(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料から、連結した標的核酸分子のライブラリーを作製する方法であって、
ａ．少なくとも１つの二本鎖領域を有する第１のアダプターを二本鎖標的分子の各末端に付加するステップ；
ｂ．試料をエキソヌクレアーゼＩＩＩおよび／またはエキソヌクレアーゼＶＩＩと接触させ、標的分子の末端に部分的に一本鎖のアダプター領域を生成するステップ；
ｃ．標的分子の各鎖上の部分的に一本鎖のアダプター領域をハイブリダイズさせることによって少なくとも２つの標的分子を接合させて二本鎖アダプター領域を形成し、および標的分子の鎖を共有結合させることにより、連結した標的分子を生成するステップ；ならびに、
ｄ．１つまたは複数のバーコード、ユニバーサル増幅プライミング部位およびシーケンスプライミング部位を含む第２のアダプターを連結した分子に付加して、それにより連結した標的核酸分子のライブラリーを生成するステップ；
を含む、前記方法。
【請求項２】
第１のアダプターが、アダプター配列が組み込まれたプライマーにより標的核酸分子を増幅することによって付加される、または第１のアダプターが、標的核酸分子の末端へのライゲーションによって付加される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１のアダプターが、両末端がライゲーションできるアダプターおよび１つの末端のみがライゲーションできるアダプターの混合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第１のアダプターが、５’末端から少なくとも約１５塩基の位置にエキソヌクレアーゼ耐性領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法のための連結した標的核酸分子のライブラリーを産生するキットの使用であって、前記キットが、少なくとも１つの二本鎖領域を有する第１のアダプター、１つまたは複数のバーコード、ユニバーサル増幅プライミング部位およびシーケンスプライミング部位を含む第２のアダプター、エキソヌクレアーゼＩＩＩおよび／またはエキソヌクレアーゼＶＩＩ、核酸ポリメラーゼ、ならびに核酸リガーゼを含み、任意選択により、第１のアダプター配列に相補的な増幅プライマー、熱安定性核酸ポリメラーゼおよび少なくとも４つのデオキシヌクレオシド三リン酸の混合物をさらに含む、前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸シーケンスの分野に関する。より具体的には、本発明は、一分子シーケンスのための核酸のライブラリーを作製する分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
一分子シーケンス（ＳＭＳ）プラットフォーム、例えばナノポア式プラットフォームは、塩基配列がリアルタイムでＤＮＡの個々の鎖から直接読まれることを可能にする。長いリード長が可能だが、ＳＭＳプラットフォームは現在、競合するショートリードシーケンスプラットフォームと比較して低いスループットの問題がある。同時に、多くのシーケンス用途、例えば腫瘍学および出生前検査は、本質的に、短い核酸断片、例えば母体血液またはがん患者の血液に微量で存在する無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）または循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を使用する（Ｎｅｗｍａｎ，Ａ．ら（２０１４）Ａｎ  ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｎｇ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ＤＮＡ  ｗｉｔｈ  ｂｒｏａｄ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｃｏｖｅｒａｇｅ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．３５１９参照）。ＳＭＳプラットフォームの長いリード長の利点の利用のために、様々な核酸標的を適応させる方法が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
いくつかの実施形態では、本発明は、試料から、連結した標的核酸分子のライブラリーを作製する方法であって、少なくとも１つの二本鎖領域を有する第１のアダプターを二本鎖標的分子の各末端に付加するステップ；試料をエキソヌクレアーゼと接触させ、標的分子の末端に、部分的に一本鎖のアダプター領域を生成するステップ；標的分子の各鎖上の部分的に一本鎖のアダプター領域をハイブリダイズさせることによって少なくとも２つの標的分子を接合させて二本鎖アダプター領域を形成し、および標的分子の鎖を共有結合させることにより、連結した標的分子を生成するステップ；１つまたは複数のバーコード、ユニバーサル増幅プライミング部位およびシーケンスプライミング部位を含む第２のアダプターを、連結した分子に付加して、それにより連結した標的核酸分子のライブラリーを生成するステップを含む方法である。第１のアダプターは、アダプター配列が組み込まれたプライマーにより標的核酸分子を増幅することによって、または標的核酸分子の末端へのライゲーションによって付加され得る。エキソヌクレアーゼは、５’−３’活性を持ち得、３’−５’活性を欠く。標的分子の接合はポリメラーゼの代用を含んでよく、ポリメラーゼは３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠き得る。いくつかの実施形態では、標的分子の接合はライゲーションステップを含み得る。いくつかの実施形態では、連結した産物は、第２のアダプターを付加するステップの前に精製され得る。
【０００４】
いくつかの実施形態では、方法は、連結した標的核酸分子のライブラリーをシーケンスするステップをさらに含む。連結した標的核酸分子は、シーケンスの前にサイズによって分画され得る。生物学的ナノポア式法、固体ナノポア式法、および一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ（登録商標））式法から選択される方法によって得られ得る。
【０００５】
いくつかの実施形態では、第１のアダプターは、両末端がライゲーションできるアダプターおよび１つの末端のみがライゲーションできるアダプターの混合物を含む。第１のアダプターは、５’末端から少なくとも約１５塩基の位置にエキソヌクレアーゼ耐性領域を含み得る。いくつかの実施形態では、エキソヌクレアーゼ耐性領域は少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第２のアダプターは、ステムループ構造を含む。いくつかの実施形態では、第２のアダプターは、共にヘアピン構造を形成する少なくとも１つの二本鎖部分および少なくとも１つの一本鎖ループからなる。
【０００６】
いくつかの実施形態では、標的分子は、最初のエキソヌクレアーゼ処置の前に増幅される。いくつかの実施形態では、連結した分子は、第２のアダプターのライゲーションの前に増幅される。
【０００７】
いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも１つの二本鎖領域を有する第１のアダプターを二本鎖標的分子の各末端に付加するステップ；アダプター含有二本鎖標的分子をエキソヌクレアーゼと接触させ、標的分子の末端に、部分的に一本鎖のアダプター領域を生成するステップ；標的分子の各鎖上の部分的に一本鎖のアダプター領域をハイブリダイズさせることによって少なくとも２つの標的分子を接合させて二本鎖アダプター領域を形成し、および標的分子の鎖を共有結合させることにより、連結した標的分子を生成するステップ；１つまたは複数のバーコード、ユニバーサル増幅プライミング部位およびシーケンスプライミング部位を含む第２のアダプターを、連結した分子に付加して、それにより連結した標的核酸分子のライブラリーを生成するステップを含む方法を使用して作製された連結した標的核酸分子のライブラリーである。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも１つの二本鎖領域を有する第１のアダプター、１つまたは複数のバーコード、ユニバーサル増幅プライミング部位およびシーケンスプライミング部位を含む第２のアダプター、エキソヌクレアーゼ、核酸ポリメラーゼ、および核酸リガーゼを含む、連結した標的核酸分子のライブラリーを産生するキットである。キットは、第１のアダプター配列に相補的な増幅プライマー、熱安定性核酸ポリメラーゼおよび少なくとも４つのデオキシヌクレオシド三リン酸の混合物をさらに含み得る。
【０００９】
いくつかの実施形態では、本発明は、試料から、連結した標的核酸分子のライブラリーを作製する方法であって、レアカット制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むアダプター分子を、二本鎖標的核酸分子の少なくとも１つの末端に付加して、アダプターライゲート標的分子を形成するステップ；アダプターライゲート標的分子をレアカット制限エンドヌクレアーゼによって消化し、部分的に一本鎖の末端を形成するステップ；部分的に一本鎖の末端をハイブリダイズおよび共有結合させることによって少なくとも２つのエンドヌクレアーゼ消化したアダプターライゲート標的分子を接合させ、それにより連結した標的分子を生成するステップを含む。いくつかの実施形態では、アダプターは、レアカット制限エンドヌクレアーゼ認識部位が組み込まれたプライマーにより標的核酸分子を増幅することによって付加される。いくつかの実施形態では、プライマーは、標的特異的配列と分子バーコードまたは無作為配列と分子バーコードをさらに含む。アダプターは、ライゲーションによって標的核酸分子の末端に付加され得る。レアカット制限エンドヌクレアーゼ認識部位は、１０以上の塩基長であり得る。レアカット制限エンドヌクレアーゼは、ホーミング制限エンドヌクレアーゼ、例えばＳｃｅＩまたはＶＤＥである。
【００１０】
いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼ消化したアダプターライゲート標的分子は、連結のステップの前に精製される。
【００１１】
いくつかの実施形態では、アダプターはバーコード配列を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、方法は、第２のアダプターを、連結した分子の少なくとも１つの末端に付加するステップをさらに含み、アダプターは少なくとも１つのシーケンスプライマー結合部位を含む。いくつかの実施形態では、方法は、連結した標的核酸分子のライブラリーをシーケンスするステップをさらに含む。連結した標的核酸分子は、例えば、沈殿剤の添加によってシーケンスの前にサイズによって分画され得る。
【００１３】
配列は、生物学的ナノポア式法、固体ナノポア式法、および一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ（登録商標））式法から選択される方法によって得られる。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本発明は、試料から、連結した標的核酸分子を作製する方法であって、レアカット制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むアダプター分子を、二本鎖標的核酸分子の少なくとも１つの末端に付加して、アダプターライゲート標的分子を形成するステップ；プライマーをアダプターライゲート標的分子の各鎖にハイブリダイズさせるステップであって、プライマーがレアカット制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むステップ；プライマーを伸長して、アダプターライゲート標的分子の各鎖から、各末端でレアカット制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含有する新しい分子を形成するステップ、新しい分子をレアカット制限エンドヌクレアーゼによって消化し、部分的に一本鎖の末端を形成するステップ；部分的に一本鎖の末端をハイブリダイズおよび共有結合させることによって少なくとも２つのエンドヌクレアーゼ消化した新しい分子を接合し、それにより連結した標的分子を生成するステップを含む。プライマーは、標的特異的配列および分子バーコードを含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、新しい分子を増幅するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも１つのシーケンスプライマー結合部位を含む第２のアダプターを、連結した分子の少なくとも１つの末端に付加して、連結した標的核酸分子をシーケンスするステップをさらに含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本発明は、レアカット制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むアダプター分子を、二本鎖標的核酸分子の少なくとも１つの末端に付加して、アダプターライゲート標的分子を形成するステップ；アダプターライゲート標的分子をレアカット制限エンドヌクレアーゼによって消化し、部分的に一本鎖の末端を形成するステップ；部分的に一本鎖の末端をハイブリダイズおよび共有結合させることによって少なくとも２つのエンドヌクレアーゼ消化したアダプターライゲート標的分子を接合し、それにより連結した標的分子を生成するステップを含む方法を使用して作製した連結した標的核酸分子のライブラリーである。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本発明は、レアカット制限エンドヌクレアーゼ認識部位および分子バーコードを含むアダプター、ユニバーサルプライミング部位を含む第２のアダプター、レアカット制限エンドヌクレアーゼおよび核酸リガーゼを含む、連結した標的核酸分子のライブラリーを産生するキットである。キットは、ユニバーサルプライミング部位に相補的なプライマー、熱安定性核酸ポリメラーゼおよび少なくとも４つのデオキシヌクレオシド三リン酸の混合物をさらに含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１−１】図１ａ：短いＤＮＡアンプリコンを長いコンカテマーに接合する方法を示す図である。ＰＣＲプライマー中のアダプターによる本発明の連結方法の実施形態の図である。
【図１−２】図１ｂ：短いＤＮＡアンプリコンを長いコンカテマーに接合する方法を示す図である。連結体の蓄積を示すゲル電気泳動画像の図である。図１ｃ：短いＤＮＡアンプリコンを長いコンカテマーに接合する方法を示す図である。連結した試料の環状コンセンサス配列リードのサイズを示すヒストグラムである。
【図２−１】図２ａ：５倍より多くシーケンススループットを増加する本発明の方法を示す図である。異なる配列特性の型および方向を示す例示的な配列リードの図である。図２ｂ：５倍より多くシーケンススループットを増加する本発明の方法を示す図である。全てのリードで特定されたフォワードおよびリバース相補鎖方向における断片およびアダプターの数を示すヒストグラムである。
【図２−２】図２ｃ：５倍より多くシーケンススループットを増加する本発明の方法を示す図である。各サイズビンにおける断片の頻度を示すヒストグラムである。図２ｄ：５倍より多くシーケンススループットを増加する本発明の方法を示す図である。リード長およびそのリードで特定された断片の数の間の関係を示す散布図である。図２ｅ：５倍より多くシーケンススループットを増加する本発明の方法を示す図である。全てのリードにわたるリードあたり特定された断片の数の頻度を示すヒストグラムである。
【図３−１】図３ａ：腫瘍学アンプリコンパネルにおいて一塩基変異体（ＳＮＶ）を正確に特定する本発明の方法を示す図である。本発明で使用した例示的なバイオインフォマティクス分析経路の図である。図３ｂ：腫瘍学アンプリコンパネルにおいて一塩基変異体（ＳＮＶ）を正確に特定する本発明の方法を示す図である。予測頻度に対してプロットした連結試料の複製において特定された入力ＤＮＡにおける公知の一塩基変異体のアリール頻度（ＡＦ）の比較を示す散布図である。図３ｃ：腫瘍学アンプリコンパネルにおいて一塩基変異体（ＳＮＶ）を正確に特定する本発明の方法を示す図である。非連結試料で見いだされる頻度に対してプロットした連結試料の複製において特定されたＡＦの比較を示す散布図である。
【図３−２】図３ｄ：腫瘍学アンプリコンパネルにおいて一塩基変異体（ＳＮＶ）を正確に特定する本発明の方法を示す図である。非連結および連結試料の３回の複製においてアンプリコンカバー度を比較する棒プロットである。
【図４−１】図４ａ：代替の標的濃縮ワークフローへの本発明の方法の適用を示す図である。標的分子がエンドリペアおよびＡテーリング（ＥＲＡＴ）によりアダプターライゲーションのために調製される本発明の連結方法の実施形態の図である。
【図４−２】図４ｂ：代替の標的濃縮ワークフローへの本発明の方法の適用を示す図である。連結体の蓄積を示すゲル電気泳動画像を示す図である。図４ｃ：代替の標的濃縮ワークフローへの本発明の方法の適用を示す図である。コンカテマーリードの連結解除後の断片長の頻度を示すヒストグラムである。
【図５】連結の間にどのようにアダプターおよび標的配列がアセンブルするかを示す図である。図５ａは、一方向の標的−アダプター組合せを示す図である。図５ｂは、別の方向の標的−アダプター組合せを示す図である。図５ｃは、図５ａおよび図５ｂに示す「連結単位」が２つの異なる方法でアセンブルできることを示す図である。
【図６−１】図６ａ：連結した標的配列のシーケンスを示す図である。連結体の蓄積を示すゲル電気泳動画像を示す図である。図６ｂ：連結した標的配列のシーケンスを示す図である。低分子量ＤＮＡラダーの電気泳動図を示す図である。
【図６−２】図６ｃ：連結した標的配列のシーケンスを示す図である。アダプターライゲーションおよびアダプターライゲート断片の選択的増幅後の電気泳動図を示す図である。図６ｄ：連結した標的配列のシーケンスを示す図である。ＬＭＷコンカテマーシーケンスランとアダプターライゲートおよびＰＣＲ増幅ＬＭＷによるランからのシーケンス断片の数を比較する散布図である。
【図７】アダプターライゲーションによる方法の変化を示す図である。
【図８】プライマー伸長による方法の変化を示す図である。
【図９】ライゲーションに続くプライマー伸長による方法の変化を示す図である。
【図１０】サイズ制御連結実験の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
第１の態様では、本発明は、試料から、連結した標的核酸分子のライブラリーを作製する方法であって、
ａ．少なくとも１つの二本鎖領域を有する第１のアダプターを二本鎖標的分子の各末端に付加するステップ；
ｂ．試料をエキソヌクレアーゼと接触させ、標的分子の末端に、部分的に一本鎖のアダプター領域を生成するステップ；
ｃ．標的分子の各鎖上の部分的に一本鎖のアダプター領域をハイブリダイズさせることによって少なくとも２つの標的分子を接合させ、二本鎖アダプター領域を形成するステップ、および標的分子の鎖を共有結合させ、それにより連結した標的分子を生成するステップ；ならびに
ｄ．１つまたは複数のバーコード、ユニバーサル増幅プライミング部位、およびシーケンスプライミング部位を含む第２のアダプターを、連結した分子に付加して、それにより連結した標的核酸分子のライブラリーを生成するステップ
を含む方法を提供する。
【００１９】
第１のアダプターは、アダプター配列が組み込まれたプライマーにより標的核酸分子を増幅することによって、または標的核酸分子の末端へのライゲーションによって付加され得る。
【００２０】
ステップｂのエキソヌクレアーゼは、５’−３’活性を持ち、３’−５活性を欠き得る。
【００２１】
ステップｃの標的分子の接合は、ポリメラーゼの代用を含む。次いでポリメラーゼは３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠き得る。
【００２２】
ステップｃの標的分子の接合はライゲーションステップを含み得る。連結した産物は、第２のアダプターを付加するステップの前に精製される。本発明の方法は、連結した標的核酸分子のライブラリーをシーケンスするステップをさらに含み得る。この場合、連結した標的核酸分子は、シーケンスの前にサイズによって分画され得る。生物学的ナノポア式法、固体ナノポア式法、および一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ（登録商標））式法から選択される方法によって得られ得る。
【００２３】
第１のアダプターは、両末端がライゲーションできるアダプターおよび１つの末端のみがライゲーションできるアダプターの混合物を含み得る。第１のアダプターは、５’末端から少なくとも約１５塩基の位置にエキソヌクレアーゼ耐性領域も含み、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチドを含み得る。第２のアダプターは、ステムループ構造を含んでよく、または共にヘアピン構造を形成する少なくとも１つの二本鎖部分および少なくとも１つの一本鎖ループからなってよい。
【００２４】
標的分子が、ステップｂのエキソヌクレアーゼ処置の前に増幅され得る、請求項１に記載の方法。連結した分子は、ステップｄの第２のアダプターのライゲーションの前に増幅される。
【００２５】
第２の態様では、本発明は、
ａ．少なくとも１つの二本鎖領域を有する第１のアダプターを二本鎖標的分子の各末端に付加するステップ；
ｂ．アダプター含有二本鎖標的分子をエキソヌクレアーゼと接触させ、標的分子の末端に、部分的に一本鎖のアダプター領域を生成するステップ；
ｃ．標的分子の各鎖上の部分的に一本鎖のアダプター領域をハイブリダイズさせることによって少なくとも２つの標的分子を接合させて二本鎖アダプター領域を形成し、および標的分子の鎖を共有結合させることにより、連結した標的分子を生成するステップ；
ｄ．１つまたは複数のバーコード、ユニバーサル増幅プライミング部位およびシーケンスプライミング部位を含む第２のアダプターを、連結した分子に付加して、それにより連結した標的核酸分子のライブラリーを生成するステップ
を含む方法を使用して作製された連結した標的核酸分子のライブラリーを提供する。
【００２６】
第３の態様では、本発明は、少なくとも１つの二本鎖領域を有する第１のアダプター、１つまたは複数のバーコード、ユニバーサル増幅プライミング部位およびシーケンスプライミング部位を含む第２のアダプター、エキソヌクレアーゼ、核酸ポリメラーゼ、および核酸リガーゼを含む、連結した標的核酸分子のライブラリーを産生するキットを提供する。キットは、第１のアダプター配列に相補的な増幅プライマー、熱安定性核酸ポリメラーゼおよび少なくとも４つのデオキシヌクレオシド三リン酸の混合物をさらに含み得る。
【００２７】
第４の態様では、本発明は、試料から、連結した標的核酸分子のライブラリーを作製する方法であって、
ａ．レアカット制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むアダプター分子を、二本鎖標的核酸分子の少なくとも１つの末端に付加して、アダプターライゲート標的分子を形成するステップ；
ｂ．アダプターライゲート標的分子をレアカット制限エンドヌクレアーゼによって消化し、部分的に一本鎖の末端を形成するステップ；
ｃ．部分的に一本鎖の末端をハイブリダイズおよび共有結合させることによって少なくとも２つのエンドヌクレアーゼ消化したアダプターライゲート標的分子を接合させ、それにより連結標的分子を生成するステップ
を含む方法を提供する。
【００２８】
アダプターは、レアカット制限エンドヌクレアーゼ認識部位が組み込まれたプライマーにより標的核酸分子を増幅することによって付加され得る。プライマーは、標的特異的配列および分子バーコードをさらに含み得る。前記レアカット制限エンドヌクレアーゼ認識部位は、少なくとも１０塩基長であり得る。レアカット制限エンドヌクレアーゼは、ホーミング制限エンドヌクレアーゼであってよく、またはＳｃｅＩおよびＶＤＥから選択されてよい。エンドヌクレアーゼ消化したアダプターライゲート標的分子は、連結のステップの前に精製される。アダプターはバーコード配列も含み得る。
【００２９】
前記方法は、第２のアダプターを、連結した分子の少なくとも１つの末端に付加するステップをさらに含んでよく、アダプターは少なくとも１つのシーケンスプライマー結合部位を含む。次いで、連結した標的核酸分子のライブラリーをシーケンスするさらなるステップが実行され得る。この場合、連結した標的核酸分子は、重合体の沈殿剤の添加によってシーケンスの前にサイズによって分画され得る。
【００３０】
第５の態様では、本発明は、試料から、連結した標的核酸分子を作製する方法であって、
ａ．レアカット制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むアダプター分子を、二本鎖標的核酸分子の少なくとも１つの末端に付加して、アダプターライゲート標的分子を形成するステップ；
ｂ．プライマーをアダプターライゲート標的分子の各鎖にハイブリダイズさせるステップであって、プライマーがレアカット制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むステップ；
ｃ．プライマーを伸長して、アダプターライゲート標的分子の各鎖から、各末端でレアカット制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含有する新しい分子を形成するステップ；
ｄ．新しい分子をレアカット制限エンドヌクレアーゼによって消化し、部分的に一本鎖の末端を形成するステップ；
ｅ．部分的に一本鎖の末端をハイブリダイズおよび共有結合させることによって少なくとも２つのエンドヌクレアーゼ消化した新しい分子を接合し、それにより連結標的分子を生成するステップ
を含む方法を提供する。
【００３１】
プライマーは、標的特異的配列を含んでよく、分子バーコードをさらに含み得る。方法は、ステップｃの後に新しい分子を増幅するステップをさらに含み得る。方法は、少なくとも１つのシーケンスプライマー結合部位を含む第２のアダプターを、連結した分子の少なくとも１つの末端に付加するステップも含み得る。この場合、連結した標的核酸分子をシーケンスするステップが追加され得る。
【００３２】
第６の態様では、本発明は、
ａ．レアカット制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むアダプター分子を、二本鎖標的核酸分子の少なくとも１つの末端に付加して、アダプターライゲート標的分子を形成するステップ；
ｂ．アダプターライゲート標的分子をレアカット制限エンドヌクレアーゼによって消化し、部分的に一本鎖の末端を形成するステップ；
ｃ．部分的に一本鎖の末端をハイブリダイズおよび共有結合させることによって少なくとも２つのエンドヌクレアーゼ消化したアダプターライゲート標的分子を接合し、それにより連結した標的分子を生成するステップ
を含む方法を使用して作製した連結した標的核酸分子のライブラリーを提供する。
【００３３】
第７の態様では、本発明は、レアカット制限エンドヌクレアーゼ認識部位および分子バーコードを含むアダプター、ユニバーサルプライミング部位を含む第２のアダプター、レアカット制限エンドヌクレアーゼおよび核酸リガーゼを含む、連結した標的核酸分子のライブラリーを産生するキットを提供する。
【００３４】
定義
以下の定義は本開示の理解を助ける。
用語「試料」は、標的核酸を含有するまたは含有すると推定される任意の組成物を指す。これは個体から単離された組織または体液の試料、例えば、皮膚、血漿、血清、髄液、リンパ液、滑液、尿、涙、血液細胞、臓器および腫瘍、ならびに個々の患者またはモデル生物から採取した細胞から確立されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の試料を含み、ホルマリン固定パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥＴ）およびそこから単離された核酸を含む。試料は、無細胞材料、例えば無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）または循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含有する無細胞血液分画も含み得る。
【００３５】
用語「核酸」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらのサブカテゴリー、例えばｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ等を含む、ヌクレオチド（例えば、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチド、天然と非天然の両方）のポリマーを指す。核酸は、一本鎖または二本鎖であってよく、通常５’−３’リン酸ジエステル結合を含有するが、いくつかの場合では、ヌクレオチド類似体は他の結合を有し得る。核酸は天然に生じる塩基（アデノシン、グアノシン、シトシン、ウラシルおよびチミジン）ならびに非天然の塩基を含み得る。非天然の塩基のいくつかの例は、例えばＳｅｅｌａら（１９９９）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ８２：１６４０に記載のものを含む。非天然の塩基は、例えば核酸二重鎖の安定性を増加し、ヌクレアーゼ消化を阻害し、またはプライマー伸長もしくは鎖の重合を遮断する、特別な機能を有し得る。
【００３６】
用語「コンカテマー（ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒ）」および「連結体（ｃｏｎｃａｔｅｎａｔｅ）」は交換可能に使用され、より短い核酸を共有結合することによって生成された長い連続的な核酸分子を指す。
【００３７】
用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は交換可能に使用される。ポリヌクレオチドは一本鎖または二本鎖核酸である。オリゴヌクレオチドは、より短いポリヌクレオチドを記載するために使用されることがある用語である。オリゴヌクレオチドは、少なくとも６個のヌクレオチドまたは約１５〜３０個のヌクレオチドから構成され得る。オリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知の任意の好適な方法、例えば、Ｎａｒａｎｇら（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０−９９；Ｂｒｏｗｎら（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９−１５１；Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２２：１８５９−１８６２；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら（１９８１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５−３１９１に記載されるように直接化学合成を含む方法によって調製される。
【００３８】
用語「プライマー」は、標的核酸内の配列（「プライマー結合部位」）とハイブリダイズし、そのような合成に好適な条件下で核酸の相補鎖に沿って合成の開始点として作用することができる一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。プライマー結合部位は各標的に特有であり、全ての標的に添加され得る（「ユニバーサルプライミング部位」または「ユニバーサルプライマー結合部位」）。
【００３９】
用語「アダプター（ａｄａｐｔｏｒ）」または「アダプター（ａｄａｐｔｅｒ）」は交換可能に使用され、さらなる特性をその配列に持たせるように別の配列に添加され得るヌクレオチド配列を意味する。アダプターは、典型的には、一本鎖または二本鎖であってよく、一本鎖部分と二本鎖部分の両方を有し得るオリゴヌクレオチドである。アダプターは、バーコードおよびユニバーサルプライマーまたはプローブ部位などの配列を含有し得る。
【００４０】
用語「ライゲーション」は、１つの分子の５’−リン酸基が別の分子の３’−ヒドロキシル基と反応する、２つの核酸鎖を接合する縮合反応を指す。ライゲーションは、典型的には、リガーゼまたはトポイソメラーゼによって触媒される酵素反応である。ライゲーションは、２つの一本鎖を接合して１つの一本鎖分子を作製することができる。ライゲーションはまた、それぞれ二本鎖分子に属する２つの鎖を接合することができ、したがって２つの二本鎖分子を接合する。ライゲーションはまた、二本鎖分子の両鎖を別の二本鎖分子の両鎖に接合することができ、したがって２つの二本鎖分子を接合する。ライゲーションはまた、二本鎖分子内の鎖の２つの末端を接合することもでき、したがって二本鎖分子のニックを修復する。
【００４１】
用語「バーコード」は、検出および特定され得る核酸配列を指す。バーコードは、様々な核酸に組み込まれ得る。バーコードは、例えば２、５、１０ヌクレオチドなど、十分長く、試料において、バーコードを組み込んだ核酸はバーコードによって区別され、グループ分けされ得る。
【００４２】
用語「マルチプレックス識別子」および「ＭＩＤ」は、標的核酸の供給源（例えば、核酸が由来する試料）を特定するバーコード（複数の試料からの核酸が合わされている場合必要とされる）を指す。同じ試料に由来する全てのまたは実質的に全ての標的核酸は、同じＭＩＤを共有する。異なる供給源または試料由来の標的核酸は混合され、同時にシーケンスされ得る。ＭＩＤを使用して、配列リードは、標的核酸が生じる個々の試料に割り当てられ得る。
【００４３】
用語「ユニーク分子識別子」および「ＵＩＤ」は、それが付加される核酸を特定するバーコードを指す。同じ試料由来の全てのまたは実質的に全ての標的核酸は、異なるＵＩＤを有する。同じ起源の標的核酸に由来する全てのまたは実質的に全ての子孫（例えば、アンプリコン）は同じＵＩＤを共有する。
【００４４】
用語「ユニバーサルプライマー」および「ユニバーサルプライミング結合部位」または「ユニバーサルプライミング部位」は、プライマーおよび（典型的には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで添加される）異なる標的核酸に存在するプライマー結合部位を指す。例えば、ユニバーサルプライミング部位は、複数の標的核酸にライゲートしたアダプターに含まれ得る。ユニバーサルプライミング部位は、例えば標的特異的プライマーの５’末端に添加されることによって標的特異的（非ユニバーサル）プライマーの部分でもあり得る。ユニバーサルプライマーは、ユニバーサルプライミング部位に結合し、ユニバーサルプライミング部位からプライマー伸長を導き得る。
【００４５】
本明細書で使用する場合、用語「標的配列」、「標的核酸」または「標的」は、検出または分析される試料における核酸配列の部分を指す。用語「標的」は、標的配列の全ての変異体、例えば１つまたは複数の変異型変異体および野生型変異体を含む。
【００４６】
用語「シーケンスする」は、標的核酸におけるヌクレオチドの配列を決定する任意の方法を指す。
【００４７】
ＤＮＡシーケンスのコストは、ムーアの法則を超える速さでここ１０年の間に劇的に減少した。本発明者らは、全ヒトゲノムをシーケンスするのにかかるコストが＄１，０００より少ない時代に急速に近づいているが、試薬のコスト、インフォーマティクス基盤、試料調製の時間およびシーケンスにより、多くの複雑なゲノムを解読することが依然として実現できていない。このため、目的の情報を含有するゲノムの一部を選択的に濃縮する複数の「標的濃縮」方法が近年開発された。これらの戦略は、シーケンスコストを下げ、シーケンスの深度を上げ、シーケンス時間を短縮し、データ分析を単純にする有効な方法を提供し、ヒトの疾患を引き起こし得るゲノム多型の検出に広く適用される。最も一般的な濃縮方法としては、マルチプレックスＰＣＲ、分子反転プローブ、およびハイブリッド捕捉がある。これらの標的濃縮手法は、典型的には、ＭｉＳｅｑおよびＨｉＳｅｑシステムによって例示されるペアエンドリードによるアレイ式のクラスター生成方法など、ショートリードシーケンスプラットフォームに理想的には好適な、短いＤＮＡ分子（１００〜３００ｂｐ）を含有するシーケンスライブラリーを生成する。（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌ．）しかしながら、一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ（登録商標））およびナノポア式シーケンスなど、代替のシーケンスプラットフォームが魅力的になりつつある。
【００４８】
例えば、一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ（登録商標））技術（Ｐａｃｉｆｉｃ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、Ｃａｌ．）は、ＤＮＡポリメラーゼが両鎖にわたる複数のパスによって数キロベースより長いリードを生成し得る、標的核酸の両鎖を含有する環状鋳型を使用する。これらの多重パスからの情報は単一パスあたりの比較的高いエラー率を軽減し、正確性の高い環状コンセンサス配列（ＣＣＳ）リードを生成するために使用される。ナノポアベースのシーケンスは、短いリンカーによって膜包埋ナノポアタンパク質に結合した単一ＤＮＡポリメラーゼを含む。鋳型および４つのユニークにタグ付けしたヌクレオチドが添加され、ＤＮＡ合成が開始する。三元複合体の形成の間に、ポリメラーゼは相補的なタグ付けされたヌクレオチドに結合する；ヌクレオチドに特異的なタグは次いでポアに捕捉される。各タグは、異なるサイズ、質量、または電荷を持つように設計され、それらは特徴的な電流遮断特性を生成するため、添加された塩基をユニークに特定する。Ｓｔｒａｎｇｅｓら（２０１６）Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎａｎｏｐｏｒｅ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｆｏｒ  ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｎ  ａｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  ａｒｒａｙ．ＰＮＡＳ１１３（４４）：Ｅ６７４９参照。
【００４９】
ロングリード技術、例えばＳＭＲＴ（登録商標）およびナノポア式法は、ｄｅ  ｎｏｖｏゲノムアセンブリ、複雑な構造多型の検出およびゲノムの伸長した繰り返し領域の特徴付けのためのショートリードシーケンサーの現在の制限に立ち向かう。
【００５０】
しかしながら、これらのロングリード技術は現在、低いシーケンススループットの問題がある。いくつかの現在利用可能なシステムでは、ランあたりに生成されるリードの数は典型的には数万である。新世代の装置は、シーケンススループットをおよそ７倍に増加すると予想されるが、依然としてショートリードシーケンサーと比較してかなり低いスループットである。これは、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）またはホルマリン固定したパラフィン包埋組織（ＦＦＰＥＴ）から抽出されたＤＮＡを含む無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）など、短いＤＮＡ分子を含む、シーケンス用途を考慮した挑戦を提示する。短いＤＮＡ断片が長いＤＮＡ鋳型へと連結される新規の試料調製戦略は、一分子シーケンサーのスループットを増加し得る。さらに、そのような方法は、これらのプラットフォームの多用途性を増加し、コスト効率の良い方法で長いおよび短いＤＮＡ分子両方をシーケンスする。
【００５１】
近年、合成生物学コミュニティーは、ゲノム工学ならびに高付加価値生体分子、例えば医薬およびバイオ燃料などの産生のために、遺伝子または遺伝子クラスターへとＤＮＡ断片を連結する様々な分子生物学的方法を開発してきた。例えば、ギブソン・アセンブリは３つの酵素：５’エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、およびＤＮＡリガーゼを利用して、単一のワンポット等温反応で相補的な末端とＤＮＡ断片を共有結合させる方法である（米国特許第８，９６８，９９９号参照）。ほとんどのギブソン・アセンブリ適用では、連結された断片はベクターにクローニングされ、続いて所望の構築物の配列検証のため細菌によって継代される。
【００５２】
一実施形態では、本発明は、シーケンスのための連結された核酸のライブラリーを生成する方法である。図１ａおよび図４ａは本発明に記載の方法の例を示す。
【００５３】
本発明は、核酸シーケンスのための試料から標的核酸のライブラリーを生成するステップを含む。試料中の全ての核酸を含む複数の核酸は、本明細書に記載の方法および組成物を使用してライブラリー分子へと転換され得る。いくつかの実施形態では、試料は対象または患者に由来する。いくつかの実施形態では、試料は、例えば生検により対象または患者由来の固体組織または固体腫瘍の断片を含み得る。試料はまた、体液（例えば、尿、痰、血清、血漿またはリンパ液、唾液、痰、汗、涙、脳脊髄液、羊水、滑液、心膜液、腹水、胸水、嚢胞液、胆汁、胃液、腸液、または糞便試料）も含み得る。試料は、正常または腫瘍細胞が存在し得る全血または血液分画を含み得る。いくつかの実施形態では、試料、特に液体試料は、無細胞材料、例えば無細胞腫瘍ＤＮＡまたは腫瘍ＲＮＡを含む無細胞ＤＮＡまたはＲＮＡなどを含み得る。いくつかの実施形態では、試料は無細胞試料、例えば無細胞腫瘍ＤＮＡまたは腫瘍ＲＮＡが存在する無細胞血液由来試料である。他の実施形態では、試料は、培養試料、例えば、培養中の細胞または培養中に存在する感染因子由来の核酸を含有するまたは含有すると考えられる培養または培養上清である。いくつかの実施形態では、感染因子は、細菌、原生動物、ウイルスまたはマイコプラズマである。試料はまた、生物由来の核酸を含有するまたは含有すると考えられる環境試料であってもよい。
【００５４】
標的核酸は、試料中に存在し得る目的の核酸である。いくつかの実施形態では、標的核酸は遺伝子または遺伝子断片である。いくつかの実施形態では、全ての遺伝子、遺伝子断片および遺伝子間領域（全ゲノム）が標的核酸を構成する。いくつかの実施形態では、ゲノムの部分のみ、例えばゲノムのコード領域（エクソーム）のみが標的核酸を構成する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、一塩基多型もしくは変異体（ＳＮＶのＳＮＰ）、または例えば遺伝子融合をもたらす遺伝的再編成を含む、遺伝的変異体、例えば多型の遺伝子座を含有する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、バイオマーカー、すなわちその変異体が疾患または症状と関連する遺伝子を含む。他の実施形態では、標的核酸は特定の生物に特有であり、生物、または薬物感受性もしくは薬物耐性など病原菌の特性の特定に役立つ。さらに他の実施形態では、標的核酸は、例えば、対象のユニークなＨＬＡまたはＫＩＲ遺伝子型を規定するＨＬＡまたはＫＩＲ配列など、ヒト対象に特有である。
【００５５】
本発明の実施形態では、１つまたは複数の標的核酸は、本発明の鋳型形状に転換される。いくつかの実施形態では、標的核酸は一本鎖形態で天然に生じる（例えば、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ウイルスＲＮＡを含むＲＮＡ；または一本鎖ウイルスＤＮＡ）。他の実施形態では、標的核酸は二本鎖形態で天然に生じる。当業者は、本発明の方法は複数の実施形態を有すると認識する。一本鎖標的核酸は二本鎖形態に転換され、次いで図１に示したステップに供され得る。より長い標的核酸は配列特異的方法（制限酵素）または非特異的方法（超音波処理）によって断片化され得るが、いくつかの適用では、より長い標的核酸はより長いリードを達成することが望まれ得る。いくつかの実施形態では、標的核酸は、例えば、環状無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）または化学的に保存もしく保管された試料に見いだされるものなどの化学的に分解されたＤＮＡなど、自然に断片化される。
【００５６】
第１のステップでは、複数の二本鎖ＤＮＡ分子が提供される。いくつかの実施形態では、二本鎖ＤＮＡ分子は、単離されたゲノムＤＮＡまたは複雑度が低減されたゲノムＤＮＡであってよい（例えば、ゲノムの増幅した選択領域またはゲノムの捕捉した選択領域、例えばエクソーム）。いくつかの実施形態では、二本鎖ＤＮＡはＲＮＡの逆転写、または一本鎖核酸を二本鎖核酸にコピーする他の方法の結果である。
【００５７】
次のステップでは、二本鎖ＤＮＡ分子は第１のアダプターに各末端で付加される。
【００５８】
一実施形態では、アダプターは制限酵素認識配列を含有する。アダプターは、ゲノム中でまれに生じるレアカット認識配列を含有することが好ましい。いくつかの実施形態では、認識配列は１０以上の塩基長である。いくつかの実施形態では、認識配列は、制限消化断片の方向性接合を確実にする非パリンドロームである。多くのそのような酵素が当技術分野で公知である。Ｂｈａｇｗａｔ，Ａ．、（１９９２）Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｕｓｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ２１６：１９９参照。いくつかの実施形態では、制限エンドヌクレアーゼは、ＳｃｅＩまたはＶＤＥなど、ホーミングイントロンコードエンドヌクレアーゼである。これらのエンドヌクレアーゼは、極端に長い認識配列（１８塩基対まで）を有し、これは哺乳動物のゲノムにおいて１度より多く起こらないようであり、さらにこれらのエンドヌクレアーゼは、断片の方向性接合を確実にする非対称のカットを生成する、Ｊａｓｉｎ，Ｍ．（１９９６）Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｗｉｔｈ  ｒａｒｅ−ｃｕｔｔｉｎｇ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１２：２２４参照。
【００５９】
いくつかの実施形態では、鋳型ＤＮＡ分子はアダプターに各末端でライゲートされ、両側に制限酵素認識配列を有する。制限酵素消化後、複数の鋳型ＤＮＡ分子は互いに接合され得る。（図１）。アダプターは、分子バーコードおよびユニバーサルプライマー部位を含むさらなる配列を含み得る。いくつかの実施形態では、アダプターは最適な長さおよびＧＣ含量を有するように設計される。いくつかの実施形態では、約１０、１５、２０、３０または４０ｂｐ長のアダプターが使用される。いくつかの実施形態では、アダプター配列のＧＣ含量は約３０％、４０％または５０％である。
【００６０】
いくつかの実施形態では、アダプターは、標的特異的部分およびアダプター部分を含む伸長するプライマーを介して付加される。いくつかの実施形態では、プライマーが使用され、プライマー伸長産物またはアンプリコンがアダプター配列を含有するプライマー伸長またはＤＮＡ増幅（例えば、ＰＣＲ）が実施される。いくつかの実施形態では、１回のプライマー伸長または増幅が実施される。他の実施形態では、１回のプライマー伸長または増幅は、標的特異的部分およびユニバーサルプライマー結合部位を含むプライマーを使用する。２回目のプライマー伸長または増幅は、アダプター配列を含むユニバーサルプライマーを使用する。
【００６１】
いくつかの実施形態では、アダプターは二本鎖標的核酸にライゲートされる。アダプターは、少なくとも１つのライゲート可能な二本鎖部分を含む。標的核酸は、ライゲーションに好適な末端を含み、または酵素的に処理されそのような末端を獲得する。いくつかの実施形態では、標的核酸の端は「研磨され」、すなわち核酸ポリメラーゼによって伸長され二本鎖末端を確実にした。いくつかの実施形態では、標的核酸の５’末端がリン酸化される。いくつかの実施形態では、ライゲーションは平滑末端ライゲーションである。いくつかの実施形態では、ライゲーションは粘着末端ライゲーションである。標的核酸の３’末端は、単一ヌクレオチド（例えばＡ）によって伸長され、アダプターは工学的に操作され、３’末端に相補的なオーバーハング（例えばＴ）を含有する。
【００６２】
いくつかの実施形態では、制限酵素認識配列は、標的特異的部分および制限酵素認識配列を含む伸長するプライマーを介して付加される。（図８）。いくつかの実施形態では、ハイブリッド手法が使用される。二本鎖アダプターは、所望の方向で制限酵素認識配列を持つように設計される。アダプターはＤＮＡ断片の両末端にライゲートされる（図９）。アダプターライゲーション後、標的特異的伸長プライマーが各鎖（（＋）または（−）鎖）に使用され、鎖特異的ＩＤ（ＳＩＤ）と制限酵素認識配列の両方を所望の方向で持つ。プライマーは、１つの鎖にハイブリダイズされるか、または２つのプライマーがアダプターライゲート標的分子の各鎖に別々にハイブリダイズされる。標的特異的プライマーおよびアダプターに存在するプライマー結合部位にハイブリダイズするプライマーは、試料から所望の標的分子のみの増幅、例えばＰＣＲによる、を可能にする。増幅産物は、制限酵素認識配列に対して所望の方向で標的ＤＮＡ断片を含む。
【００６３】
制限エンドヌクレアーゼが導入され、アダプター−ライゲート分子またはプライマー伸長の産物の末端が消化される。消化は、特定の方向でのみ接合され得る部分的に一本鎖の末端を有する非対称の分子を生成する。
【００６４】
次のステップでは、アダプター−ライゲート標的分子が接合され、連結体が形成される。いくつかの実施形態では、少なくとも２つ、少なくとも３つ、および最大５、１０以上まで、標的分子は連結体に接合される。この戦略は、各単位が所望の方向を持つ連結体の作製を可能にし、下流における特定および連結体内の各標的分子における配列情報のデコンボリューションを促進する。例えば、ＵＩＤの使用は、分子のコンセンサスが得られるように、同じオリジナル配列由来の分子の特定を可能にする。そのような手法は、がんと関連する変異体の検出のため、臨床由来の材料を典型的に表す短いＤＮＡ断片からの情報の照合に幅広い適用を有する。
【００６５】
いくつかの実施形態では、より短い核酸のプール（一緒に連結される）は１つの特定の種のみからなり、したがって生成される「コンカテマー」または「連結体」は、複数コピーの同じ短い核酸分子を含有する。いくつかの実施形態では、より短い核酸のプール（一緒に連結される）は、複数の異なる核酸種からなり、したがって生成される「コンカテマー」または「連結体」は、異なる短い核酸分子からなる（いくつかの場合では、それは複数コピーで生じ得る）。いくつかの実施形態では、より短い核酸のプールは、コンカテマーへとそれらを一緒に連結させる前に、標的濃縮手法（例えば、限定はされないが、ハイブリッド捕捉、マルチプレックスＰＣＲ、分子反転プローブ（ＭＩＰ）技術）によって事前に選択される。いくつかの実施形態では、短い核酸のプールは、特定の標的領域を濃縮されず、試料の核酸分子の全集団を表す（例えば、ゲノムＤＮＡまたは無細胞ＤＮＡ）。
【００６６】
いくつかの実施形態では、連結は無作為な形式で生じる；新しい単位は増殖するコンカテマーの両末端に添加され得る。単量体は徐々に枯渇され、高度なコンカテマー（例えば、二量体、三量体、四量体等、総称してｎ量体と呼ばれる）が生成される。図１ｂに示した実施形態では、ｎ量体の観察された長さはほぼ正確に予測されたサイズであった。
【００６７】
いくつかの実施形態では、接合ステップは、別々の分子の相補的または少なくとも部分的に相補的な一本鎖末端の生成およびハイブリダイゼーションを含む。いくつかの実施形態では、相補的または少なくとも部分的に相補的な一本鎖末端は、アダプター−ライゲート標的核酸分子を、５’−３’活性を有するエキソヌクレアーゼと接触させることによって生成される。いくつかの実施形態では、エキソヌクレアーゼは検出可能な３’−５’活性を欠損する。いくつかの実施形態では、エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼＴ５、エキソヌクレアーゼＴ７、ラムダエキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩトランケートおよびそれらの混合物から選択される。
【００６８】
いくつかの実施形態では、接合ステップは、ＤＮＡポリメラーゼを利用して、別々の分子の相補的または少なくとも部分的に相補的な一本鎖末端のハイブリダイゼーションによって形成される構造のギャップを埋める。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは検出可能な３’−エキソヌクレアーゼ活性を欠損する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは熱安定性である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼおよびＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）ポリメラーゼから選択される。
【００６９】
いくつかの実施形態では、接合ステップは、ＤＮＡリガーゼを利用して、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長された鎖をシールする。いくつかの実施形態では、ＤＮＡリガーゼは熱安定性である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡリガーゼは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼおよびそれらの混合物から選択される。
【００７０】
いくつかの実施形態では、連結された標的分子は、サイズによって分画され、好ましいサイズがさらなる分析のために選択される。いくつかの実施形態では、より大きい断片を濃縮する分画は（より高次の連結体）、例えば密集剤の存在下での磁気ビーズ捕捉など磁気ビーズ捕捉（固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）技術）、パルスフィールドゲル電気泳動を含む分取ゲル電気泳動による。
【００７１】
いくつかの実施形態では、本発明は連結反応の間に生成されたコンカテマーの最大長を制御する手段を含む。いくつかの実施形態では、連結は、両末端がライゲート可能なアダプターと１つの末端のみがライゲート可能な「有毒な」アダプターの混合物を使用することによって制限される。好適な（典型的にははるかにより少ない）濃度の「有毒な」アダプターを封じることにより、さらなるライゲーションによってもはや伸長され得ない、キャッピングされた連結体を生じる。いくつかの実施形態では、「有毒な」アダプターは、ライゲート可能な二本鎖末端およびライゲート不可能な閉ループのヘアピン末端を含む。いくつかの実施形態では、「有毒な」アダプターは、ライゲート可能なリン酸化末端およびライゲート不可能な非リン酸化末端を含む。いくつかの実施形態では、「有毒な」アダプターは、本方法のシーケンスステップに使用される第２のアダプターである（以下にさらに詳細に記載する）。さらに別の実施形態では、コンカテマーの長さは、アルカリフォスファターゼ活性を有する酵素を反応に導入することによって制御され、ライゲーションに利用可能なアダプターのリン酸化末端の数を制限する。
【００７２】
さらに他の実施形態では、連結体のサイズはサイズ依存的沈殿によって制御される。例えば、ポリマー沈殿剤の存在下でのライゲーション反応のインキュベーション。いくつかの実施形態では、沈殿剤は、所望のサイズを超える沈殿ＤＮＡに公知の濃度のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えばＰＥＧ２０００、４０００、６０００または８０００である。いくつかの実施形態では、沈殿は固体支持体上で起こり、添加剤、例えばＭｇ２＋などの陽イオンによって制御または増強され得る。いくつかの実施形態では、ＭｇＣｌ２（例えば、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭまたはそれ以上の濃度）の添加は、連結体が特定のサイズに達する場合、固体支持体上で連結体の沈殿を駆動する。
【００７３】
次のステップでは、連結した標的分子は第２のアダプターと接合される。いくつかの実施形態では、第２のアダプターは、アダプターライゲート連結標的分子のシーケンスを可能にする。いくつかの実施形態では、第２のアダプターは、特定のシーケンスプラットフォーム、例えば、シーケンスプライマー結合部位に必要なエレメントを含有する。いくつかの実施形態では、アダプターは、例えば米国特許第８４５５１９３号に記載のように、二本鎖ステム部分と一本鎖ループ部分を含むヘアピンアダプターである。
【００７４】
いくつかの実施形態では、アダプターは、１つまたは複数のバーコードを含む。バーコードは、試料が混合（マルチプレックス）される場合、試料の起源を特定するために使用されるマルチプレックス試料ＩＤ（ＭＩＤ）であり得る。バーコードはまた、各オリジナル分子およびその子孫を特定するために使用されるユニーク分子ＩＤ（ＵＩＤ）としても寄与し得る。バーコードはまた、ＵＩＤとＭＩＤの組合せでもあり得る。いくつかの実施形態では、単一のバーコードは、ＵＩＤとＭＩＤの両方として使用される。別の型のバーコードは、標的分子の各鎖、例えば（＋）および（−）鎖をマークするように設計された鎖バーコード（ＳＩＤ）である。
【００７５】
いくつかの実施形態では、各バーコードは、前定義された配列を含む。他の実施形態では、バーコードは無作為配列を含む。バーコードは１〜２０ヌクレオチド長であってよい。
【００７６】
いくつかの実施形態では、アダプターは、少なくとも１つのユニバーサルプライマーのプライマー結合部位をさらに含む。プライマー結合部位はプライマーに相補的な配列であり、プライマーが結合し鎖の伸長を促進し得る。
【００７７】
いくつかの実施形態では、アダプターは１つより多くの、例えば２つのプライマー結合部位を有する。いくつかの実施形態では、１つのプライマーは、例えばＰＣＲ（非対称ＰＣＲを含む）、線形増幅、またはローリングサークル複製（ＲＣＡ）による増幅のために使用される。
【００７８】
アダプターライゲート連結標的核酸のライブラリーはシーケンスされ得る。本発明の方法によって作製された鋳型ライブラリーは、長いリードが可能な一分子シーケンス（ＳＭＳ）技術に特に有利である。そのような技術の例としては、ＳＭＲＴ（登録商標）技術（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、Ｃａｌ．）を利用するＰａｃｉｆｉｃ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓプラットフォーム、またはＯｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）によって製造された生物学的ナノポア式装置またはＲｏｃｈｅ  Ｇｅｎｉａ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、Ｃａｌ．）または、例えば、国際出願公開第２０１６／１４２９２５号およびＳｔｒａｎｇｅｓら（２０１６）Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎａｎｏｐｏｒｅ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｆｏｒ  ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｎ  ａｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  ａｒｒａｙ．ＰＮＡＳ１１３（４４）：Ｅ６７４９に記載の固体ナノポア式装置、ならびに長いリードに好適な任意の他の現在既存のまたは将来的な一分子シーケンス技術が挙げられる。
【００７９】
いくつかの実施形態では、シーケンスステップは配列分析を含む。配列分析は１次および２次分析を含み得る。いくつかの実施形態では、１次分析は、シーケンス装置とインターフェースを取り、装置によって回収されたシグナル（例えば、蛍光または電気的な）をベースコールへと変換するソフトウェアによって実施される分析を含む。いくつかの実施形態では、２次分析は１次配列に実施され、配列アラインを含む。いくつかの実施形態では、２次分析は連結解除をさらに含む。
【００８０】
いくつかの実施形態では、連結解除は慎重なステップを含む。いくつかの実施形態では、方法は、スキャンウィンドウが各リードに沿ってスライドし、予測されるアダプター配列とほぼ一致させるステップを含む。いくつかの実施形態では、使用したアダプターの長さに依存するアダプター配列のマッチングの間の欠失および挿入を含む、１、２、３、４またはそれ以上のミスマッチは許容される。いくつかの実施形態では、各リードのアダプターの位置は、ＢＬＡＳＴなどの計算法によって位置づけられる。これらの方法は、全てのリードのアダプターおよび断片位置のリストを生成するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、連結解除後、断片は、ゲノムまたは標的ゲノム領域からの配列のリストなどのサブゲノム画分にアラインされる。
【００８１】
いくつかの実施形態では、試料は類似のサイズの標的核酸を含有する。例えば、いくつかの実施形態では、標的核酸は、試料から単離および増幅された単一遺伝子または遺伝子領域である。他の実施形態では、標的核酸は同じ長さの配列のライブラリー、例えば、母親の血液中に見いだされる無細胞胎児ＤＮＡを含むヒト血液に見いだされる無細胞ＤＮＡである。そのようなＤＮＡは、平均１５０ｂｐ長である。いくつかの実施形態では、予測されるサイズのリードの数またはパーセンテージが算出され得る。他の実施形態では、連結体の平均の長さが算出され得る。例えば、表１に示した計算は平均して、各リードが５．６８断片を含有することを実証する。
【００８２】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、非連結断片のプールのシーケンスと比較して、連結のおかげでシーケンススループットを増加する。例えば、連結の程度に依存して、スループットは２、３、４、５倍またはそれより多く増加され得る。
【００８３】
【表１】
0006925424.tif 000002
【００８４】
本発明は、シーケンスライブラリー「ＣｏｎｃａｔＳｅｑ」を調製する新規の方法およびレアカットの制限酵素を利用する関連方法である。「ＣｏｎｃａｔＳｅｑ」。方法は、非連結試料と比較してランあたり５倍より多く一分子シーケンス（ＳＭＳ）プラットフォームのシーケンススループットを増加することができる。いくつかの実施形態では、全てのシーケンスリードにわたって検出された断片の平均数は、約５と観察され得る。いくつかの実施形態では、最大５０断片からなるはるかにより長いコンカテマーが検出された。いくつかの実施形態では、５倍をはるかに超えてシーケンススループットを増加する能力は、シーケンスの前にサイズ選択をライブラリーに適用することによって達成される。
【００８５】
いくつかの実施形態では、配列決定の正確性は標的配列のいくつかのコピーを読むことから得られるコンセンサス配列に依存する。例えば、ＰａｃＢｉｏ’ｓ  ＳＭＲＴ（登録商標）技術の正確性は、鋳型の両鎖にわたる複数のパスから決定される環状コンセンサス配列（ＣＣＳ）リードに依存する。したがって、有用なシーケンス情報を生み出すコンカテマーの長さには固有の上限が存在する。例えば、現在の統計学は、５つの完全なパスによりＰａｃＢｉｏの正確性は９９％に達することを示し、ポリメラーゼリードの平均長は１０〜１５ｋｂの間であり、２および４ｋｂの間の理想的な長さの連結したシーケンスライブラリーを作製する。標的濃縮ワークフローによって生成された短い断片が典型的にはおよそ２００ｂｐであると仮定すると、本発明者らは、本発明者らの方法はさらに最適化され、ＰａｃＢｉｏシーケンススループットを１０〜２０倍に増加することができると推定する。
【００８６】
連結反応の間に生成されたコンカテマーの最大長を制御するため、本発明者らは、（サイズ選択の、上に列挙した戦略に加えて）１つまたは両方の末端の分子をキャッピングするアダプターの急上昇を使用する手法を想定する。そのようなアダプターの非限定的な例は、ＰａｃＢｉｏ特異的ヘアピンアダプターである。有毒なアダプターは、さらなる増殖からの連結を防ぐ。そのような「有毒な」アダプターの出発濃度は、最終ライブラリーのサイズ分布を制御するために使用され得る。
【００８７】
本明細書に記載の実施例は、よく特徴付けられたＤＮＡ試料において公知のＳＮＶを正確に検出することによる、本発明の方法の検証を示す。公知のアリール頻度との比較およびオリジナルプールにおける分子の表現は、非連結試料と非常に高い一致を示し、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙがエラー率またはサンプリングバイアスを著しく増加しないことを実証し、ＣｏｎｃａｔＳｅｑ（図３ｃおよび図３ｄ参照）の妥当性を確証した。本明細書に記載の方法を使用する配列決定の正確性は、「高品位」リード、例えば少なくとも５パスのＣＣＳリードを含むことのみ、および／またはＰＣＲ反応のバランスを取り各アンプリコンの等モル表現を確実にすることによって、さらに改善され得る。本明細書に記載の実施例は、非常に短い断片（８０〜２２０ｂｐ長の間）による腫瘍学標的パネルに焦点を当てたが、ＬＭＷラダーを使用する実験（図５ａ〜ｃ）は、ＣｏｎｃａｔＳｅｑがはるかにより長い断片を連結することに適用することができ、したがって他の研究領域に適用され得ることを実証する。
【００８８】
本発明の方法は、シーケンスアダプターがライゲーション、例えばハイブリッド捕捉などによって組み込まれる、マルチプレックスＰＣＲおよびワークフローによって実証されるように、様々な標的濃縮ワークフローに容易に適用され得る。同様の溶液は、他のアッセイ、例えば分子反転プローブに基づくＨＥＡＴ−Ｓｅｑ（Ｒｏｃｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃ．）などに適用され得る。この場合、オリジナルプロトコールへの唯一の改変は、環状化標的分子の増幅の間にＣｏｎｃａｔＳｅｑアダプターまたはレアカット制限酵素部位を有するアダプターを含有するプライマーの使用である。
【００８９】
その容易さにより、本明細書に記載の方法は、それらのオリジナルワークフローを最小限に改変しながら、異なる標的濃縮スキームに適用され、即席の連結方法およびそれらの変更は、限定はされないが、ＰａｃＢｉｏプラットフォームおよびナノポア式プラットフォームを含む、長いリードシーケンス技術の強力および多用途の新しい試料調製ツールを提供する。
【００９０】
いくつかの実施形態では、本発明はシーケンスに好適な連結した核酸配列のライブラリーである。ライブラリーは、さらに第２のアダプターに隣接する、連結した第１のアダプターライゲート標的核酸を含む。ライブラリーは、レアカット制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むアダプター分子を、二本鎖標的核酸分子の少なくとも１つの末端に付加して、アダプターライゲート標的分子を形成するステップ；アダプターライゲート標的分子をレアカット制限エンドヌクレアーゼによって消化し、部分的に一本鎖の末端を形成するステップ；部分的に一本鎖の末端とハイブリダイズおよび共有結合させることによって少なくとも２つのエンドヌクレアーゼ消化したアダプターライゲート標的分子を接合させ、それにより連結した標的分子を生成するステップを含む方法によって生成される。
【００９１】
いくつかの実施形態では、本発明は、シーケンスに好適な連結した核酸配列の別のライブラリーである。ライブラリーは、さらに第２のアダプターに隣接する、連結した第１のアダプターライゲート標的核酸を含む。ライブラリーは、少なくとも１つの二本鎖領域を有する第１のアダプターを二本鎖標的分子の各末端に付加するステップ；アダプター含有二本鎖標的分子をエキソヌクレアーゼと接触させ、標的分子の末端に部分的に一本鎖のアダプター領域を生成するステップ；標的分子の各鎖上の部分的に一本鎖のアダプター領域をハイブリダイズさせることによって少なくとも２つの標的分子を接合させて二本鎖アダプター領域を形成し、および標的分子の鎖を共有結合させることにより、連結した標的分子を生成するステップ；ならびに１つまたは複数のバーコード、ユニバーサル増幅プライミング部位およびシーケンスプライミング部位を含む第２のアダプターを、連結した分子に付加して、それにより連結した標的核酸分子のライブラリーを生成するステップを含む方法によって生成される。
【００９２】
いくつかの実施形態では、本発明は、レアカット制限エンドヌクレアーゼ認識部位および分子バーコードを含むアダプター、ユニバーサルプライミング部位を含む第２のアダプター、レアカット制限エンドヌクレアーゼおよび核酸リガーゼ、ならびに任意選択により、ユニバーサルプライミング部位に相補的なプライマー、熱安定性核酸ポリメラーゼおよび少なくとも４つのデオキシヌクレオシド三リン酸の混合物、を含む連結した標的核酸分子のライブラリーを産生するためのキットである。
【００９３】
いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも１つの二本鎖領域を有する第１のアダプター、１つまたは複数のバーコードを含む第２のアダプター、ユニバーサル増幅プライミング部位、およびシーケンスプライミング部位、エキソヌクレアーゼ、核酸ポリメラーゼ、および核酸リガーゼ、ならびに任意選択により、第１のアダプター配列に相補的な増幅プライマー、熱安定性核酸ポリメラーゼおよび少なくとも４つのデオキシヌクレオチド三リン酸の混合物も含む連結した標的核酸分子のライブラリーを産生するための別のキットである。
【実施例】
【００９４】
実施例１  連結した標的分子のライブラリーの作製
ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、試薬およびキット。この実施例では、市販のＫＲＡＳ変異ヒト細胞系由来のゲノムＤＮＡをＨｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＨＤ７０１）およびＰｒｏｍｅｇａ（Ｇ１４７１）から購入した。低分子量ＤＮＡラダーはＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（Ｎ３２３３）から購入した。オリゴヌクレオチドおよびＮｕｃｌｅａｓｅ−Ｆｒｅｅ  Ｄｕｐｌｅｘ  ＢｕｆｆｅｒはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。１つのオリゴヌクレオチドは、シトシンにおけるアミノ基の組込みによって内部で改変した。ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  ＭｉｘおよびＰｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼはＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（Ｅ２６２１）から購入した。エキソヌクレアーゼＩＩＩ（Ｍ０３７９）およびエキソヌクレアーゼＶＩＩ（Ｍ０２０６）はＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓから購入した。Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩおよびＭｇＣｌ２とＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎ８０８０２４１）、Ｎｕｃｌｅａｓｅ−Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒ（ＡＭ９９３７）およびＱｕｂｉｔ  ｄｓＤＮＡアッセイの試薬（Ｑ３２８５０およびＱ３２８５１）はＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。ＫＡＰＡ  Ｈｙｐｅｒ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＫＫ８５０３）およびＫＡＰＡ  Ｐｕｒｅ  Ｂｅａｄｓ（ＫＫ８００２）はＫＡＰＡ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓから購入した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  ＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒシステムのＡｇｉｌｅｎｔ  ＤＮＡ  ７５００  ｋｉｔｓ（５０６７−１５０４）は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。
【００９５】
ＰＣＲ増幅および標的分子の連結。図１〜図３に記載の実験では、ゲノムの標的領域をまず、遺伝子特異的プライマーおよび３０ｎｇのＨＤ７０１のゲノムＤＮＡを使用して、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して増幅した。この１回目のＰＣＲにより、各アンプリコンの両末端に隣接するスペーサーと一緒に標的領域を増幅した。図１ａ〜ｃおよび図２ａ〜ｅに記載した実験では、生じるＰＣＲ産物を、次いで、スペーサー配列からプライミングし、２つの別々のＰＣＲ反応で相補的なＣｏｎｃａｔＳｅｑアダプターを両末端に組み込む２つのプライマー対によって増幅した。図３ａ〜ｄに記載した実験では、プライマー不適合により２つの別々のＰＣＲ反応で２０個の標的領域をまず増幅した（それぞれ、１１および９アンプリコン）。相補的なＣｏｎｃａｔＳｅｑアダプターをそれらの末端に組み込むため、２つのＰＣＲ産物を続いて増幅した。生じるＰＣＲ産物を、次いでＫＡＰＡ  Ｐｕｒｅ  Ｂｅａｄｓを使用して洗浄し、Ｑｕｂｉｔ  ｄｓＤＮＡ  ＢＲ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを使用して定量した。２００〜３００ｎｇの２つのＰＣＲ産物それぞれを、次いで混合し、最終容積はＰＣＲグレードの水で４０μｌにした。等量（４０μｌ）のＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを添加し、５０℃で１時間インキュベートした。Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ後、ＫＡＰＡ  Ｐｕｒｅ  Ｂｅａｄｓを使用するクリーンアップステップ、続いてＱｕｂｉｔ定量（典型的には、濃度は約１０ｎｇ／μｌ）、およびＡｇｉｌｅｎｔ’ｓ  ＤＮＡ７５００アッセイを使用するサイズ範囲分析を行った。
【００９６】
連結前の標的分子へのＣｏｎｃａｔＳｅｑアダプターのライゲーション。図４ａ〜ｃに記載した実験では、２つの異なる相補的なＴテールのＣｏｎｃａｔＳｅｑアダプターを、最終濃度２０μＭでＰＣＲプライマー配列をアニーリングすることによって生成した。図４ａに記載した実験では、ＥＧＦＲ遺伝子座の４つの異なる領域をヒトゲノムＤＮＡ（男性）から増幅した。ＰＣＲ産物の濃度は、Ｑｕｂｉｔ  ｄｓＤＮＡ  ＢＲアッセイを使用して決定し、次いで等モル濃度（約７３ｎＭ）でプールした。図４ｂに記載した実験では、ＮＥＢのＬＭＷ  ＤＮＡラダーを１０ｎｇ／μｌに希釈し、投入材料として使用した。図４ａおよび図４ｂ、両方では、ＤＮＡ試料を２つの反応に分け（それぞれ約２５０ｎｇの総ＤＮＡ量を含む２５μｌ）、ＫＡＰＡ  Ｈｙｐｅｒ  Ｐｒｅｐアッセイ：末端修復、Ａテーリング、および２つのＴテールのＣｏｎｃａｔＳｅｑアダプターへのライゲーションに供した。生じたアダプターライゲート断片のプールを、次いで、ＰＣＲ増幅し、両末端に効果的にライゲートしたアダプターを有する断片を濃縮した。ＤＮＡ濃度は、Ｑｕｂｉｔ  ｄｓＤＮＡ  ＢＲ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを使用して定量した。２００〜３００ｎｇの２つのＰＣＲ産物それぞれを、次いで混合し、ＰＣＲグレードの水で４０μｌに合わせた。等量のＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを添加し、５０℃で３０、６０、１００および１２０分間インキュベートした。Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ後、ＫＡＰＡ  Ｐｕｒｅ  Ｂｅａｄｓ（０．８×比）を使用するクリーンアップステップ、続いてＱｕｂｉｔ定量およびＡｇｉｌｅｎｔ’ｓ  ＤＮＡ７５００アッセイを使用するサイズ範囲のサイズ範囲分析を行った。
【００９７】
所望の方向でＵＩＤおよびＳｃｅＩの制限部位の両方を持つ二本鎖アダプターを、ＤＮＡ断片の両末端にライゲートする（図１）。ライゲーション産物をＳｃｅＩによって消化し、ＤＮＡリガーゼによって接合する。
【００９８】
ＰａｃＢｉｏライブラリー調製。およそ１００ｎｇの連結したプールを使用して、ＰａｃＢｉｏシーケンスライブラリーをＫＡＰＡ  Ｈｙｐｅｒ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔを使用して調製した。好適なＴテールヘアピンアダプターを、Ｄｕｐｌｅｘ  Ｂｕｆｆｅｒを使用してアダプターオリゴヌクレオチド（２０μＭ）の自己アニーリングによってまず作製し、８０℃に５分間加熱後、２５℃にゆっくりと下げた（秒あたり０．２℃）。二本鎖ＤＮＡコンカテマーを、次いで、末端修復およびＡテーリングに供し、２０℃で３０分間、ヘアピンアダプターにライゲートした（アダプター対コンカテマーの比はおよそ２５０：１）。未反応のＴテールヘアピンアダプターおよび連結したＤＮＡ分子は、試料にエキソヌクレアーゼＩＩＩおよびエキソヌクレアーゼＶＩＩ（それぞれ１μｌ）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートすることによって除去した。生じたライブラリー分子は、０．８×比でＫＡＰＡ  Ｐｕｒｅ  Ｂｅａｄｓによってクリーンアップし、次いでＱｕｂｉｔ  ｄｓＤＮＡ  ＨＳ  Ａｓｓａｙを使用して定量した。平均して、シーケンスライブラリーの最終濃度は、０．５および２ｎｇ／μｌの間であった。
【００９９】
実施例２  連結した標的分子のライブラリーのシーケンス
ＰａｃＢｉｏシーケンス。Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ（バージョン２．３．１）を使用して、ＭａｇＢｅａｄ  ｏｎｅ−ｃｅｌｌ  ｐｅｒ  ｗｅｌｌ（ＯＣＰＷ）プロトコールを使用してＰａｃＢｉｏシーケンスのライブラリーを調製し、結合キットＰ６ｖ２をプレート上濃度０．０５ｎＭで使用した。プライマー調節およびアニーリング、ならびにポリメラーゼの鋳型への結合、および磁気ビーズへの複合体の結合は、正確に、Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒのプロトコールに示される通りに行った。鋳型複合体は、ＳＭＲＴ細胞にロードする前に４℃で２時間ＭａｇＢｅａｄとインキュベートした。４時間の動画を記録し、ＰａｃＢｉｏ  ＲＳＩＩ装置で１次シーケンス分析を実施した。
【０１００】
実施例３  連結した標的核酸のライブラリーを調製する代替の方法
アダプターを付加する代替の方法。図４ａは、ＳｅｑＣａｐ法（Ｒｏｃｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃ．）への適用を示し、ワークフローの変更が２つだけある。１つ目は、プロトコールの最初にＤＮＡ断片にライゲートするＹ−アダプターが、ＣｏｎｃａｔＳｅｑアダプターによって置き換えられる（図４ａ、アダプターライゲーションステップ）。２つ目は、連結が起こるように１時間、捕捉およびＰＣＲ増幅された標的分子を酵素マスターミックスとインキュベートする新しいステップが導入される。
【０１０１】
ＣｏｎｃａｔＳｅｑアダプターが、ＰＣＲ増幅によって組み込まれるのではなく、ＤＮＡ断片にライゲートされる場合、ＣｏｎｃａｔＳｅｑが作用するかどうか試験するため、本発明者らはまず、ヒトＥＧＦＲ遺伝子座からの４つのＰＣＲ産物からなるプールを生成した。アンプリコンは全て、２２０ｂｐのサイズを有し、鋳型として男性ヒトゲノムＤＮＡ（Ｇ１４７１、Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して増幅した（図４ｂ）。プールしたＤＮＡを、２つのアリコットに分け、２つの型のオーバーラップするアダプターは、Ａテールライゲーションを介して付加した。本発明者らは、図１ａに先に記載したように、連結の前に濃縮のためのＰＣＲステップを実施した。このＰＣＲ反応は、標的濃縮ライブラリーがシーケンス前に増幅される現在のワークフローのＰＣＲステップを模倣することに注意されたい。リードあたりの断片の平均数は、先のランと比較してわずかに減少した。しかしながら、オンターゲット率は優れており、ライゲーションベースの手法が有効であることを確認した。連結解除した断片の大部分は、２２０ｂｐの予測サイズを有した（図４ｃ）。第２の試験のため、本発明者らは、アダプターライゲーションの出発物質として、様々な長さの１１の二本鎖ＤＮＡを含有する低分子量ＤＮＡラダー（ＬＭＷ）を使用した。この連結実験では、リードあたりの断片の平均数は３．８倍に過ぎず（表１）、これは、混合物中のはるかにより長い分子（７６６ｂｐまで）の存在により予測されたものである。本発明者らは、ＬＭＷ断片の内訳が、アダプターライゲーションおよび／またはその後のＰＣＲ増幅によって強く影響されたことに気が付いた（図６ａ〜ｄ）。高い相関性（Ｐｅａｒｓｏｎ’ｓ  ｒ＝０．９７１）が、整列したＬＭＷ断片の頻度とアダプターライゲーション後の断片濃縮の間に見いだされ（図５ｄ）、本発明者らの方法がアセンブリの間に低バイアスで分子をサブサンプルすることを確認した。
【０１０２】
実施例４  シーケンスデータ分析
二次および三次データ分析。インサートのリードは、ＳＭＲＴ  Ｐｏｒｔａｌのデフォルト設定を使用して決定した：１より多くの全パスでのリードおよび最小予測精度９０％のみがＣＣＳリード生成に含まれた。環状コンセンサス配列リードはアダプタースキャン手法を使用して連結解除し、これを、本発明者らはＲで実行した。簡潔に言うと、３０ｂｐのウィンドウ（ＣｏｎｃａｔＳｅｑアダプターの長さに相当する）は各リードに沿ってスライドし、ａｇｒｅｐ関数を使用してＣｏｎｃａｔＳｅｑアダプター配列（フォワードおよびリバース相補鎖方向）におよそのマッチングを実施し、４つまでのミスマッチ、挿入、および／または欠失を許容する。この方法で特定したアダプターは、連結解除断片を後に残してリードから除去する。この方法によって特定された全てのアダプターおよび断片を列挙する新しいｆａｓｔｑファイルを作成する。断片の参照へのアライメントの前に、１ｂｐ長の全ての断片を除去した。スペーサー配列（図１ａ〜ｃ、図３ａ〜ｄに記載の実験において第１のＰＣＲ増幅中に導入された）は連結解除後に各断片の一部を残し、ｂｗａ  ｍｅｍを使用するアライメントの前に特異的に除去されなかった。各断片に隣接するスペーサー配列は、アライメントの間にソフトクリップされた。０または１６のいずれかのｓａｍフラグを有するアライメントのみが、それぞれフォワードまたはリバース相補鎖方向での正確なアライメントを示し、さらなる分析のために維持された。図３ａ〜ｄでは、本発明者らはｓａｍｔｏｏｌｓでｍｐｉｌｅｕｐ関数を使用してアラインした断片のパイルアップを生成した。本発明者らは、Ｐｅｒｌスクリプトを使用して、パイルアップを分割表に変換し、位置ごとの各ベースコールの頻度を報告した。関連のある位置でのアリール頻度（すなわち、公知のＨＤ７０１の一塩基変異体）をこれらの表から抽出し、その位置でアラインしたリードの総数の画分としてプロットした。
【０１０３】
実施例５  本発明の方法の評価
ＣｏｎｃａｔＳｅｑシーケンス評価。本発明者らの連結手法が成功したことを確認するため、本発明者らは詳細な検査のためにＺＭＷ９３から１７１９ｂｐからなるリードを（無作為に）選択する。その長さに基づき、本発明者らは、それが８量体であると考えた。このリードで３つの循環的な特徴が特定された：３０ｂｐ  ＣｏｎｃａｔＳｅｑアダプター、標的配列、およびスペーサー（図２ａ）。（簡潔さのために、本発明者らは、これ以降、標的と隣接するスペーサー配列を「標的」または「断片」と呼ぶ。）本発明者らの手法で使用された設計から予測されるように、アダプターはリードに沿ってフォワードおよびリバース相補鎖方向間で交替する。標的の方向は無作為であるが、両方向はほぼ同じ頻度で存在する（すなわち、フォワード方向に５、リバース相補鎖方向に３）。
【０１０４】
この型の分析を１４，７３９シーケンスリード全てに広げるため、本発明者らは、バイオインフォマティクス方法を実行し、連結解除を自動化した。この方法は、スキャンウィンドウを各リードに沿ってスライドするアルゴリズムに基づき、予測されるアダプター配列にほぼマッチングさせ（欠失および挿入を含む、４つまでのミスマッチが許容される）、リードごとにアダプターおよび断片位置のリストを生成する。予測されるように、フォワードおよびリバース相補鎖方向の全ての断片の数はほぼ正確に等しかった（図２ｂ）。同じことが両方向のアダプターにも当てはまった。本発明者らは、また、断片と比較して少数のアダプターを観察し、これはコンカテマーの末端に位置するアダプターが、トランケートされることがあり、そのために本発明者らのアダプタースキャン手法によって特定されなかったからであると仮定した。リードの末端のさらなる検査により、この仮定が確かめられた。
【０１０５】
合計で、１４，７３９リードで８９，４９６個の断片および７５，３１２個のアダプターを特定した。大多数の標的（ｎ＝６２，０９３、７４．２％）は、正確に１８７ｂｐの予測サイズを有するか、または予測サイズに非常に近かった（１８１〜１９０ｂｐ）（図２ｃ）。特に、１塩基のみからなる断片の第２集団があった（ｎ＝５８１８、６．５％）。これらの断片全てが、リードの開始または末端に位置し、これらのほとんどはアデニンまたはチミジンのいずれかであった（８５％）。これらの１塩基断片は、ライブラリー調製中にＡテールライゲーションを介してｎ量体に付加されたヘアピンアダプターのレムナントである可能性が最も高い（図１ａ）。第３の集団（ｎ＝１２，７８３、１５．３％）は、予測サイズ（＞１９０ｂｐ）よりわずかに長い断片からなった。また、これらの断片の大部分は、リードの末端に位置し、トランケートしたアダプター配列と一緒に標的を含有した。
【０１０６】
本発明者らは、５８１８個の１ヌクレオチド断片をさらなる分析から除外し、連結解除後８３，６７８個の断片を残した（表１）。平均して、各リードは５．６８個の断片を含有し、本発明者らの手法が、非連結断片のプールのシーケンスと比較して少なくとも５倍シーケンススループットを増加したことを示した。標的の参照配列へのアライメントは、素晴らしいオンターゲット率（９８．０％）を示し、連結が、標的配列の忠実度に干渉しなかったことを示した。これは、さらに、ＣｏｎｃａｔＳｅｑの有効性を確証する。
【０１０７】
本実験で連結された断片は、全て同じサイズであったため（図１ｂ、レーン［Ｎ］）、リードの長さとリードにおける断片の数の間の直線関係が予測される。この直線関係は大半のリードで観察された（図２ｄ）。残りの２２リードにおいて、少数のアダプター配列が、それらが参照配列と４つを超えるミスマッチを有したため、本発明者らのアルゴリズムによって特定されなかった。際立ったことに、多くのリード（７０．５％）が、３から７の間の断片を含有し（図２ｅ）、６００から１５００ｂｐの間の長さであり、本発明者らは、最長では１０ｋｂを超えるサイズであり５０を超える断片を含有する（図２ｄ）、広範囲なリード長を見いだした。このことは、ＣｏｎｃａｔＳｅｑは、シーケンスの前により長いコンカテマーをサイズ選択することにより、シーケンススループットをさらに増加させる可能性があることを示す。
【０１０８】
腫瘍学アンプリコンパネルにおいて一塩基変異体（ＳＮＶ）を検出することによるＣｏｎｃａｔＳｅｑの検証。本発明者らは次に、ＣｏｎｃａｔＳｅｑを使用して公知のＳＮＶを正確に特定できるかどうか、および生物試料におけるそれらのアリール頻度を調べた。このため、本発明者らは、鋳型として、よく特徴付けられたＤＮＡ参照（ＨＤ７０１、Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用するＰＣＲによって腫瘍学標的のセットを増幅した。ＨＤ７０１は、市販の操作された同質遺伝子型の細胞系であり、主な腫瘍標的の正確なアリール頻度はデジタルＰＣＲによって決定した。このＤＮＡ試料において、検証した変異体のアリール頻度（ＡＦ）は、１％から２４．５％の間であり、本発明者らのアッセイの正確性および感度のアセスメントを可能にする。５遺伝子（ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、およびＰＩＫ３ＣＡ）にわたる２０のアンプリコンは、２つの別々のマルチプレックスＰＣＲによって生成され（それぞれ１１および９標的を含有する）、次いで相補的なＣｏｎｃａｔＳｅｑアダプターを隣接させた（図１ａ）。等モル量のこれらの２つのアンプリコンプールを混合し、３つの独立した反応で連結し、続いてＰａｃＢｉｏシーケンスし、本発明者らのアッセイの再現性を評価するための３連の試料として働いた。前述のように、これらの試料においてリードあたり平均５より多くの断片が観察された（表１）。本発明者らは、対照として非連結アンプリコンのプールもシーケンスした。次いで、連結解除および非連結断片を２０の参照配列にアラインし、各アライメントのパイルアップを生成し、続いてＨＤ７０１細胞系のＤＮＡの公知の変異体のＡＦを抽出する、バイオインフォマティクスパイプラインを確立した（図３ａ）。３つ連結した試料全ておよび非連結対照のオンターゲット率はまた、非常に高かった（＞９６．１％）。ＣｏｎｃａｔＳｅｑによって特定されたアリール頻度は、連結した試料の３つの複製物と予測頻度の間に高い相関があり（Ｐｅａｒｓｏｎ’ｓ  ｒ＝０．９５９）（図３ｂ）、高い正確性と感度でこの情報を回復するＣｏｎｃａｔＳｅｑの能力を示した。連結および非連結対照におけるＡＦの比較は、さらに高い一致を示し（Ｐｅａｒｓｏｎ’ｓ  ｒ＝０．９８７）、予測頻度からのずれが、連結またはＰａｃＢｉｏシーケンスの間ではなく、アンプリコン生成の間に導入されるようであることを示した。本発明者らの手法が、連結前のプールにおいて示されるアンプリコンの頻度に著しいバイアスを導入しないことを確かめるため、本発明者らは、３つの連結した試料および非連結試料における２０アンプリコンそれぞれのカバー率を比較した（図３ｄ）。これらの群間で非常に高い相関が見いだされ（Ｐｅａｒｓｏｎ’ｓ  ｒ＞０．９４４）、ＣｏｎｃａｔＳｅｑが低バイアスでオリジナルプールからアンプリコンをサブサンプリングすることを示した。
【０１０９】
実施例６  アダプターライゲーションを介する連結した標的分子のライブラリーの作製
ＵＩＤおよび所望の方向のＳｃｅＩの制限部位の両方を持つ二本鎖アダプターを、ＤＮＡ断片の両末端にライゲートする（図１）。ライゲーション産物は、ＳｃｅＩによって消化し、ＤＮＡリガーゼによって接合する。
【０１１０】
実施例７  プライマー伸長を介する連結した標的分子のライブラリーの作製
フォワードおよびリバースプライマーは、所望の方向でＳｃｅＩの制限部位およびＵＩＤを持つように設計する（図２）。これらのプライマーを使用して、ＰＣＲを介して試料内の目的の領域を選択する。ＰＣＲ増幅に続いて、増幅産物をＳｃｅＩによって消化し、ＤＮＡリガーゼによって接合する。
【０１１１】
実施例８  ライゲーションおよびプライマー伸長を介する連結した分子のライブラリーの作製
ＵＩＤおよび所望の方向のＳｃｅＩの制限部位の両方を持つ二本鎖アダプターを、ＤＮＡ断片の両末端にライゲートする（図３）。（＋）または（−）鎖に対して設計され、鎖特異的ＩＤ（ＳＩＤ）および所望の方向のＳｃｅＩ制限部位の両方を持つ伸長プライマーは、標的分子の各鎖に別々にハイブリダイズする。ＰＣＲ後、所望のインサート方向のアダプター付加（ａｄａｐｔｅｄ）断片分子を生成する。代わりに、両鎖の伸長プライマーは、標的分子に同時にハイブリダイズする。ＰＣＲ後、無作為なインサート方向を有するアダプター付加断片分子を生成する。両反応から精製したＰＣＲ産物は、次いで上記のように処理され得る。
【０１１２】
実施例９  所望のサイズ範囲の連結体の作製
標的ＤＮＡ断片はビオチン化プライマーによってＰＣＲ増幅し、ビオチン化アンプリコンを作製する。これらは、制限酵素ＳｃｅＩによる消化に供され、連結のため非パリンドロームオーバーハングを暴露する。全てのビオチン化種は、ストレプトアビジン結合固体支持体とのインキュベーションによって除去し、完全に消化した産物のみを残す。（図１０ａ）カルボキシル化ＳｅｒａＭａｇ  Ｓｐｅｅｄｂｅａｄｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、Ｐｅｎｎ．）および増量のＰＥＧ−８０００の存在下でＴ４  ＤＮＡリガーゼを使用する標準的なライゲーション反応を実施する。３０分後、ビーズを磁化し、上清を除去し、ビーズを７０％エタノールで洗浄する。コンカテマーは次いで、ＴＥ緩衝液で溶出する。結果は図１０ｂに示す：レーン１〜５は、漸増濃度のＰＥＧ８０００（６％〜１４％  ｗ／ｖ）とのライゲーション混合物の電気泳動を示す。レーン６は、沈殿無しの対照である。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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