(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
豚サーコウイルス３型及び豚サーコウイルス２型である抗原を含有する免疫原性組成物であって、
前記免疫原性組成物は、免疫量の豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質抗原と、免疫量の豚サーコウイルス２型新（ｎｅｗ）遺伝子サブタイプＣａｐタンパク質抗原と、薬学的に許容可能な担体とを含み、
前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質抗原は、豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質又は前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質遺伝子が組み換えられている生担体であり、前記豚サーコウイルス２型新（ｎｅｗ）遺伝子サブタイプＣａｐタンパク質抗原は、豚サーコウイルス２型新（ｎｅｗ）遺伝子サブタイプＣａｐタンパク質又は前記豚サーコウイルス２型Ｃａｐタンパク質遺伝子が組み換えられている生担体であり、
前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１によりコードされるタンパク質であり、前記豚サーコウイルス２型新（ｎｅｗ）遺伝子サブタイプＣａｐタンパク質はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２によりコードされるタンパク質である、
ことを特徴とする、豚サーコウイルス３型及び豚サーコウイルス２型である抗原を含有する免疫原性組成物。
【請求項２】
前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質の含有量は２０μｇ／ｍｌ以上であり、前記豚サーコウイルス２型新（ｎｅｗ）遺伝子サブタイプＣａｐタンパク質の含有量は２０μｇ／ｍｌ以上である請求項１に記載の豚サーコウイルス３型及び豚サーコウイルス２型である抗原を含有する免疫原性組成物。
【請求項３】
前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質の含有量は２０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌであり、前記豚サーコウイルス２型新（ｎｅｗ）遺伝子サブタイプＣａｐタンパク質の含有量は２０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌである請求項１に記載の豚サーコウイルス３型及び豚サーコウイルス２型である抗原を含有する免疫原性組成物。
【請求項４】
前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質の含有量は２０μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌであり、前記豚サーコウイルス２型新（ｎｅｗ）遺伝子サブタイプＣａｐタンパク質の含有量は２０μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌである請求項１に記載の豚サーコウイルス３型及び豚サーコウイルス２型である抗原を含有する免疫原性組成物。
【請求項５】
前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質の含有量は３０μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌであり、前記豚サーコウイルス２型新（ｎｅｗ）遺伝子サブタイプＣａｐタンパク質の含有量は３０μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌである請求項１に記載の豚サーコウイルス３型及び豚サーコウイルス２型である抗原を含有する免疫原性組成物。
【請求項６】
前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質遺伝子と前記豚サーコウイルス２型新（ｎｅｗ）遺伝子サブタイプＣａｐタンパク質遺伝子とは同一生担体に組み換えられ、前記生担体は組み換え弱毒サルモネラ菌、組み換えニューカッスル病ウイルス、組み換えポックスウイルス又は組み換えアデノウイルスである請求項１に記載の豚サーコウイルス３型及び豚サーコウイルス２型である抗原を含有する免疫原性組成物。
【請求項７】
前記薬学的に許容可能な担体はアジュバントを含み、前記アジュバントは、ホワイトオイル、ドレイクオイル、及び動物油、植物油又はミネラルオイル、或いは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム及び金属塩、或いは、水中にポリアクリル酸ナトリウムのゲル粒子を含むポリマーベースアジュバント、カルボマー、スクワラン又はスクアレン、ＩＳＡ２０６アジュバント、サポニン、油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョン、水中油中水型エマルジョンを含み、
前記アジュバントの含有量は５〜２０Ｖ／Ｖ％である請求項１に記載の豚サーコウイルス３型及び豚サーコウイルス２型である抗原を含有する免疫原性組成物。
【請求項８】
前記アジュバントの含有量は１０Ｖ／Ｖ％である請求項７に記載の豚サーコウイルス３型及び豚サーコウイルス２型である抗原を含有する免疫原性組成物。
【請求項９】
前記薬学的に許容可能な担体はアジュバントを含み、前記アジュバントは水中にポリアクリル酸ナトリウムのゲル粒子を含むポリマーベースアジュバント、であり、前記アジュバントの含有量は５〜２０Ｖ／Ｖ％である請求項７に記載の豚サーコウイルス３型及び豚サーコウイルス２型である抗原を含有する免疫原性組成物。
【請求項１０】
前記アジュバントの含有量は１０Ｖ／Ｖ％である請求項９に記載の豚サーコウイルス３型及び豚サーコウイルス２型である抗原を含有する免疫原性組成物。
【請求項１１】
請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の豚サーコウイルス３型及び豚サーコウイルス２型である抗原を含有する免疫原性組成物の豚サーコウイルス関連疾患を予防及び／又は治療する医薬の調製における使用。
【請求項１２】
前記豚サーコウイルス関連疾患は、離乳後仔豚多臓器性発育不良症候群と、豚皮膚炎腎症症候群と、増殖性壊死性肺炎と、繁殖障害と、心臓及び多臓器系炎症性反応とを含む請求項１１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、獣医薬分野に関し、具体的には、豚サーコウイルス３型及び豚サーコウイルス２型である抗原を含有する免疫原性組成物及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
豚サーコウイルス（Ｐｏｒｃｉｎｅ  ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓｅｓ、ＰＣＶ）は環状一本鎖ＤＮＡウイルスであって、ゲノム長さが約１.７ｋｂであり、最も小さい動物ＤＮＡウイルスの一つである。既に二種類のＰＣＶ、即ち、豚サーコウイルス１型（ＰＣＶ１）及び豚サーコウイルス２型（ＰＣＶ２）が存在することが確定されている。ＰＣＶ１は１９７４年初めにＰＫ細胞培養物の中で一種の汚染物質として鑑定して発見されたが、ＰＣＶ１は豚に対して病原性がない。ＰＣＶ２は１９９８年初めに報道されたが、ＰＣＶ２は臨床条件下で豚の豚サーコウイルス関連疾患（Ｐｏｒｃｉｎｅ  ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅｓ、ＰＣＶＡＤ）を引き起こすことが可能であり、主に離乳後仔豚多臓器性発育不良症候群、肺炎、豚皮膚炎、腎症症候群及び繁殖障害を引き起こし、主に呼吸、泌尿、腸管、リンパ、心血管、神経、繁殖システム及び皮膚の機能障害として現れ、全世界の生豚の養殖に深刻な経済的損失をもたらしている。
【０００３】
臨床的に、ＰＣＶ２ワクチンの普遍的な応用に伴い、免疫圧力の下で、ＰＣＶ２の変異速度が速まり、ＰＣＶ２ｂとＰＣＶ２ｄの間に介在する一種類の新たな遺伝子サブタイプのウイルス株が流行し始めるが、この種類のウイルス特徴は、ＯＲＦ２遺伝子の中に突然変異が存在するか又は異なる遺伝子サブタイプのＯＲＦ２遺伝子の間での組み換えを経て生じるものである。当該新たなＰＣＶ２遺伝子サブタイプウイルス株の流行によって、その抗原と既存の遺伝子サブタイプの間に差異が存在し、既存の商品化されたワクチンはいずれもＰＣＶ２ａ又はＰＣＶ２ｂをワクチン株として調製されたものであり、最新流行するＰＣＶ２ウイルス株に対する完全な防御を行うことができない。
【０００４】
ある豚の繁殖障害症例において、ウイルスゲノムが２．０ｋｂであるサーコウイルスが１株分離され、後続的な試験の結果として、当該サーコウイルスは既知のサーコウイルスとのホモロジーが、ヌクレオチド配列であれアミノ酸配列であれ、いずれも５０％より小さいことが実証された。国際ウイルス学分類委員会の標準によると、サーコウイルスのうち同一種類に属するウイルスは７５％より大きいゲノムヌクレオチド配列のホモロジーを有し、Ｃａｐタンパク質は７０％より大きいアミノ酸配列のホモロジーを有するべきである。これにより、当該ウイルスは一種の新たな豚サーコウイルス（ＰＣＶ３）であると確定されることができる。
【０００５】
最初、早くも１９８５年に、ＰＣＶ２によって引き起こされたシステム疾患が既に散発的な状態で勃発したが、重視できなかったことが原因として、１９９０年代末期に当該疾患が大規模に勃発した。新たな豚サーコウイルスは、豚皮膚炎腎症症候群（Ｐｏｒｃｉｎｅ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＰＤＮＳ）及び繁殖障害の面でＰＣＶ２と類似した病原学特性を持ち、ＰＣＶ２とＰＣＶ３の間でタンパク質のホモロジーが非常に低く、ＰＣＶ２ワクチンではＰＣＶ３に対する効果的な予防及び交差防御を行うことができない。
【０００６】
新たな豚サーコウイルスはＰＣＶ２の既存のこと及び新たな遺伝子サブタイプの間の混合感染は臨床的なＰＣＶ感染の複雑な状況をさらに悪化させるため、当該新規臨床疫病に対する新たな免疫原性組成物を調製するのは養豚場疾患防除にとって非常に重要である。
【発明の概要】
【０００７】
先行技術の不足を解決するために、本発明は、豚サーコウイルスの混合感染を予防及び／又は治療する免疫原性組成物を提供する。当該免疫原性組成物は、豚サーコウイルス２型及び３型の混合感染に対して効果的な防御することができ、著しい免疫特性を表している。
【０００８】
本発明の一目的は、異なる豚サーコウイルスの混合感染を予防及び／又は治療する免疫原性組成物を提供することである。前記免疫原性組成物は、免疫量の豚サーコウイルス３型抗原と、免疫量の豚サーコウイルス２型抗原と、薬学的に許容可能な担体とを含む。
【０００９】
本発明の一目的は、異なる遺伝子サブタイプの豚サーコウイルス２型及び豚サーコウイルス３型の混合感染を予防及び／又は治療する免疫原性組成物を提供することである。
【００１０】
本発明の一目的は、異なる地域由来の豚サーコウイルス２型及び豚サーコウイルス３型の混合感染を予防及び／又は治療する免疫原性組成物を提供することである。
【００１１】
本発明の一目的は、上記の免疫原性組成物の豚サーコウイルス関連疾患を予防及び／又は治療する医薬の調製における用途を提供することである。
【００１２】
本発明は、初めに、目前新たな豚サーコウイルス３型免疫原性タンパク質抗原及び豚サーコウイルス２型新たな遺伝子サブタイプウイルス株免疫原性タンパク質抗原を採用して、豚サーコウイルス感染を予防及び／又は治療する免疫原性組成物を調製することで、豚サーコウイルス２型及び豚サーコウイルス３型の感染又は混合感染に対して免疫防御を行うこができるし、異なる遺伝子サブタイプ豚サーコウイルス２型ウイルス株に対しても防御を行うことができる。
【００１３】
本発明に係る免疫原性組成物は、異なる地域由来の豚サーコウイルス３型ウイルス株及び豚サーコウイルス２型ウイルス株の混合感染に対して完全に防御することができ、幅広く防御することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施形態を説明する。
【００１５】
「豚サーコウイルス３型」は、ゲノム２.０ｋｂのサーコウイルスであって、既知のサーコウイルスとのホモロジーがヌクレオチド配列であれ、アミノ酸配列であれ、いずれも５０％より小さく、新たな豚サーコウイルスである。当該豚サーコウイルス３型は多様な病原と混合感染することができ、豚皮膚炎腎症症候群、増殖性壊死性肺炎、繁殖障害、並びに心臓及び多臓器系炎症性反応を引き起こすことが可能である。
【００１６】
「豚サーコウイルス２型新（ｎｅｗ）遺伝子サブタイプ」は、新たなＰＣＶ２遺伝子サブタイプであって、ＯＲＦ２遺伝子の中に突然変異が存在するか又は異なる遺伝子サブタイプのＯＲＦ２遺伝子の間での組み換えを経て生じたものであり、ＰＣＶ２ｂの標識配列を有するが、遺伝進化分析で一つの独立的なブウランチを構成する。豚が当該遺伝子サブタイプのウイルス株に感染した後に現れる臨床的特徴として、持続的な高温、食欲減退、気分の沈み、乱雑な被毛、痩せ細り及び成長速度の減速、剖検でいずれも異なる程度の肺硬変あり、リンパ腫大、及び腎臓に壊死箇所有りということである。
【００１７】
本発明は、豚サーコウイルス３型及び豚サーコウイルス２型である抗原を含有する免疫原性組成物に関する。前記免疫原性組成物は、免疫量の豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質抗原と、免疫量の豚サーコウイルス２型新（ｎｅｗ）遺伝子サブタイプＣａｐタンパク質抗原と、薬学的に許容可能な担体とを含み、前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質抗原は、豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質又は前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質遺伝子が組み換えられている生担体であり、前記豚サーコウイルス２型新（ｎｅｗ）遺伝子サブタイプＣａｐタンパク質抗原は、豚サーコウイルス２型新（ｎｅｗ）遺伝子サブタイプＣａｐタンパク質又は前記豚サーコウイルス２型Ｃａｐタンパク質遺伝子が組み換えられている生担体である。
【００１８】
本発明に係る免疫原性組成物は、一回の免疫を経るだけで、その中の抗原成分がそれぞれの病原に対して完全に防御することができ、豚を豚サーコウイルス３型及び豚サーコウイルス２型に対する混合感染を予防及び抵抗するように防御できる。
【００１９】
本発明に係る免疫原性組成物は、豚サーコウイルス３型及び異なる遺伝子サブタイプの豚サーコウイルス２型の混合感染に対して完全に防御することができる。
【００２０】
本発明に係る免疫原性組成物は、豚を異なる地域由来の豚サーコウイルス３型ウイルス及び豚サーコウイルス２型ウイルスに対する混合感染から完全に防御できる。
【００２１】
用語「免疫原性組成物」は、豚サーコウイルス３型免疫原性及び豚サーコウイルス２型免疫原性を含有する医薬組成物を指す。当該医薬組成物は、豚の豚サーコウイルス３型及び豚サーコウイルス２型ウイルスに対する免疫反応を誘発、刺激又は強化することができる。
【００２２】
用語「免疫量」は、「免疫有効量」として理解されるべきであり、免疫防御量又は免疫応答を引き起こす有効量とも称され、受容者体内で免疫応答を効果的に誘導可能な抗原量であるが、当該量は不利な健康影響又はその合併症を含む疾患の症候又は症状を十分に予防又は改善できる。前記免疫応答は、診断目的又は他の試験に用いられるのに十分であることが可能であり、又は病原体によって引き起こされる感染による不利な健康結果又はその合併症を含む疾患の兆候又は症状を予防するために好適に用いられる。体液免疫力又は細胞により仲介される免疫力、或いはこの両者とも誘導され得る。動物の免疫原性組成物に対する免疫応答は、例えば、抗体価測定、リンパ細胞増殖分析を通じて間接的に評価されるか、或いは、野生型ウイルス株でチャレンジした後に兆候又は症状をモニタリングして直接的に評価されて良い。当該免疫原性組成物から得られる防御性免疫力は、例えば、被験動物の健康分娩の減少、死胎数の増加のような臨床兆候、被験動物の全体的な生理状況及び全体的な健康及び表現を測定することで評価されても良い。前記免疫応答は、誘導細胞性及び／又は体液免疫力を含むことができるが、これらに限定されない。
【００２３】
本発明に係る豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質抗原及び豚サーコウイルス２型Ｃａｐタンパク質抗原は、組み換え発現されたＣａｐタンパク質サブユニット抗原であって良く、その発現体系は原核発現システム、真核発現システムであっても良いし、人工的に合成された合成ペプチド抗原であっても良く、或いは、前記豚サーコウイルスＣａｐタンパク質遺伝子が組み換えられている生担体であっても良い。
【００２４】
「サブユニット抗原」は、遺伝子工学方法により病原体の防御性抗原遺伝子を原核又は真核発現システムにクローンして効果的に発現させることにより作られた抗原を指す。サブユニット抗原は、トティウイルス抗原と比べて、副反応を引き起こす可能性が小さくなることである。
【００２５】
「合成ペプチド抗原」は、免疫決定基組成成分のみを含有する低分子ペプチド、即ち、人工的な方法により天然タンパク質のアミノ酸配列順に従って防御性オリゴペプチドを合成し、担体に結合させた後にアジュバントを加えることにより作られた抗原を指す。
【００２６】
「生担体」は、遺伝子工学の方法により非病原性微生物に一種の抗原又は抗原決定基の遺伝子を含有して発現させて免疫原性を持たせることを指す。非病原性微生物は、細菌及びウイルスであっても良い。ウイルス生担体が通常担体として用いられるウイルスとして、痘苗ウイルス、禽痘ウイルス、七面鳥ヘルペスウイルス、アデノウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスがある。細菌生担体は、弱毒サルモネラ、バシラス・カルメット・ゲラン、弱毒リステリア・モノサイトゲネス、弱毒コレラ菌、弱毒シゲラ、乳酸球菌、ラクトバチルス・プランタラム、ゴルドニ・ストレプトコッカスであっても良い。
【００２７】
本発明の一実施形態として、本発明に係る豚サーコウイルス３型及び豚サーコウイルス２型である抗原を含有する免疫原性組成物において、前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質は、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１によりコードされるタンパク質であり、前記豚サーコウイルス２型新（ｎｅｗ）遺伝子サブタイプＣａｐタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２によりコードされるタンパク質である。
【００２８】
本発明に係る免疫原性タンパク質の免疫原性が良く、一回の免疫で完全に防御することができる。
【００２９】
本発明の一実施形態として、本発明に係る豚サーコウイルス３型及び豚サーコウイルス２型である抗原を含有する免疫原性組成物において、前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質のコーディング遺伝子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１が示すヌクレオチド配列又はその縮重配列を有し、前記豚サーコウイルス２型Ｃａｐタンパク質のコーディング遺伝子はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２が示すヌクレオチド配列又はその縮重配列を有する。
【００３０】
本発明の一実施形態として、本発明に係る豚サーコウイルス３型及び豚サーコウイルス２型である抗原を含有する免疫原性組成物において、前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質の含有量は２０μｇ／ｍｌ以上であり、前記豚サーコウイルス２型新（ｎｅｗ）遺伝子サブタイプＣａｐタンパク質の含有量は２０μｇ／ｍｌ以上である。
【００３１】
本発明に係る免疫原性組成物において、抗原含有量が２０μｇ／ｍｌまで低くても、免疫反応が生じるように免疫システムを刺激でき、豚に対して完全に防御することができる。
【００３２】
本発明の好ましい一実施形態として、本発明に係る豚サーコウイルス３型及び豚サーコウイルス２型である抗原を含有する免疫原性組成物において、前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質の含有量は２０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌであり、前記豚サーコウイルス２型新（ｎｅｗ）遺伝子サブタイプＣａｐタンパク質の含有量は２０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌである。
【００３３】
本発明のより好ましい実施形態として、本発明に係る豚サーコウイルス３型及び豚サーコウイルス２型である抗原を含有する免疫原性組成物において、前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質抗原の含有量は２０μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌであり、前記豚サーコウイルス２型新（ｎｅｗ）遺伝子サブタイプＣａｐタンパク質の含有量は２０μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌである。
【００３４】
本発明のより好ましい実施形態として、本発明に係る豚サーコウイルス３型及び豚サーコウイルス２型である抗原を含有する免疫原性組成物において、前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質抗原の含有量は３０μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌであり、前記豚サーコウイルス２型新（ｎｅｗ）遺伝子サブタイプＣａｐタンパク質の含有量は３０μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌである。
【００３５】
本発明に係る免疫原性組成物において、前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質抗原の含有量は、２０μｇ／ｍｌ〜３０μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、又は５０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌである含有量の範囲から選択されても良い。
【００３６】
本発明に係る免疫原性組成物において、前記豚サーコウイルス２型新（ｎｅｗ）遺伝子サブタイプＣａｐタンパク質抗原の含有量は、２０μｇ／ｍｌ〜３０μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、又は５０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌである含有量の範囲から選択されても良い。
【００３７】
本発明に係る免疫原性組成物において、前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質抗原の含有量と前記豚サーコウイルス２型新（ｎｅｗ）遺伝子サブタイプＣａｐタンパク質抗原の含有量とは単独的に上記の含有量の範囲の何れか一つからそれぞれ選択されて良い。
【００３８】
本発明の一実施形態として、本発明に係る豚サーコウイルス３型及び豚サーコウイルス２型である抗原を含有する免疫原性組成物において、前記の豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質遺伝子が組み換えられている生担体は、組み換え弱毒サルモネラ菌、組み換えニューカッスル病ウイルス、組み換えポックスウイルス又は組み換えアデノウイルスであり、前記の前記豚サーコウイルス２型新（ｎｅｗ）遺伝子サブタイプＣａｐタンパク質遺伝子が組み換えられている生担体は、組み換え弱毒サルモネラ菌、組み換えニューカッスル病ウイルス、組み換えポックスウイルス又は組み換えアデノウイルスである。
【００３９】
本発明の一実施形態として、本発明に係る豚サーコウイルス３型及び豚サーコウイルス２型である抗原を含有する免疫原性組成物において、前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質遺伝子と前記豚サーコウイルス２型新（ｎｅｗ）遺伝子サブタイプＣａｐタンパク質遺伝子とは同一生担体に組み換えられ、前記生担体は組み換え弱毒サルモネラ菌、組み換えニューカッスル病ウイルス、組み換えポックスウイルス又は組み換えアデノウイルスである。
【００４０】
本発明に係る生担体免疫原性組成物は、不活化ワクチン及び生ワクチンの利点を兼ね備えるため、免疫効果上で豚を防御できることを確保でき、且つその免疫効果がより強いため、アジュバントを添加しなくても良い。
【００４１】
本発明の一実施形態として、本発明に係る豚サーコウイルス３型及び豚サーコウイルス２型である抗原を含有する免疫原性組成物において、前記薬学的に許容可能な担体はアジュバントを含み、前記アジュバントは、ホワイトオイル、ドレイクオイル、及び動物油、植物油又はミネラルオイル、或いは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム及び金属塩、或いは、ＭｏｎｔａｎｉｄｅTMＧｅｌ、カルボマー、スクワラン又はスクアレン、ＩＳＡ２０６アジュバント、サポニン、油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョン、水中油中水型エマルジョンを含む。
【００４２】
本発明の好ましい一実施形態として、本発明に係る豚サーコウイルス３型及び豚サーコウイルス２型である抗原を含有する免疫原性組成物において、前記アジュバントはＭｏｎｔａｎｉｄｅTMＧｅｌである。
【００４３】
本発明に係る組成物に適用されるアジュバントの量は、有効量であるのが好ましい。前記「有効量」は、アジュバントが本発明に係る抗原と併用される際、過度な副作用を起こすことがなく、宿主の中でそれらの免疫学上の効果が得られることに対して、必要的な、或いは十分的な量であることを指す。施用すべきアジュバントの正確な量は、例えば、用いられる成分、治療する疾患の類型、治療すべき動物の類型と年齢、施用される方式、及び組成物における他の成分のような多様な因子によって変わることになる。
【００４４】
本発明の一実施形態として、本発明に係る豚サーコウイルス３型及び豚サーコウイルス２型である抗原を含有する免疫原性組成物において、前記アジュバントの含有量は５〜２０Ｖ／Ｖ％である。
【００４５】
本発明の好ましい一実施形態として、本発明に係る豚サーコウイルス３型及び豚サーコウイルス２型である抗原を含有する免疫原性組成物において、前記アジュバントの含有量は１０Ｖ／Ｖ％である。
【００４６】
本発明に係る免疫原性組成物は、従来の技術により配合することができ、薬学的に許容可能な担体と共に配合することが好ましい。例えば、オイルは、配合物を安定させるのに寄与する以外に、ワクチンアジュバントとしても機能する。オイルアジュバントは、自然由来であっても良いし、人工合成により得られたものであっても良い。
【００４７】
用語「アジュバント」は、組成物の免疫原性を高めるように、本発明の組成物の中に加えられる物質を指す。既知のアジュバントは、（１）水酸化アルミニウム、サポニン（Ｓａｐｏｎｉｎｅ）（例えば、ＱｕｉｌＡ）、アブリジン、ＤＤＡ、（２）アクリル酸又はメタクリル酸の重合体、無水マレイン酸とアルケニル誘導体の重合体、（３）ワクチンが水中油、油中水又は水中油中水型エマルジョンの形で調製することができ、或いは、（４）ＭｏｎｔａｎｉｄｅTMＧｅｌを含むがこれらに限定されない。
【００４８】
特に、エマルジョンは、軽質流動パラフィンオイル、イソプレノイドオイル、例えば、スクワラン又はスクアレン、オレフィン、特に、イソブチレン又はデセンオリゴマー化されて生成されたオイル、直鎖型アルキル付きの酸又はアルコールにより形成されたエステル、より特に、植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールジ（オクタン酸エステル／カプリン酸エステル）、グリセリントリ（オクタン酸エステル／カプリン酸エステル）、プロピレングリコールジオレイン酸エステル、分岐脂肪酸エステル又はアルコールのエステル、特に、イソステアリン酸エステルに基づくことが可能である。オイルと乳化剤とを共に使用してエマルジョンを形成する。乳化剤は、非イオン界面活性剤、特に、ポリオキシエチル化脂肪酸（例えば、オレイン酸）、ソルビタン、マンニトール（例えば、無水マンニトールオレイン酸エステル）、グリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール、及び選択可能なエトキシ化されたオレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸、ヒドロキシオクタデカン酸により形成されたエステル、脂肪族アルコールと多価アルコール（例えば、オレイルアルコール）のエーテル、ポリオキシプロピレン・ポリオキシエチレンブロック共重合体、特に、ＰｌｕｒｏｎｉｃＲ、より特に、Ｌ１２１（Ｈｕｎｔｅｒ等、１９９５、「Ｔｈｅ  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ」（Ｓｔｅｗａｒｄ−Ｔｕｌｌ、Ｄ．Ｅ．Ｓ監修）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、ＮＹ、５１−９４、Ｔｏｄｄ等、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９９７、１５、５６４−５７０を参照）であるのが好ましい。
【００４９】
とりわけ、アクリル酸又はメタクリル酸重合体は、糖又は多価アルコールのポリアルケニルエーテルにより架橋される。これらの化合物はカルボマーと称される。
【００５０】
好ましくは、本発明は、ＭｏｎｔａｎｉｄｅTMＧｅｌであるアジュバントを用いる。
【００５１】
本発明に係る免疫原性組成物は、さらに他の試薬を本発明に係る組成物の中に加えても良い。例えば、本発明の組成物は、例えば、医薬、免疫賦活剤（例えば、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ-ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ-ＣＳＦ）及びインターロイキン２（ＩＬ２））、抗酸化剤、界面活性剤、着色剤、揮発性油、緩衝剤、分散剤、プロペラント及び防腐剤のような試薬を更に含むことができる。このような組成物を調製するためには、本分野において周知である方法を使用しても良い。
【００５２】
本発明に係る免疫原性組成物に基づいて経口剤型又は非経口剤型に調製しても良い。
【００５３】
皮内、筋肉、腹膜内、静脈内、皮下、鼻内又は硬脳膜外経路を経て投与可能な非経口剤型であるのが好ましい。
【００５４】
本発明は、更に、上記の免疫原性組成物の豚サーコウイルス関連疾患を予防及び／又は治療する医薬の調製における用途にも関する。前記豚サーコウイルス関連疾患は、ＰＣＶ２及び豚サーコウイルス３型の単独感染又はそれらの混合感染による関連疾患である。
【００５５】
本発明の一実施形態として、前記の豚サーコウイルス関連疾患を予防及び／又は治療する医薬の調製における用途として、離乳後仔豚多臓器性発育不良症候群、豚皮膚炎腎症症候群、増殖性壊死性肺炎、繁殖障害、並びに心臓及び多臓器系炎症性反応を予防及び／又は治療する医薬の調製における用途である。
【００５６】
本発明で使用される用語「豚サーコウイルス関連疾患」は、豚サーコウイルス３型及び２型の混合感染に起因する疾患を指すためのものである。離乳後仔豚多臓器性発育不良症候群、豚皮膚炎腎症症候群、繁殖障害、並びに心臓及び多臓器系炎症性反応を非網羅的に含むがこれらに限定されない。
【００５７】
用語「予防及び／又は治療」は、豚サーコウイルス３型及び２型の混合感染関連疾患に係わる場合において、豚サーコウイルス３型及び２型の複製を抑制し、豚サーコウイルス３型及び２型の感染を抑制するか、又は豚サーコウイルス３型及び２型がその宿主の体内で定住するのを防止し、並びに豚サーコウイルス３型及び２型感染の疾患又は病症の症状を軽減することを指す。ウイルス負荷量が減少し、病症が軽減されるか及び／又は摂食量及び／又は成長が増加すると、前記予防及び／又は治療が効果に達したとみなされることができる。
【００５８】
本発明は、更に、上記の免疫原性組成物の豚サーコウイルス混合感染を予防及び／又は治療する医薬の調製における用途にも関する。
【００５９】
本発明の一実施形態として、本発明の豚サーコウイルス混合感染を予防及び／又は治療する医薬の調製における用途において、前記ＰＣＶ２遺伝子サブタイプはＰＣＶ２ａ、ＰＣＶ２ｂ、ＰＣＶ２ｄ、ＰＣＶ２新（ｎｅｗ）遺伝子サブタイプである。
【００６０】
本発明に係る免疫原性組成物は、異なるＰＣＶ２遺伝子サブタイプ及びＰＣＶ３に対して効果的に防御することができ、ワクチンの応用範囲を拡大させ、ＰＣＶ２の異なる遺伝子サブタイプ及びＰＣＶ３の単独感染並びに混合感染に対して予防及び／又は治療を行うことができる。
【００６１】
本発明に係る免疫原性組成物は、良好な免疫原性を有し、豚サーコウイルス関連疾患を予防できるし、既に豚サーコウイルスに感染した豚の臨床的特徴を軽減でき、即ち治療の役割を有する。
【００６２】
以下、具体的な実施例と結び付けて本発明をさらに具体的に記述する。本発明の利点及び特徴は記述につれてより明らかになる。但し、これらの実施例は単に例示的なものあり、本発明の範囲に対していかなる制限も構成しない。当業者は、本発明の精神及び範囲を逸脱しないという前提で本発明に係る構成の詳細及び形態に対して変更又は置換を実施することができるが、これらの変更及び置換はいずれも本発明の技術的範囲に含まれるということを理解すべきである。
【００６３】
本発明の実施例で用いられる化学試薬はいずれも分析グレードであり、中国国薬集団から入手可能である。
【００６４】
本発明に係る試験方法は、特に説明がない限り、いずれも従来の方法である。記載される生物材料は、特に説明がない限り、いずれも商業的に入手可能である。
【００６５】
［実施例１］  豚サーコウイルス３型の分離・同定
１．病理材料の由来
中国国内の一商品化養豚場で、従来の平均値に比べ、母豚の死亡率が９．４％増加し、受胎率が１．２％低下し、ミイラ変性胎子が８．２％増加する現象が現れた。臨床表現的に、影響を受けた母豚は、拒食現象を現し、多巣状丘疹、斑点及び表面皮膚炎の症状を呈した。流産した巣に異なる在胎週数のミイラ変性胎子を含有し、ＰＣＶ２関連流産の症状と一致している。母豚から観察された臨床表現及び流産症状全体として、豚サーコウイルス２型による繁殖障害疾患と一致するが、全ての母豚の腎臓、リンパ節、肺、皮膚及び死胎を含む異なる組織を免疫組織化及び定量ＰＣＲによりＰＣＶ２、ＰＲＲＳＶ、ＰＰＶ、ＣＳＦＶ、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ検査を行った結果、いずれも陰性であった。さらに原因を究明するために、各組織の病理材料を選び取って病原分離を行った。
【００６６】
２．ウイルス株の分離及び培養
病理材料を１：１０（体積比）でＤＭＥＭ培養液に加え、研磨して、組織懸濁液を調製し、組織懸濁液を繰り返して３回にかけて凍結融解させた後、１２０００ｒ／ｍｉｎ下で１５ｍｉｎ遠心し、上清液を収集し、上清液を０．２２μm膜フィルターを経てさらに濾過し、ろ液をＰＫ１５細胞上で継代させて、３７℃で１ｈ培養し、２％仔ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培養液を入れ替えるように加え、３７℃に置いて５日間培養する。ウイルスを含有する培養液を収穫し、培養液を２回にかけて凍結融解させた後、ウイルスを収穫する。
【００６７】
３．ＰＣＲ及びシークエンシング解析によるウイルス種の同定
上記のステップにおけるウイルス培養物を取って、核酸抽出試薬キットを用いてウイルスサンプルの核酸を抽出し、サーコウイルス種の特異的プライマーを使ってＰＣＲ増幅同定を行い、その結果、２０００ｂｐターゲットバンドをＰＣＲ増幅されたことが示された。ＰＣＲ生成物をシークエンシング社に送ってヌクレオチド配列決定を行い、配列決定結果に対して遺伝進化解析を行った。その結果、当該ウイルス株の全ゲノム配列及びアミノ酸配列は、既に報道された他のサーコウイルスとのホモロジーがいずれも５０％より小さいことが示された。然しながら、国際ウイルス学分類委員会の標準によると、サーコウイルス属における同一種類のウイルスは７５％より大きいゲノムヌクレオチド配列のホモロジーを有し、Ｃａｐタンパク質は７０％より大きいアミノ酸配列のホモロジーを有するべきである。これにより、当該ウイルスは新たな豚サーコウイルスであることが確定でき、目前豚の体で発見された第３の種類のサーコウイルスでもある。
【００６８】
［実施例２］  ｐＥＴ２８ａ−ＰＣＶ３-Ｃａｐ発現担体の構築
１．ＰＣＶ３ウイルスＤＮＡの抽出
プラスミド抽出キットは中国天根生物社から入手可能であり、Ｔ４  ＤＮＡ  ＬｉｇａｓｅはＢｉｏＬａｂ社から入手可能であり、ｐＥＴ２８ａプラスミドはＮｏｖａｇｅｎ社から入手可能であり、アガロースゲル抽出キットは中国天澤生物社から入手可能であり、他の試薬はいずれも分析グレードである。
【００６９】
ウイルスＤＮＡ抽出キット明細書に従って、０.２ｍｌの豚サーコウイルス３型ウイルス液を無菌の１.５ｍｌの遠沈管に入れ、０.４ｍｌのＶＢ溶液をウイルス液に加え、渦流混合させて、室温で１０分間静置する。０.４５ｍｌのＡＤ  ｂｕｆｆｅｒ（バッファ）をウイルス液に加え、力を入れて均一に混ぜ合わせる。ＶＢカラムを２ｍｌの収集管に入れ、０.６ｍｌの上記の試薬が混合されたウイルス液を取ってＶＢカラムに加え、１４０００ｇで１分間遠心して、残りの上記の試薬が混合されたウイルス液をさらにＶＢカラムに加え、１４０００ｇで１分間遠心し、２ｍｌ収集管を廃棄し、ＶＢカラムを新たな２ｍｌ収集管に入れ、０.４ｍｌのＷ１  ｂｕｆｆｅｒを加え、１４０００ｇで３０秒間遠心してから、０.６ｍｌのＷａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ（洗浄バッファ）をさらにＶＢカラムに加え、１４０００ｇで３０秒間遠心した後、ｂｕｆｆｅｒ（バッファ）を加えずに再びそのまま置いて３分間遠心し、当該ＶＢカラムを新たな１.５ｍｌ  ＥＰ管に入れ、５０μｌのＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ（ＲＮａｓｅフリー水）を加えてフィルムの中心に置いて３分間静置し、１４０００ｇで１分間遠心し、ＥＰ管内で遠心して分離された液体は豚サーコウイルス３型ウイルスＤＮＡゲノム溶液である。
【００７０】
２．Ｃａｐ遺伝子の増幅
Ｃａｐ遺伝子５′及び３′末端の保存領域配列に従ってオリゴデオキシヌクレオチドプライマーを合成し、ＰＣＲを行う。プライマー配列は表１を参照する。
【表１】
0006882602.tif 000002
【００７１】
ＰＣＲ生成物をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社に送ってシークエンシングを行い、その結果に基づいてＣａｐ遺伝子に対してコドン最適化を行い、最適化されたＣａｐ遺伝子配列は配列表ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１が示す通りである。
【００７２】
３．発現担体構築
最適化されたＣａｐ遺伝子を中国蘇州泓迅生物科技股ふん有限公司に送って完全配列合成を行い、ｐＥＴ２８ａプラスミドに連結させる。連結されたプラスミドと分子シャペロンプラスミドｐＧ−Ｔｆ２とを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に共形質転換させ、モノクローンを選んで１００μｇ／ｍｌのカナマイシン及び２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するＬＢ培地で一晩培養して、プラスミドを抽出した後にシークエンシング解析を行い、合成配列が正確であると確定され、陽性クローンはｐＥＴ２８ａ−ＰＣＶ３−Ｃａｐ／ｐＧ−Ｔｆ２発現菌株ｐＥＴ２８ａ−ＰＣＶ３-Ｃａｐ／ｐＧ−Ｔｆ２／Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）である。
【００７３】
［実施例３］  豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質の発現
実施例２で調製されたｐＥＴ２８ａ−ＰＣＶ３-Ｃａｐ／ｐＧ−Ｔｆ２／Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株を５０〜１００μｇ／ｍｌのカナマイシン及び２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するＬＢ培地に接種する。一方、ＬＢ培地に分子シャペロンタンパク質の誘導発現に用いられる５〜１０ｎｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有し、接種量は１％（Ｖ/Ｖ）あり、３７℃で振盪培養する。ＯＤ600＝０.４〜０.６である場合、２８℃で３０分間放置する。イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加えて、その最終濃度が０.１〜１.０ｍＭになるようにし、２８℃で２４時間振盪培養させる。培養が完了した後、菌体を収集し、ＰＢＳ（ＰＢＳ組成成分：塩化ナトリウム８ｇ、塩化カリウム０.２ｇ、りん酸水素二ナトリウム１.４４ｇ、リン酸二水素カリウム０.２４ｇであり、ｐＨが７.４になるように調整し、１Ｌに定容する）で菌体を再懸濁し、超音波破砕を行い、超音波で破砕した後に溶菌液を遠心して上清を取る。発現生成物の中の可溶性標的タンパク質の含有量は比較的に高く、発現量は菌体タンパク質の総量の２５％に達し得、エンドトキシンの含有量は０.２８×１０5ＥＵ／ｍｌである。
【００７４】
［実施例４］  大腸菌発現豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質のエンドトキシン除去
１.５ｍｌ遠沈管に０.５ｍｌの可溶性Ｃａｐタンパク質を含有する処理すべき上清液及び最終濃度が１％（Ｖ/Ｖ）であるトリトンＸ−１１４（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４）（添加量は５μlである）を加え、渦流振盪を行う。渦流振盪により均一に混ぜ合わせられたサンプルを氷上で５分間放置する。サンプルが冷却された後、遠沈管を直ちに３７℃水浴に入れて５ｍｉｎ温浴させて、新たな二相を形成させる。そして、サンプルを３７℃の温度条件下で６０ｓ遠心させる。遠心の後、標的タンパク質は上層に残る一方、エンドトキシンを含有する非イオン界面活性剤は油滴の形状で遠沈管の底部に残留し、これにより二相が分離される。上記のエンドトキシンを除去する全体の操作は３回循環される。最終的な純化生成物を測定した結果、タンパク質純度は低下せず、エンドトキシン含有量は０.００８×１０5ＥＵ／ｍｌに低下する。一方、２００ＫＶ透過型電子顕微鏡により６００００倍まで拡大させて、５％リンタングステン酸ネガティブ染色を経て炭素が噴射された銅メッシュ上に固定されたＰＣＶ３ウイルス様粒子を観察した結果、多量のウイルス様粒子が示され、且つ大きさが均一で、中空粒子状態を呈した。
【００７５】
実験を行った結果、トリトンＸ−１１４（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４）は、組み換えタンパク質の中に残留するエンドトキシンを除去でき、タンパク質の純度に影響を与えず、且つＰＣＶ３ウイルス様粒子の形成及び安定な形態にも影響を与えていないことが示された。
【００７６】
［実施例５］  豚サーコウイルス２型の分離・同定
１．病理材料の由来
中国国内の一免疫商品化ＰＣＶ２ワクチンの養豚場で、母豚が流産し、ミイラ変性胎子が増加する現象が散発的に起こった。影響を受けた母豚は、拒食現象を現し、流産した巣に異なる在胎週数のミイラ変性胎子を含有し、ＰＣＶ２関連流産の症状と一致している。免疫組織化及び定量ＰＣＲ検査を行った結果、ＰＣＶ２陽性であった。ＰＣＶ２商品化ワクチンで免疫した後でも依然として発病豚組織からＰＣＶ２が検出されたため、その原因は深く究明するに値する。さらに原因を究明するために、各組織の病理材料を選び取って病原分離を行った。
【００７７】
２．ウイルス株の分離及び培養
病理材料を１：１０（体積比）でＤＭＥＭ培養液に加え、研磨して、組織懸濁液を調製し、組織懸濁液を繰り返して３回にかけて凍結融解させた後、１２０００ｒ／ｍｉｎ下で１５ｍｉｎ遠心し、上清液を収集し、上清液を０．２２μm膜フィルターを経てさらに濾過し、ろ液をＰＫ１５細胞上で継代させて、３７℃で１ｈ培養し、２％仔ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培養液を入れ替えるように加え、３７℃に置いて５日間培養する。ウイルスを含有する培養液を収穫し、培養液を２回にかけて凍結融解させた後、ウイルスを収穫する。
【００７８】
３．ＰＣＲ及びシークエンシング解析によるウイルスの同定
上記のステップで収穫されたウイルス培養物を取って、核酸抽出試薬キットを用いてウイルスサンプルの核酸を抽出し、ＰＣＶ２の特異的プライマーを使ってＰＣＲ増幅同定を行い、その結果、１.７ｋｂターゲットバンドをＰＣＲ増幅されたことが示された。ＰＣＲ生成物をシークエンシング社に送ってヌクレオチド配列決定を行い、配列決定結果に対して遺伝進化解析を行った。その結果、当該ウイルス株の全ゲノム配列は、既に報道された他のＰＣＶ２とのホモロジーがいずれも９６％より小さく、アミノ酸配列は９４％より小さいということが示された。全ゲノム配列解析により、当該ウイルス株はＰＣＶ２ｂとＰＣＶ２ｄの間に介在し、ＯＲＦ２遺伝子の中に突然変異が存在するか、又は異なる遺伝子サブタイプのＯＲＦ２遺伝子の間での組み換えを経て生じたものであることをさらに示している。遺伝進化解析を行った結果、当該ウイルスは新たなＰＣＶ２遺伝子サブタイプに属すると確定された。
【００７９】
［実施例６］  ｐＥＴ２８ａ−ＰＣＶ２-Ｃａｐ発現担体の構築
１．ＰＣＶ２ウイルスＤＮＡの抽出
プラスミド抽出キットは中国天根生物社から入手可能であり、Ｔ４  ＤＮＡ  ＬｉｇａｓｅはＢｉｏＬａｂ社から入手可能であり、ｐＥＴ２８ａプラスミドはＮｏｖａｇｅｎ社から入手可能であり、アガロースゲル抽出キットは中国天澤生物社から入手可能であり、他の試薬はいずれも分析グレードである。
【００８０】
ウイルスＤＮＡ抽出キット明細書に従って、実施例２に係る方法を参照しながら０.２ｍｌの新たな豚サーコウイルス２型ウイルス液を取ってＤＮＡゲノムを抽出する。
【００８１】
２．豚サーコウイルス２型Ｃａｐ遺伝子の増幅
Ｃａｐ遺伝子５′及び３′末端の保存領域配列に従ってオリゴデオキシヌクレオチドプライマーを合成し、ＰＣＲを行う。プライマー配列は表２を参照する。
【表２】
0006882602.tif 000003
【００８２】
ＰＣＲ生成物をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社に送ってシークエンシングを行い、その結果、先行技術に係るＰＣＶ２のＣａｐタンパク質アミノ酸配列に比べ、Ｃａｐ遺伝子コーディングのアミノ酸配列は５２〜６４ビット、１０６〜１０８ビット、及び１３１〜１３７ビットで遺伝子突然変異又は組み換えが発生したことが示された。その結果に基づいてＣａｐ遺伝子に対してコドン最適化を行い、最適化されたＣａｐ遺伝子配列は配列表ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２が示す通りである。
【００８３】
３．発現担体構築
最適化されたＣａｐ遺伝子を中国蘇州泓迅生物科技股ふん有限公司に送って完全配列合成を行い、ｐＥＴ２８ａプラスミドに連結させる。連結されたプラスミドと分子シャペロンプラスミドｐＧ−Ｔｆ２とを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に共形質転換させ、モノクローンを選んで１００μｇ／ｍｌのカナマイシン及び２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するＬＢ培地で一晩培養して、プラスミドを抽出した後にシークエンシング解析を行い、合成配列が正確であると確定され、陽性クローンはｐＥＴ２８ａ−ＰＣＶ２-Ｃａｐ／ｐＧ−Ｔｆ２発現菌株ｐＥＴ２８ａ−ＰＣＶ２-Ｃａｐ／ｐＧ−Ｔｆ２／Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）である。
【００８４】
［実施例７］  豚サーコウイルス２型Ｃａｐタンパク質の発現
実施例６で調製されたｐＥＴ２８ａ−ＰＣＶ２-Ｃａｐ／ｐＧ−Ｔｆ２／Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株に対して、実施例３を参照しながらタンパク質誘導発現を行う。発現生成物の中の可溶性標的タンパク質の含有量は比較的に高く、発現量は菌体タンパク質の総量の５０％に達し得、エンドトキシンの含有量は０.２６×１０5ＥＵ／ｍｌである。
【００８５】
［実施例８］  大腸菌発現Ｃａｐタンパク質のエンドトキシン除去
実施例７で発現された可溶性Ｃａｐタンパク質を含有する上清液に対して、実施例４を参照しながらエンドトキシン除去を行う。測定を行った結果、タンパク質純度は低下せず、エンドトキシン含有量は０.００８×１０5ＥＵ／ｍｌに低下した。一方、２００ＫＶ透過型電子顕微鏡により６００００倍まで拡大させて、５％リンタングステン酸ネガティブ染色を経て炭素が噴射された銅メッシュ上に固定されたＰＣＶ２ウイルス様粒子を観察した結果、多量のウイルス様粒子が示され、且つ大きさが均一で、中空粒子状態を呈した。
【００８６】
その結果、トリトンＸ−１１４（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４）は、組み換えタンパク質の中に残留するエンドトキシンを除去でき、タンパク質の純度に影響を与えず、且つ、ＰＣＶ２ウイルス様粒子の形成及び安定な形態にも影響を与えていないことが示された。
【００８７】
［実施例９］  豚サーコウイルス３型、豚サーコウイルス２型免疫原性組成物の調製
実施例４に従って純化された豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質及び実施例８に従って純化された豚サーコウイルス２型Ｃａｐタンパク質を比率によって混合した後、水溶性アジュバントＧｅｌアジュバント（フランスＳＥＰＰＩＣ社）の中にゆっくり加え、加える過程で絶え間なく回転数が８００ｒｐｍである乳化機で１２ｍｉｎ撹拌して均一に混ぜ合わせる。免疫原性組成物の具体的な配合比率は表３を参照する。
【表３】
0006882602.tif 000004
【００８８】
［実施例１０］  豚サーコウイルス３型及び豚サーコウイルス２型である抗原をを含有する免疫原性組成物の免疫原性試験
２８〜３０日齢の、ＥＬＩＳＡ測定を行った結果、ＰＣＶ２抗原、ＰＣＶ３抗原及び抗体が陰性である健康な仔豚６０匹を５匹／群になるようにランダムに12の群に分け、実施例９で調製された豚サーコウイルス３型及び２型である免疫原性組成物で免疫する。第１〜２の群は組成物１で免疫し、第３〜４の群は組成物２で免疫し、第５〜６の群は組成物３で免疫し、第７〜８の群はそれぞれ組成物４で免疫し、第９〜１０の群はそれぞれ原性組成物５及び組成物６で免疫し、第１１〜１２の群は免疫せずにウイルスチャレンジすることである比較群とする。各免疫群は免疫原性組成物を２ｍｌ／匹を注射し、比較群はＤＭＥＭ培地を２ｍｌ／匹を接種する。免疫後２８日目にウイルスチャレンジを行い、第１の群、第３の群、第５の群、第７の群、第９の群、第１１の群を豚サーコウイルス３型ＳＧ株（Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ３、Ｓｔｒａｉｎ  ＳＧ、中国典型培養物保蔵センターに寄託され、寄託番号はＣＣＴＣＣ  ＮＯ．Ｖ２０１７１２であり、寄託日付は２０１７年３月２３日であり、寄託住所は中国武漢・武漢大学である）でウイルスチャレンジし、ウイルスチャレンジの分量はいずれも１０5.0ＴＣＩＤ50／匹である。第２の群、第４の群、第６の群、第８の群、第１０の群、第１２の群を豚サーコウイルス２型ＨＨ３株（Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ２、Ｓｔｒａｉｎ  ＨＨ３、中国典型培養物保蔵センターに寄託され、寄託番号はＣＣＴＣＣ  ＮＯ．Ｖ２０１７２６であり、寄託日付は２０１７年６月４日であり、寄託住所は中国武漢・武漢大学である）でウイルスチャレンジし、ウイルスチャレンジの分量はいずれも１０5.0ＴＣＩＤ50／匹である。ウイルスチャレンジ後、各々の仔豚を連続して観察し、各々の仔豚の臨床症状、病理変化及びウイルス検査結果に基づいて判定を行い、その具体的な結果は表４を参照する。
【表４】
0006882602.tif 000005
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【００８９】
その結果、豚サーコウイルス３型及び２型である抗原を含有する免疫原性組成物は、仔豚を一回免疫した後、仔豚に１００％（５／５）防御を行うことができる一方、ウイルスチャレンジ比較群の仔豚はウイルスチャレンジ後に全て罹患したことが示された。これは、本発明に係る豚サーコウイルス３型及び２型である抗原を含有する免疫原性組成物がかなり良い防御能力を有することを示している。且つ、本発明に係る異なる含有量の豚サーコウイルス３型及び２型である抗原を含有する免疫原性組成物は、免疫ウイルスチャレンジ後、豚の体内でいずれもウイルスが検出できず、これは、本発明に係る免疫原性組成物で免疫した後、たとえ免疫後の豚が野生型ウイルスに感染しても、豚の発育成長並びに摂食及び体重増加に影響をもたらすことがないことを示した。
【００９０】
［実施例１１］  豚サーコウイルス３型及び豚サーコウイルス２型である抗原を含有する免疫原性組成物の広範囲性防御試験
２８〜３０日齢の、ＥＬＩＳＡ検査を行った結果、ＰＣＶ２抗原、ＰＣＶ３抗原及び抗体が陰性である健康な仔豚１００匹を５匹／群になるようにランダムに２０の群に分け、第１３〜２２の群は実施例９で調製された免疫原性組成物１で免疫し、第２３〜３２の群は免疫せずにウイルスチャレンジすることである比較群とする。各免疫群は免疫原性組成物を２ｍｌ／匹を注射し、ウイルスチャレンジ比較群はＤＭＥＭ培地を２ｍｌ／匹を接種する。免疫後２８日目にウイルスチャレンジを行い、第１３の群及び第２３の群は最近中国河南省から分離された豚サーコウイルス２a遺伝子サブタイプＨＮ０６株の強毒性のウイルス株でウイルスチャレンジし、第１４の群及び第２４の群は最近中国江蘇省から分離された豚サーコウイルス２b遺伝子サブタイプＪＳ０４株の強毒性のウイルス株でウイルスチャレンジし、第１５の群及び第２５の群は最近中国吉林省から分離された豚サーコウイルス２ｄ遺伝子サブタイプＪＬ１３株の強毒性のウイルス株でウイルスチャレンジし、第１６の群及び第２６の群は最近中国重慶市から分離された豚サーコウイルス２新（ｎｅｗ）遺伝子サブタイプＣＱ１４株の強毒性のウイルス株でウイルスチャレンジし、第１７の群及び第２７の群は最近中国広東省から分離された豚サーコウイルス２新（ｎｅｗ）遺伝子サブタイプＧＤ１５株の強毒性のウイルス株でウイルスチャレンジし、第１８の群及び第２８の群は最近中国河南省から分離された豚サーコウイルス３型ＨＮ１２株の強毒性のウイルス株でウイルスチャレンジし、第１９の群及び第２９の群は最近中国江蘇省から分離された豚サーコウイルス３型ＪＳ０８株の強毒性のウイルス株でウイルスチャレンジし、第２０の群及び第３０の群は最近中国吉林省から分離された豚サーコウイルス３型ＪＬ１１株の強毒性のウイルス株でウイルスチャレンジし、第２１の群及び第３１の群は最近中国重慶市から分離された豚サーコウイルス３型ＣＱ０４株の強毒性のウイルス株でウイルスチャレンジし、第２２の群及び第３２の群は最近中国広東省から分離された豚サーコウイルス３型ＧＤ０５株の強毒性のウイルス株でウイルスチャレンジし、ウイルスチャレンジの分量は１０5.0ＴＣＩＤ50／匹である。ウイルスチャレンジ後、各々の仔豚を連続して観察し、各々の仔豚の臨床症状、病理変化及びウイルス検査に基づいて判定を行う。その具体的な結果は、表５乃至表６を参照する。
【表５】
0006882602.tif 000007
0006882602.tif 000008
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【００９１】
その結果、ウイルスチャレンジ比較群である第２３〜２７の群はウイルスチャレンジ後にいずれも異なる程度に体温が４０．５℃以上に上昇し、３〜５日間持続し、食欲が減退し、気分が沈み、被毛が乱雑で、痩せ細り及び成長速度が減速する等の臨床症状が現れ、剖検でいずれも異なる程度に肺硬変、リンパ腫大、腎臓に壊死箇所有りの病理変化が現れたことが示された。各内臓及び器官組織に対してＰＣＲ検査を行うことで、豚サーコウイルス２型ウイルスを再度分離できた一方、免疫群である第１３〜１７の群はウイルスチャレンジ後に異常臨床症状がなく、剖検でも各組織器官に異常がなく、各内臓及び器官組織に対してＰＣＲ検査を行った結果、いずれもＰＣＶ２陰性を呈した。実験結果は、本発明に係る豚サーコウイルス３型及び２型である抗原を含有する免疫原性組成物は、一回の免疫で、豚に対して異なる地域由来及び異なる遺伝子サブタイプの豚サーコウイルス２型からの攻撃を効果的で完全に免疫防御をすることができ、且つ、各内臓及び器官組織からウイルスチャレンジしたＰＣＶ２を検出できないことを示している。
【表６】
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【００９２】
その結果、ウイルスチャレンジ比較群である第２８〜３２の群はウイルスチャレンジ後にいずれも異なる程度に体温が４０．５℃以上に上昇し、３〜５日間持続し、食欲が減退し、気分が沈み、被毛が乱雑で、痩せ細り及び成長速度が減速する等の臨床症状が現れ、剖検でいずれも異なる程度に肺硬変、リンパ腫大、腎臓に壊死箇所有りの病理変化が現れたことが示された。各内臓及び器官組織に対してＰＣＲ検査を行うことで、豚サーコウイルス３型ウイルスを再度分離できた一方、免疫群である第１８〜２２の群はウイルスチャレンジ後に異常臨床症状がなく、剖検でも各組織器官に異常がなく、各内臓及び器官組織に対してＰＣＲ検査を行った結果、いずれもＰＣＶ３陰性を呈した。実験結果は、本発明に係る豚サーコウイルス３型及び２型である抗原を含有する免疫原性組成物は、豚に対して異なる地域由来の豚サーコウイルス３型からの攻撃を効果的で完全に免疫防御をすることができ、且つ、各内臓及び器官組織からウイルスチャレンジしたＰＣＶ３株を検出できないことを示している。これは、本発明に係る免疫原性組成物は、広範囲の免疫原性を有し、流行する豚サーコウイルス３型及び２型の野生型ウイルに対していずれも完全に防御することができることを示している。且つ、本発明に係る免疫原性組成物で免疫した後、たとえ免疫した豚が野生型ウイルスに感染しても、豚の発育成長並びに摂食及び体重増加に影響をもたらすことがない。
【００９３】
［実施例１２］  豚サーコウイルス３型及び２型である抗原を含有する免疫原性組成物による混合感染の防御試験
２８〜３０日齢の、ＥＬＩＳＡ検査を行った結果、ＰＣＶ２抗原、ＰＣＶ３抗原及び抗体が陰性である健康な仔豚２０匹を５匹／群になるようにランダムに四つの群に分ける。第３３の群は実施例９で調製された免疫原性組成物１で免疫し、第３４の群は実施例９で調製された免疫原性組成物５で免疫し、第３５の群は実施例９で調製された免疫原性組成物６で免疫し、第３６の群は免疫せずにウイルスチャレンジすることである比較群とする。各免疫群は免疫原性組成物を２ｍｌ／匹を注射し、比較群はＤＭＥＭ培地を２ｍｌ／匹を接種する。免疫後２８日目にウイルスチャレンジを行い、全ての群を豚サーコウイルス３型ＳＧ株と豚サーコウイルス２型ＨＨ３株との混合ウイルス液でウイルスチャレンジし、ウイルスチャレンジの分量は１０5.0ＴＣＩＤ50／匹である。ウイルスチャレンジ後、各々の仔豚を連続して観察し、各々の仔豚の臨床症状、病理変化結果に基づいて判定を行う。その具体的な結果は、表７を参照する。
【表７】
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【００９４】
その結果、ウイルスチャレンジ比較群である第３６の群はウイルスチャレンジ後にいずれも異なる程度に体温が４０．５℃以上に上昇し、５日間持続し、食欲が減退し、気分が沈み、被毛が乱雑で、痩せ細り及び成長速度が減速する等の臨床症状が現れ、剖検でいずれも異なる程度に肺硬変、リンパ腫大、腎臓に壊死箇所有りの病理変化が現れ、免疫群である第３３の群はウイルスチャレンジ後に異常臨床症状がなく、剖検でも各組織器官に異常がなかった一方、免疫群である第３４の群及び第３５の群はＰＣＶ２及びＰＣＶ３の混合感染を効果的に防御できず、依然として発病状態を呈することが示された。実験結果は、本発明に係る豚サーコウイルス３型及び２型抗原を含有する免疫原性組成物は、一回の免疫で、豚に対してＰＣＶ２及びＰＣＶ３からの連合攻撃を効果的で完全に免疫防御をすることができることを示している。
【００９５】
［実施例１３］  豚サーコウイルス３型及び２型である抗原を含有する免疫原性組成物の応用試験
中国国内の一商品化養豚場で、従来の平均値に比べ、母豚の死亡率が９．８％増加し、受胎率が１．２％低下し、ミイラ変性胎子が８．６％増加する現象が現れた。臨床表現的に、影響を受けた母豚は、拒食現象を現し、多巣状丘疹、斑点及び表面皮膚炎の症状を呈した。流産した巣に異なる在胎週数のミイラ変性胎子を含有している。臨床表現症状のある母豚から３２匹の妊娠した母豚を選んで、１６匹／群になるようにランダムにＡ群及びＢ群の二つの群に分ける。Ａ群は、免疫原性組成物接種群であり、Ａ群は実施例９で調製された免疫原性組成物１で免疫し、Ｂ群はブランクとして比較群である。免疫群に免疫原性組成物２ｍｌ／匹を注射し、ブランクである比較群にＤＭＥＭ培地を２ｍｌ／匹を接種する。２つの群の母豚の仔豚生産状況を統計し、その結果は表８を参照する。
【表８】
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【００９６】
その結果、免疫群の母豚の仔豚生産に異常がなく、健康な仔豚を生産し、平均的に１１．７匹／巣生産し、健康率は最大９９．５％である一方、ブランクである比較群は明らかなミイラ変性胎子及び虚弱仔豚の状況が現れ、健康な仔豚を平均的に６．９匹／巣生産し、健康率は５９．０％であり、そのうち、３匹の母豚は流産状況が起こり、巣全体ミイラ変性胎子であり、免疫群とブランクである比較群の差異は顕著であることが示された。
【００９７】
表８の結果は、本発明に係る豚サーコウイルス３型及び２型である抗原を含有する免疫原性組成物は、豚サーコウイルスに感染した母豚に対して良好な免疫防御する役割を有し、且つ既にＰＣＶに感染した母豚を防御を行うことができ、即ち治療の役割を有することを説明している。
【００９８】
一方、比較群であるＢ群が産んだ仔豚をそれぞれ隔離させて巣毎に飼育し、１３巣をＢ１群（Ｂ−１巣乃至Ｂ−１１巣を含み、Ｂ−５巣は巣全体ミイラ変性胎子であるため計算に入れない以外、合計１０巣の仔豚）、Ｂ２群（Ｂ−１２乃至Ｂ−１６巣を含み、Ｂ−１４巣及びＢ−１６巣は巣全体ミイラ変性胎子であるため計算に入れない以外、合計３巣の仔豚）の二つの群に分ける。Ｂ１群は母乳を飲む前に実施例９で調製された免疫原性組成物１で免疫し、Ｂ２群はブランクとして比較群である。免疫群は免疫原性組成物を２ｍｌ／匹を注射し、ブランクである比較群はＤＭＥＭ培地を２ｍｌ／匹を接種する。各々の仔豚を連続して観察し、各々の仔豚の臨床症状、病理変化及びウイルス検査に基づいて判定を行い、その具体的な結果は表９を参照。
【表９】
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【００９９】
その結果、免疫群の仔豚は、異常臨床症状がなく、各組織器官をランダムに剖検した結果、同じく異常がなく、豚の各内臓及び器官組織を剖検してＰＣＲ検査を行った結果、いずれもＰＣＶ３及びＰＣＶ２陰性を呈した一方、ブランクである比較群の仔豚はいずれも異なる程度に体温が４０．５℃以上に上昇し、５日間持続し、食欲が減退し、気分が沈み、被毛が乱雑で、痩せ細り及び成長速度が減速する等の臨床症状が現れ、一部の豚は死亡し、剖検でいずれも異なる程度に肺硬変、リンパ腫大、腎臓に壊死の箇所有りの病理変化が現れたことが示された。各内臓及び器官組織に対してＰＣＲ検査を行うことで、豚サーコウイルス３型及び豚サーコウイルス２型であるウイルスを再度分離できた。
【０１００】
ＰＣＶは豚の群の中で垂直感染されることが可能であるため、表９の結果は、本発明に係る豚サーコウイルス３型及び２型である抗原を含有する免疫原性組成物は、豚サーコウイルス３型及び２型に混合感染した仔豚に対して良好な免疫防御する役割を有し、且つ既にＰＣＶ３及びＰＣＶ２ウイルスに混合感染した仔豚に対して防御を行うことができ、即ち治療の役割を有し、防御率は１００％であることを説明している。
【０１０１】
以上の記載は、単に本発明の好ましい実施例であり、本発明に対するいかなる形式的な制限も行わない。好ましい実施例として本発明を以上のように開示したが、本発明を限定するものではない。本分野における当業者であれば、本発明の技術方案を逸脱しない範囲で、上記のように開示された技術内容を利用して変更又は修飾を同等変化とする若干の等価実施例を実施することができるが、本発明の技術方案を逸脱せずに本発明の技術実質に基づいて上記の実施例に対して行われるいかなる簡単な修正、同等変化及び修飾は、全て依然として本発明の技術方案の範囲内に属する。
【配列表】
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