(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘキソキナーゼ２特異的阻害剤を含む、ミクログリアの活性化によって媒介される急性中枢神経系損傷障害の予防及び治療のための医薬であって、
前記ヘキソキナーゼ２特異的阻害剤が、ヘキソキナーゼ２抗体又はその抗原結合フラグメント、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はロニダミンである、医薬。
【請求項２】
前記ヘキソキナーゼ２抗体が、前記抗体のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドとして発現ベクターに含まれる、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
前記抗体の抗原結合フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２又はＦｖである、請求項１に記載の医薬。
【請求項４】
前記ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡが、ベクターに含まれる、請求項１に記載の医薬。
【請求項５】
前記ヘキソキナーゼ２特異的阻害剤が、ロニダミンである、請求項１に記載の医薬。
【請求項６】
前記急ミクログリアの活性化によって媒介される急性中枢神経系損傷障害が、急性脊髄損傷、脳外傷、網膜損傷、低酸素性脳損傷、急性虚血性脳損傷、虚血性脳卒中、低酸素性脳卒中、新生児低酸素性虚血性脳症、中毒性脳症、急性脳梗塞、ラクナ梗塞、一過性脳虚血性発作、重度の頭蓋脳損傷、又は脳脊髄手術と脳脊髄放射線療法による脳や脊髄神経の損傷である、請求項１に記載の医薬。
【請求項７】
ヘキソキナーゼ２特異的阻害剤を含む、ミクログリアの活性化によって媒介される急性中枢神経系損傷障害の予防及び治療のための組成物であって、
前記ヘキソキナーゼ２特異的阻害剤が、ヘキソキナーゼ２抗体又はその抗原結合フラグメント、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はロニダミンである、組成物。
【請求項８】
前記ヘキソキナーゼ２特異的阻害剤を含む組成物が、さらに、２−デオキシグルコース、ブロモピルビン酸、グルコース６−リン酸、イマチニブ、５−チオグルコース、及びジャスモン酸メチルからなる群より選ばれる１つ又は複数の化合物を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ヘキソキナーゼ２特異的阻害剤が、ロニダミンである、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記急ミクログリアの活性化によって媒介される急性中枢神経系損傷障害が、急性脊髄損傷、脳外傷、網膜損傷、低酸素性脳損傷、急性虚血性脳損傷、虚血性脳卒中、低酸素性脳卒中、新生児低酸素性虚血性脳症、中毒性脳症、急性脳梗塞、ラクナ梗塞、一過性脳虚血性発作、重度の頭蓋脳損傷、又は脳脊髄手術と脳脊髄放射線療法による脳や脊髄神経の損傷である、請求項７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物医学の分野に属し、急性中枢神経系損傷疾患の予防及び治療におけるヘキソキナーゼ２特異的阻害剤の応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳卒中は、中風としても知られ、脳の血管の突然の破裂又は血管閉塞による脳血流の減少に起因する、虚血性及び出血性脳卒中を含む急性脳血管疾患である。その中で、虚血性脳卒中は全症例の約８５％を占める。
【０００３】
現在の組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）は、脳卒中に対するＦＤＡの承認薬である。しかし、ｔ−ＰＡは、脳卒中後３〜６時間のみに適し、治療後に患者における脳出血や脳浮腫のリスクもある。これらの欠点により、ｔ−ＰＡの応用が非常に限られて、恵まれた患者数がかなり少ない。そこで、急性虚血性脳卒中の予防及び治療に用いられる安全で効果的な薬物が非常に期待される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
急性虚血性脳卒中後の免疫系媒介炎症反応は、広く研究される治療標的である。ただし、治療標的としてこのメカニズムを使用した薬物の臨床試験の結果は満足のいくものではない。例えば、フィンゴリモドとナタリズマブのような末梢免疫系の炎症反応に対する薬物は、脳実質へのリンパ球の浸透を抑制するのに効果的であるが、臨床試験では治療を受けた後に脳卒中患者群における利益が見られなかった。そのため、虚血後のミクログリア媒介の中枢神経系炎症反応に対する詳細な調査は、急性虚血性脳卒中の予防及び治療のための新しい治療標的及び策略を提供することが期待される。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の発明者らは、スクリーニングにより一連の解糖系遺伝子を得て、ヘキソキナーゼ２の選択的アップレギュレーションが低酸素誘導ミクログリアの活性化プロセスを媒介することを同定した。本発明者らは、ヘキソキナーゼ２の選択的阻害活性を有する一連の生物学的に活性な物質が、低酸素により誘導されるミクログリアの活性化プロセスを阻害できることを確認した。さらに、本発明者らは、ヘキソキナーゼ１及びヘキソキナーゼ３の干渉が低酸素により誘導されるミクログリアの活性化プロセスを阻害できないことも発見した。
【０００６】
したがって、本発明の一態様では、急性中枢神経系損傷障害の予防及び治療のための医薬の製造におけるヘキソキナーゼ２特異的阻害剤の使用を提供する。
【０００７】
本発明の別の態様では、急性中枢神経系損傷疾患の予防及び治療のための医薬の製造におけるヘキソキナーゼ２特異的阻害剤を含む組成物の使用を提供する。
【０００８】
本発明のさらなる態様では、必要とする対象に、予防的有効量又は治療的有効量のヘキソキナーゼ２特異的阻害剤又はヘキソキナーゼ２特異的阻害剤を含む組成物を投与することを含む、急性中枢神経系傷害疾患を予防及び治療する方法を提供する。
【０００９】
本発明では、急性中枢神経系損傷の予防及び治療におけるヘキソキナーゼ２特異的阻害剤の神経保護効果を発見した。細胞学的実験及びインビボ動物実験は、選択的ヘキソキナーゼ２のアップレギュレーションが、低酸素誘導ミクログリアの活性化プロセス及び虚血後のミクログリア媒介神経炎症反応を制御するが、ヘキソキナーゼ２特異的阻害剤と遺伝子ノックダウンの両方も、ミクログリア媒介炎症反応を有意に阻害することにより、神経保護効果を発揮できると示す。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】解糖系の強化は、低酸素によるミクログリアの活性化に不可欠である。（Ａ）所定の時間の低酸素条件への曝露後のＢＶ２ミクログリアの代表的な画像である。スケールバーは１００μm（ｎ＝４）である。（Ｂ）図（Ａ）における形態変化を有するミクログリアの百分率の定量化である（ｎ＝４）。（Ｃ）低酸素によるミクログリアの活性化は、分子マーカーＣＤ１１ｂのアップレギュレーションによって確認されたことを示す。スケールバーは２５μm（ｎ＝３）である。（Ｄ）ＢＶ２細胞の低酸素により、炎症性サイトカインの産生を有意に誘導し、かつ時間依存的であることを示す（ｎ＝３）。（Ｅ〜Ｆ）低酸素は、ＢＶ２細胞の生存率に影響しない。フローサイトメトリー分析では、２４時間１％酸素に曝露した後、アネキシンＶ＋又はＰＩ＋細胞の数に有意な増加が見られなかった（ｎ＝３）。（Ｇ）２−[Ｎ−（７−ニトロベンジル−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ]−２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＮＢＤＧ）と酸素正常状態又は低酸素状態で１時間共同培養しながら曝露した細胞での２−ＮＢＤＧ摂取アッセイの代表的な画像である。スケールバーは１００μmである。（Ｈ）多点検出プレートリーダーを使用した（Ｇ）の平均蛍光強度の定量化である（ｎ＝４）。（Ｉ）解糖系の重要な代謝産物のグラフである。６時間の低酸素暴露後の有意に強化された代謝産物のマーカーを標記する（ｎ＝４）。（Ｊ〜Ｌ）解糖系の阻害剤である２−ＤＧは、低酸素時のミクログリア活性化を大幅に阻害する。（Ｊ）１％の酸素に曝露したときの２−ＤＧの添加の有無によるＢＶ２細胞の画像比較である。（Ｋ）（Ｊ）において２−ＤＧで処理した後の活性化細胞の百分率の減少である。スケールバーは５０μm（ｎ＝４）である。（Ｌ）低酸素条件下で、炎症誘導性サイトカインの産生は２−ＤＧによって有意に破壊される。＊＜０．０５；＊＊＜０．０１；＊＊＊＜０．００１。
【図２】低酸素により誘導されるミクログリアの活性化プロセスには、ヘキソキナーゼファミリーメンバーのアップレギュレーションが関与する。（Ａ）ｑＲＴ−ＰＣＲ分析酵素のmＲＮＡレベルである。画像は、６時間の低酸素後のこれらの遺伝子のmＲＮＡレベルの全体的な増加を示す（ｎ＝３）。（Ｂ〜Ｃ）所定の低酸素期間後のＢＶ２細胞（Ｂ）及び初代ミクログリア（ｐＭＧ）（Ｃ）のＨＫ１、ＨＫ２及びＨＫ３タンパク質レベル（ｎ＝４）である。
【図３】ヘキソキナーゼ２の干渉は、低酸素により誘導されるミクログリアの活性化プロセスを効果的に阻害できる。（Ａ）特異的なＨＫ２ノックダウンは、ＢＶ２ミクログリアの活性化表現型を十分に阻害することができる（ｎ＝３）。ＢＶ２細胞をＨＫ２ｓｉＲＮＡの有無にかかわらず２４時間トランスフェクトし、低酸素条件下でさらに２４時間刺激した後、ウエスタンブロット法分析により示されたタンパク質のレベルである。（Ｂ）ＨＫ２の異なる干渉フラグメントをトランスフェクトしたＢＶ２細胞は、低酸素により誘導されるミクログリアの形態学的変化を効果的に阻害できる。（Ｃ）低酸素条件下でのＨＫ２ノックダウン細胞における活性化ミクログリアの百分率の減少率である。（Ｄ）ＨＫ２ノックダウンは、ＣＤ１１ｂの発現を有意に抑制した。
【図４】ヘキソキナーゼ１及びヘキソキナーゼ３の干渉は、低酸素により誘導されるミクログリアの活性化プロセスを阻害できない。ＨＫ１及びＨＫ３干渉フラグメントを使用して、それぞれヘキソキナーゼ１及びヘキソキナーゼ３（ＡとＣ）を干渉したが、低酸素により誘導されるミクログリアの活性化による形態学的変化を効果的に阻害できない（ＢとＤ）（ｎ＝３）。
【図５】ピルビン酸キナーゼＭ２サブタイプ（ＰＫＭ２）の干渉は、低酸素により誘導されるミクログリアの活性化プロセスを阻害できない。（Ａ）低酸素刺激ＢＶ２細胞におけるＰＫＭ２タンパク質発現の免疫ブロット分析である。（Ｂ）ＰＫＭ２ノックダウンは、ＣＤ１１ｂの低酸素誘導性アップレギュレーションに影響しない。（Ｃ）代表的な画像は、ＰＫＭ２ノックダウンが低酸素により誘導されるミクログリアの形態学的変化を阻害できない。スケールバーは５０μmである。
【図６】ヘキソキナーゼ２阻害剤であるロニダミンは、低酸素により誘導されるミクログリアの活性化プロセスを効果的に阻害できる。（Ａ）低酸素中のｐＭＧ及びＢＶ２培養物の活性化状態は、ロニダミン（５０μＭ）の存在下で有意に阻害された。スケールバーは５０μmである。（Ｂ）画像は、（Ａ）のロニダミンによる治療後に活性化されたミクログリアの百分率の減少を示す。（Ｃ）免疫蛍光アッセイにより、低酸素刺激下のＢＶ２及びｐＭＧ細胞は、ロニダミンの存在下でＣＤ１１ｂの発現を減少させたことを示す。スケールバーは５０μmである。＊＜０．０５；＊＊＜０．０１；＊＊＊＜０．００１。
【図７】ヘキソキナーゼ２のアップレギュレーションは、ヒストンのアセチル化の増加と炎症誘導性サイトカインＩｌ１ｂの転写発現につながる。（Ａ）ＢＶ２細胞の低酸素条件で６時間暴露後の解糖とＴＣＡサイクルの代謝物プロファイルである。データは、低酸素状態から正常酸素状態への倍率変化を示す。ダウンレギュレーションされた代謝産物は緑色の四角で示され、アップレギュレーションされた代謝産物は赤色の四角で示される（ｎ＝４）。（Ｂ）（Ｄ）ＨＫ２阻害は、ＢＶ２細胞における細胞内アセチルＣｏＡの蓄積を逆転させ、アセチル化ヒストンのアップレギュレーションを阻害する。（Ｃ）低酸素暴露後のＢＶ２細胞及び初代ミクログリア（ｐＭＧ）におけるヒストンのアセチル化の発現レベルである（ｎ＝３）。（Ｅ）mＲＮＡレベルでのＩｌ１ｂによる低酸素誘導のアップレギュレーションは、ＨＫ２阻害により有意に減少した（ｎ＝３）。（Ｆ）ロニダミンによる前処理により、ＡｃＨ３及びＡｃＨ４のＩｌ１ｂプロモーターへの結合が減少した。各処理群におけるＡｃＨ３又はＡｃＨ４をもつＩｌ１ｂプロモーターの存在量は、同じプライマー（ｎ＝３）を使用した対応する投入サンプルと比較した。＊＜０．０５；＊＊＜０．０１；＊＊＊＜０．００１。
【図８】ロニダバミンは、ラットを中大脳動脈梗塞による脳損傷から効果的に保護する。（Ａ）各処理群における２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム塩化物（ＴＴＣ）で染色された脳切片の代表的な画像である。（Ｂ）各群の脳梗塞のサイズの定量化は、ロニダバミン投与群がＭＣＡｏによる梗塞のサイズを有意に減少させることを示した（ｎ＝６／群）。＊＜０．０５；＊＊＜０．０１；＊＊＊＜０．００１。
【図９】ヘキソキナーゼ２のインビボ遺伝子ノックダウンは、ラットを中大脳動脈梗塞による脳損傷から効果的に保護する。（Ａ）ＡＡＶベクターの注射後２１日、脳全体のイメージングを使用して、ｅＧＦＰ発現に基づくウイルス分布をモニターリングした（ｎ＝３）。（Ｂ）脳の線条切片のＨＫ２及びＣＤ１１ｂ染色は、ＣＤ１１ｂがミクログリアにおいてＨＫ２発現と正の相関を示す（ｎ＝６／群）。スケールバーは２０μmである。（Ｃ）ＴＴＣ染色は、ＭＣＡｏ手術後にＡＡＶｓｈＨＫ２で処理した群で梗塞サイズの減少を示す（ｎ＝６／群）。（Ｄ）図（Ｃ）の梗塞サイズの定量化である（ｎ＝６／群）。（Ｅ）線条体Ｉｂａ−１免疫反応性アッセイは、ＡＡＶ−ｓｈＨＫ２処理が梗塞脳半球のミクログリアの活性化を有意に阻害することを示した。スケールバーは５０μmである。（Ｆ）ラットＭＣＡｏモデルでのＡＡＶ９−ｓｈＨＫ２処理後のＩＬ−１ｂ産生の減少を示す虚血性脳半球の皮質及び線条領域の代表的な画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明を以下の実施形態でさらに説明するが、本発明の実施形態は以下の実施例に限定されず、本発明の原理及び概念に従ってなされた同等の変更又は修正は、本発明の範囲内であるとみなされる。
【００１２】
略語
２−ＮＢＤＧ、２−[Ｎ−（７−ニトロフェニル−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ]−２−デオキシ−Ｄ−グルコース；
ＣｈＩＰ、クロマチン免疫沈降；
ＤＡＢ、３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩；
ＤＡＭＰ、損傷関連の分子パターン。
ＤＨＡＰ、ジヒドロキシアセトンリン酸；
ＦＢＰ、フルクトース−１，６−ビスリン酸；
Ｇ−３−Ｐ、グリセルアルデヒド３−リン酸；
ＨＫ２、ヘキソキナーゼ２；
ＩＬ−１β、インターロイキン−１β；
ＬＰＳ、リポ多糖；
ＭＣＡｏ、中大脳動脈の閉塞；
ＮＭＤＡ、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸；
ＰＫＭ２、ピルビン酸キナーゼＭ２；
ｑＲＴ−ＰＣＲ、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応；
ｒＡＡＶ、組換えアデノ随伴ウイルス；
ＲＯＳ、活性酸素；
ｓｉＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ；
ＴＴＣ、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム塩化物。
【００１３】
一態様では、本発明は、急性中枢神経系損傷障害の予防及び治療のための医薬の製造におけるヘキソキナーゼ２特異的阻害剤の使用を提供する。ヘキソキナーゼ２特異的阻害剤とは、ヘキソキナーゼ２（ヘキソキナーゼＩＩ又はＨＫ２とも呼ばれる）の生物学的活性を特異的又は選択的に阻害できる物質を指す。
【００１４】
いくつかの実施形態では、前記ヘキソキナーゼ２特異的阻害剤は、ヘキソキナーゼ２に対する抗体又はそのフラグメントを含む。前記抗体とは、ヘキソキナーゼ２に特異的に結合し、ヘキソキナーゼ２の活性を阻害又はクレンチできるタンパク質を指す。抗体のフラグメントには、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、及びＦｖを含むことができる。抗体又はそのフラグメントの産生及び精製は、当分野で周知である。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本発明のヘキソキナーゼ２抗体は、抗体をコードするアミノ酸配列、ヌクレオチド配列、当該ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を含む発現ベクターとして存在し得る。いくつかの実施形態では、本発明のヘキソキナーゼ２抗体は、融合タンパク質として発現ベクター又は宿主細胞に存在し得る。
【００１６】
いくつかの実施形態では、前記ヘキソキナーゼ２特異的阻害剤は、ＲＮＡｉメカニズムによるヘキソキナーゼ２の合成を阻害するように、ヘキソキナーゼ２のmＲＮＡの翻訳を特異的に阻害できる物質、又はヘキソキナーゼ２のmＲＮＡを特異的に分解できる物質、例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、mｉＲＮＡ又はその修飾を含む。ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はmｉＲＮＡは、当分野で周知のインビトロ合成技術により得ることができる。いくつかの態様において、本発明のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はmｉＲＮＡは、細胞などのような特定のベクターに存在する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、前記急性中枢神経系損傷疾患は、急性虚血又は低酸素による中枢神経系損傷の疾患又は状態を指し、急性脊髄損傷、脳外傷、網膜損傷、低酸素性脳損傷、急性虚血性脳損傷、虚血性脳卒中、低酸素性脳卒中、新生児低酸素性虚血性脳症、中毒性脳症、急性脳梗塞、ラクナ梗塞、一過性脳虚血性発作、重度の頭蓋脳損傷、脳脊髄手術と脳脊髄放射線療法による脳及び脊髄神経の損傷を含むが、これらに限定しない。
【００１８】
別の態様において、本発明は、急性中枢神経系損傷障害の予防及び治療用の医薬の製造におけるヘキソキナーゼ２特異的阻害剤を含む組成物の使用を提供する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、前記組成物に含まれるヘキソキナーゼ２特異的阻害剤は上記の通りであり、かつ、当該組成物は、さらに他のヘキソキナーゼ２阻害剤を含んでもよい。前記他のヘキソキナーゼ２阻害剤は、２−デオキシグルコース、ロニダミン、ブロモピルビン酸、グルコース６−リン酸、イマチニブ、５−チオグルコース、ジャスモン酸メチルを含むが、これらに限定しない。
【００２０】
本発明のさらなる態様は、必要とする対象に、予防的有効量又は治療的有効量のヘキソキナーゼ２特異的阻害剤又はヘキソキナーゼ２特異的阻害剤を含む組成物を投与することを含む、急性中枢神経系傷害疾患を予防及び治療する方法を提供する。
【００２１】
いくつかの実施形態では、前記対象は、ヒトなどのような哺乳動物を指す。前記投与とは、例えば、皮下、経皮、筋肉内、静脈内、動脈内、舌下、口内、胃腸などの投与経路により、薬物を、例えば人体へ投与することを意味する。いくつかの実施形態では、ヘキソキナーゼ２特異的阻害剤（例えば、核酸として）は、遺伝子治療により治療又は予防される対象に投与することができる。
【００２２】
本発明のさらなる態様は、必要とする対象においてヘキソキナーゼ２の活性を選択的又は特異的に低下又は不活性化することを含む、急性中枢神経系損傷疾患を予防及び治療する方法を提供する。前記ヘキソキナーゼの活性を低下又は不活性化することは、例えば、ヘキソキナーゼ２タンパク質の発現を低下又は消滅する遺伝子工学的手段により達成することができる。例示的な一手段として、部位特異的突然変異誘導によりヘキソキナーゼ２をコードするヌクレオチド配列を変更することが挙げられる。例示的な別の手段として、ＲＮＡｉ技術によりヘキソキナーゼ２のmＲＮＡの翻訳プロセスを干渉することが挙げられる。細胞内の特定のタンパク質の発現を低下するための当業者に知られる任意の方法は、本発明の方法での使用が意図される。
【００２３】
本発明で使用される材料及び実験方法は、特に明記しない限り、従来の材料及び方法である。
【実施例】
【００２４】
実施例１  低酸素による解糖系の増強がミクログリアの活性化に必要である
材料：マウスＢＶ２ミクログリア細胞株、高グルコースＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、１１９６５−１１８）、ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、１００９９−１４１）、２−デオキシグルコース（Ｓｉｇmａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄ８３７５）、２−（Ｎ−７−ニトロ−２，１，３−ベンゾチアゾール−４−アミノ）−２−デオキシグルコース（２−ＮＢＤＧ、Ｔｈｅｒmｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎ１３１９５）、アネキシン／ＰＩ染色キット（Ｂｉｏｔｏｏｌ、Ｂ３２１１５）、フローサイトメトリー（ＣｙｔｏＦＬＥＸＳ）、レーザー共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ａ１  Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）、低酸素ワークステーション（Ｃｏｙ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ）
【００２５】
ウエスタンブロット及び免疫蛍光法に使用される抗体情報：
ＣＤ１１ｂ抗体（Ｎｏｖｕｓ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ＮＢ１１０−８９４７４）；
ＴＮＦ−α抗体（ＣＳＴ、１１４９８）；
ＩＬ−１β抗体（ＣＳＴ、１２５０７）；
ＩＬ−６抗体（Ｂｉｏｓｓ、ｂｓ−６３０９Ｒ）；
α−チューブリン抗体（Ｂｉｏｗｏｒｌｄ、ＡＰ００６４）。
【００２６】
方法：
ａ）細胞培養：マウスミクログリア細胞株ＢＶ２は、１０％ＦＢＳを含む高グルコースＤＭＥＭ培地で成長させ、５％ＣＯ２に入れ、３７℃の定温密閉インキュベーター（相対湿度９５％）で培養した。倒立顕微鏡下で成長を観察した。継代は約２〜３日ごと行われ、対数増殖期細胞を正式な実験に使用した。低酸素処理群の細胞は、Ｃｏｙ低酸素ワークステーションに配置され、酸素含有量は１％、ＣＯ２含有量は５％に設定され、残りはＮ２で満たされた；他の培養条件は、通常の培養条件と同じであった。
【００２７】
ｂ）細胞タンパク質抽出及び炎症性サイトカインタンパク質発現の検出：細胞を３５mm培養皿に播種し、２４時間静置後、対応する時間の低酸素処理を与えた。次に、全細胞タンパク質を抽出して、炎症誘導性サイトカインであるＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、及びＩＬ−６のタンパク質の発現を検出した。
【００２８】
ｃ）ＣＤ１１ｂ発現の免疫蛍光検出：ＢＶ２細胞をレーザー共焦点専用の培養プレートに播種し、低酸素で２４時間処理した後、室温で２０分間４％パラホルムアルデヒドで固定し、その後ＰＢＳＴで５分間洗浄を３回行った。洗浄後、ＤＡＫＯ抗体希釈液で希釈したＣＤ１１ｂ抗体を加え、４℃で一晩インキュベートした。翌日に、対応する蛍光標識二次抗体を加え、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、ＤＡＰＩワーキング溶液を加え、１０分間核染色した。処理後、ＰＢＳＴで３回洗浄し、レーザー共焦点顕微鏡で画像を取った。
【００２９】
ｄ）２−ＮＢＤＧ摂取アッセイ：ＢＶ２細胞を９６ウェルプレート培養プレート（側面に黒、底面に透明）に播種し、２４時間後に２００μＭ２−ＮＢＤＧを含むＤＰＢＳバッファーで置き換え、酸素正常状態又は低酸素状態にした細胞を１時間培養した後、新鮮なＤＰＢＳと交換し、蛍光顕微鏡で撮影し、多機能マイクロプレートリーダーを使用してそれぞれの処理群の蛍光値を検出し、グルコースの相対的摂取量として示した。
【００３０】
ｅ）アネキシン／ＰＩ染色：細胞を３５mm培養皿に播種し、２４時間静置後、低酸素で２４時間処理した。０．２５％トリプシンで消化することにより、細胞を回収した。次に、キットの指示に従ってアネキシンとＰＩ色素を添加し、３０分後にフローサイトメトリー細胞を使用して、低酸素が細胞死を引き起こしたかどうかを検出した。
【００３１】
ｆ）代謝産物の検出：ＢＶ２細胞を６０mm培養皿に播種し、２４時間静置後、酸素正常状態又は低酸素状態で６時間培養した。予め冷却されたＰＢＳで細胞を３回洗浄した後、１．５mｌの凍結８０％メタノールを加え、−８０℃の冷蔵庫で３０分間インキュベートした。細胞を回収し、４℃、１４，０００ｇで１５分間遠心分離した。上澄みのメタノール／水相を新しい遠心管に移し、８０℃の冷凍庫でさらに３０分間インキュベートした。遠心分離により上澄みを新しい遠心管に回収し、サンプルを窒素雰囲気下で乾燥させた。サンプルは、液体クロマトグラフィー質量分析の前に−８０℃で保存した。
【００３２】
結果：
図１Ａに示すように、低酸素はミクログリアの形態を誘導して、細胞体の増加と仮足の増加を特徴とする明確な活性化状態を示すことができた。この変化は時間的依存であり、２４時間の低酸素後に、活性化形態を示した細胞が、全細胞の約５２％を占めた（図１Ｂを参照）。同時に、図１Ｃの免疫蛍光の結果では、２４時間の低酸素状態後に、ミクログリアが活性化された分子マーカーであるＣＤ１１ｂも有意に増強されたことがわかる。また、図１Ｄに示すように、炎症誘導性サイトカインであるＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、及びＩＬ−６は、正常対照群でほとんど発現しないが、これらのタンパク質の発現レベルも低酸素時間の延長とともに有意に増加した。低酸素のプロセス全体にわたって、１％の低酸素環境で細胞死を引き起こすことが見られなかった（図１Ｅ及び１Ｆを参照）。以上の結果から、低酸素によりミクログリアが炎症性活性化表現型を呈することができたとわかる。
【００３３】
低酸素状態が進行すると、ＢＶ２細胞の好気的解糖系も大幅に強化された。図１Ｇ及び１Ｈに示すように、１時間の低酸素によりも、ＢＶ２細胞によるグルコース摂取が約１．６倍増加した。同時に、このプロセスは、解糖系の代謝物の蓄積と共に増加し、図１Ｉで示されるように、正常対照群と比較して、フルクトース１，６−ビスリン酸、ジヒドロキシアセトンリン酸、グリセルアルデヒド−３−リン酸が６時間の処理群で有意な増加を示した。２−デオキシグルコースによる解糖系の阻害後、低酸素によるミクログリアの活性化表現型は有意に阻害された（図１Ｊ〜１Ｌに示すように）。以上をまとめると、解糖系の強化は、低酸素によるミクログリアの活性化に不可欠である。
【００３４】
実施例２  低酸素により誘導されるミクログリアの活性化プロセスには、ヘキソキナーゼファミリーメンバーのアップレギュレーションが関与する。
材料：マウスＢＶ２ミクログリア細胞株、初代培養マウスミクログリア、高グルコースＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、１１９６５−１１８）、ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、１００９９−１４１）、ＲＮＡ抽出試薬ＴＲＩｚｏｌ（Ｔｈｅｒmｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１５５９６−０１８）、ＲＮＡ定量キット（Ｔｈｅｒmｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｑ１０２１１）、ＳｕｐｅｒＲｅａｌ  ｑＰＣＲ  ＰｒｅＭｉｘ（ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ）（Ｔｉａｎｇｅｎ、ＦＰ２０２−０１）、リアルタイムＰＣＲシステム（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅmｓ）、低酸素ワークステーション（Ｃｏｙ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ）。
【００３５】
ウェスタンブロッティングで使用される抗体情報：
ヘキソキナーゼ１抗体（Ａｂｃａm、１５０４２３）、
ヘキソキナーゼ２抗体（ＣＳＴ、２８６７ｓ）、
ヘキソキナーゼ３抗体（サンタクルーズ、ｓｃ−２８８９０）、
α−チューブリン抗体（Ｂｉｏｗｏｒｌｄ、ＡＰ００６４）。
リアルタイムＰＣＲで使用されたプライマーの情報が以下のとおりである。
マウスＨＫ１フォワードプライマー：ＧＴＡＧＧＧＧＴＡＣＧＣＴＴＡＧＧＴＧＧ；
マウスＨＫ１リバースプライマー：ＡＣＣＣＡＧＧＡＧＴＣＣＡＴＡＡＡＧＣＣ；
マウスＨＫ２フォワードプライマー：ＧＡＧＡＡＡＧＣＴＣＡＧＣＡＴＣＧＴＧＧ；
マウスＨＫ２リバースプライマー：ＴＣＣＡＴＴＴＧＴＡＣＴＣＣＧＴＧＧＣＴ；
マウスＨＫ３フォワードプライマー：ＧＣＴＣＣＧＴＴＧＡＧＡＧＣＡＧＡＴＴＴ；
マウスＨＫ３リバースプライマー：ＴＴＧＣＴＧＣＡＡＧＣＡＴＴＣＣＡＧＴＴ；
マウスＰＦＫＭフォワードプライマー：ＧＴＴＴＧＧＡＡＧＣＣＴＣＴＣＣＴＣＣＴＣ；
マウスＰＦＫＭリバースプライマー：ＧＡＣＧＧＣＡＧＣＡＴＴＣＡＴＡＣＣＴＴ；
マウスＰＦＫＬフォワードプライマー：ＣＧＣＡＡＧＧＴＡＴＧＡＡＴＧＣＴＧＣＴ；
マウスＰＦＫＬリバースプライマー：ＣＧＡＴＧＧＴＣＡＡＧＴＧＴＧＣＧＴＡＧ；
マウスＰＧＫ１フォワードプライマー：ＣＧＡＧＣＣＴＣＡＣＴＧＴＣＣＡＡＡＣＴ；
マウスＰＧＫ１リバースプライマー：ＧＴＣＴＧＣＡＡＣＴＴＴＡＧＣＧＣＣＴＣ；
マウスＰＫＭ１フォワードプライマー：ＣＧＴＣＣＧＣＡＧＧＴＴＴＧＡＴＧＡＧＡ；
マウスＰＫＭ１リバースプライマー：ＴＴＣＡＡＡＣＡＧＣＡＧＡＣＧＧＴＧＧＡ；
マウスＰＫＭ２フォワードプライマー：ＧＧＣＴＣＣＴＡＴＣＡＴＴＧＣＣＧＴＧＡ；
マウスＰＫＭ２リバースプライマー：ＡＡＧＧＴＡＣＡＧＧＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣ；
マウスＡｃｔｂフォワードプライマー：ＴＧＡＧＣＴＧＣＧＴＴＴＴＡＣＡＣＣＣＴ；
マウスＡｃｔｂリバースプライマー：ＴＴＴＧＧＧＧＧＡＴＧＴＴＴＧＣＴＣＣＡ。
【００３６】
方法：
ａ）細胞培養：マウスミクログリア細胞株ＢＶ２は、１０％ＦＢＳを含む高グルコースＤＭＥＭ培地で成長させ、５％ＣＯ２に入れ、３７℃の定温密閉インキュベーター（相対湿度９５％）で培養した。倒立顕微鏡下で成長を観察した。継代は約２〜３日ごと行われ、対数増殖期細胞を正式な実験に使用した。
初代培養ミクログリア：細胞を出生後０〜２日齡のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスから分離された。具体的には、大脳皮質を取り出し、髄膜及び血管を除去した。組織はさみで組織塊を解砕し、３７℃で０．１２５％トリプシンで１５分間消化した。１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭにより消化を終了し、分離した単一細胞を培養皿に播種した。細胞を融合体になるまで成長するように混合培養し、培養皿を軽く振りながら懸濁したミクログリアを分離した。細胞の純度は、ミクログリア特異的分子マーカーであるＣＤ１１ｂによって特定された。
【００３７】
ｂ）細胞タンパク質の抽出及びヘキソキナーゼファミリータンパク質発現の検出：細胞を３５mm培養皿に播種し、２４時間静置後、対応する時間の低酸素処理を与えた。次に、全細胞タンパク質を抽出して、ヘキソキナーゼファミリーのタンパク質発現を検出した。
【００３８】
結果：
図２Ａに示すように、正常対照群と比較して、ＢＶ２細胞で６時間の低酸素処理後、解糖系代謝酵素はmＲＮＡレベルで異なる水準でアップレギュレートされた。その中で、ヘキソキナーゼ１、ヘキソキナーゼ２、及びヘキソキナーゼ３では、有意な上昇が見られた。さらに、ＢＶ２細胞及び初代培養ミクログリア細胞は、異なる時間の低酸素処理後、図２Ｂと２Ｃにおいてもヘキソキナーゼファミリーがタンパク質レベルで一時的または連続的にアップレギュレートされたことがわかる。
【００３９】
実施例３  ヘキソキナーゼファミリーのその他のメンバーでなく、ヘキソキナーゼ２が低酸素により誘導されるミクログリアの活性化プロセスを媒介した
（１）ヘキソキナーゼ２の干渉が低酸素により誘導されるミクログリアの活性化プロセスを効果的に阻害できる。
材料：マウスＢＶ２ミクログリア細胞株、初代培養マウスミクログリア、高グルコースＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、１１９６５−１１８）、ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、１００９９−１４１）、ｓｉＲＮＡフラグメント、ｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬（リポフェクタミン、ＲＮＡｉＭＡＸ  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｔｈｅｒmｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１３７７８−５００）、倒立位相差顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  ＥＣＬＩＰＳＥ  Ｔｉ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）、レーザー共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ａ１  Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）、低酸素ワークステーション（Ｃｏｙ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ）
【００４０】
ウエスタンブロットに使用される抗体情報：
ヘキソキナーゼ１抗体（Ａｂｃａm、１５０４２３）；
ヘキソキナーゼ２抗体（ＣＳＴ、２８６７ｓ）；
ヘキソキナーゼ３抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ、ｓｃ−２８８９０）；
ＣＤ１１ｂ抗体（Ｎｏｖｕｓ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ＮＢ１１０−８９４７４）；
α−チューブリン抗体（Ｂｉｏｗｏｒｌｄ、ＡＰ００６４）。
【００４１】
方法：
ａ）細胞培養：マウスミクログリア細胞株ＢＶ２は、１０％ＦＢＳを含む高グルコースＤＭＥＭ培地で成長させ、５％ＣＯ２に入れ、３７℃の定温密閉インキュベーター（相対湿度９５％）で培養した。倒立顕微鏡下で成長を観察した。継代は約２〜３日ごと行われ、対数増殖期細胞を正式な実験に使用した。
【００４２】
ｂ）ＲＮＡ干渉：細胞を３５mm培養皿に播種し、２４時間静置後、ＲＮＡｉＭＡＸで５０ｎＭｓｉＲＮＡフラグメントをトランスフェクトし、スクランブルＲＮＡを対照として使用され、１２時間後に新鮮な培地と交換した。次に、対応する時間の低酸素処理を与えた際に、相応のタンパク質の発現レベルを検出した。
【００４３】
結果：
図３Ａ〜３Ｄに示すように、ＢＶ２細胞にＨＫ２の異なる干渉フラグメントをトランスフェクトした後、低酸素により誘導されるミクログリアの形態学的変化を効果的に阻害しならが、低酸素により誘導される細胞活性化のマーカーであるＣＤ１１ｂのアップレギュレーションも大幅に減少した。その過程で、ＨＫ２の干渉はＨＫ１とＨＫ３の発現に影響しなかった。
【００４４】
（２）ヘキソキナーゼ１及びヘキソキナーゼ３の干渉は、低酸素により誘導されるミクログリアの活性化プロセスを阻害できない。
材料：マウスＢＶ２ミクログリア細胞株、初代培養マウスミクログリア、高グルコースＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、１１９６５−１１８）、ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、１００９９−１４１）、ｓｉＲＮＡフラグメント、ｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬（リポフェクタミン、ＲＮＡｉＭＡＸ  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｔｈｅｒmｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１３７７８−５００）、倒立位相差顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  ＥＣＬＩＰＳＥ  Ｔｉ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）、低酸素ワークステーション（Ｃｏｙ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ）。ウエスタンブロットに使用される抗体情報：ヘキソキナーゼ１抗体（Ａｂｃａm、１５０４２３）；ヘキソキナーゼ３抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ、ｓｃ−２８８９０）；α−チューブリン抗体（Ｂｉｏｗｏｒｌｄ、ＡＰ００６４）。
【００４５】
方法：
ａ）細胞培養：マウスミクログリア細胞株ＢＶ２は、１０％ＦＢＳを含む高グルコースＤＭＥＭ培地で成長させ、５％ＣＯ２に入れ、３７℃の定温密閉インキュベーター（相対湿度９５％）で培養した。倒立顕微鏡下で成長を観察した。継代は約２〜３日ごと行われ、対数増殖期細胞を正式な実験に使用した。
【００４６】
ｂ）ＲＮＡ干渉：細胞を３５mm培養皿に播種し、２４時間静置後、ＲＮＡｉＭＡＸで５０ｎＭｓｉＲＮＡフラグメントをトランスフェクトし、スクランブルＲＮＡを対照として使用され、１２時間後に新鮮な培地と交換した。次に、対応する時間の低酸素処理を与えた際に、相応のタンパク質の発現レベルを検出した。
【００４７】
結果：
図４Ａと４Ｃに示すように、ＨＫ１とＨＫ３干渉フラグメントを使用して、それぞれヘキソキナーゼ１及びヘキソキナーゼ３を干渉したが、低酸素によるミクログリアの活性化に関連する形態学的変化を効果的に阻害できなかった（図４Ｂと４Ｄ参照）。
【００４８】
（３）ピルビン酸キナーゼＭ２サブタイプ（ＰＫＭ２）の干渉は、低酸素により誘導されるミクログリアの活性化プロセスを阻害できない。
材料：マウスＢＶ２ミクログリア細胞株、高グルコースＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、１１９６５−１１８）、ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、１００９９−１４１）、ｓｉＲＮＡフラグメント、ｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬（リポフェクタミン、ＲＮＡｉＭＡＸ  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｔｈｅｒmｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１３７７８−５００）、倒立位相差顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  ＥＣＬＩＰＳＥ  Ｔｉ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）、低酸素ワークステーション（Ｃｏｙ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ）。ウエスタンブロットに使用される抗体情報：ＰＫＭ２抗体（Ａｂｃａm、１５０４２３）；ＣＤ１１ｂ抗体（Ｎｏｖｕｓ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ＮＢ１１０−８９４７４）；α−チューブリン抗体（Ｂｉｏｗｏｒｌｄ、ＡＰ００６４）。
【００４９】
方法：
ａ）細胞培養：マウスミクログリア細胞株ＢＶ２は、１０％ＦＢＳを含む高グルコースＤＭＥＭ培地で成長させ、５％ＣＯ２に入れ、３７℃の定温密閉インキュベーター（相対湿度９５％）で培養した。倒立顕微鏡下で成長を観察した。継代は約２〜３日ごと行われ、対数増殖期細胞を正式な実験に使用した。
【００５０】
ｂ）ＲＮＡ干渉：細胞を３５mm培養皿に播種し、２４時間静置後、ＲＮＡｉＭＡＸで５０ｎＭｓｉＲＮＡフラグメントをトランスフェクトし、スクランブルＲＮＡを対照として使用され、１２時間後に新鮮な培地と交換した。次に、対応する時間の低酸素処理を与えた際に、相応のタンパク質の発現レベルを検出した。
【００５１】
結果：
図５Ａに示すように、低酸素により誘導されるミクログリアの活性化プロセスにおいて、ＰＫＭ２タンパク質は一過性のアップレギュレーションを示したが、ＰＫＭ２干渉フラグメントを使用してＰＫＭ２発現を妨害した後、低酸素によるミクログリアの活性化に関連する形態学的変化を効果的に阻害できなかった（図５Ｂと５Ｃ参照）。
【００５２】
３）ヘキソキナーゼ２阻害剤であるロニダミンは、低酸素により誘導されるミクログリアの活性化プロセスを効果的に阻害できる。
材料：マウスＢＶ２ミクログリア細胞株、初代培養マウスミクログリア、高グルコースＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、１１９６５−１１８）、ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、１００９９−１４１）、ロニダミン（Ｓｅｌｌｅｃｋ、Ｓ２６１０）、倒立位相差顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  ＥＣＬＩＰＳＥ  Ｔｉ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）、レーザー共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ａ１  Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）、低酸素ワークステーション（Ｃｏｙ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ）。ウエスタンブロットに使用される抗体情報：ＣＤ１１ｂ抗体（Ｎｏｖｕｓ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ＮＢ１１０−８９４７４）；α−チューブリン抗体（Ｂｉｏｗｏｒｌｄ、ＡＰ００６４）。
【００５３】
方法：
ａ）細胞培養：マウスミクログリア細胞株ＢＶ２は、１０％ＦＢＳを含む高グルコースＤＭＥＭ培地で成長させ、５％ＣＯ２に入れ、３７℃の定温密閉インキュベーター（相対湿度９５％）で培養した。倒立顕微鏡下で成長を観察した。継代は約２〜３日ごと行われ、対数増殖期細胞を正式な実験に使用した。
【００５４】
初代培養ミクログリア：細胞を出生後０〜２日齡のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスから分離された。具体的には、大脳皮質を取り出し、髄膜及び血管を除去した。組織はさみで組織塊を解砕し、３７℃で０．１２５％トリプシンで１５分間消化した。１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭにより消化を終了し、分離した単一細胞を培養皿に播種した。細胞を融合体になるまで成長するように混合培養し、培養皿を軽く振りながら懸濁したミクログリアを分離した。細胞の純度は、ミクログリア特異的分子マーカーであるＣＤ１１ｂによって特定された。
【００５５】
ｂ）ＣＤ１１ｂ発現の免疫蛍光検出：ＢＶ２細胞と初代培養ミクログリアをレーザー共焦点専用の培養プレートに播種し、低酸素で２４時間処理した後、室温で２０分間４％パラホルムアルデヒドで固定し、その後ＰＢＳＴで５分間洗浄を３回行った。洗浄後、ＤＡＫＯ抗体希釈液で希釈したＣＤ１１ｂ抗体を加え、４℃で一晩インキュベートした。翌日に、対応する蛍光標識二次抗体を加え、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、ＤＡＰＩワーキング溶液を加え、１０分間核染色した。処理後、ＰＢＳＴで３回洗浄し、レーザー共焦点顕微鏡で画像を取った。
【００５６】
結果：
図６Ａと６Ｂに示すように、ＢＶ２細胞及び初代ミクログリアで、２４時間の低酸素処理後に、ＣＤ１１ｂのタンパク質発現は有意にアップレギュレートされながら、有意な活性化様形態が観察された。ＣＤ１１ｂのアップレギュレーションは、ヘキソキナーゼ２阻害剤であるロニダミンの存在下で有意に阻害されたが、ＤＭＳＯに添加された溶媒対照群ではＣＤ１１ｂの発現に影響しなかった。ロニダミンは５０μＭの用量で使用され、ＤＭＳＯは溶媒として使用された。
【００５７】
実施例４  ヘキソキナーゼ２のアップレギュレーションは、ヒストンのアセチル化の増加と炎症誘導性サイトカインＩｌ１ｂの転写発現につながる。
材料：マウスＢＶ２ミクログリア細胞株、初代培養マウスミクログリア、高グルコースＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、１１９６５−１１８）、ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、１００９９−１４１）、ロニダミン（Ｓｅｌｌｅｃｋ、Ｓ２６１０）、３−ブロモピルビン酸塩（Ｓｉｇmａ、１６４９０）、ＲＮＡ抽出試薬ＴＲＩｚｏｌ（Ｔｈｅｒmｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１５５９６−０１８）、ＲＮＡ定量キット（Ｔｈｅｒmｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｑ１０２１１）、ＳｕｐｅｒＲｅａｌ  ｑＰＣＲ  ＰｒｅＭｉｘ（ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ）（Ｔｉａｎｇｅｎ、ＦＰ２０２−０１）、リアルタイムＰＣＲ機器（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅmｓ）、クロマチン免疫沈降キット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１７−２４５）、低酸素ワークステーション（Ｃｏｙ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ）、倒立位相差顕微鏡（ＮｉｋｏｎＥＣＬＩＰＳＥＴｉＭｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）。ウエスタンブロットに使用される抗体情報：アセチルヒストンＨ３抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、０６−５９９）；アセチルヒストンＨ４抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、０６−８６６）；α−チューブリン抗体（Ｂｉｏｗｏｒｌｄ、ＡＰ００６４）。
【００５８】
方法：
ａ）細胞培養：
マウスミクログリア細胞株ＢＶ２は、１０％ＦＢＳを含む高グルコースＤＭＥＭ培地で成長させ、５％ＣＯ２に入れ、３７℃の定温密閉インキュベーター（相対湿度９５％）で培養した。倒立顕微鏡下で成長を観察した。継代は約２〜３日ごと行われ、対数増殖期細胞を正式な実験に使用した。
【００５９】
初代培養ミクログリア：細胞を出生後０〜２日齡のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスから分離された。具体的には、大脳皮質を取り出し、髄膜及び血管を除去した。組織はさみで組織塊を解砕し、３７℃で０．１２５％トリプシンで１５分間消化した。１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭにより消化を終了し、分離した単一細胞を培養皿に播種した。細胞を融合体になるまで成長するように混合培養し、培養皿を軽く振りながら懸濁したミクログリアを分離した。細胞の純度は、ミクログリア特異的分子マーカーであるＣＤ１１ｂによって特定された。
【００６０】
ｂ）細胞タンパク質抽出及びアセチル化ヒストン発現の検出：ＢＶ２細胞と初代培養ミクログリアを３５mm培養皿に播種し、２４時間静置後、対応する時間の低酸素処理を与えた。次に、全細胞タンパク質を抽出して、アセチル化ヒストンタンパク質の発現を検出した。
【００６１】
ｆ）代謝産物の検出：ＢＶ２細胞を６０mm培養皿に播種し、２４時間静置後、酸素正常状態又は低酸素状態で６時間培養した。予め冷却されたＰＢＳで細胞を３回洗浄した後、１．５mｌの凍結８０％メタノールを加え、−８０℃の冷蔵庫で３０分間インキュベートした。細胞を回収し、４℃、１４，０００ｇで１５分間遠心分離した。上澄みのメタノール／水相を新しい遠心管に移し、８０℃の冷凍庫でさらに３０分間インキュベートした。遠心分離により上澄みを新しい遠心管に回収し、サンプルを窒素雰囲気下で乾燥させた。サンプルは、液体クロマトグラフィー質量分析の前に−８０℃で保存した。
【００６２】
ｄ）アセチル化ヒストンＨ３及びアセチル化ヒストンＨ４のＩｌ１ｂ遺伝子のプロモーター領域への結合を検出するクロマチン免疫沈降アッセイ：ＢＶ２細胞を１００mm培養皿に播種し、２４時間静置後、ＤＭＳＯ又はロニダミンで１時間前処理した後、６時間の無酸素処理を与えた。無酸素処理の終了後、ホルムアルデヒド溶液（Ｓｉｇmａ、Ｆ８７７５）を細胞培養培地に１％の最終濃度まで加え、１０分間架橋を行った。細胞を回収し、ソニケーターを使用してＤＮＡを１００〜１０００ｂｐに破砕した。サンプルを希釈し、入力（ｉｎｐｕｔ）として１０％を取った。残りのサンプルに、アセチル化ヒストンＨ３又はアセチル化ヒストンＨ４抗体を加えて、４℃で一晩インキュベートした。同時に、等量の正常ウサギ由来ＩｇＧを陰性対照として使用した。翌日、プロテインＧ−アガロースを加えて２時間反応した。次に、サンプルを洗浄液で洗浄し、０．２Ｍ  ＮａＣｌ溶液で６５℃で４時間インキュベートして脱架橋した。ＤＮＡをフェノール−クロロホルム法で抽出した後、Ｉｌ１ｂへの結合量を検出するために後続の定量的ＰＣＲ反応を実施した。Ｉｌ１ｂのプロモーター領域のプライマー配列は次のとおりである。
フォワード：５’−ＡＧＧＴＣＡＡＡＧＧＴＴＴＧＧＡＡＧＣＡＧ−３’；
リバース：５’−ＡＴＧＧＡＡＧＴＣＴＧＴＣＴＧＣＴＣＡＧＴＡＴＴＧ−３’。
【００６３】
結果：
図７Ａに示すように、正常対照群と比較して、６時間低酸素処理群の解糖系、トリカルボン酸回路系、及びペントースリン酸系の代謝産物は、さまざまな程度に変化し、そのうち、低酸素によるアセチル補酵素Ａの蓄積が最も顕著であった。同時に、このような変化はヘキソキナーゼ２阻害剤であるロニダミン（用量：５０μＭ）及び３−ブロモピルビン酸塩（用量：１０μＭ）により阻害された（図７Ｂ参照）。さらに、図７Ｃに示すように、低酸素時間の延長とともに、ＢＶ２及び初代ミクログリアにおけるアセチル化ヒストンＨ３及びアセチル化ヒストンＨ４も、一時的にアップレギュレーション又は継続的にアップレギュレーションする傾向を示した。
【００６４】
図７Ｄに示すように、ＢＶ２細胞で、６時間低酸素によるアセチル化ヒストンのアップレギュレーションは、ヘキソキナーゼ２の阻害剤によりも逆転することができると示した。さらに、炎症誘導性サイトカインのmＲＮＡ発現レベルが検出された。図７Ｅに示すように、リアルタイム定量ＰＣＲの結果から、Ｔｎｆａ、Ｉｌ１ｂ、及びＩｌ６のmＲＮＡの発現が低酸素によりアップレギュレーションされたが、Ｉｌ６のみがロニダミン（用量：５０μＭ）及び３−ブロモピルビン酸塩（用量：１０μＭ）により有意に阻害された。クロマチン免疫沈降の結果から、さらに、低酸素後アセチル化ヒストンのＩｌ１ｂのプロモーターへの結合がに増加し、ロニダミンの前処理により両者の結合を有意に阻害したことを示した（図７Ｆ参照）。
【００６５】
実施例５  ヘキソキナーゼ２の阻害は、ミクログリア媒介神経炎症を阻害することにより、ラットを中脳動脈梗塞による脳損傷から効果的に保護する。
（１）ロニダバミンは、ラットを中大脳動脈梗塞による脳損傷から効果的に保護する。
材料：ロニダミン（Ｓｅｌｌｅｃｋ、Ｓ２６１０）、健康な雄ＳＰＦ級Ｓｐａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム塩化物（ＴＴＣ）（分析グレード）、抱水クロラール（分析グレード）（Ｔｉａｎｊｉｎ  Ｋｅmｉｏｕ  Ｃｈｅmｉｃａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）、ＭＣＡｏナイロン縫合糸。
【００６６】
方法：
ａ）中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）モデルは、右内頸動脈ナイロン縫合法を使用して作成された。ＳＤラットは手術前に１２時間絶食させ、水を自由に摂取させた。１０％抱水クロラールの腹腔内注射で麻酔し、３７℃のサーモスタット手術台に仰臥位で固定し、スムーズな呼吸を維持した。頸部中央を切開し、顎下腺を鈍く分離し、右総頸動脈を顕微鏡下で切開し、微小血管クランプで閉鎖した。右外頸動脈を切開し、遠位端を結紮し、右総頸動脈分岐部と前部外頸動脈結紮との間に緩い結び目を作った。右内頸動脈を切開し、微小血管クランプで閉鎖した。顕微鏡眼科手術用ハサミを使用して、２つの結紮糸の間に小さな開口部を切り、ナイロン縫合糸を総頸動脈に挿入し、緩い結び目を締めて、遠位頸動脈の結紮の下で、縫合糸挿入の上で右外頸動脈を切断し、内頸動脈での微小血管クリップを撤去したとともに、縫合糸の挿入端を右総頸動脈の分岐部に配置した。外頸動脈を内外動脈と一直線になるように外向き及び下向きに引っ張った。抵抗が感じられるまで縫合糸を内頸動脈の方向に挿入し、出血を防ぐために糸を締めた。微小血管クリップを撤去し、切開部を縫合した。手術の２時間後、ロルニダミン又は対応する溶媒対照を１０mｇ／ｋｇ投与し、ワイヤーブラシを引き抜いて、２４時間灌流後に脳梗塞体積を測定した。
【００６７】
ｂ）関連文献で記載された方法により脳梗塞体積の測定をした。具体的には、ラットを断頭により殺し、ラットの脳は素早く取り除かれた。氷冷生理食塩水に１０分間置かれ、冠状面を２mm厚の脳スライスに均等に切断し、すぐに１％のＴＴＣ溶液において３７℃で３０分間染色した。その後、４％パラホルムアルデヒドバッファーで固定した。２４時間後、デジタルカメラで写真を撮影し、コンピューターに入力し、各スライスの梗塞面積（ピンクの領域は正常な脳組織で、白い領域は梗塞領域）を画像処理ソフトウェア（ＡＤＯＢＥ  ＰＨＯＴＯＳＨＯＰ  ＣＳ６）で計算し、積分により梗塞体積に変換した。梗塞体積の百分率＝脳スライスあたりの梗塞面積の合計／脳スライスあたりの脳組織全体の合計×１００％。
【００６８】
結果：
図８Ａに示すように、ＴＴＣ染色後の観察により、２時間の脳虚血及び２４時間の再灌流後に、モデル群のラット脳組織と溶媒対照群の脳組織は、いずれも明らかな梗塞領域を示した。それに対して、薬物処理群の対応する脳領域での梗塞の程度は有意に減少した。脳梗塞体積の統計分析により、溶媒対照群と比較して、１０mｇ／ｋｇのロニダミンが、中大脳動脈梗塞による虚血性脳損傷に対して有意な保護効果を有することを示した（図８Ｂ参照）。
【００６９】
（２）ヘキソキナーゼ２のインビボ遺伝子ノックダウンは、ラットを中大脳動脈梗塞による脳損傷から効果的に保護する。
材料：ロニダミン（Ｓｅｌｌｅｃｋ、Ｓ２６１０）、健康な雄ＳＰＦ級Ｓｐａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム塩化物（ＴＴＣ）（分析グレード）、抱水クロラール（分析グレード）（Ｔｉａｎｊｉｎ  Ｋｅmｉｏｕ  Ｃｈｅmｉｃａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）、ＭＣＡｏナイロン縫合糸、ｓｈＨＫ２フラグメントを含む組換えアデノ随伴ウイルス血清型９（ｒＡＡＶ−ｓｈＨＫ２）、スクランブル対照フラグメントを含む組換えアデノ随伴ウイルス血清型９（ｒＡＡＶ−ｓｈＮＣ）、免疫組織化学キット（Ａｂｃａm、ａｂ８０４３６）、脳定位固定装置、倒立位相差顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  ＥＣＬＩＰＳＥ  Ｔｉ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）、レーザー共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ａ１  Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）。
【００７０】
方法：
ａ）中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）モデルは、右内頸動脈ナイロン縫合法を使用して作成された。ＳＤラットは手術前に１２時間絶食させ、水を自由に摂取させた。１０％抱水クロラールの腹腔内注射で麻酔し、３７℃のサーモスタット手術台に仰臥位で固定し、スムーズな呼吸を維持した。頸部中央を切開し、顎下腺を鈍く分離し、右総頸動脈を顕微鏡下で切開し、微小血管クランプで閉鎖した。右外頸動脈を切開し、遠位端を結紮し、右総頸動脈分岐部と前部外頸動脈結紮との間に緩い結び目を作った。右内頸動脈を切開し、微小血管クランプで閉鎖した。顕微鏡眼科手術用ハサミを使用して、２つの結紮糸の間に小さな開口部を切り、ナイロン縫合糸を総頸動脈に挿入し、緩い結び目を締めて、遠位頸動脈の結紮の下で、縫合糸挿入の上で右外頸動脈を切断し、内頸動脈での微小血管クリップを撤去したとともに、縫合糸の挿入端を右総頸動脈の分岐部に配置した。外頸動脈を内外動脈と一直線になるように外向き及び下向きに引っ張った。抵抗が感じられるまで縫合糸を内頸動脈の方向に挿入し、出血を防ぐために糸を締めた。微小血管クリップを撤去し、切開部を縫合した。手術の２時間後、ロルニダミン又は対応する溶媒対照を１０mｇ／ｋｇ投与し、ワイヤーブラシを引き抜いて、２４時間灌流後に脳梗塞体積を測定した。
【００７１】
ｂ）関連文献で記載された方法により脳梗塞体積の測定をした。具体的には、ラットを断頭により殺し、ラットの脳は素早く取り除かれた。氷冷生理食塩水に１０分間置かれ、冠状面を２mm厚の脳スライスに均等に切断し、すぐに１％のＴＴＣ溶液において３７℃で３０分間染色した。その後、４％パラホルムアルデヒドバッファーで固定した。２４時間後、デジタルカメラで写真を撮影し、コンピューターに入力し、各スライスの梗塞面積（ピンクの領域は正常な脳組織で、白い領域は梗塞領域）を画像処理ソフトウェア（ＡＤＯＢＥ  ＰＨＯＴＯＳＨＯＰ  ＣＳ６）で計算し、積分により梗塞体積に変換した。梗塞体積の百分率＝脳スライスあたりの梗塞面積の合計／脳スライスあたりの脳組織全体の合計×１００％。
【００７２】
ｃ）脳の線条体へのｒＡＡＶ９ウイルスの注入：ウイルスは２９３Ｔ細胞にパッケージされ、ｑＰＣＲの力価は３．２×１０１２〜３．５×１０１２Ｖ．Ｇ．／mｌであった。使用したＨＫ２の干渉配列は、５’−ＧＣＧＣＡＡＣＡＴＴＣＴＣＡＴＣＧＡＴＴＴ−３’；５’−ＡＡＡＴＣＧＡＴＧＡＧＡＡＴＧＴＴＧＣＧＣ−３’であり、スクランブル対照群ｓｈＲＮＡ配列はＴＴＣＴＣＣＧＡＡＣＧＴＧＴＣＡＣＧＴであった。脳定位固定装置を使用して、上記のウイルスをそれぞれ脳の線条体に注入した。具体的な座標は、上腕骨の前で１．０mm、正中線の右側で３．０mm、硬膜下で４．５mmであった。注入されたウイルスの量は２μＬであり、注入速度は毎分０．２μＬであった。注射後、マイクロインジェクションは５分間注射部位に留まり、引き抜かれた。
【００７３】
ｄ）組織免疫蛍光による脳内ウイルス分布の検出（ｅＧＦＰ）、ヘキソキナーゼ２及びＩｂａ−１（ミクログリア活性化の別の分子マーカー）の発現：ラット脳を２時間の虚血及び２４時間の再灌流後に、脳組織全体を麻酔で取り出し、固定を経ってパラフィンに包埋し、スライスした。脳スライスの厚さは約４μmであった。脳スライスを脱ろうし、再水和し、抗原インキュベートし、上記抗体を４℃で一晩インキュベートした。翌日に、蛍光標識二次抗体を加え、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、ＤＡＰＩワーキング溶液を加え、１０分間核染色した。処理後、ＰＢＳＴで３回洗浄し、レーザー共焦点顕微鏡で画像を取った。
【００７４】
ｅ）ＩＬ−１β発現の免疫組織化学的検出：ラット脳を２時間の虚血及び２４時間の再灌流後に、脳組織全体を麻酔で取り出し、固定を経ってパラフィンに包埋し、スライスした。脳スライスの厚さは約４μmであった。脳スライスを脱ろうし、再水和し、抗原インキュベートし、上記抗体を４℃で一晩インキュベートした。翌日、サンプルをＰＢＳで洗浄した後、ＨＲＰ結合二次抗体を加え、室温で１５分間インキュベートした後、ＤＡＢ発色溶液と１分間インキュベートした。最後に、ヘマトキシリンで核染色し、Ｎｉｋｏｎ顕微鏡で画像を取った。
【００７５】
結果：
ｒＡＡＶ９−ｓｈＨＫ２及びｒＡＡＶ９−ｓｈＮＣの２０日間注射後、２つの群の体重は計量され、統計分析後に有意差が見られなかった（２つの群の体重はそれぞれ２７３．２±６．９ｇ及び２６９．３±５．０ｇであった）。手術前に、各群ごと３つを選択し、脳組織全体を取り出し、ｅＧＦＰの発現により脳内のウイルスの分布が検出された。図９Ａの画像化結果から、ウイルスが脳内に比較的に良い組織分布を示した。手術後の切片を染色した結果から、正常対照と比較して、手術梗塞側にヘキソキナーゼ２が有意にアップレギュレーションされたことを示した。ウイルスの拡散とともに、ｒＡＡＶ９−ｓｈＨＫ２群のヘキソキナーゼ２の発現は有意に阻害されたが、ｒＡＡＶ９−ｓｈＮＣの注入後、ヘキソキナーゼ２の発現に有意的に影響しなかった（図９Ｂ参照）。ＴＴＣ染色結果から（図９Ｃと９Ｄ参照）、ｒＡＡＶ９−ｓｈＮＣ群と比較して、ｒＡＡＶ９−ｓｈＨＫ２群の脳梗塞サイズが有意に減少したことを示した。同時に、図９Ｅに示すように、線条体領域Ｉｂａ−１染色から、ｒＡＡＶ９−ｓｈＮＣ群の脳梗塞半球において、ミクログリアの隆起は縮小し、活性化された形態を示した。一方、ｓｈＨＫ２群では、ミクログリアは正常な形態を示し、また、Ｉｂａ−１の発現も大幅に減少した。図９Ｆに示すように、皮質と線条体におけるＩｌ−１βの免疫組織化学染色から、インビボヘキソキナーゼ２のノックダウンにより媒介される神経保護作用は、Ｉｌ−１βの発現の減少に関連することをシエした。対照群では、Ｉｌ−１βは皮質と線条体に分布していたが、ｒＡＡＶ９−ｓｈＨＫ２群では、Ｉｌ−１βの発現が有意に阻害された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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