(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
電極上に官能化された表面を製造する方法であって、
ａ）  リンカーおよび塩析効果を媒介することができる少なくとも１種のポリマーを、電極の表面における前記リンカーおよび前記ポリマーの共有結合または非共有結合による固定化を可能にする条件下で、電極に適用するステップと、
ｂ）  前記リンカーおよび前記ポリマーの固定化の後、少なくとも１種の検出剤を、固定化されたリンカーを通した前記少なくとも１種の検出分子の共有結合または非共有結合による電極への連結を可能にする条件下で、電極に適用するステップと
を含み、
条件は、前記塩析効果を媒介することができる少なくとも１種のポリマーおよび前記少なくとも１種の検出剤を電極の表面に、検出剤が電極表面全体にわたって表面積当たり等量で存在し、塩析効果を媒介することができるポリマーが検出剤の周囲に配置され、
ｉ）  検出剤に近接する流体のイオン強度の低下を可能にし、
ｉｉ）  流体試料に含まれる分析対象への結合を可能にする
量で存在するように分布させることを可能にし、
前記塩析効果を媒介することができる少なくとも１種のポリマーが、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリグリセロール、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリメタクリレートまたは別のアクリル系ポリマー、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）および上で言及されたポリマーのコポリマーからなる群から選択される、方法。
【請求項２】
前記リンカーが、０．０１から５ｋＤａの間、０．０１から１．０ｋＤａの間、０．０１から０．５ｋＤａの間、または０．１から０．５ｋＤａの間のＭＷを有する低分子量（ＭＷ）ポリマーであり、前記ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリグリセロール、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリメタクリレートまたは別のアクリル系ポリマー、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、多糖類、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ポリシロキサンまたは上で言及されたポリマーのコポリマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記塩析効果を媒介することができるポリマーが、リンカーポリマーと同一のクラスのポリマーである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
流体試料に露出可能な官能化された表面を含む電極であって、前記官能化された表面が、塩析効果を媒介することができる少なくとも１種のポリマーおよび流体試料に含まれる分析対象に結合する少なくとも１種の検出剤を含み、前記塩析効果を媒介することができる少なくとも１種のポリマーおよび前記少なくとも１種の検出剤が電極の表面に、検出剤が電極表面全体にわたって表面積当たり本質的に等量で存在し、塩析効果を媒介することができるポリマーが検出剤の周囲に配置され、
ｉ）  検出剤に近接する流体のイオン強度の低下を可能にし、
ｉｉ）  流体試料に含まれる分析対象への結合を可能にする
量で存在するように分布する電極であって、
前記電極は請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法によって得られたまたは得られ得る、電極。
【請求項５】
前記塩析効果を媒介することができる少なくとも１種のポリマーのサイズが、デバイ長が増大して、少なくとも１種の検出分子の周囲のイオン強度が低下するようなサイズである、請求項４に記載の電極。
【請求項６】
前記塩析効果を媒介することができる少なくとも１種のポリマーの分子量（ＭＷ）が、１ｋＤａと１００ｋＤａの間、１０ｋＤａと１００ｋＤａの間、１０ｋＤａと５０ｋＤａの間、１０ｋＤａと２５ｋＤａの間、１０ｋＤａと２０ｋＤａの間または１０ｋＤａと１５ｋＤａの間である、請求項５に記載の電極。
【請求項７】
前記塩析効果を媒介することができる少なくとも１種のポリマーが、電極の表面に、リンカーを通して固定化されたか、または追加のリンカーなしに直接官能基により連結された、請求項４から６のいずれか一項に記載の電極。
【請求項８】
前記塩析効果を媒介することができるポリマーを固定化する前記リンカーが、以下の構造を有するリンカーである請求項７に記載の電極：
Ａ−Ｂ−Ｃ
（式中、Ａは：チオール、シラン、ホスホン酸、芳香族分子、カルボキシル、アミン、ＮＨＳエステル、マレイミドのクラスからの第１の官能基であり、
Ｂは、以下のクラス：上に記載されたクラスからの低分子量ポリマー、炭化水素、酸素含有基、ハロアルカン、窒素含有基、イオウ含有基、リン含有基、ホウ素含有基、または無機ポリマー鎖からの有機鎖であり、および
Ｃは、カルボキシル、アミン、ＮＨＳエステル、マレイミドのクラスからの第２の官能基である）。
【請求項９】
前記少なくとも１種の検出剤が、流体試料に含まれる分析対象に特異的に結合し、前記少なくとも１種の検出剤が：抗体およびそれらのフラグメント、核酸、アプタマー、ペプチド核酸（ＰＮＡ）受容体またはリガンドのタンパク質またはペプチド、および酵素からなる群から選択される、請求項４から８のいずれか一項に記載の電極。
【請求項１０】
少なくとも１種の検出剤のサイズが、塩析効果を媒介することができる少なくとも１種のポリマーにより検出剤が取り囲まれるようなサイズである、請求項４から９のいずれか一項に記載の電極。
【請求項１１】
請求項４から１０のいずれか一項に記載の電極または請求項１から３のいずれか一項に記載の方法により得られ得る電極を含む、少なくとも１種の分析対象を決定するための分析対象検出器であって、前記電極が、変換器と電気的に接触しているかまたは変換器の部分である、分析対象検出器。
【請求項１２】
流体試料中の少なくとも１種の分析対象を決定するための、請求項１１に記載の分析対象検出器の使用。
【請求項１３】
少なくとも１種の分析対象を決定する方法であって、
（ａ）  少なくとも１種の分析対象を含むと疑われる流体試料を、請求項４から１０のいずれか一項に記載の電極または請求項１１に記載の分析対象検出器と接触させるステップと、
（ｂ）  前記電極または検出器を用いて、電気化学的測定を実行し、それにより少なくとも１種の分析対象が決定されるステップと
を含む方法。
【請求項１４】
前記電気化学的測定が、３０℃と４０℃の間の温度で実施される、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電気化学的または電界効果に基づく検出方法を使用して試料を分析するためのセンサ装置の分野に関する。特に、本発明は、流体試料に露出可能な官能化された表面を含む電極に関し、前記官能化された表面は、塩析効果を媒介することができる少なくとも１種のポリマーおよび流体試料に含まれる分析対象に結合する少なくとも１種の検出剤を含み、前記塩析効果を媒介することができる少なくとも１種のポリマーおよび前記少なくとも１種の検出剤は電極の表面に、上記検出剤が、電極表面全体にわたって表面積当たり本質的に等量で存在し、塩析効果を媒介することができるポリマーが検出剤の周囲に配置され、検出剤に近接する流体のイオン強度の低下を可能にし、流体試料に含まれる分析対象への結合を可能にする量で存在するように分布している。本発明は、電極の官能化された表面を製造する方法、少なくとも１種の分析対象を決定するための、電極を含む分析対象検出器、および流体試料中の少なくとも１種の分析対象を決定するための前記分析対象検出器の使用にさらに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）に基づくセンサの、生物学的検出への適用に大きい進歩があった。ＦＥＴに基づく測定は、その表面電位を変化させて、その結果としてトランジスタ内におけるチャンネル電流を変化させる荷電分子のセンサ表面への結合を必要とする。この荷電に基づく感知機構は、ＦＥＴ測定を標識不要にして、広範囲の生物学的標的に対して高感度にする。例えば、ＦＥＴバイオセンサは、種々の生体分子、例えば、核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）、酵素、タンパク質の疾患マーカー、ならびにウイルス、細菌、および真核細胞の全てさえも検出することに適用されてきた。それらの多機能性、高感度および迅速な応答に起因し、ＦＥＴに基づくバイオセンサは、医療現場での（ＰｏＣ）デバイスにおける応用を見出すことに適した位置にある。
【０００３】
上で言及された利点にも拘わらず、ＦＥＴに基づくバイオセンシングは、今日までイオン強度の低い溶液における測定に限定されてきた。これは、イオン強度の高い環境における電荷の検出は、イオン性溶液中の荷電分子が対イオンを引きつけて、分子上の電荷を効果的に遮蔽する電気二重層を形成するデバイ遮蔽によって妨げられる、すなわちＤＮＡのような負に荷電した分子は、静電的相互作用によってカチオンにより取り囲まれるからである。デバイ遮蔽は、それ故、電解質濃度に依存する。
【０００４】
イオン強度が＞１００ｍＭである生理学的条件下で、デバイ遮蔽効果は、センサ表面から約１ｎｍ以内に検出を制限する。この理由で、ほとんどのＦＥＴに基づくバイオセンサは、予め脱塩するかまたは試料を希釈するかのいずれかによる非生理学的なイオン強度の条件下でのみ作動されてきた。ＰｏＣ設定で適用され得るためには、試料処理能力が患者の近くに非常に限定されるので、イオン遮蔽が、より直接的および効率的な様式で低下されなければならない。
【０００５】
２、３の最近の研究が、このデバイ遮蔽の問題を緩和する幾つかの戦略を報告した。標的分子を電極表面に近づける、小さめの受容体、例えば、アプタマーまたは小さめの抗体フラグメントの使用が、トランジスタに基づくタンパク質の検出を強化すると報告された。それに加えて、高周波数のＦＥＴ測定を行うことにより、イオン遮蔽効果が緩和され得ることが示された。
【０００６】
より最近、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のセンサへの共固定化が、高いイオン強度溶液中における生体分子のトランジスタに基づく検出を可能にすることが示された（Ｇａｏ  ２０１５年、Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．１５巻：２１４３頁；Ｇａｏ  ２０１６年、ＰＮＡＳ  １１３巻（５１号）：１４６３３〜１４６３８頁およびＷＯ２０１６／１６１２４６）。
【０００７】
ＰＥＧは、異なる目的のための電極材料にも記載された。例えば、それらは、プローブ固定化のための、および非特異的結合を低下させるためのリンカーとして記載された（Ｓｈｉｍ  ２００２年、Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．２巻：２８５頁）。さらに、ＰＥＧは、Ｆａｂフラグメントの安定剤として作用することができる（Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ  ２０１０年、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３２巻：７９８２頁）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の底流にある技術的問題は、上で言及された必要性に適合するための手段および方法の提供と見ることができる。前記技術的問題は、特許請求の範囲および以下の本明細書で特徴づけられる実施形態によって解決される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、本発明は、流体試料に露出可能な官能化された表面を含む電極に関し、前記官能化された表面は、塩析効果を媒介することができる少なくとも１種のポリマーおよび流体試料に含まれる分析対象に結合する少なくとも１種の検出剤を含み、前記少なくとも塩析効果を媒介することができるポリマーおよび前記少なくとも１種の検出剤は電極の表面に、検出剤が電極表面の全体にわたって表面積当たり本質的に等量で存在し、塩析効果を媒介することができるポリマーが検出剤の周囲に配置され、
ｉ）  検出剤に近接する流体のイオン強度の低下を可能にし、
ｉｉ）  流体試料に含まれる分析対象に結合することを可能にする
量で存在するように分布する。
【００１０】
以下で使用される用語「を有する（ｈａｖｅ）」、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」またはどのような任意のそれらの文字通りの変形も、非排除的用法で使用される。したがって、これらの用語は、これらの用語により導入される特徴の他に、さらなる特徴が、この前後関係で記載される存在物中に存在しない状況および１つまたは複数のさらなる特徴が存在する状況の両方を指すことができる。例として、「ＡがＢを有する（ｈａｓ）」、「ＡがＢを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「ＡがＢを含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」という表現は、Ｂの他に、他の要素はＡ中に存在しない状況（すなわち、Ａが、Ｂのみから排他的になる状況）およびＢの他に、要素Ｃ、要素ＣおよびＤまたはさらにさらなる要素などの１つまたは複数のさらなる要素が存在物Ａ中に存在する状況の両方を指すことができる。
【００１１】
さらに、用語「少なくとも１つ」、「１つまたは複数の」または、特徴または要素が、１回または２回以上、すなわち、２、３、４、５回、限定されない回数までに存在し得ることを示す同様な表現は、それぞれの特徴または要素を導入する場合、典型的には１回だけ使用されることが注意される。以下で、ほとんどの場合に、それぞれの特徴または要素を指すとき、「少なくとも１つ」または「１つまたは複数の」という表現は、それぞれの特徴または要素が１回または２回以上存在し得るという事実にも拘わらず、繰り返されないであろう。
【００１２】
さらに、以下で使用される用語「好ましくは」、「より好ましくは」、「特に」、「さらに特に」、「特に」、「より特に」、「典型的には」、「より典型的には」または同様な用語は、代替的可能性を限定せずに任意選択の特徴と一緒に使用される。したがって、これらの用語により導入される特徴は、任意選択の特徴であり、特許請求の範囲を限定することは決して意図されない。本発明は、当業者が認識するように、代替的特徴を使用することにより実施され得る。同様に、「本発明の実施形態において」または同様な表現により導入される特徴は、本発明の代替的実施形態に関していかなる限定もなく、本発明の範囲に関していかなる限定もなく、およびそのような様式で導入された特徴を、本発明の他の任意選択のまたは非任意選択の特徴と組み合わせる可能性に関していかなる限定もなく、任意選択の特徴であることが意図される。
【００１３】
本明細書において使用される用語「電極」は、電気的接触を可能にする構造を指す。電極は、電気回路の非金属の部分、例えば、半導体素子、電解質、真空または空気との電気的接触を行うために通常使用される。典型的には、電極は、導電性材料を含む。特に、本発明により使用されるべき電極は、固体支持体である。本明細書で使用される用語「電極」は、電流測定および／もしくは電圧測定を実施するために構成され、ならびに／または電流および／もしくは電位および／もしくは電圧を、電極と電気的に接触している要素に適用するために構成された機能性素子を一般的に指すことができる。特に、電極は、伝導性および／または半導性材料を含むことができる。例として、電極は、少なくとも１種の金属材料および／または、少なくとも１種の伝導性または半導性表面を有する少なくとも１種の有機または無機半導性材料を含むことができる。表面自体が、電極または電極の部分を形成することもできる。例として、電極は、等方的にまたは少なくとも１方向に異方的にのいずれかで、少なくとも１０００Ｓ／ｍ、例えば少なくとも１００００００Ｓ／ｍの電気伝導度を有する少なくとも１種の材料、特に少なくとも１種の表面材料を含むことができる。特に、電極は、グラフェン、炭素ナノチューブ、ケイ素ナノワイア、酸化モリブデン、二硫化モリブデン、酸化チタン、酸化亜鉛、金属酸化物、窒化ガリウム、金、ケイ素、磁性ビーズ、ナノ粒子またはこれらの材料の任意の組合せを含むことができる。
【００１４】
電極は、電気回路の非金属の部分、例えば、半導体素子、電解質、真空または空気との電気的接触を行うために通常使用される。典型的には、電極は、導電性材料を含む。特に、本発明により使用されるべき電極は固体の支持構造である。
【００１５】
本明細書において使用される用語「電気的に接触している」は、少なくとも２つの構成要素の配置または構成を一般的に指すことができて、少なくとも１つの構成要素が少なくとも１つの他の構成要素に電気的に影響することができる、ならびに／または、例えば、静電的導入によるその伝導性および電流などの、これらに限定されない他の構成要素の電気の質を少なくとも部分的に制御することができることを一般的に指す。特に、電極は、前記素子と直接物理的に接触しないで素子と電気的に接触することができる。したがって、電極は、前記素子から絶縁されているにも拘わらず、電圧の印加により素子内の電流を制御することができる。絶縁は、例えば、典型的には金属酸化物の半導体の電界効果トランジスタ（ＭＯＳＦＥＴ）、以下でさらに詳細に説明される、絶縁されたゲート電界効果トランジスタ（ＩＧＦＥＴ）のサブグループのゲート電極の場合にように、酸化物層で構成され得る。したがって、一般的に、互いに電気的に接触するために、少なくとも２つの構成要素が互いに直接物理的に接触しないで、しかしながら、その結果、構成要素が互いに電気的に影響することができるように、密に近接した位置にあることができる。しかしながら、それに加えてまたはあるいは、少なくとも２つの構成要素は、少なくとも半導性の性質、または少なくとも１種の電気伝導体などによる導電性の性質を有する少なくとも１つの接続素子により物理的に接続されていてもよい。再び、それに加えてまたはあるいは、少なくとも２つの構成要素が、別個の構成要素であってもよく、または完全にもしくは部分的に、互いに組み込まれていてもよい。例として、少なくとも１つの電極が、少なくとも１つの接続素子を通して、例えば、少なくとも１本の電気的に導電性のリード線を通して、電界効果トランジスタと接続されるか、または完全にもしくは部分的に電界効果トランジスタに組み込まれているかのいずれかであることができる。
【００１６】
本明細書において使用される用語「官能化された表面」は、ある望ましい物理的および／または化学的性質を有する本発明による電極の表面を指す。本発明による電極の表面は、塩析効果を媒介することができる少なくとも１種のポリマーおよび流体試料に含まれる分析対象に結合する少なくとも１種の検出剤を含むことで官能化されているべきである。それに加えて、前記ポリマーおよび検出剤は、検出剤が電極表面全体にわたって表面積当たり本質的に等量で存在するように、電極の表面に分布するべきである。それに加えて、前記配置において、塩析効果を媒介することができるポリマーは、検出剤の周囲に存在し、検出剤に近接する流体のイオン強度の低下を可能にし、同時に、流体試料に含まれる分析対象との結合を可能にする量で存在すべきである。配置は、典型的には、連続した層であってもよく、または各検出剤の周囲に斑点様の配置などのクラスター配置であってもよい。
【００１７】
本明細書において使用される用語「流体試料」は、検出されるべき分析対象を含むかまたはそのような分析対象を含むと疑われる任意の溶液を指す。該流体試料は、水溶液であることもあり、または有機溶媒を含む他の溶媒を含むこともある。流体試料は、どのような起源であってもよく、例えば、それは、環境に存在する流体または生物体に存在する流体（すなわち体液）または抽出物などの生物体に由来する流体を含む、天然に生ずる流体の流体試料であってもよい。それに加えて、流体は、人工流体、例えば、分析されるべき化合物を適当な溶媒に溶解することにより得られた流体、または化学反応の生成物として得られた流体であることもある。典型的には、前記流体試料は、体液、液体または溶解された環境の試料または少なくとも１種の化学化合物の溶液である。より典型的には、前記流体は、高イオン強度の流体である。流体試料は、したがって、例えば、溶解された塩または緩衝剤から生じた多量のカチオンおよびアニオンを含むであろう。高イオン強度下で、典型的には、イオンは、ミリモルの量で、典型的には、１０ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ、７５ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭまたは２００ｍＭ以上の量で存在すると理解される。体液は、典型的には、血液、血漿、血清または任意のそれらの分画、唾液、涙液、粘液、リンパ、脳脊髄液、尿、糞便、汗、精液、滑液の流体からなる群から選択される。
【００１８】
本明細書において使用される用語「分析対象」は、流体試料中に存在することも存在しないこともある分子を指し、その存在および／またはその量が検出されるべきである。使用される検出剤の種類に応じて、分析対象は、種々の種類の分子から選択され得る。特に、分析対象は、低分子、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、例えばＲＮＡまたはＤＮＡなど、ポリマーまたは他の高分子、ウイルスまたは細菌、古細菌、藻、原生動物またはカビのような単細胞生物体を含む微生物などの生物体であってもよい。しかしながら、典型的には、分析対象は、低分子化合物、例えば、酵素の代謝経路の基質、代謝経路により得られたそのような経路の中間体または生成物である。したがって、より典型的には、本発明による分析対象は、代謝物であることができる。代謝経路は、当技術分野において周知であり、種間で変化し得る。好ましくは、前記経路は、少なくともクエン酸サイクル、呼吸鎖、光合成、光呼吸、解糖、糖新生、ヘキソースモノホスフェート経路、酸化的ペントースホスフェート経路、脂肪酸の産生およびβ−酸化、尿素サイクル、アミノ酸生合成経路、タンパク質分解経路、例えば、プロテアソームの分解、アミノ酸分解経路：脂質、ポリケチド（例えば、フラボノイドおよびイソフラボノイドを含む）、イソプレノイド（例えば、テルペン、ステロール、ステロイド、カロチノイド、キサントフィルを含む）、炭水化物、フェニルプロパノイドおよび誘導体、アルカノイド、ベンゼノイド、インドール、インドール−イオウ化合物、ポルフィリン、アントシアン、ホルモン、ビタミン、補因子、例えば補欠分子団または電子キャリア、リグニン、グルコシノレート、プリン、ピリミジン、ヌクレオシド、ヌクレオチドおよび関連分子、例えば、ｔＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）またはｍＲＮＡの生合成または分解物を含む。したがって、低分子化合物の代謝物は、通常、以下のクラスの化合物で構成される：アルコール、アルカン、アルケン、アルキン、芳香族化合物、ケトン、アルデヒド、カルボン酸、エステル、アミン、イミン、アミド、シアニド、アミノ酸、ペプチド、チオール、チオエステル、ホスフェートエステル、硫酸エステル、チオエーテル、スルホキシド、エーテル、または上で言及された化合物の組合せもしくは誘導体。代謝物の中の低分子は、正常細胞の機能、器官の機能または動物の成長、発達もしくは健康のために必要とされる一次代謝物であることもある。それに加えて、低分子代謝物は、必須の生態学的な機能を有する二次代謝物、例えば生物体がその環境に適合することを可能にする代謝物をさらに含む。さらに、代謝物は、前記一次および二次代謝物に限定されず、人工低分子化合物をさらに包含する。前記人工低分子化合物は、投与されたかまたは生物体により取り入れられた外部から提供された低分子から誘導されるが、上で定義された一次または二次代謝物ではない。例えば、人工の低分子化合物は、動物の代謝経路により薬剤から得られた代謝性生成物であることもある。
【００１９】
本明細書において使用される用語「塩析効果を媒介することができるポリマー」は、１より多いモノマーサブユニットを含む高分子を指す。通常、ポリマーのモノマーサブユニットは、化学的に互いに連結され、それにより高分子が形成されている。ポリマーは、化学的に同一のモノマーからなる、すなわちホモポリマーであることも、または化学的に異なるモノマーからなる、すなわちヘテロポリマーであることもある。その化学構造に起因し、ポリマーは、モノマーサブユニットおよびそれらの性質ならびに前記モノマーのサブユニットの高分子中の配置の結果として種々の性質を有する。本発明により構想されるポリマーは、塩析効果を媒介することができるべきであり、すなわちそれは、適切に、例えば１層として配置された場合、前記ポリマー層内の周囲のイオン性流体のイオン強度を低下させるであろう。通常、該ポリマーは、このことを、溶媒、特に、水分子をその近くで富化させて、同時にイオンがポリマーの周囲から拒絶されることにより達成するであろう。ポリマーを取り巻く領域における溶媒のイオン強度の低下の結果として、溶解されたイオンにより誘発される静電的効果が、ポリマー分子の近傍で低下するであろう。したがって、適切に、例えば、電極上に１層として配置された場合、流体中における分析対象と電極との間のデバイ長は増大され得る。該デバイ長は、イオン性溶液について以下の式により決定することができる：
【００２０】
【数１】
0006921217.tif 000002
【００２１】
（式中：
λＤはデバイ長であり；
ε０は誘電率であり；
εｒは自由空間の誘電率であり；
κＢはボルツマン定常であり；
Ｔは温度であり；
ＮＡはアボガドロ数であり；
ｅは素電荷であり；
Ｉはイオン強度である）。
【００２２】
流体中におけるイオン強度およびデバイ長は、当業者によりさらなる労苦もなく決定され得る。さらに、ポリマーがデバイ長に及ぼす効果は、当技術分野において周知の技法および以下に添付する実施例における記載により当業者によって決定され得る。
【００２３】
典型的には、前記塩析効果を媒介することができる少なくとも１種のポリマーのサイズは、デバイ長が増大して少なくとも１種の検出分子の周囲のイオン強度が低下するようなサイズである。より典型的には、前記塩析効果を媒介することができる少なくとも１種のポリマーの分子量（ＭＷ）は、１ｋＤａと１００ｋＤａの間、１０ｋＤａと１００ｋＤａの間、１０ｋＤａと５０ｋＤａの間、１０ｋＤａと２５ｋＤａの間、１０ｋＤａと２０ｋＤａの間または１０ｋＤａと１５ｋＤａの間である。
【００２４】
同様に典型的には、前記塩析効果を媒介することができる少なくとも１種のポリマーは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリグリセロール、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリメタクリレートまたは別のアクリル系ポリマー、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、上で言及されたポリマーのコポリマー、多糖類、ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよびポリシロキサンからなる群から選択される。
【００２５】
上で言及された塩析効果を媒介することができるポリマーは、電極の表面に固定化されるべきである。したがって、ポリマーは、直接または間接的に、すなわちリンカーを通して、電極の表面に連結され得る。使用される連結の種類は、電極材料およびポリマーに依存する。したがって、適切に選択された場合、ポリマーと電極表面との間の直接連結が達成され得る。しかしながら、連結は、典型的には、リンカーを通して間接的に連結されるであろう。本発明により言及されたリンカーは分子であり、より典型的には、二官能性分子であり、それは、電極表面およびポリマーの両方に直接結合することが可能である。本明細書で言及された結合は、共有結合であっても非共有結合であってもよく、したがって、周囲および適用される条件に依存して、永久的であることもあり可逆的であることもある。当業者は、どのように、およびどのような条件下で直接または間接結合が達成され得るか、およびどのようなタイプのリンカーが適当であるかを熟知している。
【００２６】
典型的には、塩析効果を媒介することができるポリマーは、官能基により、電極の表面に、追加のリンカーなしで直接固定化されるか、またはリンカーを通して固定化される。より典型的には、前記リンカーは、以下の構造を有するリンカーである：
Ａ−Ｂ−Ｃ
（式中、Ａは、チオール、シラン、ホスホン酸、芳香族分子（例えばピレン）、カルボキシル、アミン、ＮＨＳエステル、マレイミドのクラスからの第１の官能基であり、Ｂは、以下のクラス：上に記載されたクラスからの低分子量ポリマー、炭化水素（例えばアルキル、アルケニル、アルキニル、フェニル）、酸素含有基（例えばエーテル）、ハロアルカン（例えばクロロ）、窒素含有基（例えばアミド）、イオウ含有基（例えばスルホキシド）、リン含有基、ホウ素含有基、または短い無機ポリマー鎖（例えばＳｉ基部を有する（シロキサン）、Ｐ基部を有する、Ｂ基部を有する、Ｓ基部を有する）からの短い有機鎖であり、およびＣは、カルボキシル、アミン、ＮＨＳエステル、マレイミドのクラスからの第２の官能基である）。
【００２７】
本発明により使用される用語「検出剤」は、流体試料中に存在する場合の検出されるべき分析対象に結合する分子を指す。典型的には、検出剤は、前記分析対象に特異的におよび選択的に結合する、すなわち、試料中に存在することもあり存在しないこともある他の分析対象と交差反応しない。特異的結合は、種々の周知の技法によって試験され得る。検出されるべき分析対象のタイプに依存して、検出剤は、種々のクラスの分子から選択され得る。当業者は、どのタイプ分析対象が、どのような分子を検出剤として検出され得るかを熟知している。典型的には、検出剤は、抗体およびそれらのフラグメント、核酸、アプタマー、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、受容体またはリガンドのタンパク質またはペプチド、および酵素からなる群から選択される。
【００２８】
本明細書で抗体およびそれらのフラグメントと称されるものは、典型的には、検出されるべき分析対象に特異的に結合する全てのタイプの抗体を包含する。通常、本発明による抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単鎖抗体、キメラ抗体または分析対象になおも結合し得るそのような抗体の任意のフラグメントもしくは誘導体である。本明細書において使用される抗体という用語により含まれるそのようなフラグメントおよび誘導体は、二重特異性抗体、合成抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、ＦｖまたはｓｃＦｖフラグメント、またはこれらの抗体の任意の化学的に改変された誘導体を包含する。抗体またはそれらのフラグメントは、一般的に、当技術分野における周知の方法を使用して得ることができる。モノクローナル抗体は、例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎの技術によるマウス骨髄腫細胞と免疫された哺乳動物、好ましくは、免疫されたマウスに由来する脾臓細胞との融合を含む技法により調製され得る。
【００２９】
本明細書で核酸と称されるものは、デスオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）ならびに化学的に改変されたそれらの誘導体の全ての種類を指す。これらの分子は当技術分野において周知である。典型的には、検出剤としての核酸は、他の核酸を分析対象として検出するために使用され得る。そのような場合に、検出剤の核酸は、検出されるべき分析対象の核酸またはそれらの一部と部分的にまたは完全に相補性である。典型的には、そのような核酸は、オリゴヌクレオチドのサイズを有する、すなわち５と３５の間のヌクレオチド長、より好ましくは、１０および２５の間のヌクレオチド長を含むことができるか、またはそれより大きい１００から１，０００の範囲内のヌクレオチド長、より好ましくは、３００と６００の間のヌクレオチド長の核酸プローブであることもできる。
【００３０】
本発明によりアプタマーと称されるものは、核酸およびペプチドアプタマーを包含する。塩基対を形成するそれらの能力に加えて、核酸は、低分子、タンパク質、核酸、さらに細胞、組織および生物体などの標的分子に特異的に結合して３次元の構造を形成するそれらの能力に起因し、他の分析対象を検出するためのアプタマーとしても使用され得る。核酸アプタマーは、インビトロにおける選択の繰り返しを通して、または種々の分子標的に結合する指数関数的富化（ＳＥＬＥＸ）技術によりリガンドの系統的発生を通して操作され得る。ペプチドアプタマーは、標的分子に特異的に結合するように選択されたかまたは操作された人工ペプチドである。これらのペプチドは、タンパク質の足場により表示された１つまたは複数の可変配列のペプチドループから通常はなる。それらは、典型的には、コンビナトリアルライブラリーから単離され、通常その後、定方向突然変異または可変領域の突然変異生成および選択の繰り返しにより改善される。
【００３１】
ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、ペプチド結合により連結された反復するＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位で構成された核酸様骨格を有する人工的に合成されたポリマーである。種々のプリンおよびピリミジン塩基は、メチレン架橋およびカルボニル基により骨格に連結されている。ＰＮＡおよび核酸は、同様な生物学的性質を有し、したがって、ＰＮＡは、核酸またはアプタマーのように検出剤として使用され得る。
【００３２】
本発明による受容体またはリガンドタンパク質またはペプチドは、他のタンパク質またはペプチドを特異的に認識することができるタンパク質またはペプチドを指す。典型的には、受容体およびリガンドのペプチドまたはタンパク質は、他のタンパク質またはペプチドなどの他の分子と特異的に相互作用することができる。それ故、受容体またはリガンドは、そのような相互作用するタンパク質またはペプチドまたはそれらと相互作用するさらに他の分子のための検出剤として使用され得る。本発明により、受容体またはリガンドのタンパク質またはペプチドは、生物学的に活性な受容体またはリガンドの全体の一部、典型的には、それらの結合ドメインを包含する部分も包含することができることが理解されるであろう。受容体またはリガンドのタンパク質およびペプチドは、天然に生ずる受容体であることもあり人工的に生成された受容体であることもある。検出剤として典型的な人工ペプチドは、環状ペプチドも含む。
【００３３】
酵素も検出剤として典型的に適当である。酵素は、分子（基質）に特異的に結合して、前記分子を他の分子（生成物）に酵素的に変換することができるタンパク質またはペプチドである。したがって、酵素は、典型的には、基質に特異的に結合することができて、したがって、流体試料中に存在する分析対象としてそのような基質を検出するために使用され得る。酵素により認識される分析対象は、通常、低分子、ペプチドまたはタンパク質を含む。しかしながら、幾種類かの酵素は、ポリマーなどの高分子も認識することができる。適当な酵素およびそれらの基質は当技術分野において周知である。
【００３４】
典型的には、前記少なくとも１種の検出剤は、リンカーを通して電極の表面に固定化される。より典型的には、前記リンカーは、０．０１から５ｋＤａの間、０．０１から１．０ｋＤａの間、０．０１から０．５ｋＤａまたは０．１から０．５ｋＤａの間のＭＷを有する低分子量（ＭＷ）のポリマーからなる群から選択され、前記ポリマーは、典型的には、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリグリセロール、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリメタクリレートまたは別のアクリル系ポリマー、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）および上で言及されたポリマーのコポリマーからなる群から選択される。そのような低分子量ポリマーの使用は、配座の安定性、柔軟性および検出剤の分析対象に対する結合能力を強化するであろう。それは、分析対象以外の種の非特異的吸着も減少させるであろう。あるいは、検出剤のために使用されるリンカーは、ポリマーについて上記のリンカーであってもよい。
【００３５】
特に、検出剤のためのリンカーは、上記の名を挙げたポリマーであることが、本発明により構想される。それに加えて、塩析効果を媒介することができるポリマーは、リンカーポリマーと同一のクラスのポリマーである、すなわち両方共、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリグリセロール、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリメタクリレートまたは別のアクリル系ポリマー、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）または上で言及されたポリマーのコポリマーであることが特に構想される。より典型的には、リンカーポリマーは、０．０１から５ｋＤａの間、０．０１から１．０ｋＤａの間、０．０１から０．５ｋＤａの間または０．１から０．５ｋＤａの間のＭＷを有する低分子量（ＭＷ）ポリマーであり、それに対して、前記塩析効果を媒介することができる少なくとも１種のポリマーの分子量（ＭＷ）は、１ｋＤａと１００ｋＤａの間、１０ｋＤａと１００ｋＤａの間、１０ｋＤａと５０ｋＤａの間、１０ｋＤａと２５ｋＤａの間、１０ｋＤａと２０ｋＤａの間または１０ｋＤａと１５ｋＤａの間である。
【００３６】
ポリマーおよび検出剤は、検出剤が電極表面全体にわたって表面積当たり本質的に等量で存在するように、電極の表面に分布すべきである。本発明の電極を使用して、分析対象の検出測定を実行する目的のためには、検出剤が電極の表面全体にわたって均一に存在することが有利であることは理解されるであろう。そのような均一な存在は、検出剤または検出剤のためのリンカーおよびポリマーを均一な溶液として電極の表面に添加することにより達成され得る。それにより、電極の全領域が、本質的に等量の検出剤またはリンカーおよびポリマーを統計的に受け入れるであろう。そのような均一なコーティングが如何にして達成され得るかも、当技術分野において完全に確立されており、本明細書の他の場所でより詳細に記載される。
【００３７】
それに加えて、ポリマーは、検出剤の周囲に配置され、検出剤に近接する流体のイオン強度の低下を可能にするが、流体試料に含まれる分析対象に結合することを未だ可能にする量で存在すべきである。典型的には、検出剤は、検出剤が流体試料と自由に接触しないように、ポリマー分子により取り囲まれる。このことは、ポリマーが、デバイ長が増大するように検出剤に近接するイオン強度を低下させることができることを可能にする。検出剤のサイズおよびポリマーのサイズは、検出剤が表面におけるポリマー層またはクラスター内にあって、自由に流体試料への接近できないかまたは限定された接近のみを有するようなサイズであるように注意が払われるべきであることは理解されるであろう。したがって、ポリマーのサイズは、検出剤のサイズ以上であるべきであり、または、換言すれば、検出剤は、好ましくは、ポリマー層またはクラスター中に埋め込まれているべきである。以下の表に、検出剤およびコーティングするために有用なポリマーがリストにされている。
【００３８】
【表１】
0006921217.tif 000003
【００３９】
ポリマー層および検出剤層の厚さは、当技術分野において周知の技法により、測定、計算および／または予測され得る。したがって、ポリマーおよび検出剤の配置を別個の層として考慮した場合、予測および／または計算に基づいて、所与の検出剤のために適当なサイズのポリマーが、さらなる労苦もなく選択され得る。
【００４０】
それに加えて、検出剤分子は、典型的には、表面でポリマー分子により完全に取り囲まれているべきである。分析対象を検出するために適当な配置を達成するために、前記検出剤および／またはそのためのリンカーは、前記少なくとも１種のポリマーと同時に適用される。典型的には、官能化された表面に存在する塩析効果を媒介することができる少なくとも１種のポリマーと少なくとも１種の検出剤とのモル比は、１：１００から１００：１、１：５０から５０：１、１：２０から２０：１、１：１０から１０：１、１：５から５：１、２：１０から８：１、３：１０から７：１、４：１０から６：１または５：１０から５：１の間である。そのようなモル比が、電極の表面における検出剤およびポリマーの以上で言及された有利な配置の形成を可能にする。特に、ポリマーおよび検出剤の適当な層またはクラスター配置は、ポリマーおよびリンカー、典型的には、ポリマーリンカーを、適当な溶媒中の溶液として電極に適用することにより得られ得る。前記溶液は、典型的には、ポリマーおよびリンカーを、１：１０から１：５０、より典型的には、１：２０の分子量比で含む。より大きい検出剤、例えば、抗体、受容体または酵素などのために、より大きな分子比が使用されるべきである、すなわちリンカーの量が増大されるべきであるということが理解されるべきである。
【００４１】
本発明の基礎となる研究において、デバイ長増大の程度は、ＰＥＧの存在および非存在下における異なる塩濃度で、系統的に二重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の検出を比較することにより定量されることが有利であった。ｄｓＤＮＡは、ＦＥＴに基づく測定に対するデバイ遮蔽効果を研究するためには、その均一な表面電荷および容易に調節され得る長さのために、理想的な生体分子である。とりわけ、ｄｓＤＮＡと一緒に固定化されたＰＥＧは、センサ表面の直ぐ隣の区域を局所的に脱塩して、局所イオン強度を少なくとも１０×低下させることができることが示された。このことは、ｄｓＤＮＡ分子を取り囲む近傍でデバイ遮蔽効果が低下する結果をもたらし、改善されたＦＥＴに基づく検出を、生理学的イオン強度下の溶液で可能にする。その結果、電極表面で検出剤を、塩析効果を媒介することができるポリマーにより取り囲むことは、電極測定のためのデバイ長を増大させることを可能にすることが、本発明により見出された。したがって、そのような溶液中における電界効果に基づく分析対象の検出を、通常なら妨げる高いイオン強度を有する溶液中で、測定は、また、効率的に実施され得る。特に、溶液のイオン強度は、塩析に起因しポリマー層で低下することが見出された。しかしながら、電極に固定化された検出剤は、検出分子に対する分析対象の結合を可能にして、その時、層中におけるイオン強度の前記低下を可能にするポリマー分子の空間的配置で取り囲まれていなければならない。ポリマーおよび検出剤の適当な配置は、検出剤または検出剤のためのリンカーとポリマー分子または前記ポリマーのためのリンカーとの予め定められた混合物を使用することにより達成され得る。官能化された電極表面を製造するプロセスも、本発明の基礎となる、本明細書の他の箇所でより詳細に記載される発見のおかげで提供される。抗体、ペプチド、受容体または酵素などの検出剤のためのリンカーとしての低分子量ポリマーの使用は特に有利なはずであり、それは、配座の安定性、柔軟性および分析対象の検出剤に対する結合能力が増大して、分析対象以外の他の種の非特異的吸着が低下するからである。
【００４２】
上記の用語で与えられた全ての定義および説明は、以下の全ての実施形態に準用適用される。
本発明は、
ａ）  リンカーおよび塩析効果を媒介することができる少なくとも１種のポリマーを、電極の表面における前記リンカーおよび前記ポリマーの共有結合または非共有結合による固定化を可能にする条件下で、電極に適用するステップと、
ｂ）  前記リンカーおよび前記ポリマーを固定化の後、少なくとも１種の検出剤を、固定化されたリンカーを通した前記少なくとも１種の検出分子の共有結合または非共有結合による電極への連結することを可能にする条件下で、電極に適用するステップと
を含む電極上に官能化された表面を製造する方法にさらに関し、
ここで、上記条件は、前記塩析効果を媒介することができる少なくとも１種のポリマーおよび前記少なくとも１種の検出剤を電極の表面に、検出剤が、電極表面全体にわたって表面積当たり等量で存在し、塩析効果を媒介することができるポリマーが検出剤の周囲に配置され、
ｉ）  検出剤に近接する流体のイオン強度の低下を可能にし、
ｉｉ）  流体試料に含まれる分析対象を結合することを可能にする
量で存在するように分布させることを可能にする。
【００４３】
リンカーおよび塩析効果を媒介することができる少なくとも１種のポリマーが、前記リンカーおよび前記ポリマーの共有結合または非共有結合による電極の表面への固定化を可能にする条件下で、電極に適用される。したがって、前記分子の固定化の種類に依存して、分子は、電極表面に共有結合で連結されるか、または非共有結合機構により接着され得る。典型的には、リンカーまたはポリマーの共有結合は、リンカーまたはポリマー分子中に存在する官能基により達成され得る。前記官能基は、電極表面に結合した共有結合を形成することができる。前記官能基は、それらの電極への共有結合による連結を可能にするために、ポリマー中に存在することもできる。典型的には、リンカーまたはポリマーの非共有結合も、リンカーまたはポリマー分子中に存在する官能基により達成され得る。前記官能基は、例えば、静電的相互作用、疎水性相互作用、パイ相互作用、水素結合またはファンデルワールス力により電極表面に結合した非共有結合を形成することができる。典型的な官能基は、チオール、シラン、ホスホン酸、芳香族分子（例えばピレン）、カルボキシル、アミン、ＮＨＳエステル、マレイミドであってもよい。
【００４４】
同じく典型的には、本発明の方法で使用される前記塩析効果を媒介することができる少なくとも１種のポリマーは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリグリセロール、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリメタクリレートまたは別のアクリル系ポリマー、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）および上で言及されたポリマーのコポリマーからなる群から選択される。
【００４５】
典型的には、本発明の方法で使用される前記リンカーは、０．０１から５ｋＤａの間、０．０１から１．０ｋＤａの間、０．０１から０．５ｋＤａまたは０．１から０．５ｋＤａのＭＷを有する低分子量（ＭＷ）ポリマーであり、前記ポリマーはポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリグリセロール、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリメタクリレートまたは別のアクリル系ポリマー、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）または上で言及されたポリマーのコポリマーである。
【００４６】
リンカーおよびポリマーの適用は、検出分子およびポリマーの構想された配置を反映する、リンカーおよびポリマーの空間的配置の形成を可能にする条件下で実施される。これは、前記分子の予め定められた混合物を電極表面に適用することにより実施され得る。典型的には、リンカーおよびポリマー分子が、適用溶液中で予め定められたモル比で混合される。ポリマーと検出剤のためのリンカーとのモル比は、典型的には、適当な溶媒中で、１：１００から１００：１、１：５０から５０：１、１：２０から２０：１、１：１０から１０：１、１：５から５：１、２：１０から８：１、３：１０から７：１、４：１０から６：１または５：１０から５：１の間である。前記溶媒は、電極表面との接触でもたらされ、リンカーおよびポリマーの前記表面への固定化を可能にする条件が適用される。それに加えて、リンカーおよびポリマーは、それらが、電極表面全体にわたって表面積当たり等量で存在するように、通常適用される。
【００４７】
特に、検出剤のためのリンカーは、上記で挙げた低分子量ポリマーであり、より典型的には、塩析効果を媒介することができるポリマーと同一のクラスのポリマーであり、すなわち両方共、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリグリセロール、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリメタクリレートまたは別のアクリル系ポリマー、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）または上で言及されたポリマーのコポリマーである。本発明の方法では、ポリマーおよび検出剤の適当な層配置は、典型的には、ポリマーおよび上記の言及されたポリマーリンカーを、適当な溶媒中のポリマーとリンカーとを１：１０から１：５０、より典型的には、１：２０の分子量比で含む溶液として、電極に適用することにより得られ得る。塩析効果を媒介することができるリンカーおよびポリマーと同一のポリマークラスの分子を使用することが、同一の固定化反応が、前記ポリマーおよびポリマーリンカーを電極表面に固定化するために使用され得るので有利である。
【００４８】
次のステップで、検出分子は、固定化されたリンカーを通して、前記少なくとも１種の検出分子を電極に共有結合または非共有結合で連結することを可能にする条件下で適用される。リンカーは、典型的には、検出分子と共有結合または非共有結合を形成することができるさらなる官能基を含む。典型的な官能基は、本明細書の他場所で特定されたものを含む。検出剤を、リンカーおよびポリマー分子をその表面に含む電極に適用すると、構想された空間的配置が生ずる。特に、前記塩析効果を媒介することができる少なくとも１種のポリマーおよび前記少なくとも１種の検出剤は、電極表面全体にわたって表面積当たり等量で存在する。それに加えて、塩析効果を媒介することができるポリマーは検出剤の周囲に配置され、検出剤に近接する流体のイオン強度の低下を可能にし、流体試料に含まれる分析対象との結合を可能にする量で存在する。
【００４９】
本発明は、本発明の電極または本発明の方法により得られる電極を備える、少なくとも１種の分析対象を決定するための分析対象検出器も提供して、ここで、前記電極は、変換器と電気的に接触しているか、または変換器の一部である。
【００５０】
本明細書において使用される用語「分析対象検出器」は、流体試料中の少なくとも１種の分析対象の検出のために適当なデバイスを指す。分析対象検出器は、分析用構成要素として本発明の電極を含むべきである。それに加えて、前記デバイスは、典型的には、流体試料をデバイス中に導入するためのロード要素および電極を流体試料と接触させることを可能にする接触要素を含むべきである。さらに、電極は、変換器と電気的に接触しているか、またはそのような変換器の一部であるべきである。典型的には、本発明による分析対象デバイスは、電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）を含み、本発明の電極が、前記トランジスタ中でゲート電極としてまたはチャンネルとして使用されている。ゲート電極としてまたはチャンネルとして使用される場合、本発明の電極は、例えば、本発明による分析対象検出器を適用する、流体試料中における分析対象の特異的および効率的な検出を可能にする。
【００５１】
あるいはまたはそれに加えて、本発明による分析対象デバイスは、電気化学的測定デバイスを備えることができて、本発明の電極は、電気化学的測定において役割を果たすことができる。用語「電気化学的測定デバイス」は、少なくとも１種の電気化学的測定を実施するために構成された任意のデバイスを一般的に指すことができる。この目的のために、少なくとも１種の電気化学的測定デバイスは、少なくとも１種の電気化学的測定を実施するために構成された１種または複数の電気デバイスを含むことができる。例として、電気化学的測定デバイスは、少なくとも１つの電極、少なくとも１つの電源、例えば：定電圧電源、可変電圧電源、定電流電源、可変電流電源、周期的電気シグナルを発生する周波数発生器からなる群から選択される少なくとも１つ電源などを備えることができる。さらに、電気化学的測定デバイスは、少なくとも１種の電気シグナルまたは電気測定変数を測定するために構成された少なくとも１つの電気測定デバイス：例えば、電圧測定デバイス、電流測定デバイス、ポテンショスタットからなる群から選択される少なくとも１つの電気測定デバイスなどを備えることができる。他の測定デバイスも利用可能である。
【００５２】
本明細書で使用される用語「電気化学的測定」は、レドックス反応の少なくとも１つの測定可能な特性の測定を一般的に指すことができる。電気化学的測定および／またはレドックス反応の測定可能な特性は、例として、電流、電圧、電位差、質量、例えば電極に堆積した質量、インピーダンス、特にインピーダンスの実数部分および／または虚数部分を含むことができる。
【００５３】
特に、電気化学的測定は、電気活性種の存在で実施され得る。本明細書で使用される用語「電気活性種」とは、例えば、電子移動を容易にすることにより、レドックス反応を容易にするかまたは増強するかまたは触媒する化合物を一般的に指すことができる。電気活性種は、流体試料に溶解されていても、および／または分析対象検出器の流体試料に露出可能な表面に固定化されていてもよい。特に、該表面は、上記の感知表面および／または多目的電極の上記の表面であってもよい。電気活性種の好ましい例は、レドックスメディエーター、特にレドックスカップル、例えば：フェリシアン化カリウム／フェロシアン化カリウム；ヘキサアミンルテニウム（ＩＩ）塩化物／ヘキサアミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物；フェロセンメタノールなどであるが、これらに限定されない。電気活性種のさらなる好ましい例は、還元剤、例えば、アスコルビン酸、グルタチオン、リポ酸、尿酸、シュウ酸、タンニンおよびフィチン酸などであるが、これらに限定されない。電気活性種は、レドックス反応の少なくとも１種の測定可能な特性の測定を容易にするかまたは強化することができる。
【００５４】
それに加えてまたはあるいは、電気化学的測定は、素子例えば電極の電気的性質の直接または間接の検出を指すことができて、ここで、該電気的性質は、化学反応によりおよび／または電子の移動によりおよび／または原子もしくは分子の結合により影響されるかまたは作用される。特に、電気的性質は、少なくとも１種のその関与因子の酸化状態の変化を含む化学反応により影響されるかまたは作用され得る。電気的性質は、例えば、電気化学的ポテンシャルおよび／または素子の電気化学的ポテンシャルの変化、電位および／または素子の電位の変化、素子に印加される電圧および／または電圧の変化および／または素子に貯蔵される電荷の量であってもよい。素子の電気的性質の直接または間接の測定は、素子の電気的性質により惹起されるおよび／または影響される電界効果に基づくこともある。したがって、特定の例として、化学反応は、素子の酸化状態を変化させることができる。素子の酸化状態の変化は、素子の酸化状態が寄与し得る電界効果により電気化学的測定で測定可能であり得る。したがって、素子の酸化状態の変化の検出は、例えば、電界効果トランジスタを使用して検出可能であり得る。特に、素子の電気的性質は、電界効果トランジスタのゲート電圧に影響することにより、電界効果トランジスタの電源電極とドレイン電極との間の電流に影響し得る。
【００５５】
本明細書において使用される用語「変換器」とは、エネルギーを１つの形態から別の形態に変換するように構成された、および／または入力シグナル、特に電気シグナル、例えば、印加される電流、電圧またはポテンシャルなどを、入力シグナルの形態と異なる形態の対応する出力シグナルに変換するように構成された、任意の種類の機能性構成要素または機能性構成要素の配置を指す。したがって、変換器は、入力シグナルとして印加された別の電気シグナル、例えば電圧またはポテンシャルを受けた後、１つの形態の電気シグナル、例えば電流を、出力シグナルとして生ずるように構成され得る。特に、変換器は、電界効果トランジスタおよび／または電気化学的測定デバイスであることまたはそれらを備えることができる。変換器が電界効果トランジスタとして与えられる場合、入力シグナルは、センサ表面における荷電種の結合により改変され得る、ゲート電極により電界効果トランジスタのチャンネルに印加される電圧またはポテンシャルであってもよく、一方、出力シグナルは、電界効果トランジスタの電源電極とドレイン電極との間のドレイン電流Ｉｄであってもよい。変換器が電気化学的測定デバイスとして実施される場合、入力シグナルは、レドックス反応の少なくとも１つの測定可能な特性であってもよい。
【００５６】
本発明は、流体試料中の少なくとも１種の分析対象を決定するために本発明の分析対象検出器の使用を一般的に考慮している。典型的には、流体中の少なくとも１種の分析対象の前記決定は、診断の目的、環境のモニタリングおよび制御、食品安全性、品質制御または製造プロセスにおいて必要とされる。
【００５７】
分析対象の検出は、典型的には、種々の異なるプロセスで役割を演ずる。それは対象中における分析対象の変化を診断するために使用することができて、それは、順送りで疾患または他の病態の診断に役立つことができる。さらに、分析対象の分析は、環境のモニタリングで、例えば、汚染の程度における変化を検出するために有用であり得る。さらに、生産、食品安全性および一般的品質制御プロセスは、典型的には分析対象の検出を必要とする。したがって、本発明による分析対象検出器は、任意のそのようなプロセスで使用され得て、典型的には、さらにそれらの自動制御を可能にする。
【００５８】
それに加えて、本発明は：
（ａ）  少なくとも１種の分析対象を含むと疑われる流体試料を、本発明の電極または本発明の分析対象検出器と接触させるステップ；および
（ｂ）  前記電極または検出器を用いて電気化学的測定を実施して、それにより少なくとも１種の分析対象が決定されるステップ
を含む、少なくとも１種の分析対象を決定する方法を考慮する。
【００５９】
この前後関係で使用される用語「を決定する」は、定量的決定、すなわち量の決定、ならびに定性的決定、すなわち分析対象の存在または非存在の決定を指す。そのような決定は、例えば、本発明の分析対象検出器を使用して、本明細書の他の箇所に記載された電気化学的測定を実行することにより実施され得る。電気化学的測定の結果に基づいて、少なくとも１種の分析対象が、上記のように決定され得る。
【００６０】
電気化学的測定は、原理的に、電極上の検出剤に対する分析対象の結合を可能にする標準条件下で実施され得る。そのような標準条件は、典型的には、流体試料の凝固点を超えて沸点未満の温度を含むことができる。幾つかの用途で、該温度は、室温の範囲内にある温度であろう。より典型的には、しかしながら、電気化学的測定は、３０℃と４０℃との間の温度で、好ましくは、少なくとも３０℃、少なくとも３２℃、少なくとも３５℃または少なくとも３７℃の温度で実施される。本発明の基礎となる研究で、測定が約３７℃で実施された場合、強いシグナル増強が達成され得、２１℃と比較して３桁の大きさでより低い検出限界に達し得ることが見出された。
【００６１】
電気活性種の存在下における電気化学的測定の実行は、例えば、シグナル増強のために実施され得る。電気活性種は、分析対象溶液に溶解されるかまたは表面に固定化され得る。典型的な電気活性種は：フェリ／フェロシアン化カリウム、ヘキサアミンルテニウム（ＩＩ）および（ＩＩＩ）塩化物、フェロセンメタノールなどのレドックスカップル；アスコルビン酸、グルタチオン、リポ酸、尿酸、シュウ酸、タンニン、フィチン酸などの還元剤である。電気化学的なまたはトランジスタに基づく測定の実行は、典型的には、シグナル増強のために表面に結合した分析対象に取り付けられた２次受容体の存在下で実施され得る。２次受容体は、それ自体でシグナルおよび／または選択性を強化することができるか、または酵素などの追加の分子で標識されてもよい。シグナルを増強する分子は、例えば、基質との相互作用によって、陽子または電子などのセンサにより直接測定可能な種の濃度における変化を生じさせることができる。
【００６２】
本発明は、プログラムがコンピュータまたはコンピュータネットワークで実行された場合、本明細書に封入された１つまたは複数の実施形態で、上で言及された本発明による方法を実行するためのコンピュータで実行可能な使用指示を含むコンピュータプログラムを、さらに開示および提案する。特に、該コンピュータプログラムは、コンピュータで読み出され得るデータキャリアに貯蔵され得る。したがって、特に、上で示されたステップｃ）およびｄ）の１つ、１つより多いまたはさらに全ての方法が、コンピュータまたはコンピュータネットワークを使用することにより、好ましくはコンピュータプログラムを使用することにより、実施されおよび／または制御されおよび／または評価され得る。
【００６３】
本発明は、プログラムがコンピュータまたはコンピュータネットワークで実行された場合、本発明による上で言及された方法を、本明細書に封入された実施形態の１つまたは複数で実施するために、プログラムコード手段を有するコンピュータプログラムの結果をさらに開示および提案する。特に、プログラムコード手段は、コンピュータで読み取り得るデータキャリアで貯蔵され得る。
【００６４】
さらに、本発明は、データ構造をストレージしたデータキャリアを開示および提案し、それは、コンピュータまたはコンピュータネットワークに、例えば、コンピュータまたはコンピュータネットワークのワーキングメモリーまたはメインメモリー中にロードされた後、本明細書で開示された１つまたは複数の実施形態により上で言及された方法を実行することができる。
【００６５】
本発明は、プログラムがコンピュータまたはコンピュータネットワークで実行されたときに、本明細書で開示された実施形態の１つまたは複数により、上で言及された方法を実施するために、機械読取り可能なキャリア上に貯蔵されたプログラムコード手段を用いたコンピュータプログラムの結果を、さらに提案および開示する。本明細書において使用される、コンピュータプログラムの結果とは、売買できる結果としてのプログラムを指す。該結果は、任意のフォーマット、例えば紙のフォーマットで、またはコンピュータ読取り可能なデータキャリアで、一般的に存在することができる。特に、コンピュータプログラムの結果は、データネットワーク上で分配され得る。
【００６６】
最終的に、本発明は、本明細書で開示された実施形態の１つまたは複数により上で言及された方法を実行するためのコンピュータシステムまたはコンピュータネットワークにより読取り可能な指示を含有する変調されたデータシグナルを提案および開示する。
【００６７】
好ましくは、本発明のコンピュータで実行される態様を参照して、本明細書で開示された実施形態の１つもしくは複数による上で言及された方法の１つもしくは複数の方法のステップまたはさらに全ての方法のステップが、コンピュータまたはコンピュータネットワークを使用することにより実施され得る。したがって、一般的に、データの提供および／または操作を含む任意の方法のステップが、コンピュータまたはコンピュータネットワークを使用することにより実施され得る。一般的に、これらの方法のステップは、典型的には、試料を提供するおよび／または実際の測定を実行するある態様などの手作業を必要とする方法のステップを除いて、任意の方法のステップを含むことができる。
【００６８】
特に、本発明は：
上で記載された実施形態の１つによる方法を実施するように適合された、少なくとも１つのプロセッサを含むコンピュータまたはコンピュータネットワーク、
コンピュータで実行される間に、上で記載された実施形態の１つによる方法を実施するように適合されるコンピュータにロード可能なデータ構造、
コンピュータで実行される間に、上のこの記載に記載された実施形態の１つによる上で言及された方法を実施するように適合されたコンピュータプログラム、
コンピュータまたはコンピュータネットワークで実行される間に、上のこの記載に記載された実施形態の１つによる上で言及された方法を実行するためのプログラム手段を含むコンピュータプログラム、
先行する実施形態によるプログラム手段を含むコンピュータプログラムであって、コンピュータに読取り可能なストレージ媒体で貯蔵されたコンピュータプログラム、
データ構造が貯蔵されたストレージ媒体であって、コンピュータまたはコンピュータネットワークのメインおよび／またはワーキングストレージにロードされた後で、該データ構造が上で記載された実施形態の１つによる上で言及された方法を実施するように適合されたストレージ媒体、および
プログラムコード手段を有するコンピュータプログラムの結果であって、プログラムコード手段が、コンピュータまたはコンピュータネットワークで実行されるならば、上で記載された実施形態の１つにより上で言及された方法を実行するために、該プログラムコード手段がストレージ媒体に貯蔵され得るかまたは貯蔵された、コンピュータプログラムの結果
をさらに開示する。
【００６９】
以下の典型的な実施形態は、本発明をさらに例示するが、如何なるものも限定と解釈されるべきではない。
１．  流体試料に露出可能な官能化された表面を含む電極であって、前記官能化された表面は、塩析効果を媒介することができる少なくとも１種のポリマーおよび流体試料に含まれる分析対象に結合する少なくとも１種の検出剤を含み、
前記塩析効果を媒介することができる少なくとも１種のポリマーおよび前記少なくとも１種の検出剤は電極の表面に、検出剤が電極表面全体にわたって表面積当たり本質的に等量で存在し、塩析効果を媒介することができるポリマーが検出剤の周囲に配置され
ｉ）  検出剤に近接する流体のイオン強度の低下を可能にし、
ｉｉ）  流体試料に含まれる分析対象に結合することを可能にする
量で存在するようにるように分布する、電極。
２．  グラフェン、炭素ナノチューブ、炭素、ケイ素ナノワイア、酸化モリブデン、二硫化モリブデン、酸化チタン、酸化亜鉛、金属酸化物、窒化ガリウム、金、銀、白金、ケイ素、磁性ビーズ、ナノ粒子またはこれらの材料の任意の組合せを含む、実施形態１の電極。
３．  前記塩析効果を媒介することができる少なくとも１種のポリマーのサイズは、デバイ長が増大して少なくとも１種の検出分子の周囲のイオン強度が低下するようなサイズである、実施形態１または２の電極。
４．  前記塩析効果を媒介することができる少なくとも１種のポリマーの分子量（ＭＷ）が、１ｋＤａと１００ｋＤａの間、１０ｋＤａと１００ｋＤａの間、１０ｋＤａと５０ｋＤａの間、１０ｋＤａと２５ｋＤａの間、１０ｋＤａと２０ｋＤａの間または１０ｋＤａと１５ｋＤａの間である、実施形態３の電極。
５．  前記塩析効果を媒介することができる少なくとも１種のポリマーが、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリグリセロール、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリメタクリレートまたは別のアクリル系ポリマー、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、上で言及されたポリマーのコポリマー、多糖類、ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよびポリシロキサンからなる群から選択される、実施形態１から４のいずれか１つの電極。
６．  前記塩析効果を媒介することができる少なくとも１種のポリマーが、電極表面に、リンカーを通して固定化されるかまたは追加のリンカーなしで官能基により直接取り付けられる、実施形態１から５のいずれか１つの電極。
７．  前記リンカーが、以下の構造：
Ａ−Ｂ−Ｃ
（式中、Ａは：チオール、シラン、ホスホン酸、芳香族分子（例えばピレン）、カルボキシル、アミン、ＮＨＳエステル、マレイミドのクラスからの第１の官能基であり、
Ｂは、以下のクラス：上に記載されたクラスからの低分子量ポリマー、炭化水素（例えばアルキル、アルケニル、アルキニル、フェニル）、酸素含有基（例えばエーテル）、ハロアルカン（例えばクロロ）、窒素含有基（例えばアミド）、イオウ含有基（例えばスルホキシド）、リン含有基、ホウ素含有基、または短い無機ポリマー鎖（例えばＳｉ基部を有する（シロキサン）、Ｐ基部を有する、Ｂ基部を有する、Ｓ基部を有する）からの短い有機鎖であり、および
Ｃは、カルボキシル、アミン、ＮＨＳエステル、マレイミドのクラスからの第２の官能基である）
を有するリンカーである、実施形態６の電極。
８．  前記少なくとも１種の検出剤が、流体試料に含まれる分析対象に特異的に結合する、実施形態１から７のいずれか１つの電極。
９．  前記少なくとも１種の検出剤が、抗体およびそれらのフラグメント、核酸、アプタマー、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、受容体またはリガンドのタンパク質またはペプチド、および酵素からなる群から選択される、実施形態８の電極。
１０．  少なくとも１種の検出剤のサイズは、検出剤が、塩析効果を媒介することができる少なくとも１種のポリマーにより取り囲まれるようなサイズである、実施形態１から９のいずれか１つの電極。
１１．  前記少なくとも１種の検出剤が、電極の表面にリンカーを通して固定化された、実施形態１から１０のいずれか１つの電極。
１２．  前記リンカーが、請求項７で定義されたリンカーである、実施形態１１の電極。
１３．  前記リンカーが、０．０１から５ｋＤａの間、０．０１から１．０ｋＤａの間、０．０１から０．５ｋＤａの間または０．１から０．５ｋＤａの間のＭＷを有する低分子量（ＭＷ）ポリマーからなる群から選択され、前記ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリグリセロール、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリメタクリレートまたは別のアクリル系ポリマー、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）および上で言及されたポリマーのコポリマーである、実施形態１１の電極。
１４．  塩析効果を媒介することができるポリマーが、リンカーポリマーと同一のクラスのポリマーである、実施形態１３の電極。
１５．  塩析効果を媒介することができる少なくとも１種のポリマーと官能化された表面に存在する少なくとも１種の検出剤とのモル比が、１：１００から１００：１の間、１：５０から５０：１の間、１：２０から２０：１の間、１：１０から１０：１の間、１：５から５：１の間、２：１０から８：１の間、３：１０から７：１の間、４：１０から６：１の間または５：１０から５：１の間である、実施形態１から１４のいずれか１つの電極。
１６．  電極上に官能化された表面を製造する方法であって、
ａ）  リンカーおよび塩析効果を媒介することができる少なくとも１種のポリマーを、電極の表面における前記リンカーおよび前記ポリマーの共有結合または非共有結合による固定化を可能にする条件下で、電極に適用するステップと、
ｂ）  前記リンカーおよび前記ポリマーの固定化の後、少なくとも１種の検出剤を、固定化されたリンカーを通した前記少なくとも１種の検出分子の共有結合または非共有結合による電極への連結を可能にする条件下で、電極に適用するステップと
を含み、
上記条件は、前記塩析効果を媒介することができる少なくとも１種のポリマーおよび前記少なくとも１種の検出剤を電極の表面に、検出剤が、電極表面全体にわたって表面積当たり等量で存在し、塩析効果を媒介することができるポリマーが、検出剤の周囲に配置され、
ｉ）  検出剤に近接する流体のイオン強度の低下を可能にし、
ｉｉ）  流体試料に含まれる分析対象と結合することを可能にする
量で存在するようにるように分布させることを可能にする、方法。
１７．  前記リンカーが、０．０１から５ｋＤａの間、０．０１から１．０ｋＤａの間、０．０１から０．５ｋＤａの間または０．１から０．５ｋＤａの間のＭＷを有する低分子量（ＭＷ）ポリマーであり、前記ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリグリセロール、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリメタクリレートまたは別のアクリル系ポリマー、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）または上で言及されたポリマーのコポリマーである、実施形態１６の方法。
１８．  前記塩析効果を媒介することができる少なくとも１種のポリマーが、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリグリセロール、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリメタクリレートまたは別のアクリル系ポリマー、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）および上で言及されたポリマーのコポリマーからなる群から選択される、実施形態１６または１７の方法。
１９．  塩析効果を媒介することができるポリマーが、リンカーポリマーとして同一のクラスのポリマーである、実施形態１７または１８の方法。
２０．  官能化された表面に存在する塩析効果を媒介することができる少なくとも１種のポリマーと少なくとも１種の検出剤とのモル比が、１：１００から１００：１の間、１：５０から５０：１の間、１：２０から２０：１の間、１：１０から１０：１の間、１：５から５：１の間、２：１０から８：１の間、３：１０から７：１の間、４：１０から６：１の間または５：１０から５：１の間である、実施形態１６から１９のいずれか１つの方法。
２１．  実施形態１から１５のいずれか１つの電極または実施形態１６から２０のいずれか１つの方法により得ることができる電極を備える、少なくとも１種の分析対象を決定するための分析対象検出器であって、前記電極が変換器と電気的に接触しているかまたは変換器の一部である分析対象検出器。
２２．  流体試料中の少なくとも１種の分析対象試料を決定するための、実施形態２１の分析対象検出器の使用。
２３．  （ａ）少なくとも１種の分析対象を含むと疑われる流体試料を、請求項１から１５のいずれか１つの電極または請求項２１の分析対象検出器と接触させるステップと、
（ｂ）  前記電極または検出器を用いて電気化学的測定を実行し、それにより少なくとも１種の分析対象が決定されるステップと
を含む、少なくとも１種の分析対象を形成決定する方法。
２４．  前記電気化学的測定が、３０℃と４０℃の間の温度、好ましくは、少なくとも３０℃、少なくとも３２℃、少なくとも３５℃または少なくとも３７℃の温度で実施される、実施形態２３の方法。
２５．  流体中の少なくとも１種の分析対象の前記決定が、診断の目的、環境のモニタリングおよび制御、食品安全性、品質制御または製造プロセスで必要とされる、実施形態２２の使用または実施形態２３もしくは２４の方法。
２６．  前記流体試料が液体または溶解された環境の試料または少なくとも１種の化学化合物の溶液である、実施形態１から１５のいずれか１つの電極、実施形態１６から２０のいずれか１つの方法または実施形態２２の使用または実施形態２３もしくは２４の方法または実施形態２５の使用もしくは方法。
２７．  前記流体が高イオン強度の流体である、実施形態１から１５のいずれか１つの電極、実施形態１６から２０のいずれか１つの方法または実施形態２２の使用または実施形態２３もしくは２４の方法、または実施形態２５もしくは２６の使用もしくは方法。
２８．  前記流体が体液である、実施形態２７の電極、方法または使用。
２８．  前記体液が、血液、血漿、血清または任意のそれらの分画、唾液、涙液、粘液、リンパ、脳脊髄液、尿、糞便、汗、精液、滑液の流体からなる群から選択される、実施形態２８の電極、方法または使用。
【００７０】
本明細書で引用されて全ての参考文献は、それらの全体の開示内容および本明細書で特に言及された開示内容に関して引用により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１ａ】図１は水晶の微量天秤による表面のキャラクタリゼーションを示す図である。ＱＣＭチップの模式図である。
【図１ｂ】異なるオーバートーン（ｎ＝５、７、９）の時間および表面改変に対する典型的な周波数および損失の変化を示す一組の代表的データである：ｄｓＤＮＡ。一般的に、分子が吸着すると周波数は減少し、一方、損失は増大する。
【図１ｃ】異なるオーバートーン（ｎ＝５、７、９）の時間および表面改変に対する典型的な周波数および損失の変化を示す一組の代表的データである：ＰＥＧ。一般的に、分子が吸着すると周波数は減少し、一方、損失は増大する。
【図１ｄ】異なるオーバートーン（ｎ＝５、７、９）の時間および表面改変に対する典型的な周波数および損失の変化を示す一組の代表的データである：両方の混合物。一般的に、分子が吸着すると周波数は減少し、一方、損失は増大する。
【図１ｅ】少なくとも３個のチップから得られた損失および周波数の変化のまとめである。損失の増大は、ＰＥＧについて３×を超えて強く、その理由は、それがＤＮＡより軟らかいからである（ｅ）。このことは、ＰＥＧで改変された表面についてのオーバートーンの「拡大」としても見られる（ｆ）。
【図１ｆ】少なくとも３個のチップから得られた損失および周波数の変化のまとめである。損失の増大は、ＰＥＧについて３×を超えて強く、その理由は、それがＤＮＡより軟らかいからである（ｅ）。このことは、ＰＥＧで改変された表面についてのオーバートーンの「拡大」としても見られる（ｆ）。
【図２ａ】図２はＦＥＴ測定を示す図である。空間的に分離された市販のＭＯＳＦＥＴに接続されたＱＣＭチップの金表面を有する、拡張ゲートＦＥＴ構成の模式図である。
【図２ｂ】異なる表面を使用して異なる濃度のＰＢＳ緩衝液で記録された典型的な移動曲線である：裸金（ｂ）。デルタＶは、非特異的なイオン吸着に起因して金でより正になる（バックグラウンド）。表面上にＤＮＡがあると、ＤＮＡ遮蔽の効果が重ね合わされ、その結果、正の値へのシフトがそれほど大きくなくなる。それと反対の傾向が混合物層について観察される。
【図２ｃ】異なる表面を使用して異なる濃度のＰＢＳ緩衝液で記録された典型的な移動曲線である：ｄｓＤＮＡ（ｃ）。デルタＶは、非特異的なイオン吸着に起因して金でより正になる（バックグラウンド）。表面上にＤＮＡがあると、ＤＮＡ遮蔽の効果が重ね合わされ、その結果、正の値へのシフトがそれほど大きくなくなる。それと反対の傾向が混合物層について観察される。
【図２ｄ】異なる表面を使用して異なる濃度のＰＢＳ緩衝液で記録された典型的な移動曲線である：（ｄ）３種の異なる表面についてのＰＢＳ濃度に対するポテンシャル変化を示す図である。デルタＶは、非特異的なイオン吸着に起因して金でより正になる（バックグラウンド）。表面上にＤＮＡがあると、ＤＮＡ遮蔽の効果が重ね合わされ、その結果、正の値へのシフトがそれほど大きくなくなる。それと反対の傾向が混合物層について観察される。
【図２ｅ】異なる表面を使用して異なる濃度のＰＢＳ緩衝液で記録された典型的な移動曲線である：ＤＮＡ＋ＰＥＧ混合物（ｅ）。デルタＶは、非特異的なイオン吸着に起因して金でより正になる（バックグラウンド）。表面上にＤＮＡがあると、ＤＮＡ遮蔽の効果が重ね合わされ、その結果、正の値へのシフトがそれほど大きくなくなる。それと反対の傾向が混合物層について観察される。
【図３】図３（ａ）は、図２から金のバックグラウンドを差し引いた後のＦＥＴデータを示す図である。ＰＢＳ濃度を増大させると、ポテンシャルはより負の値へシフトするが、その理由は、電解質イオンによるＤＮＡ遮蔽がより強いからである。明確なシグナルの増強が、裸のＤＮＡに対するＰＥＧ＋ＤＮＡ混合物について観察される。図３（ｂ）は、提案されたモデルを示す図である。ＰＥＧの添加は、効果的なデバイ長を増大させる。結果として、ＤＮＡの長い方の部分は、より大きいシグナルを生ずる所与のイオン強度で見ることができる。
【図４Ａ】測定セットアップの概略図である。半導性ＣＮＴ（炭素ナノチューブ）ネットワークが、互いにかみ合ったＡｕ電極間で整列されている（チャンネル長さ＝２０μｍ、チャンネル幅＝２ｍｍ）。それに加えて、漏洩電流を避けるために、接触はＳＵ−８フォトレジストの皮膜で保護されている。ＳＵ−８は、ＩＢＭにより独創的に開発され、特許化された（米国特許第４８８２２４５号）ＥＰＯＮ  ＳＵ−８エポキシ樹脂（Ｓｈｅｌｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌから）を主体とする、ネガのエポキシタイプの近紫外フォトレジストである。異なる液体を感知表面に提供するために、ＰＴＦＥチューブを配管された微小流体工学ＰＤＭＳチャンバーが使用された。Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極が微小流体工学チャンネルの中央に置かれた。
【図４Ｂ】測定セットアップの写真である。
【図４Ｃ】両方の分極方向における典型的な移動曲線である。ヒステリシスは極めて小さい。
【図４Ｄ】電場に整列したＣＮＴネットワークのＡＦＭ像である。上部および下部にある水平な細長い線条は、ＣＮＴを整列するために使用された金電極である。後で、同一の電極が電気測定のための電源およびドレイン接点として使用された。
【図５Ａ】ペグ化された（Ａ〜Ｃ）およびペグ化されていない（Ｄ〜Ｆ）ＣＮＴ  ＦＥＴを用いるＧＦＰ検出の比較を示す図である。ＣＮＴの表面は、ピレン酪酸（ＰＢＡ）のピレンポリ（エチレングリコール）（Ａ）との混合物またはＰＢＡのみ（Ｄ）のいずれかで改変された。次に、緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）に特異的なラクダ科の動物のナノボディ（ＶＨＨ）が、両方の表面に固定化され、ＧＦＰ溶液に暴露されてＶＨＨ−ＧＦＰ結合を推定した。ＢおよびＥは、１００ｍＭのトリス緩衝液中の異なる濃度のＧＦＰで測定された移動曲線を示す。右へのシフトは、両方の場合に見られるが、ペグ化された場合の方が応答が強い（Ｂ）。ＣおよびＦは、１ｍＭおよび１００ｍＭのイオン強度の溶液におけるＧＦＰ濃度ＣＧＦＰの関数として得られたポテンシャルシフトΔＶのまとめである。ΔＶは、定常ＩＳＤ値で読み取られ、図Ｂ、Ｅにおける水平な線により示されている。Ｃにおけるシグナルは、Ｆにおけるシグナルより最大３×大きく、そのことは、ＰＥＧによる局所緩衝希釈に帰せられる。
【図５Ｂ】ペグ化された（Ａ〜Ｃ）およびペグ化されていない（Ｄ〜Ｆ）ＣＮＴ  ＦＥＴを用いるＧＦＰ検出の比較を示す図である。ＣＮＴの表面は、ピレン酪酸（ＰＢＡ）のピレンポリ（エチレングリコール）（Ａ）との混合物またはＰＢＡのみ（Ｄ）のいずれかで改変された。次に、緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）に特異的なラクダ科の動物のナノボディ（ＶＨＨ）が、両方の表面に固定化され、ＧＦＰ溶液に暴露されてＶＨＨ−ＧＦＰ結合を推定した。ＢおよびＥは、１００ｍＭのトリス緩衝液中の異なる濃度のＧＦＰで測定された移動曲線を示す。右へのシフトは、両方の場合に見られるが、ペグ化された場合の方が応答が強い（Ｂ）。ＣおよびＦは、１ｍＭおよび１００ｍＭのイオン強度の溶液におけるＧＦＰ濃度ＣＧＦＰの関数として得られたポテンシャルシフトΔＶのまとめである。ΔＶは、定常ＩＳＤ値で読み取られ、図Ｂ、Ｅにおける水平な線により示されている。Ｃにおけるシグナルは、Ｆにおけるシグナルより最大３×大きく、そのことは、ＰＥＧによる局所緩衝希釈に帰せられる。
【図５Ｃ】ペグ化された（Ａ〜Ｃ）およびペグ化されていない（Ｄ〜Ｆ）ＣＮＴ  ＦＥＴを用いるＧＦＰ検出の比較を示す図である。ＣＮＴの表面は、ピレン酪酸（ＰＢＡ）のピレンポリ（エチレングリコール）（Ａ）との混合物またはＰＢＡのみ（Ｄ）のいずれかで改変された。次に、緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）に特異的なラクダ科の動物のナノボディ（ＶＨＨ）が、両方の表面に固定化され、ＧＦＰ溶液に暴露されてＶＨＨ−ＧＦＰ結合を推定した。ＢおよびＥは、１００ｍＭのトリス緩衝液中の異なる濃度のＧＦＰで測定された移動曲線を示す。右へのシフトは、両方の場合に見られるが、ペグ化された場合の方が応答が強い（Ｂ）。ＣおよびＦは、１ｍＭおよび１００ｍＭのイオン強度の溶液におけるＧＦＰ濃度ＣＧＦＰの関数として得られたポテンシャルシフトΔＶのまとめである。ΔＶは、定常ＩＳＤ値で読み取られ、図Ｂ、Ｅにおける水平な線により示されている。Ｃにおけるシグナルは、Ｆにおけるシグナルより最大３×大きく、そのことは、ＰＥＧによる局所緩衝希釈に帰せられる。
【図５Ｄ】ペグ化された（Ａ〜Ｃ）およびペグ化されていない（Ｄ〜Ｆ）ＣＮＴ  ＦＥＴを用いるＧＦＰ検出の比較を示す図である。ＣＮＴの表面は、ピレン酪酸（ＰＢＡ）のピレンポリ（エチレングリコール）（Ａ）との混合物またはＰＢＡのみ（Ｄ）のいずれかで改変された。次に、緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）に特異的なラクダ科の動物のナノボディ（ＶＨＨ）が、両方の表面に固定化され、ＧＦＰ溶液に暴露されてＶＨＨ−ＧＦＰ結合を推定した。ＢおよびＥは、１００ｍＭのトリス緩衝液中の異なる濃度のＧＦＰで測定された移動曲線を示す。右へのシフトは、両方の場合に見られるが、ペグ化された場合の方が応答が強い（Ｂ）。ＣおよびＦは、１ｍＭおよび１００ｍＭのイオン強度の溶液におけるＧＦＰ濃度ＣＧＦＰの関数として得られたポテンシャルシフトΔＶのまとめである。ΔＶは、定常ＩＳＤ値で読み取られ、図Ｂ、Ｅにおける水平な線により示されている。Ｃにおけるシグナルは、Ｆにおけるシグナルより最大３×大きく、そのことは、ＰＥＧによる局所緩衝希釈に帰せられる。
【図５Ｅ】ペグ化された（Ａ〜Ｃ）およびペグ化されていない（Ｄ〜Ｆ）ＣＮＴ  ＦＥＴを用いるＧＦＰ検出の比較を示す図である。ＣＮＴの表面は、ピレン酪酸（ＰＢＡ）のピレンポリ（エチレングリコール）（Ａ）との混合物またはＰＢＡのみ（Ｄ）のいずれかで改変された。次に、緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）に特異的なラクダ科の動物のナノボディ（ＶＨＨ）が、両方の表面に固定化され、ＧＦＰ溶液に暴露されてＶＨＨ−ＧＦＰ結合を推定した。ＢおよびＥは、１００ｍＭのトリス緩衝液中の異なる濃度のＧＦＰで測定された移動曲線を示す。右へのシフトは、両方の場合に見られるが、ペグ化された場合の方が応答が強い（Ｂ）。ＣおよびＦは、１ｍＭおよび１００ｍＭのイオン強度の溶液におけるＧＦＰ濃度ＣＧＦＰの関数として得られたポテンシャルシフトΔＶのまとめである。ΔＶは、定常ＩＳＤ値で読み取られ、図Ｂ、Ｅにおける水平な線により示されている。Ｃにおけるシグナルは、Ｆにおけるシグナルより最大３×大きく、そのことは、ＰＥＧによる局所緩衝希釈に帰せられる。
【図５Ｆ】ペグ化された（Ａ〜Ｃ）およびペグ化されていない（Ｄ〜Ｆ）ＣＮＴ  ＦＥＴを用いるＧＦＰ検出の比較を示す図である。ＣＮＴの表面は、ピレン酪酸（ＰＢＡ）のピレンポリ（エチレングリコール）（Ａ）との混合物またはＰＢＡのみ（Ｄ）のいずれかで改変された。次に、緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）に特異的なラクダ科の動物のナノボディ（ＶＨＨ）が、両方の表面に固定化され、ＧＦＰ溶液に暴露されてＶＨＨ−ＧＦＰ結合を推定した。ＢおよびＥは、１００ｍＭのトリス緩衝液中の異なる濃度のＧＦＰで測定された移動曲線を示す。右へのシフトは、両方の場合に見られるが、ペグ化された場合の方が応答が強い（Ｂ）。ＣおよびＦは、１ｍＭおよび１００ｍＭのイオン強度の溶液におけるＧＦＰ濃度ＣＧＦＰの関数として得られたポテンシャルシフトΔＶのまとめである。ΔＶは、定常ＩＳＤ値で読み取られ、図Ｂ、Ｅにおける水平な線により示されている。Ｃにおけるシグナルは、Ｆにおけるシグナルより最大３×大きく、そのことは、ＰＥＧによる局所緩衝希釈に帰せられる。
【図６Ａ】金の上の２つの異なる表面改変が、１０ｋＤａのＰＥＧが有り（Ａ）と無し（Ｄ）で比較された。両方の表面が、短い０．５ｋＤａのＰＥＧリンカーを使用して抗ＴＳＨ抗体フラグメントで官能化された。１０ｍＭの緩衝液中における異なるＢＳＡおよびＴＳＨの濃度について、トランジスタ移動曲線が、ＰＥＧが付いた、および付いていない表面について、それぞれ（Ｂ）および（Ｅ）でプロットされている。測定された電圧シフトは、（Ｃ）ＰＥＧ付きの表面および（Ｆ）ＰＥＧ無しの表面について示されている。シフトは、緩衝液中で１０ｍＭ（三角）および１５０ｍＭ（正方形）のＴＳＨ（中実の記号）またはＢＳＡ（中空の記号）の濃度に対してプロットされている。明確なシグナル増強が、ＰＥＧでは、１５０ｍＭの緩衝液中でさえ有意の応答で観察される。ＢＳＡの非特異的吸着の寄与は、全ての場合に小さい。
【図６Ｂ】金の上の２つの異なる表面改変が、１０ｋＤａのＰＥＧが有り（Ａ）と無し（Ｄ）で比較された。両方の表面が、短い０．５ｋＤａのＰＥＧリンカーを使用して抗ＴＳＨ抗体フラグメントで官能化された。１０ｍＭの緩衝液中における異なるＢＳＡおよびＴＳＨの濃度について、トランジスタ移動曲線が、ＰＥＧが付いた、および付いていない表面について、それぞれ（Ｂ）および（Ｅ）でプロットされている。測定された電圧シフトは、（Ｃ）ＰＥＧ付きの表面および（Ｆ）ＰＥＧ無しの表面について示されている。シフトは、緩衝液中で１０ｍＭ（三角）および１５０ｍＭ（正方形）のＴＳＨ（中実の記号）またはＢＳＡ（中空の記号）の濃度に対してプロットされている。明確なシグナル増強が、ＰＥＧでは、１５０ｍＭの緩衝液中でさえ有意の応答で観察される。ＢＳＡの非特異的吸着の寄与は、全ての場合に小さい。
【図６Ｃ】金の上の２つの異なる表面改変が、１０ｋＤａのＰＥＧが有り（Ａ）と無し（Ｄ）で比較された。両方の表面が、短い０．５ｋＤａのＰＥＧリンカーを使用して抗ＴＳＨ抗体フラグメントで官能化された。１０ｍＭの緩衝液中における異なるＢＳＡおよびＴＳＨの濃度について、トランジスタ移動曲線が、ＰＥＧが付いた、および付いていない表面について、それぞれ（Ｂ）および（Ｅ）でプロットされている。測定された電圧シフトは、（Ｃ）ＰＥＧ付きの表面および（Ｆ）ＰＥＧ無しの表面について示されている。シフトは、緩衝液中で１０ｍＭ（三角）および１５０ｍＭ（正方形）のＴＳＨ（中実の記号）またはＢＳＡ（中空の記号）の濃度に対してプロットされている。明確なシグナル増強が、ＰＥＧでは、１５０ｍＭの緩衝液中でさえ有意の応答で観察される。ＢＳＡの非特異的吸着の寄与は、全ての場合に小さい。
【図６Ｄ】金の上の２つの異なる表面改変が、１０ｋＤａのＰＥＧが有り（Ａ）と無し（Ｄ）で比較された。両方の表面が、短い０．５ｋＤａのＰＥＧリンカーを使用して抗ＴＳＨ抗体フラグメントで官能化された。１０ｍＭの緩衝液中における異なるＢＳＡおよびＴＳＨの濃度について、トランジスタ移動曲線が、ＰＥＧが付いた、および付いていない表面について、それぞれ（Ｂ）および（Ｅ）でプロットされている。測定された電圧シフトは、（Ｃ）ＰＥＧ付きの表面および（Ｆ）ＰＥＧ無しの表面について示されている。シフトは、緩衝液中で１０ｍＭ（三角）および１５０ｍＭ（正方形）のＴＳＨ（中実の記号）またはＢＳＡ（中空の記号）の濃度に対してプロットされている。明確なシグナル増強が、ＰＥＧでは、１５０ｍＭの緩衝液中でさえ有意の応答で観察される。ＢＳＡの非特異的吸着の寄与は、全ての場合に小さい。
【図６Ｅ】金の上の２つの異なる表面改変が、１０ｋＤａのＰＥＧが有り（Ａ）と無し（Ｄ）で比較された。両方の表面が、短い０．５ｋＤａのＰＥＧリンカーを使用して抗ＴＳＨ抗体フラグメントで官能化された。１０ｍＭの緩衝液中における異なるＢＳＡおよびＴＳＨの濃度について、トランジスタ移動曲線が、ＰＥＧが付いた、および付いていない表面について、それぞれ（Ｂ）および（Ｅ）でプロットされている。測定された電圧シフトは、（Ｃ）ＰＥＧ付きの表面および（Ｆ）ＰＥＧ無しの表面について示されている。シフトは、緩衝液中で１０ｍＭ（三角）および１５０ｍＭ（正方形）のＴＳＨ（中実の記号）またはＢＳＡ（中空の記号）の濃度に対してプロットされている。明確なシグナル増強が、ＰＥＧでは、１５０ｍＭの緩衝液中でさえ有意の応答で観察される。ＢＳＡの非特異的吸着の寄与は、全ての場合に小さい。
【図６Ｆ】金の上の２つの異なる表面改変が、１０ｋＤａのＰＥＧが有り（Ａ）と無し（Ｄ）で比較された。両方の表面が、短い０．５ｋＤａのＰＥＧリンカーを使用して抗ＴＳＨ抗体フラグメントで官能化された。１０ｍＭの緩衝液中における異なるＢＳＡおよびＴＳＨの濃度について、トランジスタ移動曲線が、ＰＥＧが付いた、および付いていない表面について、それぞれ（Ｂ）および（Ｅ）でプロットされている。測定された電圧シフトは、（Ｃ）ＰＥＧ付きの表面および（Ｆ）ＰＥＧ無しの表面について示されている。シフトは、緩衝液中で１０ｍＭ（三角）および１５０ｍＭ（正方形）のＴＳＨ（中実の記号）またはＢＳＡ（中空の記号）の濃度に対してプロットされている。明確なシグナル増強が、ＰＥＧでは、１５０ｍＭの緩衝液中でさえ有意の応答で観察される。ＢＳＡの非特異的吸着の寄与は、全ての場合に小さい。
【図７】２１℃および３７℃におけるウマ血清中のＴＳＨ較正曲線の測定を示す図である。誤差バーは、４個の異なるチップからの標準偏差を表す。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００７２】
本発明が、実施例により説明されるであろう。しかしながら、実施例は、本発明を単に例示するのみであり、決して、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【００７３】
実施例１
ポリエチレングリコールは、トランジスタに基づくＤＮＡ検出において、デバイ遮蔽の効果を低下させる。
【００７４】
ＱＣＭ−Ｄ測定：それらは、Ｂｉｏｌｉｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＡＢ（スエーデン、ストックホルム）のＱ−ｓｅｎｓｅ  Ｅ４で、それらの電気化学モジュールを使用して実施した。ＱＣＭ−Ｄは、４．９５ＭＨｚ、金コート、ＱＣＭ−Ｄセンサ、異なるオーバートーンで、オシレータ周波数（Δｆ）およびエネルギー損失（ΔＤ）におけるシフトを同時にモニターする。さらに、Ｑ−ｓｅｎｓｅの電気化学モジュールは、同時のＦＥＴ測定を可能にする。使用に先立って、金コートセンサは、ＵＶ／オゾン処理で１０分間清浄化して、次にＨ２Ｏ２（３０％）１部＋ＮＨ４ＯＨ  １部＋脱イオン（ＤＩ）水５部を含有する溶液中に８０℃で１０分間浸漬した。次に、センサは、ＤＩ水で徹底的に洗浄してＮ２ガスで乾燥した。全ての実験は、新鮮に清浄化されたセンサを使用して実施した。
【００７５】
拡張ゲートＦＥＴ測定：ＱＣＭＤ実験で使用された電気化学モジュールは、金コートセンサを、市販のＭＯＳＦＥＴのゲート端子に電気的に接続することを可能にした。Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極（ＷＰＩ、Ｄｒｉ−ＲＥＦ（商標）、特注された長さ）は、排出流チャンネル中のセンサ表面付近に置かれる。電気測定は、二重チャンネルソースメータ（Ｋｅｉｔｈｌｅｙ  ２６３６Ｂ）を使用して実行した。
【００７６】
ｄｓＤＮＡの調製および固定化：相補性一本鎖ＤＮＡ（ｉ）：５’−ＣＡＡＴＧＣＡＧＡＴＡＣＡＣＴＴＴＴＴＴ−Ｃ３Ｈ６−ＳＨ−３’（ｉｉ）：５’−ＡＧＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＴＴＧ−３’は、ＳＴＡＢ  ｖｉｄａ（ポルトガル）から購入した。ストランド（ｉ）は、金表面における固定化を容易にするためにチオール化される。平均分子量が１０ｋＤａのチオール化されたメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ−ＳＨ）を、Ｎａｎｏｃｓ、Ｉｎｃ．（Ｂｏｓｔｏｎ、マサチューセッツ州）から購入した。全ての他の試薬は、特に断らない限り、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
【００７７】
（Ａ）ｄｓＤＮＡ、（Ｂ）ＰＥＧ、および（Ｃ）混合されたｄｓＤＮＡ−ＰＥＧ層の形成：全ての３つの異なる表面の形成をＱＣＭ−ＤおよびＦＥＴ測定の両方によりモニターした。チオール化された二重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）は、ストランド（ｉ）および（ｉｉ）の等モルの溶液（−２０℃で貯蔵された１００μＭの貯蔵溶液の各々１０μＬ）を、全ての実験に先立って３０分間１００ｍＭ  ＰＢＳ中、室温で混合することにより形成した。チオール化されたｍＰＥＧ溶液（５ｍＭ）は、全ての実験に先立ってＰＥＧ粉末を水に溶解することにより調製した。（Ａ）ｄｓＤＮＡＳＡＭ：ｄｓＤＮＡの単層は、金コートＱＣＭ−Ｄセンサ上に、緩衝液Ａ（１０ｍＭ  トリス  ｐＨ７中に１Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中の１μＭのチオール化されたｄｓＤＮＡを、１００μＬ／分で１０分間注入して、次に１時間インキュベートすることにより形成した。次に表面を緩衝液Ａで１０分間１００μＬ／分で洗浄した。過剰のｄｓＤＮＡを洗い落とした後、異なる濃度のＰＢＳ溶液（２００ｍＭ、１００ｍＭ、５０ｍＭ、１０ｍＭ、および１ｍＭ）を、チャンバー中に注入して（１００μＬ／分で１０分間）、ＦＥＴ応答を安定なシグナルが得られるまで記録した。（Ｂ）ＰＥＧ  ＳＡＭ：１μＭのチオール化されたｍＰＥＧ（平均ＭＷ＝１０ｋＤａ）が注入されてＰＥＧ単層を形成したことを除いて、Ａと同様である。（Ｃ）混合ｄｓＤＮＡ−ＰＥＧ層：ｄｓＤＮＡの単層がセンサ表面を１μＭのチオール化されたｄｓＤＮＡと共にインキュベートすることにより先ず形成された。その後、過剰のｄｓＤＮＡを、緩衝液Ａを１００μＬ／分で１０分間流すことにより洗い落とした。ＰＥＧを、ｄｓＤＮＡの単層に緩衝液Ａ液中１μＭのｍＰＥＧ−ＳＨをチャンバーに注入することにより添加して、２０分間インキュベートした後、結合しなかったＰＥＧ分子を、１００μＬ／分で流れる緩衝液Ａにより１０分洗い落とした。ＡおよびＢと同様に、次に、異なる濃度のＰＢＳ溶液をチャンバーに注入して、異なるイオン強度条件下における混合された層のＦＥＴ応答をモニターした。
【００７８】
表面のキャラクタリゼーション：金コート水晶上におけるｄｓＤＮＡ、ＰＥＧの単層、およびｄｓＤＮＡ＋ＰＥＧ混合層の形成を、損失を伴う水晶マイクロバランス（ＱＣＭＤ）を使用してキャラクタライズした。ＱＣＭＤで、結晶の表面における質量吸着に対する応答として、振動する圧電性の水晶の共鳴周波数および損失エネルギーにおける変化を測定する（図１ａ）。次に、これらを使用して粘弾性の性質ならびに吸着された層の密度、質量および厚さを得る。図１ｂ〜ｄは、金コート水晶上に、（ｂ）ｄｓＤＮＡ、（ｃ）ＰＥＧ、および（ｄ）ｄｓＤＮＡ＋ＰＥＧ混合層が固定化されたときの、異なるオーバートーン（ｎ＝３（図１ｂ〜ｄで示していない）、５、７、９）からの、共鳴周波数における変化Δｆ、および損失係数における変化ΔＤを示す。各層について３回の別個の試行から計算された平均ΔＤおよびΔｆが、棒グラフ図１ｅおよびｆにそれぞれ示されている。ＰＥＧ（─Δｆ＝３５〜４５Ｈｚ）について検出されたΔｆは、ｄｓＤＮＡのΔｆの２倍未満（─Δｆ＝約２５Ｈｚ）であるのに、損失変化は約６×より大きいことは注目に値する。これは、ｄｓＤＮＡは表面でより剛直な層のように挙動するが、それに対してＰＥＧは、固定化されたときに高度に水和されたブラシ様構造を形成することが知られているという事実と矛盾しない。このことは、全てのオーバートーンが同じ大きさで変化するｄｓＤＮＡと比較して、ＰＥＧが固定化されたときのΔｆおよびΔＤの拡大でも明らかである。
【００７９】
フォークト粘弾性のモデル化が、ＱＣＭＤデータを全て３つの異なる層に適合させて、形成された層の物理的性質を記述するパラメーターを得るために使用される。適合されたパラメーターを表１でリストにしてある。
【００８０】
【表２】
0006921217.tif 000004
【００８１】
ｄｓＤＮＡの測定された厚さは、１Ｍ  ＮａＣｌ中で約５ｎｍであり、それは、１５塩基対のｄｓＤＮＡ（５ｎｍ）にリンカー（１ｎｍ）を加えた予想の長さに近い。これは、ｄｓＤＮＡ分子が表面に垂直に固定化されており、平坦に横たわっていないことを示す。ＰＥＧ（１０ｋＤａ）層は、１μＭのＰＥＧが固定化のために使用された場合に約９ｎｍであり、より厚い。粘弾性モデル化の結果も、ｄｓＤＮＡの剪断粘度および剪断モジュラス（それぞれ、４．７＋／−０．７ｍＰａ・ｓおよび１．３＋／−０．６ＭＰａ）が、両方共ＰＥＧ（それぞれ、１．８＋／−０．３ｍＰａ・ｓおよび０．２６＋／−０．０５ＭＰａ）よりも高いことを示す。これらの粘弾性パラメーターは、金の上のｄｓＤＮＡがＰＥＧと比較してより剛直な層を形成することを示唆する。本発明者らの結果は、ｄｓＤＮＡはかなり剛直なフィルムを形成するが、ＰＥＧは表面で軟らかいブラシ様の構造を形成することが知られていることを示す以前の研究と一致する。
【００８２】
２つの構成要素が相次いで添加された混合層で、各ステップのモデル化は、独立に行われ得る。表１に示されたように、ｄｓＤＮＡが最初に固定化されたので、適合するパラメーターは、ｄｓＤＮＡのみの層と整合する。これらの結果に基づいて、被われた表面は６０％であると推定される。次に、ＰＥＧが添加されたが、それは電気的に中性であり、ｄｓＤＮＡ分子間の空いている場所に結合することができた可能性がある。ＰＥＧが添加されたときの損失および周波数の両方における変化が、ＰＥＧは成功裏にｄｓＤＮＡ層に添加されて混合されたフィルムを生じたことを証明した。
【００８３】
ＦＥＴ測定：全ての３つの異なる表面をキャラクタライズするために使用されたＱＣＭＤデバイスは、電気化学モジュールに付属して、複数のＦＥＴ測定が、拡張ゲートＦＥＴ（ＥＧＦＥＴ）構成を使用して、同一チップで同時に行われることを可能にする。この特定のＥＧＦＥＴのセットアップで、ＱＣＭチップの金の表面は、市販のＭＯＳＦＥＴのゲート端子に電気的に接続されている（図２ａ）。生物学的溶液を感知する表面は、ＭＯＳＦＥＴ読み取りトランジスタから分離されている。これは、従来のイオン感応性ＦＥＴの電荷感度を保持しながら、感知チップの複雑性を減少させて、読み取りトランジスタを溶液との接触から保護する（Ｔａｒａｓｏｖ  ２０１６年、２Ｄ  Ｍａｔｅｒ．２：０４４００８；Ｔａｒａｓｏｖ  ２０１６年、Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．７９巻：６６９頁）。ＥＧＦＥＴ測定によるｄｓＤＮＡのデバイ遮蔽に対するＰＥＧの効果を研究するために、金に固定化されたｄｓＤＮＡから得られた移動曲線を、ｄｓＤＮＡ＋ＰＥＧ混合層と、異なるイオン強度溶液（１〜２００ｍＭ  ＰＢＳ）下で比較した（図２）。陰性対照として、イオン強度を変えて、金のみの表面の応答も測定した（図２ｂ）。ＰＢＳ濃度を増大させると、ＭＯＳＦＥＴの移動曲線はより正の値にシフトする（図２ｂおよび２ｄ）。Ｃｌ−イオンおよび金の場合に以前観察されたように、この正のポテンシャルのシフトは金表面に吸着する陰イオンの検出を意味する（Ｔａｒａｓｏｖ  ２０１２年、ＡＣＳ  Ｎａｎｏ  ６巻：９２９１頁）。
【００８４】
ｄｓＤＮＡの存在下で、ＰＢＳ濃度を増大させると、移動曲線は、さらに右にシフトするが、Ａｕのみの表面と比較して程度は小さい（図２ｃおよび図２ｄ）。金に対するアニオン吸着の非存在では、増大するイオン強度のｄｓＤＮＡ検出に対する予想される効果は、ポテンシャルをより負の値の方にシフトさせるはずである。しかしながら、このバックグラウンドのアニオン吸着のため、イオン強度を増大させると、正のポテンシャルシフトがやはり観察される。それ故、ｄｓＤＮＡ測定に対するイオン遮蔽の効果を見るために、異なるＰＢＳ濃度下における差分シグナル（ΔＶ＝ΔＶｄｓＤＮＡ−ΔＶＡｕ−ｏｎｌｙ）を取得した。他方、混合物層では、ＰＥＧの存在は、ｄｓＤＮＡにおける負電荷の検出をより明白にした。このとき、ＰＢＳ濃度の増大はポテンシャルを左にシフトさせる（図２ｅおよび図２ｄ）。バックグラウンドを差し引くと、シグナルにおけるシフトは、それ故、ＰＥＧの存在で非存在よりも大きい。
【００８５】
これらのトランジスタに基づく測定は、ＰＥＧがセンサ表面に存在するならば、２００ｍＭ  ＰＢＳにおいてさえ、ｄｓＤＮＡから検出されるシグナルの増強があることを示す。これは、ＰＥＧが、本発明者らの実験で使用された濃度で、生理学的塩濃度下においてさえデバイ長を増大させることを示す。これは、ＰＥＧが、特定の水性塩溶液中で示す塩析効果に起因し得、水＋ＰＥＧ＋塩の三元システムの組成空間の一部にわたる、ＰＥＧに富む相と塩に富む相の分離により特徴づけられる。イオンを「塩析」するＰＥＧのこの傾向が、ＰＥＧ分子のすぐ周囲の領域における効果的なイオン濃度の低下の背後の理由であると考えられる。この「局所的に脱塩された」領域は、それ故、見かけのイオン強度に関して比較的長いデバイ長を示すであろう。
【００８６】
図３ａは、センサ表面でＰＥＧがｄｓＤＮＡと混合されたときに、シグナル増強が達成されることを示す。下向きおよび上向きを指す三角は、ＰＥＧの非存在および存在のそれぞれにおける、ｄｓＤＮＡのＦＥＴシグナルのイオン強度依存性である。これは、裸金で測定されたバックグラウンドシグナルを差し引くことにより規格化された、図２ｄに示されたものと同一のデータである。このデータは、シグナルが、ＰＥＧが存在する（混合され）場合に、少なくとも３〜４×増強されることを示す。図３ｂに図式的に示された塩希釈モデルを用いて、本発明者らは、次に、ＰＥＧの非存在および存在下におけるｄｓＤＮＡ検出についての規格化されたデータを比較した。図３中の上の破線は、全イオン強度に関するデバイ長依存性を示す。ＰＥＧがｄｓＤＮＡの近傍におけるイオンの濃度を低下させることを考慮して、本発明者らは、一連のイオン強度希釈後に予想されるシグナルを計算した。少なくとも１０×希釈に達したときに予想されるシグナルは（図３ａ、下の断続線）、ＰＥＧの存在下で得られたシグナル（図３ａ、上向きの三角）と重なる。これは、本発明者らの実験条件で、本発明者らが、ＰＥＧとの混合層中のイオン濃度を少なくとも１０×希釈することを成し遂げることができて、それ故、ｄｓＤＮＡシグナルを少なくとも３×増強することができることを意味する。
【００８７】
ＰＥＧのセンサ表面への添加により、トランジスタに基づくｄｓＤＮＡの検出に対するイオン遮蔽の効果が緩和され得ることが示された。ＥＧＦＥＴを使用する金電極で行われる測定は、高イオン強度溶液下においてさえ（２００ｍＭ  ＰＢＳまでの）、ＰＥＧがｄｓＤＮＡからのシグナルを少なくとも３×増強することを示す。イオン遮蔽のこの低下は、その直ぐ周囲の領域でイオン種を排除するＰＥＧの傾向（塩析効果）に帰することができる。これは、センサ表面に存在する十分なＰＥＧ分子で、ＰＥＧ層内に局所的に脱塩された領域が創り出されることを意味する。したがって、高イオン強度溶液の存在下においてさえ、センサ表面のＰＥＧ層内の領域は、ＰＥＧ層より上の領域と比較して効果的により低いイオン強度の環境を有する。これは、センサ表面に隣接する領域内のデバイ長を増大させて、それ故、検出の範囲を表面からさらに遠くまで増大させる。
【００８８】
ＰＥＧの適用は、他のタイプのバイオセンサにも同様に拡張され得る。決定的に重要な部分は、表面におけるＰＥＧおよび受容体の量が、受容体の密度および脱塩をもたらす効果を同時に最大化するために、調整されるべきであることである。イオン遮蔽を緩和することに加えて、ＰＥＧは、センサ表面において非特異的相互作用を防止することおよび生体分子をより安定にすることに効果的であることも知られている。これらの全ての利点があるので、トランジスタに基づくバイオセンサの表面におけるＰＥＧの取込みは、ＦＥＴバイオセンサをＰｏＣ適用に向けて押し進めることにと絶大な影響を有し得る。
【００８９】
実施例２
ペグ化された炭素ナノチューブトランジスタをナノボディ受容体と共に使用する、高イオン強度溶液におけるバイオ検出
ＦＥＴに基づくバイオセンサは、感度がよく安定な変換器を大規模に実現可能な製造プロセスで提供する高品質の、選別された半導性炭素ナノチューブネットワークから作製される。組み合わされた表面官能化スキームが、デバイ遮蔽を克服するために提案された：１）分析対象が表面により密に結合することを可能にする受容体として、短いナノボディ（ＶＨＨ）が使用され、２）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）層が添加され、効果的なデバイ長を増大させる。緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）をモデルシステムとして使用して、３倍の増強が高イオン強度溶液においてペグ化された表面で示される。機構は、塩析効果により媒介されるＰＥＧによる局所緩衝希釈の点から説明される。センサは、４桁の大きさを超える動的な範囲でｐＭ以下の検出限界に達する。それに加えて、センサは、追加の表面被覆保護が実行されれば、非特異的吸着からの寄与が無視できて高度に特異的である。
【００９０】
ナノボディの固定化（混合自己集合単層（ＳＡＭ）の形成）：以前記載された、（Ｒｏｔｈｅｒ  ２０１６年、ＡＣＳ  Ａｐｐｌ．Ｍａｔｅｒ．Ｉｎｔｅｒｆ．８巻：５５７１頁）ＣＮＴ  ＦＥＴの製造後、ＣＮＴをエタノールで１時間清浄化して、ＣＮＴ選別プロセスから残ったポリマー／汚染物質を除去した。その後、ＣＮＴ電極を、エタノール中１ｍＭのピレン酪酸（ＰＢＡ、リンカー）＋０．２５ｍＭのピレン−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）で１時間処理した。その後、それを、エタノール、Ｈ２Ｏで簡単にさっと流し洗いしてから、ｐＨ７．４の１００ｍＭ  トリス中に終夜保った。次に、蒸留水でさっと流し洗いした後、１００ｍＭ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）の水溶液をチャンネル中に２０分間送液して表面を活性化した。その後、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）中の１０μＭのＧＦＰ特異的ＶＨＨナノボディまたは１０μＭのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のいずれかを、１時間、特異的および非特異的吸着実験のためにそれぞれ導入した。次に、表面を１００ｍＭ  トリスで１５分間簡単に流し洗いして、残った可能性のある活性部位を不活性化した。最終的に、最適化されたＣＮＴ  ＦＥＴに基づくＧＦＰ感知アッセイの場合に、表面を１００ｍＭ  トリス中の１００ｎＭ  ＢＳＡ溶液に３０分間暴露して非特異的結合を低下させた。
【００９１】
ＧＦＰ結合測定：電極にｐＨ７．４の１ｍＭ  トリス中で特定の濃度の緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）を１５分間流して、３回続けて測定を実施した。その後、電極にｐＨ７．４の１００ｍＭ  トリス中の同一濃度のＧＦＰを１５分間流して、再び、３回続けて測定を実施した。これらの測定および処理を、０から１００ｎＭＧＦＰの全濃度範囲について繰り返した。
【００９２】
ＣＮＴ  ＦＥＴを図４Ａで示された液体ゲート構成で操作した。測定セットアップの写真を図４Ｂに示す。ＣＮＴは、以前発行されたプロトコル（Ｒｏｔｈｅｒ  ２０１６年、ＡＣＳ  Ａｐｐｌ．Ｍａｔｅｒ．Ｉｎｔｅｒｆ．８巻：５５７１頁）に従って、ポリマーで選別されて電場で整列された。典型的なトランジスタ移動曲線を図４Ｃで示す。全てのデバイスが、ヒステリシスの小さい二極性の挙動、１０４を超える電流のオンオフ比、および１１０ｍＶ／ｄｅｃ未満の急激な閾値以下の振動を示した。典型的なデバイスのＡＦＭ像が図４Ｄに示される。
【００９３】
ＧＦＰ特異的ＶＨＨを、ピレン酪酸（ＰＢＡ）をリンカー分子として使用して炭素ナノチューブにアミノ基で結合した。ＰＥＧのシグナルに対する効果を研究するために、ＶＨＨを、ＰＢＡ＋ＰＥＧコート表面（図５Ａ）およびＰＢＡのみで改変された対照ＣＮＴ試料（図５Ｄ）の両方に固定化した。次に、両方のセンサ表面を、１ｍＭまたは１００ｍＭのいずれかのトリス緩衝液に溶解された種々のＧＦＰ濃度に暴露した。測定を、ペグ化表面について図５Ｂ、Ｃに、および非ペグ化表面について図５Ｅ、Ｆ示す。両方の場合に、移動曲線は、増大するＧＦＰ濃度に応答してより正の値にさらにシフトして、ペグ化された表面がより強く反応する（図５Ｂ、Ｅ）。図ＣおよびＦは、両方のセンサの応答をＧＦＰ濃度の関数として比較する。重要なことは、ペグ化されたセンサのシグナルが、１００ｍＭの緩衝液中で、ペグ化されていない表面と比較して３倍の増強を示す（１００ｎＭのＧＦＰについて８ｍＶに対して２５ｍＶ）ことである。１ｍＭの緩衝液中で観察されたシグナル増強は、そこまで劇的ではなく、約２倍の増大の大きさである（１００ｎＭのＧＦＰについて、２５ｍＶに対して４７ｍＶ）。これらの結果は、ＰＥＧが、達し得る最大のセンサ応答に対して強い正の影響を有することを明確に示す。
【００９４】
実施例３
トランジスタに基づく血清中の甲状腺刺激ホルモンの検出
ここで、表面化学の手法で、短い生物学的受容体としての抗体フラグメントを、脱塩をもたらすポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子と組み合わせて、血清中における直接の無標識選択的免疫検出を可能にする。ここで、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）は、要求のきびしい感度の要件に対して適切なおよび十分にキャラクタライズされた免疫感知パラメーターである代表的分析対象として選択される。この手法は、市販のＭＯＳＦＥＴ変換器に電気的接続された金の感知表面からなる拡張ゲート構成で示される。このセットアップは、簡単なチップ製造およびリンカー分子の連結について確立されたチオール−金化学という利点を有する。脱塩をもたらすＰＥＧのデバイ長に対する効果を評価するために、２種の異なる表面改変を、１０ｋＤａのＰＥＧを添加しておよび添加せずに比較する。ＳＨ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ（０．５ｋＤａ）の自己集合した単層（ＳＡＭ）のない感知表面は、以下で「Ｍｏｎｏ  ＳＡＭ」構成と称される。ＰＥＧの存在下でシステムを研究するために、ＳＨ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ（０．５ｋＤａ）とＳＨ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）とを組み合わせて、「混合ＳＡＭ」構成と名付ける（図６）。
【００９５】
抗ＴＳＨ抗体フラグメント（Ｆ（ａｂ’）２）をセンサ表面に固定化して、緩衝液および血清中におけるＴＳＨ検出を示した。デバイ長を増大させるために、ＰＥＧを表面に共固定化した。リンカーに対するＰＥＧの比は、フラグメントを組み込むために、１：２０を選んだ。この比で、ＰＥＧのない対照表面と比較して、３倍のシグナル増強が高イオン強度の緩衝液中で達成された（図６）。さらに、非特異的吸着は、チップをＢＳＡに暴露することにより試験して、極めて低いことが示された（特異的シグナルの＜１０％、図６）。次に、測定を、少なくとも３つのデバイスを用いて血清で繰り返した。較正曲線を図７に示す。測定が３７℃で実施された場合に、強いシグナル増強が達成され、２１℃と比較して、３桁の大きさで低い検出限界に達した。この改善は、より高い温度におけるより急速な結合キネティクスに主として帰着される。
引用文献
Gao 2015, Nano Lett. 15: 2143; 
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WO2016/161246;
Rother 2016, ACS Appl. Mater. Interf. 8: 5571;
Shim 2002, Nano Lett. 2: 285;
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Tarasov 2016, Biosens. Bioelectron. 79: 669;
Yoshimoto 2010, J. Am. Chem. Soc. 132: 7982.
【図１ａ】
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【図１ｂ】
0006921217.tif 000006
【図１ｃ】
0006921217.tif 000007
【図１ｄ】
0006921217.tif 000008
【図１ｅ】
0006921217.tif 000009
【図１ｆ】
0006921217.tif 000010
【図２ａ】
0006921217.tif 000011
【図２ｂ】
0006921217.tif 000012
【図２ｃ】
0006921217.tif 000013
【図２ｄ】
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【図２ｅ】
0006921217.tif 000015
【図３】
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【図４Ａ】
0006921217.tif 000017
【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
0006921217.tif 000021
【図５Ｂ】
0006921217.tif 000022
【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
0006921217.tif 000027
【図６Ｂ】
0006921217.tif 000028
【図６Ｃ】
0006921217.tif 000029
【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７】
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【配列表】
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