(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
成長中にヌクレアーゼ酵素を産生する微生物をリアルタイムでモニタリングし、迅速に同定する方法であって、以下のステップを含むことを特徴とする。
‐  DNA／RNA分子の一方の末端に蛍光発生分子（フルオロフォア）を結合し、もう一方の末端に蛍光消光（クエンチャー）分子を結合すること、
‐  前記蛍光発生分子及び前記蛍光消光分子を有する前記DNA／RNA分子を含む溶液を調製し、成長培地へ前記溶液を添加すること、
‐  前記蛍光発生分子及び前記蛍光消光分子を有する前記DNA／RNA分子を含む前記溶液から成る前記成長培地に、同定する前記微生物を播種すること、そして、
‐  光学装置を用いて微生物の前記成長中に前記成長培地中の蛍光シグナルをモニタリングすること。
【請求項２】
成長中にヌクレアーゼ酵素を産生する微生物をリアルタイムでモニタリングし、迅速に同定するために、請求項１による方法を実行するため使用するように構成されたキットであって、以下のものからなることを特徴とする。
・  適切な生理学的ｐＨ値を有し、蛍光発生分子及び蛍光消光分子を有する前記DNA／RNA分子を含む前記溶液から成る前記成長培地、
・  蛍光研究に適したチューブ及び／或いはプレート、
・  微生物の前記成長に使用される振盪または非振盪インキュベーター、
・  前記微生物の播種後、微生物の前記成長中に発生する可能性が高い前記蛍光シグナルを検出及び評価するための光学装置、
・  前記蛍光シグナルの評価用のソフトウェアを備えた装置。
【請求項３】
成長中にヌクレアーゼ酵素を産生する微生物をリアルタイムでモニタリングし、迅速に同定するためのキットであって、以下のものからなることを特徴とする。
・  適切な生理学的ｐＨ値を有し、蛍光発生分子及び蛍光消光分子を有するDNA／RNA分子を含む溶液から成る成長培地、
・  蛍光研究に適したチューブ及び／或いはプレート、
・  微生物の前記成長に使用される振盪または非振盪インキュベーター、
・  前記微生物の播種後、微生物の前記成長中に発生する可能性が高い蛍光シグナルを検出及び評価するための光学装置、
・  前記蛍光シグナルの評価用のソフトウェアを備えた装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヌクレアーゼ酵素を産生する微生物の迅速な同定方法に関する。本発明は、より詳細には、クエンチされたDNA／RNA分子（フルオロフォア及びクエンチャー標識DNA／RNA分子）またはDNA／RNA分子上に蓄積された金ナノ粒子を用いて、ヌクレアーゼ酵素を産生する微生物を迅速に同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、ヌクレアーゼ酵素（DNAse及びRNAse）の同定は、通常、重要なマーカーとして使用されている。
【０００３】
そのために、微生物をDNAを含む寒天培地で増殖させ、そして1N HClを増殖させた培養液に加え、培地の非透明性を考慮して同定を行うことができる。その実験は、約18〜24時間で実行できる。この期間を短くするためには、デヴラン・ゲルチェケル等は従来の方法とは異なる方法、いわゆるDNAse試験管法を開発した。これによって、DNA含有液体培地で成長した生物がヌクレアーゼ酵素を産生するかどうかは、培養後のアガロースゲル画像に基づいて決定される。したがって、細菌の存在を迅速に同定できると主張されている（1）。ただし、ここでは、かなり不便であるゲルランニングプロセスが二次プロセスとしてこの方法に追加されるため、多くの患者サンプルと取り込む間にシステムを簡単に適用できないことは避けられない。
【０００４】
最先端技術の範囲内で2011年8月25日に出願されたCN102321759号の中国特許出願では、S1ヌクレアーゼの活性を検出するために「分子ビーコン」技術が採用されている。
【０００５】
最先端技術の範囲内で2002年12月23日に出願されたメキシコ特許出願番号MXPA05006448号では、RNAを切断するヌクレアーゼの活性を検出するために「分子ビーコン」技術が採用されている。
【０００６】
最先端技術の範囲内で1986年9月26日に出願された米国特許出願第4719097号は一方、ホスファターゼ酵素活性を検出しながらレゾルフィン分子を使用することを開示している。
【０００７】
最先端技術の範囲内で1998年9月25日に出願されたドイツ特許出願DE19843873号では、プロテアーゼ酵素活性の検出にローダミン110分子を使用する方法が開発された。
【０００８】
最先端技術の範囲内で1998年9月25日に出願された特許出願番号WO2014207515号では、クエンチャー分子の必要性を排除してヌクレアーゼ活性を検出できる方法が開発された。
【０００９】
最先端技術の範囲内で2010年5月31日に出願されたCN101871008号の中国特許出願は、真菌酸ヌクレアーゼの同定に使用するためのゲル形態の化学物質の開発を開示している。の化学物質のｐＨは、液体の場合、5〜6であり、DNA／RNA、亜鉛、カルシウム、トルエンブルー、寒天を含んでいる。この化学物質を使用して真菌が産生するヌクレアーゼを同定する方法が開示されている。
【００１０】
前述の文書は、内容及び方法の点で、本発明による「ヌクレアーゼ酵素を産生する微生物の迅速な同定方法」とは異なる。
【００１１】
最先端技術の範囲内で2001年9月28日に出願された米国特許出願第US2003108873号は配列特異性に基づいた微生物由来の５ 'ヌクレアーゼ及び３'エキソヌクレアーゼの同定に関する。この方法は、サンプル中の細菌またはウイルス性疾患の同定及び検出に使用できる。特に、この方法は、前者が配列に特異的であるという点で、したがって、最初に核酸配列を検出することが必要であること、そして使用目的と方法で本発明による「ヌクレアーゼ酵素を産生する微生物の迅速な同定方法」とは異なる。
【００１２】
最先端技術の範囲内で2015年3月15日に出願された米国特許出願番号US2015211044号は、酵素または微生物を検出するために開発された方法に関する。この方法では、微生物が最初に濃縮された後、発色基質または蛍光発生基質を含む溶液に置かれる。酵素が存在する場合、それは発色団または発蛍光団に結合される。したがって、前記発明では、微生物は基質を含む溶液中に濃縮され、維持される必要がある。ただし、本発明による「ヌクレアーゼ酵素を産生する微生物の迅速な同定方法」では、蛍光基質を培地に直接添加し、培地条件で効率的に機能する酵素の原理を利用する。したがって、微生物は、酵素の存在に基づいて、その成長中に同定することができる。結果として、本発明は、微生物の数の決定だけでなく、殺菌化学物質に対する耐性の検出も可能にするという点で、前述の文書とは異なる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
ヌクレアーゼを産生する微生物の同定方法でのクエンチされたDNA／RNA分子（フルオロフォア及びクエンチャー標識DNA／RNA分子）及びDNA／RNA分子に蓄積された金ナノ粒子の使用の欠如は、本発明によるヌクレアーゼ酵素を産生する微生物の迅速な同定方法の開発を必要とする。
【発明の目的及び概要】
【００１４】
本発明の目的は、細菌密度に応じて、数分で表される短時間でヌクレアーゼ酵素産生微生物を迅速に同定する方法を提供することである。
【００１５】
本発明の別の目的は 、微生物培地に適切な生理学的ｐＨ値を有し、一方の末端に蛍光発生的分子が存在する、また他の末端に蛍光クエンチ分子が存在して、前記の分子は互いに結合しているDNA／RNA を含む微生物を加えることによりヌクレアーゼ酵素を産生する微生物を迅速に同定する方法を提供することである。
【００１６】
本発明の別の目的は、DNA／RNA分子は負に帯電したままの間に金粒子が正に帯電したままになるように適切なｐＨ値でチューブまたはプレートに存在する液体に微生物を播種することによりヌクレアーゼ酵素を産生する微生物を迅速に同定する方法を提供することである。
【００１７】
そして、本発明の別の目的は、リアルタイムのモニタリングが可能のヌクレアーゼ酵素を生産する微生物の迅速な同定方法を提供することである。
【００１８】
本発明は、ヌクレアーゼ酵素を産生し、ヌクレアーゼ酵素を産生しない微生物を分離するために使用される迅速な同定方法に関する。この方法では、２種類の内容物を使用できる。そして、これらは以下のとおりである。
【００１９】
‐  クエンチされたDNA／RNA分子（フルオロフォアとクエンチャー標識DNA／RNA分子）を含む液体または固体の微生物培地に微生物を播種する。この内容でヌクレアーゼ酵素を産生する生物は、培地で観察される可能性が高い蛍光によって検出される。
‐  金ナノ粒子とDNA／RNA分子を含む液体に微生物を播種する。一方、この内容では、ヌクレアーゼ酵素を生成する生物は、液体で観察される可能性が高い変色によって検出される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】化膿連鎖球菌の複製依存性の変化曲線を示す図である。
【図２】黄色ブドウ球菌の蛍光変化曲線を示す図である。
【図３】黄色ブドウ球菌の蛍光変化曲線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明によるヌクレアーゼ酵素を産生する微生物の迅速な同定方法は、図面に示されている。
【００２２】
図１は、化膿連鎖球菌の複製依存性の変化曲線であり、これはヌクレアーゼ酵素を産生する生物である。
【００２３】
図２は、黄色ブドウ球菌の蛍光変化曲線であり、これは、ヌクレアーゼ酵素を産生する生物であり、ヌクレアーゼ酵素を産生しない他の微生物の繁殖に依存しているのである。
【００２４】
図３は、黄色ブドウ球菌の蛍光変化曲線である。黄色ブドウ球菌は、異なる初期濃度での複製に依存して、ヌクレアーゼ酵素を産生する生物である。
【００２５】
本発明は、成長中にヌクレアーゼ酵素を産生する微生物をリアルタイムでモニタリングし、迅速に同定する方法であって、以下のステップを含む：
‐  DNA／RNA分子の一方の末端に蛍光発生分子（フルオロフォア）を結合し、もう一方の末端に蛍光消光（クエンチャー）分子を結合すること、
‐  前記蛍光発生分子及び前記蛍光消光分子を有する前記DNA／RNA分子を含む溶液を調製し、成長培地へ前記溶液を添加すること、
‐  前記蛍光発生分子及び前記蛍光消光分子を有する前記DNA／RNA分子を含む前記溶液から成る前記成長培地に、同定する微生物を播種すること、そして、
‐  光学装置を用いて微生物の前記成長中に前記成長培地中の蛍光シグナルをモニタリングすること。
【００２６】
本発明は、ヌクレアーゼ酵素を産生する微生物の迅速な同定のための方法であり、以下のステップを含む：
‐  正に帯電した（正の）金ナノ粒子と負に帯電した（負の）DNA／RNA分子で構成される溶液を調製すること、
‐  このように調製された溶液に同定される微生物を追加すること、そして、
‐  溶液に発生する可能性のある変色を監視することである。
【００２７】
本発明は、適切な生理学的ｐＨ値を有し、クエンチされたDNA／RNA（フルオロフォア及びクエンチャー標識DNA／RNA）分子が存在する培地を含むキットを使用して、ヌクレアーゼ酵素を産生する微生物を迅速に同定する方法である。
【００２８】
本発明は、適切な生理学的ｐＨ値を有し、クエンチされたDNA／RNA（フルオロフォア及びクエンチャー標識DNA／RNA）分子が存在する培地を含むキット、蛍光研究に適したチューブ及び／或いはプレート、微生物の増殖に使用される振盪または非振盪インキュベーター、微生物の播種後に発生する可能性が高い蛍光シグナルを検出及び評価するための光学装置、そして、シグナルの評価用のソフトウェアを備えた装置が使用されるヌクレアーゼ酵素を産生する微生物の迅速な同定のための方法である。
【００２９】
本発明は、正に帯電した金ナノ粒子及び負に帯電したDNA／RNA分子からなり、適切なｐＨ値を有する溶液を含むキットが使用される、ヌクレアーゼ酵素を産生する微生物の迅速な同定方法である。
【００３０】
本発明は、正に帯電した金ナノ粒子及び負に帯電したDNA／RNA分子からなり、適切なｐＨ値を有する溶液を含むキット、変色に適したチューブ及び／或いはプレート、微生物の播種後に生じる変色に関連する吸収シグナルを検知及び評価する光学装置、また、シグナルの評価に使用されるソフトウェアを備えた装置が使用されるヌクレアーゼ酵素を産生する微生物を迅速に同定する方法である。
【００３１】
本発明による方法の実施形態では、一方の末端がフルオロフォア分子で、他の末端にクエンチャー分子で標識されているDNA／RNA分子を含む適切な生理学的ｐＨ値を有する微生物培地に微生物が播種されていない場合、蛍光シグナルは低い。
【００３２】
ヌクレアーゼ酵素を生産する微生物の迅速な同定のために、そのような微生物は、適切な生理学的ｐＨ値を有し、一方の末端がフルオロフォア分子で、他方がクエンチャー分子で標識されたDNA／RNA分子を含む微生物培地に播種される。微生物がヌクレアーゼ酵素を産生する場合、そんな微生物のヌクレアーゼ酵素はDNA／RNA分子を切断する。したがって、クエンチャー分子とフルオロフォア分子は互いに離れている。そしてまた、蛍光シグナルの増加が観察される。シグナルのこの変化は、ヌクレアーゼ酵素の存在と、したがってヌクレアーゼ酵素を産生できる微生物の存在と直接関連しているため、酵素産生及び／或いは細菌密度に依存するそのような微生物の同定は短時間で行うことができる、例えば１０分から８時間。
【００３３】
微生物がヌクレアーゼ酵素を産生しない場合、DNA／RNA分子の切断がないため、蛍光シグナルの変化は観察されない。
【００３４】
この蛍光ベースの方法は迅速であるだけでなく、リアルタイムの監視を可能にする。これにより、ヌクレアーゼ酵素を生産する微生物の定性的（存在／不在）同定及び定量（細菌数）同定を実行できる（図１、図２及び図３）。
【００３５】
繰り返すが、この蛍光を基本とする方法は、細菌数を測定できるため、ヌクレアーゼ酵素を産生する微生物の最低殺菌（抗生物質／抗真菌性物質）濃度が検出される実験でも使用できる。
【００３６】
本発明による方法において、溶液中の蛍光シグナルのモニタリングは光学装置によって行われる。シグナルはソフトウェアによって変換及び分析される。
【００３７】
本発明による方法の別の実施形態では、金ナノ粒子及びDNA／RNA分子は、金ナノ粒子及びDNA／RNA分子を含み、特定のｐＨ値を有する液体中に、それぞれ正に帯電した状態及び負に帯電した状態で存在する。この場合、負に帯電したDNA／RNA分子と正に帯電した金ナノ粒子の間で電荷の相互作用が起こる。そのような相互作用の結果として、金ナノ粒子がDNA／RNA分子に蓄積し、溶液の色が赤から青に変わる。
【００３８】
DNA／RNA分子の存在下で青色になった溶液は、その中に置かれ、ヌクレアーゼ酵素を産生できる微生物 の存在下で DNA／RNA分子のヌクレアーゼ酵素 により切断されるため、蓄積された金ナノ粒子が溶液に再び分散され、溶液の色が再び赤色になる。この目に見える変化は、ヌクレアーゼ酵素を産生する微生物の迅速な同定に利用できる。
【００３９】
変色には、金ナノ粒子の他の発色化学物質、例えばHMRZ-86（（7R）-7- [2-（アミノチアゾールl-4-1）-（z）-2-（1-カルボキシ 1-メチルエトキシイミノ）アセトアミド] -3-（2,4-ジニトロスチリル1）-3-セフェム-4-カルボン酸トリフルオロ酢酸、E-異性体）は必要ではない。
【００４０】
参考文献
(1) Gerceker D, Karasartova D, Elyurek E, Barkar S, Kiyan M, Ozsan TM, Calgin MK, Sahin F. 2009. A new, simple, rapid test for detection of DNase activity of microorganisms: DNase Tube test. J Gen Appl Microbiol. 55 (4): 291-4. 
【図１】
0006909305.tif 000002
【図２】
0006909305.tif 000003
【図３】
0006909305.tif 000004