(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養容器の灌流装置であって、
培地を供給するために用いられる少なくとも１つの流入開口と、
消費されていない培地を導出するために用いられる少なくとも１つの流出開口と、
培地を培養細胞に放出するために用いられる円形または円柱状の少なくとも１つの灌流領域と、
を備え、
前記灌流領域は、前記流入開口に供給ラインを介して接続されており、前記流出開口に排出ラインを介して接続されており、
前記灌流領域（２）は、前記細胞培養容器（３）内に装入可能である、
灌流装置において、
前記灌流領域（２）は、幾何学的な構造（７）を有し、前記幾何学的な構造（７）は、前記供給ライン（５）と前記排出ライン（６）とを、全体的に螺線形に形成される１つの通路（８）の形態で接続し、前記培地（４）は前記通路（８）を貫流可能であり、
前記幾何学的な構造（７）は、装入された状態で前記細胞培養容器（３）の底から離間されており、
前記通路（８）の一端が、前記灌流領域の中央で、前記供給ライン（５）または前記排出ライン（６）のうちの一方に接続され、
前記通路（８）の他端が、前記灌流領域の縁部で、前記供給ライン（５）または前記排出ライン（６）のうちの他方に接続されている、
ことを特徴とする、灌流装置。
【請求項２】
前記細胞培養容器はペトリ皿である、請求項１記載の灌流装置。
【請求項３】
前記灌流装置（１）は、前記細胞培養容器（３）用の蓋（１３）として形成されている、請求項１または２記載の灌流装置。
【請求項４】
前記灌流領域（２）の前記通路（８）および／または前記幾何学的な構造（７）は、装入された状態で前記細胞培養容器（３）の前記底に対して略平行に配置されている、請求項１から３までのいずれか１項記載の灌流装置。
【請求項５】
前記幾何学的な構造（７）は、装入された状態で前記細胞培養容器（３）の前記底に対して２５０μｍ未満の間隔を有している、請求項４記載の灌流装置。
【請求項６】
前記幾何学的な構造（７）は、装入された状態で前記細胞培養容器（３）の前記底に対して２０μｍ〜１００μｍの間隔を有している、請求項４記載の灌流装置。
【請求項７】
前記灌流領域（２）は、前記細胞培養容器（３）を密閉するために用いられるシール（１４）を有する、請求項３から６までのいずれか１項記載の灌流装置。
【請求項８】
前記灌流装置（１）は、カバープレート（９）を備え、前記灌流領域（２）は、前記カバープレート（９）から離間されて配置されている、請求項１から７までのいずれか１項記載の灌流装置。
【請求項９】
前記通路（８）は、通り抜け可能に形成されている、請求項１から８までのいずれか１項記載の灌流装置。
【請求項１０】
前記通路（８）は、下向きに開いて形成されている、請求項１から９までのいずれか１項記載の灌流装置。
【請求項１１】
前記幾何学的な構造（７）は、前記灌流領域（２）に配置されている土手として形成されている、請求項１から１０までのいずれか１項記載の灌流装置。
【請求項１２】
前記通路（８）は、前記土手間を延びている、請求項１１記載の灌流装置。
【請求項１３】
前記土手は、湾曲した側壁（１０）を有する、請求項１１または１２記載の灌流装置。
【請求項１４】
前記通路（８）は、２．５ｍｍ２〜２０ｍｍ２の横断面積を有するかつ／または前記土手は、０．５ｍｍ〜５ｍｍの高さを有する、請求項１２または１３記載の灌流装置。
【請求項１５】
前記通路（８）は、８ｍｍ２〜１６ｍｍ２の横断面積を有する、請求項１２または１３記載の灌流装置。
【請求項１６】
前記土手は、２ｍｍ〜２．５ｍｍの高さを有する、請求項１２または１３記載の灌流装置。
【請求項１７】
前記土手および／または前記通路（８）は、貫流する前記培地（４）のための流動偏向用の装置（１７）を有する、請求項１１から１６までのいずれか１項記載の灌流装置。
【請求項１８】
前記流入開口（１５）および／または前記流出開口（１６）は、ポンプに接続可能である、請求項１から１７までのいずれか１項記載の灌流装置。
【請求項１９】
培地（４）を供給するために用いられる第１の流入開口（１５ａ）および第２の流入開口（１５ｂ）と、
消費されていない培地を導出するために用いられる第１の流出開口（１６ａ）および第２の流出開口（１６ｂ）と、
を備え、
前記灌流領域（２）は、
前記第１の流入開口（１５ａ）に第１の供給ライン（５ａ）を介して接続されており、
前記第２の流入開口（１５ｂ）に第２の供給ライン（５ｂ）を介して接続されており、
前記第１の流出開口（１６ａ）に第１の排出ライン（６ａ）を介して接続されており、
前記第２の流出開口（１６ｂ）に第２の排出ライン（６ｂ）を介して接続されている、
請求項１から１８までのいずれか１項記載の灌流装置。
【請求項２０】
前記幾何学的な構造（７）は、前記第１の供給ライン（５ａ）を前記第１の排出ライン（６ａ）に、全体的に螺線形に形成される１つの第１の通路（８ａ）の形態で接続し、前記第２の供給ライン（５ｂ）を前記第２の排出ライン（６ｂ）に、全体的に螺線形に形成される１つの第２の通路（８ｂ）の形態で接続し、
前記培地（４）は、前記第１の通路（８ａ）および前記第２の通路（８ｂ）を貫流可能である、請求項１９記載の灌流装置。
【請求項２１】
前記培地（４）は、前記第１の通路（８ａ）および前記第２の通路（８ｂ）を逆向きに貫流可能である、請求項２０記載の灌流装置。
【請求項２２】
前記第１の通路（８ａ）および前記第２の通路（８ｂ）は、逆向きの螺線として形成されている、請求項２０または２１記載の灌流装置。
【請求項２３】
前記灌流装置（１）を前記細胞培養容器（３）から取り外すことを可能にする保持要素（１２）を備える、請求項１から２２までのいずれか１項記載の灌流装置。
【請求項２４】
細胞培養容器と、請求項１から２３までのいずれか１項記載の灌流装置（１）とを備え、前記灌流領域（２）は、前記細胞培養容器（３）内に装入可能であるセット。
【請求項２５】
前記細胞培養容器はペトリ皿である、請求項２４記載のセット。
【請求項２６】
前記細胞培養容器（３）は、細胞（１１）を培養するために用いられる複数のチャンバを有し、前記灌流装置（１）は、複数の灌流領域（２）を有し、前記灌流領域（２）は、チャンバのそれぞれに１つずつ装入可能である、請求項２４または２５記載のセット。
【請求項２７】
前記細胞培養容器（３）は、マルチウェルプレートの形態で、細胞（１１）を培養するために用いられる複数のチャンバを有する、請求項２６記載のセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、請求項１の上位概念部の特徴を備える、細胞培養容器、特にペトリ皿用の灌流装置(Perfusionsvorrichtung)に関する。
【０００２】
細胞または微生物の挙動を調査する１つの方法は、細胞培養容器（いわゆる培養皿）内で培養を行い、その後、場合によっては薬または他の試験物質と混合された培地の影響を観察することにある。細胞培養容器は、皿形の容器、例えばペトリ皿、少なくとも部分的にプレート形の容器、例えばマルチウェルプレート、または細胞または微生物の培養に使用されるその他の容器である。
【０００３】
細胞は、細胞培養容器内への播種後、増殖し始め、容器の成長表面全体を覆うまで成長する。その際、細胞は、容器ごと、静的培養（いわゆる「バッチ法」）の場合、体温で９５％の空気と５％の二酸化炭素とからなる水蒸気飽和雰囲気を一定に保つ特殊なインキュベータ内に静置される。培地により静的に覆われた細胞は、これにより、密には載置されていない容器蓋の隙間を介した受動拡散により酸素を得る。
【０００４】
その際、主な問題は、静的培養における培養時間全体にわたって連続的に変化する周囲条件である。栄養素は、新たに覆われた培地から細胞により吸収され、化学的に変化された形で「代謝」されて再び培地に放出される。その際、代謝の活発な細胞は、栄養素過多状態の最初の１２〜２４時間で、グルコースおよびアミノ酸を酸化分解するために極めて多くの酸素を必要とし、このとき、急速に、拡散に起因した酸素勾配が、ミリメートル厚で覆われた培地内に形成される。細胞は、しばしば低酸素性となり、その代謝をますます嫌気的解糖に適合させていく。その際、グルコースは、もはやＣＯ２ではなく、ほとんど乳酸としてのみ分解され、排出される。一般に、覆われた培地の限られた体積中に含まれる栄養素は、２４〜４８時間の培養時間後、消費し尽くされている一方、培地には、同時に細胞代謝の老廃生成物が蓄積する。これに伴う栄養素の不足に基づいて、細胞は、その代謝を落とし、当初は軽度に塩基性の培地は、通例、乳酸排出に基づいて軽度に酸性化し、例えばグルタミンの分解から生じるアンモニアの蓄積の結果、軽度に毒性化する。
【０００５】
付加的に細胞は、嫌気的解糖時、エネルギ面で衰弱され、培地中の酸素含有量は、再び飽和領域に回帰する。その際、突発的に、それどころか、栄養素が不足しているためにもはや呼吸されないあるいは必要とされない酸素の過多状態が生じることがある。このことは、絶えず新たに形成される酸素ラジカルに対してラジカルスカベンジャ分子がもうほとんど存在しないことで防御機構の衰えが強まるため、細胞を傷付けてしまう。培地は、消費されたら、吸い取られ、細胞は、改めて新鮮な培地で覆われる。過剰−飢餓−サイクルは、冒頭から開始する。
【０００６】
静的培養では、この周期的な培養不均一性に基づいて、高信頼性に再現可能な、一様な説得力をもつ実験は、ほとんど行われ得ない。例えば投薬の時点は非常に重要である。薬をフィーディングサイクルの開始期に供給すると、細胞は、エネルギ面で良好な状態にあり、極めて活発な代謝を示す。続いてますます悪化していく飢餓状態に代謝が切り換わると直ちに、細胞は、時としてまったく異なる反応を示す。要約すると、培養される細胞は、古典的なバッチ法では、培養時間のどの時点でも均一な培養条件にないことを確認することができる。これに応じて、薬効についての説得力のある実験結果をインビトロで得ることは、困難である。それにもかかわらず静的培養は、低コストかつ高サンプルスループットの簡単なシステムであるため、しばしば調査に用いられる。
【０００７】
静的方法の欠点を取り除くために、従来技術では、いわゆる灌流培養法が公知となっている。灌流培養法は、細胞を培養する古典的な方法に対して学術的に証明された多くの利点を有している。例えば体内にあるのと同様に、培養される細胞が培養時間全体にわたって一様な周囲条件に曝されているようにすることができる。従来の灌流装置は、内部で細胞が培養される、軽微に正圧に対して密な、特別な灌流チャンバを有している。チューブシステムおよびポンプを介して培地が培地リザーバから灌流チャンバに供給される。リザーバは、大抵の場合、体温とされ、インキュベータと同様に空気−ＣＯ２−混合物により通気される。こうして、灌流チャンバを通流する流量が制御可能であれば、細胞に連続的に新鮮な培地を必要に応じて供給することが考慮される。これにより、一定の周囲条件が、培養時間全体にわたって支配する。このことは、他方、試験物質の供与時点にほとんど関わりなく達成され得る、説得力のある再現可能な実験結果を保証する。
【０００８】
米国特許第８５０１４６２号明細書は、それぞれ１つの灌流領域を有する複数のインサートが設けられたマルチウェルプレートを備える灌流装置を示している。インサートの下面には、ガス透過性の膜が配置されており、各膜は、それぞれのインサートに面した側に複数の突出部を有し、突出部により膜は、インサートの下面から離間される。突出部間の中間スペースは、流路を形成し、流路を通して培地は、流動することができ、その際に膜を介して培養細胞に拡散する。本構成における欠点は、培地の大部分が直接的な経路で供給ラインから排出ラインへと流れてしまうことである。インサートの多角形の縁部でも、縁部領域における培地の異なる流速と、そこに生じる渦動とに基づいて、異なる栄養素供給度が生じてしまう。この理由から、栄養素の供給度に関してゾーン状に大きな差が生じ、この差は、培養細胞の均一な成長にとって不都合であり、それゆえ望ましいものではない。
【０００９】
米国特許出願公開第２０１３／００６８３１０号明細書は、マルチウェルプレートを備え、重層的に構成された灌流装置に関する。その際、分配層および勾配層内には、微小通路が配置されており、微小通路は、培養細胞の上の培地に濃度勾配を生じさせるために用いられる。培地は、多孔質の膜を介して放出される。勾配層および分配層の微小通路のために様々な幾何学的な配置が考えられ、微小通路は、ネットワークを介して接続通路に接続されている。これにより、フィールドに類似した濃度勾配が培地に生じる。特に偏向点には、培地の高い流動圧縮が起こり、部分領域にしか、一定の流れ密度は存在しない。これにより、この灌流装置によっても、不利な栄養素供給に基づいて、培養細胞のための均一な培養条件は提供され得ない。トレーサブルな結果を伴う一連の実験にとって、このことは、極めて不都合である。
【００１０】
従来技術において公知の灌流装置の欠点は、とりわけその複雑性である。この種の複雑な灌流装置の例は、国際公開第８２／０３２２７号、国際公開第０２／２４８６１号、国際公開第２０１５／０２７９９８号、米国特許第６６７０１７０号明細書、独国特許発明第４３０５４０５号明細書、独国特許出願公開第１９７４２１６３号明細書および独国特許出願公開第１０１１８９０５号明細書に示されている。このことは、結果として、灌流培養用のワンウェイシステムがほとんど入手不能であり、仮に入手可能であっても、細胞における特殊な個別調査しか有意義でなく、かつ可能でないほど小さな成長表面を培養細胞のために有しているワンウェイシステムしか入手可能でないことを示している。他方、マルチウェイシステムの場合、運転と、ここではとりわけ滅菌組み立てとは、複雑な装置に基づいて多くの手間を要し、このことは、一般に小さなサンプルスループットに至る。
【００１１】
国際公開第２００７／１２４４８１号および国際公開第２０１１／０１１３５０号は、微小通路を介して栄養物質または試験物質が個々の細胞へ案内されるマイクロ流体デバイスに関する。一部において、物質の流れは、専ら、閉じて形成される微小通路内に作用する毛管力により引き起こされる。その際、調査対象は、微小通路の内壁に組み込まれているか、または特にこのために配置されるホルダ内に組み込まれている。これらのデバイスでは、個々の対象でしか調査が行われ得ないため、マイクロ流体デバイスは、閉じて構成されており、内蔵された灌流装置を有しており、灌流装置は、交換不能である。特に、これらの装置によっては、動的細胞培養だけが調査され、静的細胞培養は調査され得ない。加えて、微小通路の構成により、調査対象は、マイクロ流体デバイスから一部洗い流されてしまい、これにより、細胞培養のための同じく均一な培養条件は、不可能となってしまう。
【００１２】
要約すると、従来技術において公知の灌流装置を用いた灌流培養法は、従来慣用のバッチ法よりも技術的に多くの手間を要し、ひいては高コストに行われねばならず、とりわけ、既存の装置の滅菌組み立てや、より時間を要する取り扱いは、古典的なインビトロモデルに対してそれ自体は生理学的により有意義なこの代案の、比較的低い認容度に繋がっている。
【００１３】
これにより本発明の課題は、灌流培養法に用いられる公知の装置の欠点を回避する灌流装置を提供することである。さらに、静的培養用の既存の細胞培養容器を簡単に、静的培養を灌流培養に変換して灌流培養法により培養を行うことが可能な装置へと変換する可能性が提供されることが望ましい。その際、細胞培養に均一な培養条件が提供されることが望ましく、灌流装置は、細胞培養の細胞が破壊されてしまうことなく、細胞培養容器内に装入可能であることが望ましい。
【００１４】
本発明に係る灌流装置により、静的細胞培養（いわゆる「ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ」、「ｓｔａｐｌｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｉｓｈｅｓ」または「ｓｔａｐｌｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｌａｔｅｓ」）は、最短時間で灌流培養（いわゆる「ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ」）に変換あるいは拡張され得る。静的細胞培養への回帰も、極めて簡単に可能である。この目的のために、本発明に係る灌流装置は、灌流領域を備え、灌流領域は、供給ラインを介して少なくとも１つの流入開口に、そして排出ラインを介して少なくとも１つの流出開口に接続されている。灌流装置が複数の流入開口および／または複数の流出開口を備えている場合、複数の流入開口および／または複数の流出開口を灌流領域に接続するために用いられる複数の供給ラインおよび排出ラインが設けられていてもよい。
【００１５】
少なくとも１つの流入開口は、調査したい培養細胞のために培地を供給するために用いられ、少なくとも１つの流出開口を介して、消費されていない培地および場合によっては培養細胞の老廃物は、導出される。
【００１６】
灌流装置は、灌流領域を備え、灌流領域を介して培地は、調査したい培養細胞に放出され、培養細胞は、細胞培養容器内に配置されており、細胞培養容器内には、灌流領域が装入可能である。その際、本発明の意味での細胞培養容器とは、従来慣用の、従来技術において公知の皿形の容器、例えばペトリ皿、および少なくとも一部プレート形の容器、例えばマルチウェルプレート、ならびに微生物の培養および細胞培養に使用されるその他の容器、特に取り外し可能な蓋を有する細胞培養容器と解すべきである。
【００１７】
その際、静的細胞培養にとって概して一般的であるように、細胞をまずは細胞培養容器内に播種し、培地により覆うことができる。細胞が細胞培養容器の皿底またはプレート底に付着したら直ちに、静的培養を灌流培養へと変換することができる。灌流培養では、本発明に係る灌流装置の灌流領域が、細胞培養容器内に装入される。
【００１８】
流入開口は、培地リザーバに接続されてもよい。培地は、供給ラインを介して灌流領域に供給され、灌流領域を介して細胞培養容器内の培養細胞に提供される。複数の流入開口がある場合は、培地は、複数の供給ラインを介して灌流領域に供給され得る。複数の供給ラインが灌流領域内の様々な箇所で終端していれば、供給ラインの分布に応じて、培地の特に均一な放出が達成され得る。流入開口が複数あれば、一方の流入開口を介して培地を供給する一方、他方の流入開口を介して薬または他の試験物質と混合された培地を供給することも可能である。これにより特に簡単に実験を行うことができる。
【００１９】
灌流領域は、幾何学的な構造を有し、幾何学的な構造を介して培地は、培養細胞に提供される。灌流領域が装入された状態では、幾何学的な構造は、培養細胞に面している。幾何学的な構造は、供給ラインと排出ラインとを接続し、培地により貫流可能な通路を形成している。その際、幾何学的な構造は、形成される通路が灌流領域の大部分をカバーするように構成されていることができる。これにより、一方では、培地により貫流される大面積の領域を提供することができる。これにより、細胞培養容器内の培養細胞にも、培地を有する大面積の領域が提供されている。他方では、通路は、或る特定の流動速度での培地の流動を引き起こし、その結果、静的細胞培養法の欠点が生じない代わりに、灌流培養法の利点が生じる。
【００２０】
通路は、溝として形成されていてもよい。幾何学的な構造に応じて、溝深さおよび溝幅は変化してもよい。しかし、溝深さおよび／または溝幅は、少なくとも部分的または全体的に一定であってもよい。幾何学的な構造が、装入された状態で細胞培養容器の底から離間されていることにより、灌流装置は、培養細胞に干渉したり、それどころか培養細胞を破壊したりすることなく、使用され得る。これにより静的細胞培養は、細胞に悪影響を及ぼすことなく、灌流培養に変換され得る。その際、灌流領域が装入された状態での、幾何学的な構造の最も外側の領域と、細胞培養容器の底との間隔は、通路あるいは幾何学的な構造と、細胞培養容器の底との間隔に相当する。
【００２１】
本発明により、従来使用される蓋の代わりに本発明に係る灌流装置を使用し、本発明に係る灌流装置の灌流領域を細胞培養容器内に装入することにより、従来慣用の細胞培養法に使用されるペトリ皿を（しかし、例えばマルチウェルプレート等のその他の細胞培養容器も）、灌流法に使用することができる。これにより、細胞培養容器の古典的なフォーマットは、維持することができる。灌流装置の取り外しにより、システムは、灌流培養から再び従来慣用の静的培養に変換可能である。本発明に係る灌流装置は、最も簡単に取り扱い可能であり、これにより運転される灌流培養法に関して、バッチ法に対する時間的な欠点は生じない。
【００２２】
本発明の別の有利な構成は、従属請求項に規定されている。
【００２３】
有利な一実施の形態において、灌流装置は、細胞培養容器用の蓋として形成されている。この場合、通常の蓋、例えば通常のペトリ皿蓋またはマルチウェルプレートの通常のカバーは、除去され、本発明に係る灌流装置に置換され得る。その際、灌流装置全体は、簡単に交換可能な蓋内に内蔵されていることができる。これにより、静的細胞培養から灌流培養への変換は、簡単に細胞培養容器の蓋を交換することにより可能である。好ましくは、さらに灌流装置は、灌流装置を細胞培養容器から取り外すことを可能にする保持要素を備えている。これにより、細胞培養容器の蓋の交換は、ただ一度の操作で可能である。
【００２４】
好ましくは、灌流領域の通路および／または幾何学的な構造は、装入された状態で細胞培養容器の底に対して略平行に配置されている。これにより、通路を通して貫流する培地が、培養細胞に対して略一定の間隔を有しており、ひいては培養細胞のために均一な周囲条件が提供されていることが達成され得る。その際、一実施の形態において、幾何学的な構造は、装入された状態で細胞培養容器の底に対して２５０μｍ未満の間隔を有しており、好ましいのは、２０μｍ〜１００μｍの間隔である。
【００２５】
別の一実施の形態において、灌流領域は、細胞培養容器を密閉するために用いられるシールを有している。例えばシールは、灌流領域の縁部に配置されており、装入された状態で細胞培養容器を封止、例えばペトリ皿の周面において封止する。これにより、簡単な手段で、従来慣用の複雑な灌流チャンバと同様に正圧に対して密な状況を実現することができる。
【００２６】
一実施の形態において、灌流装置は、カバープレートを備え、カバープレートには、取り外しに用いられる保持要素が配置されていてもよい。灌流領域は、カバープレートから離間されて配置されていてもよい。灌流領域自体がプレート形である場合、灌流領域とカバープレートとは平行に配置されているようにしてもよい。離間により、灌流領域は、培養細胞のための成長表面が容器の上側の縁部に対してより大きな間隔を有している細胞培養容器でも使用可能である。さらに、この種の灌流領域の場合、細胞培養容器による密閉が特に簡単に実現可能である。
【００２７】
灌流領域自体は、少なくとも部分的にまたは全体的にも円形または円柱状に形成されていることができる。この種の灌流領域は、円柱形の周面を有する円形のペトリ皿内に装入されるか、または例えば細胞培養用の円柱形のチャンバを有するマルチウェルプレート内に装入される。しかし、別の形状を有する細胞培養容器、例えば直方体形の容器の場合は、灌流領域が、細胞培養容器に適合された形状を有し、例えば長方形であってもよい。
【００２８】
好ましくは、幾何学的な構造により形成される通路は、通り抜け可能に形成されており、例えば、供給ラインを排出ラインに接続する通り抜け可能な溝として形成されている。その際、供給ラインの、灌流領域内に配置される端部、および／または排出ラインの、灌流領域内に配置される端部は、通路に直接開口しているようにしてもよい。通り抜け可能な通路の場合、培地の完全な循環が簡単に実現可能である。
【００２９】
通路は、少なくとも部分的に螺線形である。一実施の形態では、通路全体が螺線形に形成されている。これにより、灌流装置の大きな領域がカバーされることができ、一様な栄養素供給、ひいては均一な培養条件が実現される。供給ラインは、この螺線形の部分の一方の端部に開口していることができるのに対し、排出ラインは、この螺線形の部分の他方の端部に開口している。特に円形の灌流領域の場合、螺線形の通路により灌流領域の表面の大部分をカバーすることができる。細胞培養容器内の培養細胞の成長表面が、実質的に灌流領域の面積に相当していると、これにより、成長表面の大きな領域が、通路を通して貫流する培地によりカバーされる。通路は、全体的に螺線形に形成されているようにしてもよい。しかし、通路の或る特定の部分だけが螺線形に形成されていることも可能である。
【００３０】
好ましい一実施の形態において、幾何学的な構造は、灌流領域に配置されている土手として形成されている。この場合、通路は、土手間を延びている、あるいは土手間に生じる空間領域として延びていることができる。その際、灌流領域が装入された状態での、土手の最も外側の領域と、細胞培養容器の底との間隔は、細胞培養容器の底との間隔に相当する。
【００３１】
好ましい一実施の形態において、土手は、湾曲した側壁を有している。その際、土手の側壁同士は、フラットな結合領域を介して結合されていてもよいし、またはしかし、程度の差こそあれシャープな１つのエッジに合流してもよい。シャープなエッジなしの湾曲した移行も可能である。湾曲した側壁により、特に静的細胞培養法の場合に問題となる酸素勾配は、回避され得る。
【００３２】
通路は、土手として成形される幾何学的な構造間の溝として形成されていてもよい。土手は、通路の内壁を形成している。その際、側壁が湾曲している場合は、横断面で見て湾曲した通路、例えば半円形の通路が生じ得る。しかし、別の幾何学形状、例えば部分的に楕円または他のオーバルの通路も可能である。特に、変化する曲率が与えられていてもよい。その最も外側の領域において、土手は、同じく湾曲して、例えば外方に反って形成されていてもよく、その結果、２つの溝間の移行は、勾配形成を回避すべく、シャープなエッジを有しない。
【００３３】
好ましい一実施の形態において、通路は、下向きに開いて形成されている。これにより培地は、直接かつ障害なく培養細胞に達することができ、これにより、他方、勾配形成は回避され得る。
【００３４】
本発明の一実施の形態において、通路の横断面積は、２．５ｍｍ２〜２０ｍｍ２、好ましくは８ｍｍ２〜１６ｍｍ２である。幾何学的な構造の高さあるいは土手の高さは、０．５ｍｍ〜５ｍｍ、好ましくは２ｍｍ〜２．５ｍｍである。その際、幾何学的な構造の高さあるいは土手の高さとは、通路の深さと解すべきである。これは、灌流装置が装入された状態で細胞培養容器の底に対して垂直に、土手の最も外側の点から溝の最も深い点までを測定した寸法である。
【００３５】
幾何学的な構造により形成される通路は、培地のための任意の流動速度を実現する。その際、通路は、１０ｍｌ／ｍｉｎまでの培地の流れを可能にするように形成されていることができ、細胞に干渉するせん断力を回避するには、０．２ｍｌ／ｈ〜１ｍｌ／ｈの培地の流れが、好ましい。通路は、勾配のゾーン化なしの、成長表面全体にわたる均一な灌流を可能にする。このことは、特に湾曲した通路形状の場合に生じる。
【００３６】
幾何学的な構造は、培地が溝間で拡散するように形成されていてもよい。これによりシステム内の増圧は回避され得る一方、マイクロサーキュレーションおよび培地の循環は、促進される。
【００３７】
同じ目的で土手および／または通路は、貫流する培地のための流動偏向に用いられる装置を有していてもよい。流動偏向用の装置は、小さなバリアまたはバッフルであってもよい。流動偏向用の装置は、同じくマイクロサーキュレーションと、通路内での培地の循環を改善する。さらに未消費の培地の溢流は、最適化され、その結果、培養される細胞のための、改善されたガスおよび栄養素の供給度が生じる。
【００３８】
流入開口および／または流出開口は、ポンプに接続されることができ、ポンプにより培地の流動が実現され、新鮮な培地が供給されるあるいは消費された培地が導出される。ここでは、例えば灌流ポンプ、ペリスタルティックポンプ、シリンジポンプ等が可能である。
【００３９】
別の一実施の形態において、灌流装置は、培地を供給するために用いられる第１および第２の流入開口と、まだ消費されていない培地を導出するために用いられる第１および第２の流出開口とを備えている。その際、例えば第１の流入開口内には、培地が供給され得る一方、第２の流入開口内には、薬または他の試験物質が供給され得る。しかし、第１の流入開口でも、第２の流入開口でも、培地のみまたは既に薬あるいは試験物質と混合された培地が供給されることも可能である。その際、灌流領域は、第１の流入開口に第１の供給ラインを介して接続され、第２の流入開口に第２の供給ラインを介して接続されている。しかし、第１および第２の流入開口が同じ供給ラインに開口することも可能である。灌流領域は、第１の流出開口に第１の排出ラインを介して接続され、第２の流出開口に第２の排出ラインを介して接続されている。しかし、第１の流出開口も、第２の流出開口も、１つの排出ラインに開口することも可能である。さらに、原則、２つより多くの流入開口および２つより多くの流出開口を設けることも可能である。さらに流入開口の数は、流出開口の数と一致している必要はない。
【００４０】
複数の流入開口が設けられていることにより、例えば供給ラインが灌流領域において相応に分配されていることで、培地の供給をさらに均一化することが可能である。さらに複数の流入開口により、個々の流入開口を介してそれぞれ異なる栄養素またはそれぞれ異なる薬あるいは他の試験物質が供給され、これらがその後相応の供給ラインを介して灌流領域に導かれ、そこで培養細胞に提供されることで、ゾーン状の調査が行われ得る。相応のゾーン内では、而して培養細胞のそれぞれ異なる反応が生じる。
【００４１】
少なくとも２つの流入開口と、少なくとも２つの流出開口とがある場合、好ましくは、幾何学的な構造は、第１の供給ラインを第１の排出ラインに第１の通路の形態で接続し、第２の供給ラインを第２の排出ラインに第２の通路の形態で接続する。その際、好ましくは、第１の通路および第２の通路は、培地により逆向きに貫流可能である。逆向きの流動により、培地の循環とマイクロサーキュレーションとはさらに改善される。
【００４２】
灌流領域の大面積の領域をカバーすることができるように、第１および第２の、少なくとも部分的に螺線形に形成される通路を、少なくとも全体的に螺線形に形成してもよく、この場合、逆向きの螺線が好ましい。
【００４３】
さらに本発明は、上述の灌流装置と、細胞培養容器、特にペトリ皿とを備えるセットに関する。
【００４４】
細胞を培養するために用いられる複数のチャンバを有する細胞培養容器、特にマルチウェルプレートの形態の細胞培養容器の場合、灌流装置が、複数の灌流領域を備え、灌流領域が、チャンバのそれぞれに１つずつ装入可能であるようにしてもよい。
【００４５】
本発明のさらなる詳細および利点については、図面を参照して行う図面の説明を基に以下に詳しく説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】従来技術による静的細胞培養用の装置の概略図である。
【図２】図２ａ〜２ｃは、本発明に係る灌流装置の斜視図、側面図および下から見た平面図である。
【図３】図３ａおよび３ｂは、本発明に係る灌流装置の２つの横断面図である。
【図４】図４ａ〜４ｇは、本発明に係る灌流装置の別の一実施の形態の斜視図、２つの側面図、下から見た平面図、上から見た平面図、２つの横断面図である。
【図５】図５ａ〜５ｇは、本発明に係る灌流装置の別の一実施の形態の斜視図、２つの側面図、下から見た平面図、上から見た平面図、２つの横断面図である。
【図６】図６ａ〜６ｈは、本発明に係る灌流装置の別の一実施の形態の斜視図、２つの側面図、下から見た平面図、上から見た平面図、３つの横断面図である。
【図７】図７ａ〜７ｃは、培地のための流動偏向用の装置の概略図である。
【図８】図８ａおよび８ｂは、２つの本発明に係るセットの概略図である。
【００４７】
図１は、静的細胞培養用の装置を示しており、細胞１１は、ペトリ皿として構成された細胞培養容器３の底に配置され、培地４で覆われている。細胞培養容器３は、蓋１３により閉鎖されている。
【００４８】
この蓋１３を本発明に係る灌流装置１に置換することができ、これにより、内部で細胞１１が既に培養されている既存の細胞培養容器３を灌流培養法に使用することが可能である。
【００４９】
図２ａの斜視図には、本発明に係る灌流装置１を示してある。灌流装置１は、カバープレート９と、カバープレート９から離間した灌流領域２とを有している。灌流領域２も、カバープレート９も、円形に形成されている。灌流領域２は、例えば円形のペトリ皿の形態の細胞培養容器３内に装入され得る。さらには流入開口１５および流出開口１６が示されており、流入開口１５を介して培地４を供給することができ、流出開口１６を介して、消費されていない培地あるいは細胞１１の老廃物を導出することができる。
【００５０】
図２ｂは、灌流装置１を下から見た平面図を示している。円形の灌流領域２の中央には、供給ライン５が示されており、供給ライン５を介して灌流領域２は、流入開口１５に接続されている。供給ライン５は、螺線形の通路８に開口している。通路８は、螺線形の土手の形態の幾何学的な構造７により形成される。通路８の螺線形状により、灌流領域２の大きな領域がカバーされ、培地４により貫流され得る。灌流領域２は、灌流領域２に配置される幾何学的な構造７とともに灌流渦巻きをなし、通路８は、渦巻きの溝により形成される。
【００５１】
本実施の形態において、供給ライン５および排出ライン６の少なくとも一部は、管接続部として形成されており、管は、灌流領域２をカバープレート９から離間させることを実現する。
【００５２】
図２ｃは、本発明に係る灌流装置１の側面図を示しており、この側面図には、カバープレート９と、同じくプレート形の灌流領域２との間の間隔、および灌流領域２に配置される幾何学的な構造７が、良好に看取可能である。さらに流入開口１５が示されている。
【００５３】
本発明に係る灌流装置１は、滅菌ワンウェイシステムとして設計されていてもよく、例えば射出成形法で製造され得る。材料としては、好ましくはプラスチック、例えばポリスチレン、ＰＥプラスチック、ＰＰプラスチック、ＰＥＴプラスチック、ＰＴＦＥプラスチック等が考えられる。
【００５４】
灌流領域２が細胞培養容器３内に装入された後、灌流培養法を行うべく、灌流法のために従来技術においてそれ自体は公知の機器類が接続され得る。流入開口１５または流出開口１６は、ポンプ、好ましくはマルチチャンネル灌流ポンプに接続され得る。このためにチューブ、好ましくはガス不透過性のチューブ、例えばネオプレン（Ｎｅｏｐｒｅｎ）と、接続アダプタ、好ましくは螺合可能なワンウェイルアーコネクタとが使用され得る。培地リザーバ、例えば水浴またはインキュベータは、細胞培養に培地４を供給するために用いられ、培地４は、場合によっては付加的に通気される。
【００５５】
図３ａは、図２ｂに示す切断線ＥＥに沿った灌流装置１の横断面図を示している。看取可能であるように、土手として形成される幾何学的な構造７は、湾曲した側壁１０を有しているので、通路８は、半円形の横断面を有している。さらに供給ライン５および排出ライン６が看取可能であり、供給ライン５は、流入開口１５を灌流領域２に接続し、その際、螺線形の通路８に開口し、排出ライン６は、螺線形の通路８の外側の縁部に配置されており、流出開口１６を灌流領域２に接続している。
【００５６】
図３ｂは、図２ｃに示す切断線ＣＣに沿った横断面図を示している。再度、土手として形成される幾何学的な構造７の湾曲した側壁１０により形成される通路８の半円形の横断面が看取可能である。管接続部として形成される供給ライン５が看取可能であり、供給ライン５は、流入開口１５を灌流領域２に接続している。
【００５７】
代替的には、流入開口１５と流出開口１６とを逆にしてもよい。その結果、新鮮な培地４は、螺線形の通路８の外側の縁部において供給される。
【００５８】
図４ａないし４ｆには、本発明に係る灌流装置の別の一実施の形態を示してある。本実施の形態は、図２ａないし２ｄならびに３ａおよび３ｂに示す灌流装置１とは、主として、カバープレート９が保持要素１２を有している点で相違している。保持要素１２により灌流装置１を灌流領域２とともに一度の操作で細胞培養容器３内に装入することができる。
【００５９】
図４ｃおよび図４ｅに示す側面図には、シール１４が示されている。シール１４は、灌流領域２の縁部を取り巻くように配置されており、円形の細胞培養容器３、例えばペトリ皿を密閉するために用いられる。図４ｂは、図２ｂに示す図示に実質的に相当する灌流装置１の本実施の形態を下から見た平面図を示している。図４ｄは、上から見た平面図を示しており、図４ｄには、保持要素１２が看取可能である。
【００６０】
図４ｆは、図４ｂに示す切断線ＣＣに沿った横断面図を示している。本実施の形態では通路形に形成される供給ライン５と、通路形に形成される排出ライン６とが看取可能であり、供給ライン５および排出ライン６により、流入開口１５および流出開口１６は、灌流領域２に接続されている。
【００６１】
図４ｇは、図４ｃに示す切断線ＡＡに沿った横断面図を示している。図４ｇには、再度、供給ライン５と、土手として形成される幾何学的な構造７の湾曲した側壁１０により形成される通路８の半円形の横断面とが看取可能である。
【００６２】
本発明に係る灌流装置１の、図５ａないし５ｇに示す実施の形態は、図４ａないし４ｇに示す実施の形態とは、主として、流入開口１５も、流出開口１６も、カバープレート９の上面に配置され、側面には配置されていない点でのみ相違している。
【００６３】
図５ｂに示す切断線ＣＣに沿った図５ｆに示す横断面図に示してあるように、流入開口１５および流出開口１６のこの配置は、供給ライン５および排出ライン６が、それほど複雑でなく、本実施の形態では通路形の短い区間で実現され得るという利点に結び付く。このことは、図５ｃに示す切断線ＡＡに沿った横断面を示している図５ｇの横断面図にも示されている。本図には、供給ライン５が看取可能であり、供給ライン５は、流入開口１５に直接移行している。流入開口１５も、流出開口１６も、供給ライン５および排出ライン６が灌流領域２に開口しているところのすぐ上に配置されている。
【００６４】
図６ａないし６ｈには、本発明に係る灌流装置１の別の一実施の形態を示してある。やはり灌流装置１は、円形のカバープレート９を備え、カバープレート９は、同じく円形の灌流領域２を細胞培養容器３内に簡単に装入するための保持要素１２を有している。灌流領域２は、シール１４により取り巻かれており、シール１４は、細胞培養容器３を密閉するために用いられる。
【００６５】
この場合、灌流装置１は、カバープレート９の中央に配置されている第１の流入開口１５ａを備えている。カバープレート９の縁部には、第２の流入開口１５ｂが配置されている。第１の流入開口１５ａおよび第２の流入開口１５ｂは、第１の供給ライン５ａおよび第２の供給ライン５ｂを介して灌流領域２に接続されている。第１の供給ライン５ａおよび第２の供給ライン５ｂは、図６ｂに示す切断線ＢＢに沿った横断面を示す図６ｆに示す横断面図に特に良好に示されている。第１の流入開口１５ａおよび第２の流入開口１５ｂは、カバープレート９の上面のすぐ上に配置されているので、第１の供給ライン５ａおよび第２の供給ライン５ｂは、短く保たれていることができる。
【００６６】
第１の流出開口１６ａは、カバープレートの縁部に配置されている一方、第２の流出開口１６ｂは、中央において第１の流入開口１５ａの近傍に配置されている。第１の流出開口１６ａおよび第２の流出開口１６ｂは、第１の排出ライン６ａおよび第２の排出ライン６ｂを介して灌流領域２に接続されている。このことは、図６ｂに示す切断線ＡＡに沿った横断面を示す図６ｇの横断面図に良好に看取可能である。やはり、第１の流出開口１６ａおよび第２の流出開口１６ｂは、カバープレート９の上面のすぐ上に配置されているので、第１の排出ライン６ａおよび第２の排出ライン６ｂは、短く保たれていることができる。
【００６７】
図６ｂに示す下から見た平面図に看取可能であるように、第１の供給ライン５ａは、第１の通路８ａに開口し、第１の通路８ａには、第１の排出ライン６ａも開口している。第２の供給ライン５ｂも、第２の排出ライン６ｂも、第２の通路８ｂに開口している。第１の通路８ａも、第２の通路８ｂも、螺線形に形成されている。第１の通路８ａおよび第２の通路８ｂは、螺線形の土手の中間スペースにより形成され、螺線形の土手は、灌流領域２の幾何学的な構造７をなしている。
【００６８】
概して、培地４および／または試験物質もしくは薬は、供給ライン５において通路８に流入し、通路８を排出ライン６に向かって貫流し、排出ライン６において、消費されていない培地４は、場合によっては細胞１１の老廃生成物とともに流出する。
【００６９】
先のケースでは、培地４は、第１の供給ライン５ａにおいて第１の通路８ａに流入し、第１の通路８ａを第１の排出ライン６ａに向かって貫流し、第１の排出ライン６ａにおいて、第１の通路８ａから流出する。培地４および／または試験物質もしくは薬は、第２の供給ライン５ｂにおいて第２の通路８ｂに流入し、第２の通路８ｂを第２の排出ライン６ｂに向かって貫流し、第２の排出ライン６ｂにおいて、消費されていない培地は、場合によっては細胞１１の老廃生成物とともに灌流領域２から流出する。本実施の形態において、第１の供給ライン５ａは、中央に配置されている一方、第２の供給ライン５ｂは、外側の縁部に配置されているので、第１の通路８ａおよび第２の通路８ｂは、培地４により逆向きに貫流される。
【００７０】
例えば通路８ａおよび８ｂに沿って、全体として、供給される培地４の２０％が消費される、すなわち、供給される新鮮な培地４の８０％が流出開口において再び流出する場合、逆向きの貫流に基づいて、平均して約９０％の新鮮な培地４を細胞１１に提供することが可能である。これにより、細胞１１のために極めて均一な周囲条件が支配し、このことは、例えば或る特定の薬または試験物質を供給しながら細胞１１の挙動を調査するために極めて有利であることが判明した。螺線形の第１の通路８ａと、螺線形の第２の通路８ｂとが逆向きであることは、特に良好に図６ｂに看取可能である。
【００７１】
図６ｈは、図６ｃに示す切断線ＣＣに沿った横断面図を示している。
【００７２】
図７ａは、本発明に係る灌流装置１の別の一実施の形態の平面図を示している。この灌流装置１は、螺線形の土手として形成される幾何学的な構造７を備え、幾何学的な構造７の中間スペースは、同じく螺線形の通路８を形成しており、螺線形の通路８は、培地４により貫流可能であり、培地４は、通路８に開口する供給ライン５において流入し、同じく通路８に開口する排出ライン６において流出する。土手の両側には、バッフルの形態の流動偏向用の装置１７が配置されており、流動偏向用の装置１７は、マイクロサーキュレーションと、貫流する培地４のより良好な循環とをもたらす。
【００７３】
図７ｂは、土手の側壁１０内に配置されていて、貫流する培地４のマイクロサーキュレーションを高める流動偏向用の装置１７が配置されている概略横断面図を示している。
【００７４】
図７ｃは、図７ａに示す切断線ＥＥに沿った横断面図を示しており、本図には、同じく流動偏向用の装置１７が看取可能であり、流動偏向用の装置１７は、土手として形成される幾何学的な構造７の側壁１０に設けられたバッフルとして配置されている。
【００７５】
図８ａは、マルチウェルプレートとして形成される細胞培養容器３を備え、細胞培養容器３は、破線で示す多数のチャンバ形の凹部１８を有し、凹部１８の底に培養細胞１１が配置される本発明に係るセットの斜視図を示している。灌流装置１は、マルチウェルプレート用の蓋として用いることができる。灌流装置１は、複数の灌流領域２を備え、灌流領域２は、チャンバ形の凹部１８のそれぞれに１つずつ装入される。灌流装置１は、複数の保持要素１２をさらに備え、保持要素１２は、灌流領域２のそれぞれに割り当てられている。さらに灌流領域２のそれぞれには、流入開口１５および流出開口１６が１つずつ割り当てられている。流入開口１５および流出開口１６は、供給ライン５および排出ライン６を介してそれぞれの灌流領域２に接続されているので、個々のチャンバ形の凹部１８には、それぞれ培地４が供給され得る。チャンバ形の凹部１８毎に流入開口１５および流出開口１６が１つずつ割り当てられているので、個々のチャンバ形の凹部１８には、それぞれ異なる培地を供給することができ、その結果、同時に複数のそれぞれ異なる実験を行うことができる。
【００７６】
図８ｂは、ペトリ皿として形成される細胞培養容器３と、灌流装置１であって、灌流装置１の灌流領域２がペトリ皿内に装入されている灌流装置１とからなる本発明に係るセットの概略図を示している。
【図１】
0006877578.tif 000002
【図２ａ】
0006877578.tif 000003
【図２ｂ】
0006877578.tif 000004
【図２ｃ】
0006877578.tif 000005
【図３ａ】
0006877578.tif 000006
【図３ｂ】
0006877578.tif 000007
【図４ａ】
0006877578.tif 000008
【図４ｂ】
0006877578.tif 000009
【図４ｃ】
0006877578.tif 000010
【図４ｄ】
0006877578.tif 000011
【図４ｅ】
0006877578.tif 000012
【図４ｆ】
0006877578.tif 000013
【図４ｇ】
0006877578.tif 000014
【図５ａ】
0006877578.tif 000015
【図５ｂ】
0006877578.tif 000016
【図５ｃ】
0006877578.tif 000017
【図５ｄ】
0006877578.tif 000018
【図５ｅ】
0006877578.tif 000019
【図５ｆ】
0006877578.tif 000020
【図５ｇ】
0006877578.tif 000021
【図６ａ】
0006877578.tif 000022
【図６ｂ】
0006877578.tif 000023
【図６ｃ】
0006877578.tif 000024
【図６ｄ】
0006877578.tif 000025
【図６ｅ】
0006877578.tif 000026
【図６ｆ】
0006877578.tif 000027
【図６ｇ】
0006877578.tif 000028
【図６ｈ】
0006877578.tif 000029
【図７ａ】
0006877578.tif 000030
【図７ｂ】
0006877578.tif 000031
【図７ｃ】
0006877578.tif 000032
【図８ａ】
0006877578.tif 000033
【図８ｂ】
0006877578.tif 000034