(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カラムアレイにおいて、１組のカラム状空間を含み、各カラム状空間は、基部を有するとともに材料が実質的にない柱空間および細胞容積を含み、前記柱空間は、１つまたは複数の柱空間に分割されて配列され、前記１つまたは複数の柱空間はそれぞれ前記カラム状空間内の前記基部から延び、各柱空間は細胞容積で囲まれ、前記細胞容積は生細胞を含み、「生」は１週間後に５０％を超える生きた細胞を含むと定義される、カラムアレイ。
【請求項２】
請求項１に記載のカラムアレイにおいて、前記１つまたは複数の柱空間は、前記基部から実質的に垂直に延びる、カラムアレイ。
【請求項３】
請求項１に記載のカラムアレイにおいて、前記細胞容積は、前記生細胞を含むヒドロゲルマトリックスを含む、カラムアレイ。
【請求項４】
請求項１に記載のカラムアレイにおいて、前記細胞容積は、ヒドロゲルマトリックスを有さない生細胞を含む、カラムアレイ。
【請求項５】
請求項１に記載のカラムアレイにおいて、前記生細胞は、正常細胞、疾患細胞、幹細胞、内皮細胞、間質細胞、心筋細胞、肝細胞、腎細胞、腫瘍細胞、肝細胞、膵臓細胞、筋細胞、脳細胞、腎細胞、および患者固有の細胞のうちの１つまたは複数から選択された、カラムアレイ。
【請求項６】
請求項３に記載のカラムアレイにおいて、前記ヒドロゲルマトリックスは、天然ヒドロゲル、合成ヒドロゲル、および天然および合成ハイブリッドヒドロゲルから選択された、カラムアレイ。
【請求項７】
請求項６に記載のカラムアレイにおいて、天然ヒドロゲルは、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、および、ヒアルロン酸（ＨＡ）、アガロース、アルギン酸塩、およびキトサンから選択される多糖類の１つまたは複数から選択され、合成ヒドロゲルは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、およびポリグリセロールセバケート（ＰＧＳ）ポリマーの１つまたは複数から選択された、カラムアレイ。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか１項に記載のカラムアレイにおいて、前記細胞容積は、微小血管系をさらに含む、カラムアレイ。
【請求項９】
請求項８に記載のカラムアレイにおいて、前記微小血管系は、実質的に無傷で天然の微小血管を前記細胞容積に加え、前記微小血管を成熟条件にさらすことにより形成される、カラムアレイ。
【請求項１０】
請求項９に記載のカラムアレイにおいて、前記無傷で天然の微小血管は、脂肪組織に由来する、カラムアレイ。
【請求項１１】
請求項１に記載のカラムアレイにおいて、前記柱空間は、少なくとも１つの入口ポートに結合されている、カラムアレイ。
【請求項１２】
請求項１に記載のカラムアレイにおいて、少なくとも２つの柱空間が、少なくとも１つの交差接続チャネルを介して流体連通している、カラムアレイ。
【請求項１３】
請求項１に記載のカラムアレイにおいて、前記カラムアレイは、静止またはかん流可能である、カラムアレイ。
【請求項１４】
請求項１に記載のカラムアレイにおいて、前記配列は、前記カラムの軸方向位置に位置する１つの柱空間と、前記軸方向位置と前記カラムの縁部との間に位置する１または複数の柱空間とを備え、少なくとも１つの外側の柱空間は、前記軸方向の柱と流体的に連通している、カラムアレイ。
【請求項１５】
請求項１１に記載のカラムアレイにおいて、前記柱空間に接続された外部かん流システムをさらに含む、カラムアレイ。
【請求項１６】
マルチウェルプレートプラットフォームにおいて、複数のウェルのそれぞれに請求項１に記載のカラムアレイを含む、マルチウェルプレートプラットフォーム。
【請求項１７】
請求項１６に記載のマルチウェルプレートプラットフォームにおいて、３８４、９６、４９、２４、１２、または６個のウェルを含む、マルチウェルプレートプラットフォーム。
【請求項１８】
１組のカラム状空間を含むカラムアレイを作成する方法において、各カラム状空間は基部を有し、材料が実質的にない柱空間および細胞容積を含み、前記柱空間は、１つまたは複数の柱空間に分割されて配置され、前記１つまたは複数の柱空間はそれぞれ前記カラム状空間内の前記基部から延び、各柱空間は細胞容積で囲まれ、前記方法は、
犠牲マトリックス材料で前記柱空間を三次元印刷し、
バイオインクで前記細胞容積を三次元印刷するか前記細胞容積をキャスティングし、
前記細胞容積を印刷するかキャスティングした後に前記犠牲マトリックス材料を除去することを含む、カラムアレイを作成する方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法において、前記犠牲材料は、ガラスおよびポリマーから選択された、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法において、前記ポリマーは、プルロニック感熱性ヒドロゲルを含む、方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法において、前記プルロニックヒドロゲルは、Ｆ１２７ヒドロゲルを含む、方法。
【請求項２２】
特定の細胞毒性についての推定薬剤をスクリーニングする方法において、請求項１６に記載のマルチウェルプレートを提供し、推定薬剤の組成物を前記プレートの１組のウェルの柱空間に加え、対照と比べた前記細胞容積内の細胞の生存率の変化を測定することを含む、方法。
【請求項２３】
血管新生に対する効果について推定薬剤をスクリーニングする方法において、請求項１６に記載のマルチウェルプレートを提供することを含み、前記細胞容積は、実質的に無傷で天然の微小血管を細胞容積に加え、前記微小血管を成熟条件にさらすことにより得られる微小血管系を含み、推定薬剤の組成物を前記柱空間に加え、対照と比べた前記微小血管系の変化を測定する、方法。
【請求項２４】
請求項２２または２３に記載の方法において、前記柱空間は、かん流システムに接続され、推定薬剤の前記組成物は、前記細胞容積をかん流させる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
［０００１］  この出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ§１１９（ｅ）の下で２０１７年４月１４日に提出された米国仮出願番号６２／４８５，４４７の利益を主張しており、その全開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
［０００２］  技術分野は、受動的または能動的にかん流可能な生きた細胞の三次元印刷された体外マイクロ流体血管新生アレイ、及び医薬品スクリーニング／試験、組織及び臓器の作製と移植、毒性スクリーニング、およびさまざまな刺激及び条件に対する血管系の反応の調査の分野での特定の用途を有する、アレイを用いたハイスループット生物医学研究プラットフォームに関する。
【背景技術】
【０００３】
［０００３］  血管新生組織工学は比較的新しく、急速に進化している技術であり、臓器移植のニーズを満たし、再生治療技術を提供するという点でパラダイムを完全に変える可能性を有している。しかしながら、この技術の完全な裏付けを実現する前に、基本的な血管生物学の追加調査が必要である。栄養素の拡散的および／または能動的かん流、推定治療薬、および他の調査薬を介して、生きた細胞、特に実質細胞および組織の迅速なハイスループット調査を可能にする拡張可能なプラットフォームを提供することが最重要である。
【０００４】
［０００４］  さまざまな用途の三次元組織構築物の作製における大きな制限は、内部構造と構成の統合とを付与する能力、および必要な栄養素または調査薬を数セルよりもおおきな厚さの構造に提供する能力である。このような統合は、天然組織を模倣し、スフェロイド、細胞凝集体、胚様体、またはウェルプレートの細胞構築物などの均質な構造物に異なる組織構築物要素（例えば、細胞、マトリックスなど）を混合することを含む現在の人工組織設計では達成できない関連性のある有用な組織応答及び機能を可能にするために必要である。また、これらの現在実施されているバルクフェーズ設計は、拡散の制限により大きさが制限されており、その結果、細胞／組織の死および機能不全が生じてしまう。一般に、拡散輸送だけで生きた組織を維持すると、組織の厚さは約１００〜２００ミクロン未満に制限される。したがって、組織構造内でかん流可能な微小血管ネットワークを生成することは、より大きな構造の作製にとって重要であると考えられている。最後に、現在の慣行は、多くの用途でしばしば必要とされる望ましい分析サンプリングのために、組織構造の内部へのアクセスを制限している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
［０００５］  したがって、内部構造の欠如、制限された構造サイズ、およびサンプリングアクセスの制限に対処するための人工組織の製作および分析の技術において切迫した需要が残っている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
［０００６］  したがって、本発明の実施形態は、同時に、１）組織構築物内の細胞および細胞区画を構造化し、２）拡散および／またはかん流の経路を組織構造内に確立し、および３）組織構造の内部へのアクセスポートが利用可能である、拡張可能なプラットフォームを提供することにより、これらおよび他の欠陥に対処して解消する。組織の構造設計、受動的または能動的かん流の実装、およびさまざまな分析のためのサンプリングの容易性において、より高い柔軟性が提供される。さらに、本発明の実施形態は、ハイスループットフォーマットに特に適している。本発明の実施形態は、モジュール設計であり、モジュールの有益な有用性を維持しながら、より複雑な組織構造の製造を可能にする。
【０００７】
［０００７］  一実施形態は、１組のカラム状（ｃｏｌｕｍｎａｒ）空間を含むカラムアレイ（ｃｏｌｕｍｎ  ａｒｒａｙ）を提供し、各カラム状空間は、基部を有し、柱容積および細胞容積を含み、柱容積は、配列内で１つまたは複数の柱に分割され、１つまたは複数の柱はそれぞれカラム状空間内で基部から延び、各柱は細胞容積で囲まれ、細胞容積は生細胞を含み、「生」は１週間後に５０％を超える生きた細胞を含むと定義される。いくつかの実施形態では、柱容積はヒドロゲルマトリックスを含み、他の実施形態では、柱容積は、印刷後に柱から洗い流される犠牲材料から形成されたカラム状空間がある。
【０００８】
［０００８］  別の実施形態は、本発明の態様によるカラムアレイの実施形態を含むマルチウェルプレートプラットフォームに関する。マルチウェルプレートプラットフォームは、例えば、３８４、９６、４９、２４、１２、または６個のウェルを含んでいてもよく、三次元印刷により正確に製造されてもよい。
【０００９】
［０００９］  別の実施形態は、１組のカラム状空間を含むカラムアレイを作製する方法を提供し、各カラム状空間は、基部を有し、柱容積および細胞容積を含み、柱容積は、配列において１つまたは複数の柱に分割され、１つまたは複数の柱はそれぞれカラム状空間内の基部から延び、各柱は細胞容積に囲まれている。一般に、この方法は、マトリックス材料で柱容積を三次元印刷すること、およびバイオインクで細胞容積を三次元印刷することまたは柱容積の周りに細胞容積をキャスティングすることを含む。柱空間を必要とする実施形態では、柱容積は、細胞容積の印刷またはキャスティング後に洗い流される犠牲材料で印刷される。
【００１０】
［００１０］  他の実施形態は、特定の細胞毒性について推定薬剤をスクリーニングする方法に関する。いくつかの実施形態によれば、この方法は、細胞容積内の柱空間のカラムアレイを含むマルチウェルプレートを提供すること、柱空間を介して細胞容積を推定薬剤と接触させること、および対照と比べた細胞容積内の細胞の生存率の変化を測定することを含む。血管新生に対する効果について推定薬剤をスクリーニングする方法も提供されている。実施形態は、細胞容積内の柱空間のカラムアレイを含むことによるマルチウェルプレートを提供し、細胞容積は、実質的に無傷で天然の微小血管を細胞容積に加え、微小血管を成熟条件にさらすことから得られる微小血管系を含み、推定薬剤の組成物を柱容積に加えることにより細胞容積を推定薬剤と接触させ、対照と比べた微小血管構造の変化を測定する。
【００１１】
［００１１］  これらおよび他の実施形態および態様は、以下の図および詳細な説明を参照することにより、より完全に詳細かつ明確にされるだろう。図面は、本発明の原理および特定の実施形態を示すために提供されており、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の全範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】［００１２］  図１Ａ〜図１Ｄ：柱の周りに細胞／コラーゲン混合物を組み込む前に、直径１ｍｍの５つの犠牲柱が製造される例示的な実施形態を示す。次に柱が犠牲になり、組織構造内に柱容積が残り、その周囲で構造の細胞が成長及び機能し続ける。図１Ａ：柱のデジタルモデルを示す。
【図１Ｂ】図１Ａ〜図１Ｄ：柱の周りに細胞／コラーゲン混合物を組み込む前に、直径１ｍｍの５つの犠牲柱が製造される例示的な実施形態を示す。次に柱が犠牲になり、組織構造内に柱容積が残り、その周囲で構造の細胞が成長及び機能し続ける。図１Ｂ：犠牲ハイドロゲルで作成された実際の柱の上面図を示す。
【図１Ｃ】図１Ａ〜図１Ｄ：柱の周りに細胞／コラーゲン混合物を組み込む前に、直径１ｍｍの５つの犠牲柱が製造される例示的な実施形態を示す。次に柱が犠牲になり、組織構造内に柱容積が残り、その周囲で構造の細胞が成長及び機能し続ける。図１Ｃ：柱を取り除いた後の最終組織構造の構造統合と短い拡散距離を強調した上面図を示す。
【図１Ｄ】図１Ａ〜図１Ｄ：柱の周りに細胞／コラーゲン混合物を組み込む前に、直径１ｍｍの５つの犠牲柱が製造される例示的な実施形態を示す。次に柱が犠牲になり、組織構造内に柱容積が残り、その周囲で構造の細胞が成長及び機能し続ける。図１Ｄ：柱容積／組織界面の拡大図を示す。
【図２Ａ】［００１３］  図２Ａ〜２Ｄ：図２Ａを示す実施例２の結果を示す。細胞形態及び図２Ｂの生存率は、非実質細胞（ＮＰＣ）を組み合わせた初代肝細胞を、４日間培養して得られる。図２Ｃおよび図２Ｄは、生／死の蛍光染色を示す。開いた矢印＝負の細胞であり、閉じた矢印＝正の（つまり死んだ）細胞である。
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｄ：図２Ａを示す実施例２の結果を示す。細胞形態及び図２Ｂの生存率は、非実質細胞（ＮＰＣ）を組み合わせた初代肝細胞を、４日間培養して得られる。図２Ｃおよび図２Ｄは、生／死の蛍光染色を示す。開いた矢印＝負の細胞であり、閉じた矢印＝正の（つまり死んだ）細胞である。
【図２Ｃ】図２Ａ〜２Ｄ：図２Ａを示す実施例２の結果を示す。細胞形態及び図２Ｂの生存率は、非実質細胞（ＮＰＣ）を組み合わせた初代肝細胞を、４日間培養して得られる。図２Ｃおよび図２Ｄは、生／死の蛍光染色を示す。開いた矢印＝負の細胞であり、閉じた矢印＝正の（つまり死んだ）細胞である。
【図２Ｄ】図２Ａ〜２Ｄ：図２Ａを示す実施例２の結果を示す。細胞形態及び図２Ｂの生存率は、非実質細胞（ＮＰＣ）を組み合わせた初代肝細胞を、４日間培養して得られる。図２Ｃおよび図２Ｄは、生／死の蛍光染色を示す。開いた矢印＝負の細胞であり、閉じた矢印＝正の（つまり死んだ）細胞である。
【図３】［００１４］  例２の薬物治療のレイアウトを示す。
【図４】［００１５］  図４Ａおよび４Ｂ：詰まった細胞と構造とを示す柱空洞の壁の位相画像を示す。
【図５】［００１６］  図５：（１）高、（２）中程度、および（３）低用量のアセトアミノフェンで処理した３Ｄ肝細胞培養の指標の変化を示す。ウェルの構成／構成については、図２を参照。
【図６Ａ】［００１７］  図６Ａ〜６Ｄ：直径０．５ｍｍの５つの犠牲柱が、柱の周りの細胞＋微小血管（コラーゲンなし；いわゆる「足場なし」）混合物の組み込み前に製造される例示的実施形態。次に、柱が犠牲になり、組織構造内に空間が残り、その周囲で構造の細胞が成長及び機能し続ける。図６Ａ：柱のデジタルモデル。
【図６Ｂ】図６Ａ〜６Ｄ：直径０．５ｍｍの５つの犠牲柱が、柱の周りの細胞＋微小血管（コラーゲンなし；いわゆる「足場なし」）混合物の組み込み前に製造される例示的実施形態。次に、柱が犠牲になり、組織構造内に空間が残り、その周囲で構造の細胞が成長及び機能し続ける。図６Ｂ：犠牲ハイドロゲルで作成された実際の柱の上面図であり、柱の直径を変更すると、柱間の間隔が変わり、それによって構造内の細胞の自発的な再統合を可能にする。
【図６Ｃ】図６Ａ〜６Ｄ：直径０．５ｍｍの５つの犠牲柱が、柱の周りの細胞＋微小血管（コラーゲンなし；いわゆる「足場なし」）混合物の組み込み前に製造される例示的実施形態。次に、柱が犠牲になり、組織構造内に空間が残り、その周囲で構造の細胞が成長及び機能し続ける。図６Ｃ：異なる用量反応を示す異なる用量の薬物で処理された構造化構築物を含む９６ウェルプレートの上面図であり（白抜き矢印）、挿入図は単一の構築物であり、ウェルから除去されている。
【図６Ｄ】図６Ａ〜６Ｄ：直径０．５ｍｍの５つの犠牲柱が、柱の周りの細胞＋微小血管（コラーゲンなし；いわゆる「足場なし」）混合物の組み込み前に製造される例示的実施形態。次に、柱が犠牲になり、組織構造内に空間が残り、その周囲で構造の細胞が成長及び機能し続ける。図６Ｄ：最初の製造で足場を加えなくても組織が形成されたことを示す、柱容積／組織界面の拡大図を示す。
【図７Ａ】［００１８］  図７Ａ〜７Ｂ：柱の周りに（細胞＋コラーゲンの）混合物の組み込み前に直径１ｍｍの３つの犠牲柱が製造される本発明の例示的実施形態を示し、設計の柔軟性を強調している。次に、柱が犠牲にされ、組織構造内に空の柱容積／柱空間が残され、その周りで構造の細胞が成長及び機能し続けている。図７Ａ：犠牲ヒドロゲルで作製された実際の柱の上面図を示す。
【図７Ｂ】図７Ａ〜７Ｂ：柱の周りに（細胞＋コラーゲンの）混合物の組み込み前に直径１ｍｍの３つの犠牲柱が製造される本発明の例示的実施形態を示し、設計の柔軟性を強調している。次に、柱が犠牲にされ、組織構造内に空の柱容積／柱空間が残され、その周りで構造の細胞が成長及び機能し続けている。図７Ｂ：柱を取り外した後の構築された組織の上面図を示す。
【図８】［００１９］  図８Ａ及び８Ｂは、柱の周りにキャスティングされた無傷の微小血管を含むコラーゲンを組み込む前に犠牲柱が製造される例示的な実施形態を示す。図８Ａ：柱空間の１つおよび微小血管を含む隣接する組織コンパートメントの上面図を示す。図８Ｂ：図８Ｂの強調された領域の拡大図を示し、構造化された構成によってサポートされる能動的な血管新生を示している。
【図９Ａ】［００２０］  図９Ａ：犠牲柱（より暗い）の断面が六角形であり、その周りに細胞または細胞＋マトリックスが堆積する（より明るい）組織構築物のＴＳＩＭ生成モデルを示す。
【図９Ｂ】図９Ｂ：犠牲柱が円柱（より暗い）であり、その周りおよび内部に細胞または細胞＋マトリックス（より明るい）が堆積している組織構築物のＴＳＩＭ生成モデルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
［００２１］  本発明の実施形態は、生存可能な組織構築物の製造および生存可能な細胞および組織のハイスループット調査のためのカラムアレイの三次元印刷に関する。マルチウェルプレートのウェル内に複数の柱をさまざまな配置と形状で印刷してもよい。次いで、微小血管を伴うまたは伴わない、およびマトリックスを伴うまたは伴わない細胞実質を、ウェル内のこれらの柱の周りにキャスティングして、組織構築物を形成する。柱は、支持マトリックスから、または除去（すなわち、洗い流され）できる犠牲材料から印刷され、細胞実質／組織構築物の全体に分散された柱空間を残す。組織構築物は、柱容積に接続されたかん流システムを介してかん流されてもよいし、受動拡散を介してかん流されてもよい。
【００１４】
［００２２］  一実施形態は、１組のカラム状空間を含むカラムアレイに関し、各カラム状空間が基部を有し、柱容積および細胞容積を含み、この柱容積は、配置において１つまたは複数の柱に分割され、１つまたは複数の柱はそれぞれカラム状空間内の基部から延び、各柱は細胞容積で囲まれ、この細胞容積は生細胞を含み、「生」は１週間後に５０％を超える生細胞を含むと定義される。柱容積は、ヒドロゲル、液体、または固体などの材料を含んでもよく、または材料が実質的にない空間であってもよく、本明細書では柱空間と呼ばれてもよい。容積が材料を含む場合、それは細胞容積をサポートしてもよい。柱容積は、細胞容積の内部へのアクセスを提供する。
【００１５】
［００２３］  生存率の分析は、当技術分野で周知である。一般的に、生存率の分析は、細胞または組織が生存率を維持または回復する能力を決定しており、これは、０％以上１００％以下な定量可能なパーセンテージとして提供されている。一般的に入手可能及び利用されている細胞生存率の分析をレビューするオンラインマニュアルは、Ｒｉｓｓ、Ｔｅｒｒｙ  Ｌ．らの、２０１３年５月１日に発行され、２０１６年７月１日に最後に更新された「Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙｓ」であり、２０１６年７月１日のものにある全ての内容は、参照により本明細書に含まれている。生存率の分析は、機械的活動、運動性、収縮、有糸分裂活動、細胞取り込み、または代謝的変換などに基づいていてもよい。細胞の総数の「生存」パーセントを確立することを目的とする分析は、本発明の範囲を定義する目的のための生存率分析と見なされる。
【００１６】
［００２４］  特定の実施形態によれば、１つまたは複数の柱は、基部から実質的に垂直に延びる。ここで、「実質的に」とは、基部からの垂線の１０％以内を意味する。分析的または臨床的な要求に応じて、他の向きも考えられる。いくつかの実施形態によれば、細胞容積は、生存細胞、および他の特定の実施形態では微小血管を含む支持ヒドロゲルマトリックスである「足場」を含んでいる。細胞容積が細胞および他の天然細胞材料および／または微小血管を含むが、マトリックス材料を含まない、足場のない実施形態も考えられる。
【００１７】
［００２５］  特定の実施形態によれば、細胞容積は、正常細胞、疾患細胞、幹細胞、内皮細胞、間質細胞、心筋細胞、肝細胞、腎細胞、腫瘍細胞、肝細胞、膵臓細胞、筋細胞、脳細胞、腎臓細胞、および患者固有の細胞の１つまたは複数から選択される生存細胞を含んでいる。より具体的な実施形態によれば、細胞容積は実質細胞を含み、組織を形成する。
【００１８】
［００２６］  ヒドロゲルマトリックスは、天然ヒドロゲル、合成ヒドロゲル、および天然および合成のハイブリッドヒドロゲルから選択されていてもよい。適切な天然ヒドロゲルの非限定的な例には、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、および、ヒアルロン酸（ＨＡ）、アガロース、アルギン酸塩、およびキトサンから選択される多糖類の１つまたは複数が含まれる。適切な合成ヒドロゲルの非限定的な例には、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、およびポリグリセロールセバケート（ＰＧＳ）ポリマーの１つまたは複数が含まれる。天然および合成ヒドロゲルの組み合わせも考えられる。
【００１９】
［００２７］  いくつかの実施形態によれば、細胞容積はさらに微小血管系を含んでいる。特定の実施形態によれば、微小血管系は、実質的に無傷な天然の微小血管を細胞容積に加え、天然の微小血管を成熟条件にさらすことにより形成されている。本研究者らは最近、無傷で天然の微小血管をゲルに組み込み、微小血管を成熟条件にさらすことにより形成されたゲルマトリックスにおける適応可能な微小血管の形成を開示した。これは、米国特許出願第１５／２０２６７５号（Ｈｏｙｉｎｇの出願）に詳細に記載されており、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる。非常に具体的な実施形態によれば、無傷で天然の微小血管は脂肪組織に由来する。
【００２０】
［００２８］  熱可逆性ヒドロゲルまたはガラス材料を含む柱が基部上に三次元印刷される犠牲キャスティング方法を採用することができる。微小血管を有するまたは有さない細胞実質などの生存細胞を含む細胞容積は、次に柱の周りに印刷またはキャスティングされる。犠牲ヒドロゲルは洗浄／洗い流されて、組織構造を形成する細胞容積の全体にわたって所望の方向に横断する柱空間を残す。非常に特定の実施形態によれば、柱空間は、基部から組織構築物を通って実質的に垂直に延びる。柱容積および柱空間を形成する柱は、円形、三角形、長方形、五角形、または六角形の断面を有する柱を含むがこれらに限定されない様々な形状で印刷されていてもよい。当業者は、柱空間と細胞容積／組織構築物とについて異なる数の相互作用またはサンプリングファサードを提供する様々な可能性のある形状を容易に想像するであろう。いくつかの実施形態によれば、柱容積または柱空間は、少なくとも１つの入口ポートを介してかん流システムに接続されることができ、それによって未熟な微小血管の成熟が制御された圧力または流れによって駆動される。他の特定の実施形態によれば、細胞容積のかん流は、柱容積と細胞容積との間の受動拡散によって達成され、他の特定の実施形態では、かん流は柱容積をかん流システム、例えばポンプ機構に接続することによって能動的に達成される。かん流を達成するためのポンピング機構の非限定的な例には、圧力駆動流量制御装置、蠕動ポンプ、およびモーターによって駆動されてもされていなくてもよいシリンジ機構が含まれる。静的なカラムアレイも考えられる。非常に特定の実施形態では、微小血管を成熟条件にさらすことは、かん流血行動態を定義して、内皮発芽を誘導するのに十分なせん断応力を提供することを含んでおり、例えば、加えられたせん断応力は１Ｐａ（１０ｄｙｎｅ／ｃｍ２）以上であってもよい。
【００２１】
［００２９］  Ｈｏｙｉｎｇの出願に記載されている装置は、血管化された体外かん流装置として特徴付けられ、犠牲方法によって形成された微小流体チャネルのネットワークに接続された実質／細胞の有無にかかわらず３Ｄマトリックスを含んでいる。現在開示されている発明の実施形態によれば、微小流体チャネルネットワークは、細胞組成物中の微小血管系が通ってかん流され得る１組の柱空間によって置き換えられる。特定の「足場のない」実施形態によれば、細胞容積には実質的にマトリックスがなく、微小血管は、ほぼ完全に実質からなる組織に埋め込まれていてもよい。
【００２２】
柱空間は、複数の目的に使用することができ、例えば、
１．細胞／組織：培地交換の増加した表面積を提供する。これは、組織構築物の生存率をサポートすることに関連するだけでなく、薬物、トレーサー、可溶性因子などの改善された送達にも関連している。
【００２３】
２．必要に応じてかん流アクセスを提供する。微小流体マニホールドを使用して、柱空間をかん流システムに接続し、それによって空間を加圧し、追加のチャネル接続および／または微小血管系に応じて、組織構造をかん流させることができる。
【００２４】
３．天然細胞の挙動及び機能を可能にする組織に構造的統合を提供する（これは、犠牲材料なしで柱容積が形成される場合に特に当てはまる）。および、
４．分析と互換性のある組織内のサンプリングアクセスポートを提供する。
【００２５】
［００３０］  分析または臨床上のニーズに応じて、柱のさまざまな配置をカラム状基部に印刷することができる。特定の実施形態は、少なくとも２つの柱が少なくとも１つの交差接続チャネルを介して流体連通していることを考える。交差接続チャネルは、柱間の任意の方向に印刷されていてもよく、例えば、非常に特定の実施形態では、交差チャネルは水平であり、柱の高さに沿った任意の高さで配置／接続される。他の非常に具体的な実施形態では、交差チャネルは、１つの柱の頂部を第２またはそれ以上の柱の底部に流体的に接続する。非常に具体的な一実施形態では、配列はハブアンドスポーク配置を含み、１つの柱は２つ以上の周囲の柱に対して中心／軸位置に配置され、少なくとも１つ、いくつかまたはすべての周囲の柱は少なくとも１つによって接続チャネルにより、中央／軸柱に接続されている。特定の実施形態では、１つ以上の周囲の柱は、軸／中央位置と柱の縁部との間に位置している。周囲の柱は、柱の半径に沿った任意の位置に配置されることができ、周囲の柱が同じ配置で半径に沿った異なる位置に配置される実施形態が考えられる。同じウェル／ベース上の異なる柱が異なる直径または異なる形状を有する実施形態が考えられる。
【００２６】
カラムアレイの複数の構成が考えられる。非限定的な例は、
１．細胞容積−マトリックス；＋柱；（足場無し）
２．細胞容積＋マトリックス；＋柱
３．細胞容積＋／−マトリックス；＋柱；かん流あり；
４．細胞容積＋／−マトリックス＋微小血管；＋柱；かん流なし（静的）
５．細胞容積＋／−マトリックス＋微小血管；＋柱；かん流あり
６．細胞容積が実質細胞を含まないことを除いた１−５、
を含んでいる。
【００２７】
［００３１］  特定の実施形態によれば、カラム状空間内の柱密度およびアレイ配置は変更されてもよい。ここで使用されているように、実質細胞は、任意の初代、培養、または誘導実質細胞が含まれる。実質細胞を伴うまたは伴わない細胞容積に含まれ得る他の細胞には、非実質細胞、間質細胞、アクセサリー細胞などが含まれる。非常に具体的な実施形態によれば、細胞容積は、初代肝細胞＋初代非実質生細胞＋／１初代脂肪微小血管が含まれる。
【００２８】
［００３２］  本発明の実施形態は、ハイスループット分析に特に適している。三次元印刷は、極端なレベルの寸法精度と細胞の／細胞内の解像度とを可能にする。特定の実施形態によれば、複数のウェルプレートプラットフォーム上の複数のウェルにカラムアレイが印刷される。印刷されたアレイは、各ウェルの構成および配置が同じでも異なっていてもよい。複数ウェルプレートプラットフォームは、標準の３８４、９６、４９、２４、１２、６のウェルプレートのいずれか、または任意の所望の数のウェルを含んでいてもよい。
【００２９】
［００３３］  一実施形態は、各カラム状空間がベースを有し、柱容積およびセル状容積を含む、１組のカラム状空間を含むカラムアレイを作製する方法を対象とし、この柱容積は、配置において１つまたは複数の柱に分割され、１つまたは複数の柱はそれぞれカラム状空間内のベースからそれぞれ延び、各柱は細胞容積に囲まれている。この方法は、マトリックス材料を使用して柱／柱容積を三次元印刷することと、バイオインクで細胞容積を三次元印刷すること、または柱容積の周りに細胞容積をキャスティングすることを含む。上述のように、柱空間は、犠牲材料を含むマトリックス材料で柱容積を印刷し、細胞容積の印刷またはキャスティングに続いて犠牲材料を除去することにより形成されることができる。特定の実施形態によれば、犠牲材料はガラスおよびポリマーから選択される。非常に具体的な実施形態では、ポリマーはプルロニック感熱性ヒドロゲルを含み、さらにより具体的な実施形態では、プルロニックヒドロゲルはＦ１２７ヒドロゲルを含む。
【００３０】
［００３４］  特定の細胞毒性について推定薬剤をスクリーニングする方法が提供される。この方法は、マルチウェルプレートを提供することと、複数のウェルでカラムアレイの実施形態を作製することを含む。柱容積を介して細胞容積を１つまたは複数の推定薬剤と接触させ、細胞容積内の細胞の生存率の変化を測定し、対照群と比較する。陽性および陰性の両方の適切な対照群は、容易に設計され、当業者に識別可能である。例えば、対照群は、細胞生存率に対する相対的な効果を測定するためのベースラインを提供する、毒性として知られる薬剤または中性として知られる薬剤であってもよい。特定の実施形態では、推定剤を含む組成物がプレートの１組のウェルの柱容積に加えられ、対照群がウェルの２つ目の組に加えられ、実験細胞容積の、対照群の細胞量に対する細胞の生存率の変化が測定される。本発明のアレイは、柱の配置に応じて、細胞容積の任意の垂直深さの柱空間および実質的な水平面を介して細胞容積のサンプリングを可能にし、位置勾配及び／または位置の違いの影響／結果を制御または回避する非常に特異な能力を提供する。
【００３１】
［００３５］  血管新生に対する効果について推定薬剤をスクリーニングする方法も提供される。本発明によるカラムアレイは、マルチウェルプレートの複数のウェルに構築される。細胞容積は、生存可能な細胞を含み、実質的に無傷の天然微小血管を細胞容積に加え、微小血管を成熟条件にさらすことに由来する微小血管系をさらに含む。微小血管は、推定薬剤の組成物を柱容積に加えることにより推定薬剤と接触する。微小血管系の変化は、対照群と比較して評価される。特定のスクリーニングの実施形態では、柱容積はかん流システムに接続され、推定薬剤を含む組成物は細胞容積をかん流する。かん流システムは、かん流チャンバを備えていてもよい。
【００３２】
例
［００３６］  以下の例は、本発明の特定の態様および実施形態を説明するために記載されており、その範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００３３】
例１
［００３７］  バイオアセンブリボット（登録商標）ロボットアセンブリワークステーションおよびＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＬＬＣ（ＡＳＬＳ）から入手可能な組織構造情報モデリング（ＴＳＩＭ（登録商標））ソフトウェアを使用して、バイオマーカースクリーニング用の肝細胞組織構造を三次元印刷で行った。使用されるロボットアセンブリワークステーションの詳細は、米国特許第９９１０９３５号に記載されており、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる。テストは、少なくとも１４日間生存可能な三次元印刷した肝細胞培養を生成させることを含んでいる。
【００３４】
静的アッセイ：生存可能な肝組織の三次元印刷分析を評価する２つの三次元印刷構造タイプと細胞タイプ構成とを提供する。
［００３８］  細胞：それぞれの培地と化合物とを含む肝臓細胞は、Ｎｕｃｒｏ−Ｔｅｃｈｎｉｃｓから提供され、ケンタッキー州ルイビルにあるＡＳＬＳの研究室に出荷された。
【００３５】
［００３９］  細胞印刷：２つの３Ｄ細胞培養設計が開発および生成された。柱のレイアウト設計は、各ウェルのコラーゲンゲルに３つまたは６つのキャビティを作成するのに、犠牲材料による方法を用いた９６ウェルプレートの各ウェル内で「ハニカム」状の構造を実現することに基づいていた（図１Ａおよび１Ｂ）。それぞれについて、初代肝細胞（Ｈｅｐｓ）（２５０，０００／ウェル）が初代ＮＰＣ（１２５，０００／ウェル）に混合されてコラーゲン（３ｍｇ／ｍｌ）に埋め込まれ、柱の周りに堆積した。犠牲となる柱はその後溶解され、媒体交換のための空洞を残して洗い流された。この設計は、１）異なる細胞タイプを区画化し、２）細胞区画とのより良い培地交換を作成することを可能にする。
【００３６】
［００４０］  隔離された柱を含む最初に提案された設計が調査されたが、例示的なハニカム設計はセル容量と設計の柔軟性を改善した。混合細胞（１区画のＨｅｐ＋ＮＰＣ）培養は、９６ウェルプレートのねずみ細胞で確立された。位相画像は１週間にわたって撮影された。４日目に、生／死の蛍光測定（生細胞は緑色に蛍光を発し、死んだ／死んでいる細胞は赤色に蛍光）とウェルの１つのカラム（合計８）を評価し、７日目に同じことを行った。特に、生きた細胞質染色であるカルセイングリーンは、コラーゲンゲルでは効果的ではなかった（緑色で強く自己蛍光を発するため、次のラウンドでは緑色の核色素を使用して信号対ノイズを改善するのに使用された）。
【００３７】
［００４１］  結果：３腔および６腔の培養の両方の結果は類似していた。印刷後、細胞は細胞コンパートメント全体で各キャビティの壁まで均等に分布していた（図１Ｃおよび１Ｄ）。細胞の形態と密度は最初の４日間持続した（図２Ａ、２Ｃ、および２Ｄ）。生／死の蛍光分析によって決定されるように、培養物内の約７０％の細胞が１週間目まで生存率を維持した（図２Ｂ）。コラーゲンゲルの自己蛍光が高すぎて自信を持って「生きた陽性」細胞を評価できないため、これらの数値は「死滅染色」画像から計算された（図２Ｃおよび２Ｄ）。培養７日間で、３腔および６腔の両方の培養を、調査チームによる組織学的評価のために１．５％のパラホルムアルデヒドで凝固した。
【００３８】
［００４２］  培養の第２ラウンドでは、ａ）細胞コンパートメントにＨｅｐ／ＮＰＣを組み合わせた６腔分析を繰り返し、ｂ）コラーゲン内のＨｅｐで、細胞コンパートメントにＮＰＣを入れて腔を満たした。両方の培養物を１４日間評価し、１週目に１カラムのウェルの生／死を評価した。培養の最後の２日間（すなわち、１３日目から）、培養液を血清飢餓状態にしてからアセトアミノフェンに１日間曝露し、続いてウェルの半分をＰＦＡで凝固し、残りの半分を評価のために尿素で可溶化した。
【００３９】
例２
［００４３］  静的薬物毒性分析：生存可能な肝臓組織をモデル化した高密度肝細胞（＋非実質細胞）の三次元印刷された培養物を提供する。この組は、３Ｄ培養でコラーゲンの低密度肝細胞を利用した１つめの組とは異なっている。
【００４０】
［００４４］  細胞：肝細胞とそれぞれの培地および化合物は、Ｎｕｃｒｏ−Ｔｅｃｈｎｉｃｓから提供され、ケンタッキー州ルイビルにあるＡＳＬＳの研究室に出荷された。
［００４５］  セル印刷：分析は、例１で使用した３Ｄ細胞培養設計を複製した。設計は、９６ウェルプレートの各ウェル内の「ハニカム」状構造に基づいており、犠牲材料方法を使用して、各ウェル内の組織模倣物に６つの腔を作成する（図１Ａおよび１Ｂ）。実験では、初代Ｈｅｐを初代ＮＰＣと混合し、３本のチューブに分けてペレット化した。中性の非ゲル化コラーゲン（３ｍｇ／ｍｌの０．３ｍｌ）を各ペレットに添加し、印刷された犠牲柱の周りにけん濁及び堆積された。次に、柱を溶解して洗い流され、培地交換用の腔を残した。６柱設計により、表面積が増加するため、細胞コンパートメントとの培地交換が向上する。３つの分離したＨｅｐ／ＮＰＣの組み合わせは、２０００万Ｈｅｐ／ｍｌ、１５００万Ｈｅｐ／ｍｌ、または１０００万Ｈｅｐ／ｍｌで、それぞれ１００万ＮＰＣ／ｍｌを含んでいる。
【００４１】
［００４６］  培養物を肝細胞維持培地（Ｌｏｎｚａ）で７日間維持した後、選択した薬剤でさらに７日間処理した（図３を参照）。
［００４７］  前と同様に、１４日間の研究の過程で位相画像が撮影された。薬物治療の初日（８日目）から開始して治療の最終日（１４日目）まで継続して培養上清を収集して溜めた。すべての３Ｄ培養物はパラホルムアルデヒドで凝固された。
【００４２】
［００４８］  結果：印刷及びセルの「キャスティング」の後、細胞は各腔の壁まで密に詰められた（図４Ａ）。細胞の密度が高いため、細胞の形態と密度を評価することは困難であった。しかしながら、腔壁は１４日間の培養期間中維持され、細胞間のマトリックスの見かけ上の存在を含む腔壁の個々の細胞の明確な証拠が示された（図４Ｂ）。アセトアミノフェンを投与したウェルは、処置の７日間で茶色になり、その強度は使用したアセトアミノフェンの用量を反映した（図５）．
［００４９］  静的３Ｄ培養の３つ目の組では、すべての培養で同じ高密度の肝細胞濃度を使用して、８０Ｋ分離ねずみの微小血管フラグメント／ｍｌを含めて２つ目の組の設計を繰り返す。この値は２つ目の組の結果から決定され、組織学的に適切な肝臓模倣物をまだ生成した試験済みの３つの密度の中で最も低い密度を示している。両方の培養物は、８日目から薬物治療を開始して１４日間、以前と同様に評価された。
【００４３】
例３
［００５０］  以下の例は、本発明の特定の実施形態による例示的な６柱カラムアレイを平底９６ウェルプレートにモデリング及び印刷するための、及び肝細胞構築物を作製および維持するための詳細なプロトコルを示している。他のアレイ構成は、モデリング、準備、印刷、または培養のために異なるまたは追加のステップを必要とする場合があり、その適応は、当業者には容易に明らかになる。
【００４４】
ＴＳＩＭで６柱印刷をモデリングする
［００５１］  各柱は、スケッチから作成され、所望の場所に配置された個々のチューブである。チューブを作成するには；
−スケッチツールの作成を選択し、
−Ｘ−ＺまたはＹ−Ｚ平面を選択して作成をクリックし、
−線の作成ツール（角度で接続された３点）を選択し、右クリックして線を終了し、
−高さ３ｍｍの線を作成し、
−さらに５つの線を作成するか、完成したチューブを後でコピーして貼り付け、
−スケッチカーブからチューブを作成するツールを選択し、
−スケッチ線を選択し、
−半径（０．２ｍｍ）を入力して作成（このチューブはＣｔｒｌ−ＣおよびＣｔｒｌ−Ｖを使用してコピーおよび貼り付けできる。貼り付けられたオブジェクトはオブジェクトリストに表示されるが、元のオブジェクトと同じ位置を占める。オブジェクトを移動してそれを視覚化）し、
−チューブを所望の位置に移動する。センターチューブの位置は（−１０６．３９２１、−５３．９６３８、１．５０００）であり、最も前方の左のウェルにある。これは、パターンが生成される開始位置になり、
−中央のチューブの周りに５本のチューブを配置する。正確な位置については、Ｐｉ＝外部チューブ番号ｉの位置（１、２、３、４、５）、Ｘｃ＝センターチューブのＸ座標、Ｙｃ＝センターチューブのＹ座標、ｒ＝ウェルの半径＝１．５５２５ｍｍ、ｎ＝外部柱の数＝５、ＰｉＸ＝チューブｉのＸ座標、ＰｉＹ＝チューブｉのＹ座標。
【００４５】
〇Ρｉ＝（ΡｉＸ，ＰｉＹ）
〇ＰｉＸ＝Ｘｃ＋ｒ＊ｃｏｓ（ｉ＊３６０／ｎ）
〇ＰｉＹ＝Ｙｃ＋ｒ＊ｓｉｎ（ｉ＊３６０／ｎ）
〇サンプル：外部チューブ３の位置、Ｐ３＝（Ｐ３Ｘ、Ｐ３Ｙ）
・Ｐ３Ｘ＝−１０６．３９２１＋１．５５２５＊ｃｏｓ（３＊３６０／５）
・Ｐ３Ｘ＝−１０７．６４８１
・Ｐ３Ｙ＝−５３．９６３８＋１．５５２５＊ｓｉｎ（３＊３６０／５）
・Ｐ３Ｙ＝−５４．８７６３
〇Ｐｉ＝（−１０７．６４８１、−５４．８７６３）
−これらの値は、右側のプロパティパネルの変換セクションの各チューブの「中心」座標空間に入力される。
【００４６】
−すべてのＺ座標が同じであることに注意されたい（高さ３ｍｍのチューブでは１．５）
−各チューブを配置した後、６つのチューブ全てを選択し、材料リストから所望の材料を割り当てる。新しい材料を作成したり、必要に応じて材料表で現在の材料を編集したりすることができる。
【００４７】
−すべてのチューブを選択した状態で、選択した硬いツールからパターンを生成する、をクリックし、９６ウェルプレートについて次の情報を入力する
〇水平カウント：１２
〇水平方向の間隔：８．８９９ｍｍ
〇垂直カウント：８
〇垂直方向の間隔：８．９６４ｍｍ
〇ヨー：−０．５００ｄｅｇ
−パターンを作成する。すべてのチューブは、それらのために所望の材料が既に選択されている必要がある
−９６ウェルプレートテンプレートをチューブの位置を確認するのに用いることができる。プロパティパネルでウェルプレートのロックアイコンが閉じていることを確認する。これにより、プレートテンプレートを誤って移動することがなくなることを確実にする。
【００４８】
−右側のプロパティパネルの正確な先端検出のボックスがオンになっていることを確認する。これにより、ＸおよびＹ軸の両方で先端検出を実行するようにバイオアセンブリボットに指示する。これにより、針が曲がりで構成されていることを確実にすることを助ける
対象物が適切な場所に配置されたら、バイオアセンブリのタブをクリックし、印刷ジョブの送信をクリックする。これにより、現在のファイルがバイオアセンブリボットに送信される
プルロニック滅菌
［００５２］  組織培養のために、プルロニックと接触したすべての材料が滅菌されることが勧められる。これには、針、バレル、ピストン、プルロニック自体が含まれる。すべてのアイテムは、事前真空サイクルで蒸気滅菌されてもよい。プルロニックは沸騰して膨張するので、プルロニックは容器の総容積の約３０％しか占めないはずである。サイクルが完了した後に、瓶を４℃で一晩置く。すべてのプルロニックがけん濁されたら、使用する準備が整っている。いくつかの例では、プルロニックが完全にけん濁される前に４℃で数日間置かれる必要がある。攪拌テーブルは、けん濁時間を短縮するのに役立つ。
【００４９】
印刷の準備
［００５３］  最適な印刷を可能にするために、印刷前にいくつかの手順を実行する必要がある。これらの手順は次のとおりである。
【００５０】
−バイオセーフティキャビネットで、先端に青いキャップが付いたきれいなバレルに印刷物を装填する。液体として容易に注ぐことができるように、プルロニックＦ−１２７は冷たい状態で加えることができる
−材料がまだ液体である間に、材料を脱気する。これには、材料を低温（＜１４°Ｃ）に保つ必要がある。脱気は、超音波処理または真空吸引によって行うことができる。
【００５１】
−白いピストンをバレルに加え、ピストンとプルロニックとの間に最小限の空気ができるまで、必要に応じて少しひねりながら押し下げる。
−プルロニックが室温に到達して完全にゲル化させる
−青いエアアダプタをバレルの頂部に取り付けて完全に締め、バレルを金属製のクリップに押し込むことにより、バレルを周囲のツールに装填する
〇ツールヘッドの下側で空気通路がねじれまたはよじれていないことを確実にする
〇エアアダプタの底部が金属クリップの頂部にほぼ載るように、バレルを金属クリップ内で可能な限り下に引く。これは、空気通路のよじれを防ぎ、針をより簡単に見ることができるように先端検出を可能にする
−青い先端キャップを取り外し、１２．７ｍｍ（０．５インチ）の長さの２２ゲージの針（青）をバレルの先端に置く
〇他の針直径も用いることができるが、以前のプレートには２２ゲージが印刷されている。他の先端が使用される場合は、印刷パラメーターを変更して抵抗の変化を調整する必要がある
〇より短い針は針ハブに衝突することなくウェルの底に届かないため、１２．７ｍｍ（０．５インチ）の針が必要である
−ツールとバレルとをベイ１に配置する
−印刷を開始すると、押し出す準備ができている材料が針の端にあるように、針を準備する。これを行うために；
〇ベイ１からツールを拾い上げるようにバイオアセンブリボットに指示する
・コントロールタブを開く
・その他タブを選択する
・回収ツールを選択する
・ドロップダウンメニューからベイ１を選択する
・回収ツールを確認する
〇ボットがツールを取り上げてホームポジションに戻ると、所望のプライミング圧力を入力する。１２．７ｍｍ（０．５インチ）の２２ゲージ針の場合、１３７．９ｋＰａ（２０ＰＳＩ）から開始する
〇「オン」という単語の横にある赤いボタンを押す。これは空気の流れを開始させる
・この分配の持続時間には制限がある。ボタンが緑色の場合、空気が分配されており、赤色の場合、空気は分配されていない。プライミングが完了する前にそれが止まった場合は、単純にもう一度ボタンを押す
〇圧力を増減するために、「＋」および「−」ボタンを使用する。これにより、内部タイマもリセットさせる。プライムの発生中に新しい圧力を入力することもでき、これにより、タイマもリセットされる。
【００５２】
〇２０ゲージ針の場合、１３７．９ｋＰａ（２０ＰＳＩ）は低すぎるであろう。プルロニックの安定した流れが押し出されるまで、圧力を６．９ｋＰａ（１ＰＳＩ）ずつ上げる
〇流れの中に明らかな気泡がなくなるまで、プライミングを続ける。これらの気泡は、針からプルロニックが吐き出されるか、流れの中に割り込まれるまで現れる。プライミングには通常、タイマの１〜２フルサイクルがかかる（すなわち、一定の流速が確立されたら、分配タイマが２回切れるようにする。各サイクルには約１０〜１５秒かかる。
【００５３】
〇針の先を清潔なタオルで拭いて、余分なプルロニックを取り除く
−ステージに対する先端のオフセットを実行する。ＴＳＩＭ内のチューブの底部のＺ値は０であるため、９６ウェルプレート内にステージに対する先端のオフセットを設定する必要がある。
【００５４】
これを行うために、
〇プレートがポジティブストップに対して上方に当たるように、９６ウェルプレートを印刷ステージ上に配置する。プレートは、１２ウェルの列が左から右に、８ウェルの列が前から後ろに移動するように配置される必要がある
〇ＨＭＩの移動コマンドを使用して、ツールを使用してボットを左前方のウェルに移動させる（任意のウェルが機能するが、これが最も見やすいものである）。
【００５５】
・制御タブを選択する
・移動タブを選択する
・ダイアルを使用して、各コマンドで移動するボットの距離を設定する
・ＸおよびＹの動きは画面の左側にあり、Ｚの動きは右側にある
・ヒント：ボットを大まかな場所に移動するには大きな動きを使用し、ボットを正確な場所に移動するには小さな動きを使用する方が常に簡単である。移動する前に、ボットに設定されている距離に常に注意願いたい。ステージはスプリング上にあり、ボットが当たって場合にたわむが、針を曲げたり、ウェルプレートを割ったりする可能性がある
〇針がウェルの中心にあり、ウェルの底にちょうど触れるように、ボットをゆっくりと下方に動かす
・このキャリブレーションステップの精度は、印刷の正しい結果を確保するために重要である
・ヒント：目と同じ高さにある場合は、ウェルの底に対して先端を視覚化する方が簡単である。針からの影及び反射は、このプロセスで非常に役立つ
・ヒント：針がステージに近い場合（０．０１ｍｍ以上０．１ｍｍ以下）、非常に小さな動きを使用するのが賢明である。これにより、視覚化がより難しくなるが、プロセスの正確性が確保される。
【００５６】
・ヒント：針に対するウェルの底の位置が不明な場合、または針がウェルに接触していると思われる場合は、移動距離を０．５ｍｍ以上に設定し、ボットをＺ方向に上方に移動させる。もしステージが跳ね上がる、もしプレートが動く、またはもし針が曲がると、針はウェルの底にある。針がプレートに触れる兆候が見えなくなるまで再び上に移動させ、次に少しずつ下に移動させる。針がプレートに触れる兆候がない場合は、同じ設定距離だけ下に戻し、少しずつ移動し続けさせる。
【００５７】
〇針がウェルの底に丁度触れているが、それを曲げさせないようになったら、ボットを０．２ｍｍだけ上に移動させる。これを視覚化するのは難しいので、ＨＭＩを参照願いたい。一旦コマンドが発行されると、ボットがコマンドを完了する間、ボタンはしばらく灰色になる。ボタンが一時的にグレー表示される場合、ボットが移動したと想定しても安全である。
【００５８】
〇キャリブレーションタブを開く
〇ステージに対する先端のオフセットのタブを選択する
〇ステージオフセットへのヒントの実行ボタンを押す。ボットは左後隅の先端センサに移動する
〇ステージに対する先端のオフセットが測定されたら、制御タブとその他タブとを使用して、ツールをベイ１に戻すようにボットに指示する
バイオアセンブリボットを使用した印刷
［００５４］  モデルがＴＳＩＭで作成され、バイオアセンブリボットに送信されると、残りのすべてのアクションはバイオアセンブリボットＨＭＩから実行されます。ＴＳＩＭモデリングを再検討する必要があるのは、構造または印刷パラメーターを変更する必要がある場合のみである。印刷するために；
−バイオアセンブリボットが準備されていること、つまり、ステージに対する先端のオフセットが決定されていること、印刷針がプライミングされていること、およびウェルプレートがふたを外した位置にあることを確認する
−印刷タブの下で、リストから所望の印刷を選択する
−プレビューウィンドウの構造が必要なすべての構造（チューブ）を有し、追加構造（ウェルプレート）が無いことを確認する
−スタートを押す
−印刷物が正しいベイにあることを確認する。この画面では、バイオアセンブリボットがどのベイに材料を入れると予想しているかがわかる。それらが正しいベイにない場合は、ドアを開いて手で動かす
−確認を押す
−ＨＭＩは自動的に進行状況バーを有するステータスタブに移動し、印刷が完了するまでこのタブに留まる
［００５５］  バイオアセンブリボットが動いているので、引き続き監視する。衝突を引き起こす可能性のある望ましくない動きがある場合は、Ｅストップボタン（フレームの左上にある黄色いベースの赤いボタン）を押す。これにより、バイオアセンブリボットのすべての機能が即時に停止し、「ハードストップ」と呼ばれる。これは、進行中の印刷がある場合は印刷を停止し、これにより、印刷を再開する必要がある。押し下げられたＥストップを解除するには、物理的に元の位置に飛び出るまでボタンを時計回りに回す。これは、バイオアセンブリボットに元のコマンドを続行させない。元のコマンドは終了し、ボットは新しいコマンドを待っている。
【００５９】
［００５６］  印刷中のＨＭＩステータスウィンドウには、印刷を一時的に停止するが、再開するとボットは中断したところから起動する、一時停止ボタンがある。一時停止コマンドは「ハードストップ」ではなく、バイオアセンブリボットは行を続行し、行の終わりで一時停止する。
【００６０】
トラブルシューティング
［００５７］  バイオアセンブリボットの印刷パラメーターは、時間をかけてまたは実験的に調整する必要がある。６柱印刷の場合、印刷パラメーターの設定または準備中の不正確さから、印刷ミスの原因となるいくつかのことがある。以下は、潜在的な問題とその解決方法のリストである。
【００６１】
−複数回の試行で先端検出の失敗
〇先端検出レーザが針の位置を特定できなかった。
クリップ内でバレルを上下にスライドさせ、次にツール内でバレルができるだけ低くなっていることを確認する
〇針が曲がっている可能性がある。針をまっすぐにするか、新しい針と交換する
−針から材料が押し出されない
〇針のプライミング手順を実行し（印刷セクションの準備で）、材料が流れ始めるまで圧力を上げる。圧力が予想される押出圧力より１３７．９ｋＰａ（２０ＰＳＩ）以上高い場合、針が詰まっている可能性がある。押出せずに２時間よりも長く放置されると、プルロニックは針内で乾燥し始める。針を交換する
−印刷中に針から材料が押し出されすぎている
〇これは、圧力が高すぎるためである可能性があるが、印刷速度が遅いとこれに寄与する可能性がある。まず、圧力を調整し、圧力が材料を押し出すための最小値に近い場合は速度を調整する
−チューブの幅は広いが、頂部に向かって細くなっている
〇開始遅延パラメーターが高すぎる可能性がある。このパラメーターは、ボットが印刷の中で動き始める前に分配を開始し、材料のベースの確立を助けるのに用いられる。これが高すぎる場合、開始時に多すぎる材料が分配される。開始遅延を減らす
−チューブは、最初はうまく印刷されるが、途中で壊れる
〇これは通常、圧力が低すぎるか、印刷速度が高すぎるためである。より多くの材料が押し出されて破損を防ぐように、圧力をわずかに上げる。印刷速度を調整すると効果が大きくなりすぎ、柱が非常に太くなる可能性がある
−針の端部にプルロニックな巻き上げがあり、ウェル内に印刷しない
〇これには２つの原因がある。ステージに対する先端のオフセットが正しく調整されていなかったため、ウェルプレート上ではなくウェルプレートの上方で印刷が開始されていた可能性がある。印刷の準備セクションの説明に従って、ステージに対する先端のオフセットを再調整する。問題が解決しない場合は、開始遅延を増やして、ボットが初期のマテリアルベースを形成する時間を増やす
−バイオアセンブリボットがウェルの中央に印刷されていない
〇ウェルプレートがステージのポジティブストップに完全に接触していることを確認する。動きがあると、端に向かってウェルに拡大効果が生じる可能性がある。ウェルプレートが適切な位置にある場合は、ＴＳＩＭセクションでの６柱プリントのモデリングセクションにリストされているパラメーターを用いて、チューブパターンがＴＳＩＭで作成されていることを確認されたい。それも正しく行われた場合、チューブをわずかに動かす必要があるかもしれない。ＴＳＩＭでは、すべてのオブジェクトを選択し、それらを所望の方向及び距離に移動させる。プリントが傾いているように見える場合は、左前方のウェルにあるものを除いたすべてのチューブを削除する。ＴＳＩＭセクションでの６柱印刷のモデリングセクションの説明に従ってパターンを再生成するが、それに応じてヨーを調整する
−ＨＭＩのコントロールは灰色表示されている
〇Ｅストップが押されて解除されていないか、ドアの１つが少し開いている。Ｅストップボタンを時計回りにねじって解除し、すべてのドアが完全に閉じていることを確認する
肝細胞構築プロトコル
［００５８］  所望のウェルに６柱構造を正常に印刷した後、残りのプロセスは無菌状態を維持するためにバイオセーフティキャビネットで実行することができる。印刷が完了し、バイオアセンブリボットに向けてドアを開けることが安全であるとき、ウェルプレートの蓋を取り換え、すぐに細胞構造の作成を開始する予定がある場合は、バイオセーフティキャビネットに移す。そうでない場合、ウェルプレートは湿度１００パーセントの培養機に保存されることができる。これにより、プルロニックの乾燥が防止される。肝細胞構造の作成手順は次のとおりである：
−コラーゲン：コラーゲンは、これらの構成の細胞外基質として使用される。コラーゲンを作るのに必要な材料は次のとおりである：
〇高濃度なねずみのしっぽのコラーゲンタイプ１（Ｃｏｒｎｉｎｇの整理番号３５４２４９）
〇４Ｘ  ＤＭＥＭ
・ｌｇのＤＭＥＭ低グルコースパウダー（Ｇｉｂｃｏの整理番号３１６００−０２６）
・０．３７ｇのＮａＨＣ０３
・０．４７６ｇのＨＥＰＥＳ
・総容量２５ｍＬの滅菌水に溶解
・フィルタ滅菌済み
〇滅菌水
−コラーゲンの最終濃度は、１ＸのＤＭＥＭで３ｍｇ／ｍＬである。したがって、１０ｍｇ／ｍＬの高濃度ストックから５ｍＬのコラーゲンには、１．５ｍＬの高濃度コラーゲン、１．２５ｍＬの４ＸのＤＭＥＭ、および２．２５ｍＬの滅菌水が必要である
〇ヒント：使用目的よりも約０．５ｍＬ多くのコラーゲンを作る準備をする。準備手順で一部の容量が失われる
〇ヒント：コラーゲンを混合するときは、ゲル化を防ぐために冷たいピペットを使用することを勧める
〇ヒント：混合中は、気泡を防ぐように優しくする。これらは取り除くのが非常に難しい場合がある
−コラーゲンは、使用準備が整うまで、無菌状態で氷上にて保管する必要がある。暖かい温度でコラーゲンがゲル化し始める
細胞培養
−構築物の肝細胞および非実質細胞の濃度と必要な細胞の総数とを決定する
−肝細胞を３７°Ｃの水浴で簡単に解凍し、解凍培地に加える
−ＮＰＣを３７°Ｃの水浴で簡単に解凍し、解凍培地に加える
−適切な容量の培地を取り除いて所望の数の細胞を得る。肝細胞とＮＰＣの両方に対してこれを行う
−所望の容量の肝細胞及びＮＰＣ溶液を一緒に加え、６０ＸＧで１０分間遠心する。肝細胞はＮＰＣをペレットに引き込むことを助ける
−上澄みを吸引する
−所望の量のコラーゲンに細胞ペレットを再けん濁する
−ピペットを用いて、コラーゲン細胞けん濁液９０ｕＬを各ウェルに分注する。これにより、少量のプルロニック柱が覆われないままになる
〇ヒント：ピペットの先端をウェルの壁に対して当てて、プルロニック柱を乱さないようにゆっくりと分注する
〇ヒント：１ｍＬの血清ピペットを使用する場合は、０．３ｍＬの残留容量を超えて分注しようとしない。これは、予想よりも迅速な分注とウェルのオーバーフローとが発生する可能性がある
−すべてのウェルが満たされたら、プレートを培養器に３０分間置いてコラーゲンをゲル化させる
−ゲル化後、各ウェルに肝細胞維持培地１００ｕＬを加える。これは、細胞に栄養を与え、プルロニックゲルを溶解し始める
−３０分間培養器に戻す
−１５０ｕＬに設定されたマイクロピペットを介してウェルから培地と溶解プルロニックとを慎重に除去する
〇ヒント：ウェルプレートを平らにして、マイクロピペットの先端をウェル内に斜めに置く。これにより、細胞コンストラクトがウェルからマイクロピペットの先端に引き抜かれなくなる
−１００ｕＬの新鮮な培地を各ウェルに加え、培養器に戻す
−このように培地を毎日交換する
−薬物治療もこのように行われる
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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