(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）変異赤血球凝集素（ＨＡ）と、（ｉｉ）変異ノイラミニダーゼ（ＮＡ）とを含む組換えＡ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ）であって、
前記変異赤血球凝集素（ＨＡ）は、配列番号1のアミノ酸配列を含み、
前記変異ノイラミニダーゼ（ＮＡ）は、配列番号２，１１，１２，１３のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、前記変異ＮＡは、ノイラミニダーゼ活性に欠陥がある、組換えＡ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ）。
【請求項２】
前記組換えＩＡＶは、前記（ｉ）に記載の変異ＨＡを含む、請求項１に記載の組換えＩＡＶ。
【請求項３】
前記（ｉｉ）に記載の変異ＮＡを含む、請求項１に記載の組換えＩＡＶ。
【請求項４】
前記変異ＮＡは、配列番号１１のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の組換えＩＡＶ。
【請求項５】
前記変異ＮＡは、配列番号１２又は１３のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の組換えＩＡＶ。
【請求項６】
前記変異ＮＡは、配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の組換えＩＡＶ。
【請求項７】
配列番号１のアミノ酸配列を含む赤血球凝集素（ＨＡ）変異体。
【請求項８】
（ｉ）請求項１から６のいずれか１項に記載の組換えＡ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ）、又は請求項７に記載の赤血球凝集素（ＨＡ）変異体と、
（ｉｉ）薬学的に許容される担体と、
を含む、免疫原性組成物。
【請求項９】
前記薬学的に許容される担体は、アジュバントである、請求項８に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
被験体においてＡ型インフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するための医薬組成物であって、
有効量の請求項８又は９に記載の免疫原性組成物を含む、医薬組成物。
【請求項１１】
前記被験体は、ヒトである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記ヒト被験体は、Ａ型インフルエンザウイルスに感染しているか、感染している疑いがあるか、又は感染するリスクがある、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記Ａ型インフルエンザウイルスは、Ｈ１Ｎ１又はＨ５Ｎ１のＡ型インフルエンザウイルスである、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記免疫原性組成物は、経口投与、経腸投与、経鼻投与、局所投与及び経粘膜投与からなる群より選択される投与経路により被験体に投与される、請求項１０から１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記免疫原性組成物は、被験体に非経口投与される、請求項１０から１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２０１６年１１月８日に出願された米国仮出願第６２／４１８，８００号の優先権を主張し、その内容が参照によりすべて本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
Ａ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ）は、オルトミクソウイルス科に属し、広く伝播し、種間の壁を超えることができる。過去１０年間のインフルエンザＡ伝染病の罹患率から見て、ＩＡＶ感染症は、世界的に健康上の大きな脅威となっている。
【０００３】
赤血球凝集素（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）は、ＩＡＶの表面にある糖タンパク質である。ＨＡ及びＮＡタンパク質の抗原ドリフト及びシフトに対処するため、ＩＡＶ感染に対する改善された防御を提供できるワクチンを開発する必要がある。従って、改善された免疫原性を有するＨＡ及びＮＡ変異体の同定は、急速に進化するＩＡＶと戦うワクチンの開発において非常に重要である。
【発明の概要】
【０００４】
本開示の少なくとも一部は、予想外に発見された組換えインフルエンザウイルス（ＩＡＶ）に基づいている。この組換えインフルエンザウイルス（ＩＡＶ）は、修飾されたＮ−グリコシル化パターンを有する変異赤血球凝集素（ＨＡ）抗原又はノイラミニダーゼ活性が欠損した変異ノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含み、野生型ＩＡＶと比較して増強された免疫原性を示した。
【０００５】
本開示の一態様において、組換えＡ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ）が提供される。上記組換えＡ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ）は、変異赤血球凝集素（ＨＡ）を含む。上記変異赤血球凝集素（ＨＡ）は、その野生型対応物と比較して、配列番号１（又は配列番号３）の残基１４２に対応する位置にＡｓｎ残基を保留し、配列番号１（又は配列番号３）の残基２８５、４９７及び５５６に対する１つ以上の位置に変異を含む。上記変異ＨＡは、配列番号１（又は配列番号３）の残基１４２に対応する位置でＮ−グリコシル化され、配列番号１（又は配列番号３）の残基２８５、４９７及び５５６に対応する１つ以上の変異位置でアグリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅ）される。
【０００６】
いくつかの実施形態において、上記変異ＨＡは、さらに配列番号１の残基２７に対応する位置にＡｓｎ残基を保留し、上記変異ＨＡは、配列番号１の残基２７に対応する位置でＮ−グリコシル化される。
【０００７】
本明細書に記載の変異ＨＡ抗原のいずれかは、配列番号１（又は配列番号３）と少なくとも８５％（例えば、９０％、９５％、９８％又は９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一例では、ＨＡ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。
【０００８】
本明細書に記載の変異ＨＡ抗原のいずれかは、本開示の範囲内に含まれる。
【０００９】
本開示の別の態様において、組換えＡ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ）が提供される。上記組換えＡ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ）は、変異ノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含む。上記変異ノイラミニダーゼ（ＮＡ）は、その野生型対応物と比較して、（ａ）１つ以上の活性部位にある変異、（ｂ）１つ以上のＮ−グリコシル化部位にある変異、又は（ａ）と（ｂ）の組み合わせを含む。上記変異ＮＡは、ノイラミニダーゼ活性に欠陥がある。
【００１０】
いくつかの実施形態において、上記変異ＮＡは、配列番号４の４４、７２及び２１９位に対応する１つ以上のＮ−グリコシル化部位に置換を含んでもよい。例えば、上記変異ＮＡは、（１）配列番号４の４４位に対応する位置、（２）配列番号４の７２位に対応する位置、（３）配列番号４の４４及び７２位に対応する位置、又は（４）配列番号４の４４、７２及び２１９位に対応する位置に置換を含んでもよい。或いは又はさらに、上記変異ＮＡは、配列番号４の１０２及び１３５位に対応する位置であり得る１つ以上の活性部位に置換を含む。本明細書に記載のＮＡ変異体のいずれかは、配列番号４と少なくとも８５％（例えば、９０％、９５％、９８％又は９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【００１１】
いくつかの実施形態において、上記変異ＮＡは、１つ以上のＮ−グリコシル化部位、１つ以上の活性部位又はその両方を含む１つ以上の領域に欠失を含み得る。例えば、上記変異ＮＡは、ストーク領域、触媒ドメイン、又はその両方に欠失を含み得る。一例では、上記変異ＮＡは、触媒ドメイン全体が欠失してもよい。他の例では、上記変異ＮＡは、触媒ドメイン及びストーク領域の両方が欠失してもよい。特定の例では、上記変異ＮＡは、配列番号２のペプチドである。
【００１２】
本発明に記載のＮＡ変異体のいずれかは、本開示の範囲に含まれる。
【００１３】
本開示の他の態様において、免疫原性組成物が提供される。上記免疫原性組成物は、（ｉ）本明細書に記載の任意の組換えＡ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ）又は任意のＨＡ変異体、及び（ｉｉ）薬学的に許容される担体を含む。上記担体はアジュバントであってもよい。
【００１４】
本開示の他の態様において、被験体においてＡ型インフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導する方法が提供される。上記方法は、上記免疫応答の誘導を必要とする被験体に有効量の本明細書に記載の免疫原性組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態において、上記被験体は、Ａ型インフルエンザウイルスに感染した可能性がある、感染した疑いがある、又は感染するリスクがあるヒト被験体である。例示的なＡ型インフルエンザウイルスは、Ｈ１Ｎ１又はＨ５Ｎ１  Ａ型インフルエンザウイルスを含むが、これらに限定されない。上記免疫原性組成物は、経口投与、経腸投与、経鼻投与、局所投与又は経粘膜投与により被験体に投与することができる。一例では、上記免疫原性組成物は、被験体に非経口的に投与することができる。
【００１５】
本開示の範囲には、本明細書に記載の組換えＩＡＶ、ＨＡ変異体又はＮＡ変異体；治療を必要とする被験体におけるＡ型インフルエンザウイルス感染の治療又は予防における組換えＩＡＶ、ＨＡ変異体若しくはＮＡ変異体を含む免疫原性組成物の使用；Ａ型インフルエンザウイルス感染を治療又は予防するための医薬品の製造におけるＩＡＶ、ＨＡ変異体、ＮＡ変異体又は免疫原性組成物の使用が含まれる。
【００１６】
以下、本発明の１つ以上の実施形態の詳細を説明する。本発明の他の特徴又は利点は、以下の図面、いくつかの実施形態の詳細な説明、及び添付の特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ−１Ｈ】Ａ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ）上の赤血球凝集素（ＨＡ）の免疫原性に対するグリコシル化の影響を示す図である。図１Ａは、ＩＡＶ表面タンパク質ＨＡ及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）のグリコシル化部位（ｇｌｙｃｏｓｉｔｅ）（Ψ）の概略図である。ＣＴは、Ｃ末端細胞質ドメインを示す。ＴＭは、膜貫通ドメインを示す。Ｎは、Ｎ末端細胞質ドメインを示す。図１Ｂは、ＭＤＣＫ細胞における異なるグリコシル化パターンを有するウイルスの複製率を示す図である。図１Ｃは、ＩＡＶの４種の変異体に感染したＡ５４９細胞のウェスタンブロット解析（抗ＨＡ、抗Ｍ１及び抗β−アクチン抗体を用いる）を示す写真である。図１Ｄは、野生型（ＷＴ）及び１４２−Ｇ  ＩＡＶ株からのグリカンアレイにおけるＨＡ結合パターンを示す図である。図１Ｅは、特定のＩＡＶ変異体の赤血球凝集アッセイを示す写真である。図１Ｆは、脱グリコシル化ＨＡを有するＷＴウイルスのグリカンアレイ解析を示す図である。図１Ｇは、マウスにおけるＷＴ  ＩＡＶ及び特定のＩＡＶ変異体の免疫原性を示す図である。不活化ウイルスでマウスを免疫化した後、免疫化されたマウスから得た血清について赤血球凝集抑制アッセイを行う。図１Ｈは、特定のウイルスで免疫化した後、致死量のＨ５Ｎ１ウイルスで攻撃したマウスの生存率を示す図である。図１Ｂ、Ｄ及びＦは、３回の独立した実験の平均値±標準誤差（ＳＥＭ）を示す。図１Ｇは、１０回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを示す。図１Ｈは、１０回の独立した実験の結果を示す。＊はＰ＜０．００１、＊＊はＰ  ＜０．０５を示す。
【図２Ａ−２Ｅ】ＩＡＶ上のノイラミニダーゼ（ＮＡ）の毒性及び構造に対するグリコシル化の影響を示す図である。図２Ａは、Ａ５４９細胞におけるウイルスの複製率の比較を示す図である。図２Ｂは、特定のグリコシル化及び脱グリコシル化ＮＡ変異体の分子量に対する、抗ＮＡ抗体を用いるウェスタンブロット解析を示す写真を示す。図２Ｃは、特定の異なるタイプのＮＡの円二色性スペクトルを示す図である。図２Ｄは、脱グリコシル化ＮＡ変異体の円二色性スペクトルを示す図である。図２Ｅは、４−ＭＵＮＡＮＡアッセイにより測定したＩＡＶのＮＡ活性を示す図である。図２Ｂは、３回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを示す。図２Ｅは、５回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを示す。＊はＰ＜０．００１を示す。
【図３Ａ−３Ｈ】ＩＡＶ上のノイラミニダーゼ（ＮＡ）の免疫原性に対するグリコシル化の影響を示す図である。図３Ａは、異なる複合糖質（４−Ｍｕα−Ｎｅｕ５Ａｃ、６−ＳＬＮ及び３−ＳＬＮ）を用いるＮＡ活性の測定を示す図である。上記ＮＡ活性は、各ＷＴ基質の活性（１００％）に対する相対活性である。図３Ｂは、ＬＭＨ細胞におけるウイルス生成の比較を示す図である。ウイルス力価は４８ｈｐｉで決定される。図３Ｃは、６−ＳＬと相互作用するウイルスの変異体の薄層クロマトグラフィーを示す写真である。図３Ｄは、３７°Ｃ及び５５°Ｃで４−ＭＵＮＡＮＡアッセイにより得られた４４−７２−Ｇウイルス、脱グリコシル化４４−７２−Ｇウイルス及び４４−７２−２１９−ＧウイルスのＮＡ活性を示す図である。図３Ｅは、透過電子顕微鏡により観察したＷＴウイルスの形態を示す写真である。図３Ｆは、図３Ｅと同様に観察した４４−７２−２１９−Ｇウイルスの形態を示す写真である。図３Ｇは、ＷＴ  ＩＡＶ（ＷＳＮ）又は特定のＮＡ変異体を含むＩＡＶで攻撃したマウスの生存率を示す図である。図３Ｈは、図３Ｇのように処理したマウスの体重を示す図である。図３Ａ、Ｂ及びＤは、３回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを示す。図３Ｇは、５回の独立した実験の結果を示す。図３Ｈは、５回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを示す。＊はＰ＜０．００１、＊＊はＰ＜０．０５を示す。
【図４Ａ−４Ｇ】弱毒生インフルエンザ万能ワクチン（ＬＡＩＶ）上のＮＡの免疫原性に対するＮＡ切断の影響を示す図である。図４Ａは、ＬＡＩＶ  Ｈ１Ｎ１  Ａ／ＷＳＮ／３３（ＷＳＮ）−ＮＡの設計概略図である。数字は、ｃＲＮＡの５'末端からのヌクレオチドの番号を表す。ＴＧＡは終止コドンである。図４Ｂは、マウスにおけるＷＴ  ＩＡＶ  （ＷＳＮ）及び特定のＩＡＶ変異体の免疫原性を示す図である。不活化ウイルスでマウスを免疫化した後、免疫化されたマウスから得られた血清を用いて赤血球凝集抑制アッセイを行う。図４Ｃは、特定のウイルスで処置した後、Ｈ５Ｎ１ウイルスで攻撃したマウスの生存率を示す図である。図４Ｄは、処理されたマウスの肺におけるＨ５Ｎ１ウイルス複製動態を示す図である。図４Ｅは、免疫化マウスから得られた血清の血球凝集抑制アッセイを用いて、マウスにＷＴ  ＩＡＶ（ＷＳＮ）及びＬＡＩＶ  ＷＳＮ-ＮＡの免疫原性を示す図である。図４Ｆは、ウイルス感染時にＬＡＩＶ  ＷＳＮ-ＮＡがＣＤ８＋Ｔ細胞活性化を誘導する能力を示す図である。免疫化マウス由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）と共にＷＳＮウイルス（ウイルス）をインキュベートした後のＣＤ８  Ｔ細胞におけるＩＮＦ-γ発現のフローサイトメトリー分析を使用する。図４Ｇは、Ｍ１及びＮＰエピトープによる刺激の際にＬＡＩＶ  ＷＳＮ-ＮＡウイルスがＣＤ８＋Ｔ細胞活性化を誘導する能力を示す図である。特定のエピトープを、免疫されたマウスからのＰＢＭＣと共にインキュベートした後のＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＮＦ-γ発現のフローサイトメトリー分析を使用する。図４Ｂ、Ｄ及びＥは、１０回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを示す。図４Ｃは、１０回の独立した実験の結果を示す。図４Ｆ及びＧのデータは、代表的な３回の実験からのものである。＊はＰ＜０．００１を示す。
【図５Ａ−５Ｉ】ＩＡＶのＨＡの免疫原性に対するＨＡ脱グリコシル化の影響を示す図である。図５Ａは、ＨＡ上の異なるグリコシル化部位を有する１１種類のＩＡＶの概略図である。ＣＴは、細胞質ドメインのＣ末端を示す。ＴＭは、膜貫通ドメインを示す。全ての組換えウイルスは、ゲノム配列決定によって確認された。図５Ｂは、４８ｈｐｉにおける１１種類のウイルス変異体に感染したＡ５４９細胞におけるウイルス産生の比較を示す図である。図５Ｃは、特定のＨＡ変異体の円二色性スペクトルを示すチャートである。図５Ｄは、抗ＨＡ抗体及び抗Ｍ１抗体を用いて、同じ濃度の４種類の特定のＩＡＶ変異体のウエスタンブロット分析を示す写真である。フィルターを抗ＨＡ及び抗Ｍ１モノクローナル抗体でプローブした。図５Ｅは、ＭＤＣＫ細胞の感染後のウイルス力価を決定するためにプラークアッセイを用いて、特定のＨＡ変異体を有するウイルスの感染力を示す図である。図５Ｆは、細胞結合アッセイを用いた、細胞受容体結合活性を示す図である。図５Ｇは、４８ｈｐｉにおける、感染したＬＭＨ細胞における特定のウイルスのウイルス産生（ウイルス力価によって決定される）の比較を示す図である。図５Ｈは、抗ＨＡ抗体を用いた、エンドグリコシダーゼカクテルによる脱グリコシル化後のＩＡＶの３つの変異体のウエスタンブロット分析を示す写真である。図５Ｉは、マウスをエンドグリコシダーゼカクテルで処理した後、致死量の特定のウイルスで攻撃した後のマウス生存率を示す図である。図５Ｂ、Ｅ、Ｆ及びＧは、３回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを示す。図５Ｉは、１０回の独立した実験の結果を示す。＊はＰ＜０．００１を示す。
【図６Ａ−６Ｅ】ＨＡの結合特異性及び結合活性に対するグリコシル化の影響を示す図である。図６Ａは、ＩＡＶ結合研究のためのグリカンアレイ上のシアロシド構造の概略図である。この合成ＳＡグリカンアレイは、２０種類のα２，３−グリカン（１-２０）、９種類のα２，６−グリカン（２１-２９）、１０種類のα２，８及びα２，９グリカン（３０-３９）のシアロシドで構成され、ＩＡＶ結合性の研究のために設計される。図６Ｂは、特定のウイルスの４つの変種のグリカンアレイ分析を示す図である。図６Ｃは、４種類のＨＡタンパク質変異体のグリカンアレイ解析を示す図である。図６Ｄは、脱グリコシル化２８５−４９７−５５６−Ｇ  ＨＡのＩＡＶのグリカンアレイ解析を示す図である。図６Ｅは、１４２−２８５−４９７−５５６−Ｇ  ＨＡのＩＡＶのグリカンアレイ解析を示す図である。図６ＢからＥは、３回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを示す。
【図７Ａ−７Ｆ】ＩＡＶのＮＡ活性に対するグリコシル化の影響を示す図である。図７Ａは、ＮＡ上の異なるグリコシル化パターンを有する８個のＩＡＶの概略図である。グリコシル化部位は示されている。Ｎは、細胞質ドメインのＮ末端を示す。ＴＭは、膜貫通ドメインを示す。全ての組換えウイルスは、ゲノム配列決定によって確認された。図７Ｂは、８つの変異型ウイルスに感染したＭＤＣＫ細胞におけるウイルス産生の比較を示す図である。図７Ｃは、５種類のＮＡタンパク質のゲル濾過分析を示す図である。図７Ｄは、５種類の脱グリコシル化ＮＡタンパク質のゲルろ過分析を示す図である。図７Ｅは、抗ＮＡ抗体を用いた、エンドグリコシダーゼカクテルでの処理後のウイルスのウエスタンブロット分析を示す写真である。図７Ｆは、４−ＭＵＮＡＮＡアッセイによる脱グリコシル化ＩＡＶに対するＮＡ活性の測定値を示すチャートである。図７Ｂは、３回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを示す。図７Ｆは、５回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを示す。＊はＰ＜０．００１を示す。
【図８Ａ−８Ｆ】ＮＡの熱安定性及びＩＡＶ形態に対するグリコシル化の影響を示す図である。図８Ａは、特定のＷＳＮ  ＮＡ変異体が３−ＳＬを切断できないことを示す写真である。図８Ｂは、４−ＭＵＮＡＮＡアッセイを用いて、特定のウイルスのＮＡ活性に対する温度の影響を示す図である。図８Ｃは、抗ＮＡ抗体を用いた、エンドグリコシダーゼカクテル（Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３及びＨ）での処理後の４４-７２-Ｇ及び４４-７２-２１９-Ｇウイルスのウエスタンブロット分析を示す写真である。図８Ｄは、透過型電子顕微鏡を用いた４４−Ｇ  ＮＡウイルスの形態を示す写真である。図８Ｅは、電子顕微鏡を用いた７２−Ｇウイルスの形態を示す写真である。図８Ｆは、電子顕微鏡を用いた４４−７２−Ｇウイルスの形態を示す写真である。図８Ｂは、５回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを示す。＊はＰ＜０．００１を示す。
【図９Ａ−９Ｃ】弱毒化生インフルエンザ万能ワクチン（ＬＡＩＶ）に対するＮＡの免疫原性に対するグリコシル化の影響を示す図である。図９Ａは、致死量のＨ５Ｎ１を投与した後、ＷＳＮ、ＬＡＩＶ、ＷＳＮ-４４-７２-２１９-Ｇ又はＰＢＳで処理したマウスの生存率を示すチャートである。図９Ｂは、免疫化マウスから得られた血清の血球凝集抑制アッセイを用いて、不活性化ウイルスで免疫化されたマウスにおいてＷＴ  ＩＡＶ及び特定のＬＡＩＶ変異体の免疫原性を示す図である。図９Ｃは、ノイラミニダーゼ阻害アッセイを用いて、示したように免疫したマウスからのＮＡ抗体の力価を示す図である。ＷＳＮ処理マウスからの血清の最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）は４．３μｇ／ｍｌであった。ＬＡＩＶ  ＷＳＮ−４４−７２−２１９−Ｇは３．２μｇ／ｍｌであった。図９Ａは、５回の独立した実験の結果を示す。図９Ｂ及びＣは、５回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを示す。
【図１０Ａ−１０Ｆ】ＬＡＩＶ  ＷＳＮ-ＮＡウイルスが低病原性の有効なワクチンであることを示す図を含む。図１０Ａは、ＮＡ発現を伴うＷＴ  ＭＤＣＫ及びＭＤＣＫにおけるＷＳＮ及びＬＡＩＶ  ＷＳＮ-ＮＡウイルスによるプラーク形成の比較を示す図（ＭＤＣＫ＋ＮＡ）である。図１０Ｂは、抗ＮＡ抗体及び抗βアクチン抗体を用いた、ＭＤＣＫ＋ＮＡ細胞におけるＮＡ発現のウエスタンブロット分析を示す写真である。図１０Ｃは、Ａ５４９細胞にＭＯＩが３のウイルスを感染させた後の所定時間における特定のウイルスの力価を示す図である。図１０Ｄは、抗Ｍ１抗体及び抗βアクチン抗体を用いた、特定のウイルスに感染したＡ５４９細胞における細胞内ウイルスＭ１タンパク質レベルのウエスタンブロット分析を示す写真である。図１０Ｅは、ＷＳＮ又は特定のＬＡＩＶ  ＷＳＮ-ＮＡウイルスに感染したマウスの生存率を示す図である。図１０Ｆは、特定のウイルスを感染させた後の１４日間のマウスの体重を示す図である。図１０Ｃは、３回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを示す。図１０Ｅは、５回の独立した実験の結果を示す。図１０Ｆは、５回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを示す。＊はＰ＜０．００１を示す。
【図１１Ａ−１１Ｃ】不活性化ＷＳＮウイルス及びＷＳＮ-ＮＡウイルスに対する宿主免疫応答を比較する図である。図１１Ａは、特定の不活化ウイルスで免疫した後、致死量のＷＳＮウイルスで攻撃したマウスの生存率を示すチャートである。図１１Ｂは、特定のウイルスで免疫した後、致死量のＨ５Ｎ１ウイルスが投与されたマウスの生存率を示すチャートである。図１１Ｃは、ノイラミニダーゼ阻害アッセイを用いて、特定のウイルスで免疫されたマウスのＮＡ抗体の力価を示すチャートである。ＷＳＮウイルス処理マウスの血清のＩＣ５０は５．２μｇ／ｍｌであり、ＷＳＮ-ＮＡウイルスは４．７μｇ／ｍｌであった。図１１Ａ及びＢは、１０回の独立した実験の結果を示す。図１１Ｃは、１０回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを示す。
【図１２Ａ−１２Ｇ】ＬＡＩＶ  ＷＳＮ-ＮＡ処理による株間保護を示す図である。図１２Ａは、マウスをＷＳＮ、ＬＡＩＶ、ＷＳＮ-ＮＡ又はＰＢＳで処理した後、致死量のＷＳＮが投与された後のマウス生存率を示すチャートである。図１２Ｂは、感染後４日目及び６日目に特定の方式で処理したマウスの肺におけるＷＳＮウイルス複製動態を示すチャートである。図１２Ｃは、マウスをＷＳＮ、ＬＡＩＶ、ＷＳＮ-ＮＡ又はＰＢＳで処理した後、致死量のＡ／ｃａｌ／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）で攻撃した後のマウス生存率を示すチャートである。図１２Ｄは、感染後４日目及び６日目に特定の方式で処理したマウスの肺におけるＡ／ｃａｌ／０７／２００９ウイルス複製動態を示すチャートである。図１２Ｅは、ＬＡＩＶ  ＷＳＮ-ＮＡ処理の用量とＨ５Ｎ１及びＷＳＮで攻撃した後のマウス生存率との関係を示すチャートである。図１２Ｆは、フローサイトメトリーを用いた、生ＷＳＮ、ＬＡＩＶ、ＷＳＮ、ＮＡ、及びＰＢＳ処理マウスからのＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＮＦ-γ発現に対する不活性化ＷＳＮウイルスの影響を示すチャートである。図１２Ｇは、抗グランザイムＢ及び抗β−アクチン抗体を用いた、生ＷＳＮウイルス（＋ｖｉｒｕｓ）、ＮＰ（＋ＮＰ）又はＭ１（＋Ｍ１）エピトープを用いたＬＡＩＶ  ＷＳＮ−ＮＡで免疫したマウスからのＣＤ８＋細胞のグランザイムＢ発現インキュベーションのウエスタンブロット分析を示す写真である。図１２Ａ、Ｃ及びＥは、１０回の独立した実験の結果を示す。図１２Ｂ、Ｄは、３回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを示す。図１２Ｆのデータは、代表的な３回の実験からのものである。＊はＰ＜０．００１を示す。
【図１３Ａ−１３Ｂ】ＩＡＶ複製に対するＭ２グリコシル化の影響を示す図である。図１３Ａは、Ｍ２ドメイン構造の概略図であり、グリコシル化部位が強調された。Ｍ２のグリコシル化部位配列は、ＮＤＳ出会った。逆遺伝学を用いて、ＮをＧに、又はＳをＩに変更した。図１３Ｂは、感染２４時間後のウイルス力価を決定するためのプラークアッセイを用いて、特定のＩＡＶ変異体（ＭＯＩ：０．０１）に感染したＭＤＣＫ細胞のウイルス複製率の比較を示すチャートである。３回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを示す。
【図１４Ａ−１４Ｄ】ウイルス放出に対するＮＡ活性の影響を示す図である。図１４Ａは、ＮＡにさまざまな修正を加えた１０種類のＩＡＶの概略図である。グリコシル化部位が示されている。ＡＳ１構築物は、活性部位１を不活性するＲ１０２Ａ変異を含む。ＡＳ２構築物は、活性部位２を不活性するＤ１３５Ａ変異を含む。Ｎは、細胞質ドメインのＮ末端を示す。ＴＭは、膜貫通ドメインを示す。全ての組換えウイルスはゲノム配列決定により確認された。図１４Ｂは、ＭＯＩが３の特定のウイルス変異体による感染後のＡ５４９細胞のウイルス力価を示す図である。感染の８及び２４時間後に培養液を集めた。図１４Ｃは、図１４Ｂのように感染したＡ５４９細胞の全細胞溶解物からの細胞内ウイルスＲＮＡを示すチャート。図１４Ｄは、抗ＮＡ、抗ＮＰ、抗Ｍ１及び抗β−アクチン抗体を用いて、図１４Ｂのように感染させたＡ５４９細胞の全細胞溶解物からのＮＡ、Ｎ及びＭ１タンパク質レベルのウエスタンブロット分析を示す写真である。図３Ｂ及びＣは、３回の独立した実験の平均値±ＳＥＭである。
【図１５Ａ−１５Ｅ】ＬＡＩＶ  ＷＳＮ−ＮＡ及びＷＳＮ−ＮＡ−ＡＳ１に対する宿主免疫応答を比較する図である。マウスに１×１０６ｐｆｕのＷＳＮ、ＬＡＩＶ  ＷＳＮ−ＮＡ、ＷＳＮ−ＮＡ−ＡＳ１又は非致死量のＷＳＮ  （ＷＳＮ  （ＵＬ））ウイルスを感染させた後、生存率（図１５Ａ）及び体重（図１５Ｂ）を１４日間記録した。赤血球凝集抑制アッセイにより処理されたマウスの血清を分析した（図１５Ｃ）。図１５Ｄは、感染の４日後の異なるＩＡＶ構築物で処理したマウスの肺におけるウイルス複製動態を示す。図１５Ｅは、致死量のＨ５Ｎ１で攻撃した後、ＷＳＮ（ＵＬ）、ＬＡＩＶ  ＷＳＮ−ＮＡ、ＷＳＮ−ＮＡ−ＡＳ１又はＰＢＳで処理したマウスの生存率の分析を示す。図１５Ａ、Ｂ、Ｅは、１０回の独立した実験の結果を示す。図１５Ｃ、Ｄは、３回の独立した実験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
現在、インフルエンザ万能ワクチンの開発について、保存ペプチド又はタンパク質を抗原として用いるとともに、異なるアジュバント及び投与方法を採用することで免疫応答を誘導することに注目されている。しかし、保存ペプチド又はタンパク質の使用は、病原性ウイルスをもたらすため安全性の懸念が生じる、及び／又は、単一のインフルエンザ株のみに対して免疫応答を誘導する場合が多い。本開示は、部分的には、増強された免疫原性を有する赤血球凝集素（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）免疫ペプチド変異体の開発によって上記問題を克服することを目的とする。このようなＨＡ及び／又はＮＡ変異体は、広範囲のインフルエンザウイルス株に対して免疫応答を誘導することができ、インフルエンザ万能ワクチンの製造に有用である。
【００１９】
したがって、本発明は、増強された免疫原性を有するＨＡ及びＮＡ変異体、上記変異体を含むインフルエンザウイルス粒子、インフルエンザウイルス粒子又はＨＡ／ＮＡ変異体を含む免疫組成物、及びインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するためのそれらの使用を開示する。
【００２０】
Ｉ．  赤血球凝集素（ＨＡ）変異体
【００２１】
赤血球凝集素（ＨＡ）は、インフルエンザウイルスの表面に見られる糖タンパク質である。ＨＡは、細胞膜にシアル酸がある呼吸器系細胞及び赤血球細胞にウイルスを結合させる。ＨＡタンパク質は、Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒのコンセンサスモチーフにおける複数のアスパラギン残基へのグリカンの付加（即ち、Ｎ−グリコシル化）により翻訳後修飾されることが多い。Ｎ−グリコシル化が発生するＡｓｎ残基は、グリコシル化部位又はＮ−グリコシル化部位と呼ばれる。
【００２２】
例えば、Ａ型インフルエンザウイルス  （Ａ／ＷＳＮ／１９３３（Ｈ１Ｎ１）由来の野生型ＨＡのアミノ酸配列は、以下の配列番号３として提供される。この野生型ＨＡのグリコシル化部位（Ａｓｎ又はＮ残基）は、太字で示される。
【００２３】
配列番号３
0006975233.tif 000002
【００２４】
他の野生型ＨＡ抗原、例えば、Ｈ１、Ｈ２又はＨ３などのＨＡ抗原は、当分野で周知であり、それらのアミノ酸配列は、遺伝子データベース、例えば、遺伝子バンクから入手できる。特定の野生型ＨＡの亜型のグリコシル化部位は、上記例示的な配列（配列番号３）を有するアミノ酸配列と比較することにより同定することができる。
【００２５】
本明細書に記載のＨＡ変異体は、当分野で周知である野生型ＨＡの亜型、例えば、Ｈ１、Ｈ２又はＨ３  ＨＡ抗原のいずれかに由来することができる。例えば、このようなＨＡ変異体は、１つ以上のグリコシル化部位を維持するが、野生型対応物と比較して１つ以上の変異した他のグリコシル化部位を有し、このような変異部位でＮ−グリコシル化が発生しない（アグリコシル化）。例えば、本明細書に記載のＨＡ変異体は、配列番号３における残基１４２（下記の配列番号１における残基１４２と同様）に対応する位置にＡｓｎ残基（グリコシル化部位）を保持し、必要に応じて配列番号３（下記の配列番号１における残基２７と同様）における残基２７に対応する位置にもＡｓｎ残基を保持する一方、配列番号３における残基２８５、４９７及び５５６（下記の配列番号１における残基２８５、４９７及び５５６と同様）に対応する位置にある１つ以上のＡｓｎ残基が変異している。このように、本明細書に記載のＨＡ変異体は、配列番号３  （又は配列番号１）における１４２位、必要に応じて位置２７に対応するＡｓｎ残基でグリコシル化され得る一方、配列番号３（又は配列番号１）における２８５、４９７及び／又は５５６位に対応する変異したグリコシル化部位でアグリコシル化されない。
【００２６】
用語「変異した」又は「変異」は、任意のタイプの変異、例えば、付加、欠失及びアミノ酸置換を意味する。いくつかの例では、配列番号３又は配列番号１における位置２８５、４９７及び５５６に対応する１つ以上のＡｓｎ残基は欠失されていてもよい。他の例では、１つ以上のこれらのＡｓｎ残基は、他のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ又はＧｌｙ）で置換されていてもよい。いくつかの実施例では、本明細書に記載のＨＡ変異体の３つのグリコシル化部位のうちの１つは変異している。他の例では、ＨＡ変異体の３つのグリコシル化部位のうちの２つ（例えば、２８５＋４９７、２８５＋５５６又は４９７＋５５６）は変異した。他の実施例では、３つのグリコシル化部位の全ては変異している（例えば、置換されている）。
【００２７】
「配列Ｙにおける位置ａに対応する配列ＸにおけるＡ残基」とは、配列Ｘ及びＹが当該分野で公知のアミノ酸配列アラインメントツール（例えばＢＬＡＳＴ（登録商標））によりアラインメントされている場合での、配列Ｘにおけるａの対応位置にある残基をいう。
【００２８】
以下、本明細書に記載の例示的なＨＡ変異体のアミノ酸配列を示す。他の例示的なＨＡ変異体は、例えば以下の実施例で後述する。
【００２９】
配列番号１  （ＨＡ  ２８５−４９７−５５６−Ｇ）
0006975233.tif 000003
【００３０】
ＨＡ変異体は、野生型ＨＡ抗原（例えば、配列番号３）と少なくとも８５％（例えば、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ上記のようなグリコシル化部位変異を含み得る。用語「配列同一性」とは、当該分野で知られているように、配列比較（アライメント）によって決定される２つのポリペプチドの配列間の関係をいう。当分野では、同一性は、２つ以上のアミノ酸残基のストリング間の一致数によって決定される２つの配列間の配列関連性の程度も意味する。同一性は、特定の数学的モデル又はコンピュータプログラム（例えば「アルゴリズム」）によるギャップアライメント（必要に応じて）により２つ以上の比較的小さい配列の間の同一の一致の割合を測定するものである。関連ペプチドの同一性は、既知の方法によって容易に計算することができる。２つのアミノ酸配列の「同一性パーセント」は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：２２６４−６８，  １９９０（Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：５８７３−７７，  １９９３において修正）に記載のアルゴリズムを用いて決定することができる。このようなアルゴリズムは、ＮＢＬＡＳＴ（登録商標）及びＸＢＬＡＳＴ（登録商標）プログラム（バージョン２．０）に組み込まれている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−１０，  １９９０）。ＢＬＡＳＴ（登録商標）タンパク質検索は、本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝５０、ワード長＝３）により実施することができる。２つの配列間にギャップが存在する場合、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ（登録商標）を用いることができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５（１７）：３３８９−３４０２，  １９９７）。ＢＬＡＳＴ（登録商標）及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ（登録商標）プログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ（登録商標）及びＮＢＬＡＳＴ（登録商標））のデフォルトパラメータを使用することができる。もう１つの一般的なローカルアライメント法は、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムに基づくものである（Ｓｍｉｔｈ，  Ｔ．Ｆ．  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  Ｍ．Ｓ．  （１９８１）  「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｍｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．」  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １４７：１９５−１９７）。動的計画法に基づく一般的なグローバルアラインメント法は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムである（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，  Ｓ．Ｂ．  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，  Ｃ．Ｄ．  （１９７０）  "Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．"  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３−４５３）。最近、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを含む他の最適グローバルアライメント法よりも速くヌクレオチド及びタンパク質配列のグローバルアライメントを生成すると考えられる高速最適グローバル配列アライメントアルゴリズム（ＦＯＧＳＡＡ）が開発された。
【００３１】
本明細書に記載のグリコシル化部位変異に加えて、本明細書に記載のＨＡ変異体は、その野生型対応物と比較して１つ以上の保存的アミノ酸置換を含み得る。当業者に理解されるように、保存的アミノ酸置換により、ＨＡ変異体は機能的に等価な変異体となることができ、即ち、変異体は特定のＨＡ変異体の機能的能力を保持できる。本明細書では、用語「保存的アミノ酸置換」とは、当該アミノ酸置換が発生したタンパク質の相対電荷又はサイズ特性を変化させないアミノ酸置換を指す。変異体は、当業者に公知のポリペプチド配列を改変するための方法に従って製造することができる。このような方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９又はＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｆ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。アミノ酸の保存的置換は、（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；及び（ｇ）Ｅ、Ｄのうちのアミノ酸の置換を含む。
【００３２】
本明細書に記載のＨＡ変異体を製造するために、目的となる野生型ＨＡの亜型抗原を選択し、通常のアミノ酸配列アライメントにより上記のグリコシル化部位に対応するグリコシル化部位を同定することができる。次いで、変異（例えば、アミノ酸残基置換）を、野生型ＨＡのコード配列の配列番号３又は配列番号１における位置２８５、４９７及び５５６に対応する１つ以上のグリコシル化部位に導入してＨＡ変異体のコード配列を得ることができる。
【００３３】
従来の組換え技術に従って本明細書に記載のＨＡ変異体のいずれかのコード配列を発現ベクターに組み込んでＨＡ変異体を製造することができる。いくつかの例では、ＨＡ変異体のコード配列をウイルスベクターに挿入してＨＡ変異体を含むＡ型インフルエンザウイルス粒子を製造することができる。
【００３４】
ＩＩ．  ノイラミニダーゼ（ＮＡ）変異体
【００３５】
ノイラミニダーゼ（ＮＡ）は、インフルエンザウイルスの表面に見られる糖タンパク質である。ＮＡは、呼吸器系及び赤血球系宿主細胞のシアル酸を酵素的に切断して、ウイルス粒子の放出を容易にし、周りの細胞の感染を促進する。
【００３６】
ＮＡタンパク質は、Ｎ末端ドメイン、膜貫通ドメイン、ストークドメイン及び触媒ドメインを含む。ＨＡタンパク質と同様に、ＮＡタンパク質は、グリコシル化部位でのＮ−グリコシル化により翻訳後修飾されることが多い。ＮＡタンパク質は、触媒活性に必要とされるいくつかの「活性部位」残基をさらに含む。
【００３７】
例えば、Ａ型インフルエンザウイルス株（Ａ／ＷＳＮ／１９３３（Ｈ１Ｎ１））に由来の野生型ＮＡのアミノ酸配列は、以下の配列番号４として提供される。
【００３８】
配列番号４
0006975233.tif 000004
【００３９】
この野生型ＮＡの残基４４、７２及び２１９（上記の配列番号４に示される）は、グリコシル化部位（Ａｓｎ又はＮ残基）であり、太字で示される。残基１０２Ｒ、１３５Ｄ、２６２Ｅ、２７７Ｒ、３５２Ｒ、３８６Ｙ及び４０９Ｅ（上記の配列番号４に示される）は、例示的な活性部位であり、太字で示される。Ｎ末端及び膜貫通ドメイン（下記の配列番号５）は、配列番号４における斜体で示される。この野生型ＮＡのストークドメイン（下記の配列番号６）は、配列番号４において下線で示される。触媒ドメイン（下記の配列番号７）は、野生型ＮＡのＣ末端に位置する。
【００４０】
Ｎ末端ドメイン（配列番号５）：
ＭＮＰＮＱＫＩＩＴＩ  ＧＳＩＣＭＶＶＧＩＩ  ＳＬＩＬＱＩＧＮＩ
【００４１】
ストークドメイン（配列番号６）
Ｉ  ＳＩＷＩＳＨＳＩＱＴ  ＧＮＱＮＨＴＧＩＣＮ  ＱＧＳＩＴＹＫＶＶＡ  ＧＱＤＳＴＳＶＩＬＴ  ＧＮＳＳ
【００４２】
触媒ドメイン（配列番号７；太字：活性部位残基）：
【００４３】
0006975233.tif 000005
【００４４】
他の野生型ＮＡの亜型、例えば、Ｎ１、Ｎ２又はＮ３は、当分野で周知であり、それらのアミノ酸配列は、遺伝子データベース、例えば、遺伝子バンクから入手できる。上記野生型ＮＡタンパク質及び機能ドメインのグリコシル化部位（例えば、Ｎ末端及び膜貫通ドメイン、ストークドメイン及び触媒ドメイン）、並びに触媒ドメインにおける活性部位／残基は、そのアミノ酸配列と上記例示的な配列（配列番号４）とを比較することにより同定することができる。
【００４５】
本明細書に記載のＮＡ変異体は、当分野で周知である野生型ＮＡの亜型、例えば、Ｎ１、Ｎ２又はＮ３などのＮＡ亜型のいずれかに由来することができる。このようなＮＡ変異体は、１つ以上の活性部位及び／又は１つ以上のＮ−グリコシル化部位に変異（例えば、付加、欠失又はアミノ酸置換）を有することによって、変異体は野生型対応物と比較してＮＡ活性において欠陥がある。本明細書に記載のＮＡ変異体の活性に「欠陥」があるとは、ＮＡ変異体の生物学的活性が野生型対応物と比較して実質的に低下することを意味する。例えば、同一又は実質的に類似の条件下で同一又は実質的に類似のアッセイによって測定した結果、ＮＡ変異体の活性は、野生型対応物に対して３０％未満（例えば、２０％未満、１０％未満又は５％未満）である。いくつかの実施例では、本明細書に記載のＮＡ変異体の生物学的活性は、従来のアッセイ及び／又は本明細書に記載のアッセイによって検出できないレベルであり得る。
【００４６】
ＮＡ活性は、当分野で周知である２−（４−メチルウンベリフェリル）−α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（４−ＭＵＮＡＮＡ）蛍光に基づくアッセイ（以下の実施例２で後述）により測定することができる。ＮＡ活性の測定方法は、ＮＡ基質特異性を決定するアッセイを含む。例えば、４−Ｍｕα−ＮｅｕＡｃ、６'−シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン（６−ＳＬＮ）、３'−シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン（３−ＳＬＮ）、３'−シアリルラクトース（３−ＳＬ）及び６'−シアリルラクトース（６−ＳＬ）を用いてＮＡ基質特異性を決定することができる。ＮＡによる基質の酵素的切断の動態は、Ｎ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）デヒドロゲナーゼ及びシアル酸アルドラーゼとの反応によって決定することができる（以下の実施例２で後述）。
【００４７】
いくつかの例では、本明細書に記載のＮＡ変異体は、１つ以上のＮ−グリコシル化部位（例えば、上述のＮ−グリコシル化部位）に１つ以上の変異を有することができる。これらの変異は、従来の方法及び／又は後述する本開示の方法により識別することができる。例示的なＮ−グリコシル化部位は、配列番号４における４４、７２及び２１９に対応する位置（Ａｓｎ残基）を含む。例えば、１つ以上のＮ−グリコシル化部位（例えば、４４、７２及び／又は２１９）は、欠失していてもよい。他の例では、１つ以上のこれらのＮ−グリコシル化部位は、他のアミノ酸（例えば、Ａｌａ又はＧｌｙ）で置換されていてもよい。いくつかの実施例では、本明細書に記載のＮＡ変異体は、１つのグリコシル化部位（例えば、４４、７２又は２１９）に置換を有していてもよい。他の例では、ＮＡ変異体は、２つのグリコシル化部位（例えば、４４＋７２、７２＋２１９又は４４＋２１９）に置換を有していてもよい。他の例では、３つのグリコシル化部位（例えば、４４＋７２＋２１９）は、置換されている。
【００４８】
以下、１つ以上の変異グリコシル化部位を有する例示的なＮＡ変異体のアミノ酸配列を示す。野生型対応物に対して、アミノ酸置換を太字で示す。
【００４９】
ＮＡ  ４４−Ｇ  （配列番号８；太字：４４位での置換）：
0006975233.tif 000006
【００５０】
ＮＡ  ７２−Ｇ  （配列番号９；太字：位置７２での置換）：
0006975233.tif 000007
【００５１】
ＮＡ  ４４−７２−Ｇ  （配列番号１０；太字：４４及び７２位での置換）：
0006975233.tif 000008
【００５２】
ＮＡ  ４４−７２−２１９−Ｇ  （配列番号１１；太字：４４、７２及び２１９位での置換）：
0006975233.tif 000009
【００５３】
あるいは又はさらに、本明細書に記載のＮＡ変異体は、当分野で公知の及び／又は本明細書に記載の１つ以上の活性部位に１つ以上の変異（例えば、欠失、付加又はアミノ酸置換）を含み得る。例示的な活性部位は、配列番号４における残基１０２、１３５、２６２、２７７、３５２、３８６及び４０９に対応する位置を含む。例えば、ＮＡ変異体は、他のアミノ酸（例えば、Ａｌａ又はＧｌｙ）で置換された配列番号４における残基１０２及び／又は１３５に対応する位置を有していてもよい。
【００５４】
以下、変異活性部位を有する２つの例示的なＮＡ変異体のアミノ酸配列を示す。野生型対応物に対して、アミノ酸置換を太字で示す。
【００５５】
ＷＳＮ−ＮＡ  ＡＳ１  （配列番号１２；太字：１０２位での置換）：
0006975233.tif 000010
【００５６】
ＷＳＮ−ＮＡ  ＡＳ２  （配列番号１３；太字：１３５位での置換）
0006975233.tif 000011
【００５７】
ＷＳＮ−ＮＡ−Ｇ３８８Ａ  （配列番号１４；太字：位置３８８での置換）：
0006975233.tif 000012
【００５８】
いくつかの実施例では、本明細書に記載のＮＡ変異体は、野生型ＮＡタンパク質（例えば、配列番号４）と少なくとも８５％（例えば、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を含みえる。このような変異体は、本明細書に記載の１つ以上のグリコシル化部位及び／又は活性部位に１つ以上の変異を含み得る。ＮＡ変異体は、１つ以上のアミノ酸置換をさらに含み得る。例えば、適宜の位置（例えば、配列番号４における３８８に対応する位置）に保存的アミノ酸残基置換を含む。
【００５９】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＮＡ変異体は、ストーク領域若しくはその一部、触媒ドメイン若しくはその一部を有するか、又はその両方が欠失した野生型ＮＡの切断型であり得る。他の例では、ＮＡ変異体は、１つ以上の活性部位の喪失をもたらすストーク領域内の部分的な欠失及び／又は触媒ドメイン内の部分的な欠失を有し得る。あるいは又はさらに、ＮＡ変異体は、１つ以上のグリコシル化部位の喪失をもたらすストーク領域内の部分的な欠失及び／又は触媒ドメイン内の部分的な欠失を有し得る。一例では、ＮＡ変異体は、触媒ドメイン（例えば、配列番号４における残基７５から残基４５３に対応する領域）全体の欠失を有し得る。他の実施例では、ＮＡ変異体は、触媒ドメイン及びストーク領域の両方が欠失していてもよい（例えば、配列番号４における残基３０から残基４５３に対応する残基の喪失）。
【００６０】
以下、本明細書に記載の２つの例示的な切断したＮＡ変異体のアミノ酸配列を示す。
【００６１】
ＬＡＩＶ  ＷＳＮ−ＮＡ（配列番号２；ストーク及び触媒ドメインの両方が欠失）：
ＭＮＰＮＱＫＩＩＴＩ  ＧＳＩＣＭＶＶＧＩＩ  ＳＬＩＬＱＩＧＮＩＩ
【００６２】
ＷＳＮ−ＮＡ−ＣＤ  （配列番号１５；触媒ドメインが欠失）：
ＭＮＰＮＱＫＩＩＴＩ  ＧＳＩＣＭＶＶＧＩＩ  ＳＬＩＬＱＩＧＮＩＩ  ＳＩＷＩＳＨＳＩＱＴ  ＧＮＱＮＨＴＧＩＣＮ  ＱＧＳＩＴＹＫＶＶＡ  ＧＱＤＳＴＳＶＩＬＴ  ＧＮＳＳ
【００６３】
本明細書に記載のＮＡ変異体のいずれかを製造するために、目的となる野生型ＮＡの亜型タンパク質を選択し、従来のアミノ酸配列アライメントにより上述したグリコシル化部位及び／又は活性部位に対応するグリコシル化部位及び／又は活性部位を同定することができる。次いで、変異（例えば、アミノ酸残基置換又は欠失）を野生型ＮＡのコード配列における１つ以上のグリコシル化部位及び／又は活性部位に導入することができる。例えば、部位特異的変異導入又はＣＲＩＳＰＲにより目的の変異を生じさせることができる。他の実施例において、終止コドンをＮＡタンパク質のコード配列の所定位置に導入して本明細書に記載の切断したＮＡ変異体を製造することができる。
【００６４】
従来技術により、本明細書に記載のいずれかのＮＡ変異体のコード配列をウイルスベクターなどのベクターに挿入することでＮＡ変異体を含むＡ型インフルエンザウイルス粒子を製造することができる。
【００６５】
ＩＩＩ．  インフルエンザウイルス粒子
【００６６】
本発明は、本明細書に記載のいずれかのＨＡ変異体及び／又はＮＡ変異体を含むＡ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ）粒子をさらに開示する。本明細書に記載のＩＡＶ粒子は、Ａ型インフルエンザウイルスの亜型のいずれかであり得、弱毒化生（ｖｉａｂｌｅ）ウイルス又は欠陥のあるウイルスであり得る。
【００６７】
Ａ型インフルエンザウイルスの亜型は、ウイルス表面タンパク質である赤血球凝集素（ＨＡ）を特徴とすることができ、Ｈ数（例えば、Ｈ１、Ｈ３及びＨ５）で標識される。さらに、亜型は、さらにウイルス表面タンパク質であるノイラミニダーゼ（ＮＡ）によって特徴付けることができ、Ｎ数（例えば、Ｎ１及びＮ２）で標識される。このように、亜型は、例えばＨ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１及びＨ５Ｎ２のように、Ｈ及びＮ数の両方で示され得る。Ｈ１Ｎ１  ＩＡＶは、Ｈ１  ＨＡタンパク質及びＮ１  ＮＡタンパク質を有する亜型である。他の実施例では、Ｈ５Ｎ１  ＩＡＶは、Ｈ５  ＨＡタンパク質及びＮ１  ＮＡタンパク質を有する亜型である。
【００６８】
弱毒化生ウイルスとは、その野生型対応物と比較して弱毒化されるように修飾（例えば、遺伝的に、化学的に、又は物理的に）されたウイルスをいう。一般的に、弱毒化生ウイルスは、適切な宿主細胞内で自己複製及びアセンブリすることができる。例えば、同一又は実質的に類似の条件下で同一又は実質的に類似のアッセイによって測定した結果、弱毒化生組換えウイルスの毒性は、野生型対応物の５０％（例えば、４０％、３０％、２０％、１０％又は以下）である。いくつかの実施例では、弱毒化生ウイルスは完全に不活化されていてもよく、即ち、その毒性が従来のアッセイ又は本明細書に記載のアッセイによっては検出できない。弱毒化は、ＨＡ抗原又はＮＡ抗原のいずれかに導入された１つ以上の変異に起因し得る。例えば、配列番号１又は配列番号３における１４２（グリコシル化部位１４２）に対応するグリコシル化部位、及び必要に応じて配列番号１又は配列番号３における２７に対応する位置（グリコシル化部位２７）のグリコシル化部位でのＨＡのグリコシル化は、ＨＡの生物活性にとって重要であり、このようなＨＡを有するＩＡＶの毒性に寄与し得る。したがって、グリコシル化部位１４２及び必要に応じてグリコシル化部位２７でグリコシル化されたＨＡ分子を有するＩＡＶは、安全性の観点から、従来の方法（例えば、当分野で公知の及び／又は本明細書の方法）を介して弱毒化又は不活性化する必要があり得る。配列番号１又は配列番号３における２８５、４９７及び５５６に対応する位置の１つ以上のグリコシル化部位での変異は、１つ以上のこれらの部位でのグリコシル化を除去することでこのようなＩＡＶ粒子の免疫原性を増強することができる。これは、ＨＡの保存領域の宿主の免疫系への曝露の増大に起因し得る。しかし、これらのグリコシル化部位での変異は、ウイルス複製率にほとんど又は全く影響を及ぼさない。以下の実施例及びＷｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ  １１４（２）：２８０−２８５，  ２０１７を参照されたい。
【００６９】
他の実施形態において、本明細書に記載のＩＡＶウイルスは、欠陥のあるウイルスであり得、ヘルプウイルス又は複製及び／又はウイルス粒子構築のための必須ウイルス成分の非存在下では、自己複製及び／又は適切な宿主細胞中でアセンブリすることができない。例えば、本明細書のＮＡ変異体を含むＩＡＶ粒子は、ノイラミニダーゼ酵素活性を欠き、少なくともウイルス粒子のアセンブリに欠陥がある。このようなＮＡ変異体を含むＩＡＶ粒子は、機能的ＮＡの存在下で製造することができる。これらのＩＡＶ粒子は、中和抗体の非存在下で様々なインフルエンザウイルス株及び亜型を認識できるＩＡＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化できるので、弱毒化生インフルエンザ万能ワクチン組成物を製造するための有利な候補である。以下の実施例及びＷｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７を参照されたい。
【００７０】
ウイルスの毒性は、ウイルス複製率、ウイルス侵入、及び／又はウイルス感染後の被験体（宿主）の生存率によって決定することができる。実施例１に示すように、ウイルス力価を測定するプラークアッセイにより決定することができる。ウイルス侵入は感染性アッセイ（実施例１に記載）により測定することができる。例示的な宿主生存率アッセイは実施例１に提供される。被験体の例には、ヒト、マウス、ブタ、ウシ、ラット、イヌ、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、サル、ウマ又はトリが含まれる。
【００７１】
弱毒化生ウイルスは、低毒性株を同定するための複数世代にわたる組織培養中又は卵上でのウイルスの継代などの当技術分野において周知の方法によって製造することができる。弱毒化生ウイルスは、化学的及び／又は物理的処理によっても製造することができる。
【００７２】
いくつかの例では、常法に従って適切な宿主細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＭＤＣＫ、Ａ５４９、ＣＨＯ又はＶｅｒｏ細胞）を用いて本明細書に記載のＩＡＶ粒子を製造することができる。ウイルス成分をコードする１つ以上の発現ベクター（例えば、ウイルスベクター）は、本明細書に記載の１つ以上のＨＡ及び／又はＮＡ変異体を含む。この発現ベクターを適切な宿主細胞に導入した後、適切な条件下で培養することにより、ＩＡＶ粒子を製造することができる。必要に応じて、ヘルパーウイルスを使用して、ＩＡＶ粒子の複製及び／又はアセンブリを容易にすることができる。又は、ウイルスゲノム複製及び／又はウイルス粒子再構築のために、宿主細胞株を用いて１つ以上の必須ウイルス成分を製造することができる。常法によって細胞培養物の上清を収集し、そこに含まれるウイルス粒子を収集することができる。このようにして得られたウイルス粒子は、当分野で公知の方法又は本明細書に開示された方法により適切な宿主（例えば、宿主細胞又は（特定病原体フリー（ＳＰＦ）ニワトリ卵などのニワトリ卵）においてさらに増殖させることができる。
【００７３】
いくつかの実施例では、ＩＡＶ粒子は、当分野で公知の化学的方法又は物理的方法によってさらに弱毒化されてもよい。例えば、ウイルスは、化学的処理によって不活化することができる。上記化学的処理として、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、バイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）、マーシオレート、グルタルアルデヒド、ドデシル硫酸ナトリウム又はそれらの組み合わせによる処理が挙げられるが、これに限定されない。あるいは又はさらに、ウイルスは、熱、ＵＶ照射、極端なｐＨ、及び凍結融解サイクル、又は当分野で周知の他の方法によって不活化されてもよい。
【００７４】
場合により、組換えＩＡＶはさらなる使用のために希釈剤に懸濁されてもよい。希釈剤の非限定的な例としては、水、生理食塩水、ブドウ糖、プロパノール、エタノール、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、デンプン、ラクチトール、マルトデキストリン、グリセロール、キシリトール、トレハロース、鉱物油、植物油、塩化ナトリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、塩化カリウム、リン酸二カルシウム、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム二水和物、及び炭酸マグネシウムが挙げられる。
【００７５】
免疫原性組成物
【００７６】
いくつかの態様において、本開示は、（ｉ）本明細書に記載のいずれかの組換えＩＡＶウイルス、ＨＡ及び／又はＮＡ変異体、並びに（ｉｉ）アジュバントであり得る薬学的に許容される担体を含む免疫原性組成物（例えば、ワクチン）を特徴とする。本明細書では、「免疫原性組成物」とは、宿主に接種された後に、宿主において免疫応答を刺激する効果を有し、疾患（例えば、ＩＡＶ感染）から宿主を完全にもしくは部分的に保護するか又はその症状（発熱、充血、頭痛など）を軽減するのに役立つ組成物を指す。いくつかの実施形態において、本発明に記載の免疫原性組成物は、上記のＩＡＶ粒子を含む。他の実施形態において、本明細書に記載の免疫原性組成物は、本明細書に記載のいずれかのＨＡ変異体及び／又はＮＡ変異体を含む。このような免疫原性組成物は、既存の病状を治療するための予防薬又は治療薬として使用することができる。
【００７７】
本明細書では、用語「抗原」又は「抗原剤」は、別段の指定がない限り、免疫適格なヒト又は動物に導入されて体液性及び／又は細胞性免疫応答を刺激する任意の剤を指す。抗原は、純粋な物質、混合物、特定の材料又は弱毒化生ウイルスであり得る。適切な抗原の例には、タンパク質、糖タンパク質、ポリペプチド、及びウイルスが含まれる。
【００７８】
本明細書に記載の免疫原性組成物によって誘発された免疫応答は、常法によって監視することができる。例えば、免疫応答は、抗体プロファイリング技術（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫（ＥＩＡ）、又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））、細胞傷害性Ｔリンパ球アッセイ及び／又は他の当分野で周知の方法により抗原に対するＣＤ８＋  Ｔ細胞誘導を決定することによって測定することができる。
【００７９】
免疫原性組成物は、常法により製造することができる。薬学的に許容される担体の例には、リン酸緩衝生理食塩水、重炭酸塩溶液、及び／又はアジュバントが含まれる。担体は、投与方法及び投与経路、ならびに標準的な製薬実践に基づいて選択することができる。適切な医薬担体、希釈剤、及びそれらの使用の医薬的な必要性について、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ  （１９９０）に記載されている。組成物はまた、インビボ送達を容易にするポリマーを含み得る。Ａｕｄｒａｎ  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２１：１２５０−５，  ２００３；  ａｎｄ  Ｄｅｎｉｓ−Ｍｉｚｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２２５：１２−２０，  ２００３を参照されたい。  
【００８０】
本明細書では、「アジュバント」は、抗原に対する免疫応答（例えば、体液性又は細胞性免疫応答）を増強、増加、上方調節、多様化又は促進する任意の物質又は物質の混合物を指す。アジュバントとしては、例えば、完全フロイントアジュバント（ＦＡ）、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウム）、界面活性物質（例えば、リゾレシチン）、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、炭化水素エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、スルホリポシクロデキストリン（ＳＬ−ＣＤ）及びサポニン（例えば、Ｑｕｉｌ  Ａ）が挙げられる。アジュバントの他の例としては、コレラ毒素、大腸菌熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）、リポソーム、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）又は免疫刺激配列オリゴデオキシヌクレオチド（ＩＳＳ−ＯＤＮ）が挙げられる。
【００８１】
当業者に知られているように、免疫原性組成物はｐＨ調整剤をさらに含み得る。ｐＨ調整剤は、酢酸、ホウ酸、炭酸、クロム酸、クエン酸、乳酸、塩酸、酒石酸、プロピオン酸、リンゴ酸、リン酸、水酸化アンモニウム、炭酸アンモニウム、エチルアミン、ジメチルアミン、グリシン、メチルアミン、トリメチルアミン、ジエタノールアミン、重炭酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、ヒドラジン、モノエタノールアミン、水酸化カリウム、リン酸ナトリウム、トロラミン、又はそれらの組み合わせであり得る。
【００８２】
いくつかの実施例では、本発明の免疫原性組成物は、防腐剤をさらに含み得る。防腐剤の適切な例には、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロルヘキシジン、イミダゾリジニル尿素、フェノール、ソルビン酸カリウム、安息香酸、ブロノポール、クロロクレゾール、パラベンエステル、フェノキシエタノール、ソルビン酸、α−トコフェロール、アスコルビン酸、アスコルビルパルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、アスコルビン酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、クエン酸、エデト酸、及びそれらの組み合わせが含まれる。
【００８３】
当分野で周知の免疫原性組成物（例えば、ワクチン）の製造方法は、Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔｓ  ４，６０１，９０３、４，５９９，２３１、４，５９９，２３０及び４，５９６，７９２に記載されている。ワクチンは、注射剤（溶液又は乳剤）として調製することができる。本発明の組換えウイルス又はＨＡペプチドは、必要に応じて生理学的に許容されかつ相溶性のある賦形剤と任意に混合することができる。賦形剤は、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール及びそれらの組み合わせを含む。ワクチンは、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、又はワクチンの有効性を増強するアジュバントなどの少量の補助物質を含み得る。免疫原性組成物にアジュバント効果を生じさせる方法は、水酸化アルミニウム又はリン酸塩（ミョウバン）などの薬剤用いて、一般的な使用濃度０．０５〜０．１％のリン酸緩衝生理食塩水を調製する方法を含む。
【００８４】
本明細書に記載の医薬組成物は、常法により様々な投与経路用の剤形に製剤化することができる。例えば、経口投与用のカプセル、ゲルシール又は錠剤に製剤化することができる。カプセル剤は、ゼラチン又はセルロースなどの任意の標準的な薬学的に許容される材料を含み得る。錠剤は、組成物と固体担体及び滑沢剤との混合物を圧縮する従来の手順に従って製剤化することができる。固体担体の例には、デンプン及び糖ベントナイトが含まれる。組成物は、ハードシェル錠剤、又は結合剤（例えば、ラクトース又はマンニトール、従来のフィラー、及び錠剤化剤）を含有するカプセル剤の形態で投与することもできる。医薬組成物は、非経口経路で投与することができる。非経口剤形の例には、水溶液、等張食塩水、５％グルコースの活性剤、又は他の周知の薬学的に許容される賦形剤が含まれる。シクロデキストリン、又は当業者に知られている他の可溶化剤を、治療薬を送達するための医薬賦形剤として利用することができる。
【００８５】
注射用組成物は、植物油、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、乳酸エチル、炭酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、エタノール及びポリオール（グリセリン、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）などの様々な担体を含み得る。静脈内注射の場合、水溶性抗体は点滴法によって投与することができ、それによってＩＡＶ粒子、ＨＡ及び／又はＮＡ変異体ならびに生理学的に許容される賦形剤を含有する医薬組成物が注入される。生理的に許容される賦形剤には、例えば、５％デキストロース、０．９％生理食塩水、リンゲル液、又はその他の適切な賦形剤が含まれる。筋肉内調製物（例えば、抗体の適切な可溶性塩形態の滅菌製剤）を注射用水、０．９％生理食塩水、又は５％グルコース溶液などの医薬賦形剤に溶解して投与することができる。
【００８６】
治療上の使用
【００８７】
本明細書に記載のいずれかの免疫原性組成物は、インフルエンザウイルス感染を治療するため、又はそのような感染の危険性を減らすために使用することができる。理論に拘束されることなく、本方法によって付与される保護は、対応するＩＡＶウイルスに対するＩＡＶ特異的又はＨＡ／ＮＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答によって部分的に媒介され得、これによって被験体において株間及び／又は亜型間保護を提供する。
【００８８】
この実施形態を実施するために、有効量の本明細書に記載の免疫原性組成物を適切な経路を介して治療を必要とする被験体に投与することができる。本明細書に記載の方法によって治療される被験体は、Ａ型インフルエンザウイルス感染症に罹患している、この感染を有することが疑われるか、又は感染の危険性がある哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ブタ、ウシ、ラット、イヌ、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、サル、ウマ又はトリ）であり得る。
【００８９】
本明細書では、用語「有効量」は、単独使用又は１つ以上の他の活性剤との併用にもかかわらず、被験体に治療効果を与えるのに必要な各活性剤の量を指す。当業者に理解されるように、有効量は、投与経路、賦形剤の使用、及び他の活性剤との併用によって異なる。投与量は、例えば抗体を合成する個体免疫系の能力、及び必要に応じて細胞媒介免疫応答を生じさせる能力を含む、治療される被験体に依存する。投与に必要とされる活性成分の正確な量は、従業員に判断にされる。しかし、適切な投与量範囲は当業者によって容易に決定可能であり、また本発明のポリペプチドの使用量はマイクログラムオーダーであり得る。初回投与及びブースター投与量のための適切なレジメンもまた可変であるが、初回投与とそれに続くその後の投与を含み得る。ワクチンの投与量は投与経路及び宿主の大きさに依存する。
【００９０】
本明細書に記載の免疫原性組成物は、インフルエンザウイルス感染を有するリスクの低減（予防的治療）又はインフルエンザウイルス感染の治療のために被験体（例えばヒト）に投与され得る。このインフルエンザウイルス感染は、任意タイプのＡ型インフルエンザウイルス（例えば、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ７、Ｈ９Ｎ２又はＨ１０Ｎ７）によって引き起こされ得る。いくつかの実施形態において、特定のインフルエンザウイルス亜型に由来するＩＡＶ、又は特定のタイプのウイルスに由来するＨＡ及び／又はＮＡ変異体を含む免疫原性組成物は、その特定のインフルエンザウイルス亜型によって引き起こされる感染の治療又はそのリスクの低減に使用され得る。本明細書では、用語「治療」は、被験体に１つ以上の活性剤を含む組成物を適用又は投与することを指す。上記被験体は、インフルエンザウイルス感染、感染の症状、又は感染の傾向を有する。治療の目的は、感染、感染の症状、又は感染の傾向を治療、治癒、緩和、軽減、改変、根治、改良又は影響することである。
【００９１】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法によって治療される被験体は、通常の医療行行為によってインフルエンザウイルスによる感染症と診断されたヒト患者であり得る。他の実施形態において、被験体は、インフルエンザウイルス感染に関連する１つ又は複数の症状（例えば、発熱、筋肉痛、悪寒、発汗、頭痛、咳、疲労、脱力感、鼻づまり、及び／又は喉の痛み）を示すヒト患者であり得る。そのようなヒト患者はＩＡＶに曝されている可能性がある。
【００９２】
いくつかの例では、ヒト被験体は感染のリスクがある。例えば、個体は、免疫無防備状態（例えば、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、喘息、慢性心疾患、慢性心臓又は肺疾患に罹患している）であってもよく、高齢（例えば、６５歳以上）であってもよく、子供又は乳児（例えば、５歳未満）であってもよく、又は感染した個体に近接して働いていても／住んでもよい。
【００９３】
本開示に記載の任意の免疫原性組成物は、適切な経路を介して治療を必要とする被験体に投与することができる。投与経路は、例えば、皮下注射又は皮下埋め込み、筋肉内注射、髄腔内注射、腹腔内注射、皮内注射、胸骨内注射、関節内注射、頭蓋内注射、病巣内注射、直腸内注射、膣内注射、鼻腔内注射、胃内注射、気管内注射、又は髄腔内注射などの非経口投与を含む。或いは、坐剤、経口製剤、経腸投与、経鼻投与、局所投与又は経粘膜投与を含む他の投与様式が望ましい場合がある。坐剤、結合剤及び担体の場合、例えば、ポリアルカレングリコール又はトリグリセリドを含み得る。経口製剤は、例えば、医薬グレードのサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムなどの常用成分を含み得る。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放製剤又は散剤の形態である。いくつかの例では、本明細書に記載の免疫原性組成物は、インフルエンザ万能ワクチン（例えば、異種間、株間及び／又は系間特異性を有するインフルエンザ万能ワクチン）として機能する経鼻投与によって被験体に投与することができる。
【００９４】
上記のように、必要な投与量は、投与経路の選択、製剤の性質、被験体の病気の性質、被験者の種、サイズ、重量、表面積、年齢、性別、投与されている他の薬及び医師の判断に依存する。適切な投与量は、０．０１〜１００．０ｍｇ／ｋｇの範囲内である。利用可能な種々の組成物及び種々の投与経路による異なる効率を考慮して、必要とされる投与量の広い変動が予想されるべきである。例えば、経口投与は、静脈内注射よりも高い投与量が必要とされることが予想される。当分野でよく理解されているように、このような投与量レベルの変動は、最適化のための標準的な経験則に基づいて調整することができる。適切な送達ビヒクル（例えば、ポリマー微粒子又は埋め込み型デバイス）中に組成物を封入することにより、特に経口送達の場合、送達効率が向上する。
【００９５】
本発明の広い範囲を説明する数値範囲及びパラメータは近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に記載されている数値は可能な限り正確に記載されている。しかしながら、いずれの数値にも、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的に生じる特定の誤差が本質的に含まれる。また、本明細書では、用語「約」は一般に、所与値又は範囲の１０％、５％、１％、又は０．５％以内を意味する。或いは、用語「約」は、平均値の許容可能な標準誤差内を意味し、この標準誤差は当業者によって判断することができる。操作／実施例以外、又は特に明記しない限り、本明細書に記載の全ての数値範囲、量、値及び割合（例えば材料の量、期間、温度、操作条件、量の比率など）は、全ての場合において用語「約」により修飾されていると理解されるべきである。したがって、そうでないと示されていない限り、本開示及び添付の特許請求の範囲に記載の数値パラメータは、近似値であり、必要に応じて変わることがある。少なくとも、各数値パラメーターは、開示された有効桁数及び通常の丸め手法により得られる数値であると理解されるべきである。
【００９６】
当業者は、動物モデルから決定された用量に基づいて、本明細書中の任意の免疫原性組成物のヒト等価用量（ＨＥＤ）を計算することができる。例えば、ＨＡ変異体をコードする組換えＩＡＶを含む免疫原性組成物の有効ＨＥＤは、ヒトについての用量当たり、約８．１ｎｇから１．６２μｇのＨＡ、好ましくは、８１ｎｇから８１０ｎｇのＨＡであり得る。好ましい一例では、本発明の組換えＩＡＶの有効ＨＥＡＤは、１用量あたり約４６８ｎｇのＨＡである。
【００９７】
投与スケジュールに関しては、本明細書に開示される免疫原性組成物は、疾患の予防又は治療の過程において被験体に少なくとも２回（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５回又はそれ以上）投与することができる。一例として、ワクチンは、数日から数年の間隔で被験体に２〜１０回投与することができる。
【００９８】
本開示の免疫原性組成物の有効性は、免疫応答の程度を決定するアッセイ（上記及び下記の実施例に記載）を用いて、インビトロ及びインビボの両方で評価することができる。
【００９９】
ＨＡ又はＮＡ変異体に特異的な抗体
【０１００】
本発明は、本明細書に記載のＨＡ又はＮＡ変異体のいずれかに特異的に結合する抗体をさらに提供する。このような抗体は、変異体の野生型対応物に結合するよりも高い親和性、結合力、より容易及び／又は長い持続時間で本明細書に記載のＨＡ又はＮＡ変異体に結合することができる。いくつかの実施例では、ＨＡ又はＮＡ変異体に「特異的に結合する」抗体は、通常のアッセイによって確定されるように、野生型対応物に結合しない（すなわち、結合活性は検出されない）。
【０１０１】
本明細書に記載の抗体は、常法により製造することができる。例えば、本明細書に記載のＨＡ又はＮＡ変異体のいずれかを適切な動物宿主（例えば、マウス、ウサギ又はヒツジ）に投与することにより、ＨＡ又はＮＡ変異体に結合可能な抗体を製造することができる。ポリクローナル抗体、抗体分子の不均一な集団は、免疫された被験体の血清中に存在する。本明細書に開示されているペプチド変異体に対するモノクローナル抗体（即ち、抗体の同種集団）は、標準的なハイブリドーマ技術を用いて調製することができる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７５）  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，  ４９５；  Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７６）  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６，  ５１１；  Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７６）  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６，  ２９２；  ａｎｄ  Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８１）  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  Ｎ．Ｙ．を参照）。特に、モノクローナル抗体は、培養中の連続細胞株から抗体分子を調製可能な任意の技術によって製造することができる（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７５）  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，  ４９５  ａｎｄ  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．  ４，３７６，１１０；  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  （Ｋｏｓｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８３）  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４，  ７２；  Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０，  ２０２６，  ａｎｄ  ｔｈｅ  ＥＢＶ−ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  （Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８３）  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  ｐｐ．  ７７−９６））。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤを含む任意の免疫グロブリン型、及びそれらの任意の亜型のものであり得る。本発明のモノクローナル抗体を製造するハイブリドーマは、インビトロ又はインビボで培養することができる。インビボで高力価のモノクローナル抗体を製造できるため、有用な製造方法となる。
【０１０２】
以下、モノクローナル抗体を製造可能な方法を示す。被験体（例えば、マウス又はウサギ）に本明細書に記載のいずれかの免疫原性組成物を２〜５週にわたって皮下、筋肉内及び／又は鼻腔内投与する。最後の免疫後、脾細胞と所属リンパ節を摘出する。免疫後に、血液サンプルを定期的に採取し、血清を遠心分離する。任意の適切な方法（例えば、ＥＬＩＳＡ又はＲＩＡ）により得られた血清における抗体の力価を測定する。次いで、投与された免疫原性組成物に対して高い抗体力価を示す動物に最終免疫を与える。免疫した動物の脾臓細胞及び所属リンパ節などから抗体産生細胞を製造することができる。抗体産生細胞の製造においては、組織残屑や赤血球をできるだけ除去することが好ましい。市販の赤血球除去剤をこの目的に使用することができる。あるいは、緩衝塩化アンモニウム及びトリスを調製して使用してもよい。このようにして調製された抗体産生細胞を骨髄腫細胞のような不死細胞と直ちに融合させることにより、抗体を産生しながら半永久的に増殖し続けるハイブリドーマ細胞を調製させることができる。マウスなどの動物由来の一般的に入手可能な細胞株を使用することができる。本発明において使用される好ましい細胞株は、ヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンを含むＨＡＴ選択培地中で生存できず、抗体産生細胞と融合した場合にのみそこで生存することができる。骨髄腫細胞の例には、マウス骨髄腫細胞株（例えば骨髄腫ＯＦ細胞）及びヒト骨髄腫細胞株（例えばＫａｒｐａｓ  ７０７Ｈ）が含まれ得る。細胞融合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞を、平均分子量が約２００から２０，０００ダルトンのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの細胞融合促進剤の存在下で市販のミエローマ細胞と混合することによって実施することができる。あるいは、細胞融合は、エレクトロポレーションのような電気刺激を利用する市販の細胞融合装置により実施してもよい。融合後、得られた細胞を希釈し、ＨＡＴ培地で培養することができる。
【０１０３】
目的のハイブリドーマは融合細胞から選択することができる。融合細胞はＨＡＴ培地中で生存してコロニーを形成する。次いで、各培養ウェルの上清を収集し、免疫原性組成物に対する抗体力価の有無を検出する。ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ又はＲＩＡなどの方法により確認することができる。抗体陽性ウェルが同定されたら、アミノプテリンを含まないＨＴ培地中で細胞を培養することができる。しばらく培養した後、培養上清中の抗体力価を再度確認する。次いで、最終的に選択された細胞を単一細胞を得るためのクローニングに供する。本発明のポリペプチドに対して高い特異性を示すクローンを選択し、一定の程度まで増殖してハイブリドーマを形成する。
【０１０４】
いくつかの実施例では、目的のＨＡ変異体に対するモノクローナル抗体を調製するハイブリドーマを選択することができる。このようにして得られたモノクローナル抗体は、任意の公知方法によって単離又は調製することができる。例えば、低血清濃度の培地でハイブリドーマを培養して得られる培養上清から抗体を調製してもよい。或いは、ハイブリドーマを動物の腹腔内に注射し、得られた腹水を集めて抗体を調製してもよい。アフィニティーカラム、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどの方法により抗体を精製又は単離することができる。これらの公知の方法は、適宜選択して用いてもよく、他の公知方法と組み合わせて用いてもよい。
【０１０５】
このようにして得られた抗体は、野生型対応物ＨＡ又はＮＡ抗原に対する、ＨＡ又はＮＡ変異体に対する抗体の結合能によって特徴付けられる。変異体に特異的に結合する抗体を単離することができる。
【０１０６】
或いは、本明細書に記載のＨＡ又はＮＡ変異体に特異的に結合する抗体は、常法に従って抗体ライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。いくつかの実施例では、野生型ＨＡ又はＮＡ抗原にて抗体ライブラリーをスクリーニングすることで、野生型抗原に結合可能な抗体を除去する。次いで、得られたサブライブラリーによりＨＡ又はＮＡ変異体に特異的に結合可能な抗体を同定する。
【０１０７】
本明細書に記載の抗体は、異なるＩＡＶ亜型に対して結合親和性及び特異性を示すことができる。これらの抗体は、免疫された被験体におけるペプチド変異体を検出すること、又は免疫療法の形態として被験体に投与することができる。
【０１０８】
実施形態の上記の説明は例としてのみ与えられており、当業者によって様々な修正がなされてもよいことが理解されるであろう。上記の説明、例、及びデータは、本発明の例示的実施形態の構造及び使用の完全な説明を提供する。発明の様々な実施形態をある程度の特殊性を用いて、又は１つ又は複数の個々の実施形態を参照しながら上記で説明したが、当業者は、本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、開示された実施形態に対して多数の変更を加えることができる。
【０１０９】
さらに詳述しなくても、当業者であれば、上記の説明に基づいて本発明を最大限に利用することができると考えられる。したがって、以下の特定の実施形態は、単なる例示として解釈されるべきであり、いかなる意味においても本開示の残りの部分を限定するものではない。本明細書で引用された全ての刊行物は、本明細書で参照された目的又は主題のために参照により組み込まれる。
【０１１０】
実施例１：免疫原性に対する赤血球凝集素（ＨＡ）のグリコシル化の影響
【０１１１】
材料及び方法
【０１１２】
細胞株及びウイルス
【０１１３】
マディン・ダービーイヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）及びヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）をダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ｌｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ．  ＭＤ）において培養した。Ａ５４９ヒト腺癌肺胞基底上皮細胞をＦ−１２Ｋ培地（ｌｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）、ＬＭＨトリ肝細胞癌細胞をＷａｙｍｏｕｔｈ'ｓ  ＭＢ  ７５２／１培地（ｌｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）において培養した。すべての培地に１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＰＢＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉfiｃ）及び抗生物質（１００Ｕ／ｍｌのペニシリンＧ及び１００ｇｍ／ｍｌのストレプトマイシン）を補充した。本試験には、Ａ型インフルエンザウイルスＡ／ＷＳＮ／３３株を用いた。
【０１１４】
組換えウイルスの調製
【０１１５】
ＲＴ−ＰＣＲによりＡ／ＷＳＮ／３３ウイルスゲノムの８つの断片を増幅した。想定シークオンＮ-Ｘ-Ｓ／Ｔを用いて、ＨＡゲノム中のグリコシル化部位を改造（異なるアミノ酸をＮに変更）するか、又は削除（ＮをＡに変更）した。ＷＴ  ＨＡのアミノ酸配列は、上記配列番号３と同様である。２８５−４９７−５５６−Ｇ  ＨＡのアミノ酸配列は、上記配列番号１と同様である。１４２−Ｇ  ＨＡ及び１４２−２８５−４９７−５５６−Ｇ  ＨＡのアミノ酸配列は、以下に示される。
【０１１６】
１４２−Ｇ  ＨＡ（配列番号１６；太字：１４２位での置換）：
0006975233.tif 000013
【０１１７】
１４２−Ｇ  ＨＡ  （配列番号１７；太字：１４２、２８５、４９７及び５５６位での置換）：
0006975233.tif 000014
【０１１８】
ｐＨＷ２０００の調製と同様に、ウイルスｃＤＮＡをｐｏｌ  Ｉ及びＣＭＶプロモーターを含むｐｃＤＮＡ３．１に挿入した。常法により８つのプラスミドをＭＤＣＫ／２９３Ｔ細胞にコトランスフェクションして組換えウイルスを調製した。上清を収集し、滴定し、使用するまで−８０℃で凍結した。
【０１１９】
抗体
【０１２０】
マウスモノクローナル抗ＨＡ抗体は、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから入手した。マウスモノクローナル抗アクチン抗体は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購入した。ヤギポリクローナル抗Ｍ１及びマウスモノクローナル抗６ｘＨｉｓ抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。ラットモノクローナル抗ＩＮＦガンマ抗体は、ＡＢｃａｍから入手した。ウサギポリクローナル抗グランザイムＢ抗体は、Ａｖｉｖａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙから購入した。すべての市販の抗体について、製造業者及び発明者によってウエスタンブロットにより特異性を検証した。
【０１２１】
ウイルス複製率
【０１２２】
１２ウェルディッシュで単層のＭＤＣＫ、Ａ５４９及びＬＭＨ細胞を培養し、１倍のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した。０．１（ＬＭＨの場合：０．０１）ｇ／ｍｌのＬ−（トシルアミド−２−フェニルエチル）クロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）−トリプシン（Ｐｉｅｒｃｅ）を含む無血清培地中で修飾されたインフルエンザウイルスの変異体をそれぞれ０．０１、０．１及び１のＭＯＩで細胞に感染させ、３７°Ｃで１時間インキュベートした。細胞を１倍のＰＢＳで２回洗浄した後、完全培地でインキュベートした。図に示す時点で、上清を回収し、プラークアッセイによりＭＤＣＫ細胞中のウイルス力価を測定した。
【０１２３】
プラークアッセイ
【０１２４】
６ウェルディッシュ中の断層のＭＤＣＫ細胞を１倍のＰＢＳで２回洗浄した。次いで、０．５μｇ／ｍｌのＴＰＣＫ−トリプシンを含有する無血清培地中で細胞にウイルスの連続１０倍希釈物を接種し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、０．５％アガロース（Ｌｏｎｚａ）及び０．５μｇ  ／  ｍｌのＴＰＣＫ−トリプシンを含有するＭＥＭで覆った。３日後、細胞を１０％ホルムアルデヒドで固定し、０．１％クリスタルバイオレット溶液で染色した。
【０１２５】
タンパク質の発現と精製
【０１２６】
ポリエチレンイミンを用いて分泌型ＨＡをコードするプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞株にトランスフェクトし、０．５％ウシ胎児血清を添加したＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。トランスフェクションの７２時間後に上清を収集し、遠心分離により清澄化した。ＨＡタンパク質を、上述のニッケルキレートクロマトグラフィーで精製した。精製タンパク質をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｆｉｌｔｅｒで濃縮し、ＰＢＳ緩衝液中で予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００ゲル濾過カラム（ＧＥ）にロードし、そして異なる画分を収集した。
【０１２７】
グリカンアレイ
【０１２８】
２５℃、６０％湿度でロボットピン（ＳＭＰ２Ｂ，  ＴｅｌｅＣｈｅｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いて、実験室で調製したペンチルアミンテールを有するグリカンを、ＮＨＳ活性化ガラススライド（Ｎｅｘｔｅｒｉｏｎ  Ｈ）にプリント（ＡＤ３２００，  ＢｉｏＤｏｔ）することによりグリカンマイクロアレイを調製した。Ｎｅｘｔｅｒｉｏｎ  Ｈスライドにグリカン１〜２９及び３０〜３９の溶液１００μＭを各グリッドについて水平方向で３回繰り返して下から上にスポットして真空乾燥した。得られた画像をＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏ  ６．０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて分析し、グリッド上の全てのスポットの蛍光強度を見つけて定量した。
【０１２９】
ウイルス結合アッセイ
【０１３０】
ノイラミニダーゼ阻害剤オセルタミビルカルボキシレート（１０μＭ）を含有する緩衝液中で同量のウイルスを不活性化した。オセルタミビルカルボキシレートを有する不活性化ウイルスの懸濁液をアレイ上に重層し、室温で３０分間インキュベートした。次いで、スライドをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ、ＰＢＳ、及び脱イオン水で連続してすすぐことにより３回洗浄した。抗Ｈ１抗体を用いて結合ウイルスを検出した。スライドを室温で６０分間穏やかに揺り動かした。洗浄工程を繰り返した後、標識二次抗体での重層により結合を検出した。
【０１３１】
感染性アッセイ
【０１３２】
製造業者のプロトコルに従ってＰＥＧウイルス沈殿キット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）を用いてウイルスを濃縮し、ウエスタンブロットによりウイルスの量を決定した。０．５μｇ／ｍｌのＴＰＣＫ−トリプシンを含有するＦ−１２Ｋ無血清培地中で同量の変異体ウイルスをＡ５４９細胞に感染させ、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を２回洗浄し、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉfiｃ）及び抗生物質（１００Ｕ／ｍｌのペニシリンＧ及び１００のｇｍ／ｍｌのストレプトマイシン）を含むＦ−１２Ｋ培地で重層した。１０ｈｐｉ後、全細胞溶解物を収集して分析した。ＭＤＣＫ細胞を０．５μｇ／ｍｌのＴＰＣＫ−トリプシンを含有する無血清培地中で感染させた変異体ウイルスに感染させ、３７°Ｃで３０分間インキュベートした。その後、プラークアッセイを行った。
【０１３３】
赤血球凝集アッセイ
【０１３４】
同量のＩＡＶ及びＨＡタンパク質を総体積１００μｌ中で２倍段階希釈した。次に、２５μｌの２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）七面鳥赤血球溶液を添加した。ウイルスと赤血球を穏やかに混合し、室温で６０分間インキュベートした後に血球凝集反応を読み取った。
【０１３５】
赤血球凝集抑制アッセイ
【０１３６】
血清サンプルを９６ウェルプレートで２倍段階希釈した後、室温で４つの赤血球凝集単位（ＨＡＵ）のＷＴ  ＷＳＮを各ウェルに添加して１時間インキュベートした。インキュベーション後、総体積が１２５μｌとなるように２５μｌの２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）七面鳥赤血球溶液を添加し、そして室温で１時間インキュベートした個々の血清サンプルのＨＡＩ力価は、細胞が凝集していない最後の希釈時の血清濃度の逆数であると決定された。
【０１３７】
細胞結合アッセイ
【０１３８】
異なる量（０〜６０μｇ／ｍＬ）のコレラ菌ノイラミニダーゼ（受容体破壊酵素、ＲＤＥ）（Ｓｉｇｍａ）で３７℃で七面鳥赤血球を６０分間前処理した。その後、赤血球をＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳを用いて２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の赤血球溶液を調製した。２５μｌの各２％溶液を同量のＩＡＶ及びＨＡタンパク質に添加し、１２５μｌの総体積を得た。ＩＡＶ及びＲＤＥ処理赤血球を室温で１時間インキュベートした後、凝集を測定した。データは、依然として完全な凝集を示したＲＤＥの最大濃度として表した。
【０１３９】
脱グリコシル化
【０１４０】
ウイルス又はタンパク質のアリコートをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した緩衝液中で脱グリコシル化した。超遠心分離後、ウイルス（１×１０７ｐｆｕ）又は精製タンパク質を含有する感染培地２００μｌをプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）、１μｇのエンドグリコシダーゼＦ１、１μｇのエンドグリコシダーゼＦ２、１μｇのエンドグリコシダーゼＦ３、及び１μｇのＨ又は１μｇのＰＮＧａｓｅ  Ｆと混合し、３７°Ｃ、暗所で２４時間インキュベートした。エンドグリコシダーゼカクテル（エンドＦ１、Ｆ２、Ｆ３及びＨ）又はＰＮＧａｓｅ  Ｆは、全てのグリカン構造を単一のＧｌｃＮＡｃ残基までトリミングすることで単一グリコシル化サンプル又は非グリコシル化サンプルを個別に生成することができる。脱グリコシル化後、サンプルをウエスタンブロットにより確認した。
【０１４１】
免疫原性試験のためのＩＡＶ調製
【０１４２】
ＷＴ、２８５−４９７−５５６−Ｇ及び１４２−２８５−４９７−５５６−Ｇ  ＨＡウイルスをＭＤＣＫ細胞中で培養した。これらのウイルスを０．１％ＢＰＬ（Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ，  Ｇｅｅｌ，  Ｂｅｌｇｉｕｍ）を用いて室温で２４時間不活性化し、次いで、ＨＮＥ緩衝液（５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）で２４時間透析し、ＭＤＣＫ細胞で連続継代を行って試験した。６〜８週齢の雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、不活性化ウイルス用量当たり等量の６μｇのＨＡを筋肉内投与し、０日目及び２１日目に２回皮下投与した。追加免疫の１週間後、マウスを１０匹／群で２群に分けた。一方の群を麻酔し、そして１０倍のＬＤ５０のＷＳＮ／３３又はＨ５Ｎ１ウイルスを鼻腔内接種し、そして他方の群の血清サンプルを抗血清産生の分析のために収集した。接種後の１４日間、マウスの生存を毎日モニターした。すべての動物実験は、Ａｃａｄｅｍｉａ  Ｓｉｎｉｃａの施設内動物管理使用委員会によって評価及び承認された。
【０１４３】
毒性アッセイ
【０１４４】
鼻腔内に５０μｌのウイルス（５ｘ１０５ＰＦＵのＷＳＮ及びＬＡＩＶ  ４４−７２−２１９−Ｇウイルス、図３Ｇ）を接種した４〜６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス５匹の群を用いて、組換えウイルスの毒性を測定した。感染後の１４日間、生存及び体重の変化を毎日記録した。
【０１４５】
結果
【０１４６】
ＨＡ構造及び活性に対するＮ１４２−グリコシル化の影響
【０１４７】
ＨＡの複数のグリコシル化部位（グリコシル化部位２７、４０、１７６、３０３及び４９７）はＨ１、Ｈ３及びＨ５亜型の間で高度に保存的であるため、野生型Ｈ１Ｎ１  Ａ／ＷＳＮ／３３（ＷＳＮ）をモデルとして特定のグリコシル化部位を作成又は削除し、逆遺伝学を使用してグリコシル化の効果を説明する（図１Ａ及び図５Ａ）。ウイルスは、グリコシル化部位−２７が欠失（即ち、Ｎ２７Ａが２７−Ｇに変異）した場合生存できなかった。同様に、４０、１７６又は３０３位における高度に保存的な潜在グリコシル化部位を変異させ（４０＋Ｇ、１７６＋Ｇ、及び３０３＋Ｇと命名）、複製に対する効果を決定した。結果は、高度に保存的又は潜在的なグリコシル化部位（４０＋Ｇ、１７６＋Ｇ、３０３＋Ｇ又は４９７−Ｇ）で変異を有する変異体の複製率及びＷＴは類似するが、ＭＤＣＫ細胞及びＡ５４９細胞の両方に感染した場合、グリコシル化部位−１４２が欠失したウイルス（１４２−Ｇ及び１４２−２８５−４９７−５５６−Ｇウイルス）の複製率は、ＷＴウイルスのそれよりも２桁低かった。これは、グリコシル化部位１４２がＩＡＶ複製において重要な役割を果たすことを示している（図１Ｂ及び図５Ｂ）。円二色性研究において、グリコシル化部位１４２のグリカンはＨＡの二次構造に影響を及ぼさず（図５Ｃ）、グリコシル化部位１４２が欠失した変異体間のＨＡ対Ｍ１の比は類似しており、これは、グリコシル化部位１４２がウイルスの構築及び／又は成熟に必須ではないことを示している（図５Ｄ）。
【０１４８】
グリコシル化部位１４２は、ウイルス侵入のために必要なものである。これは、ウイルス感染性アッセイにおいて、グリコシル化部位１４２欠失ウイルス（１４２−Ｇ又は１４２−２８５−４９７−５５６−Ｇウイルス）に感染したＡ５４９細胞において検出されたＨＡ及びＭ１のシグナルが非常に弱いためである（図１Ｃ及び図５Ｅ）。上記のように、１４２−Ｇ及び１４２−２８５−４９７−５５６−Ｇは、それぞれ配列番号１６及び１７である。グリカンアレイ解析は、グリコシル化部位１４２欠失ウイルスがＷＴウイルス（グリカン８、１０、１１及び１５−１８）ＷＴウイルスよりも多くのシアロシドと相互作用することを示した。対応するＨＡタンパク質からも同じ結果が観察された。これは、グリコシル化部位１４２でのグリコシル化がＨＡの受容体結合特異性に影響を及ぼすことを示している（図１Ｄ及び図６Ａ−Ｃ）。さらに、グリコシル化部位１４２はＨＡの結合力を調節する。これは、グリコシル化部位１４２欠失ウイルスは、グリカンアレイ分析においてより低い蛍光強度を示し、且つ赤血球凝集及び細胞結合においてより低い能力を有したためである（図１Ｄ−Ｅ及び図５Ｆ）。ＬＭＨ細胞株（ニワトリ肝細胞癌由来）における１４２−Ｇ又は１４２−２８５−４９７−５５６−Ｇウイルスの複製率は、ＷＴよりも２桁低かった結果（図５Ｇ）から分かるように、グリコシル化部位１４２欠失ウイルスは、グリカンアレイ分析においてより多くのα２，３−シアロシドと相互作用できるが、ヒト及び／又は鳥類のＷＳＮ  ＨＡに対する採用には関与していない。
【０１４９】
グリコシル化部位１４２でのグリコシル化によって影響される結合力及び特異性の分子機構をさらに研究した結果、結合力及び特異性の両方がグリカン組成物によって調節されることが見出された。エンドグリコシダーゼ（Ｅｎｄｏ-Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３及びＨ）のカクテルによる処理は、グリカンアレイ上のＷＴウイルス及び２８５-４９７-５５６-Ｇウイルスの相互作用プロファイルを変え、その相互作用パターンは１４２−Ｇ及び１４２−２８５−４９７−５５６−Ｇウイルスと類似した。上記のように、ＨＡ  ２８５−４９７−５５６−Ｇは、配列番号１である。驚くべきことに、エンドグリコシダーゼカクテルで処理した後、グリカンアレイ上のモノグリコシル化ウイルスの蛍光強度は増加したが、すべてのタイプの非グリコシル化変異体  （ＰＮＧａｓｅ  Ｆ処理）では減少した（図１Ｆ、図５Ｈ及び図６Ｄ−Ｅ）。
【０１５０】
Ｈ５Ｎ１をマウスに投与してグリコシル化部位１４２が宿主の免疫応答に関与しているかどうかを決定した。不活化１４２−２８５−４９７−５５６−Ｇウイルスで免疫したマウスは、不活化ＷＴウイルスで免疫したマウスと比較して、生存期間がより短くなり、より少ないＨＡ抗血清を誘導した一方、２８５−４９７−５５６−Ｇウイルスで免疫化したマウスは、同量のＨＡ抗血清を誘導したが、生存期間がより長くなり、免疫原性試験においてＷＳＮを投与したマウスは、全ての場合において良好に生存した（図１Ｇ−Ｈ及び図５Ｉ）。この研究は、グリコシル化部位１４２でのグリコシル化がＩＡＶの免疫原性にとって重要であることを示している。
【０１５１】
季節性Ｈ１Ｎ１株において、ＨＡ中のグリコシル化部位１４２は、ヒト免疫応答を回避するのに重要な役割を果たすと考えられている。ヒトＨ３Ｎ２  ＩＡＶはまた、ポジティブ選択による進化の過程では、この領域においてグリコシル化部位（Ｈ３におけるグリコシル化部位の番号は１４４）を獲得する。驚くべきことに、ＩＡＶがＨＡでグリコシル化部位１４２を獲得した後、この実施例の結果として、ＨＡ−ＳＡ相互作用の調節によって、ウイルス感染性の効率が促進され、宿主の免疫応答が変化した。したがって、グリコシル化部位１４２は、ヒトＩＡＶに対するワクチンの開発において考慮されるべき重要な要素となり得る。
【０１５２】
実施例２：免疫原性に対するノイラミニダーゼ（ＮＡ）のグリコシル化の影響
【０１５３】
材料及び方法
【０１５４】
組換えウイルスの調製
【０１５５】
部位特異的変異導入によりＮＡゲノムに終止コドンを追加してＮＡのストーク及び触媒ドメインを除去する以外、実施例１の方法と同様である。ＮＡストーク及び触媒ドメインのないウイルス（ＬＡＩＶ  ＷＳＮ−ＮＡ、配列番号２）を調製するために、ＮＡを安定的に発現するＭＤＣＫ／２９３Ｔ細胞株を調製して、ウイルスをレスキューし、維持し、分析した。簡単に説明すると、全長ＮＡ（ＷＳＮ株由来、配列番号４）をｃＤＮＡ発現レンチベクター（ｐＬＡＳ２ｗ．Ｐｐｕｒｏ）にクローニングした。次いで、台湾のＡｃａｄｅｍｉａ  ＳｉｎｉｃａにあるＮａｔｉｏｎａｌ  ＲＮＡｉ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ｈｔｔｐ：／／ｒｎａｉ．ｇｅｎｍｅｄ．ｓｉｎｉｃａ．ｅｄｕ．ｔｗ）によって提供されたプロトコルに従ってＮＡ発現レンチウイルスを調製した。ＨＥＫ２９３Ｔ及びＭＤＣＫ細胞を、最終濃度８μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｓｉｇｍａ）の存在下で３倍の感染多重度でＮＡ発現レンチウイルスに感染させた。細胞をウイルスと共に２４時間インキュベートした後、培地をピューロマイシン（３μｇ／ｍｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する選択培地に交換した。３日間のインキュベーション後、全細胞溶解物を回収し、ウエスタンブロット解析によりＮＡの発現効率を調べた。
【０１５６】
ＮＡ活性
【０１５７】
記載されているように、ｐｆｕ及びタンパク質試料でウイルスサンプルを標準化することによって、ＮＡの酵素活性を測定した。ウイルスのアリコートを１×１０６ｐｆｕの力価で調製し、次いで４−ＭＵＮＡＮＡ（Ｓｉｇｍａ）と共に３７℃でインキュベートした。３０分間後、０．１４ＭのＮａＯＨ及び８３％のエタノールで反応を停止し、ＮＡ活性を３６０ｎｍでの励起及び４５０ｎｍでの放射で測定した。基質の最終濃度は０から１５００ｍＭの範囲であった。蛍光を６０分間にわたって５分毎にモニターした（１２回）（４−ＭＵＮＡＮＡアッセイ）。非線形回帰を用いてデータをミカエリス−メンテン式に当てはめることにより、プリズムソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて、ＮＡのＫｍ（最大速度の半分を生じる基質濃度）及びＶｍａｘ（最大速度）を計算した。異なる複合糖質（Ｓｉｇｍａからの４−Ｍｕα−Ｎｅｕ５Ａｃ、３−ＳＬＮ、６−ＳＬＮ、３−ＳＬ及び６−ＳＬ）の酵素的切断の動態を測定するために、Ｎ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）デヒドロゲナーゼとシアル酸アルドラーゼとの反応により複合糖質から放出したＮ−アセチルノイラミン酸を測定した。Ｎ-アセチルノイラミン酸のアルドラーゼ切断産物であるＭａｎＮＡｃは、ＭａｎＮＡｃデヒドロゲナーゼ及びＮＡＤ＋と反応させてＮＡＤＨ副生成物を形成した。３４０／４５０ｎｍでのＮＡＤＨの蛍光強度を測定した。反応において、２μｇのシアル酸アルドラーゼ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、組換え）、３μｇのＭａｎＮＡｃデヒドロゲナーゼ  （Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  １４１−８、組換え）、５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）、０．２のｍＭ  ＮＡＤ＋、及び適量のＮＡを混合し、複合糖質の最終濃度を０から１５００ｍＭに調製した。蛍光を３０分間にわたって５分毎にモニターした（６回）。
【０１５８】
ＬＡＩＶ  ＷＳＮ−４４−７２−２１９−Ｇ及びＬＡＩＶ  ＷＳＮ−ＮＡで処理したマウス
【０１５９】
ＮＡを発現するＭＤＣＫ細胞中でＬＡＩＶ  ＷＳＮ−ＮＡウイルスを培養した。０日目及び２１日目に、マウスが意識している状態でウイルスが下気道に到達しないように２５μｌのＬＡＩＶ  ＷＳＮ−４４−７２−２１９−Ｇ又はＬＡＩＶ  ＷＳＮ−ＮＡ（非致死量のＷＴ  ＷＳＮ）を各マウスに経鼻投与した。ＮＡ  ４４−７２−２１９の配列は、上記の配列番号１１である。次いで、免疫原性試験を行った。
【０１６０】
抗体
【０１６１】
Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから抗ＮＡ抗体を購入した。
【０１６２】
タンパク質発現及び精製
【０１６３】
実施例１の方法でＮＡを調製した。
【０１６４】
免疫原性試験のためのＩＡＶの調製
【０１６５】
実施例１の方法によりＮＡを発現するＭＤＣＫ細胞中でＬＡＩＶ  ＷＳＮ−ＮＡウイルスを調製した。
【０１６６】
透過電子顕微鏡
【０１６７】
ＭＤＣＫ細胞を７．８ミルの厚さ（Ｅ、Ｍ、Ｓ）のＡＣＬＡＲ包埋フィルム上で１日間増殖させ、続いて５のＭＯＩでインフルエンザウイルスに感染させた。１８ｈｐｉで、ウイルス感染細胞を０．１Ｍカコジル酸緩衝液ですすぎ、２．５％グルタルアルデヒドを含む０．１Ｍカコジル酸緩衝液で４℃で３０分間固定した。次いで、細胞を１％四酸化オスミウムを含む０．１Ｍカコジル酸で３０分間後固定し、１％酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で１時間染色し、エタノールを用いて脱水し、樹脂で包埋した。ベーキングした後、ウルトラミクロトームを用いてサンプルを８０ナノメートルの薄片に切断した。最後に、サンプルをＴｅｃｎａｉ  Ｇ２  Ｓｐｉｒｉｔ  ＴＷＩＮ（ＦＥＩ  Ｃｏｍｐａｎｙ）で検査した。
【０１６８】
毒性アッセイ
【０１６９】
実施例１の方法によりマウスに５０μｌのウイルス（図１２Ｅに示されるＷＳＮ及びＬＡＩＶ  ＷＳＮ-ＮＡ、それぞれ１×１０６ＰＦＵ）を鼻腔内接種した。
【０１７０】
ノイラミニダーゼ阻害アッセイ
【０１７１】
ノイラミニダーゼ阻害アッセイによりＮＡ抗体の生成を分析した。ここで、ＮＡ−Ｆｌｕｏｒ(tm)インフルエンザノイラミニダーゼアッセイキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて実験を実施した。簡単に言うと、ウイルスをキットからの反応緩衝液と共にインキュベートした後、混合し、熱不活性化し、続いて図に示すように異なる濃度に連続希釈し、そして蛍光をモニターした。ノイラミニダーゼ阻害力価は、少なくとも５０％の阻害を有する最高希釈の逆数として計算した。
【０１７２】
ＩＡＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞分析
【０１７３】
ＰＢＳ、ＷＳＮ又はＬＡＩＶ  ＷＳＮ−ＮＡで処理したマウスから得たＰＢＭＣを、生又は不活性化ＷＳＮ（ＵＶ処理）と共に０．５μｇ／ｍｌのＴＰＣＫ−トリプシンを含むＭＯＩが３のＲＰＭＩ  １６４０培地中で３７°Ｃで１時間インキュベートした。次いで、細胞を２回洗浄し、１０％の熱不活化ＦＢＳ及び抗生物質を含むＲＰＭＩ  １６４０培地で重層した。２４時間インキュベートした後、ＣＤ８＋Ｔ細胞をＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ  Ｍｏｕｓｅ  ＣＤ８細胞キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、同社の手順に従って単離し、そしてフローサイトメトリー及びウエスタンブロットにより分析した。ウイルスタンパク質Ｍ１及びＮＰ刺激のために、ＧＭ−ＣＳＦ培養骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を、完全ＲＰＭＩ  １６４０培地中、１００μＭウイルスＭ１及びＮＰエピトープの存在下又は非存在下で３７℃で２４時間インキュベートした後、１：１の割合で免疫化されたマウスからのＰＢＭＣと混合した。４８時間インキュベートした後、ＣＤ８  ＋  Ｔ細胞を単離し、フローサイトメトリー及びウエスタンブロットにより分析した。Ｍ１エピトープはＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（配列番号１８）、ＲＬＥＤＶＦＡＧＫ（配列番号１９）及びＡＳＣＭＧＬＩＹ（配列番号２０）であり、ＮＰエピトープは、ＣＴＥＬＫＬＳＤＹ（配列番号２１）、ＳＲＹＷＡＩＲＴＲ（配列番号２２）及びＬＥＬＲＳＲＹＷＡ（配列番号２３）（Ｍｉｓｓｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）であった。ペプチドを５．０ｍｇ／ｍｌでジメチルスルホキシドに溶解し、ＲＰＭＩ  １６４０で１００μＭに希釈し、そして２０℃で貯蔵した。
【０１７４】
フローサイトメトリー
【０１７５】
細胞を回収し、そして１０６／ｍＬの密度でＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中２％ＦＢＳ）中に懸濁した。この研究で使用された抗体は抗ＩＦＮγ抗体であった。細胞蛍光強度は、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＦＣＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ３．０ソフトウェアによって分析した。
【０１７６】
結果
【０１７７】
Ｎ−４４、Ｎ−７２及びＮ−２１９でのグリコシル化はＮＡの二次構造に影響を与えた。
【０１７８】
ＮＡグリコシル化がＩＡＶのライフサイクルに関与しているかどうかを確認するために、逆遺伝学により同じウイルス株Ａ／ＷＳＮ／３３をモデルとして用いて各グリコシル化部位を調査した（図７Ａ）。ＮＡ  ４４−Ｇ、ＮＡ  ７２−Ｇ、ＮＡ  ４４−７２−Ｇ及びＮＡ  ４４−７２−２１９−Ｇのアミノ酸配列は、それぞれ上記の配列番号８−１１である。グリコシル化部位４４及び７２（ストークドメイン内）は、ウイルス複製において重要な役割を果たし、グリコシル化部位４４及び７２が欠失したウイルス（４４−７２−Ｇ又は４４−７２−２１９−Ｇウイルス）の複製率は、ＭＤＣＫ細胞及びＡ５４９細胞の両方においてＷＴウイルスよりも２桁低かった（図２Ａ及び図７Ｂ）。ＮＡ上のグリコシル化部位４４、７２及び２１９をグリコシル化して異なる分子量を有するＮＡタンパク質の変異体を形成したが、ウエスタンブロット分析及びゲル濾過において、これらの変異体をエンドグリコシダーゼカクテルで処理した後、類似する分子量を示した（図２Ｂ、図７Ｃ−Ｄ）。興味深いことに、これらの変異体の二次構造はわずかに異なっていたが、脱グリコシル化後に同じになった（図２、Ｃ〜Ｄ）。これらの結果は、グリコシル化部位４４、７２及び２１９に結合したグリカンが不均一であり、ＮＡの二次構造に影響を及ぼすことを示唆している。
【０１７９】
Ｎ−４４及びＮ−７２でのグリコシル化はＮＡ活性及び毒性に影響を与えた。
【０１８０】
グリコシル化部位４４及び７２でのグリカンは、ＮＡ活性にとって重要であることが見出された。２−（４−メチルウンベリフェリル）−α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（４−ＭＵＮＡＮＡ）を基質として用いるアッセイに基づいて、グリコシル化部位４４及び７２を含まないウイルス（４４−７２−Ｇ及び４４−７２−２１９−Ｇ）は、ＷＴよりも顕著に低いＮＡ活性を示した（図２Ｅ）。さらに、ＷＴウイルスをエンドグリコシダーゼカクテルで処理した後、分子量及びＮＡ活性は未処理ウイルスよりも低かった（図７Ｅ〜Ｆ）。
【０１８１】
異なる基質に対する最大速度（Ｖｍａｘ）及び親和性値（Ｋｍ）が変化することから分かるように、ＮＡ上のグリカンは、酵素活性、親和性及び特異性に影響を及ぼした。２'（４−メチルウンベリフェリル）−α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（４−Ｍｕα−Ｎｅｕ５Ａｃ）及び６'−シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン（６−ＳＬＮ）を基質として用いる場合、グリコシル化部位４４及び７２を含まないＮＡは、ノイラミニダーゼ活性が低いが、全ての変異体のＫｍ値は類似していた。驚くべきことに、３−ＳＬＮを基質として用いる場合、グリコシル化部位４４又は７２が欠失したＮＡの活性は５０％低下したが、Ｋｍ値は２倍以上増加した（図３Ａ、及び表１）。興味深いことに、ＬＭＨ細胞におけるこれらの変異体のウイルスの生成率は、３−ＳＬＮ（鳥類の受容体）に対するＮＡ活性に関連していた（図３Ｂ）。これらの結果は、ＮＡ上のグリコシル化が哺乳動物細胞及び鳥類細胞におけるＩＡＶ複製に異なる影響を与えることを示している（図２Ａ、及び図３Ｂ）。
【０１８２】
さらに、グリコシル化部位７２を含まないＮＡ（７２−Ｇ）は基質として６'−シアリルラクトース（６−ＳＬ）と相互作用したが、いずれの変異体も３'−シアリルラクトース（３−ＳＬ）と相互作用しなかった（図３Ｃ及び図８Ａ）。興味深いことに、４４−７２−２１９−Ｇの活性は２５〜４０℃で４４−７２−Ｇ（グリコシル化部位２１９を含む）の活性と類似していたが、より高い温度（４５、５０及び５５℃）では活性が低くなった（図８Ｂ）。４４−７２−Ｇをエンドグリコシダーゼカクテルで処理した後、ＮＡの活性は、５５℃で処理されていない場合よりも低かった。これらの結果は、グリコシル化部位２１９（触媒ドメイン内）上のグリカンがＮＡの熱安定性に影響を与えることを示している（図３Ｄ及び図８Ｃ）。
【０１８３】
グリコシル化部位４４及び７２は、ウイルスの放出及び形態形成も調節する。これは、ＷＴ、４４−Ｇ、及び７２−Ｇウイルスに感染した細胞は、多くの球状ウイルス粒子を放出したが、４４−７２−Ｇ又は４４−７２−２１９−Ｇウイルスに感染した細胞は、主にＷＴウイルス感染細胞では観察されなかった細長い糸状の粒子を生成したためである（図３Ｅ−Ｆ及び図８Ｄ−Ｆ）。さらに、ＮＡにグリカンを含まないウイルス（４４−７２−２１９−Ｇウイルス）に感染したマウスは、２０％の生存率及びかなりの体重減少を示したＷＴ感染マウスと比較して、生存率及び体重の顕著な変化が少ないことを示した。これらの結果は、ＮＡ上のグリコシル化が毒性に影響を与えることを示唆している（図３Ｇ〜Ｈ）。
【０１８４】
ＮＡのストークドメイン及び触媒ドメインを含まない弱毒化生ワクチンは、強力なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を伴う広範な防御を示した。
【０１８５】
非グリコシル化ＮＡ（４４−７２−２１９−Ｇ）を含むＩＡＶを弱毒化生インフルエンザ万能ワクチン（ＬＡＩＶ  ＷＳＮ−４４−７２−２１９−Ｇ）として使用して、ワクチンの予防可能性を判断しました。非グリコシル化ＮＡは、低ＮＡ活性及び毒性を有するために選択された。しかしながら、非グリコシル化ＮＡウイルスは、ＷＴと同様の免疫原性を示した（図９Ａ〜Ｃ）。
【０１８６】
さらに、ＮＡ活性は不活性ワクチンの効率に影響を及ぼさず、産生された抗体のレベルは非常に低かった。したがって、ＮＡのＲＮＡゲノムセグメントに終止コドンを付加することでＮＡのストークドメイン及び触媒ドメインの両方とも欠失したウイルスを生成（ＬＡＩＶ  ＷＳＮ−ＮＡ）することによりＮＡの免疫原性を増強した（図４Ａ）。ＬＡＩＶ  ＷＳＮ−ＮＡウイルスは、ＭＤＣＫ細胞内でプラークを形成せず、細胞内でＷＴ  ＮＡを発現させることによってレスキューされることが見出された（図１０Ａ〜Ｂ）。２４ｈｐｉ後、ＬＡＩＶ  ＷＳＮ−ＮＡウイルスに感染したＡ５４９細胞は上清中に放出されるウイルスがより少なく、且つ細胞内ウイルスタンパク質Ｍ１が蓄積した。これらの結果は、ＬＡＩＶ  ＷＳＮ−ＮＡウイルスがウイルス放出において欠陥があることを示している（図１０Ｃ〜Ｄ）。１×１０６ＰＦＵのＷＳＮウイルスに感染したマウスは、体重が急速に減少し、且つ感染後の６日目に死亡した。一方、経口投与により１×１０６ＰＦＵのＬＡＩＶ  ＷＳＮ  -  ＮＡウイルスに感染したマウスは、十分に生存し、体重減少を示さなかった。これらの結果は、ＬＡＩＶ  ＷＳＮ-ＮＡウイルスが低い病原性を有する有効なＬＡＩＶであり、そして細胞中のウイルスの弱毒化が生ワクチンの有効性に必須であることを示している（図１０Ｅ〜Ｆ）。免疫原性試験において、不活性化ＷＳＮ-ＮＡウイルスの免疫原性は、不活性化ＷＳＮウイルスの免疫原性と類似していた（図４Ｂ及び図１１Ａ〜Ｃ）。
【０１８７】
表１  ＮＡタンパク質及びウイルス変異体のＫｍ及びＶｍａｘ
0006975233.tif 000015
【０１８８】
上部パネルのＫｍ及びＶｍａｘはＮＡタンパク質に由来し、下部パネルのそれらはウイルス変異体に由来している。
【０１８９】
しかしながら、ＬＡＩＶ  ＷＳＮ-ＮＡウイルスをワクチンとして使用した場合、ウイルスチャレンジ研究において、それはＷＳＮ、Ａ／Ｃａｌ／０７／２００９及びＨ５Ｎ１に対して株間及び亜型間の保護を示した。ＬＡＩＶ  ＷＳＮ-ＮＡ処理マウスは、十分に生存し、肺からウイルスが除去されたが、顕著な抗体応答は誘導されなかった（図４Ｃ−Ｅ及び図１２Ａ−Ｄ）。さらに、ＬＡＩＶ  ＷＳＮ−ＮＡの保護能力は、用量依存的反応も示した（図１２Ｅ）。ウイルスがＬＡＩＶ  ＷＳＮ−ＮＡ処理マウスからの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に感染した後、ＣＤ８＋Ｔ細胞はＩＦＮ−γ及びグランザイムＢ発現を介して特異的に活性化されたが、不活性ウイルスはこの活性を示さなかった。これは、ウイルス感染時に、ＬＡＩＶ  ＷＳＮ−ＮＡがＣＤ８＋Ｔ細胞活性化を誘導できることを示している（図４Ｅ及び図１２Ｆ−Ｇ）。さらに、高度に保存的なウイルスエピトープＮＰ及びＭ１もＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を刺激した（図４Ｇ及び図１２Ｇ）。これらの結果は、ＮＡがＣＤ８＋Ｔ細胞活性化を介した宿主免疫応答の調節において重要な役割を果たしており、ＬＡＩＶ  ＷＳＮ−ＮＡが有効なワクチンであることを示している。
【０１９０】
最後に、Ｍ２上の１つのグリコシル化部位はウイルス複製に影響を及ぼさないことが観察された（図１３）。
【０１９１】
いくつかの研究から明らかであるように、ＮＡのストークドメインの多様化は、毒性及びアヒルから陸上家禽へのＩＡＶの伝染と関連しており、ＩＡＶは、配列欠失及びグリコシル化部位修飾を含む進化的過程を介してヒトの間で広がる。しかし、ＮＡのストークドメインの構造的及び機能的役割はこれまで知られておらず、またこれらの標準グリコシル化部位でのグリコシル化についての報告もなかった。この実施例からの結果は、ＮＡのストークドメイン中のグリコシル化部位がグリコシル化されてＮＡの活性、親和性及び特異性を調節し、さらにＩＡＶ複製を調節することを示した。これは、ＮＡのストークドメインにおけるグリカンがＩＡＶの毒性及び伝染において重要な役割を果たすことを示している。
【０１９２】
実施例３：低毒性のＩＡＶ上の免疫原性ＮＡ変異体の同定
【０１９３】
材料及び方法
【０１９４】
組換えウイルスの調製
【０１９５】
部位特異的変異誘発により、本明細書に記載のＮＡ変異体を調製した。触媒ドメインが欠失したＮＡ変異体（ＷＳＮ−ＮＡ−ＣＤ、上記の配列番号１５）を調製するために、ＮＡ触媒ドメインの最初のコドンの代わりに終止コドンを使用した。Ｒ１０２をＡに変更することによって、活性部位１を不活性化した変異体（ＷＳＮ-ＮＡ-ＡＳ１、上記の配列番号１２）を構築した。Ｄ１３５をＡに変更することによって、活性部位２を不活性化した変異体（ＷＳＮ-ＮＡ-ＡＳ２、上記の配列番号１３）を構築した。アミノ酸残基Ｇ３８８をＡ３８８で置換することによって、変異体ＷＳＮ-ＮＡ  Ｇ３８８Ａ（上記の配列番号１４）を構築した。
【０１９６】
ＬＡＩＶ  ＷＳＮ−４４−７２−２１９−Ｇ、ＬＡＩＶ  ＷＳＮ−ＮＡ及びＷＳＮ−ＮＡ−ＡＳ１で処理したマウス
【０１９７】
ＮＡを発現するＭＤＣＫ細胞中でＬＡＩＶ  ＷＳＮ−ＮＡ及びＷＳＮ−ＮＡ−ＡＳ１ウイルスを培養した。０日目及び２１日目に、マウスが意識している状態でウイルスが下気道に到達しないように合計２５μＬのＬＡＩＶ  ＷＳＮ−４４−７２−２１９−Ｇ、ＬＡＩＶ  ＷＳＮ−ＮＡ、ＷＳＮ−ＮＡ−ＡＳ１及び非致死量のＷＴ  ＷＳＮを各マウスに経鼻投与した。次いで、免疫原性試験を行った。
【０１９８】
毒性アッセイ
【０１９９】
５０μＬのウイルス（１×１０６ＰＦＵのＷＳＮ、ＬＡＩＶ  ＷＳＮ−ＮＡ及びＷＳＮ−ＮＡ−ＡＳ１；図１５Ａ）を鼻腔内接種した５匹の４〜６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（５匹／群）を用いて、組換えウイルスの毒性を測定した。感染後の１４日間、生存及び体重の変化を毎日記録した。
【０２００】
結果
【０２０１】
上記の種々のＮＡ変異体を調製し、ストークメイン及び触媒ドメインのどのドメインが免疫原性及び毒性に影響を与えるかを確定した（図１４Ａ）。Ａ５４９細胞がＮＡ活性欠損ウイルス（ＬＡＩＶ  ＷＳＮ−ＮＡ、ＷＳＮ−ＮＡ−ＣＤ、ＷＳＮ−ＮＡ−ＡＳ１及びＷＳＮ−ＮＡ−ＡＳ２）に感染した場合、上清中に放出されるウイルスは少なくなり、細胞内のウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）及びウイルスタンパク質（ＮＰ及びＭ１）は細胞内に蓄積した。これは、タンパク質自体ではなく、ＮＡ活性がウイルス放出の鍵であることを示唆している（図１４Ｂ〜Ｄ）。ＮＡ活性はウイルス放出の重要な役割を果たすので、ＮＡ活性部位変異型ウイルス（ＷＳＮ−ＮＡ−ＡＳ１）を弱毒化生インフルエンザ万能ワクチン（ＬＡＩＶ）として使用して、ＬＡＩＶ  ＷＳＮ−ＮＡの免疫原性と比較した。経口投与によりＷＳＮ-ＮＡ-ＡＳ１ウイルスに感染したマウスの生存率及び経時体重は、ＬＡＩＶ  ＷＳＮ-ＮＡ又はＰＢＳに感染したマウスと類似していた（図１５Ａ〜Ｂ）。ＬＡＩＶ  ＷＳＮ-ＮＡと同様に、ＷＳＮ-ＮＡ-ＡＳ１によるワクチン接種も顕著な抗体応答を誘導せず（図１５Ｃ）、また、ＷＳＮ-ＮＡ-ＡＳ１ウイルスの複製率はＬＡＩＶ  ＷＳＮ-ＮＡと同等であった（図１５Ｄ）。非致死量のＷＳＮと比較してＷＳＮ−ＮＡ−ＡＳ１ウイルスの毒性が減少したにもかかわらず（図１５Ｃ及びＤ）、ＷＳＮ−ＮＡ−ＡＳ１ウイルスへの曝露はマウスを致死量のＨ５Ｎ１から保護した（図１５Ｅ）。
【０２０２】
ＷＳＮ-ＮＡ-ＡＳ１変異体からのこれらの結果は、ＬＡＩＶ  ＷＳＮ-ＮＡの結果と同様であり（上記実施例２参照）、ＮＡ活性が宿主の免疫応答に影響を与えることを示唆している。ＩＡＶワクチンに曝露されたウイルスタンパク質はＩＡＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導するための重要な経路であるため、欠陥のある酵素活性を有するＮＡ変異体を保有するＩＡＶは、例えば、Ｈ１Ｎ１  ＩＡＶ株及びＨ５Ｎ１  ＩＡＶ株の両方に防御を付与するような亜型間の防御能力を有すると予想される。
【０２０３】
ウイルスベクター系を用いてＩＡＶタンパク質の保存領域を発現することにより、動物への致命的なＩＡＶ攻撃に対抗するようにＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導することができる。しかしながら、このようなアプローチは特定の標的に特異的な免疫応答を誘導することしかできなかった。あるいは、インフルエンザウイルスワクチン組成物を製造するためにＭＶＡ−ＮＰとＭ１の混合物を使用することが報告された。本明細書では、欠陥ＮＡを含むＩＡＶ粒子、例えばストークドメイン及び触媒ドメインを有さない切断型は、中和抗体の非存在下で様々な株及び異なる亜型のＩＡＶを認識するＩＡＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を顕著に誘導した。これらの結果は、本明細書で提供されたＩＡＶが普遍的なインフルエンザ万能ワクチン組成物を製造するための有望なアプローチであることを示している。
【０２０４】
他の実施形態
【０２０５】
本明細書に開示されている全ての特徴は、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書に開示されている各特徴は、同じ、同等、又は類似の目的を果たす代替の特徴によって置き換えられてもよい。したがって、他に明示的に述べられていない限り、開示された各特徴は、包括的な一連の同等又は類似の特徴の一例にすぎない。
【０２０６】
上記の説明から、当業者は本発明の本質的な特徴を容易に確認することができ、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明を様々な用途及び条件に適合させるように様々な変更及び修正を加えることができる。したがって、他の実施形態も特許請求の範囲内にある。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
0006975233.tif 000017
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
0006975233.tif 000019
【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
0006975233.tif 000022
【図１Ｈ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
0006975233.tif 000025
【図２Ｃ】
0006975233.tif 000026
【図２Ｄ】
0006975233.tif 000027
【図２Ｅ】
0006975233.tif 000028
【図３Ａ】
0006975233.tif 000029
【図３Ｂ】
0006975233.tif 000030
【図３Ｃ】
0006975233.tif 000031
【図３Ｄ】
0006975233.tif 000032
【図３Ｅ】
0006975233.tif 000033
【図３Ｆ】
0006975233.tif 000034
【図３Ｇ】
0006975233.tif 000035
【図３Ｈ】
0006975233.tif 000036
【図４Ａ】
0006975233.tif 000037
【図４Ｂ】
0006975233.tif 000038
【図４Ｃ】
0006975233.tif 000039
【図４Ｄ】
0006975233.tif 000040
【図４Ｅ】
0006975233.tif 000041
【図４Ｆ】
0006975233.tif 000042
【図４Ｇ】
0006975233.tif 000043
【図５Ａ】
0006975233.tif 000044
【図５Ｂ】
0006975233.tif 000045
【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
0006975233.tif 000049
【図５Ｇ】
0006975233.tif 000050
【図５Ｈ】
0006975233.tif 000051
【図５Ｉ】
0006975233.tif 000052
【図６Ａ】
0006975233.tif 000053
【図６Ｂ】
0006975233.tif 000054
【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
0006975233.tif 000060
【図７Ｄ】
0006975233.tif 000061
【図７Ｅ】
0006975233.tif 000062
【図７Ｆ】
0006975233.tif 000063
【図８Ａ】
0006975233.tif 000064
【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
0006975233.tif 000071
【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
0006975233.tif 000074
【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
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【図１３Ａ】
0006975233.tif 000089
【図１３Ｂ】
0006975233.tif 000090
【図１４Ａ】
0006975233.tif 000091
【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【配列表】
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