における存在数と同じ割合で得たいとする研究者にとって、溶解技術への感受性が異なると、重大な問題となる。残念ながら、微生物の溶解プロトコルの多くは、ある微生物に対しては有効でありながら、他の微生物に対しては不十分となる。さらに、プラスミドＤＮＡを回収するために用いられる、迅速で簡単なアルカリ溶解技術は、概して、マイクロバイオームのスクリーニングのターゲットである微生物のゲノムＤＮＡも除去する（Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｌｙｓｉｓ  ｏｐｅｎｓ  ｃｅｌｌｓ  ｂｕｔ  ｒｅｍｏｖｅｓ  ｇＤＮＡ−Ｂｉｒｎｂｏｉｍ，Ｈ．Ｃ．ａｎｄ  Ｄｏｌｙ，Ｊ，Ａ  ｒａｐｉｄ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．７（６），１９７９，１５１３−１５２４；ＫＯＨ  ｌｙｓｉｓ  ｒｅｃｏｖｅｒｓ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ−Ｒａｇｈｕｎａｔｈａｎ，Ａｒｕｍｕｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．“Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ．”Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７１．６（２００５）：３３４２−３３４７．ＰＭＣ．Ｗｅｂ．２９  Ｓｅｐｔ．２０１６）。当技術分野では、様々な生化学的方法に基づいて細胞の完全性を攻撃する溶解技術が数多く公知である。例えばリゾチーム（ペプチドグリカン細胞壁に対する酵素的攻撃）、強塩基（化学的攻撃）、界面活性剤（細胞膜の可溶化）、ビーズ破砕又は振とう（機械的破砕）、及び熱等が挙げられる（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｌｙｓｉｓ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ−Ｓａｎｑｉｎｇ  Ｙｕａｎ，Ｄｏｒａ  Ｂ．Ｃｏｈｅｎ，Ｊａｃｑｕｅｓ  Ｒａｖｅｌ，ＺａｉｄＡｂｄｏ，Ｌａｒｒｙ  Ｊ．Ｆｏｒｎｅｙ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７（３）：ｅ３３８６５．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００３３８６５；ＤＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｆｆｅｃｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｗａｇｎｅｒ  Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ  Ｂ，Ｗａｉｔｅ  ＤＷ，Ｔａｙｌｏｒ  ＭＷ．Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｄｕｅ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｅｘｔｒａｃ��ｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒ−ｓｕｂｊｅｃｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．２０１５；６：１３０．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｍｉｃｂ．２０１５．００１３０）。公知の又は市販のＤＮＡ調製方法の多くは、上記方法の１つ又は複数を用いて、通常は連続式の工程で細胞を溶解する。連続式の工程は、特に一度に多くの試料を扱う場合には顕著に時間がかかる可能性がある。不完全又は部分的な溶解でプロトコルを実施するのに十分なＤＮＡが得られる場合は、個々の溶解方法で通常は十分である。しかし、元々の集合の割合に準じたＤＮＡをマイクロバイオーム試料から得られないことが多く、特定の微生物を完全に溶解することができない場合がある。例えば、界面活性剤を基にした溶解の場合、弱い細胞壁と強い細胞膜と有する細胞の集合は破砕できるが、界面活性剤に耐性のある強い細胞壁を有する微生物を開放することはできない。このため、ＤＮＡ調製物において、界面活性剤に耐性のある細胞から得られたＤＮＡが不足又は非存在となる。別の例として、強い細胞膜を有する細胞の溶解に有効な微生物のビーズ破砕は、溶解容易な細胞から工程の初期に開放されたＤＮＡをせん断又は破壊することがある。また、種々の溶解方法は互いに相容れない傾向があり、併用する場合は、順次実施する必要がある。例えば、リゾチームは界面活性剤や強塩基の存在下では機能しないし、特定の界面活性剤は、強塩基の存在下で沈殿する。また、ビーズ破砕は加熱工程と併用するのが難しい。独立した溶解プロトコルを連続して実行することにより、個々の欠点を克服できる場合もあるが、複雑になる上、時間や費用が増大してしまう。重要なことにドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）といった界面活性剤は、下流のＤＮＡ操作を干渉するため、溶解後に除去する必要がある。また、特定の微生物は、プロトコルの順序によっては、順次実行される溶解プロトコルに耐性がある場合がある。例えば、強固なペプチドグリカン細胞壁を有する特定の微生物は、強塩基又はリゾチームを用いた初期処理から保護する脂質二重層の外包膜を有することがある。試料内の全ての微生物からＤＮＡを得るためには、複数の方法を同時に併用することが唯一効果的であり得、そうでなければ多数の工程からなる長いシーケンスが必要になる。
【０００３】
開示された方法は、多数の溶解方法を併用し、様々な細胞の構成要素が含まれるマイクロバイオーム等の試料からより代表的なＤＮＡプロファイルを得る簡単かつ迅速なプロトコルにすることにより、マイクロバイオームの研究等、割合に準じた溶解が所望又は必要とされる応用や技術に用いる溶解を合理化するものである。
【０００４】
［発明の概要］
本開示は、マイクロバイオームに存在する細菌等の細胞の溶解方法であり、３つの溶解工程である（１）熱、（２）界面活性剤、及び（３）塩基を併用して単一工程とし、例えば数分といった短時間で完了させることができる。本方法は、通常は不適合である界面活性剤による溶解と塩基による溶解とを併用し、溶解後、容易に界面活性剤を除去することができる。そして、重要なことに、溶解が困難な細菌からのゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の回収量を向上させることができる。
【０００５】
本開示は、試料内の細胞を溶解して細胞からＤＮＡを放出する方法であって、（ａ）生物学的細胞を含有する水溶液に（ｉ）イオン性界面活性剤と、（ｉｉ）前記イオン性界面活性剤を沈殿させることができる塩基と、を混合することと、（ｂ）前記イオン性界面活性剤を溶かすのに有効な時間、前記水溶液を少なくとも５０℃まで加熱することと、（ｃ）前記イオン性界面活性剤を沈殿させるのに有効な時間、前記水溶液を４０℃以下まで冷却することと、（ｄ）水溶液から沈殿物を分離することと、を含み、前記沈殿物を分離した後、生物学的細胞から放出されたＤＮＡが前記水溶液に存在する、方法である。
【０００６】
実施形態において、イオン性界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩、又はデオキシコール酸ナトリウムからなる群から選択される。実施形態において、イオン性界面活性剤の濃度は約０．１％から約１０％である。また実施形態において、イオン性界面活性剤は、濃度が約１％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である。
【０００７】
実施形態において、塩基は、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、水酸化リチウム（ＬｉＯＨ）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化ルビジウム（ＲｂＯＨ）、水酸化セシウム（ＣｓＯＨ）、水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）２）、水酸化ストロンチウム（Ｓｒ（ＯＨ）２）、及び水酸化バリウム（Ｂａ（ＯＨ）２）からなる群から選択される。実施形態において、塩基の濃度は約０．０５モル濃度から約１モル濃度である。実施形態において、塩基は濃度約０．２モル濃度の水酸化カリウム（ＫＯＨ）である。
【０００８】
実施形態において、界面活性剤は、低温では界面活性剤を沈殿させ、高温では界面活性剤を可溶である塩基と併用される。
実施形態において、イオン性界面活性剤は、濃度が１重量％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）であり、塩基は、濃度が０．２モル濃度の水酸化カリウム（ＫＯＨ）を含有する水溶液である。
【０００９】
実施形態において、加熱は約５０℃から約１００℃の温度範囲で行われる。実施形態において、加熱は約６５℃の温度で行われる。実施形態において、加熱は約９５℃の温度で行われる。実施形態において、加熱は少なくとも１分間行われる。
【００１０】
実施形態において、冷却は約４℃から約４０℃の温度範囲で行われる。実施形態において、冷却は約２０℃から約２５℃の温度で行われる。実施形態において、冷却は少なくとも３０秒間行われる。
【００１１】
実施形態において、分離は遠心分離、ろ過、重力沈降からなる群から選択される方法によって行われる。
実施形態において、生物細胞は、生試料、複合試料、混合物、及びマイクロバイオーム試料を含む、ヒト、動物、植物若しくは環境試料から得られた糞便、細胞溶解物、組織、血液、腫瘍、舌、歯、口腔スワブ、痰、粘液、創傷スワブ、皮膚スワブ、膣スワブ、又はその他の生物物質若しくは生物体液からなる群から選択される試料に由来する。
【００１２】
実施形態において、生物細胞は、多細胞生物、単細胞生物、原核生物、真核生物、微生物、細菌、古細菌、原生動物、藻類、及び真菌からなる群から選択される生物に由来する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１ａ】室温の水酸化カリウム管における白色のＳＤＳ沈殿を示す（ＫＯＨ＋ＳＤＳ）（左）。右側の試験管は、ＫＯＨの非存在下において１％ＳＤＳを透明な溶液として示す。
【図１ｂ】室温の水酸化カリウム管における白色のＳＤＳ沈殿を示す（ＫＯＨ＋ＳＤＳ）（右）。左側の試験管は、ＮａＯＨの存在下において１％のＳＤＳを透明な溶液として示し、ＮａＯＨがＳＤＳを沈殿させないことを実証している。
【図２】８つのマイクロバイオーム試料について１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲバーコーディング結果を示す。各８レーンの１５００塩基アンプリコンは異なるＤＮＡバーコードがタグ付けされている。
【図３】界面活性剤とビーズ破砕とからなる連続式の溶解方法又は本開示の併用式の溶解方法を用いて溶解された多数の試料における、門レベルでの微生物の平均存在量の比較を示すグラフである。ショアラインバイオミー社の方法を用いると、溶解がより困難なフィルミクテスの存在量が多いことがわかる。
【図４】界面活性剤とビーズ破砕とからなる連続式の溶解方法と、本開示の併用式の溶解方法とを用いて溶解された多数の試料における、属レベルでの微生物の平均存在量の比較を示すグラフである。図３の門レベルで見た場合の存在量は、属レベルでみた場合のフィルミクテスの量及び多様性の増加に対応していることがわかる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明としてみなされる主題は、本明細書の最後にある特許請求の範囲において、具体的に指示され、明確に請求されている。上述の本発明の目的、及び他の目的、特徴、及び利点は、添付の図面と併せて以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【００１５】
マイクロバイオーム内の細菌及び古細菌等の細胞にあるＤＮＡは、細胞を溶解することにより放出され得る。マイクロバイオームを調査するため、ターゲットとなるマイクロバイオーム中の細胞が溶解される。その後、得られたＤＮＡは、本明細書において、直接シーケンシングされ得る（「ショットガン」シーケンシング法、図示しない）、又は全ての細菌及び古細菌に存在する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子といった遺伝子領域を標的としたＰＣＲ増幅における鋳型として使用され得る。１６Ｓ遺伝子は、微生物の「フィンガープリント」同定方法として使用できるため、本明細書において一例として用いられている。フィンガープリント法は、ショットガン法の１０００分の１未満のシーケンシングしか必要としない。微生物は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列を用いて同定することができ、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列は全てでないにしても大部分の細菌及び古細菌においてわずかに異なる。１６Ｓ遺伝子配列に変異があるということは、細菌及び古細菌の個々の種が１６ＳｒＲＮＡ遺伝子において特徴的なＤＮＡ変異（「フィンガープリント」）を有するということであり、その特徴的なＤＮＡ変異が種又は株に対する識別子として機能することを意味する。各種キット、プロトコル及びソフトウエアにより、試料内微生物の包括的なフィンガープリンティングが可能となり、全長の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を用いて一度に多数の試料を高精度で同時に１６ＳｒＲＮＡフィンガープリンティングできる（例えば、Ｍａｒｋ  Ｄｒｉｓｃｏｌｌ及びＴｈｏｍａｓ  Ｊａｒｖｉｅによる米国仮特許出願番号６２／２６６，０７２、“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ”を参照。その全体が参照により本明細書に組み込まれる。）。既知の微生物は、１６Ｓ遺伝子のＤＮＡ配列を既知のリードのデータベースにマッピングすることによりシーケンシングした後、同定することができる。未知の微生物は、データベース内のいかなる微生物とも異なる１６ＳＤＮＡ配列を含むが、固有の１６Ｓ配列をたどって解明することができる。また、試料内の各微生物に対して得られたリードの数により、試料内の各微生物の相対的な存在量を明らかにすることができる。特定の微生物の相対的な存在量は、各マイクロバイオームの状態を示す重要な指標となり得る。このため、微生物の相対的な存在量を変化させてしまう溶解技術、又は特定の微生物から完全にＤＮＡを除外してしまう溶解技術を用いると、研究中のマイクロバイオームの状態を誤って特徴付けるシーケンシング結果を導く可能性がある。本明細書に記載の方法を用いれば、微生物の正確な相対的な存在量を試料から得ることができる。
【００１６】
本溶解工程は、「ショットガン」法によるマイクロバイオームのシーケンシングにも使用できる。この場合、ＤＮＡは溶解後、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の増幅を行わずシーケンシングされる。ショットガン法は、細菌及び古細菌の１６Ｓ遺伝子だけでなく、試料内の全てのＤＮＡ配列を読みたいと研究者が希望する場合に使用される。例えば、高深度のショットガン法によるマイクロバイオームのＤＮＡシーケンシングでは、未知の細菌／古細菌だけでなく、真菌又は多細胞の真核生物、ウイルスＤＮＡ又は任意の他のＤＮＡ含有生物から完全ＤＮＡゲノム配列を明らかにできる。完全な細菌ゲノムは、何百万塩基もの長さ（１６Ｓ遺伝子の何千倍もの長さ）であり得、真菌ゲノムは一億塩基超であり得、真核生物ゲノムは何十億塩基もの長さであり得るため、ショットガン法によるマイクロバイオームのプロファイルは１６ＳｒＲＮＡ遺伝子法によるマイクロバイオームのプロファイルの数千倍ものシーケンシングを要求する可能性があり、それに伴い時間及び費用がかかる。本実施例では１６Ｓのプロファイリング方法のみを記載するが、本明細書に記載の溶解プロトコルは、ショットガン法及び１６ＳｒＲＮＡを用いたマイクロバイオームのシーケンシング法の両方のアプローチに同等の利点を提供するものである。
【００１７】
［実施例］
以下は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を用いたマイクロバイオームのシーケンシングアプローチに対する本開示方法の一実施例である。
【００１８】
工程１）２重量％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有する水溶液にマイクロバイオーム試料を分散させた。
工程２）０．４ＭのＫＯＨを添加し、ＳＤＳ界面活性剤を白色の綿状体として沈殿させた。本実施例では、塩基（０．２ＭのＫＯＨ）により界面活性剤（１％ＳＤＳ）を沈殿させた。
【００１９】
工程３）試験管に蓋をして加熱した（温度範囲は約５０℃から約１００℃まで可）。ＳＤＳは５０℃を超える温度で溶けた。熱とＫＯＨとでペプチドグリカン細胞壁を攻撃し、ＫＯＨと熱とによる損傷の影響から微生物を保護する膜をＳＤＳにより可溶化した。本明細書で記載する併用式の曝露とは対照的に、ＫＯＨ、ＳＤＳ、及び熱へ順次曝露させた場合、微生物の細胞壁や膜の構造により、同じ結果を得られない場合があるため、工程を併用することで相乗効果が生まれる。実際に、熱により強塩基の存在下でＳＤＳが機能できるため、他に類を見ない、３つの異なる溶解技術を同時に併用する結果となっている。
【００２０】
工程４）加熱後、試料を室温に戻し（例えば、４０℃未満）、ＳＤＳ界面活性剤を沈殿させた。
工程５）試料を短時間遠心分離してＳＤＳ界面活性剤をペレット化した（付加物不要、界面活性剤の迅速除去）。
【００２１】
工程６）上清を５００ｍＭのトリス緩衝液又はｐＨ８．５の同等物を含有する試験管へ移した。放出されたＤＮＡは、１６ＳｒＲＮＡのＰＣＲ（下記の通り）による分析のために準備され、若しくは他の用途のために保存又はさらに精製することができる。
【００２２】
各ＤＮＡ試料をＰＣＲ増幅にかけた。これは、固有のＤＮＡバーコードを各試料に割り当てる方法である。８つの異なるマイクロバイオームのＰＣＲ反応の例が図２に示されており、ヒトの糞便試料１−８は、上記工程１−６に記載のプロトコルに従い、又は連続式の界面活性剤／ビーズ破砕工程を伴う標準的なプロトコルにより溶解されたものである。各試料は１５００ｂｐの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に対するプライマーを用いて、各試料に異なるＤＮＡバーコードを使用してＰＣＲ増幅された。ＰＣＲ後、試料はＤＮＡシーケンシングのためにプールされた。各試料からのリードは固有の識別ＤＮＡバーコードを含んでいたため、シーケンシング後に試料ごとに分類可能である。シーケンサーによるリード出力は、バーコードを用いて試料ごとに分類され、データベースへマッピングされ、各試料内の既知の微生物、未知の微生物、及びそれらの相対的な割合が同定される。
【００２３】
バーコードにより元の試料別に分類し、属による同定を行い、リードのソフトウエア分析によって各属に対するリードの数を定量化した後、各マイクロバイオームのリードを比較した。実験計画に応じて、出力の比較方法は多数ある。図３は、２つの試料について、マイクロバイオーム内の各微生物の量を１００％積み上げ棒グラフで示しており、マイクロバイオームを簡易に、直接比較することができる。他の有効な比較方法としては、門レベル、種若しくは系統レベル、又は他の分類学的レベルでの比較等が挙げられる。
【００２４】
多数の試料について、界面活性剤及びビーズ破砕の連続式溶解工程を用いた標準的な方法と、本明細書に記載の併用式溶解方法とを比較した。図３に示す通り、グラム陽性のフィルミクテスは、存在量がマイクロバイオームの３０％未満から６０％超まで増加した。フィルミクテスは、溶解しにくい強い細胞壁を有するグラム陽性の細菌である。これにより、本明細書に記載された溶解方法は、強い細胞壁を有する微生物を溶解するのにより優れていることが実証されている。溶解が容易なバクテリオデテス及びベルコミクロビア門は、１００％積み上げ棒グラフを用いた場合に想定されることではあるが、比例して減少している。
【００２５】
図４は、図３と同じ試料について、属レベルでの平均存在量を示す。図４は、フィルミクテスの高分解能化図であり、フィルミクテスは、界面活性剤及びビーズ破砕の連続式溶解工程を用いた標準的な方法では過小評価されている。属レベルでの存在量を示す棒グラフに差があることから、標準的な連続式溶解方法を用いた場合に、５つのフィルミクテス属（リステリア属、ブラウティア属、ラクノスピラ・インケルタエ・セディス属、ボツリオコッカス属、ルミノコッカス属）が過小評価されたことがわかる。バクテロイデス属及びアッケルマンシア属の相対的な存在量は、標準的な方法を用いた場合には多く示されてしまっている。図３の門レベルでの差と対応しているものの、標準的な方法を用いると、フィルミクテスの個々の属レベルが顕著に過小評価され得ることを示している。
【００２６】
本発明の１つ又は複数の実施形態を説明してきたが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく様々な変形が可能であることを理解されたい。従って、他の実施形態も特許請求の範囲の範囲内にある。
【図１ａ】
0006935945.tif 000002
【図１ｂ】
0006935945.tif 000003
【図２】
0006935945.tif 000004
【図３】
0006935945.tif 000005
【図４】
0006935945.tif 000006