(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（２）で表わされる化合物からなる細胞層透過促進剤。
【化２】
0006975437.tif 000048
（一般式（２）中、Ｒは、置換基を有してもよい炭素数１〜９のアルキル基であり、
ＺＺは、任意のα−アミノ酸である。）
【請求項２】
前記一般式（２）で表わされる化合物は、そのＺＺは、グルタミン又はアラニンである、請求項１記載の細胞層透過促進剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の細胞層透過促進剤を含み、生体への薬剤の吸収を補助するためのものである、薬剤吸収補助用組成物。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の細胞層透過促進剤を含み、生体に吸収させるべき薬剤を更に含む、前記薬剤の細胞層透過用の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞層透過促進剤、薬剤吸収補助用組成物、及び医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
上皮組織等を形成する細胞層では、隣り合う細胞同士の間隙がタイトジャンクション（TJ: Tight Junction）等の細胞接着構造によりシールされ、異物に対するバリア機能を果たしている。このため、細胞と細胞の間をすり抜ける細胞間隙経路での物質透過は、生体の恒常性維持のためには、きわめて制限的といえる。この細胞接着構造を一次的に緩和して、所望の物質を細胞間隙経路で透過させることにより、薬剤等の生体内への吸収を高めようとするドラッグデリバリーシステム（DDS: Drug Delivery System）の考え方がある（非特許文献１〜５）。ペプチド、タンパク質、抗体、ワクチン、核酸など、近年開発の盛んなバイオ医薬品やその候補物質の中には低バイオアベイラビリティーのものもあり、ドラッグデリバリーシステム（DDS: Drug Delivery System）の技術は、そのような薬剤の適用可能性の範囲を広げ、また、注射投与ではなく、非侵襲的な、経口、経皮、経鼻、経肺、経粘膜などの投与方法により、患者のQuality of Lifeの向上にも繋がるので、その技術の開発が望まれている。【０００３】
一方、下記非特許文献６には、シュードモナス菌由来の抗菌性物質として、環状リポペプチドの報告がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Kondoh M., et al.「Tight junction modulators: promising candidates for drug delivery.」Curr Med Chem. (2007) 14(23), pp2482-2488.
【非特許文献２】Gonzalez-Mariscal L., et al.「Strategies that Target Tight Junctions for Enhanced Drug Delivery.」Curr Pharm Des. (2016) 22(35), pp5313-5346.
【非特許文献３】Eichner M., et al.「Targeting and alteration of tight junctions by bacteria and their virulence factors such as Clostridium perfringens enterotoxin.」Pflugers Arch. (2017) 469(1), pp77-90.
【非特許文献４】藤井良和「アンピシリン坐薬」Jpn. J. Antibiot., (1986) 39, pp1-8.
【非特許文献５】山本昌「ペプチド・タンパク性医薬品の経粘膜透過促進」薬剤学, (2014) 74 (1), pp19-26.
【非特許文献６】Wen Li, et al. 「The Antimicrobial Compound Xantholysin Defines a New Group of Pseudomonas Cyclic Lipopeptides」PLoS One, (2013) 8(5), e62946.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記非特許文献６は、物質の細胞層透過を促進させる技術について、着眼するものではなかった。【０００６】
よって、本発明の目的は、物質の細胞層透過を促進させるための技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するため、本発明者らが鋭意研究した結果、特定の環状リポペプチドには、物質の細胞層透過を促進する作用効果があることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００８】
すなわち、本発明は、第１に、下記一般式（１）で表わされる化合物からなる細胞層透過促進剤を提供するものである。【０００９】
【化１】
0006975437.tif 000002
【００１０】
（一般式（１）中、Ｒは、置換基を有してもよい炭素数１〜９のアルキル基であり、
Ｘは、ロイシン又はその保存的置換、より好ましくは、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、ｔｅｒｔ−ブチルアラニン、ｔｅｒｔ−ロイシン、バリン、シクロへキシルグリシン、又はシクロヘキシルアラニン、又はアラニンであり、
ＸＸは、バリン又はその保存的置換、より好ましくは、バリン、イソロイシン、ノルロイシン、ｔｅｒｔ−ブチルアラニン、ｔｅｒｔ−ロイシン、ロイシン、シクロへキシルグリシン、又はシクロヘキシルアラニン、又はアラニンであり、
Ｙは、グルタミン酸又はその保存的置換、より好ましくは、グルタミン酸又はアスパラギン酸、又はアラニンであり、
Ｚは、グルタミン又はその保存的置換、より好ましくは、グルタミン又はアスパラギン、又はアラニンであり、
ＺＺは、任意のα−アミノ酸、より好ましくは、グルタミン又はアラニンであり、
ＹＺは、セリン、スレオニン、ホモセリン、ジアミノプロパノイックアシッド、又はジアミノブチリックアシッドであり、
Ｒ’は、ｓｅｃ−ブチル又はその保存的置換、より好ましくは、ｓｅｃ−ブチル、イソプロピル、イソペンチル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロへキシル、又はシクロへキシルメチルである。）【００１１】
本発明においては、上記一般式（１）で表わされる化合物は、下記一般式（２）で表わされる化合物であることが好ましい。【００１２】
【化２】
0006975437.tif 000003
【００１３】
（一般式（２）中、Ｒは、置換基を有してもよい炭素数１〜９のアルキル基であり、
ＺＺは、任意のα−アミノ酸、より好ましくは、グルタミン又はアラニンである。）【００１４】
また、本発明は、第２に、上記細胞層透過促進剤を含み、生体への薬剤の吸収を補助するためのものである、薬剤吸収補助用組成物を提供するものである。【００１５】
また、本発明は、第３に、上記細胞層透過促進剤を含み、生体に吸収させるべき薬剤を更に含む、医薬組成物を提供するものである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、特定の環状リポペプチドには、物質の細胞層透過を促進する作用効果があるので、これを利用して、優れた細胞層透過促進剤、薬剤吸収補助用組成物、及び医薬組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】試験例１において、モデル細胞層を用いた透過性評価試験において、分子量４０００のデキストランの透過性に与える各種環状ポリペプチの影響を評価した結果を示す図表である。
【図２】試験例２において、モデル細胞層を用いた透過性評価試験において、分子量４０００のデキストランの透過性に与える各種環状ポリペプチの影響を評価した結果を示す図表である。
【図３】試験例３において、モデル細胞層を用いた透過性評価試験において、分子量４０００のデキストランの透過性に与える各種環状ポリペプチの影響を評価した結果を示す図表である。
【図４】試験例４において、モデル細胞層を用いた透過性評価試験において、分子量４０００のデキストランの透過性に与える各種環状ポリペプチの影響を評価した結果を示す図表である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明においては、下記一般式（１）で表わされる化合物を用いる。
【００１９】
【化３】
0006975437.tif 000004
【００２０】
（一般式（１）中、Ｒは、置換基を有してもよい炭素数１〜９のアルキル基であり、
Ｘは、ロイシン（Ｌｅｕ）又はその保存的置換、より好ましくは、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ｔｅｒｔ−ブチルアラニン（Ａｌａ｛ｔＢｕ｝）、ｔｅｒｔ−ロイシン（ｔｅｒｔ−Ｌｅｕ）、バリン（Ｖａｌ）、シクロへキシルグリシン（Ｃｈｇ）、又はシクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、又はアラニン（Ａｌａ）であり、
ＸＸは、バリン（Ｖａｌ）又はその保存的置換、より好ましくは、バリン（Ｖａｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ｔｅｒｔ−ブチルアラニン（Ａｌａ｛ｔＢｕ｝）、ｔｅｒｔ−ロイシン（ｔｅｒｔ−Ｌｅｕ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、シクロへキシルグリシン（Ｃｈｇ）、又はシクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、又はアラニン（Ａｌａ）であり、
Ｙは、グルタミン酸（Ｇｌｕ）又はその保存的置換、より好ましくは、グルタミン酸（Ｇｌｕ）又アスパラギン酸（Ａｓｐ）、又はアラニン（Ａｌａ）であり、
Ｚは、グルタミン（Ｇｌｎ）又はその保存的置換、より好ましくは、グルタミン（Ｇｌｎ）又はアスパラギン（Ａｓｎ）、又はアラニン（Ａｌａ）であり、
ＺＺは、任意のα−アミノ酸、より好ましくは、グルタミングルタミン（Ｇｌｎ）又はアラニン（Ａｌａ）であり、
ＹＺは、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、ホモセリン、ジアミノプロパノイックアシッド、又はジアミノブチリックアシッドであり、
Ｒ’は、ｓｅｃ−ブチル又はその保存的置換、より好ましくは、ｓｅｃ−ブチル、イソプロピル、イソペンチル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロへキシルメチル、シクロへキシルである。）
【００２１】
なお、一般式（１）中、Ｒ’がｓｅｃ−ブチルであるときイソロイシン（Ｉｌｅ）のαアミノ基とαカルボキシル基が隣接するアミノ酸との間でペプチド結合する構成を有することとなり、同様にイソプロピルであるときはバリン（Ｖａｌ）が、イソペンチルであるときはロイシン（Ｌｅｕ）が、ｎ−ブチルであるときはノルロイシン（Ｎｌｅ）が、ｔｅｒｔ−ブチルであるときはｔｅｒｔ−ブチルアラニン（Ａｌａ｛ｔＢｕ｝）が、シクロへキシルであるときはシクロへキシルグリシン（Ｃｈｇ）が、シクロへキシルメチルであるときはシクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）が、それぞれ隣接するアミノ酸との間でペプチド結合する構成を有することとなる。
【００２２】
より具体的には、本発明においては、上記一般式（１）で表わされる化合物としては、下記一般式（２）で表わされる化合物であってもよい。
【００２３】
【化４】
0006975437.tif 000005
【００２４】
（一般式（２）中、Ｒは、置換基を有してもよい炭素数１〜９のアルキル基であり、
ＺＺは、任意のα−アミノ酸、より好ましくは、グルタミン又はアラニンである。）
【００２５】
下記には、上記一般式（２）で表わされる化合物において、
（Ａ）ＺＺ6がアラニン（Ａｌａ）、ＺＺ10がグルタミン（Ｇｌｎ）、ＺＺ13がグルタミン（Ｇｌｎ）である場合を、より詳細に化学構造式（２ａ）で表わし、
（Ｂ）ＺＺ6がグルタミン（Ｇｌｎ）、ＺＺ10がアラニン（Ａｌａ）、ＺＺ13がグルタミン（Ｇｌｎ）である場合を、より詳細に化学構造式（２ｂ）で表わし、
（Ｃ）ＺＺ6がグルタミン（Ｇｌｎ）、ＺＺ10がグルタミン（Ｇｌｎ）、ＺＺ13がアラニン（Ａｌａ）である場合を、より詳細に化学構造式（２ｃ）で表わす。
（Ｄ）ＺＺ6がグルタミン（Ｇｌｎ）、ＺＺ10がグルタミン（Ｇｌｎ）、ＺＺ13がグルタミン（Ｇｌｎ）である場合を、より詳細に化学構造式（２ｄ）で表わす。
【００２６】
【化５】
0006975437.tif 000006
【００２７】
【化６】
0006975437.tif 000007
【００２８】
【化７】
0006975437.tif 000008
【００２９】
【化８】
0006975437.tif 000009
【００３０】
上記一般式（１）で表わされる化合物としては、そのペプチド結合のＤＬ異性体構造が特定された、下記一般式（３）で表わされる化合物であってもよい。
【００３１】
【化９】
0006975437.tif 000010
【００３２】
（一般式（３）中、Ｒは、置換基を有してもよい炭素数１〜９のアルキル基であり、
ＺＺは、任意のα−アミノ酸、より好ましくは、グルタミン又はアラニンである。）
【００３３】
下記には、上記一般式（３）で表わされる化合物において、
（Ａ）ＺＺ6がアラニン（Ａｌａ）、ＺＺ10がグルタミン（Ｇｌｎ）、ＺＺ13がグルタミン（Ｇｌｎ）である場合を、より詳細に化学構造式（３ａ）で表わし、
（Ｂ）ＺＺ6がグルタミン（Ｇｌｎ）、ＺＺ10がアラニン（Ａｌａ）、ＺＺ13がグルタミン（Ｇｌｎ）である場合を、より詳細に化学構造式（３ｂ）で表わし、
（Ｃ）ＺＺ6がグルタミン（Ｇｌｎ）、ＺＺ10がグルタミン（Ｇｌｎ）、ＺＺ13がアラニン（Ａｌａ）である場合を、より詳細に化学構造式（３ｃ）で表わす。
（Ｄ）ＺＺ6がグルタミン（Ｇｌｎ）、ＺＺ10がグルタミン（Ｇｌｎ）、ＺＺ13がグルタミン（Ｇｌｎ）である場合を、より詳細に化学構造式（２ｄ）で表わす。
【００３４】
【化１０】
0006975437.tif 000011
【００３５】
【化１１】
0006975437.tif 000012
【００３６】
【化１２】
0006975437.tif 000013
【００３７】
【化１３】
0006975437.tif 000014
【００３８】
上記化合物の一般式中、Ｒは置換基を有してもよい炭素数１〜９のアルキル基として表わされるが、典型的には、そのアルキル基は任意に水酸基を有していてもよく、より典型的には置換基として１〜４個の水酸基のみを有するアルキル基であってもよく、更により典型的には置換基として１〜２個の水酸基のみを有するアルキル基であってもよい。また、アルキル基長としては炭素数１〜６であってもよく、炭素数１〜３であってもよい。更に、後述の実施例を考慮すると、Ｒとしては下記式（４）又は（５）で表わされる基であることが、より典型的である。また、下記式（４）又は（５）で表わされる基のアルキル基長は炭素数９であるが、アルキル基長としては炭素数６であってもよく、炭素数３であってもよい。
【００３９】
【化１４】
0006975437.tif 000015
【００４０】
【化１５】
0006975437.tif 000016
【００４１】
本発明に用いる上記化合物としては、上記非特許文献６に示されるように、少なくともその１種は、ある種のシュードモナス菌に含まれていることも明らかとなっており、そのような菌株、変異株、遺伝子導入株等から抽出して調製してもよく、その他の微生物等の他の生物資源から抽出して調製してもよいが、工業的に生産する観点からは、人工的に合成されたものであることがより好ましい。合成法としては、液相法、アジフェーズ法、固相法等が挙げられる。なかでも、中間体の精製を省略可能であることから固相法によって合成することがより好ましい。
【００４２】
以下には、固相法の一例として、Fmoc固相合成法の具体例を述べる。ただし、以下に示す好ましい合成法の記載は、本発明の範囲が、それらの方法で得られたものに限る趣旨のものではない。
【００４３】
（Fmoc固相合成法）
Fmoc固相合成法の手順としてはまず、樹脂上の保護基であるFmoc(9-フルオレニルメトシキカルボニル)基を20% (v/v) ピペリジン/DMF溶液中、室温で20分間反応させ除去する。樹脂を洗浄後、種々の縮合剤を用い、アミノ酸を縮合する。このサイクルを繰り返すことで目的ペプチドを獲得する。縮合剤としてはカルボジイミド試薬、ジフェニルリン酸アジド、BOP試薬、HATU試薬などが用いられる。
【００４４】
本発明においては、固相合成は、例えば、N末端から13番目のD-Gln残基を起点に合成を行うことができる。すなわち、樹脂上のFmoc基を20% (v/v) ピペリジン/DMF溶液にて脱保護後、側鎖無保護のFmoc-D-Glu-Oallylを縮合する。脱保護と縮合を繰り返し、8番目のD-Val残基まで伸長する。伸長後、脱保護を行い、N(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)-O-((2R)-2-(((アリルオキシ)カルボニル)アミノ)-3-メチルペンタノイル)-D-セリンを樹脂に導入する。樹脂上で環を形成するために、パラジウム触媒を用い、アリル基、Alloc(アリルオキシカルボニル)基を除去する。除去後、樹脂上で環を形成する。以降、Fmoc-D-Glu-Oallylの場合と同様にして順次C末端側から伸長を行うことで、目的ペプチドを得ることができる。
【００４５】
なお、この手法では、縮合させるアミノ酸を変更することにより様々な環状ペプチドが樹脂上で合成できる。例えば、N末端から13番目のD-Gln残基を他のアミノ酸に変更したい場合、樹脂との結合位置を13番目から10番目のD-Glnへ変更することで置換可能である。
【００４６】
本発明に係る細胞層透過促進剤は、上記化合物からなる、もしくは上記化合物を用いる。すなわち、後述する実施例で示されるように、上記化合物を細胞層に作用させるとその細胞接着構造に何らかの影響を与えて、細胞間隙経路の物質の透過性が亢進する。この場合、適用対象としては、具体的には、皮膚、肺、鼻、消化管、腸管、その他粘膜組織等が挙げられ、組織の種類に特に制限はない。また、細胞同士が単層に形成した形態であろうと、多層に形成した形態であろうと、その層形状の種類にも特に制限はない。また、ヒトを対象にするばかりではなく、ペット、家畜等の動物に由来する細胞層が対象であってもよい。更に、場合によっては、必要に応じて生体外に形成させた細胞層に適用してもよい。
【００４７】
一方、本発明に係る薬剤吸収補助用組成物は、上記化合物からなる細胞層透過促進剤を含み、生体への薬剤の吸収を補助するための組成物である。すなわち、この組成物で、適用の対象とする細胞層として、例えば、皮膚、肺、鼻、消化管、腸管、その他粘膜組織等を、生体に吸収させるべき所望の薬剤とともに処置することで、上記化合物が有効成分となって細胞間隙経路での物質等が亢進するので、その経路による所望の薬剤の生体への吸収率を向上させることができる。この場合、組成物の形態は、上記化合物を含んでいればよく、特に制限はないが、適用の対象とする細胞層の種類に応じて、適宜製剤的基材とともに当業者に知られた製剤手法により、例えば、軟膏、クリーム、ローション、乳液等の塗布剤、パッチ剤、貼付剤、エアロゾル剤、吸引剤、坐剤、トローチ剤、舌下錠剤、口腔内崩壊剤、ゼリー状剤、液剤、ソフトカプセル、ハードカプセル剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤等の形態を採用し得る。組成物中の上記化合物の含有量としては、例えば０．０００１〜１００質量％、より典型的には０．００１〜７５質量％、更により典型的には０．０１〜５０質量％、特に典型的には０．１〜３０質量％、特により典型的には１〜２０質量％等である。
【００４８】
本発明を適用する薬剤としては、親水性、親油性、もしくは両親媒性であってもよい低分子化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、ワクチン、核酸など、特に制限されるものではないが、例えば、少なくとも分子量５００以上、より好ましくは１０００以上、更により好ましくは２０００以上の物質に適用して、その生体への吸収率を向上して、その物質の薬剤としての適用可能性の範囲を広げ、また、注射投与ではなく、非侵襲的な、経口、経皮、経鼻、経肺、経粘膜などの投与方法の開発により、患者のQuality of Lifeの向上にも繋がるので、好ましい。
【００４９】
本発明による他に形態としては、上記薬剤吸収補助用組成物の形態中に、上記化合物と、生体に吸収させるべき所望の薬剤とを、その同一の形態中に含有せしめて、医薬組成物の形態と成してもよい。
【００５０】
本発明に係る上記化合物の投与量としては、適用の対象とする細胞層の種類や、生体に吸収させるべき薬剤の種類によっても異なり、一概ではないが、例えば、典型的には、細胞層の表面積１ｃｍ2当りへの１回適用量として０．０１μｇ〜１０ｍｇ程度であってよく、より典型的には０．１〜１ｍｇ程度であってよく、更により典型的には１μｇ〜０．１ｍｇ程度であってよい。また、後述する実施例で示されるように、上記化合物による細胞間隙の開口作用は、従来知られたアクチン重合阻害剤のような不可逆的なものではなく、可逆的であり、処置後には、比較的速やかに、おそらくは生体恒常性維持作用によりタイトジャンクション等の細胞接着構造の正常性が回復するので、異物に対するバリア機能を損ねることなく安全に使用することが可能である。
【実施例】
【００５１】
以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。【００５２】
［調製例１］（cu538-1及びcu538-2の固相合成）
Fmoc固相合成法により、下記に示すcu538-1及びcu538-2を合成した。なお、これらの化合物は下記に化学構造式とともに矢印で示したＯＨ基の位置に異性体が存在しラセミ体として得られ、これをＨＰＬＣにより分離精製することにより調製した。【００５３】
【化１６】
0006975437.tif 000017
【００５４】
【化１７】
0006975437.tif 000018
【００５５】
具体的には、以下のとおり合成した。【００５６】
PP 製濾過カラムにFmoc-NH-SAL Resin (0.37 mmol/g, 渡辺化学工業株式会社) 300 mg (0.111 mmol) を量りとり、ジメチルホルムアミド (DMF) 溶液中室温で40分間樹脂を膨潤させた。膨潤後、20% (v/v) ピペリジン/DMF溶液中、室温で20分間反応させることで樹脂上の保護基Fmoc(9-フルオレニルメトシキカルボニル) 基を除去した。DMFで10回洗浄し、1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール (HOAt, 0.333 mmol, 3 eq)、O-(7-アザ-1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N, N, N', N' -テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホルファート(HATU, 0.333 mmol, 3 eq)、N, N-ジイソプロピルアミン (DIPEA, 0.333 mmol, 3 eq)存在下で、Fmoc-D-Glu-Oallyl(0.333 mmol, 3 eq)を室温で30分間DMF中にて反応させ、樹脂上にアミノ酸を導入した。次のアミノ酸を縮合させるために、DMFで10回洗浄し、20% (v/v) ピペリジン/DMF溶液中、室温で20分間反応させることで樹脂上の保護基Fmoc 基を除去した。以下、Fmoc-D-Glu-Oallylの場合と同様にして順次C末端からFmoc-Leu-OH(0.333 mmol, 3 eq)、Fmoc-Leu-OH(0.333 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Gln(Trt)-OH(0.333 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Leu-OH(0.333 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Val-OH(0.333 mmol, 3 eq)を導入してペプチド鎖を伸長させた。20% (v/v) ピペリジン/DMF溶液中、室温で20分間反応させることで樹脂上のFmoc基を除去した。DMFで10回洗浄し、N, N'-ジイソプロピルカルボジイミド(DIPCI, 0.333 mmol, 3 eq)、1-ヒドロキシ-1H-ベンゾトリアゾールハイドレート(HOBt・H2O, 0.333 mmol, 3 eq)存在下で、N(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)-O-((2R)-2-(((アリルオキシ)カルボニル)アミノ)-3-メチルペンタノイル)-D-セリン(0.333 mmol, 3 eq)を室温で90分間DCM(ジクロロメタン)中にて反応させ、樹脂上にアミノ酸を導入した。導入後、DMFで5回洗浄、メタノールで5回洗浄、ジエチルエーテルで5回洗浄後、樹脂を乾燥させた。乾燥樹脂に対して、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0) (0.111 mmol, 1 eq)、フェニルシラン(1.11 mmol, 10 eq)存在下、室温で180分間DCM中にて反応させ、樹脂上のアリル基、Alloc(アリルオキシカルボニル)基を除去した。樹脂上で環を形成するため、DCMで5回洗浄、0.5% (w/v)  ソディウムN,N-ジエチルジチオカルバメートトリハイドレート/DMF溶液で5回洗浄、DMFで5回洗浄し、N, N'-ジイソプロピルカルボジイミド(DIPCI, 0.555 mmol, 5 eq)、1-ヒドロキシ-1H-ベンゾトリアゾールハイドレート(HOBt・H2O, 0.555 mmol, 5 eq)存在下、室温で90分間DMF中にて環を形成した。樹脂上のFmoc基を除去するため、DMFで10回洗浄し、20% (v/v) ピペリジン/DMF溶液中、室温で5分間反応させることで樹脂上のFmoc 基を除去した。DMFで10回洗浄し、N, N'-ジイソプロピルカルボジイミド(DIPCI, 0.333 mmol, 3 eq)、1-ヒドロキシ-1H-ベンゾトリアゾールハイドレート(HOBt・H2O, 0.333 mmol, 3 eq)存在下で、Fmoc-Gln(Trt)-OH(0.333 mmol, 3 eq)を室温中90分間DMF中にて反応させ、樹脂上にアミノ酸を導入した。次のアミノ酸を縮合させるために、DMFで10回洗浄し、20% (v/v) ピペリジン/DMF溶液中、室温で20分間反応させることで樹脂上のFmoc 基を除去した。以下、Fmoc-D-Glu-Oallylの場合と同様にして順次C末端からFmoc-D-Leu-OH(0.333 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Val-OH(0.333 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Gln(Trt)-OH(0.333 mmol, 3 eq)、 Fmoc-D-Glu(OtBu)-OH(0.333 mmol, 3 eq)、 Fmoc-Leu-OH(0.333 mmol, 3 eq)、(±)-3-(tert-ブチルジメチルシロキシ)デカン酸(0.333 mmol, 3 eq)を導入し、DMFで5回洗浄、メタノールで5回洗浄、ジエチルエーテルで5回洗浄後、樹脂を乾燥させた。各種側鎖保護基の除去および脱樹脂のため、水(0.6 ml)存在下でトリフルオロ酢酸 (TFA) 11.4ml中にて3時間反応させた。反応液を濾過し、濾液を集め、窒素気流下でTFAを揮発させることにより留去し、ジエチルエーテルで洗浄し、デカンテーションにより溶液を除去した。得られた残渣を減圧下で乾燥し、70%(v/v)アセトニトリル水溶液に溶解し、高速液体クロマトグラフィーを用いて精製することにより、白色固体を得た(cu538-1 : 8.18 mg, 収率8%、cu538-2：7.75 mg, 収率 8%)。なお、得られた化合物のＭＳ（質量）、及びcu538-2のＮＭＲを分析したところ、下記のデータを得た。【００５７】
（ＭＳデータ）
cu538-1 :HRMS(ES+) calcd for C84H147N18O23 [M+H]+ 1776.0886 found 1776.0884
cu538-2 :HRMS(ES+) calcd for C84H147N18O23 [M+H]+ 1776.0886 found 1776.0886
（ＮＭＲデータ）
cu538-2 : 1H NMR (600 MHz, MeOD) : δ 4.62 (bs, 1H), 4.42-4.28 (m, 7H), 4.2 (dd, 1H, J = 3.9, 11.2 Hz), 4.16-4.11 (m, 3H), 4.08-4.03 (m, 1H), 4.00 (t, 1H, J = 6.7 Hz), 3.87 (bs, 1H), 3.78 (d, 2H, J = 9.3 Hz), 2.52-2.50 (m, 3H),2.42-2.30(m, 13H), 2.24-1.99 (m, 12H), 1.94-1.83 (m, 6H), 1.71-1.32 (m, 29H), 1.22-1.17 (m, 1H), 1.09 (d, 3H, J = 6.5 Hz), 1.04 (d, 3H, J = 6.6 Hz), 1.00-0.87 (m, 54H)
13C NMR (150 MHz, MeOD) : 175.5, 174.8, 174.7, 174.6, 174.6, 174.3, 173.5, 173.2, 171.9, 69.8, 64.9, 64.3, 58.7, 58.6, 57.3, 57.1, 56.6, 55.7, 55.6, 54.9, 54.8, 54.6, 54.5, 54.3, 53.9, 53.8, 53.8, 44.4, 41.6, 41.5, 40.5, 40.5, 38.4, 37.4, 33.2, 33.0, 32.9, 32.7, 32.6, 31.1, 31.0, 30.7, 30.6, 30.5, 30.4, 27.7, 27.4, 27.4, 26.9, 26.6, 26.1, 26.0, 25.9, 25.8, 25.8, 25.6, 23.7, 23.7, 23.6, 23.5, 22.6, 22.5, 22.1, 21.6, 21.1, 20.9, 20.7, 19.7, 19.4, 16.2, 14.4, 11.3【００５８】
［調製例２］（NY-38の固相合成）
調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により、下記に示すNY-38を合成した。【００５９】
【化１８】
0006975437.tif 000019
【００６０】
具体的には、以下のとおり合成した。【００６１】
PP 製濾過カラムにFmoc-NH-SAL Resin (0.37 mmol/g, 渡辺化学工業株式会社) 100 mg (0.037 mmol) を量りとり、ジメチルホルムアミド (DMF) 溶液中室温で40分間樹脂を膨潤させた。合成法はcu538-1,2と同様の手法を用い、N末端1残基目のロイシンまで伸長を行う。Fmoc基を除去後、N, N'-ジイソプロピルカルボジイミド(DIPCI, 0.111 mmol, 3 eq)、1-ヒドロキシ-1H-ベンゾトリアゾールハイドレート(HOBt・H2O, 0.111 mmol, 3 eq)存在下で、デカン酸(0.111 mmol, 3 eq)を導入し、DMFで5回洗浄後、メタノールで5回洗浄、ジエチルエーテルで5回洗浄後、樹脂を乾燥させた。各種側鎖保護基の除去および脱樹脂のため、水(0.2 ml)存在下でトリフルオロ酢酸 (TFA) 3.8 ml中にて3時間反応させた。反応液を濾過し、濾液を集め、窒素気流下でTFAを揮発させることにより留去し、ジエチルエーテルで洗浄し、デカンテーションにより溶液を除去した。得られた残渣を減圧下で乾燥し、70%(v/v)アセトニトリル水溶液に溶解し、高速液体クロマトグラフィーを用いて精製することにより、白色固体を得た(2.6 mg, 収率 4%)。なお、得られた化合物のＭＳ（質量）を分析したところ、下記のデータを得た。【００６２】
（ＭＳデータ）
NY-38 : HRMS(ES+) calcd for C84H147N18O22 [M+H]+ 1760.0937 found 1760.0916【００６３】
［調製例３］（cu592の固相合成）
調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により、下記に示すcu592を合成した。【００６４】
【化１９】
0006975437.tif 000020
【００６５】
具体的には、以下のとおり合成した。【００６６】
PP 製濾過カラムにFmoc-NH-SAL Resin (0.37 mmol/g, 渡辺化学工業株式会社) 50 mg (0.0185 mmol) を量りとり、ジメチルホルムアミド (DMF) 溶液中室温で40分間樹脂を膨潤させた。合成法はcu538-1,2と同様の手法を用い、順次C末端からmoc-D-Glu-Oallyl(0.0555 mmol)Fmoc-Leu-OH(0.0555 mmol, 3 eq)、Fmoc-Leu-OH(0.0555 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Gln(Trt)-OH(0.0555 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Leu-OH(0.0555 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Val-OH(0.0555 mmol, 3 eq)、N(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル) -O-((2R)-2-(((アリルオキシ)カルボニル)アミノ)-3-メチルペンタノイル)-D-セリン(0.0555 mmol, 3 eq)を導入する。導入後、cu538-1,2と同様の手法を用い、環化反応を行う。その後、樹脂上のFmoc基を脱保護し、Fmoc-Ala-OH(0.0555 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Leu-OH(0.0555 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Val-OH(0.0555 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Gln(Trt) -OH(0.0555 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Glu(OtBu) -OH(0.0555 mmol, 3 eq)、 Fmoc-Leu-OH(0.0555 mmol, 3 eq)、(+)-3- (tert-ブチルジメチルシロキシ)デカン酸(0.0555 mmol, 3 eq)を導入する。cu538-1,2と同様の手法で脱樹脂後、高速液体クロマトグラフィーを用いて精製することにより、白色固体を得た(3.18 mg, 収率 10%)。なお、得られた化合物のＭＳ（質量）を分析したところ、下記のデータを得た。【００６７】
（ＭＳデータ）
cu592 :HRMS(ES+) calcd for C82H144N17O22 [M+H]+ 1719.0672 found 1719.0659【００６８】
［調製例４］（cu605の固相合成）
調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により、下記に示すcu605を合成した。【００６９】
【化２０】
0006975437.tif 000021
【００７０】
具体的には、以下のとおり合成した。【００７１】
PP 製濾過カラムにFmoc-NH-SAL Resin (0.37 mmol/g, 渡辺化学工業株式会社) 100 mg (0.037 mmol) を量りとり、ジメチルホルムアミド (DMF) 溶液中室温で40分間樹脂を膨潤させた。合成法はcu538-1,2と同様の手法を用い、順次C末端からFmoc-D-Glu-Oallyl(0.111 mmol)、Fmoc-Leu-OH(0.111 mmol, 3 eq)、 Fmoc-Leu-OH(0.111 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Ala-OH(0.111 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Leu-OH(0.111mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Val-OH(0.111 mmol, 3 eq)、N(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル) -O- ((2R)-2-(((アリルオキシ)カルボニル)アミノ)-3-メチルペンタノイル)-D-セリン(0.111 mmol, 3 eq)を導入する。導入後、cu538-1,2と同様の手法を用い、環化反応を行う。その後、樹脂上のFmoc基を脱保護し、Fmoc-Ala-OH(0.111 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Leu-OH(0.111 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Val-OH(0.111 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Gln(Trt)-OH(0.111 mmol, 3 eq)、 Fmoc-D-Glu(OtBu)-OH(0.111 mmol, 3 eq)、 Fmoc-Leu-OH(0.111 mmol, 3 eq)、(+)-3- (tert-ブチルジメチルシロキシ)デカン酸(0.111mmol, 3 eq)を導入する。cu538-1,2と同様の手法で脱樹脂後、高速液体クロマトグラフィーを用いて精製することにより、白色固体を得た(1.53 mg, 収率 2%)。なお、得られた化合物のＭＳ（質量）を分析したところ、下記のデータを得た。【００７２】
（ＭＳデータ）
cu605 : HRMS(ES+) calcd for C82H144N17O22 [M+H]+ 1719.0672 found 1719.0677【００７３】
［調製例５］（cu619の固相合成）
調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により、下記に示すcu619を合成した。【００７４】
【化２１】
0006975437.tif 000022
【００７５】
具体的には、以下のとおり合成した。【００７６】
PP 製濾過カラムにFmoc-NH-SAL Resin (0.37 mmol/g, 渡辺化学工業株式会社) 100 mg (0.037 mmol) を量りとり、ジメチルホルムアミド (DMF) 溶液中室温で40分間樹脂を膨潤させた。合成法はcu538-1,2と同様の手法を用い、順次C末端からFmoc-D-Glu-Oallyl(0.111 mmol)、Fmoc-D-Leu-OH(0.111 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Val-OH(0.111 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Ser-OH(0.111 mmol, 3 eq)、Fmoc-Gln(Trt)-OH(0.111 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Leu-OH(0.111 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Val-OH(0.111 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Gln(Trt) -OH(0.111 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Glu(OtBu)-OH(0.111 mmol, 3 eq)、 Fmoc-Leu-OH(0.111 mmol, 3 eq)、(+)-3-(tert-ブチルジメチルシロキシ)デカン酸(0.111mmol, 3 eq)を導入し、DMFで5回洗浄後、メタノールで5回洗浄、ジエチルエーテルで5回洗浄後、減圧下で樹脂を乾燥させた。乾燥樹脂に対してN, N'-ジイソプロピルカルボジイミド(DIPCI, 0.185 mmol, 5 eq)、ピリジン(0.185 mmol, 5 eq)、N,N-ジメチル-4-アミノピリジン(0.185 mmol, 5 eq)存在下、Fmoc-Ile-OH(0.111 mmol, 3 eq)を室温で120分間無水DMF中にて反応させる。この操作を二回行い、樹脂上にアミノ酸を導入した。イソロイシン残基のFmoc基を脱保護後、Fmoc-D-Ala-OH(0.111 mmol, 3 eq)、Fmoc-Leu-OH(0.111 mmol, 3 eq)、Fmoc-Leu-OH(0.111 mmol, 3 eq)を導入する。導入後、DMFで5回洗浄、メタノールで5回洗浄、ジエチルエーテルで5回洗浄後、樹脂を乾燥させた。乾燥樹脂に対して、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0) (0.111 mmol, 1 eq)、フェニルシラン(1.11 mmol, 10 eq)存在下、室温で180分間DCM中にて反応させ、樹脂上のアリル基を除去した。樹脂上で環を形成するため、DCMで5回洗浄、0.5% (w/v)  ソディウムN,N-ジエチルジチオカルバメートトリハイドレート/DMF溶液で5回洗浄、DMFで5回洗浄し、Fmoc基を脱保護後、環を形成した。cu538-1,2と同様の手法で脱樹脂後、高速液体クロマトグラフィーを用いて精製することにより、白色固体を得た(11 mg, 収率 17%)。なお、得られた化合物のＭＳ（質量）を分析したところ、下記のデータを得た。【００７７】
（ＭＳデータ）
cu619 : HRMS(ES+) calcd for C82H143N17O22 Na [M+Na]+ 1741.0491 found 1741.0494【００７８】
［調製例６］（L-Leu1L-Alaの固相合成）
調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により、下記に示すL-Leu1L-Alaを合成した。【００７９】
【化２２】
0006975437.tif 000023
収率 10%【００８０】
（ＭＳデータ）
L-Leu1L-Ala : HRMS(ES+) calcd for C81H143N18O23 [M+H]+ 1734.0417 found 1734.0393【００８１】
［調製例７］（D-Glu2D-Alaの固相合成）
調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により、下記に示すD-Glu2D-Alaを合成した。【００８２】
【化２３】
0006975437.tif 000024
収率 8%【００８３】
（ＭＳデータ）
D-Glu2D-Ala : HRMS(ES+) calcd for C82H145N18O21 [M+H]+ 1718.0832 found 1718.0809【００８４】
［調製例８］（D-Gln3D-Alaの固相合成）
調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により、下記に示すD-Gln3D-Alaを合成した。【００８５】
【化２４】
0006975437.tif 000025
収率 10%【００８６】
（ＭＳデータ）
D-Gln3D-Ala : HRMS(ES+) calcd C82H144N17O22 [M+H]+ 1719.0672 found 1719.0649【００８７】
［調製例９］（D-Val4D-Alaの固相合成）
調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により、下記に示すD-Val4D-Alaを合成した。【００８８】
【化２５】
0006975437.tif 000026
収率 9%【００８９】
（ＭＳデータ）
D-Val4D-Ala : HRMS(ES+) calcd for C82H143N18O23 [M+H]+ 1748.0573 found 1748.0537【００９０】
［調製例１０］（D-Leu5D-Alaの固相合成）
調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により、下記に示すD-Leu5D-Alaを合成した。【００９１】
【化２６】
0006975437.tif 000027
収率 9%【００９２】
（ＭＳデータ）
D-Leu5D-Ala : HRMS(ES+) calcd for C81H141N18O23 [M+H]+ 1734.0417 found 1734.0397【００９３】
［調製例１１］（D-Val8D-Alaの固相合成）
調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により、下記に示すD-Val8D-Alaを合成した。【００９４】
【化２７】
0006975437.tif 000028
収率 1%【００９５】
（ＭＳデータ）
D-Val8D-Ala : HRMS(ES+) calcd for C82H142N18O23Na [M+Na]+ 1770.0393 found 1770.0393【００９６】
［調製例１２］（D-Leu9D-Alaの固相合成）
調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により、下記に示すD-Leu9D-Alaを合成した。【００９７】
【化２８】
0006975437.tif 000029
収率 3%【００９８】
（ＭＳデータ）
D-Leu9D-Ala : HRMS(ES+) calcd for C81H140N18O23Na [M+Na]+ 1756.0236 found 1756.0238【００９９】
［調製例１３］（L-Leu11L-Alaの固相合成）
調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により下記に示すL-Leu11L-Alaを合成した。【０１００】
【化２９】
0006975437.tif 000030
収率 5%【０１０１】
（ＭＳデータ）
L-Leu11L-Ala : HRMS(ES+) calcd for C81H143N18O23 [M+H]+ 1734.0417 found 1734.0393【０１０２】
［調製例１４］（L-Leu12L-Alaの固相合成）
調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により下記に示すL-Leu12L-Alaを合成した。【０１０３】
【化３０】
0006975437.tif 000031
収率 1%【０１０４】
（ＭＳデータ）
L-Leu12L-Ala : HRMS(ES+) calcd for C81H143N18O23 [M+H]+ 1734.0417 found 1734.0393【０１０５】
［調製例１５］（L-Ile14L-Alaの固相合成）
調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により下記に示すL-Ile14L-Alaを合成した。【０１０６】
【化３１】
0006975437.tif 000032
収率 26%【０１０７】
（ＭＳデータ）
L-Ile14L-Ala : HRMS(ES+) calcd for C81H141N18O23 [M+H]+ 1734.0417 found 1734.0420【０１０８】
［調製例１６］（cu632の固相合成）
調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により下記に示すcu632を合成した。【０１０９】
【化３２】
0006975437.tif 000033
収率 5%【０１１０】
（ＭＳデータ）
cu632 : HRMS(ES+) calcd for C81H141N18O22 [M+H]+ 1718.0468 found 1718.0468【０１１１】
［調製例１７］（cu633の固相合成）
調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により下記に示すcu633を合成した。【０１１２】
【化３３】
0006975437.tif 000034
収率 5%【０１１３】
（ＭＳデータ）
cu633 : HRMS(ES+) calcd for C81H141N18O23 [M+H]+ 1675.9998 found 1676.0007【０１１４】
［調製例１８］（L-Leu1D-Leuの固相合成）
調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により下記に示すL-Leu1D-Leuを合成した。【０１１５】
【化３４】
0006975437.tif 000035
収率 12%【０１１６】
（ＭＳデータ）
L-Leu1D-Leu : HRMS(ES+) calcd for C84H147N18O22 [M+H]+ 1760.0937 found 1760.0928【０１１７】
［調製例１９］（D-Glu2L-Gluの固相合成）
調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により下記に示すD-Glu2L-Gluを合成した。【０１１８】
【化３５】
0006975437.tif 000036
収率 16%【０１１９】
（ＭＳデータ）
D-Glu2L-Glu : HRMS(ES+) calcd for C84H147N18O22 [M+H]+ 1760.0937 found 1760.0923【０１２０】
［調製例２０］（D-Gln3L-Glnの固相合成）
調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により下記に示すD-Gln3L-Glnを合成した。【０１２１】
【化３６】
0006975437.tif 000037
収率 11%【０１２２】
（ＭＳデータ）
D-Gln3L-Gln : HRMS(ES+) calcd for C84H147N18O22 [M+H]+ 1760.0937 found 1760.0920【０１２３】
［調製例２１］（D-Val4L-Valの固相合成）
調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により下記に示すD-Val4L-Valを合成した。【０１２４】
【化３７】
0006975437.tif 000038
収率 11%【０１２５】
（ＭＳデータ）
D-Val4L-Val : HRMS(ES+) calcd for C84H147N18O22 [M+H]+ 1760.0937 found 1760.0920【０１２６】
［調製例２２］（D-Leu5L-Leuの固相合成）
調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により下記に示すD-Leu5L-Leuを合成した。【０１２７】
【化３８】
0006975437.tif 000039
収率 5%【０１２８】
（ＭＳデータ）
D-Leu5L-Leu : HRMS(ES+) calcd for C84H147N18O22 [M+H]+ 1760.0937 found 1760.0920【０１２９】
［調製例２３］（L-Gln6D-Glnの固相合成）
調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により下記に示すL-Gln6D-Glnを合成した。【０１３０】
【化３９】
0006975437.tif 000040
収率 21%【０１３１】
（ＭＳデータ）
L-Gln6D-Gln : HRMS(ES+) calcd for C84H147N18O22 [M+H]+ 1760.0937 found 1760.0923【０１３２】
［調製例２４］（D-Val8L-Valの固相合成）
調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により下記に示すD-Val8L-Valを合成した。【０１３３】
【化４０】
0006975437.tif 000041
収率 9%【０１３４】
（ＭＳデータ）
D-Val8L-Val : HRMS(ES+) calcd for C84H146N18O22Na [M+Na]+ 1782.0757 found 1782.0748【０１３５】
［調製例２５］（D-Leu9L-Leuの固相合成）
調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により下記に示すD-Leu9L-Leuを合成した。【０１３６】
【化４１】
0006975437.tif 000042
収率 4%【０１３７】
（ＭＳデータ）
D-Leu9L-Leu : HRMS(ES+) calcd for C84H147N18O22 [M+H]+ 1760.0937 found 1760.0938【０１３８】
［調製例２６］（D-Gln10L-Glnの固相合成）
調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により下記に示すD-Gln10L-Glnを合成した。【０１３９】
【化４２】
0006975437.tif 000043
収率 12%【０１４０】
（ＭＳデータ）
D-Gln10L-Gln : HRMS(ES+) calcd for C84H146N18O22Na [M+Na]+ 1782.0757 found 1782.0753【０１４１】
［調製例２７］（L-Leu11D-Leuの固相合成）
調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により下記に示すL-Leu11D-Leuを合成した。【０１４２】
【化４３】
0006975437.tif 000044
収率 6%【０１４３】
（ＭＳデータ）
L-Leu11D-Leu : HRMS(ES+) calcd for C84H147N18O22 [M+H]+ 1782.0757 found 1782.0753【０１４４】
［調製例２８］（L-Leu12D-Leuの固相合成）
調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により下記に示すL-Leu12D-Leuを合成した。【０１４５】
【化４４】
0006975437.tif 000045
収率 14%【０１４６】
（ＭＳデータ）
L-Leu12D-Leu : HRMS(ES+) calcd for C84H147N18O22 [M+H]+ 1760.0937 found 1760.0938【０１４７】
［調製例２９］（D-Gln13L-Glnの固相合成）
調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により下記に示すD-Gln13L-Glnを合成した。【０１４８】
【化４５】
0006975437.tif 000046
収率 7%【０１４９】
（ＭＳデータ）
D-Gln13L-Gln : HRMS(ES+) calcd for C84H147N18O22 [M+H]+ 1760.0937 found 1760.0928【０１５０】
［調製例３０］（L-Ile14D-Ileの固相合成）
調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により下記に示すL-Ile14D-Ileを合成した。【０１５１】
【化４６】
0006975437.tif 000047
収率 16%【０１５２】
（ＭＳデータ）
L-Ile14D-Ile : HRMS(ES+) calcd for C84H147N18O22 [M+H]+ 1760.0937 found 1760.0942【０１５３】
＜試験例１＞
イヌ腎臓上皮細胞由来のMDCK II細胞を使用して、トランスウェルを用いた上皮細胞層のモデルを作成し、物質透過性評価試験を行った。具体的には、対数増殖期のMDCK II細胞を、３．４〜４．０×１０4 cellsの細胞数でトランスウェル（６．５ｍｍ径、コラーゲンコート、孔サイズ０．４μｍ）（商品名「corning transwell 3495」、コーニング社製）に播種し、基底部側ウェルとして２４穴ウェルプレートを使用して、頂端側のウェルと基底部側のウェルの各ウェルに細胞生育培地６００μＬを入れた。毎日培地交換して層形成させ、播種から３日後に培地を測定用の Hank's balanced salt solution（ＨＢＳＳ）に交換して、３７℃で１時間インキュベート後、層形成を、抵抗値測定システム（商品名「Millicell-ERS」、ミリポア社製）を使用して経上皮電気抵抗（TEER）を測定することにより確認した。その層形成の確認後、頂端側の培地を、分子量４０００のマーカー物質（ＦＤ４：蛍光標識デキストラン）（シグマ社製）を１．０w/v％の濃度となるよう添加したＨＢＳＳの１００μＬに置換し、各試験物質を下記に示す最終濃度となるよう添加した。マーカー物質の添加後５時間まで３０分間３０分間おきにトランスウェルを新しいＨＢＳＳが入った基底部側ウェルに移し、残った基底部側ウェルのＨＢＳＳ（以下「レシーバー溶液」という。）は、その５０μＬずつを９６穴ウェルプレートの１ウェルに回収した。その回収したＨＢＳＳについて、蛍光プレートリーダー（商品名「Wallac 1420 ARVO MX」、パーキンエルマー社製）を使用して、励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５２８ｎｍで蛍光強度を測定した。【０１５４】
（試験物質の最終濃度）
陰性対照：  なし（１v/v％ＤＭＳＯのみ）
試験群１：cu538-1         ０．００３ｍＭ（１v/v％ＤＭＳＯ中）
試験群２：cu538-2         ０．００３ｍＭ（１v/v％ＤＭＳＯ中）
陽性対照：Latrunclin A（LatA）  ０．０００１ｍＭ（１v/v％ＤＭＳＯ中）【０１５５】
結果を図１に示す。【０１５６】
図１に示されるように、陰性コントロールでは、分子量４０００のマーカー物質であるＦＤ４のレシーバー溶液への透過は限定的であった。一方、陽性コントロールとして、アクチン重合阻害剤であるLatrunclin A（LatA）を添加すると、試験開始５時間にわたり、継続的なマーカー物質のレシーバー溶液への透過量の増加・蓄積がみられた。アクチン重合阻害により、細胞接着構造を不可逆的に緩和することが知られている。【０１５７】
これに対し、「cu538-1」や「NY-9」の添加により、試験開始２時間の時点で、陰性コントロールに比べてほぼ４倍、「cu538-2」の添加では、陰性コントロールに比べてほぼ８倍、レシーバー溶液への透過量が増加した。ただし、試験開始２時間以降５時間までに、レシーバー溶液への透過量の増加・蓄積がほとんどみられなかった。【０１５８】
これは、「cu538-1」や「cu538-2」や「NY-38」の添加により、細胞間隙経路の物質透過の亢進が起こるものの、その効果は可逆的、すなわちタイトジャンクション等の細胞接着構造の正常性の回復が速やかで、それ以上の細胞間隙経路の物質透過量の増加・蓄積がみられなかったものと考えられた。【０１５９】
＜試験例２＞
試験物質を下記に示すように代えた以外は、試験例１と同様にして、物質透過性評価試験を行った。【０１６０】
（試験物質の最終濃度）
陰性対照：  なし（１v/v％ＤＭＳＯのみ）
試験群３：cu538-2         ０．００３ｍＭ（１v/v％ＤＭＳＯ中）
試験群４：NY-38    ０．００３ｍＭ（１v/v％ＤＭＳＯ中）
陽性対照：Latrunclin A（LatA）  ０．０００１ｍＭ（１v/v％ＤＭＳＯ中）【０１６１】
結果を図２に示す。【０１６２】
図２に示されるように、「NY-38」にも細胞層透過促進の効果が認められた。その効果は、試験例１において細胞層透過促進の効果が明らかにされた「cu538-2」よりも顕著であった。【０１６３】
＜試験例３＞
試験物質を下記に示すように代えた以外は、試験例１と同様にして、物質透過性評価試験を行った。【０１６４】
（試験物質の最終濃度）
陰性対照：  なし（１v/v％ＤＭＳＯのみ）
試験群５：cu538-2         ０．００３ｍＭ（１v/v％ＤＭＳＯ中）
試験群６：cu592    ０．００３ｍＭ（１v/v％ＤＭＳＯ中）【０１６５】
結果を図３に示す。【０１６６】
図３に示されるように、試験例１において細胞層透過促進の効果が明らかにされた「cu538-2」のアラニンスキャン体である「cu592」でも、「cu538-2」と同等の効果が認められた。【０１６７】
＜試験例４＞
試験物質を下記に示すように代えた以外は、試験例１と同様にして、物質透過性評価試験を行った。【０１６８】
（試験物質の最終濃度）
陰性対照：  なし（１v/v％ＤＭＳＯのみ）
試験群７：cu538-2         ０．００３ｍＭ（１v/v％ＤＭＳＯ中）
試験群８：cu605    ０．００３ｍＭ（１v/v％ＤＭＳＯ中）
試験群９：cu619    ０．００３ｍＭ（１v/v％ＤＭＳＯ中）【０１６９】
結果を図４に示す。【０１７０】
図４に示されるように、試験例１において細胞層透過促進の効果が明らかにされた「cu538-2」のアラニンスキャン体である「cu605」や「cu619」でも効果が認められた。特に、「cu619」では、細胞層透過促進の効果が「cu538-2」よりも顕著であった。
【図１】
0006975437.tif 000049
【図２】
0006975437.tif 000050
【図３】
0006975437.tif 000051
【図４】
0006975437.tif 000052