(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚の健康状態を増進及び／又は改善するための組成物であって、前記組成物は、ヒアルロン酸を添加した無血清培地で間葉系幹細胞を培養することによって得られる幹細胞、培養上清、及び／又は細胞分泌物を含む、組成物。
【請求項２】
請求項１の組成物であって、前記ヒアルロン酸の重量平均分子量が、５，０００以下である、組成物。
【請求項３】
請求項１または２の組成物であって、前記ヒアルロン酸の濃度が、２０μｇ／ｍｌ以上、１０００μｇ／ｍｌ以下である、組成物。
【請求項４】
化粧品用組成物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
健康食品用組成物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
創傷治癒用である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物であって、前記組成物は、間葉系幹細胞をヒアルロン酸を添加した培地で培養することによって得られる培養上清及び／又はこれらの加工物を含む、組成物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物であって、前記組成物は、ヒアルロン酸を添加した培地で培養した間葉系幹細胞を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、皮膚の健康状態を増進及び／又は改善するための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
間葉系幹細胞は成体内に存在する幹細胞（ステムセル）の一つであり、そして、中胚葉由来の組織（例えば、骨、軟骨、血管、心筋細胞等）に分化できる能力をもつ。間葉系幹細胞の例として、骨髄由来の間葉系幹細胞、脂肪組織由来の間葉系幹細胞等が挙げられる。
【０００３】
近年、間葉系幹細胞は、美容への効果が期待されており、特に、当該細胞の培養上清は、スキンケアに利用されている。例えば、非特許文献１では、間葉系幹細胞の培養上清、及びコラーゲン等を配合した化粧品が開示されている。培養上清とは、細胞を培地で培養した際に得られる、培地自体と細胞から分泌された種々の分泌物を含む組成物である。
【０００４】
特許文献１では、脂肪由来幹細胞の遊走付与剤を皮膚に塗布することにより、脂肪由来幹細胞を真皮層に遊走させ、皮膚状態を向上させることが開示されている。特許文献２では、ヒアルロン酸を含む幹細胞用培地が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１６／１９４７６０号
【特許文献２】米国特許出願公開第２０２０／０００２６７８号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】https://beauty.hotpepper.jp/kr/slnH000455287/blog/bidA031357383.html
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このように間葉系幹細胞は、化粧品への応用が期待されているが、適用対象の組織（例えば、皮膚）への効果を更に向上させることが望まれている。そこで、本開示は、皮膚の健康状態を増進及び／又は改善するための組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明者が鋭意検討したところ、培養上清を得る際に、培地にヒアルロン酸を添加してから間葉系幹細胞を培養することで、培養上清の性質に大きな変化が起こることを見出した。具体的には、当該培養上清で皮膚線維芽細胞を培養したところ、皮膚線維芽細胞の遺伝子の発現に大きな影響を及ぼすことが見出された。このメカニズムは明らかではないが、ヒアルロン酸が創傷治療等の皮膚状態の改善を促進することが知られており、幹細胞をヒアルロン酸含有培地で培養することで幹細胞が刺激され、皮膚状態を整えるための物質を生成する、などといった可能性が考えられる。
【０００９】
本開示の発明は、上記知見に基づいて完成され、一側面において、以下の発明を包含する。
（発明１）
皮膚の健康状態を増進及び／又は改善するための組成物であって、前記組成物は、ヒアルロン酸を添加した培地で間葉系幹細胞を培養することによって得られる幹細胞、培養上清、及び／又は細胞分泌物を含む、組成物。
（発明２）
発明１の組成物であって、前記ヒアルロン酸の重量平均分子量が、５，０００以下である、組成物。
（発明３）
発明１または２の組成物であって、前記ヒアルロン酸の濃度が、２０μｇ／ｍｌ以上、１０００μｇ／ｍｌ以下である、組成物。
（発明４）
化粧品用組成物である、発明１〜３のいずれか１つに記載の組成物。
（発明５）
健康食品用組成物である、発明１〜３のいずれか１つに記載の組成物。
（発明６）
アトピー治療用組成物である、発明１〜３のいずれか１つに記載の組成物。
（発明７）
以下のいずれか１種以上の遺伝子に関連する皮膚疾患治療用である、発明１〜３のいずれか１つに記載の組成物。
（ａ）Ｃｏｌ３Ａ１、
（ｂ）Ｍｅｐｒｉｎ−α、
（ｃ）Ｅｌａｓｔｉｎ、
（ｄ）ｐ１６INK4a、及び、
（ｅ）ＨＡＳ１
（発明８）
創傷治癒用である、発明１〜３のいずれか１つに記載の組成物。
（発明９）
発毛及び／又は育毛促進剤である、発明１〜３のいずれか１つに記載の組成物。
（発明１０）
発明１〜９のいずれか１つに記載の組成物であって、前記組成物は、間葉系幹細胞をヒアルロン酸を添加した培地で培養することによって得られる培養上清及び／又はこれらの加工物を含む、組成物。
（発明１１）
発明１〜１０のいずれか１つに記載の組成物であって、前記組成物は、ヒアルロン酸を添加した培地で培養した間葉系幹細胞を含む、組成物。
【発明の効果】
【００１０】
一側面において、本開示の組成物は、ヒアルロン酸を添加した培地で間葉系幹細胞を培養することによって得られる。これによって、皮膚の細胞（特に、皮膚線維芽細胞、表皮角化細胞等）の遺伝子の発現に影響を及ぼす成分が間葉系幹細胞から分泌される。そして、当該成分によって、皮膚の健康状態を増進及び／又は改善に関与する遺伝子の発現量を増減させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】定量的ＰＣＲによる各遺伝子の発現量を相対化したグラフである。
【図２】定量的ＰＣＲによる各遺伝子の発現量を相対化したグラフである。
【図３】定量的ＰＣＲによる各遺伝子の発現量を相対化したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本開示の発明を実施するための具体的な実施形態について説明する。以下の説明は、発明の理解を促進するためのものである。即ち、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００１３】
１．皮膚の健康状態を増進及び／又は改善するための組成物
一実施形態において、本開示は、皮膚の健康状態を増進及び／又は改善するための組成物に関する。こうした組成物は、ヒアルロン酸を添加した培地で間葉系幹細胞を培養することによって得られる。より具体的には、前記組成物は、間葉系幹細胞を培養することによって得られる培養上清及び／又はこれらの加工物を含むことができる。別の具体例としては、前記組成物は、ヒアルロン酸を添加した培地で培養した間葉系幹細胞及び／又は当該細胞の分泌物を含む。或いは、前記組成物は、これら幹細胞、培養上清、及び／又は細胞分泌物の任意の組み合わせを含んでもよい。
【００１４】
１−１．定義
本明細書で記載される用語「皮膚の健康状態を増進及び／又は改善するため」は、皮膚に関する特定の疾患を改善するという目的を包含する。更には、当該用語は、治療目的に限定されない。例えば、当該用語は、特定の疾患を有さないとしても、皮膚の見た目の向上（つや、はり等）させる目的を包含する。
【００１５】
また、本明細書で記載される「増進及び／又は改善」という用語は、外観上の増進及び／又は改善だけでなく、現状を維持することも含まれる。例えば、本明細書で記載される「増進及び／又は改善」という用語は、本来なら加齢により衰える特徴を維持することも含む（例えば、しわ、シミの増加などを防止すること）。
【００１６】
更に、本明細書で記載される「ヒアルロン酸を添加した培地で間葉系幹細胞を培養することによって得られる」とは、直接的に得られる物に限定されず、間接的に得られる物も含む。前者の例としては、間葉系幹細胞を培養した後の培養上清、及び、間葉系幹細胞が挙げられる。後者の例としては、培養上清を加工した物、例えば、他の成分を添加した物、及び、更なる処理を行ったものが挙げられる。更なる処理の例としては、例えば、培養上清を、フィルター処理した物、水分除去して濃縮した物、当該上清から特定の成分（例えば、細胞分泌物）を抽出した物などが挙げられる。
【００１７】
１−２．成分
一実施形態において、本開示の組成物は、以下（１）〜（２）のうち少なくともいずれか一方を含むことができる。
（１）間葉系幹細胞又はこれらの分泌物
（２）培養上清又はこれらの加工物
製品化する際の取扱いの簡便さ等を考慮すると、（２）の方が好ましい。
【００１８】
また、上記成分に加えて、他の成分を必要に応じて添加してもよい。例えば、他の成分として、賦形剤、抗生物質、ｐＨバッファ等が挙げられる。更には、他の成分として、皮膚の健康状態を増進及び／又は改善するため更なる成分（例えば、抗酸化剤、香料、美白成分、保湿成分、美白成分等）が挙げられる。
【００１９】
１−３．製造方法
一実施形態において、本開示は、皮膚の健康状態を増進及び／又は改善するための組成物の製造方法に関する。
前記製造方法は、少なくとも以下の工程を含む。
・培地にヒアルロン酸を添加する。
・添加後の培地で、間葉系幹細胞を培養する。
・培養後の培養上清及び／又は細胞を回収する。
【００２０】
１−３−１．間葉系幹細胞（脂肪由来  骨髄由来）
間葉系幹細胞は、特定の組織由来の物に限定されず、任意の組織に由来する物であってもよい。例えば、骨髄由来、臍帯血由来、胎盤由来、脂肪組織由来等が挙げられる。典型的には、骨髄由来、及び／又は脂肪組織由来の間葉系幹細胞を使用することができる。
【００２１】
１−３−２．ヒアルロン酸
培地に添加するヒアルロン酸は、特に限定されないが、低分子量のヒアルロン酸が好ましい。より具体的には、重量平均分子量が５，０００以下であり、好ましくは２，０００以下であり、更に好ましくは、１，５００以下であり、最も好ましくは、１，０００以下である。また好ましい使用濃度は２０〜１０００μｇ／ｍｌである。ヒアルロン酸の分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーと光散乱検出器を組み合わせた手法（SEC-LS）で算出されるものをいう。
【００２２】
１−３−３．培地
培地は、特に限定されず、当分野で公知の培地（例えば、ＤＭＥＭ、Ｆ１２、ＲＰＭＩ等）を使用することができる。培地の例としては、インビトロジェン製の間葉系幹細胞基礎培地、三光純薬製の間葉系幹細胞基礎培地、ＴＯＹＯＢＯ社製のＭＦ培地、バイオミメティクスシンパシーズ社のｓｆ−ＤＯＴ（登録商標）等が挙げられる。
【００２３】
１−３−４．培養条件
培養条件は、特に限定されず、当分野で公知の条件であればよい。例えば、温度は、３５℃〜４０℃、典型的には３７℃であってもよい。適宜、ＣＯ2が５％になるようインキュベータを制御してもよい。培養期間は、特に限定されないが、少なくとも２４ｈ、好ましくは４８ｈ以上培養することが好ましい。上限は特に限定されないが、１６８ｈ以下である。以下の説明は、発明の範囲を限定することを意図するものではないが、ヒアルロン酸の刺激によって、間葉系幹細胞が変化し、何かしらの有用な成分を分泌すると考えられる。従って、ヒアルロン酸の刺激後、間葉系幹細胞が変化するまで、一定時間を要するという理由から、ある程度の培養期間は必要となる。
【００２４】
好ましい実施形態において、間葉系幹細胞を最初にディッシュ上に増殖させ、その後で、ヒアルロン酸を添加した培地で培養を行う。例えば、セミコンフルエント（例えば、顕微鏡視野にて８０％以上細胞が占める状態）からコンフルエントに到達させ、その後で、ヒアルロン酸を添加した培地で培養を行う。この場合、ヒアルロン酸は、細胞とディッシュとの間に存在する足場としての役割を果たすというよりは、間葉系幹細胞に生理的な刺激を与える役割を果たす。こうした観点から、細胞の足場としてヒアルロン酸を使用する特許文献２と比べると、好ましい実施形態にかかる本発明は、技術思想において異なる。
【００２５】
更に好ましい実施形態において、培地に添加するヒアルロン酸は、低分子量のヒアルロン酸である。一般的に、細胞の足場となる細胞外マトリックスは、コラーゲン、ファイブロネクチン等、ポリマー化した高分子であることが多い。ヒアルロン酸についても、例外ではなく、足場として使用する場合には高分子のヒアルロン酸を使用することが一般的である。こうした観点から、細胞の足場としてヒアルロン酸を使用する特許文献２と比べると、更に好ましい実施形態にかかる本発明は、技術思想において異なる。
【００２６】
また、低分子のヒアルロン酸は、細胞死の抑制機能が高く、そして、シグナル伝達のトリガーとしての役割を果たす傾向が、高分子のヒアルロン酸と比べると強いと考えられる。そして、有益なシグナル伝達のトリガーとなることで、有益な物質を細胞外に分泌していると考えられる。好ましい実施形態に係る本発明は、細胞外に分泌される有益な物質を利用するものであり、細胞内成分を利用しようとする特許文献２とは、技術思想が異なる。
【００２７】
更に好ましい実施形態において、特許文献２で使用している細胞の破砕抽出物（extract）ではなく、細胞から分泌される因子を多く含んだ培養上清（培養液とも言う）を用いる。細胞の破砕抽出物を用いてしまうと、例えば、その含有物を皮膚に塗布した場合、普段細胞外に放出されることのない多くのタンパク質・核酸などが皮膚に暴露されてしまうことが予想される。このタンパク質や核酸に対する抗体が作られてしまうと、自己免疫疾患に繋がる恐れがある。具体的には、抗ＤＮＡ二重鎖抗体や抗ヒストン抗体は全身性エリテマトーデス発症患者で多く産生され、抗セントロメア抗体は全身性強皮症の発症患者で多く産生されていることが既に知られており、こうした抗体が全身の細胞に攻撃することで自己免疫疾患が発症してしまうと考えられている。従って、細胞の破砕抽出物を用いてしまうと、皮膚に裂傷などがあった場合に細胞内成分が血管内まで浸透し、その成分に対する抗体が産生されてしまう危険性を内包するため、培養上清を使用することが望ましく、更に好ましい実施形態にかかる本発明は、技術思想において特許文献２とは異なる。
【００２８】
１−３−５．その他の処理（フィルターなど）
培養後は、培養上清及び／又は細胞を回収し、更なる処理に供してもよい。例えば、培養上清の場合には、フィルターで処理したり、濃縮処理したりしてもよい。細胞の場合には、凍結保存のためにＤＭＳＯ添加の培地に移してもよい。
【００２９】
１−３−６．剤型への加工
また、一実施形態において、本開示の組成物は、特定の用途の製品用に特定の形状に加工されてもよい。例えば、組成物は、固体であってもよいし、液体であってもよいし、半固体（ゲル状）であってもよい。固体の場合には、粉末状に加工してもよいし、タブレット状に加工してもよい。組成物の成分が細胞である場合には、保存液などに細胞を懸濁した状態であってもよい。
【００３０】
２．用途
一実施形態において、本開示の組成物は、様々な用途に利用することができる。例えば、本開示の組成物は、化粧品、健康食品、治療薬等に応用することができる。上述したように、ヒアルロン酸の刺激によって、間葉系幹細胞が変化し、何かしらの有用な成分を分泌すると考えられる。従って、培養上清及び培養後の細胞のうち少なくともいずれか一方が組成物に含まれていれば、有用な成分が含まれていることになる。また、培養後の細胞の場合には、細胞外に有用な成分を分泌することができる。そして、当該有用な成分が、肌等の組織（例えば、皮膚線維芽細胞、表皮角化細胞等）に良好な影響を及ぼすことができる。
【００３１】
２−１．化粧品用組成物
一実施形態において、本開示の組成物は、化粧品に応用することができ、特に、肌の化粧品に好適である。投与形態は、特に限定されないが、肌の化粧品用途の場合には、肌に塗るのに適した形態が好ましい。例えば、本開示の組成物は、ペースト状、液体状、又はゲル状が好ましい。
【００３２】
従って、一実施形態において、本開示の組成物は、投与形態に応じて、適切な追加成分を配合してもよい。例えば、本開示の組成物は、肌の化粧品に一般的に含まれる成分を含んでもよい。当該成分の例として、保湿成分、界面活性剤、エモリエント成分、バリア改善成分、抗老化成分、美白成分、細胞賦活成分、抗炎症（刺激緩和，抗アレルギー）成分、抗酸化成分、紫外線防御成分、抗菌成分、血行促進成分、収れん成分、角質剥離成分、安定化成分（防腐，キレート，ｐＨ調整等）、温冷感成分、香料、着色剤、溶剤、帯電防止剤、表面処理剤、スクラブ剤、植物油脂、植物エキスなどが挙げられる。
【００３３】
２−２．健康食品用組成物（投与形態、他の成分）
一実施形態において、本開示の組成物は、健康食品に応用することができ、特に、肌への有用な効果を有する健康食品用組成物であってもよい。投与形態は、特に限定されないが、消化器官での消化及び吸収を考慮して、適切なカプセル・腸溶カプセルなどに内包させてもよい。健康食品用組成物の場合には、投与形態は経口摂取となる。従って、例えば、本開示の組成物は、固体状、液体状、又はゲル状が好ましい。より具体的には、組成物は咀嚼及び／又は嚥下によって摂取可能な形態であればよい。従って、組成物は、サプリメントのタブレット、ビスケット等の固形物のみならず、ゼリー、飲料などの液体状又はゲル状であってもよい。
【００３４】
従って、一実施形態において、本開示の組成物は、投与形態に応じて、適切な追加成分を配合してもよい。例えば、本開示の組成物は、健康食品に一般的に含まれる成分を含んでもよい。当該成分の例として、保存料、防腐剤、香料、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、防カビ剤、甘味料、着色料などが挙げられる。
【００３５】
２−３．アトピー治療用組成物
一実施形態において、本開示の組成物は、アトピー治療に応用することができ、特に、肌への有用な効果を有するアトピー治療用組成物であってもよい。投与形態は、特に限定されないが、例えば、塗布、皮下注射、経口投与等が挙げられる。従って、例えば、本開示の組成物は、固体状、液体状、ペースト状、又はゲル状が好ましい。
【００３６】
従って、一実施形態において、本開示の組成物は、投与形態に応じて、適切な追加成分を配合してもよい。当該成分の例として、賦形剤、キャリア、ｐＨバッファ、トランスフェクション促進剤、他のアトピー治療薬等が挙げられる。
【００３７】
２−４．その他の用途の組成物
一実施形態において、本開示の組成物は、他の用途（例、創傷治癒用、皮膚疾患治療用、発毛及び／又は育毛促進剤用等）に応用することができる。特に、本開示の組成物は、以下から選択される少なくとも１つのタンパク質の発現の増減に関連する疾患に有用となる可能性がある。
（ａ）Ｃｏｌ３Ａ１、
（ｂ）Ｍｅｐｒｉｎ−α、
（ｃ）Ｅｌａｓｔｉｎ、
（ｄ）ｐ１６INK4a、及び、
（ｅ）ＨＡＳ１
【００３８】
（ａ）Ｃｏｌ３Ａ１は、ＩＩＩ型コラーゲンのアルファ１とも呼ばれ、コラーゲン繊維の三重らせんの構成要素の一つであり、そして、組織学的には、皮膚を構成するタンパク質である。当該タンパク質の減少は、肌の老化兆候へ寄与することが知られている。また、これ以外に、Ｃｏｌ３Ａ１は、創傷治癒（手術創の治癒含む）にも関与することができる。
【００３９】
（ｂ）Ｍｅｐｒｉｎ−αは、Ｚｎプロテアーゼのサブユニットである。そして、ＩＩＩ型コラーゲンのプロペプチドを切断する機能を有する。加齢とともにＩＩＩ型コラーゲン／Ｉ型コラーゲンの比率が減少することが知られており、そして、Ｍｅｐｒｉｎも加齢とともに減少することが知られている。更には、加齢によるｍｅｐｒｉｎの減少を防ぐことでＩＩＩ型コラーゲン／Ｉ型コラーゲンの比率の減少を抑制するという知見が報告されている（https://www.jstage.jst.go.jp/article/sccj/47/4/47_278/_article/-char/ja/）。
【００４０】
（ｃ）Ｅｌａｓｔｉｎは、コラーゲンの繊維を支える役割を持つ繊維である。そして、Ｅｌａｓｔｉｎは、加齢とともに共に減少し、当該現象が皺の原因となる。また、化粧品、及び／又はサプリメントの成分としても配合されることが知られている。また、これ以外に、Ｅｌａｓｔｉｎは、創傷治癒（手術創の治癒含む）にも関与することができる。さらに、発毛及び／又は育毛剤にはエラスチン成分が配合されていることがあり、エラスチンは育毛に関与することができる。
【００４１】
（ｄ）ｐ１６INK4aは、細胞周期を阻害する機能を有することが知られており、更には、このタンパク質の発現量が増加すると老化が進行することが知られている。
【００４２】
（ｅ）ＨＡＳ１は、ヒアルロン酸合成酵素１（Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ  １）と呼ばれ、ヒアルロン酸を合成する機能を有する酵素の一つである。アトピー患者の皮膚においてＨＡＳ１の発現量及びヒアルロン酸が減少していることが知られている。このヒアルロン酸は化粧品、及び／又はサプリメントの成分としても配合されることが知られている。また、これ以外に、ＨＡＳ１は、合成したヒアルロン酸を介して創傷治癒（手術創の治癒含む）にも関与することができる。さらに、ＨＡＳ１は、合成したヒアルロン酸を介して発毛及び／又は育毛にも関与することができる。
【実施例】
【００４３】
３．実施例
３−１．実施例１（間葉系幹細胞の初代培養）
はじめに、脂肪組織由来間葉系幹細胞を準備した。具体的には、脂肪組織由来間葉系幹細胞を用いた再生医療を受ける予定の患者より、皮下脂肪組織を分取した。当該皮下脂肪組織は、投与用細胞の調製に必要な原料となる。当該皮下脂肪組織を分取した後の剰余を、初代培養に供した。なお、予め、患者から研究利用に関する同意を取得しておいた。
【００４４】
皮下脂肪組織を遠心分離（４００×ｇで５分間）に供し、３層に分離した。具体的には、上層から順に脂質画分、脂肪組織画分、及び水性画分の３層に分離した。中層の脂肪組織画分を残して、上層と下層を破棄した。残した脂肪組織画分に対して、組織重量当たり４倍量の０．１５％コラゲナーゼ酵素溶液を添加した。３７℃で１時間浸透させ、酵素処理を行った。脂肪組織が酵素処理によって分散された後、当該脂肪組織を、遠心分離（４００×ｇで５分間）に供した。間葉系幹細胞を含む間質血管細胞画分として、沈殿画分を３０ｍＬのＰＢＳ（−）溶液で懸濁した。その後、セルストレーナー（メッシュサイズ７０μｍ径）に懸濁液を通液し、セルストレーナーに捕捉された組織残渣等は破棄した。そして、通液画分を再度遠心分離（４００×ｇで５分間）に供し、沈殿画分を６ｍＬの無血清培養液ｓｆ−ＤＯＴ（バイオミメティクスシンパシーズ社）で懸濁した。細胞懸濁液全量を、Ｔ２５フラスコ（ＣｅｌｌＢＩＮＤ；Ｃｏｒｎｉｎｇ，３２８９）に播種し、インキュベータ内（３７℃，５％ＣＯ2）に静置して初代培養を開始した。
【００４５】
３−２．実施例２（継代培養、Ｐ０⇒Ｐ１⇒Ｐ２）
３日に１回の頻度で培地全交換を実施した。上澄みは破棄して、フラスコ底面上で増殖する細胞を選択的に増殖させた。セミコンフルエントまで増殖したＴ−２５フラスコ内の細胞に対して、２ｍＬの酵素溶液（ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１２６０４０２１）を添加し、細胞をフラスコの底面から剥離した（３７℃、５分間静置）。細胞をＰＢＳ（−）で希釈し、遠心分離（４００×ｇで５分間）に供した。沈殿した細胞を培養液ｓｆ−ＤＯＴで懸濁し、一部を分取してトリパンブルー染色法による細胞数計測を行った。新たなＴ７５フラスコ（ＣｅｌｌＢＩＮＤ；Ｃｏｒｎｉｎｇ，３２９０）にｓｆ−ＤＯＴで懸濁した細胞を播種し、インキュベータ内（３７℃，５％ＣＯ2）に静置して継代培養を行った（Ｐ０→Ｐ１）。その後も同様の手順で継代培養を行い、必要な細胞数を得た（Ｐ１→Ｐ２）。
【００４６】
３−３．実施例３（培養上清の調製）
まず脂肪組織由来間葉系幹細胞を上述の通りｓｆ−ＤＯＴで培養した。同培地で脂肪組織由来間葉系幹細胞をＴ７５フラスコ１枚当たり３０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2で播種した。セミコンフルエントに到達した３日目に、ＰＢＳ（−）で一回洗浄した。その後、培養上清用に、以下の２つの培地を用意した。
（ｉ）  基本培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２；ＳＩＧＭＡ，Ｄ８９００）、
（ｉｉ）基本培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２；ＳＩＧＭＡ，Ｄ８９００）＋低分子量ヒアルロン酸ＨＡ４（１００μｇ／ｍｌ 添加）
【００４７】
これら（ｉ）及び（ｉｉ）の培地で更に３日間培養し、各々の上清を回収した。回収した培養上清は０．２μｍのＰＥＳシリンジフィルター（２５ｍｍ  ＧＤ／Ｘシリンジフィルター（ＰＥＳ  ０．２μｍ滅菌済）；６８９６−２５０２；ＧＥヘルスケア・ジャパン）でろ過した。ろ過後の培養上清は、解析に使用するまで−２８℃で冷凍保管した。
【００４８】
上記で得られた培養上清を使用して、以下の３種類の培養上清を調製した。
ＣＭ１：  上記（ｉ）に由来する培養上清
Ｈ−ＣＭ：上記（ｉｉ）に由来する培養上清
ＣＭ２：  上記（ｉ）に由来する培養上清に、低分子量ヒアルロン酸ＨＡ４（１００μｇ／ｍｌ）を添加した物
【００４９】
３−４．実施例４（培養上清を用いた皮膚線維芽細胞の処理）
正常ヒト皮膚線維芽細胞（Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｅｒｍａｌ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ（ＮＨＤＦ）；Ｔａｋａｒａ，Ｃ−１２３０２）を準備した。当該細胞は、Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ，２３０１）で継代及び維持した。ＮＨＤＦを１２  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３３３６）の各ウェルに３０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2で播種し、一晩培養した。
【００５０】
３−５．実施例５（培養上清を用いた表皮角化細胞の処理）
正常ヒト表皮角化細胞（Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ（ＮＨＥＫ）；Ｔａｋａｒａ，Ｃ−１２００６）を準備した。当該細胞は、Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１７００５０４２）で継代及び維持した。ＮＨＥＫを１２  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３３３６）の各ウェルに１００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2で播種し、一晩培養した。
【００５１】
翌日（播種後１６〜２４時間）、各種上清（ＣＭ１、ＣＭ２、Ｈ−ＣＭ）に培地交換し、さらに３日間培養した（約７２時間）。培養後、ＲｅｌｉａＰｒｅｐ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｚ６０１２）を用いてＮＨＤＦ及びＮＨＥＫからＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。抽出後、５００ｎｇのＲＮＡを用いてｃＤＮＡ合成（ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ；Ｔａｋａｒａ，ＲＲ０３６Ａ）を行い、更に、定量的ＰＣＲ（Ｔｈｕｎｄｅｒｂｉｒｄ  Ｓｙｂｒ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ；ＴＯＹＯＢＯ，ＱＰＳ−２０１Ｘ５）を行った。
【００５２】
ｃＤＮＡ合成のためのミクスチャは以下の組成に従って調製した。
５ｘＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ２μｌ（最終濃度  １  ｘ）
Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ                                      ５００ｎｇ
ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  Ｈ2Ｏ                             合計１０μｌに調整
【００５３】
上記ミクスチャを、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＶｅｒｉｔｉ  ９６  ｗｅｌｌ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒを用いて、以下の条件で処理した。
３７℃  １５分
↓
８５℃  ５秒
↓
４℃  ∞
【００５４】
合成したｃＤＮＡ（１０μｌ）は９０μｌのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０＋１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０）を用いて１０倍に希釈した。当該希釈物を、定量ＰＣＲに供した。
【００５５】
３−６．実施例６（皮膚線維芽細胞及び表皮角化細胞の遺伝子の発現の解析）
より具体的には、当該希釈物を、以下の条件で混合した。
２×ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ  Ｐｒｏｂｅ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ              １０μｌ
５ｍＭ  Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ                                ０．４μｌ
５ｍＭ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ                                ０．４μｌ
Ｈ2Ｏ                                                               ８．２μｌ
ｃＤＮＡ（１０倍希釈）                                                  １μｌ
【００５６】
上記混合物を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社のＣＦＸ−Ｃｏｎｎｅｃｔを用いて、ｃＤＮＡを増幅させた。ＰＣＲサイクルの条件は以下の通りであった。
１．９５℃  １分    （初期変性）
２．９５℃  １５秒  （変性）
３．６０℃  ３０秒  （伸長）
（２〜３のステップを４０回繰り返し、ステップ３が終わるたびに蛍光シグナルを検出）
４．６５℃〜９５℃まで０．５℃刻みで温度を上昇させ、５秒ずつ温度を保持してから蛍光シグナルを検出
【００５７】
上記サイクルにて、ＰＣＲ産物の検出を行い、併せて、Ｍｅｌｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅによるＰＣＲ産物の単一性の確認を行った。
【００５８】
内部標準（すべての細胞・条件において同じ発現をしているハウスキーピング遺伝子）として、ＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を用いた。
各遺伝子を検出するためのプライマー配列は以下の通りであった。
GAPDH Forward primer: 5’ - agccacatcgctcagacac - 3’
GAPDH Reverse primer: 5’ - gcctaatacgaccaaatcc - 3’
Col3A1 Forward primer: 5’ - ctggaccccagggtcttc - 3’
Col3A1 Reverse primer: 5’ - gaccatctgatccagggtttc - 3’
Meprin-α Forward primer: 5’ - gcaccacaactcacactctttt - 3’
Meprin-α Reverse primer: 5’ - ttccacagatgtttgccttc - 3’
Elastin Forward primer: 5’ - ggaggtgttcccggagtc - 3’
Elastin Reverse primer: 5’ - ggtccccactccgtacttg - 3’
p16INK4a Forward primer: 5’ - gtggacctggctgaggag - 3’
p16INK4a Reverse primer: 5’ - ctttcaatcggggatgtctg - 3’
HAS1 Forward Primer: 5’ - acgtgcggatccttaaccc - 3’
HAS1 Reverse Primer: 3’ - aggcctagaggaccgctgat - 3’
【００５９】
全てのプライマーは株式会社ファスマックから購入した（逆相カラム精製グレード）。
各遺伝子の発現量は、定量ＰＣＲで得られた各遺伝子の発現量を、さらにＧＡＰＤＨの発現量で割って標準化したものを示している。さらに、上清を処理していないコントロール条件での発現量を「１」になるように標準化している。以上のプライマーを用いて増幅したＰＣＲ産物は全て単一のものであること（つまり、同一のプライマーで、複数種類の配列が増幅されていないこと）をＭｅｌｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅによって確認した。
【００６０】
結果を図１及び図２に示す。Ｈ−ＣＭで処理した皮膚線維芽細胞においては、検証した遺伝子の発現量は、良好な方向に変化していることが確認された。即ち、増加することが望ましいと考えられる遺伝子（Ｃｏｌ３Ａ１、Ｍｅｐｒｉｎ−α、Ｅｌａｓｔｉｎ）の発現量は増加した。一方で、減少することが望ましいと考えられる遺伝子（ｐ１６INK4a）の発現量は減少した。また、Ｈ−ＣＭで処理した表皮角化細胞においても、検証した遺伝子の発現量（具体的には、ＨＡＳ１の発現量）は、良好な方向に変化していることが確認された。
【００６１】
特筆すべき点として、こうしたＨ−ＣＭ処理による遺伝子の発現量の変化は、ＣＭ２処理による遺伝子の発現量の変化よりも顕著であった。上述したように、ＣＭ２は、脂肪組織由来間葉系幹細胞を培地で処理した後からＨＡ４を培地に添加した条件である。一方で、Ｈ−ＣＭは、脂肪組織由来間葉系幹細胞を培地で処理する前にＨＡ４を培地に添加した条件である。
【００６２】
従って、脂肪組織由来間葉系幹細胞がＨＡ４の刺激を受けて、何かしらの有用な物質を、細胞外に分泌したものと考えられる。そして、その有用な物質の存在により、皮膚線維芽細胞及び表皮角化細胞の遺伝子の発現量を、良好に変化させたものと考えられる。
【００６３】
皮膚線維芽細胞及び表皮角化細胞は、皮膚組織に存在する細胞である。従って、こうした遺伝子の発現量の変化は、皮膚の健康状態に良好な影響を及ぼすと考えられる。
【００６４】
また、Ｈ−ＣＭとＣＭ２の条件の違い及びもたらす結果の違いを考えると、Ｈ−ＣＭで処理した細胞を、例えば、皮膚線維芽細胞及び表皮角化細胞のいずれか１つと共培養した場合であっても、同様の効果が得られることが推認される。従って、Ｈ−ＣＭの条件で処理した場合には、培養上清だけでなく、培養後の細胞自体も、皮膚の健康状態にとって良好な影響を及ぼすことが推認される。こうした点を検証すべく、次に示すように、実施例７の実験を行った。
【００６５】
３−７．実施例７（皮膚線維芽細胞と間葉系幹細胞の共培養）
実施例１〜２と同じ手順にて、脂肪組織由来間葉系幹細胞を準備した。脂肪組織由来間葉系幹細胞をＴ７５フラスコ１枚当たり３０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2で播種した。セミコンフルエントに到達した３日目に、ＰＢＳ（−）で一回洗浄した。その後、培養上清用に、以下の２つの培地を用意した。
（ｉ）  基本培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２；ＳＩＧＭＡ，Ｄ８９００）、
（ｉｉ）基本培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２；ＳＩＧＭＡ，Ｄ８９００）＋低分子量ヒアルロン酸ＨＡ４（１００μｇ／ｍｌ 添加）
【００６６】
これら（ｉ）及び（ｉｉ）の培地で更に３日間培養し、各々の細胞を回収した（それぞれを、ＭＳＣ、及びＭＳＣ−Ｈ）。
【００６７】
上記と並行して、正常ヒト皮膚線維芽細胞（Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｅｒｍａｌ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ（ＮＨＤＦ）；Ｔａｋａｒａ，Ｃ−１２３０２）を準備した。当該細胞は、Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ，２３０１）で継代及び維持した。ＮＨＤＦを６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（ＣｅｌｌＢＩＮＤ；Ｃｏｒｎｉｎｇ，３３３５）の各ウェルに１００，０００個の細胞を播種した。そこに、トランスウェル（６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ用２４ｍｍインサート，０．４μｍ  ｐｏｒｅサイズ；Ｃｏｒｎｉｎｇ，３４１２）を載せた。トランスウェル内にもＦｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ，２３０１）を適量注ぎ、さらにそこに何も細胞を播種しないコントロール（ＮＨＤＦのみ）、ＭＳＣを播種（ＮＨＤＦ−ＭＳＣ）、及びＭＳＣ−Ｈを播種した（ＮＨＤＦ−ＭＳＣ−Ｈ）ものを用意した。播種したＭＳＣ及びＭＳＣ−Ｈの数はともに１００，０００個である。尚、用いたトランスウェルはあらかじめＰＬＬ（Ｐｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ；Ｃｕｌｔｒｅｘ，３４３８−１００−０１）でコーティングすることで、間葉系幹細胞がトランスウェルに張り付くことを可能にしている。コーティングは一晩かけて３７℃で行った。そして余分なＰＬＬは滅菌水で洗浄・除去した。
【００６８】
脂肪組織由来間葉系幹細胞と正常ヒト皮膚線維芽細胞を３日間共培養した。正常ヒト皮膚線維芽細胞を下側に配置し、脂肪組織由来間葉系幹細胞を上側に配置した。そして、トランスウェルには０．４μｍの、細胞より遥かに小さな穴が多数存在しているため、トランスウェル上部の脂肪組織由来間葉系幹細胞が下部に移動し、直接正常ヒト皮膚線維芽細胞と接触して効果を発揮するというより、０．４μｍの小さな穴を介して、脂肪組織由来間葉系幹細胞の分泌物が、正常ヒト皮膚線維芽細胞に作用できるようにした。
【００６９】
その後、正常ヒト皮膚線維芽細胞のＲＮＡを回収し、上記実施例６と同様の手法で、発現量を確認した。結果を、図３に示す。ＭＳＣとの共培養、及びＭＳＣ−Ｈとの共培養の結果を比較すると、ＭＳＣ−Ｈとの共培養の結果の方が、遺伝子の発現に関して良好な方向に変化していることが確認された。即ち、正常ヒト皮膚線維芽細胞において増加することが望ましいと考えられる遺伝子（Ｃｏｌ３Ａ１、Ｅｌａｓｔｉｎ）の発現量は増加した。一方で、減少することが望ましいと考えられる遺伝子（ｐ１６INK4a）の発現量は減少した。こうした結果から、培養上清だけでなく、幹細胞自体も、皮膚の健康状態にとって良好な影響を及ぼすことが示された。
【００７０】
以上、具体的な実施形態について説明してきた。上記実施形態は、具体例に過ぎず、本発明は上記実施形態に限定されない。例えば、上述の実施形態の１つに開示された技術的特徴は、他の実施形態に適用することができる。また、特記しない限り、特定の方法については、一部の工程を他の工程の順序と入れ替えることも可能であり、特定の２つの工程の間に更なる工程を追加してもよい。本発明の範囲は、特許請求の範囲によって規定される。
【要約】
【課題】皮膚の健康状態を増進及び／又は改善するための組成物を提供すること。
【解決手段】皮膚の健康状態を増進及び／又は改善するための組成物であって、前記組成物は、ヒアルロン酸を添加した培地で間葉系幹細胞を培養することによって得られる幹細胞、培養上清、及び／又は細胞分泌物を含む、組成物。
【選択図】なし【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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