(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
高濃度と低濃度の核酸標的とを同時に含む核酸試料に対してデジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）とリアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）とを同時に実行して前記核酸標的に対する核酸分子のコピー数を測定するデジタル定量的ＰＣＲ（ｄｑＰＣＲ）測定方法であって、
複数の反応ウェルを有する試験板を設け前記核酸試料を収納し、
全ての前記反応ウェルが前記核酸標的に対する陽性反応を示す場合には、前記リアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）に基づいて、
全ての前記反応ウェルが前記核酸標的に対する陽性反応を示すわけではない場合には、前記デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）に基づいて、前記核酸標的に対する前記コピー数を測定することを特徴とする測定方法。
【請求項２】
前記デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）によって前記低濃度の核酸標的のコピー数を直接定量化し、前記リアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって前記高濃度の核酸標的のＣｑ値を検出した後、前記核酸試料中の前記高濃度の核酸標的のコピー数を求めるために変換ステップを実行すること、
を含む、請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
前記リアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）反応曲線によってＰＣＲ効率を求め、
前記ＰＣＲ効率に１を足して基数とし、
前記低濃度の核酸標的のＣｑ値から前記高濃度の核酸標的のＣｑ値を引いてΔＣｑを求めて指数とし、
前記基数及び前記指数をべき乗演算に用いて各反応ウェルの核酸標的のコピー数を求め、
各反応ウェルの前記核酸標的のコピー数に前記デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）における前記反応ウェルの数を乗じて、前記高濃度核酸標的の総コピー数を求めること、
を含む前記変換ステップを実行する、請求項２に記載の測定方法。
【請求項４】
前記デジタル定量的ＰＣＲ（ｄｑＰＣＲ）が６４個以上の反応ウェルを使用して行われる、請求項２に記載の測定方法。
【請求項５】
前記デジタル定量的ＰＣＲ（ｄｑＰＣＲ）が６４〜２００００個の反応ウェルを使用して行われる、請求項４に記載の測定方法。
【請求項６】
前記変換ステップの後、ダイナミックレンジを９ログまで増大させる請求項２に記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸試料のデジタル定量的ＰＣＲ測定方法に係り、より具体的には、幅広いバリエーションの異なる濃度範囲を有する複数の核酸標的を有する被験核酸試料に適した測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
既存のデジタルＰＣＲの利点は、実験的検出において検量線法を行うことなく試料濃度を直接測定できることである。しかしながら、実際的適用では使用上不便であるという欠点が存在する。なぜなら、デジタルＰＣＲは主にポアソン分布を利用して試料濃度を推定し、試料濃度は全ての検出反応ウェルが陽性反応を示すほど高すぎてはならないからである。つまり、デジタルＰＣＲによる試料濃度の良好な測定を期待する場合、試料濃度をある程度低く保つ必要があり、試料を全ての検出反応ウェルに分配してはならない。このように、濃度が未知の試料に直面したとき、最初に事前定量化及び希釈を行う他の方法を用いる必要がある。結果として、試料濃度はデジタルＰＣＲに適用可能な濃度範囲内に収まり、デジタルＰＣＲによって試料濃度が良好に測定される。したがって、検出のダイナミックレンジ及び操作上の利便性が共に制限される。
【０００３】
一般に、被験核酸試料中の核酸標的は広い濃度範囲を有することがあり、この現象は臨床試料で特によく見られる。核酸試料中に高濃度の核酸標的及び低濃度の核酸標的が同時に示される場合、デジタルＰＣＲ測定のために核酸試料を希釈する必要がある。結果として、高濃度の核酸標的はデジタルＰＣＲに適用可能な濃度範囲内に収まり、その結果、高濃度の核酸標的をデジタルＰＣＲによって測定することができる。しかしながら、核酸試料の希釈中に、高濃度の核酸標的はデジタルＰＣＲに適用可能な濃度範囲内に収まることができるが、低濃度の核酸標的は過度に希釈され、検出できなくなる結果として感度が低下する問題が発生する。この状況は、液体生検試料中の遺伝子突然変異の検出においてよく発生する。例えば、被験核酸試料中に高濃度の野生型遺伝子及び低濃度の突然変異遺伝子が同時に示される場合、検出感度が影響を受ける可能性がある。
【０００４】
現在市場に出回っている検出のための反応ウェル又はドロップレットの数は一般に増えており、その結果、デジタルＰＣＲの適用条件を満たす高濃度の核酸標的を分配した後に十分な陰性反応ウェルが存在する可能性があり、被験試料のコピー数を測定することができる。しかしながら、検出のための反応ウェルの数が増えるとプラットフォーム技術の困難性が増し、検出コスト及び検出時間が増大する。
【０００５】
上記に基づくと、デジタルＰＣＲによって高濃度の核酸標的を検出する場合、反応ウェルの数を増加させたり、試料を希釈したりすることなく試料濃度を良好に検出して、研究を必要とする重要なトピックであるダイナミックレンジ及び操作上の利便性を改善することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、リアルタイムの定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）及びデジタルＰＣＲを同時に行うという特徴を有する核酸試料の測定方法を提供する。本発明の測定方法は、同時に示された高濃度の核酸標的及び低濃度の核酸標的を同時に検出して、検出のダイナミックレンジを拡大することができる。この方法はデジタル定量的ＰＣＲと呼ばれ、デジタルＰＣＲと定量的ＰＣＲの二重機能を有する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の核酸試料の測定方法は、以下のステップを含む。複数の反応ウェルを有する試験板を設けて核酸試料に対してデジタル定量的ＰＣＲを行う。特に、低濃度の核酸標的のコピー数をデジタルＰＣＲの機能によって直接定量化する。ｑＰＣＲの機能によって高濃度核酸標的のＣｑ値が検出され、核酸試料中の高濃度核酸標的のコピー数を求めるために変換ステップを実行する。
【０００８】
本発明のある実施形態では、ＰＣＲ効率がｑＰＣＲ反応曲線によって求められる。その後、以下のステップを含む変換ステップが実行される。ＰＣＲ効率に１を加えて基数とする。低濃度核酸標的のｑＰＣＲ  Ｃｑ値から高濃度核酸標的のＣｑ値を引いてΔＣｑを求めて指数とする。次に、基数及び指数をべき乗演算に使用して、各反応ウェルの核酸標的のコピー数を求め、このコピー数にデジタルＰＣＲにおける反応ウェルの総数を乗じて高濃度核酸標的の総コピー数を求める。
【０００９】
本発明のある実施形態では、核酸試料は２種類以上の核酸標的を含み、複数の核酸標的は異なる濃度範囲を有する。
【００１０】
本発明のある実施形態では、デジタル定量的ＰＣＲは６４個以上の反応ウェルを使用して行われる。
【００１１】
本発明のある実施形態では、デジタル定量的ＰＣＲは６４〜２００００個の反応ウェルを使用して行われる。
【００１２】
本発明のある実施形態では、変換ステップの後、ダイナミックレンジが９ログまで増大する。
【００１３】
本発明のある実施形態では、２５００個の実験用反応ウェルを有する試験板を使用する。核酸標的の濃度が高い（２５００個の全ての実験用反応ウェルが核酸標的に対する陽性反応を示すことを意味する）場合、核酸試料中の核酸標的のコピー数は１００００より大きい。
【００１４】
本発明のある実施形態では、核酸標的の濃度が低い（実験用反応ウェルの全てが核酸標的に対する陽性反応を示すわけではないことを意味する）場合、核酸試料中の核酸標的のコピー数は直接測定することができる。
【００１５】
本発明のある実施形態では、２５００個の実験用反応ウェルを有する試験板を使用する。２５００個の全ての実験用反応ウェルが核酸標的に対する陽性反応を示すわけではない場合、核酸試料中の核酸標的のコピー数は１００００以下である。
【発明の効果】
【００１６】
上記に基づいて、本発明は、低濃度の核酸標的のコピー数をデジタルＰＣＲの機能によって直接定量化する核酸試料の測定方法（デジタル定量的ＰＣＲと称される）を提供する。ｑＰＣＲの機能によって高濃度核酸標的のＣｑ値が検出され、高濃度核酸標的のコピー数を求めるために変換ステップを実行する。このように高濃度核酸標的が検出される場合、試料を希釈することなく試料濃度を良好に検出することができ、その結果、検出のダイナミックレンジ及び操作上の利便性を効果的に改善することができる。
【００１７】
本発明の前述の特徴及び利点をより理解しやすくするために、図面を伴う実施形態を以下で詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
添付図面は、本発明のさらなる理解のために含められ、本明細書に組み込まれてその一部を構成する。図面は本発明の実施形態を示し、記述とともに本発明の原理を説明する働きをする。
【００１９】
【図１】本発明がデジタルＰＣＲと定量的ＰＣＲの二重機能をどのようにして同時に実行して９ログのダイナミックレンジを実現し、変換ステップによって高濃度核酸標的のｑＰＣＲ  Ｃｑ値を高濃度核酸標的のコピー数に変換するかを説明する、本発明のある実施形態に係る核酸試料の測定方法の試験結果を示すグラフ。
【図２】本発明がデジタルＰＣＲと定量的ＰＣＲの二重機能をどのようにして同時に実行して９ログのダイナミックレンジを実現し、変換ステップによって高濃度核酸標的のｑＰＣＲ  Ｃｑ値を高濃度核酸標的のコピー数に変換するかを説明する、本発明のある実施形態に係る核酸試料の測定方法の試験結果を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は核酸試料の測定方法を提供する。最初に、本明細書で使用する用語を以下に定義及び説明する。
【００２１】
「ｑＰＣＲ」又は「リアルタイムの定量的ＰＣＲ」は、標的ＤＮＡを増幅すると同時に定量化するのにＰＣＲを用いる実験的方法を指す。様々な検出用化学物質（蛍光染料ＳＹＢＲ（登録商標）ｇｒｅｅｎや蛍光レポーターオリゴヌクレオチドプローブＴａｑｍａｎプローブなどを含む）を使用して定量化を行い、各増幅サイクルの後に反応中に蓄積された増幅されたＤＮＡに対してリアルタイムの定量化を行う。
【００２２】
「デジタルＰＣＲ」とは、核酸分子に対する絶対的定量化技術である。ｑＰＣＲと比較すると、デジタルＰＣＲは核酸分子のコピー数を直接測定することができる。試料を数十から数万の部分に分割し、異なる反応ウェルに分配した後、各反応ウェル中の核酸標的に対してＰＣＲ増幅をそれぞれ行う。増幅が完了した後、各反応ウェルの蛍光信号を解析する。
【００２３】
「Ｃｑ値」とは、ｑＰＣＲ操作プロセス中に蛍光強度が大幅に増加した増幅サイクルの数である。
【００２４】
「ＰＣＲ効率」とは、各ＰＣＲサイクル後の核酸の増加量を指す。良い設計は通常、９０％〜１１０％の間の効率をもたらし、これは核酸の量が追加の各ＰＣＲサイクルの後に９０％〜１１０％増加する可能性があることを意味する。この方法は、文献（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００２年６月７日；２９４（２）：３４７−５３）に記載の蛍光強度の増加量を用いてＰＣＲ効率を測定する方法を参照し、ＰＣＲ効率は、（ＲＣｑ−ＲＣｑ−１）／ＲＣｑ−１に等しい。ここでＲＣｑはサイクルＣｑの蛍光強度であり、ＲＣｑ−１はサイクルＣｑ−１の蛍光強度であり、最初にＲＣｑとＲＣｑ−１の両方から蛍光バックグラウンド値を差し引く必要がある。
【００２５】
「試料」とは、被験核酸試料を指す。例えば試料は、血液、組織、唾液などのソースから抽出した核酸フラグメント（ＤＮＡやＲＮＡなどを含む）であってよい。「鋳型」とは、バイオマーカとも称され、ｑＰＣＲ反応によって検出可能な特定配列を有するＤＮＡ鎖、ＲＮＡ鎖、又はマイクロＲＮＡ鎖を指す。
【００２６】
「複数の反応ウェルを有する試験板」とは、それぞれがｄｑＰＣＲ反応を行うのに使用される複数の反応ウェルを有するスライド板を指す。
【００２７】
「ダイナミックレンジ」とは、一般に濃度範囲の１つの区間を指す、既知の試料濃度（例えば既知の段階希釈率）と測定された試料濃度とが許容可能な線形性を示す線形ダイナミックレンジを指す（Ｈｕｇｇｅｔｔ，Ｊｉｍ  Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．“Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｍｉｎｉｍｕｍ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ”）。ダイナミックレンジの単位は通常、ログで表される。
【００２８】
本発明は核酸試料の測定方法を提供する。初めに、１種類以上の核酸標的を含み得る核酸試料に対してデジタル定量的ＰＣＲを行うために複数の反応ウェルを有する試験板を設ける。核酸試料が２種類以上の核酸標的を含む場合、各核酸標的の濃度範囲は異なるか又は大幅に異なる可能性がある。試験板中の反応ウェルは、様々な濃度範囲を有する異なるタイプの核酸標的を同時に測定するために個別に割り当てられる。本実施形態では、例えば６４個以上の反応ウェルを使用してデジタル定量的ＰＣＲ反応が行われ、好ましくは、例えば６４〜２００００個の反応ウェルを使用してデジタル定量的ＰＣＲ反応が行われる。
【００２９】
全ての反応ウェルが核酸標的に対する陽性反応を示す場合、核酸標的の濃度はより高く、核酸試料中の核酸標的のコピー数は、例えば１００００より大きい。既存のデジタルＰＣＲでは、高濃度の核酸標的の場合、初めに希釈を行う必要がある。結果として、試料濃度はデジタルＰＣＲに適用可能な濃度範囲内に収まり、その結果、試料濃度をデジタルＰＣＲによって良好に測定することができる。しかしながら、本発明では、全ての反応ウェルが核酸標的に対して陽性反応を示す場合に変換ステップが実行され、その結果、核酸試料中の高濃度の核酸標的のコピー数が求められる。このように、試料を希釈することなく試料濃度を良好に検出することができる。
【００３０】
本発明では、ＰＣＲ効率がｑＰＣＲ反応曲線によって求められ、その後、以下のステップを含む変換ステップが実行される。ＰＣＲ効率に１を加えて基数とする。低濃度核酸標的のｑＰＣＲ  Ｃｑ値から高濃度核酸標的のＣｑ値を引いてΔＣｑを求め指数とする。その後、基数及び指数をべき乗演算に使用して、各反応ウェルの核酸標的のコピー数を求め、これにデジタルＰＣＲにおける反応ウェルの総数を乗じて、変換された高濃度核酸標的の総コピー数を求める。
【００３１】
全ての実験用反応ウェルが核酸標的に対する陽性反応を示すわけではない場合、この核酸標的の濃度はより低い。核酸試料中の核酸標的のコピー数は、例えば１００００以下であり、コピー数の具体的な範囲は、例えば１〜１００００である。本発明の核酸試料の測定方法を用いて、核酸試料中の核酸標的のコピー数はデジタルＰＣＲによって直接測定することができる。
【００３２】
本発明の核酸試料の測定方法では、リアルタイムの定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）の特徴とデジタルＰＣＲの特徴とを組み合わせることができる。デジタルＰＣＲのダイナミックレンジは３ログであり、ｑＰＣＲのダイナミックレンジは６ログである。本発明の核酸試料の測定方法では、ダイナミックレンジをｄｑＰＣＲ技術によって９ログまで増大させることができる。
【００３３】
検出のダイナミックレンジを測定するために、文献（Ｈｕｇｇｅｔｔ，Ｊｉｍ  Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．“Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｍｉｎｉｍｕｍ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ”）に記載の一般的に用いられる方法は、被験試料を用意することと、次にこの試料に対して複数回の連続した段階希釈、例えば５回の連続した１０倍の段階希釈を実行して、全部で６つの段階希釈した試料（１０００００倍、１００００倍、１０００倍、１００倍、１０倍、１倍）を得ることである。その後、６つの段階希釈した試料を検出してその検出濃度を求め、次に既知の希釈率及び個々の検出濃度を有する６つの試料間の線形性を計算する。線形性が０．９８より大きい相関係数Ｒ２に達する場合は、この検出が６ログのダイナミックレンジに達し得ることを意味する。
【００３４】
図１、図２及び表１は、本発明のある実施形態に係る核酸試料の測定方法により得られた検出結果であり、どのようにして本発明のデジタルＰＣＲと定量的ＰＣＲの二重機能が同時に実行されて、その結果、９ログのダイナミックレンジ（既知の段階希釈濃度及びｄｑＰＣＲにより測定した検出濃度（コピー数）の相関係数Ｒ２は０．９９以上である）を実現するかを説明し、高濃度核酸標的のｑＰＣＲ  Ｃｑ値は変換ステップによって高濃度核酸標的のコピー数に変換される。
【００３５】
同じ試料から得られた連続した１０倍希釈試料が、表１に上から下に記載され、表中、上位５つの希釈率は１００，０００，０００倍から１０，０００倍である。ＰＣＲ反応後は全ての反応ウェルが陽性であり、デジタルＰＣＲによって直接測定することができない。残りの４つの希釈率はいずれも反応後に陰性の反応ウェルを示し、１ウェル当たりの試料のコピー数は、デジタルＰＣＲによって測定することができ、これに反応ウェル数を乗じて総コピー数が求められる。例えば試料希釈率が１００倍の場合、デジタルＰＣＲにより測定された１ウェル当たりのコピー数は０．２３であり、これに反応ウェル数２５００が乗じられて総コピー数５７６が求められる。試料希釈率が１０，０００倍以上の場合、試料のＣｑ値は定量的ＰＣＲによって測定することができ、総コピー数は本発明の方法の変換によって求めることができる。例えば試料希釈率が１０，０００倍である場合、定量的ＰＣＲにより測定されたＣｑ値は２０．７２である。単一コピー数でのこの試料のＣｑ値は２５．６６であり、ＰＣＲ効率は９２％である。２５．６６から２０．７２を引いて４．９４を求める。効率０．９２に１を足して１．９２を求め、１．９２の４．９４乗は、１ウェル当たりの変換されたコピー数である２４．９７であり、反応ウェル数２５００が乗じられて変換された総コピー数６２４１６が与えられる。この９つの試料は、本発明の方法により求められる変換された総コピー数及び試料希釈率によって線形回帰される。相関係数Ｒ２は、本発明の方法が実行可能性及び線形性に優れていることを示す０．９９８８（図１）及び０．９９９６（図２）である。
【００３６】
図１及び図２のデータソースは表１であり、図１のＸ座標軸は表１の試料希釈率であり、図１のＹ軸は表１の被験試料の総コピー数である。図１では、Ｙ軸の最大値がより大きいため、図中のより小さい座標点を見分けることができない。図中の各座標を明確に示すために、図１を図２のように修正した。図２では、図１の座標軸が１０を底とする対数（ｌｏｇ１０）の形に修正されている。
【００３７】
【表１】
0006929913.tif 000002
【００３８】
表２は、本発明のある実施形態に係る核酸試料の測定方法の検出結果である。本実施形態では、被験核酸試料は、高濃度の野生型遺伝子及び低濃度の突然変異遺伝子を同時に含む。本実施形態の目的は、本発明が高濃度の核酸標的と低濃度の核酸標的が共に存在する場合に良好な線形ダイナミックレンジを実現できることを示すことである。
【００３９】
表２には、５つの被験試料があり、各被験試料はＥＧＦＲ野生型遺伝子とＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ突然変異遺伝子の両方を含み、突然変異遺伝子は０．２％〜３．２％の変異アレル頻度（ＶＡＦ）を有する。本実施形態では、検出のために２種類の蛍光信号を同時に使用する。２種類の蛍光信号とは、それぞれ突然変異ＥＧＦＲ遺伝子を検出するのに使用されるＦＡＭ蛍光信号、及び野生型ＥＧＦＲ遺伝子を検出するのに使用されるＣＹ５蛍光信号である。第１の測定において、デジタルＰＣＲのＦＡＭ蛍光信号により測定された１ウェル当たりのコピー数は０．００６であり、これに反応ウェル数２５００が乗じられて突然変異ＥＧＦＲの総コピー数１５が求められる。定量的ＰＣＲのＣＹ５蛍光信号により測定されたＣｑ値は２８．５である。このとき、単一コピー数のＣｑ値は３０．２２であり、ＰＣＲ効率は０．９０であり、１ウェル当たりの変換されたコピー数は１．９の１．７２（３０．２２−２８．５）乗、すなわち３．０１であり、これに反応ウェル数２５００が乗じられて野生型ＥＧＦＲの総コピー数７５１６が求められる。突然変異ＥＧＦＲの総コピー数を野生型ＥＧＦＲの総コピー数で割って、被験試料のＶＡＦに非常に近い本発明の方法により測定されたＶＡＦ０．２０％（１５／７５１６）が求められる。この方法に従って、他の４つの測定のＶＡＦも求めることができる。全部で５つの測定のＶＡＦ及び被験試料の希釈率のＶＡＦは、この方法の実行可能性及び線形性がより低い濃度（０．２％〜３．２％）でのＶＡＦ区間において優位性を維持することを示す０．９９９６の線形回帰Ｒ２を有する。
【００４０】
【表２】
0006929913.tif 000003
【００４１】
上記に基づいて、本発明は核酸試料の測定方法を提供する。本発明の測定方法は、高濃度核酸標的を含む核酸試料がデジタルＰＣＲによって測定される場合に、試料を希釈せずに良好に試料濃度を検出することができる。核酸試料中の核酸標的が幅広い濃度範囲を有する場合（特に臨床試料の場合）、核酸試料を希釈する必要がなく、その結果、高濃度の核酸標的及び低濃度の核酸標的を同時に良好に測定することができる。また、低濃度の核酸標的が過希釈される感度の低下問題を回避することができ、その結果、検出のダイナミックレンジ及び操作上の利便性を効果的に改善することができる。より詳細には、高濃度の核酸標的はリアルタイム定量的ＰＣＲ検出によって検出され、Ｃｑ値は本発明の変換ステップによってコピー数に変換することができる。低濃度の核酸標的については、核酸試料中の核酸標的のコピー数は、デジタルＰＣＲによって直接測定することができる。
【００４２】
さらに、核酸試料中の核酸標的が幅広い濃度範囲を有する場合（特に臨床試料の場合）、核酸試料を希釈する必要がなく、その結果、高濃度の核酸標的及び低濃度の核酸標的を同時に良好に測定することができ、低濃度の核酸標的が過希釈される感度の低下問題を回避することができる。
【００４３】
上記の実施形態を参照して本発明を説明してきたが、説明した実施形態に対する修正を本発明の趣旨から逸脱することなく行うことができることは当業者に明らかであろう。したがって、本発明の範囲は上記の詳細な説明ではなく添付の請求項によって規定されるものである。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明の測定方法は、同時に示された高濃度の核酸標的及び低濃度の核酸標的を同時に検出して、検出のダイナミックレンジを拡大することができる。
【図１】
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【図２】
0006929913.tif 000005