(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトのインターロイキン３４（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ３４：ＩＬ−３４）及びヒトミクログリアを体内に有し、且つ前記ヒトＩＬ−３４が、少なくとも脳、肺、腎臓、肝臓、皮膚、及び血漿からなる群より選択される１つ以上で存在する、非ヒト動物。
【請求項２】
ヒトのＣＤ３４陽性造血幹細胞が移植された、請求項１に記載の非ヒト動物。
【請求項３】
前記ヒトのミクログリアが脳内に存在している、請求項１又は２に記載の非ヒト動物。
【請求項４】
前記ヒトのミクログリアが、ＣＤ７４、ｂ２ｍ、ＡＩＦ１、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＳＦ１Ｒ、ＩＴＧＡＭ（ＣＤ１１ｂ）、Ｐ２ＲＹ１２、ＣＸ３ＣＲ１、ＴＲＥＭ２、ＴＭＥＭ１１９、ＣＣＬ２、ＴＮＦ、ＨＧＨ（ＩＬ−６）、ＣＸＣＬ８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１ａ、ＣＸＣＬ１０、ＰＵ．１（ＳＰＩ１）、ＥＴＶ５、及びＡＰＯＥからなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を発現する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項５】
前記ヒトのミクログリアが、ＣＣＬ２、ＴＮＦ、ＨＧＨ（ＩＬ−６）、ＣＸＣＬ８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１ａ、及びＣＸＣＬ１０からなる群より選択される少なくとも１種のサイトカインを分泌する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項６】
ヒト免疫不全ウィルス（Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ：ＨＩＶ）を感染させた、請求項１〜５のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の非ヒト動物から、ヒトのミクログリアを得ることを含む、ヒトのミクログリアの製造方法。
【請求項８】
ヒトＩＬ−３４を体内に有する非ヒト動物に、ヒトのＣＤ３４陽性造血幹細胞を移植することを含む、ヒトのミクログリアを有する非ヒト動物の作製方法。
【請求項９】
前記ヒトＩＬ−３４を体内に有する非ヒト動物が、免疫不全非ヒト動物である、請求項８に記載のヒトのミクログリアを有する非ヒト動物の作製方法。
【請求項１０】
前記ヒトのミクログリアが脳内に存在している、請求項８又は９に記載のヒトのミクログリアを有する非ヒト動物の作製方法。
【請求項１１】
前記ヒトのミクログリアが、ＣＤ７４、ｂ２ｍ、ＡＩＦ１、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＳＦ１Ｒ、ＩＴＧＡＭ（ＣＤ１１ｂ）、Ｐ２ＲＹ１２、ＣＸ３ＣＲ１、ＴＲＥＭ２、ＴＭＥＭ１１９、ＣＣＬ２、ＴＮＦ、ＨＧＨ（ＩＬ−６）、ＣＸＣＬ８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１ａ、ＣＸＣＬ１０、ＰＵ．１（ＳＰＩ１）、ＥＴＶ５、及びＡＰＯＥからなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を発現する、請求項８〜１０のいずれか一項に記載のヒトのミクログリアを有する非ヒト動物の作製方法。
【請求項１２】
前記ヒトのミクログリアが、ＣＣＬ２、ＴＮＦ、ＨＧＨ（ＩＬ−６）、ＣＸＣＬ８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１ａ、及びＣＸＣＬ１０からなる群より選択される少なくとも１種のサイトカインを分泌する、請求項８〜１１のいずれか一項に記載のヒトのミクログリアを有する非ヒト動物の作製方法。
【請求項１３】
請求項８〜１２のいずれか一項に記載のヒトのミクログリアを有する非ヒト動物の作製方法により、ヒトのミクログリアを有する非ヒト動物を作製した後、前記ヒトのミクログリアを有する非ヒト動物にＨＩＶを感染させることを含む、ＨＩＶ感染非ヒト動物の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＩＬ−３４を有する非ヒト動物及びその使用に関する。特に、ヒトＩＬ−３４遺伝子を有する非ヒト動物、前記非ヒト動物を用いたヒトのミクログリアの製造方法、及び前記非ヒト動物から得られるヒトのミクログリアに関する。また、ヒトのミクログリアを有する非ヒト動物の作製方法、及びＨＩＶ感染非ヒト動物の作製方法に関する。
本願は、２０１９年１月２８日に、米国に出願された６２／７９７，３６９号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
本発明は、アメリカ国立衛生研究所から授与されたグランド＃Ｒ２１  ＤＡ０４１０１８の下でのアメリカ合衆国連邦政府の支援を受けて行われたものである。
【背景技術】
【０００２】
ミクログリアは中枢神経系（ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ：ＣＮＳ）の常在性マクロファージであり、脳の発達や免疫防御に貢献している。しかしながら、ヒトのミクログリアの正確な起源、発生および特異的なマーカーは、議論の対象となってきた。大人の脳では、正常および病的状態のいずれにおいても、ミクログリアが胎児発育段階から脳内に存在する細胞のみに由来するのか、または造血幹細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ＨＳＣ）もしくは単球からＣＮＳに流入するのかは不明である。単球は、ＣＮＳの実質に入り、ミクログリアと形態学的に類似した細胞に変化することができる。しかしながら、このような変化は特定の条件下でのみ起こり、これらの細胞が真にミクログリアであるかどうかが議論されている。マウスからマウスへの移植実験では、放射線、化学物質、もしくはミクログリア特異的自殺遺伝子の発現により内生ミクログリアを枯渇させたマウスにおいて、ドナー由来のＨＳＣが、ミクログリア様細胞を産生することが示された（例えば、非特許文献１）。【０００３】
一方、これまでに、免疫不全マウスの脳でヒトミクログリアを効率的に生成させる試みは成功していない。免疫不全マウスにヒトＣＤ３４＋細胞を移植した試験では、わずかなヒトミクログリアが確認されたのみであった（例えば、非特許文献２）。
既存のヒト化マウスは、ＮＯＤ／ＳｃｉｄＩＬ２Ｒｇ−／−（ＮＳＧ）マウスなどにおいて、ＨＳＣ（例えば、非特許文献３、非特許文献４）またはヒト胎児の肝臓および胸腺の移入により（例えば、非特許文献５）、ヒト免疫細胞を安定的に再構成させたものである。しかしながら、マウスの脳では、髄膜および血管周囲のマクロファージの数および分布が少なく、ミクログリアはほとんど認められない（非特許文献４、６）。ミクログリア細胞は、ＨＩＶ−１の主な標的であり、ＣＮＳにおけるＨＩＶ−１の主なリザーバーであるため、現在脳内ミクログリア細胞の解析に利用可能なヒト化マウスモデルは、ヒトにおけるＣＮＳへのＨＩＶ−１感染を再現するには不十分である（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Capotondo, A., et al. Brain conditioning is instrumental for successful microglia reconstitution following hematopoietic stem cell transplantation. Proc Natl Acad Sci U S A 109, 15018-15023 (2012).
【非特許文献２】Asheuer, M., et al. Human CD34+ cells differentiate into microglia and express recombinant therapeutic protein. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 3557-3562 (2004).
【非特許文献３】Arainga, M., Su, H., Poluektova, L.Y., Gorantla, S. & Gendelman, H.E. HIV-1 cellular and tissue replication patterns in infected humanized mice. Sci Rep 6, 23513 (2016).
【非特許文献４】Gorantla, S., et al. Links between progressive HIV-1 infection of humanized mice and viral neuropathogenesis. Am J Pathol 177, 2938-2949 (2010).
【非特許文献５】Denton, P.W. & Garcia, J.V. Novel humanized murine models for HIV research. Curr HIV/AIDS Rep 6, 13-19 (2009).
【非特許文献６】Dash, P.K., et al. Loss of neuronal integrity during progressive HIV-1 infection of humanized mice. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience 31, 3148-3157 (2011).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のように、従来のヒト化マウスでは、ヒトミクログリアを保持できないか、わずかな量しか保持することができず、ヒトにおけるＨＩＶ感染等を再現するには適切ではなかった。
そこで、本発明は、ヒトミクログリアの保持量の多い非ヒト動物、及びその作製方法を提供することを課題とする。また、前記非ヒト動物の利用方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、以下の態様を含む。
［１］ヒトのインターロイキン３４（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ３４：ＩＬ−３４）を体内に有する非ヒト動物。
［２］ヒトのＣＤ３４陽性造血幹細胞が移植された、［１］に記載の非ヒト動物。
［３］ヒトのミクログリアが脳内に存在している、［１］または［２］に記載の非ヒト動物。
［４］前記ヒトのミクログリアが、ＣＤ７４、ｂ２ｍ、ＡＩＦ１、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＳＦ１Ｒ、ＩＴＧＡＭ（ＣＤ１１ｂ）、Ｐ２ＲＹ１２、ＣＸ３ＣＲ１、ＴＲＥＭ２、ＴＭＥＭ１１９、ＣＣＬ２、ＴＮＦ、ＨＧＨ（ＩＬ−６）、ＣＸＣＬ８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１ａ、ＣＸＣＬ１０、ＰＵ．１（ＳＰＩ１）、ＥＴＶ５、及びＡＰＯＥからなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を発現する、［３］に記載の非ヒト動物。
［５］前記ヒトのミクログリアが、ＣＣＬ２、ＴＮＦ、ＨＧＨ（ＩＬ−６）、ＣＸＣＬ８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１ａ、及びＣＸＣＬ１０からなる群より選択される少なくとも１種のサイトカインを分泌する、［３］または［４］に記載の非ヒト動物。
［６］ヒト免疫不全ウィルス（Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ：ＨＩＶ）を感染させた、［１］〜［５］のいずれか一つに記載の非ヒト動物。
［７］［３］〜［６］のいずれか一つに記載の非ヒト動物から、ヒトのミクログリアを得ることを含む、ヒトのミクログリアの製造方法。
［８］ヒトＩＬ−３４を体内に有する非ヒト動物に、ヒトのＣＤ３４陽性造血幹細胞を移植することを含む、ヒトのミクログリアを有する非ヒト動物の作製方法。
［９］前記ヒトＩＬ−３４を体内に有する非ヒト動物が、免疫不全非ヒト動物である、［８］に記載のヒトのミクログリアを有する非ヒト動物の作製方法。
［１０］前記ヒトのミクログリアが脳内に存在している、［８］又は［９］に記載のヒトのミクログリアを有する非ヒト動物の作製方法。
［１１］前記ヒトのミクログリアが、ＣＤ７４、ｂ２ｍ、ＡＩＦ１、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＳＦ１Ｒ、ＩＴＧＡＭ（ＣＤ１１ｂ）、Ｐ２ＲＹ１２、ＣＸ３ＣＲ１、ＴＲＥＭ２、ＴＭＥＭ１１９、ＣＣＬ２、ＴＮＦ、ＨＧＨ（ＩＬ−６）、ＣＸＣＬ８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１ａ、ＣＸＣＬ１０、ＰＵ．１（ＳＰＩ１）、ＥＴＶ５、及びＡＰＯＥからなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を発現する、［８］〜［１０］のいずれか一つに記載のヒトのミクログリアを有する非ヒト動物の作製方法。
［１２］前記ヒトのミクログリアが、ＣＣＬ２、ＴＮＦ、ＨＧＨ（ＩＬ−６）、ＣＸＣＬ８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１ａ、及びＣＸＣＬ１０からなる群より選択される少なくとも１種のサイトカインを分泌する、［８］〜［１１］のいずれか一つに記載のヒトのミクログリアを有する非ヒト動物の作製方法。
［１３］［８］〜［１２］のいずれか一つに記載のヒトのミクログリアを有する非ヒト動物の作製方法により、ヒトのミクログリアを有する非ヒト動物を作製した後、前記ヒトのミクログリアを有する非ヒト動物にＨＩＶを感染させることを含む、ＨＩＶ感染非ヒト動物の作製方法。【０００７】
また、本発明は、以下の態様も含む。
［１４］ヒトＩＬ−３４を分泌する、［１］〜［６］のいずれか一つに記載の非ヒト動物。
［１５］ヒトＩＬ−３４遺伝子を有する、［１４］に記載の非ヒト動物。
［１６］ヒトのミクログリアを有する、［１４］又は［１５］に記載の非ヒト動物。
［１７］げっ歯類である、［１］〜［６］及び［１４］〜［１６］のいずれか一つに記載の非ヒト動物。
［１８］マウスである、［１７］に記載の非ヒト動物。
［１９］前記ヒトＩＬ−３４を体内に有する非ヒト動物が、ヒトＩＬ−３４遺伝子を有する、［７］〜［１２］のいずれか一つに記載のヒトのミクログリアを有する非ヒト動物の作製方法。
［２０］前記ヒトＩＬ−３４を体内に有する非ヒト動物が、ヒトＩＬ−３４を分泌している、［７］〜［１２］及び［１９］のいずれか一つに記載のヒトのミクログリアを有する非ヒト動物の作製方法。
［２１］前記非ヒト動物がげっ歯類である、［７］〜「１２」及び［１９］〜［２０］のいずれか一つに記載のヒトのミクログリアを有する非ヒト動物の作製方法。
［２２］前記げっ歯類がマウスである、［２１］に記載のヒトのミクログリアを有する非ヒト動物の作製方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ヒトミクログリアの保持量の多い非ヒト動物、及びその作製方法が提供される。また、前記非ヒト動物の利用方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】図１Ａ〜Ｄは、ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｓｕｇ  Ｔｇ（ＣＭＶ−ＩＬ−３４）１／Ｊｉｃ（ＮＯＧ−ｈＩＬ−３４）マウスの作製、およびキャラクタリゼーションの概略を示す図である。図１Ａは、ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｓｕｇ  Ｔｇ（ＣＭＶ−ＩＬ−３４）１／Ｊｉｃマウスを作製するために、ＮＯＧ−ｈＩＬ−３４トランスジェニックマウスに導入したベクターを示す。導入遺伝子（Ｔｇ）、ｈＩＬ−３４を含むベクターをＣＭＶプロモーターの下流に挿入した。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ホモ接合マウスの耳から抽出されたＤＮＡを用いたＰＣＲ解析結果を示す。ＮＯＧ−ｈＩＬ−３４トランスジェニックマウス（ＩＬ−３４＋／＋）では、ｈＩＬ−３４（３５８ｂｐ）のバンドが増幅された対照の非トランスジェニックＮＯＧマウスでは当該バンドは検出されなかった。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＮＯＧ−ｈＩＬ−３４マウスの脳、脾臓、肺、腎臓、肝臓および皮膚から抽出されたＲＮＡを用いた、リアルタイムＰＣＲの結果を示す。ＮＯＧ−ｈＩＬ−３４（ＩＬ−３４）では、ＮＯＧマウス（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較して、ｈＩＬ−３４の全組織での発現が確認された。
【図１Ｄ】図１Ｄは、血漿中のｈＩＬ−３４発現を確認した、ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図２】マウス脳の異なる領域におけるヒトＩＬ−３４の発現を示す、ＲＮＡＳｃｏｐｅアッセイの結果を示す。ＲＮＡＳｃｏｐｅアッセイを、ヒトＩＬ−３４の３８〜１７７４ｂｐを標的とするアンチセンスプローブ、Ｈｓ−ＩＬ−３４−ＮｏＸＭｍを用いて行い、ヒトＩＬ−３４は、５μｍ厚の脳切片において、単一の茶色のドットまたはクラスターのドットとして検出された。ＮＯＧマウスでは、ヒトＩＬ−３４の存在を示すシグナルは確認されなかった。倍率４０倍。
【図３Ａ】図３Ａ〜Ｂは、ＣＤ３４−ＮＯＧ−ｈＩＬ−３４マウスにおけるヒト末梢血液リンパ球の分化・増殖を示す図である。図３Ａは、末梢血のＦＡＣＳ解析の結果を示す。ＣＤ４５リンパ球集団にゲートをかけ、分化４５（ＣＤ４５）＋、ならびにヒトＣＤ３、ＣＤ１９、およびＣＤ１４細胞のヒトクラスターの代表的なプロットを確認できる。
【図３Ｂ】図３Ｂは、再構成マウスの末梢血中のヒト細胞亜郡の割合を示す図である。各シンボルは、個々のマウスを示す。
【図４Ａ】図４Ａ〜Ｆは、ＣＤ４５−ＮＯＧ−ｈＩＬ−３４マウスの脳におけるヒトミクログリア細胞の存在を示す。図４Ａは、ＣＤ３４−ＮＯＧ−ｈＩＬ−３４およびＣＤ３４−ＮＳＧマウスの間で、組織マクロファージ再構成を比較した図である。脳切片は、ＨＬＡ−ＤＲについて染色し、肝臓および脾臓は、ＣＤ６８について染色した。
【図４Ｂ】図４Ｂは、脳でのヒトＰ２ＲＹ１２７、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＤ１６３抗体で染色したものでヒト細胞が確認できる。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＨＬＡ−ＤＲについて染色されたＣＤ３４−ＮＯＧ−ｈＩＬ−３４マウスの脳から、嗅球（ＯＢ、２０倍）、皮質（ＣＴＸ、２０倍）および海馬（ＨＣ、１０倍）を拡大した図である。
【図４Ｄ】図４Ｄは、ミクログリアの形態をより高い倍率で示した図である。
【図４Ｅ】図４Ｅは、ＨＬＡ−ＤＲおよびＩｂａ−１について染色された脳の共焦点画像である。
【図４Ｆ】図４Ｆは、全Ｉｂａ−１＋細胞におけるＨＬＡ−ＤＲ／Ｉｂａ−１二重陽性ヒトミクログリア細胞の割合を示す。脳幹（ＢＳ）、中脳（ＭＢ）、小脳（ＣＢ）、大脳皮質（ＣＣ）、海馬（ＨＣ）、嗅球（ＯＢ）。
【図５Ａ】図５Ａ〜Ｂは、マウス脳におけるヒトミクログリアの再構成を示す図である。５μｍ厚パラフィン包埋脳切片をＨＬＡ−ＤＲについて染色した。図５Ａは、代表的なＣＤ３４−ＮＯＧ−ｈＩＬ−３４マウス脳を２倍の倍率で示した。マウス脳領域全体のヒトミクログリア分布の全体像が確認できる。嗅球（ＯＢ）、大脳皮質（ＣＴＸ）、海馬（ＨＣ）、中脳（ＭＢ）、小脳（ＣＢ）、線条体（ＳＴＲ）、海馬（ＨＣ）、黒質（ＳＮ）、視床（ＴＨ）、脳幹（ＢＳ）。Ｖｅｎｔａｎａ  ｉＳｃａｎ  ＨＴにより２００倍のオリジナル倍率で撮影された。脳領域（図４ＣのＯＢ、ＣＴＸおよびＨＣ）の拡大図（２０倍の対物レンズ）は、ミクログリアの形態を有するＨＬＡ−ＤＲ＋細胞を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ヒトミクログリア細胞の欠如を示す、代表的なＣＤ３４−ＮＳＧマウス脳切片を示す（２×）。髄膜および血管周囲領域（四角で囲った領域）中で認められる小数のＨＬＡ−ＤＲ＋細胞を拡大図で示す（２０倍）。
【図６】図６は、マウス脳における、ヒトおよびマウスグリア細胞の分布を示す図である。ヒトＭＨＣクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲ）およびミクログリア細胞（Ｉｂａ−１）について染色したパラフィン包埋脳組織の矢状切片である。元の共焦点画像は、６３０倍の倍率でＺｅｉｓｓ７１０システムにより収集された。
【図７】図７は、マウス神経細胞とヒトミクログリア細胞との相互作用を示す図である。ヒトＭＨＣクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲ）およびマウスニューロンマーカー（ＭＡＰ−２）、ニューロフィラメントＨ（ＮＦ−Ｈ）もしくはシナプトフィジン（ＳＹＮ）について染色したパラフィン包埋脳組織の矢状切片である。オリジナル倍率４００倍。
【図８Ａ】図８Ａ〜Ｄは、ＣＤ３４−ＮＯＧ−ｈＩＬ−３４マウスにおける全身性ＨＩＶ感染の成立を示す図である。図８Ａは、ＣＯＢＡＳ  Ａｍｐｌｉｃｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍにより求められた末梢血のウィルス量を示す図である。各シンボルは、個々の感染マウスを示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ヒトＣＤ４およびＣＤ８陽性Ｔリンパ球についての脾細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示す。ＣＤ４およびＣＤ８陽性細胞の割合を示す。
【図８Ｃ】図８Ｃは、ヒトＣＤ４およびＣＤ８陽性Ｔリンパ球についての脾細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示す。脾臓中のＨＩＶ＋群（ｎ＝１２）および対照群（ｎ＝７）におけるＣＤ４／ＣＤ８比を示す。
【図８Ｄ】図８Ｄは、ＨＬＡ−ＤＲ＋細胞、およびＨＩＶ−１ｐ２４について染色されたＨＩＶ−１感染細胞の存在を示す、脾臓切片の免疫組織学的分析の結果を示す図である。ＲＮＡＳｃｏｐｅアッセイを、８５４〜８２９１ｂｐのＨＩＶ−１を標的とするアンチセンスプローブ、Ｖ−ＨＩＶ１−Ｃｌａｄｅ−Ｂ（ＡＣＤ  ｃａｔ＃４１６１１１）を用いて行い、ＨＩＶ−１  ＲＮＡは、５μｍ厚の脾臓切片において、単一の茶色のドットまたはドットのクラスターとして検出された。未感染マウスでは、ウィルスＲＮＡの存在に対応するシグナルは検出されなかった。画像は、Ｎｕａｎｃｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘシステムによって２００倍のオリジナル倍率で撮影された。
【図９Ａ】図９Ａ〜Ｄは、ヒト化マウス脳におけるＨＩＶ感染を示す図である。図９Ａは、ＨＩＶ−１ｐ２４＋感染細胞の存在を示す、脳領域の免疫組織学的分析の結果を示す。ＲＮＡＳｃｏｐｅアッセイを、アンチセンスプローブ、Ｖ−ＨＩＶ１−Ｃｌａｄｅ−Ｂを用いて行い、ＨＩＶ−１  ＲＮＡは、単一の茶色ドットまたはドットのクラスターとして検出された。オリジナル倍率は２００倍である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ヒトミクログリア細胞（ＨＬＡ−ＤＲ＋）付近のＨＩＶ−１感染マウス脳におけるマウス星状グリア（ＧＦＡＰ）、およびＨＩＶ−１ｐ２４陽性ヒトミクログリアの免疫蛍光染色の結果を示す。オリジナル倍率は、４００倍である。
【図９Ｃ】図９Ｃは、セミ−ネステッドＲＴ−ＰＣＲによって求められた、ＣＤ３４−ＮＳＧマウスとＣＤ３４−ＮＯＧ−ｈＩＬ−３４マウスとの脳でのウィルスＲＮＡレベルの比較結果を示す。
【図９Ｄ】図９Ｄは、感染マウス脳における各ＨＩＶ−１遺伝子の発現レベルを示す。ＲＮＡｓｅｑリードは、ＨＩＶ−１ＡＤＡ配列にアライメントした。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜図１０Ｃは、ＨＩＶ感染ヒト化ＮＯＧ  ｈＩＬ−３４マウスにおけるヒト免疫細胞の分布を示す図である。図１０Ａは、脳のパラフィン包埋５μｍ厚矢状切片を、ヒト特異的免疫細胞マーカー（ＣＤ４およびＣＤ８）についてについて染色した結果を示す。画像は、Ｎｕａｎｃｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘシステムにより、２００倍のオリジナル倍率で撮影された。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ヒトＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の定量結果を示す。ＨＩＶ感染マウス（ｎ＝４）および対照マウス（ｎ＝３）について、マウスあたり少なくとも２切片でカウントした。黒バーが対象マウス、グレーバーがＨＩＶ感染マウスを示す。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、ＣＤ４／ＣＤ８比を示す。ＨＩＶ感染マウス（ｎ＝４）および対照マウス（ｎ＝３）について、マウスあたり少なくとも２切片でカウントした。
【図１１】図１１は、ＨＩＶ−１ｐ２４について染色したマウス脳領域全体にわたるＨＩＶ−１感染の全体像を示す、代表的なＣＤ３４−ＮＯＧ−ｈＩＬ−３４マウス脳を示す。２倍の倍率で撮影した。
【図１２Ａ】図１２Ａ〜Ｅは、ＣＤ３４−ＮＯＧ−ｈＩＬ−３４の脳組織における転写産物の変化を示す。Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  Ｐｅｒ  Ｋｉｌｏｂａｓｅ  Ｍｉｌｌｉｏｎ  （ＴＰＭ）値でｐ＜０．０５を有する、差次的発現遺伝子（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｇｅｎｅｓ：ＤＥＧ）を示した。非感染ＣＤ３４−ＮＯＧ−ｈＩＬ−３４マウスと感染ＣＤ３４−ＮＯＧ−ｈＩＬ−３４マウスとを比較した、ヒトゲノム（ｈ１９）に対する遺伝子のアライメントにより、６８７のＤＥＧヒト遺伝子が見出された。これらのうち、２６１遺伝子がＨＩＶ感染により上方制御され、４２６遺伝子がＨＩＶ感染により下方制御された。図１２Ａは、ＣＤ３４−ＮＯＧ−ＩＬ−３４マウス脳で発現された古典的なミクログリアマーカーのトップリストを示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂ〜Ｃは、ヒトミクログリアおよび脳において、ＨＩＶ非感染ＣＤ３４−ＮＯＧ−ＩＬ−３４およびＨＩＶ感染ＣＤ３４−ＮＯＧ−ＩＬ−３４で差次的発現された、ＨＩＶ感染関連遺伝子の対数倍変化のトップランキングを示す。図１２Ｂは、ＨＩＶ感染ＣＤ３４−ＮＯＧ−ＩＬ−３４で上方制御されたＤＥＧを示す。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、ＨＩＶ感染ＣＤ３４−ＮＯＧ−ＩＬ−３４で下方制御されたＤＥＧを示す。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、ＨＩＶ感染で上方制御されたヒト遺伝子（２６１）が、インターフェロンシグナリング、ＰＲＰおよびＴＬＲシグナリングに関連していることを示す。
【図１２Ｅ】図１２Ｅは、ＨＩＶ感染で下方制御されたヒト遺伝子（４２６）が、ＥＩＦ２シグナリングおよび酸化的リン酸化経路と密接に関連していることを示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、ＨＩＶ非感染ＣＤ３４−ＮＯＧ−ｈＩＬ−３４マウスとＨＩＶ感染ＣＤ３４−ＮＯＧ−ｈＩＬ−３４マウスとを比較した、ヒトゲノム（ｈ１９）に対する遺伝子のアライメントにより、見いだされた６８７のＤＥＧヒト遺伝子の内訳を示す円グラフである。２６１遺伝子がＨＩＶ感染により上方制御され、４２６遺伝子がＨＩＶ感染により下方制御された。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、ＨＩＶ非感染ＣＤ３４−ＮＯＧ−ｈＩＬ−３４マウス  ｖｓ  ＨＩＶ感染ＣＤ３４−ＮＯＧ−ｈＩＬ−３４マウスについて作成した、全ＤＥＧ（ヒト）のボルカノプロットである。ＸおよびＹ軸は、それぞれ、ｌｏｇ２倍変化およびｌｏｇ１０（ｐ値）を示す。青いドットは上方制御された遺伝子を示し、緑色のドットは下方制御された遺伝子を示し、黒いドットは中立的に制御された遺伝子を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
［定義］
本明細書において、特に明記しない限り、「ＩＬ−３４」は、ＩＬ−３４タンパク質を意味し、「ＩＬ−３４遺伝子」は、ＩＬ−３４のアミノ酸配列をコードする遺伝子を意味する。「遺伝子」とは、特定のタンパク質をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを意味し、エクソン及びイントロンの両方を含み得る。
【００１１】
本明細書において、「ヒトＩＬ−３４活性」とは、免疫不全マウスに導入した場合に、当該マウスの体内において、ヒトの単球やマクロファージの分化を誘導する活性を意味する。ヒトＩＬ−３４活性は、免疫不全マウスの体内において、ヒトＨＳＣからヒトミクログリアを誘導する活性を包含する。
【００１２】
本明細書において、アミノ酸配列又は塩基配列どうしの配列同一性（又は相同性）は、２つのアミノ酸配列又は塩基配列を、対応するアミノ酸又は塩基が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除くアミノ酸配列全体又は塩基配列全体に対する一致したアミノ酸又は塩基の割合として求められる。アミノ酸配列同士又は塩基配列同士の配列同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。例えば、アミノ酸配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＰにより得られたアライメントを元にした計算によって得ることができ、塩基配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＮにより得られたアライメントを元にした計算によって得ることができる。
【００１３】
本明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ＴＨＩＲＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ（Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載の方法が挙げられる。ストリンジェントな条件としては、例えば、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸溶液、ｐＨ７．０）、５×デンハルト溶液（１００×デンハルト溶液の組成：２質量％ウシ血清アルブミン、２質量％フィコール、２質量％ポリビニルピロリドン）、０．５質量％のＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ、及び５０％フォルムアミドからなるハイブリダイゼーションバッファー中で、４２〜７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件が挙げられる。インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液が挙げられる。
【００１４】
「免疫不全非ヒト動物」とは、Ｔ細胞及びＢ細胞等の機能的免疫細胞の欠如、ＤＮＡ修復の欠陥、リンパ球上の抗原特異的受容体をコードする遺伝子の再構成における欠陥、並びにＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、及びＩｇＡ等の免疫機能分子の欠如のうち、１つ以上を有する非ヒト動物を意味する。免疫不全非ヒト動物は、非ヒト動物に異常な免疫機能をもたらす上記又は他の欠陥の何れかを有し得る。
【００１５】
本明細書において、ポリヌクレオチドに関して用いる「作動可能に連結」という用語は、第一の塩基配列が第二の塩基配列に十分に近くに配置され、第一の塩基配列が第二の塩基配列又は第二の塩基配列の制御下の領域に影響を及ぼしうることを意味する。例えば、ポリヌクレオチドが「プロモーターに作動可能に連結」するとは、当該ポリヌクレオチドが、当該プロモーターの制御下で発現するように連結されていることを意味する。
本明細書において、「プロモーターが機能し得る」とは、対象の非ヒト動物の細胞内において、当該プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを発現させることができることを意味する。
本明細書において、「発現可能な状態」とは、ポリヌクレオチドが導入された細胞内で、該ポリヌクレオチドが転写され得る状態にあることを意味する。
本明細書において、「発現ベクター」とは、対象ポリヌクレオチドを含むベクターであって、該ベクターを導入した細胞内で、対象ポリヌクレオチドを発現可能な状態にするシステムを備えたベクターを意味する。
【００１６】
本明細書において、「マーカー」とは、特定種類の細胞に特異的に発現するタンパク質を意味する。「マーカー」は、好ましくは、細胞表面に存在するタンパク質である。
【００１７】
［ＩＬ−３４を有する非ヒト動物］
本発明の第１の態様は、ヒトのインターロイキン３４（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ３４：ＩＬ−３４）を体内に有する非ヒト動物である。
【００１８】
ＩＬ−３４は、コロニー刺激因子１受容体（ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＣＳＦ１Ｒ）を介して単球およびマクロファージの分化および生存を促進するサイトカインの一種である。
ヒトのＩＬ−３４の遺伝子配列及びアミノ酸配列は公知であり、それらの配列情報は、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースから取得することができる。例えば、ヒトのＩＬ−３４の遺伝子配列およびアミノ酸配列としては、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ．ＮＭ＿１５２４５６．２で登録された配列（配列番号１、２）等が挙げられる。ヒトＩＬ−３４は、前記配列を有するものに限定されず、それらのホモログ（オーソログ、パラログ）、及びそれらの変異体を包含する。
【００１９】
ヒトＩＬ−３４には、例えば、以下のものが包含される。
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つヒトＩＬ−３４活性を有するポリペプチド。
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つヒトＩＬ−３４活性を有するポリペプチド。
【００２０】
ヒトＩＬ−３４遺伝子には、例えば、以下のものが包含される。
（４）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（５）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つヒトＩＬ−３４活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（６）配列番号２に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つヒトＩＬ−３４活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（７）配列番号１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（８）配列番号１に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換、付加、又は挿入された塩基配列からなり、且つヒトＩＬ−３４活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（９）配列番号１に記載の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、且つヒトＩＬ−３４活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（１０）配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つヒトＩＬ−３４活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００２１】
上記（２）及び（５）において、欠失、置換、付加、又は挿入されるアミノ酸の数は、結果として生じるポリペプチドがヒトＩＬ−３４活性を有する限り、特に限定されない。上記（８）において、欠失、置換、付加、又は挿入される塩基の数は、結果として生じるポリヌクレオチドが、ヒトＩＬ−３４活性を有するポリペプチドをコードする限り、特に限定されない。欠失、置換、付加、又は挿入されるアミノ酸又は塩基の数は、例えば１〜８０個であることができ、１〜６０個が好ましく、１〜５０個がより好ましく、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個、１〜５個、１〜３個、１個又は２個等が例示される。
上記（３）、（６）又は（９）において、配列同一性は、８０％以上である限り、特に限定されない。配列同一性は、８５％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、９７％以上であることが特に好ましい。
【００２２】
また、配列番号２に記載のアミノ酸配列は、１〜２０位がシグナルペプチドである。シグナルペプチドは、細胞外に分泌される際に切断されるため、成熟したヒトＩＬ−３４は、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、２１〜２４２位に記載のアミノ酸配列から構成される。
したがって、ヒトＩＬ−３４には、以下のものも包含される。
（１１）配列番号２に記載のアミノ酸配列の２１〜２４２位のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（１２）配列番号２に記載のアミノ酸配列２１〜２４２位のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つヒトＩＬ−３４活性を有するポリペプチド。
（１３）配列番号２に記載のアミノ酸配列の２１〜２４２位のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つヒトＩＬ−３４活性を有するポリペプチド。
【００２３】
上記（１２）における、欠失、置換、付加、又は挿入されるアミノ酸の数は、上記（２）の場合と同様の例が挙げられる。上記（１３）における配列同一性の数値は、上記（３）の場合と同様の例が挙げられる。
【００２４】
また、ヒトＩＬ−３４遺伝子は、上記（１１）〜（１３）のいずれかのポリペプチドのＮ末端側に細胞外分泌のためのシグナルペプチドが連結されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを包含する。前記シグナルペプチドは、ヒトＩＬ−３４のシグナルペプチドに限定されず、他のタンパク質のシグナルペプチドであってもよい。そのようなシグナルペプチドとしては、例えば、ＩＬ−３４以外のサイトカインのシグナルペプチドが挙げられる。
【００２５】
非ヒト動物は、ヒト以外の動物であれば特に限定されないが、好ましくは哺乳類である。非ヒト動物としては、例えば、非ヒト霊長類（サル、チンパンジー、ゴリラなど）、げっ歯類（マウス、ラット、モルモットなど）、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ等が挙げられるが、これらに限定されない。これらの中でも、入手や試験が容易であることから、げっ歯類が好ましく、マウスがより好ましい。
【００２６】
非ヒト動物は、ヒト細胞が生着可能なことから、免疫不全非ヒト動物であることが好ましい。非ヒト動物がマウスである場合、免疫不全マウスは、Ｒａｇ１及びＲａｇ２等、免疫機能に関与する遺伝子における１つ以上の欠損により特徴付けることができる（例えば、Oettinger, M.A et al., Science, 248:1517-1523, 1990；Schatz, D. G. et al., Cell, 59:1035-1048, 1989参照）。免疫不全マウスは、マウスに異常な免疫機能をもたらす上記又は他の欠陥の何れかを有し得る。
【００２７】
免疫不全マウスとしては、例えば、ＮＯＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｓｕｇ／ＳｈｉＪｉｃ）、ＮＳＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）、ＮＯＤ／ＳｈｉＪｃｌマウス等が挙げられるが、これらに限定されない。免疫不全マウスは市販されており、これら市販の免疫不全マウスを特に制限なく用いることができる。
【００２８】
本態様の非ヒト動物は、ヒトＩＬ−３４を体内に有していることを特徴とする。ヒトＩＬ−３４を体内に有する非ヒト動物の作製方法としては、例えば、ヒトＩＬ−３４を非ヒト動物に投与する方法、ヒトＩＬ−３４遺伝子を非ヒト動物に導入する方法、ヒトＩＬ−３４を分泌する細胞を非ヒト動物に移入する方法等が挙げられる。
【００２９】
ヒトＩＬ−３４を非ヒト動物に投与する場合、ヒトＩＬ−３４が非ヒト動物の体内に保持される限り、投与方法は特に限定されないが、非経口投与であることが好ましい。非経口投与の経路としては、例えば、筋肉注射、皮下注射、血管内注射等が挙げられる。ヒトＩＬ−３４が非ヒト動物の体内に保持されていれば、ヒトＩＬ−３４の投与は、単回投与であってもよく、複数回投与であってもよい。
【００３０】
非ヒト動物が、体内にヒトＩＬ−３４を有しているか否かは、非ヒト動物の血漿を採取し、当該血漿中のヒトＩＬ−３４濃度を測定することにより、確認することができる。血漿中のヒトＩＬ−３４濃度の測定方法は、特に限定されないが、抗ヒトＩＬ−３４抗体を用いた免疫化学的方法が挙げられる。そのような方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、ＲＩＡ法、ウェスタンブロット法等が挙げられる。血漿中のヒトＩＬ−３４の測定には、市販のヒトＩＬ−３４測定用ＥＬＩＳＡキット等を用いてもよい。
【００３１】
血漿中のヒトＩＬ−３４の濃度としては、例えば、２０ｐｇ／ｍＬ以上が挙げられ、３０ｐｇ／ｍＬ以上が好ましく、５０ｐｇ／ｍＬ以上がより好ましく、８０ｐｇ／ｍＬ以上がさらに好ましく、１００ｐｇ／ｍＬ以上が特に好ましい。血漿中のヒトＩＬ−３４の濃度の上限は、特に限定されないが、例えば、１０００ｐｇ／ｍＬ以下、８００ｐｇ／ｍＬ以下、又は７００ｐｇ／ｍＬ以下等が挙げられる。
【００３２】
ヒトＩＬ−３４遺伝子を非ヒト動物に導入する場合、ヒトＩＬ−３４は、導入対象の非ヒト動物において機能し得るプロモーターの下流に作動可能に連結されていることが好ましい。哺乳類で機能可能なプロモーターとしては、例えば、ＣＭＶ（サイトメガロウィルス）プロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、レトロウィルスのＬＴＲ、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウィルス）プロモーター、ＨＳＶ−ＴＫ（単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ）プロモーター、ＥＦ１αプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
ヒトＩＬ−３４遺伝子は、発現可能な状態で非ヒト動物に導入され、例えば、発現ベクターの形態で非ヒト動物に導入される。発現ベクターは、ヒトＩＬ−３４遺伝子およびプロモーターに加えて、エンハンサー、ポリＡ付加シグナル、ターミネーター等の制御配列、薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子を含み得る。
ベクターの種類は特に限定されず、一般的に使用される発現ベクターを特に制限なく使用することができる。ベクターは、直鎖状でも環状でもよく、プラスミドなどの非ウィルスベクターでも、ウィルスベクター（例えば、レンチウィルスベクターなどのレトロウィルスベクター）でも、トランスポゾンによるベクターでもよい。
【００３４】
ヒトＩＬ−３４遺伝子の非ヒト動物への導入方法は、特に限定されず、トランスジェニック動物の作製に一般的に用いられる方法を適用することができる。ヒトＩＬ−３４遺伝子の非ヒト動物への導入方法としては、例えば、ヒトＩＬ−３４遺伝子を含む発現ベクターを、導入対象の非ヒト動物の受精卵にマイクロインジェクション等により導入する方法等が挙げられる。非ヒト動物がマウスである場合、受精卵としては、例えば、ＮＯＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｓｕｇ／ＳｈｉＪｉｃ）とＮＯＤ／ＳｈｉＪｃｌマウスとを交配させて得られた受精卵等が例示されるが、これに限定されない。
ヒトＩＬ−３４遺伝子を導入した受精卵は、３７℃で１８〜２４時間程度培養した後、仮親の子宮に移植・着床させ、仔を誕生させることにより、ヒトＩＬ−３４遺伝子を有する非ヒト動物を得ることができる。
【００３５】
上記のように得られた非ヒト動物が、ヒトＩＬ−３４遺伝子を有しているか否かは、当該非ヒト動物から採取した試料からゲノムＤＮＡを抽出してＰＣＲ法等を行うことにより、確認することができる。
また、当該非ヒト動物が、ヒトＩＬ−３４遺伝子を発現しているか否かは、当該非ヒト動物から採取した試料からＲＮＡを抽出してＲＴ−ＰＣＲ法等を行うことにより、又は当該非ヒト動物から採取した組織試料を用いてｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションを行うこと等により、確認することができる。あるいは、抗ヒトＩＬ−３４抗体を用いて、当該非ヒト動物から採取した試料中のヒトＩＬ−３４を検出することにより（例えば、ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、ＲＩＡ法、ウェスタンブロット法、ＥＩＡ法、ＲＩＡ法、免疫組織染色など）、確認することができる。
ヒトＩＬ−３４遺伝子を導入した非ヒト動物は、ヒトＩＬ−３４を分泌していることが好ましい。ここで、非ヒト動物がヒトＩＬ−３４を分泌するとは、主に、当該非ヒト動物の細胞から体液（血液、組織液、リンパ等）中にヒトＩＬ−３４が放出されることを指す。当該非ヒト動物が、ヒトＩＬ−３４を分泌しているか否かは、当該非ヒト動物から採取した血漿において、当該血漿中のヒトＩＬ−３４濃度を測定することにより、確認することができる。血漿中のヒトＩＬ−３４濃度の測定方法は、上記と同様のものが例示される。
【００３６】
ヒトＩＬ−３４を分泌する細胞（ヒトＩＬ−３４分泌細胞）を非ヒト動物に移入する場合、ヒトＩＬ−３４分泌細胞としては、例えば、ヒト臓器や血液に由来する細胞、がん細胞等が挙げられる。前記ヒト臓器に由来する細胞としては、例えば、脾臓、胸腺、肝臓、小腸、大腸、前立腺、肺、心臓、脳、腎臓、精巣、子宮等に由来する細胞等が挙げられる。前記ヒト血液に由来する細胞としては、例えば、末梢血単核細胞画分に含まれる血球細胞等が挙げられる。例えば、それらのヒト細胞から樹立された細胞株から、ヒトＩＬ−３４を分泌する細胞を選択し、非ヒト動物に移入するためのヒトＩＬ−３４分泌細胞として用いることができる。あるいは、ヒトＩＬ−３４遺伝子を導入した非ヒト動物の細胞をヒトＩＬ−３４分泌細胞として用いてもよい。前記非ヒト動物の細胞は、細胞の移入対象である非ヒト動物と同種に属する非ヒト動物の細胞であることが好ましい。例えば、細胞の移入対象である非ヒト動物がマウスであれば、ヒトＩＬ−３４遺伝子を導入する細胞はマウスの細胞であることが好ましい。ヒトＩＬ−３４遺伝子を導入する非ヒト動物の細胞は、特に限定されないが、例えば、臓器や血液に由来する細胞もしくはその細胞株、造血幹細胞（ＣＤ３４陽性造血幹細胞など）やがん細胞等が挙げられる。前記の非ヒト動物の臓器や血液に由来する細胞としては、上記ヒトＩＬ−３４分泌細胞において例示したものと同様の臓器や血液画分に由来する非ヒト動物の細胞が挙げられる。ヒトＩＬ−３４遺伝子は、上記と同様に、発現可能な状態で非ヒト動物細胞に導入され、例えば、発現ベクターの形態で非ヒト動物細胞に導入される。ヒトＩＬ−３４遺伝子の非ヒト動物細胞への導入方法は、特に限定されず、遺伝子導入法として一般的に用いられる方法を適用することができる。そのような方法としては、例えば、ウィルス感染法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、カルシウムリン酸法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポーレーション法、トランスポゾンを用いる方法、パーティクルガン法等を挙げられるが、これらに限定されない。
前記ヒト細胞株又は前記ヒトＩＬ−３４遺伝子導入細胞がヒトＩＬ−３４を分泌しているか否かは、前記細胞若しくは細胞株、又は前記ヒトＩＬ−３４遺伝子導入細胞の培養液中のＩＬ−３４濃度を測定することにより、確認することができる、培養液中のヒトＩＬ−３４濃度の測定方法は、上記と同様のものが例示される。
【００３７】
ヒトＩＬ−３４分泌細胞の非ヒト動物への移入方法は、特に限定されず、非ヒト動物への細胞の移入に一般的に用いられる方法を適用することができる。ヒトＩＬ−３４分泌細胞の非ヒト動物への移入方法としては、例えば、用いた細胞の種類に応じて、脾臓内、肝臓内、皮下又は静脈内等にヒトＩＬ−３４分泌細胞を投与する方法等が挙げられる。
ヒトＩＬ−３４分泌細胞を移入した非ヒト動物は、ヒトＩＬ−３４を分泌していることが好ましい。ここで、非ヒト動物がヒトＩＬ−３４を分泌するとは、主に、当該非ヒト動物に移入したヒトＩＬ−３４分泌細胞から体液（血液、組織液、リンパ等）中にヒトＩＬ−３４が放出されることを指す。当該非ヒト動物が、ヒトＩＬ−３４を分泌しているか否かは、当該非ヒト動物から採取した血漿において、当該血漿中のヒトＩＬ−３４濃度を測定することにより、確認することができる。血漿中のヒトＩＬ−３４濃度の測定方法は、上記と同様のものが例示される。
【００３８】
また、本態様の非ヒト動物の作製方法としては、非ヒト動物に、ヒトＩＬ−３４遺伝子を組み込んだレンチウイルスやアデノウイルス等のウィルスを直接接種して感染させ、ヒトＩＬ−３４を分泌させる方法も挙げられる。当該方法は、上述のヒトＩＬ−３４遺伝子を非ヒト動物に導入する方法に包含される。
【００３９】
本態様の非ヒト動物は、ヒトＩＬ−３４遺伝子を有するものであることが好ましく、ヒトＩＬ−３４を分泌するものであることがより好ましい。非ヒト動物が、ヒトＩＬ−３４遺伝子を有し、ヒトＩＬ−３４を分泌するものである場合、血漿中のヒトＩＬ−３４の濃度としては、上記と同様の濃度が挙げられる。
【００４０】
＜ヒトのミクログリアを有する非ヒト動物＞
ヒトＩＬ−３４を有する非ヒト動物に、ヒトのＣＤ３４陽性造血幹細胞を移植することにより、当該非ヒト動物の体内で、当該ＣＤ３４陽性造血幹細胞からヒトミクログリアが誘導される。すなわち、ヒトＩＬ−３４を有する非ヒト動物にヒトＣＤ３４陽性造血幹細胞を移植することにより、ヒトミクログリアを有する非ヒト動物を作製することができる。
したがって、本態様の非ヒト動物は、ヒトＩＬ−３４を有する非ヒト動物に、ヒトのＣＤ３４陽性造血幹細胞が移植されたものであってもよい。また、本態様の非ヒト動物は、ヒトＩＬ−３４およびヒトミクログリアを有する非ヒト動物であってもよい。
また、一実施形態において、本発明は、ヒトＩＬ−３４を体内に有する非ヒト動物に、ヒトのＣＤ３４陽性造血幹細胞を移植することを含む、ヒトのミクログリアを有する非ヒト動物の作製方法を提供する。
【００４１】
ヒトのＣＤ３４陽性造血幹細胞は、ヒトの臍帯血、骨髄、血液等から得ることができる。これらの試料から、ヒトのＣＤ３４陽性造血幹細胞を得る方法は、特に限定されないが、例えば、これらの試料の密度勾配遠心法を行った後、抗ヒトＣＤ３４抗体を用いた磁気ビーズ法によりＣＤ３４陽性細胞を単離する方法等が挙げられる。得られたヒトのＣＤ３４陽性造血幹細胞は、フローサイトメトリー等により純度を確認してもよい。
【００４２】
ヒトのＣＤ３４陽性造血幹細胞の非ヒト動物への移植方法は、特に限定されず、造血幹細胞の移植に一般的に用いられる方法を適用することができる。ヒトのＣＤ３４陽性造血幹細胞の非ヒト動物への移植方法としては、例えば、出生後の非ヒト動物（例えば、出生後０〜１日）を放射線で全身処理した後、肝臓内や静脈内にヒトＣＤ３４陽性造血幹細胞を投与する方法等が挙げられる。
移植するヒトのＣＤ３４陽性造血幹細胞の数は、特に限定されないが、例えば、１０３個以上が好ましく、１０４個以上がより好ましい。移植するヒトのＣＤ３４陽性造血幹細胞の数の上限は、特に限定されないが、例えば、１０１０個以下、１０９個以下、または１０８個以下等が例示される。
非ヒト動物が、ヒトのＣＤ３４陽性造血幹細胞を移植されたか否かは、ヒト免疫細胞マーカー（ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ８、ＣＤ１４等）に対する抗体を用いたフローサイトメトリー等により、非ヒト動物の血液試料や脾臓組織試料を分析することにより確認することができる。
【００４３】
ヒトＩＬ−３４を有する非ヒト動物に、ヒトのＣＤ３４陽性造血幹細胞を移植すると、当該非ヒト動物の体内でＣＤ３４陽性造血幹細胞からヒトミクログリアが分化・誘導されるため、ヒトミクログリアを有する非ヒト動物を得ることができる。非ヒト動物が、ヒトミクログリアを有するか否かは、ヒトミクログリアに特異的なマーカー（例えば、ＨＬＡ−ＤＲおよびＩｂａ１の二重陽性）に対する抗体を用いた免疫組織染色等により、確認することができる。
ヒトＩＬ−３４を有する非ヒト動物において、ヒトミクログリアが存在する部位は特に限定されないが、ミクログリアは、通常、中枢神経系に存在するものであるため、当該非ヒト動物においても中枢神経系に存在することが好ましく、脳内に存在することがより好ましい。
【００４４】
本態様の非ヒト動物が有するヒトミクログリアは、ＣＤ７４、ｂ２ｍ、ＡＩＦ１、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＳＦ１Ｒ、ＩＴＧＡＭ（ＣＤ１１ｂ）、Ｐ２ＲＹ１２、ＣＸ３ＣＲ１、ＴＲＥＭ２、ＴＭＥＭ１１９、ＣＣＬ２、ＴＮＦ、ＨＧＨ（ＩＬ−６）、ＣＸＣＬ８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１ａ、ＣＸＣＬ１０、ＰＵ．１（ＳＰＩ１）、ＥＴＶ５、及びＡＰＯＥからなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を発現するものであることが好ましい。これらの遺伝子は、古典的なマクロファージ／ミクログリアのマーカーとして知られる遺伝子である。また、本態様の非ヒト動物が有するヒトミクログリアは、後述の表２Ａ〜２Ｈに記載の遺伝子の一部または全部を発現していることが好ましい。
【００４５】
また、本態様の非ヒト動物が有するヒトミクログリアは、ＣＣＬ２、ＴＮＦ、ＨＧＨ（ＩＬ−６）、ＣＸＣＬ８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１ａ、及びＣＸＣＬ１０からなる群より選択される少なくとも１種のサイトカインを分泌するものであることが好ましい。
【００４６】
＜ヒト免疫不全ウィルスを感染させた非ヒト動物＞
後述する実施例で示すように、ヒトＩＬ−３４を有する非ヒト動物は、ヒトＩＬ−３４を有さない非ヒト動物と比較して、多くのヒトミクログリアを有することができる。そのため、ヒトＩＬ−３４、およびヒトミクログリアを有する非ヒト動物に、ヒト免疫不全ウィルス（Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ：ＨＩＶ）を感染させることにより、ヒト脳におけるＨＩＶ感染を適切に再現することが可能である。
したがって、本態様の非ヒト動物は、ヒトＩＬ−３４を有する非ヒト動物に、ＨＩＶを感染させたものであってもよい。前記非ヒト動物は、ヒトＩＬ−３４およびヒトミクログリアを有するものであることが好ましい。
また、一実施形態において、本発明は、上述の方法によりヒトミクログリアを有する非ヒト動物（ヒトＩＬ−３４およびヒトミクログリアを有する）を作製した後、前記ヒトのミクログリアを有する非ヒト動物にＨＩＶを感染させることを含む、ＨＩＶ感染非ヒト動物の作製方法を提供する。
【００４７】
感染に用いるＨＩＶは、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２のいずれであってもよい。非ヒト動物へのＨＩＶの感染方法は、特に限定されず、一般的に用いられる感染方法を適用することができる。非ヒト動物へのＨＩＶの感染方法としては、例えば、ＨＩＶを腹腔内投与する方法等が挙げられる。感染に用いるウィルス量は、ＨＩＶ感染が成立可能な量であれば特に限定されないが、例えば、５００〜５０００  ＴＣＩＤ５０が挙げられ、７００〜３０００  ＴＣＩＤ５０が好ましく、具体例としては１０００  ＴＣＩＤ５０が例示される。
【００４８】
非ヒト動物においてＨＩＶ感染が成立したか否かは、当該非ヒト動物から採取された末梢血中のＨＩＶ量を測定することにより、確認することができる。例えば、末梢血中に、ＨＩＶ量が１０６  ＲＮＡコピー／ｍＬ程度検出された場合に、ＨＩＶ感染が成立したと判断することができる。また、ＨＩＶの脳への感染は、当該非ヒト動物の脳組織切片において、ＨＩＶ特異的タンパク質やＲＮＡを標的とする免疫染色やｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＮＡハイブリダイゼーション等を行うことにより、確認することができる。本態様の非ヒト動物は、ＨＩＶが脳に感染していることが好ましい。
【００４９】
本態様の非ヒト動物は、ヒトＩＬ−３４を体内に有することにより、ヒトの血液リンパ系を適切に再構築することができる。特に、従来の免疫不全マウス等の非ヒト動物で困難であった、脳内におけるヒトミクログリアの再構成を可能にする。そのため、ミクログリアを主なリザーバーとするＨＩＶ等のウィルス感染モデルの作製に用いることができる。
本態様の非ヒト動物は、ミクログリアを標的とするウィルス感染機構の解明やウィルス感染治療薬のスクリーニング・評価等に用いることができる。また、本態様の非ヒト動物は、ミクログリアを介する中枢神経系疾患のメカニズムの解明や治療薬のスクリーニング・評価等に用いることができる。
【００５０】
［ヒトミクログリアの製造方法］
本発明の第２の態様は、前記第１の態様の非ヒト動物から、ヒトのミクログリアを得ることを含む、ヒトのミクログリアの製造方法である。
【００５１】
上記のように、第１の態様の非ヒト動物は、ヒトミクログリアを多く保持することができるため、ヒトミクログリアの製造に用いることができる。したがって、一態様において、本発明は、第１の態様の非ヒト動物を用いた、ヒトミクログリアの製造方法、および当該製造方法により得られたヒトミクログリアを提供する。
【００５２】
本態様のヒトミクログリアの製造方法は、以下の工程を含むことができる：
（ａ）非ヒト動物に、ヒトＩＬ−３４を投与して又はヒトＩＬ−３４遺伝子を導入して、ヒトＩＬ−３４を体内に有する非ヒト動物を得る工程；
（ｂ）前記工程（ａ）で得られた非ヒト動物に、ヒトのＣＤ３４陽性造血幹細胞を移植し、ヒトミクログリアを有する非ヒト動物を得る工程；および
（ｃ）前記工程（ｂ）で得られた非ヒト動物から、ヒトミクログリアを得る工程。
【００５３】
前記工程（ａ）および工程（ｂ）は、上記「［ＩＬ−３４を有する非ヒト動物］」の項で記載したように行うことができる。
前記工程（ｃ）は、工程（ｂ）で得られた非ヒト化動物の血液試料や脳組織から、ヒトミクログリアを単離することにより行うことができる。例えば、密度勾配遠心法、ヒトミクログリア特異的マーカーに対する抗体を用いた磁気ビーズ法等を行うことにより、それらの試料からミクログリアを単離することができる。脳組織からヒトミクログリアを単離する場合、脳組織を適当な緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水等）に懸濁してホモジナイズした後、密度勾配遠心法を行ってもよい。
ヒトミクログリア特異的マーカーとしては、例えば、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｉｂａ１、ＣＤ７４、ｂ２ｍ、ＡＩＦ１、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＳＦ１Ｒ、ＩＴＧＡＭ（ＣＤ１１ｂ）、Ｐ２ＲＹ１２、ＣＸ３ＣＲ１、ＴＲＥＭ２、ＴＭＥＭ１１９、ＣＣＬ２、ＴＮＦ、ＨＧＨ（ＩＬ−６）、ＣＸＣＬ８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１ａ、ＣＸＣＬ１０、ＰＵ．１（ＳＰＩ１）、ＥＴＶ５、およびＡＰＯＥ等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
本態様の製造方法により得られるヒトミクログリアは、ヒトミクログリアの機能の解明、ヒトミクログリアを標的とするウィルス感染機構の解明、ヒトミクログリアを標的とする薬剤の評価等に用いることができる。
【実施例】
【００５５】
本発明を実施例に基づいて説明する。ただし、本発明の実施態様は、これら実施例の記載に限定されるものではない。以下の実施例では、非ヒト動物としてマウスを用いているが、本発明の実施態様はマウスに限定されるものではない。他の材料及び方法についても、以下の実施例に記載のものに限定されるものではない。【００５６】
［方法］
＜ＮＯＧ−ｈＩＬ−３４マウスの作製＞
ＮＯＧ（ＮＯＤ  Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｇｔｍｌＳｕｇ／Ｊｉｃ）およびＮＯＤ／ＳｈｉＪｃｌ（ＮＯＤ）を使用した。ＮＯＧマウスは、実験動物中央研究所（ＣＩＥＡ）において、特定病原体不在条件下で飼育した。ＮＯＤ／ＳｈｉＪｃｌマウスは、日本クレア株式会社（東京、日本）から購入した。
ヒトＩＬ−３４発現トランスジェニックＮＯＧマウスを作製するために、ＣＭＶ−プロモーターの制御下のヒトＩＬ−３４（ｈＩＬ−３４）ｃＤＮＡ（Ｏｒｉｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）を含む線状ＤＮＡベクター（ｐＣＭＶ６−ＸＬ４）を、ＮＯＧマウスとＮＯＤマウスを交配することによって得られた受精卵にマイクロインインジェクションした。得られた２６匹の離乳仔のうちの３匹（＃１１、＃１３および＃２４）が、ｈＩＬ−３４  ｃＤＮＡを増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により陽性であった。【００５７】
＜ＮＯＧ−ｈＩＬ−３４  Ｔｇマウスのキャラクタリゼーション＞
（ＥＬＩＳＡによるヒトＩＬ−３４の定量）
製造業者の説明書に従い、ヒトＩＬ−３４  ＥＬＩＳＡ定量セット（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）を使用して、マウス血漿（１：１０希釈）内のヒトＩＬ−３４を定量することによって、ヒトＩＬ−３４のトランスジェニック発現を評価した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＵＳＡ）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。【００５８】
（ヒトＩＬ−３４転写産物のＲＴ−ＰＣＲ）
脾臓、肺、肝臓、腎臓、腸、皮膚および脳組織からのＲＮＡ単離のために、各組織をＱｉａｇｅｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｌｙｚｅｒ  ＩＩ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてＴｒｉｚｏｌ溶液中でホモジナイズし、フェノール−クロロホルム法によりＲＮＡを抽出した。ＲＮＡからのｃＤＮＡの合成を、Ｖｅｒｓｏ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｖｉｌｎｉｕｓ，Ｌｉｔｈｕａｎｉａ）を用いて製造業者の説明書に従って行い、ｃＤＮＡの増幅を、ＴａｑＭａｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙを用いてＡＢＩ  Ｓｔｅｐ  Ｏｎｅ  ＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）で行った。ヒト化ＮＯＧ−ｈＩＬ−３４  ＴｇマウスのサンプルにおけるヒトＩＬ−３４（Ｈｓ０１０５０９２６＿ｍ１）の発現を、ヒト化マウスのサンプルと比較した。ハウスキーピング遺伝子としてヒトＧＡＰＤＨ（Ｈｓ０３９２９０９７＿ｇ１）を使用した。リアルタイムＰＣＲの設定は以下の通りとした：５０℃で２分間、９５℃で１０分間、９５℃で１５秒間の４０サイクル；および６０℃で１分間。ヒト化ＮＯＧ−ｈＩＬ−３４  Ｔｇマウス群（トランスジェニック群）とヒト化マウス群（対照群）との間の、ＧＡＰＤＨに対する各標的遺伝子ｍＲＮＡの相対量の倍数変化を求めた。これは、しきい値サイクル（ＣＴ）および２−ΔΔＣＴ法を用いて行った（ΔＣＴ＝ＣＴＩＬ−３４−ＣＴＧＡＰＤＨ、Δ（ΔＣＴ）＝ΔＣＴ（トランスジェニック群）−ΔＣＴ（対照群））。【００５９】
＜ヒトＣＤ３４＋ＨＳＣの単離＞
親の書面によるインフォームドコンセント、およびネブラスカ大学医療センターの施設内審査委員会（ＵＮＭＣの婦人科および産科）の承認を得た後、ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞を健康的な満期新生児の臍帯血から得た。白血球分離培地（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｓａｎｔａ，ＡＮＡ，ＣＡ，ＵＳＡ）中の臍帯血を、３００ｇで３５分間密度勾配遠心分離した後、製造業者の説明書（ＣＤ３４＋  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｉｎｃ．，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）に従って免疫磁気ビーズを用いて、ＣＤ３４＋細胞を濃縮するために軟膜を採取した。単離したＣＤ３４＋細胞の純度をフローサイトメトリーにより評価した。ＣＤ３４＋ＨＳＣは、そのまま使用するか、または５０％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、４０％Ｉｓｃｏｖｅの改変ダルベッコ培地（ＧＩＢＣＯ、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）、および１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を含む凍結培地を用いて、液体窒素中で保存した。【００６０】
＜ヒトＣＤ３４＋ＨＳＣ移植＞
ＮＯＧ−ｈＩＬ−３４  Ｔｇマウスを、ネブラスカ大学メディカルセンター（ＵＮＭＣ）の特定病原体が存在しない施設（ＳＰＦ）で飼育した。新生仔（出生後０〜１日目）に１Ｇｙを照射した（ＲＳ  ２０００  Ｘ線照射器、Ｒａｄ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，Ｓｕｗａｎｅｅ，ＧＡ，ＵＳＡ）４時間後に、仔マウスに、１×１０５個のヒトＣＤ３４＋ＨＳＣを肝臓内注射した。合計１９匹のヒト細胞再構成動物を以下の試験に用いた。ヒト白血球の生着は、生着後１２週後の顔面静脈からの血液サンプルを、フローサイトメトリーで分析することによって調べた。【００６１】
＜フローサイトメトリー＞
血液サンプルを、顔面静脈からまたは安楽死後の直接心臓穿刺によって、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）含有チューブ（ＢＤ  Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）で採取し、１８００ｒｐｍで８分間遠心分離した。脾臓組織をホモジナイズし、４０ｕのストレーナーを用いて濾過することにより、脾細胞を採取した。血球および脾細胞をＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＢＳを含むリン酸緩衝生理食塩水）中で再懸濁し、ヒト免疫細胞マーカーに対する抗体のカクテル（ＣＤ４５＋  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ）；ＣＤ３＋  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００（ＢＤ，ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ），ＣＤ１９＋  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ６５０  （ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ）；ＣＤ４＋  ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ，  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ）；ＣＤ８＋  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ＴＭ  ４２１（ＢＶ４２１，  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ）；ＣＤ１４＋  ＰＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ）で、４℃で３０分間インキュベートした。ＲＢＣを、ＦＡＣＳ溶解溶液（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ）により溶解した。染色細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、２％パラホルムアルデヒドで固定した。データ収集は、ＢＤ  ＬＳＲ２フローサイトメーターに実装された収集ソフトウェア、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａ  ｖ６（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ）を用いて実施し、ＦＬＯＷＪＯ分析ソフトウェアｖ１０．２（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，ＵＳＡ；ｗｗｗ．ｆｌｏｗｊｏ．ｃｏｍ）を用いてデータを分析した。適切な対照集団に従ってゲートを割り当てた。【００６２】
＜ＨＩＶ−１の感染＞
ヒトの血液−リンパ系が再構成され、かつＩＬ−３４発現が陽性であるマウス（〜６−８月齢）に、マクロファージ指向性ＨＩＶ−１ＡＤＡ株を腹腔内感染させ（ｎ＝１２）、感染が確立した６週間後に安楽死させた。【００６３】
＜血漿、脾臓、脳におけるＨＩＶ−１の測定＞
感染から３週間後および６週間後に、ＣＯＢＡＳ  Ａｍｐｌｉｃｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｖ１．５キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、マウス血漿中のウィルスＲＮＡコピー数を求めた。脳内のＨＩＶ−１グループ特異的抗原（ｇａｇ）ＲＮＡの発現を、ＴａｑＭａｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙを用いてＡＢＩ  Ｓｔｅｐ  Ｏｎｅ  ＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）で上記のように分析した。２回目のＰＣＲに使用したプライマーおよびプローブは以下のとおりである：アンチセンス：５’−ＡＴＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＧＣＡＡＴＡＧＧ−３’（配列番号３）；センス：５’−ＡＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＣＣＡＴＧＣＡＡＡＡＴ−３’  （配列番号４）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）；およびＴａｑＭａｎプローブ：ＦＡＭ−ＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧＡ−ＴＡＭＲＡ（配列番号５）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）。内在性マウスＧＡＰＤＨ（Ｍｍ９９９９９９１５１５＿ｇ１）転写物を用いた全ＲＮＡ発現の正規化の後、ΔΔＣＴ法を用いて、ＲＮＡ発現の対数変化を計算した。【００６４】
脾臓および脳組織におけるＨＩＶ  ＲＮＡコピーの形態学的検出のために、製造業者の指示に従ってＲＮＡＳｃｏｐｅ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）を実施した。ＨＩＶ−１の塩基対８５４〜８２９１を標的とする７８個のプローブ対を含むチャンネル１アンチセンスＨＩＶ−１  Ｃｌａｄｅ  Ｂ標的プローブを使用した。発現の陽性は、感染細胞中の褐色の点の存在により示された。組織免疫組織化学検査は、ＨＩＶ−１ｐ２４（１：２０；Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＣＤ４（１：１００；Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＣＤ８（１：１００；Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）、およびＨＬＡ−ＤＲ（１：１００；Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，  ＣＯ，  ＵＳＡ）について、製造業者の説明書に従ってＥＸＰＯＳＥ  Ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  Ｒａｂｂｉｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＨＲＰ／ＤＡＢ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＩＨＣ  Ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡ，  ＵＳＡ）を製造業者の説明書に従って使用して、行った。【００６５】
＜免疫組織化学分析＞
組織（脾臓、肺、肝臓、腎臓、心臓、皮膚および脳の左半球）を、室温で２４時間、４％パラホルムアルデヒドで固定し、次いで、パラフィンに包埋した。パラフィン包埋５μｍ厚組織切片の抗原回復を、Ｄｅｃｌｅｒｅ／ｔｒｉｌｏｇｙ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を製造業者の説明書に従って用いて行った。ＥＸＰＯＳＥ  Ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  Ｒａｂｂｉｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＨＲＰ／ＤＡＢ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＩＨＣ  Ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）を製造業者の説明書に従って用いて、免疫組織化学検査を行った。使用した一次抗体は以下のとおりである：ＨＬＡ−ＤＲ（１：１００；Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，ＣＯ，ＵＳＡ）、ＣＤ１４（１：５００；Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＣＤ６８（１：１００；ヒトに特異的、Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＣＤ１６３（１：１００；Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）、ＣＤ６８（１：１００；マウスに特異的，ＬｉｆｅＳｐａｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ，ＵＳＡ）、およびＩｂａ−１（１：５００；Ｗａｋｏ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ，ＵＳＡ）。核をメイヤーのヘマトキシリンで対比染色し、Ｎｕａｎｃｅ  Ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（ＣＲｉ，Ｗｏｂｕｍ，ＭＡ）で２０倍および４０倍の対物レンズを用いて、明視野画像を撮影した。定量のために、ＨＬＡ−ＤＲ染色切片を、高解像度スキャナー（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．，Ｏｒｏ  Ｖａｌｌｅｙ，ＡＺ，ＵＳＡ）を用いてスキャンした。ＤＥＦＩＮＩＥＮＳ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｔｕｄｉｏ（登録商標）ソフトウェア（Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ  ＡＧ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ；ｗｗｗ．ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ．ｃｏｍ／）を用いて、ＨＬＡ−ＤＲ染色した脳切片を分析した。【００６６】
＜ＲＮＡＳｃｏｐｅ＞
ヒトＩＬ−３４の検出のために、ＲＮＡＳｃｏｐｅ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）を行った。ヒトＩＬ−３４の３８〜１７７４位を標的とする２０個のプローブ対を含むチャンネル１アンチセンスＨｓ−ＩＬ−３４−Ｎｏ−ＸＭｍを、一重発色アッセイに使用した。簡単に説明すると、５μｍ厚の脱パラフィン化および脱水したホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）脳切片を、ＨｙｂＥＺハイブリダイゼーションオーブン内で、過酸化水素で室温で１０分間、標的回収液で１００℃で８分間、およびプロテアーゼＩＶで４０℃で１５分間、前処理した。標的プローブとのハイブリダイゼーション、プレ増幅、増幅、およびＤＡＢを用いた発色検出は、４０℃のＨｙｂＥＺオーブン内で製造業者の説明書に従って行った。陽性発現は、細胞内の茶色の点の存在によって示された。【００６７】
＜免疫蛍光染色＞
パラフィン包埋組織の免疫蛍光染色のために、切片を処理し、１０％正常ヤギ血清を含む０．５％Ｔｗｅｅｎ含有１×トリス緩衝生理食塩水で抗体の非特異的吸着を抑制した。一次抗体は以下の通りである：マウス（Ｍｓ）抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ（１：１００；Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，ＣＯ，ＵＳＡ）；ＨＩＶ−１ｐ２４（１：２０；Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）；抗シナプトフィシン（１：８００；Ｈ．Ａｂｃａｍ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）；ウサギ（Ｒｂ）抗ＭＡＰ２（１：５００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）；Ｒｂ抗Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ  Ｈ（１：４００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）；ポリクローナルＲｂ  抗グリア細胞繊維性酸性タンパク質（１：１０００；Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）；およびＲｂ抗Ｉｂａ１（１：５００；Ｗａｋｏ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ，ＵＳＡ）。二次抗体は以下の通りである：Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８結合ヤギ抗Ｒｂ  ＩｇＧ（１：２００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）、およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４結合ヤギ抗Ｍｓ  ＩｇＧ（１：２００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７１０共焦点システム（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，  Ｊｅｎａ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を免疫蛍光イメージングに使用し、画像を６３倍で撮影した。【００６８】
ヒトミクログリア細胞の数を定量するために、Ｉｂａ１およびＨＬＡ−ＤＲの二重免疫染色を行ったマウス（ｎ＝３）からの代表的な矢状切片を使用した。Ｎｕａｎｃｅ  Ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（ＣＲｉ，Ｗｏｂｕｍ，ＭＡ）を使用して、４００倍の倍率で、同じ脳領域の最低２〜４の選択視野を、Ｉｂａ＋ＨＬＡＤＲ＋（ヒトミクログリア）およびＩｂａ１＋（マウスミクログリア）についてカウントした。【００６９】
＜次世代シーケンシング＞
シークエンシングのために、脳組織の前頭皮質（４匹の未感染ヒト化トランスジェニックマウス、４匹のＨＩＶ−１感染トランスジェニックマウスおよび４匹のＮＯＧ非ヒト化対照マウス）を液体窒素中で急速凍結し、−８０℃で保存した。組織ＲＮＡはＲＮｅａｓｙミニカラムを用いたＲＮＡクリーンアップにかけ、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅセット（Ｑｉａｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてＤＮａｓｅを除去した。核酸の完全性を分析した後、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２５００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、１００ｂｐ／ｒｅａｄ、≦４０００万ｒｅａｄ／ｓａｍｐｌｅで、サンプルをディープシーケンスした。ｆｑｔｒｉｍ（ｃｃｂ．ｊｈｕ．ｅｄｕ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｆｑｔｒｉｍ／）ソフトウェアを使用してリードをトリムし、リードからあいまいな塩基を除去した。トリミングの前後に、ＦＡＳＴＱＣを用いて各サンプルについて品質を評価した。リードは、マウス参照ゲノム、ＧＲＣｍ３８．ｐ３、（ｈｔｔｐｓ：／／ｕｓｗｅｓｔ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）に対して、デフォルトパラメーターを用いてＳＴＡＲ−２．５．３ａ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ａｌｅｘｄｏｂｉｎ／ＳＴＡＲ）によりアライメントし、次いで、Ｅｎｓｅｍｂｌｅアノテーションを用いて、ＲＳＥＭ  １．２．２１（ｄｅｗｅｙｌａｂ．ｇｉｔｈｕｂ．ｉｏ／ＲＳＥＭ／）により定量化した。遺伝子および転写産物の存在量は、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  Ｐｅｒ  Ｋｉｌｏｂａｓｅ  Ｍｉｌｌｉｏｎ（ＴＰＭ）値として測定した。ＴＰＭは、遺伝子の長さを正規化した後、サンプル毎に遺伝子にマッピングされたリードの割合をより容易に比較するために、シーケンシングの深度（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｅｐｔｈ）を考慮して算出した。同じパイプラインを使用して、ヒト化ＮＯＧ−ｈＩＬ−３４サンプルについてマッピングされていないリードを、さらにヒト参照ゲノムＧｒＣｈ３７（ｕｓｗｅｓｔ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）に対してアライメントし、非感染サンプルとＨＶ感染サンプルとの間で比較分析を行った。ヒトと一致しなかったリードは、ＳＴＡＲを使用してさらにＨＩＶゲノムに対してアライメントし、ＲＳＥＭにより定量化した。タンパク質をコードしていないものを除外するために、カウントおよび発現データをフィルタリングした。このフィルタリングされた遺伝子のサブセットを、（１）Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒのパッケージを用いたＲ統計ソフトウェア環境でのサンプルグループ間の様々な遺伝子の差次的発現の解析、（２）Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  ｐａｔｈｗａｙ分析（ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｃｏｍ）を用いた経路の同定、および（３）Ｇｅｎｅ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ（ｇａ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ／）を用いた生物学的プロセスおよび分子機能の解析、に使用した。【００７０】
＜統計分析＞
データは、ＧｒａｐｈＰａｄ  ｐｒｉｓｍ  ７（Ｇｒａｐｈｐａｄ，ＵＳＡ）を用いて、分析およびプロットし、平均±標準誤差平均（ｓｅｍ）として表した。トランスクリプトーム分析のために、得られたデータは、各群の平均±標準偏差として表した。スチューデントｔ検定は、Ｒ／Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒのパッケージを用いて実施した。ベンジャミニ−ホッホベルグ（ＢＨ）調整ｐ値は、多重検定によるｆａｌｓｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｒａｔｅ（ＦＤＲ）を調整して計算した。ｐ値＜０．０５は、統計的に有意な差を示すと考えられた。【００７１】
［結果］
ＣＭＶプロモーター制御下のｈＩＬ−３４導入遺伝子（Ｔｇ）を含むベクター（ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｓｕｇ）をＮＯＧマウスに導入することにより、ＮＯＧＣＩＥＡバックグラウンドのヒトＩＬ−３４トランスジェニックマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１ＳｕｇＴｇ（ＣＭＶ−ＩＬ３４）１／Ｊｉｃ）を開発した。ＮＯＧ−ｈＩＬ−３４マウスは、耳ＤＮＡのＰＣＲ分析でｈＩＬ−３４（３５８ｂｐ）転写物を増幅することにより同定された。脳を含むマウス組織におけるＩＬ−３４の発現は、ＲＴ−ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、およびＲＮＡｓｃｏｐｅによる分析によって確認した（図１Ａ〜Ｄ、図２）。ＮＯＧ−ｈＩＬ−３４マウスのヒト化は、ヒトＣＤ３４＋ＨＳＣを出生時（ＣＤ３４−ＮＳＧ）に肝内移植する標準方法に従った。【００７２】
ＣＤ３４−ＮＯＧ−ｈＩＬ−３４マウスでは、ＣＤ３４−ＮＳＧと同様に、ヒトリンパ球および骨髄細胞からなるヒト免疫系の安定した生着が達成された（図３）。驚くべきことに、ＣＤ３４−ＮＯＧ−ｈＩＬ−３４マウスの脳では、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１４、ＣＤ１６３、ＣＤ６８およびＰ２ＲＹ１２が陽性であるミクログリアの形態を備えたヒト細胞が、そのような細胞がほとんど存在しないヒトＣＤ３４−ＮＳＧマウスと比較して、明らかに有意な数の増加が認められた（図４Ａ、図４Ｂ、図５）。ヒトミクログリア様細胞は４月齢から認められる（データは６月齢のものを示す）。ヒトミクログリアはマウス脳領域全体に広く分布していた（図４Ｃ、図５）。異なるタイプのヒトミクログリアが見つかったが、それは大部分が枝分かれしたものであり、いくつかは未熟なコンパクトなアメーバ様の形態のミクログリアであった（図４Ｄ）。全ミクログリア集団におけるヒトミクログリアの割合を、ＨＬＡ−ＤＲ＋／Ｉｂａ１＋二重陽性のヒトミクログリアおよびＩｂａ１＋のマウスミクログリアを計数することによって算出し、ヒトミクログリアはある脳領域においては全ミクログリアの最大８０％となった（図４Ｅ、図４Ｆ、図６）。ＨＬＡ−ＤＲ＋／Ｉｂａ１＋陽性細胞は、嗅球（ＯＢ、５９．３±１５．４％）、皮質領域（ＣＴＸ）、線条体（ＳＴＲ）、および海馬（ＨＣ、４８．３±３４．２％）で多く、脳幹（（ＢＳ、２８．４±１２．５％））および中脳（ＭＢ、２９．５±１５．７％）で少なかった。マウスＣＮＳとヒトミクログリアとの相互作用は、正常な星状細胞の挙動およびニューロンの統合性を示した（図７）。【００７３】
次に、１０００ＴＣＩＤ５０ウィルスを腹腔内に注射してマウスにＨＩＶ−１を感染させた場合、末梢血中で〜１０６ＲＮＡコピー／ｍＬのウィルス量に達した（図８Ａ〜Ｄ）。ヒトミクログリアへの強い感染が、脳内で容易に検出された（図９Ａ、図１０Ａ〜Ｃ、図１１）。感染細胞はいくつかのマウス脳領域に見られ、ＯＢ、ＨＣ、およびＣＴＸで、最も多くの感染細胞が見られた。ＲＮＡｓｃｏｐｅ技術により、感染ヒト細胞、および感染細胞から放出された細胞外ウィルス粒子をはっきりと見ることができた。反応性の星状細胞は、ＨＩＶ感染ミクログリアまたはその近くで容易に検出された（図９）。ＣＤ３４−ＮＯＧ−ｈＩＬ−３４マウスの脳は、末梢に同程度のウィルス量を有するヒト免疫系で再構成されたＣＤ３４−ＮＳＧモデルと比較して、３〜４ｌｏｇ１０倍（１０６対１０２）高いＨＩＶウィルス量を有していた（図９Ｃ、表１）。【００７４】
【表１】
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【００７５】
同様に、感染したＣＤ３４−ＮＯＧ−ｈＩＬ−３４マウスから得た脳ＲＮＡのディープシーケンシングでは、ＣＤ３４−ＮＳＧマウスの脳では検出されなかったｇａｇ、ｎｅｆおよびｅｎｖなどのＨＩＶ−１に関連する遺伝子（Colby, D., et al. HIV RNA REBOUND POSTINTERRUPTION IN PERSONS SUPPRESSED IN FIEBIG I ACUTE HIV. in Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections (IAS-USA, Seattle, Washington, 2017).）の著しい増加を示した（図９Ｄ）。「［方法］」に記載されているように、シークエンスした全てのリードをマウスおよびヒトの参照ゲノムに対してアライメントした。合計８２個のヒトミエロイド／単球／マクロファージ／ミクログリア関連遺伝子が、ＣＤ３４−ＮＯＧ−ｈＩＬ−３４のヒト細胞に発現していた。最も高い発現は、ＭＨＣクラスＩＩ（ＣＤ７４）およびクラスＩ（Ｂ２Ｍ）であった（図１２Ａ）。ＡＩＦ１（ＩＢＡ１）、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＳＦ１Ｒ、ＩＴＧＡＭ（ＣＤ１１ｂ）、Ｐ２ＲＹ１２、ＣＸ３ＣＲ１、ＴＲＥＭ２、およびＴＭＥＭ１１９などの古典的マクロファージ／ミクログリアマーカーの発現が見られた。ＣＣＬ２、ＴＮＦ、ＨＧＦ（ＩＬ６）、ＣＸＣ１８（ＩＬ８）、ＩＬ−１０、ＩＬ１Ａ、ＣＸＣ１１０などのミクログリアによって分泌される様々なサイトカインが存在した。ミクログリアの維持および機能にとって重要な転写因子であるＰＵ．１（ＳＰＩ  １）、ＥＴＶ５、およびＡＰＯＥもまた認められた（表２）。ＨＩＶ感染ＣＤ３４−ＮＯＧ−ｈＩＬ−３４マウスと非感染マウスとの比較で異なる差次的発現を示したヒト特異的遺伝子（６８７遺伝子）の中、大部分の遺伝子（４２６遺伝子）が、ＨＩＶ感染マウスで有意な下方制御を示した（図１３Ａ、Ｂ）。下方制御された遺伝子の大部分は、ＥＩＦ２シグナル伝達および酸化的リン酸化に関与するものであった。一方、上方制御された遺伝子は、インターフェロンシグナル伝達、パターン認識受容体、トール様受容体シグナル伝達および細胞死受容体シグナル伝達（ｄｅａｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｎｇ）に関与するものであった（図１２Ｂ〜Ｅ）。【００７６】
これらの知見は、ヒトＩＬ−３４が、ヒト骨髄由来単球が出生後のマウス脳の遊走およびミクログリアへの分化に重要な役割を果たしているという事実を支持する。【００７７】
表２Ａ〜２Ｈ：ミクログリアにより発現される遺伝子のリスト【００７８】
【表２Ａ】
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【００７９】
【表２Ｂ】
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【００８０】
【表２Ｃ】
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【００８１】
【表２Ｄ】
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【００８２】
【表２Ｅ】
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【００８３】
【表２Ｇ】
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【００８４】
【表２Ｈ】
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【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明によれば、ヒトミクログリアの保持量の多い非ヒト動物、及びその作製方法が提供される。また、前記非ヒト動物の利用方法が提供される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【配列表】
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