(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多数の微小孔を有する少なくとも２種のフィルターを用いて赤血球の老化度を評価する方法であって、
血液試料から赤血球浮遊液を調製する赤血球浮遊液調製工程と、
前記赤血球浮遊液を第１のフィルターに通過させて、第１のフィルターを通過しない老化赤血球と、通過する非老化赤血球とに分離すると共に、前記赤血球浮遊液に含まれる赤血球の変形能を算出する第１の赤血球変形能算出工程と、
前記分離された非老化赤血球浮遊液を、前記第１のフィルターよりも小さい径の微小孔を有する第２のフィルターに通過させて、第２のフィルターを通過しない軽度老化赤血球と、通過する幼若赤血球とに分離すると共に、前記非老化赤血球浮遊液に含まれる非老化赤血球の変形能を算出する第２の赤血球変形能算出工程と、
前記第１の赤血球変形能算出工程で算出した赤血球の変形能、及び第２の赤血球変形能算出工程で算出した非老化赤血球の変形能を用いて、赤血球の老化度を評価する評価工程と、
を有することを特徴とする赤血球老化度評価方法。
【請求項２】
第１の赤血球変形能算出工程及び／又は第２の赤血球変形能算出工程において、さらに赤血球の通過割合を算出し、該通過割合を評価工程の評価に用いることを特徴とする請求項１記載の赤血球老化度評価方法。
【請求項３】
第１のフィルターの微小孔の径が、５．５０〜８．００μｍであることを特徴とする請求項１又は２記載の赤血球老化度評価方法。
【請求項４】
第２のフィルターの微小孔の径が、３．００〜６．００μｍであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の赤血球老化度評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、毛細血管のゴースト化の原因となる血液中の赤血球の老化度を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、マスコミでも取り上げられている毛細血管スコープを使うと、普段は見ることのできない毛細血管を観察することができ、毛細血管が消える、短くなる、数が減少するといった毛細血管のゴースト化を発見することができる。この毛細血管のゴースト化は、全身で起こり得るので、シワやたるみといった、目に見える皮膚の状態への影響だけでなく、骨粗鬆症、認知症、生活習慣病（糖尿病、高コレステロール血症等）などの深刻な病気を招く危険性がある。【０００３】
毛細血管の流れが悪くなり、ゴースト化して行く過程に重要なのは赤血球である。というのも、毛細血管には平滑筋が存在しないので、収縮・拡張の機能はなく、赤血球は自己の直径（約８μｍ）より細い毛細血管（約５μｍ）を変形しながら通過し、全身を循環しているからである。血液１μＬあたりの赤血球数は４００〜５００万個で、赤血球の体積は血液の体積の４〜５割にも達する。この赤血球の寿命は約１２０日と短く、幼若赤血球から老化赤血球まで様々なステージのものが存在する。これらステージの中で、毛細血管のゴースト化に最も関与するのは、変形能が低下した老化赤血球である。老化赤血球が毛細血管に詰まり、そこから先の毛細血管を形成する細胞に生存に必要な物質が届けられなくなり、ゴースト化が進行すると考えられる。【０００４】
近年、このような血液中の赤血球の変形能を評価する方法や装置が提案されている。
日本において開発された装置としては、例えば、MCFAN  HR300（Micro Channel Array Flow Analyzer、日本、MCヘルスケア社）がある。MCFANはシリコンで人工的に作成した毛細血管に似たものに、採血した血液を流して画像を見るという装置である。開発当初は赤血球変形能の研究に多大な貢献をすると讃えられたが、その後は信頼性が低いことが判り、今はごく限られた病院でしか使われていない。【０００５】
また、海外において開発された装置としては、回転流動による遠心応力を与えて赤血球を楕円変形させ，レーザー光線の回折像で評価するLORCA（Laser-assisted Optical Rotational Cell Analyzer、オランダ、Mechatronics社）や、負圧によるずり応力を与えて赤血球を楕円変形させ，レーザー光線の回折像で評価するRheoScan-D（韓国、RheoMeditech社）などがある（非特許文献１）。RheoScan-Dは全血で自動的に測定できること、流路に使い捨てのプラスチックマイクロチップを使用しているので使用後の洗浄が不要であること、赤血球の凝集も測定できること等の特徴を有する。
しかし、生体内での赤血球の生理的な変形は折れ曲がり変形であり、赤血球を楕円変形させて変形能を測定することが生理的な微小循環の状況を反映しているといえるのかという点には注意を要する。しかも、楕円変形に要する応力は折れ曲がり変形に要する応力よりはるかに大きいので、折れ曲がり変形を測定する方法に比べて、特に、低いずり応力で測定感度が低いという問題点がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Patricia C. Sousa, Fernando T. Pinho, Manuel A. Alves and Monica S.N. Oliveira, A review of hemorheology: Measuring techniques and recent advances, Korea-Australia Rheology J, 28(1), 1-22 (2016)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来の評価方法は、約１２０日という寿命の中の様々なステージにある赤血球を全体として求めた変形能を用いて赤血球の老化度を評価しており、老化赤血球だけあるいは老化赤血球を除いたものだけの変形能を求めることができる装置や、これが自動化された装置は開発されていない。
毛細血管のゴースト化の原因となる老化赤血球の割合はそれぞれの患者によって異なることから、そのような評価方法や装置が開発されれば、それぞれの患者に、例えば、糖尿病性網膜症、腎症等の合併症の進行リスク等について適切な診断をすることができ、臨床的意義が大きいと予測される。【０００８】
本発明の課題は、赤血球の老化度をより高精度かつ適正に評価できる赤血球老化度評価方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、血液の赤血球のしなやかさ、流れやすさといったレオロジー機能が生活習慣病の予防と治療に非常に重要であることに着目し、重力式ニッケルメッシュフィルトレーション法を用いた赤血球変形能測定装置を開発し、赤血球変形能検査を提供している。【００１０】
この重力式ニッケルメッシュフィルトレーション法（フィルターの微小孔の直径は３．２μｍ）を用いて、健診の受診者１３９名を対象に、軽症高脂血症（総コレステロール値２６０ｍｇ／ｄｌ以下）に限って検討した結果によれば、赤血球変形能は中性脂肪値と負の相関を、HDLコレステロール値と正の相関を示した（Ejima J, Ijichi T, Ohnishi Y, Maruyama T, Kaji Y, Kanaya S, Fujino T, Uyesaka N and Ohmura T : Relationship of high-density lipoprotein cholesterol and red blood cell filterability : cross-sectional study of healthy subjects. Clin Hemorheol Microcirc 22 : 1-7, 2000.）。【００１１】
また、高血圧症患者１０１名を対象にし、微小孔の直径が４．９４μｍのフィルターを用いた検討により、赤血球変形能は、平均血圧と負の相関を示すことを明らかにした（K. Odashiro et al, Impaired deformability of circulating erythrocytes obtained from nondiabetic hypertensive patients: investigation by a nickel mesh filtration technique, Clin Hypertens. 21:17，eCollection (2015)）。【００１２】
本発明者らは、さらに、血液中の赤血球の老化度をより高精度かつ適正に評価すべく鋭意検討した結果、赤血球を複数回分離して、各分離工程における赤血球の変形能を求め、これを用いて赤血球の老化度を評価することにより、より高精度かつ適正に赤血球の老化度、ひいては毛細血管のゴースト化を評価できることを見いだし、本発明を完成するに至った。【００１３】
すなわち、本発明は、以下のとおりのものである。
［１］多数の微小孔を有する少なくとも２種のフィルターを用いて赤血球の老化度を評価する方法であって、
血液試料から赤血球浮遊液を調製する赤血球浮遊液調製工程と、
前記赤血球浮遊液を第１のフィルターに通過させて、第１のフィルターを通過しない老化赤血球と、通過する非老化赤血球とに分離すると共に、前記赤血球浮遊液に含まれる赤血球の変形能を算出する第１の赤血球変形能算出工程と、
前記分離された非老化赤血球浮遊液を、前記第１のフィルターよりも小さい径の微小孔を有する第２のフィルターに通過させて、第２のフィルターを通過しない軽度老化赤血球と、通過する幼若赤血球とに分離すると共に、前記非老化赤血球浮遊液に含まれる非老化赤血球の変形能を算出する第２の赤血球変形能算出工程と、
前記第１の赤血球変形能算出工程で算出した赤血球の変形能、及び第２の赤血球変形能算出工程で算出した非老化赤血球の変形能を用いて、赤血球の老化度を評価する評価工程と、
を有することを特徴とする赤血球老化度評価方法。
［２］第１の赤血球変形能算出工程及び／又は第２の赤血球変形能算出工程において、さらに赤血球の通過割合を算出し、該通過割合を評価工程の評価に用いることを特徴とする上記［１］記載の赤血球老化度評価方法。
［３］第１のフィルターの微小孔の径が、５．５０〜８．００μｍであることを特徴とする上記［１］又は［２］記載の赤血球老化度評価方法。
［４］第２のフィルターの微小孔の径が、３．００〜６．００μｍであることを特徴とする上記［１］〜［３］のいずれか記載の赤血球老化度評価方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の赤血球老化度評価方法によれば、赤血球の老化度をより高精度かつ適正に評価できる。したがって、毛細血管のゴースト化の可能性を正確に検知でき、各種疾病の診断に応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の一実施形態に係る赤血球老化度評価方法の工程図である。
【図２】本発明の一実施形態に係る赤血球老化度評価方法に用いる装置の概略説明図である。
【図３】図２に示す装置の測定結果より得られる「高さ−時間曲線」を示す図である。
【図４】本発明の多段の方法を用いた場合（実施例１）のフィルターを通過する際の赤血球の変形能を示すグラフである。
【図５】従来の一段の方法を用いた場合のフィルターを通過する際の赤血球の変形能を示すグラフである。
【図６】本発明の多段の方法を用いた場合（実施例１）のフィルターを通過した赤血球数（割合）を示すグラフである。
【図７】従来の一段の方法を用いた場合のフィルターを通過した赤血球数（割合）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の赤血球老化度評価方法は、多数の均一な微小孔を有する少なくとも２種のフィルターを用いて赤血球の老化度を評価する方法であって、血液試料から赤血球浮遊液を調製する赤血球浮遊液調製工程と、赤血球浮遊液を第１のフィルターに通過させて、第１のフィルターを通過しない老化赤血球と、通過する非老化赤血球とに分離すると共に、赤血球浮遊液に含まれる赤血球の変形能を算出する第１の赤血球変形能算出工程と、分離された非老化赤血球浮遊液を、第１のフィルターよりも小さい径の微小孔を有する第２のフィルターに通過させて、第２のフィルターを通過しない軽度老化赤血球と、通過する幼若赤血球とに分離すると共に、非老化赤血球浮遊液に含まれる非老化赤血球の変形能を算出する第２の赤血球変形能算出工程と、第１の赤血球変形能算出工程で算出した赤血球の変形能、及び第２の赤血球変形能算出工程で算出した非老化赤血球の変形能を用いて、赤血球の老化度を評価する評価工程とを有することを特徴とする。
【００１７】
本発明の赤血球老化度評価方法は、「丸山徹，岡本和彦、ニッケルメッシュ濾過法による赤血球変形能の定量的解析，福岡医誌，95(6)，131-138 (2004)」に記載された赤血球変形能測定装置を用いて評価することができる。
【００１８】
本発明の赤血球老化度評価方法においては、第１の赤血球変形能算出工程及び／又は第２の赤血球変形能算出工程において、赤血球の通過割合を算出し、この通過割合を評価工程の評価に用いることが好ましい。これにより、より精密な赤血球の老化度の評価が可能となる。
【００１９】
また、本発明の方法では、第３のフィルターを用いた第３の赤血球変形能算出工程、第４のフィルターを用いた第４の赤血球変形能算出工程等、さらなる赤血球変形能算出工程を設け、これらの工程で算出された赤血球の変形能や通過割合を用いて評価することもできる。
【００２０】
以下、本発明の赤血球老化度評価方法について詳しく説明する。
図１に示すように、本発明の一実施形態に係る赤血球老化度評価方法は、赤血球浮遊液調製工程（Ｓ１）、第１赤血球変形能算出工程（Ｓ２）、第２赤血球変形能算出工程（Ｓ３）、及び評価工程（Ｓ４）を順次有している。
【００２１】
＜赤血球浮遊液調製工程＞
赤血球浮遊液調製工程（Ｓ１）は、血液試料から赤血球浮遊液を調製する工程であり、例えば、被験者から採取した血液試料を洗浄して赤血球浮遊液を調製する工程である。具体的には、例えば、まず、採取した血液を、遠心して緩衝液で洗浄する処理を複数回繰り返した後、緩衝液でヘマトクリット（ＨＣＴ）が所定濃度になるよう希釈して、赤血球浮遊液を調製する。
【００２２】
＜第１赤血球変形能算出工程＞
第１赤血球変形能算出工程（Ｓ２）は、赤血球浮遊液調製工程（Ｓ１）で調製した赤血球浮遊液を第１のフィルターに通過させて、第１のフィルターを通過しない老化赤血球と、通過する非老化赤血球とに分離すると共に、赤血球浮遊液に含まれる赤血球の変形能を算出する工程である。
【００２３】
本発明で用いる第１のフィルターとしては、高い定量性及び再現性を確保すべく、微小孔の形状、数、及び分布が揃った均一なフィルターが好ましく、例えば、フォトレジスト法と特殊メッキ法とを組み合わせて製造されるニッケルメッシュフィルターを挙げることができる。なお、第１のフィルターは、赤血球浮遊液調製時に混入する白血球に機械的刺激を与え難い構造のものが好ましい。
【００２４】
第１のフィルターの微小孔の径としては、被験者の状況に応じて適宜変更することができるが、一般的には、５．５０〜８．００μｍであることが好ましく、５．６０〜７．００μｍであることがより好ましく、５．７０〜６．５０μｍであることがさらに好ましい。
【００２５】
本工程においては、赤血球の変形能を算出する。この変形能は、赤血球浮遊液に含まれる赤血球（非老化赤血球）が第１のフィルターを通過する能力を示す指標であり、赤血球浮遊液がフィルターの微小孔を通過する際の圧力差や、所定量の赤血球浮遊液が通過する通過時間や、赤血球の流量（flow rate : Q）等、いわゆるフィルトレーション法により算出される各種値を用いることができる。
【００２６】
本発明の変形能の算出方法としては、具体的に例えば、図２に示すような装置を用いて算出することができる。図２に示すように、垂直に立てたガラス管１に、タイゴンチューブを介してニッケルメッシュフィルター２（例えば微小孔の直径６．０μｍ）を装着し、所定の高さ（例えば１５ｃｍ）から、赤血球浮遊液を濾過させる。この時の圧力を連続的に測定することにより、高さ（図２におけるh）−時間曲線を得る（図３参照）。同様に得た赤血球を含まない緩衝液の高さ−時間曲線と比較し、所定高さ（例えば１０ｃｍ）まで下がった時点での時間を比較し、変形能を数値化する。
【００２７】
本工程においては、さらに、赤血球の通過割合、すなわち第１のフィルターを通過しない老化赤血球、及び通過する非老化赤血球の割合を算出することが好ましい。この通過割合を評価工程において用いることにより、より精密な評価が可能となる。通過割合の算出は、従来公知の血球分析装置等を用いて、赤血球浮遊液に含まれる赤血球の全体数、老化赤血球の数、及び非老化赤血球の数のうち少なくとも２つを計測することにより求めることができる。
【００２８】
＜第２赤血球変形能算出工程＞
第２赤血球変形能算出工程（Ｓ３）は、上記第１赤血球変形能算出工程（Ｓ２）で分離された非老化赤血球浮遊液を、第１のフィルターよりも小さい径の微小孔を有する第２のフィルターに通過させて、第２のフィルターを通過しない軽度老化赤血球と、通過する幼若赤血球とに分離すると共に、非老化赤血球浮遊液に含まれる非老化赤血球の変形能を算出する工程である。
【００２９】
本工程に用いる非老化赤血球浮遊液は、第１赤血球変形能算出工程（Ｓ２）で分離したものをそのまま用いてもよいし、緩衝液でヘマトクリット（ＨＣＴ）が所定濃度になるよう希釈して用いてもよい。
【００３０】
本工程の処理は、基本的に第１赤血球変形能算出工程（Ｓ２）の処理と同様であるが、用いるフィルターが異なる。すなわち、本工程においては、第１のフィルターよりも小さい径の微小孔を有する第２のフィルターを用いる。第２のフィルターの微小孔の径としては、第１赤血球変形能算出工程（Ｓ２）の結果等に応じて適宜変更することができるが、一般的には、３．００〜６．００μｍであることが好ましく、３．５０〜５．８０μｍであることがより好ましく、４．００〜５．５０μｍであることがさらに好ましく、４．５０〜５．５０μｍであることが特に好ましい。また、第１のフィルターの微小孔の径との差が、０．１〜２．０μｍであることが好ましく、０．３〜１．５μｍであることがより好ましく、０．５〜１．０μｍであることがさらに好ましい。
【００３１】
＜評価工程＞
評価工程（Ｓ４）は、第１赤血球変形能算出工程で算出した赤血球の変形能、及び第２赤血球変形能算出工程で算出した非老化赤血球の変形能を用いて、赤血球の老化度を評価する工程である。本工程においては、上記赤血球及び非老化赤血球の変形能に追加して、第１赤血球変形能算出工程及び／又は第２赤血球変形能算出工程において算出した赤血球の通過割合を用いて、赤血球の老化を評価することが好ましい。これにより、より精密な評価が可能となる。
【００３２】
具体的に、本工程においては、変形能が低い場合には赤血球が老化していると評価し、さらに通過割合に基づく評価（通過割合が少ないほど赤血球が老化している）を、同時或いは追加的に加味して、赤血球の老化度を評価する。これにより、毛細血管のゴースト化の可能性を正確に検知でき、シワやたるみといった皮膚の状態の診断や、骨粗鬆症、認知症、生活習慣病（糖尿病、高コレステロール血症等）などの診断に応用することができ、疾病の早期発見が可能となる。
【００３３】
特に、本発明の赤血球老化度評価方法は、少なくとも２以上の分離工程における変形能（及び通過割合）を用いて評価するので、従来に比してより精密な赤血球の老化度の評価が可能となる。また、被験者の状況（年齢、血圧、患っている疾患、持病等）に応じて、フィルターの微小孔の大きさの組合せを変更することにより、より適正な評価を行うことが可能となる。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。本実施例の基本操作の概要を図１に示す。【００３５】
［基本操作］
（赤血球浮遊液調製工程）
まず、被験者から採取した血液３０ｃｃを、遠心分離機を用いて、回転数２５００ｒｐｍで、１０分間遠心分離し、緩衝液を用いて洗浄を行う。続いて、回転数を１９５０ｒｐｍ、１７００ｒｐｍ、１５５０ｒｐｍに順次変更して遠心（各１０分間）及び緩衝液による洗浄を繰り返して、洗浄赤血球を得る。得られた洗浄赤血球を、緩衝液で希釈して、ヘマクリット（ＨＣＴ）３％の赤血球浮遊液を調製する。赤血球浮遊液の１μＬあたりの赤血球数を、血球分析装置を用いて計測する。【００３６】
（第１赤血球変形能算出工程（ステージ１））
図２に示すような６．００μｍニッケルメッシュフィルターを設置した測定装置を用いる。送液ポンプで赤血球浮遊液をガラス管に入れて、変形能を測定する。また、６．００μｍニッケルメッシュフィルターを通過した非老化赤血球の１μＬあたりの赤血球数を、血球分析装置を用いて計測する。【００３７】
（第２赤血球変形能算出工程（ステージ２））
非老化赤血球浮遊液を緩衝液で希釈して非老化赤血球浮遊液を調製する。測定装置内部を緩衝液で洗浄した後、６．００μｍニッケルメッシュフィルターを５．３１μｍニッケルメッシュフィルターに交換する。送液ポンプで非老化赤血球浮遊液をガラス管に入れて、変形能を測定する。また、５．３１μｍニッケルメッシュフィルターを通過した幼若赤血球浮遊液の１μＬあたりの赤血球数を、血球分析装置を用いて計測する。【００３８】
（評価工程）
得られた各変形能、各赤血球数を用いて、血液の老化度を評価する。【００３９】
［実施例１］
上記基本操作に従い、実際のヒトから採取した血液を用いて、血液の老化度を評価する例を以下に示す。【００４０】
上記赤血球浮遊液調製工程で示した方法により、ヒトから採取した血液からＨＣＴ３％の赤血球浮遊液（サンプル液）を調製した。このときのサンプル液の赤血球数は、３２×１０４個／μｌであった。
また、比較として、このサンプル液に、赤血球変形能を低下させるフリーラジカル産生物質ＡＡＰＨ（2,2'-azobis-2-methyl-propanimidamide,dihydrochloride）を５００ｍＭで添加した比較サンプル液を調製した（赤血球数は、３２×１０４個／μｌ）。【００４１】
６．００μｍニッケルメッシュフィルターを用いて上記第１赤血球変形能算出工程（ステージ１）における手法により、変形能及び赤血球数を測定した。図４（各左側のグラフ）に示すように、ステージ１におけるサンプル液の変形能は９３％であり、比較サンプルの変形能は９０％であった。また、図６（各左側のグラフ）に示すように、ステージ１におけるフィルターを通過したサンプル液の赤血球は２６×１０４個／μｌ（通過割合：８１％）であり、フィルターを通過した比較サンプルの赤血球は２６×１０４個／μｌ（通過割合：８１％）であった。【００４２】
なお、赤血球の変形能（％）は、以下のように求めた。
赤血球浮遊液（サンプル液又は比較サンプル液）を、１５ｃｍの高さからニッケルメッシュフィルターを通過させ、通過中の圧力変化を連続的に検出し、高さ−時間曲線を得て、赤血球を含まない緩衝液の高さ−時間曲線を対照として赤血球変形能を評価した。１０ｃｍまで下がった時点での変形能を対照と比較して数値化した。【００４３】
第１赤血球変形能算出工程（ステージ１）後のサンプル液及び比較サンプル液の赤血球数は、希釈により９×１０４個／μｌに調整した。また、５．３１μｍニッケルメッシュフィルターを用いて上記第２赤血球変形能算出工程（ステージ２）における手法により、変形能及び赤血球数を測定した。【００４４】
図４（各右側のグラフ）に示すように、ステージ２におけるサンプル液の変形能は９５％であり、比較サンプルの変形能は６６％であり、３０％近い大きな差となって現れた。また、図６（各右側のグラフ）に示すように、ステージ２におけるフィルターを通過したサンプル液の赤血球は８×１０４個／μｌ（通過割合：８９％）であり、フィルターを通過した比較サンプルの赤血球は７×１０４個／μｌ（通過割合：７８％）であり、こちらも１１％程度の大きな差となって現れた。【００４５】
一方、図５に示すように、５．３１μｍニッケルメッシュフィルターのみを用いる従来の一段階の方法（サンプル液の赤血球数は、３４×１０４個／μｌ）では、サンプル液の変形能は８９％であり、比較サンプルの変形能は８０％であり、その差は１０％未満と小さいものであった。また、図７に示すように、フィルターを通過したサンプル液の赤血球は２５×１０４個／μｌ（通過割合：７４％）であり、フィルターを通過した比較サンプルの赤血球は２６×１０４個／μｌ（通過割合：７６％）であり、その差はほぼなかった（むしろ比較サンプル液の方が多かった）。【００４６】
以上のとおり、本発明の多段階の方法によれば、精度良く赤血球の状態を把握でき、正確な評価が可能となると共に、より細かな良否の分類が可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明の赤血球老化度評価方法は、赤血球の老化度を評価することができることから、産業上有用である。
【符号の説明】
【００４８】
１    ガラス管
２    ニッケルメッシュフィルター
３    恒温水槽
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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