(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
帯電した部分を有する化合物を精製するための精製方法であって、前記精製方法は、
帯電した部分を有する化合物を含む組成物を準備する工程と、
表面がハイドロキシアパタイト又はハイドロキシアパタイトが有する水酸基の少なくとも一部がフッ素原子で置換されたフッ素アパタイトで構成された吸着剤を準備する工程と、
ＨＥＰＥＳとアルコールとを含む保存用緩衝剤溶液を準備する工程と、
前記保存用緩衝剤溶液中に前記吸着剤を保存する保存工程と、
前記吸着剤に前記組成物を接触させることにより、前記吸着剤に前記化合物を吸着させる吸着工程と、
勾配溶出により前記吸着剤から前記化合物を分取する分取工程と、
を含む、精製方法。
【請求項２】
前記帯電物質が、負に帯電した部分を有する、請求項１に記載の精製方法。
【請求項３】
前記帯電物質が、正に帯電した部分を有する、請求項１に記載の精製方法。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１項に記載の精製方法により、帯電した部分を有する化合物を精製する精製工程を含む、帯電物質の生産方法。
【請求項５】
カラムと、
前記カラムに収容され、ＨＥＰＥＳとアルコールとを含む緩衝剤溶液と、
前記緩衝剤溶液中に保存され、表面がハイドロキシアパタイト又はハイドロキシアパタイトが有する水酸基の少なくとも一部がフッ素原子で置換されたフッ素アパタイトで構成された吸着剤と、
とを備える吸着装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、帯電物質の精製方法に関する。より詳しくは、リン酸カルシウム系化合物を含む吸着剤を用いた精製方法において、吸着剤が有する分解能が変動するのを抑制又は防止した精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ハイドロキシアパタイトのようなリン酸カルシウム系化合物は、生体親和性に優れることから、従来から、試料液中に含まれるタンパク質等の帯電物質を吸着・分離する液体クロマトグラフィー用カラム（吸着装置）に使用する吸着剤として広く利用されている（例えば、特許文献１参照）。【０００３】
この液体クロマトグラフィー用カラムでは、試料液中に含まれる帯電物質を、リン酸カルシウム系化合物で構成される吸着剤に吸着させた後に、吸着剤から離脱させることにより分離させ、この吸着・分離を繰り返して実施することにより、試料液中に含まれる帯電物質の分離を複数回に亘って行うことができる。【０００４】
ところで、リン酸カルシウム系化合物を含む吸着剤を用いた帯電物質の分離は、期間を空けることなく繰り返して実施されることもあるし、又は、分離の実施から７日間以上のような一定期間（保存期間）を空けた後に実施されることもある。帯電物質の分離を行うまでの一定期間においては、吸着剤は、高濃度の水酸化ナトリウム溶液（例えば、約１．０Ｍ）又はリン酸緩衝液（例えば、約０．４Ｍ）等の保存液中に保存されることがある。【０００５】
このような一定期間に亘る保存液中での保存の後に、リン酸カルシウム系化合物を含む吸着剤を用いて帯電物質の分離を実施すると、リン酸サイトに結合する塩基性タンパク質のような正帯電物質は、吸着剤から分離する正帯電物質の分離位置（溶出時間）が変化しないが、カルシウムサイトに結合する酸性タンパク質のような負帯電物質は、吸着剤から分離する分離位置（溶出時間）が変化してしまうという問題があった。。【０００６】
このような問題があるため、水酸化ナトリウム溶液又はリン酸緩衝液等の保存液中に吸着剤を用いて、液体クロマトグラフィー用カラムから流出する流出液を、所定量ずつ分画することによって、分画された各画分の流出液中に、負帯電物質を分離しようとする際には、負帯電物質が分離される画分が、保存期間の前後において変化してしまう。従って、所望の負帯電物質を回収するためには、保存期間の前後で、回収すべき画分を再設定する必要が生じるため、時間と手間とを要するという問題があった。【０００７】
このような問題を解決する技術としては、カラムを保存液中で一定期間に亘って保存した後に、保存液を比較的低濃度の濃度のリン酸緩衝液で置換してしばらく静置するステップを追加することによって、負帯電物質の溶出位置が保存期間の前後において変化するのを抑制する方法が開示されている（例えば、特許文献２参照）。しかしながら、保存工程の後にリン酸緩衝液を通す工程を別途実行する必要があるため、当該方法は、分離作業をより効率良く行えるものとする観点においてさらなる工夫の余地があった。また、正帯電物質の溶出位置の変化を防止する観点においてさらなる工夫の余地があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２０１３−５３４２５２号公報
【特許文献２】国際公開第２０１９／２２４６６０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、帯電した部分を有する化合物の精製において、精製に用いる吸着剤に付着した保存液を置換して静置する工程を行うことなく、保存液の影響により化合物の溶出位置が変動するのを抑制することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
［Ａ１］
帯電した部分を有する化合物を精製するための精製方法であって、前記精製方法は、
帯電した部分を有する化合物を含む組成物を準備する工程と、
表面がハイドロキシアパタイト又はハイドロキシアパタイトが有する水酸基の少なくとも一部がフッ素原子で置換されたフッ素アパタイトで構成された吸着剤を準備する工程と、
ＨＥＰＥＳとアルコールとを含む保存用緩衝剤溶液を準備する工程と、
前記保存用緩衝剤溶液中に前記吸着剤を保存する保存工程と、
前記吸着剤に前記組成物を接触させることにより、前記吸着剤に前記化合物を吸着させる吸着工程と、
勾配溶出により前記吸着剤から前記化合物を分取する分取工程と、
を含む、精製方法。
［Ａ２］
前記帯電物質が、負に帯電した部分を有する、［Ａ１］に記載の精製方法。
［Ａ３］
前記帯電物質が、正に帯電した部分を有する、［Ａ１］に記載の精製方法。
［Ａ４］
［Ａ１］から［Ａ３］のいずれかに記載の精製方法により、帯電した部分を有する化合物を精製する精製工程を含む、帯電物質の生産方法。
［Ａ５］
帯電した部分を有する化合物を精製するために用いられ、かつ、表面がハイドロキシアパタイト又はハイドロキシアパタイトが有する水酸基の少なくとも一部がフッ素原子で置換されたフッ素アパタイトで構成された吸着剤を保存するために用いられる保存用緩衝剤溶液であって、
前記保存用緩衝剤溶液は、ＨＥＰＥＳとアルコールとを含む、
保存用緩衝剤溶液。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の目的は、帯電した部分を有する化合物の精製において、精製に用いる吸着剤を保存するための保存液を置換して静置する工程を行うことなく、保存液の影響により化合物の溶出位置が変動するのを抑制することである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の一実施形態の精製方法を適用し得る吸着剤を備える吸着装置の一例を示す縦断面図である。
【図２】実施例１における溶出の結果を示す図である。
【図３】比較例１における溶出の結果を示す図である。
【図４】比較例２における溶出の結果を示す図である。
【図５】比較例３における溶出の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の精製方法を添付図面に示す好適実施形態に基づいて詳細に説明する。まず、本発明の精製方法について説明するのに先立って、本発明の精製方法を適用し得る吸着剤を備える吸着装置の一例について説明する。
【００１４】
なお、以下では、吸着装置を用いて分離する帯電物質がタンパク質である場合、すなわち、負帯電物質が酸性タンパク質であり、正帯電物質が塩基性タンパク質である場合を一例として説明する。
【００１５】
＜吸着装置＞
図１は、本発明の精製方法を適用し得る吸着剤を備える吸着装置の一例を示す縦断面図である。なお、以下の説明では、図１中の上側を「流入側」、下側を「流出側」と言う。
【００１６】
ここで、流入側とは、目的とするタンパク質を分離（精製）する際に、例えば、試料液（試料を含む液体）、溶出液であるリン酸系緩衝液等の液体を、吸着装置内に供給する側のことを言い、一方、流出側とは、前記流入側と反対側、すなわち、前記液体が吸着装置内から流出する側のことを言う。
【００１７】
タンパク質を試料液から分離（精製）する、図１に示す吸着装置１は、カラム２と、粒状の吸着剤（充填剤）３と、２枚のフィルタ部材４、５とを有している。
【００１８】
カラム２は、カラム本体２１と、このカラム本体２１の流入側端部および流出側端部に、それぞれ装着されるキャップ（蓋体）２２、２３とで構成されている。
【００１９】
カラム本体２１は、例えば、円筒状の部材で構成されている。カラム本体２１を含めカラム２を構成する各部（各部材）の構成材料は、例えば、各種ガラス材料、各種樹脂材料、各種金属材料、若しくは、各種セラミックス材料等であってもよいし、又は、これらの任意の組み合わせであってもよい。
【００２０】
カラム本体２１には、その流入側開口および流出側開口を、それぞれ塞ぐようにフィルタ部材４、５を配置した状態で、その流入側端部および流出側端部に、それぞれキャップ２２、２３が螺合により装着される。
【００２１】
このような構成のカラム２では、カラム本体２１と各フィルタ部材４、５とにより、吸着剤充填空間２０が画成されている。そして、この吸着剤充填空間２０の少なくとも一部に（本実施形態では、ほぼ満量で）、吸着剤３が充填されている。
【００２２】
吸着剤充填空間２０の容積は、試料液の容量に応じて適宜設定され、特に限定されないが、試料液１ｍＬに対して、約０．１ｍＬ以上約１００ｍＬ以下が好ましく、約１ｍＬ以上約５０ｍＬ以下がより好ましい。
【００２３】
また、カラム本体２１に各キャップ２２、２３を装着した状態で、これらの間の液密性が確保されるように構成されている。
【００２４】
各キャップ２２、２３のほぼ中央には、それぞれ、流入管２４および流出管２５が液密に固着（固定）されている。この流入管２４およびフィルタ部材４を介して吸着剤３に、前記液体が供給される。また、吸着剤３に供給された液体は、吸着剤３同士の間（間隙）を通過して、フィルタ部材５および流出管２５を介して、カラム２外へ流出する。このとき、試料液（試料）に含まれる分離すべきタンパク質（以下、単に「タンパク質」と言うこともある）と、分離すべきタンパク質以外の物質（分離すべきタンパク質以外の夾雑タンパク質（以下、単に「夾雑タンパク質」と言うこともある）が含まれていてもよい）とは、吸着剤３に対する吸着性の差異およびリン酸系緩衝液に対する親和性の差異に基づいて分離される。
【００２５】
各フィルタ部材４、５は、それぞれ、吸着剤充填空間２０から吸着剤３が流出するのを防止する機能を有するものである。これらのフィルタ部材４、５は、例えば、ステンレス網フィルタ又はステンレス焼結フィルタであることが好ましい。
【００２６】
吸着剤３は、少なくとも一部分にリン酸カルシウム系化合物を含む。吸着剤３は、より好ましくは、その少なくとも表面が、リン酸カルシウム系化合物で構成されている。かかる吸着剤３には、分離すべきタンパク質が、このタンパク質固有の吸着（担持）力で特異的に吸着し、この吸着力の差に応じて、分離すべきタンパク質以外の他の物質（夾雑タンパク質を含む）と分離・精製される。
【００２７】
リン酸カルシウム系化合物は、例えば、ハイドロキシアパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）、ＴＣＰ（Ｃａ３（ＰＯ４）２）、Ｃａ２Ｐ２Ｏ７、Ｃａ（ＰＯ３）２、ＤＣＰＤ（ＣａＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ）、Ｃａ４Ｏ（ＰＯ４）２、若しくは、これらの一部が他の原子または原子団で置換されたもの等であってもよいし、又は、これらのうちの１種または２種以上の組み合わせであってもよい。
【００２８】
ここで、タンパク質は、一般的に、その構成アミノ酸として酸性アミノ酸を比較的多く含み負に帯電する酸性タンパク質と、塩基性アミノ酸を比較的多く含み正に帯電する塩基性タンパク質とに分類される。
【００２９】
リン酸カルシウム系化合物は、その結晶構造中に、正に帯電するＣａサイトと、負に帯電するリン酸サイトとを有している。
【００３０】
したがって、酸性タンパク質は、リン酸カルシウム系化合物が有するＣａサイトと、該酸性タンパク質の酸性アミノ酸残基との間でイオン結合が形成されることにより、リン酸カルシウム系化合物に吸着される。塩基性タンパク質は、リン酸カルシウム系化合物が有するリン酸サイトと、塩基性アミノ酸残基との間でイオン結合が形成されることにより、リン酸カルシウム系化合物に吸着される。タンパク質のリン酸カルシウム系化合物に対する結合（吸着）の強度は、各タンパク質（酸性タンパク質および塩基性タンパク質）の帯電量に応じて異なる。
【００３１】
このため、その少なくとも表面がリン酸カルシウム系化合物で構成される吸着剤３を用いれば、タンパク質（酸性タンパク質および塩基性タンパク質）と、他の物質（例えば、夾雑タンパク質等）とを、これらの吸着剤３に対する吸着力の差を利用して分離することが可能となる。
【００３２】
リン酸カルシウム系化合物は、上述したものの中でも、ハイドロキシアパタイトを主成分とするものが好ましい。特に、ハイドロキシアパタイトは、生体を構成する成分に近いため、タンパク質を吸着・分離する際に、かかるタンパク質が変質（変性）するのを好適に防止することができる。また、溶出液として、リン酸系緩衝液の塩濃度を変えて用いることで、タンパク質を、吸着剤３から特異的に取り外すことができるという利点も有する。
【００３３】
ここで、リン酸カルシウム系化合物がハイドロキシアパタイトを「主成分とする」とは、リン酸カルシウム系化合物の全質量を１００質量％としたとき、ハイドロキシアパタイトの質量が約５０％以上であることを意味する。この質量は、より好ましくは約６０％以上であり、さらに好ましくは約７０％以上であり、さらにより好ましくは約８０％以上であり、最も好ましくは約９０％以上である。
【００３４】
さらに、ハイドロキシアパタイトは、それが有する水酸基の少なくとも一部がフッ素原子で置換されたものであってもよい。フッ素原子で置換されたハイドロキシアパタイト（以下、「フッ素アパタイト」と言う）は、その結晶構造中にフッ素原子（フッ素イオン）が存在することにより、カルシウム原子（カルシウムイオン）のフッ素アパタイトからの離脱をより確実に防止することができる。
【００３５】
なお、以下では、ハイドロキシアパタイトおよびフッ素原子で置換されたハイドロキシアパタイトを、総称して「アパタイト」と言うこともある。
【００３６】
上記吸着剤３は、図１に示すように、粒状（顆粒状）の形態（形状）を有することが好ましい。上記吸着剤３の形態は、例えば、ペレット状（小塊状）、ブロック状（例えば、隣接する空孔同士が互いに連通する多孔質体、ハニカム形状）等であってもよい。吸着剤３を粒状とすることにより、その表面積を増大させることができ、タンパク質の分離特性の向上を図ることができる。
【００３７】
粒状の吸着剤３の平均粒径は、特に限定されないが、約０．５μｍから約１５０μｍであるのが好ましく、約１０μｍから約８０μｍであるのがより好ましい。このような平均粒径の吸着剤３を用いることにより、前記フィルタ部材５の目詰まりを確実に防止しつつ、吸着剤３の表面積を十分に確保することができる。
【００３８】
吸着剤３は、その全体がリン酸カルシウム系化合物で構成されたものであってもよく、又は、担体（基体）の表面をリン酸カルシウム系化合物で被覆したものであってもよい。これらの中でも、その全体がリン酸カルシウム系化合物で構成されたものであるのが好ましい。これにより、吸着剤３の強度をさらに向上することができる。また、多量のタンパク質を分離する際の使用に適したカラム２を得ることができる。
【００３９】
その全体がリン酸カルシウム系化合物で構成された吸着剤３は、例えば、湿式合成法や乾式合成法を用いて、リン酸カルシウム系化合物粒子（一次粒子）を得、かかるリン酸カルシウム系化合物粒子を含有するスラリーを、乾燥や造粒することにより、乾燥粒子を得、さらに、この乾燥粒子を焼成する等して得ることができる。
【００４０】
一方、担体の表面をリン酸カルシウム系化合物で被覆した吸着剤３は、例えば、樹脂等で構成される担体に、前記乾燥粒子を衝突（ハイブリダイズ）させる方法等により得ることができる。
【００４１】
本実施形態のように、吸着剤３を吸着剤充填空間２０にほぼ満量充填する場合には、吸着剤３は、吸着剤充填空間２０の各部において、ほぼ同一の組成を有していることが好ましい。これにより、吸着装置１は、タンパク質の分離（精製）能が特に優れたものとなる。
【００４２】
なお、吸着剤充填空間２０の一部（例えば流入管２４側の一部）に吸着剤３を充填し、その他の部分には他の吸着剤を充填してもよい。
【００４３】
＜精製方法＞
次に、このような吸着装置１を用いたタンパク質の精製方法について説明する。
【００４４】
［１Ａ］  調製工程
まず、分離（精製）すべきタンパク質と、分離すべきタンパク質以外の物質（混合物）とを含有する試料液（組成物）を準備する。
【００４５】
タンパク質が遺伝子組み換えタンパク質（モノクローナル抗体等）である場合、試料液は、タンパク質をコードする遺伝子を含む核酸を導入したヒツジ、ウサギ、ニワトリ等の哺乳動物、カイコ等の昆虫のような動物、チャイニーズハムスター卵巣細胞由来のＣＨＯ細胞のような動物細胞、大腸菌のような微生物等からの分泌物、それらの細胞質成分等、又は、それらの任意の組み合わせであってもよい。
【００４６】
タンパク質が天然のタンパク質である場合、試料液は、例えば、各種動物由来の血液（血漿）、リンパ液、唾液、鼻汁のような体液等であってもよい。
【００４７】
タンパク質のうち酸性タンパク質は、例えば、ＢＳＡ、ＨＳＡ、フィブリノゲン、ペプシノーゲン、α−グロブリン、β−グロブリン、又は、γ−グロブリン等であってもよい。また、塩基性タンパク質は、例えば、リゾチーム、ソーマチン、チトクロムＣ、リボヌクレアーゼ、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、α−キモトリプシン、ヒストン、プロタミン、ポリリジン、又は、モネリン等であってもよい。
【００４８】
なお、これらのタンパク質（酸性タンパク質および塩基性タンパク質）は、そのアミノ酸配列の一部のアミノ酸が他のアミノ酸に置き換えられた改変体であってもよい。
【００４９】
試料液（つまり、分離対象の帯電した部分を有する化合物を含む組成物）としては、前記微生物等からの分泌物や、動物由来の体液をそのまま用いてもよい。あるいは、試料液は、これらを水や生理食塩水のような中性緩衝液中で希釈したもの、およびフィルタ等の濾過膜で濾過したものであってもよい。また、試料液には、複数種のタンパク質が含まれていてもよい。
【００５０】
［２Ａ］  供給工程
次に、得られた試料液を、流入管２４およびフィルタ部材４を介して吸着剤３に供給して、カラム２（吸着装置１）内を通過させて、吸着剤３に接触させる。
【００５１】
これにより、吸着剤３に対して吸着能が高いタンパク質や、分離（精製）すべきタンパク質以外の混入物（夾雑タンパク質等）の中でも吸着剤３に対して比較的吸着能の高いもの（タンパク質）は、カラム２内に保持される。そして、吸着剤３に対して吸着能の低い混入物は、フィルタ部材５および流出管２５を介してカラム２内から流出する。
【００５２】
［３Ａ］  分画工程
次に、流入管２４からカラム２内に、タンパク質を溶出させるための溶出液として例えばリン酸系緩衝液を供給する。そして、カラム２内から流出管２５を介して流出する流出液を、所定量ずつ分画（採取）する。これにより、吸着剤３に吸着しているタンパク質および混入物は、それぞれが有する吸着剤３に対する吸着力の差に応じて異なるタイミングでそれぞれ流出し、それぞれが、各分画内に溶解した状態で回収（分離・精製）される。
【００５３】
すなわち、吸着剤３には、タンパク質および混入物が、それぞれに固有の吸着（担持）力で特異的に吸着している。つまり、それらには、吸着剤３に対する吸着力に差がある。この吸着力の差に応じて、タンパク質と混入物とが分離、精製される。分離（精製）すべきタンパク質が溶解している分画を選択的に回収することによって、精製されたタンパク質を得ることができる。
【００５４】
溶出液において用いられる緩衝剤は、ＨＥＰＥＳ及びＭＥＳ等のＧｏｏｄバッファ、硫酸塩、又は、リン酸塩であることが好ましい。これらの中でも、スルホ基を有する緩衝剤及びリン酸塩がより好ましい。スルホ基を有する緩衝剤は、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳであることが好ましい。リン酸塩は、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸リチウム、又は、リン酸アンモニウム等であってもよい。これらの中でも、リン酸ナトリウムが最も好ましい。溶出液には、塩化ナトリウム等の塩がさらに含まれていてもよい。
【００５５】
リン酸系緩衝液（リン酸塩を溶解させた溶液）のｐＨは、より高い方が溶出力を高める観点においては有利であるが、一般的には吸着バッファ（平衡化バッファ）と同程度のｐＨにすることが好ましい。また、中性付近のｐＨであることでタンパク質が変性しにくい。そのため、上記ｐＨ値は、例えば、好ましくは約５．５から８．５、より好ましくは約６．５から７．５に設定される。
【００５６】
分離するタンパク質の変質（変成）を防止する観点及びリン酸緩衝剤の析出を防止する観点から、緩衝液（溶出液）の温度は、好ましくは約１０から５０℃であり、より好ましくは約２０から３５℃である。したがって、かかるｐＨ範囲および温度範囲の緩衝液を用いることにより、目的とするタンパク質の回収率を向上できる。ただし、変成しやすいタンパク質が分離対象である場合には、上記温度はより低い温度（冷蔵室程度の温度）であってもよい。
【００５７】
緩衝液の塩濃度は、５００ｍＭ以下であるのが好ましく、４００ｍＭ以下であるのがより好ましい。このような塩濃度の緩衝液を用いて、タンパク質の分離を行うことにより、リン酸衝液中の金属イオンによるタンパク質への悪影響を防止することができる。
【００５８】
塩濃度が約１から４００ｍＭの緩衝液がさらに好ましく用いられる。また、緩衝液の塩濃度は、タンパク質の分離操作の際に、連続的または段階的に変化させるのが好ましい。これにより、タンパク質の分離操作を効率化できる。
【００５９】
緩衝液の流速は、０．１から１０ｍＬ／分程度であるのが好ましく、１から５ｍＬ／分程度であるのがより好ましい。このような流速で、タンパク質の分離を行うことにより、分離操作に長時間を要することなく、目的とするタンパク質を確実に分離すること、すなわち、高純度なタンパク質を得ることができる。
【００６０】
以上のような操作により、所定の画分に、タンパク質が回収される。これにより、分離すべき精製されたタンパク質が、所定の画分中に得られる。
【００６１】
次いで、上記工程１Ａから３Ａを行ったカラムには、以下で述べるように、本発明の一実施形態における保存工程を適用することができる。従って、上記工程１Ａから３Ａは、本発明の精製方法を適用するためのカラムを準備する工程であると理解することができる。本発明の一実施形態において、精製方法を適用するためのカラムは、すでに使用されることにより、吸着剤の吸着能を変化させる物質が含まれている（可能性がある）カラム、又は、未使用であっても、不純物の存在等の何らかの理由により、吸着能が変化した吸着剤を有するカラムでことが好ましい。
【００６２】
＜保存＞
［４Ａ］  保存工程
ここで、この吸着装置１を用いた従来の分離方法では、上述したタンパク質の分離（精製）の後に、期間を空けることなく、高濃度の緩衝液（リン酸系緩衝液等）を用いて、吸着剤３に吸着する他の物質（夾雑タンパク質等）を溶出させて洗浄し、その後、再度、タンパク質の分離に吸着装置１を供することで、タンパク質の分離が繰り返して実施されていた。
【００６３】
あるいは、吸着剤３は、１から３０日間のような一定期間（保存期間）を空けた後に、吸着装置１においてタンパク質の分離に用いられることもある。従来の方法においては、帯電物質の分離までの一定期間において、他の物質のさらなる溶出等を目的に、通常、高濃度の水酸化ナトリウム溶液（例えば、１．０Ｍ程度）やリン酸緩衝液（例えば０．４Ｍ程度）等の保存液中に吸着剤３が保存されていた。
【００６４】
しかしながら、そのように水酸化ナトリウムやリン酸緩衝液中で一定期間をおいた後に、吸着装置１を用いたタンパク質の分離を実施すると、リン酸サイトに結合する塩基性タンパク質の分離位置（溶出時間）は変化しなくても、カルシウムサイトに結合する酸性タンパク質の分離位置（溶出時間）が、保存前と比較して変化することがあった。
【００６５】
また、７日間よりもさらに長い期間（例えば、３０日程度）に亘ってリン酸緩衝液（例えば、１５ｍＭ程度のリン酸緩衝液）中で吸着剤３を保存した場合、酸性タンパク質（負帯電物質）の溶出位置は変化しないが、塩基性タンパク質（正負帯電物質）の溶出位置が変化してしまうことがあった。そのため、特許文献２に記載の方法によって正負帯電物質を精製する場合には、正負帯電物質を回収すべき画分を再設定する必要が生じてしまう場合があった。なお、これは本発明者が発見した課題である。
【００６６】
これに対し、本発明の精製方法では、ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、コラミン塩酸、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、アセトアミドグリシン、トリシン、グリシンアミド及びビシンからなる群より選択される緩衝剤と、アルコールとを含む緩衝剤溶液を保存液として用いること（工程「４Ａ」）により、余分な工程を行うことなく、溶出時間のズレを防止することができる。ここで、上記緩衝剤は、ｐＨ６．０から８．０の範囲で最大となる緩衝能を有するものであってもよい。
【００６７】
前記保存液として用いられる緩衝剤溶液に含まれる緩衝剤は、ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、コラミン塩酸、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、アセトアミドグリシン、トリシン、グリシンアミド及びビシンからなる群より選択されるものであることが好ましい。これらは、いわゆるグッドバッファと呼ばれるものであり、ｐＨ６．０&#12316;８．０の範囲で緩衝能を有し、極性溶媒に対して溶解性であり、非極性溶媒に対して非溶解性である。前記緩衝剤は、これらの中でも、ＭＥＳ又はＨＥＰＥＳであることがより好ましく、ＨＥＰＥＳであることが最も好ましい。
【００６８】
前記保存液中の緩衝剤の濃度は、好ましくは約１．０ｍＭ以上約１００ｍＭ以下、より好ましくは約２．０ｍＭ以上約５０ｍＭ以下であり、さらに好ましくは約３．０ｍＭ以上約３０ｍＭ以下であり、さらに好ましくは約４．０ｍＭ以上約２０ｍＭ以下である。
【００６９】
前記保存液はアルコールを含む。アルコールは、保存液の全質量を１００体積％としたとき、５から４０体積％であることが好ましく、１０から３０体積％であることがさらに好ましく、１５から２５体積％であることが最も好ましい。アルコールの濃度をかかる濃度範囲に設定することで、バクテリア等の発生をより抑制するとともに、吸着剤の劣化を防止することができる。
【００７０】
上記アルコールは低級アルコールであることが好ましい。低級アルコールとは、炭素数１から６の１価のアルコールを意味する。低級アルコールは、生理学的又は薬学的に許容できるものであれば特に制限されない。低級アルコールの具体例として、例えば、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブチルアルコール、ｓ−ブチルアルコール、ｔ−ブチルアルコール、イソブチルアルコール、ペンチルアルコール及びヘキシルアルコールが挙げられる。本発明による効果をより一層顕著に奏するという観点から、低級アルコールは、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブチルアルコール、ｓ−ブチルアルコール、ｔ−ブチルアルコール及びイソブチルアルコールであることが好ましく、エタノール及びイソプロパノールであることがより好ましく、エタノールであることが更に好ましい。低級アルコールは、１種単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００７１】
本発明の精製方法は、以上のような一定期間をおいた後の吸着剤３において、この吸着剤３に吸着するタンパク質の吸着能（分離能）の変化が抑制されている。これにより、保存液を他のバッファに置換しなくても、溶出時間の変化が抑制される。
【００７２】
以上の説明では、タンパク質を帯電物質の一例としたが、負帯電物質は、酸性タンパク質の他、酸性アミノ酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は、負電荷リポソーム等であってもよい。正帯電物質は、塩基性タンパク質の他、塩基性アミノ酸、正電荷コレステロール、又は、正電荷リポソーム等であってもよい。
【００７３】
以上、本発明の精製方法について説明したが、本発明は、これに限定されるものではない。
【００７４】
本発明の精製方法においては、本発明の趣旨を没却しない範囲において、１以上の工程が追加されてもよい。
【実施例】
【００７５】
次に、本発明の具体的実施例について説明する。
１．吸着装置の製造
吸着剤（充填剤）としてハイドロキシアパタイト（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製、ＣＨＴ  ４０μｍ  Type  Ｉ）を、ステンレスカラム（内径４．０ｍｍ×長さ１００ｍｍ）の充填空間にほぼ満量となるように充填することにより、吸着装置を製造した。【００７６】
２．吸着装置によるタンパク質（酸性タンパク質および塩基性タンパク質）の分離
（実施例１）
２−１．保存液による保存前の吸着装置によるタンパク質の分離
＜１Ａ＞  まず、酸性タンパク質としてのＢＳＡ（牛血清アルブミン）の含有量が１０ｍｇ／ｍＬ、塩基性タンパク質としてのα−キモトリプシノーゲンＡの含有量が５ｍｇ／ｍＬとなるように、ＢＳＡおよびα−キモトリプシノーゲンＡを、それぞれ、１．０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）に溶解させて混合液を得た。その後、混合液を０．２２μｍのフィルタで濾過することで試料液を得た。【００７７】
＜２Ａ＞  次に、吸着装置を、クロマト装置に装着した。吸着装置を、１Ｍ  ＮａＯＨで洗浄し、０．４Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５、温度２５℃）で置換した。次いで、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５、温度２５℃）を、通液速度１．０ｍＬ／ｍｉｎで吸着装置に通液することで、吸着装置を平衡化した。【００７８】
＜３Ａ＞  次に、試料液５０μＬを、流速１ｍＬ／ｍｉｎで、吸着装置内に供給した後、リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を１５分で１０ｍＭから４００ｍＭ（７５％）となるようにグラジエントをかけ、吸着装置内から流出する流出液（溶出液）の吸光度（280nm）を、測定した。測定終了後に、吸着装置を、０．４Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５、温度２５℃）で洗浄し、さらに水で洗浄した。
＜４Ａ＞次いで、２０％エタノールを含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を、通液速度１．０ｍＬ／ｍｉｎで吸着装置に通液することで、吸着剤を上記ＨＥＰＥＳ緩衝液中に浸漬させた。そして、この状態で、吸着剤を３０日間保存した。【００７９】
２−２．保存液による保存後の吸着装置によるタンパク質の分離
＜１Ｂ＞  次に、吸着装置を、クロマト装置に装着した。その後、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５、温度２５℃）を、通液速度１．０ｍＬ／ｍｉｎで吸着装置に通液することで、吸着装置を平衡化した。【００８０】
＜２Ｂ＞  次に、前記工程＜１Ａ＞で調製したのと同様の試料液５０μＬを、流速１ｍＬ／ｍｉｎで、吸着装置内に供給した後、リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を１５分で１０ｍＭから４００ｍＭ（７５％）となるようにグラジエントをかけ、吸着装置内から流出する流出液（溶出液）の吸光度（280nm）を、測定した。実施例１における溶出の結果を図２に示す。保存後にも酸性タンパク質と塩基性タンパク質のどちらの溶出位置も変化しなかった。【００８１】
（比較例１）
上記工程４Ａにおいて、２０％エタノールを含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に代えて、１Ｍ  ＮａＯＨを用いて吸着剤を保存し、工程４Ａの終了後かつ上記工程１Ｂを行う前に、０．４Ｍ  ＮａＰ  ｐＨ６．５で吸着装置の保存液を置換するステップを追加したこと以外は、実施例１と同様に試験を行った。なお、比較例１では、吸着剤をリン酸緩衝液に浸漬して静置するような従来技術で行われている工程は行われていない。比較例１における溶出の結果を図３に示す。保存後に酸性タンパク質の溶出位置が変化することがわかった。【００８２】
（比較例２）
上記工程４Ａにおいて、２０％エタノールを含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）による保存工程に代えて、１Ｍ  ＮａＯＨを用いて吸着剤を保存し、工程４Ａの終了後に、吸着装置を１０ｍｍ  ＮａＰ  ｐＨ６．５で置換し、１時間以上の各所定時間に亘って静置するステップを追加したこと以外は、実施例１と同様にして試験を行った。比較例２における溶出の結果を図４に示す。比較例２より、静置時間を長くすると緩和効果が大きくなることがわかった。【００８３】
（比較例３）
上記工程４Ａにおいて、２０％エタノールを含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）による保存工程に代えて、２０％エタノールを含む１０ｍｍ  ＮａＰ  ｐＨ６．５を用いて吸着剤を保存したこと以外は、実施例１と同様に試験を行った。比較例３における溶出の結果を図５に示す。カラムの保存前と比較して、酸性タンパク質の溶出位置は変化しなかったが、塩基性タンパク質の溶出位置が変化してしまった。【００８４】
以下の態様に限定されるものではないが、これらの実施例及び比較例における分離試験の典型的態様をわかりやすくまとめると下記の表の通りである。なお、実施例１の本文中に説明されているように、表１において、「高濃度ＮａＰ」でｐＨ置換し、「２０％ＥｔＯＨ＋ＨＥＰＥＳ」で保存する前に、水又は低濃度のＮａＰ（リン酸緩衝液）でさらに吸着剤を洗浄する工程を追加してもよい。
【００８５】
表１
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【００８６】
表２
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【００８７】
表３
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【００８８】
表４
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【００８９】
特許文献２に記載されているように、吸着剤を１Ｍ  ＮａＯＨで保存する期間が７日間である場合、１０ｍＭ  ＮａＰ  ｐＨ６．５に置換＋1時間静置すると、ＢＳＡの溶出位置（Run2 - Run-1）は-5(s)とずれてしまう結果となった。ＮａＯＨで長期保存すると、１０ｍｍ  ＮａＰ  ｐＨ６．５での静置時間を1時間以上にする必要があり、ＮａＯＨ保存期間毎に１０ｍｍ  ＮａＰ  ｐＨ６．５での静置時間を決定しなければならないと考えられ、前準備が煩雑となってしまう。これに対し、本発明の精製方法によれば、静置工程を行う必要が無いため、そのような静置時間を決定する必要もない。【００９０】
本発明の一実施形態に係る精製方法によれば、リン酸カルシウム系化合物で構成される吸着剤の吸着能が、保存工程によって変化することが抑制される。。【００９１】
そのため、吸着剤から分離する分離位置（溶出時間）を、前記保存液による保存の前後において、ほぼ一定に保つことができる。したがって、吸着剤が充填された液体クロマトグラフィー用カラムから流出する流出液を、所定量ずつ分画することで、分画された各画分の流出液中に、帯電物質を分離する際に、帯電物質が分離される画分に、前記保存液による保存の前後において、ズレが生じるのを的確に抑制または防止することができる。よって、保存液を交換したり、回収すべき画分を再設定したりする必要がなくなることから、時間と手間とを要することなく、試料液中からの帯電物質の分離を行うことができる。【００９２】
本明細書において、「約」が付された数値は、矛盾が生じない範囲内で当該数値が異なっていてもよいことを示している。「約」が付された数値は、例えば、プラスマイナス１０％の誤差を含む範囲であってもよい。この範囲は、より好ましくはプラスマイナス５％の範囲であり、さらに好ましくはプラスマイナス１％の範囲であり、最も好ましくは誤差がないこと（当該数値そのもの）の範囲である。
【符号の説明】
【００９３】
１                吸着装置
２                カラム
３                吸着剤
４                フィルタ部材
５                フィルタ部材
２０              吸着剤充填空間
２１              カラム本体
２２              キャップ
２３              キャップ
２４              流入管
２５              流出管
【要約】
【課題】本発明の目的は、帯電した部分を有する化合物の精製において、精製に用いる吸着剤に付着した保存液を置換して静置する工程を行うことなく、保存液の影響により化合物の溶出位置が変動するのを抑制することである。帯電した部分を有する化合物を精製するための精製方法であって、前記精製方法は、帯電した部分を有する化合物を含む組成物を準備する工程と、少なくとも一部分にリン酸カルシウム系化合物を含み、ｐＨ６．０から８．０の範囲で緩衝能を有し、極性溶媒に対して溶解性であり、非極性溶媒に対して非溶解性である緩衝剤とアルコールとを含む緩衝剤溶液を準備する工程と、前記緩衝剤溶液中に前記吸着剤を保存する保存工程と、前記緩衝剤溶液中に保存された前記吸着剤に前記組成物を接触させることにより、前記吸着剤に前記化合物を吸着させる吸着工程と、勾配溶出により前記吸着剤から前記化合物を分取する分取工程と、を含む、精製方法。
【選択図】図１【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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