(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タバコ植物若しくはその一部、又はタバコ細胞培養物のスクロースエステル含有量を増加させる方法であって、ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を阻害することにより、前記タバコ植物又はタバコ細胞培養物を改変するステップを含む、前記方法。
【請求項２】
タバコ植物若しくはその一部、又はタバコ細胞培養物のスクロースエステル含有量を増加させるための、ジテルペン合成遺伝子をコードするポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチドの部分の使用であって、前記ポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチドの部分が、前記タバコ植物若しくはその一部、又はタバコ細胞培養物における前記ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を阻害する、前記使用。
【請求項３】
スクロースエステル含有量が増加しているタバコ植物若しくはその一部、タバコ植物繁殖材料、タバコ葉、カットされ採取されたタバコ葉、加工されたタバコ葉、又はカットされ加工されたタバコ葉、又はタバコ細胞培養物を生成する方法であって、ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を阻害するように前記タバコを改変するステップを含む、前記方法。
【請求項４】
ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を阻害するように改変されなかったタバコ植物又はタバコ細胞培養物との比較において、スクロースエステル含有量が増加している、請求項１〜３のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項５】
ジテルペン合成遺伝子が、シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）、ＣＢＴｏｌシクラーゼ、又はテルペンシンターゼ３−８である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法若しくは使用。
【請求項６】
ジテルペン合成遺伝子の発現がＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を使用して阻害される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項７】
シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）の発現が、前記シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）のエクソン１の少なくとも一部分、エクソン２の少なくとも一部分、及びエクソン３の少なくとも一部分を含むｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトを使用して阻害される、請求項６に記載の方法又は使用。
【請求項８】
ＣＢＴｏｌシクラーゼ遺伝子の発現が、前記ＣＢＴｏｌシクラーゼ遺伝子のエクソン４の少なくとも一部分、イントロン４、エクソン５、イントロン５、エクソン６、イントロン６、及びエクソン７の少なくとも一部分を含むｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトを使用して阻害される、請求項６に記載の方法又は使用。
【請求項９】
テルペンシンターゼ３−８遺伝子の発現が、前記テルペンシンターゼ３−８遺伝子の少なくともヌクレオチド１４９７〜１５１７を含むｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトを使用して阻害され、但しナンバリングが配列番号３とのアライメントにより決定される、請求項６に記載の方法又は使用。
【請求項１０】
テルペンシンターゼ３−８遺伝子の発現が、前記テルペンシンターゼ３−８遺伝子の少なくともヌクレオチド８８４〜９０４を含むｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトを使用して阻害され、但しナンバリングが配列番号３とのアライメントにより決定される、請求項６に記載の方法又は使用。
【請求項１１】
非改変植物又は非改変タバコ細胞培養物との比較において、スクロースエステル含有量の増加を実現するように改変されたタバコ植物若しくはその一部、又はタバコ細胞培養物であって、前記改変が、ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現の阻害であり、前記ジテルペン合成遺伝子が、シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）又はテルペンシンターゼ３−８である、前記タバコ植物若しくはその一部、又はタバコ細胞培養物。
【請求項１２】
請求項７〜１０のいずれかで定義するｄｄＲＮＡｉコンストラクトを含むタバコ植物若しくはその一部、又はタバコ細胞培養物。
【請求項１３】
請求項１１又は１２に記載のタバコ植物又はタバコ細胞培養物から取得可能なタバコ植物繁殖材料。
【請求項１４】
植物の種子である、請求項１３に記載のタバコ植物繁殖材料。
【請求項１５】
タバコ植物のスクロースエステル含有量が、ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を阻害するように改変されなかったタバコ植物又はタバコ細胞培養物と比較して、改変されたタバコ植物又はタバコ細胞培養物において少なくとも２倍高い、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法若しくは使用。
【請求項１６】
タバコ植物のスクロースエステル含有量が、ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を阻害するように改変されなかったタバコ植物又はタバコ細胞培養物と比較して、改変されたタバコ植物又はタバコ細胞培養物において少なくとも２倍高い、請求項１１若しくは１２に記載のタバコ植物若しくはその一部、又はタバコ細胞培養物。
【請求項１７】
タバコ植物を生育させるための、請求項１１に記載のタバコ植物又はその一部の使用。
【請求項１８】
タバコ産業製品を製造するための、請求項１１、１２及び１６のいずれかに記載のタバコ植物若しくはその一部、又はタバコ細胞培養物の使用。
【請求項１９】
作物を成長させるための、請求項１１、１２及び１６のいずれかに記載のタバコ植物又はその一部の使用。
【請求項２０】
タバコ葉を製造するための、請求項１１、１２及び１６のいずれかに記載のタバコ植物又はその一部の使用。
【請求項２１】
タバコ葉が加工されたタバコ葉である、請求項２０に記載のタバコ植物又はその一部の使用。
【請求項２２】
加工されたタバコ葉が、乾燥により加工されている、請求項２１に記載のタバコ植物又はその一部の使用。
【請求項２３】
請求項１１、１２及び１６のいずれかに記載のタバコ植物の、又は請求項１３若しくは１４に記載の繁殖材料から繁殖させたタバコ植物から取得可能であるか、又は請求項１７〜２２のいずれかに記載の使用により取得されたタバコ植物から取得可能である、タバコ植物の採取された葉。
【請求項２４】
カットされ採取された葉である、請求項２３に記載のタバコ植物の採取された葉。
【請求項２５】
ｉ）請求項１７〜２２のいずれかに記載の使用から取得可能なタバコ植物から取得可能であるか、
ii）請求項１１、１２及び１６のいずれかに記載のタバコ植物を加工することにより取得可能であるか、
iii）請求項１３若しくは１４に記載のタバコ植物繁殖材料から繁殖させたタバコ植物から取得可能であるか、又は
iv）請求項２３若しくは２４に記載のタバコ植物の採取された葉を加工することにより取得可能である、
加工されたタバコ葉。
【請求項２６】
非生存性の加工されたタバコ葉である、請求項２５に記載の加工されたタバコ葉。
【請求項２７】
タバコが、乾燥、発酵、加熱殺菌、又はその組み合わせにより加工される、請求項２５又は２６に記載の加工されたタバコ葉。
【請求項２８】
カットされ加工されたタバコ葉である、請求項２５〜２７のいずれかに記載の加工されたタバコ葉。
【請求項２９】
（ａ）請求項１１、１２及び１６のいずれかに記載の植物若しくはその一部、又は；（ｂ）請求項１１、１２及び１６のいずれかに記載のタバコ細胞培養物、から作製される乾燥したタバコ材料。
【請求項３０】
請求項１１、１２及び１６のいずれかに記載のタバコ植物又はその一部から作製される乾燥したタバコ材料の抽出物。
【請求項３１】
請求項２９に記載の乾燥したタバコ材料を含むタバコブレンド。
【請求項３２】
ｉ）請求項１１、１２及び１６のいずれかに記載のタバコ植物若しくはその一部、又は請求項１１、１２及び１６のいずれかに記載のタバコ細胞培養物、
ii）請求項１３又は１４に記載のタバコ植物繁殖材料から繁殖させたタバコ植物又はその一部、
iii）請求項２３又は２４に記載のタバコ植物の採取された葉、
iv）請求項２５〜２８のいずれかに記載の加工されたタバコ葉、
ｖ）請求項２９に記載の乾燥したタバコ材料、
vi）請求項３０に記載の抽出物、或いは
vii）請求項３１に記載のタバコブレンド、
から調製されるタバコ産業製品。
【請求項３３】
タバコ産業製品が、可燃性の喫煙物品である、請求項３２に記載のタバコ産業製品。
【請求項３４】
タバコ産業製品が、無煙タバコ製品である、請求項３２に記載のタバコ産業製品。
【請求項３５】
タバコ産業製品が、非可燃性エアゾール供給システムである、請求項３２に記載のタバコ産業製品。
【請求項３６】
タバコ産業製品が、タバコ加熱デバイス又はエアゾール発生デバイスである、請求項３５に記載のタバコ産業製品。
【請求項３７】
請求項１１、１２及び１６のいずれかに記載の植物若しくはその一部、又はその抽出物、或いは請求項１１、１２及び１６のいずれかに記載のタバコ細胞培養物、或いは請求項２９に記載の乾燥したタバコ材料、或いは請求項３０に記載のタバコブレンド、を含む可燃性の喫煙物品、非可燃性エアゾール供給システム、無煙タバコ製品、又はタバコ加熱デバイス。
【請求項３８】
抽出物がタバコ抽出物である、請求項３７に記載の可燃性の喫煙物品。
【請求項３９】
タバコ抽出物を調製するための、請求項１１、１２及び１６のいずれかに記載のタバコ植物若しくはその一部、又はタバコ細胞培養物の使用。
【請求項４０】
（ａ）請求項１１、１２及び１６のいずれかに記載のタバコ植物若しくはその一部、又はタバコ細胞培養物を用意すること；及び
（ｂ）（ａ）の前記タバコ植物若しくはその一部、又はタバコ細胞培養物からタバコ抽出物を調製すること、
を含む、タバコ抽出物の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タバコの香りを改善することに関し、特にタバコ植物中のスクロースエステル含有量に関する。特に、本発明は、タバコ植物中のスクロースエステル含有量を増加させることに関する。より具体的には、本発明は、ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を阻害する方法及び使用、並びにタバコ植物及びその下流生成物（例えば、繁殖材料、採取された（harvested）葉、加工された（processed）タバコ、タバコ製品）に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物のトリコームは、表皮の伸長を含む特殊化した構造であり、多くの植物のアリエル表面に見出され得る。その形態は、種間はもとより、植物器官上のその場所、そのサイズ及び密度を含む種内でも異なる。それは、昆虫、病原微生物、及び草食動物に対する最善の防御を提供し、また降霜条件及び有風条件等の環境に対する保護を提供すると考えられている。トリコームは腺性及び分泌性生成物であり得、その主要機能は、植物表面において保存される、又は揮発する害虫若しくは花粉媒介者相互作用性の化学物質を産生することであり得る。そのような植物のトリコームは、経済上及び商業上の重要性を有する天然物を製造するための工場として機能する。有利には、分泌される化合物は、トリコーム腺においてのみ生成され、周辺キューティクルの下方にある腺細胞外部に蓄積する。したがって、滲出物は植物を非侵襲性溶媒中に浸漬することにより容易且つ完全に回収可能である。滲出物質が植物の外部に実質的に蓄積するからである。植物のトリコーム二次滲出物組成の操作は、昆虫耐性を増強するのに使用され（参照として本明細書に組み込まれているWang et al. Nature Biotechnology 19, 371-374(2001))、また腺性トリコームの代謝的エンジニアリングがエッセンシャルオイルの品質を強化するのに使用されている（参照として本明細書に組み込まれているMahmoud and Croteau Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Jul 17;98(15):8915-20. Epub 2001 Jun 26）。
【０００３】
いくつかのタバコ品種は、高バイオマス及び高い滲出物蓄積能力の両方を保持する。例えば、実験的なタバコ系統Ｔ．Ｉ．１０６８は、腺トリコーム滲出物として乾燥葉重量の最大１７％を生成し得る（参照として本明細書に組み込まれているWagner, G.J 1991 Plant Physiology 96, 675-679)。トリコーム腺性滲出物のほぼ７２％がジテルペノイドであり、またほぼ２４％がスクロースエステルである。
【０００４】
スクロースエステルの最も豊富な天然供給源は、タバコ植物であると思われる。糖（スクロース又はグルコース）とエステル化し得るアシル基及びアシル基の組合せには多くの可能性があることから、糖エステルは化合物の複雑な混合物である。このような化合物は、それを産生するタバコ葉の粘着性のテクスチャーに主に関係する（参照として本明細書に組み込まれているKandra, L. and G.J. Wagner, Archives Biochem. Biophys. 265 (1988) 425-432）。スクロースエステルは、トルコタバコ煙の重要な香り成分である３−メチル吉草酸及び３−メチル酪酸の前駆体であり（参照として本明細書に組み込まれているKandra, L., et al. Eur. J. Biochem. 188 (1990) 385-391）、さらに３−メチル吉草酸は、タバコに「トルコ風味」をもたらすと言われている。
【０００５】
Ｔ．Ｉ．１０６８トリコーム滲出物は、センブレノイド及びラブダノイドジテルペノイドを主に含有する。ＣＢＴジオール（α及びβ位置異性体）、シス−アビエノール、及びラブデンジオールは、滲出物重量の約６０、１０、及び０．６％をそれぞれ占める。Ｔ．Ｉ．１０６８トリコーム滲出物のジテルペン及びＣＢＴジオールの主要なジテルペンコンポーネントについて、その一般的な合成経路を図２に示す。葉緑体のメチルエリトリトールホスフェート（ＭＥＰ，methyl-erythritol-phosphate）経路は、ジテルペン合成用のゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ，geranylgeranyl pyrophosphate）を供給する。
【０００６】
タバコの官能特性又は知覚特性は、タイプが異なれば顕著に変化し、そして遺伝的差異を含む要因の複雑性により影響を受ける。タバコの抗真菌特性及び官能特性は、スクロースエステル含有量と関連すると考えられている。タバコの独特のアロマ及び香りプロファイルは、あるレベルで乾燥させた葉に存在する独特の香り及びアロマ化合物、又はこのような化合物の前駆体の結果であり、そしてスクロースエステル含有物を含み得る。
【０００７】
トルコタバコ（時にオリエンタルタバコと呼ばれる）は望ましい官能特性を有し、それはきわめて芳香性で、マイルドな香りを有する葉が小型化した多様なタバコであり、そして含有するニコチン量はその他のタバコ品種よりも少ない。測定可能な量のスクロースエステルが、タバコの乾燥／エージングプロセスを経ても残存し、したがって、市販のトルコ（又はオリエンタル）タバコの不可欠な成分として現れることが確認されている（参照として本明細書に組み込まれているM. Ashraf-Khorassani,et al. Contributions to tobacco Research Vol 21: 7; October 2005）。さらに、スクロースエステルは、トルコタバコ煙内の芳香性カルボン酸の前駆体であり、したがって、トルコタバコの重要な香りコンポーネントである（参照として本明細書に組み込まれているArrendale, R.F., et al., J. Agric. Food Chem. 38 (1990) 75-85）。
【０００８】
天然のスクロースエステルには、分子内のエステル化の程度及びエステル官能性の分布に起因して分析上の難問が存在する。スクロース分子内には、アシル基を有し得る４つの部位（例えば、１次が１箇所、２次が３箇所）がグルコース（ＧＬＵ，glucose）環上に存在し;またフルクトース（ＦＲＵ，fructose）環上には別の４部位（例えば、１次が２箇所、２次が２箇所）が見出され得る。今日まで、エステルの酸部分の同定は、スクロースメチル／ブチルエステル又はスクローストリメチルシリル（ＴＭＳ，trimethylsilyl）誘導体のガスクロマトグラフィー−マススペクトロメトリー（ＧＣ−ＭＳ，gas chromatography - mass spectrometry）、及び液体クロマトグラフィー−マススペクトロメトリー（ＬＣ−ＭＳ，liquid chromatography-mass spectrometry）によっている（参照として本明細書に組み込まれているSlocombe et al. Plant Physiol. 148, 1830-1846を参照）。より高分子量の炭化水素誘導体を取り込むための努力において、高温ガスクロマトグラフィー（ＧＣ，gas chromatography）が検討されたが、ほとんど奏功しなかった（参照として本明細書に組み込まれているKarrer, R., et al., J. High Resolu. Chromatogr. 15 (1992) 585-589）。エステルの酸加水分解及び遊離したカルボン酸の再誘導体化によりデータが取得され、それに由来するスクロースエステル上のアシル置換パターンに関する推定が報告されているが、しかしこのアプローチでは、異なる解釈が成り立ち得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Wang et al. Nature Biotechnology 19, 371-37４（2001）
【非特許文献２】Mahmoud and Croteau Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Jul 17;98(15):8915-20. Epub 2001 Jun 26
【非特許文献３】Wagner, G.J 1991 Plant Physiology 96, 675-679
【非特許文献４】Kandra, L. and G.J. Wagner, Archives Biochem. Biophys. 265 (1988) 425-432
【非特許文献５】Kandra, L., et al. Eur. J. Biochem. 188 (1990) 385-391
【非特許文献６】M. Ashraf-Khorassani,et al. Contributions to tobacco Research Vol 21: 7;October 2005
【非特許文献７】Arrendale, R.F., et al., J. Agric. Food Chem. 38 (1990) 75-85
【非特許文献８】Slocombe et al. Plant Physiol. 148, 1830-1846
【非特許文献９】Karrer, R., et al., J. High Resolu. Chromatogr. 15 (1992) 585-589
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本明細書において教示するジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を阻害することにより、スクロースエステル含有量が増加したタバコを生成するようにタバコを改変すれば、タバコ植物は商業的に望ましい特性を有するようになり、そのタバコ植物によって、顕著な香り（及び／又はアロマ及び／又はテイスト）の特徴、例えばトルコタバコに見出される特徴等が生成可能であることを驚くべきことに見出した。これにより、タバコ製品の消費者が追い求める優れた香り（及び／又はアロマ及び／又はテイスト）の特徴を有するタバコ製品が製造可能となる。
【００１１】
本発明者らは、特定の二次化合物を生成する特殊化したトリコーム腺細胞における炭素流動の制御及び経路について調査した。本発明者らの１つの目的は、トリコーム滲出物の化学的性質（chemistry）を改変してジテルペン含有量を変化させるために、トリコーム腺ジテルペン代謝を最適化することであった。同一条件下で繁殖させた野生型植物カウンターパートと比較して、滲出物中のスクロースエステル含有量の増加を意外にも示した植物系統の細胞株を構築した。植物系統は、ＣＢＴｏｌ（シンターゼ）及びテルペンシンターゼ３−８の形成を触媒する酵素を標的とした。テルペンシンターゼ３−８は、いくつかの実施形態において、シス−アビエノールシンターゼと呼ばれる場合もある。
【００１２】
本発明者らは、ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を阻害することにより、タバコ植物のスクロースエステル含有量を増加させる方法を驚くべきことに決定した。本発明以前には、ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現の阻害が、特に収率及びその他の商業的に望ましい特性を改善しつつ、スクロースエステル含有量を増加させるのに使用され得ることは知られていなかった。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
１つの態様によれば、本発明は、タバコ植物若しくはその一部、又はタバコ細胞培養物のスクロースエステル含有量を増加させる方法であって、ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を阻害することにより、前記タバコ植物又はタバコ細胞培養物を改変するステップを含む方法を提供する。
【００１４】
別の態様では、タバコ植物若しくはその一部、又はタバコ細胞培養物のスクロースエステル含有量を増加させるためのジテルペン合成遺伝子の使用が提供される。
【００１５】
本発明は、別の態様では、スクロースエステル含有量が増加しているタバコ植物若しくはその一部、タバコ植物繁殖材料、タバコ葉、カットされ採取されたタバコ葉、加工されたタバコ葉、又はカットされ加工されたタバコ葉、又はタバコ細胞培養物を生成する方法であって、ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を阻害するために、前記タバコを改変するステップを含む方法を提供する。
【００１６】
別の態様では、ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を阻害するように改変されなかったタバコ植物又はタバコ細胞培養物との比較においてスクロースエステル含有量が増加している、本発明による方法又は使用が提供される。
【００１７】
別の態様では、改変がジテルペン合成遺伝子の活性又は発現の阻害である、非改変植物又は非改変タバコ細胞培養物との比較において、スクロースエステル含有量の増加を実現するように改変されているタバコ植物若しくはその一部、又はタバコ細胞培養物が提供される。
【００１８】
１つの態様では、本発明によるタバコ植物又はタバコ細胞培養物から取得可能なタバコ植物繁殖材料（例えば、植物の種子）が提供される。
【００１９】
本発明は、別の態様では、ジテルペン合成遺伝子が、シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２，cyclase 2）、ＣＢＴｏｌシクラーゼ、又はテルペンシンターゼ３−８である、方法又は使用、タバコ植物、又はタバコ植物繁殖材料、又はタバコ細胞培養物を提供する。
【００２０】
本発明は、１つの態様では、ジテルペン合成遺伝子が、シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）である、方法又は使用、タバコ植物、又はタバコ植物繁殖材料を提供する。
【００２１】
本発明は、１つの態様では、ジテルペン合成遺伝子がＣＢＴｏｌシクラーゼである、方法又は使用、タバコ植物、又はタバコ植物繁殖材料を提供する。
【００２２】
本発明は、１つの態様では、ジテルペン合成遺伝子が、テルペンシンターゼ３−８である、方法又は使用、タバコ植物、又はタバコ植物繁殖材料を提供する。
【００２３】
本発明は、別の態様では、ジテルペン合成遺伝子の発現がＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ，RNA interference）を使用して阻害される、本発明による方法又は使用、タバコ植物若しくはその一部、又はタバコ植物繁殖材料、又はタバコ細胞培養物を提供する。
【００２４】
１つの態様では、シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）の発現が、シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）のエクソン１の少なくとも一部分、エクソン２の少なくとも一部分、及びエクソン３の少なくとも一部分を含むｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトを使用して阻害される、方法、使用、タバコ植物、又はタバコ植物繁殖材料、又はタバコ細胞培養物が提供される。
【００２５】
１つの態様では、方法、使用、タバコ植物、又はタバコ植物繁殖材料、又はタバコ細胞培養物が提供され、その場合、シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）の発現がｄｓＲＮＡを使用して阻害され、該ｄｓＲＮＡは、細胞内の内在性の経路により、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ，RNA-induced silencing complex）に対して、シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）のエクソン１の少なくとも一部分、エクソン２の少なくとも一部分、及びエクソン３の少なくとも一部分に対応するｍＲＮＡに結合するように導く一本鎖短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ，single stranded short interfering RNA）に変換される。１つの態様では、一本鎖ｓｉＲＮＡは、シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）のエクソン１の少なくとも一部分、エクソン２の少なくとも一部分、及びエクソン３の少なくとも一部分に対応するｍＲＮＡに対して相補的な配列を有するアンチセンス（又はガイド）ストランドを生成する。
【００２６】
１つの態様では、ＣＢＴｏｌシクラーゼ遺伝子の発現が、ＣＢＴｏｌシクラーゼ遺伝子のエクソン４の少なくとも一部分、イントロン４、エクソン５、イントロン５、エクソン６、イントロン６、及びエクソン７の少なくとも一部分を含むｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトを使用して阻害される、本発明による方法、使用、タバコ植物、又はタバコ植物繁殖材料、又はタバコ細胞培養物が提供される。
【００２７】
別の態様では、本発明による方法、使用、タバコ植物、又はタバコ植物繁殖材料、又はタバコ細胞培養物が提供されるが、その場合、ＣＢＴｏｌシクラーゼ遺伝子の発現がｄｓＲＮＡを使用して阻害され、該ｄｓＲＮＡは、細胞内の内在性の経路により、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に対して、ＣＢＴｏｌシクラーゼのエクソン４の少なくとも一部分、イントロン４、エクソン５、イントロン５、エクソン６、イントロン６、及びエクソン７の少なくとも一部分に対応するｍＲＮＡに結合するように導く一本鎖ｓｉＲＮＡに変換される。１つの態様では、一本鎖ｓｉＲＮＡは、ＣＢＴｏｌシクラーゼ遺伝子のエクソン４の少なくとも一部分、エクソン５、エクソン６、及びエクソン７の少なくとも一部分に対応するｍＲＮＡに対して相補的な配列を有するアンチセンス（又はガイド）ストランドを生成する。
【００２８】
１つの態様では、テルペンシンターゼ３−８遺伝子の発現が、配列番号３の少なくともヌクレオチド１４９７〜１５１７に対応する配列を含むｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトを使用して阻害される、本発明による方法、使用、タバコ植物、又はタバコ植物繁殖材料、又はタバコ細胞培養物が提供される。
【００２９】
別の態様では、テルペンシンターゼ３−８遺伝子の発現が、配列番号３の少なくともヌクレオチド１４９７〜１５１７に対応する配列を含む人工的マイクロＲＮＡｉ（ａｍｉＲＮＡｉ，artificial micro RNAi）を使用して阻害される、本発明による方法、使用、タバコ植物、又はタバコ植物繁殖材料、又はタバコ細胞培養物が提供される。
【００３０】
１つの態様では、テルペンシンターゼ３−８遺伝子の発現が、配列番号３の少なくともヌクレオチド８８４〜９０４に対応する配列を含むｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトを使用して阻害される、本発明による方法、使用、タバコ植物、又はタバコ植物繁殖材料、又はタバコ細胞培養物が提供される。
【００３１】
別の態様では、テルペンシンターゼ３−８遺伝子の発現が、配列番号３の少なくともヌクレオチド８８４〜９０４に対応する配列を含む人工的マイクロＲＮＡｉ（ａｍｉＲＮＡｉ）を使用して阻害される、本発明による方法、使用、タバコ植物、又はタバコ植物繁殖材料、又はタバコ細胞培養物が提供される。
【００３２】
１つの態様では、タバコ植物のスクロースエステル含有量は、ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を阻害するように改変されなかったタバコ植物又はタバコ細胞培養物と比較して、改変されたタバコ植物又はタバコ細胞培養物において少なくとも２倍（好適には少なくとも３倍）高い、本発明の方法若しくは使用、本発明のタバコ植物若しくはその一部、又は本発明のタバコ植物繁殖材料若しくはタバコ細胞培養物が提供される。
【００３３】
１つの態様では、タバコ植物を育成させるための、本発明のタバコ植物又はその一部の使用が提供される。
【００３４】
別の態様では、本発明は、タバコ産業製品を製造するための、本発明のタバコ植物若しくはその一部、又はタバコ細胞培養物の使用を提供する。
【００３５】
別の態様では、作物を栽培するための、本発明のタバコ植物又はその一部の使用が提供される。
【００３６】
１つの態様では、本発明は、本発明による植物若しくはその一部、又はその抽出物、或いは本発明によるタバコ細胞培養物から作製される乾燥したタバコ材料を提供する。
【００３７】
別の態様では、本発明による前記乾燥したタバコ材料を含むタバコブレンドが提供される。
【００３８】
１つの態様では、タバコ葉（例えば、加工された（好ましくは乾燥した）タバコ葉）を製造するための、本発明のタバコ植物又はその一部の使用が提供される。
【００３９】
別の態様では、本発明の、又は本発明の繁殖材料から繁殖させたタバコ植物から取得可能な、又は本発明の使用により取得されたタバコ植物から取得可能な、タバコ植物の採取された葉が提供される。
【００４０】
１つの態様では、カットされ採取された葉である、本発明のタバコ植物の採取された葉が提供される。
【００４１】
本発明は、別の態様では、
ｉ）本発明の使用から取得可能なタバコ植物から取得可能であるか、
ii）本発明のタバコ植物を加工することにより取得可能であるか、
iii）本発明のタバコ植物繁殖材料から繁殖させたタバコ植物から取得可能であるか、又は
iv）本発明のタバコ植物の採取された葉を加工することにより取得可能である、
加工されたタバコ葉（好ましくは非生存性の加工されたタバコ葉）を提供する。
【００４２】
１つの態様では、タバコが、乾燥、発酵、加熱殺菌、又はその組合せにより加工される、本発明の加工されたタバコ葉が提供される。
【００４３】
１つの態様では、カットされ加工されたタバコ葉である、本発明の加工されたタバコ葉が提供される。
【００４４】
本発明は、別の態様では、
ｉ）本発明のタバコ植物若しくはその一部、又は本発明のタバコ細胞培養物、
ii）本発明のタバコ植物繁殖材料から繁殖させたタバコ植物又はその一部、
iii）本発明のタバコ植物の採取された葉、
iv）本発明の加工されたタバコ葉、
から調製されるタバコ産業製品を提供する。
【００４５】
１つの態様では、タバコ製品が喫煙物品である、本発明のタバコ産業製品が提供される。
【００４６】
別の態様では、タバコ製品が無煙タバコ製品である、本発明のタバコ産業製品が提供される。
【００４７】
１つの態様では、タバコ製品が、タバコ加熱デバイス、例えばエアゾール発生デバイス等である、本発明のタバコ産業製品が提供される。
【００４８】
１つの態様では、本発明による植物若しくはその一部、又はその抽出物（例えば、タバコ抽出物）、或いは本発明によるタバコ細胞培養物；或いは本発明による乾燥したタバコ材料；或いは本発明によるタバコブレンドを含む喫煙物品、無煙タバコ製品、又はタバコ加熱デバイスが提供される。
【００４９】
１つの態様では、説明及び図面を参照しながら本明細書に実質的に記載される方法、タバコ葉、タバコ植物、タバコ植物繁殖材料、採取された葉、加工されたタバコ、タバコ製品、使用、又はその組合せが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
本発明の実施形態を、添付図面を参照しながら、例示目的に限定してここに記載する。
【図１】スクロースエステルの一般構造を示す図である。
【図２】プラスチド内のジテルペン合成経路の概略を示す図である。
【図３】遺伝子導入系統と対比して屋外栽培した対照の未乾燥（green）葉分析結果を提示するグラフを示す図である。個々の植物の化学的性質は、量の少ないものから多いものの順番で配置されている。
【図４】遺伝子導入系統と対比して、対照内の総スクロースエステル含有量を提示するグラフを示す図である。
【図５】対照と対比して、系統ＧＷ−３におけるスクロースエステルの富化を実証するグラフを示す図である。スクロースエステル含有量は、総主要滲出化合物に占める割合（％）として表わす。
【図６】対照と対比して、系統ＧＷ−３におけるシス−アビエノールの富化を実証するグラフを示す図である。シス−アビエノール含有量は、総主要滲出化合物に占める割合（％）として表わす。
【図７】以下に記載する配列番号１を示す図である。
【図８】以下に記載する配列番号２を示す図である。
【図９】以下に記載する配列番号３を示す図である。
【図１０】以下に記載する配列番号４を示す図である。
【図１１】以下に記載する配列番号５を示す図である。
【図１２】以下に記載する配列番号６を示す図である。
【図１３】以下に記載する配列番号７を示す図である。
【図１４】以下に記載する配列番号８を示す図である。
【図１５】以下に記載する配列番号９を示す図である。
【図１６】以下に記載する配列番号１０を示す図である。
【図１７】以下に記載する配列番号１１を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
配列表
本明細書及び対応する配列表全体を通じて使用される配列識別子の概要を以下の通り提示する。
【００５２】
配列番号１は、ＣＢＴｏｌシクラーゼ遺伝子をコードするヌクレオチド配列に対応する。このヌクレオチド配列はＧｅｎｂａｎｋ：ＡＹ０４９０９０において注釈付けされている。
【００５３】
配列番号２はポリペプチドＣＢＴｏｌシクラーゼのアミノ酸配列に対応する。
【００５４】
配列番号３は、ｃＤＮＡ遺伝子配列、すなわちニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）由来のテルペンシンターゼ３−８遺伝子のコーディング配列に対応する。完全長ｃＤＮＡ遺伝子配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＹ５２８６４５において注釈付けされている。
【００５５】
配列番号４は、ニコチアナ・タバカム由来のポリペプチドテルペンシンターゼ３−８のアミノ酸配列に対応する。
【００５６】
配列番号５は、５’→３’の順番で、配列ＡＦ４０１２３４に由来する５４番〜７１６番ヌクレオチド（ＣＹＣ２  ｍＲＮＡの完全コーディング配列であり、配列番号９のヌクレオチドナンバリングに対応する）からなるセンスフラグメント；ヘアピンループとしての部分的なＧＵＳ  Ａフラグメント（７８７番〜１８１２番ヌクレオチド）；及びセンスフラグメントの逆相補鎖を含む。図では、下線付きの配列は、７８７番〜１８１２番ヌクレオチドに由来するＧＵＳ  Ａフラグメント（ＡＦ５０２１２８）に対応する。センス方向のＣＹＣ２  ｍＲＮＡに由来する５４〜７１６ヌクレオチド配列（ＡＦ４０１２３４は配列番号９に対応）は、ＡＹ４９５６９４由来の下記のゲノム配列（ＡＹ４９５６９４はＣＹＣ２遺伝子のゲノム配列であり、配列番号８に対応する）：ヌクレオチド１〜２５、１番エクソン（ヌクレオチド２６〜２７１）、２番エクソン（ヌクレオチド１２５３〜１５２９）、及び３番エクソンの最初から１１５個のヌクレオチド（ヌクレオチド２３６６〜２４８０）に対応するが、ヌクレオチドのナンバリングは配列番号８のナンバリングに対応する。配列番号５はｄｓＲＮＡをコードし、そしてｄｓＲＮＡを生成するために、ｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクト（本明細書では、ＧＷ１と呼ぶときがある）で使用される。
【００５７】
配列番号６は、センス及びアンチセンス方向でエクソン４の部分配列、イントロン４、エクソン５、イントロン５、エクソン６、イントロン６、及び部分的なエクソン７を含み、ＧＵＳスペーサーにより分離したニコチアナ・タバカムのＣＢＴｏｌシクラーゼ遺伝子由来の配列を含む。部分的な遺伝子の各要素を以下の順番で図に示す：Ｎ．タバカムシクラーゼ遺伝子（ＡＹ０４９０９０）、部分的なエクソン４−フォワード方向のヌクレオチド２８５４〜ヌクレオチド４１７５、部分的なエクソン４、イントロン４（太字）、エクソン５、イントロン５（太字）、エクソン６、イントロン６（太字）、部分的なエクソン７（配列番号１のヌクレオチド２８５４〜４１７５に対応）；その後に７８６〜１８１６（下線部）のＧＵＳループ−部分的なＧＵＳ  Ａ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ５０２１２８）；その後にＮ．タバカムシクラーゼ遺伝子（ＡＹ０４９０９０）と同一であるが、但し逆相補（逆相補を影付きで示す）の配列。この配列は、ｄｓＲＮＡをコードし、そしてｄｓＲＮＡを生成させるためにｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクト（本明細書では、ＧＷ３と呼ぶときがある）で使用される。
【００５８】
配列番号７は、ニコチアナ・タバカム由来のテルペンシンターゼ３−８遺伝子からの２１個のヌクレオチド配列、及びシロイヌナズナ属（Arabidopsis）のｍｉＲＮＡ１６８配列と一致する配列を含む。配列は、シロイヌナズナ属のｍｉＲＮＡ１６８ａに対応し、第１及び第２のイタリック体の配列は、テルペンシンターゼ３−８遺伝子ＡＹ５２８６４５由来の２１個のヌクレオチド配列に対応する（１４９７〜１５１７ｎｔ）。第１のイタリック体の配列（強調されている）は逆相補方向である。第２のイタリック体の配列（下線部）は、フォワード方向であり、及び３つの改変（太字）を有する。配列は、ａｍｉＲＮＡｉをコードし、ａｍｉＲＮＡｉを生成させるために、ｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクト（本明細書では、ＧＷ２と呼ぶときがある）で使用される。
【００５９】
配列番号８は、シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）のゲノム配列に対応する。このヌクレオチド配列はＧｅｎｂａｎｋ：ＡＹ４９５６９４において注釈付けされている。
【００６０】
配列番号９は、Ｇｅｎｂａｎｋ：（ＡＦ４０１２３４）において注釈付けされているシクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）のｍＲＮＡの完全コーディング配列に対応する。
【００６１】
配列番号１０は、シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）配列番号９によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対応する。
【００６２】
配列番号１１は、ニコチアナ・タバカム由来のテルペンシンターゼ３−８遺伝子からの２１個のヌクレオチド配列、及びシロイヌナズナ属のｍｉＲＮＡ１６８ａ配列と一致する配列を含む。配列は、シロイヌナズナ属のｍｉＲＮＡ１６８ａ配列に対応し、第１及び第２のイタリック体の配列は、テルペンシンターゼ３−８遺伝子ＡＹ５２８６４５に由来する逆相補の２１個のヌクレオチド配列に対応する（８８４〜９０４ｎｔ）。第１のイタリック体の配列（強調されている）は逆相補方向である。第２のイタリック体の配列（下線部）は、フォワード方向であり、及び改変（太字）を有する。配列はａｍｉＲＮＡｉをコードし、そしてａｍｉＲＮＡｉを生成させるために、ｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクト（本明細書では、ＧＷ５と呼ぶときがある）で使用される。
【００６３】
詳細な説明
初めて、本発明者らは、タバコ内のジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を阻害することにより、タバコ植物のスクロースエステル含有量を増加させることができることを明らかにした。理論に拘泥するものではないが、ジテルペン合成遺伝子を阻害すると、その結果、ジテルペン形成のための炭素利用が低下し、したがって、スクロースエステルの生成が増強されると考えられている。
【００６４】
１つの実施形態では、本発明は、タバコ植物のスクロースエステル含有量を増加させる方法であって、ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を阻害することにより、前記タバコ植物を改変するステップを含む方法を提供する。
【００６５】
好適には、本発明で使用されるジテルペン合成遺伝子は、シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）であり得る。好適には、本発明で使用されるジテルペン合成遺伝子は、ＣＢＴｏｌシクラーゼ遺伝子であり得る。好適には、本発明で使用されるジテルペン合成遺伝子は、テルペンシンターゼ３−８遺伝子であり得る。
【００６６】
用語「増加している（increasing）」は、本明細書においては、本発明の製品（例えば、植物、その一部（例えば、葉）、加工された葉、又はタバコ製品）内のスクロースエステルの濃度及び／又は総含有量が、本発明に基づき改変されなかった同等の製品と比較してそれより高いことを意味するのに使用される。
【００６７】
本明細書で定義する用語「同等の製品」とは、本発明により改変されなかったが、しかしその他の関連するすべての特質（例えば、植物の種、生育条件、タバコを加工する方法等）が同一であったタバコ植物に由来する製品である。本発明による同等の製品は、ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を阻害するように改変されなかったタバコ植物から取得可能な（obtainable）又は取得された（obtained）タバコ植物若しくはその一部、例えばタバコ葉、採取された葉、カットされ採取された葉、加工されたタバコ葉、又はタバコ植物繁殖材料、又はタバコ製品、又はその組合せ等を意味し得る。同等の製品は対照としても知られている場合もある。１つの実施形態では、同等の製品は、活性又は発現が阻害されたジテルペン合成遺伝子を含まない製品である。
【００６８】
本明細書で定義する用語「非改変植物」は、ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を阻害するように本発明により改変されなかったが、その他の関連するすべての特質が同一であった（例えば、植物の種、生育条件、タバコを加工する方法等）タバコ植物である。１つの実施形態では、非改変植物は、活性又は発現が阻害されたジテルペン合成遺伝子を含まない植物である。
【００６９】
さらなる態様では、スクロースエステル含有量は未乾燥葉から測定される。さらなる態様では、スクロースエステル含有量は、乾燥した葉、例えば空気乾燥、熱風乾燥、火力乾燥、又は天日乾燥した葉から測定される。さらなる態様では、スクロースエステル含有量は、熱風乾燥した葉から測定される。さらなる態様では、スクロースエステル含有量は、空気乾燥した葉から測定される。
【００７０】
用語「スクロースエステル含有量」は、本明細書においては、スクロースエステルとして分類される化合物の群全体の濃度及び／又は総含有量を意味するのに使用される。タバコ中に一般的に存在するスクロースエステルは、図１に示す式により表わすことができる。
【００７１】
スクロースエステルの濃度及び／又は総含有量を決定するための、当技術分野において公知の任意の方法が使用され得る。スクロースエステル（ＳＥ，sucrose ester）を分析する１つの好ましい方法は、鹸化によりスクロースから遊離したアシル基の分析、その後のＧＣ−ＭＳによるそのブチルエステルの分析と関係する。この方法による分析は、スクロースエステル量において強力な定量法を提供する。代替法は、葉表面積１ｃｍ２当たりのスクロースのμｇを測定することによるスクロースエステルの分析と関係する。スクロースエステル含有量の決定は、タバコ葉において評価可能である。スクロースエステル含有量を分析するための適する方法は、例えばガムサンプルをオーバーナイト、２２℃で８０％メタノール中に配置して鹸化する鹸化ステップを含み得る。次に、サンプルは、ヘキサンと水の間で分配し得る。サンプルを分配するために、サンプルは、例えばＮ２の下で最初に乾燥されてもよく、次にｎ−ＢｕＯＨ及びＨ２ＳＯ４が添加可能である。サンプルは、パルスボルテックスする前に、１１０°まで１時間加熱され得る。抽出を行い、別のチューブに移すために乾燥サンプルをＣＨＣｌ３に溶解し、そしてＮ２下で乾燥することができる。サンプルは、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ，dimethyl formamide）及びビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセタミドに溶解可能である。サンプルは、例えば７０°において誘導体化した後、室温まで冷却され得る。誘導体化されたサンプルは、次にＧＣ−ＭＳにより分析可能である。溶出した化合物は、そのリテンションタイムにより、及びＭＳプロファイルを標準と比較することにより同定することができる。
【００７２】
１つの実施形態では、スクロースエステル含有量が増加している本発明のタバコ植物により取得可能な又は取得されたタバコ植物、タバコ植物繁殖材料、タバコ葉、採取された葉、カットされ採取された葉、加工されたタバコ葉、カットされ加工されたタバコ葉、タバコ製品、又はその組合せを製造する方法であって、ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を阻害するように前記タバコを改変するステップを含む方法が提供される。スクロースエステル含有量の増加は、タバコ植物、タバコ植物繁殖材料、タバコ葉、採取された葉、カットされ採取された葉、加工されたタバコ葉、カットされ加工されたタバコ葉、タバコ製品、又はその組合せ内のスクロースエステル含有量を、同等の製品と比較することにより決定され得る。
【００７３】
好適には、スクロースエステル含有量は、タバコ植物、例えば改変されたタバコ植物において増加し得る。好適には、スクロースエステル含有量は、タバコ葉（例えば、改変されたタバコ植物に由来するタバコ葉）において増加し得る。好適には、スクロースエステル含有量は、採取された葉（例えば、改変されたタバコ植物に由来する採取されたタバコ葉）において増加し得る。好適には、スクロースエステル含有量は、カットされ採取された葉（例えば、改変されたタバコ植物に由来するカットされ採取されたタバコ葉）において増加し得る。好適には、スクロースエステル含有量は、加工されたタバコ葉（例えば、改変されたタバコ植物に由来する加工されたタバコ葉）において増加し得る。好適には、スクロースエステル含有量は、カットされ加工されたタバコ葉（例えば、改変されたタバコ植物に由来するカットされ加工されたタバコ葉）において増加し得る。好適には、スクロースエステル含有量は、乾燥したタバコ葉（例えば、改変されたタバコ植物に由来するタバコ葉）のトリコーム滲出物において増加し得る。好適には、スクロースエステル含有量は、未乾燥のタバコ葉（例えば、改変されたタバコ植物に由来するタバコ葉）の抽出物において増加し得る。好適には、スクロースエステル含有量は、タバコ製品（例えば、改変されたタバコ植物又はその一部から製造されるタバコ製品）において増加し得る。好適には、スクロースエステル含有量は、上記製品又はその組合せのうちの任意の１つにおいて増加し得る。
【００７４】
１つの実施形態では、スクロースエステル含有量は、乾燥したタバコ葉（例えば、改変されたタバコ植物に由来するタバコ葉）のトリコーム滲出物において増加している。
【００７５】
１つの実施形態では、スクロースエステル含有量は、未乾燥のタバコ葉（例えば、改変されたタバコ植物に由来するタバコ葉）において増加している。
【００７６】
１つの実施形態では、タバコ植物又はその一部のスクロースエステル含有量は、類似した生育条件下で生育したが、ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を阻害するように改変されなかったタバコ植物又はその一部のスクロースエステル含有量とそれぞれ比較したとき、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍増加し得る。好適には、スクロースエステル含有量は、約２倍〜約１０倍、好ましくは約３倍〜約１０倍、好適には約３倍〜約５倍増加し得る。
【００７７】
１つの実施形態では、方法又は使用は、ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を阻害するように改変されなかったタバコ植物又はその一部との比較において、より具体的には、導入された阻害が存在しないタバコ植物による発現と比較して又はそれに対して、スクロースエステル含有量の増加を引き起こす。
【００７８】
一実施形態では、タバコ植物又はその一部は、ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を阻害するように改変されなかったタバコ植物又はその一部とそれぞれ比較したとき、スクロースエステル含有量の増加を実現するように改変されている。
【００７９】
用語「改変すること」又は「改変された」とは、本明細書で使用する場合、変更された又は変化したタバコ植物を意味する。本発明は、植物を遺伝的に改変する又は植物を非遺伝的に改変する技術を使用する植物の改変を含む。そのような方法は当技術分野において周知されており、また遺伝的改変技術の例として、形質転換、遺伝子導入、シスジェニクス、及び遺伝子編集法が挙げられる。非遺伝的改変技術の例として、高速中性子変異誘発、化学的変異誘発、及びモダン集団解析アプローチが挙げられる。１つの実施形態では、用語「改変すること」とは、阻害されたジテルペン合成遺伝子を有する天然のバリアントを選択すること、及びそのような特性又は遺伝子を商業的に望ましい特性を有する第２の植物内に、交配により組み込むことを意味する。
【００８０】
用語「阻害すること」（例えば、ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を阻害すること）とは、本明細書で使用する場合、ジテルペン合成遺伝子の活性若しくは発現が、同等の製品内の遺伝子の遺伝子活性若しくは発現と比較して低下若しくは減少していること、又はジテルペン合成遺伝子により生成されるタンパク質の量若しくは活性が低下していることを意味する。
【００８１】
１つの実施形態では、用語「阻害すること」（例えば、ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を阻害すること）とは、本明細書で使用する場合、ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現が、同等の製品内の遺伝子の遺伝子活性又は発現と比較して低下していることを意味する。
【００８２】
ジテルペン合成遺伝子の「活性」又は「機能」は、ジテルペンの生合成において機能するその能力に関する。ジテルペン合成遺伝子の活性又は機能は、ジテルペン合成の直接的な生成物を測定することにより、すなわちジテルペンのレベルを測定することにより決定可能である。滲出物コンポーネントは、アセトニトリルで葉又はリーフディスクを洗浄することにより測定され得る。洗浄物はローターエバポレーションにより濃縮されて油性の残留物が得られる。残留物は、トリメチルシリル（ＴＭＳ）エステルを形成するために、次に誘導体化可能である（参照として本明細書に組み込まれているSeverson et al. 1985. J. Agric. Food Chem. 33, 870-875の記載に従い）。ＴＭＳ誘導体は、次にマススペクトロメトリーと連結したガスクロマトグラフィー（ＧＣ−ＭＳ，gas chromatography coupled to mass spectrometry）により分離及び分析可能である。溶出した化合物は、Wangら（2001）（前出、参照として本明細書に組み込まれている）に記載されるように、そのリテンションタイムにより、及びＭＳプロファイルを標準と比較することにより同定可能である。１つの実施形態では、ジテルペン合成遺伝子の直接的な生成物は、シス−アビエノール、α−ＣＢＴ−オール、β−ＣＢＴ−オール、α−ＣＢＴ−ジオール、β−ＣＢＴ−ジオール、又はラブデンジオールであり得る。
【００８３】
特定のジテルペン合成遺伝子の活性は、遺伝子の転写を測定することにより測定可能である。転写測定方法は当技術分野において周知されており、特にノーザンブロット、ＲＮＡ−Ｓｅｑ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＤＮＡマイクロアレイ、及びＲＴ−ＰＣＲが挙げられる。或いは、遺伝子の活性は、遺伝子産物、例えば前記遺伝子によりコードされるタンパク質のレベルを測定することにより間接的に測定され得る。
【００８４】
遺伝子の活性又は発現は、転写、翻訳、すなわちタンパク質発現のレベル、又はジテルペン合成遺伝子によりコードされるタンパク質の活性を意味し得る。本発明の１つの態様によれば、遺伝子発現は、転写及び／又は翻訳を阻害することにより阻害され得る。１つの実施形態では、遺伝子の活性又は発現は、転写のレベル、すなわち生成されるｍＲＮＡの量、又は翻訳、すなわち生成されるタンパク質のレベル又は量を意味し得る。
【００８５】
発現及び／又は機能の阻害、抑制、又は阻止
ジテルペン合成遺伝子の発現又は機能を阻害又は抑制又は阻止するための当技術分野において公知の任意の方法が本方法で使用され得る。
【００８６】
例として、本方法は、
・配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号１１として示すアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列に変異を起こさせるステップ；
・配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号１１として示すアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の発現制御に寄与する制御領域（例えば、プロモーター及びエンハンサー）に変異を起こさせるステップ；
・配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号１１として示すアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列のレベルを低下させるアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡを提供するステップ、
を含み得る。
【００８７】
上記アプローチのそれぞれは、配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号１１として示すアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の発現又は機能の低下又は阻止を引き起こす。
【００８８】
本明細書で用いる場合、用語「変異」は、天然の遺伝的バリアント又は工学的改変バリアントを含む。特に、用語「変異」とは、配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号１１として表わされる配列と比較して、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列内、若しくはアミノ酸配列内の変化、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、タンパク質の発現若しくは機能を抑制するアミノ酸配列を意味する。
【００８９】
好ましい実施形態では、植物内に存在する、配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号１１として示す配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含むタンパク質をコードする核酸配列の各コピーは、本明細書で定義するように変異する（例えば、植物内で前記タンパク質をコードする遺伝子の各ゲノムコピーが変異する）。例えば、Ｎ．タバカム（N. tabacum）の異質四倍体ゲノム内の遺伝子の各コピーは、変異し得る。
【００９０】
好ましい実施形態では、本発明による植物又は植物細胞は、変異についてホモ接合性である。
【００９１】
１つの実施形態では、好ましくは、本発明による植物又は植物細胞は、変異した核酸のみを発現する。換言すれば、いくつかの実施形態では、内在性の（又は内在性で機能的な）タンパク質は、本発明による植物内に存在しない。換言すれば、内在性タンパク質が存在したとしても、不活性化した形態及び／又はトランケーションされた形態であるのが好ましい。
【００９２】
１つの実施形態では、本方法は、配列番号１、配列番号３、若しくは配列番号８として示す配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列内に変異を起こさせるステップを含み得る。
【００９３】
変異は、配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号１１として示すアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列が、完全に又は部分的に欠損するように、さもなければ非機能的にするように、植物ゲノムを変化させる可能性がある。
【００９４】
変異は、配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号１１として示すアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列を中断させる可能性がある。
【００９５】
中断は、核酸配列が転写及び／又は翻訳されないようにする可能性がある。
【００９６】
核酸配列は、例えば、タンパク質の翻訳が低下する又は阻止されるように核酸配列のＡＴＧ開始コドンを欠損させる、さもなければ変化させることにより中断され得る。
【００９７】
核酸配列は、タンパク質の発現を低下させる、若しくは阻止する、又はタンパク質輸送に影響を及ぼす１若しくは２以上のヌクレオチド変化（複数可）を含み得る。例えば、タンパク質の発現は、１若しくは２以上の未成熟終止コドン、フレームシフト、スプライス変異体、又はオープンリーディングフレーム内の非許容性のアミノ酸置換の導入により低下し得る又は阻止され得る。
【００９８】
未成熟終止コドンとは、終止コドンをオープンリーディングフレームに導入し、そして全アミノ酸配列の翻訳を阻止する変異を意味する。未成熟終止コドンは、ＴＡＧ（「ａｍｂｅｒ」）、ＴＡＡ（「ｏｃｈｒｅ」）、又はＴＧＡ（「ｏｐａｌ」又は「ｕｍｂｅｒ」）コドンであり得る。
【００９９】
フレームシフト変異（フレーミングエラー又はリーディングフレームシフトとも呼ばれる）は、３で割り切れない、核酸配列内のいくつかのヌクレオチドのインデル（挿入又は欠損）により引き起こされた変異である。コドンによる遺伝子発現がトリプレットによるものであることから、挿入又は欠損は、リーディングフレームを変化させる可能性があり、オリジナルとは完全に異なる翻訳を引き起こす。フレームシフト変異は、多くの場合、変異の後ろのコドンが、異なるアミノ酸をコードするように読み取られてしまう原因となる。フレームシフト変異は、未成熟終止コドンの導入を一般的に引き起こす。
【０１００】
スプライス変異体は、メッセンジャーＲＮＡ前駆体から成熟メッセンジャーＲＮＡへのプロセシング期間中にスプライシングが生ずる特異的部位においていくつかのヌクレオチドの挿入、欠損、又は変化を引き起こす。スプライシング部位が欠損すると、その結果、成熟ｍＲＮＡ内に１又は２以上のイントロンが残留することとなり、異常タンパク質の生成を引き起こす可能性がある。
【０１０１】
非許容性のアミノ酸置換とは、タンパク質の機能の低下又は削剥を引き起こすタンパク質内の非同義的アミノ酸置換の原因となる変異を意味する。
【０１０２】
核酸配列に変異をもたらす当技術分野において公知の任意の方法は、本方法で利用可能である。例えば、相同的な組換えが利用可能であり、そのような組換えでは、関連する核酸配列（複数可）を変異させ、そして植物又は植物細胞を形質転換するのに使用されるベクターが作製される。変異した配列を発現する組換え植物又は植物細胞が、次に選択され得る。
【０１０３】
１つの実施形態では、変異は、配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号１１として示すアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含むタンパク質に非許容性のアミノ酸置換を導入する。
【０１０４】
１つの実施形態では、変異は、配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号１１として示すタンパク質、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列に関連して、タンパク質の活性を低下させる。
【０１０５】
１つの実施形態では、変異は、レベル又は発現を変化させないが、配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号１１として示すタンパク質、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列に関連して、タンパク質の活性を低下させる。
【０１０６】
核酸配列は、完全に又は部分的に欠損し得る。欠損は、連続的であり得る、又は複数のセクションの配列を含み得る。欠損は、核酸配列が機能的タンパク質をもはやコードしないように、十分な量のヌクレオチド配列を取り除くのが好ましい。欠損は、例えば核酸配列のコーディング部分の少なくとも５０、６０、７０、８０、又は９０％を除去し得る。
【０１０７】
欠損は、ジテルペン合成遺伝子の１又は２以上のドメインを除去し得る。欠損は、全部であり得、この場合同等の非改変型植物の対応するゲノムと比較したとき、核酸配列のコーディング部分の１００％が存在しない。
【０１０８】
植物内の核酸配列を欠損させる方法は、当技術分野において公知である。例えば、相同的な組換えが利用可能であり、同法では、関連する核酸配列（複数可）が欠如しており、植物又は植物細胞を形質転換するのに使用されるベクターが構築される。配列の新規の部分を発現する組換え植物又は植物細胞が、次に選択され得る。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現は、本発明に基づき改変されなかったタバコ植物内のジテルペン合成遺伝子の活性又は発現と比較したとき、少なくとも約１０％、２０％、３０％、又は４０％、好適には少なくとも約５０％、６０％、７０％、より好適には少なくとも約８０％、９０％、９５％、又は１００％阻害され得る又は低下し得る。
【０１１０】
好ましい実施形態では、ジテルペン合成遺伝子は、活性又は発現を実質的に有し得ない、すなわち植物は、好ましくはジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を阻害するように改変されなかった植物と比較したとき、約１％未満（好適には約０．１％未満）の活性又は発現を含み得ることを意味する。
【０１１１】
ジテルペン合成遺伝子とは、本明細書で使用する場合、ジテルペンの生成に関与するあらゆる遺伝子を指す。好適には、ジテルペン合成遺伝子は、植物ジテルペン合成遺伝子である。そのような遺伝子は、直接的にはジテルペンを生成する生合成経路の一部であり得る、又は例えば代謝前駆体を提供することにより、生合成経路に間接的に供給され得る。ジテルペン合成遺伝子は、特殊な（二次）代謝又は一般（一次）代謝に関与し得る。１つの実施形態では、本明細書で使用されるジテルペン合成遺伝子とは、特殊な（二次）代謝に関与する遺伝子を指す。好適には、本発明で使用されるようなジテルペン合成遺伝子は、シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）、ＣＢＴｏｌシクラーゼ、及びテルペンシンターゼ３−８からなるジテルペン合成遺伝子の群から選択され得る、又はシクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）、ＣＢＴｏｌシクラーゼ、若しくはテルペンシンターゼ３−８のうちの任意の１つと相同である。好適には、本発明で使用されるようなジテルペン合成遺伝子は、シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）、ＣＢＴｏｌシクラーゼ、及びテルペンシンターゼ３−８からなるジテルペン合成遺伝子の群から選択され得る。
【０１１２】
好適には、本発明で使用されるようなジテルペン合成遺伝子は、シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）である。好適には、本発明で使用されるようなジテルペン合成遺伝子は、ＣＢＴｏｌシクラーゼである。好適には、本発明で使用されるようなジテルペン合成遺伝子は、テルペンシンターゼ３−８である。
【０１１３】
１つの実施形態では、本明細書で引用するジテルペン合成遺伝子は、シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）であり、
ｉ）配列番号８又は配列番号９として本明細書に示すポリヌクレオチド配列、又は
ii）ジテルペン合成遺伝子をコードする、ｉ）に示すポリヌクレオチド配列の機能的断片、又は
iii）配列番号１０として本明細書に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は
iv）高度に厳密な条件の下で、上記ｉ）、ii）、若しくはiii）において教示するポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列、又は
ｖ）上記ｉ）、ii）、若しくはiii）に示すポリヌクレオチドと少なくとも７０％（好ましくは８５％、より好ましくは９０％）の同一性を有するポリヌクレオチド配列、又は
vi）遺伝子コードの縮重に起因して、ｉ）、ii）、若しくはiii）に示すポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオチド配列
を含むポリヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【０１１４】
１つの実施形態では、本明細書で引用するジテルペン合成遺伝子は、ＣＢＴｏｌシクラーゼであり、
ｉ）配列番号１として本明細書に示すポリヌクレオチド配列、又は
ii）ジテルペン合成遺伝子をコードする、ｉ）に示すポリヌクレオチド配列の機能的断片、又は
iii）配列番号２として本明細書に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は
iv）高度に厳密な条件の下で、上記ｉ）、ii）、若しくはiii）において教示するポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列、又は
ｖ）上記ｉ）、ii）、若しくはiii）に示すポリヌクレオチドと少なくとも７０％（好ましくは８５％、より好ましくは９０％）の同一性を有するポリヌクレオチド配列、又は
vi）遺伝子コードの縮重に起因して、ｉ）、ii）、若しくはiii）に示すポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオチド配列
を含むポリヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【０１１５】
１つの実施形態では、本明細書で引用するジテルペン合成遺伝子は、テルペンシンターゼ３−８であり、
ｉ）配列番号３として本明細書に示すポリヌクレオチド配列、又は
ii）ジテルペン合成遺伝子をコードする、ｉ）に示すポリヌクレオチド配列の機能的断片、又は
iii）配列番号４として本明細書に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は
iv）高度に厳密な条件の下で、上記ｉ）、ii）、若しくはiii）において教示するポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列、又は
ｖ）上記ｉ）、ii）、若しくはiii）に示すポリヌクレオチドと少なくとも７０％（好ましくは８５％、より好ましくは９０％）の同一性を有するポリヌクレオチド配列、又は
vi）遺伝子コードの縮重に起因して、ｉ）、ii）、若しくはiii）に示すポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオチド配列
を含むポリヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【０１１６】
１つの実施形態では、本発明に基づき用いられるジテルペン合成遺伝子は、タバコ植物にとって内在性であり得る。
【０１１７】
本明細書において「内在性」遺伝子という場合、それは、その天然の形態で植物に見出されるような（すなわち、ヒトの介入が一切存在しない）対象遺伝子を指すだけでなく、その後植物に（再）導入される単離された形態の同一遺伝子（又は実質的に相同な核酸／遺伝子）（導入遺伝子）も指す。例えば、そのような導入遺伝子を含有する遺伝子導入植物は、導入遺伝子発現の実質的な低下、及び／又は内在性遺伝子の発現の実質的な低下と遭遇し得る。単離された遺伝子は生物から単離され得る、又は例えば、化学合成による人工物であり得る。
【０１１８】
別の実施形態では、本発明に基づき用いられるジテルペン合成遺伝子は、タバコ植物にとって外因性であり得る。
【０１１９】
遺伝子が本発明に基づき用いられるジテルペン合成遺伝子であるか判断するために、当業者は、遺伝子がジテルペンを生成する能力を有するか判断することができる。本明細書において上記したようなジテルペンの含有量を測定することができる。要するに、ジテルペン含有量を測定する方法は、アセトニトリルを用いて葉又はリーフディスクを洗浄することにより１枚の葉又は複数の葉から滲出物を収集するステップを含み得る。洗浄物から得られた残留物は、次にトリメチルシリル（ＴＭＳ）エステルを形成するために誘導体化可能である（参照として本明細書に組み込まれているSeverson et al. 1985（前出）の記載に従い）。ＴＭＳ誘導体は、次にマススペクトロメトリーと連結したガスクロマトグラフィー（ＧＣ−ＭＳ）により分離及び分析可能である。溶出した化合物は、そのリテンションタイムにより、及びＭＳプロファイルを標準と比較することにより同定可能である。
【０１２０】
本発明は、植物のスクロースエステル含有量を増加させるためのジテルペン合成遺伝子の使用も提供する。
【０１２１】
遺伝子の発現又は遺伝子産物を減少させる方法は、当技術分野において十分に文書化されている。
【０１２２】
１つの実施形態では、ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現は、当技術分野において公知の任意の方法により阻害され得る。好適には、シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）、ＣＢＴｏｌシクラーゼ、及びテルペンシンターゼ３−８からなるジテルペン合成遺伝子の群から選択されるジテルペン合成遺伝子の活性又は発現は、当技術分野において公知の任意の方法により阻害され得る。好適には、シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）の活性又は発現は、当技術分野において公知の任意の方法により阻害され得る。好適には、ＣＢＴｏｌシクラーゼの活性又は発現は、当技術分野において公知の任意の方法により阻害され得る。好適には、テルペンシンターゼ３−８の活性又は発現は、当技術分野において公知の任意の方法により阻害され得る。
【０１２３】
ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を阻害する方法として、ＲＮＡ干渉、アンチセンス若しくはセンスコサプレッション（参照として本明細書に組み込まれているWang and Wagner 2003, Planta Volume 216, Issue 4, pp 686-691を参照）、遺伝子編集、又は標的変異誘発を挙げることができる。１つの実施形態では、ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現の阻害は、遺伝子編集の使用により達成され得る。遺伝子編集は、当技術分野において公知の任意の方法を使用しては実施され得る。いくつかの非限定的な例が本明細書に提示されている。
【０１２４】
１つの実施形態では、ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現の阻害は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムの使用を含め、ＣＲＩＳＰＲを含む遺伝子編集法を使用して達成され得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集ツール、例えばClontech社（Avenue du President Kennedy 78100 Saint-Germain-en-Laye、フランス）製の「Guide-it」等が市販されている。
【０１２５】
遺伝子編集の別の方法として、キットとして市販されている（例えば、Addgene社製、1Kendall Sq. Ste. B7102, Cambridge, MA 02139、米国）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ，transcription activator-like effector nuclease）技術の使用が挙げられる。１つの実施形態では、ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現の阻害は、ＴＡＬＥＮを使用して達成され得る。
【０１２６】
別の実施形態では、方法は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、例えばSigma-Aldrich社から入手可能なCompoZr（登録商標）Zinc Finger Nuclease Technology等の使用を含み得る。別の実施形態は、SilvaらのCurr Gene Ther. Feb 2011; 11(1): 11-27に記載されている（その教示が参照として本明細書に組み込まれている）メガヌクレアーゼの使用（又はさらなる方法）を含み得る。
【０１２７】
１つの実施形態では、ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を阻害する方法は、標的変異誘発であり得る。標的変異誘発の任意の方法が使用され得る。１つの実施形態では、方法は、オリゴヌクレオチド指定変異誘発（ＯＤＭ，oligonucleotide-directed mutagenesis）、例えば、Keygene社（Agro Business Park 90, 6708 PW Wageningen、オランダ）から入手可能なKeyBase（登録商標）等であり得る。別の実施形態では、ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現の阻害は、コンストラクト又はベクター（例えば、プラスミド）の使用により達成され得る。
【０１２８】
本発明の遺伝子コンストラクトは、宿主細胞においてジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を阻害するのに適し得る発現カセットの形態であり得る。遺伝子コンストラクトは、それがベクターに組み込まれることなく宿主細胞に導入され得る。例えば、核酸分子であり得る遺伝子コンストラクトは、リポソーム又はウイルス粒子内に組み込まれ得る。或いは、精製された核酸分子（例えば、ヒストンを含まないＤＮＡ又はネイキッドＤＮＡ）が、適する手段、例えば直接エンドサイトーシスによる取り込みにより宿主細胞内に直接挿入され得る。遺伝子コンストラクトは、トランスフェクション、感染、微量注射、細胞融合、プロトプラスト融合、又は弾道衝撃法により、宿主対象（例えば、植物）の細胞内に直接導入され得る。或いは、本発明の遺伝子コンストラクトは、パーティクルガン法を使用して宿主細胞内に直接導入され得る。
【０１２９】
或いは、遺伝子コンストラクトは、適する宿主細胞内で発現させるために、組換えベクターを含み得る、又はその中に内包され得る。組換えベクターは、プラスミド、コスミド、又はファージであり得る。そのような組換えベクターは、本発明の遺伝子コンストラクトを用いて宿主細胞を形質転換するのに、及びその中で発現カセットを複製するのにきわめて有用である。当業者は、本発明の遺伝子コンストラクトは、発現を目的として多くの種類のバックボーンベクターと組み合わせ可能であることを認識している。バックボーンベクターは、バイナリーベクター、例えば大腸菌（E.coli）及びアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の両方において複製可能であるバイナリーベクターであり得る。例えば、適するベクターは、pBINプラスミド、例えばpBIN19等であり得る（Bevan M., 1984, Nucleic Acids Research 12:8711-21）。
【０１３０】
組換えベクターは、ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を阻害する配列に付加して、様々なその他の機能的要素を含み得る。例えば、ベクターは、プロモーターを含み得る。さらに、組換えベクターは、宿主細胞の細胞基質内で自律的に複製するように設計され得る。この場合、ＤＮＡ複製を誘発又は制御する要素が、組換えベクター内で必要とされ得る。或いは、組換えベクターは、それが宿主細胞のゲノムに一体化するように設計され得る。この場合、標的を定めた組み込み（例えば、相同的組換えによる）になじむＤＮＡ配列が想定される。
【０１３１】
組換えベクターは、クローニングプロセスにおいて選択マーカーとして、すなわちトランスフェクト又は変換された細胞の選択を可能にする、及び異種のＤＮＡを取り込んだベクターを内包する細胞の選択を可能にするために使用され得る遺伝子をコードするＤＮＡも含み得る。ベクターは、コーディング配列の発現を制御することと関係するＤＮＡ、又は発現したポリペプチドを宿主細胞の特定部分、例えばトリコーム若しくは腺性トリコームへと向けるためのＤＮＡも含み得る。したがって、ベクターは、選択マーカー遺伝子（例えば、抗生物質耐性遺伝子）；ポリペプチド終了シグナル；及びタンパク質標的配列（例えば、輸送ペプチド）からなる群から選択される少なくとも１つの追加の要素を含み得る。
【０１３２】
１つの実施形態では、方法又は使用は、ＲＮＡｉを使用してジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を阻害することを含み得る。１つの実施形態では、ＲＮＡｉ法は、ｍｉＲＮＡ、例えば人工的マイクロＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）を使用する。１つの実施形態では、ＲＮＡｉ法は、ｓｉＲＮＡを使用する。１つの実施形態では、ＲＮＡｉ法は、ｄｓＲＮＡを使用する。
【０１３３】
１つの実施形態では、方法又は使用は、干渉オリゴヌクレオチドを使用してジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を阻害するステップを含み得る。１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡベースである。１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、例えばｄｓＲＮＡｉである。１つの実施形態では、方法は、ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を阻害するＲＮＡｉ分子、例えばｄｓＲＮＡｉを用いてタバコ植物の細胞を形質転換するステップを含み得る。
【０１３４】
１つの実施形態では、ジテルペン合成遺伝子の発現がＲＮＡｉ（例えば、ｄｓＲＮＡｉ）を使用して阻害されるタバコ植物及びタバコ植物繁殖材料が提供される。方法は、変換された細胞からタバコ植物を再生するステップを含み得る。
【０１３５】
ＲＮＡｉ（例えば、ｄｓＲＮＡｉ）分子は、形質転換植物内で、ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を、ＲＮＡｉ分子を用いて変換されなかった野生型植物内のポリペプチドの濃度と比較して、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくはそれ超、又は１００％減少させる能力を有し得る。１つの実施形態では、ＲＮＡｉ分子は、形質転換植物内で、ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を３０％〜１００％、好ましくは４０％〜１００％、より好ましくは９０％〜１００％減少させる能力を有し得る。
【０１３６】
ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現は、当技術分野において公知の任意の方法により阻害され得る。好適には、シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）、ＣＢＴｏｌシクラーゼ、及びテルペンシンターゼ３−８からなるジテルペン合成遺伝子の群から選択されるジテルペン合成遺伝子の活性又は発現は、当技術分野において公知の任意の方法により阻害され得る。
【０１３７】
好適には、方法は、細胞内の内在性経路により小分子又は短分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に変換されるヘアピン構造を形成するＲＮＡをコードするｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトを用いてタバコ植物の細胞を形質転換するステップを含み得る。
【０１３８】
好適には、シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）の活性又は発現は、当技術分野において公知の任意の方法により阻害され得る。１つの実施形態では、シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）の配列は、配列番号８に定める通りである。１つの実施形態では、シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）のアミノ酸配列は、配列番号１０に定める通りである。シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）の発現は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、アンチセンス若しくはセンスコサプレッション、遺伝子編集、又は標的変異誘発の使用を含め、ＣＲＩＳＰＲを含む遺伝子編集法を含む任意の方法により阻害され得る。１つの実施形態では、シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）の活性又は発現は、ＲＮＡｉにより阻害され得る。シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）の活性又は発現は、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡを使用するＲＮＡｉにより阻害され得る。
【０１３９】
１つの実施形態では、シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）の活性又は発現を阻害する方法は、シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）のエクソン１の少なくとも一部分、エクソン２の少なくとも一部分、及びエクソン３の少なくとも一部分を標的とする。好ましい実施形態では、方法は、シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）のエクソン１の少なくとも一部分、エクソン２の少なくとも一部分、及びエクソン３の少なくとも一部分を標的とする。１つの実施形態では、方法は、シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）のエクソン１の少なくとも一部分、エクソン２の少なくとも一部分、及び３番エクソンの最初から１１５個のヌクレオチドを標的とする。１つの実施形態では、方法は、シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）のヌクレオチド１〜２５、ヌクレオチド２６〜２７１（エクソン１）、ヌクレオチド１２５３〜１５２９（エクソン２）、及び３番エクソンの最初から１１５個のヌクレオチド（ヌクレオチド２３６６〜２４８０）を標的とし、但しナンバリングは配列番号８とのアライメントにより決定される。
【０１４０】
先行する実施形態のいずれかにおいて、シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）の活性又は発現は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムの使用を含め、ＣＲＩＳＰＲを含む遺伝子編集法を使用して阻害され得る。先行する実施形態のいずれかにおいて、シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）の活性又は発現は、ＲＮＡｉ法を使用して阻害され得る。
【０１４１】
好適には、ＣＢＴｏｌシクラーゼ遺伝子の活性又は発現は、当技術分野において公知の任意の方法により阻害され得る。１つの実施形態では、ＣＢＴｏｌシクラーゼ遺伝子の配列は、配列番号１に定める通りである。１つの実施形態では、ＣＢＴｏｌシクラーゼのアミノ酸配列は、配列番号２に定める通りである。ＣＢＴｏｌシクラーゼ遺伝子の発現は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、アンチセンス又はセンスコサプレッション、遺伝子編集、又は標的変異誘発の使用を含め、ＣＲＩＳＰＲを含む遺伝子編集法を含む任意の方法により阻害され得る。１つの実施形態では、ＣＢＴｏｌシクラーゼ遺伝子の活性又は発現は、ＲＮＡｉにより阻害され得る。ＣＢＴｏｌシクラーゼ遺伝子の活性又は発現は、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡを使用するＲＮＡｉにより阻害され得る。
【０１４２】
別の実施形態では、ＣＢＴｏｌシクラーゼ遺伝子の活性又は発現を阻害する方法は、ＣＢＴｏｌシクラーゼのエクソン４の少なくとも一部分、イントロン４、エクソン５、イントロン５、エクソン６、イントロン６、及びエクソン７の少なくとも一部分を標的とする。好ましい実施形態では、方法は、ＣＢＴｏｌシクラーゼ遺伝子のエクソン４の少なくとも一部分、イントロン４、エクソン５、イントロン５、エクソン６、イントロン６、及びエクソン７の少なくとも一部分を標的とする。１つの実施形態では、方法は、ＣＢＴｏｌシクラーゼ遺伝子のヌクレオチド５’−２８５４〜４１７５−３’を標的とし、但しナンバリングは配列番号１とのアライメントにより決定される。
【０１４３】
先行する実施形態のいずれかにおいて、ＣＢＴｏｌシクラーゼ遺伝子の活性又は発現は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムの使用を含め、ＣＲＩＳＰＲを含む遺伝子編集法を使用して阻害され得る。先行する実施形態のいずれかにおいて、ＣＢＴｏｌシクラーゼ遺伝子の活性又は発現は、ＲＮＡｉ法を使用して阻害され得る。
【０１４４】
好適には、テルペンシンターゼ３−８遺伝子の活性又は発現は、当技術分野において公知の任意の方法により阻害され得る。１つの実施形態では、テルペンシンターゼ３−８遺伝子の配列は、配列番号３に定める通りである。１つの実施形態では、テルペンシンターゼ３−８のアミノ酸配列は、配列番号４に定める通りである。テルペンシンターゼ３−８遺伝子の発現は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、アンチセンス若しくはセンスコサプレッション、遺伝子編集、又は標的変異誘発の使用を含め、ＣＲＩＳＰＲを含む遺伝子編集法を含む任意の方法により阻害され得る。１つの実施形態では、テルペンシンターゼ３−８遺伝子の活性又は発現は、ＲＮＡｉにより阻害され得る。テルペンシンターゼ３−８遺伝子の活性又は発現は、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡを使用するＲＮＡｉにより阻害され得る。１つの実施形態では、テルペンシンターゼ３−８遺伝子の活性又は発現を阻害する方法は、テルペンシンターゼ３−８遺伝子の少なくともヌクレオチド１４９７〜１５１７を標的とし、但しナンバリングは配列番号３とのアライメントにより決定される。１つの実施形態では、テルペンシンターゼ３−８遺伝子の活性又は発現を阻害する方法は、テルペンシンターゼ３−８遺伝子の少なくともヌクレオチド８８４〜９０４を標的とし、但しナンバリングは配列番号３とのアライメントにより決定される。好ましい実施形態では、ＲＮＡｉ法は、テルペンシンターゼ３−８遺伝子のヌクレオチド８８４〜９０４を標的とし、但しナンバリングは配列番号３とのアライメントにより決定される。
【０１４５】
先行する実施形態のいずれかにおいて、テルペンシンターゼ３−８遺伝子の活性又は発現は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムの使用を含め、ＣＲＩＳＰＲを含む遺伝子編集法を使用して阻害され得る。先行する実施形態のいずれかにおいて、テルペンシンターゼ３−８遺伝子の活性又は発現は、ＲＮＡｉ法を使用して阻害され得る。
【０１４６】
１つの実施形態では、方法は、送達ベクター内にパッケージされた、ｄｓＲＮＡをコードするヌクレオチド配列又はａｍｉＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡにより導かれるＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ，DNA-directed RNA interference）コンストラクトを用いてタバコ植物の細胞を形質転換するステップを含み得る。
【０１４７】
１つの実施形態では、ＲＮＡｉ分子は、ｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトによりコードされるｄｓＲＮＡである。
【０１４８】
１つの実施形態では、ＲＮＡｉ分子は、ｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトによりコードされるａｍｉＲＮＡである。１つの実施形態では、本発明は、ジテルペン合成遺伝子の発現を阻害するｄｓＲＮＡをコードするように設計されたｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡ配列を含むコンストラクトを提供する。
【０１４９】
別の実施形態では、本発明は、ジテルペン合成遺伝子の発現を阻害するａｍｉＲＮＡをコードするように設計されたｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡ配列を含むコンストラクトを提供する。
【０１５０】
コンストラクトは、ベクターに含まれ得る。好適には、ベクターはプラスミドであり得る。
【０１５１】
１つの実施形態では、本発明で使用されるベクターは、アグロバクテリウム属に基づくプラスミドpKYLX71:35S2である。このプラスミドは、Anらにより記載されるpGA471プラスミドに基づく（参照として本明細書に組み込まれているAn, G. et al. 1985 EMBO J. 4, 277-284）。別の実施形態では、本発明で使用されるベクターは、pCAMBIA2300である。pCAMBIAベクターバックボーンは、ｐＰＺＰベクターに由来する。
【０１５２】
用語「ＤＮＡにより導かれるＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）」とは、本明細書で使用する場合、細胞の内在性ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を活性化させるのに使用されるＤＮＡコンストラクトを意味する。好適には、このコンストラクトは、変換されると１つ又は複数の標的遺伝子のサイレンシングを引き起こす自己相補性ＲＮＡ、例えば、二本鎖のＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ，double stranded RNA）、又は一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ，single stranded RNA）、又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ，short-hairpin RNA）、又はマイクロＲＮＡ（例えば、人工的マイクロＲＮＡ−ａｍｉＲＮＡ）を発現するように設計される。有利には、ｄｄＲＮＡｉの使用とは、発現したＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ又はａｍｉＲＮＡ）が継続的に生成され、これにより被標的遺伝子の長期サイレンシングを実現することができることを意味する。対照的に、細胞に直接投与される低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ，small interfering RNA）（例えば、本発明に基づくｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトから継続に発現しない）は、細胞内で代謝回転し、遺伝子を一時的にサイレンシングさせるにすぎない。
【０１５３】
１つの実施形態では、方法又は使用は、ｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトから発現するｄｓＲＮＡを使用してジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を阻害するステップを含み得る。
【０１５４】
別の実施形態では、方法又は使用は、ｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトから発現するａｍｉＲＮＡを使用してジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を阻害するステップを含み得る。
【０１５５】
したがって、１つの実施形態では、ジテルペン合成遺伝子の発現がｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトを使用して阻害されるタバコ植物及びタバコ植物繁殖材料、タバコ葉、カットされ採取された葉、加工されたタバコ葉、又はカットされ加工されたタバコ葉が提供される。好適には、ｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトは、植物のゲノムＤＮＡに組み込まれ得る。タバコ植物、タバコ植物繁殖材料、タバコ葉、カットされ採取された葉、加工されたタバコ葉、又はカットされ加工されたタバコ葉は、ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を阻害するｄｓＲＮＡ又はａｍｉＲＮＡを発現するｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトを含み得る。ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を阻害するｄｓＲＮＡ又はａｍｉＲＮＡを発現するｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトを含むタバコ植物、タバコ植物繁殖材料、タバコ葉、カットされ採取された葉、加工されたタバコ葉、又はカットされ加工されたタバコ葉は、ｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトを含まないタバコ植物、タバコ植物繁殖材料、タバコ葉、カットされ採取された葉、加工されたタバコ葉、又はカットされ加工されたタバコ葉と比較して、スクロースエステル含有量が増加し得る。
【０１５６】
ｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトは、ジテルペン合成遺伝子の全部又は一部を含み得る。コンストラクトは、ジテルペン合成遺伝子のエクソン及び／又はイントロンを含み得る。ｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトは、転写されるとヘアピンＲＮＡ構造を生成する部分的な遺伝子配列を含み得る。ｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトによりコードされるＲＮＡは、イントロンヘアピン構造若しくはＧＵＳヘアピン構造を有し得る、又は単一の完全長ＲＮＡであり得る。本明細書に記載するように、本発明者らは、タバコ植物中のスクロースエステル含有量を増加させる際に使用される、ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を阻害するＲＮＡｉ分子の驚くべき有効性を実証した。
【０１５７】
用語「エクソン」とは、本明細書で使用する場合、イントロンがＲＮＡスプライシングにより除去された後に、遺伝子により生成される最終的な成熟ＲＮＡをコードする遺伝子の部分を意味する。
【０１５８】
用語「イントロン」とは、本明細書で使用する場合、最終的なＲＮＡ生成物の成熟期間中にＲＮＡスプライシングにより除去される、遺伝子内のヌクレオチド配列を意味する。
【０１５９】
用語「少なくとも〜の一部分」又は「部分的な配列」とは、本明細書で使用する場合、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、４００、又は少なくとも５００個の連続したヌクレオチドを含む配列を意味する。例えば、ｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトは、エクソンの少なくとも一部分を含む場合があり、該コンストラクトは前記エクソンに由来する１００個の連続したヌクレオチドを含む。
【０１６０】
用語「〜に対応するｍＲＮＡ」とは、本明細書で使用する場合、ＲＮＡはＤＮＡと同一の配列を有すること、すなわちヌクレオチドの配列は、ｍＲＮＡ配列及びＤＮＡ配列の両方において同一であることを意味するが、但しＲＮＡでは、チミン（Ｔ）がウラシル（Ｕ）に置き換わり、そしてデオキシリボースがリボースに置換されている点を除く。
【０１６１】
ｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトは、シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）の発現を阻害するのに使用され得る。１つの実施形態では、シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）の配列は、配列番号８に定める通りである。１つの実施形態では、シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１０に定める通りである。好適には、ｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトは、シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）の全部又は一部を含み得る。
【０１６２】
１つの実施形態では、ｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトは、シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）の少なくともエクソン１の部分、エクソン２の少なくとも一部分、及びエクソン３の少なくとも一部分を含み得る。好適には、ｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトは、シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）のエクソン１の少なくとも一部分、エクソン２の少なくとも一部分、及び３番エクソンの最初から１１５個のヌクレオチドを含み得る。好適には、ｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトは、シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）のヌクレオチド１〜２５、ヌクレオチド２６〜２７１（エクソン１）、ヌクレオチド１２５３〜１５２９（エクソン２）、及び３番エクソンの最初から１１５個のヌクレオチド（ヌクレオチド２３６６〜２４８０）を含み得るが、但しナンバリングは配列番号８とのアライメントにより決定される。好適には、ｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトは、配列番号５に定める配列を含み得る。
【０１６３】
ｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトは、ＣＢＴｏｌシクラーゼ遺伝子の発現を阻害するのに使用され得る。１つの実施形態では、ＣＢＴｏｌシクラーゼ遺伝子の配列は、配列番号１に定める通りである。１つの実施形態では、ＣＢＴｏｌシクラーゼのアミノ酸配列は、配列番号２に定める通りである。好適には、ｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトは、ＣＢＴｏｌシクラーゼ遺伝子の全部又は一部を含み得る。
【０１６４】
別の実施形態では、ｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトは、ＣＢＴｏｌシクラーゼ遺伝子のエクソン４の少なくとも一部分、イントロン４、エクソン５、イントロン５、エクソン６、イントロン６、及びエクソン７の少なくとも一部分を含み得る。好適には、ｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトは、ＣＢＴｏｌシクラーゼ遺伝子のヌクレオチド５’−２８５４〜４１７５−３’を含み得るが、但しナンバリングは配列番号１とのアライメントにより決定される。好適には、ｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトは、配列番号６に定める配列を含み得る。
【０１６５】
ｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトは、テルペンシンターゼ３−８遺伝子の発現を阻害するのに使用され得る。好適には、ｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトは、テルペンシンターゼ３−８遺伝子の全部又は一部を含み得る。好適には、ｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトは、テルペンシンターゼ３−８遺伝子の少なくともヌクレオチド１４９７〜１５１７を含み得るが、但しナンバリングは配列番号３とのアライメントにより決定される。１つの実施形態では、テルペンシンターゼ３−８遺伝子の配列は、配列番号３に定める通りである。１つの実施形態では、テルペンシンターゼ３−８のアミノ酸配列は、配列番号４に定める通りである。好適には、ｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトは、配列番号７に定める配列を含み得る。好適には、ｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトは、テルペンシンターゼ３−８遺伝子の少なくともヌクレオチド８８４〜９０４を含み得るが、但しナンバリングは配列番号３とのアライメントにより決定される。好適には、ｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトは、配列番号１１に定める配列を含み得る。
【０１６６】
ｄｓＲＮＡをコードするｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトの配列は、１つの実施形態では、配列番号７に定める配列を含み得る。配列番号７を含むｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトから発現するｄｓＲＮＡは、ジテルペン合成遺伝子の活性若しくは発現を阻害する、又はジテルペン合成遺伝子を下方制御するのに使用され得るが、但し該ジテルペン合成遺伝子はシクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）である。
【０１６７】
ｄｓＲＮＡをコードするｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトの配列は、別の実施形態では、配列番号８に定める配列を含み得る。配列番号８を含むｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトから発現するｄｓＲＮＡは、ジテルペン合成遺伝子の活性若しくは発現を阻害する、又はジテルペン合成遺伝子を下方制御するのに使用され得るが、但し該ジテルペン合成遺伝子はＣＢＴｏｌシクラーゼ遺伝子である。
【０１６８】
ａｍｉＲＮＡをコードするｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトの配列は、１つの実施形態では、配列番号９に定める配列を含み得る。配列番号９を含むｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトから発現するａｍｉＲＮＡは、ジテルペン合成遺伝子の活性若しくは発現を阻害する、又はジテルペン合成遺伝子を下方制御するのに使用され得るが、但し該ジテルペン合成遺伝子は、テルペンシンターゼ３−８遺伝子である。
【０１６９】
本明細書で使用される用語「ＧＷ１」又は「ＧＷ−１」は、シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）のエクソン１の少なくとも一部分、エクソン２の少なくとも一部分、及び３番エクソンの最初から１１５個のヌクレオチドを含むｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトを意味し得る。
【０１７０】
本明細書で使用される用語「ＧＷ２」又は「ＧＷ−２」は、テルペンシンターゼ３−８遺伝子の少なくともヌクレオチド１４９７〜１５１７を含むｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトを意味し得るが、但しナンバリングは配列番号３とのアライメントにより決定される。
【０１７１】
本明細書で使用される用語「ＧＷ３」又は「ＧＷ−３」は、ＣＢＴｏｌシクラーゼ遺伝子のエクソン４の少なくとも一部分、イントロン４、エクソン５、イントロン５、エクソン６、イントロン６、及びエクソン７の少なくとも一部分を含むｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトを意味し得る。
【０１７２】
本明細書で使用される用語「ＧＷ５」又は「ＧＷ−５」は、テルペンシンターゼ３−８遺伝子の少なくともヌクレオチド８８４〜９０４を含むｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトを意味し得るが、但しナンバリングは配列番号３とのアライメントにより決定される。
【０１７３】
したがって、本発明のｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトは、ｄｓＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含み得るが、但しｄｓＲＮＡをコードする配列は、配列番号５若しくは８に実質的に記載されるヌクレオチド配列、又はその機能的なバリアント若しくは断片である。
【０１７４】
好適には、本発明のｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトは、ｄｓＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含み得るが、但しｄｓＲＮＡコーディング配列は、配列番号５に実質的に記載されるヌクレオチド配列、又はその機能的なバリアント若しくは断片である。
【０１７５】
好適には、本発明のｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトは、ｄｓＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含み得るが、但しｄｓＲＮＡコーディング配列は、配列番号６に実質的に記載されるヌクレオチド配列、又はその機能的なバリアント若しくは断片である。
【０１７６】
別の実施形態では、本発明のｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトは、ａｍｉＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含み得るが、但しａｍｉＲＮＡコーディング配列は、配列番号９に実質的に記載されるヌクレオチド配列である。
【０１７７】
ｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトのバリアント又は断片が生成するように、ｄｓＲＮＡ（例えば、配列番号７）又はａｍｉＲＮＡ（例えば、配列番号９）をコードする配列を改変し、その配列が、ジテルペン合成遺伝子の発現を阻害又は下方制御するようになおも機能し、それによりタバコ植物のスクロース含有量を増加させることは、当業者にとって比較的容易に理解されるということが認識される。ｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトの機能的なバリアント及び断片は、ジテルペン合成遺伝子によりコードされるｍＲＮＡのレベルが、同一条件下で生育した対応する野生型植物細胞内の同一のジテルペン合成遺伝子ｍＲＮＡのレベルを下回り低下しているかどうか決定する標準的な検査技術を使用することにより、容易に識別され得る。そのような技術の例は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ，polymerase chain reaction）である。当業者は、ジテルペン合成遺伝子によりコードされるポリペプチドの濃度は、標準的な技術、例えば酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ，Enzyme-linked immunosorbent assay）、蛍光活性化セルソーティング、ウェスタンブロッティング、又はクロマチン免疫沈降法（ＣｈＩＰ，Chromatin Immunoprecipitation）等を使用することにより、野生型植物及び遺伝子導入植物において直接測定され得ることを認識する。
【０１７８】
別の実施形態では、タバコ細胞、タバコ植物若しくはその一部、及び／又は植物繁殖材料は、ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を阻害するコンストラクトを含み得る。好ましい実施形態では、コンストラクトは、ｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトであり、より好ましくは、ｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトは、シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）、ＣＢＴｏｌシクラーゼ遺伝子、又はテルペンシンターゼ３−８遺伝子の活性又は発現を阻害するＲＮＡｉモジュールを含む。
【０１７９】
さらなる実施形態では、タバコ細胞、タバコ植物若しくはその一部、及び／又は植物繁殖材料は、
ｉ）配列番号５、配列番号６、又は配列番号７、配列番号１１として本明細書に示すポリヌクレオチド配列、又は
ii）機能的断片がジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を阻害する、ｉ）に示すポリヌクレオチド配列の断片、又は
iii）上記ｉ）又はii）に示すポリヌクレオチドと少なくとも７０％（好ましくは８５％、より好ましくは９０％）の同一性を有するポリヌクレオチド配列、
を含み得る。
【０１８０】
１つの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号５、配列番号６、又は配列番号７、又は配列番号１１と少なくとも８０％の同一性を有し得る。好適には、ポリヌクレオチド配列は、配列番号５、配列番号６、又は配列番号７、又は配列番号１１と少なくとも９０％の同一性を有し得る。好適には、ポリヌクレオチド配列は、配列番号５、配列番号６、又は配列番号７、又は配列番号１１と少なくとも９５％の同一性（より好適には少なくとも９９％の同一性）を有し得る。
【０１８１】
有利な実施形態では、ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現の阻害は、タバコ植物のスクロースエステル含有量の増加、及び同時にタバコ植物のその他の香りコンポーネントにおいてその１又は２以上の変化を引き起こす可能性がある。ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現の阻害は、スクロースエステル含有量の増加、及びジテルペン含有量の変化を引き起こす可能性がある。スクロースエステル含有量の増加は、シス−アビエノール、ラブデンジオール、及びＣＢＴ−オール含有量からなる群から選択される香り化合物において、その１又は２以上の増加を伴う可能性がある。
【０１８２】
スクロースエステル含有量の増加は、シス−アビエノール含有量の増加及びラブデンジオール含有量の増加を伴う可能性がある。別の実施形態では、スクロースエステル含有量の増加は、ラブデンジオール含有量の増加を伴う可能性がある。スクロースエステル含有量の増加は、ＣＢＴ−オールの増加及び高シス−アビエノール含有量を伴う可能性がある。
【０１８３】
１つの実施形態では、本発明の方法は、トルコ風の滲出物の化学的性質を有するバーレイ種又は熱風乾燥葉を生成する。好ましくは、バーレイ種又は熱風乾燥葉は、ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現が阻害されていない同等のバーレイ種又は熱風乾燥植物よりもトルコ風タバコに類似した化学的性質を有する。
【０１８４】
１つの実施形態では、本発明によるタバコ植物又はその一部は、本発明に基づき改変されたバーレイ種又は熱風乾燥植物である。１つの実施形態では、本発明は、トルコ風の滲出物の化学的性質を有するように、本発明に基づき改変されたバーレイ種又は熱風乾燥植物に関する。１つの実施形態では、本発明によるタバコ植物（例えば、改変されたタバコ植物）は、オリエンタル又はトルコタバコ植物ではない。
【０１８５】
１つの実施形態では、タバコ植物又はその一部は乾燥される。１つの実施形態では、タバコ植物又はその一部は、乾燥、例えば空気乾燥、熱風乾燥、火力乾燥、又は天日乾燥される。さらなる態様では、タバコ植物又はその一部は熱風乾燥される。さらなる態様では、タバコ植物又はその一部は空気乾燥される。
【０１８６】
熱風乾燥は当技術分野において周知されており、火室又はガス燃料供給システムにより供給される熱風でタバコを乾燥させるプロセスを指す。このプロセスは、乾燥の過程全体にわたり、ゆっくりと温度を上げながら、タバコを煙に曝露することなく加熱乾燥する。この方法は、糖度が高いタバコを生成し、また中〜高レベルのニコチンを有する。スミスのタバコ収蔵室（Smith Tobacco Barn）は、従来型の熱風乾燥式タバコ収蔵室の例である。
【０１８７】
空気乾燥したタバコとして、バーレイ種、メリーランド、及びダークタバコが挙げられる。共通因子として、乾燥は、加熱及び湿度において主に人工的供給源が用いられないことが挙げられる。バーレイタバコは、淡〜暗褐色であり、油分が多く、そして糖分は低い。バーレイタバコは、収蔵室内で空気乾燥される。主要なバーレイ種栽培国として、アルゼンチン、ブラジル、イタリア、マラウィが挙げられ、また米国のバーレイ種タバコ植物には、例えばＣｌａｙ４０２、Ｃｌａｙ４０３、Ｃｌａｙ５０２、Ｋｙ１４、Ｋｙ９０７、Ｋｙ９１０、Ｋｙ８９５９、ＮＣ２、ＮＣ３、ＮＣ４、ＮＣ５、ＮＣ２０００、ＴＮ８６、ＴＮ９０、ＴＮ９７、Ｒ６１０、Ｒ６３０、Ｒ７１１、Ｒ７１２、ＮＣＢＨ１２９、Ｂｕ２１ｘＫｙ１０、ＨＢ０４Ｐ、Ｋｙ１４ｘＬ８、Ｋｔ２００、Ｎｅｗｔｏｎ９８、Ｐｅｄｉｇｏ５６１、Ｐｆ５６１、及びＶａ５０９が含まれる。
【０１８８】
メリーランドタバコは、非常にフワフワしており、燃焼特性が良好で、低ニコチンであり、そしてニュートラルなアロマを有する。主要なメリーランド種栽培国として、米国及びイタリアが挙げられる。空気乾燥したダークタバコは、空気乾燥したダークタバコに中程度の褐色〜暗褐色及び異なるアロマを付与するその発酵プロセスにより、その他の種類から主に区別される。その葉の糖含有量は低いが、しかしニコチン含有量は高い。空気乾燥したダークタバコは、噛みタバコ及び嗅ぎタバコの製造で主に使用される。火力乾燥したダークタバコの主要な栽培地域は、米国のテネシー州、ケンタッキー州、及びバージニア州である。
【０１８９】
好ましい実施形態では、本発明のタバコは、少なくとも３−メチルバレレートアセチル化スクロースエステルをトルコ風のタバコと同量含有する。
【０１９０】
「トルコ風の滲出物の化学的性質」とは、本発明の植物により生成された滲出物が、トルコタバコに認められるものと類似した滲出物の化学的性質を有することを意味する。トルコ（又はオリエンタル）タバコ、例えばＮ．タバカム変種サムスン（Samsun）の化学的性質は、R. Seversonら（1985）（前出、参照として本明細書に組み込まれている）により特徴づけられている。トルコタバコは、低レベルのＣＢＴ−ジオール、高レベルのＣＢＴの酸化生成物、及び高レベルの３−メチル吉草酸含有スクロースエステルを含有することが公知である。したがって、本発明は、トルコタバコ風トリコーム滲出物を含むより高いバイオマスタバコ植物を有利に提供する。
【０１９１】
１つの実施形態では、増量した３−メチルバレレートスクロースエステルを含むタバコ植物が提供される。タバコ植物は、本発明により改変されなかったタバコ植物、すなわちジテルペン合成遺伝子の阻害が導入されなかった植物との比較において、増量した３−メチルバレレートスクロースエステルを含み得る。好ましくは、本発明のタバコ系統は、ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を阻害するように改変されなかった対照タバコ植物に対して、少なくとも２倍の３−メチルバレレートスクロースエステルを含有する。さらなる態様では、本発明のタバコ植物は、少なくともトルコタイプタバコと同量の３−メチルバレレートを含有する。
【０１９２】
有利には、本発明のタバコ植物は、屋外において正常に生育する。１つの実施形態では、ＣＢＴｏｌシンターゼノックダウン植物は、有利には、トルコタバコと同様にＣＢＴジオールが低く、シス−アビエノールが高く、３−メチル吉草酸含有スクロースエステルが高いが、しかしトルコタイプとは異なり、本発明のＣＢＴｏｌシンターゼノックダウン植物は、トルコタバコ植物よりも多くのバイオマスを生成し得る。トルコタバコタイプの場合、収率は、一般的に６００〜１１００ポンド／エーカーの範囲である。
【０１９３】
用語「機能的断片」とは、本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチドと同様に機能する能力を有するポリヌクレオチドの一部分を指す。例えば、ポリヌクレオチドがジテルペン合成遺伝子である場合、機能断片はジテルペン合成遺伝子として機能する能力を有さなければならず、例えば、機能的断片はジテルペン合成遺伝子の活性を保持する。機能的断片は、完全長ポリヌクレオチドの活性のレベル以上の活性のレベルを有し得る。ポリヌクレオチドがｄｓＲＮＡ又はａｍｉＲＮＡをコードする場合には、機能的断片は、ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を阻害する能力を有さなければならない。
【０１９４】
１つの実施形態では、機能的断片は、少なくとも５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００個の連続したヌクレオチドを含む、本明細書において議論されるようなジテルペン合成遺伝子の一部分であり得る。いくつかの実施形態では、機能的断片は、本明細書において議論されるジテルペン合成遺伝子の少なくとも１５０個のヌクレオチドを含み得る。機能的断片がｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトの機能的断片である１つの実施形態では、機能的断片は、少なくとも５０、７５、１００、１５０、２００、又は２５０個の連続したヌクレオチドを含む、本明細書において議論されるようなＲＮＡｉの一部分であり得る。
【０１９５】
用語「遺伝子コードの縮重」とは、本明細書で使用する場合、アミノ酸を規定する３コドンの組合せの重複性として表わされる、ポリペプチド配列をコードするコドンにおける冗長性を指す。例えば、イソロイシンアミノ酸を有するポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子では、イソロイシンは、AUU、AUC、又はAUAによりコードされ得る。これは、ＲＮＡをコードするＤＮＡ分子は、複数の配列を有し得るが、得られるポリペプチドはなおも同一の配列を有することを意味する。換言すれば、ヌクレオチド配列に多形性が認められても、同一のポリペプチド産物をコードし得る。これは、１つの核酸配列は、第２の配列に対して配列同一性が非常に低くても、同一のポリペプチド配列をコードする配列を含み得ることを意味する。
【０１９６】
本発明の方法及び使用は、少なくとも１つのジテルペン合成遺伝子の阻害を含む。阻害は、当業者にとって公知の任意の手段により達成され得る。
【０１９７】
本発明のいくつかの実施形態では、プロモーターが提供され得る。本発明で使用されるプロモーターは、構成型プロモーター、セネッセンス特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、発生学的に制御されたプロモーター、及び誘導性プロモーターからなる群から選択される１又は２以上であり得る。１つの実施形態では、プロモーターは、構成型プロモーターであり得る。
【０１９８】
遺伝子はすべての細胞型において同一レベルで発現されない可能性はあるものの、構成型プロモーターは、植物の発育期間中に植物の様々な部分全体にわたり、連続的に遺伝子の発現を指示する。公知の構成的プロモーターの例として、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ転写物（Odell JT, Nagy F, Chua NH. (1985). Identification of DNA sequences required for Activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter, Nature. 313 810-2）、及びライスアクチン１遺伝子（Zhang W, McElroy D, Wu R. (1991)）に付随するプロモーターが挙げられ、これらは本明細書において参照として組み込まれている。遺伝子導入ライス植物内のライスＡｃｔ１５’領域の活性（参照として本明細書に組み込まれている、Plant Cell 3 1155-65）、及びトウモロコシユビキチン１遺伝子（Cornejo MJ, Luth D, Blankenship KM, Anderson OD, Blechl AE. (1993)、Activity of a maize ubiquitin promoter in transgenic rice. Plant Molec. Biol. 23 567-81（参照として本明細書に組み込まれている））の分析。構成的プロモーター、例えばカーネーションエッチドリングウイルス（ＣＥＲＶ，Carnation Etched Ring Virus）プロモーター等（参照として本明細書に組み込まれている、Hull R, Sadler J, LongstaffM (1986)。The sequence of carnation etched ring virus DNA: comparison with cauliflower mosaic virus and retroviruses。参照として本明細書に組み込まれている、EMBO Journal, 5(2):3083-3090）。
【０１９９】
構成型プロモーターは、カーネーションエッチドリングウイルス（ＣＥＲＶ）プロモーター、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター）、ライスアクチン１遺伝子又はトウモロコシユビキチン１遺伝子に由来のプロモーターから選択され得る。好適には、プロモーターは、ＣＥＲＶプロモーターであり得る。
【０２００】
或いはいくつかの実施形態では、プロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター）でなくてもよい。１つの実施形態では、プロモーターは、セネッセンス特異的プロモーターであり得る。「セネッセンス特異的プロモーター」（ＳＡＧ，senescence-specific promoter）は、老化関連遺伝子の発現を制御することと関連するプロモーターであり得る。したがって、プロモーターは、それが老化した組織においてコーディング配列（すなわち、遺伝子）と作動可能に連結しており、その連結が実質的に排他的である該コーディング配列の発現を制限し得る。したがって、セネッセンス特異的プロモーターは、植物組織の老化が進行するときに限って３’タンパク質コード領域の発現が実質的に生ずるように、発生学的に制御された様式で、植物組織において遺伝子発現を優先的に促進する能力を有するプロモーターであり得る。老化は、植物のより若い部分、例えば種子等ではなく、植物のより古い部分、例えばより古い葉等で生ずる傾向を有するものと認識される。
【０２０１】
非常に多くの老化関連遺伝子を発現することが公知である植物の一例として、シロイヌナズナ属が挙げられる。したがって、プロモーターは、シロイヌナズナ属内の老化関連遺伝子から単離され得る。参照として本明細書に組み込まれているGepsteinら（The Plant Journal, 2003, 36, 629-642）は、モデルとしてシロイヌナズナ属を使用して、ＳＡＧとそのプロモーターの詳細な試験を実施した。遺伝子コンストラクトは、この文献で開示されているＳＡＧのいずれかに由来するプロモーターを含み得る。例えば、適するプロモーターは、ＳＡＧ１２、ＳＡＧ１３、ＳＡＧ１０１、ＳＡＧ２１、及びＳＡＧ１８、又はその機能的なバリアント若しくは機能的断片からなる群から選択され得る。
【０２０２】
１つの実施形態では、プロモーターは、ＳＡＧ１２又はＳＡＧ１３プロモーターであり得る。１つの実施形態では、プロモーターは、当業者にとって公知のＳＡＧ１２プロモーター又はその機能的なバリアント若しくは断片であり得（Gan & Amasino, 1997, Plant Physiology, 113: 313-319）、これは参照として本明細書に組み込まれている。適するプロモーター及びその配列は、国際公開第２０１０／０９７６２３号に見出され得る（参照として本明細書に組み込まれている）。
【０２０３】
別の実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーターであり得る。組織特異的プロモーターは、植物の１つの（又はいくつかの）部分内にある遺伝子の発現を、通常そのような植物の部分の寿命全体にわたり指示するプロモーターである。組織特異的プロモーターのカテゴリーには、特異性が絶対的ではないプロモーターも一般的に含まれる、すなわち、該プロモーターは、好ましい組織以外の組織内においても低レベルの発現を指示し得る。いくつかの組織特異的プロモーターは当技術分野において公知であり、ジャガイモ塊茎内で発現しているパタチン遺伝子、及び小麦、大麦、又はトウモロコシの胚乳内で発現している高分子量グルテニン遺伝子に付随するプロモーターを含む。このようなプロモーターのいずれも、本発明で使用され得る。
【０２０４】
好適には、組織特異的プロモーターは、葉特異的プロモーターであり得る。好適には、葉特異的プロモーターは、ＡＳＹＭＭＥＴＲＩＣ  ＬＥＡＶＥＳ１（ＡＳ１）を含み得る。特に好ましい実施形態では、組織特異的プロモーターは、根特異的プロモーターではない。
【０２０５】
別の実施形態では、プロモーターは、発生制御型プロモーターであり得る。発生制御型プロモーターは、植物の発育期間中の特定の時期において、１又は２以上の植物の部分に存在する遺伝子の発現変化を指示する。遺伝子は、その他の時期に、異なる（通常より低い）レベルで当該植物の部分内で発現し得るが、またその他の植物の部分においても発現し得る。
【０２０６】
１つの実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターであり得る。誘導性プロモーターは、インデューサーに反応して遺伝子の発現を指示する能力を有する。インデューサーが存在しない場合には、遺伝子は発現しない。インデューサーは、プロモーター配列に直接作用し得る、又はリプレッサー分子の効果を和らげることにより作用し得る。インデューサーは、化学物質、例えば代謝物、タンパク質、増殖制御因子、又は毒性元素等、生理学的ストレス、例えば熱、傷害、若しくは浸透圧等、又は病原体若しくは害虫がもたらす作用の間接的結果であり得る。発生制御型プロモーターは、植物の生活環の特定の時点において、植物により産生される内在性インデューサー、又は環境上の刺激に応答する誘導性プロモーターの特定のタイプとして記載される場合もある。公知の誘導性プロモーターの例として、例えば参照として本明細書に組み込まれている、Warner SA, Scott R, Draper J.（1993）（Isolation of an asparagus intracellular PR gene (AoPR1) wound-responsive promoter by the inverse polymerase chain reaction and its characterization in transgenic tobacco. Plant J. 3 191-201）等により記載される傷害反応、参照として本明細書に組み込まれている、Benfey&Chua（1989）（Benfey, P.N., and Chua, N-H. (1989) Regulated genes in transgenic plants. Science 244 174-181）により開示される温度応答と関連したプロモーター、及び参照として本明細書に組み込まれている、Gatz（1995）（Gatz, C. (1995) Novel inducible/repressible gene expression systems. Methods in Cell Biol. 50 411-424）により記載されるような化学的に誘発されたプロモーターが挙げられる。
【０２０７】
したがって、１つの実施形態では、プロモーターは、ＣＥＲＶプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（完全な又はトランケーションされた）、リブロース二リン酸カルボキシラーゼ遺伝子プロモーター、エンドウマメ・プラストシアニンプロモーター、ノパリン合成酵素プロモーター、クロロフィルｒ／ｂ結合プロモーター、高分子量グルテニンプロモーター、α、β−グリアジンプロモーター、ホルデインプロモーター、及びパタチンプロモーターからなる群から選択され得る。
【０２０８】
１つの実施形態では、プロモーターは、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター又は重複したエンハンサー領域又はダブルエンハンサー領域を有する改変された３５Ｓプロモーターであり得る（参照として本明細書に組み込まれているR. Kay et al. Science. 1987 Jun 5;236(4806):1299-302）。
【０２０９】
組換えベクターは、クローニングプロセスにおいて選択マーカーとして使用され得る、すなわちトランスフェクトされた又は変換された細胞の選択を可能にする、及び異種のＤＮＡを組み込んだベクターを内包する細胞の選択を可能にする遺伝子をコードするＤＮＡも含み得る。ベクターは、コーディング配列の発現を制御することと関係する、又は発現したポリペプチドを宿主細胞の特定の部分、例えば葉緑体へと向けるためのＤＮＡも含み得る。したがって、ベクターは、選択マーカー遺伝子（例えば、抗生物質耐性遺伝子）；ポリペプチド終了シグナル；及びタンパク質標的配列（例えば、葉緑体輸送ペプチド）からなる群から選択される少なくとも１つの追加の要素を含み得る。
【０２１０】
適するマーカー遺伝子の例として、抗生物質耐性遺伝子、例えばカナマイシン、ジェネテシン（Ｇ４１８）、及びハイグロマイシン（ｎｐｔ−ＩＩ、ｈｙｇ−Ｂ）に対する耐性を付与する遺伝子等；除草剤耐性遺伝子、例えばホスフィノトリシン及びスルホンアミドに基づく除草剤に対する耐性を付与する遺伝子等（それぞれｂａｒ及びｓｕＩ；ＥＰ−Ａ−２４２２４６、ＥＰ−Ａ−０２４９６３７）；及びスクリーニング可能なマーカー、例えばベータ−グルクロニダーゼ（ＧＢ２１９７６５３）、ルシフェラーゼ、及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ，green fluorescent protein）等が挙げられる。マーカー遺伝子は第２のプロモーターにより制御される場合もあり、該プロモーターは、種子の中にあっても、またなくてもよいが、細胞内での発現を可能にし、これにより植物の任意の発達段階において、マーカーを含有する細胞又は組織の選択を可能にする。適する第２のプロモーターは、アグロバクテリウム属のノパリンシンターゼ遺伝子のプロモーターであり、また３５Ｓカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ，cauliflower mosaic virus）転写物をコードする遺伝子に由来するプロモーターである。但し、任意のその他の適する第２のプロモーターも使用され得る。
【０２１１】
商業的に望ましい特性
用語「商業的に望ましい特性」として、例えば、収率、成熟した植物の高さ、採取可能な葉の数、平均節間長、カッター葉の長さ、カッター葉の幅、品質、非生物的（例えば干ばつ）ストレス耐性、除草剤耐性、及び／又は生物的（例えば、昆虫、細菌、又は菌類）ストレス耐性等の特性が挙げられる。
【０２１２】
本明細書で教示する用語「商業的に望ましい特性」とは、類似した屋外条件において生育させたときに、干ばつ耐性、害虫耐性、成熟した植物の高さ、採取可能な葉の数、平均節間長、カッター葉の長さ、カッター葉の幅、及び収率からなる群から選択される特性において、同等の植物の熱風乾燥された親に認められる前記特性と同等の１又は２以上の特性を意味する。
【０２１３】
別途規定しない限り、本明細書で使用されるタバコ収率とは、標準的な農学的実践法及び乾燥実践法を経た後の、標準的な屋外条件下における、１エーカー当たりの乾燥したタバコ葉の重量に基づき計算される乾燥した葉の収率を意味する。
【０２１４】
１つの態様では、本発明のタバコ植物は、類似した屋外条件において生育させたとき、同等の植物の収率に対して、その５０％〜１５０％の間、５５％〜１４５％の間、６０％〜１４０％の間、６５％〜１３５％の間、７０％〜１３０％の間、７５％〜１２５％の間、８０％〜１２０％の間、８５％〜１１５％の間、９０％〜１１０％の間、９５％〜１０５％、５０％〜１００％の間、５５％〜１００％の間、６０％〜１００％の間、６５％〜１００％の間、７０％〜１００％の間、７５％〜１００％の間、８０％〜１００％の間、８５％〜１００％の間、９０％〜１００％の間、９５％〜１００％の間、１００％〜１５０％の間、１０５％〜１５０％の間、１１０％〜１５０％の間、１１５％〜１５０％の間、１２０％〜１５０％の間、１２５％〜１５０％の間、１３０％〜１５０％の間、１３５％〜１５０％の間、１４０％〜１５０％の間、又は１４５％〜１５０％の間の収率を有する。
【０２１５】
別の態様では、本発明のタバコ植物の収率は、類似した屋外条件で生育させたとき、同等の植物の収率のほぼ１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、又は３．０倍である。
【０２１６】
別の態様では、本発明のタバコ植物の収率は、類似した屋外条件で生育させたとき、熱風乾燥された同等の植物の収率と同等である。
【０２１７】
１つの態様では、本発明のタバコ植物は、１エーカー当たり約１２００〜３５００ポンドの間、１３００〜３４００ポンドの間、１４００〜３３００ポンドの間、１５００〜３２００ポンドの間、１６００〜３１００ポンドの間、１７００〜３０００ポンドの間、１８００〜２９００ポンドの間、１９００〜２８００ポンドの間、２０００〜２７００ポンドの間、２１００〜２６００ポンドの間、２２００〜２５００ポンドの間、及び２３００〜２４００ポンドの間からなる群から選択される収率を実現する。
【０２１８】
別の態様では、本発明のタバコ植物は、１エーカー当たり約１２００〜３５００ポンドの間、１３００〜３５００ポンドの間、１４００〜３５００ポンドの間、１５００〜３５００ポンドの間、１６００〜３５００ポンドの間、１７００〜３５００ポンドの間、１８００〜３５００ポンドの間、１９００〜３５００ポンドの間、２０００〜３５００ポンドの間、２１００〜３５００ポンドの間、２２００〜３５００ポンドの間、２３００〜３５００ポンドの間、２４００〜３５００ポンドの間、２５００〜３５００ポンドの間、２６００〜３５００ポンドの間、２７００〜３５００ポンドの間、２８００〜３５００ポンドの間、２９００〜３５００ポンドの間、３０００〜３５００ポンドの間、及び３１００〜３５００ポンドの間からなる群から選択される収率を実現する。
【０２１９】
さらなる態様では、本発明のタバコ植物は、１エーカー当たり約１２００〜３５００ポンドの間、１２００〜３４００ポンドの間、１２００〜３３００ポンドの間、１２００〜３２００ポンドの間、１２００〜３１００ポンドの間、１２００〜３０００ポンドの間、１２００〜２９００ポンドの間、１２００〜２８００ポンドの間、１２００〜２７００ポンドの間、１２００〜２６００ポンドの間、１２００〜２５００ポンドの間、１２００〜２４００ポンドの間、１２００〜２３００ポンドの間、１２００〜２２００ポンドの間、１２００〜２１００ポンドの間、１２００〜２０００ポンドの間、１２００〜１９００ポンドの間、１２００〜１８００ポンドの間、１２００〜１７００ポンドの間、１２００〜１６００ポンドの間、１２００〜１５００ポンドの間、及び１２００〜１４００ポンドの間からなる群から選択される収率を実現する。
【０２２０】
タバコ植物
本発明は、タバコ植物並びにタバコ細胞と関連する方法、使用、タバコ植物、及び植物繁殖材料を提供する。
【０２２１】
用語「タバコ」とは、本明細書で用いる場合、タバコ製品の製造で使用されるニコチアナ属の植物を意味する。適する「タバコ」植物の非限定的な例として、Ｎ．タバカム及びＮ．ルスチカ（例えば、Ｎ．タバカム  Ｌ．、ＬＡ  Ｂ２１、ＬＮ  ＫＹ１７１、Ｔｌ  １４０６、バスマ、ガルパオ、ペリケ、ベインハルト１０００−１、及びペチコ）が挙げられる。
【０２２２】
１つの実施形態では、適するタバコ植物は任意のＮ．タバカム種であり得る。
【０２２３】
別の実施形態では、適するタバコ植物は非タバカム種であり得る。
【０２２４】
タバコ材料は、バーレイ品種として一般的に知られているニコチアナ・タバカム種の品種、フルー又はブライト品種、及びダーク品種に由来し得、又はそれらから取得され得る。いくつかの実施形態では、タバコ材料は、バーレイ、バージニア、又はダークタバコ植物に由来する。タバコ植物は、バーレイタバコ、レアタバコ、スペシャリティタバコ、膨化タバコ等から選択され得る。
【０２２５】
タバコ栽培品種及びエリートタバコ栽培品種の使用も、本明細書において検討される。本明細書で使用されるタバコ植物は、したがってタバコ品種又はエリートタバコ栽培品種であり得る。特に有用なニコチアナ・タバカム品種として、バーレイタイプ、ダークタイプ、及び熱風乾燥タイプのタバコが挙げられる。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、タバコ植物は、例えば下記の品種のうちの１又は２以上から選択され得る：Ｎ．タバカム  Ｌ栽培品種Ｔ．Ｉ．１０６８、Ｎ．タバカムＡＡ３７−１、Ｎ．タバカムＢ１３Ｐ、Ｎ．タバカム・クサンシ（N.tabacum Xanthi）（ミッチェル-モール(Mitchell-Mor)）、Ｎ．タバカムＫＴ  Ｄ＃３ハイブリッド１０７、Ｎ．タバカムＢｅｌ−Ｗ３、Ｎ．タバカム７９−６１５、Ｎ．タバカム・サムスンホルムズ（Samsun Holmes）ＮＮ、Ｎ．タバカムＢＵ２１×Ｎ．タバカム・ホジャパラド（Hoja Parado）の交配に由来するＦ４、ライン９７、Ｎ．タバカムＫＴＲＤＣ＃２ハイブリッド４９、Ｎ．タバカムＫＴＲＤＣ＃４ハイブリッド１  １０、Ｎ．タバカム・バーレイ２１、Ｎ．タバカムＰＭ０１６、Ｎ．タバカムＫＴＲＤＣ＃５ＫＹ１６０ＳＩ、Ｎ．タバカムＫＴＲＤＣ＃７ＦＣＡ、Ｎ．タバカムＫＴＲＤＣ＃６ＴＮ８６ＳＩ、Ｎ．タバカムＰＭ０２１、Ｎ．タバカムＫ１４９、Ｎ．タバカムＫ３２６、Ｎ．タバカムＫ３４６、Ｎ．タバカムＫ３５８、Ｎ．タバカムＫ３９４、Ｎ．タバカムＫ３９９、Ｎ．タバカムＫ７３０、Ｎ．タバカムＫＹ１０、Ｎ．タバカムＫＹ１４、Ｎ．タバカムＫＹ１６０、Ｎ．タバカムＫＹ１７、Ｎ．タバカムＫＹ８９５９、Ｎ．タバカムＫＹ９、Ｎ．タバカムＫＹ９０７、Ｎ．タバカムＭＤ６０９、Ｎ．タバカム・マクネイル（McNair）３７３、Ｎ．タバカムＮＣ２０００、Ｎ．タバカムＰＧ０１、Ｎ．タバカムＰＧ０４、Ｎ．タバカムＰ０１、Ｎ．タバカムＰ０２、Ｎ．タバカムＰ０３、Ｎ．タバカムＲＧ１  １、Ｎ．タバカムＲＧ１７、Ｎ．タバカムＲＧ８、Ｎ．タバカム・スペイト（Speight）Ｇ−２８、Ｎ．タバカムＴＮ８６、Ｎ．タバカムＴＮ９０、Ｎ．タバカムＶＡ５０９、Ｎ．タバカムＡＳ４４、Ｎ．タバカム・バンケット（Banket）Ａ１、Ｎ．タバカム・バスマドラマ（Basma Drama）Ｂ８４／３１、Ｎ．タバカム・バスマＩジクナ（Basma I Zichna）ＺＰ４／Ｂ、Ｎ．タバカム・バスマクサンシ（Basma Xanthi）ＢＸ２Ａ、Ｎ．タバカム・バテク（Batek）、Ｎ．タバカム・ベスキジェンバー（Besuki Jember）、Ｎ．タバカムＣ１０４、Ｎ．タバカム・コーカー（Coker）３１９、Ｎ．タバカム・コーカー３４７、Ｎ．タバカム・クリオロミシオネロ（Criollo Misionero）、Ｎ．タバカムＰＭ０９２、Ｎ．タバカム・デルクレスト（Delcrest）、Ｎ．タバカム・ジェベル（Djebel）８１、Ｎ．タバカムＤＶＨ４０５、Ｎ．タバカム・ガルパオコマム（Galpao Comum）、Ｎ．タバカムＨＢ０４Ｐ、Ｎ．タバカム・ヒックスブロードリーフ（Hicks Broadleaf）、Ｎ．タバカム・カバクラクエラッソナ（Kabakulak Elassona）、Ｎ．タバカムＰＭ１０２、Ｎ．タバカム・クツァゲ（Kutsage）Ｅ１、Ｎ．タバカムＫＹ１４×Ｌ８、Ｎ．タバカムＫＹ１７１、Ｎ．タバカムＬＡ  ＢＵ２１、Ｎ．タバカム・マクネイル９４４、Ｎ．タバカムＮＣ２３２６、Ｎ．タバカムＮＣ７１、Ｎ．タバカムＮＣ２９７、Ｎ．タバカムＮＣ３、Ｎ．タバカムＰＶＨ０３、Ｎ．タバカムＰＶＨ０９、Ｎ．タバカムＰＶＨ１９、Ｎ．タバカムＰＶＨ２１  １０、Ｎ．タバカム・レッドロシアン（Red Russian）、Ｎ．タバカム・サムスン（Samsun）、N.タバカム・サプラク（Saplak）、Ｎ．タバカム・シンマバ（Simmaba）、Ｎ．タバカム・タルガー（Talgar）２８、Ｎ．タバカムＰＭ１３��、Ｎ．タバカム・ウィスリカ（Wislica）、Ｎ．タバカム・ヤヤルダグ（Yayaldag）、Ｎ．タバカムＮＣ４、Ｎ．タバカムＴＲマドーレ（Madole）、Ｎ．タバカム・プリレップ（Prilep）ＨＣ−７２、Ｎ．タバカム・プリレップＰ２３、Ｎ．タバカム・プリレップＰＢ１５６／１、Ｎ．タバカム・プリレップＰ１２−２／１、Ｎ．タバカム・ヤカ（Yaka）ＪＫ−４８、Ｎ．タバカム・ヤカＪＢ１２５／３、Ｎ．タバカムＴＩ−１０６８、Ｎ．タバカムＫＤＨ−９６０、Ｎ．タバカムＴＩ−１０７０、Ｎ．タバカムＴＷ１３６、Ｎ．タバカムＰＭ２０４、Ｎ．タバカムＰＭ２０５、Ｎ．タバカム・バスマ（Basma）、Ｎ．タバカムＴＫＦ４０２８、Ｎ．タバカムＬ８、Ｎ．タバカムＴＫＦ２００２、Ｎ．タバカムＴＮ９０、Ｎ．タバカムＧＲ１４１、Ｎ．タバカム・バスマクサンシ、Ｎ．タバカムＧＲ１４９、Ｎ．タバカムＧＲ１５３、及びＮ．タバカム・ペティットハバナ（Petit Havana）。
【０２２７】
品種又は栽培品種の非限定的な例は、ＢＤ６４、ＣＣ１０１、ＣＣ２００、ＣＣ２７、ＣＣ３０１、ＣＣ４００、ＣＣ５００、ＣＣ６００、ＣＣ７００、ＣＣ８００、ＣＣ９００、コーカー１７６、コーカー３１９、コーカー３７１ゴールド、コーカー４８、ＣＤ２６３、ＤＦ９１  １、ＤＴ５３８ＬＣガルパオタバコ、ＧＬ２６Ｈ、ＧＬ３５０、ＧＬ６００、ＧＬ７３７、ＧＬ９３９、ＧＬ９７３、ＨＢ０４Ｐ、ＨＢ０４Ｐ  ＬＣ、ＨＢ３３０７ＰＬＣ、ハイブリッド４０３ＬＣ、ハイブリッド４０４ＬＣ、ハイブリッド５０１ＬＣ、Ｋ１４９、Ｋ３２６、Ｋ３４６、Ｋ３５８、Ｋ３９４、Ｋ３９９、Ｋ７３０、ＫＤＨ９５９、ＫＴ２００、ＫＴ２０４ＬＣ、ＫＹ１０、ＫＹ１４、ＫＹ１６０、ＫＹ１７、ＫＹ１７１、ＫＹ９０７、ＫＹ９０７ＬＣ、ＫＴＹ１４×Ｌ８ＬＣ、リトルクリッテンデン（Little Crittenden）、マクネイル３７３、マクネイル９４４、ｍｓＫＹ１４×Ｌ８、ナロウリーフマドーレ（Narrow Leaf Madole）、ナロウリーフマドーレＬＣ、ＮＢＨ９８、Ｎ−１２６、Ｎ−７７７ＬＣ、Ｎ−７３７１ＬＣ、ＮＣ１００、ＮＣ１０２、ＮＣ２０００、ＮＣ２９１、ＮＣ２９７、ＮＣ２９９、ＮＣ３、ＮＣ４、ＮＣ５、ＮＣ６、ＮＣ７、ＮＣ６０６、ＮＣ７１、ＮＣ７２、ＮＣ８１０、ＮＣ  ＢＨ１２９、ＮＣ２００２、ニールスミスマドーレ（Neal Smith Madole）、ＯＸＦＯＲＤ２０７、ＰＤ７３０２ＬＣ、ＰＤ７３０９ＬＣ、ＰＤ７３１２ＬＣ’Periq’e’タバコ、ＰＶＨ０３、ＰＶＨ０９、ＰＶＨ１９、ＰＶＨ５０、ＰＶＨ５１、Ｒ６１０、Ｒ６３０、Ｒ７−１１、Ｒ７−１２、ＲＧ１７、ＲＧ８１、ＲＧ  Ｈ５１、ＲＧＨ４、ＲＧＨ５１、ＲＳ１４１０、スペイト１６８、スペイト１７２、スペイト１７９、スペイト２１０、スペイト２２０、スペイト２２５、スペイト２２７、スペイト２３４、スペイトＧ−２８、スペイトＧ−７０、スペイトＨ−６、スペイトＨ２０、スペイトＮＦ３、ＴＩ１４０６、ＴＩ１２６９、ＴＮ８６、ＴＮ８６ＬＣ、ＴＮ９０、ＴＮ９７、ＴＮ９７ＬＣ、ＴＮ  Ｄ９４、ＴＮ  Ｄ９５０、ＴＲ（トムロッソン（Tom Rosson））マドーレ、ＶＡ３０９、ＶＡ３５９、ＡＡ３７−１、Ｂ１３Ｐ、クサンシ（ミッチェル-モール）、Ｂｅｌ−Ｗ３、７９−６１５、サムスンホルムズＮＮ、ＫＴＲＤＣナンバー２ハイブリッド４９、バーレイ２１、ＫＹ８９５９、ＫＹ９、ＭＤ６０９、ＰＧ０１、ＰＧ０４、Ｐ０１、Ｐ０２、Ｐ０３、ＲＧ１  １、ＲＧ８、ＶＡ５０９、ＡＳ４４、バンケットＡ１、バスマドラマＢ８４／３１、バスマＩジクナＺＰ４／Ｂ、バスマクサンシＢＸ２Ａ、バテク、ベスキジェンバー（Besuki Jember）、Ｃ１０４、コーカー３４７、クリオロミシオネロ、デルクレスト、ジェベル８１、ＤＶＨ４０５、ガルパオコマム、ＨＢ０４Ｐ、ヒックスブロードリーフ、カバクラクエラッソナ、クツァゲＥ１、ＬＡ  ＢＵ２１、ＮＣ２３２６、ＮＣ２９７、ＰＶＨ２１  １０、レッドロシアン、サムスン、サプラク、シンマバ、タルガー２８、ウィスリカ、ヤヤルダグ、プリレップＨＣ−７２、プリレップＰ２３、プリレップＰＢ１５６／１、プリレップＰ１２−２／１、ヤカＪＫ−４８、ヤカＪＢ１２５／３、ＴＩ−１０６８、ＫＤＨ−９６０、ＴＩ−１０７０、ＴＷ１３６、バスマ、ＴＫＦ４０２８、���８、ＴＫＦ２００２、ＧＲ１４１、バスマクサンシ、ＧＲ１４９、ＧＲ１５３、ペティットハバナである。上記これらの低コンバーター亜品種も、たとえ本明細書で特に識別されないとしても検討される。
【０２２８】
タバコ植物はバーレイ種であり得る。
【０２２９】
１つの実施形態では、タバコ植物は、Ｎ．タバカム  Ｌ．であり、最も好ましい実施形態では、タバコ植物は、Ｎ．タバカム  Ｌ栽培品種Ｔ．Ｉ．１０６８である。
【０２３０】
１つの実施形態では、植物繁殖材料は、本発明のタバコ植物から取得可能であり得る。「植物繁殖材料」とは、本明細書で用いる場合、さらなる植物が生成し得る、植物から得られるあらゆる植物由来物質を意味する。好適には、植物繁殖材料は種子であり得る。
【０２３１】
１つの実施形態では、本発明のタバコ細胞、タバコ植物、及び／又は植物繁殖材料は、阻害された又は下方制御されたジテルペン合成遺伝子を含み得る。別の実施形態では、タバコ細胞、タバコ植物、及び／又は植物繁殖材料は、本発明によるコンストラクト又はベクターを含み得る。別の実施形態では、タバコ細胞、タバコ植物、及び／又は植物繁殖材料は、本発明による方法により取得可能であり得る（例えば、取得され得る）。
【０２３２】
好適には、本発明によるタバコ植物又はその一部は、ジテルペン合成遺伝子の発現を阻害するように改変されなかったタバコ植物又はその一部と比較して、少なくとも１つのジテルペン合成遺伝子の発現低下を含み得る。
【０２３３】
１つの実施形態では、本発明に基づくタバコ植物又はその一部分は、本発明のタバコ細胞を含む。別の実施形態では、植物繁殖材料は、本発明のタバコ植物から取得可能であり得る（例えば、取得され得る）。
【０２３４】
１つの実施形態では、タバコ製品の製造のための上記実施形態において提供されるようなタバコ細胞の使用が提供される。さらに、タバコ植物を育成するための、本明細書に記載するタバコ植物の使用が提供される。
【０２３５】
本発明は、別の実施形態では、タバコ製品の製造のための、上記実施形態のタバコ植物の使用も提供する。別の実施形態では、作物を成長させるための、本発明のタバコ植物の使用が提供される。１つの実施形態では、本発明によるジテルペン合成遺伝子の使用は、タバコ植物の滲出物の化学的性質に変化をもたらす可能性がある。
【０２３６】
１つの実施形態では、本発明によるジテルペン合成遺伝子の使用は、タバコ植物のスクロースエステル含有量の増加を引き起こす可能性がある。別の実施形態では、ジテルペン合成遺伝子の使用（例えば、その阻害）は、スクロースエステルのトリコーム滲出物濃度の増加、並びにＣＢＴ−オール、シス−アビエノール、及びラブデンジオールのうちの１又は２以上の含有量の増加を引き起こす可能性がある。好適には、これは、野生型植物と比較して、植物がジテルペン合成遺伝子発現の減少を示すときに観察され得る。
【０２３７】
１つの実施形態では、本発明は、タバコ細胞培養物（例えば、インビトロ培養における）を提供する。タバコ細胞培養物は、タバコ細胞懸濁培養物であり得る。インビトロで培養されたこのようなタバコ細胞は、例えば、従来型のタバコ粒子、シュレッド、細かくカットされた若しくは長くカットされたタバコラミナに対する代替物として、添加成分として、又は代替物及び添加物の両方としてタバコ製品に組み込まれ得る。
【０２３８】
１つの実施形態では、タバコ製品を製造するためのタバコ細胞培養物、例えば本発明による採取された及び／又は加工されたタバコ細胞培養物、又はそれからの抽出物の使用が提供される。
【０２３９】
インビトロ培養物から採取されたタバコ細胞は、例えば粉末を生成するために乾燥、例えば凍結乾燥され得る。
【０２４０】
当業者は、タバコ細胞のインビトロ培養を確立するための公知の方法について認識している。例示目的に限定して下記の方法が使用され得る：目的とするタバコ植物から種子を収集し、そしてその外部を滅菌して望ましくない生物を取り除き、前記種子を栽植して目的とするタバコ植物に生育させ、外植片として使用するためにタバコ植物から（例えば、タバコの茎から）組織を取り出し、タバコ外植片からカルス培養物を確立し、該カルス培養物から細胞懸濁培養物を確立し、そして培養材料（例えば、タバコ細胞を含む）を採取してタバコ細胞培養物を生成するステップ。
【０２４１】
タバコ細胞は、濾過、例えば減圧濾過を含む様々な方法により採取され得る。サンプルは、水を添加することによりフィルター内で洗浄され、そして残りの液体は濾過、例えば減圧濾過により除去され得る。
採取されたタバコ細胞培養物は、さらなる加工、例えば空気乾燥及び／又は凍結乾燥等の乾燥の対象となり得る。採取されたタバコ細胞培養物又は乾燥した採取されたタバコ細胞培養物又はそれからの抽出物は、本発明によるタバコ製品に組み込まれ得る。
【０２４２】
製品
本発明は、本発明によるタバコから取得可能な、又は取得された製品も提供する。ジテルペン合成遺伝子活性又は発現が阻害されており、そして増加したスクロースエステル含有量を含むタバコ植物から取得可能な又は取得された製品が提供される。
【０２４３】
本明細書で使用する場合、用語「タバコ産業製品」は、可燃性の喫煙物品、例えばシガレット、シガリロ、シガー、パイプ又は手巻きシガレット用のタバコ等（タバコ、タバコ派生品、膨化タバコ、再構成されたタバコ、タバコ代用品又はその他の喫煙可能物質に基づくかどうかを問わない）、不燃性のエアゾール供給システム、例えば燃焼せずに基材から化合物を放出する加熱製品、例えば電子シガレット、タバコ加熱製品等、及び基材の複合物からエアゾールを生成するハイブリッドシステム、例えば液体又はゲル又は固体の基質を含有するハイブリッドシステム、並びにこのようなエアゾール供給システム内で使用されるエアゾール化可能な基材等；及びエアゾールを含まない送達物品、例えばロゼンジ、ガム、パッチ等、呼吸可能な粉末を含む物品、及び無煙タバコ製品、例えばスヌース及びスナッフ等が含まれるように意図されており、該エアゾールを含まない送達物品は、ニコチンを送達する場合もあれば、送達しない場合もある。
【０２４４】
好適には、タバコ産業製品は、本発明に基づくタバコ植物又はその一部から調製され得る（例えば、含み得る）。
【０２４５】
好適には、タバコ産業製品は、本発明に基づくタバコ細胞培養物から調製され得る。
【０２４６】
好適には、タバコ産業製品は、本発明に基づくタバコ植物繁殖材料から繁殖させたタバコ植物又はその一部から調製され得る（例えば、含み得る）。
【０２４７】
好適には、タバコ産業製品は、本発明に基づくタバコ植物の採取された葉から調製され得る（例えば、含み得る）。
【０２４８】
好適には、タバコ産業製品は、本発明に基づく加工されたタバコ葉から調製され得る（例えば、含み得る）。
【０２４９】
好適には、タバコ産業製品は、本発明に基づく乾燥したタバコ材料から調製され得る（例えば、含み得る）。
【０２５０】
好適には、タバコ産業製品は、本発明に基づくタバコブレンドから調製され得る（例えば、含み得る）。
【０２５１】
１つの実施形態では、タバコ産業製品は、シガレット、シガリロ、及びシガーからなる群から選択される可燃性の喫煙物品である。
【０２５２】
１つの実施形態では、タバコ産業製品は、可燃性の喫煙物品、例えばフィルター、フィルターロッド、フィルターロッドセグメント、タバコ、タバコロッド、タバコロッドセグメント、スピル等、添加物放出コンポーネント、例えばカプセル、糸、ビーズ等、ペーパー、例えばプラグラップ、チッピングペーパー又はシガレットペーパー等のうちの１又は２以上のコンポーネントを含む。
【０２５３】
１つの実施形態では、タバコ産業製品は、非可燃性のエアゾール供給システムである。
【０２５４】
１つの実施形態では、タバコ産業製品は、非可燃性エアゾール供給システム、例えばヒーターやエアゾール化可能な基質等のうちの１又は２以上のコンポーネントを含む。
【０２５５】
１つの実施形態では、エアゾール供給システムは、ベーピングデバイスとしても知られている電子的シガレットである。
【０２５６】
１つの実施形態では、電子シガレットは、ヒーター、ヒーターに電力を供給する能力を有する電源、エアゾール化可能な基質、例えば液体又はゲル等、筐体を含み、またマウスピースを含んでもよい。
【０２５７】
１つの実施形態では、エアゾール化可能な基質は、基質容器内に収納される。１つの実施形態では、基質容器は、ヒーターと組み合わされる、又はそれを含む。
【０２５８】
１つの実施形態では、タバコ産業製品は、基材を燃焼させずに加熱することにより、１又は２以上の化合物を放出させる加熱製品である。基材は、例えば、ニコチンを含有してもまた含有しなくてもよい、タバコ又はその他の非タバコ製品であり得るエアゾール化可能な材料である。１つの実施形態では、加熱製品はタバコ加熱製品である。
【０２５９】
１つの実施形態では、加熱製品は電子素子である。
【０２６０】
１つの実施形態では、タバコ加熱製品は、ヒーター、ヒーターに電力を供給する能力を有する電源、エアゾール化可能な基質、例えば固体又はゲル材料等を含む。
【０２６１】
１つの実施形態では、加熱製品は非電子的物品である。
【０２６２】
１つの実施形態では、加熱製品は、エアゾール化可能な基質、例えば固体又はゲル材料等、及び電子的手段を一切用いず、チャコール等の燃焼材料を燃焼させること等により、エアゾール化可能な基質に加熱エネルギーを供給する能力を有する熱源を含む。
【０２６３】
１つの実施形態では、加熱製品は、エアゾール化可能な基質を加熱することにより生み出されるエアゾールを濾過する能力を有するフィルターも含む。
【０２６４】
いくつかの実施形態では、エアゾール化可能な基材は、蒸気若しくはエアゾール発生剤、又は保水物質、例えばグリセロール、プロピレングリコール、トリアセチン、若しくはジエチレングリコール等を含み得る。
【０２６５】
１つの実施形態では、タバコ産業製品は、基材の複合物を燃焼ではなく加熱することによりエアゾールを生成するハイブリッドシステムである。基材は、例えばニコチンを含有しても、また含有しなくてもよい固体、液体、又はゲルを含み得る。１つの実施形態では、ハイブリッドシステムは、液体又はゲル基質、及び固体基質を含む。固体基質は、例えばニコチンを含有してもまた含有しなくてもよいタバコ又はその他の非タバコ製品であり得る。１つの実施形態では、ハイブリッドシステムは、液体又はゲル基質及びタバコを含む。
【０２６６】
別の実施形態では、製品は、ジテルペン合成遺伝子活性又は発現を阻害する、本発明のｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクト及び増加したスクロースエステル含有量を含み得る。
【０２６７】
１つの実施形態では、タバコ葉を製造するための、本発明のタバコ植物の使用が提供される。好適には、タバコ葉は、加工工程等の下流の用途に供され得る。したがって、１つの実施形態では、上記実施形態の使用は、加工されたタバコ葉を提供し得る。好適には、タバコ葉は、乾燥工程、発酵工程、加熱殺菌工程、又はそれらの組合せの対象となり得る。
【０２６８】
別の実施形態では、タバコ葉はカットされ得る。いくつかの実施形態では、タバコ葉は、乾燥工程、発酵工程、加熱殺菌工程、又はそれらの組合せに供される前又は後においてカットされ得る。
【０２６９】
１つの実施形態では、本発明は採取された本発明のタバコ植物の葉を提供する。１つの実施形態では、採取された葉は、ジテルペン合成遺伝子活性又は発現が阻害され、及びスクロースエステル含有量が増加しているタバコ植物から取得可能であり得る。さらなる実施形態では、採取された葉は、本発明の繁殖材料から繁殖させたタバコ植物から取得可能であり得る（例えば、取得され得る）。別の実施形態では、本発明の方法又は使用から取得可能な採取された葉が提供される。好適には、採取された葉は、カットされ採取された葉であり得る。いくつかの実施形態では、採取された葉は、生存性のタバコ細胞を含み得る。いくつかの実施形態では、採取された葉は、生存性のタバコ細胞を含まない。その他の実施形態では、採取された葉は、さらなる加工の対象となり得る。
【０２７０】
一部のタバコ植物は、葉柄をカットすること、及びすべての葉を同時に採取することにより採取され得る（例えば、バーレイ種のタバコと同様に）。その他のタバコ植物（例えば、熱風乾燥したタバコ）は、葉が熟成する際に個々の葉が葉柄から除去されるプライミング等のプロセス内のいくつかのステージにおいて採取され得る。
【０２７１】
加工されたタバコ葉も提供される。加工されたタバコ葉は、本発明のタバコ植物から取得可能であり得る。好適には、加工されたタバコ葉は、本発明の方法及び／又は使用のいずれかに基づき取得されたタバコ植物から取得可能であり得る。１つの実施形態では、加工されたタバコ葉は、好ましくは対照葉と比較したとき、すなわち本発明により改変されなかったタバコ植物に由来する葉と比較したとき、ジテルペン合成遺伝子活性又は発現が阻害され、そしてスクロースエステル含有量が増加しているタバコ植物から取得可能であり得る。加工されたタバコ葉は、ジテルペン合成遺伝子活性又は発現の低下、及び増加したスクロースエステル含有量を含み得る。
【０２７２】
別の実施形態では、加工されたタバコ葉は、本発明によるタバコ植物繁殖材料から繁殖させたタバコ植物から取得可能であり得る。本発明の加工されたタバコ葉は、採取された本発明の葉を加工することにより取得可能である。
【０２７３】
用語「加工されたタバコ葉」とは、本明細書で用いる場合、当技術分野においてタバコが供される１又は２以上の加工ステップを経たタバコ葉を意味する。「加工されたタバコ葉」は、生存細胞を含まない又は実質的に含まない。
【０２７４】
用語「生存細胞」とは、増殖することができ、及び／又は代謝的に活性である細胞を意味する。したがって、細胞が生存していないと言われる場合には、「非生存性」とも呼ばれ、その場合、細胞は生存細胞の特徴を示さない。
【０２７５】
用語「実質的に生存しない細胞」とは、全細胞のうち約５％未満が生存していることを意味する。全細胞のうち、好ましくは約３％未満、より好ましくは約１％未満、なおいっそうより好ましくは約０．１％未満が生存している。
【０２７６】
１つの実施形態では、加工されたタバコ葉は、乾燥工程、発酵工程、加熱殺菌工程のうちの１又は２以上により加工され得る。好適には、加工されたタバコ葉は乾燥工程により加工され得る。タバコ葉は、当技術分野において公知の任意の方法により乾燥され得る。１つの実施形態では、タバコ葉は、空気乾燥、火力乾燥、熱風乾燥、及び天日乾燥からなる群から選択される乾燥法のうちの１又は２以上により乾燥され得る。好適には、タバコ葉は空気乾燥され得る。好適には、タバコ葉は熱風乾燥され得る。
【０２７７】
１つの実施形態では、本発明による加工された葉は、本発明に基づき改変されなかった同等の製品（例えば、加工された葉）と比較して、増加したスクロースエステル含有量を含む。
【０２７８】
１つの態様では、本発明による空気乾燥された葉は、本発明に基づき改変されなかった同等の製品（例えば、空気乾燥された葉）と比較して、増加したスクロースエステル含有量を含む。
【０２７９】
好適には、スクロースエステル含有量は、葉柄カットされた空気乾燥植物の下部１／３葉において測定され得る。好適には、スクロースエステル含有量は、葉柄カットされた空気乾燥植物の中間１／３葉において測定され得る。好適には、スクロースエステル含有量は、葉柄カットされた空気乾燥植物の上部１／３葉において測定され得る。
【０２８０】
「下部葉」とは、本明細書で使用する場合、植物の下側三分の一内の葉（例えば、植物の基部に最も近い葉）を指し、「上部葉」とは、本明細書で使用する場合、植物の上側三分の一内の葉（例えば、植物の基部から最も離れた葉）を指す。「中間の葉」とは、本明細書で使用する場合、下部位置と上部位置の間に位置する植物の中央三分の一（例えば、下部葉及び上部葉の中間に位置する葉）を意味する。
【０２８１】
好適には、本発明による葉柄カットされた空気乾燥植物の下部１／３葉は、本発明に基づき改変されなかった同等の製品（例えば、葉柄カットされた空気乾燥植物の下部１／３葉）と比較して、増加したスクロースエステル含有量を含み得る。好適には、本発明による葉柄カットされた空気乾燥植物の中間１／３葉は、本発明に基づき改変されなかった同等の製品（例えば、葉柄カットされた空気乾燥植物の中間１／３葉）と比較して、増加したスクロースエステル含有量を含み得る。好適には、本発明による葉柄カットされた空気乾燥植物の上部１／３葉は、本発明に基づき改変されなかった同等の製品（例えば、葉柄カットされた空気乾燥植物の上部１／３葉）と比較して、増加したスクロースエステル含有量を含み得る。
【０２８２】
１つの態様では、本発明による熱風乾燥した葉は、本発明に基づき改変されなかった同等の製品（例えば、熱風乾燥した葉）と比較して、増加したスクロースエステル含有量を含む。
【０２８３】
好適には、スクロースエステル含有量は、熱風乾燥した植物の第１のプライミングにおいて測定され得る。好適には、スクロースエステル含有量は、熱風乾燥した植物の第２（或いは中間）のプライミングにおいて測定され得る。好適には、スクロースエステル含有量は、熱風乾燥した植物の第３（或いは最終）のプライミングにおいて測定され得る。
【０２８４】
本明細書で使用する場合、「プライミング」とは、タバコ植物からの葉の除去を指す。これは、熱風乾燥した植物の成熟した又は熟した葉の除去を指す場合もある。
【０２８５】
「第１のプライミング」とは、本明細書で使用する場合、タバコ植物から最初に採取される葉を指す（例えば、タバコ植物の最下部から得られる葉）。「第２の（又は中間のプライミング）プライミング」とは、本明細書で使用する場合、初回プライミング後にタバコ植物から採取される葉（例えば、タバコ植物の中間部から得られる葉）を指す。「第３（又は最終）のプライミング」とは、本明細書で使用する場合、タバコ植物から最後に採取される葉（例えば、タバコ植物の最上部から得られる葉）を指す。
【０２８６】
好適には、本発明による熱風乾燥した植物の葉の第１のプライミングは、本発明に基づき改変されなかった同等の製品（例えば、熱風乾燥した植物の葉の第１のプライミング）と比較して、増加したスクロースエステル含有量を含み得る。好適には、本発明による熱風乾燥した植物の葉の第２（又は中間）のプライミングは、本発明に基づき改変されなかった同等の製品（例えば、熱風乾燥した植物の葉の第２（又は中間）のプライミング）と比較して、増加したスクロースエステル含有量を含み得る。好適には、本発明による熱風乾燥した植物の葉の第３（又は最終）のプライミングは、本発明に基づき改変されなかった同等の製品（例えば、熱風乾燥した植物の葉の第３（又は最終）のプライミング）と比較して、増加したスクロースエステル含有量を含み得る。
【０２８７】
一般的に、空気乾燥は、十分に換気された収蔵室内でタバコ葉を吊り下げ、そして放置乾燥することにより達成される。これは、４〜８週間にわたり通常実施される。空気乾燥は、バーレイ種のタバコに特に適する。
【０２８８】
好適には、タバコ葉は火力乾燥され得る。火力乾燥は、大型の収蔵室内でタバコ葉を吊り下げ、その収蔵室内で、連続的又は間欠的に弱く煙らせながら広葉樹の炎を継続することにより一般的に達成され、その乾燥は、プロセス及びタバコに応じて３日間〜１０週間を通常要する。
【０２８９】
別の実施形態では、タバコ葉は熱風乾燥され得る。熱風乾燥は、タバコ葉をタバコスティック上に糸で吊るし、そしてそれを乾燥収蔵室内のタイアーポールから吊り下げる工程を含み得る。収蔵室は、外部供給式の火室から通ずる煙道を通常有する。これにより、一般的に、煙に曝露されないで加熱乾燥させたタバコが得られる。通常、温度は乾燥工程の過程全体にわたりゆっくりと上昇し、全プロセスに約１週間を要する。
【０２９０】
好適には、タバコ葉は天日乾燥され得る。この方法は、むき出しのタバコの天日への曝露を一般的に含む。
【０２９１】
好適には、加工されたタバコ葉は発酵工程により加工され得る。発酵は、当技術分野において公知の任意の方式で実施可能である。一般的に、発酵期間中に、タバコ葉は、湿気を保持するために、例えば黄麻布でくるまれたスタック状（バルク状）の乾燥タバコに積層される。葉内に残留する水とタバコの重量が組み合わさって自然の熱が生成し、タバコを熟成させる。バルク中心部の温度は毎日モニタリングされる。いくつかの方法では、毎週、バルク全体が開放される。次に葉を取り出して振動及び湿度を与え、そして内側の葉が外側に来るように、また底部にあった葉がバルクの最上部に配置されるようにバルクを回転させる。これにより、バルク全体を通じて均等な発酵が保証される。葉の上のさらなる湿気に加え、葉それ自体が実際に回転することで熱が生成し、タバコに本来含まれるアンモニアが放出され、そしてニコチンが低下する一方、色の深みも増し、またタバコのアロマも良化する。一般的に、発酵プロセスは、タバコの品種、葉上の葉柄の位置、厚さ、及び葉の使用目的に応じて最長６カ月継続する。
【０２９２】
好適には、加工されたタバコ葉は、加熱殺菌により加工され得る。加熱殺菌工程は、タバコ葉が、無煙タバコ製品、最も好ましくはスヌースを製造するのに用いられる場合、特に好ましい可能性がある。タバコ葉の加熱殺菌は、当技術分野において公知の任意の方法により実施され得る。例えば、加熱殺菌は、その教示が参照により本明細書に組み込まれる、J Fould, L Ramstrom, M Burke, K Fagerstrom. Effect of smokeless tobacco (snus) on smoking and public health in Sweden. Tobacco Control (2003) 12: 349-359に詳記するように実施され得る。
【０２９３】
スヌースの製造期間中、加熱殺菌は、タバコが蒸気で２４〜３６時間加熱処理されるプロセス（約１００℃の温度に達する）により一般的に実施される。これにより、ほぼ無菌の製品がもたらされ、また理論に束縛されるものではないが、この結果のひとつとして、さらなるＴＳＮＡ形成が制限されるものと考えられている。
【０２９４】
１つの実施形態では、加熱殺菌は蒸気式加熱殺菌であり得る。
【０２９５】
いくつかの実施形態では、加工されたタバコ葉はカットされ得る。加工されたタバコ葉は、加工前又は後でカットされ得る。好適には、加工されたタバコ葉は、加工後にカットされ得る。
【０２９６】
いくつかの実施形態では、タバコ植物、採取されたタバコ植物の葉、及び／又は加工されたタバコ葉は、ニコチンを抽出するのに利用可能である。ニコチンの抽出は、当技術分野において公知の任意の方法を用いて実現され得る。例えば、タバコからニコチンを抽出する方法は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第２，１６２，７３８号明細書に教示されている。
【０２９７】
１つの態様では、本発明は、本発明によるタバコ植物若しくはその一部、又は本発明によるタバコ細胞培養物から作製された乾燥したタバコ材料を提供する。
【０２９８】
別の態様では、本発明は、本発明によるタバコ植物若しくはその一部から、又は本発明によるタバコ細胞培養物から作製されたタバコ材料を含むタバコブレンドを提供する。１つの態様では、本発明は、本発明による乾燥したタバコ材料を含むタバコブレンドを提供する。
【０２９９】
好適には、本発明によるタバコブレンドは、本発明によるタバコ植物若しくはその一部から、又は本発明によるタバコ細胞培養物から得られるタバコについて、そのほぼ１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％含み得る。好適には、タバコブレンドは、本発明によるタバコ植物若しくはその一部から、又は本発明によるタバコ細胞培養物から得られるタバコについて、そのほぼ１０％含み得る。好適には、タバコブレンドは、本発明によるタバコ植物若しくはその一部から、又は本発明によるタバコ細胞培養物から得られるタバコについて、そのほぼ２０％含み得る。好適には、タバコブレンドは、本発明によるタバコ植物若しくはその一部から、又は本発明によるタバコ細胞培養物から得られるタバコについて、そのほぼ３０％含み得る。好適には、タバコブレンドは、本発明によるタバコ植物若しくはその一部から、又は本発明によるタバコ細胞培養物から得られるタバコについて、そのほぼ４０％含み得る。好適には、タバコブレンドは、本発明によるタバコ植物若しくはその一部から、又は本発明によるタバコ細胞培養物から得られるタバコについて、そのほぼ５０％含み得る。好適には、タバコブレンドは、本発明によるタバコ植物若しくはその一部から、又は本発明によるタバコ細胞培養物から得られるタバコについて、そのほぼ６０％含み得る。好適には、タバコブレンドは、本発明によるタバコ植物若しくはその一部から、又は本発明によるタバコ細胞培養物から得られるタバコについて、そのほぼ７０％含み得る。好適には、タバコブレンドは、本発明によるタバコ植物若しくはその一部から、又は本発明によるタバコ細胞培養物から得られるタバコについて、そのほぼ８０％含み得る。好適には、タバコブレンドは、本発明によるタバコ植物若しくはその一部から、又は本発明によるタバコ細胞培養物から得られるタバコについて、そのほぼ９０％含み得る。
【０３００】
１つの態様では、本発明のタバコブレンド製品では、本発明によるタバコ植物若しくはその一部、又は本発明によるタバコ細胞培養物から乾燥したタバコが、乾燥重量として少なくとも約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は９５パーセントを占める。
【０３０１】
好適には、乾燥したタバコ材料は空気乾燥され得る。好適には、乾燥したタバコ材料は熱風乾燥され得る。好適には、乾燥したタバコ材料は天日乾燥され得る。
【０３０２】
本発明によるタバコ製品又は喫煙物品は、本発明によるタバコ材料（例えば、乾燥したタバコ材料）を含み得る。
【０３０３】
別の態様では、本発明は、タバコ製品を提供する。本発明によるタバコ製品は、ブレンドされたタバコ製品であり得る。１つの実施形態では、タバコ製品は、本発明のタバコ植物又はその一部から調製され得る。１つの実施形態では、タバコ製品は、ジテルペン合成遺伝子活性又は発現が阻害されており、そしてスクロースエステル含有量が増加しているタバコ植物から調製され得る。タバコ製品は、低下したジテルペン合成遺伝子の活性又は発現及び増加したスクロースエステル含有量を含み得る。好適には、タバコ植物又はその一部分は、本発明によるタバコ植物繁殖材料から繁殖され得る。
【０３０４】
用語「その一部分」とは、タバコ植物の文脈において本明細書で用いる場合、タバコ植物の一部分を意味する。好ましくは、「その一部分」とはタバコ植物の葉である。
【０３０５】
別の実施形態では、タバコ製品は、採取された本発明の葉から調製され得る。さらなる実施形態では、タバコ製品は、加工された本発明のタバコ葉から調製され得る。好適には、タバコ製品は、乾燥工程、発酵工程、及び／又は加熱殺菌工程のうちの１又は２以上により加工されたタバコ葉から調製され得る。好適には、タバコ製品はカットされたタバコ葉を含み得るが、上記実施形態にしたがって加工されてもよい。
【０３０６】
１つの実施形態では、タバコ製品は喫煙物品であり得る。本明細書で用いる場合、用語「喫煙物品」は、タバコ、タバコ派生品、膨化タバコ、再構成タバコ、又はタバコ代用品に基づき、喫煙可能な製品、例えば巻きタバコ、シガレット、シガー、及びシガリロ等を含み得る。
【０３０７】
別の実施形態では、タバコ製品は無煙タバコ製品であり得る。用語「無煙タバコ製品」とは、本明細書で用いる場合、喫煙する及び／又は燃焼させるように意図されないタバコ製品を意味する。１つの実施形態では、無煙タバコ製品として、スヌース、嗅ぎ煙草、噛みタバコ等を挙げることができる。
【０３０８】
さらなる実施形態では、タバコ製品は、タバコ加熱デバイス又はハイブリッドデバイス又はｅ−シガレット等であり得る。一般的に、加熱デバイス又はハイブリッドデバイスでは、熱源の内部、近傍、又は下流に位置し得る、物理的に分離したエアゾール形成基質又は材料に、熱源から熱を移動させることによりエアゾールが生成される。喫煙期間中、熱源からの熱移動により揮発性化合物がエアゾール形成基材から放出され、そして喫煙物品を通じて吸引された空気中に取り込まれる。放出された化合物が冷やされると、凝縮してエアゾールを形成し、ユーザーにより吸入される。
【０３０９】
消費用のエアゾール発生物品及びデバイス、又はタバコ喫煙用の加熱デバイスは、当技術分野において公知である。そのようなデバイスとして、例えば、電気加熱式エアゾール発生デバイスを挙げることができ、同デバイス内では、エアゾール発生デバイスの１又は２以上の電気発熱要素からタバコ加熱デバイスのエアゾール形成基材に熱を移動させることにより、エアゾールが発生する。好適には、タバコ加熱デバイスは、エアゾール発生デバイスであり得る。
【０３１０】
好ましくは、タバコ加熱デバイスは、非燃焼加熱式デバイスであり得る。非燃焼加熱式デバイスは、当技術分野において公知であり、またタバコを燃焼させるのではなく、加熱することにより化合物を放出させる。非燃焼加熱式デバイスの適する例として、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３／０３４４５９号パンフレット、又は英国特許第２５１５５０２号明細書に教示するものが該当し得る。
【０３１１】
１つの実施形態では、タバコ加熱デバイスのエアゾール形成基材は、本発明に基づくタバコ製品であり得る。
【０３１２】
１つの実施形態では、タバコ加熱デバイスは、ハイブリッドデバイスであり得る。
【０３１３】
ポリヌクレオチド／ポリペプチド／コンストラクト
本発明の特定の実施形態では、ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を阻害するコンストラクトは、プロモーターの指示下に置かれた植物細胞中に形質変換（transformed）され得る。本発明の特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ又はａｍｉＲＮＡを発現してジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を阻害するｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトは、プロモーターの指示下に置かれた植物細胞中に形質変換され得る。
【０３１４】
コンストラクトは、適するベクター、例えば植物形質転換ベクターによって本発明による植物に導入され得る。植物形質転換ベクターは、５’−３’の転写方向で、プロモーター配列、ジテルペン合成遺伝子を標的とする、好ましくはシクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）、ＣＢＴｏｌシクラーゼ、又はテルペンシンターゼ３−８を標的とするｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクト配列を含む発現カセットを含み得るが、イントロンも含んでもよく、またＲＮＡポリメラーゼに対する終止シグナル及びポリアデニラーゼに対するポリアデニル化シグナルを含む３’非翻訳転写終結配列を含んでもよい。プロモーター配列は、１又は２以上のコピー内に存在し得るが、またそのようなコピーは、上記プロモーター配列と同一、又はそのバリアントであり得る。転写終結コドン配列は、植物、細菌、又はウイルスの遺伝子から取得され得る。適する転写終結コドン配列は、例えば、エンドウマメｒｂｃＳ  Ｅ９転写終結コドン配列、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のノパリンシンターゼ遺伝子に由来するｎｏｓ転写終結コドン配列、及びカリフラワーモザイクウイルスに由来する３５Ｓ転写終結コドン配列である。当業者は、その他の適する転写終結コドン配列を容易に認識する。
【０３１５】
本発明のコンストラクトは、プロモーターの強度を高める遺伝子発現増強機構も含み得る。そのようなエンハンサーエレメントの例として、エンドウ豆プラストシアニン遺伝子のプロモーターの部分に由来するエレメントが挙げられ、また参照として本明細書に組み込まれている国際特許出願第９７／２００５６号の主題でもある。適するエンハンサーエレメントは、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのノパリンシンターゼ遺伝子に由来するｎｏｓエンハンサーエレメント、及びカリフラワーモザイクウイルス由来の３５Ｓエンハンサーエレメントであり得る。
【０３１６】
これらの制御領域は、プロモーターＤＮＡ配列と同一の遺伝子に由来し得る、或いはニコチアナ・タバカム若しくはその他の生物、例えばナス科（Solanaceae）の植物から得られる、又はヤコウカ亜科（subfamily Cestroideae）から得られる異なる遺伝子に由来し得る。すべての制御領域は、変換される組織の細胞内で動作する能力を有するべきである。
【０３１７】
プロモーターＤＮＡ配列は、本発明で使用される配列をコードする対象遺伝子と同一の遺伝子（例えば、プロモーターの指令を受けることとなる遺伝子、例えば本発明の調節解除された硝酸レダクターゼをコードする遺伝子）に由来し得る、或いはニコチアナ・タバカム若しくはその他の生物から、例えばナス科の植物、又はヤコウカ亜科から得られる異なる遺伝子に由来し得る。
【０３１８】
発現カセットは、基本的植物形質転換ベクター、例えばｐＢＩＮ１９プラス、ｐＢＩ１０１、ｐＫＹＬＸ７１：３５Ｓ２、ｐＣＡＭＢＩＡ２３００等、又は当技術分野において公知のその他の適する植物形質転換ベクターに組み込まれ得る。発現カセットに付加して、植物形質転換ベクターは、形質転換プロセスに必要な配列を含む。そのような配列は、アグロバクテリウム属ｖｉｒ遺伝子、１若しくは２以上のＴ−ＤＮＡ境界配列、及び選択マーカー、又は遺伝子導入植物細胞を識別するその他の手段を含み得る。
【０３１９】
用語「植物形質転換ベクター」とは、インビボ又はインビトロで発現する能力を有するコンストラクトを意味する。好ましくは、発現ベクターは、生物のゲノムに組み込まれる。用語「組み込まれる」には、好ましくは、ゲノムへの安定な組込みが含まれる。
【０３２０】
植物を形質転換する技術は当技術分野において周知されており、例えば、アグロバクテリウム媒介型の形質転換を含む。遺伝子改変植物の構築における基本的な原則は、挿入された遺伝物質の安定的維持が得られるように、植物ゲノム内に遺伝情報を挿入することである。一般技術のレビューは、参照として本明細書に組み込まれている、Potrykus（Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225）、及びChriston（AgroFood-Industry Hi-Tech March/April1994 17-27）による文献に見出され得る。
【０３２１】
一般的に、アグロバクテリウム媒介型形質転換では、外来の所望のＤＮＡ、すなわちｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトを担持するバイナリーベクターを、アグロバクテリウムと標的植物から得た外植片との同時培養により適するアグロバクテリウム系統から標的植物に移動させる。形質転換植物組織は、次に選択培地上で再生するが、同選択培地は、選択マーカー及び植物成長ホルモンを含む。代替法として、フローラルディップ法（参照として本明細書に組み込まれている、Clough & Bent, 1998 Plant J. 1998 Dec;16(6):735-43）が挙げられ、同法により、インタクトな植物の花芽がキメラ遺伝子を含有するアグロバクテリウム系統の懸濁液と接触することとなり、そして結実後、形質転換された個々の植物を発芽させ、そして選択培地上で成長させることにより識別される。アグロバクテリウムによる植物組織の直接感染は単純な技法であり、幅広く採用されているが、同法は参照として本明細書に組み込まれている、Butcher D. N. et al., (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, eds.: D. S. Ingrams and J.P. Helgeson, 203-208に記載されている。
【０３２２】
さらに適する形質転換方法として、例えば、ポリエチレングリコール、又はエレクトロポレーション技術、粒子衝突、マイクロインジェクション、及びシリコンカーバイドファイバーの使用等を用いたプロトプラスト中への直接遺伝子移入法が挙げられる。シリコンカーバイドホイスカー技術を含むバリスティック形質転換法を用いた植物の形質転換は、参照として本明細書に組み込まれている、Frame B R、Drayton P R、Bagnaall S V、Lewnau C J, Bullock W P、Wilson H M、Dunwell J M、Thompson J A & Wang K (1994)で教示されている。シリコンカーバイドホイスカー媒介式形質転換による、結実能力のある遺伝子導入トウモロコシ植物の製造は、参照として本明細書に組み込まれている、The plant Journal 6: 941-948に教示されており、またウイルス形質転換技術は、例えば、Meyer P、Heidmmm I & Niedenhof I (1992)に教示されている。植物用のベクター系としてのキャッサバモザイクウイルスの使用は、参照として本明細書に組み込まれている、Gene 110: 213-217に教示されている。植物の形質転換に関するさらなる教示は、参照として本明細書に組み込まれている、欧州特許第Ａ−０４４９３７５号明細書に見出され得る。
【０３２３】
さらなる態様では、本発明は、ｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトを担持するベクター系、及び植物等の生物のゲノムにベクター系を導入するステップに関する。ベクター系は、１つのベクターを含み得るが、２つのベクターを含んでもよい。２ベクターの場合、ベクター系は、バイナリーベクター系と通常呼ばれる。バイナリーベクター系は、参照として本明細書に組み込まれている、Gynheung Anetal, (1980), Binary Vectors, Plant Molecular Biology Manual A3, 1-19においてさらに詳細に記載されている。
【０３２４】
植物細胞を形質転換するために広範に採用されている１つの系は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスに由来するＴｉプラスミド、又はアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）に由来するＲｉプラスミドを使用する。参照として本明細書に組み込まれている、Anetal., (1986), Plant Physiol. 81, 301-305 and Butcher D. N. et al., (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, eds.: D. S. Ingrams and J.P. Helgeson, 203-208。植物を対象とした本発明による所望の外因性遺伝子導入法をそれぞれ実施した後、さらなるＤＮＡ配列の存在及び／又は挿入が必要となり得る。植物細胞を形質転換するためのＴ−ＤＮＡの使用について集中的に研究されており、参照として本明細書に組み込まれている、欧州特許第Ａ−１２０５１６号明細書; Hoekema, in: The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B. B., Amsterdam, 1985, Chapter V; Fraley, et al., Crit. Rev. Plant Sci., 4:1-46; and Anetal., EMBO J (1985) 4:277-284に記載されている。
【０３２５】
ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を阻害するｄｓＲＮＡ又はａｍｉＲＮＡを発現するｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトで変換された植物細胞は、必要な増殖因子、例えばアミノ酸、植物ホルモン、ビタミン等が供給された、適する培養培地内で細胞を培養すること等による周知の組織培養法に基づき増殖し、維持され得る。
【０３２６】
本発明に関連する用語「遺伝子導入植物」には、本発明によるｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトを含む任意の植物が含まれる。したがって、遺伝子導入植物は、本発明によるｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトで変換された植物である。好ましくは、遺伝子導入植物は、本発明によれば、ジテルペン合成遺伝子活性又は発現阻害、及びスクロースエステル含有量増加を示す。用語「遺伝子導入植物」は、本来の環境内にある天然型のヌクレオチドコーディング配列が、やはりその本来の環境内に存在するその天然のプロモーターの制御下に置かれているとき、それらの配列をカバーしない。
【０３２７】
１つの態様では、本発明によるｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクト、植物形質転換ベクター、又は植物細胞は、単離された形態である。用語「単離された」とは、配列が生来的に自然において付随し、また自然において見出されるような少なくとも１つのその他のコンポーネントから、配列が少なくとも実質的に遊離していることを意味する。
【０３２８】
１つの態様では、本発明によるｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクト、植物形質転換ベクター、又は植物細胞は、精製された形態である。用語「精製された」とは、比較的純粋な状態にある、例えば、少なくとも約９０％純粋、又は少なくとも約９５％純粋、又は少なくとも約９８％純粋であることを意味する。
【０３２９】
用語「ヌクレオチド配列」とは、本明細書で使用する場合、オリゴヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列、並びにそのバリアント、相同体、断片、及び誘導体（例えば、その一部分等）を指す。ヌクレオチド配列は、ゲノム起源又は合成起源又は組換え起源であり得、センス又はアンチセンスストランドに対応するしないに関わらず、二本鎖又は一本鎖であり得る。
【０３３０】
本発明に関連して、用語「ヌクレオチド配列」には、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及びＲＮＡが含まれる。好ましくは、該用語は、ＤＮＡ、より好ましくは本発明をコードするｃＤＮＡ配列を意味する。
【０３３１】
好ましい実施形態では、本発明と関係し、そして本発明の範囲そのものに含まれる場合のヌクレオチド配列、すなわちジテルペン合成遺伝子には、天然型のヌクレオチド配列がその本来の環境内にあり、そしてやはりその本来の環境内にあるその生来的に付随する配列（複数可）と連結されているときには、そのような天然型のヌクレオチド配列が含まれる。呼びやすくするために、この好ましい実施形態を「天然型のヌクレオチド配列」と呼ぶものとする。こうしたことから、用語「天然型のヌクレオチド配列」とは、その本来の環境内にあるヌクレオチド配列全体であって、やはりその本来の環境内にある生来的に付随するプロモーター全体と作動的に連結している場合におけるヌクレオチド配列全体を意味する。
【０３３２】
一般的に、本発明の範囲に含まれるＲＮＡｉ分子は、組換えＤＮＡ技術を使用して調製される（すなわち、組換えＤＮＡ）。但し、本発明の代替的実施形態では、ヌクレオチド配列は、当技術分野において周知の化学的方法を使用して全部又は一部について合成され得る（本明細書において参照として組み込まれているCaruthers MH et al., (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 and Horn T et al., (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232を参照）。
【０３３３】
本明細書で定義するようなジテルペン合成遺伝子として特別な特性を有するタンパク質、又は改変に適するタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、前記タンパク質を産生する任意の細胞又は生物から識別及び／又は単離及び／又は精製され得る。ヌクレオチド配列を識別及び／又は単離及び／又は精製するための様々な方法が、当技術分野において周知されている。例として、適する配列が識別及び／又は単離及び／又は精製されたら、ある１つの配列についてより多くを調製するＰＣＲ増幅技術が使用され得る。
【０３３４】
さらなる例として、ゲノムＤＮＡ及び／又はｃＤＮＡライブラリーが、酵素を産生する生物から得られる染色体ＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡを使用して構築され得る。酵素のアミノ酸配列が公知の場合には、標識されたオリゴヌクレオチドプローブが合成され、そして生物から調製されたゲノムライブラリーから、酵素をコードするクローンを識別するのに使用され得る。或いは、別の公知の酵素遺伝子と相同である配列を含有する標識されたオリゴヌクレオチドプローブが、酵素をコードするクローンを識別するのに使用される。後者の場合、ハイブリダイゼーション及び厳格性が低い洗浄条件が使用される。
【０３３５】
なおもさらなる代替形態では、酵素をコードするヌクレオチド配列が、確立された標準法、例えば参照として本明細書に組み込まれているBeucage S.L. et al., (1981) Tetrahedron Letters 22, p 1859-1869により記載されているホスホロアミダイト法、又は参照として本明細書に組み込まれている Matthesらの(1984) EMBO J. 3, p 801-805により記載される方法により合成的に調製され得る。ホスホロアミダイト法では、オリゴヌクレオチドが、例えば自動ＤＮＡ合成装置内で合成され、精製され、アニーリングされ、ふさわしいベクター内にライゲート及びクローン化される。
【０３３６】
本明細書で使用する場合、用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」、及び／又は用語「タンパク質」と同義である。いくつかの事例では、用語「アミノ酸配列」は、用語「ペプチド」と同義である。いくつかの事例では、用語「アミノ酸配列」は、用語「酵素」と同義である。
【０３３７】
本発明は、本明細書で定義する特別な特性を有するポリペプチドのアミノ酸配列（複数可）とある程度の配列同一性又は配列相同性を有する配列、又は任意のヌクレオチド配列、すなわちそのようなポリペプチドをコードするジテルペン合成遺伝子の使用も含む（以後「相同的配列（複数可）」と呼ぶ）。本明細書では、用語「相同的」とは、対象アミノ酸配列及び対象ヌクレオチド配列と所定の相同性を有する実体を意味する。本明細書では、用語「相同性」は、「同一性」に同じであり得る。
【０３３８】
相同的アミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列及び／又は断片は、機能的活性を保持し、及び／又はジテルペン合成遺伝子の活性を増強するポリペプチドを提供及び／又はコードすべきである。一般的に、相同的配列は、例えば対象アミノ酸配列と同一の活性部位等を含む、又は同一の活性部位をコードする。相同性は、類似性（すなわち、類似した化学特性／機能を有するアミノ酸残基）に関しても検討され得るが、本発明の文脈においては、配列同一性に関して相同性という表現を用いるのが好ましい。
【０３３９】
１つの実施形態では、相同的配列には、対象配列と比較して１又は複数の付加、欠損、及び／又は置換を有する、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列が含まれると考えられる。
【０３４０】
相同性、又は同一性の比較は、目視により、又はより一般的には、容易に入手可能な配列比較プログラムを用いて実施され得る。このような市販のコンピュータープログラムは、２又は３以上の配列の間の相同性の割合（％）を計算することができる。相同性の割合（％）又は同一性の割合（％）は、連続した配列について計算され得る、すなわち一方の配列が他方の配列とアラインメントされ、そして一方の配列内の各アミノ酸が他方の配列内の対応するアミノ酸と一度に１残基ずつ直接比較される。これは「非ギャップ」アラインメントと呼ばれる。一般的に、そのような非ギャップアラインメントは、残基数が比較的短い場合にのみ実施される。
【０３４１】
これは、非常に単純で、一貫性のある方法であるが、例えば、１つの挿入又は欠損以外は同一である配列の対において、それ以降のアミノ酸残基がアラインメントから排除される原因となり、したがってグローバルアラインメントを実施したときに、相同性の割合（％）の著しい低下を引き起こす可能性があるという点が考慮されない。したがって、ほとんどの配列比較法は、挿入及び欠損の可能性を考慮して、全体的な相同性スコアに対して不当にペナルティーを科さない最適なアラインメントを生成するように設計される。これは、局所的相同性を最大化させるように、配列アラインメント内に「ギャップ」を挿入することにより達成される。
【０３４２】
但し、このより複雑な方法は、同数の同一のアミノ酸について、ギャップができる限り少なくなるように配列アラインメントを行い、２つの比較される配列間においてより高い関連性を反映させることにより、多くのギャップを有するスコアよりも高いスコアを実現するように、アラインメント内に生ずる各ギャップに対して「ギャップペナルティー」を割り振る。ギャップの存在に対して比較的高いコスト、及びギャップ内の後続する各残基に対してより小さなペナルティーを科す「アフィンギャップコスト」が一般的に用いられる。これは、最も一般的に用いられるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティーにより、もちろん、ギャップがより少ない最適化されたアラインメントが得られる。ほとんどのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティーの修正を可能にする。但し、配列比較用にそのようなソフトウェアを用いる場合、デフォルト値を使用するのが好ましい。
【０３４３】
最大相同率（％）の計算は、したがってギャップペナルティーを考慮しつつ、最適なアラインメントの生成を最初に必要とする。そのようなアラインメントを実施するのに適するコンピュータープログラムは、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（Invitrogen Corp.社）である。配列比較を実施することができるソフトウェアの例として、例えば、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ausubel et al. 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed - Chapter 18を参照）、ＢＬＡＳＴ２（FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8 and tatiana@ncbi.nlm.nih.govを参照）、ＦＡＳＴＡ（Altschul et al. 1990 J. Mol. Biol. 403-410）、及びＡｌｉｇｎＸが挙げられるが、但しこれらに限定されない。少なくともＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２、及びＦＡＳＴＡが、オフライン及びオンラインサーチに利用可能である（Ausubel et al. 1999, pages 7-58 to 7-60を参照）。
【０３４４】
最終的な相同性の割合（％）は、同一性に関して測定可能であるが、アラインメントプロセスそのものは、一般的にオールオアナッシングの対比較に基づかない。むしろ、化学的類似性又は進化距離に基づき各ペアワイズ比較に対してスコアを割り振る、スケール化類似性スコアマトリックスが一般的に用いられる。一般的に用いられるそのようなマトリックスの例は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス−ＢＬＡＳＴパッケージプログラムのデフォルトマトリックスである。Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩプログラムは、パブリックデフォルト値、又は供給される場合にはカスタムシンボル比較表のいずれかを一般的に使用する（さらに詳しくは、ユーザーマニュアルを参照）。いくつかの用途では、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩパッケージ用のデフォルト値を使用するのが好ましい。
【０３４５】
或いは、相同性の割合（％）は、ＣＬＵＳＴＡＬに類似したアルゴリズムに基づき、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（Invitrogen Corp.社）内の複数のアラインメント特性を用いて計算され得る（Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237-244）ソフトウェアが最適なアラインメントを生成したら、相同性の割合（％）、好ましくは配列同一性の割合（％）を計算することが可能である。ソフトウェアは、一般的に配列比較の一環としてこの計算を行い、そして数値結果を生成する。
【０３４６】
配列同一性を決定するときに、ギャップペナルティーを使用する場合、好ましくは、ペアワイズアラインメント用として、下記のパラメーターが使用される：
【０３４７】
【表１】
0006965357.tif 000002
【０３４８】
【表２】
0006965357.tif 000003
【０３４９】
１つの実施形態では、ＣＬＵＳＴＡＬは、上記で定義されたギャップペナルティー及びギャップエクステンションセットと共に利用可能である。いくつかの実施形態では、ＢＬＡＳＴ又はＣＬＵＳＴＡＬアラインメントで用いられるギャップペナルティーは、これまでに詳記したギャップペナルティーとは異なる可能性がある。当業者は、ＢＬＡＳＴ及びＣＬＵＳＴＡＬアラインメントを実施するための標準パラメーターは定期的に変化し得るが、またＢＬＡＳＴ又はＣＬＵＳＴＡＬアラインメントアルゴリズムについて詳記された標準パラメーターに基づきしかるべきパラメーターを、その時に選択することができるものと認識する。
【０３５０】
好適には、ヌクレオチド配列に関して同一性の程度は、少なくとも２０個の連続したヌクレオチドにおいて、好ましくは少なくとも３０個の連続したヌクレオチドにおいて、好ましくは少なくとも４０個の連続したヌクレオチドにおいて、好ましくは少なくとも５０個の連続したヌクレオチドにおいて、好ましくは少なくとも６０個の連続したヌクレオチドにおいて、好ましくは少なくとも１００個の連続したヌクレオチドにおいて決定され、該ヌクレオチド配列は、ｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトをコードする。ヌクレオチド配列に関して同一性の程度は、少なくとも１０個の連続したヌクレオチドにおいて、好ましくは２０個の連続したヌクレオチド、好ましくは少なくとも３０個の連続したヌクレオチドにおいて、好ましくは少なくとも４０個の連続したヌクレオチドにおいて、好ましくは少なくとも５０個の連続したヌクレオチドにおいて、好ましくは少なくとも６０個の連続したヌクレオチドにおいて、好ましくは少なくとも１００個の連続したヌクレオチドにおいて決定される。
【０３５１】
好適には、ヌクレオチド配列に関する同一性の程度は、配列全体にわたり決定され得る。
【０３５２】
配列は、サイレント変化を引き起こし、機能的に同等の物質を生み出すアミノ酸残基の欠損、挿入、又は置換を有し得る。計画的なアミノ酸置換は、物質の二次的結合活性が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性における類似性に基づいてなし得る。例えば、負電荷を有するアミノ酸として、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる；正電荷を有するアミノ酸として、リジン及びアルギニンが挙げられる；並びに類似した親水性値を有する無荷電極性頭部基を備えるアミノ酸として、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、及びチロシンが挙げられる。
【０３５３】
保存的置換は、例えば、下記の表に基づきなし得る。第２の列の同一ブロック内、及び好ましくは第３の列の同一行内のアミノ酸は、相互に置換し得る：
【０３５４】
【表３】
0006965357.tif 000004
【０３５５】
本発明は、生じる可能性がある相同的置換（置換及び交換は、いずれも既存のアミノ酸残基と代替残基とが相互に交換することを意味するために本明細書で用いられる）、すなわち似た者同士の置換、例えば塩基性には塩基性、酸性には酸性、極性には極性等の置換も含む。１つのクラスの残基から別のクラスに、また或いは非天然のアミノ酸、例えばオルニチン（以後、Ｚと呼ぶ）、ジアミノ酪酸オルニチン（以後Ｂと呼ぶ）、ノルロイシンオルニチン（以後Ｏと呼ぶ）、ピリイルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン、及びフェニルグリシン等の組み込みを含め、相同的ではない置換も生じる可能性がある。
【０３５６】
交換は、非天然アミノ酸によってもなされる可能性があり、非天然アミノ酸として、アルファ＊及びアルファ−二置換型＊アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸＊、乳酸＊、天然アミノ酸のハロゲン化合物誘導体、例えばトリフルオロチロシン＊、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン＊、ｐ−Ｂｒ−フェニルアラニン＊、ｐ−Ｉ−フェニルアラニン＊、Ｌ−アリル−グリシン＊、β−アラニン＊、Ｌ−α−アミノ酪酸＊、Ｌ−γ−アミノ酪酸＊、Ｌ−α−アミノイソ酪酸＊、Ｌ−ε−アミノカプロン酸＃、７−アミノヘプタン酸＊、Ｌ−メチオニンスルホン＃＊、Ｌ−ノルロイシン＊、Ｌ−ノルバリン＊、ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン＊、Ｌ−ヒドロキシプロリン＃、Ｌ−チオプロリン＊、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）のメチル誘導体、例えば４−メチル−Ｐｈｅ＊、ペンタメチル−Ｐｈｅ＊等、Ｌ−Ｐｈｅ（４−アミノ）＃、Ｌ−Ｔｙｒ（メチル）＊、Ｌ−Ｐｈｅ（４−イソプロピル）＊、Ｌ−Ｔｉｃ（１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシル酸）＊、Ｌ−ジアミノプロピオン酸＃、及びＬ−Ｐｈｅ（４−ベンジル）＊が含まれる。＊の表記は上記考察のために（相同的又は相同的ではない置換に関連して）利用されており、誘導体の疎水的性質を表し、一方、＃は誘導体の親水性の性質を表し、＃＊は、両親媒性の特徴を表すのに利用されている。
【０３５７】
バリアントのアミノ酸配列は、アミノ酸スペーサー、例えばグリシン又はβ−アラニン残基等に付加して、アルキル基、例えば、メチル、エチル、又はプロピル基等を含む、配列内の任意の２つのアミノ酸残基の間に挿入され得る、好適なスペーサー基を含み得る。さらなる変化形態は、ペプトイド形態内の１又は２以上のアミノ酸残基の存在と関係し、当業者には十分に理解される。誤解を回避するために、α炭素置換基がα炭素ではなく残基の窒素原子上にあるようなバリアントのアミノ酸残基を指すのに「ペプトイド形態」が用いられる。ペプトイド形態のペプチドを調製する方法は、当技術分野、例えばSimon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371 and Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134において公知である。
【０３５８】
本発明で使用されるヌクレオチド配列は、合成ヌクレオチド又は改変されたヌクレオチドをその中に含み得る。オリゴヌクレオチドに対するいくつかの異なる種類の改変が当技術分野において公知である。これには、分子の３’及び／又は５’末端におけるメチルホスホネート及びホスホロチオエートバックボーン、及び／又はアクリジン若しくはポリリジン鎖の付加が含まれる。本発明の目的に照らせば、本明細書に記載するヌクレオチド配列は、当技術分野において利用可能な任意の方法により改変され得るものと理解される。そのような改変は、本発明のヌクレオチド配列のインビボでの活性又は寿命を増強するために実施され得る。
【０３５９】
本発明は、本発明の核酸配列に対して相補的な配列、又は本発明の配列若しくはそれと相補的な配列とハイブリダイズする能力を有する配列も含む。用語「ハイブリダイゼーション」は、本明細書で用いる場合、「核酸のストランドが塩基対形成を通じて、相補鎖と結合するプロセス」、並びにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術で実施されるような増幅プロセスが含まれるものとする。
【０３６０】
本発明は、本発明のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列とも関連する（本明細書に提示するヌクレオチド配列の相補的な配列を含む）。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、厳密な条件下で決定される（例えば、５０℃及び０．２×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａ３、ｐＨ７．０｝）。より好ましくは、ハイブリダイゼーションは、高度に厳密な条件下で決定される（例えば、６５℃及び０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａ３、ｐＨ７．０｝）。
【０３６１】
１つの態様では、本発明で使用される配列は合成配列−すなわち、インビトロでの化学的合成又は酵素的合成により調製された配列である。それには宿主生物に対する最適なコドン利用を用いて作製された配列が含まれるが、但しこれに限定されない。
【０３６２】
用語「発現ベクター」とは、インビボ又はインビトロで発現する能力を有するコンストラクトを意味する。１つの実施形態では、本発明のベクターはｄｓＲＮＡを発現する。１つの実施形態では、本発明のベクターはａｍｉＲＮＡを発現する。好ましくは、発現ベクターは、適する宿主生物のゲノムに組み込まれる。用語「組み込まれる」は、好ましくはゲノムへの安定な組込みをカバーする。
【０３６３】
本発明のヌクレオチド配列はベクター内に存在し得るが、該ベクター内では、該ヌクレオチド配列が適する宿主生物にヌクレオチド配列を発現させる能力を有する制御配列と作動可能に連結している。本発明で使用されるｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトは、本発明のポリペプチドの発現を実現するために、本明細書に記載するような適する宿主細胞に変換され得る。ベクター、例えばプラスミド、コスミド、又はファージベクターの選択は、それが導入される宿主細胞に多くの場合依存する。ベクターは、例えばＲＮＡ生成用としてインビトロで使用され得る、又は宿主細胞のトランスフェクト、変換、形質導入、若しくは感染用として使用され得る。
【０３６４】
したがって、さらなる実施形態では、本発明は、本発明のヌクレオチド配列を複製可能なベクターに導入し、該ベクターを適合性のある宿主細胞に導入し、そしてベクターの複製を引き起こす条件下で宿主細胞を増殖させることにより、本発明のヌクレオチド配列を作製する方法を提供する。ベクターは、対象となる宿主細胞内で該ベクターの複製を可能にするヌクレオチド配列をさらに含み得る。そのような配列の例として、プラスミドｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＡＭＢ１、及びｐＩＪ７０２の複製起点が挙げられる。
【０３６５】
いくつかの出願では、本発明で使用されるヌクレオチド配列は、選択された宿主細胞等にヌクレオチド配列を発現させる能力を有する制御配列と作動可能に連結している。例として、本発明は、そのような制御配列と作動可能に連結した本発明のヌクレオチド配列を含むベクターをカバーする、すなわちベクターは発現ベクターである。
【０３６６】
用語「作動可能に連結した」とは、記載されているコンポーネントが、その意図した方式でそれが機能するのを可能にする関係にあるような配置関係を意味する。コーディング配列と「作動可能に連結した」制御配列は、コーディング配列の発現が対照配列と適合性を有する条件下で実現するようにライゲートされる。
【０３６７】
用語「制御配列」には、プロモーター及びエンハンサー及びその他の発現制御シグナルが含まれる。用語「プロモーター」は、当技術分野の通常の意味合い、例えばＲＮＡポリメラーゼ結合部位で使用される。ｄｓＲＮＡ又はａｍｉＲＮＡをコードするｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクト内のヌクレオチド配列は、少なくともプロモーターと作動可能に連結し得る。
【０３６８】
用語「コンストラクト」は、「カセット」又は「ベクター」等の用語と同義であり、それには、プロモーターと直接的又は間接的に連結した、本発明に基づき使用されるヌクレオチド配列が含まれる。
【０３６９】
間接的な連結の例として、適するスペーサー基、例えばプロモーターと本発明のヌクレオチド配列の中間に位置する、Ｓｈ１−イントロン又はＡＤＨイントロン等のイントロン配列の提供が挙げられる。同じことは、直接的又は間接的な連結を含む本発明と関連して、用語「融合した」についてもいえる。いくつかのケースでは、該用語は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が野生型遺伝子プロモーターと通常通りに付随している天然の組合せであって、それらが両方共にその本来の環境内にある場合の組合せをカバーしない。ｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトは、遺伝子コンストラクトの選択を可能にするマーカーさえも含有する又は発現する場合がある。
【０３７０】
植物を形質転換するのに使用される一般的な技術のレビューは、参照として本明細書に組み込まれているPotrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225)、及びChristou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)による文献に見出され得る。植物の形質転換に関するさらなる教示は、参照として本明細書に組み込まれている欧州特許第Ａ−０４４９３７５号に見出され得る。
【０３７１】
別途規定しない限り、本明細書で用いるすべての技術的及び科学的用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般的に理解される意味と同一の意味を有する。Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, New York (1994)、及びHale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991)は、本開示で使用される用語の多くについて、当業者に一般的なディクショナリーを提供する。
【０３７２】
本開示は、本明細書に開示する例示的な方法及び材料に限定されず、また本明細書に記載するものと類似した又は同等のあらゆる方法及び材料は、本開示の実施形態を実践又は試験するのに利用可能である。数値の範囲には、範囲を規定する数字も含まれる。別途明示しない限り、核酸配列はいずれも、左から右に５’→３’の向きで記載されており、アミノ酸配列は、左から右にアミノ基→カルボキシ基の向きでそれぞれ記載されている。
【０３７３】
本明細書に提示される表題は、本明細書を全体的に参照することにより理解され得る本開示の様々な態様又は実施形態を限定するものではない。したがって、直下で定義する用語は、本明細書を全体的に参照することにより、さらに完全に定義される。
【０３７４】
アミノ酸は、本明細書ではアミノ酸の名称、３文字略号、又は１文字略号を用いて表される。用語「タンパク質」には、本明細書で用いる場合、タンパク質、ポリペプチド、及びペプチドが含まれる。本明細書で用いる場合、用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」及び／又は用語「タンパク質」と同義である。いくつかの事例では、用語「アミノ酸配列」は、用語「ペプチド」と同義である。いくつかの事例では、用語「アミノ酸配列」は、用語「酵素」と同義である。
【０３７５】
用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、本明細書では交換可能に用いられる。本開示及び特許請求の範囲では、アミノ酸残基について、従来方式の１文字及び３文字コードが使用され得る。アミノ酸の３文字コードは、ＩＵＰＡＣＩＵＢ生化学命名法に関する合同委員会（ＪＣＢＮ，Joint Commission on Biochemical Nomenclature）に準拠して規定される通りである。またポリペプチドは、遺伝子コードの縮重に起因して、１を超えるヌクレオチド配列によりコードされ得るものとやはり理解される。
【０３７６】
用語のその他の定義も、本明細書全体を通じて提示され得る。例示的な実施形態がより詳細に記載する前に、本開示は、記載されている特定の実施形態に限定されない、したがって、当然ながら変化する可能性もあると理解される。また、本明細書で用いる用語は、特定の実施形態を記載する目的に限定され、そして本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるので、制限するようには意図されないものとやはり理解される。
【０３７７】
ある範囲の値が提示される場合、その内容について別途明確な指示がない限り、下限の単位の１０分の１まで、当該範囲の上限及び下限の間の中間的な値それぞれも特に開示されるものと理解される。記載された任意の値の間のより狭い範囲のそれぞれ、又は記載された範囲内の中間的な値、及び当該記載された範囲内の任意のその他の記載された値、又は中間的な値は本開示に含まれる。これらのより狭い範囲の上限及び下限は、該範囲に独立して含まれる又はそれから除外され得る、並びにいずれか一方若しくは両方の限界がより狭い範囲に含まれる、又はそのいずれも含まれない場合の各範囲も本開示に含まれ、記載された範囲内において、特に除外された任意の限界が設けられる。一方又は両方の限界が、記載された範囲に含まれる場合、そのような含まれる限界の一方又は両方を除いた範囲も本開示に含まれる。
【０３７８】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いる場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、その内容について別途明確な指示がない限り、複数形の指示物が含まれることに留意しなければならない。したがって、例えば、「酵素」又は「硝酸レダクターゼ」を指す場合、それには、複数のそのような候補薬剤、及び当業者にとって公知のその同等物等が含まれる。
【０３７９】
本明細書で議論される公開資料は、本出願の出願日に先立つそれらの開示のためにもっぱら提供される。本明細書内のいずれも、そのような公開資料が、本明細書に添付される特許請求の範囲に対する先行技術に該当するとした承認として解釈されない。
【０３８０】
長所
有利には、ジテルペン合成遺伝子の活性又は発現を阻害すれば、タバコ植物のスクロースエステル含有量が増加する。理論に拘泥するものではないが、ジテルペン形成のための炭素利用が低下すれば、スクロースエステルの生成が強化されると考えられる。有利には、本発明の方法は、高バイオマス植物である好ましい「トルコ風」の化学的性質を有するタバコ植物の生産を可能にする。有利には、本発明は、望ましいタバコ煙の化学的性質及び非燃焼加熱式製品に有用な化学的性質を提供する。本発明は、下記の図及び実施例を参照しながら、例示目的に限定して以下に記載される。
［実施例］
【実施例１】
【０３８１】
遺伝子導入コンストラクト、ＧＷ１、ＧＷ２、ＧＷ３、ＧＷ５の調製
本発明者らは、転写後遺伝子サイレンシング戦略（ＰＴＧＳ，posttranscriptional gene silencing strategy）を使用して、植物トリコームの二次代謝を精査し、トリコーム発現遺伝子がスクロースエステル含有量に及ぼす効果を評価する試みを行った。シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）、ＣＢＴｏｌシクラーゼ、及びテルペンシンターゼ３−８の機能を、ＲＮＡｉを使用して評価した。コンストラクトを調製し、植物を再生する方法は、従来の分子クローニング技術（Sambrook et al. 1989 Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）と共に、Wang及びWagner（2003年）（前出、参照として本明細書に組み込まれている）に詳細に記載されている。
【０３８２】
遺伝子導入コンストラクトＧＷ１−シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）の発現を阻害する
このｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトを、シクラーゼ２遺伝子（ＣＹＣ２）に基づいて設計した。ＣＹＣ２のｍＲＮＡの完全コーディング配列は、ＡＦ４０１２３４として注釈付けされている。ゲノム配列は、ＡＹ４９５６９４として注釈付けされている。ＧＷ１植物を作り出すのに使用されるコンストラクトは次のように構成される：５’→３’の順番で、配列ＡＦ４０１２３４に由来する５４番〜７１６番ヌクレオチドから得られるセンス断片；ヘアピンループとして部分的なＧＵＳ  Ａ断片（７８７番〜１８１２番ヌクレオチド）、但しＧＵＳ  Ａの注釈番号はＡＦ５０２１２８である；及びＣＹＣ２センス断片の逆相補鎖。該コンストラクトは、ＣＹＣ２  ｍＲＮＡ（ＡＦ４０１２３４）に由来するヌクレオチド５４〜７１６をセンス方向で含む。この配列は、ゲノム配列（ＡＹ４９５６９４）に由来するヌクレオチド位置に対応する：ヌクレオチド１〜２５、ヌクレオチド２６〜２７１（エクソン１）、ヌクレオチド１２５３〜１５２９（エクソン２）、及び３番エクソンの最初から１１５個のヌクレオチド（ヌクレオチド２３６６〜２４８０）。プラスミドpKYLX71-35S2は、遺伝子コンストラクトで使用されるバイナリーベクターであった（Wangら（2001）、前出、参照として本明細書に組み込まれている）。ＧＷ１コンストラクトインサートの配列を、配列番号５に定める。
【０３８３】
遺伝子導入コンストラクトＧＷ２−テルペンシンターゼ３−８遺伝子の発現を阻害する
このｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトを、ｍｉＲＮＡ１６８一次転写物（ＥＵ５４９０５５．１；ＧＩ：１７１１９５３９８）（５’−１２７〜５３５−３’）に基づいて設計したが、その場合、１９６〜２１６を、オリジナルの配列（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＹ５２８６４５、配列番号３に示すヌクレオチド位置に対応する）に対して逆相補のヌクレオチド１４９７からの２１個のヌクレオチドと置換し、そしてヌクレオチド２７９〜２９９を、フォワード方向のオリジナル鎖からの２１個のヌクレオチドと置換したが、但しエリア１４９７〜１５１７を使用したときには、３つの塩基が改変された。５’−HindIII、及び３’−EcoRI制限部位に隣接するモジュール延長部を２Ｘ３５Ｓプロモーター及び３５Ｓターミネーターの間に挿入した。２Ｘ３５Ｓ  ｐｒｏｍ−ｍｉＲＮＡｉ３−８及び３５Ｓターミネーターを含有した延長モジュールを、バイナリーベクターｐＣＡＭＢＩＡ２３００の複数のクローニング部位（ＭＣＳ，multiple cloning site）に導入した。組換えベクター（ＫｍＲ）を、Ａ．ツメファシエンス、ＧＶ３１０１（ＲｉｆＲ、ＧｍＲ）に挿入した。コロニーを三種抗生物質（Ｋｍ、Ｒｉｆ、Ｇｅｎ）上で選択した。アグロバクテリウム形質転換は、プラスミドＰＣＲにより確認した。ＧＷ２コンストラクトインサートの配列を配列番号７に定める。
【０３８４】
遺伝子導入コンストラクトＧＷ３−ＣＢＴｏｌシクラーゼ遺伝子の発現を阻害する
このｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトを、Ｎ．タバカムのシクラーゼ遺伝子（ＡＹ０４９０９０）に基づいて設計した。この二本鎖ＲＮＡｉモジュールを下記の方法で構築した：Ｎ．タバカムのシクラーゼ遺伝子（ＡＹ０４９０９０）に由来する部分的な配列（部分的なエクソン４、完全なイントロン４、エクソン５、イントロン５、エクソン６、イントロン６、及び部分的なエクソン７からなる、フォワード及びリバース方向での配列番号１の５’−２８５４〜４１７５−３’）。フォワードストレッチとリバースストレッチの間のスペーサーは、部分的なＧＵＳ  Ａ遺伝子（５’−７８６〜１８１６−３’）であった。プラスミドpCAMBIA2300は、この遺伝子コンストラクトで使用されるバイナリーベクターであった。ＧＷ３コンストラクトインサートの配列を配列番号６に定める。
【０３８５】
遺伝子導入コンストラクトＧＷ５−テルペンシンターゼ３−８遺伝子の発現を阻害する
このｄｄＲＮＡｉ  ＤＮＡコンストラクトを、ｍｉＲＮＡ１６８一次転写物（ＥＵ５４９０５５．１；ＧＩ：１７１１９５３９８）（５’−１２７〜５３５−３’）に基づいて設計したが、その場合、１９６〜２１６を、オリジナルの配列（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＹ５２８６４５、配列番号３に示すヌクレオチド位置に対応する）に対して逆相補のヌクレオチド８８４からの２１個のヌクレオチドと置換し、そしてヌクレオチド２７９〜２９９を、フォワード方向のオリジナルの鎖からの２１個のヌクレオチドと置換したが、但しエリア８８４〜９０４を使用したとき、センス鎖の４塩基を改変した。５’−HindIII、及び３’−EcoRI制限部位に隣接するモジュール延長部を、２Ｘ３５Ｓプロモーターと３５Ｓターミネーターの間に挿入した。２Ｘ３５Ｓ  ｐｒｏｍ−ｍｉＲＮＡｉ３−８及び３５Ｓターミネーターを含有した延長モジュールをバイナリーベクターｐＣＡＭＢＩＡ２３００の複数のクローニング部位（ＭＣＳ）に導入した。組換えベクター（ＫｍＲ）を、Ａ．ツメファシエンス、ＧＶ３１０１（ＲｉｆＲ、ＧｍＲ）に挿入した。コロニーを三種抗生物質（Ｋｍ、Ｒｉｆ、Ｇｅｎ）上で選択した。アグロバクテリウム形質転換は、プラスミドＰＣＲにより確認した。ＧＷ５コンストラクトインサートの配列を配列番号１１に定める。
【実施例２】
【０３８６】
Ｔ．Ｉ．１０６８のＡｇｒｏ形質転換及び再生
Ｎ．タバカムのＴ．Ｉ．１０６８種子を、ＫＴＲＤＣ種子コレクションから取得し、そして表面を７０％ＥｔＯＨ、１分間、次に５％（ｖ／ｖ）Ｃｈｌｏｒｏｘで滅菌処理し、そして次に滅菌水で３回洗浄した。植物を、ＰＬＡＮＴＣＯＮ（登録商標）容器（MP Biomedicals社、ＬＬＣ）内、インビトロで生育させ、そして形質転換用の外植片ストックとして使用した。すべてのコンストラクトをアグロバクテリウム媒介式の形質転換によりタバコ栽培品種Ｔ．Ｉ．１０６８に導入し、そして導入遺伝子の存在は、ＰＣＲにより確認した。Ａ．ツメファシエンス形質転換を、一部改変して参照として本明細書に組み込まれている、Horschらが記載するHorsch RB, Fry JE, Hoffmann NL, Eichholtz D, Rogers SG, Fraley RT (1985) Science 227:1229-1231に従い本質的に実施した。アグロバクテリウムを、５０ｍｇ／ｌのＫｍ、５０ｍｇ／ｌのＲｉｆ、及び３５ｍｇ／ｌのＧｍを含有するＬＢ培地上、オーバーナイトで生育させた（ＧＷ１、ＧＷ２）。ＧＷ３では、ＫｍをＨｙｇ（５５ｍｇ／ｌ）に置換した。
【０３８７】
無菌生育植物（４５日齢）から得たカットされた葉の小片（１ｃｍ２）を、細菌（１×１０８ｃｆｕ／ｍｌ）を用いて暗光、２日間イノキュレーションし、次にブロッティング乾燥し、そしてＧａｍｂｏｒｇ  Ｂ−５ビタミン（Sigma-Aldrich Co. LTD社、Ｉｒｖｉｎｅ、英国）、３％スクロース、１ｍｇ／ｌのＢＡＰ、並びに２００ｍｇ／ｌのＫｍ（又はＧＷ３では５５ｍｇ／ｌのＨｙｇ）、及び４００ｍｇ／ｌのセフォタキシムが補充された０．０５ｍｇ／ｌのＮＡＡが補充されたＭＳ培地に移した。約１カ月後、小片の端部において小植物体を形成し、そして同一の培地上で１回継代した後、小植物体を、同一の、但しホルモンが除去され、抗生物質は半分に低下した培地に移した。発根した植物を、生育室内の施肥されたPro-Mix（Premier Horticulture Inc.社、カナダ）に移した。個々の形質転換体をＧＣ−ＭＳにより分析し、そして望ましい変化を有する形質転換体を、Ｔ１世代のさらなる分析用として自己播種した。
【実施例３】
【０３８８】
屋外栽培対照と遺伝子導入系統の未乾燥葉分析
屋外テスト用の各系統の調製及び屋外テストデザイン
Ｔ３又はＴ２植物の自家受粉から生成した系統ＧＷ１及びＧＷ２から得た種子を表面滅菌処理し、そしてＧａｍｂｏｒｇ  Ｂ−５ビタミン（Sigma-Aldrich Co. LTD社、Ｉｒｖｉｎｅ、英国）、３％のスクロース、及びＫｍ（２００ｍｇ／ｌ）が補充されたＭＳ培地上、インビトロで発芽させた。ＧＷ３種子を、表面滅菌処理し、そしてＨｙｇ（５５ｍｇ／ｌ）を含有した培地上で発芽させた。１カ月後、小植物体を、温室内のフロートトレイ（施肥されたPro-Mix（Premier Horticulture Inc.社、カナダ）に移し、そして屋外に移植する前７〜８週間生育させた。標準的な屋外実践法を使用し、また必要に応じて潅注を使用した。熱風及び空気乾燥物（バーレイ種の場合）の採取及び収集をほぼ４．５カ月後に完了した。熱風乾燥ステップには下記事項が含まれた：８５〜１００°Ｆ、９４％ＲＨでの４８時間着色；１００〜１２０°Ｆ、５４％ＲＨでの２４時間予乾；１２０〜１３５°Ｆ、４０％ＲＨでの３０時間葉乾燥；１３５〜１６８°Ｆ、２２％ＲＨでの４０時間茎乾燥。
【０３８９】
ＧＣ−ＭＳによるＴＭＳ誘導体としての滲出物コンポーネントの測定
未乾燥葉測定では、２枚のリーフディスク（直径２ｃｍ）を、各植物の中位葉の葉層中間部からカットした。ディスクを、アセトニトリル（５ｍｌ）で３０秒間洗浄した。洗浄物を真空ローターエバポレーションにより濃縮して、油性の残留物を得た。Seversonら（1985）（前出、参照として本明細書に組み込まれている）の記載に本質的に従い、以下のように残留物を誘導体化してトリメチルシリル（ＴＭＳ）エステルを形成した：アセトニトリル洗浄物を蒸発乾燥させ、１ｍｌのＣＨＣｌ３に溶解し、１．５ｍｌのＧＣバイアルに移し、そして４０℃、Ｎ２流下で乾燥させた。誘導体化したサンプルを１ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、そして５０μｌのビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセタミド（ＢＳＴＦＡ，[bis(trimethylsilyl) trifluoroacetamide]）、及び内部標準センブレンとして２４μｇのセンブレンを各バイアルに添加した。サンプルを７０℃で４５分間誘導体化し、室温まで冷却し、そして分析した。
【０３９０】
ＴＭＳ誘導体を、フィルム厚０．２５μｍ及び直径０．２５ｍｍの３０．０ｍ  Ａｇｉｌｅｎｔキャピラリーカラム１９０９１Ｊ−４１３を使用して、ＧＣ−ＭＳ（ＨＰ５９７３ＭＳ及び自動サンプルラーインジェクターを備えたＨＰ６８９０  ＧＣ）により分離及び分析した。ヘリウムがキャリヤガスであり、その流量は１．８ｍｌ／分で一定であり、また注入温度は２５０℃であった。ＴＭＳエステル誘導体を測定するためのオーブンプログラムは以下の通りであった：初期温度１８０℃、２．０分間；２８０℃まで１分当たり８℃の速度、保持時間９．５分。総ランタイムは２４．０分であった。溶出した化合物を、そのリテンションタイムにより、及びＭＳプロファイルを標準と比較することにより同定した。ジテルペノイドは、シス−アビエノール〜βＣＢＴ−ジオールにつき６〜８分；ジテルペノイド酸化生成物につき８〜１３．５分；スクロースエステルにつき１７〜２２．５分において溶出した。熱風及び空気乾燥した組織のコンポーネント測定では、代表的な葉の６．１４×６．１４ｃｍの小片（未乾燥組織のリーフディスク、１２枚と同等）を乾燥組織からカットし、そしてアセトニトリルで洗浄した。未乾燥葉分析で使用した葉と同一の葉を使用して、空気及び熱風乾燥物について、１系統及び１対照当たり１０〜１６個の複製サンプルを調製した（リーフパンチ）。ＴＭＳ誘導体としての化学分析用サンプルの調製は上記の通りであったが、またスクロースエステルのアシル基については下記の通りであった。
【０３９１】
すべての化合物及び内部標準について積分したピーク面積を記録し、そしてそれぞれの相対的な量を全体に占める割合（％）として計算した。スクロースエステルタイプの非常に多くのピークについて、それを１つにまとめて総ピーク面積とした。
【０３９２】
１植物当たりの平均葉数、１植物当たりの葉の未乾燥重量（green weight）、及び対照と遺伝子導入系統の１植物当たりの総滲出物重量を、下記の表１に示す。データは、摘花後１９日目において、系統毎に３つの植物を平均したものである（摘花とはタバコの花の除去を指す）。
【０３９３】
コンストラクトＧＷ２及びＧＷ５（Ｔ０）、及びそのＴ１及びＴ２世代に関するＧＣ−ＭＳの結果は同一であった；いずれもラブデンジオールが非常に高く、そしてＣＢＴ−ジオールとシス−アビエノールが低かった。冗長性を回避するために、コンストラクトＧＷ２のみを使用して屋外作業を実施した。
【０３９４】
【表４】
0006965357.tif 000005
【０３９５】
表１は、１植物当たりの平均葉数、１植物当たりの葉の未乾燥重量がテストした遺伝子導入系統間で類似していたこと、及び対照植物と類似していたことを示す。
【０３９６】
屋外栽培した対照と遺伝子導入系統の未乾燥葉分析
未乾燥葉滲出物化学分析を摘花直後に実施し、そして各系統において屋外における滲出物の化学的性質は温室内の植物に認められたものと類似していたこと、及び化学的性質における植物間の変動は、屋外における対照及び各系統について約２５〜３０％であったことが明らかとなった（図３を参照）。グラフ上の各ポイントは、１つの植物からのデータを表す。図３に提示するデータは、下記事項を示している：
・系統ＧＷ１及びＧＷ３ではシス−アビエノールが増えている
・系統ＧＷ２では、ラブデンジオールが増えている
【０３９７】
スクロースエステルアシル組成の測定
使用した方法は、Seversonら（1985）（前出、参照として本明細書に組み込まれている）の方法から改変されている。３０ｍｌのＣｏｒｅｘガラスチューブ内のガムサンプル、５〜１０ｍｇに対してＫＯＨ（１Ｍ）を含む８０％のＭｅＯＨ、０．５ｍｌを添加し、そして２２℃、オーバーナイトで放置して鹸化する。サンプルを次にＮ２下で乾燥し、その後にｎ−ＢｕＯＨ、１ｍｌ及び濃Ｈ２ＳＯ４、３滴を添加した。サンプルを次に１１０℃で１時間加熱し、その後コンポーネントをパルス式ボルテックスミキサー（それぞれ１０パルス、１．５秒）を使用してヘキサンと水の間（各１．５ｍｌ）で分配する。６〜７回の抽出を行った（水相がリトマス試験紙で中性となるまで）。水相は、Ｋ２ＳＯ４、Ｈ２ＳＯ４、及び糖を含有し、そしてヘキサン相は、アシル基のブチルエステルを含む。ヘキサンを１．５ｍｌのＧＣバイアルに移し、そして同一のカラムを使用してＧＣ−ＭＳにより分析する（ＴＭＳの場合も同様）。ヘリウムがキャリヤガスであり、その流量は１．８ｍｌ／分で一定であり、また注入温度は２５０℃であった。ブチルエステル誘導体を測定するためのオーブンプログラムは以下の通りであった：初期温度９０℃、３．０分間；１６０℃まで１分当たり３℃の速度、保持時間２分、２５０℃まで１分当たり１５℃の速度、保持時間５分。総ランタイムは３９．３３分であった。
【０３９８】
図４のデータは、対照と比較したとき、系統ＧＷ１及びＧＷ３（シス−アビエノールを多く含む）もまたスクロースエステル収率の増強を示すことを明確に示している。グラフ上の各ポイントは１つの植物からのデータを表す。アシル組成は不変であり、したがってこのような系統は、高レベルのシス−アビエノール及び高い３−メチル吉草酸前駆体が存在するという点においてトルコタバコ又はオリエンタルタバコと類似しているが、しかし有利なことに、それらは比較的高バイオマスの植物により産生される。
【０３９９】
図４は下記事項を示している：
・高シス−アビエノール系統（ＧＷ１及びＧＷ３）では、対照に対してスクロースエステルが大幅に増えている。
・ＧＷ２系統（高ラブデンジオール）では、スクロースエステルも上昇した。
【実施例４】
【０４００】
未乾燥対熱風乾燥した屋外タバコ、並びに未乾燥対空気乾燥したタバコにおける滲出物コンポーネント
ＲＮＡｉ系統を屋外で生育させ、Ｔ２又はＴ３について特性は安定であった。熱風及び空気乾燥物（バーレイ種の場合）の採取及び収集をほぼ４．５カ月後に完了した。熱風乾燥ステップには実施例３に記載するように下記事項が含まれた：８５〜１００°Ｆ、９４％ＲＨでの４８時間着色；１００〜１２０°Ｆ、５４％ＲＨでの２４時間予乾；１２０〜１３５°Ｆ、４０％ＲＨでの３０時間葉乾燥；１３５〜１６８°Ｆ、２２％ＲＨでの４０時間茎乾燥。
【０４０１】
表面積に基づいて滲出物コンポーネントを再計算するのに、図３及び図４で作成したＴＭＳクロマトグラムと同一のクロマトグラムを使用し、表２及び表３にμｇ／ｃｍ２として表す（未乾燥対熱風乾燥物、及び未乾燥対空気乾燥物）。計算は、既知量の内部標準センブレンとの比較に基づき、ピーク応答はすべての化合物について同一であると仮定した。表２に示す化合物量は、対照について２０個の未乾燥植物、並びに系統ＧＷ１〜３について３４〜３６個の未乾燥植物及び１０〜１４個の乾燥した植物の平均値±それらの各標準偏差、を表わす。
【０４０２】
【表５】
0006965357.tif 000006
【０４０３】
表２に示すデータは、熱風乾燥しても、対照植物のスクロースエステル滲出物コンポーネントは増加しないが、コンストラクトＧＷ１、ＧＷ２、又はＧＷ３を含む遺伝子導入植物のスクロースエステル含有量は確かに増加することを示している。熱風乾燥は、コンストラクトＧＷ１、ＧＷ２、又はＧＷ３を含む遺伝子導入植物のＬＤ含有量も増加させた。熱風乾燥は、すべてのタバコのシス−アビエノール含有量を増加させた。
【０４０４】
データは、熱風乾燥は、未乾燥タバコと比較して、ＧＷ２遺伝子導入植物の滲出物コンポーネントのα−ＣＢＴ−ジオール含有量を増加させることを示している。対照植物のα−ＣＢＴ−ジオール含有量は、熱風乾燥によっても増加するが、その程度はより小さい。データは、熱風乾燥は、未乾燥タバコと比較して、ＧＷ２遺伝子導入植物の滲出物コンポーネントのβ−ＣＢＴ−ジオール含有量を増加させることも示している。対照植物のβ−ＣＢＴ−ジオール含有量は、熱風乾燥により影響を受けない。
【０４０５】
酸化生成物が遺伝子導入系統で増加した。
【０４０６】
表３（下記）に示す化合物量は、対照について平均２０個の未乾燥植物、並びに系統ＧＷ１〜３について３４〜３６個の未乾燥植物及び８〜１６個の乾燥した植物の平均値±それらの各標準偏差を表わす。
【０４０７】
下記の表３に示すデータは、空気乾燥は対照植物のスクロースエステル滲出物コンポーネントを増加させないが、しかし、コンストラクトＧＷ１、ＧＷ２、又はＧＷ３を含む遺伝子導入植物のスクロースエステル含有量をわずかながら確かに増加させることを示している。スクロースエステル含有量は、遺伝子導入系統において空気乾燥しても安定である。データは、熱風乾燥は、未乾燥タバコと比較して、ＧＷ２遺伝子導入植物の滲出物コンポーネントのα−ＣＢＴ−ジオール含有量（遺伝子導入物内のマイナーなコンポーネントである）を増加させることも示している。対照植物のα−ＣＢＴ−ジオール含有量は、熱風乾燥により影響を受けない。
【０４０８】
データは、空気乾燥は、未乾燥タバコと比較して、ＧＷ２遺伝子導入植物の滲出物コンポーネントのβ−ＣＢＴ−ジオール含有量を増加させることを示している。対照植物のβ−ＣＢＴ−ジオール含有量も熱風乾燥によりやはり増加するが、しかしその程度はより少ない。空気乾燥は、コンストラクトＧＷ１、ＧＷ２、又はＧＷ３を含む遺伝子導入植物のＬＤ含有量も増加させた。空気乾燥は、対照及びＧＷ１又はＧＷ３を含むタバコのシス−アビエノール含有量も増加させた。
【０４０９】
酸化生成物が遺伝子導入系統で増加した。
【０４１０】
【表６】
0006965357.tif 000007
【実施例５】
【０４１１】
ジテルペノイド組成及びスクロースエステルのアシル組成の分析
ジテルペノイド組成及びスクロースエステルアシル組成を、実施例３に記載するように測定した。本発明者らは、遺伝子導入系統内のジテルペノイド組成とスクロースエステル組成を、対照のＴ．Ｉ．１０６８、及び天日乾燥したトルコタイプの市販タバコと比較した。天日乾燥した市販タバコは、プレスされた葉として本発明者らに送付された。遺伝子導入タバコ系統について示すデータは、１０〜１４個の間の植物の平均値を示す一方、Ｔ．Ｉ．１０６８対照は１６個の植物における平均値を示す。
【０４１２】
下記の市販トルコタイプを比較分析した：
Ａ＝オリエンタル、供給業者：Socotab EOOD社、２０１３年の収穫品
Ｂ＝トルコ−Ｓａｍｓｕｎ、２０１３年の収穫品、ＳＭＡＬグレード
Ｃ＝トルコ−ＩＸＭＩＲ、２０１３年の収穫品、ＹＺＡＬグレード
【０４１３】
表４  ジテルペノイド含有物の滲出物組成分析を参照。
表４（下記）のデータは、熱風乾燥した遺伝子導入系統ＧＷ１、ＧＷ２、及びＧＷ３は、対照及び／又は試験したトルコ植物と比較して、スクロースエステル含有量が高いことを示している。
【０４１４】
表５  スクロースエステルアシル基組成の滲出物組成分析を参照。
遺伝子導入タバコ系統について示すデータは、４〜８個の間の植物の平均値を示す一方、Ｔ．Ｉ．１０６８対照は１０個の植物における平均値を示す。表５（下記）のデータは、遺伝子導入タバコ系統ＧＷ１、ＧＷ２、及びＧＷ３のスクロースエステルアシル組成は、トルコタイプタバコの組成と類似している、すなわち３−Ｍｅバレリックアシル基に富んでいることを示す。
【０４１５】
【表７】
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【０４１６】
【表８】
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【実施例６】
【０４１７】
ＧＷ３表面化学分析
未乾燥屋外サンプル、空気乾燥したサンプル、及び熱風乾燥したサンプルの分析を実施した。可能であれば、リーフパンチを採集して未乾燥屋外データを得る場合、屋外で葉のマーキング及びナンバリングすることにより、同一の葉に由来するサンプルにおいてすべて実施した。空気又は熱風乾燥後、未乾燥／空気乾燥物及び未乾燥／熱風乾燥物が直接比較可能なように、同一の番号が付された葉をサンプリングした。下記の表は、未乾燥サンプル対熱風乾燥サンプル、及び未乾燥サンプル対空気乾燥サンプルの結果を示す。データは、葉１ｃｍ２当たりのマイクログラムに標準化された。
【０４１８】
【表９】
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【０４１９】
未乾燥、又は熱風乾燥物、又は空気乾燥物の後のカッコ内の数値は、どのくらいの数の独立したサンプルを分析し、そして平均値を導出するのに使用したかを表わす。例えば、対照の未乾燥（２０）とは２０個の独立したサンプルを意味する。これらの平均値は、その下の標準偏差と共に提示される、例えば、対照の未乾燥（２）の場合、６．６９５±３．８３４。
【０４２０】
未乾燥〜熱風乾燥物のデータは、対照及びＧＷ３−高シス−アビエノールの各系統に関する。このデータは、シス−アビエノールは未乾燥〜熱風乾燥において大幅に減少し、このシスは、ＧＷ３−高シス−アビエノール系統について最も右側のカラムに示すように、ある「酸化生成物」に分解した可能性があることを示している。このデータは、ＧＷ３の未乾燥〜熱風乾燥物においてラブデンジオールが増加したことも示している。この変化は比例的であり、例えば未乾燥〜熱風乾燥においてシスが低下したとき（μｇ／ｃｍ２）、ラブデンジオールは比例的に増加した。ＧＷ３の未乾燥〜熱風乾燥において、「酸化型」のカラムの数値も実質的に増加したことに留意すること。さらに、ＣＢＴジオールは、未乾燥〜熱風乾燥において大幅に変化せず、またスクロースエステル量は、対照の未乾燥〜熱風において大幅に変化しなかった；一方、ＧＷ３系統では有意に増加した（＋４．７）。別の分析（図示せず）では、スクロースエステルが安定であることから予想されるように、未乾燥〜熱風乾燥においてアシル基組成の定性的な変化は認められないことが示唆された。未乾燥〜空気乾燥のデータは、未乾燥〜空気乾燥における変化は、未乾燥〜熱風乾燥で観測された変化よりも小さいことを示している。酸化型のみが、おそらくはシス−アビエノール分解に起因して実質的に増加しているように見えた。
【０４２１】
図５は、スクロースエステル含有量は、対照と比較して、遺伝子導入系統ＧＷ−３内で増えたことを実証する。スクロースエステル含有量は、総主要滲出化合物に占める割合（％）として表わされる。図６は、シス−アビエノール含有量は、対照と比較して、遺伝子導入系統ＧＷ−３内で増えたことを実証する。シス−アビエノール含有量は、総主要滲出化合物に占める割合（％）として表わされる。
【実施例７】
【０４２２】
熱風乾燥及び空気乾燥した２０１６年の屋外タバコの滲出物コンポーネント
ＲＮＡｉ系統を屋外で生育させ、Ｔ２又はＴ３について特性は安定であり、これを採取した。熱風乾燥した植物を、２０１６年に３回のプライミングとして採取した。２０１６年トライアルでは、空気乾燥植物を葉柄カットし、空気乾燥し、そして分析前に下部１／３葉、中間部１／３葉、及び上部１／３葉に分離した。これは、商業生産で使用される一般的アプローチの模倣であった。
【０４２３】
【表１０】
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【０４２４】
結論
表７のデータは、２０１６年の熱風乾燥した屋外タバコにおいて、対照と比較して系統ＧＷ１〜３ではスクロースエステルが増えたことを示している。
【０４２５】
【表１１】
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【０４２６】
結論
表８のデータは、２０１６年の空気乾燥した屋外タバコにおいて、対照と比較して系統ＧＷ１〜３ではスクロースエステルが増えたことを示している。
【０４２７】
上記明細書に記載するすべての公開資料は、本明細書に参照として組み込まれる。記載されている本発明の方法及びシステムについて、本発明の範囲及び精神から逸脱しないその様々な修飾形態及び変更形態は、当業者にとって明白である。本発明は特定の好ましい実施形態に関連して記載されているが、主張されるような本発明は、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきでないと理解すべきである。確かに、本発明を実施するに当たり、生化学及びバイオテクノロジー、又は関連分野の当業者にとって、記載するモードの様々な改変は明らかであるが、そのような改変も下記の特許請求の範囲内であるように意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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