(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−ラウリルサルコシンまたはその塩を有効成分として含み、Ｎ−ラウリルサルコシンまたはその塩の濃度が４〜５５質量％である、生体組織透明化用組成物。
【請求項２】
前記組成物は、尿素、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート））、ＣＨＡＰＳＯ（３−[（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート））、スクロース、フルクトース、グリセロール、ジアトリゾ酸、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ−２０）、２−２−チオジエタノール、イオヘキソールからなる群より選択される１種以上をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の生体組織透明化用組成物。
【請求項３】
前記生体組織は、脳、血管、肝臓、肺、腎臓、膵臓又は腸であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の生体組織透明化用組成物。
【請求項４】
固定化された生体組織を請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物と接触させて透明化させるステップを含むことを特徴とする、生体組織の透明化方法。
【請求項５】
前記固定化された生体組織は、パラホルムアルデヒド、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ジプロピレングリコールジグリシジルエーテル、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、グルタルアルデヒド及びポリアクリルアミドからなる群より選択される１種以上により固定化された生体組織であることを特徴とする、請求項４に記載の生体組織の透明化方法。
【請求項６】
前記方法は、固定化された生体組織をＮ−ラウリルサルコシン又はその塩で前処理するステップをさらに行うことを特徴とする、請求項４又は５に記載の生体組織の透明化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体組織透明化用組成物及びそれを用いた生体組織の透明化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｘ線を通じた医療診断技術は、ＣＴやＭＲＩのような２次元スキャニングを行った後に３次元で再構成する技術によって立体的に観察し、精巧に診断することができる技術として発展してきた。光源ではない超音波などを活用する場合も３次元的な映像を具現する技術が診断に活発に用いられている。しかし、現在開発された技術の大部分はミリメートルレベルの相対的にマクロ分解能を有した技術であって、細胞レベルでの分析が可能なマイクロレベルの３次元で測定する技術は、相対的にその発展が充分でなく、現在大部分の細胞レベルの分析は伝統的な２次元技術を用いている。すなわち、生検又は剖検組織など生体組織を固定液で固定した後、パラフィン又はポリマーで包埋した後、数マイクロメートル又はナノメートルの厚さで切片を作り、光や電磁波が透過するようにした後、透過イメージを光学又は電子顕微鏡を用いて取得する技術を用いて微細構造を分析する。
【０００３】
このような微細イメージング技術を用いて３次元イメージを獲得するためには、共焦点顕微鏡などを用いる必要があり、この場合、一般的に数十マイクロメートルレベルの厚さ情報を獲得することができる。大略的にこの厚さは、光源が浸透できる深さによってその限界が決定される。しかし、大部分の生体組織内の有意な構造物が数百マイクロメートル以上のサイズを有しているので、このような方法では一部の情報のみを取得することができる。したがって、より厚い組織内のイメージを獲得するためには、数十マイクロ厚さの連続的な切片を製作し、これを一つずつ顕微鏡で通じてイメージングした後、さらに再構成する一連の過程を必要とする。特に、脳組織の場合、一つのニューロン全体をイメージングするとき、場合に応じては、一つのニューロンが数ｍまでもその軸索を延ばすので、組織を切って付ける一連の過程を進行するうち発生できる問題点が幾何級数的に発生する。
【０００４】
組織の透明化技術は、組織の損傷なしに組織内部の構造及びタンパク質の分布を確認することができるので、既存の技術の観察限界を超えてより深い所まで組織構造を観察し、多様な器官系から統合的な構造と分子情報の接近を可能とするので、最近多様な方法で組織を透明化する技術が開発された。
【０００５】
従来、組織の透明化技術としては、有機溶媒を用いた組織透明化過程であるＳｐａｔｌｅｈｏｌｚ、ＢＡＢＢ、Ｓｃａｌｅ  Ｓ、ｉＤＩＳＣＯ法と、ポリマー注入法であるＡＣＴ（ａｃｔｉｖｅ  ＣＬＡＲＩＴＹ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）法によって処理された組織の抗原保存性が報告されたものがある。ＡＣＴを除いた他の方法の場合、蛍光と抗原の保存性が減少する問題を有している。ＡＣＴの場合、９０％以上の抗原保存性があり、これはＣＬＡＲＩＴＹのように固定されたタンパク質に追加でヒドロゲルポリマーとの結合を必要とする方法に比べてより高い保存性を示す。しかし、強い組織固定過程は抗原性の損失を誘発して使用可能な抗体が減少するなどの問題点を考慮しなければならないので、多様な技術の改善が必要である。
【０００６】
また、最近開発された組織の透明化方法である「ＣＬＡＲＩＴＹ」基盤技術は、組織内のＨｙｄｒｏｇｅｌを追加してＤＮＡやタンパク質など診断に重要な重要物質を保持する一種の組織内の網支持体を作った後、脂質のみを選択的に除去する方法を用いる（非特許文献１、Ｃｈｕｎｇ  Ｋ、ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ  ４９７（７４４９）：３３２−３３７参照）。
【０００７】
しかし、前記方法は、ヒドロゲル支持体を組織に浸透させるが、ヒドロゲルの濃度が高くなると、タンパク質との結合度が高くなってより細かな網状の構造が作られるので、組織がさらに硬くなる。一方、組織が硬くなると、界面活性剤により脂質が抜けにくくなるので、透明化にかかる時間が長くなる。また、前記方法は、組織の表面に空気及び黒い粒子の沈着をもたらすか、組織を黄色く変色させる問題点がある。
【０００８】
また、前記方法は、過程が非常に複雑で付加的な装備がたくさん必要である。例えば、脳一つを透明化するためには、少なくとも３０，０００，０００万ウォン以上が必要である。それだけでなく、一度に一つの脳のみ透明化が可能なので、経済的、時間的に多くの損失が誘発される。より大きい問題は、抗体を用いた染色が網構造を成すポリアクリルアミド（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）の間を透過するのが困難である。
【０００９】
したがって、組織内のタンパク質の分布情報を得るためには、組織の透明化以後に抗原性の保存程度と抗体の組織内の浸透力を考慮して抗体の物理的な拡散能力を向上させる必要があるが、結合組織が多い硬い組織である場合、抗体の拡散速度は顕著に落ちるので、それを補うための新しい技法が要求される。
【００１０】
上述したように、従来研究では、組織の透明化のための過程が複雑であるだけでなく、多くの費用と時間が必要である。したがって、過程の単純化、費用節減はもちろん抗体染色まで最適化して脳だけでなく多様な組織を透明化し得る技術が必要である。
【００１１】
さて、本発明者は、生体組織の透明化技術を研究するうちに、本発明による生体組織の透明化組成物及びこれを用いた生体組織透明化方法は、高価の電気泳動装置と高価の溶液を必要とせず、脳、肝、肺、腎臓、腸、心臓、筋肉、血管などの多様な生体組織に損傷なしに適用が可能であるだけでなく、バブルの形成、変色及び暗色の堆積物を発することがなく、生体組織の透明性が向上し、透明化された組織内の抗体染色が可能であるため、生体組織の構造的イメージ化を通じて多様な疾患の原因を究明して治療法見つけるのに有用に用いられ得ることを確認し、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、生体組織透明化用組成物を提供することにある。
【００１３】
本発明のまた他の目的は、生体組織の透明化方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記目的を達成するために、本発明は、下記化学式１で表示されるアミノ酸又はその塩を含む生体組織透明化用組成物を提供する。
【００１５】
【化１】
0006945881.tif 000002
【００１６】
前記化学式１で、Ｒ１は、水素又はＣ１−Ｃ２アルキルであり、Ｒ２は、水素又は直鎖又は分岐のＣ８−Ｃ２０アルキルカルボニル又はＣ８−Ｃ２０アルケニルカルボニルであり、Ｒ３は、水素又は必須アミノ酸の側鎖を意味する。
【００１７】
また、本発明は、固定化された生体組織を前記組成物と接触させて透明化するステップを含む生体組織の透明化方法を提供する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明による生体組織の透明化用組成物及びそれを用いた生体組織の透明化方法は、高価な電気泳動装置と高価な溶液を必要とせず、脳、肝、肺、腎臓、腸、心臓、筋肉、血管などの多様な生体組織に損傷なしに適用が可能であるだけでなく、バブルの形成、変色及び暗色の堆積物を生ずることがなく、生体組織の透明性が向上され、透明化された組織内の抗体染色が可能であるため、生体組織の構造的イメージ化を通じて多様な疾患の原因を究明して治療法を見つけるのに有用に用いられ得る。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明による組織の透明化方法を通じて透明化されたマウスの全体組織に対するイメージであり、図１の左側イメージに比べて、本発明による組織の透明化方法を行った図１の右側イメージがマウスの全体組織が相対的に顕著に透明化されたことが分かる。
【図２ａ】透明化前のマウスの脳（ｈａｌｆ  ｂｒａｉｎ）である。
【図２ｂ】実験例１を通じて透明化されたマウスの脳である。
【図３ａ】透明化前のマウスの脳（ｈａｌｆ  ｂｒａｉｎ）である。
【図３ｂ】実験例３で４０ｗ／ｖ％のＮ−ラウリルサルコシン溶液の前処理後のマウスの脳である。
【図３ｃ】実験例３を通じて透明化されたマウスの脳であり、マウスの脳が透明化されるによって、マウスの脳の裏側にある字が肉眼で識別が可能であることが分かる。
【図４ａ】マウスの膵臓（ｐａｎｃｒｅａｓ）である。
【図４ｂ】実験例３で最終透明化されたマウスの膵臓であり、マウスの膵臓が透明化されたことが分かる。
【図５ａ】透明化前のＰＢＳ溶液での全体脳のイメージである。
【図５ｂ】実験例３の４０ｗ／ｖ％のＮ−ラウリルサルコシン溶液でのマウスの全体脳のイメージである。
【図５ｃ】実験例３で最終透明化されたマウスの全体脳であり、マウスの脳が透明化されたことを確認することができる。
【図６ａ】Ｌｅｃｔｉｎ−４８８のマウスの脳イメージであり、マウスの脳の透明化が進行されたので、緑色の染色イメージが容易に確認されることが分かる。
【図６ｂ】Ｌｅｃｔｉｎ−４８８のマウスの膵臓イメージであり、マウスの膵臓の透明化が進行されたので、緑色の染色イメージが容易に確認されることが分かる。
【図７ａ】Ｌｅｃｔｉｎ−４８８の脳血管のイメージであり、脳の透明化が進行されたので、緑色の染色イメージが容易に確認されることが分かる。
【図７ｂ】Ｌｅｃｔｉｎ−４８８の小脳血管のイメージであり、小脳の透明化が進行されたので、緑色の染色のイメージが容易に確認されることが分かる。
【図７ｃ】Ｌｅｃｔｉｎ−４８８の膵臓血管のイメージであり、膵臓の透明化が進行されたので、緑色の染色のイメージが容易に確認されることが分かる。
【図８ａ】透明化されたマウスの全体脳のイメージである。
【図８ｂ】透明化された全体脳のＴＨ−抗体に対する５Ｘ顕微鏡レンズのイメージを示す。
【図８ｃ】海馬の周辺にあるｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｎｅｕｒｏｎ−ＧＦＰ  ２０Ｘ顕微鏡レンズのイメージを示す。
【図９】ＴＨ−ｎｅｕｒｏｎのビデオ映像資料の一部イメージである。
【図１０】ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｎｅｕｒｏｎ−ＧＦＰのビデオ映像資料の一部イメージである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明に対して具体的に説明する。
【００２１】
本発明は、下記化学式１で表示されるアミノ酸又はその塩を含む生体組織透明化用組成物を提供する。
【００２２】
【化２】
0006945881.tif 000003
【００２３】
前記化学式１で、Ｒ１は、水素又はＣ１−Ｃ２アルキルであり、Ｒ２は、水素又は直鎖又は分岐のＣ８−Ｃ２０アルキルカルボニル又はＣ８−Ｃ２０アルケニルカルボニルであり、Ｒ３は、必須アミノ酸の側鎖を意味する。
【００２４】
以下、本発明による生体組織透明化用組成物に対してより具体的に説明する。
【００２５】
本発明による生体組織透明化用組成物は、光と他の分子の透過を阻む脂質成分を生体組織から除去し、タンパク質の構造的変性を生じることがなく、組織を硬くする役目をする前記化学式１で表示されるアミノ酸又はその塩を含む。
【００２６】
このとき、前記化学式１で、Ｒ１は、水素又はＣ１−Ｃ２アルキルであり、Ｒ２は、水素又は直鎖又は分岐のＣ８−Ｃ２０アルキルカルボニル又はＣ８−Ｃ２０アルケニルカルボニルであり、Ｒ３は、必須アミノ酸の側鎖を示す。
【００２７】
ここで、前記「直鎖又は分岐のＣ８−Ｃ２０アルキルカルボニル」は、少なくとも一つの二重結合を有する炭素数８〜２０のアルキル鎖のカルボニルを意味し、前記「必須アミノ酸の側鎖」は、通常的に必須アミノ酸と呼ばれる２０個のアミノ酸、すなわち、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、システイン、プロリン、グルタミン、ヒスチジン、リシン、アルギニン、チロシン、トリプトファンでＮＨ２（ＣＯＯＨ）ＣＨ−を母体とする場合の置換基を意味する。例えば、グリシンの側鎖は水素であり、アラニンの側鎖はメチルである。
【００２８】
より好ましくは、本発明による生体組織透明化用組成物は、前記化学式１において、Ｒ１は、メチルであり、Ｒ２は、直鎖又は分岐のＣ８−Ｃ２０アルキルカルボニルであり、Ｒ３は、水素であるアミノ酸又は塩を含み得る。
【００２９】
また、本発明による生体組織透明化用組成物において、前記化学式１で表示されるアミノ酸又はその塩が４〜５５ｗ／ｖ％（重量／体積％）の濃度で含まれ得、１０〜５０ｗ／ｖ％の濃度が好ましく、３５〜４５ｗ／ｖ％の濃度がより好ましい。
【００３０】
このとき、前記濃度を示すための溶液としては、通常のこの分野で用いる擬似体液であってもよく、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ）、ＴＢＳ（ｔｒｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、蒸溜水などが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００３１】
前記化学式１で表示されるアミノ酸又はその塩が４ｗ／ｖ％未満で含まれる場合には、生体組織の透明化速度が顕著に遅くなり、５５ｗ／ｖ％超過で含まれる場合には、前記化学式１で表示されるアミノ酸又は塩が完全に溶解されないことがある。
【００３２】
さらに、本発明による生体組織透明化用組成物は、浸透圧を調節して生体組織の透明化をはやく促進する役目をする物質をさらに含み得る。好ましくは、尿素、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート））、ＣＨＡＰＳＯ（３−[（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート））、スクロース、フルクトース、グリセロール、ジアトリゾ酸、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ−２０）、２−２−チオジエタノール、イオヘキソールなどが挙げられる。
【００３３】
このとき、前記生体組織の透明化をはやく促進する物質は、２０〜６０ｗ／ｖ％の濃度で含まれ得、３０〜５０ｗ／ｖ％の濃度で含まれることが好ましい。前記濃度が２０ｗ／ｖ％未満である場合、組織の透明化速度が遅くなり、６０ｗ／ｖ％超過である場合、結晶が誘発されるか溶液に溶けないことがある。
【００３４】
また、前記生体組織の透明化をはやく促進する物質の濃度は、化学式１で表示されるアミノ酸又はその塩の好ましい濃度範囲に適宜調整できる。
【００３５】
従来の透明化方法を用いるためには、組織と溶液の屈折率を合わせるためにマウンティング溶液を別途に追加で購入及び製作する必要があるが、本発明による生体組織透明化用組成物は、屈折率を合わせる溶液が必要なく、これは費用節減の効果を示す。
【００３６】
上述したように、本発明による生体組織の透明化用組成物は、高価の電気泳動装置と高価の溶液を必要とせず、脳、肝、肺、腎臓、腸、心臓、筋肉、血管などの多様な生体組織に損傷なしに適用が可能であるだけでなく、バブルの形成、変色及び暗色の堆積物を発することがなく、生体組織の透明性が向上されるので、生体組織の透明化用組成物として有用に用いることができる。
【００３７】
また、本発明は、固定化された生体組織を前記組成物と接触させて透明化するステップを含む生体組織の透明化方法を提供する。
【００３８】
以下、本発明による生体組織の透明化方法を具体的に説明する。
【００３９】
本発明による生体組織の透明化方法は、固定化された生体組織を前記組成物と接触させて透明化するステップを含む。
【００４０】
具体的に、本発明による生体組織の透明化方法は、固定化された生体組織を前記化学式１で表示されるアミノ酸又はその塩を有効成分として含む組成物と接触させ、生体組織の物理化学的特性を変形して透明化することで、より深く光が浸透するようにする。
【００４１】
本発明による生体組織の透明化方法は、バブルの形成、変色及び暗色の堆積物を発することなく、生体組織の透明性を向上させ、タンパク質の変性などによって所望する組織内の情報が損失又は歪曲されないので、特に、ＧＦＰタンパク質など多様な蛍光体（Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）を組織内の情報検出において有用に用いることができる。
【００４２】
また、本発明による生体組織の透明化方法において、生体組織は、透明化する前に通常的に抗原性の損失を誘発しないとともに生体組織を固定化する方法であれば、特に制限なしに適用して固定化し得るが、ＰＦＡ（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ジプロピレングリコールジグリシジルエーテル、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、グルタルアルデヒド、ポリアクリルアミドなどを用いて通常的な方法で固定化され得る。
【００４３】
さらに、本発明による生体組織の透明化方法において、生体組織を脱水するための前処理ステップをさらに行うことができ、通常的に生体組織を脱水する前処理方法であれば、特な制限なしに用いることができるが、固定化された生体組織を前記化学式１で表示されるアミノ酸を２０〜５０ｗ／ｖ％濃度の溶液に担持することが好ましく、３５〜４５ｗ／ｖ％濃度の溶液に担持することがより好ましい。前処理溶液の濃度が２０ｗ／ｖ％未満で含まれる場合には、脱水が効果的に行われずに組織の透明化過程で組織の膨隆現象が生ずることがあり、５０ｗ／ｖ％超過で含まれる場合には、前記化学式１で表示されるアミノ酸又は塩が完全に溶解されず、それ以上脱水効果が増大されない。
【００４４】
このとき、前記濃度を示すための溶液としては、通常の分野に用いる擬似体液であってもよく、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ）、ＴＢＳ（ｔｒｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、蒸溜水、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ−２０）、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート））、ＣＨＡＰＳＯ（３−[（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート））などが好ましいが、これに限定されるものではない。また、担持の温度は、４０〜６０℃が適切であるが、これに限定されるものではない。
【００４５】
このような前処理過程を通じて、固定化物質とタンパク質の構造的結合力を増加させ、変性を発することがなく、組織をより硬くするだけでなく、組織の透明化過程で組織の膨隆を防止し、抗体処理過程、洗浄過程などで発生する組織の亀裂を防止し得る。
【００４６】
本発明による生体組織の透明化方法は、多様な脊椎動物の組織に適用し得、特に、脳、血管、肝臓、肺、腎臓、膵臓、腸などに適用することが好ましく、前記生体組織の全体部分を一度に透明化し得る。
【００４７】
さらに、本発明は、前記透明化された生体組織内の重要情報、すなわち、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、蛍光信号などの検出方法を提供する。
【００４８】
本発明による透明化された生体組織は、ＧＦＰ蛍光、免疫染色を通じてタンパク質又はｍＲＮＡを検出し得る。タンパク質の場合、固定過程の間にアミノ酸に存在するアミノ基同士の共有結合を成して互いにネットワークを形成するので、非常に安定的である一方、ＲＮＡやＤＮＡのような核酸の場合、アミノ基が存在しないので、固定された組織でも相対的に不安定である。特に、電気泳動過程が含まれる場合、核酸が有した電気的性質によって組織内の位置が変わる恐れがある。一方、本発明による透明化された生体組織は、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）細胞及びドーパミン活性神経マーカー抗体であるチロシンヒドロキシラーゼなどに対する蛍光染色に優れる。
【００４９】
本発明による生体組織の透明化方法は、損傷していない生体組織の細胞と分子の３次元分布をイメージ化して観察することで、複雑な構造を有する多様な生体組織に対して一つの完全な構造で数百マイクロメートル以上のサイズで観察研究を行うことができるので、組織内の有用な情報を取得して脳疾患などの多様な疾患の原因を究明するのに効果的に用いることができる。
【実施例】
【００５０】
以下、本発明を実施例及び実験例によって詳しく説明する。
【００５１】
ただし、下記の実施例及び実験例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容が下記実施例及び実験例によって限定されるものではない。
【００５２】
＜実験例１＞生体組織の透明化１
本発明による組成物で生体組織を透明化するために、次のように実施した。
【００５３】
全ての動物実験過程は、大韓民国の啓明大学校動物資源大学委員会の指針書（Ａｐｐｒｏｖａｌ  Ｎｏ．ＫＭ−２０１４−２０Ｒ１）によって実施した。
【００５４】
まず、チレタミン（Ｔｉｌｅｔａｍｉｎｅ）−ゾラゼパム（ｚｏｌａｚｅｐａｍ）−キシラジン（ｘｙｌａｚｉｎｅ）混合物を用いて成体マウス（８週齢）を麻酔し、マウスの血管を染色するために、ｔａｉｌ  ｖｅｉｎでＬｅｃｔｉｎ−４８８（Ｃａｔ＃  ＤＬ１１７４）を注入した。Ｌｅｃｔｉｎを注入してから５分間後、径深灌流で氷冷した１Ｘリン酸緩衝溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）５０ｍＬを灌流させた後、氷冷した４％のＰＦＡが含まれたＰＢＳを灌流させた。その後、器官を摘出して４％のＰＦＡ溶液に浸した後、４℃で１２ｈの間インキュベーションした。
【００５５】
次に、前記サンプルを室温に移して２時間の間さらにインキュベーションし、５０ｍｌのＰＢＳで２回洗浄した。前記固定化されたサンプルを４ｗ／ｖ％のＮ−ラウリルサルコシンナトリウム塩と６０ｗ／ｖ％の尿素の混合溶液で、５５℃の温度で２２０ｒｐｍで３日間インキュベーションし、その結果を図２に示した。
【００５６】
図２の（ａ）は、透明化前のマウスの脳（ｈａｌｆ  ｂｒａｉｎ）であり、（ｂ）は、実験例１で透明化されたマウスの脳（ｈａｌｆ  ｂｒａｉｎ）である。
【００５７】
したがって、本発明によるＮ−ラウリルサルコシンナトリウム塩と尿素の混合溶液は、生体組織を透明にすることが分かる。
【００５８】
＜実験例２＞生体組織の透明化２
本発明による組成物で生体組織を透明化するために、次のように実行した。
【００５９】
具体的に、前記実験例１で固定化されたサンプルを４ｗ／ｖ％のＮ−ラウリルサルコシンナトリウム塩と６０ｗ／ｖ％の尿素の混合溶液で、５５℃の温度で２２０ｒｐｍで３日間インキュベーションし、１５ｗ／ｖ％のＮ−ラウリルサルコシンナトリウム塩と５０ｗ／ｖ％の尿素の混合溶液で、５５℃の温度で２２０ｒｐｍで２日間さらにインキュベーションした。
【００６０】
前記実験例１の透明化された組織より一層硬く透明になることが分かった。
【００６１】
＜実験例３＞生体組織の透明化３
本発明による組成物で生体組織を透明化するために、次のように実行した。
【００６２】
具体的に、前記実験例１で固定化されたサンプルを予め用意した４０ｗ／ｖ％のＮ−ラウリルサルコシンナトリウム塩で１２時間処理する前処理過程をさらに行うこと以外は、実験例１と同一に実行し、その結果を図１、図３〜図５に示した。
【００６３】
図１は、透明化されたマウスの全体組織に対するイメージである。
【００６４】
図３の（ａ）は、透明化前のマウスの脳（ｈａｌｆ  ｂｒａｉｎ）であり、（ｂ）は、実験例３で４０ｗ／ｖ％のＮ−ラウリルサルコシン溶液の前処理後のマウスの脳であり、（ｃ）は、実験例３を最終透明化されたマウスの脳である。
【００６５】
図４（ａ）は、マウスの膵臓（ｐａｎｃｒｅａｓ）であり、（ｂ）は、実験例３で最終透明化されたマウスの膵臓である。
【００６６】
図５（ａ）は、透明化前のＰＢＳ溶液での全体脳であり、（ｂ）は、実験例３の４０ｗ／ｖ％のＮ−ラウリルサルコシン溶液でのマウスの全体脳であり、（ｃ）は、実験例３で最終透明化されたマウスの全体脳である。
【００６７】
図１、図３〜図５に示したように、マウスの透明化された全体組織及び透明化された脳、膵臓を確認することができる。したがって、本発明による透明化方法は、生体組織を完壁に透明化するのに最適であることが分かる。
【００６８】
＜実験例４＞透明化された成体マウスの脳及び膵臓のイメージ確認
本発明による透明化方法により透明化された脳及び膵臓の血管を確認するために、選択的平面照明顕微鏡（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｐｌａｎｅ  Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ  ＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙＬｉｇｈｔｓｈｅｅｔ  Ｚ．１）で５Ｘ及び２０Ｘ対物レンズを用いてマウスの脳と膵臓を免疫染色イメージ化してＧＦＰ信号を確認した。
【００６９】
具体的に、前記実験例２で透明化された組織を５０ｍＬの蒸溜水に３回交替することで１２時間インキュベーションした。その後、サンプルをドーパミン活性ニューロンマーカー抗体であるチロシンヒドロキシラーゼ（Ｃａｔ＃  ａｂ１１２）を１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とＰＢＳ溶液の混合溶液に入れ、４℃で３日間インキュベーションした。３日後、さらに蒸溜水に１２ｈの間洗浄した後、２次抗体のＤｏｎｋｅｙ  Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−５９４に３日間４℃でインキュベーションし、１ＸのＰＢＳで６時間洗浄した。洗浄を終えたサンプルは、さらにＮ−ラウリルサルコシンと尿素の混合溶液に入れて１２時間インキュベーションした後、選択的平面照射顕微鏡で測定し、３次元イメージは、Ｚｅｉｓｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅで再構成して免疫染色イメージとＧＦＰ信号を確認した。その結果を図６〜図１０に示した。イメージ化（Ｚ−ｓｔａｃｋ  ｖｏｌｕｍｅ）は、０．６ｍｍ〜３ｍｍまで観察が可能であった。
【００７０】
図６の（ａ）は、Ｌｅｃｔｉｎ−４８８のマウスの脳イメージであり、（ｂ）は、Ｌｅｃｔｉｎ−４８８のマウスの膵臓イメージである。
【００７１】
図７（ａ）は、Ｌｅｃｔｉｎ−４８８の脳血管のイメージであり、（ｂ）は、Ｌｅｃｔｉｎ−４８８の小脳血管のイメージであり、（ｃ）は、Ｌｅｃｔｉｎ−４８８の膵臓血管のイメージである。
【００７２】
図８（ａ）は、透明化されたマウスの全体脳のイメージであり、（ｂ）は、透明化された全体脳のＴＨ−抗体に対する５Ｘ顕微鏡レンズのイメージであり、（ｃ）は、ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓの周辺にあるｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｎｅｕｒｏｎ−ＧＦＰ  ２０Ｘ顕微鏡レンズのイメージである。
【００７３】
図９は、ＴＨ−ｎｅｕｒｏｎのビデオ映像資料の一部イメージである。
【００７４】
図１０は、ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｎｅｕｒｏｎ−ＧＦＰビデオ映像資料の一部イメージである。
【００７５】
図６〜図１０から分かるように、組織の活性化された構造を透明化した後、単一光子顕微鏡を用いて視覚的に確認が可能であり、３次元的に血管パターンを再構成することができた。特に、イメージ化された膵臓の血管パターンの場合、一般的なイメージ化及び３次元再構成で全体的なパターンを追跡することが非常に難しいが、本発明の組織の透明化方法は、３次元的血管系の再構成と視覚的なイメージを提供することができる。
【００７６】
したがって、本発明による生体組織の透明化方法は、損傷していない生体組織の細胞と分子の３次元分布をイメージ化して観察することで、複雑な構造を有する多様な生体組織に対して一つの完全な構造で観察研究を実行することができるので、組織内の有用な情報を取得して膵臓機能及び脳疾患の研究に効果的に用いられ得る。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明による生体組織の透明化用組成物及びそれを用いた生体組織の透明化方法は、高価な電気泳動装置と高価な溶液を必要とせず、脳、肝、肺、腎臓、腸、心臓、筋肉、血管などの多様な生体組織に損傷なしに適用が可能であるだけでなく、バブルの形成、変色及び暗色の堆積物を発することがなく、生体組織の透明性が向上され、透明化された組織内の抗体染色が可能であるので、生体組織の構造的イメージ化を通じて多様な疾患の原因を究明して治療法を見つけるのに有用である。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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