(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＧＮのＮ末側のモチーフとＮＧＲのＣ末側のモチーフ、またはＬＹＮのＮ末側のモチーフと配列番号４４および配列番号４５からなる群から選択されるＣ末側のモチーフとを含み、前記それぞれのＮ末側およびＣ末側のモチーフとの間にβストランド構造を有する、単離された細胞透過性ペプチドであって、ここで、前記細胞透過性ペプチドの完全長が、４０個以下のアミノ酸で構成される、細胞透過性ペプチド。
【請求項２】
糖タンパク質に特異的に結合する、請求項１に記載の細胞透過性ペプチド。
【請求項３】
βストランド構造が、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号３８および配列番号４２からなる群から選択されるペプチド、または配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号３８および配列番号４２からなる群から選択されるペプチドの１または２個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたペプチドを含む、請求項１または２に記載の細胞透過性ペプチド。
【請求項４】
配列番号１、配列番号３４、配列番号２、配列番号３、配列番号６および配列番号７からなる群から選択される、アミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞透過性ペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞透過性ペプチドを有効成分として含有する、がんの治療または予防のための医薬組成物。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞透過性ペプチドを核内の薬剤の送達キャリアとして含有する、がんの治療または予防のための医薬組成物。
【請求項７】
薬剤が、前記細胞透過性ペプチドのＮ末端部分および／またはＣ末端部分に結合する、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
薬剤が、ドキソルビシン、マイトマイシンＣ、ビンデシン、メトトレキサート、レチノイン酸、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、エピルビシン、アクチノマイシンＤ、ゲムシタビンおよびオテラシルカリウムからなる群から選択される、請求項６または７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
がんが、上皮細胞がんまたは癌腫、肉腫または血液がんである、請求項５または６に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
がんが、肺癌、胃癌、胆のう・胆管癌、すい臓癌、肝癌、結腸癌、直腸癌、乳癌、骨肉腫、脂肪肉腫、血管肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、急性前骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、悪性リンパ腫および多発性骨髄腫からなる群から選択される、請求項５または６に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
配列番号１、配列番号３４、配列番号２および配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、ペプチドであって、ここで前記ペプチドの完全長が、４０個以下のアミノ酸で構成される、ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、２０１９年６月２１日に出願された日本国特許出願番号２０１９−１１５２２２の出願日の利益を主張し、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。【０００２】
本発明はペプチドに関し、特に細胞透過性ペプチドまたは送達キャリアに関する。
【背景技術】
【０００３】
近年がんへの対策は急がれており、ニーズに合わせた種々の抗がん剤が開発され、目覚ましい効果をもたらしている。【０００４】
例えば微小管に結合し、安定化させ脱重合を阻害することで、腫瘍細胞の分裂を阻害する、パクリタキセルおよびドセタキセルなどのタキサン系や、微小管の重合を阻害し細胞分裂を停止させる、ビンクリスチンおよびビンブラスチンなどのビンカアルカロイド系の化合物などが知られている。またＤＮＡと結合して抗がん効果を発揮する、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチンおよびオキサリプラチンなどの白金製剤などは、注射または点滴静注によりに簡単に用いることができる（非特許文献１〜３）。【０００５】
さらに抗がん剤の作用効果を高めるために、ＤＤＳ（Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）を利用し、内部に抗がん剤など医薬品を封入させたミセル複合体やリポソームに封入した抗がん剤などの開発がすすめられている（非特許文献４）。またＮＧＲモチーフが糖タンパク質に結合することで、融合ポリペプチド−抗がん剤が、効率的にがん細胞を標的とすることができるという報告もある（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第８，６３６，９７８号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Beth A. Weaver、How Taxol/paclitaxel kills cancer cells. Mol Biol Cell. 2014 Sep 15; 25(18): 2677-2681.
【非特許文献２】Maryam Moudi et al、Int J Prev Med. 2013 Nov; 4(11): 1231-1235.
【非特許文献３】Cara A. Rabik et al、 Molecular Mechanisms of Resistance and Toxicity Associated with Platinating Agents. Cancer Treat Rev. 2007 Feb; 33(1): 9-23.
【非特許文献４】Bruno F. O. Nascimento et al、A Review on (Hydro)Porphyrin-Loaded Polymer Micelles: Interesting and Valuable Platforms for Enhanced Cancer Nanotheranostics Pharmaceutics 2019, 11(2), 81.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ところですべての抗がん剤化合物などの活性剤は、選択毒性の問題、つまり正常細胞への影響に直面する。上記した白金製剤もまた、腎毒性の議論を避けては通れない。さらにＤＤＳを利用した抗がん剤でさえも細胞毒性の問題は無視できない。すなわち、いかに標的細胞のみに抗がん剤などの薬剤または活性剤を作用せるかが大きな問題の一つとなっている。またがんなどの重篤な疾患において、疾患を有する者の病状や状態に合わせた種々の治療選択肢を提供することは非常に重要である。それゆえ、標的細胞に対し選択毒性（標的細胞へ特異的に作用する）がより高い、細胞透過性ペプチドの提供を目的とする。また活性剤送達キャリアとしての細胞透過性ペプチドの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を続けたところ、細胞表面に結合するリガンド分子のＮＧＲモチーフから、細胞表面に結合するためには、構造上、別なモチーフも必要ではないかとの着想に基づき、結合に必要な独自のモチーフを見出した。ついで上記独自のモチーフを有するペプチドが、細胞質内に取り込まれて核へ移動した後、アポトーシスを誘導するという驚くべき知見を突き止め、さらに研究を進めた結果、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下に関する：【００１０】
〔１〕ＲＧＮ、ＲＧＨ、ＲＹＮ、ＬＹＮ、ＦＦＮおよびＱＹＮからなる群から選択されるモチーフと、ＮＧＲ、配列番号４４および配列番号４５からなる群から選択されるモチーフとを含み、前記それぞれのモチーフとの間にβストランド構造を有する、単離された細胞透過性ペプチド。
〔２〕糖タンパク質に特異的に結合する、〔１〕に記載の細胞透過性ペプチド。
〔３〕前記細胞透過性ペプチドの完全長が、４０個以下のアミノ酸で構成される、〔１〕または〔２〕に記載の細胞透過性ペプチド。
〔４〕配列番号１、配列番号３４、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９からなる群から選択される、アミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、〔１〕〜〔３〕のいずれか一項に記載の細胞透過性ペプチド。
〔５〕配列番号１、配列番号３４、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９からなる群から選択される、アミノ酸配列を有する、〔１〕〜〔４〕のいずれか一項に記載の細胞透過性ペプチド。
〔６〕〔１〕〜〔５〕のいずれか一項に記載の細胞透過性ペプチドを有効成分として含有する、がんの治療または予防のための医薬組成物。
〔７〕〔１〕〜〔５〕のいずれか一項に記載の細胞透過性ペプチドを核内の薬剤送達キャリアとして含有する、がんの治療または予防のための医薬組成物。
〔８〕薬剤が、前記細胞透過性ペプチドのＮ末端部分および／またはＣ末端部分に結合する、〔６〕または〔７〕に記載の医薬組成物。
〔９〕薬剤が、ドキソルビシン、マイトマイシンＣ、ビンデシン、メトトレキサート、レチノイン酸、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、エピルビシン、アクチノマイシンＤ、ゲムシタビンおよびオテラシルカリウムからなる群から選択される、〔８〕に記載の医薬組成物。
〔１０〕がんが、上皮細胞がんまたは癌腫、非上皮性がんまたは肉腫または血液がんである、〔６〕〜〔９〕のいずれか一項に記載の医薬組成物。
〔１１〕がんが、肺癌、胃癌、胆のう・胆管癌、すい臓癌、肝癌、結腸癌、直腸癌、乳癌、骨肉腫、脂肪肉腫、血管肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、急性前骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、悪性リンパ腫および多発性骨髄腫からなる群から選択される、〔１０〕に記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の細胞透過性ペプチドは、単に細胞膜を通過するのではなく、細胞膜受容体を介し、細胞膜を透過して細胞質内に移行することができる。またそれのみならず、核へ移行することもできる。さらに正常細胞には影響が少なく、標的細胞におけるアポトーシスを誘導し、腫瘍等を抑制・縮小することから、選択毒性がより高い（標的細胞へ特異的に作用する）、細胞透過性ペプチドの提供を提供することができる。細胞核内へ、活性剤送達キャリアとしての細胞透過性ペプチドも提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、正常細胞とがん細胞に対する、実施例１のアポトーシス誘導作用を示すグラフである。
【図２Ａ】図２Ａは、正常細胞と各種がん細胞に対する、実施例２の細胞死誘導作用を示すグラフである。
【図２Ｂ−Ｅ】図２Ｂ〜Ｅは、がん細胞に対する、実施例の細胞死誘導作用を示すグラフである。
【図３】図３は、実施例２とＣＤ１３が結合していることを示す、免疫沈降の画像である。
【図４】図４は、実施例２をがん細胞に投与した、共焦点顕微鏡の画像写真である。
【図５Ａ−Ｂ】図５ＡおよびＢは、実施例２を正常細胞または各種がん細胞に投与した、共焦点顕微鏡の画像写真である。
【図６】図６は、対照または実施例２を投与した後の腫瘍の大きさと投与日数を示すグラフである
【図７】図７は、対照、比較例４または実施例３を投与した後の腫瘍の大きさと投与日数を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書で特に規定のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似したまたは均等な任意の方法および材料の使用が発明の態様において見出されるが、一部の好適な方法および材料を本明細書に記載するものとする。本発明は、記載される特定の方法、プロトコールおよび試薬に限定されるものではなく、当業者によりこれらが使用される文脈に依存して変更されてもよいことが理解されよう。また特に示さない限り、アミノ酸は左から右にアミノ基末端（Ｎ末端）→カルボキシル基末端（Ｃ末端）の向きで記述される。
【００１４】
本開示を通して、文脈によりそうでないことが要請されない限り、「〜を含む」、「〜を含む」、および「〜を含むこと」という語は、言明されるステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の包含を含意するが、他の任意のステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の除外は含意しないことが理解されるであろう。
【００１５】
本明細書で用いられている、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、明らかに別の指示がない限り複数形を含む。
【００１６】
本明細書で使用される「ペプチド」、「オリゴペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、ペプチド結合によって接合された少なくとも２アミノ酸残基のポリマーを指すために、可換的に使用される。この用語は、特定な長さのポリマーを意味せず、そのペプチドが組換え技術を使って生産されるか、化学合成または酵素合成を用い産生されるか、天然物であるかどうかまたは単離されたかどうかを、区別することは意図されない。
【００１７】
本明細書で使用される「アミノ酸」という用語は、その広い意味で、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に組み込まれうる任意の化合物および／または物質を指す。一部の態様において、アミノ酸は、一般構造Ｈ２Ｎ−Ｃ（Ｈ）（Ｒ）−ＣＯＯＨを有する。一部の態様において、アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸、合成アミノ酸、Ｄ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸である。
【００１８】
本明細書で使用される「細胞透過性ペプチド」（ＣＰＰ：ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）という用語は、互換的に使用され、「輸送ペプチド」または「担体ペプチド」とも呼ばれる。細胞透過性ペプチドは、限定されないが、生物学的応答を引き起こすまたはその機能に影響を及ぼしうる細胞に対し、細胞膜を横断し、細胞に侵入するまたは細胞内に移行する能力を有する公知またはそれが実証されうる可変長のペプチド鎖を指す。
【００１９】
本明細書で使用される「モチーフ」という用語は、特定の細胞の受容体分子によって認識されうる、または特定の構造または機能を有するペプチドを指す。
【００２０】
第一の態様において、本発明は、ＲＧＮ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ）、ＲＧＨ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ）、ＲＹＮ（Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ）、ＬＹＮ（Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ）、ＦＦＮ（Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ）およびＱＹＮ（Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ）からなる群から選択される第一のモチーフと、ＮＧＲ（Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）、ＮＧＱＲ（Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ）（配列番号４４）およびＮＧＹＲ（Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ）（配列番号４５）からなる群から選択される第二のモチーフとを含み、前記第一および第二のモチーフとの間にβストランド構造を有する、単離された細胞透過性ペプチドである。また本発明は、ＲＧＮ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ）またはＬＹＮ（Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ）のどちらかで表されるモチーフと、ＮＧＲ（Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）または配列番号４４のどちらかで表されるモチーフとを含み、前記それぞれのモチーフとの間にβストランド構造を有し、単離された細胞透過性ペプチドである。さらに本発明は、ＲＧＮ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ）モチーフおよびＮＧＲ（Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）モチーフを含み、前記ＲＧＮモチーフと前記ＮＧＲモチーフとの間にβストランド構造を有する、単離された細胞透過性ペプチドである。一態様において、第一または第二のモチーフは、糖タンパク質または細胞膜受容体に特異的に結合する能力があればよく、例えばβターン構造を構成するアミノ酸配列であればよい。
【００２１】
本発明の一部の態様において、βターン構造を構成するアミノ酸配列は、限定されないが、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４４、配列番号４５、ＬＹＮ（Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ）またはＬＹ（Ｌｅｕ−Ｔｙｒ）を有するペプチドであってよい。標的細胞の細胞質内または核内タンパク質に特異的に結合する能力があればよく、βストランド構造を構成するアミノ酸配列は、限定されないが、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号３８または配列番号４２を有するペプチドであってよい。
【００２２】
また一部の態様によれば、さらにＮ末端またはＣ末端にランダムコイル構造が付加されてもよい。ランダムコイル構造を構成するアミノ酸配列は、親水性を高めるアミノ酸配列であればよい。例えば、限定されないが、Ｎ末側のアミノ酸配列は、ＫＤ（Ｌｙｓ−Ａｓｐ）、ＴＤ（Ｔｈｒ−Ａｓｐ）、ＫＴ（Ｌｙｓ−Ｔｈｒ）、ＫＨ（Ｌｙｓ−Ｈｉｓ）、ＫＲ（Ｌｙｓ−Ａｒｇ）、ＫＮ（Ｌｙｓ−Ａｓｎ）またはＫＨＧ（Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ）を有するペプチドであってよい。Ｃ末側のアミノ酸配列は、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８または配列番号４３を有するペプチドであってよい。
【００２３】
本発明の一部の態様によれば、細胞透過性ペプチドの完全長が、４０個以下のアミノ酸で構成される、細胞透過性ペプチドであってよい。一部の態様において、細胞透過性ペプチドの完全長は、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０アミノ酸残基以下のペプチドであってよい。さらに任意で、細胞透過性ペプチドの細胞透過能力を抑制することなしに１、２、３、４または５個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されている断片、またはかかる断片の配列変異体を含むアミノ酸配列を有してもよい。また細胞透過性ペプチド中のアミノ酸の欠失、他のアミノ酸で置換または付加は、それぞれ独立して、または同時に起こってもよい。
【００２４】
一態様において、限定されないが、ＫＤＮＲＧＮＬＬＱＣＶＣＴＧＮＧＲＧＥＷＫＣ（配列番号１）、ＫＤＮＲＧＮＬＬＱＣＩＣＴＧＮＧＲＧＥＷＫＣ（配列番号２）、ＴＤＴＲＧＮＬＬＱＣＩＣＴＧＮＧＲＧＥＷＫＣ（配列番号３）、ＫＴＤＳＲＧＨＶＬＱＣＬＣＴＧＮＧＲＧＥＷＫＣ（配列番号４）、ＫＨＧＲＹＮＬＫＱＣＫＭＳＬＮＧＱＲＧＥＣＷＣ（配列番号５）、ＫＨＧＬＹＮＬＫＱＣＫＭＳＬＮＧＱＲＧＥＣＷＣ（配列番号６）、ＫＨＧＬＹＮＬＫＱＣＫＭＳＶＮＧＱＲＧＥＣＷＣ（配列番号７）、ＫＮＧＦＦＮＬＫＱＣＫＭＳＶＮＧＱＲＧＥＣＷＣ（配列番号８）、ＫＲＧＱＹＮＬＫＱＣＫＭＳＶＮＧＹＲＧＥＣＷＣ（配列番号９）およびＫＤＮＲＧＮＬＬＱＣＬＣＴＧＮＧＲＧＥＷＫＣ（配列番号３４）からなる群から選択される、アミノ酸配列を有する、単離された細胞透過性ペプチドであってよい。また一態様において、細胞透過性ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号３４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
【００２５】
また一部の態様において、限定されないが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号３４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、ペプチドまたは細胞透過性ペプチドであってよいし、または配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号３４に示されるアミノ酸配列からなる、ペプチドまたは細胞透過性ペプチドであってもよい。一態様において、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号３４からなる群から選択される、アミノ酸配列と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、ペプチドまたは細胞透過性ペプチドであってもよい。
【００２６】
本明細書で使用される「特異的に」という用語は、非特異的である糖タンパク質の親和性と比べ、特異的である糖タンパク質に対し有意に高い結合親和性（例えば、３、４、５、６、７、８、９または１０倍高い結合親和性）を有する糖タンパク質を指す。
【００２７】
本明細書で使用される「糖タンパク質」という用語は、タンパク質を構成するアミノ酸の一部に糖鎖が結合したものを指す。
【００２８】
本明細書で使用される「細胞膜受容体」という用語は、細胞膜に表面に存在するタンパク質（複合タンパク質を含む）だけでなく、細胞膜を貫通し細胞質中にもそのタンパク質の一部が存在するタンパク質をも指す。
【００２９】
本発明の別の態様によれば、本発明は、標的細胞の糖タンパク質または細胞膜受容体に特異的に結合する、細胞透過性ペプチドでよい。一部の態様において、細胞表面の糖タンパク質または細胞膜受容体は、細胞マーカーであってよく、例えば、限定されないが、細胞マーカーは、Ｔ細胞系、Ｂ細胞系、骨髄系、赤芽球系または巨核球系のマーカー、またはがん幹細胞マーカーであってよい。一態様において、細胞表面の糖タンパク質または細胞膜受容体は、ＣＤ３、ＣＤ９、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ６５、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ１６６、ＣＤ２７１、ＣＤ３２６、ＣＤ３３８またはＣＤ３４０であってよい。
【００３０】
本明細書において、「アポトーシスを誘導する」は、標的細胞を死滅させるまたは細胞死させると言い換えてよい。
【００３１】
本発明の別の態様によれば、細胞透過性ペプチドは、標的細胞におけるアポトーシスを誘導する。
【００３２】
本発明の別の態様において、標的細胞は、Ｔ細胞系、Ｂ細胞系、骨髄系、赤芽球系または巨核球系のマーカー、またはがん幹細胞マーカーを発現する細胞であってよい。また標的細胞は、例えば、限定されないが、ＣＤ３、ＣＤ９、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ６５、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ１６６、ＣＤ２７１、ＣＤ３２６、ＣＤ３３８またはＣＤ３４０を発現する細胞であってよい。標的細胞は、障害または状態に罹患しているそれらの細胞を指し、細胞増殖障害に罹患したこれらの細胞、限定されないが、例示的には、悪性腫瘍、すなわち、上皮細胞がんまたは癌腫、非上皮性がんまたは肉腫または血液がん（血液性細胞がん）などのがん細胞または腫瘍細胞であってよく、かかるがん細胞または腫瘍細胞は、肝細胞癌（肝細胞癌または胆管癌）、すい臓癌、胃癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、甲状腺癌または肺癌（小細胞肺癌または非小細胞性肺癌）、喉頭癌、咽頭癌または舌癌などの上皮細胞がんまたは癌腫、骨肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、線維肉腫、脂肪肉腫または血管肉腫などの肉腫（非上皮細胞がん）、または白血病、すなわち、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、急性前骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、悪性リンパ腫または多発性骨髄腫などの血液がんであってもよい。
【００３３】
本発明の別の態様によれば、薬理学的活性剤（活性剤）または薬剤が、細胞透過性ペプチドの末端部分に直接またはリンカーにより結合または付加されてよい。別の態様において、リンカーは、水溶性高分子であってよい。また一部の態様において、例えば限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または、アジド−アルキン付加環化反応を起こすアジ化物（Ａｚｉｄｅ）またはジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）などのクリックケミストリー試薬であってよい。一部の態様によれば、活性剤または薬剤が、細胞透過性ペプチドのアミノ基末端（Ｎ末端）部分および／またはカルボキシル基末端（Ｃ末端）部分に直接結合されてよい。
【００３４】
本発明の一部の態様によれば、活性剤または薬剤は、限定されないが、タンパク質、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ポリサッカリド、脂質、抗体、抗体断片、アプタマー、核酸（例えば、限定されないが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム）、小分子薬物、またはその他のいずれの生物学的活性物質であってよい。一部の態様において、活性剤または薬剤は、細胞内で作用してもよく、または標的細胞内部の成分に対して特異的であってよく、さらに、細胞毒性剤または細胞分裂阻害剤であってもよい。一態様において、活性剤または薬剤としては、細胞毒性放射性核種、化学毒素、またはタンパク質毒素であってもよい。また一態様において、活性剤または薬剤は、抗がん剤または抗腫瘍剤であってよく、例えば限定されないが、パクリタキセル、ドキソルビシン、ビンデシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メトトレキサート、マイトマイシンＣ、レチノイン酸、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、ドセタキセル、ブレオマイシン、フルオロウラシル、エピルビシン、アクチノマイシンＤ、ゲムシタビン、オテラシルカリウムまたは酸化鉄ナノ粒子であってもよい。
【００３５】
本発明の別の側面によれば、本発明は、ＲＧＮ、ＲＧＨ、ＲＹＮ、ＬＹＮ、ＦＦＮおよびＱＹＮからなる群から選択されるモチーフと、ＮＧＲ、配列番号４４および配列番号４５からなる群から選択されるモチーフとを含み、前記それぞれのモチーフとの間にβストランド構造を有する、細胞透過性ペプチドを有効成分として含有する、医薬または医薬組成物であってよい。また本発明は、ＲＧＮモチーフおよびＮＧＲモチーフを含み、前記ＲＧＮモチーフと前記ＮＧＲモチーフとの間にβストランド構造を有する、細胞透過性ペプチドを有効成分として含有する、医薬または医薬組成物であってよい。本発明の医薬または医薬組成物においては、有効成分の効果を妨げない限り、有効成分を他の任意成分と組み合わせてよい。一部の態様において、医薬組成物には、薬学的に許容し得る担体、賦形剤または希釈剤を含んでよく、さらに不活性希釈剤、平滑剤、緩衝剤、またはアジュバント、例えば、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤またはバッファーなどを含んでもよい。医薬組成物は、例えば、限定されないが、経口投与、非経口投与または直腸投与などであってよい。また本発明の医薬組成物は、固形形態（制限されずに、カプセル、錠剤、丸薬、顆粒、粉末または坐薬を含む）、または、液体形態（制限されずに、溶液、懸濁液またはエマルションを含む）であってよい。さらに、投与経路や薬物放出様式などに応じて、本発明の医薬または医薬組成物を、適切な材料、例えば時限崩壊性の材料等で被覆してよく、また、適切な薬物放出システムに組み込んでもよい。
【００３６】
本明細書に記載され本発明の医薬または医薬組成物は、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、限定することなく、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、腫瘍内、直腸、動脈内、門脈内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内および子宮内等の経路で投与してよく、各投与経路に適した剤形に製剤してもよい。かかる剤形および製剤方法は任意の公知のものを適宜採用することができる。
【００３７】
本明細書で使用される「処置」または「予防」という用語は、状態、病気、症状または望ましくないその副作用の抑制、軽減、遅延、緩和および除去を含む。
【００３８】
本発明の一部の態様において、本発明は、ＲＧＮ、ＲＧＨ、ＲＹＮ、ＬＹＮ、ＦＦＮおよびＱＹＮからなる群から選択されるモチーフと、ＮＧＲ、配列番号４４および配列番号４５からなる群から選択されるモチーフとを含み、前記それぞれのモチーフとの間にβストランド構造を有する、単離された細胞透過性ペプチドを有効成分として含有する、がんまたは腫瘍の処置または予防のための組成物、医薬組成物もしくは医薬である。また本発明は、ＲＧＮモチーフとＮＧＲモチーフとを含み、前記ＲＧＮモチーフと前記ＮＧＲモチーフとの間にβストランド構造を有する、がんまたは腫瘍の処置または予防のための細胞透過性ペプチドまたは組成物、医薬組成物もしくは医薬である。また限定されないが、例示的ながんまたは腫瘍は、肝細胞癌（肝細胞癌または胆管癌）、すい臓癌、胃癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、甲状腺癌、肺癌（小細胞肺癌または非小細胞性肺癌）、喉頭癌、咽頭癌または舌癌などの上皮細胞がんまたは癌腫、骨肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、線維肉腫、脂肪肉腫または血管肉腫などの肉腫（非上皮細胞がん）、または白血病、悪性リンパ腫または多発性骨髄腫などの血液がんであってよい。
【００３９】
本発明の一部の態様において、本発明は、がんまたは腫瘍の処置または予防のための、ＲＧＮ、ＲＧＨ、ＲＹＮ、ＬＹＮ、ＦＦＮおよびＱＹＮからなる群から選択されるモチーフと、ＮＧＲ、配列番号４４および配列番号４５からなる群から選択されるモチーフとを含み、前記それぞれのモチーフとの間にβストランド構造を有する、単離された細胞透過性ペプチドであってもよい。
【００４０】
本明細書で使用される「キャリア」という用語は、薬理学的活性剤（活性剤）または薬剤輸送体を言い、それ自身輸送される活性剤または薬剤と相互または補助作用を有していてよく、およびそれ自身何らかの活性を有していてもよい。
【００４１】
本発明の一部の態様において、本発明は、標的細胞における細胞内または核内への、薬理学的活性剤（活性剤）または薬剤送達のためのキャリアであって、前記キャリアが、ＲＧＮ、ＲＧＨ、ＲＹＮ、ＬＹＮ、ＦＦＮおよびＱＹＮからなる群から選択されるモチーフと、ＮＧＲ、配列番号４４および配列番号４５からなる群から選択されるモチーフとを含み、前記それぞれのモチーフとの間にβストランド構造を有する、単離された細胞透過性ペプチドである。本発明は、キャリアが、糖タンパク質または細胞膜受容体に特異的に結合してよい。また、ある態様において、本発明は、ＲＧＮモチーフとＮＧＲモチーフとを含み、前記ＲＧＮモチーフと前記ＮＧＲモチーフとの間にβストランド構造を有する、標的細胞における細胞内または核内への、薬理学的活性剤（活性剤）または薬剤送達のための細胞透過性ペプチドまたはキャリアペプチドもしくはキャリアであってよい。さらに、本発明のキャリアの標的細胞（または悪性腫瘍）が、上皮細胞がんまたは癌腫、肉腫または血液がんであってよく、例示的には、限定されないが上記した通りである。また細胞透過性ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号３４からなる群から選択される、アミノ酸配列であってよく、例示的な、標的細胞の糖たんぱく質または細胞膜受容体、標的細胞、およびキャリアに付加し得る活性剤または薬剤などは上記した通りである。
【００４２】
本発明の一部の態様において、本発明は、ＲＧＮ、ＲＧＨ、ＲＹＮ、ＬＹＮ、ＦＦＮおよびＱＹＮからなる群から選択されるモチーフと、ＮＧＲ、配列番号４４および配列番号４５からなる群から選択されるモチーフとを含み、前記それぞれのモチーフとの間にβストランド構造を有する、単離された細胞透過性ペプチドを、標的細胞における細胞内または核内への、薬理学的活性剤（活性剤）または薬剤送達のためのまたはキャリアペプチドもしくはキャリアとして含有する、がんまたは腫瘍の処置または予防のための医薬または医薬組成物であってよい。また限定されないが、例示的なアミノ酸配列、標的細胞の糖タンパク質または細胞膜受容体、標的細胞（または悪性腫瘍）、および活性剤または薬剤などは上記した通りである。さらに上記組成物に含まれてよい、薬学的に許容し得る担体、賦形剤または希釈剤、または不活性希釈剤などは、限定されないが、上記した通りである。
【００４３】
本発明のまた別の側面によれば、本発明は、がんまたは腫瘍の処置または予防のための医薬または医薬組成物の製造における、ＲＧＮ、ＲＧＨ、ＲＹＮ、ＬＹＮ、ＦＦＮおよびＱＹＮからなる群から選択されるモチーフと、ＮＧＲ、配列番号４４および配列番号４５からなる群から選択されるモチーフとを含み、前記それぞれのモチーフとの間にβストランド構造を有する、細胞透過性ペプチド、または薬理学的活性剤（活性剤）または薬剤送達のためのキャリアペプチドもしくはキャリアの使用であってよい。また本発明は、がんまたは腫瘍の処置または予防のための医薬または医薬組成物の製造における、ＲＧＮモチーフとＮＧＲモチーフとを含み、前記ＲＧＮモチーフと前記ＮＧＲモチーフとの間にβストランド構造を有する、細胞透過性ペプチドの使用であってよい。また限定されないが、例示的ながんまたは腫瘍、医薬または医薬組成物の用途、細胞透過性ペプチドまたは薬理学的活性剤（活性剤）または薬剤送達のためのキャリアペプチドもしくはキャリアが有してよいアミノ酸配列、標的細胞の糖たんぱく質または細胞膜受容体、標的細胞（または悪性腫瘍）、および活性剤または薬剤、含んでよい薬学的に許容し得る担体、賦形剤または希釈剤、さらに不活性希釈剤、平滑剤または緩衝剤などは、上記した通りである。
【００４４】
本発明のさらなる別の側面によれば、本発明は、対象において、がんまたは腫瘍を処置または予防するための方法であって、がんまたは腫瘍を有する対象へ、治療的に有効量の、ＲＧＮ、ＲＧＨ、ＲＹＮ、ＬＹＮ、ＦＦＮおよびＱＹＮからなる群から選択されるモチーフと、ＮＧＲ、配列番号４４および配列番号４５からなる群から選択されるモチーフとを含み、前記それぞれのモチーフとの間にβストランド構造を有する、細胞透過性ペプチドまたは、薬理学的活性剤（活性剤）または薬剤送達のためのキャリアペプチドもしくはキャリアを投与することを含む、前記方法である。また本発明は、対象において、がんまたは腫瘍を処置または予防するための方法であって、がんまたは腫瘍を有する対象へ、治療的に有効量の、ＲＧＮモチーフとＮＧＲモチーフとを含み、前記ＲＧＮモチーフと前記ＮＧＲモチーフとの間にβストランド構造を有する、細胞透過性ペプチドを投与することを含む、前記方法である。一態様によれば、対象が、ヒトまたは、サル、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、トリ、カメ、スッポンまたはゼブラフィッシュなどの非ヒト哺乳類対象であってよい。また限定されないが、例示的ながんまたは腫瘍は、上記した通りである。
【００４５】
本明細書に記載される本発明の各種方法における有効量とは、例えば、がんに関しては、がん細胞の死滅を促進し、または、がん細胞を死滅させる量であってよく、がん細胞の増殖に関しては、細胞の増殖を抑制、または、細胞増殖を遅延する量であってよい。疾患の処置に関しては、疾患の症状を低減し、または疾患の進行を遅延もしくは停止する量であってよく、疾患を抑制し、または治癒する量でもある。かかる量は、培養細胞などを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験や、マウス、ラット、イヌ、ブタまたはサルなどのモデル動物における試験により適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。また、本発明の処置方法に用いる薬物の用量は当業者に公知であるか、または、上記の試験等により適宜決定することができる。本明細書に記載される本発明の処置方法において投与する有効成分の具体的な用量は、処置を要する対象に関する種々の条件、例えば、がんの状態やステージ、症状の重篤度、対象の一般健康状態、年齢、体重、対象の性別、食事、投与の時期および頻度、併用している医薬、治療への反応性、剤形、および治療に対するコンプライアンスなどを考慮して決定され得る。
【００４６】
また一部の態様において、本発明は、少なくとも４、３、２または１日ごと、または１日多数回（すなわち１日２、３、４回または５回以上）で、経口、門脈内、静脈内、筋肉内、皮下、経鼻、経肺、経皮、局所、腫瘍内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内、子宮内、舌下または直腸投与で、約２．５、５、７．５、１０．０、１２．５または１５ｍｇ／ｋｇ、または約２．５〜１５ｍｇ／ｋｇの範囲内で対象に投与されてよい。また本発明の１日総投与量は、限定されずに、例えば、約１μｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／体重ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／体重ｋｇ、約１００μg／ｋｇ〜約１０ｍｇ／体重ｋｇなどであってよい。例示的ながんまたは腫瘍、細胞透過性ペプチドまたは薬理学的活性剤（活性剤）または薬剤送達のためのキャリアペプチドもしくはキャリアが有してよいアミノ酸配列、標的細胞（または悪性腫瘍）などは、上記した通りである。
【実施例】
【００４７】
本発明を以下の例でさらに詳細に説明するが、これらは例示に過ぎず、本発明を決して限定するものではない。【００４８】
図１、２Ａ−Ｅ、６および７において、有意差検定は、両側ｔ−検定を行った。５％または１％水準で有意差が認められた場合、それぞれ＊または＊＊印で示した。【００４９】
ペプチドの作成
本発明で用いるペプチドは、化学的に合成することもできるし、遺伝子工学的に生産することもできる。本発明で用いるペプチドまたは薬剤を付加したペプチドは、当業者に公知の一般法に従って調製され得る。なおペプチドは、株式会社医学生物学研究所（日本）またはジェンスクリプトジャパン株式会社（日本）に委託により作成した。合成方法を簡単に述べると、Ｈ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−２−クロトトリチルクロライド（ＣＴＣ）樹脂（Ｍｅｒｃｋ）を、ＤＭＦで膨潤した。次に、Ｆｍｏｃ−アミノ酸（４当量）、ＤＩＣ（４当量）およびＨＯＢｔ（４当量）の条件下で１時間撹拌し、カップリング反応により、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）、Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｇｌｙ、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｇｌｙ、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｖａｌ、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｌｅｕ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｙ、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）およびＬｙｓ（Ｂｏｃ）をそれぞれ順次導入した。さらに樹脂を２０％ピペリジン／ＤＭＦで処理した後、メタノールで洗浄および乾燥し、ペプチド−樹脂を得た。得られたペプチド−樹脂１００ｍｇを、３ｍＬのクリーベイジカクテル（ＴＦＡ／１，２ーエタンジチオール／チオアニソール／フェノール／Ｈ２Ｏ／トリイソプロピルシラン＝６８．５／１０／１０／５／３．５／１Ｖ／Ｖ）で、３０℃で４時間処理した。さらに、これに冷ジエチルエーテルを添加し、室温で乾燥させた。続いて、得られたペプチドを、逆相−ＨＰＬＣにより、カラム：Ｃ１８、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、溶出：Ａ液（１００％水、０．１％ＴＦＡ）とＢ液（１００％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ）の直線的勾配および検出：２１０ｎｍの条件下で、分取精製したペプチドを実施例１（配列番号１）（株式会社医学生物学研究所）とした。【００５０】
また上記ペプチド−樹脂に、Ａｈｘリンカーを介してＦＩＴＣを結合させ、上記同様に精製したペプチドを実施例２（配列番号３２）（ジェンスクリプトジャパン株式会社）とした。【００５１】
さらに上記ペプチド−樹脂を、ＤＭＦ溶媒中において、Ａｚｉｄｅ−ＰＥＧ４−ＮＨＳ（ＣＬＩＣＫ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＴＯＯＬＳ）を当量で混合した。さらに、この溶液に１０倍当量のＤＩＥＡを加え、室温で１時間撹拌し、得られたペプチド（Ｍ．Ｗ．２７２５．０９、９５％、１００．５ｍｇ、ＴＦＡ  ｆｒｅｅ）（株式会社ピーエイチジャパン）を、滅菌Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で、５０ｍｇ／ｍｌ（１７．５ｍＭ）に調整した。滅菌したＭｉｌｌｉ−Ｑ水で溶解したＤｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ（Ｄｏｘ）（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ社）４ｍｌ（１１ｍｇ／ｍｌ）に１ｍｌの０．５Ｍリン酸バッファー（ｐＨ５．５）を添加した後、２０ｍｌの滅菌したＭｉｌｌｉ−Ｑ水を添加し、これをＤｏｘ溶解液とした。その一方で、ＤＭＳＯで溶解したＤＢＣＯ−ＰＥＧ５−ＮＨＳ  Ｅｓｔｅｒ（Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｏｏｌｓ、ＡＺ、ＵＳＡ）溶液（２５ｍｇ/ｍｌ）０．５ｍｌと、７．５ｍｌのＤｏｘ溶解液を室温で３時間混和した。反応液を、Ａバッファー（０．１％（Ｖ／Ｖ）酢酸（富士フィルム和光純薬））で平衡化した１ｍｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  １５  ＲＰＣカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に吸着させた。その後ＡバッファーとＢバッファー（０．１％（Ｖ／Ｖ）酢酸を含むアセトニトリル（ＡＮＣ）（富士フィルム和光純薬）９０：水１０）の３０〜４４％線状勾配で、１ｍｌ／ｍｉｎの流速で、Ｄｏｘ−ＰＥＧ５−ＤＢＣＯ画分を分画した。同時に２１０ｎｍから５００ｎｍまでの吸光度をモニタリングした。分取した上記画分を、遠心式濃縮機で濃縮し、ＤＭＳＯで６７ｍｇ／ｍｌ（５２．６ｍＭ）の濃度になるように溶解した。上記の得られたペプチドと調整したＤｏｘ−ＰＥＧ５−ＤＢＣＯ溶液を、モル比１：１の割合で、ＤＭＳＯ中で室温３時間混和した。得られた反応溶液を上記カラムに吸着させた後、ＡバッファーとＢバッファーを用い、２０〜４５％線状勾配で、上記と同様に分画した。さらに上記同様に濃縮した後、滅菌Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で溶解し、これを実施例３（配列番号３３）とした。【００５２】
また上記ＣＴＣ樹脂にＬｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）、Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｇｌｙ、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｇｌｙ、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、ＶａｌおよびＣｙｓ（Ｔｒｔ）を、実施例１と同様の手順で順次導入し、分取精製したペプチドを比較例１（配列番号２９）（株式会社医学生物学研究所）とした。【００５３】
さらに上記ＣＴＣ樹脂にＡｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｇｌｙ、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）およびＣｙｓ（Ｔｒｔ）を、実施例１と同様の手順で順次導入した。次に、得られたペプチド−樹脂を、ペプチド濃度１ｍｇ/ｍｌ下で、水：ＤＭＳＯ＝１：１の溶媒で２４時間の酸化反応した後、上記同様、分取精製したペプチドを比較例３（配列番号３１）（株式会社医学生物学研究所）とした。【００５４】
また上記ＣＴＣ樹脂にＬｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）、Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｇｌｙ、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｇｌｙ、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｌｅｕ、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｌｅｕ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｙ、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）およびＬｙｓ（Ｂｏｃ）を、実施例１と同様の手順で順次導入し、分取精製したペプチドを得た（配列番号３４）。また、結果として得られたペプチド−樹脂を、Ａｈｘリンカーを介してＦＩＴＣを結合させ、分取精製したペプチドを実施例４（配列番号３５）（ジェンスクリプトジャパン株式会社）とした。【００５５】
さらに上記ＣＴＣ樹脂にＬｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）、Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ｇｌｙ、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｇｌｙ、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｉｌｅ（Ｂｏｃ）、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｌｅｕ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｙ、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）およびＬｙｓ（Ｂｏｃ）を、実施例１と同様の手順で順次導入し、分取精製したペプチドを得た（配列番号２）。また、結果として得られたペプチド−樹脂を、Ａｈｘリンカーを介してＦＩＴＣを結合させ、分取精製したペプチドを実施例５（配列番号３６）（ジェンスクリプトジャパン株式会社）とした。【００５６】
また上記ＣＴＣ樹脂にＴｒｐ（Ｂｏｃ）、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ｇｌｙ、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｙ、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｌｅｕ、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）およびＬｙｓ（Ｂｏｃ）を、実施例１と同様の手順で順次導入し、分取精製したペプチドを得た（配列番号６）。また、結果として得られたペプチド−樹脂を、Ａｈｘリンカーを介してＦＩＴＣを結合させ、分取精製したペプチドを実施例６（配列番号３７）（ジェンスクリプトジャパン株式会社）とした。【００５７】
Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｗａｎｇ樹脂（Ｍｅｒｃｋ）を用い、５％のピペリジン含有のＤＭＦ（０．１％ＨＯＢｔ）でＮ末端Ｆｍｏｃを脱保護した後、Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ｇｌｙ、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｇｌｙ、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）およびＧｌｙを、実施例１と同様の手順で順次導入し、分取精製したペプチドを比較例２（配列番号３０）（株式会社医学生物学研究所）とした。【００５８】
実施例１〜６および比較例１〜３のアミノ酸配列一次構造情報は、マトリクス支援レーザー励起イオン化法スペクトルで確認し、精製度は逆相−ＨＰＬＣ（Ｃ１８）で解析し、９８％以上であることを確認した。【００５９】
細胞培養
ミトコンドリア膜電位の変化測定試験では、ヒト線維肉腫由来ＨＴ−１０８０細胞（ＨＴ−１０８０細胞、ＪＣＲＢ細胞バンク）を、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのがん細胞の細胞死誘導試験および実施例２の核移行試験では、ＨＴ−１０８０細胞、ヒト骨肉腫細胞株Ｈｏｓ細胞（Ｈｏｓ細胞、ＪＣＲＢ細胞バンク）、ヒト組織球性リンパ腫・マクロファージＵ９３７細胞（Ｕ９３７細胞、ＪＣＲＢ細胞バンク）、ヒト骨髄性白血病細胞ＨＬ−６０細胞（ＨＬ−６０細胞、ＪＣＲＢ細胞バンク）、急性単球性白血病ＴＨＰ−１細胞（ＴＨＰ−１細胞、ＪＣＲＢ細胞バンク）、ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞Ａ５４９細胞（Ａ５４９細胞、東北大学加齢医学研究所附属医用細胞資源センター）、ヒト膵臓がん細胞ＭＩＡ  Ｐａｃａ２細胞（ＭＩＡ  Ｐａｃａ２細胞、東北大学加齢医学研究所附属医用細胞資源センター）および高分化型ヒト肝癌由来細胞株ＨｕＨ７細胞（ＨｕＨ７細胞、東北大学加齢医学研究所附属医用細胞資源センター）を、がん細胞として用いた、また、対照として正常ヒト歯肉線維芽細胞Ｇｉｎ−１（Ｇｉｎ−１細胞、（株）ＤＳファーマバイオメディカル）を用いた。上記細胞を、それぞれ９６穴培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ）に５０００個／１００μｌで播種し、以下の試験に供した。【００６０】
がんマウスの作成
ＨＴ−１０８０細胞（１×１０７個／２００μｌ）を５週齢ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（日本チャールス・リバー）の背中へ皮下移植した。さらに、移植後の腫瘍が３０〜６０ｍｍ３に達したことを確認した後、これを以下の試験に供した。【００６１】
試験例１  ミトコンドリア膜電位の変化測定試験
実施例１、比較例１〜３の合成ペプチドをそれぞれ細胞に添加して、血清添加培地（α−ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）で培養し、またコントロールとして血清添加培地（α−ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）のみで培養した。７日間培養後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で一回洗浄し、２μＭのＪＣ−１で、３７℃、５％ＣＯ２細胞培養器中で３０分間染色した。さらにＰＢＳで一回洗浄し、ＰＢＳを１００μｌ添加し、共焦点レーザースキャン顕微鏡ＬＳＭ８００（Ｚｅｉｓｓ）で画像を取得した後、ＩｍａｇｅＪで解析した。【００６２】
図１は、縦軸にアポトーシス率（ＪＣ１染色グリーン細胞数／全細胞数×１００（％））の平均値±ＳＤ（標準偏差）、横軸に、実施例１、比較例１、比較例２および比較例３を示す。実施例１の左中央右のバーにおいて、左側のバーは２５μｇ／ｍｌ、中央のバーは５０μｇ／ｍｌ、右側のバーは１００μｇ／ｍｌのそれぞれの添加したペプチド濃度を示す。比較例１、比較例２および比較例３の左右のバーにおいて、左側のバーは５０μｇ／ｍｌ、右側のバーは１００μｇ／ｍｌのそれぞれの添加したペプチド濃度を示す。実施例１で刺激したときのみ、ＨＴ−１０８０細胞に対してアポトーシス率の上昇が認められた。その一方で、比較例１、比較例２、および比較例３では、ＨＴ−１０８０細胞のアポトーシス率の上昇は観察されなかった。またＧｉｎ−１細胞へ、実施例１の５０μｇ／ｍｌ投与では、アポトーシス率の上昇は観察されなかった。本発明の細胞透過性ペプチドが、正常細胞には影響を及ぼさないが、がん細胞においてアポトーシス誘導作用を有することが実証された。【００６３】
試験例２Ａ  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのがん細胞の細胞死誘導試験
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのがん細胞の細胞死誘導試験をするために、配列番号１のペプチドをＦＩＴＣでラベルしたペプチド（実施例２）用いた。実施例２を１００μｌ添加し、さらに１０％ＦＢＳを加え、血清添加培地（Ａｌｐｈａ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ＭＥＭ（α−ＭＥＭ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）＋１０％ＦＢＳ）２００μｌの条件下で９日間、培養した試験例を作成した。さらに実施例２添加培地を７日間ごとに全量交換し２１日間培養した試験例も作成した。また対照としは血清添加培地（α−ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）のみで培養した細胞を用いた。培養終了後、上清を除きＰＢＳで一回洗浄、生細胞染色用蛍光色素Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ（同仁化学研究所）（最終濃度０．１μｇ／ｍｌ）と死細胞染色用蛍光色素Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）（同仁化学研究所）（最終濃度０．３μｇ／ｍｌ）添加したＰＢＳ中で、３７℃、５％ＣＯ２細胞培養器内で３０分間染色した。その後、共焦点レーザースキャン顕微鏡ＬＳＭ８００で、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭとＰＩで生細胞と死細胞を染め分けた画像を取得した。次に、ＩｍａｇｅＪを用い、全細胞数に対する死細胞の比率の解析を行った。【００６４】
結果は、死細胞率（ＰＩ染色赤色細胞数／全細胞数×１００（％））の平均値±ＳＤ（標準偏差）で示された。図２Ａは、縦軸に各細胞に対する実施例２（５０μｇ／ｍｌ）で９日間培養した時点の死細胞率、横軸に各種細胞を示す。Ｇｉｎ−１細胞に対する死細胞率の上昇は観察されなかった。一方、ＨＴ−１０８０細胞、Ｕ９３７細胞、ＨＬ−６０細胞およびＨｏｓ細胞に対する死細胞率の上昇は１％水準で有意差が認められた。ＴＨＰ−１細胞に対しては５％水準で有意差が認められた。培養２１日目ＨＴ−１０８０細胞へ、６．２５および１２．５μｇ／ｍｌの実施例２投与では、約７５％以上の死細胞率の上昇がそれぞれ観察された。さらに、２５、５０および１００μｇ／ｍｌ投与結果は９５％以上の死細胞率の上昇が認められた（図示せず）。本発明の細胞透過性ペプチドは、正常細胞においては細胞死誘導作用を有さないが、がん細胞においては細胞死誘導作用を有することから、非常に高い選択毒性が実証された。【００６５】
試験例２Ｂ  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのがん細胞の細胞死誘導試験
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのがん細胞の細胞死誘導試験をするために、配列番号３４のペプチドをＦＩＴＣでラベルしたペプチドを実施例４、配列番号２のペプチドをＦＩＴＣでラベルしたペプチドを実施例５、および配列番号６のペプチドをＦＩＴＣでラベルしたペプチドを実施例６として用いた。
実施例２および４〜６をそれぞれ１２．５、２５、５０および１００μｇ／ｍｌとなるよう調整し、上記試験例２Ａと同じ方法でＨＴ−１０８０細胞を用い、９日間の投与試験を行った。細胞染色および、その後の全細胞数に対する死細胞の比率解析は上記試験例２Ａと同様に行った。【００６６】
図２Ｂは、縦軸にＨＴ１０８０細胞に対する実施例２または実施例４〜６（それぞれ、１２．５、２５、５０および１００μｇ／ｍｌ）で９日間培養した時点の死細胞率、横軸に各実施例およびその投与濃度、または対照を示す。ＨＴ−１０８０細胞に対する死細胞率の上昇は１％水準で有意差が認められた。実施例２の５０および１００μｇ／ｍｌ投与では、少なくとも６０％以上を示した。実施例４および５の同様の投与濃度では、それぞれ少なくとも６０％および５０％以上の死細胞率を示した。また投与濃度が、２５および１２．５μｇ／ｍｌである、実施例２、４および５では、それぞれおよそ５０％〜４０％の死細胞率を示した。とりわけ実施例６は、その投与濃度が１２．５μｇ／ｍｌであっても、１００μｇ／ｍｌの投与濃度とほぼ同等な死細胞率を示し、約３５％の死細胞率を維持した。本実験によって、実施例２、４〜６が、１２．５μｇ／ｍｌの投与濃度でも有効であることが示された。【００６７】
試験例２Ｃ〜Ｅ  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのがん細胞の細胞死誘導試験
実施例２の投与量を５０μｇ／ｍｌになるよう調整し、上記試験例２Ａと同じ方法でＡ５４９細胞、ＭＩＡ  Ｐａｃａ２細胞またはＨｕＨ７細胞を用い、９日、１６日または２３日間の投与試験を行った。細胞染色および、その後の全細胞数に対する死細胞の比率解析は上記試験例２Ａと同様に行った。【００６８】
図２Ｃ〜Ｅは、縦軸に各種細胞に対する実施例２（５０μｇ／ｍｌ）で９、１６日または２３日間培養した時点の死細胞率を、横軸に実施例２または対照を示す。各いずれの細胞においても死細胞率の上昇は、１％水準で有意差が認められた。図２Ｃに示されるＡ５４９細胞への投与試験では、培養９日目では、約５０％近く、１６日目では、約６０％近く、２１日目では、約８０％以上の死細胞率がそれぞれ確認された。また図２Ｄに示されるＭＩＡ  Ｐａｃａ２細胞への投与試験では、９日目では約１０％程度の死細胞率であったが、１６日目では約５０％程度、２３日目では、約８０％の死細胞率を実証した。これは、有効手立ての少ないすい臓癌に対し、本発明が有効であることを示す。またこれらのがん細胞に対し、日を追うごとに実施例２の効果があることを示す。これに対し、図２Ｅに示されるＨｕＨ７細胞への投与試験では、投与９日目と１６および２３日目の効果がほぼ同じであり、投与初期から、がん細胞死滅効果が実証された。これにより、本発明の上皮細胞がんへの有効性が確認された。【００６９】
試験例３  免疫沈降による結合タンパク質解析試験
実施例２（８０μｇ／４００μｌ）をＨＴ１０８０細胞（４０００万個）に４℃で２時間作用させた。次いでＰＢＳで洗浄後、遠心した細胞を、Ｈａｌｔ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ＆  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｕｓｅ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ，ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（１０μｌ）添加したＩＰ  Ｌｙｓｉｓ／Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ  １０００μｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で４℃、５分間の条件で溶解した。４℃で１０分間遠心分離し、上清を採取した。タンパク質１ｍｇとした上清に、８０μｌのＡ／Ｇアガロースを加え、４℃で１時間撹拌し、さらに１分間遠心分離し、これを前処理溶解液とした。前処理溶解液（１ｍｇ／６００μｌ）に、ＩｇＧ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉ−Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＦＩＴＣ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）１０μｇ、またはＭｏｕｓｅ  ＩｇＧ  Ｉｓｏｔｙｐｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）１０μｇをそれぞれ添加して、４℃で一晩振とうした。その後、２０μｌのＡ／Ｇアガロースを加え、４℃で２時間振とうした。上記洗浄バッファーで３回洗浄後、Ａ／Ｇアガロースに２×Ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ｌａｎｅ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）２０μｌを添加した。これを１００℃で５分間加熱し、１分間遠心分離した後、サンプルを回収した。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（８％）にロードした。ウェスタンブロティングでは、１次抗体として、ＰＥ標識ヒトＣＤ１３抗体（Ｃｌｏｎｅ：ＷＭ−１５  Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＩｇＧ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉ−Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＦＩＴＣ）またはＨＲＰ−標識抗ｔｕｂｕｌｉｎ抗体（ＭＢＬライフサイエンス）、２次抗体としてＨＲＰ−標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｂｃａｍ）を用いた。【００７０】
図３の左のレーンには、免疫沈降に用いた溶解液の１０％をロードした。中央のレーンには、ＩｇＧ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉ−Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  （ＦＩＴＣ）で免疫沈降したサンプルをロードした。右のレーンには、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  Ｉｓｏｔｙｐｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌで免疫沈降したサンプルをロードした。右のレーンではＣＤ１３が検出されなかったが、中央のレーンでは、ＣＤ１３が検出された。すなわち、実施例２が細胞膜上のＣＤ１３に特異的に結合することが証明された。【００７１】
試験例４  実施例２における、細胞膜への結合試験
ＰＥ標識ヒトＣＤ１３抗体（Ｃｌｏｎｅ：ＷＭ−１５  Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）（１μｇ／１００μｌ）と実施例２（１μｇ／１００μｌ）を各細胞（５０万個／１００μｌ）に添加し、４℃で１時間染色した。ＰＢＳで洗浄した後、ＨＴ１０８０細胞の蛍光強度を基準に各細胞のＣＤ１３発現と実施例２の結合部位を、共焦点レーザースキャン顕微鏡ＬＳＭ８００で観察した。ＨＴ１０８０細胞とＧｉｎ−１細胞には、最もＣＤ１３（赤色）発現が強く、実施例２（緑色）の発光も強かった。さらに重ね合わせ写真では、強い黄色が観察されたことから、実施例２とＣＤ１３は共局在していることが観察された。さらに、ＣＤ１３の発現がＵ９３７細胞、ＨＬ−６０細胞、ＴＨＰ−１細胞およびＨｏｓ細胞でも上記と同様の現象が認められた（図示せず）。【００７２】
試験例５Ａ  がん細胞における、実施例２の核移行試験
実施例２を最終的濃度５０μｇ／ｍｌになるように、血清添加培地（α−ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）２００μｌ下で、３日または９日間培養した。なお培養３日間では、細胞死が認められなかった。一方で、培養９日間では細胞死が認められたため、上記細胞培養日数で試験した。上記それぞれの細胞をはがして、Ｃｅｌｌｖｉｅｗガラスボトムシャーレ（３５×１０ｍｍ）（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に移した。培養３日目の細胞は、１０％ホルマリンエタノールで固定した後、ＤＡＰＩ染色した。培養９日目の細胞は、固定せずに、ＤＡＰＩ染色した。さらに経時的に共焦点レーザースキャン顕微鏡ＬＳＭ８００で観察した。【００７３】
図４は、ＨＴ１０８０細胞培養３日目および９日目における、実施例２（緑色）、ＤＡＰＩ（青色）、実施例２（緑色）とＤＡＰＩ（青色）の重ね合わせ、および微分干渉像の写真である。３日目のＨＴ１０８０細胞では、実施例２（緑色）が核染色のＤＡＰＩ（青色）の周りの細胞質に存在していた。しかし、９日目のＨＴ１０８０細胞中の実施例２とＤＡＰＩ染色の重ね合わせの画像の色が水色を呈することから、実施例２は核に移行し染色体ＤＮＡと結合していることが確認された。【００７４】
さらにＧｉｎ−１細胞または上記がん細胞に、５０μｇ／ｍｌの濃度で実施例２を添加し９日間培養後、ＤＡＰＩ染色後、共焦点レーザースキャン顕微鏡ＬＳＭ８００でＺスキャンを行った。図５Ａは、Ｇｉｎ−１細胞または上記がん細胞における実施例２（緑色）とＤＡＰＩ（青色）の重ね合わせた、ＸＹ、ＸＺおよびＹＺ断面のそれぞれの写真である。Ｇｉｎ−１細胞の核は、ＤＡＰＩによって染色されず、実施例２が、細胞質に留まっていることがＸＺ断面、ＹＺ断面からも確認された。一方、Ｕ９３７細胞、ＨＬ−６０細胞、ＴＨＰ−１細胞およびＨｏｓ細胞は、実施例２とＤＡＰＩ染色の重ね合わせの画像の色が水色を呈した。さらにそれぞれの細胞のＸＺ断面，ＹＺ断面から実施例２が核に移行し、染色体ＤＮＡと結合していたことが確認された。【００７５】
同様に、Ａ５４９細胞、ＭＩＡ  Ｐａｃａ２細胞およびＨｕＨ７細胞でも５０μｇ／ｍｌの濃度で実施例２を添加し２３日間培養後、ＤＡＰＩ染色後、共焦点レーザースキャン顕微鏡ＬＳＭ８００でＺスキャンを行った。図５Ｂは、各種がん細胞における実施例２（緑色）とＤＡＰＩ（青色）の重ね合わせた、ＸＹ、ＸＺおよびＹＺ断面のそれぞれの写真である。結果は、実施例２とＤＡＰＩ染色の重ね合わせの画像の色が水色を呈した。またそれぞれの細胞のＸＺ断面、ＹＺ断面から、実施例２が核に移行し、染色体ＤＮＡと結合していたことが確認された。【００７６】
試験例５Ｂ  実施例２が結合する細胞質内および核内タンパク質の解析試験
実施例２を最終的濃度５０μｇ／ｍｌになるように、血清添加培地（α−ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）４ｍｌに調整し、ＨＴ１０８０細胞（２０００万個）を、３７℃、５％ＣＯ２細胞培養器中で５日間培養した。ＰＢＳで洗浄、細胞を回収後、ＮＥ−ＰＥＲ  Ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  （ＰＩＥＲＣＥ）で、細胞質と核からタンパク質をそれぞれ回収した。細胞質および核のタンパク質１ｍｇに、８０μｌのＡ／Ｇアガロースをそれぞれ加え、４℃で１時間撹拌し試料の前処理を行った。前処理溶解液（１ｍｇ／６００μｌ）に、ＩｇＧ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉ−Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＦＩＴＣ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）１０μｇを添加して、４℃で一晩振とうした。その後、２０μｌのＡ／Ｇアガロースを加え、４℃で２時間振とうした。洗浄バッファーで３回洗浄後、Ａ／ＧアガロースにＥｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  （Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）５０μｌを添加しサンプルを回収、Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）５μｌを添加しｐＨを中性に調整し、これを実施例２に結合するタンパク質同定のための試料として用いた。Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｅｖｏ  Ｇ２−ＸＳ  Ｑｔｏｆ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｅｖｏ  Ｇ２−ＸＳ）を用い、ショットガン解析により網羅的にタンパク質を同定した。【００７７】
下表は、検出されたタンパク質から免疫沈降に用いた抗体と実施例２を除いた、細胞質および核から同定されたタンパク質を、アクセッション番号、タンパク質名称、検出されたペプチドの同定数、特異的なペプチドの同定数、信頼性スコア、細胞質内タンパク質量（ｆｍｏｌ）および核内タンパク質量（ｆｍｏｌ）で示した。【００７８】
【表１】
0006932340.tif 000002
【００７９】
解析の結果、リンカー・ヒストンＨ１―３、コア・ヒストン（Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３−２、Ｈ４）および、４０Ｓを構成する２２種類および６０Ｓを構成する２８種類のリボソームタンパク質が、それぞれ同定された。さらに４０Ｓおよび６０Ｓリボゾームタンパク質が細胞質内より、核内で多く検出された。これは、実施例２が、核に移行後、核内にも存在する４０Ｓおよび６０Ｓリボゾームタンパク質に結合することを示す。上記解析により、実施例２が核内に移行し得ることが、生化学的にも実証された。【００８０】
試験例６  がんマウスにおける、実施例２のがん細胞増殖抑制およびアポトーシス試験
実施例２を無菌水で溶解し、２倍濃度α−ＭＥＭ（グルタミンおよび抗生物質を含まない）を加え、２００μｇ／２００μｌへ調整した。これを、がんマウスの腹腔内に１０ｍｇ／ｋｇになるように３日ごとに投与した。対照投与群には、２００μｌの１倍濃度α−ＭＥＭを用い、これをがんマウスの腹腔内に３日ごとに投与した。３日ごとにＤＲＥＴＥＣ体重計（株式会社ドリテック、Ｊａｐａｎ）で体重を測定し、ノギス（最大１５０ｍｍ、最小０．０５ｍｍ）（ＭＩＴＵＴＯＹＯ、Ｊａｐａｎ）で腫瘍の大きさ（推定体積（短径×長径×高さ×π／６ｍｍ３））を測定した。【００８１】
図６に実施例２投与群（Ｎ=６）と対照投与群（Ｎ＝６）の腫瘍の大きさの変遷をグラフに表した。縦軸は腫瘍の大きさの平均値±ＳＤ（標準偏差）、横軸は投与後の日数を示す。対照投与群と比べ、１２日目から２４日目まで実施例２投与群は、腫瘍の増殖抑制が１％水準で有意差が認められた。対照投与群では、２４日目で１５００ｍｍ３を超えた。その一方で、実施例２を用いたマウスでは、約６００ｍｍ３で、その腫瘍成長抑制効果が確認された。さらにその後、３３日まで、腫瘍の縮小傾向が確認された。【００８２】
試験例７  がんマウスにおける、実施例３の抗がん剤送達試験
実施例３を５ｍｇ／ｋｇ、および比較例４（Ｄｏｘ）を１．２ｍｇ／ｋｇにそれぞれなるように、実施例２と同様に処理し、これをがんマウスに供した後、同様の手法で、腫瘍の大きさを測定した。【００８３】
図７は、対照投与群（Ｎ=２）、比較例４投与群（Ｎ＝２）および実施例３投与群（Ｎ=２）の腫瘍の大きさの変遷をグラフとして示す。縦軸は腫瘍の大きさの平均値±ＳＤ（標準偏差）、横軸は投与後の日数をそれぞれ表す。１８日目から２４日目まで実施例３投与群は対照投与群と比較例４投与群と比べて腫瘍の増殖抑制が１％水準で有意差が認められた。対照投与群と比較例４投与群では、２４日目で約２０００ｍｍ３まで大きくなった。その一方で、実施例３投与群では、腫瘍の大きさが１８日目で８００ｍｍ３から５００ｍｍ３まで減少し、２４日までその抑制効果が確認された。すなわち、ペプチドそのものの抗がん効果だけでなく、抗がん剤の効果も重複し、大きく腫瘍を縮小させた。本発明のペプチドが、抗がん剤単独投与に比べ、標的細胞に特異的に作用し、がん細胞への高い毒性を有することを示した。また上記結果は、本発明のペプチドが、抗がん剤などの活性剤の送達キャリアとしても有効であることを実証するものである。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明の細胞透過性ペプチドは、選択毒性の高い、従来の治療法とは異なる新たな手段に応用することができる。また医薬品としてだけでなく、病巣の診断にも応用でき、さらに核内に種々の活性剤を運ぶキャリアペプチドとしての使用も期待される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ−Ｅ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ−Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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