(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分として六酸化四砒素（Ａｓ４Ｏ６）を含む脳癌予防または治療用薬学組成物であって、
前記六酸化四砒素は、以下の（i）乃至（iii）の特性
（i）格子定数：
ａ＝ｂ＝ｃ＝１１．０７３４Å
α＝β＝γ＝９０゜
Ｖ＝１３５７．８２Å３
（ii）Ａｓ−Ｏ結合長さ：１．７８６Å
（iii）Ｏ−Ａｓ−Ｏ結合角：９８．３６゜
を有する六酸化四砒素の結晶多形ａが９９重量％以上である
ことを特徴とする脳癌予防または治療用薬学組成物。
【請求項２】
前記六酸化四砒素は純度が９９．９％以上である
請求項１に記載の脳癌予防または治療用薬学組成物。
【請求項３】
前記結晶多形ａはＸ線粉末回折分光図で、光源波長が１．５４０６Åの時、回折角２θ＝１０〜５０°で１°／ｍｉｎの速度（scan step ０．０２°）で表示されたピークが１３．８４、２７．８８、３２．３２、３５．３、３９．８４、４２．３８、４６．３４、４８．６、及び４９．３４と示される
請求項１に記載の脳癌予防または治療用薬学組成物。
【請求項４】
有効成分として六酸化四砒素（Ａｓ４Ｏ６）を含む脳癌転移抑制用薬学組成物であって、
前記六酸化四砒素は、以下の（i）乃至（iii）の特性
（i）単位格子定数：
ａ＝ｂ＝ｃ＝１１．０７３４Å
α＝β＝γ＝９０゜
Ｖ＝１３５７．８２Å３
（ii）Ａｓ−Ｏ結合長さ：１．７８６Å
（iii）Ｏ−Ａｓ−Ｏ結合角：９８．３６゜
を有する六酸化四砒素の結晶多形ａが９９重量％以上である
ことを特徴とする脳癌転移抑制用薬学組成物。
【請求項５】
請求項１乃至３のうちのいずれか一項に記載の六酸化四砒素（Ａｓ４Ｏ６）を含む脳癌予防または治療用薬学組成物の製造方法であって、
塩化ナトリウムを１００〜８００℃に加熱した後、冷却する第１工程；
塩化ナトリウムの上に三酸化二砒素（Ａｓ２Ｏ３）を上げた後、密閉状態で１００℃から１０００℃まで加熱した後、冷却する第２工程；
濾過紙で結晶化された結晶を分離する第３工程；及び
前記第３工程で得た結晶を第２工程の三酸化二砒素の代わりに使用して第２工程及び第３工程を４〜１０回繰り返して六酸化四砒素結晶を得る第４工程；を含む方法により製造され、
前記第４工程で得た六酸化四砒素結晶は六酸化四砒素の結晶多形ａ（Ａｓ４Ｏ６−ａ）が９９重量％以上である
ことを特徴とする脳癌予防または治療用薬学組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、六酸化四砒素の結晶多形を含む脳癌予防または治療用薬学組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
癌は制御されない細胞成長と特徴付けられ、このような異常な細胞成長により腫瘍（tumor）と呼ばれる細胞塊りが形成されて周囲の組織に侵入し、甚だしい場合には身体の他の器官に転移されることもある。学問的には新生物（neoplasia）とも呼ばれる。癌は多様な程度の有病率で身体の全ての組織及び臓器に影響を及ぼす。
【０００３】
特に、脳癌（悪性脳腫瘍）の場合、脳に大きい損傷を起こして、生存率が非常に低い癌である。脳癌に対する既存の治療法には外科的な手術による摘出が最も効果的であるが、脳癌の種類や発生部位によって手術が不可能な場合が多いし、完全摘出時、手術後の合併症の危険性が非常に大きい。また、脳には薬物の侵入を抑制する血液脳関門（brain-blood barrier；ＢＢＢ）が存在するので、抗癌剤を用いた化学療法で脳癌を治療するためには、他の癌に比べて高濃度の抗癌剤投与が必要になって、身体の他の臓器に深刻な副作用を誘発するようになる問題点がある
【０００４】
したがって、脳癌治療と関連してＢＢＢ通過に難しさがない、かつ坑癌効果が優れる治療剤が持続的に要求されている実状である。
【０００５】
一方、本発明者らは既に砒素が含まれた自然産信石から分離精製技術を通じて精製された六酸化四砒素が動物実験で癌転移抑制効果を表しており、併せて、子宮癌、膀胱癌、肺癌、上顎洞癌、腎臓癌などの末期癌患者に投与した時、優れる坑癌治療効果があるという技術的特徴として特許登録（特許文献１）を受けたことがある。
【０００６】
本発明者らが砒素に対する持続的な研究結果、前記特許登録に開示された方法と異なる新規な製造方法により、六酸化四砒素の結晶多形ａが９９％以上である六酸化四砒素を製造することができ、このような六酸化四砒素を含む組成物が特に脳癌予防または治療に顕著な効果があることを明らかにして、本発明を完成するようになった。
【０００７】
一方、従来の六酸化四砒素が悪性神経膠腫（malignant glioma）の細胞侵襲抑制を誘導する点が報告されたが（非特許文献１）、前記文献には六酸化四砒素がどんな結晶多形を有するかに対して開示されたところがないだけでなく、前記文献に記載された六酸化四砒素より、本発明の製造方法により製造された、六酸化四砒素の結晶多形ａが９９％以上である組成物がより優れる脳癌治療効果があると確認された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】韓国特許登録第２７２８３５号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】J Neurosurg 121:1483-1491、2014
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、有効成分として六酸化四砒素（Ａｓ４Ｏ６）の結晶多形を含む脳癌予防または治療用薬学組成物を提供することにある。
【００１１】
本発明の他の目的は、有効成分として六酸化四砒素（Ａｓ４Ｏ６）の結晶多形を含む脳癌予防または治療用薬学組成物の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は六酸化四砒素（Ａｓ４Ｏ６）の結晶多形を含む脳癌予防または治療用薬学組成物であって、六酸化四砒素の結晶多形ａ（Ａｓ４Ｏ６−ａ）を９９％以上含む薬学組成物に関するものである。
【００１３】
前記組成物は、六酸化四砒素の結晶多形ｂ（Ａｓ４Ｏ６−ｂ）を１％未満に含むことができる。
【００１４】
前記六酸化四砒素は、純度が９９．９％以上でありうる。
【００１５】
前記Ａｓ４Ｏ６−ａ及びＡｓ４Ｏ６−ｂは、以下の（i）乃至（iii）の特性を有するものでありうる：
【００１６】
【表１】
0006824431.tif 000002
【００１７】
前記Ａｓ４Ｏ６−ａはＸ−線粉末回折分光図で、光源波長が１．５４０６Åの時、回折角２θ １０°〜５０°の範囲で１°／ｍｉｎの速度（scan step ０．０２°）で表示されたピークが１３．８４、２７．８８、３２．３２、３５．３、３９．８４、４２．３８、４６．３４、４８．６、及び４９．３４と示されることを特徴とする結晶形である（図１参照）。また、２θ値１３．８と２７．９で示される主ピークの割合が１:１．３であることを特徴とする。
【００１８】
前記Ａｓ４Ｏ６−ｂはＸ−線粉末回折分光図で、光源波長が１．５４０６Åの時、回折角２θ １０°〜５０°範囲で１°／ｍｉｎの速度（scan step ０．０２°）で表示されたピークが１３．８６、２７．９２、３２．３６、３５．３４、３９．９、４２．４４、４６．４、４８．６６、及び４９．４と示されることを特徴とする結晶形である（図１参照）。また、２θ値１３．８と２７．９で示される主ピークの割合が１：２．５であることを特徴とする。
【００１９】
本発明の他の態様によれば、有効成分として六酸化四砒素（Ａｓ４Ｏ６）の結晶多形を含む脳癌転移抑制用薬学組成物であって、六酸化四砒素の結晶多形ａを９９％以上含む脳癌転移抑制用薬学組成物に関するものである。
【００２０】
本発明の他の態様によれば、有効成分として六酸化四砒素（Ａｓ４Ｏ６）の結晶多形を含む脳癌予防または治療用薬学組成物の製造方法であって、
【００２１】
塩化ナトリウムを１００〜８００℃に加熱した後、冷却する第１工程；
【００２２】
塩化ナトリウムの上に三酸化二砒素（Ａｓ２Ｏ３）を上げた後、密閉状態で１００℃から１０００℃まで加熱した後、冷却する第２工程；
【００２３】
濾過紙で結晶化された結晶を分離する第３工程；及び
【００２４】
前記第３工程で得た結晶を第２工程の三酸化二砒素の代わりに使用して第２工程及び第３工程を４〜１０回繰り返して六酸化四砒素結晶を得る第４工程；
【００２５】
を含む方法により製造され、
【００２６】
前記第４工程で得た六酸化四砒素の結晶が六酸化四砒素の結晶多形ａ（Ａｓ４Ｏ６−ａ）を９９％以上含むことを特徴とする、脳癌予防または治療用薬学組成物の製造方法に関するものである。
【００２７】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００２８】
本発明は、有効成分として六酸化四砒素（Ａｓ４Ｏ６）を含む脳癌予防または治療用組成物であって、六酸化四砒素の結晶多形ａ（Ａｓ４Ｏ６−ａ）を９９％以上含む組成物に関するものである。
【００２９】
本発明の脳癌予防または治療用組成物の製造方法は、塩化ナトリウムを１００〜８００℃に加熱した後、冷却する第１工程；塩化ナトリウムの上に三酸化二砒素（Ａｓ２Ｏ３）を上げた後、密閉状態で１００℃から１０００℃まで加熱した後、冷却する第２工程；濾過紙で結晶化された結晶を分離する第３工程；及び前記第３工程で得た結晶を第２工程の三酸化二砒素の代わりに使用して第２工程及び第３工程を４〜１０回繰り返して六酸化四砒素の結晶を得る第４工程；を含む。
【００３０】
高嶺土材質の合成反応器、及び合成反応器の上部にフィルターが装着できるクランプを準備し、合成反応器内に塩化ナトリウムを上げて、加熱及び冷却を進行する。本発明の製造方法で塩化ナトリウムを使用する理由は、第２工程で三酸化二砒素を塩化ナトリウムの上に上げて加熱することによって、砒素化合物に熱が均等に伝達されながら砒素化合物が昇華することに助けになるためであり、第１工程を通じてこのような塩化ナトリウムの不純物及び水分を除去するために１００〜８００℃に２〜６時間の間加熱する。第１工程において、塩化ナトリウムを加熱した後、室温で３〜１０時間の間冷却する。
【００３１】
次に、塩化ナトリウムの上に三酸化二砒素（Ａｓ２Ｏ３）を上げた後、密閉状態で１００℃から１０００℃まで加熱し、以後、冷却する第２工程を進行する。ここで、三酸化二砒素を上げた後、クランプに昇華される砒素が捕集できるフィルター（濾過紙）を各フィルターとフィルターとの間の間隔が２ｍｍ〜６ｍｍになるように３〜６個装着する。この時に使われるフィルターは、平量（basic weight）７０〜１００ｇ／ｍ２、厚さ（thickness）０．１７〜０．２５ｍｍ、濾過速度（filtration speed）２２〜３０ｓ／１００ｍｌ、及び保留粒子径（retention rate）５〜１０μｍのものを使用することが好ましい。
【００３２】
フィルターを装着してから密閉させた後、合成反応器の下部に１００℃から１０００℃まで段階的に上げながら３時間〜１０時間の間加熱して濾過紙の最上部の中心部の温度は１５０℃±１００℃維持されるようにし、濾過紙を通過しながら六酸化四砒素が結晶化されるようにする。そして、常温で５時間以上、好ましくは５時間〜１０時間の間冷却する。
【００３３】
次に、離隔して積層に設置された３〜６個の濾過紙に捕集された白色結晶を分離する第３工程を遂行する。
【００３４】
合成反応器の塩化ナトリウムの上に残留する微量の三酸化二砒素を除去した後、前記捕集された白色結晶を上げた後、第２工程及び第３工程を同一条件で４〜１０回繰り返して最終的に六酸化四砒素結晶を収得する。本発明の製造方法により得られた結晶構造を確認した結果、大部分Ａｓ４Ｏ６−ａであり、Ａｓ４Ｏ６−ａが９９％以上であると確認された。
【００３５】
本発明の六酸化四砒素の結晶多形を含む薬学組成物は、脳癌の予防または治療に有用に使用できる。
【００３６】
本発明の薬学組成物は各々通常の方法によって、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアゾールなどの経口型剤形、外用剤、坐剤、及び滅菌注射溶液の形態に剤形化して使用できる。前記薬学組成物に含まれることができる担体、賦形剤、及び希釈剤には、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、非晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシ安息香酸、プロピルヒドロキシ安息香酸、タルク、マグネシウムステアレート、及び鉱物油を挙げることができる。製剤化する場合には、普通使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤、または賦形剤を使用して調剤される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれて、このような固形製剤は本発明の六酸化四砒素に少なくとも１つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロースまたはラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤の以外にマグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も使われる。経口のための液状製剤には、懸濁剤、内用液剤、油剤、シロップ剤などが該当されるが、よく使われる単純希釈剤である水、リキッドパラフィンの以外に、さまざまな賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれることができる。非経口投与のための製剤には滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、油剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステルなどが使用できる。坐剤の基剤には、ウィテップゾール（witepsol）、マクロゴール、ツイーン（tween）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用できる。
【００３７】
前記薬学組成物の投与量は治療を受ける対象の年齢、性別、体重と、治療する特定疾患または病理状態、疾患または病理状態の深刻度、投与経路及び処方者の判断によって変わる。このような因子に基づいた投与量の決定は当業者の水準内にあり、一般的に投与量は０．０１ｍｇ／ｋｇ／日乃至略５００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。より好ましい投与量は０．１ｍｇ／ｋｇ／日乃至１００ｍｇ／ｋｇ／日である。投与は１日に１回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。前記投与量はどんな面でも本発明の範囲を限定するものではない。
【００３８】
前記薬学組成物は、ネズミ、家畜、ヒトなどの哺乳動物に多様な経路に投与できる。投与の全ての方式は予想できるが、例えば、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内粘膜、または脳血管内注射により投与できる。
【発明の効果】
【００３９】
本発明の脳癌予防または治療用組成物は、六酸化四砒素の結晶多形ａを９９％以上含むことによって、優れる坑癌効果を有する。
【００４０】
また、本発明の組成物は、特に脳膠芽腫などの脳癌転移を抑制する効果に優れることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】Ａｓ４Ｏ６−ａ及びＡｓ４Ｏ６−ｂのＸ−線粉末回折分光図
【図２】Ｕ−８７ＭＧ細胞株に実施例１、及び比較例１乃至３を処理し、４８時間（図２Ａ）及び７２時間（図２Ｂ）培養した後、ＭＴＴアッセイにより細胞増殖抑制効果を評価した結果グラフ
【図３】Ｕ−１１８ＭＧ細胞株に実施例１、及び比較例１乃至３を処理し、４８時間（図３Ａ）及び７２時間（図３Ｂ）培養した後、ＭＴＴアッセイにより細胞増殖抑制効果を評価した結果グラフ
【図４】大脳神経膠腫症と診断された患者（臨床試験−１）の治療前のＭＲＩ写真であって、Ｔ２強調横断面ＳＥ映像（T2 weighted axial SE images）
【図５】臨床試験−１の大脳神経膠腫症患者に対する実施例１の投与及び放射線治療２ケ月後の腫瘍サイズが減少したことを示すＭＲＩ写真であって、Ｔ２強調横断面ＳＥ映像
【図６】臨床試験−１の大脳神経膠腫症患者に対する実施例１の投与及び放射線治療３ケ月後のＭＲＩ写真であって、腫瘍がほとんど消えることを示すＴ２強調横断面ＳＥ映像
【図７】左側頭頂側頭葉（left parieto-temporal lobe）に膠芽腫があると診断された患者（臨床試験−２）の治療前のＭＲＩ写真であって、図７ＡはＴ２強調横断面ＳＥ映像（T2 weighted axial SE images）であり、図７Ｂは造影増強後のＴ１強調横断面ＳＥ映像（Post-contrast T1 weighted axial S2 images）
【図８】臨床試験−２の膠芽腫患者に対する手術及び放射線治療後のＭＲＩ写真であって、図８ＡはＴ２増強ＳＥ＆ＦＬＡＩＲ映像（T2 weighted SE & FLAIR images）であり、図８ＢはＴ２強調横断面ＳＥ映像
【図９】臨床試験−２の膠芽腫患者に対する実施例１の投与４ケ月（図９Ａ）、７ケ月（図９Ｂ）、及び１０ケ月（図９Ｃ）後の各々のＭＲＩ写真であって、Ｔ１強調横断面ＳＥ映像
【図１０】Ｕ−８７ＭＧ細胞株をＢａｌｂ／Ｃ雌ヌードマウスに接種した後、腫瘍映像信号抑制結果を示した写真（図１０Ａ）及びグラフ（図１０Ｂ）である。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
以下、本発明の好ましい実施例を詳細に説明する。しかしながら、本発明はここで説明される実施例に限定されず、他の形態に具体化されることもできる。むしろ、ここで紹介される内容が徹底し完全になり、当業者に本発明の思想を十分に伝達するために提供するものである。
【００４３】
実施例１：本発明の六酸化四砒素の製造
【００４４】
高嶺土で特殊製作された合成反応器（高さ１００ｍｍ、直径１９０ｍｍ）と、３〜６個のフィルターを装着することができるクランプを準備する。クランプは合成反応器から５０ｍｍ離れて１次クランプを設置し、前記１次クランプから２〜６ｍｍ間隔でその上部に２次〜６次クランプを設置し、この際、各クランプの規格は直径２１０ｍｍ及び厚さ１０ｍｍである。
【００４５】
称量した太い塩（水分含有量１０％以下）４００ｇ〜６００ｇを合成反応器に投入して２０ｍｍ内外に厚さを均等に押し固めて１００℃〜８００℃で３時間の間熱を徐々に加熱しながら反応器の内部の塩表面温度が２９０±３０℃になるように連続加熱して水分及び不純物を除去し、室温で５時間の間冷却させる。
【００４６】
原料物質であるＡｓ２Ｏ３（純度９８％以上、製造社YUNNAN WENSHAN JINCHI ARSENIC CO., LTD.）１００ｇを合成反応器内の太い塩の上に入れて、合成機の上部に位置した昇華される砒素が捕集できるフィルター（濾過紙）を各フィルターとフィルターとの間の間隔が２〜６ｍｍになるように３〜６個のクランプを装着する。この時に使われるフィルターは、平量（basic weight）７０〜１００ｇ／ｍ２、厚さ（thickness）０．１７〜０．２５ｍｍ、濾過速度（filtration speed）２２〜３０ｓ／１００ｍｌ、及び保留粒子径（retention rate）５〜１０μｍのものを使用することが好ましい。
【００４７】
クランプを用いてフィルターを固定させ、合成反応器の下部に熱を加えて１００℃から１，０００℃まで段階的に温度を上げる。まず、合成反応器の下部の外部温度を３５０℃±１００℃位になるように１時間の間加熱し、以後に合成反応器の下部の外部温度を６００〜６５０℃、及び７００〜１，０００℃位になるように加熱して、総５時間〜１０時間の間加熱してフィルターの最上部の濾過紙の中心部の温度が１５０℃±１００℃を維持するようにした後、常温で５〜７時間位冷却する。この過程で、合成反応器の塩の上に上がっている粉末Ａｓ２Ｏ３は合成反応器の内部で気体に変わって上昇してから、合成反応器の外部の上部温度が相対的に低いので、液体に変わり、以後、固体に結晶化されてフィルター上に白色結晶体が生成される。
【００４８】
採取した白色結晶体を合成反応器の太い塩の上に入れて、また加熱及び冷却し、結晶を採取する工程をまた４回繰り返して最終的に結晶１２．０ｇを得た。得られた砒素化合物の結晶の構造を確認した結果、大部分Ａｓ４Ｏ６−ａであり、Ａｓ４Ｏ６−ａが９９重量％以上であり、Ａｓ４Ｏ６−ｂが１重量％未満であると確認された。
【００４９】
ＤＳＣ（示差走査熱分析）値が昇温速度が１０℃／ｍｉｎの時、Ａｓ４Ｏ６−ａは２８２．６７℃である点で吸熱ピーク（融点）が示されることが確認されており、Ａｓ４Ｏ６−ｂは２８６．７７℃である点で吸熱ピーク（融点）が示されることが確認された。
【００５０】
Ａｓ４Ｏ６−ａ及びＡｓ４Ｏ６−ｂの粉末Ｘ線回折分光図を図１に図示し、Ａｓ４Ｏ６−ａ及びＡｓ４Ｏ６−ｂの回折データは次の表２の通りである。
【００５１】
【表２】
0006824431.tif 000003
【００５２】
図１及び表２から確認できるように、Ａｓ４Ｏ６−ａは２θ値１３．８と２７．９で示される主ピークの割合が１：１．３で、Ａｓ４Ｏ６−ｂは２θ値１３．８と２７．９で示される主ピークの割合が１：２．５であることを特徴とする。製造された化合物のＤＳＣ分析、構造決定、及びＸ線回折分析は、次のような方法により遂行した。
【００５３】
（１）ＤＳＣ分析
【００５４】
ＤＳＣ装備（SDT Q600 V20.9 Build 20）で、Ｎ２ １００ｍＬ／ｍｉｎを流しながら１０℃／ｍｉｎ昇温速度で３１０℃まで上昇させながら試料２０．０ｍｇを分析した。
【００５５】
（２）Ｘ線結晶学
【００５６】
六酸化四砒素（Ａｓ４Ｏ６、ＭＷ＝３９５．６）の単結晶をglass fiberの上に上げた後、X-ray beamを照射して回折されて出る写真紋と回折データの体系性の有無を観察して空間群（space group）を決定し、単位格子定数（cell parameter）を決定する。回折強さは１０゜＜２θ＜５０゜範囲で収集する。このデータを構造結晶プログラム（ＳＨＥＬＸＴＬプログラム）を使用して重原子方法（Patterson方法）によりＡｓ４Ｏ６の結晶構造を確認する。
【００５７】
（３）Ｘ線回折分析法
【００５８】
収得した結晶を粉砕して１０μｍ〜３０μｍ（−３２５メッシュ）の粒子に作り、Ｘ−線回折分析用ガラスホルダー（２０ｍｍ×１６ｍｍ×１ｍｍ）に充填させた後、ガラススライドなどで圧着させ、検体面とホルダー面が平行をなすように滑らかにして試料を準備した。ＸＲＤのＣｕ Ｋα１（１．５４０６０Å）を用いて２θ １０°〜５０°範囲で１°／ｍｉｎの速度（scan step ０．０２°）で結晶のＸ−線回折分光図を描く。
【００５９】
比較例１：六酸化四砒素の製造
【００６０】
高嶺土で特殊製作された合成反応器（高さ１００ｍｍ、直径１９０ｍｍ）と、３〜６個のフィルターが装着できるクランプを準備する。クランプは合成反応器から５０ｍｍ離れて１次クランプを設置し、前記１次クランプから２〜６ｍｍ間隔でその上部に２次〜６次クランプを設置し、この時の各クランプの規格は直径２１０ｍｍ及び厚さ１０ｍｍである。
【００６１】
称量した太い塩（水分含有量１０％以下）４００ｇ〜６００ｇを合成反応器に投入して２０ｍｍ内外に厚さを均等に押し固めて１００℃〜８００℃３時間の間熱を徐々に加熱しながら反応器の内部の塩表面温度が２９０±３０℃になるように連続加熱して水分及び不純物を除去し、室温で５時間の間冷却させる。
【００６２】
原料物質であるＡｓ２Ｏ３（純度９８％以上、製造社YUNNAN WENSHAN JINCHI ARSENIC CO., LTD.）１００ｇを合成反応器内の太い塩の上に入れて、合成機の上部に位置した昇華される砒素が捕集できるフィルター（濾過紙）を各フィルターとフィルターとの間の間隔が２〜６ｍｍになるように３〜６個のクランプを装着する。この時に使われるフィルターは、平量（basic weight）７０〜１００ｇ／ｍ２、厚さ（thickness）０．１７〜０．２５ｍｍ、濾過速度（filtration speed）２２〜３０ｓ／１００ｍｌ、及び保留粒子径（retention rate）５〜１０μｍのものを使用することが好ましい。
【００６３】
クランプを用いてフィルターを固定させ、合成反応器の下部に熱を加えて１００℃から１，０００℃まで段階的に温度を上げる。まず、合成反応器の下部の外部温度を３５０℃±１００℃位になるように１時間の間加熱し、以後に合成反応器の下部の外部温度を６００〜６５０℃、及び７００〜１，０００℃位になるように加熱して、総５時間〜１０時間の間加熱してフィルターの最上部濾過紙の中心部の温度が１５０℃±１００℃を維持するようにした後、常温で５〜７時間位冷却する。この過程で、合成反応器の塩の上に上がった粉末Ａｓ２Ｏ３は合成反応器の内部で気体に変わって上昇してから合成反応器の外部の上部温度が相対的に低いので液体に変わり、以後、固体に結晶化されてフィルター上に白色結晶体が生成される。フィルターから４８．５ｇの結晶を採取した。採取した砒素化合物の結晶構造を確認した結果、９９％以上が大部分Ａｓ４Ｏ６−ｂであると確認された。
【００６４】
比較例２乃至４：六酸化四砒素の製造
【００６５】
実施例１（結晶多形Ａｓ４Ｏ６−ａが９９％以上である組成物）と比較例１（結晶多形Ａｓ４Ｏ６−ｂが９９％以上である組成物）を各々４：１、及び１：１に混合して、各々比較例２及び比較例３にした。
【００６６】
実験例１：ヒト神経膠腫（human glioma）細胞増殖抑制効果実験
【００６７】
１−１．細胞増殖アッセイ（ＭＴＴアッセイ）
【００６８】
（１）実験材料及び細胞培養
【００６９】
牛胎兒血清（ＦＢＳ）と細胞培養培地を準備し（Hyclone社）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、３−（４，５−ジメチル−チアゾール−２イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（３−（４，５−dimetyl-thiazol-２yl）−２，５−diphenyltetrazolium bromide、ＭＴＴ）を準備した（Amresco LLC、ＵＳＣ）。
【００７０】
ヒトの癌細胞株であって、ヒト脳膠芽腫細胞株（human brain glioblastoma cells）であるＵ−８７ＭＧ及びＵ−１１８ＭＧ細胞株を中国科学アカデミーの上海細胞銀行から入手し、細胞培養条件によって１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｍ／ｍＬストレプトマイシンが含まれたＥＭＥＭ（Eagle’s Minimum Essential Medium）培地を用いて５％ＣＯ２及び９５％空気と湿気がある状態の培養器で細胞を培養した。培地は３日毎に交替した。
【００７１】
（２）細胞増殖アッセイ（ＭＴＴアッセイ）
【００７２】
実施例１、及び比較例１乃至３の細胞増殖に対する効果をＭＴＴアッセイを用いて評価した。ＭＴＴアッセイはＭＴＴに対して生きている細胞が不溶性暗青色ホルマザン反応物を生成する能力に基盤する。トリプシン処理により細胞を培地に浮遊させて集めた後、４×１０３細胞／ウェル（cells／well）の密度で９６−ウェル培養ディッシュ（Costar、Cambridge、ＭＡ、ＵＳＡ）に分株される。２４時間後に、処理試料として実施例１、及び比較例１乃至３の各々を０、０．６２５、１．２５、２．５、５、１０、２０、４０、または８０μMになるように１０％ＦＢＳを含む培地が入っている細胞に添加した後、培養した。実施例１、及び比較例１乃至３は、５×１０−２Ｍ濃度で貯蔵溶液として１Ｍ水酸化ナトリウムに溶解した。４８時間及び７２時間培養し、細胞増殖に対するＭＴＴアッセイを遂行し、各時間間隔の最後に上澄液を除去し、ウェル（well）当たり５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ溶液を２０μＬずつ添加してからホルマザン結晶を形成するために３７℃で４時間の間インキュベーションした。インキュベーション後に、上澄液をまた除去し、ＤＭＳＯを全てのウェル当たり１００μＬずつ添加し、暗青色結晶を完全に溶解するように混合した。室温で１５分間放置して全ての結晶が完全に溶解されるようにし、５７０ｎｍ（Ａ５７０ｎｍ）波長でマイクロ−プレート機で吸光度を測定した。
【００７３】
（３）統計分析
【００７４】
試料を処理しない対照群の吸光度値を１００として計算し、前記対照群対比試料を処理した処理群の吸光度値を較正（calibration）し、細胞増殖抑制率を以下の式によって計算した。
【００７５】
細胞増殖抑制率（％）＝（（対照群細胞の平均吸光度−処理群細胞の平均吸光度）／対照群細胞の平均吸光度）×１００
【００７６】
全てのデータは平均±標準誤差（means±ＳＥＭ）で表現される。１元配置分散分析（one-way analysis of variance、ＡＮＯＶＡ）後、ダネットの事後検証（Dunnett’s post-test）により多重比較を遂行した。留意水準はｐ＜０．０５であり、各実験は３回ずつ反復された。
【００７７】
（４）Ｕ−８７ＭＧ細胞株利用実験結果
【００７８】
実施例１、及び比較例１乃至３をヒト脳膠芽腫細胞株であるＵ−８７ＭＧに処理してから、４８時間及び７２時間培養し、ＭＴＴアッセイを遂行した結果は、図２に示した。実施例１を処理した後、４８時間（図２Ａ）及び７２時間（図２Ｂ）培養した実験結果全てで、比較例１を処理した場合に比べて脳膠芽腫細胞の増殖抑制率の高いことが確認された。また、実施例１と比較例１が４：１に混合された比較例２や、１：１に混合された比較例３に比べて、実施例１が脳膠芽腫細胞の増殖抑制率の高いことが確認された。
【００７９】
（５）Ｕ−１１８ＭＧ細胞利用実験結果
【００８０】
実施例１、及び比較例１乃至３をヒト脳膠芽腫細胞株であるＵ−１１８ＭＧに処理してから、４８時間及び７２時間培養し、ＭＴＴアッセイを遂行した結果は、図３に示した。実施例１を処理した後、４８時間（３Ａ）及び７２時間（図３Ｂ）培養した実験結果全てで、比較例１に比べて膠芽腫細胞の増殖抑制率の高いことが確認された。また、実施例１と比較例１が４：１に混合された比較例２や、１：１に混合された比較例３に比べて、実施例１が脳膠芽腫細胞の増殖抑制率の高いことが確認された。
【００８１】
実験例２：臨床試験
【００８２】
実施例１の組成物を用いて次のように臨床試験を施行した。
【００８３】
（１）臨床試験−１：５１歳女性患者
【００８４】
自覚症状はなかったが、健康検診で脳病変が発見された女性患者であって、ソウル大学病院で行なった脳組織検査で大脳神経膠腫症（gliomatosis cerebri；病理的診断は退形成星細胞腫（anaplastic astrocytomas）である）診断を受けており、診断日後、１０日目の日から両腕の運動性弱化及び震い症状が現れ始まった以後、症状が急速に進行された。診断日後、１７日目の日から一日に１５ｍｇずつ実施例１を投与し、運動性弱化及び震い症状が改善され始めた。診断日後２７日目〜７５日目までの期間の間放射線治療を併行し、以後に症状が完全に消えた。この患者の治療前のＭＲＩ写真は図４に示し、実施例１の投与と共に放射線治療２ケ月及び３ケ月後の写真は各々図５及び図６に示した。
【００８５】
（２）臨床試験−２：１６歳女性患者
【００８６】
頭痛、嘔吐、複視（diplopia）、及び視野障害症状を示した患者であって、左側頭頂側頭葉（left parieto-temporal lobe）に膠芽腫（glioblastoma、left parieto-temporal lobe）があると診断された。診断日後、３日目の日、腫瘍除去手術を受けて、病理学的診断結果、ＷＨＯ等級ＩＶ／ＩＶの膠芽腫であると確認されて、診断日後、４５日目〜９０日目までの期間の間放射線とTremodal（６１．２Ｇｙ／３３ｆｘ）治療をし、放射線及びTremodal治療後、相変らずＭＲＩ上、残存腫瘍が確認された。診断日後、９５日目から１日に３回ずつ５ｍｇの実施例１を１７ケ月間投薬した。実施例１の投与を受けてから２ケ月以後から自覚症状がなかったし、残存腫瘍のサイズが実施例１の服用後、減少したことが確認された。この患者の治療前のＭＲＩ写真は図７に示し、手術及び放射線治療後のＭＩＲ写真は図８に示し、実施例１の投与４ケ月、７ケ月、及び１０ケ月後の各々のＭＲＩ写真は、図９Ａ、図９Ｂ、及び９Ｃとして示した。
【００８７】
臨床試験結果を通じて、本発明の組成物は血液脳関門（brain-blood barrier；ＢＢＢ）を通過して膠芽腫のような悪性脳腫瘍の増殖を効果的に抑制する効果があると確認された。
【００８８】
実験例３：ヒト脳膠芽腫移植動物モデルでの体内薬効試験
【００８９】
（１）実験方法
【００９０】
ヒト脳膠芽腫株Ｕ−８７ＭＧ（ＡＴＣＣから購入）を温度３７℃、５％ＣＯ２及び９５％空気条件下の培養器で１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μＬ／ｍＬストレプトマイシンが含まれたＥＭＥＭ（Eagle’s Minimum Essential Medium）培地を用いて培養した。培地は３日毎に交替した。
【００９１】
ルシフェラーゼで表記したＵ−８７ＭＧ細胞を体重１６〜１９ｇのＢａｌｂ／Ｃ雌ヌードマウス１５頭の脳の中に脳原発部位接種を進行し、細胞接種量は５×１０５／５ｕＬとした。動物の手術部位が回復し、腫瘍細胞が少し成長した接種日から６日目の日、動物に対して映像検査を実施し、映像結果によってランダムに各グループ別の４頭ずつ２グループに分けて、試験群には実施例１を生理食塩水（NaCl ０．９％）に溶解した溶液を投与し、対照群には試験群に使われた溶媒である生理食塩水のみを投与することにした。２グループの動物は各々毎日１回ずつ生理食塩水または２．２５ｍｇ／ｋｇの実施例１を投与し、投与容量は実験動物の体重１０ｕＬ／ｇとした。投与過程に動物体重と健康状態を続けて検査し、同時に映像検査を進行する。体重が過度（＞２０％）減少あるいは健康状態がよくない動物に対して安楽死させ、腫瘍を除去してホルマリン固定を行い、以後、組織学検査を進行する。
【００９２】
（２）体重測定結果
【００９３】
薬物投与後、９日経過時、次のように試験群動物の体重はほとんど変化がなかったが、対照群動物の体重減少がより大きく表れた。
【００９４】
【表３】
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【００９５】
また、実験過程で対照群動物は細胞接種１５日が経過しながら体重が顕著に下降し、１７〜１９日位に動物が死亡し始めた。
【００９６】
（３）腫瘍映像信号抑制結果
【００９７】
また、腫瘍映像信号抑制結果を確認した結果、図１０Ａのように投薬７日目（接種日から１３日目）から対照群動物は腫瘍信号の強度が大きく、腫瘍の脊椎転移によって脊椎で腫瘍信号が分布することが示されたことに比べて、試験群動物の腫瘍信号は脊椎でほとんど確認されず、その強度も遥かに少ないことが示された。図１０Ｂから確認されるように、投薬７日目及び９日目（細胞接種日から１３日目及び１５日目）の対照群及び試験群の生体映像結果を比較して見ると、対照群で腫瘍の増殖及び転移による発光信号強度が試験群に比べて遥かに大きく示される点が確認される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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