(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
モリンガ抽出物及び杜仲抽出物を有効成分として含む歯周疾患の予防または改善用の組成物であって、
前記モリンガ抽出物と杜仲抽出物との重量比（モリンガ抽出物：杜仲抽出物）が、２：１〜４：１であり、
前記モリンガ抽出物が、１．２〜５ｍｇ／ｇのアストラガリンを含むモリンガ葉の水抽出物であり、前記杜仲抽出物が、１．０〜１５ｍｇ／ｇのピノレシノールジグルコシドを含む杜仲皮の水抽出物であることを特徴とする、組成物。
【請求項２】
前記組成物が、食品または薬学組成物であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記モリンガ抽出物と杜仲抽出物との重量比（モリンガ抽出物：杜仲抽出物）が、２：１または４：１であることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記歯周疾患が、歯肉炎または歯周炎であることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物には、ザクロ、桔梗、梔子、黄ごん、蓮の葉、ハリグワの葉、生姜、芍薬、牛膝、レッドクローバー、蒲公英及び蒲公英根の抽出物からなる群より選択された一つ以上の抽出物が有効成分としてさらに含まれることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
前記ザクロ抽出物には、０．５〜３ｍｇ／ｇのエラグ酸が含まれたことを特徴とする請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記桔梗、梔子、黄ごん、蓮の葉、ハリグワの葉、生姜、芍薬、牛膝、レッドクローバー、蒲公英及び蒲公英根の抽出物の抽出溶媒が、水、炭素数１〜４の低級炭化水素またはこれらの混合物であることを特徴とする請求項５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、歯肉炎、歯周炎の予防及び改善用の組成物に関し、より詳しくは、歯肉炎及び歯周炎の症状緩和効果を越え、損傷した歯ぐき組織の炎症緩和及び傷の治癒、歯槽骨消失の抑制及び再生によって歯周炎を直接的に治療できる天然物来由の有効成分を含む歯肉炎及び歯周炎の予防及び改善用の組成物に関する。
【０００２】
本出願は、２０１７年３月２４日出願の韓国特許出願第１０−２０１７−００３７９３５号に基づく優先権を主張し、該当出願の明細書及び図面に開示された内容は、すべて本出願に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
歯周疾患は、代表的な晩成炎症疾患［Ｗｉｌｌｉａｍｓ、１９９０；  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｐａｑｕｅｔｔｅ、２０００］であって、歯肉炎とともにこれに関わる歯槽骨の消失が起こると知られており［Ｓａｌｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．、１９８２；Ｓａｍｅｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．、１９９０］、多様な細菌の増殖とこれに関わる炎症が、強力な病因とされており［Ｌｉｓｔｇａｒｔｅｎ、１９８７］、近来には、酸化窒素（ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ）の酸化ストレスが発病に関与すると知られていることから［Ｌｏｈｉｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８］、抗炎症、抗酸化及び骨多孔症治療剤などがこれらの歯周疾患の予防及び治療に比較的良好な効果があると知られている［Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．、２０１２；  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１４；  Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．、２０１６］．  ＭＦ［Ｃｈｅｅｎｐｒａｃｈａ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０；  Ｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．、２０１５］。
【０００４】
現在まで、機能性食品または成分の適切な複合組成による効能成分の多様化によって薬効が向上すると知られているが［Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００８；  Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．、２０１４ａｂ；  Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．、２０１５；  Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２０１５］、モリンガ葉抽出粉末及び杜仲抽出物の複合組成による歯肉炎及び歯周炎の改善効果については全く研究されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、天然物を有効成分として含み、歯肉炎、歯周炎を含む歯周疾患の予防、改善または治療用の組成物を提供することを目的とする。
【０００６】
特に、歯周疾患による症状の緩和を越え、損傷した歯肉組織の再生または歯槽骨の消失を直接的に治療できる効果を奏する歯周疾患の予防、改善または治療用の食品組成物、薬学組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の課題を達成するため、本発明は、モリンガ抽出物及び杜仲抽出物を有効成分として含む歯周疾患の予防、改善または治療用の組成物、この製造方法及びこの用途を提供する。
【０００８】
より具体的に、一実施例によって、前記モリンガ抽出物はモリンガ葉の抽出物であり、前記杜仲抽出物は杜仲皮の抽出物であることを特徴とする組成物、この製造方法及びこの用途を提供する。
【０００９】
より具体的に、一実施例によって、本発明は、前記モリンガ抽出物及び杜仲抽出物の抽出溶媒が、水、炭素数１〜４の低級炭化水素またはこれらの混合物であることを特徴とする組成物、この製造方法及びこの用途を提供する。
【００１０】
より具体的に、一実施例によって、本発明は、前記モリンガ抽出物と杜仲抽出物との重量比（モリンガ抽出物：杜仲抽出物）が、１：１〜８：１または８：１〜２：１であることを特徴とする組成物、この製造方法及びこの用途を提供する。
【００１１】
より具体的に、一実施例によって、本発明は、前記モリンガ抽出物及び杜仲抽出物の抽出溶媒が、水、炭素数１〜４のアルコール、またはこれらの混合物であることを特徴とする組成物、この製造方法及びこの用途を提供する。
【００１２】
さらに他の実施例によって、本発明は、前記歯周疾患が歯肉炎または歯周炎であることを特徴とする組成物、この製造方法及びこの用途を提供する。
【００１３】
さらに他の実施例によって、本発明は、前記組成物が食品組成物または薬学組成物であることを特徴とする歯肉炎、歯周炎の予防または改善用の組成物、この製造方法及びこの用途を提供する。
【００１４】
さらに他の一実施例によって、本発明は、前記組成物が、ザクロ、桔梗、梔子、黄ごん、蓮の葉、ハリグワの葉、生姜、芍薬、牛膝、レッドクローバー、蒲公英及び蒲公英根の抽出物からなる群より選択された一つ以上の抽出物を有効成分としてさらに含むことを特徴とする組成物、この製造方法及びこの用途を提供する。
【００１５】
より具体的に、さらに他の実施例によって、本発明は、前記ザクロ抽出物には０．５〜３ｍｇ／ｇのエラグ酸が含まれたことを特徴とする組成物、この製造方法及びこの用途を提供する。
【００１６】
より具体的に、さらに他の実施例によって、本発明は、前記桔梗、梔子、黄ごん、蓮の葉、ハリグワの葉、生姜、芍薬、牛膝、レッドクローバー、蒲公英及び蒲公英根の抽出物の抽出溶媒が、水、炭素数１〜４の低級炭化水素またはこれらの混合物であることを特徴とする組成物、この製造方法及びこの用途を提供する。
【００１７】
以下、より具体的に説明する。
【００１８】
本発明者は、ヒトに安全なさまざまな天然物を対象にして歯周疾患改善の有効性を調べるところ、モリンガ抽出物と杜仲抽出物とをともに使えば、歯周疾患の改善に有意味な相乗効果があることを見出し、特に、歯周疾患による症状緩和を越え、損傷した歯肉組織の再生または歯槽骨の消失を直接的に治療できる効果を奏することを確認し、本発明を完成した。
【００１９】
［抽出物］
本発明による組成物には、モリンガ抽出物及び杜仲抽出物を有効成分として含む。
【００２０】
これに加え、本発明による組成物には有効成分として、ザクロ、桔梗、梔子、黄ごん、蓮の葉、ハリグワの葉、生姜、芍薬、牛膝、レッドクローバー、蒲公英及び蒲公英根の抽出物からなる群より選択された一つ以上の抽出物をさらに選択的に含む。前記ザクロ抽出物は、ザクロ濃縮物を称する。
【００２１】
モリンガは、原産地がインドである小木であるが、世界のどこでも栽培され、モリンガ木が広く用いられる多くの地域で帰化して野生する。ワサビノキ科に属するモリンガは１３種のモリンガ木があり、モリンガ・オレイフェラ（Ｍｏｒｉｎｇａ  ｏｌｅｉｆｅｒａ）が最も広く知られている。モリンガ・オレイフェラは、傘のように開かれた４〜８ｍ高さの木であり、３０〜７０ｃｍ長さの葉は落葉性であり、花は白色で香りが濃く、果実は緑色で革質性及び懸垂性の長三角形の長いさやであって、長さは３０〜４０ｃｍに至る特徴を有し、インド北西部のヒマラヤ山すそに自生し、熱帯全地域で栽培する多目的樹種の一種である。モリンガ（Ｍｏｒｉｎｇａ  ｏｌｅｉｆｅｒａ）は、タンパク質とビタミンが豊かで栄養学的に利用価値が高く、医薬的に過血糖症と抗炎症、抗癌などの多様な薬理作用を有しており、モリンガの花、根、種子、葉、果実には、他の植物に比べて、ビタミン、フラボノイド、アミノ酸などのような植生化学物質（ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ）が豊かであると知られている。モリンガの多様な部位の中で、葉は、β−カロチン、タンパク質、ビタミンＣ、カルシウムなどが豊かで抗酸化剤として用いられ、皮膚炎症や皮膚傷痕の治癒に効果を奏すると報告されている。また、モリンガ葉は、肝機能保護効果、癌細胞の細胞自殺と増殖抑制の効果などが報告されている。望ましく、本発明においてはモリンガ葉を使用する。
【００２２】
杜仲（Ｅｕｃｏｍｍｉａ  Ｂａｒｋ）は、杜仲木［Ｅｕｃｏｍｍｉａ  ｕｌｍｏｉｄｅｓ  Ｏｌｉｖｅｒ、杜仲科（Ｅｕｃｏｍｍｉａｃｅａｅ）］の幹皮として周皮を取り除いたものである。板状であり、両端が若干内方へ巻き込まれており、長さと幅は一定でなく、厚さは３〜７ｍｍである。外表面は淡褐色または灰褐色であり、あるものは、明らかなしわ柄または縦に割れた溝柄があり、あるものは比較的薄い。粗い皮が除去されていないものからは、明らかな皮目が見られる。内裏面は平滑で、褐色または暗褐色を帯びながら細い縦しわがある。内裏面は、質が弱くて折りやすい。これを折ると、細くて銀白色の細かく弾性が豊かな樹脂の糸が出る。横断面を顕微鏡で見れば、最外層には厚い殻皮層がある。殻皮層は、内側に数層のコルク細胞が整えて並べている。この細胞の細胞壁は木化しており、その下にはコルク皮層がある。師部は多くの部分を占め、５〜７列で横に配列された石細胞環があり、各々の環には３〜５個の石細胞がある。髄線は２〜３列の細胞となっており、コルク層の近くに位置し、時々一方へ傾いていることがある。髄の辺りでは、白色のガッタパーチャを含んだ柔細胞が見られ、このような柔細胞は、特に師部の内側に多い。高血圧、ウイルス感染症、腎臓疾患及び肝疾患に用いられてきた代表的な漢方薬材である［Ｈｓｉｅｈ  ａｎｄ  Ｙｅｎ、２０００；  Ｋｗａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００３；Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．、２００８］。
【００２３】
桔梗は、キキョウ［Ｐｌａｔｙｃｏｄｏｎ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ  Ａ．  Ｄｅ  Ｃａｎｄｏｌｌｅ、キキョウ科（Ｃａｍｐａｎｕｌａｃｅａｅ）］の根であって、そのまままたは周皮を取り除いたものである。長細い紡錘形または円錐形であり、時々枝が分けられることもある。主根は、長さ１０〜１５ｃｍ、直径１〜３ｃｍである。表面は灰褐色、淡褐色または白色であり、上端には、幹を取り除いた痕跡が凹まれて残っており、その辺りには細い横しわと縦溝がある。根頭部を除いた根のほとんどには、粗い縦しわと横溝があり、皮目形態の横線がある。質は堅いが折りやすい。横断面は線維性ではなく、皮部は木部よりも少し薄くてほぼ白色であり、ところどころ隙間があり、形成層の付近は褐色を帯びる。木部は白色ないし淡褐色であり、組織は皮部よりも少し密である。師部は広くて、外側の師部の髄線は曲げられており、師管束はほとんど押されて退廃されている。維管は束をなして散らばっており、その中には黄褐色の顆粒状物質が入っている。内側の師部の中には維管束が師管と共に配列されている。形成層は環をなし、木部は髄線が広くて、道管は多角形であり、一つまたはいくつかが集まって放射状に配列されている。
【００２４】
梔子は、ラテン名で「Ｇａｒｄｅｎｉａｅ  Ｆｒｕｃｔｕｓ」である、Ｇａｒｄｅｎｉａ  ｊａｓｍｉｎｏｉｄｅｓ  Ｅｌｌｉｓ［アカネ科（Ｒｕｂｉａｃｅａｅ）］のよく熟した果実であって、そのまま、または沸湯にゆでるか蒸たものである。「新編中葯志」によれば、梔子（Ｇａｒｄｅｎｉａ  ｊａｓｍｉｎｏｉｄｅｓ  Ｅｌｌｉｓ）は山梔子といい、韓国の梔子（Ｇａｒｄｅｎｉａ  ｊａｓｍｉｎｏｉｄｅｓ  Ｅｌｌｉｓ  ｖａｒ．  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ  Ｎａｋａｉ）は、大梔子または水梔子という。ところが、「韓国植物名考」によれば、前記両種は同種として認めている。日本、台湾、中国に分布し、果実は、解熱、利胆、血止め作用をすると知られている。
【００２５】
黄ごんは、ラテン名「Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａｅ  Ｒａｄｉｘ」である、コガネバナ ［Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ  ｂａｉｃａｌｅｎｓｉｓ  Ｇｅｏｒｇｉ、シソ科（Ｌａｂｉａｔａｅ）］の根であって、そのまま、または周皮を取り除いたものである。根は、円錐形であって捩じられて曲がっており、表面は黄褐色ないし濃い黄色であり、質は堅くて弱く、切断しやすい。切断面は黄色であり、中心部は赤褐色である。匂いがほとんどなくて味は若干苦い。抗菌作用、抗炎症作用、血圧降下、血止め作用、肝治療作用、解熱、鎮吐、利尿作用が報告された。主な化学成分には、フォーサイトール（ｆｏｒｓｙｔｈｏｌ）、ステロール（ｓｔｅｒｏｌ）化合物、サポニン（ｓａｐｏｎｉｎ）、オレアノール酸（ｏｌｅａｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）などがある。
【００２６】
蓮の葉は、蓮（Ｎｅｌｕｍｂｏ  ｎｕｃｉｆｅｒａ）の葉であって、蓮は根茎から長い葉柄と長い花軸が上って水面の上で葉と花を咲かせ、葉は根茎から出て高さ１〜２ｍの葉柄の先端につく。また、直径４０ｃｍ内外であって水に濡れず、葉脈が放射状に広がって縁端がのっぺりしている。葉柄は表に刺があり、中にある穴は地下茎の穴と連通する。葉の表面には目に見えない綿毛が生えられており、水が落ちれば滴のように丸くなって転がるだけで全然濡れない。蓮の葉は「荷葉」ともいうが、暑さと湿気を退け、出血を止め、お血をなくす効果がある。このことから、暑さと湿気による下痢を止め、渇をなくし、頭と目にたまった風と熱をなく目まいを治療し、喀血や鼻血、尿血、子宮出血などの各種出血症の治療に良い。蓮の葉は、抗菌作用と血圧降下作用をし、胃膓を丈夫にし、美容と精力にも良い。
【００２７】
ハリグワ（Ｃｕｄｒａｎｉａ  ｔｒｉｃｕｓｐｉｄａｔａ  Ｂｕｒｅａｕ）の葉は、長さ約６〜１０ｃｍの葉が枝に交互につく。先端は尖っているか、鈍く尖っている卵形状であり、縁端が２〜３またに分かれることもあり、鋸歯はない。岩間や坂で育つ木の葉は小さくて縁端がひどく割れてしっぽが長い。触って見れば厚い。前面と葉柄に綿毛がある。裏面には絨毛がある。秋に黄色く染まる。
【００２８】
生姜（Ｚｉｎｇｉｂｅｒ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）は、単子葉植物生姜木生姜科の多年草である。東南アジアが原産地であり、野菜として栽培する。根茎は横に伸び、多肉質であり、塊をなして黄色であり、辛味と香りがある。根茎の各節から葉鞘になっている偽茎が真っ直ぐ伸び、高さが３０〜５０ｃｍに達し、上部に葉が２列に並べる。葉は交互につき、皮針形であり、細長くて基部の方が長い葉鞘となる。韓国では花が咲かないが、熱帯地方では８月に葉鞘に包まれた長さ２０〜２５ｃｍの花幹が出て、その先に花穂がつき花が咲く。花は、苞間から出て長さが４〜７．６ｃｍである。萼は、短い筒形状であり、花冠の端部は３つに割れ、割れた片は尖った先を有する。雄しべは一つであり、葯は黄色である。子房は下位であり、花柱は糸のように細い。
【００２９】
芍薬は、芍薬（Ｐａｅｏｎｉａ  ｌａｃｔｉｆｌｏｒａ  Ｐａｌｌａｓ）またはその他の同属近縁植物［ボタン科（Ｐａｅｏｎｉａｃｅａｅ）］の根を称する。根は円柱状であり、曲がっていることがあり、長さ５〜２０ｃｍ、直径１０〜２５ｍｍであり、大きい根は縦に割れている。表面は白色または茶色を帯びてきれいであるが、縦しわが明らかで、しわまたはひげ根の切られた跡が凹んでいることがあり、横に皮目が明らかであり、根の上部には幹跡や完全に剥がれていない茶色の皮がたまに残っている。質は堅くて折られにくい。横断面を拡大鏡で見れば、粒状で非常に緻密であり、形成層が明らかで、乳白色または茶色であって髄線と形成層が見える。
【００３０】
牛膝は、逐鎚（Ａｃｈｙｒａｎｔｈｅｓ  ｊａｐｏｎｉｃａ  Ｎａｋａｉ）  または牛膝［Ａｃｈｙｒａｎｔｈｅｓ  ｂｉｄｅｎｔａｔａ  Ｂｌｕｍｅ、ヒユ科（Ａｍａｒａｎｔｈａｃｅａｅ）］の根である。円柱状の主根に長細い側根が多くついており、長さ５〜２０ｃｍ、直径３〜５ｍｍである。根の上部には幹が短く残っている。表面は灰色を帯びた黄色ないし淡黄色である。質は堅いが、折れやすく、折れた面は角質であって黄白色ないし黄褐色である。
【００３１】
レッドクローバー（Ｒｅｄ  ｃｌｏｖｅｒ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ  Ｌ）は、マメ科の多年草であり、紅車軸草、赤詰草、紅三葉草または金花菜ともいう。地中海沿岸と西南アジアが原産地であり、全世界に広く分布栽培されている直立型牧草である。レッドクローバーは、飼料用としても使われたり、春には幼い葉を軽くゆでて若菜として食べたりもする。レッドクローバーは、去痰効果があって咳や喘息の治療に効能があると知られている。地上部（ａｅｒｉａｌ  ｐａｒｔｓ）及び根部に分けられる。望ましく本発明においては、地上部を用いる。
【００３２】
蒲公英（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｐｌａｔｙｃａｒｐｕｍ）は、被子植物門の双子葉綱に属する植物であり、野原で日がよく入る所で育つ。幹はなく、葉が根から出て、横に伸びる。葉は逆に立てた皮針形であり、長さが６〜１５ｃｍ、幅が１．２〜５ｃｍであって、羽状で深く切り込まれた形状であり、縁端に鋸歯があり、毛が若干ある。 
【００３３】
蒲公英の根は、長さが７〜８．５ｍｍであり、冠毛は長さが６ｍｍであって淡い白色を帯びる。
【００３４】
本発明において、用語「抽出物」とは、抽出処理によって得られる抽出液、前記抽出液の希釈液や濃縮液、前記抽出液を乾燥して得られる乾燥物、前記抽出液の粗精製物や精製物、またはこれらの混合物など、抽出液そのもの及び抽出液を用いて形成可能な全ての剤形の抽出物を含む。
【００３５】
本発明の目的を阻害しない限り、本発明による抽出物には、各々の植物を説明して特定した部位の外にも、その葉、幹、樹皮、根、花または花芽、果実、種子、樹液及び全体植物が含まれ得る。
【００３６】
本発明による抽出物を製造するために、通常の技術者は、当業界における公知の任意の適した方法を用いることができる。例えば、溶媒抽出法を用い得る。植物全体または任意の部分を粉砕した後（例えば、ブレンダー）、抽出溶媒を処理して溶媒抽出物を得ることができる。粉砕前に乾燥過程を経た後、粉砕してもよい。また、溶媒抽出物は、減圧蒸留及び凍結乾燥または噴霧乾燥などのような追加的な過程によって粉末状態に製造され得る。
【００３７】
前記使用される抽出溶媒の種類は特に制限されず、当該技術分野における公知の任意の溶媒を用いることができる。前記抽出溶媒の非制限的な例には、水；メタノール、エタノール、プロピルアルコール、ブチルアルコールなどのＣ１〜Ｃ４の低級アルコール；グリセリン、ブチレングリコール、プロピレングリコールなどの多価アルコール；及びメチルアセテート、エチルアセテート、アセトン、ベンゼン、ヘキサン、ジエチルエーテル、ジクロロメタンなどの炭化水素系溶媒；またはこれらの混合物を用いることができ、望ましくは、水、炭素数１〜４の低級アルコールを単独でまたは二種以上を混合して用いることができる。前記溶媒を用いて一回以上抽出して溶媒抽出物を製造することができ、前記溶媒抽出物を減圧蒸留した後に凍結乾燥または噴霧乾燥して得た乾燥抽出物を製造することもできる。
【００３８】
前記抽出溶媒の量は、用いられる抽出溶媒の種類によって多様にすることができ、例えば、対象植物の乾燥重量に対して１〜２０倍、または５〜２０倍、より望ましくは５〜１０倍、最も望ましくは５〜８倍で用い得る。  
【００３９】
前記溶媒抽出に際し、抽出温度、抽出時間、抽出気圧は、これに制限されないが、１００〜１５０℃、５〜１０時間、０．１〜０．３Ｍｐａで施し得る。
【００４０】
この他にも、当業界における公知の多様な抽出工程、例えば、温浸（ｍａｃｅｒａｔｉｏｎ）、インフュージョン（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）、パーコレーション（ｐｅｒｃｏｌａｔｉｏｎ）、消化、煎じ汁（ｄｅｃｏｃｔｉｏｎ）、高温連続抽出（ｈｏｔ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）、水性−アルコール性抽出、逆流抽出、マイクロ波補助抽出、超音波抽出、初臨界流体抽出、組織片抽出（ｐｈｙｔｏｎｉｃ  ｅｘｔｒａｃｔ、例えば、ハイドロフルオロカーボン溶媒など）などを選択して用い得、これらは単独でまたは二種以上の方法を併用して行い得る。
【００４１】
本発明によるレッドクローバー抽出物にはイソフラボンが含まれ、全体レッドクローバー抽出物に対して５０〜４００ｍｇ／ｇのイソフラボンが含まれ得る。本発明によるレッドクローバー抽出物から上述したような濃度のイソフラボンが収得可能な理由は、原料産地の差、使用部位の種類、上述の特定製造方法（例えば、抽出溶媒）などに起因したと考えられるが、本発明はこのような事項に限定されない。
【００４２】
本発明による杜仲抽出物には、ピノレシノールジグルコシド（Ｐｉｎｏｒｅｓｉｎｏｌ  ｄｉｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）が含まれ、全体杜仲抽出物に対して１．０〜１５ｍｇ／ｇのピノレシノールジグルコシドが含まれ得る。本発明による杜仲抽出物から上述したような濃度のピノレシノールジグルコシドが収得可能な理由は、原料産地の差、使用部位の種類、上述の特定製造方法（例えば、抽出溶媒）などに起因したと考えられるが、本発明はこのような事項に限定されない。
【００４３】
本発明によるモリンガ抽出物には、アストラガリン（Ａｓｔｒａｇａｌｉｎ）が含まれ、全体モリンガ抽出物に対して１．２〜５ｍｇ／ｇのアストラガリンが含まれ得る。本発明によるモリンガ抽出物から上述したような濃度のアストラガリンが収得可能な理由は、原料産地の差、使用部位の種類、上述の特定製造方法（例えば、抽出溶媒）などに起因したと推測されるが、本発明はこのような事項に限定されない。
【００４４】
ザクロ（Ｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅ、Ｐｕｎｉｃａ  ｇｒａｎａｔｕｍ  Ｌ）は、アジア西南部、インド北西部及びアメリカカリフォルニアの自生植物であって、現在は、亜熱帯及び熱帯各地に広く広がっている植物である。昔からザクロ、特に赤ザクロは強壮剤として知られており、特に、高血圧と動脈硬化の予防に良い効果を奏すると知られている。また、水溶性糖質が３８〜４７％で多量含まれており、多様なビタミンとミネラルを含む。
【００４５】
本発明に用いられるザクロの種類は特に制限されないが、赤ザクロが望ましい。具体的な例には、イラン、カリフォルニア、台湾、ウズベキスタン、トルコ及び韓国産赤ザクロが挙げられる。例えば、トルコ産ザクロ品種には、Ｈｉｃａｚｎａｒ  ｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅ  ｃｖ．、Ｃｅｋｉｒｄｅｋｓｉｚ  ＶＩ  ｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅ  ｃｖ．、Ｓｉｌｉｆｋｅ  Ａｓｉｓｉ  ｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅ  ｃｖ．、Ｋａｔｉｒｂａｓｉ  ｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅ  ｃｖ．  またはＬｅｆａｎ  ｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅ  ｃｖ．などがあるが、これらに制限されない。本発明によるザクロ抽出物は、使用されたザクロの産地及び収獲時期などによって相違し得る。
【００４６】
本発明において、用語「濃縮物」とは、後述の方法によって収得する濃縮液、濃縮液の希釈液、前記濃縮液を乾燥して得られる乾燥物、前記濃縮液の粗精製物や精製物、またはこれらの混合物など、濃縮液そのもの及び濃縮液を用いて形成可能な全ての剤形の濃縮物を含む。
【００４７】
本発明によるザクロ濃縮物を製造するための望ましいザクロ部位はザクロ果肉である。
【００４８】
本発明によるザクロ濃縮物は、次のような方法で製造可能である。例えば、先ず、ザクロを洗浄した後、皮と種を完全に取り除き、高温で短時間殺菌し、でん粉解酵素を添加してザクロに含まれているでん粉などの多糖類を分解する。その後、選択的に、ゼラチン、シリコンジオキシド、ベントナイト、シリカゾル（ｓｉｌｉｃａｓｏｌ）、タンニン、セルロースまたはカリウムカゼイネート（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｃａｓｅｉｎａｔｅ）などの添加剤を添加してザクロ濃縮物の濁度、色相、粘度などを調節し、加熱濃縮してザクロ濃縮物を製造し得る。さらに、追加で各段階の間にろ過段階を含んでもよく、例えば、皮と種の除去段階後かつ高温殺菌段階前、でん粉解酵素処理段階後かつ濃縮段階前、または濃縮段階後のいずれか一つ以上でろ過工程をさらに含み得る。
【００４９】
より具体的に、下記の段階を含んで製造できる：
Ｓ１）ザクロの皮と種を取り除いてザクロ果肉のみを収得する段階と、
Ｓ２）ザクロ果肉を１００〜１０５℃で５０〜８０秒間殺菌した後、４８〜５５℃に冷却する段階と、
Ｓ３）冷却したザクロ果肉に４８〜５５℃ででん粉解酵素を処理する段階と、
Ｓ４）ザクロ果肉分解物を順次に７０〜１００℃及び４００〜８５０ｍｂａｒで加温加圧して２回以上加熱濃縮し、４０〜８０℃及び１００〜３５０ｍｂａｒで減温減圧して１回以上加熱濃縮する段階
選択的に、Ｓ１段階とＳ２段階との間、Ｓ３段階とＳ４段階との間、及びＳ４段階後のうちいずれか一つ以上でろ過段階をさらに含み得る。
【００５０】
以下、各段階別により具体的に説明する。
【００５１】
Ｓ１）ザクロの皮と種を取り除いてザクロ果肉のみを収得する段階
本発明は、ザクロ皮と種を含まないザクロ果肉のみを用いた抽出物を提供する。ザクロの皮と種は副作用をもたらし得、例えば、ザクロ皮に含まれた特定のアルカロイド（ａｌｋａｌｏｉｄ）は、身体機能を低下させる作用をし、呼吸器系と筋肉に影響を及ぼし、中毒されれば、発作、痙攣、昏睡状態などが起こり得る。また、ザクロ種の抽出物を服用すれば、一部の人にとってアレルギーである舌の腫脹（ｔｏｎｇｕｅ  ｓｗｅｌｌｉｎｇ）などの副作用を起こし得る。
【００５２】
Ｓ２）ザクロ果肉を１００〜１０５℃で５０〜８０秒間殺菌した後４８〜５５℃に冷却する段階
ザクロ果肉は、順次に殺菌後に冷却する段階を経る。殺菌は、１００〜１０５℃で５０〜８０秒間、より望ましくは５５〜７０秒間迅速に行うことが望ましく、４８〜５５℃に冷却することが望ましい。
【００５３】
Ｓ３）冷却したザクロ果肉に４８〜５５℃ででん粉解酵素を処理する段階
冷却したザクロ果肉にでん粉解酵素を処理する段階を経る。望ましくは、４８〜５５℃で１０〜６０分間施し、より望ましくは４８〜５５℃で２０〜４０分間施し得る。利用可能なでん粉解酵素は特に制限されず、当業界における公知の多様なでん粉解酵素を用いることができ、例えば、ペクチナーゼ（ｐｅｃｔｉｎａｓｅ）、プロテイナーゼ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）、アミラーゼ、セルラーゼなどを用い得るが、望ましくはペクチナーゼを用い得る。
【００５４】
Ｓ４）ザクロ果肉分解物を順次に７０〜１００℃及び４００〜８５０ｍｂａｒで加温加圧して２回以上加熱濃縮し、４０〜８０℃及び１００〜３５０ｍｂａｒで減温減圧して１回以上加熱濃縮する段階
ザクロ果肉分解物を順次に加温加圧して加熱濃縮し、減温減圧して加熱濃縮する段階を経る。
【００５５】
望ましくは、加温加圧して２回以上、より望ましくは３回以上加熱濃縮し、減温減圧して１回以上、より望ましくは２回以上加熱濃縮し得、総３回以上加熱濃縮し得る。
【００５６】
加温加圧して加熱濃縮することは、温度条件７０〜１００℃及び圧力条件４００〜８５０ｍｂａｒの範囲内で行われ、加熱濃縮次数（回数）ごとに温度及び圧力を異にするが、前記温度及び圧力範囲内で温度を加温して加圧することであれば、制限されることなく本発明の範囲に含まれる。望ましくは、７０〜８５℃で４００〜５５０ｍｂａｒで１次加熱濃縮、８５〜９２℃で５５０〜７５０ｍｂａｒで２次加熱濃縮、及び９２〜１００℃で７５０〜８５０ｍｂａｒで３次加熱濃縮し得る。より望ましくは、７８〜８２℃で４５０〜５００ｍｂａｒで１次加熱濃縮、８５〜９０℃で６００〜６５０ｍｂａｒで２次加熱濃縮、及び９２〜９８℃で８００〜８５０ｍｂａｒで３次加熱濃縮し得る。
【００５７】
減温減圧して加熱濃縮することは、温度条件４０〜８０℃及び圧力条件１００〜３５０ｍｂａｒの範囲内で行われ、加熱濃縮次数（回数）ごとに温度及び圧力を異にするが、前記温度及び圧力範囲内で温度を減温して減圧することであれば、制限されなく本発明の範囲に含まれる。望ましくは、６０〜８０℃で２５０〜３５０ｍｂａｒで４次加熱濃縮及び４０〜６０℃で１００〜２５０ｍｂａｒで５次加熱濃縮し得る。より望ましくは６５〜７２℃で３００〜３３０ｍｂａｒで４次加熱濃縮及び４５〜５５℃で１００〜１５０ｍｂａｒで５次加熱濃縮し得る。
【００５８】
本発明によるザクロ濃縮物には、ザクロ濃縮物の総重量に対して０．５〜３ｍｇ／ｇのエラグ酸が含まれる。本発明によるザクロ濃縮物のエラグ酸含量の高い理由は、原料であるザクロ産地の差、果肉のみの利用、上述の特定製造方法（例えば、濃縮方法、加熱温度及び圧力）などに起因したと考えられるが、本発明はこのような事項に限定されない。
【００５９】
［組成物］
本発明は、歯周疾患の予防、改善または治療に用いるための組成物を提供する。より具体的に、本発明は、モリンガ抽出物及び杜仲抽出物を有効成分として含む歯周疾患の予防、改善または治療方法に用いるための組成物を提供する。
【００６０】
本発明による組成物は、モリンガ抽出物及び杜仲抽出物を有効成分として含む。
【００６１】
これに加え、本発明による組成物には、有効成分として、ザクロ、桔梗、梔子、黄ごん、蓮の葉、ハリグワの葉、生姜、芍薬、牛膝、レッドクローバー、蒲公英及び蒲公英根の抽出物からなる群より選択された一つ以上の抽出物を選択的に含む。
【００６２】
本発明において、「有効成分として含まれる」という意味は、本発明による組成物から歯周疾患の予防、改善または治療効果を示す程度で添加されることを意味し、ターゲット細胞への伝達及び安定化などのために多様な成分を副成分として添加して多様な形態に剤形化（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）できることを含む意味である。
【００６３】
本発明による組成物に、各々の成分が次のような割合で含まれ得る。
【００６４】
モリンガ抽出物と杜仲抽出との重量比（モリンガ抽出物：杜仲抽出物）は、１：１〜８：１または８：１〜２：１であり得る。より望ましくは、モリンガ抽出物と杜仲抽出物との重量比（モリンガ抽出物：杜仲抽出物）は、２：１〜４：１であり得る。前記重量比の範囲内で優れた相乗効果を発揮する。
【００６５】
また、本発明による組成物には、本発明の各々の抽出物（及び濃縮物）が組成物の最終形態の中に少なくとも約０．０００１％〜９０％、０．００１％〜９０％、０．０１％〜９０％、０．１％〜９０％、０．１％〜９０％、０．１％〜８０％、０．１％〜７０％、０．１％〜６０％、０．１％〜５０％、０．１％〜４０％、０．１％〜３０％、０．１％〜２０％または０．１％〜１０％の範囲で含まれ得る。
【００６６】
また、本発明による組成物には、少なくとも約０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９９％以上の範囲で本発明の複合物を含み得る。
【００６７】
前記％は、組成物の総重量に対する重量または総体積に対する体積を基準で計算することができ、濃度は、組成物の目的とする効果または組成物が混入される製品によって調整可能である。
【００６８】
本発明による組成物は、上述の方法で製造されたモリンガ抽出物及び杜仲抽出を混合して製造できる。これに加え、選択的に、上述の方法で製造されたザクロ、桔梗、梔子、黄ごん、蓮の葉、ハリグワの葉、生姜、芍薬、牛膝、レッドクローバー、蒲公英及び蒲公英根の抽出物からなる群より選択された一つ以上の抽出物を混合して製造し得る。さらに、組成物の保管性、流通性、安定性などを向上させる目的で追加工程を加えて製造し得る。
【００６９】
本発明による組成物は多様に製品化できる。例えば、食品組成物、薬学組成物または口腔製品などに製品化し得る。
【００７０】
本発明は、前記組成物のいずれか一つの組成物を含む薬学的組成物を提供する。本発明は、前記組成物のいずれか一つの組成物を投与して、歯周疾患を予防、改善または治療する方法を提供する。
【００７１】
本発明による薬学的組成物は、薬学的に有効な量のモリンガ抽出物及び杜仲抽出物を単独で含むか、選択的に、ザクロ、桔梗、梔子、黄ごん、蓮の葉、ハリグワの葉、生姜、芍薬、牛膝、レッドクローバー、蒲公英及び蒲公英根の抽出物からなる群より選択された一つ以上の抽出物を混合するか、一つ以上の薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含み得る。
【００７２】
前記「薬学的に許容される」とは、生理学的に許容されてヒトに投与されるとき、活性成分の作用を阻害せず、通常的に、胃腸障害、めまいのようなアレルギー反応またはこれの類似反応を起こさないことを意味する。
【００７３】
前記担体、賦形剤及び希釈剤の例には、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、でん粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート及び鉱物油を挙げることができる。また、充填剤、抗凝集剤、滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤及び防腐剤などをさらに含み得る。
【００７４】
前記「薬学的に有効な量」とは、陰性対照群に比べてそれ以上の反応を示す量を意味し、望ましくは、歯周疾患の改善、予防及び／または治療の効果を示すのに十分な量を意味する。
【００７５】
また、本発明の薬学的組成物は、哺乳動物に投与された後、活性成分の迅速、持続または遅延した放出を提供できるよう、当業界における公知の方法を使って剤形化することができる。剤形は、粉末、顆粒、錠剤、エマルション、シロップ、エアロゾール、軟質または硬質ゼラチンカプセル、滅菌注射溶液、滅菌粉末の形態であり得る。
【００７６】
本発明の薬学的組成物の投与経路はこれに限定されないが、経口的または非経口的に投与できる。非経口的な投与経路には、例えば、経皮、鼻腔、腹腔、筋肉、皮下または静脈などの様々な経路が含まれ得る。経口投与を含む場合、当該組成物は、錠剤、カプセル剤、カシェ剤、ゲルカプ剤（ｇｅｌｃａｐ）、液剤、懸濁剤などの形態で経口剤形化し得る。錠剤またはカプセル剤は結合剤（例えば、予備ゼラチン化したトウモロコシでん粉、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微細結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、滑石またはシリカ）；崩壊剤（例えば、じゃがいもでん粉またはでん粉グリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）のような薬剤学的に許容される賦形剤とともに通常の手段によって製造できる。錠剤は、当該分野おける公知の方法で被覆し得る。経口投与用の液体製剤は、液剤、シロップ剤または懸濁剤の形態を取り得るが、これに限定されず、これらは使用前に水または他の適したビヒクルと構成するための無水生成物として存在し得る。このような液体製剤は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化した食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンドオイル、オイル性エステル、エチルアルコールまたは分画化した野菜オイル）；及び防腐剤（例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸）のような薬剤学的に許容される添加剤とともに通常の手段によって製造することができる。また、当該製剤は、場合によって、緩衝塩、風味剤、着色剤及び甘味剤を含み得る。経口投与用の製剤は、歯周疾患を治療するために本発明で有用な結合タンパク質の徐放、制御放出または持続放出のために適切に剤形化できる。
【００７７】
本発明の組成物の望ましい投与量は、患者の状態及び体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路及び時間によって異なるが、当業者によって適切に選択可能である。
【００７８】
本発明の組成物は、単独でまたは手術、放射線治療、ホルモン治療、化学治療及び生物学的反応調節剤を使用する方法と併用して使うことができる。例えば、本発明の薬学的組成物は、歯周疾患の改善、予防及び／または治療効果を奏する公知の化合物と併せて投与することができる。
【００７９】
本発明は、前記組成物を含む食品組成物を提供する。本発明は、前記組成物を摂取して歯周疾患を予防または改善する方法を提供する。
【００８０】
本発明による食品組成物は、食品学的に有効な量のモリンガ抽出物及び杜仲抽出物を単独で含むか、または一つ以上の食品学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含み得る。
【００８１】
本発明の食品組成物は、食品、機能性食品（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｆｏｏｄ）、栄養補助剤（ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、健康機能食品（ｈｅａｌｔｈ  ｆｅｅｄ）及び食品添加剤（ｆｏｏｄ  ａｄｄｉｔｉｖｅｓ）などの全ての天然素材の加工形態を含む。前記類型の食品組成物は、当業界における公知の通常の方法によって多様な形態に製造することができる。
【００８２】
前記食品の種類は特に制限されない。前記物質を添加できる食品の例には、ドリンク剤、肉類、ソーセージ、パン、ビスケット、餠、チョコレート、キャンディ類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲み物、アルコール飲料及びビタミン複合剤、乳製品及び乳加工製品などがあり、通常の意味の健康機能食品を全て含む。
【００８３】
本発明によるモリンガ抽出物及び杜仲抽出物の複合物は、食品にそのまま添加するか、または他の食品または食品成分とともに使うことができ、通常の方法によって適切に使用可能である。有効成分の混合量は、その使用目的（予防または改善用）によって適切に用いることができる。一般的に、健康機能食品中の前記複合物の両は、全体食品重量の０．１〜９０重量部で添加し得る。しかし、健康及び衛生を目的とするか、または健康調節を目的とする長期間の摂取の場合は、前記量が前記範囲以下であり得、安全性面で如何なる問題もないため、有効成分は前記範囲以上の量を使用してもよい。
【００８４】
本発明食品組成物は、指示された割合で必須成分として前記モリンガ抽出物及び杜仲抽出物の複合物を含むことを除いては、他の成分は特に制限されず、選択的に、ザクロ、桔梗、梔子、黄ごん、蓮の葉、ハリグワの葉、生姜、芍薬、牛膝、レッドクローバー、蒲公英及び蒲公英根の抽出物からなる群より選択された一つ以上の抽出物を混合してもよく、通常の飲み物のように様々な香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含み得る。上述の天然炭水化物の例には、単糖、例えば、ブドウ糖、果糖など；二糖、例えば、マルトース、スクロースなど；及び多糖、例えば、デキストリン、シクロデキストリンなどのような通常の糖、及びキシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールが挙げられる。上述したものの外の香味剤として、天然香味剤（タウマチン、ステビア抽出物（例えば、レバウディオサイドＡ、グリシルリジンなど）及び合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を有利に使うことができる。
【００８５】
上述のものの外に本発明の食品組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤及び天然風味剤などの風味剤、着色剤及び増進剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使われる炭酸化剤などを含み得る。その他に、天然果実ジュース及び果実ジュース飲料及び野菜飲料の製造のための果肉を含み得る。
【００８６】
また、本発明は、前記のような組成物を含む口腔製品を提供する。前記口腔製品は、歯周疾患の予防または改善の効果を奏する。前記口腔製品は、歯磨き、口腔洗浄剤、口腔スプレー、ガム、軟膏及びパッチ剤などであり得る。
【００８７】
前記口腔製品は、種類及び使用目的によって、通常使用する研磨剤、湿潤剤、結合剤、気泡剤、甘味剤、防腐剤、薬効剤、香料、酸性度調節剤、増白剤などからなる群より選択された添加剤を適量追加配合して使い得る。
【００８８】
例えば、前記研磨剤は、リン酸一水素カルシウム、沈降シリカ、炭酸カルシウム、含水アルミナ、カオリン、重曹（ＮａＨＣＯ３）などからなる群より選択された一種以上を用い得る。前記湿潤剤には、グリセリン、ソルビトール、非結晶性ソルビトール液、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、キシリトールなどからなる群より選択された一種以上を用い得るが、これらに制限されない。前記結合剤には、カラギナン、ザンタンガム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、ラポナイトなどからなる群より選択された一種以上を用い得るが、これらに制限されない。前記気泡剤には、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウロイルサルコシン酸ナトリウムなどの陰イオン界面活性剤と、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン系縮合高分子物質などからなる群より選択された一種以上を用い得るが、これらに制限されない。前記甘味剤は、サッカリンナトリウム、アスパルテーム、甘草酸などを単独でまたは二種以上を混合して用い得るが、これらに制限されない。前記防腐剤には、パラオキシ安息香酸エステル、安息香酸ナトリウムなどを単独でまたは二種以上を混合して用い得る。前記薬効剤には、フッ化ナトリウム、フッ化リン酸ナトリウム、フッ化スズ、フッ化アミン、クロルヘキシジン、トラネキサム酸、アラントイン類、カプロン酸類、ポリリン酸塩類、酵素類及び生薬抽出物などを用い得る。香料には、ペパーミントオイル、スペアミントオイル、メントール、カルボンなどを適量混合して用い得る。前記酸性度調整剤には、リン酸、リン酸ナトリウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム、コハク酸、コハク酸ナトリウム、酒石酸、酒石酸ナトリウムなどを用い得、望ましい酸性度は５〜８程度である。前記増白剤には酸化チタンを用い得るが、これに制限されない。
【００８９】
本発明による組成物は、キットとして提供できる。
【００９０】
本発明による組成物は容器に含まれ、容器は、瓶、金属チューブ、ラミネートチューブ、プラスチックチューブ、ディスペンサ、圧力容器、障壁容器、パッケージ、コンパートメント、コンパクト容器、組成物を保持できるパン（ｐａｎ）、または他のタイプの容器、例えば、分散媒体（ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎｓ）または組成物が保持される望ましい瓶、ディスペンサまたはパッケージ内に注入またはブローモールドされたプラスチック容器などが含まれ得るが、これらに制限されない。前記キットには、キットまたは組成物を使うための指示書が含まれ得、指示書は別の用紙に記載されるか、または、容器表面、容器包装紙の表面上に記載され得る。指示事項には、文字、語句、略語、絵または記号などが含まれるが、これらに制限されない。指示書には、例えば、キットまたは組成物の使用方法、適用方法及び保持方法などについての指示事項が含まれ得る。容器には事前に決められた量に応じて分配して入れることができる。
【００９１】
［歯周疾患の改善、予防及び／または治療］
本発明による組成物は、歯周疾患の改善、予防及び／または治療に効果を奏する。
【００９２】
より具体的に、本発明による組成物は、歯周疾患の症状を緩和または改善し、ひいては、傷の治癒、抗炎症、歯槽骨消失の抑制及び再生による歯肉、歯周の損傷を直接的に治療できる効果を奏する。
【００９３】
前記歯周疾患は、口内炎、歯肉炎、歯周炎、歯槽骨損傷、歯槽骨の骨多孔症、歯槽骨軟化症、歯槽骨減少症、歯槽骨再形成障害などからなる群より選択された一種以上の疾患であり得、望ましくは歯肉炎及び歯周炎である。
【００９４】
本発明によれば、天然物を有効成分して含むので、人体に安全である。特に、歯肉炎及び歯周炎による症状の緩和を越え、傷の治癒、抗炎症、歯槽骨の消失抑制及び再生によって、歯肉及び歯周の損傷を直接的に治療できる効果を奏する。したがって、歯肉炎及び歯周炎を含む歯周疾患の予防、改善または治療用の組成物として、多様な分野（食品、薬品、医薬外品など）において有用に活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
本明細書に添付される次の図面は、本発明の望ましい実施例を例示するものであり、発明の詳細な説明とともに本発明の技術的な思想をさらに理解させる役割をするため、本発明は図面に記載された事項だけに限定されて解釈されてはならない。
【図１】歯肉炎が誘導された動物モデルにおいて、１１種の天然物素材を処理した後、歯肉組織内ＩＬ−１βの含量測定による抗炎症効果を確認したものである。
【図２】歯周炎が誘導された動物モデルにおいて、５種の天然物素材を処理した後、歯槽骨（Ａｌｖｅｏｌａｒ  ｂｏｎｅ  ｖｏｌｕｍｅ）の面積測定によって歯槽骨の消失抑制効果を確認したものである。
【図３】モリンガ葉抽出物及び杜仲抽出物の複合割合別の体重増減量の測定による歯肉炎及び歯周炎の改善効果を確認したものである。
【図４】モリンガ葉抽出物及び杜仲抽出物の複合割合別の炎症指標であるＩＬ−１βの歯肉組織内の含量測定による歯肉炎及び歯周炎の改善効果を確認したものである。
【図５】モリンガ葉抽出物及び杜仲抽出物の複合割合別の炎症指標であるＴＮＦ−αの歯肉組織内の含量測定による歯肉炎及び歯周炎の改善効果を確認したものである。
【図６】モリンガ葉抽出物及び杜仲抽出物の複合割合別の歯肉組織内のＭＤＡ含量測定を通じた抗酸化効果による歯肉炎及び歯周炎の改善効果を確認したものである。
【図７】モリンガ葉抽出物及び杜仲抽出物の複合割合別の歯槽骨内の破骨細胞数の測定による歯肉炎及び歯周炎の改善効果を確認したものである。
【図８】モリンガ葉抽出物及び杜仲抽出物の複合割合別の歯槽骨面積値の測定による歯槽骨消失抑制及び再生効果の確認による歯肉炎及び歯周炎の改善効果を確認したものである。
【図９】モリンガ葉抽出物及び杜仲抽出物の複合割合別の口腔内頬側溝部の総好気性生菌数を測定し、抗菌による歯肉炎及び歯周炎の改善効果を確認したものである。
【発明を実施するための形態】
【００９６】
以下、本発明を具体的な実施例を挙げて説明する。しかし、本発明による実施例は多くの他の形態に変形されることができ、本発明の範囲が後述する実施例に限定されると解釈されてはならない。本発明の実施例は当業界で平均的な知識を有する者に本発明をより完全に説明するために提供されるものである。
【００９７】
［実施例］
［１．試験物質製造］
ザクロ、桔梗、梔子、黄ごん、モリンガ、蓮の葉、ハリグワの葉、生姜、芍薬、牛膝、杜仲、レッドクローバー、蒲公英及び蒲公英根の抽出物（即ち、１４種の天然物素材）を次の製造工程によって製造した。各々の原料に対し、以下の抽出条件で各二つ以上のロットを製造して抽出収率、指標成分の含量、性状などを分析した。
【００９８】
［１．１．ザクロ濃縮粉末の製造］
ザクロ濃縮物は、次のような方法で製造した。
【００９９】
先ず、ザクロ１，０００ｋｇの異物を取り除き、壊れた果実を分離及び洗浄した。分類した果実を切断して皮を取り除き、圧搾して種を分離して、ザクロ果肉４５０ｋｇを得た。ろ過した後、１００〜１０５℃で６０秒間殺菌し、４８〜５５℃に冷却した。ペクチナーゼをザクロジュース１０００Ｌ当たり７０〜１００ｍｌを投入し、４８〜５５℃で３０分間でん粉分解をした。その後、濁度及び色相の維持、服用に有利な粘度生成などのために、ザクロジュース１０，０００Ｌ当たりベントナイト９００ｇを投入し、４８〜５５℃で１０分間撹拌した。その後、１．５ｍｍ及び１ｍｍ真空ろ過し、加熱濃縮（順次に、８０℃で４７５ｍｂａｒで１２ｂｒｉｘまで、８７℃で６２６ｍｂａｒで１７ｂｒｉｘまで、９５℃で８４７ｍｂａｒで３１Ｂｒｉｘまで、７０℃で３１２ｍｂａｒで４３Ｂｒｉｘまで、そして４９℃で１１８ｍｂａｒで６５Ｂｒｉｘまで加熱濃縮）した後、さらに０．１５ｍｍろ過してエラグ酸１．８〜３．０ｍｇ／ｇを含むザクロ濃縮液を得た。その後、前記ザクロ濃縮液をデキストリンと９：１の割合で混合した後、スプレードライ（ｓｐｒａｙ  ｄｒｙ）過程によってエラグ酸０．５〜３ｍｇ／ｇを含むザクロ濃縮粉末を製造した。
【０１００】
［１．２．モリンガを含む１３種の天然物素材の抽出物の製造］
桔梗、梔子、黄ごん、モリンガ、蓮の葉、ハリグワの葉、生姜、芍薬、牛膝、杜仲、蒲公英及び蒲公英根の抽出物を、次の方法によって製造した。
【０１０１】
杜仲は、乾皮（煎ったもの）原物を使用した。モリンガは、モリンガ葉を使用した。レッドクローバー抽出物は、イソフラボンを８％含むように製造された原料をＢｉｏｓｅａｃｈ  ｌｉｆｅ  ｃｏ．  Ｌｔｄ．（スペイン）から購買して使用した。
【０１０２】
乾燥した各々の原物を正確に３０ｋｇ秤量した後、きれいに洗浄し、原物：溶媒を３：２０の割合（ｋｇ：ｋｇ）で抽出器に入れ、１２１℃、０．１５Ｍｐａで６時間抽出し、これを繰り返して総２回抽出した。前記溶媒としては水を使用した。抽出物をろ過によって固形分を除去した後、ろ過液を減圧濃縮して２５ｂｒｉｘ（±５ｂｒｉｘ）の濃縮物を得た。濃縮物：デキストリン＝９：１の割合（ｋｇ：ｋｇ）で混ぜてスプレードライヤー（ｓｐｒａｙ  ｄｒｙｅｒ）で粉末化を行った。粉末化した各々の抽出物は、指標成分の含量分析によって原料標準化及び製造工程標準化に使用し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験による安全性及び有効性の評価に使用した。
【０１０３】
［２．１４種の天然物素材に対する効能評価］
前記１．１．の製造方法によって製造されたザクロ濃縮粉末、１．２．の製造方法によって製造された１４種の試料のＥＰＤモデルに対する歯肉炎及び歯周炎の改善効果を確認した。
【０１０４】
［２．１．動物実験を通じる効能評価］
以下では、ザクロ濃縮粉末及びモリンガ葉を含む１３種（桔梗、梔子、黄ごん、モリンガ、蓮の葉、ハリグワの葉、生姜、芍薬、牛膝、杜仲、レッドクローバー、蒲公英及び蒲公英根）の抽出物各々の歯肉炎及び歯周炎の改善効果を評価した。
【０１０５】
また、モリンガ葉抽出物（ＭＦ）及び杜仲抽出物（ＥＣ）の単独または複合組成物の歯肉炎及び歯周炎の改善効果を評価した。
【０１０６】
［２．１．１．動物実験による１４種の天然物抽出物に対する効能評価］
以下では、ザクロ濃縮粉末及びモリンガ葉を含む１３種（桔梗、梔子、黄ごん、モリンガ、蓮の葉、ハリグワの葉、生姜、芍薬、牛膝、杜仲、レッドクローバー、蒲公英及び蒲公英根）の抽出物、各々の歯肉炎及び歯周炎の改善効果を評価した。
【０１０７】
現在、代表的な歯肉炎及び歯周炎改善モデルとして用られている、歯牙境部結紮ラット（ｒａｔ）の歯周疾患（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｔｉｓ；ＥＰＤ）を用いて評価した。即ち、歯牙境部結紮２４時間後から単独抽出物を各々滅菌蒸留水に溶解し、５ｍｌ／ｋｇの用量（２００ｍｇ／ｋｇ）で毎日１回ずつ１０日間強制で経口投与し、歯肉組織内のインターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ、ＩＬ）−１β及び歯槽骨量の変化を組織病理学的変化とともに観察した。この際、ｎｏｎ−ｓｔｅｒｏｉｄ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｒｕｇｓ（ＮＳＡＩＤｓ）系列の抗炎症剤であるインドメタシン（ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ；ＩＮＤ）５ｍｇ／ｋｇ経口投与群と各々比較評価した。
【０１０８】
［実験物質の組成及び投与］
ザクロ濃縮粉末及びモリンガ葉を含む１３種（桔梗、梔子、黄ごん、モリンガ、蓮の葉、ハリグワの葉、生姜、芍薬、牛膝、杜仲、レッドクローバー、蒲公英及び蒲公英根）の抽出物を４０ｍｇ／ｍｌの濃度で滅菌蒸留水に溶解し、５ｍｌ／ｋｇの用量（２００ｍｇ／ｋｇ）で歯牙境部結紮２４時間後から毎日１回ずつ１０日間各々経口投与し、ＩＮＤは、１ｍｇ／ｍｌの濃度で滅菌蒸留水に溶解し、５ｍｌ／ｋｇの用量（５ｍｇ／ｋｇ）で歯牙境部結紮２４時間後から毎日１回ずつ１０日間経口投与した。正常媒体対照群及びＥＰＤ（歯周疾患）  対照群においては、天然物抽出物の代わりに媒体である滅菌蒸留水のみを同一用量及び頻度で経口投与した。
【０１０９】
［歯周疾患の誘発］
本研究者などの以前の方法［Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１４；  Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．、２０１６］に従って、実験動物を１０日間実験室の環境に順化させた後、げっ歯類用吸入麻酔器（Ｓｕｒｇｉｖｅｔ、Ｗａｕｋｅｓｈａ、ＷＩ、ＵＳＡ）と換気装置（Ｍｏｄｅｌ  ６８７、Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を用いて３％のイソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ、Ｈａｎａ  Ｐｈａｒｍ．Ｃｏ．、Ｈｗａｓｕｎｇ、Ｋｏｒｅａ）と７０％のＮ２Ｏ及び２８．５％のＯ２混合ガスで全身吸入麻酔し、左側切歯の歯牙境部に３−０ナイロン縫合糸を用いて結紮を施して歯周炎及び歯肉疾患を誘発した。一方、正常媒体対照群では、切歯の歯牙境部の部分のみを確認した後、結紮しなかった。
【０１１０】
［歯肉組織内のＩＬ−１β変化確認］
１１日間ＥＰＤを施した歯肉組織を均質化した後、ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（ＩＬ−１β  ｒａｔ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を用いて測定した。試験方法は、製造社の方法にしたがって行い、均質化したサンプルと標準品１００ｕＬを各ウェル（ｗｅｌｌ）に添加した後、３７℃培養器で２時間培養した。培養後に上澄液を除去し、各ウェルに１Ｘｂｉｏｔｉｎで標識された抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）を各１００ｕＬずつ入れた後、３７℃培養器で１時間培養した。各ウェルの上澄液を除去して３回洗浄した後、１００ｕＬの１Ｘｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｖｉｄｉｎを入れた後、３７℃で１時間培養した。各ウェルに、３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジンを９０ｕＬ入れた後、３７℃で１５〜３０分間培養した。各ウェルに停止液（ｓｔｏｐ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を５０ｕＬずつ入れた後、マイクロプレートリーダー（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ、Ｔｅｃａｎ、Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で４５０ｎｍの波長で吸光度を測定して結果値を計算した。
【０１１１】
［歯槽骨量の変化確認］
歯槽骨消失量の測定は、Ｃｒａｗｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．［１９８７］の方法によって測定し、サンプル投与１０日後（ＥＰＤ１１日後）ラットを犠牲させた後、歯牙と歯ぐきを最大限に摘出した。ＥＰＤを施した二つの歯牙の間の歯ぐきの端部と、切歯（ｉｎｃｉｓｏｒ）の端部、即ち、歯ぐきの外に露出した歯牙の最下端部とを平行にして面積を計算してｍｍ／ｒａｔｓで表した。
【０１１２】
［２．１．１．１．歯周疾患誘導モデルにおける１４種の天然物抽出物に対する歯肉組織内のＩＬ−１β含量変化の確認による歯肉炎及び歯周炎の改善効果確認（図１）］
ＥＰＤ対照群の場合、正常媒体対照群に比べて有意味な（ｐ＜０．０１）歯肉組織内ＩＬ−１β含量の増加が認められたが、ＩＮＤ、モリンガ葉、黄ごん、レッドクローバー、牛膝、梔子、杜仲、蒲公英根、ザクロ、蒲公英、生姜、及び桔梗抽出物の投与群順にＥＰＤ対照群に比べて有意味な（ｐ＜０．０１）ＩＬ−１β含量の減少が各々認められた。一方、蓮の葉、ハリグワの葉及び芍薬抽出物投与群においては、ＥＰＤ対照群に比べて有意味な歯肉組織内ＩＬ−１β含量の変化は認められなかった。
【０１１３】
［２．１．１．２．歯周疾患誘導モデルにおける１４種の天然物抽出物に対する歯槽骨量変化の確認による歯肉炎及び歯周炎の改善効果確認（図２）］
ＥＰＤ対照群の場合、正常媒体対照群に比べて有意味な（ｐ＜０．０１）歯槽骨量の減少が認められたが、ＩＮＤ、レッドクローバー、杜仲、モリンガ葉、牛膝及び梔子抽出物の投与群順にＥＰＤ対照群に比べて有意味な（ｐ＜０．０１またはｐ＜０．０５）歯槽骨量の増加が認められた。一方、ザクロ、桔梗、黄ごん、蓮の葉、ハリグワの葉、生姜、芍薬、蒲公英及び蒲公英根の投与群においては、ＥＰＤ対照群に比べて有意味な歯槽骨量の変化は認められなかった。
【０１１４】
［２．１．２．動物実験によるモリンガ葉抽出物（ＭＦ）、杜仲抽出物（ＥＣ）及びこれらの複合物に対する効能評価］
現在、代表的な歯肉炎及び歯周炎改善モデルに用いられている歯牙境部結紮ラット歯周疾患（ＥＰＤ）を用いて、９種のモリンガ葉抽出物（ＭＦ）及び杜仲抽出物（ＥＣ）の複合組成物（ＭＦ：ＥＣ＝１：１、１：２、１：４、１：６、１：８、２：１、４：１、６：１及び８：１複合組成、ｍｇ：ｍｇ）を各々滅菌蒸留水に溶解し、５ｍｌ／ｋｇの用量（２００ｍｇ／ｋｇ）で毎日１回ずつ１０日間強制で経口投与し、体重、歯槽骨損失率（ａｌｖｅｏｌａｒ  ｂｏｎｅ  ｌｏｓｓ  ｉｎｄｅｘ）、口腔組織内の好気性生菌水、歯肉内ＩＬ−１β及び腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ；ＴＮＦ）−αの含量、脂質過酸化（ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ；ＭＤＡ含量）、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ；ｉＮＯＳ）及びミエロペルオキシダーゼ（ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＭＰＯ）活性の変化を組織病理学的変化とともに観察した。本実験では、以前の報告に準して［Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２０１６］、各々のＭＦ及びＥＣ単独組成物と比較して、同時に統計学的に有意味な（ｐ＜０．０１またはｐ＜０．０５）薬効上昇を示す複合組成物を、相乗効果を示すＭＦ：ＥＣ複合組成物として認め、ｎｏｎ−ｓｔｅｒｏｉｄ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｒｕｇｓ（ＮＳＡＩＤｓ系抗炎症剤であるインドメタシン（ＩＮＤ）５ｍｇ／ｋｇを経口投与群と各々比較評価した。
【０１１５】
【表１】
0006929954.tif 000002
【０１１６】
［実験物質の組成及び投与］
適正量のＭＦまたはＥＣを滅菌蒸留水に直接溶解し、５ｍｌ／ｋｇの用量で歯牙境部結紮２４時間後から、毎日１回ずつ１０日間強制で経口投与した。即ち、ＭＦ及びＥＣ単独組成物においては、各々４０ｍｇ／ｍｌの濃度で滅菌蒸留水に溶解し、５ｍｌ／ｋｇ（２００ｍｇ／ｋｇ）の用量で経口投与し、ＭＦ：ＥＣの１：１、１：２、１：４、１：６、１：８、２：１、４：１、６：１及び８：１複合組成物においては、５ｍｌの蒸留水にＭＦ及びＥＣ各々を１００：１００、６６：１３４、４０：１６０、２８：１７２、２２：１７８、１３４：６６、１６０：４０、１７２：２８及び１７８：２２ｍｇ：ｍｇずつ溶解し、５ｍｌ／ｋｇ（総量２００ｍｇ／ｋｇ）の用量で各々経口投与した。ＩＮＤも１ｍｇ／ｍｌの濃度で滅菌蒸留水に溶解し、５ｍｌ／ｋｇの用量（５ｍｇ／ｋｇ）で歯牙境部結紮２４時間後から毎日１回ずつ１０日間経口投与し、正常媒体対照群及びＥＰＤ対照群においては、同一の投与ストレスを加えるために、天然物抽出物またはＩＮＤの代わりに、媒体である滅菌蒸留水のみを同一用量及び頻度で経口投与した。
【０１１７】
［歯周疾患誘発］
本研究者などの以前の方法［Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１４；  Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．、２０１６］に従って、実験動物を１０日間実験室の環境に順化させた後、げっ歯類用吸入麻酔器（Ｓｕｒｇｉｖｅｔ、Ｗａｕｋｅｓｈａ、ＷＩ、ＵＳＡ）と換気装置（Ｍｏｄｅｌ  ６８７、Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を用いて３％のイソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ、Ｈａｎａ  Ｐｈａｒｍ．Ｃｏ．、Ｈｗａｓｕｎｇ、Ｋｏｒｅａ）と７０％のＮ２Ｏ及び２８．５％のＯ２混合ガスで全身吸入麻酔し、左側切歯の歯牙境部に３−０ナイロン縫合糸を用いて結紮を施して歯周炎及び歯肉疾患を誘発した。一方、正常媒体対照群では、切歯の歯牙境部の部分のみを確認した後、結紮しなかった。
【０１１８】
［増体量の確認方法］
増体量を測定するために実験期間における体重変化を電子はかりによって測定した。歯牙結紮１日後、試料投与初日の体重を測定し、１０日後、最終サンプル投与日の体重を測定して増体量を測定した。
【０１１９】
増体量＝犠牲させた日の体重−サンプル投与開始時点における体重（結紮後２４時間後）
［歯肉組織内のＩＬ−１βとＴＮＦ−αの変化確認］
１１日間ＥＰＤを施した歯肉組織を均質化した後、ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（ＩＬ−１β  ｒａｔ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を用いて測定した。試験方法は、製造社の方法にしたがって行い、均質化したサンプルと標準品１００ｕＬを各ウェルに添加した後、３７℃培養器で２時間培養した。培養後に上澄液を除去し、各ウェルに１Ｘｂｉｏｔｉｎで標識された抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）を各１００ｕＬずつ入れた後、３７℃培養器で２時間培養した。培養後、上澄液を除去し、各ウェルに１Ｘｂｉｏｔｉｎで標識された抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）を各１００ｕＬずつ入れた後、３７℃培養器で１時間培養した。各ウェルの上澄液を除去して３回洗浄した後、１００ｕＬの１Ｘｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｖｉｄｉｎを入れた後、３７℃で１時間培養した。各ウェルに、３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジンを９０ｕＬ入れた後、３７℃で１５〜３０分間培養した。各ウェルに停止液（ｓｔｏｐ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を５０ｕＬずつ入れた後、マイクロプレートリーダー（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ、Ｔｅｃａｎ、Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で４５０ｎｍの波長で吸光度を測定して結果値を計算した。
【０１２０】
［ＭＤＡ含量確認方法］
脂質過酸化指標であるＭＤＡを測定するために、歯牙の結紮部位と接触している歯肉組織を切り取った後、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（ｐＨ７．４）バッファー（ｂｕｆｆｅｒ）に入れてホモジナイザーによって均質化した。１００ｕｌの均質化した歯肉組織に、２００ｕＬの反応混合物（８．１％（ｗ／ｖ）のドデシル硫酸ナトリウム、１５００ｕｌの２０％（ｖ／ｖ）の酢酸、１５００ｕｌの０．８％（ｗ／ｖ）のチオバルビツール酸、７００ｕｌのＤＷ）を添加する。９５℃で１時間反応させた後、３０００Ｘｇで１０分間遠心分離した後、上澄液をＵＶ／分光光度計を用いて６５０ｎｍで測定する。
【０１２１】
［破骨細胞数の測定方法］
破骨細胞数の測定は、ＴＲＡＰ染色によってＴＲＡＰ陽性多核細胞の数を数えて評価した。ＴＲＡＰ染色は、ＴＲＡＰ染色キット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を用いてキットに記載の染色過程を守って施した。脱パラフィンと水和過程を経たスライドを固定液（クエン酸塩溶液２５ｍｌ、アセトン６５ｍｌ、３７％のホルムアルデヒド８ｍｌ）に３０秒間浸漬した後、流れる水に１０分間水洗した。３７℃の蒸留水４５ｍｌ、ファストガーネットＧＢＣ溶液０．５ｍｌ、亜硝酸ナトリウム溶液０．５ｍｌ、ナフトールＡＳ−ＢＩ  ０．５ｍｌ、アセテート溶液２ｍｌ、酒石酸塩溶液１ｍｌを混合した溶液をスライドガラスに滴下した後、平均１６時間程度、３７℃のヒューミッドチャンバーで反応させた。その後、１００％のアルコールに水洗し、対照染色のために１時間の間メチルグリーンで染色して封入した。光学顕微鏡を用いて歯槽骨の表面に沿って形成されたＴＲＡＰ陽性多核の破骨細胞（核３つ以上）の数を測定した。
【０１２２】
［歯槽骨量の変化確認］
歯槽骨消失量の測定は、Ｃｒａｗｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．［１９８７］の方法によって測定し、サンプル投与１０日後（ＥＰＤ１１日後）ラットを犠牲させた後、歯牙と歯ぐきを最大限に摘出する。ＥＰＤを施行した二つの歯牙の間の歯ぐきの端部と、切歯の端部、即ち、歯ぐきの外に露出した歯牙の最下端部とを平行にして面積を計算してｍｍ／ｒａｔｓで表した。
【０１２３】
［好気性生菌数の変化測定方法］
好気性生菌数の測定のために結紮した左側切歯を抜いた後、結紮部と接触していた歯周組織を切り取った後、０．３ｍｌのブレインハートインフュージョン培地（ＢＨＩ、Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｎｓｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｎｙ、ＵＳＡ）に盛る。組織を均質化した後、１：１００、そして１：１０００の割合で希釈して血液寒天培地（ｂｌｏｏｄ  ａｇａｒ）に接種して３７℃で４８時間５％のＣＯ２条件で培養した後、コロニー数を測定して生菌数を計算した。
生菌数＝コロニー数×１０５ＣＦＵ／ｇ  ｔｉｓｓｕｅｓ
【０１２４】
［２．１．２．１．歯周疾患誘導モデルにおける体重変化（図３）］
ＥＰＤ対照群の場合、正常媒体対照群に比べて有意味な（ｐ＜０．０５）体重の減少が、結紮後７日（投与開始後６日）後から認められ始め、１０日間の投与期間における増体量も、正常媒体対照群に比べて有意味な（ｐ＜０．０１）減少を示した。一方、ＭＦ及びＥＣ単独組成物、ＭＦ：ＥＣが１：１及び８：１である複合組成物投与群においては、ＥＰＤ対照群に比べて有意味な（ｐ＜０．０１またはｐ＜０．０５）体重の増加が投与開始８日後から認められ、ＭＦ：ＥＣが４：１及び６：１である複合組成物投与群においては投与開始６日後から、ＭＦ：ＥＣが１：２、１：４及び２：１である複合組成物投与群においては投与開始７日後から、ＭＦ：ＥＣが１：６及び１：８である複合組成物投与群においては投与開始９日及び１０日後から、ＥＰＤ対照群に比べて有意味な（ｐ＜０．０１またはｐ＜０．０５）体重の増加が各々認められ、全てのＭＦとＥＣ単独及び複合組成物投与群においては、ＥＰＤ対照群に比べて有意味な（ｐ＜０．０１）増体量の増加が各々認められた。
【０１２５】
［２．１．２．２．歯周疾患誘導モデルにおける歯肉組織内のＩＬ−１β含量変化の確認による歯肉炎及び歯周炎の改善効果確認（図４）］
ＥＰＤ対照群の場合、正常媒体対照群に比べて有意味な（ｐ＜０．０１）歯肉組織内ＩＬ−１β含量の増加が認められたが、ＥＣ単独組成物２００ｍｇ／ｋｇ投与群を含む全ての実験物質投与群においてはＥＰＤ対照群に比べて有意味な（ｐ＜０．０１）ＩＬ−１β含量の減少が各々認められ、特に、ＭＦ：ＥＣが２：１及び４：１である複合組成物投与群においては、各々のＭＦ及びＥＣ単独組成物投与群に比べても有意味な（ｐ＜０．０１またはｐ＜０．０５）歯肉組織内ＩＬ−１β含量の減少が同順に認められた。
【０１２６】
［２．１．２．３．歯周疾患誘導モデルにおける歯肉組織内のＴＮＦ−α含量変化の確認による歯肉炎及び歯周炎の改善効果確認（図５）］
ＥＰＤ対照群の場合、正常媒体対照群に比べて有意味な（ｐ＜０．０１）歯肉組織内ＴＮＦ−α含量の増加が認められたが、ＭＦ：ＥＣ  １：１の複合組成物２００ｍｇ／ｋｇ投与群を含む全ての実験物質投与群においては、ＥＰＤ  対照群に比べて有意味な（ｐ＜０．０１）ＴＮＦ−α含量の減少が各々認められ、特に、ＭＦ：ＥＣが２：１及び４：１である複合組成物投与群においては、各々のＭＦ及びＥＣ単独組成物投与群に比べても有意味な（ｐ＜０．０１またはｐ＜０．０５）歯肉組織内ＴＮＦ−α含量の減少が同順に認められた。
【０１２７】
［２．１．２．４．歯周疾患誘導モデルにおける歯肉組織内のＭＤＡ含量変化の確認を通じた抗酸化による歯肉炎及び歯周炎の改善効果確認（図６）］
ＥＰＤ対照群の場合、正常媒体対照群に比べて有意味な（ｐ＜０．０１）歯肉組織内ＭＤＡ含量の増加が認められたが、ＭＦ：ＥＣが１：２である複合組成物２００ｍｇ／ｋｇ投与群を含む全ての実験物質投与群においては、ＥＰＤ対照群に比べて有意味な（ｐ＜０．０１）ＭＤＡ含量の減少が各々認められ、特に、ＭＦ：ＥＣが２：１及び４：１である複合組成物投与群においては、各々のＭＦ及びＥＣ単独組成物投与群に比べても有意味な（ｐ＜０．０１またはｐ＜０．０５）歯肉組織内ＭＤＡ含量の減少が同順に認められた。
【０１２８】
［２．１．２．５．歯周疾患誘導モデルにおける歯槽骨内の破骨細胞数の測定による歯肉炎及び歯周炎の改善効果確認（図７）］
破骨細胞数は、ＥＰＤ対照群においては、正常媒体対照群に比べて７１５．６３％の変化を示したが、ＩＮＤ、ＭＦ及びＥＣ単独組成物、ＭＦ：ＥＣが、１：１、１：２、１：４、１：６、１：８、２：１、４：１、６：１及び８：１である複合組成物２００ｍｇ／ｋｇ投与群においては、各々ＥＰＤ対照群に比べて、−５０．１９、−３４．４８、−４３．６８、−３６．４０、−４３．３０、−４１．００、−３５．６３、−３４．８７、−６３．２２、−５７．０９、−４１．７６及び−３４．４８％の変化を示した。
【０１２９】
［２．１．２．６．歯周疾患誘導モデルにおける歯槽骨量の変化測定による歯肉炎及び歯周炎の改善効果確認（図８）］
ＥＰＤ対照群の場合、正常媒体対照群に比べて有意味な（ｐ＜０．０１）歯槽骨量の減少が認められたが、ＭＦ：ＥＣが６：１である複合組成物２００ｍｇ／ｋｇ投与群を含む全ての実験物質投与群においては、ＥＰＤ対照群に比べて有意味な（ｐ＜０．０１）歯槽骨量の増加が認められ、特に、ＭＦ：ＥＣが２：１及び４：１である複合組成物投与群においては、各々のＭＦ及びＥＣ単独組成物投与群に比べても有意味な（ｐ＜０．０１またはｐ＜０．０５）歯槽骨量の増加が同順に認められた。
【０１３０】
［２．１．２．７．歯周疾患誘導モデルにおける口腔内頬側溝部の総好気性生菌数の変化測定を通じた抗菌による歯肉炎及び歯周炎の改善効果確認（図９）］
ＥＰＤ対照群の場合、正常媒体対照群に比べて有意味な（ｐ＜０．０１）口腔内頬側溝部の総好気性生菌数の増加が認められたが、ＥＰＤ対照群と類似な生菌数を示したＩＮＤ  ５ｍｇ／ｋｇ投与群を除いた全ての実験物質投与群においては、ＥＰＤ対照群に比べて有意味な（ｐ＜０．０１）口腔内生菌数の減少が各々認められ、特に、ＭＦ：ＥＣが２：１及び４：１である複合組成物投与群においては、各々のＭＦ及びＥＣ単独組成物投与群に比べても有意味な（ｐ＜０．０１またはｐ＜０．０５）口腔内頬側溝部の総好気性生菌数の減少が同順に認められた。
【図１】
0006929954.tif 000003
【図２】
0006929954.tif 000004
【図３】
0006929954.tif 000005
【図４】
0006929954.tif 000006
【図５】
0006929954.tif 000007
【図６】
0006929954.tif 000008
【図７】
0006929954.tif 000009
【図８】
0006929954.tif 000010
【図９】
0006929954.tif 000011