(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞用培地及び受精卵用培地を含む混合培地中で、受精卵を培養することを含み、
前記受精卵の培養を、受精卵から離隔した脂肪組織由来幹細胞の培養とともに行う胚盤胞の調製方法（但し、ヒト受精卵を除く）。
【請求項２】
前記受精卵と脂肪組織由来幹細胞とを同一容器内の混合培地中で共培養することを含む請求項１に記載の調製方法。
【請求項３】
前記脂肪組織由来幹細胞の培養を、前記混合培地と通液可能に離隔された容器であって、幹細胞用培地が添加された容器中で行う請求項１に記載の調製方法。
【請求項４】
前記脂肪組織由来幹細胞の生物種と、前記受精卵の生物種が同一である請求項１から３のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項５】
前記受精卵が、非ヒト哺乳動物の受精卵である請求項１から４のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項６】
幹細胞用培地及び受精卵用培地を含む混合培地中で、受精卵を培養することを含み、
前記受精卵の培養を、受精卵から離隔した脂肪組織由来幹細胞の培養とともに行う受精卵の胚盤胞への誘導方法（但し、ヒト受精卵を除く）。
【請求項７】
幹細胞用培地と、受精卵用培地と、脂肪組織由来幹細胞と、通液可能な膜を介して接続された上下２層の培養容器と、を含む受精卵培養用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胚盤胞の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本においては、現在５組に１組の夫婦が不妊症と診断され、増加の一途をたどっている。不妊の原因の１つに着床不全によるものがあるが、現行の生殖医療技術では、治療することが困難である。着床不全の治療には、例えば、子宮内膜の再生、着床する受精卵の卵質の改善等が考えられる。特に、受精卵の成熟（例えば、胚細胞から胚盤胞への分化誘導）を活性化することができれば、着床率ひいては妊娠率は大きく改善することが期待できる。
【０００３】
例えば、特許文献１には、脂肪組織由来幹細胞と卵子とを接触させた状態で共培養することで、卵子を活性化することが記載されている。また、非特許文献１には、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞から分泌される生理活性物質がブタ胚の成長を改善することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１６−００７１６１号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Molecular Reproduction & Development 80: 1035-1047, 2013.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、受精卵から胚盤胞へ分化誘導する胚盤胞の調製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するための具体的手段は以下の通りであり、本発明は以下の態様を包含する。第１の態様は、幹細胞用培地及び受精卵用培地を含む混合培地中で、受精卵を培養することを含み、受精卵の培養を受精卵から離隔した脂肪組織由来幹細胞の培養とともに行う胚盤胞の調製方法である。調製方法における受精卵の培養は、受精卵と脂肪組織由来幹細胞とを同一容器内の混合培地中で共培養して行ってもよく、受精卵を混合培地中で培養しつつ、脂肪組織由来幹細胞の培養を、受精卵を培養する混合培地と通液可能に離隔された幹細胞用培地中で行ってもよい。
【０００８】
調製方法において、脂肪組織由来幹細胞の生物種と受精卵の生物種とが同一であってよく、受精卵はヒト受精卵であってもよく、非ヒト哺乳動物の受精卵であってもよい。
【０００９】
第２の態様は、幹細胞用培地及び受精卵用培地を含む混合培地中で、受精卵を培養することを含み、受精卵の培養を受精卵から離隔した脂肪組織由来幹細胞の培養とともに行う受精卵の胚盤胞への誘導方法である。誘導方法における受精卵の培養は、受精卵と脂肪組織由来幹細胞とを同一容器内の混合培地中で共培養であってよく、脂肪組織由来幹細胞の培養を混合培地と通液可能に離隔された幹細胞用培地中で行ってもよい。
【００１０】
誘導方法において、脂肪組織由来幹細胞の生物種と受精卵の生物種とが同一であってよく、受精卵はヒト受精卵であってもよく、非ヒト哺乳動物の受精卵であってもよい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、受精卵から胚盤胞へ分化誘導する胚盤胞の調製方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】混合培地における脂肪組織由来幹細胞の細胞増殖を示す図である。
【図２】混合培地における受精卵の分化を示す図である。
【図３】脂肪組織由来幹細胞の培養上清を添加した混合培地における受精卵の分化を示す図である。
【図４】混合培地中で、受精卵と脂肪組織由来幹細胞を共培養した場合の受精卵の分化を示す図である。
【図５】混合培地中における脂肪組織由来幹細胞の分化マーカーの発現状態を示す図である。
【図６】脂肪組織由来幹細胞の階層培養における培地の影響を示す図である。
【図７】受精卵と脂肪組織由来幹細胞とを階層培養した場合の受精卵の分化を示す図である。
【図８】受精卵の分化における培養条件の影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。また組成物中の各成分の含有量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。ただし、以下に示す実施形態は、本発明の技術思想を具体化するための、胚盤胞の調製方法を例示するものであって、本発明は、以下に示す胚盤胞の調製方法に限定されない。
【００１４】
胚盤胞の調製方法
胚盤胞の調製方法は、幹細胞用培地及び受精卵用培地を含む混合培地中で、受精卵を培養する培養工程を含む。培養工程においては、受精卵の培養を、受精卵から離隔した状態にある脂肪組織由来幹細胞の培養とともにｉｎ  ｖｉｔｒｏで行う。受精卵の培養を脂肪組織由来幹細胞と非接触の状態で行うことにより、優れた効率で受精卵から胚盤胞へ分化誘導することができる。また、受精卵（胚細胞）の発育・分化速度を亢進させることができる。
【００１５】
受精卵は、卵生殖を行う生物種の雌雄の配偶子が結合して形成する最初の細胞である。受精卵を培養すると、２細胞期胚、４細胞期胚、８細胞期胚、桑実胚を経て胚盤胞にまで分化する。そして胚盤胞はさらに、初期胚盤胞、中期胚盤胞、及び後期（拡張）胚盤胞に分類される。受精卵を胚盤胞まで分化誘導した後、子宮内に移植することで不妊治療における着床率を向上できる。
【００１６】
受精卵の由来は、哺乳動物であればよい。哺乳動物としては、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター等を挙げることができる。受精卵の由来はヒトであってもよく、非ヒト哺乳動物であってもよい。
【００１７】
受精卵とともに培養される脂肪組織由来幹細胞は、脂肪組織に含まれる体性幹細胞であってよい。脂肪組織由来幹細胞は、多能性を維持している限り体性幹細胞の培養（継代培養を含む）により得られる幹細胞であってもよい。脂肪組織由来幹細胞は、例えば、脂肪組織由来再生細胞（ＡＤＲＣｓ；Ａｄｉｐｏｓｅ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌｓ）であってもよく、ＡＤＲＣｓを培養して得られる脂肪組織由来間葉系幹細胞（ＡＭＳＣ；Ａｄｉｐｏｓｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ）であってもよい。すなわち、本明細書において、脂肪組織由来幹細胞は、ＡＤＲＣｓ、ＡＭＳＣ、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ；Ａｄｉｐｏｓｅ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ）、脂肪組織由来間葉系幹細胞（ＡＴ−ＭＳＣ；Ａｄｉｐｏｓｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ）等のいずれであってもよく、これらからなる群から選択される少なくとも１種を含むことが好ましく、少なくともＡＭＳＣを含むことがより好ましい。
【００１８】
脂肪組織由来幹細胞の由来、すなわち生物種は、受精卵の生物種と同一であっても異なっていてもよい。脂肪組織由来幹細胞の生物種は、受精卵の生物種と同一であることが好ましく、脂肪組織由来幹細胞の由来と受精卵となる卵子の由来とが同一個体であることがより好ましい。
【００１９】
脂肪組織由来幹細胞は、公知の調製方法によって得ることができる。例えば、脂肪組織を脱凝集剤で処理した後、遠心分離処理によりＡＤＲＣｓ（再生細胞）を濃縮し、濃縮されるＡＤＲＣｓを回収し、必要に応じて培養することで調製することができる。脱凝集剤としては、例えば、中性プロテアーゼ、コラゲナーゼ、トリプシン、リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、ペプシン等を挙げることができ、コラゲナーゼを含むことが好ましい。脂肪組織から再生細胞を回収する方法の詳細については、例えば、特開２０１２−５１９２３号公報、特開２０１２−７５４３９号公報、国際公開第２０１５／０４２１８２号、国際公開２００６／１２７００７号等を参照することができる。また、ＡＤＲＣｓは、市販の装置（例えば、Ｃｅｌｕｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（サイトリ・セラピューティクス社、米国、サンディエゴ））を用いて調製してもよい。
【００２０】
ＡＤＲＣｓが得られる脂肪組織は、生体のいずれの部位に存在するものであってもよく、皮下組織に存在する皮下脂肪であることが好ましい。皮下脂肪は生体のいずれの部位から採取されるものであってもよく、例えば、腰背部、大腿部等から採取してもよい。
【００２１】
ＡＤＲＣｓは、脂肪幹細胞（例えば、ＡＭＳＣ、ＡＳＣなど）、前駆細胞等の少なくとも１種を含み、血管内皮細胞、血管周皮細胞、それらの前駆細胞等を更に含むものであってよい。したがって、ＡＤＲＣｓを培養することで脂肪幹細胞を精製することができる。ＡＤＲＣｓの培養は、例えば、適当な培地に懸濁した後、培養器に播種して一晩培養することで行う。培養条件は、例えば、３７℃、５％ＣＯ２であってよい。その後、培地交換によって浮遊細胞（非接着性細胞）の少なくとも一部を除去してもよい。さらに、適宜培地交換を、例えば２から４日に一度、行いながら培養を継続してよい。必要に応じて継代培養を行ってもよい。継代数は特に限定されず、例えば３継代程度から５継代程度までに留めておいてよい。培養用の培地には、通常の動物細胞培養用の培地を使用することができる。例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（ＤＭＥＭ）（日水製薬株式会社等）、α−ＭＥＭ（大日本製薬株式会社等）、ＤＭＥＭ：Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２混合培地（１：１）（大日本製薬株式会社等）、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２  ｍｅｄｉｕｍ（大日本製薬株式会社等）、ＭＣＤＢ２０１培地（機能性ペプチド研究所）等を使用することができる。培地には、血清（ウシ胎仔血清、ヒト血清、羊血清など）または血清代替物（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）など）を添加してもよい。血清または血清代替物の添加量は例えば５％（ｖ／ｖ）以上３０％（ｖ／ｖ）以下の範囲内であってよい。
【００２２】
ＡＤＲＣｓを培養することによって、接着性細胞として脂肪幹細胞を選択的に生存・増殖させることができる。続いて、増殖した脂肪幹細胞を回収する。回収操作は常法に従えばよく、例えば酵素処理（トリプシンやディスパーゼ処理）後の細胞をセルスクレイパー、ピペットなどで剥離することによって容易に回収することができる。また、市販の温度感受性培養皿などを用いてシート培養した場合は、酵素処理をせずにそのままシート状に細胞を回収することも可能である。このようにして回収した脂肪幹細胞を用いることにより、受精卵の分化をより効果的に誘導することができる。
【００２３】
胚盤胞の調製方法において受精卵の培養は、幹細胞用培地及び受精卵用培地を含む混合培地中で行う。幹細胞用培地としては、例えば、ＭＥＭ、ＭＥＭα、ＤＭＥＭ、ＧＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２  ｍｅｄｉｕｍ、ＩＭＤＭ、ＲＰＩ  １６４０、Ｄ−ＰＢＳ、ＨＢＳＳ等を挙げることができ、これらの混合培地であってもよい。また、受精卵用培地としては、例えば、ＫＳＯＭ、ＰＡＭ−５、ＯＲＩＧＩＯ  Ｓｅｑｅｎｔｉａｌ  Ｆｅｒｔ（ＯＲＩＧＩＯ社製）、ＯＲＩＧＩＯ  Ｓｅｑｅｎｔｉａｌ  Ｂｌａｓｔ（ＯＲＩＧＩＯ社製）、Ｃｌｅａｖ、ＯＲＩＧＩＯ  Ｓｅｑｅｎｔｉａｌ（ＯＲＩＧＩＯ社製）、ＳＡＧＥ  １−Ｓｔｅｐ（ＯＲＩＧＩＯ社製）、ＡＲＴＥＣ（コージンバイオ株式会社製）、ＨＩＧＲＯＷ  ＯＶＩＴ（扶桑薬品工業株式会社製）、ＱＡ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓａｇｅ  ＢｉｏＰｈａｒｍａ，Ｉｎｃ．社製）、後期用培地として、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓａｌｅｓ  Ｃｏ，Ｉｎｃ．社製）等を挙げることができ、これらの混合培地であってもよい。混合培地における幹細胞用培地及び受精卵用培地の混合比は、培養方法に応じて適宜選択すればよい。また、混合培地には、血清、血清代替物、血漿、血清アルブミン、タンパク質、成長因子、サイトカイン、ホルモン、アミノ酸、ビタミン、抗生物質等の添加剤がさらに含まれていてもよい。
【００２４】
一実施形態では、受精卵の培養は、受精卵と脂肪組織由来幹細胞とを同一容器内の混合培地中で共培養することで行ってもよい。この場合、受精卵と脂肪組織由来幹細胞とが直接接触しない状態で共培養する。混合培地を用いることで、脂肪組織由来幹細胞の細胞数を維持したまま、受精卵の分化を効率的に誘導することができる。幹細胞用培地及び受精卵用培地からなる混合培地における幹細胞用培地の含有率は、例えば、１体積％以上であってよく、好ましくは５体積％以上、１０体積％、１５体積％以上、２０体積％以上、３０体積％以上、又は４０体積％以上である。混合培地における幹細胞用培地の含有率の上限は、例えば８０体積％以下であってよく、好ましくは６０体積％以下、５０体積％以下、４０体積％以下、又は３０体積％以下である。
【００２５】
受精卵と脂肪組織由来幹細胞とを同一容器内の混合培地中で共培養する場合、受精卵と脂肪組織由来幹細胞とをそれぞれ、同一容器内の別の区画で培養すればよい。また、受精卵を培養する区画と、脂肪組織由来幹細胞を培養する区画との間には隔壁を設けてもよいし、設けなくてもよい。
【００２６】
また別の実施形態では、受精卵の培養は、受精卵を混合培地中で培養し、脂肪組織由来幹細胞を混合培地と通液可能に離隔された幹細胞用培地中で培養して行ってもよい。この場合、例えば、受精卵を培養する第１容器と、第１容器と通液可能な隔壁を介して接続される第２容器とを用いて受精卵と脂肪組織由来幹細胞の培養をおこなってよい。例えば、第１容器には少なくとも受精卵用培地を添加して受精卵を培養し、第２容器には幹細胞用培地を添加して脂肪組織由来幹細胞を培養してもよい。第１容器と第２容器は平面上に並べて配置されてもよく、上下２段に配置されてもよい。受精卵の分化と脂肪組織由来幹細胞の増殖効率の観点から、第１容器と第２容器は、上下２段に配置されることが好ましく、第１容器を下段、第２容器を上段に配置することがより好ましい。
【００２７】
第１容器と第２容器を区画する通液可能な隔壁としては、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリテトラフルオロエチレン等の樹脂製透過膜が挙げられる。樹脂製透過膜は、必要に応じて、コラーゲン処理されていてもよい。コラーゲン処理により、細胞接着性が向上して良好な状態で脂肪組織由来幹細胞を培養することができる。樹脂製透過膜の厚みとしては、例えば１０μｍ以上３０μｍ以下であってよい。樹脂製透過膜は、樹脂膜に透過孔を設けることで形成できる。透過孔の大きさは、例えば０．４μｍ以上８μｍ以下であってよい。
【００２８】
第１容器及び第２容器を用いる受精卵の培養は、例えば、トランズウェルパーミアブルサポート（コーニング社製）を用いて行うことができる。
【００２９】
第１容器には、混合培地を添加してもよいし、受精卵用培地を添加してもよい。第１容器に受精卵用培地を添加した場合であっても、第２容器に幹細胞用培地を添加して通液可能な隔壁を介して接続することで第１容器内に幹細胞用培地が拡散して、第１容器内に混合培地が形成されることになる。また第２容器には幹細胞用培地を添加することが好ましい。これにより脂肪組織由来幹細胞をより良好な状態で培養することができる。
【００３０】
受精卵の培養条件は、一般に採用されている条件であってよい。例えば、ヒトの受精卵の場合、３７℃、５％ＣＯ２であってよい。また、ブタ、ウシ、ウマ等の場合は、例えば３８℃から３９℃、５％ＣＯ２であってよい。培養時間は、胚盤胞が形成されるまでであればよく、例えば、２日以上１０日以下であってよい。受精卵の培養数は１つの容器あたり、１個であってもよく、複数個であってもよい。また、脂肪組織由来幹細胞の播種数は、受精卵１個に対して、例えば１×１０３個以上１×１０６個以下であってよく、好ましくは１×１０３個以上１×１０５個以下、又は５×１０３個以上５×１０４個以下であってよい。
【００３１】
本発明の別態様は、幹細胞用培地及び受精卵用培地を含む混合培地中で、受精卵を培養することを含み、受精卵の培養を受精卵から離隔した脂肪組織由来幹細胞の培養とともに行う受精卵の胚盤胞への誘導方法、または分化誘導方法であってよい。また、別態様では、幹細胞用培地及び受精卵用培地を含む混合培地中で、受精卵を培養することを含み、受精卵の培養を受精卵から離隔した脂肪組織由来幹細胞の培養とともに行う胚盤胞の製造方法であってもよい。
【００３２】
不妊症の処置方法
不妊症の処置方法は、対象の不妊症を処置する方法であり、幹細胞用培地及び受精卵用培地を含む混合培地中で受精卵を培養し、受精卵の培養を受精卵から離隔した脂肪組織由来幹細胞の培養とともに行って受精卵を胚盤胞への分化誘導することと、分化誘導された胚盤胞を対象の子宮内に移植することと、を含んでいてよい。分化誘導された胚盤胞を移植することで、着床率が向上する。不妊症の処置方法の対象となる動物は、哺乳動物であればよく、哺乳動物にはヒトが含まれる。また対象は非ヒト哺乳動物であってもよい。
【００３３】
着床不全改善方法
着床不全改善方法は、対象の着床不全を改善する方法であり、幹細胞用培地及び受精卵用培地を含む混合培地中で受精卵を培養し、受精卵の培養を受精卵から離隔した脂肪組織由来幹細胞の培養とともに行って受精卵を胚盤胞への分化誘導することと、分化誘導された胚盤胞を対象の子宮内に移植することと、を含んでいてよい。分化誘導された胚盤胞を移植することで、着床率が向上する。着床不全改善方法の対象となる動物は、哺乳動物であればよく、哺乳動物にはヒトが含まれる。また対象は非ヒト哺乳動物であってもよい。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３５】
参考例１
脂肪組織由来間葉系幹細胞の調製
マウス（ＩＣＲ、雌、５週齢）の両肢の皮下から、マウス脂肪組織を採取した。採取した脂肪組織１ｇから２ｇに対して１０ｍｌの０．２％コラゲナーゼ溶液（ＧＩＢＣＯ  １７１００−０１７）を加えて脂肪組織を浸漬した状態で、はさみで細切りにした。細切りにした脂肪組織に０．２％コラゲナーゼ溶液２０ｍｌを加え、３７℃で１２０ｒｐｍ、１時間振とうした。その後、セルストレーナー（ＦＡＬＣＯＮ社製、ＲＥＦ  ３５２３６０）で濾過し、濾液を４００Ｇで５分間遠心処理した。上清を除去し、得られたペレットをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１０ｍｌに懸濁して４００Ｇで５分間遠心処理することを３回繰り返して細胞ペレットを得た。得られた細胞ペレットをマウスＡＤＲＣｓとした。マウスＡＤＲＣｓを、培地としてＭＥＭα／ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ社製）を用い、３７℃、５％ＣＯ２で５日間、培養を行い、３継代後に脂肪組織由来間葉系幹細胞（ＡＭＳＣ）を得た。なお、培地交換は３日ごとに行った。
【００３６】
参考例２
混合培地でのＡＭＳＣの培養
幹細胞用培地としてＭＥＭα／ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ社製；以下、ＭＥＭαと略記することがある）を、受精卵用培地としてＫＳＯＭ（ＴｒａｎｓＧｅｎｉｃ社製）を準備した。２種の培地を容積基準で混合し、培地として、ＭＥＭα１００％、ＭＥＭα８０％＋ＫＳＯＭ２０％、ＭＥＭα５０％＋ＫＳＯＭ５０％、ＭＥＭα２０％＋ＫＳＯＭ８０％、ＫＳＯＭ１００％を準備した。Ｃｈａｍｂｅｒ  Ｓｌｉｄｅ  （８ｗｅｌｌ  ｇｌａｓｓ  ｓｌｉｄｅ）を用いて、１ｗｅｌｌ中に１×１０４個のＡＭＳＣを播種し、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。培養開始から２４時間後、４８時間後、７２時間後、及び９６時間後のＡＭＳＣをＤＡＰＩで染色し、細胞数を計測した。結果を図１に示す。
【００３７】
図１に示されるように、受精卵用培地の混合割合が増すごとにＡＭＳＣの細胞増殖が抑制されるが、受精卵用培地の混合率が２０％程度までは細胞増殖に対する影響が少ない。
【００３８】
比較例１
参考例２と同様に混合培地を準備した。受精卵としてＩＣＲマウスの２細胞期胚を購入し、３ｃｍディッシュにて各混合培地中で、受精卵の培養を３７℃、５％ＣＯ２で行った。培養開始から９６時間後まで毎日観察し、４細胞期胚、８細胞期胚、桑実胚、初期胚盤胞、中期胚盤胞、及び後期胚盤胞までの到達率をそれぞれ算出した。結果を図２に示す。
【００３９】
図２に示されるように、幹細胞用培地の混合割合が増すごとに受精卵の分化が抑制された。
【００４０】
比較例２
１×１０６個のＡＭＳＣをＭＥＭα／ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）培地を添加した１０ｃｍディッシュに播種し、３７℃、５％ＣＯ２にて４８時間培養した。４８時間培養後の培養液を、０．２２μｍのフィルターを通し、培養上清とした。得られた培養上清とＫＳＯＭ（ＴｒａｎｓＧｅｎｉｃ）を５：５又は２：８の割合で混合して混合培地とした。購入したＩＣＲマウスの２細胞期胚の培養を、混合培地を添加した３ｃｍディッシュにて、３７℃、５％ＣＯ２で開始した。培養開始から９６時間後まで毎日観察し、４細胞期胚、８細胞期胚、桑実胚、初期胚盤胞、中期胚盤胞、後期胚盤胞までの到達率をそれぞれ算出した。結果を図３に示す。
【００４１】
図３に示されるように、ＡＭＳＣの培養上清を２０％添加することで、受精卵の分化がやや促進された。
【００４２】
実施例１
培地として、ＭＥＭα５０％＋ＫＳＯＭ５０％、ＭＥＭα２０％＋ＫＳＯＭ８０％、ＫＳＯＭ１００％を準備した。３ｃｍディッシュに培地を添加し、１×１０５個のＡＭＳＣと１０個のＩＣＲマウスの２細胞期胚とを、互いに接触しないように播種し、３７℃、５％ＣＯ２で同時に培養を開始した。培養開始から９６時間後まで毎日観察し、４細胞期胚、８細胞期胚、桑実胚、初期胚盤胞、中期胚盤胞、後期胚盤胞までの到達率をそれぞれ算出した。結果を図４に示す。
【００４３】
図４に示されるように、幹細胞用培地を２０％混合した混合培地中で、受精卵が効率よく分化した。
【００４４】
幹細胞用培地を２０％混合した混合培地中で培養したＡＭＳＣの細胞表面マーカーについて、Ｍｏｕｓｅ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｍｕｌｔｉ−Ｃｏｌｏｒ  Ｆｌｏｗ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＣＤ１０５、Ｓｃａ−１、ＣＤ２９及びＣＤ４５を染色し、フローサイトメトリーを用いて、細胞表面の分化マーカーの発現を確認した。結果を図５に示す。
【００４５】
図５に示されるように、混合培地で培養したＡＭＳＣにおける幹細胞分化マーカーの発現状態は、幹細胞用培地で培養したＡＭＳＣにおける発現状態と同様であった。
【００４６】
参考例１
通液可能な膜を介して接続された上下２層の培養容器として、トランズウェルパーミアブルサポート（コーニング社製；ディッシュ径３ｃｍ、孔径０．４μｍ）を用いた。上層の培地としてＭＥＭα／ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）を、下層の培地としてＭＥＭα／ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）またはＫＳＯＭ（ＴｒａｎｓＧｅｎｉｃ）を添加した。上層に１×１０５個のＡＭＳＣを播種し、３７℃、５％ＣＯ２で培養を開始した。培養開始から２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後のＡＭＳＣをＤＡＰＩで染色し、細胞数を計測した。結果を図６に示す。（Ａ）は下層に幹細胞用培地（ＭＥＭα）を用いた場合であり、（Ｂ）は下層に受精卵用培地（ＫＳＯＭ）を用いた場合である。
【００４７】
図６に示されるように、上下２層の培養容器を用いて、上層でＡＭＳＣを幹細胞用培地で培養する場合には、下層の培地が幹細胞用培地又は受精卵用培地のいずれでも、ＡＭＳＣの増殖はほぼ影響されない。
【００４８】
実施例２
トランズウェルパーミアブルサポート（コーニング社製；ディッシュ径３ｃｍ、孔径０．４μｍ）を用い、下層で培地として受精卵用培地（ＫＳＯＭ）を添加して１０個のＩＣＲマウスの２細胞期胚を３７℃、５％ＣＯ２で培養した。（Ａ）では上層に受精卵用培地（ＫＳＯＭ）を添加して、ＡＭＳＣは播種しなかった。（Ｂ）では上層に幹細胞用培地（ＭＥＭα）を添加して、ＡＭＳＣは播種しなかった。（Ｃ）では上層に幹細胞用培地（ＭＥＭα）を添加して、１×１０５個のＡＭＳＣを播種した。培養開始から９６時間後まで毎日観察し、４細胞期胚、８細胞期胚、桑実胚、初期胚盤胞、中期胚盤胞及び後期胚盤胞までの到達率をそれぞれ算出した。結果を図７に示す。
【００４９】
図７に示されるように、上層において、ＡＭＳＣを幹細胞用培地中で培養しつつ、下層において、受精卵を受精卵用培地中で培養することにより、受精卵が極めて効率的に分化する。
【００５０】
受精卵の分化における培養方法の影響について、（Ａ）受精卵用培地中での培養の場合、（Ｂ）ＡＭＳＣの培養上清を２０％添加した混合培地中での培養の場合（上清添加培養）、（Ｃ）幹細胞用培地を２０％添加した混合培地中、ＡＭＳＣと非接触の状態で同一容器中での共培養の場合（同一非接触共培養）、（Ｄ）上層でＡＭＳＣを幹細胞用培地中で培養し、下層で受精卵を混合培地中で培養した場合（階層培養）の４細胞期胚、８細胞期胚、桑実胚、初期胚盤胞、中期胚盤胞及び後期胚盤胞までの到達率（％）を表１及び図８に示す。
【００５１】
【表１】
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【００５２】
表１及び図８に示されるように、受精卵を混合培地中、ＡＭＳＣと非接触の状態で共培養することで、受精卵が効率的に分化する。
【要約】
【課題】受精卵から胚盤胞へ分化誘導する胚盤胞の調製方法を提供する。
【解決手段】幹細胞用培地及び受精卵用培地を含む混合培地中で、受精卵を培養することを含み、受精卵の培養を、受精卵から離隔した脂肪組織由来幹細胞の培養とともに行う胚盤胞の調製方法である。
【選択図】図８【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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