(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
等モル量の１−｛２−［（３Ｓ，４Ｒ）−１−［（３Ｒ，４Ｒ）−１−シクロペンチル−３−フルオロ−４−（４−メトキシフェニル）ピロリジン−３−カルボニル］−４−（メトキシメチル）ピロリジン−３−イル］−５−（トリフルオロメチル）フェニル｝ピペリジン−４−カルボン酸とリン酸を含む結晶であって、１−｛２−［（３Ｓ，４Ｒ）−１−［（３Ｒ，４Ｒ）−１−シクロペンチル−３−フルオロ−４−（４−メトキシフェニル）ピロリジン−３−カルボニル］−４−（メトキシメチル）ピロリジン−３−イル］−５−（トリフルオロメチル）フェニル｝ピペリジン−４−カルボン酸とリン酸の共結晶であり、粉末Ｘ線回折スペクトルにおいて、２θで示される回折角度として５．７°、１１．５°、１３．９°、１９．０°及び２１．９°（それぞれ±０．２°）にピークを示す、結晶。
【請求項２】
示差走査熱量測定分析で２３０℃〜２４０℃に吸熱ピークを有する請求項１に記載の結晶。
【請求項３】
１−｛２−［（３Ｓ，４Ｒ）−１−［（３Ｒ，４Ｒ）−１−シクロペンチル−３−フルオロ−４−（４−メトキシフェニル）ピロリジン−３−カルボニル］−４−（メトキシメチル）ピロリジン−３−イル］−５−（トリフルオロメチル）フェニル｝ピペリジン−４−カルボン酸、リン酸および良溶媒の混合物に種晶を加えることを含む、請求項１〜２のいずれか１項に記載の結晶の製造方法。
【請求項４】
１−｛２−［（３Ｓ，４Ｒ）−１−［（３Ｒ，４Ｒ）−１−シクロペンチル−３−フルオロ−４−（４−メトキシフェニル）ピロリジン−３−カルボニル］−４−（メトキシメチル）ピロリジン−３−イル］−５−（トリフルオロメチル）フェニル｝ピペリジン−４−カルボン酸、リン酸および良溶媒の混合物に貧溶媒を加え、種晶を加えた後、さらに貧溶媒を加えることを含む、請求項１〜２のいずれか１項に記載の結晶の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜２のいずれか１項に記載の結晶を有効成分として含有するメラノコルチン受容体１作動薬。
【請求項６】
請求項１〜２のいずれか１項に記載の結晶と製薬上許容される添加剤を含有する医薬組成物。
【請求項７】
メラノコルチン受容体１の活性化により病態の改善が見込まれる疾患を予防又は治療するための請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
疾患が関節リウマチ、痛風性関節炎、変形性関節症、炎症性腸疾患、全身性強皮症、乾癬、線維症、プロトポルフィリン症、全身性エリテマトーデス、黒色腫、皮膚癌、白斑症、脱毛、疼痛、虚血／再かん流傷害、脳の炎症性疾患、肝炎、敗血症／敗血症性ショック、腎炎、移植、ＨＩＶ疾患の増悪、血管炎、ブドウ膜炎、網膜色素変性症、加齢黄斑変性、微生物感染、セリアック病、ネフローゼ症候群およびメラノーマ浸潤から選ばれる１つ以上の疾患である請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
メラノコルチン受容体１の活性化により病態の改善が見込まれる疾患を予防又は治療するための医薬の製造における、請求項１〜２のいずれか１項に記載の結晶の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は１−｛２−［（３Ｓ，４Ｒ）−１−［（３Ｒ，４Ｒ）−１−シクロペンチル−３−フルオロ−４−（４−メトキシフェニル）ピロリジン−３−カルボニル］−４−（メトキシメチル）ピロリジン−３−イル］−５−（トリフルオロメチル）フェニル｝ピペリジン−４−カルボン酸（以下、「ピロリジン化合物Ａ」又は「化合物Ａ」と称することがある。）とリン酸を含む結晶に関する。より詳細には、医薬品原薬として優れた性質を有した、等モル量のピロリジン化合物Ａとリン酸を含む結晶（以下、「本発明結晶」と称することがある。）及びこれを有効成分として含有する医薬組成物などに関する。
【背景技術】
【０００２】
国際公開ＷＯ２０１５／１８２７２３号パンフレット（以下、特許文献１）にはメラノコルチン受容体１（ＭＣ１Ｒ）作動活性（アゴニスト活性）を有するピロリジン化合物又はその薬理的に許容しうる塩、並びにこれら化合物及びこれら化合物を有効成分として含有する医薬組成物はＭＣ１Ｒの活性化により病態の改善が見込まれる様々な疾患の治療又は予防に有用であることが開示されており、実施例１９にピロリジン化合物Ａの塩酸塩が記載されている。しかしながら、特許文献１にはピロリジン化合物Ａの結晶に関する記載や示唆はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１５／１８２７２３号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は医薬品原薬として使用可能な一定の品質を有するピロリジン化合物Ａの結晶を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ピロリジン化合物Ａの塩酸塩は結晶化せず、潮解性があり、医薬品の原薬としては適さないことが判明した。そこで、本発明者らはピロリジン化合物Ａについて、医薬品原薬として使用可能な一定の品質を有する結晶を得るために１０００を超える条件で結晶化を試みた。その結果、純度、熱的安定性、吸湿性、潮解性、化学的安定性及び安全性の観点から、等モル量のピロリジン化合物Ａとリン酸を含む結晶が医薬品原薬として使用可能な一定の品質を有する結晶であることを見出し、本発明を完成するに至った。
さらに、当該等モル量のピロリジン化合物Ａとリン酸を含む結晶は結晶化しにくいことが判明した。そこで、本発明者らは再現性よく、短い時間で、十分な純度を有する結晶を得るための条件を検討した。晶析温度、晶析溶媒の組成によっては不純物の増加、析出の遅延、結晶の微細化による撹拌流動性および濾過性の悪化といった課題が認められた。これらの課題を解決するため、本発明者らは結晶化に用いる試薬や溶媒の種類や量、比率などに加え、結晶化の手順なども鋭意検討し、不純物が少なく、ろ過などの操作性も良い医薬品原薬に適した品質の結晶を効率よく取得する方法を見出した。【０００６】
本発明は以下に関する。
［１］
等モル量の１−｛２−［（３Ｓ，４Ｒ）−１−［（３Ｒ，４Ｒ）−１−シクロペンチル−３−フルオロ−４−（４−メトキシフェニル）ピロリジン−３−カルボニル］−４−（メトキシメチル）ピロリジン−３−イル］−５−（トリフルオロメチル）フェニル｝ピペリジン−４−カルボン酸とリン酸を含む結晶。
［２］
等モル量の１−｛２−［（３Ｓ，４Ｒ）−１−［（３Ｒ，４Ｒ）−１−シクロペンチル−３−フルオロ−４−（４−メトキシフェニル）ピロリジン−３−カルボニル］−４−（メトキシメチル）ピロリジン−３−イル］−５−（トリフルオロメチル）フェニル｝ピペリジン−４−カルボン酸とリン酸からなる、［１］に記載の結晶。
［３］
１−｛２−［（３Ｓ，４Ｒ）−１−［（３Ｒ，４Ｒ）−１−シクロペンチル−３−フルオロ−４−（４−メトキシフェニル）ピロリジン−３−カルボニル］−４−（メトキシメチル）ピロリジン−３−イル］−５−（トリフルオロメチル）フェニル｝ピペリジン−４−カルボン酸とリン酸の共結晶である［１］または［２］のいずれかに記載の結晶。
［４］
粉末Ｘ線回折スペクトルにおいて、２θで示される回折角度として５．７°、１１．５°、１３．９°、１９．０°及び２１．９°（それぞれ±０．２°）にピークを示す［１］〜［３］のいずれか１つに記載の結晶。
［５］
示差走査熱量測定分析で２３０℃〜２４０℃に吸熱ピークを有する［１］〜［４］のいずれか１つに記載の結晶。
［６］
１−｛２−［（３Ｓ，４Ｒ）−１−［（３Ｒ，４Ｒ）−１−シクロペンチル−３−フルオロ−４−（４−メトキシフェニル）ピロリジン−３−カルボニル］−４−（メトキシメチル）ピロリジン−３−イル］−５−（トリフルオロメチル）フェニル｝ピペリジン−４−カルボン酸、リン酸および良溶媒の混合物に種晶を加えることにより得られる、［１］〜［５］のいずれか１つに記載の結晶。
［７］
１−｛２−［（３Ｓ，４Ｒ）−１−［（３Ｒ，４Ｒ）−１−シクロペンチル−３−フルオロ−４−（４−メトキシフェニル）ピロリジン−３−カルボニル］−４−（メトキシメチル）ピロリジン−３−イル］−５−（トリフルオロメチル）フェニル｝ピペリジン−４−カルボン酸、リン酸および良溶媒の混合物に貧溶媒を加え、種晶を加えた後、さらに貧溶媒を加えることにより得られる、［１］〜［６］のいずれか１つに記載の結晶。
［８］
［１］〜［７］のいずれか１つに記載の結晶を有効成分として含有するメラノコルチン受容体１作動薬。
［９］
［１］〜［７］のいずれか１つに記載の結晶と製薬上許容される添加剤を含有する医薬組成物。
［１０］
メラノコルチン受容体１の活性化により病態の改善が見込まれる疾患を予防又は治療するための［９］に記載の医薬組成物。
［１１］
疾患が関節リウマチ、痛風性関節炎、変形性関節症、炎症性腸疾患、全身性強皮症、乾癬、線維症、プロトポルフィリン症、全身性エリテマトーデス、黒色腫、皮膚癌、白斑症、脱毛、疼痛、虚血／再かん流傷害、脳の炎症性疾患、肝炎、敗血症／敗血症性ショック、腎炎、移植、ＨＩＶ疾患の増悪、血管炎、ブドウ膜炎、網膜色素変性症、加齢黄斑変性、微生物感染、セリアック病、ネフローゼ症候群およびメラノーマ浸潤から選ばれる1つ以上の疾患である［１０］に記載の医薬組成物。
［１２］
［１］〜［７］のいずれか１つに記載の結晶の有効量を患者に投与することを含む、メラノコルチン受容体１の活性化により病態の改善が見込まれる疾患を予防又は治療する方法。
［１３］
メラノコルチン受容体１の活性化により病態の改善が見込まれる疾患を予防又は治療するための医薬の製造における、［１］〜［７］のいずれか１つに記載の結晶の使用。
［１４］
メラノコルチン受容体１の活性化により病態の改善が見込まれる疾患を予防又は治療するための、［１］〜［７］のいずれか１つに記載の結晶。【０００７】
本発明は以下にも関する。
［１５］
１−｛２−［（３Ｓ，４Ｒ）−１−［（３Ｒ，４Ｒ）−１−シクロペンチル−３−フルオロ−４−（４−メトキシフェニル）ピロリジン−３−カルボニル］−４−（メトキシメチル）ピロリジン−３−イル］−５−（トリフルオロメチル）フェニル｝ピペリジン−４−カルボン酸、リン酸および良溶媒の混合物に種晶を加えることを含む、［１］〜［５］のいずれか１つに記載の結晶の製造方法。
［１６］
１−｛２−［（３Ｓ，４Ｒ）−１−［（３Ｒ，４Ｒ）−１−シクロペンチル−３−フルオロ−４−（４−メトキシフェニル）ピロリジン−３−カルボニル］−４−（メトキシメチル）ピロリジン−３−イル］−５−（トリフルオロメチル）フェニル｝ピペリジン−４−カルボン酸、リン酸および良溶媒の混合物に貧溶媒を加え、種晶を加えた後、さらに貧溶媒を加えることを含む、［１５］に記載の製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
等モル量のピロリジン化合物Ａとリン酸を含む結晶は、結晶を得る際に使用した溶媒が残留することがなく、熱的安定性に優れ、湿度に対して重量変化が少なく安定であり、潮解せず、化学的安定性に優れ、安全性の観点から生体へ悪影響を及ぼす可能性のある化合物を含まない結晶であり、該結晶を再現性よく工業的に適した方法で得られることから、医薬品原薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は本発明結晶の粉末Ｘ線回折測定を行った結果を示す図である。
【図２】図２は本発明結晶の示差走査熱量測定を行った結果を示す図である。
【図３】図３は本発明結晶中の分子の単結晶Ｘ線回折測定に基づくオルテップ図を示す図である。
【図４】図４は本発明結晶中の分子の単結晶Ｘ線回折測定に基づくパッキング図（ａ軸投影図）を示す図である。
【図５−１】図５−１は実験例７において条件１で得られた結晶の粒子サイズ分布を示す図である。
【図５−２】図５−２は実験例７において条件３で得られた結晶の粒子サイズ分布を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は等モル量の下記式で示されるピロリジン化合物Ａとリン酸を含む結晶、及びこれを有効成分として含有する医薬組成物などに関する。
【化１】
0006977185.tif 000002
【００１１】
本発明結晶におけるピロリジン化合物Ａ及び／又はリン酸は、同位元素（例えば、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｆ、３２Ｐなど）などで標識された化合物及び重水素変換体を包含する。
【００１２】
本発明において、等モル量のピロリジン化合物Ａとリン酸を含む結晶は、結晶を得る際に使用した溶媒などの他の分子が残留しておらず、ピロリジン化合物Ａとリン酸が１：１のモル比で結晶を構成している、すなわち、ピロリジン化合物Ａに対してリン酸が１モル当量含まれている。
【００１３】
本発明結晶の好ましい態様として、ピロリジン化合物Ａとリン酸が塩を形成しておらず、ピロリジン化合物Ａとリン酸が１：１のモル比で非イオン結合及び／又は非共有結合で結びついている共結晶を挙げることができる。１つの態様では、本発明結晶は図１に示される粉末Ｘ線回折パターンを示し、特徴的なピークは２θで示される回折角度で５．７°、１１．５°、１３．９°、１９．０°及び／又は２１．９°（それぞれ±０．２°）を挙げることができ、より詳細には２θで示される回折角度で５．７°、１１．５°、１３．９°、１７．４°、１９．０°、２０．４°及び／又は２１．９°（それぞれ±０．２°）にピークを有し、さらに詳細には２θで示される回折角度で５．７°、７．４°、１１．５°、１２．３°、１３．９°、１７．４°、１９．０°、２０．４°及び／又は２１．９°（それぞれ±０．２°）にピークを有し、とりわけ詳細には２θで示される回折角度で後記表２に記載のピークを有する（以下、これらピークを有する結晶をＢ形結晶またはリン酸Ｂ形結晶と称することがある。）。また他の１つの態様では、上記Ｂ形結晶は図２に示される示差走査熱量分析（以下、ＤＳＣと表記することがある。）曲線を示し、２３０℃〜２４０℃に吸熱ピークを有する。
【００１４】
本発明結晶は、残留溶媒が、医薬品規制調和国際会議（International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use：以下、ＩＣＨと称する。）が定める基準値以下である結晶である点に有利な効果を有する。また、他の利点として、有機不純物、無機不純物、残留金属、残留溶媒、遺伝毒性不純物等が、ＩＣＨのガイドラインで定められた基準値以下である結晶であることが挙げられる。
【００１５】
また、本発明の結晶としては、これを、非凝集結晶のモード径が７μｍ以上である結晶として製造することが好ましく、より好ましくは７〜１５μｍ、特に好ましくは８〜１２μｍである結晶として製造することが挙げられる。モード径とは、粒子サイズ分布の体積％が極大値を取るときの粒子径である。本発明の結晶の製造方法において、全体の結晶のうち少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の結晶をこのようなモード径とすることにより、結晶のろ過のしやすさなど、操作性が向上する。
【００１６】
本発明結晶は、例えば、特許文献１の実施例１９として記載されている方法に準じて製造することができるピロリジン化合物Ａ  １モルに対して、リン酸を１〜１０モル、好ましくは１〜５モルを反応させることにより得ることができる。この他、後述の実施例に示すような方法によっても製造することができる。
【００１７】
本発明結晶を得るために用いる溶媒は適宜選択することができるが、例えば、良溶媒または貧溶媒を単独でまたは適切に組み合わせて用いることができる。良溶媒としてはピロリジン化合物Ａの溶解度が高い溶媒である限り限定されるものではなく、例えば、ケトン（例えば、アセトン、２−ブタノンなど）、エステル（例えば、酢酸エチル、酢酸メチルなど）、アルコール（例えば、メタノール、エタノール、ｉ―プロパノールなど）、およびこれら溶媒の混合物が挙げられる。貧溶媒としてはピロリジン化合物Ａの溶解度が低い溶媒である限り限定されるものではなく、例えば、水、アルカン（例えば、ヘキサン、ヘプタンなど）、芳香族炭化水素（例えば、ベンゼン、トルエンなど）、エーテル（例えば、ジエチルエーテル、ジメチルエーテル、ジイソプロピルエーテルなど）、およびこれら溶媒の混合物が挙げられる。
【００１８】
本発明結晶を得る方法のある１つの態様として、ピロリジン化合物Ａと良溶媒の混合物にリン酸を加え、得られた混合物に種晶を加え、ろ過する方法が挙げられる。好ましくは、ピロリジン化合物Ａを良溶媒に溶解し、リン酸を加え、得られた混合物に種晶を加えた後にろ過する方法が挙げられる。さらに好ましくは、ピロリジン化合物Ａを酢酸エチルまたはエタノールに溶解し、リン酸を加え、得られた混合物に種晶を加えた後にろ過する方法が挙げられる。
【００１９】
また、他の１つの態様として、ピロリジン化合物Ａと良溶媒の混合物にリン酸を加え、得られた混合物に貧溶媒を加え、ろ過する方法が挙げられる。好ましくは、ピロリジン化合物Ａを良溶媒に溶解し、リン酸を加え、得られた混合物に貧溶媒を添加した後に種晶を添加し、ろ過する方法が挙げられる。より好ましくは、ピロリジン化合物Ａを良溶媒に溶解し、リン酸を加え、得られた混合物に貧溶媒を添加した後に種晶を添加し、さらに貧溶媒を添加し、ろ過する方法が挙げられる。さらに好ましくは、ピロリジン化合物Ａを良溶媒に溶解し、リン酸を加え、得られた混合物に水を添加した後に種晶を添加し、さらに水を添加してろ過する方法が挙げられる。
【００２０】
良溶媒と貧溶媒を組み合わせて用いる場合の好適な組み合わせと比率としては、例えばエタノール：トルエン＝１：９、エタノール：ジイソプロピルエーテル＝３：７、アセトン：トルエン＝３：７などが挙げられる。良溶媒と水を組み合わせて用いる場合の好適な良溶媒の例としては、酢酸エチルやエタノールなどが挙げられる。良溶媒と貧溶媒、具体的には水を組み合わせて用いる場合であって、水を種晶の添加前と添加後に２回添加する場合、種晶の添加前に添加する水（１度目の水の添加）の量はピロリジン化合物Ａの重量に対して体積比で３倍、種晶の添加後に添加する水（２度目の水の添加）の量はピロリジン化合物Ａの重量に対して体積比で４．５倍が好ましい。他の１つの態様として、添加する水の量がピロリジン化合物Ａの重量に対して体積比で５〜１０倍であり、種晶の添加の前後に分けて添加する方法が挙げられる。より好ましくは、水の量がピロリジン化合物Ａの重量に対して体積比で６〜９倍、より好ましくは７．５倍である。また、他の１つの態様として、１度目の水の添加の量と２度目の水の添加の量の体積比が１：１〜１：２、好ましくは２：３である例が挙げられる。他の１つの態様としては、種晶を添加した後の水の添加前に、７０％以上、好ましくは８０％以上の結晶が析出している程度に、種晶の添加の前に水を加える例が挙げられる。また、種晶を添加する際の温度は、２８〜３２℃、好ましくは３０℃に設定する例が挙げられる。これらの温度も、種晶を添加した後の水の添加前で、７０％以上、好ましくは８０％以上の結晶が析出している温度を選択することが好ましい。
【００２１】
本発明結晶の種晶は後述の実施例３、実験例２又は実験例３に記載の方法で得ることができる。また、これらの方法により得られた結晶を本発明結晶の種晶として用いて、例えば実施例１または２に記載の方法又は実施例１または２に記載の方法に準じた方法によっても種晶を得ることができる。
【００２２】
本発明結晶はヒトＭＣ１Ｒアゴニスト活性を有しているので、メラノコルチン受容体１作動薬の有効成分として用いることができ、また、本発明結晶及びこれを有効成分として含有する医薬組成物はＭＣ１Ｒの活性化により病態の改善が見込まれる様々な疾患の治療又は予防のために有用である。このような疾患としては、例えば、関節リウマチ、痛風性関節炎、変形性関節症、炎症性腸疾患、全身性強皮症、乾癬、線維症、プロトポルフィリン症（例えば、赤芽球性プロトポルフィリン症など）、全身性エリテマトーデス、黒色腫、皮膚癌、白斑症、脱毛、疼痛、虚血／再かん流傷害、脳の炎症性疾患、肝炎、敗血症／敗血症性ショック、腎炎、移植、ＨＩＶ疾患の増悪、血管炎、ブドウ膜炎、網膜色素変性症、加齢黄斑変性、微生物感染、セリアック病、ネフローゼ症候群、及びメラノーマ浸潤から選ばれる１つ以上の疾患などが挙げられる。とりわけ、全身性強皮症、乾癬、プロトポルフィリン症、黒色腫、皮膚癌、白斑症、脱毛、網膜色素変性症、加齢黄斑変性、及びネフローゼ症候群から選ばれる１つ以上の疾患などの治療又は予防のために有用である。特に、全身性強皮症、プロトポルフィリン症、黒色腫、白斑症、網膜色素変性症、加齢黄斑変性、及びネフローゼ症候群から選ばれる１つ以上の疾患などの治療又は予防のために有用である。
【００２３】
本発明結晶を有効成分として含有する医薬組成物は本発明結晶と製薬上許容される添加剤、例えば、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤及び等張化剤などと混合することで得ることができる。
【００２４】
本発明結晶及びこれを有効成分として含有する医薬組成物は適当な投与形態、例えば、粉末剤、注射剤、錠剤、カプセル剤及び局所外用剤などに調製した後、その投与形態に応じた適当な投与方法、例えば、静脈内投与、経口投与及び経皮投与などによって、患者に投与することができる。本発明における用語「患者」は、本発明結晶による予防又は治療の対象となる個体であり、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトである。
【００２５】
投与量は患者の年齢、体重、一般的健康状態、性別、食事、投与時間、投与方法、排泄速度、薬物の組合せ、投与時に治療されている患者の病状の程度に応じ、それらあるいはその他の要因を考慮して決められる。本発明結晶及びこれを有効成分として含有する医薬組成物は、低毒性で安全に使用することができ、その１日の投与量（すなわち有効量）は、患者の状態や体重、投与経路などによって異なるが、例えば、非経口的には約０．０００１〜１０００ｍｇ／人／日、好ましくは約０．００１〜１０００ｍｇ／人／日、特に好ましくは０．０１〜５００ｍｇ／人／日投与され、また経口的には約０．０００１〜１０００ｍｇ／人／日、好ましくは０．０１〜５００ｍｇ／人／日投与されることが望ましい。
【００２６】
本発明において、「予防」とは病気や疾患や症状を発症していない個体に対して本発明結晶又はこれを含有する医薬組成物を投与する行為を意味している。また、「治療」とは既に病気や疾患や症状を発症した個体に対して本発明結晶又はこれを含有する医薬組成物を投与する行為を意味している。従って、既に病気や疾患や症状を発症した個体に対し、症状などの悪化防止や発作防止や再発防止のために投与する行為は「治療」の一態様である。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明を実施例及び実験例により詳細に説明するが、本発明はこれらより何ら限定されるものではない。なお、「当量」は「モル当量」を意味する。【００２８】
実施例１  本発明結晶の合成
【化２】
0006977185.tif 000003
化合物１（２６．１８ｇ）をジクロロメタン（２０７ｍＬ）に溶解させ、そこに化合物２（４．４ｍＬ）及び酢酸（３．５６ｍＬ）を加えて室温下で３０分間撹拌した。その後、さらに、水素化トリアセトキシホウ素ナトリウム（１３．２ｇ）を加えて室温下で１時間撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて撹拌した後、ジクロロメタンにて抽出した。得られた有機層を飽和食塩水にて洗浄し、硫酸マグネシウムにて乾燥し、減圧濃縮した。残渣をＮＨシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝７５：２５〜５５：４５）、次いでシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１００：０〜９５：５）にて精製し、化合物３（２４．２５ｇ）を無色の粉体として得た（ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ６９０［Ｍ＋Ｈ］＋）。【００２９】
化合物３（２４．２４ｇ）をメタノール（２４０ｍＬ）に溶解させ、そこに水酸化ナトリウム水溶液（２ｍｏｌ／Ｌ、７０．２ｍＬ）を加えて室温下で１９時間撹拌した。その後、さらに、塩酸水（２ｍｏｌ／Ｌ、７４ｍＬ）を加えた後、反応液を減圧濃縮した。濃縮残渣に水及び酢酸エチルを加えて撹拌後、酢酸エチルにて抽出した。得られた有機層をリン酸緩衝液（０．１ｍｏｌ／Ｌ、３００ｍＬ）及び食塩水にて洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１００：０〜９０：１０）にて精製した後、酢酸エチルに溶解させ、リン酸緩衝液（０．１ｍｏｌ／Ｌ、２００ｍＬ）を加えて室温下で撹拌し、酢酸エチルで抽出した。有機層を水及び飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮することで化合物４（２３．７ｇ）を無色の粉体として得た（ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ６７６［Ｍ＋Ｈ］＋）。【００３０】
化合物４（１３５ｍｇ）をエタノール（０．７ｍＬ）に溶解させ、本発明結晶を種晶として少量加えた。そこにリン酸（２５ｍｇ）をエタノール（０．５ｍＬ）に溶解させたリン酸溶液を加え、さらにエタノール（０．２ｍＬ）を加えて室温下で一晩撹拌した。析出した結晶を濾取し、酢酸エチル（０．６ｍＬ）で洗浄後、５０℃で４時間減圧乾燥し、１１２．７ｍｇの本発明結晶を得た。１Ｈ−ＮＭＲで残留溶媒の有無を確認したが、残留溶媒は認められなかった。元素分析測定結果を以下の表１に示す。【００３１】
【表１】
0006977185.tif 000004
【００３２】
＜粉末Ｘ線回折（以下、ＸＲＰＤと称することがある）測定＞
粉末Ｘ線回折測定装置Ｘ’ＰｅｒｔＰｒｏ（ＰＡＮａｌｙｔｉｃａｌＢ．Ｖ．社製）を用いて、以下の条件で測定した。
Ｘ線発生装置：Ｘ線管球（対陰極：銅、管電圧：４５ｋＶ、管電流：４０ｍＡ）
入射光学系：フォーカシング集光ミラー
受光光学系：高速半導体アレイ検出器（Ｘ−Ｃｅｌｅｒａｔｏｒ）、拡張受光側アーム
サンプルステージ：ＨＴＳサンプルステージ（Ｘ軸方向に４ｍｍ幅で振動）
積算回数：５回（それぞれ入射角を−２、−１、０、１、及び２°に変更）
測定範囲：２θ＝３〜４０°
スキャン速度：０．６６８４５１°／秒
ステップ：０．０１６７°【００３３】
結果を図１に示した。２θで示される回折角度が５．７°のピーク強度を１００とした時の相対ピーク強度が５以上のピークは以下の表２の通りである。【００３４】
【表２】
0006977185.tif 000005
【００３５】
＜示差走査熱量（ＤＳＣ）測定＞
示差走査熱量測定装置Ｘ−ＤＳＣ７０００（エスアイアイ・ナノテクノロジー株式会社）を用いて、以下の条件で測定した。
昇温速度：１０℃／ｍｉｎ（２５℃〜３００℃）
雰囲気：窒素  １００ｍＬ／ｍｉｎ
結果を図２に示した。吸熱ピークが約２３０℃〜２４０℃に認められた。【００３６】
＜単結晶Ｘ線回折測定＞
エタノール２ｍＬにスパーテル（小）半分程度の本発明結晶を加えて溶かし、室温で４日間静置し、結晶化を行った。得られた結晶を単結晶Ｘ線回折装置Ｒ−ＡＸＩＳ  ＲＡＰＩＤ／Ｒ（リガク社）（ＣｕＫα線）により、２３℃で格子定数の決定及び回折ピーク強度の測定、続いて直接法による位相決定，フルマトリクス最小自乗法による構造精密化を行い、構造を解析した。得られた結晶学的データ及び結晶構造解析結果を表３に示した。なお、信頼度因子（Ｒ値）は３．０６％であり、他の各種パラメータも本結晶構造解析が十分に信頼性の高い解析結果であることを示した。【００３７】
【表３】
0006977185.tif 000006
【００３８】
本発明結晶中の分子のオルテップ図を図３に、パッキング図を図４に示した。結晶中において、非対称単位中にピロリジン化合物Ａとリン酸がそれぞれ独立に一分子ずつ存在していた。【００３９】
本発明結晶の絶対配置を検証した結果、フラックパラメータは０．０２（３）であったことから、本発明結晶は図３に示す１分子の１−｛２−［（３Ｓ，４Ｒ）−１−［（３Ｒ，４Ｒ）−１−シクロペンチル−３−フルオロ−４−（４−メトキシフェニル）ピロリジン−３−カルボニル］−４−（メトキシメチル）ピロリジン−３−イル］−５−（トリフルオロメチル）フェニル｝ピペリジン−４−カルボン酸と１分子のリン酸を構成単位とする結晶であることを確認した。【００４０】
アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）が発行しているガイダンス（Regulatory Classification of Pharmaceutical Co-Crystals Guidance for Industry）には、共結晶は結晶格子内に２種類以上の異なる分子が含まれており、それらが非イオン結合及び／又は非共有結合で結びついている結晶と記載されている。ピロリジン化合物Ａとリン酸の間に共有結合が存在していないことは上述の結晶構造解析で既に確認しているので、ピロリジン化合物Ａとリン酸の間にイオン的相互作用が認められるか否かを検討した。【００４１】
リン酸はブレンステッド酸であるため、ピロリジン化合物Ａとイオン的相互作用が認められる場合、ピロリジン化合物Ａがブレンステッド塩基としてプロトンを受容する必要がある。ピロリジン化合物Ａの場合、リン酸からプロトンを受容する可能性があるのは３箇所の窒素（Ｎ１８、Ｎ１９、Ｎ２０）である。ここで、本発明結晶における全ての水素結合部位について表４に示した。【００４２】
【表４】
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【００４３】
（１）Ｎ１８
Ｎ１８はｓｐ３混成の窒素であり、ピロリジン化合物Ａの中で最も塩基性が高く、リン酸からプロトンを受容する可能性がある窒素である。しかしながらＮ１８（より厳密には、Ｎ１８に結合している水素原子）は隣接したピロリジン化合物Ａ（対称演算子（symmetry operators）：−Ｘ＋１／２＋２，−Ｙ＋２，Ｚ＋１／２）のカルボン酸の酸素（Ｏ１６）との水素結合を形成しており、プロトンの授与が行われていると判断した。そのため、Ｎ１８はリン酸からプロトンを受容できない。同時にＮ１８と隣接するリン酸のいずれの酸素との原子間距離もファンデルワールス半径の和を上回ることから、イオン的相互作用が可能な距離にリン酸は存在しないと判断した。【００４４】
（２）Ｎ１９
Ｎ１９はｓｐ２混成の窒素であるため、塩基性が弱く、塩を形成できないと考えた。同時にＮ１９と最も近い距離にあるリン酸の酸素（Ｏ１３）の原子間距離がファンデルワールス半径の和であることから、イオン的相互作用が可能な距離に無いと判断した。【００４５】
（３）Ｎ２０
Ｎ２０もｓｐ２混成の窒素であるため、塩基性が弱く、塩を形成できないと考えた。同時にＮ２０と隣接するリン酸のいずれの酸素との原子間距離もファンデルワールス半径の和を上回ることから、イオン的相互作用が可能な距離にリン酸は存在しないと判断した。【００４６】
以上の結果から、本発明結晶におけるピロリジン化合物Ａの窒素（Ｎ１８、Ｎ１９、Ｎ２０）とリン酸との間の結びつきはイオン的な相互作用によるものではないことが明らかとなり、ピロリジン化合物Ａとリン酸は塩を形成しておらず、本発明結晶は共結晶であると判断した。本実施例にて得られた結晶を本明細書においてはＢ形結晶と称する。【００４７】
実施例２  本発明結晶の合成（２）
【化３】
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化合物３（２７６ｍｇ）のエタノール（１．４ｍL）溶液に１，２−エタンジスルホン酸水和物（３８ｍｇ）を加え、室温で４０分間撹拌した。結晶を濾取し、その結晶をエタノール（０．８４ｍL）で２回洗浄した。４０℃以下で乾燥して、化合物５（１７８ｍｇ）を得た。化合物５（３７．１ｋｇ）の酢酸エチル（１６７．５ｋｇ）懸濁液に、室温で炭酸カリウム（６．５ｋｇ）の水（１４８．３Ｌ）溶液及び水（３６．８Ｌ）を順に加え、混合物を室温で１５分間撹拌した。水層を除き、有機層を水（１８６Ｌ）で２回洗浄し、酢酸エチル（６７．２ｋｇ）を加え、不溶物をろ過した。７８Ｌまで濃縮した後、エタノール（１４６．５ｋｇ）を加え、７８Ｌまで濃縮した。エタノール（１４６．９ｋｇ）を加え、５６Ｌまで濃縮した。エタノール（４４ｋｇ）で希釈し、室温で２４％水酸化ナトリウム水溶液（８．７ｋｇ）及び水（３０．１ｋｇ）を順に加え、混合物を４０℃で５時間撹拌して、化合物４を得た。化合物４の溶液に、３０℃でリン酸（１２．０ｋｇ）の水（５５．７Ｌ）溶液及び水（５５．７Ｌ）を順に加えた。本発明結晶を種晶（９２８ｇ）として加え、１４時間撹拌した。水（１６７．０Ｌ）を加え、４時間撹拌した後に２５℃に冷却した。固体を濾取し、該固体を水（１８２Ｌ）で洗浄した。固体を５０℃以下で乾燥して、本発明結晶（３５．２ｋｇ）を得た。この結晶は、ろ過性などの操作性に優れた結晶であった。【００４８】
実験例１  ピロリジン化合物Ａの結晶化検討
ピロリジン化合物Ａを用いて、単一溶媒２５種及び混合溶媒４４種を用いた長期保存による結晶化検討、貧溶媒（Anti-solvent）２種及び良溶媒（Good-solvent）１２種を用いて溶媒の混合比を変えて作成した９６種の混合溶媒を用いた１か月撹拌による結晶化検討、並びに添加溶媒２６種を用いたgrindingによる結晶化検討を実施した。その結果、長期保存及び１か月撹拌による結晶化検討で結晶を得ることができた。得られた結晶の粉末Ｘ線回折を測定した結果、全ての結晶でピークは一致しており、同一の結晶形であった。晶析条件を検討したが、結晶が得られる全ての条件で結晶中に溶媒が残留していた。結晶を乾燥させる工程についても検討したが、残留溶媒をＩＣＨが定める残留溶媒基準値以下にすることはできなかった。
従って、フリー体であるピロリジン化合物Ａは結晶化するが、結晶を得る際に使用した溶媒が残留してしまい、また、化学的安定性も低かったので、医薬品原薬として採用することはできない。【００４９】
実験例２  ピロリジン化合物Ａを含む混合物の結晶化検討（１）
約９００ｍｇのピロリジン化合物Ａをテトラヒドロフラン３０ｍＬに溶解させ、９６ウェルプレートの各バイアルに１００μＬずつ分注した（約３ｍｇ／バイアル）。また、リン酸、塩酸、Ｌ（−）−リンゴ酸、Ｌ（＋）−酒石酸、マレイン酸、硫酸及びマロン酸を含む２１種の酸並びに水酸化ナトリウム及びＬ−アルギニンを含む８種の塩基（以下、カウンター化合物と称することがある。）を後述する８種の溶媒に溶解させた０．１ｍｏｌ／Ｌ溶液４５μＬ（１部の酸については、０．０５ｍｏｌ／Ｌ溶液９０μＬ）をそれぞれ各バイアルに分注した。１昼夜開放により溶媒を蒸散させた後、４時間減圧乾燥した。酢酸エチル、アセトン及びトルエンを含む８種の溶媒２５０μＬを各バイアルに分注後、５分間超音波により撹拌し、密栓して、室温で６日間撹拌した。析出物のあるバイアルについては析出物を濾取し、ＸＲＰＤを測定した。析出物の無いバイアルについては室温で溶媒を蒸散させ、固体の見られた場合には濾取してＸＲＰＤを測定した。ＸＲＰＤ測定装置及び測定条件は実施例１と同じである。【００５０】
リン酸と酢酸エチルの組合せ、Ｌ（−）−リンゴ酸とトルエンの組合せ、Ｌ（＋）−酒石酸とアセトンの組合せ及びマレイン酸とトルエンの組合せのバイアルから、それぞれリン酸Ａ形結晶、Ｌ（−）−リンゴ酸Ｄ形結晶、Ｌ（＋）−酒石酸Ｅ形結晶及びマレイン酸Ｆ形結晶が得られた。なお、これら以外にもカウンター化合物のみの結晶、すなわち、結晶中にピロリジン化合物Ａを含まない結晶が確認できたバイアルがあった。一方、塩酸を加えたバイアルからは８種全ての溶媒で結晶は得られなかった。また、硫酸、マロン酸及びＬ−アルギニンを加えたバイアルからも全ての溶媒で結晶は得られなかった。【００５１】
実験例３  ピロリジン化合物Ａを含む混合物の結晶化検討（２）
約８００ｍｇのピロリジン化合物Ａをテトラヒドロフラン４０ｍＬに溶解させ、９６ウェルプレートの各バイアルに１００μＬずつ分注した（約２ｍｇ／バイアル）。また、リン酸、塩酸、Ｌ（−）−リンゴ酸、Ｌ（＋）−酒石酸、マレイン酸、硫酸及びマロン酸を含む２２種の酸、水酸化ナトリウム及びＬ−アルギニンを含む８種の塩基（以下、カウンター化合物と称することがある。）を後述する１２種の溶媒に溶解させた０．１ｍｏｌ／Ｌ溶液３０μＬ（１部の酸については、０．０５ｍｏｌ／Ｌ溶液６０μＬ）をそれぞれ各バイアルに分注した。分注後、窒素を吹付け、溶媒を蒸散させた。混合比３：７及び１：９のエタノールとトルエンの混合溶媒、混合比３：７のエタノールとジイソプロピルエーテルの混合溶媒、混合比３：７及び１：９のアセトンとトルエンの混合溶媒、及び混合比３：７の酢酸エチルとヘプタンの混合溶媒を含む１２種の溶媒２００μＬを各バイアルに分注し、密栓して、室温で３日間撹拌した。析出物のあるバイアルについては析出物を濾取して、ＸＲＰＤを測定した。析出物の無いバイアルについては室温で溶媒を蒸散させ、約１か月後に固体が認められた場合には、固体を採取してＸＲＰＤを測定した。ＸＲＰＤ測定装置及び測定条件は実施例１と同じである。【００５２】
結晶が得られた組合せのバイアルを以下の表５に示す。表中、−は結晶が得られていないことを示し、Ａ及びＢなどはそれぞれＡ形結晶及びＢ形結晶などが得られたことを示している。すなわち、今回得られたマレイン酸Ｆ形結晶は実験例２で得られたマレイン酸Ｆ形結晶とＸＲＰＤパターンが一致しており、今回得られたリン酸Ｂ形結晶は実験例２で得られたリン酸Ａ形結晶とは異なる結晶であることを示している。なお、実験例２と同様に、これら以外にもカウンター化合物のみの結晶が確認できたバイアルがあった。一方、塩酸を加えたバイアルからは１２種全ての溶媒で結晶は得られなかった。また、Ｌ（−）−リンゴ酸及びＬ（＋）−酒石酸について、実験例２では結晶が得られたが、今回は１２種全ての溶媒で結晶は得られなかった。【００５３】
【表５】
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【００５４】
実験例４  ピロリジン化合物Ａを含む混合物の結晶化検討（３）
実験例２及び３で得られた結晶の中でリン酸Ａ形結晶及びリン酸Ｂ形結晶以外について、再現性の確認を行った。その結果、Ｌ（−）−リンゴ酸Ｄ形結晶、Ｌ（＋）−酒石酸Ｅ形結晶、硫酸Ｊ形結晶及びＬ−アルギニンＫ形結晶については、再度取得することはできなかった。一方、マレイン酸及びマロン酸との組み合わせにおいては再度結晶を取得することができた。【００５５】
＜Ｌ（−）−リンゴ酸、Ｌ（＋）−酒石酸及び硫酸＞
ピロリジン化合物Ａ約８０ｍｇをテトラヒドロフラン４ｍＬに溶解させ、９６ウェルプレートの各バイアルに１００μＬずつ分注した（約２ｍｇ／バイアル）。また、Ｌ（−）−リンゴ酸、Ｌ（＋）−酒石酸及び硫酸を後述する溶媒に溶解させた０．１ｍｏｌ／Ｌ溶液３０μＬをそれぞれ各バイアルに分注した。分注後、窒素吹付けにより溶媒を蒸散させた後、Ｌ（−）−リンゴ酸を入れたバイアルにはトルエン、Ｌ（＋）−酒石酸を入れたバイアルにはアセトン、及び硫酸を入れたバイアルには混合比３：７の酢酸エチルとヘプタンの混合溶媒を２００μＬ各バイアルに分注し、密栓したものを各サンプルについて８つ作成した。合計２４個のバイアルを室温で７日間撹拌したが、全てのバイアルで析出物は得られなかった。【００５６】
＜Ｌ−アルギニン＞
ピロリジン化合物Ａを約６５ｍｇ測り取り、エタノール０．３ｍＬ、及びトルエン２．１ｍＬに室温で溶解させた。Ｌ−アルギニンを約１９ｍｇ測り取り、エタノール０．６ｍＬ、及び水０．６ｍＬに溶解し、前記ピロリジン化合物Ａの溶液に加えた。溶液だったため、窒素吹付けにより溶媒を蒸散させたところ、一部白い粉を含む飴状物が得られた。これをエタノール０．３ｍＬに再溶解し、ジイソプロピルエーテルを０．６ｍＬ滴下した。実験例３で得られたＬ−アルギニンＫ形結晶を種晶として加えたが溶解したため、トルエンを１．２ｍＬ加え、昼夜撹拌した。溶液だったので、窒素吹付けにより溶媒を蒸散させ、残渣をＸＲＰＤ測定したところ、非晶質だった。これにヘプタン０．６ｍＬを加え、室温で一晩撹拌した後、顕微鏡観察した。結晶成分は認められなかった。【００５７】
＜マレイン酸Ｆ形結晶＞
ピロリジン化合物Ａを約６５ｍｇ測り取り、トルエン０．５ｍLに室温で溶解させた。そこに、マレイン酸約１３ｍｇをエタノール７５μＬに溶解させたものと、先に得られたマレイン酸Ｆ形結晶を種晶として少量加えたところ、反応液がゲル状（寒天状）となり撹拌不能となった。トルエン１．０ｍＬをさらに加え、スパーテルで激しくこすったところ、懸濁液となった。濾取した結晶を４０℃で５時間減圧乾燥して、５７ｍｇのマレイン酸Ｆ形結晶が得られた。得られた結晶中には、０．１当量のトルエンが残留していたことを１Ｈ−ＮＭＲで確認した。【００５８】
＜マロン酸Ｇ形結晶＞
ピロリジン化合物Ａを約３２５ｍｇ測り取り、アセトン１ｍＬに室温で溶解させた。マロン酸５５ｍｇを測り取り、アセトン０．５ｍＬに室温で溶解させ、前記ピロリジン化合物Ａの溶液に加えた。この溶液にトルエンを６ｍＬ滴下した。後述のマロン酸Ｉ形結晶を種晶として少量を加え、２晩室温で撹拌した。全量をろ過して４０℃で３．５時間減圧乾燥し、３１７ｍｇの結晶を得た。得られた結晶中には、１当量のトルエンを含んでいることを１Ｈ−ＮＭＲで確認した。トルエンを水に置換することを目的に、動的水蒸気吸着測定（Dynamic Vapour Sorption：ＤＶＳ）装置を用いて、２５℃、７０％ＲＨの条件下で７２時間保存した結果、非晶質化が認められた。【００５９】
＜マロン酸Ｈ形結晶＞
ピロリジン化合物Ａを約６５ｍｇ測り取り、混合比３：７の酢酸エチルとヘプタンの混合溶媒２ｍＬに室温で溶解させた。マロン酸１１ｍｇを測り取り、酢酸エチル０．３ｍＬに室温で溶解させ、前記ピロリジン化合物Ａの溶液に加えた。固いガム状物が生成したため、酢酸エチル３ｍＬを加え懸濁液とした。３日間室温撹拌した後、窒素吹付により溶媒を蒸散させ、乾固物に酢酸エチル３ｍＬを加え撹拌し、ヘプタン１．２ｍＬを徐々に加えた。実験例３で得られたマロン酸Ｇ形結晶を種晶として少量を加えると急激に析出物が生じた。２晩室温で撹拌後、全量をろ過して４０℃で３．５時間減圧乾燥し、３８ｍｇの結晶を得た。【００６０】
＜マロン酸Ｉ形結晶＞
ピロリジン化合物Ａを約６５ｍｇ測り取り、混合比１：９のアセトンとトルエンの混合溶媒２．３ｍＬに室温で溶解させた。マロン酸１１ｍｇを測り取り、アセトン０．１ｍＬに室温で溶解させ、前記ピロリジン化合物Ａの溶液に加えた。室温で３晩撹拌し、全量をろ過して４０℃で２時間減圧乾燥し、５１ｍｇの結晶を得た。得られた結晶中には、１当量のトルエンを含んでいることを１Ｈ−ＮＭＲで確認した。この結晶はトルエン和物である可能性があるため、さらに減圧乾燥することにより溶媒を含まない結晶が得られるかを確認することを目的に、約５ｍｇを６０℃で４時間減圧乾燥したところ、トルエンが約０．５当量残留しており、結晶形に変化がないことを確認した。【００６１】
実施例３  本発明結晶の合成（３）
以下の表６に示す量のピロリジン化合物Ａ及びリン酸を以下に示す溶媒に加え、以下に示す時間撹拌した。結果を以下の表６に示す。ＸＲＰＤ測定装置及び測定条件は実施例１と同じである。ＸＲＰＤの結果でＡは実験例２で得られたリン酸Ａ形結晶と同じ結晶、Ｂは実験例３で得られたリン酸Ｂ形結晶と同じ結晶であることを示している。さらに、リン酸Ｂ形結晶は実施例１で得られた本発明結晶の結晶と同じであった。【００６２】
【表６】
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【００６３】
（ａ）法ではＡ形結晶とＢ形結晶の混合物が得られた。この結晶は元素分析の結果から１．５当量のリン酸を含んでいることが判明した。アセトン／トルエン溶媒を用いた（ｆ）法では、新たなＣ形結晶が得られた。このＣ形結晶は元素分析の結果から２当量のリン酸を含んでいることが判明した。また、いずれの方法によってもＡ形結晶を単独で得ることは出来なかった。【００６４】
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）及び（ｆ）法において、リン酸添加直後に非晶質又は飴状物が生成したが、非晶質を７日から１０日室温撹拌する、又は飴状物をスパーテルで長時間頻回にこする作業により結晶を得ることができた。また、（ｄ）法においては、晶析開始１日後には結晶の懸濁液であったが、室温撹拌を４日間継続したところ飴状物となった。さらにこれを窒素で溶媒蒸散し、エタノール中、一晩室温で撹拌したところ、Ｂ形結晶が得られた。【００６５】
実験例５  ピロリジン化合物Ａの塩酸塩の合成
【化４】
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化合物１（１９．４３ｇ）のクロロホルム（１５７ｍＬ）溶液に化合物２（３．３ｍＬ）および酢酸（２．７ｍＬ）を加えて室温下で３０分間撹拌した後、水素化トリアセトキシホウ素ナトリウム（１０．０ｇ）を加えて室温下で２０時間撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて撹拌した後、クロロホルムにて抽出した。得られた有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水にて洗浄し、硫酸マグネシウムにて乾燥し、減圧濃縮した。残渣をＮＨシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝７５：２５〜５５：４５）、次いでシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１００：０〜９５：５）およびシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９９：１〜９６：４）にて精製し、化合物３（２１．９２ｇ）を無色の粉体として得た（ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ６９０［Ｍ＋Ｈ］＋）。【００６６】
化合物３（２１．９１ｇ）のメタノール（２００ｍＬ）溶液に水酸化ナトリウム水溶液（２ｍｏｌ／Ｌ、６３．６ｍＬ）を加えて室温下で３時間撹拌した。塩酸水（２ｍｏｌ／Ｌ、６３．６ｍＬ）を加えた後、反応液を減圧濃縮した。濃縮残渣に水および酢酸エチルを加えて撹拌後、酢酸エチルにて抽出した。得られた有機層を飽和食塩水にて洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９８：２〜９０：１０）にて精製した後、酢酸エチルに溶解し、リン酸緩衝液（０．１ｍｏｌ／Ｌ、３００ｍＬ）を加えて室温下で３時間撹拌した。酢酸エチルで抽出後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮することで化合物４（１７．４０ｇ）を無色の粉体として得た（ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ６７６［Ｍ＋Ｈ］＋）。【００６７】
化合物４（１７．４０ｇ）の酢酸エチル（２５０ｍＬ）溶液に塩酸−酢酸エチル溶液（４ｍｏｌ／Ｌ、３１．８ｍＬ）を加えて室温下で３０分間撹拌した。溶媒を減圧留去し、ジエチルエーテルを加えて撹拌後に濾取し、減圧乾燥することで化合物４の塩酸塩（１７．４３ｇ）を無色の粉体として得た（ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ６７６［Ｍ＋Ｈ］＋）。【００６８】
実験例６  ピロリジン化合物Ａの塩酸塩の非晶質、ピロリジン化合物Ａの非晶質、ピロリジン化合物Ａの結晶及び再現性が認められたピロリジン化合物Ａを含む混合物の結晶の比較
特許文献１の実施例１９に記載のピロリジン化合物Ａの塩酸塩は非晶質であり、その後の検討でもピロリジン化合物Ａの塩酸塩の結晶は得られていない（上記実験例２及び３を参照）ことから、非晶質のピロリジン化合物Ａの塩酸塩を比較試験に用いた。また、以下に示す比較試験結果において、塩酸塩はピロリジン化合物Ａの塩酸塩であり、実験例５に記載の方法により得られた化合物の結果を示した。【００６９】
以下に示す比較試験結果において、フリー体非晶質はピロリジン化合物Ａのフリー体の非晶質であり、実施例１に記載の方法により得られた化合物４の結果を示した。【００７０】
以下に示す比較試験結果において、フリー体結晶はピロリジン化合物Ａのフリー体の結晶であり、この結晶は結晶中の残留溶媒をＩＣＨが定める基準値以下にすることができないことを実験例１で示しており、医薬品原薬として適した結晶ではないことを確認済である。【００７１】
以下に示す比較試験結果において、リン酸Ａ形＋Ｂ形結晶は実施例３に記載の（ａ）法により得られた結晶の結果を、リン酸Ｂ形結晶は実施例１に記載の方法により得られた本発明結晶の結果を、リン酸Ｃ形結晶は実施例３に記載の（ｆ）法により得られた結晶の結果を、マレイン酸Ｆ形結晶は実験例４に記載の方法により得られたマレイン酸Ｆ形結晶の結果を示した。【００７２】
以下に示す比較試験結果において、マロン酸Ｈ形結晶は実験例４に記載の方法により得られたマロン酸Ｈ形結晶の結果を示した。マロン酸はＨ形の他にＧ形及びＩ形結晶を取得できているが、これらはいずれもトルエンを分子中に含有している。トルエンは中枢神経系などに障害を引き起こすことが知られている化合物であり、医薬品原薬中に含まれていることは安全性の観点から好ましくなく、Ｇ形及びＩ形結晶は医薬品原薬として適した結晶ではないことが明らかであるため、これらについては比較試験を行わなかった。【００７３】
上述した各結晶について、熱的安定性、吸湿性・潮解性、及び化学的安定性を評価した。【００７４】
＜熱的安定性評価＞
熱重量／示差熱同時測定装置ＴＧ／ＤＴＡ７２００（エスアイアイ・ナノテクノロジー株式会社）を用いて、以下の条件で評価した。
昇温速度：１０Ｋ／分
雰囲気：窒素２００ｍＬ／分【００７５】
＜吸湿性・潮解性評価＞
水分吸着測定装置ＤＶＳ−１又はＤＶＳ−ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ（Surface Measurement Systems Limited社）を用いて、次のようにして評価した。試料を予め風袋重量を補正したセルに取り、装置の精密天秤に吊るして測定開始時の重量を精密に測定した。段階的に湿度を変化させた時の重量変化を経時的に記録し、各湿度での平衡重量を求めた。乾燥時（０％ＲＨ）又は、別法で確認した開始時の水分量より換算した無水物を基準とし、各湿度での重量の変化率を求めた。【００７６】
＜化学的安定性評価＞
試料を６０℃密栓状態及び６０℃７５％ＲＨで１週間保存し、保存前後での類縁物質の増減を高速液体クロマトグラフ法により個々のピークの面積百分率により算出し、さらに保存後の状態を観察した。
結果を以下の表７に示す。【００７７】
【表７】
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【００７８】
ピロリジン化合物Ａ及びこれを含む混合物で再現性のある固体として、塩酸塩非晶質、フリー体非晶質、フリー体結晶、リン酸Ａ形＋Ｂ形結晶、本発明結晶の１態様であるリン酸Ｂ形結晶、リン酸Ｃ形結晶、マレイン酸Ｆ形結晶、マロン酸Ｇ形結晶、マロン酸Ｈ形結晶、及びマロン酸Ｉ形結晶が見出されている。これらの中で、フリー体結晶は残留溶媒をＩＣＨが定める基準値以下にすることができず、マロン酸Ｇ形結晶及びマロン酸Ｉ形結晶は分子内にトルエンを含有しており安全性の観点から医薬品原薬としては適した結晶ではなかった。マレイン酸Ｆ形結晶も同様に残留溶媒のトルエンを完全に除去することができなかった。一方、本発明結晶からは残留溶媒は確認されず、分子内にトルエンを含まないので安全性の観点からは問題のない結晶であると考えられる。【００７９】
また、塩酸塩非晶質、リン酸Ｃ形結晶、マレイン酸Ｆ形結晶、及びマロン酸Ｈ形結晶はいずれも潮解性が認められたが、リン酸Ｂ形結晶に潮解性は認められず、９０％ＲＨでの重量変化は１％未満、６０℃７５％ＲＨで１週間保存しても類縁物質の増加は０．０５％であり、湿度に対して安定であり、化学的にも大変安定な結晶であった。【００８０】
さらに、フリー体非晶質、及びリン酸Ａ形＋Ｂ形結晶は共に、１３０℃に加熱すると２％以上の重量変化が認められたが、リン酸Ｂ形結晶は２００℃以上でも重量変化が認められず熱的安定性にも優れた結晶であった。【００８１】
実験例７  本発明結晶の析出条件検討
【化５】
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【００８２】
条件１
化合物５（１５．００ｇ）の酢酸エチル（６７．７５ｇ）溶液に、炭酸カリウム水溶液（炭酸カリウム２．６４ｇ、精製水７５ｍL）を２５℃で滴下し、３０分間３００ｒｐｍで撹拌した。有機層を分離し、精製水で洗浄した後、減圧濃縮した。エタノール（５９．０３ｇ）を加えて体積が２７ｍLになるまで減圧濃縮する作業を二度繰り返した。
得られた濃縮混合物に、体積が４５ｍLになるまでエタノール（２４．３２ｇ）を加え、２４％水酸化ナトリウム水溶液（４．７９ｇ）と精製水（１２ｍL）を２５℃で滴下し、３００ｒｐｍで６時間撹拌した。反応混合物に８５％リン酸水溶液（６．６１ｇ）および精製水（２２．５ｍL、化合物４の重量に対して体積比で１．５倍量）を５分間で滴下し、次いで精製水（９０ｍL、化合物４の重量に対して体積比で６．０倍量）を３０分かけて滴下した。精製水の滴下終了後、３０分間撹拌し、反応温度を３５℃にして種晶（０．３７４６ｇ、化合物４の重量に対して重量比で０．０２５倍量）を加えた。種晶の添加から１０時間後に反応温度を２０℃にし、さらに３０分間撹拌した後、不溶物をろ取し、減圧乾燥して本発明結晶（７．４８ｇ）を得た。
得られた結晶はろ過性が悪く、ろ過に時間がかかったうえ、乾燥前の湿体はスラリー状になって作業性が悪かった。
得られた結晶の粒子サイズを測定すると、モード径は６μｍ程度であった。条件１で得られた結晶の粒子サイズ分布を測定した（図５−１）。【００８３】
条件２
化合物３（１７．５８ｇ）のエタノール溶液（５３．２０ｇ）に水酸化ナトリウム水溶液（２４％、４．６７ｇ）および精製水（１６．２０ｇ）を加えて４０℃で３時間撹拌して化合物４の溶液（７３．１４ｇ）を得た。得られた化合物４の溶液のうち１８．２８ｇにリン酸（１．９１ｇ、２．６当量）および精製水（７．４９ｇ、化合物４の重量に対して体積比で１．５倍量）を３５℃で加え、１時間撹拌した後、種晶（１２５ｍｇ、化合物４の重量に対して重量比で０．０２５倍量）を加えた。種晶の添加から１７時間３０分後、２時間かけて精製水（３０．０ｍL、化合物４の重量に対して体積比で６．０倍）を添加した。１０時間後、反応温度を２０℃にし、撹拌を続けた。２７時間後、固体を濾取し、該固体を精製水（２５．２３ｇ、化合物４の重量に対して体積比で５倍量）で洗浄した。固体を５０℃で乾燥して、本発明結晶（４．０１ｇ）を得た。
種晶の添加から１６時間後および２１時間後にサンプリングし、ＨＰＬＣにより定量して結晶の析出率を算出したところ、それぞれ４％および９７％であった。
条件２のように種晶接種前の精製水量が少ない場合には、結晶析出率が極めて低くなることがわかった。すなわち、本発明結晶を析出させるためには、エタノール溶液に添加する精製水量、すなわち晶析溶媒の組成が重要であることがわかった。また、析出率が低い溶液に精製水をさらに添加すると結晶は析出したが、条件１と同様にろ過などの操作性が不良な結晶が得られた。【００８４】
条件３
化合物３（２６．３７ｇ）のエタノール溶液（７９．８２ｇ）に水酸化ナトリウム水溶液（２４％、７．０１ｇ）および精製水（２４．３０ｇ）を加えて４０℃で４時間３０分撹拌して化合物４の溶液を得た。得られた化合物４の溶液に２０℃にてリン酸（９．７０ｇ、２．２当量）および精製水（４５．００ｇ、化合物４の重量に対して体積比で１．５倍量）を加え、さらに精製水（４５．１３ｇ、化合物４の重量に対して体積比で１．５倍量）を加えて３０℃にて４０分間撹拌した後、種晶（７５１ｍｇ、化合物４の重量に対して重量比で０．０２５倍量）を加えた。１６時間後、２時間かけて精製水（１３５ｍＬ、化合物４の重量に対して体積比で４．５倍）を添加した。６時間後に温度を２０℃とし、さらに１時間撹拌した。固体を濾取し、該固体を精製水（１５０．０２ｇ、化合物４の重量に対して体積比で５倍量）で洗浄した。固体を５０℃で乾燥して、本発明結晶（２６．９５ｇ）を得た。
得られた結晶の粒子サイズを測定すると、モード径は１０μｍ程度であった。得られた結晶は、ろ過などの操作性は良好であった。条件３で得られた結晶の粒子サイズ分布を測定した（図５−２）。
上記の通り、温度を３０℃程度に設定し、条件３に記載した程度の量の精製水を加えてから種晶を添加し、一定程度の時間をおいて結晶を大きく成長させた後にさらに精製水を添加することによって、良好な析出率および操作性で結晶を取得した。【００８５】
【表８】
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【００８６】
反応装置および撹拌条件
条件２
反応装置：ＥａｓｙＭａｘ（登録商標）（メトラー・トレド社）
撹拌条件：３００ｒｐｍ
【００８７】
条件３
反応装置：ＯｐｔｙＭａｘ（登録商標）（メトラー・トレド社）
撹拌条件：２５０ｒｐｍ
【００８８】
ＨＰＬＣ測定条件
機器名：
カラム：ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３Ｖ（５μｍ、４．６Ｘ１５０ｍｍ）
流動層Ａ：水／アセトニトリル／トリフルオロ酢酸＝１９００：１００：１
流動層Ｂ：水／アセトニトリル／トリフルオロ酢酸＝１００：１９００：１【００８９】
粒子トレンド測定条件
機器名：Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｔｒａｃｋ（登録商標）ＭＡＬＶＥＲＮ，Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ  ２０００（湿式）
測定範囲：０．０２０〜２０００．０００μｍ
測定時間：１０秒間
測定強度範囲：３．０〜２０．０％
撹拌速度：約２０００ｒｐｍ【００９０】
上記の通り、条件３のように十分な精製水を加えてから種晶を添加し、一定程度の時間をおいて結晶を大きく成長させた後にさらに精製水を添加することによって、十分な析出量を担保しつつ、流動性やろ過性の良好なコード長の大きい結晶を多く含む結晶を得ることができた。これにより、ろ過などの操作性が改善した。
【００９１】
実験例８  ヒトＭＣ１Ｒアゴニスト測定
本発明結晶を用いて、特許文献１の実験例１に記載の以下の方法に準じて、細胞内ｃＡＭＰ濃度を測定し、ＥＣ５０値を算出した。 
（１）細胞の培養方法
ヒトＭＣ１Ｒアゴニスト活性測定にはヒトメラノーマ細胞株ＨＢＬを用いた。ＨＢＬの培養：１０％ＦＣＳ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含むＦ−１０  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅを用いて培養した。
（２）ｃＡＭＰアッセイおよびデータの算出
各濃度の化合物溶液をｃＡＭＰアッセイバッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１％ＢＳＡを含むＨＢＳＳ（Hank's Balanced Salt Solution））と混和し、９６ウェルプレートに分注した。ＨＢＬは５×１０４／ｍＬとなるように０．５ｍＭ  ＩＢＭＸを含むｃＡＭＰアッセイバッファーに懸濁し、上記９６ウェルプレートに分注後に混和し、３７℃で３０分間静置後、細胞内ｃＡＭＰ濃度をＥｎｖｉｓｉｏｎを用いた蛍光法により測定した（ｅｘ．３２０ｎｍ、ｅｍ．５９０ｎｍ及び６６５ｎｍ）。得られたデータはｒａｔｉｏ値（６６５ｎｍ測定値／５９０ｎｍ測定値×１００００）から、Ｐｒｉｓｍ  ５．０２を用いてｃＡＭＰ濃度の定量値を算出し、ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ％値（ｖｅｈｉｃｌｅのｃＡＭＰ濃度平均値を０％、αＭＳＨの１０−６ＭでのｃＡＭＰ濃度平均値を１００％としたときの各サンプルの％）を算出し、ＥＣ５０値を計算した。
結果、本発明結晶はＥＣ５０値５．３ｎＭを示し、強いヒトＭＣ１Ｒアゴニスト活性を有する結晶であった。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明結晶は結晶を得る際に使用した溶媒が残留することがなく、熱的安定性に優れ、湿度に対して重量変化が少なく安定であり、潮解せず、化学的安定性に優れており、安全性の観点からも生体に対して悪影響を及ぼす可能性のある化合物を含まない結晶であり、さらに該結晶を再現性よく工業的に適した方法で得られることから、医薬品原薬として優れた結晶である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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