(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の緑内障の治療、阻害または予防に使用するための薬剤の製造のための、１００００Ｄａ以下の平均分子量（Ｍｗ）を有するデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項２】
前記対象の開放隅角緑内障、好ましくは原発性開放隅角緑内障の治療、阻害または予防に使用するための、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
緑内障を患っている対象の眼圧の低下に使用するための薬剤の製造のための、１００００Ｄａ以下の平均分子量（Ｍｗ）を有するデキストラン硫酸または前記その薬学的に許容される塩の使用。
【請求項４】
１０ｍｍＨｇ〜２０ｍｍＨｇの正常な眼圧範囲内への眼圧の低下に使用するための、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
対象の高眼圧症の治療、阻害または予防に使用するための薬剤の製造のための、１００００Ｄａ以下の平均分子量（Ｍｗ）を有するデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項６】
前記対象が、緑内障により引き起こされる高眼圧症を患っている、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
緑内障、好ましくは開放隅角緑内障、及び／または高眼圧症を患っている対象における網膜神経節細胞の喪失及び網膜神経線維層の減少の阻害に使用するための薬剤の製造のための、１００００Ｄａ以下の平均分子量（Ｍｗ）を有するデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項８】
前記対象が、開放隅角緑内障、好ましくは原発性開放隅角緑内障を患っている、請求項３、４、６または７に記載の使用。
【請求項９】
前記薬剤は、前記対象への全身投与のために製剤化されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
前記薬剤は、前記対象への静脈内投与または皮下投与のために製剤化されており、好ましくは前記対象への皮下投与のために製剤化されている、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記平均分子量（Ｍｗ）が、２０００〜１００００Ｄａの範囲内、好ましくは３０００〜１００００Ｄａの範囲内、より好ましくは３５００〜９５００Ｄａの範囲内、４５００〜７５００Ｄａの範囲内のような、好ましくは４５００〜５５００Ｄａの範囲内である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
前記デキストラン硫酸または前記その薬学的に許容される塩が、１５〜２０％の範囲、好ましくは約１７％の平均硫黄含有量を有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３】
前記デキストラン硫酸または前記その薬学的に許容される塩が、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法により測定される数平均分子量（Ｍｎ）を、１８５０〜３５００Ｄａの区間内、好ましくは１８５０〜２５００Ｄａの区間内、より好ましくは１８５０〜２３００Ｄａの区間内に有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
前記デキストラン硫酸または前記その薬学的に許容される塩が、ＮＭＲ分光法により測定されるＭｎを、１８５０〜２０００Ｄａの区間内に有する、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記デキストラン硫酸または前記その薬学的に許容される塩が、グルコース単位あたりの平均硫酸数を、２．５〜３．０の区間内、好ましくは２．５〜２．８の区間内、より好ましくは２．６〜２．７の区間内に有する、請求項１３または１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記デキストラン硫酸または前記その薬学的に許容される塩におけるグルコース単位の平均数が、５．１であり、かつグルコース単位あたりの平均硫酸数が２．６〜２．７である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１７】
前記薬剤は、水性注射溶液として製剤化されている、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１８】
前記その薬学的に許容される塩が、デキストラン硫酸のナトリウム塩である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本実施形態は、一般的に、緑内障の予防、治療または阻害に関し、特に緑内障の予防、治療または阻害におけるデキストラン硫酸の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
緑内障は、不可逆的な失明を引き起こす可能性のある進行性の視神経障害の一群を表し、主要な危険因子は眼圧（ＩＯＰ）の上昇である。原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）では、通常、線維柱帯網（ＴＭ）の細胞充実性、ＴＭの収縮、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）レベルの異常の結果として、ＴＭからの眼房水（ＡｑＨ）の流出が減少すると、ＩＯＰの増加が起こる。ＴＭの弾性型の繊維は、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、及びフィブロネクチンで構成されたアモルファスＥＣＭに埋め込まれた微細な原線維の鞘に囲まれている。ＴＭ内の傍シュレム管組織（ＪＣＴ）内の弾性様線維の鞘に関連するプラーク物質の存在、いわゆる鞘由来（ＳＤ）プラークも、ＰＯＡＧの病理学的特徴である。したがって、ＰＯＡＧ患者は、同年齢の対照の眼に比べて、ＴＭのＳＤプラークが有意により多く、より厚い。しかしながら、偽落屑緑内障眼は、健常な眼に比べて、ＳＤプラーク物質のレベルは同等であるが、ＩＯＰレベルが高いことが示されているため、これらのＳＤプラークが流出抵抗性の増加に寄与するとは考えられない。それでも、ＴＭの鞘の周囲でＥＣＭレベルが増加し、この堆積が流出抵抗性の増加に寄与する可能性がある。ＴＭにおけるこれらの細胞及びＥＣＭの変化は、ＴＭ細胞の収縮能力の変化とともに、ＴＭの機能不全を引き起こし、最終的にはＡｑＨ流出の厳密な制御を失わせる。
【０００３】
ＰＯＡＧにおいてＴＭ機能障害を引き起こすメカニズムはおそらく多因子的であるが、ＡｑＨ内の病理学的に高レベルのトランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）が寄与していると考えられる。一部のＰＯＡＧ患者は、同年齢の白内障または他の形態の緑内障の患者から採取したＡｑＨに比べて、ＡｑＨのＴＧＦ−βレベルが上昇している。ＴＭにおけるＥＣＭ堆積の増加及びＩＯＰ増加におけるＴＧＦ−βの役割は、緑内障のヒト眼灌流実験及びげっ歯類モデルにおいて示されている。同様に、培養ヒトＴＭ細胞の遺伝子発現研究も、ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２アイソフォームの両方がＥＣＭタンパク質の過剰発現を誘導し、これが緑内障において認められるＴＭの変化に寄与し得るという主張を支持している。さらに、ＴＧＦ−βは、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子（ＰＡＩ）−１及び組織メタロプロテイナーゼ阻害因子（ＴＩＭＰ）のレベルの増加を介して、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の活性化を阻害することにより、ＥＣＭの分解を予防する。ＰＡＩ−１は、プラスミン依存性のＭＭＰ活性化に必要な、プラスミノーゲンからプラスミンへの変換を阻害する。ＴＧＦ−βのＩＯＰ増加効果は、ＴＭ細胞の増殖の減少及びアポトーシス誘導、それによるＴＭ細胞の総数の減少におけるサイトカインの能力に起因している。
【０００４】
ＴＧＦ−βはまた、ＲｈｏＡ−Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）シグナル伝達経路を通じてＴＭ細胞の収縮を刺激し、ＴＭ収縮性はＩＯＰに有意に影響を及ぼす。Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ阻害剤を使用してＲｈｏＡを介したＴＭ収縮を軽減または除去した研究により、緑内障及びＩＯＰの増加を伴う他の医学的病態を治療すると考えられる新規クラスのＩＯＰ低下薬がもたらされた。しかしながら、Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ阻害剤だけでは、ＰＯＡＧの一部の患者で発生する慢性線維性病変に対処できる可能性は低く、その有効性はまだ精査されていない。最終的に、ＩＯＰの上昇は、視神経乳頭及び網膜の細胞の代謝的及び生化学的変化をもたらす。また、機械的軸索圧迫は、逆行性及び順行性の両方の軸索輸送に影響を及ぼす。代謝及び生化学的変化は、機械的軸索圧迫とともに、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）から神経栄養因子を奪い、最終的にはＲＧＣのアポトーシス及び視神経乳頭陥凹にまで達するが、このことは、緑内障の診断を特徴づけるものである。
【０００５】
緑内障の治療目標は視力低下を予防することであり、これは緑内障による視力低下が不可逆的であるためである。現在、緑内障は、点眼薬、丸薬、レーザー手術、伝統的な手術、またはこれらの方法の併用により治療されている。これらの治療のほとんどは、視覚情報を脳に伝達する視神経を損傷する可能性のあるＩＯＰを低下及び／または制御するように設計されている。しかしながら、ＩＯＰ制御は最善の場合でも不完全であり、疾患の進行を制限または逆転させることのできる改善された治療法に対する満たされていない必要性が存在している。
【発明の概要】
【０００６】
対象の緑内障を治療、阻害、または予防することが一般的な目的である。
【０００７】
この目的及び他の目的は、本明細書に開示する実施形態によって満たされる。
【０００８】
実施形態の一態様は、対象の緑内障を治療、阻害、または予防する際に使用するためのデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩に関する。
【０００９】
実施形態の別の態様は、対象の高眼圧症の治療、阻害、または予防に使用するためのデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩に関する。
【００１０】
実施形態のさらなる態様は、緑内障及び／または高眼圧症を患っている対象における網膜神経節細胞の喪失及び網膜神経線維層の減少を阻害する際に使用するためのデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩に関する。
【００１１】
実施形態のさらに別の態様は、緑内障を患っている対象の眼圧を低下させる際に使用するためのデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩に関する。
【００１２】
実施形態のさらなる態様は、対象の緑内障の治療、阻害または予防のための薬剤の製造のための；対象の高眼圧症の治療、阻害または予防のための；緑内障を患っている対象の眼圧を下げるための；または、緑内障及び／または高眼圧症を患っている対象における網膜神経節細胞の喪失及び網膜神経線維層の減少のためのデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩の使用に関する。
【００１３】
実施形態のさらに別の態様は、緑内障の治療、阻害または予防方法に関する。方法は、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される誘導体を、緑内障を患っている対象に投与することを含む。
【００１４】
実施形態のさらなる態様は、高眼圧症の治療、阻害または予防方法に関する。方法は、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される誘導体を、高眼圧症を患っている対象に投与することを含む。
【００１５】
実施形態の別の態様は、網膜神経節細胞の喪失及び網膜神経線維層の減少の阻害方法に関する。方法は、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される誘導体を、緑内障及び／または高眼圧症を患っている対象に投与することを含む。
【００１６】
実施形態のさらに別の態様は、緑内障を患っている対象の眼圧の低下方法に関する。方法は、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される誘導体を、緑内障を患っている対象に投与することを含む。
【００１７】
本実施形態のデキストラン硫酸は、緑内障を患っている対象において正常なＩＯＰの迅速かつ再現性のある回復を引き起こす。ＩＯＰを健康な対象の正常範囲にまで低下させることは、網膜におけるＲＧＣの保持及び網膜神経線維層（ＲＮＦＬ）の保持に関連していた。デキストラン硫酸で処置した対象の隅角においてラミニン及びフィブロネクチンのレベルが有意に減少したことで確認されたように、正常なＩＯＰレベルの回復は、確立されたＴＭ瘢痕要素の溶解から生じることが示唆されている。
【００１８】
実施形態、ならびにそのさらなる目的及び利点は、添付の図面とともに以下の説明を参照することにより最もよく理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）を患っており、生理食塩水対照または実施形態によるデキストラン硫酸で処置した対象の眼圧（ＩＯＰ）の変化を示す。
【図２】ＰＯＡＧを患っており、生理食塩水対照または実施形態によるデキストラン硫酸で処置した対象の網膜神経節細胞（ＲＧＣ）数の変化を示す。
【図３】ＰＯＡＧを患っており、生理食塩水対照または実施形態によるデキストラン硫酸で処置した対象の網膜神経線維層（ＲＮＦＬ）の厚さの変化を示す。
【図４】ＰＯＡＧを患っており、生理食塩水対照または実施形態によるデキストラン硫酸で処置した対象の虹彩角膜角の前眼部画像を示す。
【図５】ＰＯＡＧを患っており、生理食塩水対照または実施形態によるデキストラン硫酸で処置した対象の隅角のラミニン免疫反応性の変化を示す。
【図６】ＰＯＡＧを患っており、生理食塩水対照または実施形態によるデキストラン硫酸で処置した対象の隅角のフィブロネクチン免疫反応性の変化を示す。
【図７】ＰＯＡＧを患っており、生理食塩水対照または実施形態によるデキストラン硫酸で処置した対象の体重の差異を示す。
【図８】ＰＯＡＧを患っており、生理食塩水対照または実施形態によるデキストラン硫酸で処置した対象の代表的なフルオレセイン血管造影画像である。
【図９】イソレクチンＢ４染色を使用した脈絡膜新生血管を示す。対照群（図９Ａ）及び治療群（図９Ｂ）の新生血管の代表的な画像である。（図９Ｃ）：棒グラフは平均新生血管面積を示す。
【図１０】ＩＶ型コラーゲン染色を使用した脈絡膜新生血管を示す。対照群（図１０Ａ）及び治療群（図１０Ｂ）の新生血管の代表的な画像である。（図１０Ｃ）：棒グラフは平均新生血管面積を示す。
【図１１】ＲＮＦＬの光干渉断層撮影（ＯＣＴ）分析の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本実施形態は、一般的に、緑内障の予防、治療または阻害に関し、特に緑内障の予防、治療または阻害におけるデキストラン硫酸の使用に関する。
【００２１】
デキストラン硫酸処置は、緑内障、特に原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）を患っている対象の緑内障眼における正常な眼圧（ＩＯＰ）の迅速かつ再現性のある回復をもたらした。正常なＩＯＰレベルの回復は、デキストラン硫酸で処置した対象の眼において、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）のカウント数及び網膜神経線維層（ＲＮＦＬ）の厚さの保持が維持されたことによって証明されたように、網膜のＲＧＣの保持に関連していた。デキストラン硫酸処置した対象の隅角におけるラミニン及びフィブロネクチンのレベルが有意に低かったため、デキストラン硫酸処置は、確立された線維柱帯網（ＴＭ）瘢痕要素の溶解ももたらした。
【００２２】
観察の臨床的意義は以下の通りである。緑内障の患者は現在、眼液産生を制限するか眼液流出を増加させることによりＩＯＰを低下させる薬剤の点眼薬で毎日治療されている。これらの治療法はコンプライアンスが不十分であるため、ＩＯＰの制御が不完全であり、ほとんどの患者で進行性の視力喪失をもたらす。視力喪失をもたらす眼の病変を予防及び逆転させ、ＩＯＰ制御を有意に改善する治療法は非常に価値が高いと考えられる。
【００２３】
緑内障の治療に有用な候補薬は、眼の血管形成すなわち血管新生を誘発すべきではない。そうしなければ、眼におけるそのような病理学的血管形成は、重度の視覚障害をもたらし得る。本明細書に提示する実験データは、デキストラン硫酸が治療対象の眼に対して抗血管形成効果または血管形成促進効果を有さないことを示している。したがって、デキストラン硫酸は、眼における病理学的血管形成のリスクを伴わずに、眼の適応症において安全に使用することができる。
【００２４】
それにより、実施形態のデキストラン硫酸は、緑内障の予防、治療または阻害において効果的に使用することができる。
【００２５】
したがって、実施形態の態様は、対象の緑内障を治療、阻害または予防する際に使用するためのデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩に関する。
【００２６】
緑内障は、眼疾患の一群であり、視神経及び網膜への損傷ならびに関連する視力喪失をもたらす。緑内障の最も一般的なタイプは開放隅角緑内障であるが、あまり一般的ではない閉鎖隅角緑内障及び正常眼圧緑内障が含まれる。開放隅角緑内障は時間とともにゆっくりと発症し、痛みはない。側視力が低下し始め、その後中心視力が低下し、治療しないと失明する場合がある。閉塞隅角緑内障は、徐々にまたは突然発症し得る。突然の発症は、重度の目の痛み、かすみ目、瞳孔拡張、瞳孔の発赤、吐き気などである。緑内障による視力喪失は、一度発生すると永続的である。
【００２７】
早期治療の場合、薬物療法、レーザー治療、または手術により緑内障疾患の進行を遅らせるかまたは停止させることが可能であり得る。現代における緑内障管理の目標は、緑内障による損傷及び神経損傷を回避し、患者の視野及び総体の生活の質を最小限の副作用で保持することである。これには、適切な診断技術及びフォローアップ検査、ならびに個々の患者に対する慎重な治療選択が必要である。眼圧は緑内障の主要な危険因子の１つに過ぎないが、様々な医薬品及び／または外科的手法によって眼圧を低下させることが、現在、緑内障治療の主力となっている。
【００２８】
眼圧は、薬物、通常は点眼薬を用いて低下させることができる。緑内障の治療にはいくつかのクラスの薬剤が使用され、各クラスにはいくつかの薬剤がある。これらの薬はそれぞれ、局所的及び全身的な副作用を引き起こす場合がある。投薬プロトコールの遵守は、混乱を招き、高コストになり得る。緑内障患者の視力喪失の主な理由は、薬の服用及びフォローアップ訪問における遵守の不足である。
【００２９】
緑内障を治療するために、レーザー手術及び従来の手術の両方が実施される。手術及びレーザー治療は、緑内障を治癒することはできないため、一般的に一時的な解決策である。
【００３０】
したがって、対象の緑内障を治療、阻害または予防するために使用することができる薬剤を提供する必要があると、長い間、考えられていた。
【００３１】
実施形態によるデキストラン硫酸または薬学的に許容される塩は、ＩＯＰの増加、すなわち緑内障によって引き起こされるような高眼圧症を患っている対象に投与すると、ＩＯＰの低下を誘発する。実際、デキストラン硫酸の投与後、ＩＯＰは正常化、すなわち、健康な対象の正常なＩＯＰ範囲にまで低下する。したがって、実施形態によるデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩は、緑内障の最も有害な構成要素の１つ、すなわち異常な及び増加したＩＯＰに対抗し、治療することができる。
【００３２】
さらに、実施形態によるデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩の投与は、ＲＧＣに神経保護効果を提供する。より詳細には、デキストラン硫酸の投与は、処置した対象の眼におけるＲＧＣカウント数の維持及びＲＮＦＬ厚さの保持に認められるように、ＲＧＣを損傷及び細胞死から保護した。
【００３３】
ＲＧＣは、眼の網膜の内面近くに位置するニューロンのタイプであり、一般的には神経節細胞層と呼ばれる。ＲＧＣは、視床、視床下部、及び中脳（ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｏｎ）すなわち中脳（ｍｉｄｂｒａｉｎ）のいくつかの領域に、網膜から活動電位の形で画像形成及び非画像形成視覚情報を集合的に送信する。ＲＧＣは、そのサイズ、接続、及び視覚刺激に対する反応の点で大きく異なるが、すべて脳に伸びる長い軸索を有するという明確な特性を共有している。これらの軸索は、視神経、視交叉、及び視索を形成する。
【００３４】
神経線維層または視神経線維層と呼ばれることもあるＲＮＦＬは、視神経の線維の拡張によって形成される。ＲＮＦＬは感受性の高い構造であり、高ＩＯＰなどのいくつかのプロセスは、その自然のアポトーシスを誘発することができる。
【００３５】
実施形態のデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩の神経保護効果は、ＲＧＣの損傷及びアポトーシスを効果的に予防し、それによりＲＮＦＬを保持することである。
【００３６】
前述のように、ＴＭ細胞充実性及びＴＭ収縮の異常などのＴＭ機能不全は、緑内障を患っている対象に認められるような高ＩＯＰの根本的な原因であり得る。実施形態のデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩は、緑内障の対象に確立されたＴＭ瘢痕を分散及び減衰させる。これにより、ＴＭを介したＡｑＨ流出が正常化される。
【００３７】
実施形態のデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩の抗瘢痕効果は、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩によって誘発されるいくつかのメカニズムの結果であることが示唆される。したがって、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質を分解し、組織メタロプロテイナーゼ阻害因子（ＴＩＭＰ）の活性を抑制する酵素であるマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を誘導する。デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩は、デコリンなどの天然の抗瘢痕分子をさらに誘導し、それにより、ＴＧＦ−β及び様々な増殖因子、例えば、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などを遮断する。デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩は、ＴＧＦ−β活性に対する阻害効果も有し、過剰なレベルのＴＧＦ−βの存在下においても線維形成を阻害する。デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩は、免疫細胞の接着及び細胞凝集をさらに阻害する。瘢痕は、炎症性サイトカイン、特にＴＧＦ−βによって駆動され、ＴＧＦ−βにより活性化されるプロテインキナーゼ１（ＴＡＫ−１）のレベルを抑制する。デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩は、瘢痕及び線維形成を促進するＴＧＦ−β及び他のサイトカインを遮断し、同時に抗瘢痕分子を刺激する。デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩によって誘発されるこれらのメカニズムを総合すると、ＴＭ瘢痕を分散及び減衰させることにより、緑内障眼にプラスの効果がある。
【００３８】
先行技術の抗緑内障薬は一般的に、緑内障を治療または治癒することも、緑内障の根本原因に対抗することもできないが、むしろ眼液産生を制限するか、または眼液流出を増加させることにより、緑内障の症状を緩和、例えば、ＩＯＰを低下させる。しかしながら、そのような薬剤を使用する治療は、通常、コンプライアンスが不十分であり、ＩＯＰ制御が不完全であるため、ほとんどの対象において進行性の視力喪失をもたらす。これは、実施形態のデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩とは明らかに対照的であり、それらは、ＩＯＰを低減及び正常化するだけでなく、ＲＧＣ及びＲＮＦＬに対する神経保護効果を提供し、確立されたＴＭ瘢痕要素を溶解し、それにより実際の緑内障の阻害及び治療を可能にする。
【００３９】
デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩は、眼に病理学的な血管形成を引き起こすことなく緑内障の治療、阻害または予防を達成する。したがって、緑内障の治療、阻害、または予防に使用する薬剤は、眼において血管形成すなわち血管新生を誘発しないことが重要である。薬剤は、それを誘発するならば重度の視覚障害をもたらすことになるであろう。本明細書に示す実験データは、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩が、眼において抗血管形成効果も血管形成促進効果も有さず、それにより眼の適応症への投与に適していることを示す。
【００４０】
開放隅角緑内障は緑内障の最も一般的な形態であり、すべての緑内障症例の少なくとも９０％を占める。流出経路の詰まりが原因で、眼圧が上昇する。開放隅角とは、虹彩が角膜と交わる角度が、本来あるべき広さで開いていることを意味する。当技術分野において、開放隅角緑内障は、原発性緑内障、原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）、または慢性緑内障とも呼ばれる。
【００４１】
特定の実施形態では、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩は、対象のＰＯＡＧなどの開放隅角緑内障の治療、阻害または予防に使用するためのものである。
【００４２】
デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩は、ＩＯＰを高眼圧症の範囲から正常なＩＯＰ範囲へ効果的に低下させる。
【００４３】
したがって、実施形態の別の態様は、対象の高眼圧症の治療、阻害または予防に使用するためのデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩に関する。
【００４４】
特定の実施形態では、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩は、高眼圧症を患っている対象の眼圧を低下させる際に使用するためのものである。
【００４５】
したがって、実施形態の態様は、緑内障、好ましくは開放隅角緑内障、例えばＰＯＡＧを患っている対象の眼圧を低下させる際に使用するためのデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩に関する。
【００４６】
ヒトでは、通常のＩＯＰ範囲は一般的には１０ｍｍＨｇ〜２０ｍｍＨｇであり、ＩＯＰの平均値は約１５．５ｍｍＨｇであり、変動幅は約２．７５ｍｍＨｇである。高眼圧症（ＯＨＴ）は、正常よりも高い、すなわち、ヒトの場合、一般的には２０ｍｍＨｇよりも高いＩＯＰとして定義される。
【００４７】
したがって、一実施形態では、眼圧を低下させることは、１０ｍｍＨｇ〜２０ｍｍＨｇの正常ＩＯＰ範囲内、例えば、１２．７５ｍｍＨｇ〜１８．２５ｍｍＨｇのＩＯＰ範囲内となるように、眼圧を低下させるか、または眼圧を回復させることを含む。
【００４８】
一実施形態では、対象は、緑内障、好ましくはＰＯＡＧなどの開放隅角緑内障によって引き起こされる高眼圧症を患っている。
【００４９】
緑内障、特に開放隅角緑内障及びＰＯＡＧは高眼圧症の主な原因であるが、例えば、高血圧；ストレス；過剰な塩、硬化油、アルコール、砂糖を含む食事；目の外傷；喫煙；糖尿病；及び心臓病を含む高眼圧症の他の考えられる原因が存在する。また、いくつかの医薬品は、特定の個体において高眼圧症を引き起こす副作用を有する。例えば、喘息及び他の症状の治療に使用されるステロイド薬は、高眼圧症のリスクを高めることが示されている。眼からの水分産生と排液のバランスに影響を及ぼす可能性のある様々な眼の外傷は、高眼圧症を引き起こし得る。高眼圧症は、夜間の眼圧上昇、ＩＯＰスパイク、偽落屑症候群、色素分散症候群、及び角膜環などの他の眼の病態とも関連している。
【００５０】
デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩は、神経保護効果を提供して、ＲＧＣの損傷及び細胞死を予防または少なくとも軽減し、ＲＮＦＬの完全性及び厚さを維持する。
【００５１】
したがって、実施形態のさらなる態様は、緑内障、好ましくはＰＯＡＧなどの開放隅角緑内障、及び／または高眼圧症を患っている対象における網膜神経節細胞の喪失及び網膜神経線維層の減少の阻害に使用するためのデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩に関する。
【００５２】
ＩＯＰの増加及びＲＧＣの細胞死の増加はまた、直接的または間接的に、介在ニューロン及び光受容体などの他の網膜ニューロンに影響を及ぼす場合がある。例えば、ＲＧＣの細胞死は萎縮を引き起こし、これにより、シナプスの喪失及び他の網膜ニューロンの細胞死が引き起こされる場合がある。
【００５３】
したがって、ＩＯＰを正常化し、ＲＧＣの損傷及び細胞死を減らすことは、他の網膜病態、例えば、糖尿病性網膜症及び光受容体の喪失に関連する様々な遺伝的病態の治療、予防または阻害に有用であろう。
【００５４】
デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩は、ＩＯＰを低下させるだけでなく、同時に網膜ニューロンを損傷及び細胞死から直接保護することにより、緑内障及び関連する網膜の病態を治療、予防または阻害するためのユニークな薬剤である。
【００５５】
一実施形態では、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩を、対象への全身投与用に製剤化する。一実施形態では、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩を、全身投与の一例として非経口投与用に製剤化する。
【００５６】
非経口投与経路の例として、静脈内（ｉ．ｖ．）投与、動脈内投与、筋肉内投与、脳内投与、脳室内投与、髄腔内投与、及び皮下（ｓ．ｃ．）投与が挙げられる。
【００５７】
一実施形態では、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩を、好ましくは、対象への静脈内（ｉ．ｖ．）または皮下（ｓ．ｃ．）投与用に製剤化する。したがって、ｉ．ｖ．及びｓ．ｃ．投与は、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩の全身投与の好ましい例である。特定の実施形態では、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩を、対象へのｓ．ｃ．投与用に製剤化する。
【００５８】
一実施形態では、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩を、水性注射溶液として、好ましくは水性ｉ．ｖ．またはｓ．ｃ．注射溶液として製剤化する。したがって、実施形態のデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩を、好ましくは、選択した溶媒または賦形剤を含む水性注射溶液として製剤化する。溶媒は、有利には水性溶媒であり、特に緩衝液である。そのような緩衝液の非限定的な例は、クエン酸一水和物（ＣＡＭ）緩衝液などのクエン酸緩衝液、またはリン酸緩衝液である。例えば、実施形態のデキストラン硫酸を、０．９％ＮａＣｌ生理食塩水などの生理食塩水に溶解し、その後、場合により７５ｍＭのＣＡＭで緩衝し、水酸化ナトリウムを使用してｐＨを約５．９に調整することができる。また、生理食塩水、すなわちＮａＣｌ（水溶液）などの水性注射溶液を含む、非緩衝化溶液も可能である。さらに、緩衝液が必要な場合は、ＣＡＭ及びリン酸緩衝液以外の他の緩衝系を使用することができる。
【００５９】
実施形態は注射に限定されず、眼内、硝子体内、経小帯、経鼻、頬側、真皮、気管、気管支、または局所投与を含む他の投与経路を代替的に使用することができる。次いで、活性化合物であるデキストラン硫酸を、特定の投与経路に基づいて選択する適切な賦形剤、溶媒または担体とともに製剤化する。
【００６０】
眼内投与とは、対象の眼球に進入させる投与を指す。硝子体内投与とは、対象の眼を通して、好ましくは眼の内腔に直接投与することを指す。経小帯投与とは、眼の毛様体と水晶体を接続する一連の線維である毛様体小帯を介した投与を指す。
【００６１】
担体は、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩の送達効率及び／または有効性を向上させるためのビヒクルとして機能する物質を指す。
【００６２】
賦形剤は、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩と組み合わせて製剤化する薬理学的に不活性な物質を指し、例えば、薬物の吸収もしくは溶解を促進するために、または他の薬物動態学的考慮のために使用する増量剤、充填剤、希釈剤及び製品を含む。
【００６３】
デキストラン硫酸の薬学的に許容される塩とは、本明細書に開示する効果を有し、投与した用量（複数可）においてそのレシピエントに有害ではないデキストラン硫酸の塩を指す。
【００６４】
デキストラン硫酸は、好ましくは、いわゆる低分子量デキストラン硫酸である。
【００６５】
以下における、デキストラン硫酸の（平均）分子量及び硫黄含有量への言及は、デキストラン硫酸の薬学的に許容される塩に対しても適用されるものとする。したがって、デキストラン硫酸の薬学的に許容される塩は、好ましくは、以下の実施形態で考察するような平均分子量及び硫黄含有量を有する。
【００６６】
デキストラン硫酸は、硫酸化多糖、特に硫酸化グルカン、すなわち、多くのグルコース分子から作られる多糖である。本明細書中で定義する平均分子量は、個々の硫酸化多糖がこの平均分子量とは異なる分子量を有し得るが、平均分子量は硫酸化多糖の平均分子量を表すことを示す。これは、デキストラン硫酸試料のこの平均分子量の周りに分子量の自然分布が存在することをさらに意味する。
【００６７】
デキストラン硫酸の平均分子量（Ｍｗ）は通常、ゲル排除／浸透クロマトグラフィー、光散乱または粘度などの間接的な方法を使用して決定される。このような間接的な方法を使用した平均分子量の決定は、カラムと溶離液の選択、流速、較正手順などを含む多くの要因に依存する。
【００６８】
平均分子量（Ｍｗ）：
【化１】
0006817466.tif 000002
は、光散乱及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）法などの、数値ではなく分子サイズに高い感受性を示す方法に対して一般的である。正規分布が想定される場合、Ｍｗの各側で同じ重量、すなわち、Ｍｗ未満の分子量を有する試料中のデキストラン硫酸分子の総重量は、Ｍｗ以上の分子量を有する試料中のデキストラン硫酸分子の総重量に等しい。
【００６９】
一実施形態では、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩は、好ましくは４００００Ｄａ以下、より好ましくは２００００Ｄａ以下、特に１００００Ｄａ以下の平均分子量を有する。
【００７０】
１００００Ｄａを超える平均分子量のデキストラン硫酸は、一般的に、より低い平均分子量を有するデキストラン硫酸に比べて、対傷害特性効果が低い。これは、好ましい範囲内の平均分子量を有するデキストラン硫酸分子に比べて、より大きなデキストラン硫酸分子（＞１００００Ｄａ）では、対象に安全に投与することができるデキストラン硫酸の最大用量が低いことを意味する。結果として、デキストラン硫酸をｉｎ  ｖｉｖｏで対象に投与する場合、そのようなより大きなデキストラン硫酸分子は臨床用途にはあまり適していない。
【００７１】
一実施形態では、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩は、２０００〜１００００Ｄａの範囲内の平均分子量を有する。別の実施形態では、平均分子量は２５００〜１００００Ｄａの範囲内である。特に好ましい実施形態では、平均分子量は３０００〜１００００Ｄａの範囲内である。
【００７２】
場合により、好ましい実施形態では、デキストラン硫酸分子の４０％未満が３０００Ｄａ未満の分子量を有し、好ましくはデキストラン硫酸分子の３５％未満、例えば、３０％未満または２５％未満が、３０００Ｄａ未満の分子量を有する。さらに、または代替的に、デキストラン硫酸分子の２０％未満が１００００Ｄａ超の分子量を有し、好ましくはデキストラン硫酸分子の１５％未満、例えば１０％未満または５％未満が１００００Ｄａ超の分子量を有する。したがって、特定の実施形態では、デキストラン硫酸は、平均分子量の周りに実質的に狭い分子量分布を有する。
【００７３】
特定の実施形態では、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩の平均分子量は、３５００〜９５００Ｄａの範囲内、例えば３５００〜８５００Ｄａの範囲内である。
【００７４】
別の特定の実施形態では、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩の平均分子量は、４５００〜７５００Ｄａの範囲内である。
【００７５】
さらなる特定の実施形態では、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩の平均分子量は、４５００〜５５００Ｄａの範囲内である。
【００７６】
したがって、現在の好ましい実施形態では、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩の平均分子量は、好ましくはおよそ５０００Ｄａ、または少なくとも実質的に５０００Ｄａ近辺、例えば５０００±５００Ｄａ、例えば５０００±４００Ｄａ、好ましくは５０００±３００Ｄａまたは５０００±２００Ｄａ、例えば５０００±１００Ｄａである。したがって、一実施形態では、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩の平均分子量は、４．５ｋＤａ、４．６ｋＤａ、４．７ｋＤａ、４．８ｋＤａ、４．９ｋＤａ、５．０ｋＤａ、５．１ｋＤａ、５．２ｋＤａ、５．３ｋＤａ、５．４ｋＤａまたは５．５ｋＤａである。
【００７７】
特定の実施形態では、上記のデキストラン硫酸またはその薬学的塩の平均分子量は平均Ｍｗであり、好ましくは、ゲル排除／浸透クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、光散乱または粘度に基づく方法によって決定する。
【００７８】
特定の実施形態では、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩は、平均して、約５グルコース単位または約５をわずかに上回るグルコース単位からなり、少なくとも２．０、例えば少なくとも２．５のグルコース単位あたりの平均硫酸塩数を有する。
【００７９】
デキストラン硫酸は、デキストランのポリアニオン誘導体であり、硫黄を含有する。実施形態のデキストラン硫酸の平均硫黄含量は、好ましくは１５〜２０％、より好ましくは約１７％であり、一般的にグルコシル残基あたり約または少なくとも２つの硫酸基に対応する。特定の実施形態では、デキストラン硫酸の硫黄含量は、好ましくは、対応するデキストラン分子の硫黄含量の最大可能度に等しいか、少なくともそれに近い。
【００８０】
特定の実施形態では、実施形態のデキストラン硫酸は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法により測定される数平均分子量（Ｍｎ）を、１８５０〜３５００Ｄａの区間内で有する。
【００８１】
数平均分子量（Ｍｎ）：
【化２】
0006817466.tif 000003
は、通常、例えば、ＮＭＲ分光法やクロマトグラフィーなどの末端基アッセイによって導き出される。正規分布が想定される場合、Ｍｎの各側に同数のデキストラン硫酸分子を見出すことができ、すなわち、試料中のＭｎ未満の分子量を有するデキストラン硫酸分子の数は、試料中のＭｎを上回る分子量を有するデキストラン硫酸分子の数に等しい。
【００８２】
好ましい実施形態では、実施形態のデキストラン硫酸は、ＮＭＲ分光法により測定されるＭｎを、１８５０〜２５００Ｄａの区間内で、好ましくは１８５０〜２３００Ｄａの区間内で、より好ましくは１８５０〜２０００Ｄａの区間内で有する。
【００８３】
特定の実施形態では、実施形態のデキストラン硫酸は、グルコース単位あたりの平均硫酸塩数を、２．５〜３．０の区間内で、好ましくは２．５〜２．８の区間内で、より好ましくは２．６〜２．７の区間内で有する。
【００８４】
特定の実施形態では、実施形態のデキストラン硫酸は、グルコース単位の平均数を、４．０〜６．０の区間内で、好ましくは４．５〜５．５の区間内で、より好ましくは５．０〜５．２の区間内で有し、例えば約５．１個を有する。
【００８５】
別の特定の実施形態では、実施形態のデキストラン硫酸は、平均５．１のグルコース単位及び２．６〜２．７のグルコース単位あたりの平均硫酸塩数を有し、その結果、一般的には、ＮＭＲ分光法により測定される数平均分子量（Ｍｎ）を、１８５０〜２０００Ｄａの区間内で有する。
【００８６】
実施形態に従って使用することができるデキストラン硫酸またはその薬学的塩は、ＷＯ２０１６／０７６７８０に記載されている。
【００８７】
実施形態によるデキストラン硫酸は、デキストラン硫酸の薬学的に許容される塩として提供することができる。そのような薬学的に許容される塩として、例えば、デキストラン硫酸のナトリウム塩またはカリウム塩が挙げられる。
【００８８】
特定の実施形態では、Ｎａ＋対イオンを含むデキストラン硫酸のナトリウム塩は、ＮＭＲ分光法により測定されるＭｎを、２０００〜２５００Ｄａの区間内で、好ましくは２１００〜２３００Ｄａの区間内で有する。
【００８９】
実施形態のデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩の適切な用量範囲は、対象のサイズ及び体重、対象を治療する場合のその病態、ならびに他の考慮事項に応じて変わり得る。特にヒト対象の場合、可能な用量範囲は、体重１μｇ／ｋｇ〜１５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは体重１０μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇであり得る。
【００９０】
好ましい実施形態では、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩は、対象の体重０．０５〜５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは対象の体重０．０５もしくは０．１〜４０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは対象の体重０．０５もしくは０．１〜３０ｍｇ／ｋｇ、または０．１〜２５ｍｇ／ｋｇまたは０．１〜１５ｍｇ／ｋｇまたは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与するように製剤化する。
【００９１】
実施形態のデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩の投与は、好ましくは、対象において、緑内障、高眼圧症、及び／またはＲＧＣ及びＲＮＦＬの損傷を引き起こし得る事象または病態の発生後できるだけ早く開始する。
【００９２】
デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩の投与は、緑内障の治療に必ずしも限定される必要はないが、代わりに、またはさらに、予防に使用することができる。言い換えれば、実施形態のデキストラン硫酸は、緑内障、高眼圧症、及び／またはＲＧＣ及びＲＮＦＬの損傷を発症するリスクが高い対象に投与することができる。
【００９３】
本明細書中で使用する緑内障、高眼圧、及び／またはＲＧＣの喪失、及びＲＮＦＬの減少の抑制は、１００％の治療または治癒は必ずしも発生しないものの、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩が、病態の症状及び影響を軽減することを意味する。例えば、高眼圧症の抑制は、ＩＯＰの低下、おそらくは正常ＩＯＰ範囲、例えば２０ｍｍＨｇ以下にまで低下させることを伴う。ＲＧＣの喪失の抑制には、損傷または喪失し得るＲＧＣの数を減らすことが含まれ、健康な対象において認められる通常のＲＧＣの喪失を上回るＲＧＣの喪失を予防することまでが含まれる。同様に、ＲＮＦＬの減少の抑制には、ＲＮＦＬの厚さの減少の停止または少なくとも減少が含まれ、健康な対象において認められる通常のＲＮＦＬの減少を上回るＲＮＦＬの減少を予防することまでが含まれる。緑内障の抑制には、ＩＯＰの低下、ＲＧＣの喪失の低減、ＲＮＦＬの減少の低減、及び／またはＴＭ瘢痕要素の溶解などの、緑内障によって引き起こされる症状及び病態の減少または少なくとも軽減が含まれる。
【００９４】
実施形態のデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩は、単回投与の機会において、例えば、単回注射またはボーラス注射の形態で投与することができる。このボーラス投与は、患者に非常に迅速に注射することが可能だが、デキストラン硫酸溶液を患者に数分、例えば５〜１０分以上注入するように、時間をかけて注入すると有利である。
【００９５】
あるいは、実施形態のデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩を、治療期間中に複数回、すなわち少なくとも２回投与することができる。したがって、実施形態のデキストラン硫酸は、例示的な例として、１日に１回または複数回、週に１回または複数回、月に１回または複数回投与することができる。
【００９６】
特定の実施形態では、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩を、１週または複数週の連続した週、例えば、少なくとも２〜５週の連続した週にわたって、週に複数回、例えば、２〜１４回、好ましくは２〜７回の投与用に製剤化する。特定の実施形態では、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩を、複数日、例えば複数の連続した日数、例えば２〜１４日にわたって、１日に１回または２回投与するために製剤化する。
【００９７】
一実施形態では、対象は、哺乳類対象、好ましくは霊長類、より好ましくはヒト対象である。実施形態は、特に、ヒト対象の緑内障を治療、阻害、または予防することを対象とするが、実施形態を獣医学的用途に用いてもよい。動物対象の非限定的な例として、霊長類、ネコ、イヌ、ブタ、ウマ、マウス、ラットが挙げられる。
【００９８】
実施形態の他の態様は、対象の緑内障の治療、阻害もしくは予防のための薬剤の製造のための；対象の高眼圧症の治療、阻害もしくは予防のための；緑内障を患っている対象の眼圧を低下させるための；または緑内障、好ましくは開放隅角緑内障、及び／または高眼圧症を患っている対象におけるＲＧＣの喪失及びＲＮＦＬの減少のためのデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩の使用に関する。
【００９９】
実施形態のさらに別の態様は、緑内障の治療、阻害または予防方法に関する。方法は、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される誘導体を、緑内障、好ましくは開放隅角緑内障を患っている対象に投与することを含む。
【０１００】
実施形態のさらなる態様は、高眼圧症の治療、阻害または予防方法に関する。方法は、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される誘導体を、高眼圧症を患っている対象に投与することを含む。
【０１０１】
実施形態の別の態様は、網膜神経節細胞の喪失及び網膜神経線維層の減少の阻害方法に関する。方法は、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される誘導体を、緑内障、好ましくは開放隅角緑内障、及び／または高眼圧症を患っている対象に投与することを含む。
【０１０２】
実施形態のさらに別の態様は、緑内障を患っている対象の眼圧の低下方法に関する。方法は、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される誘導体を、緑内障を患っている対象に投与することを含む。
【実施例】
【０１０３】
実施例１−緑内障眼に対するデキストラン硫酸の効果
結果
眼圧（ＩＯＰ）
２８日間の全期間にわたる炎症性サイトカインＴＧＦ−βの週２回の前房内注射により、ＩＯＰ上昇を誘発した。これにより、１４日目までに線維柱帯網（ＴＭ）ドレナージポータルの瘢痕化が誘発され、ＩＯＰが上昇した。毎日のデキストラン硫酸塩／生理食塩水の皮下投与を１４日目に開始した。
【０１０４】
両群においてＩＯＰは１４日目に上昇し、生理食塩水を皮下注射した動物では、ＩＯＰ上昇が進行した。しかしながら、上昇したＩＯＰは、７日間のデキストラン硫酸処置後に低下し始め、２４日目までにデキストラン硫酸群のＩＯＰは、対照に比べて有意に低く（Ｐ＜０．００１）、正常化した。２８日目の実験終了時において、ＩＯＰは対照群よりも有意に低いままであった（Ｐ＞０．００１）（図１）。
【０１０５】
網膜神経節細胞（ＲＧＣ）数
デキストラン硫酸処置は、２８日目に網膜に存在するＲＧＣ数の減少を有意に予防した（Ｐ＞０．００１）（図２）が、これはデキストラン硫酸の神経保護効果を示唆している。この神経保護効果は、ＩＯＰ低下による直接または間接的な効果によるものである可能性がある。
【０１０６】
網膜神経線維層（ＲＮＦＬ）の光干渉断層撮影（ＯＣＴ）分析
ＲＮＦＬは、ＲＧＣに属する軸索を含み、ＲＧＣ細胞体の喪失に付随して失われる。ＲＮＦＬは、生理食塩水処置と比較してデキストラン硫酸処置後も保持された（図３及び１１）が、これはデキストラン硫酸の神経保護効果を示唆している。この神経保護効果は、ＩＯＰ低下による直接または間接的な効果によるものである可能性がある。
【０１０７】
隅角の前眼部画像化
生理食塩水とデキストラン硫酸で処置した眼の両方で、虹彩角膜角は「開いた」ままであったが、これはＩＯＰの増加が隅角の閉塞によるものではないことを示している。図４参照。
【０１０８】
線維柱帯網（ＴＭ）瘢痕
デキストラン硫酸処置は、隅角の免疫反応性ラミニン（図５）及びフィブロネクチン（図６）のレベルの有意な減少（Ｐ＜０．００１ラミニン；Ｐ＜０．０１フィブロネクチン）によって証明されるように、ＴＭ瘢痕を有意に減衰させた。
【０１０９】
体重
デキストラン硫酸処置群のラットはより活動的あった。両群で体重を測定した場合、デキストラン硫酸処置した動物は、生理食塩水処置した動物よりも治療期間中に体重増加が少なかったため、その差はわずかに存在するが有意なものではなかった（図７）。
【０１１０】
結論
デキストラン硫酸処置により、緑内障眼において正常なＩＯＰの迅速かつ再現性のある回復がもたらされた。正常なＩＯＰレベルの回復は、デキストラン硫酸処置ラットの眼におけるＲＧＣカウント数の維持及びＲＮＦＬ厚さの保持によって証明されるように、網膜のＲＧＣの保持に関連していた。デキストラン硫酸処置ラットの隅角においてラミニン及びフィブロネクチンのレベルが有意に低かったため、ＩＯＰ低下は、おそらくは確立されたＴＭ瘢痕要素の溶解に起因するものであった。
【０１１１】
観察の臨床的意味は以下の通りである。緑内障の患者は現在、眼液産生を制限するか、または眼液流出を増加させることによりＩＯＰを低下させる薬剤の点眼薬で毎日治療されている。これらの治療法は、コンプライアンスが不十分であるため、ＩＯＰの制御が不完全であり、ほとんどの患者で進行性の視力喪失をもたらす。視力低下をもたらす眼の病変を逆転させ、ＩＯＰ制御を有意に向上させる治療法は非常に価値が高いであろう。実施形態によるデキストラン硫酸は、ＩＯＰの正常化、ＲＧＣ及びＲＮＦＬの保持、ならびにＴＭ瘢痕要素の溶解をもたらすそのような治療を可能にする。
【０１１２】
材料及び方法
研究の設計
成体雄スプラーグドーリーラットにおいて、週２回のトランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）の前房内（ＩＣ）注射を繰り返して眼圧（ＩＯＰ）を高めることにより、緑内障を誘発した。ＩＯＰの持続的な増加（２週間後）は、網膜神経節細胞の細胞死をもたらす（３０〜４０％）。デキストラン硫酸（Ｔｉｋｏｍｅｄ  ＡＢ、スウェーデン、ＷＯ２０１６／０７６７８０）を、実験開始から毎日皮下注射により１５ｍｇ／ｋｇ投与し、ＲＧＣ保護を対照と比較して評価した。
【０１１３】
群１  ｎ＝１２匹のラット；２４眼のＩＯＰ＋ＩＣ  ＴＧＦ−β（週２回、２８日間）（０日目〜２８日目）＋デキストラン硫酸を毎日皮下投与（１４日目〜２８日目）。
【０１１４】
群２  ｎ＝８匹のラット；１６眼のＩＯＰ＋ＩＣ  ＴＧＦ−β（２８日間、週２回）（０日目〜２８日目）＋ビヒクル（生理食塩水）を毎日皮下投与（１４日目〜２８日目）。
【０１１５】
群３  ｎ＝８匹のラット；８眼のＩＯＰ＋インタクト（非損傷眼）及び８眼のＩＯＰ＋ＩＣ  リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を毎日（２８日間）。
【０１１６】
測定する評価項目
・ＩＯＰ、０日目〜２８日目の試験を通して、週２回；
・２８日目の脳特異的ホメオボックス／ＰＯＵドメインタンパク質３Ａ（Ｂｒｎ３ａ）に対して免疫反応性のあるＲＧＣ（ＲＧＣの生存率）をカウントするための免疫組織化学；
・群１及び２における２８日目の線維柱帯網の瘢痕を評価するためのラミニン及びフィブロネクチンの免疫組織化学；
・ＲＧＣ軸索を含む網膜神経線維層の角度と厚さを調べるための２８日目の前眼部及びＯＣＴ画像；ならびに
・２８日目の体重。
【０１１７】
動物及び手術
１２時間の光周期サイクルで餌と水を自由に摂取させて飼育した１６匹の８〜１０週齢の雄の１７５〜２００ｇのスプラーグドーリーラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｋｅｎｔ，ＵＫ）をこれらの実験に使用した。１９８６年動物法（英国）及び眼科及び視覚研究における動物の使用に関するＡＲＶＯ声明に定められた内務省のガイドラインに従って、バーミンガム大学の生物医学サービスユニットにおいて手術を実施した。すべての眼科手術手順及びＩＯＰ測定は、１．５Ｌ／ｍｉｎの流速で２〜５％イソフルラン／９５％Ｏ２を使用した吸入麻酔（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｖｅｔ  Ｓｕｐｐｌｉｅｓ，Ｓｔｏｋｅ，ＵＫ）の下で完了させた。すべてのラットの術後の福祉を綿密にモニタリングした。
【０１１８】
０日目に、１５°使い捨てブレードを使用して角膜を通して両眼の前房に１ヶ所の自己閉鎖創を作出し、自作の使い捨て滅菌ガラスマイクロピペット（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｋｅｎｔ，ＵＫ）を使用して生成したトンネルを通して、２８日間にわたって１週間に２回（週２回）、繰り返し、３．５μｌの活性ヒト組換えＴＧＦ−β１（５ｎｇ／μｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）をＩＣ注射（毎週月曜日及び木曜日）できるようにした。
【０１１９】
ＩＯＰ測定
ｉＣａｒｅ  Ｔｏｎｏｌａｂ反跳式眼圧計（Ｉｃａｒｅ，Ｈｅｌｓｉｎｋｉ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用して、各実験の期間中、午前９時〜１１時の間に週２回、ＩＯＰを記録し、サーカディアン変動による読み取り値の交絡を回避した。５％イソフルランによる麻酔導入直後に、各測定機会において、眼圧計で中心角膜の６回の反跳測定を行い、全体的な平均ＩＯＰ測定値（ｍｍＨｇ）を求めたが、グラフのすべてのデータポイントは、正確な測定値を確保するために、順番に取得した３つの読み取り値の平均±ＳＥＭ（６回の反跳ごとに）を表す。
【０１２０】
ＯＣＴ及び前眼部画像化
光干渉断層撮影により、ＲＧＣ密度の代替測定値であるＲＮＦＬの網膜の厚さをｉｎ  ｖｉｖｏで測定することができる。２８日目に、吸入麻酔下のすべてのラットにおいて、Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ  ＨＲＡ３共焦点走査レーザー検眼鏡（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）を使用して、ＯＣＴ網膜神経線維層分析を実施した。隅角の前眼部画像を、視神経乳頭周囲の網膜のＯＣＴ画像とともに撮影した。内蔵ソフトウェアを使用して画像を分割し、ＲＮＦＬの厚さを定量化した。
【０１２１】
免疫組織化学（ＩＨＣ）用の組織調製
ラットを高濃度ＣＯ２にさらして殺傷し、１００ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で経心腔的灌流を行って血液を洗い流した後、ｐＨ７．４のＰＢＳ中の１００ｍｌの４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）でさらに灌流した。解剖したＩＨＣ用の眼を、ＰＢＳ中の４％ＰＦＡ中に４℃で２時間浸漬して後固定し、その後、高濃度スクロース溶液（１０％、２０％及び３０％スクロースを含有するＰＢＳ；すべてＳｉｇｍａ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫより購入）に、それぞれ４℃、２４時間、浸漬することにより凍結保護し、次いで、ｐｅｅｌ−ａｗａｙ金型容器（Ａｇａｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｅｓｓｅｘ，ＵＫ）内でｏｐｔｉｍａｌ  ｃｕｔｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｈａｎｄｏｎ，Ｒｕｎｃｏｒｎ，ＵＫ）に包埋した。ｏｐｔｉｍａｌ  ｃｕｔｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍに浸漬した眼を、砕いたドライアイスで急速に凍結させた後、−８０℃で保存し、その後、−２２℃で、Ｂｒｉｇｈｔクライオスタットミクロトーム（Ｂｒｉｇｈｔ，Ｈｕｎｔｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ）を用いて、視神経乳頭を通る傍矢状平面において厚さ１５μｍで切片化した。切片を正に帯電したガラススライド（Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  ｐｌｕｓ；Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＵＳＡ）にマウントし、３７℃で２時間放置して乾燥させ、−２０℃で保存した。
【０１２２】
免疫組織化学
凍結切片を３０分間解凍した後、ＰＢＳで３×５分間洗浄し、次いで０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ）で２０分間透過処理した。切片をＰＢＳ中の０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．３％Ｔｗｅｅｎ−２０（すべてＳｉｇｍａより購入）で３０分間ブロックし、一次抗体（表１）で一晩インキュベートした後、ＰＢＳで３×５分間洗浄し、二次抗体（表１）で室温（ＲＴ；２０〜２５℃）、１時間インキュベートした。次いで、切片をＰＢＳで３×５分間洗浄し、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含有するＶｅｃｔｏｒｓｈｉｅｌｄ封入剤にマウントした。二次抗体のみでインキュベートした対照組織切片はすべて陰性に染色された（示さず）。
【表１】
0006817466.tif 000004
【０１２３】
免疫組織化学の定量化
免疫蛍光染色後、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ  ２落射蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｌｔｄ）で切片を観察し、Ｚｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＣａｍ  ＨＲｃを使用して各抗体について同じ露光時間で画像をキャプチャした。前述の方法［１］に従ってＩＨＣを定量した。簡潔に述べると、ＴＭ線維形成の定量に使用する関心領域は、すべての眼／ＴＭ内の処置に対する同じ規定サイズの象限によって画定され、ＴＭのこの画定した象限内でＥＣＭの堆積を定量化し、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（米国国立衛生研究所）を使用して、標準化バックグラウンド閾値を上回る免疫蛍光ピクセル（％）を計算した。各抗体について、ＴＭの領域における明るさの閾値レベルをインタクトな未処置の眼の切片を使用して設定し、被験群のピクセル強度分析の基準レベルを規定した。画像には無作為化した番号を割り当て、評価者による定量化中の治療群の盲検化を確保した。
【０１２４】
網膜切片におけるＲＧＣを定量化するために、視神経のいずれかの側の神経節細胞層由来の２５０μｍの直線部分由来の網膜の厚さ１５μｍの傍矢状切片において、ＲＰＢＭＳ＋／ＤＡＰＩ＋  ＲＧＣをカウントした。対照群と治療群の各眼の４つの網膜切片を定量化した。画像には無作為化した番号を割り当て、評価者による定量化中の治療群の盲検化を確保した。
【０１２５】
統計
すべての統計解析は、ＳＰＳＳ２０（ＩＢＭ，ＵＳＡ）を使用して実施した。正規分布試験を実施して、治療を比較するための最も適切な統計解析を決定した。統計的有意性はｐ＜０．０５で判定した。ＩＯＰデータ、ＴＭ線維形成、及びＲＧＣ生存率を、スチューデントｔ検定を用いて有意差について、または＞２群の比較±ＳＥＭについて１因子ＡＮＯＶＡを使用して試験し、これをテキストで提供するか、または平均±ＳＥＭとしてグラフで示す。
【０１２６】
実施例２−新生血管の加齢性黄斑変性（ｎＡＭＤ）のマウスモデルにおけるデキストラン硫酸の血管への影響の調査
眼の病理学的な血管形成は、重度の視覚障害をもたらし得る。したがって、血管新生を誘発するか、または血管新生の病状を促進する薬物は極めて禁忌である。
【０１２７】
マウスレーザー誘発性脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）モデルは、血管新生の加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）研究の重要な主力モデルである。網膜色素上皮（ＲＰＥ）及びブルッフ膜に標的化レーザー損傷を投与することにより、この手順は血管形成を誘導し、血管新生ＡＭＤで観察される顕著な病理をモデリングする。非ヒト霊長類で最初に開発されたレーザー誘発性ＣＮＶモデルは、他の多くの種に実装されるようになり、その最新のモデルはマウスである。このモデルは、分子メカニズム、遺伝子操作の効果、薬物治療効果などの、眼の新生血管生物学の多くの態様の研究に適用することができる。
【０１２８】
結果
眼底フルオレセイン血管造影における脈絡膜の新生血管膜の可視化
網膜血管を、眼底フルオレセイン血管造影で明確に可視化した。脈絡膜血管新生を、過蛍光のパッチとして示した。図８は、各マウスの代表的なフルオレセイン血管造影画像を示す。様々な眼においてＣＮＶのサイズにはばらつきがあった。時折、２つのＣＮＶが合併して強いフルオレセインのリークを有していたが、これらは定量分析から除外した。眼底フルオレセイン血管造影画像の目視検査では、２群間でＣＮＶのサイズに有意差は示されなかった。
【０１２９】
ＣＮＶ分析
各群で７２のレーザー燃焼スポットを実施した。網膜下出血または重度の炎症のために２つのレーザースポットが合併するか、または大きすぎた（＞１０００００μｍ２）ＣＮＶは、最終データ分析から除外した。表２は、最終データ分析に含めたＣＮＶの数をまとめたものである。
【表２】
0006817466.tif 000005
【０１３０】
イソレクチンＢ４を使用した血管新生の定量化
イソレクチンＢ４（Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａレクチンＩ−イソレクチンＢ４）は、内皮細胞で発現するため、網膜血管のマーカーとして使用されている。また、活性化ミクログリア及び網膜の浸潤性マクロファージにも発現している。イソレクチンＢ４陽性面積の平均は、被験化合物処置群で４３９７２±２３０２μｍ２、生理食塩水対照群で４２４３２±２０１５μｍ２であった（図９）。レクチンＢ４＋病変の２群間に統計的な差はなかった。
【０１３１】
ＩＶ型コラーゲンを使用した新規血管領域の定量化
ＩＶ型コラーゲンは、血管マトリックスの層状の層を形成する。したがって、新規血管を実証するために使用されている。デキストラン硫酸塩処置群では、新規血管の面積の平均は５４６８１±２３７８μｍ２であったが、ビヒクル（生理食塩水）処置対照群では５８２１５±２２９３μｍ２であった（図１０）。２群間に統計的な有意差はなかった。
【０１３２】
結論
結果は、デキストラン硫酸が、１日あたり０．６ｍｇ／ｍｌの用量では、レーザー誘発性ＣＮＶに対して抗血管形成効果も血管形成促進効果も有さないことを示している。これは、眼の適応症に対するデキストラン硫酸の適応性を示している。
【０１３３】
材料及び方法
マウス
２４匹の１０〜１２週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、クイーンズ大学ベルファストの生物サービスユニットから購入した。すべてのマウスを、水と固形飼料を自由に摂取できる状態で飼育し、１２時間の光周期サイクルにさらした。この研究での動物の使用に関するすべての手順は、眼と視覚の研究における動物の使用に関する視覚と眼科学研究協会会議（ＡＲＶＯ）の声明に従って、及び１９８６年の動物法（科学的手順）の規制（ＵＫ）の下で実施した。プロトコールは、クイーンズ大学ベルファストの動物福祉倫理委員会によって承認された。
【０１３４】
被験化合物
被験化合物であるデキストラン硫酸（Ｔｉｋｏｍｅｄ  ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ，ＷＯ２０１６／０７６７８０）を、６ｍｇ／ｍｌの濃度で提供した。滅菌生理食塩水（Ａｑｕｐｈａｒｍから購入）を使用して、化合物を使用濃度（０．６ｍｇ／ｍｌ）に希釈した。
【０１３５】
ＣＮＶ誘発
７５ｍｇ／ｋｇケタミン及び７．５ｍｇ／ｋｇキシラジンの腹腔内注射でマウスを麻酔した。１％アトロピン及び２．５％フェニレフリンで瞳孔を拡張させた（Ｂａｕｓｃｈ  ＆  Ｌｏｍｂ）。ＣＮＶを誘発するために、スポットサイズ１００μｍ、出力２５０ｍＷ、及び持続時間１００ミリ秒で、ＨＧＭ  Ｅｌｉｔｅ  ５３２  Ｇｒｅｅｎ  Ｌａｓｅｒ（Ｌｉｔｅｃｈｎｉｃａ  Ｌｔｄ，Ｍｉｄｄｅｓｅｘ，ＵＫ）を使用したレーザー光凝固によってブルッフ膜−脈絡膜の破裂を達成した。レーザースポットは、網膜血管と視神経乳頭から２〜３乳頭直径の間に配置した。レーザーを当てた部位での泡形成は、ブルッフ膜の破裂の成功を示す。気泡が発生したレーザー熱傷のみが本研究に含まれる。さらに、ＣＮＶ誘発中に重度の網膜下出血を示したレーザー熱傷は研究から除外した。各網膜に３回のレーザー熱傷を当てた。
【０１３６】
薬物投与
ＣＮＶ誘発の直後に、すべてのマウスに５００μｌのデキストラン硫酸または生理食塩水を皮下注射した。レーザーＣＮＶ誘発後９日間、１日１回注射を繰り返した。詳細な処置を表３に示す。
【表３】
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【０１３７】
蛍光血管造影
ＣＮＶ誘発後１０日目に、各群から３匹のマウスを眼底フルオレセイン血管造影のために無作為に選択した。７５ｍｇ／ｋｇケタミン及び７．５ｍｇ／ｋｇキシラジンの腹腔内注射でマウスを麻酔した。１％アトロピン及び２．５％フェニレフリンで瞳孔を拡張させた。１００μｌの１％ナトリウム蛍光を腹腔内に注射した。Ｍｉｃｒｏｎ  ＩＶ  Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ）を使用して眼底画像をキャプチャした。フルオレセイン血管造影及び眼の採取後、マウスを殺処分した。
【０１３８】
試料収集
ＣＮＶ誘発後１０日目に、すべてのマウスを殺処分し、眼を慎重に除去した。すべての目を２％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｄｏｒｓｅｔ，ＵＫ）で室温、２時間固定し、次いで洗浄し、４℃でＰＢＳ中に保存した。記載するプロトコール［２，３］を使用して、ＲＰＥ−脈絡膜−強膜全組織標本を調製した。簡潔に述べると、角膜、毛様体、虹彩及び水晶体を含む眼の前眼部を除去した。眼杯に５つの垂直カットを行い、網膜組織を慎重に除去した。結膜及び眼筋を含む眼球外組織を、眼杯（ＲＰＥ／脈絡膜／強膜を含む）から慎重に除去した。ＲＰＥ／脈絡膜／強膜全組織標本を、Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａレクチンＩ−イソレクチンＢ４及びＩＶ型コラーゲン免疫染色のためにさらに処理した。
【０１３９】
ＲＰＥ／脈絡膜／強膜全組織標本の免疫染色
十分に確立されたイソレクチンＢ４及びＩＶ型コラーゲン標識技術を使用してＣＮＶを検出した。イソレクチンＢ４は、浸潤性マクロファージと血管内皮細胞の両方を標識する。ＩＶ型コラーゲンは、血管の基底膜を標識する。両方のマーカーは、ＣＮＶを検出するために広く使用されている。
【０１４０】
ＲＰＥ／脈絡膜／強膜全組織標本を、室温で１時間、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＰＢＳで透過処理した。次いで、試料を０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＰＢＳ中の１０％ＢＳＡで１時間ブロックし、ビオチン化Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａレクチンＩ−イソレクチンＢ４（ＧＳＬ  Ｉｓｏｌｅｃｔｉｎ  Ｂ４、１：５０、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ，ＵＫ）及びＩＶ型コラーゲン（１：５０、ＢＩＯ−ＲＡＤ，ＵＫ）の存在下で４℃、一晩インキュベートした。ＰＢＳで徹底的に洗浄（１０分×３）した後、試料をストレプトアビジン−フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（１：１００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＫ）及びヤギ抗ウサギＡＦ５９４（１：１００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＫ）の存在下で室温、２時間インキュベートした。試料を、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ，ＵＫ）を使用してスライドガラスにフラットマウントし、蛍光顕微鏡で観察した。
【０１４１】
画像の取得及び解析
Ｌｅｃｉａ蛍光顕微鏡を使用して、上記で調製したＲＰＥ脈絡膜／強膜全組織標本試料から画像を取得した。ＣＮＶの全領域をキャプチャできるように、１０倍の対物レンズを使用した。画像化ソフトウェアＩｍａｇｅＪを使用して画像を解析した。ＣＮＶのサイズを測定するために、ＣＮＶの境界線に対し、手動で輪郭を描き、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを使用してサイズを自動的に計算した。
【０１４２】
統計解析
すべてのデータ（各群のＣＮＶのサイズ）を、平均値±ＳＥＭとして表した。スチューデントｔ検定を使用して、デキストラン硫酸群と生理食塩水対照群の差を比較した。
【０１４３】
研究の設計
本研究では、２４匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（１０〜１２週齢）を使用した。マウスを無作為に２つの群に分けた（群あたり１２匹のマウス）
・群１：デキストラン硫酸処置（生理食塩水中のデキストラン硫酸０．６ｍｇ／ｍｌ  ５００μｌ）、皮下注射、９日間のＣＮＶ誘導後１日１回。
・群２：ビヒクル処置（生理食塩水５００μｌ）、皮下注射、９日間のＣＮＶ誘導後１日１回。
ＣＮＶ誘発後１０日目に、各群から３匹のマウスを、眼底フルオレセイン血管造影のために無作為に選択した。ＣＮＶ誘発後１０日目にすべてのマウスを殺処分した。免疫組織化学検査のために、眼を採取して処理した。
【０１４４】
実施例３−シュワン細胞においてデキストラン硫酸により誘導される遺伝子発現の変化の解析
結果
シュワン細胞の発現解析
シュワン細胞で発現していない遺伝子を、データ解析の前に除去した。ｌｏｇ２対数変換した発現値に対して、「発現未満」レベルを５に設定した。これにより、シュワン細胞培養物において解析するための１５，８４２のユニークなプローブが残った。解析の次の工程では、３セットのデータ（Ｄ０対照試料とＤ２対照試料の比較；Ｄ０対照試料とＤ２デキストラン硫酸処置試料の比較；Ｄ２対照試料とＤ２デキストラン硫酸処置試料の比較）を解析して、細胞に対するＣＭの影響及びデキストラン硫酸によって誘発される相対的変化を確立した。
【０１４５】
Ｄ０対照試料をＤ２対照試料と比較すると、シュワン細胞培養物において５８５個の遺伝子が示差的に発現していた。これらの遺伝子の影響を受ける分子機能は、細胞運動（１．１４Ｅ−０７−２．４９Ｅ−０３）；細胞形態（５．５６Ｅ−０７−２．３６Ｅ−０３）；細胞発生（７．３Ｅ−０６−２．４８Ｅ−０３）；細胞の成長及び増殖（７．３Ｅ−０６−２．４８Ｅ−０３）；細胞の集合及び組織化（１．２３Ｅ−０５−２．３６Ｅ−０３）；細胞機能及び維持（１．２３Ｅ−０５−２．４７Ｅ−０３）；細胞死及び生存（１．５３Ｅ−０５−２．５１Ｅ−０３）；脂質代謝（８．１４Ｅ−０５−１．６Ｅ−０３）；低分子生化学（８．１４Ｅ−０５−１．６Ｅ−０３）；分子輸送（１．１８Ｅ−０４−２．２９Ｅ−０３）；タンパク質輸送（１．６２Ｅ−０４−１．６Ｅ−０３）；炭水化物代謝（３．２２Ｅ−０４−１．７８Ｅ−０３）；遺伝子発現（３．９８Ｅ−０４−２．２Ｅ−０３）；細胞シグナル伝達（４．３９Ｅ−０４−２．２５Ｅ−０３）；細胞間シグナル伝達及び相互作用（５．０５Ｅ−０４−２．４８Ｅ−０３）；細胞の易感染性（７．６９Ｅ−０４−１．５８Ｅ−０３）；細胞周期（１．１２Ｅ−０３−１．８Ｅ−０３）；アミノ酸代謝（１．６Ｅ−０３−１．６Ｅ−０３）；ならびに核酸代謝（１．６Ｅ−０３−１．６Ｅ−０３）に関連している。
【０１４６】
上記に提示した値は、これらの遺伝子と異なる経路との関連の統計的有意性を表すｐ値である。２つのｐ値は、観測された統計的有意性の下限と上限を表す（ｐ＜０．０５は有意である）。
【０１４７】
Ｄ０対照をＤ２デキストラン硫酸処置試料と比較した場合に評価されるように、デキストラン硫酸は、シュワン細胞培養物において１２４４個の遺伝子の示差的発現を誘導した。これらの遺伝子の影響を受ける分子機能は、細胞形態（１．４３Ｅ−０８−８．３９Ｅ−０４）；細胞運動（１．４Ｅ−０７−９．６Ｅ−０４）；翻訳後修飾（３．９３Ｅ−０７−６．７１Ｅ−０５）；タンパク質合成（３．９３Ｅ−０７−１．０８Ｅ−０４）；タンパク質輸送（３．９３Ｅ−０７−１．２６Ｅ−０６）；細胞死と生存（２．１３Ｅ−０６−８．６５Ｅ−０４）；細胞集合及び組織化（７．４６Ｅ−０６−８．２４Ｅ−０４）；ＤＮＡの複製、組換え、修復（７．４６Ｅ−０６−７．４６Ｅ−０６）；細胞機能及び維持（９．５３Ｅ−０６−６．４６Ｅ−０４）；遺伝子発現（１．２７Ｅ−０５−４．９２Ｅ−０４）；細胞発生（１．２９Ｅ−０５−９．０６Ｅ−０４）；細胞の成長及び増殖（１．２９Ｅ−０５−９．０６Ｅ−０４）；細胞間シグナル伝達及び相互作用（１．９７Ｅ−０５−８．８１Ｅ−０４）；アミノ酸代謝（４．２２Ｅ−０５−８．２４Ｅ−０４）；小分子生化学（４．２２Ｅ−０５−８．２４Ｅ−０４）；脂質代謝（４．８１Ｅ−０５−３．６４Ｅ−０４）；分子輸送（３．６４Ｅ−０４−３．６４Ｅ−０４）；ならびに細胞周期（４．５３Ｅ−０４−４．８６Ｅ−０４）に関連している。
【０１４８】
Ｄ２対照をＤ２デキストラン硫酸処置試料と比較した場合に評価されるように、デキストラン硫酸は、シュワン細胞培養物において７００個の遺伝子の示差的発現を誘導した。これらの遺伝子の影響を受ける分子機能は、細胞形態（１．４９Ｅ−０７−５．６２Ｅ−０３）；細胞の集合及び組織化（１．４９Ｅ−０７−５．９５Ｅ−０３）；細胞運動（７．２４Ｅ−０７−６．０６Ｅ−０３）；細胞死と生存（９．４１Ｅ−０６−５．９５Ｅ−０３）；アミノ酸代謝（２．５６Ｅ−０５−３．７Ｅ−０３）；翻訳後修飾（２．５６Ｅ−０５−１．０５Ｅ−０３）；低分子生化学（２．５６Ｅ−０５−３．７Ｅ−０３）；細胞間シグナル伝達及び相互作用（５．０５Ｅ−０５−５．７６Ｅ−０３）；遺伝子発現（７．１８Ｅ−０５−４．９４Ｅ−０３）；細胞周期（１．０６Ｅ−０４−５．９５Ｅ−０３）；細胞発生（１．０６Ｅ−０４−５．９５Ｅ−０３）；細胞機能及び維持（１．９６Ｅ−０４−５．９５Ｅ−０３）；細胞の成長及び増殖（２．３５Ｅ−０４−５．９５Ｅ−０３）；ＤＮＡの複製、組換え、修復（２．７５Ｅ−０４−５．９５Ｅ−０３）；細胞シグナル伝達（５．９２Ｅ−０４−２．５４Ｅ−０３）；細胞組成（６．２６Ｅ−０４−６．２６Ｅ−０４）；脂質代謝（６．２６Ｅ−０４−１．８５Ｅ−０３）；分子輸送（６．２６Ｅ−０４−５．９５Ｅ−０３）；タンパク質合成（１．０５Ｅ−０３−１．９３Ｅ−０３）；治療薬に対する細胞応答（１．８５Ｅ−０３−１．８５Ｅ−０３）；タンパク質輸送（２．６６Ｅ−０３−５．９５Ｅ−０３）；ならびにＲＮＡ転写後修飾（４．３２Ｅ−０３−４．３２Ｅ−０３）に関連している。
【０１４９】
機構的分子ネットワークモデルは、デキストラン硫酸により示差的に調節される分子の効果をシミュレートし、これらの変化の機能的結果を評価することができる。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏモデルにより、デキストラン硫酸が、神経細胞死；アポトーシス；及びタンパク質の合成を阻害し、さらに、血管形成；細胞の遊走；細胞生存率；細胞生存度；細胞運動；細胞の増殖；細胞の分化；細胞の恒常性；細胞周期の進行；細胞の形質転換；ならびにＲＮＡの発現を活性化することが示された。
【０１５０】
表４は、培養したシュワン細胞における遺伝子発現変化の結果をまとめたものである。
【表４】
0006817466.tif 000007
【０１５１】
対照培養物において２日間で発現が変化した２１個の遺伝子は、デキストラン硫酸処置培養物においては同じ２日間で全く変化を示さなかった。対照培養物で発現が増加した１つの遺伝子は、デキストラン硫酸処置培養物においては同じ２日間で下方制御された。対照培養物で下方制御された１３個の遺伝子は、デキストラン硫酸処置培養物においては２日間で上方制御された。１２２個の遺伝子が、培養液中の増殖因子によって有意に下方制御され、この下方制御はデキストラン硫酸処置培養物においてはさらに強力であった。対照培養では４４１個の遺伝子が上方制御され、デキストラン硫酸の添加により、この上方制御が有意に強化された。
【０１５２】
細胞接着に対するデキストラン硫酸の効果
デキストラン硫酸の強力で顕著な表現型効果の１つは、細胞接着に対する効果であった。
【０１５３】
遺伝子発現の解析は、これがマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）とも呼ばれるメタロペプチダーゼなどの、細胞接着を調節する酵素の発現に対するデキストラン硫酸の効果によるものであることを示した。表５参照。
【０１５４】
シュワン細胞の細胞運動及び接着を調節する経路に対するこれらの分子の凝集効果（１７分子、表５参照）は、細胞運動を活性化する一方で細胞接着を阻害するものであった。
【表５】
0006817466.tif 000008
【０１５５】
この発見は、細胞接着及び接着関連分子に影響を及ぼすすべての分子相互作用、ならびにシュワン細胞における細胞接着に対するそれらの効果の再評価をもたらした。２１７個の接着関連分子（１９７個の遺伝子と２０個の薬物）の完全なリストを以下に示す。
【０１５６】
ＡＣＥ２、ＡＣＰ１、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＧＲＢ１、ＡＤＧＲＥ２、ＡＤＩＰＯＱ、ＡＧ４９０、ＡＭＢＮ、ＡＮＧＰＴ１、ＡＮＴＸＲ１、ＡＲＡＰ３、ＡＲＭＳ２、バチマスタット、ＢＣＡＭ、ＢＣＡＰ３１、ＢＣＡＲ１、ベンジルオキシカルボニル−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−アルデヒド、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＴＣ、Ｃ１ＱＢＰ、Ｃａ２＋、ＣＡ９、ＣＡＤＭ１、ＣＡＬＲ、カリクリンＡ、カスパーゼ、ＣＢＬ、ＣＤ２０９、ＣＤ３６、ＣＤ４４、ＣＤ４６、ＣＤＨ１３、セリバスタチン、クロラムフェニコール、コンドロイチン硫酸、ＣＬＥＣ４Ｍ、コルヒチン、Ｉ型コラーゲン、コラーゲン（複数可）、ＣＯＭＰ、ＣＲＫ、ＣＲＰ、ＣＳＦ１、ＣＳＦ２ＲＢ、ＣＴＧＦ、クルクミン、ＣＸＣＬ１２、サイクリックＡＭＰ、ＤＡＢ２、ＤＡＧ１、ＤＣＮ、ＤＤＲ１、デスフェリキソケリン７７２ＳＭ、ＤＯＣＫ２、ＤＳＧ２、ＤＳＧ４、デュラパタイト、Ｅｆｎａ、ＥＦＮＡ１、ＥＦＮＢ、ＥＦＮＢ１、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＥＧＲ１、ＥＬＮ、ＥＮＧ、ＥＰ３００、Ｅｐｈ受容体、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＢ１、エプチフィバチド、エチレンジアミン四酢酸、ＥＴＳ１、Ｆ１１Ｒ、Ｆ３、ＦＢＬＮ５、ＦＢＮ１、Ｆｃ受容体、ＦＣＮ２、ＦＥＲＭＴ２、ＦＥＳ、ＦＧＦ２、ＦＧＦＲ１、フィブリン、ＦＮ１、接着斑キナーゼ、ＦＳＨ  、ＦＵＴ３、ＦＵＴ６、ＦＵＴ７、ＦＹＮ、ＨＡＣＤ１、ヘパリン、ヒストンｈ３、ヒストンｈ４、ＨＲＡＳ、ＨＳＰＧ２、ＨＴＮ１、ヒアルロン酸、ヒドロコルチゾン、過酸化水素、ＩＣＡＭ１、ＩＣＡＭ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＩｇＧ、Ｉｇｇ３、ＩＬ１、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ６、ＩＬＫ、インテグリン、インテグリンα４β１、インテグリンα、ＩＰＯ９、ＩＴＧＡ１、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ３、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＢ２、ＩＴＧＢ３、ＩＴＧＢ５、ＪＡＫ２、Ｊｎｋ、ＫＰ−ＳＤ−１、ＬＡＭＣ１、ラミニン、ラミニン１、レボチロキシン、ＬＧＡＬＳ３、ＬＩＦ、リポ多糖、ＬＯＸ、ＬＲＰ１、ＬＲＰＡＰ１、ＭＡＤ１Ｌ１、マンノース、ＭＡＰＫ７、ＭＢＬ２、ＭＥＲＴＫ、メトロニダゾール、ＭＧＡＴ５、ＭＭＰ２、Ｍｎ２＋、ＮＣＫ、ＮＥＤＤ９、ＮＲＧ１、オカダ酸、ＯＬＲ１、Ｐ３８  ＭＡＰＫ、ＰＤＧＦ  ＢＢ、ホスファチジルイノシトール、ＰＫＭ、血小板活性化因子、ＰＬＤ１、ＰＬＧ、ＰＭＰ２２、ＰＯＤＸＬ、ＰＯＳＴＮ、ＰＲＫＣＤ、ＰＴＡＦＲ、ＰＴＥＮ、ＰＴＧＥＲ２、ＰＴＫ２、ＰＴＫ２Ｂ、ＰＴＮ、ＰＴＰＮ１１、ＰＴＰＲＺ１、ピロリジンジチオカルバメート、Ｒａｃ、ＲＡＬＢ、ＲＡＮＢＰ９、ＲＨＯＡ、ＲＨＯＢ、ＲＰＳＡ、ＳＤＣ３、ＳＥＬＥ、セレクチン、ＳＥＬＬ、ＳＥＭＡ３Ａ、シンバスタチン、ＳＩＲＰＡ、ＳＰＡＲＣ、スフィンゴシン−１−リン酸、ＳＰＩ１、ＳＰＰ１、ＳＰＲＹ２、ＳＲＣ、ＳＴＡＲＤ１３、ＳＷＡＰ７０、ＴＥＫ、ＴＦＰＩ、ＴＦＰＩ２、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＭ２、ＴＨＢＳ２、ＴＨＹ１、甲状腺ホルモン、ＴＩＭＰ２、チロフィバン、ＴＬＮ１、ＴＬＮ２、ＴＮＦ、ＴＰ６３、トレチノイン、ＶＡＶ１、ＶＣＡＭ１、ＶＣＡＮ、Ｖｅｇｆ、ＶＨＬ、ＶＴＮ、ＶＷＦ、及びＷＲＲ−０８６。
【０１５７】
細胞接着を調節する１９７個の遺伝子のうち、１７個の分子がシュワン細胞培養物で示差的に発現し、全体的にわずかに接着が増加した。
【０１５８】
結果は、組織線維形成のシグナル及び免疫細胞の接着を低下させることによるデキストラン硫酸の抗瘢痕効果に関連している（実施例１参照）。
【０１５９】
デキストラン硫酸の影響を受ける上流の調節因子経路
シュワン細胞では、上流の調節因子の解析により、デキストラン硫酸が、表６に示すように、いくつかの増殖因子の効果を、系内のそれらの活性化を増加させるかそれらの阻害を減少させることにより、調節したことが明らかになった。
【表６】
0006817466.tif 000009
【０１６０】
デキストラン硫酸はデコリン遺伝子を上方制御する
興味深いことに、遺伝子発現データから、デキストラン硫酸がデコリンと呼ばれる天然の瘢痕軽減分子の産生を活性化することが示された。デコリンは、線維芽細胞による瘢痕産生を刺激する増殖因子を「駆逐」することで瘢痕産生をさらに遮断する。
【０１６１】
デコリンは、平均で９０〜１４０ｋＤの分子量の糖タンパク質である。これは、低分子ロイシンリッチプロテオグリカン（ＳＬＲＰ）ファミリーに属し、コンドロイチン硫酸またはデルマタン硫酸のいずれかからなるグルコサミノグリカン（ＧＡＧ）鎖を有するロイシンリピートを含むタンパク質コアからなる。デコリンは、デコリンのＩ型コラーゲン結合領域を介して、Ｉ型コラーゲン原線維に結合する。
【０１６２】
デコリンは、トランスフォーミング成長因子β１／２（ＴＧＦ−β１／２）アンタゴニストとして作用し、瘢痕を軽減する。報告によると、急性瘢痕におけるデコリンの支配的な効果が、ＴＧＦ−β１／２の中和による炎症性線維形成の抑制を介した抗線維形成性であることが示されている。デコリンはコラーゲンにも直接結合し、その機能の１つは、創傷治癒中のコラーゲンの組織化に影響を与えることである。
【０１６３】
デコリンは、脳病変、水頭症、及び慢性脊髄創傷のモデルにおける瘢痕の抑制において以前に記載されている。デコリンは、緑内障モデルの既存の線維柱帯網の瘢痕の線維溶解も誘発する。
【０１６４】
デキストラン硫酸は、デコリン発現の増加を誘導し、その倍率変化は１．２４２倍であった。
【０１６５】
結論
シュワン細胞では、栄養素とグルコースを多く含む対照培養物がシュワン細胞の活性化を繰り返す。デキストラン硫酸処置培養物は、グリア活性化の２４時間後に加えたデキストラン硫酸の効果を模倣した。
【０１６６】
シュワン細胞において認められる分子効果は、アポトーシスに対する保護；血管形成の誘導；細胞の遊走及び運動の増加；細胞の生存率及び生存度の向上；ならびに細胞分化の誘導におけるデキストラン硫酸の役割を支持するものであることは結果から明らかである。
【０１６７】
デキストラン硫酸は、シュワン細胞の細胞剥離及び運動を促進した。細胞接着に対する効果は、主にメタロプロテイナーゼ型酵素の発現によるものであったが、他の接着分子の調節もこの効果に寄与した。
【０１６８】
この発見は、実施例１に認められるデキストラン硫酸の抗瘢痕効果も説明するであろう。結果は、実施例１において認められる抗瘢痕効果が、組織リモデリングを補助し、損傷した組織の線維形成（瘢痕）シグナルをブロックする分解酵素を活性化するデキストラン硫酸によって媒介されることを示唆するものである。
【０１６９】
病理学的反応としての瘢痕は、ＴＧＦ−βによって駆動される。ＴＧＦ−βは、免疫細胞の接着、細胞の活性化、細胞運動、細胞の凝集、線維形成及びＴＧＦ−βの誘導を引き起こす１７１分子の大きな相互接続ネットワークを誘発する。デキストラン硫酸の投与は、免疫細胞の接着、細胞の活性化、細胞の凝集、線維形成、ＴＧＦ−βの自己活性化におけるＴＧＦ−βによる誘発効果を完全に無効化した。シュワン細胞のＴＧＦ−βによって駆動される分子ネットワークに対するデキストラン硫酸のこれらの不活性化効果は、ＴＧＦ−βが活性化されている場合でも、すなわち過剰量のＴＧＦ−βの存在下でも認められる。
【０１７０】
デキストラン硫酸により調節される遺伝子の上流の調節因子の解析により、デキストラン硫酸が、ヘパリンの効果と同様に、細胞に対する既存の増殖因子の効果を増強することが示された。仮説は、デキストラン硫酸が増殖因子分子に結合し、その受容体への結合を促進するというものである。
【０１７１】
デキストラン硫酸の抗瘢痕作用は、緑内障を含む線維増殖（瘢痕）病態を治療するための潜在的な用途を示している。実験結果は、線維増殖（瘢痕）病態の発症を予防すること、及びそのような線維増殖（瘢痕）病態において既に確立された線維性瘢痕を溶解させることの両方におけるデキストラン硫酸の役割を支持するものである。
【０１７２】
したがって、抗瘢痕効果を有するデキストラン硫酸は、既に確立された瘢痕を溶解させる必要がある組織リモデリングに有効である。デキストラン硫酸のこの抗瘢痕効果は、例えば、細胞接着の阻害、細胞動員の誘導、メタロプロテアーゼ及び瘢痕溶解酵素の誘導、ならびにデコリンの誘導を介したＴＧＦ−β、特にＴＧＦ−β１の阻害を含む、デキストラン硫酸の前述の作用機序の結果であると考えられる。デキストラン硫酸で得られるこの後者の効果は、デコリンの誘導による線維形成及び瘢痕形成の予防または少なくとも阻害にさらに関連している。
【０１７３】
材料及び方法
実験の設計
ｎ＝８×２５ｃｍ２の培養フラスコを設置した。処置当日（播種後２４時間）に２本のフラスコから回収した。これは０日目の時点を表す。残りのフラスコのうち、３つのフラスコを対照培地で処置し、３つを、デキストラン硫酸を含む培地（ＣＭ）で処置して、０．０１ｍｇ／ｍｌの最終濃度にした。処置したフラスコの細胞を、４８時間後に回収した。したがって、収集したデータは、（ａ）未処置細胞（０日目の対照及び２日目の対照）ならびに（ｂ）デキストラン硫酸で４８時間処置した細胞（２日目のデキストラン硫酸処置）を表す。
【０１７４】
全細胞に対する組織培養プレートのコーティング
ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中の５０μｇ／ｍｌのポリ−ｄ−リジンの溶液をフラスコごとに２ｍｌ加え、暗所で３７℃、一晩インキュベートすることにより、２５ｃｍ２フラスコをコーティングした。フラスコを細胞培養水で洗浄し、暗所で３０分間風乾した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の２５μｇ／ｍｌラミニンの溶液をフラスコあたり１ｍｌ添加し、暗所で３７℃、２時間インキュベートすることにより、フラスコをコーティングした。細胞をプレーティングする前にラミニンフラスコをＰＢＳで３回洗浄した。
【０１７５】
ヒトシュワン細胞
高グルコースＤＭＥＭに１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加することにより、シュワン細胞増殖培地を調製し、３７℃に予熱した。３７℃の水浴で２分以内の間、細胞を解凍させた。
【０１７６】
１２個のバイアル由来の細胞をそれぞれ、１０ｍｌの高グルコースＤＭＥＭ培地を含むチューブに静かに移し、４００相対遠心力場（ＲＣＦ）で１０分間遠心分離した。ペレットを培地に再懸濁した。１２個のバイアル由来の細胞を混合し、以前にコーティングした２５ｃｍ２フラスコに均等に分配した（ｎ＝８）。細胞を、５％ＣＯ２の存在下、３７℃でインキュベートした。細胞をデキストラン硫酸処置の２４時間前に静置した。
【０１７７】
薬物処置
デキストラン硫酸（Ｔｉｋｏｍｅｄ  ＡＢ、スウェーデン、ＷＯ２０１６／０７６７８０）を２０ｍｇ／ｍｌのストック濃度で提供し、４℃の温度監視式冷蔵庫に保管した。新鮮な１００×デキストラン硫酸ストック（１．０ｍｇ／ｍｌ）を滅菌ＤＭＥＭ−Ｆ１２中に調製した。濃縮した薬物ストックを滅菌濾過し、それぞれの培地に加えた（１９．６ｍｌのＣＭ及び０．４ｍｌのデキストラン硫酸ストック溶液）。１９．６ｍｌのＣＭ及び０．４ｍｌのＤＭＥＭ−Ｆ１２を使用して対照を作成した。デキストラン硫酸及びＣＭをそれぞれのフラスコに加え（各５ｍｌ）、各ディッシュにおいて、それぞれ０．０１ｍｇ／ｍｌのデキストラン硫酸濃度及び合計１０ｍｌのＣＭを達成した。
【０１７８】
培養物回収及び細胞溶解
清潔でラベルの付いた１５ｍｌファルコンチューブにＣＭを吸引した。フラスコ（培地なし）を−８０℃の冷凍庫に３０分間静置した。Ｆａｌｃｏｎチューブ内のＣＭを３０００×ｇで５分間回転させた。上清を除去し、小さなペレットを室温（ＲＴ、約２２℃）で２．５ｍｌのトリゾール：水（４：１）溶液に再懸濁した。
【０１７９】
凍結させたフラスコを冷凍庫から一つずつ取り出し、適切なチューブに由来するトリゾール−水をフラスコに移した。フラスコを室温で５分間放置した後、内容物を吸引して１５ｍｌファルコンチューブに戻した（フラスコの底を溶液で完全に洗浄した後）。フラスコを顕微鏡下で検査し、細胞の完全な除去を確保した。１５ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブに集めたライセートを−８０℃の冷凍庫に静置した。
【０１８０】
ＲＮＡ抽出
ホモジネートを含むファルコンチューブを冷凍庫から取り出し、ＲＴで５分間保存して、核タンパク質複合体を完全に解離させた。
【０１８１】
１ｍｌの溶解物の２つのアリコートを各試料から除去し、２００μｌのクロロホルムをそれぞれに加え（細胞溶解工程中に使用したＴＲＩｚｏｌ試薬１ｍｌあたり０．２ｍｌのクロロホルム）、チューブを激しく振盪した。試料を室温で２〜３分間保存し、続いて４℃で１５分間、１２，０００×ｇで遠心分離した。
【０１８２】
混合物は３層に分離した：下部の赤色フェノール−クロロホルム相、中間相及び無色の上部水相。ＲＮＡは上部の水相に残り、ＤＮＡは白い中間（中間期）相に、タンパク質はピンク色の底部（有機）相に残った。水相の上部３／４を新しい清潔なエッペンドルフチューブに移した。
【０１８３】
等量の１００％エタノールを加えることにより、ＲＮＡを水相から沈殿させた。沈殿したＲＮＡをスピンカートリッジに固定し、２回洗浄して乾燥させた。ＲＮＡを５０μｌの温かいＲＮａｓｅフリー水で溶出した。精製されたＲＮＡの量と品質を、Ｎａｎｏｄｒｏｐによって測定した。ＲＮＡを、アレイ解析のためにＳｏｕｒｃｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅに移す前に−８０℃で保存した。
【０１８４】
発現データの解析計画
発現データを、細胞株ごとに別々のファイルにダウンロードした。「バックグラウンド補正」発現は、アレイの「ｇＰｒｏｃｅｓｓｅｄＳｉｇｎａｌ」からのデータであり、これは関連するプローブの実際のシグナルから抽出したバックグラウンドシグナルの結果である。これは、アレイ解析で最も頻繁に使用される変数である。すべての試料について、バックグラウンド補正したシグナルを、統計解析のためにｌｏｇ２対数変換した。試料の誤検出率を減らすために、「発現未満」レベルのシグナルを除去した。ｌｏｇ２対数変換した発現値に対して、「発現未満」レベルを５に設定した。
【０１８５】
統計解析
各アレイ上の対照プローブの発現パターンに基づいて、解析の前にすべてのアレイに対して中央値センタリングを実行して、結果のばらつきを減らすことにした。以下のアルゴリズムを使用してデータを解析した。
・Ｄ０対照試料とＤ２対照試料の比較−通常培養の細胞において認められる発現変化
・Ｄ０対照試料とＤ２デキストラン硫酸処置試料の比較−デキストラン硫酸処置培養物の細胞において認められる発現変化
・Ｄ２対照試料とＤ２デキストラン硫酸処置試料の比較−培養物中のデキストラン硫酸によって誘導される示差発現
【０１８６】
予備解析を実施して、３つのデータセットの任意の組み合わせ間で示差的に発現しなかった遺伝子をスクリーニング除外した。単純非ストリンジェントＡＮＯＶＡ（ｐ＜０．０５）を実行して、発現パターンを探した。３つのデータセットで変化のないプローブは除外した。残りのプローブセットを、Ｖｏｌｃａｎｏプロットを使用して、倍率の変化と有意性を解析した。プローブの発現の２０％を超える変化（ＦＣ≧１．２またはＦＣ≦０．８４）は、第１の例では有意であるとみなし、発現パターンを検出できるようにした。
【０１８７】
品質パラメーター
シュワン細胞の細胞ストックから取得した細胞カウント数から、播種濃度を計算した。
【０１８８】
アレイサービスプロバイダーによる追加の品質管理により、ＲＮＡが高品質（分解なし）であり、その量がＡｇｉｌｅｎｔのＬｏｗ  ｉｎｐｕｔ  ＲＮＡマイクロアレイのパラメーター内であることが示された。
【０１８９】
生データの分析から、予想通り、アレイ間に有意差があることが示された。しかしながら、これらの差異（すべてのアレイに含まれる同じ対照試料の差異によって反映される）は、正規化手法によって容易に除去された。アレイ間のばらつきを除去する選択したデータの中央値センタリング法は、異なるＲＮＡ濃度を示す対照間に認められると予想された全体的な差異には影響を及ぼさなかった。
【０１９０】
上述の実施形態は、本発明のいくつかの例示的な実施例として理解すべきである。当業者であれば、本発明の範囲から逸脱することなく、実施形態に対して様々な修正、組み合わせ、及び変更を行い得ることを理解するであろう。特に、異なる実施形態における異なる部分の解決策は、技術的に可能な他の構成で組み合わせることができる。しかしながら、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義される。
参考文献
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【図１】
0006817466.tif 000010
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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