(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗虫遺伝子であって、前記抗虫遺伝子はＮｌｓｅｒｐｉｎ１遺伝子であり、前記抗虫遺伝
子はコガネムシ緑僵病菌の水稻害虫に対する毒性を増強可能であり、前記Ｎｌｓｅｒｐｉ
ｎ１遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１に示され、前記Ｎｌｓｅｒｐｉ
ｎ１遺伝子のヌクレオチド配列コードのアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に示され
、コードアミノ酸は４２２個であり、コードアミノ酸分子量は４７．６５ｋＤ、等電点は
６．７３であり、Ｎｌｓｅｒｐｉｎ１遺伝子の発現カセットを有効的発現するためにコガ
ネムシ緑僵病菌ゲノムに導入することを含む、
ことを特徴とする抗虫遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物防除の分野に関するものであり、具体的には、抗虫遺伝子及びその用途に関
する。
【背景技術】
【０００２】
水稲は、重要な食糧作物であり、世界の諸国では、農業生産と国民生活の中で重要な地位
を占めている。稲生産を確保するためには、害虫の予防法と対処法が第１である。ところ
で、トビイロウンカ（Ｎｉｌａｐａｒｖａｔａ  ｌｕｇｅｎｓ  Ｓｔaｌ）は、特にアジ
ア諸国では、最も主要な水稻害虫の１つであり、稲汁を吸い、卵を産み、稲組織を破壊し
、乾かせ倒伏させ、それだけでなく、水稲ウイルス病を蔓延させ、稲収量を大きく失うこ
とがある。
【０００３】
現在、トビイロウンカの防除は、抗虫稲種の開発と化学殺虫剤の応用という２つの重要な
手段が用いられている。その中、抗虫種の利用は、往々にしてトビイロウンカの快速破壊
性とハイレベルの変異がために、耐用年数が短縮され、長時間的サイクル、高コストであ
るという欠陥がある。化学殺虫剤の持続的かつ大量の使用は、ビロウカノンの耐薬性をレ
ベルアップさせるだけでなく、環境や非標的生物に対して深刻な危害も及ぼすことがある
。一方では、微生物農薬は、賞味期間が長く、分解されやすく、環境にやさしく、害虫に
薬剤耐性を発生させ難いなどの利点を踏まえ、害虫の生物学的防除において広く使われて
いる。この中では、生物防除緑僵病菌は、トビイロウンカの防除に潜在能力を持つもので
あると、確認されている。ところが、トビイロウンカの発病力は、環境や、宿主昆虫自身
の防御メカニズムなどの多くの要素に影響されるので、その殺虫速率が遅い。このような
タイムラグ効果が故に、トビイロウンカの生物防御能力上で大幅に割引き、大規模な応用
普及において重要な制限要因である。そのため、化学殺虫剤の使用を効果的に減らし、抗
虫稲類の使用年限を遅らせ、また微生物農薬の応用規模を拡大できる新たな防除法を求め
得ることは、トビイロウンカコントロールの事業展開において肝心なところである。
【０００４】
生物防除真菌の発病メカニズムおよび分子生物学の深遠な研究にともなって、遺伝子工学
上で生物防除真菌を遺伝子改造することによって、菌株毒性を強めたエンジニア菌の構築
では大きな進展を遂げた。これによって、新たな適用可能な遺伝子資源、特に菌虫相互作
用への関与で宿主免疫制御を可能にさせる遺伝子の発掘は、真菌制剤の改良において新た
な研究方向を提供している。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の目的は従来の技術における欠陥を克服するために、抗虫遺伝子及びその用途を提
供することである。
【０００６】
抗虫遺伝子であって、前記抗虫遺伝子はＮｌｓｅｒｐｉｎ１遺伝子であり、前記抗虫遺伝
子はコガネムシ緑僵病菌の水稻害虫に対する毒性を顕著に増強可能であり、前記Ｎｌｓｅ
ｒｐｉｎ１遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１に示されることを特徴と
する前記抗虫遺伝子である。
【０００７】
好ましくは、前記Ｎｌｓｅｒｐｉｎ１遺伝子のヌクレオチド配列コードのアミノ酸配列は
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に示される。
【０００８】
好ましくは、請求項１または２に記載のＮｌｓｅｒｐｉｎ１遺伝子の発現カセットを有効
的発現のためにコガネムシ緑僵病菌ゲノムに導入する。
【０００９】
好ましくは、Ｎｌｓｅｒｐｉｎ１遺伝子フラグメントを真菌発現白ターｐＡＮ５２−１Ｎ
中にクローンし、アスペルギルス・ニデュランスのグリセルアルデヒド−３−りん酸デヒ
ドロゲナーゼ遺伝子のプロモータＰｇｐｄＡとターミネータＴｔｒｐＣの間に位置させて
ｐＡＮ５２−Ｎｌｓｅｒｐｉｎ１を獲得することと、ｐＥＴ２９ｂ−Ｂａｒプラスミドを
ＸｂａＩ単一酵素により切断し、切断したグルホシネート耐性遺伝子ｂａｒの発現エレメ
ントＰｇｐｄＡ−ｂａｒ−ＴｔｒｐＣを同じくＸｂａＩ単一酵素により切断し且つ脱リン
酸化されたｐＡＮ５２−Ｎｌｓｅｒｐｉｎ１中に導入し、スクリーンしてＮｌｓｅｒｐｉ
ｎ１とｂａｒ遺伝子の両発現フレーム方向相同のバイナリーベクタープラスミドを獲得し
、前記バイナリーベクタープラスミドをＨｉｎｄＩＩＩにより線形化し、その後ＰＥＧ媒
介融合のプロトプラスト形質転換によりコガネムシ緑僵病菌野生株中に導入することと、
および、前記Ｎｌｓｅｒｐｉｎ１遺伝子はコガネムシ緑僵病菌のトビイロウンカに対する
毒性を顕著に増強可能である。
【００１０】
本発明は、従来の技術に比べて、以下の技術効果を有する。
１）本研究は、トビイロウンカの免疫負制御のファクターであるＮｌｓｅｒｐｉｎ１遺伝
子を研究対象とし、クローン鑑定および生物学的情報の分析を行うのであった。ｑＲＴ−
ＰＣＲによってその時空的発現規律および病原性真菌の誘導発現モードを分析し、真菌発
現ベクターを構築し、ＰＥＧ媒介融合のプロトプラスト形質転換によりコガネムシ緑僵病
菌を導入することによって、トビイロウンカ毒性を著しく強めた超発現Ｎｌｓｅｒｐｉｎ
１の遺伝子組換え菌株を獲得した。
２）汚染ゼロである。従来で使用される化学的防除法は、害虫に一定の抑制効果があるが
、ひと、畜、はたけや水田などの生態系に汚染をもたらし、生態系を破壊し、汚染物が残
されてしまうことがある。本発明の害虫抑制機構及びその方法は、この不都合を克服する
ことができる。
３）本発明はトビイロウンカの免疫負制御のファクターであるＮｌｓｅｒｐｉｎ１遺伝子
を研究対象とし、クローン鑑定と生物学的情報分析を行って、殺虫真菌の遺伝改良に新ら
な策略と遺伝子資源を提供している。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】コガネムシ緑僵病菌野生株によりトビイロウンカ成虫を汚染した後におけるＮｌｓｅｒｐｉｎ１の誘導発現モードを示す図である（横軸は接種時間であり、縦軸は相対発現量である）。
【図２】Ｎｌｓｅｒｐｉｎ１超発現菌株のスクリーンおよび鑑定を示す図である（図２（B）横軸はトゥランスフォーメイションであり、縦軸は相対発現量である）。
【図３】野生株と超発現株ＭａＴ６の菌糸成長（Ａ）と胞子形成量（Ｂ）を示す図である。
【図４】野生株と超発現株ＭａＴ６のトビイロウンカ毒性に関するタイム−デス率の模擬グラフおよび致死中時ＬＴ５０を示す図である（図４（Ａ）横軸は接種後日数であり、縦軸は累積死亡率である）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の目的、技術案及び利点をより明確にするために、以下、図面とともに本発明をさ
らに詳細に説明する。
【００１３】
本発明に記載の遺伝子とタンパク質は、特定の例示配列を含む以外、前記特定に例示した
タンパク質の除草剤耐性活性の特徴を保存した一部及び／断片（タンパク質全体に比べ内
部及び／又は末端が欠失した）、変異体、突然変異体、置換物（アミノ酸を置換するタン
パク質）、キメラ、融合タンパク質も含む。前記「変異体」又は「変異」とは、同一のタ
ンパク質をコーディングする又は除草剤耐性活性を有する等価タンパク質をコーディング
するヌクレオチド配列を指す。前記「等価タンパク質」とは、請求項のタンパク質と同一
又は基本的に同一の除草剤トレランスの生物活性を有するタンパク質を指す。
【００１４】
本発明に記載の「抗虫」は、標的昆虫成長発育繁殖に対し抑制作用を持つことである。具
体的には、標的昆虫はトビイロウンカである。
【００１５】
本発明に記載の「超発現株」、「超発現株ＭａＴ６」、「ＭａＴ６」はみな同一真菌株を
指す。
【００１６】
本発明に記載の遺伝子とタンパク質は、特定の例示配列を含む以外、前記特定に例示した
タンパク質の除草剤耐性活性の特徴を保存した一部及び／断片（タンパク質全体に比べ内
部及び／又は末端が欠失した）、変異体、突然変異体、置換物（アミノ酸を置換するタン
パク質）、キメラ、融合タンパク質も含む。前記「変異体」又は「変異」とは、同一のタ
ンパク質をコーディングする又は除草剤耐性活性を有する等価タンパク質をコーディング
するヌクレオチド配列を指す。前記「等価タンパク質」とは、請求項のタンパク質と同一
又は基本的に同一の除草剤トレランスの生物活性を有するタンパク質を指す。
【００１７】
本発明に記載のＤＮＡ分子またはタンパク配列の「フラグメント」若しくは「短化切断」
は、元ＤＮＡまたはタンパク配列（ヌクレオチドまたはアミノ酸）の一部やその人為的改
造形態（例えば植物発現に適合な配列）をさし、前記配列の長度は変化することがあるが
、抗虫活性を有し得るタンパクまたはポリペプチドを確保（コード）できる十分な長度で
ある。
【００１８】
セリンプロテアーゼ阻害剤（ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｓ
ｅｒｐｉｎ）は、昆虫の体内に広く存在している構造が保存的で、機能が多様なプロテア
ーゼ阻害剤のスーパーファミリーであり、主にセリンプロテナーゼのプロテアーゼカスケ
ード反応を抑制することによって、トールシグナル伝達経路（Ｔｏｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉ
ｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ）とプロフェノールオキシダーゼ活性化経路（ｐｒｏｐｈｅｎｏｌ
ｏｘｉｄａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ）を負制御して、宿主の外来侵
入物に対する防御レスポンスをを減少させる。
【００１９】
実施例１
受験トビイロウンカコロニーは、本試験室で保存し構築したものであった。人工気候室内
（温度２４±１℃、光のサイクル１６Ｌ：８Ｄ、相対湿度７０％±５％）でＴＮ１水稻苗
を持って飼育し維持されたコロニーであった。コガネムシ緑僵病（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕ
ｍ  ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）野生株はＰＤＡ（ジャガイモデキストロース寒天培地）斜面
上で４℃にて保存、２５℃で培養、世代をこえて継承とした。
トビイロウンカＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡ合成した。具体的には、トビイロウンカ５歳若
虫１０個を取ってすり鉢中に置いて液体窒素で研磨し均質にさせた。Ｔｒｉｚｏｌ法によ
ってトビイロウンカ全ＲＮＡを抽出し、微量紫外分光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−２
０００（米））と寒天ゲル電気泳動でＲＮＡの質量と濃度を測定した。検査合格したＲＮ
Ａをモジュールとし、Ｐｒｉｍｅ  Ｓｃｒｉｐｔ(ＴＭ)１ｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ（ＪＰ））試験キットを用いて、手順書に
従ってｃＤＮＡを合成し、−２０℃で保存した。
セリンプロテアーゼ阻害剤ｓｅｒｐｉｎ１遺伝子のタンパク配列を検索源とし、トビイロ
ウンカゲノムデータベース中でローカールＢｌａｓｔＰによってホモロジー配列検索を行
い、１つの予測タンパクを取得し、Ｎｌｓｅｒｐｉｎ１と名付けた。ＰｒｉｍｅｒＰｒｅ
ｍｉｅｒ５によってＮｌｓｅｒｐｉｎ１増幅プライマーを下記のように設計した。
0006936979.tif 000002
実施例１に記載のトビイロウンカｃＤＮＡをモジュールとし、ＰＣＲ増幅を行った。ＰＣ
Ｒ増幅系は、ｃＤＮＡモジュールは１μＬ、ｄＮＴＰｓ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）は２μＬ、
順逆方向のプライマー（１０μｍｏｌ／Ｌ）はそれぞれ０．５μＬ、１０×バッファー（
Ｍｇ２＋を含む）は２．５μＬ、ＬＡＴａｑ酵素は０．２５μＬ、ｄｄＨ２Ｏは２５μＬ
まで補充とした。増幅工程は、９４℃で５ｍｉｎ予め変性、９４℃で３０ｓ変性、６０℃
３０ｓアニーリング、７２℃で１．５ｍｉｎ伸長、３５サイクル、そして７２℃で７ｍｉ
ｎ伸長とした。ＰＣＲ反応が終わったら、１．５％のアガロースゲルで反応産出物の数と
分子量を電気泳動で検出した。
目標増幅産出物を割りゴムで回収し、ｐＭＤ１８−Ｔベクター（ＴａＫａＲａ（ＪＰ））
に接種し、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ  ＤＨ５α感受性細胞中に転化し、陽
性トゥランスフォーメイションを上海生物工程有限公司に送ってシーケンシングを頼ん
増幅した産出物は、シーケンシングを行った結果は、トビイロウンカのＮｌｓｅｒｐｉｎ
１遺伝子ｃＤＮＡ配列全長は１２６９ｂｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される）、コー
ドアミノ酸は４２２個（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に示される）、コードアミノ酸分子量は
４７．６５  ｋＤ、等電点は６．７３であった。
【００２０】
実施例２
コガネムシ緑僵病菌野生株（以下、野生株と称される）の分生子胞子懸濁液スプレー法に
よりトビイロウンカ成虫に接種し、異なる時間で誘導したトビイロウンカＮｌｓｅｒｐｉ
ｎ１の発現量を検出した。具体的には、野生株分生子胞子を０．０２％ツイーン（Ｔｗｅ
ｅｎ）−８０水溶液により５×１０７個／ｍＬ濃度の懸濁液を調製し、スプレー法により
トビイロウンカ若虫に接種した（接種体積は１ｍＬ、３ロット、かつロットごとは１００
個）。相同体積で接種した０．０２％Ｔｗｅｅｎ−８０水溶液を対照とした。それぞれ０
時間（未接種）、接種後６、１２、２４と４８時間の後に虫体を収集し、７５％のアルコ
ールで虫体表面を３回消毒し、毎回は３分時間とし、そして無菌蒸留水により５回洗浄し
、虫体を干させて予備用とした。Ｎｌｓｅｒｐｉｎ１遺伝子ｃＤＮＡ配列によって一対の
定量ＰＣＲプライマーを下記のように設計した。
0006936979.tif 000003
サンプルＲＮＡの抽出とｃＤＮＡの合成工程は実施例１と同様である。ｑＲＴ−ＰＣＲ分
析はＳＹＢＲR  ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＴＭＩＩ試験キットを用いた。反応系は、２×
ＳＹＢＲR  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  ＴａｑＴＭＩＩ１０μＬ、上下流プライマー（１０μ
ｍｏｌ／Ｌ）はそれぞれ１μＬ、適量希釈したｃＤＮＡ２μＬとｄｄＨ２Ｏ６μＬとし、
２０μＬ反応系であった。増幅工程は、９５℃で３０ｓ予め変性、そして４０増幅サイク
ルに（９５℃で５ｓ変性、６０℃で３４ｓアニーニング）進入とした。融解グラフは、９
５℃１５ｓ、６０℃１ｍｉｎ、９５℃１５ｓとした。トビイロウンカβ−Ａｃｔｉｎ遺伝
子を内部標準をとした。増幅プライマーは下記のとおりであった。
0006936979.tif 000004
反応系と工程は上記と同様であった。各試験は３回生物学的および３回技術的リピートを
行った。Ｎｌｓｅｒｐｉｎ１遺伝子の病原性真菌に接種した異なる時間誘導後における相
対発現量は２−ΔΔＣｔとし計算され、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−８０接種グループの発現
量を基数とし、その値は１とした。対照グループ（未接種）と対比すると、４８時間内で
野生株誘導Ｎｌｓｅｒｐｉｎ１発現量はいずれも顕著な降下トレントを呈した（Ｐ＜０．
０５）。野生株接種の６時間後に、Ｎｌｓｅｒｐｉｎ１発現量が最低であり、ただ対照の
４１．７％となった。誘導からの２４時間と４８時間後に、その発現量が対照の６３．８
％と７６．４％となり、いずれも対照グループとの相違が顕著なレベルになった（Ｐ＜０
．０５）。具体的結果は図１に示される。
【００２１】
実施例３
ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩで消化したＮｌｓｅｒｐｉｎ１遺伝子フラグメントを真菌発現白タ
ーｐＡＮ５２−１Ｎ中にクローンし、アスペルギルス・ニデュランスのグリセルアルデヒ
ド−３−りん酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモータＰｇｐｄＡとターミネータＴｔｒｐ
Ｃの間に位置させてｐＡＮ５２−Ｎｌｓｅｒｐｉｎ１を形成した。ｐＥＴ２９ｂ−Ｂａｒ
プラスミドをＸｂａＩ単一酵素により切断し、切断したグルホシネート（ＰＰＴ）耐性遺
伝子ｂａｒの発現エレメントＰｇｐｄＡ−ｂａｒ−ＴｔｒｐＣを同じくＸｂａＩ単一酵素
により切断し且つ脱リン酸化されたｐＡＮ５２−Ｎｌｓｅｒｐｉｎ１中に導入し、スクリ
ーンしてＮｌｓｅｒｐｉｎ１とｂａｒ遺伝子の両発現フレーム方向相同のクローンを取得
し、そうすれば成功的に標的遺伝子と耐性標記遺伝子を含むバイナリーベクタープラスミ
ドｐＡＮ５２−Ｎｌｓｅｒｐｉｎ１−Ｂａｒを構築できた。該プラスミドをＨｉｎｄＩＩ
Ｉにより線形化し、その後、ＰＥＧ媒介融合のプロトプラスト形質転換によりコガネムシ
緑僵病菌野生株中に導入した。
選択的プレート上で８個の成長が良かったトゥランスフォーメイションをランダムにピッ
クアップし培養し、菌糸体ゲノムＤＮＡを抽出し、２回のＰＣＲ鑑定を行なって、それぞ
れＮｌＦＡＦ１とｂａｒ遺伝子の存在鑑定を行なった。具体的には、８個の成長および胞
子形成が良かったトゥランスフォーメイションをランダムにピックアップして、ガラスペ
ーパーを敷いたＳＤＡＹプレート上に分生子胞子を均一に塗布し、２５℃で３日培養した
後、ＣＡＴＢ法により菌糸体ゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ鑑定を行なった。各トゥラン
スフォーメイションのゲノムＤＮＡをモジュールとし、まずｂａｒ遺伝子のプライマーで
ある、Ｂａｒ−Ｆ：５´−ＡＧＡＡＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＣＣＧＡＣＡＴ−３；Ｂａｒ−
Ｒ：５´−ＣＴＧＣＣＡＧＡＡＡＣＣＣＡＣＧＴＣＡＴＧＣ−３´を用いて、ＰＣＲ反応
を行なって、ｂａｒのゲノム中における存在鑑定を行なった。そしてｂａｒ遺伝子陽性の
トゥランスフォーメイションゲノムをモジュールとし、ＮｌＦＡＦ１遺伝子によりプライ
マーである、ｉＳ１Ｆ：５´−  ＴＣＴＴＣＴＴＣＴＣＧＣＣＴＣＡＣＡＧＣ  −３´；
ｉＳ１Ｒ：５´−  ＣＧＡＡＣＴＴＧＧＧＡＡＴＧＧＡＣＡＣＣ−３´を用いて、ＰＣＲ
増幅反応を行なって、ゲノム中におけるＮｌｓｅｒｐｉｎ１遺伝子の存在鑑定を行なった
。
上記ｂａｒ遺伝子とＮｌｓｅｒｐｉｎ１遺伝子ＰＣＲ増幅系は、ｃＤＮＡモジュールは１
μＬ、ｄＮＴＰｓ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）は２μＬ、順逆方向のプライマー（１０μｍｏｌ
／Ｌ）はそれぞれ０．５μＬ、１０×バッファー（Ｍｇ２＋含有）は２．５μＬ、ＬａＴ
ａｑ酵素は０．２５μＬ、ｄｄＨ２Ｏは２５μＬまで補充とした。増幅反応工程は、９４
℃で予め５ｍｉｎ変性、そして３５増幅サイクル（毎サイクルは順次に９４℃で３０ｓ変
性、６０℃で３０ｓアニーリング、７２℃で４５ｓ伸長）に進入、サイクルが終わったら
再び７２℃で７ｍｉｎ伸長とした。
得られた６個の陽性トゥランスフォーメイションの全ＲＮＡは逆転写を行った。具体的に
は、ｑＲＴ−ＰＣＲ法によりＮｌｓｅｒｐｉｎ１遺伝子の相対転写発現レベルの測定をし
た。ＴＲＩｚｏｌ法により上記ＰＣＲにおいて双陽性トゥランスフォーメイションと鑑定
したＲＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔR  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ試験キ
ットによってｃＤＮＡに逆転写した。逆転写系は、４μＬ２×ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔR
緩衝液、１μＬ・５０μＭのＯｌｉｇｏ  ｄＴ  Ｐｒｉｍｅｒ、１μＬ・１００μＭのＲ
ａｎｄｏｍ  ６  ｍｅｒｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、１μＬのＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔR  ＲＴ  
Ｅｎｚｙｍｅ  ＭｉｘＩの逆転写酵素、および２μＬの全ＲＮＡ、そして再蒸留水で２０
μＬまで補充とした。逆転写反応工程は、まず３７℃で１５ｍｉｎ反応、再び８５℃で５
ｓ逆転写酵素失活とした。ｑＲＴ−ＰＣＲ分析はＳＹＢＲR  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａ
ｑＴＭＩＩ試験キットを用いた。反応はリアルタイムで定量ＰＣＲすなわちＭａｓｔｅｒ
ｃｙｃｌｅｒR  ｅｐ  ｒｅａｌｐｌｅｘ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅ
ｒｍａｎｙ）上でなされた。ｑＲＴ−ＰＣＲ系は、２×ＳＹＢＲR  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ
ＴａｑＴＭＩＩ１０μＬ、１０μＭの上下流検測プライマーはそれぞれ１μＬ（前記「
１．４」のｑＳ１Ｆ／ｑＳ１Ｒと同様）、および２μＬ適量希釈したｃＤＮＡ、そして再
蒸留水で２０μＬまで補充とした。増幅工程は、９５℃で３０ｓ予め変性、そして４０増
幅サイクル（９５℃で５ｓ変性、６０℃で３４ｓアニーリング）に進入とした。融解グラ
フは９５℃１５ｓ、６０℃１ｍｉｎ、９５℃１５ｓであった。１８Ｓ  ｒＲＮＡを内部標
準とし、増幅プライマーは１８ＳＦ：ＴＧＧＴＴＴＣＴＡＧＧＡＣＣＧＣＣＧＴＡＡ；１
８ＳＲ：ＣＣＴＴＧＧＣＡＡＡＴＧＣＴＴＴＣＧＣとした。反応系と工程は上記と同様で
あった。２−ΔΔＣｔ法により異なるトゥランスフォーメイション中におけるＮｌｓｅｒ
ｐｉｎ１遺伝子の相対発現量を算出し、Ｎｌｓｅｒｐｉｎ１遺伝子転写発現レベルが最高
の陽性トゥランスフォーメイションをピックアップして次の試験用とした。
その結果は、遺伝子ｂａｒとＮｌｓｅｒｐｉｎ１は６個のトゥランスフォーメイション中
で同時に検出可能であり、６個の陽性トゥランスフォーメイションをＳＤＡＹプレート上
で４日培養した場合、その菌糸中にともにＮｌｓｅｒｐｉｎ１発現があった（図２に示さ
れる）。図２（Ａ）は、超発現トゥランスフォーメイションＴ１−Ｔ８中におけるＮｌｓ
ｅｒｐｉｎ１とｂａｒ遺伝子のＰＣＲ鑑定を示す（ただしＭは１００ｂｐ分子量のＭａｒ
ｋｅｒ）。図２（Ｂ）は、超発現陽性トゥランスフォーメイションにおけるＮｌｓｅｒｐ
ｉｎ１遺伝子の転写発現レベルを示す（コラム図における異なる小文字は値間差異の顕著
さ（Ｐ＜０．０５）が示される）。Ｔ６トゥランスフォーメイション中におけるＮｌｓｅ
ｒｐｉｎ１の転写発現量が最高で、該菌株はＭａＴ６と名付けて、超発現株であった。
【００２２】
実施例４
＜超発現株ＭａＴ６の表現型分析及毒性測定＞
１）菌落成長速率の測定
野生株と超発現株の分生子胞子を０．０２％ツイーン８０によりそれぞれ１×１０７個／
ｍＬ懸濁液を調製し、２００μＬ取ってＰＤＡプレート上に塗布し、２５℃で３日培養し
、その後パンチャーにより５ｍｍ直径の菌コロニーブロックを切り取り、それぞれＰＤＡ
培地プレート上に接種し、２５℃で持続的に８日培養した。毎日、十字法（ｃｒｏｓｓｉ
ｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）により菌コロニー直径を測定し撮影した。菌糸成長データは図３（
Ａ）に示される。その結果は、ＰＤＡプレート上で成長していた時は、ＭａＴ６と野生株
の菌コロニー直径は大きな差異がなかったとわかった。
２）胞子形成潜在性の測定
具体的には、野生株と超発現株の分生子胞子を０．０２％ツイーン８０によりそれぞれ１
×１０７個／ｍＬの胞子懸濁液を調製し、２００μＬ取ってそれぞれＰＤＡプレート上に
塗布し、２５℃で７日培養し、パンチャーにより０．６ｍｍ直径の菌糸円片を切り取って
、１ｍＬの０．０２％ツイーン８０中に入れ、渦振動して均一に混合させた後、顕微鏡で
胞子濃度の計算を行った。胞子形成量のデータは図３（Ｂ）に示される。その結果は、Ｐ
ＤＡプレート上で８日培養した後は、ＭａＴ６の胞子形成量は３．０２×１０８個／ｃｍ
２であり、野生株の胞子形成量（３．０７×１０８個／ｃｍ２）に比べて顕著な変化がな
かったとわかった。
野生株と超発現株ＭａＴ６の菌糸成長と胞子形成量の比較分析結果は、図３に示される。
図３によれば、Ｎｌｓｅｒｐｉｎ１遺伝子超発現は、超発現菌株の菌糸成長と胞子形成の
プロセスを影響しなかったと分かった。
３）毒性測定
野生株と超発現株の分生子胞子懸濁液（１×１０７個／ｍＬ）をそれぞれＰＤＡプレート
上に塗布し、持続的に７日培養した後、分生子胞子粉を掻き取って２０ｍＬ０．０２％ツ
イーン８０溶液が入れたバッフルドフラスコ中に移し、充分に振動させ、シェークして分
生子胞子を均一に配布させるようにした。顕微鏡によって血球数板で観察し、胞子数と濃
度を計数し、０．０２％ツイーン８０溶液によってそれぞれを濃度１×１０６、１×１０
７と１×１０８個／ｍＬの胞子懸濁液に調製した。
予め用意した稲苗を取って、毎カップの稲苗にトビイロウンカ成虫４０個を接種し、１ｍ
Ｌの各濃度胞子液を吸い取って、スプレー法によって成虫を処理し、スプレー後に試験虫
の逃しを防止するためにカップエッジに穴を刺してあるプラスティック蓋を覆った。各濃
度ごとに３回繰り返しとして、１ｍＬ０．０２％ツイーン８０溶液を対照とした。２５℃
、１４Ｌ：１０Ｄ条件下で飼育し、１日ずつ定時的に観察し、死亡率を記録し、持続的に
１０日観察しながら、適時に虫死体を移出して２５℃温度で置いて保湿培養し、虫死体の
表面で生み出した菌コロニーの特徴によって真菌致死の発病率を確知した。実際の接種剤
分は稲苗旁らに置かれるカバーガラス（２０×２０ｍｍ）によって胞子を収集し、メダン
染色した後、顕微鏡で胞子数を観察した。これによって、トビイロウンカ及び水稲の葉上
に沈んだ胞子付着量を胞子数として標準化できた。
超発現菌株ＭａＴ６と野生株のトビイロウンカに関するパラレル生物測定の結果は、Ｍａ
Ｔ６のトビイロウンカ成虫に対する毒性は、野生菌株Ｍａ４５６より著しく高かった。ト
ビイロウンカ成虫の、ＭａＴ３とＭａ４５６分生子胞子（１×１０８個胞子／ｍＬ）が接
種した後におけるデス率と接種後の時間は正の相関を呈し、菌スプレー後の時間の増加に
つれて累計デス率が増加するようであった。ＭａＴ６の７日目に引き起こした累計デス率
はそれぞれ７４．７％であったが、対照菌株は約５９．２％であった。虫死体は保湿培養
された後、全部典型的な感染による致死的症状が発見した。ＭａＴ６および野生株のトビ
イロウンカ成虫に対する毒性測定データの確率分析によれば、受け取られ得るタイム−デ
ス率のモーデルを模擬した。超発現株ＭａＴ３と野生株Ｍａ４５６のトビイロウンカに対
する毒性のタイム−デス率模擬グラフおよび致死時間ＬＴ５０は、具体的に図４に示され
る。ここで、ＣＫは空白対照グループ（０．０２％ツイーン８０処理）。分析の結果は、
ＭａＴ６のトビイロウンカ成虫に対する毒性が顕著に上昇し、半分致死時間ＬＴ５０は３
．６日であり、対照野生株Ｍａ４５６と比べて１．５日早かった、とわかった。
【００２３】
配列表
<110>  中国計量大学
<120>  抗虫遺伝子及びその用途
<160>  2
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  2
<211>  1269
<212>  DNA/RNA
<213>  Nilaparvata lugens
<400>  2
atgatgatac tgtggatgtg tgtagttgcg gttactctac cagttttcac caaccaacaa        60
tgtctcacca aagatgactc gaagccttca accgacccgc aagcaaggct ggctctgttc       120
agaggccaac aggagttcag cctggcaatg ctgcagacgg tgaaccacat gtacccgaac       180
cagaacatct tcttctcgcc tcacagcatc taccaggcaa tgttgttgtc ctactttgtc       240
gccgccaatc acaccgaagc ctccattaag aaggccatct tcctgcccaa gcaacaggat       300
aagttgagta ctatgcaggc ttacaggttg gagaaattct tccaaagcat gcgattggtc       360
aacggatctg acagctatga actgcgcagt gctaaccgac tatttgtctc acaacagcag       420
aaggtgaagg agtgcatgct ggagctgttc aaggacgagg tgcagcaggt ggatttcgcc       480
aagtcagcag aatcggcgcg agtgatcaac cagtgggtgg ccaaccagac caggaacaac       540
attaaggagt tgatacctga aggcagtatt agcgagacaa cacaactcat actgacaaat       600
gcggcctact tcaagggact atggaagtca aagttcttga aatccaactc ccgaaaggag       660
atcttctaca ttaacagttc taaaaacgcg tttgttacca tgatgagaca gaagggaaca       720
ttcaatcatg ccgtatcaga acaactagga gcccacatcc tggagctgcc ttacaaaggt       780
gatgacgtca gcatgtttgt cctacttcct ccctttgcca gtccgtcagg tatcaccaac       840
atcctaaagc ggttgaccct gaagactctg cacgagatca tagacgaaga cagcatgatt       900
ccgcgtgccg tcgaggtgtc cattcccaag ttcgaggttg aaaagtctat cgagttggtc       960
cagatcctga cctcgttcgg catcgacatg ttcgaagaca ctgccgacct gtcgtcgctg      1020
accgatgcga ccggcccgcg tgtgcgattc accgacgccg tgcacaaggc gcgactccag      1080
gtggacgagg acggcacaac cgccgcagct gcgactgccg ttctgtcgtt caggtcgtca      1140
cgaccgctcg atccggcaca gttcatttgc aaccatccgt ttgtctacat catctacgac      1200
aaggtcgcac aggttgtgct gttcaccggg gtgtatagca cgcctgaagg cggtaatgaa      1260
gctcagtaa                                                              1269
<210>  2
<211>  422
<212>  PRT
<213>  Nilaparvata lugens
<400>  2
Met Met Ile Leu Trp Met Cys Val Val Ala Val Thr Leu Pro Val Phe 
1               5                   10                  15      
Thr Asn Gln Gln Cys Leu Thr Lys Asp Asp Ser Lys Pro Ser Thr Asp 
20                  25                  30          
Pro Gln Ala Arg Leu Ala Leu Phe Arg Gly Gln Gln Glu Phe Ser Leu 
35                  40                  45              
Ala Met Leu Gln Thr Val Asn His Met Tyr Pro Asn Gln Asn Ile Phe 
50                  55                  60                  
Phe Ser Pro His Ser Ile Tyr Gln Ala Met Leu Leu Ser Tyr Phe Val 
65                  70                  75                  80  
Ala Ala Asn His Thr Glu Ala Ser Ile Lys Lys Ala Ile Phe Leu Pro 
85                  90                  95      
Lys Gln Gln Asp Lys Leu Ser Thr Met Gln Ala Tyr Arg Leu Glu Lys 
100                 105                 110         
Phe Phe Gln Ser Met Arg Leu Val Asn Gly Ser Asp Ser Tyr Glu Leu 
115                 120                 125             
Arg Ser Ala Asn Arg Leu Phe Val Ser Gln Gln Gln Lys Val Lys Glu 
130                 135                 140                 
Cys Met Leu Glu Leu Phe Lys Asp Glu Val Gln Gln Val Asp Phe Ala 
145                 150                 155                 160 
Lys Ser Ala Glu Ser Ala Arg Val Ile Asn Gln Trp Val Ala Asn Gln 
165                 170                 175     
Thr Arg Asn Asn Ile Lys Glu Leu Ile Pro Glu Gly Ser Ile Ser Glu 
180                 185                 190         
Thr Thr Gln Leu Ile Leu Thr Asn Ala Ala Tyr Phe Lys Gly Leu Trp 
195                 200                 205             
Lys Ser Lys Phe Leu Lys Ser Asn Ser Arg Lys Glu Ile Phe Tyr Ile 
210                 215                 220                 
Asn Ser Ser Lys Asn Ala Phe Val Thr Met Met Arg Gln Lys Gly Thr 
225                 230                 235                 240 
Phe Asn His Ala Val Ser Glu Gln Leu Gly Ala His Ile Leu Glu Leu 
245                 250                 255     
Pro Tyr Lys Gly Asp Asp Val Ser Met Phe Val Leu Leu Pro Pro Phe 
260                 265                 270         
Ala Ser Pro Ser Gly Ile Thr Asn Ile Leu Lys Arg Leu Thr Leu Lys 
275                 280                 285             
Thr Leu His Glu Ile Ile Asp Glu Asp Ser Met Ile Pro Arg Ala Val 
290                 295                 300                 
Glu Val Ser Ile Pro Lys Phe Glu Val Glu Lys Ser Ile Glu Leu Val 
305                 310                 315                 320 
Gln Ile Leu Thr Ser Phe Gly Ile Asp Met Phe Glu Asp Thr Ala Asp 
325                 330                 335     
Leu Ser Ser Leu Thr Asp Ala Thr Gly Pro Arg Val Arg Phe Thr Asp 
340                 345                 350         
Ala Val His Lys Ala Arg Leu Gln Val Asp Glu Asp Gly Thr Thr Ala 
355                 360                 365             
Ala Ala Ala Thr Ala Val Leu Ser Phe Arg Ser Ser Arg Pro Leu Asp 
370                 375                 380                 
Pro Ala Gln Phe Ile Cys Asn His Pro Phe Val Tyr Ile Ile Tyr Asp 
385                 390                 395                 400 
Lys Val Ala Gln Val Val Leu Phe Thr Gly Val Tyr Ser Thr Pro Glu 
405                 410                 415     
Gly Gly Asn Glu Ala Gln 
420         
【要約】      （修正有）【課題】化学的防除法による、ヒト、家畜、畑や水田など生態系の汚染や、生態系の破壊、汚染物の残留を克服し、汚染ゼロである、害虫抑制機構となる抗虫遺伝子、生物防除真菌及び方法を提供する。【解決手段】抗虫遺伝子であるＮｌｓｅｒｐｉｎ１遺伝子、コガネムシ緑僵病菌ゲノムに導入したＮｌｓｅｒｐｉｎ１遺伝子の発現カセット、発現カセットで形質転換したコガネムシ緑僵病菌を提供する。【効果】Ｎｌｓｅｒｐｉｎ１遺伝子は、コガネムシ緑僵病菌の水稲害虫に対する毒性を顕著に増強する。【選択図】なし【図１】
0006936979.tif 000005
【図２】
0006936979.tif 000006
【図３】
0006936979.tif 000007
【図４】
0006936979.tif 000008