(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸性ホスファターゼ突然変異体であって、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示される酸性ホスファターゼ親のアミノ酸配列と比較して、Ｋ１１５Ｉ、Ｓ２４０Ｅ、Ｋ１１５Ｉ／Ｓ２４０Ｅ、Ｋ１１５Ｆ／Ｋ４４Ｃ／Ｄ２０６Ｉ又はＫ１１５Ｉ／Ｓ２４０Ｅ／Ｄ２０６Ｉの突然変異を有し、且つニコチンアミドモノヌクレオチドを基質とし、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示される酸性ホスファターゼ親よりも高い触媒活性を有するタンパク質であることを特徴とする酸性ホスファターゼ突然変異体。
【請求項２】
ニコチンアミドリボシドの調製方法であって、
ＫＣｌ及び無水ＭｇＣｌ２が存在する条件で、酸性ホスファターゼ突然変異体を用いてニコチンアミドモノヌクレオチドを触媒してニコチンアミドリボシドに転化することを含み、前記酸性ホスファターゼ突然変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示される酸性ホスファターゼ親のアミノ酸配列と比較して、Ｋ１１５Ｉ、Ｓ２４０Ｅ、Ｋ１１５Ｉ／Ｓ２４０Ｅ、Ｋ１１５Ｆ／Ｋ４４Ｃ／Ｄ２０６Ｉ又はＫ１１５Ｉ／Ｓ２４０Ｅ／Ｄ２０６Ｉの突然変異を有し、且つニコチンアミドモノヌクレオチドを基質とし、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示される酸性ホスファターゼ親よりも高い触媒活性を有するタンパク質であることを特徴とするニコチンアミドリボシドの調製方法。
【請求項３】
ＫＣｌ及び無水ＭｇＣｌ２を水に溶解して、ＫＣｌとＭｇＣｌ２の混合溶液を得るステップ１）と、
室温に冷却するステップ２）と、
ＫＣｌとＭｇＣｌ２の混合溶液にニコチンアミドモノヌクレオチドを加えて溶解し、ｐＨ値を６−７に調整するステップ３）と、
前記酸性ホスファターゼ突然変異体を加えて、ｐＨ値を６．８−７．３に調整するステップ４）と、
３７±５℃で少なくとも１．５時間反応させるステップ５）とを順次含むことを特徴とする請求項２に記載のニコチンアミドリボシドの調製方法。
【請求項４】
前記酸性ホスファターゼ突然変異体でニコチンアミドモノヌクレオチドを触媒してニコチンアミドリボシドに転化する酵素反応が開始する前に、反応系にコンニャクグルコマンナン及び／又はレバウディオサイドＡを加えることをさらに含むことを特徴とする請求項２又は３に記載のニコチンアミドリボシドの調製方法。
【請求項５】
前記酸性ホスファターゼ突然変異体は、純粋な酵素液の形態で投入され、
前記純粋な酵素液とは、前記酸性ホスファターゼ突然変異体遺伝子を含有する微生物について発現を誘導した後、細胞を破壊し、沈殿を遠心去除した粗酵素液をニッケルカラムで精製処理して得た前記酸性ホスファターゼ含有溶液であることを特徴とする請求項２又は３に記載のニコチンアミドリボシドの調製方法。
【請求項６】
前記酸性ホスファターゼ突然変異体は、固定化酵素であり、
前記固定化酵素は、前記酸性ホスファターゼ突然変異体に０．２−０．８Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４を加えて、ｐＨ値を７．５−９．５に調整し、次に固相樹脂を加えて室温で１２−２４ｈ撹拌し、ろ過により濾液を除去する方法により調製されることを特徴とする請求項２又は３に記載のニコチンアミドリボシドの調製方法。
【請求項７】
前記酸性ホスファターゼ突然変異体でニコチンアミドモノヌクレオチドを触媒してニコチンアミドリボシドに転化する酵素反応液からニコチンアミドリボシド精製品を精製する後処理をさらに含み、
前記後処理には、
酵素反応液をろ過して、濾液を収集するステップ１）と、
濾液のｐＨ値を５．０±０．５に調整するステップ２）と、
ステップ２）でｐＨが調整された濾液を精密ろ過して、濾液を収集するステップ３）と、
ステップ３）で精密ろ過して得た精密ろ過液を、ポリスチレンを分取カラムのフィラー、エタノール及び水を移動相として勾配溶出を行い、目標ピークの溶出液を収集する分取液相で精製するステップ４）と、
ステップ４）で収集した溶出液を凍結乾燥させて、ニコチンアミドリボシド精製品を得るステップ５）とを含むことを特徴とする請求項２又は３に記載のニコチンアミドリボシドの調製方法。
【請求項８】
請求項１に記載の酸性ホスファターゼ突然変異体およびその親を含む酸性ホスファターゼ固定化酵素の調製方法であって、
ＰＣＲ技術により酸性ホスファターゼ親の遺伝子配列を増幅し、次に、増幅産物を発現ベクターに挿入して、組換えプラスミドを得て、シーケンシングにより確認した後、組換えプラスミドを宿主細胞に形質転換して培養及び発現誘導を行い、発現終了後、細胞を収集して細胞破壊処理を行い、上澄み液を収集して酸性ホスファターゼ親の粗酵素液を得ることを含む、酸性ホスファターゼ親を調製するステップ１）と、
逆ＰＣＲ技術により突然変異部位のプライマー配列を設計し、設計したプライマーを用いて、ステップ１）の組換えプラスミドをテンプレートとして逆ＰＣＲ増幅を行い、次に、増幅産物をＤｐｎ  Ｉ酵素消化テンプレートで処理した後、宿主細胞に形質転換して培養及び発現誘導を行い、発現終了後、細胞を収集して細胞破壊処理を行い、上澄み液を収集して酸性ホスファターゼ突然変異体の粗酵素液を得ることを含む、酸性ホスファターゼ突然変異体を調製するステップ２）と、
アガロースゲルをニッケル担体として、塩化ニッケル溶液をニッケルに塗布して、１×ＰＢＳ＋１０ｍＭイミダゾール溶液を用いてニッケルカラムを平衡化する、ニッケルカラムを製造するステップａ）と、酸性ホスファターゼ親及び／又は突然変異体の粗酵素液とニッケルフィラーを均一に混合した後、氷浴において１−２ｈインキュベートし、次に、インキュベートした混合物をステップａ）で製造されたニッケルカラムに注入する、サンプル注入のステップｂ）と、まず、１×ＰＢＳ＋１０ｍＭイミダゾール溶液を用いて一回目の溶出を行い、次に、１×ＰＢＳ＋（２００−５００）ｍＭイミダゾール溶液を用いて二回目の溶出を行い、溶出液を収集して酸性ホスファターゼ親及び／又は突然変異体の精製酵素液を得る、溶出ステップｃ）とを含む、ニッケルカラムを用いて酸性ホスファターゼ親及び／又は突然変異体の粗酵素液を精製するステップ３）と、
ステップ３）で得られた精製後の酵素液に０．２−０．８Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４を加えて、ｐＨ値を７．５−９．５に調整し、次に固相樹脂を加えて、室温で１２−２４ｈ撹拌し、濾液をろ過除去して、酸性ホスファターゼ固定化酵素を得ることを含む、固相樹脂で固定化するステップ４）と、を含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
組換えベクター、組換え細胞又は組換え微生物を含む生物材料であって、
請求項１に記載の酸性ホスファターゼ突然変異体をコードする遺伝子を含有することを特徴とする生物材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学及び生物工学の技術分野に関し、特に遺伝子部位特異的突然変異の方法により人工的に得られた酸性ホスファターゼ突然変異体、その応用及びそのニコチンアミドリボシドの調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酸性ホスファターゼ（ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）は、加水分解酵素であり、リン酸モノエステル（ヌクレオチド、タンパク質など）の分子加水分解を触媒してリン酸基を去除し、標的分子を脱リン酸化する役割を有し、酸性環境で最も効果的であるため、酸性ホスファターゼと命名され、ＥＣ番号がＥＣ  ３．１．３．２である。
【０００３】
ニコチンアミドリボシド（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ  ｒｉｂｏｓｉｄｅ、略語ＮＲ）は、ニコチンアミドヌクレオシド、ニコチンアミドリボヌクレオシド、ナイアシンリボース／グリコシド、ニコチンアミドヌクレオシド、β−Ｄ−ニコチンアミドヌクレオシドとも呼ばれ、ＣＡＳ番号が１３４１−２３−７であり、その構造式が以下の式に示される。
【０００４】
【化１】
0006893000.tif 000002
【０００５】
ニコチンアミドリボシドは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）の前駆体であり、且つビタミンＢ３の由来である。研究から明らかなように、ニコチンアミドリボシドを補充することにより細胞内ＮＡＤの濃度を向上させ、それによりＮＡＤ欠乏に起因するさまざまな不健康な状態を予防及び改善する作用を果たす。
【０００６】
しかしながら、ニコチンアミドリボシドには、水環状で自発的に不安定性になりニコチンアミドとリボース産物に分解する高エネルギーグリコシド結合が含まれる。このような自発的な分解は、具体的な環境の条件に応じて数時間又は数日間かけて起こり、この結果、食べ物には天然ニコチンアミドリボシドの保持が困難であり、また天然由来からのニコチンアミドリボシドの分離が困難であり、このため、中国の国内外では化学合成方法によりニコチンアミドリボシドを生産するのが一般的である。
【０００７】
米国特許出願ＵＳ２０１７／０１２１７４６Ａ１において、ニコチンアミドモノヌクレオチド及び／又はその誘導体、水及び特定の溶媒を原料として、リン酸モノエステル加水分解酵素による触媒作用下でニコチンアミドリボシドを生産するニコチンアミドリボシドの生産方法が開示されている。該方法は、酵素法でニコチンアミドリボシドを調製し、化学合成法よりも環境及び健康により優しくプロセスが単純化されるという利点を有し、ニコチンアミドリボシドの生産の発展トレンドとなっている。ただし、野生型酸性ホスファターゼの活性が低いため、酵素法でニコチンアミドリボシドを生産するコストが高くなり、したがって、酸性ホスファターゼの酵素活性を向上させることは、ニコチンアミドリボシドの酵素法の産業化にとって重要な意義がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、野生型酸性ホスファターゼの低活性により酵素法でニコチンアミドリボシドを工業的に生産するコストが高いという技術的課題を解決するために、酵素活性を向上させた酸性ホスファターゼ、及び該酵素を用いたニコチンアミドリボシドの調製方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成させるために、本発明は、まず、酸性ホスファターゼ突然変異体を提供し、該酸性ホスファターゼ突然変異体は、
（ａ）アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示されるタンパク質、
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠失又は追加され、且つニコチンアミドモノヌクレオチドを基質とし、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示される酸性ホスファターゼ親よりも高い触媒活性を有し、（ａ）から誘導されるタンパク質、又は、
（ｃ）与（ａ）又は（ｂ）において限定されたタンパク質のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有し且つニコチンアミドモノヌクレオチドを基質とし、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示される酸性ホスファターゼ親よりも高い触媒活性を有するタンパク質である。
【００１０】
上記酸性ホスファターゼ親は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来し、その遺伝子配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されており、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されている。
【００１１】
好ましくは、与如ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示される酸性ホスファターゼ親のアミノ酸配列と比較して、本発明の突然変異体は、第４４位、第１１５位、第２０６位及び第２４０位の部位のうちの少なくとも１つに少なくとも１つの突然変異を有する。
【００１２】
より好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示される酸性ホスファターゼ親のアミノ酸配列と比較して、本発明の突然変異体は、Ｋ４４Ｃ、Ｋ１１５Ｆ、Ｋ１１５Ｉ、Ｄ２０６Ｉ及びＳ２４０Ｅの突然変異のうちの少なくとも１つを有する。
【００１３】
本発明は、ニコチンアミドリボシドの調製方法をさらに提供し、該方法は、ＫＣｌ及び無水ＭｇＣｌ２が存在する条件で、酸性ホスファターゼを用いてニコチンアミドモノヌクレオチドを触媒してニコチンアミドリボシドに転化することを含み、酸性ホスファターゼは、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示される酸性ホスファターゼ親又は下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の酸性ホスファターゼ突然変異体である。
（ａ）アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示されるタンパク質、
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠失又は追加され、且つニコチンアミドモノヌクレオチドを基質とし、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示される酸性ホスファターゼ親よりも高い触媒活性を有し、（ａ）から誘導されるタンパク質、又は、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）において限定されたタンパク質のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有し且つニコチンアミドモノヌクレオチドを基質とし、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示される酸性ホスファターゼ親よりも高い触媒活性を有するタンパク質。
【００１４】
本発明のニコチンアミドリボシドの調製方法の転化経路は、以下に示される。
【化２】
0006893000.tif 000003
【００１５】
好ましくは、本発明のニコチンアミドリボシドの調製方法は、ＫＣｌ及び無水ＭｇＣｌ２を水に溶解して、ＫＣｌとＭｇＣｌ２の混合溶液を得るステップ１）と、室温に冷却するステップ２）と、ＫＣｌとＭｇＣｌ２の混合溶液にニコチンアミドモノヌクレオチドを加えて溶解し、ｐＨ値を６−７に調整するステップ３）と、酸性ホスファターゼを加えて、ｐＨ値を６．８−７．３に調整するステップ４）と、３７±５℃で少なくとも１．５時間反応させるステップ５）と、を順次含む。
【００１６】
基質であるニコチンアミドモノヌクレオチドの分解を防止するために、より好ましくは、前記酸性ホスファターゼでニコチンアミドモノヌクレオチドを触媒してニコチンアミドリボシドに転化する酵素反応が開始する前に、反応系にコンニャクグルコマンナン及び／又はレバウディオサイドＡを加える。より好ましくは、コンニャクグルコマンナンを加える。
【００１７】
より好ましくは、コンニャクグルコマンナン及び／又はレバウディオサイドＡの添加量は、ニコチンアミドモノヌクレオチドの重量の０．１−０．５倍である。
【００１８】
本発明の方法では、まず、ＫＣｌ及び無水ＭｇＣｌ２を溶解して室温に降温した後、基質であるニコチンアミドモノヌクレオチドに加え、このようにすると、溶解に生じる過剰な熱により基質へ影響を与えることを回避し、さらに転化率の低下を防止できるという利点がある。
【００１９】
好ましくは、本発明の方法のステップ１）では、水中の不純物による基質への影響により転化率が低下することを防止するように、水として再蒸留水が使用される。再蒸留水とは、一回蒸留された水を再度蒸留して得た水であり、英語名がｄｏｕｂｌｅ  ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒであり、ｄｄｗａｔｅｒと略語し、ｄｄＨ２Ｏと呼ばれることもある。
【００２０】
好ましくは、本発明の方法ステップ３）及びステップ４）では、ｐＨ値の調整にＮａＯＨが使用される。
【００２１】
好ましくは、本発明の方法では、反応系におけるニコチンアミドモノヌクレオチドの最終濃度が１００±５０ｇ／Ｌである。
【００２２】
好ましくは、本発明の方法では、反応系におけるＫＣｌの最終濃度が１５±５ｇ／Ｌである。
【００２３】
好ましくは、本発明の方法では、反応系におけるＭｇＣｌ２の最終濃度が４０±１０ｇ／Ｌである。
【００２４】
本発明の方法では、酸性ホスファターゼ親は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来し、その遺伝子配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されており、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されている。
【００２５】
本発明の方法に使用される酸性ホスファターゼは、市販されている商品酵素であってもよく、自作した酵素製品であってもよく、ここで、酵素製品とは、未精製の粗酵素の形態であってもよく、完全又は部分的に精製された酵素であってもよく、本発明の酸性ホスファターゼは、以下の方法によって自作できる。
【００２６】
酸性ホスファターゼ親の調製：ＰＣＲ技術によりＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される遺伝子配列を増幅し、次に、増幅産物を発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）のＮｄｅＩ及びＥｃｏＲ  Ｉ部位に挿入して、組換えプラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＮＳ３を得て、シーケンシングにより確認した後、組換えプラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＮＳ３を大腸菌に形質転換して培養及び発現誘導を行い、発現終了後、菌体を収集して細胞破壊処理を行い、上澄み液を収集して酸性ホスファターゼ親の粗酵素液を得る。
【００２７】
酸性ホスファターゼ突然変異体の調製：逆ＰＣＲ技術により突然変異部位のプライマー配列を設計し、設計したプライマーを用いて、組換えプラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＮＳ３をテンプレートとして逆ＰＣＲ増幅を行い、次に、増幅産物をＤｐｎ  Ｉ酵素消化テンプレートで処理した後、大腸菌に形質転換し、形質転換された大腸菌に対して培養及び発現誘導を行い、発現終了後、菌体を収集して細胞破壊処理を行い、上澄み液を収集して酸性ホスファターゼ突然変異体の粗酵素液を得る。
【００２８】
好ましくは、本発明の方法に使用される酸性ホスファターゼは、上記酸性ホスファターゼ親及び／又は突然変異体の粗酵素液を精製処理した精製酵素液である。
【００２９】
好ましくは、ニッケルカラムを用いて上記酸性ホスファターゼ親及び／又は突然変異体の粗酵素液を精製処理する。
【００３０】
好ましくは、ニッケルカラムを用いて上記酸性ホスファターゼ親及び／又は突然変異体の粗酵素液を精製処理する方法には、アガロースゲルをニッケル担体として、塩化ニッケル溶液をニッケルに塗布して、１×ＰＢＳ＋１０ｍＭイミダゾール溶液を用いてニッケルカラムを平衡化する、ニッケルカラムを製造するステップ１）と、粗酵素液とニッケルフィラーを均一に混合した後、氷浴において１−２ｈインキュベートし、次に、インキュベートした混合物をステップ１）で製造されたニッケルカラムに注入する、サンプル注入のステップ２）と、まず、１×ＰＢＳ＋１０ｍＭイミダゾール溶液を用いて一回目の溶出を行い、次に、１×ＰＢＳ＋（２００−５００）ｍＭイミダゾール溶液を用いて二回目の溶出を行い、溶出液を収集して精製酵素液を得る、溶出ステップ３）とが含まれる。
【００３１】
勿論、上記ニッケルカラムを用いて精製処理する方法は、本発明の酸性ホスファターゼ親及び突然変異体以外の酸性ホスファターゼの粗酵素液の精製にも適用できる。
【００３２】
粗酵素液の上記精製処理方法では、一回目の溶出は、夾雑タンパク質を除去し、二回目の溶出は、酸性ホスファターゼタンパク質を溶出することに用いられる。
【００３３】
好ましくは、本発明の方法では、酸性ホスファターゼとして固定化酵素が使用される。固定化酵素とは、一定の空間範囲で触媒作用を果たし、且つ繰り返して連続的に使用可能な酵素である。通常、酵素触媒反応が水溶液で行われるが、固定化酵素は、水溶性酵素を物理又は化学方法で処理することで、水に不溶であるが、酵素活性を有する状態にしたものである。固定化後の酵素は、一般に、安定性が高まり、反応系から分離されやすくなり、且つ制御されやすくなり、繰り返して利用可能であり、輸送も保存も容易になり、自動化生産に有利である。
【００３４】
本発明の方法に使用されている固定化酵素は、直接市販品として購入してもよく、自作してもよく、非固定化酵素を購入して自分で固定化させてもよい。固定化には、本分野で公知するさまざまな酵素固定化担体、たとえば、従来の無機担体材料としてのシリカ、活性炭、ガラスビーズなど、及び有機高分子担体であるマクロポーラス型ポリＮ−アミノエチルアクリルアミド−ポリエチレンなどが使用され得る。本発明では、ニッケル材料又は固相樹脂を用いて酸性ホスファターゼを固定化するのが好ましい。
【００３５】
好ましくは、固相樹脂を用いて酸性ホスファターゼを固定化する方法には、酸性ホスファターゼに０．２−０．８Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４を加えて、ｐＨ値を７．５−９．５に調整し、固相樹脂を加えて室温で１２−２４ｈ撹拌し、次に濾液をろ過除去して、酸性ホスファターゼ固定化酵素を得ることを含む。
【００３６】
勿論、上記固定化方法は、本発明の酸性ホスファターゼ親及び突然変異体以外の酸性ホスファターゼの固定化にも適用できる。
【００３７】
好ましくは、本発明によるニコチンアミドリボシドの調製方法は、酸性ホスファターゼでニコチンアミドモノヌクレオチドを触媒してニコチンアミドリボシドに転化する酵素反応液からニコチンアミドリボシド精製品を精製する後処理をさらに含み、該後処理は、酵素反応液をろ過して、濾液を収集するステップ１）と、溶液でのニコチンアミドリボシドの安定性を向上させるために、濾液のｐＨ値を５．０±０．５に調整するステップ２）と、ステップ２）でｐＨが調整された濾液を精密ろ過して、濾液を収集するステップ３）と、ステップ３）で精密ろ過して得た精密ろ過液を、ポリスチレンを分取カラムのフィラー、エタノール及び水を移動相として勾配溶出を行い、目標ピークの溶出液を収集する分取液相で精製するステップ４）と、ステップ４）で収集した溶出液を凍結乾燥させて、ニコチンアミドリボシド精製品を得るステップ５）と、を含む。
【００３８】
本発明の方法におけるろ過とは、物理方法で溶液中の固体と液体を分離する過程を意味し、常圧ろ過、減圧ろ過、遠心ろ過など、一般的なろ過方法であれば、本発明に適用できる。好ましくは、上記後処理のステップ１）では、２００−４００メッシュのろ過膜で酵素反応液をろ過することで、酵素反応液中の酸性ホスファターゼを除去する。
【００３９】
精密ろ過は、マイクロポーラスろ過とも呼ばれ、マイクロポーラスろ過膜をろ過媒体として、０．１〜０．３ＭＰａの圧力の作用下で、０．１〜１μｍの粒子及び細菌をカットオフし、大分子有機物や無機塩などを透過させることである。好ましくは、上記後処理のステップ３）では、０．４５μｍのマイクロポーラスろ過膜で濾液を精密ろ過する。
【００４０】
好ましくは、上記後処理のステップ４）では、移動相の流速は４０ｍｌ／ｍｉｎであり、検出波長は２６０ｎｍであり、溶出勾配は、０−１３ｍｉｎ、エタノール０％、水１００％；１３−２３ｍｉｎ、エタノール１％、水９９％；２３−３１ｍｉｎ、エタノール５％、水９５％；３１−４３ｍｉｎ、エタノール２０％、水８０％；４３−４５ｍｉｎ、エタノール２０％、水８０％；４５−６０ｍｉｎ、エタノール１００％、水０％である。
【００４１】
好ましくは、在上記後処理のステップ５）の凍結乾燥前に、収集した溶出液のｐＨ値を塩酸で３−４に調整し、このＰＨ条件下で、ニコチンアミドリボシドのすべてが塩酸と反応してニコチンアミドリボシドクロリドを生成する。
【００４２】
安定性がより高く性状がより良好なニコチンアミドリボシドを得るために、好ましくは、上記後処理のステップ５）の凍結乾燥前に、収集した溶出液にコンニャクグルコマンナン及び／又はレバウディオサイドＡを加えて均一に混合する。
【００４３】
より好ましくは、コンニャクグルコマンナン及び／又はレバウディオサイドＡの添加量は、ニコチンアミドリボシドの重量の１−２倍であり、さらに好ましくは１．５倍である。
【００４４】
凍結乾燥の効率を向上させて、凍結乾燥時間を短縮させるために、好ましくは、上記後処理のステップ５）の凍結乾燥前に、収集した溶出液を濃縮処理させて、大量の水分を除去する。本発明における濃縮とは、物理方法により溶媒を蒸発させることで溶液の濃度を向上させるプロセスであり、減圧蒸留法、限外ろ過法、透析法、吸着法、凍結乾燥法などを含む。好ましくは、溶出液をニコチンアミドリボシドの濃度が４０−９０ｇ／Ｌとなるまで濃縮させる。
【００４５】
ニコチンアミドリボシドの生物分解を防止するために、好ましくは、濃縮処理は、２５℃以下の温度で行われ、より好ましくは、濃縮処理は、２０℃以下の温度で行われる。
【００４６】
より好ましくは、上記濃縮処理には、ナノろ過濃縮が使用される。
【００４７】
ナノろ過とは、逆浸透と超濾の間にある圧力駆動膜分離プロセスであり、孔径範囲が数ナノ程度であり溶媒分子又は相対分子量の小さな溶質又は低コストのイオンを透過させることで分離と濃縮の効果を奏するナノろ過膜をろ過媒体とする。
【００４８】
好ましくは、上記後処理のステップ５）の凍結乾燥における昇華温度を２５℃以下に制御する。好ましくは、ニコチンアミドリボシド精製品における含水率が２％以下となるまで凍結乾燥させる。
【００４９】
本発明は、酸性ホスファターゼ固定化酵素の調製方法をさらに提供し、
ＰＣＲ技術により酸性ホスファターゼ親の遺伝子配列を増幅し、次に、増幅産物を発現ベクターに挿入して、組換えプラスミドを得て、シーケンシングにより確認した後、組換えプラスミドを宿主細胞に形質転換して培養及び発現誘導を行い、発現終了後、細胞を収集して細胞破壊処理を行い、上澄み液を収集して酸性ホスファターゼ親の粗酵素液を得ることを含む、酸性ホスファターゼ親を調製するステップ１）と、
逆ＰＣＲ技術により突然変異部位のプライマー配列を設計し、設計したプライマーを用いて、ステップ１）の組換えプラスミドをテンプレートとして逆ＰＣＲ増幅を行い、次に、増幅産物をＤｐｎ  Ｉ酵素消化テンプレートで処理した後、宿主細胞に形質転換して培養及び発現誘導を行い、発現終了後、細胞を収集して細胞破壊処理を行い、上澄み液を収集して酸性ホスファターゼ突然変異体の粗酵素液を得ることを含む、酸性ホスファターゼ突然変異体を調製するステップ２）と、
アガロースゲルをニッケル担体として、塩化ニッケル溶液をニッケルに塗布して、１×ＰＢＳ＋１０ｍＭイミダゾール溶液を用いてニッケルカラムを平衡化する、ニッケルカラムを製造するステップａ）と、酸性ホスファターゼ親及び／又は突然変異体の粗酵素液とニッケルフィラーを均一に混合した後、氷浴において１−２ｈインキュベートし、次に、インキュベートした混合物をステップａ）で製造されたニッケルカラムに注入する、サンプル注入のステップｂ）と、まず、１×ＰＢＳ＋１０ｍＭイミダゾール溶液を用いて一回目の溶出を行い、次に、１×ＰＢＳ＋（２００−５００）ｍＭイミダゾール溶液を用いて二回目の溶出を行い、溶出液を収集して酸性ホスファターゼ親及び／又は突然変異体の精製酵素液を得る、溶出ステップｃ）とを含む、ニッケルカラムを用いて酸性ホスファターゼ親及び／又は突然変異体の粗酵素液を精製するステップ３）と、
ステップ３）で得られた精製後の酵素液に０．２−０．８Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４を加えて、ｐＨ値を７．５−９．５に調整し、次に固相樹脂を加えて、室温で１２−２４ｈ撹拌し、濾液をろ過除去して、酸性ホスファターゼ固定化酵素を得ることを含む、固相樹脂で固定化するステップ４）と、を含む。
【００５０】
上記酸性ホスファターゼ固定化酵素の調製方法では、酸性ホスファターゼは、本発明の上記酸性ホスファターゼ親及び突然変異体であるが、本発明の酸性ホスファターゼ親及び突然変異体以外の酸性ホスファターゼ親及び突然変異体であってもよい。
【００５１】
本発明は、組換えベクター、組換え細胞又は組換え微生物を含む生物材料をさらに提供し、前記生物材料は、本発明の上記酸性ホスファターゼ突然変異体をコードする遺伝子を含有する。
【００５２】
本発明は、ニコチンアミドリボシドの調製における上記酸性ホスファターゼ突然変異体の応用をさらに提供する。
【発明の効果】
【００５３】
有益な効果は、以下のとおりである。
酸性ホスファターゼ親に比べて、本発明による酸性ホスファターゼ突然変異体は、酵素活性、温度安定性及びｐＨ安定性のいずれも著しく向上する。本発明によるニコチンアミドリボシドの調製方法では、基質であるニコチンアミドモノヌクレオチドの転化率が９９％と高く、調製されたニコチンアミドリボシドの純度が９９％以上に達する。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本発明の実施例１における組換えプラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＮＳ３の構築プロセスを示す図である。
【図２】実施例７の突然変異体Ｋ１１５Ｉの酵素反応液のＨＰＬＣスペクトルである。
【図３】実施例８の親の酵素反応液のＨＰＬＣスペクトルである。
【図４】実施例９の突然変異体Ｋ１１５Ｉの酵素反応液のＨＰＬＣスペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
以下、特定の実施例及び図面を参照しながら本発明についてさらに詳細に説明し、以下の実施例は、本発明を解釈するものであり、本発明は以下の実施例に制限されるものではなく、実施例において条件が明記されない場合、一般的な条件又はメーカが推薦した条件で行われる。特に断らない限り、本発明の実施例に使用される原料及びほかの化学試薬は、すべて市販品である。
【実施例１】
【００５６】
実施例１
＜酸性ホスファターゼ親の調製＞
図１に示すように、プライマー対として５′−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＴＧＡＣＣＡＴＴＧＣＧＡＡＧＧＡＴＴＡＣＣＧＴ−３′、及び５′−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴ−３′を用いて、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される酸性ホスファターゼ遺伝子ＮＳ−３（そのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示される）をＰＣＲ増幅技術により増幅し、得たＰＣＲ増幅産物を酵素切断断すると同時に、発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）のＮｄｅＩ及びＥｃｏＲ  Ｉ部位に挿入し、組換えプラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＮＳ３を得た。シーケンシングにより確認した後、組換えプラスミドを大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ｄｅ３）に形質転化した。得た組換え大腸菌を小体積のＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬのＡｍｐを含有する）に接種して、３０〜３７℃で一晩培養した後、１〜５％の接種量で一定の体積のＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬのＡｍｐを含有する）に移し、３０〜３７℃でＯＤ６００が０．６〜１．０となるまで培養し続け、最終濃度０．１ｍＭ〜１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加え、２０〜３７℃で発現誘導を１０〜２０ｈ行った後、菌体を遠心分離により収集した。
【実施例２】
【００５７】
実施例２
＜酸性ホスファターゼ突然変異体の調製＞
突然変異部位：Ｋ４４Ｃ、Ｋ１１５Ｆ、Ｋ１１５Ｉ、Ｄ２０６Ｉ、Ｓ２４０Ｅ、Ｋ１１５Ｉ／Ｓ２４０Ｅ、Ｋ１１５Ｆ／Ｋ４４Ｃ／Ｄ２０６Ｉ、Ｋ１１５Ｉ／Ｓ２４０Ｅ／Ｄ２０６Ｉを設計し、表１に示される突然変異プライマー配列を用いて、実施例１で構築された組換えプラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＮＳ３をテンプレートとして逆ＰＣＲを行い、ＰＣＲ系及びＰＣＲプログラムは、以下のとおりである。
PCR系：
PrimeSTAR（登録商標）  GXL  DNA  Polymerase    0.5ul
5×PrimeSTAR  GXL  Buffer（MG2+  plus）*2      10ul
テンプレートプラスミド                        1ul
dNTP(2.5mM  each)                              4ul
突然変異プライマー１                          1ul
突然変異プライマー２                          1ul
滅菌水                                up  to  50ul
PCRプログラム：
98℃                                3min
98℃                                10s
30×  50-65℃                              15s
72℃                                7min
30回サイクル
72℃                                10min
ＰＣＲ産物をゲル回収キッドで精製した後、Ｄｐｎ  Ｉで酵素切断を行い、酵素切断後、産物を大腸菌ＤＨ５αに形質転化し、Ａｍｐ平板のスクリーニングをした後、菌落を選択してシーケンシングに供し、Ｋ４４Ｃ、Ｋ１１５Ｆ、Ｋ１１５Ｉ、Ｄ２０６Ｉ、Ｓ２４０Ｅ、Ｋ１１５Ｉ／Ｓ２４０Ｅ、Ｋ１１５Ｆ／Ｋ４４Ｃ／Ｄ２０６Ｉ、Ｋ１１５Ｉ／Ｓ２４０Ｅ／Ｄ２０６Ｉ部位での突然変異が成功した突然変異組換えプラスミド形質転化大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ｄｅ３）が得られたことを確認した。得られた突然変異体組換え大腸菌を小体積のＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬのＡｍｐを含有する）に接種して、３０〜３７℃で一晩培養した後、１〜５％の接種量で一定の体積のＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬのＡｍｐを含有する）に移し、３０〜３７℃でＯＤ６００が０．６〜１．０となるまで培養し続け、最終濃度０．１ｍＭ〜１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加えて、２０〜３７℃で発現誘導を１０〜２０ｈ行った後、菌体を遠心分離により収集した。
【００５８】
【表１】
0006893000.tif 000004
【実施例３】
【００５９】
実施例３
＜酸性ホスファターゼ粗酵素液の調製＞
発酵して収集した菌体を、その質量に対して４倍の１×ＰＢＳ＋１０ｍＭイミダゾール溶液で再懸濁させた後、高圧ホモジナイザーで菌体を破砕し、均質化終了後、撹拌しながら全体積０．５−１％のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を加えてｐＨを７．０−８．０に調整し、遠心分離により上層の透明酵素液を収集し、酵素液を０．４５μＬろ過膜でろ過し、濾液を収集して、酸性ホスファターゼの粗酵素液を得た。
【実施例４】
【００６０】
実施例４
＜ニッケルカラムの調製＞
ａ）カラムをきれいに洗浄した後、アガロースゲルをニッケル担体として、ニッケルフィラー（ｍｌ）：菌体（ｇ）＝１：２の割合でアガロースゲルを準備し、ｄｄＨ２Ｏ及び１×ＰＢＳを用いてそれぞれ５カラム体積でアガロースゲルを順次洗浄した。
ｂ）０．２ｍｏｌ／Ｌ塩化ニッケル溶液を調製してニッケルに塗布し、ニッケルを十分に塗布するために、繰り返して塗布してもよい。
ｃ）５カラム体積のｄｄＨ２Ｏで未結合のＮｉ２＋を洗い落とし、次に、５−１０カラム体積の１×ＰＢＳ＋１０ｍＭイミダゾール溶液（ｐＨ＝８．０）を用いてニッケルカラムを平衡化した。
【実施例５】
【００６１】
実施例５
＜サンプル注入及び溶出＞
ａ）実施例３で得られた酸性ホスファターゼの粗酵素液とニッケルフィラーを均一に混合した後、三角フラスコに移して、回転数１００ｒｍのシェーカーにおいて氷浴により１−２ｈインキュベートした。
ｂ）１×ＰＢＳ＋１０ｍＭイミダゾール溶液（ｐＨ＝８．０）を用いて夾雑タンパク質を溶出し、次に、１×ＰＢＳ＋２００ｍＭイミダゾール溶液（ｐＨ＝８．０）を用いて目標タンパク質を十分に溶出し、溶出液を収集して酸性ホスファターゼの精製酵素液を得た。
【実施例６】
【００６２】
実施例６
＜酵素活性の比較実験＞
酵素活性の測定方法：最終濃度２００ｍＭのＫＣｌ及び４００ｍＭのＭｇＣｌ２を補因子として、２００ｕＬの反応系に最終濃度２ｍｍｏｌのＮＭＮを加え、次に、希釈後の精製酵素液１０ｕＬを加え、空白対照では、精製酵素液の代わりに緩衝液を用い、３７℃、ｐＨ７．０の条件で、均一に混合して１０ｍｉｎ反応させた直後、１０％トリクロロ酢酸溶液２００ｕＬを加えて均一に混合し、反応を終了させ、サンプリングしてメタノールで５０倍希釈した後、ＨＰＬＣが産物を検出できるほどの量で注入し、酵素活性単位Ｕを計算した。
酸性ホスファターゼ酵素活性Ｕの定義：３７℃、ｐＨ７．０の条件で、１分間内で基質ＮＭＮを加水分解して１ｕｍｏｌを放出するために必要な酵素量であり、１つの酵素活性国際単位（Ｕ）と呼ばれる。
酸性ホスファターゼ親及び本発明の酸性ホスファターゼ突然変異体の酵素活性及びその安定性の比較実験の結果を表２に示し、そのうち、温度安定性及びｐＨ安定性とは、目標酵素を対応する保存条件で１２ｈ保存した後の残留活性≧９０％である保存範囲である。
【００６３】
【表２】
0006893000.tif 000005
【００６４】
結果から明らかなように、本発明の酸性ホスファターゼ突然変異体は、酸性ホスファターゼ親に比べて、酵素活性、温度安定性及びｐＨ安定性のいずれも有意に向上した。
【実施例７】
【００６５】
実施例７
＜ニコチンアミドリボシドの調製＞
全系２Ｌを設計して、基質の最終濃度を１００ｇ／Ｌに設定し、きれいな３Ｌ三口フラスコを準備し、ｄｄＨ２Ｏ  １Ｌを加えて、次にＫＣｌ  ３０ｇ及び無水ＭｇＣｌ２  ８０ｇを加え、撹拌して溶解させ、溶液の温度が室温になると、ＮＭＮ  ２００ｇを加えて５Ｍ  ＮａＯＨでｐＨを６−７に調整して、完全に溶解させた。反応温度を３７℃に設定して、実施例５で得られた酸性ホスファターゼ突然変異体Ｋ１１５Ｉの精製酵素液９００ｍｌを加えて、２Ｌ系となるまでｐＨ７．０のリン酸ナトリウム緩衝液を補充し、反応系をｐＨ７．２に調整して、反応を開始させた。２ｈ反応後、反応液を純水で５０〜１００倍希釈し、マイクロポーラスろ過をした後、高速液体クロマトグラフィーにより反応の結果を分析し、分析方法は、表３に示され、そのＨＰＬＣスペクトルは、図２に示された。検出結果から明らかなように、基質ＮＭＮは、明らかに分解しており、約４２％の基質が分解し、残りのＮＭＮがＮＲに転化する転化率は、９９．９％であった。
【００６６】
【表３】
0006893000.tif 000006
【実施例８】
【００６７】
実施例８
全系２Ｌを設計して、基質の最終濃度を１００ｇ／Ｌに設定し、きれいな３Ｌ三口フラスコを準備し、ｄｄＨ２Ｏ  １Ｌを加えて、次にＫＣｌ  ３０ｇ及び無水ＭｇＣｌ２  ８０ｇを加え、撹拌して溶解させ、溶液の温度が室温になると、コンニャクグルコマンナン２０ｇを加えて、次にＮＭＮ  ２００ｇを加えて５Ｍ  ＮａＯＨでｐＨを６−７に調整して、完全に溶解させた。反応温度を３７℃に設定して、実施例５で得られた酸性ホスファターゼ突然変異体Ｋ１１５Ｉの精製酵素液９００ｍｌを加えて、２Ｌ系となるまでｐＨ７．０のリン酸ナトリウム緩衝液を補充し、反応系をｐＨ７．２に調整して、反応を開始させた。２ｈ反応後、反応液を純水で５０〜１００倍希釈し、マイクロポーラスろ過をした後、高速液体クロマトグラフィーにより反応の結果を分析し、分析方法は、表３に示され、そのＨＰＬＣスペクトルは、図３に示された。検出結果から明らかなように、基質ＮＭＮは、明らかなに分解しておらず、ＮＭＮがＮＲに転化する転化率は９９．８％であった。
【実施例９】
【００６８】
実施例９
全系２Ｌを設計して、基質の最終濃度を１００ｇ／Ｌに設定し、きれいな３Ｌ三口フラスコを準備し、ｄｄＨ２Ｏ  １Ｌを加えて、次にＫＣｌ  ３０ｇ及び無水ＭｇＣｌ２  ８０ｇを加え、撹拌して溶解させ、溶液の温度が室温になると、コンニャクグルコマンナン２０ｇを加えて、次にＮＭＮ  ２００ｇを加えて５Ｍ  ＮａＯＨでｐＨを６−７に調整して、完全に溶解させた。反応温度を３７℃に設定して、実施例５で得られた酸性ホスファターゼ親の精製酵素液９００ｍｌを加えて、２Ｌ系となるまでｐＨ７．０のリン酸ナトリウム緩衝液を補充し、反応系をｐＨ７．２に調整して、反応を開始させた。２ｈ反応後、反応液を純水で５０〜１００倍希釈し、マイクロポーラスろ過をした後、高速液体クロマトグラフィーにより反応の結果を分析し、分析方法は、表３に示され、そのＨＰＬＣスペクトルは、図４に示された。検出結果から明らかなように、基質ＮＭＮは、明らかなに分解しておらず、ＮＭＮがＮＲに転化する転化率は、７２．５％であった。
【実施例１０】
【００６９】
実施例１０
ニコチンアミドリボシドを調製する触媒が完全に反応した後、２００−４００メッシュの濾布で酵素反応液をろ過して、それにおける酸性ホスファターゼを除去し、得られた濾液に２−６Ｍ塩酸を加えてＰＨを約５．０に調整し、さらに、０．４５μｍのマイクロポーラスろ過膜で精密ろ過し、精密ろ過液を収集し、表４に示された制御条件の分取液相で精密ろ過液を精製し、ＮＲ画分の溶出液を収集すると、ニコチンアミドリボシド純度が９９％より大きい水溶液を得て、次に、得られた純度が９９％より大きいニコチンアミドリボシド水溶液を２５℃以下の温度でナノろ過して濃縮させ、ニコチンアミドリボシドの濃度を５０−６０ｇ／Ｌに向上させ、次に、塩酸を加えてＰＨを３−４に調整し、濃度９０ｇ／Ｌでニコチンアミドリボシド水溶液にコンニャクグルコマンナンを加えて、十分に溶解して均一に撹拌し、凍結乾燥装置において昇華温度を２５℃以下に制御しながら乾燥させ、２４時間後、純度９９％以上の白色粉末状のニコチンアミドリボシド精製品を得た。上記実施例７、８、９の酵素反応液を分離精製して得たニコチンアミドリボシド精製品の収量及び純度を表５に示した。
【００７０】
【表４】
0006893000.tif 000007
【００７１】
【表５】
0006893000.tif 000008
【図１】
0006893000.tif 000009
【図２】
0006893000.tif 000010
【図３】
0006893000.tif 000011
【図４】
0006893000.tif 000012
【配列表】
0006893000000001.app