(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
校正品、ピーク校正品、測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルに対して化学発光免疫反応を行い、化学発光を励起させ１回目と２回目の読み取りを記録し、ピーク校正品の２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分の増幅ＡをＲ０とし、測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の増幅Ａ’がＲ０を超えているかを比較し、Ｒ０を超えている場合、サンプルがＨＤ−ＨＯＯＫ効果を有し、Ｒ０未満の場合、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果を有しないとする、というステップを含むＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルを同定する方法であって、当該方法は、
（１）校正品、ピーク校正品、測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルを第１の抗体または抗原によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体または抗原と混合し、インキュベートすることによって、混合液が得られるステップと、
（２）１回目の読み取り：ステップ（１）の混合液に、さらに、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、インキュベートした後に励起光を照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ１とするステップと、
（３）２回目の読み取り：ステップ（２）において１回目の読み取りを行った後の反応溶液をさらにインキュベートした後に、励起光を再度照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ２とするステップと、
（４）サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値に対する２回目の読み取りによって得られた信号値の増幅Ａについて、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％で算出するステップと、
（５）ピーク校正品の２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分の増幅ＡをＲ０とするステップと、
（６）測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａ’の値をＲ０と比較し、Ａ’がＲ０以上である場合、このサンプルがＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルであると同定するステップと、を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａ’の値をＲ０と比較し、Ａ’がＲ０以上である場合、測定対象サンプルがＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルであり、希釈する必要があり、Ａ’がＲ０未満の場合、そのまま校正曲線でサンプルの濃度を算出するとされ、
前記校正曲線は、校正品の１回目の読み取りと校正品の濃度によって作成された曲線であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
化学発光免疫反応を実施するための免疫反応装置と、
化学発光を励起させ１回目と２回目の読み取りを記録するための化学発光免疫反応励起
及びカウント装置と、
測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅Ａ’によってＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルの有無を特定するためのプロセッサと、を備える免疫測定におけるＨＤ−ＨＯＯＫ効果を同定するためのシステムであって、
当該システムを使用する方法が、
（１）校正品、ピーク校正品、測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルを第１の抗体または抗原によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体または抗原と混合し、インキュベートすることによって、混合液が得られるステップと、
（２）１回目の読み取り：ステップ（１）の混合液に、さらに、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、インキュベートした後に励起光を照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ１とするステップと、
（３）２回目の読み取り：ステップ（２）において１回目の読み取りを行った後の反応溶液をさらにインキュベートした後に、励起光を再度照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ２とするステップと、
（４）サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値に対する２回目の読み取りによって得られた信号値の増幅Ａについて、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％で算出するステップと、
（５）ピーク校正品の２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分の増幅ＡをＲ０とするステップと、
（６）測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａ’の値をＲ０と比較し、Ａ’がＲ０以上である場合、このサンプルがＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルであると同定するステップとを含むことを特徴とする、前記システム。
【請求項４】
前記システムは、
化学発光免疫反応を実施するための免疫反応装置と、
化学発光を励起させ１回目と２回目の読み取りを記録するための化学発光免疫反応励起及びカウント装置と、
測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅Ａ’が、ピーク校正品の２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分の増幅Ｒ０を超えているかを比較し、Ｒ０を超えている場合、サンプルがＨＤ−ＨＯＯＫ効果を有し、Ｒ０未満の場合、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果を有しないとするプロセッサと、を備え、
化学発光の２回目の読み取りは、同一の免疫反応に対して一定の時間が経過した後に再度励起させ読み取ることによって得られるものである、請求項３に記載のシステム。
【請求項５】
測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａ’の値をＲ０と比較し、Ａ’がＲ０以上である場合、測定対象サンプルがＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルであり、希釈する必要があり、Ａ’がＲ０未満の場合、そのまま校正曲線でサンプルの濃度を算出するとされ、
前記校正曲線は、校正品の１回目の読み取りと校正品の濃度によって作成された曲線であることを特徴とする請求項３に記載のシステム。
【請求項６】
校正品、ピーク校正品、第１の抗体または抗原によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体または抗原、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を含む試薬キットの使用方法であって、
校正品、ピーク校正品、測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルに対して化学発光免疫反応を行うステップと、
化学発光を励起させ１回目と２回目の読み取りを記録するステップと、
測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅Ａ’によってＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルの有無を特定するステップとを含み、
前記方法は、
（１）校正品、ピーク校正品、測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルを第１の抗体または抗原によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体または抗原と混合し、インキュベートすることによって、混合液が得られるステップと、
（２）１回目の読み取り：ステップ（１）の混合液に、さらに、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、インキュベートした後に励起光を照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ１とするステップと、
（３）２回目の読み取り：ステップ（２）において１回目の読み取りを行った後の反応溶液をさらにインキュベートした後に、励起光を再度照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ２とするステップと、
（４）サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値に対する２回目の読み取りによって得られた信号値の増幅Ａについて、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％で算出するステップと、
（５）ピーク校正品の２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分の増幅ＡをＲ０とするステップと、
（６）測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａ’の値をＲ０と比較し、Ａ’がＲ０以上である場合、このサンプルがＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルであると同定するステップと、を含むことを特徴とする前記試薬キットの使用方法。
【請求項７】
前記キットの使用方法は、校正品、ピーク校正品、測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルに対して化学発光免疫反応を行うステップと、
化学発光を励起させ１回目と２回目の読み取りを記録するステップと、
測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の増幅Ａ'がピーク校正品の２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分の増幅Ｒ０を超えているかを比較し、Ｒ０を超えている場合、サンプルがＨＤ−ＨＯＯＫ効果を有し、Ｒ０未満の場合、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果を有しないとするステップとを含む請求項６に記載の方法。
【請求項８】
測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａ’の値をＲ０と比較し、Ａ’がＲ０以上である場合、測定対象サンプルがＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルであり、希釈する必要があり、Ａ’がＲ０未満の場合、そのまま校正曲線でサンプルの濃度を算出するとされ、
前記校正曲線は、校正品の１回目の読み取りと校正品の濃度によって作成された曲線であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項９】
（１）測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルに対して化学発光免疫反応を行い、化学発光を励起させ１回目と２回目の読み取りを記録し、２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅をＡとするステップと、
（２）測定すべき目標抗原または抗体を含む既知の一連の標準物質の２回の読み取りの差分増幅Ａ’に基づいて標準曲線を作成し、及び／または、測定すべき目標抗原または抗体を含む既知の一つの標準物質の２回の読み取りの差分増幅Ａ’’に基づいて標準を作成するステップと、
（３）測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅Ａを前記標準曲線および／または標準と比較するステップと、を含む免疫測定方法であって、
前記測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅Ａは、前記標準曲線と比較され、
前記既知の一連の標準物質の濃度は、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果が生じる濃度よりも低く、および／または前記既知の標準物質は陽性対照であり、
前記方法は、
（４）測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記標準曲線の最大値を超えている場合、サンプルを希釈してから測定するステップ、をさらに含み、
前記免疫測定方法は、さらに、
（ａ１）測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルを第１の抗体または抗原によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体または抗原と混合し、インキュベートすることによって、混合液が得られるステップと、
（ａ２）１回目の読み取り：ステップ（ａ１）の混合液に、さらに、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、インキュベートした後に励起光を照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ１とするステップと、
（ａ３）２回目の読み取り：ステップ（ａ２）において１回目の読み取りを行った後の反応溶液をさらにインキュベートした後に、励起光を再度照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ２とするステップと、
（ａ４）サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値に対する２回目の読み取りによって得られた信号値の増幅Ａについて、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％で算出するステップと、
（ａ５）測定すべき目標抗原または抗体を含む既知の一連の標準物質（ただし、標準物質の濃度は、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果が生じる濃度よりも低い）の２回の読み取りの増幅Ａ’に基づいて標準曲線を作成するステップと、
（ａ６）測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記標準曲線の最大値を超えている場合、サンプルを希釈してから測定するステップと、を含むことを特徴とする免疫測定方法。
【請求項１０】
（１）測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルに対して化学発光免疫反応を行い、化学発光を励起させ１回目と２回目の読み取りを記録し、２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅をＡとするステップと、
（２）測定すべき目標抗原または抗体を含む既知の一連の標準物質の２回の読み取りの差分増幅Ａ’に基づいて標準曲線を作成し、及び／または、測定すべき目標抗原または抗体を含む既知の一つの標準物質の２回の読み取りの差分増幅Ａ’’に基づいて標準を作成するステップと、
（３）測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅Ａを前記標準曲線および／または標準と比較するステップと、を含む免疫測定方法であって、
測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅Ａを前記標準と比較し、かつ前記標準は臨界値であり、および／または、前記既知の標準物質は陽性対照であり、
前記方法は、
（４）測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記臨界値を超えていると、前記測定対象サンプルの濃度が既知の標準物質の濃度よりも高くなっているとするステップ、をさらに含み、
前記方法は、
（ｃ１）測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルを第１の抗体または抗原によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体または抗原と混合し、インキュベートすることによって、混合液が得られるステップと、
（ｃ２）１回目の読み取り：ステップ（ｃ１）の混合液に、さらに、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、インキュベートした後に励起光を照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ１とするステップと、
（ｃ３）２回目の読み取り：ステップ（ｃ２）において１回目の読み取りを行った後の反応溶液をさらにインキュベートした後に、励起光を再度照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ２とするステップと、
（ｃ４）サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値に対する２回目の読み取りによって得られた信号値の増幅Ａについて、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％で算出するステップと、
（ｃ５）測定すべき目標抗原または抗体を含む既知の一つの標準物質の２回の読み取りの増幅Ａ’’を臨界値とするステップと、
（ｃ６）測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａを臨界値と比較して、測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記臨界値を超えていると、前記測定対象サンプルの濃度が既知の標準物質の濃度よりも高くなっているとするステップと、をさらに含むことを特徴とする免疫測定方法。
【請求項１１】
（１）測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルに対して化学発光免疫反応を行い、化学発光を励起させ１回目と２回目の読み取りを記録し、２回目の読み取りと
１回目の読み取りとの間の差分増幅をＡとするステップと、
（２）測定すべき目標抗原または抗体を含む既知の一連の標準物質の２回の読み取りの差分増幅Ａ’に基づいて標準曲線を作成し、及び／または、測定すべき目標抗原または抗体を含む既知の一つの標準物質の２回の読み取りの差分増幅Ａ’’に基づいて標準を作成するステップと、
（３）測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅Ａを前記標準曲線および／または標準と比較するステップと、を含む免疫測定方法であって、
測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅Ａを前記標準と比較し、かつ前記標準は臨界値であり、および／または、前記既知の標準物質は陽性対照であり、
ここで、前記免疫測定方法は、
（４）測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記臨界値を超え、かつそれと同時に前記測定対象サンプルの１回目の読み取りが前記既知の標準物質よりも低くなっていると、サンプルを希釈してから測定するステップ、をさらに含み、
ここで、前記免疫測定方法は、
（ｄ１）測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルを第１の抗体または抗原によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体または抗原と混合し、インキュベートすることによって、混合液が得られるステップと、
（ｄ２）１回目の読み取り：ステップ（ｄ１）の混合液に、さらに、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、インキュベートした後に励起光を照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ１とするステップと、
（ｄ３）２回目の読み取り：ステップ（ｄ２）において１回目の読み取りを行った後の反応溶液をさらにインキュベートした後に、励起光を再度照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ２とするステップと、
（ｄ４）サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値に対する２回目の読み取りによって得られた信号値の増幅Ａについて、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％で算出するステップと、
（ｄ５）測定すべき目標抗原または抗体を含む既知の一つの標準物質の２回の読み取りの増幅Ａ’’を臨界値とするステップと、
（ｄ６）測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａを臨界値と比較して、測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記臨界値を超え、かつそれと同時に前記測定対象サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値が前記既知の標準物質よりも低くなっていると、サンプルを希釈してから測定するステップと、をさらに含むことを特徴とする免疫測定方法。
【請求項１２】
（１）測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルに対して化学発光免疫反応を行い、化学発光を励起させ１回目と２回目の読み取りを記録し、２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅をＡとするステップと、
（２）測定すべき目標抗原または抗体を含む既知の一連の標準物質の２回の読み取りの差分増幅Ａ’に基づいて標準曲線を作成し、及び／または、測定すべき目標抗原または抗体を含む既知の一つの標準物質の２回の読み取りの差分増幅Ａ’’に基づいて標準を作成するステップと、
（３）測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅Ａを前記標準曲線および／または標準と比較するステップと、を含む免疫測定方法であって、
測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅Ａを前記標準と比較し、かつ前記標準は臨界値であり、および／または、前記既知の標準物質は陽性対照であり、
ここで、前記免疫測定方法は、
（４）前記サンプルの濃度を特定するステップをさらに含み、
ここで、前記免疫測定方法は、
（ｂ１）測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルを第１の抗体または抗原によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体または抗原と混合し、インキュベートすることによって、混合液が得られるステップと、
（ｂ２）１回目の読み取り：ステップ（ｂ１）の混合液に、さらに、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、インキュベートした後に励起光を照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ１とするステップと、
（ｂ３）２回目の読み取り：ステップ（ｂ２）において１回目の読み取りを行った後の反応溶液をさらにインキュベートした後に、励起光を再度照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ２とするステップと、
（ｂ４）サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値に対する２回目の読み取りによって得られた信号値の増幅Ａについて、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％で算出するステップと、
（ｂ５）測定すべき目標抗原または抗体を含む既知の一連の標準物質の２回の読み取りの増幅Ａ’に基づいて標準曲線を作成するステップと、
（ｂ６）Ａの値および標準曲線によって測定対象物質の濃度がその対応する校正曲線の上昇区間に位置するかそれとも下降区間に位置するかを特定し、測定対象サンプルのＲＬＵ１をそれに対応する前記校正曲線に代入して濃度を算出するステップと、をさらに含み、
前記校正曲線は、測定すべき目標抗原または抗体を含む既知の一連の標準物質の１回目の読み取りと既知の一連の標準物質の濃度によって作成された曲線であることを特徴とする免疫測定方法。
【請求項１３】
免疫測定を同定するためのシステムであって、
化学発光免疫反応を実施するための免疫反応装置と、
化学発光を励起させ１回目と２回目の読み取りを記録するとともに、２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅をＡとするための化学発光免疫反応励起及びカウント装置と、
プロセッサとを備え、
前記プロセッサは、測定すべき目標抗原または抗体を含む既知の一連の標準物質の２回の読み取りの増幅Ａに基づいて標準曲線を作成するのに用いられ、ここで標準物質の濃度はＨＤ−ＨＯＯＫ効果が生じる濃度よりも低く、測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記標準曲線の最大値を超えている場合、サンプルを希釈してから測定し、
ここで、前記システムを使用する方法は、
（１）測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルを第１の抗体または抗原によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体または抗原と混合し、インキュベートすることによって、混合液が得られるステップと、
（２）１回目の読み取り：ステップ（１）の混合液に、さらに、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、インキュベートした後に励起光を照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ１とするステップと、
（３）２回目の読み取り：ステップ（２）において１回目の読み取りを行った後の反応溶液をさらにインキュベートした後に、励起光を再度照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ２とするステップと、
（４）サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値に対する２回目の読み取りによって得られた信号値の増幅Ａについて、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％
で算出するステップと、
（５）測定すべき目標抗原または抗体を含む既知の一連の標準物質（ただし、標準物質
の濃度はＨＤ−ＨＯＯＫ効果が生じる濃度よりも低くなっている）の２回の読み取りの増幅Ａに基づいて標準曲線を作成するステップと、
（６）測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記標準曲線の最大値を超えている場合、サンプルを希釈してから測定するステップとを含むことを特徴とする、免疫測定を同定するためのシステム。
【請求項１４】
免疫測定を同定するためのシステムであって、
化学発光免疫反応を実施するための免疫反応装置と、
化学発光を励起させ１回目と２回目の読み取りを記録するとともに、２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅をＡとするための化学発光免疫反応励起及びカウント装置と、
プロセッサとを備え、
前記プロセッサは、測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａを臨界値と比較するのに用いられ、
ここで前記システムを使用する方法は、
（１）測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルを第１の抗体または抗原によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体または抗原と混合し、インキュベートすることによって、混合液が得られるステップと、
（２）１回目の読み取り：ステップ（１）の混合液に、さらに、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、インキュベートした後に励起光を照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ１とするステップと、
（３）２回目の読み取り：ステップ（２）において１回目の読み取りを行った後の反応溶液をさらにインキュベートした後に、励起光を再度照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ２とするステップと、
（４）サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値に対する２回目の読み取りによって得られた信号値の増幅Ａについて、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％で算出するステップと、
（５）測定すべき目標抗原または抗体を含む既知の一つの標準物質の２回の読み取りの増幅Ａを臨界値とするステップと、
（６）測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａを臨界値と比較して、測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記臨界値を超えていると、前記測定対象サンプルの濃度が前記既知の標準物質の濃度よりも高くなっているとするステップとを含むことを特徴とする、前記免疫測定を同定するためのシステム。
【請求項１５】
免疫測定を同定するためのシステムであって、
化学発光免疫反応を実施するための免疫反応装置と、
化学発光を励起させ１回目と２回目の読み取りを記録するとともに、２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅をＡとするための化学発光免疫反応励起及びカウント装置と、
プロセッサとを備え、
前記プロセッサは、測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａを臨界値と比較するのに用いられ、測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記臨界値を超え、かつそれと同時に前記測定対象サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値が前記臨界値の決定に用いた既知の標準物質よりも低くなっていると、サンプルを希釈してから測定し、
前記既知の標準物質は陽性対照であり、
ここで前記システムを使用する方法は、
（１）測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルを第１の抗体または抗原によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体または抗原と混合し、インキュベートすることによって、混合液が得られるステップと、
（２）１回目の読み取り：ステップ（１）の混合液に、さらに、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、インキュベートした後に励起光を照射して出射光量を検出し
光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ１とするステップと、
（３）２回目の読み取り：ステップ（２）において１回目の読み取りを行った後の反応溶液をさらにインキュベートした後に、励起光を再度照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ２とするステップと、
（４）サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値に対する２回目の読み取りによって得られた信号値の増幅Ａについて、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％で算出するステップと、
（５）測定すべき目標抗原または抗体を含む既知の一つの標準物質の２回の読み取りの増幅Ａを臨界値とするステップと、
（６）測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａを臨界値と比較して、測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記臨界値を超え、かつそれと同時に前記測定対象サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値が前記既知の標準物質よりも低くなっていると、サンプルを希釈してから測定するステップとを含むことを特徴とする、免疫測定を同定するためのシステム。
【請求項１６】
免疫測定を同定するためのシステムであって、
化学発光免疫反応を実施するための免疫反応装置と、
化学発光を励起させ１回目と２回目の読み取りを記録するとともに、２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅をＡとするための化学発光免疫反応励起及びカウント装置と、
プロセッサとを備え、
前記プロセッサは、測定すべき目標抗原または抗体を含む既知の一連の標準物質の１回目の読み取りと２回の読み取りの増幅Ａに基づいてそれぞれ校正曲線と標準曲線を作成し、測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルの１回目の読み取りと２回の読み取りの増幅Ａをそれぞれ校正曲線及び標準曲線と比較して、サンプルの濃度を特定するのに用いられ、
ここで、前記システムを使用する方法は、
（１）測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルを第１の抗体または抗原によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体または抗原と混合し、インキュベートすることによって、混合液が得られるステップと、
（２）１回目の読み取り：ステップ（１）の混合液に、さらに、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、インキュベートした後に励起光を照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ１とするステップと、
（３）２回目の読み取り：ステップ（２）において１回目の読み取りを行った後の反応溶液をさらにインキュベートした後に、励起光を再度照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ２とするステップと、
（４）サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値に対する２回目の読み取りによって得られた信号値の増幅Ａについて、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％で算出するステップと、
（５）測定すべき目標抗原または抗体を含む既知の一連の標準物質の２回の読み取りの増幅Ａに基づいて標準曲線を作成するステップと、
（６）Ａの値によって測定対象物質の濃度が標準曲線の上昇区間に位置するかそれとも下降区間に位置するかを特定し、測定対象サンプルのＲＬＵ１をそれに対応する校正曲線に代入して濃度を算出するステップとを含むことを特徴とする、免疫測定を同定するためのシステム。
【請求項１７】
第１の抗体または抗原によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体または抗原、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を含むキットの使用方法であって、
（１）測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルに対して化学発光免疫反応を行い、化学発光を励起させ１回目と２回目の読み取りを記録し、２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅をＡとするステップと、
（２）測定すべき目標抗原または抗体を含む既知の一連の標準物質の２回の読み取りの差分増幅Ａ’に基づいて標準曲線を作成し、及び／または、測定すべき目標抗原または抗体を含む既知の一つの標準物質の２回の読み取りの差分増幅Ａ’’に基づいて標準を作成するステップと、
（３）測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅Ａを前記標準曲線および／または標準と比較するステップとを含み、
ここで、測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅Ａを前記標準曲線と比較し、
前記既知の一連の標準物質の濃度は、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果が生じる濃度よりも低く、および／または前記既知の標準物質は陽性対照であり、
前記キットの使用方法は、
（４）測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記標準曲線の最大値を超えている場合、サンプルを希釈してから測定するステップをさらに含み、
また前記キットの使用方法は、
（ａ１）測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルを第１の抗体または抗原によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体または抗原と混合し、インキュベートすることによって、混合液が得られるステップと、
（ａ２）１回目の読み取り：ステップ（ａ１）の混合液に、さらに、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、インキュベートした後に励起光を照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ１とするステップと、
（ａ３）２回目の読み取り：ステップ（ａ２）において１回目の読み取りを行った後の反応溶液をさらにインキュベートした後に、励起光を再度照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ２とするステップと、
（ａ４）サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値に対する２回目の読み取りによって得られた信号値の増幅Ａについて、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％で算出するステップと、
（ａ５）測定すべき目標抗原または抗体を含む既知の一連の標準物質（ただし、標準物質の濃度は、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果が生じる濃度よりも低い）の２回の読み取りの増幅Ａ'に基づいて標準曲線を作成するステップと、
（ａ６）測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記標準曲線の最大値を超えている場合、サンプルを希釈してから測定するステップとを含むことを特徴とする、前記キットの使用方法。
【請求項１８】
第１の抗体または抗原によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体または抗原、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を含むキットの使用方法であって、
（１）測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルに対して化学発光免疫反応を行い、化学発光を励起させ１回目と２回目の読み取りを記録し、２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅をＡとするステップと、
（２）測定すべき目標抗原または抗体を含む既知の一連の標準物質の２回の読み取りの差分増幅Ａ’に基づいて標準曲線を作成し、及び／または、測定すべき目標抗原または抗体を含む既知の一つの標準物質の２回の読み取りの差分増幅Ａ’’に基づいて標準を作成するステップと、
（３）測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅Ａを前記標準曲線および／または標準と比較するステップとを含み、
ここで、測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅Ａを前記標準曲線と比較し、
前記既知の一連の標準物質の濃度は、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果が生じる濃度よりも低く、および／または前記既知の標準物質は陽性対照であり、
測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅Ａを前記標準と比較し、かつ前記標準は臨界値であり、
ここで、前記キットの使用方法は、
（４）測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記臨界値を超えていると、前記測定対象サンプルの濃度が既知の標準物質の濃度よりも高くなっているとするステップをさらに含み、
および／または、前記既知の標準物質は陽性対照であり、
また、前記キットの使用方法は、
（ｃ１）測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルを第１の抗体または抗原によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体または抗原と混合し、
インキュベートすることによって、混合液が得られるステップと、
（ｃ２）１回目の読み取り：ステップ（ｃ１）の混合液に、さらに、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、インキュベートした後に励起光を照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ１とするステップと、
（ｃ３）２回目の読み取り：ステップ（ｃ２）において１回目の読み取りを行った後の反応溶液をさらにインキュベートした後に、励起光を再度照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ２とするステップと、
（ｃ４）サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値に対する２回目の読み取りによって得られた信号値の増幅Ａについて、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％で算出するステップと、
（ｃ５）測定すべき目標抗原または抗体を含む既知の一つの標準物質の２回の読み取りの増幅Ａ’’を臨界値とするステップと、
（ｃ６）測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａを臨界値と比較して、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記臨界値を超えていると、前記測定対象サンプルの濃度が既知の標準物質の濃度よりも高くなっているとするステップと、を含むことを特徴とする前記キットの使用方法。
【請求項１９】
第１の抗体または抗原によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体または抗原、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を含むキットの使用方法であって、
（１）測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルに対して化学発光免疫反応を行い、化学発光を励起させ１回目と２回目の読み取りを記録し、２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅をＡとするステップと、
（２）測定すべき目標抗原または抗体を含む既知の一連の標準物質の２回の読み取りの差分増幅Ａ’に基づいて標準曲線を作成し、及び／または、測定すべき目標抗原または抗体を含む既知の一つの標準物質の２回の読み取りの差分増幅Ａ’’に基づいて標準を作成するステップと、
（３）測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅Ａを前記標準曲線および／または標準と比較するステップとを含み、
ここで、測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅Ａを前記標準曲線と比較し、
前記既知の一連の標準物質の濃度は、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果が生じる濃度よりも低く、および／または前記既知の標準物質は陽性対照であり、
測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅Ａを前記標準と比較し、かつ前記標準は臨界値であり、
前記キットの使用方法は、
（４）測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記臨界値を超え、かつそれと同時に前記測定対象サンプルの１回目の読み取りが前記既知の標準物質よりも低くなっていると、サンプルを希釈してから測定するステップをさらに含み、
ここで、前記キットの使用方法は、
（ｄ１）測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルを第１の抗体または抗原によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体または抗原と混合し、インキュベートすることによって、混合液が得られるステップと、
（ｄ２）１回目の読み取り：ステップ（ｄ１）の混合液に、さらに、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、インキュベートした後に励起光を照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ１とするステップと、
（ｄ３）２回目の読み取り：ステップ（ｄ２）において１回目の読み取りを行った後の反応溶液をさらにインキュベートした後に、励起光を再度照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ２とするステップと、
（ｄ４）サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値に対する２回目の読み取りによって得られた信号値の増幅Ａについて、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％で算出するステップと、
（ｄ５）測定すべき目標抗原または抗体を含む既知の一つの標準物質の２回の読み取りの増幅Ａ’’を臨界値とするステップと、
（ｄ６）測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａを臨界値と比較して、測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記臨界値を超え、かつそれと同時に前記測定対象サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値が前記既知の標準物質よりも低くなっていると、サンプルを希釈してから測定するステップとを含むことを特徴とする、キットの使用方法。
【請求項２０】
第１の抗体または抗原によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体または抗原、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を含むキットの使用方法であって、
（１）測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルに対して化学発光免疫反応を行い、化学発光を励起させ１回目と２回目の読み取りを記録し、２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅をＡとするステップと、
（２）測定すべき目標抗原または抗体を含む既知の一連の標準物質の２回の読み取りの差分増幅Ａ’に基づいて標準曲線を作成し、及び／または、測定すべき目標抗原または抗体を含む既知の一つの標準物質の２回の読み取りの差分増幅Ａ’’に基づいて標準を作成するステップと、
（３）測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅Ａを前記標準曲線および／または標準と比較するステップとを含み、
ここで、測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅Ａを前記標準曲線と比較し、
前記キットの使用方法は、
（４）サンプルの濃度を特定するステップをさらに含み、
ここで、前記キットの使用方法は、
（ｂ１）測定すべき目標抗原または抗体を含む測定対象サンプルを第１の抗体または抗原によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体または抗原と混合し、インキュベートすることによって、混合液が得られるステップと、
（ｂ２）１回目の読み取り：ステップ（ｂ１）の混合液に、さらに、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、インキュベートした後に励起光を照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ１とするステップと、
（ｂ３）２回目の読み取り：ステップ（ｂ２）において１回目の読み取りを行った後の反応溶液をさらにインキュベートした後に、励起光を再度照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ２とするステップと、
（ｂ４）サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値に対する２回目の読み取りによって得られた信号値の増幅Ａについて、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％で算出するステップと、
（ｂ５）測定すべき目標抗原または抗体を含む既知の一連の標準物質の２回の読み取りの増幅Ａ’に基づいて標準曲線を作成するステップと、
（ｂ６）Ａの値によって測定対象物質の濃度が標準曲線の上昇区間に位置するかそれとも下降区間に位置するかを特定し、測定対象サンプルのＲＬＵ１をそれに対応する校正曲線に代入して濃度を算出するステップとをさらに含み、
前記標準曲線は、測定すべき目標抗原または抗体を含む既知の一連の標準物質の１回目の読み取りと既知の一連の標準物質の濃度によって作成された曲線であることを特徴とする、キットの使用方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、２０１６年１１月２２日に提出された、発明の名称が「免疫測定方法、免疫測定を同定するためのシステム及びキット」である中国特許出願ＣＮ２０１６１１０２６６２３．１を基礎として優先権を主張するものであり、その記載内容の全てを、ここに援用する。
本願は、２０１６年１１月２２日に提出された、発明の名称が「免疫測定方法、免疫測定を同定するためのシステム及びキット」である中国特許出願ＣＮ２０１６１１０３４２３７．７を基礎として優先権を主張するものであり、その記載内容の全てを、ここに援用する。
本願は、２０１６年１１月２２日に提出された、発明の名称が「ＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルを同定する方法及び免疫測定におけるＨＤ−ＨＯＯＫ効果を同定するシステム」である中国特許出願ＣＮ２０１６１１０３４２５２．１を基礎として優先権を主張するものであり、その記載内容の全てを、ここに援用する。
本願は、２０１７年０８月０５日に提出された、発明の名称が「免疫測定装置」である中国特許出願ＣＮ２０１７１０６９５５３０．６を基礎として優先権を主張するものであり、その記載内容の全てを、ここに援用する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、光励起化学発光（Ｌｉｇｈｔ  Ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ａｓｓａｙ、ＬｉＣＡ）の技術分野に関し、具体的には、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルを同定する方法，免疫測定におけるＨＤ−ＨＯＯＫ効果を同定するためのシステム、キット及び装置，免疫測定方法，免疫測定を同定するためのシステム、キット及び装置に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
免疫学的検出は抗原抗体の特異的反応原理に基づいて行われるものであり、同位体、酵素、化学発光物質などを利用して被測定物を表示したり信号を増幅させたりすることができるので、よくタンパク質、ホルモンなどの微量生物活性物質を検出するのに用いられる。
【０００４】
化学発光免疫分析は、近年、発展が迅速な非放射性免疫検出技術であり、その原理が化学発光物質を利用して信号を増幅させると共に、その発光強度によって、免疫結合過程に対して直接測定するものである。この方法は、免疫学的検出の重要な方向の一つとなっている。
【０００５】
光励起化学発光法は、化学発光分析技術の常法の一つであり、生物分子間の相互作用の研究に使用することができ、臨床的には、主に疾病の検出に用いられる。この技術は、高分子微粒子技術、有機合成、タンパク質化学及び臨床検出など関連分野の研究が統合されている。それは、感光微粒子と発光微粒子を一定の範囲内で結合させることで、イオン化酸素エネルギーの伝達が発生し、光信号が発せられることによって、測定対象サンプルを検出するものとされている。ここで、感光微粒子の内部に感光化合物が充填されて、発光微粒子の内部に発光化合物とランタノイド族元素が充填されている。赤色レーザ光（６００〜７００ｎｍ）の励起で、感光微粒子はエネルギーの高い状態の一重項酸素イオン（４μＳ）を放出し、その伝播距離は約２００ｎｍとされている。感光微粒子と発光微粒子の距離が十分に接近すると、感光微粒子が放出した一重項酸素イオンが発光微粒子に到達することができ、そして一連の化学反応により、５２０〜６２０ｎｍの高いエネルギー準位の光を放出し、機器によって検出される。本反応系では、微粒子の濃度が低く、衝突確率が小さく、バックグラウンド信号が微弱である。感光微粒子と発光微粒子とが免疫反応によって結合された後になってはじめて、明らかな光を放出するようになるため、システムの感度が高い。疾病の診断において、通常の検出モードには、抗原または抗体を被覆する発光微粒子、ビオチンまたはジゴキシゲニンによって標識された抗原又は抗体、アビジン又は抗ジゴキシゲニンによって被覆された感光微粒子、中和抗原又は抗体等の３つ〜４つの成分が含まれている。以上の各成分は、２つのステップ以上のインキュベート反応によって、測定対象の抗原または抗体に結合され、化学出射光量の強弱で測定対象サンプルを定性的または定量的に検出する。従来の酵素免疫分析方法と比較して、均一、感度が高く、操作が簡便で自動化しやすい等の特徴を有する。したがって、その応用の見通しは非常に広い。
【０００６】
Ｄｏｕｂｌｅ−Ａｎｔｉ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙの検出モードにおいて、検出対象物質の濃度が一定の濃度まで高くなった時、Ｄｏｕｂｌｅ−Ａｎｔｉ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ複合体を形成することができないために信号値が低いという現象は、高用量−フック効果（Ｈｉｇｈ  Ｄｏｓｅ−Ｈｏｏｋ  Ｅｆｆｅｃｔ、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果）と呼ばれる。つまり、高用量−フック効果とは、Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｉｔｅ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙにおいて、その用量反応曲線における高用量部分の線形性傾向が後に向けて平らに無限延伸するのではなく、フック状のように下方に向けて湾曲されるため、偽陰性の現象が発生してしまう。
【０００７】
ＨＤ−ＨＯＯＫ効果は免疫検出で頻繁に発生するもので、その発生率は陽性サンプルの３０％程度を占めている。ＨＤ−ＨＯＯＫ効果の存在により、測定対象サンプルに対して、その濃度が検出用キットの線形性範囲を超えたためか、それともそれ自体の濃度がその値であるかを正しく区別できないため、実験上の誤診を招いてしまい、特に偽陰性率が上昇することとなる。
【０００８】
具体的には、一方、高濃度のサンプルを検出する際に、高用量−フック効果により、検出信号が低くなり、サンプルについても濃度が低いと誤って判読されるおそれがある。従来の解決策としては、試薬の成分を増やし、測定対象サンプルを希釈したり２段法で検出したりすることである。
【０００９】
その一方、高用量−フック効果により、サンプル濃度が一定の値まで高くなると、信号が続けて上昇するわけではなく、検出範囲が制限されている。従来では、主に抗体の最適化または抗体の向上によって検出範囲を広げるとされている。
【００１０】
通常の検出フローには、測定対象物および試薬の反応孔への投入、１段目のインキュベーション、汎用液の添加、２段目のインキュベーション及び読み取り、という５つのステップが含まれている。
【００１１】
本発明の検出方法は、通常の検出フローに基づいて、反応を中断することなく、反応過程において信号値を複数回読み取り、信号の変化を観測することによってサンプルの真実の濃度を判断するものである。
【発明の概要】
【００１２】
従来技術に存在する欠陥に関して、本発明は、反応を中断することなく、２回の読み取りによって検出範囲を広げるとともに、測定対象サンプルにＨＤ−ＨＯＯＫ効果が存在するかどうかを正確に判定し、測定対象サンプルにおける測定対象物の濃度を簡便かつ迅速に算出することができる、免疫測定方法を提供することを目的とする。
【００１３】
上記目的及び他の関連する目的を達成するために、本発明は以下の技術的手段を採用する。
【００１４】
本発明の第１の側面は、校正品、ピーク校正品、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルに対して化学発光免疫反応を行い、化学発光を励起させ１回目と２回目の読み取りを記録し、ピーク校正品の２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分の増幅ＡをＲ０とし、測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の増幅Ａ’がＲ０を超えているかを比較し、Ｒ０を超えている場合、サンプルがＨＤ−ＨＯＯＫ効果を有し、Ｒ０未満の場合、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果を有しないとする、というステップを含む、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルを同定する方法を提供する。
【００１５】
なお、測定対象サンプルの差分増幅とピーク校正品の差分増幅を検出する反応条件及び反応時間はいずれも一致している。本発明の一つの好ましい実施の形態によれば、前記方法は、
（１）校正品、ピーク校正品、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルを第１の抗体（または抗原）によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体（または抗原）と混合し、インキュベートすることによって、混合液が得られるステップと、
（２）１回目の読み取り：ステップ（１）の混合液に、さらに、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、インキュベートした後に励起光を照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ１とするステップと、
（３）２回目の読み取り：ステップ（２）において１回目の読み取りを行った後の反応溶液をさらにインキュベートした後に、励起光を再度照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ２とするステップと、
（４）サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値に対する２回目の読み取りによって得られた信号値の増幅Ａについて、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％で算出するステップと、
（５）ピーク校正品の２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分の増幅ＡをＲ０とするステップと、
（６）測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａ’の値をＲ０と比較し、Ａ’がＲ０以上である場合、このサンプルがＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルであると同定するステップと、を含む。
【００１６】
本明細書では、用語「ピーク校正品」とは、特定の濃度の測定対象物を含むサンプルを意味し、ここで、Ｄｏｕｂｌｅ−Ａｎｔｉ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙによる測定対象物用量反応曲線における高用量部分の線形性傾向が下方に向かって曲がり始めるときの濃度は、ピーク校正品における測定対象物の濃度となる。
【００１７】
本発明の一つの好ましい実施の形態によれば、測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａ’の値をＲ０と比較し、Ａ’がＲ０以上である場合、測定対象サンプルがＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルであり、希釈する必要があり、Ａ’がＲ０未満の場合、そのまま校正曲線でサンプルの濃度を算出するとされている。
前記校正曲線は、校正品の１回目の読み取りと校正品の濃度によって作成された曲線である。
【００１８】
本発明の一つの好ましい実施の形態によれば、発光微粒子とは発光化合物およびランタノイド族元素化合物が充填されている高分子微粒子のことをいい、前記感光微粒子は感光化合物が充填されている高分子微粒子であり、赤色レーザ光による励起で一重項酸素イオンを発生させることができる。
【００１９】
本発明の一つの好ましい実施の形態によれば、ステップ（２）と（３）において、６００〜７００ｎｍの赤色励起光で照射し、反応溶液の出射光量を検出し、出射光の検出波長は５２０〜６２０ｎｍとされている。
【００２０】
本発明の一つの好ましい実施の形態によれば、前記抗原とは免疫原性を有する物質をいい、前記抗体とは有機体によって生じられた、特定の外来物を認識することができる免疫グロブリンをいい、前記第１の抗体及び第２の抗体とは前記目標抗原に特異的に結合可能な抗体をいい、前記第１の抗原および第２の抗原とは、前記目標抗体に特異的に結合可能な抗原をいう。
【００２１】
本発明の第２の側面は、
化学発光免疫反応を実施するための免疫反応装置と、
化学発光を励起させ１回目と２回目の読み取りを記録するための化学発光免疫反応励起及びカウント装置と、
測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅Ａ’によってＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルの有無を特定するためのプロセッサと、を備える
免疫測定におけるＨＤ−ＨＯＯＫ効果を同定するためのシステムを提供する。
【００２２】
本発明の一つの好ましい実施の形態によれば、前記システムは、
化学発光免疫反応を実施するための免疫反応装置と、
化学発光を励起させ１回目と２回目の読み取りを記録するための化学発光免疫反応励起及びカウント装置と、
測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅Ａ’が、ピーク校正品の２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分の増幅Ｒ０を超えているかを比較し、Ｒ０を超えている場合、サンプルがＨＤ−ＨＯＯＫ効果を有し、Ｒ０未満の場合、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果を有しないとするプロセッサと、を備え、
化学発光の２回目の読み取りは、同一の免疫反応に対して一定の時間が経過した後に再度励起させ読み取ることによって得られるものである。
【００２３】
１つの具体的な実施の形態においては、本発明の免疫測定を同定するためのシステムは、例えば溶液の収容容器のような免疫反応装置と、例えば光子カウントモジュールと発光ダイオードのような化学発光免疫反応励起及びカウント装置と、たとえばコンピュータのような前記読み取りに対して処理やプロットなどをするプロセッサを備える。このような免疫測定を同定するためのシステムは、例えば、本出願人の実用新案ＣＮ２０１５３２６４６Ｕを参照することができ、その記載内容の全てを、ここに援用する。
【００２４】
本発明の一つの好ましい実施の形態によれば、前記システムの使用方法は、
（１）校正品、ピーク校正品、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルを第１の抗体（または抗原）によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体（または抗原）と混合し、インキュベートすることによって、混合液が得られるステップと、
（２）１回目の読み取り：ステップ（１）の混合液に、さらに、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、インキュベートした後に励起光を照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ１とするステップと、
（３）２回目の読み取り：ステップ（２）において１回目の読み取りを行った後の反応溶液をさらにインキュベートした後に、励起光を再度照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ２とするステップと、
（４）サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値に対する２回目の読み取りによって得られた信号値の増幅Ａについて、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％で算出するステップと、
（５）ピーク校正品の２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分の増幅ＡをＲ０とするステップと、
（６）測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａ’の値をＲ０と比較し、Ａ’がＲ０以上である場合、このサンプルがＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルであると同定するステップと、を含む。
【００２５】
本発明によれば、測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａ’の値をＲ０と比較し、Ａ’がＲ０以上である場合、測定対象サンプルがＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルであり、希釈する必要があり、Ａ’がＲ０未満の場合、そのまま校正曲線でサンプルの濃度を算出するとされている。
前記校正曲線は、校正品の１回目の読み取りと校正品の濃度によって作成された曲線である。
【００２６】
本発明の第３の側面は、校正品、ピーク校正品、第１の抗体（または抗原）によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体（または抗原）、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を含むキットであって、前記キットの使用方法は、校正品、ピーク校正品、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルに対して化学発光免疫反応を行い、化学発光を励起させ１回目と２回目の読み取りを記録し、測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅Ａ’によってＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルの有無を特定することを特徴とするキットを提供する。
【００２７】
本発明の一つの好ましい実施の形態によれば、前記キットの使用方法は、校正品、ピーク校正品、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルに対して化学発光免疫反応を行い、化学発光を励起させ１回目と２回目の読み取りを記録し、測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の増幅Ａ’がピーク校正品の２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分の増幅Ｒ０を超えているかを比較し、Ｒ０を超えている場合、サンプルがＨＤ−ＨＯＯＫ効果を有し、Ｒ０未満の場合、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果を有しないとする、というステップを含む。
【００２８】
本発明の一つの好ましい実施の形態によれば、前記キットの使用方法は、
（１）校正品、ピーク校正品、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルを第１の抗体（または抗原）によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体（または抗原）と混合し、インキュベートすることによって、混合液が得られるステップと、
（２）１回目の読み取り：ステップ（１）の混合液に、さらに、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、インキュベートした後に励起光を照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ１とするステップと、
（３）２回目の読み取り：ステップ（２）において１回目の読み取りを行った後の反応溶液をさらにインキュベートした後に、励起光を再度照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ２とするステップと、
（４）サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値に対する２回目の読み取りによって得られた信号値の増幅Ａについて、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％で算出するステップと、
（５）ピーク校正品の２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分の増幅ＡをＲ０とするステップと、
（６）測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａ’の値をＲ０と比較し、Ａ’がＲ０以上である場合、このサンプルがＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルであると同定するステップと、を含む。
【００２９】
本発明の一つの好ましい実施の形態によれば、測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａ’の値をＲ０と比較し、Ａ’がＲ０以上である場合、測定対象サンプルがＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルであり、希釈する必要があり、Ａ’がＲ０未満の場合、そのまま校正曲線でサンプルの濃度を算出するとされている。
前記校正曲線は、校正品の１回目の読み取りと校正品の濃度によって作成された曲線である。
【００３０】
ここで、上記方法は非疾患診断目的の方法であることに特に留意されたく、前記方法はＤｏｕｂｌｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙまたはＤｏｕｂｌｅ−Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙの検出過程において簡便かつ迅速にＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルを選別し、高濃度の抗原（または抗体）サンプルを低濃度の抗原（または抗体）サンプルとして誤認されることを防止するのに用いられるものである。
【００３１】
好ましくは、前記抗原とは免疫原性を有する物質をいう。例えば、タンパク質、ポリペプチドが挙げられる。代表的な抗原（これに限定されるものではない）として、サイトカイン、腫瘍マーカー、メタロプロテイン、心血管糖尿病関連タンパク質などが挙げられる。
【００３２】
前記抗体とは、有機体によって生じられた、特定の外来物を認識することができる免疫グロブリンをいう。
【００３３】
本発明の実施例において、前記抗原又は抗体は、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、Ｂ型肝炎表面抗体（ＨＢｓＡｂ）、癌抗原１２５（ＣＡ１２５）、フェリチン（Ｆｅｒｒ）およびＣペプチド（ＣＰ）から選ばれるものである。
【００３４】
本発明の方法によって検出され得るサンプルは特に限定されず、測定すべき目標抗原（または抗体）が含まれる任意のサンプルであってもよく、代表的な例としては、血清サンプル、尿サンプル、唾液サンプルなどが挙げられる。本発明では、血清サンプルが好ましい。
【００３５】
好ましくは、前記第１の抗体及び第２の抗体は、前記抗原に特異的に結合可能な抗体である。
【００３６】
同一の抗原に対して、対応する第１の抗体及び第２の抗体は同じでも異なっていてもよく、そして同時に前記抗原に結合することができる。
【００３７】
前記第１の抗原および第２の抗原は、前記目標抗体に特異的に結合可能な抗原をいう。
【００３８】
同一の抗体に対して、対応する第１の抗原及び第２の抗原は同じでも異なっていてもよく、そして同時に前記抗体に結合することができる。
【００３９】
好ましくは、前記標識物と標識物特異結合物とは特異的に結合することができる。
【００４０】
より好ましくは、前記標識物はビオチンであり、前記標識物特異結合物はストレプトアビジンである。
【００４１】
好ましくは、前記発光微粒子とは発光化合物およびランタノイド族元素化合物が充填されている高分子微粒子のことをいう。発光化合物は、Ｄｉｏｘｅｎｅ（ジオキセン）またはｔｈｉｏｘｅｎｅ（ジメチルチオフェン）の誘導体等とされてもよく、ランタノイド族元素化合物は、Ｅｕ（ＴＴＡ）３／ＴＯＰＯまたはＥｕ（ＴＴＡ）３／Ｐｈｅｎ等とされてもよく、当該微粒子は市販品から購入することができる。発光微粒子の表面官能基は、タンパク質を結合可能な任意の基であり得る。例えば、カルボキシル基、アルデヒド基、アミノ基、エポキシエチル基またはハロゲン化アルキル基などの様々な従来公知の、タンパク質を結合可能な官能基が挙げられる。
【００４２】
好ましくは、前記感光微粒子は感光化合物が充填されている高分子微粒子であり、赤色レーザ光による励起で一重項酸素イオンを発生させることができる。それが発光微粒子に十分に接近すると、一重項酸素イオンが発光微粒子に伝達され、発光微粒子中の発光化合物と反応して紫外線を発生し、紫外線によってさらにランタノイド族元素化合物が励起され特定の波長の光子を発生する。感光化合物としては、フタロシアニン染料などを用いることができ、当該微粒子も市販品から購入することができる。
【００４３】
好ましくは、ステップ（２）と（３）において、６００〜７００ｎｍの赤色励起光で照射し、反応溶液の出射光量を検出し、出射光の検出波長は５２０〜６２０ｎｍとされている。
【００４４】
さらに、赤色レーザ光（６００〜７００ｎｍ）で感光微粒子を照射し、感光微粒子に一重項酸素イオンを放出させ、一重項酸素イオンの一部が発光微粒子に受け入れられ、これによって５２０〜６２０ｎｍの高いエネルギー準位の光が出射される。
【００４５】
検出範囲内では、測定すべき目標抗原の濃度は、Ｄｏｕｂｌｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ複合体の数として表され、そして光子の数に比例する。しかしながら、測定すべき目標抗原の濃度が高すぎると、測定すべき抗原の一部がそれぞれ個別の抗体と結合するので、Ｄｏｕｂｌｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ複合体が減少し、光信号が低くなり、測定すべき目標抗原の真実の濃度が反映されなくなる。
【００４６】
同様に、検出範囲内では、測定すべき目標抗体の濃度は、Ｄｏｕｂｌｅ−Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ複合体の数として表され、そして光子の数に比例する。しかしながら、測定すべき目標抗体の濃度が高すぎると、測定すべき抗体の一部がそれぞれ個別の抗原と結合するので、Ｄｏｕｂｌｅ−Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ複合体が減少し、光信号が低くなり、測定すべき目標抗体の真実の濃度が反映されなくなる。
【００４７】
本発明の方法は、２回の読み取りによって、２回の読み取りによって得られた信号値の増幅間の関係を比較することによって、検出範囲を広げ、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルを区別することで機能する。２回の読み取りの違いは、以下の３つの点によって決められる。
【００４８】
第１点では、１回目の読み取りでは、感光微粒子が赤色レーザ光（６００〜７００ｎｍ）によって照射された後、一重項酸素イオンを放出する。一重項酸素イオンの一部が発光微粒子に伝達された後、一連の化学反応により、５２０〜６２０ｎｍの高いエネルギー準位の光を出射するが、一重項酸素イオンの他の一部が抗体（または抗原）に結合されていない測定すべき目標抗原（または抗体）と反応するので、測定すべき目標抗原（または抗体）の濃度を低下させるようになる。低濃度サンプルについては、測定すべき目標抗原（または抗体）の濃度が低下したら、Ｄｏｕｂｌｅ−Ａｎｔｉ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ複合体が減少し、２回目の読み取りでは信号値が低下する。高濃度のＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルについては、測定すべき目標抗原（または抗体）の濃度が低下したら、Ｄｏｕｂｌｅ−Ａｎｔｉ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ複合体が増加し、２回目の読み取りでは信号値が逆に上昇する。
【００４９】
第２点では、低濃度サンプルについては、感光微粒子が１回目の読み取り中に赤色レーザ光（６００〜７００ｎｍ）に照射され、一重項酸素イオンを放出した後、そのエネルギーが損失するので、２回目の読み取りでは信号が低下する。
【００５０】
第３点では、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果については、１回目の読み取りでは、抗原抗体反応がまだ平衡に達しておらず、２回の読み取りの間隔時間においても反応が正の方向に向けて進行するので、２回目の読み取りでは信号が上昇する。
【００５１】
以上に説明したように、本発明では、反応が平衡に達していないときに１回目の読み取りを行い、感光微粒子が励起光に照射され一重項酸素イオンを放出し、その一部が発光微粒子に伝達され、他の一部が未結合の測定すべき目標抗原または抗体と反応することができ、測定すべき目標抗原または抗体の一部が消耗され、反応平衡を逆の方向に移動させる一方、感光微粒子は１回の励起後に若干消耗され、２回目の読み取りでは、測定すべき目標抗原または抗体の濃度が低いサンプルの信号値が低下するのに対して、濃度が高いサンプルのＤｏｕｂｌｅ−Ａｎｔｉ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ複合体と感光微粒子との結合は１回目の読み取りではまだまだ平衡に達しておらず、２回目の読み取りでは反応が正の方向に移動するので信号が上昇することになり、測定すべき目標抗原（または抗体）の濃度の上昇と伴い、２回目の光励起による光の信号値および１回目の信号値の上昇幅も上昇する。信号の上昇幅はサンプルの濃度とは正の相関関係があり、２回の信号の増幅を比較すると、信号値が低く増幅が大きいサンプルがＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルであることを示すことができる。
【００５２】
本発明の第４の側面は、
化学発光免疫反応を記録するとともにインキュベートされた後の混合液に対して複数回の読み取りを実行するための読み取りユニットと、
前記読み取りユニットに接続され、前記読み取りユニットの読み取りによって免疫測定にはＨＤ−ＨＯＯＫのリスクの有無を判定する処理ユニットと、を備える
ＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルを同定するための測定装置を提供する。
【００５３】
本発明のいくつかの実施の形態では、インキュベートされた後の混合液を読み取りユニットに移動し読み取りを実行するための移動機構をさらに備える。
【００５４】
本発明の他のいくつかの実施の形態では、前記装置は、化学発光免疫反応のために適切な環境温度を提供するためのインキュベータをさらに備える。
【００５５】
本発明のいくつかの実施の形態では、前記装置は、読み取りが完了した後の混合液を前記インキュベータに復帰させ再度インキュベートするための復帰機構をさらに備える。
【００５６】
本発明のいくつかの具体的な実施の形態では、前記移動機構は押出し機構であり、前記復帰機構は押戻し機構であり、前記混合液はスラットで収容される。
【００５７】
本発明の他のいくつかの具体的な実施の形態では、前記読み取りユニットは化学発光免疫反応を記録するとともにインキュベートされた後の混合液に対して２回の読み取りを実行することに用いられる。
【００５８】
本発明のいくつかの具体的な実施の形態では、前記インキュベータは第１のインキュベータと第２のインキュベータとを有し、前記押出し機構は、第１のインキュベータ内でインキュベートされた後の混合液を第２のインキュベータに押出しインキュベートするのに用いられ、かつ前記押出し機構は第２のインキュベータ内でインキュベートされた後の混合液を読み取りユニットに押出し１回目の読み取りを実行するのに用いられ、
前記押戻し機構は、１回目の読み取りが完了した後の混合液を第２のインキュベータに押戻し再度インキュベートするのに用いられ、
前記押出し機構は、さらに、第２のインキュベータ内で再度インキュベートされた後の混合液を読み取りユニットに押出し２回目の読み取りを実行するのに用いられ、
前記処理ユニットが２回目の読み取りと１回目の読み取りの増幅が標準曲線の最大値を超えていると検出した場合、免疫測定にはＨＤ−ＨＯＯＫのリスクが存在すると判定する。
【００５９】
本発明の他のいくつかの具体的な実施の形態では、前記押戻し機構は、
底板と、
前記底板に設けられているガイドレールと、
前記ガイドレールに設けられ、スラットを支持するための移動カップ機構と、
前記移動カップ機構を前記ガイドレールに沿って移動させるための駆動装置と、
前記底板の両端に設けられ、前記移動カップ機構の位置を検出するための光電センサと、
前記光電センサに接続され、前記光電センサによって発せられた位置信号に基づいて前記移動カップ機構の位置を調整することができる位置調整機構と、を備える。
【００６０】
本発明のいくつかの具体的な実施の形態では、前記ガイドレールは直線レールまたは可変レールである。
【００６１】
本発明のいくつかの具体的な実施の形態では、前記装置は、前記インキュベータの一方の側に設けられ、測定対象サンプルと試薬とを混合させるためのスラット用試料添加皿と、前記インキュベータの他方の側に設けられ、試薬を収納するための試薬冷蔵領域とをさらに備える。
【００６２】
本発明の他のいくつかの具体的な実施の形態では、前記装置は、前記スラット用試料添加皿の一方の側に設けられた、ブランクスラットスタッキング及びローディング機構をさらに備え、前記ブランクスラットスタッキング及びローディング機構は、ブランクスラットをスラット用試料添加皿に押し付けるのに用いられる。
【００６３】
本発明のいくつかの具体的な実施の形態では、前記装置は、サンプル試験管を支持するためのサンプル試験管載置棚をさらに備える。
【００６４】
本発明の他のいくつかの具体的な実施の形態では、前記装置は、前記サンプル試験管載置棚におけるブランクスラットスタッキング及びローディング機構に近隣する側に設けられ、予備希釈プレートに対して希釈処理するための希釈プレートシェーカーをさらに備える。
【００６５】
本発明のいくつかの具体的な実施の形態では、前記装置は、試料添加針が設けられている機械式アームをさらに備え、
前記機械式アームは、前記サンプル試験管載置棚領域からサンプルを吸引してスラット用試料添加皿のスラット内に割り当てるための第１の機械式アームと、前記試薬冷蔵領域から試薬を吸引してスラット用試料添加皿のスラット内に割り当てるための第２の機械式アームとを有する。
【００６６】
本発明の他のいくつかの具体的な実施の形態では、前記装置は、第１の機械式アームの試料添加針を洗浄するための第１の洗浄機構と、第２の機械式アームの試料添加針を洗浄するための第２の洗浄機構とをさらに備える。
【００６７】
具体的には、サンプルがインキュベータに入る前に、以下のステップが行われる必要がある。
１．ブランクスラットがブランクスラットスタッキング及びローディング機構によってスラット用試料添加皿の位置Ｄ０に押し付けられる。
２．ブランクスラットがスラット用試料添加皿の位置Ｄ０に押し付けられた後、スラット用試料添加皿の位置Ｄ１まで時計回りに９０度回転させ、この位置で、第１の機械式アームでサンプル試験管載置棚領域からサンプルを吸引してブランクスラットに試料添加する。
３．試料添加完了後のスラットを、スラット用試料添加皿の位置Ｄ２まで時計回りに９０度回転させ、この位置では動作なし。
４．スラットを、スラット用試料添加皿の位置Ｄ３まで時計回りに９０度回転させ、この位置では、第２の機械式アームで試薬冷蔵領域から試薬を吸引して、当該位置にあるスラット内に割り当てる。
【００６８】
位置Ｄ３にある全てのスラットの試料添加が完了し、そして全てインキュベータに押し込まれた後（その押出し機構は未図示）、スラット用試料添加皿を位置Ｄ３から位置Ｄ０まで回転させ（この工程は、位置Ｄ１にあるスラットがサンプル割り当てを完了した後に行われる。）、スラット用試料添加皿の１回のサイクルが完了する。スラット用試料添加皿が全負荷で運転するとき、スラット用試料添加皿の位置Ｄ０ではブランクスラットがローディングされ、位置Ｄ１ではサンプルの割り当てが行われ、位置Ｄ２では待機中、位置Ｄ３では試薬の割り当てが行われ、そして試薬割り当て後にスラットがインキュベータに押し込まれる。スラット用試料添加皿の回転は、Ｄ０〜Ｄ３の４つの領域内の動作が全て完了するまで待たなければならない。
【００６９】
試料添加完了後のスラットが第１のインキュベータに入った後、スラットが押出し機構によって第２のインキュベータに送られ、この工程において、測定対象サンプルと試薬が含まれるスラットに標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加える必要もあり、その後サンプルを第２のインキュベータ１２に入れ、インキュベートされ、インキュベートされた後に、スラットが押出し機構によって読み取りユニットに送られ励起光に照射され、出射光量を検出し、１回目の読み取りを記録する。１回目の読み取りが完了した後のスラットが押戻し機構によって第２のインキュベータに押し戻され再度インキュベートされ、再度インキュベートされた後に、前記スラットは再び押出し機構によって読み取りユニットに送られ励起光に照射され、出射光量を検出し、２回目の読み取りを記録する。２回の読み取りが完了した後に、処理ユニットによって２回の読み取りが処理され、２回目の読み取りと１回目の読み取りの増幅が標準曲線の最大値を超えている場合、当該免疫測定にはＨＤ−ＨＯＯＫのリスクが存在すると判定する。一つの方法としては、その装置が定性的にＨＤ−ＨＯＯＫに関する提示情報を与え、作業者がサンプルを希釈してから再度測定することである。もう一つの方法としては、その装置が直接に定量的な結果を与えることであるが、その結果は線形性範囲よりも遥かに高くなっている。
【００７０】
従来技術と比べて、この装置は読み取りユニットを設けることにより、読み取りユニットでインキュベートされた後の混合液に対して２回乃至複数回の読み取りを実行し、そして処理ユニットで読み取りユニットによる読み取りを処理することによって、免疫測定にはＨＤ−ＨＯＯＫのリスクが存在するかどうかを判定し、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果に起因する、測定対象サンプルに対してその濃度が検出用キットの線形性範囲を超えたためか、それともそれ自体の濃度がその値であるかを正しく区別できないことを回避し、実験上の誤診を回避することができる。
【００７１】
本発明の第５の側面は、（１）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルに対して化学発光免疫反応を行い、化学発光を励起させ１回目と２回目の読み取りを記録し、２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅をＡとするステップと、（２）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む既知の一連の標準物質の２回の読み取りの差分増幅Ａ’に基づいて標準曲線を作成し、および／または、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む既知の一つの標準物質の２回の読み取りの差分増幅Ａ’’に基づいて標準を作成するステップと、（３）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅Ａを前記標準曲線および／または標準と比較するステップと、を含む免疫測定方法を提供する。
【００７２】
なお、測定対象サンプルの差分増幅と既知の標準物質の差分増幅を検出する反応条件及び反応時間はいずれも一致している。
【００７３】
本発明のいくつかの実施の形態では、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅Ａを前記標準曲線と比較する。
【００７４】
本発明のいくつかの実施例では、前記既知の標準物質の濃度は、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果が生じる濃度よりも低く、かつ前記既知の標準物質は陽性対照である。
【００７５】
本発明の他のいくつかの実施例では、前記方法は、（４）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記標準曲線の最大値を超えている場合、サンプルを希釈してから測定するステップ、をさらに含む。
【００７６】
本発明のいくつかの具体的な実施例では、前記方法は、
（ａ１）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルを第１の抗体（または抗原）によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体（または抗原）と混合し、インキュベートすることによって、混合液が得られるステップと、
（ａ２）１回目の読み取り：ステップ（ａ１）の混合液に、さらに、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、インキュベートした後に励起光を照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ１とするステップと、
（ａ３）２回目の読み取り：ステップ（ａ２）において１回目の読み取りを行った後の反応溶液をさらにインキュベートした後に、励起光を再度照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ２とするステップと、
（ａ４）サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値に対する２回目の読み取りによって得られた信号値の増幅Ａについて、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％で算出するステップと、
（ａ５）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む既知の一連の標準物質（ただし、標準物質の濃度は、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果が生じる濃度よりも低い。）の２回の読み取りの増幅Ａ’に基づいて標準曲線を作成するステップと、
（ａ６）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記標準曲線の最大値を超えている場合、サンプルを希釈してから測定するステップと、を含む。
【００７７】
本発明のいくつかの実施の形態では、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅Ａを前記標準と比較し、かつ前記標準は臨界値であり、および／または、前記既知の標準物質は陽性対照である。
【００７８】
本発明のいくつかの実施例では、前記方法は、（４）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記臨界値を超えていると、前記測定対象サンプルの濃度が既知の標準物質の濃度よりも高くなっているとするステップ、をさらに含む。
【００７９】
本発明のいくつかの具体的な実施例では、前記方法は、
（ｃ１）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルを第１の抗体（または抗原）によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体（または抗原）と混合し、インキュベートすることによって、混合液が得られるステップと、
（ｃ２）１回目の読み取り：ステップ（ｃ１）の混合液に、さらに、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、インキュベートした後に励起光を照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ１とするステップと、
（ｃ３）２回目の読み取り：ステップ（ｃ２）において１回目の読み取りを行った後の反応溶液をさらにインキュベートした後に、励起光を再度照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ２とするステップと、
（ｃ４）サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値に対する２回目の読み取りによって得られた信号値の増幅Ａについて、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％で算出するステップと、
（ｃ５）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む既知の一つの標準物質の２回の読み取りの増幅Ａ’’を臨界値とするステップと、
（ｃ６）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａを臨界値と比較して、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記臨界値を超えていると、前記測定対象サンプルの濃度が既知の標準物質の濃度よりも高くなっているとするステップと、を含む。
【００８０】
本発明のいくつかの実施例では、前記方法は、（４）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記臨界値を超え、かつそれと同時に前記測定対象サンプルの１回目の読み取りが前記既知の標準物質よりも低くなっていると、サンプルを希釈してから測定するステップ、をさらに含む。
【００８１】
本発明のいくつかの具体的な実施例では、前記方法は、
（ｄ１）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルを第１の抗体（または抗原）によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体（または抗原）と混合し、インキュベートすることによって、混合液が得られるステップと、
（ｄ２）１回目の読み取り：ステップ（ｄ１）の混合液に、さらに、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、インキュベートした後に励起光を照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ１とするステップと、
（ｄ３）２回目の読み取り：ステップ（ｄ２）において１回目の読み取りを行った後の反応溶液をさらにインキュベートした後に、励起光を再度照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ２とするステップと、
（ｄ４）サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値に対する２回目の読み取りによって得られた信号値の増幅Ａについて、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％で算出するステップと、
（ｄ５）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む既知の一つの標準物質の２回の読み取りの増幅Ａ’’を臨界値とするステップと、
（ｄ６）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａを臨界値と比較して、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記臨界値を超え、かつそれと同時に前記測定対象サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値が前記既知の標準物質よりも低くなっていると、サンプルを希釈してから測定するステップと、を含む。
【００８２】
本発明のいくつかの実施例では、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅Ａを前記標準曲線と比較して、かつ、前記方法は、（４）サンプルの濃度を特定するステップをさらに含む。
【００８３】
本発明のいくつかの具体的な実施例では、前記方法は、
（ｂ１）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルを第１の抗体（または抗原）によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体（または抗原）と混合し、インキュベートすることによって、混合液が得られるステップと、
（ｂ２）１回目の読み取り：ステップ（ｂ１）の混合液に、さらに、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、インキュベートした後に励起光を照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ１とするステップと、
（ｂ３）２回目の読み取り：ステップ（ｂ２）において１回目の読み取りを行った後の反応溶液をさらにインキュベートした後に、励起光を再度照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ２とするステップと、
（ｂ４）サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値に対する２回目の読み取りによって得られた信号値の増幅Ａについて、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％で算出するステップと、
（ｂ５）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む既知の一連の標準物質の２回の読み取りの増幅Ａ’に基づいて標準曲線を作成するステップと、
（ｂ６）Ａの値によって測定対象物質の濃度が標準曲線の上昇区間に位置するかそれとも下降区間に位置するかを特定し、測定対象サンプルのＲＬＵ１をそれに対応する標準曲線に代入して濃度を算出するステップと、を含む。
【００８４】
本発明によれば、前記発光微粒子とは発光化合物およびランタノイド族元素化合物が充填されている高分子微粒子のことをいい、前記感光微粒子は感光化合物が充填されている高分子微粒子であり、赤色レーザ光による励起で一重項酸素イオンを発生させることができる。
【００８５】
本発明によれば、６００〜７００ｎｍの赤色励起光で照射し、反応溶液の出射光量を検出し、出射光の検出波長は５２０〜６２０ｎｍとされている。
【００８６】
本発明によれば、前記抗原とは免疫原性を有する物質をいい、前記抗体とは有機体によって生じられた、特定の外来物を認識することができる免疫グロブリンをいい、前記第１の抗体及び第２の抗体とは前記目標抗原に特異的に結合可能な抗体をいい、前記第１の抗原および第２の抗原とは、前記目標抗体に特異的に結合可能な抗原をいう。
【００８７】
本発明の第６の側面は、免疫測定を同定するためのシステムであって、
化学発光免疫反応を実施するための免疫反応装置と、
化学発光を励起させ１回目と２回目の読み取りを記録するとともに、２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅をＡとするための化学発光免疫反応励起及びカウント装置と、
プロセッサと、を備えるシステムを提供する。
【００８８】
１つの具体的な実施の形態においては、本発明の免疫測定を同定するためのシステムは、例えば溶液の収容容器のような免疫反応装置と、例えば光子カウントモジュールと発光ダイオードのような化学発光免疫反応励起及びカウント装置と、たとえばコンピュータのような前記読み取りに対して処理やプロットなどをするプロセッサを備える。このような免疫測定を同定するためのシステムは、例えば、本出願人の実用新案ＣＮ２０１５３２６４６Ｕを参照することができ、その記載内容の全てを、ここに援用する。
【００８９】
本発明のいくつかの実施の形態では、前記プロセッサは、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む既知の一連の標準物質の２回の読み取りの増幅Ａに基づいて標準曲線を作成するのに用いられ、ここで標準物質の濃度はＨＤ−ＨＯＯＫ効果が生じる濃度よりも低く、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記標準曲線の最大値を超えている場合、サンプルを希釈してから測定する。
【００９０】
本発明のいくつかの具体的な実施の形態では、前記システムの使用方法は、
（１）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルを第１の抗体（または抗原）によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体（または抗原）と混合し、インキュベートすることによって、混合液が得られるステップと、
（２）１回目の読み取り：ステップ（１）の混合液に、さらに、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、インキュベートした後に励起光を照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ１とするステップと、
（３）２回目の読み取り：ステップ（２）において１回目の読み取りを行った後の反応溶液をさらにインキュベートした後に、励起光を再度照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ２とするステップと、
（４）サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値に対する２回目の読み取りによって得られた信号値の増幅Ａについて、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％で算出するステップと、
（５）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む既知の一連の標準物質（ただし、標準物質の濃度はＨＤ−ＨＯＯＫ効果が生じる濃度よりも低くなっている。）の２回の読み取りの増幅Ａに基づいて標準曲線を作成するステップと、
（６）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記標準曲線の最大値を超えている場合、サンプルを希釈してから測定するステップと、を含む。
【００９１】
本発明のいくつかの実施の形態では、前記プロセッサは、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａを臨界値と比較するのに用いられ、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記臨界値を超えていると、前記測定対象サンプルの濃度が前記既知の標準物質の濃度よりも高くなっているとする。
【００９２】
本発明のいくつかの具体的な実施の形態では、前記システムの使用方法は、
（１）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルを第１の抗体（または抗原）によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体（または抗原）と混合し、インキュベートすることによって、混合液が得られるステップと、
（２）１回目の読み取り：ステップ（１）の混合液に、さらに、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、インキュベートした後に励起光を照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ１とするステップと、
（３）２回目の読み取り：ステップ（２）において１回目の読み取りを行った後の反応溶液をさらにインキュベートした後に、励起光を再度照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ２とするステップと、
（４）サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値に対する２回目の読み取りによって得られた信号値の増幅Ａについて、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％で算出するステップと、
（５）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む既知の一つの標準物質の２回の読み取りの増幅Ａを臨界値とするステップと、
（６）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａを臨界値と比較して、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記臨界値を超えていると、前記測定対象サンプルの濃度が前記既知の標準物質の濃度よりも高くなっているとするステップと、を含む。
【００９３】
本発明のいくつかの実施の形態では、前記プロセッサは、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａを臨界値と比較するのに用いられ、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記臨界値を超え、かつそれと同時に前記測定対象サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値が前記既知の標準物質よりも低くなっていると、サンプルを希釈してから測定する。
【００９４】
本発明のいくつかの具体的な実施の形態では、前記システムの使用方法は、
（１）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルを第１の抗体（または抗原）によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体（または抗原）と混合し、インキュベートすることによって、混合液が得られるステップと、
（２）１回目の読み取り：ステップ（１）の混合液に、さらに、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、インキュベートした後に励起光を照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ１とするステップと、
（３）２回目の読み取り：ステップ（２）において１回目の読み取りを行った後の反応溶液をさらにインキュベートした後に、励起光を再度照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ２とするステップと、
（４）サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値に対する２回目の読み取りによって得られた信号値の増幅Ａについて、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％で算出するステップと、
（５）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む既知の一つの標準物質の２回の読み取りの増幅Ａを臨界値とするステップと、
（６）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａを臨界値と比較して、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記臨界値を超え、かつそれと同時に前記測定対象サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値が前記既知の標準物質よりも低くなっていると、サンプルを希釈してから測定するステップと、を含む。
【００９５】
本発明のいくつかの実施の形態では、前記プロセッサは、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む既知の一連の標準物質の１回目の読み取りと２回の読み取りの増幅Ａに基づいてそれぞれ標準曲線を作成し、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの１回目の読み取りと２回の読み取りの増幅Ａを標準曲線と比較して、サンプルの濃度を特定するのに用いられる。
【００９６】
本発明のいくつかの具体的な実施の形態では、前記システムの使用方法は、
（１）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルを第１の抗体（または抗原）によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体（または抗原）と混合し、インキュベートすることによって、混合液が得られるステップと、
（２）１回目の読み取り：ステップ（１）の混合液に、さらに、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、インキュベートした後に励起光を照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ１とするステップと、
（３）２回目の読み取り：ステップ（２）において１回目の読み取りを行った後の反応溶液をさらにインキュベートした後に、励起光を再度照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ２とするステップと、
（４）サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値に対する２回目の読み取りによって得られた信号値の増幅Ａについて、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％で算出するステップと、
（５）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む既知の一連の標準物質の２回の読み取りの増幅Ａに基づいて標準曲線を作成するステップと、
（６）Ａの値によって測定対象物質の濃度が標準曲線の上昇区間に位置するかそれとも下降区間に位置するかを特定し、測定対象サンプルのＲＬＵ１をそれに対応する標準曲線に代入して濃度を算出するステップと、を含み、
前記校正曲線は、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む既知の一連の標準物質の１回目の読み取りと既知の一連の標準物質の濃度によって作成された曲線である。
【００９７】
本発明によれば、前記発光微粒子とは発光化合物およびランタノイド族元素化合物が充填されている高分子微粒子のことをいい、前記感光微粒子は感光化合物が充填されている高分子微粒子であり、赤色レーザ光による励起で一重項酸素イオンを発生させることができる。
【００９８】
本発明によれば、６００〜７００ｎｍの赤色励起光で照射し、反応溶液の出射光量を検出し、出射光の検出波長は５２０〜６２０ｎｍとされている。
【００９９】
本発明によれば、前記抗原とは免疫原性を有する物質をいい、前記抗体とは有機体によって生じられた、特定の外来物を認識することができる免疫グロブリンをいい、前記第１の抗体及び第２の抗体とは前記目標抗原に特異的に結合可能な抗体をいい、前記第１の抗原および第２の抗原とは、前記目標抗体に特異的に結合可能な抗原をいう。
【０１００】
本発明の第７の側面は、第１の抗体（または抗原）によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体（または抗原）、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を含むキットであって、前記キットの使用方法は、（１）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルに対して化学発光免疫反応を行い、化学発光を励起させ１回目と２回目の読み取りを記録し、２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅をＡとするステップと、（２）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む既知の一連の標準物質の２回の読み取りの差分増幅Ａ’に基づいて標準曲線を作成し、および／または、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む既知の一つの標準物質の２回の読み取りの差分増幅Ａ’’に基づいて標準を作成するステップと、（３）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅Ａを前記標準曲線および／または標準と比較するステップと、を含むことを特徴とするキットを提供する。
【０１０１】
本発明のいくつかの実施の形態では、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅Ａを前記標準曲線と比較する。
【０１０２】
本発明のいくつかの実施例では、前記既知の標準物質の濃度は、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果が生じる濃度よりも低く、かつ前記既知の標準物質は陽性対照である。
【０１０３】
本発明の他のいくつかの実施例では、前記キットの使用方法は、（４）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記標準曲線の最大値を超えている場合、サンプルを希釈してから測定するステップ、をさらに含む。
【０１０４】
本発明のいくつかの具体的な実施例では、前記キットの使用方法は、
（ａ１）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルを第１の抗体（または抗原）によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体（または抗原）と混合し、インキュベートすることによって、混合液が得られるステップと、
（ａ２）１回目の読み取り：ステップ（ａ１）の混合液に、さらに、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、インキュベートした後に励起光を照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ１とするステップと、
（ａ３）２回目の読み取り：ステップ（ａ２）において１回目の読み取りを行った後の反応溶液をさらにインキュベートした後に、励起光を再度照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ２とするステップと、
（ａ４）サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値に対する２回目の読み取りによって得られた信号値の増幅Ａについて、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％で算出するステップと、
（ａ５）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む既知の一連の標準物質（ただし、標準物質の濃度は、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果が生じる濃度よりも低い。）の２回の読み取りの増幅Ａ’に基づいて標準曲線を作成するステップと、
（ａ６）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記標準曲線の最大値を超えている場合、サンプルを希釈してから測定するステップと、を含む。
【０１０５】
本発明のいくつかの実施の形態では、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅Ａを前記標準と比較し、かつ前記標準は臨界値であり、および／または、前記既知の標準物質は陽性対照である。
【０１０６】
本発明のいくつかの実施例では、前記キットの使用方法は、（４）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記臨界値を超えていると、前記測定対象サンプルの濃度が既知の標準物質の濃度よりも高くなっているとするステップ、をさらに含む。
【０１０７】
本発明のいくつかの具体的な実施例では、前記キットの使用方法は、
（ｃ１）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルを第１の抗体（または抗原）によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体（または抗原）と混合し、インキュベートすることによって、混合液が得られるステップと、
（ｃ２）１回目の読み取り：ステップ（ｃ１）の混合液に、さらに、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、インキュベートした後に励起光を照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ１とするステップと、
（ｃ３）２回目の読み取り：ステップ（ｃ２）において１回目の読み取りを行った後の反応溶液をさらにインキュベートした後に、励起光を再度照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ２とするステップと、
（ｃ４）サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値に対する２回目の読み取りによって得られた信号値の増幅Ａについて、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％で算出するステップと、
（ｃ５）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む既知の一つの標準物質の２回の読み取りの増幅Ａ’’を臨界値とするステップと、
（ｃ６）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａを臨界値と比較して、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記臨界値を超えていると、前記測定対象サンプルの濃度が既知の標準物質の濃度よりも高くなっているとするステップと、を含む。
【０１０８】
本発明のいくつかの実施例では、前記キットの使用方法は、（４）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記臨界値を超え、かつそれと同時に前記測定対象サンプルの１回目の読み取りが前記既知の標準物質よりも低くなっていると、サンプルを希釈してから測定するステップ、をさらに含む。
【０１０９】
本発明のいくつかの具体的な実施例では、前記キットの使用方法は、
（ｄ１）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルを第１の抗体（または抗原）によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体（または抗原）と混合し、インキュベートすることによって、混合液が得られるステップと、
（ｄ２）１回目の読み取り：ステップ（ｄ１）の混合液に、さらに、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、インキュベートした後に励起光を照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ１とするステップと、
（ｄ３）２回目の読み取り：ステップ（ｄ２）において１回目の読み取りを行った後の反応溶液をさらにインキュベートした後に、励起光を再度照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ２とするステップと、
（ｄ４）サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値に対する２回目の読み取りによって得られた信号値の増幅Ａについて、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％で算出するステップと、
（ｄ５）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む既知の一つの標準物質の２回の読み取りの増幅Ａ’’を臨界値とするステップと、
（ｄ６）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａを臨界値と比較して、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記臨界値を超え、かつそれと同時に前記測定対象サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値が前記既知の標準物質よりも低くなっていると、サンプルを希釈してから測定するステップと、を含む。
【０１１０】
本発明のいくつかの実施例では、前記キットの使用方法は、（４）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの１回目の読み取りと２回の読み取りの増幅Ａを標準曲線と比較して、サンプルの濃度を特定するステップをさらに含む。
【０１１１】
本発明のいくつかの具体的な実施例では、前記キットの使用方法は、
（ｂ１）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルを第１の抗体（または抗原）によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体（または抗原）と混合し、インキュベートすることによって、混合液が得られるステップと、
（ｂ２）１回目の読み取り：ステップ（ｂ１）の混合液に、さらに、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、インキュベートした後に励起光を照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ１とするステップと、
（ｂ３）２回目の読み取り：ステップ（ｂ２）において１回目の読み取りを行った後の反応溶液をさらにインキュベートした後に、励起光を再度照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ２とするステップと、
（ｂ４）サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値に対する２回目の読み取りによって得られた信号値の増幅Ａについて、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％で算出するステップと、
（ｂ５）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む既知の一連の標準物質の２回の読み取りの増幅Ａ’に基づいて標準曲線を作成するステップと、
（ｂ６）Ａの値によって測定対象物質の濃度が標準曲線の上昇区間に位置するかそれとも下降区間に位置するかを特定し、測定対象サンプルのＲＬＵ１をそれに対応する標準曲線に代入して濃度を算出するステップと、を含み、
前記校正曲線は、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む既知の一連の標準物質の１回目の読み取りと既知の一連の標準物質の濃度によって作成された曲線である。
【０１１２】
ここで、上記方法は非疾患診断目的の方法であることに特に留意されたく、前記方法はＤｏｕｂｌｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙまたはＤｏｕｂｌｅ−Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙの検出過程において２回の読み取りによって検出範囲を広げるとともに、測定対象サンプルにＨＤ−ＨＯＯＫ効果が存在するかどうかを正確に判定し、測定対象サンプルにおける測定対象物の濃度を簡便かつ迅速に算出することができる。
【０１１３】
好ましくは、前記抗原とは免疫原性を有する物質をいう。例えば、タンパク質、ポリペプチドが挙げられる。代表的な抗原（これに限定されるものではない）として、サイトカイン、腫瘍マーカー、メタロプロテイン、心血管糖尿病関連タンパク質などが挙げられる。
【０１１４】
前記抗体とは、有機体によって生じられた、特定の外来物を認識することができる免疫グロブリンをいう。
【０１１５】
本発明のいくつかの実施例では、前記抗原又は抗体は、インスリン（ＩＮＳ）、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗体（ＨＢｓＡｂ）、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）およびチロトロピン（ＴＳＨ）などから選ばれるものである。
【０１１６】
本発明の方法によって検出され得るサンプルは特に限定されず、測定すべき目標抗原（または抗体）が含まれる任意のサンプルであってもよく、代表的な例としては、血清サンプル、尿サンプル、唾液サンプルなどが挙げられる。本発明では、血清サンプルが好ましい。
【０１１７】
好ましくは、前記第１の抗体及び第２の抗体は、前記抗原に特異的に結合可能な抗体である。
【０１１８】
同一の抗原に対して、対応する第１の抗体及び第２の抗体は同じでも異なっていてもよく、そして同時に前記抗原に結合することができる。
【０１１９】
前記第１の抗原および第２の抗原は、前記目標抗体に特異的に結合可能な抗原をいう。
【０１２０】
同一の抗体に対して、対応する第１の抗原及び第２の抗原は同じでも異なっていてもよく、そして同時に前記抗体に結合することができる。
【０１２１】
好ましくは、前記標識物と標識物特異結合物とは特異的に結合することができる。
【０１２２】
より好ましくは、前記標識物はビオチンであり、前記標識物特異結合物はストレプトアビジンである。
【０１２３】
好ましくは、前記発光微粒子とは発光化合物およびランタノイド族元素化合物が充填されている高分子微粒子のことをいう。発光化合物は、Ｄｉｏｘｅｎｅ（ジオキセン）またはｔｈｉｏｘｅｎｅ（ジメチルチオフェン）の誘導体等とされてもよく、ランタノイド族元素化合物は、Ｅｕ（ＴＴＡ）３／ＴＯＰＯまたはＥｕ（ＴＴＡ）３／Ｐｈｅｎ等とされてもよく、当該微粒子は市販品から購入することができる。発光微粒子の表面官能基は、タンパク質を結合可能な任意の基であり得る。例えば、カルボキシル基、アルデヒド基、アミノ基、エポキシエチル基またはハロゲン化アルキル基などの様々な従来公知の、タンパク質を結合可能な官能基が挙げられる。
【０１２４】
好ましくは、前記感光微粒子は感光化合物が充填されている高分子微粒子であり、赤色レーザ光による励起で一重項酸素イオンを発生させることができる。それが発光微粒子に十分に接近すると、一重項酸素イオンが発光微粒子に伝達され、発光微粒子中の発光化合物と反応して紫外線を発生し、紫外線によってさらにランタノイド族元素化合物が励起され特定の波長の光子を発生する。感光化合物としては、フタロシアニン染料などを用いることができ、当該微粒子も市販品から購入することができる。
【０１２５】
好ましくは、６００〜７００ｎｍの赤色励起光で照射し、反応溶液の出射光量を検出し、出射光の検出波長は５２０〜６２０ｎｍとされている。
【０１２６】
さらに、赤色レーザ光（６００〜７００ｎｍ）で感光微粒子を照射し、感光微粒子に一重項酸素イオンを放出させ、一重項酸素イオンの一部が発光微粒子に受け入れられ、これによって５２０〜６２０ｎｍの高いエネルギー準位の光が出射される。
【０１２７】
検出範囲内では、測定すべき目標抗原の濃度は、Ｄｏｕｂｌｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ複合体の数として表され、そして光子の数に比例する。しかしながら、測定すべき目標抗原の濃度が高すぎると、測定すべき抗原の一部がそれぞれ個別の抗体と結合するので、Ｄｏｕｂｌｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ複合体が減少し、光信号が低くなり、測定すべき目標抗原の真実の濃度が反映されなくなる。
【０１２８】
同様に、検出範囲内では、測定すべき目標抗体の濃度は、Ｄｏｕｂｌｅ−Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ複合体の数として表され、そして光子の数に比例する。しかしながら、測定すべき目標抗体の濃度が高すぎると、測定すべき抗体の一部がそれぞれ個別の抗原と結合するので、Ｄｏｕｂｌｅ−Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ複合体が減少し、光信号が低くなり、測定すべき目標抗体の真実の濃度が反映されなくなる。
【０１２９】
本発明の方法は、２回の読み取りによって得られた信号値の増幅間の関係を比較することによって、検出範囲を広げることで機能する。２回の読み取りの違いは、以下の３つの点によって決められる。
【０１３０】
第１点では、１回目の読み取りでは、感光微粒子が赤色レーザ光（６００〜７００ｎｍ）によって照射された後、一重項酸素イオンを放出する。一重項酸素イオンの一部が発光微粒子に伝達された後、一連の化学反応により、５２０〜６２０ｎｍの高いエネルギー準位の光を出射するが、一重項酸素イオンの他の一部が抗体（または抗原）に結合されていない測定すべき目標抗原（または抗体）と反応するので、測定すべき目標抗原（または抗体）の濃度を低下させるようになる。低濃度サンプルについては、測定すべき目標抗原（または抗体）の濃度が低下したら、Ｄｏｕｂｌｅ−Ａｎｔｉ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ複合体が減少し、２回目の読み取りでは信号値が低下する。高濃度サンプルについては、測定すべき目標抗原（または抗体）の濃度が低下したら、Ｄｏｕｂｌｅ−Ａｎｔｉ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ複合体が増加し、２回目の読み取りでは信号値が逆に上昇する。
【０１３１】
第２点では、低濃度サンプルについては、感光微粒子が１回目の読み取り中に赤色レーザ光（６００〜７００ｎｍ）に照射され、一重項酸素イオンを放出した後、そのエネルギーが損失するので、２回目の読み取りでは信号が低下する。
【０１３２】
第３点では、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果については、１回目の読み取りでは、抗原抗体反応がまだ平衡に達しておらず、２回の読み取りの間隔時間においても反応が正の方向に向けて進行するので、２回目の読み取りでは信号が上昇する。
【０１３３】
以上に説明したように、本発明では、反応が平衡に達していないときに１回目の読み取りを行い、感光微粒子が励起光に照射され一重項酸素イオンを放出し、その一部が発光微粒子に伝達され、他の一部が未結合の測定すべき目標抗原または抗体と反応することができ、測定すべき目標抗原または抗体の一部が消耗され、反応平衡を逆の方向に移動させる一方、感光微粒子は１回の励起後に若干消耗され、２回目の読み取りでは、測定すべき目標抗原または抗体の濃度が低いサンプルの信号値が低下するのに対して、濃度が高いサンプルのＤｏｕｂｌｅ−Ａｎｔｉ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ複合体と感光微粒子との結合は１回目の読み取りではまだまだ平衡に達しておらず、２回目の読み取りでは反応が正の方向に移動するので信号が上昇することになり、測定すべき目標抗原（または抗体）の濃度の上昇と伴い、２回目の光励起による光の信号値および１回目の信号値の上昇幅も上昇する。信号の上昇幅はサンプルの濃度とは正の相関関係があり、２回の信号の増幅を比較することによって、検出範囲を広げることができ、検出過程において、その濃度を簡便かつ迅速に算出することができる。
【０１３４】
従来技術と比較して、本発明の前記方法は、光励起化学発光プラットフォーム（発光酸素チャネル）の無洗浄および反応の均一性に基づいて、免疫反応の進行を中断することなく１つの反応に対して複数回の信号測定を行うことができ、異なる反応時間での光信号を検出し、２回の信号の大きさを比較することによって、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルを区別することができ、前記方法は検出範囲によって制限されず、検出範囲を１００倍以上に効果的に広げた。同時に、本発明の方法は、Ｄｏｕｂｌｅ−Ａｎｔｉ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙにおけるＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルを１００％正確に同定することができ、前記方法はＤｏｕｂｌｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙの正確性を顕著に改善し、Ｄｏｕｂｌｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙの偽陰性率を低下させることができる。また、本発明の方法は操作が簡単であり、２回の読み取りによって検出範囲を広げ、検出過程において、測定対象物の濃度を簡便かつ迅速に算出することができる。
【０１３５】
本発明の第８の側面は、
化学発光免疫反応を記録するとともにインキュベートされた後の混合液に対して複数回の読み取りを実行するための読み取りユニットと、
前記読み取りユニットに接続され、前記読み取りユニットの読み取りによって免疫測定にはＨＤ−ＨＯＯＫのリスクの有無を判定する処理ユニットと、を備える
免疫測定装置を提供する。
【０１３６】
本発明のいくつかの実施の形態では、前記装置は、インキュベートされた後の混合液を読み取りユニットに移動し読み取りを実行するための移動機構をさらに備える。
【０１３７】
本発明の他のいくつかの実施の形態では、前記装置は、化学発光免疫反応のために適切な環境温度を提供するためのインキュベータをさらに備える。
【０１３８】
本発明のいくつかの実施の形態では、前記装置は、読み取りが完了した後の混合液を前記インキュベータに復帰させ再度インキュベートするための復帰機構をさらに備える。
【０１３９】
本発明のいくつかの具体的な実施の形態では、前記移動機構は押出し機構であり、前記復帰機構は押戻し機構であり、前記混合液はスラットで収容される。
【０１４０】
本発明の他のいくつかの具体的な実施の形態では、前記読み取りユニットは化学発光免疫反応を記録するとともにインキュベートされた後の混合液に対して２回の読み取りを実行することに用いられる。
【０１４１】
本発明のいくつかの具体的な実施の形態では、前記インキュベータは第１のインキュベータと第２のインキュベータとを有し、前記押出し機構は、第１のインキュベータ内でインキュベートされた後の混合液を第２のインキュベータに押出しインキュベートするのに用いられ、かつ前記押出し機構は第２のインキュベータ内でインキュベートされた後の混合液を読み取りユニットに押出し１回目の読み取りを実行するのに用いられ、
前記押戻し機構は、１回目の読み取りが完了した後の混合液を第２のインキュベータに押戻し再度インキュベートするのに用いられ、
前記押出し機構は、さらに、第２のインキュベータ内で再度インキュベートされた後の混合液を読み取りユニットに押出し２回目の読み取りを実行するのに用いられ、
前記処理ユニットが２回目の読み取りと１回目の読み取りの増幅が標準曲線の最大値を超えていると検出した場合、免疫測定にはＨＤ−ＨＯＯＫのリスクが存在すると判定する。
【０１４２】
本発明の他のいくつかの具体的な実施の形態では、前記押戻し機構は、
底板と、
前記底板に設けられているガイドレールと、
前記ガイドレールに設けられ、スラットを支持するための移動カップ機構と、
前記移動カップ機構を前記ガイドレールに沿って移動させるための駆動装置と、
前記底板の両端に設けられ、前記移動カップ機構の位置を検出するための光電センサと、
前記光電センサに接続され、前記光電センサによって発せられた位置信号に基づいて前記移動カップ機構の位置を調整することができる位置調整機構と、を備える。
【０１４３】
本発明のいくつかの具体的な実施の形態では、前記ガイドレールは直線レールまたは可変レールである。
【０１４４】
本発明のいくつかの具体的な実施の形態では、前記装置は、前記インキュベータの一方の側に設けられ、測定対象サンプルと試薬とを混合させるためのスラット用試料添加皿と、前記インキュベータの他方の側に設けられ、試薬を収納するための試薬冷蔵領域とをさらに備える。
【０１４５】
本発明の他のいくつかの具体的な実施の形態では、前記装置は、前記スラット用試料添加皿の一方の側に設けられた、ブランクスラットスタッキング及びローディング機構をさらに備え、前記ブランクスラットスタッキング及びローディング機構は、ブランクスラットをスラット用試料添加皿に押し付けるのに用いられる。
【０１４６】
本発明のいくつかの具体的な実施の形態では、前記装置は、サンプル試験管を支持するためのサンプル試験管載置棚をさらに備える。
【０１４７】
本発明の他のいくつかの具体的な実施の形態では、前記装置は、前記サンプル試験管載置棚におけるブランクスラットスタッキング及びローディング機構に近隣する側に設けられ、予備希釈プレートに対して希釈処理するための希釈プレートシェーカーをさらに備える。
【０１４８】
本発明のいくつかの具体的な実施の形態では、前記装置は、試料添加針が設けられている機械式アームをさらに備え、
前記機械式アームは、前記サンプル試験管載置棚領域からサンプルを吸引してスラット用試料添加皿のスラット内に割り当てるための第１の機械式アームと、前記試薬冷蔵領域から試薬を吸引してスラット用試料添加皿のスラット内に割り当てるための第２の機械式アームとを有する。
【０１４９】
本発明の他のいくつかの具体的な実施の形態では、前記装置は、第１の機械式アームの試料添加針を洗浄するための第１の洗浄機構と、第２の機械式アームの試料添加針を洗浄するための第２の洗浄機構とをさらに備える。
【０１５０】
具体的には、サンプルがインキュベータに入る前に、以下のステップが行われる必要がある。
１．ブランクスラットがブランクスラットスタッキング及びローディング機構によってスラット用試料添加皿の位置Ｄ０に押し付けられる。
２．ブランクスラットがスラット用試料添加皿の位置Ｄ０に押し付けられた後、スラット用試料添加皿の位置Ｄ１まで時計回りに９０度回転させ、この位置で、第１の機械式アームでサンプル試験管載置棚領域からサンプルを吸引してブランクスラットに試料添加する。
３．試料添加完了後のスラットを、スラット用試料添加皿の位置Ｄ２まで時計回りに９０度回転させ、この位置では動作なし。
４．スラットを、スラット用試料添加皿の位置Ｄ３まで時計回りに９０度回転させ、この位置では、第２の機械式アームで試薬冷蔵領域から試薬を吸引して、当該位置にあるスラット内に割り当てる。
【０１５１】
位置Ｄ３にある全てのスラットの試料添加が完了し、そして全てインキュベータに押し込まれた後（その押出し機構は未図示）、スラット用試料添加皿を位置Ｄ３から位置Ｄ０まで回転させ（この工程は、位置Ｄ１にあるスラットがサンプル割り当てを完了した後に行われる。）、スラット用試料添加皿の１回のサイクルが完了する。スラット用試料添加皿が全負荷で運転するとき、スラット用試料添加皿の位置Ｄ０ではブランクスラットがローディングされ、位置Ｄ１ではサンプルの割り当てが行われ、位置Ｄ２では待機中、位置Ｄ３では試薬の割り当てが行われ、そして試薬割り当て後にスラットがインキュベータに押し込まれる。スラット用試料添加皿の回転は、Ｄ０〜Ｄ３の４つの領域内の動作が全て完了するまで待たなければならない。
【０１５２】
試料添加完了後のスラットが第１のインキュベータに入った後、スラットが押出し機構によって第２のインキュベータに送られ、この工程において、測定対象サンプルと試薬が含まれるスラットに標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加える必要もあり、その後サンプルを第２のインキュベータ１２に入れ、インキュベートされ、インキュベートされた後に、スラットが押出し機構によって読み取りユニットに送られ励起光に照射され、出射光量を検出し、１回目の読み取りを記録する。１回目の読み取りが完了した後のスラットが押戻し機構によって第２のインキュベータに押し戻され再度インキュベートされ、再度インキュベートされた後に、前記スラットは再び押出し機構によって読み取りユニットに送られ励起光に照射され、出射光量を検出し、２回目の読み取りを記録する。２回の読み取りが完了した後に、処理ユニットによって２回の読み取りが処理され、２回目の読み取りと１回目の読み取りの増幅が標準曲線の最大値を超えている場合、当該免疫測定にはＨＤ−ＨＯＯＫのリスクが存在すると判定する。一つの方法としては、その装置が定性的にＨＤ−ＨＯＯＫに関する提示情報を与え、作業者がサンプルを希釈してから再度測定することである。もう一つの方法としては、その装置が直接に定量的な結果を与えることであるが、その結果は線形性範囲よりも遥かに高くなっている。
【０１５３】
従来技術と比べて、本発明の利点としては、この装置は読み取りユニットを設けることにより、読み取りユニットでインキュベートされた後の混合液に対して２回乃至複数回の読み取りを実行し、そして処理ユニットで読み取りユニットによる読み取りを処理することによって、免疫測定にはＨＤ−ＨＯＯＫのリスクが存在するかどうかを判定し、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果に起因する、測定対象サンプルに対してその濃度が検出用キットの線形性範囲を超えたためか、それともそれ自体の濃度がその値であるかを正しく区別できないことを回避し、実験上の誤診を回避することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１５４】
以下、本発明について、添付の図面を参照しながらより詳細に説明する。
【０１５５】
【図１】本発明に係るＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルを同定する測定装置及び免疫測定装置の筐体内部構成を示す図一である。
【図２】本発明に係るＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルを同定する測定装置及び免疫測定装置の筐体内部構成を示す図二である。
【図３】本発明に係るＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルを同定する測定装置及び免疫測定装置の押戻し機構を示す図一である。
【図４】本発明に係るＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルを同定する測定装置及び免疫測定装置の押戻し機構を示す図二である。
【図５】本発明に係るＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルを同定する測定装置及び免疫測定装置を示す図一である。
【図６】本発明に係るＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルを同定する測定装置及び免疫測定装置を示す図二である。
【図７】本発明に係るＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルを同定する測定装置及び免疫測定装置の一つの完全な測定フローを示すシーケンスチャートである。
【図８】ＨＣＧ＋βにおける従来の方法を用いて得られた信号値とサンプル濃度との関係を示すグラフである。
【図９】ＨＣＧ＋βにおける本発明の方法を用いて得られた信号値及びＡのそれぞれとサンプル濃度との関係を示すグラフである。
【図１０】Ｆｅｒｒにおける従来の方法を用いて得られた信号値とサンプル濃度との関係を示すグラフである。
【図１１】Ｆｅｒｒにおける本発明の方法を用いて得られた信号値及びＡのそれぞれとサンプル濃度との関係を示すグラフである。
【図１２】Ｃペプチドにおける従来の方法を用いて得られた信号値とサンプル濃度との関係を示すグラフである。
【図１３】Ｃペプチドにおける本発明の方法を用いて得られた信号値及びＡのそれぞれとサンプル濃度との関係を示すグラフである。
【図１４】ＨＢｓＡｂにおける従来の方法を用いて得られた信号値とサンプル濃度との関係を示すグラフである。
【図１５】ＨＢｓＡｂにおける本発明の方法を用いて得られた信号値及びＡのそれぞれとサンプル濃度との関係を示すグラフである。
【図１６】ＩＮＳにおける従来の方法を用いて得られた信号値とサンプル濃度との関係を示すグラフである。
【図１７】ＩＮＳにおける本発明の方法を用いて得られた１回目の読み取り信号及び増幅Ａとサンプル濃度との関係を示すグラフである。
【図１８】ＨＢｓＡｂにおける従来の方法を用いて得られた信号値とサンプル濃度との関係を示すグラフである。
【図１９】ＨＢｓＡｂにおける本発明の方法を用いて得られた１回目の読み取り信号及び増幅Ａとサンプル濃度との関係を示すグラフである。
【図２０】ＡＦＰにおける従来の方法を用いて得られた信号値とサンプル濃度との関係を示すグラフである。
【図２１】ＡＦＰにおける本発明の方法を用いて得られた１回目の読み取り信号及び増幅Ａとサンプル濃度との関係を示すグラフである。
【図２２】ＴＳＨにおける従来の方法を用いて得られた信号値とサンプル濃度との関係を示すグラフである。
【図２３】ＴＳＨにおける本発明の方法を用いて得られた１回目の読み取り信号及び増幅Ａとサンプル濃度との関係を示すグラフである。
【図２４】Ｆｅｒｒにおける従来の方法を用いて得られた信号値とサンプル濃度との関係を示すグラフである。
【図２５】Ｆｅｒｒにおける本発明の方法を用いて得られた１回目の読み取り信号及び増幅Ａとサンプル濃度との関係を示すグラフである。
【図２６】Ｃペプチドにおける従来の方法を用いて得られた信号値とサンプル濃度との関係を示すグラフである。
【図２７】Ｃペプチドにおける本発明の方法を用いて得られた１回目の読み取り信号及び増幅Ａとサンプル濃度との関係を示すグラフである。
【図２８】ＨＢｓＡｂにおける従来の方法を用いて得られた信号値とサンプル濃度との関係を示すグラフである。
【図２９】ＨＢｓＡｂドにおける本発明の方法を用いて得られた１回目の読み取り信号及び増幅Ａとサンプル濃度との関係を示すグラフである。
【０１５６】
図面において、同一の構成要素については、同一の参照番号で示される。図面は実際の比例を反映するわけではない。
【発明を実施するための形態】
【０１５７】
本発明の具体的な実施の形態についてさらに説明する前に、本発明の保護範囲は下記の特定の具体的な実施の形態に限定されないことを理解されたい。また、本発明の実施例で使用される用語は特定の具体的な実施の形態を説明するために用いられるものであり、本発明の保護範囲を限定するためのものではないことを理解されたい。
【０１５８】
実施例で数値の範囲が与えられた場合、特に断らない限り、各数値範囲の両端点及び両端点間のいずれかの数値を用いることができることを理解されたい。別途に定義されない限り、本発明で用いられるすべての技術的用語および科学的用語は、当業者によって通常に理解される意味と同義である。実施例で用いられた具体的な方法、デバイス、材料の他に、当業者による従来技術への理解及び本発明の記載に基づいて、実施例に記載された方法、デバイス、材料と類似または同等する従来技術のいずれの方法、デバイス及び材料を利用して本発明を実現することもできる。
【０１５９】
特に断らない限り、本発明において開示される実験方法、検出方法および調製方法はいずれも本技術分野における従来の分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、分析化学、細胞培養、組み換えＤＮＡ技術、ならびに関連分野における従来技術を採用するものである。これらの技術は、従来の文献において十分に説明されている。具体的には、ＳａｍｂｒｏｏｋなどのＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ  ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９  ａｎｄ  Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１  ；Ａｕｓｕｂｅｌなど，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７  ａｎｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｕｐｄａｔｅｓ  ；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ；Ｗｏｌｆｆｅ，ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮ，Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９８  ；ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．３０４，Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  （Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓａｒｍａｎ  ａｎｄ  Ａ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ，ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９９  ；及びＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１１９，Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｄ．）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９などを参照されたい。
【０１６０】
本発明者らが鋭意検討した結果、反応を中断することなく２回の読み取りを設け、２回の読み取りの増幅Ａを臨界値と比較することによって、測定対象サンプルを希釈してから測定する必要があるか否かを判定することができ、又は、２回の読み取りの増幅Ａとサンプル濃度との関係を確立して、２回の読み取りによって検出範囲を広げることによって、検出過程において、その濃度を簡便かつ迅速に算出することができ、又は、２回の読み取りの増幅とサンプルがＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルであるかどうかとの関係を検討することによって、Ｄｏｕｂｌｅ−Ａｎｔｉ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙにおけるＨＤ−ＨＯＯＫ効果による偽陰性を簡便で効果的に排除することができ、そしてＤｏｕｂｌｅ−Ａｎｔｉ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙの正確性を向上させることができることを見出した。また、本発明者らは、インキュベートされた後の混合液に対して２回又は２回以上の読み取りを実行することができ、上記のＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルを同定する方法及び免疫測定方法を実施することができる、測定装置をさらに提供した。
【０１６１】
図１および図２に示すように、本発明に係るＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルを同定する測定装置及び免疫測定装置の筐体内部構成の概略図を示している。それは、
第１のインキュベータ１１および第２のインキュベータ１２を有し、化学発光免疫反応のために適切な環境温度を提供するためのインキュベータ１と、
光電子増倍管またはレーザー発振機とされてもよく、化学発光免疫反応を記録するとともにインキュベートされた後の混合液に対して２回の読み取りを実行するための読み取りユニット２と、
前記インキュベータ１と前記読み取りユニット２との間に設置され、インキュベータ１を横断する第１の押出し機構３１と第１の押出し機構３の末端に接続され筐体内部に位置する第２の押出し機構３２とを有する押出し機構３と、備える。
【０１６２】
第１の押出し機構３１と第２の押出し機構３２とが連携して、第１のインキュベータ１１内でインキュベートされた後のスラットを読み取りユニット２に送り１回目の読み取りを実行するのに用いられ、そして第２のインキュベータ１２内でインキュベートされた後のスラットを読み取りユニット２に送り２回目の読み取りを実行するのに用いられるものである。
【０１６３】
前記スラットは、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプル、第１の抗体（または抗原）によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体（または抗原）の混合液である。前記混合液には、さらに標識物特異結合物で標識された感光微粒子が加えられている。
【０１６４】
前記読み取りユニット２と前記第２のインキュベータ１２との間に設置された押戻し機構は、図３に示す押戻し機構は直線レール押戻し機構４とされ、図４に示す押戻し機構は可変レール押戻し機構４′とされ、この２種類の押戻し機構はいずれも１回目の読み取り完了後のスラットを第２のインキュベータ１２に押戻し再度インキュベートするのに用いられる。
【０１６５】
１回目の読み取りでは、インキュベートされた後のスラットに励起光を照射して出射光量を検出し、２回目の読み取りでは、再度インキュベートされた後のスラットに励起光を照射して出射光量を検出する。
【０１６６】
処理ユニット（未図示）は、２回目の読み取りおよび１回目の読み取りの増幅が標準曲線の最大値を超えていると、スラットを希釈してから測定する。前記標準曲線は、測定すべき目標抗原または抗体を含む既知の一連の標準物質の２回の読み取りの増幅に基づいて作成されたものであり、前記標準物質の濃度は、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果が生じる濃度よりも低い。ここで、前記処理ユニットは前記読み取りに対して処理やプロットなどをするコンピュータとされてもよい。
【０１６７】
インキュベータを第１のインキュベータおよび第２のインキュベータとして設定されたのは、免疫測定装置の機械的実現を容易にするためのものであり、本発明はこれに限定されないを理解されたい。
【０１６８】
同様に、前記移動機構も機械式アーム掴み取り型とされてもよく、前記復帰機構も機械式アーム掴み取り型とされてもよく、本発明はこれに限定されないを理解されたい。
【０１６９】
本発明のいくつかの具体的な実施例では、前記押戻し機構は、
底板４１と、
前記底板４１に設けられているガイドレールと、
前記ガイドレールに設けられ、スラットを支持するための移動カップ機構４３と、
前記移動カップ機構４３を前記ガイドレールに沿って移動させるための駆動装置と、
前記底板４１の両端に設けられ、センサストッパ片４６に接続され、センサストッパ片４６によって前記移動カップ機構４３の位置を検出する光電センサ４５と、
前記光電センサ４５に接続され、前記光電センサ４５によって発せられた位置信号に基づいて前記移動カップ機構４３の位置を調整することができる位置調整機構と、を備え、
前記ガイドレールは、図３に示すように直線レール４２１とされ、また図４に示すように可変レール４２２とされてもよい。
前記駆動装置は、具体的には、ステッピングモータ４４１を有し、前記ステッピングモータ４４１はモータ固定板４４２を介して前記ガイドレール２の一端に固定され、前記ステッピングモータ４４１の出力端にはタイミングプーリ４４３が設けられており、前記ガイドレール２の他端にはアイドラプーリ４４４が設けられており、前記タイミングプーリ４４３と前記アイドラプーリ４４４にはタイミングベルト４４５が掛けられている。前記アイドラプーリ４４４の軸心にはアイドラシャフト４４６が穿設され、前記アイドラシャフト４４６がアイドラプレート４４７に固定されている。
前記移動カップ機構４３は、移動カップドラグ板４３１と、前記移動カップドラグ板４３１に接続される移動カップ接続板４３２とを有し、前記移動カップ接続板４３２はタイミングベルト押さえ板４４８を介して前記タイミングベルト４４５に接続されている。
前記位置調整機構は、具体的には、位置調整板４６とコントローラ（未図示）とを有し、前記コントローラは前記位置調整板４６と前記光電センサ４５にそれぞれ接続され、前記コントローラは受信した光電センサ４５からの位置信号によって位置調整板４６を制御して移動カップ機構４３の位置を調整する。一般に、その位置調整機構は微調整に用いられ、移動カップ機構４３が指定位置に到達していないとき又は到達した位置がずれているときに、その位置調整機構はそれを微調整するようにされている。
【０１７０】
本発明の他のいくつかの具体的な実施例では、図５に示すように、その装置は、前記インキュベータ１の一方の側に設けられた、回転可能なスラット用試料添加皿５をさらに有し、ブランクスラットは前記スラット用試料添加皿５で測定対象サンプルと試薬との混合を完了し、前記サンプルは測定すべき目標抗原（または抗体）が含まれ、前記試薬は第１の抗体（または抗原）によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体（または抗原）である。
【０１７１】
本発明のいくつかの具体的な実施例では、その装置は、前記インキュベータ１の他方の側に設けられた、試薬を収納するための試薬冷蔵領域８をさらに備える。
【０１７２】
本発明の他のいくつかの具体的な実施例では、前記スラット用試料添加皿５の一方の側に設けられた、ブランクスラットをスラット用試料添加皿５に押し付けるためのブランクスラットスタッキング及びローディング機構６をさらに備える。
【０１７３】
本発明のいくつかの具体的な実施例では、サンプル試験管を支持するためのサンプル試験管載置棚７をさらに備える。
【０１７４】
本発明の他のいくつかの具体的な実施例では、試料添加針が設けられている機械式アーム（未図示）をさらに備え、
前記機械式アームは、前記サンプル試験管載置棚領域からサンプルを吸引するための第１の機械式アームと、前記試薬冷蔵領域から試薬を吸引するための第２の機械式アームとを有する。
【０１７５】
本発明のいくつかの具体的な実施例では、第１の機械式アームの試料添加針を洗浄するための第１の洗浄機構９と、第２の機械式アームの試料添加針を洗浄するための第２の洗浄機構１０とをさらに備える。
【０１７６】
直線レール４２１とした場合、当該モジュールの長さが長くなり、筐体（すなわち、図１および図２に示す全体構成）およびポンプ１１の位置が（図５に示すように）比較的コンパクトになり、着脱が複雑になる。可変レール４２２とすると、一実施形態として、前記可変レール４２２は曲線状のガイドレールとして設計されてもよく、当該モジュールの幅が広くなり、筐体および第２の洗浄機構１０の位置が（図６に示すように）比較的コンパクトになるが、着脱には影響がない。
【０１７７】
具体的には、サンプルがインキュベータ１に入る前に、以下のステップが行われる必要がある。
１．ブランクスラットがブランクスラットスタッキング及びローディング機構６によってスラット用試料添加皿５の位置Ｄ０に押し付けられる。
２．ブランクスラットがスラット用試料添加皿５に押し付けられた後、スラット用試料添加皿の位置Ｄ１まで時計回りに９０度回転させ、この位置で、第１の機械式アームでサンプル試験管載置棚領域７からサンプルを吸引してブランクスラットに試料添加する。
３．試料添加完了後のスラットを、スラット用試料添加皿の位置Ｄ２まで時計回りに９０度回転させ、この位置では動作なし。
４．スラットを、スラット用試料添加皿の位置Ｄ３まで時計回りに９０度回転させ、この位置では、第２の機械式アームで試薬冷蔵領域８から試薬を吸引して、当該位置にあるスラット内に割り当てる。
【０１７８】
位置Ｄ３にある全てのスラットの試料添加が完了し、そして全てインキュベータ１に押し込まれた後、スラット用試料添加皿５を位置Ｄ３から位置Ｄ０まで回転させ（この工程は、位置Ｄ１にあるスラットがサンプル割り当てを完了した後に行われる。）、スラット用試料添加皿５の１回のサイクルが完了する。スラット用試料添加皿が全負荷で運転するとき、スラット用試料添加皿５の位置Ｄ０ではブランクスラットがローディングされ、位置Ｄ１ではサンプルの割り当てが行われ、位置Ｄ２では待機中、位置Ｄ３では試薬の割り当てが行われ、そして試薬割り当て後にスラットがインキュベータ１に押し込まれる。スラット用試料添加皿５の回転は、Ｄ０〜Ｄ３の４つの領域内の動作が全て完了するまで待たなければならない。
【０１７９】
試料添加完了後のスラットが第１のインキュベータ１１に入った後、前記スラットが押出し機構３によって第２のインキュベータに送られ、この工程において、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、その後スラットを第２のインキュベータ１２に入れインキュベートされ、スラットが押出し機構３によって読み取りユニット２に送られ励起光に照射され、出射光量を検出し、１回目の読み取りを記録する。１回目の読み取りが完了した後のスラットが直線レール押戻し機構４又は可変レール押戻し機構４′によって第２のインキュベータ１２に押し戻され再度インキュベートされ、再度インキュベートされた後に、前記スラットは再び押出し機構３によって読み取りユニット２に送られ励起光に照射され、出射光量を検出し、２回目の読み取りを記録する。
【０１８０】
２回の読み取りが完了した後に、処理ユニット２によって２回の読み取りが処理され、２回目の読み取りと１回目の読み取りの増幅が標準曲線の最大値を超えている場合、かつそれと同時に前記測定対象サンプルの１回目の読み取りが前記既知の標準物質よりも低くなっている場合、一つの方法としては、その装置が定性的にＨＤ−ＨＯＯＫに関する提示情報を与え、作業者がサンプルを希釈してから再度測定することであり、もう一つの方法としては、その装置が直接に定量的な結果を与えることであるが、その結果は線形性範囲よりも遥かに高くなっている。図７は一つの完全な測定フローを示すシーケンスチャートであり、この図は希釈フローなしの測定シーケンスチャートである。図面では、ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅは、それぞれ、第１群のスラット、第２群のスラット、第３群のスラット、第４群のスラットおよび第５群のスラットを表す。
【０１８１】
１）仮に、毎回８つのブランクスラットをブランクスラットスタッキング及びローディング機構６からスラット用試料添加皿５に押し込まれるとすると、この工程は約２０秒かかり、図７では無視される。
２）スラット用試料添加皿５の回転時間は無視される。
３）ブランクスラットを位置Ｄ１まで回転させると、スラットはその位置Ｄ１でサンプルの割り当てが行われ、図７のＤ１に示す位置では、仮にサンプルの割り当てが１吸引８分けを採用して、一つのサンプルを異なる８つのスラット内に割り当て、組毎の試料添加動作が３０秒かかるとすると、８つのスラットで合計２４０秒かかることになる。
４）スラットは位置Ｄ３で試薬の割り当てが行われ、図７のＤ３に示す位置では、仮に試薬の割り当てが１吸引８分けを採用して、試薬Ｒ１の割り当てが完了した直後に試薬Ｒ２の割り当てが行われ、仮にスラット毎に試薬を割り当てる時間が３０秒かかるとすると、８つのスラットで合計４８０秒かかることになる。
５）スラットが位置Ｄ３から第１のインキュベータ１１に送られる時間は無視され、この工程は、第２の機械式アームによって試料添加針を洗浄するときに完了させることができる。
６）図７のＦは１回目のインキュベーションの時間を示す。
７）各スラットに感光微粒子を割り当てる時間は図７では無視され、汎用液装填領域１２は図５および図６に示す通りである。
８）図７のＦは２回目のインキュベーションの時間を表す。
９）図７のＧは、読み取りユニットで１つのスラットを読み取る時間（機械移動及びスラットの廃棄時間を含む）を示す。
【０１８２】
上記工程では、試薬割当段階において２種類の試薬Ｒ１およびＲ２が割り当てられたが、３種類の試薬Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が割り当てられるとされてもよいことを理解されたい。仮に、試薬Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はいずれもサンプル割り当て完了後に添加されるとすると、例えば、ＨＢｅＡｂの場合には、Ｒ３は５０μｌの中和ｅ抗原であり、運転過程はＲ１およびＲ２のみの場合と類似し、ただ試薬割当段階ではもう１つの試薬が加えられただけで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の割り当ての順序が任意である。
【０１８３】
同様に、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３のうちの１種がサンプル割当前に添加されることを理解されたい。例えばＣＡ１９−９の場合には、Ｒ３は１５μｌのサンプル希釈液であり、位置Ｄ１で第２の機械式アームを用いて１種の試薬の割り当てを完了して、そして第１の機械式アームでサンプルの割り当てを完了するとされ、その他の工程はＲ１およびＲ２のみの場合と同様である。
【０１８４】
同様に、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３のうち、Ｒ３は予備希釈液であり、予備希釈プレートが必要とされることを理解されたい。例えば、ＨＣＶの場合には、１０μｌのサンプルに１００μｌの希釈液を加え、そして２５μｌの希釈後のサンプルを採取して試験に使用する。ブランクスラットをＤ１まで回転させた後、第２の機械式アームで希釈液Ｒ３を予備希釈プレートに割り当て、第１の機械式アームでサンプルを予備希釈プレートに割り当て、必要があれば繰り返して吸引押出することができ、ここで、希釈液の割り当て工程では、１吸引複数分けの連合試料添加を行うことができ、例えば、５つのアイテムで実施し、１つは予備希釈が必要とされ、他の４つは予備希釈が不要とされるとすると、第１の機械式アームで５部のサンプルを吸引して、１部は予備希釈プレート内に割り当て、他の４部はブランクスラットに割り当てる。その後、予備希釈プレートに対して震盪処理を行い、図５および図６を参照すると、サンプル試験管載置棚７におけるブランクスラットスタッキング及びローディング機構６に近隣する側に希釈プレートシェーカー１１が設けられており、震盪処理後に、第１の機械式アームで希釈後のサンプルをスラット内に割り当てる。その後の工程は、Ｒ１およびＲ２のみの場合と一致しているので、ここでは説明を省略する。
【０１８５】
本発明で述べたとおり、用語「第１の抗体」および「第２の抗体」は、ある抗原（例えば、腫瘍マーカー）に特異的に結合可能な抗体をいう。同一の抗原（例えば、腫瘍マーカー）に対して、対応する第１の抗体及び第２の抗体は同じでも異なっていてもよく、そして同時に前記抗原に結合することができる。用語「第１の抗原」および「第２の抗原」は、ある抗体（例えば、Ｂ型肝炎表面抗体）に特異的に結合可能な抗原をいう。同一の抗体（例えば、Ｂ型肝炎表面抗体）に対して、対応する第１の抗原及び第２の抗原は同じでも異なっていてもよく、そして同時に前記抗体に結合することができる。
【０１８６】
本発明で述べたとおり、用語「抗原」とは免疫原性を有する物質をいい、例えば、タンパク質、ポリペプチドが挙げられる。代表的な抗原（これに限定されるものではない）として、サイトカイン、腫瘍マーカー、メタロプロテイン、心血管糖尿病関連タンパク質などが挙げられる。
【０１８７】
本発明で述べたとおり、用語「腫瘍マーカー」とは、腫瘍の発生と増殖中において、腫瘍細胞自体によって生成され、または有機体による腫瘍細胞に対する反応によって生成され、腫瘍の存在および成長を反映するような物質をいう。本分野における代表的な腫瘍マーカー（これに限定されるものではない）としては、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌抗原１２５（ＣＡ１２５）などが挙げられる。
【０１８８】
Ｄｏｕｂｌｅ−Ａｎｔｉ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙの基本原理は以下のとおりである。
Ｄｏｕｂｌｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙの基本原理は当業者には周知である。従来のやり方では、第１の抗体を固相担体に固定化した後、第１の抗体を抗原に反応させてから、標識された第２の抗体に反応させ、最後に化学発光またはＥｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙを行い信号を検出するようにされている。
【０１８９】
光励起化学発光法の基本原理は以下のとおりである。
光励起化学発光法の基本原理は当業者には周知である。従来のやり方では、感光微粒子と発光微粒子を一定の範囲内で結合させることで、イオン化酸素エネルギーの伝達が発生し、光信号が発せられることによって、測定対象サンプルを検出するものとされている。ここで、感光微粒子の内部に感光化合物が充填されて、発光微粒子の内部に発光化合物とランタノイド族元素が充填されている。赤色レーザ光（６００〜７００ｎｍ）の励起で、感光微粒子はエネルギーの高い状態の一重項酸素イオン（４μＳ）を放出し、その伝播距離は約２００ｎｍとされている。感光微粒子と発光微粒子の距離が十分に接近すると、感光微粒子が放出した一重項酸素イオンが発光微粒子に到達することができ、そして一連の化学反応により、５２０〜６２０ｎｍの高いエネルギー準位の光を放出し、機器によって検出される。
【０１９０】
本発明の１つの好ましい実施例では、第１の抗体が発光微粒子に固定化されたという特徴を十分に利用するとともに、ビオチンで標識された第２の抗体、ストレプトアビジンによって被覆された感光微粒子を採用して、血清サンプル又は抗原標準対照液と第１の抗体に被覆された発光微粒子、ビオチンで標識された第２の抗体を順次または同時に反応容器に添加し、次いでストレプトアビジンで標識された感光微粒子を添加することによって、以下のような反応が発生する。
（１）発光微粒子上の第１の抗体が血清サンプル又は抗原標準対照液における対応する抗原と結合して、「抗原−第１の抗体−発光微粒子」の三元複合体が形成される。
（２）第２の抗体が血清サンプル又は抗原標準対照液における対応する抗原と結合し、最後に「第２の抗体−抗原−第１の抗体−発光微粒子」となるＤｏｕｂｌｅ−Ａｎｔｉ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ複合体が形成される。
ビオチンとストレプトアビジンが特異的に結合することによって、Ｄｏｕｂｌｅ−Ａｎｔｉ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ複合体を感光微粒子に結合させる。
【０１９１】
このとき、感光微粒子と発光微粒子との距離が２００ｎｍ未満となり、感光微粒子が赤色励起光（６００〜７００ｎｍ）で照射された後、放出した一重項酸素イオンが発光微粒子に受け取られる。一連の化学反応により、５２０〜６２０ｎｍの高いエネルギー準位の光を放出し、化学出射光量の強弱で測定対象サンプルを定性的または定量的に検出する。
【０１９２】
本発明の他の好ましい実施例では、第１の抗原が発光微粒子に固定化されたという特徴を十分に利用するとともに、ビオチンで標識された第２の抗原、ストレプトアビジンによって被覆された感光微粒子を採用して、血清サンプル又は抗原標準対照液と第１の抗原に被覆された発光微粒子、ビオチンで標識された第２の抗原を順次または同時に反応容器に添加し、次いでストレプトアビジンで標識された感光微粒子を添加することによって、以下のような反応が発生する。
（１）発光微粒子上の第１の抗原が血清サンプル又は抗原標準対照液における対応する抗体と結合して、「抗体−第１の抗原−発光微粒子」の三元複合体が形成される。
（２）第２の抗原が血清サンプル又は抗原標準対照液における対応する抗体と結合し、最後に「第２の抗原−抗体−第１の抗原−発光微粒子」となるＤｏｕｂｌｅ−Ａｎｔｉ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ複合体が形成される。
ビオチンとストレプトアビジンが特異的に結合することによって、Ｄｏｕｂｌｅ−Ａｎｔｉ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ複合体を感光微粒子に結合させる。
【０１９３】
このとき、感光微粒子と発光微粒子との距離が２００ｎｍ未満となり、感光微粒子が赤色励起光（６００〜７００ｎｍ）で照射された後、放出した一重項酸素イオンが発光微粒子に受け取られる。一連の化学反応により、５２０〜６２０ｎｍの高いエネルギー準位の光を放出し、化学出射光量の強弱で測定対象サンプルを定性的または定量的に検出する。
【０１９４】
以下、本発明の関連操作の詳細について、さらに説明する。
（１）第１の抗体（または抗原）によって被覆された発光微粒子を試薬１とし、博陽生物科技有限公司から購入することができる。
（２）第２の抗体（または抗原）は、本分野で公知されている種々のマーカーおよびその特異的結合物系で標識され得る。第２の抗体（または抗原）がビオチン−アビジン系によって標識されるのが好ましい。ビオチンで標識された第２の抗体（または抗原）を試薬２とし、博陽生物科技有限公司から購入することができる。
（３）ストレプトアビジンによって被覆された感光微粒子を汎用液とし、博陽生物科技有限公司から購入することができる。
（４）校正品
測定すべき目標抗原（または抗体）で一定の濃度範囲内（ピーク校正品の濃度はＨＤ−ＨＯＯＫ効果濃度に等しい）の既知の標準物質溶液を調製する。校正品、試薬１および試薬２を均一に混合し、インキュベーション反応後にＬｉＣＡ汎用液を添加し、続けてしばらくインキュベートした後に１回目の読み取り（ＲＬＵ１）を実行し、もうしばらくインキュベートした後に２回目の読み取り（ＲＬＵ２）を実行し、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％を計算し、標準物質のＲＬＵ１および２回の読み取りの増幅Ａに基づいてそれぞれ標準物質濃度と校正曲線及び標準曲線を作成する。標準物質のＲＬＵ１と濃度との校正曲線は、非ＨＤ−ＨＯＯＫ効果段階では、ＲＬＵ１が濃度の上昇とともに増加すると表現され、ＲＬＵ１の上昇区間とし、濃度がＨＤ−ＨＯＯＫ効果段階まで増加した後、ＲＬＵ１が濃度の上昇とともに減少すると表現され、ＲＬＵ１の下降区間とする。標準物質の２回の読み取りの増幅と濃度との標準曲線は、増幅が濃度の上昇とともに増加すると表現され、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果に影響されない。
既知標準物質溶液の濃度範囲は、必要に応じて、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果濃度を跨いでもよく、又はＨＤ−ＨＯＯＫ効果濃度未満であってもよい。
（５）サンプルの検出
本発明の方法によって検出可能なサンプルは、特に限定されず、抗原（または抗体）を含む任意のサンプルであればよく、代表的な例としては、血清サンプル、尿サンプル、唾液サンプルなどが挙げられる。血清サンプルが好ましい。
（６）サンプル濃度計算
測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａの値を校正品のＡと比較して、測定対象サンプルのＡが校正品のＡを超えている場合、このサンプルの濃度が校正品の濃度より大きいとされ、それと同時に、このサンプルのＲＬＵ１がこの校正品のＲＬＵ１より小さくなる場合、このサンプルのＲＬＵ１の低さがＨＤ−ＨＯＯＫ効果に起因するものであり、希釈して検出する必要があることが示される。
あるいは、測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａの値を校正品のＡと校正品の濃度との標準曲線に代入し、測定対象サンプルの濃度がＲＬＵ１の上昇区間にあるかそれとも下降区間にあるかを判断し、そして測定対象サンプルのＲＬＵ１を所在区間の校正品のＲＬＵ１と校正品の濃度との校正曲線に代入し測定対象サンプルの濃度を算出する。
あるいは、測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａの値をＨＤ−ＨＯＯＫ効果の臨界値Ｒ０と比較し、ＡがＲ０未満の場合、このサンプルがＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルではなく、測定対象サンプルのＲＬＵ１を校正品のＲＬＵ１と校正品の濃度との校正曲線に代入し測定対象サンプルの濃度を算出する。ＡがＲ０以上の場合、このサンプルがＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルであると同定し、希釈して検出する必要がある。
【０１９５】
実施例１  ヒト血清サンプルにおけるヒト絨毛性ゴナドトロピン及びβサブユニット（ＨＣＧ＋β）の検出
博陽生物科技（上海）有限公司製のヒト絨毛性ゴナドトロピン及びβサブユニット（ＨＣＧ＋β）検出キット（光励起化学発光法）を採用して、血清サンプルにおけるヒト絨毛性ゴナドトロピン及びβサブユニット（ＨＣＧ＋β）の含有量を検出する。前記キットは、校正品１〜校正品６（すなわち、既知の一連の標準物質）、試薬１（発光抗体、すなわち、抗体によって被覆された発光微粒子）、試薬２（ビオチン標識抗体、すなわち、ビオチンで標識された抗体）を含む。
【０１９６】
［校正品１〜校正品６］従来のキットにおける濃度既知のサンプルであって、濃度はＨＤ−ＨＯＯＫサンプルよりはるかに小さく、測定対象物の濃度を算出するための校正曲線を作成するのに用いられる。
【０１９７】
［使用される他の成分］ＬｉＣＡ汎用液（ストレプトアビジンで標識された感光微粒子）、この製品は博陽生物科技有限公司製の光励起化学発光分析システム用補助試薬である。それは、機器および対応する光励起化学発光法検出キットと一緒に使用され、抗原や抗体の検出に用いられる。
【０１９８】
Ｒｏｃｈｅ検出（検出限界を超えたサンプルを希釈して検出する）によって得られた１８人のＨＣＧ＋β濃度被験者の血清サンプルについて、それぞれ従来の方法および本発明の方法で検出する。
【０１９９】
［従来の検出方法］測定対象サンプル、校正品、試薬１（発光抗体、すなわち、マウスモノクローナル抗体によって被覆された発光微粒子）および試薬２（ビオチン標識抗体、すなわち、ビオチンで標識されたマウスモノクローナル抗体）をキュベットに別々に加えた後、３７℃で１５ｍｉｎインキュベートし、汎用液（ストレプトアビジンで標識された感光微粒子）を加え、３７℃で１０ｍｉｎインキュベートし、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵを読み取り、サンプルの濃度を算出して、その結果を表１に示す。
【０２００】
［本発明の２回読み取り方法］測定対象サンプル、校正品、試薬１（発光抗体、すなわち、マウスモノクローナル抗体によって被覆された発光微粒子）および試薬２（ビオチン標識抗体、すなわち、ビオチンで標識されたマウスモノクローナル抗体）を３７℃で１５ｍｉｎインキュベートし、汎用液（ストレプトアビジンで標識された感光微粒子）を加え、３７℃で３ｍｉｎインキュベートし、ＲＬＵ１を読み取り、３７℃で続けて７ｍｉｎインキュベートし、ＲＬＵ２を読み取り、２回目の信号値の増幅Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％を算出して、その結果を表１に示す。
【０２０１】
【表１】
0006980800.tif 000002
【０２０２】
Ｒｏｃｈｅ検出結果を真実の濃度とする。表１および図８からわかるように、従来の検出では、濃度が５４５３１ｍＩＵ／ｍｌに上昇するまでは信号値が濃度の上昇と共に増加し、濃度が上昇し続けると、信号値がＨＣＧ＋β濃度の上昇と共に低下し、すなわち、濃度が５４５３１ｍＩＵ／ｍｌを超えると、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果が発生する。従来の検出では、検出範囲が０〜１００００ｍＩＵ／ｍｌであり、検出上限を超えたサンプルの濃度は＞１００００ｍＩＵ／ｍｌとして表示される。ＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルの濃度が上昇し続けると、信号が低下し続けるので、サンプル１８のように超高濃度サンプルが低濃度として報告されることになる。そのため、従来の検出では、測定対象サンプルの検出結果が、真実の濃度であるか、それともＨＤ−ＨＯＯＫ効果の影響で低濃度として報告されたかを識別できなくなる。
【０２０３】
本発明の方法では、２回の読み取りによってＨＤ−ＨＯＯＫ効果に起因する報告濃度が低いサンプルを同定するようにされている。各測定対象サンプルについて、信号値の結果であるＲＬＵ１、ＲＬＵ２を順番に検出し、２回目の読み取りの増幅Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％をサンプルの濃度を判定するための指標の一つとする。表１および図９からわかるように、信号値が５４５３１ｍＩＵ／ｍｌまでは濃度とともに上昇し続け、その後、信号値が濃度の上昇とともに低下するが、増幅Ａは濃度とともに上昇し続けることになる。したがって、測定対象サンプルのＡの値と校正品のＡの値とを直接に比較すれば、測定対象サンプルの濃度と校正品の濃度との大小関係を判定することができる。サンプル１０〜１８の増幅Ａがいずれも校正品６の増幅（１１．１％）を超えており、かつＡの値が増加し続けるので、サンプル１０〜１８のＨＣＧ＋β濃度はいずれも１００００ｍＩＵ／ｍｌを超え、かつ濃度が上昇し続け、それはＲｏｃｈｅの濃度結果と一致することが示されている。サンプル１８の信号値が校正品６よりも低くなり、従来の方法では濃度が８７１３．０２ｍＩＵ／ｍｌとして検出されるが、本発明の方法ではそれがＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルとして同定することができ、希釈して検出する必要がある。
【０２０４】
実施例２  サンプルにおけるフェリチン（Ｆｅｒｒ）の検出
博陽生物科技（上海）有限公司製のフェリチン（Ｆｅｒｒ）検出キット（化学発光法）を採用して、サンプルにおけるフェリチン（Ｆｅｒｒ）（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄから購入、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ：３０−ＡＦ１０）の含有量を検出する。前記キットは、校正品１〜校正品６（すなわち、既知の一連の標準物質）、試薬１（発光抗体、すなわち、抗体によって被覆された発光微粒子）、試薬２（ビオチン標識抗体、すなわち、ビオチンで標識された抗体）を含む。
【０２０５】
［校正品１〜校正品６］従来のキットにおける濃度既知のサンプルであって、濃度はＨＤ−ＨＯＯＫサンプルよりはるかに小さく、測定対象物の濃度を算出するための校正曲線を作成するのに用いられる。
【０２０６】
［使用される他の成分］ＬｉＣＡ汎用液（ストレプトアビジンで標識された感光微粒子）、この製品は博陽生物科技有限公司製の光励起化学発光分析システム用補助試薬である。それは、機器および対応する光励起化学発光法検出キットと一緒に使用され、抗原や抗体の検出に用いられる。
【０２０７】
高濃度のフェリチン抗原を段階希釈し、異なる濃度のフェリチンを含むサンプルの濃度値を、それぞれ従来の検出方法および本発明の検出方法で測定する。
【０２０８】
［従来の検出方法］校正品１〜校正品６、測定対象サンプル１〜１５、試薬１（発光抗体、すなわち、マウスモノクローナル抗体によって被覆された発光微粒子）および試薬２（ビオチン標識抗体、すなわち、ビオチンで標識されたマウスモノクローナル抗体）をキュベットに加えた後、３７℃で１５ｍｉｎインキュベートし、ＬｉＣＡ汎用液（ストレプトアビジンで標識された感光微粒子）を加え、３７℃で１０ｍｉｎインキュベートし、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵを読み取り、その結果を表２に示す。
【０２０９】
［本発明の２回読み取り方法］校正品１〜校正品６、測定対象サンプル１〜１５、試薬１（発光抗体、すなわち、マウスモノクローナル抗体によって被覆された発光微粒子）および試薬２（ビオチン標識抗体、すなわち、ビオチンで標識されたマウスモノクローナル抗体）を３７℃で１５ｍｉｎインキュベートし、ＬｉＣＡ汎用液（ストレプトアビジンで標識された感光微粒子）を加え、３７℃で３ｍｉｎインキュベートし、ＲＬＵ１を読み取り、３７℃で続けて７ｍｉｎインキュベートし、ＲＬＵ２を読み取り、２回目の信号値の増幅Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％を算出して、その結果を表２に示す。
【０２１０】
【表２】
0006980800.tif 000003
【０２１１】
従来の検出では、表２および図１０からわかるように、濃度が５１０００ｎｇ／ｍｌに上昇するまでは信号値が濃度の上昇と共に増加し、濃度が上昇し続けると、信号値がＦｅｒｒ濃度の上昇と共に低下し、従来の検出範囲が０〜２０００ｎｇ／ｍｌであり、検出上限を超えたサンプルの濃度は＞２０００ｎｇ／ｍｌとして表示される。ＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルの濃度が上昇し続け、濃度が２５５００００ｎｇ／ｍｌまで上昇し、信号が校正品６の信号以下に低下すると、サンプル１５のように超高濃度サンプルが低濃度として報告されることになる。そのため、従来の検出では、測定対象サンプルの検出結果が、真実の濃度であるか、それともＨＤ−ＨＯＯＫ効果の影響で低濃度として報告されたかを識別できなくなる。
【０２１２】
本発明の方法では、２回の読み取りによってＨＤ−ＨＯＯＫ効果に起因する報告濃度が低いサンプルを同定するようにされている。各測定対象サンプルについて、信号値の結果であるＲＬＵ１、ＲＬＵ２を順番に検出し、２回目の読み取りの増幅Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％をサンプルの濃度を判定するための指標の一つとする。表２および図１１からわかるように、信号値が５１０００ｎｇ／ｍｌまでは濃度とともに上昇し続け、その後、信号値が濃度の上昇とともに低下するが、増幅Ａは濃度とともに上昇し続けることになる。したがって、測定対象サンプルのＡの値と校正品のＡの値とを直接に比較すれば、測定対象サンプルの濃度と校正品の濃度との大小関係を判定することができる。サンプル４〜１５の増幅Ａがいずれも校正品６の増幅（−５．５％）を超えているので、サンプル４〜１５のＦｅｒｒ濃度はいずれも２０００ｎｇ／ｍｌを超えていることが示されている。それは実際の濃度に合致しており、サンプル１５の信号値が校正品６よりも低くなり、従来の方法では濃度が１８６０．９７ｎｇ／ｍｌとして検出されるが、本発明の方法では、それは濃度が検出範囲を超えたサンプルとして同定することができ、希釈して検出する必要がある。
【０２１３】
実施例３  サンプルにおけるＣペプチド（ＣＰ）の検出
博陽生物科技（上海）有限公司製のＣペプチド（ＣＰ）検出キット（化学発光法）を採用して、サンプルにおけるＣペプチド（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄから購入、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ：３０−ＡＣ９６）の含有量を検出する。前記キットは、校正品１〜校正品６（すなわち、既知の一連の標準物質）、試薬１（発光抗体、すなわち、抗体によって被覆された発光微粒子）、試薬２（ビオチン標識抗体、すなわち、ビオチンで標識された抗体）を含む。
【０２１４】
［校正品１〜校正品６］従来のキットにおける濃度既知のサンプルであって、濃度はＨＤ−ＨＯＯＫサンプルよりはるかに小さく、測定対象物の濃度を算出するための校正曲線を作成するのに用いられる。
【０２１５】
［使用される他の成分］ＬｉＣＡ汎用液（ストレプトアビジンで標識された感光微粒子）、この製品は博陽生物科技有限公司製の光励起化学発光分析システム用補助試薬である。それは、機器および対応する光励起化学発光法検出キットと一緒に使用され、抗原や抗体の検出に用いられる。
【０２１６】
高濃度のＣペプチド抗原を段階希釈し、異なる濃度のＣペプチドを含むサンプルの濃度値を、それぞれ従来の検出方法および本発明の検出方法で測定する。
【０２１７】
［従来の検出方法］校正品１〜校正品６、測定対象サンプル１〜１５、試薬１（発光抗体、すなわち、マウスモノクローナル抗体によって被覆された発光微粒子）および試薬２（ビオチン標識抗体、すなわち、ビオチンで標識されたマウスモノクローナル抗体）をキュベットに加えた後、３７℃で１５ｍｉｎインキュベートし、ＬｉＣＡ汎用液（ストレプトアビジンで標識された感光微粒子）を加え、３７℃で１０ｍｉｎインキュベートし、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵを読み取り、その結果を表３に示す。
【０２１８】
［本発明の２回読み取り方法］校正品１〜校正品６、測定対象サンプル１〜１５、試薬１（発光抗体、すなわち、マウスモノクローナル抗体によって被覆された発光微粒子）および試薬２（ビオチン標識抗体、すなわち、ビオチンで標識されたマウスモノクローナル抗体）を３７℃で１５ｍｉｎインキュベートし、ＬｉＣＡ汎用液（ストレプトアビジンで標識された感光微粒子）を加え、３７℃で３ｍｉｎインキュベートし、ＲＬＵ１を読み取り、３７℃で続けて７ｍｉｎインキュベートし、ＲＬＵ２を読み取り、２回目の信号値の増幅Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％を算出して、その結果を表３に示す。
【０２１９】
【表３】
0006980800.tif 000004
【０２２０】
従来の検出では、表３および図１２からわかるように、濃度が１００００ｎｇ／ｍｌに上昇するまでは信号値が濃度の上昇と共に増加し、濃度が上昇し続けると、信号値がＣペプチド濃度の上昇と共に低下し、従来の検出範囲が０〜３０ｎｇ／ｍｌであり、検出上限を超えたサンプルの濃度は＞３０ｎｇ／ｍｌとして表示される。濃度が３３５０００００ｎｇ／ｍｌまで上昇し、信号が校正品６の信号以下に低下すると、サンプル１６、１７のように超高濃度サンプルが低濃度として報告されることになる。そのため、従来の検出では、測定対象サンプルの検出結果が、真実の濃度であるか、それともＨＤ−ＨＯＯＫ効果の影響で低濃度として報告されたかを識別できなくなる。
【０２２１】
本発明の方法では、２回の読み取りによってＨＤ−ＨＯＯＫ効果に起因する報告濃度が低いサンプルを同定するようにされている。各測定対象サンプルについて、信号値の結果であるＲＬＵ１、ＲＬＵ２を順番に検出し、２回目の読み取りの増幅Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％をサンプルの濃度を判定するための指標の一つとする。表３および図１３からわかるように、信号値が１００００ｎｇ／ｍｌまでは濃度とともに上昇し続け、その後、信号値が濃度の上昇とともに低下するが、増幅Ａは濃度とともに上昇し続けることになる。したがって、測定対象サンプルのＡの値と校正品のＡの値とを直接に比較すれば、測定対象サンプルの濃度と校正品の濃度との大小関係を判定することができる。サンプル５〜１７の増幅Ａがいずれも校正品６の増幅（−４．９％）を超えているので、サンプル５〜１７のＣペプチド濃度はいずれも３０ｎｇ／ｍｌを超え、検出上限を超えていることが示されている。それは実際の濃度に合致しており、サンプル１６、１７の信号値が校正品６よりも低くなり、従来の方法では濃度がそれぞれ、８．１５ｎｇ／ｍｌ、０．７６ｎｇ／ｍｌとして検出されるが、本発明の方法では、それらは検出上限を超えたサンプルとして同定することができ、希釈して検出する必要がある。
【０２２２】
実施例４  ヒト血清サンプルにおけるＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の検出
博陽生物科技（上海）有限公司製のＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）検出キット（光励起化学発光法）を採用して、サンプルにおけるＨＢｓＡｇの濃度を検出する。前記キットは、校正品１〜校正品６（すなわち、既知の一連の標準物質）、試薬１（発光抗体、すなわち、抗体によって被覆された発光微粒子）、試薬２（ビオチン標識抗体、すなわち、ビオチンで標識された抗体）を含む。
【０２２３】
［校正品１〜校正品６］従来のキットにおける濃度既知のサンプルであって、濃度はＨＤ−ＨＯＯＫサンプルよりはるかに小さく、測定対象物の濃度を算出するための校正曲線を作成するのに用いられる。
【０２２４】
［使用される他の成分］ＬｉＣＡ汎用液（ストレプトアビジンで標識された感光微粒子）、この製品は博陽生物科技有限公司製の光励起化学発光分析システム用補助試薬である。それは、機器および対応する光励起化学発光法検出キットと一緒に使用され、抗原や抗体の検出に用いられる。
【０２２５】
［まず、本発明の方法で校正品１〜校正品６、測定対象の血清サンプル１〜１５を検出する］測定対象物、試薬１（抗体によって被覆された発光微粒子）および試薬２（ビオチンで標識された抗体）をキュベットに加えた後、３７℃で１５ｍｉｎインキュベートし、ＬｉＣＡ汎用液（ストレプトアビジンで標識された感光微粒子）を加え、３７℃で３ｍｉｎインキュベートし、ＲＬＵ１を読み取り、３７℃で続けて７ｍｉｎインキュベートし、ＲＬＵ２を読み取り、２回目の信号値の増幅Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％を算出して、その結果を表４に示す。
【０２２６】
【表４】
0006980800.tif 000005
【０２２７】
本発明の方法によって得られた１５個の血清サンプルの濃度は表４に示す通りである。まず、校正品６の増幅と比較するによって検出上限（３３６．５６ＩＵ／ｍＬ）を超えたサンプルを識別し、すなわち、Ａの値が２７％を超えると、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルであると判定し、希釈してから検出することを提案する。一方、Ａが２７％未満であると、検出範囲内のサンプルであると判定し、そのまま校正曲線でサンプル濃度を算出することができる。
【０２２８】
サンプルを段階希釈した後に濃度の変化を検出することで上記結論の信頼性を検証する。サンプル１〜サンプル１５に対していずれも２倍希釈と４倍希釈を行うとともに、従来の検出方法で未希釈の原倍サンプル、２倍希釈サンプルと４倍希釈サンプルを検出して、希釈後の濃度の変化を観測することによってそのサンプルにはＨＤ−ＨＯＯＫ効果が存在するか否かを判定し、すなわち、希釈後にサンプル濃度が逆に上昇する場合はＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルであると判定する。非ＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルは希釈後に濃度が低下することになる。その結果を表５に示す。
【０２２９】
【表５】
0006980800.tif 000006
【０２３０】
表５から、血清サンプル１、２、３、５、６、９、１２、１３、１４、１５が希釈された後に検出濃度が上昇し、それらはＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルであることが証明され、濃度が３３６．５６ＩＵ／ｍＬを超えていることがわかる。血清サンプル４、７、８、１０、１１の濃度は希釈後に低下し、それらはＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルではないことが証明され、本発明方法の結果と完全に同一であった。
【０２３１】
実施例５  ヒト血清サンプルにおけるＣＡ１２５の検出
博陽生物科技（上海）有限公司製の炭水化物抗原１２５（ＣＡ１２５）検出キット（光励起化学発光法）を採用して、サンプルにおけるＣＡ１２５の濃度を検出する。前記キットは、校正品１〜校正品６（すなわち、既知の一連の標準物質）、試薬１（発光抗体、すなわち、抗体によって被覆された発光微粒子）、試薬２（ビオチン標識抗体、すなわち、ビオチンで標識された抗体）を含む。
【０２３２】
［校正品１〜校正品６］従来のキットにおける濃度既知のサンプルであって、濃度はＨＤ−ＨＯＯＫサンプルよりはるかに小さく、測定対象物の濃度を算出するための校正曲線を作成するのに用いられる。
【０２３３】
［使用される他の成分］ＬｉＣＡ汎用液（ストレプトアビジンで標識された感光微粒子）、この製品は博陽生物科技有限公司製の光励起化学発光分析システム用補助試薬である。それは、機器および対応する光励起化学発光法検出キットと一緒に使用され、抗原や抗体の検出に用いられる。
【０２３４】
［まず、本発明の方法で校正品１〜校正品６、測定対象の血清サンプル１〜１８を検出する］測定対象物、試薬１（抗体によって被覆された発光微粒子）および試薬２（ビオチンで標識された抗体）をキュベットに加えた後、３７℃で１５ｍｉｎインキュベートし、ＬｉＣＡ汎用液（ストレプトアビジンで標識された感光微粒子）を加え、３７℃で３ｍｉｎインキュベートし、ＲＬＵ１を読み取り、３７℃で続けて７ｍｉｎインキュベートし、ＲＬＵ２を読み取り、２回目の信号値の増幅Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％を算出して、その結果を表６に示す。
【０２３５】
【表６】
0006980800.tif 000007
【０２３６】
本発明の方法によって得られた１８個の血清サンプルの濃度は表６に示す通りである。まず、校正品６の増幅と比較するによって検出上限を超えたサンプルを識別し、すなわち、Ａの値が７．４％を超えると、検出上限を超えたサンプルであると判定し、希釈してから検出することを提案する。一方、Ａが７．４％未満であると、非ＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルであると判定し、そのまま校正曲線でサンプル濃度を算出することができる。
【０２３７】
サンプルを段階希釈した後に濃度の変化を検出することで上記結論の信頼性を検証する。サンプル１〜サンプル１８に対していずれも２倍希釈と４倍希釈を行うとともに、従来の検出方法で未希釈の原倍サンプル、２倍希釈サンプルと４倍希釈サンプルを検出して、希釈後の濃度の変化を観測することによってそのサンプルにはＨＤ−ＨＯＯＫ効果が存在するか否かを判定し、すなわち、希釈後にサンプル濃度が逆に上昇する場合はＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルであると判定する。非ＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルは希釈後に濃度が低下することになる。その結果を表７に示す。
【０２３８】
【表７】
0006980800.tif 000008
【０２３９】
表７から、血清サンプル１６、１７、１８が希釈された後に検出濃度が上昇し、それらはＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルであることが証明され、血清サンプル１〜１５の濃度は希釈後に低下し、それらはＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルではないことが証明される。本発明方法の結果と完全に同一であった。サンプルが希釈されていない場合、従来の方法で原倍のサンプルを検出すると、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果のために血清サンプル１６、１７および１８は低濃度サンプルとして誤って判断されることになる。
【０２４０】
実施例６  サンプルにおけるＢ型肝炎ウイルス表面抗体（ＨＢｓＡｂ）の検出
博陽生物科技（上海）有限公司製のＢ型肝炎ウイルス表面抗体（ＨＢｓＡｂ）検出キット（光励起化学発光法）を採用して、サンプルにおけるＢ型肝炎ウイルス表面抗体（北京中科京達生物技術有限公司から購入、Ｃｌｏｎｅ  Ｎｏ：Ｍ２２０１）の含有量を検出する。前記キットは、校正品１〜校正品６（すなわち、既知の一連の標準物質）、試薬１（発光抗体、すなわち、抗体によって被覆された発光微粒子）、試薬２（ビオチン標識抗体、すなわち、ビオチンで標識された抗体）を含む。
【０２４１】
［校正品１〜校正品６］従来のキットにおける濃度既知のサンプルであって、濃度はＨＤ−ＨＯＯＫサンプルよりはるかに小さく、測定対象物の濃度を算出するための校正曲線を作成するのに用いられる。
【０２４２】
［使用される他の成分］ＬｉＣＡ汎用液（ストレプトアビジンで標識された感光微粒子）、この製品は博陽生物科技有限公司製の光励起化学発光分析システム用補助試薬である。それは、機器および対応する光励起化学発光法検出キットと一緒に使用され、抗原や抗体の検出に用いられる。
【０２４３】
高濃度のＨＢｓＡｂを段階希釈し、異なる濃度のＨＢｓＡｂを含むサンプルの濃度値を、それぞれ従来の検出方法および本発明の検出方法で測定する。
【０２４４】
［従来の検出方法］校正品１〜校正品６、測定対象サンプル１〜１４、試薬１（ＨＢｓＡｇによって被覆された発光微粒子）および試薬２（ビオチンで標識されたＨＢｓＡｇ）をキュベットに加えた後、３７℃で１５ｍｉｎインキュベートし、ＬｉＣＡ汎用液（ストレプトアビジンで標識された感光微粒子）を加え、３７℃で１０ｍｉｎインキュベートし、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵを読み取り、その結果を表８に示す。
【０２４５】
［本発明の２回読み取り方法］校正品１〜校正品６、測定対象サンプル１〜１４、試薬１（ＨＢｓＡｇによって被覆された発光微粒子）および試薬２（ビオチンで標識されたＨＢｓＡｇ）を３７℃で１５ｍｉｎインキュベートし、ＬｉＣＡ汎用液（ストレプトアビジンで標識された感光微粒子）を加え、３７℃で３ｍｉｎインキュベートし、ＲＬＵ１を読み取り、３７℃で続けて７ｍｉｎインキュベートし、ＲＬＵ２を読み取り、２回目の信号値の増幅Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％を算出して、その結果を表８に示す。
【０２４６】
【表８】
0006980800.tif 000009
【０２４７】
従来の検出では、表８および図１４からわかるように、濃度が１００００ｍＩＵ／ｍｌに上昇するまでは信号値が濃度の上昇と共に増加し、濃度が上昇し続けると、信号値がＨＢｓＡｂ濃度の上昇と共に低下し、従来の検出範囲が０〜１０００ｍＩＵ／ｍｌであり、検出上限を超えたサンプルの濃度は＞１０００ｍＩＵ／ｍｌとして表示される。濃度が３３５０００ｍＩＵ／ｍｌ及びそれ以上に上昇し、信号が校正品６の信号以下に低下すると、サンプル１２、１３、１４のように超高濃度サンプルが低濃度として報告されることになる。そのため、従来の検出では、測定対象サンプルの検出結果が、真実の濃度であるか、それともＨＤ−ＨＯＯＫ効果の影響で低濃度として報告されたかを識別できなくなる。
【０２４８】
本発明の方法では、２回の読み取りによってＨＤ−ＨＯＯＫ効果に起因する報告濃度が低いサンプルを同定するようにされている。各測定対象サンプルについて、信号値の結果であるＲＬＵ１、ＲＬＵ２を順番に検出し、２回目の読み取りの増幅Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％をサンプルの濃度を判定するための指標の一つとする。表８および図１５からわかるように、信号値が１００００ｍＩＵ／ｍｌまでは濃度とともに上昇し続け、その後、信号値が濃度の上昇とともに低下するが、増幅Ａは濃度とともに上昇し続けることになる。したがって、測定対象サンプルのＡの値と校正品のＡの値とを直接に比較すれば、測定対象サンプルの濃度と校正品の濃度との大小関係を判定することができる。サンプル８〜１４の増幅Ａがいずれも校正品６の増幅（３５．９％）を超えているので、サンプル８〜１４のＨＢｓＡｂ濃度はいずれも１０００ｍＩＵ／ｍｌを超え、検出上限を超えていることが示されている。それは実際の濃度に合致しており、サンプル１２、１３、１４の信号値が校正品６よりも低くなり、従来の方法では濃度が８０２．５７ｍＩＵ／ｍｌ、３５２．２２ｍＩＵ／ｍｌ、１４７．９ｍＩＵ／ｍｌとして検出されるが、本発明の方法では、それらは濃度が検出範囲を超えたサンプルとして同定することができ、希釈して検出する必要がある。
【０２４９】
実施例７  定性的キットＡｎｔｉ−ＨＣＶにおける本発明方法の適用
博陽生物科技（上海）有限公司製のＣ型肝炎ウイルス抗体検出キット（化学発光法）を採用して、サンプルにおけるＡｎｔｉ−ＨＣＶの含有量を検出する。前記キットは、参考品、陰性対照、陽性対照、試薬１（発光ＨＣＶ抗原、すなわち、ＨＣＶ抗原によって被覆された発光微粒子）及び試薬２（ビオチン標識ＨＣＶ抗原、すなわち、ビオチンで標識されたＨＣＶ抗原）を含む。
【０２５０】
［参考品、陰性対照、陽性対照］参考品は参考として測定対象サンプルの陰性、陽性を判定するための濃度既知の標準品であり、陰性対照、陽性対照は、試験の有効性を判定するための濃度既知の標準品である。高濃度のＡｎｔｉ−ＨＣＶを段階希釈し、異なる濃度のＡｎｔｉ−ＨＣＶを含むサンプルの信号値を、それぞれ従来の検出方法および本発明の検出方法で測定する。
【０２５１】
［従来の検出方法］段階希釈された一連のＡｎｔｉ−ＨＣＶサンプル、試薬１（発光ＨＣＶ抗原、すなわち、ＨＣＶ抗原によって被覆された発光微粒子）および試薬２（ビオチン標識ＨＣＶ抗原、すなわち、ビオチンで標識されたＨＣＶ抗原）をキュベットに加えた後、３７℃で１５ｍｉｎインキュベートし、ＬｉＣＡ汎用液（ストレプトアビジンで標識された感光微粒子）を加え、３７℃で１０ｍｉｎインキュベートし、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵを読み取り、その結果を表９に示す。
【０２５２】
［本発明の２回読み取り方法］段階希釈された一連のＡｎｔｉ−ＨＣＶサンプル、試薬１（発光ＨＣＶ抗原、すなわち、ＨＣＶ抗原によって被覆された発光微粒子）および試薬２（ビオチン標識ＨＣＶ抗原、すなわち、ビオチンで標識されたＨＣＶ抗原）を３７℃で１５ｍｉｎインキュベートし、ＬｉＣＡ汎用液（ストレプトアビジンで標識された感光微粒子）を加え、３７℃で３ｍｉｎインキュベートし、ＲＬＵ１を読み取り、３７℃で続けて７ｍｉｎインキュベートし、ＲＬＵ２を読み取り、２回目の信号値の増幅Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％を算出して、その結果を表９に示す。
【０２５３】
【表９】
0006980800.tif 000010
【０２５４】
表９に示すように、抗原の希釈倍数を１０，０００倍に減少させた後、信号値は濃度の上昇と共に低下し、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果が生じ、濃度が一定の値（例えばサンプル１２）まで上昇し続けると、ＲＬＵは参考値ｃｕｔ  ｏｆｆ以下に低下し、従来の検出方法では、その結果が陰性であると誤って判定されてしまう。本発明の方法では、まず、２回の信号の増幅Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％を観察し、測定対象サンプルのＡの値と陽性対照のＡの値（−２５％）とを比較し、測定対象サンプルと陽性対照との大小関係を判定し、上記の表に示すように、サンプル１２のＡの値（４７％）は陽性対照のＡの値（−２５％）よりもはるかに高くなり、このサンプルの濃度が陽性対照を超えていることが示され、陽性サンプルであり、その信号の不十分はＨＤ−ＨＯＯＫ効果に起因するもので、希釈して検証する必要がある。
【０２５５】
実施例８  サンプルにおけるインスリン（ＩＮＳ）の検出
博陽生物科技（上海）有限公司製のインスリン（ＩＮＳ）検出キット（化学発光法）を採用して、サンプルにおけるインスリン（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄから購入、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ：３０Ｒ−２７０４）の含有量を検出する。
【０２５６】
高濃度のインスリン抗原を段階希釈し、異なる濃度のインスリンを含むサンプルの信号値を、それぞれ従来の検出方法および本発明の検出方法で測定する。
【０２５７】
［従来の検出方法］濃度既知の測定対象サンプル、試薬１（発光抗体、すなわち、マウスモノクローナル抗体によって被覆された発光微粒子）および試薬２（ビオチン標識抗体、すなわち、ビオチンで標識されたマウスモノクローナル抗体）をキュベットに加えた後、３７℃で１５ｍｉｎインキュベートし、ＬｉＣＡ汎用液（ストレプトアビジンで標識された感光微粒子）を加え、３７℃で１０ｍｉｎインキュベートし、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵを読み取り、その結果を表１０に示す。
【０２５８】
［本発明の２回読み取り方法］濃度既知の測定対象サンプル、試薬１（発光抗体、すなわち、マウスモノクローナル抗体によって被覆された発光微粒子）および試薬２（ビオチン標識抗体、すなわち、ビオチンで標識されたマウスモノクローナル抗体）を３７℃で１５ｍｉｎインキュベートし、ＬｉＣＡ汎用液（ストレプトアビジンで標識された感光微粒子）を加え、３７℃で３ｍｉｎインキュベートし、ＲＬＵ１を読み取り、３７℃で続けて７ｍｉｎインキュベートし、ＲＬＵ２を読み取り、２回目の信号値の増幅Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％を算出して、その結果を表１０に示す。
【０２５９】
【表１０】
0006980800.tif 000011
【０２６０】
表１０および図１６から、濃度が３μＩＵ／ｍｌから１００００μＩＵ／ｍｌになるまで信号値が濃度の上昇と共に増加し、濃度が上昇し続けると、信号値がインスリン濃度の上昇と共に低下し、すなわち、濃度が１０，０００μＩＵ／ｍｌを超えると、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果が発生し、従来の検出では、抗原濃度がこの検出範囲を超えたサンプルの報告濃度は低濃度となる（報告濃度はいずれも１０，０００μＩＵ／ｍｌ未満である）。
【０２６１】
本発明の方法では、２回の読み取りによって検出範囲を広げるようにされている。各測定対象サンプルについて、信号値の結果であるＲＬＵ１、ＲＬＵ２を順番に検出し、２回目の読み取りの増幅Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％をサンプルの濃度区間を判定するための指標の一つとする。表１０および図１７からわかるように、信号値が１０，０００μＩＵ／ｍｌまでは濃度とともに上昇し続け、その後、信号値が濃度の上昇とともに低下するが、増幅Ａは濃度とともに上昇し続けることになる。
【０２６２】
インスリン校正品の濃度は３μＩＵ／ｍｌから１，０００，０００μＩＵ／ｍｌまでの範囲をカバーしており、本発明の方法を利用してそれぞれＲＬＵ１とＡの校正曲線及び標準曲線（図１７参照）を作成する。濃度の上昇とともにＡが上昇し続け、ＲＬＵ１は３μＩＵ／ｍｌから１０，０００μＩＵ／ｍｌまでの上昇区間および１０，０００μＩＵ／ｍｌから１，０００，０００μＩＵ／ｍｌまでの下降区間に分けられる。本発明の方法を利用して測定対象サンプルのＲＬＵ１、ＲＬＵ２およびＡを検出する。まず、Ａの値によって測定対象物質の濃度が３μＩＵ／ｍｌから１０，０００μＩＵ／ｍｌの上昇区間にあるか、それとも１０，０００μＩＵ／ｍｌから１，０００，０００μＩＵ／ｍｌまでの下降区間にあるかを特定し、次いで測定対象物質のＲＬＵ１を対応する校正曲線に代入して正確な濃度を算出する。
【０２６３】
表１０から、インスリン濃度が１０，０００μＩＵ／ｍｌのとき、信号のピークがあり、それに対応するＡは２０％となる。測定対象物のＡ＜２０％の場合、その測定対象サンプルがＨＤ−ＨＯＯＫサンプルではなく、そのＲＬＵ１を濃度が１０，０００μＩＵ／ｍｌ未満の校正曲線に代入して濃度を算出し、Ａ≧２０％の場合、その測定対象サンプルがＨＤ−ＨＯＯＫサンプルであり、そのＲＬＵ１を濃度が１０，０００μＩＵ／ｍｌを超える校正曲線に代入して濃度を算出し、これによって検出上限を１０，０００μＩＵ／ｍｌから１，０００，０００μＩＵ／ｍｌに広げた。
【０２６４】
実施例９  サンプルにおけるＢ型肝炎ウイルス表面抗体（ＨＢｓＡｂ）の検出
博陽生物科技（上海）有限公司製のＢ型肝炎ウイルス表面抗体検出キット（光励起化学発光法）を採用して、サンプルにおけるＢ型肝炎ウイルス表面抗体（北京中科京達生物技術有限公司から購入、Ｃｌｏｎｅ  Ｎｏ：Ｍ２２０１）の濃度を検出する。
【０２６５】
高濃度のＨＢｓＡｂを段階希釈し、異なる濃度のＨＢｓＡｂを含むサンプルの信号値を、それぞれ従来の検出方法および本発明の検出方法で測定する。
【０２６６】
［従来の検出方法］段階希釈されたＨＢｓＡｂサンプル、試薬１（ＨＢｓＡｇによって被覆された発光微粒子）および試薬２（ビオチンで標識されたＨＢｓＡｇ）をキュベットに加えた後、３７℃で１５ｍｉｎインキュベートし、ＬｉＣＡ汎用液（ストレプトアビジンで標識された感光微粒子）を加え、３７℃で１０ｍｉｎインキュベートし、光子カウンタでＲＬＵを読み取る。
【０２６７】
［本発明の２回読み取り方法］段階希釈されたＨＢｓＡｂサンプル、試薬１（ＨＢｓＡｇによって被覆された発光微粒子）および試薬２（ビオチンで標識されたＨＢｓＡｇ）をキュベットに加えた後、３７℃で１５ｍｉｎインキュベートし、ＬｉＣＡ汎用液（ストレプトアビジンで標識された感光微粒子）を加え、３７℃で３ｍｉｎインキュベートし、ＲＬＵ１を読み取り、３７℃で続けて７ｍｉｎインキュベートし、ＲＬＵ２を読み取り、２回目の信号値の増幅Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％を算出して、その結果を表１１に示す。
【０２６８】
【表１１】
0006980800.tif 000012
【０２６９】
表１１および図１８から、濃度が１ｍＩＵ／ｍｌから１００００ｍＩＵ／ｍｌになるまで信号値が濃度の上昇と共に増加し、濃度が上昇し続けると、信号値がＨＢｓＡｂ濃度の上昇と共に低下し、すなわち、濃度が１０，０００ｍＩＵ／ｍｌを超えると、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果が発生し、従来の検出では、抗原濃度がこの検出範囲を超えたサンプルの報告濃度は低濃度となる（報告濃度はいずれも１０，０００ｍＩＵ／ｍｌ未満である）。
【０２７０】
本発明の方法では、２回の読み取りによって検出範囲を広げるようにされている。各測定対象サンプルについて、信号値の結果であるＲＬＵ１、ＲＬＵ２を順番に検出し、２回目の読み取りの増幅Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％をサンプルの濃度区間を判定するための指標の一つとする。表１１および図１９からわかるように、信号値が１０，０００ｍＩＵ／ｍｌまでは濃度とともに上昇し続け、その後、信号値が濃度の上昇とともに低下するが、増幅Ａは濃度とともに上昇し続けることになる。
【０２７１】
ＨＢｓＡｂ校正品の濃度は１ｍＩＵ／ｍｌから３，３５０，０００ｍＩＵ／ｍｌまでの範囲をカバーしており、本発明の方法を利用してそれぞれＲＬＵ１とＡの校正曲線及び標準曲線（図１９参照）を作成する。濃度の上昇とともにＡが上昇し続け、ＲＬＵ１は１ｍＩＵ／ｍｌから１０，０００ｍＩＵ／ｍｌまでの上昇区間および１０，０００ｍＩＵ／ｍｌから３，３５０，０００ｍＩＵ／ｍｌまでの下降区間に分けられる。本発明の方法を利用して測定対象サンプルのＲＬＵ１、ＲＬＵ２およびＡを検出する。まず、Ａの値によって測定対象物質の濃度が１ｍＩＵ／ｍｌから１０，０００ｍＩＵ／ｍｌまでの上昇区間にあるか、それとも１０，０００ｍＩＵ／ｍｌから３，３５０，０００ｍＩＵ／ｍｌまでの下降区間にあるかを特定し、次いで測定対象物質のＲＬＵ１を対応する校正曲線に代入して正確な濃度を算出する。
【０２７２】
表１１から、ＨＢｓＡｂ濃度が１０，０００ｍＩＵ／ｍｌのとき、信号のピークがあり、それに対応するＡは３７．５％となる。測定対象物のＡ＜３７．５％の場合、その測定対象サンプルがＨＤ−ＨＯＯＫサンプルではなく、そのＲＬＵ１を濃度が１０，０００ｍＩＵ／ｍｌ未満の校正曲線に代入して濃度を算出し、Ａ≧３７．５％の場合、その測定対象サンプルがＨＤ−ＨＯＯＫサンプルであり、そのＲＬＵ１を濃度が１０，０００ｍＩＵ／ｍｌを超える校正曲線に代入して濃度を算出し、これによって検出上限を１０，０００ｍＩＵ／ｍｌから３，３５０，０００ｍＩＵ／ｍｌに広げた。
【０２７３】
実施例１０  サンプルにおけるアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）の検出
博陽生物科技（上海）有限公司製のアルファフェトプロテイン検出キット（光励起化学発光法）を採用して、サンプルにおけるＡＦＰ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄから購入、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ：３０−１３７０）の含有量を検出する。
【０２７４】
高濃度のＡＦＰ抗原を段階希釈し、異なる濃度のＡＦＰを含むサンプルの信号値を、それぞれ従来の検出方法および本発明の検出方法で測定する。前記従来の検出方法および本発明の検出方法は実施例８を参照する。その検出結果を以下に示す。
【０２７５】
【表１２】
0006980800.tif 000013
【０２７６】
表１２および図２０から、濃度が５ｎｇ／ｍｌから１００００ｎｇ／ｍｌになるまで信号値が濃度の上昇と共に増加し、濃度が上昇し続けると、信号値がＡＦＰ濃度の上昇と共に低下し、すなわち、濃度が１０，０００ｎｇ／ｍｌを超えると、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果が発生し、従来の検出では、抗原濃度がこの検出範囲を超えたサンプルの報告濃度は低濃度となる（報告濃度はいずれも１０，０００ｎｇ／ｍｌ未満である）。
【０２７７】
本発明の方法では、２回の読み取りによって検出範囲を広げるようにされている。各測定対象サンプルについて、信号値の結果であるＲＬＵ１、ＲＬＵ２を順番に検出し、２回目の読み取りの増幅Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％をサンプルの濃度区間を判定するための指標の一つとする。表１２および図２１からわかるように、信号値が１０，０００ｎｇ／ｍｌまでは濃度とともに上昇し続け、その後、信号値が濃度の上昇とともに低下するが、増幅Ａは濃度とともに上昇し続けることになる。
【０２７８】
ＡＦＰ校正品の濃度は５ｎｇ／ｍｌから１，０００，０００ｎｇ／ｍｌまでの範囲をカバーしており、本発明の方法を利用してそれぞれＲＬＵ１とＡの校正曲線及び標準曲線（図２１参照）を作成する。濃度の上昇とともにＡが上昇し続け、ＲＬＵ１は５ｎｇ／ｍｌから１０，０００ｎｇ／ｍｌまでの上昇区間および１０，０００ｎｇ／ｍｌから１，０００，０００ｎｇ／ｍｌまでの下降区間に分けられる。本発明の方法を利用して測定対象サンプルのＲＬＵ１、ＲＬＵ２およびＡを検出する。まず、Ａの値によって測定対象物質の濃度が５ｎｇ／ｍｌから１０，０００ｎｇ／ｍｌまでの上昇区間にあるか、それとも１０，０００ｎｇ／ｍｌから１，０００，０００ｎｇ／ｍｌまでの下降区間にあるかを特定し、次いで測定対象物質のＲＬＵ１を対応する校正曲線に代入して正確な濃度を算出する。
【０２７９】
表１２から、ＡＦＰ濃度が１０，０００ｎｇ／ｍｌのとき、信号のピークがあり、それに対応するＡは１８％となる。測定対象物のＡ＜１８％の場合、その測定対象サンプルがＨＤ−ＨＯＯＫサンプルではなく、そのＲＬＵ１を濃度が１０，０００ｎｇ／ｍｌ未満の校正曲線に代入して濃度を算出し、Ａ≧１８％の場合、その測定対象サンプルがＨＤ−ＨＯＯＫサンプルであり、そのＲＬＵ１を濃度が１０，０００ｎｇ／ｍｌを超える校正曲線に代入して濃度を算出し、これによって検出上限を１０，０００ｎｇ／ｍｌから１，０００，０００ｎｇ／ｍｌに広げた。
【０２８０】
実施例１１  サンプルにおけるチロトロピン（ＴＳＨ）の検出
博陽生物科技（上海）有限公司製のチロトロピン検出キット（光励起化学発光法）を採用して、サンプルにおけるチロトロピン（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄから購入、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ：３０Ｒ−ＡＴ００９）の含有量を検出する。
【０２８１】
高濃度のＴＳＨ抗原を段階希釈し、異なる濃度のＴＳＨを含むサンプルの信号値を、それぞれ従来の検出方法および本発明の検出方法で測定する。前記従来の検出方法および本発明の検出方法は実施例８を参照する。その検出結果を以下に示す。
【０２８２】
【表１３】
0006980800.tif 000014
【０２８３】
表１３および図２２から、濃度が１μＩＵ／ｍｌから１００００μＩＵ／ｍｌになるまで信号値が濃度の上昇と共に増加し、濃度が上昇し続けると、信号値がＴＳＨ濃度の上昇と共に低下し、すなわち、濃度が１０，０００μＩＵ／ｍｌを超えると、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果が発生し、従来の検出では、抗原濃度がこの検出範囲を超えたサンプルの報告濃度は低濃度となる（報告濃度はいずれも１０，０００μＩＵ／ｍｌ未満である）。
【０２８４】
本発明の方法では、２回の読み取りによって検出範囲を広げるようにされている。各測定対象サンプルについて、信号値の結果であるＲＬＵ１、ＲＬＵ２を順番に検出し、２回目の読み取りの増幅Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％をサンプルの濃度区間を判定するための指標の一つとする。表１３および図２３からわかるように、信号値が１０，０００μＩＵ／ｍｌまでは濃度とともに上昇し続け、その後、信号値が濃度の上昇とともに低下するが、増幅Ａは濃度とともに上昇し続けることになる。
【０２８５】
ＴＳＨ校正品の濃度は１μＩＵ／ｍｌから１，０００，０００μＩＵ／ｍｌまでの範囲をカバーしており、本発明の方法を利用してそれぞれＲＬＵ１とＡの校正曲線及び標準曲線（図２３参照）を作成する。濃度の上昇とともにＡが上昇し続け、ＲＬＵ１は１μＩＵ／ｍｌから１０，０００μＩＵ／ｍｌまでの上昇区間および１０，０００μＩＵ／ｍｌから１，０００，０００μＩＵ／ｍｌまでの下降区間に分けられる。本発明の方法を利用して測定対象サンプルのＲＬＵ１、ＲＬＵ２およびＡを検出する。まず、Ａの値によって測定対象物質の濃度が３μＩＵ／ｍｌから１０，０００μＩＵ／ｍｌまでの上昇区間にあるか、それとも１０，０００μＩＵ／ｍｌから１，０００，０００μＩＵ／ｍｌまでの下降区間にあるかを特定し、次いで測定対象物質のＲＬＵ１を対応する校正曲線に代入して正確な濃度を算出する。
【０２８６】
表１３から、ＴＳＨ濃度が１０，０００μＩＵ／ｍｌのとき、信号のピークがあり、それに対応するＡは１７．０％となる。測定対象物のＡ＜１７．０％の場合、その測定対象サンプルがＨＤ−ＨＯＯＫサンプルではなく、そのＲＬＵ１を濃度が１０，０００μＩＵ／ｍｌ未満の校正曲線に代入して濃度を算出し、Ａ≧１７．０％の場合、その測定対象サンプルがＨＤ−ＨＯＯＫサンプルであり、そのＲＬＵ１を濃度が１０，０００μＩＵ／ｍｌを超える校正曲線に代入して濃度を算出し、これによって検出上限を１０，０００μＩＵ／ｍｌから１，０００，０００μＩＵ／ｍｌに広げた。
【０２８７】
実施例１２  ヒト血清サンプルにおけるＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の検出
本発明による免疫測定法に係るキットを採用して、サンプルにおけるＨＢｓＡｇの濃度を検出する。前記キットは、校正品１〜校正品６、ピーク校正品、試薬１（発光抗体、すなわち、抗体によって被覆された発光微粒子）、試薬２（ビオチン標識抗体、すなわち、ビオチンで標識された抗体）を含む。
【０２８８】
［校正品１〜校正品６］従来のキットにおける濃度既知のサンプルであって、濃度はＨＤ−ＨＯＯＫサンプルよりはるかに小さく、測定対象物の濃度を算出するための校正曲線を作成するのに用いられる。
【０２８９】
［ピーク校正品の選定］既知のＨＤ−ＨＯＯＫサンプルを段階希釈し、従来の方法でその信号値を検出し、信号値が最も高いサンプルをピーク校正品として選定する。すなわち、ピーク校正品の濃度未満のサンプルではＨＤ−ＨＯＯＫ効果が発生することなく、ピーク校正品の濃度を超えると、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果が発生することになる。そのＡの値をＲ０と表記し、測定対象物がＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルであるか否かを判定するための臨界値とする。
【０２９０】
［使用される他の成分］ＬｉＣＡ汎用液（ストレプトアビジンで標識された感光微粒子）、この製品は博陽生物科技有限公司製の光励起化学発光分析システム用補助試薬である。それは、機器および対応する光励起化学発光法検出キットと一緒に使用され、抗原や抗体の検出に用いられる。
【０２９１】
［まず、本発明の方法で校正品１〜校正品６、ピーク校正品、測定対象の血清サンプル１〜１５を検出する］測定対象物、試薬１（抗体によって被覆された発光微粒子）および試薬２（ビオチンで標識された抗体）をキュベットに加えた後、３７℃で１５ｍｉｎインキュベートし、ＬｉＣＡ汎用液（ストレプトアビジンで標識された感光微粒子）を加え、３７℃で３ｍｉｎインキュベートし、ＲＬＵ１を読み取り、３７℃で続けて７ｍｉｎインキュベートし、ＲＬＵ２を読み取り、２回目の信号値の増幅Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％を算出して、その結果を表１４に示す。
【０２９２】
【表１４】
0006980800.tif 000015
【０２９３】
本発明の方法によって得られた１５個の血清サンプルの濃度は表１４に示す通りである。まず、ピーク校正品の増幅Ｒ０と比較するによってＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルを識別し、すなわち、Ａの値が３１％を超えると、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルであると判定し、希釈してから検出することを提案する。一方、Ａが３１％未満であると、非ＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルであると判定し、そのまま校正曲線でサンプル濃度を算出することができる。
【０２９４】
サンプルを段階希釈した後に濃度の変化を検出することで上記結論の信頼性を検証する。サンプル１〜サンプル１５に対していずれも２倍希釈と４倍希釈を行うとともに、従来の検出方法で未希釈の原倍サンプル、２倍希釈サンプルと４倍希釈サンプルを検出して、希釈後の濃度の変化を観測することによってそのサンプルにはＨＤ−ＨＯＯＫ効果が存在するか否かを判定し、すなわち、希釈後にサンプル濃度が逆に上昇する場合はＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルであると判定する。非ＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルは希釈後に濃度が低下することになる。その結果を表１５に示す。
【０２９５】
【表１５】
0006980800.tif 000016
【０２９６】
表１５から、血清サンプル１、２、３、５、６、９、１２、１３、１４、１５が希釈された後に検出濃度が上昇し、それらはＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルであることが証明され、血清サンプル４、７、８、１０、１１の濃度は希釈後に低下し、それらはＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルではないことが証明される。本発明方法の結果と完全に同一であった。
【０２９７】
実施例１３  ヒト血清サンプルにおけるＣＡ１２５の検出
本発明による免疫測定法に係るキットを採用して、サンプルにおけるＣＡ１２５の濃度を検出する。前記キットは、校正品１〜校正品６、ピーク校正品、試薬１（発光抗体、すなわち、抗体によって被覆された発光微粒子）、試薬２（ビオチン標識抗体、すなわち、ビオチンで標識された抗体）を含む。
【０２９８】
［校正品１〜校正品６］従来のキットにおける濃度既知のサンプルであって、濃度はＨＤ−ＨＯＯＫサンプルよりはるかに小さく、測定対象物の濃度を算出するための校正曲線を作成するのに用いられる。
【０２９９】
［ピーク校正品の選定］既知のＨＤ−ＨＯＯＫサンプルを段階希釈し、従来の方法でその信号値を検出し、信号値が最も高いサンプルをピーク校正品として選定する。すなわち、ピーク校正品の濃度未満のサンプルではＨＤ−ＨＯＯＫ効果が発生することなく、ピーク校正品の濃度を超えると、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果が発生することになる。そのＡの値をＲ０と表記し、測定対象物がＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルであるか否かを判定するための臨界値とする。
【０３００】
［まず、本発明の方法で校正品１〜校正品６、ピーク校正品、測定対象の血清サンプル１〜１８を検出する］測定対象物、試薬１（抗体によって被覆された発光微粒子）および試薬２（ビオチンで標識された抗体）をキュベットに加えた後、３７℃で１５ｍｉｎインキュベートし、ＬｉＣＡ汎用液（ストレプトアビジンで標識された感光微粒子）を加え、３７℃で３ｍｉｎインキュベートし、ＲＬＵ１を読み取り、３７℃で続けて７ｍｉｎインキュベートし、ＲＬＵ２を読み取り、２回目の信号値の増幅Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％を算出して、その結果を表１６に示す。
【０３０１】
【表１６】
0006980800.tif 000017
【０３０２】
本発明の方法によって得られた１８個の血清サンプルの濃度は表１６に示す通りである。まず、ピーク校正品の増幅Ｒ０と比較するによってＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルを識別し、すなわち、Ａの値が１８．７％を超えると、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルであると判定し、希釈してから検出することを提案する。一方、Ａが１８．７％未満であると、非ＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルであると判定し、そのまま校正曲線でサンプル濃度を算出することができる。
【０３０３】
サンプルを段階希釈した後に濃度の変化を検出することで上記結論の信頼性を検証する。サンプル１〜サンプル１８に対していずれも２倍希釈と４倍希釈を行うとともに、従来の検出方法で未希釈の原倍サンプル、２倍希釈サンプルと４倍希釈サンプルを検出して、希釈後の濃度の変化を観測することによってそのサンプルにはＨＤ−ＨＯＯＫ効果が存在するか否かを判定し、すなわち、希釈後にサンプル濃度が逆に上昇する場合はＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルであると判定する。非ＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルは希釈後に濃度が低下することになる。その結果を表１７に示す。
【０３０４】
【表１７】
0006980800.tif 000018
【０３０５】
表１７から、血清サンプル１６、１７、１８が希釈された後に検出濃度が上昇し、それらはＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルであることが証明され、血清サンプル１〜１５の濃度は希釈後に低下し、それらはＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルではないことが証明される。本発明方法の結果と完全に同一であった。
【０３０６】
実施例１４  サンプルにおけるフェリチン（Ｆｅｒｒ）の検出
本発明による免疫測定法に係るキットを採用して、サンプルにおけるフェリチン（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄから購入、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ：３０−ＡＦ１０）の含有量を検出する。前記キットは、校正品１〜校正品６、ピーク校正品、試薬１（発光抗体、すなわち、抗体によって被覆された発光微粒子）、試薬２（ビオチン標識抗体、すなわち、ビオチンで標識された抗体）を含む。
【０３０７】
［校正品１〜校正品６］従来のキットにおける濃度既知のサンプルであって、濃度はＨＤ−ＨＯＯＫサンプルよりはるかに小さく、測定対象物の濃度を算出するための校正曲線を作成するのに用いられる。
【０３０８】
［ピーク校正品の選定］既知のＨＤ−ＨＯＯＫサンプルを段階希釈し、従来の方法でその信号値を検出し、信号値が最も高いサンプル、本実験ではすなわちサンプル９をピーク校正品として選定する。ピーク校正品の濃度未満のサンプルではＨＤ−ＨＯＯＫ効果が発生することなく、ピーク校正品の濃度を超えると、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果が発生することになる。そのＡの値をＲ０と表記し、測定対象物がＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルであるか否かを判定するための臨界値とする。
【０３０９】
高濃度のフェリチン抗原を段階希釈し、異なる濃度のフェリチンを含むサンプルの濃度値を、それぞれ従来の検出方法および本発明の検出方法で測定する。
【０３１０】
［従来の検出方法］校正品１〜校正品６、ピーク校正品、測定対象サンプル１〜１５、試薬１（発光抗体、すなわち、マウスモノクローナル抗体によって被覆された発光微粒子）および試薬２（ビオチン標識抗体、すなわち、ビオチンで標識されたマウスモノクローナル抗体）をキュベットに加えた後、３７℃で１５ｍｉｎインキュベートし、ＬｉＣＡ汎用液（ストレプトアビジンで標識された感光微粒子）を加え、３７℃で１０ｍｉｎインキュベートし、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵを読み取り、その結果を下記の表に示す。
【０３１１】
［本発明の２回読み取り方法］校正品１〜校正品６、ピーク校正品、測定対象サンプル１〜１５、試薬１（発光抗体、すなわち、マウスモノクローナル抗体によって被覆された発光微粒子）および試薬２（ビオチン標識抗体、すなわち、ビオチンで標識されたマウスモノクローナル抗体）を３７℃で１５ｍｉｎインキュベートし、ＬｉＣＡ汎用液（ストレプトアビジンで標識された感光微粒子）を加え、３７℃で３ｍｉｎインキュベートし、ＲＬＵ１を読み取り、３７℃で続けて７ｍｉｎインキュベートし、ＲＬＵ２を読み取り、２回目の信号値の増幅Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％を算出して、その結果を表１８に示す。
【０３１２】
【表１８】
0006980800.tif 000019
【０３１３】
表１８および図２４からわかるように、従来の方法で高濃度の抗原を段階希釈したサンプルを検出する場合、濃度が５１０００ｎｇ／ｍｌに上昇するまでは信号値が濃度の上昇と共に増加し、濃度が上昇し続けると、信号値がＦｅｒｒ濃度の上昇と共に低下し、すなわち、濃度が５１０００ｎｇ／ｍｌを超えると、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果が発生する。すなわち、濃度が５１０００ｎｇ／ｍｌであるサンプル９がピーク校正品となり、Ｒ０が１３．９％である。
【０３１４】
従来の検出では、検出範囲が０〜２０００ｎｇ／ｍｌであり、検出上限を超えたサンプルの濃度は＞２０００ｎｇ／ｍｌとして表示される。ＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルの濃度が上昇し続けると、信号が低下し続けるので、サンプル１５のように超高濃度サンプルが低濃度として報告されることになる。そのため、従来の検出では、測定対象サンプルの検出結果が、真実の濃度であるか、それともＨＤ−ＨＯＯＫ効果の影響で低濃度として報告されたかを識別できなくなる。
【０３１５】
本発明の方法では、２回の読み取りによってＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルを同定するようにされている。各測定対象サンプルについて、信号値の結果であるＲＬＵ１、ＲＬＵ２を順番に検出し、２回目の読み取りの増幅Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％をサンプルの濃度を判定するための指標の一つとする。表１８および図２５からわかるように、信号値が５１０００ｎｇ／ｍｌまでは濃度とともに上昇し続け、その後、信号値が濃度の上昇とともに低下するが、増幅Ａは濃度とともに上昇し続けることになる。したがって、測定対象サンプルのＡの値と校正品のＡの値とを直接に比較すれば、測定対象サンプルの濃度と校正品の濃度との大小関係を判定することができる。サンプル１０〜１５の増幅Ａがいずれもピーク校正品の増幅Ｒ０（１３．９％）を超えているので、サンプル１０〜１５のＦｅｒｒ濃度はいずれも５１０００ｎｇ／ｍｌを超え、ＨＤ−ＨＯＯＫサンプルであることが示されている。それは実際の濃度に合致しており、サンプル１５の信号値が校正品６よりも低くなり、従来の方法では濃度が１８６０．９７ｎｇ／ｍｌとして検出されるが、本発明の方法では、それはＨＤ−ＨＯＯＫサンプルであると同定することができ、希釈して検出する必要がある。
【０３１６】
実施例１５  サンプルにおけるＣペプチド（ＣＰ）の検出
本発明による免疫測定法に係るキットを採用して、サンプルにおけるＣペプチド（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄから購入、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ：３０−ＡＣ９６）の含有量を検出する。前記キットは、校正品１〜校正品６、ピーク校正品、試薬１（発光抗体、すなわち、抗体によって被覆された発光微粒子）、試薬２（ビオチン標識抗体、すなわち、ビオチンで標識された抗体）を含む。
【０３１７】
［校正品１〜校正品６］従来のキットにおける濃度既知のサンプルであって、濃度はＨＤ−ＨＯＯＫサンプルよりはるかに小さく、測定対象物の濃度を算出するための校正曲線を作成するのに用いられる。
【０３１８】
［ピーク校正品の選定］既知のＨＤ−ＨＯＯＫサンプルを段階希釈し、従来の方法でその信号値を検出し、信号値が最も高いサンプル、本実験ではすなわちサンプル９をピーク校正品として選定する。ピーク校正品の濃度未満のサンプルではＨＤ−ＨＯＯＫ効果が発生することなく、ピーク校正品の濃度を超えると、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果が発生することになる。そのＡの値をＲ０と表記し、測定対象物がＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルであるか否かを判定するための臨界値とする。
【０３１９】
高濃度のＣペプチド抗原を段階希釈し、異なる濃度のＣペプチドを含むサンプルの濃度値を、それぞれ従来の検出方法および本発明の検出方法で測定する。
【０３２０】
［従来の検出方法］校正品１〜校正品６、ピーク校正品、測定対象サンプル１〜１５、試薬１（発光抗体、すなわち、マウスモノクローナル抗体によって被覆された発光微粒子）および試薬２（ビオチン標識抗体、すなわち、ビオチンで標識されたマウスモノクローナル抗体）をキュベットに加えた後、３７℃で１５ｍｉｎインキュベートし、ＬｉＣＡ汎用液（ストレプトアビジンで標識された感光微粒子）を加え、３７℃で１０ｍｉｎインキュベートし、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵを読み取り、その結果を表１９に示す。
【０３２１】
［本発明の２回読み取り方法］校正品１〜校正品６、ピーク校正品、測定対象サンプル１〜１５、試薬１（発光抗体、すなわち、マウスモノクローナル抗体によって被覆された発光微粒子）および試薬２（ビオチン標識抗体、すなわち、ビオチンで標識されたマウスモノクローナル抗体）を３７℃で１５ｍｉｎインキュベートし、ＬｉＣＡ汎用液（ストレプトアビジンで標識された感光微粒子）を加え、３７℃で３ｍｉｎインキュベートし、ＲＬＵ１を読み取り、３７℃で続けて７ｍｉｎインキュベートし、ＲＬＵ２を読み取り、２回目の信号値の増幅Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％を算出して、その結果を表１９に示す。
【０３２２】
【表１９】
0006980800.tif 000020
【０３２３】
表１９および図２６からわかるように、従来の方法で高濃度の抗原を段階希釈したサンプルを検出する場合、濃度が１００００ｎｇ／ｍｌに上昇するまでは信号値が濃度の上昇と共に増加し、濃度が上昇し続けると、信号値がＣペプチド濃度の上昇と共に低下し、すなわち、濃度が１００００ｎｇ／ｍｌを超えると、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果が発生する。すなわち、濃度が１００００ｎｇ／ｍｌであるサンプル９がピーク校正品となり、Ｒ０が２３．３％である。
【０３２４】
従来の検出では、検出範囲が０〜３０ｎｇ／ｍｌであり、検出上限を超えたサンプルの濃度は＞３０ｎｇ／ｍｌとして表示される。ＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルの濃度が上昇し続けると、信号が低下し続けるので、サンプル１６、１７のように超高濃度サンプルが低濃度として報告されることになる。そのため、従来の検出では、測定対象サンプルの検出結果が、真実の濃度であるか、それともＨＤ−ＨＯＯＫ効果の影響で低濃度として報告されたかを識別できなくなる。
【０３２５】
実施例１６  サンプルにおけるＢ型肝炎ウイルス表面抗体（ＨＢｓＡｂ）の検出
本発明による免疫測定法に係るキットを採用して、サンプルにおけるＢ型肝炎ウイルス表面抗体（北京中科京達生物技術有限公司から購入、Ｃｌｏｎｅ  Ｎｏ：Ｍ２２０１）の濃度を検出する。前記キットは、校正品１〜校正品６、ピーク校正品、試薬１（発光抗原、すなわち、抗原によって被覆された発光微粒子）、試薬２（ビオチン標識抗原、すなわち、ビオチンで標識された抗原）を含む。
【０３２６】
［校正品１〜校正品６］従来のキットにおける濃度既知のサンプルであって、濃度はＨＤ−ＨＯＯＫサンプルよりはるかに小さく、測定対象物の濃度を算出するための校正曲線を作成するのに用いられる。
【０３２７】
［ピーク校正品の選定］既知のＨＤ−ＨＯＯＫサンプルを段階希釈し、従来の方法でその信号値を検出し、信号値が最も高いサンプル、本実験ではすなわちサンプル９をピーク校正品として選定する。ピーク校正品の濃度未満のサンプルではＨＤ−ＨＯＯＫ効果が発生することなく、ピーク校正品の濃度を超えると、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果が発生することになる。そのＡの値をＲ０と表記し、測定対象物がＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルであるか否かを判定するための臨界値とする。
【０３２８】
高濃度のＨＢｓＡｂを段階希釈し、異なる濃度のＨＢｓＡｂを含むサンプルの濃度値を、それぞれ従来の検出方法および本発明の検出方法で測定する。
【０３２９】
［従来の検出方法］校正品１〜校正品６、ピーク校正品、測定対象サンプル１〜１４、試薬１（ＨＢｓＡｇによって被覆された発光微粒子）および試薬２（ビオチンで標識されたＨＢｓＡｇ）をキュベットに加えた後、３７℃で１５ｍｉｎインキュベートし、ＬｉＣＡ汎用液（ストレプトアビジンで標識された感光微粒子）を加え、３７℃で１０ｍｉｎインキュベートし、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵを読み取り、その結果を表２０に示す。
【０３３０】
［本発明の２回読み取り方法］校正品１〜校正品６、ピーク校正品、測定対象サンプル１〜１４、試薬１（ＨＢｓＡｇによって被覆された発光微粒子）および試薬２（ビオチンで標識されたＨＢｓＡｇ）を３７℃で１５ｍｉｎインキュベートし、ＬｉＣＡ汎用液（ストレプトアビジンで標識された感光微粒子）を加え、３７℃で３ｍｉｎインキュベートし、ＲＬＵ１を読み取り、３７℃で続けて７ｍｉｎインキュベートし、ＲＬＵ２を読み取り、２回目の信号値の増幅Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％を算出して、その結果を表２０に示す。
【０３３１】
【表２０】
0006980800.tif 000021
【０３３２】
表２０および図２８からわかるように、従来の方法で高濃度のＨＢｓＡｂを段階希釈したサンプルを検出する場合、濃度が１００００ｍＩＵ／ｍｌに上昇するまでは信号値が濃度の上昇と共に増加し、濃度が上昇し続けると、信号値がＨＢｓＡｂ濃度の上昇と共に低下し、すなわち、濃度が１００００ｍＩＵ／ｍｌを超えると、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果が発生する。すなわち、濃度が１００００ｍＩＵ／ｍｌであるサンプル９がピーク校正品となり、Ｒ０が３７．５％である。
【０３３３】
従来の検出では、検出範囲が０〜１０００ｍＩＵ／ｍｌであり、検出上限を超えたサンプルの濃度は＞１０００ｍＩＵ／ｍｌとして表示される。ＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルの濃度が上昇し続けると、信号が低下し続けるので、サンプル１２、１３、１４のように超高濃度サンプルが低濃度として報告されることになる。そのため、従来の検出では、測定対象サンプルの検出結果が、真実の濃度であるか、それともＨＤ−ＨＯＯＫ効果の影響で低濃度として報告されたかを識別できなくなる。
【０３３４】
本発明の方法では、２回の読み取りによってＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルを同定するようにされている。各測定対象サンプルについて、信号値の結果であるＲＬＵ１、ＲＬＵ２を順番に検出し、２回目の読み取りの増幅Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％をサンプルの濃度を判定するための指標の一つとする。表２０および図２９からわかるように、信号値が１００００ｍＩＵ／ｍｌまでは濃度とともに上昇し続け、その後、信号値が濃度の上昇とともに低下するが、増幅Ａは濃度とともに上昇し続けることになる。したがって、測定対象サンプルのＡの値と校正品のＡの値とを直接に比較すれば、測定対象サンプルの濃度と校正品の濃度との大小関係を判定することができる。サンプル１０〜１４の増幅Ａがいずれもピーク校正品の増幅Ｒ０（３７．５％）を超えているので、サンプル１０〜１４のＨＢｓＡｂ濃度はいずれも１００００ｍＩＵ／ｍｌを超え、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルであることが示されている。それは実際の濃度に合致しており、サンプル１２、１３、１４の信号値が校正品６よりも低くなり、従来の方法では濃度が８０２．５７ｍＩＵ／ｍｌ、３５２．２２ｍＩＵ／ｍｌ、１４７．９ｍＩＵ／ｍｌとして検出されるが、本発明の方法では、それらはＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルであると同定することができ、希釈して検出する必要がある。
【０３３５】
上記の実施例は、本発明の原理およびその効果の単なる例示であり、本発明を限定することを意図するものではない。当業者であれば、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、上記の実施例の修正または変更をなし得る。したがって、本発明の精神および思想から逸脱することなく当業者によって行われたすべての均等の修正または変更は、依然として添付の特許請求の範囲によって網羅されるべきである。
以下に、本願出願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］校正品、ピーク校正品、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルに対して化学発光免疫反応を行い、化学発光を励起させ１回目と２回目の読み取りを記録し、ピーク校正品の２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分の増幅ＡをＲ０とし、測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の増幅Ａ’がＲ０を超えているかを比較し、Ｒ０を超えている場合、サンプルがＨＤ−ＨＯＯＫ効果を有し、Ｒ０未満の場合、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果を有しないとする、というステップを含むことを特徴とするＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルを同定する方法。
［２］前記方法は、
（１）校正品、ピーク校正品、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルを第１の抗体（または抗原）によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体（または抗原）と混合し、インキュベートすることによって、混合液が得られるステップと、
（２）１回目の読み取り：ステップ（１）の混合液に、さらに、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、インキュベートした後に励起光を照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ１とするステップと、
（３）２回目の読み取り：ステップ（２）において１回目の読み取りを行った後の反応溶液をさらにインキュベートした後に、励起光を再度照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ２とするステップと、
（４）サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値に対する２回目の読み取りによって得られた信号値の増幅Ａについて、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％で算出するステップと、
（５）ピーク校正品の２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分の増幅ＡをＲ０とするステップと、
（６）測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａ’の値をＲ０と比較し、Ａ’がＲ０以上である場合、このサンプルがＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルであると同定するステップと、を含むことを特徴とする［１］に記載の方法。
［３］測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａ’の値をＲ０と比較し、Ａ’がＲ０以上である場合、測定対象サンプルがＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルであり、希釈する必要があり、Ａ’がＲ０未満の場合、そのまま校正曲線でサンプルの濃度を算出するとされ、
前記校正曲線は、校正品の１回目の読み取りと校正品の濃度によって作成された曲線であることを特徴とする［１］又は［２］に記載の方法。
［４］発光微粒子とは発光化合物およびランタノイド族元素化合物が充填されている高分子微粒子のことをいい、前記感光微粒子は感光化合物が充填されている高分子微粒子であり、赤色レーザ光による励起で一重項酸素イオンを発生させることができることを特徴とする［２］に記載の方法。
［５］ステップ（２）と（３）において、６００〜７００ｎｍの赤色励起光で照射し、反応溶液の出射光量を検出し、出射光の検出波長は５２０〜６２０ｎｍとされていることを特徴とする［２］に記載の方法。
［６］前記抗原とは免疫原性を有する物質をいい、前記抗体とは有機体によって生じられた、特定の外来物を認識することができる免疫グロブリンをいい、前記第１の抗体及び第２の抗体とは前記目標抗原に特異的に結合可能な抗体をいい、前記第１の抗原および第２の抗原とは、前記目標抗体に特異的に結合可能な抗原をいうことを特徴とする［２］に記載の方法。
［７］化学発光免疫反応を実施するための免疫反応装置と、
化学発光を励起させ１回目と２回目の読み取りを記録するための化学発光免疫反応励起及びカウント装置と、
測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅Ａ’によってＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルの有無を特定するためのプロセッサと、を備える
免疫測定におけるＨＤ−ＨＯＯＫ効果を同定するためのシステム。
［８］前記システムは、
化学発光免疫反応を実施するための免疫反応装置と、
化学発光を励起させ１回目と２回目の読み取りを記録するための化学発光免疫反応励起及びカウント装置と、
測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅Ａ’が、ピーク校正品の２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分の増幅Ｒ０を超えているかを比較し、Ｒ０を超えている場合、サンプルがＨＤ−ＨＯＯＫ効果を有し、Ｒ０未満の場合、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果を有しないとするプロセッサと、を備え、
化学発光の２回目の読み取りは、同一の免疫反応に対して一定の時間が経過した後に再度励起させ読み取ることによって得られるものである、［７］に記載のシステム。
［９］前記システムの使用方法は、
（１）校正品、ピーク校正品、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルを第１の抗体（または抗原）によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体（または抗原）と混合し、インキュベートすることによって、混合液が得られるステップと、
（２）１回目の読み取り：ステップ（１）の混合液に、さらに、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、インキュベートした後に励起光を照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ１とするステップと、
（３）２回目の読み取り：ステップ（２）において１回目の読み取りを行った後の反応溶液をさらにインキュベートした後に、励起光を再度照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ２とするステップと、
（４）サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値に対する２回目の読み取りによって得られた信号値の増幅Ａについて、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％で算出するステップと、
（５）ピーク校正品の２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分の増幅ＡをＲ０とするステップと、
（６）測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａ’の値をＲ０と比較し、Ａ’がＲ０以上である場合、このサンプルがＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルであると同定するステップと、を含むことを特徴とする［７］に記載のシステム。
［１０］測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａ’の値をＲ０と比較し、Ａ’がＲ０以上である場合、測定対象サンプルがＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルであり、希釈する必要があり、Ａ’がＲ０未満の場合、そのまま校正曲線でサンプルの濃度を算出するとされ、
前記校正曲線は、校正品の１回目の読み取りと校正品の濃度によって作成された曲線であることを特徴とする［９］に記載のシステム。
［１１］発光微粒子とは発光化合物およびランタノイド族元素化合物が充填されている高分子微粒子のことをいい、前記感光微粒子は感光化合物が充填されている高分子微粒子であり、赤色レーザ光による励起で一重項酸素イオンを発生させることができることを特徴とする［９］に記載のシステム。
［１２］ステップ（２）と（３）において、６００〜７００ｎｍの赤色励起光で照射し、反応溶液の出射光量を検出し、出射光の検出波長は５２０〜６２０ｎｍとされていることを特徴とすることを特徴とする［９］に記載のシステム。
［１３］前記抗原とは免疫原性を有する物質をいい、前記抗体とは有機体によって生じられた、特定の外来物を認識することができる免疫グロブリンをいい、前記第１の抗体及び第２の抗体とは前記目標抗原に特異的に結合可能な抗体をいい、前記第１の抗原および第２の抗原とは、前記目標抗体に特異的に結合可能な抗原をいうことを特徴とする［９］に記載のシステム。
［１４］校正品、ピーク校正品、第１の抗体（または抗原）によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体（または抗原）、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を含むキットであって、前記キットの使用方法は、校正品、ピーク校正品、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルに対して化学発光免疫反応を行い、化学発光を励起させ１回目と２回目の読み取りを記録し、測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅Ａ’によってＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルの有無を特定することを特徴とするキット。
［１５］前記キットの使用方法は、校正品、ピーク校正品、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルに対して化学発光免疫反応を行い、化学発光を励起させ１回目と２回目の読み取りを記録し、測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の増幅Ａ'がピーク校正品の２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分の増幅Ｒ０を超えているかを比較し、Ｒ０を超えている場合、サンプルがＨＤ−ＨＯＯＫ効果を有し、Ｒ０未満の場合、ＨＤ−ＨＯＯＫ効果を有しないとする、というステップを含む［１４］に記載のキット。
［１６］前記キットの使用方法は、
（１）校正品、ピーク校正品、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルを第１の抗体（または抗原）によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体（または抗原）と混合し、インキュベートすることによって、混合液が得られるステップと、
（２）１回目の読み取り：ステップ（１）の混合液に、さらに、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、インキュベートした後に励起光を照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ１とするステップと、
（３）２回目の読み取り：ステップ（２）において１回目の読み取りを行った後の反応溶液をさらにインキュベートした後に、励起光を再度照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ２とするステップと、
（４）サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値に対する２回目の読み取りによって得られた信号値の増幅Ａについて、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％で算出するステップと、
（５）ピーク校正品の２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分の増幅ＡをＲ０とするステップと、
（６）測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａ’の値をＲ０と比較し、Ａ’がＲ０以上である場合、このサンプルがＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルであると同定するステップと、を含むことを特徴とする［１４］に記載のキット。
［１７］測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａ’の値をＲ０と比較し、Ａ’がＲ０以上である場合、測定対象サンプルがＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルであり、希釈する必要があり、Ａ’がＲ０未満の場合、そのまま校正曲線でサンプルの濃度を算出するとされ、
前記校正曲線は、校正品の１回目の読み取りと校正品の濃度によって作成された曲線であることを特徴とする［１４］に記載のキット。
［１８］発光微粒子とは発光化合物およびランタノイド族元素化合物が充填されている高分子微粒子のことをいい、前記感光微粒子は感光化合物が充填されている高分子微粒子であり、赤色レーザ光による励起で一重項酸素イオンを発生させることができることを特徴とする［１６］に記載のキット。
［１９］ステップ（２）と（３）において、６００〜７００ｎｍの赤色励起光で照射し、反応溶液の出射光量を検出し、出射光の検出波長は５２０〜６２０ｎｍとされていることを特徴とすることを特徴とする［１６］に記載のキット。
［２０］前記抗原とは免疫原性を有する物質をいい、前記抗体とは有機体によって生じられた、特定の外来物を認識することができる免疫グロブリンをいい、前記第１の抗体及び第２の抗体とは前記目標抗原に特異的に結合可能な抗体をいい、前記第１の抗原および第２の抗原とは、前記目標抗体に特異的に結合可能な抗原をいうことを特徴とする［１６］に記載のキット。
［２１］化学発光免疫反応を記録するとともにインキュベートされた後の混合液に対して複数回の読み取りを実行するための読み取りユニットと、
前記読み取りユニットに接続され、前記読み取りユニットの読み取りによって免疫測定にはＨＤ−ＨＯＯＫのリスクの有無を判定する処理ユニットと、を備える
ＨＤ−ＨＯＯＫ効果サンプルを同定するための測定装置。
［２２］インキュベートされた後の混合液を読み取りユニットに移動し読み取りを実行するための移動機構をさらに備えることを特徴とする［２１］に記載の免疫測定装置。
［２３］化学発光免疫反応のために適切な環境温度を提供するためのインキュベータをさらに備えることを特徴とする［２１］又は［２２］に記載の免疫測定装置。
［２４］読み取りが完了した後の混合液を前記インキュベータに復帰させ再度インキュベートするための復帰機構をさらに備えることを特徴とする［２３］に記載の免疫測定装置。
［２５］前記移動機構は押出し機構であり、前記復帰機構は押戻し機構であり、前記混合液はスラットで収容されることを特徴とする［２４］に記載の免疫測定装置。
［２６］前記読み取りユニットは化学発光免疫反応を記録するとともにインキュベートされた後の混合液に対して２回の読み取りを実行することに用いられることを特徴とする［２１］〜［２５］のいずれか１つに記載の免疫測定装置。
［２７］前記インキュベータは第１のインキュベータと第２のインキュベータとを有し、前記押出し機構は、第１のインキュベータ内でインキュベートされた後の混合液を第２のインキュベータに押出しインキュベートするのに用いられ、かつ前記押出し機構は第２のインキュベータ内でインキュベートされた後の混合液を読み取りユニットに押出し１回目の読み取りを実行するのに用いられ、
前記押戻し機構は、１回目の読み取りが完了した後の混合液を第２のインキュベータに押戻し再度インキュベートするのに用いられ
前記押出し機構は、さらに、第２のインキュベータ内で再度インキュベートされた後の混合液を読み取りユニットに押出し２回目の読み取りを実行するのに用いられ、
前記処理ユニットが２回目の読み取りと１回目の読み取りの増幅Ａが標準曲線の最大値を超えていると検出した場合、免疫測定にはＨＯＯＫのリスクが存在すると判定することを特徴とする［２５］に記載の免疫測定装置。
［２８］前記押戻し機構は、
底板と、
前記底板に設けられているガイドレールと、
前記ガイドレールに設けられ、スラットを支持するための移動カップ機構と、
前記移動カップ機構を前記ガイドレールに沿って移動させるための駆動装置と、
前記底板の両端に設けられ、前記移動カップ機構の位置を検出するための光電センサと、
前記光電センサに接続され、前記光電センサによって発せられた位置信号に基づいて前記移動カップ機構の位置を調整することができる位置調整機構とを備えることを特徴とする［２５］に記載の免疫測定装置。
［２９］前記ガイドレールは直線レールまたは可変レールであることを特徴とする［２８］に記載の免疫測定装置。
［３０］前記インキュベータの一方の側に設けられ、測定対象サンプルと試薬とを混合させるためのスラット用試料添加皿と、前記インキュベータの他方の側に設けられ、試薬を収納するための試薬冷蔵領域とをさらに備えることを特徴とする［２３］〜［２５］のいずれか１つ又は［２７］〜［２９］のいずれか１つに記載の免疫測定装置。
［３１］前記スラット用試料添加皿の一方の側に設けられた、ブランクスラットスタッキング及びローディング機構をさらに備え、前記ブランクスラットスタッキング及びローディング機構は、ブランクスラットをスラット用試料添加皿に押し付けるのに用いられることを特徴とする［３０］に記載の免疫測定装置。
［３２］サンプル試験管を支持するためのサンプル試験管載置棚をさらに備えることを特徴とする［３１］に記載の免疫測定装置。
［３３］前記サンプル試験管載置棚におけるブランクスラットスタッキング及びローディング機構に近隣する側に設けられ、予備希釈プレートに対して希釈処理するための希釈プレートシェーカーをさらに備えることを特徴とする［３２］に記載の免疫測定装置。
［３４］試料添加針が設けられている機械式アームをさらに備え、
前記機械式アームは、前記サンプル試験管載置棚領域からサンプルを吸引してスラット用試料添加皿のスラット内に割り当てるための第１の機械式アームと、前記試薬冷蔵領域から試薬を吸引してスラット用試料添加皿のスラット内に割り当てるための第２の機械式アームとを有することを特徴とする［３２］に記載の免疫測定装置。
［３５］第１の機械式アームの試料添加針を洗浄するための第１の洗浄機構と、第２の機械式アームの試料添加針を洗浄するための第２の洗浄機構とをさらに備えることを特徴とする［３４］に記載の免疫測定装置。
［３６］（１）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルに対して化学発光免疫反応を行い、化学発光を励起させ１回目と２回目の読み取りを記録し、２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅をＡとするステップと、（２）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む既知の一連の標準物質の２回の読み取りの差分増幅Ａ’に基づいて標準曲線を作成し、または、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む既知の一つの標準物質の２回の読み取りの差分増幅Ａ’’に基づいて標準を作成するステップと、（３）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅Ａを前記標準曲線および／または標準と比較するステップと、を含む免疫測定方法。
［３７］測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅Ａを前記標準曲線と比較することを特徴とする［３６］に記載の免疫測定方法。
［３８］前記既知の一連の標準物質の濃度は、ＨＯＯＫ効果が生じる濃度よりも低く、および／または前記既知の標準物質は陽性対照であることを特徴とする［３７］に記載の免疫測定方法。
［３９］前記方法は、（４）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記標準曲線の最大値を超えている場合、サンプルを希釈してから測定するステップ、をさらに含むことを特徴とする［３８］に記載の免疫測定方法。
［４０］前記方法は、
（ａ１）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルを第１の抗体（または抗原）によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体（または抗原）と混合し、インキュベートすることによって、混合液が得られるステップと、
（ａ２）１回目の読み取り：ステップ（ａ１）の混合液に、さらに、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、インキュベートした後に励起光を照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ１とするステップと、
（ａ３）２回目の読み取り：ステップ（ａ２）において１回目の読み取りを行った後の反応溶液をさらにインキュベートした後に、励起光を再度照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ２とするステップと、
（ａ４）サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値に対する２回目の読み取りによって得られた信号値の増幅Ａについて、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％で算出するステップと、
（ａ５）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む既知の一連の標準物質（ただし、標準物質の濃度は、ＨＯＯＫ効果が生じる濃度よりも低い）の２回の読み取りの増幅Ａ’に基づいて標準曲線を作成するステップと、
（ａ６）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記標準曲線の最大値を超えている場合、サンプルを希釈してから測定するステップと、を含むことを特徴とする［３９］に記載の免疫測定方法。
［４１］測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅Ａを前記標準と比較し、かつ前記標準は臨界値であり、および／または、前記既知の標準物質は陽性対照であることを特徴とする［３６］に記載の免疫測定方法。
［４２］前記方法は、（４）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記臨界値を超えていると、前記測定対象サンプルの濃度が既知の標準物質の濃度よりも高くなっているとするステップ、をさらに含むことを特徴とする［４１］に記載の免疫測定方法。
［４３］前記方法は、
（ｃ１）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルを第１の抗体（または抗原）によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体（または抗原）と混合し、インキュベートすることによって、混合液が得られるステップと、
（ｃ２）１回目の読み取り：ステップ（ｃ１）の混合液に、さらに、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、インキュベートした後に励起光を照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ１とするステップと、
（ｃ３）２回目の読み取り：ステップ（ｃ２）において１回目の読み取りを行った後の反応溶液をさらにインキュベートした後に、励起光を再度照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ２とするステップと、
（ｃ４）サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値に対する２回目の読み取りによって得られた信号値の増幅Ａについて、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％で算出するステップと、
（ｃ５）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む既知の一つの標準物質の２回の読み取りの増幅Ａ’’を臨界値とするステップと、
（ｃ６）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａを臨界値と比較して、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記臨界値を超えていると、前記測定対象サンプルの濃度が既知の標準物質の濃度よりも高くなっているとするステップと、を含むことを特徴とする［４２］に記載の免疫測定方法。
［４４］前記方法は、（４）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記臨界値を超え、かつそれと同時に前記測定対象サンプルの１回目の読み取りが前記既知の標準物質よりも低くなっていると、サンプルを希釈してから測定するステップ、をさらに含むことを特徴とする［４１］に記載の免疫測定方法。
［４５］前記方法は、
（ｄ１）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルを第１の抗体（または抗原）によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体（または抗原）と混合し、インキュベートすることによって、混合液が得られるステップと、
（ｄ２）１回目の読み取り：ステップ（ｄ１）の混合液に、さらに、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、インキュベートした後に励起光を照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ１とするステップと、
（ｄ３）２回目の読み取り：ステップ（ｄ２）において１回目の読み取りを行った後の反応溶液をさらにインキュベートした後に、励起光を再度照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ２とするステップと、
（ｄ４）サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値に対する２回目の読み取りによって得られた信号値の増幅Ａについて、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％で算出するステップと、
（ｄ５）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む既知の一つの標準物質の２回の読み取りの増幅Ａ’’を臨界値とするステップと、
（ｄ６）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａを臨界値と比較して、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記臨界値を超え、かつそれと同時に前記測定対象サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値が前記既知の標準物質よりも低くなっていると、サンプルを希釈してから測定するステップと、を含むことを特徴とする［４４］に記載の免疫測定方法。
［４６］前記方法は、（４）サンプルの濃度を特定するステップをさらに含むことを特徴とする［３７］に記載の免疫測定方法。
［４７］前記方法は、
（ｂ１）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルを第１の抗体（または抗原）によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体（または抗原）と混合し、インキュベートすることによって、混合液が得られるステップと、
（ｂ２）１回目の読み取り：ステップ（ｂ１）の混合液に、さらに、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、インキュベートした後に励起光を照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ１とするステップと、
（ｂ３）２回目の読み取り：ステップ（ｂ２）において１回目の読み取りを行った後の反応溶液をさらにインキュベートした後に、励起光を再度照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ２とするステップと、
（ｂ４）サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値に対する２回目の読み取りによって得られた信号値の増幅Ａについて、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％で算出するステップと、
（ｂ５）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む既知の一連の標準物質の２回の読み取りの増幅Ａ’に基づいて標準曲線を作成するステップと、
（ｂ６）Ａの値によって測定対象物質の濃度が標準曲線の上昇区間に位置するかそれとも下降区間に位置するかを特定し、測定対象サンプルのＲＬＵ１をそれに対応する標準曲線に代入して濃度を算出するステップと、を含み
前記校正曲線は、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む既知の一連の標準物質の１回目の読み取りと既知の一連の標準物質の濃度によって作成された曲線であることを特徴とする［４６］に記載の免疫測定方法。
［４８］前記発光微粒子とは発光化合物およびランタノイド族元素化合物が充填されている高分子微粒子のことをいい、前記感光微粒子は感光化合物が充填されている高分子微粒子であり、赤色レーザ光による励起で一重項酸素イオンを発生させることができることを特徴とする［３６］〜［４７］のいずれか１つに記載の免疫測定方法。
［４９］６００〜７００ｎｍの赤色励起光で照射し、反応溶液の出射光量を検出し、出射光の検出波長は５２０〜６２０ｎｍとされていることを特徴とする［４０］、［４３］、［４５］及び［４７］のいずれか１つに記載の免疫測定方法。
［５０］前記抗原とは免疫原性を有する物質をいい、前記抗体とは有機体によって生じられた、特定の外来物を認識することができる免疫グロブリンをいい、前記第１の抗体及び第２の抗体とは前記目標抗原に特異的に結合可能な抗体をいい、前記第１の抗原および第２の抗原とは、前記目標抗体に特異的に結合可能な抗原をいうことを特徴とする［４０］、［４３］、［４５］及び［４７］のいずれか１つに記載の免疫測定方法。
［５１］免疫測定を同定するためのシステムであって、
化学発光免疫反応を実施するための免疫反応装置と、
化学発光を励起させ１回目と２回目の読み取りを記録するとともに、２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅をＡとするための化学発光免疫反応励起及びカウント装置と、
プロセッサと、を備えるシステム。
［５２］前記プロセッサは、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む既知の一連の標準物質の２回の読み取りの増幅Ａに基づいて標準曲線を作成するのに用いられ、ここで標準物質の濃度はＨＯＯＫ効果が生じる濃度よりも低く、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記標準曲線の最大値を超えている場合、サンプルを希釈してから測定することを特徴とする［５１］に記載のシステム。
［５３］前記システムの使用方法は、
（１）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルを第１の抗体（または抗原）によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体（または抗原）と混合し、インキュベートすることによって、混合液が得られるステップと、
（２）１回目の読み取り：ステップ（１）の混合液に、さらに、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、インキュベートした後に励起光を照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ１とするステップと、
（３）２回目の読み取り：ステップ（２）において１回目の読み取りを行った後の反応溶液をさらにインキュベートした後に、励起光を再度照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ２とするステップと、
（４）サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値に対する２回目の読み取りによって得られた信号値の増幅Ａについて、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％で算出するステップと、
（５）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む既知の一連の標準物質（ただし、標準物質の濃度はＨＯＯＫ効果が生じる濃度よりも低くなっている）の２回の読み取りの増幅Ａに基づいて標準曲線を作成するステップと、
（６）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記標準曲線の最大値を超えている場合、サンプルを希釈してから測定するステップとを含むことを特徴とする［５２］に記載のシステム。
［５４］前記プロセッサは、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａを臨界値と比較するのに用いられ、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記臨界値を超えていると、前記測定対象サンプルの濃度が前記既知の標準物質の濃度よりも高くなっているとすることを特徴とする［５１］に記載のシステム。
［５５］前記システムの使用方法は、
（１）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルを第１の抗体（または抗原）によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体（または抗原）と混合し、インキュベートすることによって、混合液が得られるステップと、
（２）１回目の読み取り：ステップ（１）の混合液に、さらに、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、インキュベートした後に励起光を照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ１とするステップと、
（３）２回目の読み取り：ステップ（２）において１回目の読み取りを行った後の反応溶液をさらにインキュベートした後に、励起光を再度照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ２とするステップと、
（４）サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値に対する２回目の読み取りによって得られた信号値の増幅Ａについて、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％で算出するステップと、
（５）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む既知の一つの標準物質の２回の読み取りの増幅Ａを臨界値とするステップと、
（６）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａを臨界値と比較して、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記臨界値を超えていると、前記測定対象サンプルの濃度が前記既知の標準物質の濃度よりも高くなっているとするステップとを含むことを特徴とする［５４］に記載のシステム。
［５６］前記プロセッサは、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａを臨界値と比較するのに用いられ、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記臨界値を超え、かつそれと同時に前記測定対象サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値が前記既知の標準物質よりも低くなっていると、サンプルを希釈してから測定し、
および／または前記既知の標準物質は陽性対照であることを特徴とする［５１］に記載のシステム。
［５７］前記システムの使用方法は、
（１）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルを第１の抗体（または抗原）によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体（または抗原）と混合し、インキュベートすることによって、混合液が得られるステップと、
（２）１回目の読み取り：ステップ（１）の混合液に、さらに、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、インキュベートした後に励起光を照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ１とするステップと、
（３）２回目の読み取り：ステップ（２）において１回目の読み取りを行った後の反応溶液をさらにインキュベートした後に、励起光を再度照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ２とするステップと、
（４）サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値に対する２回目の読み取りによって得られた信号値の増幅Ａについて、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％で算出するステップと、
（５）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む既知の一つの標準物質の２回の読み取りの増幅Ａを臨界値とするステップと、
（６）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａを臨界値と比較して、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記臨界値を超え、かつそれと同時に前記測定対象サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値が前記既知の標準物質よりも低くなっていると、サンプルを希釈してから測定するステップとを含むことを特徴とする［５６］に記載のシステム。
［５８］前記プロセッサは、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む既知の一連の標準物質の１回目の読み取りと２回の読み取りの増幅Ａに基づいてそれぞれ校正曲線と標準曲線を作成し、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの１回目の読み取りと２回の読み取りの増幅Ａをそれぞれ校正曲線及び標準曲線と比較して、サンプルの濃度を特定するのに用いられることを特徴とする［５１］に記載のシステム。
［５９］前記システムの使用方法は、
（１）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルを第１の抗体（または抗原）によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体（または抗原）と混合し、インキュベートすることによって、混合液が得られるステップと、
（２）１回目の読み取り：ステップ（１）の混合液に、さらに、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、インキュベートした後に励起光を照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ１とするステップと、
（３）２回目の読み取り：ステップ（２）において１回目の読み取りを行った後の反応溶液をさらにインキュベートした後に、励起光を再度照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ２とするステップと、
（４）サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値に対する２回目の読み取りによって得られた信号値の増幅Ａについて、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％で算出するステップと、
（５）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む既知の一連の標準物質の２回の読み取りの増幅Ａに基づいて標準曲線を作成するステップと、
（６）Ａの値によって測定対象物質の濃度が標準曲線の上昇区間に位置するかそれとも下降区間に位置するかを特定し、測定対象サンプルのＲＬＵ１をそれに対応する校正曲線に代入して濃度を算出するステップと、を含むことを特徴とする［５８］に記載のシステム。
［６０］前記発光微粒子とは発光化合物およびランタノイド族元素化合物が充填されている高分子微粒子のことをいい、前記感光微粒子は感光化合物が充填されている高分子微粒子であり、赤色レーザ光による励起で一重項酸素イオンを発生させることができることを特徴とする［５１］〜［５９］のいずれか１つに記載のシステム。
［６１］６００〜７００ｎｍの赤色励起光で照射し、反応溶液の出射光量を検出し、出射光の検出波長は５２０〜６２０ｎｍとされていることを特徴とする［５３］、［５５］、［５７］、［５９］のいずれか１つに記載のシステム。
［６２］前記抗原とは免疫原性を有する物質をいい、前記抗体とは有機体によって生じられた、特定の外来物を認識することができる免疫グロブリンをいい、前記第１の抗体及び第２の抗体とは前記目標抗原に特異的に結合可能な抗体をいい、前記第１の抗原および第２の抗原とは、前記目標抗体に特異的に結合可能な抗原をいうことを特徴とする［５３］、［５５］、［５７］、［５９］のいずれか１つに記載のシステム。
［６３］第１の抗体（または抗原）によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体（または抗原）、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を含むキットであって、前記キットの使用方法は、（１）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルに対して化学発光免疫反応を行い、化学発光を励起させ１回目と２回目の読み取りを記録し、２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅をＡとするステップと、（２）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む既知の一連の標準物質の２回の読み取りの差分増幅Ａ’に基づいて標準曲線を作成し、または、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む既知の一つの標準物質の２回の読み取りの差分増幅Ａ’’に基づいて標準を作成するステップと、（３）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅Ａを前記標準曲線および／または標準と比較するステップと、を含むことを特徴とするキット。
［６４］測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅Ａを前記標準曲線と比較することを特徴とする［６３］に記載のキット。
［６５］前記既知の一連の標準物質の濃度は、ＨＯＯＫ効果が生じる濃度よりも低く、および／または前記既知の標準物質は陽性対照であることを特徴とする［６４］に記載のキット。
［６６］前記キットの使用方法は、（４）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記標準曲線の最大値を超えている場合、サンプルを希釈してから測定するステップ、をさらに含むことを特徴とする［６５］に記載のキット。
［６７］前記キットの使用方法は、
（ａ１）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルを第１の抗体（または抗原）によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体（または抗原）と混合し、インキュベートすることによって、混合液が得られるステップと、
（ａ２）１回目の読み取り：ステップ（ａ１）の混合液に、さらに、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、インキュベートした後に励起光を照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ１とするステップと、
（ａ３）２回目の読み取り：ステップ（ａ２）において１回目の読み取りを行った後の反応溶液をさらにインキュベートした後に、励起光を再度照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ２とするステップと、
（ａ４）サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値に対する２回目の読み取りによって得られた信号値の増幅Ａについて、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％で算出するステップと、
（ａ５）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む既知の一連の標準物質（ただし、標準物質の濃度は、ＨＯＯＫ効果が生じる濃度よりも低い）の２回の読み取りの増幅Ａ'に基づいて標準曲線を作成するステップと、
（ａ６）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記標準曲線の最大値を超えている場合、サンプルを希釈してから測定するステップとを含むことを特徴とする［６６］に記載のキット。
［６８］測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回目の読み取りと１回目の読み取りとの間の差分増幅Ａを前記標準と比較し、かつ前記標準は臨界値であることを特徴とする［６３］に記載のキット。
［６９］前記キットの使用方法は、（４）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記臨界値を超えていると、前記測定対象サンプルの濃度が既知の標準物質の濃度よりも高くなっているとするステップ、をさらに含み、
および／または、前記既知の標準物質は陽性対照であることを特徴とする［６８］に記載のキット。
［７０］前記キットの使用方法は、
（ｃ１）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルを第１の抗体（または抗原）によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体（または抗原）と混合し、インキュベートすることによって、混合液が得られるステップと、
（ｃ２）１回目の読み取り：ステップ（ｃ１）の混合液に、さらに、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、インキュベートした後に励起光を照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ１とするステップと、
（ｃ３）２回目の読み取り：ステップ（ｃ２）において１回目の読み取りを行った後の反応溶液をさらにインキュベートした後に、励起光を再度照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ２とするステップと、
（ｃ４）サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値に対する２回目の読み取りによって得られた信号値の増幅Ａについて、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％で算出するステップと、
（ｃ５）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む既知の一つの標準物質の２回の読み取りの増幅Ａ’’を臨界値とするステップと、
（ｃ６）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａを臨界値と比較して、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記臨界値を超えていると、前記測定対象サンプルの濃度が既知の標準物質の濃度よりも高くなっているとするステップと、を含むことを特徴とする［６９］に記載のキット。
［７１］前記キットの使用方法は、（４）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記臨界値を超え、かつそれと同時に前記測定対象サンプルの１回目の読み取りが前記既知の標準物質よりも低くなっていると、サンプルを希釈してから測定するステップをさらに含むことを特徴とする［６８］に記載のキット。
［７２］前記キットの使用方法は、
（ｄ１）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルを第１の抗体（または抗原）によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体（または抗原）と混合し、インキュベートすることによって、混合液が得られるステップと、
（ｄ２）１回目の読み取り：ステップ（ｄ１）の混合液に、さらに、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、インキュベートした後に励起光を照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ１とするステップと、
（ｄ３）２回目の読み取り：ステップ（ｄ２）において１回目の読み取りを行った後の反応溶液をさらにインキュベートした後に、励起光を再度照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ２とするステップと、
（ｄ４）サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値に対する２回目の読み取りによって得られた信号値の増幅Ａについて、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％で算出するステップと、
（ｄ５）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む既知の一つの標準物質の２回の読み取りの増幅Ａ’’を臨界値とするステップと、
（ｄ６）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａを臨界値と比較して、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルの２回の読み取りの増幅Ａが前記臨界値を超え、かつそれと同時に前記測定対象サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値が前記既知の標準物質よりも低くなっていると、サンプルを希釈してから測定するステップと、を含むことを特徴とする［７１］に記載のキット。
［７３］前記キットの使用方法は、（４）サンプルの濃度を特定するステップをさらに含むことを特徴とする［６４］に記載のキット。
［７４］前記キットの使用方法は、
（ｂ１）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む測定対象サンプルを第１の抗体（または抗原）によって被覆された発光微粒子、標識物で標識された第２の抗体（または抗原）と混合し、インキュベートすることによって、混合液が得られるステップと、
（ｂ２）１回目の読み取り：ステップ（ｂ１）の混合液に、さらに、標識物特異結合物で標識された感光微粒子を加え、インキュベートした後に励起光を照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ１とするステップと、
（ｂ３）２回目の読み取り：ステップ（ｂ２）において１回目の読み取りを行った後の反応溶液をさらにインキュベートした後に、励起光を再度照射して出射光量を検出し、光子カウンタで読み取り、ＲＬＵ２とするステップと、
（ｂ４）サンプルの１回目の読み取りによって得られた信号値に対する２回目の読み取りによって得られた信号値の増幅Ａについて、Ａ＝（ＲＬＵ２／ＲＬＵ１−１）×１００％で算出するステップと、
（ｂ５）測定すべき目標抗原（または抗体）を含む既知の一連の標準物質の２回の読み取りの増幅Ａ’に基づいて標準曲線を作成するステップと、
（ｂ６）Ａの値によって測定対象物質の濃度が標準曲線の上昇区間に位置するかそれとも下降区間に位置するかを特定し、測定対象サンプルのＲＬＵ１をそれに対応する校正曲線に代入して濃度を算出するステップと、を含み、
前記標準曲線は、測定すべき目標抗原（または抗体）を含む既知の一連の標準物質の１回目の読み取りと既知の一連の標準物質の濃度によって作成された曲線であることを特徴とする［７３］に記載のキット。
［７５］前記発光微粒子とは発光化合物およびランタノイド族元素化合物が充填されている高分子微粒子のことをいい、前記感光微粒子は感光化合物が充填されている高分子微粒子であり、赤色レーザ光による励起で一重項酸素イオンを発生させることができることを特徴とする［６３］〜［７４］に記載のキット。
［７６］６００〜７００ｎｍの赤色励起光で照射し、反応溶液の出射光量を検出し、出射光の検出波長は５２０〜６２０ｎｍとされていることを特徴とすることを特徴とする［６７］、［７０］、［７２］、［７４］に記載のキット。
［７７］前記抗原とは免疫原性を有する物質をいい、前記抗体とは有機体によって生じられた、特定の外来物を認識することができる免疫グロブリンをいい、前記第１の抗体及び第２の抗体とは前記目標抗原に特異的に結合可能な抗体をいい、前記第１の抗原および第２の抗原とは、前記目標抗体に特異的に結合可能な抗原をいうことを特徴とする［６７］、［７０］、［７２］、［７４］に記載のキット。
［７８］化学発光免疫反応を記録するとともにインキュベートされた後の混合液に対して複数回の読み取りを実行するための読み取りユニットと、
前記読み取りユニットに接続され、前記読み取りユニットの読み取りによって免疫測定にはＨＯＯＫのリスクの有無を判定する処理ユニットと、を備える免疫測定装置。
［７９］インキュベートされた後の混合液を読み取りユニットに移動し読み取りを実行するための移動機構をさらに備えることを特徴とする［７８］に記載の免疫測定装置。
［８０］化学発光免疫反応のために適切な環境温度を提供するためのインキュベータをさらに備えることを特徴とする［７８］又は［７９］に記載の免疫測定装置。
［８１］読み取りが完了した後の混合液を前記インキュベータに復帰させ再度インキュベートするための復帰機構をさらに備えることを特徴とする［８０］に記載の免疫測定装置。
［８２］前記移動機構は押出し機構であり、前記復帰機構は押戻し機構であり、前記混合液はスラットで収容されることを特徴とする［８１］に記載の免疫測定装置。
［８３］前記読み取りユニットは化学発光免疫反応を記録するとともにインキュベートされた後の混合液に対して２回の読み取りを実行することに用いられることを特徴とする［７８］〜［８２］のいずれか１つに記載の免疫測定装置。
［８４］前記インキュベータは第１のインキュベータと第２のインキュベータとを有し、前記押出し機構は、第１のインキュベータ内でインキュベートされた後の混合液を第２のインキュベータに押出しインキュベートするのに用いられ、かつ前記押出し機構は第２のインキュベータ内でインキュベートされた後の混合液を読み取りユニットに押出し１回目の読み取りを実行するのに用いられ、
前記押戻し機構は、１回目の読み取りが完了した後の混合液を第２のインキュベータに押戻し再度インキュベートするのに用いられ
前記押出し機構は、さらに、第２のインキュベータ内で再度インキュベートされた後の混合液を読み取りユニットに押出し２回目の読み取りを実行するのに用いられ、
前記処理ユニットが２回目の読み取りと１回目の読み取りの増幅が標準曲線の最大値を超えていると検出した場合、免疫測定にはＨＯＯＫのリスクが存在すると判定する
ことを特徴とする［８２］に記載の免疫測定装置。
［８５］前記押戻し機構は、
底板と、
前記底板に設けられているガイドレールと、
前記ガイドレールに設けられ、スラットを支持するための移動カップ機構と、
前記移動カップ機構を前記ガイドレールに沿って移動させるための駆動装置と、
前記底板の両端に設けられ、前記移動カップ機構の位置を検出するための光電センサと、
前記光電センサに接続され、前記光電センサによって発せられた位置信号に基づいて前記移動カップ機構の位置を調整することができる位置調整機構とを備えることを特徴とする［８２］に記載の免疫測定装置。
［８６］前記ガイドレールは直線レールまたは可変レールであることを特徴とする［８５］に記載の免疫測定装置。
［８７］前記インキュベータの一方の側に設けられ、測定対象サンプルと試薬とを混合させるためのスラット用試料添加皿と、前記インキュベータの他方の側に設けられ、試薬を収納するための試薬冷蔵領域とをさらに備えることを特徴とする［８０］〜［８２］のいずれか１つ又は［８４］〜［８６］のいずれか１つに記載の免疫測定装置。
［８８］前記スラット用試料添加皿の一方の側に設けられた、ブランクスラットスタッキング及びローディング機構をさらに備え、前記ブランクスラットスタッキング及びローディング機構は、ブランクスラットをスラット用試料添加皿に押し付けるのに用いられることを特徴とする［８７］に記載の免疫測定装置。
［８９］サンプル試験管を支持するためのサンプル試験管載置棚をさらに備えることを特徴とする［８８］に記載の免疫測定装置。
［９０］前記サンプル試験管載置棚におけるブランクスラットスタッキング及びローディング機構に近隣する側に設けられ、予備希釈プレートに対して希釈処理するための希釈プレートシェーカーをさらに備えることを特徴とする［８９］に記載の免疫測定装置。
［９１］試料添加針が設けられている機械式アームをさらに備え、
前記機械式アームは、前記サンプル試験管載置棚領域からサンプルを吸引してスラット用試料添加皿のスラット内に割り当てるための第１の機械式アームと、前記試薬冷蔵領域から試薬を吸引してスラット用試料添加皿のスラット内に割り当てるための第２の機械式アームとを有することを特徴とする［８９］に記載の免疫測定装置。
［９２］第１の機械式アームの試料添加針を洗浄するための第１の洗浄機構と、第２の機械式アームの試料添加針を洗浄するための第２の洗浄機構とをさらに備えることを特徴とする［９１］に記載の免疫測定装置。
【図１】
0006980800.tif 000022
【図２】
0006980800.tif 000023
【図３】
0006980800.tif 000024
【図４】
0006980800.tif 000025
【図５】
0006980800.tif 000026
【図６】
0006980800.tif 000027
【図７】
0006980800.tif 000028
【図８】
0006980800.tif 000029
【図９】
0006980800.tif 000030
【図１０】
0006980800.tif 000031
【図１１】
0006980800.tif 000032
【図１２】
0006980800.tif 000033
【図１３】
0006980800.tif 000034
【図１４】
0006980800.tif 000035
【図１５】
0006980800.tif 000036
【図１６】
0006980800.tif 000037
【図１７】
0006980800.tif 000038
【図１８】
0006980800.tif 000039
【図１９】
0006980800.tif 000040
【図２０】
0006980800.tif 000041
【図２１】
0006980800.tif 000042
【図２２】
0006980800.tif 000043
【図２３】
0006980800.tif 000044
【図２４】
0006980800.tif 000045
【図２５】
0006980800.tif 000046
【図２６】
0006980800.tif 000047
【図２７】
0006980800.tif 000048
【図２８】
0006980800.tif 000049
【図２９】
0006980800.tif 000050