(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘリコバクター・ピロリのカタラーゼにおけるアミノ酸配列：RIPERVVHAKGSGAYGTFTV(配列番号２)若しくはKNPENYFAEVEQAAFSPANV(配列番号３)又はそれらの一部と反応する抗体又はその断片を用いる、生体試料中のヘリコバクター・ピロリを検出する免疫学的測定方法。
【請求項２】
免疫学的測定方法が免疫凝集法、酵素免疫測定法、化学発光免疫測定法、電気化学発光免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射性免疫測定法、イムノクロマトグラフィー法、ウェスタンブロット法及びイムノブロット法から成る群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
免疫学的測定方法がサンドイッチ法である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
サンドイッチ法が酵素免疫測定法である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
酵素免疫測定法が、ルシフェラーゼを標識酵素として使用する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
ルシフェラーゼがホタルルシフェラーゼである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
生体試料が糞便である、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
ヘリコバクター・ピロリのカタラーゼにおけるアミノ酸配列：RIPERVVHAKGSGAYGTFTV(配列番号２)若しくはKNPENYFAEVEQAAFSPANV(配列番号３)又はそれらの一部と反応する抗体又はその断片。
【請求項９】
請求項８記載の抗体又はその断片を固定化した不溶性担体。
【請求項１０】
請求項８記載の抗体もしくはその断片、又は請求項９記載の不溶性担体を含む、生体試料中のヘリコバクター・ピロリ検出用免疫学的測定試薬。
【請求項１１】
請求項１０記載の試薬を含む、生体試料中のヘリコバクター・ピロリ検出用免疫学的測定試薬キット。
【請求項１２】
請求項１０記載の試薬を用いる生体試料中のヘリコバクター・ピロリの検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、生体試料におけるヘリコバクター・ピロリのカタラーゼを抗原とし、その抗原の特定のアミノ酸配列と反応する抗体を用いて当該抗原を検出することによって、ヘリコバクター・ピロリの感染を検査する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘリコバクター・ピロリに感染すると、胃癌のリスクが高まることが知られている。そのヘリコバクター・ピロリの感染の診断を補助するものとして、迅速ウレアーゼ試験、鏡検法、培養法、尿素呼気試験、抗体検査、抗原検査等が知られている。特に、糞便検体を用いる便中のヘリコバクター・ピロリ抗原検査は、検体の採取・取り扱いが煩雑であるものの、糞便検体の採取部位に依らず非侵襲的且つ直接的に検査できる方法であり、有用である。
【０００３】
ヘリコバクター・ピロリの抗原としては、ウレアーゼ(特許文献１及び２)やヘリコバクター・ピロリの表面抗原であるLPS抗原(特許文献３)、フラジェリン等が知られている。特に、糞便検体中のヘリコバクター・ピロリの抗原として、ネイティブなカタラーゼを測定することによってヘリコバクター・ピロリの感染を判定することが有用とされており(例えば特許文献４〜７)、例えば、特許文献５には、消化管排泄物中に存在するヘリコバクター・ピロリのネイティブな(立体構造を保持し活性を有する)カタラーゼを検出することにより、ヘリコバクター・ピロリへの感染を判定することを特徴とする検査方法が開示されている。ヘリコバクター・ピロリの検査キットも各種市販されている。
【０００４】
しかしながら、従来において、カタラーゼ構造遺伝子が変異又は一部欠損しているヘリコバクター・ピロリ感染者がいることが示唆されていること(非特許文献１)から、臨床現場では、ネイティブなカタラーゼを測定する方法より、さらに高感度なヘリコバクター・ピロリ感染の検査方法が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第4219402号公報
【特許文献２】特開平11-318490号公報
【特許文献３】特許第4054681号公報
【特許文献４】特許第3393855号公報
【特許文献５】特許第3504633号公報
【特許文献６】特許第4763149号公報
【特許文献７】特許第4443117号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】神島雄一郎ら, Progress in Medicine, 1999年, Vol. 19, No. 5, pp. 1292-1296
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上述の実情に鑑み、生体試料においてヘリコバクター・ピロリのカタラーゼを高感度に検出可能な、ヘリコバクター・ピロリの感染を検査する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、生体試料におけるヘリコバクター・ピロリの変性カタラーゼを抗原とし、その抗原の特定のアミノ酸配列と反応する抗体を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下を包含する。
（１）ヘリコバクター・ピロリのカタラーゼにおけるアミノ酸配列：RIPERVVHAKGSGAYGTFTV(配列番号２)若しくはKNPENYFAEVEQAAFSPANV(配列番号３)又はそれらの一部と反応する抗体又はその断片を用いる、生体試料中のヘリコバクター・ピロリを検出する免疫学的測定方法。
（２）免疫学的測定方法が免疫凝集法、酵素免疫測定法、化学発光免疫測定法、電気化学発光免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射性免疫測定法、イムノクロマトグラフィー法、ウェスタンブロット法及びイムノブロット法から成る群より選択される、（１）記載の方法。
（３）免疫学的測定方法がサンドイッチ法である、（１）記載の方法。
（４）サンドイッチ法が酵素免疫測定法である、（３）記載の方法。
（５）酵素免疫測定法が、ルシフェラーゼを標識酵素として使用する、（４）記載の方法。
（６）ルシフェラーゼがホタルルシフェラーゼである、（５）記載の方法。
（７）生体試料が糞便である、（１）〜（６）のいずれか１記載の方法。
（８）ヘリコバクター・ピロリのカタラーゼにおけるアミノ酸配列：RIPERVVHAKGSGAYGTFTV(配列番号２)若しくはKNPENYFAEVEQAAFSPANV(配列番号３)又はそれらの一部と反応する抗体又はその断片。
（９）（８）記載の抗体又はその断片を固定化した不溶性担体。
（１０）（８）記載の抗体もしくはその断片、又は（９）記載の不溶性担体を含む、生体試料中のヘリコバクター・ピロリ検出用免疫学的測定試薬。
（１１）（１０）記載の試薬を含む、生体試料中のヘリコバクター・ピロリ検出用免疫学的測定試薬キット。
（１２）（１０）記載の試薬を用いる生体試料中のヘリコバクター・ピロリの検査方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る変性カタラーゼとも反応する抗体によれば、生体試料におけるヘリコバクター・ピロリ感染の検査において、従来のネイティブなカタラーゼを抗原とする測定法よりも高い感度でヘリコバクター・ピロリを検出することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
本発明に係る方法(以下、「本方法」と称する)は、ヘリコバクター・ピロリのカタラーゼにおけるアミノ酸配列：RIPERVVHAKGSGAYGTFTV(配列番号２)若しくはKNPENYFAEVEQAAFSPANV(配列番号３)又はそれらの一部と反応する抗体又はその断片(以下、「本発明に係る抗体又はその断片」と称する)を用いて、生体試料中のヘリコバクター・ピロリを検出する免疫学的測定方法である。本方法は、ヘリコバクター・ピロリ感染の検査方法、ヘリコバクター・ピロリ感染を検査するためのin vitroにおけるデータ収集方法等ということもできる。
【００１３】
ヘリコバクター・ピロリのカタラーゼは、分子量約50kDaのサブユニットが4個集合した4量体構造を有する。ヘリコバクター・ピロリのカタラーゼのアミノ酸配列を配列番号１に示す。以下では、「ヘリコバクター・ピロリのカタラーゼ」を単に「カタラーゼ」と称する場合がある。
【００１４】
「ネイティブなカタラーゼ」とは、活性を有するヘリコバクター・ピロリのカタラーゼを意味する。すなわち、ネイティブなカタラーゼは4個のサブユニットを有し、立体構造を保持していると考えられる。また、「変性カタラーゼ」とは、SDSや還元剤等の変性剤で変性・乖離され、立体構造がほどかれたヘリコバクター・ピロリのカタラーゼを意味する。すなわち、変性カタラーゼは立体構造がほどかれたサブユニットに相当するものであってもよい。
【００１５】
本発明に係る抗体又はその断片は、ネイティブなカタラーゼと変性カタラーゼとの双方に反応する抗体又はその断片である。換言すれば、本発明に係る抗体又はその断片は、ヘリコバクター・ピロリのカタラーゼについて立体構造の保持や活性の有無を要求しない抗体又はその断片であり、変性したヘリコバクター・ピロリのカタラーゼ抗原をウェスタンブロット等によって検出できる。例えば、カタラーゼ活性が確認されたヘリコバクター・ピロリのリコンビナントカタラーゼ(59.4kDa)を、電気泳動(SDS-PAGE)した後、ニトロセルロース膜に転写し、1次抗体として本発明に係る抗体又はその断片、2次抗体としてHRP標識抗マウス抗体を用いることで、検出(ウェスタンブロッティング)することができる。一方、ネイティブなカタラーゼに特異的な抗体は、立体構造を保持し活性を有するヘリコバクター・ピロリのカタラーゼにしか反応しない抗体であり、変性したヘリコバクター・ピロリのカタラーゼ抗原とは反応しないため、SDS等によりカタラーゼ抗原が変性してしまうウェスタンブロット等に使用することはできない。
【００１６】
本方法によれば、本発明に係るネイティブなカタラーゼと変性カタラーゼとの双方に反応する抗体又はその断片を使用することで、ヘリコバクター・ピロリ感染の検査において、従来のネイティブなカタラーゼのみを抗原とする測定法よりも高い感度でヘリコバクター・ピロリを検出することができる。
【００１７】
本発明に係る抗体は、カタラーゼの配列番号１に示すアミノ酸配列における第49番目〜第68番目のアミノ酸配列に相当する配列番号２に示すアミノ酸配列若しくは第301番目〜第320番目のアミノ酸配列に相当する配列番号３に示すアミノ酸配列又はそれらの一部と反応する抗体である。ここで、配列番号２又は３に示すアミノ酸配列の一部とは、配列番号２又は３に示すアミノ酸配列に含まれる5個以上、好ましくは6個以上、より好ましくは7個以上、及び20個以下、好ましくは18個以下、より好ましくは16個以下の連続したアミノ酸残基、或いは、配列番号２又は３に示すアミノ酸配列に含まれる3個以上、好ましくは4個以上、より好ましくは5個以上、及び10個以下、好ましくは8個以下、より好ましくは6個以下の連続したアミノ酸残基の少なくとも2つ以上の組み合わせを意味する。
本発明に係る抗体としては、例えばモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、それらの混合物が挙げられる。
【００１８】
モノクローナル抗体は、通常のモノクローナル抗体の作製方法によって作製できる。例えば、マウスを使った以下の方法が挙げられる。具体的には、免疫原として、配列番号２若しくは３に示すアミノ酸配列もしくはそれらの一部を含む(又はそれから成る)ペプチド又はカタラーゼ（配列番号１）もしくはカタラーゼ（配列番号１）を含む溶菌液（抽出物）でマウスを免疫した後、その脾臓を摘出し、脾臓由来のB細胞を調製し、別に増殖させたマウスミエローマ細胞と電気融合法等により細胞融合させ、B細胞とミエローマ細胞が融合して出来た細胞(ハイブリドーマ)を、選択培地を利用して増殖及びクローニングを行う。その結果、発育したコロニーが配列番号２若しくは３に示すアミノ酸配列又はそれらの一部に対する抗体を産生しているか否かを酵素免疫測定法やウェスタンブロット等により確認する。配列番号２若しくは３に示すアミノ酸配列又はそれらの一部に対する抗体を産生していると認められた細胞をクローニングし、抗体産生細胞株を得る。得られた抗体産生細胞株を培養し、その培養上清又は培養細胞をマウスの腹腔内で増殖させて得られた腹水より抗体を精製し、配列番号２若しくは３に示すアミノ酸配列又はそれらの一部と反応するモノクローナル抗体を得ることができる。
【００１９】
また、ポリクローナル抗体は、通常のポリクローナル抗体の作製方法によって作製できる。例えば、免疫原として配列番号２若しくは３に示すアミノ酸配列又はそれらの一部を含む(又はそれから成る)ペプチド又はカタラーゼ（配列番号１）でウサギを免疫した後、血液を採取して抗血清を得る。得られた抗血清からポリクローナル抗体を精製し、配列番号２若しくは３に示すアミノ酸配列又はそれらの一部と反応するポリクローナル抗体を得ることができる。
【００２０】
本発明に係る抗体は、いずれの免疫グロブリン(Ig)クラス(IgA、IgG、IgE、IgD、IgM、IgY等)及びサブクラス(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等)のものであってもよい。また、免疫グロブリンの軽鎖は、κ鎖又はλ鎖のいずれであってもよい。
【００２１】
本発明に係る抗体断片(フラグメント)は、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、Fd、Fabc等を含む。このような抗体断片の作製方法は当技術分野で公知であり、例えばパパイン、ペプシン等のプロテアーゼによる抗体分子の消化により得ることができる。
【００２２】
また、本発明に係る抗体又はその断片は、Bacteroides fragilis、Bacillus subtilis、Campylobacter jejuni、Helicobacter felis、Helicobacter bizzozeronii、Helicobacter mustelae、Escherichia coli、Campylobacter coli、Bacteroides vulgatus、Bifidobacterium infantis及びBifidobacterium breveからなる群のうち少なくとも1つの菌種とは交差反応しないものである。
【００２３】
本方法では、本発明に係る抗体又はその断片を用いて、生体試料中のヘリコバクター・ピロリを免疫学的測定方法により検出する。具体的には、生体試料中のヘリコバクター・ピロリのカタラーゼ抗原と本発明に係る抗体又はその断片とを接触させ、抗原抗体反応を生じさせ、形成した免疫複合体に基づいて当該生体試料中のヘリコバクター・ピロリのカタラーゼ抗原を検出又は測定する。
【００２４】
本方法に用いられる生体試料は、ヘリコバクター・ピロリが存在し得るものであればよく、特に制限されず、固体及び液体のいずれであってもよい。例えば、糞便、消化液(唾液、胃液、胃洗浄液等)等が用いられる。本発明に係る抗体は各種消化管内で変性作用を受けたヘリコバクター・ピロリのカタラーゼを検出可能であることから、生体試料として糞便を用いる際に、本発明は特に有用である。生体試料は、予め保存用溶液や希釈用溶液と混合されていてもよく、例えば、便潜血検査用の採便容器やBL採便容器（栄研化学）中の保存用溶液を使用してもよい。なお、糞便を生体試料として使用する場合、便潜血検査に用いられる採便容器にて採取した糞便を使用することもできる。これにより、例えば、便潜血検査の際に、同一の検体を用いて、ヘリコバクター・ピロリの感染検査もまた行うこともでき、再度糞便を採取する必要がない。
【００２５】
免疫学的測定方法は、抗体又はその断片を用いる測定法であればよく、本発明に係る抗体又はその断片を用いることにより、所望の効果を奏するものである。免疫学的測定方法としては、例えば、標識物質で標識された抗原又は抗体を用いる標識イムノアッセイが挙げられ、特に、免疫比ろう法、免疫比濁法等によるラテックス凝集法や金コロイド凝集法等の免疫凝集法、酵素免疫測定法、化学発光免疫測定法、電気化学発光免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射性免疫測定法、及びイムノクロマトグラフィー法等のサンドイッチ法、ウェスタンブロット法、イムノブロット法等を挙げることができ、特に限定されない。
【００２６】
検出方法としては、例えば、反応液の吸光度や散乱光、発色、発光、蛍光等を光学的手法により測定する方法、標識した放射性同位体の放射能を測定する方法などが挙げられる。
【００２７】
上記酵素免疫測定法としては、例えば、ELISA法、生物発光酵素免疫測定法、化学発光酵素免疫測定法が挙げられる。また、生物発光酵素免疫測定法としては、BLEIA(登録商標)法が挙げられる。
【００２８】
BLEIA（登録商標）法は、例えば、固相として磁性粒子に抗体（又は抗原）を結合させ、当該抗体（又は抗原）と検体中の抗原（又は抗体）を反応させ、ルシフェラーゼで標識した抗体を用いて免疫反応を行い、基質としてルシフェリンを用いて、ルシフェラーゼ複合体の酵素活性を生物発光で検出し、生体試料中の物質を測定又は検出する測定方法である。
【００２９】
標識イムノアッセイの場合には固相化抗体及び標識抗体のうち少なくとも一方が本発明に係る抗体又はその断片であればよい。また、固相化抗体及び標識抗体は双方を同一の抗体としてもよく、異なる抗体としてもよい。サンドイッチ法では、固相化された抗体と、標識物質で標識された抗体とで、試料中の抗原（ヘリコバクター・ピロリのカタラーゼ）をサンドイッチし、標識物質自体、又は酵素等の標識物質に対する基質等を加えて発色等させることにより、検体中のヘリコバクター・ピロリのカタラーゼを検出してもよい。
【００３０】
抗体又はその断片を固定化する固相担体としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ラテックス、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス、又は磁性体等の材質より成る粒子、マイクロプレート、試験管、スティック、又は試験片等の形状の不溶性担体を用いることができる。
不溶性担体の粒子径としては、0.01〜50μm、0.1〜10μmが好ましく、より好ましくは0.5〜5μmであるが、特にこの範囲に限定されない。
【００３１】
固相化抗体は、固相担体と抗体又はその断片を物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法によって結合させることにより調製することができる。
【００３２】
抗体又はその断片を標識抗体とするための標識としては、それ自体が蛍光、発光又は発色する物質であってもよいが、基質と反応して蛍光、発光又は発色を生じる酵素であってもよい。
また、標識としては、酵素と反応して蛍光、発光若しくは発色を生じる酵素と特異的に結合できる分子であってもよい。
【００３３】
例えば、このような酵素として、ルシフェラーゼを用いることができる。酵素がホタルルシフェラーゼの場合、基質はホタル・ルシフェリンなどであってよい。また、酵素は、ウミホタルルシフェラーゼ(基質(Luciferin)＝イミダゾピラジノン誘導体)、夜光虫ルシフェラーゼ(基質＝夜光虫Luciferin)、オワンクラゲイクオリン(基質＝セレンテラジン)、ウミシイタケルシフェラーゼ(基質＝セレンテラジン)、バクテリアルシフェラーゼ(基質＝フラビンモノヌクレオチド)等であってもよい。さらには、酵素として特許第3466765号公報に記載のビオチン化ルシフェラーゼを、基質として特許第4379644号公報や特許第4503724号公報に記載のルシフェリンを使用してもよい。
【００３４】
また、酵素として、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)を用いてよい。この場合、基質は、o-フェニレンジアミン(発色)、テトラメチルベンチジン(TMBZ)(発色)、ルミノール(化学発光)等であってよい。
【００３５】
さらに、酵素として、アルカリホスファターゼ(ALP)を用いてもよい。この場合、その基質は、p-ニトロフェニルホスファート(発色)、AMPPD(登録商標)(3-(2'-spiroadamantane)-4-methoxy-4-(3''-phosphoryloxy)phenyl-1,2-dioxetane disodium salt)(化学発光)等であってよい。
基質と反応して蛍光、発光又は発色を生じる酵素が、ストレプトアビジンと結合した酵素の場合、標識はビオチンであってもよい。
【００３６】
ビオチンは分子量約200の化合物でアビジンやストレプトアビジン等と特異的に結合する。別名ビタミンHと呼ばれることからも分かるように、生体に必要不可欠な微量成分の一つである。アビジンやストレプトアビジンとの親和性がきわめて高い上に安定であるため、タンパク質や核酸を、アビジンやストレプトアビジンを介して標識したり固相化したりするために用いられる。タンパク質や核酸と結合するために各種の官能基を導入したビオチンの誘導体が市販されている。
【００３７】
一方、アビジンは分子量約66000の塩基性タンパク質、ストレプトアビジンは分子量約52000の弱酸性〜中性のタンパク質で、4個のサブユニットから構成される。熱やタンパク質分解酵素に対しては安定であり、4個のビオチン結合部位を持つ。卵白から精製されたアビジンやStreptomyces avidiniiから精製されたストレプトアビジンが代表的である。ストレプトアビジンの方が、非特異結合が少ないことから、アッセイ系にはストレプトアビジンがよく用いられる。アビジンやストレプトアビジンとビオチンの結合反応は二つの物質を混合するだけで特別な反応条件を必要としない。
【００３８】
また、本発明に係る試薬は、本発明に係る抗体又はその断片を含む、生体試料中のヘリコバクター・ピロリ検出用免疫学的測定試薬であり、本方法に使用するものである。例えば、免疫学的測定方法の種類に応じて、本発明に係る試薬は、本発明に係る抗体又はその断片を固相化抗体(例えば、不溶性担体に固定化された本発明に係る抗体又はその断片)及び/又は標識抗体の形態で含むことができる。
【００３９】
さらに、本発明に係る試薬は、キット化することもできる。本発明に係るキットは、本発明に係る試薬以外に、例えば免疫学的測定方法において使用する試薬、容器、プレート、使用説明書等をさらに含むことができる。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４１】
i．抗体の作製と試験
ヘリコバクター・ピロリを微好気環境下で5日間培養した後、遠心分離により集菌してからリン酸緩衝液に再懸濁する操作を繰り返してヘリコバクター・ピロリを洗浄した。洗浄したヘリコバクター・ピロリをリン酸緩衝液で懸濁し、超音波ホモジナイザーを用いて破砕した。破砕したヘリコバクター・ピロリを遠心分離し、その遠心上清を抽出物として得て免疫原とした。
【００４２】
得られた免疫原50〜100μgをマウス(BALB/c)に2週間間隔で3〜5回免疫した。免疫後の脾細胞とマウスミエローマ細胞とを融合し、融合された細胞を限外希釈法にてクローニングした。細胞をクローニング後、免疫原を固相化したELISA法でスクリーニングし、ヘリコバクター・ピロリ抗原と反応を示す抗体を産生する細胞(CHP001〜CHP006)を得た。抗体産生が確認された細胞を培養し、培養上清中に産生された抗体をプロテインA又はプロテインGを用いて精製し、各抗体（以下、CHP001〜CHP006と記載することもある）を得た。
【００４３】
また、免疫原をウサギ(PHP001〜PHP003)に2週間間隔で3〜5回免疫し、血液を採取して抗血清を得た。得られた抗血清から抗体をプロテインA又はプロテインGを用いて精製し、各抗体（以下、PHP001〜PHP003と記載することもある）を得た。
【００４４】
得られた各抗体を組み合わせて試薬を作製し、上述のヘリコバクター・ピロリからの抽出物の希釈系列を試料として、BLEIA法により測定した(試薬及びBLEIA法の詳細は、下記iv.糞便検体中ヘリコバクター・ピロリの検出における、BLEIA法参照)。希釈系列に対して比例的な反応が得られたのは、CHP001、CHP002、CHP003、CHP004、CHP005、CHP006、PHP003から得られた抗体を組み合わせたときであった。
【００４５】
続いて、これらの7種の抗体を表１に示す通り組み合わせて作製した試薬13種と、ピロリ抗原検出用EIAキットの市販品A及びBを用いて、糞便検体201例を試料として測定した。なお、作製した試薬13種については、上述のヘリコバクター・ピロリからの抽出物 1.5ng/mLを試料とし、BLEIA法により測定した測定値をカットオフ、すなわち1COI（COI：カットオフインデックス）とし、当該カットオフの発光強度に対する試料の発光強度の比を測定値(COI)として算出した後、1COI未満を陰性、1COI以上を陽性と判定した。その結果、201例のうち172例は全ての試薬で陰性と判定され、26例は全ての試薬で陽性と判定され、各試薬及び市販品A及びBの測定結果は一致したが、3例において各試薬で判定が乖離し、判定が一致しなかった。判定が乖離した3例の糞便検体の結果を表１に示す。表１には、固相に固定化した抗体と、標識に使用した抗体を記載した。
【００４６】
最終的に、判定が乖離した3検体において、3例で陰性となったCHP001、3例で陽性となったCHP002、CHP003、及びCHP006を、正確にヘリコバクター・ピロリを検出しうるモノクローナル抗体の候補として選択すると共に、ポリクローナル抗体であるPHP003について、これらの抗体の解析を行った。
【００４７】
【表１】
0006867529.tif 000002
【００４８】
ii．抗体の特性評価
［精製リコンビナントヘリコバクター・ピロリ カタラーゼとの反応性］
30％過酸化水素水10μLに0.02mg/mL精製リコンビナントヘリコバクター・ピロリ カタラーゼ(59.4kDa)(Seramun Diagnostica GmbH社製, AGX-5-000-0648)を2μL添加し、カタラーゼ活性を確認した。
【００４９】
カタラーゼ活性が確認されたヘリコバクター・ピロリのリコンビナントカタラーゼを、約1％のドデシル硫酸ナトリウム及び約10mMのジチオスレイトールの存在下で95℃以上に15分間加熱して変性させ、電気泳動(SDS-PAGE)した後、ニトロセルロース膜に転写し、1次抗体として各抗体(CHP001、CHP002、CHP003、CHP006)、2次抗体としてHRP標識抗マウス抗体を用い、発光により検出(ウェスタンブロッティング)した。その結果、CHP002、CHP003、CHP006では検出できたが、CHP001では検出できなかった。これにより、CHP002、CHP003、CHP006は、変性カタラーゼと反応できることが確認された。
【００５０】
また、固相化抗体を用いない点、試料として糞便検体を用いない点、及びカタラーゼ活性が確認されたヘリコバクター・ピロリのリコンビナントカタラーゼを変性させることなく結合させた磁性粒子並びに酵素で標識した各抗体(CHP001、CHP002、CHP003、CHP006、PHP003)を用いた点を除いて、後述のiv.糞便検体中ヘリコバクター・ピロリの検出における、BLEIA法と同様に、各抗体との反応性を確認した。この結果、CHP001、CHP002、CHP003、CHP006、PHP003のいずれの抗体においても反応が確認された。これにより、CHP001、CHP002、CHP003、CHP006、PHP003は、ネイティブなカタラーゼと反応できることが確認された。
【００５１】
［菌株による反応性の比較及び他菌種との反応性］
ピロリ菌のカタラーゼと高い相同性を示す菌としてBacteroides fragilis、Bacillus subtilis、Campylobacter jejuni、ヘリコバクター属として、培養が成功したHelicobacter felis、Helicobacter bizzozeronii、Helicobacter mustelae、及びその他の細菌について交差反応性を確認した。
【００５２】
PHP003においてHelicobacter bizzozeronii、Helicobacter mustelaeとの弱い交差反応が認められたが、CHP001、CHP002とCHP003、CHP006では、Bacteroides fragilis、Bacillus subtilis、Campylobacter jejuni、Helicobacter felis、Helicobacter bizzozeronii、Helicobacter mustelae、Escherichia coli、Campylobacter coli、Bacteroides vulgatus、Bifidobacterium infantis、Bifidobacterium breveについて交差反応は認められなかった。
【００５３】
iii．抗体が反応するアミノ酸配列の解析
上記CHP001、CHP002、CHP003、CHP006、PHP003について、ペプチドマッピングにより抗体が反応するアミノ酸配列の解析を行った。ペプチドマッピングによるアミノ酸配列解析は、次のiv.糞便検体中ヘリコバクター・ピロリの検出におけるBLEIA法において、試料としてビオチン化ペプチドを用いた点を除き、同様の方法で行った。参考例として、ヘリコバクター・ピロリのリコンビナントカタラーゼと各抗体の反応性についても、同様の方法で確認した。
【００５４】
具体的には、アミノ酸配列解析は、以下の工程により行った。
1) 各種抗体を磁性粒子に固相化又は抗体無添加磁性粒子を調製した。
2) 各種抗体固相化磁性粒子又は抗体無添加磁性粒子溶液、各種ビオチン化ペプチド60pmolをそれぞれ混合し、37℃で15分間反応させた。
3) 磁性粒子を洗浄液で洗浄し、洗浄液を除去した後、ストレプトアビジン-ビオチン化ルシフェラーゼを添加し、37℃で15分間反応させた。
4) 磁性粒子を洗浄液で洗浄し、洗浄液を除去した後、ルシフェラーゼに対する基質液（ルシフェリン溶液）を添加し、発光強度を測定した。
5) それぞれの試料について、[各種抗体固相化磁性粒子の発光強度]/[抗体無添加磁性粒子の発光強度]を算出した。
6）[各種抗体固相化磁性粒子の発光強度]/[抗体無添加磁性粒子の発光強度]の値が他の配列の算出値と比べて明らかに高いペプチド配列を、抗体が反応するアミノ酸配列と判定した。
*2)〜4)は全自動生物化学発光免疫測定装置BLEIA-1200(栄研化学社製)にて測定した。
結果を以下の表２に示す。
【００５５】
【表２】
0006867529.tif 000003
【００５６】
iv．糞便検体中ヘリコバクター・ピロリの検出
反応するアミノ酸配列を解析した下記実施例１、２及び比較例１、２の抗体により試薬を調製し、生物発光酵素免疫測定法(BLEIA法、特開平10−239314公報に記載の方法に準じた方法)で、試料(ヒト糞便)中のヘリコバクター・ピロリの測定を行った。
【００５７】
試料：
試料は、糞便検体約35mgをBL採便容器（栄研化学）の緩衝液2mLに懸濁後、フィルター濾過して得られた糞便抽出液を試料として用いた。
【００５８】
試薬：
実施例１及び２、並びに比較例１〜３の試薬は、以下の通りであった：
〔実施例１〕試薬２：ヘリコバクター・ピロリのネイティブなカタラーゼ及び変性カタラーゼに対するモノクローナル抗体2種(固相用抗体：CHP002, 標識用抗体：CHP003)；
〔実施例２〕試薬３：試薬２と異なるヘリコバクター・ピロリのネイティブなカタラーゼ及び変性カタラーゼに対するモノクローナル抗体1種(固相及び標識用抗体：CHP006)；
〔比較例１〕試薬１：ネイティブカタラーゼ特異的抗体1種(固相及び標識用抗体：CHP001)；
〔比較例２〕試薬４：ヘリコバクター・ピロリに対するポリクローナル抗体1種(固相及び標識用抗体：PHP003)；
〔比較例３〕市販のELISAヘリコバクター・ピロリ検出キットA。
【００５９】
検体：
内視鏡検査、血清抗体価、及び尿素呼気試験により以下の基準で陽性又は陰性と臨床において診断された糞便検体133例をそれぞれ用いた。
陽性：「現感染」：《既往》除菌歴なし、《内視鏡検査》びまん発赤あり、木村・竹本分類C-2以上の萎縮、《H.pylori 感染検査》血清抗体価が10U/ml以上(陰性高値(3〜9U/ml)は尿素呼気試験(UBT)で2.5‰以上）。
陰性：「未感染」及び「既感染」
「未感染」：《既往》除菌歴なし、《内視鏡検査》びまん発赤なし、萎縮なし、《H.pylori 感染検査》血清抗体価が3U/ml未満。
「既感染」：《既往歴》除菌歴あり(除菌成功)又は除菌歴なし、《内視鏡検査》びまん発赤なし、C-2以上の萎縮、《H.pylori 感染検査》血清抗体価が3U/ml未満（陰性高値(3〜9U/ml)は尿素呼気試験(UBT)で2.5‰未満）。
【００６０】
測定方法（BLEIA法）：
特開平10-239314号公報(抗体と酵素の双方にビオチンを結合)に記載の方法で行い、固相担体として磁性粒子、検出用の酵素にビオチン化ルシフェラーゼ、基質にルシフェリンを使用し、抗体として、試薬１〜４の各抗体を用いた。
1) 各種固相用抗体を磁性粒子に固相化し、各種抗体固相化磁性粒子を作製した。
具体的には、50mMリン酸緩衝液(pH7.0)中で、市販の磁性粒子1mgに対して5μgの各種抗体を反応させ、希釈液(0.1％BSA、0.09％アジ化ナトリウムを含む50mMリン酸緩衝液(pH7.0))で希釈して1.5mg/mLの抗体固相化磁性粒子を作製した。
2) 各種標識用抗体とビオチン化試薬を混合し、各種ビオチン標識抗体を作製した。
具体的には、50mMリン酸緩衝液(pH8.0)中で、各種抗体溶液とSulfosuccinimidyl N-[N'-(D-biotinyl)-6-aminohexanoyl]-6'-aminohexanoate(同仁化学)溶液をモル比1：20で混合し、30℃で2時間反応させ、抗体にビオチンを結合させた。次に50mMリン酸緩衝液(pH7.0)を用いてゲルろ過し、未反応のSulfosuccinimidyl N-[N'-(D-biotinyl)-6-aminohexanoyl]-6'-aminohexanoateを除去し、ビオチン標識抗体溶液を得た。
3) ストレプトアビジン-ビオチン化ルシフェラーゼの作製
具体的には、緩衝液(100mM塩化ナトリウム、4mM EDTA-2Na、0.09％アジ化ナトリウム、0.2％ BSAを含む0.2Mリン酸緩衝液(pH7.0))中で、50mMリン酸緩衝液(pH7.0)で溶解したストレプトアビジン(ロシュ・ダイアグノスティックス)とビオチン化ルシフェラーゼ(キッコーマンバイオケミファ)をモル比1：4で混合し、30℃で2時間反応させて、ストレプトアビジン-ビオチン化ルシフェラーゼを作製した。
4) 試薬１〜４の組合せにおいて、それぞれ、ビオチン標識抗体溶液80μLと、試料50μLと、抗体固相化磁性粒子(1.5mg/mL)20μLを混合し、37℃で15分間反応させた。
5) 磁性粒子を含む反応溶液に、BL洗浄液(栄研化学)500μLを加え、BL洗浄液を除去し、この操作を5回繰り返した。続いて、ストレプトアビジン-ビオチン化ルシフェラーゼを80μL加えて、37℃で15分間反応させた。
6) 磁性粒子を含む反応溶液にBL洗浄液(栄研化学)500μLを加え、洗浄液を除去し、この操作を5回繰り返した。続いて、BL発光試薬セット(栄研化学)のBL発光試薬１  50μLとルシフェラーゼに対する基質液(ルシフェリン溶液)であるBL発光基質液 50μLを加え、発光強度を測定した。
7) それぞれの試料及びBLEIA‘栄研’H.ピロリ抗原のキャリブレータ1、キャリブレータ2の発光強度から、COI＝(試料の発光強度−キャリブレータ1の発光強度)/((キャリブレータ2の発光強度−キャリブレータ1の発光強度)/補正係数)を算出した。
8) 1 COI未満を陰性、1 COI以上を陽性と判定した。
*4)〜8)は全自動生物化学発光免疫測定装置BLEIA-1200にて測定。
【００６１】
比較例３の市販キットについては、OD値0.1以上を陽性と判定した。
【００６２】
測定結果：
臨床診断の結果と併せて、測定結果を以下の表３に示す。
【００６３】
【表３】
0006867529.tif 000004
【００６４】
表３に示すように、臨床診断で陽性109例、陰性24例のとき、比較例３では、感度88％、特異度100％、一致率90％であり、比較例１(CHP001,ネイティブなカタラーゼを検出する抗体を用いたBLEIA法)では、感度96％、特異度100％、一致率97％であった。一方、本願発明の実施例１及び２の「RIPERVVHAKGSGAYGTFTV(配列番号２)」又は「KNPENYFAEVEQAAFSPANV(配列番号３)」に含まれるアミノ酸配列と結合しうる抗体(CHP002, CHP003, CHP006)を用いてカタラーゼを検出するBLEIA法では感度99％、特異度100％、一致率99％となり、本発明に係る抗体によれば、ヘリコバクター・ピロリをより高感度に検出できることが示され、臨床上、有用であることが示された。
【要約】
【課題】生体試料においてヘリコバクター・ピロリのカタラーゼを感度良く検出することで、より高感度なヘリコバクター・ピロリ感染の検査方法を提供することを目的とする。
【解決手段】ヘリコバクター・ピロリの変性カタラーゼと反応する抗体又はその断片を用いる、生体試料中のヘリコバクター・ピロリを検出する免疫学的測定方法。
【選択図】なし【配列表】
0006867529000001.app