(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列内の３１３番目の位置でアルギニンへの置換、及び１７６番目の位置でアスパラギン、トリプトファン、ヒスチジン及びグリシンからなる群から選択されるアミノ酸への置換を含む、Ｏ−スクシニルホモセリントランスフェラーゼ（O-succinyl homoserine transferase）活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、配列番号６３、配列番号７５、配列番号９５及び配列番号９７のアミノ酸配列からなる群から選択される少なくともいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＯ−スクシニルホモセリントランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載のＯ−スクシニルホモセリントランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号６４、配列番号７６、配列番号９６及び配列番号９８の核酸配列からなる群から選択される少なくともいずれか１つの配列を含む、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１に記載のＯ−スクシニルホモセリントランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドまたはその変異体ポリペプチドが含まれるかまたは過発現された、Ｏ−スクシニルホモセリンを生産するコリネバクテリウム（corynebacterium）属微生物。
【請求項６】
前記コリネバクテリウム属微生物において、アスパルトキナーゼ（aspartokinase）活性が非変異微生物に比べてさらに強化された、請求項５に記載のＯ−スクシニルホモセリンを生産するコリネバクテリウム属微生物。
【請求項７】
前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム（corynebacterium glutamicum）である、請求項５に記載のＯ−スクシニルホモセリンを生産するコリネバクテリウム属微生物。
【請求項８】
前記コリネバクテリウム属微生物において、シスタチオニンシンターゼ（cystathionine synthase）、Ｏ−アセチルホモセリン（チオール）リアーゼ、及びホモセリンキナーゼからなる群から選択される少なくとも１つ以上の活性が不活性化された、請求項５に記載のＯ−スクシニルホモセリンを生産するコリネバクテリウム属微生物。
【請求項９】
前記コリネバクテリウム属微生物において、アスパルトキナーゼ（aspartokinase）活性が非変異微生物に比べてさらに強化され、シスタチオニンシンターゼ（cystathionine synthase）、Ｏ−アセチルホモセリン（チオール）リアーゼ、及びホモセリンキナーゼからなる群から選択される少なくとも１つ以上の活性が不活性化された、請求項５に記載のＯ−スクシニルホモセリンを生産するコリネバクテリウム属微生物。
【請求項１０】
請求項５〜９のいずれか一項に記載のＯ−スクシニルホモセリンを生産するコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階；及び
前記培養する段階で培養された微生物または培地からＯ−スクシニルホモセリンを分離または回収する段階を含む、Ｏ−スクシニルホモセリンの生産方法。
【請求項１１】
（ａ）請求項５〜９のいずれか一項に記載のＯ−スクシニルホモセリンを生産するコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階；及び
（ｂ）前記Ｏ−スクシニルホモセリンと硫化物とを反応させる段階を含む、Ｌ−メチオニンの生産方法。
【請求項１２】
前記（ａ）段階で培養された微生物または培地からＯ−スクシニルホモセリンを分離または回収する段階をさらに含む、請求項１１に記載のＬ−メチオニンの生産方法。
【請求項１３】
前記（ｂ）段階でＯ−スクシニルホモセリンと硫化物との反応によって生成されたＬ−メチオニンを分離または回収する段階を含む、請求項１１に記載のＬ−メチオニンの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、Ｏ−スクシニルホモセリントランスフェラーゼ変異体、これをコードするポリヌクレオチド、前記変異体を含む微生物及び前記微生物を用いたＯ−スクシニルホモセリンの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｏ−スクシニルホモセリンは、生体内の必須アミノ酸の一種であるメチオニンの前駆体として作用する。メチオニンは飼料及び食品添加剤だけでなく、輸液剤、医薬品の合成原料として用いられる。
【０００３】
メチオニンは化学合成と生物学的合成を介して生産される。一方、発酵を介して生産したＬ−メチオニン前駆体から酵素転換反応によってＬ−メチオニンを生産する２段階工法（特許文献１）も公知された。
【０００４】
前記の２段階工法では、メチオニン前駆体としてＯ−スクシニルホモセリン（O-succinyl homoserine）とＯ−アセチルホモセリン（O-acetyl homoserine）が用いられ、メチオニンの経済的な大量生産のためにＯ−スクシニルホモセリンを高収率で生産することが非常に重要である。
【０００５】
ｍｅｔＡ遺伝子は、ホモセリン（Homoserine）にスクシニルｃｏＡ（Succinyl-coA）のスクシニル部位（Succinyl group）を結合させてＯ−スクシニルホモセリン（O-succinyl homoserine）を作る酵素であるホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼ（homoserine O-succinyltransferase、ＭｅｔＡ）をコードする遺伝子であって、Ｏ−スクシニルホモセリン生産菌株の開発において最も重要な遺伝子の１つである。
【０００６】
メチオニン生合成経路でシスタチオニンガンマシンターゼ（cystathionine gamma synthase）をコードするｍｅｔＢ遺伝子欠損を介してＯ−スクシニルホモセリンが蓄積される菌株を製作することができる。しかし、Ｏ−スクシニルホモセリン生産菌株は、Ｌ−メチオニン要求性を示す。このような理由から、培地に添加されたメチオニンによってホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼがフィードバック阻害（feedback inhibition）を受けて活性が抑制され、最終的には、高濃度のＯ−スクシニルホモセリンを得ることができなくなる。
【０００７】
従って、従来の多くの特許は、フィードバック調節体系からｍｅｔＡのフィードバック阻害を解除する研究に集中した。しかし、ｍｅｔＡによってコードされるホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼは、野生型タンパク質自体としても安定性が低く、フィードバック解除のために変異が導入されると不安定性がより大きくなる問題点を抱えている。高い生産能を有するＯ−スクシニルホモセリン生産菌株の開発のためには、ｍｅｔＡ遺伝子のフィードバック阻害が除去され、酵素安定性が確保される必要がある。
【０００８】
自然界に存在するほとんどの微生物は、メチオニンを生合成するためにＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンを中間体として用い、一般的には、ＭｅｔＡはＯ−スクシニルホモセリンを、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ（homoserine O-acetyltransferase、ＭｅｔＸ）はＯ−アセチルホモセリンを生成させる。そして、ＭｅｔＸはＭｅｔＡとは異なり、フィードバック阻害を受けず、酵素安定性も高い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２００８／０１３４３２号
【特許文献２】韓国登録特許第０６２００９２号公報
【特許文献３】国際公開第２００６／０６５０９５号
【特許文献４】国際公開第２００９／０９６６８９号
【特許文献５】国際公開第２０１０／０９８６２９号
【特許文献６】韓国登録特許第１０−００５７６８４号公報
【特許文献７】韓国登録特許第０９２４０６５号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8
【非特許文献２】Pearson et al（1988）[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444
【非特許文献３】Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276−277
【非特許文献４】Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453
【非特許文献５】Smith and Waterman, Adv. Appl. Math（1981） 2:482
【非特許文献６】Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353−358（1979）
【非特許文献７】Gribskov et al（1986） Nucl. Acids Res. 14: 6745
【非特許文献８】Appl. Microbiol. Biothcenol.（1999）52:541-545
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らはＯ−スクシニルホモセリンの生産を増加させるために鋭意努力した結果、Ｏ−スクシニルホモセリンを合成する活性を有するタンパク質を発掘することにより、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本出願の一つの目的は、配列番号１のアミノ酸配列内の３１３番目のアミノ酸がアルギニンへの置換、及び１７６番目の位置でグルタミン以外の他のアミノ酸への置換を含む、Ｏ−スクシニルホモセリントランスフェラーゼ（O-succinyl homoserine transferase）活性を有するポリペプチドを提供することにある。
【００１３】
本出願の他の目的は、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することにある。
本出願の別の目的は、前記Ｏ−スクシニルホモセリントランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを含むＯ−スクシニルホモセリンを生産するコリネバクテリウム（corynebacterium）属微生物を提供することにある。
【００１４】
本出願の別の目的は、前記微生物を培地で培養する段階；及び前記培養された微生物または培地からＯ−スクシニルホモセリンを分離または回収する段階を含む、Ｏ−スクシニルホモセリンの生産方法を提供することにある。
【００１５】
本出願の別の目的は、前記微生物を培地で培養する段階；及び前記Ｏ−スクシニルホモセリンと硫化物とを反応させる段階を含む、Ｌ−メチオニンの生産方法を提供することにある。
【発明の効果】
【００１６】
本出願に係る変異されたＯ−スクシニルホモセリントランスフェラーゼタンパク質は、天然型に比べてＯ−スクシニルホモセリン転換活性を増大させるところ、既存の化学合成経路の代替としてより効率的なＯ−スクシニルホモセリンの大量生産に広く活用される。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下では、本出願をさらに詳細に説明する。
一方、本出願で開示される各説明及び実施形態は、それぞれの他の説明及び実施形態にも適用されうる。すなわち、本出願で開示された様々な要素の任意の組み合わせが本出願のカテゴリに属する。また、下記記述される具体的な叙述によって、本出願のカテゴリが制限されることは言えない。
【００１８】
また、当該技術分野の通常の知識を有する者は、通常の実験のみを使用して本出願に記載された本出願の特定様態に対する多数の等価物を認知するか、確認することができる。さらに、これらの同等物は、本出願に含まれるものと意図される。
【００１９】
前記目的を達成するための本出願の一つの様態は、新規なＯ−スクシニルホモセリントランスフェラーゼ（O-succinyl homoserine transferase）活性を有するポリペプチドを提供する。前記新規な変異型ポリペプチドは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）由来のアミノ酸配列、具体的には、配列番号１のアミノ酸配列で３１３番目のアミノ酸がアルギニンに置換され、１７６番目のアミノ酸がグルタミン以外の他のアミノ酸に置換された、Ｏ−スクシニルホモセリントランスフェラーゼ（O-succinyl homoserine transferase）活性を有するポリペプチドであってもよい。また、前記ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列内の３１３番目の位置でアルギニンへの置換、及び１７６番目の位置でグルタミン以外の他のアミノ酸への置換を含み、Ｏ−スクシニルホモセリントランスフェラーゼ（O-succinyl homoserine transferase）活性を有するものであってもよい。より具体的には、前記ポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列で前記１７６番目のアミノ酸がアスパラギン、トリプトファン、ヒスチジンまたはグリシンに置換された、Ｏ−スクシニルホモセリントランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであってもよいが、これに制限されるものではない。
【００２０】
このような変異型ポリペプチドは、配列番号１のＯ−スクシニルホモセリントランスフェラーゼの活性を有するポリペプチドに比べてＯ−スクシニルホモセリントランスフェラーゼ活性が強化された特徴を有する。
【００２１】
本出願において、用語、「Ｏ−スクシニルホモセリントランスフェラーゼ（O-succinyl homoserine transferase）活性」は、ホモセリン（Homoserine）をＯ−スクシニルホモセリン（O-succinyl homoserine）に転換する活性を意味する。前記Ｏ−スクシニルホモセリントランスフェラーゼはスクシニルＣｏＡとＬ−ホモセリンを基質として、ＣｏＡとＯ−スクシニルホモセリンに転換しうる酵素を通称する。
【００２２】
[反応式]
スクシニルＣｏＡ＋Ｌ−ホモセリン⇔ＣｏＡ＋Ｏ−スクシニルホモセリン
本出願でＯ−スクシニルホモセリントランスフェラーゼは、Ｏ−アセチルホモセリントランスフェラーゼであるＭｅｔＸタンパク質のアミノ酸配列の一部を他のアミノ酸に変換してＯ−スクシニルホモセリントランスフェラーゼの活性を有することを意味する。前記ＭｅｔＸタンパク質はコリネバクテリウム属由来のＭｅｔＸであってもよく、より具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）由来の配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するＭｅｔＸであってもよいが、これに制限されない。前記ＭｅｔＸタンパク質は、公知のデータベースであるＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋからその配列を得ることができる。
【００２３】
本出願において、Ｏ−スクシニルホモセリントランスフェラーゼを確保する方法は、当該分野でよく知られている様々な方法が適用可能である。その方法の例としては、酵素発現に通常的に広く用いられるコリネバクテリウム属微生物で酵素を高効率で確保できるようにコドン最適化が含まれた遺伝子合成技術及び微生物の大量遺伝体情報に基づいて生物情報学的方法によって有用酵素資源のスクリーニング方法を介して確保してもよく、これに制限されるものではない。
【００２４】
本出願でＯ−スクシニルホモセリントランスフェラーゼ変異体は、「変異されたＯ−スクシニルホモセリントランスフェラーゼ」または「変異型Ｏ−スクシニルホモセリントランスフェラーゼ」で混用されてもよい。一方、このような変異体は、非自然的な（non-naturally occurring）ものであってもよい。
【００２５】
本出願の変異されたＯ−スクシニルホモセリントランスフェラーゼは、具体的には、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するコリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）由来のＭｅｔＸのＮ末端から３１３番目のアミノ酸残基がアルギニンに置換され、１７６番目のアミノ酸がグルタミン以外の他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含むものであってもよい。具体的には、前記１７６番目のグルタミンのアミノ酸残基がアスパラギン、トリプトファン、ヒスチジンまたはグリシンに置換されたものであってもよいが、これに制限されない。本出願の変異されたＯ−スクシニルホモセリントランスフェラーゼは、配列番号１に記載されたアミノ酸配列のＮ末端から３１３番目及び／または１７６番目の位置に変異を含むポリペプチドを含み；前記３１３番目の位置の変異はアルギニンへのアミノ酸置換、及び／または１７６番目の位置の変異はアスパラギン、トリプトファン、ヒスチジン及びグリシンからなる群から選択されるアミノ酸置換を含み；前記ポリペプチドは、配列番号１と少なくとも８５％以上の相同性または同一性を有するものであってもよいが、これに制限されない。
【００２６】
また、本出願のＯ−スクシニルホモセリントランスフェラーゼ（O-succinyl homoserine transferase）活性を有するポリペプチドは、配列番号６３、配列番号７５、配列番号９５及び配列番号９７からなる群から選択される少なくともいずれか１つのアミノ酸配列で構成されるものであってもよい。具体的には、これは配列番号１のＮ末端から３１３番目のアミノ酸がアルギニン（arginine）に、１７６番目のアミノ酸がアスパラギン（asparagine）、トリプトファン（tryptophan）、ヒスチジン（histidine）またはグリシン（glycine）に変異されたＯ−スクシニルホモセリントランスフェラーゼ（O-succinyl homoserine transferase）活性を有するポリペプチドに対するアミノ酸配列であってもよいが、これに制限されるものではない。前記変異を含み、野生型よりも優れたＯ−スクシニルホモセリン転換活性を有する以上、前記配列と５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％以上の相同性または同一性を有するポリペプチドを制限なく含んでもよい。
【００２７】
また、本出願でのＭｅｔＸは、配列番号１のアミノ酸配列またはこれと８０%以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列で構成されるＭｅｔＸタンパク質であってもよいが、これに制限されるものではない。具体的には、本出願の前記ＭｅｔＸタンパク質は、配列番号１及び前記配列番号１と少なくとも８０％以上、８５％以上、具体的には、９０％以上、より具体的には、９５％以上、さらに具体的には、９９％以上の相同性または同一性を示すタンパク質を含んでもよい。
【００２８】
本出願において、用語、ポリペプチド「変異型（variant）」は、１つ以上のアミノ酸が保存的置換（conservative substitution）及び／または変更（modification）において、前記列挙された配列（the recited sequence）と相異するが、前記ポリペプチドの機能（functions）または特性（properties）が維持されるポリペプチドを称する。変異型ポリペプチドは、数個のアミノ酸置換、欠失または付加によって識別される配列（identified sequence）と相異する。これらの変異型は、一般的に前記ポリペプチド配列のいずれかを変更し、前記変更されたポリペプチドの特性を評価して識別されうる。つまり、変異型の能力は本来のタンパク質（native protein）に比べて増加したり、変わらなかったり、または減少しうる。これらの変異型は、一般的に前記ポリペプチド配列のいずれかを変更して、変更されたポリペプチドの反応性を評価して識別されうる。また、一部の変異型は、Ｎ末端リーダー配列または膜転移ドメイン（transmembrane domain）などの１つ以上の部分が除去された変異型を含んでもよい。他の変異型は、成熟タンパク質（mature protein）のＮ末端及び／またはＣ末端から一部が除去された変異型を含んでもよい。前記用語、「変異型」は、変異体、変更、変異されたタンパク質、変異型ポリペプチド、変異などの用語（英語表現では、modification、modified protein、modified polypeptide、mutant、mutein、divergentなど）が用いられてもよく、変異された意味で用いられる用語であれば、これに制限されない。具体的には、前記変異型はコリネバクテリウム・グルタミカム由来のＯ−スクシニルホモセリントランスフェラーゼのアミノ酸が変異され、その活性が野生型と比較して効率的に増加されうる変異型を含む。
【００２９】
本出願において、用語、「保存的置換（conservative substitution）」は、１つのアミノ酸を類似の構造的及び／または化学的性質を有する別のアミノ酸に置換させることを意味する。前記変異型は、１つ以上の生物学的活性を依然として保有しながら、例えば、１つ以上の保存的置換を有してもよい。これらのアミノ酸置換は、一般的に残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒性（amphipathic nature）での類似性に基づいて発生しうる。例えば、陽に荷電された（塩基性）（Positively charged（basic））のアミノ酸は、アルギニン、リジン、及びヒスチジンを含み；陰に荷電された（酸性）（negatively charged（acidic））のアミノ酸は、グルタミン酸及びアスパラギン酸を含み；芳香族アミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンを含み；疎水性アミノ酸は、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンを含む。通常的に、保存性置換は生成されたポリペプチドの活性にほとんど影響を与えないか、または影響を及ぼさない。
【００３０】
また、変異型はポリペプチドの特性と２次構造に最小限の影響を有するアミノ酸の欠失または付加を含む他の変更を含んでもよい。例えば、ポリペプチドは翻訳と同時に（co-translationally）または翻訳後に（post-translationally）タンパク質の転移（transfer）に関与するタンパク質Ｎ末端のシグナル（またはリーダー）配列とコンジュゲートしてもよい。また、前記ポリペプチドはポリペプチドを確認、精製、または合成できるように、他の配列またはリンカーとコンジュゲートされてもよい。すなわち、本出願で「特定の配列番号に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質またはポリペプチド」と記載されていても、その配列番号のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同一あるいは相応する活性を有する場合であれば、一部の配列が欠失、変更、置換、保存的置換または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も、本出願で用いることができるのは自明である。例えば、前記変異型ポリペプチドと同一あるいは相応する活性を有する場合であれば、前記アミノ酸配列の前後にタンパク質の機能を変更していない配列の追加、自然に発生しうる突然変異、そのサイレント突然変異（silent mutation）または保存的置換を除外することなく、これらの配列の追加、あるいは突然変異を有する場合でも、本願の範囲内に属するのが自明である。
【００３１】
また、コドン縮退性（codon degeneracy）によって、前記配列番号６３、配列番号７５、配列番号９５及び配列番号９７のアミノ酸配列からなる群から選択される少なくともいずれか１つのアミノ酸配列を含む、タンパク質またはそれと相同性または同一性を有するタンパク質に翻訳されうるポリヌクレオチドも含まれるのは自明である。また、公知の遺伝子配列から調製されうるプローブ、例えば、前記ポリヌクレオチド配列の全体または一部に対する相補配列と厳格な条件下でハイブリダイズし、Ｏ−スクシニルホモセリントランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする配列であれば制限なく含まれてもよい。前記「厳しい条件」とは、ポリヌクレオチド間の特異的混成化を可能にする条件を意味する。これらの条件は、文献（例えば、J. Sambrook et al.,）に具体的に記載されている。例えば、相同性または同一性が高い遺伝子同士、８０％以上、８５％以上、具体的には、９０％以上、より具体的には、９５％以上、さらに具体的には、９７％以上、特に具体的には、９９％以上の相同性または同一性を有する遺伝子同士でハイブリダイズする。そして、それより相同性または同一性が低い遺伝子同士はハイブリダイズしない条件、または通常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、具体的には、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度で、１回、具体的には、２回〜３回洗浄する条件を挙げられる。
【００３２】
混成化は、たとえ混成化の厳密度によって塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能であっても、２つの核酸が相補的配列を有することを要求する。用語、「相補的」は、互いに混成化が可能であるヌクレオチド塩基間の関係を記述するために用いられる。例えば、ＤＮＡに関すると、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、本出願は、また、実質的に類似の核酸配列だけでなく、全体配列に相補的な単離された核酸断片を含みうる。
【００３３】
具体的には、相同性または同一性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値で混成化段階を含む混成化条件を用い、上述した条件を用いて探知してもよい。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃または６５℃であってもよいが、これに制限されるものではなく、その目的に応じて当業者によって適切に調節されてもよい。
【００３４】
ポリヌクレオチドを混成化する適切な厳密度は、ポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当該技術分野でよく知られている（非特許文献１参照）。
相同性（homology）または同一性（identity）は、２つの与えられたアミノ酸配列または塩基配列に関連される程度を意味し、パーセンテージで示されてもよい。
【００３５】
用語、相同性及び同一性は、多くの場合、相互交換的に用いられてもよい。
保存された（conserved）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列相同性または同一性は標準配列アルゴリズムによって決定されるし、用いられるプログラムによって確立されたデフォルトのギャップペナルティが一緒に用いられてもよい。実質的には、相同性を有するか（homologous）または同一な（identical）配列は、一般的に配列全体または全長の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％以上で中間または高い厳しい条件（stringent conditions）でハイブリダイズしてもよい。ハイブリダイズするポリヌクレオチドでコドンの代わりに縮退コドンを含有するポリヌクレオチドも考慮されうる。
【００３６】
任意の２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が、相同性、類似性または同一性を有するかどうかは、例えば、非特許文献２と同じデフォルトのパラメータを用いて「ＦＡＳＴＡ」プログラムのような公知のコンピュータアルゴリズムを利用して決定してもよい。または、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite、非特許文献３）（バージョン５.０.０またはそれ以降のバージョン）で実行されるような、ニードルマン−ウンシュ（Needleman-Wunsch）アルゴリズム（非特許文献４）を用いて決定してもよい。（ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J., et al, Nucleic AcidsＲesearch 12: 387（1984））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403（1990）；Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994、及び[CARILLO ETA/.]（1988）SIAM J Applied Math 48: 1073を含む）。例えば、国立生物工学情報データベースセンターのＢＬＡＳＴ、またはＣｌｕｓｔａｌＷを用いて相同性、類似性または同一性を決定してもよい。
【００３７】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性、類似性または同一性は、例えば、非特許文献５に公知されたように、例えば、非特許文献４のようなＧＡＰコンピュータプログラムを利用して配列情報を比較することによって決定してもよい。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列のうち、より短いものからのシンボルの全体数で同様の配列されたシンボル（つまり、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を割った値として定義する。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメータは、（１）一進法の比較マトリックス（同一性のための１及び非同一性のための０の値を含有する）及び非特許文献６に開示されたように、非特許文献７の加重された比較マトリックス（またはＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）；（２）各ギャップのための３．０のペナルティ及び各ギャップの各記号のための追加の０．１０ペナルティ（またはギャップ開放ペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５）；及び（３）末端ギャップのための無ペナルティを含んでもよい。したがって、本願で用いられたものとして、用語、「相同性」または「同一性」は、配列間の関連性（relevance）を示す。
【００３８】
本出願の他の一つの様態は、前記Ｏ−スクシニルホモセリントランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
本出願において、用語、「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド単量体（monomer）が共有結合によって長く鎖状につながったヌクレオチドの重合体（polymer）で一定の長さ以上のＤＮＡまたはＲＮＡ鎖であり、より具体的には、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド断片を意味する。
【００３９】
本出願でＯ−スクシニルホモセリントランスフェラーゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子は、変異型Ｏ−スクシニルホモセリントランスフェラーゼ遺伝子であり、具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム由来であってもよい。遺伝暗号の縮退性（genetic code degeneracy）に起因して、同じアミノ酸配列をコードする塩基配列及びその変異体も、本出願に含まれるし、その例として配列番号６４、配列番号７６、配列番号９６または配列番号９８と示してもよいが、これに制限されない。
【００４０】
また、変異型ポリヌクレオチドも遺伝暗号の縮退性（genetic code degeneracy）に起因し、同じアミノ酸配列をコードする塩基配列及びその変異体も、本出願に含まれる。
本出願のもう一つの様態として、本出願は、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞及び前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換された微生物を提供する。具体的には、前記導入は、形質転換によって行われてもよいが、これに制限されない。
【００４１】
具体的には、Ｏ−スクシニルホモセリントランスフェラーゼ変異型ポリペプチドを含む微生物は、野生型Ｏ−スクシニルホモセリントランスフェラーゼポリペプチドを含む微生物に比べて宿主細胞の成長を阻害することなく、Ｏ−スクシニルホモセリンの生産能が向上されるため、これらの微生物からＯ−スクシニルホモセリンを高収率で収得することができる。
【００４２】
本出願で用いられた用語、「ベクター」は、適合した宿主内で目的タンパク質を発現できるように、適合の調節配列に作動可能に連結された前記目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。前記調節配列は、転写を開始しうるプロモーター、このような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適合のｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含んでもよい。ベクターは、適切な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムとは無関係に複製されたり機能することができ、ゲノムそのものに統合されてもよい。
【００４３】
本出願で用いられるベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば特に限定されず、当業界に知られている任意のベクターを用いてもよい。通常用いられるベクターの例としては、天然の状態であるか、組換えされた状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとして、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いてもよく、プラスミドベクターとして、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系などを用いてもよい。具体的には、ｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いてもよいが、これに制限されない。
【００４４】
本出願で使用可能なベクターは、特に制限されるものではなく、公知の発現ベクターを用いてもよい。また、細胞内の染色体挿入用ベクターを介して染色体内に目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入させてもよい。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界で知られている任意の方法、例えば、相同組換えによって行われてもよいが、これに限定されない。前記染色体に挿入されたかどうかを確認するための選別マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。選別マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選別、すなわち目的核酸分子が挿入されたかどうかを確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面タンパク質の発現のような選択可能な表現型を付与するマーカーが用いられてもよい。選択剤（selective agent）が処理された環境では、選別マーカーを発現する細胞のみ生存したり他の表現形質を示すので、形質転換された細胞を選別できる。
【００４５】
本出願において、用語、「形質転換」は、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入して、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは宿主細胞内で発現することさえできれば、宿主細胞の染色体内に挿入され位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、これらをすべて含んでもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡ及びＲＮＡを含む。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、あらゆる形態で導入されるものであっても構わない。例えば、前記ポリヌクレオチドは、それ自体で発現されるのに必要なすべての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入されてもよい。前記発現カセットは、通常、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含んでもよい。前記発現カセットは、それ自体の複製が可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入されて、宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよいが、これに限定されない。前記形質転換する方法は、核酸を細胞内に導入するあらゆる方法も含まれており、宿主細胞に応じて当分野で公知のように適合した標準技術を選択して行ってもよい。例えば、電気穿孔法（electroporation）、リン酸カルシウム（Ｃａ（Ｈ２ＰＯ４）２、ＣａＨＰＯ４、またはＣａ３（ＰＯ４）２）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、微細注入法（microinjection）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥデキストラン法、陽イオンリポソーム法、及び酢酸リチウムＤＭＳＯ法などがあるが、これに制限されない。
【００４６】
また、前記において、用語、「作動可能に連結された」というのは、本出願の目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するようにするプロモーター配列と、前記ポリヌクレオチド配列が機能的に連結されていることを意味する。作動可能な連結は、当業界の公知の遺伝子組換え技術を利用して製造してもよく、部位特異的ＤＮＡ切断及び連結は当業界の切断及び連結酵素などを用いて製作してもよいが、これに制限されない。
【００４７】
本出願で用いられる用語、「Ｏ−スクシニルホモセリンを生産する微生物」とは、自然的にＯ−スクシニルホモセリン生産能を有している微生物またはＯ−スクシニルホモセリン生産能がない親菌株にＯ−スクシニルホモセリンの生産能が付与された微生物を意味する。
【００４８】
前記Ｏ−スクシニルホモセリンを生産する微生物は、変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むか、または変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換されて変異型ポリペプチドを発現しうる細胞または微生物であって、本出願の目的上、前記宿主細胞または微生物はＭｅｔＸ変異型ポリペプチドを含むＯ−スクシニルホモセリンを生産できる微生物であればいずれも可能である。具体例としては、エシェリキア（Escherichia）属、セラチア（Serratia）属、エルウィニア（Erwinia）属、エンテロバクテリア（Enterobacteria）属、サルモネラ（Salmonella）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属またはコリネバクテリウム（Corynebacterium）属などの微生物菌株が含まれてもよく、具体的には、コリネバクテリウム属微生物であってもよく、より具体的な例としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）であってもよいが、これに限定されない。
【００４９】
本出願において、用語、「Ｏ−スクシニルホモセリンを生産するコリネバクテリウム属（the genus Corynebacterium）微生物」とは、天然型または変異を介してＯ−スクシニルホモセリン生産能を有しているコリネバクテリウム属微生物を意味する。コリネバクテリウム属微生物の培養物がＯ−スクシニルホモセリンを有しているのはすでに知られていた。ただし、Ｏ−スクシニルホモセリンの生産能が著しく低く、生産メカニズムに作用する遺伝子やメカニズムの原理が明らかにされていない状態である。したがって、本出願でＯ−スクシニルホモセリン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物とは、天然型微生物自体または外部Ｏ−スクシニルホモセリン生産メカニズムと関連する遺伝子が挿入されたり、内在的遺伝子の活性を強化させたり不活性させて向上されたＯ−スクシニルホモセリン生産能を有するようになったコリネバクテリウム属微生物を意味する。
【００５０】
本出願で「コリネバクテリウム属微生物」は、具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）などであるが、必ずこれに限定されるものではない。より具体的には、本出願でコリネバクテリウム属微生物は、高濃度のＯ−スクシニルホモセリンの露出されても、細胞生長と生存に影響を少なく受けるコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）であってもよい。
【００５１】
前記微生物は、シスタチオニンシンターゼ（cystathionine synthase）、Ｏ−アセチルホモセリン（チオール）リアーゼ、及びホモセリンキナーゼからなる群から選択される少なくとも１つ以上のタンパク質活性が不活性化されうる。すなわち、前記で選択された１つのタンパク質活性、２つのタンパク質活性または３つのタンパク質活性すべての活性が不活性になりうる。
【００５２】
本出願において、用語、タンパク質活性の「不活性化」は、内在的活性に比べて活性が弱化されたり、または活性がないことをすべて含む概念である。
これらのタンパク質活性の不活性化は、当該分野でよく知られている様々な方法の適用で達成されうる。前記方法の例として、前記タンパク質の活性が除去された場合を含めて、前記タンパク質をコードする染色体上の遺伝子の全体または一部を欠失させる方法；前記酵素の活性が減少されるように突然変異された遺伝子で染色体上の前記タンパク質をコードする遺伝子を代替する方法；前記タンパク質をコードする染色体上の遺伝子の発現調節配列に変異を導入する方法；前記タンパク質をコードする遺伝子の発現調節配列を活性が弱いかない配列に交替する方法（例えば、前記遺伝子のプロモーターを内在的プロモーターよりも弱いプロモーターに交替する方法）；前記タンパク質をコードする染色体上の遺伝子の全体または一部を欠失させる方法；前記染色体上の遺伝子の転写体に相補的に結合して前記ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）を導入する方法；前記タンパク質をコードする遺伝子のＳＤ配列の前段にＳＤ配列と相補的な配列を人為的に付加して２次構造を形成させ、リボソーム（ribosome）の付着が不可能にする方法及びその配列のＯＲＦ（open reading frame）の３’末端に逆転写されるようにプロモーターを付加するＲＴＥ（Reverse transcription engineering）方法などがあり、これらの組み合わせでも達成できるが、前記例によって特に制限されるものではない。
【００５３】
具体的には、タンパク質をコードする遺伝子の一部または全体を欠失さする方法は、微生物内染色体挿入用ベクターを介して染色体内の内在的目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、一部の核酸配列が欠失されたポリヌクレオチドまたはマーカー遺伝子に交替することにより行われてもよい。その一例として、相同組換えによって遺伝子を欠失させる方法を用いてもよいが、これに限定されない。また、前記で「一部」とは、ポリヌクレオチドの種類によって相異し、当業者が適切に決定してもよいが、具体的には、１〜３００個、より具体的には、１〜１００個、より具体的には、１〜５０個であってもよい。しかし、特にこれに制限されるものではない。
【００５４】
また、発現調節配列を変更する方法は、前記発現調節配列の活性をさらに不活性化するように核酸配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換、またはこれらの組み合わせで発現調節配列上の変異を誘導して行うか、さらに弱い活性を有する核酸配列に交替することにより行ってもよい。前記発現調節配列には、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、及び転写と解読の終結を調節する配列を含んでもよいが、これに限定されない。
【００５５】
併せて、染色体上の遺伝子配列を変更する方法は、前記タンパク質の活性をさらに不活性化するように遺伝子配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換、またはこれらの組み合わせで配列上の変異を誘導して行うか、さらに弱い活性を有するように改良された遺伝子配列または活性がないように改良された遺伝子配列に交替することにより行ってもよいが、これに限定されるものではない。具体的には、前記微生物は、シスタチオニンガンマシンターゼをコードするｍｅｔＢ遺伝子、Ｏ−スクシニルホモセリンの分解経路であるＯ−アセチルホモセリン（チオール）リアーゼをコードするｍｅｔＹ遺伝子、及びホモセリンキナーゼをコードする遺伝子ｔｈｒＢからなる群から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子がさらに欠損または弱化されてもよい。
【００５６】
本出願で用いられる前記用語、「欠損（deletion）」は、目的遺伝子の開始コドンに該当する塩基配列から終結コドンまでの塩基配列領域、あるいはその調節部位塩基配列の一部または全部を染色体の内部から除去した形態を意味する。
【００５７】
本願で用いられる前記用語、「弱化（weakening）」は、微生物菌株で相応するＤＮＡによってコードされる１つ以上の酵素に対する細胞内活性を除去したり減少させることを意味するが、例えば、遺伝子のプロモーター（promoter）部位及び５’−ＵＴＲ部位の塩基配列を変更させることでタンパク質の発現を弱化させるか該当遺伝子のＯＲＦ部位に突然変異を導入することにより、タンパク質の活性を弱化させうる。具体的には、前記微生物はシスタチオニンガンマシンターゼをコードするｍｅｔＢ遺伝子、Ｏ−スクシニルホモセリンの分解経路であるＯ−アセチルホモセリン（チオール）リアーゼをコードするｍｅｔＹ遺伝子、及びホモセリンキナーゼをコードする遺伝子ｔｈｒＢからなる群から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子がさらに欠損または弱化されてもよい。
【００５８】
また、前記コリネバクテリウム属微生物は、アスパルトキナーゼ（aspartokinase）活性が非変異微生物に比べてさらに強化された、Ｏ−スクシニルホモセリンを生産するコリネバクテリウム属微生物であってもよい。
【００５９】
本出願において、用語、タンパク質活性の「強化」は、前記タンパク質の活性が導入されたり、または内在的活性に比べて増加されることを意味する。前記活性の「導入」は、自然的あるいは人為的に微生物が本来有していなかった特定ポリペプチドの活性が現れるようになることを意味する。
【００６０】
本出願において、用語、タンパク質の活性が内在的活性に比べて「増加」するということは、微生物が有するタンパク質の内在的活性または変更前の活性に比べて活性が向上したことを意味する。前記「内在的活性」は、自然的または人為的な要因による遺伝的変異で微生物の形質が変化する場合、形質変化前の親菌株または非変更微生物が本来有していた特定タンパク質の活性をいう。変更前の活性で混用して用いられてもよい。
【００６１】
具体的には、本出願において活性の増加は、
１）前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコピー数の増加、
２）前記ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列の変更、
３）前記タンパク質の活性が増強されるように染色体上のポリヌクレオチド配列の変更、
４）前記タンパク質の活性を示す外来ポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドのコドン最適化された変異型ポリヌクレオチドの導入、または
５）その組み合わせによって強化されるように変更する方法などにより行われてもよいが、これに制限されない。
【００６２】
前記１）ポリヌクレオチドのコピー数の増加は、特にこれに制限されないが、ベクターに作動可能に連結された形態で行われるか、宿主細胞内の染色体内に挿入されることによって行なわれてもよい。具体的には、宿主とは無関係に複製されて機能することができるベクターに本願のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結されて宿主細胞内に導入されることによって行われるか、宿主細胞内の染色体内に前記ポリヌクレオチドを挿入させうるベクターに前記ポリヌクレオチドが作動可能に連結されて宿主細胞内に導入されることにより、前記宿主細胞の染色体内前記ポリヌクレオチドのコピー数を増加させる方法で行われてもよい。
【００６３】
次に、２）ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列の変更は、特にこれに制限されないが、前記発現調節配列の活性をさらに強化するように核酸配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせで配列上の変異を誘導して行うか、さらに強い活性を有する核酸配列に交替することによって行われてもよい。前記発現調節配列は、特にこれに制限されないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、転写及び解読の終結を調節する配列などを含んでもよい。
【００６４】
前記ポリヌクレオチド発現単位の上部には、本来のプロモーターの代わりに強力な異種プロモーターが連結されてもよいが、前記強力なプロモーターの例としては、ＣＪ７プロモーター（特許文献２及び３）、ｌｙｓＣＰ１プロモーター（特許文献４）、ＥＦ−Ｔｕプロモーター、ｇｒｏＥＬプロモーター、ａｃｅＡあるいはａｃｅＢプロモーターなどがあるが、これに限定されない。併せて、３）染色体上のポリヌクレオチド配列の変更は、特にこれに制限されないが、前記ポリヌクレオチド配列の活性をより強化するように核酸配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換、またはこれらの組み合わせで発現調節配列上の変異を誘導して実行するか、さらに強い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列に交替することによって行われてもよい。
【００６５】
また、４）外来ポリヌクレオチド配列の導入は、前記タンパク質と同一／類似の活性を示すタンパク質をコードする外来ポリヌクレオチド、またはそのコドン最適化された変異型ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入して行われてもよい。前記外来ポリヌクレオチドは、前記のタンパク質と同一／類似の活性を示す限り、その由来や配列に制限なく用いられてもよい。また、導入された前記外来ポリヌクレオチドが宿主細胞内で最適化された転写、翻訳が行われるようにそのコドンを最適化して宿主細胞内に導入してもよい。前記導入は、公知の形質転換方法を当業者が適宜選択して行われてもよく、宿主細胞内で前記導入されたポリヌクレオチドが発現されることでタンパク質が生成され、その活性が増加されうる。
【００６６】
最後に、５）前記１）〜４）の組み合わせによって強化されるように変更する方法は、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコピー数の増加、その発現が増加するように発現調節配列の変更、染色体上の前記ポリヌクレオチド配列の変更及び前記タンパク質の活性を示す外来ポリヌクレオチドまたはそのコドン最適化された変異型ポリヌクレオチドの変更の中の１つ以上の方法を一緒に適用して行なわれてもよい。
【００６７】
本出願において、前記遺伝子またはポリヌクレオチドの配列は、米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）などのデータベースから得ることができる。
本出願のもう一つの様態として、本出願は記述された微生物を培養する段階及び培養された微生物または培養培地からＯ−スクシニルホモセリンを回収する段階を含む、Ｏ−スクシニルホモセリンを生産する方法を提供する。
【００６８】
本出願のもう一つの様態として、本出願は記述された微生物を培養する段階及び培養された微生物またはＯ−スクシニルホモセリンと硫化物とを反応させる段階を含む、Ｌ−メチオニン生産方法を提供する。
【００６９】
具体的には、前記硫化物と反応させる段階は、公知のいずれかの方法を用いてＯ−スクシニルホモセリンからＬ−メチオニンを生成することを意味する。一例として、硫化物であるメチルメルカプタンをＯ−スクシニルホモセリンと反応させてＬ−メチオニンを生産してもよく、硫化物であるシステインを反応させてシスタチオニンを生成した後、段階的な反応によってメチオニンを生産してもよい。また、各反応の速度及び収率向上のために触媒や酵素を添加したり、酵素を含む微生物内で反応させてもよい。
【００７０】
前記「Ｏ−スクシニルホモセリン」は、本出願の記述された微生物が生産したＯ−スクシニルホモセリンを含有した発酵液であるか、精製された形態であってもよい。また、前記の「硫化物」は、例えば、メチルメルカプタンであってもよく、前記メチルメルカプタンは液状のメチルメルカプタンナトリウム（sodium methyl mercaptan、ＣＨ３Ｓ−Ｎａ）の形態、ガスまたは液化状態のメチルメルカプタン（ＣＨ３ＳＨ）だけででなく、特許文献５に記載された形態でジメチルスルフィド（ＤＭＳ、Dimethylsulfide）を含むメチルメルカプタンなど硫黄原子を提供することができる形態を含んでいるメチルメルカプタン誘導体すべてを意味することができる。
【００７１】
前記Ｌ−メチオニンを生産する方法は、当業界に公知された最適化された培養条件及び酵素活性の条件で当業者によって容易に決定されてもよい。具体的な培養方法及び培地は、前記説明した通りである。
【００７２】
また、前記Ｌ−メチオニンの生産方法は、前記培養段階で培養された微生物または培地からＯ−スクシニルホモセリンを分離または回収する段階をさらに含んでもよい。
本出願の「Ｏ−スクシニルホモセリン」は、Ｏ−スクシニルホモセリンそのものの形体だけではなく、その塩形態も含まれるのは当業者に自明である。
【００７３】
前記方法において、前記微生物を培養する段階は、特に制限されないが、公知の回分式培養方法、連続式培養方法、流加式培養方法などにより行われてもよい。このとき、培養条件は、特に制限されないが、塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア）または酸性化合物（例えば、リン酸または硫酸）を用いて、適正ｐＨ（例えば、ｐＨ５〜９、具体的には、ｐＨ６〜８、最も具体的には、ｐＨ６．８）を調節してもよく、酸素または酸素含有ガス混合物を培養物に導入させて好気性条件を維持してもよい。培養温度は２０〜４５℃、具体的には、２５〜４０℃を維持してもよく、約１０〜１６０時間培養してもよいが、これに制限されるものではない。前記培養によって生産されたＯ−スクシニルホモセリンは、培地中に分泌されるか細胞内に残留してもよい。
【００７４】
また、用いられる培養用培地は、炭素供給源としては、糖及び炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、澱粉及びセルロース）、油脂及び脂肪（例えば、大豆油、ヒマワリの種油、ピーナッツ油及びココナッツ油）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、及びリノール酸）、アルコール（例えば、グリセロール及びエタノール）及び有機酸（例えば、酢酸）などを個別に用いたり、または混合して用いてもよいが、これに制限されない。窒素供給源としては、窒素含有有機化合物（例えば、ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆泊分及びウレア）、または無機化合物（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、及び硝酸アンモニウム）などを個別に用いたり、または混合して用いてもよいが、これに制限されない。リン供給源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、これに相応するナトリウム含有塩などを個別に用いたり、または混合して用いてもよいが、これに制限されない。また、培地には他の金属塩（例えば、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄）、アミノ酸及びビタミンのような必須成長促進物質を含んでもよい。
【００７５】
本出願の前記培養段階で生産されたＯ−スクシニルホモセリンまたはＬ−メチオニンを回収する方法は、培養方法によって当該分野で公知の適切な方法を用いて培養液から目的とするアミノ酸を収集（collect）してもよい。例えば、遠心分離、ろ過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化及びＨＰＬＣなどが用いられてもよく、当該分野で公知の適切な方法を用いて、培地または微生物から目的とするＯ−スクシニルホモセリンまたはＬ−メチオニンを回収してもよい。
【００７６】
以下、本出願の実施例により、より詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本出願を例示的に説明するためのものであり、本出願の範囲がこれらの実施例により制限されるものではない。
【００７７】
実施例１：Ｏ−アセチルホモセリントランスフェラーゼ活性を有するｍｅｔＸプラスミドの製作
Ｏ−アセチルホモセリントランスフェラーゼ（ＭｅｔＸ）をコードする遺伝子を増幅するためにＷＴ（Wild type）由来の報告された配列に基づいてプロモーター部位（開始コドンの上部約３００ｂｐ）からターミネーター部位（終結コドンの下部約１００ｂｐ）まで増幅するためのプライマー（配列番号５及び６）の両末端にＢａｍＨＩ制限酵素部位を挿入して考案した。
【００７８】
【表１】
0006946479.tif 000002
【００７９】
ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間変性後、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、７２℃で９０秒重合を３０回繰り返した後、７２℃で７分間重合反応を行った。その結果、ｍｅｔＸ遺伝子のコーディング部位１５４６ｂｐのＤＮＡ断片を得た。ｐＥＣＣＧ１１７（特許文献６）ベクターとｍｅｔＸＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩで処理し、ＤＮＡ接合酵素を用いて連結した後、クローニングすることによりプラスミドを獲得し、これをｐＥＣＣＧ１１７-ｍｅｔＸ ＷＴと命名した。
【００８０】
実施例２：Ｏ−スクシニルホモセリントランスフェラーゼ活性を有する変異型ｍｅｔＸプラスミドの製作
新規なｍｅｔＸ変異位置を選別し、配列番号１のアミノ酸配列で１７６番目のアミノ酸と３１３番目のアミノ酸を他のアミノ酸に置換した。
【００８１】
より具体的には、Ｑ１７６Ｎ及びＬ３１３Ｒ変異を製作した。実施例１で製作されたｐＥＣＣＧ１１７−ｍｅｔＸＷＴプラスミドを鋳型とし、Ｏ−アセチルホモセリントランスフェラーゼ１７６番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換され、３１３番目のアミノ酸がアルギニンに置換される変異ベクターを作成するために１７６番目の変異付与プライマーペア（配列番号７及び８）と３１３番目の変異付与プライマーペア（配列番号９及び１０）を考案した。
【００８２】
【表２】
0006946479.tif 000003
【００８３】
前記それぞれのプライマーと一緒に位置特異的突然変異キット（site-directed mutagenesis kit、stratagene、アメリカ）を用いてｍｅｔＸ変異遺伝子を製造した。既存の野生型プラスミドＷＴをベースにしたＬ３１３Ｒ変異型プラスミドはＷＴ_Ｌ３１３Ｒと、Ｑ１７６Ｎ及びＬ３１３Ｒ変異型プラスミドはＷＴ_Ｑ１７６Ｎ_Ｌ３１３Ｒと命名された。
【００８４】
実施例３：Ｏ−スクシニルホモセリントランスフェラーゼ活性を有する変異型ｍｅｔＸの基質特異性及び活性の比較実験
Ｏ−スクシニルホモセリンを過量生産する変異型ｍｅｔＸの活性を比較するために、ホモセリンを蓄積し、生産されたＯ−スクシニルホモセリンの利用性が欠損された菌株を作製した。Ｏ−スクシニルホモセリン分解経路であるシスタチオニンガンマシンターゼをコードするｍｅｔＢ遺伝子、Ｏ−スクシニルホモセリンの分解経路であるＯ−アセチルホモセリン（チオール）リアーゼをコードするｍｅｔＹ遺伝子が欠損された菌株を作製した。まず、ｍｅｔＢ遺伝子を欠損するためにＷＴ由来のｍｅｔＢ遺伝子の塩基配列情報に基づいて、ｍｅｔＢ遺伝子の５’上部部位を増幅するためのプライマーペア（配列番号１１及び１２）と３’の下部部位を増幅するためのプライマーペア（配列番号１３及び１４）を考案した。配列番号１１及び１４のプライマーは、それぞれの末端にＸｂａＩ制限酵素部位（下線で表示）を挿入した。
【００８５】
【表３】
0006946479.tif 000004
【００８６】
ＷＴの染色体を鋳型とし、配列番号１１、及び配列番号１２、配列番号１３及び配列番号１４のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間変性後、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、７２℃で９０秒重合を３０回繰り返した後、７２℃で７分間重合反応を行った。その結果、ｍｅｔＢ遺伝子の５’上部部位の４５０ｂｐＤＮＡ断片と３’の下部部位の４６７ｂｐのＤＮＡ断片を得た。
【００８７】
増幅された２種類のＤＮＡ切片を鋳型とし、配列番号１１及び配列番号１４のプライマーでＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間変性後、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、７２℃で３分重合を３０回繰り返した後、７２℃で７分間重合反応を行った。その結果、ｍｅｔＢ遺伝子の中央部分が欠損されて上部と下部のみを含む９１７ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。
【００８８】
ｐＤＺベクターと９１７ｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素ＸｂａＩで処理した後、ＤＮＡ接合酵素を用いて連結した後、クローニングすることによりプラスミドを獲得し、これをｐＤＺ−△ｍｅｔＢと命名した。
【００８９】
ｐＤＺ−△ｍｅｔＢベクターをＷＴ菌株に電気パルス法で導入した後、カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有した選別培地で形質転換菌株を獲得した。２次組換え過程（cross-over）で染色体上に挿入されたＤＮＡ断片によってｍｅｔＢ遺伝子が欠損された菌株であるＷＴ△ｍｅｔＢを獲得した。
【００９０】
Ｏ−スクシニルホモセリンのもう一つの分解経路であるｍｅｔＹ遺伝子を欠損させるために、ＷＴ由来ｍｅｔＹ遺伝子の塩基配列情報に基づいてｍｅｔＹ遺伝子の５’上部部位を増幅するためのプライマーペア（配列番号１５及び１６）と３’の下部部位を増幅するためのプライマーペア（配列番号１７及び１８）を考案した。配列番号１５及び１８のプライマーは、それぞれの末端にＸｂａＩ制限酵素部位（下線で表示）を挿入した。
【００９１】
【表４】
0006946479.tif 000005
【００９２】
ＷＴの染色体を鋳型とし、配列番号１５、及び配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間変性後、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、７２℃で９０秒重合を３０回繰り返した後、７２℃で７分間重合反応を行った。その結果、ｍｅｔＹ遺伝子の５’上部部位の５１２ｂｐＤＮＡ断片と３’の下部部位の５２０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。
【００９３】
増幅された２種類のＤＮＡ切片を鋳型とし、配列番号１５、及び配列番号１８のプライマーでＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間変性後、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、７２℃で３分重合を３０回繰り返した後、７２℃で７分間重合反応を行った。その結果、ｍｅｔＹ遺伝子の中央部分が欠損されて上部と下部のみを含む１０３２ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。
【００９４】
ｐＤＺベクターと１０３２ｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素ＸｂａＩで処理した後、ＤＮＡ接合酵素を用いて連結した後、クローニングすることによりプラスミドを獲得し、これをｐＤＺ−△ｍｅｔＹと命名した。
【００９５】
ｐＤＺ−△ｍｅｔＹベクターを前記で製作されたＷＴ△ｍｅｔＢ菌株にそれぞれが電気パルス法で導入した後、カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有した選別培地で形質転換菌株を獲得した。２次組換え過程（cross-over）で染色体上に挿入されたＤＮＡ断片によって、ｍｅｔＹ遺伝子が欠損された菌株であるＷＴ△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹを獲得した。
【００９６】
Ｏ−スクシニルホモセリンの生成を最大化するために、ＷＴ由来のアスパルトキナーゼ（配列番号１９）をコードするｌｙｓＣ遺伝子（配列番号２０）を対象に、変異導入ベクターを製作するために変異位置を中心に５’の上部部位を増幅するためのプライマーペア（配列番号２１及び２２）と３’の下部部位を増幅するためのプライマーペア（配列番号２３及び２４）を考案した。配列番号２１及び２４のプライマーは、それぞれの末端にＸｂａＩ制限酵素部位（下線で表示）を挿入し、配列番号２２及び２３のプライマーは、互いに交差するように考案された部位にヌクレオチド置換変異（下線で表示）が位置するようにした。
【００９７】
【表５】
0006946479.tif 000006
【００９８】
ＷＴの染色体を鋳型とし、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３及び配列番号２４のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間変性後、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、７２℃で３０秒重合を３０回繰り返した後、７２℃で７分間重合反応を行った。その結果、ｌｙｓＣ遺伝子の変異を中心に５’の上部部位の５０９ｂｐＤＮＡ断片と３’の下部部位の５２０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。
【００９９】
増幅された２種類のＤＮＡ切片を鋳型とし、配列番号２１、及び配列番号２４のプライマーでＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間変性後、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、７２℃で６０秒重合を３０回繰り返した後、７２℃で７分間重合反応を行った。その結果、３１１番目のトレオニンがイソロイシンにアスパルトキナーゼ変異体（配列番号２５）をコードするｌｙｓＣ遺伝子の変異（配列番号２６）を含む１０１１ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。
【０１００】
コリネバクテリウム・グルタミカム内で複製が不可能なｐＤＺベクター（特許文献７）と１０１１ｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素ＸｂａＩで処理した後、ＤＮＡ接合酵素を用いて連結した後、クローニングすることによりプラスミドを獲得し、これをｐＤＺ−ｌｙｓＣ（Ｔ３１１Ｉ）と命名した。
【０１０１】
ｐＤＺ−ｌｙｓＣ（Ｔ３１１Ｉ）ベクターをＷＴ△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹに電気パルス法（非特許文献８）で導入した後、カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有した選別培地で形質転換菌株を獲得した。２次組換え過程（cross-over）で染色体上に挿入されたＤＮＡ断片によって、ｌｙｓＣ遺伝子にヌクレオチド変異が導入された菌株、ＷＴ△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ、ｌｙｓＣ（Ｔ３１１Ｉ）を獲得し、これをコリネバクテリウム・グルタミカムＷＴ△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ、ｌｙｓＣ（Ｔ３１１Ｉ）と命名した。
【０１０２】
前記の実施例１と２で製作されたｐＥＣＣＧ１１７−ｍｅｔＸＷＴ、ｐＥＣＣＧ１１７−ｍｅｔＸＷＴ_Ｌ３１３Ｒ、ｐＥＣＣＧ１１７−ｍｅｔＸＷＴ_Ｑ１７６Ｎ_Ｌ３１３Ｒベクターを前記で製作されたＷＴ△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹに電気パルス法で導入した後、カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有した選別培地に塗抹して、それぞれの形質転換株を獲得した。
【０１０３】
前記で製作された菌株のＯ−アセチルホモセリン（Ｏ−ＡＨ；O-Acetyl Homoserine）及びＯ−スクシニルホモセリン（Ｏ−ＳＨ；O-Succinyl Homoserine）の生産能を比較するため、以下のような方法で培養し、培養液中Ｏ−アセチルホモセリン及びＯ−スクシニルホモセリンの濃度を分析した。
【０１０４】
下記の培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに菌株を１白金耳を接種し、３７℃で２０時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。ＨＰＬＣを用いてＯ−アセチルホモセリン及びＯ−スクシニルホモセリンの濃度を分析し、分析された濃度は表６の通りである。
【０１０５】
＜培地組成（ｐＨ７．０）＞
グルコース１００ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４４０ｇ、大豆タンパク質２．５ｇ、トウモロコシ浸漬固形分（Corn Steep Solids）５ｇ、尿素３ｇ、ＫＨ２ＰＯ４１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、カルシウムパントテン酸２０００μｇ、ニコチン酸アミド３０００μｇ、ＣａＣＯ３３０ｇ、Ｌ−メチオニン０．３g（蒸留水１リットル基準）。
【０１０６】
【表６】
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【０１０７】
前記の表６を参照すると、対照群ｍｅｔＸＷＴプラスミドが導入された菌株の場合はＯ−アセチルホモセリンを生成することとは異なり、ｍｅｔＸ変異プラスミドが導入された菌株の場合、２つの変異型すべてＯ−スクシニルホモセリンを生成することを確認した。特に、ｍｅｔＸ_ＷＴ_Ｑ１７６Ｎ_Ｌ３１３Ｒの場合、Ｏ−スクシニルホモセリンが大きく増加したことを確認した。すなわち、前記変異が導入された菌株はトランスフェラーゼの基質特異性が変わってＯ−スクシニルホモセリンを生成した。
【０１０８】
実施例４：飽和突然変異誘発（saturated mutagenesis）を介したＭｅｔＸ変異の制作及びＯ−アセチルホモセリン生産能の評価
Ｏ−スクシニルホモセリンの生産能が高いｍｅｔＸの１７６変異位置に他のアミノ酸が置換された変異型を製作するために飽和突然変異誘発を用いた。３１３番目のアミノ酸がアルギニンに置換され、１７６番目のアミノ酸が他のアミノ酸が置換された１８種を製作し、実施例１で製作されたプラスミドを鋳型として用いた。それぞれの変異型、置換されたアミノ酸、及び各変異型に用いられたプライマー配列番号は以下の表７に示した。
【０１０９】
【表７】
0006946479.tif 000008
【０１１０】
具体的には、前記表２で示したプライマーを用いて、位置特異的突然変異キット（site-directed mutagenesis kit、Stratagene、米国）を行い、変異型ｍｅｔＸ遺伝子を製造した。製作された変異プラスミドをＷＴ△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ、ｌｙｓＣ（Ｔ３１１Ｉ）菌株に導入して、実施例４と同様の方法でフラスコの評価を行った。その結果は、次の表８の通りである。
【０１１１】
【表８−１】
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【０１１２】
【表８−２】
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【０１１３】
【表８−３】
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【０１１４】
前記の表３を参照すれば、ほとんどの変異体がＯ−スクシニルホモセリンを生成しなかったが、ｍｅｔＸの変異体（Ｌ３１３Ｒ、Ｑ１７６Ｎ）、（Ｌ３１３Ｒ、Ｑ１７６Ｗ）、（Ｌ３１３Ｒ、Ｑ１７６Ｈ）、または（Ｌ３１３Ｒ、Ｑ１７６Ｇ）でそれぞれ野生型よりも高いレベルでＯ−スクシニルホモセリンを生成することを確認した。つまり、配列番号１のアミノ酸配列で３１３番目のアミノ酸がアルギニンに置換され、１７６番目のアミノ酸がアスパラギン、トリプトファン、ヒスチジンまたはグリシンに置換された場合、スクシニルｃｏＡに対する基質特異性がトランスフェラーゼに付与され、結果的にＯ−スクシニルホモセリンを生成しうることを確認した。
【０１１５】
以上の結果は、本出願の変異体がＯ−スクシニルホモセリンの生産を増加させうることを示唆する。
また、前記製作されたＷＴ△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ、ｌｙｓＣ（Ｔ３１１Ｉ）／ｐＥＣＣＧ１１７−ｍｅｔＸＷＴ_Ｑ１７６Ｎ_Ｌ３１３Ｒ菌株及びＷＴ△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ、ｌｙｓＣ（Ｔ３１１Ｉ）／ｐＥＣＣＧ１１７−ｍｅｔＸＷＴ_Ｑ１７６Ｗ_Ｌ３１３Ｒ菌株は、それぞれＣＡ０５−５１３６及びＣＡ０５−５１３７と呼ばれ、これをブダペスト条約下の受託機関である韓国微生物保存センターに２０１７年５月１１日付けで寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１２０２４Ｐ及びＫＣＣＭ１２０２５Ｐを与えられた。
【０１１６】
以上の説明から、本出願が属する技術分野の当業者は、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施されうることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものと理解しなければならない。本出願の範囲は、前記詳細な説明より、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本出願の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【０１１７】
【表９】
0006946479.tif 000012
【０１１８】
【表１０】
0006946479.tif 000013
【配列表】
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