(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツロソネート（Ｋｄｏ）モイエティに接合されていないモノホスホリル脂質Ａ（ＭＬＡ）を構成的に生産する細菌であり、
前記細菌は、グラム陰性であり、かつ親細菌細胞と比べ、ＬｐｘＥポリペプチドをコーディングする遺伝子の発現を増加させる遺伝的変形を含み、ＬｐｘＥポリペプチドをコーディングする当該遺伝子は、前記細菌の染色体に存在し、
前記細菌の染色体は、ウンデカプレニルピロホスフェートホスファターゼ（Ｕｎｄ−ＰＰホスファターゼ）をコーディングするポリヌクレオチドの突然変異、ホスファチジルグリセロールリン酸ホスファターゼ（ＰＧＰホスファターゼ）をコーディングするポリヌクレオチドの突然変異、及びＫｄｔＡポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドの突然変異を含み、前記突然変異は、親細菌細胞と比べ、前記ポリヌクレオチドの発現を減少させる、細菌。
【請求項２】
前記ＭＬＡは、１−脱リン酸−脂質Ａ、１−脱リン酸−テトラ−アシル化脂質Ａ、１−脱リン酸−ペンタアシル化脂質Ａ、またはそれらの組み合わせを含むものであることを特徴とする請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
前記Ｕｎｄ−ＰＰホスファターゼをコーディングするポリヌクレオチドは、ｂａｃＡ遺伝子、ｐｇｐＢ遺伝子、ｙｂｊＧ遺伝子、またはそれらの組み合わせであることを特徴とする請求項１に記載の細菌。
【請求項４】
前記ＰＧＰホスファターゼをコーディングするポリヌクレオチドは、ｐｇｐＢ遺伝子、ｐｇｐＡ遺伝子、ｐｇｐＣ遺伝子、またはそれらの組み合わせであることを特徴とする請求項１に記載の細菌。
【請求項５】
前記細菌は、ｂａｃＡ遺伝子の突然変異、ｐｇｐＢ遺伝子の突然変異、及びｙｂｊＧ遺伝子の突然変異を含み、前記突然変異は、親細菌細胞と比べ、前記ポリヌクレオチドの発現を減少させることを特徴とする請求項１に記載の細菌。
【請求項６】
前記突然変異は、欠失、挿入、点突然変異、格子移動突然変異、またはそれらの組み合わせであることを特徴とする請求項１に記載の細菌。
【請求項７】
前記点突然変異は、ミスセンス突然変異またはナンセンス突然変異であることを特徴とする請求項６に記載の細菌。
【請求項８】
ＬｐｘＬポリペプチド、ＬｐｘＭポリペプチド、またはその組み合わせからなる群から選択されたポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の細菌。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドは、誘導性であるか、あるいは構成的に発現されることを特徴とする請求項８に記載の細菌。
【請求項１０】
前記ポリヌクレオチドは、ＰＬプローモーター、ＰＲプローモーター及びＰＲ’プローモーターからなる群から選択されたプローモーターによって発現されることを特徴とする請求項８に記載の細菌。
【請求項１１】
前記細菌は、ＬｐｘＴポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドの突然変異、ＰａｇＰポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドの突然変異、またはそれらの組み合わせをさらに含み、前記突然変異は、親細菌細胞と比べ、前記ポリヌクレオチドの発現を減少させることを特徴とする請求項１に記載の細菌。
【請求項１２】
前記細菌は、発現誘導剤、発現誘導刺激、またはそれらの組み合わせによる発現誘導なしに、ＭＬＡを生産することを特徴とする請求項１に記載の細菌。
【請求項１３】
前記発現誘導剤は、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）であることを特徴とする請求項１２に記載の細菌。
【請求項１４】
前記細菌は、抗生物質の存在または非存在において、ＭＬＡを生産することを特徴とする請求項１に記載の細菌。
【請求項１５】
請求項１ないし１４のうちいずれか１項に記載の細菌を培養して培養物を得る段階と、
前記培養物から前記細菌を得る段階と、
得られた細菌からＭＬＡを得る段階と、を含むモノホスホリル脂質Ａ（ＭＬＡ）を生産する方法。
【請求項１６】
前記細菌を培養する段階は、発現誘導剤、発現誘導刺激、またはそれらの組み合わせなしに培養することを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細菌を培養する段階は、抗生物質の存在または非存在において遂行することを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＬＡ：monophosphoryl lipid Ａ）を構成的に生産する細菌、及び前記細菌を利用してＭＬＡを生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂質多糖類（ＬＰＳ：lipopolysaccharide）は、グラム陰性細菌において、ペブチドグリカンを取り囲む外膜の構成成分中の一つである。ＬＰＳは、脂質Ａと、脂質Ａに共有結合で接合された多種の糖を含んだ物質である。ＬＰＳの成分中、脂質Ａは、エンドトキシンとしても知られており、グラム陰性細菌の毒性を担当する。
【０００３】
脂質Ａは、ミリリットル当たりピコグラムの量で、細胞（例えば、単核球または大食球）を活性化させ、免疫系の非常に力強い刺激剤としても使用される。脂質Ａ、その誘導体、またはその変異体は、アジュバントのようなワクチンの成分としても使用される。モノホスホリル脂質Ａ（ＭＬＡ）は、アジュバントとして使用され、アレルギー特異的免疫治療及び癌免疫治療に使用されており、また痴呆の予防及び治療に効果があると報告された。大腸菌のようなグラム陰性菌の膜に存在する脂質Ａは、２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツロソネート（Ｋｄｏ）のような糖が接合されたものである。従って、ＭＬＡを生産するために、細菌の外膜からＬＰＳを抽出した後、ＬＰＳを、酸の存在で加熱し、炭酸ナトリウム存在下で加水分解させ、Ｋｄｏ及び１−リン酸基、またはアシル鎖を除去するか、あるいは化学的方法でＭＬＡを合成することができる。しかし、そのような方法は、過程が複雑であり、収率の低いという問題がある。
【０００４】
遺伝工学的方法によって外来遺伝子を細菌に導入する場合、該細菌は、外来遺伝子の発現を防ぐために、自然突然変異を誘導し、外来遺伝子を除去してしまう。そのような自然突然変異体の生成は、遺伝工学的変形の効率を落とす原因にもなる。
【０００５】
そのために、既存方法に比べて簡単であり、酸加水分解なしに、ＭＬＡ及び誘導体を生産し、自然突然変異体生成の確率が低下し、ＭＬＡ及び誘導体を構成的に発現させ、収率を高める方法を開発する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
１以上の具体例は、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＬＡ）を構成的に生産する細菌を提供する。
【０００７】
１以上の具体例は、ＭＬＡを高い収率で生産する方法を提供する。
【０００８】
さらなる様相は、以下の説明で部分的に説明され、部分的に、下記記載から明白であるか、あるいは提示された具体例を実施することによっても得られる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
１以上の具体例によれば、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＬＡ）を構成的に（constitutively）生産する細菌であり、前記細菌は、ＬｐｘＥポリペプチドを含み、前記細菌の染色体は、ウンデカプレニルピロホスフェートホスファターゼ（Ｕｎｄ−ＰＰホスファターゼ：undecaprenyl pyrophosphate phosphatase）をコーディングするポリヌクレオチドの突然変異、ホスファチジルグリセロールリン酸ホスファターゼ（ＰＧＰホスファターゼ：phosphatidylglycerophosphate phosphatase）をコーディングするポリヌクレオチドの突然変異、またはそれらの組み合わせを含む細菌を提供する。
【００１０】
１以上の具体例によれば、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＬＡ）を生産する方法は、前述の具体例による細菌を培養して培養物を得る段階と、前記培養物から前記細菌を得る段階と、得られた細菌からＭＬＡを得る段階と、を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
これら及び／または他の様相は、添付された図面と係わり、以下の具体例の説明から明らかになり、さらに容易に理解されるであろう：
【図１】１以上の具体例による細菌において、１−脱リン酸−脂質Ａを生成する過程を示す模式図である。
【図２】ＥｃＬｐｘＬ及びＥｃＬｐｘＭを含む重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ：polymerase chain reaction）産物を製造する方法を示す模式図である。
【図３】相同組換え方法を利用し、脱リン酸化酵素、ｌｐｘＥで、大腸菌染色体のｂａｃＡを代替する方法を示す模式図である。
【図４】染色体に挿入された脱リン酸化酵素の安定性を安定化させた菌株を作製する過程を示した模式図である。
【図５】大腸菌ゲノムのｂａｃＡを除去し、脱リン酸化酵素で代替された菌株から抽出された脂質の薄膜クロマトグラフィ（ＴＬＣ：thin layer chromatography）結果を示す写真であり、レーン１は、１−脱リン酸−脂質Ａを生産するＫＨＳＣ００４４（同一細胞ストックで培養したコロニー８個のうち２個）を示し、レーン２は、１−脱リン酸−脂質Ａを生産することができないＫＨＳＣ００４４（同一細胞ストックで培養したコロニー８個のうち６個）を示し、レーン３は、１−脱リン酸−脂質Ａを生産するＫＨＳＣ００３１（同一細胞ストックで培養したコロニー７個のうち６個）を示し、レーン４は、１−脱リン酸−脂質Ａを生産することができないＫＨＳＣ００３１（同一細胞ストックで培養したコロニー７個のうち１個）を示し、レーン５は、１−脱リン酸−脂質Ａを生産する大腸菌ＫＨＳＣ００４５（同一細胞ストックで培養したコロニー７個のうち７個いずれも）を示し、レーン６は、合成された１−脱リン酸−ヘキサアシル化された脂質Ａ（ＩｎｖｏｖｏＧｅｎ）を示し、レーン７は、サルモネラミネソタＲ５９５から、酸塩基加水分解後に分離精製した１−脱リン酸−脂質Ａ（ＩｎｖｏｖｏＧｅｎ）を示す。
【図６】大腸菌ＫＨＳＣ００４５と大腸菌ＫＨＳＣ００５５との脂質ＴＬＣ結果を示す写真であり、レーン１は、合成された１−脱リン酸−ヘキサアシル化された脂質Ａ（ＩｎｖｏｖｏＧｅｎ）を示し、レーン２は、発現誘導剤を使用し、脂質化酵素の過発現を誘導して培養したＫＨＳＣ００４５を示し、レーン３は、発現誘導剤の使用なしに培養したＫＨＳＣ００５５を示す。
【図７】大腸菌ＫＨＳＣ００４５と大腸菌ＫＨＳＣ００５５との脂質ＴＬＣ結果を示す写真であり、レーン１は、抗生剤と培養されたＫＨＳＣ００５５を示し、レーン３は、抗生剤の使用なしに培養したＫＨＳＣ００５５を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本出願は、韓国特許庁に、２０１７年７月５日付けで出願された韓国特許出願１０−２０１７−００８５４０６の優先権を主張し、その開示内容全体は、本明細書に参照として含まれる。
【００１３】
本明細書で使用された用語「発現増加（increase expression）」は、ある遺伝子の発現産物、例えば、細胞において、遺伝子によってコーディングされたｍＲＮＡまたはタンパク質の検出可能な増加を言う。用語「親細菌細胞（parent bacterial cell）」は、特定遺伝的変形を有さない同一の細菌細胞を言う。野生型細胞が遺伝的変形に利用される場合、前記親細菌細胞は、「野生型（wild-type）」細胞でもある。例えば、遺伝子の発現を増加させる遺伝変形を含む細菌は、親細菌細胞の発現に比べ、約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上または約１００％以上までさらに高い発現産物のレベルを有することができる。細胞において発現産物の増加は、当業界に知られた任意の方法によっても検証される。発現産物のレベルは、ｍＲＮＡまたはタンパク質のような発現産物の活性または量を測定することによっても決定される。
【００１４】
遺伝的変形は、ポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドを細胞に導入する変形、親細胞の遺伝物質の１以上のヌクレオチドを置換、添加（すなわち、挿入）または欠失させる変形であり、親細胞の遺伝物質の変形を引き起こす化学的変形（化合物への露出）を含む。該遺伝的変形は、参照種の異種（ｈeterologous）または相同性（homologous）の変形を含む。該遺伝的変形は、ポリペプチドに対するコーディング領域の変形を含む。該遺伝的変形は、また遺伝子の発現、またはオペロンの機能を変更する非コーディング（non-coding）調節領域の変形を含む。該非コーディング領域は、５’−非コーディング配列（コーディング配列の５’）及び３’−非コーディング配列（コーディング配列の３’）を含む。
【００１５】
本明細書に使用された核酸またはポリペプチドの用語「配列同一性（sequence identity）」は、配列を、可能な限り多く互いにマッチングするように整列させた後で測定された特定領域について、２つの相応する配列のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の同一性程度を言う。前記配列同一性は、特定比較可能な領域の２つの最適に整列された相応する配列を比較することによって測定された値であり、前記比較可能な領域において、配列の一部は、参照配列と比較し、添加されたり欠失されたりもする。一部具体例において、配列同一性の百分率は、全体比較可能な領域において、２つの最適に整列された相応する配列を比較する段階、アミノ酸または核酸が、２つの配列において、同一位置の数を決定し、マッチされた位置の数を得る段階、比較可能な範囲内において、全ての位置の総数（すなわち、範囲サイズ）を、マッチされた位置の数に分ける段階、及びその結果に１００を乗じ、配列同一性の百分率を得る段階によっても算出される。配列同一性のパーセントは、公知された配列比較プログラム、例えば、ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰ（ＮＣＢＩ）、ＣＬＣ Main Workbench（ＣＬＣ ｂｉｏ．）、ＭｅｇＡｌｉｇｎＴＭ（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ）を利用して決定される。
【００１６】
同一であったり類似したりする機能または活性を有することができる他種のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを確認する段階において、配列同一性での類似度が利用される。例えば、類似した配列は、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または１００％の配列同一性を有することができる。
【００１７】
本明細書に記載された用語「外因性（exogenous）」、及びそれと類似したものは、宿主細胞に導入された参照分子（例：核酸）または参照活性を言う。核酸は、適切な方式で、外因性として宿主に導入される。例えば、該核酸は、宿主細胞に導入され、宿主染色体にも挿入され、または核酸は、非染色体性遺伝物質、例えば、宿主染色体に統合されない発現ベクター（例：プラスミド）にも導入される。タンパク質をコーディングする核酸は、発現可能な形態（すなわち、それにより、核酸が転写及び翻訳される）で導入されなければならない。外因性遺伝子は、相同性遺伝子、すなわち、内因性（endogenous）遺伝子と同一な遺伝子、または異種遺伝子を含んでもよい。
【００１８】
一様相は、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＬＡ：monophosphoryl lipid Ａ）を構成的に（constitutively）生産する細菌を提供する。
【００１９】
前記細菌は、親細菌細胞と比べ、ＬｐｘＥポリペプチドをコーディングする遺伝子の発現を増加させる遺伝的変形を含んでもよい。前記細菌の染色体は、ウンデカプレニルピロホスフェートホスファターゼ（Ｕｎｄ−ＰＰホスファターゼ）の突然変異、ホスファチジルグリセロールリン酸ホスファターゼ（ＰＧＰホスファターゼ：phosphatidylglycerophosphateホスファターゼ）をコーディングするポリヌクレオチドの突然変異、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。
【００２０】
前記モノホスホリル脂質Ａの脂質Ａモイエティは、２個のグルコサミン（炭水化物または糖）に付着したアシル鎖からなり、一般的に、各グルコサミンに、１つのリン酸基を含む。２つのジサッカライド（disaccharide）は、β（１→６）連結でも連結される。アシル鎖は、グルコサミンジサッカライドのＣ−２，Ｃ−２’，Ｃ−３及びＣ−３’位置に、ヒドロキシ残基の基から選択されたヒドロキシ残基に直接付着することができる。アシル鎖は、例えば、そのＣ−３位置、にヒドロキシ残基を有することができ、さらなるアシル鎖が、前記アシル鎖が位置したヒドロキシ残基に付着することができる。付着した各アシル鎖は、同一であっても異なっていてもよい。アシル鎖の個数により、トリ−アシル化された脂質Ａ、テトラ−アシル化された脂質Ａ、ペンタ−アシル化された脂質Ａ、ヘキサ−アシル化された脂質Ａ、またはヘプタ−アシル化された脂質Ａでもある。免疫系を良好に活性化させる脂質Ａは、６個のアシル鎖を含む脂質Ａと知られている。グルコサミンに直接付着した４個のアシル鎖は、長さが１０個ないし２２個の炭素からなるベータヒドロキシアシル鎖であり、２個のさらなるアシル鎖が、主にベータヒドロキシ基に付着したものでもある。
【００２１】
前記ＭＬＡは、１つのリン酸基だけがグルコサミンジサッカライドのＣ−１位置またはＣ−４’位置に結合されたモノホスホリル脂質を言う。前記ＭＬＡは、トリ−アシル化された脂質Ａ、テトラ−アシル化された脂質Ａ、ペンタ−アシル化された脂質Ａ、ヘキサ−アシル化された脂質Ａ、またはヘプタ−アシル化されたＭＬＡでもある。例えば、前記ＭＬＡは、１−脱リン酸−脂質Ａ、１−脱リン酸−テトラ−アシル脂質Ａ、１−脱リン酸−ペンタ−アシル脂質Ａ、またはそれらの組み合わせでもある。
【００２２】
前記ＭＬＡは、２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツロソネート（Ｋｄｏ：２−keto−３−deoxy−Ｄ−manno−octulosonate）を含まないものでもある。Ｋｄｏは、ほとんど全てのＬＰＳで保存されたＬＰＳの構成成分である。
【００２３】
前記ＭＬＡは、生きている細菌の膜、例えば、外膜に存在するものでもある。
【００２４】
用語「細菌（bacteria）」は、原核細菌を言う。前記細菌は、グラム陰性（Gram-negative）細菌でもある。グラム陰性細菌は、グラム染色法に使用されるクリスタルバイオレットに染色されない種類の細菌を言う。グラム陰性細菌の膜は、それぞれの二重膜からなる外膜と内膜とからなっており、薄いペブチドグリカン層が存在する。前記細菌は、エスケリチア（Escherichia）属細菌、シゲラ（Shigella）属細菌、サルモネラ（Salmonella）属細菌、カンピロバクター（Campylobacter）属細菌、ナイセリア（Neisseria）属細菌、ヘモフィルス（Haemophilus）属細菌、エロモナス（Aeromonas）属細菌、フランシセラ（Francisella）属細菌、エルシニア（Yersinia）属細菌、クレブシエラ（Klebsiella）属細菌、ボルデテラ（Bordetella）属細菌、レジオネラ（Legionella）属細菌、コリネバクテリア（Corynebacteria）属細菌、シトロバクター（Citrobacter）属細菌、クラミジア（Chlamydia）属細菌、ブルセラ（Brucella）属細菌、シュードモナス（Pseudomonas）属細菌、ヘリコバクター（Helicobacter）属細菌、バークホルデリア（Burkholderia）属細菌、ポルフィロモナス（porphyromonas）属細菌、リゾビウム（Rhizobium）属細菌、メソリゾビウム（Mesorhizobium）属細菌及びビブリオ（Vibrio）属細菌からなるグループから選択された細菌でもある。該細菌は、例えば、大腸菌である。
【００２５】
１以上の具体例による細菌は、ＭＬＡを構成的に生産することができる。本明細書に記載された用語「構成的に」は、発現誘導剤、発現誘導刺激、または抗生物質の存在有無とかかわらず生産されるものを意味する。
【００２６】
１以上の具体例による細菌は、増加されたコピー数のＬｐｘＥポリペプチドをコーディングする遺伝子を含んでもよい。前記細菌は、ＬｐｘＥポリペプチドをコーディングする１以上の外来（exogenous）ポリヌクレオチドを含んでもよい。
【００２７】
前記ＬｐｘＥポリペプチドは、ＥＣ ３．１．３．−に属する。前記ＬｐｘＥは、脂質ホスフェートホスファターゼ（lipid phosphate phosphatase）ファミリーに属する。前記ＬｐｘＥポリペプチドは、３個アミノ酸モチーフからなる（tripartite）活性部位と、６個の膜通過ヘリックスとを含んでもよい。脂質リン酸ホスファターゼは、リン酸モノエステル結合に特異的に結合する加水分解酵素であり、リン酸基を含む脂質から、リン酸基を除去することができる。前記ＬｐｘＥは、１−位置を特異的に脱リン酸化させるホスフェートホスファターゼでもある。前記ＬｐｘＥポリペプチドは、アキフェックス（Aquifex）属細菌、ヘリコバクター属細菌、フランシセラ属細菌、ボルデテラ属細菌、ブルセラ属細菌、リゾビウム属細菌、メソリゾビウム属細菌、レジオネラ属細菌、アグロバクテリウム属細菌、クロロビウム属細菌、ロドスピリルム（Rhodospirillum）属細菌、マグネトスピリルム（Magnetospirillum）属細菌、クロロバクルム（Chlorobaculum）属細菌、ペロディクティオン（Pelodictyon）属細菌、シュードビブリオ（Pseudovibro）属細菌、フェロスピリラム（Phaeospirillum）属細菌、シントロフォバクター（Syntrophobacter）属細菌、ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）属細菌、ポルフィロモナス（Porphyromonas）属細菌、ラルストニア（Ralstonia）属細菌、Limnohabitans属細菌及びサーモデスルホバクテリウム（Thermodesulfobacterium）属細菌からなる群から選択された細菌のＬｐｘＥポリペプチドでもある。前記アキフェックス属細菌は、アキフェックス・エオリカス（Aquifex aeolicus）またはアキフェックス・ピロフィラス（Aquifex pyrophilus）を含んでもよい。アキフェックス属細菌は、好熱性細菌であり、約８５℃ないし９５℃範囲の温度で最も良好に育つことができる。前記アキフェックス属細菌は、アキフェックス・エオリカスでもある。前記ヘリコバクター属細菌は、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）でもある。例えば、前記ＬｐｘＥポリペプチドは、アキフェックス・エオリカス由来ＬｐｘＥポリペプチド（ＡａＬｐｘＥ：Aquifex aeolicus ＬｐｘＥポリペプチド）またはヘリコバクター・ピロリ由来ＬｐｘＥ（ＨｐＬｐｘＥ：Helicobactor pylori ＬｐｘＥポリペプチド）でもある。前記ＬｐｘＥポリペプチドは、配列番号１２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは配列番号１２のアミノ酸配列に、約９９％、約９７％、約９５％、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％または約１０％以上の配列同一性を有するポリペプチドでもある。前記ＬｐｘＥポリペプチドは、突然変異されたポリペプチドでもある。
【００２８】
前記ＬｐｘＥポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドは、前記細菌の染色体に存在するものでもある。前記ＬｐｘＥポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドは、配列番号１３の核酸配列に、約９９％、約９７％、約９５％、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％または約１０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドでもある。前記ポリヌクレオチドは、突然変異されたヌクレオチド配列でもある。例えば、前記ポリヌクレオチドは、野生型ＬｐｘＥポリペプチドのＮ−末端から１７番目アミノ酸であるセリン（１７Ｓｅｒ）をコーディングするヌクレオチド配列に対する、ＡＧＣからＴＣＧへの突然変異を含んでもよい。
【００２９】
前記ＬｐｘＥポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドは、構成的にも発現される。用語「構成的に発現（constitutively express）」は、発現誘導剤または発現誘導刺激の存在なしも、遺伝子を発現させることができるものであると言うことができる。
【００３０】
１以上の具体例による前記細菌は、前記細菌の染色体において、ウンデカプレニルピロホスフェートホスファターゼ（Ｕｎｄ−ＰＰホスファターゼ：undecaprenyl pyrophosphate ホスファターゼ）をコーディングするポリヌクレオチドの突然変異、ホスファチジルグリセロールリン酸ホスファターゼ（ＰＧＰホスファターゼ：phosphatidylglycerophosphate ホスファターゼ）をコーディングするポリヌクレオチドの突然変異、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。用語「細菌染色体（bacterial chromosome）」は、細菌の遺伝情報を含むものであり、環形のＤＮＡでもある。前記細菌染色体は、プラスミド（plasmid）を除外させることができる。該プラスミドは、細菌染色体と物理的に分離されており、独立して複製することができる環形のＤＮＡを言う。
【００３１】
前記Ｕｎｄ−ＰＰホスファターゼは、ウンデカプレニルピロホスフェートの脱リン酸化を触媒し、ウンデカプレニルホスフェートを生産する酵素である。ウンデカプレニルホスフェートは、細菌の外被（envelope）に送られる炭化水素重合体のためのグリカン生合成中間体（intermediate）の脂質運搬体である。
【００３２】
前記Ｕｎｄ−ＰＰホスファターゼをコーディングするポリヌクレオチドは、ｂａｃＡ遺伝子、ｐｇｐＢ遺伝子、ｙｂｊＧ遺伝子、またはそれらの組み合わせでもある。ｂａｃＡ遺伝子は、過発現時、抗生物質であるバシトラシン（bacitracin）に抵抗性を引き起こす遺伝子である。ｐｇｐＢ遺伝子は、ホスファチジルグリセロールリン酸（ＰＧＰ）を脱リン酸化させ、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ：phosphatidyl glycerol）を生成する過程を触媒する酵素をコーディングする遺伝子である。該酵素は、Ｕｎｄ−ＰＰホスファターゼ活性を有することができる。前記ｙｂｊＧ遺伝子は、過発現時、Ｕｎｄ−ＰＰホスファターゼ活性を増大させ、バシトラシンに対する抵抗性を増大させることができる遺伝子である。
【００３３】
前記ＰＧＰホスファターゼをコーディングするポリヌクレオチドは、ｐｇｐＢ遺伝子、ｐｇｐＡ遺伝子、ｐｇｐＣ遺伝子、またはそれらの組み合わせでもある。ｐｇｐＡ遺伝子またはｐｇｐＣ遺伝子は、ＰＧＰをホスファチジルグリセロール（ＰＧ）で脱リン酸化させる脂質ホスファターゼをコーディングする遺伝子である。
【００３４】
前記細菌は、例えば、ｂａｃＡ遺伝子の突然変異、ｐｇｐＢ遺伝子の突然変異及びｙｂｊＧ遺伝子の突然変異を含んでもよい。
【００３５】
用語「遺伝子（gene）」は、遺伝情報の単位であり、ポリペプチドをコーディングする開かれた解読枠（ＯＲＦ：open reading frame）、及び遺伝子の転写（transcription）を調節する調節配列（regulatory sequence）を含んでもよい。前記調節配列は、遺伝子の転写を開始するＤＮＡ領域であるプローモーター（promoter）、転写を促進することができるエンハンサー（enhancer）、転写を抑制することができるサイレンサー（silencer）、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。
【００３６】
用語「突然変異（mutation）」は、遺伝物質の変異を言い、点突然変異、格子移動（frame shift）突然変異、挿入、欠失、逆位または転座を含んでもよい。例えば、前記突然変異は、欠失（deletion）、挿入（insertion）、点突然変異（point mutation）、格子移動突然変異（frame shift mutation）、またはそれらの組み合わせでもある。前記点突然変異は、ミスセンス（missense）突然変異またはナンセンス（nonsense）突然変異でもある。前記突然変異により、遺伝物質が、前記細菌のゲノムから欠失されたり導入されたりする。
【００３７】
１以上の具体例による前記細菌は、ＬｐｘＬポリペプチド及びＬｐｘＭポリペプチドからなる群から選択されたポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドをさらに含んでもよい。前記ポリヌクレオチドは、誘導的または構成的にも発現される。誘導性発現は、発現誘導剤または発現誘導刺激（例えば、熱処理）による発現を言う。構成的発現は、発現誘導剤または発現誘導刺激なしも発現されるものを言う。前記ポリヌクレオチドは、ＰＬプローモーター、ＰＲプローモーター及びＰＲ’プローモーターからなる群から選択されたプローモーターによっても発現される。前記ＰＬプローモーター、ＰＲプローモーター及びＰＲ’プローモーターは、ラムダファージ（lambda phage）由来プローモーターでもある。
【００３８】
前記ＬｐｘＬポリペプチドは、ＥＣ ２．３．１．２４１に属することができる。前記ＬｐｘＬポリペプチドは、脂質Ａ生合成ラウロイル転移酵素（lauroyl transferase）であり、ラウロイル−アシル伝達タンパク質（ＡＣＰ：acyl carrier protein）から、Ｋｄｏ２−脂質ＩＶＡにラウレート（laurate）を転移し、Ｋｄｏ２−（ラウロイル）−脂質ＩＶＡを形成することを触媒する酵素である。前記ＬｐｘＬポリペプチドは、エスケリチア属細菌、シゲラ属細菌、サルモネラ属細菌、カンピロバクター属細菌、ナイセリア属細菌、ヘモフィルス属細菌、エロモナス属細菌、フランシセラ属細菌、エルシニア属細菌、クレブシエラ属細菌、ボルデテラ属細菌、レジオネラ属細菌、コリネバクテリア属細菌、シトロバクター属細菌、クラミジア属細菌、ブルセラ属細菌、シュードモナス属細菌、ヘリコバクター属細菌、バークホルデリア属細菌、ポルフィロモナス属細菌、リゾビウム属細菌、メソリゾビウム属細菌及びビブリオ属細菌からなるグループから選択された細菌のＬｐｘＬポリペプチドでもある。例えば、前記ＬｐｘＬポリペプチドは、大腸菌のＬｐｘＬポリペプチド（ＥｃＬｐｘＬ）でもある。前記ＬｐｘＬポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１のアミノ酸配列に、約９９％、約９７％、約９５％、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％、またはそれら以上の配列同一性を有するポリペプチドでもある。前記ＬｐｘＬポリペプチドは、配列番号２の核酸配列、または配列番号２の核酸配列に、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％、またはそれら以上の配列同一性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコーディングされるものでもある。
【００３９】
前記ＬｐｘＭポリペプチドは、ＥＣ ２．３．１．２４３に属することができる。前記ＬｐｘＭポリペプチドは、脂質Ａ生合成ミリストイル転移酵素（myristoyl transferase）であり、ミリストイル−アシル伝達タンパク質、からミリステート（myristate）をＫｄｏ２−ラウロイル−脂質ＩＶＡに転移し、Ｋｄｏ２−脂質Ａを形成することを触媒する酵素である。前記ＬｐｘＭポリペプチドは、エスケリチア属細菌、シゲラ属細菌、サルモネラ属細菌、カンピロバクター属細菌、ナイセリア属細菌、ヘモフィルス属細菌、エロモナス属細菌、フランシセラ属細菌、エルシニア属細菌、クレブシエラ属細菌、ボルデテラ属細菌、レジオネラ属細菌、コリネバクテリア属細菌、シトロバクター属細菌、クラミジア属細菌、ブルセラ属細菌、シュードモナス属細菌、ヘリコバクター属細菌、バークホルデリア属細菌、ポルフィロモナス属細菌、リゾビウム属細菌、メソリゾビウム属細菌及びビブリオ属細菌からなるグループから選択された細菌のＬｐｘＭポリペプチドでもある。例えば、前記ＬｐｘＭポリペプチドは、大腸菌のＬｐｘＭポリペプチド（ＥｃＬｐｘＭ）でもある。前記ＬｐｘＭポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号５のアミノ酸配列に、約９９％、約９７％、約９５％、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％、またはそれら以上の配列同一性を有するポリペプチドでもある。前記ＬｐｘＭポリペプチドは、配列番号６の核酸配列、または配列番号６の核酸配列に、約９９％、約９７％、約９５％、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％、またはそれら以上の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコーディングされるものでもある。
【００４０】
１以上の具体例による前記細菌は、ＬｐｘＴポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチド、ＰａｇＰポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチド、ＫｄｔＡポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチド、またはそれらの組み合わせさらに含んでもよい。前記ＬｐｘＴポリペプチドは、ＥＣ ２．７．４．２９に属することができる。前記ＬｐｘＴポリペプチドは、内膜タンパク質（inner membrane protein）ＬｐｘＴでもある。前記ＬｐｘＴポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸配列、または配列番号１８のアミノ酸配列に、約９９％、約９７％、約９５％、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％、またはそれら以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドでもある。例えば、前記ＬｐｘＴポリペプチドは、大腸菌ＬｐｘＴポリペプチド（ＥｃＬｐｘＴ）でもある。前記ＰａｇＰポリペプチドは、ＥＣ ２．１．１．２５１に属することができる。前記ＰａｇＰポリペプチドは、パルミテート（palmitate）を含むヘプタ−アシル脂質Ａ種類の生合成に必要な脂質Ａパルミトイル転移酵素（palmitoyltransferase）でもある。前記ＫｄｔＡポリペプチドは、ＥＣ ２．４．９９．１２２．４．９９．１３２．４．９９．１４２．４．９９．１５に属することができる。前記ＫｄｔＡポリペプチドは、脂質ＩＶＡにＫｄｏを付着させる酵素である。前記ＫｄｔＡポリペプチドは、配列番号２２のアミノ酸配列、または配列番号２２のアミノ酸配列に、約９９％、約９７％、約９５％、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％、またはそれら以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドでもある。前記ＫｄｔＡポリペプチドは、大腸菌ＫｄｔＡポリペプチドでもある。
【００４１】
１以上の具体例による前記細菌は、発現誘導剤、発現誘導刺激、またはそれらの組み合わせによる発現誘導なしに、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＬＡ）を生産することができる。前記発現誘導剤は、遺伝子の発現を引き起こすことができる化合物でもある。例えば、前記発現誘導剤は、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ：isopropyl β−Ｄ−１−thiogalactopyranoside）、アラビノース、テトラサイクリン、トリプトファン、またはそれらの組み合わせでもある。前記発現誘導刺激は、遺伝子の発現を引き起こすことができる物理的刺激であり、例えば、熱処理（heat treatment）または熱ショック（heat shock）でもある。
【００４２】
前記細菌は、抗生物質なしにも培養される。前記抗生物質は、例えば、カナマイシン、アンピシリン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、またはそれらの組み合わせでもある。
【００４３】
他の様相は、前述の具体例のうちいずれか一つによる細菌を培養して培養物を得る段階と、前記培養物から前記細菌を得る段階と、得られた細菌からＭＬＡを得る段階と、を含むＭＬＡを生産する方法を提供する。
【００４４】
１以上の具体例による方法と係わり、前述の用語「ＭＬＡ」、「構成的に」及び「細菌」は、前述の通りである。
【００４５】
１以上の具体例による方法は、ＭＬＡを構成的に生産する前述のもののうち一つによる細菌を培養する段階を含んでもよい。
【００４６】
前記培養は、公知された方法を利用して手も行われる。例えば、前記培養方法は、回分培養（batch culture）、流加培養（fed-batch culture）、連続培養（continuous culture）、醗酵（fermentation）、またはそれらの組み合わせでもある。
【００４７】
培養液の種類、培養温度、培養条件などは、公知されたようなものでもある。培養温度は、例えば、約１０℃ないし約４３℃、約２０℃ないし約４３℃、約２０℃ないし約４０℃、約２５℃ないし約４３℃、約２５℃ないし約３５℃、約２７℃ないし約３３℃、約１０℃ないし約１５℃、約１５℃ないし約２０℃、約２０℃ないし約２５℃、約２５℃ないし約３０℃、約３０℃ないし約３３℃、約３３℃ないし約３７℃、約３７℃ないし約４０℃、または約４０℃ないし約４３℃でもある。前記細菌は、回分培養、流加培養または連続培養の方式によっても培養される。前記培養は、静置（stationary）、または振盪の条件でも培養される。培養期間は、例えば、約１時間ないし約１週間、約３時間ないし約６日、約６時間ないし約５日、約９時間ないし約４日、約１２時間ないし約３日、約１８時間ないし約２日、約１日、または一晩でもある。培養培地は、抗生物質を含んでも含まなくともない。前記抗生物質は、例えば、カナマイシン、アンピシリン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、またはそれらの組み合わせでもある。
【００４８】
前記細菌を培養する段階は、発現誘導剤、発現誘導刺激、またはそれらの組み合わせなしにも遂行される。
【００４９】
１以上の具体例による前記方法は、培養物から細菌を得る段階を含んでもよい。培養物から細菌を得る方法は、公知された方法を利用して遂行されることができる。例えば、前記細菌を得る段階は、遠心分離によっても遂行される。得られた細菌は、緩衝液によっても洗浄される。
【００５０】
１以上の具体例による前記方法は、得られた細菌からＭＬＡを得る段階を含んでもよい。
【００５１】
前記ＭＬＡは、前記細菌の脂質からも分離される。前記脂質は、公知された方法を利用しても得られる。前記ＭＬＡは、物理的または化学的な方法を利用しても得られる。前記物理的方法は、超音波または冷解凍を反復的に利用することができる。化学的方法は、有機溶媒または沈澱を利用した抽出でもある。例えば、有機溶媒は、クロロホルム、フェノール、石油エーテル、ジクロロメタン、メタノール、ヘキサン、イソプロピルアルコール、酢酸エチル、アセトニトリル、エタノール、ブタノール、またはそれらの組み合わせでもある。例えば、脂質を抽出する方法は、ブライ・ダイアー（Bligh and Dyer）抽出法（Bligh, E.G. and Dyer, W.J., Can. J. Biochem. Physiol., 1959, vol. 37, pp. 911-917）でもある。前記方法は、前記脂質からＭＬＡを精製する段階をさらに含んでもよい。前記得られた脂質Ａは、遊離（free）形態、すなわち、Ｋｄｏモイエティに接合されていない形態でもあるために、Ｋｄｏモイエティを除去する加水分解段階を含まない。
【００５２】
以下、添付図面に図示になった実施例参照して詳細に説明し、参照番号は、全体にわたし、類似要素を指す。それと係わり、本具体例は、他の形態を有することができ、ここに記載された説明に制限されることに解釈されてはいけない。従って、具体例は、図面を参照し、本説明の様態について説明するために、以下に記載するのみである。本願に使用された用語「及び／または」は、関連する列挙された項目のうち１以上の任意及び全部の組み合わせを含む。「１以上」のような表現は、構成要素目録の前にある場合、構成要素の全体目録を変形し、その目録の個別的な構成要素を変形するものではない。
【００５３】
以下、本発明の１以上の具体例について、下記実施例参照して詳細に説明する。しかし、それら実施例は説明のためのものであるのみ、本開示の１以上の具体例の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００５４】
［実施例１．大腸菌ＬｐｘＬ及び大腸菌ＬｐｘＭをコーディングするポリヌクレオチドを含むベクターの準備］
［１．１．ｐＷＳＫ２９−ＥｃＬｐｘＬＥｃＬｐｘＭの準備］
大腸菌ＬｐｘＬポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドを得るために、大腸菌Ｗ３１１０ゲノム（GenBank Accession Ｎｏ．ＮＣ＿０００９１８．１）（ＡＴＣＣ）から、下記プライマー対を使用した第１重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、リボゾーム結合部位（ＲＢＳ：ribosome binding site）を含むＥｃＬｐｘＬポリペプチド（GenBank Accession Ｎｏ．ＢＡＡ３５８５２．１、配列番号１）をコーディングするポリヌクレオチド（GenBank Accession Ｎｏ．ＡＰ００９０４８．１（ｃ１１１８１５９，１１１７２３９、配列番号２）を増幅した：
ＬｐｘＬ順方向プライマーＰ１：
５’−ＣＧＣＡＧＴＣＴＡＧＡＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＴＴＧＡＴＧＡＣＧＡＡＴＣＴＡＣＣＣＡＡＧＴＴＣＴＣ−３’（配列番号３）
ＬｐｘＬ逆方向プライマーＰ２：
５’−ＣＧＣＴＡＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧＴＴＴＣＣＡＴＴＧＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＣＧＴＧＡＡＧＧＡＡＣＧＣＣＴＴＣ−３’（配列番号４）
大腸菌ＬｐｘＭポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドを得るために、大腸菌Ｗ３１１０ゲノムから、下記プライマー対を利用した第２ ＰＣＲを行い、ＲＢＳを含むＥｃＬｐｘＭポリペプチド（GenBank Accession Ｎｏ．ＢＡＡ１５６６３．１、配列番号５）をコーディングするポリヌクレオチド（GenBank Accession Ｎｏ．ＡＰ００９０４８．１（ｃ１９４１９０７．１９４０９３６、ＳＥＱＩＤＮＯ：６）を増幅した（図２参照）：
ＬｐｘＭ順方向プライマーＰ３：
５’−ＧＡＡＧＧＣＧＴＴＣＣＴＴＣＡＣＧＣＴＡＴＴＡＡＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＡＴＧＧＡＡＡＣＧＡＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＴＡＧＣＧ−３’（配列番号７）
ＬｐｘＭ逆方向プライマーＰ４：
５’−ＧＣＡＧＡＡＧＣＴＴＴＴＡＴＴＴＧＡＴＧＧＧＡＴＡＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＣＧ−３’（配列番号８）
前記第１ ＰＣＲから得られたＥｃＬｐｘＬポリヌクレオチド、及び第２ ＰＣＲから得られたＥｃＬｐｘＭポリヌクレオチドをテンプレートにし、前記ＬｐｘＬ順方向プライマーＰ１とＬｐｘＭ逆方向プライマーＰ４とを使用した第３ ＰＣＲを行い、ＥｃＬｐｘＬポリヌクレオチドとＥｃＬｐｘＭポリヌクレオチドよが融合されたＥｃＬｐｘＬＥｃＬｐｘＭポリヌクレオチドを増幅した。
【００５５】
前記ＰＣＲのために、ＫＯＤホットスタートＤＮＡ重合酵素（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用し、Ｔ３０００ thermocycler（Biometra）で行った。
【００５６】
増幅された産物を、ＤｏｋＤｏ−Ｐｒｅｐ ＰＣＲ purification kit（ＥＬＰＩＳ−ＢＩＯＴＥＣＨ．Ｉｎｃ．）を使用して精製し、精製された産物をｐＷＳＫ２９プラスミド（Wang, R. F., and Kushner, S. R., Gene (1991), vol. 100, pp. 195-199）に導入した。クローニングされたプラスミドを、大腸菌ＤＨ５αに、電気穿孔法（electroporation）で形質転換させ、ＬＢ−アンピシリンプレートで選別した。クローニングされたプラスミドをｐＷＳＫ２９−ＥｃＬｐｘＬＥｃＬｐｘＭと命名した（図２参照）。
【００５７】
［１．２．ｐＫＨＳＣ０００４の準備］
ｐＷＳＫ２９−ＥｃＬｐｘＬＥｃＬｐｘＭのプローモーター配列を、ＰＬプローモーター配列（５’−ＴＴＧＡＣＡＴＡＡＡＴＡＣＣＡＣＴＧＧＣＧＧＴＧＡＴＡＣＴ−３’、配列番号９）に変異させるために、１．１で準備されたｐＷＳＫ２９−ＥｃＬｐｘＬＥｃＬｐｘＭをテンプレートにし、下記プライマー対を使用し、部位特異的突然変異誘導（site-directed mutagenesis）を行った：
ＰＬプローモーター順方向プライマー：５’−ＧＧＣＡＧＴＧＡＧＣＧＣＡＡＣＧＣＡＧＡＡＴＴＣＴＴＧＡＣＡＴＡＡＡＴＡＣＣＡＣＴＧＧＣＧＧＴＧＡＴＡＣＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣ−３’（配列番号１０）
ＰＬプローモーター逆方向プライマー：５’−ＧＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＡＡＧＴＡＴＣＡＣＣＧＣＣＡＧＴＧＧＴＡＴＴＴＡＴＧＴＣＡＡＧＡＡＴＴＣＴＧＣＧＴＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＣ−３’（配列番号１１）
前記ＰＣＲのために、Quikchange Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent）を使用し、Ｔ３０００ thermocycler（Biometra）で行った。
【００５８】
部位特異的突然変異誘導を行った後、反応物を、Ｄｐｎ１制限酵素（ＥＬＰＩＳ−ＢＩＯＴＥＣＨ．Ｉｎｃ．）で処理した。その後、大腸菌ＤＨ５αに電気穿孔法で形質転換させ、ＬＢ−アンピシリン固体培地で選別した。得られたプラスミドをｐＫＨＳＣ０００４と命名した。
【００５９】
［１．３．ｐＢＡＤ３０−ＨｐＬｐｘＥ−ｆｒｔ−ｋａｎ−ｆｒｔの準備］
［１．３．１．ｐＢＡＤ３０−ＨｐＬｐｘＥの準備］
ヘリコバクター・ピロリＬｐｘＥ（ＨｐＬｐｘＥ：Helicobactor pylori ＬｐｘＥ）をコーディングする遺伝子ｈｐ００２１において、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識配列を欠失させるために、Ｎ−末端から１７番目アミノ酸であるセリン（１７Ｓｅｒ）をコーディングするヌクレオチド配列を、ＡＧＣからＴＣＧに突然変異させた。突然変異されたｈｐ００２１遺伝子は、Integrated ＤＮＡ technology（ｍＢｉｏｔｅｃｈ、ＲＯＫ）で合成した。
【００６０】
突然変異されたｈｐ００２１をテンプレートにし、下記プライマー対を使用し、ＨｐＬｐｘＥアミノ酸配列（配列番号１２）をコーディングするポリヌクレオチド（配列番号１３）を増幅した：
突然変異ＨｐＬｐｘＥ増幅用順方向プライマー：
５’−ＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＴＴＧＡＴＧＡＡＡＡＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＴＡＡＡＣＡＡＡＡＡＴＴＴ−３’（配列番号１４）
突然変異ＨｐＬｐｘＥ増幅用逆方向プライマー：
５’−ＡＧＣＴＡＣＡＡＧＣＴＴＴＴＡＡＧＧＣＴＴＴＴＴＧＧＧＧＣ−３’（配列番号１５）
ＰＣＲのために、ＫＯＤホットスタートＤＮＡポリメラーゼ（Novagen）を使用し、Ｔ３０００ thermocycler（Biometra）で行った。
【００６１】
１．１．に記載されたようにＰＣＲを行い、増幅された産物を精製した。精製された産物を、ｐＢＡＤ３０（Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J., J Bacteriol (1995). 177(14), pp. 4121-4130）にクローニングした。クローニングされたプラスミドを、１．１．に記載されたように、大腸菌に形質転換して選別した。クローニングされたプラスミドをｐＢＡＤ３０−ＨｐＬｐｘＥと命名した。
【００６２】
［１．３．２．ｐＢＡＤ３０−ＨｐＬｐｘＥ−ｆｒｔ−ｋａｎ−ｆｒｔの準備］
ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識配列を両側に有したｆｒｔ−ｋａｎ−ｆｒｔポリヌクレオチドは、下記プライマー対と、テンプレートとしてのｐＫＤ４（Kirill A. Datsenko, and Barry L. Wanner PNAS (2000), vol. 97, pp. 6640-6645）プラスミドとを利用して増幅した：
ｆｒｔ−ｋａｎ−ｆｒｔ増幅用順方向プライマー：
５’−ＧＣＡＧＡＡＧＣＴＴＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ−３’（配列番号１６）
ｆｒｔ−ｋａｎ−ｆｒｔ増幅用逆方向プライマー：
５’−ＧＣＡＧＡＡＧＣＴＴＡＴＧＡＡＴＡＴＣＣＴＣＣＴＴＡＧＴＴＣＣＴＡＴ−３’（配列番号１７）
ＰＣＲは、ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＬＰＩＳ−ＢＩＯＴＥＣＨ．Ｉｎｃ．）を使用し、Ｔ３０００ thermocycler（Biometra）で行った。
【００６３】
ＰＣＲ後、増幅された産物は、１．１．に記載されたように精製した。精製された産物を１．３．１．に記載されたように得られたｐＢＡＤ３０−ＨｐＬｐｘＥにクローニングした。クローニングされたプラスミドを、１．１．に記載されたように、大腸菌に形質転換して選別した。クローニングされたプラスミドを、ｐＢＡＤ３０−ＨｐＬｐｘＥ−ｆｒｔ−ｋａｎ−ｆｒｔと命名した。
【００６４】
［実施例２．大腸菌ストレーンの準備］
［２．１．大腸菌ＫＨＳＣ００４４（ｐＷＳＫ２９−ＥｃＬｐｘＬＥｃＬｐｘＭ，△ｌｐｘＴ，△ｐａｇＰ，ｂａｃＡ：：ＨｐＬｐｘＥ，ｋｄｔＡ：：ｋａｎ，Ｗ３１１０）ストレインの準備］
［２．１．１．ｌｐｘＴ遺伝子がゲノムから除去された大腸菌の準備］
大腸菌ゲノムにおいて、ＬｐｘＴポリペプチド（配列番号１８）をコーディングするｌｐｘＴ遺伝子（配列番号１９）に、カナマイシンカセットが挿入された大腸菌ストレインｌｐｘＴ：：ｋａｎ，Ｗ３１１０を準備した。
【００６５】
その後、ｐＣＰ２０プラスミド（Kirill A. Datsenko, and Barry L. Wanner PNAS (2000), vol. 97, pp. 6640-6645）を、ｌｐｘＴ：：ｋａｎ，Ｗ３１１０に形質転換した。選別された大腸菌をＬＢ固体培地に接種し、４２℃の温度で選別し、ｌｐｘＴとカナマイシンカセットとが除去された大腸菌ストレイン、すなわち、△ｌｐｘＴ，Ｗ３１１０を準備した。
【００６６】
［２．１．２．ｐａｇＰ及びｌｐｘＴ遺伝子がゲノムから除去された大腸菌の準備］
大腸菌ゲノムにおいてｐａｇＰ遺伝子にカナマイシンカセットが挿入された大腸菌ストレインＪＷ０６１７（ｐａｇＰ：：ｋａｎ）（Keio Ｅ．ｃｏｌｉ knockout library）から、Ｐ１ウイルスを準備した。２．１．１で準備された△ｌｐｘＴ，Ｗ３１１０にＰ１ウイルスを形質導入させ、ＬＢ−カナマイシン固体培地で選別し、ｐａｇＰ遺伝子の代わりに、ｐａｇＰ：：ｋａｎが挿入された大腸菌ストレイン、すなわち、△ｌｐｘＴ，ｐａｇＰ：：ｋａｎ，Ｗ３１１０を準備した。
【００６７】
２．１．１．に記載されたようなｐＣＰ２０プラスミドを、前記△ｌｐｘＴ，ｐａｇＰ：：ｋａｎ，Ｗ３１１０に形質転換し、その後、形質転換された大腸菌をＬＢ−アンピシリン固体培地で選別した。選別された大腸菌をＬＢ固体培地に接種し、４２℃の温度で選別し、ｐａｇＰとカナマイシンカセットとが除去された大腸菌ストレイン、すなわち、△ｌｐｘＴ，△ｐａｇＰ，Ｗ３１１０を準備した。
【００６８】
［２．１．３．ｌｐｘＴ及びｐａｇＰ遺伝子がゲノムから除去され、ゲノムのｂａｃＡ遺伝子がＨｐＬｐｘＥ−ｆｒｔ−ｋａｎ−ｆｒｔポリヌクレオチドで代替された大腸菌の準備］
ｂａｃＡ遺伝子と相同組換えを行うことができるｂａｃＡ：：ＨｐＬｐｘＥ−ｆｒｔ−ｋａｎ−ｆｒｔポリヌクレオチドを準備するために、１．３．２．で準備されたｐＢＡＤ３０−ＨｐＬｐｘＥ−ｆｒｔ−ｋａｎ−ｆｒｔをテンプレートにし、下記プライマー対を利用して増幅した：
ｂａｃＡ：：ＨｐＬｐｘＥ−ｆｒｔ−ｋａｎ−ｆｒｔ増幅用順方向プライマー：
５’−ＡＡＣＣＴＧＧＴＣＡＴＡＣＧＣＡＧＴＡＧＴＴＣＧＧＡＣＡＡＧＣＧＧＴＡＣＡＴＴＴＴＡＡＴＡＡＴＴＴＡＧＧＧＧＴＴＴＡＴＴＧＡＴＧＡＡＡＡＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＴＡＡＡＣＡＡＡＡＡＴ−３’（配列番号２０）
ｂａｃＡ：：ＨｐＬｐｘＥ−ｆｒｔ−ｋａｎ−ｆｒｔ増幅用逆方向プライマー：
５’−ＴＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＣＡＴＣＣＧＡＣＡＣＴＡＴＴＣＣＴＣＡＡＴＴＡＡＡＡＧＡＡＣＡＣＧＡＣＡＴＡＣＡＣＣＧＣＡＧＣＣＧＣＣＡＣＡＴＧＡＡＴＡＴＣＣＴＣＣＴＴＡＧＴＴＣＣＴＡ−３’（配列番号２１）
ＰＣＲのために、ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＬＰＩＳ）を使用し、Ｔ３０００thermocycler（Biometra）で行った。
【００６９】
ＰＣＲ後、１増幅された産物を、１．に記載されたように精製した。精製された産物は、大腸菌ＤＹ３３０（Yu, D., et. al., PNAS. (2000). 97 (11), pp. 5978-5983）に、電気穿孔法で形質転換した。形質転換により、ＤＹ３３０ゲノムのｂａｃＡ遺伝子の上下塩基配列との相同組換え過程を介して、ｂａｃＡ：：ＨｐＬｐｘＥ−ｆｒｔ−ｋａｎ−ｆｒｔ，ＤＹ３３０大腸菌を製造した（図３参照）。
【００７０】
大腸菌ｂａｃＡ：：ＨｐＬｐｘＥ−ｆｒｔ−ｋａｎ−ｆｒｔ，ＤＹ３３０から、Ｐ１ウイルスを準備した。前記Ｐ１ウイルスを、２．１．２．で準備された大腸菌△ｌｐｘＴ，△ｐａｇＰ，Ｗ３１１０ストレインに形質導入し、ＬＢ−カナマイシン固体培地で選別した。選別された大腸菌を、△ｌｐｘＴ，△ｐａｇＰ，ｂａｃＡ：：ＨｐＬｐｘＥ−ｆｒｔ−ｋａｎ−ｆｒｔ，Ｗ３１１０と命名した（図３参照）。
【００７１】
［２．１．４．ｌｐｘＴ及びｐａｇＰ遺伝子がゲノムから除去され、ゲノムのｂａｃＡ遺伝子がＨｐＬｐｘＥ遺伝子で代替された大腸菌の準備］
２．１．１．に記載されたようなｐＣＰ２０プラスミドを、２．１．３．に記載されたように準備された△ｌｐｘＴ，△ｐａｇＰ，ｂａｃＡ：：ＨｐＬｐｘＥ−ｆｒｔ−ｋａｎ−ｆｒｔ，Ｗ３１１０に形質転換させ、ＬＢ−アンピシリン固体培地で選別した。選別された大腸菌をＬＢ固体培地に接種し、４２℃の温度で選別し、ｂａｃＡとカナマイシンカセットとが除去され、ＨｐＬｐｘＥが導入された大腸菌ストレイン、すなわち、△ｌｐｘＴ，△ｐａｇＰ，ｂａｃＡ：：ＨｐＬｐｘＥ，Ｗ３１１０を準備した（図３及び図４の最初行で左側参照）。
【００７２】
［２．１．５．大腸菌ｐＷＳＫ２９−ＥｃＬｐｘＬＥｃＬｐｘＭ，△ｌｐｘＴ，△ｐａｇＰ，ｂａｃＡ：：ＨｐＬｐｘＥ，Ｗ３１１０ストレインの準備］
１．１．に記載されたように準備されたｐＷＳＫ２９−ＥｃＬｐｘＬＥｃＬｐｘＭプラスミドを、２．１．４で記載されたように準備された△ｌｐｘＴ，△ｐａｇＰ，ｂａｃＡ：：ＨｐＬｐｘＥ，Ｗ３１１０に、電気穿孔法で形質転換させた。形質転換された大腸菌を選別し、大腸菌ｐＷＳＫ２９−ＥｃＬｐｘＬＥｃＬｐｘＭ，△ｌｐｘＴ，△ｐａｇＰ，ｂａｃＡ：：ＨｐＬｐｘＥ，Ｗ３１１０ストレインを準備した（図４の最初行で真ん中参照）。
【００７３】
［２．１．６．大腸菌ＫＨＳＣ００４４ストレインの準備］
大腸菌染色体において、ＫｄｔＡポリペプチド（配列番号２２）をコーディングするｋｄｔＡ遺伝子（配列番号２３）にカナマイシンカセットが挿入されており、ｐＥｃＫｄｔＡプラスミドを含んでいる大腸菌、すなわち、ＨＳＣ１／ｐＥｃＫｄｔ（Chung, H. S., and Raetz, C. R., Biochemistry (2010), vol. 49 (19), pp. 4126-4137）から、Ｐ１ウイルスを準備した。前記Ｐ１ウイルスを、２．１．５．で準備された大腸菌ｐＷＳＫ２９−ＥｃＬｐｘＬＥｃＬｐｘＭ，△ｌｐｘＴ，△ｐａｇＰ，ｂａｃＡ：：ＨｐＬｐｘＥ，Ｗ３１１０ストレインに形質導入し（図３参照）、この大腸菌を選別した。選別された大腸菌を、ＫＨＳＣ００４４（ｐＷＳＫ２９−ＥｃＬｐｘＬＥｃＬｐｘＭ，△ｌｐｘＴ，△ｐａｇＰ，ｂａｃＡ：：ＨｐＬｐｘＥ，ｋｄｔＡ：：ｋａｎ，Ｗ３１１０）と命名した（図４の最初行で右側参照）。
【００７４】
［２．２．大腸菌ＫＨＳＣ００３１（ｐＷＳＫ２９−ＥｃＬｐｘＬＥｃＬｐｘＭ，△ｌｐｘＴ，△ｐａｇＰ，△ｙｂｊＧ，ｂａｃＡ：：ＨｐＬｐｘＥ，ｋｄｔＡ：：ｋａｎ，Ｗ３１１０）ストレインの準備］
［２．２．１．ｌｐｘＴ，ｐａｇＰ，ｙｂｊＧ遺伝子がゲノムから除去され、ゲノムのｂａｃＡ遺伝子がＨｐＬｐｘＥ遺伝子で代替された大腸菌の準備］
大腸菌ゲノム中のｙｂｊＧ遺伝子に、カナマイシンカセットが挿入された大腸菌ストレイン（ＪＷ５１１２（ｙｂｊＧ：：ｋａｎ））（Keio Ｅ．ｃｏｌｉ knockout library）からＰ１ウイルスを準備した。２．１．４．で準備された△ｌｐｘＴ，△ｐａｇＰ，ｂａｃＡ：：ＨｐＬｐｘＥ，Ｗ３１１０にＰ１ウイルスを形質導入した。大腸菌をＬＢ−カナマイシン固体培地で選別し、ｙｂｊＧ遺伝子の代わりに、ｙｂｊＧ：：ｋａｎが挿入された大腸菌ストレイン、すなわち、△ｌｐｘＴ，△ｐａｇＰ，ｂａｃＡ：：ＨｐＬｐｘＥ，ｙｂｊＧ：：ｋａｎ，Ｗ３１１０を準備した。
【００７５】
２．１．１．に記載されたようなｐＣＰ２０プラスミドを、前記△ｌｐｘＴ，△ｐａｇＰ，ｂａｃＡ：：ＨｐＬｐｘＥ，ｙｂｊＧ：：ｋａｎ，Ｗ３１１０に形質転換させ、ＬＢ−アンピシリン固体培地で選別した。選別された大腸菌をＬＢ−アンピシリン固体培地で選別した後、接種して４２℃の温度で選別し、ｙｂｊＧとカナマイシンカセットとが除去された大腸菌ストレイン、すなわち、△ｌｐｘＴ，△ｐａｇＰ，△ｙｂｊＧ，ｂａｃＡ：：ＨｐＬｐｘＥ，Ｗ３１１０を準備した（図４の２行目で左側参照）。
【００７６】
［２．２．２．大腸菌ｐＷＳＫ２９−ＥｃＬｐｘＬＥｃＬｐｘＭ，△ｌｐｘＴ，△ｐａｇＰ，△ｙｂｊＧ，ｂａｃＡ：：ＨｐＬｐｘＥ，ｋｄｔＡ：：ｋａｎ，Ｗ３１１０ストレインの準備］
１．１．に記載されたように準備されたｐＷＳＫ２９−ＥｃＬｐｘＬＥｃＬｐｘＭプラスミドを、２．２．１．で記載されたように準備された△ｌｐｘＴ，△ｐａｇＰ，△ｙｂｊＧ，ｂａｃＡ：：ＨｐＬｐｘＥ，Ｗ３１１０に電気穿孔法で形質転換させた。形質転換された大腸菌をＬＢ−アンピシリン固体培地で選別し、大腸菌ｐＷＳＫ２９−ＥｃＬｐｘＬＥｃＬｐｘＭ，△ｌｐｘＴ，△ｐａｇＰ，△ｙｂｊＧ，ｂａｃＡ：：ＨｐＬｐｘＥ，Ｗ３１１０ストレインを準備した（図４の２行目で真ん中参照）。
【００７７】
［２．２．３．大腸菌ＫＨＳＣ００３１ストレインの準備］
２．１．６．に記載されたようなＨＳＣ１／ｐＥｃＫｄｔからＰ１ウイルスを準備した。前記Ｐ１ウイルスを、２．２．２．で準備された大腸菌ｐＷＳＫ２９−ＥｃＬｐｘＬＥｃＬｐｘＭ，△ｌｐｘＴ，△ｐａｇＰ，△ｙｂｊＧ，ｂａｃＡ：：ＨｐＬｐｘＥ，Ｗ３１１０ストレインに形質導入し、ＬＢ−カナマイシン／アンピシリン固体培地で選別した。選別された大腸菌を、ＫＨＳＣ００３１（ｐＷＳＫ２９−ＥｃＬｐｘＬＥｃＬｐｘＭ，△ｌｐｘＴ，△ｐａｇＰ，△ｙｂｊＧ，ｂａｃＡ：：ＨｐＬｐｘＥ，ｋｄｔＡ：：ｋａｎ，Ｗ３１１０）と命名した（図４の２行目で右側参照）。
【００７８】
［２．３．大腸菌ＫＨＳＣ００４５（ｐＷＳＫ２９−ＥｃＬｐｘＬＥｃＬｐｘＭ，△ｌｐｘＴ，△ｐａｇＰ，△ｙｂｊＧ，△ｐｇｐＢ，ｂａｃＡ：：ＨｐＬｐｘＥ，ｋｄｔＡ：：ｋａｎ，Ｗ３１１０）ストレインの準備］
［２．３．１．ｌｐｘＴ，ｐａｇＰ，ｙｂｊＧ及びｐｇｐＢ遺伝子がゲノムから除去され、ゲノムのｂａｃＡ遺伝子がＨｐＬｐｘＥ遺伝子で代替された大腸菌の準備］
大腸菌ゲノム中のｐｇｐＢ遺伝子にカナマイシンカセットが挿入された大腸菌ストレイン（ＪＷ１２７０（ｐｇｐＢ：：ｋａｎ））（Keio Ｅ．ｃｏｌｉ knockout library）からＰ１ウイルスを準備した。２．２．１．で準備された△ｌｐｘＴ，△ｐａｇＰ，△ｙｂｊＧ，ｂａｃＡ：：ＨｐＬｐｘＥ，Ｗ３１１０にＰ１ウイルスを形質導入させ、ＬＢ−カナマイシン固体培地で選別し、ｐｇｐＢ遺伝子の代わりに、ｐｇｐＢ：：ｋａｎが挿入された大腸菌ストレイン、すなわち、△ｌｐｘＴ，△ｐａｇＰ，△ｙｂｊＧ，ｂａｃＡ：：ＨｐＬｐｘＥ，ｐｇｐＢ：：ｋａｎＷ３１１０を準備した。
【００７９】
２．１．１．に記載されたようなｐＣＰ２０プラスミドを、前記△ｌｐｘＴ，△ｐａｇＰ，△ｙｂｊＧ，ｂａｃＡ：：ＨｐＬｐｘＥ，ｐｇｐＢ：：ｋａｎ，Ｗ３１１０に形質転換させ、ＬＢ−アンピシリン固体培地で選別した。選別された大腸菌をＬＢ固体培地に接種し、４２℃の温度で選別し、ｐｇｐＢとカナマイシンカセットとが除去された大腸菌ストレイン、すなわち、△ｌｐｘＴ，△ｐａｇＰ，△ｙｂｊＧ，△ｐｇｐＢ，ｂａｃＡ：：ＨｐＬｐｘＥ，Ｗ３１１０を準備した（図４の３行目で左側参照）。
【００８０】
［２．３．２．大腸菌ｐＷＳＫ２９−ＥｃＬｐｘＬＥｃＬｐｘＭ，△ｌｐｘＴ，△ｐａｇＰ，△ｙｂｊＧ，△ｐｇｐＢ，ｂａｃＡ：：ＨｐＬｐｘＥ，ｋｄｔＡ：：ｋａｎ，Ｗ３１１０ストレインの準備］
１．１．で準備されたｐＷＳＫ２９−ＥｃＬｐｘＬＥｃＬｐｘＭプラスミドを、２．３．１で準備された△ｌｐｘＴ，△ｐａｇＰ，△ｙｂｊＧ，△ｐｇｐＢ，ｂａｃＡ：：ＨｐＬｐｘＥ，Ｗ３１１０に電気穿孔法で形質転換させた。形質転換された大腸菌をＬＢ−アンピシリン固体培地で選別し、大腸菌ｐＷＳＫ２９−ＥｃＬｐｘＬＥｃＬｐｘＭ，△ｌｐｘＴ，△ｐａｇＰ，△ｙｂｊＧ，△ｐｇｐＢ，ｂａｃＡ：：ＨｐＬｐｘＥ，Ｗ３１１０ストレインを準備した（図４の３行目で真ん中参照）。
【００８１】
［２．３．３．大腸菌ＫＨＳＣ００４５ストレインの準備］
２．１．６．に記載されたようなＨＳＣ１／ｐＥｃＫｄｔ（Chung, H. S., and Raetz, C. R., Biochemistry (2010), vol. 49 (19), pp. 4126-4137）からＰ１ウイルスを準備した。前記Ｐ１ウイルスを、２．３．２．で準備された大腸菌ｐＷＳＫ２９−ＥｃＬｐｘＬＥｃＬｐｘＭ，△ｌｐｘＴ，△ｐａｇＰ，△ｙｂｊＧ，△ｐｇｐＢ，ｂａｃＡ：：ＨｐＬｐｘＥ，Ｗ３１１０ストレインに形質導入し、ＬＢ−カナマイシン／アンピシリン固体培地で選別した。選別された大腸菌をＫＨＳＣ００４５（ｐＷＳＫ２９−ＥｃＬｐｘＬＥｃＬｐｘＭ，△ｌｐｘＴ，△ｐａｇＰ，△ｙｂｊＧ，△ｐｇｐＢ，ｂａｃＡ：：ＨｐＬｐｘＥ，ｋｄｔＡ：：ｋａｎ，Ｗ３１１０）と命名した（図４の３行目で右側参照）。ＫＨＳＣ００４５ストレインは、２０１７年７月６日付けで、ブダペスト条約により、国際寄託機関である韓国生命工学研究院（the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology）に寄託した（受託番号：ＫＣＴＣ １３２９６ＢＰ）。
【００８２】
［２．４．大腸菌ＫＨＳＣ００５５（ｐＫＨＳＣ０００４，△ｌｐｘＴ，△ｐａｇＰ，△ｙｂｊＧ，△ｐｇｐＢ，ｂａｃＡ：：ＨｐＬｐｘＥ，ｋｄｔＡ：：ｋａｎ，Ｗ３１１０）ストレインの準備］
［２．４．１大腸菌ｐＫＨＳＣ０００４，△ｌｐｘＴ，△ｐａｇＰ，△ｙｂｊＧ，△ｐｇｐＢ，ｂａｃＡ：：ＨｐＬｐｘＥ，ｋｄｔＡ：：ｋａｎ，Ｗ３１１０ストレインの準備］
１．２．で準備されたｐＫＨＳＣ０００４プラスミドを、２．３．１で準備された△ｌｐｘＴ，△ｐａｇＰ，△ｙｂｊＧ，△ｐｇｐＢ，ｂａｃＡ：：ＨｐＬｐｘＥ，Ｗ３１１０に電気穿孔法で形質転換させた。形質転換された大腸菌をＬＢ−アンピシリン固体培地で選別し、大腸菌ｐＫＨＳＣ０００４，△ｌｐｘＴ，△ｐａｇＰ，△ｙｂｊＧ，△ｐｇｐＢ，ｂａｃＡ：：ＨｐＬｐｘＥ，Ｗ３１１０ストレインを準備した（図４の４行目で左側参照）。
【００８３】
［２．４．２．大腸菌ＫＨＳＣ００５５ストレインの準備］
大腸菌染色体中のＫｄｔＡポリペプチド（配列番号２２）をコーディングするｋｄｔＡ遺伝子（配列番号２３）に、カナマイシンカセット（ｆｒｔ−ｋａｎ−ｆｒｔ）が挿入され、ｐＥｃＫｄｔＡプラスミドを含んでいる大腸菌を下記方法で準備した。
【００８４】
ｋｄｔＡ遺伝子と相同組換えすることができるｋｄｔＡ：：ｆｒｔ−ｋａｎ−ｆｒｔポリヌクレオチドを増幅するために、ｐＫＤ４（Kirill A. Datsenko, and Barry L. Wanner PNAS (2000), vol. 97, pp. 6640-6645）プラスミドをテンプレートにし、下記プライマーカップルを利用して増幅した：
ｋｄｔＡ：：ｆｒｔ−ｋａｎ−ｆｒｔ増幅用順方向プライマー：
５’−ＧＣＴＡＡＡＴＡＣＡＴＡＧＡＡＴＣＣＣＣＡＧＣＡＣＡＴＣＣＡＴＡＡＧＴＣＡＧＣＴＡＴＴＴＡＣＴＡＴＧＣＴＣＧＡＡＴＴＧＣＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ−３’（配列番号２４）
ｋｄｔＡ：：ｆｒｔ−ｋａｎ−ｆｒｔ増幅用逆方向プライマー：
５’−ＡＴＣＧＡＴＡＴＧＡＣＣＡＴＴＧＧＴＡＡＴＧＧＧＡＴＣＧＡＡＡＧＴＡＣＣＣＧＧＡＴＡＡＡＴＣＧＣＣＣＧＴＴＴＴＴＧＣＡＴＴＧＡＡＴＡＴＣＣＴＣＣＴＴＡＧＴＴＣＣＴＡＴＴＣＣ−３’（配列番号２５）
ＰＣＲのために、ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＬＰＩＳ）を使用し、Ｔ３０００thermocycler（Biometra）で行った。
【００８５】
ＰＣＲ後、増幅された産物を、１．１．に記載されたように精製した。精製された産物を、ｐＥｃＫｄｔＡ（Chung, H. S., and Raetz, C. R., Biochemistry (2010), vol. 49 (19), pp. 4126-4137）プラスミドを含んでいる大腸菌ＤＹ３３０に電気穿孔法で形質転換し、ＤＹ３３０ゲノムのｋｄｔＡ遺伝子の上下塩基配列との相同組換え過程を介し、ｐＥｃＫｄｔＡ，ｋｄｔＡ：：ｆｒｔ−ｋａｎ−ｆｒｔ，ＤＹ３３０大腸菌を製造した（図３参照）。
【００８６】
ｐＥｃＫｄｔＡ，ｋｄｔＡ：：ｆｒｔ−ｋａｎ−ｆｒｔ，ＤＹ３３０からＰ１ウイルスを準備した。前記Ｐ１ウイルスを２．４．１．で準備された大腸菌ｐＫＨＳＣ０００４，△ｌｐｘＴ，△ｐａｇＰ，△ｙｂｊＧ，△ｐｇｐＢ，ｂａｃＡ：：ＨｐＬｐｘＥ，Ｗ３１１０ストレインに形質導入し、ＬＢ−カナマイシン固体培地で選別した。選別された大腸菌をＫＨＳＣ００５５（ｐＫＨＳＣ０００４，△ｌｐｘＴ，△ｐａｇＰ，△ｙｂｊＧ，△ｐｇｐＢ，ｂａｃＡ：：ＨｐＬｐｘＥ，ｋｄｔＡ：：ｆｒｔ−ｋａｎ−ｆｒｔ，Ｗ３１１０）と命名した（図４の４行目で右側参照）。ＫＨＳＣ００５５ストレインは、２０１７年７月６日付けで、ブダペスト条約により、国際寄託機関である韓国生命工学研究院（the Kkorea Research Institute of Bioscience and Biotechnology）に寄託した（受託番号：ＫＣＴＣ １３２９７ＢＰ）。
【００８７】
［実施例３．ＫＨＳＣ００４４，ＫＨＳＣ３１，ＫＨＳＣ００４５及びＫＨＳＣ００５５大腸菌での脂質組成の確認］
［３．１．ＫＨＳＣ００４４、ＫＨＳＣ００３１及びＫＨＳＣ００４５の培養］
それぞれ２．１．６．、２．２．３．及び２．３．３．に記載されたように、大腸菌ＫＨＳＣ００４４，ＫＨＳＣ００３１及びＫＨＳＣ００４５を準備した。
【００８８】
各大腸菌ストック（stock）から、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン（ＥＭＤ millipore）、及び１ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（ＵＢＰ Ｂｉｏ）を含むＬＢ固体培地に接種し、再培養した。ＫＨＳＣ００４４（８個コロニー）、ＫＨＳＣ００３１（７個コロニー）及びＫＨＳＣ００４５（７個コロニー）を選択し、それぞれ５０μｇ／ｍＬのアンピシリン（ＥＭＤ millipore）、及び１ｍＭのＩＰＴＧを含む３ｍＬのＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩中培養した。培養液を５０μｇ／ｍＬのアンピシリン、及び１ｍＭのＩＰＴＧを含む２００ｍＬのＬＢ液体培地に接種し、ＯＤ６００が０．０６ないし０．１になるように希釈し、３０℃で一晩中培養した。
【００８９】
［３．２．ＫＨＳＣ００５５の培養］
２．４．２．に記載されたように、大腸菌ＫＨＳＣ００５５を準備した。
【００９０】
ＫＨＳＣ００５５ストックから、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン含有／非含有のＬＢ液体培地３ｍＬに接種し、３０℃で一晩中培養した。培養液を、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン含有／非含有の２００ｍＬのＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩中培養した。
【００９１】
［３．３．ＫＨＳＣ００４４，ＫＨＳＣ００３１，ＫＨＳＣ００４５及びＫＨＳＣ００５５大腸菌からの脂質抽出］
３．１．及び３．２．に記載されたように培養した大腸菌培養液を、常温で４，０００ｘｇの速度で約２０分間遠心分離し、各ストレインの大腸菌を得た。得られた大腸菌を３０ｍＬのＰＢＳで洗浄した後、８ｍＬのＰＢＳに再懸濁した。
【００９２】
再懸濁された大腸菌に、１０ｍＬのクロロホルム及び２０ｍＬのメタノールを加え、時折振盪しながら、約１時間常温でインキュベーションした。順に、インキュベーションされた混合物を、常温で２，５００ｘｇの速度で約３０分間遠心分離して上澄み液を得た。得られた上澄み液に、１０ｍＬのクロロホルム、及び１０ｍＬの水を加えて完全に混合した後、常温で、２，５００ｘｇの速度で約２０分間遠心分離した。遠心分離された混合物から有機溶媒層を分離し、上部の水性層に、あらかじめ平衡化された有機溶媒層を添加し、有機溶媒層を２回抽出した。有機溶媒層をプーリング（pooling）し、回転蒸発機で乾燥させて脂質を得た。得られた脂質を、５ｍＬの４：１（ｖ／ｖ）クロロホルム：メタノールに溶解させ、水槽で超音波を照射した。超音波が照射された脂質を新たな試験管に移し、得られた脂質を常温で窒素ガス下で乾燥させた後、−８０℃で保管した。
【００９３】
［３．４．薄膜クロマトグラフィ（ＴＬＣ）による脂質分析］
３．３．に記載されたように分離され各ストレインの大腸菌からの膜脂質は、陽性対照群として、ＭＰＬＡ Synthetic（ＩｎｖｏｖｏＧｅｎ、カタログコード：ｔｌｒｌ−ｍｐｌｓ）、合成された１−脱リン酸−ヘキサアシル化された脂質Ａ（図５のレーン６、図６のレーン１）及びＭＰＬＡ−ＳＭ（ＩｎｖｏｖｏＧｅｎ、カタログコードｔｌｒｌ−ｍｐｌａ、サルモネラミネソタＲ５９５のＬＰＳを酸塩基加水分解した後で分離精製した１−脱リン酸−脂質Ａ（図５のレーン７）を使用して分析した。
【００９４】
薄膜クロマトグラフィ（ＴＬＣ：thin layer chromatography）を遂行するために、３．２．に記載されたように、２００ｍＬの大腸菌培養液から脂質を得て、得られた総脂質の１／３を２００μＬの４：１（ｖ／ｖ）クロロホルム：メタノールに溶解させた。その後、５μＬないし１５μＬを１０ｘ１０ｃｍ高性能ＴＬＣ（ＨＰＴＬＣ：high-performance ＴＬＣ）プレート（ＥＭＤ Chemicals）にスポッティング（spotting）し、４０：２５：４：２（ｖ／ｖ）のクロロホルム：メタノール：水：アンモニウムヒドロキシド（２８％（ｖ／ｖ）アンモニア）の溶媒で展開した。展開されたプレートを乾燥させ、１０％（ｖ／ｖ）硫酸（エタノール中）に噴霧して視覚化させ、３００℃のホットプレートで加熱した。脂質のＴＬＣ結果を図５、図６及び図７に示した。
【００９５】
図５は、大腸菌ゲノムのｂａｃＡを除去し、脱リン酸化酵素で代替された菌株から抽出された脂質のＴＬＣ結果を示す写真である。図５において、レーン１は、１−脱リン酸−脂質Ａを生産するＫＨＳＣ００４４（同一細胞ストックで培養したコロニー８個のうち２個）であり、レーン２は、１−脱リン酸−脂質Ａを生産することができないＫＨＳＣ００４４（同一細胞ストックで培養したコロニー８個のうち６個）であり、レーン３は、１−脱リン酸−脂質Ａを生産するＫＨＳＣ００３１（同一細胞ストックで培養したコロニー７個のうち６個）であり、レーン４は、１−脱リン酸−脂質Ａを生産することができないＫＨＳＣ００３１（同一細胞ストックで培養したコロニー７個のうち１個）であり、レーン５は、１−脱リン酸−脂質Ａを安定して生産する大腸菌ＫＨＳＣ００４５（同一細胞ストックで培養したコロニー７個のうち７個全部）であり、レーン６は、合成された１−脱リン酸−ヘキサアシル化された脂質Ａ（ＩｎｖｏｖｏＧｅｎ、カタログコードｔｌｒｌ−ｍｐｌｓ）であり、レーン７は、サルモネラミネソタＲ５９５から、酸塩基加水分解後に分離及び精製された１−脱リン酸−脂質Ａ（ＩｎｖｏｖｏＧｅｎ、カタログコード：ｔｌｒｌ−ｍｐｌａ）である。
【００９６】
図６は、大腸菌ＫＨＳＣ００４５と大腸菌ＫＨＳＣ００５５との脂質ＴＬＣ結果を示す写真である。図６において、レーン１は、合成された１−脱リン酸−ヘキサアシル化された脂質Ａ（ＩｎｖｏｖｏＧｅｎ、カタログコードｔｌｒｌ−ｍｐｌｓ）であり、レーン２は、過発現誘導剤を使用し、脂質化酵素の過発現を誘導して培養したＫＨＳＣ００４５であり、レーン３は、過発現誘導剤の使用なしに培養したＫＨＳＣ００５５である。
【００９７】
図７は、大腸菌ＫＨＳＣ００４５，ＫＨＳＣ００５５の脂質のＴＬＣ結果を示す写真であり、レーン１は、抗生物質と培養したＫＨＳＣ００５５であり、レーン３は、抗生物質の使用なしに培養したＫＨＳＣ００５５である。
【００９８】
図５に示されているように、ＫＨＳＣ００４４及びＫＨＳＣ００３１は、それぞれ１つのコロニーから作られた細胞ストックであるにもかかわらず、選択された８個のＫＨＳＣ００４４コロニーのうち、１−脱リン酸−脂質Ａが検出されたコロニー（レーン１、８個のコロニー中の２個）と、それが検出されないコロニー（レーン２、８個のコロニーのうち６個）、並びに選択された７個のＫＨＳＣ００３１コロニーのうち、１−脱リン酸−脂質Ａ街検出されたコロニー（レーン３、７個のコロニーのうち６個）と、それが検出されないコロニー（レーン４、７個のコロニーのうち１個）が含まれるということを確認した。しかし、１−脱リン酸−脂質Ａは、ＫＨＳＣ００４５の選択された７個のコロニーいずれもで検出された（レーン５）。
【００９９】
そのような結果は、大腸菌のゲノムに脱リン酸化酵素を挿入する場合、大腸菌は、１−脱リン酸−脂質Ａを生産する菌株において、挿入された脱リン酸化酵素の活性を不活性化させ、１−脱リン酸−脂質Ａを生産することができない菌株として、容易に自然突然変異体大腸菌を形成することを示す。
【０１００】
従って、脱リン酸化酵素をゲノムに挿入し、１−脱リン酸−脂質Ａを生成するために、大腸菌のゲノムに存在するウンデカプレニルピロホスフェートホスファターゼ（Ｕｎｄ−ＰＰホスファターゼ）遺伝子（ｂａｃＡ、ｐｇｐＢまたはｙｂｊＧ）、あるいはホスファチジルグリセロールリン酸ホスファターゼ（ＰＧＰホスファターゼ）遺伝子（ｐｇｐＢ、ｐｇｐＡまたはｐｇｐＣ）のそれぞれ、あるいはそれらの組み合わせをゲノムから除去すれば（図５のレーン１、レーン３またはレーン５）、大腸菌から１−脱リン酸−脂質Ａを安定して生成し、自然突然変異の確率が低下した生きている大腸菌を得る可能性があるということを確認した。
【０１０１】
大腸菌ＫＨＳＣ００４５に対して、培養時、脂質化酵素の過発現が、１−脱リン酸−ヘキサアシル化された脂質Ａを効果的に生成するのに必要である。合成された１−脱リン酸−ヘキサアシル化された脂質Ａ（図６のレーン１）と、過発現誘導剤を使用し、脂質化酵素の過発現を誘導して培養したＫＨＳＣ００４５とを陽性対照群として使用し、膜脂質成分を比較した結果、ｐＫＨＳＣ０００４に形質転換させた大腸菌ＫＨＳＣ００５５は、過発現誘導剤の使用なしにも、１−脱リン酸−ヘキサアシル化された脂質Ａ（図６のレーン３）を効果的に生産する生きている大腸菌であるということを確認した（図６のレーン３）。
【０１０２】
大腸菌ＫＨＳＣ００５５については、プラスミドｐＫＨＳＣ０００４は、大腸菌ＫＨＳＣ００５５で安定して維持されるが、大腸菌ＫＨＳＣ００５５は、抗生物質の存在（図７のレーン１）、または抗生物質の使用なしに（図７のレーン２）、１−脱リン酸−ヘキサアシル化された脂質Ａを効果的に生産した。
【０１０３】
前述のように、１以上の具体例により、ＭＬＡを構成的に生産する細菌、及び前記細菌を利用してＭＬＡを生産する方法は、酸加水分解なしに、単にＭＬＡ及びその誘導体を生産することができ、自然突然変異の可能性を低下させ、ＭＬＡ及びその誘導体の構成的発現により、ＭＬＡ及びその誘導体を、上昇した収率で生産することができる。
【０１０４】
寄託機関名称：韓国生命工学研究院生物資源センター（Korean Collection for Type Cultures）
受託番号：ＫＣＴＣ１３２９６ＢＰ
受託日：Ｊｕｌｙ ０６，２０１７
【他１】
【０１０５】
0006980041.tif 000002
【他２】
【０１０６】
0006980041.tif 000003
【０１０７】
寄託機関名称：韓国生命工学研究院生物資源センター（Korean Collection for Type Cultures）
受託番号：ＫＣＴＣ１３２９７ＢＰ
受託日：Ｊｕｌｙ ０６，２０１７
【他３】
【０１０８】
0006980041.tif 000004
【他４】
【０１０９】
0006980041.tif 000005
【０１１０】
本明細書に記載された具体例は、説明の意味としてのみ考慮されなければならず、限定の目的のためではないと見なされなければならない。各具体例内の特徴または様相の説明は、一般的に他の具体例での他の類似の特徴または様相に利用可能であると見なされなければならない。
【０１１１】
１以上の具体例について、図面を参照して説明されたが、本技術分野の当業者であるならば、特許請求の範囲によって定義されたような本明細書の思想及び範囲を外れずに、形態及び細部事項の多様な変更がなされるものであると理解するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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