(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗血栓活性を示し、下記一般式（Ｉ）で表される構造を有するオリゴ糖又はその薬学的に許容可能な塩。
【化１】
0006980018.tif 000035
[式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、それぞれ独立して−Ｈ又は−ＳＯ３−であり、Ｒ６は、−Ｈ、置換又は非置換のＣ１〜Ｃ６アルキル基又はＣ７〜Ｃ１２アリール基であり、Ｒ７は、−Ｈ、−ＳＯ３−、又はＣ２〜Ｃ５アシル基であり、Ｒ８は、下記一般式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、又は（ＩＶ）で表される置換基である。ｎは、０又は１〜８の自然数である。]
【化２】
0006980018.tif 000036
【化３】
0006980018.tif 000037
【化４】
0006980018.tif 000038
[式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、及び（ＩＶ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７は、上記と同じであり、Ｒ９及びＲ１０は、−Ｈ、置換又は非置換のＣ１〜Ｃ６アルキル基又はＣ７〜Ｃ１２アリール基であり、Ｒ１１は、−ＮＨＲ１２又は−ＯＲ１３であり、そのうちＲ１２及びＲ１３は、−Ｈ、置換又は非置換のＣ１〜Ｃ６アルキル基又はＣ７〜Ｃ１２アリール基である。]
【請求項２】
前記Ｒ８が前記一般式（ＩＩ）で表される置換基であるとき、前記オリゴ糖は、下記一般式（Ｖ）で表される構造を有する、請求項１に記載のオリゴ糖又はその薬学的に許容可能な塩。
【化５】
0006980018.tif 000039
[式（Ｖ）中、Ｒ１が−Ｈであり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５が−ＳＯ３−であり、又は、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５が−ＳＯ３−であり、Ｒ２が−Ｈである。]
【請求項３】
前記Ｒ８が前記一般式（ＩＩＩ）で表される置換基であるとき、前記オリゴ糖は、下記一般式（ＶＩ）で表される構造を有する、請求項１に記載のオリゴ糖又はその薬学的に許容可能な塩。
【化６】
0006980018.tif 000040
[式（ＶＩ）中、Ｒ１が−Ｈであり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５が−ＳＯ３−であり、又は、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５が−ＳＯ３−であり、Ｒ２が−Ｈである。]
【請求項４】
前記Ｒ８が前記一般式（ＩＶ）で表される置換基であるとき、前記オリゴ糖は、下記一般式（ＶＩＩ）で表される構造を有する、請求項１に記載のオリゴ糖又はその薬学的に許容可能な塩。
【化７】
0006980018.tif 000041
[式（ＶＩＩ）中、Ｒ１が−Ｈであり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５が−ＳＯ３−であり、又は、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５が−ＳＯ３−であり、Ｒ２が−Ｈである。]
【請求項５】
前記一般式（Ｉ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、及び（ＶＩＩ）で表される構造において、ｎは、１、２、３、又は４である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のオリゴ糖又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項６】
前記薬学的に許容可能な塩は、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩又は有機アンモニウム塩である、請求項１に記載のオリゴ糖又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項７】
前記薬学的に許容可能な塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、又はカルシウム塩である、請求項６に記載のオリゴ糖又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項８】
請求項１に記載のオリゴ糖又はその薬学的に許容可能な塩からなる抗血栓活性を示すオリゴ糖混合物であって、
前記オリゴ糖混合物において、Ｒ８が一般式（ＩＩ）で表される置換基である、一般式（Ｉ）で示されるオリゴ糖又はその薬学的に許容可能な塩が占める比率は、モル比で９５％以上であり、
又は前記オリゴ糖混合物において、Ｒ８が一般式（ＩＩＩ）で表される置換基である、一般式（Ｉ）で示されるオリゴ又はその薬学的に許容可能な塩が占める比率は、モル比で９５％以上であり、
又は前記オリゴ糖混合物において、Ｒ８が一般式（ＩＶ）で表される置換基である、一般式（Ｉ）で示されるオリゴ糖又はその薬学的に許容可能な塩が占める比率は、モル比で９５％以上である、オリゴ糖混合物。
【請求項９】
請求項１に記載のオリゴ糖又はその薬学的に許容可能な塩を製造する方法であって、
１）天然フコシル化グリコサミノグリカンのカルボン酸をエステル化し、
２）有機溶媒において、強アルカリ及び還元剤の存在下でフコシル化グリコサミノグリカンを「β−脱離反応」によって解重合し、さらに末端基を還元することでオリゴ糖の混合物を取得し、又は有機溶媒において、強アルカリの存在下でフコシル化グリコサミノグリカンを「β−脱離反応」によって解重合し、さらに末端基をピーリング処理してオリゴ糖の混合物を取得し、
３）分離、精製を行い、置換基によって構造を適宜修飾することで所期の精製オリゴ糖を取得することを含む、オリゴ糖又はその薬学的に許容可能な塩の製造方法。
【請求項１０】
前記オリゴ糖は、請求項１に記載の一般式（Ｉ）で表される構造を有し、前記Ｒ８が請求項１に記載の一般式（ＩＩ）で表される置換基であり、前記製造方法は、
ａ）フコシル化グリコサミノグリカンを第四級アンモニウム塩の形態に変換し、有機溶媒において、フコシル化グリコサミノグリカン第四級アンモニウム塩のヘキスロン酸残基におけるカルボキシ基を、全部又は部分的にカルボン酸エステルに変換し、
ｂ）還元剤を含む無水有機溶媒において、上記ステップａ）で得られるフコシル化グリコサミノグリカンカルボン酸エステルを強アルカリで処理することでβ−脱離解重合し、及び末端基を還元し、還元性末端がＤ−アセチルアミノガラクチトールであるオリゴ糖の混合物を取得し、
ｃ）上記ステップｂ）で得られるオリゴ糖の混合物をアルカリ金属塩に変換し、さらに水溶液においてカルボン酸エステルをアルカリ加水分解することにより、遊離カルボキシ基を含むオリゴ糖の混合物を取得し、
ｄ）クロマトグラフィーを用いて上記ステップｃ）で得られるオリゴ糖混合物を分離することにより、精製オリゴ糖を取得し、
ｅ）上記ステップｄ）で得られる精製オリゴ糖に対して、適宜に置換基による構造修飾を施すことを含む、請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記ステップａ）において、前記フコシル化グリコサミノグリカンの第四級アンモニウム塩は、ベンゼトニウム塩（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［２−［２−［４（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシ］エトキシ］エチル］ベンザルコニウム塩）であり、前記有機溶媒は、ジメチルホルムアミド（以下「ＤＭＦ」と称する）、又はＤＭＦとエタノールの混合物であり、前記カルボン酸エステルは、ベンジルエステルであり、前記「全部又は部分的にカルボン酸エステルに変換する」とは、フコシル化グリコサミノグリカンのカルボキシ基エステル化度が３０％〜１００％の範囲であることを意味し、
前記ステップｂ）において、前記有機溶媒は、ＤＭＦ、又はＤＭＦとエタノールの混合物であり、前記還元剤は、水素化ホウ素ナトリウムであり、前記強アルカリは、ナトリウムエトキシドであり、
前記ステップｃ）において、前記オリゴ糖混合物をアルカリ金属塩に変換するとき、反応液に塩化ナトリウムの飽和水溶液を加えてオリゴ糖混合物をナトリウム塩の形態に変換し、前記アルカリ加水分解とは、濃度が０．２５Ｍ〜１ＭのＮａＯＨ水溶液においてオリゴ糖のカルボン酸エステル基を加水分解することを意味し、
前記ステップｄ）において、前記クロマトグラフィーは、ゲルクロマトグラフィー及び／又はイオン交換クロマトグラフィーであり、
前記ステップｅ）において、置換基による構造修飾は、オリゴ糖のＤ−グルクロン酸基及び不飽和ヘキスロン酸基におけるカルボキシ基をエステル化し、又はＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン基を脱アセチル化した後、適宜に再アシル化又は再硫酸化し、又は還元性末端−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ−ｏｌのＣ１位ヒドロキシ基をアルキル化することで遂行される、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記オリゴ糖は、請求項１に記載の一般式（Ｉ）で表される構造を有し、前記Ｒ８が請求項１に記載の一般式（ＩＩＩ）、又は一般式（ＩＶ）で表される置換基であり、前記製造方法は、
ａ）フコシル化グリコサミノグリカンを第四級アンモニウム塩に変換し、さらに有機溶媒においてフコシル化グリコサミノグリカン第四級アンモニウム塩のヘキスロン酸残基におけるカルボキシ基を、全部又は部分的にカルボン酸エステルに変換し、
ｂ）無水有機溶媒において、上記ステップａ）で得られるフコシル化グリコサミノグリカンのカルボン酸エステルを強アルカリで処理することでβ−脱離解重合し、さらに少量の強アルカリ水溶液を加えて解重合物をピーリング処理することにより、還元性末端の糖基−Ｄ−ＧａｌＮＡｃを除去して還元性末端の糖基が−Ｄ−ＧｌｃＡであるオリゴ糖の混合物を取得し、
ｃ）上記ステップｂ）で得られるオリゴ糖の混合物をアルカリ金属塩に変換し、水溶液においてオリゴ糖のカルボン酸エステルをアルカリ加水分解することにより、遊離カルボキシ基を含むオリゴ糖の混合物を取得し、
ｄ）クロマトグラフィーを用いて上記ステップｃ）で得られるオリゴ糖混合物からオリゴ糖を分離、精製し、
ｅ）上記ステップｄ）で得られる精製オリゴ糖に対して、適宜に置換基による構造修飾を施すことを含む、請求項９に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記ステップａ）において、前記第四級アンモニウム塩は、ベンゼトニウム塩であり、前記有機溶媒は、ＤＭＦ、又はＤＭＦとエタノールの混合物であり、前記カルボン酸エステルは、ベンジルエステルであり、前記「全部又は部分的にカルボン酸エステルに変換する」とは、フコシル化グリコサミノグリカンのカルボキシ基エステル化度が３０％〜１００％の範囲であることを意味し、
前記ステップｂ）において、前記有機溶媒は、ＤＭＦ、又はＤＭＦとエタノールの混合物であり、前記強アルカリは、ナトリウムエトキシドであり、前記少量の強アルカリ水溶液とは、反応液全体に対して体積比で１／５〜１／１０である１Ｍ〜２ＭのＮａＯＨ水溶液を指し、
前記ステップｃ）において、前記オリゴ糖混合物をアルカリ金属塩に変換するとき、反応液に塩化ナトリウムの飽和水溶液を加えることによりオリゴ糖混合物をナトリウム塩の形態に変換し、前記アルカリ加水分解とは、濃度が０．０５Ｍ〜１ＭのＮａＯＨ水溶液においてオリゴ糖のカルボン酸エステル基を加水分解することを意味し、
前記ステップｄ）において、前記クロマトグラフィーは、ゲルクロマトグラフィー及び／又はイオン交換クロマトグラフィーであり、
前記ステップｅ）において、前記置換基による構造修飾は、オリゴ糖のＤ−ＧｌｃＡ及びΔＵＡにおけるカルボキシ基をエステル化し、又はＤ−ＧａｌＮＡｃを脱アセチル化し、さらに再アシル化又は再硫酸化し、又は還元性末端−Ｄ−ＧｌｃＡのＣ１位ヘミアセタールをアルキル化、還元、還元アミノ化又は還元アルキル化することで遂行される、請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
抗血栓活性を示す薬物組成物であって、
抗血栓効果を示す有効量の活性成分と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含んでなり、
前記活性成分は、請求項１に記載のオリゴ糖又はその薬学的に許容可能な塩、又は請求項８に記載のオリゴ糖混合物である、薬物組成物。
【請求項１５】
前記薬物組成物の製剤形態は、注射用水溶液又は注射用凍結乾燥粉体であり、
単位製剤形態に、２０ｍｇ〜１００ｍｇの前記活性成分を含む、請求項１４に記載の薬物組成物。
【請求項１６】
請求項１に記載のオリゴ糖又はその薬学的に許容可能な塩の、又は請求項８に記載のオリゴ糖混合物の、血栓塞栓性疾患を治療及び／又は予防する薬物の製造における使用であって、
前記血栓塞栓性疾患は、静脈血栓塞栓、動脈血栓塞栓、及び／又は虚血性心疾患又は虚血性脳血管障害である、薬物の製造における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品の技術分野に関し、具体的には、抗血栓活性を示すオリゴ糖又はオリゴ糖同族体の混合物、前記オリゴ糖又はオリゴ糖同族体の混合物の薬学的に許容可能な塩、並びに前記オリゴ糖又はオリゴ糖同族体の混合物の製造方法及び用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
虚血性卒中、冠動脈疾患、静脈血栓塞栓塞栓症などの血栓塞栓性疾患は、人にとって主な致死性病因である。臨床で血栓溶解薬、抗凝固薬、抗血小板薬などの抗血栓薬が血栓症を予防、治療する基本手段になっているが、従来の抗血栓薬は、出血傾向と重篤の出血症を引き起こすおそれがあるという深刻な欠点を共通して抱えているため、出血傾向と出血リスクを低減することが新規抗血栓薬の研究開発に当たって核心的な目標になっている。近年、内因性凝固機構が病理学的血栓形成に緊密に関わり、止血機序に必須でないことが研究により解明され、出血傾向を殆ど示さない抗血栓薬開発において内因系凝固因子を標的とする阻害剤が注目されつつあり、血液凝固因子ＸＩＩａ、ＸＩａ及びＩＸａを阻害対象とする阻害剤の前臨床と臨床試験が積極的に行われている。テンナーゼ複合体（Ｘａｓｅ）は、内因系凝固カスケードにおいて最下流に位置する律速因子であるため、その特異的な阻害剤が特に実用性が高いと考えられる。
【０００３】
フコシル化グリコサミノグリカン（Ｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ  Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ、以下、「ＦＧ」とも称する）は、現在、棘皮動物のみで発見され、特定の化学構造と薬理活性を有するグリコサミノグリカンである。フコシル化グリコサミノグリカンは、コンドロイチン硫酸に類似した主鎖を有し、フコシル基（Ｆｕｃｏｓｙｌ、以下では「Ｆｕｃ」とも称する）による側鎖置換を有するグリコサミノグリカン誘導体である（Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ．ａｌ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ，１９９２，３３：４９５９〜６２；  Ｍｏｕｒaｏ  ｅｔ．ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，２７１：２３９７３〜８４）。天然由来のＦＧ（以下、「天然ＦＧ」とも称する）は、内因系テンナーゼ活性を阻害することで非常に高い抗凝固活性を示すことが研究により解明されている（Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ，２００８，１００：４２０〜８；  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，２７１：２３９７３〜８４）。一方、天然ＦＧが血小板凝集を誘発して血液循環における血小板数を低下させ、第ＸＩＩ因子を亢進させて低血圧を引き起こすなど、広範囲でありながら一見矛盾した薬理作用を示すため（Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ，１９８８，５９：４３２〜４；  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ，２０１０，１０３：９９４〜１００４）、天然ＦＧは全身投与に適さず、実用性に制限がある。そこで、適宜に解重合した低重合度ＦＧが開発され、低重合度ＦＧＡＧは、血小板凝集に対する促進活性が抑えられ（Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ，１９９１，６５：３６９〜７３）、内因系テンナーゼに対して優れた特異性を示す。
【０００４】
本発明者は、天然ＦＧを化学手法に解重合し、解重合物の化学特性と薬理特性について鋭意研究を重ねた結果、中国発明特許第１０１７２４０８６Ｂ号に示すような過酸化剤でＦＧを解重合する方法を開発し、また、得られた解重合物が血栓形成を抑制して出血傾向を効率よく低下させることのできることを見出した。ところが、上記方法で得られる解重合物は、末端構造が複雑であり、分離や精製が困難であった。
【０００５】
棘皮動物の体壁から抽出して得られる天然ＦＧに、通常、分子量分布において天然ＦＧに近いグルカン、フカン（Ｆｕｃａｎ）及び／又はヘキソサミンを含む多糖成分が含まれる。天然ＦＧに含まれる多糖成分をゲルクロマトグラフィー、限外ろ過、イオン交換クロマトグラフィーによって完全に除去することが難しく、上述の特許文献に開示の方法を用いて棘皮動物から天然ＦＧを抽出して得られる抽出物に、通常、質量％で１０％〜２０％程度の他の多糖成分が含まれる。ゆえに、酸化剤を用いて解重合する場合、これらの多糖成分も解重合してしまうことから、天然ＦＧの解重合物に含まれるオリゴ糖組成が特に複雑である。
【０００６】
中国特許公開第１０３２１４５９１Ａ号に、ＦＧを脱アセチル化・脱アミノ化して解重合する方法（以下、「脱アセチル化・脱アミノ化解重合法」とも称する）が開示され、該方法によれば、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）−（β１→４）−Ｄ−グルクロン酸（Ｄ−ＧｌｃＡ）のグリコシド結合を選択的に分解し、還元性末端２，５−脱水タロース基（ａｎＴａｌ）を含む解重合物を得ることができ、解重合物におけるオリゴ糖同族体は、何れも３ｍ個の単糖残基で構成される（ｍは、自然数であり、以下でも同じである）。脱アセチル化・脱アミノ化による解重合法は、天然ＦＧに含まれるグルカンとフカンを解重合できず、脱アセチル化・脱アミノ化により解重合するとき、これらの解重合できない多糖類不純物を、ゲルクロマトグラフィー又は限外ろ過を用いて除去することができる。天然ＦＧを脱アセチル化・脱アミノ化して得られる解重合物は、構造上より規則的であり、解重合物に含まれるオリゴ糖をさらに分離、精製することができる（ＣＮ１０４３７０９８０Ａ）。さらに、脱アセチル化・脱アミノ化によって天然ＦＧを解重合して得られるオリゴ糖の同族体において、ノナサッカリド（ｎｏｎａｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＮＳａｃ）は、優れたテンナーゼ（Ｘａｓｅ）阻害活性を示す最小断片でもある（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１５；１１２（２７）：８２８４〜９）。
【０００７】
本発明者が提出した中国特許出願第２０１３１００９９８００号に、天然ＦＧをβ−脱離して解重合する方法（以下、「β−脱離解重合法」とも称する）が開示され、該方法によれば、非水性溶媒においてアルカリ性試薬の存在下でＦＧのカルボン酸エステルを処理することにより、Ｄ−ＧａｌＮＡｃ−（β１→４）−Ｄ−ＧｌｃＡのグリコシド結合を選択的に分解し、非還元性末端が不飽和Δ４，５−ヘキスロン酸（ΔＵＡ）である解重合物を得ることができ、得られた解重合物は、一連のオリゴ糖で構成される混合物である。また、β−脱離解重合法は、グリコシド結合に対して選択性が特に高く、天然ＦＧの抽出物に含まれる他の多糖成分を解重合しないため、ＦＧ抽出物から非ＦＧ類の多糖成分を容易に除去することができる。
【０００８】
ところが、中国特許公開第１０３２１４５９１Ａ号に開示の脱アセチル化・脱アミノ化解重合法で得られる解重合物とは異なり、中国特許出願第２０１３１００９９８００号に開示のβ−脱離法解重合で得られる解重合物は、非還元性末端が構造上規則的であるが、その一方で還元性末端の形態が多種多様であり、還元性末端の糖基としては「−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ」に加えて、Ｌ−Ｆｕｃ−（α１→３）によって置換された「−４−Ｄ−ＧｌｃＡ」などが挙げられる。還元性末端の構造が複雑であるため、前記解重合物からオリゴ糖を分離、精製しようとすることは技術面でのハードルが高く、混合物形態の解重合物をそのまま利用するのが一般的である。
【０００９】
精製オリゴ糖の化学構造が純粋であり、品質制御のレベルがより高く、応用価値もより高いことは、製薬分野の技術者にとっては熟知のことでもあるが、天然ＦＧの解重合物としては、その末端構造の規則度が精製オリゴ糖を製造する際の技術難易度に影響を与える。
【００１０】
理論上、β−脱離解重合法を用いれば「−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ−（β１→４）−Ｄ−ＧｌｃＡ−」のグリコシド結合を選択的に分解することができ、解重合物の還元性末端が「−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ」残基となり、解重合物におけるオリゴ糖同族体が３ｍ個の単糖残基で構成される。中国特許出願第２０１３１００９９８００号に記載の天然ＦＧのβ−脱離解重合物には還元性末端が「−［Ｌ−Ｆｕｃ−（α１→３）］−Ｄ−ＧｌｃＡ−」であるオリゴ糖が一定量で存在するため、前記条件下でβ−脱離反応を行う際に副反応が伴い、特に解重合物の還元性末端における糖基が部分的に分解されてしまう。
【００１１】
天然ＦＧのβ−脱離反応条件について更なる検討を重ねた結果、本発明者は、還元剤を用いて天然ＦＧの還元性末端の糖基を糖アルコール基に還元し、さらに、そのカルボン酸エステル化物を中国特許第２０１３１００９９８００号に記載のアルカリ性の非水性溶媒、β−脱離反応によって処理した場合、得られた解重合物には、「−Ｄ−ＧｌｃＡ−」残基を還元性末端とするオリゴ糖が一定の量で存在し、かつ解重合物をＨＰＧＰＣで解析し、面積百分率法を用いて計算したところ「−Ｄ−ＧｌｃＡ−」を還元性末端とするオリゴ糖がオリゴ糖全体において約１０％〜３０％占めることを見出した。この結果は、末端未還元状態の天然ＦＧを同じ条件で解重合して得られる解重合物に似ている。こうした研究により、天然ＦＧの還元性末端における糖基を糖アルコール基に還元してもＦＧカルボン酸エステルのβ−脱離反応にほとんど影響がないが、解重合物の還元性末端における糖基の分解を低下させることもできないことが実証されている。
【００１２】
中国特許出願第２０１３１００９９８００号に開示のβ−脱離反応で使われるアルカリ性の非水性溶媒にそのまま還元剤（例えば、水素化ホウ素ナトリウム）を加えた場合、天然ＦＧカルボン酸エステルのβ−脱離反応が通常のとおり起こりうるが、意外なことに産物の還元性末端がほとんどＤ−アセチルアミノガラクチトール基（−３−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ−ｏｌ）となり、「−３−Ｄ−ＧｌｃＡ（−ｏｌ）」残基を還元性末端とするオリゴ糖の含有量が著しく低下する。これをＨＰＧＰＣの面積百分率法で計算する場合、その含有量が約５％であり、ＨＰＧＰＣ検出限度の以下になることがある。こうした処理により、解重合物におけるオリゴ糖同族体は、より規則的な末端構造を有することとなり、つまり、前記オリゴ糖同族体は、３ｍ個の単糖残基で構成され、非還元性末端の糖基が「Ｌ−Ｆｕｃ−（α１−３）−ΔＵＡ−１−」となり、還元性末端の糖基が「−３−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ−ｏｌ」となる。
【００１３】
本発明者は、アルカリ性の非水有機溶媒、還元剤の存在下でβ−脱離反応を行い、そしてクロマト方法を用いてＦＧのβ−脱離解重合物から一連の新規化学構造を有する「精製オリゴ糖」を初めて分離、精製することに成功した。前記精製オリゴ糖に共通する化学構造として、全て３ｍ個の単糖残基で構成され、非還元性末端が「Ｌ−Ｆｕｃ−（α１−３）−ΔＵＡ−１−」であり、還元性末端の糖基が「−３−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ−ｏｌ」である。
【００１４】
さらに、本発明者は、鋭意検討を重ねた結果、３ｍ個の単糖残基を含むオリゴ糖が還元性末端の「末端ピーリング」によって１個の単糖残基を失い、「（３ｍ−１）個の単糖残基を含む」オリゴ糖を形成し、これらのオリゴ糖の還元性末端が「−Ｄ−ＧｌｃＡ」であることを見出した。さらに、本発明者は、ＦＧカルボン酸エステルのβ−脱離反応条件について検討を重ねた結果、驚異的にも以下の現象を発見した。
【００１５】
以上で言うアルカリ性の非水反応溶液に少量の強アルカリ性（例えば、ＮａＯＨ）水溶液を加えると、前記３ｍ個の単糖残基を含み且つ「−３−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ」を還元性末端とするＦＧオリゴ糖は、「末端ピーリング」が起こりやすくなり、結果として末端の「−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ」糖基を失ってしまう。ところが、前記「末端ピーリング」で形成される還元性末端が「−Ｄ−ＧｌｃＡ」であり且つ（３ｍ−１）個の単糖残基を含むオリゴ糖は、更なる「末端ピーリング処理」が起こり難くなる。そのため、アルカリ性の非水性溶媒においてＦＧカルボン酸エステルを処理する条件を変えることで、β−脱離法によってＤ−ＧａｌＮＡｃ−（β１→４）−Ｄ−ＧｌｃＡグリコシド結合を分解し、還元性末端の「末端ピーリング」によって解重合物末端の「−３−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ」糖基を除去することができ、その結果、新規で且つ規則的な化学構造を有するオリゴ糖同族体を得ることができる。
【００１６】
また、ＨＰＧＰＣクロマト解析とＮＭＲ構造解析の結果、無水有機溶媒において強アルカリでＦＧカルボン酸エステルを処理して「β−脱離解重合」を行い、反応液に少量の強アルカリ水溶液を加えることによりβ−脱離解重合物に対して更に「末端ピーリング」を引き起こした場合、解重合物に含まれるオリゴ糖同族体はより規則的な化学構造を有することとなり、つまり、前記オリゴ糖同族体が（３ｍ−１）個の単糖残基で構成され、非還元性末端の糖基がいずれも「Ｌ−Ｆｕｃ−（α１−３）−ΔＵＡ−１−」となり、還元性末端の糖基がいずれもＣ３位置にＬ−Ｆｕｃ置換基に有する「−４−Ｄ−ＧｌｃＡ」となることが確認できる。
【００１７】
天然由来のＦＧカルボン酸エステルを「β−脱離反応」及び「末端ピーリング」によって処理して得られるオリゴ糖同族体は、より規則的な化学構造を有するため、分離や精製を経て一連の精製オリゴ糖が得ることができる。このような精製オリゴ糖は、共通点としていずれも（３ｍ−１）個の単糖残基で構成され、非還元性末端が「Ｌ−Ｆｕｃ−（α１−３）−ΔＵＡ−１−」であり、還元性末端が「−４−［Ｆｕｃ−（α１−３）］−Ｄ−ＧｌｃＡ」である。
【００１８】
本発明では、天然ＦＧのカルボン酸エステルのβ−脱離条件を改良することで化学構造（特に、還元性末端の糖基構造）がより規則的なＦＧ解重合物を取得した。これらのＦＧ解重合物としては、還元性末端が「−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ−ｏｌ」または「−Ｄ−ＧｌｃＡ」である。本発明によれば、天然ＦＧ解重合物の末端構造より規則的であるため、解重合物から精製オリゴ糖を得ることができ、また、特定の置換基を用いて上述の精製オリゴ糖を修飾することでＦＧオリゴ糖の誘導体を得ることができる。
【００１９】
さらに、ＦＧオリゴ糖についてその抗凝固活性、内因系テンナーゼに対する阻害活性、並びにそのヘパリンコファクターＩＩ（ＨＣ−ＩＩ）依存的なアンチトロンビン（すなわち、活性化凝固因子ＩＩａ）活性の構造活性相関を検討した結果、本発明者は、以下の問題点を明らかにした。
【００２０】
つまり、還元性末端が「−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ−ｏｌ」であり且つ３ｍ個の単糖残基を含むＦＧオリゴ糖の同族体として、内因系テンナーゼを阻害するに当たって最も有効で且つ最も簡単な構造断片は、ノナサッカリド（ＮＳａｃ）であり、還元性末端が「−Ｄ−ＧｌｃＡ」であり且つ（３ｍ−１）個の単糖残基を含むＦＧオリゴ糖同族体として、内因系テンナーゼを阻害するに当たって最も有効で且つ最も簡単な構造断片は、オクタサッカリド（Ｏｓａｃ）である。これらの精製オリゴ糖はその活性に差が多少あっても、いずれもＨＣ−ＩＩ依存的なアンチトロンビン活性、及び体外における抗凝固活性を示し、さらに動物モデルの動脈血栓形成と静脈血栓形成を抑制する薬理活性を示す。
【００２１】
本発明に係る精製オリゴ糖、及びその構造を修飾して得られる誘導体は、いずれも凝固因子に対して阻害活性、並びに高い抗凝固活性と抗血栓活性を示すため、血栓塞栓性疾患の予防及び／又は治療に有用であると考えられる。
【００２２】
以上のことから、本発明によれば、「β−脱離解重合」又は「β−脱離解重合＋末端ピーリング」によって化学構造（特に、還元性末端の糖基構造）がより規則的な天然ＦＧの解重合物を提供することができ、さらに、構造上より一律性を示すＦＧオリゴ糖の同族体を提供することができる。また、本発明によれば、非還元性末端として不飽和ヘキスロン酸構造を有する精製ＦＧオリゴ糖、その構造を修飾して得られる誘導体、及びこれらの混合物を提供することができる。本発明に係るオリゴ糖は、抗凝固活性及び抗血栓活性を示すため、本発明は、さらにこれらのオリゴ糖及びその混合物の、血栓塞栓性疾患を予防及び／又は治療する薬物の製造における用途を提供することができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
本発明は、抗凝固活性及び抗血栓活性を示す精製オリゴ糖、前記精製オリゴ糖の製造方法を提供し、並びに、前記精製オリゴ糖又はその混合物、又は前記精製オリゴ糖又はその混合物の薬学的に許容可能な塩を含んでなる薬物組成物を提供することを目的とする。また、本発明は、前記精製オリゴ糖、前記精製オリゴ糖の混合物、又は前記精製オリゴ糖又はその混合物を含んでなる薬物組成物の、血栓塞栓性疾患を予防及び／又は治療する薬物の製造における用途を提供することをその目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
上記目的を達成すべく、本発明は、以下のように構成される。
【００２５】
本発明は、抗血栓活性を示し、特に内因系テンナーゼに対して阻害活性を示すオリゴ糖及びその薬学的に許容可能な塩を提供し、前記オリゴ糖は、下記一般式（Ｉ）で表される構造を有する。
【００２６】
【化１】
0006980018.tif 000002
【００２７】
式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して−Ｈ又は−ＳＯ３−であり、Ｒ６は、−Ｈ、置換又は非置換のＣ１〜Ｃ６アルキル基又はＣ７〜Ｃ１２アリール基であり、Ｒ７は、−Ｈ、−ＳＯ３−Ｈ又はＣ２〜Ｃ５アシル基であり、Ｒ８は、下記一般式（ＩＩ）、一般式（ＩＩＩ）又は一般式（ＩＶ）で表される置換基である。ｎは、０又は１〜８の自然数である。
【００２８】
【化２】
0006980018.tif 000003
【００２９】
【化３】
0006980018.tif 000004
【００３０】
【化４】
0006980018.tif 000005
【００３１】
一般式（ＩＩ）、一般式（ＩＩＩ）及び一般式（ＩＶ）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、上記と同じであり、Ｒ９及びＲ１０は、−Ｈ、置換又は非置換のＣ１〜Ｃ６アルキル基又はＣ７〜Ｃ１２アリール基であり、Ｒ１１は、−ＮＨＲ１２又は−ＯＲ１３であり、そのうちＲ１２及びＲ１３は、−Ｈ、置換又は非置換のＣ１〜Ｃ６アルキル基又はＣ７〜Ｃ１２アリール基である。
【００３２】
本発明において、一般式（Ｉ）で表される構造を有するオリゴ糖とは、「精製オリゴ糖」を指すものである。一般的に言うと、前記「精製オリゴ糖」としては、純度が９５％以上である。例えば、分析型の高效ゲルクロマトグラフィー（ＨＰＧＰＣ）を用い、例えばＡｇｉｌｅｎｔ社製の高速液体クロマトグラフとゲルカラム、及び汎用型の示差検出器（ＲＩＤ）を用いて検出し、面積百分率法に従って算出した場合、前記精製オリゴ糖は、純度が９５％以上である。
【００３３】
本発明において、一般式（Ｉ）で表される構造を有するオリゴ糖としては、Ｒ８が上記一般式（ＩＩ）で表される置換基であることが好ましく、すなわち前記オリゴ糖は、下記一般式（Ｖ）で表される構造を有することが好ましい。
【００３４】
【化５】
0006980018.tif 000006
【００３５】
式（Ｖ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して−Ｈ又は−ＳＯ３−であり、Ｒ６は、−Ｈ、置換又は非置換のＣ１〜Ｃ６アルキル基又はＣ７〜Ｃ１２アリール基であり、Ｒ７は、−Ｈ、−ＳＯ３−又はＣ２〜Ｃ５アシル基であり、Ｒ９は、−Ｈ、置換又は非置換のＣ１〜Ｃ６アルキル基又はＣ７〜Ｃ１２アリール基であり、ｎは、０又は１〜８の自然数である。
【００３６】
好ましくは、一般式（Ｖ）で示される化合物において、Ｒ１が−Ｈであり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、共に−ＳＯ３−である。
【００３７】
好ましくは、一般式（Ｖ）で示される化合物において、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、共に−ＳＯ３−であり、Ｒ２は、−Ｈである。
【００３８】
また、本発明において、一般式（Ｉ）で表される構造を有するオリゴ糖としては、Ｒ８が上記一般式（ＩＩＩ）で表される置換基であることが好ましく、すなわち前記オリゴ糖は、下記一般式（ＶＩ）で表される構造を有することが好ましい。
【００３９】
【化６】
0006980018.tif 000007
【００４０】
式（ＶＩ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して−Ｈ又は−ＳＯ３−であり、Ｒ６は、−Ｈ、置換又は非置換のＣ１〜Ｃ６アルキル基又はＣ７〜Ｃ１２アリール基であり、Ｒ７は、−Ｈ、−ＳＯ３−又はＣ２〜Ｃ５アシル基であり、Ｒ１０は、−Ｈ、置換又は非置換のＣ１〜Ｃ６アルキル基又はＣ７〜Ｃ１２アリール基であり、ｎは、１〜８の自然数である。
【００４１】
好ましくは、一般式（ＶＩ）で示される化合物において、Ｒ１が−Ｈであり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、−ＳＯ３−である。
【００４２】
好ましくは、一般式（ＶＩ）で示される化合物において、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、−ＳＯ３−であり、Ｒ２は、−Ｈである。
【００４３】
また、本発明において、一般式（Ｉ）で表される構造を有するオリゴ糖としては、Ｒ８が下記一般式（ＩＶ）で表される置換基であることが好ましく、すなわち前記オリゴ糖は、下記一般式（ＶＩＩ）で表される構造を有することが好ましい。
【００４４】
【化７】
0006980018.tif 000008
【００４５】
式（ＶＩＩ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して−Ｈ又は−ＳＯ３−であり、Ｒ６は、−Ｈ、置換又は非置換のＣ１〜Ｃ６アルキル基又はＣ７〜Ｃ１２アリール基であり、Ｒ７は、−Ｈ、−ＳＯ３−又はＣ２〜Ｃ５アシル基であり、Ｒ１１は、−ＮＨＲ１２又は−ＯＲ１３であり、そのうちＲ１２及びＲ１３は、−Ｈ、置換又は非置換のＣ１〜Ｃ６アルキル基又はＣ７〜Ｃ１２アリール基であり、ｎは、０又は１〜８の自然数である。
【００４６】
好ましくは、上記一般式（ＶＩＩ）で示される化合物において、Ｒ１は、−Ｈであり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、−ＳＯ３−である。
【００４７】
好ましくは、上記一般式（ＶＩＩ）で示される化合物において、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、−ＳＯ３−であり、Ｒ２は、−Ｈである。
【００４８】
当業者にとって容易に理解できるが、本発明に係るオリゴ糖を分離、精製するに際して、オリゴ糖の重合度が増えるほど技術難度が高くなる。そのため、本発明の上記一般式（Ｉ）、（Ｖ）、（ＶＩ）又は（ＶＩＩ）で示される構造を有するオリゴ糖は、ｎが１、２、３又は４であることが好ましい。
【００４９】
本発明に係る精製オリゴ糖に、置換基として硫酸エステル基及び／又は遊離カルボキシ基が存在する場合、薬学的に許容可能な無機イオン及び／又は有機イオンと結合して塩を形成することができる。本発明に係るオリゴ糖の薬学的に許容可能な塩としては、例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩又は有機アンモニウム塩が挙げられる。
【００５０】
好ましくは、本発明に係るオリゴ糖の薬学的に許容可能な塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩又はカルシウム塩である。
【００５１】
当業者にとって容易に理解できるが、同族体形態の本発明に係る精製オリゴ糖を、例えば、上記一般式（Ｖ）で示される同族体、又は上記一般式（ＶＩ）で示される同族体、又は上記一般式（ＶＩＩ）で示される同族体又はそれらの薬学的に許容可能な塩を混合することにより、特定構造を有するオリゴ糖同族体の混合物を得ることができる。特に、後述の本発明に係る化合物の製造方法によれば、特定の処理を経て化学構造（特に、還元性末端の糖基構造）がより規則的な同族体形態のＦＧオリゴ糖混合物を得ることができる。
【００５２】
さらに、本発明は、抗血栓活性を示し、特に内因系テンナーゼに対して阻害活性を示すオリゴ糖混合物を提供し、前記オリゴ糖混合物は、上記一般式（Ｉ）で表される構造を有するオリゴ糖又はその薬学的に許容可能な塩で構成される。前記オリゴ糖混合物を構成する一般式（Ｉ）で表されるオリゴ糖又はその薬学的に許容可能な塩において、Ｒ８は、一般式（ＩＩ）、又は一般式（ＩＩＩ）、又は一般式（ＩＶ）で表される置換基である。具体的には、前記混合物においてＲ８が一般式（ＩＩ）で表される置換基である一般式（Ｉ）で示されるオリゴ糖又はその薬学的に許容可能な塩が占める比率は、モル比で９５％以上であり、又は前記混合物においてＲ８が一般式（ＩＩＩ）で表される置換基である一般式（Ｉ）で示されるオリゴ糖又はその薬学的に許容可能な塩が占める比率は、モル比で９５％以上であり、又は前記混合物においてＲ８が一般式（ＩＶ）で表される置換基である一般式（Ｉ）で示されるオリゴ糖又はその薬学的に許容可能な塩が占める比率は、モル比で９５％以上である。
【００５３】
好ましくは、本発明に係るオリゴ糖混合物は、上記一般式（Ｖ）で表される構造を有するオリゴ糖同族体又はその薬学的に許容可能な塩の混合物である。より好ましくは、本発明に係るオリゴ糖混合物は、上記一般式（Ｖ）で表される構造を有するオリゴ糖同族体又はその薬学的に許容可能な塩の混合物であり、そのうちＲ１は、−Ｈであり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、−ＳＯ３−である。本発明のもう１つの好適な実施形態によれば、上記一般式（Ｖ）で表される構造を有するオリゴ糖同族体又はその薬学的に許容可能な塩の混合物において、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、−ＳＯ３−であり、Ｒ２は、−Ｈである。
【００５４】
好ましくは、本発明に係るオリゴ糖混合物において、オリゴ糖混合物は、上記一般式（ＶＩ）で表される構造を有するオリゴ糖同族体又はその薬学的に許容可能な塩の混合物である。より好ましくは、上記一般式（ＶＩ）で表される構造を有するオリゴ糖同族体又はその薬学的に許容可能な塩の混合物において、Ｒ１は、−Ｈであり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、−ＳＯ３−である。本発明のもう１つの好適な実施形態によれば、上記一般式（ＶＩ）で表される構造を有するオリゴ糖同族体又はその薬学的に許容可能な塩の混合物において、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、−ＳＯ３−であり、Ｒ２は、−Ｈである。
【００５５】
好ましくは、本発明に係るオリゴ糖混合物において、オリゴ糖混合物は、上記一般式（ＶＩＩ）で表される構造を有するオリゴ糖同族体又はその薬学的に許容可能な塩の混合物である。より好ましくは、上記一般式（ＶＩＩ）で表される構造を有するオリゴ糖同族体又はその薬学的に許容可能な塩の混合物において、Ｒ１は、−Ｈであり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、−ＳＯ３−である。本発明のもう１つの好適な実施形態によれば、上記一般式（ＶＩＩ）で表される構造を有するオリゴ糖同族体又はその薬学的に許容可能な塩の混合物において、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、−ＳＯ３−であり、Ｒ２は、−Ｈである。
【００５６】
本発明は、さらに、前記オリゴ糖の製造方法、及び前記オリゴ糖混合物の製造方法を提供する。
【００５７】
まず、本発明は、上記一般式（Ｉ）で表される構造を有するオリゴ糖及びその薬学的に許容可能な塩の製造方法を提供する。前記製造方法は、棘皮動物に由来のフコシル化グリコサミノグリカン（ＦＧ）を製造原料とし、以下の手順に従って解重合することを含む。
【００５８】
本発明の１つの好適な実施形態によると、ＦＧカルボキシ基をエステル化し、強アルカリと還元剤を含む無水有機溶媒において、ＦＧカルボン酸エステルを「β−脱離反応」によって解重合し、還元剤を用いて解重合物の還元性末端におけるＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン基（−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ）を糖アルコール（−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ−ｏｌ）に還元することによりオリゴ糖の混合物を得る。
【００５９】
本発明のもう１つの好適な実施形態によると、ＦＧカルボキシ基をエステル化し、強アルカリを含む無水有機溶媒においてＦＧを「β−脱離反応」によって解重合した後、アルカリ性水溶液を加え、「末端ピーリング」によって解重合物の還元性末端の−Ｄ−ＧａｌＮＡｃを除去し、還元性末端が−Ｄ−グルクロン酸基（−Ｄ−ＧｌｃＡ）であるオリゴ糖の混合物を得る。
【００６０】
前記「β−脱離解重合＋末端基還元」又は「β−脱離解重合＋末端ピーリング」によって得られるオリゴ糖の混合物を分離、精製し、さらに構造修飾を加えることで所期の精製オリゴ糖が得られる。
【００６１】
特に、本発明に係るオリゴ糖の製造方法は、一般式（Ｉ）で示される構造を有し、Ｒ８が上記一般式（ＩＩ）で表される置換基であるオリゴ糖を製造する方法である。ここで、「一般式（Ｉ）で示される構造を有し、Ｒ８が上記一般式（ＩＩ）で表される置換基であるオリゴ糖」は、実に上記一般式（Ｖ）で示される構造を有するオリゴ糖である。
【００６２】
前記一般式（Ｖ）で示される構造を有するオリゴ糖の製造方法は、いわゆる「β−脱離解重合＋末端基還元」の処理を含み、強アルカリ、還元剤を含む無水有機溶媒において、カルボン酸エステル化されたＦＧの「Ｄ−ＧａｌＮＡｃ−（β１→４）−ＧｌｃＡ」におけるグリコシド結合を「β−脱離反応」によって分解し、さらに還元剤を用いて解重合物の還元性末端−Ｄ−ＧａｌＮＡｃを−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ−ｏｌに還元することを含む。前記製造方法によれば、規則的な末端構造を有するオリゴ糖同族体の混合物が得られ、さらに、分離、精製し、特定の置換基による構造修飾を施すことで所期の精製オリゴ糖が得られる。前記製造方法は、具体的には、以下の処理を含む。
【００６３】
ａ）天然ＦＧを第四級アンモニウム塩の形態に変換し、有機溶媒において前記ＦＧ第四級アンモニウム塩におけるＤ−ＧｌｃＡのカルボキシ基を全部又は部分的にカルボン酸エステルに変換する。
【００６４】
還元剤を含む有機溶媒において、強アルカリを用いてステップａ）で得られるカルボン酸エステル化のＦＧ第四級アンモニウム塩を処理することでβ−脱離解重合し、そして解重合物の還元性末端における−Ｄ−ＧａｌＮＡｃを−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ−ｏｌに還元することにより、規則的な末端構造を有するオリゴ糖同族体の混合物を得る。
【００６５】
ｃ）ステップｂ）で得られるオリゴ糖同族体の混合物をアルカリ金属塩の形態に変換し、水溶液においてオリゴ糖同族体のカルボン酸エステルをアルカリ加水分解することにより、遊離カルボキシ基を含むオリゴ糖同族体の混合物を得る。
【００６６】
ｄ）クロマトグラフ法を利用して、ステップｃ）で得られるオリゴ糖混合物に含まれるオリゴ糖同族体を分離、精製する。
【００６７】
ｅ）ステップｄ）で得られる精製オリゴ糖について、適宜に構造修飾を施す。
【００６８】
上記一連の処理を反応経路図に纏めると、以下のとおりである。
【００６９】
【化８】
0006980018.tif 000009
【００７０】
反応経路図１において、Ｎａｔｕｒａｌ  ＦＧ１は、棘皮動物に由来の天然ＦＧであり、一連の多糖同族体の混合物である。ＦＧ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓａｌｔ２は、第四級アンモニウム塩の形態のＦＧである。ＦＧ  ｅｓｔｅｒ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓａｌｔ３は、ＦＧにおけるＤ−ＧｌｃＡのカルボキシ基を全部又は部分的にエステル化したものであり、第四級アンモニウム塩の形態で存在する。ｄＦＧ  ｅｓｔｅｒ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓａｌｔ４は、ＦＧカルボン酸エステルをβ−脱離反応によって解重合したものであり、還元性末端の糖基−Ｄ−ＧａｌＮＡｃを、反応液に含まれる還元剤によってｒｅｄｕｃｅｄ  ｄＦＧ  ｅｓｔｅｒ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓａｌｔ５に還元することができる。Ｒｅｄｕｃｅｄ  ｄＦＧ６は、アルカリ金属塩の形態で存在する上記産物５のカルボン酸エステル基を加水分解したものであり、解重合物４、５及び６は、いずれもオリゴ糖同族体の混合物である。Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ７は、解重合物６から分離した精製オリゴ糖であり、精製オリゴ糖８は、置換基を用いて上記産物７を修飾して得られる精製オリゴ糖である。
【００７１】
反応経路図１において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ９及びｎは、いずれも上記一般式（Ｉ）の場合と同じであり、ｘは、平均値が約４０〜８０の範囲内にある自然数であり、ｙは、約０〜１５範囲内にある自然数であり、−ＣＯＯＸは、カルボン酸エステル及び／又はカルボン酸の第四級アンモニウム塩である。
【００７２】
反応経路図１に示すように、天然ＦＧは、その化学構造において主鎖構造がコンドロイチン硫酸に類似し、側鎖に硫酸エステル化されたＬ−Ｆｕｃ置換基を有する。天然ＦＧとは、通常、「三糖構造単位」である｛−４）−［Ｌ−ＦｕｃＳ−（α１−３）］−Ｄ−ＧｌｃＡ−（β１−３）−Ｄ−ＧａｌＮＡｃＳ−（β１−｝が順に連結してなる多糖体であり、そのうちＦｕｃＳ及びＧａｌＮＡｃＳは、それぞれ硫酸エステル化のＦｕｃ及び硫酸エステル化のＧａｌＮＡｃを表す。また、天然ＦＧは、平均値で約４０〜８０個の三糖構造単位で構成され、ｘの平均値は、約４０〜８０の範囲である。
【００７３】
抽出、精製時に使用する方法にもよるが、天然ＦＧ塩は、通常、アルカリ金属又はアルカリ土類金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩又はカルシウム塩等）の形態で存在する。そして、後の有機溶媒中における化学反応を成し遂げるため、前記ステップａ）で天然ＦＧを第四級アンモニウム塩の形態に変換する（反応経路図１の２）。
【００７４】
天然ＦＧの第四級アンモニウム塩は、当分野で慣用の方法を用いて得ることができる。例えば、沈降法を用いて第四級アンモニウム塩への変換を実現することができ、このとき、ＦＧのアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩の水溶液に有機アンモニウム塩を過量で加え、水不溶性のＦＧ第四級アンモニウム塩を形成して前記水溶液に沈降物させる。なお、イオン交換樹脂を用いてＦＧのアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩をＨ型のＦＧに変換し、そしてアルカリ性の有機アンモニウムを用いて前記Ｈ型のＦＧを中和することでＦＧ第四級アンモニウム塩を得ることもできる。
【００７５】
反応経路図１のステップａ２）では、ＦＧ第四級アンモニウム塩２のＤ−ＧｌｃＡ残基におけるカルボキシ基を全部又は部分的にカルボン酸エステル３を変換する処理が行われる。ＦＧのカルボキシ基をエステル化することは、後のβ−脱離反応に有利である。カルボキシ基形態で存在するＧｌｃＡは、β−脱離解重合が起こり難いが、カルボン酸エステルは、エステル基の電子効果に起因してβ−脱離反応が起こりやすくなるからである。
【００７６】
前記ＦＧのＧｌｃＡのカルボキシ基エステル化反応は、通常、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ＤＭＦと低級アルコール、ケトン及び／又はエーテルとの混合溶媒などの有機溶媒で行われ、前記ＦＧのＧｌｃＡのカルボキシ基と定比のハロゲン化炭化水素を反応させることにより、エステル化度の異なる所期のＦＧカルボン酸エステルを得ることができる。前記ＦＧカルボン酸エステルのエステル化度とは、エステル化反応で生成したカルボン酸エステル基のモル数とエステル化反応前の遊離カルボキシ基のモル数との比を指すものである。前記ハロゲン化炭化水素については特に制限がないが、Ｃ１〜Ｃ６の直鎖状又は分岐状、飽和又は不飽和、置換又は非置換の脂肪族アルキル基、又は置換又は非置換のＣ７〜Ｃ１２芳香族アルキル基などが挙げられる。本発明者が提出した中国特許出願第２０１１１０３１８７０４．Ｘ号に、ＦＧカルボン酸エステル誘導体を製造する方法が開示され、該発明特許出願の全技術内容は、参考として本明細書に取り込まれる。
【００７７】
反応経路図１のステップｂ）では、ＦＧカルボン酸エステルをβ−脱離解重合（ｂ１）して解重合物４を得て、解重合物４の還元性末端−Ｄ−ＧａｌＮＡｃを還元剤によって−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ−ｏｌ（ｂ２）に還元して解重合物５を得る処理が行われる。
【００７８】
以上で述べたように、中国特許出願第２０１３１００９９８００号には、天然ＦＧのβ−脱離解重合法が開示され、該方法では非還元性末端が不飽和のΔＵＡである解重合物が得られるが、解重合物の還元性末端の糖基構造が複雑である。例えば、前記還元性末端の糖基は、「−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ」に加えてＬ−Ｆｕｃ置換の「−Ｄ−ＧｌｃＡ」を含む。還元性末端の構造が複雑であるため、解重合物から精製オリゴ糖を分離することが困難となり、やむを得ず混合物形態の解重合物をそのまま利用するのが一般的である。理論上、β−脱離解重合法では「Ｄ−ＧａｌＮＡｃ−（β１→４）−Ｄ−ＧｌｃＡ」グリコシド結合選択的に分解することができ、解重合物の還元性末端が「−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ」残基となる。しかしながら、中国特許出願第２０１３１００９９８００号に開示のβ−脱離解重合法で製造される天然ＦＧの解重合物には、還元性末端が「−Ｄ−ＧｌｃＡ」であるオリゴ糖を一定量で含むため、関連の条件下で副反応が少なからず一定の程度で発生し、特に、解重合物の還元性末端の糖基が一部分解されることが考えられる。ここで、中国特許出願第２０１３１００９９８００号に開示の全技術内容は、参考として本明細書に取り込まれる。
【００７９】
製薬分野の技術者からすれば、精製オリゴ糖の化学構造が純粋であり、品質制御のレベルが高く、応用価値もより高いことを熟知している。天然ＦＧのβ−脱離反応条件についいて検討を重ねた結果、本発明者は、驚異的にも以下の問題点を発見した。
【００８０】
つまり、還元剤（例えば、水素化ホウ素ナトリウム）を用いて天然ＦＧの還元性末端の糖基を糖アルコールに還元した場合、そのカルボン酸エステル化物がアルカリ性の非水性溶媒においてβ−脱離反応を起こりうるが、解重合物のＨＰＧＰＣクロマトグラムを分析すると、−Ｄ−ＧｌｃＡを還元性末端とするオリゴ糖がオリゴ糖全体において約１０％〜３０％を占め（面積百分率法で算出）、これは同じ条件下で非還元末端を有する天然ＦＧを解重合して得られる産物に似ている。このことから、末端還元がＦＧカルボン酸エステルのβ−脱離反応を影響しないと認められる。
【００８１】
さらに検討を行ったところ、前記アルカリ性の非水性溶媒に還元剤（例えば、水素化ホウ素ナトリウム）を直接加えても、天然ＦＧカルボン酸エステルのβ−脱離反応が通常のとおり起こりうることが分かり、一方で意外なことに産物の還元性末端がほとんど−３−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ−ｏｌであり、還元性末端が−３−Ｄ−ＧｌｃＡ−ｏｌであるオリゴ糖の含有量がいずれも約５％の程度と僅かであり、ＨＰＧＰＣ検出限度を下回る場合があることが確認できる。このことから、解重合物末端を還元する場合、アルカリ性条件下で還元性末端の糖基が分解することを効果的に回避でき、解重合物が規則的な還元性末端を有するようになることが確認できる。
【００８２】
当業者であれば、反応液に還元剤（例えば、水素化ホウ素ナトリウム）が存在するため、β−脱離解重合して得られる解重合物の末端糖基が速やかに糖アルコールに還元されることを容易に理解できる。還元性末端の糖基を糖アルコールに還元しても、ヘキスロン酸エステルのβ−脱離反応には影響がなく、一方で解重合物末端の糖基を糖アルコールに還元することでアルカリ性の条件下で還元性末端の糖基が破壊されたり、分解されることを効果的に回避できる。したがって、還元剤の存在下でＦＧカルボン酸エステルをβ−脱離によって解重合することにより、化学構造がより規則的な解重合物を得ることができる。
【００８３】
ここで、前記「化学構造がより規則的である」とは、１）解重合物に含まれるオリゴ糖同族体が全て３ｍ個の単糖残基で構成され、２）オリゴ糖同族体の非還元性末端の糖基が「Ｌ−Ｆｕｃ−（α１−３）−ΔＵＡ−１−」であり、還元性末端の糖基が「−３−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ−ｏｌ」であることを意味する。
【００８４】
以上を纏めると、前記ステップｂ）の技術要素が還元剤の存在下でβ−脱離解重合反応を行い、前記β−脱離反応の条件が非水性溶媒において強アルカリでＦＧカルボン酸エステルを処理する点に尽きる。ステップａ）でＦＧカルボン酸をエステル化する際の反応溶液として非水性溶媒が用いられるため、前記カルボン酸のエステル化反応が終了した後、反応液の更なる後続処理が不要となり、そのままステップｂ）でのβ−脱離解重合反応に用いることができる。
【００８５】
ステップｂ）で使用する還元剤は、還元性末端の糖基を糖アルコールに還元可能な化合物であり、例えば、水素化ホウ素ナトリウムが挙げられる。還元剤の用量は、解重合物の収率に緊密に関連する。当業者であれば理解できるが、解重合物の収率と構造均一性を確保する観点から、該反応では化学当量からして過量の還元剤を使用する必要がある。また、ステップｂ）で言う強アルカリは、低級ナトリウムアルコキシド、ジアザビシクロなどである。
【００８６】
反応経路図１のステップｃ）は、ＦＧのβ−脱離解重合で得られるオリゴ糖同族体の混合物５をアルカリ金属塩の形態に変換するステップであり、具体的には、反応溶液に無機塩（例えば、塩化ナトリウム）の飽和水溶液を加えることで行われる。アルカリを用いてオリゴ糖同族体のカルボン酸エステルを加水分解するとき、通常、無機アルカリ水溶液（例えば、０．０５Ｍ〜１ＭのＮａＯＨ又はＫＯＨ）を用い、よって、遊離カルボキシ基を含むオリゴ糖同族体の混合物６を得ることができる。
【００８７】
反応経路図１のステップｄ）は、オリゴ糖混合物を分離、精製して一連の精製オリゴ糖７を得るステップである。ステップｄ）では、通常、クロマトグラフ法を利用してオリゴ糖を分離、精製し、ゲルクロマトグラフィー及び／又はイオン交換クロマトグラフィーを利用することができ、これらの手法は当業者にとって常套手段に過ぎない。なお、前記ゲルクロマトグラフィー及び／又はイオン交換クロマトグラフィーを限外ろ過や塩析法などと併用することで分離、精製効果の向上を図ることができる。
【００８８】
反応経路図１のステップｅ）では、ステップｄ）で得られるオリゴ糖７について構造修飾を行い、オリゴ糖８を得る処理が行われる。前記化合物８は、Ｒ８が一般式（ＩＩ）で表される置換基である一般式（Ｉ）のオリゴ糖であり、上記一般式（Ｖ）で示されるオリゴ糖に等しいものである。
【００８９】
オリゴ糖７を第四級アンモニウム塩の形態に変換し、そして当分野の慣用手段を利用して有機溶媒においてハロゲン化炭化水素と反応させることにより、Ｒ６がＣ１〜Ｃ６脂肪族アルキル基又はＣ７〜Ｃ１２アリール基である一般式（Ｖ）のオリゴ糖を容易に得ることができる。
【００９０】
また、中国特許出願第１０３２１４５９１Ａ号及び関連文献（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１５；１１２（２７）：８２８４〜９）に開示のヒドラジン分解法を利用してオリゴ糖７のＤ−ＧａｌＮＡｃにおけるアセチル基を除去することにより、脱アセチル化のオリゴ糖を得ることができ、すなわちＲ７が−Ｈである一般式（Ｖ）のオリゴ糖を得ることができる。前記脱アセチル化のオリゴ糖を、酸無水物やＥｔ３Ｎ．ＳＯ３と反応することでＮ−再アシル化や再硫酸化のオリゴ糖を得ることができ、すなわちＲ７がＣ２〜Ｃ５アシル基又は−ＳＯ３Ｈである一般式（Ｖ）で表されるオリゴ糖を得ることができる。
【００９１】
なお、オリゴ糖７の還元性末端−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ−ｏｌのＣ１位におけるアルコール性水酸基については、酸性条件下でアルコールと反応させて末端アルキル化物に変換してもよい。当業者にとって容易に理解できるが、前記アルキル化反応によってＲ９が置換又は非置換のＣ１〜Ｃ６脂肪族アルキル基又はＣ７〜Ｃ１２アリール基である一般式（Ｖ）の化合物を得ることができる。
【００９２】
なお、上述の各構造修飾を組合わせることで、本発明に係る各構造を有し、一般式（Ｖ）で表されるオリゴ糖を得ることができる。
【００９３】
本発明の一好適な実施形態において、反応経路図１の製造方法は、以下のとおりである。
【００９４】
ステップａ）において、ＦＧの第四級アンモニウム塩は、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［２−［２−［４（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシ］エトキシ］エチル］ベンザルコニウム塩であり、すなわちベンゼトニウム（Ｂｅｎｚｅｔｈｏｎｉｕｍ）塩である。前記有機溶媒は、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）や、ＤＭＦとエタノールの混合物である。前記カルボン酸エステルは、ベンジルエステルであり、前記「全部又は部分的にカルボン酸エステルに変換する」とは、混合物３のカルボキシ基エステル化度が約３０％〜約１００％の範囲であることを意味する。
【００９５】
ステップｂ）において、有機溶媒は、ＤＭＦや、ＤＭＦとエタノールの混合物である。前記還元剤は、水素化ホウ素ナトリウムであり、前記強アルカリは、ナトリウムエトキシドである。
【００９６】
ステップｃ）において、第四級アンモニウム塩の混合物をアルカリ金属塩に変換するとき、反応液に塩化ナトリウム飽和水溶液を加え、オリゴ糖同族体５をナトリウム塩の形態に変換すること。また、前記水溶液において行われるアルカリ加水分解とは、濃度が０．０５Ｍ〜１ＭのＮａＯＨ水溶液においてオリゴ糖同族体のカルボン酸エステルを加水分解することを意味する。
【００９７】
ステップｄ）で言うクロマトグラフ法については特に制限がないが、例えば、ゲルクロマトグラフィー及び／又はイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる
【００９８】
ステップｅ）で言う構造に対して更なる修飾を施す際の手法については特に制限がなく、例えばオリゴ糖のＤ−グルクロン酸基（ＧｌｃＡ）と不飽和ヘキスロン酸（ΔＵＡ）のカルボキシ基をエステル化してもよく、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン基（ＧａｌＮＡｃ）を脱アセチル化してから適宜に再アシル化又は再硫酸化してもよく、還元性末端の糖アルコール（Ｄ−ＧａｌＮＡｃ−ｏｌ）をアルキル化してもよい。
【００９９】
由来の異なる天然ＦＧの硫酸エステル化は、その形態に差異があり、これは周知のことである。既に報告があるが、ＦＧ側鎖のＬ−Ｆｕｃの硫酸エステル化としては、２，４−ジ硫酸エステル（Ｌ−Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓ）、３，４−ジ硫酸エステル（Ｌ−Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ）、３−硫酸エステル（Ｌ−Ｆｕｃ３Ｓ）及び４−硫酸エステル（Ｌ−Ｆｕｃ４Ｓ）や、硫酸エステル基による置換がない場合が挙げられ、主鎖のＤ−ＧａｌＮＡｃの硫酸エステル化としては、４，６−ジ硫酸エステル（Ｄ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６Ｓ）、４−硫酸エステル（Ｄ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ）及び６−硫酸エステル（Ｄ−ＧａｌＮＡｃ６Ｓ）や、硫酸エステル基による置換がない場合が挙げられる。一部の天然ＦＧに、硫酸エステル化の形態が異なるＬ−ＦｕｃＳ及び／又はＤ−ＧａｌＮＡｃＳが同時に存在し、一方、他の一部の天然ＦＧに含まれるＬ−ＦｕｃＳ及び／又はＤ−ＧａｌＮＡｃＳの硫酸エステル化は、比較的規則的であり、単一な形態を維持する（Ｐｏｍｉｎ  ＶＨ．Ｍａｒ  Ｄｒｕｇｓ．２０１４，１２，２３２〜５４）。
【０１００】
前記一般式（Ｖ）で表されるオリゴ糖を製造する際、各ステップでの処理が糖基の硫酸エステル基の安定性に影響を与えず、オリゴ糖の硫酸化形態は、天然ＦＧの硫酸化形態によって決められる。硫酸化形態が比較的に規則的である天然ＦＧにとっては、β−脱離解重合物におけるオリゴ糖の種類が少なく、同じ重合度のオリゴ糖の化学構造が同じであることから、本発明に係る精製オリゴ糖が容易に得られる。
【０１０１】
例えば、Ｓｔｉｃｈｏｐｕｓ  ｖａｒｉｅｇａｔｕｓ（タマナマコ）、Ｂｏｈａｄｓｃｈｉａ  ａｒｇｕｓ（ジャノメナマコ）及びＳｔｉｃｈｏｐｕｓ  ｍｏｎｏｔｕｂｅｒｃｕｌａｔｕｓなどの棘皮動物の体壁から抽出、精製した天然ＦＧにおいて、側鎖のフコシル基が主にＬ−Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓであり、主鎖のヘキソサミンが主にＤ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６Ｓである。したがって、これらの天然ＦＧは、下記一般式（ＶＩＩＩ）で表されるオリゴ糖及びその薬学的に許容可能な塩の製造に好適であり、前記化合物は、実にＲ１、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５が−ＳＯ３Ｈであり、Ｒ２が−Ｈである一般式（Ｖ）で表されるオリゴ糖である。
【０１０２】
【化９】
0006980018.tif 000010
【０１０３】
式（ＶＩＩＩ）中、Ｒ６、Ｒ７及びＲ９は、上記の場合と同じである。
【０１０４】
Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａ（ハネジナマコ）、Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｆｕｓｃｏｐｕｎｃｔａｔａ（ウフジナマコ）、Ｓｔｉｃｈｏｐｕｓ  ｈｏｒｒｅｎｓ（オニイボナマコ）及びＰｅａｒｓｏｎｏｔｈｅｉａ  ｇｒａｅｆｆｅｉ（クロエリナマコ）等の棘皮動物の体壁から抽出した天然ＦＧにおいて、側鎖のフコシル基が主にＬ−Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓであり、主鎖のヘキソサミンが主にＤ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６Ｓである。したがって、これらの天然ＦＧは、下記一般式（ＩＸ）で表されるオリゴ糖及びその薬学的に許容可能な塩の製造に好適であり、前記化合物は、実にＲ１が−Ｈであり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５が−ＳＯ３Ｈである一般式（Ｖ）で表されるオリゴ糖である。
【０１０５】
【化１０】
0006980018.tif 000011
【０１０６】
式（ＩＸ）中、Ｒ６、Ｒ７及びＲ９は、上記の場合と同じである。
【０１０７】
また、本発明の一好適な実施形態によれば、オリゴ糖の製造方法は、一般式（Ｉ）で示される構造を有し、且つＲ８が上記一般式（ＩＩＩ）又は一般式（ＩＶ）で表される置換基であるオリゴ糖を製造する方法である。ここで、「一般式（Ｉ）で示される構造を有し、且つＲ８が上記一般式（ＩＩＩ）又は一般式（ＩＶ）で表される置換基であるオリゴ糖」とは、実に上記一般式（ＶＩ）又は一般式（ＶＩＩ）で表されるオリゴ糖を指すものである。前記製造方法は、「β−脱離解重合＋末端ピーリング」を含み、すなわち還元剤を含まない有機溶媒においてカルボン酸エステル化された天然ＦＧをβ−脱離解重合し、そして「末端ピーリング」によってＦＧ解重合物の還元性末端のＤ−ＧａｌＮＡｃ残基を除去し、還元性末端が−Ｄ−ＧｌｃＡであるオリゴ糖同族体の混合物を得る方法である。前記製造方法としては、具体的には、以下のステップを含む。
【０１０８】
ａ）天然ＦＧを第四級アンモニウム塩の形態に変換し、有機溶媒においてＦＧ第四級アンモニウム塩のＤ−ＧｌｃＡにおけるカルボキシ基を全部又は部分的にカルボン酸エステルに変換する。
【０１０９】
ｂ）無水有機溶媒において、強アルカリを用いて前記ＦＧカルボン酸エステルを処理することでβ−脱離解重合し、そして少量の強アルカリ水溶液を加えて末端ピーリングを行うことにより、解重合物の還元性末端の−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ残基を除去し、還元性末端が−Ｄ−ＧｌｃＡであるオリゴ糖同族体の混合物を得る。
【０１１０】
ｃ）ステップｂ）で得られるオリゴ糖混合物をアルカリ金属塩に変換し、アルカリ性水溶液においてオリゴ糖同族体のカルボン酸エステルを加水分解することにより、遊離カルボキシ基を含むオリゴ糖同族体の混合物を得る。
【０１１１】
ｄ）クロマトグラフィーを利用して、ステップｃ）で得られるオリゴ糖混合物からオリゴ糖を分離、精製する。
【０１１２】
ｅ）ステップｄ）で得られる精製オリゴ糖に対して、適宜に構造修飾を施す。
【０１１３】
前記ステップａ）〜（ｅ）での処理を、下記反応経路図２に纏めて示す。
【０１１４】
【化１１】
0006980018.tif 000012
【０１１５】
反応経路図２において、Ｎａｔｕｒａｌ  ＦＧ１、ＦＧ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓａｌｔ２、ＦＧ  ｅｓｔｅｒ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓａｌｔ３及びｄＦＧ  ｅｓｔｅｒ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓａｌｔ４は、何れも反応経路図１の場合と同じである。そのうち、ｄＦＧ  ｅｓｔｅｒ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓａｌｔ５は、解重合物４が「末端ピーリング」を経て末端の−Ｄ−ＧａｌＮＡｃを失い、還元性末端が−Ｄ−ＧｌｃＡである解重合物である。ｄＦＧ６は、アルカリ金属塩形態の産物５のカルボン酸エステル基を加水分解して得られる産物である。解重合物４、５及び６は、いずれもオリゴ糖同族体の混合物である。Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ７は、解重合物６から分離、精製した精製オリゴ糖であり、精製オリゴ糖８及び９は、前記精製オリゴ糖７を置換基によって適宜に修飾して得られる精製オリゴ糖である。
【０１１６】
反応経路図２に示す化学構造にいて、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１０、Ｒ１１及びｎは、上記一般式（Ｉ）の場合と同じであり、ｘ、ｙ及び−ＣＯＯＸは、反応経路図１の場合と同じである。
【０１１７】
反応経路図２のステップａ）において、天然ＦＧの第四級アンモニウム塩への変換、及びＦＧのカルボキシ基エステル化は、反応経路図１の場合と同じである。
【０１１８】
反応経路図２のステップｂ）では、ＦＧのカルボン酸エステルをβ−脱離解重合して（ｂ１）解重合物４（少量の産物５を含む）を得て、そして「末端ピーリング」によって解重合物４の還元性末端の−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ残基を除去して（ｂ２）解重合物５を得ることが行われる。
【０１１９】
以上で述べたように、中国特許出願第２０１３１００９９８００号に開示の天然ＦＧのβ−脱離解重合物は、主に還元性末端が−Ｄ−ＧａｌＮＡｃであるオリゴ糖であるが、還元性末端が「−Ｄ−ＧｌｃＡ−」であるオリゴ糖も一定量で含み、β−脱離解重合物の還元性末端の糖基が分解することが起こっていると推定できる。その結果、還元性末端の構造が複雑であり、解重合物からオリゴ糖を分離、精製することは困難であった。
【０１２０】
当業者であれば、強アルカリ性の条件下で「末端ピーリング（ｐｅｅｌｉｎｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）」を行うとき、一部の多糖体（例えば、繊維素など）が還元性末端の単糖残基を１個ずつ順番に失うことを熟知している（Ｗｈｉｓｔｌｅｒ  ＲＬ，ｅｔ  ａｌ．Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９５８，１３：２８９〜３２９）。実に、本発明者は、天然ＦＧを中国特許出願第２０１３１００９９８００号に記載の条件で解重合するとき、産物に不飽和の低分子化合物を含む副産物が一定量で存在し、これは既に報告されているピーリング処理時における還元性末端糖基の分解物に似ていることを見出した。中国特許出願第２０１３１００９９８００号に開示の天然ＦＧのβ−脱離反応が強アルカリの条件下で行われるため、解重合物に含まれる還元性末端が「−Ｄ−ＧｌｃＡ−」であるオリゴ糖は、解重合物の「末端ピーリング」と緊密に関わることが考えられる。
【０１２１】
当業者であれば容易に理解できるが、β−脱離解重合の反応液に還元剤を加えて解重合物の末端を糖アルコールに還元することにより、「末端ピーリング」の発生を効果的に回避することができ、一方、制御可能な前提でＦＧのβ−脱離解重合時の「末端ピーリング」を利用することにより、「−Ｄ−ＧｌｃＡ」を還元性末端とする一連のＦＧオリゴ糖を得ることもできる。本発明者は、この識見に基づきＦＧカルボン酸エステルのβ−脱離反応条件について更に検討を行った結果、以下の驚くべき結論を得ることに至った。
【０１２２】
１）前記アルカリ性の非水溶媒に少量の強アルカリ（例えば、ＮａＯＨ）水溶液を加えると、還元性末端が「−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ」であるＦＧオリゴ糖は、「末端ピーリング」を起こりやすくなり、前記還元性末端の糖基を失ってしまう。ところが、還元性末端が「−Ｄ−ＧｌｃＡ」であるＦＧオリゴ糖は、このような「末端ピーリング」をめったに起こさない。
【０１２３】
２）ＨＰＧＰＣクロマト解析及びＮＭＲ構造解析から、無水有機溶媒において強アルカリでＦＧカルボン酸エステルを処理することでβ−脱離解重合を遂行し、さらに反応液に少量の強アルカリ水溶液を加えてβ−脱離解重合物をピーリングすると、解重合物に含まれる「オリゴ糖同族体」は、特に規則的な化学構造を有することが確認できる。つまり、前記オリゴ糖同族体は、（３ｍ−１）個の単糖残基で構成され、かつ非還元性末端の糖基が「Ｌ−Ｆｕｃ−（α１−３）−ΔＵＡ−１−」であり、還元性末端の糖基がＣ３位にＬ−ＦｕｃＳ置換基を有する「−４−Ｄ−ＧｌｃＡ」である。
【０１２４】
３）天然ＦＧのカルボン酸エステルをβ−脱離解重合し、末端ピーリング処理を経て得られるオリゴ糖同族体は、分離、精製を経て一連の「精製オリゴ糖」となり、これらの精製オリゴ糖は、化学構造において共通した特徴を有し、つまり、前記オリゴ糖は、（３ｍ−１）個の単糖残基を含み、非還元性末端が「Ｌ−Ｆｕｃ−（α１−３）−ΔＵＡ−１−」であり、還元性末端が「−４−［Ｌ−Ｆｕｃ−（α１−３）］−Ｄ−ＧｌｃＡである。
【０１２５】
前記ステップｂ）において、まず、還元剤を含まない非水性溶媒において強アルカリでＦＧカルボン酸エステルを処理することでβ−脱離解重合を行い（反応経路図２のｂ１）、解重合物４（少量のオリゴ糖５を含むことがある）を得る。ここで、ＦＧカルボン酸をエステル化する際の反応溶媒が非水性溶媒であるため、反応液を処理することなくそのままステップｂ）のβ−脱離解重合反応に用いることができる。ステップｂ）の強アルカリとしては、通常、低級ナトリウムアルコキシド、ジアザビシクロなどを適宜使用することができる。
【０１２６】
反応経路図２のステップｂ）では、さらに前記β−脱離反応液に少量の強アルカリ水溶液を加え、解重合物４を「末端ピーリング」によって解重合物５に変換することが行われる（反応経路図２のｂ２）。前記強アルカリ水溶液としては、０．２５Ｍ〜２ＭのＮａＯＨ、ＫＯＨ又はＣａ（ＯＨ）２の飽和水溶液を使用しよもよく、前記「少量の強アルカリ水溶液」とは、反応液全体に対して体積比で約１／５〜１／１０の強アルカリ水溶液を指すものである。
【０１２７】
反応経路図２のステップｃ）では、解重合物５をアルカリ金属塩に変換し、カルボン酸エステルを加水分解することが行われ、これは、反応経路図１の場合と同じである。
【０１２８】
反応経路図２のステップｄ）では、オリゴ糖６の混合物を分離、精製して一連の精製オリゴ糖７を得ることが行われる。前記精製方法としては、通常、ゲルクロマトグラフィー及び／又はイオン交換クロマトグラフィーを利用することができ、実際需要に合わせて限外ろ過、塩析法などを併用することで分離、精製効果をさらに高めることができる。
【０１２９】
反応経路図２のステップｅ）では、ステップｄ）で得られるオリゴ糖７に対して構造修飾を行うことにより、精製オリゴ糖８又は９を得る。そのうち、前記オリゴ糖８は、一般式（ＶＩ）で表されるオリゴ糖と実に同じであり、前記化合物９は、一般式（ＶＩＩ）で表されるオリゴ糖と実に同じである。
【０１３０】
オリゴ糖７を第四級アンモニウム塩に変換し、当分野の慣用手段を利用して有機溶媒においてハロゲン化炭化水素反応と反応させることで、Ｒ６が置換又は非置換のＣ１〜Ｃ６アルキル基又はＣ７〜Ｃ１２アリール基であるオリゴ糖を得ることができる。
【０１３１】
また、ヒドラジン分解法を利用してオリゴ糖７のＤ−ＧａｌＮＡｃにおけるアセチル基を除去し、脱アセチル化のオリゴ糖を得ることができる。さらに、前記脱アセチル化のオリゴ糖を酸無水物、又はＥｔ３Ｎ．ＳＯ３と反応させることにより、Ｎ−再アシル化又は再硫酸化のオリゴ糖を得ることができ、すなわちＲ７がＣ２〜Ｃ５アシル基又は−ＳＯ３Ｈである一般式（ＶＩ）又は一般式（ＶＩＩ）のオリゴ糖を得ることができる。
【０１３２】
オリゴ糖７の還元性末端−Ｄ−ＧｌｃＡを、酸性条件下でアルコール化合物と反応させてアルキル化してもよく、このとき、Ｒ１０が置換又は非置換のＣ１〜Ｃ６アルキル基又はＣ７〜Ｃ１２アリール基である一般式（ＶＩ）の化合物が得られる。
【０１３３】
オリゴ糖７の還元性末端−Ｄ−ＧｌｃＡのＣ１位におけるアルデヒド基を、有機アミンの存在下でアミノ化してもよく、このとき、アミンと末端糖基のＣ１位におけるアルデヒド基とが反応してシッフ塩基を形成し、さらに、還元剤を用いて第二級アミンに還元することによりＲ１１が−ＮＨＲ１２である一般式（ＶＩＩ）の化合物９を得ることができる。
【０１３４】
オリゴ糖７の還元性末端−Ｄ−ＧｌｃＡのＣ１位におけるアルデヒド基を、例えば、水素化ホウ素ナトリウムなどの還元剤を用いて糖アルコール（−Ｄ−ＧｌｃＡ−ｏｌ）に還元してもよく、さらに、前記−Ｄ−ＧｌｃＡ−ｏｌを酸性条件下でアルコール化合物と反応させてアルキル化することにより、Ｒ１１が−ＯＲ１３であり、Ｒ１３が−Ｈ、置換又は非置換のＣ１〜Ｃ６アルキル基又はＣ７〜Ｃ１２アリール基である一般式（ＶＩＩ）の化合物９を得ることができる。
【０１３５】
上述の構造修飾を組合わせることにより、本発明の特定構造を有する一般式（ＶＩ）又は一般式（ＶＩＩ）で表されるオリゴ糖が得られる。
【０１３６】
本発明の一好適な実施形態において、反応経路図２に示す製造方法は、以下の通りである。
【０１３７】
ステップａ）のＦＧ第四級アンモニウム塩は、塩化ベンゼトニウム塩であり、前記有機溶媒は、ＤＭＦや、ＤＭＦとエタノールの混合物である。前記カルボン酸エステルは、ベンジルエステルであり、前記「全部又は部分的にカルボン酸エステルに変換する」とは、化合物３のカルボキシ基エステル化度が約３０％〜約１００％の範囲であることを意味する。
【０１３８】
ステップｂ）の有機溶媒は、ＤＭＦや、ＤＭＦとエタノールの混合物であり、前記強アルカリは、ナトリウムエトキシドである。
【０１３９】
ステップｃ）において、第四級アンモニウム塩の混合物をアルカリ金属塩に変換するとき、反応液に塩化ナトリウムの飽和水溶液を加え、オリゴ糖同族体をナトリウム塩の形態にすることが行われ、前記水溶液においてアルカリ加水分解を行うとき、濃度が０．０５Ｍ〜１ＭのＮａＯＨ水溶液においてオリゴ糖同族体のカルボン酸エステルを加水分解することが行われる。
【０１４０】
ステップｄ）で言うクロマトグラフィーについては特に制限がなく、ゲルクロマトグラフィー及び／又はイオン交換クロマトグラフィーを利用することができる。
【０１４１】
ステップｅ）で言う構造修飾については特に制限がなく、例えば、オリゴ糖のＤ−ＧｌｃＡ及びΔＵＡにおけるカルボキシ基をエステル化してもよく、Ｄ−ＧａｌＮＡｃを脱アセチル化してから適宜に再アシル化又は再硫酸化してもよく、或いは還元性末端−Ｄ−ＧｌｃＡのＣ１位におけるヘミアセタールをアルキル化、還元、還元アミノ化又は還元アルキル化してもよい。
【０１４２】
反応経路図２に示すオリゴ糖の製造方法で得られるオリゴ糖の硫酸化形態は、天然ＦＧの硫酸化形態によって決められる。
【０１４３】
そのため、Ｓｔｉｃｈｏｐｕｓ  ｖａｒｉｅｇａｔｕｓ、Ｓｔｉｃｈｏｐｕｓ  ｈｏｒｒｅｎｓ及びＳｔｉｃｈｏｐｕｓＭｏｎｏｔｕｂｅｒｃｕｌａｔｕｓなどの棘皮動物に由来の天然ＦＧは、一般式（Ｘ）及び一般式（ＸＩ）で表されるオリゴ糖、及びその薬学的に許容可能な塩を製造するのに好適であり、前記化合物は、実にＲ１、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５が−ＳＯ３Ｈであり、Ｒ２が−Ｈである一般式（ＶＩ）及び一般式（ＶＩＩ）で表されるオリゴ糖である。
【０１４４】
【化１２】
0006980018.tif 000013
【０１４５】
【化１３】
0006980018.tif 000014
【０１４６】
式（Ｘ）及び式（ＸＩ）中、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１０及びＲ１１は、いずれも上記の場合と同じである。
【０１４７】
一方、Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａ、Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｆｕｓｃｏｐｕｎｃｔａｔａ及びＰｅａｒｓｏｎｏｔｈｅｉａ  ｇｒａｅｆｆｅｉなどの棘皮動物に由来の天然ＦＧは、一般式（ＸＩＩ）及び一般式（ＸＩＩＩ）で表されるオリゴ糖を製造するのに好適であり、前記化合物は、実にＲ１が−Ｈであり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５が−ＳＯ３−である一般式（ＶＩ）及び一般式（ＶＩＩ）のオリゴ糖である。
【０１４８】
【化１４】
0006980018.tif 000015
【０１４９】
【化１５】
0006980018.tif 000016
【０１５０】
式（ＸＩＩ）及び式（ＸＩＩＩ）中、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１０及びＲ１１は、いずれも上記の場合と同じである。
【０１５１】
また、本発明の一好適な実施形態において、天然ＦＧのβ−脱離反応を利用して化学構造がより規則的なＦＧオリゴ糖混合物を得ることができる。
【０１５２】
本発明は、さらに、オリゴ糖混合物及びその薬学的に許容可能な塩の製造方法を提供する。本発明に係るオリゴ糖混合物及びその薬学的に許容可能な塩の製造方法によると、オリゴ糖混合物は、本明細書に記載の一般式（Ｉ）で表される構造を有するオリゴ糖の同族体で構成され、かつ前記一般式（Ｉ）で表されるオリゴ糖の同族体において、Ｒ８が一般式（ＩＩ）、一般式（ＩＩＩ）又は一般式（ＩＶ）で示される置換基である。具体的には、Ｒ８が一般式（ＩＩ）、一般式（ＩＩＩ）又は一般式（ＩＶ）で表される置換基である一般式（Ｉ）のオリゴ糖は、前記混合物においてモル比で９５％以上である。また、前記製造方法によると、天然ＦＧを反応基質とし、強アルカリ、還元剤の存在下でＦＧカルボン酸エステルをβ−脱離解重合し、末端基を還元してオリゴ糖同族体の混合物を得ることができ、或いは強アルカリの存在下でＦＧカルボン酸エステルをβ−脱離解重合し、末端基をピーリングしてオリゴ糖同族体の混合物を得ることができる。その後、後処理を行い、置換基を用いて適宜に構造修飾を施すことにより、所期の分子量分布を有するオリゴ糖混合物を得ることができる。
【０１５３】
以上で述べたように、反応経路図１のステップａ）〜ステップｃ）に従って天然産物ＦＧを処理することにより、非還元性末端がＬ−ＦｕｃＳ−（α１−３）−ΔＵＡ−１−であり、還元性末端が−Ｄ−ＧａｌＮＡｃＳであるオリゴ糖同族体の混合物を得ることができる。また、本発明の一好適な実施形態において、オリゴ糖混合物の製造方法は、強アルカリ、還元剤の存在下でＦＧカルボン酸エステルをβ−脱離解重合し、そして末端基を還元してオリゴ糖同族体の混合物を得ることを含み、オリゴ糖混合物に含まれるオリゴ糖同族体は、上記一般式（Ｉ）で示される構造を有し、Ｒ８が上記一般式（ＩＩ）で表される置換基である。前記製造方法としては、具体的には、以下のステップを含む。
【０１５４】
ａ）天然ＦＧを第四級アンモニウム塩に変換し、有機溶媒においてＦＧのヘキスロン酸残基におけるカルボキシ基を全部又は部分的にカルボン酸エステルに変換する。
【０１５５】
ｂ）有機溶媒において、還元剤、強アルカリの存在下でＦＧカルボン酸エステルをβ−脱離解重合し、末端基を還元して還元性末端が−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ−ｏｌであるオリゴ糖同族体の混合物を得る。
【０１５６】
ｃ）ステップｂ）で得られるオリゴ糖混合物をアルカリ金属塩に変換し、水溶液においてオリゴ糖同族体のカルボン酸エステルをアルカリ加水分解し、遊離カルボキシ基を含むオリゴ糖同族体の混合物を得て、さらに適宜に後処理を行う。
【０１５７】
ｄ）ステップｄ）で得られるオリゴ糖混合物については、置換基を用いて適宜に構造修飾を加えることができる。
【０１５８】
本発明の一好適な実施形態において、ステップａ）の第四級アンモニウム塩をベンゼトニウム塩に変換するとき、有機溶媒としてＤＭＦや、ＤＭＦ−エタノール混合物を使用することができ、前記カルボン酸エステルは、ベンジルエステルであり、前記「全部又は部分的にカルボン酸エステルに変換する」とは、ＦＧのカルボキシ基エステル化度が約３０％〜約１００％の範囲であることを意味する。
【０１５９】
また、本発明の一好適な実施形態において、ステップｂ）の有機溶媒としてＤＭＦや、ＤＭＦ−エタノール混合物を使用することができ、前記還元剤は、水素化ホウ素ナトリウムであり、前記強アルカリは、ナトリウムエトキシドである。
【０１６０】
また、本発明の一好適な実施形態において、ステップｃ）で第四級アンモニウム塩混合物をアルカリ金属塩に変換するとき、反応液に塩化ナトリウムの飽和水溶液を加えてオリゴ糖同族体をナトリウム塩の形態に変換し、前記「水溶液におけるアルカリ加水分解」とは、濃度が０．０５Ｍ〜１ＭのＮａＯＨ水溶液においてオリゴ糖のカルボン酸エステルを加水分解すること意味する。
【０１６１】
以上で述べたように、従来の方法で製造される天然ＦＧには、通常、分子量分布がＦＧに類似するフカン、糖原、及びヘキソサミンを含む多糖体が一定量で含まれる。これらの多糖成分は、上記ステップａ）及びステップｂ）の処理を経てもその量に変化が少ない。そのため、ステップｃ）の後処理において限外ろ過、透析、又はゲルクロマトグラフィーを利用してこれらの多糖類不純物を除去することが行われる。
【０１６２】
反応経路図１に示すように、β−脱離解重合、末端還元によって得られる解重合物は、分子量分布がより大きくなる可能性がある（反応経路図１に示されるオリゴ糖混合物６において、ｎ値が約０〜１５の整数である）。そこで、ステップｃ）の後処理において限外ろ過、透析、又はゲルクロマトグラフィーを利用して重合度が比較的高いオリゴ糖や、低分子化合物を除去することが行われ、よって、所望の分子量分布を有するオリゴ糖混合物を得ることができる。
【０１６３】
ステップｄ）において、置換基による構造修飾については特に制限がなく、例えば、オリゴ糖のＤ−ＧｌｃＡ及び不飽和ΔＵＡのカルボキシ基をエステル化してもよく、Ｄ−ＧａｌＮＡｃを脱アセチル化してから適宜に再アシル化又は再硫酸化してもよく、還元性末端Ｄ−ＧａｌＮＡｃ−ｏｌのＣ１位におけるヒドロキシ基をアルキル化してもよい。
【０１６４】
中国発明特許第２０１３１００９９８００号に開示のオリゴ糖混合物に比べ、本発明に係るＲ８が一般式（ＩＩ）で表される置換基であるオリゴ糖同族体の混合物は、化学構造がより規則的である。前者の混合物に含まれるオリゴ糖は、割合で約１０％〜３０％のオリゴ糖の還元性末端がＤ−ＧｌｃＡ（又はその誘導体）であり、残りのオリゴ糖の還元性末端がＤ−ＧａｌＮＡｃ（又はその誘導体）である。一方、本発明に係るオリゴ糖混合物に含まれるオリゴ糖としては、還元性末端がほとんどＤ−ＧａｌＮＡｃ（又はその誘導体）であり、還元性末端がＤ−ＧｌｃＡ（又はその誘導体）であるオリゴ糖を含まないか、或いは僅かな量で含むだけである。
【０１６５】
なお、以上で述べたように、反応経路図２のステップａ）〜ステップｃ）の通り天然ＦＧを処理することにより、非還元性末端がＬ−ＦｕｃＳ−（α１−３）−ΔＵＡ−１−であり、還元性末端が−Ｄ−ＧｌｃＡであるオリゴ糖同族体の混合物を得ることができる。そのため、本発明のもう１つの好適な実施形態によれば、オリゴ糖混合物の製造方法は、強アルカリの存在下でＦＧカルボン酸エステルをβ−脱離解重合し、末端をピーリングしてオリゴ糖同族体の混合物を得ること含み、このとき、混合物に含まれるオリゴ糖同族体としては、本発明に係る一般式（Ｉ）で示される構造を有し、かつＲ８が上記一般式（ＩＩＩ）又は一般式（ＩＶ）で表される置換基である。前記製造方法は、具体的には、以下のステップを含む。
【０１６６】
ａ）天然ＦＧを第四級アンモニウム塩の形態に変換し、有機溶媒においてＦＧのヘキスロン酸残基におけるカルボキシ基を全部又は部分的にカルボン酸エステルに変換する。
【０１６７】
ｂ）無水有機溶媒において、強アルカリを用いてＦＧカルボン酸エステルをβ−脱離解重合させ、そして少量の強アルカリ水溶液を加えてＦＧ解重合物をピーリングして還元性末端の−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ残基を除去し、よって、還元性末端が−Ｄ−ＧｌｃＡであるオリゴ糖同族体の混合物を得る。
【０１６８】
ｃ）ステップｂ）で得られるオリゴ糖混合物をアルカリ金属塩に変換し、そして水溶液においてオリゴ糖混合物のカルボン酸エステル基をアルカリ加水分解することにより、遊離カルボキシ基を含むオリゴ糖同族体の混合物を得て、適宜に後処理を行う。
【０１６９】
ｄ）ステップｃ）で得られるオリゴ糖混合物に対して、置換基による構造修飾を適宜に施す。
【０１７０】
本発明の一好適な実施形態において、ステップａ）で言う第四級アンモニウム塩は、ベンゼトニウム塩であり、有機溶媒として、ＤＭＦや、ＤＭＦ−エタノール混合物を使用することができる。また、カルボン酸エステルは、ベンジルエステルであり、ＦＧカルボン酸エステルのカルボキシ基のエステル化度は、約３０％〜約１００％の範囲である。
【０１７１】
ステップｂ）で言う有機溶媒は、ＤＭＦや、ＤＭＦ−エタノール混合物であり、強アルカリは、ナトリウムエトキシドであり、前記「少量の強アルカリ水溶液」とは、反応液全体に対して体積比で約１／５〜１／１０の１Ｍ〜２ＭのＮａＯＨ水溶液を意味する。
【０１７２】
ステップｃ）において、第四級アンモニウム塩混合物をアルカリ金属塩に変換するとき、反応液に塩化ナトリウムの飽和水溶液を加え、オリゴ糖同族体をナトリウム塩の形態に変換することが行われる。前記「水溶液におけるアルカリ加水分解」とは、濃度が０．０５Ｍ〜１ＭのＮａＯＨ水溶液においてオリゴ糖同族体のカルボン酸エステル基を加水分解することを意味する。また、前記後処理において、ゲルクロマトグラフィー、限外ろ過及び／又は透析法を利用して未解重合の高分子多糖類不純物を除去し、並びに重合度が比較的高いオリゴ糖や、低分子不純物を除去することができ、よって、所望の分子量を有するオリゴ糖混合物が得られる。
【０１７３】
ステップｄ）で言う構造修飾については特に制限がなく、例えば、オリゴ糖のＤ−ＧｌｃＡ及びΔＵＡのカルボキシ基をエステル化してもよく、Ｄ−ＧａｌＮＡｃを脱アセチルしてから適宜に再アシル化又は再硫酸化してもよく、還元性末端−Ｄ−ＧｌｃＡのＣ１位におけるヘミアセタールをアルキル化、還元、還元アミノ化又は還元アルキル化してもよい。
【０１７４】
中国発明特許第２０１３１００９９８００に開示のオリゴ糖混合物に比べ、本発明に係るＲ８が一般式（ＩＩＩ）又は一般式（ＩＶ）で表される置換基であるオリゴ糖混合物は、化学構造がより規則的である。前者の混合物に含まれるオリゴ糖は、割合で約１０％〜３０％のオリゴ糖の還元性末端がＤ−ＧｌｃＡ（又はその誘導体）であり、残りのオリゴ糖の還元性末端がＤ−Ｇａｌ−ＮＡｃ（又はその誘導体）である。一方、本発明のオリゴ糖混合物に含まれるオリゴ糖は、還元性末端がほとんどＤ−ＧｌｃＡ（又はその誘導体）であり、還元性末端がＤ−ＧａｌＮＡｃ（又はその誘導体）であるオリゴ糖を含まないか、又は僅かな量で含むだけである。
【０１７５】
Ｓ．ｖａｒｉｅｇａｔｕｓ、Ｓ．ｈｏｒｒｅｎｓ及びＳ．Ｍｏｎｏｔｕｂｅｒｃｕｌａｔｕｓなどの棘皮動物に由来の天然ＦＧを原料とし、本発明に係るオリゴ糖混合物の製造方法を利用することにより、前記一般式（ＶＩＩＩ）、一般式（Ｘ）及び一般式（ＸＩ）で表されるオリゴ糖同族体の混合物を製造することができ、また、Ｈ．ｓｃａｂｒａ、Ｈ．ｆｕｓｃｏｐｕｎｃｔａｔａ及びＰ．ｇｒａｅｆｆｅｉなどの棘皮動物に由来の天然ＦＧを原料とし、本発明に係るオリゴ糖混合物の製造方法を利用することにより、前記一般式（ＩＸ）、一般式（ＸＩＩ）及び一般式（ＸＩＩＩ）で表されるオリゴ糖同族体の混合物を製造することができる。
【０１７６】
天然ＦＧを脱アセチル化・脱アミノ化によって解重合し、側鎖にＬ−Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓ置換基を有するオリゴ糖同族体にとって、テンナーゼに対して最も高い阻害活性を示す最小構造断片がノナサッカリドであることが既に報告されている（Ｚｈａｏ  ＬＹ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，２０１５，１１２：８２８４〜８２８９）。本発明者は、本発明に係る精製オリゴ糖が内因系テンナーゼ（人や実験動物に由来のテンナーゼ）を阻害する際の構造活性相関について検討を行った結果、以下の識見を得ることに至った。
【０１７７】
１）本発明に係るオリゴ糖は、内因系テンナーゼを選択的に抑制する活性を有する。インビトロ酵素活性測定システムを用いて測定したところ、本発明に係るオリゴ糖がテンナーゼを阻害するときのＩＣ５０値が約５〜２００ｎｇ／ｍｌの範囲であることが確認できる。前記「内因系テンナーゼを選択的に抑制する活性」とは、これらのオリゴ糖がテンナーゼに対して特に顕著な阻害活性を示す濃度において、アンチトロンビン（ＡＴ）の存在又は非存在を問わずにＩＩａ、Ｘａ、ＸＩＩａなどの凝固因子や血小板活性に対して明らかな影響を示さず、一方でさほど高くないヘパリンコファクターＩＩ（ＨＣ−ＩＩ）依存的なＩＩａ阻害活性を示すことを意味する。
【０１７８】
２）３ｍ個の単糖残基を含み且つ非還元性末端がΔＵＡであり、還元性末端が−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ−ｏｌである一連のオリゴ糖にとっても、テンナーゼに対して特に高い阻害活性を示す最小構造断片がノナサッカリドである。この結果から、非還元性末端及び還元性末端の糖基構造がそのテンナーゼ阻害活性にさほど影響がないことが確認できる。
【０１７９】
３）（３ｍ−１）個の単糖残基を含み且つ還元性末端が−Ｄ−ＧｌｃＡ（−ｏｌ）である一連のオリゴ糖にとっては、テンナーゼに対して特に強い阻害活性を示す最小構造断片がオクタサッカリドである。この結果から、上記ノナサッカリドの還元性末端−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ−ｏｌがテンナーゼ阻害活性を発揮するに際して必須構造でないことが確認できる。
【０１８０】
４）つまり、重合度がオクタサッカリド以上の本発明に係るオリゴ糖は、内因系テンナーゼに対していずれも強い阻害活性を示し（ＩＣ５０値が、いずれも約１００ｎｇ／ｍｌ未満である）、重合度がより高いオリゴ糖は、重合度が高くなるほど阻害活性が高くなる傾向を示す。
【０１８１】
５）本発明に係るオリゴ糖において、ヘキササッカリド又はペンタサッカリドは、高い濃度で内因系テンナーゼに対して阻害活性を示すが、その活性が比較的に弱いものである。なお、ヘキササッカリド及びペンタサッカリドは、さほど高くないが、ヘパリンコファクターＩＩ（ＨＣ−ＩＩ）依存的なＩＩａ阻害活性を示す。
【０１８２】
６）本発明に係るオリゴ糖にとって、置換基による構造修飾は、水溶性、油水分配係数などのオリゴ糖の理学的特性を改善することができ、一方で凝固因子に対する阻害活性や、抗凝固・抗血栓活性についてはさほど影響がない。
【０１８３】
７）本発明に係るオリゴ糖は、内因性凝固機構を阻害することで強い抗凝固活性を示し、薬物濃度が約２〜１８μｇ／ｍＬの範囲で人コントロール血漿の活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）を倍増することができ、一方で外因性凝固に対しては明らかな影響を示さない。
【０１８４】
８）動物モデルにおいて、本発明に係るオリゴ糖は、動脈・静脈血栓形成を抑制することができる。例えば、本発明者が鋭意検討を重ねた結果、各種の実験動物モデルに皮下経由（ｓｃ）又は静脈経由（ｓｃ）、約２Ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの投与量で本発明の化合物（例えば、ノナサッカリド又はオクタサッカリド）を投与し、血栓重量を計測すると、実験性静脈血栓形成（例えば、下大静脈を結紮して血栓形成を促す場合）に対する抑制率が７０％〜１００％に達し、並びに、臨床で使われる低分子ヘパリン系薬物に比べ、本発明のオリゴ糖が同等の抗血栓活性を示す投与量で出血時間と出血量がより低い傾向を示すことを見出した。
【０１８５】
９）本発明に係るオリゴ糖混合物は、内因系テンナーゼ阻害活性及び抗凝固・抗血栓活性からして精製オリゴ糖に類似する活性を有する。
【０１８６】
以上のことから、本発明に係るオリゴ糖及びその混合物は、優れた抗凝固・抗血栓活性を示し、特に重合度がオクタサッカリド以上である場合、本発明に係るオリゴ糖及びその混合物が内因系テンナーゼに対して優れた特異性を示すため、内因系テンナーゼ阻害剤として有用であると認められる。現在、内因性凝固機構が病的血栓形成に緊密に関わるが、止血機構にとっては必須でなく、内因性凝固機構に特異的な阻害剤が病的血栓形成を抑制し、出血傾向を効率よく低下させることのできることが解明されている。テンナーゼが内因性凝固機構の最下流に位置する律速酵素であるため、内因系テンナーゼは、出血傾向が低い抗凝固・抗血栓薬物のターゲットとして注目されつつある。
【０１８７】
本発明に係るオリゴ糖及びその混合物が優れた抗凝固・抗血栓活性を示すため、これらのオリゴ糖及びオリゴ糖混合物は、血栓疾患の予防及び／又は治療に有用であると考えられる。そこで、本発明は、さらに、前記オリゴ糖又はオリゴ糖混合物を含んでなる薬物組成物を提供する。
【０１８８】
本発明に係る薬物組成物は、抗血栓活性を示し、抗血栓効果を示す有効量で本発明に係るオリゴ糖又はその薬学的に許容可能な塩と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含んでなる。そのうち、前記オリゴ糖とは、上記一般式（Ｉ）で表される構造を有する化合物を指す。
【０１８９】
本発明に係るオリゴ糖の理化学特性に基づき、本発明に係る薬物組成物を、例えば、注射用水溶液や、使用直前で水溶液に調製可能な凍結乾燥粉体など、非経口製剤に調製することが好ましいが、呼吸道経由で投与するスプレーや、経皮投与の貼付剤、軟膏剤又はゲル剤などに調製してもよい。
【０１９０】
本発明に係るオリゴ糖は、水溶性がよく、水溶液に調製しやすい。また、活性成分の分子量が低いため、限外ろ過を利用して病原性微生物や発熱物質を除去することが可能である。また、水溶液及び／又は凍結乾燥粉体の調製に使われる薬用賦形剤として、例えば塩化ナトリウム、緩衝塩など、溶液の浸透圧及び／又はｐＨ値を調整可能な無機塩を使用することができ、一方でコソルベント及び／又は界面活性剤を含まないのが好ましい。使用直前で注射液に調製可能な凍結乾燥粉体には、無機塩及び／又は緩衝塩を添加する以外、マンノース等の製剤成形に有用な薬用賦形剤をさらに添加してもよい。
【０１９１】
通常、オリゴ糖類は経口投与で生体利用度に限界があるが、本発明に係るオリゴ糖（特に、置換基による構造修飾で得られるオリゴ糖）を経口投与する場合に一定の薬物効果を発揮できるため、本発明に係る薬物組成物をタブレット、カプセル等の当分野で慣用の経口剤に調製することができる。
【０１９２】
当業者であれば容易に理解できるが、前記オリゴ糖及びその薬学的に許容可能な塩を含む薬物組成物を特定の製剤形態に調製した場合、その抗血栓効果を発揮させるための有効投与量が製剤形態、投与形態や、患者の体重及び生理状態などに緊密に関わる。一般的に言うと、本発明に係る薬物組成物の単位製剤において、前記オリゴ糖活性成分の含有量が約５ｍｇ〜１００ｍｇの範囲であり、本発明の一好適な実施形態によれば、本発明に係る薬物組成物の単位製剤において前記オリゴ糖活性成分の含有量が約２０ｍｇ〜８０ｍｇの範囲である。
【０１９３】
また、本発明は、抗血栓活性を示す薬物組成物を提供し、前記薬物組成物は、抗血栓効果を示す有効量で本発明に係るオリゴ糖混合物と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含んでなる。
【０１９４】
本発明に係るオリゴ糖混合物を含む薬物組成物としては、製剤形態や投与量がいずれも本発明に係るオリゴ糖を含む薬物組成物に似ており、例えば、投与に際して非経口の方式が好ましく、特に皮下注射又は静脈注射が好ましい。また、製剤形態として注射用水溶液又は凍結乾燥粉体が好ましく、本発明の一好適な実施形態によれば、薬物組成物の単位製剤において前記オリゴ糖活性成分の含有量が約２０〜１００ｍｇの範囲である。
【０１９５】
本発明に係るオリゴ糖、オリゴ糖混合物、及びこれらの薬学的に許容可能な塩は、優れた抗凝固・抗血栓活性を示し、例えば、血栓形成性心血管疾病、血栓性脳血管疾患、肺静脈血栓塞栓、末梢静脈血栓塞栓、深部静脈血栓塞栓、末梢性動脈血栓塞栓などの血栓塞栓性疾患の予防及び治療に有用であると考えられる。したがって、本発明は、さらに前記オリゴ糖、オリゴ糖混合物、及びこれらの薬学的に許容可能な塩の、血栓塞栓性疾患を治療及び／又は予防する薬物の製造における用途を提供し、ここで、前記血栓塞栓性疾患については特に制限がないが、例えば、静脈血栓塞栓形成、動脈血栓塞栓形成、虚血性心疾患及び虚血性脳血管障害などが挙げられる。
【０１９６】
さらに、本発明は、前記オリゴ糖及び／又はオリゴ糖混合物及びその薬学的に許容可能な塩を含む薬物組成物の、血栓塞栓性疾患を治療及び／又は予防する薬物の製造における用途を提供し、ここで、前記血栓塞栓性疾患については特に制限がないが、例えば、静脈血栓塞栓形成、動脈血栓塞栓形成、虚血性心疾患及び虚血性脳血管障害などが挙げられる。
【０１９７】
本明細書で使われる縮語を、以下の表１に纏めて示す。
【０１９８】
【表１】
0006980018.tif 000017
【図面の簡単な説明】
【０１９９】
【図１】化合物Ａ１〜Ａ４のＨＰＧＰＣクロマトグラムである。
【図２】化合物Ａ１の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル及び信号帰属を示す図である。
【図３】化合物Ａ２の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル及び信号帰属を示す図である。
【図４】化合物Ａ３の１３Ｃ−１Ｈ  ＨＳＱＣスペクトル及び信号帰属を示す図である。
【図５】化合物Ａ１のＱ−ＴＯＦＭＳスペクトル及び信号帰属を示す図である。
【図６】化合物Ｂ１の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル及び信号帰属を示す図である。
【図７】化合物Ｂ２の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル及び信号帰属を示す図である。
【図８】化合物Ｂ３の１３Ｃ−１Ｈ  ＨＳＱＣスペクトル及び信号帰属を示す図である。
【図９】化合物Ｂ２のＱ−ＴＯＦＭＳスペクトル及び信号帰属を示す図である。
【図１０】化合物Ｂ６〜Ｂ８のＨＰＧＰＣクロマトグラムである。
【図１１】混合物Ｃ１の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル及び信号帰属を示す図である。
【図１２】混合物Ｄ１のＨＰＬＣグラフである。
【図１３】混合物Ｄ１の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル及び信号帰属を示す図である。
【図１４】マウス下大静脈の血栓塞栓形成に対するＡ２及びＤ１の影響を示す図である。
【図１５】マウス出血量に対するＡ２及びＤ１の影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０２００】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に制限されないことに留意されたい。
【０２０１】
実施例１
化合物Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４及びＡ５の製造：Ｌ−２，４−ジ硫酸フコシル基−（α１→３）−Ｌ−４−デオキシ−スレオ−ヘクス−４−エノピラノシルウロン酸基−（α１→３）−｛−Ｄ−Ｎ−アセチル−２−デオキシ−２−アミノ−４，６−ジ硫酸ガラクトシル基−（β１→４）−［Ｌ−２，４−ジ硫酸フコシル基−（α１→３）］−Ｄ−グルクロン酸基−（β１→３）｝（ｎ＋１）−Ｄ−Ｎ−アセチル−２−デオキシ−２−アミノ−４，６−ジ硫酸化ガラクチトール（ｎがそれぞれ０、１〜４の自然数であるヘキササッカリド、ノナサッカリド、ドデカサッカリド、ペンタデカサッカリド及びオクタデカサッカリドである。）
【０２０２】
１．１  材料
ＳｖＦＧは、Ｓｔｉｃｈｏｐｕｓ  Ｖａｒｉｅｇａｔｕｓに由来の天然ＦＧであり（ナトリウム塩）、文献の方法を用いて製造され（Ｚｈａｏ  ＬＹ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，２０１５，１１２：８２８４〜８２８９）、純度が９８％であり（ＨＰＧＰＣ、面積百分率法）、重均分子量Ｍｗが約７０ｋＤａであった。塩化ベンゼトニウム、塩化ベンジル、ＤＭＦ、水酸化ナトリウム、塩化ナトリウム及びエタノールなどは、何れも市販の分析用試薬であった。Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ１０，Ｍｅｄｉｕｍ（５０〜１００μｍ）は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製であり、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−６／Ｐ−２  ｇｅｌ，ｆｉｎｅ（４５−９０μｍ）は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製であり、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−１０ｇｅｌ，Ｍｅｄｉｕｍ（９０−１８０μｍ）は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製であり、ＨＰＬＣクロマトグラフは、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００／１２６０系のクロマトグラフであった。
【０２０３】
１．２  方法
１）ＳｖＦＧ第四級アンモニウム塩への変換：２．０ｇのＳｖＦＧを脱イオン水３０ｍＬで溶解し、塩化ベンゼトニウム５．０ｇを脱イオン水８０ｍＬで溶解した。撹拌しながら塩化ベンゼトニウム溶液をＳｖＦＧ溶液に滴下して白色の沈降物を得て、沈降物を脱イオン水５５ｍＬで３回洗浄し、減圧乾燥してＳｖＦＧの第四級アンモニウム塩５．３４ｇを得た。
【０２０４】
２）ＳｖＦＧのカルボキシ基エステル化：ステップ１）で得られるＳｖＦＧの第四級アンモニウム塩を丸底フラスコに入れ、ＤＭＦを２６ｍＬ加えて溶解した後、塩化ベンジル０．７６９ｍＬを加えて３５℃、２４時間撹拌しながら反応させた。反応液を静置して室温（２５℃）に冷却し、サンプルを取って産物の１Ｈ−ＮＭＲを測定したところ、ＦＧのカルボキシ基エステル化度が約４１％であった。
【０２０５】
３）還元剤存在下でのβ−脱離解重合：ステップ２）の反応液に、使用直前に調製した０．０８Ｍのナトリウムエトキシド−エタノール溶液（０．４ＭのＮａＢＨ４を含む）８．９ｍＬを加え、３０分間撹拌して反応させた。
【０２０６】
４）解重合物ナトリウム塩への変換及びカルボン酸エステルの加水分解：ステップ３）の反応液に、ＮａＣｌ飽和溶液３５ｍＬと無水エタノール２８４ｍＬを加え、４０００ｒｐｍ、１０分間遠心して沈降物を得た。沈降物を水９０ｍＬに溶かし、６ＭのＮａＯＨ溶液１．５ｍＬを加えて室温で撹拌しながら反応させた。３０分後、６ＭのＨＣｌを滴下して反応液をｐＨ〜７．０に中和した。反応液を０．４５μｍのろ過膜でろ過し、ろ過液をＧ１０ゲルカラムで脱塩してから凍結乾燥し、解重合物ｄＳｖＦＧを１．０５９ｇ得た（収率：５３％）。
【０２０７】
５）化合物Ａ１〜Ａ５の分離、精製：１ｇのｄＳｖＦＧを取って０．２ＭのＮａＣｌ溶液１０ｍＬで溶解し、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−１０ゲルカラム（カラム径２ｃｍ×カラム長さ２００ｃｍ）に注入して０．２ＭのＮａＣｌ溶液で溶出し、流速１０ｍＬ／時間、２．５ｍＬ／チューブの条件で溶出画分を回収した。システイン硫酸法によって溶出画分を検出して溶出グラフを作製し、同じ成分の溶出画分については１つに合わせた。ＨＰＧＰＣを利用して（ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ２０００ＳＷ  ＸＬ、カラム径７．８ｍｍ×カラム長さ３００ｍｍ）純度を測定し、精製が不十分であると思われる試料については、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−１０ゲルカラムを用いて更に精製を行った。精製オリゴ糖は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１０又はＢｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−２ゲルカラムで脱塩し、凍結乾燥した。
【０２０８】
６）スペクトル解析：１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ及び２Ｄ−ＮＭＲ測定は、Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ  ８００ＭＨｚの核磁気共鳴分光器を用いて行った。測定条件はスペクトル幅が１６０２５．６Ｈｚであり、採集時間が２．０４４７秒であり、パルス幅が９．５秒であり、緩和時間が１秒であり、繰り返して３２回走査を行った。測定する際、試料濃度が１０〜１５ｇ／Ｌであり、測定直前に重水で３回凍結乾燥を行った。ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦＭＳは、ｍｉｃｒＯＴＯＦ−ＱＩＩ  ＥＳＩ−ＭＳ（Ｂｒｕｋｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）質量分析器を用いて行った。マススペクトルの条件として、毛細管電圧が２５００Ｖであり、スプレー電圧が０．６ｂａｒであり、乾燥ガスの流速が４．０  Ｌ／分間であり、乾燥ガスの温度が＋１８０℃であり、ｍ／ｚ走査範囲が５０〜３０００であった。データは、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｃｏｍｐａｓｓ  Ｄａｔａ−Ａｎａｌｙｓｉｓ  ４．０（Ｂｒｕｋｅｒ−Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）ソフトを用いて解析した。
【０２０９】
１．３  結果評価
１）前記方法を利用して化合物Ａ１を３５ｍｇ、Ａ２を４５ｍｇ、Ａ３を５５ｍｇ、Ａ４を３５ｍｇ、Ａ５を２０ｍｇそれぞれ取得し、ＨＰＧＰＣで測定したところ、純度がいずれも約９９％であった。オリゴ糖Ａ１〜Ａ５のＨＰＧＰＣクロマトグラムを、図１に示す。
【０２１０】
２）化合物Ａ１〜Ａ５の構造解析：図２に、オリゴ糖Ａ１の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル及び信号帰属を示し、図３に、化合物Ａ２の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル及び信号帰属を示す。また、図４に、化合物Ａ３の１３Ｃ−１Ｈ  ＨＳＱＣスペクトル及び信号帰属を示し、図５に、化合物Ａ１のＱ−ＴＯＦＭＳスペクトル及び信号帰属を示す。化合物Ａ１〜Ａ２の１Ｈ／１３Ｃ−ＮＭＲ信号帰属は、それぞれ表１及び表２に纏めて示す。
【０２１１】
１Ｈ−／１３Ｃ−ＮＭＲ、２Ｄ−ＮＭＲ及びＱ−ＴＯＦＭＳ解析から、化合物Ａ１〜Ａ５の化学構造がＬ−Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓ−（α１，３）−ΔＵＡ−（α１，３）−｛Ｄ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６Ｓ−（β１，４）−［Ｌ−Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓ−（α１，３）］−Ｄ−ＧｌｃＡ−（β１，３）｝ｎ＋１−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６Ｓ−ｏｌであり、そのうちｎが１、２、３、４及び５であった。つまり、化合物Ａ１〜Ａ５がそれぞれヘキササッカリド、ノナサッカリド、ドデカサッカリド、ペンタデカサッカリド及びオクタデカサッカリドであると確認できた。化合物Ａ１〜Ａ５を一般式で表する場合、以下のとおりであった。
【０２１２】
【化１６】
0006980018.tif 000018
【０２１３】
式中、化合物Ａ１は、ｎが１であり、化合物Ａ２は、ｎが２であり、化合物Ａ３は、ｎが３であり、化合物Ａ４は、ｎが４であり、化合物Ａ５は、ｎが５である。
【０２１４】
【表２】
0006980018.tif 000019
注：表２においてｒＡは、還元性末端Ｄ−ＧａｌＮＡｃ−ｏｌを表し、ｄＵ及びｄＦは、それぞれΔＵＡ、及びΔＵＡに結合するＬ−Ｆｕｃを表す。
【０２１５】
【表３】
0006980018.tif 000020
注：表３においてｒＡ、ｒＵ及びＲＦは、それぞれ還元性末端のＧａｌＮＡｃ−ｏｌ、還元性末端に隣接するＤ−ＧｌｃＡ及びＬ−Ｆｕｃ糖基を表し、ｄＵ、ｄＡ及びｄＦは、それぞれΔＵＡ、ΔＵＡに結合するＤ−ＧａｌＮＡｃ、及びΔＵＡに結合するＬ−Ｆｕｃを表す。
【０２１６】
実施例２
化合物Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４及びＢ５の製造：Ｌ−３，４−ジ硫酸フコシル基−（α１，３）−Ｌ−４−デオキシ−スレオ−ヘクス−４−エノピラノシルウロン酸基−（α１，３）−｛Ｄ−Ｎ−アセチル−２−デオキシ−２−アミノ−４，６−ジ硫酸ガラクトシル基−（β１，４）−［Ｌ−３，４−ジ硫酸化フコシル基−（α１，３）−］Ｄ−グルクロン酸基−（β１，３）｝ｎ−Ｄ−Ｎ−アセチル−２−デオキシ−２−アミノ−４，６−ジ硫酸化ガラクトース−［Ｌ−３，４−ジ硫酸化フコシル基−（α１，３）−］−Ｄ−グルクロン酸オール（ｎがそれぞれ０、１、２、３及び４であるペンタサッカリド、オクタサッカリド、ウンデカサッカリド、テトラデカサッカリド及びヘプタデカサッカリドである。）
【０２１７】
２．１  材料
ＨｓＦＧは、Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｆｕｓｃｏｐｕｎｃｔａｔａ（リュウキュウフジナマコ）に由来の天然ＦＧであり（ナトリウム塩）、文献の方法（Ｚｈａｏ  ＬＹ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，２０１５，１１２：８２８４〜８２８９）に従って製造され、純度が９８％であり（ＨＰＧＰＣ法）、重均分子量Ｍｗが約５０ｋＤａであった。塩化ベンゼトニウム、塩化ベンジル、ＤＭＦ、水酸化ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウム、塩化ナトリウム及びエタノールなどは、何れも市販の分析用試薬であった。Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ１０／Ｇ２５，ｍｅｄｉｕｍ（５０〜１００μｍ）は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製であり、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−１２  ｇｅｌ，ｆｉｎｅ（４５〜９０μｍ）は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製であり、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−１０ｇｅｌ，ｍｅｄｉｕｍ（９０〜１８０μｍ）は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製であり、ＨＰＬＣクロマトグラフは、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００／１２６０系ＨＰＬＣクロマトグラフであった。
【０２１８】
２．２  方法
１）ＨｓＦＧの第四級アンモニウム塩への変換：ＨｓＦＧを３．５ｇ取って、実施例１の１．２の１）と同様にしてＨｓＦＧの第四級アンモニウム塩を１０．３ｇ得た。
【０２１９】
２）ＨｓＦＧのカルボキシ基エステル化：実施例１の１．２の２）と同様にしてＨｓＦＧ第四級アンモニウム塩をＨｓＦＧカルボン酸エステルに変換し、サンプルを取って１Ｈ−ＮＭＲを測定したところ、産物のカルボキシ基エステル化度が約４４％であった。
【０２２０】
３）ＨｓＦＧのβ−脱離解重合及び末端ピーリング：ステップ２）で得られた反応液に、使用直前に調製した０．０８Ｍのナトリウムエトキシドを含むエタノール溶液を１６．７ｍＬ加え、室温で撹拌しながら３０分間反応させた後、２ＭのＮａＯＨ溶液２．５ｍＬを加え、６０℃で撹拌しながら３０分間反応させた。
【０２２１】
４）解重合物ナトリウム塩への変換、カルボン酸エステル基の加水分解及び末端還元：ステップ３）の反応液に、順にＮａＣｌ飽和溶液６７ｍＬ、無水エタノール５３６ｍＬを加え、４０００ｒｐｍ、１０分間遠心した。沈降物を水１２０ｍＬで溶解し、６ＭのＮａＯＨ溶液１．０ｍＬを加え、室温で撹拌しながら３０分間反応させた。そして、ＮａＢＨ４を終濃度が約０．１Ｍになるように加え、室温下撹拌しながら３０分間反応させた後、６ＭのＨＣｌを滴下して反応液をｐＨ〜７．０に中和した。反応液を０．４５μｍのろ過膜でろ過し、ろ液を３０ｋＤａの限外ろ過カセットでろ過し、ろ液を濃縮してＧ２５ゲルカラムに注入して脱塩した後、凍結乾燥して解重合物ｄＨｓＦＧを１．５３ｇ得た（収率：４３．７％）。
【０２２２】
５）化合物Ｂ１〜Ｂ５の分離、精製：ステップ４）のｄＨｓＦＧ  １ｇを０．２ＭのＮａＣｌ溶液１０ｍＬで溶解した後、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−１０ゲルカラム（カラム径２ｃｍ×カラム長さ２００ｃｍ）に注入し、０．２ＭのＮａＣｌ溶液、流速１５ｍＬ／時間の条件で溶出し、溶出画分を２．５ｍＬ／チューブで回収した。溶出画分は、紫外分光光度計（λｍａｘが２３４ｎｍである）で検出し、ＨＰＧＰＣ（ＴＳＫ  Ｇ２０００  ＳＷカラム）を利用して溶出画分の純度と組成成分を測定した。精製が不十分と思われる画分は、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−１０ゲルカラムを利用してＨＰＧＰＣクロマトグラムに単一の溶出ピークが現れるまで精製した。精製済みの画分は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１０又はＢｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−２ゲルカラムで脱塩した後、凍結乾燥した。
【０２２３】
６）スペクトル解析：実施例１の１．２の６）と同様に、Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ  ８００ＭＨｚの核磁気共鳴分光器を用いて１Ｈ−／１３Ｃ−ＮＭＲ、２Ｄ−ＮＭＲ測定を行い、ｍｉｃｒｏＴＯＦ−ＱＩＩ  ＥＳＩ−ＭＳ（Ｂｒｕｋｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）質量分析器を用いてＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦＭＳ測定を行った。測定データは、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｃｏｍｐａｓｓ  Ｄａｔａ−Ａｎａｌｙｓｉｓ  ４．０（Ｂｒｕｋｅｒ−Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）ソフトを用いて解析した。
【０２２４】
２．３  結果評価
１）前記方法に従って化合物Ｂ１を５４ｍｇ、化合物Ｂ２を１７７ｍｇ、化合物Ｂ３を１５４ｍｇ、化合物Ｂ４を８６ｍｇ、化合物Ｂ５を５７ｍｇそれぞれ得て、ＨＰＧＰＣを用いて測定したところ、純度が何れも９９％を超えた。
【０２２５】
２）化合物Ｂ１〜Ｂ５の構造解析：図６に、オリゴ糖Ｂ１の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示し、図７に、化合物Ｂ２の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル及び信号帰属を示し、図８に、化合物Ｂ３の１３Ｃ−１Ｈ  ＨＳＱＣスペクトル及び信号帰属を示し、図９に、化合物Ｂ２のＱ−ＴＯＦＭＳスペクトル及び信号帰属を示す。化合物Ｂ１〜Ｂ２の１Ｈ／１３Ｃ−ＮＭＲ信号帰属は、それぞれ表３及び表４に纏めて示す。
【０２２６】
１Ｈ−／１３Ｃ−ＮＭＲ、２Ｄ−ＮＭＲ及びＱ−ＴＯＦＭＳ解析から、化合物Ｂ１〜Ｂ５の化学構造がＬ−Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ−（α１，３）−Ｌ−ΔＵＡ−（α１，３）−｛Ｄ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６Ｓ−（β１，４）−［Ｌ−Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ−（α１，３）］−Ｄ−ＧｌｃＡ−（β１，３）｝ｎ−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６Ｓ−（β１，４）−［Ｌ−Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ−（α１，３）］−Ｄ−ＧｌｃＡ−ｏｌであり、そのうちｎがそれぞれ０、１、２、３及び４であった。つまり、化合物Ｂ１〜Ｂ５がそれぞれペンタサッカリド、オクタサッカリド、ウンデカサッカリド、テトラデカサッカリド及びヘプタデカサッカリドであると確認できた。化合物Ｂ１〜Ｂ５を一般式で表する場合、以下のとおりであった。
【０２２７】
【化１７】
0006980018.tif 000021
【０２２８】
式中、化合物Ｂ１は、ｎが０であり、化合物Ｂ２は、ｎが１であり、化合物Ｂ３は、ｎが２であり、化合物Ｂ４は、ｎが３であり、化合物Ｂ５は、ｎが４である。
【０２２９】
【表４】
0006980018.tif 000022
注：表４においてｒＵ、ｄＵは、それぞれ還元性末端のＤ−ＧｌｃＡ−ｏｌ及び非還元性末端のΔＵＡを表し、ｒＦ、ｄＦは、それぞれ還元性末端Ｄ−ＧｌｃＡ−ｏｌ、ΔＵＡに結合するＬ−Ｆｕｃ糖基を表し、Ａは、Ｄ−ＧａｌＮＡｃを表す。
【０２３０】
【表５】
0006980018.tif 000023
注：表５において、ｒＡは、還元性末端に隣接するＧａｌＮＡｃを表し、ｒＵ、ｄＵは、それぞれ還元性末端のＤ−ＧｌｃＡ−ｏｌ、非還元性末端のΔＵＡを表し、ｒＦ、ｄＦは、それぞれ還元性末端Ｄ−ＧｌｃＡ−ｏｌ、ΔＵＡに結合するＬ−Ｆｕｃ糖基を表す。
【０２３１】
実施例３
化合物Ｂ６、Ｂ７、Ｂ８の製造：Ｌ−３，４−ジ硫酸フコシル基−（α１，３）−Ｌ−４−デオキシ−スレオ−ヘクス−４−エノピラノシルウロン酸基−（α１，３）−｛Ｄ−Ｎ−アセチル−２−デオキシ−２−アミノ−４，６−ジ硫酸ガラクトシル基−（β１，４）−［Ｌ−３，４−ジ硫酸化フコシル基−（α１，３）−］Ｄ−グルクロン酸基−（β１，３）｝ｎ−Ｄ−Ｎ−アセチル−２−デオキシ−２−アミノ−４，６−ジ硫酸化ガラクトース−（β１，４）−［Ｌ−３，４−ジ硫酸化フコシル基−（α１，３）−］−Ｄ−グルクロン酸（そのうち、ｎが０、１及び２である）
【０２３２】
３．１  材料
ＨｓＦＧは、実施例２の２．１と同じく、Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｆｕｓｃｏｐｕｎｃｔａｔａ（リュウキュウフジナマコ）に由来のＦＧナトリウム塩であった。塩化ベンゼトニウム、塩化ベンジル、ＤＭＦ、水酸化ナトリウム、塩化ナトリウム及びエタノールなどは、何れも市販の分析用試薬であった。
【０２３３】
３．２  方法
１）ＨｓＦＧ第四級アンモニウム塩への変換：実施例２の２．２の１）と同様にして、ＨｓＦＧ３．５ｇを用いてＨｓＦＧの第四級アンモニウム塩９．５５ｇを得た。
【０２３４】
２）ＨｓＦＧのカルボキシ基エステル化：実施例２の２．２の２）と同様にしてＨｓＦＧカルボキシ基エステルを得て、１Ｈ−ＮＭＲを測定したところ、カルボキシ基のエステル化度が約４４％であった。
【０２３５】
３）ＨｓＦＧのβ−脱離解重合：ステップ２）で得られた反応液に、新たに調製した０．０８Ｍのナトリウムエトキシドを含むエタノール溶液１６．０ｍＬを加え、室温で撹拌しながら３０分間反応させた。
【０２３６】
４）解重合物ナトリウム塩への変換、及びカルボン酸エステル基の加水分解：ステップ３）で得られた反応液に、飽和塩化ナトリウム溶液６７ｍＬと無水エタノール５３６ｍＬを加え、４０００ｒｐｍ、１０分間遠心した。沈降物を水１２５ｍＬで溶かし、６ＭのＮａＯＨ溶液を１．０５ｍＬ加え、室温で撹拌しながら３０分間反応させた後、６ＭのＨＣｌを滴下してｐＨ〜７．０に中和した。反応液を０．４５μｍのろ過膜でろ過し、ろ液を３０ｋＤａの限外ろ過カセットでろ過し、ろ液をＧ２５ゲルカラムで脱塩し、凍結乾燥して解重合物ｄＨｓＦＧ’を１．６２３ｇ得た（収率：４６．４％）。
【０２３７】
５）化合物Ｂ６〜Ｂ８の分離、精製：解重合物ｄＨｓＦＧ’１ｇを０．２ＭのＮａＣｌ溶液１０ｍＬに溶かした後、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−１０ゲルカラム（カラム径２ｃｍ×カラム長さ２００ｃｍ）に注入し、０．２ＭのＮａＣｌ溶液、流速１５ｍＬ／時間の条件下で溶出し、溶出画分を２．５ｍＬ／チューブで回収した。溶出画分を紫外分光光度計（λｍａｘ：２３４ｎｍ）で測定し、同じ組成の溶出画分を１つに合わせた。ＨＰＧＰＣ（ＴＳＫ  Ｇ２０００  ＳＷカラム）を利用して試料の純度と組成を測定し、精製が不十分であると思われる試料については、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−１０ゲルカラムを用いて更に精製した。精製済みのオリゴ糖は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１０又はＢｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−２ゲルカラムで脱塩し、凍結乾燥した。
【０２３８】
６）スペクトル解析：実施例１の１．２の６）と同様に、Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ  ８００ＭＨｚの核磁気共鳴分光器を用いて１Ｈ−／１３Ｃ−ＮＭＲ、２Ｄ−ＮＭＲ測定を行い、ｍｉｃｒｏＴＯＦ−ＱＩＩ  ＥＳＩ−ＭＳ（Ｂｒｕｋｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）質量分析器分析を用いてＱ−ＴＯＦＭＳ測定を行った。測定データは、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｃｏｍｐａｓｓ  Ｄａｔａ−Ａｎａｌｙｓｉｓ  ４．０（Ｂｒｕｋｅｒ−Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）ソフトを用いて解析した。
【０２３９】
３．３  結果評価
１）上記３．２のステップに従って処理することにより、化合物Ｂ６を４７ｍｇ、化合物Ｂ７を５５ｍｇ、化合物Ｂ８を３５ｍｇそれぞれ得て、ＨＰＧＰＣで測定し、面積百分率法で算出したところ、純度がいずれも９９％を超えた。
【０２４０】
２）化合物Ｂ６〜Ｂ８の構造解析：化合物Ｂ６〜Ｂ８のＨＰＧＰＣクロマトグラムを、図１０に示す。１Ｈ−／１３Ｃ−ＮＭＲ、２Ｄ−ＮＭＲ及びＱ−ＴＯＦＭＳ解析から、化合物Ｂ６、Ｂ７及びＢ８がＬ−Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ−（α１，３）−Ｌ−ΔＵＡ−（α１，３）−｛Ｄ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６Ｓ−（β１，４）−［Ｌ−Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ−（α１，３）］−Ｄ−ＧｌｃＡ−（β１，４）｝ｎ−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６Ｓ−（β１，４）−［Ｌ−Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ−（α１，３）］−Ｄ−ＧｌｃＡであり、そのうちｎが０、１及び２であった。すなわちペンタサッカリド、オクタサッカリド及びウンデカサッカリドであると確認できた。化合物Ｂ６、Ｂ７及びＢ８を一般式で表する場合、以下のとおりであった。
【０２４１】
【化１８】
0006980018.tif 000024
【０２４２】
式中、化合物Ｂ６は、ｎが０であり、化合物Ｂ７は、ｎが１であり、化合物Ｂ８は、ｎが２である。
【０２４３】
実施例４
化合物Ａ６、Ａ７及びＡ８の製造：Ｌ−Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓ−（α１，３）−［６−メチル−ΔＵＡ−（α１，３）］−｛Ｄ−Ｇａｌ−ＮＡｃ４Ｓ６Ｓ−（β１，４）−［Ｌ−Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓ−（α１，３）−］−Ｄ−６−メチル−ＧｌｃＡ−（β１，４）｝２−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６Ｓ−ｏｌ、Ｌ−Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓ−（α１，３）−Ｌ−ΔＵＡ−（α１，３）−｛Ｄ−ＧａｌＮＳ４Ｓ６Ｓ−（β１，４）−［Ｌ−Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓ−（α１，３）−］−Ｄ−ＧｌｃＡ−（β１，３）｝２−Ｄ−ＧａｌＮＳ４Ｓ６Ｓ−ｏｌ、及びＬ−Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓ−（α１，３）−［６−メチル−ΔＵＡ−（α１，３）］−｛Ｄ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６Ｓ−（β１，４）−［Ｌ−Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓ−（α１，３）−］−Ｄ−６−メチル−ＧｌｃＡ−（β１，３）｝２−Ｄ−１−メチル−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６Ｓ−ｏｌ
【０２４４】
４．１  材料
化合物Ａ２は、実施例１で製造したものであり、硫酸ヒドラジン、水加ヒドラジン、Ｅｔ３Ｎ．ＳＯ３（［Ｅｔ３Ｎ−ＳＯ３Ｈ］Ｃｌ、Ｎ，Ｎ−ジエチル−Ｎ−スルホエタンアンモニウムクロライド）などは、何れも市販の分析用試薬であった。
【０２４５】
４．２  方法と評価
１）化合物Ａ６の製造：化合物Ａ２を１０ｍｇ取って水０．５ｍＬで溶かし、Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｘ８水素型陽イオン交換カラムでＨ＋型に変換し、溶出液を水酸化テトラメチルアンモニウムで中和してから凍結乾燥することにより、化合物Ａ２のテトラブチルアンモニウム塩１９ｍｇを得た。化合物Ａ２のテトラブチルアンモニウム塩をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）１ｍＬで溶かし、２Ｍのトリメチルシリルジアゾメタン（ＴＭＳＤ）を１５μＬ加えて室温、６０分間反応させた後、酢酸１５μＬを加えて残りのＴＭＳＤを除去した。その後、４℃で無水エタノール４ｍＬを加えて４０００ｒｐｍ、３０分間遠心し、沈降物に水１ｍＬを加えて溶解させ、Ｄｏｗｅｘ／ｒ５０ｗ×８  ５０−１００（Ｎａ＋型）イオン交換カラムでナトリウム型に変換した。得られた産物をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１０カラムで脱塩して凍結乾燥することにより、化合物Ａ６を８．３５ｍｇ得た。そして、実施例１の１．２の６）と同様に１Ｈ−／１３Ｃ−ＮＭＲ、２Ｄ−ＮＭＲを測定した結果、化合物Ａ６（ΔＵＡのカルボメトキシ基の信号が３．７０ｐｐｍに現れる）がＬ−Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓ−（α１，３）−［６−メチル−ΔＵＡ−（α１，３）］−｛Ｄ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６Ｓ−（β１，４）−［Ｌ−Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓ−（α１，３）−］−Ｄ−６−メチル−ＧｌｃＡ−（β１，４）｝２−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６Ｓ−ｏｌであると確認でき、構造式は、以下のとおりであった。
【０２４６】
【化１９】
0006980018.tif 000025
【０２４７】
２）化合物Ａ７の製造：化合物Ａ２を１０ｍｇ取って硫酸ヒドラジン２．５ｍｇ及び水加ヒドラジン０．２５ｍＬを加え、窒素ガス雰囲気、１０５℃で撹拌しながら１５時間反応させた。反応液に１６％のＮａＣｌ溶液０．５ｍＬ及び無水エタノール３ｍＬを加え、４０００ｒｐｍ、２０分間遠心し、得られた沈降物を水１０ｍＬで溶かして５００〜１０００Ｄａの透析バッグで透析し、透析捕捉液を凍結乾燥して脱アセチル化物８ｍｇを得た。実施例１の１．２の６）と同様にしてＮＭＲスペクトルを測定した結果、脱アセチル化物（２．０ｐｐｍにあるＡｃメチルの信号が消え、ＧａｌＮＨ２の２位Ｈ信号が３．０ｐｐｍに現れる）の化学構造が以下のとおりであると確認できた。
【０２４８】
【化２０】
0006980018.tif 000026
【０２４９】
化合物Ａ２の脱アセチル化物を水１ｍＬに溶かし、Ｎａ２ＣＯ３を３６ｍｇ加えて５５℃まで加熱し、反応開始から０、５時間、１０時間経過の時点でＥｔ３Ｎ．ＳＯ３を１５ｍｇ加え、５５℃で撹拌しながら１５時間反応させた。そして、反応溶液に１６％のＮａＣｌ溶液１ｍＬと無水エタノール８ｍＬを加え、４０００ｒｐｍ、２０分間遠心し、得られた沈降物を水１０ｍＬで溶解した後、５００〜１０００Ｄａの透析バッグで透析し、透析捕捉液を凍結乾燥してＮ−硫酸化物Ａ７を６．８ｍｇ得た。
【０２５０】
実施例１の１．２の６）と同様にして１Ｈ−／１３Ｃ−ＮＭＲ、２Ｄ−ＮＭＲを測定し、化合物Ａ７がＬ−Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓ−（α１，３）−Ｌ−ΔＵＡ−（α１，３）−｛Ｄ−ＧａｌＮＳ４Ｓ６Ｓ−（β１，４）−［Ｌ−Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓ−（α１，３）−］−Ｄ−ＧｌｃＡ−（β１，３）｝２−Ｄ−Ｇａｌ−ＮＳ４Ｓ６Ｓ−ｏｌであり、以下の化学構造であることが確認できた。
【０２５１】
【化２１】
0006980018.tif 000027
【０２５２】
３）化合物Ａ８の製造：２０ｍｇの化合物Ａ２を取ってメタノール溶液５ｍＬを加え、Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｘ８水素型陽イオン交換樹脂を触媒とし、窒素ガス雰囲気下で一晩加熱還流した。樹脂をろ過にて除去し、ろ液を減圧蒸留することで溶媒を除去し、化合物Ａ２のＣ１位におけるヒドロキシ基がアルキル化された産物を得た。産物をＤｏｗｅｘ  ５０Ｘ８陽イオン交換カラムでＨ＋型に変換し、溶出液を水酸化テトラメチルアンモニウムで中和して凍結乾燥することにより、化合物Ａ２のＣ１位ヒドロキシ基アルキル化物のテトラブチルアンモニウム塩を３７ｍｇ得た。そして、産物を２ｍＬのＤＭＳＯで溶解し、さらに２ＭのＴＭＳＤを３０μＬ加え、室温で６０分間反応させた後、酢酸３０μＬを加えて残りのＴＭＳＤを除去し、４℃で１６％のＮａＣｌ溶液２ｍＬと無水エタノール８ｍＬを加え、４０００ｒｐｍ、３０分間遠心した。沈降物を水２ｍＬで溶解し、Ｄｏｗｅｘ／ｒ５０ｗ×８  ５０−１００（Ｎａ＋型）交換カラムでナトリウム型に変換し、さらにＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１０カラムで脱塩し、凍結乾燥して化合物Ａ８を１３．５ｍｇ得た。
【０２５３】
実施例１の１．２の６）と同様にして１Ｈ−／１３Ｃ−ＮＭＲ、２Ｄ−ＮＭＲを測定し、化合物Ａ８（ΔＵＡのカルボメトキシ基のメチル信号が３．７０ｐｐｍに現れ、還元性末端のメチル信号が３．２３ｐｐｍに現れる）がＬ−Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓ−（α１，３）−［６−メチル−ΔＵＡ−（α１，３）］−｛Ｄ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６Ｓ−（β１，４）−［Ｌ−Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓ−（α１，３）−］−Ｄ−６−メチル−ＧｌｃＡ−（β１，３）｝２−Ｄ−１−メチル−Ｇａｌ−ＮＡｃ４Ｓ６Ｓ−ｏｌであり、化学構造が下記のおとりであると確認できた。
【０２５４】
【化２２】
0006980018.tif 000028
【０２５５】
また、Ｃ２〜Ｃ６の直鎖状又は分岐状のアルカン又はアルケンに相応するアルコールを用い、本実施例と同様にしてヒドロキシ基アルキル化物Ａ８’を製造することもできる。
【０２５６】
実施例５
化合物Ｂ９、Ｂ１０及びＢ１１の製造：Ｌ−Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓ−（α１，３）−Ｌ−ΔＵＡ−（α１，３）−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６Ｓ−（β１，４）−［Ｌ−Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓ−（α１，３）］−Ｄ−ＧｌｃＡ−（β１，３）−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６Ｓ−（β１，４）−［Ｌ−Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓ−（α１，３）］−Ｄ−β１−ベンジル−ＧｌｃＡ、Ｌ−Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓ−（α１，３）−Ｌ−６−メチル−ΔＵＡ−（α１，３）−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６Ｓ−（β１，４）−［Ｌ−Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓ−（α１，３）］−Ｄ−６−メチル−ΔＵＡ−ＧｌｃＡ−（β１，３）−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６Ｓ−（β１，４）−［Ｌ−Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓ−（α１，３）］−Ｄ−β１−ベンジル−６−メチル−ＧｌｃＡ、及びＬ−Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓ−（α１，３）−Ｌ−ΔＵＡ−（α１，３）−｛Ｄ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６Ｓ−（β１，４）−［Ｌ−Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓ−（α１，３）］−Ｄ−ＧｌｃＡ−（β１，３）｝２−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６Ｓ−（β１，４）−［Ｌ−Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓ−（α１，３）］−Ｄ−１−デオキシ−１−アミノ−ＧｌｃＡ−ｏｌ−Ｎ−４−安息香酸エチルエステル
【０２５７】
５．１  材料
ＳｖＦＧを原料とし、実施例２と同様にしてウンデカサッカリド（Ｂ３’）を製造し、実施例３と同様にしてオクタサッカリド（Ｂ７’）を製造した。４−アミノ安息香酸エチルエステル、水酸化テトラメチルアンモニウム、ジクロロメタン、ピリジン、無水酢酸、ベンジルアルコール、三フッ化ホウ素エーテラートなどは、何れも市販の分析用試薬であった。
【０２５８】
５．２  方法と評価
１）化合物Ｂ９の製造：４０ｍｇの化合物Ｂ７’を取って水４ｍＬで溶解し、Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｘ８水素型陽イオン交換カラムでＨ＋型に変換し、溶出液を水酸化テトラメチルアンモニウムで中和し、凍結乾燥して化合物Ｂ７’のテトラブチルアンモニウム塩を８０ｍｇ得た。化合物Ｂ７’のテトラブチルアンモニウム塩に、ピリジン８ｍＬ及び無水酢酸８ｍＬを加え、１００℃て撹拌しながら３０分間反応させた。室温で窒素ガスを噴き込むことで液体成分を飛ばし、残留物をジクロロメタン４ｍＬで溶かした後、ベンジルアルコールを１２８μＬ加え、０℃で三フッ化ホウ素エーテラート（ＢＦ３ＯＥｔ２）を２０μＬ滴下してから３６時間かけて加熱還流を行い、水を加えて反応を停止させた。反応液を十分振り回してから静置し、ＣＨ２Ｃｌ２相を回収し、ＣＨ２Ｃｌ２を減圧蒸留によって除去した。室温で残留物に０．０２Ｍのメタノールナトリウムを含むメタノール溶液を４ｍＬ加え、撹拌しながら１０分間反応させることによりアセチル基を離脱させ、メタノールを減圧蒸留によって除去した。Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｘ８水素型陽イオン交換カラムでＨ＋型に変換し、溶出液を水酸化ナトリウムで中和してからＢｉｏ−ｇｅｌ  Ｐ６で分離、精製し、糖類を含む試料を回収して濃縮し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１０カラムで脱塩し、凍結乾燥して化合物Ｂ９を２４ｍｇ得た。
【０２５９】
実施例１の１．２の６）と同様にして１Ｈ−／１３Ｃ−ＮＭＲ、２Ｄ−ＮＭＲを測定した結果、化合物Ｂ９（ベンジル−ＣＨ２信号が４．６ｐｐｍに現れ、ベンゼン環信号が７．３ｐｐｍに現れる）がＬ−Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓ−（α１，３）−Ｌ−ΔＵＡ−（α１，３）−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６Ｓ−（β１，４）−［Ｌ−Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓ−（α１，３）］−Ｄ−ＧｌｃＡ−（β１，３）−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６Ｓ−（β１，４）−［Ｌ−Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓ−（α１，３）］−Ｄ−１−ベンジル−ＧｌｃＡ−ｏｌであり、化学構造が以下のとおりであると確認できた。
【０２６０】
【化２３】
0006980018.tif 000029
【０２６１】
２）化合物Ｂ１０の製造：１０ｍｇの化合物Ｂ９を取ってに水０．５ｍＬで溶かし、Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｘ８水素型陽イオン交換カラムでＨ＋型に変換し、溶出液を水酸化テトラメチルアンモニウムで中和し、凍結乾燥して化合物Ｂ９のテトラブチルアンモニウム塩を１９ｍｇ得た。そして、化合物Ｂ９のテトラブチルアンモニウム塩をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）１ｍＬに溶かし、２Ｍのトリメチルシリルジアゾメタン（ＴＭＳＤ）１５μＬを加えて室温で６０分反応間させた後、酢酸１５μＬを加えて残りのＴＭＳＤを除去し、４℃で無水エタノール４ｍＬを加えて４０００ｒｐｍ、３０分間遠心した。沈降物を水１ｍＬで溶かし、Ｄｏｗｅｘ／ｒ５０ｗ×８  ５０−１００（Ｎａ＋型）交換樹脂でナトリウム型に変換した。産物をＢｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−６で精製し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１０カラムで脱塩し、凍結乾燥して化合物Ｂ１０を８．３５ｍｇ得た。
【０２６２】
実施例１の１．２の６）と同様にして１Ｈ−／１３Ｃ−ＮＭＲ、２Ｄ−ＮＭＲを測定した結果、化合物Ｂ１０（カルボキシ基エステルのメチル信号が約３．７ｐｐｍに現れ、ベンジル−ＣＨ２信号が４．６ｐｐｍに現れ、ベンゼン環の信号が７．３ｐｐｍに現れる）がＬ−Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓ−（α１，３）−Ｌ−６−メチル−ΔＵＡ−（α１，３）−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６Ｓ−（β１，４）−［Ｌ−Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓ−（α１，３）］−Ｄ−６−メチル−ΔＵＡ−ＧｌｃＡ−（β１，３）−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６Ｓ−（β１，４）−［Ｌ−Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓ−（α１，３）］−Ｄ−β−１−ベンジル−６−メチル−ＧｌｃＡであると確認でき、化学構造が以下のとおりであった。
【０２６３】
【化２４】
0006980018.tif 000030
【０２６４】
３）化合物Ｂ１１の製造：４−アミノ安息香酸エチルエステル３３０ｍｇを氷酢酸とメタノールの混合溶液（１：９）８０μＬで溶解し、さらにシアノ水素化ホウ素ナトリウム７０ｍｇを加えた。一方、２０ｍｇの化合物Ｂ３’を水２ｍＬで溶解した後、前記溶液と混ぜ合わせて６０℃の定温水浴で４時間反応させた。クロロホルム２ｍＬを加えて十分混合してから抽出し、水相をＢｉｏ−ｇｅｌ  Ｐ１０カラムで精製し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１０カラムで脱塩し、凍結乾燥して化合物Ｂ１１を約１４ｍｇ得た。
【０２６５】
実施例１の１．２の６）と同様にして１Ｈ−／１３Ｃ−ＮＭＲ、２Ｄ−ＮＭＲを測定した結果、化合物Ｂ１１（エチルエステル基の−ＣＨ３及び−ＣＨ２信号がそれぞれ１．３ｐｐｍ及び４．３ｐｐｍに現れ、ベンゼン環の信号は２つに分けられ、それぞれ６．７８ｐｐｍ及び７．６８ｐｐｍに現れる）がＬ−Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓ−（α１，３）−Ｌ−ΔＵＡ−（α１，３）−｛Ｄ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６Ｓ−（β１，４）−［Ｌ−Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓ−（α１，３）］−Ｄ−ＧｌｃＡ−（β１，３）｝２−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６Ｓ−（β１，４）−［Ｌ−Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓ−（α１，３）］−Ｄ−１−デオキシ−１−アミノ−ＧｌｃＡ−ｏｌ−Ｎ−４−安息香酸エチルエステルであると確認でき、化学構造が以下のとおりであった。
【０２６６】
【化２５】
0006980018.tif 000031
【０２６７】
また、ベンジルアルコールの代わりにＣ８〜Ｃ１２の芳香族アルコール（例えば、４−メチルベンジルアルコール、４−アミルベンジルアルコール）を用い、本実施例のＢ９と同様にしてＣ８〜Ｃ１２のアリール誘導体Ｂ９’を得た。また、４−アミノ安息香酸エチルエステルの代わりに４−アミノ−（Ｃ８〜Ｃ１２）安息香酸エステル（例えば、４−アミノ−安息香酸プロピルエステル、４−アミノ−安息香酸ペンチルエステル）を用い、本実施例のＢ１１と同様にしてＣ８〜Ｃ１２のアリール誘導体Ｂ１１’を得た。
【０２６８】
実施例６：オリゴ糖混合物Ｃ１の製造
６．１  材料
ＳｖＦＧは、実施例１と同様のものであった。塩化ベンゼトニウム、塩化ベンジル、ＤＭＦ、水酸化ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウム、塩化ナトリウム及びエタノールなどは、何れも市販の分析用試薬であった。Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０（ｍｅｄｉｕｍ，５０−１００μｍ）は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製であった。
【０２６９】
６．２  方法
１）ＳｖＦＧ第四級アンモニウム塩への変換：７０ｇのＳｖＦＧを水１Ｌで溶解し、また、塩化ベンゼトニウム１７５ｇを水２．８Ｌで溶解した。塩化ベンゼトニウム溶液に、撹拌しながらＳｖＦＧ溶液を滴下し、滴下が終わると遠心し、沈降物を脱イオン水で３回洗浄し、減圧乾燥してＳｖＦＧの第四級アンモニウム塩を２１０ｇ得た。
【０２７０】
２）ＳｖＦＧのカルボキシ基エステル化：ステップ１）で得られたＳｖＦＧの第四級アンモニウム塩を１．０２０ＬのＤＭＦで溶解し、さらに塩化ベンジル２９ｍＬを加えて３５℃で撹拌しながら２４時間反応させた後、静置して反応液を室温（２５℃）まで冷却した。サンプルを取って１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定し、ＦＧのカルボキシ基エステル化度が約４６％であると確認できた。
【０２７１】
３）還元剤存在下でのＳｖＦＧのβ−脱離解重合：ステップ２）の反応液に、使用直前に調製した０．４ＭのＮａＢＨ４、０．０８Ｍのナトリウムエトキシドを含むエタノール溶液３３３ｍＬを加え、室温で撹拌しながら３０分間反応させた。
【０２７２】
４）後処理：ステップ３）の反応溶液に、塩化ナトリウム飽和溶液１．３３３Ｌ及び無水エタノール１０．７Ｌを加え、４０００ｒｐｍ、１０分間遠心した。沈降物を水５Ｌで溶かし、さらに６ＭのＮａＯＨ溶液４０ｍＬを加えて室温で３０分間反応させた後、６ＭのＨＣｌを滴下して反応液をｐＨ〜７．０に中和した。産物を、順に０．１ｍ２の１０ｋＤａ、３ｋＤａの限外ろ過カセット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）でろ過し、高分子の不純物と低分子の不純物を除去し、オリゴ糖混合物Ｃ１を３５ｇ得た。
【０２７３】
５）スペクトル解析：実施例１の１．２の６）と同様にして１Ｈ−／１３Ｃ−ＮＭＲ、２Ｄ−ＮＭＲスペクトルを測定した。
【０２７４】
６．３  結果評価
１）前記方法に従ってオリゴ糖混合物Ｃ１を３５ｇ得て、収率が５０％であった。
【０２７５】
２）ＨＰＧＰＣ解析の結果から、オリゴ糖混合物Ｃ１に、ヘキササッカリド、ノナサッカリド、ドデカサッカリド、ペンタデカサッカリド、オクタデカサッカリド及びエイコササッカリドを含み、含有量がそれぞれ１４．２％、２３．１％、２４．１％、１６．０％、８．９％、５．１％であると確認できた。
【０２７６】
３）オリゴ糖混合物Ｃ１の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル及び信号帰属を、図１１に示す。オリゴ糖混合物Ｃ１の１Ｈ−ＮＭＲにおいて、５．４〜５．７ｐｐｍの範囲で３つの高い強度の信号ピークが現れ、そのうち５．７７ｐｐｍの信号ピークは、オリゴ糖混合物Ｃ１の非還元性末端ΔＵＡにおける４位水素信号であった。また、５．６ｐｐｍ及び５．４３ｐｐｍに現れる信号は、それぞれ還元性末端に隣接する糖鎖内のＬ−Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓ末端の水素信号、及び非還元性末端ΔＵＡに結合するＬ−Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓ末端の水素信号であった。
【０２７７】
還元性末端の信号を解析し、特に−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６Ｓ−ｏｌ及び−Ｄ−ＧｌｃＡ−ｏｌのＣ１位（−ＣＨ２）炭素信号を解析した結果、還元性末端の構造が−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６Ｓ−ｏｌであるオリゴ糖の含有量が９５％を超えることを確認できた。
【０２７８】
１３Ｃ−ＮＭＲ及び２Ｄ−ＮＭＲの解析から、混合物Ｃ１は、オリゴ糖同族体としてＬ−Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓ−（α１，３）−Ｌ−ΔＵＡ−（α１，３）−｛Ｄ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６Ｓ−（β１，４）−［Ｌ−Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓ−（α１，３）］−Ｄ−ＧｌｃＡ−（β１，３）｝ｎ−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６Ｓ−ｏｌ（ｎは、自然数である）で構成され、そのうちｎが１〜７である化合物は、全体において約９５％を占めることが確認できた。
【０２７９】
実施例７：オリゴ糖混合物Ｄ１及びＤ２の製造
７．１  材料
ＨｓＦＧは、実施例２と同様のものであった。塩化ベンゼトニウム、塩化ベンジル、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＴＭＳＤ、水酸化ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウム、塩化ナトリウム及びエタノールなどは、何れも市販の分析用試薬であった。分画分子量がそれぞれ３０ｋＤａ、１０ｋＤａ、３ｋＤａである限外ろ過カセット（０．５ｍ２）は、Ｍｅｒｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製であった。
【０２８０】
７．２  方法
１）ＨｓＦＧ第四級アンモニウム塩への変換：ＨｓＦＧを３３０ｇ取って水４．９Ｌで溶解した。一方、塩化ベンゼトニウム８２５ｇを水１３．２Ｌで溶解し、撹拌しながら前記ＨｓＦＧ溶液に加え、４０００ｒｐｍ、１０分間遠心した。沈降物を脱イオン水９Ｌで３回洗浄し、減圧乾燥してＨｓＦＧの第四級アンモニウム塩を８０４ｇ得た。
【０２８１】
２）ＨｓＦＧのカルボキシ基エステル化：ステップ１）で得られたＨｓＦＧの第四級アンモニウム塩を３０Ｌの反応釜に投入し、ＤＭＦを３．９Ｌ加えて溶解させた。３５℃で塩化ベンジル９７ｍＬを加えて撹拌しながら２４時間反応させた後、反応液を静置して室温（２５℃）まで冷却させた。サンプルを取って１Ｈ−ＮＭＲを測定し、産物のカルボキシ基エステル化度が約４６％であると確認できた。
【０２８２】
３）ＨｓＦＧのβ−脱離解重合及び末端ピーリング：ステップ２）の反応液に、新たに調製した０．０８Ｍのナトリウムエトキシドを含むエタノール溶液１．３Ｌを加え、室温で撹拌しながら３０分間反応させた後、反応液に２ＭのＮａＯＨ溶液２．５ｍＬを加え、６０℃で撹拌しながら９０分間反応させた。
【０２８３】
４）後処理：ステップ３）の反応溶液に、塩化ナトリウムの飽和溶液５．３６Ｌ及び無水エタノール５７Ｌを加え、４０００ｒｐｍ、１０分間遠心した。沈降物を水１４．５Ｌで溶解し、６ＭのＮａＯＨ溶液１２２ｍＬを加えて室温で撹拌しながら３０分間反応させた。そして、ＮａＢＨ４を５４．３ｇ加えて室温で撹拌しながら引き続き３０分間反応させた。６ＭのＨＣｌを滴下して反応液をｐＨ〜７．０に中和した後、０．４５μｍのろ過膜でろ過し、ろ過液を順に０．５ｍ２の３０ｋＤａ（透過液を回収する）、１０ｋＤａ（透過液を回収する）及び３ｋＤａ（捕捉液を回収する）の限外ろ過カセットでろ過し、凍結乾燥してオリゴ糖混合物Ｄ１を９８．７ｇ得た。測定した結果、３０ｋＤａの限外ろ過膜でろ過して得られた捕捉液に未解重合の高分子画分を含み、該高分子画分は、フカンや、ヘキソサミンを含むヘテロ多糖類で構成されることが確認できた。
【０２８４】
５）オリゴ糖混合物Ｄ１のカルボキシ基甲エステル化：オリゴ糖混合物Ｄ１を２０ｇ取って水３００ｍＬに溶かし、撹拌しながら６．２５％の塩化ベンゼトニウム溶液８００ｍＬを加え、しばらく静置してから４０００ｒｐｍ、１０分間遠心した。沈降物を脱イオン水３００ｍＬで３回洗浄し、減圧乾燥してオリゴ糖混合物Ｄ１の第四級アンモニウム塩５８ｇを得た。得られたオリゴ糖混合物Ｄ１の第四級アンモニウム塩をＤＭＳＯ５．８Ｌに溶かし、２ＭのＴＭＳＤを８７ｍＬ加えて室温で撹拌しながら６０分間反応させた後、酢酸８７ｍＬを加えて残りのＴＭＳＤを除去した。そして、撹拌しながら順に塩化ナトリウムの飽和溶液５．９Ｌ、９５％のエタノール６３Ｌを加え、４０００ｒｐｍ、３０分間遠心した。沈降物を脱イオン水２Ｌで溶かし、３ｋＤａの限外ろ過カセットでろ過することで脱塩し、捕捉液を凍結乾燥してオリゴ糖混合物Ｄ２を１６．３ｇ得た。
【０２８５】
６）スペクトル解析：実施例１の１．２の６）と同様にして１Ｈ−／１３Ｃ−ＮＭＲ、２Ｄ−ＮＭＲを測定した。
【０２８６】
７．３  結果評価
１）オリゴ糖混合物Ｄ１の収率と化学組成
前記方法に従ってオリゴ糖混合物Ｄ１を９８．７ｇ得て、収率が約３０％であった。ＨＰＧＰＣの解析結果から（図１２）、オリゴ糖混合物Ｄ１にペンタサッカリド、オクタサッカリド、ウンデカサッカリド、テトラデカサッカリド、ヘプタデカサッカリド及びエイコササッカリドを含み、これら多糖体の含有量がそれぞれ４．３％、１７．１％、１８．０％、１６．３％、１４．１％及び１１．１％であり、ペンタサッカリド〜ノナコササッカリドが合計で約９６．０％であると確認できた。
【０２８７】
図１３に、オリゴ糖混合物Ｄ１の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルに示す。オリゴ糖混合物Ｄ１の１Ｈ−ＮＭＲにおいて、５．６８５ｐｐｍに現れる信号は、強度が高く、ΔＵＡの４位水素信号であった。５．０〜５．６ｐｐｍに３つの高強度信号ピーク（それぞれ５．２８３，５．２０１及び５．０３０ｐｐｍである）が現れ、それぞれＤ−ＧｌｃＡ、ΔＵＡ、Ｄ−ＧｌｃＡ−ｏｌに結合するＬ−Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓのα−末端水素信号であった。還元性末端糖基の末端炭素、水素信号を解析した結果、オリゴ糖混合物Ｄ１において、還元性末端糖基が−Ｄ−ＧｌｃＡ−ｏｌであるオリゴ糖の含有量が９５％であることが確認できた。
【０２８８】
１３Ｃ−ＮＭＲ及び２Ｄ−ＮＭＲの解析から、オリゴ糖混合物Ｄ１は、オリゴ糖同族体としてＬ−Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ−（α１，３）−Ｌ−ΔＵ−（α１，３）−｛Ｄ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６Ｓ−（β１，４）−［Ｌ−Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ−（α１，３）］−Ｄ−ＧｌｃＡ−（β１，３）｝ｎ−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６Ｓ−（β１，４）−［Ｌ−Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ−（α１，３）］−Ｄ−ＧｌｃＡ−ｏｌ（ｎは、自然数である）の混合物であることが確認できた。
【０２８９】
２）オリゴ糖混合物Ｄ２収率と化学組成
前記方法に従ってオリゴ糖混合物Ｄ２を１６．３ｇ得て、収率が約８０％であった。ＨＰＧＰＣ解析結果から、オリゴ糖混合物Ｄ２にペンタサッカリド、オクタサッカリド、ウンデカサッカリド、テトラデカサッカリド、ヘプタデカサッカリド、エイコササッカリドを含み、これら多糖体の含有量がそれぞれ３．３４％、１６．７１％、１７．０３％、１７．２５％、１３．７８％及び１２．２５％であると確認できた。
【０２９０】
また、オリゴ糖混合物Ｄ１の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルに比べ、オリゴ糖混合物Ｄ２の１Ｈ−ＮＭＲに、新たにヘキスロン酸（オール）に結合するメチル（エステル）基の信号がそれぞれ３．７ｐｐｍ、３．２ｐｐｍに現れた。１Ｈ−／１３Ｃ−ＮＭＲ、２Ｄ−ＮＭＲの解析結果から、オリゴ糖混合物Ｄ２がオリゴ糖同族体としてＬ−Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ−（α１，３）−Ｌ−６−メチル−ΔＵＡ−（α１，３）−｛Ｄ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６Ｓ−（β１，４）−［Ｌ−Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ−（α１，３）］−Ｄ−６−メチル−ＧｌｃＡ−（β１，４）｝ｎ−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６Ｓ−（α１，３）−［Ｌ−Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ−（α１，３）］−Ｄ−６−メチル−ＧｌｃＡ−ｏｌ（ｎは、自然数である）の混合物であり、そのうちｎ＝１〜９である化合物は、合計で約９６％を占めることが確認できた。
【０２９１】
実施例８：抗凝固活性及び凝固因子阻害活性
８．１  材料
オリゴ糖Ａ１〜Ａ８、オリゴ糖Ｂ１〜Ｂ１１、オリゴ糖混合物Ｃ１、Ｄ１、Ｄ２は、実施例１〜７で製造したものであった。対照物として、エノキサパリンナトリウム注射液（ＬＭＷＨは、Ｍｗが３５００〜５５００Ｄａであり、サノフィ・アベンティス社製である）を用いた。人コントロール血漿（０４７Ｂ−Ｄ０２４Ａ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）測定キット、プロトロンビン時間（ＰＴ）測定キットは、いずれもドイツＴＥＣＯ  ＧｍｂＨ社製であり、第ＶＩＩＩ因子測定キット、ヘパリンコファクターＩＩ（ＨＣＩＩ）、ＡＴ依存的な第ＩＩａ因子阻害活性測定キット、ＡＴ依存的な第Ｘａ因子阻害活性測定キット、トロンビン（すなわち第ＩＩａ因子）、トロンビン基質ＣＳ０１（３８）、ＫＫ基質ＣＳ３１（０２）は、いずれもフランスＨＹＰＨＥＮ  ＢｉｏＭｅｄ社製であり、第ＶＩＩＩ因子は、ドイツＢａｙｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＬＬＣ社製であり、ＡＤＰは、米国Ｃｈｒｏｎｏｌｏｇ社製であり、クエン酸ナトリウム、抱水クロラール、生理食塩水は、いずれも市販のものであった。
【０２９２】
ＸＳ１０５電子天秤、ＦＥ２０ｐＨ計は、ＭＥＴＴＬＥＲ  ＴＯＬＥＤＯ社製であり、ＨＨ−４定温水浴は、?義市予華社製であり、ＶＯＲ７６Ｘ−６ボルテックスは、海南其林貝爾社製であり、Ｓｐｅｃｔｒａｆｕｇｅ−２４  Ｄ９０７３８６遠心机は、Ｌａｂｎｅｔ社製であり、ＭＣ−４０００凝固計は、ドイツＴＩＣＯ  ＧｍｂＨ社製であり、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅｄｅｒ  ＥＬｘ  ８０８マイクロプレートリーダーは、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ社製であり、Ｃｈｒｏｎｏｌｏｇ−７００型血小板凝集計は、米国Ｃｈｒｏｎｏ−ｌｏｇ社製であった。
【０２９３】
８．２  方法
１）試料溶液の調製：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を用いてオリゴ糖Ａ１〜Ａ８、オリゴ糖Ｂ１〜Ｂ１１、及びオリゴ糖混合物Ｃ１、Ｄ１、Ｄ２を溶解し、一連の濃度に希釈した。
【０２９４】
２）抗凝固活性の測定：人コントロール血漿９０μＬに、試料又は対照物溶液１０μＬを加えて十分混ぜ合わせ、ＡＰＴＴ測定キット及びＰＴ測定キットのマニュアルに従い、ＭＣ−４０００凝固計を用いて凝固時間（すなわち、ＡＰＴＴ及びＰＴ時間）を測定した。
【０２９５】
３）凝固因子阻害活性の測定：テンナーゼ阻害活性は、第ＶＩＩＩ因子と第ＶＩＩＩ因子測定キットを併用し、測定キットのマニュアル及び文献方法を参考しつつ測定した。具体的には、９６ウェルプレートに、測定試料溶液、対照物溶液又はＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（陰性対照物）を各ウェルごとに３０μＬ加え、そして順に第ＶＩＩＩ因子（２ＩＵ／ｍＬ）３０μＬ、Ｒ２（６０ｎＭの第ＩＸａ因子、かつＦＩＩａ、ＰＣ／ＰＳ、Ｃａ２＋を含む）３０μＬを加えて十分振り混ぜ、３７℃、２分間保持した後、Ｒ１（５０ｎＭの第Ｘ因子、かつトロンビン阻害剤を含む）３０μＬを加えて十分振り混ぜ、３７℃、１分間保持した。そして、Ｒ３（濃度が約８．４ｍＭである第Ｘａ因子発色基質ＳＸａ−１１）３０μＬを加え、マイクロプレートリーダーを用いて波長４０５ｎｍで吸光度（ＯＤ４０５）を測定し、３０秒間の間隔で連続して７．５分間かけて測定を行った。ＯＤ４０５値の変化に基づき、テンナーゼ活性、テンナーゼに対する測定試料の阻害活性ＩＣ５０値を算出した。
【０２９６】
ＡＴ依存的な第Ｘａ因子阻害活性は、ヘパリンＡｎｔｉ−ＦＸａキットを用いて測定した。具体的には、９６ウェルプレートに、測定試料溶液、対照物溶液又はＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（陰性対照物）を３０μＬ加えた後、１ＩＵ／ｍＬのＡＴ溶液３０μＬを加えて十分混合し、３７℃、１分間保持してから更に８μｇ／ｍＬの第Ｘａ因子溶液３０μＬを加えて十分混合し、３７℃、１分間保持した。最後に、予め加熱した１．２５ｍＭのＸａ発色基質ＳＸａ−１１を３０μＬ加え、マイクロプレートリーダーを利用してＯＤ４０５を測定した。
【０２９７】
ＡＴ依存的なＩＩａ阻害活性は、ヘパリンＡｎｔｉ−ＦＩＩａキットを用いて測定した。具体的には、９６ウェルプレートに、測定試料溶液、対照物溶液又はＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（陰性対照物）３０μＬを加えた後、１ＩＵ／ｍＬのＡＴ溶液３０μＬを加えて十分振り混ぜ、３７℃、２分間保持してから更に２４ＩＵ／ｍＬの第ＩＩａ因子溶液３０μＬを加えて十分振り混ぜ、３７℃、２分間保持した。そして、予め加熱した１．２５ｍＭの第ＩＩａ因子特異的発色基質ＣＳ−０１（３８）を３０μＬ加えて十分振り混ぜ、マイクロプレートリーダーを用いてＯＤ４０５を測定し、第ＩＩａ因子に対する各試料のＩＣ５０値を算出した。
【０２９８】
ＨＣ−ＩＩ依存的なＩＩａ阻害活性は、下記のとおり行った。すなわち、測定試料溶液、対照物溶液又はＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（陰性対照物）３０μＬを加えた後、１μＭのＨＣＩＩ溶液３０μＬを加え、３７℃、２分間保持してから更に２０ＮＩＨ／ｍＬの第ＩＩａ因子３０μＬを加え、３７℃、１分間保持した。最後に、予め加熱した４．５ｍＭの第ＩＩａ因子発色基質ＣＳ−０１（３８）３０μＬを加え、マイクロプレートリーダーを用いてＯＤ４０５を測定し、第ＩＩａ因子に対する各試料のＩＣ５０値を算出した。
【０２９９】
データ処理として、平行ウェルで測定したＯＤ４０５平均値を、各濃度における測定試料及び対照物の測定値とし、該測定値を縦軸に、測定時間を横軸にして回帰直線を描き、回帰直線の傾き（吸光度の変化率：ＯＤ４０５／分間）から凝固因子活性を推算した。このとき、陰性対照ウェルの凝固因子活性を１００％とし、測定試料存在下での凝固因子活性（百分比）を算出した。また、測定試料の濃度を横軸とし、測定試料存在下での凝固因子活性を縦軸とし、下記式に従って回帰分析を行うことによりＩＣ５０値を算出した。
【０３００】
［数１］
Ｂ＝（ＩＣ５０）ｎ／｛（ＩＣ５０）ｎ＋［Ｉ］ｎ｝
【０３０１】
式中、Ｂは、測定試料存在下での凝固因子活性（百分比）であり、［Ｉ］は、測定試料の濃度であり、ＩＣ５０は、半数阻害濃度（活性を５０％抑制したときの測定試料の濃度）であり、ｎは、Ｈｉｌｌ係数である。
【０３０２】
４）表面亢進及び血小板活性については、下記に従って測定した。第ＸＩＩ因子促進活性を測定するに際して、９６ウェルプレートに、一連の濃度の異なる測定試料及び対照物溶液３０μＬを加えた後、０．１５ＭのＮａＣｌを含む０．０２ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）緩衝液で４倍希釈した人コントロール血漿３０μＬを加え、３７℃、２分間保持してから６ｍＭのｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ発色基質ＣＳ−３１（０２）を３０μＬ加え、マイクロプレートリーダーを用いてＯＤ４０５値を測定した。
【０３０３】
血小板促進活性を測定するに際しては、健康受験者から採集した血漿を用いて多血小板血漿（ＰＲＰ）及び少血小板血漿（ＰＰＰ）を調製し、Ｃｈｒｏｎｏｌｏｇ−７００型血小板凝集計、比濁法を利用して、生理食塩水で一連の濃度に調製した測定試料溶液の血小板凝集能を測定した。
【０３０４】
８．３  結果評価
１）抗凝固及び凝固因子阻害活性については、結果を下記表６に示す。本発明に係るオリゴ糖及びその混合物は、ＡＰＴＴ活性を亢進することができるが、ＰＴ、ＴＴに対して影響を示さないことから、内因系凝固機構を阻害することで抗凝固活性を示し、外因系凝固に対しては顕著な影響を示さないことが確認できた。また、本発明に係るオリゴ糖及びその混合物は、テンナーゼに対して優れた阻害活性を示すが、ＩＩａ、Ｘａ、ＸＩＩａなどの凝固因子に対してはアンチトロンビン（ＡＴ）の存在・非存在とは関係なく顕著な影響を示さず、その一方でヘパリンコファクターＩＩ（ＨＣ−ＩＩ）依存的なＩＩａ阻害活性を示すことが確認できた。
【０３０５】
Ｃ２〜Ｃ６の直鎖状又は分岐状のアルカン又はアルケンに対応するアルコールを用い、実施例４と同様にしてヒドロキシ基アルキル化物Ａ８’を製造し、活性を測定した結果、これらの誘導体は、化合物Ａ８に類似した活性を有することが確認できた。つまり、ＡＰＴＴを向上させることができるが（ＡＰＴＴ凝固時間を倍増するときの薬物濃度が７．０〜１０μｇ／ｍＬ）、ＰＴ、ＴＴについては影響がなく、一方でテンナーゼを選択的に阻害し（ＩＣ５０が５０〜１００ｎｇ／ｍＬ）、ＩＩａ、Ｘａ、ＸＩＩａなどの凝固因子に対しては顕著な影響を示さず、ヘパリンコファクターＩＩ（ＨＣ−ＩＩ）依存的なＩＩａ阻害活性もあることが確認できた。
【０３０６】
本実施例のＢ９と同様にして、Ｃ８〜Ｃ１２アリール基を有する誘導体Ｂ９’を製造し、本実施例のＢ１１と同様にしてＣ８〜Ｃ１２アリール基を有する誘導体Ｂ１１’を製造した。これらの誘導体は、それぞれＢ９及びＢ１１に類似した活性を示し、ＡＰＴＴ凝固時間を倍増するときの薬物濃度が６．０〜９μｇ／ｍＬであり、一方でＰＴ、ＴＴに対しては影響がなく、なお、テンナーゼを選択的に阻害することができ（ＩＣ５０が４０〜１１０  ｎｇ／ｍＬ）、ヘパリンコファクターＩＩ（ＨＣ−ＩＩ）依存的なＩＩａ阻害活性もあることが確認できた。
【０３０７】
【表６】
0006980018.tif 000032
注：表６中、＃は、＞１２８μｇ／ｍＬを表し、  ＃＃は、＞５０００ｎｇ／ｍＬを表す。
【０３０８】
２）表面亢進及び血小板活性について検討を行った結果、１００μｇ／ｍＬ以下の濃度範囲内において、全てのオリゴ糖及びオリゴ糖混合物がいずれも明らかなＸＩＩ促進活性を示さず、また、５０μｇ／ｍＬ以下の濃度範囲において、全てのオリゴ糖及びオリゴ糖混合物がいずれも血小板促進活性を示さないことが確認できた。
【０３０９】
実施例９：抗血栓活性及び出血への影響
９．１  材料
実施例１と同様にしてＡ２を製造し、実施例７と同様にしてＤ１を製造した。対照物として、低分子ヘパリン（ＬＭＷＨ）は、フランスのサノフィ・アベンティス社製であり、ロット番号が４ＳＨ６９であった。抱水クロラール（トリクロロアセトアルデヒド一水和物）は、国薬グループ化学試薬有限会社製であり、生理食塩水は、昆明南疆製薬有限会社製であった。実験動物として、オスのＳＤラットは、体重が２５０〜３５０ｇであり、湖南ＳＪＡ実験動物有限会社により提供され、許可証番号がＳＣＸＫ（湘）２０１１−０００３であった。ニュージーランドウサギは、昆明医科大学により提供され、許可証番号がＳＣＸＫ（Ｄｉａｎ）２０１１−０００４であり、ウサギ脳粉末浸出液を調製するために用いられる。                                  
【０３１０】
９．２  方法
９．２．１  静脈血栓形成の評価
組分けと投与：ラットを、ランダムに１）生理食塩水（ＮＳ）対照組、２）ＬＭＷＨ  ４．０ｍｇ／ｋｇ組、３）Ａ２  ２．５ｍｇ／ｋｇ組、４）Ａ２組  ５．０ｍｇ／ｋｇ、５）Ａ２  １０ｍｇ／ｋｇ組、６）Ｄ１  ２．５ｍｇ／ｋｇ組、７）Ｄ１  ５．０ｍｇ／ｋｇ組、及び８）Ｄ１  １０ｍｇ／ｋｇ組で構成される８組に分け、各組に８匹ずつであった。各組のラットに対して背中の皮下注射（ｓｃ．）によって投与を行い、投与量がいずれも１ｍＬ／ｋｇであった。投与から１時間後にモデル構築実験を遂行した。
【０３１１】
ウサギ脳粉末浸出液の調製：ニュージーランドウサギの脳を摘出し、文献の方法（Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ，２０１０，１０３（５）：９９４〜１００４）を利用してウサギ脳粉末浸出液を調製し、後の使用に備えて−２０℃に保存した。
【０３１２】
ウサギ脳粉末浸出液による大静脈血栓の誘導：ラットの腹腔に１０％の抱水クロラール（３００ｍｇ／ｋｇ）を注射して麻酔を行い、腹部中央線に沿って腹壁を縦方向で切開した。そして、内臓を移動して下大静脈及びその分岐を分離し、結紮糸を下大静脈の左腎静脈下縁から通過させ、左腎静脈下縁における下大静脈の分岐を結紮した。大腿静脈から２％のウサギ脳粉末浸出液を注射し（１ｍＬ／ｋｇ）、２０秒後に左腎静脈下縁の結紮糸を結紮した。手術が終わると、内臓を腹腔に戻して医療用ガーゼ（生理食塩水で浸潤したもの）で被せた。２０分後に、結紮糸の下２ｃｍの位置で止血鉗子を用いて血管を挟み、血管を縦方向から切開して血栓を取り出した。血栓の長さ及び湿重量を測定し、さらに血栓を５０℃、２４時間乾燥させた後に乾燥重量を測定した。
【０３１３】
データ処理と統計学解析：データをＳＰＳＳソフトで整理、分析し、測定データは、平均値±標準偏差（ｘ±ｓ）で表し、各組のデータについては１標本Ｋ−Ｓ検定法によって正規性検定を行い、ルビーン検定法によって等分散性検定を行った。データが正規分布にならない場合、等分散性については一元配置分散分析を利用して有意差を判定し、そうでない場合には、二標本ｔ検定法を利用して有意差を判定した。
【０３１４】
９．２．２  出血傾向の評価
組分けと投与：マウスを、ランダムに１）生理食塩水（ＮＳ）対照組、２）ＬＭＷＨ  ４．０ｍｇ／ｋｇ組、２）ＬＭＷＨ  ２０ｍｇ／ｋｇ組、３）ＬＭＷＨ  １００ｍｇ／ｋｇ組、４）Ａ２  ５ｍｇ／ｋｇ組、５）Ａ２  ２５ｍｇ／ｋｇ組、６）Ａ２  １２５ｍｇ／ｋｇ組、７）Ｄ１  ５ｍｇ／ｋｇ組、８）Ｄ１  ２５ｍｇ／ｋｇ組、１０）Ｄ１  １２５ｍｇ／ｋｇ組で構成される１０組に分け、各組に８匹ずつであった。各組のマウスに対して、背中の皮下注射（ｓｃ．）によって投与を行い、投与量がいずれも１０ｍＬ／ｋｇであった。
【０３１５】
試験方法：各組に対して、皮下経由で投与を行い、６０分後にマウスを固定装置に固定し、尻尾切り法を利用して尻尾先を５ｍｍの程度切り取った後、マウスの尻尾を純水４０ｍＬ（３７℃）を入れたビーカーに浸漬し、切断した尻尾から第１滴の血が流れ出すと時間計測を始め、撹拌し続けた。６０分経過の時点でビーカーを別の箇所に移し、６０分後に紫外分光光度計で溶液の吸光度（ＯＤ５４０）を測定した。
【０３１６】
また、健康なマウスから全血を取って、量が異なるマウス全血を純水４０ｍＬに入れ、均一に混ぜ合わせた後に６０分間静置した。上記と同様にして溶液の吸光度（ＯＤ５４０）を測定し、体積を横軸とし、吸光度を縦軸として出血量評価用の検量線を作製した。そして、検量線に基づき各実験組のマウスの出血量を算出した。
【０３１７】
データ処理と統計学解析：データをＳＰＳＳソフトで整理、分析し、測定データを平均値±標準偏差（ｘ±ｓ）で表し、各組のデータについては１標本Ｋ−Ｓ検定法によって正規性検定を行い、ルビーン検定法によって等分散性検定を行った。データが正規分布にならない場合、等分散性については一元配置分散分析を利用して有意差を判定し、そうでない場合には、二標本ｔ検定法を利用して有意差を判定した。
【０３１８】
９．３  結果評価
１）図１４に、抗血栓活性の測定結果を示す。図１４に示すように、上記実験の投与量で投与を行った場合、Ａ２及びＤ１はいずれも抗血栓活性を示し、特に、投与量が５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲において血栓形成阻害率が７０％以上に達した。
【０３１９】
２）図１５は、出血傾向への影響を示す図である。図１５に示すように、Ａ２、Ｄ１及びＬＭＷＨを、それぞれの抗血栓効果を示す有効投与量から数倍高くして投与を行った場合、ＬＭＷＨ投与組の出血量に比べ、Ａ２及びＤ１投与組の出血量は著しく低下した。
【０３２０】
実施例１０：Ａ３薬物組成物の凍結乾燥粉体の調製
１０．１  材料
化合物Ａ３は、精製ドデカサッカリドであり、実施例１と同様にして製造した。塩化ナトリウムは、薬用レベルのものであり、滅菌注射用水、２ｍＬ容量のホウケイ酸ガラス製注射用バイアル、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ２限外ろ過カセット（Ｍｅｒｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）及びＶｉｒＴｉｓ  Ｕｌｔｒａ  ３５  ＥＬ冷凍結乾燥装置は、いずれも市販ルートから入手できるものであった。
【０３２１】
１０．２  配合
下記表７に示す組成、配合量に従ってＡ３薬物組成物を調製した。
【０３２２】
【表７】
0006980018.tif 000033
【０３２３】
１０．３  組成物の調製
１）表７に示す用量の２倍量となるように４０ｇのＡ３、８ｇのＮａＣｌを秤量し、注射用水１．０Ｌを加えた後に撹拌して完全に溶解させ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製の限外ろ過装置を用いて分画分子量が１０ｋＤａの限外ろ過カセットで熱源物質を取り除いた。滅菌条件下で０．２２μｍの膜でろ過して除菌し、溶液を２ｍＬ規格のペニシリンボトルに分注し、各ボトルに０．５ｍＬずつであった。分注に際しては注入量を監視しつつ、ゴム栓を半分程度に押し付けた後、パイロットテスト型の冷凍乾燥装置（米国ＶｉｒＴｉｓ社製）の乾燥室に入れ、指定の凍結乾燥曲線に従って凍結乾燥を行った。その後、ゴム栓を全部押し付けて凍結乾燥機から取り出し、キャップで押し付けて密封し、合格品を検定した。
【０３２４】
２）凍結乾燥は、以下の手順に従って行った。まず、試料を凍結乾燥機に入れて−２５℃の温度で1時間保持し、−４５℃の温度で３時間保持した後、冷却トラップ内を−５０℃まで下げて４０Ｐａとなるまで真空引きした。そして、１時間かけて定速で−３０℃に昇温し、２時間保持した。２時間かけて定速で−２０℃に昇温した後、４０〜３０Ｐａの真空度で６時間保持した。そして、２時間かけて−５℃に昇温し、３０〜２０Ｐａの真空度で２時間保持し、０．５時間かけて１０℃に昇温し、３０〜２０Ｐａの真空度で３時間保持し、最後に０．５時間かけて４０℃に昇温し、最低真空度で４時間保持した。
【０３２５】
１０．４  結果評価
上記方法に従って調製したＡ３凍結乾燥製剤は、合格品として１９６０バイアルが得られ、合格率が約９８％であった。得られた凍結乾燥品は、見た目で画一的であり、滅菌状況、熱源物質及び不溶性微粒子などは、いずれも合格以上であった。水分率を測定したところ、水分含有率がいずれも約３％未満であり、また、分注量を測定したところ、いずれも指定分注量の９５〜１１５％の範囲内であると確認できた。
【０３２６】
実施例１１：Ｄ１薬物組成物の凍結乾燥粉体の調製
１１．１  材料
実施例７と同様にしてオリゴ糖混合物Ｄ１を製造した。塩化ナトリウムは、薬用レベルのものであり、滅菌注射用水、２ｍＬ容量のホウケイ酸ガラス制注射用バイアル、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ２限外ろ過カセット（Ｍｅｒｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、凍結乾燥装置（ＬＹＯ−２０ｍ２、上海Ｔｏｆｆｌｏｎ有限会社製）は、いずれも市販ルートから入手できるものであった。
【０３２７】
１１．２  配合
下記表８に示す組成、配合量に従ってＤ１薬物組成物を調製した。
【０３２８】
【表８】
0006980018.tif 000034
【０３２９】
１１．３  組成物の調製
１）表８に示す用量の２０倍量となるように１０００ｇのＤ１、１８０ｇのＮａＣｌを秤量し、注射用水２０Ｌを加えた後に撹拌して完全に溶解させ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製の限外ろ過装置を用いて分画分子量が１０ｋＤａの限外ろ過カセットで熱源物質を取り除いた。滅菌条件下で０．２２μｍの膜でろ過して除菌した後、溶液を２ｍＬ規格のペニシリンボトルに分注し、各ボトルに０．５ｍＬずつであった。分注に際しては注入量を監視しつつ、ゴム栓を半分程度に押し付けた後、製造型の冷凍乾燥装置（ＬＹＯ−２０ｍ２、上海Ｔｏｆｆｌｏｎ有限会社製）の乾燥室に入れ、指定の凍結乾燥曲線に従って凍結乾燥した。その後、ゴム栓を全部押し付けて凍結乾燥機から取り出し、キャップで押し付けて密封し、合格品を検定した。
【０３３０】
２）凍結乾燥は、以下の手順に従って行った。まず、試料を凍結乾燥機に投入して−２５℃の温度で1時間保持し、そして−４５℃の温度で３時間保持した後、冷却トラップ内を−５０℃まで下げて４０Ｐａとなるまで真空引きした。そして、１時間かけて定速で−３０℃に昇温し、２時間保持した。２時間かけて定速で−２０℃に昇温した後、４０〜３０Ｐａの真空度で６時間保持した。そして、２時間かけて−５℃に昇温し、３０〜２０Ｐａの真空度で２時間保持し、０．５時間かけて１０℃に昇温し、３０〜２０Ｐａの真空度で３時間保持し、最後に０．５時間かけて４０℃に昇温し、最低真空度で４時間保持した。
【０３３１】
１１．４  結果評価
上記方法に従って調製したＤ１凍結乾燥製剤は、合格品として１７，６００バイアルが得られ、合格率が約８８％であった。合格品は、見た目や性状からして白色の粗粉であった。分注状況については、重量法を利用して測定し、いずれも合格であることが確認できた。滅菌状況については、適量の合格品を取って「中国薬局方、２０１５年版、第４部１１０１」に従って測定した結果、いずれも注射剤の品質要求を満たすことを確認した。また、熱源物質については、上記合格品を取って濃度が３．５ｍｇ／１ｍＬのＤ１溶液を調製し、「中国薬局方、２０１５年版、第４部１１４２」に従って測定した結果、いずれも注射剤の熱源物質要求を満たすことが確認した。
【図１】
0006980018.tif 000042
【図２】
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【図３】
0006980018.tif 000044
【図４】
0006980018.tif 000045
【図５】
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【図６】
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【図７】
0006980018.tif 000048
【図８】
0006980018.tif 000049
【図９】
0006980018.tif 000050
【図１０】
0006980018.tif 000051
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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