(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アザミ（Cirsium japonicum）の花抽出物を有効成分として含むメラニン生成促進用組成物。
【請求項２】
前記組成物が白斑、白髪または低色素症の予防または改善のための化粧料組成物である、請求項１に記載のメラニン生成促進用組成物。
【請求項３】
前記アザミの花抽出物が、前記化粧料組成物の総重量に対して０．０００１ないし１５重量％含まれる、請求項２に記載のメラニン生成促進用組成物。
【請求項４】
前記組成物が、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤含有クレンジング、オイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーションおよびスプレーよりなる群から選ばれる剤形である、請求項２に記載のメラニン生成促進用組成物。
【請求項５】
前記組成物が白斑、白髪または低色素症の予防または治療のための薬学的組成物である、請求項１に記載のメラニン生成促進用組成物。
【請求項６】
前記アザミの花抽出物が、前記薬学的組成物の総重量に対して０．０００１ないし７０重量％含まれる、請求項５に記載のメラニン生成促進用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アザミ抽出物を有効成分として含むメラニン生成促進用組成物に関するものであり、より具体的にはメラニンの生成を促進し、黒化を誘導して白斑（vitiligo）、白髪（gray hair）または低色素症（hypochromatism）を予防、改善または治療できるアザミ抽出物を有効成分として含む組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
人体の皮膚の表皮基底層に存在するメラニン細胞（melanocyte）から生成されるメラニン（melanin）は、黒い色素とタンパク質の複合形態を持つフェノール系高分子物質をいう。上記メラニンは、濃度と分布によって人の肌の色を決めたり、紫外線から人の肌を保護する役割もする。
【０００３】
メラニンが過剰に生成されると、シミ、そばかすなどの色素沈着を誘発する。しかし、逆にメラニンの生成が過剰に抑制されると、白斑の皮膚病変が現れたり、毛根のメラニン細胞の数と機能が減少して白髪が発生したり、低色素症が発生したりして皮膚がんの危険因子になったりもする。したがって、メラニンの生成を抑える美白関連の研究同様、メラニンの生成を促進して黒化を誘導する研究も非常に重要である。
【０００４】
これらの白斑、白髪および低色素症は外見上良くないだけでなく、社会活動においても多くの困難が生じる。このため、白斑や低色素症の場合、外科的施術を利用して治療したり、化粧品などの皮膚外用剤を利用して一時的に隠す場合が多く、白髪の場合、多くの人々が染めて一時的に白髪を隠している。しかし、このような方法は、これらの根本的な予防、改善または治療方法ではないため、より根本的な解決のためにはメラニン生成促進剤の研究が必要な実情である。
【０００５】
これに関連して韓国登録特許第１０−１６６９３５９号公報は、クロフネツツジ抽出物、ヤマハギ抽出物、アベマキ抽出物の混合物を含むメラニン合成促進用組成物に関して開示しているが、上記それぞれの抽出物は様々な抽出物を混合して使用するため、原料の準備と製造工程が複雑だという問題がある。
【０００６】
一方、アザミ（Cirsium japonicum）は、キク科に属する多年草で、民間や韓方処方に薬剤として広く利用されており、新芽は食用として使われる。アザミの俗名Cirsiumは静脈腫瘍という意味のギリシア語から由来し、古代から血管が膨らむ疾病を治癒する薬剤として利用されたことに由来する。アザミには、生理活性に優れた様々な二次代謝産物であるアピゲニン（apigenin）、ミリセチン（myricetin）、ルテオリン（luteolin）およびケンペロール（kaempferol）などが含まれており、凉血、止血、去?、消癰腫などの効能があると知られている。
【０００７】
上記アザミの効能に関連して韓国登録特許第１０−１２８１７１０号公報は、アザミ抽出物の肥満治療および予防効果を開示しており、韓国公開特許第１０−２０１７−００２５３７５号公報はアザミ抽出物の肌の再生、肌のシワ改善、肌の美白効果などを開示しているが、いまだにアザミ抽出物のメラニン合成促進効果に関しては明らかになっていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】韓国登録特許第１０−１６６９３５９号公報
【特許文献２】韓国登録特許第１０−１２８１７１０号公報
【特許文献３】韓国公開特許第１０−２０１７−００２５３７５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このため、本発明者らは、上記のような問題とともに、白斑、白髪および低色素症を抜本的に解決するために、人体の刺激が少なくメラニンの生成を効果的に促進できる天然素材を研究していたところ、アザミ抽出物がメラニンの生成を促進することにより黒化を誘導し、皮膚刺激および細胞毒性がなく、人体の安定性が優れていることを確認して本発明を完成した。
【００１０】
本発明の目的は、メラニン生成促進用組成物を提供することである。本発明の他の目的は、上記メラニン生成促進用組成物を含む白斑、白髪または低色素症の予防、または改善用化粧料組成物を提供することである。本発明のもう一つの目的は、上記メラニン生成促進用組成物を含む白斑症、白髪または低色素症の予防、または治療用薬学的組成物を提供することである。本発明のもう一つの目的は、上記メラニン生成促進用組成物を個体に投与してメラニンの生成を促進することによって、白斑、白髪または低色素症の予防、改善または治療する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成するために、本発明では、アザミ抽出物を有効成分として含むメラニン生成促進用組成物を提供する。
【００１２】
上記他の目的を達成するために、本発明では、アザミ抽出物を有効成分として含むことを特徴とする白斑、白髪または低色素症の予防または改善用化粧料組成物を提供する。
【００１３】
上記他の目的を達成するために、本発明では、アザミ抽出物を有効成分として含むことを特徴とする白斑、白髪または低色素症の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００１４】
上記他の目的を達成するために、本発明では、上記アザミ抽出物を有効成分として含む組成物を個体に投与してメラニンの生成を促進することによって、白斑、白髪または低色素症の予防、改善または治療する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のアザミ抽出物を有効成分として含むメラニン生成促進用組成物は、皮膚刺激および細胞毒性がなく、人体の安定性が優れながらも、メラニンの生成促進に非常に効果的であるため、白斑、白髪または低色素症の予防、改善または治療用化粧料または薬学的組成物に有効成分として安全に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ヒトメラニン細胞（Human melanocyte）でアザミ抽出物の濃度によるメラニン合成促進効果をグラフで示したものである。
【図２】Ｂ１６メラノーマ細胞（B16 melanoma cell）でアザミ抽出物の濃度によるメラニン合成促進効果をグラフで示したものである。
【図３】3D skinでアザミ抽出物の濃度によるメラニン合成促進効果をグラフで示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明において、アザミ（Cirsium japonicum）は、キク科に属する多年草で、民間および韓方処方に薬剤として広く利用されており、新芽は食用として使われる。
【００１８】
本発明において、アザミ抽出物は、アザミの花、葉、幹、根および全草からなる群から選ばれたいずれか１つ以上から抽出されたものを意味し、望ましくはアザミの花から抽出されたものを意味する。
【００１９】
本発明によるアザミ抽出物は、色素細胞であるメラニンの生成を促進し、生成されたメラニン細胞の活性化によりメラニンの合成を増加させて色素の再沈着（repigmentation）を起こす。
【００２０】
本発明のアザミ抽出物は、当分野で公知の通常の溶媒を使用して抽出することができ、抽出した液体は液体形態で使われるか、濃縮および／または乾燥して使われる。この際、上記溶媒に水、炭素数１ないし４の無水または含水低級アルコール（メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなど）、上記低級アルコールと水との混合溶媒、アセトン、エチルアセテート、クロロホルム、または１，３−ブタンジオールのいずれか１つの溶媒を使うことができる。望ましくは、メタノール、エタノールまたはブタノールを用いて抽出することができる。しかし、特にこれに限られるわけではなく、抽出する有機溶媒によって抽出物の有効成分の抽出程度と損失程度が異なることもあるので、適した有機溶媒を選んで使うようにすることが望ましい。
【００２１】
上記抽出方法は、特にこれに限られるわけではないが、冷浸抽出、超音波抽出、または還流冷却抽出方法などがあり、超音波抽出方法で実施することが望ましい。
【００２２】
上記超音波抽出は、振動数が１秒に２０，０００回以上の振動素子を用いて各種天然素材から有用成分を化学的な力ではなく、物理的な力で常温で抽出する方法で、溶媒抽出、植物性オイル抽出または水蒸気蒸留抽出と違って常温で天然素材が含有している有効成分を破壊することなく、高濃度で抽出できる長所がある。
【００２３】
一つの具体例として、上記超音波抽出は乾燥したアザミの粉末を６０ないし８０％エタノール溶液を用いて常温で２４ないし７２時間実施することができる。望ましくは、６５％ないし７５％エタノール溶液を用いて常温で３６ないし６０時間実施し、より望ましくは７０％エタノール溶液を用いて常温で４８時間実施する。上記数値の下限から外れる場合、アザミに含まれている本発明の有効成分が十分抽出されず、上限を超える場合、有効成分の抽出量に有意な差がなく、上記有効成分の不純物が抽出され、工程の効率性が落ちることになる。
【００２４】
本発明のアザミ抽出物は、抽出、分画、または精製の各段階で得られるすべての抽出液、分画、精製物、それらの希釈液、濃縮液または乾燥物であり得る。
【００２５】
本発明のアザミ抽出物を有効成分として含むメラニン生成促進用組成物は、組成物全体の重量を基準としてアザミ抽出物を０．０００１ないし７０．０重量％、望ましくは０．００１ないし６８．０重量％含む。上記アザミ抽出物の含量が０．０００１重量％未満の場合、メラニン生成促進効果を期待することはできず、７０．０重量％を超過する場合、含有量の増加によるメラニン生成促進効果の増加量が微々たるもので、医薬品の剤形の製造が困難になる。
【００２６】
一つの具体的な態様として、本発明のアザミ抽出物を有効成分として含むメラニン生成促進用組成物は、メラニン細胞の破壊または機能の異常で発生する白斑、白髪または低色素症の予防、改善または治療のための化粧料組成物または薬学的組成物として使うことができる。
【００２７】
上記白斑（vitiiligo）は、自己免疫機能の異常でメラニン細胞が破壊され、多様な大きさと形態の白い斑点が皮膚に現われる現象で、後天的脱色素性疾患を意味する。
【００２８】
上記白髪（gray hair）は、毛根のメラニン細胞の数と機能が減少し、毛髪が白く変わる現象を意味する。
【００２９】
上記低色素症（hypochromatism）は、湿疹、アトピー性皮膚炎、炎症性皮膚炎などの皮膚疾患によって局所的にメラニン細胞に機能的障害が発生して一時的に病変部位の皮膚が白くなる疾患を意味する。
【００３０】
本発明において、白斑、白髪または低色素症の予防、改善または治療は、皮膚または毛包に存在する非活動性メラニン細胞または色素母細胞を刺激し、分化、増殖および移動を促進し、メラニンを生成して白斑、白髪または低色素症の症状を予防、改善または治療することである。
【００３１】
本発明の一つの具体例によれば、アザミ抽出物を有効成分として含むことによって、細胞内のメラニンの生成を促進して白斑、白髪または低色素症の予防または改善に効果のある化粧料組成物を提供する。
【００３２】
本発明のアザミ抽出物を有効成分として含む化粧料組成物は、化粧料組成物全体の重量を基準としてアザミ抽出物を０．０００１ないし１５．０重量％、望ましくは０．００１ないし１０．０重量％含む。上記アザミ抽出物の含量が０．０００１重量％未満の場合、白斑、白髪または低色素症の予防または改善に効果を期待することはできず、１５．０重量％を超過する場合、化粧品の剤形の製造が困難になる。
【００３３】
上記化粧料組成物は、上記アザミ抽出物以外に化粧料組成物に通常用いられる成分を追加して含めることができる。例えば、抗酸化剤、安定化剤、可溶化剤、ビタミン、顔料および香料などの通常の補助剤および担体を含めることができる。
【００３４】
上記化粧料組成物は、当業界で通常製造されるいかなる剤形でも製造することができる。例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤含有クレンジング、オイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファウンデーションまたはスプレーなどに剤形化される。より詳しくは、栄養クリーム、収斂化粧水、柔軟化粧水、ローション、エッセンス、栄養ゲルまたはマッサージクリームなどの剤形に製造される。しかし、特にこれに限られたものではない。
【００３５】
上記化粧料組成物の剤形がペースト、クリームまたはゲルの場合、担体成分として動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルクまたは酸化亜鉛などが利用される。
【００３６】
上記化粧料組成物の剤形がパウダーまたはスプレーの場合、担体成分としてラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、ケイ酸カルシウムまたはポリアミドパウダーが用いられ、特にスプレーの場合、追加でハイドロクロロフルオロカーボン、プロパン／ブタンまたはジメチルエーテルなどの高圧ガスを含めることができる。
【００３７】
上記化粧料組成物の剤形が溶液または乳濁液の場合、担体成分として溶媒、可溶化剤または乳化剤が利用される。例えば、水、エタノール、イソプロパノール、炭酸エチレン、エチルアセテート、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３ブタンジオール、グリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコールまたはソルビ
タンの脂肪酸エステルが利用される。
【００３８】
上記化粧料組成物の剤形が懸濁液の場合、担体成分として水、エタノールまたはプロピレングリコールなどの液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステルおよびポリオキシエチレンソルビタンエステルなどの懸濁剤、微結晶セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガまたはトラカントなどが利用される。
【００３９】
上記化粧料組成物の剤形が界面活性剤含有クレンジングの場合、担体成分として脂肪族アルコールサルフェート、脂肪族アルコールエーテルサルフェート、スルホサクシネートモノエステル、イセチオネート、イミダゾリニウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルサルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体またはエトキシ化グリセリン脂肪酸エステルなどが利用される。
【００４０】
本発明の一つの具体例によれば、アザミ抽出物を有効成分として含めることによって、細胞内のメラニンの生成を促進して白斑、白髪または低色素症の予防または治療に効果のある薬学的組成物を提供する。
【００４１】
本発明のアザミ抽出物を有効成分に含む薬学的組成物は、組成物全体の重量を基準としてアザミ抽出物を０．０００１ないし７０．０重量％、望ましくは０．００１ないし６８．０重量％含む。上記アザミ抽出物の含有量が０．０００１重量％未満の場合、白斑、白髪または低色素症の予防または治療効果を期待することはできず、７０．０重量％を超過する場合、含有量の増加による上記効果の増加量が微々たるもので、医薬品の剤形の製造が困難になる。
【００４２】
上記薬学的組成物は、上記アザミ抽出物以外に薬学的組成物に通常許容される担体を追加して含めることができる。
【００４３】
上記薬学的組成物に通常許容される担体は、製剤時に通常用いられるものとして、炭水化物類化合物（例えば、ラクトース、アミロース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、セルロースなど）、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、塩類溶液、アルコール、アラビアゴム、植物性油（例えば、トウモロコシ油、綿実油、豆乳、オリーブ油、ココナッツ油)、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウムおよびミネラルオイルなどを含むが、これに限られるわけではない。
【００４４】
本発明の薬学的組成物は、上記成分以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などを追加して含めることができる。適した薬学的に許容される担体や製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences（19th ed., 1995）に詳しく記載されている。
【００４５】
本発明の薬学的組成物は、ラット、マウス、家畜、人などの哺乳動物に経口または非経口投与によって適用することができ、望ましくは非経口投与、より望ましくは塗布による局所投与（topical application）方式で適用することができる。
【００４６】
上記薬学的組成物の適した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度および反応・感応性などの要因によっ
て多様に処方される。本発明の薬学的組成物の経口投与量は、成人基準で０．００１〜３００ｍｇ／ｋｇ（体重）範囲内である。また、外用剤の場合、成人基準で１．０ないし３．０ｍｌの量で１日１回ないし５回塗って１ヶ月以上継続するのが良い。ただし、上記投与量は、本発明の範囲を限定するものではない。
【００４７】
本発明のアザミ抽出物を有効成分として含む化粧料または薬学的組成物は、個体内投与、皮下投与または塗布による局部投与などにより個体のメラニンの生成を促進し、生成されたメラニン細胞の活性化によりメラニンの合成が増加して色素再沈着（repigmentation）を起こすことによって、白斑、白髪または低色素症を緩和、好転、予防、改善または治療するなどの目的を達成できる利点がある。
【００４８】
一つの具体的態様として、本発明はアザミ抽出物を有効成分に含むメラニン生成促進用組成物を個体に投与して個体の白斑、白髪および低色素症を改善する方法およびその用途を提供する。
【００４９】
本発明の個体に投与する組成物は、上述のようにメラニン生成促進効果によって個体の白斑、白髪および低色素症を改善または治療する効果がある。
【００５０】
本発明において、用語「個体」は、本発明の上記組成物を投与して症状が改善する状態または疾患を持つ人を含む猿、牛、馬、豚、羊、犬、猫、ラット、マウス、チンパンジーなどの哺乳動物を意味する。
【００５１】
本発明において、用語「改善」は、個体においてメラニン細胞の破壊または機能異常で発生する白斑、白髪または低色素症の（ａ）発展の抑制、（ｂ）軽減、（ｃ）除去を意味する。
【００５２】
一方、本発明のアザミ抽出物は、皮膚刺激および細胞毒性がなく、人体の安定性が優れ、人体に対する副作用がほとんどない天然抽出物で、メラニンの生成促進に非常に効果的であるため、白斑、白髪または低色素症の予防、改善または治療用化粧料または薬学的組成物に有効成分として安全に利用できる。
【００５３】
もう一つの具体的態様として、本発明は、上記アザミ抽出物を有効成分として含む組成物を個体に投与してメラニンの生成を促進することによって、白斑、白髪または低色素症の予防、改善または治療する方法を提供する。
【００５４】
上記個体は、人を含む哺乳動物で、メラニンの生成を促進することによって、白斑、白髪または低色素症を改善する対象である。
【００５５】
上記投与は、経口または非経口投与であり、望ましくは非経口投与、より望ましくは塗布による局部投与であり、その投与量などは製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態などの要因に応じて当業界の通常の知識を持った者によって容易に変更して使用することができる。
【００５６】
本発明による白斑、白髪または低色素症の予防、改善または治療用組成物を個体に投与することによって、個体のメラニンの生成を促進して白斑、白髪または低色素症を予防し、改善することができる。
【００５７】
上記目的を達成するために、本発明では、アザミ抽出物を有効成分として含むメラニン生成促進用組成物を提供する。
【００５８】
上記他の目的を達成するために、本発明では、アザミ抽出物を有効成分として含むことを特徴とする白斑、白髪または低色素症の予防または改善用化粧料組成物を提供する。
【００５９】
上記他のもう一つの目的を達成するために、本発明ではアザミ抽出物を有効成分として含むことを特徴とする白斑、白髪または低色素症の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００６０】
上記他のもう一つの目的を達成するために、本発明では、上記アザミ抽出物を有効成分として含む組成物を個体に投与してメラニンの生成を促進することによって、白斑、白髪または低色素症の予防、改善または治療する方法を提供する。
【実施例】
【００６１】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、もっぱら本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨により、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないことは、当業界において通常の知識を持った者にとって自明であろう。
【００６２】
実施例１：アザミ抽出物の製造
アザミの花を採取して異物および不純物が完全に除去されるようにきれいに洗浄した後、２０ないし３５℃で陰干しした後、粒子の大きさが１ｍｍ以下になるように粉砕した。その後、上記粉砕されたアザミ花粉末１ｋｇを７０％エタノール溶媒に浸した後、４８時間超音波抽出して得た抽出液を濾過紙（Advantes, No.2）を用いて濾過した。上記濾過物を減圧濃縮してアザミ抽出物を製造した。
【００６３】
実施例２：ヒトメラニン細胞でアザミ抽出物によるメラニン生成促進効果を測定
ヒトメラニン細胞をＨＭＧＳ（Human Melanocytes Growth Supplement）が含まれたＭ２５４培地を用いて６−ウェルプレート（well plate）に１ウェル当たり１．５×１０５個で接種した後、細胞がウェルの底に約８０％以上付着するまで５％ＣＯ２および３７℃で培養した。培養後、培地を除去して実施例１の試料を適当濃度に希釈した培地に交換した後、５日間５％ＣＯ２および３７℃で培養した。実施例１によるアザミ抽出物の濃度範囲は、細胞毒性がない１ｐｐｍ、３ｐｐｍ、５ｐｐｍに決定した。培地を除去した細胞をＰＢＳ（phosphated buffersalinee）で洗浄した後、細胞を回収した。回収された細胞は、血球計算盤を用いて細胞数を測定した後、１０，０００ないし１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄み液を除去し、ペレットを得た。得られた細胞ペレットを６０℃で乾燥させた後、１０％ＤＭＳＯを含有した１Ｍ水酸化ナトリウム液１００μｌを入れて６０℃の恒温槽で細胞内のメラニン溶液を得た。この溶液を用いてマイクロプレートリーダー（microplate reader）で４５０ｎｍで吸光度を測定し、細胞の一定数当たりのメラニンの量を求めた。その結果を下表１と図１に示した。
【００６４】
【表１】
0006921440.tif 000002
【００６５】
上表１と図１に示したとおり、本発明によるアザミ抽出物が濃度依存的に対照群に比べてメラニン生成促進率が高かった。したがって、本発明によるアザミ抽出物がメラニンの生成を促進する効果があることがわかった。
【００６６】
実施例３：Ｂ１６メラノーマ細胞でアザミ抽出物によるメラニン生成促進効果を測定
Ｂ１６メラノーマ細胞を１０％のＦＢＳ（fetal bovine serum）を含有したＤＭＥＭ培地で６−ウェルプレート（well plate）に１ウェル当たり１×１０５個で接種した後、細胞がウェルの底に約８０％以上付着するまで５％ＣＯ２および３７℃で培養した。培養後、培地を除去して実施例１の試料を適当濃度に希釈した培地に交換した後、３日間５％ＣＯ２および３７℃で培養した。実施例１によるアザミ抽出物の濃度範囲は、細胞毒性がない１０ｐｐｍ、５０ｐｐｍ、１００ｐｐｍに決定した。培地を除去した細胞をＰＢＳ（phosphated buffersalinee）で洗浄した後、細胞を回収した。回収された細胞は、血球計算盤を用いて細胞数を測定した後、１０，０００ないし１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄み液を除去し、ペレットを得た。得られた細胞ペレットを６０℃で乾燥させた後、１０％ＤＭＳＯを含有した１Ｍ水酸化ナトリウム液１００μｌを入れて６０℃の恒温槽で細胞内のメラニンを得た。この液を用いてマイクロプレートリーダー（microplate
reader）で４５０ｎｍで吸光度を測定し、細胞の一定数当たりのメラニンの量を求めた。その結果を下表２と図２に示した。
【００６７】
【表２】
0006921440.tif 000003
【００６８】
上表２と図２に示したとおり、本発明によるアザミ抽出物が濃度依存的に対照群に比べてメラニン生成促進率が高く、アザミ抽出物を１００ｐｐｍで処理したとき、対照群と比較して２倍以上のメラニン生成促進率を示すことが観察された。したがって、本発明によるアザミ抽出物がメラニンの生成を促進する効果があることがわかった。
【００６９】
実施例４：３Ｄ  ｓｋｉｎでアザミ抽出物によるメラニン生成促進効果を測定
３Ｄ  ｓｋｉｎを保存培地（maintenance medium）として１２−ウェルプレート（well
plate）に５％ＣＯ２および３７℃で培養した。培地を交換した後、アザミ抽出物を細胞毒性がない５０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ濃度で処理した。１０日間アザミ抽出物を濃度に合わせて処理した培地に３回交換した後、５％ＣＯ２および３７℃で培養した。培地を除去した細胞をＰＢＳ（phosphated buffersalinee）で洗浄した後、細胞を回収した。１０，０００ないし１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄み液を除去し、ペレットを得た。得られた細胞ペレットを６０℃で乾燥させた後、１０％ＤＭＳＯを含有した１Ｍ水酸化ナトリウム液１００μｌを入れて６０℃の恒温槽で細胞内のメラニンを得た。この液を用いてマイクロプレートリーダー（microplate reader）で４５０ｎｍで吸光度を測定し、細胞の一定数当たりのメラニンの量を求めた。その結果を下表３と図３に示した。
【００７０】
【表３】
0006921440.tif 000004
【００７１】
上表３と図３に示したとおり、本発明によるアザミ抽出物が濃度依存的に対照群に比べてメラニン生成促進率が高かった。したがって、本発明によるアザミ抽出物がメラニンの生成を促進する効果があることがわかった。
【００７２】
実施例５：アザミ抽出物の人体の皮膚に対する安全性確認試験
本発明によるアザミ抽出物が人体の皮膚に安全であることを確認するために、皮膚安全性検証実験を行った。このために、皮膚累積刺激試験を実施した。
【００７３】
実施例１のアザミ抽出物をそれぞれ０．１％、０．５％および１％含有した栄養クリームを製造した。具体的には、液状の精製水、トリエタノールアミンおよびプロピレングリコールを７０℃に加熱して溶解した後、蜜蝋、流動パラフィン、油状成分、乳化剤および防腐剤を７０℃に加熱して溶解した液を添加して乳化させた。乳化が完了した後、上記溶液を４５℃に冷却し、アザミ抽出物をそれぞれ０．１％、０．５％および１％添加して分散させた後、３０℃に冷却した。上記アザミ抽出物の含有量を０．１％、０．５％および１％に増加させることによって、流動パラフィンの含有量をそれぞれ９．９１％、９．５１％および９．０１％に減らして栄養クリームを製造した。
【００７４】
上記のように製造した栄養クリームを用いて健康な３０人の成人を対象に上腕部分に隔日で計９回の２４時間累積貼布を施行し、アザミ抽出物が皮膚に刺激を与えるか測定した。
【００７５】
貼布方法は、フィンチャンバー（Finn chamber、Epitest Ltd、フィンランド）を用いた。チャンバーに上記各皮膚外用剤を１５μｌずつ滴下した後、貼布を実施した。毎回皮膚に現れた反応の程度を下記の数式を用いて点数化し、その結果を下表４に示した。
平均反応度＝［｛（反応指数×反応度）／（総被験者数×最高点数（４点））｝×１００］／検査回数（９回）
反応度において±は１点、＋は２点および＋＋は４点の点数を与え、平均反応度が３未
満の場合、安全な組成物と判定される。
【００７６】
【表４】
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【００７７】
上表４に示すように、試験群１、２および３すべて±、＋および＋＋に該当する人の数がすべて０人であり、平均反応も０．００だった。上記試験の結果、３以下の平均反応度
を示したので、本発明によるアザミ抽出物は明確な累積刺激の様相を現わさない人体の皮膚に安全な物質と判定された。
【００７８】
本発明の組成物は、下記のとおり製剤例として製造できるが、これに限られるわけではない。
【００７９】
製剤例１：化粧料の製剤
１−１．柔軟化粧水
下表５のとおりアザミ抽出物を有効成分に含む柔軟化粧水を通常の方法によって製造した。
【００８０】
【表５】
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【００８１】
１−２．栄養化粧水
下表６のとおりアザミ抽出物を有効成分に含む栄養化粧水を通常の方法によって製造した。
【００８２】
【表６】
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【００８３】
１−３．栄養クリーム
下表７のとおりアザミ抽出物を有効成分に含む栄養クリームを通常の方法によって製造した。
【００８４】
【表７】
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【００８５】
１−４．マッサージクリーム
下表８のとおりアザミ抽出物を有効成分として含む栄養クリームを通常の方法によって製造した。
【００８６】
【表８】
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【００８７】
１−５．パック
下表９のとおりアザミ抽出物を有効成分に含むパックを通常の方法によって製造した。
【００８８】
【表９】
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【００８９】
製造例２：薬剤学的製剤
２−１．散剤の製造
【００９０】
【表１０】
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【００９１】
上記の成分を互いに混合し、次いで密封袋に充填することによって、アザミ抽出物を有効成分として含む散剤を製造した。
【００９２】
２−２．錠剤の製造
【００９３】
【表１１】
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【００９４】
上記の成分を互いに混合し、次いで通常の錠剤の製造方法により打錠することによって、アザミ抽出物を有効成分として含む錠剤を製造した。
【００９５】
２−３．カプセル剤の製造
【００９６】
【表１２】
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【００９７】
上記の成分を互いに混合し、次いで通常のカプセルの製造方法によりゼラチンカプセルに充填することによって、アザミ抽出物を有効成分として含むカプセル剤を製造した。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明のアザミ抽出物を有効成分として含むメラニン生成促進用組成物は、皮膚刺激および細胞毒性がなく、人体の安定性が優れながらも、メラニンの生成促進に非常に効果的であるため、白斑、白髪または低色素症の予防、改善または治療用化粧料または薬学的組成物に有効成分として安全に利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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