(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
胎児付属物由来組織細胞の培養上清を有効成分として含む、脳神経障害治療剤であって、前記胎児付属物由来組織細胞がワルトン膠質由来間葉系細胞、羊膜由来間葉系細胞、絨毛膜由来間葉系細胞、またはこれらの組み合わせであって、かつ単離された幹細胞ではなく、前記培養上清が、分泌されたタンパク質であるＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ１０、ＦＧＦ４、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＰＤＧＦｂｂ、ＴＧＦ−ｂ２及びＶＥＧＦ−Ａを含む、脳性小児麻痺における脳神経障害治療剤であって、脳神経障害の回復を促進する、脳神経障害治療剤。
【請求項２】
前記胎児付属物由来組織細胞が、ワルトン膠質由来間葉系細胞である、請求項１に記載の脳神経障害治療剤。
【請求項３】
前記胎児付属物由来組織細胞が、羊膜由来間葉系細胞、絨毛膜由来間葉系細胞、またはこれらの組み合わせである、請求項１に記載の脳神経障害治療剤。
【請求項４】
前記胎児付属物由来組織細胞が、トリプシンにより調製される、請求項３に記載の脳神経障害治療剤。
【請求項５】
前記脳神経障害治療剤が、神経前駆細胞の軸索を伸長させる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の脳神経障害治療剤。
【請求項６】
前記脳神経障害治療剤が、脳障害の症状が固定される慢性期に投与される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の脳神経障害治療剤。
【請求項７】
前記脳神経障害治療剤が、脳室内投与、髄腔内投与又は経鼻投与である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の脳神経障害治療剤。
【請求項８】
（ａ）胎児付属物由来組織細胞を培養する工程及び（ｂ）前記胎児付属物由来組織細胞の培養上清を回収する工程を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の脳神経障害治療剤の製造方法。
【請求項９】
前記（ａ）胎児付属物由来組織細胞を培養する工程が、１〜３日間の培養である、請求項８に記載の脳神経障害治療剤の製造方法。
【請求項１０】
前記（ａ）胎児付属物由来組織細胞を培養する工程が、５×１０4〜５×１０6個／ｍＬの培養開始時の細胞の密度である、請求項８又は９に記載の脳神経障害治療剤の製造方法。
【請求項１１】
前記（ａ）胎児付属物由来組織細胞を培養する工程が、９５％空気、５％ＣＯ２条件下である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の脳神経障害治療剤の製造方法。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の脳神経障害治療剤を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
凍結乾燥製剤である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胎児付属物由来組織細胞の培養上清を含む脳障害の治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
周産期の新生児脳障害は出生１０００人に１〜２人の頻度で合併し、その後の生涯にわたる脳性麻痺の原因となり、また本人のみならず養育する家族にも多大な負担がかかる病態である。
【０００３】
脳性麻痺の原因となる周産期脳障害には、低酸素性虚血性脳症、脳出血、脳室周囲白質軟化症などがあり、これらの主病態は細胞内Ｃａ上昇、ミトコンドリア機能不全から生じる活性酸素の上昇、マクロファージの活性化とそれに伴う高サイトカイン血症という炎症病態である。特に、脳出血は未熟児に合併しやすく、最も症状が重く生命予後が悪い。
【０００４】
治療法として低体温療法が有効とされているが、施行児８〜９人の内１人に効果があるとされる程度である。且つ低体温療法以外に確立された治療法がないのが現状である。
【０００５】
これまでは、自家骨髄由来間葉系細胞をそのまま脳性麻痺患者へ投与する臨床研究が進められており、その有効性が報告されている（非特許文献１）。また、臍帯由来細胞の投与の報告はあるが、一部の運動機能において著明な改善には至っていない（非特許文献２）。さらに、臍帯血由来細胞を新生児脳出血モデルマウスに投与することにより、運動機能障害が有意に改善することが報告されている（特許文献１）。また、臍帯及び胎盤由来細胞を視神経傷害モデルマウスに移植することにより、視神経の再成長が促進されることが報告されている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ２０１３  Ｄｅｃ；１５（１２）：１５４９−６２
【非特許文献２】Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ２０１５  １７（２）：  ２２４−２３１
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１７／２０４２３１号
【特許文献２】特表２００７−５２１７９３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
脳出血や虚血等を起因とする脳神経障害では、原因となる出血や虚血を治癒するだけではなく、当該原因により障害を受けた神経細胞等の保護または再生を促進する必要がある。このような神経細胞等の保護または再生のため臍帯由来細胞を投与することが考えられているが、臍帯からの採取方法によって得られる細胞の特性が異なり、臍帯由来であれば如何なる細胞、または如何なるドナーであってもその効果を有するか不明である。また、脳神経障害において、腰椎穿刺によるクモ膜下腔内投与において行われることが想定されているが、当該投与方法はリスクが高くより容易な投与経路にて効果を奏する治療剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、胎児付属物由来組織細胞の培養上清が、脳神経前駆細胞の増殖・生存、脳障害部位へのホーミング、脳神経前駆細胞の分化・成熟を促進することにより、脳神経を再生し、脳神経障害に有効であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、下記に関するものである：
（１）胎児付属物由来組織細胞の培養上清を有効成分として含む、脳神経障害治療剤。
（２）胎児付属物由来組織細胞が、臍帯細胞、胎盤細胞、卵膜細胞、絨毛膜細胞、羊膜細胞、またはこれらの組み合わせである、（１）に記載の脳神経障害治療剤。
（３）胎児付属物由来組織細胞が、ワルトン膠質由来間葉系細胞、羊膜由来間葉系細胞、絨毛膜由来間葉系細胞、またはこれらの組み合わせである、（１）または（２）に記載の脳神経障害治療剤。
（４）培養上清中にサイトカイン及びケモカインを含む、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の脳神経障害治療剤。
（５）ＩＬ−６、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８及びＣＣＬ２を含む、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の脳神経障害治療剤。
（６）培養上清が、胎児付属物由来組織細胞を１〜３日間培養して得られる、（１）〜（５）のいずれか１項に記載の脳神経障害治療剤。
（７）培養開始時の胎児付属物由来組織細胞の密度が５×１０４〜５×１０６個／ｍＬである、（１）〜（６）のいずれか１項に記載の脳神経障害治療剤。
（８）脳神経障害が、遺伝性疾患ではない脳神経障害である、（１）〜（７）のいずれか１項に記載の脳神経障害治療剤。
（９）脳神経障害が、ジスキネジア（レボドパ誘発性ジスキネジア、慢性もしくは遅発性ジスキネジア、または口腔顔面ジスキネジア）、下肢静止不能症候群（薬剤誘発性または特発性）、薬物誘発性ジストニア、舞踏病（ハンチントン病、毒素誘発性舞踏病、シデナム（Ｓｙｄｅｎｈａｍ）舞踏病、妊娠舞踏病、ウィルソン病、薬物誘発性舞踏病、または代謝性もしくは内分泌系舞踏病）、顔面けいれん（運動性、音声性、単純性、複雑性またはトゥレット症候群など）、ジストニア（急性、全身性、限局性、分節性、性的、中間性、心因性または急性ジストニー反応など）、Ｓｏｄｅｍｙｔｏｐｉｃパーキンソン病、常同性運動障害（自閉症、遺伝性または小児性関連運動障害など）、強迫性障害、ナルコレプシー（脱力発作など）、伝達性海綿状脳症（クロイツフェルト・ヤコブ病またはクールーなど）、認知症（アルツハイマー、レビー小体型認知症、脳血管性認知症、ピック病またはアルコール性認知症など）、神経有棘赤血球症、発作またはけいれん、アテトーシス（ハンチントン病、呼吸停止、新生児黄疸または脳卒中関連など）、または脳性小児麻痺である、（１）〜（８）のいずれか１項に記載の脳神経障害治療剤。
（１０）（ａ）胎児付属物由来組織細胞を培養する工程及び（ｂ）前記胎児付属物由来組織細胞の培養上清を回収する工程を含む、（１）〜（９）のいずれか１項に記載の脳神経障害治療剤の製造方法。
（１１）（１）〜（９）のいずれか１項に記載の脳神経障害治療剤を含む、医薬組成物。
（１２）凍結乾燥製剤である、（１１）に記載の医薬組成物。
（１３）胎児付属物由来組織細胞の培養上清を有効成分として含む、脳神経再生促進剤。
（１４）胎児付属物由来組織細胞が、臍帯細胞、胎盤細胞、卵膜細胞、絨毛膜細胞、羊膜細胞、またはこれらの組み合わせである、（１３）に記載の脳神経再生促進剤。
（１５）胎児付属物由来組織細胞が、ワルトン膠質由来間葉系細胞、羊膜由来間葉系細胞、絨毛膜由来間葉系細胞、またはこれらの組み合わせである、（１３）または（１４）に記載の脳神経再生促進剤。
（１６）脳神経再生促進剤が、脳神経前駆細胞増殖・生存促進剤、脳神前駆細胞ホーミング促進剤、脳神経前駆細胞分化・成熟促進剤、またはこれらの組み合わせである、（１３）〜（１５）のいずれか１項に記載の脳神経再生促進剤。
（１７）培養上清中にサイトカイン及びケモカインを含む、（１３）〜（１６）のいずれか１項に記載の脳神経再生促進剤。
（１８）ＩＬ−６、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８及びＣＣＬ２を含む、（１３）〜（１７）のいずれか１項に記載の脳神経再生促進剤。
（１９）培養上清が、胎児付属物由来組織細胞を１〜３日間培養して得られる、（１３）〜（１８）のいずれか１項に記載の脳神経再生促進剤。
（２０）培養開始時の分娩後由来組織の密度が５×１０４〜５×１０６個／ｍＬである、（１３）〜（１９）のいずれか１項に記載の脳神経再生促進剤。
（２１）脳神経再生が、遺伝性疾患ではない脳神経障害で起こる、（１３）〜（２０）のいずれか１項に記載の脳神経再生促進剤。
（２２）脳神経再生が、ジスキネジア（レボドパ誘発性ジスキネジア、慢性もしくは遅発性ジスキネジア、または口腔顔面ジスキネジア）、下肢静止不能症候群（薬剤誘発性または特発性）、薬物誘発性ジストニア、舞踏病（ハンチントン病、毒素誘発性舞踏病、シデナム（Ｓｙｄｅｎｈａｍ）舞踏病、妊娠舞踏病、ウィルソン病、薬物誘発性舞踏病、または代謝性もしくは内分泌系舞踏病）、顔面けいれん（運動性、音声性、単純性、複雑性またはトゥレット症候群など）、ジストニア（急性、全身性、限局性、分節性、性的、中間性、心因性または急性ジストニー反応など）、Ｓｏｄｅｍｙｔｏｐｉｃパーキンソン病、常同性運動障害（自閉症、遺伝性または小児性関連運動障害など）、強迫性障害、ナルコレプシー（脱力発作など）、伝達性海綿状脳症（クロイツフェルト・ヤコブ病またはクールーなど）、認知症（アルツハイマー、レビー小体型認知症、脳血管性認知症、ピック病またはアルコール性認知症など）、神経有棘赤血球症、発作またはけいれん、アテトーシス（ハンチントン病、呼吸停止、新生児黄疸または脳卒中関連など）、または脳性小児麻痺で起こる、（１３）〜（２１）のいずれか１項に記載の脳神経再生促進剤。
（２３）（ａ）胎児付属物由来組織細胞を培養する工程及び（ｂ）前記胎児付属物由来組織細胞の培養上清を回収する工程を含む、（１３）〜（２２）のいずれか１項に記載の脳神経再生促進剤の製造方法。
（２４）（１３）〜（２２）のいずれか１項に記載の脳神経再生促進剤を含む、医薬組成物。
（２５）凍結乾燥製剤である、（２４）に記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、胎児付属物由来組織細胞の培養上清を含む、脳神経障害の治療剤を提供することが可能となる。本製剤は、多くのドナーの細胞培養上清を混合することにより、均質な脳神経障害治療剤を製造でき、また細胞を含む製剤と比較して、製造、保管、投与が容易である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ワルトン膠質由来間葉系細胞と神経前駆細胞の共培養による神経再生。（２）共培養した場合、（１）単独培養と比較して、培養３日目および７日目において神経前駆細胞の増殖又は生存維持、移動(遊走)、及び分化・成熟が亢進した。
【図２】ワルトン膠質由来間葉系細胞培養上清による神経再生（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）。（２）培養上清を添加した場合、（１）培地のみの添加と比較して、培養３日目および７日目において神経前駆細胞の生存維持、移動(遊走)、及び分化・成熟が亢進した。
【図３】ワルトン膠質由来間葉系細胞培養上清による治療（１）。培養上清を低酸素処置小児まひモデルマウスに投与した場合(左バー)、培地のみの投与(右バー)と比較して、Ｙ−ｍａｚｅ試験での（１）総エントリー数、（２）交替行動率が改善した。（３）Ｙ−ｍａｚｅ試験における健常マウス（上段）と培養上清投与による治療マウス（下段）の自発行動のパターンを示す。
【図４】ワルトン膠質由来間葉系細胞培養上清による治療（２）。治療前（Ｐｒｅ）において、低酸素処置小児まひモデルマウス群（右バー）は健常群（左バー）と比較して、ローターロッド試験での運動機能が低下していた。２週間にわたる治療後（２Ｗ）、及びその後の休薬２週間後（４Ｗ）において、培養上清を低酸素処置小児まひモデルマウスに投与した治療群 (右バー)は対照群(中バー)と比較して、ローターロッド試験での運動機能が有意に回復し（ｐ＜０．０５，  Ｔｕｋｅｙ検定）、健常群（左バー）と同等であった。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を具体的な実施の形態に即して詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施の形態に束縛されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、任意の形態で実施することが可能である。
【００１４】
なお、本開示で引用する特許公報、特許出願公開公報、及び非特許文献等は、何れもその全体が援用により、あらゆる目的において本開示に組み込まれるものとする。
【００１５】
本開示において、数値に対して適用された場合の「〜」とは、規定された基準値以上で、かつ規定された基準値以下の範囲に入る値の範囲を指す。
【００１６】
１．  胎児付属物由来組織
本開示において「胎児付属物由来組織」（「分娩後由来組織」ともいう）とは、分娩時に摘出される一群の組織を意味し、臍帯、卵膜（羊膜、絨毛膜、脱落膜からなる）、胎盤などを含む。本発明の胎児付属物由来組織は、哺乳類から採取された胎児付属物由来組織であれば特に限定されないが、例えば、霊長類哺乳動物の胎児付属物由来組織である。より好ましくは、ヒトの胎児付属物由来組織である。
【００１７】
本開示において「臍帯」とは、胎児と胎盤を繋ぐ白色の管状組織であり、胎盤を含まない組織を意味する。臍帯の実質部分である「ワルトン膠質」は、胚外中胚葉由来の結合組織を意味し、２つの臍動脈と臍静脈とを覆うことによって臍帯を保護する。本発明の臍帯は、哺乳類から採取された臍帯であれば特に限定されないが、例えば、霊長類哺乳動物の臍帯である。より好ましくは、ヒトの臍帯である。
【００１８】
本開示において「卵膜」とは、羊水を包んでいる膜のことを意味する。卵膜は一枚の膜ではなく、子宮内膜の変化したものである「脱落膜」、「絨毛膜」及び「羊膜」の３層から構成されている。本発明の卵膜は、哺乳類から採取された卵膜であれば特に限定されないが、例えば、霊長類哺乳動物の卵膜である。より好ましくは、ヒトの卵膜である。また、卵膜の内層である羊膜、中間層である絨毛膜、外層である脱落膜をそれぞれ分離して使用してもよく、これらの膜組織を組み合わせて使用してもよい。
【００１９】
本開示において「胎盤」とは、出産後の母体から得ることができる胎盤組織を示す。胎盤は分娩後容易に摘出することができるが、臍帯血バンクで臍帯血分離採取後、インフォームドコンセントを得て入手したヒト胎盤を用いるのが好ましい。より好ましくは、感染症等の検査結果等の詳細を把握した上記胎盤を用いる。本発明の胎盤は、哺乳類から採取された胎盤であれば特に限定されないが、例えば、霊長類哺乳動物の胎盤である。より好ましくは、ヒトの胎盤である。
【００２０】
本開示において「胎児付属物由来組織細胞」（「分娩後由来組織細胞」ともいう）とは、胎児付属物由来組織から、物理的及び／又は酵素的処理により得られる細胞を意味し、特別に単離された幹細胞とは異なる。胎児付属物由来組織細胞は臍帯血や胎児付属物由来組織由来の各種幹細胞と異なり、多世代にわたる継代培養や詳細な細胞分画を必要としないため、調製が容易である。
【００２１】
２．胎児付属物由来組織の回収および処理
一般に、胎児付属物由来組織は生後のその娩出直後に回収する。好ましい実施形態では、胎児付属物由来組織は、インフォームドコンセント後にドナーから、又は臍帯血バンクを介して回収する。ドナーの感染症等の病歴または検査結果を得て胎児付属物由来組織と関連付けることが好ましい。このような病歴を使用して、胎児付属物由来組織またはそこから採取した胎児付属物由来組織細胞の使用を制限することができる。
【００２２】
胎児付属物由来組織細胞を回収する前に、臍帯血および胎盤血等の血液を除去及び／または洗浄することが好ましい。特定の実施形態では、例えば、胎盤中の臍帯血を回収する。これには従来の臍帯血回収プロセスを施すことができる。典型的には、流注下でニードルまたはカニューレを使用して胎盤から採血する（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、米国特許第５，３７２，５８１号；Ｈｅｓｓｅｌら、米国特許第５，４１５，６６５号を参照）。ニードルまたはカニューレは通常臍静脈中に配置し、胎盤を軽くマッサージして胎盤からの臍帯血の流出を容易にすることができる。胎盤はさらなる操作なしで流注により出血して、臍帯血回収の際の組織破壊を最小にすることが好ましい。
【００２３】
哺乳動物の胎児付属物由来組織またはその一部分は、概して前述のように回収し調製した後、任意の当技術分野で知られている方法で処理することができる、例えば、灌流、洗浄、細切、破壊または培養容器へ接着することができ、例えば、細切後、１つまたは複数の組織破壊酵素で消化、または培養容器へ接着して胎児付属物由来組織細胞を得ることができる。
【００２４】
一実施形態では、器官の一部または全部の物理的破壊によって、哺乳動物胎児付属物由来組から細胞を回収する。例えば、胎児付属物由来組織、またはその一部分は、例えば、破砕する、せん断する、細分する、さいの目に切る、細切れにする、細かく砕く、メッシュに通すなどすることができる。典型的には、胎児付属物由来組織は、例えば、培地、生理食塩水等の細胞の生存を害しない溶液に浸して破壊することができる。次いで組織を培養して、接着性の胎児付属物由来組織細胞の集団を得ることができる。
【００２５】
物理的破壊および／または酵素による消化および細胞回収の前に、胎児付属物由来組織を個別の組織に切断することができる。例えば、羊膜、絨毛膜等の卵膜、臍帯、胎盤葉、またはこれらの任意の組合せの全部または一部を得るように切断することができる。胎児付属物由来組織細胞は、羊膜、絨毛膜、臍帯（ワルトン膠質等）またはこれらの任意の組み合わせから得ることが好ましい。典型的には、胎児付属物由来組織細胞は、胎児付属物由来組織の小さな塊、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または約１０００立方ミリメートル体積である胎児付属物由来組織の塊の破壊によって得ることができる。例えばトリパンブルー色素排除試験法により測定して、破壊法が複数、より好ましくは大部分、およびより好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％の前記胎児付属物由来組織中の細胞を生存状態にするという条件で、任意の物理的破壊法を使用することができる。
【００２６】
別の特定の実施形態では、胎児付属物由来組織細胞は胎児付属物由来組織の物理的破壊によって回収し、この場合物理的破壊は酵素による消化を併用し、これは１つまたは複数の組織消化酵素を使用することによって実施することができる。胎児付属物由来組織を消化するために使用することができる酵素には、パパイン、デオキシリボヌクレアーゼ、セリンプロテアーゼ、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼまたはエラスターゼなどがある。セリンプロテアーゼは血清中でアルファ２マイクログロブリンによって阻害される可能性があり、また血清中には基質となるタンパク質が大量に含まれるため、消化に使用する培地は通常無血清である。一般にＥＤＴＡおよび／またはＤＮａｓｅを酵素による消化の手順中で使用して、細胞回収の効率を増大させることができる。
【００２７】
組織消化酵素は任意の組合せとして使用することができる。トリプシンを使用する消化に関する典型的な濃度は、トリプシン０．０５％〜約２％、例えば、トリプシン約０．０５％を含む。プロテアーゼは組合せで、すなわち２つ以上のプロテアーゼを同じ消化反応中で使用することができ、または同時に使用して胎児付属物由来組織細胞を切り離すことができる。例えば、一実施形態では、胎盤、またはその一部分を、例えば３０分間約１〜約２ｍｇ／ｍｌで適量のコラゲナーゼＩを用いて最初に消化して、次に３７℃において例えば１０分間約０．２５％の濃度で、トリプシンを用いて消化する。セリンプロテアーゼは、他の酵素の使用後に連続して使用することが好ましい。
【００２８】
消化後、消化物を例えば血清を含む培養培地で洗浄し、洗浄した細胞は培養容器に播種する。次いで細胞は差次的接着によって単離し、間葉系細胞を調製する。例えば、臍帯のワルトン膠質由来間葉系細胞、卵膜の羊膜由来間葉系細胞、卵膜の絨毛膜由来間葉系細胞、及び胎盤由来間葉系細胞を調製することができる。さらに、これらの間葉系細胞は、培養上清を調製する前に、複数回、好ましくは１０、９、８、７、６、５、４又は３回以下の範囲で、血清を含む培養培地で継代培養することができる。なお、本開示における胎児付属物由来組織細胞は、特に幹細胞を単離するための工程を含まず、細胞の調製が容易である。
【００２９】
３．培養上清の調製
胎児付属物由来組織細胞の「培養」とは、常法に従って、例えば、以下のように実施することができる。培養容器中で、必要に応じてナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素、アミノ酸、ビタミン、ホルモン、サイトカイン、抗生物質、脂肪酸、糖または目的に応じてその他の化学成分もしくは血清のような生体成分を含有した基本培地中に胎児付属物由来組織細胞を加えて、ＣＯ２インキュベーター内で、培養温度を３０℃〜４０℃、好ましくは３７℃で、二酸化炭素ガス濃度を０．０３％〜４０％、好ましくは５〜１０％、さらに好ましくは５％に調節して培養する。培養期間は、数時間レベルの短期間のものから、１日、１．５日、２日、３日、５日、７日間までを挙げることができる。
【００３０】
培地（培養液ともいう）については、胎児付属物由来組織細胞の増殖、維持・生存、タンパク質の分泌等を阻害するものでなければいかなる培地を用いてもよい。尚、基本培地としてはダルベコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）の他、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ハムＦ１２培地（ＨａｍＦ１２）、ＲＰＭＩ１６４０培地等を用いることができる。また、二種以上の基本培地を併用することにしてもよい。混合培地の一例として、ＩＭＤＭとＨａｍＦ１２を等量混合した培地（例えば、ＩＭＤＭ／ＨａｍＦ１２）を挙げることができる。また、培地に添加可能な成分の例として、血清（ウシ胎仔血清、ヒト血清、ウマ血清、ヒツジ血清等）、血清代替物（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔなど）、各種コンディションド培地、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、抗生物質、各種ビタミン、海洋深層水、各種ミネラルを挙げることができる。
【００３１】
本開示において、脳神経障害治療剤を調製するための胎児付属物由来組織細胞の培地は、血清を含まないものであることが好ましい。血清を含まないことでプリオン等の感染のリスクや、ウシ血清アルブミン等の異種タンパク質の混入を防ぐことができ、脳神経障害治療剤の安全性が高められる。例えば、血清を含まない培地（無血清培地）で胎児付属物由来組織細胞を培養することによって、血清成分を含まない培養上清を調製することができる。
【００３２】
本開示において、脳神経障害治療剤を調製するための培地は、海洋深層水を含むことができる。「海洋深層水」とは、一般的に深度２００メートルより深いところの海水であって、グリーンランド周辺において、塩分濃度差によって生じた「プルーム」と呼ばれる垂直に沈む地球規模の海流が始まりとなって、一度も大気に触れる事なく、何世紀もの歳月をかけて地球を回っているといわれる海水である。この海洋深層水は、太陽光線がほとんど届かず、しかも低温高圧の状態にあるので、細菌が少なく、無機栄養塩（ミネラル）等を豊富に含んでいる。海洋深層水を含むことにより、培養上清の分泌タンパク質の量を調節し、海洋深層水を含まない場合と比較して、より高活性の脳神経障害治療剤を調製することができる。培地中に含まれる海洋深層水の濃度（ｖ／ｖ）は、例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または８０％以上であり、また９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％または１０％以下であり、１〜８５％、５〜８５％、１０％〜８５％、１５％〜８５％、２０％〜８５％、２５％〜８５％、３０％〜８５％、４０％〜８５％、５０％〜８５％、６０％〜８５％、７０％〜８５％、８０％〜８５％、１〜７５％、５〜７５％、１０％〜７５％、１５％〜７５％、２０％〜７５％、２５％〜７５％、３０％〜７５％、４０％〜７５％、５０％〜７５％、６０％〜７５％、７０％〜７５％、１〜４５％、５〜４５％、１０％〜４５％、１５％〜４５％、２０％〜４５％、２５％〜４５％、３０％〜４５％、４０％〜４５％、１〜１０％または５〜１０％の範囲であり、７３％または８１％である。
【００３３】
胎児付属物由来組織細胞の培養上清を得るための培養時間としては、例えば、５時間〜７日間、１日〜６日間、１日〜５日間、１日〜４日間、１日〜３日間または１日〜２日間であってもよく、０．５日間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間または７日間である。培養温度は例えば、３６℃〜３８℃、例えば３７℃、であり、ＣＯ２濃度は４〜６％、例えば５％である。また、培養は、例えば非接着性条件下での三次元培養、例えば浮遊培養（例えば、分散培養、凝集浮遊培養など）により行ってもよい。
【００３４】
胎児付属物由来組織細胞の培養上清を得るための、培養開始時の胎児付属物由来組織細胞の密度としては、例えば、１×１０４〜１×１０７個／ｍＬ、５×１０４〜５×１０６個／ｍＬ、１×１０５〜５×１０６個／ｍＬ、２×１０５〜５×１０６個／ｍＬ、５×１０５〜５×１０６個／ｍＬまたは１×１０６〜５×１０６個／ｍＬであってもよく、２×１０５個／ｍＬ、３×１０５個／ｍＬ、４×１０５個／ｍＬ、５×１０５個／ｍＬ、６×１０５個／ｍＬ、７×１０５個／ｍＬ、８×１０５個／ｍＬ、９×１０５個／ｍＬ、１×１０６個／ｍＬ、２×１０６個／ｍＬ、３×１０６個／ｍＬ、４×１０６個／ｍＬ、５×１０６個／ｍＬ、６×１０６個／ｍＬ、７×１０６個／ｍＬ、８×１０６個／ｍＬ、７×１０６個／ｍＬ、８×１０６個／ｍＬ、９×１０６個／ｍＬまたは１×１０７個／ｍＬである。
【００３５】
培養後に、細胞成分を分離除去することによって、胎児付属物由来組織細胞の培養上清を得ることができる。本開示において、培養上清とは、培養液から細胞成分を分離除去した上清そのものだけでなく、各種処理（例えば、遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、脱塩、保存等）を適宜施した培養上清もその範囲に含む。培養上清の処理方法の詳細は後述する。本開示において培養上清とは、細胞成分を含まない。このため、本開示における培養上清は、培養に用いられた胎児付属物由来組織細胞は含んでおらず、細胞医療用の組成物ではない。
【００３６】
本開示において、胎児付属物由来組織細胞はサイトカイン、ケモカイン、増殖因子等を培地中に分泌する。培養上清中に含まれるタンパク質としては、脳神経再生に重要なＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ（ＩＬ）−６、Ｃ−Ｘ−Ｃ  Ｍｏｔｉｆ  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  Ｌｉｇａｎｄ（ＣＸＣＬ）１、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８（ＩＬ−８ともいう）及びＣ−Ｃ  Ｍｏｔｉｆ  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  Ｌｉｇａｎｄ（ＣＣＬ）２（ＭＣＰ−１ともいう）があげられる。
【００３７】
本開示において、胎児付属物由来組織細胞の培養上清中にはさらに以下の１種又は２種以上のタンパク質が含まれてもよい：
ＴＮＦ  Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  Ｍｅｍｂｅｒ  １４（ＬＩＧＨＴともいう），Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ（ＩＬ）−１ａ，ＩＬ−１ｂ，ＩＬ−２，ＩＬ−３，ＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−７，ＩＬ−１０，ＩＬ−１２ｐ４０／７０，ＩＬ−１３，ＩＬ−１５，ＩＬ−１６，Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ（ＩＦＮ）−ｇ，Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ  （ＴＮＦ）−ａ，ＴＮＦ−ｂなどのサイトカイン；
Ｃ−Ｘ−Ｃ  Ｍｏｔｉｆ  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  Ｌｉｇａｎｄ（ＣＸＣＬ）１／２／３（ＧＲＯａ／ｂ／ｇともいう），ＣＸＣＬ６，ＣＸＣＬ９（ＭＩＧともいう），ＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０ともいう），ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ−１ともいう），ＣＸＣＬ１３，Ｃ−Ｃ  Ｍｏｔｉｆ  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  Ｌｉｇａｎｄ（ＣＣＬ）１，ＣＣＬ４，ＣＣＬ５，ＣＣＬ７，ＣＣＬ８，ＣＣＬ１１，ＣＣＬ１３，ＣＣＬ１５，ＣＣＬ１７，ＣＣＬ１８，ＣＣＬ２０（ＬＡＲＣともいう），ＣＣＬ２２，ＣＣＬ２３，ＣＣＬ２４，ＣＣＬ２６，Ｃ−Ｘ３−Ｃ  Ｍｏｔｉｆ  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  Ｌｉｇａｎｄ（ＣＸ３ＣＬ）１（ＦＫＮともいう）などのケモカイン；
Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ，Ｂｒａｉｎ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｆａｃｔｏｒ（ＢＤＮＦ），Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ），Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＦＧＦ）−４，ＦＧＦ−６，ＦＧＦ−７，ＦＧＦ−９，Ｆｍｓ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅ  ３  Ｌｉｇａｎｄ（ＦＬＴ−３Ｌ），Ｇｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｆａｃｔｏｒ（ＧＤＮＦ），Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  Ｃｏｌｏｎｙ−Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ（ＧＭ−ＣＳＦ），Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  Ｃｏｌｏｎｙ−Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ（Ｇ−ＣＳＦ），  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ），Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＩＧＦ）−１，Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＧＦＢＰ）−２，ＩＧＦＢＰ−１，ＩＧＦＢＰ−４，ＩＧＦＢＰ−３，Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＰＤＧＦ）−ＢＢ，Ｐｌａｃｅｎｔａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＰＬＧＦ），Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＴＧＦ）−ｂ１，ＴＧＦ−ｂ２，ＴＧＦ−ｂ３，Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ（ＴＰＯ），Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ），Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  Ｃｏｌｏｎｙ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ（Ｍ−ＣＳＦ），Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ（ＮＴ）−３，ＮＴ−４，  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）−Ａなどの増殖因子／関連因子；
Ｌｅｐｔｉｎ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ），  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ（ＭＩＦ），Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ（ＯＰＮ），Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ（ＯＰＧ），Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ  Ｍ（ＯＳＭ），  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ（ＴＩＭＰ）−１，ＴＩＭＰ−２などのその他メディエーターなど。
【００３８】
本開示において、胎児付属物由来組織細胞の培養上清中に含まれうる因子は以下の点で神経再生に重要である。本開示に係る培養上清はこれらの因子の一部又は全部を含み、脳または中枢神経の再生に適している（Ｂｏｒｕｃｚｋｏｗｓｋｉら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ  ．２０１９  ２０，２４３３；Ｗａｔｓｏｎら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０２０  ７１５，１３４５３３；Ｗａｎｇら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０１７  ８，２６；  Ｂａｂａら、ＰＬＯＳ  ＯＮＥ  ２０１９  １４（９）  ｅ０２２１１１１；Ｗａｎｇら、Ａｃｔａ  Ｍｅｄｉｃａ  Ｏｋａｙａｍａ  ２０１２  ６６（６）  ４２９など）。：
a)  神経前駆細胞の増殖・生存：ＢＤＮＦ，ＣＣＬ５，ＣＸＣＬ１，ＣＸＣＬ７，ＣＸＣＬ８，ＣＸ３ＣＬ１，ＥＧＦ，ＦＧＦ−９，Ｇ−ＣＳＦ，ＩＧＦ−１，ＩＬ−６，ＯＰＮ等
ｂ）神経前駆細胞の分化・成熟：ＢＤＮＦ，  ＣＣＬ１１，ＣＸＣＬ１，ＣＸＣＬ７，ＣＸＣＬ９，ＣＸＣＬ１２，ＣＸ３ＣＬ１，ＦＧＦ−４，ＦＧＦ−９，ＧＤＮＦ，ＧＭ−ＣＳＦ，ＩＬ−１ｂ，ＬＩＦ，ＯＰＮ，ＳＣＦ，ＴＧＦ−ｂ３等
ｃ）神経前駆細胞の遊走：ＣＣＬ２，ＣＣＬ１１，ＣＣＬ２０，ＣＸＣＬ１，ＣＸＣＬ７，ＣＸＣＬ８，ＣＸＣＬ１２，ＥＧＦ，ＩＧＦ−１，等
ｄ）神経栄養：ＧＤＮＦ，ＮＧＦ，ＮＴ−４／５等
ｅ）アストロサイトの活性化等：ＢＤＮＦ，ＩＦＮ−ｇ，ＩＬ−１ａ，ＩＬ−１ｂ等
ｆ）ミクログリア細胞の活性化等：ＣＣＬ１７，ＣＸＣＬ１０，Ｌｅｐｔｉｎ等
ｇ）オリゴデンドロサイトの再生等：ＣＸＣＬ１，ＣＸＣＬ７，ＣＸＣＬ８，ＣＸＣＬ１２，ＣＸ３ＣＬ１，ＥＧＦ，Ｍ−ＣＳＦ，ＮＴ−４，ＩＧＦＢＰ−４等
ｈ）血管新生：Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ、ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ５，ＣＸＣＬ６，ＣＸＣＬ７，ＣＸＣＬ８，Ｇｒｏａ／ｂ／ｃ，ＨＧＦ、ＩＧＦ−１、ＩＬ−６、ＶＥＧＦ，ＳＣＦ等
ｉ）抗炎症：ＣＣＬ４，ＩＬ−１０，ＩＬ−１３，ＴＧＦ−ｂ２等
【００３９】
本開示において、胎児付属物由来組織細胞の培養上清であるサイトカイン及びケモカイン（及び増殖因子等）の混合物は、胎児付属物由来組織細胞培養上清の一部として又は胎児付属物由来組織細胞培養上清から単離されたサイトカイン及びケモカイン（及び増殖因子等）の混合物として使用され得る。胎児付属物由来組織細胞培養上清から単離されたサイトカイン及びケモカイン（及び増殖因子等）の混合物中、サイトカイン及びケモカイン（及び増殖因子等）の一部を１又は複数の対応する遺伝子組み換え等のサイトカイン及びケモカイン（及び増殖因子等）で置き換え、または対応する遺伝子組み換え等のサイトカイン及びケモカイン（及び増殖因子等）を添加してもよい。
【００４０】
４．脳神経障害治療剤
本開示に係る脳神経障害治療剤は、胎児付属物由来組織細胞の培養上清を含有することにより、脳神経障害に対して神経組織を再生する効果を奏する。この効果の程度は、従来の臍帯血幹細胞等の移植の効果の一部または全部を代替しうる。また、本開示に係る脳神経障害治療剤は、驚くべきことに、脳室下帯の神経前駆細胞の増殖、脳神経障害部位へのホーミング、脳神経傷害部位での神経細胞の分化・成熟を促進することにより、脳神経の神経組織一般に対し広く一般的な神経再生効果を奏する。このため、本開示に係る脳神経障害治療剤は、特定の脳神経障害に限定されず、広範囲の脳神経障害に対して脳神経再生促進剤として脳神経障害の治療、症状の軽減等に用いることが可能である。本発明の脳神経障害治療剤は、脳神経障害の発症前であるために、当該脳神経障害への罹患が未知の段階であっても、対象への投与により対象内における脳神経障害の進行を有効に抑制できる。このため、本開示に係る脳神経障害治療剤を習慣的に用いることにより、多岐に渡る脳神経障害を発症前に治療し、発症の予防、遅延又は軽減することも可能である。すなわち、本開示において「治療」の範囲には、脳神経障害による症状や異常を根治する処置だけでなく、根治に至らないまでも症状や異常を軽減させる、あるいは処置をしない場合に比べて遅らせる処置も含まれ、さらに、発症の予防、遅延又は軽減することも含まれる。
【００４１】
本開示に係る脳神経障害治療剤は、神経再生を促進することから、多岐にわたる脳神経障害に適用することができる。脳神経障害としては、例えば、遺伝性疾患ではない脳神経障害である。本開示に係る脳神経障害治療剤は、非限定的に、ジスキネジア（レボドパ誘発性ジスキネジア、慢性及び遅発性ジスキネジア、並びに口腔顔面ジスキネジア）、下肢静止不能症候群（薬剤誘発性及び特発性）、薬物誘発性ジストニア、舞踏病（ハンチントン病、毒素誘発性舞踏病、シデナム（Ｓｙｄｅｎｈａｍ）舞踏病、妊娠舞踏病、ウィルソン病、薬物誘発性舞踏病、並びに代謝性及び内分泌系舞踏病）、顔面けいれん（運動性、音声性、単純性、複雑性及びトゥレット症候群など）、ジストニア（急性、全身性、限局性、分節性、性的、中間性、心因性及び急性ジストニー反応など）、Ｓｏｄｅｍｙｔｏｐｉｃパーキンソン病、常同性運動障害（自閉症、遺伝性及び小児性関連運動障害など）、強迫性障害、ナルコレプシー（脱力発作など）、伝達性海綿状脳症（クロイツフェルト・ヤコブ病及びクールーなど）、認知症（アルツハイマー、レビー小体型認知症、脳血管性認知症、ピック病及びアルコール性認知症など）、神経有棘赤血球症、発作及びけいれん、アテトーシス（ハンチントン病、呼吸停止、新生児黄疸及び脳卒中関連など）、及び脳性小児麻痺があげられる。
【００４２】
ある実施形態では、本開示に係る脳神経障害治療剤により治療する脳障害、例えば脳性小児麻痺の徴候又は症状は、運動機能障害、言語若しくは発話機能障害、歩行若しくは移動機能障害(例えば、歩行速度の低下)、機能障害性筋力、機能障害性筋緊張、異常反射、異常協調、痙直、不随意運動、異常歩行、異常バランス、筋肉量低下、障害性骨格発達又は障害性筋肉発達である。いくつかの実施形態では、本開示に係る脳神経障害治療剤により治療する脳障害、例えば脳性小児麻痺の徴候又は症状は、手の力の障害、手先の器用さの障害、歩行速度の障害又は歩行障害である。いくつかの実施形態では、本開示に係る脳神経障害治療剤により治療する脳障害、例えば脳性小児麻痺の徴候又は症状は、感覚運動障害又は感覚運動機能の障害、例えば、それだけに限らないが、運動失調、全身制御障害、協調若しくはバランス障害、身体感覚の障害、固有受容性感覚の障害、持久力障害、手の機能の障害、手の力の障害、細かな手の協調の喪失若しくは障害、反射亢進、握力の障害、筋力低下、筋緊張障害、運動範囲障害、痙直、力の障害/衰弱、振戦、四肢機能の障害、上肢機能障害、下肢機能障害、下肢筋力の障害、歩行障害(例えば、歩行速度低下)、立つ能力の障害、発話障害(例えば、構音障害)、顎機能の障害、咀嚼の障害、及び顎関節の障害、器用さの障害、反射、又は本明細書に記載する若しくは当技術分野で既知の任意の他の感覚運動機能である。
【００４３】
前記脳神経障害治療剤が投与される対象は、典型的には、標的組織に損傷を有するヒト患者であるが、ヒト以外の哺乳動物（ペット動物、家畜、実験動物を含む。具体的には例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、サル、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ等）への適用も想定される。
【００４４】
前記脳神経障害の発生する部位は、特に限定はされない。前記疾患の発生する部位は、脳全体又は一部であり、脳には前脳および脳幹があり、前脳には大脳及び間脳、脳幹には中脳および菱脳がある。大脳には、嗅脳、へんとう、線条体、海馬および大脳新皮質などがあり、間脳には視床上部、視床、視床下部、視床腹部、下垂体、松果体および第三脳室などがある。中脳には、中脳蓋、大脳脚、視蓋前域および中脳水道などがあり、菱脳には、橋、小脳および延髄などがある。前記脳神経障害の発生する部位は、これらの部位のいずれであってもよい。
【００４５】
本開示に係る脳神経障害治療剤を用いた治療方法は、胎児付属物由来組織細胞培養上清を経鼻（鼻腔内）投与して、脳の損傷部を修復すること、を含む。本治療方法によれば、脳性小児麻痺等の脳神経障害により損傷を受けた領域を低侵襲性で且つ効果的に回復させることができる。
【００４６】
５．製造方法
本開示においては、
（ａ）胎児付属物由来組織細胞を培養する工程、及び
（ｂ）前記胎児付属物由来組織細胞の培養上清を回収する工程、
を含む、脳神経障害治療剤の製造方法も提供される。この製造方法は、前記回収された培養上清に遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、および脱塩の中から選択される一つ以上の処理を施す工程をさらに含んでもよい。このような工程を含むことにより、脳神経障害治療剤の取り扱いや保存、運搬がより容易になる。また、前記製造方法は、前記回収された培養上清に、追加の成分を添加する工程をさらに含んでいてもよい。そのような追加の成分の添加により、脳神経障害治療用組成物全体の物性を変化させ、その特性を向上することが可能である。また、前記製造方法は、胎児付属物由来組織の摘出する工程、及び胎児付属物由来組織から胎児付属物由来組織細胞体細胞を調製する工程をさらに含んでいてもよい。各々の工程ならびに追加の成分等については、本開示に係る脳神経障害治療剤の説明において記載した事項がそのまま当てはまる。前記回収された培養上清に遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、および脱塩の中から選択される一つ以上の処理を施す工程と、前記回収された培養上清に、追加の成分を添加する工程の両方を含む場合には、両工程はどちらを先に行ってもよく、また可能な場合には同時並行して行ってもよい。
【００４７】
上記工程（ｂ）においては、胎児付属物由来組織細胞培養上清を回収する。例えば、スポイトやピペットなどで培養液を吸引して回収することができる。回収した培養上清はそのまま或いは一以上の処理を経た後に本開示に係る脳神経障害治療剤の有効成分として使用される。ここでの処理として、遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、製剤化、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、脱塩、保存（例えば、４℃  、−８０℃）  を例示することができる。尚、胎児付属物由来組織細胞の培養上清は、複雑高度な精製をしなくとも、所期の作用を示す。このため、本開示に係る脳神経障害治療剤は簡便な工程で製造できる。複雑な精製工程を要しないことは、精製に伴う活性の低下を回避できる点においても有利である。
【００４８】
本開示に係る胎児付属物由来組織細胞培養上清は、複数のドナーからの胎児付属物由来組織細胞の由来であってもよい。すなわち、複数のドナーからの胎児付属物由来組織細胞を混合して培養し、培養上清を回収してもよく、個々のドナー由来の胎児付属物由来組織細胞の培養上清を混合してもよく、一以上の処理（遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、製剤化、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、脱塩、保存）を経た後に、個々のドナー由来の胎児付属物由来組織細胞の培養上清を混合してもよい。但し、本開示に係る胎児付属物由来組織細胞培養上清は、混入するウィルス等による感染のリスクがあるため、大多数のドナーからの胎児付属物由来組織細胞を混合して培養しないほうが好ましい。尚、複数のドナーからの胎児付属物由来組織細胞の培養上清は、均質な脳神経障害治療剤として製造できる点において有利である。
【００４９】
＜胎児付属物由来組織細胞培養上清の濃縮方法＞
本開示に係る脳神経障害治療用組成物は、製剤化されたものであってもよい。製剤化
のための胎児付属物由来組織細胞培養上清の濃縮方法としては、培養上清の濃縮に通常用いられている方法を適用することができる。濃縮方法の例としては、例えば、以下の二つの方法を挙げることができる。
１）スピンカラム濃縮法
培養上清をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔｓ−１０Ｋ（ミリポア社製）を用いて濃縮
する。具体的な操作手順は次の通りである。
（ｉ）  培養上清（最大１５ｍＬ）  をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔｓ−１０Ｋへ投入し、×  ４０００ｇで約６０分間遠心し、２００μＬまで濃縮する。
（ｉｉ）  上記チューブへ培養上清と同量の滅菌ＰＢＳを投入し、再度×  ４０００ｇで約６０分間遠心し、ベース溶液をＰＢＳへ置換する。
（ｉｉｉ）  得られた溶液２００μＬをマイクロテストチューブへ回収し、濃縮胎児付属物由来組織細胞培養上清とする。
【００５０】
２）エタノール沈殿濃縮法
培養上清をエタノール沈殿法により濃縮する。具体的な操作手順は次の通りである。
（ｉ）  培養上清５ｍＬに対し１００％エタノール４５ｍＬを加え、混和し、−２０℃  で６０分間放置する。
（ｉｉ）  ４℃  、×  １５０００ｇで１５分間遠心する。
（ｉｉｉ）  上澄みを除去し、９０％エタノール１０ｍＬを加え、よく攪拌する。
（ｉｖ）  ４℃  、×  １５０００ｇで５分間遠心する。
（ｖ）  上澄みを除去し、得られたペレットを滅菌水５００μＬに溶解し、マイクロテストチューブへ回収し、濃縮胎児付属物由来組織細胞培養上清とする。
【００５１】
＜胎児付属物由来組織細胞培養上清の凍結乾燥方法＞
また本開示に係る脳神経障害治療剤における胎児付属物由来組織細胞培養上清は、凍結乾燥されたものであってもよい。これにより、良好な保存安定性が得られる。胎児付属物由来組織細胞培養上清の凍結乾燥方法としては、培養上清の凍結乾燥に通常用いられている方法を適用することができる。凍結乾燥方法の例としては、例えば、以下の方法を挙げることができる。凍結乾燥した培養上清は粉末製剤として、または水等の適切な溶剤等で再構成して使用することができる。
（ｉ）上記方法で得られた胎児付属物由来組織細胞培養上清又は濃縮胎児付属物由来組織細胞培養上清を−８０℃で２時間から半日凍結する。
（ｉｉ）凍結後、サンプルチューブの蓋を開放し、凍結乾燥機へセットする。
（ｉｉｉ）１〜２日間凍結乾燥を行う。
（ｉｖ）得られたサンプルを凍結乾燥胎児付属物由来組織細胞培養上清とする（−８０℃で保存可能）。
【００５２】
６．医薬組成物
適用される被検体の状態に応じて、期待される治療効果が維持されることを条件として、本開示に係る脳神経障害治療剤は、医薬組成物として他の成分を追加的に含んでもよい。追加的に含まれ得る成分の一例は以下の通りである。
（ｉ）生体吸収性材料
有機系生体吸収性材料としてヒアルロン酸、コラーゲン、フィブリノーゲン（例えばボルヒール（登録商標））等を使用することができる。
【００５３】
（ｉｉ）ゲル化材料
ゲル化材料は、生体親和性が高いものを用いることが好ましく、ヒアルロン酸、コラー
ゲン又はフィブリン糊等を用いることができる。ヒアルロン酸、コラーゲンとしては種々
のものを選択して用いることができるが、本開示に係る脳神経障害治療剤の適用目的（適用組織）に適したものを採用することが好ましい。用いるコラーゲンは可溶性（酸可溶性コラーゲン、アルカリ可溶性コラーゲン、酵素可溶性コラーゲン等）であることが好ましい。
【００５４】
（ｉｉｉ）その他
製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）  を含有させることもできる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、Ｄ−マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。無痛化剤としてはベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。抗生物質、ｐＨ調整剤、成長因子（例えば、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）  、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ））等を含有させることにしてもよい。
【００５５】
本開示に係る医薬組成物の最終的な形態は特に限定されない。形態の例は液体状（液状、ゲル状など）及び固体状（粉状、細粒、顆粒状など、凍結乾燥製剤を含む）である。本開示に係る医薬組成物は、吸入に適した形態を有していてもよく、例えば、ネブライザーやディフューザーによって霧状に散布可能な液体の形態を有していてもよい。脳神経障害の関係部位が脳であり、血液脳関門の存在を考慮すると、本開示に係る脳神経障害治療用組成物は経鼻投与、脳室内投与または髄腔内投与が可能な形態であることが望ましい。例えばスプレー状あるいは粉末状の形態で経鼻投与を行ってもよい。胎児付属物由来組織細胞の培養上清は、事前の準備や保存の点において、胎児付属物由来組織細胞や胎児付属物由来幹細胞などを用いる場合よりも有利であり、脳神経障害の急性期や亜急性期の治療に特に適するといえる。また、細胞成分を含まず、免疫拒絶の問題を克服し得るという点においても、胎児付属物由来組織細胞の培養上清の有用性は極めて高い。
【００５６】
とはいえ、実施形態によっては、本開示に係る脳神経障害治療剤は胎児付属物由来組織細胞の培養上清に加えて胎児付属物由来組織細胞、胎児付属物由来幹細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、又は間葉系幹細胞等を含むもの、あるいはこれらの幹細胞等と併用であってもよい。このような幹細胞等を追加的に用いることにより、治療効果が向上する場合がある。
【００５７】
本開示においては、本開示に係る脳神経障害治療剤を、脳神経障害発症前の対象に、前記脳神経障害の発症を抑えるために有効な量投与することを含む、前記対象において脳神経障害発症前に前記脳神経障害の発症を抑える方法、も提供される。前記対象は、ヒト、またはヒト以外の哺乳動物（ペット動物、家畜、実験動物を含む。具体的には例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、サル、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ等）であってもよい。前記対象は、脳神経障害を発病するリスクを有すると判定された対象であってもよい。そのようなリスクは、遺伝子診断、家系分析等により判定することが出来る。例えば、特定の遺伝子における特定のアレル、ＳＮＰの存在が、特定の疾患への罹患確率に相関することが統計的に明らかにされている例がある。
【００５８】
本開示に係る脳神経障害治療剤の投与量は、期待される治療効果が維持されることを条件として限定されないが、例えば、未処理の培養上清の量に換算して、０．１ｍＬ／ｋｇ／日〜１００ｍＬ／ｋｇ／日、１ｍＬ／ｋｇ／日〜１００ｍＬ／ｋｇ／日又は５ｍＬ／ｋｇ／日〜１００ｍＬ／ｋｇ／日であり、未処理の培養上清のタンパク質量に換算して、０．１  ｍｇ／ｋｇ／日〜  １０００  ｍｇ／ｋｇ／日であり、また、１ｍｇ／ｋｇ／日〜  １００  ｍｇ／ｋｇ／日であってもよい。また、投与の方法は特に制限されない。例えば、前記脳神経障害治療剤の投与は、非経口投与であることが好ましく、非経口投与としては、全身性投与であっても局所投与であってもよい。前記脳神経障害治療剤の投与方法の例としては、期待される治療効果が維持されることを条件として限定されないが、例えば、静脈内投与、動脈内投与、門脈内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、経肺投与（経肺吸収）、脳室内投与、髄腔内投与及び経鼻投与等を挙げることができる。中でも、経鼻投与等は、低侵襲性であり、好ましい。また、脳室内投与、髄腔内投与及び経鼻投与によれば、血液脳関門の通過可能性について懸念する必要が無いため、脳神経障害の治療においては特に有効である。投与スケジュールとしては例えば一日一回〜数回、二日に一回、或いは三日に一回などを採用できる。投与スケジュールの作成においては、対象の性別、年齢、体重、病態などを考慮することができる。
【００５９】
７．脳神経再生促進剤
本開示に係る胎児付属物由来組織細胞培養上清は脳神経再生促進剤である。「脳神経再生」とは、脳における神経前駆細胞の増加、分化・成熟等による神経の修復又は神経の発生過程で生じる様々な現象のうち少なくとも一つを示していればよい。また、その結果として、神経再生とは、本来の神経の機能が完全又は部分的に回復する現象を含むことが好ましい。効率的な神経再生が達成されたかどうかは、公知の方法により確認可能である。例えば、神経損傷があり神経再生促進剤が投与された患者又は畜患と、神経損傷があり神経再生促進剤が投与されていない患者又は畜患とを比較して、神経再生促進剤が投与された患者又は畜患のほうで、損傷した神経の機能の回復の程度が高い場合、効率的な神経再生が達成されたと判断できる。神経の機能の回復は、後述の実施例に示すように、刺激への反応や運動機能の回復等を指標に評価できる。運動機能の回復は例えば、ローターロッド試験（Ｏｈら、Ｅｘｐ．  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  ２０１８  ５０（４），  ２２；  Ｋｏｓｓａｔｚら、Ｆｒｏｎｔ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２０１８  ９，  ３７６）、Ｙ−ｍａｚｅ試験（Ｍｉｅｄｅｌら、Ｊ．  Ｖｉｓ．  Ｅｘｐ．  ２０１７（１２３）；  Ｓａｒｎｙａｉら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  ２０００  ９７（２６），  １４７３１）、ハンギングワイヤ試験（Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓら、Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．２０１４（８５））など、公知な方法で調べることができる。
【００６０】
神経再生は、欠損が生じた神経由来の細胞であって、治療対象部位にもともと存在する細胞（内在性の細胞）によるものであってもよいし、例えば神経再生促進剤とともに移植された細胞（外来性の細胞）によるものであってもよい。これらの細胞としては、神経細胞、神経前駆細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、造血幹細胞等を挙げることができる。
【００６１】
本開示に係る胎児付属物由来組織細胞培養上清は脳神経再生促進剤であり、脳神経前駆細胞増殖・生存促進剤でありうる。「脳神経前駆細胞増殖・生存促進剤」とは、脳における神経前駆細胞の増殖又は生存維持を促進する薬剤である。効率的な脳神経前駆細胞の増殖又は生存維持が達成されたかどうかは、公知の方法により確認可能である。例えば、後述の実施例に示すように、脳神経前駆細胞増殖・生存促進剤を添加することにより、脳もしくは脳由来またはこれらに相当する神経前駆細胞の増殖又は生存が亢進することを観察することにより評価できる。神経前駆細胞は生体から採取した細胞でもよく、ｉＰＳ等の幹細胞から分化させた細胞でもよく、細胞株（例えば、Ａ１７２，Ｂ６５，Ｃ６，ＫＳ−１，Ｎ２Ａ，ＰＣ１２，ＳＨ−ＳＹ５Ｙ，ＳＫＮ−ＢＥ２，Ｔ９８Ｇ，Ｕ２５１，Ｕ８７，ＹＨ−１３）を使用してもよい。
【００６２】
本開示に係る胎児付属物由来組織細胞培養上清は脳神経再生促進剤であり、脳神経前駆細胞ホーミング促進剤でありうる。「脳神経前駆細胞ホーミング促進剤」とは、脳障害部位への神経前駆細胞の遊走を促進する薬剤である。効率的な脳神経前駆細胞のホーミングが達成されたかどうかは、公知の方法により確認可能である。例えば、神経損傷があり脳神経前駆細胞ホーミング促進剤が投与された患者又は畜患と、神経損傷があり脳神経前駆細胞増殖促進剤が投与されていない患者又は畜患とを比較して、脳神経前駆細胞ホーミング促進剤が投与された患者又は畜患のほうで、脳神経前駆細胞の、海馬の顆粒細胞下帯や脳室下帯からの脳障害部位への移動が多く観察される場合、効率的な脳神経前駆細胞のホーミングが達成されたと判断できる。また、神経前駆細胞などの細胞を併用して投与した場合、投与した細胞が脳障害部位へ集積することによっても同様に判断できる。脳神経前駆細胞のホーミングは、後述の実施例に示すように、脳神経前駆細胞のマーカー（例えば、ＤＣＸ  （ｄｏｕｂｌｅｃｏｒｔｉｎ）、ＳＯＸ２（ＳＲＹ  （ｓｅｘ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  Ｙ）−ｂｏｘ  ２）、ＰＡＸ６（ｐａｉｒｅｄ  ｂｏｘ  ６））を指標に評価できる。
【００６３】
本開示に係る胎児付属物由来組織細胞培養上清は脳神経再生促進剤であり、脳神経前駆細胞分化・成熟促進剤でありうる。「脳神経前駆細胞分化・成熟促進剤」とは、脳における神経前駆細胞が軸索を伸展して、神経細胞への分化・成熟することを促進する薬剤である。
効率的な脳神経前駆細胞の分化・成熟が達成されたかどうかは、公知の方法により確認可能である。例えば、後述の実施例に示すように、脳神経前駆細胞分化・成熟促進剤を添加することにより、脳または脳由来の神経前駆細胞が軸索を伸展することを観察する、あるいは進展した軸索の長さを測定することにより評価できる。神経前駆細胞は生体から採取した細胞でもよく、ｉＰＳ等の幹細胞から分化させた細胞でもよく、細胞株（例えば、Ａ１７２，Ｂ６５，Ｃ６，ＫＳ−１，Ｎ２Ａ，ＰＣ１２，ＳＨ−ＳＹ５Ｙ，ＳＫＮ−ＢＥ２，Ｔ９８Ｇ，Ｕ２５１，Ｕ８７，ＹＨ−１３）を使用してもよい。
【００６４】
本開示に係る脳神経再生促進剤はサイトカイン、ケモカイン等を含む。サイトカイン、ケモカイン等としては、脳神経再生に重要なＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ（ＩＬ）−６、Ｃ−Ｘ−Ｃ  Ｍｏｔｉｆ  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  Ｌｉｇａｎｄ（ＣＸＣＬ）１、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８（ＩＬ−８ともいう）及びＣ−Ｃ  Ｍｏｔｉｆ  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  Ｌｉｇａｎｄ（ＣＣＬ）２（ＭＣＰ−１ともいう）があげられる。
【００６５】
本開示に係る脳神経再生促進剤はさらに以下の１種又は２種以上のタンパク質が含まれてもよい：
ＴＮＦ  Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  Ｍｅｍｂｅｒ  １４（ＬＩＧＨＴともいう），Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ（ＩＬ）−１ａ，ＩＬ−１ｂ，ＩＬ−２，ＩＬ−３，ＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−７，ＩＬ−１０，ＩＬ−１２ｐ４０／７０，ＩＬ−１３，ＩＬ−１５，ＩＬ−１６，Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ（ＩＦＮ）−ｇ，Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ  （ＴＮＦ）−ａ，ＴＮＦ−ｂなどのサイトカイン；
Ｃ−Ｘ−Ｃ  Ｍｏｔｉｆ  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  Ｌｉｇａｎｄ（ＣＸＣＬ）１／２／３（ＧＲＯａ／ｂ／ｇともいう），ＣＸＣＬ６，ＣＸＣＬ９（ＭＩＧともいう），ＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０ともいう），ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ−１ともいう），ＣＸＣＬ１３，Ｃ−Ｃ  Ｍｏｔｉｆ  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  Ｌｉｇａｎｄ（ＣＣＬ）１，ＣＣＬ４，ＣＣＬ５，ＣＣＬ７，ＣＣＬ８，ＣＣＬ１１，ＣＣＬ１３，ＣＣＬ１５，ＣＣＬ１７，ＣＣＬ１８，ＣＣＬ２０（ＬＡＲＣともいう），ＣＣＬ２２，ＣＣＬ２３，ＣＣＬ２４，ＣＣＬ２６，Ｃ−Ｘ３−Ｃ  Ｍｏｔｉｆ  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  Ｌｉｇａｎｄ（ＣＸ３ＣＬ）１（ＦＫＮともいう）などのケモカイン；
Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ，Ｂｒａｉｎ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｆａｃｔｏｒ（ＢＤＮＦ），Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ），Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＦＧＦ）−４，ＦＧＦ−６，ＦＧＦ−７，ＦＧＦ−９，Ｆｍｓ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅ  ３  Ｌｉｇａｎｄ（ＦＬＴ−３Ｌ），Ｇｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｆａｃｔｏｒ（ＧＤＮＦ），Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  Ｃｏｌｏｎｙ−Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ（ＧＭ−ＣＳＦ），Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  Ｃｏｌｏｎｙ−Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ（Ｇ−ＣＳＦ），  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ），Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＩＧＦ）−１，Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＧＦＢＰ）−２，ＩＧＦＢＰ−１，ＩＧＦＢＰ−４，ＩＧＦＢＰ−３，Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＰＤＧＦ）−ＢＢ，Ｐｌａｃｅｎｔａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＰＬＧＦ），Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＴＧＦ）−ｂ１，ＴＧＦ−ｂ２，ＴＧＦ−ｂ３，Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ（ＴＰＯ），Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ），Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  Ｃｏｌｏｎｙ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ（Ｍ−ＣＳＦ），Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ（ＮＴ）−３，ＮＴ−４，  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）−Ａなどの増殖因子／関連因子；
Ｌｅｐｔｉｎ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ），  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ（ＭＩＦ），Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ（ＯＰＮ），Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ（ＯＰＧ），Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ  Ｍ（ＯＳＭ），  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ（ＴＩＭＰ）−１，ＴＩＭＰ−２などのその他メディエーターなど。
【００６６】
本開示において、脳神経再生促進剤を調製するための培地は、海洋深層水を含むことができる。「海洋深層水」とは、一般的に深度２００メートルより深いところの海水であって、グリーンランド周辺において、塩分濃度差によって生じた「プルーム」と呼ばれる垂直に沈む地球規模の海流が始まりとなって、一度も大気に触れる事なく、何世紀もの歳月をかけて地球を回っているといわれる海水である。この海洋深層水は、太陽光線がほとんど届かず、しかも低温高圧の状態にあるので、細菌が少なく、無機栄養塩（ミネラル）等を豊富に含んでいる。海洋深層水を含むことにより、培養上清の分泌タンパク質の量を調節し、海洋深層水を含まない場合と比較して、より高活性の脳神経障害治療剤を調製することができる。培地中に含まれる海洋深層水の濃度（ｖ／ｖ）は、例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または８０％以上であり、また９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％または１０％以下であり、１〜８５％、５〜８５％、１０％〜８５％、１５％〜８５％、２０％〜８５％、２５％〜８５％、３０％〜８５％、４０％〜８５％、５０％〜８５％、６０％〜８５％、７０％〜８５％、８０％〜８５％、１〜７５％、５〜７５％、１０％〜７５％、１５％〜７５％、２０％〜７５％、２５％〜７５％、３０％〜７５％、４０％〜７５％、５０％〜７５％、６０％〜７５％、７０％〜７５％、１〜４５％、５〜４５％、１０％〜４５％、１５％〜４５％、２０％〜４５％、２５％〜４５％、３０％〜４５％、４０％〜４５％、１〜１０％または５〜１０％の範囲であり、７３％または８１％である。
【００６７】
脳神経再生促進剤である、胎児付属物由来組織細胞の培養上清を得るための培養時間としては、例えば、５時間〜７日間、１日〜６日間、１日〜５日間、１日〜４日間、１日〜３日間または１日〜２日間であってもよく、０．５日間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間または７日間である。培養温度は例えば、３６℃〜３８℃、例えば３７℃、であり、ＣＯ２濃度は４〜６％、例えば５％である。また、培養は、例えば非接着性条件下での三次元培養、例えば浮遊培養（例えば、分散培養、凝集浮遊培養など）により行ってもよい。
【００６８】
脳神経再生促進剤である、胎児付属物由来組織細胞の培養上清を得るための、培養開始時の胎児付属物由来組織細胞の密度としては、例えば、１×１０４〜１×１０７個／ｍＬ、５×１０４〜５×１０６個／ｍＬ、１×１０５〜５×１０６個／ｍＬ、２×１０５〜５×１０６個／ｍＬ、５×１０５〜５×１０６個／ｍＬまたは１×１０６〜５×１０６個／ｍＬであってもよく、２×１０５個／ｍＬ、３×１０５個／ｍＬ、４×１０５個／ｍＬ、５×１０５個／ｍＬ、６×１０５個／ｍＬ、７×１０５個／ｍＬ、８×１０５個／ｍＬ、９×１０５個／ｍＬ、１×１０６個／ｍＬ、２×１０６個／ｍＬ、３×１０６個／ｍＬ、４×１０６個／ｍＬ、５×１０６個／ｍＬ、６×１０６個／ｍＬ、７×１０６個／ｍＬ、８×１０６個／ｍＬ、７×１０６個／ｍＬ、８×１０６個／ｍＬ、９×１０６個／ｍＬまたは１×１０７個／ｍＬである。
【００６９】
本開示に係る脳神経再生促進剤は、神経再生を促進することから、多岐にわたる脳神経障害に適用することができる。脳神経障害としては、例えば、遺伝性疾患ではない脳神経障害である。本開示に係る脳神経障害治療剤は、非限定的に、ジスキネジア（レボドパ誘発性ジスキネジア、慢性及び遅発性ジスキネジア、並びに口腔顔面ジスキネジア）、下肢静止不能症候群（薬剤誘発性及び特発性）、薬物誘発性ジストニア、舞踏病（ハンチントン病、毒素誘発性舞踏病、シデナム（Ｓｙｄｅｎｈａｍ）舞踏病、妊娠舞踏病、ウィルソン病、薬物誘発性舞踏病、並びに代謝性及び内分泌系舞踏病）、顔面けいれん（運動性、音声性、単純性、複雑性及びトゥレット症候群など）、ジストニア（急性、全身性、限局性、分節性、性的、中間性、心因性及び急性ジストニー反応など）、Ｓｏｄｅｍｙｔｏｐｉｃパーキンソン病、常同性運動障害（自閉症、遺伝性及び小児性関連運動障害など）、強迫性障害、ナルコレプシー（脱力発作など）、伝達性海綿状脳症（クロイツフェルト・ヤコブ病及びクールーなど）、認知症（アルツハイマー、レビー小体型認知症、脳血管性認知症、ピック病及びアルコール性認知症など）、神経有棘赤血球症、発作及びけいれん、アテトーシス（ハンチントン病、呼吸停止、新生児黄疸及び脳卒中関連など）、及び脳性小児まひがあげられる。
【００７０】
ある実施形態では、本開示に係る脳神経再生促進剤により治療する脳障害、例えば脳性小児麻痺の徴候又は症状は、運動機能障害、言語若しくは発話機能障害、歩行若しくは移動機能障害(例えば、歩行速度の低下)、機能障害性筋力、機能障害性筋緊張、異常反射、異常協調、痙直、不随意運動、異常歩行、異常バランス、筋肉量低下、障害性骨格発達又は障害性筋肉発達である。いくつかの実施形態では、本開示に係る脳神経再生促進剤により治療する脳障害、例えば脳性小児麻痺の徴候又は症状は、手の力の障害、手先の器用さの障害、歩行速度の障害又は歩行障害である。いくつかの実施形態では、本開示に係る脳神経再生促進剤により治療する脳障害、例えば脳性小児麻痺の徴候又は症状は、感覚運動障害又は感覚運動機能の障害、例えば、それだけに限らないが、運動失調、全身制御障害、協調若しくはバランス障害、身体感覚の障害、固有受容性感覚の障害、持久力障害、手の機能の障害、手の力の障害、細かな手の協調の喪失若しくは障害、反射亢進、握力の障害、筋力低下、筋緊張障害、運動範囲障害、痙直、力の障害/衰弱、振戦、四肢機能の障害、上肢機能障害、下肢機能障害、下肢筋力の障害、歩行障害(例えば、歩行速度低下)、立つ能力の障害、発話障害(例えば、構音障害)、顎機能の障害、咀嚼の障害、及び顎関節の障害、器用さの障害、反射、又は本明細書に記載する若しくは当技術分野で既知の任意の他の感覚運動機能である。
【００７１】
本開示においては、
（ａ）胎児付属物由来組織細胞を培養する工程、及び
（ｂ）前記胎児付属物由来組織細胞の培養上清を回収する工程、
を含む、脳神経再生促進剤の製造方法も提供される。この製造方法は、前記回収された培養上清に遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、および脱塩の中から選択される一つ以上の処理を施す工程をさらに含んでもよい。このような工程を含むことにより、脳神経再生促進剤の取り扱いや保存、運搬がより容易になる。また、前記製造方法は、前記回収された培養上清に、追加の成分を添加する工程をさらに含んでいてもよい。そのような追加の成分の添加により、脳神経再生促進用組成物全体の物性を変化させ、その特性を向上することが可能である。また、前記製造方法は、胎児付属物由来組織から胎児付属物由来組織細胞を調製する工程をさらに含んでいてもよい。各々の工程ならびに追加の成分等については、本開示に係る脳神経障害治療剤の説明において記載した事項がそのまま当てはまる。前記回収された培養上清に遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、および脱塩の中から選択される一つ以上の処理を施す工程と、前記回収された培養上清に、追加の成分を添加する工程の両方を含む場合には、両工程はどちらを先に行ってもよく、また可能な場合には同時並行して行ってもよい。
【００７２】
適用される被検体の状態に応じて、期待される治療効果が維持されることを条件として、本開示に係る脳神経再生促進剤は、医薬組成物として他の成分を追加的に含んでもよい。追加的に含まれ得る成分の一例は以下の通りである。
（ｉ）生体吸収性材料
有機系生体吸収性材料としてヒアルロン酸、コラーゲン、フィブリノーゲン（例えばボルヒール（登録商標））等を使用することができる。
【００７３】
（ｉｉ）ゲル化材料
ゲル化材料は、生体親和性が高いものを用いることが好ましく、ヒアルロン酸、コラーゲン又はフィブリン糊等を用いることができる。ヒアルロン酸、コラーゲンとしては種々のものを選択して用いることができるが、本開示に係る脳神経再生促進剤の適用目的（適用組織）に適したものを採用することが好ましい。用いるコラーゲンは可溶性（酸可溶性コラーゲン、アルカリ可溶性コラーゲン、酵素可溶性コラーゲン等）であることが好ましい。
【００７４】
（ｉｉｉ）その他
製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を含有させることもできる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、Ｄ−マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。無痛化剤としてはベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。抗生物質、ｐＨ調整剤、成長因子（例えば、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ））等を含有させることにしてもよい。
【００７５】
本開示に係る脳神経再生促進剤の医薬組成物の最終的な形態は特に限定されない。形態の例は液体状（液状、ゲル状など）及び固体状（粉状、細粒、顆粒状など、凍結乾燥製剤を含む）である。本開示に係る医薬組成物は、吸入に適した形態を有していてもよく、例えば、ネブライザーやディフューザーによって霧状に散布可能な液体の形態を有していてもよい。脳神経障害の関係部位が脳であり、血液脳関門の存在を考慮すると、本開示に係る脳神経再生促進用組成物は経鼻投与、脳室内投与または髄腔内投与が可能な形態であることが望ましい。例えばスプレー状あるいは粉末状の形態で経鼻投与を行ってもよい。胎児付属物由来組織細胞の培養上清は、事前の準備や保存の点において、胎児付属物由来組織細胞や胎児付属物由来幹細胞を用いる場合よりも有利であり、脳神経障害の急性期や亜急性期の治療に特に適するといえる。また、細胞成分を含まず、免疫拒絶の問題を克服し得るという点においても、胎児付属物由来組織細胞の培養上清の有用性は極めて高い。
【実施例】
【００７６】
次に実施例によって本発明を更に詳細に説明する。なお，本発明はこれにより限定されるものではない。
【００７７】
実施例１：胎児付属物由来組織細胞及び培養上清の調製
１）  ワルトン膠質由来間葉系細胞の調製
高知大学医学部附属病院産婦人科からインフォームドコンセントにて供与された、ヒト臍帯を７０％エタノールに数秒浸漬させ滅菌し、リン酸緩衝液（Ｄ−ＰＢＳ）を用い、周囲に付着した血液等を洗浄除去した。その後、臍帯を切開して臍静脈及び臍動脈を除去し、ワルトン膠質を臍帯周囲膜から切り離した。ワルトン膠質を細切後、１０ｃｍプラスチックシャーレ上に２ｇの組織片を並べた。組織片の上から細胞培養メッシュＣｅｌｌａｍｉｇｏ（登録商標）（ＴＳＵＢＡＫＩＭＯＴＯ  ＣＨＡＩＮ社製）を乗せ、ＭＥＭα（１０％  ＦＢＳ，１００ｕ／ｍＬ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ，１００μｇ／ｍＬ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含む）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。組織片から遊離及び増殖した接着性の細胞を２〜５回継代した細胞をワルトン膠質由来間葉系細胞とした。
【００７８】
２）羊膜由来間葉系細胞の調製
高知大学医学部附属病院産婦人科からインフォームドコンセントにて供与された、ヒト卵膜を７０％エタノールに数秒浸漬させ滅菌し、用手法により膜の剥離を行った。卵膜胎児側から１層目を羊膜として回収し、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−Ｅｏｓｉｎ染色により膜構造の確認を行った。［０．０５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ／０．２  ｍＭ  ＥＤＴＡ］溶液に浸漬させ、３７℃で１．５時間反応させて羊膜上皮組織を分散させた。残った羊膜結合織に対して［２．４ｍｇ／Ｌ  Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ、０．０ｌ  ｍｇ／ｍＬ  ＤＮａｓｅ］酵素溶液に浸漬させ、３７℃で１．５時間反応させて羊膜結合織を分散させた。羊膜結合織分散液は７０μｍセルストレーナーを通過させ、通過した液に対し遠心分離及び上清除去、Ｄ−ＰＢＳ再浮遊操作を２回繰り返して酵素溶液を除き、得られた細胞にＭＥＭα（１０％  ＦＢＳ，１００ｕ／ｍＬ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ，１００μｇ／ｍＬ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含む）を添加し、３７℃  、５％ＣＯ２下で培養した。増殖した細胞を２〜５回継代した細胞を羊膜由来間葉系細胞とした。
【００７９】
３）絨毛膜由来間葉系細胞
前記ヒト卵膜を７０％エタノールに数秒浸漬させ滅菌し、用手法により膜の剥離を行った。卵膜胎児側から２層目を絨毛膜結合織として回収し、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−Ｅｏｓｉｎ染色により膜構造の確認を行った。絨毛膜結合織に対して［２．４ｍｇ／Ｌ  Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ、０．０ｌ  ｍｇ／ｍＬ  ＤＮａｓｅ］酵素溶液に浸漬させ、３７℃  で１．５時間反応させて絨毛膜結合織を分散させた。絨毛膜結合織分散液は１００μｍセルストレーナーを通過させ、通過した液に対し遠心分離及び上清除去、Ｄ−ＰＢＳ再浮遊操作を２回繰り返した。さらに［０．０５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ／０．２  ｍＭ  ＥＤＴＡ］溶液に浸漬させ、３７℃で５分間反応後、ＭＥＭα（１０％  ＦＢＳ，１００ｕ／ｍＬ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ，１００μｇ／ｍＬ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含む）を添加し反応を停止させた。Ｔｒｙｐｓｉｎによる分散液は、７０μｍセルストレーナーを通過させ、通過した液に対し遠心分離及び上清除去、Ｄ−ＰＢＳ再浮遊操作を２回繰り返して酵素溶液を除き、得られた細胞にＭＥＭα（１０％  ＦＢＳ，１００ｕ／ｍＬ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ，１００μｇ／ｍＬ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含む）を添加し、３７℃、５％  ＣＯ２下で培養した。増殖した細胞を２−５回継代した細胞を絨毛膜由来間葉系細胞とした。
【００８０】
４）胎児付属物由来組織細胞の培養
ヒトワルトン膠質由来間葉系細胞、ヒト羊膜由来間葉系細胞またはヒト絨毛膜由来間葉系細胞をＤＭＥＭ培地またはＲＰＭＩ１６４０培地に２×１０５個／ｍＬで懸濁し、海洋深層水を添加せず、または添加して、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。海洋深層水としては、高知県室戸の沖合から取水した「天海の水  １０００」（赤穂化成社製）を使用した。ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ  ＮＣ−１００（ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ社製）を用いて細胞の生存率を測定したところ、経時的に生存率は低下するものの、海洋深層水の添加、非添加により差は見られなかった。培地を回収し、３００Ｇで１０分間、遠心分離して培養上清を調製した。
【００８１】
実施例２：胎児付属物由来組織細胞と神経前駆細胞の共培養による神経再生
１）神経前駆細胞の調製
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（日本チャールスリバー：ＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃ  ｓｃｉｄ／Ｊ）の生後１週齢程度の新生児を安楽死させて脳組織を採取した。脳室下帯周囲組織を切り出し、これを神経細胞用分散液（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ  Ｄａｉｎｉｐｐｏｎ  Ｐｈａｒｍａ社製）を用いて分散させ、得られた細胞を２０ｎｇ／ｍＬのｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）、１０ｎｇ／ｍＬ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  （ＦＧＦ）、２μＬ／ｍＬヘパリン（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を添加したＮｅｕｒｏＣｕｌｔ増殖培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）において、３７℃、５％ＣＯ２下で培養し、神経前駆細胞塊を形成させ、以下の試験に供した。
【００８２】
２）共培養
実施例１で調製したヒトワルトン膠質由来間葉系細胞と、実施例２で調製したマウス神経前駆細胞をそれぞれＮｅｕｒｏＣｕｌｔ Ｂａｓａｌ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に懸濁し、μ−ｓｌｉｄｅ  ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  （ｉｂｉｄｉ社製）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２で、両細胞が非接触条件下で共培養した。顕微鏡的観察により培養３日目と７日目に神経前駆細胞の増殖と分化・成熟を評価した。図１に示すように、ワルトン膠質由来間葉系細胞と共培養した神経前駆細胞は、単独で培養した場合と比較して、神経前駆細胞の増殖又は生存維持が促進し、神経前駆細胞の移動(遊走)が観察され、さらに軸索を伸展したニューロンへの分化・成熟が認められた。
以上の結果から、ワルトン膠質由来間葉系細胞は、調製した状態（すなわち、幹細胞などを単離しているわけではないため、各種細胞が含まれる状態）で、神経前駆細胞の増殖、生存、移動(遊走)、分化・成熟を亢進する因子を分泌しているものと考えられた。
【００８３】
実施例３：胎児付属物由来組織細胞培養上清による神経再生（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
１）  神経前駆細胞に対する効果
実施例２で調製した神経前駆細胞をＮｅｕｒｏＣｕｌｔ Ｂａｓａｌ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に懸濁し、μ−ｓｌｉｄｅ  ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  （ｉｂｉｄｉ社製）に播種して、そこに実施例１で得られたヒトワルトン膠質由来間葉系細胞の培養上清を５０％（ｖ／ｖ）で添加して、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。対照として、ワルトン膠質由来間葉系細胞培養上清を調製する際に使用した培地を同量添加した。顕微鏡的観察により培養３日目と７日目に神経前駆細胞の増殖と分化・成熟を評価した。図２に示すように、ワルトン膠質由来間葉系細胞の培養上清を添加した神経前駆細胞は、対照と比較して、培養３日目には軸索の伸展が認められ、培養３日目、７日目には細胞の増殖又は生存維持が促進され、さらに神経前駆細胞の移動(遊走)が観察された。
以上の結果から、ワルトン膠質由来間葉系細胞は、調製した状態（すなわち、幹細胞などを単離しているわけではないため、各種細胞が含まれる状態）で、神経前駆細胞の増殖、生存、移動(遊走)、分化・成熟を亢進する因子を分泌しており、ワルトン膠質由来間葉系細胞の培養上清は神経再生を促進するものと考えられた。
【００８４】
２）  神経前駆細胞に対する効果（２）
神経前駆細胞である、ヒト神経芽細胞腫株ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（ＡＴＣＣ、番号ＣＲＬ−２２２６）をＤＭＥＭ培養液にて２ｘｌ０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬで９６ウェルプラスチックプレートに１００μＬずつ播種した。実施例１で調製した各種培養上清を１００μＬ添加し、３７℃、５％  ＣＯ２下で５日間培養した。対照として、各種培養上清を調製する際に使用した培地を同量添加して培養した。培養後位相差顕微鏡にて撮影し、解析ソフトＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を使用し神経突起の長さを測定した。
対照群の平均神経突起長が２９μｍに対して、ヒトワルトン膠質由来間葉系細胞、ヒト羊膜由来間葉系細胞及びヒト絨毛膜由来間葉系細胞の培養上清を添加した場合の平均神経突起長はそれぞれ、６２μｍ、４３μｍ及び４１μｍ（ｎ＝３ウェル）であり、胎児付属物由来組織細胞培養上清は神経前駆細胞の軸索伸長を促し、神経分化を促進することが示唆された。
以上の結果から、胎児付属物由来組織細胞は、調製した状態（すなわち、幹細胞などを単離しているわけではないため、各種細胞が含まれる状態）で、神経前駆細胞の生存維持及び分化・成熟を亢進する因子を分泌しており、胎児付属物由来組織細胞の培養上清は神経再生を促進するものと考えられた。
【００８５】
３）  培養上清中に含まれる因子
実施例１で調製したワルトン膠質由来間葉系細胞、羊膜由来間葉系細胞、絨毛膜由来間葉系細胞の培養上清中に含まれる因子を抗体アレイ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社製、Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ａｒｒａｙ  Ｃ５）により調べた（ｎ＝３）。表１〜３に示すように、培養上清中にはＩＬ−６などのサイトカイン、ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＧＲＯａ／ｂ／ｇなどのケモカイン、ＢＤＮＦ、ＥＧＦなどの増殖因子、Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ（ＯＰＮ）などが含まれていることが分かり、これらの因子が神経再生を促進しているものと考えられた。なお、海洋深層水を８、４１、７３、８１％の濃度で添加した培地で培養上清を調製した場合、これらの一部の因子、またはすべての因子の濃度が増加することが分かった。
【００８６】
【表１】
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【００８７】
【表２】
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【００８８】
【表３】
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【００８９】
実施例４：胎児付属物由来組織細胞培養上清による神経再生（ｉｎ  ｖｉｖｏ）
１）  マウス低酸素再灌流処置小児脳性麻痺モデルの作製
ＩＣＲマウス（日本チャールスリバー、Ｃｒｌ：ＣＤ１）を用いて、Ｒｉｃｅ−Ｖａｎｎｕｃｃｉらの方法に基づいて低酸素再灌流処置小児脳性麻痺モデルマウスを作製した（Ｗａｎｇら、Ｊ  Ｍａｔｅｒｎ  Ｆｅｔａｌ  Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｍｅｄ．  ２０１５；２８（７）：８４２−７）。生後1週齢（7日〜９日）のマウス（雌雄）を２％イソフルランで麻酔し、右側頸動脈を脳動脈瘤クリップ（ミズホ社製）で梗塞した。個体を８％酸素濃度下に１２０分間放置し、その後、脳動脈クリップを外して、血流を再灌流させた。脳障害の症状が固定される３週間経過後のマウスを以下の実験に供した。
【００９０】
２）  ワルトン膠質由来間葉系細胞培養上清による治療（１）
低酸素処置小児麻痺モデルマウスに、実施例１で調製したワルトン膠質由来間葉系細胞培養上清１０μＬを２週間にわたり隔日で経鼻投与した。治療後のマウスを用いてＹ−ｍａｚｅ試験（小原医科産業社製、ＹＭ−３００２）を行い、８分間の自由行動について、自発的行動の指標である総エントリー数、短期作業記憶の指標である交替行動率を測定した（ｎ＝４）。図３に示すように、培養上清投与群では治療２週間後において、自発的行動、短期的作業記録が改善した。
【００９１】
３）  ワルトン膠質由来間葉系細胞培養上清による治療（２）
低酸素処置小児麻痺モデルマウスに、実施例１で調製したワルトン膠質由来間葉系細胞培養上清１０μＬを２週間にわたり隔日で経鼻投与した。治療後のマウスを用いてローターロッド試験（室町機械社製、ＭＫ−６１０Ａ）を行い、３００秒間で８０ｒｐｍまで加速するローター上からの落下までの時間を測定したところ、培養上清投与群では、治療１週間後を底とし、回復傾向を示した（治療前、治療１週間後及び治療２週間後の歩行時間は、健常マウスの歩行時間に対してそれぞれ、６７、３４、５０％（ｎ＝２））。
次に、ワルトン膠質由来間葉系細胞培養上清の治療効果をより長期に確認した。低酸素処置小児麻痺モデルマウスを無作為に２群に分け、治療群のマウスには実施例１で調製したワルトン膠質由来間葉系細胞培養上清１０μＬを２週間にわたり隔日で経鼻投与した（ｎ＝５）。治療前後のマウスを用いてローターロッド試験（室町機械社製、ＭＫ−６１０Ａ）を行い、３００秒間で４０ｒｐｍまで加速するローター上からの落下までの時間を測定した。対照群（非治療群：ｎ＝２）と比較して、ワルトン膠質由来間葉系細胞培養上清による、２週間にわたる治療を行った群では有意な回復が観察され（２Ｗ：ｐ＜０．０５，  Ｔｕｋｅｙ検定）、健常マウス（ｎ＝７）と同等であった。さらに、休薬２週間後（４Ｗ）においても治療効果は継続した（図４）。
【００９２】
以上のことから、胎児付属物由来組織細胞は、調製した状態（すなわち、幹細胞などを単離しているわけではないため、各種細胞が含まれる状態）で、神経前駆細胞の増殖、生存、ホーミング、分化・成熟を亢進する因子を分泌しており、胎児付属物由来組織細胞の培養上清は神経を再生し、脳性小児麻痺等の脳神経障害の治療に使用できることが分かった。
【要約】
【課題】脳出血や虚血等を起因とする脳障害では、原因となる出血や虚血を治癒するだけではなく、当該原因により障害を受けた神経細胞等の保護または再生を促進する必要がある。そこで、本発明は、このような脳神経細胞等の保護または再生を促進する効果を有する新規な脳神経障害治療剤提供することを課題とする。
【解決手段】胎児付属物由来組織細胞の培養上清を有効成分として含む、脳神経障害治療剤。
【選択図】図３【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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