(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えコリネバクテリウム・グルタミカムの、リシン生産における使用であって、
前記組換えコリネバクテリウム・グルタミカムは、コリネバクテリウム・グルタミカムにおいてプロテアーゼ遺伝子ＦｔｓＨを過剰発現することによって構築して得られることを特徴とする使用。 
【請求項２】
前記プロテアーゼ遺伝子ＦｔｓＨのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１に示されるものであることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記コリネバクテリウム・グルタミカムはＡＴＣＣ１３０３２であることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記組換えコリネバクテリウム・グルタミカムが、
（１）コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムに対してＰＣＲを実行し、ＦｔｓＨ遺伝子を増幅し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に示されるヌクレオチド配列のＦｔｓＨ遺伝子断片を得る工程と、
（２）工程（１）で得られたＦｔｓＨ遺伝子断片を過剰発現プラスミドにクローンし、組換えプラスミドを得る工程と、
（３）工程（２）で得られた組換えプラスミドをコリネバクテリウム・グルタミカムに導入し、スクリーニングして組換えコリネバクテリウム・グルタミカムを得る工程と、を含み、
工程（１）において、ＦｔｓＨ遺伝子設計を増幅するプライマーの配列として、プライマー１のヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３に示されるものであり、プライマー２のヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４に示されるものであることを特徴とする方法により構築される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
工程（１）において、ＰＣＲ増幅を、９４℃で３０秒間変性し、５５℃で３０秒間アニールし、７２℃で２分間延伸するというサイクルを３０回繰り返すことによって行うことを特徴とする請求項４に記載の使用。
【請求項６】
工程（２）において、前記過剰発現プラスミドはｐＸＭＪ１９であることを特徴とする請求項４に記載の使用。
【請求項７】
（ｉ）組換えコリネバクテリウム・グルタミカムをシード培地に接種し、培養してシード液を得る工程と、
（ｉｉ）予備処理された固定化担体を発酵培地に入れて、発酵培地と一緒に滅菌し、その後、発酵培地にシード液を仕込み、バッチ式で発酵させて発酵液を得る工程と、
を含み、
バッチの発酵が終了した毎に、得られた発酵液を新しい発酵培地で置き換え、糖が全て消耗するまでに培養して、発酵を終了させてリシンを得ることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項８】
工程（ｉ）において、シード培地における各成分の濃度は、ショ糖１５〜３５ｇ／Ｌ、ペプトン５〜１５ｇ／Ｌ、酵母パウダー１〜１０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム５〜１０ｇ／Ｌ、七水硫酸マグネシウム０．１〜１ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１〜５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム５〜１５ｇ／Ｌ、尿素１〜５ｇ／Ｌであり、溶媒は水であり、
前記培養は、２８〜３４℃、２００〜２５０ｒｐｍの条件で１０〜１４ｈ培養することであることを特徴とする請求項７に記載の使用。
【請求項９】
工程（ｉｉ）において、前記固定化担体は、綿繊維織物、不織布、ポリエステル繊維、ポリビニルアルコール繊維、ゼオライト、細菌セルロースフィルム、シルク、サトウキビバガス、及びトウモロコシの茎の中のいずれか１つ又は複数の組み合わせであり、
前記予備処理は、固定化担体を２〜８ｃｍ×２〜８ｃｍの正方形にカットし、純水で洗浄して乾燥した後、エチルアルコールに浸漬し、そして純水で洗浄した後、沸騰水浴で１０〜４０ｍｉｎ処理して乾燥することであり、
前記固定化担体の使用量は１〜１０ｇ／５００ｍＬ発酵培地であることを特徴とする請求項７に記載の使用。
【請求項１０】
工程（ｉｉ）において、発酵培地における各成分の濃度は、グルコース８０〜１２０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム３０〜５０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．５〜１．５ｇ／Ｌ、糖蜜１０〜２５ｇ／Ｌ、コーンスティープリカー１０〜２５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１〜５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄１００〜３００ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン１００〜２００ｍｇ／Ｌ、ニコチンアミド４０〜８０ｍｇ／Ｌ、パントテン酸カルシウム５〜１５ｍｇ／Ｌ、ＶＢ１  ５〜１５ｍｇ／Ｌ、硫酸銅０．５〜２ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛０．５〜２ｍｇ／Ｌ、ビオチン０．５〜２ｍｇ／Ｌ、炭酸カルシウム１０〜５０ｇ／Ｌであり、溶媒は水であり、
前記発酵は、２８〜３４℃、２００〜２５０ｒｐｍの条件下で６０〜９０ｈ発酵するであることを特徴とする請求項７記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は微生物及び発酵プロセス技術分野に関し、具体的には、生物的成膜によって連続的に発酵してリシンを生産する組換えコリネバクテリウム・グルタミカム、及びその構築方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−リシンは、アスパラギン酸ファミリーに属するアミノ酸であって、人と動物に必要である自身合成できないアミノ酸の１つであり、飼料添加剤、食品強化剤、医薬品などの面に広く適用され、それにおいて、リシン製品の９０％以上は飼料添加剤として用いられている。
【０００３】
バイオフィルムは自然界に広く存在し、バイオフィルムの形成過程において、細菌の自身分泌による細胞外ポリマー（ＥＰＳ）はバイオフィルム形成の基質であり、層別散布という特徴を有し、細菌の粘着と会合の面で重要な役割を果たす。
【０００４】
今、固定化連続発酵という技術は既に生産に実用化され、それにおいて、バイオフィルムによる固定化連続発酵は有効になった。しかしながら、コリネバクテリウム・グルタミカムでは、バイオフィルムによる固定化連続発酵はあまり開示されない。
【０００５】
コリネバクテリウム・グルタミカムは産業において重要な菌株であるが、その成膜力は極めて弱くて連続的発酵が困難であるため、当該菌株の分子修飾を行なってその成膜効果を強化させ、後期の固定化連続発酵を実現しなければならない。
【０００６】
コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）において、プロテアーゼＦｔｓＨ（ＥＣ３．４．２４．−）はＮｇｃｌ  ２６０３遺伝子がコードしたものであると知られている。ＦｔｓＨ（Ｆｉｌａｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｈ）はＡＡＡプロテアーゼファミリーに属するフィルム結合プロテアーゼである。生体において、ＦｔｓＨのオリゴマー化によって６量体の環形構造を形成し、タンパク加水分解活性サイドを６量複合体の穴の中央に埋め込むようになる。ＦｔｓＨタンパクの保存パッチは、Ｎ−エンド膜貫通領域、ＡＡＡ構造、亜鉛イオン結合パッチなどを含む。ＦｔｓＨは、ＡＴＰ酵素活性、タンパク加水分解活性及び分子シャペロン活性を有し、バイオフィルムの形成に参与し、タンパク質の質量バランスを制御し、熱ショック、高張、光ストレスなどの応答にも関係がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、従来技術の不足に対し、コリネバクテリウム・グルタミカムの成膜力を高め、従来技術においてコリネバクテリウム・グルタミカムの成膜力が弱くて固定化連続発酵に使用できないという問題を解決するために、組換えコリネバクテリウム・グルタミカムを提供した。
【０００８】
また、本発明は、上記組換えコリネバクテリウム・グルタミカムの構築方法を提供した。
【０００９】
最後に、本発明は、上記組換えコリネバクテリウム・グルタミカムの、生物的成膜によるリシン連続的発酵生産における使用を提供した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、上記した技術問題を解決するために、コリネバクテリウム・グルタミカムにおいてプロテアーゼ遺伝子ＦｔｓＨを過剰発現することによって構築して得られる組換えコリネバクテリウム・グルタミカムを開示した。
【００１１】
それにおいて、上記のプロテアーゼ遺伝子ＦｔｓＨのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１に示されるものである。
【００１２】
それにおいて、上記のコリネバクテリウム・グルタミカムはＡＴＣＣ１３０３２である。 
【００１３】
それにおいて、上記したプロテアーゼ遺伝子ＦｔｓＨを過剰発現するとは、発現担体にプロテアーゼＦｔｓＨ遺伝子配列を導入し、プロテアーゼＦｔｓＨのコピー数を増加し、プロテアーゼＦｔｓＨ活性を強化させることである。
【００１４】
上記組換えコリネバクテリウム・グルタミカムの構築方法は、
（１）コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムに対してＰＣＲを実行し、ＦｔｓＨ遺伝子を増幅し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に示されるヌクレオチド配列のＦｔｓＨ遺伝子断片を得る工程と、
（２）工程（１）で得られたＦｔｓＨ遺伝子断片を過剰発現プラスミドｐＸＭＪ１９にクローンし、組換えプラスミドｐＸＭＪ１９＊ＦｔｓＨを得る工程と、
（３）工程（２）で得られた組換えプラスミドｐＸＭＪ１９＊ＦｔｓＨをコリネバクテリウム・グルタミカムに導入し、スクリーニングして組換えコリネバクテリウム・グルタミカムを得る工程と、
を含み、
工程（１）において、ＦｔｓＨ遺伝子設計を増幅するためのプライマーの配列として、プライマー１のヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３に示されるものであり、プライマー２のヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４に示されるものである。
【００１５】
工程（１）において、上記のＰＣＲ増幅は、９４℃で３０秒間変性し、５５℃で３０秒間アニールし、７２℃で２分間延伸するというサイクルを３０回繰り返すことによって行われる。
【００１６】
工程（２）において、上記の過剰発現プラスミドはｐＸＭＪ１９である。
【００１７】
上記のプロテアーゼＦｔｓＨを過剰発現したコリネバクテリウム・グルタミカムのリシン生産における使用も、本発明の保護範囲にあり、
（ｉ）組換えコリネバクテリウム・グルタミカムをシード培地に接種し、培養してシード液を得る工程と、
（ｉｉ）予備処理された固定化担体を発酵培地に入れて、発酵培地と一緒に滅菌を行い、発酵培地へシード液を仕込み、バッチで発酵して発酵液を得る工程と、
を含み、
それにおいて、バッチの発酵が終了した毎に、得られた発酵液を新しい発酵培地で置き換え、糖が全て消耗するまでに約７０ｈ培養し、発酵を終了させてリシンを得、
それにおいて、上記の糖は、グルコース、糖蜜及びショ糖の３つの組み合わせである。
【００１８】
工程（ｉ）において、シード培地における各成分の濃度は、ショ糖１５〜３５ｇ／Ｌ、ペプトン５〜１５ｇ／Ｌ、酵母パウダー１〜１０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム５〜１０ｇ／Ｌ、七水硫酸マグネシウム０．１〜１ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１〜５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム５〜１５ｇ／Ｌ、尿素１〜５ｇ／Ｌであり、溶媒は水であり、
上記の培養は、２８〜３４℃、２００〜２５０ ｒｐｍの条件で１０〜１４ｈ培養することである。
【００１９】
工程（ｉｉ）において、上記の固定化担体は綿繊維織物、不織布、ポリエステル繊維、ポリビニルアルコール繊維、ゼオライト、細菌セルロースフィルム、シルク、サトウキビバガス及びトウモロコシの茎の中のいずれか１つ又は複数の組み合わせであり、
上記の予備処理は、固定化担体を２〜８ｃｍ×２〜８ｃｍの正方形（好ましくは５ｃｍ×５ｃｍ）にカットし、純水で洗浄してオーブンで乾燥した後、エチルアルコールで１ｈ浸漬し、そして純水で洗浄した後、沸騰水浴で１０〜４０ｍｉｎ（好ましくは２０ｍｉｎ）処理して乾燥することであり、
固定化担体の使用量は、１〜１０ｇ／５００ｍＬ発酵培地であり、
上記の滅菌は、１１５℃で１５ｍｉｎ滅菌することである。
【００２０】
工程（ｉｉ）において、発酵培地における各成分の濃度は、グルコース８０〜１２０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム３０〜５０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．５〜１．５ｇ／Ｌ、糖蜜１０〜２５ｇ／Ｌ、コーンスティープリカー１０〜２５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１〜５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄１００〜３００ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン１００〜２００ｍｇ／Ｌ、ニコチンアミド４０〜８０ｍｇ／Ｌ、パントテン酸カルシウム５〜１５ｍｇ／Ｌ、ＶＢ１ ５〜１５ｍｇ／Ｌ、硫酸銅０．５〜２ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛０．５〜２ｍｇ／Ｌ、ビオチン０．５〜２ｍｇ／Ｌ、炭酸カルシウム１０〜５０ｇ／Ｌであり、溶媒は水であり、
工程（ｉｉ）において、５００ｍＬの振盪フラスコ毎に発酵培地５０ｍＬを加え、１０％〜３０％（ｖ／ｖ）のシード液を仕込み、２８〜３４℃、２００〜２５０ｒｐｍ／ｍｉｎの条件で６０〜９０ｈ（好ましくは７２ｈ）発酵した。
【発明の効果】
【００２１】
本発明は従来技術に比べると、以下のメリットがある。
１）本発明によれば、コリネバクテリウム・グルタミカムの固定化発酵によってリシンを生産する方法を発明し、繊維（綿繊維織物、不織布、ポリエステル繊維、ポリビニルアルコール繊維、細菌セルロースフィルム、シルク、サトウキビバガス及びトウモロコシの茎）を固定化材として使用し、固定された菌体は繰り返して使用でき、連続発酵が可能になった。
２）本発明によれば、プロテアーゼＦｔｓＨを過剰発現したコリネバクテリウム・グルタミカムを構築し、コリネバクテリウム・グルタミカムの成膜力を高めるため、コリネバクテリウム・グルタミカムの固定化連続発酵はフリー発酵のオリジナル菌よりも、その産量が３８．２％向上した、また、発酵周期が２６．４％短縮された。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ｐＸＭＪ１９／＊ＦｔｓＨプラスミドアガロースゲル電気泳動図である。それにおいて、レーン１はオリジナルプラスミドｐＸＭＪ１９であり、レーン２は組換えプラスミドｐＸＭＪ１９／＊ＦｔｓＨであり、レーン３はＭａｒｋｅｒである。
【図２】コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２オリジナル菌と組換え菌の電子顕微鏡図である。
【図３】コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２オリジナル菌と組換え菌の発酵周期図である。
【図４】コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２オリジナル菌と組換え菌の、クリスタルバイオレット染色法によってバイオフィルム量を半定量的に計測する試験データである。
【図５】コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２オリジナル菌と組換え菌の固定化バッチ式発酵とフリー発酵によるリシン産量の比較図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下の実施例によれば、本発明を更に明らかに理解できる。しかしながら、当業者にとって理解しやすいように、実施例に記載された内容はただ本発明を説明するためのものであり、請求の範囲に詳細に記述される本発明はこれに制限されるべきではない。
以下の実施例に用いられるプラスミドｐＸＭＪ１９は、武漢ＭｉａｏＬｉｎｇ生物科技有限会社から購入された。特に説明しない限り、全ての酵素はＴＡＫＡＲＡから購入され、プラスミド抽出・ゲル回収キットはＴｉａｎＧｅｎから購入された。
【００２４】
実施例１：プロテアーゼＦｔｓＨ過剰発現プラスミドの構築
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の染色体を使用してＰＣＲを実行し、ＦｔｓＨ遺伝子を増幅した。
具体的には、以下のプライマー１とプライマー２を使用し、９４℃で３０秒間変性し、５５℃で３０秒間アニールし、７２℃で２分間延伸するというサイクルの反応条件で３０回繰り返してＰＣＲを実行し、２６１４ｂｐの遺伝子断片（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２）を増幅した。
【００２５】
増幅された配列はＦｔｓＨコード配列、及び２０ｂｐの担体相同の配列を含む。なお、プライマー１はＢａｍＨＩの制限酵素認識サイドを有し、プライマー２はＢａｍＨＩの制限酵素認識サイドを有する。ＢａｍＨＩ制限酵素認識サイドをボールド体で示した。
【００２６】
【表１】
0006877622.tif 000002
【００２７】
得られたポリヌクレオチドと制限酵素ＢａｍＨＩで処理されたｐＸＭＪ１９プラスミドを一段階クローンし、プロテアーゼＦｔｓＨ遺伝子を過剰発現するための組換えプラスミドｐＸＭＪ１９／＊ＦｔｓＨを得た。そのアガロースゲル電気泳動を図１に示される。レーン１はオリジナルｐＸＭＪ１９プラスミドであり、レーン２は構築されたプラスミドｐＸＭＪ１９／＊ＦｔｓＨであり、レーン３はＭａｒｋｅｒである。それにおいて、オリジナルｐＸＭＪ１９プラスミドの大きさは６６０１ｂｐであるが、組換えプラスミドｐＸＭＪ１９／＊ＦｔｓＨの大きさは９１６９ｂｐである。図から分かるように、ＦｔｓＨ遺伝子断片は既に発現プラスミドｐＸＭＪ１９に挿入された。
【００２８】
実施例２：プロテアーゼＦｔｓＨ過剰発現菌株の構築
得られたｐＸＭＪ１９／＊ＦｔｓＨ組換えプラスミドをコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２コンピテントセルに導入し、６．５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢプレートでスクリーニングし、２〜３日間培養して形質転換細胞を抽出し、そしてコロニーＰＣＲによって検証し、プロテアーゼＦｔｓＨを過剰発現した組換え菌株を得た。プライマー３とプライマー４を使用してＰＣＲを実行し、遺伝子が組換えプラスミドに挿入されたかを検証した。
【００２９】
【表２】
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【００３０】
修飾菌株が成功に構築された後、９６ウェルプレート及びＳＥＭ電子顕微鏡試験を行った。電子顕微鏡写真を図２に示される。これを一見して分るように、組換え菌によるバイオフィルムはオリジナル菌のよりも多いであった。成膜効果が向上された後、固定化連続発酵を行った。
【００３１】
実施例３：組換え菌によるリシン発酵の試験（組換え菌固定）
活性化培地成分は、グルコース１０ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母パウダー５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌである。
【００３２】
上記のシード培地としては、ショ糖２５ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母パウダー５ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム５ｇ／Ｌ、水硫酸マグネシウム・七水和物１ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１２ｇ／Ｌ、尿素５ｇ／Ｌである。
【００３３】
発酵培地の配合としては、グルコース１００ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム４０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム１ｇ／Ｌ、糖蜜２０ｇ／Ｌ、コーンスティープリカー２０ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄１５０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン１００ｍｇ／Ｌ、ニコチンアミド５０ｍｇ／Ｌ、パントテン酸カルシウム１０ｍｇ／Ｌ、ＶＢ１ １０ｍｇ／Ｌ、硫酸銅１ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛１ｍｇ／Ｌ、ビオチン２ｍｇ／Ｌ、炭酸カルシウム４０ｇ／Ｌである。
【００３４】
５０ｍＬ遠心管毎に活性化培地５ｍＬを加え、組換え菌を仕込み、３０℃、２２０ｒｐｍの条件で２０ｈ活性化した。
【００３５】
活性化終了後、それぞれシード培地５０ｍＬ入り５００ｍＬ振盪フラスコに注ぎ、３０℃、２２０ｒｐｍの条件で１２ｈ培養した。
【００３６】
５００ｍＬの振盪フラスコ毎に発酵培地５０ｍＬを注ぎ、担体も発酵培地に加えて、一緒に１１５℃で１５ｍｉｎ滅菌を行いた。
【００３７】
発酵培地にシード液５ｍＬを仕込み、３０℃、２２０ｒｐｍの条件で７２ｈ発酵した。
【００３８】
固定化連続発酵：発酵過程において、１バッチ目では菌体が既に固定化担体に吸着され、この際に、既に振盪フラスコにより約７２ｈ培養した。２バッチ目では発酵液を除去し、菌体が吸着された固定化担体を残し、新しい発酵培地５０ｍＬを注ぎ、グルコース、糖蜜及びショ糖の３つの組み合わせである糖が全て消耗するまでに約６０ｈ培養し、発酵周期のデータを測定し、図３に示される。リシン産量を図５に示される。後のバッチの固定化連続発酵にはいずれも当該方法を採用した。
【００３９】
綿繊維担体材の予備処理：綿繊維担体を５ｃｍ×５ｃｍの正方形にカットし、純水で洗浄してオーブンで乾燥した後、エチルアルコールで１ｈ浸漬し、純水で２回洗浄した後、沸騰水浴で２０ｍｉｎ処理してオーブンで乾燥し、１．５ｇ秤量し、発酵液入り振盪フラスコに加え、一緒に１１５℃で１５ｍｉｎ滅菌を行いた。
【００４０】
比較例１：オリジナル菌固定
実施例３に仕込まれた組換え菌をオリジナル菌（コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２）に変更した以外、実施例３と同じ工程で実行し、得られた発酵周期データを図３に示される。リシン産量を図５に示される。
【００４１】
比較例２：組換え菌のフリー発酵（組換え菌）
発酵培地に担体を加えない以外、実施例３と同じ工程で実行し、得られた発酵周期データを図３に示される。リシン産量を図５に示される。
【００４２】
比較例３：オリジナル菌のフリー発酵（オリジナル菌）
実施例３に仕込まれた組換え菌をオリジナル菌（コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２）に変更し、発酵培地に担体を加えない以外、実施例３と同じ工程で実行し、得られた発酵周期データを図３に示される。リシン産量を図５に示される。 
【００４３】
図３から分かるように、固定化発酵はフリー発酵に比べると、その周期が短縮され、それにおいて、組換え菌の固定化発酵周期はオリジナル菌よりも２６．４％短縮した。从図５から分かるように、固定化発酵はフリー発酵に比べると、得られたリシンの産量が向上し、また、組換え菌の固定化産量はオリジナル菌よりも３８．２％向上した。上記の発酵周期の短縮及びリシン産量の向上は、いずれも固定化発酵と組換え菌を使用してコリネバクテリウム・グルタミカムの成膜力を強化させたからである。
【００４４】
実施例４：還元糖の測定方法
ＤＮＳ（ジニトロサリチル酸）を使用し、アルカリ条件で還元糖と酸化還元反応し、３−アミノ−５−ニトロサリチル酸を生成した。当該生成物は沸騰条件で赤茶の色を呈し、一定の濃度範囲内には、色の濃淡は還元糖の含有量に比例し、紫外分光光度計（ＯＤ５４０）で還元糖含有量を測定した。
【００４５】
見込み糖含有量を０．１〜１．０ｍｇ／ｍＬの間にするようにサンプルを適切に希釈した後、希釈後のサンプル０．５ｍＬを１０ｍＬ目盛りチューブに取り、ＤＮＳ  ０．５ｍＬを加え、沸騰水で５ｍｉｎ沸騰した直後、５ｍｉｎ冷却し、純水８ｍＬを加えて均一に混合し、また、純水０．５ｍＬとＤＮＳサンプル０．５ｍＬをブランクサンプルとする。予め本試験に用いられるＤＮＳ還元糖含有量の標準曲線を作製しておき、紫外分光光度計によって５４０ｎｍ波長で吸光度を計測し、還元糖含有量の計量とする。
【００４６】
実施例５：リシン含有量の測定
発酵液毎に１００μＬサンプリングし、０．１Ｍ塩酸溶液で５０倍希釈し、サンプル毎に希釈液４００μＬを取り、ＰＩＴＣプレカラム誘導体化を実行し、ＲＰ−ＨＰＬＣ法でリシン含有量を計測し、サンプル毎のリシン濃度を算出した。
【００４７】
オリジナル菌と本発明に係る構築の組換え菌で固定化連続発酵試験を行い、１０バッチの発酵試験による発酵結果を表３に示される。図５から分かるように、修飾後の菌株の固定化連続発酵によるリシン産量は、フリー発酵のオリジナル菌よりも３８．２％向上した。図３から分かるように、修飾後の菌株の固定化発酵周期はオリジナル菌よりも２６．４％短縮された。
【００４８】
【表３】
0006877622.tif 000004
【００４９】
実施例６：クリスタルバイオレット染色法によるバイオフィルム量の半定量的な計測
無色９６ウェルプレートに発酵培地２００μＬを加え（固定化担体と炭酸カルシウムを加えない）、そしてオリジナル菌と組換え菌２０μＬをそれぞれ加えて培養し、１２ｈ、２４ｈ、３６ｈ、４８ｈ経過した時点に、クリスタルバイオレット染色法とＥＬＩＳＡリーダーでＯＤ５７０ｎｍを計測した。図４から分かるように、プロテアーゼＦｔｓＨを過剰発現した組換え菌はその成膜力が明らかに向上した。
【００５０】
本発明によると、プロテアーゼＦｔｓＨを過剰発現したコリネバクテリウム・グルタミカム、その構築方法、及びそのリシン生産における使用の構想及び方法を提供し、具体的には、当該技術手段を実現するための方法とルートは多いが、以上に記載されたのはただ本発明の好ましい実施形態であり、当業者にとって明らかであるように、本発明の原理から離脱しない限り、若干の改良と修飾を加えることができ、これらの改良と修飾も本発明の保護範囲にある。本実施例に明確的でない各組成部分は、いずれも従来技術によって実現できる。
【配列表フリーテキスト】
【００５１】
SEQUENCE LISTING
<110>  NANJING TECH UNIVERSITY
<120>  METHOD FOR PRODUCING LYSINE BY UTILIZINGADSORPTION AND IMMOBILIZED FERMENTATION OF RECOMBINANT CORYNEBACTERIUM GLUTAMICU
<160>  6
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  1
<211>  2562
<212>  DNA
<213>  Protease(FTSH)
<400>  1
atgaaaaaca agaaatacct gcagttcggc ggtatcgcag ccgtaatcct catcgttctg            60
ttcttggtgt ccctgtttag cagtgacacc aggaacttcc aggaggtcga tacctctgtt           120
gcgatggcac agcttgacgc cggaaacgtc gccgaagctc aaatcgatga cagggaacag       180
cgcgtccgac tgaccttgcg tgaacccatc acggtggatg aacgcgaagg cgttgaagag           240
atcctcgcgc agtacccagc tcgtaccgcg ccagcgatct ttgagaaggt ggaagcatcc           300
aacactgatt cctataccac caatgtgacg caggagagct tcctgatgtc catgctgagc           360
ttcatcctgc cgatggtgat catcttcggt ttgctgatgt tcttcctcac ccgcatgcag             420
ggtggtggca tgtttggcat cggtggatcc aaggccaagc agctgaccaa ggatatgccc           480
accaacacct tcgcggatgt tgctggcgct gaagaagcag tggatgaact ccatgagatc       540
aaggacttcc tggaagaccc cacccgctac gaagccctcg gagcgaaaat ccctcgtggt       600
gtgctgcttt acggccctcc cggtactggt aaaaccctgc tggctcgtgc cgtagctggt           660
gaggctggcg tgccgttcta ctcaatttcc ggttctgact ttgtggaaat gttcgtcggt             720
gttggtgcct cgcgtgtgcg tgatctgttt aagcaggcca aggaaaacag tccctgcatc           780
atcttcgtcg atgagatcga tgcggttggt cgcgcccgtg gctcaggaat gggtggcgga       840
cacgatgagc gtgaacagac cctgaaccag ttgctcgttg agatggatgg ctttggtgat       900
cgtcaaggcg tcattctgat ggctgctacc aaccgcccag atgttcttga cccagcgctg       960
ctgcgtcctg gccgtttcga ccgccagatc ccagtcacca accctgacct acgcggccgt      1020
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gcattggcaa agcgcaccgc cggcatgtcc ggcgctgacc tggcaaacgt gcttaacgaa      1140
gccgcgctgc taaccgcccg cgtgggtggc aacgtgatca ccgccgacgc tctggaagaa      1200
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actgcccaag aagatgacaa gggcatgtac aaccgcaacg aattgttcgc ccgcctggtc      1440
tttgccatgg gtggacgctc cgcggaagaa ctagtcttcg gcgaacccac caccggcgcc      1500
tccgccgata ttgaaatggc caccaagatc gcccgatcca tggtgaccga atatggcatg      1560
tccccagctg tcggcatggt gaaatacggc caagaacagg gcgacccatt ctccggacgc      1620
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cagttcctcc tggacaaagc ccatgaagtg tcctactcca tcctggctga ataccgcgac          1740
cacctggacc gcctcgcgga aaaactcctg gaaaaggaaa ccctgcgacg cccagacctc      1800
gaagcgcttt tcgacgacat cgtcccacgc aaggtcgccg aagtcttccc cgacgagtcc        1860
acacgattcc ctcgccaaga aaaccgcgaa ccagtaaaaa ccccagtgga gctcgcactg      1920
gaacgtggcg aagaaccacc aaagaagttc tccattcttg aggcctcccg cgcaacccgc      1980
gaacgccgtc gcaaggaatt ggaagctcag ggtaagttgc cggtgcagcc tgcgtcttct       2040
gccggcgtgg cacctgcggc cggagcagct gccggatcct atggcacccc acctccagct      2100
gattggagcg tgcccggttc cgctggaaag caccgctcac gtgcagaaga acagccagct      2160
gagcagggct tcccggctca gaccccggca caagctcctg agcagtcccc tgattcaagt       2220
ggcggccgcc ccaaccctta cgcgactcca accgcatccg gtgagcaccc tggtatgaag      2280
gcctatggct tcggcgattc cgaactcatg gaccaatcaa caggtgcgga acatacccca       2340
ggtaacgttt cacaggaatc cccaaccgaa atgatcgggt tccgtttgcc ggatcatgaa       2400
cgttcggact acccagaaaa ggcgcaaaaa gagtcggtgc tggatgcttc tgaaaccaca      2460
gaaatgcctg tcgttccaga tcagcccatc gatggtgatt ccgggaagtc cgctgagggc      2520
acacaggaga atccggaaaa tgaaggagac aaccgtggat aa                       2562
<210>  2
<211>  2614
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<400>  2
gcctgcaggt cgactctaga ggatccatga aaaacaagaa atacctgcag ttcggcggta        60
tcgcagccgt aatcctcatc gttctgttct tggtgtccct gtttagcagt gacaccagga         120
acttccagga ggtcgatacc tctgttgcga tggcacagct tgacgccgga aacgtcgccg       180
aagctcaaat cgatgacagg gaacagcgcg tccgactgac cttgcgtgaa cccatcacgg       240
tggatgaacg cgaaggcgtt gaagagatcc tcgcgcagta cccagctcgt accgcgccag       300
cgatctttga gaaggtggaa gcatccaaca ctgattccta taccaccaat gtgacgcagg        360
agagcttcct gatgtccatg ctgagcttca tcctgccgat ggtgatcatc ttcggtttgc         420
tgatgttctt cctcacccgc atgcagggtg gtggcatgtt tggcatcggt ggatccaagg        480
ccaagcagct gaccaaggat atgcccacca acaccttcgc ggatgttgct ggcgctgaag       540
aagcagtgga tgaactccat gagatcaagg acttcctgga agaccccacc cgctacgaag       600
ccctcggagc gaaaatccct cgtggtgtgc tgctttacgg ccctcccggt actggtaaaa         660
ccctgctggc tcgtgccgta gctggtgagg ctggcgtgcc gttctactca atttccggtt         720
ctgactttgt ggaaatgttc gtcggtgttg gtgcctcgcg tgtgcgtgat ctgtttaagc         780
aggccaagga aaacagtccc tgcatcatct tcgtcgatga gatcgatgcg gttggtcgcg       840
cccgtggctc aggaatgggt ggcggacacg atgagcgtga acagaccctg aaccagttgc       900
tcgttgagat ggatggcttt ggtgatcgtc aaggcgtcat tctgatggct gctaccaacc         960
gcccagatgt tcttgaccca gcgctgctgc gtcctggccg tttcgaccgc cagatcccag        1020
tcaccaaccc tgacctacgc ggccgtgaac agatcctgga agttcacgcc aagggtaagc       1080
ctttcgcacc cgatgcagat atcaaggcat tggcaaagcg caccgccggc atgtccggcg      1140
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ccctgtccgc atgggcgttg gaagacatcg agcgcgtcta caaggtcacc atcttggccc        1380
gcggtcgcac cggcggtcac gccatgactg cccaagaaga tgacaagggc atgtacaacc      1440
gcaacgaatt gttcgcccgc ctggtctttg ccatgggtgg acgctccgcg gaagaactag        1500
tcttcggcga acccaccacc ggcgcctccg ccgatattga aatggccacc aagatcgccc        1560
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actccatcct ggctgaatac cgcgaccacc tggaccgcct cgcggaaaaa ctcctggaaa       1800
aggaaaccct gcgacgccca gacctcgaag cgcttttcga cgacatcgtc ccacgcaagg      1860
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agttgccggt gcagcctgcg tcttctgccg gcgtggcacc tgcggccgga gcagctgccg      2100
gatcctatgg caccccacct ccagctgatt ggagcgtgcc cggttccgct ggaaagcacc       2160
gctcacgtgc agaagaacag ccagctgagc agggcttccc ggctcagacc ccggcacaag      2220
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catccggtga gcaccctggt atgaaggcct atggcttcgg cgattccgaa ctcatggacc       2340
aatcaacagg tgcggaacat accccaggta acgtttcaca ggaatcccca accgaaatga      2400
tcgggttccg tttgccggat catgaacgtt cggactaccc agaaaaggcg caaaaagagt      2460
cggtgctgga tgcttctgaa accacagaaa tgcctgtcgt tccagatcag cccatcgatg       2520
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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