(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原とアジュバントとを含み、
前記アジュバントは、Ｂ型肝炎ウイルス様粒子（ＨＢｃ  ＶＬＰ）であり、
前記粒子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列とは少なくとも９０％が一致するアミノ酸配列を有するものを含み、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１とは同じ機能を有し、
前記抗原は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に由来するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のいずれか一つで表される組換えＲＳＶ  Ｆタンパク質である、
ワクチン組成物。
【請求項２】
前記アジュバントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列からなるＨＢｃ  ＶＬＰである、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
前記アジュバントは、０．１μｇ〜１，０００μｇのアジュバント有効量で存在する、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
前記抗原とアジュバントとの重量比は１０：１〜１：１０である、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
前記抗原とアジュバントとの重量比は５：１〜１：５である、請求項４に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
粘膜ワクチンの接種に使用される、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
経口、鼻腔、直腸または膣に使用される、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
上記ワクチン組成物は、粘膜免疫応答と全身性免疫応答とを誘導するためのものであり、
前記粘膜免疫応答は、抗原特異的分泌型ＩｇＡ抗体の発生であり、前記全身性免疫応答は、抗原特異的ＩｇＧ抗体の発生および抗原特異的細胞性免疫の発生である、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
請求項１に記載のワクチン組成物を含み、
被験者の粘膜表面に投与して被験者にワクチンを接種するための、医薬組成物。
【請求項１０】
前記粘膜表面は、気道粘膜、胃腸粘膜、膣粘膜、鼻粘膜、直腸粘膜および口腔粘膜からなる群から選ばれる、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記被験者は、人または動物である、請求項９に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、２０１６年１１月２２日付けて出願した米国の仮出願第６２／４２５，０７９号の優先権を主張しており、ここに参照することによって、その全体が本明細書中へ組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、ワクチン組成物、および免疫原性を向上させて抗原に対する免疫応答を改善する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ワクチンアジュバントの世界市場は、２０２１年までに、２０１６年の４．６７０億ドルから７．６９４億ドルに上がると予測されている。このような市場成長を促進する主な原因は、感染性疾患や動物伝染病の大流行により、多くの政府機関の免疫計画に対する注目が高められていること、および現有の疾患や新興疾患に対抗する、改善された持効性の免疫作用への注目度が益々高められていることにある。
【０００４】
粘膜表面は、大部分の感染性物質の侵入門戸であり、また、動物にとって、侵入門戸の箇所にてすぐに強力な防御性抗体と細胞経由の免疫応答を発生することは非常に重要であるため、近年、粘膜表面によって送達するワクチンに対して、関心が寄せられている。粘膜ワクチンは、アジュバントと送達システムを使用することで完成できる。前記アジュバントと送達システムは、ワクチン抗原を口腔、腸、鼻、直腸、または膣の粘膜表面に付着させた後、ワクチン抗原を粘膜関連のリンパ組織に接触させる。そのため、粘膜ワクチンは、全身性免疫（ＩｇＧ抗体の発生）と粘膜免疫（分泌型ＩｇＡ抗体の発生）とを有効に誘導するという利点を提供することにおいては優位であり、また、値段が低く、投与しやすく、大規模なワクチン接種に適用できる。
【０００５】
免疫学でよく使用されるアジュバントとしては、１９３０年代以来、アルミニウム塩はワクチンに使用されてきた。しかしながら、たとえ世界中に広く使用されていても、アルミニウム塩は、相対的に弱くて、一部の疾患にしか効果がない。
【０００６】
そのため、粘膜上皮細胞を透過して防御性と持効性の免疫応答を誘導できるアジュバントを有する粘膜ワクチンは求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前記事情に鑑みて、本発明は、抗原と、組換えＢ型肝炎ウイルス様粒子（ＨＢｃ  ＶＬＰ、本明細書において単に「ＨＢｃ」ともいう）であるアジュバントとを含むワクチン組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記組換えＨＢｃ  ＶＬＰは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列（ＭＤＩＤＰＹＫＥＦＧＡＴＶＥＬＬＳＦＬＰＳＤＦＦＰＳＶＲＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹＲＥＡＬＥＳＰＥＨＣＳＰＨＨＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＴＬＡＴＷＶＧＮＮＬＥＤＰＡＳＲＤＬＶＶＮＹＶＮＴＮＭＧＬＫＩＲＱＬＬＷＦＨＩＳＣＬＴＦＧＲＥＴＶＬＥＹＬＶＳＦＧＶＷＩＲＴＰＰＡＹＲＰＰＮＡＰＩＬＳＴＬＰＥＴＴＶ）との一致度が少なくとも８０％であり、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と同じ機能を有するアミノ酸配列を含んでもよい。本発明の一つの具体的な実施態様において、前記アジュバントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列からなる組換えＨＢｃ  ＶＬＰである。
【０００９】
本発明の一つの具体的な実施態様において、前記抗原は、感染性疾患に由来する抗原である。本発明のもう一つの具体的な実施態様において、前記抗原は、ヒト免疫不全ウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルス、単純疱疹ウイルス１型、単純疱疹ウイルス２型、ヒトサイトメガロウイルス、デング熱ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  Ｖｉｒｕｓ、ＲＳＶともいう）、重症急性呼吸器症候群ウイルス（Ｓｅｖｅｒｅ  Ａｃｕｔｅ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＳＡＲＳ）  Ｖｉｒｕｓ）、ヒトパピローマウイルス、インフルエンザウイルス、Ｈｉｂ、髄膜炎ウイルス、サルモネラ、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、腸管毒素原性大腸菌、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、連鎖球菌、モラクセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、マラリア原虫またはトキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）、スタンワース・デカペプチド（Ｓｔａｎｗｏｒｔｈ  ｄｅｃａｐｅｐｔｉｄｅ）からなる群から選ばれる１種に由来する。
【００１０】
本発明のまたもう一つの態様によれば、本発明は、上記ワクチン組成物を被験者の粘膜表面に投与することを含む、被験者にワクチンを接種する方法を提供する。
【００１１】
本発明のもう一つの具体的な実施態様において、前記粘膜表面は、気道粘膜、胃腸粘膜、膣粘膜、鼻粘膜、直腸粘膜、および口腔粘膜からなる群から選ばれる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、組換えＨＢｃ  ＶＬＰを提供する。また、本発明は、感染性物質に由来する抗原と、アジュバントとしてのアジュバント有効量の組換えＨＢｃ  ＶＬＰとを含むワクチン組成物を提供する。本発明のワクチン組成物は、被験者体内で前記抗原に特異的な抗体応答を誘導でき、被験者を前記感染性物質による感染から保護し、副作用を引き起こさない。よって、本発明のアジュバント、ワクチン組成物、および免疫を実現する方法は、大規模な生産を容易に実現し、抗体を区別する特異性を増加させるのに寄与し、不必要な反応、例えば、アレルギーを避ける。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
下記の具体的な実施態様の詳細な説明と図面を参照することで、本発明をより完全に理解できる。
【図１】図１Ａ〜１Ｉは、ＨＲφ２４、ＨＲφ、ＨＲφ−３φ組換えタンパク質およびＨＢｃのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果である。図１Ａ、１Ｃ、１Ｅおよび１Ｇは、それぞれ、精製したＨＲφ２４、ＨＲφ、ＨＲφ−３φ組換えタンパク質およびＨＢｃについての、クマシーブリリアントブルー染色を示し；図１Ｂ、１Ｄおよび１Ｆは、それぞれ、精製したＨＲφ２４、ＨＲφおよびＨＲφ−３φ組換えタンパク質についての、抗Ｈｉｓ抗体を使用したウェスタンブロッティングを示し；図１Ｈは、精製したＨＢｃについての、ウサギポリクローナル抗ＨＢｃ抗体を使用したウェスタンブロッティングを示し；また、図１Ｉは、精製したＨＢｃおよびＨＲφ２４組換えタンパク質についての、マウスモノクローナル抗ＲＳＶ抗体を使用したウェスタンブロッティングを示す。
【図２】図２は、精製したＨＢｃのＴＥＭ画像を示す。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、鼻内（ＩＮ）免疫接種スケジュールを示す。図３Ａは、候補ワクチンを使用して、各群のマウスに免疫接種を０、３、６、および９週間目で合計４回行い、１２週間目でマウスにＲＳＶチャレンジを受けさせることを示し；図３Ｂは、候補ワクチンを使用して、各群のマウスに免疫接種を０、３、および６週間目で合計３回行い、９週間目でマウスにＲＳＶチャレンジを受けさせることを示す。さらに、もう一つの群は、ＲＳＶチャレンジの前に、ホルマリンで固定したＲＳＶ（ＦＩＲＳＶ）を使用して筋肉内（ｉ．ｍ）免疫接種を行う。ＲＳＶチャレンジの２日前に、同じ投与スキームを使用した各群から、マウス血清、ＢＡＬＦおよび脾臓を採集する。
【図４】図４Ａ〜４Ｆは、ＨＢｃ  ＶＬＰと混合したか、または混合していないＨＲφ２４の鼻内投与を４服受けたマウスの体内におけるＨＲφ２４およびＦＩＲＳＶ特異的抗体応答を示す。ＲＳＶチャレンジを行う２日前に、各群からマウス血清を採集する。図４Ａ〜４Ｃは、それぞれ、血清から測定したＨＲφ２４特異的全ＩｇＧ、ＩｇＧ１、およびＩｇＧ２ａ応答を示し；また、図４Ｄ〜４Ｆは、それぞれ、血清から測定したＦＩＲＳＶ特異的全ＩｇＧ、ＩｇＧ１、およびＩｇＧ２ａ応答を示す。
【図５】図５Ａ〜５Ｋは、ＣｐＧと混合したか、または混合していないＨＲφ２４およびＨＢｃ  ＶＬＰの混合物の鼻内投与を４服受けたマウスの体内におけるＨＲφ２４およびＦＩＲＳＶ特異的抗体応答および脾細胞再刺激を示す。ＲＳＶチャレンジを行う２日前に、マウス血清、ＢＡＬＦ、および脾臓を採集する。図５Ａ〜５Ｄは、それぞれ、血清から測定したＨＲφ２４特異的全ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ応答およびＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比を示し；図５Ｅ〜５Ｈは、それぞれ、血清から測定したＦＩＲＳＶ特異的全ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ応答およびＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比を示し；図５Ｉおよび５Ｊは、それぞれ、ＢＡＬＦから検出したＨＲφ２４およびＦＩＲＳＶ特異的分泌型ＩｇＡ（ｓＩｇＡ）応答を示し；また、図５Ｋは、抗原再刺激実験において検出したＩＦＮ−γのレベルを示す。
【図６】図６Ａ〜６Ｈは、ＣｐＧと混合したか、または混合していないＨＲφ２４およびＨＢｃ  ＶＬＰの混合物の鼻内投与を４服受けたマウスの体内におけるＲＳＶ  Ｆタンパク質部位φおよび部位ＩＩ特異的抗体応答を示す。ＲＳＶチャレンジを行う２日前に、各群のマウス血清を採集する。図６Ａ〜６Ｄは、それぞれ、血清から測定した部位φ特異的全ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ応答およびＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比を示し；また、図６Ｅ〜６Ｈは、それぞれ、血清から測定した部位ＩＩ特異的全ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ応答およびＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比を示す。
【図７】図７Ａ〜７Ｅは、ＨＢｃ  ＶＬＰもしくはＣｐＧと混合したか、または混合していないＨＲφ２４、ＨＲφもしくはＨＲφ−３φの鼻内投与を３服受けたマウスの体内におけるＨＲφ２４特異的抗体応答を示す。ＲＳＶチャレンジを行う２日前に、血清およびＢＡＬＦを採集する。図７Ａ、７Ｂ、７Ｃおよび７Ｅは、それぞれ、血清から測定したＨＲφ２４特異的全ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＡ応答を示し；また、図７Ｄは、ＢＡＬＦから検出したＨＲφ２４特異的ｓＩｇＡ応答を示す。
【図８】図８は、血清中和力価を示す。ＲＳＶチャレンジを行う２日前に、対照群または鼻内投与を４服受けてワクチンを接種したマウスの血清を採集し、ＲＳＶプラークの形成に対する抑制を試験する。
【図９】図９は、チャレンジ後のマウスの体重変化を示す。ＲＳＶチャレンジを行った後、対照群または鼻内投与を４服受けてワクチンを接種したマウスの体重変化を５日間観察する。体重変化は、０日目の体重に対して減少した百分率で示す。
【図１０】図１０は、肺組織病理学を示す。ＲＳＶチャレンジを行った５日後、対照群または鼻内投与を４服受けてワクチンを接種したマウスの肺組織を採集し、組織学的分析を行う。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明を下記の具体的な実施態様で例示的に説明する。当業者は、本発明の開示および説明に基づいて、本発明の他の利点を予想できる。本発明は、異なる具体的な実施態様に開示されているように実施または応用できる。本発明の精神と範疇に反せず、異なる態様および応用において本発明を実施するように、上記の実施態様を修飾および／または変更できる。
【００１５】
本明細書において、明記されていない限り、単数形式の「一つ」および「前記」は複数の対象を含む。よって、例えば、記載されている「一つの抗原」は抗原の混合物を含み、記載されている「一つの医薬上許容できるキャリア」は２種類または複数種類のこのようなキャリアの混合物等を含む。このように、用語の「一つ」、「一つまたは複数の」、および「少なくとも一つ」は本明細書で互換に使用できる。
【００１６】
また、本明細書で使用されている「および／または」は、２種類の特定の特徴または成分のうちの一方または両方の詳細な説明に使用される。よって、本明細書において、文型の「Ａおよび／またはＢ」に使用される用語である「および／または」は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ（のみ）」および「Ｂ（のみ）」の意味を含む。
【００１７】
本発明は、抗原とアジュバントとを含むワクチン組成物を提供する。前記アジュバントは、組換えＨＢｃ  ＶＬＰである。
【００１８】
本明細書において、用語の「ウイルス様粒子」（ＶＬＰ）とは、ウイルスのような構造であるが、ウイルスゲノムが欠けているため、非感染性のものを示す。本明細書において、用語の「非感染性」とは、宿主細胞内に入れないことを示す。典型的には、ウイルス様粒子は、全部または一部のウイルスゲノム、特に、前記ウイルスゲノムの複製性および感染性の部分が欠けているため、複製できず、病原性が欠けている。前記ウイルス様粒子は、ウイルスカプシド、例えば、ウイルスエンベロープと呼ばれる脂質膜が覆っている対応ウイルスのウイルスカプシドであってもよい。用語の「ウイルスカプシド」または「カプシド」とは、ウイルスタンパク質サブユニットからなる大分子部品を示す。なお、ウイルス様粒子は、通常、異種発現により大量に生産し、容易に精製できる。
【００１９】
一度、適宜な発現系内で前記タンパク質の組換え発現を行うと、ＶＬＰが自発的に形成できる。特定のＶＬＰを生産する方法は、当分野では公知である。ＶＬＰの存在は、当分野の公知の従来技術、例えば、電子顕微鏡、Ｘ線結晶学等で検出できる。
【００２０】
本発明の一つの具体的な実施態様において、前記アジュバントは、組換えＢ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）であってもよい。本発明のもう一つの具体的な実施態様において、前記アジュバントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列との一致度が少なくとも８０％であり、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と同じ機能を有するアミノ酸配列を含む組換えＨＢｃＡｇであってもよい。本発明のまたもう一つの具体的な実施態様において、前記組換えＨＢｃＡｇは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列との一致度が少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であるアミノ酸配列を含む。
【００２１】
本明細書において、用語の「配列一致性」または、例えば、「８０％の配列が一致する」を含むこととは、比較ウィンドウ全体において、ヌクレオチドが一対一またはアミノ酸が一対一であることを基準とする場合の配列の一致性の程度を示す。よって、「配列一致性の百分率」は、比較ウィンドウ内で、二つの最も適切に対応する配列を比較して、二つの配列に出現している一致した核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または一致したアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓおよびＭｅｔ）の位置数を確認し、整合位置数を得って、前記整合位置数を比較ウィンドウ内の位置の総数（すなわち、ウィンドウのサイズ）で割った結果に１００を掛けることで、配列一致性の百分率を得ることにより、算出できる。含まれているのは、本明細書に開示されているいずれの参考配列（例えば、配列表を参照）と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列一致性を有するヌクレオチドおよびポリペプチドであり、典型的には、前記ポリペプチドの変異体は、その参考ポリペプチドの少なくとも一種の生物学活性または機能を保持している。
【００２２】
本発明の一つの具体的な実施態様において、前記アジュバントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列からなる組換えＨＢｃＡｇ（本明細書において「ＨＢｃＡｇ１４８」ともいう）であり、また、ウイルス様粒子を形成することはすでに証明されている。
【００２３】
本発明は、ＨＢｃＡｇ１４８ウイルス様粒子を含むアジュバント組成物を提供する。前記ＨＢｃＡｇ１４８ウイルス様粒子は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に由来するカプシドタンパク質が自己組織化して形成した不活性空カプシドである。ＨＢＶは、環状の部分二本鎖ＤＮＡゲノムを有する小さなエンベロープウイルスであり、全世界の感染性肝疾患の主な原因である。ＨＢＶの感染は、世界中の約２０億人を影響し、また、一般的に、成年のＨＢＶ感染は短い。ＨＢｃＡｇは、コアカプシド、すなわち、ＨＢＶの最内層の表面で見つけられる抗原である。ＨＢｃＡｇ１４８  ＶＬＰの組織は遺伝物質に入っていないので、非感染性である。
【００２４】
本発明の一つの具体的な実施態様において、前記抗原は、ヒト免疫不全ウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルス、単純疱疹ウイルス１型、単純疱疹ウイルス２型、ヒトサイトメガロウイルス、デング熱ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ＲＳＶ、ＳＡＲＳウイルス、ヒトパピローマウイルス、インフルエンザウイルス、Ｈｉｂ、髄膜炎ウイルス、サルモネラ、ナイセリア、ボレリア、クラミジア、ボルデテラ、腸管毒素原性大腸菌、カンピロバクター、連鎖球菌、モラクセラ、マイコプラズマ、マイコバクテリウム、ヘモフィルス、マラリア原虫またはトキソプラズマ、スタンワース・デカペプチドを含む感染性疾患に由来するが、これらに限定されない。
【００２５】
上記感染性疾患に由来する抗原とは、試験生物体内で発生する免疫応答をターゲットとする任意の物質を示す。上記感染性疾患に由来する抗原は、免疫担当細胞と接触する際の免疫応答（例えば、免疫担当細胞の成熟、サイトカインの発生、および抗体の発生）のターゲットであってもよい。
【００２６】
本発明の一つの具体的な実施態様において、前記抗原は、ＲＳＶに由来してもよい。本明細書に記載されているように、ＲＳＶは、乳幼児の下気道感染の最もよく見られる原因とされている。ＲＳＶは、三つの連続遺伝子（ＳＨ−Ｇ−Ｆ）でコードされる小疎水性糖タンパク質（ＳＨ）、付着糖タンパク質（Ｇ）、および融合糖タンパク質（Ｆ）という三種類の表面糖タンパク質を有する。ＲＳＶワクチンの研究開発において、主要なターゲット抗原がＲＳＶ  ＦおよびＧであるのは、これらの抗原が各々に中和抗体およびＴ細胞応答を発生させることができるためである。特にＦは、ＲＳＶ隔離群ではかなりの保守性を有するため、注目されている。従来、ＲＳＶ  Ｆの融合前と融合後の二つの構造に発見され、中和（ＮＴ）活性に関連する周知の二種類の主な抗原性部位が存在している。これらは、最初はネズミ科動物のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）に結合する１１２９（部位ＩＩ）（Ｂｅｅｌｅｒ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ａｒｂｉｚａ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９２）、および１０１Ｆ（部位ＩＶ）（Ｗｕ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，２００７）により同定された。部位ＩＩは、パリビズマブ（ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ）のターゲットとして知られており、パリビズマブは、高リスク群の乳児群における重篤なＲＳＶ疾患を低減できる。ＭｃＬｅｌｌａｎら（ＭｃＬｅｌｌａｎ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１３）は、ＲＳＶを有効に中和するが、融合後のＦタンパク質に結合しないことを示すマウス抗体５Ｃ４を単離した。５Ｃ４は、免疫接種されたＰＢＭＣｓから単離したＤ２５およびＡＭ２２の他の二種類の抗体とこのような性質を共有し、この抗体は、ＲＳＶを中和することにおいて、パリビズマブより１００倍大きい効果を示す（ＭｃＬｅｌｌａｎ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。Ｄ２５およびＡＭ２２は、部位φをターゲットとし、前記部位は、融合前のＲＳＶ  Ｆ三量体の表面に位置する準安定状態抗原性部位である（Ｓｐｉｔｓ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｂｅａｕｍｏｎｔ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。Ｆタンパク質の融合前の晶体構造と融合後の晶体構造は、二つの構造のいずれにも部位ＩＩおよび部位ＩＶが発見されているが、部位φが融合前の形式のみに特異性を有することを示唆している（ＭｃＬｅｌｌａｎ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【００２７】
ＲＳＶ  Ｆの融合ペプチド領域は、Ｆ１サブユニットのアミノ基末端に位置し（Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｐ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、その膜貫通セグメントは、４，３−疎水性７塩基繰り返し配列（ＨＲ）、およびコイルドコイル構造を思わせる配列モチーフ（Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｓｉｎｇｈ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９９）という二つの領域を含む。これらの領域は、それぞれ、ＨＲＮおよびＨＲＣを指し、約２７０個のアミノ酸の中間領域で隔てられている。ＨＲＮおよびＨＲＣは、三量体であるヘアピン様構造を形成し、前記ＨＲＣ領域は、ＨＲＮ領域によって形成されたコイルドコイルと反平行になるように封入する（Ｂａｋｅｒ，Ｋ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。
【００２８】
本発明の一つの具体的な実施態様において、前記抗原は、ＨＲＮ領域と、ＨＲＣ領域と、部位φ、部位ＩＩおよび部位ＩＶからなる群から選ばれる少なくとも一つ抗原性部位とを含む組換えＲＳＶ  Ｆタンパク質である。本発明のもう一つの具体的な実施態様において、前記抗原は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のいずれか一つで表すことができる。
【００２９】
一つの具体的な実施態様において、前記ワクチン組成物は、被験者体内で、感染性物質、例えば、ＲＳＶに対する免疫応答の誘導に使用できる。そのため、いくつかの具体的な実施態様において、治療有効量の組換えＲＳＶ  Ｆタンパク質を抗原として含むワクチン組成物を被験者に投与し、ＲＳＶに対する免疫応答を引き起こすことができる。
【００３０】
本発明のもう一つの具体的な実施態様において、必要のある被験者体内のＲＳＶ感染を十分に予防または緩和する条件で、治療有効量の組換えＲＳＶ  Ｆタンパク質を抗原として含むワクチン組成物を前記被験者に投与する。前記ワクチン組成物は、前記被験者体内で、ＲＳＶ抗原、例えば、ＲＳＶ  Ｆタンパク質に対抗する免疫応答を十分に引き起こす量で投与する。本発明の一つの具体的な実施態様において、前記ワクチン組成物は、粘膜ワクチンの接種に適用し、経口、鼻内、経直腸または経膣で前記被験者に投与できる。
【００３１】
本発明の一つの具体的な実施態様において、前記アジュバントは、０．１μｇ〜１，０００μｇのアジュバント有効量で前記ワクチン組成物に存在する。本発明のもう一つの具体的な実施態様において、前記ワクチン組成物は、重量比が１０：１〜１：１０である抗原とアジュバントとの混合物を含む。本発明のまたもう一つの具体的な実施態様において、前記ワクチン組成物に含まれる抗原とアジュバントとの重量比は５：１〜１：５である。
【００３２】
本発明の一つの具体的な実施態様において、ワクチン組成物におけるＨＢｃ  ＶＬＰは、抗原に対する免疫応答を有効に強化する、および／または所望する免疫応答へ発展させるように調整する、唯一のアジュバントとして使用する。本発明のもう一つの具体的な実施態様において、前記ワクチン組成物は、追加のアジュバントを含んでもよい。本発明に用いられる追加のアジュバントは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを含んでもよいが、これに限定されない。
【００３３】
本発明の一つの具体的な実施態様において、前記ワクチン組成物は、医薬上許容できるキャリアをさらに含んでもよい。本明細書において、「医薬上許容できるキャリア」は、本発明のワクチン組成物の投与に適用し得る任意または全ての溶剤、分散媒体、抗菌剤や抗真菌剤、等張化剤や吸収遅延剤等を含む。本発明に用いられる医薬上許容できるキャリアは、防腐剤、懸濁剤、増粘剤、等張化剤、緩衝剤、および湿潤剤を含んでもよいが、これらに限定されない。
【００３４】
本発明は、さらに、ＨＢｃＡｇ１４８  ＶＬＰと医薬上許容できるキャリアとを含有するアジュバント組成物を供給すること、および前記アジュバント組成物を抗原としての組換えＲＳＶ  Ｆタンパク質と合わせることを含む、ワクチン組成物の製造方法を提供する。本発明の一つの具体的な実施態様において、前記ＨＢｃＡｇ１４８  ＶＬＰは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列からなる。
【００３５】
本発明のまたもう一つの態様によれば、本発明は、上記ＨＢｃＡｇ１４８  ＶＬＰをコードする核酸分子を提供する。本発明の一つの具体的な実施態様において、前記核酸分子は、コドンが最適化されて原核細胞内で発現するためのものである。もう一つの具体的な実施態様において、前記原核細胞は、大腸菌細胞である。さらにもう一つの具体的な実施態様において、前記核酸分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５の核酸配列（ＡＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＣＣＣＴＴＡＴＡＡＡＧＡＡＴＴＴＧＧＡＧＣＴＡＣＴＧＴＧＧＡＧＴＴＡＣＴＣＴＣＧＴＴＴＴＴＧＣＣＴＴＣＴＧＡＣＴＴＣＴＴＴＣＣＴＴＣＣＧＴＣＡＧＡＧＡＴＣＴＴＣＴＡＧＡＣＡＣＣＧＣＣＴＣＡＧＣＴＣＴＧＴＡＴＣＧＡＧＡＡＧＣＣＴＴＡＧＡＧＴＣＴＣＣＴＧＡＧＣＡＴＴＧＣＴＣＡＣＣＴＣＡＣＣＡＴＡＣＴＧＣＡＣＴＣＡＧＧＣＡＡＧＣＣＡＴＴＣＴＣＴＧＣＴＧＧＧＧＧＧＡＡＴＴＧＡＴＧＡＣＴＣＴＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＧＴＧＧＧＴＡＡＴＡＡＴＴＴＧＧＡＡＧＡＴＣＣＡＧＣＡＴＣＣＡＧＧＧＡＴＣＴＡＧＴＡＧＴＣＡＡＴＴＡＴＧＴＴＡＡＴＡＣＴＡＡＣＡＴＧＧＧＴＴＴＡＡＡＧＡＴＣＡＧＧＣＡＡＣＴＡＴＴＧＴＧＧＴＴＴＣＡＴＡＴＡＴＣＴＴＧＣＣＴＴＡＣＴＴＴＴＧＧＡＡＧＡＧＡＧＡＣＴＧＴＡＣＴＴＧＡＡＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＣＴＴＴＣＧＧＡＧＴＧＴＧＧＡＴＴＣＧＣＡＣＴＣＣＴＣＣＡＧＣＣＴＡＴＡＧＡＣＣＡＣＣＡＡＡＴＧＣＣＣＣＴＡＴＣＴＴＡＴＣＡＡＣＡＣＴＴＣＣＧＧＡＡＡＣＴＡＣＴＧＴＴ）との一致度が少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である核酸配列を含む。
【００３６】
本発明の一つの具体的な実施態様において、前記核酸分子は、コドンが最適化されて真核細胞内で発現するためのものである。もう一つの具体的な実施態様において、前記真核細胞は、酵母細胞または哺乳動物細胞である。またもう一つの具体的な実施態様において、前記哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。
【００３７】
本発明は、さらに、上記のワクチン組成物により粘膜免疫応答と全身性免疫応答とを誘導する方法を提供する。前記ワクチン組成物を必要のある被験者に投与し、前記被験者体内における粘膜免疫応答と全身性免疫応答とを誘導する。前記粘膜免疫応答は、抗原特異的ＩｇＡ抗体の発生であり、前記全身性免疫応答は、抗原特異的ＩｇＧ抗体の発生および抗原特異的細胞性免疫の発生である。
【００３８】
本発明のまたもう一つの態様によれば、本発明は、上記のワクチン組成物を被験者に投与することを含む、被験者にワクチンを接種する方法を提供する。ワクチン接種方法は、ワクチン分野で公知の任意の従来経路により前記ワクチン組成物を投与することを含む。前記経路は、例えば、粘膜（例えば、眼部、鼻内、肺部、口腔、胃部、小腸、直腸、膣、または尿路）表面経由、胃腸以外（例えば、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、または腹腔内）の経路経由、または外用投与（例えば、貼付剤のような経皮薬物送達システム経由）である。
【００３９】
本発明の一つの具体的な実施態様において、前記ワクチン組成物を前記被験者の粘膜表面に投与する。本発明のもう一つの具体的な実施態様において、前記粘膜表面は、気道粘膜、胃腸粘膜、膣粘膜、鼻粘膜、直腸粘膜、および口腔粘膜からなる群から選ばれる。
【００４０】
複数の実施態様で例示的に本発明を説明した。本発明の範疇は、下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４１】
実施例１：組換えＨＢｃ  ＶＬＰ発現ベクターの構築
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．  ｃｏｌｉ））で発現するための最適化されたコドンを有するＨＢｃタンパク質の完全長ｃＤＮＡ配列（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＢｉｏＳｃｉ＆Ｔｅｃｈ）を合成した。この配列をＰＣＲテンプレートとして使用し、ＨＢｃのヌクレオチド１〜４４４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）を増幅した後、６−ＨｉｓでＣ末端にタグを付加したｐＥＴ２８ａのＮｃｏＩ−ＸｈｏＩ制限酵素部位に挿入することによって、組換えＨＢｃ  ＶＬＰプラスミドを得た。得られたプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞内に形質転換して、タンパク質発現に使用した。
【００４２】
実施例２：組換えＲＳＶキメラＦタンパク質発現ベクターの構築
大腸菌で発現するための最適化されたコドンを有するＲＳＶ  Ｆタンパク質の完全長ｃＤＮＡ配列（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＢｉｏＳｃｉ＆Ｔｅｃｈ）を合成した。この配列をＰＣＲテンプレートとして使用し、ＨＲＮと部位φを含有するヌクレオチド４５７〜６３３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、部位ＩＩを含有するヌクレオチド７６０〜８４９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、部位ＩＶを含有するヌクレオチド１２６４〜１３１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、およびそのＣ末端α−ヘリックス（ＨＲＣ）を含有するヌクレオチド１４２６〜１５６０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）を含む、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の４種類の遺伝子断片を増幅した。
【００４３】
この４種類のＰＣＲアンプリコンを部分オーバーラップＰＣＲにより連結し、ＧＳＧＳ、ＧＧＧＳ、ＧＧＳＧ、ＳＧＳＧおよびＧＧのようなグリシンリッチリンカーで連結して、構築した遺伝子（ＨＲφ２４と命名する）を形成し、その後、前記遺伝子を、６−Ｈｉｓでカルボキシル基末端にタグを付加したｐＥＴ２８ｂのＮｃｏＩ−ＸｈｏＩ制限酵素部位に挿入することによって、ＨＲφ２４プラスミドを得た。
【００４４】
ＨＲφ、ＨＲφ−３φおよびＨＢｃプラスミドの構築過程は、ＨＲφ２４プラスミドと類似しているが、以下のような差異がある。
【００４５】
ＨＲφプラスミドの構築については、ＲＳＶ  Ｆタンパク質のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９で表される遺伝子断片を増幅した。その後、その２種類のＰＣＲアンプリコンを、６−ＨｉｓでＣ末端にタグを付加してグリシンリッチリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）で連結したｐＥＴ２８ａのＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ制限酵素部位に挿入することによって、ＨＲφプラスミドを得た。
【００４６】
ＨＲφ−３φプラスミドの構築については、ＲＳＶ  Ｆタンパク質のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９で表される遺伝子断片を増幅した。さらに、ＰＣＲにより、ＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩ、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ、またはＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位のそれぞれを含む３種類の部位φ断片を製作した。その後、その５種類のＰＣＲアンプリコンを、６−ＨｉｓでＣ末端にタグを付加してグリシンリッチリンカーで連結したｐＥＴ２８ａのＮｃｏＩ  ＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ制限酵素部位に挿入することによって、ＨＲφ−３φプラスミドを得た。
【００４７】
上記で得られたプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞内に形質転換して、タンパク質発現を行った。
【００４８】
実施例１および２のＰＣＲに使用されたプライマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９で表され、表１に示されている。
【００４９】
【表１−１】
0006902804.tif 000002
【表１−２】
0006902804.tif 000003
【００５０】
実施例３：組換えタンパク質発現および精製
実施例１および２で得られた形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）において、組換えＲＳＶ  Ｆタンパク質−６ＨｉｓおよびＨＢｃ−６Ｈｉｓをそれぞれ発現させ、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーで精製した。２００体積部の溶出緩衝液（３５０ｍＭ、１５０ｍＭから０ｍＭまでのイミダゾール、１×ＰＢＳの中）に対する１体積部のサンプルのグラジエント溶出により、溶出した（５００ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．０を使用）タンパク質に緩衝液交換を行い、工程ごとに１２時間行った。遠心濃縮機（１０，０００ＭＷＣＯ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用することにより、溶出したタンパク質−６Ｈｉｓを約１ｍｇ／ｍＬの濃度まで濃縮した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで前記タンパク質の分子サイズおよび純度を測定した。
【００５１】
抗Ｈｉｓタグであると指向された抗体を使用したウェスタンブロッティングにより、同じ移動度のバンドを検出し、その結果を図１Ｂ、１Ｄ、および１Ｆに示す。抗ＨＢｃと抗ＲＳＶであると指向された抗体を使用したウェスタンブロッティングにより、同じ移動度のバンドを検出し、その結果をそれぞれ図１Ｈおよび１Ｉに示す。クマシーブリリアントブルーで染色したゲルに対する光学密度スキャンは、精製したタンパク質ＨＲφ２４、ＨＲφ、ＨＲφ−３φおよびＨＢｃが全タンパク質の９０％以上に相当すること（図１Ａ、１Ｃ、１Ｅ、および１Ｇ）を示し、その純度は十分に免疫接種を行える。
【００５２】
実施例４：組換えＨＢｃ  ＶＬＰの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像
室温で、ＰＢＳにおける８μｇの精製したＨＢｃ  ＶＬＰを、銅メッシュ（３００メッシュ）に３分間吸着させた。その後、ろ紙を用いてメッシュを軽く優しく拭った。１％酢酸ウラニル水溶液で３０秒間染色した後、過量の液体を除去した。ＪＥＭ−１４００電子顕微鏡を使用して、８０ｋＶでメッシュを検査した。
ＨＢｃ  ＶＬＰがウイルス様粒子を形成することはＴＥＭで証明された（図２）。
【００５３】
実施例５：動物免疫分析
１．ＲＳＶ  Ａ２株の原液の製作
ＡＴＣＣからＲＳＶ  Ａ２株を得た。ＨＥｐ−２細胞ＡＴＣＣにおいてウイルスの繁殖を実施した。ＲＳＶ  Ａ２を使用して、０．２のｍ．ｏ．ｉ（感染多重度）で、１００ｍｍのペトリ皿（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において成長した融合度が８０％と高い細胞を接種した。３７℃のＣＯ２インキュベーターにおいて、血清を含まないダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ））でウイルスの吸着を行った。２時間後、培地を、２％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭに交換し、ペトリ皿を再び４８〜７２時間培養した。３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、細胞破片から、前記ウイルスを含有する上清液を分離した。その後、遠心濃縮機（１００，０００ＭＷＣＯ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）でウイルスを濃縮した。
【００５４】
２．ＲＳＶプラーク試験
プラーク試験によりＲＳＶウイルス力価（ｔｉｔｅｒ）を測定した。１×ＰＢＳで１２ウェルプレート中のＨＥｐ−２細胞融合単層を洗浄した後、複数種類の希釈度（１０−３〜１０−７）のＲＳＶ  Ａ２ウイルスで前記細胞を感染させた。２時間のウイルス吸着を行った後、上清液を除去し、１×ＰＢＳで細胞の単層を洗浄した後、ＤＭＥＭ＋２％ウシ胎児血清＋０．３％アガロースで覆った。３７℃でＣＯ２インキュベーターにおいて５日間培養した後、細胞を１０％ホルマリンで固定し、０．０５％クリスタルバイオレットで染色して、プラーク定量を行った。
【００５５】
３．ワクチン投与およびＲＳＶチャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）
病原体のないＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌性マウス（６〜８週齢）を、ランダムで複数群に分け、鼻内（ｉ．ｎ）経路で候補ワクチンを使用して０、２１、４２および６３日目で免疫接種を行い（図３Ａ）、または０、２１および４２日目で免疫接種を行い（図３Ｂ）、８４日目（図３Ａ）または６３日目（図３Ｂ）でマウスに１×１０６  ｐ．ｆ．ｕ  ＲＳＶチャレンジさせた。候補ワクチンは、ＨＲφ２４、ＨＢｃ  ＶＬＰ＋ＨＲφ２４、ＨＢｃ  ＶＬＰ＋ＨＲφ２４＋ＣｐＧ（ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３０）（台湾のＧｅｎｏｍｉｃｓ社）、ＨＲφ、ＨＢｃ  ＶＬＰ＋ＨＲφ、ＨＢｃ  ＶＬＰ＋ＨＲφ＋ＣｐＧ、ＨＲφ−３φ、ＨＢｃ  ＶＬＰ＋ＨＲφ−３φ、およびＨＢｃ  ＶＬＰｓ＋ＨＲφ−３φ＋ＣｐＧを含む。さらに、対照群、ＨＢｃ  ＶＬＰのみを使用して免疫接種を行った群、および１×１０５  ｐ．ｆ．ｕホルマリンで固定したＲＳＶ（ＦＩＲＳＶ）を使用して筋肉内（ｉ．ｍ）免疫接種を行った群を含む。
【００５６】
ＲＳＶチャレンジを行う２日前に、同じ投与スキームを使用した各群から、マウス血清、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）および脾臓を採集した。ＲＳＶチャレンジについては、１．５％イソフルランで動物を麻酔した後、１×１０６  ｐ．ｆ．ｕ  ＲＳＶの鼻内接種で感染させた。ＲＳＶチャレンジを行った後、マウスの体重変化を５日間観察した。最後に、マウスを犠牲にし、個体の肺を採集して、ウイルス負荷および組織病理学実験を行った。
【００５７】
実施例６：候補ワクチンで引き起こした抗体応答についての評価
酵素結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）により、実施例５に記載されている免疫接種したマウスから採集した血清およびＢＡＬＦの抗体応答を検査した。簡単に説明すれば、４℃で、５０μＬの精製ＨＲφ２４（１０μｇ／ｍｌ）を９６ウェルプレートに塗布して、一晩放置した。２％ＢＳＡで前記プレートを３７℃で１時間ブロッキングし、血清サンプルの試験希釈剤（１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、１×ＰＢＳの中）における段階希釈液（１０−２〜５．１２×１０−４）またはＢＡＬＦの段階希釈液（１０−１〜１．２８×１０−３）を使用して室温で２時間培養した。サンプルごとに希釈曲線を作成し、最も優れた濃度となる希釈物の逆数を終点力価として算出し、前記の最も優れた濃度は、バックグラウンド値（集めた元免疫血清に１／５０の希釈を行ったもの、または集めた対照ＢＡＬＦに１／５の希釈を行ったもの）より、０．１Ｕ高い。５０より低い（陰性サンプル）ＩｇＧ力価、または５より低い分泌型ＩｇＡ（ｓＩｇＡ）力価を、任意に５０または５とした。
【００５８】
図４Ａ〜４Ｆを参照して、これらの図は候補ワクチンの免疫原性評価結果を示し、そのうち、各群のマウスは、ｉ）ＨＲφ２４（１０μｇ）、ｉｉ）ＨＲφ２４（５０μｇ）、ｉｉｉ）ＨＢｃ（１０μｇ）＋ＨＲφ２４（５０μｇ）、または陰性対照としてのｉｖ）ＨＢｃ（１０μｇ）をそれぞれ４服使用して鼻内経路で免疫接種を行った。間接的なＥＬＩＳＡにより、採集した最終の血清のＨＲφ２４特異的またはＦＩＲＳＶ特異的ＩｇＧ応答を分析した。結果、ＨＢｃ／ＨＲφ２４混合物を使用して鼻内免疫接種を行うと、顕著に高いＨＲφ２４特異的全ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａが生成されること（図４Ａ〜４Ｃ）が明らかになった。ＦＩＲＳＶ特異的全ＩｇＧおよびＩｇＧ１も誘導されているが、顕著に高いものではない（図４Ｄおよび４Ｅ）。これらの結果から、ＨＢｃ  ＶＬＰがＨＲφ２４特異的体液応答を向上できることが証明された。
【００５９】
図５Ａ〜５Ｊを参照して、ＨＢｃ  ＶＬＰの投与量と応答の関係を評価するために、ｉ）ＨＲφ２４（１０μｇ）、ｉｉ）ＨＢｃ  ＶＬＰ（５０μｇ）＋ＨＲφ２４（１０μｇ）、ｉｉｉ）ＨＲφ２４（１０μｇ）＋ＣｐＧ（２０μｇ）、ｉｖ）ＨＢｃ  ＶＬＰ（２５μｇ）＋ＨＲφ２４（１０μｇ）＋ＣｐＧ（２０μｇ）（図面ではＨＢｃ＋ＨＲφ２４＋ＣｐＧ−１と表記）、ｖ）ＨＢｃ  ＶＬＰ（５０μｇ）＋ＨＲφ２４（１０μｇ）＋ＣｐＧ（２０μｇ）（図面ではＨＢｃ＋ＨＲφ２４＋ＣｐＧ−２と表記）、またはｖｉ）ＨＢｃ  ＶＬＰ（５０μｇ）をそれぞれ４服使用して、各群のマウスに鼻内免疫接種を行った。間接的なＥＬＩＳＡにより、血清およびＢＡＬＦを分析した。図５Ａ〜５Ｃおよび５Ｉには、ＨＢｃ  ＶＬＰ／ＨＲφ２４混合物の投与により、顕著に高い血清ＨＲφ２４特異的全ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよび肺ＨＲφ２４特異的ｓＩｇＡを引き起こせることが示されている。また、アジュバントとしてＣｐＧを使用する場合、これらの体液応答は向上しなかった。
【００６０】
ＲＳＶに対抗する防御免疫は、有効なＴｈ１偏向応答およびＩＦＮ−γの発生を必要とするため、我々は、免疫接種したマウスに由来する脾細胞の、ＨＲφ２４組換えタンパク質の体外刺激に対する応答能力を試験した。マウスＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡキット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）により、４８時間ＨＲφ２４刺激培養物からのＴ細胞増殖を測定した。これらの細胞の培養物上清液からのＡｇ特異的ＩＦＮ−γの発生を分析した。図５Ｋに示すように、ＨＲφ２４を使用して免疫接種を行ったマウスに由来する脾細胞では、ＨＲφ２４刺激の後にはＩＦＮ−γの分泌がないことが示されている。それに対して、ＨＢｃ／ＨＲφ２４、ＨＢｃ／ＨＲφ２４／ＣｐＧおよびＨＲφ２４／ＣｐＧを使用して免疫接種を行った群のマウスに由来する脾細胞では、ＨＲφ２４刺激の後には顕著に高いレベルのＩＦＮ−γが分泌されることが示されている。特に注目すべきことは、ＨＢｃを使用して免疫接種を行ったマウスの体内または対照群では、ＩＦＮ−γの分泌がないことです。
【００６１】
図６Ａ〜６Ｈを参照して、ＲＳＶ  Ｆタンパク質抗原性部位に対抗する特異的応答を検出するために、ＲＳＶ  Ｆ部位φ、ＩＩおよびＩＶペプチドを使用してＥＬＩＳＡプレート（１０μｇ／ｍＬ）に塗布した。図６Ａ〜６Ｈには、ＨＢｃ／ＨＲφ２４混合物を受けたマウスのみは、部位φ特異的や部位ＩＩ特異的全ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａが顕著に高く生成できることが示されている。全ての群において、部位ＩＶ特異的ＩｇＧが検出されていなかった（データは図示されず）。
【００６２】
また、図７Ａ〜７Ｅは、ＨＢｃ  ＶＬＰあるいはＣｐＧと混合したか、または混合していないＨＲφ２４、ＨＲφ、またはＨＲφ−３φの鼻内投与を３服受けたマウスの体内におけるＨＲφ２４特異的抗体応答を示す。各群のマウスは、ｉ）ＨＢｃ  ＶＬＰ（２５μｇ）、ｉｉ）ＨＲφ２４（５０μｇ）、ｉｉｉ）ＨＢｃ  ＶＬＰ（２５μｇ）＋ＨＲφ２４（２５μｇ）、ｉｖ）ＨＢｃ  ＶＬＰｓ（２５μｇ）＋ＨＲφ２４（２５μｇ）＋ＣｐＧ（２０μｇ）、ｖ）ＨＢｃ  ＶＬＰ（２５μｇ）＋ＨＲφ２４（５０μｇ）、ｖｉ）ＨＢｃ  ＶＬＰ（２５μｇ）＋ＨＲφ２４（５０μｇ）＋ＣｐＧ（２０μｇ）、ｖｉｉ）ＨＲφ（５０μｇ）、ｖｉｉｉ）ＨＢｃ  ＶＬＰ（２５μｇ）＋ＨＲφ（５０μｇ）、ｉｘ）ＨＢｃ  ＶＬＰ（２５μｇ）＋ＨＲφ（５０μｇ）＋ＣｐＧ（２０μｇ）、ｘ）ＨＲφ−３φ（５０μｇ）、ｘｉ）ＨＢｃ  ＶＬＰ（２５μｇ）＋ＨＲφ−３φ（５０μｇ）、またはｘｉｉ）ＨＢｃ  ＶＬＰ（２５μｇ）＋ＨＲφ−３φ（５０μｇ）＋ＣｐＧ（２０μｇ）をそれぞれ３服使用して鼻内免疫接種を行った。間接的なＥＬＩＳＡにより、血清およびＢＡＬＦを分析した。
【００６３】
図７Ａ〜７Ｅを参照して、これらの図は、アジュバントとしてＨＢｃを使用することで、ＨＲφ２４、ＨＲφおよびＨＲφ−３φは、顕著に高い血清ＨＲφ２４特異的全ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＡ、および肺ＨＲφ２４特異的ｓＩｇＡを引き起こせることを示し、特にＨＢｃ／ＨＲφ２４群では最も高い終点力価が観察された。また、アジュバントとしてＨＢｃとＣｐＧとの混合物を使用することで、ＨＲφ２４もより高い血清ＨＲφ２４特異的全ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＡ、および肺ＨＲφ２４特異的ｓＩｇＡを引き起こせる。
【００６４】
実施例７：候補ワクチンの、マウスを保護してＲＳＶ感染に対抗することにおける效果
前記候補ワクチンを４回投与する際の効果を評価するために、実施例５および図５Ａ〜６Ｈに記載されている生ＲＳＶ  Ａ２株チャレンジの免疫接種したマウスを使用した。
【００６５】
１．ＲＳＶチャレンジを行った後の血清中和力価
中和抗体は、ワクチンにより誘導する免疫応答における重要な機能性成分である。図８は、ＨＲφ２４群に由来する血清がプラークの形成を約１０％低減でき、ＨＢｃ／ＨＲφ２４群に由来する血清がプラークの形成を約２５％低減でき、アジュバントとしてＣｐＧを受けた群がプラークを約１７％〜３５％低減できることを示す。
【００６６】
２．ＲＳＶチャレンジを行った後のマウス体重変化
マウスがチャレンジ感染された後の体重変化は、ワクチンの防御効果の評価における最も重要な指標である。図９を参照して、ＦＩＲＳＶの筋肉注射を受けたマウスは最も高い体重減少（約２３％）を示し、ＨＢｃ／ＨＲφ２４を使用して免疫接種を行ったマウスは約１０％の体重減少を示す。異なる投与量のＨＢｃ（０、２５、５０μｇ）を使用して免疫接種を行ったマウス、すなわち、ＨＲφ２４＋ＣｐＧ群、ＨＢｃ＋ＨＲφ２４＋ＣｐＧ−１群、ＨＢｃ＋ＨＲφ２４＋ＣｐＧ−２群のマウスは、それぞれ、チャレンジ後の４日目で、約８％、４％および０％の体重減少を示す。
【００６７】
そのため、本発明は、より良い防御を提供することにより、マウスの体重減少を予防し、さらに、生ＲＳＶチャレンジ後の最初の体重減少からの迅速な回復を提供する。これにより、本願の抗原による抗ウイルス性免疫は、生ＲＳＶ  Ａ２ウイルス株に対抗するための防御を提供することが証明されている。
【００６８】
３．ＲＳＶチャレンジを行った後の肺組織病理学
チャレンジを行った５日後、マウス個体から肺組織を採集して組織学的分析に使用した。組織学的分析について、肺サンプルを１０％中性緩衝ホルマリンで２４時間固定し、パラフィンに包埋され、厚さ５μｍの切片を切り出し、ヘマトキシリン−エオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。
【００６９】
図１０を参照して、対照群またはワクチン接種したマウスの体内では、肺組織病理学的な変化が観察された。ＦＩＲＳＶで免疫接種したマウスでは、重篤レベルの組織病理学を示す。
【００７０】
１９６０年代の後半では、臨床試験でＬｏｔ  １００  ＦＩＲＳＶワクチンを使用した時、ワクチンを接種した子供は、感染の際に増強した気道疾患を発生させた（Ｋｉｍ，Ｈ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，１９６９）。また、今までの研究は、ＲＳＶチャレンジマウスの体内では、ＦＩＲＳＶが顕著な肺部の肺胞隔炎（ａｌｖｅｏｌｉｔｉｓ）および血管周囲炎（ｐｅｒｉｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ）を誘発したことが示されている。それに対して、図１０に示すように、気管および肺胞周囲のある程度の浸潤で証明されているように、ＣｐＧと混合したか、または混合していないＨＢｃ／ＨＲφ２４混合物群を受けたマウスは、中度の肺部病理学を示す。また、組換えＨＲφ２４のみを使用して免疫接種を行ったマウスの体内では、明らかな肺部病理学変化が観察されていない。
【００７１】
本発明は、精製したＨＢｃＡｇ１４８タンパク質、および前記ＨＢｃＡｇ１４８タンパク質をコードして大腸菌で発現するための最適化されたコドンを有する核酸分子を提供する。ＴＥＭにより証明されているように、前記精製したＨＢｃＡｇ１４８タンパク質はウイルス様粒子を形成する。また、マウスに対して、ＲＳＶ候補ワクチンおよびアジュバントＨＢｃＡｇ１４８を同時に鼻内投与することで、ＨＢｃＡｇ１４８の体内免疫応答向上における効果が観察された。本発明によって、ＨＢｃＡｇ１４８は、ＲＳＶに対抗する血清全ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ応答を向上させ、このアジュバント効果は、ＣｐＧモチーフと類似することが明らかになった。
【００７２】
よって、これらの結果により、本発明の組換えＨＢｃ  ＶＬＰをアジュバントとして含むワクチン組成物は、前記抗原に特異的な全身性および粘膜抗体応答を誘導できることが明らかになった。本発明のワクチン組成物を使用して免疫接種を行ったマウスは、前記抗原に対抗するように保護されることが示されるため、肺疾患を引き起こさない。また、ＦＩＲＳＶと比べて、マウスモデルにおいて、本発明のワクチン組成物は、リンパ細胞を過度に刺激せず、潜在的、かつ、安全なＲＳＶ候補ワクチンを提供する。
【００７３】
上記の内容では、例示的に好ましい具体的な実施態様により本発明を詳細に記載している。しかしながら、本発明の範疇は、記載された具体的な実施態様に限定されるものではない。逆に、本発明は、様々な修飾および類似的な調整を意図的に含んでいる。したがって、特許請求の範囲は、最も広い解釈により規定されるため、このような修飾および類似的な調整を全て含んでいる。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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