(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
超臨界流体及びモディファイアを含む移動相中に試料を注入してカラムに導入し、該カラムを通過する間に前記試料中の成分を分離する、超臨界流体クロマトグラフを用いた成分分離方法であって、
前記試料中の目的成分はアミノ基及び／又はアミド基を含むものであり、前記超臨界流体として二酸化炭素を用いるとともに、前記モディファイアはヘキサフルオロイソプロパノールを含む、超臨界流体クロマトグラフを用いた成分分離方法。
【請求項２】
前記試料中の目的成分はペプチド又はタンパク質である、請求項１に記載の超臨界流体クロマトグラフを用いた成分分離方法。
【請求項３】
前記モディファイアは有機溶媒としてメタノール又はエタノールを含む、請求項１に記載の超臨界流体クロマトグラフを用いた成分分離方法。
【請求項４】
前記モディファイアはさらにイソプロパノールを含む、請求項３に記載の超臨界流体クロマトグラフを用いた成分分離方法。
【請求項５】
前記モディファイアはさらに水を含む、請求項３に記載の超臨界流体クロマトグラフを用いた成分分離方法。
【請求項６】
前記モディファイアはさらに蟻酸を含む、請求項３に記載の超臨界流体クロマトグラフを用いた成分分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、超臨界流体クロマトグラフを用いて試料中の成分を分離する方法に関し、さらに詳しくは、試料中の高極性の成分を分離して分析したり或いは精製したりするのに好適な成分分離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
超臨界流体クロマトグラフ（Supercritical Fluid Chromatograph、以下、「ＳＦＣ」と称すことがある）は、臨界点（臨界温度、臨界圧力）を超える温度及び圧力を有する流体（超臨界流体）を主な移動相としたクロマトグラフであり、移動相の温度及び圧力を調整することによってその溶出力を制御することができるという特徴を有している。ＳＦＣでは、温度、圧力ともに臨界点が比較的低いこと、取り扱いが容易であること、廉価であることなどの理由により、超臨界流体として二酸化炭素が広く利用されている。超臨界流体として二酸化炭素を用いたＳＦＣは流体の粘性が低いため、移動相の流速を高め、従来の高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）に比べても短時間で分析することができるという利点を有する（特許文献１、非特許文献１等参照）。
【０００３】
超臨界状態である二酸化炭素はヘキサンと同程度の疎水性を有するが、多くの場合、二酸化炭素だけではカラムから目的成分を溶出させることができない。そのため、一般的には、モディファイアと呼ばれる有機溶媒を超臨界流体に添加することで移動相の極性を調整し、疎水性化合物だけでなく親水性化合物も含めた幅広い化合物の分析を行えるようにしている。モディファイアとしては一般に、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトニトリルなどの、二酸化炭素を混和する有機溶媒が用いられるが、極性の高い化合物を分析する際には、蟻酸や酢酸などの酸、蟻酸アンモニウムや酢酸アンモニウムなどの塩、ジエチルアミンなどの塩基を有機溶媒に加えたものがモディファイアとして使用される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】US2016/0202218A1
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】「Nexera UC  Supercritical Fluid Extraction/Chromatograph System」、Shimadzu Corporation、［online］、[2017年6月26日検索]、インターネット＜URL : http://www.shimadzu.com/an/hplc/nexera_uc/index.html＞
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
近年、液体クロマトグラフ質量分析装置（ＬＣ−ＭＳ）を利用したペプチドやタンパク質の分析が盛んに行われるようになっているが、分析の高速化や分離特性の向上などの観点から、ペプチドやタンパク質をＳＦＣで分析したいという強い要望がある。しかしながら、従来用いられている超臨界流体とモディファイアとを組み合わせた移動相では、良好に分離できる成分の極性や分子量に制約があり、ペプチドやタンパク質のような高極性で且つ高分子量の成分を良好に分離することは困難であった。
【０００７】
本発明は上記課題に鑑みて成されたものであり、その目的とするところは、ペプチドやタンパク質といった高極性、高分子量の成分を高い分離性能で以て分離することができる超臨界流体クロマトグラフを用いた成分分離方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために成された本発明は、超臨界流体及びモディファイアを含む移動相中に試料を注入してカラムに導入し、該カラムを通過する間に前記試料中の成分を分離する、超臨界流体クロマトグラフを用いた成分分離方法であって、
前記試料中の目的成分はアミノ基及び／又はアミド基を含むものであり、前記超臨界流体として二酸化炭素を用いるとともに、前記モディファイアはヘキサフルオロイソプロパノールを含むことを特徴としている。
【０００９】
ヘキサフルオロイソプロパノールは極性を有しており強い水素結合特性を示す。それによって、アミド基やアミノ基などの、水素結合受容体として作用する基を含む成分に対して高い溶解性を有する。一方で、ヘキサフルオロイソプロパノールは紫外波長領域において光学的に透明な物質であり、超臨界流体クロマトグラフと組み合わせて用いられる質量分析装置におけるエレクトロスプレーイオン源において目的成分のイオン化を抑制する作用も小さい。そのため、超臨界流体クロマトグラフにおいてヘキサフルオロイソプロパノールを移動相に添加しても、成分検出に対する悪影響は殆どない。
【００１０】
本発明者の実験的な検討によれば、二酸化炭素である超臨界流体にヘキサフルオロイソプロパノールを含むモディファイアを添加した移動相を用いることにより、ペプチドの濃度に依らずペプチドを高い分離性能で以て検出できることが確認できた。このように本発明に係る超臨界流体クロマトグラフを用いた成分分離方法によれば、従来は困難であった高極性で高分子量の成分を高い分離性能で以て分離することが可能である。
【００１１】
上述したようなヘキサフルオロイソプロパノールの特性から、本発明に係る超臨界流体クロマトグラフを用いた成分分離方法は、アミノ基及び／又はアミド基を含む成分の分離に有効であるということができる。具体的には、本発明に係る超臨界流体クロマトグラフを用いた成分分離方法は、試料中のペプチド又はタンパク質の分離に特に有効である。
【００１２】
また、本発明に係る超臨界流体クロマトグラフを用いた成分分離方法では、モディファイアとして、従来用いられている各種の有機溶媒にヘキサフルオロイソプロパノールを混和したものを用いることができる。
【００１３】
例えば、モディファイアは、有機溶媒としてメタノール又はエタノールを含むものとすることができる。また、モディファイアは、さらにイソプロパノールを含むものとすることができる。また、モディファイアは、メタノール又はエタノールに加えて水を含むものとすることができる。またモディファイアは、メタノール又はエタノールに加えて蟻酸を含むものとすることができる。
このように、ヘキサフルオロイソプロパノール以外の様々な有機溶媒を適宜混合することで、溶出力を調整することができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係る超臨界流体クロマトグラフを用いた成分分離方法によれば、 従来の超臨界流体クロマトグラフでは高い分離性能で分離することが困難であったペプチドやタンパク質などの高極性、高分子量の化合物を高い分離性能で分離することができる。それによって、試料中のそうした化合物を、高いスループットで精度良く同定したり定量したりすることができる。また、試料中のそうした化合物を効率良く且つ高い純度で精製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明に係る成分分離方法を実施する超臨界流体クロマトグラフの一実施例の要部の構成図。
【図２】モディファイアにヘキサフルオロイソプロパノールを添加した場合と添加しない場合とにおけるクロマトグラムの実測例を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明に係る成分分離方法の一実施形態について説明する。
図１は本発明に係る成分分離方法を実施する超臨界流体クロマトグラフ（ＳＦＣ）の一実施例の流路構成図である。
このＳＦＣは、液体ＣＯ2ボンベ１０、モディファイア容器１１、ＣＯ2ポンプ１２、送液ポンプ１３、オートサンプラ１４、カラムオーブン１５、カラム１６、検出器１７、及び、背圧レギュレータ１８、を備える。液体ＣＯ2ボンベ１０は超臨界流体としての液体ＣＯ2の供給源である。モディファイア容器１１は超臨界流体に添加される、後述する特徴的なモディファイアが貯留されている容器である。
【００１７】
このＳＦＣの基本的な動作は次のとおりである。背圧レギュレータ１８は、ＣＯ2ポンプ１２及び送液ポンプ１３とカラム１６入口との間の入口側流路２０内、カラム１６内、及びカラム１６出口と背圧レギュレータ１８との間の出口側流路２１内の移動相の圧力を、ＣＯ2の臨界圧力（７．４MPa）を超える圧力、例えば１０MPaに調整する。ＣＯ2ポンプ１２は液体ＣＯ2ボンベ１０から液体ＣＯ2を吸引して入口側流路２０へ送給する。一方、送液ポンプ１３はモディファイア容器１１からモディファイアを吸引して入口側流路２０へ送給する。入口側流路２０中で液体ＣＯ2とモディファイアとは混合され、移動相としてカラム１６に流される。入口側流路２０に設けられたオートサンプラ１４は所定のタイミングで移動相中に液体試料を注入する。
【００１８】
カラム１６が内装されたカラムオーブン１５は、移動相の主要物質であるＣＯ2の臨界温度（３１℃）を超える、例えば４０℃程度に調整されている。そのため、カラム１６内を通過する移動相は超臨界状態になる。移動相の流れに乗ってカラム１６内に導入された試料は、カラム１６の内壁に設けられている固定相との相互作用により成分毎に分離される。そして、成分毎に時間差を有してカラム１６から溶出し出口側流路２１に流れる。出口側流路２１に設けられている検出器１７は紫外可視分光検出器（ＵＶ検出器）等であり、カラム１６中で分離された移動中の成分を臨界状態のまま検出する。成分検出後の移動相は背圧レギュレータ１８を経て図示しない回収容器等に回収される。
【００１９】
なお、検出器１７としては、液体クロマトグラフにおいて用いられるＰＤＡ（Photo Diode Array）を用いた多波長検出器、旋光度検出器、円二色性検出器、蛍光検出器、屈折率検出器、及び蒸発光散乱検出器などの光学的検出器を用いてもよい。また、エレクトロスプレーイオン源などの大気圧イオン源を用いた質量分析装置を検出器１７として用いてもよい。
【００２０】
従来の一般的なＳＦＣでは、モディファイアとして、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトニトリルなどを主成分として、必要に応じて、蟻酸、酢酸、蟻酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、ジエチルアミンなどが適宜量添加されたものが利用される。それに対し本発明に係る成分分離方法では、試料成分としてペプチドやタンパク質などの高極性の生体高分子化合物を分離し分析する際に、ヘキサフルオロイソプロパノール（Hexafluoro-2-propanol）を加えたモディファイアが利用される。
【００２１】
ヘキサフルオロイソプロパノール（化学式：（ＣＦ3）2ＣＨＯＨ、ＣＡＳ番号：920-66-1）はフルオロアルコールの一種であり、高い極性、高い酸性度を示す。また、ヘキサフルオロイソプロパノールは、水、メタノール、ヘキサン、イソプロパノールなどの各種の溶媒に混和可能である。一般に、ヘキサフルオロイソプロパノールは、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリアミド、ポリビニルアルコールなどの樹脂の溶媒として使用されているが、高極性の高分子化合物であるペプチドやタンパク質も溶解させることができる。また、紫外波長領域において光学的に透明であるため、ＵＶ検出器等での検出に影響を与えない。また、エレクトロスプレーイオン源でのイオン化の抑制作用も小さいため、エレクトロスプレーイオン源を搭載した質量分析装置での検出にも影響を与えない。
【００２２】
ここで、モディファイアとしてヘキサフルオロイソプロパノールを添加した場合の効果を実測結果に基づいて説明する。
図２（ｂ）は、モディファイアとして、従来一般的である、メタノール、イソプロパノール、水、及び蟻酸の混合液を用い、ペプチドを含む試料をＳＦＣで測定することで得られたクロマトグラムである。図から分かるように、ピークのテーリングがかなり大きく、ピーク開始点から終了点までの幅が拡がってしまっている。また、ピーク波形形状も悪く、成分濃度が低い場合にはピークトップの位置の把握も困難である。このように分離性能は低いため定量性は低く、この検出信号に基づいてペプチドを分取・精製しても純度が低いものしか得られない。
【００２３】
これに対し、図２（ａ）は、メタノール、イソプロパノール、水、及び蟻酸の混合液にさらに適宜量のヘキサフルオロイソプロパノールを添加した混合液を用い、上記試料をＳＦＣで測定して得られたクロマトグラムである。図２（ｂ）と比較すれば明らかであるように、ピーク開始点から終了点までの幅は狭く、鋭い波形形状の良好なピークが得られている。これにより、高い定量性を得ることができる。また、この検出信号に基づいてペプチドを分取・精製したときに高い純度のものを得ることができる。
このように、上述したＳＦＣにおいてヘキサフルオロイソプロパノールをモディファイアに添加することで、ペプチドの分離性能を大幅に向上することができる。
【００２４】
また、ペプチドに関するヘキサフルオロイソプロパノールの有効性から、さらに分子量の大きなタンパク質や、ペプチド、タンパク質以外の、アミノ基やアミド基を含む高極性の成分の分離性能を高めるにも十分な効果があることは容易に想到し得る。
【００２５】
なお、上記実測例では、メタノール、イソプロパノール、水、及び蟻酸の混合液にヘキサフルオロイソプロパノールを添加していたが、ヘキサフルオロイソプロパノール以外の溶媒は必ずしもそれらが揃っている必要はなく、それらは適宜変更することができる。
【００２６】
また、上記実施例のＳＦＣにおいて、超臨界流体へのモディファイアの混合量は一定ではなく、試料注入時点からの時間経過に伴って変化させる、つまりはグラジエント溶離を行うようにしてもよい。
【００２７】
また、上記実施例は本発明の一例であるから、本発明の趣旨の範囲で適宜に変形、追加、修正を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは明らかである。
【符号の説明】
【００２８】
１０…液体ＣＯ2ボンベ
１１…モディファイア容器
１２…ＣＯ2ポンプ
１３…送液ポンプ
１４…オートサンプラ
１５…カラムオーブン
１６…カラム
１７…検出器
１８…背圧レギュレータ
【図１】
0006819800.tif 000002
【図２】
0006819800.tif 000003