(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪肝を治療するための薬剤を調製するための安定性の高いマンガンスーパーオキシドジスムターゼの使用であって、前記安定性の高いマンガンスーパーオキシドジスムターゼのアミノ酸配列が配列識別番号４に示される、
使用。
【請求項２】
前記脂肪肝がアルコール性脂肪肝または非アルコール性脂肪肝である、
請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記脂肪肝がメタボリックシンドロームを伴う脂肪肝である、
請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記メタボリックシンドロームが高血糖またはインスリン抵抗性である、
請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記薬剤が経口、注射または胃内経路によって投与される、
請求項１から４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記注射が静脈内注射静脈注射または腹腔内注射である、
請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記薬剤の剤形が、錠剤、カプセル剤、粉末注射剤、注射またはエアロゾルである、
請求項１から４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記薬剤が１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、
請求項１から４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記賦形剤が希釈剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、溶媒および／または緩衝剤である、
請求項８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物医学、機能性食品等の分野に属し、特にスーパーオキシドジスムターゼの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪肝は広範囲に及ぶ慢性疾患であり、アルコール性脂肪肝疾患（ＡＬＤ）と非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）に分類することができる。脂肪肝は、肝硬変および肝臓がんなどの肝疾患の主因である。非アルコール性脂肪肝疾患は、脂肪蓄積および代謝障害（インスリン抵抗性など）を伴う肝臓を特徴とする。長期の高脂肪食またはレプチンをコードする肥満遺伝子のノックアウトによって引き起こされる脂肪肝および代謝の変化は、最終的に、肝線維症、肝硬変および肝臓がんなどの非アルコール性脂肪肝疾患の発生につながる。アルコール性脂肪肝疾患は、長期にわたるアルコール乱用によって引き起こされ、単純な脂肪症から末期の肝疾患に至ることもある。非アルコール性脂肪肝疾患およびアルコール性脂肪肝疾患の病因は非常に複雑であるが、腸バリア損傷が、腸内細菌叢の変化ならびにＮＡＦＬＤおよびＡＬＤの発生を伴って、病原体関連分子パターン（ｐａｍｐｓ）の腸管外組織への移行につながることを示す証拠が増加している。腸バリア損傷は脂肪肝発達の重要な駆動因子（ｄｒｉｖｅｒ）であることが知られているが、腸バリア損傷を修復することによって脂肪肝症状を治療する有効な方法はほとんどない。
【０００３】
フリーラジカルは、長期間の腸バリアの破壊に関与していると考えられてきたが、腸内容物のフリーラジカルに注意を払った人はほとんどいなかった。インビトロ研究は、細胞内および細胞外スーパーオキシドラジカルがＣａｃｏ−２細胞の単層構造を破壊することができることを示している。現在、細胞外スーパーオキシドは、マクロファージおよび単球を含む炎症細胞に主に由来すると考えられている。一方、メタゲノミクスの分析は、代謝性疾患の患者の腸内細菌叢の酸化ストレスが有意に増加したことを示している。ラットモデルで、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）菌株が細胞外スーパーオキシドを産生し、ヒドロキシルラジカルを産生することは注目に値する。腸内細菌叢がスーパーオキシドを産生することを示す直接的な証拠がないにも関わらず、腸内微生物は細胞外スーパーオキシドの別の供給源であり得、腸管の局所環境に影響を及ぼし得る。最近の研究は、高脂肪食の摂食が腸内微生物の活性酸素種（ＲＯＳ）の増加と密接に関連していることを示しているが、脂肪肝の発生に対する腸内細菌叢の活性酸素の影響の詳細は未だ研究されていない。
【発明の概要】
【０００４】
本出願の発明者らは、脂肪肝に対する腸内細菌スーパーオキシドの潜在的効果を調査し、脂肪肝を治療するための新しいアプローチを提案した。
【０００５】
具体的には、本発明は、脂肪肝を治療するための薬剤を調製するための安定性の高いマンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭＳ−ＳＯＤ）の使用であって、安定性の高いマンガンスーパーオキシドジスムターゼのアミノ酸配列が配列識別番号４に示される使用を提供する。
【０００６】
特定の実施形態では、脂肪肝がアルコール性脂肪肝または非アルコール性脂肪肝である。
【０００７】
特定の実施形態では、脂肪肝がメタボリックシンドロームを伴う脂肪肝である。
【０００８】
好ましくは、メタボリックシンドロームが高血糖またはインスリン抵抗性である。
【０００９】
好ましくは、薬剤が経口、注射または胃内経路によって投与される。
【００１０】
さらに好ましくは、注射が静脈注射または腹腔内注射である。
【００１１】
好ましくは、薬剤の剤形が、錠剤、カプセル剤、粉末注射、注射またはエアロゾルである。
【００１２】
好ましくは、薬剤が、１つまたは複数の希釈剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、溶媒および／または緩衝剤などのような薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。これらの賦形剤は、ＭＳ−ＳＯＤと共に当技術分野で周知の様式で薬剤として調製され、その量も当業者に知られている。
【００１３】
本発明によって提供される安定性の高いマンガンスーパーオキシドジスムターゼは、スーパーオキシドレベルを有効に減少させることができ、アルコール性脂肪肝、非アルコール性脂肪肝、メタボリックシンドロームを伴う脂肪肝などの種々のタイプの脂肪肝に対して優れた治療効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】酸化ストレスに関連する酵素の遺伝子存在量分析を示す図である。
【００１５】
【図１Ｂ】マウス腸糞便中の相対的スーパーオキシドレベルを示す図である（ｎ＝８〜１４）。
【００１６】
【図２Ａ】血漿中の総ＳＯＤ活性を示す図である（ｎ＝８）。
【００１７】
【図２Ｂ】腸壁中の総ＳＯＤ活性を示す図である（ｎ＝８）。
【００１８】
【図２Ｃ】盲腸内容物中の総ＳＯＤ活性を示す図である（ｎ＝７〜８）。
【００１９】
【図３Ａ】高脂肪食群とＭＳ−ＳＯＤ処置群の体重比較を示す図である。
【００２０】
【図３Ｂ】脂肪組織の相対重量を示す図である。
【００２１】
【図３Ｃ】肝臓のＨＥおよびオイルレッドＯ染色のグラフである（ｎ＝６〜９）。
【００２２】
【図３Ｄ】脂肪肝スコアを示す図である（ｎ＝６〜９）。
【００２３】
【図３Ｅ】肝臓中の総トリグリセリド含量を示す図である（ｎ＝７〜１１）。
【００２４】
【図３Ｆ】肝細胞サイトカインおよびケモカインのｍＲＮＡ相対発現レベルを示す図である（ｎ＝１０〜１５）。
【００２５】
【図３Ｇ】ブドウ糖負荷試験（ＧＴＴ）結果を示す図である（ｎ＝１０〜２０）。
【００２６】
【図３Ｈ】インスリン負荷試験（ＩＴＴ）結果を示す図である（ｎ＝１０〜２０）。
【００２７】
【図３Ｉ】空腹時血糖値を示す図である（ｎ＝１０〜２０）。
【００２８】
【図３Ｊ】空腹時インスリンレベルを示す図である（ｎ＝１０〜２０）。
【００２９】
【図３Ｋ】インスリン抵抗性ＨＯＭＡ−ＩＲ指標レベルの恒常性モデル評価を示す図である（ｎ＝１０〜２０）。
【００３０】
【図４Ａ】血漿中のエタノール濃度を示す図である。
【００３１】
【図４Ｂ】肝臓中のアルコール脱水素酵素（Ａｄｈ１）およびチトクロムＰ４５０２Ｅ１（Ｃｙｐ２ｅ１）のｍＲＮＡレベルを示す図である。
【００３２】
【図４Ｃ】肝臓重量と体重の比を示す図である（ｎ＝８〜１０）。
【００３３】
【図４Ｄ】血漿中のアラニンアミノトランスフェラーゼレベルを示す図である（ｎ＝８〜１０）。
【００３４】
【図４Ｅ】肝臓のＨＥおよびオイルレッドＯ染色の結果を示す図である（ｎ＝６〜１０）。
【００３５】
【図４Ｆ】オイルレッドＯ染色に基づく脂肪肝スコアを示す図である（ｎ＝６〜１０）。
【００３６】
【図４Ｇ】肝臓中の総トリグリセリド含量を示す図である（ｎ＝７〜１０）。
【００３７】
【図４Ｈ】肝臓中のＣｃｌ２  ｍＲＮＡの相対発現レベルを示す図である（ｎ＝８〜１０）。
【００３８】
【図４Ｉ】腸糞便中のスーパーオキシドの相対量を示す図である（ｎ＝６〜８）。
【００３９】
【図４Ｊ】盲腸細菌のＰＣｏＡ分析を示す図である（ｎ＝６〜８）。
【００４０】
【図４Ｋ】糞便アルブミンレベルを示す図である（ｎ＝８〜１１）。
【００４１】
【図４Ｌ】血漿中のエンドトキシンレベルを示す図である（ｎ＝８〜１１）。
【００４２】
【図５Ａ】体重の変化を示す図である。
【００４３】
【図５Ｂ】脂肪組織の相対重量を示す図である。
【００４４】
【図５Ｃ】肝臓のＨＥおよびオイルレッドＯ染色の結果を示す図である。
【００４５】
【図５Ｄ】脂肪肝スコアを示す図である。
【００４６】
【図５Ｅ】肝臓中の総トリグリセリド含量を示す図である。
【００４７】
【図５Ｆ】肝臓中のＣｃｌ４  ｍＲＮＡレベルを示す図である。
【００４８】
【図５Ｇ】ブドウ糖負荷試験（ＧＴＴ）結果を示す図である。
【００４９】
【図５Ｈ】インスリン負荷試験（ＩＴＴ）結果を示す図である。
【００５０】
【図５Ｉ】腸内細菌叢の分類のバリエーションの図である。
【００５１】
【図５Ｊ】糞便アルブミンレベルを示す図である。
【００５２】
【図５Ｋ】血漿中のエンドトキシンリポ多糖レベルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
以下の実施例では、特に明記しない限り、種々の指標の検出および監視を、当技術分野で公知の方法によって行った。
【００５４】
それらのうち、血漿インスリン、グルコース、総コレステロールおよび血中エタノールを測定するためのキットは全て、南京建成生物工程研究所（Ｎａｎｊｉｎｇ  ＪｉａｎＣｈｅｎｇ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から購入した。ＬＰＳアッセイキットはＢｉｏｓｗａｍｐから購入した。
【００５５】
実施例で使用したマウスは全て広東実験動物センター（Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）から購入した。
【００５６】
ブドウ糖負荷試験（ＧＴＴ）およびインスリン負荷試験（ＩＴＴ）は「ブドウ糖負荷試験の原理および臨床応用（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  Ｔｅｓｔ）」、Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｍｅｄ  Ｊ．２００９、第３２巻、第５号、４４０〜４４３頁を参照されたい。
【００５７】
実施例１：安定性の高いマンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭＳ−ＳＯＤ）の調製
【００５８】
標的遺伝子を得るために、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＨＢ２７のゲノム（米国のＡＴＣＣセルバンクから購入、受託番号ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−１６３）を鋳型として使用して、以下のプライマー、順方向プライマー５'−ａａｇａａｔｔｃａｔｇｃｃｇｔａｃｃｃｇｔｔｃａａｇｃｔ−３'（配列識別番号１）および逆方向プライマー５'−ｃｔｇｔｃｇａｃｔｃａｇｇｃｔｔｔｇｔｔｇａａｇａａｃ−３'（配列識別番号２）を使用して増幅を行った。増幅産物を、回収キット（Ｓａｎｇｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（上海）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）を使用して回収し、酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌ  Ｉで二重消化し、同じ酵素で二重消化したプラスミドベクターｐＥＴ２８ａ（＋）（Ｓａｎｇｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（上海）Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．から購入）に連結した。組換えプラスミドをコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｓａｎｇｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（上海）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）に形質転換した。正しいＭＳ−ＳＯＤヌクレオチド配列を有する菌株を配列決定によってスクリーニングし、その菌株を培養してＭＳ−ＳＯＤタンパク質を得た。ＭＳ−ＳＯＤをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は以下の通りである。
ａｔｇｃｃｇｔａｃｃｃｇｔｔｃａａｇｃｔｔｃｃｔｇａｃｃｔａｇｇｃｔａｃｃｃｃｔａｃｇａｇｇｃｃｃｔｃｇａｇｃｃｃｃａｃａｔｔｇａｃｇｃｃａａｇａｃｃａｔｇｇａｇａｔｃｃａｃｃａｃｃａｇａａｇｃａｃｃａｃｇｇｇｇｃｃｔａｃｇｔｇａｃｇａａｃｃｔｃａａｃｇｃｃｇｃｃｃｔｇｇａｇａａｇｔａｃｃｃｃｔａｃｃｔｃｃａｃｇｇｇｇｔｇｇａｇｇｔｇｇａｇｇｔｃｃｔｃｃｔｇａｇｇｃａｃｃｔｃｇｃｃｇｃｃｃｔｔｃｃｃｃａｇｇａｃａｔｃｃａｇａｃｃｇｃｃｇｔｇｃｇｃａａｃａａｃｇｇｇｇｇｃｇｇｇｃａｃｃｔｇａａｃｃａｃａｇｃｃｔｃｔｔｃｔｇｇａｇｇｃｔｃｃｔｃａｃｃｃｃｃｇｇｇｇｇｇｇｃｃａａｇｇａｇｃｃｃｇｔｇｇｇｇｇａｇｃｔｇａａｇａａｇｇｃｃａｔｔｇａｃｇａｇｃａｇｔｔｃｇｇｇｇｇｃｔｔｃｃａｇｇｃｃｃｔｃａａｇｇａｇａａｇｃｔｃａｃｃｃａｇｇｃｇｇｃｃａｔｇｇｇｃｃｇｇｔｔｃｇｇｃｔｃｇｇｇｃｔｇｇｇｃｃｔｇｇｃｔｃｇｔｇａａｇｇａｃｃｃｃｔｔｃｇｇｃａａｇｃｔｃｃａｃｇｔｃｃｔｃｔｃｃａｃｃｃｃｃａａｃｃａａｇａｃａａｃｃｃｃｇｔｇａｔｇｇａｇｇｇｃｔｔｃａｃｃｃｃｃａｔｃｇｔｇｇｇｃａｔｔｇａｃｇｔｃｔｇｇｇａｇｃａｃｇｃｃｔａｃｔａｃｃｔｃａａｇｔａｃｃａｇａａｃｃｇｃｃｇｇｇｃｃｇａｔｔａｃｃｔｃｃａｇｇｃｃａｔｃｔｇｇａａｃｇｔｃｃｔｃａａｃｔｇｇｇａｃｇｔｇｇｃｃｇａｇｇａｇｔｔｃｔｔｃａａｔａａａｇｃｃｔｇａ（配列識別番号３）。
【００５９】
ＭＳ−ＳＯＤのアミノ酸配列は以下の通りである。  ＭＰＹＰＦＫＬＰＤＬＧＹＰＹＥＡＬＥＰＨＩＤＡＫＴＭＥＩＨＨＱＫＨＨＧＡＹＶＴＮＬＮＡＡＬＥＫＹＰＹＬＨＧＶＥＶＥＶＬＬＲＨＬＡＡＬＰＱＤＩＱＴＡＶＲＮＮＧＧＧＨＬＮＨＳＬＦＷＲＬＬＴＰＧＧＡＫＥＰＶＧＥＬＫＫＡＩＤＥＱＦＧＧＦＱＡＬＫＥＫＬＴＱＡＡＭＧＲＦＧＳＧＷＡＷＬＶＫＤＰＦＧＫＬＨＶＬＳＴＰＮＱＤＮＰＶＭＥＧＦＴＰＩＶＧＩＤＶＷＥＨＡＹＹＬＫＹＱＮＲＲＡＤＹＬＱＡＩＷＮＶＬＮＷＤＶＡＥＥＦＦＫＫＡ（配列識別番号４）。
【００６０】
実施例２：高脂肪食によって誘導されたマウスの腸内細菌叢に対するＭＳ−ＳＯＤの効果  １．動物モデルの確立６〜８週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（広東実験動物センターから購入）を３つの群に分けた。
（１）正常対照群（ＮＣ）：低脂肪食（脂肪由来カロリー１０％）を１８週間与えた。
（２）高脂肪食群（ＨＦＤ）：高脂肪食（脂肪由来カロリー６０％）を１８週間与えた。
（３）高脂肪食＋ＭＳ−ＳＯＤ群（ＨＦＤ＋ＭＳ−ＳＯＤ）：マウスに高脂肪食を１８週間与え、８週目から胃内投与によって３  Ｕ  ＭＳ−ＳＯＤ／ｇ体重を投与した。胃内投与の用量は、１８週目まで、１日１回、マウス１匹当たり０．１ｍｌとした。ＭＳ−ＳＯＤは、実施例１に示される調製物から得た。
【００６１】
低脂肪食の成分は、トウモロコシ粉、大豆粉、小麦粉、魚、植物油等である。
【００６２】
高脂肪食の成分は、低脂肪食にラードを追加した。
【００６３】
２．実験内容
（１）酸化ストレスに関連する酵素の検出バイオテクノロジー企業に委託して、ＮＣ群およびＨＦＤ群のマウスの腸内細菌叢に対するメタゲノミクス配列決定を行うことによって、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（Ｍｎ−ＳＯＤ）、銅−亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（ＣｕＺｎ−ＳＯＤ）、グルタチオンペルオキシダーゼ、カタラーゼおよびスーパーオキシドレダクターゼの遺伝子存在量を得た。具体的には、ａ．ＮＣ群およびＨＦＤ群のマウスの糞便をマウス１匹当たり１ｇずつ別々に取り、次いで、５ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する）に懸濁した。得られた試料を繰り返し凍結し、−８０℃および６０℃で３回解凍して、微生物細胞を破壊した。
【００６４】
ｂ．ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＴｒｉｚｏｌ方法キットを使用して試料の全ＲＮＡを抽出し、ＡＢＩ  ７５００  ｒｔＰＣＲシステムを使用したリアルタイム定量的蛍光ＰＣＲによって試料を検出した。
【００６５】
ｃ．酵素遺伝子の相対発現の測定  １８ｓＲＮＡを内部参照遺伝子として使用して、標的遺伝子と内部参照遺伝子を定量的ＰＣＲによって同時に増幅し、次いで、標的遺伝子の相対発現をＣｔ比較法によって分析した。プライマー配列は、ＮＩＨ  ｑＰｒｉｍｅｒｄｅｐｏｔデータベースから得た。
【００６６】
（２）スーパーオキシドレベルの検出  Ｂｅｙｏｔｉｍｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙのスーパーオキシド検出キットを使用して試験を行った。検出の原理は以下の通りである。スーパーオキシドを使用して水溶性テトラゾリウム−１（ＷＳＴ−１）を還元して、可溶性着色物質を生成することによって、スーパーオキシドを検出することができる。
【００６７】
ａ．２００μｌのスーパーオキシド緩衝液、１０μｌのＷＳＴ−１溶液、および２μｌのカタラーゼ溶液をＥＬＩＳＡプレートの検出ウェルに添加した。  ｂ．試験する処理試料を検出ウェルに添加した。  ｃ．３７℃で３分間インキュベートし、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【００６８】
３．実験結果
１）高脂肪食の摂取は、マウスの腸内微生物のスーパーオキシドレベルを増加させた。
【００６９】
マンガンスーパーオキシドジスムターゼ、銅−亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、カタラーゼおよびスーパーオキシドレダクターゼ遺伝子を含むマウスの活性酸素代謝に関連する遺伝子の試験を行ったところ、銅−亜鉛ＳＯＤを除く、全ての他の酵素の遺伝子存在量が減少することが分かった（図１Ａ）。しかしながら、マウスの腸内細菌叢のスーパーオキシドのレベルは有意に増加した（図１Ｂ）。これらのデータは、高脂肪食が腸内微生物のスーパーオキシドのレベルを増加させ、活性酸素代謝に関与する遺伝子の存在量を減少させ得ることを明確に示した。
【００７０】
２）ＭＳ−ＳＯＤは、高脂肪食によって誘導される腸内細菌叢のスーパーオキシドレベルの不均衡に対して修復効果を有していた。
【００７１】
上記のように、ＭＳ−ＳＯＤの効果を試験するために、比較実験を同時に行った。結果は、高脂肪食群マウスと比較して、ＭＳ−ＳＯＤ（胃内投与した）群のスーパーオキシドレベルが正常レベルに減少することを示し（図１Ｂ）、ＭＳ−ＳＯＤが高脂肪食によって誘導される腸内細菌叢のスーパーオキシドレベルの不均衡を修復することができることを示している。
【００７２】
実施例３：マウスの腸管におけるＳＯＤ活性に対するＭＳ−ＳＯＤの胃内投与および注射の効果
【００７３】
１．動物モデルの確立６〜８週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（広東実験動物センターから購入）を３つの群に分けた。
（１）ＭＳ−ＳＯＤ胃内投与群：マウスに６  Ｕ  ＭＳ−ＳＯＤ／ｇ体重／日を胃内（経口）投与し、胃内投与の用量はマウス１匹当たり０．１ｍｌ、１日１回、７連続日とした。
（２）リン酸緩衝液対照群：マウスに１日当たり０．１ｍｌの用量のリン酸緩衝液を、１日１回、７連続日にわたって胃内（経口）投与した。
（３）ＭＳ−ＳＯＤ腹腔内注射群：マウスに６  Ｕ  ＭＳ−ＳＯＤ／ｇ体重／日を腹腔内注射し、注射の用量はマウス１匹当たり０．１ｍｌ、１日１回、７連続日とした。
【００７４】
２．実験内容７日後、実験マウスの各群の血漿、空腸、回腸、結腸および盲腸内容物を採取し、ピロガロール法を使用して（ＧＢ／Ｔ５００９．１７１−２００３「健康食品中のスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）活性の測定（Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ  （ＳＯＤ）  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｆｏｏｄｓ）」参照）、ＳＯＤの活性を検出した。
【００７５】
３．実験結果図２Ａに示されるように、ＭＳ−ＳＯＤの注射は血漿中の総ＳＯＤ活性の増加を引き起こした。対照的に、ＭＳ−ＳＯＤを胃内（経口）投与しても、マウスの血漿中の総ＳＯＤは有意に変化せず、経口ＭＳ−ＳＯＤが腸外器官に影響を及ぼさなかったことを示している。図２Ｂに示されるように、空腸、回腸および結腸における総ＳＯＤ活性は有意に変化しなかった。しかしながら、図２Ｃに示されるように、盲腸内容物のＳＯＤ活性は有意に増強され、ＭＳ−ＳＯＤが腸内細菌環境の酸化還元電位を直接変化させることができることを示している。
【００７６】
実施例４：高脂肪食のマウスの肝臓の脂質蓄積およびメタボリックシンドロームに対するＭＳ−ＳＯＤの効果
【００７７】
１．動物モデルの確立動物モデルの確立は、実施例２と同じとした。
【００７８】
２．実験結果
（１）マウスの体重および脂肪組織含量を調べた。図３Ａおよび図３Ｂに示されるように、ＭＳ−ＳＯＤの胃内投与は、マウスの体重および脂肪組織含量を変化させなかった。しかしながら、肝臓切片から、長期の高脂肪食が脂肪肝につながったことが分かる。ＭＳ−ＳＯＤを胃内投与した後、脂肪肝症状は有意に軽減され（図３Ｃ〜図３Ｄ）、肝臓のトリグリセリド含量は有意に減少した（図３Ｅ）。
【００７９】
（２）肝臓組織のｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写した。肝臓における重要なサイトカインの発現を、リアルタイム蛍光定量的ＰＣＲによって試験した。結果は、ＭＳ−ＳＯＤが、高脂肪食の摂取中に腫瘍壊死因子ｔｎｆ−α、ケモカインｃｃｌ４、ｃｃｌ８、ｃｘｃｌ１、ｃｘｃｌ２およびｃｘｃｌ１０のｍＲＮＡレベルを有意に減少させることを示した（図３Ｆ）。
【００８０】
（３）高脂肪食の摂食は、耐糖能およびインスリン抵抗性などの代謝障害にもつながった。ブドウ糖負荷試験（ＧＴＴ）は、血糖値が、高脂肪食を与えたマウスと比較して、ＭＳ−ＳＯＤを胃内投与したマウスで有意に減少することを示した（図３Ｇ）。これと一致して、インスリン負荷試験の結果は、高脂肪食のみを与えられたマウスと比較して、高脂肪食を与えられ、ＭＳ−ＳＯＤを胃内投与されたマウスはインスリンに対してより感受性であることを示した（図３Ｈ）。正常な対照群と比較して、高脂肪食の摂食は、空腹時血糖値とインスリン抵抗性のマーカーであるＨＯＭＡ−ＩＲ指標を有意に増加させた。ＭＳ−ＳＯＤは、これらのパラメーターをほぼ正常に修復することができる（図３Ｉ〜図３Ｋ）。ＭＳ−ＳＯＤは、高脂肪食によって誘導されるインスリン感受性障害を改善することができる。ＭＳ−ＳＯＤは、高脂肪食によって引き起こされる脂肪肝および代謝障害を有意に減少させることができることが分かる。
【００８１】
実施例５：ＭＳ−ＳＯＤはアルコール性脂肪肝の症状を緩和した
【００８２】
Ｉ．実験プロトコル
【００８３】
１．動物モデル
６０匹の８週齢の雄Ｃ５７マウス（広東実験動物センターから購入）をＳＰＦ環境で飼育し、３つの群に分けた。ブランク対照群（対照）：Ｌｉｅｂｅｒ−ＤｅＣａｒｌｉアルコール非含有液体食を９週間与えた。モデル対照群：（アルコール、Ａｌｃ）：Ｌｉｅｂｅｒ−ＤｅＣａｒｌｉアルコール性液体食を９週間与えた。ＭＳ−ＳＯＤ処置群（Ａｌｃ＋ＳＯＤ）：ＭＳ−ＳＯＤ（３  Ｕ／ｇ体重）を胃内投与しながら、Ｌｉｅｂｅｒ−ＤｅＣａｒｌｉアルコール性液体食を９週間与えた。
【００８４】
Ｌｉｅｂｅｒ−ＤｅＣａｒｌｉアルコール性液体食（ＴＰ４２３１Ｃ、脂肪４０％、タンパク質１８％、炭水化物１４％、アルコール２８％を含むカロリー、Ｔｒｏｐｈｉｃ  Ａｎｉｍａｌ  Ｆｅｅｄ  Ｈｉｇｈ−Ｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ、中国から購入）。
【００８５】
２．実験プロトコルＭＳ−ＳＯＤ処置群にＭＳ−ＳＯＤ溶液（３  Ｕ／ｇ体重）を胃内投与し、胃内投与量はマウス１匹当たり０．１ｍｌ、１日１回とし、胃内投与期間は９週間とした。ブランク対照群とモデル対照群に滅菌水を胃内投与し、胃内投与の量、頻度および期間は処置群と同じとした。実験期間中、新鮮な糞便を２週間毎の金曜日の午前９時に回収し、−８０℃で保存した。胃内介入の４週目、６週目および８週目に、マウスの血漿中のＡＬＴ／ＡＳＴレベルを眼窩からの採血によって監視した。実験の最終日に、マウスを解剖し、組織を採取し、−８０°Ｃで凍結した。
【００８６】
３．実験結果マウスをｌｉｂｅｒ  ＤｅＣａｒｌｉ食によって８週間誘導した。血漿中のエタノールレベルおよび肝臓中のアルコール脱水素酵素、チトクロムｐ４５０２Ｅ１発現などのエタノール代謝は、ＭＳ−ＳＯＤによって影響されなかった（図４Ａ、図４Ｂ）。肝臓重量／体重比はアルコール群で有意に高く、アルコール群と比較して、アルコール＋ＳＯＤ群の肝臓重量／体重比はわずかに低かった（図４Ｃ）。同時に、アルコール＋ＳＯＤ群では血漿中のアラニンアミノトランスフェラーゼレベルが有意に減少した（図４Ｄ）。重要なことに、ＭＳ−ＳＯＤ群では肝脂質蓄積および肝臓ｃｃｌ２発現が有意に減少した（図４Ｅ〜図４Ｈ）。慢性的アルコール乱用は、糞便中のスーパーオキシドのレベルがより高いという明らかな傾向を示したが、ＭＳ−ＳＯＤはアルコール摂取中にスーパーオキシドのレベルを有意に減少させることができる（図４Ｉ）。最後に、ＭＳ−ＳＯＤの胃内投与は、慢性アルコールによって引き起こされる腸管透過性の上昇および微生物産物の移行が有意に減少した（図４Ｊ〜図４Ｌ）。要約すると、ＭＳ−ＳＯＤは、アルコール摂取によって引き起こされる腸内細菌叢の不均衡、腸漏出および脂肪肝などの症状を改善することができる。
【００８７】
実施例６：ＭＳ−ＳＯＤは、レプチン遺伝子欠損マウス（ｏｂ／ｏｂマウス）の脂肪肝およびメタボリックシンドロームの症状を緩和した
【００８８】
Ｉ．実験プロトコル
【００８９】
１．動物モデル
レプチン遺伝子欠損マウス（ｏｂ／ｏｂマウス）：広東実験動物センターから購入した６〜８週齢の雄マウス。
【００９０】
２．実験プロトコル
【００９１】
（１）ｏｂ／ｏｂマウスに８週目から１２週目までＭＳ−ＳＯＤ（３  Ｕ／ｇ体重）を与えた。
【００９２】
（２）ブドウ糖負荷試験（ＧＴＴ）：マウスに、１６時間の絶食後、グルコース（１ｇ／ｋｇ体重）を腹腔内注射した。血中グルコース濃度を、それぞれ０、３０、６０、９０、１２０分で測定した。
【００９３】
（３）インスリン負荷試験（ＩＴＴ）：マウスに、６時間の絶食後、インスリン（０．３５Ｕ／ｋｇ体重）を腹腔内注射した。血中グルコース濃度を、それぞれ０、３０、６０、９０、１２０分で測定した。
【００９４】
３．実験結果
【００９５】
ＭＳ−ＳＯＤ処置は、レプチン遺伝子欠損マウス（ｏｂ／ｏｂマウス）の脂肪肝およびメタボリックシンドロームを緩和した。ＭＳ−ＳＯＤはｏｂ／ｏｂマウスの体重を有意に変化させなかった（図５Ａ、図５Ｂ）が、脂肪組織指標は有意に改善され（図５Ｃ、図５Ｄ）、肝臓のトリグリセリド含量も有意に減少した（図５Ｅ）。肝臓Ｃｃｌ４のｍＲＮＡレベルも有意に減少した（図５Ｆ）。ＧＴＴおよびＩＴＴ実験は、ＭＳ−ＳＯＤの胃内投与が、マウスの血中グルコースの優れた制御、血中グルコースの有意な減少およびインスリンに対する大きな感受性をもたらすことを実証した（図５Ｇ、図５Ｈ）。重要なことに、高脂肪食の摂食モデルと同様に、ＭＳ−ＳＯＤ処置は腸内細菌叢の組成を有意に変化させた（図５Ｉ）。糞便アルブミンおよび血漿中のエンドトキシンリポ多糖のレベルを監視することによって、ＭＳ−ＳＯＤが腸漏出および細菌産物の移行を有意に改善することが分かった（図５Ｊ、図５Ｋ）。結論として、ＭＳ−ＳＯＤはＯＢ／ＯＢマウスモデルで脂肪肝および代謝障害の症状を軽減することができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図３Ｋ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図４Ｊ】
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【図４Ｋ】
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【図４Ｌ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図５Ｊ】
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【図５Ｋ】
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【配列表】
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