(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
寄託番号ＣＣＴＣＣ  Ｍ  ２０１７１７４で中国典型培養物保蔵センター（ＣＣＴＣＣ）に寄託されているシュードモナス・スタッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ）株。
【請求項２】
請求項１に記載のシュードモナス・スタッツェリ株を培養するステップと、前記シュードモナス・スタッツェリ株の培養細胞を溶解するステップと、前記溶解物からヘパリナーゼを単離及び／又は精製するステップとを含む、ヘパリナーゼを生産する方法。
【請求項３】
ｉ）分子量７４７９１Ｄａであること、
ｉｉ）等電点７．７７であること、
ｉｉｉ）基質としてヘパリン（ＨＥＰ）及びＨＳ（ヘパラン硫酸）を用いたＨＥＰ／ＨＳ酵素活性比が０．８７：１であること、
ｉｖ）基質としてＨＥＰを用いたミハエリス定数が４．２０であること、
ｖ）基質としてＨＳを用いたミハエリス定数が０．２８であること、並びに
ｖｉ）ＨＥＰが基質として使用される場合、主要なヘパリン二糖類産物がＩＩＳ及びＩＳであること
の特徴を有する、ヘパリナーゼ。
【請求項４】
ｉ）分子量９４７１６Ｄａであること、
ｉｉ）等電点５．７６であること、
ｉｉｉ）基質としてヘパリン（ＨＥＰ）及びＨＳ（ヘパラン硫酸）を用いたＨＥＰ／ＨＳ酵素活性比が１：４．３であること、
ｉｖ）基質としてＨＥＰを用いたミハエリス定数が０．０９であること、並びに
ｖ）基質としてＨＳを用いたミハエリス定数が０．２５であること
の特徴を有する、ヘパリナーゼ。
【請求項５】
ａ）請求項１に記載のシュードモナス・スタッツェリ株を培養し、培養した細菌細胞を採集するステップと、
ｂ）緩衝液中にステップａ）で得られた細胞を再懸濁し、溶解し、遠心分離後に上清を採集するステップと、
ｃ）飽和度２０％〜１００％の硫酸アンモニウムによりステップｂ）で得られた上清を沈殿させ、得られた沈殿物を緩衝液に溶解し、前記緩衝液に対して透析するステップと、
ｄ）ステップｃ）の産物を、陰イオン交換カラムにロードし、緩衝液で前記カラムを平衡化し、ロード通過画分及び平衡化通過画分を採集し、前記緩衝液に対して採集した前記ロード通過画分及び前記平衡化通過画分を透析するステップと、
ｅ）陽イオン交換カラムにステップｄ）の産物をロードし、緩衝液で前記カラムを平衡化し、同じ緩衝液に基づく塩化ナトリウム溶液で直線勾配溶出を実行し、ヘパリナーゼ活性を持つ溶出液の画分を採集するステップと
を含む、ヘパリナーゼを生産する方法。
【請求項６】
ステップｅ）が、前記緩衝液に対して採集した前記溶出液を透析することをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記方法が、前記ヘパリナーゼをさらに精製するために、ヘパリナーゼアフィニティーカラムを使用する１つ又は複数のアフィニティークロマトグラフィーステップをさらに含む、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記方法が、
ｆ）ヘパリナーゼアフィニティーカラムにステップｅ）の産物をロードし、緩衝液で前記カラムを平衡化し、同じ緩衝液に基づく塩化ナトリウム溶液で直線勾配溶出を実行し、ヘパリナーゼ活性を持つ溶出液の画分を採集し、前記緩衝液に対して採集した前記溶出液を透析するステップをさらに含む、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項９】
ａ）請求項１に記載のシュードモナス・スタッツェリ株を培養し、培養した細菌細胞を採集するステップと、
ｂ）緩衝液中にステップａ）で得られた細胞を再懸濁し、溶解し、遠心分離後に上清を採集するステップと、
ｃ）飽和度２０％〜１００％の硫酸アンモニウムによりステップｂ）で得られた上清を沈殿させ、得られた沈殿物を緩衝液に溶解し、前記緩衝液に対して透析するステップと、
ｄ）ステップｃ）の産物を陰イオン交換カラムにロードし、緩衝液で前記カラムを平衡化し、同じ緩衝液に基づく塩化ナトリウム溶液で直線勾配溶出を実行し、ヘパリナーゼ活性を持つ溶出液の画分を採集するステップと
を含む、ヘパリナーゼを生産する方法。
【請求項１０】
ステップｄ）が、前記緩衝液に対して採集した前記溶出液を透析することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法が、前記ヘパリナーゼをさらに精製するために、ヘパリナーゼアフィニティーカラムを使用する１つ又は複数のアフィニティークロマトグラフィーステップをさらに含む、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法が、
ｅ）ヘパリナーゼアフィニティーカラムにステップｄ）の産物をロードし、緩衝液で前記カラムを平衡化し、同じ緩衝液に基づく塩化ナトリウム溶液で直線勾配溶出を実行し、ヘパリナーゼ活性を持つ前記溶出液の画分を採集し、前記緩衝液に対して採集した前記溶出液を透析するステップと、
ｆ）ヘパリナーゼアフィニティーカラムにステップｅ）の産物をロードし、緩衝液で前記カラムを平衡化し、同じ緩衝液に基づく塩化ナトリウム溶液で、定組成溶出を実行し、ヘパリナーゼ活性を持つ溶出液の画分を採集するステップと、
ｇ）ヘパリナーゼアフィニティーカラムにステップｆ）の産物をロードし、緩衝液で前記カラムを平衡化し、同じ緩衝液に基づく塩化ナトリウム溶液で直線勾配溶出を実行し、ヘパリナーゼ活性を持つ溶出液の画分を採集し、前記緩衝液に対して採集した前記溶出液を透析するステップと
をさらに含む、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１３】
配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、配列番号２に示されるアミノ酸配列と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸置換、欠失又は付加を有するアミノ酸配列を含むか、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む、ヘパリナーゼ。
【請求項１４】
配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のヘパリナーゼ。
【請求項１５】
請求項１３又は１４に記載のヘパリナーゼをコードしているヌクレオチド配列、又は配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１６】
発現制御配列に作動可能に連結されている請求項１５に記載のポリヌクレオチドを含む、発現構築物。
【請求項１７】
請求項１５に記載のポリヌクレオチドを含むか、又は請求項１６に記載の発現構築物で形質転換されており、前記ヘパリナーゼを発現する能力がある、宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１３又は１４に記載のヘパリナーゼを生産する方法であって、
ａ）前記ヘパリナーゼの発現を可能にする条件下で請求項１７に記載の宿主細胞を培養するステップと、
ｂ）ステップａ）から得られた培養物から、前記宿主細胞によって発現されたヘパリナーゼを得るステップと
を含む、方法。
【請求項１９】
ｃ）ステップｂ）から得られたヘパリナーゼを精製するステップをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ヘパリンを、請求項１に記載のシュードモナス・スタッツェリ株、請求項３、４、１３及び１４のいずれか一項に記載のヘパリナーゼ又は請求項１７に記載の宿主細胞と接触させるステップを含む、低分子量ヘパリン若しくは超低分子量ヘパリンを生産する方法。
【請求項２１】
前記陰イオン交換カラムが、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｂｉｇ  Ｂｅａｄｓ、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ、及びＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラムから選択され、前記陽イオン交換カラムがＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムであり、前記塩化ナトリウム溶液が、０〜０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液である、請求項５に記載の方法。
【請求項２２】
前記ヘパリナーゼアフィニティーカラムが、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  Ｓｕｌｆａｔｅカラム及びヘパリンコンジュゲートＣＮＢｒ活性化型Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂヘパリナーゼアフィニティーカラムから選択され、ステップｆ）における前記塩化ナトリウム溶液が、０．１５〜０．６Ｍ塩化ナトリウム溶液である、請求項８に記載の方法。
【請求項２３】
前記陰イオン交換カラムが、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｂｉｇ  Ｂｅａｄｓ、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ、及びＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラムから選択され、前記塩化ナトリウム溶液が、０〜０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液である、請求項９に記載の方法。
【請求項２４】
前記ヘパリナーゼアフィニティーカラムが、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  Ｓｕｌｆａｔｅカラム及びヘパリンコンジュゲートＣＮＢｒ活性化型Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂヘパリナーゼアフィニティーカラムから選択され、ステップｅ）における塩化ナトリウム溶液が０．０５〜０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液であり、ステップｆ）における塩化ナトリウム溶液が２．５Ｍ塩化ナトリウム溶液であり、ステップｇ）における塩化ナトリウム溶液が０〜０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液である、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物工学の分野に関する。特に、本発明は、ヘパリナーゼ産生シュードモナス・スタッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ）株及びそれから得られるヘパリナーゼに関する。さらに、本発明は、前記ヘパリナーゼの調製品及び使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘパリナーゼとは、ヘパリン及びヘパリノイドの骨格においてグルコシド結合を特異的に壊すことができる酵素を指す。ヘパリナーゼは、例えば、血液から残留ヘパリンを除去する、低分子量ヘパリンを調製する、ヘパリン構造を研究する、又はヘパリンの品質試験を行う、等に広く使用されている。ヘパリナーゼは、フラボバクテリウム・ヘパリナム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｅｐａｒｉｎｕｍ）から当初発見、単離され、いくつかの微生物及び動物組織においてその後見いだされた。文献には２０種類以上のヘパリナーゼが報告されている。例えば、Ｙａｎｇ  Ｖ．Ｃ．は、フラボバクテリウム・ヘパリナムからヘパリナーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩを見いだし；Ｒｏｂｅｒｔ  Ｗ．Ｂｅｌｌａｍｙらは、細胞外に分泌されるヘパリナーゼをバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ＢＨ１００（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２６１３）から見いだし；Ｗａｎ−Ｓｅｏｋ  Ｋｉｍらは、バクテロイデス・スターコリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｔｅｒｃｏｒｉｓ）ＨＪ−１５からヘパリンリアーゼを見いだした（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１２年、３５９：３７〜４３頁）。中国特許出願第２０１４１０８３９２７８．８号は、スフィンゴバクテリウム・デジョネンス（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄａｅｊｅｏｎｅｎｓｅ）の細菌から得た新規のヘパリナーゼＳＤｈｅｐＩ及びＳＤｈｅｐＩＩを開示した。中国特許出願第２０１５１００４０５２４．８号は、クリセオバクテリウム・メニンゴセプティカム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）の細菌から得た新規のヘパリナーゼＣＭＨＥＰＩを開示した。上記ヘパリナーゼの全ては、各々異なるものである。
【０００３】
最も広く研究され、広く使用されているヘパリナーゼは、フラボバクテリウム・ヘパリナム由来のヘパリナーゼＩ、ヘパリナーゼＩＩ及びヘパリナーゼＩＩＩであり、それぞれ、分子量約４３、７８、６６ｋＤａ及び等電点およそ９．０を持つモノマータンパク質である。ヘパリナーゼの発見は、ヘパリンの構造研究及び品質試験の促進に重要な役割を演じてきた。フラボバクテリウム・ヘパリナムから産生されるヘパリナーゼＩ、ＩＩ及びＩＩＩは、ヘパリンの品質試験及び低分子量ヘパリンの生産に使用されてきた。
【０００４】
天然から得られた様々なヘパリナーゼ産生微生物によって産生される様々なヘパリナーゼがあり、それを用いて様々な産物をヘパリンの酵素性分解によって得ることができる。調査及び産業における様々な要求を満たすために、新たなヘパリナーゼが、当業者において今なお必要とされている。
【発明の詳細な説明】
【０００５】
第１の態様において、本発明は、寄託番号ＣＣＴＣＣ  Ｍ  ２０１７１７４で中国典型培養物保蔵センター（ＣＣＴＣＣ）に寄託されているシュードモナス・スタッツェリ株を提供する。
【０００６】
この株は、本発明者らによって畑で単離されたシュードモナス・スタッツェリ株であり、ヘパリン又はその誘導体を溶解する活性を有し、Ｚ７と名づけられる。本発明者らは、その株から新規の２つの細胞内ヘパリナーゼＰＳｈｅｐＩ及びＰＳｈｅｐＩＩをさらに単離し、精製した。これら新規の２つのヘパリナーゼは、現在公知のヘパリナーゼと異なる物理化学的特性を有し、ヘパリンの酵素性分解の間に溶解部位に対して高い選択性を有し、その選択性は、ヘパリン産物の品質試験又は低分子若しくは超低分子量ヘパリンの調製に使用され得る。
【０００７】
したがって別の態様において、本発明は、Ｚ７シュードモナス・スタッツェリ株を用いてヘパリナーゼを生産する用途及び方法も包含する。例えば、Ｚ７株からヘパリナーゼを生産する方法は、Ｚ７シュードモナス・スタッツェリ株を培養するステップと、シュードモナス・スタッツェリ株の培養細胞を溶解するステップと、溶解物からヘパリナーゼを単離及び／又は精製するステップとを含んでもよい。培養は適切な条件下で実施されることが好ましい。例えば、Ｚ７シュードモナス・スタッツェリ株は約３０℃の温度で培養されてもよい。一部の実施形態において、培養は発酵である。シュードモナス・スタッツェリ株の適切な培養／発酵条件は、当業技術者によって直ちに決定され得る。溶解は、凍結融解溶解、超音波処理、高圧処理など細胞を破壊するための当業者に公知の様々な方法によって実施され得る。加えて、当業者は、分子量、等電点などヘパリナーゼの特定の特性にしたがって細胞溶解物からヘパリナーゼを単離及び／又は精製する適切な方法を選択することができる。例えば、特定のヘパリナーゼは、分子ふるい、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、ヘパリナーゼアフィニティークロマトグラフィーなどによって単離及び／又は精製され得る。
【０００８】
別の態様において、本発明は、シュードモナス・スタッツェリ株、好ましくは本発明のＺ７シュードモナス・スタッツェリ株から得られるヘパリナーゼを提供する。ヘパリナーゼは、例えば、ＰＳｈｅｐＩ又はＰＳｈｅｐＩＩである。
【０００９】
一部の実施形態において、ヘパリナーゼ（ＰＳｈｅｐＩなど）は、
ｉ）分子量７４７９１Ｄａであること、
ｉｉ）等電点約７．７７であること、
ｉｉｉ）基質としてヘパリン（ＨＥＰ）及びＨＳ（ヘパラン硫酸）をそれぞれ用いたＨＥＰ／ＨＳ酵素活性比が約０．８７：１であること、
ｉｖ）基質としてＨＥＰを用いたミハエリス定数が約４．２０であること、
ｖ）基質としてＨＳを用いたミハエリス定数が約０．２８であること、
ｖｉ）ＨＥＰが基質として使用される場合、主要なヘパリン二糖類産物がＩＩＳ及びＩＳであること
からなる群から選択される特徴の１つ又は複数を有する。
【００１０】
一部の実施形態において、ヘパリナーゼ（ＰＳｈｅｐＩなど）は、例えば、
ａ）本発明のＺ７シュードモナス・スタッツェリ株を培養し、培養した細菌細胞を採集するステップと、
ｂ）緩衝液中にステップａ）で得られた細胞を再懸濁し、溶解し、遠心分離後に上清を採集するステップと、
ｃ）飽和度２０％〜１００％の硫酸アンモニウムによりステップｂ）で得られた上清を沈殿させ、得られた沈殿物を緩衝液に溶解し、緩衝液に対して透析するステップと、
ｄ）ステップｃ）の産物を、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｂｉｇ  Ｂｅａｄｓ、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ又はＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラムを含むがこれに限定されない陰イオン交換カラムにロードし、緩衝液で平衡化し、ロード通過画分及び平衡化通過画分を採集し、緩衝液に対して採集したロード通過画分及び平衡化通過画分を透析するステップと、
ｅ）ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムなどの陽イオン交換カラムにステップｄ）の産物をロードし、緩衝液でカラムを平衡化し、同じ緩衝液に基づく塩化ナトリウム溶液（例えば０〜０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液）で直線勾配溶出を実行し、ヘパリナーゼ活性を持つ溶出液の画分を採集し、任意選択で緩衝液に対して採集した溶出液を透析するステップと
を含む方法によって得ることができる。
【００１１】
中国特許出願第２０１１１０２４１２６０．４号に記述される方法などヘパリナーゼの活性を測定する様々な方法が、当業者に公知である。したがって、本発明の方法において、ヘパリナーゼを調製する間クロマトグラフィーステップにおけるあらゆる画分のヘパリナーゼ活性を監視して、所望の画分を採集することができる。
【００１２】
ＰＳｈｅｐＩは、上記ステップｄ）における陰イオン交換カラムによる粗分離後にＰＳｈｅｐＩＩから分離され、ステップｅ）のように、大量の望ましくないタンパク質が、陽イオン交換カラムによって除去され、得られたＰＳｈｅｐＩは、したがって精製されている。しかしながら、１つ又は複数のアフィニティークロマトグラフィーステップをさらに含めて、ＰＳｈｅｐＩヘパリナーゼをさらに精製してもよい。Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  Ｓｕｌｆａｔｅカラム又はヘパリンコンジュゲートＣＮＢｒ活性化型Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂヘパリナーゼアフィニティーカラムなどのヘパリナーゼアフィニティーカラムを使用して１つ又は複数のアフィニティークロマトグラフィーステップが実行される。
【００１３】
例えば、いくつかの好ましい実施形態において、本方法は、
ｆ）Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  Ｓｕｌｆａｔｅカラム又はヘパリンコンジュゲートＣＮＢｒ活性化型Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂヘパリナーゼアフィニティーカラムなどのヘパリナーゼアフィニティーカラムにステップｅ）の産物をロードし、緩衝液でカラムを平衡化し、同じ緩衝液に基づく塩化ナトリウム溶液（例えば０．１５〜０．６Ｍ塩化ナトリウム溶液）で直線勾配溶出を実行し、ヘパリナーゼ活性を持つ溶出液の画分を採集し、任意選択で緩衝液に対して採集した溶出液を透析するステップをさらに含む。
【００１４】
一部の実施形態において、本方法は、産物を濃縮するステップをさらに含む。
【００１５】
一部の実施形態において、緩衝液はトリス−ＨＣｌ緩衝液である。一部の実施形態において、緩衝液はＣａＣｌ２含有トリス−ＨＣｌ緩衝液である。一部の実施形態において、トリス−ＨＣｌの濃度は、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、好ましくは約２５ｍＭである。一部の実施形態において、緩衝液中のＣａＣｌ２の濃度は、約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、好ましくは約１０ｍＭである。一部の実施形態において、緩衝液のｐＨは、約７．０〜約７．５の範囲、好ましくは約７．０である。一部の実施形態において、同じ緩衝液が、全てのステップにおいて使用される。
【００１６】
他の実施形態において、ヘパリナーゼ（ＰＳｈｅｐＩＩなど）は、
ｉ）分子量９４７１６Ｄａであること、
ｉｉ）等電点約５．７６であること、
ｉｉｉ）基質としてヘパリン（ＨＥＰ）及びＨＳ（ヘパラン硫酸）をそれぞれ用いたＨＥＰ／ＨＳ酵素活性比が約１：４．３であること、
ｉｖ）基質としてＨＥＰを用いたミハエリス定数が約０．０９であること、
ｖ）基質としてＨＳを用いたミハエリス定数が約０．２５であること
からなる群から選択される特徴の１つ又は複数を有する。
【００１７】
一部の実施形態において、ヘパリナーゼ（ＰＳｈｅｐＩＩなど）は、例えば、
ａ）本発明のＺ７シュードモナス・スタッツェリ株を培養し、培養した細菌細胞を採集するステップと、
ｂ）緩衝液中にステップａ）で得られた細胞を再懸濁し、溶解し、遠心分離後に上清を採集するステップと、
ｃ）飽和度２０％〜１００％の硫酸アンモニウムによりステップｂ）で得られた上清を沈殿させ、得られた沈殿物を緩衝液に溶解し、緩衝液に対して透析するステップと、
ｄ）ステップｃ）の産物を、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｂｉｇ  Ｂｅａｄｓ、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ又はＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラムを含むがこれに限定されない陰イオン交換カラムにロードし、緩衝液でカラムを平衡化し、同じ緩衝液に基づく塩化ナトリウム溶液（例えば０〜０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液）で直線勾配溶出を実行し、ヘパリナーゼ活性を持つ溶出液の画分を採集し、任意選択で緩衝液に対して採集した溶出液を透析するステップと
を含む方法によって得ることができる。
【００１８】
中国特許出願第２０１１１０２４１２６０．４号に記述される方法などヘパリナーゼの活性を測定する様々な方法が、当業者に公知である。したがって本発明の方法において、ヘパリナーゼを調製する間クロマトグラフィーステップにおけるあらゆる画分のヘパリナーゼ活性を監視して、所望の画分を採集することができる。
【００１９】
上記ステップｄ）における陰イオン交換カラムに対する粗分離後、ＰＳｈｅｐＩ及びＰＳｈｅｐＩＩは分離され、そうして得たＰＳｈｅｐＩＩはすでに精製されている。しかしながら、１つ又は複数のアフィニティークロマトグラフィーステップをさらに含めて、ＰＳｈｅｐＩＩヘパリナーゼをさらに精製してもよい。Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  Ｓｕｌｆａｔｅカラム又はヘパリンコンジュゲートＣＮＢｒ活性化型Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂヘパリナーゼアフィニティーカラムなどのヘパリナーゼアフィニティーカラムを使用して１つ又は複数のアフィニティークロマトグラフィーステップが実行される。
【００２０】
例えば、一部の好ましい実施形態において、本方法は、
ｅ）ヘパリナーゼアフィニティーカラム（Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  Ｓｕｌｆａｔｅカラムなど）にステップｄ）の産物をロードし、緩衝液でカラムを平衡化し、同じ緩衝液に基づく塩化ナトリウム溶液（例えば０．０５〜０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液）で直線勾配溶出を実行し、ヘパリナーゼ活性を持つ溶出液の画分を採集し、緩衝液に対して採集した溶出液を透析するステップと、
ｆ）ヘパリナーゼアフィニティーカラム（例えば、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  Ｓｕｌｆａｔｅカラム）にステップｅ）の産物をロードし、緩衝液でカラムを平衡化し、同じ緩衝液に基づく塩化ナトリウム溶液（例えば２．５Ｍ塩化ナトリウム溶液）で、定組成溶出を実行し、ヘパリナーゼ活性を持つ溶出液の画分を採集するステップと、
ｇ）ヘパリナーゼアフィニティーカラム（Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  Ｓｕｌｆａｔｅカラムなど）にステップｆ）の産物をロードし、緩衝液でカラムを平衡化し、同じ緩衝液に基づく塩化ナトリウム溶液（例えば０〜０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液）で直線勾配溶出を実行し、ヘパリナーゼ活性を持つ溶出液の画分を採集し、任意選択で緩衝液に対して採集した溶出液を透析するステップと
をさらに含む。
【００２１】
一部の実施形態において、本方法は、産物を濃縮するステップをさらに含む。
【００２２】
一部の実施形態において、緩衝液はトリス−ＨＣｌ緩衝液である。一部の実施形態において、緩衝液はＣａＣｌ２含有トリス−ＨＣｌ緩衝液である。一部の実施形態において、トリス−ＨＣｌの濃度は、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、好ましくは約２５ｍＭである。一部の実施形態において、緩衝液中のＣａＣｌ２の濃度は、約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、好ましくは約１０ｍＭである。一部の実施形態において、緩衝液のｐＨは、約７．０〜約７．５の範囲、好ましくは約７．０である。一部の実施形態において、同じ緩衝液が、全てのステップにおいて使用される。
【００２３】
別の態様において、本発明は、ヘパリナーゼ（ＰＳｈｅｐＩなど）を生産する方法を提供し、方法は、
ａ）本発明のシュードモナス・スタッツェリ株を培養し、培養した細菌細胞を採集するステップと、
ｂ）緩衝液中にステップａ）で得られた細胞を再懸濁し、溶解し、遠心分離後に上清を採集するステップと、
ｃ）飽和度２０％〜１００％の硫酸アンモニウムによりステップｂ）で得られた上清を沈殿させ、得られた沈殿物を緩衝液に溶解し、緩衝液に対して透析するステップと、
ｄ）ステップｃ）の産物を、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｂｉｇ  Ｂｅａｄｓ、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ又はＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラムなどの陰イオン交換カラムにロードし、緩衝液でカラムを平衡化し、ロード通過画分及び平衡化通過画分を採集し、緩衝液に対して採集したロード通過画分及び平衡化通過画分を透析するステップと、
ｅ）ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムなどの陽イオン交換カラムにステップｄ）の産物をロードし、緩衝液でカラムを平衡化し、同じ緩衝液に基づく塩化ナトリウム溶液（例えば０〜０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液）で直線勾配溶出を実行し、ヘパリナーゼ活性を持つ溶出液の画分を採集し、任意選択で緩衝液に対して採集した溶出液を透析するステップと
を含む。
【００２４】
一部の実施形態において、本方法は、ヘパリナーゼをさらに精製するために、１つ又は複数のアフィニティークロマトグラフィーステップをさらに含み、１つ又は複数のアフィニティークロマトグラフィーステップは、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  Ｓｕｌｆａｔｅカラム又はヘパリンコンジュゲートＣＮＢｒ活性化型Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂヘパリナーゼアフィニティーカラムなどのヘパリナーゼアフィニティーカラムを使用する。
【００２５】
一部の実施形態において、本方法は、
ｆ）Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  Ｓｕｌｆａｔｅカラム又はヘパリンコンジュゲートＣＮＢｒ活性化型Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂヘパリナーゼアフィニティーカラムなどのヘパリナーゼアフィニティーカラムにステップｅ）の産物をロードし、緩衝液でカラムを平衡化し、同じ緩衝液に基づく塩化ナトリウム溶液（例えば０．１５〜０．６Ｍ塩化ナトリウム溶液）で直線勾配溶出を実行し、ヘパリナーゼ活性を持つ溶出液の画分を採集し、任意選択で緩衝液に対して採集した溶出液を透析するステップをさらに含む。
【００２６】
一部の実施形態において、本方法は、産物を濃縮するステップをさらに含む。
【００２７】
さらに別の態様において、本発明は、ヘパリナーゼ（ＰＳｈｅｐＩＩなど）を生産する方法を提供し、方法は、
ａ）本発明のシュードモナス・スタッツェリ株を培養し、培養した細菌細胞を採集するステップと、
ｂ）緩衝液中にステップａ）で得られた細胞を再懸濁し、溶解し、遠心分離後に上清を採集するステップと、
ｃ）飽和度２０％〜１００％の硫酸アンモニウムによりステップｂ）で得られた上清を沈殿させ、得られた沈殿物を緩衝液に溶解し、緩衝液に対して透析するステップと、
ｄ）ステップｃ）の産物を、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｂｉｇ  Ｂｅａｄｓ、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ又はＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラムなどの陰イオン交換カラムにロードし、緩衝液でカラムを平衡化し、同じ緩衝液に基づく塩化ナトリウム溶液（例えば０〜０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液）で直線勾配溶出を実行し、ヘパリナーゼ活性を持つ溶出液の画分を採集し、任意選択で緩衝液に対して採集した溶出液を透析するステップと
を含む。
【００２８】
一部の実施形態において、本方法は、ヘパリナーゼをさらに精製するために、１つ又は複数のアフィニティークロマトグラフィーステップをさらに含み、１つ又は複数のアフィニティークロマトグラフィーステップは、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  Ｓｕｌｆａｔｅカラム又はヘパリンコンジュゲートＣＮＢｒ活性化型Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂヘパリナーゼアフィニティーカラムなどのヘパリナーゼアフィニティーカラムを使用する。
【００２９】
一部の実施形態において、本方法は、
ｅ）ヘパリナーゼアフィニティーカラム（Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  Ｓｕｌｆａｔｅカラムなど）にステップｄ）の産物をロードし、緩衝液でカラムを平衡化し、同じ緩衝液に基づく塩化ナトリウム溶液（例えば０．０５〜０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液）で直線勾配溶出を実行し、ヘパリナーゼ活性を持つ溶出液の画分を採集し、緩衝液に対して採集した溶出液を透析するステップと、
ｆ）ヘパリナーゼアフィニティーカラム（例えば、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  Ｓｕｌｆａｔｅカラム）にステップｅ）の産物をロードし、緩衝液でカラムを平衡化し、同じ緩衝液に基づく塩化ナトリウム溶液（例えば２．５Ｍ塩化ナトリウム溶液）で、定組成溶出を実行し、ヘパリナーゼ活性を持つ溶出液の画分を採集するステップと、
ｇ）ヘパリナーゼアフィニティーカラム（Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  Ｓｕｌｆａｔｅカラムなど）にステップｆ）の産物をロードし、緩衝液でカラムを平衡化し、同じ緩衝液に基づく塩化ナトリウム溶液（例えば０〜０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液）で直線勾配溶出を実行し、ヘパリナーゼ活性を持つ溶出液の画分を採集し、任意選択で緩衝液に対して採集した溶出液を透析するステップと
をさらに含む。
【００３０】
一部の実施形態において、本方法は、産物を濃縮するステップをさらに含む。
【００３１】
本発明のヘパリナーゼを生産する上記方法の一部の実施形態において、緩衝液はトリス−ＨＣｌ緩衝液である。一部の実施形態において、緩衝液はＣａＣｌ２含有トリス−ＨＣｌ緩衝液である。一部の実施形態において、トリス−ＨＣｌの濃度は、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、好ましくは約２５ｍＭである。一部の実施形態において、緩衝液中のＣａＣｌ２の濃度は、約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、好ましくは約１０ｍＭである。一部の実施形態において、緩衝液のｐＨは、約７．０〜約７．５の範囲、好ましくは約７．０である。一部の実施形態において、同じ緩衝液が、全てのステップにおいて使用される。
【００３２】
本発明者らは、ＰＳｈｅｐＩの配列をさらに同定し、そのアミノ酸配列は配列番号２に示され、そのコーディングヌクレオチド配列は配列番号１に示される。
【００３３】
したがって、別の態様において、本発明は、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸置換、欠失又は付加を有するアミノ酸配列を含むヘパリナーゼをさらに提供する。ヘパリナーゼは、ＰＳｈｅｐＩの活性を保持する又は実質的に保持することが好ましい。一部の実施形態において、ヘパリナーゼは、シュードモナス・スタッツェリから得られる、又は由来する、又は単離される。一部の実施形態において、ヘパリナーゼは組換えにより生産される、すなわち、ヘパリナーゼは組換えヘパリナーゼである。ヘパリナーゼの組換え生産の方法は、以下でさらに記述される。
【００３４】
用語「含む」が、タンパク質又は核酸の配列を記述するために本明細書において使用される場合、タンパク質又は核酸は配列からなってもよく、又はタンパク質又は核酸の一方又は両方の端で追加のアミノ酸又はヌクレオチドを有してもよいが、本明細書に記述される活性を依然として有する。
【００３５】
一部の実施形態において、本発明のヘパリナーゼは、追加のリンカーを含んでも又は別のタグタンパク質に融合されてもよい。そのようなリンカー及び／又はタグは、対象の宿主細胞における本発明のヘパリナーゼの産生を容易にし、発現量を増大させ、又は可溶性発現を増大させ、ヘパリナーゼの単離及び精製を容易にし得るが、ヘパリナーゼの活性に実質的に影響を及ぼさない。そのような様々なリンカー及び／又はタグが、当業者に公知である。適切なリンカー及び／又はタグには、例えば、６×Ｈｉｓ、ＧＳＴ（グルタチオントランスフェラーゼ）、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）などがある。適切なリンカー及び／又はタグは、適切な商業的発現ベクターを選択することによって一般に入手することができる。
【００３６】
ペプチド又はタンパク質における適切な保存的アミノ酸置換は当業技術者に公知であり、得られる分子の生物活性を改変することなく一般に実施することができる。一般に、当業者は、ポリペプチドの非必須領域における１つのアミノ酸置換が、生物活性を実質的に改変しないことを認識することになる（例えば、Ｗａｔｏｓｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ、第４版、１９８７年、Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ  Ｃｏ．、２２４頁を参照のこと）。
【００３７】
配列「同一性」は、当業者に周知の意味を有し、２つの核酸若しくはポリペプチド分子又は領域間の配列同一性のパーセンテージは、開示されている技術を使用して算出することができる。配列同一性は、ポリヌクレオチド若しくはポリペプチドの全長に沿って又は分子の領域に沿って測定され得る。（例えば：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８年；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３年；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、第Ｉ部、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４年；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７年；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１年を参照のこと）。２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド間の同一性を測定する方法は多く存在するが、用語「同一性」は、当業者に周知である（Ｃａｒｒｉｌｌｏ，Ｈ．及びＬｉｐｍａｎ，Ｄ．ＳＩＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ  ４８：１０７３頁［１９８８年］）。
【００３８】
別の態様において、本発明は、上述した本発明のヘパリナーゼをコードしているヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００３９】
本明細書で使用される、「ポリヌクレオチド」とは、３’−５’リン酸ジエステル結合によって接続された複数のヌクレオチドの巨大分子を指し、ヌクレオチドは、リボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチドの配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）など異なる宿主細胞用にコドン最適化されて、ヘパリナーゼの発現を改善されてもよい。コドン最適化を実行する方法は、当業者に公知である。
【００４０】
この態様の一部の特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む。
【００４１】
別の態様において、本発明は、発現制御配列に作動可能に連結された本発明のポリヌクレオチドを含む発現構築物を提供する。
【００４２】
本発明の発現構築物において、本発明のヘパリナーゼをコードしているポリヌクレオチドの配列は、宿主細胞におけるヘパリナーゼの所望の転写及び産生を可能にするように発現制御配列に作動可能に連結されている。適切な発現制御配列には、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合部位などのリボソーム動作部位、ポリアデニル化部位、転写スプライシング配列、転写終結配列及びｍＲＮＡ安定化配列などがあるが、これに限定されない。
【００４３】
本明細書で使用される、用語「作動可能に連結される」とは、対象のヌクレオチド配列の転写を転写制御配列によって制御及び調節する目的で対象のヌクレオチド配列に制御配列を取り付けることを指す。対象のヌクレオチド配列に発現制御配列を作動可能に連結する技術は、当業者に公知である。
【００４４】
本発明の発現構築物に使用するベクターには、プラスミドベクターなど宿主細胞において独立して複製するベクター；さらに、宿主細胞のＤＮＡに組み込まれ、宿主細胞のＤＮＡと共に複製する能力があるベクターがある。本発明に適切なベクターが多く市販されている。特定の実施形態において、本発明の発現構築物は、Ｎｏｖａｇｅｎ社製ｐＥＴ３０ａから得られる。特定の実施形態において、本発明の発現構築物は、Ｎｏｖａｇｅｎ社製ｐＥＴ２８ａから得られる。
【００４５】
別の態様において、本発明は、本発明のヘパリナーゼをコードしているヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む又はそのポリヌクレオチドを含む発現構築物で形質転換された宿主細胞を提供し、宿主細胞は本発明のヘパリナーゼを発現する能力がある。宿主細胞は組換え宿主細胞であることが好ましい。
【００４６】
本発明のヘパリナーゼを発現するための宿主細胞には、原核生物、酵母及び高等真核生物がある。典型的な原核生物の宿主には、エシェリキア属、バチルス属、サルモネラ属、及びシュードモナス属及びストレプトマイセス属の細菌がある。好ましい実施形態において、宿主細胞はエシェリキア属、好ましくは大腸菌の細胞である。本発明の特定の実施形態において、使用される宿主細胞は、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株の細胞である。
【００４７】
本発明の組換え発現構築物は、熱ショックトランスフォーメーション、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクション、顕微鏡下注射、脂質体媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、プロトプラスト融合、微粒子銃、ウイルストランスフォーメーションなどを含むがこれに限定されない周知の様々な技術のうちの１つによって宿主細胞に導入され得る。
【００４８】
別の態様において、本発明は、
ａ）ヘパリナーゼの発現を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養するステップと、
ｂ）ステップａ）から得られた培養物から、宿主細胞によって発現されたヘパリナーゼを得るステップと、
ｃ）任意選択で、ステップｂ）から得られたヘパリナーゼをさらに精製するステップと
を含む、ヘパリナーゼを組換えにより生産する方法を提供する。
【００４９】
さらに別の態様において、本発明は、低分子量ヘパリン又は超低分子量ヘパリンを生産すること、又はヘパリン、低分子ヘパリン又は超低分子量ヘパリンの品質を試験することにおける、本発明のシュードモナス・スタッツェリ株、本発明のヘパリナーゼ又は本発明の宿主細胞の使用を提供する。
【００５０】
さらに別の態様において、本発明は、ヘパリンを、本発明のシュードモナス・スタッツェリ株、本発明のヘパリナーゼ又は本発明の宿主細胞と接触させるステップを含む、低分子量ヘパリン若しくは超低分子量ヘパリンを生産する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】精製したＰＳｈｅｐＩ、ＰＳｈｅｐＩＩのＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像を示す図である
【図２】ＰＳｈｅｐＩによるＨＥＰの酵素性分解産物の液体クロマトグラフィー画像である。
【実施例】
【００５２】
本発明は、例によって以下でさらに記述されるが、その例に限定されることを目的としない。
【００５３】
本出願の例において、ヘパリン（ＨＥＰ）及びヘパリン硫酸（ＨＳ）の酵素活性は、中国特許出願第２０１１１０２４１２６０．４号を参照することにより決定される。タンパク質含有量及び酵素純度を決定する方法は、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１２年、３５９：３７〜４３頁に記述されている。
【００５４】
デスルフラーゼを検出する方法：１ｍｇ／ｍｌ  Ｉ−Ｓ  １０μｌと反応させるために５２ｍＩＵヘパリナーゼを使用し、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．０を含有する）緩衝液を添加して反応系を２００μｌにした。反応を、室温で２４時間実行し、ヘパリナーゼを１００℃水浴中で５分間煮沸することによって不活性化し、ＨＰＬＣ−ＳＡＸカラムにロードして、ＩＩ−Ｓ及びＩ−Ｓの相対的パーセンテージを決定した。
【００５５】
実施例１：新たなシュードモナス・スタッツェリ株の単離及び同定
ヘパリナーゼ産生株のスクリーニング
土壌サンプルを、中湖北省雲夢県城関鎮の西部から採集し；ヘパリンを精製水に溶解し（８ｇ／Ｌ以下）、各土壌サンプルに注いで、各土壌サンプルを保湿した。サンプルを、２週間に１回そのように処理し（頻度は、土壌サンプルの乾燥によって決めた）、３５〜４０日間培養した。スプーン２杯の土壌サンプルを、秤量スプーンで取り、加圧殺菌した精製水に添加し、シェーカー中で、３０℃で２〜３時間振盪して（１５０ｒｐｍ）、土壌サンプルを精製水中に均一に分布させた。溶解した土壌サンプルを含む精製水２０ｍｌを、加圧殺菌した種培養培地２００ｍｌにピペットで移し、シェーカー中で、３０℃で１６時間振盪し（１５０ｒｐｍ）、次いで細菌液体２．５ｍｌを４ｍｌ石英キュベットにピペットで移してＯＤ６００を試験し、それにより株の増殖を決定した。前のステップにおいて株のＯＤ６００が２．４より大きい場合、次いで、細菌液体２０ｍｌを、加圧殺菌した発酵培地２００ｍｌにピペットで移し、シェーカー中で、３０℃で２４時間振盪し（１５０ｒｐｍ）、次いで細菌液体３ｍｌをサンプルとしてピペットで取った。
【００５６】
細菌液体２．５ｍｌを、細菌液体サンプル３ｍｌからピペットで取り、４ｍｌ石英キュベットに添加してＯＤ６００を検出し、それにより株の増殖を決定した。株のＯＤ６００が２．０より大きい場合、そのことは、株が発酵培地中でよく増殖したことを意味する。同時に、残りの細菌液体０．５ｍｌを遠心分離して（４℃、５０００ｇ、５分間）上清を得、次いで上清を超純水で１０倍に希釈して使用した。ヘパリンを超純水に溶解して、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．７ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌに希釈した。Ａｚｕｒｅ  Ａ溶液（２０ｍｇ／Ｌ）２．５ｍｌ及びヘパリン水溶液２５μｌをキュベットに添加し、混合して、６２０ｎｍで吸収値を検出し、次いで標準曲線をプロットした。その後、希釈した株上清の吸収値を６２０ｎｍで同様に検出し、ヘパリン濃度を算出した。ヘパリン濃度が５．５ｇ／Ｌ未満の場合、細菌液体は、ヘパリンを消費できる株を含有すると見なす（ヘパリナーゼ産生）。５．５ｇ／Ｌ未満のヘパリン濃度をもたらした細菌液体を希釈し、平板培養し（１０ｅ−６、１０ｅ−７、１０ｅ−８、１０ｅ−９）、約３〜４日後にコロニー又は微生物集団を固形培地表面上で観察した。複数のコロニーを、前ステップにおける培地表面から拾って、プレート画線を実施し、培養２〜３日後に比較的純粋な単一コロニーを選択した。
【００５７】
プレート画線により得たコロニーをこすり取り、種培地に添加し、１６時間培養し、次いで発酵培地に約２４時間移した（１０％接種原）。サンプルを発酵培地から取り出し、そのヘパリン消費を、上述したステップを参照して検出した。ヘパリンの消費が、なお５．５ｇ／Ｌ未満の場合、純粋な単一コロニーが得られるまで、次いで希釈、コーティング及びプレート画線のステップを繰り返して、株をさらに精製した。コロニーの純度によって、再スクリーニングを数回実施することもできる。この実験では、所望の活性を持つ土壌サンプル全てを３回スクリーニングした。
【００５８】
単一コロニーを斜面培地に画線し、液体培地中で貯蔵した。画線した斜面培地を、低温庫に貯蔵し、培養した細菌液体を５０％グリセリン中に貯蔵し、−２０℃で冷凍庫に貯蔵した。
【００５９】
ヘパリナーゼ産生株の同定
ヘパリナーゼ産生株を、純粋な単一コロニーに精製し、次いでＧｕａｎｇｄｏｎｇ  Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒに送付して、同定した。
【００６０】
細菌顕微鏡観察、物理化学的特性分析及び１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列整列化によって、本発明者らが、ヘパリナーゼを産生できるシュードモナス・スタッツェリ株をスクリーニングしたことが確認され、その株をＺ７と名づけた。株を、ブタペスト条約に基づき２０１７年４月１０日に寄託番号ＣＣＴＣＣ  Ｍ  ２０１７１７４で中国典型培養物保蔵センター（ＣＣＴＣＣ）（武漢大学、中国武漢市、４３００７２）に寄託した。
【００６１】
シュードモナス・スタッツェリは、ヒトに対して基本的に非病原性であり、カラゲーニンを分解できることが公知である。その細菌は、下水処理及び土壌汚物処理に有効な細菌であり、金属を腐食する能力を持つ脱窒細菌である。しかしながら、シュードモナス・スタッツェリがヘパリナーゼを産生する能力について報告は全くなかった。
【００６２】
Ｚ７株のヘパリナーゼ活性の同定
所望の酵素活性を持つ同定されたＺ７株を発酵し、ＨＥＰ及びＨＳに対する活性を細胞破砕後に測定した（発酵細胞１Ｌ）。結果を、表１に示す。
【表１】
0006863626.tif 000002
【００６３】
実施例２：Ｚ７株由来ヘパリナーゼの調製及び活性決定
培地の調製：
種培地の配合：牛肉エキス５ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母粉末５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０；発酵培地の配合：ヘパリン８ｇ／Ｌ、ペプトン２ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム２．５ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０；固形培地は、発酵培地に寒天粉末２０ｇ／Ｌを添加することによって調製する。
【００６４】
株の発酵及び粗酵素溶液の調製：
Ｚ７シュードモナス・スタッツェリ株を、細菌を２環こすり取ることによりプレート又は斜面から種培養培地に植菌した。培養１６時間後に、種を、１５％植菌量で二次液体種培養培地に添加し、１日間培養し、次いで２０％植菌量で発酵培地２Ｌに植菌し、１日間培養した。細菌細胞を、３８００ｒｐｍ、４℃、４５分間の遠心分離により採集し、次いで沈殿物を２５ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．０を含有する）に懸濁し、高圧ホモジナイザーにより４℃、８００バールで３〜４サイクル溶解し、３０分間遠心分離した（１２０００ｒｐｍ、４℃）。上清を、氷浴中で硫酸アンモニウムにより沈殿させ、硫酸アンモニウム飽和度２０％〜１００％における沈殿物を採集し、トリス−ＨＣｌ緩衝液１００ｍｌに溶解し、同じ緩衝液に対して終夜透析した。
【００６５】
調製方法Ｉ
Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム分離：前ステップ後の透析した粗酵素溶液を、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．０を含有する）緩衝液で平衡化した２．５×３０ｃｍ  Ｑカラムにロードした。カラムを、同じ緩衝液３カラム容積で平衡化し、０〜０．５Ｍ塩化ナトリウムを含有する緩衝液の直線勾配で溶出した。所望の活性を持つピークが１つ得られ、ＰＳｈｅｐＩＩと呼んだ。ロード通過画分及び平衡化通過画分を検出し、ヘパリナーゼ活性を有することを見いだし、この部分の酵素溶液をＰＳｈｅｐＩと名づけた。ＰＳｈｅｐＩ及びＰＳｈｅｐＩＩ画分を採集し、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．０を含有する）緩衝液２Ｌに対して終夜透析した。
【００６６】
Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  ＳｕｌｆａｔｅカラムＩによるＰＳｈｅｐＩの精製：透析したＰＳｈｅｐＩ含有酵素溶液を、ＣＳカラム（２．５×３０ｃｍ）に適用し、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．０を含有する）緩衝液３カラム容積で平衡化した。カラムを、０〜１Ｍ塩化ナトリウムを含有する同じ緩衝液の勾配で次いで溶出した。酵素活性を持つ画分を検出し、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．０を含有する）緩衝液２Ｌに対して終夜透析した。
【００６７】
Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  ＳｕｌｆａｔｅカラムＩＩによるＰＳｈｅｐＩの精製：前ステップ後の透析した酵素溶液を取り出し、同じサイズの十分に平衡化したＣＳカラムにロードした。カラムを、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含有する２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．０を含有する）緩衝液３カラム容積で平衡化し、０．１５〜０．６Ｍ塩化ナトリウムを含有する同じ緩衝液の勾配で次いで溶出した。酵素活性を持つ画分を検出し、終夜透析した。
【００６８】
ＳＰカラムによるＰＳｈｅｐＩの精製：前ステップ後の透析した酵素溶液を、十分に平衡化したＳＰカラム（仕様：２．５×３０ｃｍ）にロードした。カラムを、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．０を含有する）緩衝液３カラム容積で次いで平衡化し、０〜０．５Ｍ塩化ナトリウムを含有する同じ緩衝液の勾配で次いで溶出した。ヘパリナーゼ活性を検出した。炭水化物鎖から硫酸を除去し得る望ましくない酵素の検出を、酵素活性を持つ単一画分に対して実施し、そのような反応が全くなく、ヘパリン処理後に１％未満のＩＩＳ含有量である画分を採集し、その画分は、不純物バンドを基本的に全く有さない。最終的に、産物を３０Ｋ限外濾過遠心管中で濃縮した。濃縮した酵素は、高純度のＰＳｈｅｐＩ酵素である。濃縮した酵素を、対応する緩衝液で０．５ｍｌにし、比１：１でグリセロールと混合し、−２０℃で冷凍庫に貯蔵した。
【００６９】
Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  ＳｕｌｆａｔｅカラムＩを用いる勾配溶出によるＰＳｈｅｐＩＩの精製：透析したＰＳｈｅｐＩＩ画分を、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．０を含有する）緩衝液で平衡化した２．５×３０ｃｍ  ＣＳカラムにロードした。カラムを、０．０５Ｍ塩化ナトリウムを含有する緩衝液３カラム容積で平衡化し、０．０５〜０．５Ｍ塩化ナトリウムを含有する同じ緩衝液の直線勾配で次いで溶出した。酵素活性を持つ画分を採集し、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．０を含有する）緩衝液２Ｌを使用して終夜透析した。
【００７０】
Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  ＳｕｌｆａｔｅカラムＩＩを用いる定組成溶出によるＰＳｈｅｐＩＩの精製：前ステップ後の透析したＰＳｈｅｐＩＩ画分を、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．０を含有する）緩衝液で平衡化した２．５×３０ｃｍ  ＣＳカラムにロードした。カラムを、同じ緩衝液３カラム容積で、次いで平衡化した。酵素活性を持つ画分を、０．２５Ｍ塩化ナトリウムを含有する同じ緩衝液で定組成溶出によって次いで採集した。
【００７１】
Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  ＳｕｌｆａｔｅカラムＩＩＩによるＰＳｈｅｐＩＩの濃縮：前ステップにおける定組成溶出後の活性ＰＳｈｅｐＩＩ画分を、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．０を含有する）緩衝液１容積に添加し、平衡化した２．５×３０ｃｍ  ＣＳカラムにロードした。カラムを、同じ緩衝液３カラム容積で平衡化し、０〜０．５Ｍ塩化ナトリウムを含有する同じ緩衝液の勾配で次いで溶出した。酵素活性を持つ画分を、炭水化物鎖から硫酸を除去し得る望ましくない酵素の検出に、別々に供した。望ましくない酵素反応が全くなく、ヘパリン処理後に１％未満のＩＩＳ含有量である画分を採集し、その画分は、高純度の新たな酵素ＰＳｈｅｐＩＩである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実行して、その画分が不純物バンドを基本的に含まないことを確認した。高純度ＰＳｈｅｐＩＩを、３０ＫＤ限外濾過遠心管を使用して濃縮し、グリセロール１容積と混合し、−２０℃で冷凍庫に貯蔵した。
【００７２】
各ステップ後のＰＳｈｅｐＩ並びにＰＳｈｅｐＩＩの酵素活性、タンパク質含有量、（比活性）精製比及び（総活性）収率を、それぞれ表２及び表３に示す。
【表２】
0006863626.tif 000003
【表３】
0006863626.tif 000004
【００７３】
調製方法ＩＩ
Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム分離：上記硫酸アンモニウム沈殿によって調製した透析した粗酵素溶液を、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．０を含有する）緩衝液で平衡化した標準２．５×３０ｃｍ  Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムにロードし、カラムを、同じ緩衝液３カラム容積で平衡化した。同じ緩衝液中の０〜１Ｍ塩化ナトリウムによる直線勾配溶出を実行した。酵素活性を持つ画分を検出し、ＰＳｈｅｐＩＩと標識し、採集し、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．０を含有する）緩衝液２Ｌで終夜透析した。ロード通過画分及び平衡化通過画分を検出し、酵素活性を持つ画分を採集し、ＰＳｈｅｐＩと標識した。
【００７４】
ＳＰカラムによるＰＳｈｅｐＩの精製：前ステップで得られたＰＳｈｅｐＩ含有酵素溶液を、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．０を含有する）緩衝液で平衡化した２．５×３０ｃｍ  ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗにロードした。カラムを、同じ緩衝液３カラム容積で平衡化し、０〜０．５Ｍ塩化ナトリウムを含有する同じ緩衝液の直線勾配で次いで溶出した。活性画分を採集し、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．０を含有する）緩衝液２Ｌに対して終夜透析した。
【００７５】
Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  ＳｕｌｆａｔｅカラムによるＰＳｈｅｐＩの精製：前ステップで得られた酵素溶液を、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．０を含有する）緩衝液で平衡化した２．５×３０ｃｍ  Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  Ｓｕｌｆａｔｅカラムにロードし、カラムを、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含有する同じ緩衝液３カラム容積で次いで平衡化し、０．１５〜０．６Ｍ塩化ナトリウムを含有する同じ緩衝液の直線勾配で次いで溶出した。活性画分を採集し、プールし、３０ｋＤ限外濾過遠心管による限外濾過によって１ｍＬに濃縮した。
【００７６】
Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  Ｓｕｌｆａｔｅ−Ｉを用いる直線勾配溶出によるＰＳｈｅｐＩＩの精製：Ｑカラムによって分離した透析した酵素溶液を、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．０を含有する）緩衝液で平衡化した標準２．５×３０ｃｍ  Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  Ｓｕｌｆａｔｅカラムにロードし、カラムを、０．０５Ｍ塩化ナトリウムを含有する同じ緩衝液で次いで平衡化し、０．０５〜０．５Ｍ塩化ナトリウムを含有する緩衝液で勾配溶出を得た。活性画分を採集し、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．０を含有する）緩衝液に対して終夜透析した。
【００７７】
Ｃｅｌｌｕｌｉｄｅ  Ｓｕｌｆａｔｅ−ＩＩカラムを用いる定組成溶出によるＰＳｈｅｐＩＩの精製：これまでのステップからの透析した酵素溶液を、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．０を含有する）緩衝液で平衡化した標準２．５×３０ｃｍ  Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  Ｓｕｌｆａｔｅカラムに再びロードし、次いで、０．２５Ｍ塩化ナトリウムを含有する同じ緩衝液８００ｍｌで定組成的に溶出した。活性画分を、次いで採集した。
【００７８】
Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  Ｓｕｌｆａｔｅ−ＩＩＩカラム濃度：定組成溶出後に２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．０を含有する）緩衝液１容積を活性ＰＳｈｅｐＩＩ溶液に添加し、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．０を含有する）緩衝液で平衡化した２．５×３０ｃｍ  ＣＳカラムにロードした。カラムを、同じ緩衝液で平衡化し、０〜０．５Ｍ塩化ナトリウムを含有する同じ緩衝液の直線勾配で次いで溶出した。活性画分を採集し、プールし、３０ｋＤ限外濾過遠心管を使用して限外濾過によって１ｍＬに濃縮した。
【００７９】
精製過程の各ステップで得られた酵素活性及びタンパク質含有量を、以下の表４及び表５に示す：
【表４】
0006863626.tif 000005
【表５】
0006863626.tif 000006
【００８０】
実施例３：ヘパリナーゼＰＳｈｅｐＩ及びＰＳｈｅｐＩＩの特徴付け
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定したＰＳｈｅｐＩの分子量は、およそ７４７００Ｄａであった。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ質量分析で決定したＰＳｈｅｐＩの正確な分子量は、７４７９１Ｄａであった。等電点電気泳動で決定したＰＳｈｅｐＩの等電点は、７．７７であった。
【００８１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定したＰＳｈｅｐＩＩの分子量は、約９４０００Ｄａであり、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ質量分析で決定した正確な分子量は、９４７１６Ｄａであった。等電点電気泳動で決定したＰＳｈｅｐＩＩの等電点は、５．７６であった。
【００８２】
ヘパラン硫酸（ＨＳ）基質を、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．０を含有する）緩衝液に溶解して、１ｍｇ／ｍＬの濃度でヘパラン硫酸溶液を調製した。ヘパラン硫酸基質の濃度をそれぞれ０．１、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０ｍｇ／ｍＬに設定し、様々なヘパラン硫酸基質濃度での酵素の活性を測定して、ヘパラン硫酸について酵素のミハエリス定数を算出した。
【００８３】
ヘパリン（ＨＥＰ）基質を、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．０を含有する）緩衝液に溶解して、１ｍｇ／ｍＬの濃度でヘパリン溶液を調製した。ヘパリン基質の濃度をそれぞれ０．０１、０．０３、０．０５、０．１、０．２、０．４、０．５、０．６、０．８、１．０ｍｇ／ｍＬに設定し、様々なヘパリン基質濃度での酵素の活性を測定して、ヘパリンについて酵素のミハエリス定数を算出した。各条件下での酵素反応の初速度を異なる基質濃度で決定して、ミハエリス定数を決定した。
【００８４】
ＨＥＰ及びＨＳを基質として使用した場合、ＰＳｈｅｐＩのミハエリス定数をそれぞれ４．２０及び０．２８と決定した。ＨＥＰ及びＨＳを基質として使用した場合、ＰＳｈｅｐＩＩのミハエリス定数をそれぞれ０．０９及び０．２５と決定した。
【００８５】
実施例４：ＰＳｈｅｐＩ及びＰＳｈｅｐＩＩの基質特異性及び産物特異性
ＰＳｈｅｐＩの基質特異性に関する研究：ＰＳｈｅｐＩの活性を、基質としてヘパリン（ＨＥＰ）、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）及びデルマタン硫酸（ＤＳ）をそれぞれ使用して決定した。ＰＳｈｅｐＩは、ＣＳ及びＤＳを基質として使用した場合酵素活性を有さず、ＨＥＰ及びＨＳを基質として使用した場合に酵素活性を有し、活性比がＨＥＰ：ＨＳ＝約０．８７：１であることが判明した。
【００８６】
ＰＳｈｅｐＩＩの基質特異性に関する研究：ＰＳｈｅｐＩＩの活性を、基質としてヘパリン（ＨＥＰ）、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）及びデルマタン硫酸（ＤＳ）をそれぞれ使用して決定した。ＰＳｈｅｐＩＩ酵素は、ＣＳ及びＤＳを基質として使用した場合酵素活性を有さず、ＨＥＰ及びＨＳを基質として使用した場合に酵素活性を有し、活性比がＨＥＰ：ＨＳ＝約１：４．３であることが判明した。
【００８７】
ＨＥＰのＰＳｈｅｐＩ酵素的加水分解に関する二糖類分析：ＰＳｈｅｐＩの３ＩＵ（ヘパリンに基づく酵素活性）を、５０ｍｇヘパリンに添加し、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．０を含有する）緩衝液で５００μｌにし、３７℃で２４時間酵素的加水分解し、次いで１００℃水浴中に５分間置いて不活性化し、次いでサンプルの二糖類成分について液相分析を実施した。結果を、図２に示す。ＰＳｈｅｐＩによるＨＥＰの酵素的加水分解後、産物の主要な二糖類成分はＩＩＳ及びＩＳであり、ＩＳのピーク領域が６７．９２％を占めた。
【００８８】
実施例５：ヘパリナーゼＰＳｈｅｐＩの配列決定
Ｚ７シュードモナス・スタッツェリ株のゲノムＤＮＡを、キットの指示にしたがって「ＴＩＡＮａｍｐ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ＤＮＡ  Ｋｉｔ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」を使用することによって抽出した。その後、Ｚ７シュードモナス・スタッツェリ株の抽出したゲノムＤＮＡを配列決定して、Ｚ７シュードモナス・スタッツェリ株のゲノム配列を得た。
【００８９】
Ｚ７シュードモナス・スタッツェリから単離、精製したＰＳｈｅｐＩ酵素を、Ｋｕｍａｒａｔｈａｎ法（略してＫ法）によるゲル内消化に供し、その後ＭＡＬＤＩ分析して、ヘパリナーゼＰＳｈｅｐＩのペプチドスペクトルを得た。ペプチドスペクトルによって得られたタンパク質配列情報を、Ｚ７株のゲノム配列から得られたＯＲＦと整列して、ＰＳｈｅｐＩのコード配列（１９７１ｂｐ、配列番号１）及びアミノ酸配列（６５６アミノ酸残基、配列番号２）を最終的に得た。
【００９０】
実施例６：ＰＳｈｅｐＩ操作した細菌の調製
ＰＳｈｅｐＩの収率をさらに増大させるために（Ｚ７株の酵素収率は、約１５０ＩＵ／Ｌであった）、発明者らは、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）のコドン優先傾向にしたがってＰＳｈｅｐＩのコード配列にコドン最適化を実行し、ＰＳｈｅｐＩ酵素のＮ末端に６×Ｈｉｓタグを付加した。対応するコード配列を、ｐＥＴ−３０ａベクターにクローニングし、次いで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換して操作した株を得た。操作した細菌を発酵して、最高約１００００ＩＵ／Ｌ（Ｚ７株の収率は、約１５０ＩＵ／Ｌであった）の収率で操作した酵素を得た。操作した酵素並びに野生型の酵素の２３２ｎｍ終点吸光度値、分子量、ヘパリンを加水分解する効力及び収率は、一致しており、したがって、操作した酵素及び野生型の酵素が、実質的に同じ特性を有することを確認した。
【図１】
0006863626.tif 000007
【図２】
0006863626.tif 000008
【配列表】
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