(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
・  少なくとも１つの軽鎖定常領域Ｃ末端を含む抗体、もしくは標的結合特性を保持する抗体断片または誘導体、および
・  アントラサイクリン系小分子
を含み、前記アントラサイクリン系小分子（単数または複数）が、前記抗体、断片または誘導体の軽鎖定常領域Ｃ末端（単数または複数）のみに連結され、
前記アントラサイクリン系小分子がペプチド配列を含むリンカーを介して、前記抗体、断片または誘導体に連結され、
前記アントラサイクリン系小分子が、式（ｉ）
【化１】
0006817492.tif 000022
の構造を含む、ＰＮＵ−１５９６８２またはその誘導体から選択される、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）。
【請求項２】
前記抗体または断片または誘導体が、
・  腫瘍特異的であるか、または
・  健康な組織上よりも腫瘍組織上でより高い割合で発現される抗原に結合する、
請求項１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項３】
前記抗体または断片または誘導体がヒトおよび／またはマウスＣＳ１に結合しない、請求項１または２に記載の抗体薬物複合体。
【請求項４】
前記抗体または断片または誘導体がｈｕ４−２−１７のＣＤＲ（カバット番号付けに基づく）
・  ＨＣ  ＣＤＲ１  ＳＹＹＭＳ
・  ＨＣ  ＣＤＲ２  ＡＩＧＩＳＧＮＡＹＹＡＳＷＡＫＳ
・  ＨＣ  ＣＤＲ３  ＤＨＰＴＹＧＭＤＬ
・  ＬＣ  ＣＤＲ１  ＥＧＮＮＩＧＳＫＡＶＨ
・  ＬＣ  ＣＤＲ２  ＤＤＤＥＲＰＳ、および
・  ＬＣ  ＣＤＲ３  ＱＶＷＤＳＳＡＹＶ
を含み、ＣＤＲは抗体の標的に結合することができるように、適切なタンパク質フレームワークに含まれる、請求項１から３の何れか１項に記載の抗体薬物複合体。
【請求項５】
前記抗体または断片または誘導体がｈｕＥＲＣＳ−４０９のＣＤＲ（カバット番号付けに基づく）
・  ＨＣ  ＣＤＲ１  ＳＹＧＶＩ
・  ＨＣ  ＣＤＲ２  ＩＩＧＳＳＧＮＴＹＹＡＳＳＶＫＧ
・  ＨＣ  ＣＤＲ３  ＹＹＧＤＳＧＦＤＳ
・  ＬＣ  ＣＤＲ１  ＲＡＳＱＳＩＧＳＷＬＳ
・  ＬＣ  ＣＤＲ２  ＧＡＳＮＬＡＳ、および
・  ＬＣ  ＣＤＲ３  ＬＧＡＳＰＮＧＷＡ
を含み、ＣＤＲは抗体の標的に結合することができるように、適切なタンパク質フレームワークに含まれる、請求項１から３の何れか１項に記載の抗体薬物複合体。
【請求項６】
前記抗体または断片または誘導体が、以下からなるリストのうちの少なくとも１つを含む、請求項１から５の何れか１項に記載の抗体薬物複合体：
・  トラスツズマブの可変ドメイン（配列番号１または２の可変ドメイン）、
・  ｈｕ４−２−１７の可変ドメイン（配列番号４または５の可変ドメイン）、および／または
・  ｈｕＥＲＣＳ−４０９の可変ドメイン（配列番号７または８の可変ドメイン）。
【請求項７】
前記リンカーのペプチド配列が、ソルターゼ酵素認識モチーフの特異的切断から生じるペプチドモチーフを含むか、またはそれからなる、請求項１から６の何れか１項に記載の抗体薬物複合体。
【請求項８】
前記ソルターゼ酵素認識モチーフがＬＰＸＴＧ、ＬＰＱＴＧ、ＬＰＥＴＧ、ＬＰＸＡＧ、ＬＰＸＳＧ、ＬＡＸＴＧ、ＬＰＸＴＡ、ＮＰＱＴＧ、ＮＰＱＴＮ、ＬＰＬＴＧ、ＬＡＦＴＧ、およびＬＰＮＴＡからなる群から選択され、好ましくは前記リンカーがＬＰＥＴＧまたはＬＰＱＴＧの配列を含むかまたはそれからなる、請求項７に記載の抗体薬物複合体。
【請求項９】
前記リンカーの前記ペプチド配列がＧnまたはＧｌｙn（ｎが１〜２１であり、好ましくはｎが１、２、３、４または５であり、最も好ましくはｎが２である）と表示されるオリゴグリシン配列（「タグ」）を含むか、またはそれからなる、請求項１から６の何れか１項に記載の抗体薬物複合体。
【請求項１０】
前記リンカーが、式ＮＨ2−（ＣＨ2）m−ＮＨ2（式中、ｍ≧１および≦１１、好ましくはｍ＝２）のアルキルジアミノ基をさらに含む、請求項１から９の何れか１項に記載の抗体薬物複合体。
【請求項１１】
前記リンカーが少なくとも１つのさらなる切断可能または非切断可能リンカーをさらに含み、リンカーが好ましくは、ヒドラジンリンカー、チオ尿素リンカー、自己免疫リンカー、スクシンイミジルトランス−４−（マレイミジルメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）リンカー、ジスルフィドリンカー、セレノエーテルリンカー、アミドリンカー、チオエーテルリンカー、および／またはマレイミドリンカーからなる群から選択される、請求項１から１０の何れか１項に記載である抗体薬物複合体。
【請求項１２】
前記ペプチドリンカーがスペーサー配列を含み、好ましくは前記ペプチドリンカーが、Ｎ末端からＣ末端に、４つのグリシン残基および１つのセリン残基からなるスペーサー配列Ｇ4Ｓを含む、請求項１から１１の何れか１項に記載である抗体薬物複合体。
【請求項１３】
（ｉ）抗体、断片または誘導体と、（ｉｉ）アントラサイクリン系小分子との間の、≧１〜≦２の間の任意の値の化学量論比を有する、請求項１から１２の何れか１項に記載の抗体薬物複合体。
【請求項１４】
２本の重鎖と２本の軽鎖からなる抗体であって、各重鎖が配列番号４（ｈｕ４−２−１７  ＨＣ）に記載のアミノ酸配列からなり、各軽鎖が配列番号５（ｈｕ４−２−１７  ＬＣ）に記載のアミノ酸配列を含み、前記抗体はヒトＲＯＲ１に結合する抗体；および
アントラサイクリン系小分子であって、ペプチド配列を含むリンカーを介して前記抗体の軽鎖定数領域Ｃ末端（単数または複数）のみに連結されている前記アントラサイクリン系小分子
を含む抗体薬物複合体（ＡＤＣ）であって、
前記アントラサイクリン系小分子が、式（ｉ）のＰＮＵ−１５９６８２誘導体からなり、
前記リンカーが、Ｎ末端からＣ末端に、４つのグリシン残基と１つのセリン残基からなるペプチドスペーサー配列であるＧ4Ｓ、ソルターゼ特異的切断に由来するペプチドモチーフＬＰＱＴ、２つのグリシン残基Ｇ2、および式ＮＨ2−（ＣＨ2）2−ＮＨ2のアルキルジアミノ基からなるリンカーである、
抗体薬物複合体（ＡＤＣ）。
【請求項１５】
２本の重鎖と２本の軽鎖からなる抗体であって、各重鎖が配列番号７（ｈｕＥＲＣＳ−４０９  ＨＣ）に記載のミノ酸配列からなり、各軽鎖が配列番号８（ｈｕＥＲＣＳ−４０９  ＬＣ）に記載のアミノ酸配列からなり、前記抗体はヒトＲＯＲ１に結合する抗体；および
アントラサイクリン系小分子であって、ペプチド配列をリンカーを介して前記抗体の軽鎖定数領域Ｃ末端（単数または複数）のみに連結されている前記アントラサイクリン系小分子
を含む抗体薬物複合体（ＡＤＣ）であって、
前記アントラサイクリン系小分子が、式（ｉ）のＰＮＵ−１５９６８２誘導体からなり、
前記リンカーが、Ｎ末端からＣ末端に、４つのグリシン残基と１つのセリン残基からなるペプチドスペーサー配列であるＧ4Ｓ、ソルターゼ特異的切断に由来するペプチドモチーフＬＰＥＴ、２つのグリシン残基Ｇ2、および式ＮＨ2−（ＣＨ2）2−ＮＨ2のアルキルジアミノ基からなるリンカーである、
抗体薬物複合体（ＡＤＣ）。
【請求項１６】
前記ＰＮＵ-１５９６８２誘導体と前記抗体との比が約２である、請求項１４から１５の何れか１項に記載の抗体薬物複合体（ＡＤＣ）。
【請求項１７】
治療有効量の請求項１から１６の何れか１項に記載の抗体薬物複合体と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項１８】
ａ）軽鎖Ｃ末端（単数または複数）にソルターゼ酵素認識モチーフを有する抗体または断片または誘導体、および
ｂ）各々オリゴグリシンタグを有する１つ以上のアントラサイクリン系小分子の部位特異的ソルターゼ酵素媒介結合によって得ることができる抗体薬物複合体。
【請求項１９】
請求項１から１６の何れか１項に記載の抗体薬物複合体を製造する方法であって、以下の工程を含む、方法：
ａ）軽鎖Ｃ末端（単数または複数）にソルターゼ酵素認識モチーフを有する抗体または断片または誘導体を提供する工程、
ｂ）各々オリゴグリシンタグを有する１つ以上のアントラサイクリン系小分子を提供する工程、および
ｃ）前記ソルターゼ酵素認識モチーフを認識するソルターゼ酵素を使用するソルターゼ媒介結合の手段によって、抗体または断片または誘導体および１つ以上のアントラサイクリン系小分子を結合させる工程。
【請求項２０】
腫瘍性疾患に罹患しているか、および／または腫瘍性疾患と診断された対象の治療に使用するための、請求項１７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、強力な薬物を保持し、インビボで改善された特性、特にインビボで改善された忍容性を示す抗体薬物複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
結合タンパク質、特に腫瘍細胞に特異的な抗体に対する低分子量毒素（毒性「小分子」、ＭＷ ＜２，５００ダルトン）の共有結合コンジュゲートは、癌細胞の破壊のためにそれらを特異的に標的化するための強力なツールである。このような抗体薬物複合体（ＡＤＣ）は、癌の治療のために医学的および商業的に非常に興味深い。癌治療のための有効かつ安全なＡＤＣを開発するためには、いくつかの局面に対処する必要がある：第１に、抗体は正常または健康な組織細胞によってほとんどまたは理想的に発現されない所与の腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）に特異的である必要がある。第２に、薬物と抗体／結合タンパク質との間の共有結合または結合は血流中の毒性ペイロードの望ましくない放出を防ぐために循環中で十分に安定である必要があり、同時に、癌細胞への結合および／または癌細胞への内在化の際に薬物を効果的に放出する必要がある。第３に、ＡＤＣは、実質的な量で内在化されなければならない。第４に、毒性ペイロードは、抗体から放出され、適切な細胞内区画に入ってその毒性を発揮しなければならない。第５に、たとえ潜在的に限られた量のＴＳＡが癌細胞上で発現され、したがって限られた量のＡＤＣのみが内在化されるとしても、または癌細胞への結合の際に、または癌細胞への内在化の際に、毒性ペイロードの放出が十分に高い効率で行われない場合であっても、癌細胞の破壊を引き起こすために、毒性ペイロードは、十分に高い毒性または効力を有さなければならない。
【０００３】
しかし、同様に、ＡＤＣはまた、（ａ）健康な細胞上でのＴＳＡの発現に起因する非標的組織におけるオン標的結合、（ｂ）意図されるＴＳＡ以外の抗原の結合に起因するオフ標的結合、および／または（ｃ）血流中での早期の薬物ペイロード放出、溶解された標的細胞から放出されたペイロードまたは放出された代謝産物によって引き起こされ得る一般的な毒性によって一般的に媒介される、副作用の誘導を回避しなければならない。
【０００４】
ＡＤＣ開発に対するこれらの複数の制約は、このタイプの治療を、臨床評価を通してもたらすことを最も困難にする。さらに、このような生物学的製品を作製することおよび試験することは高コストであるので、当業者は、抗体、リンカーおよび毒素の全ての可能な変異体および組み合わせ、ならびに特定の結合部位（単数または複数）および抗体に対する毒素の比を系統的に試験する自由がない。
【０００５】
実際に、文献は多数の可能な毒素ペイロードおよびリンカーについて（例えば、Ｊａｉｎら、２０１５を参照のこと）、さらに、多数の可能な結合部位および結合方法について報告する。
【０００６】
"Location Matters: Site of Conjugation Modulates Stability and Pharmacokinetics of Antibody Drug Conjugates" (Strop et al., Chemistry & Biology, 20, 2013) において、著者らは、微生物トランスグルタミナーゼにより結合されたＡＤＣについて報告している。それらの抗体重鎖および軽鎖Ｃ末端に結合したＭＭＡＤ毒素は、インビボおよびインビトロの両方で同様の効力を示した。１０ｍｇ／ｋｇおよび２５ｍｇ／ｋｇのＡＤＣの投与は、ラットにおいて等しく良好に忍容性を示した。
【０００７】
本出願人は驚くべきことに、１つ以上の特定部位、すなわち、一方または両方の抗体（または抗体誘導体）軽鎖のＣ末端のみに結合したアントラサイクリン毒素を有するＡＤＣが治療的に効果的であるだけでなく、代替部位、すなわち、一方または両方の抗体重鎖のＣ末端上、または抗体重鎖および軽鎖のＣ末端の組合せ上に結合したアントラサイクリン毒素を有する同等のＡＤＣよりも著しくインビボで忍容性を示すことを見出した。そのような教示はＷＯ２０１６／１５０５６４（その内容が参照により本明細書に組み込まれる）には見出されていない。ＷＯ２０１６／１５０５６４は同じクラスの毒素を記載するが、抗体重鎖および軽鎖のＣ末端の組み合わせへのそれらの付着のみを記載する。
【０００８】
抗体Ｃ末端の毒素付着の手段に関する教示、すなわちＷＯ２０１４／１４０３１７（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）においても、軽鎖Ｃ末端へのアントラサイクリン毒素の優先的付着に言及していない。
【０００９】
従って、本発明の目的はインビボで改善された特性を示し、特にインビボで高度に忍容性を示す抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を提供することである。特に、同数の同じ毒素を含むが、別のＣ末端に結合したその対応物よりも、インビボでより良好に忍容性を示す抗体薬物複合体を提供することが目的である。
このような抗体薬物複合体を含む医薬組成物を提供することが別の目的である。
また、このような抗体薬物複合体の製造方法を提供することを目的とする。
【００１０】
腫瘍性疾患に罹患しているか、発症する危険性があるか、および／または腫瘍性疾患と診断されている対象の治療に使用するための抗体薬物複合体を提供することが別の目的である。
【００１１】
本発明の別の目的は、免疫疾病または障害に罹患しているか、発症する危険性があるか、および／または診断された対象の治療に使用するための抗体薬物複合体を提供することである。
【００１２】
これらおよび他の目的は、独立した請求項に記載の方法および手段によって達成される。従属請求項は、具体的な実施形態に関連する。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、インビボ忍容性の改善された特性を含む、インビボにおける改善された特性を示す抗体薬物複合体を提供する。本発明及びその特徴の一般的な利点を以下に詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明による、アントラサイクリン含有ＡＤＣの全体を示す。Ａｂは、アントラサイクリン分子毒素を導くペプチド配列を含むリンカーに、その定常領域軽鎖Ｃ末端の一方または両方で連結された抗体または断片または誘導体を指す。
【図２】図２は、本発明によるアントラサイクリン分子含有ＡＤＣの好ましい実施形態を示す：  −  アントラサイクリン分子は、式（ｉ）のＰＮＵ誘導体に相当する。  −  Ｌ1は任意のリンカーであり、切断可能リンカーであってもよい。  −  ｍは１以上１１以下であり、好ましくは、ｍは２である。  −  ｎは１以上２１以下であり、好ましくは、Ｎは１、２、３、４または５である。  −  ソルターゼ認識配列はソルターゼ酵素認識モチーフ（例えば、ＬＰＸＴＧ）の特異的切断の産物（例えば、ＬＰＸＴ）（図ではＣ−末端からＮ−末端配向に描写される）を表し、ここで、Ｘは任意のアミノ酸である。  −  スペーサー配列は任意である（図ではＣ−末端からＮ−末端配向に描写される）。  −  Ａｂは、その定常領域軽鎖Ｃ末端の一方または両方でスペーサー配列（存在する場合）またはソルターゼ認識配列（スペーサー配列が存在しない場合）に連結される抗体である。
【図３】図３は、実施例で使用した（Ａ）ペンタグリシン修飾ＰＮＵ誘導体（Ｇ５−ＰＮＵ）、（Ｂ）トリグリシン修飾ＰＮＵ誘導体（Ｇ３−ＰＮＵ）、および（Ｃ）ジグリシン修飾ＰＮＵ誘導体（Ｇ２−ＰＮＵ）を示す。
【図４】図４は、（Ａ）ＳＫＢＲ３（ＨＥＲ２陽性ヒト乳癌）および（Ｂ）Ｋａｒｐａｓ−２９９（ＨＥＲ２陰性ヒトＴ細胞リンパ腫）細胞株に対する、以下のＡＤＣによる、インビトロ細胞死滅アッセイの用量応答曲線を示す：Ｔｒａｓ−ＨＣ−ＰＮＵ（その重鎖Ｃ末端の両方に連結されたアントラサイクリン分子を含むＨＥＲ２標的ＡＤＣ）、およびＴｒａｓ−ＬＣ−ＰＮＵ（その軽鎖Ｃ末端の両方に連結されたアントラサイクリン分子を含むＨＥＲ２標的ＡＤＣ）。重鎖上のみにまたは軽鎖上のみにアントラサイクリンサイクリンペイロードを含むＡＤＣは同等のインビトロ効力を示し、それは抗原媒介性である。
【図５】図５は、ＳＫＯＶ３（ＨＥＲ２陽性ヒト卵巣癌）細胞株に対する、以下のＡＤＣによる、インビトロ細胞死滅アッセイの用量応答曲線を示す：Ｔｒａｓ−ＨＣ−ＰＮＵ（その重鎖Ｃ末端の両方に連結されたアントラサイクリン分子を含むＨＥＲ２標的ＡＤＣ）、およびＴｒａｓ−ＬＣ−ＰＮＵ（その軽鎖Ｃ末端の両方に連結されたアントラサイクリン分子を含むＨＥＲ２標的ＡＤＣ）、Ａｃ１０−ＨＣ−ＰＮＵ（その重鎖Ｃ末端の両方に連結されたアントラサイクリン分子を含むＣＤ３０標的ＡＤＣ）、およびＡｃ１０−ＬＣ−ＰＮＵ（その軽鎖Ｃ末端の両方に連結されたアントラサイクリン分子を含むＣＤ３０標的ＡＤＣ）。重鎖上のみにまたは軽鎖上のみにアントラサイクリンサイクリンペイロードを含むＡＤＣは同等のインビトロ効力を示し、抗原媒介性である。
【図６】図６は、（Ａ）ｈｕ４−２−１７−ＰＮＵ（重鎖および軽鎖Ｃ末端の両方に連結したアントラサイクリンペイロードを有するＲＯＲ１標的ＡＤＣ）、（Ｂ）ｈｕ４−２−１７−ＨＣ−ＰＮＵ（重鎖Ｃ末端に連結したアントラサイクリンペイロードを有するＲＯＲ１標的ＡＤＣ）、または（Ｃ）ｈｕ４−２−１７−ＬＣ−ＰＮＵ（軽鎖Ｃ末端に連結したアントラサイクリンペイロードを有するＲＯＲ１標的ＡＤＣ）で処置した雌ＣＤ１マウスにおけるＡＤＣ  ＩｇＧおよびアントラサイクリン毒素の経時的血清濃度を示す。
【図７】図７は、遺伝子工学的に改変されたマウスＥＭＴ−６乳癌細胞におけるヒトＲＯＲ１の発現のＦＡＣＳ分析を示す。インビボ試験のために選択されたＥＭＴ−６−ＲＯＲ１クローン１４を、蛍光標識された抗ＲＯＲ１抗体クローン２Ａ２を用いたＲＯＲ１発現についてのＦＡＣＳ染色によって分析した。陰性対照は、蛍光標識されたアイソタイプ適合対照抗体による同じ細胞の染色を示す。
【図８】図８は、（Ａ）ＲＯＲ１過剰発現ＥＭＴ６クローン１４細胞および（Ｂ）ＣＳ１陽性Ｌ３６３（ヒト形質細胞白血病）細胞に対するインビトロ細胞死滅アッセイの用量応答曲線を示す：ｈｕＥＲＣＳ−４０９−ＬＣ−ＰＮＵ（軽鎖Ｃ末端に結合したＧ３−ＰＮＵを含むＣＳ１標的ＡＤＣ）、ｈｕＥＲＣＳ−４０９−ＨＣ−ＰＮＵ（重鎖Ｃ末端に結合したＧ３−ＰＮＵを含むＣＳ１標的ＡＤＣ）、ｈｕＥＲＣＳ−４０９−ＬＣ−ＰＮＵ（軽鎖Ｃ末端に結合したＧ２−ＰＮＵを含むＣＳ１標的ＡＤＣ）、ｈｕＥＲＣＳ−４０９−ＨＣ−ＰＮＵ（重鎖Ｃ末端に結合したＧ２−ＰＮＵを含むＣＳ１標的ＡＤＣ）、ｈｕ４−２−１７−ＬＣ−ＰＮＵ（軽鎖Ｃ末端に結合したＧ３−ＰＮＵを含むＲＯＲ１標的ＡＤＣ）、ｈｕ４−２−１７−ＨＣ−ＰＮＵ（重鎖Ｃ末端に結合したＧ３−ＰＮＵを含むＲＯＲ１標的ＡＤＣ）、ｈｕ４−２−１７−ＬＣ−ＰＮＵ（軽鎖Ｃ末端に結合したＧ２−ＰＮＵを含むＲＯＲ１標的ＡＤＣ）、およびｈｕ４−２−１７−ＨＣ−ＰＮＵ（重鎖Ｃ末端に結合したＧ２−ＰＮＵを含むＲＯＲ１標的ＡＤＣ）。これらの結果はアントラサイクリンペイロードを重鎖上のみに、または軽鎖上のみに含むＡＤＣが、同等インビトロ効力を示し、抗原媒介性であることを示す。
【図９】図９は腫瘍細胞を同所移植し、下記で処置したＢＡＬＢ／Ｃ雌マウスのＲＯＲ１過剰発現ＥＭＴ−６（クローン１４）腫瘍体積（カリパスによる；平均値の標準誤差に対応するエラーバーを有するグループ当たりの平均値）の進展を示す：ビヒクル対照、０．５ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照ＡＤＣ（重鎖Ｃ末端の両方に結合したアントラサイクリン分子を含むＣＤ３０標的ＡＤＣ）；０．５ｍｇ／ｋｇのｈｕ４−２−１７−ＰＮＵ（重鎖および軽鎖のＣ末端の両方に連結したアントラサイクリンペイロードを含むＲＯＲ１標的ＡＤＣ）；１．０ｍｇ／ｋｇのｈｕ４−２−１７−HＣ−ＰＮＵ（重鎖Ｃ末端にアントラサイクリンペイロードを含むＲＯＲ１標的ＡＤＣ）；および１．０ｍｇ／ｋｇのｈｕ４−２−１７−ＬＣ−ＰＮＵ（軽鎖Ｃ末端にアントラサイクリンペイロードを含むＲＯＲ１標的ＡＤＣ）。等しい毒素負荷で、重鎖Ｃ末端のみまたは軽鎖Ｃ末端のみに毒素を有するＲＯＲ１標的ＡＤＣは、重鎖Ｃ末端および軽鎖Ｃ末端の両方に毒素を有するＲＯＲ１標的ＡＤＣと比較して、優れたインビボ効力を示す。重鎖Ｃ末端のみまたは軽鎖Ｃ末端のみに毒素が存在するＲＯＲ１標的ＡＤＣは、本質的にインビボ効力が等しい。
【００１５】
（定義）
別に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が関連する技術分野の通常の技術者により一般に理解されているものと同じ意味を有する。これに加えて、本発明の実施に際して読者を補助するために、以下の定義が提供される。
【００１６】
用語「抗体」は、所与の抗原、エピトープまたはエピトープ類への強力な一価、二価または多価結合を示すポリペプチド鎖（単数または複数）を指す。特に明記しない限り、抗体は任意の適切な技術（例えば、ハイブリドーマ技術、リボソームディスプレイ、ファージディスプレイ、遺伝子シャッフリングライブラリー、半合成もしくは完全合成ライブラリー、またはそれらの組み合わせ）を使用して生成され得る。本発明の抗体はインタクトな抗体（例えば、本明細書中に例示されるＩｇＧ１抗体）である。本明細書中で特に明記しない限り、全ての抗体および抗原結合断片配列を含む全てのペプチド配列は、Ｎ→Ｃの順で記載される。
【００１７】
インタクトな抗体は、典型的にはジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖（約４５〜７０ｋＤ）および２つの軽（Ｌ）鎖（約２０〜２５ｋＤ）を含む。抗体鎖をコードする認識された免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、およびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンに分類され、そしてこれらは免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥをそれぞれ定義する。抗体のそれぞれの重鎖は、重鎖可変領域（ＶH）および重鎖定常領域から構成される。ＩｇＧの場合では、鎖定常領域は３つのドメイン、ＣH1、ＣH2およびＣH3から構成される。各々の軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶL）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つの領域、ＣLから構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、Ｆｃ受容体を発現する免疫系の様々な細胞および古典的補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介する。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、（それらのコードされるアミノ酸配列に関して）同一の抗体分子からなる。
【００１８】
抗体のＶHおよびＶL領域は、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）が挿入された、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる超可変性の領域にさらに区分することができる。各ＶHおよびＶLは、アミノ末端からカルボキシル末端までＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配列した３つのＣＤＲと４つのＦＲから構成される。ＣＤＲおよびＦＲ領域の位置、ならびに番号付けシステム、例えばＩＭＧＴシステムおよびカバットシステムが定義されている。
【００１９】
さらに、抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭを含むがこれらに限定されない任意のアイソタイプであり得る。従って、例えば、抗体は、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２のような任意のＩｇＡ、またはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、または合成ＩｇＧのような任意のＩｇＧであり得る。
【００２０】
さらに、抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭとの二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ）フォーマットおよび一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）融合体などの誘導体フォーマット（「抗体誘導体」）に含まれ得る。一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）は一本鎖抗体であり、すなわち、それは、一般にスペーサーペプチドを介して連結された、ポリペプチド連結におけるＶHドメインおよびＶLドメインを含むポリペプチドである。ｓｃＦｖ融合は、重鎖のＮ末端またはＣ末端、または軽鎖のＮ末端に対するものである。ＤＶＤ−Ｉｇフォーマットは、それぞれのＶL／ＶH対がＮ末端に別のＶL／ＶH対を有するＩｇ型抗体からなる。２つのＶL／ＶH対は、同じまたは異なる抗原結合特異性を有する。また、抗体は、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）２または一本鎖ＦＶ（ｓｃＦｖ）のような典型的な抗体フォーマットの断片中に存在することができる。疑義を避けるために、用語「抗体誘導体」および「抗体断片」の両方は標的結合能力を保持する実施形態を指す、すなわち、もはや標的に結合することができない実施形態を除外する。
【００２１】
「キメラ抗体」という用語は、ある種からの抗原を標的とする抗原結合領域（ＶHおよびＶL）と、別の種の免疫グロブリン配列に対応する定常領域とを含む抗体を指す。
「非ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリン配列に対応する定常領域を含まない抗体を指す。
【００２２】
用語「ヒト化抗体」はヒトおよび非ヒト（例えば、ウサギ）免疫グロブリンに由来する配列を含むキメラ抗体を指し、その結果、いくつかまたは全て（例えば、Ｒａｄｅｒ  Ｃ．ら、１９９８におけるように軽鎖および重鎖の非ヒトＣＤＲ３配列のみを維持する）、または実質的に全てのＣＤＲ領域が非ヒト起源であり、一方、実質的に全てのＦＲ領域は、ヒト免疫グロブリン配列のものに対応する。
【００２３】
本明細書中に記載される抗体または断片または誘導体は、インタクトな抗体の酵素的または化学的修飾によって産生され得るか、または組換えＤＮＡ方法論を使用して新規に合成され得るか、またはファージディスプレイライブラリーを使用して同定され得る。これらの抗体または抗体誘導体を生成するための方法は、当該分野で公知である。
【００２４】
本発明の抗体または断片または誘導体は任意の適切な技術（例えば、任意の適切な真核生物または非真核生物の発現系または無細胞系を使用する）によって産生され得る。特定の実施形態において、抗体または断片または誘導体は、哺乳動物発現系を使用して産生される。特定の実施形態において、抗体または断片または誘導体は、昆虫発現系を用いて産生される。
【００２５】
「治療的に活性な化合物」とは、本発明において、治療的に有益な作用を提供する化合物をいい、特に、抗体薬物複合体を含む。治療的に活性な化合物はしばしば、組成物として処方され、例えば、生理学的に許容される緩衝液中に処方される。
【００２６】
「忍容性」は、投与された組成物（治療的に活性な化合物を含むか、またはそれからなる）の有害作用がヒトまたは他の動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、サルなどによって、またはヒトまたは他の動物のグループによって忍容され得る程度をいう。一実施形態では、忍容性が死亡率の割合と比較して決定することができる。
【００２７】
「有害作用または有害事象」は、治療的に活性な化合物の投与から生じる望ましくない作用または有害事象である。特に、有害作用には、治療的に活性な化合物での処置の日における体重減少、特に初期体重の１０％、１５％、または２０％を超える体重減少が含まれる。特に、有害作用には、死亡（動物モデルにおいて、自然発生であろうと、安楽死基準を満たした後であろうと）が含まれる。特に、死亡に関連する有害作用は代替の治療的に活性な化合物および／または緩衝液対照と比較して、治療的に活性な化合物の単回または反復（定常または漸増）投与後の動物モデル（例えば、マウス、ラットなどのグループ）において評価される。特に、忍容性は動物モデルにおいて、最大耐容用量に関して、すなわち、治療的に活性な化合物で処置された動物のグループ内の死亡数に関して評価され、ここで、所与のグループは、投与範囲にわたって所与の投与の化合物で処置される。
【００２８】
本明細書で使用される「治療」、「治療」、および「治療効果」という用語は、必ずしも１００％または完全な治療を意味するものではない。むしろ、潜在的な利益または治療効果を有するものとして当業者によって認識される様々な程度の治療が存在する。この点で、本発明の方法は、任意の量の任意のレベルの治療を提供することができる。さらに、本発明の方法によって提供される治療は、治療される疾患の１つ以上の状態または症状の治療を含み得る。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明を詳細に説明する前に、本発明は説明されたデバイスの特定の構成要素部分に限定されず、あるいはそのようなデバイスおよび方法は変化するので、説明された方法のプロセス工程に限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図していないことを理解されたい。明細書および添付の請求項において使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は文脈が明確に別途指示しない限り、単数形および／または複数形の参照を含むことに留意されたい。さらに、数値によって区切られるパラメーター範囲が与えられる場合、その範囲は、これらの限界値を含むものとみなされることを理解されたい。
【００３０】
さらに、本明細書に開示される実施形態は、互いに関連しない個々の実施形態として理解されることを意味しないことを理解されたい。一実施形態で議論される特徴は、本明細書に示される他の実施形態に関連しても開示されることを意味する。１つの場合において、特定の特徴が１つの実施形態で開示されず、別の実施形態で開示される場合、当業者は、前記特徴が前記他の実施形態で開示されることを意味しないことを必ずしも意味しないことを理解するのであろう。業者であれば、他の実施形態についても前記特徴を開示することが本出願の主旨であるが、単に明瞭にするため、及び本明細書を管理可能な量に維持するために、これが行われていないことを理解されよう。
【００３１】
さらに、本明細書で参照される先行技術文献の内容は、参照により組み込まれる。これは、特に、標準的または通常方法を開示する先行技術文献を指す。その場合、参照による組み込みは、主に、十分な可能な開示を提供し、長時間の繰り返しを回避する目的を有する。
【００３２】
抗体薬物複合体（ＡＤＣ）
第１の態様によれば、本発明は
・  少なくとも１つの軽鎖定常領域Ｃ末端を含む抗体、または標的結合特性を保持する抗体断片もしくは誘導体、および
・  アントラサイクリン系小分子（単数または複数）
を含む、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）に関し、アントラサイクリン分子は抗体、断片または誘導体の軽鎖定常領域Ｃ末端（単数または複数）のみに連結され、アントラサイクリン系小分子はペプチド配列を含むリンカーを介して、前記抗体、断片または誘導体に連結される。
「アントラサイクリン系小分子」は、本明細書では「アントラサイクリン分子」とも呼ばれる。
【００３３】
本発明のＡＤＣと比較して、アントラサイクリン分子は、抗体または断片または誘導体軽鎖定常領域Ｃ末端の一方または両方以外の部位で抗体に共有結合しないことが意図される。
本発明によるＡＤＣの視覚的描写を図１に示す。
【００３４】
抗体に関する発明の態様
本発明の抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭを含むがこれらに限定されない任意のアイソタイプのものであり得る。従って、例えば、抗体は、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２のような任意のＩｇＡ、またはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、または合成ＩｇＧのような任意のＩｇＧであり得る。
【００３５】
さらに、抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭとの二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ）フォーマットおよび一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）融合体などの誘導体フォーマット（「抗体誘導体」）に含まれ得る。好ましい実施形態において、抗体誘導体は、ＤＶＤ−Ｉｇフォーマットである。
抗体または断片または誘導体は、一価、二価または多価抗体である。
【００３６】
抗体または断片または誘導体は、単一特異性であっても多重特異性であってもよい。「多重特異性」という用語は、所与の抗原の２つ以上の異なるエピトープに対して特異性を有するか、または少なくとも２つの異なる抗原に対して特異性を有する抗体または断片もしくは誘導体を意味する。
好ましい態様において、抗体はＩｇＧ抗体である。
【００３７】
抗体または断片または誘導体は、任意の抗原を標的とする（または結合する）が腫瘍特異的であるか、または健康な組織よりも腫瘍組織上でより高い割合で発現される抗原を優先的に標的とする。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「より高い割合で発現される」は、少なくとも１０％高い、好ましくは少なくとも２０％高い、より好ましくは少なくとも３０％高い、より好ましくは少なくとも４０％高い、より好ましくは少なくとも５０％高い、より好ましくは少なくとも６０％高い、より好ましくは少なくとも７０％高い、より好ましくは少なくとも８０％高い、より好ましくは少なくとも９０％高い、さらにより好ましくは少なくとも１００％高いことを意味する。発現割合はＲＴ−ＰＣＲまたは免疫組織染料のように、当業者によって知られている技術からの方法で決定することができる。
【００３９】
特に、抗原はヒト抗原である。好ましい実施形態において、抗原はＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＣＳ１、ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎまたはＨＥＲ２であり、より好ましくはＲＯＲ１、ＣＳ１、またはＨＥＲ２であり、さらにより好ましくはＲＯＲ１またはＨＥＲ２である。特に、抗原は、ヒトＲＯＲ１（ＧｅｎＢａｎｋからの配列ＮＰ＿００５００３に基づく）、ヒトＲＯＲ２（ＧｅｎＢａｎｋからの配列ＮＰ＿００４５５１．２に基づく）、ヒトＣＳ１（ＧｅｎＢａｎｋからの配列ＮＭ＿０２１１８１．３に基づく）、ヒトｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ（ＧｅｎＢａｎｋからの配列ＮＰ＿０３７５３６に基づく）、またはヒトＨＥＲ２（ＧｅｎＢａｎｋからの配列ＮＰ＿００４４３９に基づく）であり得る。一実施形態では抗体または断片または誘導体がヒトおよび／またはマウスＣＳ１に結合せず、この実施形態では好ましくは抗体または断片または誘導体がヒトＣＳ１に結合しない。
【００４０】
好ましい実施形態において、抗体または断片または誘導体は、実施例に示される抗体または抗体誘導体のＣＤＲを含む。特に、抗体または断片または誘導体は、トラスツズマブのＣＤＲ（ａｂＹｓｉｓソフトウェアを用いたカバット番号付けに基づく）を含み得る：
【表Ａ】
0006817492.tif 000002
特に、抗体または断片または誘導体は、ｈｕ４−２−１７のＣＤＲ（カバット番号付けに基づく）を含み得る：
【表Ｂ】
0006817492.tif 000003
特に、抗体または断片または誘導体は、ｈｕＥＲＣＳ−４０９のＣＤＲを含み得る（カバット番号付けに基づく）：
【表Ｃ】
0006817492.tif 000004
【００４１】
好ましい実施形態において、抗体または断片または誘導体は、実施例に示される抗体の可変ドメインを含む。特に、抗体または断片または誘導体は、トラスツズマブの可変ドメイン（表２の配列番号１／２の可変ドメイン）を含み得る。特に、抗体または断片または誘導体は、ｈｕ４−２−１７の可変ドメイン（表２の配列番号４／５の可変ドメイン）を含み得る。特に、抗体または断片または誘導体は、ｈｕＥＲＣＳ−４０９の可変ドメイン（表２の配列番号７／８の可変ドメイン）から構成されることができる。
【００４２】
毒素に関する発明の態様
本発明のＡＤＣは１つまたは２つのアントラサイクリン系小分子（「アントラサイクリン分子」）を含み、ここで、各々のアントラサイクリン分子は、ペプチド配列を含むリンカーを介して、軽鎖定常領域Ｃ末端で前記抗体または抗体誘導体に連結される。
【００４３】
アントラサイクリンは癌治療における化学療法薬としてのそれらの証明された臨床的バリデーションのために、ＡＤＣのペイロードとして使用するためのＤＮＡインターカレート毒素の非常に興味深いクラスである（Ｍｉｎｏｔｔｉ，２００４）。アントラサイクリンは抗腫瘍活性の高い赤色ポリケチドであり、もともとストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種に由来する。様々な固形癌および血液癌のための化学療法薬として日常的に使用されるものを含む、多くの誘導体が、過去４０年間に記載されている、例えば、ドキソルビシン（アドリアマイシンとも呼ばれる）、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ピラルビシン、ゾルビシン、アクラルビシン、カミノマイシン、およびバルルビシン。ＰＮＵ−１５９６８２と呼ばれる新規なアントラサイクリン誘導体がアントラサイクリンネモルビシンの代謝産物として記載されており（Ｑｕｉｎｔｉｅｒｉ，２００５）、これは、１つの卵巣（Ａ２７８０）および１つの乳癌（ＭＣＦ７）細胞株（ＷＯ２０１２／０７３２１７）を用いて、ピコからフェムトモル領域におけるインビトロ細胞殺傷に対して極めて高効力を示すことが報告されている。
【００４４】
一実施形態では、本発明のＡＤＣがペプチド配列を含むリンカーを介して、軽鎖定常領域Ｃ末端で前記抗体または断片または誘導体に連結される１つのアントラサイクリン分子を含む。一実施形態では、ＡＤＣがペプチド配列を含むリンカーを介して、２つの軽鎖定常領域Ｃ末端の各々で前記抗体または断片または誘導体に各々連結される２つのアントラサイクリン分子を含む。
一実施形態では、少なくとも１つのアントラサイクリン系小分子がドキソルビシンではない。
【００４５】
一実施形態では、アントラサイクリン系小分子がＰＮＵ−１５９６８２から、またはその誘導体から、または以下の式（ｉ）の構造を含むものから、以下の式（ｉ）の構造を含むものの誘導体から選択される。好ましい実施形態では、その波線でリンカーに結合した毒素が本明細書に参照に組み込まれたＷＯ２０１６／１０２６７９に説明されるように、式（ｉ）のものであり、Ｑｕｉｎｔｉｅｒｉら（２００５）に記述されているように、ＰＮＵ−１５９６８２である。
【化１】
0006817492.tif 000005
【００４６】
アントラサイクリン分子ではない毒素は、植物、真菌、または細菌分子であり得る。いくつかの実施形態では、アントラサイクリン分子ではない毒素が小分子細胞毒素、ペプチド毒素、または蛋白質毒素である。これらの毒素の多くの具体的な例が当技術分野で公知である。例えば、Ｄｙｂａら、Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．１０：２３１１−３４，２００４；Ｋｕｙｕｃａｋら、Ｆｕｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．６：１６４５−５８，２０１４；Ｂｅｒａｕｄら、Ｉｎｆｌａｍｍ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ．１０：３２２−４２，２０１１；およびＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４８：１９９−２２１，１９８４．を参照のこと。いくつかの実施形態において、アントラサイクリン分子ではない毒素はメイタンシノイド（例えば、メイタンシノールまたはＤＭ１メイタンシノイド）、タキサン、カリケアミシン、セマドチン、モノメチルアウリスタチン（例えば、モノメチルアウリスタチンＥまたはモノメチルアウリスタチンＦ）、またはピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）であり得る。アントラサイクリン分子ではない毒素は、ビンクリスチンおよびプレドニゾンであってもよい。様々な実施形態において、アントラサイクリン分子ではない毒素は代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサートなどの抗葉酸剤、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシドのようなフルオロピリミジン、またはプリンもしくはアデノシンの類似体）；マイトマイシン−Ｃ、ダクチノマイシン、またはピロロベンゾジアゼピンのような他の非アントラサイクリン挿入剤；カリケアミシン、チアンシマイシン、および他のエンジインのようなＤＮＡ反応剤；白金誘導体（例えば、シスプラチンまたはカルボプラチン）；アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、シクロホスファミド、イホスファミドニトロソウレアまたはチオテパ）；抗有糸分裂薬（ビンクリスチンなどのビンカアルカロイド、パクリタキセルまたはドセタキセルなどのタキソイド）；トポイソメラーゼ阻害薬（例えば、エトポシド、テニポシド、アムサクリン、トポテカン）；細胞周期阻害薬（例えば、フラボピリドール）；または微小管薬（例えば、エポチロン、チューブリシン、プレチューブリシン、ディスコデルモリド類似体、またはエレウテロビン類似体）であり得る。アントラサイクリン分子ではない毒素は、プロテオソーム阻害剤、ボルテゾミブ、アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、テニポシド、またはドキソルビシンなどのトポイソメラーゼ阻害剤、またはヨウ素（131Ｉ）、イットリウム（90Ｙ）、ルテチウム（177Ｌｕ）、アクチニウム（225Ａｃ）、プラセオジム、アスタチン（Ａｔ）、レニウム（Ｒｅ）、ビスマス（ＢｉまたはＢｉ）、およびロジウム（Ｒｈ）を含む放射性同位体であり得る。
【００４７】
アントラサイクリン分子ではない毒素は、好ましくは以下からなる群から選択される：
・  メイタンシンを含むメイタンシノイド、
・  モノメチルアウリスタチン  ＭＭＡＥ、モノメチルアウリスタチン  ＭＭＡＦなどのアウリスタチン、
・  カリケアミシン、
・  ツブリシン
・  デュオカルマイシン
・  放射性同位体
・  毒性ペイロードを含むリポソーム
・  タンパク質毒素
・  タキサン、および／または
・  ピロロベンゾジアゼピン類。
【００４８】
さらに、ＡＤＣは特に撮像を可能にするために、標識または色素を含んでもよい。この標識または色素は蛍光標識（蛍光色素または蛍光タンパク質を含む）、発色団標識、ヨウ素を含有する放射性同位元素標識（例えば、125Ｉ）、ガリウム（67Ｇａ）、インジウム（111Ｉ）、テクネチウム（99mＴｃ）、リン（32Ｐ）、炭素（14Ｃ）、トリチウム（3Ｈ）、他の放射性同位元素（例えば、放射性イオン）、および／またはアビジンもしくはストレプトアビジンなどのタンパク質標識からなる群より選択される少なくとも１つであり得る。
【００４９】
リンカーに関する発明の態様
本発明は、
・  少なくとも１つの軽鎖定常領域Ｃ末端を含む抗体、または標的結合特性を保持する抗体断片もしくは誘導体、および
・  アントラサイクリン系小分子
を含み、アントラサイクリン分子（単数または複数）は抗体、断片または誘導体の軽鎖定常領域Ｃ末端（単数または複数）のみに連結され、アントラサイクリン系小分子はペプチド配列を含むリンカーを介して、前記抗体、断片または誘導体に連結される、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）に関する。
【００５０】
好ましい実施形態において、前記リンカーの前記ペプチド配列はソルターゼ酵素認識モチーフの特異的切断から生じるペプチドモチーフを含み、またはそれからなり、前記ソルターゼ酵素認識モチーフは、好ましくはペンタペプチドを含む。
【００５１】
好ましい実施形態では、前記ソルターゼ酵素認識モチーフが−ＬＰＸＴＧ−、−ＬＰＸＡＧ−、−ＬＰＸＳＧ−、−ＬＡＸＴＧ−、−ＬＰＸＴＧ−、−ＬＰＸＴＡ−、および−ＮＰＱＴＧ−からなる群から選択され、ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり、好ましくは、ＸはＥまたはＱである。
【００５２】
本明細書の他の場所ならびにＷＯ２０１４１４０３１７（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるように、ソルターゼ（ソルターゼトランスペプチダーゼとも呼ばれる）は特定のペプチドモチーフを含む特定の選別シグナルを認識し、切断することによって表面タンパク質を修飾する原核生物酵素のグループを形成する。このペプチドモチーフはまた、本明細書において、「ソルターゼ酵素認識モチーフ」、「ソルターゼ認識モチーフ」、「ソルターゼタグ」または「ソルターゼ認識タグ」と呼ばれる。通常、所与のソルターゼ酵素は、認識される１つ以上のソルターゼ酵素認識モチーフを有する。
【００５３】
ソルターゼ酵素は天然に存在し得るか、または遺伝子工学的改変を受け得る（Ｄｏｅｒｒら、２０１４）。ソルターゼクラスおよびそれらの対応する認識配列は一般に、Ｓｐｉｒｉｇら（２０１１）において議論される。黄色ブドウ球菌由来のＡ  ２Ａ−９およびＡ  ４Ｓ−９を含む遺伝子工学的に改変されたソルターゼは、Ｄｏｒｒら（２０１４）およびＣｈｅｎら（２０１１）に記載される。
【００５４】
背景として、ソルターゼペプチド転移の一般的概念を例示するために、例えば、ソルターゼＡは求核剤としてオリゴ−グリシン−ストレッチを使用してペプチド転移を触媒し、これにより、オリゴ−グリシンの末端アミノ基が、ソルターゼ認識配列タグの最後の２つＣ末端残基を結合するペプチド結合に対して求核攻撃を引き起こす。これにより、そのペプチド結合が破壊され、ソルターゼタグのＣ末端の最後から２番目の残基とオリゴ−グリシンペプチドのＮ末端グリシンとの間に新たなペプチド結合が形成される、即ち、ペプチド転移が生じる。
【００５５】
以下の表はソルターゼ酵素認識モチーフの非限定的な例、および特異的切断後に得られるペプチドモチーフを示し、後者はＡＤＣリンカー内に含まれる（ＮからＣ末端配向）：
【表１】
0006817492.tif 000006
【００５６】
ソルターゼ結合に先立ち、ソルターゼ酵素認識モチーフはそのＣ端末において、さらに、Ｈｉｓタグ、ＭｙｃタグまたはＳｔｒｅｐタグのような他のタグを担持することができる（ＷＯ２０１４１４０３１７の図４ａを参照、本明細書はその内容を参照により組み込む）。しかし、ソルターゼ酵素認識モチーフの４番目と５番目のアミノ酸の間のペプチド結合はソルターゼ媒介結合（コンジュゲージョン）の際に切断されるので、これらの追加のタグは結合産物中に現れない。
【００５７】
ソルターゼ酵素認識モチーフは、遺伝子融合によって抗体軽鎖のＣ末端（単数または複数）に融合され得、そしてそれと同時発現される。ソルターゼ酵素認識モチーフは免疫グロブリン軽鎖の一方または両方の最後の天然に存在するＣ末端アミノ酸に付加され得、これはヒト免疫グロブリンκ（ｋａｐｐａ）軽鎖の場合、Ｃ末端システイン残基である。前記融合または付属物は直接的に、または本明細書の他の箇所に記載される追加のリンカー要素を介して間接的に行うことができる。
【００５８】
前述したように、いくつかの事例（例えば、Ｉｇ  ｋａｐｐａ軽鎖のＣ末端において、Ｂｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）参照）では、結合たんぱく質のＣ末端とソルターゼ酵素認識モチーフとの間に追加的なアミノ酸（以下、「スペーサー配列」という）を加えることが有益である。これは、結合タンパク質に対するペイロードのソルターゼ酵素結合効率を改善することを示している。Ｉｇ  ｋａｐｐａ軽鎖の場合、Ｉｇ  ｋａｐｐａ軽鎖の最後のＣ末端システインアミノ酸とソルターゼ認識配列との間に５アミノ酸を付加すると、結合の動態が改善されることが観察された（Ｂｅｅｒｌｉら（２０１５）を参照のこと）。従って、別の好ましい実施形態は、任意に、≧１および≦１１アミノ酸（「スペーサー配列」）が抗体の最後のＣ末端アミノ酸とソルターゼ認識配列との間に付加されることである。好ましい実施形態では、ペプチド配列ＧqＳ（ｑは、好ましくは１〜１０、より好ましくは４または５である）が最後の軽鎖Ｃ末端アミノ酸とソルターゼ酵素認識モチーフとの間に添加される。
【００５９】
好ましい実施形態において、前記リンカーの前記ペプチド配列はＧnまたはＧｌｙn（ここで、ｎは１〜２１であり、好ましくは、ｎは１、２、３、４または５である）と示されるオリゴグリシン配列（「タグ」）を含むか、またはそれからなる。
【００６０】
好ましい実施形態では、前記リンカーの前記ペプチド配列がソルターゼ酵素認識モチーフの特異的切断から生じるペプチドモチーフ、および好ましくは−ＬＰＸＴＧn−、−ＬＰＸＡＧn−、−ＬＰＸＳＧn−、−ＬＡＸＴＧn−、−ＬＰＸＴＧn−および−ＮＰＱＴＧn−（ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり、好ましくは、ＸはＥまたはＱであり、ｎは１〜２１であり、好ましくは、ｎは１、２、３、４または５である）からなる群より選択されるオリゴグリシン配列を含むか、またはそれからなる。好ましい実施形態において、前記リンカーの前記ペプチド配列は−ＬＰＸＴＧn（ここで、Ｘが任意のアミノ酸であり、好ましくは、ＸがＥまたはＱであり、ｎが１〜２１であり、好ましくは、ｎが１、２、３、４または５である）を含むか、またはそれからなる。
【００６１】
アントラサイクリン分子が式（ｉ）のものである一実施形態では、リンカーがＮＨ2−（ＣＨ2）m−ＮＨ2（式中、ｍ≧１および≦１１、好ましくはｍ＝２）のアルキルジアミノ基をさらに含むことが好ましい。この実施形態では、ＮＨ2−（ＣＨ2）m−ＮＨ2の１つのアミノ基が式（ｉ）の波線において直接的に連結されてアミド結合を形成することが好ましい。
【００６２】
アントラサイクリン分子が式（ｉ）のものであり、リンカーがＮＨ2−（ＣＨ2）m−ＮＨ2（式中、ｍ≧１および≦１１、好ましくはｍ＝２）の式のアルキルジアミノ基をさらに含む別の実施形態では、１つのアミノ基がリンカー要素Ｌ１を介して式（ｉ）の波線に連結されてもよい。
【００６３】
前記アルキルジアミノ基の第２のアミノ基は、オリゴペプチドリンカー、より好ましくはオリゴグリシン（Ｇｌｙn）に連結されることがさらに好ましい。好ましくは、オリゴグリシンが１〜２１グリシン残基の長さ（すなわち、ｎは１〜２１）、好ましくは１、２、３、４または５アミノ酸の長さを有する。
本発明のＡＤＣの一定の非限定的な実施形態の視覚的描写を図２に示す。
【００６４】
別の実施形態では、リンカーが好ましくはヒドラジンリンカー、チオ尿素リンカー、自己免疫リンカー、スクシンイミジルトランス−４−（マレイミジルメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）リンカー、ジスルフィドリンカー、セレノエーテルリンカー、アミドリンカー、チオエーテルリンカー、および／またはマレイミドリンカーからなる群より選択される、少なくとも１つのさらなる切断可能または非切断可能リンカーをさらに含み得る。
【００６５】
当業者は、さらなるリンカーが適切であり得ることを理解している。このようなリンカーは、非切断性であり得るか、またはｐＨ、酸化還元電位、または特定の細胞内／細胞外酵素の変化によって切断され得る。切断可能なオリゴペプチドリンカーには、プロテアーゼ又はマトリックスメタロプロテアーゼ切断可能リンカーが含まれる。リンカーは、上記の組み合わせを含み得ることを理解されたい。例えば、リンカーは、バリン−シトルリンＰＡＢリンカーであってもよい。
【００６６】
薬物抗体比率（ＤＡＲ）に関する態様
好ましい実施形態において、各軽鎖定常領域Ｃ末端に連結されたアントラサイクリン分子を有するように設計された本発明のＡＤＣは、≧１と≦２との間、好ましくは≧１．７５と≦２との間、より好ましくは≧１．９と≦２との間の任意の値の抗体とペイロードとの間の化学量論比を有する。この比はまた、薬物対抗体比（「ＤＡＲ」）と称され得る。ＤＡＲを決定する方法は当業者に周知であり、逆相クロマトグラフィー、またはＨＰＬＣ−ＭＳを使用する方法を含む。ソルターゼ媒介ペプチド転移反応は、１００％完全ではなく、記載されたＤＡＲを有するＡＤＣの調製をもたらすことが理解される。
ＡＤＣが追加の非アントラサイクリン毒素を含む実施形態では、ＤＡＲは≧１〜≦４の間の任意の値であり得る。
【００６７】
別の好ましい実施形態において、１つの軽鎖定常領域Ｃ末端のみに連結されたアントラサイクリン分子を有するように設計された本発明のＡＤＣは、≧０．５と≦１との間、好ましくは≧０．７５と≦１との間、より好ましくは≧０．９と≦１との間の任意の値の、抗体とペイロードとの間の化学量論比を有する。
【００６８】
機能特性に関する発明の態様
一実施形態では本発明が
・  少なくとも１つの軽鎖定常領域Ｃ末端を含む抗体、または標的結合特性を保持する抗体断片もしくは誘導体、および
・  アントラサイクリン系小分子
を含み、アントラサイクリン分子（単数または複数）は抗体、断片、または誘導体の軽鎖定常領域Ｃ末端（単数または複数）のみに連結され、アントラサイクリン系小分子はペプチド配列を含むリンカーを介して、前記抗体、断片、または誘導体に連結された抗体薬物複合体（ＡＤＣ）に関連し、前記ＡＤＣは好ましくは同じ数および種類のアントラサイクリン分子を有するが、アントラサイクリン分子（単数または複数）が重鎖定常領域Ｃ末端または重鎖および軽鎖定常領域Ｃ末端の両方の混合物に連結された同等なＡＤＣと比較して、インビボで改善された忍容性を示す、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）に関連する。
【００６９】
この実施形態と関連して、マウスモデルにおいて、忍容性は７〜１４日間にわたり、所定の投与量について、死亡率割合と比較して評価されることが好ましい。この実施形態と関連して、忍容性は、２．５〜４０ｍｇ／ｋｇの投与量のＡＤＣを用いて評価されることが好ましい。
【００７０】
同等なＡＤＣはインビトロで非常に類似した細胞殺傷活性を示したが、予想外に、抗体の軽鎖のみに連結されたアントラサイクリンを有するＡＤＣは、２つの試験された同等の用量レベルのインビボで死亡がなく、これに比較して重鎖のみにまたは重鎖および軽鎖の両方に連結された同等なＡＤＣでは、より低い用量で各１／５の死亡マウスをもたらし、より高い用量で５／５の死亡マウスをもたらした（表５を参照のこと）。同様に、別の実験において、アントラサイクリンが軽鎖のみに連結されたＡＤＣは、重鎖のみにまたは重鎖および軽鎖に連結された毒素を有するＡＤＣと比較して、かなり高い用量で許容された。明らかに、患者に安全に投与することができる量の尺度としてのより高い忍容性は、医薬品に有利である。
【００７１】
一実施形態では、本発明は
・  少なくとも１つの軽鎖定常領域Ｃ末端を含む抗体、または標的結合特性を保持する抗体断片もしくは誘導体、および
・  アントラサイクリン系小分子
を含み、アントラサイクリン分子（単数または複数）は抗体、断片、または誘導体の軽鎖定常領域Ｃ末端（単数または複数）のみに連結され、アントラサイクリン系小分はペプチド配列を含むリンカーを介して、前記抗体、断片または誘導体に連結され、前記ＡＤＣは同じ数および種類のアントラサイクリン分子を有するが、アントラサイクリン分子が重鎖定常領域Ｃ末端または重鎖定常領域Ｃ末端と軽鎖定常領域Ｃ末端の両方の混合物に連結された同等なＡＤＣと比較して、インビボでより大きな治療指数を示す、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）に関する。治療指数は、治療作用を引き起こす治療剤の量と、毒性を引き起こす量との対比である。意外にも、同じ投与量で重鎖Ｃ末端と比較して軽鎖Ｃ末端に結合した同じ量の毒素が、インビボでより高い効力を生じることを示した（図９を参照のこと）。
【００７２】
一実施形態では本発明は
・  少なくとも１つの軽鎖定常領域Ｃ末端を含む抗体、または標的結合特性を保持する抗体断片もしくは誘導体、および
・  アントラサイクリン系小分子
を含み、アントラサイクリン分子（単数または複数）は抗体、断片、または誘導体の軽鎖定常領域Ｃ末端（単数または複数）のみに連結され、アントラサイクリン系小分子はペプチド配列を含むリンカーを介して、前記抗体、断片、または誘導体に連結され、同じ治療効果のために、前記ＡＤＣは好ましくは同じ数および種類のアントラサイクリン分子を有するが、アントラサイクリン分子が重鎖定常領域Ｃ末端または重鎖定常領域Ｃ末端と軽鎖定常領域Ｃ末端の両方の混合物に連結された同等なＡＤＣと比較して、低減された投薬頻度および／またはより低い投薬量をインビボで必要とする、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）に関する。
【００７３】
一実施形態では本発明は
・  少なくとも１つの軽鎖定常領域Ｃ末端を含む抗体、または標的結合特性を保持する抗体断片もしくは誘導体、および
・  アントラサイクリン系小分子
を含み、アントラサイクリン分子（単数または複数）は抗体、断片または誘導体の軽鎖定常領域Ｃ末端（単数または複数）のみに連結され、アントラサイクリン系小分子はペプチド配列を含むリンカーを介して、前記抗体、断片または誘導体に連結され、前記ＡＤＣは好ましくは同じ数および種類のアントラサイクリン分子を有するが、アントラサイクリン分子が重鎖定常領域Ｃ末端または重鎖および軽鎖定常領域Ｃ末端の両方の混合物に連結された同等なＡＤＣと比較して、減少した疎水性を示す、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）に関する。そのような疎水性の減少は、ＡＤＣの取扱いおよび製剤を改善することができる。
【００７４】
医薬組成物
いくつかの関連する態様において、本明細書中に記載される抗体薬物複合体の治療的に有効な量および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。
【００７５】
薬学的に許容される担体はヒトまたは獣医学対象への投与に適切な１つ以上の適合性固体または液体充填材、希釈剤、他の賦形剤、または封入物質（例えば、生理学的に許容される担体または薬理学的に許容される担体）であり得る。用語「担体」は、活性成分の使用、例えば、対象への活性成分の投与を容易にするために活性成分と併用される有機若しくは無機成分（天然若しくは合成）を意味する。薬学的に許容される担体は、所望の薬効を実質的に損なわないように、１種若しくは複数種の活性成分、例えば、ハイブリッド分子と混合することができ、また、組成物中に２種以上の薬学的に許容される担体が存在する場合には、互いに混合することができる。薬学的に許容される材料は典型的には悪心、めまい、発疹、または胃の不調のような有意な望ましくない生理学的効果を生じることなく、対象（例えば、患者）に投与することができる。例えば、治療目的でヒト患者に投与される場合、薬学的に許容される担体を含む組成物が免疫原性でないことが望ましい。
【００７６】
本発明の医薬組成物は、さらに、例えば、塩の形態の酢酸、塩の形態のクエン酸、塩の形態のホウ酸、及び塩の形態のリン酸などの好適な緩衝剤を含有することができる。組成物は、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベン、およびチメロサールなどの適切な防腐剤を任意に含有することもできる。本発明の医薬組成物は単位剤形で提供され得、そして任意の適切な方法によって調製され得、その多くは薬学の分野において周知である。このような方法は、本発明の抗体または抗原結合断片を、１つ以上の補助成分を構成する担体と会合させる工程を包含する。一般に、組成物は活性剤を液体担体、微細に分割された固体担体、またはその両方と一様かつ密接に会合させ、次いで、必要であれば、生成物を成形することによって調製される。
【００７７】
非経口投与に好適な組成物は、本発明の組成物の滅菌水性調製物を含むのが好都合であり、これは、好ましくはレシピエントの血液と等張性である。この水性調製物は、好適な分散又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて、公知の方法に従い製剤化することができる。滅菌注射調製物はまた、非毒性の非経口的に許容される希釈剤若しくは溶媒中の滅菌注射液若しくは懸濁液、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液であってよい。使用することができる許容される車両および溶媒の中には、水、リンガー溶液、および生理食塩水がある。さらに、無菌の固定油を、溶媒または懸濁媒として慣例的に使用できる。この目的のために、合成モノ−またはジ−グリセリドのような任意の無刺激の不揮発性油を使用することができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸を注射剤の調製に使用することができる。経口、皮下、静脈内、筋肉内などの投与に好適な担体製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに見いだすことができる。
【００７８】
本発明の医薬組成物の調製及びそれらの様々な投与経路は、当技術分野で公知の方法に従って実施することができる。本発明に関して有用な送達系は、本発明の組成物の送達が、治療しようとする部位の感作を引き起こす前に、並びにそれを引き起こすのに十分な時間で、実施されるように、定時放出、遅延放出、及び持続的放出を含む。本発明の組成物は、他の治療薬または療法と併用することができる。このようなシステムは本発明の組成物の反復投与を回避することができ、それによって、対象および医師に対する利便性を増大させることができ、本発明の特定の組成物に特に好適であり得る。
【００７９】
多くのタイプの放出送達系が利用可能であり、当業者に公知である。適切な放出送達系としては、ポリ（ラクチド−グリコリド）、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、およびポリ無水物などのポリマーベース系が挙げられる。薬物を含有する前記のポリマーのマイクロカプセルは例えば、米国特許第５，０７５，１０９号に記載されている。送達システムはまた、コレステロール、コレステロールエステル、および脂肪酸などのステロール、またはモノジグリセリドおよびトリグリセリドなどの中性脂肪を含む脂質である非ポリマー系；ハイドロゲル放出系；可塑性系；ペプチドベースの系；ワックスコーティング；従来の結合剤および賦形剤を使用する圧縮錠剤；部分的に融合された移植片などを含む。具体的な例としては（ａ）活性成分が米国特許第４，４５２，７７５号、第４，６６７，０１４号、第４，７４８，０３４号、および第５，２３９，６６０号に記載されているようなマトリクス内の形態で含有されるエロージョン系、および（ｂ）活性成分が米国特許第３，８３２，２５３号および第３，８５４，４８０号に記載されているようなポリマーから制御された割合で浸透する拡散系が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、ポンプを用いたハードウエア送達系を使用することができ、そのいくつかは、移植のために改変されている。
【００８０】
一般に、本発明のＡＤＣまたは医薬組成物は例えば、バイアル、パウチ、アンプル、および／または治療方法に適切な任意の容器中に適切に包装される。成分は濃縮物（凍結乾燥組成物を含む）として提供され得、これは使用前にさらに希釈され得るか、またはそれらは使用濃度で提供され得る。インビボでの使用のために、成分の所望の量および濃縮を有する滅菌容器中で、単一用量が提供され得る。
【００８１】
ＡＤＣを製造する手段および方法によって得られるＡＤＣ
第１の態様によれば、本発明は、
・  少なくとも１つの軽鎖定常領域Ｃ末端を含む抗体、または標的結合特性を保持する抗体断片もしくは誘導体、および
・  アントラサイクリン系小分子
を含み、ここで、アントラサイクリン分子（単数または複数）は抗体、断片または誘導体の軽鎖定常領域Ｃ末端（単数または複数）のみに連結され、
・  アントラサイクリン系小分子はペプチド配列を含むリンカーを介して、前記抗体、断片または誘導体に連結される、
抗体薬物複合体（ＡＤＣ）に関する。
【００８２】
一実施形態では、本発明の抗体薬物複合体は、
ａ）軽鎖Ｃ末端にソルターゼ酵素認識モチーフを有する抗体または断片または誘導体、および
ｂ）各々オリゴグリシンタグを有する１つ以上のアントラサイクリン系小分子の部位特異的ソルターゼ酵素媒介結合
によって得ることができる。
【００８３】
本発明はまた、本発明のＡＤＣを産生する方法に関し、この方法は、以下の工程を含む：
ａ）軽鎖Ｃ末端（単数または複数）にソルターゼ酵素認識モチーフを有する抗体または抗体誘導体を提供する工程、
ｂ）各々オリゴグリシンタグを有する１つ以上のアントラサイクリン系小分子を提供する工程、および
ｃ）抗体または抗体誘導体および１つ以上のアントラサイクリン系小分子を、前記ソルターゼ酵素認識モチーフを認識するソルターゼ酵素を使用するソルターゼ媒介結合によって結合する工程。
好ましくは本明細書中で議論される全ての実施形態において、ソルターゼ酵素認識モチーフは軽鎖Ｃ末端（単数または複数）のみに提供される。
【００８４】
本明細書中で議論される全ての実施形態（化膿連鎖球菌ソルターゼＡが使用される場合）において、オリゴ−グリシンＧｌｙnは任意にオリゴ−アラニンＡｌａnで置換され得ることを理解することは重要である。
【００８５】
抗体または断片または誘導体、アントラサイクリン系小分子、リンカーおよびソルターゼ、ならびに本明細書中で言及される任意の他の制限に関する全ての以前に言及された制限は本発明のＡＤＣを記載する実施形態の好ましい実施形態を表し、部位特異的ソルターゼ酵素媒介結合およびＡＤＣを産生する方法によって得られる。
【００８６】
医療用途および治療方法
本発明はさらに、腫瘍性疾患に罹患しているか、発症する危険性があるか、および／または腫瘍性疾患と診断された対象の治療における使用のための、本明細書中に記載されるようなＡＤＣに関する。
【００８７】
本発明はまた、免疫疾患または障害に罹患しているか、発症する危険性があるか、および／または診断された対象の治療における使用のための、本明細書中に記載されるようなＡＤＣをいう。あるいは、腫瘍性疾患に罹患しているか、発症する危険性があるか、および／または腫瘍性疾患と診断されている患者を治療するための方法が提供され、この方法は治療的に効果的な量または用量での上記記載による抗体薬物複合体の投与を含む。
【００８８】
本明細書で使用される「治療する」または「治療」という用語は、必ずしも１００％または完全な治療を意味するものではない。むしろ、潜在的な利益または治療効果を有するものとして当業者によって認識される様々な程度の治療が存在する。この点で、本発明の方法は、任意の量の任意のレベルの治療を提供することができる。さらに、本発明の方法によって提供される治療は、治療される疾患の１つ以上の状態または症状の治療を含み得る。特に、治療は、静脈内注入として投与されてもよい。
一実施形態では、ＡＤＣは単剤療法として投与される。代替の実施形態では、ＡＤＣがさらなる治療薬と一緒にまたは並行して投与される。
特に、ＡＤＣは、約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。
「対象」という用語はヒトおよび非ヒト動物（特に非ヒト哺乳動物）を指し、好ましくはヒト動物を指す。
【実施例】
【００８９】
本発明は図面および前記の説明において詳細に図示および説明されてきたが、そのような図示および説明は例示または例示的であり、限定的ではないと考えられるべきであり、本発明は開示された実施形態に限定されない。開示される実施形態に対する他の変形形態は、図面、開示、及び添付の特許請求の範囲の研究から、請求される発明を実施する際に当業者によって理解され、実施され得る。特許請求の範囲において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、他の要素又はステップを排除するものではなく、不定冠詞「ａ（１つの）」又は「ａｎ（１つの）」は複数形を除外するものではない。特定の手段が相互に異なる従属請求項に列挙されているという単なる事実は、これらの手段の組み合わせを使用して利益を得ることができないことを示すものではない。特許請求の範囲のどの引用符号も、範囲を限定すると解釈するべきではない。
【００９０】
本明細書中に開示される全てのアミノ酸配列はＮ末端からＣ末端まで示され（ここで、配向Ｃ末端からＮ末端として示される図１を除く）；本明細書中に開示される全ての核酸配列が５’→３’で示される。
【００９１】
実施例１：抗体の発現および精製
発現ベクター：ヒトＣＳ１に結合するために上記で決定されたＦａｂ配列を、ヒト発現のためにコドン最適化した；可変ドメインを、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＵＳＡ）によってＤＮＡとして合成し、適切な制限部位および適切な定常ドメインを含む発現ベクター内に含めた（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における発現についてはＷａｌｄｍｅｉｅｒら、２０１６年、およびＣＨＯ細胞における発現についてはＢｅｅｒｌｉら、２０１５年）。
【００９２】
ＨＥＫの発現と精製：
発現ベクターを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＬＴＸ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｒｅｉｎａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，１５３８８１００）を用いたＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＬＴＸ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｅｉｎａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，１５３８８１００）を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした；１日のインキュベーション（３７℃、５％ＣＯ2、増殖培地：１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１００ＩＵ／ｍＬのＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅおよび２ｍＭのＬ−グルタミン（すべてＢｉｏｃｏｎｃｅｐｔ，Ａｌｌｓｃｈｗｉｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含むＬ−グルタミンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）高グルコース（４．５ｇ／Ｌ））後、細胞を選択条件下で増殖させた。細胞を分割し、さらに増殖させた（３７℃、５％ＣＯ2）；コンフルエントに達したら、組織培養皿を２０μｇ／ｍｌのポリ−Ｌ−リシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｐ１５２４）で、３７℃で２時間コーティングし、ＰＢＳで２回洗浄した。次に、細胞をトリプシン処理し、ポリ−Ｌ−リシンでコーティングしたプレート上に１：３に分けた。コンフルエントに達した後、細胞をＰＢＳで洗浄し、続いて、１μｇ／ｍＬのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ、Ｐ８８３３）、１００ＩＵ／ｍＬのＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ）、１６１μｇ／ｍＬのＮ−アセチル−Ｌ−システイン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ８１９９）および１０μｇ／ｍＬのＬ−グルタチオン還元物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇ６５２９）を補充した生成培地（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３１３３０−０３）に培地を置き換えた。上清を隔週で回収し、濾過する（０．２２μｍ）ことにより細胞を除去して、精製まで４℃で保存した。
【００９３】
精製のために、濾過した上清をＰＢＳ平衡化プロテインＡカラムにロードし、ＰＢＳで洗浄した；溶出は、AＫＴＡ純粋（ＧＥヘルスケア）上で０．１Ｍグリシン（ｐＨ  ２．５）を用いて行った。画分を１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）で直ちに中和し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質純度および品質について分析した。タンパク質含有画分をプールし、Ａｍｉｃｏｎ濾過ユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｓｃｈａｆｆｈａｕｓｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，ＵＦＣ９０１００８）を用いて緩衝液交換に供して１：１００の希釈に到達させ、次いで低保持フィルター（０．２０μｍ，Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ＰＡ４９．１）を用いて滅菌濾過した。
【００９４】
ＣＨＯ発現および精製：完全長重鎖および軽鎖のそれぞれをコードする発現ベクターを、哺乳動物発現ベクター中で構築した。抗体を、当技術分野で公知の方法によってＣＨＯ細胞中で一過性に発現させ、組換え抗体を、当技術分野で公知のように、ＣＨＯ細胞上清からの標準的なタンパク質Ａ精製によって精製した。要するに、ＣＨＯ細胞上清を遠心分離によって回収し、滅菌濾過（０．２μｍ）した後、タンパク質Ａカラムを用いたＦＰＬＣベースのアフィニティー精製を行った。結合した抗体を０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．５〜３．５）で溶出し、直ちに１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で中和した。所望の最終製剤緩衝液への緩衝液交換を、当該分野で公知のように行った（例えば、透析またはＴＦＦ）。組換え抗体の純度および完全性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥＣおよびＭＳによって分析した。
【００９５】
【表２】
0006817492.tif 000007
0006817492.tif 000008
【００９６】
表３は、その後の実施例で使用される抗体バッチの発現および精製に使用されるプロトコルを、それらの最終濃度および緩衝液と共に列挙する。
【表３】
0006817492.tif 000009
【００９７】
黄色ブドウ球菌由来のソルターゼＡ。組換えアフィニティー精製ソルターゼＡ酵素を、ＷＯ２０１４１４０３１７Ａ１に開示されているように大腸菌中で産生した。
【００９８】
グリシン修飾毒素の作製。ペンタグリシン修飾ＥＤＡ−アントラサイクリン誘導体（Ｇ５−ＰＮＵ）、トリグリシン修飾ＥＤＡ−アントラサイクリン誘導体（Ｇ３‐ＰＮＵ）およびジグリシン修飾ＥＤＡ−アントラサイクリン誘導体（Ｇ２−ＰＮＵ）を、それぞれＣｏｎｃｏｒｔｉｓ／Ｌｅｖｅｎａにより製造した（それぞれ、図３（Ａ），（Ｂ），（Ｃ））。グリシン修飾毒素の同一性および純度を、質量分析およびＨＰＬＣによって確認した。Ｇｌｙ修飾毒素の各々はＨＰＬＣクロマトグラム中の単一ピークによって測定されるように、＞９５％の純度を示した。
【００９９】
ソルターゼ媒介性抗体結合。標識ｍＡｂ［１０μＭ］を、結合緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＣａＣｌ2、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０体積％グリセロール）中のグリシン修飾毒素［２００μＭ］および３〜４μＭソルターゼＡと共に、２５℃で少なくとも３．５時間インキュベートすることによって、上記の毒素を表４の抗体に結合させた。タンパク質Ａカラム（ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｇｒａｖｉｔｒａｐカラム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通すことによって反応を停止させた。結合した複合体を、５カラム容量の溶出緩衝液（０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．５、５０ｎＭ  ＮａＣｌ）で溶出し、１カラム容量分画を、２５％  ｖ／ｖまでの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−またはＨＥＰＥＳ（ｐＨ８）ベースを含有するチューブに収集して、酸を中和した。タンパク質含有画分をプールし、表４の製剤緩衝液中に製剤化した。
【０１００】
ＡＤＣ解析学。ＤＡＲは、０．０５〜０．１％  ＴＦＡ／Ｈ2Ｏと０．０４〜０．１％  ＴＦＡ／ＣＨ3ＣＮとの間の２５分間の線形勾配で、１ｍＬ／分／８０℃で実行されるＰｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｓ  ＰＬＲＰ  ２．１ｍｍ×５ｃｍ、５μｍカラム上で行われる逆相クロマトグラフィーによって評価した。まず、ｐＨ８．０のＤＴＴとの３７℃、１５分間のインキュベーションによりサンプルを還元した。逆相クロマトグラフィーにより決定されたＤＡＲを以下の表４にまとめる。
【０１０１】
【表４】
0006817492.tif 000010
0006817492.tif 000011
【０１０２】
実施例２：
全ての忍容性評価は、オーリゴン（Ａｕｒｉｇｏｎ）で行った。表５のＡＤＣ（ＰＢＳ中に製剤化された）を、５匹のＣＤ−１雌マウス（５〜６週齢；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｓｕｌｚｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙから）のグループに、示された用量で１４日間にわたって２回（１日目および８日目に、ボーラスによる静脈内投与によって）投与した。マウスをケージ当たり５匹の動物のグループで飼育し、水およびペレットを自由に与えた。研究全体を通して１日２回モニターしたパラメーターは、死亡率およびケージサイドでの臨床観察を含んだ。
【０１０３】
【表５】
0006817492.tif 000012
【０１０４】
表５の結果は、重鎖Ｃ末端でアントラサイクリンペイロードを含むＡＤＣ（Ｔｒａｓ−HＣ−ＰＮＵ）または重鎖および軽鎖Ｃ末端の両方でアントラサイクリンペイロードを含むＡＤＣ（Ｔｒａｓ−ＰＮＵ）で処理したマウスと比較して、軽鎖Ｃ末端でアントラサイクリンペイロードを含むＡＤＣ（Ｔｒａｓ−ＬＣ−ＰＮＵ）で処理したマウスの同等ＡＤＣ投与における有意に低い死亡率を示した。
【０１０５】
実施例３：
表６のＡＤＣ（ＰＢＳ中に製剤化された）を、３匹のＣＤ−１雌マウス（４〜６週齢；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｓｕｌｚｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙから）のグループに、１日目に示された用量で（ボーラスによる静脈内投与によって）投与し、１４日間（２．５および５ｍｇ／ｋｇ用量について）または２８日間（１０、１５および２０ｍｇ／ｋｇ用量について）観察した。マウスをケージ当たり３匹の動物のグループで飼育し、水およびペレットを自由に与えた。研究全体を通して１日２回モニターしたパラメーターは、死亡率およびケージサイドでの臨床観察を含んだ。
【０１０６】
【表６】
0006817492.tif 000013
【０１０７】
表６の結果は軽鎖Ｃ末端にアントラサイクリンペイロードを含むＡＤＣ（Ｔｒａｓ−ＬＣ−ＰＮＵ）で処理されたマウスとは対照的に、重鎖Ｃ末端にアントラサイクリンペイロードを含むＡＤＣ（Ｔｒａｓ−ＨＣ−ＰＮＵ）または重鎖および軽鎖Ｃ末端の両方にアントラサイクリンペイロードを含むＡＤＣ（Ｔｒａｓ−ＰＮＵ）で処理されたマウスでは有意に低い用量で死亡が生じることを示した。
【０１０８】
実施例４：
表７のＨＥＲ２標的化ＡＤＣの細胞毒性を、ＨＥＲ２陽性ヒトＳＫＢＲ３細胞株を用いて調べた。ＨＥＲ２陰性ヒト細胞株Ｋａｒｐａｓ−２９９を対照として使用した。このために、ウェル当たり５０００個のＳＫＢＲ３および５０００個のＫａｒｐａｓ−２９９細胞を、それぞれ、１０体積％を補充した７５μＬのＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ中の９６ウェルプレート（水を含有する端のウェルを除く）上にプレートした。ＦＣＳ、１００ＩＵ／ｍＬ  Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅおよび２ｍＭ  Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを、１ウェルあたり６．６６×１０4ｃｅｌｌｓの密度で、５％ＣＯ2雰囲気の加湿インキュベーター中で、３７℃で増殖させた。１日間インキュベーションした後、それぞれのＡＤＣを、増殖培地中の２５μＬの３．５倍連続希釈液（８０μｇ／ｍＬの開始ＡＤＣ濃度、２０μｇ／ｍＬ〜０．８９ｎｇ／ｍＬの範囲の最終ＡＤＣ濃度を与えた）をそれぞれのウェルに添加した。さらに４日後、プレートをインキュベーターから取り出し、室温に平衡化した。約３０分後、５０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏＯＢ２．０発光溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｇ９２４３）を各ウェルに添加した。プレートを７５０ｒｐｍで５分間振盪し、続いて振盪せずに１０分間インキュベートした後、Ｓｐａｒｋ  １０Ｍプレートリーダー上で、ウェル当たり１秒の積分時間で発光を測定した。発光対ＡＤＣ濃度（ｎｇ／ｍＬ）の曲線を、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅに適合させた。プリズムソフトウェアの組み込み「ｌｏｇ（阻害剤）ｖｓ応答−可変勾配（４つのパラメータ）」ＩＣ50決定機能を使用して決定されたＩＣ50値を表７に報告する。
【表７】
0006817492.tif 000014
【０１０９】
図４は、表７のＡＤＣを用いたＳＫＢＲ３およびＫａｒｐａｓ−２９９細胞株についてのインビトロ細胞死滅アッセイの用量−応答曲線を示す。図および表によれば、アントラサイクリンペイロードを重鎖上のみに、または軽鎖上のみに含む同等なＡＤＣは、同等のインビトロ効力を示す。
【０１１０】
実施例５：
表８のＨＥＲ２標的化ＡＤＣの細胞毒性を、ＨＥＲ２陽性ヒトＳＫＯＶ３細胞株を用いて調べた。同等のＣＤ３０標的ＡＤＣをアイソタイプ対照として使用した。このために、実施例４のプロトコルに従ったが、ウェルあたり２,０００  ＳＫＯＶ３細胞を、１０体積％ＦＣＳ、１００ＩＵ／ｍＬ  Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅおよび２ｍＭ  Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを補充した７５μＬのＤＭＥＭの９６ウェルプレート（水を含有する端のウェルを除く）上に、ウェルあたり２．６６×１０4細胞の濃度でプレーティングした。
【０１１１】
【表８】
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【０１１２】
図５は、表８のＡＤＣを用いたＳＫＯＶ３細胞株に対するインビトロ細胞死滅アッセイの用量−応答曲線を示す。図および表によれば、アントラサイクリンペイロードを重鎖上のみに、または軽鎖上のみに含む同等なＡＤＣは、同等のインビトロ効力および抗原媒介性を示す。
【０１１３】
実施例６：
表９のＡＤＣ（ＰＢＳ中に製剤化された）を、３匹または６匹のＣＤ−１雌マウス（４〜６週齢；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｓｕｌｚｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙから）のグループに、１日目に示された用量で（ボーラスによる静脈内投与によって）投与し、７〜１０日間観察した。マウスをケージ当たり３匹の動物のグループで飼育し、水およびペレットを自由に与えた。研究全体を通して１日２回モニターしたパラメーターは、死亡率およびケージサイドでの臨床観察を含んだ。
【表９】
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【０１１４】
表９の結果は軽鎖Ｃ末端にアントラサイクリンペイロードを含むＡＤＣで処置されたマウスとは対照的に、重鎖Ｃ末端にアントラサイクリンペイロードを含むＡＤＣで処置されたマウス、または重鎖Ｃ末端および軽鎖Ｃ末端の両方にアントラサイクリンペイロードを含むＡＤＣで処置されたマウスの死亡が有意に低い用量で生じていることを示す。
【０１１５】
実施例７：
表１０のＡＤＣ（ＰＢＳ中に製剤化）を、１５匹のスイスの雌異系交配ＣＤ１マウスのグループ（体重２１〜２６ｇ；フランス、Ｓａｉｎｔ  ＢｅｒｔｈｅｖｉｎのＪａｎｖｉｅｒから；単純なランダム割り当てによりグループに割り当てた）に１ｍｇ／ｋｇ（ボーラスによる単回静脈内投与により）で投与した。マウスをケージ当たり３匹の動物のグループで飼育し、水およびペレットを自由に与えた。処置グループあたり３匹のマウスのグループを、ＡＤＣ投与から１時間、２４時間、３日、７日および１４日目に深麻酔後の末端出血によって安楽死させた。所与のグループからの血清および時点を、ＥＬＩＳＡによる分析のために収集した。
【０１１６】
血清サンプルの希釈系列（希釈係数３．５）を、２μｇ／ｍｌのｈｕＲＯＲ１抗原でコーティングしたＥＬＩＳＡプレート上に捕捉した。結合したＡＤＣは自社開発のマウス抗ＰＮＵ  ｍＡｂ（ヒトＩｇＧ−ＰＮＵコンジュゲートでマウスを免疫化し、ＢＳＡ−ＰＮＵコンジュゲートでスクリーニングすることによって生成される）で検出されたが、結合した総ＩｇＧはＨＲＰ結合ロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，７０９−０３５−１４９）の１：２５００希釈で検出された。ＡＤＣおよび総ＩｇＧの血清濃度を、既知濃度の同じＡＤＣのサンプルと比較することによって、サンプル滴定の最大値の半分から計算した。図６は経時的な血清濃度の曲線を示す；これらは表１０に報告されるように、ＰｒｉｓｍのＡＵＣ機能を使用して分析され、曲線下面積（ＡＵＣ）を決定した。
【表１０】
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【０１１７】
表１０の結果は、重鎖Ｃ末端および軽鎖Ｃ末端の両方にアントラサイクリンペイロードを含むＡＤＣで処置されたマウス、または重鎖Ｃ末端にアントラサイクリンペイロードを含むＡＤＣで処置されたマウスよりも、軽鎖Ｃ末端にアントラサイクリンペイロードを含むＡＤＣで処置されたマウスの有意に高い暴露（ＡＵＣ）を示している。さらに、表１０は、重鎖Ｃ末端にアントラサイクリンペイロードを含むＡＤＣがかなりの範囲までペイロードを失うことを示している。
【０１１８】
実施例８：
マウスＥＭＴ−６乳癌細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１００ＩＵ／ｍＬのＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（全て、Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ，Ａｌｌｓｃｈｗｉｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含むＬ−グルタミンを含むＤＭＥＭ完全（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）高グルコース（４．５ｇ／Ｌ））中、３７℃および５％  ＣＯ2で培養した。細胞を移植によりＲＯＲ１を過剰表現するように設計し、セルを遠心分離（６ｍｉｎ，１２００ｒｐｍ，４℃）し、ＲＰＭＩ−１６４０メディア（５ｘ１０6  ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）で再懸濁した。４００μＬの細胞懸濁液を、１３．３μｇのトランスポータブルベクターｐＰＢ−ＰＧＫ−Ｐｕｒｏ−ＲＯＲ１（完全長ＲＯＲ１（ＮＰ＿００５００３．２）とピューロマイシン耐性遺伝子の同時発現を指令する）および６．６μｇのトランスポザーゼ含有ベクターｐＣＤＮＡ３．１＿ｈｙ＿ｍＰＢを含有する４００μＬのＲＰＭＩに添加した。ＤＮＡ／ＥＭＴ−６細胞混合物をエレクトロポレーションキュベット（０．４ｃｍ−ギャップ、１６５−２０８８、ＢｉｏＲａｄ、Ｃｒｅｓｓｉｅｒ、スイス）に移し、３００Ｖおよび９５０μＦでキャパシタンスエクステンダーを有するＢｉｏｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩを使用してエレクトロポレーションした。次に、細胞を室温で５〜１０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を１２００ｒｐｍで６分間遠心分離し、１回洗浄し、続いてＤＭＥＭに完全に再懸濁した後、５％ＣＯ2雰囲気の加湿インキュベーター中で、３７℃でインキュベーションした。エレクトロポレーションの１日後、ヒトＲＯＲ１を安定に発現する細胞プールを、３μｇ／ｍＬのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｐ８８３３）を添加することによって選択した。ＲＯＲ１を発現する単一細胞クローンは、抗生物質選択ＥＭＴ−６−ＲＯＲ１細胞に由来した。次いで、細胞を抗ＲＯＲ１抗体２Ａ２と共に３０分間インキュベートし（４℃、最終濃度２μｇ／ｍＬ）、続いて遠心分離および洗浄した。次いで、細胞を前述のように再懸濁し、暗所（３０分、４℃）で１：２５０希釈した抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｆｃγ特異的）ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ，１２−４９９８−８２）とインキュベートし、緩衝液中で１回洗浄し、ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ機器（ＢＤ  Ｂｉｏｃｓｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＵＳＡ）を用いたＦＡＣＳによる抗原発現細胞の単一選別まで氷上に保持した。以下の実験で使用したクローン１４上のＲＯＲ１の発現を、ＦＡＣＳによって決定した（図７）。
【０１１９】
実施例９：
表１１のＣＳ１標的化およびＲＯＲ１標的化ＡＤＣの細胞毒性を、実施例８のＲＯＲ１過剰発現ＥＭＴ６クローン１４細胞およびＣＳ１陽性Ｌ３６３細胞株を用いて調べた。このために、実施例４のプロトコルに従ったが、１ウェルあたり１０００個のＥＭＴ６クローン１４および１００００個のＬ３６３細胞を、１０体積％ＦＣＳ、１００ＩＵ／ｍＬ  Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅおよび２ｍＭ  Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを補充した７５μＬのＤＭＥＭ中にそれぞれウェルあたり１．３×１０4細胞および１．３×１０5の濃度でプレーティングした。
【表１１】
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【０１２０】
図８は、表１１のＡＤＣを有するＲＯＲ１過剰発現ＥＭＴ６クローン１４細胞およびＬ３６３細胞に対するインビトロ細胞死滅アッセイの用量応答曲線を示す。図および表のように、重鎖上のみに、または軽鎖上のみに、アントラサイクリンペイロードを含む同等なＡＤＣは同等インビトロ効力を示し、抗原媒介性である。
【０１２１】
実施例１０：
以下の研究をＰｒｏＱｉｎａｓｅで行った。０日目に、１００μｌのＰＢＳ中の１ｘ１０6  ＥＭＴ−６−ＲＯＲ１クローン１４腫瘍細胞（実施例８から）を、５〜６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの乳房脂肪パッドに同所的に移植した。３日目に約３０〜８０ｍｍ3（カリパスによる）の平均腫瘍体積に達したら、マウスを、腫瘍の大きさに従ってそれぞれ６匹の動物のグループにブロックランダム化した。表１２のＡＤＣ（ＰＢＳ中に製剤化）を、３日目に示された用量で投与した（ボーラスによる静脈内投与による）。マウスに水およびペレットを自由に与えた。カリパスによって週２回評価した腫瘍体積の進展（グループあたりの平均および平均の標準誤差に対応するエラーバー）を図９に示す。
【０１２２】
【表１２】
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【０１２３】
図９の結果は、重鎖Ｃ末端のみまたは軽鎖Ｃ末端のみにアントラサイクリン分子を含む本発明のＡＤＣがインビボで本質的に等しく有効であり、それらのトレースが本質的に完全に重なることを示している。
【０１２４】
本明細書に提示する実施例によれば、軽鎖Ｃ末端にアントラサイクリン分子を含む本発明のＡＤＣは重鎖Ｃ末端にアントラサイクリン分子を含むＡＤＣと比較して、腫瘍細胞および腫瘍に対する有効性に関して等しいが、軽鎖Ｃ末端にアントラサイクリン分子を含む本発明のＡＤＣは忍容性および安定性を含む、インビボでの顕著な有益な特性を示す。
【０１２５】
参考文献
Beerli et al., "Sortase Enzyme-Mediated Generation of Site-Specifically Conjugated Antibody Drug Conjugates with High In Vitro and In Vivo Potency"; PloS One 10, e131177, 2015.
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Dorr et al., "Reprogramming the specificity of sortase enzymes"; PNAS, 2014.
Dorywalska et al., "Site-Dependent Degradation of a Non-Cleavable Auristatin-Based Linker-Payload in Rodent Plasma and its Effect on ADC Efficacy"; PLOS ONE, 2015.
Drake et al., "Aldehyde Tag Coupled with HIPS Chemistry Enables the Production of ADCs Conjugated Site-specifically to Different Antibody Regions with Distinct In vivo Efficacy and PK Outcomes"; Bioconjugate Chemistry, 25, 2014.
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Strop et al., "Location Matters: Site of Conjugation Modulates Stability and Pharmacokinetics of Antibody Drug Conjugates"; Chemistry & Biology, 20, 2013.
Waldmeier et al., "Transpo-mAb display: Transposition-mediated B cell display and functional screening of full-length IgG antibody libraries"; mAbs, 8(4), 2016.
Swindells, et al., "abYsis: Integrated Antibody Sequence and Structure-Management, Analysis, and Prediction"; J. Mol. Biol. 429, 356-364, 2017
【０１２６】
配列
下記の配列は、本出願の開示の一部を形成する。ＷＩＰＯ  ＳＴ  ２５互換性のある電子化配列表もまた、この出願と共に提供される。疑義を避けるため、以下の表中の配列と電子化配列表中の配列との間に齟齬が存在する場合、この表中の配列は正しいものとみなされるものとする。
【０１２７】
アミノ酸配列（定常ドメインは下線付きで示し、Ｙａｂａｓｉｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｓｗｉｎｄｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，  ｉｎｄｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．を使用してカバットシステムに基づいて確認されたＣＤＲは太字でしめす）ＨＣ：重鎖、ＬＣ：軽鎖。
【表１３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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