(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンジニアリングされた天然に存在しないクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）系であって、
ａ）それぞれがダイレクトリピート配列に連結されたガイド配列を含む１つ以上のガイドＲＮＡ、又は、前記の１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列；ここで、前記ガイド配列は標的配列とハイブリダイズ可能である、及び
ｂ）Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質、又は前記Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質をコードする１つ以上のヌクレオチド配列、
を含み、前記１つ以上のガイド配列が前記標的配列にハイブリダイズし、前記標的配列がプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の３’側にあり、及び前記ガイドＲＮＡが前記Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質と複合体を形成する、系。
【請求項２】
エンジニアリングされた天然に存在しないクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）ベクター系であって、
ａ）それぞれがダイレクトリピート配列に連結されたガイド配列を含む１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列に作動可能に連結された第１の調節エレメント；ここで、前記ガイド配列は標的配列とハイブリダイズ可能である、
ｂ）Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第２の調節エレメント、
を含む１つ以上のベクターを含み、
構成成分（ａ）及び（ｂ）が前記系の同じ又は異なるベクター上に位置し、
転写されると、前記１つ以上のガイド配列が前記標的配列にハイブリダイズし、前記標的配列がプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の３’側にあり、及び前記ガイドＲＮＡが前記Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質と複合体を形成する、系。
【請求項３】
前記標的配列が細胞内にある、請求項１又は２に記載の系。
【請求項４】
前記細胞が真核細胞である、請求項３に記載の系。
【請求項５】
転写されると、前記１つ以上のガイド配列が前記標的配列にハイブリダイズし、前記ガイドＲＮＡが前記Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質と複合体を形成して、それが前記標的配列の遠位に切断を生じさせる、請求項１又は２に記載の系。
【請求項６】
前記切断により、４又は５ｎｔ  ５’オーバーハングを伴う付着末端型の二本鎖切断が生じる、請求項５に記載の系。
【請求項７】
前記ＰＡＭが５’Ｔリッチモチーフを含む、請求項１又は２に記載の系。
【請求項８】
前記Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質が、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）１、野兎病菌亜種ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）、プレボテラ・アルベンシス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ａｌｂｅｎｓｉｓ）、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＣ２０１７  １、ブチリビブリオ・プロテオクラスチカス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ）、ペレグリニバクテリア細菌（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、パルクバクテリア細菌（Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、スミセラ属種（Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ  ｓｐ．）ＳＣＡＤＣ、アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＡ２０２０、カンディダタス・メタノプラズマ・テルミツム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ  ｔｅｒｍｉｔｕｍ）、ユーバクテリウム・エリゲンス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ）、モラクセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ）２３７、レプトスピラ・イナダイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ）、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６、ポルフィロモナス・クレビオリカニス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ）３、プレボテラ・ディシエンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ）及びポルフィロモナス・マカカエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅ）からなる群から選択される細菌種に由来する、請求項１又は２に記載の系。
【請求項９】
前記ＰＡＭ配列がＴＴＮであり［式中、ＮはＡ／Ｃ／Ｇ又はＴである］、且つ前記エフェクタータンパク質がＦｎＣｐｆ１であるか、又は前記ＰＡＭ配列がＴＴＴＶであり［式中、ＶはＡ／Ｃ又はＧである］、且つ前記エフェクタータンパク質がＰａＣｐｆ１ｐ、ＬｂＣｐｆ１又はＡｓＣｐｆ１である、請求項８に記載の系。
【請求項１０】
前記Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質が１つ以上の核局在化シグナルを含む、請求項１又は２に記載の系。
【請求項１１】
前記Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が真核細胞での発現にコドン最適化されている、請求項１又は２に記載の系。
【請求項１２】
構成成分（ａ）及び（ｂ）が１つのベクター上に位置する、請求項２に記載の系。
【請求項１３】
前記系が、（ａ）前記１つ以上のガイドＲＮＡ、及び、（ｂ）前記Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質、又は、前記Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質をコードするｍＲＮＡ、を含む、請求項１に記載の系。
【請求項１４】
前記系がｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含まない、請求項１又は２に記載の系。
【請求項１５】
目的の標的遺伝子座を改変するインビトロ又はエキソビボの方法であって、前記方法が、請求項１又は２に記載の系を前記目的の標的遺伝子座に送達するステップを含み、前記Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質は前記１つ以上のガイドＲＮＡと複合体を形成し、及びプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の３’側にある目的の標的遺伝子座に前記複合体が結合すると、前記Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質が前記目的の標的遺伝子座の改変を誘導する、方法。
【請求項１６】
前記目的の標的遺伝子座が細胞内にある、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞は真核細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞が動物又はヒト細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が植物細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記目的の標的遺伝子座がインビトロでＤＮＡ分子に含まれる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質と１つ以上のガイドＲＮＡとが、１つ以上のポリヌクレオチド分子として前記細胞に送達される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記目的の標的遺伝子座がＤＮＡを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＤＮＡが弛緩型又はスーパーコイルである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記目的の標的遺伝子座の前記改変が鎖切断である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
前記鎖切断が、４又は５ｎｔ  ５’オーバーハングを伴う付着末端型のＤＮＡ二本鎖切断を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記目的の標的遺伝子座が、前記付着末端型ＤＮＡ二本鎖切断へのＤＮＡインサートの組込みによって改変される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質が１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
前記１つ以上のポリヌクレオチド分子が１つ以上のベクター内に含まれる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
前記１つ以上のポリヌクレオチド分子が、前記Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質及び／又は１つ又は複数の前記ガイドＲＮＡを発現するように作動可能に構成された１つ以上の調節エレメントを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記１つ以上のポリヌクレオチド分子が送達系に含まれる、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
前記１つ以上のポリヌクレオチド分子が、粒子、小胞、又は１つ以上のウイルスベクターによって送達される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
前記粒子が脂質、糖、金属又はタンパク質を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記小胞がエキソソーム又はリポソームを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記１つ以上のウイルスベクターが、アデノウイルスの１つ以上、１つ以上のレンチウイルス又は１つ以上のアデノ随伴ウイルスを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１又は２に記載の系を含むインビトロ又はエキソビボ宿主細胞又は細胞株。
【請求項３６】
前記細胞が真核細胞である、請求項３５に記載の宿主細胞又は細胞株。
【請求項３７】
前記細胞が動物細胞である、請求項３６に記載の宿主細胞又は細胞株。
【請求項３８】
前記細胞がヒト細胞である、請求項３６に記載の宿主細胞又は細胞株。
【請求項３９】
前記細胞が幹細胞である、請求項３６に記載の宿主細胞又は細胞株。
【請求項４０】
前記細胞が植物細胞である、請求項３６に記載の宿主細胞又は細胞株。
【請求項４１】
目的の遺伝子によってコードされる改変された目的の形質を有する、植物を作製する方法であって、請求項１又は２に記載の系に植物細胞を接触させるステップ又は請求項１５に記載の方法に前記植物細胞を供するステップであって、それにより前記目的の遺伝子を改変するか或いは導入するステップ、及び前記植物細胞から植物を再生するステップを含む、方法。
【請求項４２】
請求項１又は２に記載の系を含む粒子。
【請求項４３】
前記ガイドＲＮＡと複合体を形成した前記Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質を含有する、請求項４２に記載の粒子。
【請求項４４】
前記複合体、ガイドＲＮＡ又はタンパク質が、少なくとも１つの糖部分にコンジュゲートされる、請求項１又は２に記載の系。
【請求項４５】
１ｍＭ〜１５ｍＭの濃度のＭｇ２＋を含む、請求項１又は２に記載の系。
【請求項４６】
前記１つ以上の調節エレメントが誘導プロモーターを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項４７】
前記少なくとも１つの糖部分がＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である、請求項４４に記載の系。
【請求項４８】
ゲノム編集における使用のための、請求項１又は２に記載の系。
【請求項４９】
遺伝子治療用の医薬の製造における、請求項１又は２に記載の系の使用。
【請求項５０】
遺伝子改変された非ヒト動物又は植物の製造における、請求項１又は２に記載の系の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願及び参照による援用
本願は、２０１５年６月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／１８１，７３９号明細書；２０１５年７月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／１９３，５０７号明細書、２０１５年８月５日に出願された米国仮特許出願第６２／２０１，５４２号明細書、２０１５年８月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／２０５，７３３号明細書、２０１５年９月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／２３２，０６７号明細書、２０１５年１２月１８日に出願された米国特許出願第１４／９７５，０８５号明細書、及び欧州特許出願第１６１５０４２８．７号明細書の利益及びそれらに対する優先権を主張する。
【０００２】
前述の出願の各々、並びにその中に引用されるか又はその審査手続中に引用される全ての文献（「出願引用文献」）及び本明細書に引用される文献中で引用又は参照される全ての文献は、本明細書で言及されるか又は本明細書に参照によって援用される任意の文献中にある任意の製品に関する任意の製造者の指示書、説明書、製品仕様書、及びプロダクトシートと共に、本明細書によって参照により本明細書に援用され、且つ本発明の実施に用いられ得る。より具体的には、参照される全ての文献は、各個別の文献について参照によって援用されることが具体的且つ個別に指示されたものとするのと同程度に参照によって援用される。
【０００３】
連邦政府支援研究に関する記載事項
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）から付与された助成金第ＭＨ１００７０６号に基づく連邦政府の支援を受けて行われた。連邦政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００４】
配列表
本願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、この配列表は本明細書によって全体として参照により援用される。２０１５年１２月１７日に作成された前記ＡＳＣＩＩ複製物は、名称４７６２７．０５．２１２３＿ＳＬ．ｔｘｔ、サイズが２，４６７，２０５バイトである。
【０００５】
本発明は、概して、遺伝子転写物の摂動又は核酸編集など、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）及びその構成成分に関するベクター系を使用し得る配列ターゲティングを含む遺伝子発現の制御に用いられる系、方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００６】
ゲノムシーケンシング技法及び解析方法の最近の進歩により、様々な生物学的機能及び疾患に関連する遺伝因子をカタログ化し及びマッピングする能力は急速に向上している。個々の遺伝エレメントを選択的に摂動させることによる原因遺伝的変異の体系的なリバースエンジニアリングを可能にするとともに合成生物学、バイオテクノロジー的、及び医学的応用を進歩させるには、正確なゲノムターゲティング技術が必要である。標的化したゲノム摂動を生じさせるためにデザイナージンクフィンガー、転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）、又はホーミングメガヌクレアーゼなどのゲノム編集技法が利用可能であるものの、新規戦略及び分子機構を利用した、且つ安価で、セットアップし易く、スケーリングが可能で、及び真核生物ゲノム内の複数の位置を標的化するのに適した新規のゲノムエンジニアリング技術が依然として必要とされている。それは、ゲノムエンジニアリング及びバイオテクノロジーにおける新規適用の主要なリソースとなるであろう。
【０００７】
細菌及び古細菌適応免疫のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、タンパク質組成及びゲノム遺伝子座構成に関して極めて高度な多様性を示す。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系遺伝子座は５０を超える遺伝子ファミリーを有し、厳密な意味で普遍的な遺伝子はないことから、急速な進化及び遺伝子座構成の極めて高度な多様性が示唆される。これまでのところ、多方向からの手法をとることにより、９３個のＣａｓタンパク質について約３９５個のプロファイルのｃａｓ遺伝子が包括的に同定されている。分類に含まれるのは、シグネチャ遺伝子プロファイル＋遺伝子座構成のシグネチャである。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の新規分類が提案されており、ここではこれらの系が大まかに２つのクラス、マルチサブユニットエフェクター複合体を有するクラス１と、Ｃａｓ９タンパク質に例示される単一サブユニットエフェクターモジュールを有するクラス２とに分けられる。クラス２  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に関連する新規エフェクタータンパク質は、強力なゲノムエンジニアリングツールとして開発することができ、推定上の新規エフェクタータンパク質の予測並びにそれらのエンジニアリング及び最適化が重要である。
【０００８】
本願におけるいかなる文献の引用又は特定も、かかる文献が本発明の先行技術として利用可能であると認めるものではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
幅広い適用で核酸又はポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ又はこれらの任意のハイブリッド又は誘導体）を標的化する代替的且つロバストなシステム及び技法が喫緊に必要とされている。本発明はこの必要性に応え、関連する利点を提供する。本願の新規ＤＮＡ又はＲＮＡターゲティング系がゲノム及びエピゲノムターゲティング技術のレパートリーに加わることにより、直接的な検出、分析及び操作を通じて特定の標的部位の研究及び摂動又は編集が変わり得る。本願のＤＮＡ又はＲＮＡターゲティング系を有害作用なしにゲノム又はエピゲノムターゲティングに有効に利用するためには、これらのＤＮＡ又はＲＮＡターゲティングツールのエンジニアリング及び最適化の側面を理解することが決定的に重要である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、目的の標的遺伝子座に関連する又はそこにある配列を改変する方法を提供し、この方法は、推定Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座エフェクタータンパク質と１つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を前記遺伝子座に送達するステップを含み、ここでエフェクタータンパク質は１つ以上の核酸成分と複合体を形成し、及び前記複合体が目的の遺伝子座に結合すると、エフェクタータンパク質が目的の標的遺伝子座に関連する又はそこにある配列の改変を誘導する。好ましい実施形態において、改変は鎖切断の導入である。好ましい実施形態において、目的の標的遺伝子座に関連する又はそこにある配列はＤＮＡを含み、及びエフェクタータンパク質はサブタイプＶ−Ａ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座又はサブタイプＶ−Ｂ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座によってコードされる。
【００１１】
用語のＣａｓ酵素、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ＣＲＩＳＰＲタンパク質、Ｃａｓタンパク質及びＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓは概して同義的に用いられ、Ｃａｓ９に具体的に言及することによるなど、特に明らかでない限り、本明細書で言及する際は常に類推から本願に更に記載される新規ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を指すことが理解されるであろう。本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、好ましくはＣｐｆ１エフェクタータンパク質である。
【００１２】
本発明は、目的の標的遺伝子座に関連する又はそこにある配列を改変する方法を提供し、この方法は、Ｃｐｆ１遺伝子座エフェクタータンパク質と１つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を、遺伝子座に関連する又はそこにある前記配列に送達するステップを含み、ここでＣｐｆ１エフェクタータンパク質は１つ以上の核酸成分と複合体を形成し、及び前記複合体が目的の遺伝子座に結合すると、エフェクタータンパク質が目的の標的遺伝子座に関連する又はそこにある配列の改変を誘導する。好ましい実施形態において、改変は鎖切断の導入である。好ましい実施形態において、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質は１つの核酸成分；有利にはエンジニアリングされた又は天然に存在しない核酸成分と複合体を形成する。目的の標的遺伝子座に関連する又はそこにある配列の改変の誘導は、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質−核酸ガイド下であり得る。好ましい実施形態において、１つの核酸成分はＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）である。好ましい実施形態において、１つの核酸成分は成熟ｃｒＲＮＡ又はガイドＲＮＡであり、ここで成熟ｃｒＲＮＡ又はガイドＲＮＡはスペーサー配列（又はガイド配列）及びダイレクトリピート配列又はこれらの誘導体を含む。好ましい実施形態において、スペーサー配列又はその誘導体はシード配列を含み、ここでシード配列は、標的遺伝子座における配列の認識及び／又はそれとのハイブリダイゼーションに決定的に重要である。好ましい実施形態において、ＦｎＣｐｆ１ガイドＲＮＡのシード配列は、スペーサー配列（又はガイド配列）の５’末端上の最初の約５ｎｔ以内にある。好ましい実施形態において、鎖切断は５’オーバーハングを伴う付着末端型切断である。好ましい実施形態において、目的の標的遺伝子座に関連する又はそこにある配列は、線状ＤＮＡ又はスーパーコイルＤＮＡを含む。
【００１３】
本発明の態様は、１つ以上の天然に存在しない又はエンジニアリングされた又は改変された又は最適化された核酸成分を有するＣｐｆ１エフェクタータンパク質複合体に関する。好ましい実施形態において、この複合体の核酸成分は、ダイレクトリピート配列に連結されたガイド配列を含むことができ、ここでダイレクトリピート配列は１つ以上のステムループ又は最適化された二次構造を含む。好ましい実施形態において、ダイレクトリピートは１６ｎｔの最小長さ及び単一のステムループを有する。更なる実施形態において、ダイレクトリピートは長さが１６ｎｔより長く、好ましくは１７ｎｔより長く、且つ２つ以上のステムループ又は最適化された二次構造を有する。好ましい実施形態において、ダイレクトリピートは１つ以上のタンパク質結合ＲＮＡアプタマーを含むように改変されてもよい。好ましい実施形態において、１つ以上のアプタマーは、最適化された二次構造の一部として含まれてもよい。かかるアプタマーはバクテリオファージコートタンパク質との結合能を有し得る。バクテリオファージコートタンパク質は、Ｑβ、Ｆ２、ＧＡ、ｆｒ、ＪＰ５０１、ＭＳ２、Ｍ１２、Ｒ１７、ＢＺ１３、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、ＭＸ１、ＴＷ１８、ＶＫ、ＳＰ、ＦＩ、ＩＤ２、ＮＬ９５、ＴＷ１９、ＡＰ２０５、φＣｂ５、φＣｂ８ｒ、φＣｂ１２ｒ、φＣｂ２３ｒ、７ｓ及びＰＲＲ１を含む群から選択され得る。好ましい実施形態において、バクテリオファージコートタンパク質はＭＳ２である。本発明はまた、３０以上、４０以上又は５０以上のヌクレオチド長である複合体の核酸成分も提供する。
【００１４】
本発明はゲノム編集方法を提供し、この方法は、２ラウンド以上のＣｐｆ１エフェクタータンパク質ターゲティング及び切断を含む。特定の実施形態において、第１のラウンドは、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質がシード配列から遠く離れた標的遺伝子座に関連する配列を切断することを含み、及び第２のラウンドは、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質が標的遺伝子座にある配列を切断することを含む。本発明の好ましい実施形態では、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質による第１のターゲティングラウンドによってインデルが生じ、及びＣｐｆ１エフェクタータンパク質による第２のターゲティングラウンドが相同依存性修復（ＨＤＲ）によって修復され得る。本発明の最も好ましい実施形態では、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質による１つ以上のターゲティングラウンドにより、修復鋳型の挿入によって修復され得る付着末端型切断が生じる。
【００１５】
本発明は、目的の標的遺伝子座に関連する又はそこにある配列のゲノム編集又は改変方法を提供し、この方法は、任意の所望の細胞型、原核細胞又は真核細胞にＣｐｆ１エフェクタータンパク質複合体を導入するステップを含み、それによってＣｐｆ１エフェクタータンパク質複合体が、真核生物又は原核細胞のゲノムにＤＮＡインサートを組み込むように有効に機能する。好ましい実施形態において、細胞は真核細胞であり、及びゲノムは哺乳類ゲノムである。好ましい実施形態において、ＤＮＡインサートの組込みは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ベースの遺伝子挿入機構によって促進される。好ましい実施形態において、ＤＮＡインサートは、外因的に導入されたＤＮＡ鋳型又は修復鋳型である。好ましい一実施形態において、外因的に導入されたＤＮＡ鋳型又は修復鋳型は、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質複合体又は１つの構成成分又は複合体の構成成分の発現用ポリヌクレオチドベクターと共に送達される。より好ましい実施形態において、真核細胞は非分裂細胞（例えば、ＨＤＲによるゲノム編集が特に難題となる非分裂細胞）である。ヒト細胞における好ましいゲノム編集方法において、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質には、限定はされないが、ＦｎＣｐｆ１、ＡｓＣｐｆ１及びＬｂＣｐｆ１エフェクタータンパク質が含まれ得る。
【００１６】
本発明はまた、目的の標的遺伝子座を改変する方法も提供し、この方法は、Ｃ２ｃ１遺伝子座エフェクタータンパク質と１つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を前記遺伝子座に送達するステップを含み、ここでＣ２ｃ１エフェクタータンパク質は１つ以上の核酸成分と複合体を形成し、及び前記複合体が目的の遺伝子座に結合すると、エフェクタータンパク質が目的の標的遺伝子座の改変を誘導する。好ましい実施形態において、改変は鎖切断の導入である。
【００１７】
かかる方法において、目的の標的遺伝子座はインビトロでＤＮＡ分子に含まれ得る。好ましい実施形態において、そのＤＮＡ分子はプラスミドである。
【００１８】
かかる方法において、目的の標的遺伝子座は細胞内のＤＮＡ分子に含まれ得る。細胞は原核細胞又は真核細胞であってもよい。細胞は哺乳類細胞であってもよい。哺乳類細胞は、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、げっ歯類又はマウス細胞であってもよい。細胞は、家禽、魚類又はエビなどの非哺乳類真核細胞であってもよい。細胞はまた、植物細胞であってもよい。植物細胞は、キャッサバ、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、又はコメなどの作物植物であってもよい。植物細胞はまた、藻類、樹木又は野菜であってもよい。本発明によって細胞に導入される改変は、抗体、デンプン、アルコール又は他の所望の細胞産出物などの生物学的産物の産生向上のため細胞及び細胞の子孫を変化させるようなものであり得る。本発明によって細胞に導入される改変は、産生される生物学的産物を変える変化が細胞及び細胞の子孫に含まれるようなものであり得る。
【００１９】
本発明は、目的の標的遺伝子座を改変する方法を提供し、この方法は、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座エフェクタータンパク質と１つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を前記遺伝子座に送達するステップを含み、ここでエフェクタータンパク質は１つ以上の核酸成分と複合体を形成し、及び前記複合体が目的の遺伝子座に結合すると、エフェクタータンパク質が目的の標的遺伝子座の改変を誘導する。好ましい実施形態において、改変は鎖切断の導入である。
【００２０】
好ましい実施形態において、目的の標的遺伝子座はＤＮＡを含む。
【００２１】
かかる方法において、目的の標的遺伝子座は細胞内のＤＮＡ分子に含まれ得る。細胞は原核細胞又は真核細胞であってもよい。細胞は哺乳類細胞であってもよい。哺乳類細胞は、非ヒト哺乳動物、例えば、霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、げっ歯類、ウサギ科（Ｌｅｐｏｒｉｄａｅ）、例えば、サル、雌ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ウサギ、ラット又はマウス細胞であってもよい。細胞は、非哺乳類真核細胞、例えば、家禽類のトリ（例えば、ニワトリ）、脊椎動物魚類（例えば、サケ）又は甲殻類（例えば、カキ、ハマグリ（ｃｌａｉｍ）、ロブスター、エビ）細胞であってもよい。細胞はまた、植物細胞であってもよい。植物細胞は、単子葉植物又は双子葉植物のもの又は作物又は穀物植物のもの、例えば、キャッサバ、トウモロコシ、モロコシ、ダイズ、コムギ、オートムギ又はコメであってもよい。植物細胞はまた、藻類、樹木又は生産植物、果実又は野菜のもの（例えば、柑橘類の木、例えば、オレンジ、グレープフルーツ又はレモンの木などの木；モモ又はネクタリンの木；リンゴ又はセイヨウナシの木；アーモンド又はクルミ又はピスタチオの木などの堅果類の木；ナス科植物；アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の植物；アキノノゲシ属（Ｌａｃｔｕｃａ）の植物；ホウレンソウ属（Ｓｐｉｎａｃｉａ）の植物；トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）の植物；綿、タバコ、アスパラガス、ニンジン、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、トマト、ナス、コショウ、レタス、ホウレンソウ、イチゴ、ブルーベリー、ラズベリー、ブラックベリー、ブドウ、コーヒー、ココア等）であってもよい。
【００２２】
記載される方法の任意のものにおいて、目的の標的遺伝子座は目的のゲノム又はエピゲノム遺伝子座であってもよい。記載される方法の任意のものにおいて、複合体は、多重化した使用向けに複数のガイドと共に送達されてもよい。記載される方法の任意のものにおいて、２つ以上のタンパク質が用いられてもよい。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態において、目的の標的遺伝子座に関連する又はそこにある配列の生化学的な又はインビトロ若しくはインビボでの切断、例えばＦｎＣｐｆ１エフェクタータンパク質による切断は、推定トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒ  ＲＮＡ）配列なしに生じる。本発明の他の実施形態において、切断、例えば他のＣＲＩＳＰＲファミリーエフェクタータンパク質による切断は、推定トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒ  ＲＮＡ）配列を伴い生じ得るが、しかしながらＦｎＣｐｆ１遺伝子座の評価後、本出願人らは、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質複合体による標的ＤＮＡ切断にｔｒａｃｒＲＮＡは必要ないと結論付けた。本出願人らは、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質及びｃｒＲＮＡ（ダイレクトリピート配列とガイド配列とを含むガイドＲＮＡ）のみを含むＣｐｆ１エフェクタータンパク質複合体が標的ＤＮＡの切断に十分であったことを決定した。従って、本発明は、本明細書において上記に記載されるとおりの目的の標的遺伝子座を改変する方法を提供し、ここでエフェクタータンパク質はＣｐｆ１タンパク質であり、及びエフェクタータンパク質は、ｔｒａｃｒの存在なしに標的配列と複合体を形成する。
【００２４】
記載される方法の任意のものにおいて、エフェクタータンパク質（例えばＣｐｆ１）及び核酸成分は、そのタンパク質及び／又は１つ又は複数の核酸成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子によって提供されてもよく、及びここで１つ以上のポリヌクレオチド分子は、タンパク質及び／又は１つ又は複数の核酸成分を発現するように作動可能に構成されている。１つ以上のポリヌクレオチド分子は、タンパク質及び／又は１つ又は複数の核酸成分を発現するように作動可能に構成された１つ以上の調節エレメントを含み得る。１つ以上のポリヌクレオチド分子は１つ以上のベクター内に含まれ得る。本発明は、かかる１つ又は複数のポリヌクレオチド分子、例えばタンパク質及び／又は１つ又は複数の核酸成分を発現するように作動可能に構成されたかかるポリヌクレオチド分子、並びにかかる１つ又は複数のベクターを包含する。
【００２５】
記載される方法の任意のものにおいて、鎖切断は一本鎖切断又は二本鎖切断であってもよい。
【００２６】
調節エレメントは誘導性プロモーターを含み得る。ポリヌクレオチド及び／又はベクター系は誘導性系を含み得る。
【００２７】
記載される方法の任意のものにおいて、１つ以上のポリヌクレオチド分子は送達系に含まれてもよく、又は１つ以上のベクターが送達系に含まれてもよい。
【００２８】
記載される方法の任意のものにおいて、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物は、リポソーム、粒子（例えばナノ粒子）、エキソソーム、微小胞、遺伝子銃又は１つ以上のベクター、例えば核酸分子又はウイルスベクターによって送達されてもよい。
【００２９】
本発明はまた、本明細書で考察するとおりの特徴を有するか又は本明細書に記載される方法のいずれかに定義される組成物である天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物も提供する。
【００３０】
本発明はまた、１つ以上のベクターを含むベクター系も提供し、この１つ以上のベクターは、本明細書で考察するとおりの特徴を有するか又は本明細書に記載される方法のいずれかに定義される組成物である天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子を含む。
【００３１】
本発明はまた、１つ以上のベクター又は１つ以上のポリヌクレオチド分子を含む送達系も提供し、この１つ以上のベクター又はポリヌクレオチド分子は、本明細書で考察するとおりの特徴を有するか又は本明細書に記載される方法のいずれかに定義される組成物である天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子を含む。
【００３２】
本発明はまた、療法的治療方法に用いられる、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、又は前記組成物の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、又は前記組成物の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含むベクター又は送達系も提供する。療法的治療方法には、遺伝子若しくはゲノム編集、又は遺伝子療法が含まれ得る。
【００３３】
本発明はまた、新規クラス２  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を予想し、且つその中の構成成分を同定するための計算方法及びアルゴリズムも包含する。
【００３４】
本発明はまた、エフェクタータンパク質の１つ以上のアミノ酸残基が改変されていてもよい方法及び組成物、例えば、エンジニアリングされた又は天然に存在しないエフェクタータンパク質又はＣｐｆ１も提供する。ある実施形態において、改変は、エフェクタータンパク質の１つ以上のアミノ酸残基の突然変異を含み得る。１つ以上の突然変異は、エフェクタータンパク質の１つ以上の触媒活性ドメインにあってもよい。このエフェクタータンパク質は、前記１つ以上の突然変異を欠くエフェクタータンパク質と比較してヌクレアーゼ活性が低下し又は消失していてもよい。このエフェクタータンパク質は、目的の標的遺伝子座におけるいずれか一方のＤＮＡ又はＲＮＡ鎖の切断を誘導しないことがあり得る。エフェクタータンパク質は目的の標的遺伝子座におけるいずれのＤＮＡ又はＲＮＡ鎖の切断も誘導しないことがあり得る。好ましい実施形態において、１つ以上の突然変異は２つの突然変異を含み得る。好ましい実施形態において、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質、例えば、エンジニアリングされた又は天然に存在しないエフェクタータンパク質又はＣｐｆ１において１つ以上のアミノ酸残基が改変される。好ましい実施形態において、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質はＦｎＣｐｆ１エフェクタータンパク質である。好ましい実施形態において、１つ以上の改変された又は突然変異したアミノ酸残基は、ＦｎＣｐｆ１エフェクタータンパク質のアミノ酸位置付番を基準にしてＤ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ又はＤ１２５５Ａである。更に好ましい実施形態において、１つ以上の突然変異したアミノ酸残基は、ＡｓＣｐｆ１におけるアミノ酸位置を基準としてＤ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ、Ｄ１２６３Ａ、又はＬｂＣｐｆ１におけるアミノ酸位置を基準としてＬｂＤ８３２Ａ、Ｅ９２５Ａ、Ｄ９４７Ａ又はＤ１１８０Ａである。
【００３５】
本発明はまた、ＲｕｖＣドメインを含むエフェクタータンパク質の触媒活性ドメインにあるべき１つ以上の突然変異又は２つ以上の突然変異も提供する。本発明の一部の実施形態において、ＲｕｖＣドメインは、ＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩ若しくはＲｕｖＣＩＩＩドメイン、又はＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩ若しくはＲｕｖＣＩＩＩドメイン等と同種であるか又は本明細書に記載される方法のいずれかに記載されるとおりの任意の関連性のあるドメインと同種である触媒活性ドメインを含み得る。エフェクタータンパク質は１つ以上の異種機能ドメインを含み得る。１つ以上の異種機能ドメインは１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）ドメインを含み得る。１つ以上の異種機能ドメインは少なくとも２つ又はそれ以上のＮＬＳドメインを含み得る。１つ以上のＮＬＳドメインはエフェクタータンパク質（例えばＣｐｆ１）の末端に又はその近傍に又はそれに近接して位置してもよく、及びＮＬＳが２つ以上の場合には、それらの２つの各々がエフェクタータンパク質（例えばＣｐｆ１）の末端に又はその近傍に又はそれに近接して位置してもよい。１つ以上の異種機能ドメインは１つ以上の転写活性化ドメインを含み得る。好ましい実施形態において、転写活性化ドメインはＶＰ６４を含み得る。１つ以上の異種機能ドメインは１つ以上の転写抑制ドメインを含み得る。好ましい実施形態において、転写抑制ドメインはＫＲＡＢドメイン又はＳＩＤドメイン（例えばＳＩＤ４Ｘ）を含む。１つ以上の異種機能ドメインは１つ以上のヌクレアーゼドメインを含み得る。好ましい実施形態において、ヌクレアーゼドメインはＦｏｋ１を含む。
【００３６】
本発明はまた、以下の活性：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写解除因子活性、ヒストン修飾活性、ヌクレアーゼ活性、一本鎖ＲＮＡ切断活性、二本鎖ＲＮＡ切断活性、一本鎖ＤＮＡ切断活性、二本鎖ＤＮＡ切断活性及び核酸結合活性のうちの１つ以上を有するように１つ以上の異種機能ドメインも提供する。少なくとも１つ以上の異種機能ドメインはエフェクタータンパク質のアミノ末端にあるか又はその近傍にあってもよく、及び／又はここで少なくとも１つ以上の異種機能ドメインはエフェクタータンパク質のカルボキシ末端にあるか又はその近傍にある。１つ以上の異種機能ドメインはエフェクタータンパク質に融合されてもよい。１つ以上の異種機能ドメインはエフェクタータンパク質に繋留されてもよい。１つ以上の異種機能ドメインはリンカー部分を介してエフェクタータンパク質に連結されてもよい。
【００３７】
本発明はまた、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ニトラチフラクター属（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、パルビバクラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アゾスピリラム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、スフェロヘータ属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクター属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、パルディバクター属（Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）、クロストリジアリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｒｉｄｉｕｍ）、レプトトリキア属（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、アリシクロバチルス属（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノメチオフィラス属（Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｏｐｈｉｌｕｓ）、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、ヘルココッカス属（Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ）、レプトスピラ属（Ｌｅｔｏｓｐｉｒａ）、デスルホビブリオ属（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）、デスルホナトロヌム属（Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ）、オピツツス科（Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ）、ツベリバチルス属（Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバチルス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｕｓ）、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）又はアシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）を含む属の生物由来のエフェクタータンパク質（例えばＣｐｆ１）を含むエフェクタータンパク質（例えばＣｐｆ１）も提供する。
【００３８】
本発明はまた、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、Ｓ．エクイシミリス（Ｓ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、Ｓ．サングイニス（Ｓ．ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）；Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）、Ｃ．コリ（Ｃ．ｃｏｌｉ）；Ｎ．サルスギニス（Ｎ．ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ）、Ｎ．テルガルカス（Ｎ．ｔｅｒｇａｒｃｕｓ）；Ｓ．アウリクラリス（Ｓ．ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓ）、Ｓ．カルノスス（Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ）；Ｎ．メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）；リステリア菌（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、Ｌ．イバノビイ（Ｌ．ｉｖａｎｏｖｉｉ）；ボツリヌス菌（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、破傷風菌（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ）、Ｃ．ソルデリイ（Ｃ．ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ）由来の生物のエフェクタータンパク質（例えばＣｐｆ１）を含むエフェクタータンパク質（例えばＣｐｆ１）も提供する。
【００３９】
エフェクタータンパク質は、第１のエフェクタータンパク質（例えばＣｐｆ１）オルソログ由来の第１の断片と第２のエフェクター（例えばＣｐｆ１）タンパク質オルソログ由来の第２の断片とを含むキメラエフェクタータンパク質を含むことができ、ここで第１及び第２のエフェクタータンパク質オルソログは異なる。第１及び第２のエフェクタータンパク質（例えばＣｐｆ１）オルソログのうちの少なくとも一方は、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ニトラチフラクター属（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、パルビバクラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アゾスピリラム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、スフェロヘータ属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクター属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、パルディバクター属（Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）、クロストリジアリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｒｉｄｉｕｍ）、レプトトリキア属（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、アリシクロバチルス属（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノメチオフィラス属（Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｏｐｈｉｌｕｓ）、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、ヘルココッカス属（Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ）、レプトスピラ属（Ｌｅｔｏｓｐｉｒａ）、デスルホビブリオ属（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）、デスルホナトロヌム属（Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ）、オピツツス科（Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ）、ツベリバチルス属（Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバチルス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｕｓ）、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）又はアシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）を含む生物由来のエフェクタータンパク質（例えばＣｐｆ１）を含むことができ；例えば、第１の断片と第２の断片とを含むキメラエフェクタータンパク質であって、ここで第１及び第２の断片の各々は、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ニトラチフラクター属（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、パルビバクラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アゾスピリラム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、スフェロヘータ属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクター属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、パルディバクター属（Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）、クロストリジアリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｒｉｄｉｕｍ）、レプトトリキア属（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、アリシクロバチルス属（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノメチオフィラス属（Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｏｐｈｉｌｕｓ）、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、ヘルココッカス属（Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ）、レプトスピラ属（Ｌｅｔｏｓｐｉｒａ）、デスルホビブリオ属（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）、デスルホナトロヌム属（Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ）、オピツツス科（Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ）、ツベリバチルス属（Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバチルス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｕｓ）、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）又はアシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）を含む生物のＣｐｆ１から選択され、ここで第１及び第２の断片は同じ細菌由来でなく；例えば、第１の断片と第２の断片とを含むキメラエフェクタータンパク質であって、ここで第１及び第２の断片の各々は、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、Ｓ．エクイシミリス（Ｓ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、Ｓ．サングイニス（Ｓ．ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）；Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）、Ｃ．コリ（Ｃ．ｃｏｌｉ）；Ｎ．サルスギニス（Ｎ．ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ）、Ｎ．テルガルカス（Ｎ．ｔｅｒｇａｒｃｕｓ）；Ｓ．アウリクラリス（Ｓ．ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓ）、Ｓ．カルノスス（Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ）；Ｎ．メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）；リステリア菌（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、Ｌ．イバノビイ（Ｌ．ｉｖａｎｏｖｉｉ）；ボツリヌス菌（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、破傷風菌（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ）、Ｃ．ソルデリイ（Ｃ．ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ）；野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）１、プレボテラ・アルベンシス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ａｌｂｅｎｓｉｓ）、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＣ２０１７  １、ブチリビブリオ・プロテオクラスチカス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒ���ｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ）、ペレグリニバクテリア細菌（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、パルクバクテリア細菌（Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、スミセラ属種（Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ  ｓｐ．）ＳＣＡＤＣ、アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＡ２０２０、カンディダタス・メタノプラズマ・テルミツム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ  ｔｅｒｍｉｔｕｍ）、ユーバクテリウム・エリゲンス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ）、モラクセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ）２３７、レプトスピラ・イナダイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ）、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６、ポルフィロモナス・クレビオリカニス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ）３、プレボテラ・ディシエンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ）及びポルフィロモナス・マカカエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅ）のＣｐｆ１から選択され、ここで第１及び第２の断片は同じ細菌由来でない。
【００４０】
本発明の好ましい実施形態において、エフェクタータンパク質はＣｐｆ１遺伝子座に由来し（本明細書では、かかるエフェクタータンパク質は「Ｃｐｆ１ｐ」とも称される）、例えばＣｐｆ１タンパク質である（及びかかるエフェクタータンパク質又はＣｐｆ１タンパク質又はＣｐｆ１遺伝子座に由来するタンパク質は「ＣＲＩＳＰＲ酵素」とも称される）。Ｃｐｆ１遺伝子座には、限定はされないが、図６４に列挙される細菌種のＣｐｆ１遺伝子座が含まれる。より好ましい実施形態において、Ｃｐｆ１ｐは、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）１、プレボテラ・アルベンシス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ａｌｂｅｎｓｉｓ）、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＣ２０１７  １、ブチリビブリオ・プロテオクラスチカス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ）、ペレグリニバクテリア細菌（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、パルクバクテリア細菌（Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、スミセラ属種（Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ  ｓｐ．）ＳＣＡＤＣ、アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＡ２０２０、カンディダタス・メタノプラズマ・テルミツム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ  ｔｅｒｍｉｔｕｍ）、ユーバクテリウム・エリゲンス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ）、モラクセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ）２３７、レプトスピラ・イナダイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ）、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６、ポルフィロモナス・クレビオリカニス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ）３、プレボテラ・ディシエンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ）及びポルフィロモナス・マカカエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅ）から選択される細菌種に由来する。特定の実施形態において、Ｃｐｆ１ｐは、アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＡ２０２０から選択される細菌種に由来する。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質は、限定はされないが、野兎病菌亜種ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．Ｎｏｖｉｃｉｄａ）を含め、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）１の亜種に由来する。
【００４１】
本発明の更なる実施形態において、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）又はＰＡＭ様モチーフが目的の標的遺伝子座へのエフェクタータンパク質複合体の結合を導く。本発明の好ましい実施形態において、ＰＡＭは５’ＴＴＮであり［式中、ＮはＡ／Ｃ／Ｇ又はＴである］、及びエフェクタータンパク質はＦｎＣｐｆ１ｐである。本発明の別の好ましい実施形態において、ＰＡＭは５’ＴＴＴＶであり［式中、ＶはＡ／Ｃ又はＧである］、及びエフェクタータンパク質はＡｓＣｐｆ１、ＬｂＣｐｆ１又はＰａＣｐｆ１ｐである。特定の実施形態において、ＰＡＭは５’ＴＴＮであり［式中、ＮはＡ／Ｃ／Ｇ又はＴである］、エフェクタータンパク質はＦｎＣｐｆ１ｐであり、及びＰＡＭはプロトスペーサーの５’末端の上流に位置する。本発明の特定の実施形態において、ＰＡＭは５’ＣＴＡであり、ここでエフェクタータンパク質はＦｎＣｐｆ１ｐであり、及びＰＡＭはプロトスペーサー又は標的遺伝子座の５’末端の上流に位置する。好ましい実施形態において、本発明は、Ｃｐｆ１ファミリーのＴリッチなＰＡＭによってＡＴリッチゲノムのターゲティング及び編集が可能となるＲＮＡガイド下ゲノム編集ヌクレアーゼのターゲティング範囲の拡張をもたらす。
【００４２】
特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素はエンジニアリングされ、ヌクレアーゼ活性を低下又は消失させる１つ以上の突然変異を含むことができる。ＦｎＣｐｆ１ｐ  ＲｕｖＣドメインにおけるアミノ酸位置としては、限定はされないが、Ｄ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、Ｅ１０２８Ａ、Ｄ１２２７Ａ、Ｄ１２５５Ａ、Ｎ１２５７Ａ、Ｄ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、Ｅ１０２８Ａ、Ｄ１２２７Ａ、Ｄ１２５５Ａ及びＮ１２５７Ａが挙げられる。本出願人らはまた、ＰＤ−（Ｄ／Ｅ）ＸＫヌクレアーゼスーパーファミリー及びＨｉｎｃＩＩエンドヌクレアーゼ様に最も類似した推定上の第２のヌクレアーゼドメインも同定している。ヌクレアーゼ活性を実質的に低下させるためこの推定ヌクレアーゼドメインに生成される点突然変異としては、限定はされないが、Ｎ５８０Ａ、Ｎ５８４Ａ、Ｔ５８７Ａ、Ｗ６０９Ａ、Ｄ６１０Ａ、Ｋ６１３Ａ、Ｅ６１４Ａ、Ｄ６１６Ａ、Ｋ６２４Ａ、Ｄ６２５Ａ、Ｋ６２７Ａ及びＹ６２９Ａが挙げられる。好ましい実施形態において、ＦｎＣｐｆ１ｐ  ＲｕｖＣドメインの突然変異はＤ９１７Ａ又はＥ１００６Ａであり、ここでＤ９１７Ａ又はＥ１００６Ａ突然変異はＦｎＣｐｆ１エフェクタータンパク質のＤＮＡ切断活性を完全に不活性化する。別の実施形態において、ＦｎＣｐｆ１ｐ  ＲｕｖＣドメインの突然変異はＤ１２５５Ａであり、ここで突然変異型ＦｎＣｐｆ１エフェクタータンパク質は、核酸分解活性の有意な低下を有する。
【００４３】
ＡｓＣｐｆ１ｐ  ＲｕｖＣドメインにおけるアミノ酸位置としては、限定はされないが、９０８、９９３、及び１２６３が挙げられる。好ましい実施形態において、ＡｓＣｐｆ１ｐ  ＲｕｖＣドメインの突然変異は、Ｄ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ、及びＤ１２６３Ａであり、ここでＤ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ、及びＤ１２６３Ａ突然変異はＡｓＣｐｆ１エフェクタータンパク質のＤＮＡ切断活性を完全に不活性化する。ＬｂＣｐｆ１ｐ  ＲｕｖＣドメインにおけるアミノ酸位置としては、限定はされないが、８３２、９４７又は１１８０が挙げられる。好ましい実施形態において、ＬｂＣｐｆ１ｐ  ＲｕｖＣドメインの突然変異はＬｂＤ８３２Ａ、Ｅ９２５Ａ、Ｄ９４７Ａ又はＤ１１８０Ａであり、ここでＬｂＤ８３２Ａ、Ｅ９２５Ａ、Ｄ９４７Ａ又はＤ１１８０Ａ突然変異はＬｂＣｐｆ１エフェクタータンパク質のＤＮＡ切断活性を完全に不活性化する。
【００４４】
突然変異はまた、隣接残基、例えば、ヌクレアーゼ活性（ａｃｒｉｖｉｔｙ）に関与する上記に指示したものの近傍にあるアミノ酸にも作成することができる。一部の実施形態では、ＲｕｖＣドメインのみが不活性化され、及び他の実施形態では、別の推定ヌクレアーゼドメインが不活性化され、ここでエフェクタータンパク質複合体はニッカーゼとして機能して、一方のＤＮＡ鎖のみを切断する。好ましい実施形態において、他方の推定ヌクレアーゼドメインはＨｉｎｃＩＩ様エンドヌクレアーゼドメインである。一部の実施形態では、２つのＦｎＣｐｆ１、ＡｓＣｐｆ１又はＬｂＣｐｆ１変異体（各々異なるニッカーゼ）を用いて特異性を増加させ、２つのニッカーゼ変異体を用いて標的にあるＤＮＡを切断する（ここで両方のニッカーゼが、オフターゲット改変を最小限に抑え又はなくしつつＤＮＡ鎖を切断し、ここでは一方のＤＮＡ鎖のみが切断され、続いて修復される）。好ましい実施形態において、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質は、２つのＣｐｆ１エフェクタータンパク質分子を含むホモ二量体として目的の標的遺伝子座に関連する又はそこにある配列を切断する。好ましい実施形態において、ホモ二量体は、そのそれぞれのＲｕｖＣドメインに異なる突然変異を含む２つのＣｐｆ１エフェクタータンパク質分子を含み得る。
【００４５】
本発明は、２つ以上のニッカーゼを使用する方法、詳細にはデュアル又はダブルニッカーゼ手法を企図する。一部の態様及び実施形態において、シングルタイプのＦｎＣｐｆ１、ＡｓＣｐｆ１又はＬｂＣｐｆ１ニッカーゼ、例えば、本明細書に記載されるとおりの改変ＦｎＣｐｆ１、ＡｓＣｐｆ１又はＬｂＣｐｆ１又は改変ＦｎＣｐｆ１、ＡｓＣｐｆ１又はＬｂＣｐｆ１ニッカーゼが送達されてもよい。これにより、標的ＤＮＡに２つのＦｎＣｐｆ１ニッカーゼが結合することになる。加えて、異なるオルソログ、例えば、ＤＮＡの一方の鎖（例えばコード鎖）に対するＦｎＣｐｆ１、ＡｓＣｐｆ１又はＬｂＣｐｆ１ニッカーゼと非コード鎖又は反対側のＤＮＡ鎖に対するオルソログとを使用し得ることもまた想定される。オルソログは、限定はされないが、ＳａＣａｓ９ニッカーゼ又はＳｐＣａｓ９ニッカーゼなどのＣａｓ９ニッカーゼであってもよい。異なるＰＡＭを必要とし、また異なるガイド要件も有し得る、従って使用者のより高度な制御が可能となる２つの異なるオルソログを使用することが有利であり得る。特定の実施形態において、ＤＮＡ切断には、各タイプが標的ＤＮＡの異なる配列にガイドされる少なくとも４タイプのニッカーゼが関わることになり、ここでは各ペアが一方のＤＮＡ鎖に第１のニックを導入し、及び第２のペアが第２のＤＮＡ鎖にニックを導入する。かかる方法では、標的ＤＮＡに少なくとも２つの一本鎖切断ペアが導入され、ここで第１及び第２の一本鎖切断ペアが導入されると、第１及び第２の一本鎖切断ペアの間にある標的配列が切り出される。特定の実施形態において、オルソログの一方又は両方は制御可能、即ち誘導性である。
【００４６】
本発明の特定の実施形態において、ガイドＲＮＡ又は成熟ｃｒＲＮＡは、ダイレクトリピート配列及びガイド配列又はスペーサー配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。特定の実施形態において、ガイドＲＮＡ又は成熟ｃｒＲＮＡは、ガイド配列又はスペーサー配列に連結したダイレクトリピート配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。特定の実施形態において、ガイドＲＮＡ又は成熟ｃｒＲＮＡは１９ｎｔの部分的ダイレクトリピートと、続く２０〜３０ｎｔ、有利には約２０ｎｔ、２３〜２５ｎｔ又は２４ｎｔのガイド配列又はスペーサー配列を含む。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質はＦｎＣｐｆ１、ＡｓＣｐｆ１又はＬｂＣｐｆ１エフェクタータンパク質であり、検出可能なＤＮＡ切断を達成するのに少なくとも１６ｎｔのガイド配列を必要とし、及びインビトロで効率的なＤＮＡ切断を達成するのに最低でも１７ｎｔのガイド配列を必要とする。特定の実施形態において、ダイレクトリピート配列はガイド配列又はスペーサー配列の上流（即ち５’側）に位置する。好ましい実施形態において、ＦｎＣｐｆ１、ＡｓＣｐｆ１又はＬｂＣｐｆ１ガイドＲＮＡのシード配列（即ち、標的遺伝子座の配列の認識及び／又はそれとのハイブリダイゼーションに必須の重要な配列）は、ガイド配列又はスペーサー配列の５’末端上の最初の約５ｎｔ以内にある。
【００４７】
本発明の好ましい実施形態において、成熟ｃｒＲＮＡはステムループ又は最適化ステムループ構造又は最適化二次構造を含む。好ましい実施形態において、成熟ｃｒＲＮＡはダイレクトリピート配列中にステムループ又は最適化ステムループ構造を含み、ここでステムループ又は最適化ステムループ構造は切断活性に重要である。特定の実施形態において、成熟ｃｒＲＮＡは好ましくは単一のステムループを含む。特定の実施形態において、ダイレクトリピート配列は好ましくは単一のステムループを含む。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質複合体の切断活性は、ステムループＲＮＡ二重鎖構造に影響を及ぼす突然変異を導入することによって改変される。好ましい実施形態において、ステムループのＲＮＡ二重鎖を維持する突然変異が導入されてもよく、それによってエフェクタータンパク質複合体の切断活性が維持される。他の好ましい実施形態において、ステムループのＲＮＡ二重鎖構造を破壊する突然変異が導入されてもよく、それによってエフェクタータンパク質複合体の切断活性が完全に無効にされる。
【００４８】
本発明はまた、本明細書に記載される方法又は組成物のいずれかにおける真核生物又は真核細胞での発現にコドン最適化されたエフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド配列も提供する。本発明のある実施形態において、コドン最適化エフェクタータンパク質はＦｎＣｐｆ１ｐ、ＡｓＣｐｆ１又はＬｂＣｐｆ１であり、真核細胞又は生物、例えば、本明細書の他の部分で挙げるような細胞又は生物、例えば、限定なしに、酵母細胞、又は哺乳類細胞又は生物、例えば、マウス細胞、ラット細胞、及びヒト細胞又は非ヒト真核生物、例えば植物における作動性に関してコドン最適化される。
【００４９】
本発明の特定の実施形態において、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質をコードする核酸配列に少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）が付加される。好ましい実施形態において、少なくとも１つ以上のＣ末端又はＮ末端ＮＬＳが付加される（従ってＣｐｆ１エフェクタータンパク質をコードする１つ又は複数の核酸分子が１つ又は複数のＮＬＳのコーディングを含むことができ、そのため発現した産物には１つ又は複数のＮＬＳが付加又は接続されていることになる）。好ましい実施形態において、真核細胞、好ましくはヒト細胞における最適な発現及び核ターゲティングのため、Ｃ末端ＮＬＳが付加される。好ましい実施形態において、コドン最適化エフェクタータンパク質はＦｎＣｐｆ１ｐ、ＡｓＣｐｆ１又はＬｂＣｐｆ１であり、且つガイドＲＮＡのスペーサー長さは１５〜３５ｎｔである。特定の実施形態において、ガイドＲＮＡのスペーサー長さは、少なくとも１６ヌクレオチド、例えば少なくとも１７ヌクレオチドである。特定の実施形態において、スペーサー長さは１５〜１７ｎｔ、１７〜２０ｎｔ、２０〜２４ｎｔ、例えば、２０、２１、２２、２３、又は２４ｎｔ、２３〜２５ｎｔ、例えば、２３、２４、又は２５ｎｔ、２４〜２７ｎｔ、２７〜３０ｎｔ、３０〜３５ｎｔ、又は３５ｎｔ又はそれ以上である。本発明の特定の実施形態において、コドン最適化エフェクタータンパク質はＦｎＣｐｆ１ｐであり、且つガイドＲＮＡのダイレクトリピート長さは少なくとも１６ヌクレオチドである。特定の実施形態において、コドン最適化エフェクタータンパク質はＦｎＣｐｆ１ｐであり、且つガイドＲＮＡのダイレクトリピート長さは１６〜２０ｎｔ、例えば、１６、１７、１８、１９、又は２０ヌクレオチドである。特定の好ましい実施形態において、ガイドＲＮＡのダイレクトリピート長さは１９ヌクレオチドである。
【００５０】
本発明はまた、複数の核酸成分を送達する方法も包含し、ここで各核酸成分は異なる目的の標的遺伝子座に特異的であり、それにより複数の目的の標的遺伝子座を改変する。複合体の核酸成分は１つ以上のタンパク質結合ＲＮＡアプタマーを含み得る。１つ以上のアプタマーはバクテリオファージコートタンパク質との結合能を有し得る。バクテリオファージコートタンパク質は、Ｑβ、Ｆ２、ＧＡ、ｆｒ、ＪＰ５０１、ＭＳ２、Ｍ１２、Ｒ１７、ＢＺ１３、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、ＭＸ１、ＴＷ１８、ＶＫ、ＳＰ、ＦＩ、ＩＤ２、ＮＬ９５、ＴＷ１９、ＡＰ２０５、φＣｂ５、φＣｂ８ｒ、φＣｂ１２ｒ、φＣｂ２３ｒ、７ｓ及びＰＲＲ１を含む群から選択され得る。好ましい実施形態において、バクテリオファージコートタンパク質はＭＳ２である。本発明はまた、３０以上、４０以上又は５０以上のヌクレオチド長である複合体の核酸成分も提供する。
【００５１】
本発明はまた、細胞、構成成分及び／又は系に微量のカチオンが存在する本発明の細胞、構成成分及び／又は系も包含する。有利には、カチオンはマグネシウム、例えばＭｇ２＋である。カチオンは微量で存在し得る。好ましい範囲は約１ｍＭ〜約１５ｍＭのカチオンであることができ、これは有利にはＭｇ２＋である。好ましい濃度は、ヒトベースの細胞、構成成分及び／又は系について約１ｍＭ、及び細菌ベースの細胞、構成成分及び／又は系について約１０ｍＭ〜約１５ｍＭであり得る。例えば、Ｇａｓｉｕｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ４，２０１２，ｗｗｗ．ｐｎａｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｄｏｉ／１０．１０７３／ｐｎａｓ．１２０８５０７１０９を参照のこと。
【００５２】
従って、本発明の目的は、本出願人らが権利を留保し、且つ任意の以前に公知の製品、プロセス、又は方法のディスクレーマー（ｄｉｓｃｌａｉｍｅｒ）を本明細書によって開示するような以前に公知のいかなる製品、製品の作製プロセス、又は製品の使用方法も本発明の範囲内に包含しないことである。更に、本発明は、本出願人らが権利を留保し、且つ任意の以前に記載された製品、製品の作製プロセス、又は製品の使用方法のディスクレーマー（ｄｉｓｃｌａｉｍｅｒ）を本明細書によって開示するような、米国特許商標庁（ＵＳＰＴＯ）（米国特許法第１１２条第一段落）又は欧州特許庁（ＥＰＯ）（ＥＰＣ第８３条）の明細書の記載及び実施可能要件を満たさないいかなる製品、製品の作製プロセス、又は製品の使用方法も本発明の範囲内に包含しないよう意図されることが注記される。本発明の実施においては、第５３条（ｃ）ＥＰＣ及び規則２８（ｂ）及び（ｃ）ＥＰＣに準拠することが有利であり得る。本明細書におけるいかなる事項も、見込み（ｐｒｏｍｉｓｅ）であると解釈されてはならない。
【００５３】
この開示及び特に特許請求の範囲及び／又は段落において、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「〜を含んだ（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「〜を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの用語は、米国特許法にあるそれに帰される意味を有し得る；例えば、これらは「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「〜を含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「〜を含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得ること；及び「〜から本質的になっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」及び「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」などの用語が米国特許法にあるそれらに帰される意味を有することが注記される。
【００５４】
上記及び他の実施形態が開示され、又は以下の詳細な説明から明らかで、それに包含される。
【００５５】
本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に示される。本発明の原理が利用される例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明、及びその添付の図面を参照することにより、本発明の特徴及び利点の更なる理解が得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１Ａ〜図１ＢはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の新規分類を示す。クラス２はマルチサブユニットｃｒＲＮＡ−エフェクター複合体（Ｃａｓｃａｄｅ）を含み、及びクラス２はシングルサブユニットｃｒＲＮＡ−エフェクター複合体（Ｃａｓ９様）を含む。
【図２】図２は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓの分子構成を提供する。
【図３】図３Ａ〜図３Ｄは、Ｉ型及びＩＩＩ型エフェクター複合体の構造を提供する：広範な配列多様性にも関わらず共通のアーキテクチャ／共通の祖先。
【図４】図４は、ＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）中心システムとしてのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓを示す。
【図５】図５Ａ〜図５ＤはＣａｓ１系統発生を示し、ここではアダプテーション及びｃｒＲＮＡ−エフェクターモジュールの組換えがＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ進化の主要な側面を示す。
【図６】図６は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓセンサス、特に古細菌及び細菌間におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタイプ／サブタイプの分布を示す。
【図７】図７は、Ｃａｓ候補を同定するためのパイプラインを示す。
【図８】図８Ａ〜図８Ｄは、クラス２系の完全な遺伝子座の構成を示す。
【図９】図９Ａ〜図９Ｂは、Ｃ２ｃ１近隣（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ）を示す。
【図１０】図１０Ａ〜図１０Ｃは、Ｃａｓ１ツリーを示す。
【図１１】図１１Ａ〜図１１Ｂは、クラス２ファミリーのドメイン構成を示す。
【図１２】図１２Ａ〜図１２Ｂは、クラス２タンパク質のＴｎｐＢ相同性領域を示す（それぞれ掲載順に、配列番号２４６〜４２８）。
【図１３】図１３Ａ〜図１３Ｂは、Ｃ２ｃ２近隣を示す。
【図１４】図１４Ａ〜図１４Ｅは、Ｃ２ｃ２ファミリーのＨＥＰＮ  ＲｘｘｘｘＨモチーフを示す（それぞれ掲載順に、配列番号４２９〜１０３２）。
【図１５】図１５は、Ｃ２Ｃ１：１．アリシクロバチルス・アシドテッレストリス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）ＡＴＣＣ  ４９０２５を示す（それぞれ掲載順に、配列番号１０３４〜１０３７）。
【図１６】図１６は、Ｃ２Ｃ１：４．デスルホナトロヌム・チオディスミュタンス（Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ  ｔｈｉｏｄｉｓｍｕｔａｎｓ）株ＭＬＦ−１を示す（それぞれ掲載順に、配列番号１０３８〜１０４１）。
【図１７】図１７は、Ｃ２Ｃ１：５．オピツツス科細菌（Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＴＡＶ５を示す（それぞれ掲載順に、配列番号１０４２〜１０４５）。
【図１８】図１８は、Ｃ２Ｃ１：７．バチルス・サーモアミロボランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｖｏｒａｎｓ）株Ｂ４１６６を示す（それぞれ掲載順に、配列番号１０４６〜１０４９）。
【図１９】図１９は、Ｃ２Ｃ１：９．バチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＳＰ２．１を示す（それぞれ掲載順に、配列番号１０５０〜１０５３）。
【図２０】図２０は、Ｃ２Ｃ２：１．ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＡ２０２０を示す（それぞれ掲載順に、配列番号１０５４〜１０５７）。
【図２１】図２１は、Ｃ２Ｃ２：２．ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＫ４Ａ１７９を示す（それぞれ掲載順に、配列番号１０５８〜１０６４）。
【図２２】図２２は、Ｃ２Ｃ２：３．［クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）］アミノフィルム（ａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）ＤＳＭ  １０７１０を示す（それぞれ掲載順に、配列番号１０６５〜１０６８）。
【図２３】図２３は、Ｃ２Ｃ２：４．ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＫ４Ａ１４４を示す（それぞれ掲載順に、配列番号１０６９及び１０７０）。
【図２４】図２４は、Ｃ２Ｃ２：５．カルノバクテリウム・ガリナルム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＤＳＭ  ４８４７を示す（それぞれ掲載順に、配列番号１０７１〜１０７４）。
【図２５】図２５は、Ｃ２Ｃ２：６．カルノバクテリウム・ガリナルム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＤＳＭ  ４８４７を示す（それぞれ掲載順に、配列番号１０７５〜１０８１）。
【図２６】図２６は、Ｃ２Ｃ２：７．パルディバクター・プロピオニシゲネス（Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｇｅｎｅｓ）ＷＢ４を示す（配列番号１０８２）。
【図２７】図２７は、Ｃ２Ｃ２：８．リステリア・シーリゲリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ）血清型１／２ｂを示す（それぞれ掲載順に、配列番号１０８３〜１０８６）。
【図２８】図２８は、Ｃ２Ｃ２：９．リステリア・ウェイヘンステファネンシス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ）ＦＳＬ  Ｒ９−０３１７を示す（配列番号１０８７）。
【図２９】図２９は、Ｃ２Ｃ２：１０．リステリア属細菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＦＳＬ  Ｍ６−０６３５を示す（それぞれ掲載順に、配列番号１０８８及び１０９１）。
【図３０】図３０は、Ｃ２Ｃ２：１１．レプトトリキア・ワデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｗａｄｅｉ）Ｆ０２７９を示す（配列番号１０９２）。
【図３１】図３１は、Ｃ２Ｃ２：１２．レプトトリキア・ワデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｗａｄｅｉ）Ｆ０２７９を示す（それぞれ掲載順に、配列番号１０９３〜１０９９）。
【図３２】図３２は、Ｃ２Ｃ２：１４．レプトトリキア・シャヒイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｈａｈｉｉ）ＤＳＭ  １９７５７を示す（それぞれ掲載順に、配列番号１１００〜１１０３）。
【図３３】図３３は、Ｃ２Ｃ２：１５．ロドバクター・カプスラータス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）ＳＢ  １００３を示す（それぞれ掲載順に、配列番号１１０４及び１１０５）。
【図３４】図３４は、Ｃ２Ｃ２：１６．ロドバクター・カプスラータス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）Ｒ１２１を示す（それぞれ掲載順に、配列番号１１０６及び１１０７）。
【図３５】図３５は、Ｃ２Ｃ２：１７．ロドバクター・カプスラータス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）ＤＥ４４２を示す（それぞれ掲載順に、配列番号１１０８及び１１０９）。
【図３６】図３６は、ＤＲのツリーを示す。
【図３７】図３７は、Ｃ２Ｃ２のツリーを示す。
【図３８】図３８Ａ〜図３８ＢＢは、Ｃａｓ−Ｃｐｆ１オルソログの配列アラインメントを示す（それぞれ掲載順に、配列番号１０３３及び１１１０〜１１６６）。
【図３９】図３９Ａ〜図３９Ｂは、Ｃｐｆ１遺伝子座アラインメントの概要を示す。
【図４０】図４０Ａ〜図４０Ｘは、ＰＡＣＹＣ１８４  ＦｎＣｐｆ１（ＰＹ００１）ベクター構築物（ｃｏｎｔｒｕｃｔ）を示す（それぞれ掲載順に、配列番号１１６７及び配列番号１１６８〜１１８９）。
【図４１】図４１Ａ〜図４１Ｉは、配列番号１１９０のとおりのヌクレオチド配列及び配列番号１１９１のとおりのタンパク質配列を有するヒト化ＰａＣｐｆ１の配列を示す。
【図４２】図４２は、ＰＡＭチャレンジアッセイを示す。
【図４３】図４３は、内因性ＦｎＣｐｆ１遺伝子座の概略図を示す。ｐＹ０００１は、部分的ＦｎＣｐｆ１遺伝子座を有するｐＡＣＹ１８４骨格（ＮＥＢ由来）である。ギブソンアセンブリを用いてＦｎＣｐｆ１遺伝子座を３ピースでＰＣＲ増幅し、Ｘｂａ１及びＨｉｎｄ３切断ｐＡＣＹＣ１８４にクローニングした。ｐＹ０００１は、アセチルトランスフェラーゼ３’配列の２５５ｂｐから第４のスペーサー配列までの内因性ＦｎＣｐｆ１遺伝子座を含んだ。スペーサー（ｓｐａｃｅ）４はもはやダイレクトリピートが隣接しないため、スペーサー１〜３のみが活性である可能性がある。
【図４４】図４４はＰＡＭライブラリを示し、それぞれ掲載順に、配列番号１１９２〜１１９５を開示する。両方のＰＡＭライブラリ（左及び右）がｐＵＣ１９にある。左ＰＡＭライブラリの複雑性は４８〜６５ｋであり、右ＰＡＭライブラリの複雑性は４７〜１６ｋである。両方のライブラリとも、＞５００の表現で調製した。
【図４５】図４５Ａ〜図４Ｅは、ＦｎＣｐｆ１  ＰＡＭスクリーンコンピュータ分析を示す。スクリーンＤＮＡをシーケンシングした後、左ＰＡＭ又は右ＰＡＭのいずれかに対応する領域を抽出した。各試料について、シーケンシングしたライブラリに存在するＰＡＭの数を、ライブラリ中の期待されるＰＡＭの数（左ライブラリについて４＾８、右について４＾７）と比較した。図４４Ａは、左ライブラリがＰＡＭ枯渇を示したことを示す。この枯渇を定量化するため、エンリッチメント比を計算した。両方の条件とも（対照ｐＡＣＹＣ又はＦｎＣｐｆ１を含有するｐＡＣＹＣ）、ライブラリ中の各ＰＡＭについて以下のとおり比を計算した
【数１】
0006898865.tif 000002
分布をプロットすると、対照試料はほとんどエンリッチメントを示さず、ｂｉｏｒｅｐは両方ともエンリッチメントを示す。図４４Ｂ〜図４４ＤはＰＡＭ比分布を示す。図４４Ｅは、比が８を上回るＰＡＭを収集し、度数分布をプロットしたところ、５’ＹＹＮ  ＰＡＭが明らかになったことを示す。
【図４６】図４６は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座が活性に発現することを示すフランシセラ・トレランセス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅｓ）Ｃｐｆ１遺伝子座のＲＮＡｓｅｑ分析を示す。Ｃｐｆ１及びＣａｓ遺伝子に加えて、２つの小さい非コード転写物が高度に転写され、これは推定ｔｒａｃｒＲＮＡである可能性がある。ＣＲＩＳＰＲアレイもまた発現する。推定ｔｒａｃｒＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲアレイは両方ともに、Ｃｐｆ１及びＣａｓ遺伝子と同じ方向に転写される。ここで、ＲＮＡｓｅｑ実験で同定された全てのＲＮＡ転写物が遺伝子座に対してマッピングされる。ＦｎＣｐｆ１遺伝子座を更に評価した後、本出願人らは、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質複合体による標的ＤＮＡ切断にｔｒａｃｒＲＮＡは必要ないと結論付けた。本出願人らは、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質及びｃｒＲＮＡ（ダイレクトリピート配列とガイド配列とを含むガイドＲＮＡ）のみを含むＣｐｆ１エフェクタータンパク質複合体が標的ＤＮＡを切断するのに十分であったことを決定した。
【図４７】図４７は、Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲアレイの拡大表示を示す。多くの異なる短い転写物を同定することができる。このプロットでは、同定された全てのＲＮＡ転写物がＣｐｆ１遺伝子座に対してマッピングされる。
【図４８】図４８は、８５ヌクレオチド長未満の転写物を選択した後の２つの推定ｔｒａｃｒＲＮＡの同定を示す。
【図４９】図４９は、推定ｔｒａｃｒＲＮＡ１（配列番号１１９６）の拡大表示及びＣＲＩＳＰＲアレイを示す。
【図５０】図５０は、それぞれ掲載順に、配列番号１１９７〜１２０３を開示する推定ｔｒａｃｒＲＮＡ２の拡大表示を示す。
【図５１】図５１は、推定ｃｒＲＮＡ配列を示す（リピートは青色、スペーサーは黒色）（それぞれ掲載順に、配列番号１２０５及び１２０６）。
【図５２】図５２は、インビボで予想ＦｎＣｐｆ１  ＰＡＭを確認するアッセイの概略図を示す。
【図５３】図５３は、５’ＴＴＮ  ＰＡＭを有する内因性スペーサー１をコードするｐＵＣ１９で形質転換したＦｎＣｐｆ１遺伝子座を有する細胞及び対照細胞を示す。
【図５４】図５４は、ＦｎＣｐｆ１遺伝子座における推定ｔｒａｃｒＲＮＡ配列位置を指示する概略図、ｃｒＲＮＡ（配列番号１２０７）及びｐＵＣプロトスペーサーベクターを示す。
【図５５】図５５は、細胞ライセート中でインキュベートしたＴＴａ  ＰＡＭ及びプロトスペーサー１配列を含むＰＣＲ断片を示すゲルである。
【図５６】図５６は、細胞ライセート中でインキュベートした種々のＰＡＭを有するｐＵＣ−スペーサー１を示すゲルである。
【図５７】図５７は、細胞ライセート中でインキュベートした後のＢａｓＩ消化を示すゲルである。
【図５８】図５８は、３つの推定ｃｒＲＮＡ配列（配列番号１２０８）の消化結果を示すゲルである。
【図５９】図５９は、標的部位を含有する標的ＤＮＡ片：５’−ＴＴＡｇａｇａａｇｔｃａｔｔｔａａｔａａｇｇｃｃａｃｔｇｔｔａａａａ−３’（配列番号１２０９）に対する種々の長さのスペーサーの試験を示すゲルである。結果は、ｃｒＲＮＡ１〜７がＦｎＣｐｆ１による標的ＤＮＡのインビトロ切断の媒介に成功したことを示している。ｃｒＲＮＡ８〜１３は標的ＤＮＡの切断を促進しなかった。それぞれ掲載順に配列番号１２１０〜１２４８を開示する。
【図６０】図６０は、最小限のＦｎＣｐｆ１遺伝子座を示す概略図である。
【図６１】図６１は、最小限のＣｐｆ１ガイド（配列番号１２４９）を示す概略図である。
【図６２】図６２Ａ〜図６２ＥはＰａＣｐｆ１  ＰＡＭスクリーンコンピュータ分析を示す。スクリーンＤＮＡをシーケンシングした後、左ＰＡＭ又は右ＰＡＭのいずれかに対応する領域を抽出した。各試料について、シーケンシングしたライブラリに存在するＰＡＭの数を、ライブラリ中の期待されるＰＡＭの数（４＾７）と比較した。（図６２Ａ）左ライブラリはごく僅かなＰＡＭ枯渇を示した。この枯渇を定量化するため、エンリッチメント比を計算した。両方の条件とも（対照ｐＡＣＹＣ又はＰａＣｐｆ１を含有するｐＡＣＹＣ）、ライブラリ中の各ＰＡＭについて以下のとおり比を計算した
【数２】
0006898865.tif 000003
分布をプロットすると、対照試料はほとんどエンリッチメントを示さず、ｂｉｏｒｅｐは両方ともエンリッチメントを示す。図６２Ｂ〜図６２ＤはＰＡＭ比分布を示す。図６２Ｅは、比が４．５を上回る全てのＰＡＭを収集し、度数分布をプロットしたところ、５’ＴＴＴＶ  ＰＡＭ［式中、ＶはＡ又はＣ又はＧである］が明らかになったことを示す。
【図６３】図６３は、ＣＢｈ−ＮＬＳ−ｈｕＰａＣｐｆ１−ＮＬＳ−３ｘＨＡ−ｐＡと表されるヒトコドン最適化ＰａＣｐｆ１配列のベクターマップを示す。
【図６４】図６４Ａ〜図６４Ｂは、種々の細菌における５１個のＣｐｆ１遺伝子座の系統樹を示す。強調表示した囲み枠は、遺伝子参照番号１〜１７を示す。枠で囲んだ／番号を付したオルソログは予想成熟ｃｒＲＮＡを伴いインビトロ切断活性に関して試験した；番号を枠で囲んだオルソログはこのインビトロアッセイで活性を示したものである。
【図６５】図６５Ａ〜図６５Ｈは、３８４９ｎｔの遺伝子長さを有するラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＣ２０１７  １  Ｃｐｆ１（図６４の参照番号３）のヒトコドン最適化配列の詳細を示す。図６５Ａ：コドン適合指数（ＣＡＩ）。遺伝子配列の長さに沿ったコドン使用頻度の分布。高い遺伝子発現レベルという点で見たとき、１．０のＣＡＩは所望の発現生物において完璧であると考えられ、及び＞０．８のＣＡＩは良好と見なされる。図６５Ｂ：最適コドン使用頻度（ＦＯＰ）。計算されたコドンクオリティ群におけるパーセンテージコドン分布。所望の発現生物における所与のアミノ酸についての最も高い使用頻度のコドンを１００の値に設定する。図６５Ｃ：ＧＣ含量調整。ＧＣ含量の理想的なパーセンテージ範囲は３０〜７０％である。６０ｂｐウィンドウにおける％ＧＣ含量のピークは除去している。図６５Ｄ：制限酵素及びシス作用性エレメント。図６５Ｅ：リピート配列を除去する。図６５Ｆ〜図６５Ｇ：最適化配列（最適化配列長さ：３８４９、ＧＣ％５４．７０）（配列番号１２５０）。図６５Ｈ：タンパク質配列（配列番号１２５１）。
【図６６】図６６Ａ〜図６６Ｈは、３８７３ｎｔの遺伝子長さを有するブチリビブリオ・プロテオクラスチカス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ）Ｃｐｆ１（図６４の参照番号４）のヒトコドン最適化配列の詳細を示す。図６６Ａ：コドン適合指数（ＣＡＩ）。遺伝子配列の長さに沿ったコドン使用頻度の分布。高い遺伝子発現レベルという点で見たとき、１．０のＣＡＩは所望の発現生物において完璧であると考えられ、及び＞０．８のＣＡＩは良好と見なされる。図６６Ｂ：最適コドン使用頻度（ＦＯＰ）。計算されたコドンクオリティ群におけるパーセンテージコドン分布。所望の発現生物における所与のアミノ酸についての最も高い使用頻度のコドンを１００の値に設定する。図６６Ｃ：ＧＣ含量調整。ＧＣ含量の理想的なパーセンテージ範囲は３０〜７０％である。６０ｂｐウィンドウにおける％ＧＣ含量のピークは除去している。図６６Ｄ：制限酵素及びシス作用性エレメント。図６６Ｅ：リピート配列を除去する。図６６Ｆ〜図６６Ｇ：最適化配列（最適化配列長さ：３８７３、ＧＣ％５４．０５）（配列番号１２５２）。図６６Ｈ：タンパク質配列（配列番号１２５３）。
【図６７】図６７Ａ〜図６７Ｈは、４５８１ｎｔの遺伝子長さを有するペレグリニバクテリア細菌（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０  Ｃｐｆ１（図６４の参照番号５）のヒトコドン最適化配列の詳細を示す。図６７Ａ：コドン適合指数（ＣＡＩ）。遺伝子配列の長さに沿ったコドン使用頻度の分布。高い遺伝子発現レベルという点で見たとき、１．０のＣＡＩは所望の発現生物において完璧であると考えられ、及び＞０．８のＣＡＩは良好と見なされる。図６７Ｂ：最適コドン使用頻度（ＦＯＰ）。計算されたコドンクオリティ群におけるパーセンテージコドン分布。所望の発現生物における所与のアミノ酸についての最も高い使用頻度のコドンを１００の値に設定する。図６７Ｃ：ＧＣ含量調整。ＧＣ含量の理想的なパーセンテージ範囲は３０〜７０％である。６０ｂｐウィンドウにおける％ＧＣ含量のピークは除去している。図６７Ｄ：制限酵素及びシス作用性エレメント。図６７Ｅ：リピート配列を除去する。図６７Ｆ〜図６７Ｇ：最適化配列（最適化配列長さ：４５８１、ＧＣ％５０．８１）（配列番号１２５４）。図６７Ｈ：タンパク質配列（配列番号１２５５）。
【図６８】図６８Ａ〜図６８Ｈは、４２０６ｎｔの遺伝子長さを有するパルクバクテリア細菌（Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７  Ｃｐｆ１（図６４の参照番号６）のヒトコドン最適化配列の詳細を示す。図６８Ａ：コドン適合指数（ＣＡＩ）。遺伝子配列の長さに沿ったコドン使用頻度の分布。高い遺伝子発現レベルという点で見たとき、１．０のＣＡＩは所望の発現生物において完璧であると考えられ、及び＞０．８のＣＡＩは良好と見なされる。図６８Ｂ：最適コドン使用頻度（ＦＯＰ）。計算されたコドンクオリティ群におけるパーセンテージコドン分布。所望の発現生物における所与のアミノ酸についての最も高い使用頻度のコドンを１００の値に設定する。図６８Ｃ：ＧＣ含量調整。ＧＣ含量の理想的なパーセンテージ範囲は３０〜７０％である。６０ｂｐウィンドウにおける％ＧＣ含量のピークは除去している。図６８Ｄ：制限酵素及びシス作用性エレメント。図６８Ｅ：リピート配列を除去する。図６８Ｆ〜図６８Ｇ：最適化配列（最適化配列長さ：４２０６、ＧＣ％５２．１７）（配列番号１２５６）。図６８Ｈ：タンパク質配列（配列番号１２５７）。
【図６９】図６９Ａ〜図６９Ｈは、３９００ｎｔの遺伝子長さを有するスミセラ属種（Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ  ｓｐ．）ＳＣＡＤＣ  Ｃｐｆ１（図６４の参照番号７）のヒトコドン最適化配列の詳細を示す。図６９Ａ：コドン適合指数（ＣＡＩ）。遺伝子配列の長さに沿ったコドン使用頻度の分布。高い遺伝子発現レベルという点で見たとき、１．０のＣＡＩは所望の発現生物において完璧であると考えられ、及び＞０．８のＣＡＩは良好と見なされる。図６９Ｂ：最適コドン使用頻度（ＦＯＰ）。計算されたコドンクオリティ群におけるパーセンテージコドン分布。所望の発現生物における所与のアミノ酸についての最も高い使用頻度のコドンを１００の値に設定する。図６９Ｃ：ＧＣ含量調整。ＧＣ含量の理想的なパーセンテージ範囲は３０〜７０％である。６０ｂｐウィンドウにおける％ＧＣ含量のピークは除去している。図６９Ｄ：制限酵素及びシス作用性エレメント。図６９Ｅ：リピート配列を除去する。図６９Ｆ〜図６９Ｇ：最適化配列（最適化配列長さ：３９００、ＧＣ％５１．５６）（配列番号１２５８）。図６９Ｈ：タンパク質配列（配列番号１２５９）。
【図７０】図７０Ａ〜図７０Ｈは、４０７１ｎｔの遺伝子長さを有するアシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６  Ｃｐｆ１（図６４の参照番号８）のヒトコドン最適化配列の詳細を示す。図７０Ａ：コドン適合指数（ＣＡＩ）。遺伝子配列の長さに沿ったコドン使用頻度の分布。高い遺伝子発現レベルという点で見たとき、１．０のＣＡＩは所望の発現生物において完璧であると考えられ、及び＞０．８のＣＡＩは良好と見なされる。図７０Ｂ：最適コドン使用頻度（ＦＯＰ）。計算されたコドンクオリティ群におけるパーセンテージコドン分布。所望の発現生物における所与のアミノ酸についての最も高い使用頻度のコドンを１００の値に設定する。図７０Ｃ：ＧＣ含量調整。ＧＣ含量の理想的なパーセンテージ範囲は３０〜７０％である。６０ｂｐウィンドウにおける％ＧＣ含量のピークは除去している。図７０Ｄ：制限酵素及びシス作用性エレメント。図７０Ｅ：リピート配列を除去する。図７０Ｆ〜図７０Ｇ：最適化配列（最適化配列長さ：４０７１、ＧＣ％５４．８９）（配列番号１２６０）。図７０Ｈ：タンパク質配列（配列番号１２６１）。
【図７１】図７１Ａ〜図７１Ｈは、３７６８ｎｔの遺伝子長さを有するラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＡ２０２０  Ｃｐｆ１（図６４の参照番号９）のヒトコドン最適化配列の詳細を示す。図７１Ａ：コドン適合指数（ＣＡＩ）。遺伝子配列の長さに沿ったコドン使用頻度の分布。高い遺伝子発現レベルという点で見たとき、１．０のＣＡＩは所望の発現生物において完璧であると考えられ、及び＞０．８のＣＡＩは良好と見なされる。図７１Ｂ：最適コドン使用頻度（ＦＯＰ）。計算されたコドンクオリティ群におけるパーセンテージコドン分布。所望の発現生物における所与のアミノ酸についての最も高い使用頻度のコドンを１００の値に設定する。図７１Ｃ：ＧＣ含量調整。ＧＣ含量の理想的なパーセンテージ範囲は３０〜７０％である。６０ｂｐウィンドウにおける％ＧＣ含量のピークは除去している。図７１Ｄ：制限酵素及びシス作用性エレメント。図７１Ｅ：リピート配列を除去する。図７１Ｆ〜図７１Ｇ：最適化配列（最適化配列長さ：３７６８、ＧＣ％５１．５３）（配列番号１２６２）。図７１Ｈ：タンパク質配列（配列番号１２６３）。
【図７２】図７２Ａ〜図７２Ｈは、３８６４ｎｔの遺伝子長さを有するカンディダタス・メタノプラズマ・テルミツム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ  ｔｅｒｍｉｔｕｍ）Ｃｐｆ１（図６４の参照番号１０）のヒトコドン最適化配列の詳細を示す。図７２Ａ：コドン適合指数（ＣＡＩ）。遺伝子配列の長さに沿ったコドン使用頻度の分布。高い遺伝子発現レベルという点で見たとき、１．０のＣＡＩは所望の発現生物において完璧であると考えられ、及び＞０．８のＣＡＩは良好と見なされる。図７２Ｂ：最適コドン使用頻度（ＦＯＰ）。計算されたコドンクオリティ群におけるパーセンテージコドン分布。所望の発現生物における所与のアミノ酸についての最も高い使用頻度のコドンを１００の値に設定する。図７２Ｃ：ＧＣ含量調整。ＧＣ含量の理想的なパーセンテージ範囲は３０〜７０％である。６０ｂｐウィンドウにおける％ＧＣ含量のピークは除去している。図７２Ｄ：制限酵素及びシス作用性エレメント。図７２Ｅ：リピート配列を除去する。図７２Ｆ〜図７２Ｇ：最適化配列（最適化配列長さ：３８６４、ＧＣ％５２．６７）（配列番号１２６４）。図７２Ｈ：タンパク質配列（配列番号１２６５）。
【図７３】図７３Ａ〜図７３Ｈは、３９９６ｎｔの遺伝子長さを有するユーバクテリウム・エリゲンス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ）Ｃｐｆ１（図６４の参照番号１１）のヒトコドン最適化配列の詳細を示す。図７３Ａ：コドン適合指数（ＣＡＩ）。遺伝子配列の長さに沿ったコドン使用頻度の分布。高い遺伝子発現レベルという点で見たとき、１．０のＣＡＩは所望の発現生物において完璧であると考えられ、及び＞０．８のＣＡＩは良好と見なされる。図７３Ｂ：最適コドン使用頻度（ＦＯＰ）。計算されたコドンクオリティ群におけるパーセンテージコドン分布。所望の発現生物における所与のアミノ酸についての最も高い使用頻度のコドンを１００の値に設定する。図７３Ｃ：ＧＣ含量調整。ＧＣ含量の理想的なパーセンテージ範囲は３０〜７０％である。６０ｂｐウィンドウにおける％ＧＣ含量のピークは除去している。図７３Ｄ：制限酵素及びシス作用性エレメント。図７３Ｅ：リピート配列を除去する。図７３Ｆ〜図７３Ｇ：最適化配列（最適化配列長さ：３９９６、ＧＣ％５０．５２）（配列番号１２６６）。図７３Ｈ：タンパク質配列（配列番号１２６７）。
【図７４】図７４Ａ〜図７４Ｈは、４２６９ｎｔの遺伝子長さを有するモラクセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ）２３７  Ｃｐｆ１（図６４の参照番号１２）のヒトコドン最適化配列の詳細を示す。図７４Ａ：コドン適合指数（ＣＡＩ）。遺伝子配列の長さに沿ったコドン使用頻度の分布。高い遺伝子発現レベルという点で見たとき、１．０のＣＡＩは所望の発現生物において完璧であると考えられ、及び＞０．８のＣＡＩは良好と見なされる。図７４Ｂ：最適コドン使用頻度（ＦＯＰ）。計算されたコドンクオリティ群におけるパーセンテージコドン分布。所望の発現生物における所与のアミノ酸についての最も高い使用頻度のコドンを１００の値に設定する。図７４Ｃ：ＧＣ含量調整。ＧＣ含量の理想的なパーセンテージ範囲は３０〜７０％である。６０ｂｐウィンドウにおける％ＧＣ含量のピークは除去している。図７４Ｄ：制限酵素及びシス作用性エレメント。図７４Ｅ：リピート配列を除去する。図７４Ｆ〜図７４Ｇ：最適化配列（最適化配列長さ：４２６９、ＧＣ％５３．５８）（配列番号１２６８）。図７４Ｈ：タンパク質配列（配列番号１２６９）。
【図７５】図７５Ａ〜図７５Ｈは、３９３９ｎｔの遺伝子長さを有するレプトスピラ・イナダイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ）Ｃｐｆ１（図６４の参照番号１３）のヒトコドン最適化配列の詳細を示す。図７５Ａ：コドン適合指数（ＣＡＩ）。遺伝子配列の長さに沿ったコドン使用頻度の分布。高い遺伝子発現レベルという点で見たとき、１．０のＣＡＩは所望の発現生物において完璧であると考えられ、及び＞０．８のＣＡＩは良好と見なされる。図７５Ｂ：最適コドン使用頻度（ＦＯＰ）。計算されたコドンクオリティ群におけるパーセンテージコドン分布。所望の発現生物における所与のアミノ酸についての最も高い使用頻度のコドンを１００の値に設定する。図７５Ｃ：ＧＣ含量調整。ＧＣ含量の理想的なパーセンテージ範囲は３０〜７０％である。６０ｂｐウィンドウにおける％ＧＣ含量のピークは除去している。図７５Ｄ：制限酵素及びシス作用性エレメント。図７５Ｅ：リピート配列を除去する。図７５Ｆ〜図７５Ｇ：最適化配列（最適化配列長さ：３９３９、ＧＣ％５１．３０）（配列番号１２７０）。図７５Ｈ：タンパク質配列（配列番号１２７１）。
【図７６】図７６Ａ〜図７６Ｈは、３８３４ｎｔの遺伝子長さを有するラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６  Ｃｐｆ１（図６４の参照番号１４）のヒトコドン最適化配列の詳細を示す。図７６Ａ：コドン適合指数（ＣＡＩ）。遺伝子配列の長さに沿ったコドン使用頻度の分布。高い遺伝子発現レベルという点で見たとき、１．０のＣＡＩは所望の発現生物において完璧であると考えられ、及び＞０．８のＣＡＩは良好と見なされる。図７６Ｂ：最適コドン使用頻度（ＦＯＰ）。計算されたコドンクオリティ群におけるパーセンテージコドン分布。所望の発現生物における所与のアミノ酸についての最も高い使用頻度のコドンを１００の値に設定する。図７６Ｃ：ＧＣ含量調整。ＧＣ含量の理想的なパーセンテージ範囲は３０〜７０％である。６０ｂｐウィンドウにおける％ＧＣ含量のピークは除去している。図７６Ｄ：制限酵素及びシス作用性エレメント。図７６Ｅ：リピート配列を除去する。図７６Ｆ〜図７６Ｇ：最適化配列（最適化配列長さ：３８３４、ＧＣ％５１．０６）（配列番号１２７２）。図７６Ｈ：タンパク質配列（配列番号１２７３）。
【図７７】図７７Ａ〜図７７Ｈは、３９３０ｎｔの遺伝子長さを有するポルフィロモナス・クレビオリカニス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ）３  Ｃｐｆ１（図６４の参照番号１５）のヒトコドン最適化配列の詳細を示す。図７７Ａ：コドン適合指数（ＣＡＩ）。遺伝子配列の長さに沿ったコドン使用頻度の分布。高い遺伝子発現レベルという点で見たとき、１．０のＣＡＩは所望の発現生物において完璧であると考えられ、及び＞０．８のＣＡＩは良好と見なされる。図７７Ｂ：最適コドン使用頻度（ＦＯＰ）。計算されたコドンクオリティ群におけるパーセンテージコドン分布。所望の発現生物における所与のアミノ酸についての最も高い使用頻度のコドンを１００の値に設定する。図７７Ｃ：ＧＣ含量調整。ＧＣ含量の理想的なパーセンテージ範囲は３０〜７０％である。６０ｂｐウィンドウにおける％ＧＣ含量のピークは除去している。図７７Ｄ：制限酵素及びシス作用性エレメント。図７７Ｅ：リピート配列を除去する。図７７Ｆ〜図７７Ｇ：最適化配列（最適化配列長さ：３９３０、ＧＣ％５４．４２）（配列番号１２７４）。図７７Ｈ：タンパク質配列（配列番号１２７５）。
【図７８】図７８Ａ〜図７８Ｈは、４１１９ｎｔの遺伝子長さを有するプレボテラ・ディシエンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ）Ｃｐｆ１（図６４の参照番号１６）のヒトコドン最適化配列の詳細を示す。図７８Ａ：コドン適合指数（ＣＡＩ）。遺伝子配列の長さに沿ったコドン使用頻度の分布。高い遺伝子発現レベルという点で見たとき、１．０のＣＡＩは所望の発現生物において完璧であると考えられ、及び＞０．８のＣＡＩは良好と見なされる。図７８Ｂ：最適コドン使用頻度（ＦＯＰ）。計算されたコドンクオリティ群におけるパーセンテージコドン分布。所望の発現生物における所与のアミノ酸についての最も高い使用頻度のコドンを１００の値に設定する。図７８Ｃ：ＧＣ含量調整。ＧＣ含量の理想的なパーセンテージ範囲は３０〜７０％である。６０ｂｐウィンドウにおける％ＧＣ含量のピークは除去している。図７８Ｄ：制限酵素及びシス作用性エレメント。図７８Ｅ：リピート配列を除去する。図７８Ｆ〜図７８Ｇ：最適化配列（最適化配列長さ：４１１９、ＧＣ％５１．８８）（配列番号１２７６）。図７８Ｈ：タンパク質配列（配列番号１２７７）。
【図７９】図７９Ａ〜図７９Ｈは、３８８８ｎｔの遺伝子長さを有するポルフィロモナス・マカカエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅ）Ｃｐｆ１（図６４の参照番号１７）のヒトコドン最適化配列の詳細を示す。図７９Ａ：コドン適合指数（ＣＡＩ）。遺伝子配列の長さに沿ったコドン使用頻度の分布。高い遺伝子発現レベルという点で見たとき、１．０のＣＡＩは所望の発現生物において完璧であると考えられ、及び＞０．８のＣＡＩは良好と見なされる。図７９Ｂ：最適コドン使用頻度（ＦＯＰ）。計算されたコドンクオリティ群におけるパーセンテージコドン分布。所望の発現生物における所与のアミノ酸についての最も高い使用頻度のコドンを１００の値に設定する。図７９Ｃ：ＧＣ含量調整。ＧＣ含量の理想的なパーセンテージ範囲は３０〜７０％である。６０ｂｐウィンドウにおける％ＧＣ含量のピークは除去している。図７９Ｄ：制限酵素及びシス作用性エレメント。図７９Ｅ：リピート配列を除去する。図７９Ｆ〜図７９Ｇ：最適化配列（最適化配列長さ：３８８８、ＧＣ％５３．２６）（配列番号１２７８）。図７９Ｈ：タンパク質配列（配列番号１２７９）。
【図８０】図８０Ａ〜図８０Ｉは、各オルソログ（図６４の付番、参照番号３〜１７を参照）のダイレクトリピート（ＤＲ）配列及びそれらの予想折り畳み構造を示す。それぞれ掲載順に、配列番号１２８０〜１３１３を開示する。
【図８１】図８１は、ヒトＥｍｘ１遺伝子座のＰＣＲアンプリコンの切断を示す。それぞれ掲載順に、配列番号１３１４〜１３１８を開示する。
【図８２】図８２Ａ〜図８２Ｂは、５’ＤＲのトランケーションが切断活性に及ぼす効果を示す。図８２Ａは、５つのＤＲトランケーションによる切断結果が示されるゲルを示す。図８２Ｂは、ｃｒＤＮＡデルタＤＲ５が５’末端のステムループを破壊した図を示す。これは、５’末端のステムループが切断活性に必須であることを示している。それぞれ掲載順に、配列番号１３１９〜１３２４を開示する。
【図８３】図８３は、ｃｒＲＮＡ−ＤＮＡ標的ミスマッチが切断効率に及ぼす効果を示す。それぞれ掲載順に、配列番号１３２５〜１３３５を開示する。
【図８４】図８４は、精製フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）及びプレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）Ｃｐｆ１を使用したＤＮＡの切断を示す。配列番号１３３６を開示する。
【図８５】図８５Ａ〜図８５ＢはＤＲ二次構造の図を示す。図８５ＡはＦｎＣｐｆ１  ＤＲ二次構造（配列番号１３３７）を示す（ステムループを強調表示する）。図８５ＢはＰａＣｐｆ１  ＤＲ二次構造（配列番号１３３８）を示す（ステムループを強調表示する、ループ領域の一塩基の違いを除き同一）。
【図８６】図８６は、ＦｎＣｐ１遺伝子座のＲＮＡｓｅｑ分析の更なる図を示す。
【図８７】図８７Ａ〜図８７Ｂは成熟ｃｒＲＮＡ配列の概略図を示す。図８７ＡはＦｎＣｐｆ１の成熟ｃｒＲＮＡ配列を示す。図８７ＢはＰａＣｐｆ１の成熟ｃｒＲＮＡ配列を示す。それぞれ掲載順に、配列番号１３３９〜１３４２を開示する。
【図８８】図８８は、ヒトコドン最適化フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）ＦｎＣｐｆ１を使用したＤＮＡの切断を示す。上のバンドは、切断されていない完全長断片（６０６ｂｐ）に対応する。三角形は約３４５ｂｐ及び約２６１ｂｐの予想切断産物サイズを示す。
【図８９】図８９は、Ｃｐｆ１オルソログによる切断を実証するインビトロオルソログアッセイを示す。
【図９０】図９０Ａ〜図９０Ｃは、インビトロ切断アッセイから計算的に導き出されたＰＡＭを示す。
【図９１】図９１は、５’オーバーハングを伴う付着末端型のＣｐｆ１切断を示す。それぞれ掲載順に、配列番号１３４３〜１３４５を開示する。
【図９２】図９２は、スペーサー長さが切断に及ぼす効果を示す。それぞれ掲載順に、配列番号１３４６〜１３５２を開示する。
【図９３】図９３は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＦｎＣｐｆ１媒介性インデルのＳＵＲＶＥＹＯＲデータを示す。
【図９４】図９４Ａ〜図９４Ｆは、野生型ＦｎＣｐｆ１遺伝子座における転写物のプロセシングと比較した、ＦｎＣｐｆ１遺伝子座のセクションを欠失させたときの転写物のプロセシングを示す。図９５Ｂ、図９５Ｄ及び図９５Ｆは、プロセシングされたスペーサーを拡大表示する。それぞれ掲載順に、配列番号１３５３〜１４０１を開示する。
【図９５】図９５Ａ〜図９５Ｅは、野兎病菌亜種ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｕ１１２  Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座が、５’−ＴＴＮ  ＰＡＭが隣接するプロトスペーサーを含有するプラスミドの形質転換に対して免疫を付与することを示す。図９５Ａは、野兎病菌亜種ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｕ１１２（ＮＣ＿００８６０１）に見られる２つのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の構成を示す。ＦｎＣａｓ９及びＦｎＣｐｆ１のドメイン構成を比較する。図９５Ｂは、ＰＡＭ位置及びアイデンティティを発見するためのプラスミド枯渇アッセイの概略図を提供する。異種ＦｎＣｐｆ１遺伝子座プラスミド（ｐＦｎＣｐｆ１）又は空のベクター対照のいずれかを担持するコンピテントな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を、ランダム化された５’又は３’ＰＡＭ配列が隣接するマッチするプロトスペーサーを含有するプラスミドのライブラリで形質転換し、抗生物質で選択して、標的化が成功したＰＡＭを有するプラスミドを枯渇させた。生き残ったコロニーのプラスミドを抽出し、シーケンシングして、枯渇ＰＡＭ配列を決定した。図９５Ｃ〜図９５Ｄは、プラスミド枯渇アッセイによって決定したときのＦｎＣｐｆ１  ＰＡＭの配列ロゴを示す。情報量によって位置の文字の高さが決まる；エラーバーは９５％ベイズ信頼区間を示す。図９５Ｅは、ｐＦｎＣｐｆ１を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が５’−ＴＴＮ  ＰＡＭを有するプラスミドに対してロバストな干渉を実証することを示す（ｎ＝３、エラーバーは平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す）。
【図９６】図９６Ａ〜図９６Ｃは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＦｎＣｐｆ１及びＣＲＩＳＰＲアレイの異種発現がプラスミドＤＮＡ干渉及びｃｒＲＮＡ成熟を媒介するのに十分であることを示す。野兎病菌亜種ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｕ１１２の低分子ＲＮＡ−ｓｅｑ（図９６Ａ）が、ＦｎＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲアレイの転写及びプロセシングを明らかにする。成熟ｃｒＲＮＡは１９ｎｔ部分的ダイレクトリピートで始まり、それに２３〜２５ｎｔのスペーサー配列が続く。合成プロモーターによってドライブされるＦｎＣｐｆ１及びＣＲＩＳＰＲアレイを有するプラスミドで形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の低分子ＲＮＡ−ｓｅｑ（図９６Ｂ）は、Ｃａｓ遺伝子及びＦｎＣｐｆ１遺伝子座における他の配列エレメントに非依存的なｃｒＲＮＡプロセシングを示す。図９６Ｃは、ＦｎＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の異なるトランケーションを有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を示し、プラスミドＤＮＡ干渉にＦｎＣｐｆ１及びＣＲＩＳＰＲアレイのみが必要であることを示す（ｎ＝３、エラーバーは平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示す）。配列番号１５８０を開示する。
【図９７】図９７Ａ〜図９７Ｅは、インビトロでのＤＮＡの切断のためＦｎＣｐｆ１がｃｒＲＮＡによって標的化されることを示す。図９７Ａは、ＦｎＣｐｆ１  ｃｒＲＮＡ−ＤＮＡターゲティング複合体の概略図である。切断部位は赤色矢印で示す（それぞれ掲載順に、配列番号１４０２及び１４０３を開示する）。ＦｎＣｐｆ１及びｃｒＲＮＡ単独は、標的ＤＮＡのＲＮＡガイド下切断をｃｒＲＮＡ依存的及びＭｇ２＋依存的に媒介した（図９７Ｂ）。図９７Ｃは、ＦｎＣｐｆ１が線状ＤＮＡ及びスーパーコイルＤＮＡの両方を切断することを示す。図９７Ｄは、ＦｎＣｐｆ１消化標的からのサンガーシーケンシングトレースが付着末端型のオーバーハングを示すことを示す（それぞれ掲載順に、配列番号１４０４及び１４０６を開示する）。Ｎと示される、鋳型によらない追加的なアデニンの付加は、シーケンシングで使用したポリメラーゼのアーチファクトである。可視化を助けるためリバースプライマーリードは逆相補体にした。図９７Ｅは、切断が５’ＰＡＭにおける塩基対合に依存することを示す。ＦｎＣｐｆ１は、正しくワトソン・クリック対合したＤＮＡにおけるＰＡＭのみを認識することができる。
【図９８】図９８Ａ〜図９８Ｂは、ＦｎＣｐｆ１のＣ末端ＲｕｖＣドメインにある触媒残基がＤＮＡ切断に必要であることを示す。図９８Ａは、ＦｎＣｐｆ１のドメイン構造を示し、ＲｕｖＣ触媒残基を強調表示している。触媒残基は、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＲｕｖＣ（ＰＤＢ  ＩＤ：４ＥＰ５）との配列相同性に基づき同定した。図９８Ｂは、ＦｎＣｐｆ１のＲｕｖＣ触媒残基の突然変異（Ｄ９１７Ａ及びＥ１００６Ａ）及びＳｐＣａｓ９のＲｕｖＣ触媒残基の突然変異（Ｄ１０Ａ）が二本鎖ＤＮＡ切断を妨げることを示す未変性ＴＢＥ  ＰＡＧＥゲルを示す。ＦｎＣｐｆ１のＲｕｖＣ触媒残基の突然変異（Ｄ９１７Ａ及びＥ１００６Ａ）がＤＮＡニッキング活性を妨げる一方、ＳｐＣａｓ９のＲｕｖＣ触媒残基の突然変異（Ｄ１０Ａ）は標的部位のニッキングをもたらすことを示す変性ＴＢＥ−尿素ＰＡＧＥゲル。
【図９９】図９９Ａ〜図９９Ｅは、インビトロでのＦｎＣｐｆ１ヌクレアーゼ活性のｃｒＲＮＡ要件を示す。図９９Ａは、スペーサー長さがＦｎＣｐｆ１切断活性に及ぼす効果を示す。図９９Ｂは、ｃｒＲＮＡ−標的ＤＮＡミスマッチがＦｎＣｐｆ１切断活性に及ぼす効果を示す。図９９Ｃは、ダイレクトリピート長さがＦｎＣｐｆ１切断活性に及ぼす効果を実証する。図９９Ｄは、ＦｎＣｐｆ１切断活性がダイレクトリピートＲＮＡ構造のステムの二次構造に依存することを示す。図９９Ｅは、ＦｎＣｐｆ１切断活性がループ突然変異の影響を受けないが、ダイレクトリピートの最も３’側の塩基の突然変異に感受性を有することを示す。それぞれ掲載順に、配列番号１４０７〜１４３３を開示する。
【図１００】図１００Ａ〜図１００Ｆは、Ｃｐｆ１ファミリータンパク質の多様性及び機能の分析を提供する。図１００Ａ〜図１００Ｂは、機能分析に選択した１６個のＣｐｆ１オルソログの系統発生学的比較を示す。保存配列は濃い灰色で示す。ＲｕｖＣドメイン、架橋ヘリックス、及びジンクフィンガーを強調表示する。図１００Ｃは、１６個のＣｐｆ１ファミリータンパク質からのダイレクトリピートのアラインメントを示す。ｃｒＲＮＡ成熟後に除去される配列は灰色で表示する。非保存塩基は赤色で表示する。ステム二重鎖は灰色で強調表示する。図１００Ｄは、成熟ｃｒＲＮＡにおけるダイレクトリピート配列のＲＮＡｆｏｌｄ（Ｌｏｒｅｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）の図を示す。ＦｎＣｐｆ１の予測を、３つのあまり保存されていないオルソログと共に示す。図１００Ｅは、同様のダイレクトリピート配列を有するオルソログｃｒＲＮＡがＦｎＣｐｆ１と共に標的ＤＮＡ切断の媒介に機能可能であることを示す。図１００Ｆは、プロトスペーサーに隣接するランダム化したＰＡＭを含有するプラスミドライブラリのインビトロ切断を用いて同定された８個のＣｐｆ１ファミリータンパク質のＰＡＭ配列を示す。それぞれ掲載順に、配列番号１４３４〜１４５３を開示する。
【図１０１】図１０１Ａ〜図１０１Ｅは、Ｃｐｆ１がヒト細胞株においてロバストなゲノム編集を媒介することを示す。図１０１Ａは、ＣＭＶドライブ発現ベクターを使用したＨＥＫ  ２９３ＦＴ細胞における個々のＣｐｆ１ファミリータンパク質の発現を示す概略図である。対応するｃｒＲＮＡを、ｃｒＲＮＡ配列に融合したＵ６プロモーターを含有するＰＣＲ断片を使用して発現させる。トランスフェクト細胞はＳｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼアッセイ又は標的ディープシーケンシングのいずれかを用いて分析した。図１０１Ｂ（上）はＤＮＭＴ１ターゲティングｃｒＲＮＡ  ３の配列を示し、及びシーケンシングリード（下）は代表的なインデルを示す。図１０１Ｂは、それぞれ掲載順に、配列番号１４５４〜１４６５を開示する。図１０１Ｃは、インビトロ及びインビボ切断活性の比較を提供する。ＤＮＭＴ１標的領域をＰＣＲ増幅し、このゲノム断片を使用してＣｐｆ１媒介切断を試験した。８つ全てのＣｐｆ１ファミリータンパク質がインビトロでＤＮＡ切断を示した（上）。候補７−ＡｓＣｐｆ１及び１３−Ｌｂ３Ｃｐｆ１はヒト細胞においてロバストなインデル形成を促進した（下）。図１０１Ｄは、ヒトＤＮＭＴ１遺伝子座におけるＣｐｆ１及びＳｐＣａｓ９標的配列を示す（それぞれ掲載順に、配列番号１４６６〜１４７３を開示する）。図１０１Ｅは、Ｃｐｆ１及びＳｐＣａｓ９ゲノム編集効率の比較を提供する。標的部位は、図１０１Ｄに示す配列に対応する。
【図１０２】図１０２Ａ〜図１０２Ｄは、ＦｎＣｐｆ１  ＰＡＭを同定するためのインビボプラスミド枯渇アッセイを示す（図９５もまた参照）。図１０２Ａ：ランダム化した５’ＰＡＭ配列を有するプラスミドのライブラリによるｐＦｎＣｐｆ１を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の形質転換。プラスミドのサブセットを枯渇させた。プロットは、枯渇レベルを順位付けした順番に示す。枯渇は、ｐＡＣＹＣ１８４大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）対照と比較した正規化存在量の負のｌｏｇ２倍数比として計測する。３．５の閾値を上回るＰＡＭを使用して配列ロゴを生成する。図１０２Ｂ：ランダム化した３’ＰＡＭ配列を有するプラスミドのライブラリによるｐＦｎＣｐｆ１を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の形質転換。プラスミドのサブセットを枯渇させた。プロットは、枯渇レベルを順位付けした順番に示す。枯渇は、ｐＡＣＹＣ１８４大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）対照と比較した正規化存在量の負のｌｏｇ２倍数比として計測し、３．５の閾値を上回るＰＡＭを使用して配列ロゴを生成する。図１０２Ｃ：ランダム化した５’ＰＡＭ配列を有するプラスミドの入力ライブラリ。プロットは、枯渇レベルを順位付けした順番に示す。枯渇は、ｐＡＣＹＣ１８４大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）対照と比較した正規化存在量の負のｌｏｇ２倍数比として計測する。３．５の閾値を上回るＰＡＭを使用して配列ロゴを生成する。図１０２Ｄ：５’ＰＡＭの２位及び３位における塩基のペアワイズの組み合わせについて有意な閾値を超えるユニークなＰＡＭの数。
【図１０３】図１０３Ａ〜図１０３ＤはＦｎＣｐｆ１タンパク質精製を示す（図９７もまた参照）。図１０３Ａは、段階的精製を示すＦｎＣｐｆ１のクマシーブルー染色アクリルアミドゲルを示す。Ｎｉ−ＮＴＡカラムから、ＭＢＰ−ＦｎＣｐｆ１融合物のサイズ（１８９．７ｋＤ）と一致する１６０ｋＤを少し上回るバンが溶出した。ＴＥＶプロテアーゼを加えると、１４７ｋＤの遊離ＦｎＣｐｆ１のサイズと一致するより低分子量のバンドが現れた。図１０３Ｂ：ｆｎＣｐｆ１のサイズ排除ゲルろ過。ＦｎＣｐｆ１はサイズ約３００ｋＤ（６２．６５ｍＬ）で溶出したことから、Ｃｐｆ１が溶液中で二量体として存在し得ることが示唆される。図１０３Ｃは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムのキャリブレーションに使用したタンパク質標準を示す。ＢＤｅｘ＝ブルーデキストラン（ボイド容積）、Ａｌｄ＝アルドラーゼ（１５８ｋＤ）、Ｏｖ＝オボアルブミン（４４ｋＤ）、ＲｉｂＡ＝リボヌクレアーゼＡ（１３．７ｋＤ）、Ａｐｒ＝アプロチニン（６．５ｋＤ）。図１０３Ｄ：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムの検量線。Ｋａは、（溶出容積−ボイド容積）／（幾何学的カラム容積−ボイド容積）として計算される。標準をプロットし、対数曲線にフィッティングした。
【図１０４】図１０４Ａ〜図１０４Ｅは、ＦｎＣｐｆ１の切断パターンを示す（図９７もまた参照）。ＦｎＣｐｆ１消化ＤＮＡ標的からのサンガーシーケンシングトレースは付着末端型のオーバーハングを示す。Ｎと示される、鋳型によらない追加的なアデニンの付加は、シーケンシングで使用したポリメラーゼのアーチファクトである。プロトスペーサー１（図１０４Ａ）、プロトスペーサー２（図１０４Ｂ）、及びプロトスペーサー３（図１０４Ｃ）並びに標的ＤＮＭＴ１及びＥＭＸ１（図１０４Ｄ）を伴う種々のＴＴＮ  ＰＡＭのサンガートレースが示される。（−）鎖配列は上部鎖配列を示すため逆相補にしている。切断部位は赤色の三角形で示す。小さい三角形は推定代替切断部位を示す。図１０４Ｅは、ＰＡＭ−遠位ｃｒＲＮＡ−標的ＤＮＡミスマッチがＦｎＣｐｆ１切断活性に及ぼす効果を示す。それぞれ掲載順に、配列番号１４７４〜１４９４を開示する。
【図１０５】図１０５Ａ〜図１０５Ｂは、ＦｎＣｐｆ１（配列番号１４９５）、ＡｓＣｐｆ１（配列番号１４９６）、及びＬｂＣｐｆ１（配列番号１４９７）のアミノ酸配列アラインメント示す（図１００もまた参照）。保存されている残基を赤色の背景で強調表示し、保存されている突然変異を囲み線及び赤色のフォントで強調表示する。二次構造予測をアラインメントの上（ＦｎＣｐｆ１）及び下（ＬｂＣｐｆ１）に強調表示する。αヘリックスはカール様の記号として示し、β鎖はダッシュとして示す。図９５Ａで同定されているタンパク質ドメインもまた強調表示する。
【図１０６】図１０６Ａ〜図１０６Ｄは、哺乳類実験に選択した１６個のＣｐｆ１ファミリータンパク質に対応する細菌ゲノム遺伝子座のマップを提供する（図１００もまた参照）。図１０６Ａ〜図１０６Ｄは、それぞれ掲載順に、配列番号１４９８〜１５１３を開示する。
【図１０７】図１０７Ａ〜図１０７Ｅは、Ｃｐｆ１ファミリータンパク質のインビトロでの特徴付け示す。図１０７Ａは、Ｃｐｆ１ファミリータンパク質を使用したインビトロＰＡＭスクリーニングの概略図である。ランダム化した５’ＰＡＭ配列を担持するプラスミドのライブラリを個々のＣｐｆ１ファミリータンパク質及びそれらの対応するｃｒＲＮＡによって切断した。非切断プラスミドＤＮＡを精製し、シーケンシングして、枯渇した特異的ＰＡＭモチーフを同定した。図１０７Ｂは、７−ＡｓＣｐｆ１に関して５’ＰＡＭの２位及び３位における塩基のペアワイズの組み合わせについて有意な閾値を超えるユニーク配列の数を示す。図１０７Ｃは、１３−ＬｂＣｐｆ１に関して５’ＰＡＭの２位、３位、及び４位における三つ組の塩基の組み合わせについて有意な閾値を超えるユニークなＰＡＭの数を示す。図１０７Ｄ〜図１０７Ｅ、Ｅ及びＦは、７−ＡｓＣｐｆ１消化標的（図１０７Ｅ）及び１３−ＬｂＣｐｆ１消化標的（図１０７Ｆ）からのサンガーシーケンシングトレースを示し、付着末端型のオーバーハングを示す。Ｎと示される、鋳型によらない追加的なアデニンの付加は、シーケンシングで使用したポリメラーゼのアーチファクトである。切断部位は赤色の三角形で示す。小さい三角形は推定代替切断部位を示す。図１０７Ｄ〜図１０７Ｅは、それぞれ掲載順に、配列番号１５１４〜１５１９を開示する。
【図１０８】図１０８Ａ〜図１０８Ｆは、更なる遺伝子座におけるヒト細胞ゲノム編集効率を示す。Ｓｕｒｖｅｙｏｒゲルは、ＤＮＭＴ１標的部位１（図１０８Ａ）、２（図１０８Ｂ）、及び４（図１０８Ｃ）における各Ｃｐｆ１ファミリータンパク質によって達成されたインデル効率の定量化を示す。図１０８Ａ〜図１０８Ｃは、更なる遺伝子座におけるヒト細胞ゲノム編集効率及びＤＮＭＴ標的部位の切断のサンガーシーケンシングを示す。Ｓｕｒｖｅｙｏｒゲルは、ＥＭＸ１標的部位１（図１０８Ｄ）及び２（図１０８Ｅ）における各Ｃｐｆ１ファミリータンパク質によって達成されたインデル効率の定量化を示す。ＡｓＣｐｆ１及びＬｂＣｐｆ１及びＤＮＭＴ１標的部位２、３、及び４（図１０８Ｆ）のインデル分布。シアン色のバーは全インデルカバレージを表す；青色のバーはインデルの３’末端の分布を表す。各標的について、ＰＡＭ配列は赤色であり、標的配列は薄青色である。
【図１０９】図１０９Ａ〜図１０９Ｃは、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼの一次構造のコンピュータ分析から３つの個別的な領域が明らかになることを示す。第一にＣ末端ＲｕｖＣ様ドメインであり、これは唯一機能的に特徴付けられたドメインである。第二にＮ末端α−ヘリックス領域であり、及び第三に、ＲｕｖＣ様ドメインとα−ヘリックス領域との間に位置する混合α及びβ領域である。
【図１１０】図１１０Ａ〜図１１０ＥはＡｓＣｐｆ１  Ｒａｄ５０アラインメント（ＰＤＢ  ４Ｗ９Ｍ）を示す。それぞれ掲載順に、配列番号１５２０及び１５２１を開示する。図１１０ＣはＡｓＣｐｆ１  ＲｕｖＣアラインメント（ＰＤＢ  ４ＬＤ０）を示す。それぞれ掲載順に、配列番号１５２２及び１５２３を開示する。図１１０Ｄ〜図１１０Ｅは、ＦｎＣｐｆ１におけるＲａｄ５０ドメインを同定するＡｓＣｐｆ１及びＦｎＣｐｆ１のアラインメント示す。それぞれ掲載順に、配列番号１５２４及び１５２５を開示する。
【図１１１】図１１１は、ＤＮＡを有する複合体におけるＲａｄ５０（４Ｗ９Ｍ）の構造を示す。ＤＮＡ相互作用残基は（赤色で）強調表示する。
【図１１２】図１１２は、ホリデイジャンクションを有する複合体におけるＲｕｖＣ（４ＬＤ０）の構造を示す。ＤＮＡ相互作用残基は赤色で強調表示する。
【図１１３】図１１３は、ＡｓＣｐｆ１のｂｌａｓｔが部位特異的リコンビナーゼＸｅｒＤの領域とアラインメントすることを示す。ＸｅｒＤの活性部位領域はＬＹＷＴＧＭＲ（配列番号１）［Ｒが触媒残基である］である。それぞれ掲載順に、配列番号１５２６〜１５２７を開示する。
【図１１４】図１１４は、Ｃｐｆ１オルソログにおいてある領域が保存されており（黄色のボックス）及びＲは保存されていないが、高度に保存されたアスパラギン酸（オレンジ色のボックス）がこの領域のすぐＣ末端側にあり及び近傍の保存領域（青色のボックス）でアルギニンが絶対的に保存されていることを示す。ＬｂＣｐｆ１におけるＤ７３２はアスパラギン酸である。それぞれ掲載順に、配列番号１２０４及び１５２８−１５７９を開示する。
【図１１５Ａ】図１１５Ａは、トランスフェクションの２４時間前に２４ウェル当たり１５０，０００個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞をプレーティングした実験を示す。細胞に、４００ｎｇ  ｈｕＡｓＣｐｆ１プラスミドと、Ｕ６プロモーターの後ろにタンデムで置かれたＧＲＩＮ２８に対する１つのガイド配列とＥＭＸ１に対する１つを含む１００ｎｇのタンデムガイドプラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後に細胞を回収し、タンデムガイドによって媒介されるＡｓＣｐｆ１活性をＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼアッセイを用いてアッセイした。
【図１１５Ｂ】図１１５Ｂは、ＧＲＩＮ２８及びＥＭＸ１遺伝子の両方におけるインデル形成を実証する。
【図１１６】図１１６は、漸増濃度のＥＤＴＡ（及び漸減濃度のＭｇ２＋）によるアレイのＦｎＣｐｆ１切断を示す。緩衝液は２０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ７（室温）、５０ｍＭ  ＫＣｌであり、タンパク質精製から持ち込まれる潜在的な微量の非特異的ＲＮアーゼに起因するＲＮＡの分解を防ぐため、マウスＲＮアーゼ阻害剤を含む。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
本明細書の図は例示目的に過ぎず、必ずしも一定の尺度で描かれているとは限らない。
【００５８】
本願は、これまでに記載されているＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系と機能上異なる新規ＲＮＡガイド下エンドヌクレアーゼ（例えばＣｐｆ１エフェクタータンパク質）について記載し、従ってこれらの新規エンドヌクレアーゼ（ｅｎｄｏｎｕｌｃｅａｓｅ）に関連するエレメントの用語は、本明細書ではそれに伴い修正される。本明細書に記載されるＣｐｆ１関連ＣＲＩＳＰＲアレイは、追加的なｔｒａｃｒＲＮＡを必要とすることなく成熟ｃｒＲＮＡにプロセシングされる。本明細書に記載されるｃｒＲＮＡはスペーサー配列（又はガイド配列）とダイレクトリピート配列とを含み、標的ＤＮＡの効率的な切断には、Ｃｐｆ１ｐ−ｃｒＲＮＡ複合それだけで十分である。本明細書に記載されるシード配列、例えばＦｎＣｐｆ１ガイドＲＮＡのシード配列は、スペーサー配列（又はガイド配列）の５’末端上の最初の約５ｎｔ以内にあり、シード配列内の突然変異はＣｐｆ１エフェクタータンパク質複合体の切断活性に悪影響を及ぼす。
【００５９】
一般に、ＣＲＩＳＰＲ系は、標的配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈ではプロトスペーサーとも称される）の部位におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメントによって特徴付けられる。ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成の文脈では、「標的配列」は、ガイド配列がそれを標的化する、例えばそれと相補性を有するように設計される配列を指し、ここでは標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションが、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。標的配列との相補性が切断活性（ａｃｉｔｉｖｉｔｙ）に重要となるガイド配列のセクションは、本明細書ではシード配列と称される。標的配列はＤＮＡ又はＲＮＡポリヌクレオチドなどの任意のポリヌクレオチドを含むことができ、目的の標的遺伝子座内に含まれる。一部の実施形態において、標的配列は細胞の核又は細胞質に位置する。本明細書に記載される発明は、Ｃａｓ９がその中の例示的エフェクタータンパク質であるクラス２  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の新規エフェクタータンパク質を包含し、従って本願で新規エフェクタータンパク質を記載するために用いられる用語は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を記載するために用いられる用語に関係し得る。
【００６０】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座は５０を超える遺伝子ファミリーを有し、厳密な意味で普遍的な遺伝子というのはない。従って、単一の系統樹は実現可能でなく、新規ファミリーの同定には多方向からの手法が必要となる。これまでのところ、９３個のＣａｓタンパク質について３９５個のプロファイルのｃａｓ遺伝子が包括的に同定されている。分類に含まれるのは、シグネチャ遺伝子プロファイル＋遺伝子座構成のシグネチャである。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の新規分類を図１に提案する。クラス１はマルチサブユニットｃｒＲＮＡ−エフェクター複合体（Ｃａｓｃａｄｅ）を含み、クラス２はシングルサブユニットｃｒＲＮＡ−エフェクター複合体（Ｃａｓ９様）を含む。図２はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓの分子構成を提供する。図３はＩ型及びＩＩＩ型エフェクター複合体の構造を提供する：広範な配列多様性にも関わらず共通のアーキテクチャ／共通の祖先。図４は、ＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）中心システムとしてのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓを示す。図５はＣａｓ１系統発生を示し、ここではアダプテーション及びｃｒＲＮＡ−エフェクターモジュールの組換えがＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ進化の主要な側面を示す。図６は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓセンサス、特に古細菌及び細菌間におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタイプ／サブタイプの分布を示す。
【００６１】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の作用は通常３段階に分けられる：（１）アダプテーション又はスペーサー組込み、（２）ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の一次転写物のプロセシング（プレｃｒＲＮＡ）並びにスペーサー及びＣＲＩＳＰＲリピートの５’及び３’断片に対応する可変領域を含むｃｒＲＮＡの成熟、及び（３）ＤＮＡ（又はＲＮＡ）干渉。公知のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の大多数に存在する２つのタンパク質、Ｃａｓ１及びＣａｓ２が、ＣＲＩＳＰＲカセットへのスペーサーの挿入に十分である。これらの２つのタンパク質が、このアダプテーション過程に必要な複合体を形成する；Ｃａｓ１のエンドヌクレアーゼ活性はスペーサーの組込みに必要であり、一方、Ｃａｓ２は非酵素的機能を果たすものと思われる。Ｃａｓ１−Ｃａｓ２複合体は、この系の残りの部分から準自律的であるように見えるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓの高度に保存された「情報処理」モジュールに相当する（Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｍａｋａｒｏｖａ  ＫＳ，Ｋｏｏｎｉｎ  ＥＶ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１５；１３１１：４７−７５を参照）。
【００６２】
これまでに記載されているクラス２系、即ちＩＩ型及び推定Ｖ型は、ｃａｓオペロンの３又は４つの遺伝子のみ、即ちアダプテーションモジュールを含むｃａｓ１及びｃａｓ２遺伝子（ｃａｓ１−ｃａｓ２遺伝子ペアは干渉に関わらない）、干渉に関与するがプレｃｒＲＮＡプロセシング及びアダプテーションにもまた寄与するシングルマルチドメインエフェクタータンパク質、及び多くの場合に、少なくとも幾つかのＩＩ型系では不必要な、機能が特徴付けられていない第４の遺伝子からなった（及び場合によっては第４の遺伝子はｃａｓ４であるか（生化学的又はインシリコのエビデンスは、Ｃａｓ４が３システインＣ末端クラスターを含むＰＤ−（ＤＥ）ｘＫスーパーファミリーヌクレアーゼであり；５’−ｓｓＤＮＡエキソヌクレアーゼ活性を有することを示している）又は不活性化ＡＴＰアーゼをコードするｃｓｎ２である）。ほとんどの場合、ＣＲＩＳＰＲアレイ及びｔｒａｃｒＲＮＡ、即ちトランスコードされる小さいＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡとして知られる個別的なＲＮＡ種の遺伝子が、クラス２  ｃａｓオペロンに隣接する。ｔｒａｃｒＲＮＡは、それぞれのＣＲＩＳＰＲアレイ内のリピートと部分的に相同であり、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座と会合しない遍在性の細菌酵素であるＲＮアーゼＩＩＩによって触媒されるプレｃｒＲＮＡのプロセシングに必須である。
【００６３】
Ｃａｓ１は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のほとんどに存在する最も保存されたタンパク質であり、他のＣａｓタンパク質よりも低速で進化する。従って、Ｃａｓ１系統発生はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系分類のガイドとして用いられてきた。生化学的又はインシリコのエビデンスは、Ｃａｓ１が金属依存性デオキシリボヌクレアーゼであることを示している。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＣａｓ１を欠失させると、「細菌抗ウイルス免疫及びＤＮＡ修復におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの二重の機能（Ａ  ｄｕａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｎｔｉｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｒｅｐａｉｒ）」，Ｂａｂｕ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７９：４８４−５０２（２０１１）に記載されるとおり、ＤＮＡ損傷に対する感受性が増加し、染色体分離が損なわれる。生化学的又はインシリコのエビデンスは、Ｃａｓ２がＵリッチ領域に特異的なＲＮアーゼであり、二重鎖ＤＮアーゼであることを示している。
【００６４】
本発明の態様は、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に関連する新規エフェクタータンパク質の同定及びエンジニアリングに関する。好ましい実施形態において、このエフェクタータンパク質はシングルサブユニットエフェクターモジュールを含む。更なる実施形態において、エフェクタータンパク質は、インビトロ、インビボ又はエキソビボ適用において原核細胞又は真核細胞で機能する。本発明のある態様は、新規クラス２  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を予想し、且つその中の構成成分を同定するための計算方法及びアルゴリズムを包含する。
【００６５】
一実施形態において、新規クラス２  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座を同定するための計算方法は、以下のステップ：Ｃａｓ１タンパク質をコードする全てのコンティグを検出するステップ；ｃａｓ１遺伝子から２０ｋＢの範囲内にある全ての予測タンパク質コード遺伝子を同定するステップ；同定された遺伝子をＣａｓタンパク質特異的プロファイルと比較してＣＲＩＳＰＲアレイを予測するステップ；５００アミノ酸より大きい（＞５００ａａ）タンパク質を含有する未分類の候補ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座を選択するステップ；ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ及びＨＨＰｒｅｄを用いて選択候補を分析し、それにより新規クラス２  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座を単離及び同定するステップを含む。上述のステップに加えて、更なるホモログに関してメタゲノミクスデータベースを検索することによって候補の更なる分析が行われ得る。
【００６６】
一態様において、Ｃａｓ１タンパク質をコードする全てのコンティグを検出するステップは、「ＧｅｎｅＭａｒｋＳ：遺伝子予測のための自己訓練法が微生物ゲノムで始まる。調節領域における配列モチーフの発見への影響（ＧｅｎｅＭａｒｋＳ：ａ  ｓｅｌｆ−ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｓｔａｒｔｓ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｇｅｎｏｍｅｓ．Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｆｉｎｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｍｏｔｉｆｓ  ｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｒｅｇｉｏｎｓ）」Ｊｏｈｎ  Ｂｅｓｅｍｅｒ，Ａｌｅｘａｎｄｒｅ  Ｌｏｍｓａｄｚｅ  ａｎｄ  Ｍａｒｋ  Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （２００１）２９，ｐｐ  ２６０７−２６１８（本明細書において参照により援用される）に更に記載されるとおりの遺伝子予測プログラムであるＧｅｎｅｍａｒｋＳによって実施される。
【００６７】
一態様において、全ての予測タンパク質コード遺伝子を同定するステップは、同定された遺伝子をＣａｓタンパク質特異的プロファイルと比較し、古いドメイン及び完全長タンパク質の十分にアノテートされた多重配列アラインメントモデルのコレクションからなるタンパク質アノテーションリソースであるＮＣＢＩ保存ドメインデータベース（ＣＤＤ）に従いそれらをアノテートすることによって行われる。これらは、ＲＰＳ−ＢＬＡＳＴによってタンパク質配列における保存されたドメインを迅速に同定するための位置特異的スコア行列（ＰＳＳＭ）として利用可能である。ＣＤＤの内容には、三次元構造情報を用いてドメイン境界を明示的に定義し、且つ配列／構造／機能の関係について洞察を提供するＮＣＢＩのキュレーションによるドメイン、並びに幾つもの外部ソースのデータベース（Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ、ＣＯＧ、ＰＲＫ、ＴＩＧＲＦＡＭ）からインポートされたドメインモデルが含まれる。更なる態様において、ＣＲＩＳＰＲアレイは、「ＰＩＬＥＲ−ＣＲ：ＣＲＩＳＰＲリピートの高速且つ正確な同定（ＰＩＬＥＲ−ＣＲ：ｆａｓｔ  ａｎｄ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ  ｒｅｐｅａｔｓ）」，Ｅｄｇａｒ，Ｒ．Ｃ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，Ｊａｎ  ２０；８：１８（２００７）（本明細書において参照により援用される）に記載されるとおりの、ＣＲＩＳＰＲリピートを見つけ出すための公開されているドメインソフトウェアであるＰＩＬＥＲ−ＣＲプログラムを用いて予測した。
【００６８】
更なる態様では、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（位置特異的反復的基本局所アラインメント検索ツール）を用いてケース・バイ・ケース分析が実施される。ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴは、タンパク質間ＢＬＡＳＴを用いて所与のスコア閾値を上回って検出された配列の多重配列アラインメントから位置特異的スコアリング行列（ＰＳＳＭ）又はプロファイルを導出する。このＰＳＳＭは新規マッチに関するデータベースの更なる検索に用いられ、続いてこれらの新規に検出された配列で反復するためアップデートされる。従って、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴは、タンパク質間の遠縁の関係性を検出する手段を提供する。
【００６９】
別の態様において、ＢＬＡＳＴ又はＰＳＩ−ＢＬＡＳＴと同じように使用し易いと同時に離れたホモログを見つけ出すのにはるかに感受性が高い配列データベース検索及び構造予測方法であるＨＨｐｒｅｄを用いてケース・バイ・ケース分析が実施される。実際に、ＨＨｐｒｅｄの感受性は、現在利用可能な最も強力な構造予測サーバーに匹敵する。ＨＨｐｒｅｄは、プロファイル隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）のペアワイズ比較をベースとする最初のサーバーである。最も従来的な配列検索方法はＵｎｉＰｒｏｔ又はＮＲなどの配列データベースを検索するが、ＨＨｐｒｅｄは、Ｐｆａｍ又はＳＭＡＲＴなどのアラインメントデータベースを検索する。これによりヒットのリストが雑然とした単一配列の山でなく、何個かの配列ファミリーへと大幅に単純化される。主要な公的に利用可能なプロファイル及びアラインメントデータベースは全てＨＨｐｒｅｄで利用可能である。ＨＨｐｒｅｄは入力として単一のクエリ配列又は多重アラインメントを受け入れる。ＨＨｐｒｅｄは僅か数分以内にＰＳＩ−ＢＬＡＳＴと同様の読み易いフォーマットで検索結果を返す。検索オプションには、局所又は大域アラインメント及び二次構造類似性のスコアリングが含まれる。ＨＨｐｒｅｄは、ペアワイズのクエリ−鋳型配列アラインメント、合成クエリ−鋳型多重アラインメント（例えば推移的検索のため）、並びにＨＨｐｒｅｄアラインメントからＭＯＤＥＬＬＥＲソフトウェアによって計算される三次元構造モデルを生成することができる。
【００７０】
核酸がＤＮＡ又はＲＮＡであり、及び一部の態様においてＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド（ｈｙｂｉｒｄ）又はその誘導体もまた指し得る用語「核酸ターゲティング系」は、まとめて、ＤＮＡ又はＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現に関与するか又はその活性を誘導する転写物及び他のエレメントを指し、この遺伝子は、ＤＮＡ又はＲＮＡターゲティングＣａｓタンパク質をコードする配列及びＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列と（全ての系ではないが、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系において）トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列とを含むＤＮＡ又はＲＮＡターゲティングガイドＲＮＡ、又はＤＮＡ又はＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列及び転写物を含み得る。本明細書に記載されるＣｐｆ１  ＤＮＡターゲティングＲＮＡガイド下エンドヌクレアーゼ系では、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は不要である。一般に、ＲＮＡターゲティング系は、標的ＲＮＡ配列の部位におけるＲＮＡターゲティング複合体の形成を促進するエレメントによって特徴付けられる。ＤＮＡ又はＲＮＡターゲティング複合体の形成の文脈では、「標的配列」は、ＤＮＡ又はＲＮＡターゲティングガイドＲＮＡがそれと相補性を有するように設計されるＤＮＡ又はＲＮＡ配列を指し、ここで標的配列とＲＮＡターゲティングガイドＲＮＡとの間のハイブリダイゼーションが、ＲＮＡターゲティング複合体の形成を促進する。一部の実施形態において、標的配列は細胞の核又は細胞質に位置する。
【００７１】
本発明のある態様において、本願のＤＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ＤＮＡターゲティング系とも称される新規ＤＮＡターゲティング系は、特異的ＤＮＡ配列を標的化するのにカスタマイズしたタンパク質を作成する必要はなく、むしろ単一のエフェクタータンパク質又は酵素をＲＮＡ分子によって特異的ＤＮＡ標的を認識するようにプログラムすることができ、換言すれば前記ＲＮＡ分子を用いて酵素を特異的ＤＮＡ標的に動員することができる同定されたＶ型（例えばサブタイプＶ−Ａ及びサブタイプＶ−Ｂ）Ｃａｓタンパク質に基づく。本発明の態様は特に、ＤＮＡターゲティングＲＮＡガイド下Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系に関する。
【００７２】
本発明のある態様において、本願のＲＮＡ−又はＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ＲＮＡターゲティング系とも称される新規ＲＮＡターゲティング系は、特異的ＲＮＡ配列を標的化するのにカスタマイズしたタンパク質を作成する必要はなく、むしろ単一の酵素をＲＮＡ分子によって特異的ＲＮＡ標的を認識するようにプログラムすることができ、換言すれば前記ＲＮＡ分子を用いて酵素を特異的ＲＮＡ標的に動員することができる同定されたＶＩ型Ｃａｓタンパク質に基づく。
【００７３】
本明細書に記載される核酸ターゲティング系、ベクター系、ベクター及び組成物は、様々な核酸ターゲティング適用、タンパク質などの遺伝子産物の合成の変化又は改変、核酸切断、核酸編集、核酸のスプライシング；標的核酸の輸送、標的核酸の追跡、標的核酸の単離、標的核酸の可視化等において用いられ得る。
【００７４】
本明細書で使用されるとき、Ｃａｓタンパク質又はＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の新規分類に提示されるタンパク質のいずれかを指す。有利な実施形態において、本発明は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座、例えばサブタイプＶ−Ａと称されるＣｐｆ１コード遺伝子座に同定されるエフェクタータンパク質を包含する。現在、サブタイプＶ−Ａ遺伝子座は、ｃａｓ１、ｃａｓ２、ｃｐｆ１と称される異なる遺伝子及びＣＲＩＳＰＲアレイを包含する。Ｃｐｆ１（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質Ｃｐｆ１、サブタイプＰＲＥＦＲＡＮ）は、Ｃａｓ９の特徴的アルギニンリッチクラスターに対応するものと共にＣａｓ９の対応するドメインと相同なＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含む大型タンパク質（約１３００アミノ酸）である。しかしながら、Ｃｐｆ１は、全てのＣａｓ９タンパク質に存在するＨＮＨヌクレアーゼドメインを欠いており、及びＨＮＨドメインを含む長いインサートを含有するＣａｓ９と対照的に、ＲｕｖＣ様ドメインはＣｐｆ１配列において連続的である。従って、詳細な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ酵素はＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインのみを含む。
【００７５】
Ｃｐｆ１遺伝子は、幾つかの多様な細菌ゲノムに見られ、典型的にはｃａｓ１、ｃａｓ２、及びｃａｓ４遺伝子及びＣＲＩＳＰＲカセット（例えば、フランシセラ属参照ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｃｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｆｘ１のＦＮＦＸ１＿１４３１−ＦＮＦＸ１＿１４２８）で同じ遺伝子座にある。従って、この推定新規ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のレイアウトはＩＩ−Ｂ型と類似しているものと思われる。更に、Ｃａｓ９と同様に、Ｃｐｆ１タンパク質は、トランスポゾンＯＲＦ−Ｂと相同の容易に同定可能なＣ末端領域を含有し、活性ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼ、アルギニンリッチ領域、及びＺｎフィンガー（Ｃａｓ９にはない）を含む。しかしながら、Ｃａｓ９と異なり、Ｃｐｆ１はまた、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓコンテクストのない幾つかのゲノムにも存在し、ＯＲＦ−Ｂとのその比較的高い類似性から、これがトランスポゾン構成成分である可能性が示唆される。これが真正のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系であったならば、Ｃｐｆ１はＣａｓ９の機能性の類似体であり、新規ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタイプ、即ちＶ型であろうことが示唆された（Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｍａｋａｒｏｖａ  ＫＳ，Ｋｏｏｎｉｎ  ＥＶ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１５；１３１１：４７−７５を参照）。しかしながら、本明細書に記載されるとおり、Ｃｐｆ１は、同一のドメイン構造を有しない、従ってサブタイプＶ−Ｂと称されるＣ２ｃ１ｐとそれを区別するため、サブタイプＶ−Ａと称される。
【００７６】
有利な実施形態において、本発明は、サブタイプＶ−Ａと称されるＣｐｆ１遺伝子座に同定されるエフェクタータンパク質を含む組成物及びシステムを包含する。
【００７７】
本発明の態様はまた、原核細胞又は真核細胞におけるインビトロ、インビボ又はエキソビボでのゲノムエンジニアリングにおける、例えば１つ以上の遺伝子又は１つ以上の遺伝子産物の発現を変化させる又は操作するための、本明細書に記載される組成物及び系の方法及び使用も包含する。
【００７８】
本発明の実施形態において、用語の成熟ｃｒＲＮＡ及びガイドＲＮＡ及びシングルガイドＲＮＡは、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）などの前述の引用文献にあるとおり同義的に使用される。一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズして標的配列に対するＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導くのに十分な標的ポリヌクレオチド配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを用いて最適にアラインメントしたとき、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％以上であるか、又はそれより高い。最適アラインメントは、配列のアラインメントに好適な任意のアルゴリズムを用いて決定することができ、その非限定的な例としては、スミス−ウォーターマンアルゴリズム、ニードルマン−ブンシュアルゴリズム、バローズ・ホイーラー変換に基づくアルゴリズム（例えば、バローズ・ホイーラーアライナー）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ｗｗｗ．ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍにおいて利用可能）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎにおいて利用可能）、及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔにおいて利用可能）が挙げられる。一部の実施形態において、ガイド配列は、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５ヌクレオチド長以上であるか、又はそれより長い。一部の実施形態において、ガイド配列は、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２ヌクレオチド長未満か、又はそれより短い。好ましくはガイド配列は１０〜３０ヌクレオチド長である。ガイド配列が標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導く能力は、任意の好適なアッセイによって評価し得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するのに十分なＣＲＩＳＰＲ系の構成成分が、試験しようとするガイド配列を含め、ＣＲＩＳＰＲ配列の構成成分をコードするベクターのトランスフェクションによるなどして対応する標的配列を有する宿主細胞に提供されてもよく、続いて本明細書に記載されるとおりのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイなどにより、標的配列内における優先的な切断を評価し得る。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は、標的配列、試験しようとするガイド配列を含めたＣＲＩＳＰＲ複合体の構成成分、及び供試ガイド配列と異なる対照ガイド配列を提供して、それらの供試ガイド配列と対照ガイド配列との反応間の標的配列における結合又は切断速度を比較することにより、試験管内で判定することができる。他のアッセイも可能であり、当業者には想起されるであろう。ガイド配列は、任意の標的配列を標的化するように選択することができる。一部の実施形態において、標的配列は細胞のゲノム内の配列である。例示的標的配列には、標的ゲノムにおいてユニークなものが含まれる。
【００７９】
一般に、及び本明細書全体を通じて、用語「ベクター」は、それに連結されている別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。ベクターとしては、限定はされないが、一本鎖、二本鎖、又は部分的二本鎖の核酸分子；１つ以上の遊離末端を含む、遊離末端のない（例えば環状の）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は両方を含む核酸分子；及び当該技術分野において公知の他の種類のポリヌクレオチドが挙げられる。ある種のベクターは「プラスミド」であり、これは、標準的な分子クローニング技術によるなどして追加のＤＮＡセグメントを挿入することのできる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、ここでベクターには、ウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）へのパッケージングのためのウイルス由来ＤＮＡ又はＲＮＡ配列が存在する。ウイルスベクターはまた、宿主細胞へのトランスフェクションのためのウイルスによって担持されるポリヌクレオチドも含む。特定のベクターは、それが導入される宿主細胞での自己複製能を有する（例えば、細菌性複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム哺乳類ベクター）は宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより宿主ゲノムと共に複製される。更に、特定のベクターは、それが作動可能に連結された遺伝子の発現を導くことが可能である。かかるベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。真核細胞における発現用の、及びそこでの発現をもたらすベクターは、本明細書では、「真核細胞発現ベクター」と称することができる。組換えＤＮＡ技法において有用な一般的な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。
【００８０】
組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に好適な形態の本発明の核酸を含むことができ、これはつまり、組換え発現ベクターが、発現させる核酸配列に作動可能に連結された１つ以上の調節エレメント（これは、発現に用いられる宿主細胞に基づき選択されてもよい）を含むことを意味する。組換え発現ベクターの範囲内において、「作動可能に連結された」は、ヌクレオチド配列の（例えば、インビトロ転写／翻訳系における、又はベクターが宿主細胞に導入される場合に宿主細胞における）発現が可能となる形で目的のヌクレオチド配列が１つ又は複数の調節エレメントに連結されていることを意味するように意図される。
【００８１】
用語「調節エレメント」には、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、及び他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル及びポリＵ配列などの転写終結シグナル）が含まれることが意図される。かかる調節エレメントについては、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。調節エレメントには、多くの種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を導くもの及び特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を導くもの（例えば、組織特異的調節配列）が含まれる。組織特異的プロモーターは、主として、所望の目的組織、例えば、筋肉、ニューロン、骨、皮膚、血液、特定の臓器（例えば、肝臓、膵臓）、又は特定の細胞型（例えば、リンパ球）において発現を導き得る。調節エレメントはまた、細胞周期依存的又は発生段階依存的様式など、時間依存的様式で発現を導いてもよく、この発現もまた組織又は細胞型特異的であることも又はそうでないこともある。一部の実施形態において、ベクターは、１つ以上のｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター（例えば、１、２、３、４、５個、又はそれより多いｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌ  ＩＩプロモーター（例えば、１、２、３、４、５個、又はそれより多いｐｏｌ  ＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌ  Ｉプロモーター（例えば、１、２、３、４、５個、又はそれより多いｐｏｌ  Ｉプロモーター）、又はこれらの組み合わせを含む。ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの例としては、限定はされないが、Ｕ６及びＨ１プロモーターが挙げられる。ｐｏｌ  ＩＩプロモーターの例としては、限定はされないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意選択でＲＳＶエンハンサーと共に）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意選択でＣＭＶエンハンサーと共に）［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１−５３０（１９８５）を参照］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、及びＥＦ１αプロモーターが挙げられる。また、用語「調節エレメント」には、ＷＰＲＥなどのエンハンサーエレメント；ＣＭＶエンハンサー；ＨＴＬＶ−ＩのＬＴＲにおけるＲ−Ｕ５’セグメント（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．８（１），ｐ．４６６−４７２，１９８８）；ＳＶ４０エンハンサー；及びウサギβ−グロビンのエクソン２と３との間のイントロン配列（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．７８（３），ｐ．１５２７−３１，１９８１）も包含される。当業者によれば、発現ベクターの設計が、形質転換する宿主細胞の選択、所望の発現レベルなどの要因に依存し得ることが理解されるであろう。ベクターは宿主細胞に導入することができ、それにより、本明細書に記載されるとおりの核酸によってコードされる転写物、タンパク質、又はペプチドが、融合タンパク質又はペプチド（例えば、クラス��ー化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）転写物、タンパク質、酵素、それらの突然変異型、それらの融合タンパク質等）を含め、産生され得る。
【００８２】
有利なベクターとしては、レンチウイルス及びアデノ随伴ウイルスが挙げられ、かかるベクターのタイプもまた、特定のタイプの細胞を標的化するように選択することができる。
【００８３】
本明細書で使用されるとき、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座エフェクタータンパク質の「ｃｒＲＮＡ」又は「ガイドＲＮＡ」又は「シングルガイドＲＮＡ」又は「ｓｇＲＮＡ」又は「１つ以上の核酸成分」という用語には、標的核酸配列とハイブリダイズして標的核酸配列への核酸ターゲティング複合体の配列特異的結合を導くのに十分な標的核酸配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列が含まれる。一部の実施形態において、相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを用いて最適にアラインメントしたとき、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％以上であるか、又はそれより高い。最適アラインメントは、配列のアラインメントに好適な任意のアルゴリズムを用いて決定することができ、その非限定的な例としては、スミス−ウォーターマンアルゴリズム、ニードルマン−ブンシュアルゴリズム、バローズ−ホイーラー変換に基づくアルゴリズム（例えば、バローズ・ホイーラーアライナー）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ｗｗｗ．ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍにおいて利用可能）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎにおいて利用可能）、及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔにおいて利用可能）が挙げられる。ガイド配列（核酸ターゲティングガイドＲＮＡ内にある）が標的核酸配列への核酸ターゲティング複合体の配列特異的結合を導く能力は、任意の好適なアッセイによって評価し得る。例えば、核酸ターゲティング複合体を形成するのに十分な核酸ターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の構成成分が、試験しようとするガイド配列を含め、対応する標的核酸配列を有する宿主細胞へと、核酸ターゲティング複合体の構成成分をコードするベクターのトランスフェクションによるなどして提供されてもよく、続いて本明細書に記載されるとおりのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイなどにより、標的核酸配列内における優先的なターゲティング（例えば切断）を評価し得る。同様に、標的核酸配列の切断は、標的核酸配列、試験しようとするガイド配列を含めた核酸ターゲティング複合体の構成成分、及び供試ガイド配列と異なる対照ガイド配列を提供して、それらの供試ガイド配列と対照ガイド配列との反応間で標的配列における結合又は切断速度を比較することにより、試験管内で判定することができる。他のアッセイも可能であり、当業者には想起されるであろう。ガイド配列、ひいては核酸ターゲティングガイドＲＮＡは、任意の標的核酸配列を標的化するように選択し得る。標的配列はＤＮＡであってもよい。標的配列は任意のＲＮＡ配列であってもよい。一部の実施形態において、標的配列は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、プレｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒｉｂｏｓｏｍａａｌ  ＲＮＡ）（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、非コードＲＮＡ（ｎ���ＲＮＡ）、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、及び小さい細胞質ＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ）からなる群から選択されるＲＮＡ分子内の配列であってもよい。一部の好ましい実施形態において、標的配列は、ｍＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、及びｒＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡ分子内の配列であってもよい。一部の好ましい実施形態において、標的配列は、ｎｃＲＮＡ、及びｌｎｃＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡ分子内の配列であってもよい。一部のより好ましい実施形態において、標的配列はｍＲＮＡ分子又はプレｍＲＮＡ分子内の配列であってもよい。
【００８４】
一部の実施形態において、核酸ターゲティングガイドＲＮＡは、ＲＮＡターゲティングガイドＲＮＡ内の二次構造度が低下するように選択される。一部の実施形態において、核酸ターゲティングガイドＲＮＡのヌクレオチドのうち最適に折り畳まれたとき自己相補性塩基対合に関与するのは約７５％、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、１％以下であるか、又はそれより少ない。最適な折り畳みは、任意の好適なポリヌクレオチド折り畳みアルゴリズムによって決定し得る。一部のプログラムは最小ギブズ自由エネルギーの計算に基づく。かかる一つのアルゴリズムの例は、Ｚｕｋｅｒ  ａｎｄ  Ｓｔｉｅｇｌｅｒ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９（１９８１），１３３−１４８）により記載されるとおりのｍＦｏｌｄである。別の例示的な折り畳みアルゴリズムは、ウィーン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｖｉｅｎｎａ）のＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙにおいて開発された、セントロイド構造予測アルゴリズムを用いるオンラインウェブサーバーＲＮＡｆｏｌｄである（例えば、Ａ．Ｒ．Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃｅｌｌ  １０６（１）：２３−２４；及びＰＡ  Ｃａｒｒ  ａｎｄ  ＧＭ  Ｃｈｕｒｃｈ，２００９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２７（１２）：１１５１−６２を参照）。
【００８５】
「ｔｒａｃｒＲＮＡ」配列又は類似の用語は、ｃｒＲＮＡ配列とハイブリダイズするのに十分な相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列を含む。本明細書において上記に指摘するとおり、本発明の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡはＣｐｆ１エフェクタータンパク質複合体の切断活性に必要ない。
【００８６】
本出願人らはまた、Ｃｐｆ１／Ｃ２ｃ１／Ｃ２ｃ２などのＶ型／ＶＩ型タンパク質のＤＮＡターゲティング及び切断能力を検証するチャレンジ実験も実施する。この実験は、ＳｔＣａｓ９の異種発現に関する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における同様の研究（Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３９，９２７５−９２８２（２０１１））と極めて類似している。本出願人らは、ＰＡＭ及び抵抗性遺伝子の両方を含有するプラスミドを異種大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に導入し、次に対応する抗生物質上にプレーティングする。プラスミドのＤＮＡ切断がある場合、本出願人らは生存コロニーを観察しない。
【００８７】
更なる詳細において、ＤＮＡ標的に関してアッセイは以下のとおりである。このアッセイでは、２つの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を使用する。一方は、細菌株由来の内因性エフェクタータンパク質遺伝子座をコードするプラスミドを有する。他方の株は空のプラスミドを有する（例えばｐＡＣＹＣ１８４、対照株）。可能な全ての７又は８ｂｐ  ＰＡＭ配列を抗生物質耐性プラスミド（アンピシリン耐性遺伝子を有するｐＵＣ１９）に提供する。ＰＡＭは、プロトスペーサー１（内因性エフェクタータンパク質遺伝子座における第１のスペーサーに対するＤＮＡ標的）の配列の隣りに位置する。２つのＰＡＭライブラリをクローニングした。一方は、プロトスペーサーの５’側に８ランダムｂｐ（例えば合計６５５３６個の異なるＰＡＭ配列＝複雑性）を有する。他方のライブラリは、プロトスペーサーの３’側に７ランダムｂｐを有する（例えば複雑性の合計は１６３８４個の異なるＰＡＭである）。両方のライブラリをクローニングすると、可能性のあるＰＡＭ当たり平均５００個のプラスミドを有することになった。試験株及び対照株に別個の形質転換で５’ＰＡＭ及び３’ＰＡＭライブラリを形質転換し、形質転換細胞を別々にアンピシリンプレートに播いた。プラスミドによる認識及び続く切断／干渉によって細胞はアンピシリンに対して脆弱になり、成長が妨げられる。形質転換の約１２時間後、試験株及び対照株によって形成された全てのコロニーを回収し、プラスミドＤＮＡを単離した。プラスミドＤＮＡを鋳型として使用してＰＣＲ増幅し、続いてディープシーケンシングを行った。非形質転換ライブラリ中の全てのＰＡＭの表現が、形質転換細胞におけるＰＡＭの予想される表現を示した。対照株に見られる全てのＰＡＭの表現が、実際の表現を示した。試験株における全てのＰＡＭの表現が、どのＰＡＭが酵素によって認識されないかを示したとともに、対照株との比較により、枯渇したＰＡＭの配列を抽出することが可能である。
【００８８】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の一部の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とｃｒＲＮＡ配列との間の相補性の程度は、最適にアラインメントしたときのこれらの２つのうち短い方の長さに沿ったものである。本明細書に記載されるとおり、本発明の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡは必要ない。先に記載されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系（例えばＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系）の一部の実施形態において、キメラ合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の設計は、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの間の少なくとも１２ｂｐの二重鎖構造を取り込み得るが、しかしながら本明細書に記載されるＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系では、この系がｔｒａｃｒＲＮＡを利用しないため、かかるキメラＲＮＡ（ｃｈｉ−ＲＮＡ）は不可能である。
【００８９】
毒性及びオフターゲット効果を最小限に抑えるため、送達される核酸ターゲティングガイドＲＮＡの濃度を制御することが重要となり得る。核酸ターゲティングガイドＲＮＡの最適濃度は、細胞モデル又は非ヒト真核生物動物モデルにおける種々の濃度の試験、及びディープシーケンシングを用いた潜在的なオフターゲットゲノム遺伝子座における改変の程度の分析によって決定することができる。最も高いレベルのオンターゲット改変をもたらす一方でオフターゲット改変レベルを最小限に抑える濃度が、インビボ送達に選択されるべきである。核酸ターゲティング系は、有利にはＶ型／ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ系に由来する。一部の実施形態において、核酸ターゲティング系の１つ以上のエレメントが、内因性ＲＮＡターゲティング系を含む特定の生物に由来する。本発明の好ましい実施形態において、ＲＮＡターゲティング系はＶ型／ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ系である。詳細な実施形態では、Ｖ型／ＶＩ型ＲＮＡターゲティングＣａｓ酵素はＣｐｆ１／Ｃ２ｃ１／Ｃ２ｃ２である。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、これらのホモログ、又はこれらの改変バージョンが挙げられる。実施形態において、本明細書において言及されるとおりのＣｐｆ１／Ｃ２ｃ１／Ｃ２ｃ２などのＶ型／ＶＩ型タンパク質は、Ｃｐｆ１／Ｃ２ｃ１／Ｃ２ｃ２などのＶ型／ＶＩ型タンパク質のホモログ又はオルソログもまた包含する。用語「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅ）」（本明細書では「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とも称される）及び「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）」（本明細書では「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とも称される）は、当該技術分野において周知である。更なる指針として、本明細書で使用されるとおりのタンパク質の「ホモログ」は、それがそのホモログであるところのタンパク質と同じ又は同様の機能を果たす同じ種のタンパク質である。しかしホモログタンパク質は構造上関係がなくてもよく、又は構造上部分的にのみ関係している。本明細書で使用されるとおりのタンパク質の「オルソログ」は、それがそのオルソログであるところのタンパク質と同じ又は同様の機能を果たす異なる種のタンパク質である。しかしオルソログタンパク質は構造上関係がなくてもよく、又は構造上部分的にのみ関係している。ホモログ及びオルソログは相同性モデリングによって同定し得る（例えば、Ｇｒｅｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｖｏｌ．２２８（１９８５）１０５５、及びＢｌｕｎｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ｖｏｌ  １７２（１９８８），５１３）又は「構造的ＢＬＡＳＴ（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ＢＬＡＳＴ）」（Ｄｅｙ  Ｆ，Ｃｌｉｆｆ  Ｚｈａｎｇ  Ｑ，Ｐｅｔｒｅｙ  Ｄ，Ｈｏｎｉｇ  Ｂ．「“構造的ＢＬＡＳＴ”に向けて：構造的関係を用いて機能を推測する（Ｔｏｗａｒｄ  ａ“ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ＢＬＡＳＴ”：ｕｓｉｎｇ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｔｏ  ｉｎｆｅｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２０１３  Ａｐｒ；２２（４）：３５９−６６．ｄｏｉ：１０．１００２／ｐｒｏ．２２２５を参照のこと）。また、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座の分野における適用に関して、Ｓｈｍａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）も参照のこと。しかしホモログタンパク質は構造上関係がなくてもよく、又は構造上部分的にのみ関係している。詳細な実施形態では、本明細書において言及されるとおりのＣｐｆ１のホモログ又はオルソログは、Ｃｐｆ１と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％などの配列相同性又は同一性を有する。更なる実施形態において、本明細書において言及されるとおりのＣｐｆ１のホモログ又はオルソログは、野生型Ｃｐｆ１と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％などの配列同一性を有する。Ｃｐｆ１が１つ以上の突然変異を有する場合（突然変異型）、本明細書において言及されるとおりの前記Ｃｐｆ１のホモログ又はオルソログは、突然変異型Ｃｐｆ１と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％などの配列同一性を有する。
【００９０】
ある実施形態において、Ｖ型Ｃａｓタンパク質は、限定はされないが、アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ）、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）又はモラクセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ）を含む属の生物のオルソログであり得る；詳細な実施形態では、Ｖ型Ｃａｓタンパク質は、限定はされないが、アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６；ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６（ＬｂＣｐｆ１）又はモラクセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ）２３７を含む種の生物のオルソログであり得る。詳細な実施形態では、本明細書において言及されるとおりのＣｐｆ１のホモログ又はオルソログは、本明細書に開示されるＣｐｆ１配列の１つ以上と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％などの配列相同性又は同一性を有する。更なる実施形態において、本明細書において言及されるとおりのＣｐｆのホモログ又はオルソログは、野生型ＦｎＣｐｆ１、ＡｓＣｐｆ１又はＬｂＣｐｆ１と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％などの配列同一性を有する。
【００９１】
詳細な実施形態では、本発明のＣｐｆ１タンパク質は、ＦｎＣｐｆ１、ＡｓＣｐｆ１又はＬｂＣｐｆ１と少なくとも６０％、より詳細には少なくとも７０、例えば少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％などの配列相同性又は同一性を有する。更なる実施形態において、本明細書において言及されるとおりのＣｐｆ１タンパク質は、野生型ＡｓＣｐｆ１又はＬｂＣｐｆ１と少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、より詳細には少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％などの配列同一性を有する。詳細な実施形態では、本発明のＣｐｆ１タンパク質はＦｎＣｐｆ１と６０％未満の配列同一性を有する。当業者は、これにトランケート型のＣｐｆ１タンパク質が含まれ、従ってトランケート型の長さにわたって配列同一性が決定されることを理解するであろう。
【００９２】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系酵素のオルソログを同定する幾つかの方法は、目的のゲノムのｔｒａｃｒ配列を同定するステップを含み得る。ｔｒａｃｒ配列の同定は、以下のステップに関し得る：データベースでダイレクトリピート又はｔｒａｃｒメイト配列を検索して、ＣＲＩＳＰＲ酵素を含むＣＲＩＳＰＲ領域を同定するステップ。センス方向及びアンチセンス方向の両方にＣＲＩＳＰＲ酵素に隣接するＣＲＩＳＰＲ領域中の相同配列を検索するステップ。転写ターミネーター及び二次構造を調べるステップ。ダイレクトリピート又はｔｒａｃｒメイト配列ではないが、ダイレクトリピート又はｔｒａｃｒメイト配列と５０％より高い同一性を有する任意の配列を潜在的ｔｒａｃｒ配列として同定するステップ。その潜在的ｔｒａｃｒ配列を取り、それと会合している転写終結配列に関して分析するステップ。このシステムでは、ＲＮＡシーケンシングデータから、計算的に同定された潜在的ｔｒａｃｒＲＮＡがごく低発現であったことが明らかになり、ｔｒａｃｒＲＮＡが本系の機能に不要であり得る可能性が示唆された。ＦｎＣｐｆ１遺伝子座を更に評価し、インビトロ切断結果を合わせた後、本出願人らは、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質複合体による標的ＤＮＡ切断にｔｒａｃｒＲＮＡは必要ないと結論付けた。本出願人らは、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質及びｃｒＲＮＡ（ダイレクトリピート配列とガイド配列とを含むガイドＲＮＡ）のみを含むＣｐｆ１エフェクタータンパク質複合体が標的ＤＮＡを切断するのに十分であったことを決定した。
【００９３】
本明細書に記載される機能のいずれも、複数のオルソログ由来の断片を含むキメラ酵素を含め、他のオルソログ由来のＣＲＩＳＰＲ酵素にエンジニアリングし得ることが理解されるであろう。かかるオルソログの例は、本明細書の他の部分に記載される。従って、キメラ酵素は、限定はされないが、コリネバクター属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、ステレラ属（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フィリファクター属（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フラビイボラ属（Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スフェロヘータ属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、アゾスピリラム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、パルビバクラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ニトラチフラクター属（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）及びカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）を含む属の生物のＣＲＩＳＰＲ酵素オルソログの断片を含み得る。キメラ酵素は第１の断片と第２の断片とを含むことができ、これらの断片（ｆｒａｇｒｍｅｎｔ）は、本明細書に挙げられる属又は本明細書に挙げられる種の生物のＣＲＩＳＰＲ酵素オルソログのものであり得る；有利には断片は、異なる種のＣＲＩＳＰＲ酵素オルソログ由来である。
【００９４】
実施形態において、本明細書において言及されるとおりのＶ型／ＶＩ型ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質、詳細にはＣｐｆ１／Ｃ２ｃ１／Ｃ２ｃ２タンパク質にはまた、Ｃｐｆ１／Ｃ２ｃ１／Ｃ２ｃ２又はそのホモログ若しくはオルソログの機能変異体も包含される。タンパク質の「機能変異体」は、本明細書で使用されるとき、当該のタンパク質の活性を少なくとも部分的に保持しているかかるタンパク質の変異体を指す。機能変異体には、多型等を含め、突然変異体（これは挿入、欠失、又は置換突然変異体であり得る）が含まれ得る。また、機能変異体の範囲内には、かかるタンパク質と、別の、通常は無関係の核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドとの融合産物も含まれる。機能変異体は天然に存在するものであってもよく、又は人工のものであってもよい。有利な実施形態は、エンジニアリングされた又は天然に存在しないＶ型／ＶＩ型ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質、例えば、Ｃｐｆ１／Ｃ２ｃ１／Ｃ２ｃ２又はそのオルソログ若しくはホモログを含み得る。
【００９５】
ある実施形態において、Ｖ型／ＶＩ型ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質、詳細にはＣｐｆ１／Ｃ２ｃ１／Ｃ２ｃ２又はそのオルソログ若しくはホモログをコードする１つ又は複数の核酸分子は、真核細胞での発現にコドン最適化され得る。真核生物は、本明細書に考察されるとおりのものであってもよい。１つ又は複数の核酸分子は、エンジニアリングされたもの又は天然に存在しないものであってもよい。
【００９６】
ある実施形態において、Ｖ型／ＶＩ型ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質、詳細にはＣｐｆ１／Ｃ２ｃ１／Ｃ２ｃ２又はそのオルソログ若しくはホモログは１つ以上の突然変異を含み得る（ひいてはそれをコードする１つ又は複数の核酸分子が１つ又は複数の突然変異を有し得る）。突然変異は人工的に導入された突然変異であってもよく、限定はされないが、触媒ドメインにおける１つ以上の突然変異が含まれ得る。Ｃａｓ９酵素に関連する触媒ドメインの例としては、限定はされないが、ＲｕｖＣ  Ｉ、ＲｕｖＣ  ＩＩ、ＲｕｖＣ  ＩＩＩ及びＨＮＨドメインを挙げることができる。
【００９７】
ある実施形態において、Ｃｐｆ１／Ｃ２ｃ１／Ｃ２ｃ２又はそのオルソログ若しくはホモログなどのＶ型／ＶＩ型タンパク質は、機能ドメインと融合した又はそれに作動可能に連結された汎用核酸結合タンパク質として用いられ得る。例示的機能ドメインとしては、限定はされないが、翻訳開始因子、翻訳活性化因子、翻訳抑制因子、ヌクレアーゼ、詳細にはリボヌクレアーゼ、スプライソソーム、ビーズ、光誘導性／制御性ドメイン又は化学物質誘導性／制御性ドメインを挙げることができる。
【００９８】
一部の実施形態において、非改変核酸ターゲティングエフェクタータンパク質は切断活性を有し得る。一部の実施形態において、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質は、標的配列内及び／又は標的配列の相補体内又は標的配列と会合した配列においてなど、標的配列の位置又はその近傍における一方又は両方の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）鎖の切断を導き得る。一部の実施形態において、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質は、標的配列の最初又は最後のヌクレオチドから約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００、又はそれを超える塩基対以内にある一方又は両方のＤＮＡ鎖又はＲＮＡ鎖の切断を導き得る。一部の実施形態において、切断は、付着末端型であり、即ち付着末端を生じ得る。一部の実施形態において、切断は、５’オーバーハングを伴う付着末端型切断である。一部の実施形態において、切断は、１〜５ヌクレオチド、好ましくは４又は５ヌクレオチドの５’オーバーハングを伴う付着末端型切断である。一部の実施形態において、切断部位はＰＡＭから離れており、例えば、切断は非標的鎖上の１８番目のヌクレオチドの後及び標的鎖上の２３番目のヌクレオチドの後で起こる（図９７Ａ）。一部の実施形態において、切断部位は非標的鎖上の（ＰＡＭから数えて）１８番目のヌクレオチドの後及び標的鎖上の（ＰＡＭから数えて）２３番目のヌクレオチドの後に起こる（図９７Ａ）。一部の実施形態において、ベクターは、対応する野生型酵素と比べて突然変異していてもよい核酸ターゲティングエフェクタータンパク質をコードし、そのため突然変異型核酸ターゲティングエフェクタータンパク質は、標的配列を含有する標的ポリヌクレオチドの一方又は両方のＤＮＡ鎖又はＲＮＡ鎖を切断する能力を欠くことになる。更なる例として、Ｃａｓタンパク質の２つ以上の触媒ドメイン（例えばＣａｓ９タンパク質のＲｕｖＣ  Ｉ、ＲｕｖＣ  ＩＩ、及びＲｕｖＣ  ＩＩＩ又はＨＮＨドメイン）を突然変異させることにより、実質的に全てのＤＮＡ切断活性を欠く突然変異型Ｃａｓタンパク質が作製されてもよい。本明細書に記載されるとおり、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質の対応する触媒ドメインもまた、突然変異させることにより、全てのＤＮＡ切断活性を欠いているか又はＤＮＡ切断活性が実質的に低下した突然変異型Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質を作製し得る。一部の実施形態において、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質は、突然変異酵素のＲＮＡ切断活性が非突然変異型の酵素の核酸切断活性の約２５％、１０％、５％、１％、０．１％、０．０１％以下、又はそれ未満であるとき、実質的に全てのＲＮＡ切断活性を欠いていると見なされ得る；一例は、突然変異型の核酸切断活性が非突然変異型と比較したときゼロ又は無視できる程度のときであり得る。エフェクタータンパク質は、Ｖ型／ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ系からの複数のヌクレアーゼドメインを有する最も大型のヌクレアーゼと相同性を共有する一般的な酵素クラスを参照して同定し得る。最も好ましくは、エフェクタータンパク質は、Ｃｐｆ１／Ｃ２ｃ１／Ｃ２ｃ２などのＶ型／ＶＩ型タンパク質である。更なる実施形態において、エフェクタータンパク質はＶ型タンパク質である。由来するとは、本出願人らは、由来酵素が野生型酵素と高度な配列相同性を有するという意味で概して野生型酵素をベースとするが、しかしそれは当該技術分野において公知のとおりの又は本明細書に記載されるとおりの何らかの方法で突然変異している（改変されている）ことを意味する。
【００９９】
この場合もまた、用語のＣａｓ及びＣＲＩＳＰＲ酵素及びＣＲＩＳＰＲタンパク質及びＣａｓタンパク質は、概して同義的に用いられ、Ｃａｓ９に具体的に言及することによるなど、特に明らかでない限り、本明細書で言及する際は常に類推から、本願に更に記載される新規ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を指すことが理解されるであろう。上述のとおり、本明細書において用いられる残基付番の多くは、Ｖ型／ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からのエフェクタータンパク質を参照する。しかしながら、本発明には、他の微生物種由来の更に多くのエフェクタータンパク質が含まれることが理解されるであろう。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質は構成的に存在しても、又は誘導可能に存在しても、又は条件的に存在しても、又は投与されても、又は送達されてもよい。エフェクタータンパク質最適化を用いて機能を増強し、又は新規機能を開発してもよく、キメラエフェクタータンパク質を作成することができる。及び本明細書に記載されるとおり、エフェクタータンパク質を汎用核酸結合タンパク質として用いられるように改変してもよい。
【０１００】
典型的には、核酸ターゲティング系のコンテクストでは、核酸ターゲティング複合体の形成（標的配列にハイブリダイズし、且つ１つ以上の核酸ターゲティングエフェクタータンパク質と複合体を形成したガイドＲＮＡを含む）は、標的配列内に又はその近傍に（例えば、それから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０塩基対、又はそれ以上の範囲内に）一方又は両方のＤＮＡ鎖又はＲＮＡ鎖の切断をもたらす。本明細書で使用されるとき、用語「目的の標的遺伝子座と会合した１つ又は複数の配列」は、標的配列付近の近傍（例えば標的配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０塩基対、又はそれ以上の範囲内、ここで標的配列は目的の標的遺伝子座内に含まれる）にある配列を指す。
【０１０１】
コドン最適化された配列の例は、この場合、真核生物、例えばヒトでの発現に最適化されるか（即ちヒトでの発現に最適化されている）、又は別の本明細書で考察されるとおりの真核生物、動物又は哺乳動物に最適化された配列である；例えば、コドン最適化配列の例として国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）のＳａＣａｓ９ヒトコドン最適化配列を参照のこと（当該技術分野及び本開示における知識から、特にエフェクタータンパク質（例えばＣｐｆ１）に関して、１つ又は複数のコード核酸分子のコドン最適化は当業者の範囲内にある）。これが好ましいが、他の例が可能であることが理解され、ヒト以外の宿主種に対するコドン最適化、又は特定の器官に対するコドン最適化が公知である。一部の実施形態において、ＤＮＡ／ＲＮＡターゲティングＣａｓタンパク質をコードする酵素コード配列が、特定の細胞、例えば真核細胞での発現にコドン最適化される。真核細胞は、特定の生物、例えば植物又は限定はされないがヒトを含めた哺乳動物、又は本明細書で考察されるとおりの非ヒト真核生物又は動物又は哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、家畜、又は非ヒト哺乳動物又は霊長類のものであるか、又はそれに由来し得る。一部の実施形態において、ヒト又は動物に対するいかなる実質的な医学的利益もなくそれらに苦痛を生じさせる可能性のあるヒトの生殖細胞系列遺伝子アイデンティティの改変方法及び／又は動物の遺伝子アイデンティティの改変方法、更にかかる方法から得られる動物は除外され得る。一般に、コドン最適化とは、天然配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０個以上、又はそれより多いコドン）を、天然のアミノ酸配列を維持しつつ、当該の宿主細胞の遺伝子においてより高頻度で又は最も高頻度で使用されるコドンに置き換えることにより、目的の宿主細胞における発現を増強するための核酸配列の改変方法を指す。様々な種が、特定のアミノ酸のあるコドンについて特定のバイアスを呈する。コドンバイアス（生物間でのコドン使用の違い）は、多くの場合にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関し、次にはそれが、数ある中でも特に、翻訳されるコドンの特性及び特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられている。細胞において選択のｔＲＮＡが優勢であることは、概して、ペプチド合成で最も高頻度に使用されるコドンを反映するものである。従って、コドン最適化に基づき所与の生物における最適な遺伝子発現に合わせて遺伝子を調整することができる。コドン使用表が、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎ／で利用可能な「コドン使用データベース（Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ）」で容易に利用可能であり、これらの表を幾つもの方法で適合させることができる。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．「国際的ＤＮＡ配列データベースから表にしたコドン使用：２０００年の状況（Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｔａｂｕｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ  ｆｏｒ  ｔ���ｅ  ｙｅａｒ  ２０００）」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）を参照のこと。特定の配列を特定の宿主細胞における発現にコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズムもまた利用可能であり、Ｇｅｎｅ  Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ，ＰＡ）などもまた利用可能である。一部の実施形態において、ＤＮＡ／ＲＮＡターゲティングＣａｓタンパク質をコードする配列中の１つ以上のコドン（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０以上、又は全てのコドン）が、特定のアミノ酸について最も高頻度に使用されるコドンに対応する。酵母におけるコドン使用に関しては、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ／ｃｏｄｏｎ＿ｕｓａｇｅ．ｓｈｔｍｌで利用可能なオンライン酵母ゲノムデータベース、又は「酵母におけるコドン選択（Ｃｏｄｏｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ）」，Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９８２  Ｍａｒ  ２５；２５７（６）：３０２６−３１が参照される。藻類を含めた植物におけるコドン使用に関しては、「高等植物、緑藻類、及びシアノバクテリアにおけるコドン使用（Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｉｎ  ｈｉｇｈｅｒ  ｐｌａｎｔｓ，ｇｒｅｅｎ  ａｌｇａｅ，ａｎｄ  ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）」，Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ａｎｄ  Ｇｏｗｒｉ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９０  Ｊａｎ；９２（１）：１−１１；並びに「植物遺伝子におけるコドン使用（Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｉｎ  ｐｌａｎｔ  ｇｅｎｅｓ）」，Ｍｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８９  Ｊａｎ  ２５；１７（２）：４７７−９８；又は「種々の植物及び藻類系統における葉緑体及びチアネレ遺伝子のコドンバイアスに関する選択（Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｃｏｄｏｎ  ｂｉａｓ  ｏｆ  ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ  ａｎｄ  ｃｙａｎｅｌｌｅ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｐｌａｎｔ  ａｎｄ  ａｌｇａｌ  ｌｉｎｅａｇｅｓ）」，Ｍｏｒｔｏｎ  ＢＲ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ．１９９８  Ａｐｒ；４６（４）：４４９−５９が参照される。
【０１０２】
一部の実施形態において、ベクターは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上、又はそれより多いＮＬＳなど、１個以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を含む核酸ターゲティングエフェクタータンパク質、例えばＶ型／ＶＩ型ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質、詳細にはＣｐｆ１／Ｃ２ｃ１／Ｃ２ｃ２又はそのオルソログ若しくはホモログをコードする。一部の実施形態において、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質は、アミノ末端又はその近傍に約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上、又はそれより多いＮＬＳを含むか、カルボキシ末端又はその近傍に約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上、又はそれより多いＮＬＳを含むか、又はこれらの組み合わせ（例えば、アミノ末端にゼロ個又は少なくとも１個以上のＮＬＳ及びカルボキシ末端にゼロ個又は１個以上のＮＬＳ）である。２個以上のＮＬＳが存在する場合、各々を他と独立して選択してもよく、従って単一のＮＬＳが２つ以上のコピーで存在してもよく、及び／又は１つ以上のコピーで存在する１つ以上の他のＮＬＳとの組み合わせで存在してもよい。一部の実施形態において、ＮＬＳは、ＮＬＳの最も近いアミノ酸がＮ末端又はＣ末端からポリペプチド鎖に沿って約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、又はそれより多いアミノ酸の範囲内にあるとき、Ｎ末端又はＣ末端の近傍にあると見なされる。ＮＬＳの非限定的な例としては、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２）を有するＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ；ヌクレオプラスミンのＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号３）を有するヌクレオプラスミンビパルタイトＮＬＳ）；アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号４）又はＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号５）を有するｃ−ｍｙｃ  ＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号６）を有するｈＲＮＰＡ１  Ｍ９  ＮＬＳ；インポーチン−αのＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号７）；筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号８）及びＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号９）；ヒトｐ５３の配列ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号１０）；マウスｃ−ａｂｌ  ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号１１）；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ（配列番号１２）及びＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号１３）；肝炎ウイルスデルタ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号１４）；マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号１５）；ヒトポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号１６）；及びステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号１７）に由来するＮＬＳ配列が挙げられる。一般に、１つ以上のＮＬＳは、真核細胞の核における検出可能な量のＤＮＡ／ＲＮＡターゲティングＣａｓタンパク質の蓄積をドライブするのに十分な強度である。一般に、核局在化活性の強度は、核酸ターゲティング��フェクタータンパク質内のＮＬＳの数、用いられる詳細なＮＬＳ、又はこれらの組み合わせ要因から導き出すことができる。核内での蓄積の検出は任意の好適な技法によって実施し得る。例えば、検出可能なマーカーを核酸ターゲティングタンパク質に融合してもよく、それにより、核の位置を検出する手段（例えば、ＤＡＰＩなど、核に特異的な染色）と組み合わせるなどして細胞内での位置を可視化してもよい。細胞核はまた、細胞から単離してもよく、次にその内容物を、免疫組織化学、ウエスタンブロット、又は酵素活性アッセイなど、任意の好適なタンパク質検出方法によって分析してもよい。核内における蓄積はまた、核酸ターゲティング複合体形成の効果に関するアッセイ（例えば、標的配列におけるＤＮＡ又はＲＮＡ切断又は突然変異に関するアッセイ、又はＤＮＡ又はＲＮＡターゲティング複合体形成及び／又はＤＮＡ又はＲＮＡターゲティングＣａｓタンパク質活性の影響を受けて変化した遺伝子発現活性に関するアッセイ）によるなどして、核酸ターゲティングＣａｓタンパク質又は核酸ターゲティング複合体に曝露されていない対照、又は１つ以上のＮＬＳを欠く核酸ターゲティングＣａｓタンパク質に曝露された対照と比較して間接的に決定してもよい。本明細書に記載されるＣｐｆ１エフェクタータンパク質複合体及び系の好ましい実施形態において、コドン最適化Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質は、タンパク質のＣ末端に付加されたＮＬＳを含む。特定の実施形態において、限定なしに、オルガネラ、例えば、ミトコンドリア、プラスチド、葉緑体、小胞、ゴルジ、（核又は細胞）膜、リボソーム、核小体、ＥＲ、細胞骨格、液胞、中心体、ヌクレオソーム、顆粒、中心小体などの細胞内の特定の部位にＣａｓを局在化させるためなど、他の局在化タグがＣａｓタンパク質に融合されてもよい。
【０１０３】
一部の実施形態において、核酸ターゲティング系の１つ以上のエレメントの発現をドライブする１つ以上のベクターが宿主細胞に導入され、核酸ターゲティング系のエレメントが発現すると、１つ以上の標的部位において核酸ターゲティング複合体の形成が導かれる。例えば、核酸ターゲティングエフェクター酵素及び核酸ターゲティングガイドＲＮＡが、各々別個のベクター上で別個の調節エレメントに作動可能に連結されてもよい。核酸ターゲティング系の１つ又は複数のＲＮＡは、トランスジェニック核酸ターゲティングエフェクタータンパク質動物又は哺乳動物、例えば、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を構成的に又は誘導性に又は条件的に発現する動物又は哺乳動物；又は本来核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を発現しているか又は核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を含有する細胞を有する動物又は哺乳動物へと、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質をインビボでコードし及び発現する１つ又は複数のベクターをそれに事前投与するなどして送達することができる。或いは、同じ又は異なる調節エレメントから発現するエレメントのうちの２つ以上が単一のベクターに組み合わされてもよく、１つ以上の追加のベクターが、第１のベクターに含まれない核酸ターゲティング系の任意の構成成分を提供する。単一のベクターに組み合わされる核酸ターゲティング系エレメントは、あるエレメントが第２のエレメントに対して５’側（その「上流」）に位置し、又はそれに対して３’側（その「下流」）に位置するなど、任意の好適な向きで配置されてもよい。あるエレメントのコード配列は第２のエレメントのコード配列と同じ鎖上又は逆鎖上に位置してもよく、同じ又は逆の方向に向いていてもよい。一部の実施形態において、単一のプロモーターが、１つ以上のイントロン配列内に組み込まれた（例えば、各々が異なるイントロンにあるか、２つ以上が少なくとも１つのイントロンにあるか、又は全てが単一のイントロンにある）、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質及び核酸ターゲティングガイドＲＮＡをコードする転写物の発現をドライブする。一部の実施形態において、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質と核酸ターゲティングガイドＲＮＡとは同じプロモーターに作動可能に連結されていて、そこから発現してもよい。核酸ターゲティング系の１つ以上のエレメントを発現させるための送達媒体、ベクター、粒子、ナノ粒子、製剤及びその構成成分については、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）など、前述の文献で使用されているとおりである。一部の実施形態において、ベクターは制限エンドヌクレアーゼ認識配列などの１つ以上の挿入部位（「クローニング部位」とも称される）を含む。一部の実施形態において、１つ以上の挿入部位（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上、又はそれより多い挿入部位）は、１つ以上のベクターの１つ以上の配列エレメントの上流及び／又は下流に位置する。複数の異なるガイド配列を使用すると、単一の発現構築物を用いて細胞内の複数の異なる対応する標的配列へと核酸ターゲティング活性を標的化させることができる。例えば、単一のベクターが、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０個以上、又はそれより多いガイド配列を含み得る。一部の実施形態において、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上、又はそれより多いかかるガイド配列含有ベクターが提供され、及び任意選択で細胞に送達されてもよい。一部の実施形態において、ベクターは、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質をコードする酵素コード配列に作動可能に連結された調節エレメントを含む。核酸ターゲティングエフェクタータンパク質又は１つ又は複数の核酸ターゲティングガイドＲＮＡは別個に送達してもよく；及び有利には、これらのうちの少なくとも１つが粒子複合体によって送達される。核酸ターゲティングエフェクタータンパク質に発現する時間を与えるため、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質ｍＲＮＡを核酸ターゲティングガイドＲＮＡより先に送達してもよい。核酸ターゲティングエフェクタータンパク質ｍＲＮＡは核酸ターゲティングガイドＲＮＡの投与の１〜１２時間前（好ましくは約２〜６時間前）に投与されてもよい。或いは、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質ｍＲＮＡ及び核酸ターゲティングガイドＲＮＡは一緒に投与されてもよい。有利には、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質ｍＲＮＡ＋ガイドＲＮＡの初回投与から１〜１２時間後（好ましくは約２〜６時間後）にガイドＲＮＡの第２のブースター用量が投与されてもよい。核酸ターゲティングエフェクタータンパク質ｍＲＮＡ及び／又はガイドＲＮＡの追加の投与は、最も効率的なゲノム改変レベルを達成するのに有用であり得る。
【０１０４】
一態様において、本発明は、核酸ターゲティング系の１つ以上のエレメントの使用方法を提供する。本発明の核酸ターゲティング複合体は、標的ＤＮＡ又はＲＮＡ（一本鎖又は二本鎖、線状又はスーパーコイル状）を改変する有効な手段を提供する。本発明の核酸ターゲティング複合体は、非常に多数の細胞型における標的ＤＮＡ又はＲＮＡの改変（例えば、欠失、挿入、転位、不活性化、活性化）を含め、多岐にわたる有用性を有する。このように本発明の核酸ターゲティング複合体は、例えば、遺伝子療法、薬物スクリーニング、疾患診断、及び予後判定において、広範な適用性を有する。例示的核酸ターゲティング複合体は、目的の標的遺伝子座内の標的配列にハイブリダイズするガイドＲＮＡと複合体を形成したＤＮＡ又はＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を含む。
【０１０５】
一実施形態において、本発明は、標的ＲＮＡを切断する方法を提供する。本方法は、標的ＲＮＡに結合して前記標的ＤＮＡの切断を生じさせる核酸ターゲティング複合体を用いて標的ＲＮＡを改変するステップを含み得る。ある実施形態において、本発明の核酸ターゲティング複合体は、細胞に導入されると、ＲＮＡ配列に切断（例えば一本鎖又は二本鎖切断）を作り出し得る。例えば、本方法を用いて細胞内の疾患ＲＮＡを切断することができる。例えば、組み込もうとする配列に上流配列及び下流配列が隣接した外因性ＲＮＡ鋳型が細胞に導入されてもよい。これらの上流及び下流配列は、ＲＮＡにおける組込み部位の両側と配列類似性を共有している。必要に応じて、ドナーＲＮＡはｍＲＮＡであってもよい。外因性ＲＮＡ鋳型は、組み込もうとする配列（例えば、突然変異型ＲＮＡ）を含む。組込み配列は、細胞にとって内因性又は外因性の配列であってもよい。組み込もうとする配列の例としては、タンパク質をコードするＲＮＡ又は非コードＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ）が挙げられる。従って、組込み配列は、１つ又は複数の適切な制御配列に作動可能に連結され得る。或いは、組込み配列が調節機能を提供し得る。外因性ＲＮＡ鋳型中の上流及び下流配列は、目的のＲＮＡ配列とドナーＲＮＡとの間の組換えを促進するように選択される。上流配列は、標的組込み部位の上流のＲＮＡ配列と配列類似性を共有するＲＮＡ配列である。同様に、下流配列は、標的組込み部位の下流のＲＮＡ配列と配列類似性を共有するＲＮＡ配列である。外因性ＲＮＡ鋳型中の上流及び下流配列は、標的ＲＮＡ配列と７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の配列同一性を有し得る。好ましくは、外因性ＲＮＡ鋳型中の上流及び下流配列は、標的ＲＮＡ配列と約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する。一部の方法において、外因性ＲＮＡ鋳型中の上流及び下流配列は、標的ＲＮＡ配列と約９９％又は１００％の配列同一性を有する。上流又は下流配列は、約２０ｂｐ〜約２５００ｂｐ、例えば、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、又は２５００ｂｐを含み得る。一部の方法において、例示的上流又は下流配列は、約２００ｂｐ〜約２０００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約１０００ｂｐ、又はより詳細には約７００ｂｐ〜約１０００ｂｐを有する。一部の方法において、外因性ＲＮＡ鋳型はマーカーを更に含み得る。かかるマーカーは標的組込みのスクリーニングを容易にし得る。好適なマーカーの例としては、制限部位、蛍光タンパク質、又は選択可能マーカーが挙げられる。本発明の外因性ＲＮＡ鋳型は組換え技術を用いて構築することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６を参照）。外因性ＲＮＡ鋳型を組み込むことによる標的ＲＮＡの改変方法では、核酸ターゲティング複合体によってＤＮＡ又はＲＮＡ配列に切断（例えば、二本鎖又は一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡにおける二本鎖又は���本鎖切断）が導入され、外因性ＲＮＡ鋳型との相同組換えによってこの切断が修復されると、鋳型がＲＮＡ標的に組み込まれる。二本鎖切断の存在が鋳型の組込みを促進する。他の実施形態において、本発明は、真核細胞におけるＲＮＡの発現を改変する方法を提供する。本方法は、ＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ又はプレｍＲＮＡ）に結合する核酸ターゲティング複合体を用いて標的ポリヌクレオチドの発現を増加又は減少させるステップを含む。一部の方法では、標的ＲＮＡを不活性化させて細胞の発現の改変を生じさせることができる。例えば、ＲＮＡターゲティング複合体が細胞内の標的配列に結合すると、標的ＲＮＡが不活性化され、そのためその配列は翻訳されないか、コードされたタンパク質が産生されないか、又は配列が野生型配列のようには機能しなくなる。例えば、タンパク質又はマイクロＲＮＡをコードする配列を不活性化して、タンパク質又はマイクロＲＮＡ又はプレマイクロＲＮＡ転写物が産生されないようにし得る。ＲＮＡターゲティング複合体の標的ＲＮＡは、真核細胞にとって内因性又は外因性の任意のＲＮＡであってもよい。例えば、標的ＲＮＡは、真核細胞の核に存在するＲＮＡであってもよい。標的ＲＮＡは、遺伝子産物（例えばタンパク質）をコードする配列（例えば、ｍＲＮＡ又はプレｍＲＮＡ）又は非コード配列（例えば、ｎｃＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ、又はｒＲＮＡ）であってもよい。標的ＲＮＡの例としては、生化学的シグナル伝達経路に関連する配列、例えば、生化学的シグナル伝達経路関連ＲＮＡが挙げられる。標的ＲＮＡの例としては、疾患関連ＲＮＡが挙げられる。「疾患関連」ＲＮＡは、非疾患対照の組織又は細胞と比較して罹患組織に由来する細胞において翻訳産物を異常なレベルで、又は異常な形態で産生している任意のＲＮＡを指す。それは異常に高いレベルで発現するようになる遺伝子から転写されるＲＮＡであってもよく；それは異常に低いレベルで発現するようになる遺伝子から転写されるＲＮＡであってもよく、ここで発現の変化は疾患の発生率及び／又は進行と相関する。疾患関連ＲＮＡはまた、疾患の病因に直接関与するか、又はそれに関与する１つ又は複数の遺伝子との連鎖不平衡がある１つ又は複数の突然変異又は遺伝的変異を有する遺伝子から転写されるＲＮＡも指す。翻訳産物は既知であっても又は未知であってもよく、及び正常レベルであっても又は異常レベルであってもよい。ＲＮＡターゲティング複合体の標的ＲＮＡは、真核細胞にとって内因性又は外因性の任意のＲＮＡであってもよい。例えば、標的ＲＮＡは、真核細胞の核に存在するＲＮＡであってもよい。標的ＲＮＡは、遺伝子産物（例えばタンパク質）をコードする配列（例えば、ｍＲＮＡ又はプレｍＲＮＡ）又は非コード配列（例えば、ｎｃＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ、又はｒＲＮＡ）であってもよい。
【０１０６】
一部の実施形態において、本方法は、核酸ターゲティング複合体を標的ＤＮＡ又はＲＮＡに結合させて前記標的ＤＮＡ又はＲＮＡの切断を生じさせ、それにより標的ＤＮＡ又はＲＮＡを改変するステップを含むことができ、ここで核酸ターゲティング複合体は、前記標的ＤＮＡ又はＲＮＡ内の標的配列にハイブリダイズするガイドＲＮＡと複合体を形成した核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を含む。一態様において、本発明は、真核細胞におけるＤＮＡ又はＲＮＡの発現を改変する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、核酸ターゲティング複合体をＤＮＡ又はＲＮＡに結合させて、前記結合により前記ＤＮＡ又はＲＮＡの発現の増加又は減少を生じさせるステップを含み；ここで核酸ターゲティング複合体は、ガイドＲＮＡと複合体を形成した核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を含む。同様の考察及び条件が、標的ＤＮＡ又はＲＮＡを改変する方法にも上記のとおり適用される。実際上、これらの試料採取、培養及び再導入の選択肢は本発明の全態様に適用される。一態様において、本発明は、真核細胞の標的ＤＮＡ又はＲＮＡを改変する方法を提供し、これはインビボ、エキソビボ又はインビトロであってもよい。一部の実施形態において、本方法は、ヒト又は非ヒト動物から細胞又は細胞集団を試料採取するステップ、及び１つ又は複数の細胞を改変するステップを含む。培養は任意の段階でエキソビボで行われ得る。この１つ又は複数の細胞が、更には非ヒト動物又は植物に再導入されてもよい。再導入される細胞について、細胞は幹細胞であることが特に好ましい。
【０１０７】
実際、本発明の任意の態様において、核酸ターゲティング複合体は、標的配列にハイブリダイズするガイドＲＮＡと複合体を形成した核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を含み得る。
【０１０８】
本発明は、核酸ターゲティング系及びその構成成分に関係した、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列ターゲティングが関わる遺伝子発現の制御に用いられる系、方法及び組成物のエンジニアリング及び最適化に関する。有利な実施形態において、エフェクター酵素は、Ｃｐｆ１／Ｃ２ｃ１／Ｃ２ｃ２などのＶ型／ＶＩ型タンパク質である。本方法の利点は、ＣＲＩＳＰＲ系がオフターゲット結合及びその結果として生じる副作用を最小限に抑え、又はそれを回避することである。これは、標的ＤＮＡ又はＲＮＡに対して高度な配列特異性を有するように構成された系を用いて達成される。
【０１０９】
核酸ターゲティング複合体又は系に関して、好ましくは、ｃｒＲＮＡ配列は１つ以上のステムループ又はヘアピンを有し、３０ヌクレオチド長以上、４０ヌクレオチド長以上、又は５０ヌクレオチド長以上であり；ｃｒＲＮＡ配列は１０〜３０ヌクレオチド長であり、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質はＶ型／ＶＩ型Ｃａｓ酵素である。特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡ配列は４２〜４４ヌクレオチド長であり、及び核酸ターゲティングＣａｓタンパク質は野兎病菌亜種ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｎｏｖｏｃｉｄａ）Ｕ１１２のＣｐｆ１である。特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡは、１９ヌクレオチドのダイレクトリピート及び２３〜２５ヌクレオチドのスペーサー配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり、及び核酸ターゲティングＣａｓタンパク質は野兎病菌亜種ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｎｏｖｏｃｉｄａ）Ｕ１１２のＣｐｆ１である。
【０１１０】
２つの異なるアプタマー（各々が個別の核酸ターゲティングガイドＲＮＡと会合している）を用いると、アクチベーター−アダプタータンパク質融合物及びリプレッサー−アダプタータンパク質融合物を異なる核酸ターゲティングガイドＲＮＡと共に使用して、１つのＤＮＡ又はＲＮＡの発現を活性化する一方で別のＤＮＡ又はＲＮＡの発現を抑制することが可能になる。これらは、その異なるガイドＲＮＡと共に、多重化手法で一緒に、又は実質的に一緒に投与することができる。比較的少数のエフェクタータンパク質分子を多数の改変ガイドと共に使用することができるため、例えば１０又は２０又は３０個など、多数のかかる改変された核酸ターゲティングガイドＲＮＡを全て同時に使用し得る一方で１つのみの（又は少なくとも最小数の）エフェクタータンパク質分子を送達するだけで十分である。アダプタータンパク質は１つ以上のアクチベーター又は１つ以上のリプレッサーと会合（好ましくは連結又は融合）していてもよい。例えば、アダプタータンパク質は第１のアクチベーター及び第２のアクチベーターと会合していてもよい。第１及び第２のアクチベーターは同じであってもよいが、これらは好ましくは異なるアクチベーターである。３つ以上又は更には４つ以上のアクチベーター（又はリプレッサー）を使用してもよく、しかしパッケージサイズにより、個数が５を超える異なる機能ドメインとなることは制限され得る。アダプタータンパク質との直接的な融合と比べて、好ましくはリンカーが用いられ、ここでは２つ以上の機能ドメインがアダプタータンパク質と会合する。好適なリンカーとしてはＧｌｙＳｅｒリンカーを挙げることができる。
【０１１１】
核酸ターゲティングエフェクタータンパク質−ガイドＲＮＡ  複合体が全体として２つ以上の機能ドメインと会合し得ることもまた想定される。例えば、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質と会合した２つ以上の機能ドメインがあってもよく、又はガイドＲＮＡと（１つ以上のアダプタータンパク質を介して）会合した２つ以上の機能ドメインがあってもよく、又は核酸ターゲティングエフェクタータンパク質と会合した１つ以上の機能ドメイン及びガイドＲＮＡと（１つ以上のアダプタータンパク質を介して）会合した１つ以上の機能ドメインがあってもよい。
【０１１２】
アダプタータンパク質とアクチベーター又はリプレッサーとの間の融合は、リンカーを含み得る。例えば、ＧｌｙＳｅｒリンカーＧＧＧＳ（配列番号１８）を使用することができる。これらを３個（（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号１９））又は６個（配列番号２０）、９個（配列番号２１）又は更には１２個（配列番号２２）又はそれ以上の反復で使用することにより、必要に応じて好適な長さを提供することができる。リンカーは、ガイドＲＮＡと機能ドメイン（アクチベーター又はリプレッサー）との間、又は核酸ターゲティングＣａｓタンパク質（Ｃａｓ）と機能ドメイン（アクチベーター又はリプレッサー）との間に使用することができる。リンカー、使用者は適切な量の「機械的柔軟性」を操作する。
【０１１３】
本発明は、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質とガイドＲＮＡとを含む核酸ターゲティング複合体を包含し、ここで核酸ターゲティングエフェクタータンパク質は少なくとも１つの突然変異［そのため核酸ターゲティングエフェクタータンパク質は、その少なくとも１つの突然変異を有しない核酸ターゲティングエフェクタータンパク質の５％以下の活性を有する］、及び任意選択で少なくとも１つ以上の核局在化配列を含み；ガイドＲＮＡは、細胞内の目的のＲＮＡにおける標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含み；及びここで：核酸ターゲティングエフェクタータンパク質は２つ以上の機能ドメインと会合し；又はガイドＲＮＡの少なくとも１つのループが、１つ以上のアダプタータンパク質に結合する１つ又は複数の個別的なＲＮＡ配列の挿入によって改変され、及びここでアダプタータンパク質は２つ以上の機能ドメインと会合し；又は核酸ターゲティングＣａｓタンパク質は１つ以上の機能ドメインと会合し、及びガイドＲＮＡの少なくとも１つのループが、１つ以上のアダプタータンパク質に結合する１つ又は複数の個別のＲＮＡ配列の挿入によって改変され、及びここでアダプタータンパク質は１つ以上の機能ドメインと会合する。
【０１１４】
一態様において、本発明は、突然変異型疾患遺伝子を含むモデル真核細胞を作成する方法を提供する。一部の実施形態において、疾患遺伝子は、疾患の罹患又は発症リスクの増加に関連する任意の遺伝子である。一部の実施形態において、本方法は、（ａ）１つ以上のベクターを真核細胞に導入するステップ［１つ以上のベクターは、Ｃｐｆ１酵素及びダイレクトリピート配列に連結されたガイド配列を含む保護型ガイドＲＮＡのうちの１つ以上の発現をドライブする］；及び（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて前記疾患遺伝子内の標的ポリヌクレオチドの切断を生じさせるステップ［ＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズする配列を含むガイドＲＮＡと複合体を形成したＣｐｆ１酵素を含む］を含み、それにより突然変異型疾患遺伝子を含むモデル真核細胞を生成する。一部の実施形態において、前記切断は、前記Ｃｐｆ１酵素によって標的配列の位置にある１本又は２本の鎖を切断することを含む。一部の実施形態において、前記切断は標的遺伝子の転写の減少をもたらす。一部の実施形態において、本方法は、前記切断された標的ポリヌクレオチドを非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ベースの遺伝子挿入機構によって外因性鋳型ポリヌクレオチドで修復するステップを更に含み、前記修復は、前記標的ポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、又は置換を含む突然変異をもたらす。一部の実施形態において、前記突然変異は、標的配列を含む遺伝子からのタンパク質発現に１つ以上のアミノ酸変化をもたらす。
【０１１５】
ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここで宿主は真核細胞である。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここで宿主は哺乳類細胞である。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここで宿主は非ヒト真核細胞である。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここで非ヒト真核細胞は非ヒト哺乳類細胞である。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここで非ヒト哺乳類細胞には、限定はされないが、霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタ（ｐｒｏｃｉｎｅ）、イヌ、げっ歯類、ウサギ科動物、例えば、サル、雌ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ウサギ、ラット又はマウス細胞が含まれ得る。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、細胞は、家禽（例えばニワトリ）、脊椎動物魚類（例えば、サケ）又は甲殻類（例えば、カキ、ハマグリ（ｃｌａｉｍ）、ロブスター、エビ）細胞などの非哺乳類真核細胞であってもよい。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、非ヒト真核細胞は植物細胞である。植物細胞は、単子葉植物又は双子葉植物のもの又は作物又は穀物植物のもの、例えば、キャッサバ、トウモロコシ、モロコシ、ダイズ、コムギ、オートムギ又はコメであってもよい。植物細胞はまた、藻類、木又は生産植物、果実又は野菜のもの（例えば、柑橘類の木、例えば、オレンジ、グレープフルーツ又はレモンの木などの木；モモ又はネクタリンの木；リンゴ又はセイヨウナシの木；アーモンド又はクルミ又はピスタチオの木などの堅果類の木；ナス科植物；アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の植物；アキノノゲシ属（Ｌａｃｔｕｃａ）の植物；ホウレンソウ属（Ｓｐｉｎａｃｉａ）の植物；トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）の植物；綿、タバコ、アスパラガス、ニンジン、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、トマト、ナス、コショウ、レタス、ホウレンソウ、イチゴ、ブルーベリー、ラズベリー、ブラックベリー、ブドウ、コーヒー、ココア等）であってもよい。
【０１１６】
一態様において、本発明は、疾患遺伝子に関連する細胞シグナル伝達イベントを調節する生物学的に活性な薬剤の開発方法を提供する。一部の実施形態において、疾患遺伝子は、疾患の罹患又は発症リスクの増加に関連する任意の遺伝子である。一部の実施形態において、本方法は、（ａ）上述の実施形態のいずれか一つのモデル細胞に試験化合物を接触させるステップ；及び（ｂ）前記疾患遺伝子の前記突然変異に関連する細胞シグナル伝達イベントの低下又は増大の指標となる読取りの変化を検出するステップを含み、それにより前記疾患遺伝子に関連する前記細胞シグナル伝達イベントを調節する前記生物学的に活性な薬剤が開発される。
【０１１７】
一態様において、本発明は、１つ以上の細胞内の遺伝子に１つ以上の突然変異を導入することによって１つ以上の細胞を選択する方法を提供し、この方法は、１つ又は複数の細胞に１つ以上のベクターを導入するステップ［１つ以上のベクターは、Ｃｐｆ１、ダイレクトリピート配列に連結されたガイド配列、及び編集用鋳型のうちの１つ以上の発現をドライブし；ここで編集用鋳型は、Ｃｐｆ１切断を無効にする１つ以上の突然変異を含む］；選択されるべき１つ又は複数の細胞内の標的ポリヌクレオチドと編集用鋳型を相同組換えさせるステップ；Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて前記遺伝子内の標的ポリヌクレオチドの切断を生じさせるステップ［Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体は、（１）標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズするガイド配列、及び（２）ダイレクトリピート配列と複合体を形成したＣｐｆ１を含み、ここでＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体が標的ポリヌクレオチドに結合すると細胞死が誘導される］を含み、それにより、１つ以上の突然変異が導入された１つ以上の細胞の選択が可能になり；これは本スプリットＣｐｆ１を含む。本発明の別の好ましい実施形態において、選択される細胞は真核細胞であってもよい。本発明の態様は、選択マーカー又は対抗選択系を含み得る二段階プロセスが不要な特異的細胞の選択を可能にする。詳細な実施形態では、モデル真核細胞はモデル真核生物内に含まれる。
【０１１８】
一態様において、本発明は、ダイレクトリピート配列の下流にガイド配列を含む組換えポリヌクレオチドを提供し、ここでガイド配列は、発現すると、真核細胞に存在する対応する標的配列へのＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体の配列特異的結合を導く。一部の実施形態において、標的配列は真核細胞に存在するウイルス配列である。一部の実施形態において、標的配列は癌原遺伝子又は癌遺伝子である。
【０１１９】
一態様において、本発明は、（ａ）ダイレクトリピート配列と、ＤＲ配列の下流の１つ以上のガイド配列（本明細書に記載されるとおりの改変ガイド配列のいずれかを含む）を挿入するための１つ以上の挿入部位とに作動可能に連結された第１の調節エレメント［ガイド配列は、発現すると、真核細胞内の標的配列へのＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体の配列特異的結合を導き、ここでＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体は、標的配列（及び任意選択でＤＲ配列）にハイブリダイズするガイド配列と複合体を形成したＣｐｆ１（本明細書に記載されるとおりの修飾酵素のいずれかを含む）を含む］；及び／又は（ｂ）核局在化配列及び／又はＮＥＳを含む前記Ｃｐｆ１酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に連結された第２の調節エレメント、を含むベクター系又は真核生物宿主細胞を提供する。一部の実施形態において、この宿主細胞は構成成分（ａ）及び（ｂ）を含む。一部の実施形態において、構成成分（ａ）、構成成分（ｂ）、又は構成成分（ａ）及び（ｂ）は、宿主真核細胞のゲノムに安定に組み込まれる。一部の実施形態において、構成成分（ａ）は、第１の調節エレメントに作動可能に連結された２つ以上のガイド配列を更に含み、ここでこれらの２つ以上のガイド配列の各々は、発現すると、真核細胞内の異なる標的配列へのＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体の配列特異的結合を導く。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、真核細胞の核内における及び／又は核外への検出可能な量の前記ＣＲＩＳＰＲ酵素の蓄積をドライブするのに十分な強度の１つ以上の核局在化配列及び／又は核外移行配列又はＮＥＳを含む。一部の実施形態において、Ｃｐｆ１酵素は、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）１、野兎病菌亜種ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）、プレボテラ・アルベンシス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ａｌｂｅｎｓｉｓ）、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＣ２０１７  １、ブチリビブリオ・プロテオクラスチカス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ）、ペレグリニバクテリア細菌（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、パルクバクテリア細菌（Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、スミセラ属種（Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ  ｓｐ．）ＳＣＡＤＣ、アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＡ２０２０、カンディダタス・メタノプラズマ・テルミツム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ  ｔｅｒｍｉｔｕｍ）、ユーバクテリウム・エリゲンス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ）、モラクセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ）２３７、レプトスピラ・イナダイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ）、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６、ポルフィロモナス・クレビオリカニス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ）３、プレボテラ・ディシエンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ）、又はポルフィロモナス・マカカエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅ）Ｃｐｆ１（本明細書に記載されるとおりの修飾酵素のいずれかを含む）に由来し、Ｃｐｆ１の更なる変化又は突然変異を含むこともあり、及びキメラＣｐｆ１であってもよい。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は真核細胞での発現にコドン最適化される。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は標的配列の位置における１本又は２本の鎖の切断を導く。好ましい実施形態において、鎖切断は５’オーバーハングを伴う付着末端型切断である。一部の実施形態において、Ｃｐｆ１はＤＮＡ鎖切断活性を欠いている（例えば、野生型酵素又はヌクレアーゼ活性を減少させる突然変異若しくは変化を有しない酵素と比較したとき５％以下のヌクレアーゼ活性）。一部の実施形態において、第１の調節エレメントはポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。一部の実施形態において、第２の調節エレメントはポリメラーゼＩＩプロモーターである。一部の実施形態において、ダイレクトリピートは１６ｎｔの最小長さ及び単一のステムループを有する。更なる実施形態において、ダイレクトリピートは１６ｎｔより長い長さ、好ましくは１７ｎｔ超を有し、且つ２つ以上のステムループ又は最適化された二次構造を有する。一部の実施形態において、ガイド配列は少なくとも１６、１７、１８、１９、２０、２５ヌクレオチド、又は１６〜３０、又は１６〜２５、又は１６〜２０ヌクレオチド長である。
【０１２０】
一態様において、本発明は、本明細書に記載される構成成分の１つ以上を含むキットを提供する。一部の実施形態において、本キットは、本明細書に記載されるとおりのベクター系又は宿主細胞とキットの使用説明書とを含む。
【０１２１】
改変Ｃｐｆ１酵素
Ｃｐｆ１ヌクレアーゼの一次構造のコンピュータ分析から、３つの個別的な領域が明らかになる（図１）。第一にＣ末端ＲｕｖＣ様ドメインであり、これは唯一機能的に特徴付けられたドメインである。第二にＮ末端α−ヘリックス領域であり、及び第三に、ＲｕｖＣ様ドメインとα−ヘリックス領域との間に位置する混合α及びβ領域である。
【０１２２】
Ｃｐｆ１一次構造内に、構造化されていない領域の幾つかの小さいストレッチが予想される。溶媒に露出していて、且つ異なるＣｐｆ１オルソログ内で保存されていない非構造化領域は、スプリット及び小さいタンパク質配列の挿入に好ましいサイドである（図２及び図３）。加えて、これらのサイドを使用してＣｐｆ１オルソログ間のキメラタンパク質を作成することができる。
【０１２３】
上記の情報に基づき、酵素の不活性化につながる又は二本鎖ヌクレアーゼをニッカーゼ活性に改変する突然変異体を作成することができる。代替的実施形態では、この情報を用いてオフターゲット効果が低下した酵素（本明細書の他の部分に記載される）が開発される。
【０１２４】
上述のＣｐｆ１酵素の特定のものにおいて、酵素は、限定はされないが、ＦｎＣｐｆ１タンパク質又は任意の対応するオルソログに基づいて位置Ｄ９１７、Ｅ１００６、Ｅ１０２８、Ｄ１２２７、Ｄ１２５５Ａ、Ｎ１２５７を含む１つ以上の残基の突然変異によって改変される。ある態様において、本発明は、本明細書において考察される組成物を提供し、ここでＣｐｆ１酵素は、ＦｎＣｐｆ１タンパク質又はＣｐｆ１オルソログにおける対応する位置に基づいてＤ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、Ｅ１０２８Ａ、Ｄ１２２７Ａ、Ｄ１２５５Ａ、Ｎ１２５７Ａ、Ｄ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、Ｅ１０２８Ａ、Ｄ１２２７Ａ、Ｄ１２５５Ａ及びＮ１２５７Ａからなる群から選択される１つ以上の突然変異を含む不活性化酵素である。ある態様において、本発明は、本明細書において考察される組成物を提供し、ここでＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＦｎＣｐｆ１タンパク質又はＣｐｆ１オルソログにおける対応する位置に基づいてＤ９１７、又はＥ１００６及びＤ９１７、又はＤ９１７及びＤ１２５５を含む。
【０１２５】
上述のＣｐｆ１酵素の特定のものにおいて、酵素は、限定はされないが、ＡｓＣｐｆ１（アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６）のアミノ酸位置付番を基準として位置Ｒ９０９、Ｒ９１２、Ｒ９３０、Ｒ９４７、Ｋ９４９、Ｒ９５１、Ｒ９５５、Ｋ９６５、Ｋ９６８、Ｋ１０００、Ｋ１００２、Ｒ１００３、Ｋ１００９、Ｋ１０１７、Ｋ１０２２、Ｋ１０２９、Ｋ１０３５、Ｋ１０５４、Ｋ１０７２、Ｋ１０８６、Ｒ１０９４、Ｋ１０９５、Ｋ１１０９、Ｋ１１１８、Ｋ１１４２、Ｋ１１５０、Ｋ１１５８、Ｋ１１５９、Ｒ１２２０、Ｒ１２２６、Ｒ１２４２、及び／又はＲ１２５２を含む（ＲｕｖＣドメイン内の）１つ以上の残基の突然変異によって改変される。
【０１２６】
上述の天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素の特定のものにおいて、酵素は、限定されないが、ＡｓＣｐｆ１（アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６）のアミノ酸位置付番を基準として位置Ｋ３２４、Ｋ３３５、Ｋ３３７、Ｒ３３１、Ｋ３６９、Ｋ３７０、Ｒ３８６、Ｒ３９２、Ｒ３９３、Ｋ４００、Ｋ４０４、Ｋ４０６、Ｋ４０８、Ｋ４１４、Ｋ４２９、Ｋ４３６、Ｋ４３８、Ｋ４５９、Ｋ４６０、Ｋ４６４、Ｒ６７０、Ｋ６７５、Ｒ６８１、Ｋ６８６、Ｋ６８９、Ｒ６９９、Ｋ７０５、Ｒ７２５、Ｋ７２９、Ｋ７３９、Ｋ７４８、及び／又はＫ７５２を含む（ＲＡＤ５０ドメイン内の）１つ以上の残基の突然変異によって改変される。
【０１２７】
Ｃｐｆ１酵素の特定のものにおいて、酵素は、限定されないが、ＡｓＣｐｆ１（アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６）のアミノ酸位置付番を基準として位置Ｒ９１２、Ｔ９２３、Ｒ９４７、Ｋ９４９、Ｒ９５１、Ｒ９５５、Ｋ９６５、Ｋ９６８、Ｋ１０００、Ｒ１００３、Ｋ１００９、Ｋ１０１７、Ｋ１０２２、Ｋ１０２９、Ｋ１０７２、Ｋ１０８６、Ｆ１１０３、Ｒ１２２６、及び／又はＲ１２５２を含む１つ以上の残基の突然変異によって改変される。
【０１２８】
特定の実施形態において、Ｃｐｆ１酵素は、限定されないが、ＬｂＣｐｆ１（ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６）のアミノ酸位置付番を基準として位置Ｒ８３３、Ｒ８３６、Ｋ８４７、Ｋ８７９、Ｋ８８１、Ｒ８８３、Ｒ８８７、Ｋ８９７、Ｋ９００、Ｋ９３２、Ｒ９３５、Ｋ９４０、Ｋ９４８、Ｋ９５３、Ｋ９６０、Ｋ９８４、Ｋ１００３、Ｋ１０１７、Ｒ１０３３、Ｒ１１３８、Ｒ１１６５、及び／又はＲ１２５２を含む１つ以上の残基の突然変異によって改変される。
【０１２９】
特定の実施形態において、Ｃｐｆ１酵素は、限定されないが、ＡｓＣｐｆ１（アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６）のアミノ酸位置付番を基準として位置Ｋ１５、Ｒ１８、Ｋ２６、Ｑ３４、Ｒ４３、Ｋ４８、Ｋ５１、Ｒ５６、Ｒ８４、Ｋ８５、Ｋ８７、Ｎ９３、Ｒ１０３、Ｎ１０４、Ｔ１１８、Ｋ１２３、Ｋ１３４、Ｒ１７６、Ｋ１７７、Ｒ１９２、Ｋ２００、Ｋ２２６、Ｋ２７３、Ｋ２７５、Ｔ２９１、Ｒ３０１、Ｋ３０７、Ｋ３６９、Ｓ４０４、Ｖ４０９、Ｋ４１４、Ｋ４３６、Ｋ４３８、Ｋ４６８、Ｄ４８２、Ｋ５１６、Ｒ５１８、Ｋ５２４、Ｋ５３０、Ｋ５３２、Ｋ５４８、Ｋ５５９、Ｋ５７０、Ｒ５７４、Ｋ５９２、Ｄ５９６、Ｋ６０３、Ｋ６０７、Ｋ６１３、Ｃ６４７、Ｒ６８１、Ｋ６８６、Ｈ７２０、Ｋ７３９、Ｋ７４８、Ｋ７５７、Ｔ７６６、Ｋ７８０、Ｒ７９０、Ｐ７９１、Ｋ７９６、Ｋ８０９、Ｋ８１５、Ｔ８１６、Ｋ８６０、Ｒ８６２、Ｒ８６３、Ｋ８６８、Ｋ８９７、Ｒ９０９、Ｒ９１２、Ｔ９２３、Ｒ９４７、Ｋ９４９、Ｒ９５１、Ｒ９５５、Ｋ９６５、Ｋ９６８、Ｋ１０００、Ｒ１００３、Ｋ１００９、Ｋ１０１７、Ｋ１０２２、Ｋ１０２９、Ａ１０５３、Ｋ１０７２、Ｋ１０８６、Ｆ１１０３、Ｓ１２０９、Ｒ１２２６、Ｒ１２５２、Ｋ１２７３、Ｋ１２８２、及び／又はＫ１２８８を含む１つ以上の残基の突然変異によって改変される。
【０１３０】
特定の実施形態において、酵素は、限定されないが、ＦｎＣｐｆ１（フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｕ１１２）のアミノ酸位置付番を基準として位置Ｋ１５、Ｒ１８、Ｋ２６、Ｒ３４、Ｒ４３、Ｋ４８、Ｋ５１、Ｋ５６、Ｋ８７、Ｋ８８、Ｄ９０、Ｋ９６、Ｋ１０６、Ｋ１０７、Ｋ１２０、Ｑ１２５、Ｋ１４３、Ｒ１８６、Ｋ１８７、Ｒ２０２、Ｋ２１０、Ｋ２３５、Ｋ２９６、Ｋ２９８、Ｋ３１４、Ｋ３２０、Ｋ３２６、Ｋ３９７、Ｋ４４４、Ｋ４４９、Ｅ４５４、Ａ４８３、Ｅ４９１、Ｋ５２７、Ｋ５４１、Ｋ５８１、Ｒ５８３、Ｋ５８９、Ｋ５９５、Ｋ５９７、Ｋ６１３、Ｋ６２４、Ｋ６３５、Ｋ６３９、Ｋ６５６、Ｋ６６０、Ｋ６６７、Ｋ６７１、Ｋ６７７、Ｋ７１９、Ｋ７２５、Ｋ７３０、Ｋ７６３、Ｋ７８２、Ｋ７９１、Ｒ８００、Ｋ８０９、Ｋ８２３、Ｒ８３３、Ｋ８３４、Ｋ８３９、Ｋ８５２、Ｋ８５８、Ｋ８５９、Ｋ８６９、Ｋ８７１、Ｒ８７２、Ｋ８７７、Ｋ９０５、Ｒ９１８、Ｒ９２１、Ｋ９３２、Ｉ９６０、Ｋ９６２、Ｒ９６４、Ｒ９６８、Ｋ９７８、Ｋ９８１、Ｋ１０１３、Ｒ１０１６、Ｋ１０２１、Ｋ１０２９、Ｋ１０３４、Ｋ１０４１、Ｋ１０６５、Ｋ１０８４、及び／又はＫ１０９８を含む１つ以上の残基の突然変異によって改変される。
【０１３１】
特定の実施形態において、酵素は、限定されないが、ＬｂＣｐｆ１（ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６）のアミノ酸位置付番を基準として位置Ｋ１５、Ｒ１８、Ｋ２６、Ｋ３４、Ｒ４３、Ｋ４８、Ｋ５１、Ｒ５６、Ｋ８３、Ｋ８４、Ｒ８６、Ｋ９２、Ｒ１０２、Ｋ１０３、Ｋ１１６、Ｋ１２１、Ｒ１５８、Ｅ１５９、Ｒ１７４、Ｒ１８２、Ｋ２０６、Ｋ２５１、Ｋ２５３、Ｋ２６９、Ｋ２７１、Ｋ２７８、Ｐ３４２、Ｋ３８０、Ｒ３８５、Ｋ３９０、Ｋ４１５、Ｋ４２１、Ｋ４５７、Ｋ４７１、Ａ５０６、Ｒ５０８、Ｋ５１４、Ｋ５２０、Ｋ５２２、Ｋ５３８、Ｙ５４８、Ｋ５６０、Ｋ５６４、Ｋ５８０、Ｋ５８４、Ｋ５９１、Ｋ５９５、Ｋ６０１、Ｋ６３４、Ｋ６４０、Ｒ６４５、Ｋ６７９、Ｋ６８９、Ｋ７０７、Ｔ７１６、Ｋ７２５、Ｒ７３７、Ｒ７４７、Ｒ７４８、Ｋ７５３、Ｋ７６８、Ｋ７７４、Ｋ７７５、Ｋ７８５、Ｋ７８７、Ｒ７８８、Ｑ７９３、Ｋ８２１、Ｒ８３３、Ｒ８３６、Ｋ８４７、Ｋ８７９、Ｋ８８１、Ｒ８８３、Ｒ８８７、Ｋ８９７、Ｋ９００、Ｋ９３２、Ｒ９３５、Ｋ９４０、Ｋ９４８、Ｋ９５３、Ｋ９６０、Ｋ９８４、Ｋ１００３、Ｋ１０１７、Ｒ１０３３、Ｋ１１２１、Ｒ１１３８、Ｒ１１６５、Ｋ１１９０、Ｋ１１９９、及び／又はＫ１２０８を含む１つ以上の残基の突然変異によって改変される。
【０１３２】
特定の実施形態において、酵素は、限定されないが、ＭｂＣｐｆ１（モラクセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ）２３７）のアミノ酸位置付番を基準として位置Ｋ１４、Ｒ１７、Ｒ２５、Ｋ３３、Ｍ４２、Ｑ４７、Ｋ５０、Ｄ５５、Ｋ８５、Ｎ８６、Ｋ８８、Ｋ９４、Ｒ１０４、Ｋ１０５、Ｋ１１８、Ｋ１２３、Ｋ１３１、Ｒ１７４、Ｋ１７５、Ｒ１９０、Ｒ１９８、Ｉ２２１、Ｋ２６７、Ｑ２６９、Ｋ２８５、Ｋ２９１、Ｋ２９７、Ｋ３５７、Ｋ４０３、Ｋ４０９、Ｋ４１４、Ｋ４４８、Ｋ４６０、Ｋ５０１、Ｋ５１５、Ｋ５５０、Ｒ５５２、Ｋ５５８、Ｋ５６４、Ｋ５６６、Ｋ５８２、Ｋ５９３、Ｋ６０４、Ｋ６０８、Ｋ６２３、Ｋ６２７、Ｋ６３３、Ｋ６３７、Ｅ６４３、Ｋ７８０、Ｙ７８７、Ｋ７９２、Ｋ８３０、Ｑ８４６、Ｋ８５８、Ｋ８６７、Ｋ８７６、Ｋ８９０、Ｒ９００、Ｋ９０１、Ｍ９０６、Ｋ９２１、Ｋ９２７、Ｋ９２８、Ｋ９３７、Ｋ９３９、Ｒ９４０、Ｋ９４５、Ｑ９７５、Ｒ９８７、Ｒ９９０、Ｋ１００１、Ｒ１０３４、Ｉ１０３６、Ｒ１０３８、Ｒ１０４２、Ｋ１０５２、Ｋ１０５５、Ｋ１０８７、Ｒ１０９０、Ｋ１０９５、Ｎ１１０３、Ｋ１１０８、Ｋ１１１５、Ｋ１１３９、Ｋ１１５８、Ｒ１１７２、Ｋ１１８８、Ｋ１２７６、Ｒ１２９３、Ａ１３１９、Ｋ１３４０、Ｋ１３４９、及び／又はＫ１３５６を含む１つ以上の残基の突然変異によって改変される。
【０１３３】
非活性化／不活性化Ｃｐｆ１タンパク質
Ｃｐｆ１タンパク質がヌクレアーゼ活性を有する場合、Ｃｐｆ１タンパク質は、低下したヌクレアーゼ活性、例えば、野生型酵素と比較したとき少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は１００％のヌクレアーゼ不活性化を有するように改変することができ；又は別の言い方をすれば、Ｃｐｆ１酵素は有利には、非突然変異型又は野生型Ｃｐｆ１酵素又はＣＲＩＳＰＲ酵素のヌクレアーゼ活性の約０％、又は非突然変異型又は野生型Ｃｐｆ１酵素、例えば非突然変異型又は野生型フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｕ１１２（ＦｎＣｐｆ１）、アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６（ＡｓＣｐｆ１）、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６（ＬｂＣｐｆ１）又はモラクセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ）２３７（ＭｂＣｐｆ１  Ｃｐｆ１酵素又はＣＲＩＳＰＲ酵素のヌクレアーゼ活性の約３％又は約５％又は約１０％以下を有する。これは、Ｃｐｆ１及びそのオルソログのヌクレアーゼドメインに突然変異を導入することによって可能である。
【０１３４】
より詳細には、不活性化Ｃｐｆ１酵素は、ＡｓＣｐｆ１のアミノ酸位置Ａｓ９０８、Ａｓ９９３、Ａｓ１２６３又はＣｐｆ１オルソログにおける対応する位置で突然変異した酵素を含む。加えて、不活性化Ｃｐｆ１酵素は、ＬｂＣｐｆ１のアミノ酸位置Ｌｂ８３２、９２５、９４７又は１１８０又はＣｐｆ１オルソログにおける対応する位置で突然変異した酵素を含む。より詳細には、不活性化Ｃｐｆ１酵素は、ＡｓＣｐｆ１の突然変異ＡｓＤ９０８Ａ、ＡｓＥ９９３Ａ、ＡｓＤ１２６３Ａの１つ以上又はＣｐｆ１オルソログにおける対応する突然変異を含む酵素を含む。加えて、不活性化Ｃｐｆ１酵素は、ＬｂＣｐｆ１の突然変異ＬｂＤ８３２Ａ、Ｅ９２５Ａ、Ｄ９４７Ａ又はＤ１１８０Ａの１つ以上又はＣｐｆ１オルソログにおける対応する突然変異を含む酵素を含む。
【０１３５】
不活性化Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ酵素には、例えば、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写解除因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性、ＤＮＡ切断活性、核酸結合活性、及び分子スイッチ（例えば、光誘導性）を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる群からの１つ以上のドメインを含め、１つ以上の機能ドメインが（例えば融合タンパク質を介して）会合していてもよい。好ましいドメインは、Ｆｏｋ１、ＶＰ６４、Ｐ６５、ＨＳＦ１、ＭｙｏＤ１である。Ｆｏｋ１が提供される場合、機能性二量体を実現するため複数のＦｏｋ１機能ドメインが提供され、且つｇＲＮＡが、Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３２，Ｎｕｍｂｅｒ  ６，Ｊｕｎｅ  ２０１４）に具体的に記載されるとおり機能的使用（Ｆｏｋ１）に適切な間隔を提供するように設計されることが有利である。アダプタータンパク質は、公知のリンカーを利用してかかる機能ドメインを結合し得る。場合によっては、更に少なくとも１つのＮＬＳが提供されることが有利である。場合によっては、ＮＬＳをＮ末端に配置することが有利である。２つ以上の機能ドメインが含まれる場合、それらの機能ドメインは同じであっても、又は異なってもよい。
【０１３６】
一般に、不活性化Ｃｐｆ１酵素上の１つ以上の機能ドメインの位置は、機能ドメインが帰属機能的効果で標的に影響を及ぼすのに正しい空間的配置を可能にするものである。例えば、機能ドメインが転写アクチベーター（例えば、ＶＰ６４又はｐ６５）である場合、転写アクチベーターは、それが標的の転写に影響を及ぼすことが可能な空間的配置で置かれる。同様に、転写リプレッサーは、有利には標的の転写に影響を及ぼすように配置されることになり、及びヌクレアーゼ（例えばＦｏｋ１）は、有利には標的を切断又は部分的に切断するように配置されることになる。これには、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＮ末端／Ｃ末端以外の位置が含まれ得る。
【０１３７】
不安定化されたＣｐｆ１
特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの本発明に係るエフェクタータンパク質（ＣＲＩＳＰＲ酵素；Ｃｐｆ１）は不安定化ドメイン（ＤＤ）と会合又は融合される。一部の実施形態において、ＤＤはＥＲ５０である。このＤＤの対応する安定化リガンドは、一部の実施形態において４ＨＴである。そのため、一部の実施形態では、少なくとも１つのＤＤのうち１つがＥＲ５０であり、従って安定化リガンドが４ＨＴ又はＣＭＰ８である。一部の実施形態において、ＤＤはＤＨＦＲ５０である。このＤＤの対応する安定化リガンドは、一部の実施形態においてＴＭＰである。そのため、一部の実施形態では、少なくとも１つのＤＤのうち１つがＤＨＦＲ５０であり、従って安定化リガンドがＴＭＰである。一部の実施形態において、ＤＤはＥＲ５０である。このＤＤの対応する安定化リガンドは、一部の実施形態においてＣＭＰ８である。従ってＣＭＰ８は、ＥＲ５０系における４ＨＴの代替的な安定化リガンドであり得る。ＣＭＰ８及び４ＨＴを競合的に使用し得る／使用すべきである可能性があり得るが、一部の細胞型はこれらの２つのリガンドのうちのいずれか一方の影響を受け易いこともあり、及び本開示及び当該技術分野における知識から、当業者はＣＭＰ８及び／又は４ＨＴを使用することができる。
【０１３８】
一部の実施形態において、１つ又は２つのＤＤがＣＲＩＳＰＲ酵素のＮ端側末端に融合され、１つ又は２つのＤＤがＣＲＩＳＰＲ酵素のＣ末端に融合されてもよい。一部の実施形態では、少なくとも２つのＤＤがＣＲＩＳＰＲ酵素と会合され、及びＤＤは同じＤＤであり、即ちＤＤは同種である。従って、ＤＤの両方（又は２つ以上）がＥＲ５０  ＤＤであり得る。一部の実施形態ではこれが好ましい。或いは、ＤＤの両方（又は２つ以上）がＤＨＦＲ５０  ＤＤであり得る。これもまた、一部の実施形態では好ましい。一部の実施形態において、少なくとも２つのＤＤがＣＲＩＳＰＲ酵素と会合され、及びＤＤは異なるＤＤであり、即ちＤＤは異種である。従って、ＤＤのうちの１つがＥＲ５０であり得る一方、ＤＤのうちの１つ以上又は任意の他のＤＤがＤＨＦＲ５０であり得る。異種である２つ以上のＤＤがあることは、より高い分解制御レベルがもたらされ得るため有利であり得る。Ｎ端又はＣ端における２つ以上のＤＤのタンデム融合が分解を増強し得る；及びかかるタンデム融合は、例えばＥＲ５０−ＥＲ５０−Ｃ２ｃ２又はＤＨＦＲ−ＤＨＦＲ−Ｃｐｆ１であり得る。いずれの安定化リガンドも存在しないならば高レベルの分解が起こり、一方の安定化リガンドが存在せず、他方の（又は別の）安定化リガンドが存在するならば中間レベルの分解が起こり得る一方、安定化リガンドの両方（又は２つ以上）が存在するならば低レベルの分解が起こり得ることが想定される。制御はまた、Ｎ末端ＥＲ５０  ＤＤ及びＣ末端ＤＨＦＲ５０  ＤＤを有することによってももたらされ得る。
【０１３９】
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素とＤＤの融合物は、ＤＤとＣＲＩＳＰＲ酵素との間にリンカーを含む。一部の実施形態において、リンカーはＧｌｙＳｅｒリンカーである。一部の実施形態において、ＤＤ−ＣＲＩＳＰＲ酵素は少なくとも１つの核外移行シグナル（ＮＥＳ）を更に含む。一部の実施形態において、ＤＤ−ＣＲＩＳＰＲ酵素は２つ以上のＮＥＳを含む。一部の実施形態において、ＤＤ−ＣＲＩＳＰＲ酵素は少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。これは、ＮＥＳに加えて含むのであってもよい。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＣＲＩＳＰＲ酵素とＤＤとの間のリンカーとして、又はその一部として、局在化（核内移行又は核外移行）シグナルを含むか、又はそれから本質的になるか、又はそれからなる。ＨＡ又はＦｌａｇタグもまた、リンカーとしての本発明の範囲内にある。本出願人らはＮＬＳ及び／又はＮＥＳをリンカーとして使用し、また、ＧＳほどの短さのものから最大（ＧＧＧＧＳ）３に至るまでのグリシンセリンリンカーも使用する。
【０１４０】
不安定化ドメインには、広範囲のタンパク質に不安定性を付与する一般的な有用性がある；例えば、Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．Ｍａｒ  ７，２０１２；１３４（９）：３９４２−３９４５（参照により本明細書に援用される）を参照のこと。ＣＭＰ８又は４−ヒドロキシタモキシフェンは不安定化ドメインであり得る。より一般的には、哺乳類ＤＨＦＲの温度感受性突然変異体（ＤＨＦＲｔｓ）、Ｎ末端規則による不安定化残基が、許容温度で安定であるが、３７℃で不安定であることが分かった。ＤＨＦＲｔｓを発現する細胞に哺乳類ＤＨＦＲの高親和性リガンドであるメトトレキサートを加えると、タンパク質の分解が部分的に阻害された。これは、本来細胞において分解の標的となるタンパク質を小分子リガンドが安定化させ得ることの重要な実証であった。ラパマイシン誘導体を使用すると、ｍＴＯＲのＦＲＢドメインの不安定突然変異体（ＦＲＢ＊）が安定化し、融合したキナーゼＧＳＫ−３βの機能が回復した６，７。この系は、リガンド依存的な安定性が、複雑な生物学的環境において特異的タンパク質の機能を調節する魅力的な戦略に相当することを実証した。タンパク質活性を制御する系には、ラパマイシン誘導性のＦＫ５０６結合タンパク質とＦＫＢＰ１２との二量体化によってユビキチン相補性が生じるとＤＤが機能性になることが関与し得る。ヒトＦＫＢＰ１２又はｅｃＤＨＦＲタンパク質の突然変異体は、その高親和性リガンド、それぞれＳｈｉｅｌｄ−１又はトリメトプリム（ＴＭＰ）が存在しない場合には代謝的に不安定となるようエンジニアリングすることができる。これらの突然変異体は、本発明の実施において有用な可能な不安定化ドメイン（ＤＤ）の一部であり、及びＣＲＩＳＰＲ酵素との融合物としてのＤＤの不安定性が、プロテアソームによる融合タンパク質全体の分解をＣＲＩＳＰＲタンパク質にもたらす。Ｓｈｉｅｌｄ−１及びＴＭＰは用量依存的にＤＤに結合して、それを安定化させる。エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ＥＲＬＢＤ、ＥＲＳ１の残基３０５〜５４９）もまた、不安定化ドメインとしてエンジニアリングすることができる。エストロゲン受容体シグナル伝達経路は乳癌などの種々の疾患に関与するため、この経路は広く研究されており、数多くのエストロゲン受容体作動薬及び拮抗薬が開発されている。従って、ＥＲＬＢＤと薬物との適合性のあるペアが公知である。突然変異体ＥＲＬＢＤに結合するが、野生型のＥＲＬＢＤには結合しないリガンドがある。３つの突然変異（Ｌ３８４Ｍ、Ｍ４２１Ｇ、Ｇ５２１Ｒ）をコードするこれらの突然変異ドメインのうちの１つを使用することにより１２、内因性エストロゲン感受性ネットワークを乱すことのないリガンドを用いてＥＲＬＢＤ由来のＤＤの安定性を調節することが可能である。追加の突然変異（Ｙ５３７Ｓ）を導入してＥＲＬＢＤを更に不安定化させ、それを潜在的なＤＤ候補として構成することができる。この四重突然変異体は有利なＤＤ展開である。この突然変異ＥＲＬＢＤをＣＲＩＳＰＲ酵素に融合させることができ、リガンドを用いてその安定性を調節し又は撹乱させると、それによりＣＲＩＳＰＲ酵素がＤＤを有し得る。別のＤＤは、Ｓｈｉｅｌｄ１リガンドに��って安定化した、突然変異ＦＫＢＰタンパク質をベースとする１２ｋＤａ（１０７アミノ酸）タグであり得る；例えば、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５，（２００８）を参照のこと。例えばＤＤは、合成の生物学的に不活性な小分子、Ｓｈｉｅｌｄ−１に結合し、且つそれによって可逆的に安定化される、改変されたＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）であってもよく；例えば、Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ  ＬＡ，Ｃｈｅｎ  ＬＣ，Ｍａｙｎａｒｄ−Ｓｍｉｔｈ  ＬＡ，Ｏｏｉ  ＡＧ，Ｗａｎｄｌｅｓｓ  ＴＪ．「合成小分子を使用して生細胞のタンパク質機能を調節するための迅速で可逆的且つ調整可能な方法（Ａ  ｒａｐｉｄ，ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ，ａｎｄ  ｔｕｎａｂｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」．Ｃｅｌｌ．２００６；１２６：９９５−１００４；Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ  ＬＡ，Ｓｅｌｌｍｙｅｒ  ＭＡ，Ｃｏｎｔａｇ  ＣＨ，Ｗａｎｄｌｅｓｓ  ＴＪ，Ｔｈｏｒｎｅ  ＳＨ．「生存マウスにおけるタンパク質安定性及び機能の化学的制御（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｍｉｃｅ）」．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２００８；１４：１１２３−１１２７；Ｍａｙｎａｒｄ−Ｓｍｉｔｈ  ＬＡ，Ｃｈｅｎ  ＬＣ，Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ  ＬＡ，Ｏｏｉ  ＡＧ，Ｗａｎｄｌｅｓｓ  ＴＪ．「生物学的にサイレントな小分子を用いて条件的タンパク質安定性をエンジニアリングする指向的手法（Ａ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ｓｉｌｅｎｔ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００７；２８２：２４８６６−２４８７２；及びＲｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．Ｍａｒ  ２３，２０１２；１９（３）：３９１−３９８（これらは全て、参照により本明細書に援用される）を参照されたく、及び本発明の実施においてＣＲＩＳＰＲ酵素と会合させるＤＤの選択において本発明の実施で用いられ得る。見られるとおり、当該技術分野における知識は幾つものＤＤを含み、及びＤＤは、有利にはリンカーを伴い、ＣＲＩＳＰＲ酵素と会合させる、例えばそれに融合することができ、それによりＤＤをリガンドの存在下で安定化させることができ、及びそれが存在しないとき、ＤＤは不安定になることができ、それによりＣＲＩＳＰＲ酵素が全体として不安定化し、又はＤＤはリガンドが存在しない場合に安定化させることができ、及びリガンドが存在するときＤＤは不安定になることができ；ＤＤはＣＲＩＳＰＲ酵素及びひいてはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体又は系の調節又は制御−いわばオン又はオフ調整を可能にし、それにより系を例えばインビボ又はインビトロ環境で調節又は制御する手段を提供する。例えば、目的のタンパク質をＤＤタグとの融合物として発現させると、それが細胞内で不安定化し、例えばプロテアソームによって急���に分解される。従って、安定化リガンドが存在しないと、Ｄが会合したＣａｓの分解につながる。新規ＤＤを目的のタンパク質に融合させると、その不安定性が目的のタンパク質に付与され、融合タンパク質全体の急速な分解が生じる。Ｃａｓのピーク活性が、オフターゲット効果の低下に時に有益である。従って、高い活性の短いバーストが好ましい。本発明はかかるピークを提供することが可能である。ある意味では、本系は誘導性である。別のある意味では、本系は安定化リガンドの非存在下で抑制され、安定化リガンドの存在下で抑制が解除される。
【０１４１】
オフターゲット効果を低下させる酵素突然変異
一態様において、本発明は、オフターゲット効果の低下をもたらす１つ以上の突然変異を有する本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ酵素、好ましくはクラス２  ＣＲＩＳＰＲ酵素、好ましくはＶ型又はＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば好ましくは、限定はされないが、本明細書の他の部分に記載されるとおりのＣｐｆ１、即ち、標的遺伝子座に改変を生じさせるのに用いられるが、しかしガイドＲＮＡと複合体化したときなどの、オフターゲットに向けた活性は低下又は消失させる改良されたＣＲＩＳＰＲ酵素、並びにガイドＲＮＡと複合体を形成したときなどの、ＣＲＩＳＰＲ酵素の活性を増加させるための改良されたＣＲＩＳＰＲ酵素を提供する。本明細書において以下に記載するとおりの突然変異酵素は、本明細書の他の部分に記載されるとおりの本発明に係る方法のいずれにおいても用いられ得ることが理解されるべきである。本明細書の他の部分に記載されるとおりの方法、産物、組成物及び使用のいずれも、同様に以下に更に詳述するとおりの突然変異ＣＲＩＳＰＲ酵素に適用可能である。本明細書に記載されるとおりの態様及び実施形態において、Ｃｐｆ１をＣＲＩＳＰＲ酵素として参照するとき又は読めるとき、機能性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の再構成は、好ましくはｔｒａｃｒ配列を必要とせず又はそれに依存せず、及び／又はダイレクトリピートはガイド（標的又はスペーサー）配列の５’（上流）側にあることが理解されるべきである。
【０１４２】
更なる指針として、以下の詳細な態様及び実施形態を提供する。
【０１４３】
本発明者らは、意外にも、非改変ＣＲＩＳＰＲ酵素と比較したオフターゲット活性の低下及び／又は非改変ＣＲＩＳＰＲ酵素と比較した標的活性の増加を付与する改変をＣＲＩＳＰＲ酵素に加え得ることを決定した。従って、本発明の特定の態様において、本明細書には、幅広い遺伝子改変適用に有用性があり得る改良されたＣＲＩＳＰＲ酵素が提供される。また、本明細書には、いずれも本明細書に開示される改変ＣＲＩＳＰＲ酵素を含む、ＣＲＩＳＰＲ複合体、組成物及び系、並びに方法及び使用も提供される。
【０１４４】
本開示において、用語「Ｃａｓ」は「Ｃｐｆ１」又はＣＲＩＳＰＲ酵素を意味し得る。本発明のこの態様との関連において、Ｃｐｆ１又はＣＲＩＳＰＲ酵素は突然変異しているか又は改変されており、「それによってＣＲＩＳＰＲ複合体内の酵素は非改変酵素と比較したとき１つ以上のオフターゲット遺伝子座を改変する能力が低下している」（又は同様の表現）；及び、本明細書を読むとき、用語「Ｃｐｆ１」又は「Ｃａｓ」又は「ＣＲＩＳＰＲ酵素」などは、本発明における突然変異した又は改変されたＣｐｆ１又はＣａｓ又はＣＲＩＳＰＲ酵素を含むことが意図され、即ち、「それによってＣＲＩＳＰＲ複合体内の酵素は非改変酵素と比較したとき１つ以上のオフターゲット遺伝子座を改変する能力が低下している」（又は同様の表現）。
【０１４５】
ある態様において、本明細書に定義するとおりのエンジニアリングされたＣｐｆ１タンパク質、例えばＣｐｆ１が提供され、このタンパク質は、ＲＮＡを含む核酸分子と複合体化してＣＲＩＳＰＲ複合体を形成し、ＣＲＩＳＰＲ複合体内にあるとき、核酸分子が１つ以上の標的ポリヌクレオチド遺伝子座を標的化し、このタンパク質は非改変Ｃｐｆ１タンパク質と比較して少なくとも１つの改変を含み、及びここでこの改変タンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ複合体は、非改変Ｃｐｆ１タンパク質を含む複合体と比較したとき活性の変化を有する。本明細書においてＣＲＩＳＰＲ「タンパク質」と言うとき、Ｃｐｆ１タンパク質は好ましくは改変されたＣＲＩＳＰＲ酵素（酵素活性が増加又は低下している（又は全くない）、例えば限定なしにＣｐｆ１である。用語「ＣＲＩＳＰＲタンパク質」は、野生型ＣＲＩＳＰＲタンパク質と比較して酵素活性が増加又は低下している（又は全くない）など、ＣＲＩＳＰＲタンパク質が変化しているかどうかに関わらず、「ＣＲＩＳＰＲ酵素」と同義的に使用され得ることが理解されるべきである。
【０１４６】
ある態様において、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲタンパク質の活性の変化には、オフターゲットポリヌクレオチド遺伝子座と比較して、ＲＮＡを含む核酸分子又は標的ポリヌクレオチド遺伝子座に関する結合特性の変化、ＲＮＡを含む核酸分子又は標的ポリヌクレオチド遺伝子座に関する結合反応速度の変化、又はＲＮＡを含む核酸分子又は標的ポリヌクレオチド遺伝子座に関する結合特異性の変化が含まれる。
【０１４７】
一部の実施形態において、非改変Ｃａｓは、Ｃｐｆ１など、ＤＮＡ切断活性を有する。一部の実施形態において、Ｃａｓは、標的配列内及び／又は標的配列の相補体内など、標的配列の位置で一方又は両方の鎖の切断を導く。一部の実施形態において、Ｃａｓは、標的配列の最初又は最後のヌクレオチドから約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００塩基対、又はそれ以上の範囲内で一方又は両方の鎖の切断を導く。一部の実施形態において、ベクターは、突然変異型Ｃａｓが標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの一方又は両方の鎖を切断する能力を欠くように対応する野生型酵素と比べて突然変異しているＣａｓをコードする。一部の実施形態において、Ｃａｓは、突然変異した酵素のＤＮＡ切断活性が非突然変異型の酵素のＤＮＡ切断活性の約２５％、１０％、５％、１％、０．１％、０．０１％以下、又はそれ未満である場合に、あらゆるＤＮＡ切断活性を実質的に欠いていると見なされる；一例は、突然変異型のＤＮＡ切断活性が非突然変異型と比較したとき皆無であるか又は無視できる程度である場合であり得る。従って、Ｃａｓは１つ以上の突然変異を含んでもよく、機能ドメインとの融合を伴う又は伴わない汎用ＤＮＡ結合タンパク質として用いられ得る。突然変異は人工的に導入された突然変異か又は機能獲得型若しくは機能喪失型突然変異であってもよい。本発明の一態様において、Ｃａｓ酵素はタンパク質、例えばＴＡＧ、及び／又は化学的に誘導可能／制御可能なドメインなどの誘導可能／制御可能なドメインに融合されてもよい。本発明におけるＣａｓはキメラＣａｓタンパク質；例えば、キメラであることによって機能が増強されたＣａｓであってもよい。キメラＣａｓタンパク質は、２つ以上の天然に存在するＣａｓからの断片を含有する新規Ｃａｓであり得る。これらは、あるＣａｓ９ホモログの１つ又は複数のＮ末端断片と別のＣａｓホモログの１つ又は複数のＣ末端断片との融合物を含み得る。ＣａｓはｍＲＮＡの形態で細胞に送達することができる。Ｃａｓの発現は誘導性プロモーターの制御下にあってもよい。公知の突然変異に読めることを回避することは、明示的に本発明の目的である。実際、語句「それによってＣＲＩＳＰＲ複合体内の酵素は非改変酵素と比較したとき１つ以上のオフターゲット遺伝子座を改変する能力が低下し、及び／又はそれによってＣＲＩＳＰＲ複合体内の酵素は非改変酵素と比較したとき１つ以上の標的遺伝子座を改変する能力が増加する」（又は同様の表現）は、ニッカーゼ又はデッドＣａｓをもたらすのみの突然変異又は公知のＣａｓ９突然変異に読めるものとは意図されない。しかしながら、これは、「それによってＣＲＩＳＰＲ複合体内の酵素は非改変酵素と比較したとき１つ以上のオフターゲット遺伝子座を改変する能力が低下し、及び／又はそれによってＣＲＩＳＰＲ複合体内の酵素は非改変酵素と比較したとき１つ以上の標的遺伝子座を改変する能力が増加する」（又は同様の表現）ような本発明１つ又は複数の改変又は１つ又は複数の突然変異を、ニッカーゼ又はデッドである酵素をもたらす突然変異と組み合わせることができないと言っているわけではない。かかるデッド酵素は増強された核酸分子結合剤であり得る。及びかかるニッカーゼは増強されたニッカーゼであり得る。例えば、溝内及び／又はその近傍にある１つ又は複数の中性アミノ酸及び／又は核酸（例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｇＲＮＡにごく接近したＣａｓにおいて他の位置にある他の荷電残基を１つ又は複数の正電荷アミノ酸に変更すると、「それによってＣＲＩＳＰＲ複合体内の酵素は非改変酵素と比較したとき１つ以上のオフターゲット遺伝子座を改変する能力が低下し、及び／又はそれによってＣＲＩＳＰＲ複合体内の酵素は非改変酵素と比較したとき１つ以上の標的遺伝子座を改変する能力が増加する」ことになり、例えば更なる切断がもたらされ得る。これは増強されたオンターゲット切断及びオフターゲット切断の両方であり得るため（スーパーカッティングＣｐｆ１）、当該技術分野においてｔｒｕ−ガイド又はｔｒｕ−ｓｇＲＮＡとして知られるものと共にそれを用いることにより（例えば、Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，「トランケート型ガイドＲＮＡを使用したＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓヌクレアーゼ特異性の改善（Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡｓ）」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３２，２７９−２８４（２０１４）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２８０８  Ｒｅｃｅｉｖｅｄ  １７  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２０１３  Ａｃｃｅｐｔｅｄ  ０６  Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１４  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ２６  Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１４  Ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ  オンライン  ２９  Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１４を参照）、オフターゲット切断が高くなることなしにオンターゲット活性を増強し、又はスーパーカッティングニッカーゼを作り、又はスーパー結合剤のためＣａｓをデッドにする突然変異と組み合わせる。
【０１４８】
特定の実施形態において、エンジニアリングされたＣｐｆ１タンパク質の活性変化には、ターゲティング効率の増加又はオフターゲット結合の低下が含まれる。特定の実施形態において、エンジニアリングされたＣｐｆ１タンパク質の活性変化には、切断活性の改変が含まれる。
【０１４９】
特定の実施形態において、活性変化には、オフターゲットポリヌクレオチド遺伝子座と比較した、ＲＮＡを含む核酸分子又は標的ポリヌクレオチド遺伝子座に関する結合特性の変化、ＲＮＡを含む核酸分子又は標的ポリヌクレオチド遺伝子座に関する結合反応速度の変化、又はＲＮＡを含む核酸分子又は標的ポリヌクレオチド遺伝子座に関する結合特異性の変化が含まれる。
【０１５０】
特定の実施形態において、活性変化には、ターゲティング効率の増加又はオフターゲット結合の低下が含まれる。特定の実施形態において、活性変化には、切断活性の改変が含まれる。特定の実施形態において、活性変化には、標的ポリヌクレオチド遺伝子座に関する切断活性の増加が含まれる。特定の実施形態において、活性変化には、標的ポリヌクレオチド遺伝子座に関する切断活性の低下が含まれる。特定の実施形態において、活性変化には、オフターゲットポリヌクレオチド遺伝子座に関する切断活性の低下が含まれる。特定の実施形態において、活性変化には、オフターゲットポリヌクレオチド遺伝子座に関する切断活性の増加が含まれる。
【０１５１】
従って、特定の実施形態において、標的ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｙｃｌｅｏｔｉｄｅ）遺伝子座に対する特異性はオフターゲットポリヌクレオチド遺伝子座と比較したとき増加している。他の実施形態において、標的ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｙｃｌｅｏｔｉｄｅ）遺伝子座に対する特異性はオフターゲットポリヌクレオチド遺伝子座と比較したとき低下している。
【０１５２】
本発明のある態様において、エンジニアリングされたＣｐｆ１タンパク質の活性の変化には、ヘリカーゼ反応速度の変化が含まれる。
【０１５３】
本発明のある態様において、エンジニアリングされたＣｐｆ１タンパク質は、ＲＮＡを含む核酸分子、又は標的ポリヌクレオチド遺伝子座鎖、又はオフターゲットポリヌクレオチド遺伝子座鎖とのタンパク質の会合を変化させる改変を含む。本発明のある態様において、エンジニアリングされたＣｐｆ１タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を変化させる改変を含む。
【０１５４】
特定の実施形態において、改変Ｃｐｆ１タンパク質は、ポリヌクレオチド遺伝子座への核酸分子の標的化を変化させる改変を含む。特定の実施形態において、改変は、核酸分子と会合するタンパク質の領域における突然変異を含む。特定の実施形態において、改変は、標的ポリヌクレオチド遺伝子座の鎖と会合するタンパク質の領域における突然変異を含む。特定の実施形態において、改変は、オフターゲットポリヌクレオチド遺伝子座の鎖と会合するタンパク質の領域における突然変異を含む。特定の実施形態において、改変又は突然変異は、ＲＮＡを含む核酸分子、又は標的ポリヌクレオチド遺伝子座の鎖、又はオフターゲットポリヌクレオチド遺伝子座の鎖と会合するタンパク質の領域における正電荷の減少を含む。特定の実施形態において、改変又は突然変異は、ＲＮＡを含む核酸分子、又は標的ポリヌクレオチド遺伝子座の鎖、又はオフターゲットポリヌクレオチド遺伝子座の鎖と会合するタンパク質の領域における負電荷の減少を含む。特定の実施形態において、改変又は突然変異は、ＲＮＡを含む核酸分子、又は標的ポリヌクレオチド遺伝子座の鎖、又はオフターゲットポリヌクレオチド遺伝子座の鎖と会合するタンパク質の領域における正電荷の増加を含む。特定の実施形態において、改変又は突然変異は、ＲＮＡを含む核酸分子、又は標的ポリヌクレオチド遺伝子座の鎖、又はオフターゲットポリヌクレオチド遺伝子座の鎖と会合するタンパク質の領域における負電荷の増加を含む。特定の実施形態において、改変又は突然変異は、タンパク質とＲＮＡを含む核酸分子、又は標的ポリヌクレオチド遺伝子座の鎖、又はオフターゲットポリヌクレオチド遺伝子座の鎖との間の立体障害を増加させる。特定の実施形態において、改変又は突然変異は、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、又はＴｈｒの置換を含む。特定の実施形態において、改変又は突然変異は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｇｌｕ、又はＡｓｐによる置換を含む。特定の実施形態において、改変又は突然変異は結合溝内のアミノ酸置換を含む。
【０１５５】
一態様において、本発明は、
Ｃｐｆ１などの、本明細書で定義される天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素
を提供し、ここで：
この酵素はガイドＲＮＡと複合体化してＣＲＩＳＰＲ複合体を形成し、
ＣＲＩＳＰＲ複合体内にあるとき、ガイドＲＮＡが１つ以上の標的ポリヌクレオチド遺伝子座を標的化して、酵素がポリヌクレオチド遺伝子座を変化させ、及び
この酵素は少なくとも１つの改変を含み、
それによってＣＲＩＳＰＲ複合体内の酵素は非改変酵素と比較したとき１つ以上のオフターゲット遺伝子座を改変する能力が低下し、及び／又はそれによってＣＲＩＳＰＲ複合体内の酵素は非改変酵素と比較したとき１つ以上の標的遺伝子座を改変する能力が増加する。
【０１５６】
任意のかかる天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素において、改変には、酵素の１つ以上のアミノ酸残基の改変が含まれ得る。
【０１５７】
任意のかかる天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素において、改変には、非改変酵素において正電荷の残基が含まれる領域に位置する１つ以上のアミノ酸残基の改変が含まれ得る。
【０１５８】
任意のかかる天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素において、改変には、非改変酵素において正電荷の１つ以上のアミノ酸残基の改変が含まれ得る。
【０１５９】
任意のかかる天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素において、改変には、非改変酵素において正電荷でない１つ以上のアミノ酸残基の改変が含まれ得る。
【０１６０】
改変には、非改変酵素において非荷電の１つ以上のアミノ酸残基の改変が含まれ得る。
【０１６１】
改変には、非改変酵素において負電荷の１つ以上のアミノ酸残基の改変が含まれ得る。
【０１６２】
改変には、非改変酵素において疎水性の１つ以上のアミノ酸残基の改変が含まれ得る。
【０１６３】
改変には、非改変酵素において極性の１つ以上のアミノ酸残基の改変が含まれ得る。
【０１６４】
上述の天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素の特定のものにおいて、改変には、溝に位置する１つ以上の残基の改変が含まれ得る。
【０１６５】
上述の天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素の特定のものにおいて、改変には、溝の外部に位置する１つ以上の残基改変が含まれ得る。
【０１６６】
上述の天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素の特定のものにおいて、改変には１つ以上の残基の改変が含まれ、この１つ以上の残基は、アルギニン、ヒスチジン又はリジンを含む。
【０１６７】
上述の天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素の任意のものにおいて、酵素は前記１つ以上の残基の突然変異によって改変され得る。
【０１６８】
上述の天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素の特定のものにおいて、酵素は前記１つ以上の残基の突然変異によって改変され、ここでこの突然変異は、アラニン残基による非改変酵素中の残基の置換を含む。
【０１６９】
上述の天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素の特定のものにおいて、酵素は前記１つ以上の残基の突然変異によって改変され、ここでこの突然変異は、アスパラギン酸又はグルタミン酸による非改変酵素中の残基の置換を含む。
【０１７０】
上述の天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素の特定のものにおいて、酵素は前記１つ以上の残基の突然変異によって改変され、ここでこの突然変異は、セリン、スレオニン、アスパラギン又はグルタミンによる非改変酵素中の残基の置換を含む。
【０１７１】
上述の天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素の特定のものにおいて、酵素は前記１つ以上の残基の突然変異によって改変され、ここでこの突然変異は、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン又はバリンによる非改変酵素中の残基の置換を含む。
【０１７２】
上述の天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素の特定のものにおいて、酵素は前記１つ以上の残基の突然変異によって改変され、ここでこの突然変異は、極性アミノ酸残基による非改変酵素中の残基の置換を含む。
【０１７３】
上述の天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素の特定のものにおいて、酵素は前記１つ以上の残基の突然変異によって改変され、ここでこの突然変異は、極性アミノ酸残基でないアミノ酸残基による非改変酵素中の残基の置換を含む。
【０１７４】
上述の天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素の特定のものにおいて、酵素は前記１つ以上の残基の突然変異によって改変され、ここでこの突然変異は、負電荷アミノ酸残基による非改変酵素中の残基の置換を含む。
【０１７５】
上述の天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素の特定のものにおいて、酵素は前記１つ以上の残基の突然変異によって改変され、ここでこの突然変異は、負電荷アミノ酸残基でないアミノ酸残基による非改変酵素中の残基の置換を含む。
【０１７６】
上述の天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素の特定のものにおいて、酵素は前記１つ以上の残基の突然変異によって改変され、ここでこの突然変異は、非荷電アミノ酸残基による非改変酵素中の残基の置換を含む。
【０１７７】
上述の天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素の特定のものにおいて、酵素は前記１つ以上の残基の突然変異によって改変され、ここでこの突然変異は、非荷電アミノ酸残基でないアミノ酸残基による非改変酵素中の残基の置換を含む。
【０１７８】
上述の天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素の特定のものにおいて、酵素は前記１つ以上の残基の突然変異によって改変され、ここでこの突然変異は、疎水性アミノ酸残基による非改変酵素中の残基の置換を含む。
【０１７９】
上述の天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素の特定のものにおいて、酵素は前記１つ以上の残基の突然変異によって改変され、ここでこの突然変異は、疎水性アミノ酸残基でないアミノ酸残基による非改変酵素中の残基の置換を含む。
【０１８０】
一部の実施形態において、好ましくはＣｐｆ１酵素など、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）１、野兎病菌亜種ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）、プレボテラ・アルベンシス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ａｌｂｅｎｓｉｓ）、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＣ２０１７  １、ブチリビブリオ・プロテオクラスチカス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ）、ペレグリニバクテリア細菌（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、パルクバクテリア細菌（Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、スミセラ属種（Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ  ｓｐ．）ＳＣＡＤＣ、アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＡ２０２０、カンディダタス・メタノプラズマ・テルミツム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ  ｔｅｒｍｉｔｕｍ）、ユーバクテリウム・エリゲンス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ）、モラクセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ）２３７、レプトスピラ・イナダイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ）、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６、ポルフィロモナス・クレビオリカニス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ）３、プレボテラ・ディシエンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ）、又はポルフィロモナス・マカカエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅ）Ｃｐｆ１（例えば、本明細書に記載されるとおり改変されたこれらの生物のうちの１つのＣｐｆ１）に由来し、及び更なる突然変異若しくは変化を含み得るか、又はキメラＣｐｆ１であり得る。
【０１８１】
特定の実施形態において、Ｃｐｆ１タンパク質は１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）ドメインを含む。特定の実施形態において、Ｃｐｆ１タンパク質は少なくとも２つ又はそれ以上のＮＬＳを含む。
【０１８２】
特定の実施形態において、Ｃｐｆ１タンパク質は、第１のＣＲＩＳＰＲオルソログ由来の第１の断片と第２のＣＩＲＳＰＲオルソログ由来の第２の断片とを含むキメラＣＲＩＳＰＲタンパク質を含み、及び第１及び第２のＣＲＩＳＰＲオルソログは異なる。
【０１８３】
特定の実施形態において、酵素は改変によって改変されるか又は改変を含み、例えば、本明細書に列挙される残基又はそれぞれのオルソログにおける対応する残基のいずれか一つの突然変異による改変を含むか、それから本質的になるか又はそれからなり；又は酵素は、本願全体を通じた本開示における任意の１つ（単一）、２つ（二重）、３つ（三重）、４つ（四重）又はそれ以上の位置、又はＣＲＩＳＰＲ酵素オルソログにおける対応する残基又は位置に改変を含むか、それから本質的になるか又はそれからなり、例えば、酵素は、本明細書に記載されるＣｐｆ１残基のいずれか一つ、又はＣＲＩＳＰＲ酵素オルソログにおける対応する残基又は位置に改変を含むか、それから本質的になるか又はそれからなる。かかる酵素において、各残基はアラニン残基による置換によって改変されてもよい。
【０１８４】
本出願人らは、最近になって、特異性が増強されたＣａｓ９オルソログの作成方法を記載した（Ｓｌａｙｍａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１５「特異性が改善された合理的にエンジニアリングされたＣａｓ９ヌクレアーゼ（Ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｃａｓ９  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）」）。このストラテジーを用いると、Ｃｐｆ１オルソログの特異性を増強することができる。突然変異誘発の主な残基は好ましくは、全てＲｕｖＣドメイン内の正電荷残基である。追加的な残基は、異なるオルソログ間で保存されている正電荷残基である。
【０１８５】
特定の実施形態において、Ｃｐｆ１の特異性は、非標的ＤＮＡ鎖を安定させる残基を突然変異させることにより改善し得る。
【０１８６】
上述の天然に存在しないＣｐｆ１酵素の特定のものにおいて、酵素は、限定されないが、ＡｓＣｐｆ１（アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６）のアミノ酸位置付番を基準として位置Ｒ９０９、Ｒ９１２、Ｒ９３０、Ｒ９４７、Ｋ９４９、Ｒ９５１、Ｒ９５５、Ｋ９６５、Ｋ９６８、Ｋ１０００、Ｋ１００２、Ｒ１００３、Ｋ１００９、Ｋ１０１７、Ｋ１０２２、Ｋ１０２９、Ｋ１０３５、Ｋ１０５４、Ｋ１０７２、Ｋ１０８６、Ｒ１０９４、Ｋ１０９５、Ｋ１１０９、Ｋ１１１８、Ｋ１１４２、Ｋ１１５０、Ｋ１１５８、Ｋ１１５９、Ｒ１２２０、Ｒ１２２６、Ｒ１２４２、及び／又はＲ１２５２を含めた、（ＲｕｖＣドメイン内の）１つ以上の残基の突然変異によって改変される。
【０１８７】
上述の天然に存在しないＣｐｆ１酵素の特定のものにおいて、酵素は、限定されないが、ＡｓＣｐｆ１（アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６）のアミノ酸位置付番を基準として位置Ｋ３２４、Ｋ３３５、Ｋ３３７、Ｒ３３１、Ｋ３６９、Ｋ３７０、Ｒ３８６、Ｒ３９２、Ｒ３９３、Ｋ４００、Ｋ４０４、Ｋ４０６、Ｋ４０８、Ｋ４１４、Ｋ４２９、Ｋ４３６、Ｋ４３８、Ｋ４５９、Ｋ４６０、Ｋ４６４、Ｒ６７０、Ｋ６７５、Ｒ６８１、Ｋ６８６、Ｋ６８９、Ｒ６９９、Ｋ７０５、Ｒ７２５、Ｋ７２９、Ｋ７３９、Ｋ７４８、及び／又はＫ７５２を含めた（ＲＡＤ５０ドメイン内の）１つ以上の残基の突然変異によって改変される。
【０１８８】
上述の天然に存在しないＣｐｆ１酵素の特定のものにおいて、酵素は、限定されないが、ＡｓＣｐｆ１（アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６）のアミノ酸位置付番を基準として位置Ｒ９１２、Ｔ９２３、Ｒ９４７、Ｋ９４９、Ｒ９５１、Ｒ９５５、Ｋ９６５、Ｋ９６８、Ｋ１０００、Ｒ１００３、Ｋ１００９、Ｋ１０１７、Ｋ１０２２、Ｋ１０２９、Ｋ１０７２、Ｋ１０８６、Ｆ１１０３、Ｒ１２２６、及び／又はＲ１２５２を含む１つ以上の残基の突然変異によって改変される。
【０１８９】
特定の実施形態において、酵素は、限定されないが、ＬｂＣｐｆ１（ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６）のアミノ酸位置付番を基準として位置Ｒ８３３、Ｒ８３６、Ｋ８４７、Ｋ８７９、Ｋ８８１、Ｒ８８３、Ｒ８８７、Ｋ８９７、Ｋ９００、Ｋ９３２、Ｒ９３５、Ｋ９４０、Ｋ９４８、Ｋ９５３、Ｋ９６０、Ｋ９８４、Ｋ１００３、Ｋ１０１７、Ｒ１０３３、Ｒ１１３８、Ｒ１１６５、及び／又はＲ１２５２を含む１つ以上の残基の突然変異によって改変される。
【０１９０】
特定の実施形態において、Ｃｐｆ１酵素は、限定されないが、ＡｓＣｐｆ１（アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６）のアミノ酸位置付番を基準として位置Ｋ１５、Ｒ１８、Ｋ２６、Ｑ３４、Ｒ４３、Ｋ４８、Ｋ５１、Ｒ５６、Ｒ８４、Ｋ８５、Ｋ８７、Ｎ９３、Ｒ１０３、Ｎ１０４、Ｔ１１８、Ｋ１２３、Ｋ１３４、Ｒ１７６、Ｋ１７７、Ｒ１９２、Ｋ２００、Ｋ２２６、Ｋ２７３、Ｋ２７５、Ｔ２９１、Ｒ３０１、Ｋ３０７、Ｋ３６９、Ｓ４０４、Ｖ４０９、Ｋ４１４、Ｋ４３６、Ｋ４３８、Ｋ４６８、Ｄ４８２、Ｋ５１６、Ｒ５１８、Ｋ５２４、Ｋ５３０、Ｋ５３２、Ｋ５４８、Ｋ５５９、Ｋ５７０、Ｒ５７４、Ｋ５９２、Ｄ５９６、Ｋ６０３、Ｋ６０７、Ｋ６１３、Ｃ６４７、Ｒ６８１、Ｋ６８６、Ｈ７２０、Ｋ７３９、Ｋ７４８、Ｋ７５７、Ｔ７６６、Ｋ７８０、Ｒ７９０、Ｐ７９１、Ｋ７９６、Ｋ８０９、Ｋ８１５、Ｔ８１６、Ｋ８６０、Ｒ８６２、Ｒ８６３、Ｋ８６８、Ｋ８９７、Ｒ９０９、Ｒ９１２、Ｔ９２３、Ｒ９４７、Ｋ９４９、Ｒ９５１、Ｒ９５５、Ｋ９６５、Ｋ９６８、Ｋ１０００、Ｒ１００３、Ｋ１００９、Ｋ１０１７、Ｋ１０２２、Ｋ１０２９、Ａ１０５３、Ｋ１０７２、Ｋ１０８６、Ｆ１１０３、Ｓ１２０９、Ｒ１２２６、Ｒ１２５２、Ｋ１２７３、Ｋ１２８２、及び／又はＫ１２８８を含む１つ以上の残基の突然変異によって改変される。
【０１９１】
特定の実施形態において、Ｃｐｆ１酵素は、限定されないが、ＦｎＣｐｆ１（フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｕ１１２）のアミノ酸位置付番を基準として位置Ｋ１５、Ｒ１８、Ｋ２６、Ｒ３４、Ｒ４３、Ｋ４８、Ｋ５１、Ｋ５６、Ｋ８７、Ｋ８８、Ｄ９０、Ｋ９６、Ｋ１０６、Ｋ１０７、Ｋ１２０、Ｑ１２５、Ｋ１４３、Ｒ１８６、Ｋ１８７、Ｒ２０２、Ｋ２１０、Ｋ２３５、Ｋ２９６、Ｋ２９８、Ｋ３１４、Ｋ３２０、Ｋ３２６、Ｋ３９７、Ｋ４４４、Ｋ４４９、Ｅ４５４、Ａ４８３、Ｅ４９１、Ｋ５２７、Ｋ５４１、Ｋ５８１、Ｒ５８３、Ｋ５８９、Ｋ５９５、Ｋ５９７、Ｋ６１３、Ｋ６２４、Ｋ６３５、Ｋ６３９、Ｋ６５６、Ｋ６６０、Ｋ６６７、Ｋ６７１、Ｋ６７７、Ｋ７１９、Ｋ７２５、Ｋ７３０、Ｋ７６３、Ｋ７８２、Ｋ７９１、Ｒ８００、Ｋ８０９、Ｋ８２３、Ｒ８３３、Ｋ８３４、Ｋ８３９、Ｋ８５２、Ｋ８５８、Ｋ８５９、Ｋ８６９、Ｋ８７１、Ｒ８７２、Ｋ８７７、Ｋ９０５、Ｒ９１８、Ｒ９２１、Ｋ９３２、Ｉ９６０、Ｋ９６２、Ｒ９６４、Ｒ９６８、Ｋ９７８、Ｋ９８１、Ｋ１０１３、Ｒ１０１６、Ｋ１０２１、Ｋ１０２９、Ｋ１０３４、Ｋ１０４１、Ｋ１０６５、Ｋ１０８４、及び／又はＫ１０９８を含む１つ以上の残基の突然変異によって改変される。
【０１９２】
特定の実施形態において、Ｃｐｆ１酵素は、限定されないが、ＬｂＣｐｆ１（ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６）のアミノ酸位置付番を基準として位置Ｋ１５、Ｒ１８、Ｋ２６、Ｋ３４、Ｒ４３、Ｋ４８、Ｋ５１、Ｒ５６、Ｋ８３、Ｋ８４、Ｒ８６、Ｋ９２、Ｒ１０２、Ｋ１０３、Ｋ１１６、Ｋ１２１、Ｒ１５８、Ｅ１５９、Ｒ１７４、Ｒ１８２、Ｋ２０６、Ｋ２５１、Ｋ２５３、Ｋ２６９、Ｋ２７１、Ｋ２７８、Ｐ３４２、Ｋ３８０、Ｒ３８５、Ｋ３９０、Ｋ４１５、Ｋ４２１、Ｋ４５７、Ｋ４７１、Ａ５０６、Ｒ５０８、Ｋ５１４、Ｋ５２０、Ｋ５２２、Ｋ５３８、Ｙ５４８、Ｋ５６０、Ｋ５６４、Ｋ５８０、Ｋ５８４、Ｋ５９１、Ｋ５９５、Ｋ６０１、Ｋ６３４、Ｋ６４０、Ｒ６４５、Ｋ６７９、Ｋ６８９、Ｋ７０７、Ｔ７１６、Ｋ７２５、Ｒ７３７、Ｒ７４７、Ｒ７４８、Ｋ７５３、Ｋ７６８、Ｋ７７４、Ｋ７７５、Ｋ７８５、Ｋ７８７、Ｒ７８８、Ｑ７９３、Ｋ８２１、Ｒ８３３、Ｒ８３６、Ｋ８４７、Ｋ８７９、Ｋ８８１、Ｒ８８３、Ｒ８８７、Ｋ８９７、Ｋ９００、Ｋ９３２、Ｒ９３５、Ｋ９４０、Ｋ９４８、Ｋ９５３、Ｋ９６０、Ｋ９８４、Ｋ１００３、Ｋ１０１７、Ｒ１０３３、Ｋ１１２１、Ｒ１１３８、Ｒ１１６５、Ｋ１１９０、Ｋ１１９９、及び／又はＫ１２０８を含む１つ以上の残基の突然変異によって改変される。
【０１９３】
特定の実施形態において、酵素は、限定されないが、ＭｂＣｐｆ１（モラクセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ）２３７）のアミノ酸位置付番を基準として位置Ｋ１４、Ｒ１７、Ｒ２５、Ｋ３３、Ｍ４２、Ｑ４７、Ｋ５０、Ｄ５５、Ｋ８５、Ｎ８６、Ｋ８８、Ｋ９４、Ｒ１０４、Ｋ１０５、Ｋ１１８、Ｋ１２３、Ｋ１３１、Ｒ１７４、Ｋ１７５、Ｒ１９０、Ｒ１９８、Ｉ２２１、Ｋ２６７、Ｑ２６９、Ｋ２８５、Ｋ２９１、Ｋ２９７、Ｋ３５７、Ｋ４０３、Ｋ４０９、Ｋ４１４、Ｋ４４８、Ｋ４６０、Ｋ５０１、Ｋ５１５、Ｋ５５０、Ｒ５５２、Ｋ５５８、Ｋ５６４、Ｋ５６６、Ｋ５８２、Ｋ５９３、Ｋ６０４、Ｋ６０８、Ｋ６２３、Ｋ６２７、Ｋ６３３、Ｋ６３７、Ｅ６４３、Ｋ７８０、Ｙ７８７、Ｋ７９２、Ｋ８３０、Ｑ８４６、Ｋ８５８、Ｋ８６７、Ｋ８７６、Ｋ８９０、Ｒ９００、Ｋ９０１、Ｍ９０６、Ｋ９２１、Ｋ９２７、Ｋ９２８、Ｋ９３７、Ｋ９３９、Ｒ９４０、Ｋ９４５、Ｑ９７５、Ｒ９８７、Ｒ９９０、Ｋ１００１、Ｒ１０３４、Ｉ１０３６、Ｒ１０３８、Ｒ１０４２、Ｋ１０５２、Ｋ１０５５、Ｋ１０８７、Ｒ１０９０、Ｋ１０９５、Ｎ１１０３、Ｋ１１０８、Ｋ１１１５、Ｋ１１３９、Ｋ１１５８、Ｒ１１７２、Ｋ１１８８、Ｋ１２７６、Ｒ１２９３、Ａ１３１９、Ｋ１３４０、Ｋ１３４９、及び／又はＫ１３５６を含む１つ以上の残基の突然変異によって改変される。
【０１９４】
天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素の任意のものにおいて：
標的と１つ以上のオフターゲット遺伝子座の対応する配列との間には単一のミスマッチが存在してもよく；及び／又は
標的と１つ以上のオフターゲット遺伝子座の対応する配列との間には２、３又は４つ又はそれより多いミスマッチが存在してもよく、及び／又は
ここで（ｉｉ）において、前記２、３又は４つ又はそれより多いミスマッチは連続している。
【０１９５】
天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素の任意のものにおいて、ＣＲＩＳＰＲ複合体内の酵素は非改変酵素と比較したとき１つ以上のオフターゲット遺伝子座を改変する能力が低下してもよく、及びＣＲＩＳＰＲ複合体内の酵素は非改変酵素と比較したとき前記標的遺伝子座を改変する能力が増加する。
【０１９６】
天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素の任意のものにおいて、ＣＲＩＳＰＲ複合体内にあるとき、標的と少なくとも１つのオフターゲット遺伝子座との間にあるとおりの酵素の改変能力の相対的な差が、非改変酵素の相対的な差と比較して増加し得る。
【０１９７】
天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素の任意のものにおいて、ＣＲＩＳＰＲ酵素は１つ以上の追加の突然変異を含んでもよく、この１つ以上の追加の突然変異は１つ以上の触媒活性ドメインにある。
【０１９８】
かかる天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、前記１つ以上の追加の突然変異を欠く酵素と比較してヌクレアーゼ活性が低下し又は消失していてもよい。
【０１９９】
一部のかかる天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は標的配列のその位置におけるいずれか一方のＤＮＡ鎖の切断を導かない。
【０２００】
ＣＲＩＳＰＲ酵素が１つ以上の触媒活性ドメインに１つ以上の追加の突然変異を含む場合、この１つ以上の追加の突然変異は、ＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩ又はＲｕｖＣＩＩＩを含むＣＲＩＳＰＲ酵素の触媒活性ドメインにあってもよい。
【０２０１】
理論によって拘束されないが、本発明のある態様において、記載される方法及び突然変異は、オンターゲット部位における切断をもたらす位置へのＣＲＩＳＰＲ酵素ドメイン（例えば、Ｃｐｆ１ドメイン）のコンホメーション再編成及びオフターゲット部位におけるそれらのコンホメーション状態の回避を増強することを提供する。ＣＲＩＳＰＲ酵素は一連の協調的な段階で標的ＤＮＡを切断する。初めに、ＰＡＭ相互作用ドメインが標的ＤＮＡの５’側のＰＡＭ配列を認識する。ＰＡＭ結合後、標的配列の最初の１０〜１２ヌクレオチド（シード配列）がｇＲＮＡ：ＤＮＡ相補性に関してサンプリングされ、これはＤＮＡ二重鎖の分離に依存するプロセスである。シード配列ヌクレオチドがｇＲＮＡと相補的である場合、残りのＤＮＡがほどかれ、ｇＲＮＡの全長が標的ＤＮＡ鎖とハイブリダイズする。ｎｔ溝がＤＮＡリン酸骨格の正電荷との非特異的相互作用によって非標的ＤＮＡ鎖を安定化させて巻き戻しを促進し得る。ＲＮＡ：ｃＤＮＡ及びＣａｓ９：ｎｃＤＮＡ相互作用がｃＤＮＡ：ｎｃＤＮＡのリハイブリダイゼーションと競合してＤＮＡの巻き戻しをドライブする。他のＣＲＩＳＰＲ酵素ドメイン、例えば異なるドメインに接続するリンカーが、ヌクレアーゼドメインのコンホメーションに更に影響を与え得る。従って、提供される方法及び突然変異には、限定なしに、ＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩＩ、ＲｕｖＣＩＩＩ及びリンカーが包含される。シード配列相互作用、及び標的及び非標的ＤＮＡ鎖との相互作用を含め、標的ＤＮＡ結合によってもたらされる例えばＣｐｆ１のコンホメーション変化により、ドメインがヌクレアーゼ活性を惹起する位置にあるかどうかが決まる。従って、本明細書に提供される突然変異及び方法は、ＰＡＭ認識及びＲＮＡ−ＤＮＡ塩基対合にとどまらない改変を実証し、可能にする。
【０２０２】
ある態様において、本発明は、オンターゲット相互作用に関わるとき切断活性に関連するコンホメーションへと向かう改良された平衡及び／又はオフターゲット相互作用に関わるとき切断活性に関連するコンホメーションから離れる改良された平衡を含む、Ｃｐｆ１などの本明細書で定義されるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを提供する。一態様において、本発明は、校正機能が改良されたＣａｓ（例えばＣｐｆ１）ヌクレアーゼ、即ち、オンターゲット部位でヌクレアーゼ活性を含むコンホメーションをとり、且つオフターゲット部位においてそのコンホメーションが一層不利になるＣａｓ（例えばＣｐｆ１）ヌクレアーゼを提供する。Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ５２７（７５７６）：１１０−３，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１５５４４，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ２８  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０１５．Ｅｐｕｂ  ２０１５  Ｏｃｔ  ２８は、フェルスター共鳴エネルギー転移ＦＲＥＴ）実験を用いてオンターゲット及びオフターゲットＤＮＡと会合したときのＣａｓ（例えばＣｐｆ１）触媒ドメインの相対配向を検出しており、これは本発明のＣＲＩＳＰＲ酵素（例えばＣｐｆ１）に当てはめることができる。
【０２０３】
本発明は更に、改変ガイドＲＮＡを使用してヌクレアーゼ活性及び／又は特異性を調節する方法及び突然変異を提供する。考察されるとおり、オンターゲットヌクレアーゼ活性を増加又は減少させることができる。また、オフターゲットヌクレアーゼ活性を増加又は減少させることもできる。更に、オンターゲット活性対オフターゲット活性に関して特異性の増加又は減少があり得る。改変されたガイドＲＮＡには、限定なしに、トランケート型ガイドＲＮＡ、デッドガイドＲＮＡ、化学的に改変されたガイドＲＮＡ、機能ドメインと会合したガイドＲＮＡ、機能ドメインを含む改変ガイドＲＮＡ、アプタマーを含む改変ガイドＲＮＡ、アダプタータンパク質を含む改変ガイドＲＮＡ、及び付加又は改変されたループを含むガイドＲＮＡが含まれる。一部の実施形態において、１つ以上の機能ドメインはデッドｇＲＮＡ（ｄＲＮＡ）と会合している。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素を有するｄＲＮＡ複合体は、遺伝子座上で機能ドメインによる遺伝子調節を導く一方で、ｇＲＮＡが別の遺伝子座におけるＣＲＩＳＰＲ酵素によるＤＮＡ切断を導く。一部の実施形態において、ｄＲＮＡは、オフターゲット調節と比較して目的の遺伝子座に関する調節の選択性が最大となるように選択される。一部の実施形態において、ｄＲＮＡは、標的遺伝子調節が最大となり、且つ標的切断が最小限となるように選択される。
【０２０４】
以下の考察の目的上、機能ドメインへの言及は、ＣＲＩＳＰＲ酵素と会合した機能ドメイン又はアダプタータンパク質と会合した機能ドメインのことであり得る。
【０２０５】
本発明の実施では、個別的な１つ又は複数のＲＮＡループ又は個別的な１つ又は複数の配列に結合することのできるアダプタータンパク質をリクルートし得る個別的な１つ又は複数のＲＮＡループ又は個別的な（ｄｉｓｃｔｉｎｃｔ）１つ又は複数の配列の挿入により、Ｃａｓ（例えばＣｐｆ１）タンパク質と衝突することなくｇＲＮＡのループを伸長させてもよい。アダプタータンパク質には、限定はされないが、バクテリオファージコートタンパク質の多様性の範囲内にある直交性のＲＮＡ結合タンパク質／アプタマーの組み合わせが含まれ得る。かかるコートタンパク質のリストには、限定はされないが、以下が含まれる：Ｑβ、Ｆ２、ＧＡ、ｆｒ、ＪＰ５０１、Ｍ１２、Ｒ１７、ＢＺ１３、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、ＭＸ１、ＴＷ１８、ＶＫ、ＳＰ、ＦＩ、ＩＤ２、ＮＬ９５、ＴＷ１９、ＡＰ２０５、φＣｂ５、φＣｂ８ｒ、φＣｂ１２ｒ、φＣｂ２３ｒ、７ｓ及びＰＲＲ１。これらのアダプタータンパク質又は直交性ＲＮＡ結合タンパク質は、１つ以上の機能ドメインを含むエフェクタータンパク質又は融合物を更にリクルートし得る。一部の実施形態において、機能ドメインは、トランスポザーゼドメイン、インテグラーゼドメイン、リコンビナーゼドメイン、リゾルバーゼドメイン、インベルターゼドメイン、プロテアーゼドメイン、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメイン、ＤＮＡヒドロキシルメチラーゼドメイン、ＤＮＡデメチラーゼドメイン、ヒストンアセチラーゼドメイン、ヒストンデアセチラーゼドメイン、ヌクレアーゼドメイン、リプレッサードメイン、アクチベータードメイン、転写調節タンパク質（又は転写複合体リクルート）ドメイン、細胞取込み活性関連ドメイン、核酸結合ドメイン、抗体提示ドメイン、ヒストン修飾酵素、ヒストン修飾酵素のリクルーター；ヒストン修飾酵素の阻害因子、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデメチラーゼ、ヒストンキナーゼ、ヒストンホスファターゼ、ヒストンリボシラーゼ、ヒストンデリボシラーゼ、ヒストンユビキチナーゼ、ヒストンデユビキチナーゼ、ヒストンビオチナーゼ及びヒストンテールプロテアーゼからなる群から選択され得る。一部の好ましい実施形態では、機能ドメインは転写活性化ドメイン、例えば、限定なしに、ＶＰ６４、ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡ、ＳＥＴ７／９又はヒストンアセチルトランスフェラーゼである。一部の実施形態において、機能ドメインは転写抑制ドメイン、好ましくはＫＲＡＢである。一部の実施形態において、転写抑制ドメインはＳＩＤ、又はＳＩＤのコンカテマー（例えばＳＩＤ４Ｘ）である。一部の実施形態において、機能ドメインは後成的に改変されるドメインであり、後成的に改変される酵素が提供される。一部の実施形態において、機能ドメインは活性化ドメインであり、これはＰ６５活性化ドメインであってもよい。一部の実施形態において、機能ドメインはシチジンデアミナーゼなどのデアミナーゼである。シチジンデアミナーゼ（ｄｅａｍｉｎｅｓｅ）は、それがシチジンからウリジンへの変換を誘導するところである標的核酸に向かい、ＣからＴへの置換（相補鎖上ではＧからＡ）が生じ得る。かかる実施形態では、ＤＮＡ切断なしにヌクレオチド置��が達成され得る。
【０２０６】
ある態様において、本発明はまた、Ｃａｓ（例えば、Ｃｐｆ１）結合活性及び／又は結合特異性を調節する方法及び突然変異も提供する。特定の実施形態において、ヌクレアーゼ活性を欠くＣａｓ（例えば、Ｃｐｆ１）タンパク質が用いられる。特定の実施形態において、Ｃａｓ（例えば、Ｃｐｆ１）ヌクレアーゼの結合を促進するがヌクレアーゼ活性は促進しない、改変されたガイドＲＮＡが利用される。かかる実施形態では、オンターゲット結合を増加又は減少させることができる。また、かかる実施形態では、オフターゲット結合を増加又は減少させることもできる。更に、オンターゲット結合対オフターゲット結合に関して特異性の増加又は減少があり得る。
【０２０７】
詳細な実施形態では、オフターゲット切断の低下は、鎖分離を不安定化させることにより、より詳細にはＤＮＡ相互作用領域における正電荷を低下させる突然変異をＣｐｆ１酵素に導入することにより確実にされる（本明細書に記載され及びＳｌａｙｍａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１６（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１；３５１（６２６８）：８４−８にＣａｓ９に関して更に例示されるとおり）。更なる実施形態において、オフターゲット切断の低下は、標的鎖とガイドＲＮＡ配列との間の相互作用に影響を及ぼす突然変異、より詳細には標的比活性を保持しているがオフターゲット活性を低下させるような方法でＣｐｆ１と標的ＤＮＡ鎖のリン酸骨格との間の相互作用を破壊する突然変異をＣｐｆ１酵素に導入することにより確実にされる（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１６，Ｎａｔｕｒｅ，  ２８；５２９（７５８７）：４９０−５によってＣａｓ９に関して記載されるとおり）。詳細な実施形態では、オフターゲット活性は改変Ｃｐｆ１によって低下し、ここでは野生型Ｃｐｆ１と比較して標的鎖及び非標的鎖の両方との相互作用が改変されている。
【０２０８】
オンターゲット対オフターゲット活性の活性及び／又は特異性を増加又は減少させるため、又はオンターゲット対オフターゲット結合の結合及び／又は特異性を増加又は減少させるため様々な組み合わせで利用し得る方法及び突然変異を用いて、他の効果が促進されるように加えられる突然変異又は改変を補償し又は増強することができる。他の効果が促進されるように加えられるかかる突然変異又は改変には、Ｃａｓ（例えば、Ｃｐｆ１）に対する突然変異又は改変及び／又はガイドＲＮＡに加えられる突然変異又は改変が含まれる。特定の実施形態において、本方法及び突然変異は、化学的に改変されたガイドＲＮＡと共に用いられる。ガイドＲＮＡの化学的改変の例としては、限定なしに、１つ以上の末端ヌクレオチドにおける２’−Ｏ−メチル（Ｍ）、２’−Ｏ−メチル３’ホスホロチオエート（ＭＳ）、又は２’−Ｏ−メチル３’チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）の取込みが挙げられる。かかる化学的に改変されたガイドＲＮＡは、改変されていないガイドＲＮＡと比較したとき高い安定性及び高い活性を含むことができ、しかしながらオンターゲット対オフターゲット特異性は予測不可能である（Ｈｅｎｄｅｌ，２０１５，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３（９）：９８５−９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３２９０，オンライン発行  ２９  Ｊｕｎｅ  ２０１５を参照）。化学的に改変されたガイドＲＮＡには、限定なしに、ホスホロチオエート結合を有するＲＮＡ及びリボース環の２’及び４’炭素間にメチレン架橋を含むロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドが更に含まれる。本発明の方法及び突然変異は、化学的に改変されたガイドＲＮＡによるＣａｓ（例えば、Ｃｐｆ１）ヌクレアーゼ活性及び／又は結合の調節に用いられる。
【０２０９】
ある態様において、本発明は、ヌクレアーゼ、転写アクチベーター、転写リプレッサーなどの機能ドメインを含む本明細書に定義するとおりの本発明に係るＣａｓ（例えばＣｐｆ１）タンパク質の結合及び／又は結合特異性を改変するための方法及び突然変異を提供する。例えば、Ｃａｓ（例えばＣｐｆ１）タンパク質は、例えば本明細書の他の部分に記載されるＣｐｆ１突然変異などの突然変異を導入することによってヌクレアーゼヌルにする、又はヌクレアーゼ活性が変化した又は低下したものにすることができ、例えば、ＦｎＣｐｆ１ｐ  ＲｕｖＣドメインにおけるアミノ酸位置を基準としてＤ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、Ｅ１０２８Ａ、Ｄ１２２７Ａ、Ｄ１２５５Ａ、Ｎ１２５７Ａ、Ｄ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、Ｅ１０２８Ａ、Ｄ１２２７Ａ、Ｄ１２５５Ａ及びＮ１２５７Ａ；又は例えば、本明細書の他の部分に記載されるとおりの推定上の第２のヌクレアーゼドメインを基準としてＮ５８０Ａ、Ｎ５８４Ａ、Ｔ５８７Ａ、Ｗ６０９Ａ、Ｄ６１０Ａ、Ｋ６１３Ａ、Ｅ６１４Ａ、Ｄ６１６Ａ、Ｋ６２４Ａ、Ｄ６２５Ａ、Ｋ６２７Ａ及びＹ６２９Ａを含む。ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ（例えば、Ｃｐｆ１）タンパク質は、機能ドメインのＲＮＡガイド下標的配列依存性送達に有用である。本発明は、Ｃａｓ（例えば、Ｃｐｆ１）タンパク質の結合を調節する方法及び突然変異を提供する。一実施形態において、機能ドメインは、ＲＮＡガイド下転写因子を提供するＶＰ６４を含む。別の実施形態において、機能ドメインは、ＲＮＡガイド下ヌクレアーゼ活性を提供するＦｏｋ  Ｉを含む。米国特許出願公開第２０１４／０３５６９５９号明細書、米国特許出願公開第２０１４／０３４２４５６号明細書、米国特許出願公開第２０１５／００３１１３２号明細書、及びＭａｌｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９（６１２１）：８２３−６，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２３２０３３，オンライン発行  ３  Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１３が挙げられ、及び本明細書の教示を通じて、本発明は、本明細書の教示と関連して適用されるこれらの文献の方法及び材料を包含する。特定の実施形態において、オンターゲット結合が増加する。特定の実施形態において、オフターゲット結合が減少する。特定の実施形態において、オンターゲット結合が減少する。特定の実施形態において、オフターゲット結合が増加する。従って、本発明はまた、機能性Ｃａｓ（例えば、Ｃｐｆ１）結合タンパク質のオンターゲット結合対オフターゲット結合の特異性を増加又は減少させることも提供する。
【０２１０】
ＲＮＡガイド下結合タンパク質としてのＣａｓ（例えば、Ｃｐｆ１）の使用はヌクレアーゼヌルＣａｓ（例えば、Ｃｐｆ１）に限定されない。ヌクレアーゼ活性を含むＣａｓ（例えば、Ｃｐｆ１）酵素もまた、特定のガイドＲＮＡと共に用いられるとき、ＲＮＡガイド下結合タンパク質として機能し得る。例えば低分子ガイドＲＮＡ及び標的とミスマッチのヌクレオチドを含むガイドＲＮＡが、標的切断はほとんど又は全くなしに、標的配列へのＲＮＡによって導かれるＣａｓ９結合を促進することができる（例えば、Ｄａｈｌｍａｎ，２０１５，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３（１１）：１１５９−１１６１，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３３９０，オンライン発行  ０５  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０１５を参照）。ある態様において、本発明は、ヌクレアーゼ活性を含むＣａｓ（例えば、Ｃｐｆ１）タンパク質の結合を調節する方法及び突然変異を提供する。特定の実施形態において、オンターゲット結合が増加する。特定の実施形態において、オフターゲット結合が減少する。特定の実施形態において、オンターゲット結合が減少する。特定の実施形態において、オフターゲット結合が増加する。特定の実施形態において、オンターゲット結合対オフターゲット結合の特異性の増加又は減少がある。特定の実施形態において、ガイドＲＮＡ−Ｃａｓ（例えば、Ｃｐｆ１）酵素のヌクレアーゼ活性もまた調節される。
【０２１１】
ＲＮＡ−ＤＮＡヘテロ二重鎖形成が、ＰＡＭに最も近いシード領域配列のみならず、標的領域全体にわたる切断活性及び特異性に重要である。従って、トランケート型ガイドＲＮＡは切断活性及び特異性の低下を示す。ある態様において、本発明は、変化したガイドＲＮＡを用いて切断の活性及び特異性を増加させる方法及び突然変異を提供する。
【０２１２】
本発明はまた、Ｃａｓ（例えば、Ｃｐｆ１）ヌクレアーゼ特異性の改変を標的範囲に対する改変に合わせて行い得ることも実証する。例えばＰＡＭ特異性を変化させる突然変異を選択して、それらの突然変異を、オンターゲット配列対オフターゲット配列の特異性を増加させる（又は必要であれば減少させる）ｎｔ溝突然変異と組み合わせることにより、増加した標的特異性に加えてＰＡＭ認識の調整的な改変も有するＣａｓ（例えば、Ｃｐｆ１）突然変異体を設計することができる。一つのかかる実施形態では、ＰＩドメイン残基を突然変異させて所望のＰＡＭ配列の認識を調整すると同時に、１つ以上のｎｔ溝アミノ酸を突然変異させて標的特異性を変化させる。本明細書に記載されるＣａｓ（例えば、Ｃｐｆ１）方法及び改変を用いると、ＰＡＭ認識の変化によって起こる特異性の喪失に対抗し、ＰＡＭ認識の変化によって起こる特異性の獲得を増強し、ＰＡＭ認識の変化によって起こる特異性の獲得に対抗し、又はＰＡＭ認識の変化によって起こる特異性の喪失を増強することができる。
【０２１３】
本方法及び突然変異は、ＰＡＭ認識が変化した任意のＣａｓ（例えば、Ｃｐｆ１）酵素で用いることができる。ＰＡＭの非限定的な例に含まれるものは、本明細書のいずれかに記載されるとおりである。
【０２１４】
更なる実施形態において、本方法及び突然変異は改変タンパク質で用いられる。
【０２１５】
天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素の任意のものにおいて、ＣＲＩＳＰＲ酵素は１つ以上の異種機能ドメインを含み得る。
【０２１６】
１つ以上の異種機能ドメインには１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）ドメインが含まれ得る。１つ以上の異種機能ドメインには少なくとも２つ以上のＮＬＳが含まれ得る。
【０２１７】
１つ以上の異種機能ドメインには１つ以上の転写活性化ドメインが含まれる。転写活性化ドメインにはＶＰ６４が含まれ得る。
【０２１８】
１つ以上の異種機能ドメインには１つ以上の転写抑制ドメインが含まれる。転写抑制ドメインにはＫＲＡＢドメイン又はＳＩＤドメインが含まれ得る。
【０２１９】
１つ以上の異種機能ドメインには１つ以上のヌクレアーゼドメインが含まれ得る。１つ以上のヌクレアーゼドメインにはＦｏｋ１が含まれ得る。
【０２２０】
１つ以上の異種機能ドメインは以下の活性の１つ以上を有し得る：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写解除因子活性、ヒストン修飾活性、ヌクレアーゼ活性、一本鎖ＲＮＡ切断活性、二本鎖ＲＮＡ切断活性、一本鎖ＤＮＡ切断活性、二本鎖ＤＮＡ切断活性及び核酸結合活性。
【０２２１】
少なくとも１つ以上の異種機能ドメインは、酵素のアミノ末端又はその近傍及び／又は酵素のカルボキシ末端又はその近傍にあり得る。
【０２２２】
１つ以上の異種機能ドメインはＣＲＩＳＰＲ酵素と融合しているか、又はＣＲＩＳＰＲ酵素に係留されているか、又はリンカー部分によってＣＲＩＳＰＲ酵素に連結されていてもよい。
【０２２３】
天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素の任意のものにおいて、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）１、野兎病菌亜種ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）、プレボテラ・アルベンシス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ａｌｂｅｎｓｉｓ）、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＣ２０１７  １、ブチリビブリオ・プロテオクラスチカス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ）、ペレグリニバクテリア細菌（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、パルクバクテリア細菌（Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、スミセラ属種（Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ  ｓｐ．）ＳＣＡＤＣ、アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＡ２０２０、カンディダタス・メタノプラズマ・テルミツム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ  ｔｅｒｍｉｔｕｍ）、ユーバクテリウム・エリゲンス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ）、モラクセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ）２３７、レプトスピラ・イナダイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ）、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６、ポルフィロモナス・クレビオリカニス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ）３、プレボテラ・ディシエンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ）、又はポルフィロモナス・マカカエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅ）（例えば、本明細書に記載されるとおり改変されたこれらの生物のうちの１つのＣｐｆ１）を含む属の生物由来のＣＲＩＳＰＲ酵素を含むことができ、及び更なる突然変異若しくは変化を含み得るか、又はキメラＣａｓ（例えばＣｐｆ１）であり得る。
【０２２４】
天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素の任意のものにおいて、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、第１のＣａｓ（例えばＣｐｆ１）オルソログ由来の第１の断片と第２のＣａｓ（例えばＣｐｆ１）オルソログ由来の第２の断片とを含むキメラＣａｓ（例えばＣｐｆ１）酵素を含むことができ、第１及び第２のＣａｓ（例えばＣｐｆ１）オルソログは異なる。第１及び第２のＣａｓ（例えばＣｐｆ１）オルソログのうちの少なくとも一方は、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）１、野兎病菌亜種ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）、プレボテラ・アルベンシス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ａｌｂｅｎｓｉｓ）、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＣ２０１７  １、ブチリビブリオ・プロテオクラスチカス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ）、ペレグリニバクテリア細菌（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、パルクバクテリア細菌（Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、スミセラ属種（Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ  ｓｐ．）ＳＣＡＤＣ、アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＡ２０２０、カンディダタス・メタノプラズマ・テルミツム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ  ｔｅｒｍｉｔｕｍ）、ユーバクテリウム・エリゲンス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ）、モラクセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ）２３７、レプトスピラ・イナダイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ）、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６、ポルフィロモナス・クレビオリカニス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ）３、プレボテラ・ディシエンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ）、又はポルフィロモナス・マカカエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅ）を含む生物由来のＣａｓ（例えばＣｐｆ１）を含み得る。
【０２２５】
天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素の任意のものにおいて、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするヌクレオチド配列は真核生物での発現にコドンが最適化されていてもよい。
【０２２６】
天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素の任意のものにおいて、細胞は真核細胞又は原核細胞であってもよい；ここでＣＲＩＳＰＲ複合体は細胞において作動可能であり、それによってＣＲＩＳＰＲ複合体の酵素は非改変酵素と比較したとき細胞の１つ以上のオフターゲット遺伝子座を改変する能力が低下し、及び／又はそれによってＣＲＩＳＰＲ複合体内の酵素は非改変酵素と比較したとき１つ以上の標的遺伝子座を改変する能力が増加する。
【０２２７】
従って、ある態様において、本発明は、本明細書に定義するとおりのエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲタンパク質又は系を含む真核細胞を提供する。
【０２２８】
特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの方法は、１つ以上の目的の遺伝子のプロモーターを含む調節エレメントと細胞内で作動可能に接続した１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸が提供又は導入されるＣａｓ（例えばＣｐｆ１）トランスジェニック細胞を提供するステップを含み得る。本明細書で使用されるとき、用語「Ｃａｓトランスジェニック細胞」は、Ｃａｓ遺伝子がゲノム的に組み込まれている真核細胞などの細胞を指す。細胞の性質、タイプ、又は起源は、本発明によれば特に限定されない。また、Ｃａｓトランス遺伝子を細胞に導入する方法も様々であってよく、当該技術分野において公知のとおりの任意の方法であり得る。特定の実施形態において、Ｃａｓトランスジェニック細胞は、単離細胞にＣａｓトランス遺伝子を導入することによって得られる。特定の他の実施形態において、Ｃａｓトランスジェニック細胞は、Ｃａｓトランスジェニック生物から細胞を単離することによって得られる。例として、及び限定なしに、本明細書において言及されるとおりのＣａｓトランスジェニック細胞は、Ｃａｓノックイン真核生物など、Ｃａｓトランスジェニック真核生物に由来してもよい。国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ１３／７４６６７号明細書）（参照により本明細書に援用される）が参照される。Ｒｏｓａ遺伝子座の標的化に関するＳａｎｇａｍｏ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願公開第２０１２００１７２９０号明細書及び同第２０１１０２６５１９８号明細書の方法を、本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系を利用するように改変し得る。Ｒｏｓａ遺伝子座の標的化に関するＣｅｌｌｅｃｔｉｓに譲渡された米国特許出願公開第２０１３０２３６９４６号明細書の方法もまた、本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系を利用するように改変し得る。更なる例として、Ｃａｓ９ノックインマウスについて記載しているＰｌａｔｔ  ｅｔ．ａｌ．（Ｃｅｌｌ；１５９（２）：４４０−４５５（２０１４））（参照により本明細書に援用される）が参照され、及びこれは本明細書に定義するとおりの本発明のＣＲＩＳＰＲ酵素に当てはめることができる。Ｃａｓトランス遺伝子はＬｏｘ−Ｓｔｏｐ−ポリＡ−Ｌｏｘ（ＬＳＬ）カセットを更に含んでもよく、それによりＣａｓ発現をＣｒｅリコンビナーゼによって誘導可能なものにすることができる。或いは、Ｃａｓトランスジェニック細胞は、単離細胞にＣａｓトランス遺伝子を導入することによって得てもよい。トランス遺伝子の送達系は当該技術分野において周知である。例として、Ｃａｓトランス遺伝子は、同様に本明細書の他の部分に記載されるとおり、例えば真核細胞においてベクター（例えば、ＡＡＶ、アデノウイルス、レンチウイルス）及び／又は粒子及び／又はナノ粒子送達を用いて送達し得る。
【０２２９】
当業者は、本明細書において参照されるとおりのＣａｓトランスジェニック細胞などの細胞が、例えば、及び限定なしに、Ｐｌａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４），Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）又はＫｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．．（２００９）に記載されるとおり、組み込まれたＣａｓ遺伝子を有することに加えて更なるゲノム変化を含み、又はＣａｓを標的遺伝子座にガイドすることが可能なＲＮＡと複合体を形成したときＣａｓの配列特異的作用によって生じる突然変異、例えば１つ以上の発癌突然変異などを含み得ることを理解するであろう。
【０２３０】
本発明はまた、本節に記載されるなどの、本明細書に記載されるとおりのエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲタンパク質を含む組成物も提供する。
【０２３１】
本発明はまた、上記に記載される任意の天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体を含む天然に存在しないエンジニアリングされた組成物も提供する。
【０２３２】
ある態様において、本発明は、１つ以上のベクターを含むベクター系を提供し、ここで１つ以上のベクターは、
ａ）本明細書に定義するとおりのエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第１の調節エレメント；及び任意選択で、
ｂ）ガイド配列、ダイレクトリピート配列を含むガイドＲＮＡを含む１つ以上の核酸分子をコードする１つ以上のヌクレオチド配列に作動可能に連結された第２の調節エレメントを含み、任意選択で構成成分（ａ）及び（ｂ）は同じ又は異なるベクターに位置する。
【０２３３】
本発明はまた、
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体構成成分又は前記構成成分を含むか若しくはそれをコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列を細胞に送達するように作動可能に構成された送達系であって、前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体は細胞において作動可能である、送達系
を含む天然に存在しないエンジニアリングされた組成物も提供し、
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体構成成分又は細胞における転写及び／又は翻訳のためＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列は、
（Ｉ）本明細書に記載の天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素（例えば、エンジニアリングされたＣｐｆ１）；
（ＩＩ）以下を含むＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓガイドＲＮＡ：
ガイド配列、
ダイレクトリピート配列、
を含み、ここで：
ＣＲＩＳＰＲ複合体内の酵素は非改変酵素と比較したとき１つ以上のオフターゲット遺伝子座を改変する能力が低下し、及び／又はそれによってＣＲＩＳＰＲ複合体内の酵素は非改変酵素と比較したとき１つ以上の標的遺伝子座を改変する能力が増加する。
【０２３４】
ある態様において、本発明はまた、本節に記載されるなどの、本明細書に記載されるとおりのエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲタンパク質を含む系も提供する。
【０２３５】
任意のかかる組成物において、本明細書のいずれかで記載されるとおり、送達系には、酵母系、リポフェクション系、マイクロインジェクション系、微粒子銃系、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン、脂質：核酸コンジュゲート又は人工ビリオンが含まれ得る。
【０２３６】
任意のかかる組成物において、送達系には、１つ以上のベクターを含むベクター系が含まれてもよく、ここでは構成成分（ＩＩ）が、ガイド配列とダイレクトリピート配列と任意選択的に含むポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された第１の調節エレメントを含み、及び構成成分（Ｉ）が、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された第２の調節エレメントを含む。
【０２３７】
任意のかかる組成物において、送達系には、１つ以上のベクターを含むベクター系が含まれてもよく、ここでは構成成分（ＩＩ）が、ガイド配列及びダイレクトリピート配列に作動可能に連結された第１の調節エレメントとを含み、及び構成成分（Ｉ）が、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された第２の調節エレメントを含む。
【０２３８】
任意のかかる組成物において、組成物は２つ以上のガイドＲＮＡを含むことができ、各ガイドＲＮＡが異なる標的を有し、それによって多重化がある。
【０２３９】
任意のかかる組成物において、１つ又は複数のポリヌクレオチド配列が１つのベクター上にあってもよい。
【０２４０】
本発明はまた、
ａ）本明細書における本発明の構築物のいずれか１つの天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第１の調節エレメント；及び
ｂ）ガイドＲＮＡの１つ以上をコードする１つ以上のヌクレオチド配列に作動可能に連結された第２の調節エレメントであって、ガイドＲＮＡがガイド配列とダイレクトリピート配列とを含む、第２の調節エレメント、
を含む１つ以上のベクターを含む、エンジニアリングされた天然に存在しないクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）ベクター系も提供し、ここで：
構成成分（ａ）及び（ｂ）は同じ又は異なるベクター上に位置し、
ＣＲＩＳＰＲ複合体が形成され；
ガイドＲＮＡが標的ポリヌクレオチド遺伝子座を標的化し、酵素がポリヌクレオチド遺伝子座を変化させ、及び
ＣＲＩＳＰＲ複合体内の酵素は非改変酵素と比較したとき１つ以上のオフターゲット遺伝子座を改変する能力が低下し、及び／又はそれによってＣＲＩＳＰＲ複合体内の酵素は非改変酵素と比較したとき１つ以上の標的遺伝子座を改変する能力が増加する。
【０２４１】
かかる系において、構成成分（ＩＩ）は、ガイド配列とダイレクトリピート配列とを含むポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された第１の調節エレメントを含むことができ、及び構成成分（ＩＩ）は、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された第２の調節エレメントを含むことができる。かかる系において、適用可能な場合、ガイドＲＮＡにはキメラＲＮＡが含まれ得る。
【０２４２】
かかる系において、構成成分（Ｉ）は、ガイド配列及びダイレクトリピート配列に作動可能に連結された第１の調節エレメントを含むことができ、及び構成成分（ＩＩ）は、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された第２の調節エレメントを含むことができる。かかる系は２つ以上のガイドＲＮＡを含むことができ、各ガイドＲＮＡが異なる標的を有し、それによって多重化がある。構成成分（ａ）及び（ｂ）は同じベクター上にあってもよい。
【０２４３】
ベクターを含む任意のかかる系において、１つ以上のベクターには、１つ以上のレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス又は単純ヘルペスウイルスなど、１つ以上のウイルスベクターが含まれ得る。
【０２４４】
調節エレメントを含む任意のかかる系において、前記調節エレメントの少なくとも１つは組織特異的プロモーターを含むことができる。組織特異的プロモーターは、哺乳類血球細胞、哺乳類肝細胞又は哺乳類眼において発現を導き得る。
【０２４５】
上述の組成物又は系の任意のものにおいて、ダイレクトリピート配列は１つ以上のタンパク質相互作用ＲＮＡアプタマーを含むことができる。１つ以上のアプタマーはテトラループに位置し得る。１つ以上のアプタマーは、ＭＳ２バクテリオファージコートタンパク質との結合能を有し得る。
【０２４６】
上述の組成物又は系の任意のものにおいて、細胞は真核細胞又は原核細胞であってもよい；ここでＣＲＩＳＰＲ複合体は細胞において作動可能であり、それによってＣＲＩＳＰＲ複合体の酵素は非改変酵素と比較したとき細胞の１つ以上のオフターゲット遺伝子座を改変する能力が低下し、及び／又はそれによってＣＲＩＳＰＲ複合体内の酵素は非改変酵素と比較したとき１つ以上の標的遺伝子座を改変する能力が増加する。
【０２４７】
本発明はまた、上記に記載される組成物のいずれかの又は上記に記載される系のいずれかからのＣＲＩＳＰＲ複合体も提供する。
【０２４８】
本発明はまた、細胞の目的の遺伝子座を改変する方法も提供し、この方法は、本明細書に記載されるエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ酵素（例えば、エンジニアリングされたＣｐｆ１）、組成物のいずれか又は本明細書に記載される系又はベクター系のいずれかに細胞を接触させるステップを含み、又はここで細胞が、細胞内に存在する本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ複合体のいずれかを含む。かかる方法において、細胞は原核細胞又は真核細胞であってもよく、好ましくは真核細胞である。かかる方法において、生物が細胞を含み得る。かかる方法において、生物はヒト又は他の動物でなくてもよい。
【０２４９】
任意のかかる方法がエキソビボ又はインビトロであってもよい。
【０２５０】
特定の実施形態において、前記ガイドＲＮＡ又はＣａｓタンパク質の少なくとも一方をコードするヌクレオチド配列は、目的の遺伝子のプロモーターを含む調節エレメントと細胞内で作動可能に接続されており、それによって少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系構成成分の発現が目的の遺伝子のプロモーターによってドライブされる。「作動可能に接続されている」は、本明細書の他の部分においても言及されるとおり、ガイドＲＮＡ及び／又はＣａｓをコードするヌクレオチド配列がヌクレオチド配列の発現を可能にする形で１つ又は複数の調節エレメントに連結されていることを意味するように意図される。用語「調節エレメント」もまた本明細書の他の部分に記載される。本発明によれば、調節エレメントは、好ましくは目的の内因性遺伝子のプロモーターなど、目的の遺伝子のプロモーターを含む。特定の実施形態において、プロモーターはその内因性ゲノム位置にある。かかる実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ及び／又はＣａｓをコードする核酸は、その天然のゲノム位置にある目的の遺伝子のプロモーターの転写制御下にある。特定の他の実施形態において、プロモーターはベクター又はプラスミドなどの（別個の）核酸分子上に提供されるか、又は他の染色体外核酸上に提供され、即ちプロモーターはその天然のゲノム位置に提供されない。特定の実施形態において、プロモーターは非天然のゲノム位置にゲノム的に組み込まれる。
【０２５１】
任意のかかる方法、前記改変には、遺伝子発現の改変が含まれ得る。前記遺伝子発現の改変には、遺伝子発現を活性化させること及び／又は遺伝子発現を抑制することが含まれ得る。従って、ある態様において、本発明は、遺伝子発現を調節する方法を提供し、この方法は、本明細書に記載されるとおりのエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲタンパク質又は系を細胞に導入することを含む。
【０２５２】
本発明はまた、それを必要としている個体の疾患、障害又は感染を治療する方法も提供し、この方法は、本明細書に記載されるエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ酵素（例えばエンジニアリングされたＣｐｆ１）、組成物、系又はＣＲＩＳＰＲ複合体のいずれかの有効量を投与するステップを含む。疾患、障害又は感染には、ウイルス感染が含まれ得る。ウイルス感染はＨＢＶであってもよい。
【０２５３】
本発明はまた、上記に記載されるエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ酵素（例えばエンジニアリングされたＣｐｆ１）、組成物、系又はＣＲＩＳＰＲ複合体のいずれかの遺伝子又はゲノム編集への使用も提供する。
【０２５４】
本発明はまた、哺乳類細胞における目的のゲノム遺伝子座の発現を変化させる方法も提供し、この方法は、本明細書に記載されるエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ酵素（例えばエンジニアリングされたＣｐｆ１）、組成物、系又はＣＲＩＳＰＲ複合体に細胞を接触させ、それによりＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ（ベクター）を送達し、及びＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体を形成させて標的と結合させ、及び発現の増加又は低下、又は遺伝子産物の改変など、ゲノム遺伝子座の発現が変化したかどうかを決定することを含む。
【０２５５】
本発明はまた、療法薬として用いられる、上記に記載されるエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ酵素（例えばエンジニアリングされたＣｐｆ１）、組成物、系又はＣＲＩＳＰＲ複合体のいずれかも提供する。療法薬は遺伝子若しくはゲノム編集、又は遺伝子療法のためのものであってもよい。
【０２５６】
特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりのエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ酵素（例えばエンジニアリングされたＣｐｆ１）の活性には、任意選択で遺伝子の転写の低下をもたらすゲノムＤＮＡ切断が含まれる。
【０２５７】
ある態様において、本発明は、本明細書に記載されるとおの方法によりゲノム遺伝子座の発現が変化した単離細胞を提供し、ここで発現の変化は、ゲノム遺伝子座の発現を変化させる方法に供されていない細胞との比較である。関連する態様において、本発明は、かかる細胞から樹立された細胞株を提供する。
【０２５８】
一態様において、本発明は、例えばＨＳＣ（造血幹細胞）の目的のゲノム遺伝子座（例えば、この目的のゲノム遺伝子座は、異常タンパク質発現又は疾患条件若しくは状態に関連する突然変異に関連する）にある標的配列の操作によって生物又は非ヒト生物を改変する方法を提供し、この方法は、
Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）ポリヌクレオチド配列であって、
（ａ）ＨＳＣ内の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、
（ｂ）ダイレクトリピート配列、
を含むポリヌクレオチド配列、及び
ＩＩ．任意選択で少なくとも１つ以上の核局在化配列を含む、ＣＲＩＳＰＲ酵素、
を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を、例えばそれを含有する粒子にＨＳＣを接触させることによって、ＨＳＣに送達するステップを含み、
ここで、ガイド配列は標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導き、及び
ここでＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズするガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み；及び
この方法はまた、任意選択で、例えば、ＨＤＲ鋳型を含有するＨＳＣと接触する粒子を介するか、又はＨＤＲ鋳型を含有する別の粒子にＨＳＣを接触させることにより、ＨＤＲ鋳型を送達するステップも含むことができ、ここでＨＤＲ鋳型は正常型又は低度異常型のタンパク質の発現をもたらし；「正常」は野生型に関するものであり、及び「異常」は病態又は疾患状態を引き起こすタンパク質発現であってもよく；及び
任意選択で本方法は、生物又は非ヒト生物からＨＳＣを単離又は入手するステップ、任意選択でＨＳＣ集団を拡大するステップ、１つ又は複数の粒子とＨＳＣとの接触を実施して改変されたＨＳＣ集団を入手するステップ、任意選択で改変されたＨＳＣの集団を拡大するステップ、及び任意選択で改変されたＨＳＣを生物又は非ヒト生物に投与するステップを含み得る。
【０２５９】
一態様において、本発明は、例えばＨＳＣの目的のゲノム遺伝子座（例えば、この目的のゲノム遺伝子座は、異常タンパク質発現又は疾患条件若しくは状態に関連する突然変異に関連する）にある標的配列の操作によって生物又は非ヒト生物を改変する方法を提供し、この方法は、Ｉ．（ａ）ＨＳＣ内の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、及び（ｂ）少なくとも１つ以上のダイレクトリピート配列、及びＩＩ．任意選択で１つ以上のＮＬＳを有する、ＣＲＩＳＰＲ酵素、を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を、例えばそれを含有する粒子にＨＳＣを接触させることによって、ＨＳＣに送達するステップを含み、ガイド配列は標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導き、及びここでＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的配列にハイブリダイズするガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み；及び
この方法はまた、任意選択で、例えば、ＨＤＲ鋳型を含有するＨＳＣと接触する粒子を介するか、又はＨＤＲ鋳型を含有する別の粒子にＨＳＣを接触させることにより、ＨＤＲ鋳型を送達するステップも含むことができ、ここでＨＤＲ鋳型は正常型又は低度異常型のタンパク質の発現をもたらし；「正常」は野生型に関するものであり、及び「異常」は病態又は疾患状態を引き起こすタンパク質発現であってもよく；及び
任意選択で本方法は、生物又は非ヒト生物からＨＳＣを単離又は入手するステップ、任意選択でＨＳＣ集団を拡大するステップ、１つ又は複数の粒子とＨＳＣとの接触を実施して改変されたＨＳＣ集団を入手するステップ、任意選択で改変されたＨＳＣの集団を拡大するステップ、及び任意選択で改変されたＨＳＣを生物又は非ヒト生物に投与するステップを含み得る。
【０２６０】
この送達は、例えば、１つ以上の調節エレメントに機能的に連結している１つ以上のポリヌクレオチドを含有するベクターを含有する１つ以上の粒子を介した、ＣＲＩＳＰＲ複合体の任意の１つ以上又は全てをコードする１つ以上のポリヌクレオチドであって、有利にはｉｎ  ｖｉｖｏ発現のための１つ以上の調節エレメントに連結したポリヌクレオチドの送達であり得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列、ガイド配列、ダイレクトリピート配列の一部又は全部がＲＮＡであってもよい。ＲＮＡであって、かかるダイレクトリピート配列の特徴を「含む」と言われるポリヌクレオチドが言及される場合、ＲＮＡ配列がその特徴を備えることは理解されるであろう。ポリヌクレオチドがＤＮＡであって、かかるダイレクトリピート配列の特徴を含むと言われる場合、ＤＮＡ配列はその問題の特徴を含むＲＮＡに転写されるか、又は転写されることができる。特徴がＣＲＩＳＰＲ酵素などのタンパク質である場合、言及されるＤＮＡ又はＲＮＡ配列は（ＤＮＡの場合には、初めに転写されてから）翻訳されるか、又は翻訳されることができる。
【０２６１】
特定の実施形態において、本発明は、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物をＨＳＣと例えば接触させることによって送達するステップを含む、目的のゲノム遺伝子座であって、例えば異常タンパク質発現又は疾患条件若しくは状態に関連する突然変異に関連するＨＳＣの目的のゲノム遺伝子座における標的配列の操作によって生物、例えばヒトを含む哺乳動物又は非ヒト哺乳動物若しくは生物を改変する方法を提供し、ここで組成物は、組成物を発現させるためその組成物を機能的にコードする１つ以上のウイルス、プラスミド又は核酸分子ベクター（例えばＲＮＡ）を含む１つ以上の粒子を含み、この組成物は、（Ａ）Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ＲＮＡポリヌクレオチド配列に機能的に連結している第１の調節エレメントであって、ポリヌクレオチド配列が、（ａ）真核細胞中の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、（ｂ）ダイレクトリピート配列を含む、第１の調節エレメント、及びＩＩ．少なくとも１つ以上の核局在化配列（又は一部の実施形態はＮＬＳが関与しないこともあるため任意選択で少なくとも１つ以上の核局在化配列）を含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に機能的に連結している第２の調節エレメント［（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は５’から３’への方向に並び、構成成分Ｉ及びＩＩは系の同じ又は異なるベクターに位置し、転写されると、且つガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的結合を誘導し、及びＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的配列にハイブリダイズするガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む］、又は（Ｂ）天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物であって、Ｉ．（ａ）真核細胞中の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、及び（ｂ）少なくとも１つ以上のダイレクトリピート配列に機能的に連結している第１の調節エレメント、ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に機能的に連結している第２の調節エレメント、［構成成分Ｉ及びＩＩは系の同じ又は異なるベクターに位置し、転写されると、且つガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的結合を誘導し、及びＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的配列にハイブリダイズするガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む］を含む１つ以上のベクターを含むベクター系を含む組成物を含み；この方法は、任意選択で、例えば、ＨＤＲ鋳型を含有するＨＳＣと接触する粒子を介するか、又はＨＤＲ鋳型を含有する別の粒子にＨＳＣを接触させることにより、ＨＤＲ鋳型を送達するステップもまた含むことができ、ここでＨＤＲ鋳型は正常型又は低度異常型のタンパク質の発現をもたらし；「正常」は野生型に関するものであり、及び「異常」は病態又は疾患状態を引き起こすタンパク質発現であってよく；及び任意選択でこの方法は、ＨＳＣを生物又は非ヒト生物から単離又は入手するステップ、任意選択でＨＳＣ集団を拡大するステップ、１つ以上の粒子と、ＨＳＣとの接触を実施して改変されたＨＳＣ集団を入手するステップ、任意選択で改変ＨＳＣの集団を拡大するステップ及び任意選択で改変ＨＳＣを生物又は非ヒト生物に投与するステップを含み得る。一部の実施形態では、構成成分Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩが同じベクターに位置する。他の実施形態では、構成成分Ｉ及びＩＩが同じベクターに位置し、一方で構成成分ＩＩＩが別のベクターに位置する。他の実施形態では、構成成分Ｉ及びＩＩＩが同じベクターに位置し、一方で構成成分ＩＩが別のベクターに位置する。他の実施形態では、構成成分ＩＩ及びＩＩＩが同じベクターに位置し、一方で構成成分Ｉが別のベクターに位置する。他の実施形態では、構成成分Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩの各々が異なるベクターに位置する。本発明はまた、本明細書に記載されるとおりのウイルス又はプラスミドベクター系も提供する。
【０２６２】
標的配列の操作とは、出願者らは標的配列の後成的操作も意味する。これは、標的配列のメチル化状態の改変（即ちメチル化又はメチル化パターン又はＣｐＧ島の付加又は除去）、ヒストン改変、標的配列への接触し易さの増加又は低減によるか、又は三次元折り畳みの促進によるなどの、標的配列のクロマチン状態の操作であってもよい。目的のゲノム遺伝子座における標的配列の操作によってヒトを含む生物若しくは哺乳動物又は非ヒト哺乳動物若しくは生物を改変する方法が言及される場合、これは生物（又は哺乳動物）に全体として適用されても、又は（その生物が多細胞生物である場合）当該生物の単一細胞若しくは細胞集団だけに適用されてもよいことは理解されるであろう。例えばヒトの場合、出願者らは特に単一細胞又は細胞集団を想定し、それらは好ましくはｅｘ  ｖｉｖｏで改変されて、次に再び導入され得る。この場合、生検又は他の組織試料若しくは生体液試料が必要となり得る。これに関して幹細胞もまた特に好ましい。しかし、当然ながらｉｎ  ｖｉｖｏ実施形態もまた想定される。そして本発明は、ＨＳＣに関して特に有利である。
【０２６３】
本発明は、一部の実施形態では、例えば、
Ｉ．第１のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ（例えば、Ｃｐｆ１）系ＲＮＡ（ＲＮＡ）ポリヌクレオチド配列であって、
（ａ）第１の標的配列にハイブリダイズ可能な第１のガイド配列、
（ｂ）第１のダイレクトリピート配列、及び
を含む第１のポリヌクレオチド配列、
ＩＩ．第２のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ（例えば、Ｃｐｆ１）系ガイドＲＮＡポリヌクレオチド配列であって、
（ａ）第２の標的配列にハイブリダイズ可能な第２のガイド配列、
（ｂ）第２のダイレクトリピート配列、及び
を含む第２のポリヌクレオチド配列、及び
ＩＩＩ．少なくとも１つ以上の核局在化配列を含み、且つ１つ以上の突然変異を含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列［（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は５’から３’への方向に並ぶ］；又は
ＩＶ．Ｉ．〜ＩＩＩ．の１つ以上の１つ又は複数の発現産物、例えば第１及び第２のダイレクトリピート配列、ＣＲＩＳＰＲ酵素；
［転写されると、第１及び第２のガイド配列がそれぞれ第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ複合体と第１及び第２の標的配列との配列特異的結合を誘導し、第１のＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）第１の標的配列にハイブリダイズする第１のガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、第２のＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）第２の標的配列にハイブリダイズする第２のガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列がＤＮＡ又はＲＮＡであり、及び第１のガイド配列が第１の標的配列の近傍でＤＮＡ二重鎖の一方の鎖の切断を誘導し、且つ第２のガイド配列が第２の標的配列の近傍で他方の鎖の切断を誘導して二本鎖切断を生じさせ、それにより生物又は非ヒト生物を改変する］を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を含む粒子をＨＳＣに接触させることによる送達するステップを含む、ＨＳＣの目的のゲノム遺伝子座であって、例えば異常タンパク質発現又は疾患条件若しくは状態に関連する突然変異に関連する目的のゲノム遺伝子座におけるＤＮＡ二重鎖の逆鎖上にある第１及び第２の標的配列の操作によって生物又は非ヒト生物を改変する方法を包含し、；及びこの方法は、任意選択で、例えば、ＨＤＲ鋳型を含有するＨＳＣと接触する粒子を介するか、又はＨＤＲ鋳型を含有する別の粒子にＨＳＣを接触させることにより、ＨＤＲ鋳型を送達するステップもまた含むことができ、ここでＨＤＲ鋳型は正常型又は低度異常型のタンパク質の発現をもたらし；「正常」は野生型に関するものであり、及び「異常」は病態又は疾患状態を引き起こすタンパク質発現であってよく；及び任意選択でこの方法は、生物又は非ヒト生物からＨＳＣを単離又は入手するステップ、任意選択でこのＨＳＣ集団を拡大するステップ、１つ以上の粒子とＨＳＣとの接触を実施して改変されたＨＳＣ集団を入手するステップ、任意選択で改変ＨＳＣの集団を拡大するステップを含み、及び任意選択で改変ＨＳＣを生物又は非ヒト生物に投与するステップとを含む、前記ゲノム遺伝子座のコードエレメント、非コードエレメント又は調節エレメント内の標的配列の操作を含む方法。本発明の一部の方法において、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列、第１及び第２のガイド配列、第１及び第２のダイレクトリピート配列の一部又は全部がＲＮＡである。本発明のさらなる実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列、第１及び第２のガイド配列、第１及び第２のダイレクトリピート配列をコードするポリヌクレオチドはＲＮＡであり、リポソーム、ナノ粒子、エキソソーム、微小胞、又は遺伝子銃によって送達される；しかし、送達は粒子によることが有利である。本発明の特定の実施形態において、第１及び第２のダイレクトリピートは１００％の同一性を共有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つ以上のベクターを含むベクター系内に含まれ得る。好ましい実施形態において、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素は、その酵素が相補鎖ニッキング酵素となるような１つ以上の突然変異を有し、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素は、その酵素が非相補鎖ニッキング酵素となるような１つ以上の突然変異を有する。或いは、第１の酵素が非相補鎖ニッキング酵素であってもよく、及び第２の酵素が相補鎖ニッキング酵素であってもよい。本発明の好ましい方法において、第１のガイド配列が第１の標的配列の近傍でＤＮＡ二重鎖の一方の鎖の切断を誘導し、且つ第２のガイド配列が第２の標的配列の近傍で他方の鎖の切断を誘導することにより、５’オーバーハングが生じる。本発明の実施形態において、５’オーバーハングは高々２００塩基対、好ましくは高々１００塩基対、又はより好ましくは高々５０塩基対である。本発明の実施形態において、５’オーバーハングは少なくとも２６塩基対、好ましくは少なくとも３０塩基対、又はより好ましくは３４〜５０塩基対である。
【０２６４】
本発明は、一部の実施形態では、例えば、
Ｉ．第１の調節エレメントであって、
（ａ）第１の標的配列にハイブリダイズ可能な第１のガイド配列、及び
（ｂ）少なくとも１つ以上のダイレクトリピート配列
に機能的に連結している第１の調節エレメント、
ＩＩ．第２の調節エレメントであって、
（ａ）第２の標的配列にハイブリダイズ可能な第２のガイド配列、及び
（ｂ）少なくとも１つ以上のダイレクトリピート配列
に機能的に連結している第２の調節エレメント、
ＩＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素（例えば、Ｃｐｆ１）をコードする酵素コード配列に機能的に連結している第３の調節エレメント、及び
Ｖ．Ｉ．〜ＩＶ．の１つ以上の１つ又は複数の発現産物、例えば第１及び第２のダイレクトリピート配列、ＣＲＩＳＰＲ酵素；
［転写されると、構成成分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶが系の同じ又は異なるベクターに位置し、且つ第１及び第２のガイド配列がそれぞれ第１及び第２の標的配列に対する第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を誘導し、第１のＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）第１の標的配列にハイブリダイズする第１のガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、第２のＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）第２の標的配列にハイブリダイズする第２のガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列がＤＮＡ又はＲＮＡであり、及び第１のガイド配列が第１の標的配列の近傍でＤＮＡ二重鎖の一方の鎖の切断を誘導し、且つ第２のガイド配列が第２の標的配列の近傍で他方の鎖の切断を誘導して二本鎖切断を生じさせ、それにより生物又は非ヒト生物を改変する］を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を含む１つ以上の粒子をＨＳＣに接触させることにより送達するステップを含む、例えばＨＳＣの目的のゲノム遺伝子座であって、異常タンパク質発現又は疾患条件若しくは状態に関連する突然変異に関連する目的のゲノム遺伝子座におけるＤＮＡ二重鎖の逆鎖上にある第１及び第２の標的配列の操作によって生物又は非ヒト生物を改変する方法を包含し；及びこの方法は、任意選択で、例えば、ＨＤＲ鋳型を含有するＨＳＣと接触する粒子を介するか、又はＨＤＲ鋳型を含有する別の粒子にＨＳＣを接触させることにより、ＨＤＲ鋳型を送達するステップもまた含むことができ、ここでＨＤＲ鋳型は正常型又は低度異常型のタンパク質の発現をもたらし；「正常」は野生型に関するものであり、及び「異常」は病態又は疾患状態を引き起こすタンパク質発現であってよく；及び任意選択でこの方法は、生物又は非ヒト生物からＨＳＣを単離又は入手するステップ、任意選択でこのＨＳＣ集団を拡大するステップ、１つ以上の粒子とＨＳＣとの接触を実施して改変されたＨＳＣ集団を入手するステップ、任意選択で改変ＨＳＣの集団を拡大するステップ、及び任意選択で改変ＨＳＣを生物又は非ヒト生物に投与するステップを含み得る。
【０２６５】
本発明はまた、本明細書に記載されるとおりのベクター系も提供する。この系は、１つ、２つ、３つ又は４つの異なるベクターを含み得る。従って構成成分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶは１つ、２つ、３つ又は４つの異なるベクターに位置してもよく、本明細書では、構成成分の可能な位置の全ての組み合わせが想定され、例えば：想定される全ての位置の組み合わせで、構成成分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶが同じベクターに位置してもよく；構成成分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶが各々異なるベクターに位置してもよく；構成成分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶが合計２つ又は３つの異なるベクターに位置してもよい等である。本発明の一部の方法において、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列、第１及び第２のガイド配列、第１及び第２のダイレクトリピート配列の一部又は全部がＲＮＡである。本発明のさらなる実施形態において、第１及び第２のダイレクトリピート配列は１００％の同一性を共有する。好ましい実施形態において、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素は、その酵素が相補鎖ニッキング酵素となるような１つ以上の突然変異を有し、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素は、その酵素が非相補鎖ニッキング酵素となるような１つ以上の突然変異を有する。或いは、第１の酵素が非相補鎖ニッキング酵素であってもよく、及び第２の酵素が相補鎖ニッキング酵素であってもよい。本発明のさらなる実施形態において、ウイルスベクターの１つ以上は、リポソーム、ナノ粒子、エキソソーム、微小胞、又は遺伝子銃によって送達される；しかし、粒子送達が有利である。
【０２６６】
本発明の好ましい方法において、第１のガイド配列が第１の標的配列の近傍でＤＮＡ二重鎖の一方の鎖の切断を誘導し、且つ第２のガイド配列が第２の標的配列の近傍で他方の鎖の切断を誘導することにより、５’オーバーハングが生じる。本発明の実施形態において、５’オーバーハングは高々２００塩基対、好ましくは高々１００塩基対、又はより好ましくは高々５０塩基対である。本発明の実施形態において、５’オーバーハングは少なくとも２６塩基対、好ましくは少なくとも３０塩基対、又はより好ましくは３４〜５０塩基対である。
【０２６７】
本発明は、一部の実施形態では、例えば、１つ以上の突然変異を有するＣａｓタンパク質とＨＳＣ中のＤＮＡ分子のそれぞれ第１の鎖及び第２の鎖を標的にする２つのガイドＲＮＡとを含む粒子をＨＳＣに接触させることにより、ＨＳＣに導入し、それによりガイドＲＮＡがＤＮＡ分子を標的化し、且つＣａｓタンパク質がＤＮＡ分子の第１の鎖及び第２の鎖の各々をニッキングし、それによりＨＳＣ中の標的を変化させることにより（及び、Ｃａｓタンパク質と２つのガイドＲＮＡとは天然では一緒に存在しない）、例えばＨＳＣにおける目的のゲノム遺伝子座であって、例えば異常タンパク質発現又は疾患条件若しくは状態に関連する突然変異に関連する目的のゲノム遺伝子座を改変する方法を包含し、及びこの方法は、任意選択で、例えば、ＨＤＲ鋳型を含有するＨＳＣと接触する粒子を介するか、又はＨＤＲ鋳型を含有する別の粒子にＨＳＣを接触させることにより、ＨＤＲ鋳型を送達するステップもまた含むことができ、ここでＨＤＲ鋳型は正常型又は低度異常型のタンパク質の発現をもたらし；「正常」は野生型に関するものであり、及び「異常」は病態又は疾患状態を引き起こすタンパク質発現であってよく；及び任意選択でこの方法は、生物又は非ヒト生物からＨＳＣを単離又は入手するステップ、任意選択でこのＨＳＣ集団を拡大するステップ、１つ以上の粒子とＨＳＣとの接触を実施して改変されたＨＳＣ集団を入手するステップ、任意選択で改変ＨＳＣの集団を拡大するステップ及び任意選択で改変ＨＳＣを生物又は非ヒト生物に投与するステップを含み得る。本発明の好ましい方法において、Ｃａｓタンパク質がＤＮＡ分子の第１の鎖及び第２の鎖の各々をニッキングすることにより、５’オーバーハングが生じる。本発明の実施形態において、５’オーバーハングは高々２００塩基対、好ましくは高々１００塩基対、又はより好ましくは高々５０塩基対である。本発明の実施形態において、５’オーバーハングは少なくとも２６塩基対、好ましくは少なくとも３０塩基対、又はより好ましくは３４〜５０塩基対である。本発明の態様において、Ｃａｓタンパク質は、真核細胞、好ましくは哺乳類細胞又はヒト細胞での発現にコドンが最適化されている。本発明の態様は、遺伝子産物の発現を低下させること、又は遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子に鋳型ポリヌクレオチドが更に導入されること、又は２つの５’オーバーハングのリアニーリング及びライゲーションを可能にすることにより介在配列が正確に切り出されること、又は遺伝子産物の活性又は機能を変化させること、又は遺伝子産物の発現を増加させることに関する。本発明のある実施形態において、遺伝子産物はタンパク質である。
【０２６８】
本発明は、一部の実施形態では、例えば、
ａ）ＨＳＣの二本鎖ＤＮＡ分子のそれぞれ第１の鎖及び第２の鎖を標的化する２つのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ガイドＲＮＡの各々に機能的に連結している第１の調節エレメント、及び
ｂ）Ｃａｓ（例えば、Ｃｐｆ１）タンパク質に機能的に連結している第２の調節エレメント、又は
ｃ）ａ）又はｂ）の１つ以上の発現産物、
［構成成分（ａ）及び（ｂ）は系の同じ又は異なるベクターに位置する］を含む１つ以上の粒子をＨＳＣに接触させることにより、ＨＳＣに導入し、それによりガイドＲＮＡがＨＳＣのＤＮＡ分子を標的化し、且つＣａｓタンパク質がそのＨＳＣのＤＮＡ分子の第１の鎖及び第２の鎖の各々をニッキングすることにより（及び、Ｃａｓタンパク質と２つのガイドＲＮＡとは天然では一緒に存在しない）、ＨＳＣにおける目的のゲノム遺伝子座、例えば異常タンパク質発現又は疾患条件若しくは状態に関連する突然変異に関連する目的のゲノム遺伝子座を改変する方法を包含し；及びこの方法は、任意選択で、例えばＨＤＲ鋳型を含有するＨＳＣと接触する粒子を介するか、又はＨＤＲ鋳型を含有する別の粒子にＨＳＣを接触させることにより、ＨＤＲ鋳型を送達するステップもまた含むことができ、ここでＨＤＲ鋳型は正常型又は低度異常型のタンパク質の発現をもたらし；「正常」は野生型に関するものであり、及び「異常」は病態又は疾患状態を引き起こすタンパク質発現であってよく；及び任意選択でこの方法は、生物又は非ヒト生物からＨＳＣを単離又は入手するステップ、任意選択でＨＳＣ集団を拡大するステップ、１つ以上の粒子とＨＳＣとの接触を実施して改変されたＨＳＣ集団を入手するステップ、任意選択で改変ＨＳＣの集団を拡大するステップ、及び任意選択で改変ＨＳＣを生物又は非ヒト生物に投与するステップを含み得る。本発明の態様において、ガイドＲＮＡは、ダイレクトリピート配列に融合したガイド配列及びｔｒａｃｒ配列を含み得る。本発明の態様は、遺伝子産物の発現を低下させること、又は遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子に鋳型ポリヌクレオチドが更に導入されること、又は２つの５’オーバーハングのリアニーリング及びライゲーションを可能にすることにより介在配列が正確に切り出されること、又は遺伝子産物の活性又は機能を変化させること、又は遺伝子産物の発現を増加させることに関する。本発明のある実施形態において、遺伝子産物はタンパク質である。本発明の好ましい実施形態において、系のベクターはウイルスベクターである。さらなる実施形態において、系のベクターは、リポソーム、ナノ粒子、エキソソーム、微小胞、又は遺伝子銃によって送達され；及び粒子が好ましい。一態様において、本発明は、ＨＳＣ中の標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させるステップであって、前記標的ポリヌクレオチドの切断を生じさせ、それにより標的ポリヌクレオチドを改変するステップを含み、ここでＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズするガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列はダイレクトリピート配列に連結する。一部の実施形態において、前記突然変異は、標的配列を含む遺伝子から発現するタンパク質に１つ以上のアミノ酸変化をもたらす。一部の実施形態において、本方法は、１つ以上のベクター又はその１つ又は複数の発現産物を例えば１つ又は複数の粒子によって例えば前記ＨＳＣに送達するステップを更に含み、ここで１つ以上のベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ダイレクトリピート配列に連結されたガイド配列のうちの１つ以上の発現をドライブする。一部の実施形態において、前記ベクターは例えば対象のＨＳＣに送達される。一部の実施形態において、前記改変は細胞培養物内の前記ＨＳＣにおいて起こる。一部の実施形態において、本方法は、前記改変前に対象から前記ＨＳＣを単離するステップを更に含む。一部の実施形態において、本方法は、前記ＨＳＣ及び／又はそこから得られた細胞を前記対象に戻すステップを更に含む。
【０２６９】
一態様において、本発明は、例えば突然変異型疾患遺伝子を含むＨＳＣを作成する方法を提供する。一部の実施形態において、疾患遺伝子は、疾患の罹患又は発症リスクの増加に関連する任意の遺伝子である。一部の実施形態において、本方法は、（ａ）１つ以上のベクター又はその１つ又は複数の発現産物を例えば１つ又は複数の粒子によってＨＳＣに導入するステップ［１つ以上のベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ダイレクトリピート配列に連結されたガイド配列のうちの１つ以上の発現をドライブする］；及び（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて前記疾患遺伝子内の標的ポリヌクレオチドの切断を生じさせるステップ［ＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズするガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む］を含み、及び任意選択で、適用可能な場合、それにより突然変異型疾患遺伝子を含むＨＳＣが作成される。一部の実施形態において、前記切断は、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素によって標的配列の位置にある１本又は２本の鎖を切断することを含む。一部の実施形態において、前記切断は標的遺伝子の転写の減少をもたらす。一部の実施形態において、本方法は、前記切断された標的ポリヌクレオチドを外因性鋳型ポリヌクレオチドによる相同組換えによって修復するステップを更に含み、前記修復は、前記標的ポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、又は置換を含む突然変異をもたらす。一部の実施形態において、前記突然変異は、標的配列を含む遺伝子からのタンパク質発現に１つ以上のアミノ酸変化をもたらす。一部の実施形態において、改変ＨＳＣは動物に投与され、それにより動物モデルが作成される。
【０２７０】
一態様において、本発明は、例えばＨＳＣ内の標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて前記標的ポリヌクレオチドの切断を生じさせ、それにより標的ポリヌクレオチドを改変するステップを含み、このＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズするガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、ここで前記ガイド配列はダイレクトリピート配列に連結されている。他の実施形態では、本発明は、例えばＨＳＣから生じる真核細胞におけるポリヌクレオチドの発現を改変する方法を提供する。この方法は、ＨＳＣ中のポリヌクレオチドに結合するＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して標的ポリヌクレオチドの発現を増加又は低下させるステップを含み；有利にはＣＲＩＳＰＲ複合体は、１つ以上の粒子を介して送達される。
【０２７１】
一部の方法では、標的ポリヌクレオチドを不活性化することにより例えばＨＳＣにおける発現の改変を生じさせることができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体が細胞中の標的配列に結合すると標的ポリヌクレオチドが不活性化され、そのためその配列が転写されなくなり、コードタンパク質が産生されなくなり、又はその配列は野生型配列のようには機能しなくなる。
【０２７２】
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のＲＮＡ、例えばガイド又はｇＲＮＡは改変することができ；例えばアプタマー又は機能ドメインを含めることができる。アプタマーは、特定の標的分子に結合する合成オリゴヌクレオチド；例えば、小分子、タンパク質、核酸、及び更には細胞、組織及び生物など、様々な分子標的に結合するようにインビトロ選択の反復ラウンド又はＳＥＬＥＸ（試験管内進化法）によってエンジニアリングされている核酸分子である。アプタマーは、抗体と競合する分子認識特性を提供する点で有用である。その識別的な認識に加えて、アプタマーは、治療適用において免疫原性をほとんど又は全く誘発しないことを含め、抗体に優る利点を提供する。従って、本発明の実施においては、酵素又はＲＮＡの一方又は両方が機能ドメインを含み得る。
【０２７３】
一部の実施形態では、機能ドメインは転写活性化ドメイン、好ましくはＶＰ６４である。一部の実施形態では、機能ドメインは転写抑制ドメイン、好ましくはＫＲＡＢである。一部の実施形態では、転写抑制ドメインはＳＩＤ、又はＳＩＤのコンカテマー（例えばＳＩＤ４Ｘ）である。一部の実施形態では、機能ドメインは後成的修飾ドメインであり、従って後成的修飾酵素が提供される。一部の実施形態では、機能ドメインは活性化ドメインであり、これはＰ６５活性化ドメインであってもよい。一部の実施形態において、機能ドメインはヌクレアーゼ活性を含む。一つのかかる実施形態において、機能ドメインはＦｏｋ１を含む。
【０２７４】
本発明はまた、上記に記載される、又は上記に記載される方法のいずれかによる改変ＣＲＩＳＰＲ酵素、組成物、系又は複合体のいずれかを含むインビトロ又はエキソビボ細胞も提供する。この細胞は真核細胞又は原核細胞であってもよい。本発明はまた、かかる細胞の子孫も提供する。本発明はまた、任意のかかる細胞又は任意のかかる子孫の産物も提供し、この産物は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の改変ＣＲＩＳＰＲ酵素によって改変されたとおりの前記１つ以上の標的遺伝子座の産物である。この産物は、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質であってもよい。一部のかかる産物は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の改変ＣＲＩＳＰＲ酵素によって改変されていてもよい。一部のかかる改変された産物において、標的遺伝子座の産物は、前記改変ＣＲＩＳＰＲ酵素によって改変されていない前記標的遺伝子座の産物と物理的に異なる。
【０２７５】
本発明はまた、上記に記載される天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素のいずれかをコードするポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子も提供する。
【０２７６】
任意のかかるポリヌクレオチドが、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された１つ以上の調節エレメントを更に含み得る。
【０２７７】
１つ以上の調節エレメントを含む任意のかかるポリヌクレオチドにおいて、１つ以上の調節エレメントは、真核細胞における天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素の発現のために作動可能に構成され得る。真核細胞はヒト細胞であってもよい。真核細胞はげっ歯類細胞、任意選択でマウス細胞であってもよい。真核細胞は酵母細胞であってもよい。真核細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であってもよい。真核細胞は昆虫細胞であってもよい。
【０２７８】
１つ以上の調節エレメントを含む任意のかかるポリヌクレオチドにおいて、１つ以上の調節エレメントは、原核細胞における天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素の発現のために作動可能に構成され得る。
【０２７９】
１つ以上の調節エレメントを含む任意のかかるポリヌクレオチドにおいて、１つ以上の調節エレメントは、インビトロ系における天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素の発現のために作動可能に構成され得る。
【０２８０】
本発明はまた、上述のポリヌクレオチド分子のいずれかを含む発現ベクターも提供する。本発明はまた、１つ又は複数のかかるポリヌクレオチド分子、例えば１つ又は複数のタンパク質及び／又は核酸構成成分を発現するように作動可能に構成されたかかるポリヌクレオチド分子、並びに１つ又は複数のかかるベクターも提供する。
【０２８１】
本発明は更に、Ｃａｓ（例えば、Ｃｐｆ１）に突然変異（ｍｕａｔｉｏｎ）を作成する方法又は本明細書に記載の本発明によるＣＲＩＳＰＲ酵素のオルソログである突然変異した又は改変されたＣａｓ（例えば、Ｃｐｆ１）を提供し、これは、改変及び／又は突然変異のための、核酸分子、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｇＲＮＡ等に近接していてもよいか、又はそれに接触していてもよい当該のオルソログにおける１つ又は複数のアミノ酸、及び／又は本明細書に記載の本発明によるＣＲＩＳＰＲ酵素における本明細書に同定される１つ又は複数のアミノ酸と類似又は対応する１つ又は複数のアミノ酸を確定するステップ、及び１つ又は複数の改変及び／又は１つ又は複数の突然変異を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるオルソログを合成し、又は調製し、又は発現させるステップ又は中性アミノ酸を荷電、例えば正電荷アミノ酸へと、例えばアラニンを例えばリジンへと本明細書で考察するとおり突然変異させる、例えば改変する、例えば変更する又は突然変異させるステップを含む。このように改変されたオルソログはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に用いることができ；及びそれを発現する１つ又は複数の核酸分子は、分子を送達する又は本明細書において考察するとおりのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系構成成分をコードするベクター又は他の送達系において使用し得る。
【０２８２】
ある態様において、本発明は効率的なオンターゲット活性を提供し、且つオフターゲット活性を最小限に抑える。ある態様において、本発明はＣＲＩＳＰＲタンパク質による効率的なオンターゲット切断を提供し、且つＣＲＩＳＰＲタンパク質によるオフターゲット切断最小限に抑える。ある態様において、本発明は、ＤＮＡ切断なしに遺伝子座におけるＣＲＩＳＰＲタンパク質のガイド特異的結合を提供する。ある態様において、本発明は、遺伝子座におけるＣＲＩＳＰＲタンパク質のガイドによって導かれる効率的なオンターゲット結合を提供し、且つＣＲＩＳＰＲタンパク質のオフターゲット結合を最小限に抑える。従って、ある態様において、本発明は標的特異的遺伝子調節を提供する。ある態様において、本発明は、ＤＮＡ切断なしに遺伝子座におけるＣＲＩＳＰＲ酵素のガイド特異的結合を提供する。従って、ある態様において、本発明は、単一のＣＲＩＳＰＲ酵素を用いてある遺伝子座で切断を提供し、且つ別の遺伝子座で遺伝子調節を提供する。ある態様において、本発明は、１つ以上のＣＲＩＳＰＲタンパク質及び／又は酵素を用いて複数の標的の直交性の活性化及び／又は阻害及び／又は切断を提供する。
【０２８３】
別の態様において、本発明は、エキソビボ又はインビボでの細胞プール中のゲノムにおける遺伝子の機能スクリーニング方法を提供し、この方法は、複数のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むライブラリの投与又は発現を含み、ここでスクリーニングはＣＲＩＳＰＲ酵素の使用を更に含み、ＣＲＩＳＰＲ複合体は異種機能ドメインを含むように改変される。ある態様において、本発明は、ライブラリの宿主への投与又は宿主におけるインビボ発現を含むゲノムのスクリーニング方法を提供する。ある態様において、本発明は、宿主に投与されるか又は宿主において発現するアクチベーターを更に含む、本明細書に考察されるとおりの方法を提供する。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここでアクチベーターはＣＲＩＳＰＲタンパク質に付加される。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここでアクチベーターはＣＲＩＳＰＲタンパク質のＮ末端又はＣ末端に付加される。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここでアクチベーターはｇＲＮＡループに付加される。ある態様において、本発明は、宿主に投与されるか又は宿主において発現するリプレッサー更に含む、本明細書に考察されるとおりの方法を提供する。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここでスクリーニングは遺伝子座の遺伝子活性化、遺伝子阻害、又は切断に影響を及ぼし及びそれを検出することを含む。
【０２８４】
ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここで宿主は真核細胞である。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここで宿主は哺乳類細胞である。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここで宿主は非ヒト真核細胞である。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここで非ヒト真核細胞は非ヒト哺乳類細胞である。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここで非ヒト哺乳類細胞には、限定はされないが、霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタ（ｐｒｏｃｉｎｅ）、イヌ、げっ歯類、ウサギ科動物、例えば、サル、雌ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ウサギ、ラット又はマウス細胞が含まれ得る。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、細胞は、家禽トリ（例えば、ニワトリ）、脊椎動物魚類（例えば、サケ）又は甲殻類（例えば、カキ、ハマグリ（ｃｌａｉｍ）、ロブスター、エビ）細胞などの非哺乳類真核細胞であってもよい。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、非ヒト真核細胞は植物細胞である。植物細胞は、単子葉植物若しくは双子葉植物又は作物若しくは穀物植物、例えば、キャッサバ、トウモロコシ、モロコシ、ダイズ、コムギ、オートムギ又はコメであってもよい。植物細胞はまた、藻類、木又は生産植物、果実又は野菜（例えば、柑橘類の木、例えば、オレンジ、グレープフルーツ又はレモンの木；モモ又はネクタリンの木；リンゴ又はセイヨウナシの木；アーモンド又はクルミ又はピスタチオの木などの堅果類の木；ナス科植物；アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の植物；アキノノゲシ属（Ｌａｃｔｕｃａ）の植物；ホウレンソウ属（Ｓｐｉｎａｃｉａ）の植物；トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）の植物；綿、タバコ、アスパラガス、ニンジン、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、トマト、ナス、コショウ、レタス、ホウレンソウ、イチゴ、ブルーベリー、ラズベリー、ブラックベリー、ブドウ、コーヒー、ココア等の木）であってもよい。
【０２８５】
ある態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体又はその１つ又は複数の構成成分又はそれをコードする１つ又は複数の核酸分子の送達を含む本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここで前記１つ又は複数の核酸分子は１つ又は複数の調節配列に作動可能に連結され、且つインビボで発現する。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここでインビボ発現は、レンチウイルス、アデノウイルス、又はＡＡＶによる。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここで送達は、粒子、ナノ粒子、脂質又は細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）による。
【０２８６】
詳細な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体を葉緑体に標的化することが有益であり得る。多くの場合、この標的化は、葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）又はプラスチド輸送ペプチドと呼ばれるＮ末端伸長部の存在によって実現し得る。発現ポリペプチドが植物プラスチド（例えば葉緑体）に区画化されるべきである場合、細菌供給源からの染色体トランス遺伝子が、発現ポリペプチドをコードする配列に融合した、ＣＴＰ配列をコードする配列を有しなければならない。従って、外因性ポリペプチドの葉緑体への局在化は、多くの場合に、ＣＴＰ配列をコードするポリヌクレオチド配列を、外因性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’領域に作動可能に連結することによって達成される。ＣＴＰは、プラスチドへの転位中のプロセシング段階で除去される。しかしながらプロセシング効率は、ＣＴＰのアミノ酸配列及びペプチドのＮＨ２末端における近傍の配列の影響を受け得る。葉緑体を標的化するための記載されている他のオプションは、トウモロコシｃａｂ−ｍ７シグナル配列（米国特許第７，０２２，８９６号明細書、国際公開第９７／４１２２８号パンフレット）、エンドウマメグルタチオンレダクターゼシグナル配列（国際公開第９７／４１２２８号パンフレット）及び米国特許出願公開第２００９０２９８６１号明細書に記載されるＣＴＰである。
【０２８７】
ある態様において、本発明は、細胞の目的のゲノム遺伝子座にある標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を各々が含む一対のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体を提供し、ここで各ｇＲＮＡの少なくとも１つのループは、１つ以上のアダプタータンパク質に結合する１つ又は複数の個別のＲＮＡ配列の挿入によって改変され、及びアダプタータンパク質が１つ以上の機能ドメインと会合し、各ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓの各ｓｇＲＮＡは、ＤＮＡ切断活性を有する機能ドメインを含む。ある態様において、本発明は、本明細書において考察するとおりの一対のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体を提供し、ここでＤＮＡ切断活性はＦｏｋ１ヌクレアーゼに起因する。
【０２８８】
ある態様において、本発明は、細胞へのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体又はその１つ又は複数の構成成分又はそれをコードする１つ又は複数の核酸分子の送達を含む、目的のゲノム遺伝子座にある標的配列の切断方法を提供し、ここで前記１つ又は複数の核酸分子は１つ又は複数の調節配列に作動可能に連結され、且つインビボで発現する。ある態様において、本発明は、本明細書において考察するとおりの方法を提供し、ここで送達は、レンチウイルス、アデノウイルス、又はＡＡＶによる。ある態様において、本発明は、本明細書において考察するとおりの方法又は本明細書において考察するとおりの一対のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体を提供し、ここで対のうちの第１の複合体の標的配列は二本鎖ＤＮＡの第１の鎖上にあり、且つ対のうちの第２の複合体の標的配列は二本鎖ＤＮＡの第２の鎖上にある。ある態様において、本発明は、本明細書において考察するとおりの方法又は本明細書において考察するとおりの一対のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体を提供し、ここで第１及び第２の複合体の標的配列は互いに近接しているため、ＤＮＡが相同依存性修復を促進する形で切断される。ある態様において、本明細書における方法は、細胞に鋳型ＤＮＡを導入するステップを更に含むことができる。ある態様において、本明細書における方法又は本明細書における一対のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体は、突然変異していないＣＲＩＳＰＲ酵素のヌクレアーゼ活性の約５％以下を有するように突然変異しているＣＲＩＳＰＲ酵素を各ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体が有することを含み得る。
【０２８９】
ある態様において、本発明は、本明細書において考察するとおりのライブラリ、方法又は複合体を提供し、ここでｇＲＮＡは少なくとも１つの非コード機能性ループを有するように改変され、例えば少なくとも１つの非コード機能性ループは抑制性であり；例えば少なくとも１つの非コード機能性ループはＡｌｕを含む。
【０２９０】
一態様において、本発明は、遺伝子産物の発現を変化させ又は改変する方法を提供する。前記方法は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含有し及び発現する細胞に、Ｃａｓタンパク質とＤＮＡ分子を標的化するガイドＲＮＡとを含むエンジニアリングされた天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を導入するステップを含むことができ、それによってガイドＲＮＡが、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を標的化し、及びＣａｓタンパク質が、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を切断し、それによって遺伝子産物の発現が変化し；及び、Ｃａｓタンパク質とガイドＲＮＡとは天然では一緒に存在しない。本発明は更に、真核細胞での発現にコドン最適化されたＣａｓタンパク質を包含する。好ましい実施形態において真核細胞は哺乳類細胞であり、より好ましい実施形態において哺乳類細胞はヒト細胞である。本発明の更なる実施形態において、遺伝子産物の発現は減少する。
【０２９１】
ある態様において、本発明は、変化した細胞及びそれらの細胞の子孫、並びに当該の細胞によって作られる産物を提供する。本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ（例えば、Ｃｐｆ１）タンパク質及び系は、改変された標的遺伝子座を含む細胞の作製に使用される。一部の実施形態において、この方法は、核酸ターゲティング複合体を標的ＤＮＡ又はＲＮＡに結合させて前記標的ＤＮＡ又はＲＮＡの切断を生じさせ、それにより標的ＤＮＡ又はＲＮＡを改変するステップを含むことができ、ここで核酸ターゲティング複合体は、前記標的ＤＮＡ又はＲＮＡ内の標的配列にハイブリダイズするガイドＲＮＡと複合体を形成した核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を含む。一態様において、本発明は、細胞の遺伝子座を修復する方法を提供する。別の態様において、本発明は、真核細胞におけるＤＮＡ又はＲＮＡの発現を改変する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、核酸ターゲティング複合体をＤＮＡ又はＲＮＡに結合させて、前記結合により前記ＤＮＡ又はＲＮＡの発現の増加又は減少を生じさせるステップを含み；ここで核酸ターゲティング複合体は、ガイドＲＮＡと複合体を形成した核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を含む。同様の考察及び条件が、標的ＤＮＡ又はＲＮＡを改変する方法にも上記のとおり適用される。実際上、これらの試料採取、培養及び再導入の選択肢は本発明の全態様に適用される。ある態様において、本発明は、真核細胞の標的ＤＮＡ又はＲＮＡを改変する方法を提供し、これはインビボ、エキソビボ又はインビトロであってもよい。一部の実施形態において、本方法は、ヒト又は非ヒト動物から細胞又は細胞集団を試料採取するステップ、及び１つ又は複数の細胞を改変するステップを含む。培養は任意の段階でエキソビボで行われ得る。かかる細胞は、限定なしに、植物細胞、動物細胞、任意の生物の特定の細胞型、例えば、幹細胞、免疫細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、心血管細胞、上皮細胞、幹細胞などであり得る。細胞は、本発明により改変されると、遺伝子産物を例えば制御された量で産生することができ、これは用途に応じて増加又は減少させてもよく、及び／又は突然変異させてもよい。特定の実施形態において、細胞の遺伝子座が修復される。この１つ又は複数の細胞が、更には非ヒト動物又は植物に再導入されてもよい。再導入される細胞について、細胞は幹細胞であることが好ましい場合もある。
【０２９２】
ある態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ系、又は構成成分を一過性に含む細胞を提供する。例えば、ＣＲＩＳＰＲタンパク質又は酵素及び核酸が細胞に一過性に提供され、遺伝子座が変化すると、続いてＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上の構成成分の量が減少する。続いて、ＣＲＩＳＰＲの媒介による遺伝子変化を得た細胞、その細胞の子孫、及びその細胞を含む生物は、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ系構成成分を低下した量で含むか、又はその１つ以上のＣＲＩＳＰＲ系構成成分をもはや含有しない。一つの非限定的な例は、本明細書に更に記載するような自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系である。従って、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系によって変化した１つ以上の遺伝子座を含むが、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ系構成成分を本質的に欠いている細胞、及び生物、並びに細胞及び生物の子孫を提供する。特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ系構成成分は実質的に存在しない。かかる細胞、組織及び生物は、有利には、所望の又は選択された遺伝子変化を含むが、潜在的に非特異的に作用し、安全性の問題につながり、又は規制当局の承認の妨げとなる可能性のあるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ構成成分又はその残遺物は失われている。更に、本発明は、当該の細胞、生物、並びに細胞及び生物の子孫によって作られる産物を提供する。
【０２９３】
誘導性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系（「スプリット−Ｃｐｆ１」）
ある態様において、本発明は、
誘導性二量体の第１の半体に結合した第１のＣｐｆ１融合構築物、及び
誘導性二量体の第２の半体に結合した第２のＣｐｆ１融合構築物
を含む、天然に存在しない又はエンジニアリングされた誘導性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供し、ここで
第１のＣｐｆ１融合構築物は１つ以上の核局在化シグナルに作動可能に連結され、
第２のＣｐｆ１融合構築物は１つ以上の核外移行シグナルに作動可能に連結され、
誘導物質エネルギー源に接触すると誘導性二量体の第１及び第２の半体が一体になり、
誘導性二量体の第１及び第２の半体が一体になると、第１及び第２のＣｐｆ１融合構築物が機能性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を構成することが可能になり、
Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が、細胞の目的のゲノム遺伝子座にある標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み、及び
機能性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が標的配列に結合し、及び任意選択で、ゲノム遺伝子座を編集して遺伝子発現を変化させる。
【０２９４】
本発明のある態様では、誘導性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系において誘導性二量体は誘導性ヘテロ二量体であるか、又はそれを含むか、又はそれから本質的になるか、又はそれからなる。ある態様では、誘導性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系において、誘導性ヘテロ二量体の第１の半体又は第１の部分又は第１の断片はＦＫＢＰ、任意選択でＦＫＢＰ１２であるか、又はそれを含むか、又はそれからなるか、又はそれから本質的になる。本発明のある態様では、誘導性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系において、誘導性ヘテロ二量体の第２の半体又は第２の部分又は第２の断片はＦＲＢであるか、又はそれを含むか、又はそれからなるか、又はそれから本質的になる。本発明のある態様では、誘導性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系において、第１のＣｐｆ１融合構築物の配置は、Ｎ’末端Ｃｐｆ１パート−ＦＲＢ−ＮＥＳであるか、又はそれを含むか、又はそれからなるか、又はそれから本質的になる。本発明のある態様では、誘導性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系において、第１のＣｐｆ１融合構築物の配置は、ＮＥＳ−Ｎ’末端Ｃｐｆ１パート−ＦＲＢ−ＮＥＳであるか、又はそれを含むか、又はそれからなるか、又はそれから本質的になる。本発明のある態様では、誘導性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系において、第２のＣｐｆ１融合構築物の配置は、Ｃ’末端Ｃｐｆ１パート−ＦＫＢＰ−ＮＬＳであるか、又はそれを含むか、又はそれから本質的になるか、又はそれからなる。ある態様では、本発明は、誘導性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系において、第２のＣｐｆ１融合構築物の配置が、ＮＬＳ−Ｃ’末端Ｃｐｆ１パート−ＦＫＢＰ−ＮＬＳであるか、又はそれを含むか、又はそれからなるか、又はそれから本質的になることを提供する。ある態様において、誘導性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系には、Ｃｐｆ１パートを誘導性二量体の半体又は部分又は断片と分離するリンカーがあってもよい。ある態様では、誘導性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系において、誘導物質エネルギー源は、ラパマイシンであるか、又はそれを含むか、又はそれから本質的になるか、又はそれからなる。ある態様では、誘導性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系において、誘導性二量体は誘導性ホモ二量体である。ある態様では、誘導性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系において、Ｃｐｆ１はＦｎＣｐｆ１である。ある態様では、誘導性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系において、Ｃｐｆ１の一方又は両方のパートに、１つ以上の機能ドメイン、例えば、任意選択で転写アクチベーター、転写性又はＦｏｋ１ヌクレアーゼなどのヌクレアーゼを含む機能ドメインが会合している。ある態様では、誘導性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系において、機能性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は標的配列に結合し、及び酵素は、任意選択で少なくとも１つの突然変異を有しないＣｐｆ１と比較したとき少なくとも９７％、又は１００％のヌクレアーゼ活性の低下（又は３％以下及び有利には０％のヌクレアーゼ活性）を有するデッドＣｐｆ１である。本発明は更に、本明細書に考察されるとおりの誘導性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系をコードするポリヌクレオチドを包含し、及び本発明のある態様はそれを提供する。
【０２９５】
ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりに係る、誘導性二量体の第１の半体又は部分又は断片に結合し、且つ１つ以上の核局在化シグナルに作動可能に連結された第１のＣｐｆ１融合構築物を送達するためのベクターを提供する。ある態様において、本発明は、誘導性二量体の第２の半体又は部分又は断片に結合し、且つ１つ以上の核外移行シグナルに作動可能に連結された第２のＣｐｆ１融合構築物を送達するためのベクターを提供する。
【０２９６】
ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの、誘導性二量体の第１の半体又は部分又は断片に結合し、且つ１つ以上の核局在化シグナルに作動可能に連結された第１のＣｐｆ１融合構築物；及び本明細書に考察されるとおりの、誘導性二量体の第２の半体又は部分又は断片に結合し、且つ１つ以上の核外移行シグナルに作動可能に連結された第２のＣｐｆ１融合構築物の両方を送達するためのベクターを提供する。
【０２９７】
ある態様において、ベクターはシングルプラスミド又は発現カセットであってもよい。
【０２９８】
本発明は、ある態様において、本明細書において考察される任意のベクターで形質転換された、又は本明細書に考察されるとおりの誘導性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を発現する真核生物宿主細胞又は細胞株を提供する。
【０２９９】
本発明は、ある態様において、本明細書において考察される任意のベクターで形質転換された、又は本明細書において考察される誘導性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を発現するトランスジェニック生物、又はその子孫を提供する。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの誘導性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を構成的に発現するモデル生物を提供する。
【０３００】
ある態様において、本発明は、
誘導性ヘテロ二量体の第１の半体に結合した第１のＣｐｆ１融合構築物、及び
誘導性ヘテロ二量体の第２の半体に結合した第２のＣｐｆ１融合構築物
を含む、天然に存在しない又はエンジニアリングされた誘導性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供し、ここで
第１のＣｐｆ１融合構築物は１つ以上の核局在化シグナルに作動可能に連結され、
第２のＣｐｆ１融合構築物は核外移行シグナルに作動可能に連結され、
誘導物質エネルギー源に接触すると誘導性ヘテロ二量体の第１及び第２の半体が一体になり、
誘導性ヘテロ二量体の第１及び第２の半体が一体になると、第１及び第２のＣｐｆ１融合構築物が機能性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を構成することが可能となり、
Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、細胞の目的のゲノム遺伝子座にある標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み、及び
機能性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系がゲノム遺伝子座を編集して遺伝子発現を変化させる。
【０３０１】
ある態様において、本発明は、それを必要としている対象を治療する方法を提供し、この方法は、本明細書に考察されるとおりのポリヌクレオチド又は本明細書において考察される任意のベクターで対象を形質転換することにより遺伝子編集を誘導するステップ、及び誘導物質エネルギー源を対象に投与するステップを含む。本発明は、医薬、例えば、対象を治療するための、又は対象を治療するかかる方法のためのかかる医薬の製造におけるかかるポリヌクレオチド又はベクターの使用を包含する。本発明は、それを必要としている対象を治療する方法であって、遺伝子編集を誘導するステップを含む方法において用いられる、本明細書に考察されるとおりのポリヌクレオチド又は本明細書において考察される任意のベクターを包含し、ここで方法は、誘導物質エネルギー源を対象に投与するステップを更に含む。ある態様では、この方法において、修復鋳型もまた提供され、これは例えば前記修復鋳型を含むベクターによって送達される。
【０３０２】
本発明はまた、それを必要としている対象を治療する方法も提供し、この方法は、本明細書において考察されるポリヌクレオチド又は本明細書において考察される任意のベクターで対象を形質転換することにより転写活性化又は抑制を誘導するステップを含み、ここで前記ポリヌクレオチド又はベクターは、触媒的に不活性なＣｐｆ１及び本明細書に考察されるとおりの１つ以上の会合した機能ドメインをコードし又はそれらを含み；本方法は、誘導物質エネルギー源を対象に投与するステップを更に含む。本発明はまた、それを必要としている対象を治療する方法であって転写活性化又は抑制を誘導するステップを含む方法において用いられる、本明細書において考察されるポリヌクレオチド又は本明細書において考察される任意のベクターも提供し、この方法は、誘導物質エネルギー源を対象に投与するステップを更に含む。
【０３０３】
従って、本発明は、特に、１つ以上のＮＬＳ及び／又は１つ以上のＮＥＳがある、ホモ二量体並びにヘテロ二量体、デッドＣｐｆ１又は例えば突然変異によって本質的にヌクレアーゼ活性を有しないＣｐｆ１、系又は複合体；スプリットＣｐｆ１に連結された１つ又は複数の機能ドメイン；治療方法を含めた、方法、及び使用を包含する。
【０３０４】
本明細書においてＣｐｆ１、Ｃｐｆ１タンパク質又はＣｐｆ１酵素に言及する場合、これに本スプリットＣｐｆ１が含まれることは理解されるであろう。一態様において、本発明は、遺伝子産物の発現を変化させ又は改変する方法を提供する。前記方法は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含有し及び発現する細胞に、Ｃｐｆ１タンパク質とＤＮＡ分子を標的化するガイドＲＮＡとを含むエンジニアリングされた天然に存在しないＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を導入するステップを含むことができ、それによってガイドＲＮＡが、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を標的化し、及びＣｐｆ１タンパク質が、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を切断し、それによって遺伝子産物の発現が変化し；及び、ここでＣｐｆ１タンパク質とガイドＲＮＡとは天然では一緒に存在しない。本発明は、ダイレクトリピート（ＤＲ）配列に連結されたガイド配列を含むガイドＲＮＡを包含する。本発明は更に、真核細胞での発現にコドン最適化されているＣｐｆ１タンパク質を包含する。好ましい実施形態において真核細胞は哺乳類細胞であり、より好ましい実施形態において哺乳類細胞はヒト細胞である。本発明の更なる実施形態において、遺伝子産物の発現は減少する。
【０３０５】
一態様において、本発明は、Ｃｐｆ１タンパク質と細胞内の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を標的化するガイドＲＮＡとを含むエンジニアリングされた天然に存在しないＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供し、それによってガイドＲＮＡが、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を標的化し、及びＣｐｆ１タンパク質が、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を切断し、それによって遺伝子産物の発現が変化し；及び、ここでＣｐｆ１タンパク質とガイドＲＮＡとは天然では一緒に存在せず；これは本スプリットＣｐｆ１を含む。本発明は、ＤＲ配列に連結されたガイド配列を含むガイドＲＮＡを包含する。本発明は更に、真核細胞での発現にコドン最適化されているＣｐｆ１タンパク質を包含する。好ましい実施形態において真核細胞は哺乳類細胞であり、より好ましい実施形態において哺乳類細胞はヒト細胞である。本発明の更なる実施形態において、遺伝子産物の発現は減少する。
【０３０６】
別の態様において、本発明は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を標的化するＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ガイドＲＮＡに作動可能に連結された第１の調節エレメントと、Ｃｐｆ１タンパク質に作動可能に連結された第２の調節エレメントとを含む１つ以上のベクターを含むエンジニアリングされた天然に存在しないベクター系を提供し；これは本スプリットＣｐｆ１を含む。構成成分（ａ）及び（ｂ）は系の同じ又は異なるベクター上に位置してもよい。ガイドＲＮＡが、細胞内の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を標的化し、及びＣｐｆ１タンパク質が、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を切断し、それによって遺伝子産物の発現が変化し；及び、ここでＣｐｆ１タンパク質とガイドＲＮＡとは天然では一緒に存在しない。本発明は、ＤＲ配列に連結されたガイド配列を含むガイドＲＮＡを包含する。本発明は更に、真核細胞での発現にコドン最適化されているＣｐｆ１タンパク質を包含する。好ましい実施形態において真核細胞は哺乳類細胞であり、より好ましい実施形態において哺乳類細胞はヒト細胞である。本発明の更なる実施形態において、遺伝子産物の発現は減少する。
【０３０７】
一態様において、本発明は、１つ以上のベクターを含むベクター系を提供する。一部の実施形態において、この系は、（ａ）ＤＲ配列とＤＲ配列の下流に１つ以上のガイド配列を挿入するための１つ以上の挿入部位とに作動可能に連結された第１の調節エレメント［ガイド配列は、発現すると、真核細胞内の標的配列へのＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体の配列特異的結合を導き、ここでＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズするガイド配列、及び（２）ＤＲ配列と複合体を形成したＣｐｆ１を含む］；及び（ｂ）核局在化配列を含む前記Ｃｐｆ１酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に連結された第２の調節エレメントを含み；ここで構成成分（ａ）及び（ｂ）は系の同じ又は異なるベクター上に位置し；これは本スプリットＣｐｆ１を含む。一部の実施形態において、構成成分（ａ）は、第１の調節エレメントに作動可能に連結された２つ以上のガイド配列を更に含み、ここでこれらの２つ以上のガイド配列の各々は、発現すると、真核細胞内の異なる標的配列へのＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体の配列特異的結合を導く。
【０３０８】
一部の実施形態において、Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体は、真核細胞の核内における検出可能な量の前記Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体の蓄積をドライブするのに十分な強度の１つ以上の核局在化配列を含む。理論によって拘束されることを望むものではないが、真核生物におけるＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体活性に核局在化配列は必要でなく、しかしかかる配列が含まれると、特に核内の核酸分子の標的化に関して、系の活性が亢進すると考えられる。
【０３０９】
一部の実施形態において、Ｃｐｆ１酵素は、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）１、野兎病菌亜種ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）、プレボテラ・アルベンシス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ａｌｂｅｎｓｉｓ）、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＣ２０１７  １、ブチリビブリオ・プロテオクラスチカス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ）、ペレグリニバクテリア細菌（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、パルクバクテリア細菌（Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、スミセラ属種（Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ  ｓｐ．）ＳＣＡＤＣ、アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＡ２０２０、カンディダタス・メタノプラズマ・テルミツム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ  ｔｅｒｍｉｔｕｍ）、ユーバクテリウム・エリゲンス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ）、モラクセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ）２３７、レプトスピラ・イナダイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ）、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６、ポルフィロモナス・クレビオリカニス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ）３、プレボテラ・ディシエンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ）、及びポルフィロモナス・マカカエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅ）からなる群から選択される細菌種のＣｐｆ１であり、これらの生物に由来する突然変異Ｃｐｆ１を含み得る。酵素はＣｐｆ１ホモログ又はオルソログであってもよい。一部の実施形態において、Ｃｐｆ１は真核細胞での発現にコドン最適化される。一部の実施形態において、Ｃｐｆ１は標的配列の位置における１本又は２本の鎖の切断を導く。好ましい実施形態において、鎖切断は５’オーバーハングを伴う付着末端型切断である。一部の実施形態において、第１の調節エレメントはポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。一部の実施形態において、第２の調節エレメントはポリメラーゼＩＩプロモーターである。一部の実施形態において、ダイレクトリピートは１６ｎｔの最小長さ及び単一のステムループを有する。更なる実施形態において、ダイレクトリピートは１６ｎｔより長い長さ、好ましくは１７ｎｔ超を有し、且つ２つ以上のステムループ又は最適化された二次構造を有する。
【０３１０】
一態様において、本発明は、（ａ）ダイレクトリピート配列とＤＲ配列の下流に１つ以上のガイド配列を挿入するための１つ以上の挿入部位とに作動可能に連結された第１の調節エレメント［ガイド配列は、発現すると、真核細胞内の標的配列へのＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体の配列特異的結合を導き、Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズするガイド配列、及び（２）ＤＲ配列と複合体を形成したＣｐｆ１を含む］；及び／又は（ｂ）核局在化配列を含む前記Ｃｐｆ１酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に連結された第２の調節エレメントを含む真核生物宿主細胞を提供する。一部の実施形態において、宿主細胞は構成成分（ａ）及び（ｂ）を含み；これは本スプリットＣｐｆ１を含む。一部の実施形態において、構成成分（ａ）、構成成分（ｂ）、又は構成成分（ａ）及び（ｂ）は、宿主真核細胞のゲノムに安定に組み込まれる。一部の実施形態において、構成成分（ａ）は、第１の調節エレメントに作動可能に連結された２つ以上のガイド配列を更に含み、ここでこれらの２つ以上のガイド配列の各々は、発現すると、真核細胞内の異なる標的配列へのＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体の配列特異的結合を導く。一部の実施形態において、ＣＰｆ１は真核細胞での発現にコドン最適化される。一部の実施形態において、Ｃｐｆ１は標的配列の位置における１本又は２本の鎖の切断を導く。好ましい実施形態において、鎖切断は５’オーバーハングを伴う付着末端型切断である。一部の実施形態において、Ｃｐｆ１はＤＮＡ鎖切断活性を欠いている。一部の実施形態において、第１の調節エレメントはポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。一部の実施形態において、ダイレクトリピートは１６ｎｔの最小長さ及び単一のステムループを有する。更なる実施形態において、ダイレクトリピートは１６ｎｔより長い長さ、好ましくは１７ｎｔ超を有し、且つ２つ以上のステムループ又は最適化された二次構造を有する。ある態様において、本発明は、記載される実施形態のいずれかに係る真核生物宿主細胞を含む非ヒト真核生物；好ましくは多細胞真核生物を提供する。他の態様において、本発明は、記載される実施形態のいずれかに係る真核生物宿主細胞を含む真核生物；好ましくは多細胞真核生物を提供する。これらの態様の一部の実施形態における生物は、動物；例えば哺乳類であってもよい。また、生物は、昆虫などの節足動物であってもよい。生物はまた、植物であってもよい。更に、生物は真菌であってもよい。
【０３１１】
一態様において、本発明は、本明細書に記載される構成成分の１つ以上を含むキットを提供する。一部の実施形態において、本キットはベクター系とキットの使用説明書とを含む。一部の実施形態において、ベクター系は、（ａ）ダイレクトリピート配列とＤＲ配列の下流に１つ以上のガイド配列を挿入するための１つ以上の挿入部位とに作動可能に連結された第１の調節エレメント［ガイド配列は、発現すると、真核細胞内の標的配列へのＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体の配列特異的結合を導き、Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズするガイド配列、及び（２）ＤＲ配列と複合体を形成したＣｐｆ１を含む］；及び／又は（ｂ）核局在化配列を含む前記Ｃｐｆ１酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に連結された第２の調節エレメントを含み、及び有利にはこれは本スプリットＣｐｆ１を含む。一部の実施形態において、本キットは、系の同じ又は異なるベクター上に位置する構成成分（ａ）及び（ｂ）を含む。一部の実施形態において、構成成分（ａ）は、第１の調節エレメントに作動可能に連結された２つ以上のガイド配列を更に含み、ここでこれらの２つ以上のガイド配列の各々は、発現すると、真核細胞内の異なる標的配列へのＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体の配列特異的結合を導く。一部の実施形態において、Ｃｐｆ１は、真核細胞の核内における検出可能な量の前記Ｃｐｆ１の蓄積をドライブするのに十分な強度の１つ以上の核局在化配列を含む。一部の実施形態において、Ｃｐｆ１酵素は、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）１、野兎病菌亜種ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）、プレボテラ・アルベンシス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ａｌｂｅｎｓｉｓ）、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＣ２０１７  １、ブチリビブリオ・プロテオクラスチカス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ）、ペレグリニバクテリア細菌（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、パルクバクテリア細菌（Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、スミセラ属種（Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ  ｓｐ．）ＳＣＡＤＣ、アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＡ２０２０、カンディダタス・メタノプラズマ・テルミツム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ  ｔｅｒｍｉｔｕｍ）、ユーバクテリウム・エリゲンス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ）、モラクセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ）２３７、レプトスピラ・イナダイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ）、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６、ポルフィロモナス・クレビオリカニス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ）３、プレボテラ・ディシエンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ）��及びポルフィロモナス・マカカエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅ）からなる群から選択される細菌種のＣｐｆ１であり、これらの生物に由来する突然変異Ｃｐｆ１を含み得る。酵素はＣｐｆ１ホモログ又はオルソログであってもよい。一部の実施形態において、Ｃｐｆ１は真核細胞での発現にコドン最適化される。一部の実施形態において、Ｃｐｆ１は標的配列の位置における１本又は２本の鎖の切断を導く。好ましい実施形態において、鎖切断は５’オーバーハングを伴う付着末端型切断である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＤＮＡ鎖切断活性を欠いている。一部の実施形態において、ダイレクトリピートは１６ｎｔの最小長さ及び単一のステムループを有する。更なる実施形態において、ダイレクトリピートは１６ｎｔより長い長さ、好ましくは１７ｎｔ超を有し、且つ２つ以上のステムループ又は最適化された二次構造を有する。
【０３１２】
一態様において、本発明は、真核細胞内の標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて前記標的ポリヌクレオチドの切断を生じさせ、それにより標的ポリヌクレオチドを改変するステップを含み、ここでＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズするガイド配列と複合体を形成したＣｐｆ１を含み、前記ガイド配列はダイレクトリピート配列に連結されている。一部の実施形態において、前記切断は、前記Ｃｐｆ１によって標的配列の位置にある１本又は２本の鎖を切断することを含み；これは本スプリットＣｐｆ１を含む。一部の実施形態において、前記切断は標的遺伝子の転写の減少をもたらす。一部の実施形態において、本方法は、前記切断された標的ポリヌクレオチドを外因性鋳型ポリヌクレオチドによる相同組換えによって修復するステップを更に含み、前記修復は、前記標的ポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、又は置換を含む突然変異をもたらす。一部の実施形態において、前記突然変異は、標的配列を含む遺伝子から発現するタンパク質に１つ以上のアミノ酸変化をもたらす。一部の実施形態において、本方法は、前記真核細胞に１つ以上のベクターを送達するステップを更に含み、ここで１つ以上のベクターは、Ｃｐｆ１、及びＤＲ配列に連結されたガイド配列のうちの１つ以上の発現をドライブする。一部の実施形態において、前記ベクターは対象の真核細胞に送達される。一部の実施形態において、前記改変は細胞培養物中の前記真核細胞で起こる。一部の実施形態において、本方法は、前記改変の前に対象から前記真核細胞を単離するステップを更に含む。一部の実施形態において、本方法は、前記真核細胞及び／又はそれに由来する細胞を前記対象に戻すステップを更に含む。
【０３１３】
一態様において、本発明は、真核細胞内のポリヌクレオチドの発現を改変する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体をポリヌクレオチドに結合させて、前記結合により前記ポリヌクレオチドの発現の増加又は減少を生じさせるステップを含み；ここでＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体は、前記ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズするガイド配列であって、ダイレクトリピート配列に連結されているガイド配列と複合体を形成したＣｐｆ１を含み；これは本スプリットＣｐｆ１を含む。一部の実施形態において、本方法は、前記真核細胞に１つ以上のベクターを送達するステップを更に含み、ここで１つ以上のベクターは、Ｃｐｆ１、及びＤＲ配列に連結されたガイド配列のうちの１つ以上の発現をドライブする。
【０３１４】
一態様において、本発明は、突然変異型疾患遺伝子を含むモデル真核細胞を作成する方法を提供する。一部の実施形態において、疾患遺伝子は、疾患の罹患又は発症リスクの増加に関連する任意の遺伝子である。一部の実施形態において、本方法は、（ａ）１つ以上のベクターを真核細胞に導入するステップ［１つ以上のベクターは、Ｃｐｆ１、及びダイレクトリピート配列に連結されたガイド配列のうちの１つ以上の発現をドライブする］；及び（ｂ）Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて前記疾患遺伝子内の標的ポリヌクレオチドの切断を生じさせるステップ［Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体は、（１）標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズするガイド配列、及び（２）ＤＲ配列と複合体を形成したＣｐｆ１を含む］を含み、それにより突然変異型疾患遺伝子を含むモデル真核細胞を作成し；これは本スプリットＣｐｆ１を含む。一部の実施形態において、前記切断は、前記Ｃｐｆ１によって標的配列の位置にある１本又は２本の鎖を切断することを含む。好ましい実施形態において、鎖切断は５’オーバーハングを伴う付着末端型切断である。一部の実施形態において、前記切断は標的遺伝子の転写の減少をもたらす。一部の実施形態において、本方法は、前記切断された標的ポリヌクレオチドを外因性鋳型ポリヌクレオチドによる相同組換えによって修復するステップを更に含み、前記修復は、前記標的ポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、又は置換を含む突然変異をもたらす。一部の実施形態において、前記突然変異は、標的配列を含む遺伝子からのタンパク質発現に１つ以上のアミノ酸変化をもたらす。
【０３１５】
一態様において、本発明は、疾患遺伝子に関連する細胞シグナル伝達イベントを調節する生物学的に活性な薬剤の開発方法を提供する。一部の実施形態において、疾患遺伝子は、疾患の罹患又は発症リスクの増加に関連する任意の遺伝子である。一部の実施形態において、本方法は、（ａ）記載される実施形態のいずれか一つのモデル細胞に試験化合物を接触させるステップ；及び（ｂ）前記疾患遺伝子の前記突然変異に関連する細胞シグナル伝達イベントの低下又は増大の指標となる読取りの変化を検出するステップを含み、それにより前記疾患遺伝子に関連する前記細胞シグナル伝達イベントを調節する前記生物学的に活性な薬剤が開発される。
【０３１６】
一態様において、本発明は、ダイレクトリピート配列の下流にガイド配列を含む組換えポリヌクレオチドを提供し、ここでガイド配列は、発現すると、真核細胞に存在する対応する標的配列へのＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体の配列特異的結合を導く。一部の実施形態において、標的配列は真核細胞に存在するウイルス配列である。一部の実施形態において、標的配列は癌原遺伝子又は癌遺伝子である。
【０３１７】
一態様において、本発明は、１つ以上の細胞内の遺伝子に１つ以上の突然変異を導入することによって１つ以上の細胞を選択する方法を提供し、この方法は、１つ又は複数の細胞に１つ以上のベクターを導入するステップ［１つ以上のベクターは、Ｃｐｆ１、ダイレクトリピート配列に連結されたガイド配列、及び編集用鋳型のうちの１つ以上の発現をドライブし；ここで編集用鋳型は、Ｃｐｆ１切断を無効にする１つ以上の突然変異を含む］；選択されるべき１つ又は複数の細胞内の標的ポリヌクレオチドと編集用鋳型を相同組換えさせるステップ；Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて前記遺伝子内の標的ポリヌクレオチドの切断を生じさせるステップ［Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体は、（１）標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズするガイド配列、及び（２）ダイレクトリピート配列と複合体を形成したＣｐｆ１を含み、ここでＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体が標的ポリヌクレオチドに結合すると細胞死が誘導される］を含み、それにより、１つ以上の突然変異が導入された１つ以上の細胞の選択が可能になり；これは本スプリットＣｐｆ１を含む。本発明の別の好ましい実施形態において、選択される細胞は真核細胞であってもよい。本発明の態様は、選択マーカー又は対抗選択系を含み得る二段階プロセスが不要な特異的細胞の選択を可能にする。
【０３１８】
本明細書には、語句「これは本スプリットＣｐｆ１を含む」又は同様の文があり；及びこれは、本明細書の実施形態におけるＣｐｆ１が本明細書に考察されるとおりのスプリットＣｐｆ１であり得ることを示すためのものである。
【０３１９】
ある態様において、本発明は、誘導性ヘテロ二量体の第１の半体に結合した第１のＣｐｆ１融合構築物と誘導性ヘテロ二量体の第２の半体に結合した第２のＣｐｆ１融合構築物とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた誘導性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に関し、第１のＣｐｆ１融合構築物は１つ以上の核局在化シグナルに作動可能に連結され、第２のＣｐｆ１融合構築物は核外移行シグナルに作動可能に連結され、誘導物質エネルギー源に接触すると誘導性ヘテロ二量体の第１及び第２の半体が一体になり、誘導性ヘテロ二量体の第１及び第２の半体が一体になると、第１及び第２のＣｐｆ１融合構築物が機能性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を構成することが可能となり、Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が、細胞の目的のゲノム遺伝子座にある標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み、及び機能性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系がゲノム遺伝子座を編集して遺伝子発現を変化させる。本発明のある実施形態において、誘導性ヘテロ二量体の第１の半体はＦＫＢＰ１２であり、及び誘導性ヘテロ二量体の第２の半体はＦＲＢである。本発明の別の実施形態において、誘導物質エネルギー源はラパマイシンである。
【０３２０】
誘導物質エネルギー源は、単純に誘導物質又は二量体化剤であると考えられてもよい。一貫性を保つため本明細書では全体を通して用語「誘導物質エネルギー源」を使用する。誘導物質エネルギー源（又は誘導物質）はＣｐｆ１を再構成するように働く。一部の実施形態において、誘導物質エネルギー源は、誘導性二量体の２つの半体の作用によってＣｐｆ１の２つのパートを一体にする。従って誘導性二量体の２つの半体は誘導物質エネルギー源の存在下で一体になる。二量体の２つの半体は、誘導物質エネルギー源なしに二量体を形成する（二量体化する）ことはない。
【０３２１】
従って、誘導性二量体の２つの半体は誘導物質エネルギー源と協働して二量体を二量体化する。ひいてはこれがＣｐｆ１の第１及び第２のパートを一体にすることにより、Ｃｐｆ１を再構成する。
【０３２２】
ＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物は、各々が、スプリットＣｐｆ１の１つのパートを含む。これらは、好ましくは本明細書に記載されるＧｌｙＳｅｒリンカーなどのリンカーを介して二量体の２つの半体のうちの一方に融合される。二量体の２つの半体は、一緒になってホモ二量体を形成する実質的に同じ２つの単量体であってもよく、又はそれらは、一緒になってヘテロ二量体を形成する異なる単量体であってもよい。このように、２つの単量体は、完全な二量体のうちの一方の半体であると考えることができる。
【０３２３】
Ｃｐｆ１は、Ｃｐｆ１酵素の２つのパートが実質的に機能性のＣｐｆ１を含むという意味でスプリットである。このＣｐｆ１は、ニッカーゼ又はヌクレアーゼ（ＤＮＡの両方の鎖を切断する）などのゲノム編集酵素として（標的ＤＮＡ及びガイドと複合体を形成するとき）機能してもよく、又はそれは、本質的に、典型的にはその触媒ドメインにおける１つ又は複数の突然変異に起因して触媒活性がほとんど僅かしかないか又は全くないＤＮＡ結合タンパク質であるデッドＣｐｆ１であってもよい。
【０３２４】
スプリットＣｐｆ１の２つのパートは、スプリットＣｐｆ１のＮ’末端パート及びＣ’末端パートと考えることができる。この融合は、典型的にはＣｐｆ１のスプリット点にある。換言すれば、スプリットＣｐｆ１のＮ’末端パートのＣ’末端が二量体半体のうちの一方に融合し、一方でＣ’末端パートのＮ’末端が他方の二量体半体に融合する。
【０３２５】
Ｃｐｆ１は、切断点が新しく作り出されるという意味で分割される必要はない。スプリット点は典型的にはインシリコで設計され、構築物にクローニングされる。一緒になって、スプリットＣｐｆ１の２つのパート、Ｎ’末端パート及びＣ’末端パートは、好ましくは野生型アミノ酸（又はそれをコードするヌクレオチド）の少なくとも７０％以上、好ましくは野生型アミノ酸（又はそれをコードするヌクレオチド）の少なくとも８０％以上、好ましくは少なくとも９０％以上、好ましくは少なくとも９５％以上、及び最も好ましくは少なくとも９９％以上を含む完全なＣｐｆ１を形成する。何らかのトリミングがある可能性があってもよく、突然変異体が想定される。非機能性ドメインは完全に除去されてもよい。重要な点は、２つのパートが一体にされ得ること、及び所望のＣｐｆ１機能が回復し又は元に戻ることである。
【０３２６】
二量体はホモ二量体又はヘテロ二量体であってよい。
【０３２７】
第１のＣｐｆ１構築物に作動可能に連結して１つ以上、好ましくは２つのＮＬＳが用いられ得る。第１のＣｐｆ１構築物に作動可能に連結して１つ以上、好ましくは２つのＮＥＳが用いられ得る。ＮＬＳ及び／又はＮＥＳは好ましくはスプリットＣｐｆ１二量体（即ち半体二量体）融合物に隣接し、即ち、１つのＮＬＳが第１のＣｐｆ１構築物のＮ’末端に位置してもよく、及び１つのＮＬＳが第１のＣｐｆ１構築物のＣ’末端にあってもよい。同様に、１つのＮＥＳが第２のＣｐｆ１構築物のＮ’末端に位置してもよく、及び１つのＮＥＳが第２のＣｐｆ１構築物のＣ’末端にあってもよい。Ｎ’末端又はＣ’末端に言及する場合、これらが対応するヌクレオチド配列の５’末端及び３’末端に対応することが理解されるであろう。
【０３２８】
好ましい配置は、第１のＣｐｆ１構築物が５’−ＮＬＳ−（Ｎ’末端Ｃｐｆ１パート）−リンカー−（二量体の第１の半体）−ＮＬＳ−３’で配置されるというものである。好ましい配置は、第２のＣｐｆ１構築物が５’−ＮＥＳ−（二量体の第２の半体）−リンカー−（Ｃ’末端Ｃｐｆ１パート）−ＮＥＳ−３’で配置されるというものである。好ましくはこれらの構築物の各々の上流に好適なプロモーターがある。これらの２つの構築物は別個に送達されても、又は一緒に送達されてもよい。
【０３２９】
一部の実施形態において、第２のＣｐｆ１構築物に作動可能に連結されているＮＥＳの１つ又は全てがＮＬＳに取り換えられてもよい。しかしながら、これは典型的には好ましくない可能性があり、他の実施形態では、第２のＣｐｆ１構築物に作動可能に連結している局在化シグナルは１つ以上のＮＥＳである。
【０３３０】
また、ＮＥＳがスプリットＣｐｆ１のＮ’末端断片に作動可能に連結されてもよいこと、及びＮＬＳがスプリットＣｐｆ１のＣ’末端断片に作動可能に連結されてもよいことも理解されるであろう。しかしながら、ＮＬＳがスプリットＣｐｆ１のＮ’末端断片に作動可能に連結され、及びＮＥＳがスプリットＣｐｆ１のＣ’末端断片に作動可能に連結されている配置が好ましいこともある。
【０３３１】
ＮＥＳは、少なくとも誘導物質エネルギー源が提供されるまで（例えば、少なくとも誘導物質にエネルギー源が供給されてその機能を果たすまで）、第２のＣｐｆ１融合構築物を核外に局在させるように機能する。誘導物質の存在によって細胞質内での２つのＣｐｆ１融合物の二量体化が刺激され、二量体化した第１及び第２のＣｐｆ１融合物にとって核に局在することが熱力学的に価値のあるものとなる。理論によって拘束されないが、本出願人らは、ＮＥＳが第２のＣｐｆ１融合物を細胞質へと（即ち核外に）隔離すると考える。第１のＣｐｆ１融合物上のＮＬＳが、それを核に局在させる。いずれの場合にも、本出願人らはＮＥＳ又はＮＬＳを用いて平衡を所望の方向にシフトさせる（核輸送の平衡）。二量体化は典型的には核外で行われ（ごく僅かな一部が核内で起こり得る）、二量体化した複合体上のＮＬＳが核輸送の平衡を核局在化にシフトさせるため、二量体化し、ひいては再構成されたＣｐｆ１が核に侵入する。
【０３３２】
有利には、本出願人らは、スプリットＣｐｆ１の機能を元に戻すことが可能である。一過性トランスフェクションを用いてこの概念が証明され、誘導物質エネルギー源の存在下ではバックグラウンドで二量体化が起こる。Ｃｐｆ１の別々の断片では活性は見られない。次にレンチウイルス送達による安定発現を用いてこれを展開すると、スプリットＣｐｆ１手法を用い得ることが示される。
【０３３３】
この本スプリットＣｐｆ１手法は、Ｃｐｆ１活性を誘導性にすることが可能となり、従って時間的制御が可能となるため有益である。更に、自己集合した複合体からのバックグラウンド活性を低下させるために種々の局在配列（即ち、好ましいものとしてＮＥＳ及びＮＬＳ）を用いることができる。組織特異的プロモーター、例えば第１及び第２のＣｐｆ１融合構築物の各々に対するものもまた組織特異的ターゲティングに用いることができ、ひいては空間的制御がもたらされ得る。必要に応じて２つの異なる組織特異的プロモーターを使用してより細密な制御を及ぼし得る。発生段階特異的プロモーターに関して同じ手法を用いてもよく、又は発生段階特異的及び組織特異的プロモーターの混合物があってもよく、ここでは第１及び第２のＣｐｆ１融合構築物のうち一方が組織特異的プロモーターの制御下にあり（即ちそれに作動可能に連結されているか、又はそれを含む）、一方で第１及び第２のＣｐｆ１融合構築物のうちの他方が発生段階特異的プロモーターの制御下にある（即ちそれに作動可能に連結されているか、又はそれを含む）。
【０３３４】
誘導性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、本明細書に記載されるとおりの、例えば第１のＣｐｆ１融合構築物に作動可能に連結されたとおりの１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を含む。これらの核局在化配列は、理想的には、真核細胞の核に検出可能な量の前記第１のＣｐｆ１融合構築物の蓄積をドライブするのに十分な強度である。理論によって拘束されることを望むものではないが、真核生物におけるＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体活性に核局在化配列は必要でなく、しかしかかる配列が含まれると、特に核内の核酸分子の標的化に関して、系の活性が亢進し、本２パート系の動作を助けると考えられる。
【０３３５】
同様に、第２のＣｐｆ１融合構築物が核外移行配列（ＮＥＳ）に作動可能に連結される。実際には、これは１つ以上の核外移行配列に連結され得る。換言すれば、第２のＣｐｆ１融合構築物と共に使用される核外移行配列の数は、好ましくは１又は２又は３つである。典型的には２つが好ましいが、１つが十分であり、従って一部の実施形態では好ましい。ＮＬＳ及びＮＥＳの好適な例は当該技術分野において公知である。例えば、好ましい核外移行シグナル（ＮＥＳ）はヒトタンパク質チロシン（ｔｙｒｏｓｉｎ）キナーゼ２である。好ましいシグナルは種特異的であり得る。
【０３３６】
ＦＲＢ及びＦＫＢＰ系が用いられる場合、ＦＫＢＰは好ましくは核局在化配列（ＮＬＳ）に隣接している。ＦＲＢ及びＦＫＢＰ系が用いられる場合、好ましい配置は、Ｎ’末端Ｃｐｆ１−ＦＲＢ−ＮＥＳ：Ｃ’末端Ｃｐｆ１−ＦＫＢＰ−ＮＬＳである。従って、第１のＣｐｆ１融合構築物がＣ’末端Ｃｐｆ１パートを含むことになり、及び第２のＣｐｆ１融合構築物がＮ’末端Ｃｐｆ１パートを含むことになり得る。
【０３３７】
本発明に有益な別の態様は、それを速やかにオンし得ること、即ちそれが迅速な応答を有することである。理論によって拘束されないが、Ｃｐｆ１活性は、既存の（既に存在する）融合構築物の（誘導物質エネルギー源との接触による）二量体化によると、新規融合構築物の発現（特に翻訳）によるよりも速く誘導され得ると考えられる。そのため、第１及び第２のＣｐｆ１融合構築物は標的細胞において事前に、即ちＣｐｆ１活性が必要になる前に発現させてもよい。次にＣｐｆ１活性を時間的に制御し、次に誘導物質エネルギー源を加えることによって速やかに構成させることができ、これは理想的には、例えばベクターによって送達されるＣｐｆ１の発現（転写の誘導を含む）によるよりも速く作用する（ヘテロ二量体を二量体化し、それによりＣｐｆ１活性を提供する）。
【０３３８】
用語Ｃｐｆ１又はＣｐｆ１酵素及びＣＲＩＳＰＲ酵素は、特に明らかでない限り本明細書では同義的に使用される。
【０３３９】
本出願人らは、ＣＰｆ１が２つの構成成分に分割することができ、これらは一体に戻されると機能性ヌクレアーゼを再構成することを実証する。本出願人らは、ラパマイシン感受性二量体化ドメインを用いて、Ｃｐｆ１媒介性ゲノム編集及び転写調節を時間的に制御するため、化学物質誘導性のＣｐｆ１を作成する。言い換えれば、本出願人らは、Ｃｐｆ１を、２つの断片に分割することによって化学物質誘導性にし得ること、及びラパマイシン感受性二量体化ドメインを用いてＣｐｆ１を制御して再アセンブリし得ることを実証する。本出願人らは、再アセンブルされたＣｐｆ１を用いてゲノム編集（ヌクレアーゼ／ニッカーゼ活性による）並びに転写調節（ＤＮＡ結合ドメインとして、いわゆる「デッドＣｐｆ１」）を媒介し得ることを示す。
【０３４０】
従って、ラパマイシン感受性二量体化ドメインの使用が好ましい。Ｃｐｆ１の再アセンブリが好ましい。再アセンブリは、結合活性の回復によって決まり得る。Ｃｐｆ１がニッカーゼであるか又は二本鎖切断を誘導する場合、野生型と比較した好適な比較パーセンテージを本明細書に記載する。
【０３４１】
ラパマイシン処理は１２日間続き得る。用量は２００ｎＭであり得る。この時間及び／又はモル濃度の投与は、ヒト胎児腎臓２９３ＦＴ（ＨＥＫ２９３ＦＴ）細胞株に適切な用量の一例であり、これを他の細胞株にも用いることができる。この数字は、インビボ治療適用向けに例えばｍｇ／ｋｇ単位に外挿することができる。しかしながら、対象へのラパマイシン投与に標準的な投薬量が同様に本明細書において用いられることもまた想定される。「標準的な投薬量」とは、ラパマイシンの通常の治療使用下又は主な適用下の投薬量（即ち臓器拒絶反応の予防に向けたラパマイシンの投与時に用いられる用量）を意味する。
【０３４２】
Ｃｐｆ１−ＦＲＢ／ＦＫＢＰ片の好ましい配置が別々であり、ＦＲＢ及びＦＫＢＰがラパマイシンの誘導によって二量体化することにより機能性完全長Ｃｐｆ１ヌクレアーゼの再アセンブリが起こるまでは不活性であることは注目に値する。従って、誘導性ヘテロ二量体の第１の半体に結合した第１のＣｐｆ１融合構築物を誘導性ヘテロ二量体の第１の半体に結合した第２のＣｐｆ１融合構築物と別個に送達し、及び／又はそれと別個に局在させることが好ましい。
【０３４３】
核局在化したＣｐｆ１（Ｃ）−ＦＫＢＰ断片と二量体化する可能性が低い細胞質にＣｐｆ１（Ｎ）−ＦＲＢ断片を隔離するためには、Ｃｐｆ１（Ｎ）−ＦＲＢ上に、ヒトタンパク質チロシン（ｔｙｒｏｓｉｎ）キナーゼ２由来の単一の核外移行配列（ＮＥＳ）を使用すること（Ｃｐｆ１（Ｎ）−ＦＲＢ−ＮＥＳ）が好ましい。ラパマイシンの存在下では、Ｃｐｆ１（Ｎ）−ＦＲＢ−ＮＥＳはＣｐｆ１（Ｃ）−ＦＫＢＰ−２ｘＮＬＳと二量体化して完全なＣｐｆ１タンパク質を再構成し、これにより核輸送の平衡が核内移行に向かってシフトし、ＤＮＡターゲティングが可能となる。
【０３４４】
高投薬量のＣｐｆ１は、ガイド鎖に対してほとんどミスマッチを呈しないオフターゲット（ＯＴ）配列におけるインデル頻度を悪化させ得る。かかる配列は、ミスマッチが連続していないか、及び／又はガイドのシード領域外にある場合に特に影響を受け易い。従って、Ｃｐｆ１活性の時間的制御を用いることにより長期発現実験における投薬量を低下させることができ、従って構成的に活性なＣｐｆ１と比較してオフターゲットインデルが低下し得る。
【０３４５】
ウイルス送達が好ましい。詳細には、レンチウイルス又はＡＡＶ送達ベクターが想定される。本出願人らは、レンチＣＲＩＳＰＲプラスミドと同様に、スプリット−Ｃｐｆ１レンチウイルス構築物を作成する。スプリット片は、ＡＡＶの約４．７ｋｂのサイズ制限に適合するよう十分に小さくなければならない。
【０３４６】
本出願人らは、スプリットＣｐｆ１の安定した低コピー数の発現を用いて、オフターゲット部位に重大な突然変異なく標的化した遺伝子座に実質的なインデルを誘導し得ることを実証する。本出願人らは、Ｃｐｆ１断片（本明細書に記載されるスプリット５に基づく２つのパート）をクローニングする。
【０３４７】
例えばＣｐｆ１（Ｃ）−ＦＫＢＰ−２×ＮＬＳ（デッドＣｐｆ１（Ｃ）−ＦＫＢＰ−２×ＮＬＳ−ＶＰ６４）に加えて、ＶＰ６４トランス活性化ドメインを含むデッドＣｐｆ１もまた使用し得る。これらの断片は、触媒的に不活性なＣｐｆ１−ＶＰ６４融合物（デッドＣｐｆ１−ＶＰ６４）を再構成する。ラパマイシンの存在下でＶＰ６４によって転写活性化が誘導され、Ｃｐｆ１（Ｃ）−ＦＫＢＰ融合物とＣｐｆ１（Ｎ）−ＦＲＢ融合物との二量体化が誘導される。換言すれば、本出願人らはスプリットデッドＣｐｆ１−ＶＰ６４の誘導能を試験し、ラパマイシンの存在下ではスプリットデッドＣｐｆ１−ＶＰ６４によって転写活性化が誘導されることを明らかにする。そのため、本誘導性Ｃｐｆ１に１つ以上の機能ドメイン、例えば転写アクチベーター又はリプレッサー又はヌクレアーゼ（Ｆｏｋ１など）を会合してもよい。機能ドメインはスプリットＣｐｆ１の一方のパートに結合し、又はそれと融合してもよい。
【０３４８】
好ましい配置は、第１のＣｐｆ１構築物が５’−第１の局在化シグナル−（Ｎ’末端Ｃｐｆ１パート）−リンカー−（二量体の第１の半体）−第１の局在化シグナル−３’で配置され、及び第２のＣｐｆ１構築物が５’−第２の局在化シグナル−（二量体の第２の半体）−リンカー−（Ｃ’末端Ｃｐｆ１パート）−第２の局在化シグナル−機能ドメイン−３’で配置されるというものである。ここでは第２のＣｐｆ１構築物の３’末端に機能ドメインが置かれる。或いは、第１のＣｐｆ１構築物の５’末端に機能ドメインが置かれてもよい。１つ以上の機能ドメインが３’末端又は５’末端又は両方の末端に用いられてもよい。好ましくはこれらの構築物の各々の上流に好適なプロモーターがある。これらの２つの構築物は別個に送達されても、又は一緒に送達されてもよい。局在化シグナルは、それらが各構築物上で互いに混じり合わない限りＮＬＳ又はＮＥＳであってもよい。
【０３４９】
ある態様において、本発明は、少なくとも１つの突然変異を有しないＣｐｆ１酵素と比較したときＣｐｆ１が少なくとも９７％、又は１００％のヌクレアーゼ活性の低下を有する誘導性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供する。
【０３５０】
従って、Ｃｐｆ１がデッドＣｐｆ１であることもまた好ましい。理想的には、スプリットは常に、１つ又は複数の触媒ドメインが影響を受けないようなものでなければならない。デッドＣｐｆ１とは、ＤＮＡ結合は起こるが切断又はニッカーゼ活性は示されないことが意図される。
【０３５１】
ある態様において、本発明は、１つ以上の機能ドメインがＣｐｆ１と会合している本明細書に考察されるとおりの誘導性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供する。この機能ドメインは、スプリットＣｐｆ１のうちの一方のパート又は両方と会合（即ち結合又は融合）していてもよい。スプリットＣｐｆ１の２つのパートの各々と会合したものがあってもよい。従ってこれらは、典型的には、当該の構築物内にある融合物として、第１及び／又は第２のＣｐｆ１融合構築物の一部として提供され得る。機能ドメインは、本明細書で考察するとおり、典型的にはＧｌｙＳｅｒリンカーなどのリンカーを介して融合される。１つ以上の機能ドメインは転写活性化ドメイン又はリプレッサードメインであってもよい。それらは異なるドメインであってもよいが、全ての機能ドメインがアクチベーター又はリプレッサーのいずれかであり、これら２つの混合物は使用されないことが好ましい。
【０３５２】
転写活性化ドメインは、ＶＰ６４、ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡ又はＳＥＴ７／９を含み得る。
【０３５３】
ある態様において、本発明は、Ｃｐｆ１と会合した１つ以上の機能ドメインが転写リプレッサードメインである本明細書に考察されるとおりの誘導性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供する。
【０３５４】
ある態様において、本発明は、転写リプレッサードメインがＫＲＡＢドメインである本明細書に考察されるとおりの誘導性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供する。
【０３５５】
ある態様において、本発明は、転写リプレッサードメインが、ＮｕＥドメイン、ＮｃｏＲドメイン、ＳＩＤドメイン又はＳＩＤ４Ｘドメインである本明細書に考察されるとおりの誘導性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供する。
【０３５６】
ある態様において、本発明は、アダプタータンパク質と会合した１つ以上の機能ドメインが、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写解除因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性、ＤＮＡ切断活性、ＤＮＡ組込み活性又は核酸結合活性を含む１つ以上の活性を有する本明細書に考察されるとおりの誘導性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供する。
【０３５７】
ヒストン修飾ドメインもまた、一部の実施形態において好ましい。例示的ヒストン修飾ドメインは以下で考察する。トランスポザーゼドメイン、ＨＲ（相同組換え）機構ドメイン、リコンビナーゼドメイン、及び／又はインテグラーゼドメインもまた、本機能ドメインとして好ましい。一部の実施形態において、ＤＮＡ組込み活性は、ＨＲ機構ドメイン、インテグラーゼドメイン、リコンビナーゼドメイン及び／又はトランスポザーゼドメインを含む。
【０３５８】
ある態様において、本発明は、ＤＮＡ切断活性がヌクレアーゼに起因する本明細書に考察されるとおりの誘導性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供する。
【０３５９】
ある態様において、本発明は、ヌクレアーゼがＦｏｋ１ヌクレアーゼを含む本明細書に考察されるとおりの誘導性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供する。
【０３６０】
本スプリットＣｐｆ１系と共に好ましいかかる機能ドメインの使用はまた、Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（「エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体によるゲノム規模の転写活性化（Ｇｅｎｏｍｅ−ｓｃａｌｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｃｏｍｐｌｅｘ）」Ｎａｔｕｒｅ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  １１  Ｄｅｃ  ２０１４）にも詳細に考察されている。
【０３６１】
本系は任意のガイドと共に用いることができる。
【０３６２】
特定の実施形態において、改変されたガイドが用いられ得る。上述のＫｏｎｅｒｍａｎｎ  Ｎａｔｕｒｅ  １１  Ｄｅｃ  ２０１４論文の教示を具体化するガイドが特に好ましい。これらのガイドは、タンパク質と結合するＲＮＡ部分（アプタマー）が加えられるように改変される。かかる１つ又は複数の部分はガイドの一部分を置き換え得る。次に対応するＲＮＡ結合タンパク質ドメインを用いてＲＮＡを認識し、及び本明細書に記載されるものなどの機能ドメインをガイドにリクルートすることができる。これは主にデッドＣｐｆ１と共に用いるためであり、転写活性化若しくは抑制又はＦｏｋ１などのヌクレアーゼによるＤＮＡ切断につながる。デッドＣｐｆ１と組み合わせたかかるガイドの使用は強力であり、Ｃｐｆ１それ自体もまた本明細書で考察するとおりのその独自の機能ドメインと会合している場合には、特に強力である。デッドＣｐｆ１（その独自の会合した機能ドメインを有する又は有しない）が本発明に従い再構成するように誘導されるとき、即ちスプリットＣｐｆ１であるとき、このツールは特に有用である。
【０３６３】
同様に本発明における使用に好ましいガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、細胞の目的のゲノム遺伝子座にある標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含むことができ、ここでｇＲＮＡは、１つ以上のアダプタータンパク質に結合する１つ又は複数の個別のＲＮＡ配列の挿入によって改変され、及びアダプタータンパク質は１つ以上の機能ドメインと会合している。Ｃｐｆ１は少なくとも１つの突然変異を含んでもよく、そのためＣｐｆ１酵素は少なくとも１つの突然変異を有しないＣｐｆ１酵素の５％以下のヌクレアーゼ活性を有し；及び／又は少なくとも１つ以上の核局在化配列を含み得る。また、細胞の目的のゲノム遺伝子座にある標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含む１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、少なくとも１つ以上の核局在化配列を含むＣｐｆ１酵素を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物も提供され、ここでＣｐｆ１酵素は少なくとも１つの突然変異を含み、そのためＣｐｆ１酵素は少なくとも１つの突然変異を有しないＣｐｆ１酵素の５％以下のヌクレアーゼ活性を有し、少なくとも１つのｇＲＮＡは、１つ以上のアダプタータンパク質に結合する１つ又は複数の個別のＲＮＡ配列の挿入によって改変され、及びアダプタータンパク質は１つ以上の機能ドメインと会合している。
【０３６４】
好ましくは、１つ以上のアダプタータンパク質に結合する１つ又は複数の個別のＲＮＡ配列の挿入によって改変されているｇＲＮＡ。１つ以上のアダプタータンパク質に結合する１つ又は複数の個別のＲＮＡ配列の挿入は、好ましくは、同じ又は異なる１つ又は複数のアダプタータンパク質に特異的なアプタマー配列又は２つ以上のアプタマー配列である。アダプタータンパク質は、好ましくは、ＭＳ２、ＰＰ７、Ｑβ、Ｆ２、ＧＡ、ｆｒ、ＪＰ５０１、Ｍ１２、Ｒ１７、ＢＺ１３、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、ＭＸ１、ＴＷ１８、ＶＫ、ＳＰ、ＦＩ、ＩＤ２、ＮＬ９５、ＴＷ１９、ＡＰ２０５、φＣｂ５、φＣｂ８ｒ、φＣｂ１２ｒ、φＣｂ２３ｒ、７ｓ、ＰＲＲ１を含む。特にスプリットデッドＣｐｆ１を安定に発現する細胞株が有用であり得る。
【０３６５】
本出願人らは、Ｃｐｆ１を２つの個別的な断片に分割することができ、これらの断片は、化学物質誘導を用いて一体に戻すと、機能性完全長Ｃｐｆ１ヌクレアーゼを再構成することを実証する。スプリットＣｐｆ１のアーキテクチャは種々の適用に有用となり得る。例えば、スプリットＣＰｆ１は、各断片を異なる組織特異的プロモーター下に置くことによりＣｐｆ１活性を横断的細胞集団に制限する遺伝学的戦略を可能にし得る。加えて、ＡＰＡ及びジベレリンなどの異なる化学物質誘導性二量体化ドメインもまた用いることができる。
【０３６６】
誘導物質エネルギー源は、好ましくは化学物質誘導である。
【０３６７】
スプリット位置又は部位は、Ｃｐｆ１酵素の第１のパートが第２のパートと分離される点である。一部の実施形態において、第１のパートがアミノ酸１〜Ｘを含むか又はそれをコードし、一方で第２のパートがアミノ酸Ｘ＋１〜最後までを含むか又はそれをコードする。十分なＤＮＡ結合活性、及び必要であればＤＮＡニッカーゼ又は切断活性、例えば野生型Ｃｐｆ１と比較して少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の活性が保持されるならば、アミノ酸（又はそれらをコードするヌクレオチド）は分割末端のいずれかの端部からトリミングされ得るため、この例では付番は連続的であるが、これは必ずしも必要でないこともある。
【０３６８】
本明細書に提供される例示的付番は野生型タンパク質、好ましくは野生型ＦｎＣｐｆ１を基準にし得る。しかしながら、ＦｎＣｐｆ１タンパク質などの野生型Ｃｐｆ１の突然変異体を使用し得ることが想定される。付番はまた、例えば何らかのＮ’又はＣ’末端トランケーション又は欠失が用いられ得るため、ＦｎＣｐｆ１付番に正確に従わないこともあり、しかしこれは標準的な配列アラインメントツールを使用して対処することができる。オルソログもまた配列アラインメントツールとして好ましい。
【０３６９】
従って、スプリット位置は、例えば結晶データ及び／又は計算構造予測に基づく当該技術分野の通常の技術を用いて選択されてもよい。
【０３７０】
例えば、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼの一次構造のコンピュータ分析から、３つの個別的な領域が明らかになる（図１）。第一にＣ末端ＲｕｖＣ様ドメインであり、これは唯一機能的に特徴付けられたドメインである。第二にＮ末端α−ヘリックス領域であり、及び第三に、ＲｕｖＣ様ドメインとα−ヘリックス領域との間に位置する混合α及びβ領域である。Ｃｐｆ１一次構造内に、構造化されていない領域の幾つかの小さいストレッチが予想される。溶媒に露出していて、且つ異なるＣｐｆ１オルソログ内で保存されていない非構造化領域が、スプリットに好ましいサイドに相当し得る（図２及び図３）。
【０３７１】
以下の表は、Ａｓ及びＬｂＣｐｆ１内の非限定的な潜在的スプリット領域を提供する。かかる領域内のスプリット部位が適当であり得る。
【０３７２】
【表１】
0006898865.tif 000004
【０３７３】
Ｆｎ、Ａｓ及びＬｂ  Ｃｐｆ１突然変異体については、潜在的なスプリット部位に対応するのがどの位置かは、例えば配列アラインメントに基づき容易に明らかになるはずである。非Ｆｎ、Ａｓ及びＬｂ酵素については、オルソログと意図されるＣｐｆ１との間に比較的高度な相同性が存在する場合にはオルソログの結晶構造を用いることができ、又は計算による予測を用いてもよい。
【０３７４】
理想的には、スプリット位置は領域又はループ内に位置しなければならない。好ましくは、スプリット位置はアミノ酸配列の中断が構造的特徴（例えばα−ヘリックス又はβシート）の部分的又は完全な破壊をもたらさないところに存在する。非構造化領域（それらの領域が結晶中に「凍結」されるほど十分には構造化されていないため結晶構造に現れない領域）が好ましい選択肢であることが多い。本出願人らは、例えば、Ｃｐｆ１の表面上に露出している非構造化領域にスプリットを作製し得る。
【０３７５】
本出願人らは、好ましい例として、及び指針として提供される以下の手順に従い得る。非構造化領域は結晶構造に現れないため、本出願人らは、Ｃｐｆ１の一次アミノ酸配列を有する結晶の周囲のアミノ酸配列を相互参照する。各非構造化領域は例えば約３〜１０アミノ酸で構成されることができ、これは結晶中に現れない。従って本出願人らはこれらのアミノ酸の間にスプリットを作製する。より多くの潜在的スプリット部位が含まれるように、本出願人らは非構造化領域の場合と同じ基準を用いてＣｐｆ１の外部にあるループに位置するスプリットを含める。
【０３７６】
一部の実施形態において、スプリット位置（ｐｏｓｉｔｏｎ）はＣｐｆ１のループの外部にある。他の好ましい実施形態において、スプリット位置はＣｐｆ１の非構造化領域にある。非構造化領域は、典型的には、結晶パターンから構造を容易に決定できない極めて柔軟性の高い外部ループである。
【０３７７】
スプリット位置が同定されると、好適な構築物を設計することができる。
【０３７８】
典型的には、スプリットアミノ酸の第１のパートのＮ’端側末端（又はそれをコードするヌクレオチドの５’末端）にＮＥＳが位置する。その場合、スプリットアミノ酸の第２のパートのＣ’端側末端（又はそれをコードするヌクレオチドの３’末端）にＮＬＳが位置する。このようにして、第１のＣｐｆ１融合構築物を１つ以上の核外移行シグナルに作動可能に連結してもよく、及び第２のＣｐｆ１融合構築物を核局在化シグナルに作動可能に連結してもよい。
【０３７９】
当然ながら、逆の配置が提供されてもよく、ここではスプリットアミノ酸の第１のパートのＮ’端側末端（又はそれをコードするヌクレオチドの５’末端）にＮＬＳが位置する。その場合、スプリットアミノ酸の第２のパートのＣ’端側末端（又はそれをコードするヌクレオチドの３’末端）にＮＥＳが位置する。このように、第１のＣｐｆ１融合構築物を１つ以上の核局在化シグナルに作動可能に連結してもよく、及び第２のＣｐｆ１融合構築物を核外移行シグナルに作動可能に連結してもよい。
【０３８０】
パッケージングのためには、２つのパート（スプリットの両側）をほぼ同じ長さに保つスプリットが有利であり得る。例えば、転写物がほぼ同じサイズであるとき、両片間の化学量論を維持し易くなると考えられる。
【０３８１】
特定の例では、コドン最適化されたヒトＣｐｆ１、例えばＦｎＣｐｆ１のＮ末端片及びＣ末端片が、それぞれＦＲＢ及びＦＫＢＰ二量体化ドメインに融合する。この配置が好ましいこともある。これらは取り換えられてもよい（即ちＮ’末端にＦＫＢＰ、及びＣ’末端にＦＲＢ）。
【０３８２】
本明細書では、Ｃｐｆ１断片を二量体化ドメインと分離するため、（ＧＧＧＧＳ）３などのリンカーが好ましくは使用される。（ＧＧＧＧＳ）３は、比較的長いリンカー（１５アミノ酸）であるため好ましい。グリシン残基は最も可動性が高く、及びセリン残基はリンカーがタンパク質の外側にある可能性を高める。（ＧＧＧＧＳ）６（ＧＧＧＧＳ）９又は（ＧＧＧＧＳ）１２が、好ましくは代替として用いられ得る。他の好ましい代替例は、（ＧＧＧＧＳ）１、（ＧＧＧＧＳ）２、（ＧＧＧＧＳ）４、（ＧＧＧＧＳ）５、（ＧＧＧＧＳ）７、（ＧＧＧＧＳ）８、（ＧＧＧＧＳ）１０、又は（ＧＧＧＧＳ）１１である。
【０３８３】
例えば、（ＧＧＧＧＳ）３がＮ’末端Ｃｐｆ１断片とＦＲＢとの間に含まれてもよい。例えば、（ＧＧＧＧＳ）３がＦＫＢとＣ’末端Ｃｐｆ１断片との間に含まれてもよい。
【０３８４】
代替的なリンカーが利用可能であり、しかしＣｐｆ１の２つのパートが一緒になり、ひいてはＣｐｆ１活性が元に戻る機会を最大限にするには、高度に可動性のリンカーが最も良好に働くと考えられる。一つの代替例は、ヌクレオプラスミンのＮＬＳをリンカーとして使用し得ることである。
【０３８５】
Ｃｐｆ１と任意の機能ドメインとの間にもリンカーを使用することができる。この場合もまた、ここに（ＧＧＧＧＳ）３リンカー（又はその６、９、又は１２リピートバージョン）を使用してもよく、又はＣＰｆ１と機能ドメインとの間にヌクレオプラスミンのＮＬＳをリンカーとして使用することができる。
【０３８６】
ＦＲＢ／ＦＫＢＰ系の代替例が想定される。例えばＡＢＡ及びジベレリン系。
【０３８７】
従って、ＦＫＢＰファミリーの好ましい例は、以下の誘導性系のいずれか一つである。ＦＫ５０６の存在下でカルシニューリンＡ（ＣＮＡ）と二量体化するＦＫＢＰ；ＦＫＣｓＡの存在下でＣｙＰ−Ｆａｓと二量体化するＦＫＢＰ；ラパマイシンの存在下でＦＲＢと二量体化するＦＫＢＰ；クーママイシンの存在下でＧｒｙＢと二量体化するＧｙｒＢ；ジベレリンの存在下でＧＩＤ１と二量体化するＧＡＩ；又はＨａＸＳの存在下でＨａｌｏＴａｇと二量体化するＳｎａｐタグ。
【０３８８】
ＦＫＢＰファミリーそれ自体の範囲内での代替例もまた好ましい。例えば、ＦＫ１０１２の存在下でホモ二量体化するＦＫＢＰ（即ち、あるＦＫＢＰが別のＦＫＢＰと二量体化する）。従って、
誘導性ホモ二量体の第１の半体に結合した第１のＣｐｆ１融合構築物、及び
誘導性ホモ二量体の第２の半体に結合した第２のＣｐｆ１融合構築物、
を含む、天然に存在しない又はエンジニアリングされた誘導性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系もまた提供され、
第１のＣｐｆ１融合構築物は１つ以上の核局在化シグナルに作動可能に連結され、
第２のＣｐｆ１融合構築物は（任意選択で１つ以上の）核外移行シグナルに作動可能に連結され、
誘導物質エネルギー源に接触すると誘導性ホモ二量体の第１及び第２の半体が一体になり、
誘導性ホモ二量体の第１及び第２の半体が一体になると、第１及び第２のＣｐｆ１融合構築物が機能性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を構成することが可能となり、
Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が、細胞の目的のゲノム遺伝子座にある標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み、及び
機能性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が標的配列に結合し、及び任意選択で、ゲノム遺伝子座を編集して遺伝子発現を変化させる。
【０３８９】
一実施形態において、ホモ二量体は好ましくはＦＫＢＰであり、及び誘導物質エネルギー源は好ましくはＦＫ１０１２である。別の実施形態において、ホモ二量体は好ましくはＧｒｙＢであり、及び誘導物質エネルギー源は好ましくはクーママイシンである。別の実施形態において、ホモ二量体は好ましくはＡＢＡであり、及び誘導物質エネルギー源は好ましくはジベレリンである。
【０３９０】
他の実施形態において、二量体はヘテロ二量体である。ヘテロ二量体の好ましい例は、以下の誘導性系のいずれか一つである：ＦＫ５０６の存在下でカルシニューリンＡ（ＣＮＡ）と二量体化するＦＫＢＰ；ＦＫＣｓＡの存在下でＣｙＰ−Ｆａｓと二量体化するＦＫＢＰ；クーママイシンの存在下で、ラパマイシンの存在下でＦＲＢと二量体化するＦＫＢＰ；ジベレリンの存在下でＧＩＤ１と二量体化するＧＡＩ；又はＨａＸＳの存在下でＨａｌｏＴａｇと二量体化するＳｎａｐタグ。
【０３９１】
ＦＫＢＰ／ＦＲＢは十分に特徴付けられており、且つ両方のドメインとも十分に小さく（＜１００アミノ酸）パッケージングの助けとなるため、本出願人らはＦＫＢＰ／ＦＲＢを使用した。更に、ラパマイシンは長い間使用されており、副作用について十分に理解されている。大型の二量体化ドメイン（＞３００ａａ）も機能するはずであるが、Ｃｐｆ１再構成を可能にするのに一層長いリンカーが必要となり得る。
【０３９２】
Ｐａｕｌｍｕｒｕｇａｎ  ａｎｄ  Ｇａｍｂｈｉｒ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，Ａｕｇｕｓｔ  １５，２００５  ６５；７４１３）が、ＦＲＢ／ＦＫＢＰ／ラパマイシン系の背景について考察している。別の有用な論文は、Ｃｒａｂｔｒｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３，９９−１０７，Ｊａｎ  ２００６）による論稿である。
【０３９３】
ある例では、シングルベクター、発現カセット（プラスミド）が構築される。ｇＲＮＡはＵ６プロモーターの制御下にある。２つの異なるＣｐｆ１スプリットが使用される。スプリットＣｐｆ１構築物は、スプリットＣＰｆ１のＣ末端パートにＧｌｙＳｅｒリンカーを介してＦＫＢＰが融合した、ＮＬＳが隣接する第１のＣｐｆ１融合構築物；及びスプリットＣＰｆ１のＮ末端パートとＧｌｙＳｅｒリンカーを介してＦＲＢが融合した、ＮＥＳが隣接する第２のＣｐｆ１融合構築物をベースとする。第１及び第２のＣｐｆ１融合構築物を分離するため、転写時にスプリットするＰ２Ａが使用される。スプリットＣｐｆ１はラパマイシンの存在下で野生型と同様のインデル形成を示すが、ラパマイシンの非存在下では、野生型と比べてインデル形成が著しく低下する。
【０３９４】
従って、シングルベクターが提供される。このベクターは、
誘導性二量体の第１の半体に結合した第１のＣｐｆ１融合構築物、及び
誘導性二量体の第２の半体に結合した第２のＣｐｆ１融合構築物、
を含み、
第１のＣｐｆ１融合構築物が１つ以上の核局在化シグナルに作動可能に連結され、
第２のＣＰｆ１融合構築物が１つ以上の核外移行シグナルに作動可能に連結され、
誘導物質エネルギー源に接触すると誘導性ヘテロ二量体の第１及び第２の半体が一体になり、
誘導性ヘテロ二量体の第１及び第２の半体が一体になると、第１及び第２のＣｐｆ１融合構築物が機能性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を構成することが可能となり、
Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が、細胞の目的のゲノム遺伝子座にある標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み、及び
機能性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が標的配列に結合し、及び任意選択で、ゲノム遺伝子座を編集して遺伝子発現を変化させる。これらのエレメントは、好ましくは単一の構築物、例えば発現カセットに提供される。
【０３９５】
第１のＣｐｆ１融合構築物には、好ましくは、各末端に少なくとも１つの核局在化シグナルが隣接する。第２のＣｐｆ１融合構築物には、好ましくは、各末端に少なくとも１つの核外移行シグナルが隣接する。
【０３９６】
また、それを必要としている対象を治療する方法も提供され、この方法は、系をコードするポリヌクレオチド又は任意の本ベクターで対象を形質転換することにより遺伝子編集を誘導するステップ、及び誘導物質エネルギー源を対象に投与するステップを含む。好適な修復鋳型もまた提供されることができ、これは、例えば、前記修復鋳型を含むベクターによって送達される。
【０３９７】
また、それを必要としている対象を治療する方法も提供され、この方法は、本系をコードするポリヌクレオチド又は任意の本ベクターで対象を形質転換することにより転写活性化又は抑制を誘導するステップであって、前記ポリヌクレオチド又はベクターが触媒的に不活性なＣｐｆ１及び１つ以上の関連する機能ドメインをコードするか又はそれを含むステップを含み；本方法は、誘導物質エネルギー源を対象に投与するステップを更に含む。
【０３９８】
前記治療方法に用いられる本系を含む組成物もまた提供される。かかる治療方法のための医薬の製造における本系の使用もまた提供される。
【０３９９】
本系によって治療可能な病態の例は本明細書又は本明細書の引用文献に記載される。
【０４００】
シングルベクターは転写物スプリット剤、例えばＰ２Ａを含むことができる。Ｐ２Ａは転写物を２つに分割して、第１及び第２のＣｐｆ１融合構築物を分離する。分割は「リボソームスキッピング」に起因する。本質的には、リボソームが翻訳中にアミノ酸を読み飛ばし、これによりタンパク質鎖が切れて２つの別個のポリペプチド／タンパク質がもたらされる。シングルベクターはまた、低バックグラウンド活性は懸念されないものの高い誘導性活性が所望される適用にも有用である。
【０４０１】
一例を挙げるとすれば、クローン胚性幹細胞株の作成である。通常の手順は、ｗｔ  ＣＰｆ１又はＣｐｆ１ニッカーゼをコードするプラスミドによる一過性トランスフェクションである。これらのプラスミドがＣｐｆ１分子を産生し、この分子は数日間活性のまま留まり、オフターゲット活性の可能性がより高い。スプリットＣｐｆ１にシングル発現ベクターを使用すると、「高い」Ｃｐｆ１活性をより短い時間ウィンドウ（例えばラパマイシンなどの誘導物質の１用量）に制限することが可能になる。継続的な（毎日の）誘導物質（例えばラパマイシン）処理がなければ、シングル発現スプリットＣｐｆ１ベクターの活性は低く、不必要なオフターゲット効果が生じる可能性の低下がもたらされる。
【０４０２】
誘導されたＣｐｆ１活性のピークが一部の実施形態において有益であり、これはシングル送達ベクターを使用して最も容易にもたらされ得るが、デュアルベクター系（各ベクターがスプリットＣＰｆ１の一方の半体を送達する）によることもまた可能である。ピークは高活性で、且つ短い時間スケール、典型的には誘導物質の寿命にわたるものであってもよい。
【０４０３】
従って、クローン胚性幹細胞株の作成方法が提供され、この方法は、本系をコードするポリヌクレオチド又は本ベクターのうちの１つで１つ以上の胚性幹細胞をトランスフェクトして本スプリットＣｐｆ１を発現させるステップ、及び１つ以上の幹細胞に本誘導物質エネルギー源を投与し又は接触させることによりＣｐｆ１の再構成を誘導するステップを含む。修復鋳型が提供されてもよい。
【０４０４】
本明細書に記載されるあらゆる方法と同様に、好適なｇＲＮＡ又はガイドが必要となり得ることが理解されるであろう。
【０４０５】
機能ドメインなどが酵素のいずれか一方のパートと「会合」している場合、それらは典型的には融合物である。用語「〜と会合している」は、本明細書では、例えばＣｐｆ１のパートと機能ドメインとの間で、一つの分子がどのように別の分子と「会合」しているかに関して用いられる。かかるタンパク質間相互作用の場合、この会合は、抗体がエピトープを認識する方法における認識の観点で考えられてもよい。或いは、一つのタンパク質が別のタンパク質と、それら２つの融合物を介して会合していてもよく、例えば一つのサブユニットが別のサブユニットに融合していてもよい。融合は典型的には、例えば、各タンパク質又はサブユニットをコードするヌクレオチド配列を併せてスプライシングすることにより、一方のアミノ酸配列を他方のアミノ酸配列に加えることによって起こる。或いは、これは、本質的に、融合タンパク質など、２つの分子間の結合又は直接的な連結と考えられてもよい。いずれにしろ、融合タンパク質は２つの目的のサブユニット間（即ち酵素と機能ドメインとの間又はアダプタータンパク質と機能ドメインとの間）にリンカーを含んでもよい。従って、一部の実施形態において、ＣＰｆ１のパートは機能ドメインへの結合によってそれと会合している。他の実施形態において、ＣＰｆ１は機能ドメインと、それらの２つが任意選択で中間リンカーを介して一体に融合されているため、会合している。リンカーの例としては、本明細書で考察されるＧｌｙＳｅｒリンカーが挙げられる。
【０４０６】
誘導物質の他の例としては、光及びホルモンが挙げられる。光について、誘導性二量体はヘテロ二量体であってもよく、二量体の第１の光誘導性半体と二量体の第２の（及び相補的な）光誘導性半体とを含む。第１及び第２の光誘導性二量体半体の好ましい例はＣＩＢ１及びＣＲＹ２系である。ＣＩＢ１ドメインは光感受性クリプトクロム２（ＣＲＹ２）のヘテロ二量体結合パートナーである。
【０４０７】
別の例において、青色光応答性磁石二量体化系（ｐＭａｇ及びｎＭａｇ）がスプリットＣｐｆ１タンパク質の２つのパートに融合され得る。光刺激に応答してｐＭａｇとｎＭａｇとが二量体化し、Ｃｐｆ１が再構成する。例えば、かかる系については、Ｎｉｈｏｎｇａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３，７５５−７９０，２０１５）にＣａｓ９に関連して記載されている。
【０４０８】
本発明は、誘導物質エネルギー源が熱、超音波、電磁エネルギー又は化学物質であり得ることを包含する。本発明の好ましい実施形態において、誘導物質エネルギー源は、抗生物質、小分子、ホルモン、ホルモン誘導体、ステロイド又はステロイド誘導体であってもよい。より好ましい実施形態において、誘導物質エネルギー源は、アブシジン酸（ＡＢＡ）、ドキシサイクリン（ＤＯＸ）、クマート、ラパマイシン、４−ヒドロキシタモキシフェン（４ＯＨＴ）、エストロゲン又はエクジソンであってもよい。本発明は、少なくとも１つのスイッチが、抗生物質ベースの誘導性系、電磁エネルギーベースの誘導性系、小分子ベースの誘導性系、核内受容体ベースの誘導性系及びホルモンベースの誘導性系からなる群から選択され得ることを提供する。より好ましい実施形態において、少なくとも１つのスイッチは、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）／ＤＯＸ誘導性系、光誘導性系、ＡＢＡ誘導性系、クマートリプレッサー／オペレーター系、４ＯＨＴ／エストロゲン誘導性系、エクジソンベースの誘導性系及びＦＫＢＰ１２／ＦＲＡＰ（ＦＫＢＰ１２−ラパマイシン複合体）誘導性系からなる群から選択されてもよい。かかる誘導物質についてはまた、本明細書及びＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５１４１８号明細書（参照により本明細書に援用される）においても考察されている。
【０４０９】
一般に、ｗｔ、ニッカーゼ又はデッドＣｐｆ１のいずれであれ（会合した機能ドメインを伴う又は伴わない）、Ｃｐｆ１のなし得る任意の使用を、本スプリットＣｐｆ１手法を用いて探究することができる。その有益性は依然としてＣｐｆ１活性の誘導性の性質である。
【０４１０】
更なる例として、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質とのスプリットＣＰｆ１融合物を作製することができる。これによりゲノム遺伝子座のイメージングが（「最適化したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によるヒト生細胞のゲノム遺伝子座の動的イメージング（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｌｏｃｉ  ｉｎ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａｎ  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）」Ｃｈｅｎ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ２０１３を参照）、但し誘導可能な方法で可能となり得る。そのため、一部の実施形態において、Ｃｐｆ１パートのうちの１つ以上が蛍光タンパク質、例えばＧＦＰに会合され得る（及び詳細にはそれと融合され得る）。
【０４１１】
更なる実験は、野生型（ｗｔ）とスプリットＣｐｆ１との間で、オンターゲット切断が同じレベルにあるときオフターゲット切断に違いがあるかどうかに取り組む。これを行うため、本出願人らはｗｔ及びスプリットＣｐｆ１プラスミドの一過性トランスフェクションを用い、及び種々の時点で回収する。本出願人らは、オンターゲット切断が±５％以内である一組の試料を見付けた後にオフターゲット活性化（ａｃｔｉｖａｔａｔｉｏｎ）を調べる。本出願人らは、ガイドなしに（レンチウイルスを使用して）ｗｔ又はスプリットＣｐｆ１を安定に発現する細胞株を作製する。抗生物質選択の後、別個のレンチウイルスでガイドを送達し、及び種々の時点で回収してオン／オフターゲット切断を計測する。
【０４１２】
本出願人らは、ＦＲＢ（Ｎ）Ｃｐｆ１−ＮＥＳ断片に不安定化配列（ＰＥＳＴ、「高応答性レポーター系の開発のためのｍＲＮＡ不安定化及びタンパク質不安定化エレメント（Ｕｓｅ  ｏｆ  ｍＲＮＡ−ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｔｏ  ｄｅｖｅｌｏｐ  ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ）」Ｖｏｏｎ  ＤＣ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００５を参照）を導入して、スプリットデッドＣｐｆ１−ＶＰ６４複合体のより速い分解、ひいてはその安定性の低下を促進する。
【０４１３】
本明細書において他の部分に記載されるとおりのかかる不安定化配列（ＰＥＳＴを含む）は、スプリットＣｐｆ１系との使用に有利であり得る。
【０４１４】
スプリットデッドＣｐｆ１−ＶＰ６４及びＭＳ２−ｐ６５−ＨＳＦ１＋ガイドを安定に発現する細胞株を作成する。ＰＬＸ抵抗性スクリーニングから、薬物スクリーニングにおいて非可逆的な時限式の転写活性化が有用であり得ることが実証され得る。この手法は、スプリットデッドＣｐｆ１−ＶＰ６４が可逆的でない場合に有利であり得る。
【０４１５】
一態様において、本発明は、少なくとも１つのスイッチを含み得る天然に存在しない又はエンジニアリングされたＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供し、ここで前記Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の活性は、スイッチに関して少なくとも１つの誘導物質エネルギー源と接触させることによって制御される。本発明のある実施形態において、少なくとも１つのスイッチ又は前記Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の活性に関する制御は、活性化され、増強され、終結され、又は抑制されてもよい。少なくとも１つの誘導物質エネルギー源との接触により、第１の効果及び第２の効果が生じ得る。第１の効果は、核内移行、核外移行、二次構成成分のリクルート（エフェクター分子など）、（タンパク質、ＤＮＡ又はＲＮＡの）コンホメーション変化、切断、カーゴの放出（ケージド分子又は補因子など）、会合又は解離のうちの１つ以上であってもよい。第２の効果は、少なくとも１つのスイッチ又は前記Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の活性に関する制御の活性化、増強、終結又は抑制のうちの１つ以上であってもよい。一実施形態において、第１の効果及び第２の効果はカスケードで起こり得る。
【０４１６】
本発明の別の態様において、Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、少なくとも１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）、核外移行シグナル（ＮＥＳ）、機能ドメイン、可動性リンカー、突然変異、欠失、変化又はトランケーションを更に含み得る。ＮＬＳ、ＮＥＳ又は機能ドメインの１つ以上は条件的に活性化又は不活性化されてもよい。別の実施形態において、突然変異は、転写因子相同性領域の突然変異、ＤＮＡ結合ドメインの突然変異（塩基性ヘリックスループヘリックスの突然変異する塩基性残基など）、内因性ＮＬＳの突然変異又は内因性ＮＥＳの突然変異のうちの１つ以上であってもよい。本発明は、誘導物質エネルギー源が熱、超音波、電磁エネルギー又は化学物質であり得ることを包含する。本発明の好ましい実施形態において、誘導物質エネルギー源は、抗生物質、小分子、ホルモン、ホルモン誘導体、ステロイド又はステロイド誘導体であってもよい。より好ましい実施形態において、誘導物質エネルギー源は、アブシジン酸（ＡＢＡ）、ドキシサイクリン（ＤＯＸ）、クマート、ラパマイシン、４−ヒドロキシタモキシフェン（４ＯＨＴ）、エストロゲン又はエクジソンであってもよい。本発明は、少なくとも１つのスイッチが、抗生物質ベースの誘導性系、電磁エネルギーベースの誘導性系、小分子ベースの誘導性系、核内受容体ベースの誘導性系及びホルモンベースの誘導性系からなる群から選択され得ることを提供する。より好ましい実施形態において、少なくとも１つのスイッチは、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）／ＤＯＸ誘導性系、光誘導性系、ＡＢＡ誘導性系、クマートリプレッサー／オペレーター系、４ＯＨＴ／エストロゲン誘導性系、エクジソンベースの誘導性系及びＦＫＢＰ１２／ＦＲＡＰ（ＦＫＢＰ１２−ラパマイシン複合体）誘導性系からなる群から選択されてもよい。
【０４１７】
本願に詳述されるとおりの制御の態様は、少なくとも１つ以上のスイッチに関する。用語「スイッチ」は、本明細書で使用されるとき、生物学的機能のあらゆる側面（当該機能の活性化、抑制、増強又は終結など）を含め、変化に影響を及ぼすように協調的に働く系又は一組の構成成分を指す。一態様において、用語のスイッチは、遺伝子調節タンパク質の基本的構成成分と、これらのタンパク質が認識する特異的ＤＮＡ配列とを含む遺伝的スイッチを包含する。一態様において、スイッチは、遺伝子調節において用いられる誘導性系及び抑制性系に関する。一般に、誘導性系は、遺伝子発現を可能にする何らかの分子（誘導物質と呼ばれる）の存在がない限り、オフであり得る。この分子は、「発現を誘導する」と言われる。これを起こさせる方法は、制御機構並びに細胞型の違いに依存する。抑制性系は、遺伝子発現を抑制する何らかの分子（コリプレッサーと呼ばれる）の存在下以外ではオンである。この分子は、「発現を抑制する」と言われる。これを起こさせる方法は、制御機構並びに細胞型の違いに依存する。用語「誘導性」は、本明細書で使用されるとき、関与する分子機構に関係なくスイッチのあらゆる態様を包含し得る。従って、本発明に包含されるとおりのスイッチには、限定はされないが、抗生物質ベースの誘導性系、電磁エネルギーベースの誘導性系、小分子ベースの誘導性系、核内受容体ベースの誘導性系及びホルモンベースの誘導性系が含まれ得る。好ましい実施形態において、スイッチは、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）／ＤＯＸ誘導性系、光誘導性系、アブシジン酸（ＡＢＡ）誘導性系、クマートリプレッサー／オペレーター系、４ＯＨＴ／エストロゲン誘導性系、エクジソン−ベースの誘導性系又はＦＫＢＰ１２／ＦＲＡＰ（ＦＫＢＰ１２−ラパマイシン複合体）誘導性系であってもよい。
【０４１８】
本Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、個々の内因性遺伝子の発現を時間的及び空間的に正確に調節し又は変化させるように設計され得る。Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、目的の遺伝子のプロモーター配列に結合して遺伝子発現を変更するように設計され得る。Ｃｐｆ１は２つに分割されてもよく、ここでは一方の半体がクリプトクロムヘテロ二量体（クリプトクロム−２又はＣＩＢ１）の一方の半体に融合し、一方で残りのクリプトクロムパートナーがＣｐｆ１の他方の半体に融合する。一部の態様において、転写エフェクタードメインもまた、Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に含まれ得る。エフェクタードメインは、ＶＰ１６、ＶＰ６４、若しくはｐ６５などのアクチベーター、又はＫＲＡＢ、ＥｎＲ、若しくはＳＩＤなどのリプレッサーのいずれかであり得る。刺激されていない状態では、一方の半体のＣｐｆ１−クリプトクロム２タンパク質は目的の遺伝子のプロモーターに局在し、しかしＣＩＢ１−エフェクタータンパク質に結合はしない。青色スペクトル光で刺激すると、クリプトクロム−２が活性化してコンホメーション変化を起こし、その結合ドメインが露出する。ひいてはＣＩＢ１がクリプトクロム−２に結合し、目的の遺伝子のプロモーター領域へのＣｐｆ１の第２の半体の局在化がもたらされ、ゲノム編集が開始され、それにより遺伝子の過剰発現又はサイレンシングが生じ得る。ＬＩＴＥの態様については、Ｌｉｕ，Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００８  ａｎｄ  Ｋｅｎｎｅｄｙ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１０（この内容は本明細書において全体として参照により援用される）に更に記載されている。
【０４１９】
機能を更に調節し得るアクチベーター及びリプレッサードメインが、種、強度、機構、持続期間、サイズ、又はあらゆる他のパラメータに基づき選択されてもよい。好ましいエフェクタードメインとしては、限定はされないが、トランスポザーゼドメイン、インテグラーゼドメイン、リコンビナーゼドメイン、リゾルバーゼドメイン、インベルターゼドメイン、プロテアーゼドメイン、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメイン、ＤＮＡデメチラーゼドメイン、ヒストンアセチラーゼドメイン、ヒストンデアセチラーゼドメイン、ヌクレアーゼドメイン、リプレッサードメイン、アクチベータードメイン、核局在化シグナルドメイン、転写−タンパク質リクルートドメイン、細胞取込み活性関連ドメイン、核酸結合ドメイン又は抗体提示ドメインが挙げられる。
【０４２０】
更に化学物質誘導性系を作成する幾つかの異なる方法がある：１．アブシジン酸（ＡＢＡ）によって誘導可能なＡＢＩ−ＰＹＬベースの系（例えば、ｓｔｋｅ．ｓｃｉｅｎｃｅｍａｇ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ａｂｓｔｒａｃｔ／ｓｉｇｔｒａｎｓ；４／１６４／ｒｓ２のウェブサイトを参照）、２．ラパマイシン（又はラパマイシンをベースとする関連する化学物質）によって誘導可能なＦＫＢＰ−ＦＲＢベースの系（例えば、ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｎｍｅｔｈ／ｊｏｕｒｎａｌ／ｖ２／ｎ６／ｆｕｌｌ／ｎｍｅｔｈ７６３．ｈｔｍｌのウェブサイトを参照）、３．ジベレリン（ＧＡ）によって誘導可能なＧＩＤ１−ＧＡＩベースの系（例えば、ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｎｃｈｅｍｂｉｏ／ｊｏｕｒｎａｌ／ｖ８／ｎ５／ｆｕｌｌ／ｎｃｈｅｍｂｉｏ．９２２．ｈｔｍｌのウェブサイトを参照）。
【０４２１】
本発明により企図される別の系は、細胞内局在の変化に基づく化学物質誘導性系である。本出願人らはまた、目的のゲノム遺伝子座を標的化するようにエンジニアリングされた誘導性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系も包含し、ここでＣｐｆ１酵素は、化学物質又はエネルギー感受性タンパク質の異なるパートに更に連結される２つの融合構築物に分割される。化学物質又はエネルギー感受性タンパク質に化学物質が結合し又はエネルギーが伝達されると、この化学物質又はエネルギー感受性タンパク質がＣｐｆ１酵素のいずれか一方の半体の細胞内局在を変化させる（即ちＣｐｆ１酵素のいずれか一方の半体が細胞の細胞質から核に輸送される）ことになる。融合構築物が、再構成されたＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に対する基質がないためその活性が封鎖されている一つの細胞内コンパートメント又は細胞小器官から、基質が存在する別のところへとこのように輸送されると、構成成分が一緒になって機能的活性を再構成し、次にその所望の基質（即ち哺乳類核内のゲノムＤＮＡ）に接触して標的遺伝子発現の活性化又は抑制をもたらすことが可能になる。
【０４２２】
他の誘導性系、限定はされないが、重金属による調節［Ｍａｙｏ  ＫＥ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １９８２，２９：９９−１０８；Ｓｅａｒｌｅ  ＰＦ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９８５，５：１４８０−１４８９及びＢｒｉｎｓｔｅｒ  ＲＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）１９８２，２９６：３９−４２］、ステロイドホルモン［Ｈｙｎｅｓ  ＮＥ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８１，７８：２０３８−２０４２；Ｋｌｏｃｋ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）１９８７，３２９：７３４−７３６及びＬｅｅ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）１９８１，２９４：２２８−２３２．］、熱ショック［Ｎｏｕｅｒ  Ｌ：Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ：ＣＲＣ；１９９１］などが企図され、及び他の試薬が開発されている［Ｍｕｌｌｉｃｋ  Ａ，Ｍａｓｓｉｅ  Ｂ：Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｉｎ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ：Ｓｐｅｉｒ  ＲＥ．Ｗｉｌｅｙ；２０００：１１４０−１１６４及びＦｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ  Ｍ，．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ  ２００１，１７：１−５１］。しかしながら、これらの誘導性哺乳類プロモーターには、「オフ」状態の「漏れ易さ」及び誘導物質（熱ショック、重金属、グルココルチコイド等）の多面発現効果など、制限がある。哺乳類細胞における細胞過程への妨害を減らすため、昆虫ホルモン（エクジソン）の使用が提案されている［Ｎｏ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９６，９３：３３４６−３３５１］。別のエレガントな系は誘導物質としてラパマイシンを使用し［Ｒｉｖｅｒａ  ＶＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １９９６、２：１０２８−１０３２］、しかし免疫抑制薬としてのラパマイシンの役割はそのインビボ使用の主要な制約であったため、従って遺伝子発現の制御のため、生物学的に不活性な化合物を見付ける必要があった［Ｓａｅｚ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２０００，９７：１４５１２−１４５１７］。
【０４２３】
詳細な実施形態では、本明細書に記載される遺伝子編集システムは、細胞の条件が変化したときに宿主細胞を効率的に死滅させる機構であるパスコード（ｐａｓｓｃｏｄｅ）キルスイッチの制御下に置かれる。これはハイブリッドＬａｃＩ−ＧａｌＲファミリー転写因子を導入することにより確実となり、この転写因子は、オンへの切り換えに、細胞生存に重要な酵素をコードする遺伝子のドライブに用いることのできるＩＰＴＧが必要である（Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１５  Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｈｅｍｂｉｏ．１９７９）。異なる化学物質に感受性を有する異なる転写因子を組み合わせることにより、「コード」が生成され得る。このシステムを用いてＣＲＩＳＰＲ誘導遺伝子改変の程度を空間的及び時間的に制御することができ、これは、治療適用を含めた種々の分野で有益であり得るとともに、その意図された環境からのＧＭＯの「エスケープ」を回避するのにもまた有益であり得る。
【０４２４】
自己不活性化システム
細胞内のゲノムにおける遺伝子の全てのコピーが編集された後は、それ以上当該細胞においてＣＲＩＳＲＰ／Ｃｐｆ１発現が続行する必要はない。実際、発現が持続すれば、意図しないゲノム部位でオフターゲット効果が起こる場合等、望ましくないこともある。従って時限的発現が有用となり得る。誘導性発現は一つの手法を提供するが、更に本出願人らは、ＣＲＩＳＰＲベクターそれ自体の中の非コードガイド標的配列の使用に頼る自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系を想定する。従って、発現開始後、ＣＲＩＳＰＲ系はそれ自体の破壊をもたらし得るが、しかし破壊が完了する前に、標的遺伝子のゲノムコピーを編集する時間があり得る（二倍体細胞における通常の点突然変異では、これに必要となるのは高々２つの編集である）。単純に、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、ＣＲＩＳＰＲ酵素それ自体のコード配列を標的化するか、又は以下の１つ以上に存在するユニーク配列に相補的な１つ以上の非コードガイド標的配列を標的化する追加的なＲＮＡ（即ち、ガイドＲＮＡ）を含む：
（ａ）非コードＲＮＡエレメントの発現を駆動するプロモーター内、
（ｂ）Ｃｐｆ１遺伝子の発現を駆動するプロモーター内、
（ｃ）Ｃｐｆ１コード配列におけるＡＴＧ翻訳開始コドンから１００ｂｐ以内、
（ｄ）例えばＡＡＶゲノムにおける、ウイルス送達ベクターの逆方向末端反復配列（ｉＴＲ）内。
【０４２５】
更に、当該のＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ複合体をコードするベクター、例えば別個のベクター又は同じベクターで送達することができる。別個のベクターにより提供される場合、Ｃｐｆ１発現を標的とするＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡは、逐次的に又は同時に投与することができる。逐次的に投与される場合、Ｃｐｆ１発現を標的化するＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡは、例えば遺伝子編集又は遺伝子エンジニアリングが意図されるＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡの後に送達されるべきである。この期間は数分の期間であってもよい（例えば、５分、１０分、２０分、３０分、４５分、６０分）。この期間は数時間の期間であってもよい（例えば、２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、２４時間）。この期間は数日の期間であってもよい（例えば、２日、３日、４日、７日）。この期間は数週の期間であってもよい（例えば、２週間、３週間、４週間）。この期間は数ヵ月の期間であってもよい（例えば、２ヵ月、４ヵ月、８ヵ月、１２ヵ月）。この期間は数年の期間であってもよい（２年、３年、４年）。このようにして、Ｃａｓ酵素は、１つ又は複数の目的のゲノム遺伝子座などの第１の標的にハイブリダイズ可能な第１のｇＲＮＡと会合し、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の所望の１つ又は複数の機能（例えば遺伝子エンジニアリング）を受け持ち；及び続いてＣｐｆ１酵素は、次にＣｐｆ１又はＣＲＩＳＰＲカセットの少なくとも一部を含む配列にハイブリダイズ可能な第２のｇＲＮＡと会合し得る。Ｃｐｆ１タンパク質の発現をコードする配列がｇＲＮＡの標的である場合、酵素は妨げられ、系が自己不活性化する。同じように、本明細書に説明されるとおり、例えば、リポソーム、リポフェクション、ナノ粒子、微小胞を介して適用されるＣｐｆ１発現を標的とするＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡが、逐次的又は同時に投与されてもよい。同様に、１つ以上の標的を標的化するために用いられる１つ以上のガイドＲＮＡの不活性化に自己不活性化が用いられ得る。
【０４２６】
一部の態様において、ＣＲＩＳＰＲ酵素開始コドンの下流の配列にハイブリダイゼーション可能なシングルｇＲＮＡが提供され、それによって幾らかの時間の後、ＣＲＩＳＰＲ酵素発現が失われる。一部の態様において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系をコードするポリヌクレオチドの１つ以上のコード又は非コード領域にハイブリダイゼーション可能な１つ以上のｇＲＮＡが提供され、それによって幾らかの時間の後、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の１つ以上、又は場合によっては全てが不活性化する。この系の一部の態様において、及び理論によって制限されることなく、細胞は複数のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体を含むことができ、ここでＣＲＩＳＰＲ複合体の第１のサブセットが、編集しようとする１つ又は複数のゲノム遺伝子座を標的化可能な第１のｇＲＮＡを含み、及びＣＲＩＳＰＲ複合体の第２のサブセットが、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系をコードするポリヌクレオチドを標的化可能な少なくとも１つの第２のｇＲＮＡを含み、ここでＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体の第１のサブセットが１つ又は複数の標的ゲノム遺伝子座の編集を媒介し、及びＣＲＩＳＰＲ複合体の第２のサブセットが最終的にＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を不活性化し、それにより細胞における更なるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ発現が不活性化される。
【０４２７】
従って本発明は、真核細胞に送達するための１つ以上のベクターを含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供し、ここで１つ又は複数のベクターは、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ酵素、より詳細にはＣｐｆ１；（ｉｉ）細胞内の標的配列にハイブリダイズ可能な第１のガイドＲＮＡ；及び（ｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするベクター内の１つ以上の標的配列にハイブリダイズ可能な第２のガイドＲＮＡをコードする。第１のガイドＲＮＡは、細胞内で発現すると、細胞内の標的配列への第１のＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導き；第２のガイドＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするベクター内の標的配列への第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導き；ＣＲＩＳＰＲ複合体はガイドＲＮＡに結合したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、それによってガイドＲＮＡはその標的配列とハイブリダイズすることができ；及び第２のＣＲＩＳＰＲ複合体はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を不活性化して、細胞によるＣＲＩＳＰＲ酵素の発現の継続を妨げる。
【０４２８】
１つ又は複数のベクター、コードされる酵素、ガイド配列等の更なる特徴については、本明細書の他の部分に開示される。本系は、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ酵素、より詳細にはＣｐｆ１；（ｉｉ）細胞内の第１の標的配列にハイブリダイズ可能な配列を含む第１のｇＲＮＡ、（ｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするベクターにハイブリダイズ可能な第２のガイドＲＮＡをコードすることができる。同様に、酵素は１つ以上のＮＬＳ等を含むことができる。
【０４２９】
様々なコード配列（ＣＲＩＳＰＲ酵素、ガイドＲＮＡ）が単一のベクターに含まれてもよく、又は複数のベクターに含まれてもよい。例えば、あるベクター上の酵素及び別のベクター上の様々なＲＮＡ配列をコードすること、又はあるベクター上の酵素及び１つのｇＲＮＡ、及び別のベクター上の残りのｇＲＮＡをコードすること、又は任意の他の並べ替えが可能である。一般に、合計１つ又は２つの異なるベクターを使用する系が好ましい。
【０４３０】
複数のベクターを使用する場合、それらを不均衡な数で、及び理想的には、第２のガイドＲＮＡと比べて第１のガイドＲＮＡをコードするベクターを過剰として送達することが可能であり、それによりゲノム編集が起こる機会が得られるまでＣＲＩＳＰＲ系の最終的な不活性化を遅らせる助けとなる。
【０４３１】
第１のガイドＲＮＡは、本明細書の他の部分に記載されるとおり、ゲノム内の任意の目的の標的配列を標的化することができる。第２のガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９酵素をコードするベクター内の配列を標的化し、それにより当該のベクターからの酵素の発現を不活性化する。従ってベクター内の標的配列は発現を不活性化可能でなければならない。好適な標的配列は、例えば、Ｃｐｆ１コード配列の翻訳開始コドンの近傍又はその範囲内、非コード配列内、非コードＲＮＡエレメントの発現をドライブするプロモーター内、Ｃｐｆ１遺伝子の発現をドライブするプロモーターの範囲内、Ｃｐｆ１コード配列におけるＡＴＧ翻訳開始コドンから１００ｂｐ以内、及び／又は例えばＡＡＶゲノムにおける、ウイルス送達ベクターの逆方向末端反復配列（ｉＴＲ）の範囲内にあり得る。この領域近傍での二本鎖切断はＣｐｆ１コード配列のフレームシフトを引き起こし得るため、タンパク質発現の喪失が生じ得る。「自己不活性化」ガイドＲＮＡの代替的な標的配列は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の発現又はベクターの安定性に必要な調節領域／配列を編集し／不活性化することを目的としたものであり得る。例えば、Ｃｐｆ１コード配列のプロモーターが破壊された場合、転写が阻害又は防止され得る。同様に、ベクターが複製、維持又は安定性用の配列を含む場合、それらを標的化することが可能である。例えば、ＡＡＶベクターにおいて有用な標的配列はｉＴＲ内にある。標的化に有用な他の配列は、プロモーター配列、ポリアデニル化部位（ｐｏｌｙａｄｅｎｌｙａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ）等であり得る。
【０４３２】
更に、ガイドＲＮＡがアレイフォーマットで発現する場合、両方のプロモーターを同時に標的化する「自己不活性化」ガイドＲＮＡにより、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ発現構築物内から介在するヌクレオチドが切り出されることになり、事実上その完全な不活性化につながる。同様に、ガイドＲＮＡが両方のＩＴＲを標的化する場合に、又は２つ以上の他のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ構成成分を同時に標的化する場合に、介在ヌクレオチドが切り出され得る。本明細書に説明されるとおりの自己不活性化は、一般に、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１の調節をもたらすためＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系と共に適用可能である。例えば、本明細書に説明されるとおりの自己不活性化を、本明細書に説明されるとおりの突然変異、例えば増大障害のＣＲＩＳＰＲ修復に適用してもよい。この自己不活性化の結果として、ＣＲＩＳＰＲ修復の活性はあくまでも一過性である。
【０４３３】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１が停止する前に標的ゲノム遺伝子座が編集されることを確実にする手段として、「自己不活性化」ガイドＲＮＡの５’末端（例えば１〜１０ヌクレオチド、好ましくは１〜５ヌクレオチド）への非ターゲティングヌクレオチドの付加を用いてそのプロセシングを遅らせ、及び／又はその効率を改変することができる。
【０４３４】
自己不活性化ＡＡＶ−ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の一態様において、１つ以上の目的のｇＲＮＡターゲティングゲノム配列（例えば１〜２、１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜３０個）を共発現するプラスミドが、エンジニアリングされたＡＴＧ開始部位又はその近傍（例えば５ヌクレオチド以内、１５ヌクレオチド以内、３０ヌクレオチド以内、５０ヌクレオチド以内、１００ヌクレオチド以内）でＬｂＣｐｆ１配列を標的化する「自己不活性化」ｇＲＮＡを含んで作製され得る。Ｕ６プロモーター領域における調節配列もまた、ｇＲＮＡで標的化することができる。Ｕ６ドライブ型ｇＲＮＡは、複数のｇＲＮＡ配列を同時にリリースすることができるようなアレイフォーマットで設計し得る。初めに標的組織／細胞へと送達されると（細胞を離れた）ｇＲＮＡが蓄積し始める一方、核内のＣｐｆ１レベルが上昇する。Ｃｐｆ１は全てのｇＲＮＡと複合体を形成してＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１プラスミドのゲノム編集及び自己不活性化を媒介する。
【０４３５】
自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の一態様は、単独での、又は１〜４個まで又はそれより多い異なるガイド配列；例えば約２０又は約３０個までのガイド配列のタンデム（ｔａｎｄａｍ）アレイフォーマットでの発現である。個別の自己不活性化ガイド配列毎に異なる標的を標的化し得る。これは、例えば１つのキメラｐｏｌ３転写物からプロセシングされ得る。Ｕ６又はＨ１プロモーターなどのＰｏｌ３プロモーターが用いられ得る。本明細書において全体を通して言及されるものなどのＰｏｌ２プロモーター。逆方向末端反復（ｉＴＲ）配列がＰｏｌ３プロモーター−１つ又は複数のｇＲＮＡ−Ｐｏｌ２プロモーター−Ｃｐｆ１に隣接し得る。
【０４３６】
キメラのタンデムアレイ転写物の一態様は、１つ以上のガイドが１つ以上の標的を編集する一方で１つ以上の自己不活性化ガイドがＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系を不活性化するというものである。従って、例えば、増大障害を修復するための記載されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系を本明細書に記載される自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系と直接組み合わせてもよい。かかる系は、例えば、修復のための標的領域に向けられた２つのガイド並びにＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１の自己不活性化に向けられた少なくとも第３のガイドを有し得る。国際公開第２０１５／０８９３５１号パンフレットとして２０１４年１２月１２日に公開された「ヌクレオチドリピート障害におけるＣｒｉｓｐｒ−Ｃａｓ系の組成物及び使用方法（Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  Ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｏｆ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｃｒｉｓｐｒ−Ｃａｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）」と題される出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６９８９７号明細書が参照される。
【０４３７】
Ｃｐｆ１による標的遺伝子座の遺伝子編集又は変化
二本鎖切断点又は鎖のうちの一方における一本鎖切断点は、有利には、修正が起こるように標的位置に十分に近くなければならない。ある実施形態において、その距離は５０、１００、２００、３００、３５０又は４００ヌクレオチド以下である。理論によって拘束されることを望むものではないが、切断点が標的位置に十分に近く、末端リセクションの間にエキソヌクレアーゼの媒介による除去を受ける領域内に切断点がなければならないと考えられる。鋳型核酸配列は末端リセクション領域内の配列の修正にのみ用いられ得るため、標的位置と切断点との間の距離が大き過ぎる場合、末端リセクションに突然変異が含まれないことになり得るとともに、ひいては修正されないことになり得る。
【０４３８】
ＨＤＲ媒介修正の誘導を目的としてガイドＲＮＡ及びＶ型／ＶＩ型分子、詳細にはＣｐｆ１／Ｃ２ｃ１／Ｃ２ｃ２又はそのオルソログ若しくはホモログ、好ましくはＣｐｆ１ヌクレアーゼが二本鎖切断を誘導する実施形態において、切断部位は０〜２００ｂｐ（例えば、０〜１７５、０〜１５０、０〜１２５、０〜１００、０〜７５、０〜５０、０〜２５、２５〜２００、２５〜１７５、２５〜１５０、２５〜１２５、２５〜１００、２５〜７５、２５〜５０、５０〜２００、５０〜１７５、５０〜１５０、５０〜１２５、５０〜１００、５０〜７５、７５〜２００、７５〜１７５、７５〜１５０、７５〜１２５、７５〜１００ｂｐ）だけ標的位置から離れている。ある実施形態において、切断部位は、０〜１００ｂｐ（例えば、０〜７５、０〜５０、０〜２５、２５〜１００、２５〜７５、２５〜５０、５０〜１００、５０〜７５又は７５〜１００ｂｐ）だけ標的位置から離れている。更なる実施形態では、ＨＤＲ媒介修正を誘導するため、Ｃｐｆ１又はそのオルソログ若しくはホモログと複合体を形成した２つ以上のガイドＲＮＡを使用して多重化切断を誘導し得る。
【０４３９】
相同性アームは、例えば、リセクトされた一本鎖オーバーハングがドナー鋳型内の相補領域を見付けることが可能になるように、少なくとも末端リセクションが起こり得る領域の範囲までは延在していなければならない。全長は、プラスミドサイズ又はウイルスパッケージング制限などのパラメータによって制限されることになり得る。ある実施形態において、相同性アームは反復エレメント内までは延在しなくてもよい。例示的相同性アーム長さとしては、少なくとも５０、１００、２５０、５００、７５０又は１０００ヌクレオチドが挙げられる。
【０４４０】
標的位置は、本明細書で使用されるとき、Ｖ型／ＶＩ型、詳細にはＣｐｆ１／Ｃ２ｃ１／Ｃ２ｃ２又はそのオルソログ若しくはホモログ、好ましくはＣｐｆ１分子依存性過程によって改変される標的核酸又は標的遺伝子（例えば染色体）上にある部位を指す。例えば、標的位置は、標的核酸の改変Ｃｐｆ１分子切断及び鋳型核酸の誘導による標的位置の改変、例えば修正であり得る。ある実施形態において、標的位置は、１つ以上のヌクレオチドが加えられる標的核酸上の２つのヌクレオチド間、例えば隣接するヌクレオチド間の部位であり得る。標的位置は、鋳型核酸によって変化する、例えば修正される１つ以上のヌクレオチドを含み得る。ある実施形態において、標的位置は標的配列（例えば、ガイドＲＮＡが結合する配列）の範囲内にある。ある実施形態において、標的位置は標的配列（例えば、ガイドＲＮＡが結合する配列）の上流又は下流にある。
【０４４１】
鋳型核酸は、この用語が本明細書で使用されるとき、標的位置の構造を変化させるためにＶ型／ＶＩ型分子、詳細にはＣｐｆ１／Ｃ２ｃ１／Ｃ２ｃ２又はそのオルソログ若しくはホモログ、好ましくはＣｐｆ１分子及びガイドＲＮＡ分子と併せて用いることのできる核酸配列を指す。ある実施形態において、標的核酸は、典型的には１つ又は複数の切断部位又はその近傍に鋳型核酸の配列の一部又は全てを有するように改変される。ある実施形態において、鋳型核酸は一本鎖である。代替的実施形態において、鋳型核酸（ｎｕｃｅｉｃ  ａｃｉｄ）は二本鎖である。ある実施形態において、鋳型核酸はＤＮＡ、例えば二本鎖ＤＮＡである。代替的実施形態において、鋳型核酸は一本鎖ＤＮＡである。
【０４４２】
ある実施形態において、鋳型核酸は、相同組換えに関与することによって標的位置の構造を変化させる。ある実施形態において、鋳型核酸は標的位置の配列を変化させる。ある実施形態において、鋳型核酸は、標的核酸への改変された又は天然に存在しない塩基の取込みをもたらす。
【０４４３】
鋳型配列は、切断の媒介又は触媒による標的配列との組換えを起こし得る。ある実施形態において、鋳型核酸は、Ｃｐｆ１媒介性切断イベントによって切断される標的配列上の部位に対応する配列を含み得る。ある実施形態において、鋳型核酸は、第１のＣｐｆ１媒介性イベントで切断される標的配列上の第１の部位、及び第２のＣｐｆ１媒介性イベントで切断される標的配列上の第２の部位の両方に対応する配列を含み得る。
【０４４４】
特定の実施形態において、鋳型核酸は、翻訳される配列のコード配列に変化をもたらす配列、例えば、タンパク質産物中のあるアミノ酸の別のアミノ酸との置換、例えば、野生型対立遺伝子への突然変異対立遺伝子の形質転換、突然変異対立遺伝子への野生型対立遺伝子の形質転換、及び／又は終止コドンの導入、アミノ酸残基の挿入、アミノ酸残基の欠失、又はナンセンス突然変異をもたらすものを含むことができる。特定の実施形態において、鋳型核酸は、非コード配列の変化、例えば、エクソン又は５’若しくは３’非翻訳若しくは非転写領域の変化をもたらす配列を含むことができる。かかる変化には、制御エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサーの変化、及びシス作用性又はトランス作用性制御エレメントの変化が含まれる。
【０４４５】
標的遺伝子の標的位置と相同性を有する鋳型核酸を使用して標的配列の構造を変化させてもよい。鋳型配列は、望ましくない構造、例えば望ましくない又は突然変異のヌクレオチドを変化させるために用いられ得る。鋳型核酸は、組み込まれると、陽性対照エレメントの活性の減少；陽性対照エレメントの活性の増加；陰性対照エレメントの活性の減少；陰性対照エレメントの活性の増加；遺伝子の発現の減少；遺伝子の発現の増加；障害又は疾患に対する抵抗性の増加；ウイルス侵入に対する抵抗性の増加；突然変異の修正又は望ましくないアミノ酸残基の変化、遺伝子産物の生物学的特性の付与、増加、消失若しくは減少、例えば酵素の酵素活性の増加、又は遺伝子産物が別の分子との相互作用する能力の増加をもたらす配列を含み得る。
【０４４６】
鋳型核酸は、標的配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヌクレオチド又はそれ以上の配列の変更をもたらす配列を含み得る。ある実施形態において、鋳型核酸は、２０±１０、３０±１０、４０±１０、５０±１０、６０±１０、７０±１０、８０±１０、９０±１０、１００±１０、１１０±１０、１２０±１０、１３０±１０、１４０±１０、１５０±１０、１６０±１０、１７０±１０、１８０±１０、１９０±１０、２００±１０、２１０±１０、又は２２０±１０ヌクレオチド長であってもよい。ある実施形態において、鋳型核酸は、３０±２０、４０±２０、５０±２０、６０±２０、７０±２０、８０±２０、９０±２０、１００±２０、１１０±２０、１２０±２０、１３０±２０、１４０±２０、１５０±２０、１６０±２０、１７０±２０、１８０±２０、１９０±２０、２００±２０、２１０±２０、又は２２０±２０ヌクレオチド長であってもよい。ある実施形態において、鋳型核酸は、１０〜１，０００、２０〜９００、３０〜８００、４０〜７００、５０〜６００、５０〜５００、５０〜４００、５０〜３００、５０〜２００、又は５０〜１００ヌクレオチド長である。
【０４４７】
鋳型核酸は以下の構成成分を含む：［５’相同性アーム］−［置換配列］−［３’相同性アーム］。相同性アームが染色体への組換え、従って望ましくないエレメント、例えば突然変異又はシグネチャの置換配列による置換をもたらす。ある実施形態において、相同性アームは最も遠位の切断部位に隣接する。ある実施形態において、５’相同性アームの３’末端は置換配列の５’末端の隣の位置である。ある実施形態において、５’相同性アームは、置換配列の５’末端から５’側に少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、又は２０００ヌクレオチド延在し得る。ある実施形態において、３’相同性アームの５’末端は置換配列の３’末端の隣の位置である。ある実施形態において、３’相同性アームは、置換配列の３’末端から３’側に少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、又は２０００ヌクレオチド延在し得る。
【０４４８】
特定の実施形態において、ある種の配列リピートエレメントが含まれること回避するため、一方又は両方の相同性アームが短くされ得る。例えば、配列リピートエレメントを回避するため５’相同性アームが短くされてもよい。他の実施形態において、配列リピートエレメントを回避するため３’相同性アームが短くされてもよい。一部の実施形態において、ある種の配列リピートエレメントが含まれることを回避するため、５’及び３’相同性アームの両方が短くされてもよい。
【０４４９】
特定の実施形態において、突然変異を修正するための鋳型核酸は、一本鎖オリゴヌクレオチドとして用いられるように設計され得る。一本鎖オリゴヌクレオチドを用いるとき、５’及び３’相同性アームは約２００塩基対（ｂｐ）長、例えば、少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、又は２００ｂｐ長にまで及ぶ範囲であり得る。
【０４５０】
Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質複合体系が非相同末端結合を促進した
特定の実施形態では、ヌクレアーゼ誘導性非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を用いて遺伝子特異的ノックアウトを標的化することができる。ヌクレアーゼ誘導性ＮＨＥＪはまた、目的の遺伝子内の配列の除去（例えば欠失）にも用いることができる。概して、ＮＨＥＪは、ＤＮＡ内の二本鎖切断をその両端を一体につなぎ合わせることによって修復する；しかしながら、概して、元の配列が復元されるのは、それらが二本鎖切断によって形成された当初と厳密に同じとおりの２つの適合末端が完全にライゲートされた場合に限られる。二本鎖切断点のＤＮＡ末端は多くの場合に酵素的プロセシングを受けるため、それらの末端がつなぎ直される前に、一方又は両方の鎖にヌクレオチドの付加又は除去が生じる。これにより、ＮＨＥＪ修復部位のＤＮＡ配列に挿入及び／又は欠失（インデル）突然変異が存在することになる。これらの突然変異の３分の２が、典型的にはリーディングフレームを変化させ、ひいては非機能性タンパク質を作り出す。加えて、リーディングフレームを維持しているものの、多くの配列を挿入し又は欠失させる突然変異は、タンパク質の機能性を破壊し得る。重要な機能ドメインにおける突然変異は、タンパク質の重要でない領域における突然変異よりも許容性が低いと見込まれるため、これは遺伝子座依存的である。ＮＨＥＪによって生成されるインデル突然変異は本質的に予測不可能である；しかしながら、恐らくは小さいマイクロホモロジー領域に起因して、所与の切断部位で特定のインデル配列が選好され、集団内で大きな比率を占める。欠失の長さは大きく異なり得る；最も一般的には１〜５０ｂｐの範囲内であるが、優に５０ｂｐを超えることもあり、例えば、優に約１００〜２００ｂｐを超えるまでに至ることもある。挿入はより短い傾向があり、切断部位を直接取り囲む配列の短い重複を含むことが多い。しかしながら、大きい挿入を得ることが可能であり、その場合、挿入された配列は、ゲノムの他の領域又は細胞内に存在するプラスミドＤＮＡにまで到達していることが多い。
【０４５１】
ＮＨＥＪは変異原性過程であるため、特定の最終的な配列の生成が必要でない限り、小さい配列モチーフの欠失にもまた用い得る。二本鎖切断が短い標的配列の近傍を標的とする場合、ＮＨＥＪ修復によって生じる欠失突然変異は多くの場合に望ましくないヌクレオチドにかかり、従ってそれを除去する。より大型のＤＮＡセグメントの欠失には、その配列の各側に１つずつ、２つの二本鎖切断を導入すると、それらの末端間でＮＨＥＪが起こり、介在配列全体が除去され得る。これらの手法は両方ともに、特定のＤＮＡ配列の欠失に用いることができる；しかしながら、ＮＨＥＪのエラープローンの性質はなおも、修復部位にインデル突然変異を作り出し得る。
【０４５２】
二本鎖を切断するＶ型／ＶＩ型分子、詳細にはＣｐｆ１／Ｃ２ｃ１／Ｃ２ｃ２又はそのオルソログ若しくはホモログ、好ましくはＣｐｆ１分子及び一本鎖、又はニッカーゼ、Ｖ型／ＶＩ型分子、詳細には、Ｃｐｆ１／Ｃ２ｃ１／Ｃ２ｃ２又はそのオルソログ若しくはホモログ、好ましくはＣｐｆ１分子の両方が、本明細書に記載される方法及び組成物においてＮＨＥＪ媒介性インデルの生成に用いられ得る。遺伝子、例えば目的の遺伝子のコード領域、例えば初期コード領域を標的とするＮＨＥＪ媒介性インデルは、目的の遺伝子をノックアウトする（即ち、その発現を消失させる）ために用いることができる。例えば、目的の遺伝子の初期コード領域は、転写開始部位の直後の配列、コード配列の第１のエクソン内の配列、又は転写開始部位から５００ｂｐ以内（例えば、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００又は５０ｂｐ未満）の配列を含む。
【０４５３】
ガイドＲＮＡ及びＶ型／ＶＩ型分子、詳細にはＣｐｆ１／Ｃ２ｃ１／Ｃ２ｃ２又はそのオルソログ若しくはホモログ、好ましくはＣｐｆ１ヌクレアーゼが、ＮＨＥＪ媒介性インデルを誘導するため二本鎖切断を生成するある実施形態において、ガイドＲＮＡは、標的位置のヌクレオチドにごく近接して１つの二本鎖切断を位置させるように構成され得る。ある実施形態において、切断部位は、標的位置から０〜５００ｂｐ（例えば、標的位置から５００、４００、３００、２００、１００、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１ｂｐ未満）だけ離れていてもよい。
【０４５４】
Ｖ型／ＶＩ型分子、詳細にはＣｐｆ１／Ｃ２ｃ１／Ｃ２ｃ２又はそのオルソログ若しくはホモログ、好ましくはＣｐｆ１ニッカーゼと複合体を形成する２つのガイドＲＮＡが、ＮＨＥＪ媒介性インデルを誘導するため２つの一本鎖切断を誘導するある実施形態において、２つのガイドＲＮＡは、標的位置のヌクレオチドのＮＨＥＪ修復がもたらされるように２つの一本鎖切断を位置させるように構成され得る。
【０４５５】
Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質複合体は機能エフェクターを送達することができる
遺伝子をＤＮＡレベルで突然変異させることにより発現を永久的に消失させるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ媒介性遺伝子ノックアウトと異なり、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓノックダウンは人工転写因子を用いて遺伝子発現を一時的に低下させることが可能である。ＦｎＣｐｆ１タンパク質など、Ｃｐｆ１タンパク質の両方のＤＮＡ切断ドメインにある鍵となる残基を突然変異させると（例えばＦｎＣｐｆ１タンパク質のＤ９１７Ａ及びＨ１００６Ａ突然変異又はＡｓＣｐｆ１タンパク質によるＤ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ、Ｄ１２６３Ａ又はＬｂＣｐｆ１タンパク質によるＤ８３２Ａ、Ｅ９２５Ａ、Ｄ９４７Ａ又はＤ１１８０Ａ）、触媒的に不活性なＣｐｆ１が生成される。触媒的に不活性なＣｐｆ１はガイドＲＮＡと複合体を形成し、当該のガイドＲＮＡのターゲティングドメインによって特定されるＤＮＡ配列に局在化するが、しかしながら、これは標的ＤＮＡを切断しない。ＦｎＣｐｆ１タンパク質（例えばＤ９１７Ａ及びＨ１００６Ａ突然変異）など、不活性Ｃｐｆ１タンパク質をエフェクタードメイン、例えば転写抑制ドメインと融合させると、ガイドＲＮＡによって特定される任意のＤＮＡ部位へとそのエフェクターをリクルートすることが可能になる。特定の実施形態において、Ｃｐｆ１を転写抑制ドメインに融合させて遺伝子のプロモーター領域にリクルートしてもよい。特に遺伝子抑制について、本明細書では、内因性転写因子の結合部位を遮断すれば、遺伝子発現を下方制御する助けとなり得ることが企図される。別の実施形態において、不活性Ｃｐｆ１をクロマチン修飾タンパク質と融合させてもよい。クロマチン状態が変化すると、標的遺伝子の発現の低下が起こり得る。
【０４５６】
ある実施形態において、ガイドＲＮＡ分子は、既知の転写応答エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー等）、既知の上流活性化配列、及び／又は標的ＤＮＡの発現を制御可能であると疑われる未知又は既知の機能の配列を標的とすることができる。
【０４５７】
一部の方法において、標的ポリヌクレオチドを不活性化させることにより細胞に発現の改変を生じさせ得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体が細胞内の標的配列に結合すると、標的ポリヌクレオチドが不活性化され、そのためその配列が転写されないか、コードされたタンパク質が産生されないか、又は配列が野生型配列のようには機能しなくなる。例えば、タンパク質又はマイクロＲＮＡコード配列を不活性化してタンパク質が産生されないようにし得る。
【０４５８】
特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｄ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ及びＤ１２２５Ａからなる群から選択される１つ以上の突然変異を含み、及び／又は１つ以上の突然変異はＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣドメインにあるか、又は他に本明細書で考察するとおりの突然変異である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は触媒ドメインに１つ以上の突然変異を有し、ここで転写されると、ダイレクトリピート配列が単一のステムループを形成し、及びガイド配列が標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導き、及びここで酵素は機能ドメインを更に含む。一部の実施形態において、機能ドメインは転写活性化ドメイン、好ましくはＶＰ６４である。一部の実施形態において、機能ドメインは転写抑制ドメイン、好ましくはＫＲＡＢである。一部の実施形態において、転写抑制ドメインはＳＩＤ、又はＳＩＤのコンカテマー（例えばＳＩＤ４Ｘ）である。一部の実施形態において、機能ドメインは後成的に改変されるドメインであり、後成的に改変される酵素が提供される。一部の実施形態において、機能ドメインは活性化ドメインであり、これはＰ６５活性化ドメインであってもよい。
【０４５９】
Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質複合体又はその構成成分の送達
本開示及び当該技術分野における知識から、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系、特に本明細書に記載される新規ＣＲＩＳＰＲ系、又はその構成成分又はその核酸分子（例えばＨＤＲ鋳型を含む）又はその構成成分をコードし又は提供する核酸分子は、本明細書に概略的にも詳細にも記載される送達系によって送達し得る。
【０４６０】
ベクター送達、例えば、プラスミド、ウイルス送達：ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えばＣｐｆ１、及び／又は任意の本ＲＮＡ、例えば、ガイドＲＮＡは、任意の適切なベクター、例えば、プラスミド又はウイルスベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、アデノウイルス、又は他の種類のウイルスベクター、又はこれらの組み合わせを用いて送達することができる。Ｃｐｆ１及び１つ以上のガイドＲＮＡを１つ以上のベクター、例えばプラスミド又はウイルスベクターにパッケージングすることができる。一部の実施形態において、ベクター、例えばプラスミド又はウイルスベクターは、例えば筋肉注射によって目的の組織に送達されるが、一方で送達は、静脈内、経皮、鼻腔内、口腔、粘膜、又は他の送達方法によることもある。かかる送達は単回投与によっても、又は複数回投与によってもよい。当業者は、本明細書で送達される実際の投薬量が、ベクターの選択、標的細胞、生物、又は組織、治療する対象の全身状態、求められる形質転換／改変の程度、投与経路、投与様式、求められる形質転換／改変の種類など、種々の要因に応じて大きく異なり得ることを理解する。
【０４６１】
かかる用量は、例えば、担体（水、生理食塩水、エタノール、グリセロール、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油など）、希釈剤、薬学的に許容可能な担体（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、薬学的に許容可能な賦形剤、及び／又は当該技術分野で公知の他の化合物を更に含み得る。投薬量は、１つ以上の薬学的に許容可能な塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩；及び酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸塩を更に含み得る。加えて、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝物質、ゲル又はゲル化物質、香料、着色剤、ミクロスフェア、ポリマー、懸濁剤などの補助物質もまたこの中に存在し得る。加えて、１つ以上の他の従来の医薬成分、例えば、防腐剤、湿潤剤、懸濁剤、界面活性剤、酸化防止剤、固化防止剤、充填剤、キレート化剤、コーティング剤、化学安定剤などもまた、特に投薬形態が再構成可能な形態である場合に存在し得る。好適な例示的成分として、微結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリソルベート８０、フェニルエチルアルコール、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン類、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、パラクロロフェノール、ゼラチン、アルブミン、及びこれらの組み合わせが挙げられる。薬学的に許容可能な賦形剤の徹底的な考察は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１）（参照により本明細書に援用される）において利用可能である。
【０４６２】
本明細書のある実施形態において、送達はアデノウイルスを介し、これは、少なくとも１×１０５粒子（粒子単位、ｐｕとも称される）のアデノウイルスベクターを含有する単回ブースター用量であり得る。本明細書のある実施形態において、用量は好ましくは、少なくとも約１×１０６粒子（例えば、約１×１０６〜１×１０１２粒子）、より好ましくは少なくとも約１×１０７粒子、より好ましくは少なくとも約１×１０８粒子（例えば、約１×１０８〜１×１０１１粒子又は約１×１０８〜１×１０１２粒子）、及び最も好ましくは少なくとも約１×１００粒子（例えば、約１×１０９〜１×１０１０粒子又は約１×１０９〜１×１０１２粒子）、又は更には少なくとも約１×１０１０粒子（例えば、約１×１０１０〜１×１０１２粒子）のアデノウイルスベクターである。或いは、用量は、約１×１０１４粒子以下、好ましくは約１×１０１３粒子以下、更により好ましくは約１×１０１２粒子以下、更により好ましくは約１×１０１１粒子以下、及び最も好ましくは約１×１０１０粒子以下（例えば、約１×１０９粒子（ａｒｔｉｃｌｅｓ）以下）を含む。従って、用量は、例えば、約１×１０６粒子単位（ｐｕ）、約２×１０６ｐｕ、約４×１０６ｐｕ、約１×１０７ｐｕ、約２×１０７ｐｕ、約４×１０７ｐｕ、約１×１０８ｐｕ、約２×１０８ｐｕ、約４×１０８ｐｕ、約１×１０９ｐｕ、約２×１０９ｐｕ、約４×１０９ｐｕ、約１×１０１０ｐｕ、約２×１０１０ｐｕ、約４×１０１０ｐｕ、約１×１０１１ｐｕ、約２×１０１１ｐｕ、約４×１０１１ｐｕ、約１×１０１２ｐｕ、約２×１０１２ｐｕ、又は約４×１０１２ｐｕのアデノウイルスベクターを含む単回用量のアデノウイルスベクターを含有し得る。例えば、２０１３年６月４日に付与されたＮａｂｅｌ，ｅｔ．ａｌ．に対する米国特許第８，４５４，９７２  Ｂ２号明細書（参照によって本明細書に援用される）のアデノウイルスベクター、及びその第２９欄第３６〜５８行にある投薬量を参照のこと。本明細書のある実施形態において、アデノウイルスは複数回用量で送達される。
【０４６３】
本明細書のある実施形態において、送達はＡＡＶを介する。ヒトに対するＡＡＶのインビボ送達についての治療上有効な投薬量は、約１×１０１０〜約１×１０１０の機能性ＡＡＶ／ｍｌ溶液を含有する約２０〜約５０ｍｌの生理食塩水の範囲であると考えられる。投薬量は、治療利益と任意の副作用との均衡がとれるように調整され得る。本明細書のある実施形態において、ＡＡＶ用量は、概して、約１×１０５〜１×１０５０ゲノムＡＡＶ、約１×１０８〜１×１０２０ゲノムＡＡＶ、約１×１０１０〜約１×１０１６ゲノム、又は約１×１０１１〜約１×１０１６ゲノムＡＡＶの濃度範囲である。ヒト投薬量は約１×１０１３ゲノムＡＡＶであってもよい。かかる濃度は、約０．００１ｍｌ〜約１００ｍｌ、約０．０５〜約５０ｍｌ、又は約１０〜約２５ｍｌの担体溶液で送達され得る。他の効果的な投薬量が、当業者により、用量反応曲線を作成するルーチンの試験を用いて容易に確立され得る。例えば、２０１３年３月２６日に付与されたＨａｊｊａｒ，ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第８，４０４，６５８  Ｂ２号明細書、第２７欄、第４５〜６０行を参照のこと。
【０４６４】
本明細書のある実施形態において、送達はプラスミドを介する。かかるプラスミド組成物では、投薬量は、反応を誘発するのに十分な量のプラスミドでなければならない。例えば、プラスミド組成物中のプラスミドＤＮＡの好適な分量は、個体７０ｋｇ当たり約０．１〜約２ｍｇ、又は約１μｇ〜約１０μｇであり得る。本発明のプラスミドは、概して、（ｉ）プロモーター；（ｉｉ）前記プロモーターに作動可能に連結された、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列；（ｉｉｉ）選択可能マーカー；（ｉｖ）複製起点；及び（ｖ）（ｉｉ）の下流で（ｉｉ）に作動可能に連結された転写ターミネーターを含み得る。プラスミドはＣＲＩＳＰＲ複合体のＲＮＡ構成成分もコードし得るが、これらのうちの１つ以上は、代わりに異なるベクター上にコードされてもよい。
【０４６５】
本明細書の用量は平均７０ｋｇの個体に基づく。投与頻度は医学又は獣医学の実務者（例えば、医師、獣医師）、又は当該技術分野の科学者の裁量の範囲内にある。また、実験に使用されるマウスは典型的には約２０ｇであり、マウス実験から７０ｋｇの個体にスケールアップし得ることも注記される。
【０４６６】
本明細書に提供される組成物に用いられる投薬量は、反復投与又は繰り返し投与向けの投薬量を含む。詳細な実施形態では、投与は数週間、数ヵ月、又は数年間の期間の範囲内で反復される。最適な投薬量レジームを得るため、好適なアッセイを実施することができる。反復投与は、より低い投薬量の使用が可能であり、これはオフターゲット改変に正の影響を及ぼし得る。
【０４６７】
一部の実施形態では本発明のＲＮＡ分子はリポソーム製剤又はリポフェクチン製剤などで送達され、当業者に周知の方法により調製することができる。かかる方法は、例えば、米国特許第５，５９３，９７２号明細書、同第５，５８９，４６６号明細書及び同第５，５８０，８５９号明細書（これらは参照により本明細書に援用される）に記載されている。特に哺乳類細胞へのｓｉＲＮＡ送達の増強及び改良を目的とした送達系が開発されており（例えば、Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔ．２００３，５３９：１１１−１１４；Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２００２，２０：１００６−１０１０；Ｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｖｉｓｉｏｎ．２００３，９：２１０−２１６；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００３，３２７：７６１−７６６；Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎ．２００２，３２：１０７−１０８及びＳｉｍｅｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ  ２００３，３１，１１：２７１７−２７２４を参照）、本発明に適用し得る。ｓｉＲＮＡは近年、霊長類における遺伝子発現の抑制への使用が成功しており（例えば、Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｔｉｎａ  ２４（４）：６６０を参照）、これは本発明にも適用し得る。
【０４６８】
実際、ＲＮＡ送達はインビボ送達の有用な方法である。リポソーム又はナノ粒子を用いてＣｐｆ１及びｇＲＮＡ（及び、例えばＨＲ修復鋳型）を細胞内に送達することが可能である。従って、Ｃｐｆ１などのＣＲＩＳＰＲ酵素の送達、及び／又は本発明のＲＮＡの送達は、ＲＮＡ形態で、微小胞、リポソーム又は１つ又は複数の粒子を介することができる。例えば、Ｃｐｆ１  ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡをインビボ送達用にリポソーム粒子にパッケージングすることができる。リポソームトランスフェクション試薬、例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのリポフェクタミン及び市販の他の試薬は、ＲＮＡ分子を肝臓に効果的に送達することができる。
【０４６９】
同様に好ましいＲＮＡの送達手段としてはまた、ＲＮＡの粒子による送達（Ｃｈｏ，Ｓ．，Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｍ．，Ｓｏｎ，Ｓ．，Ｘｕ，Ｑ．，Ｙａｎｇ，Ｆ．，Ｍｅｉ，Ｙ．，Ｂｏｇａｔｙｒｅｖ，Ｓ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．，「内皮細胞への低分子干渉ＲＮＡ送達用の脂質様ナノ粒子（Ｌｉｐｉｄ−ｌｉｋｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）」，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，１９：３１１２−３１１８，２０１０）又はエキソソームによる送達（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ａ．，Ｌｅｖｉｎｓ，Ｃ．，Ｃｏｒｔｅｚ，Ｃ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．，ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．，「ｓｉＲＮＡ送達用の脂質ベースのナノ療法（Ｌｉｐｉｄ−ｂａｓｅｄ  ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２６７：９−２１，２０１０，ＰＭＩＤ：２００５９６４１）も挙げられる。実際、エキソソームは、ＣＲＩＳＰＲ系とある程度の類似性を有する系であるｓｉＲＮＡの送達に特に有用であることが示されている。例えば、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．（「インビトロ及びインビボでのｓｉＲＮＡのエキソソーム媒介送達（Ｅｘｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ）」Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２０１２  Ｄｅｃ；７（１２）：２１１２−２６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１２．１３１．Ｅｐｕｂ  ２０１２  Ｎｏｖ  １５）は、エキソソームがいかに種々の生物学的障壁を越えた薬物送達に有望なツールであるか、及びｓｉＲＮＡのインビトロ及びインビボ送達に利用できるかを記載している。彼らの手法は、発現ベクターのトランスフェクションにより、ペプチドリガンドに融合したエキソソームタンパク質を含む標的エキソソームを作成するものである。次にトランスフェクト細胞上清からエキソソームが精製され、特徴付けられた後、ＲＮＡがエキソソームにロードされる。本発明に係る送達又は投与はエキソソームを用いて、詳細には、限定はされないが脳に対して行うことができる。ビタミンＥ（α−トコフェロール）をＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓにコンジュゲートさせて、例えばＵｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（ＨＵＭＡＮ  ＧＥＮＥ  ＴＨＥＲＡＰＹ  ２２：７１１−７１９（Ｊｕｎｅ  ２０１１））によって行われた脳への低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の送達と同じように、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と共に脳に送達することができる。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又はフリーＴｏｃｓｉＢＡＣＥ又はＴｏｃ−ｓｉＢＡＣＥ／ＨＤＬが充填され且つＢｒａｉｎ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｋｉｔ  ３（Ａｌｚｅｔ）に接続された浸透圧ミニポンプ（モデル１００７Ｄ；Ａｌｚｅｔ，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）でマウスが注入された。背側第三脳室内への注入のため、正中線上でブレグマから約０．５ｍｍ後方に脳注入カニューレが留置された。Ｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．は、ＨＤＬを含む僅か３ｎｍｏｌのＴｏｃ−ｓｉＲＮＡが、同じＩＣＶ注入法による同程度の標的の減少を誘導可能であったことを見出した。脳を標的としてＨＤＬと共投与される、α−トコフェロールにコンジュゲートされた同様の投薬量のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓを本発明においてヒトで企図することができ、例えば、脳を標的とする約３ｎｍｏｌ〜約３μｍｏｌのＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓを企図し得る。Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（（ＨＵＭＡＮ  ＧＥＮＥ  ＴＨＥＲＡＰＹ  ２２：４６５−４７５（Ａｐｒｉｌ  ２０１１））は、ラットの脊髄におけるインビボでの遺伝子サイレンシングのためのＰＫＣγを標的とする短鎖ヘアピンＲＮＡのレンチウイルス媒介送達方法を記載している。Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．は、１×１０９形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌの力価を有する約１０μｌの組換えレンチウイルスをくも膜下カテーテルによって投与した。脳を標的とするレンチウイルスベクターにおいて発現する同様の投薬量のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓを本発明においてヒトに企図することができ、例えば、１×１０９形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌの力価を有するレンチウイルスにおける脳を標的とする約１０〜５０ｍｌのＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓを企図し得る。
【０４７０】
Ｃｐｆ１とｃｒＲＮＡとを含む予めアセンブルした組換えＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１複合体は、例えば電気穿孔によってトランスフェクトしてもよく、それにより高い突然変異率が得られ、且つ検出可能なオフターゲット突然変異がなくなる。Ｈｕｒ，Ｊ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ，「Ｃｐｆ１リボ核タンパク質の電気穿孔によるマウスにおける標的突然変異誘発（Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｐｆ１  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）」，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１６  Ｊｕｎ  ６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３５９６．［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］。
【０４７１】
脳への局所送達に関して、これは様々な方法で達成することができる。例えば、物質を線条体内に例えば注入によって送達することができる。注入は、開頭により定位的に行うことができる。
【０４７２】
ＮＨＥＪ又はＨＲ効率を増強させることもまた、送達の助けとなる。ＮＨＥＪ効率は、Ｔｒｅｘ２などの末端プロセシング酵素の共発現によって増強することが好ましい（Ｄｕｍｉｔｒａｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１１  Ａｕｇｕｓｔ；１８８（４）：７８７−７９７）。ＨＲ効率は、Ｋｕ７０及びＫｕ８６などのＮＨＥＪ機構を一過性に阻害して増加させることが好ましい。ＨＲ効率はまた、ＲｅｃＢＣＤ、ＲｅｃＡなどの原核生物又は真核生物相同組換え酵素の共発現によって増加させることもできる。
【０４７３】
パッケージング及びプロモーター
インビボでのゲノム改変を媒介するため、本発明のＣｐｆ１をコードする核酸分子、例えばＤＮＡをベクター、例えばウイルスベクターにパッケージングする方法としては、以下が挙げられる：
・ＮＨＥＪ媒介遺伝子ノックアウトを達成するため：
・シングルウイルスベクター：
・２つ以上の発現カセットを含むベクター：
・プロモーター−Ｃｐｆ１コード核酸分子−ターミネーター
・プロモーター−ｇＲＮＡ１−ターミネーター
・プロモーター−ｇＲＮＡ２−ターミネーター
・プロモーター−ｇＲＮＡ（Ｎ）−ターミネーター（ベクターのサイズ限界まで）
・ダブルウイルスベクター：
・Ｃｐｆ１の発現をドライブするための１つの発現カセットを含むベクター１
・プロモーター−Ｃｐｆ１コード核酸分子−ターミネーター
・１つ以上のガイドＲＮＡの発現をドライブするためのもう１つの発現カセットを含むベクター２
・プロモーター−ｇＲＮＡ１−ターミネーター
・プロモーター−ｇＲＮＡ（Ｎ）−ターミネーター（ベクターのサイズ限界まで）
・相同依存性修復を媒介するため。
・上記に記載されるシングル及びダブルウイルスベクター手法に加えて、相同依存性修復鋳型の送達のため更なるベクターを使用することができる。
【０４７４】
Ｃｐｆ１コード核酸分子の発現のドライブに用いられるプロモーターには、以下が含まれ得る：
−ＡＡＶ  ＩＴＲはプロモーターとして役立ち得る：これは、追加のプロモーターエレメント（ベクター内で場所をとり得る）の必要性がなくなる点で有利である。空いた追加の空間を使用して、追加のエレメント（ｇＲＮＡなど）の発現をドライブすることができる。また、ＩＴＲ活性は比較的弱いため、Ｃｐｆ１の過剰発現による潜在的な毒性を軽減するために使用することができる。
−偏在発現には、使用し得るプロモーターとしては、ＣＭＶ、ＣＡＧ、ＣＢｈ、ＰＧＫ、ＳＶ４０、フェリチン重鎖又は軽鎖等が挙げられる。
【０４７５】
脳又は他のＣＮＳでの発現には、プロモーター：全てのニューロン用のシナプシンＩ、興奮性ニューロン用のＣａＭＫＩＩα、ＧＡＢＡ作動性ニューロン用のＧＡＤ６７又はＧＡＤ６５又はＶＧＡＴ等を使用することができる。
【０４７６】
肝臓での発現には、アルブミンプロモーターを使用することができる。
【０４７７】
肺での発現には、ＳＰ−Ｂを使用することができる。
【０４７８】
内皮細胞には、ＩＣＡＭを使用することができる。
【０４７９】
造血細胞には、ＩＦＮβ又はＣＤ４５を使用することができる。
【０４８０】
骨芽細胞には、ＯＧ−２を使用することができる。
【０４８１】
ガイドＲＮＡのドライブに用いられるプロモーターには、以下が含まれ得る：
−Ｕ６又はＨ１などのＰｏｌ  ＩＩＩプロモーター
−ｇＲＮＡを発現させるためのＰｏｌ  ＩＩプロモーター及びイントロンカセットの使用。
【０４８２】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
Ｃｐｆ１及び１つ以上のガイドＲＮＡは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、アデノウイルス又は他のプラスミド又はウイルスベクタータイプを使用して、詳細には、例えば、米国特許第８，４５４，９７２号明細書（アデノウイルス用の製剤、用量）、同第８，４０４，６５８号明細書（ＡＡＶ用の製剤、用量）及び同第５，８４６，９４６号明細書（ＤＮＡプラスミド用の製剤、用量）並びにレンチウイルス、ＡＡＶ及びアデノウイルスが関わる臨床試験及びそのような臨床試験に関する刊行物からの製剤及び用量を用いて送達することができる。例えば、ＡＡＶについて、投与経路、製剤及び用量は、米国特許第８，４５４，９７２号明細書及びＡＡＶが関わる臨床試験にあるとおりであってもよい。アデノウイルスについては、投与経路、製剤及び用量は、米国特許第８，４０４，６５８号明細書及びアデノウイルスが関わる臨床試験にあるとおりであってもよい。プラスミド送達については、投与経路、製剤及び用量は、米国特許第５，８４６，９４６号明細書及びプラスミドが関わる臨床試験にあるとおりであってもよい。用量は、平均７０ｋｇの個体（例えば男性成人ヒト）に基づくか、又はそれに当てはめてもよく、異なる体重及び種の患者、対象、哺乳動物用に調整することができる。投与頻度は、患者又は対象の年齢、性別、全般的な健康、他の条件並びに対処される特定の状態又は症状を含めた通常の要因に応じて、医学又は獣医学実務者（例えば、医師、獣医師）の範囲内である。ウイルスベクターは、目的の組織に注射することができる。細胞型特異的ゲノム改変について、Ｃｐｆ１の発現は細胞型特異的プロモーターによってドライブすることができる。例えば、肝臓特異的発現にはアルブミンプロモーターが用いられてもよく、及びニューロン特異的発現には（例えばＣＮＳ障害を標的化するため）シナプシンＩプロモーターが用いられてもよい。
【０４８３】
インビボ送達に関しては、他のウイルスベクターと比べて幾つかの理由でＡＡＶが有利である：
低毒性（これは、免疫応答を活性化させ得る細胞粒子の超遠心が不要な精製方法に起因し得る）及び
宿主ゲノムに組み込まれないため、挿入突然変異誘発を引き起こす確率の低さ。
【０４８４】
ＡＡＶは４．５又は４．７５Ｋｂのパッケージング限界を有する。これは、Ｃｐｆ１並びにプロモーター及び転写ターミネーターが全て同じウイルスベクターに収まる必要があることを意味する。４．５又は４．７５Ｋｂよりも大きい構築物はウイルス産生の大幅な低下につながり得る。ＳｐＣａｓ９はかなり大きく、遺伝子それ自体が４．１Ｋｂを超えるため、ＡＡＶにパッケージングすることが困難である。従って本発明の実施形態は、より短いＣｐｆ１のホモログを利用することを含む。
【０４８５】
ＡＡＶに関して、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５又はこれらの任意の組み合わせであり得る。標的化しようとする細胞に関連するＡＡＶのＡＡＶを選択することができる；例えば、脳又は神経細胞の標的化にはＡＡＶ血清型１、２、５又はハイブリッドカプシドＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５又はこれらの任意の組み合わせを選択することができ；及び心臓組織の標的化にはＡＡＶ４を選択することができる。ＡＡＶ８は肝臓への送達に有用である。本明細書におけるプロモーター及びベクターが個々に好ましい。これらの細胞に関する特定のＡＡＶ血清型の一覧は以下のとおりである（Ｇｒｉｍｍ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：５８８７−５９１１（２００８）を参照）。
【０４８６】
【表２】
0006898865.tif 000005
【０４８７】
レンチウイルス
レンチウイルスは、有糸分裂細胞及び分裂終了細胞の両方でその遺伝子の感染能及び発現能を有する複合的レトロウイルスである。最も一般的には、公知のレンチウイルスはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）であり、これは他のウイルスのエンベロープ糖タンパク質を用いて広範囲の細胞型を標的化する。
【０４８８】
レンチウイルスは以下のとおり調製し得る。ｐＣａｓＥＳ１０（これはレンチウイルストランスファープラスミド骨格を含有する）のクローニング後、低継代（ｐ＝５）のＨＥＫ２９３ＦＴをＴ−７５フラスコに５０％コンフルエンスとなるように播種し、その翌日、１０％ウシ胎仔血清含有及び抗生物質不含のＤＭＥＭ中でトランスフェクトした。２０時間後、培地をＯｐｔｉＭＥＭ（無血清）培地に交換し、４時間後にトランスフェクションを行った。細胞に１０μｇのレンチウイルストランスファープラスミド（ｐＣａｓＥＳ１０）及び以下のパッケージングプラスミド：５μｇのｐＭＤ２．Ｇ（ＶＳＶ−ｇシュードタイプ）、及び７．５ｕｇのｐｓＰＡＸ２（ｇａｇ／ｐｏｌ／ｒｅｖ／ｔａｔ）をトランスフェクトした。トランスフェクションは、カチオン性脂質デリバリー剤（５０ｕＬ  Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００及び１００ｕｌ  Ｐｌｕｓ試薬）を含む４ｍＬ  ＯｐｔｉＭＥＭ中で行った。６時間後、培地を１０％ウシ胎仔血清を含む抗生物質不含ＤＭＥＭに交換した。これらの方法では細胞培養中に血清を使用するが、無血清方法が好ましい。
【０４８９】
レンチウイルスは以下のとおり精製し得る。４８時間後にウイルス上清を回収した。初めに上清から残屑を除去し、０．４５ｕｍ低タンパク質結合（ＰＶＤＦ）フィルタでろ過した。次にそれを超遠心機において２４，０００ｒｐｍで２時間スピンした。ウイルスペレットを５０ｕｌのＤＭＥＭ中に４℃で一晩再懸濁した。次にそれをアリコートに分け、直ちに−８０℃で凍結した。
【０４９０】
別の実施形態において、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）をベースとする最小限の非霊長類レンチウイルスベクターもまた、特に眼遺伝子療法に企図される（例えば、Ｂａｌａｇａａｎ，Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ  ２００６；８：２７５−２８５を参照）。別の実施形態において、滲出型（ｗｅｂ  ｆｏｒｍ）の加齢黄斑変性症の治療のため網膜下注射によって送達される血管新生抑制タンパク質エンドスタチン及びアンジオスタチンを発現するウマ伝染性貧血ウイルスベースのレンチウイルス遺伝子療法ベクターであるＲｅｔｉｎｏＳｔａｔ（登録商標）もまた企図され（例えば、Ｂｉｎｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＨＵＭＡＮ  ＧＥＮＥ  ＴＨＥＲＡＰＹ  ２３：９８０−９９１（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１２）を参照のこと）、このベクターは本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系向けに改変し得る。
【０４９１】
別の実施形態において、ＨＩＶ  ｔａｔ／ｒｅｖによって共有される共通のエクソンを標的化するｓｉＲＮＡと、核小体局在ＴＡＲデコイと、抗ＣＣＲ５特異的ハンマーヘッド型リボザイムとを含む自己不活性化レンチウイルスベクター（例えば、ＤｉＧｉｕｓｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ２：３６ｒａ４３を参照のこと）を本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に使用し及び／又は適合させてもよい。患者の体重１キログラム当たり最低２．５×１０６個のＣＤ３４＋  細胞を収集し、２μｍｏｌ／Ｌ−グルタミン、幹細胞因子（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）（１００ｎｇ／ｍｌ）、及びトロンボポエチン（１０ｎｇ／ｍｌ）（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）を含有するＸ−ＶＩＶＯ  １５培地（Ｌｏｎｚａ）中２×１０６細胞／ｍｌの密度でで１６〜２０時間予備刺激し得る。フィブロネクチン（２５ｍｇ／ｃｍ２）（ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ、Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．）で被覆した７５ｃｍ２組織培養フラスコにおいて、予備刺激した細胞をレンチウイルスによって感染多重度５で１６〜２４時間にわたって形質導入し得る。
【０４９２】
レンチウイルスベクターについては、パーキンソン病の治療にあるとおり開示されており、例えば、米国特許出願公開第２０１２０２９５９６０号明細書及び米国特許第７３０３９１０号明細書及び同第７３５１５８５号明細書を参照のこと。レンチウイルスベクターはまた、眼疾患の治療についても開示されており、例えば、米国特許出願公開第２００６０２８１１８０号明細書、２００９０００７２８４号明細書、米国特許出願公開第２０１１０１１７１８９号明細書；米国特許出願公開第２００９００１７５４３号明細書；米国特許出願公開第２００７００５４９６１号明細書、米国特許出願公開第２０１００３１７１０９号明細書を参照のこと。レンチウイルスベクターはまた、脳への送達についても開示されており、例えば、米国特許出願公開第２０１１０２９３５７１号明細書；米国特許出願公開第２０１１０２９３５７１号明細書、米国特許出願公開第２００４００１３６４８号明細書、米国特許出願公開第２００７００２５９７０号明細書、米国特許出願公開第２００９０１１１１０６号明細書及び米国特許第７２５９０１５号明細書を参照のこと。
【０４９３】
ＲＮＡ送達
ＲＮＡ送達：ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えばＣｐｆ１、及び／又は本ＲＮＡのいずれか、例えばガイドＲＮＡはまた、ＲＮＡの形態で送達することもできる。Ｃｐｆ１  ｍＲＮＡはインビトロ転写を用いて作成することができる。例えば、Ｃｐｆ１  ｍＲＮＡは、以下のエレメント：βグロビン−ポリＡテール（１２０以上の一連のアデニン）由来のＴ７＿プロモーター−コザック配列（ＧＣＣＡＣＣ）−Ｃｐｆ１−３’ＵＴＲを含有するＰＣＲカセットを用いて合成することができる。このカセットは、Ｔ７ポリメラーゼによる転写に使用することができる。ガイドＲＮＡはまた、Ｔ７＿プロモーター−ＧＧ−ガイドＲＮＡ配列を含有するカセットからのインビトロ転写を用いて転写することもできる。
【０４９４】
発現を増強し、及び可能性のある毒性を低下させるため、ＣＲＩＳＰＲ酵素コード配列及び／又はガイドＲＮＡを、例えば擬似Ｕ又は５−メチル−Ｃを使用して１つ以上の改変ヌクレオシドを含むように改変することができる。
【０４９５】
ｍＲＮＡ送達方法は、現在、肝臓送達に特に有望である。
【０４９６】
ＲＮＡ送達に関する多くの臨床研究はＲＮＡｉ又はアンチセンスに焦点が置かれているが、これらの系は、本発明を実施するためのＲＮＡの送達に適合させることができる。以下のＲＮＡｉ等の参考文献は、それに従い読まれるべきである。
【０４９７】
粒子送達系及び／又は製剤：
幾つかのタイプの粒子送達系及び／又は製剤が、多様な生物医学的適用において有用であることが知られている。一般に、粒子は、その輸送及び特性の点で一単位として挙動する小さい物体として定義される。粒子は、更に直径に基づき分類される。粗粒子は２，５００〜１０，０００ナノメートルの範囲を包含する。微粒子は１００〜２，５００ナノメートルのサイズを有する。超微粒子、又はナノ粒子は、概して１〜１００ナノメートルのサイズである。１００ｎｍ限度の基準は、粒子をバルク材料と区別する新規特性が典型的には１００ｎｍ未満の臨界長さスケールで生じるという事実である。
【０４９８】
本明細書で使用されるとき、粒子送達系／製剤は、本発明における粒子を含む任意の生物学的送達系／製剤として定義される。本発明における粒子は、１００ミクロン（μｍ）未満の最大径（例えば直径）を有する任意の実体である。一部の実施形態において、本発明の粒子は１０μｍ未満の最大径を有する。一部の実施形態において、本発明の粒子は２０００ナノメートル（ｎｍ）未満の最大径を有する。一部の実施形態において、本発明の粒子は１０００ナノメートル（ｎｍ）未満の最大径を有する。一部の実施形態において、本発明の粒子は９００ｎｍ、８００ｎｍ、７００ｎｍ、６００ｎｍ、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、又は１００ｎｍ未満の最大径を有する。典型的には、本発明の粒子は５００ｎｍ以下の最大径（例えば直径）を有する。一部の実施形態において、本発明の粒子は２５０ｎｍ以下の最大径（例えば直径）を有する。一部の実施形態において、本発明の粒子は２００ｎｍ以下の最大径（例えば直径）を有する。一部の実施形態において、本発明の粒子は１５０ｎｍ以下の最大径（例えば直径）を有する。一部の実施形態において、本発明の粒子は１００ｎｍ以下の最大径（例えば直径）を有する。より小さい粒子、例えば５０ｎｍ以下の最大径を有する粒子が、本発明の一部の実施形態で使用される。一部の実施形態において、本発明の粒子は２５ｎｍ〜２００ｎｍの範囲の最大径を有する。
【０４９９】
粒子の特徴付け（例えば、形態、寸法等を特徴付けることを含む）は種々の異なる技法を用いて行われる。一般的な技法は、電子顕微鏡法（ＴＥＭ、ＳＥＭ）、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）、動的光散乱（ＤＬＳ）、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）、粉末Ｘ線回折（ＸＲＤ）、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、紫外・可視分光法、二重偏光干渉法及び核磁気共鳴（ＮＭＲ）である。特徴付け（寸法計測）は、天然粒子（即ち負荷前）に関して行われても、又はカーゴの負荷後に行われてもよく（本明細書においてカーゴとは、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の１つ以上の構成成分、例えばＣＲＩＳＰＲ酵素又はｍＲＮＡ又はガイドＲＮＡ、又はこれらの任意の組み合わせを指し、及び更なる担体及び／又は賦形剤を含み得る）、それにより本発明の任意のインビトロ、エキソビボ及び／又はインビボ適用のための送達に最適なサイズの粒子が提供される。特定の好ましい実施形態において、粒子寸法（例えば直径）の特徴付けは、動的レーザー散乱法（ＤＬＳ）を用いた計測に基づく。粒子、その作製及び使用方法並びにその計測に関して、米国特許第８，７０９，８４３号明細書；米国特許第６，００７，８４５号明細書；米国特許第５，８５５，９１３号明細書；米国特許第５，９８５，３０９号明細書；米国特許第５，５４３，１５８号明細書；及びＪａｍｅｓ  Ｅ．Ｄａｈｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｃａｒｍｅｎ  Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１４）ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  １１  Ｍａｙ  ２０１４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎａｎｏ．２０１４．８４による発表が挙げられる。
【０５００】
本発明の範囲内の粒子送達系は、限定はされないが、固体、半固体、エマルション、又はコロイド粒子を含め、任意の形態で提供され得る。従って、限定はされないが、例えば、脂質ベースのシステム、リポソーム、ミセル、微小胞、エキソソーム、又は遺伝子銃を含め、本明細書に記載される送達系の任意のものが、本発明の範囲内の粒子送達系として提供され得る。
【０５０１】
粒子
適切な場合、本明細書における粒子又はナノ粒子への言及は同義的であり得ることが理解されるであろう。ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡは、粒子又は脂質エンベロープを使用して同時に送達し得る；例えば、本発明のＣＲＩＳＰＲ酵素及びＲＮＡ（例えば複合体としての）は、７Ｃ１など、Ｄａｈｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開第２０１５０８９４１９  Ａ２号パンフレット及びその引用文献にあるとおりの粒子によって送達することができ（例えば、Ｊａｍｅｓ  Ｅ．Ｄａｈｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｃａｒｍｅｎ  Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１４）ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  １１  Ｍａｙ  ２０１４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎａｎｏ．２０１４．８４を参照）、例えば、送達粒子は脂質又はリピドイド及び親水性ポリマー、例えばカチオン性脂質及び親水性ポリマーを含み、例えばカチオン性脂質には、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）又は１，２−ジテトラデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）が含まれ、及び／又は親水性ポリマーには、エチレングリコール又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれ；及び／又は粒子は、コレステロール（例えば、製剤１＝ＤＯＴＡＰ  １００、ＤＭＰＣ  ０、ＰＥＧ  ０、コレステロール  ０；製剤番号２＝ＤＯＴＡＰ  ９０、ＤＭＰＣ  ０、ＰＥＧ  １０、コレステロール  ０；製剤番号３＝ＤＯＴＡＰ  ９０、ＤＭＰＣ  ０、ＰＥＧ  ５、コレステロール  ５からの粒子）を更に含み、粒子は効率的な多段階プロセスを用いて形成され、ここでは初めに、エフェクタータンパク質及びＲＮＡを、例えば１：１モル比で、例えば室温で、例えば３０分間、例えば無菌ヌクレアーゼフリー１×ＰＢＳ中において共に混合し；及びそれとは別に、製剤に適用し得るとおりＤＯＴＡＰ、ＤＭＰＣ、ＰＥＧ、及びコレステロールをアルコール、例えば１００％エタノール中に溶解し；及び、これらの２つの溶液を共に混合して、複合体を含有する粒子を形成する）。
【０５０２】
核酸ターゲティングエフェクタータンパク質（Ｃｐｆ１などのＶ型タンパク質など）ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡは、粒子又は脂質エンベロープを使用して同時に送達し得る。好適な粒子の例としては、限定はされないが、米国特許第９，３０１，９２３号明細書に記載されるものが挙げられる。
【０５０３】
例えば、Ｓｕ  Ｘ，Ｆｒｉｃｋｅ  Ｊ，Ｋａｖａｎａｇｈ  ＤＧ，Ｉｒｖｉｎｅ  ＤＪ  （「脂質被包ｐＨ応答性ポリマーナノ粒子を使用したインビトロ及びインビボｍＲＮＡ送達（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｕｓｉｎｇ  ｌｉｐｉｄ−ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ  ｐＨ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）」Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ．２０１１  Ｊｕｎ  ６；８（３）：７７４−８７．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｍｐ１００３９０ｗ．Ｅｐｕｂ  ２０１１  Ａｐｒ  １）は、ポリ（β−アミノエステル）（ＰＢＡＥ）コアがリン脂質二重層シェルによって被包された生分解性コア−シェル構造化ナノ粒子について記載している。これらはインビボｍＲＮＡ送達のために開発された。ｐＨ応答性ＰＢＡＥ成分はエンドソーム破壊を促進するように選ばれ、一方、脂質表面層はポリカチオンコアの毒性を最小限に抑えるように選択された。従って、これは本発明のＲＮＡの送達に好ましい。
【０５０４】
一実施形態において、自己集合生体付着性ポリマーをベースとする粒子／ナノ粒子が企図され、これは、ペプチドの経口送達、ペプチドの静脈内送達及びペプチドの経鼻送達、脳への全てに適用し得る。疎水性薬物の経口吸収及び眼内送達など、他の実施形態もまた企図される。分子エンベロープ技術は、保護され且つ疾患部位に送達されるエンジニアリングされたポリマーエンベロープを含む（例えば、Ｍａｚｚａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．ＡＣＳＮａｎｏ，２０１３．７（２）：１０１６−１０２６；Ｓｉｅｗ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ，２０１２．９（１）：１４−２８；Ｌａｌａｔｓａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ，２０１２．１６１（２）：５２３−３６；Ｌａｌａｔｓａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ，２０１２．９（６）：１６６５−８０；Ｌａｌａｔｓａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ，２０１２．９（６）：１７６４−７４；Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ，２０１２．５（５−６）：４５８−６８；Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｒａｍａｎ  Ｓｐｅｃｔ，２０１２．４３（５）：６８１−６８８；Ａｈｍａｄ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ２０１０．７：Ｓ４２３−３３；Ｕｃｈｅｇｂｕ，Ｉ．Ｆ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ，２００６．３（５）：６２９−４０；Ｑｕ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００６．７（１２）：３４５２−９及びＵｃｈｅｇｂｕ，Ｉ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ，２００１．２２４：１８５−１９９を参照）。標的組織に応じて単回又は複数回用量での約５ｍｇ／ｋｇの用量が企図される。
【０５０５】
一実施形態において、ＭＩＴのＤａｎ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ研究室によって開発された、腫瘍成長を止めるためＲＮＡを癌細胞に送達することのできる粒子／ナノ粒子を、本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系に使用し及び／又は適合させることができる。詳細には、Ａｎｄｅｒｓｏｎ研究室は、新規生体材料及びナノ製剤の合成、精製、特徴付け、及び製剤化のための完全に自動化されたコンビナトリアルシステムを開発した。例えば、Ａｌａｂｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１３  Ａｕｇ  ６；１１０（３２）：１２８８１−６；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ  Ｍａｔｅｒ．２０１３  Ｓｅｐ  ６；２５（３３）：４６４１−５；Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．２０１３  Ｍａｒ  １３；１３（３）：１０５９−６４；Ｋａｒａｇｉａｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．２０１２  Ｏｃｔ  ２３；６（１０）：８４８４−７；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．２０１２  Ａｕｇ  ２８；６（８）：６９２２−９及びＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２  Ｊｕｎ  ３；７（６）：３８９−９３を参照のこと。
【０５０６】
米国特許出願公開第２０１１０２９３７０３号明細書はリピドイド化合物に関し、同様にポリヌクレオチドの投与に特に有用であり、これは、本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系の送達に適用し得る。一態様において、アミノアルコールリピドイド化合物が、細胞又は対象に送達される薬剤と組み合わされて、マイクロパーティクル、ナノ粒子、リポソーム、又はミセルを形成する。粒子、リポソーム、又はミセルによって送達される薬剤は、気体、液体、又は固体の形態であってもよく、及び薬剤はポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、又は小分子であってもよい。アミノアルコール（ｍｉｎｏａｌｃｏｈｏｌ）リピドイド化合物は、他のアミノアルコールリピドイド化合物、ポリマー（合成又は天然）、界面活性剤、コレステロール、炭水化物、タンパク質、脂質等と組み合わされて粒子を形成し得る。次にはこれらの粒子が任意選択で医薬賦形剤と組み合わされて医薬組成物を形成し得る。
【０５０７】
米国特許出願公開第２０１１０２９３７０３号明細書はまた、アミノアルコールリピドイド化合物を調製する方法も提供する。アミンの１つ以上の等価物をエポキシド末端化合物の１つ以上の等価物と好適な条件下で反応させると、本発明のアミノアルコールリピドイド化合物が形成される。特定の実施形態において、アミンの全てのアミノ基がエポキシド末端化合物と完全に反応して第三級アミンを形成する。他の実施形態において、アミンの全てのアミノ基がエポキシド末端化合物と完全には反応せずに第三級アミンを形成し、それによりアミノアルコールリピドイド化合物に第一級又は第二級アミンが生じる。これらの第一級又は第二級アミンはそのままにされるか、又は異なるエポキシド末端化合物などの別の求電子剤と反応させてもよい。当業者によって理解されるであろうとおり、アミンが過剰未満のエポキシド末端化合物と反応すると、様々な数の末端部を有する複数の異なるアミノアルコールリピドイド化合物が生じることになる。ある種のアミン類は２つのエポキシド由来化合物末端部で完全に官能化されてもよく、一方、他の分子はエポキシド末端化合物末端部で完全には官能化されない。例えば、ジアミン又はポリアミンは、分子の様々なアミノ部分の１、２、３、又は４つのエポキシド由来化合物末端部を含んで第一級、第二級、及び第三級アミンを生じ得る。特定の実施形態において、全てのアミノ基が完全には官能化されない。特定の実施形態において、同じタイプのエポキシド末端化合物のうちの２つが使用される。他の実施形態において、２つ以上の異なるエポキシド末端化合物が使用される。アミノアルコールリピドイド化合物の合成は溶媒有り又は無しで実施され、及び合成は３０〜１００℃、好ましくは約５０〜９０℃の範囲の高温で実施され得る。調製されたアミノアルコールリピドイド化合物は任意選択で精製されてもよい。例えば、アミノアルコールリピドイド化合物の混合物を精製して、特定の数のエポキシド由来化合物末端部を有するアミノアルコールリピドイド化合物を得てもよい。又は混合物を精製して、特定の立体又は位置異性体を得てもよい。アミノアルコールリピドイド化合物はまた、ハロゲン化アルキル（例えばヨウ化メチル）又は他のアルキル化剤を用いてアルキル化されてもよく、及び／又はそれらはアシル化されてもよい。
【０５０８】
米国特許出願公開第２０１１０２９３７０３号明細書はまた、この発明の方法によって調製されたアミノアルコールリピドイド化合物のライブラリも提供する。これらのアミノアルコールリピドイド化合物は、液体ハンドラー、ロボット、マイクロタイタープレート、コンピュータ等が関わるハイスループット技法を用いて調製され及び／又はスクリーニングされ得る。特定の実施形態において、アミノアルコールリピドイド化合物は、ポリヌクレオチド又は他の薬剤（例えば、タンパク質、ペプチド、小分子）を細胞にトランスフェクトする能力に関してスクリーニングされる。
【０５０９】
米国特許出願公開第２０１３０３０２４０１号明細書は、コンビナトリアル重合を用いて調製されたポリ（β−アミノアルコール）（ＰＢＡＡ）類の一クラスに関する。この発明のＰＢＡＡは、コーティング（医療器具又はインプラントのフィルム又は多層フィルムコーティングなど）、添加剤、材料、賦形剤、生物付着防止剤、マイクロパターニング剤、及び細胞封入剤など、バイオテクノロジー及び生物医学的適用において用いられ得る。表面コーティングとして使用される場合、これらのＰＢＡＡは、インビトロ及びインビボの両方で、その化学構造に応じて様々なレベルの炎症を誘発した。この材料クラスの化学的多様性は大きいため、インビトロでマクロファージ活性化を阻害するポリマーコーティングを同定することが可能であった。更に、これらのコーティングは、カルボキシル化ポリスチレンマイクロパーティクルの皮下移植後の炎症細胞の動員を低減し、及び線維症を低減する。これらのポリマーを使用して、細胞封入用の高分子電解質複合体カプセルを形成し得る。本発明もまた、抗菌性コーティング、ＤＮＡ又はｓｉＲＮＡ送達、及び幹細胞組織工学など、他の多くの生物学的適用を有し得る。米国特許出願公開第２０１３０３０２４０１号明細書の教示は、本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系に適用し得る。一部の実施形態において、本明細書に記載されるとおり、及び特に、別段明らかでない限りあらゆる粒子への送達適用に関して国際公開第２０１４１１８２７２号パンフレット（参照により本明細書に援用される）及びＮａｉｒ，ＪＫ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １３６（４９），１６９５８−１６９６１）及び本明細書の教示を参照して、糖ベースの粒子、例えばＧａｌＮＡｃを使用してもよい。
【０５１０】
別の実施形態において、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）が企図される。抗トランスサイレチン低分子干渉ＲＮＡが脂質ナノ粒子に封入され、ヒトに送達されており（例えば、Ｃｏｅｌｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１３；３６９：８１９−２９を参照）、及びかかるシステムを本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系に適合させて応用し得る。静脈内投与される約０．０１〜約１ｍｇ／ｋｇ体重の用量が企図される。注入関連反応のリスクを低下させる薬物投与が企図され、デキサメタゾン、アセトアミノフェン（ａｃｅｔａｍｐｉｎｏｐｈｅｎ）、ジフェンヒドラミン又はセチリジン、及びラニチジンなどが企図される。４週間毎の５用量にわたる約０．３ｍｇ／キログラムの複数回用量もまた企図される。
【０５１１】
ＬＮＰは、ｓｉＲＮＡの肝臓への送達に極めて有効であることが示されており（例えば、Ｔａｂｅｒｎｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ａｐｒｉｌ  ２０１３，Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．４，ｐａｇｅｓ  ３６３−４７０を参照のこと）、従ってＣＲＩＳＰＲ  ＣａｓをコードするＲＮＡの肝臓への送達に企図される。２週間毎に６ｍｇ／ｋｇのＬＮＰの約４用量の投薬量が企図され得る。Ｔａｂｅｒｎｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．は、０．７ｍｇ／ｋｇで投与するＬＮＰの最初の２サイクル後に腫瘍退縮が観察され、及び６サイクルの終わりまでに患者がリンパ節転移の完全退縮及び肝腫瘍の実質的な縮小を伴う部分奏効を達成したことを実証した。この患者においては４０用量後に完全奏効が得られ、２６ヵ月間にわたって投与を受けた後も患者は寛解を保ったまま治療を完了した。ＶＥＧＦ経路阻害薬による先行治療後に進行していた、腎臓、肺、及びリンパ節を含めた肝外疾患部位を有する２人のＲＣＣ患者は、約８〜１２ヵ月間全ての部位で疾患の安定が得られ、及びＰＮＥＴ及び肝転移患者は１８ヵ月間（３６用量）にわたって延長試験を継続し、疾患は安定していた。
【０５１２】
しかしながら、ＬＮＰの電荷が考慮されなければならない。カチオン性脂質を負電荷脂質と組み合わせると、細胞内送達を促進する非二重層構造が誘導されるためである。荷電ＬＮＰは静脈内注射後に循環から急速に除去されるため、ｐＫａ値が７未満のイオン化可能なカチオン性脂質が開発された（例えば、Ｒｏｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ  １２８６−２２００，Ｄｅｃ．２０１１を参照）。ＲＮＡなどの負電荷ポリマーは低ｐＨ値（例えばｐＨ４）でＬＮＰに負荷することができ、ここでイオン化可能な脂質は正電荷を呈する。しかしながら、生理的ｐＨ値では、ＬＮＰは、より長い循環時間と適合する低い表面電荷を呈する。４種のイオン化可能なカチオン性脂質、即ち、１，２−ジリネオイル（ｄｉｌｉｎｅｏｙｌ）−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−ケト−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＫＤＭＡ）、及び１，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ）が着目されている。これらの脂質を含有するＬＮＰ  ｓｉＲＮＡシステムは、インビボで肝細胞において著しく異なる遺伝子サイレンシング特性を呈し、効力は、第ＶＩＩ因子遺伝子サイレンシングモデルを用いて系列ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ＞ＤＬｉｎＫＤＭＡ＞ＤＬｉｎＤＭＡ＞＞ＤＬｉｎＤＡＰに従い様々であることが示されている（例えば、Ｒｏｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ  １２８６−２２００，Ｄｅｃ．２０１１を参照）。ＬＮＰ又はＬＮＰ中の又はそれに関連するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ＲＮＡの１μｇ／ｍｌの投薬量が、特にＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡを含有する製剤について企図され得る。
【０５１３】
ＬＮＰ及びＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ封入の調製は、Ｒｏｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ  １２８６−２２００，Ｄｅｃ．２０１１）を使用し及び／又は適合させ得る。カチオン性脂質１，２−ジリネオイル（ｄｉｌｉｎｅｏｙｌ）−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシケト−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＫ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ）、（３−ｏ−［２”−（メトキシポリエチレングリコール２０００）サクシノイル］−１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリコール（ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ）、及びＲ−３−［（ω−メトキシ−ポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］−１，２−ジミリスチルオクスルプロピル（ｄｉｍｙｒｉｓｔｙｌｏｘｌｐｒｏｐｙｌ）−３−アミン（ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ）がＴｅｋｍｉｒａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）によって供給され、又は合成されてもよい。コレステロールはＳｉｇｍａ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し得る。特定のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ  ＲＮＡは、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎＫ−ＤＭＡ、及びＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡを含有するＬＮＰに封入してもよい（４０：１０：４０：１０モル比のカチオン性脂質：ＤＳＰＣ：ＣＨＯＬ：ＰＥＧＳ−ＤＭＧ又はＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ）。必要な場合、０．２％ＳＰ−ＤｉＯＣ１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｃａｎａｄａ）を取り入れて細胞取込み、細胞内送達、及び体内分布を評価する。封入は、カチオン性脂質：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ（４０：１０：４０：１０モル比）で構成される脂質混合物をエタノール中に１０ｍｍｏｌ／ｌの最終脂質濃度となるように溶解することにより実施し得る。このエタノール脂質溶液を５０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸塩、ｐＨ４．０に滴下して加えると、多層小胞が形成され、３０％エタノールｖｏｌ／ｖｏｌの最終濃度が生じ得る。エクストルーダ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を使用して２つの積み重ねた８０ｎｍ  Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅポリカーボネートフィルタで多層小胞を押し出した後、大きい単層小胞が形成され得る。封入は、３０％エタノールｖｏｌ／ｖｏｌを含有する５０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸塩、ｐＨ４．０中に２ｍｇ／ｍｌのＲＮＡを、押し出されて予め形成された大きい単層小胞に滴下して加え、０．０６／１ｗｔ／ｗｔの最終ＲＮＡ／脂質重量比となるように常に混合しながら３１℃で３０分間インキュベートすることにより達成し得る。Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  ２再生セルロース透析膜を使用したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４での１６時間の透析によってエタノールの除去及び製剤化緩衝液の中和を実施した。ナノ粒径分布はＮＩＣＯＭＰ  ３７０粒径測定機、小胞／強度モード、及びガウスフィッティング（Ｎｉｃｏｍｐ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎ���，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）を使用した動的光散乱によって決定し得る。３つ全てのＬＮＰ系の粒径が直径約７０ｎｍであり得る。ＲＮＡ封入効率は、透析前及び透析後に収集した試料からＶｉｖａＰｕｒｅＤ  ＭｉｎｉＨカラム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して遊離ＲＮＡを除去することにより決定し得る。溶出したナノ粒子から封入されたＲＮＡを抽出し、２６０ｎｍで定量化し得る。Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＵＳＡ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ）からのコレステロールＥ酵素アッセイを用いて小胞中のコレステロール含有量を計測することにより、ＲＮＡ対脂質比を決定した。本明細書におけるＬＮＰ及びＰＥＧ脂質の考察と併せて、ＰＥＧ化リポソーム又はＬＮＰも同様にＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系又はその構成成分の送達に好適である。
【０５１４】
大きいＬＮＰの調製は、Ｒｏｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ  １２８６−２２００，Ｄｅｃ．２０１１を使用し及び／又は応用し得る。エタノール中にＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、及びコレステロールを５０：１０：３８．５モル比で含有する脂質プレミックス溶液（２０．４ｍｇ／ｍｌ総脂質濃度）を調製し得る。酢酸ナトリウムを０．７５：１（酢酸ナトリウム：ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ）のモル比でこの脂質プレミックスに加え得る。続いて混合物を１．８５容積のクエン酸塩緩衝液（１０ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ３．０）と激しく撹拌しながら合わせることにより脂質を水和させると、３５％エタノールを含有する水性緩衝液中でリポソームの自然形成が起こり得る。このリポソーム溶液を３７℃でインキュベートして、粒径を時間依存的に増加させ得る。インキュベーション中様々な時点でアリコートを取り出して、動的光散乱（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）によってリポソームサイズの変化を調べ得る。所望の粒径に達したところで、総脂質の３．５％の最終ＰＥＧモル濃度が得られるようにリポソーム混合物にＰＥＧ脂質水溶液（ストック＝３５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）エタノール中１０ｍｇ／ｍｌ  ＰＥＧ−ＤＭＧ）を加え得る。ＰＥＧ−脂質を加えると、リポソームはそのサイズで、更なる成長が事実上クエンチされるはずである。次に空のリポソームに約１：１０（ｗｔ：ｗｔ）のＲＮＡ対総脂質でＲＮＡを加え、続いて３７℃で３０分間インキュベートすると、負荷されたＬＮＰが形成され得る。続いてこの混合物をＰＢＳで一晩透析し、０．４５μｍシリンジフィルタでろ過し得る。
【０５１５】
球状核酸（ＳＮＡ（商標））構築物及び他のナノ粒子（特に金ナノ粒子）もまた、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を意図した標的に送達する手段として企図される。多量のデータが、核酸機能化金ナノ粒子をベースとするＡｕｒａＳｅｎｓｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓの球状核酸（ＳＮＡ（商標））構築物が有用であることを示している。
【０５１６】
本明細書の教示と併せて用い得る文献としては、Ｃｕｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１  １３３：９２５４−９２５７、Ｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｍａｌｌ．２０１１  ７：３１５８−３１６２、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．２０１１  ５：６９６２−６９７０、Ｃｕｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２  １３４：１３７６−１３９１、Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．２０１２  １２：３８６７−７１、Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１２  １０９：１１９７５−８０、Ｍｉｒｋｉｎ，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１２  ７：６３５−６３８  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２  １３４：１６４８８−１６９１、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１３  ４９５：Ｓ１４−Ｓ１６、Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１３  １１０（１９）：７６２５−７６３０、Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．５，２０９ｒａ１５２（２０１３）及びＭｉｒｋｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｍａｌｌ，１０：１８６−１９２が挙げられる。
【０５１７】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の遠位端に結合したＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチドリガンドによってポリエチレンイミン（ＰＥＩ）をＰＥＧ化して、ＲＮＡを含む自己集合性ナノ粒子を構築し得る。この系は、例えば、インテグリンを発現する腫瘍新生血管系を標的化し、且つ血管内皮成長因子受容体−２（ＶＥＧＦ  Ｒ２）の発現を阻害して、それにより腫瘍血管新生を達成するｓｉＲＮＡを送達する手段として用いられている（例えば、Ｓｃｈｉｆｆｅｌｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．１９を参照）。ナノプレックスは、等容積のカチオン性ポリマーと核酸との水溶液を混合して２〜６の範囲にわたって正味モル過剰のイオン化可能窒素（ポリマー）対リン酸（核酸）を得ることにより調製し得る。カチオン性ポリマーと核酸との間の静電相互作用によって平均粒径分布が約１００ｎｍのポリプレックスが形成され、従ってここではナノプレックスと称された。Ｓｃｈｉｆｆｅｌｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．の自己集合性ナノ粒子での送達には、約１００〜２００ｍｇの投薬量のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓが想定される。
【０５１８】
Ｂａｒｔｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（ＰＮＡＳ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２５，２００７，ｖｏｌ．１０４，ｎｏ．３９）のナノプレックスもまた、本発明に適用され得る。Ｂａｒｔｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．のナノプレックスは、等容積のカチオン性ポリマーと核酸との水溶液を混合して２〜６の範囲にわたって正味モル過剰のイオン化可能な窒素（ポリマー）対リン酸（核酸）を得ることにより調製される。カチオン性ポリマーと核酸との間の静電相互作用によって平均粒径分布が約１００ｎｍのポリプレックスが形成され、従ってここではナノプレックスと称された。Ｂａｒｔｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．のＤＯＴＡ−ｓｉＲＮＡは、以下のとおり合成された：１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸モノ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）（ＤＯＴＡ−ＮＨＳエステル）をＭａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ（Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）から注文した。カーボネート緩衝液（ｐＨ９）中１００倍モル過剰のＤＯＴＡ−ＮＨＳ−エステルを有するアミン改変ＲＮＡセンス鎖を微量遠心管に加えた。室温で４時間撹拌することにより内容物を反応させた。ＤＯＴＡ−ＲＮＡセンスコンジュゲートをエタノール沈殿させて、水中に再懸濁し、及び非改変アンチセンス鎖とアニーリングさせることにより、ＤＯＴＡ−ｓｉＲＮＡを得た。液体は全てＣｈｅｌｅｘ−１００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で前処理して微量金属の汚染が除去された。シクロデキストリン含有ポリカチオンを使用することにより、Ｔｆ標的及び非標的ｓｉＲＮＡナノ粒子を形成し得る。典型的には、３（±）の電荷比及び０．５ｇ／リットルのｓｉＲＮＡ濃度で水中にナノ粒子が形成された。標的ナノ粒子の表面上にある１パーセントのアダマンタン−ＰＥＧ分子をＴｆ（アダマンタン−ＰＥＧ−Ｔｆ）で改変した。注射用に５％（ｗｔ／ｖｏｌ）グルコース担体溶液中にナノ粒子を懸濁した。
【０５１９】
Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ  ４６４，１５  Ａｐｒｉｌ  ２０１０）は、標的ナノ粒子送達系を使用するＲＮＡ臨床試験を行う（臨床試験登録番号ＮＣＴ００６８９０６５）。標準ケア療法に抵抗性の固形癌患者に対し２１日間サイクルの１、３、８及び１０日目に用量の標的ナノ粒子を３０分間静脈内注入によって投与する。ナノ粒子は、（１）線状シクロデキストリン系ポリマー（ＣＤＰ）、（２）癌細胞の表面上のＴＦ受容体（ＴＦＲ）に会合するようにナノ粒子の外側に提示されたヒトトランスフェリンタンパク質（ＴＦ）標的リガンド、（３）親水性ポリマー（生体液中でのナノ粒子の安定性を促進するために用いられるポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、及び（４）ＲＲＭ２の発現を低下させるように設計されたｓｉＲＮＡ（臨床で使用された配列は、以前はｓｉＲ２Ｂ＋５と称された）を含有する合成送達系からなる。ＴＦＲは悪性細胞で上方制御されることが長く知られており、及びＲＲＭ２は確立された抗癌標的である。これらのナノ粒子（臨床版はＣＡＬＡＡ−０１と称される）は、非ヒト霊長類における複数回投与試験で良好に忍容されることが示されている。１人の慢性骨髄性白血病患者にｓｉＲＮＡがリポソーム送達によって投与されているが、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．の臨床試験は、ｓｉＲＮＡを標的送達系で全身送達して固形癌患者を治療する初期ヒト試験である。標的送達系がヒト腫瘍への機能性ｓｉＲＮＡの有効な送達を提供し得るかどうかを確かめるため、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．は、３つの異なる投与コホートからの３人の患者の生検を調べた；患者Ａ、Ｂ及びＣ、全員が転移性黒色腫を有し、それぞれ１８、２４及び３０ｍｇ・ｍ−２  ｓｉＲＮＡのＣＡＬＡＡ−０１の投与を受けた。同程度の用量が本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系にも企図され得る。本発明の送達は、線状シクロデキストリン系ポリマー（ＣＤＰ）、癌細胞の表面上のＴＦ受容体（ＴＦＲ）に会合するようにナノ粒子の外側に提示されたヒトトランスフェリンタンパク質（ＴＦ）標的リガンド、及び／又は親水性ポリマー（例えば、生体液中でのナノ粒子の安定性を促進するために用いられるポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を含有するナノ粒子で達成され得る。
【０５２０】
本発明に関しては、ＣＲＩＳＰＲ複合体の１つ以上の構成成分、例えばＣＲＩＳＰＲ酵素又はｍＲＮＡ又はガイドＲＮＡをナノ粒子又は脂質エンベロープを用いて送達することが好ましい。他の送達系又はベクターを本発明のナノ粒子の態様と併せて用いてもよい。
【０５２１】
一般に、「ナノ粒子」は、直径が１０００ｎｍ未満の任意の粒子を指す。特定の好ましい実施形態において、本発明のナノ粒子は最大径（例えば直径）が５００ｎｍ以下である。他の好ましい実施形態において、本発明のナノ粒子は最大径が２５ｎｍ〜２００ｎｍの範囲である。他の好ましい実施形態において、本発明のナノ粒子は最大径が１００ｎｍ以下である。他の好ましい実施形態において、本発明のナノ粒子は最大径が３５ｎｍ〜６０ｎｍの範囲である。
【０５２２】
本発明に包含されるナノ粒子（ｎａｎｏａｒｔｉｃｌｅ）は、例えば、固体ナノ粒子（例えば、銀、金、鉄、チタンなどの金属）、非金属、脂質ベースの固体、ポリマー）、ナノ粒子の懸濁液、又はこれらの組み合わせとして、種々の形態で提供され得る。金属、誘電体、及び半導体ナノ粒子、並びにハイブリッド構造（例えば、コアシェルナノ粒子）を調製してもよい。半導体材料でできているナノ粒子はまた、電子エネルギーレベルの量子化が起こるのに十分に小さい（典型的には１０ｎｍ未満）ならば、標識量子ドットであってもよい。かかるナノスケール粒子は、生物医学的適用において薬物担体又は造影剤として用いられ、本発明における同様の目的に応用し得る。
【０５２３】
半固体及び軟質ナノ粒子が製造されており、本発明の範囲内にある。半固体の性質のプロトタイプナノ粒子がリポソームである。各種のリポソームナノ粒子が現在、抗癌薬及びワクチンの送達系として臨床で用いられている。一方の親水性の半体と他方の疎水性の半体とを有するナノ粒子はヤヌス粒子と呼ばれ、特にエマルションを安定化させるのに有効である。ヤヌス粒子は水／油界面で自己集合して、固体界面活性剤として働くことができる。
【０５２４】
米国特許第８，７０９，８４３号明細書（参照により本明細書に援用される）は、治療剤含有粒子を組織、細胞、及び細胞内区画に標的化して送達するための薬物送達システムを提供する。本発明は、界面活性剤、親水性ポリマー又は脂質にコンジュゲートしたポリマーを含む標的粒子を提供する。
【０５２５】
米国特許第６，００７，８４５号明細書（参照により本明細書に援用される）は、多官能化合物を１つ以上の疎水性ポリマー及び１つ以上の親水性ポリマーと共有結合的に連結することにより形成されたマルチブロック共重合体のコアを有し、且つ生物学的に活性な材料を含有する粒子を提供する。
【０５２６】
米国特許第５，８５５，９１３号明細書（参照により本明細書に援用される）は、肺系統への薬物送達のためその表面上に界面活性剤を取り込んだ、タップ密度が０．４ｇ／ｃｍ３未満で平均直径が５μｍ〜３０μｍの空気力学的に軽い粒子を有する粒子状組成物を提供する。
【０５２７】
米国特許第５，９８５，３０９号明細書（参照により本明細書に援用される）は、界面活性剤及び／又は正電荷又は負電荷治療薬又は診断薬と肺系統への送達用の逆の電荷の荷電分子との親水性又は疎水性複合体を取り込んだ粒子を提供する。
【０５２８】
米国特許第５，５４３，１５８号明細書（参照により本明細書に援用される）は、生物学的に活性な材料を含有する生分解性固体コア及び表面上のポリ（アルキレングリコール）部分を有する生分解性注射用粒子を提供する。
【０５２９】
国際公開第２０１２１３５０２５号パンフレット（米国特許出願公開第２０１２０２５１５６０号明細書としても公開されている）（参照により本明細書に援用される）は、コンジュゲート型ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ポリマー及びコンジュゲート型アザ大環状分子（まとめて「コンジュゲート型リポマー（ｌｉｐｏｍｅｒ）」又は「リポマー」と称される）について記載している。特定の実施形態において、かかるコンジュゲート型リポマーを、インビトロ、エキソビボ及びインビボゲノム摂動を達成してタンパク質発現の改変を含めた遺伝子発現の改変を行うためＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のコンテクストで使用し得ることを想定し得る。
【０５３０】
一実施形態において、ナノ粒子はエポキシド改変脂質ポリマー、有利には７Ｃ１であってもよい（例えば、Ｊａｍｅｓ  Ｅ．Ｄａｈｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｃａｒｍｅｎ  Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１４）ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  １１  Ｍａｙ  ２０１４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎａｎｏ．２０１４．８４を参照）。Ｃ７１は、Ｃ１５エポキシド末端脂質をＰＥＩ６００と１４：１のモル比で混合することにより合成され、Ｃ１４ＰＥＧ２０００と配合されて、ＰＢＳ溶液中で少なくとも４０日間安定なナノ粒子が作製された（直径３５〜６０ｎｍ）。
【０５３１】
エポキシド改変脂質ポリマーを利用して本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を肺細胞、心血管細胞又は腎細胞に送達し得るが、しかしながら、当業者はこの系を応用して他の標的器官に送達し得る。約０．０５〜約０．６ｍｇ／ｋｇの範囲の投薬量が想定される。数日間又は数週間にわたる、合計投薬量を約２ｍｇ／ｋｇとする投薬もまた想定される。
【０５３２】
エキソソーム
エキソソームは、ＲＮＡ及びタンパク質を輸送する内因性のナノ小胞であり、これはＲＮＡを脳及び他の標的器官に送達することができる。免疫原性を低下させるため、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２９：３４１）はエキソソーム産生に自己由来の樹状細胞を使用した。ニューロン特異的ＲＶＧペプチドに融合したエキソソーム膜タンパク質Ｌａｍｐ２ｂを発現するように樹状細胞をエンジニアリングすることにより、脳への標的化が達成された。精製エキソソームに電気穿孔によって外因性ＲＮＡが負荷された。静脈内注射されるＲＶＧ標的化エキソソームが、ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡを脳内のニューロン、ミクログリア、オリゴデンドロサイトに特異的に送達し、特異的遺伝子ノックダウンが得られた。ＲＶＧエキソソームに予め曝露してもノックダウンは減弱しなかったとともに、他の組織における非特異的取込みは観察されなかった。アルツハイマー病の治療標的であるＢＡＣＥ１の強力なｍＲＮＡ（６０％）及びタンパク質（６２％）ノックダウンによって、エキソソーム媒介ｓｉＲＮＡ送達の治療可能性が実証された。
【０５３３】
免疫学的に不活性なエキソソームのプールを得るため、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ  ｅｔ  ａｌ．は、同種主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）ハプロタイプの近交系Ｃ５７ＢＬ／６マウスから骨髄を採取した。未熟樹状細胞は、ＭＨＣ−ＩＩ及びＣＤ８６など、Ｔ細胞アクチベーターを欠くエキソソームを多量に産生するため、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ  ｅｔ  ａｌ．は、顆粒球／マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を有する樹状細胞を７日間選択した。翌日、十分に確立された超遠心法プロトコルを用いて培養上清からエキソソームを精製した。産生されたエキソソームは物理的に均一であり、ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）及び電子顕微鏡法によって決定したとき分布サイズのピークが直径８０ｎｍであった。Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ  ｅｔ  ａｌ．は、１０６細胞当たり（タンパク質濃度に基づき計測して）６〜１２μｇのエキソソームを得た。
【０５３４】
次に、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ  ｅｔ  ａｌ．は、ナノスケール適用に適合させた電気穿孔プロトコルを用いて改変エキソソームに外因性カーゴを負荷する可能性を調べた。ナノメートルスケールでの膜粒子に対する電気穿孔は十分に特徴付けられていないため、非特異的Ｃｙ５標識ＲＮＡを使用して電気穿孔プロトコルを経験的に最適化した。超遠心法及びエキソソームの溶解後に、封入されるＲＮＡの量をアッセイした。４００Ｖ及び１２５μＦでの電気穿孔が最大のＲＮＡ保持をもたらし、以降の全ての実験でこれを使用した。
【０５３５】
Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ  ｅｔ  ａｌ．は、１５０μｇのＲＶＧエキソソームに封入された１５０μｇの各ＢＡＣＥ１  ｓｉＲＮＡを正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスに投与し、４つの対照とノックダウン効率を比較した：未治療マウス、ＲＶＧエキソソームのみを注入したマウス、インビボカチオン性リポソーム試薬と複合体化したＢＡＣＥ１  ｓｉＲＮＡを注入したマウス、及びＲＶＧ−９Ｒ（ｓｉＲＮＡに静電的に結合する９つのＤ−アルギニンとコンジュゲートしたＲＶＧペプチド）と複合体化したＢＡＣＥ１  ｓｉＲＮＡを注入したマウス。投与３日後に皮質組織試料を分析し、ｓｉＲＮＡ−ＲＶＧ−９Ｒ治療マウス及びｓｉＲＮＡＲＶＧエキソソーム治療マウスの両方で有意なタンパク質ノックダウン（４５％、Ｐ＜０．０５、対６２％、Ｐ＜０．０１）が観察され、ＢＡＣＥ１  ｍＲＮＡレベルの有意な低下がもたらされた（それぞれ６６％±１５％、Ｐ＜０．００１及び６１％±１３％、Ｐ＜０．０１）。更に、この出願人らは、ＲＶＧ−エキソソーム治療動物においてアルツハイマー病におけるアミロイド斑の主要な構成成分である総β−アミロイド１−４２レベルの有意な低下（５５％、Ｐ＜０．０５）を実証した。観察された低下は、正常マウスでＢＡＣＥ１阻害薬の脳室内注射後に実証されたβ−アミロイド１−４０の低下よりも大きかった。Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ  ｅｔ  ａｌ．はＢＡＣＥ１切断産物でｃＤＮＡ末端の５’迅速増幅（ＲＡＣＥ）を実施し、これは、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉ媒介性ノックダウンのエビデンスを提供した。
【０５３６】
最後に、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ  ｅｔ  ａｌ．は、ＩＬ−６、ＩＰ−１０、ＴＮＦα及びＩＦＮ−α血清濃度を評価することにより、ＲＮＡ−ＲＶＧエキソソームがインビボで免疫応答を誘導したかどうかを調べた。エキソソーム治療後、ｓｉＲＮＡ−ＲＶＧ−９Ｒと対照的にｓｉＲＮＡ−トランスフェクション試薬治療と同様に全てのサイトカインにおける有意でない変化を記録し、これはＩＬ−６分泌を強力に刺激したことから、エキソソーム治療の免疫学的に不活性なプロファイルが確認された。エキソソームがｓｉＲＮＡの２０％しか封入しないことを所与とすれば、対応するレベルの免疫刺激なしに５分の１のｓｉＲＮＡで同等のｍＲＮＡノックダウン及びより大きいタンパク質ノックダウンが達成されたため、ＲＶＧ−エキソソームによる送達はＲＶＧ−９Ｒ送達よりも効率的であるように見える。この実験は、ＲＶＧ−エキソソーム技術の治療可能性を実証したものであり、これは潜在的に神経変性疾患に関連する遺伝子の長期サイレンシングに適している。Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ  ｅｔ  ａｌ．のエキソソーム送達系は、治療標的、特に神経変性疾患への本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の送達に適用し得る。約１００〜１０００ｍｇのＲＶＧエキソソームに封入された約１００〜１０００ｍｇのＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓの投薬量が本発明に企図され得る。
【０５３７】
Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ７，２１１２−２１２６（２０１２））は、培養細胞に由来するエキソソームをどのようにインビトロ及びインビボでのＲＮＡの送達に利用することができるかを開示している。このプロトコルは、初めに、ペプチドリガンドと融合したエキソソームタンパク質を含む、発現ベクターのトランスフェクションによる標的エキソソームの作成を記載している。次に、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．は、トランスフェクト細胞上清からエキソソームをどのように精製し及び特徴付けるかを説明する。次に、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．は、ＲＮＡをエキソソームに負荷するために重要なステップを詳説する。最後に、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．は、どのようにエキソソームを使用してインビトロで及びマウス脳においてインビボでＲＮＡを効率的に送達するかを概説する。エキソソーム媒介性ＲＮＡ送達の見込まれた結果の例が機能アッセイによって評価され、イメージングもまた提供される。プロトコル全体は約３週間かかる。本発明に係る送達又は投与は、自己由来樹状細胞から産生されたエキソソームを使用して実施されてもよい。本明細書における教示から、これを本発明の実施において用いることができる。
【０５３８】
別の実施形態において、Ｗａｈｌｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１２，Ｖｏｌ．４０，Ｎｏ．１７  ｅ１３０）の血漿エキソソームが企図される。エキソソームは、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ細胞、Ｔ細胞、肥満細胞、上皮細胞及び腫瘍細胞を含めた多くの細胞型によって産生されるナノサイズの小胞（３０〜９０ｎｍサイズ）である。これらの小胞は後期エンドソームの内向きの出芽によって形成され、次に細胞膜との融合時に細胞外環境へと放出される。エキソソームは天然で細胞間にＲＮＡを有するため、この特性は遺伝子療法に有用であり得るとともに、この開示から、本発明の実施に用いることができる。
【０５３９】
血漿からのエキソソームは、バフィーコートを９００ｇで２０分間遠心して血漿を単離し、続いて細胞上清を回収し、３００ｇで１０分間遠心して細胞を除去し、１６  ５００ｇで３０分間遠心し、続いて０．２２ｍｍフィルタでろ過することにより調製することができる。１２０  ０００ｇで７０分間の超遠心によってエキソソームをペレット化する。エキソソームへのｓｉＲＮＡの化学的トランスフェクションをＲＮＡｉヒト／マウススターターキット（Ｑｕｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で製造者の指示に従い実施する。ｓｉＲＮＡを１００ｍｌ  ＰＢＳに２ｍｍｏｌ／ｍｌの最終濃度で加える。ＨｉＰｅｒＦｅｃｔトランスフェクション試薬を加えた後、混合物を室温で１０分間インキュベートする。過剰なミセルを除去するため、アルデヒド／硫酸塩ラテックスビーズを使用してエキソソームを再単離する。エキソソームへのＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓの化学的トランスフェクションをｓｉＲＮＡと同様に行い得る。エキソソームを健常ドナーの末梢血から単離した単球及びリンパ球と共培養し得る。従って、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓを含有するエキソソームをヒトの単球及びリンパ球に導入し、且つヒトに自己再導入し得ることが企図され得る。従って、本発明に係る送達又は投与を血漿エキソソームを用いて実施し得る。
【０５４０】
リポソーム
本発明に係る送達又は投与は、リポソームで実施することができる。リポソームは、内部の水性区画を取り囲む単層又は多重膜脂質二重層及び比較的不透過性の外側の親油性リン脂質二重層からなる球形の小胞構造である。リポソームは、生体適合性であり、非毒性であり、親水性及び親油性の両方の薬物分子を送達することができ、そのカーゴを血漿酵素による分解から保護し、且つ生体膜及び血液脳関門（ＢＢＢ）を越えてそのロードを輸送するため、薬物送達担体として大いに注目を集めてきた（例えば、レビューについては、Ｓｐｕｃｈ  ａｎｄ  Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ４６９６７９，１２  ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照のこと）。
【０５４１】
リポソームは幾つかの異なるタイプの脂質から作製することができる；しかしながら、薬物担体としてのリポソームの作成には、リン脂質が最も一般的に用いられている。脂質薄膜が水溶液と混合されたときにリポソーム形成は自然に起こるが、また、ホモジナイザー、ソニケーター、又は押出し装置を使用して振盪の形態の力を加えることによっても促進し得る（例えば、レビューについては、Ｓｐｕｃｈ  ａｎｄ  Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ４６９６７９，１２  ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照のこと）。
【０５４２】
その構造及び特性を改変するため、リポソームに幾つかの他の添加剤を加えてもよい。例えば、リポソーム構造の安定化を助けるため、及びリポソームの内部カーゴの漏出を防ぐため、リポソーム混合物にコレステロール又はスフィンゴミエリンのいずれかを加えてもよい。更に、リポソームは、水素化卵ホスファチジルコリン又は卵ホスファチジルコリン、コレステロール、及びジセチルリン酸から調製され、その平均小胞サイズは約５０及び１００ｎｍに調整された（例えば、レビューについては、Ｓｐｕｃｈ  ａｎｄ  Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ４６９６７９，１２  ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照のこと）。
【０５４３】
リポソーム製剤は主に、１，２−ジステアロイル（ｄｉｓｔｅａｒｏｒｙｌ）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、スフィンゴミエリン、卵ホスファチジルコリン及びモノシアロガングリオシドなどの天然リン脂質及び脂質で構成され得る。この製剤はリン脂質のみでできているため、リポソーム製剤は多くの難題に直面しており、その１つが血漿中での不安定性である。これらの難題を解消しようとする幾つかの試みが、特に脂質膜の操作においてなされている。これらの試みの１つは、コレステロールの操作に着目するものであった。従来の製剤にコレステロールを加えると、封入された生物学的活性化合物が血漿又は１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）中に急速に放出されることが抑えられ、安定性が増す（例えば、レビューについては、Ｓｐｕｃｈ  ａｎｄ  Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ４６９６７９，１２  ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照のこと）。
【０５４４】
特に有利な実施形態において、トロイの木馬リポソーム（分子トロイの木馬としても知られる）が望ましく、ｈｔｔｐ：／／ｃｓｈｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．ｃｓｈｌｐ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／２０１０／４／ｐｄｂ．ｐｒｏｔ５４０７．ｌｏｎｇにおいてプロトコルを参照し得る。これらの粒子は、トランス遺伝子を血管内注射後に脳全体に送達することが可能である。制約により拘束されるものではないが、特異抗体が表面にコンジュゲートした中性脂質粒子はエンドサイトーシスによって血液脳関門を通過することが可能であると考えられる。本出願人は、トロイの木馬リポソームを利用してヌクレアーゼのＣＲＩＳＰＲファミリーを血管内注射によって脳に送達することを仮定し、これにより、胚を操作する必要なしに全脳トランスジェニック動物が実現し得る。リポソームでの生体内投与には、約１〜５ｇのＤＮＡ又はＲＮＡが企図され得る。
【０５４５】
別の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系又はその構成成分は安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）などのリポソームで投与され得る（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．８，Ａｕｇｕｓｔ  ２００５を参照）。ＳＮＡＬＰで標的化される特定のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓの毎日の約１、３又は５ｍｇ／ｋｇ／日の静脈内注射が企図される。毎日の治療は約３日間にわたり、次に毎週、約５週間にわたり得る。別の実施形態において、特定のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓが封入されたＳＮＡＬＰの約１又は２．５ｍｇ／ｋｇの用量の静脈内注射による投与もまた企図される（例えば、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．４４１，４  Ｍａｙ  ２００６を参照）。ＳＮＡＬＰ製剤は、脂質３−Ｎ−［（ｗメトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］−１，２−ジミリスチルオキシ−プロピルアミン（ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）及びコレステロールを２：４０：１０：４８モルパーセント比で含有し得る（例えば、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．４４１，４  Ｍａｙ  ２００６を参照）。
【０５４６】
別の実施形態において、安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）は、高度に血管新生したＨｅｐＧ２由来肝腫瘍への分子の送達に有効であるが、血管新生が不十分なＨＣＴ−１１６由来肝腫瘍においては有効でないことが分かっている（例えば、Ｌｉ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１２）１９，７７５−７８０を参照）。ＳＮＡＬＰリポソームは、Ｄ−Ｌｉｎ−ＤＭＡ及びＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡをジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール及びｓｉＲＮＡと共に２５：１脂質／ｓｉＲＮＡ比及び４８／４０／１０／２モル比のコレステロール／Ｄ−Ｌｉｎ−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡを用いて製剤化することにより調製し得る。得られたＳＮＡＬＰリポソームは約８０〜１００ｎｍサイズである。
【０５４７】
更に別の実施形態において、ＳＮＡＬＰは、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，ＵＳＡ）、３−Ｎ−［（ｗ−メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］−１，２−ジミレスチルオキシプロピルアミン（ｄｉｍｙｒｅｓｔｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ）、及びカチオン性１，２−ジリノレイルオキシ−３−Ｎ，Ｎジメチルアミノアミノプロパンを含み得る（例えば、Ｇｅｉｓｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ２０１０；３７５：１８９６−９０５を参照）。例えばボーラス静脈内注入として投与される１用量当たり合計約２ｍｇ／ｋｇのＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓの投薬量が企図され得る。
【０５４８】
更に別の実施形態において、ＳＮＡＬＰは、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ；Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ  Ｉｎｃ．）、ＰＥＧ−ｃＤＭＡ、及び１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ；Ｎ−ジメチル）アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）を含み得る（例えば、Ｊｕｄｇｅ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１９：６６１−６７３（２００９）を参照）。インビボ研究に用いられる製剤は、約９：１の最終脂質／ＲＮＡ質量比を含み得る。
【０５４９】
ＲＮＡｉナノメディシンの安全性プロファイルが、Ａｌｎｙｌａｍ  ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＢａｒｒｏｓ  ａｎｄ  Ｇｏｌｌｏｂによってレビューされている（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ６４（２０１２）１７３０−１７３７を参照）。安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）は、４つの異なる脂質−低ｐＨでカチオン性のイオン化可能な脂質（ＤＬｉｎＤＭＡ）、中性ヘルパー脂質、コレステロール、及び拡散性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質で構成される。この粒子は直径約８０ｎｍであり、生理的ｐＨで電荷的に中性である。製剤化時、イオン化可能な脂質が粒子形成の間に脂質をアニオン性ＲＮＡと凝縮させる働きをする。漸進的に酸性になるエンドソーム条件下で正電荷のとき、イオン化可能な脂質はまた、ＳＮＡＬＰとエンドソーム膜との融合も媒介し、細胞質中へのＲＮＡの放出を可能にする。ＰＥＧ−脂質は粒子を安定化させ、製剤化時の凝集を低減し、続いて薬物動態特性を改善する中性の親水性外部を提供する。
【０５５０】
現在までに、ＲＮＡを有するＳＮＡＬＰ製剤を使用して２つの臨床プログラムが開始されている。Ｔｅｋｍｉｒａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓは、最近、高ＬＤＬコレステロールの成人ボランティアにおけるＳＮＡＬＰ−ＡｐｏＢの第Ｉ相単回投与試験を完了した。ＡｐｏＢは主に肝臓及び空腸に発現し、ＶＬＤＬ及びＬＤＬのアセンブリ及び分泌に必須である。１７人の対象に単一用量のＳＮＡＬＰ−ＡｐｏＢが投与された（７用量レベルにわたる用量漸増）。肝毒性（前臨床試験に基づき潜在的用量制限毒性として予想された）のエビデンスはなかった。（２人中）１人の対象が最も高い用量で免疫系刺激と一致してインフルエンザ様症状を起こし、試験終了が決定された。
【０５５１】
Ａｌｎｙｌａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓも同様にＡＬＮ−ＴＴＲ０１を進めており、これは上記に記載されるＳＮＡＬＰ技術を用い、ＴＴＲアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）の治療のため突然変異体及び野生型の両方のＴＴＲの肝細胞産生を標的化する。３つのＡＴＴＲ症候群が記載されている：家族性アミロイドポリニューロパチー（ＦＡＰ）及び家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）−両方ともにＴＴＲの常染色体優性突然変異によって引き起こされる；及び野生型ＴＴＲによって引き起こされる老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）。ＡＬＮ−ＴＴＲ０１のプラセボ対照単回用量漸増第Ｉ相試験が最近、ＡＴＴＲ患者で完了した。ＡＬＮ−ＴＴＲ０１が１５分間の静脈内注入として３１人の患者に（２３人は試験薬物及び８人はプラセボ）０．０１〜１．０ｍｇ／ｋｇの用量範囲内で（ｓｉＲＮＡに基づく）投与された。治療は良好に忍容され、肝機能検査値の重大な増加はなかった。≧０．４ｍｇ／ｋｇで２３人中３人の患者に注入関連反応が認められた；全員が注入速度の減速に応答し、全員が試験を続行した。２人の患者に１ｍｇ／ｋｇの最も高い用量で血清サイトカインＩＬ−６、ＩＰ−１０及びＩＬ−１ｒａの最小限且つ一過性の上昇が認められた（前臨床及びＮＨＰ試験から予想されたとおり）。ＡＬＮ−ＴＴＲ０１の期待された薬力学的効果である血清ＴＴＲの低下が１ｍｇ／ｋｇで観察された。
【０５５２】
更に別の実施形態において、ＳＮＡＬＰは、例えばカチオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロール及びＰＥＧ−脂質をエタノール中に、例えばそれぞれ４０：１０：４０：１０のモル比で可溶化させることにより作製し得る（Ｓｅｍｐｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２８  Ｎｕｍｂｅｒ  ２  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２０１０，ｐｐ．１７２−１７７を参照）。水性緩衝液（５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ４）にそれぞれ３０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）及び６．１ｍｇ／ｍｌの最終エタノール及び脂質濃度となるように混合しながら脂質混合物を加え、２２℃で２分間平衡化させた後、押し出した。水和した脂質を、２つの積み重ねた８０ｎｍ細孔径フィルタ（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ）で２２℃においてＬｉｐｅｘ  Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ）を使用して、動的光散乱分析によって決定したとき７０〜９０ｎｍの小胞直径が観察されるまで押し出した。これには、概して１〜３回のパスが必要であった。ｓｉＲＮＡ（３０％エタノールを含有する５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ４水溶液中に可溶化した）を、予め平衡化した（３５℃）小胞に約５ｍｌ／分の速度で混合しながら加えた。０．０６（ｗｔ／ｗｔ）の最終目標ｓｉＲＮＡ／脂質比に達した後、混合物を３５℃で更に３０分間インキュベートして小胞再構築及びｓｉＲＮＡの封入を可能にした。次にエタノールを除去し、外部緩衝液を透析又はタンジェンシャルフローダイアフィルトレーションのいずれかによってＰＢＳ（１５５ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５）と交換した。制御された段階的希釈方法プロセスを用いてｓｉＲＮＡをＳＮＡＬＰに封入した。ＫＣ２−ＳＮＡＬＰの脂質構成要素は、５７．１：７．１：３４．３：１．４のモル比で用いられたＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（カチオン性脂質）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ；Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ）及びＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡであった。負荷粒子が形成されたところで、ＳＮＡＬＰをＰＢＳで透析し、使用前に０．２μｍフィルタで滅菌ろ過した。平均粒径は７５〜８５ｎｍであり、ｓｉＲＮＡの９０〜９５％が脂質粒子内に封入された。インビボ試験に使用した製剤中の最終的なｓｉＲＮＡ／脂質比は約０．１５（ｗｔ／ｗｔ）であった。使用直前に、第ＶＩＩ因子ｓｉＲＮＡを含有するＬＮＰ−ｓｉＲＮＡ系を滅菌ＰＢＳ中に適切な濃度に希釈し、製剤を１０ｍｌ／ｋｇの合計容積で外側尾静脈から静脈内投与した。この方法及びこれらの送達系は、本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系に当てはめることができる。
【０５５３】
他の脂質
アミノ脂質２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）などの他のカチオン性脂質を利用して、例えばＳｉＲＮＡと同様に、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ又はその構成成分又はそれをコードする１つ又は複数の核酸分子を封入してもよく（例えば、Ｊａｙａｒａｍａｎ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１２，５１，８５２９−８５３３を参照）、従って本発明の実施に用い得る。以下の脂質組成を有する予め形成された小胞が企図され得る：アミノ脂質、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール及び（Ｒ）−２，３−ビス（オクタデシルオキシ）プロピル−１−（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）プロピルカルバメート（ＰＥＧ−脂質）、それぞれモル比４０／１０／４０／１０、及び約０．０５（ｗ／ｗ）のＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡ／総脂質比。７０〜９０ｎｍの範囲の狭い粒径分布及び０．１１±０．０４の低い多分散性指数（ｎ＝５６）が確実となるように、粒子を最大３回まで８０ｎｍ膜で押し出し、その後ガイドＲＮＡに加えた。極めて強力なアミノ脂質１６を含有する粒子を使用してもよく、ここで４つの脂質構成成分１６、ＤＳＰＣ、コレステロール及びＰＥＧ−脂質のモル比（５０／１０／３８．５／１．５）はインビボ活性を増強させるため更に最適化され得る。
【０５５４】
Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｓ  Ｄ  Ｋｏｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（「マウスにおける化学的に改変されたｍＲＮＡの送達後の治療用タンパク質の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｆｔｅｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｍＲＮＡ  ｉｎ  ｍｉｃｅ）：Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ：２９，Ｐａｇｅｓ：１５４−１５７（２０１１））は、脂質エンベロープを用いたＲＮＡの送達について記載している。脂質エンベロープの使用は本発明においても好ましい。
【０５５５】
別の実施形態では、脂質を本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系又はその１つ又は複数の構成成分又はそれをコードする１つ又は複数の核酸分子と共に製剤化して、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成してもよい。脂質としては、限定はされないが、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ４、Ｃ１２−２００及びコリピド（ｃｏｌｉｐｉｄ）ジステロイルホスファチジルコリン（ｄｉｓｔｅｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ  ｃｈｏｌｉｎｅ）、コレステロールが挙げられ、及びＰＥＧ−ＤＭＧを小胞自然形成手順を用いてｓｉＲＮＡの代わりにＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓと共に製剤化してもよい（例えば、Ｎｏｖｏｂｒａｎｔｓｅｖａ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ（２０１２）１，ｅ４；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１１．３を参照）。構成成分のモル比は約５０／１０／３８．５／１．５（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ又はＣ１２−２００／ジステロイルホスファチジルコリン（ｄｉｓｔｅｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ  ｃｈｏｌｉｎｅ）／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ）であってもよい。最終的な脂質：ｓｉＲＮＡ重量比は、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ及びＣ１２−２００脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の場合、それぞれ約１２：１及び９：１であり得る。製剤は、＞９０％の捕捉効率で約８０ｎｍの平均粒子直径を有し得る。３ｍｇ／ｋｇ用量が企図され得る。
【０５５６】
Ｔｅｋｍｉｒａは、米国及び米国外に、ＬＮＰ及びＬＮＰ製剤の様々な態様に関する約９５のパテントファミリーのポートフォリオを有し（例えば、米国特許第７，９８２，０２７号明細書；同第７，７９９，５６５号明細書；同第８，０５８，０６９号明細書；同第８，２８３，３３３号明細書；同第７，９０１，７０８号明細書；同第７，７４５，６５１号明細書；同第７，８０３，３９７号明細書；同第８，１０１，７４１号明細書；同第８，１８８，２６３号明細書；同第７，９１５，３９９号明細書；同第８，２３６，９４３号明細書及び同第７，８３８，６５８号明細書及び欧州特許第１７６６０３５号明細書；同第１５１９７１４号明細書；同第１７８１５９３号明細書及び同第１６６４３１６号明細書を参照）、これらは全て、本発明に使用及び／又は応用することができる。
【０５５７】
ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系又はその構成成分又はそれをコードする１つ又は複数の核酸分子は、タンパク質、タンパク質前駆体、又は部分的又は完全にプロセシングされた形態のタンパク質又はタンパク質前駆体をコードし得る改変核酸分子を含む組成物の製剤の態様に関する米国特許出願公開第２０１３０２５２２８１号明細書及び同第２０１３０２４５１０７号明細書及び同第２０１３０２４４２７９号明細書（Ｍｏｄｅｒｎａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓに譲渡された）に更に記載されるものなど、ＰＬＧＡミクロスフェアに封入して送達し得る。製剤は、モル比５０：１０：３８．５：１．５〜３．０（カチオン性脂質：膜融合性脂質：コレステロール：ＰＥＧ脂質）を有し得る。ＰＥＧ脂質は、限定はされないが、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧから選択され得る。膜融合性脂質はＤＳＰＣであり得る。また、Ｓｃｈｒｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ、米国特許出願公開第２０１２０２５１６１８号明細書も参照のこと。
【０５５８】
Ｎａｎｏｍｅｒｉｃｓの技術は、低分子量疎水性薬物、ペプチド、及び核酸ベースの治療薬（プラスミド、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）を含めた広範囲の治療薬に関するバイオアベイラビリティの難題に対処している。この技術が明らかな利点を実証している特定の投与経路には、経口経路、血液脳関門を越える輸送、固形腫瘍への送達、並びに眼への送達が含まれる。例えば、Ｍａｚｚａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．２０１３  Ｆｅｂ  ２６；７（２）：１０１６−２６；Ｕｃｈｅｇｂｕ  ａｎｄ  Ｓｉｅｗ，２０１３，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．１０２（２）：３０５−１０及びＬａｌａｔｓａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ．２０１２  Ｊｕｌ  ２０；１６１（２）：５２３−３６を参照のこと。
【０５５９】
米国特許出願公開第２００５００１９９２３号明細書は、ポリヌクレオチド分子、ペプチド及びポリペプチド及び／又は医薬品などの生理活性分子を哺乳類の体に送達するためのカチオン性デンドリマーについて記載している。デンドリマーは、生理活性分子の送達を、例えば、肝臓、脾臓、肺、腎臓又は心臓に（又は更には脳までも）標的化するのに好適である。デンドリマーは、単純な分岐単量体単位から段階的に調製される合成三次元巨大分子であり、その性質及び機能は容易に制御し、変化させることができる。デンドリマーは、構成要素を多機能コアに（ダイバージェント合成手法）、又は多機能コアに向かって（コンバージェント合成手法）反復的に加えることによって合成され、構成要素の三次元シェルを加える毎に、より高世代のデンドリマーの形成につながる。ポリプロピレンイミンデンドリマーはジアミノブタンコアから開始され、それに第一級アミンへのアクリロニトリルの二重マイケル付加によって２倍の数のアミノ基が加えられ、続いてニトリルが水素化される。この結果、アミノ基の倍増がもたらされる。ポリプロピレンイミンデンドリマーは１００％プロトン化可能な窒素及び最大６４個の末端アミノ基（第５世代、ＤＡＢ  ６４）を含有する。プロトン化可能な基は、通常、中性ｐＨでプロトンを受け取ることが可能なアミン基である。デンドリマーの遺伝子デリバリー剤としての使用は、大部分が、コンジュゲート単位としてそれぞれアミン／アミド又はＮ−−Ｐ（Ｏ２）Ｓの混合物を有するポリアミドアミン及び亜リン酸含有化合物の使用に着目したものであり、それより低い世代のポリプロピレンイミンデンドリマーの遺伝子送達への使用に関しては報告がない。ポリプロピレンイミンデンドリマーもまた、周囲アミノ酸性基によって化学的に改変されたとき薬物送達及びゲスト分子のそれらの封入のためのｐＨ感受性制御放出系として研究されている。ＤＮＡを有するポリプロピレンイミンデンドリマーの細胞傷害性及び相互作用並びにＤＡＢ  ６４のトランスフェクション有効性もまた研究されている。
【０５６０】
米国特許出願公開第２００５００１９９２３号明細書は、先行の報告に反して、ポリプロピレンイミンデンドリマーなどのカチオン性デンドリマーが、特異的標的化及び低毒性など、遺伝物質など、生理活性分子の標的化した送達において用いるのに好適な特性を示すという観察に基づく。加えて、カチオン性デンドリマーの誘導体もまた、生理活性分子の標的化された送達に好適な特性を示す。また、「カチオン性ポリアミンポリマー及びデンドリマーポリマーを含めた様々なポリマーは抗増殖活性を有することが示され、従って、新生物及び腫瘍、炎症性障害（自己免疫障害を含む）、乾癬及びアテローム性動脈硬化症など、望ましくない細胞増殖によって特徴付けられる障害の治療に有用であり得る。ポリマーは単独で活性薬剤として用いられてもよく、又は遺伝子療法用の薬物分子又は核酸など、他の治療剤の送達ビヒクルとして用いられてもよい。そのような場合、ポリマーそれ自体の固有の抗腫瘍活性が、送達される薬剤の活性を補完し得る」ことを開示するＢｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，米国特許出願公開第２００８０２６７９０３号明細書も参照のこと。これらの特許公報の開示は、１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系又はその１つ又は複数の構成成分又はそれをコードする１つ又は複数の核酸分子の送達に関する本明細書における教示と併せて用いられ得る。
【０５６１】
超荷電タンパク質
超荷電タンパク質は、異常に高い理論上の正味正電荷又は負電荷を有するエンジニアリングされた又は天然に存在するタンパク質の一クラスであり、１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系又はその１つ又は複数の構成成分又はそれをコードする１つ又は複数の核酸分子の送達に用いられ得る。超負電荷及び超正電荷の両方のタンパク質とも、熱的又は化学的に誘導される凝集に耐える著しい能力を呈する。超正電荷タンパク質はまた、哺乳類細胞に侵入することも可能である。プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡ、又は他のタンパク質など、これらのタンパク質と関連付けるカーゴが、インビトロ及びインビボの両方でこれらの巨大分子を哺乳類細胞に機能的に送達することを可能にし得る。Ｄａｖｉｄ  Ｌｉｕの研究室は、２００７年に超荷電タンパク質の作成及び特徴付けを報告した（Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２９，１０１１０−１０１１２）。
【０５６２】
哺乳類細胞へのＲＮＡ及びプラスミドＤＮＡの非ウイルス性送達は、研究及び治療適用の両方に価値がある（Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２６，５６１−５６９）。精製＋３６  ＧＦＰタンパク質（又は他の超正電荷タンパク質）を適切な無血清培地中でＲＮＡと混合して複合体化させた後、細胞に加える。この段階で血清を含めると、超荷電タンパク質−ＲＮＡ複合体の形成が阻害され、治療の有効性が低下する。以下のプロトコルが種々の細胞株に有効であることが分かっている（ＭｃＮａｕｇｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０６，６１１１−６１１６）（しかしながら、具体的な細胞株に対して手順を最適化するには、タンパク質及びＲＮＡの用量を変化させるパイロット実験を行わなければならない）。
【０５６３】
（１）処理前日、４８ウェルプレートにウェル当たり１×１０５細胞をプレーティングする。
【０５６４】
（２）処理当日、最終濃度２００ｎＭとなるように精製＋３６  ＧＦＰタンパク質を無血清培地中に希釈する。５０ｎＭの最終濃度となるようにＲＮＡを加える。ボルテックスして混合し、室温で１０分間インキュベートする。
【０５６５】
（３）インキュベーション中、細胞から培地を吸引し、ＰＢＳで１回洗浄する。
【０５６６】
（４）＋３６  ＧＦＰ及びＲＮＡのインキュベーション後、細胞にタンパク質−ＲＮＡ複合体を加える。
【０５６７】
（５）細胞を複合体と共に３７℃で４時間インキュベートする。
【０５６８】
（６）インキュベーション後、培地を吸引し、２０Ｕ／ｍＬヘパリンＰＢＳで３回洗浄する。細胞を血清含有培地と共に、活性に関するアッセイに応じて更に４８時間又はそれ以上インキュベートする。
【０５６９】
（７）免疫ブロット、ｑＰＣＲ、表現型アッセイ、又は他の適切な方法によって細胞を分析する。
【０５７０】
Ｄａｖｉｄ  Ｌｉｕの研究室は、＋３６  ＧＦＰが様々な細胞で有効なプラスミド送達試薬であることを更に見出した。プラスミドＤＮＡはｓｉＲＮＡよりも大きいカーゴであるため、プラスミドを有効に複合体化するためには、比例して更なる＋３６  ＧＦＰタンパク質が必要になる。有効なプラスミド送達のため、本出願人らは、インフルエンザウイルスヘマグルチニンタンパク質に由来する公知のエンドソーム破壊ペプチドであるＣ末端ＨＡ２ペプチドタグを担持する＋３６  ＧＦＰの変異体を開発している。以下のプロトコルが種々の細胞において有効となっているが、上記のとおり、プラスミドＤＮＡ及び超荷電タンパク質の用量を特定の細胞株及び送達の適用に最適化することが助言される。
【０５７１】
（１）処理前日、４８ウェルプレートにウェル当たり１×１０５をプレーティングする。
【０５７２】
（２）処理当日、無血清培地中の精製ｐ３６  ＧＦＰタンパク質を最終濃度２ｍＭとなるように希釈する。１ｍｇのプラスミドＤＮＡを加える。ボルテックスして混合し、室温で１０分間インキュベートする。
【０５７３】
（３）インキュベーション中、細胞から培地を吸引し、ＰＢＳで１回洗浄する。
【０５７４】
（４）ｐ３６  ＧＦＰ及びプラスミドＤＮＡのインキュベーション後、タンパク質−ＤＮＡ複合体を細胞に穏やかに加える。
【０５７５】
（５）細胞を複合体と共に３７℃で４時間インキュベートする。
【０５７６】
（６）インキュベーション後、培地を吸引し、ＰＢＳで洗浄する。血清含有培地中で細胞をインキュベートし、更に２４〜４８時間インキュベートする。
【０５７７】
（７）適宜、プラスミド送達を分析する（例えば、プラスミドによってドライブされる遺伝子発現による）。
【０５７８】
また、例えば、ＭｃＮａｕｇｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０６，６１１１−６１１６（２００９）；Ｃｒｏｎｉｃａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５，７４７−７５２（２０１０）；Ｃｒｏｎｉｃａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １８，８３３−８３８（２０１１）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ５０３，２９３−３１９（２０１２）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｄ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９（７），８３１−８４３（２０１２）も参照のこと。超荷電タンパク質の方法は、本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系の送達に使用及び／又は応用することができる。Ｄｒ．Ｌｕｉ及び本明細書における文献のこれらの系を本明細書における教示と併せて１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系又はその１つ又は複数の構成成分又はそれをコードする１つ又は複数の核酸分子の送達に用いることができる。
【０５７９】
細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）
更に別の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系の送達に細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）が企図される。ＣＰＰは、（ナノサイズ粒子から化学的小分子及び大型ＤＮＡ断片に至るまでの）様々な分子カーゴの細胞取込みを促進する短鎖ペプチドである。用語「カーゴ」は、本明細書で使用されるとき、限定はされないが、治療剤、診断プローブ、ペプチド、核酸、アンチセンスオリゴヌクレオチド、プラスミド、タンパク質、ナノ粒子を含めた粒子、リポソーム、発色団、小分子及び放射性物質からなる群を含む。本発明の態様では、カーゴにはまた、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系の任意の構成成分又は機能性ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系全体も含まれ得る。本発明の態様は、所望のカーゴを対象に送達する方法を更に提供し、この方法は、（ａ）本発明の細胞透過性ペプチドと所望のカーゴとを含む複合体を調製するステップ、及び（ｂ）複合体を対象に経口的に、関節内に、腹腔内に、くも膜下腔内に、動脈内に（ｉｎｔｒａｒｔｅｒｉａｌｌｙ）、鼻腔内に、実質内に、皮下に、筋肉内に、静脈内に、経皮的に、直腸内に、又は局所的に投与するステップを含む。カーゴは、共有結合を介した化学的連結によるか、又は非共有結合性の相互作用によるかのいずれかでペプチドと会合している。
【０５８０】
ＣＰＰの機能は、カーゴを細胞内に送達することであり、これは一般的にはエンドサイトーシスを通じて起こるプロセスであって、カーゴは哺乳類生細胞のエンドソームに送達される。細胞透過性ペプチドのサイズ、アミノ酸配列、及び電荷は様々であるが、全てのＣＰＰが、細胞膜を移行し且つ細胞質又は細胞小器官への様々な分子カーゴの送達を促進する能力である１つの個別的な特徴を有する。ＣＰＰの移行は３つの主な侵入機構に分類し得る：膜における直接の透過、エンドサイトーシスを介する侵入、及び一過性構造の形成を通じた移行。ＣＰＰは、癌及びウイルス阻害薬、並びに細胞標識用の造影剤を含め、種々の疾患の治療におけるドラッグデリバリー剤として医薬において数多くの適用が見出されている。後者の例としては、ＧＦＰ、ＭＲＩ造影剤、又は量子ドットの担体としての働きが挙げられる。ＣＰＰには、研究及び医薬に用いられるインビトロ及びインビボ送達ベクターとして大きな可能性がある。ＣＰＰのアミノ酸組成は、典型的には、リジン又はアルギニンなど正電荷アミノ酸の高い相対存在量を含むか、又は極性／荷電アミノ酸と非極性疎水性アミノ酸との交互のパターンを含む配列を有するかのいずれかである。これらの２つの構造タイプは、それぞれポリカチオン性又は両親媒性と称される。第３のＣＰＰクラスは、非極性残基のみを含む疎水性ペプチドであり、これは正味電荷が低いか又は細胞取込みに重要な疎水性アミノ酸基を有する。発見当初のＣＰＰの一つはヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）由来のトランス活性化転写アクチベーター（Ｔａｔ）であり、これは多数の培養下細胞型によって周囲の培地から効率的に取り込まれることが見出された。それ以降、既知のＣＰＰの数は大幅に増え続け、より有効なタンパク質形質導入特性を有する小分子合成類似体が作成されている。ＣＰＰとしては、限定はされないが、ペネトラチン、Ｔａｔ（４８−６０）、トランスポータン、及び（Ｒ−ＡｈＸ−Ｒ４）（Ａｈｘ＝アミノヘキサノイル）が挙げられる。
【０５８１】
米国特許第８，３７２，９５１号明細書は、高い細胞透過性効率及び低毒性を呈する好酸球カチオン性タンパク質（ＥＣＰ）から送達されるＣＰＰを提供する。ＣＰＰをそのカーゴで脊椎動物対象に送達する態様もまた提供されている。ＣＰＰ及びそれらの送達の更なる態様は、米国特許第８，５７５，３０５号明細書；８；同第６１４，１９４号明細書及び同第８，０４４，０１９号明細書に記載されている。ＣＰＰはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系又はその構成成分の送達に使用することができる。ＣＰＰを用いてＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系又はその構成成分を送達できることはまた、論稿「Ｃａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡの細胞透過性ペプチド媒介送達による遺伝子破壊（Ｇｅｎｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｃａｓ９    ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ）」，Ｓｕｒｅｓｈ  Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ，Ａｂｕ−Ｂｏｎｓｒａｈ  Ｋｗａｋｕ  Ｄａｄ，Ｊａｇａｄｉｓｈ  Ｂｅｌｏｏｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２０１４  Ａｐｒ  ２．［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］（全体として参照により援用される）にも提供されており、ここでは、ＣＰＰコンジュゲート組換えＣａｓ９タンパク質及びＣＰＰ複合体化ガイドＲＮＡによる処理が、ヒト細胞株における内因性遺伝子破壊につながることが実証されている。この論文では、Ｃａｓ９タンパク質はチオエーテル結合によってＣＰＰにコンジュゲートされた一方、ガイドＲＮＡはＣＰＰと複合体化され、縮合した正電荷粒子を形成した。胚性幹細胞、皮膚線維芽細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨｅＬａ細胞、及び胚性癌腫細胞を含めたヒト細胞を改変Ｃａｓ９及びガイドＲＮＡで同時に及び逐次的に処理すると、プラスミドトランスフェクションと比べてオフターゲット突然変異が低下した効率的な遺伝子破壊につながったことが示された。
【０５８２】
植込み型デバイス
別の実施形態において、植込み型デバイスもまた、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系又はその１つ又は複数の構成成分又はそれをコードする１つ又は複数の核酸分子の送達に企図される。例えば、米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書は、薬物を局所的に長時間溶出する植込み型医療器具を、幾つかのタイプのかかるデバイス、治療の実施態様及び植え込み方法を含めて開示しており、それが提供される。デバイスは、例えばデバイス本体として用いられるマトリックスなどのポリマー基質、及び薬物、及び場合によっては金属又は更なるポリマーなどの追加的な足場材料、及び可視性及びイメージングを増強する材料を含む。植込み型送達デバイスは局所的な長期間にわたる放出を提供するのに有利であってよく、ここで薬物は、腫瘍、炎症、変性などの罹患範囲の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に直接又は症候性の対象のため、又は損傷した平滑筋細胞に、又は予防のため放出される。薬物の一種は上記に開示されるとおりＲＮＡであり、このシステムは本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系に使用及び／又は応用することができる。一部の実施形態において植え込み方法は、小線源照射療法及び針生検を含め、現在他の治療向けに開発及び使用されている既存の植え込み手技である。そのような場合、この発明に記載される新規インプラントの寸法は、元のインプラントと同様である。典型的には、同じ治療手技中に数個のデバイスが植え込まれる。
【０５８３】
米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書は、例えば任意選択でマトリックスであってもよい生体安定性及び／又は分解性及び／又は生体吸収性ポリマー基質を含む、腹腔などの体腔及び／又は薬物送達システムが繋留されたり又は付着したりしない任意の他のタイプの投与に適用可能なシステムを含め、薬物送達植込み型又は挿入型システムを提供する。用語「挿入」にはまた、植込みも含まれることに留意しなければならない。薬物送達システムは、好ましくは米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書に記載されるとおりの「Ｌｏｄｅｒ」として植え込まれる。
【０５８４】
ポリマー又は複数のポリマーが生体適合性であり、薬剤及び／又は複数の薬剤を取り入れ、及び制御された速度での薬剤の放出を可能にし、ここでマトリックスなどのポリマー基質の総容積は、例えば、一部の実施形態では、任意選択で及び好ましくは、治療レベルの薬剤の放出を可能にする最大容積以下である。非限定的な例として、かかる容積は、薬剤負荷容積による必要に応じて好ましくは０．１  ｍ３〜１０００ｍｍ３の範囲内である。Ｌｏｄｅｒは、任意選択で、例えば及び限定なしに膝関節、子宮内又は子宮頸部リングなど、そのサイズが機能によって決まるデバイスで例えば取り込まれるとき、より大きくてもよい。
【０５８５】
薬物送達システム（組成物を送達するための）は、一部の実施形態において、好ましくは分解性ポリマーを用いるように設計され、ここで主な放出機構はバルク侵食である；又は一部の実施形態において、非分解性の、又は徐々に分解されるポリマーが使用され、ここで主な放出機構はバルク侵食よりむしろ拡散であり、従って外側部分が膜として機能し、及びその内側部分が、実質的に長期間にわたって（例えば約１週間〜約数ヵ月）周囲からの影響を受けない薬物リザーバとして機能する。異なる放出機構を有する異なるポリマーの組み合わせもまた、任意選択で用いられ得る。表面の濃度勾配は、好ましくは相当な期間の全薬物放出期間にわたって事実上一定に維持され、従って拡散速度は事実上一定である（「ゼロモード」拡散と呼ばれる）。用語「一定」とは、好ましくは治療有効性の下限閾値より高く維持されるが、しかしなおも任意選択で初期バーストを特徴とし得るか、及び／又は変動し得る、例えば一定限度増加及び減少し得る拡散速度が意味される。拡散速度は、好ましくは長期間そのように維持され、及び治療上有効な期間、例えば有効なサイレンシング期間を最適化するのに特定のレベルで一定であると見なすことができる。
【０５８６】
薬物送達システムは、本質的に化学的であるか、それとも酵素及び対象の体内にある他の因子からの攻撃に起因するかに関わらず、任意選択で及び好ましくは分解からヌクレオチドベースの治療剤を遮蔽するように設計される。
【０５８７】
米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書の薬物送達システムは、例えば任意選択で、限定はされないが、熱的加熱及び冷却、レーザービーム、及び集束超音波を含めた超音波及び／又はＲＦ（高周波）による方法又はデバイスを含め、非侵襲性及び／又は最小侵襲性の起動及び／又は加速／速度方法によって任意選択でデバイスの植込み時及び／又は植込み後に動作させる検知及び／又は起動器具と関連付けられる。
【０５８８】
米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書の一部の実施形態によれば、局所送達部位には、任意選択で、腫瘍、自己免疫疾患状態を含めた活性化及び／又は慢性的炎症及び感染、筋肉及び神経組織を含めた変性組織、慢性痛、変性部位、及び骨折箇所及び組織の再生強化のための他の創傷箇所、及び傷害された心筋、平滑筋及び横紋筋を含め、細胞の高度な異常増殖、及び抑制されたアポトーシスによって特徴付けられる標的部位が含まれ得る。
【０５８９】
組成物の植込み部位、又は標的部位は、好ましくは標的局所送達に十分に小さい半径、面積及び／又は容積を特徴とする。例えば、標的部位は任意選択で約０．１ｍｍ〜約５ｃｍの範囲の直径を有する。
【０５９０】
標的部位の位置は、好ましくは治療有効性を最大化するように選択される。例えば、薬物送達システム（任意選択で上記に記載したとおりの植込み用デバイスを伴う）の組成物は、任意選択で及び好ましくは、腫瘍環境、又はそれに関連する血液供給の範囲内又はその近くに植え込まれる。
【０５９１】
例えば組成物（任意選択でデバイスを伴う）は、任意選択で、脈管系の範囲内などでニップルを用いて膵臓、前立腺、乳房、肝臓の範囲内又はその近くに植え込まれる。
【０５９２】
標的の位置は、任意選択で、（任意選択で体内の任意の部位がＬｏｄｅｒの植込みに好適であり得るように、あくまでも非限定的な例として）：１．基底核、白質及び灰白質におけるパーキンソン病又はアルツハイマー病のような変性部位の脳；２．筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の場合のような脊椎；３．ＨＰＶ感染症予防のための子宮頸部；４．活性化及び慢性的炎症関節；５．乾癬の場合のような真皮；６．鎮痛効果のための交感神経及び感覚神経部位；７．骨内植え込み；８．急性及び慢性感染部位；９．腟内；１０．内耳−聴覚系、内耳の迷路、前庭系；１１．気管内；１２．心内；冠動脈、心外膜；１３．膀胱；１４．胆管系；１５．限定されないが、腎臓、肝臓、脾臓を含む実質組織；１６．リンパ節；１７．唾液腺；１８．歯肉；１９．関節内（関節の中）；２０．眼内；２１．脳組織；２２．脳室；２３．腹腔を含む腔（例えば、限定されないが、卵巣癌について）；２４．食道内及び２５．直腸内を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる群から選択される。
【０５９３】
任意選択でシステム（例えば組成物を含有するデバイス）の挿入は、標的部位及び当該部位の近傍におけるＥＣＭへの材料の注射によって、標的部位及びかかる部位の近傍の局所ｐＨ及び／又は温度及び／又はＥＣＭにおける薬物の拡散及び／又は薬物動態に影響を及ぼす他の生物学的因子に影響を及ぼすことを伴う。
【０５９４】
任意選択で、一部の実施形態によれば、前記薬剤の放出は、挿入前及び／又は挿入時及び／又は挿入後に、非侵襲性及び／又は最小侵襲性及び／又は他の起動及び／又は加速／減速方法、例えば、レーザービーム、放射線照射、熱的加熱及び冷却、及び集束超音波を含めた超音波及び／又はＲＦ（高周波）方法又はデバイス、及び化学的アクチベーターによって動作させるアプライアンスを検知及び／又は起動することを伴い得る。
【０５９５】
米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書の他の実施形態によれば、薬物は好ましくは、例えば以下に記載するとおり乳房、膵臓、脳、腎臓、膀胱、肺、及び前立腺における限局性の癌の場合に、ＲＮＡを含む。ＲＮＡｉで例示されるが、多くの薬物がＬｏｄｅｒへの封入に適用可能であり、かかる薬物を、例えばマトリックスなど、Ｌｏｄｅｒ基質で封入することができる限り、この発明に関連して使用することができ、このシステムは本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系の送達に使用及び／又は応用することができる。
【０５９６】
特定の適用の別の例として、異常な遺伝子発現に起因して神経及び筋肉変性疾患が発生する。ＲＮＡの局所送達は、かかる異常な遺伝子発現に干渉する治療特性を有し得る。小薬物及び巨大分子を含めた抗アポトーシス、抗炎症性及び抗変性薬物の局所送達もまた、場合により治療効果があり得る。そのような場合、Ｌｏｄｅｒは、一定の速度での及び／又は別途植え込まれる専用のデバイスを介した長期放出に適用される。これは全て、本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系に使用及び／又は応用することができる。
【０５９７】
特定の適用の更に別の例として、精神障害及び認知障害が遺伝子修飾薬で治療される。遺伝子ノックダウンは治療の選択肢である。薬剤を中枢神経系部位に局所的に送達するＬｏｄｅｒは、限定はされないが、精神病、双極性疾患、神経症性障害及び行動疾患を含めた精神障害及び認知障害に対する治療選択肢である。Ｌｏｄｅｒはまた、特定の脳部位における植込み時に小薬物及び巨大分子を含めた薬物を局所的に送達することもできる。これは全て、本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系に使用及び／又は応用することができる。
【０５９８】
特定の適用の別の例として、局所部位における自然及び／又は適応免疫メディエーターのサイレンシングにより、移植臓器拒絶反応の予防が可能となる。移植臓器及び／又は移植部位に植え込まれたＬｏｄｅｒによるＲＮＡ及び免疫調節試薬の局所送達が、移植臓器に対して活性化したＣＤ８などの免疫細胞を撃退することにより局所免疫抑制を与える。これは全て、本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系に使用及び／又は応用することができる。
【０５９９】
特定の適用の別の例として、ＶＥＧＦ及びアンジオゲニンなどを含む血管成長因子は、血管新生に不可欠である。因子、ペプチド、ペプチド模倣体の局所送達、又はそれらのリプレッサーの抑制は、重要な治療モダリティである；Ｌｏｄｅｒによるリプレッサーのサイレンシング並びに血管新生を刺激する因子、ペプチド、巨大分子及び小薬物の局所送達は、末梢、全身及び心血管疾患に治療効果がある。
【０６００】
植込みなどの挿入方法は、任意選択で、かかる方法において任意選択で改変なしに、或いは任意選択で重要でない改変のみを伴い、他のタイプの組織移植及び／又は挿入及び／又は組織試料採取に既に用いられているものであってもよい。かかる方法としては、任意選択で、限定はされないが、小線源照射療法、生検、ＥＲＣＰなどの、超音波を伴う及び／又は伴わない内視鏡検査、脳組織への定位的方法、関節、腹部器官、膀胱壁及び体腔への腹腔鏡の植え込みを含む腹腔鏡検査が挙げられる。
【０６０１】
本明細書において考察される植込み型デバイス技術は、本明細書における教示と共に用いることができ、従ってこの開示及び当該技術分野における知識により、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系又はその構成成分又は構成成分をコードするか又はそれを提供するその核酸分子を植込み型デバイスによって送達し得る。
【０６０２】
患者特異的スクリーニング方法
ＤＮＡ、例えばトリヌクレオチドリピートを標的とする核酸ターゲティング系を使用して、かかるリピートの存在に関して患者又は患者の試料をスクリーニングすることができる。このリピートは核酸ターゲティング系のＲＮＡの標的であることができ、その核酸ターゲティング系によるこのリピートへの結合がある場合、当該の結合を検出して、それによりかかるリピートの存在を示すことができる。従って、核酸ターゲティング系を使用して、リピートの存在に関して患者又は患者試料をスクリーニングすることができる。次に、患者に好適な１つ又は複数の化合物を投与して状態に対応し得る；又は、核酸ターゲティング系を投与して結合させ、挿入、欠失、又は突然変異を生じさせて、状態を緩和し得る。
【０６０３】
本発明は核酸を使用して標的ＤＮＡ配列を結合する。
【０６０４】
ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡ
ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡはまた、別々に送達されてもよい。ＣＲＩＳＰＲ酵素に発現する時間を与えるため、ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡをガイドＲＮＡより先に送達してもよい。ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡはガイドＲＮＡ投与の１〜１２時間前（好ましくは約２〜６時間前）に投与されてもよい。
【０６０５】
或いは、ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡは一緒に投与されてもよい。有利には、ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ＋ガイドＲＮＡの初回投与から１〜１２時間後（好ましくは約２〜６時間後）にガイドＲＮＡの第２のブースター用量が投与されてもよい。
【０６０６】
本発明のＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、即ちＣｐｆ１エフェクタータンパク質は、時に本明細書においてＣＲＩＳＰＲ酵素と称される。エフェクタータンパク質は酵素をベースとし又はそれに由来し、従って一部の実施形態において用語「エフェクタータンパク質」は必ず「酵素」を含むことが理解されるであろう。しかしながら、また、エフェクタータンパク質は一部の実施形態において必要に応じてＤＮＡ又はＲＮＡ結合を有し得るが、デッドＣａｓエフェクタータンパク質機能を含め、必ずしも切断又はニッキング活性を有するとは限らないことも理解されるであろう。
【０６０７】
ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及び／又はガイドＲＮＡの追加の投与は、最も効率的なゲノム改変レベルを達成するのに有用であり得る。一部の実施形態において、特に治療方法の中で遺伝性疾患が標的化されるとき、好ましくは表現型の変化がゲノム改変の結果であり、好ましくはここで表現型を修正し又は変化させるため修復鋳型が提供される。
【０６０８】
一部の実施形態において、標的となり得る疾患としては、疾患を引き起こすスプライス欠損に関係しているものが挙げられる。
【０６０９】
一部の実施形態において、細胞標的としては、造血幹／前駆細胞（ＣＤ３４＋）；ヒトＴ細胞；及び眼（網膜細胞）−例えば光受容前駆細胞が挙げられる。
【０６１０】
一部の実施形態において、遺伝子標的としては、ヒトβグロビン−ＨＢＢ（鎌状赤血球貧血の治療用、遺伝子変換の（内因性鋳型として近縁のＨＢＤ遺伝子を使用した）刺激によることを含む）；ＣＤ３（Ｔ細胞）；及びＣＥＰ９２０−網膜（眼）が挙げられる。
【０６１１】
一部の実施形態において、疾患標的としてはまた、癌；鎌状赤血球貧血（点突然変異に基づく）；ＨＩＶ；β−サラセミア；及び眼科的疾患又は眼疾患−例えばレーベル先天黒内障（ＬＣＡ）を引き起こすスプライス欠損も挙げられる。
【０６１２】
一部の実施形態において、送達方法には、酵素−ガイド複合体（リボ核タンパク質）のカチオン性脂質媒介性「直接」送達及びプラスミドＤＮＡの電気穿孔が含まれる。
【０６１３】
本発明の方法は、ｄｓＯＤＮ又はｓｓＯＤＮ（以下参照）であってもよい修復鋳型などの鋳型の送達を更に含むことができる。鋳型の送達は、ＣＲＩＳＰＲ酵素又はガイドの一部又は全部の送達と同時であっても又は別個であってもよく、且つ同じ又は異なる送達機構によってもよい。一部の実施形態において、鋳型はガイドと共に、好ましくはＣＲＩＳＰＲ酵素もまた共に送達されることが好ましい；一例はＡＡＶベクターであってもよい。
【０６１４】
本発明の方法は、（ａ）前記二本鎖切断によって生じたオーバーハングに相補的なオーバーハングを含む二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）を細胞に送達するステップであって、前記ｄｓＯＤＮが目的の遺伝子座に組み込まれるステップ；又は−（ｂ）一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）を細胞に送達するステップであって、前記ｓｓＯＤＮが前記二本鎖切断の相同依存性修復の鋳型として働くステップを更に含むことができる。本発明の方法は個体の疾患の予防又は治療方法であってもよく、任意選択で前記疾患は前記目的の遺伝子座の欠陥によって引き起こされる。本発明の方法は個体においてインビボで行うか又は個体から採取した細胞上でエキソビボで行うことができ、任意選択で前記細胞は個体に戻される。
【０６１５】
毒性及びオフターゲット効果を最小限に抑えるため、送達されるＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡの濃度を制御することが重要となり得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡの最適濃度は、細胞モデル又は動物モデルにおける種々の濃度の試験、及びディープシーケンシングを用いた潜在的なオフターゲットゲノム遺伝子座における改変の程度の分析によって決定することができる。例えば、ヒトゲノムのＥＭＸ１遺伝子の５’−ＧＡＧＴＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ−３’（配列番号２３）を標的化するガイド配列について、ディープシーケンシングを用いて以下の２つのオフターゲット遺伝子座における改変レベルを評価することができる、１：５’−ＧＡＧＴＣＣＴＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡ−３’（配列番号２４）及び２：５’−ＧＡＧＴＣＴＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ−３’（配列番号２５）。最も高いレベルのオンターゲット改変をもたらす一方でオフターゲット改変レベルを最小限に抑える濃度が、インビボ送達に選択されるべきである。
【０６１６】
誘導性系
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は誘導性系の一成分を形成し得る。この系の誘導可能な性質により、エネルギーの形態を用いた遺伝子編集又は遺伝子発現の時空間的制御が可能となり得る。エネルギーの形態としては、限定はされないが、電磁放射線、音響エネルギー、化学エネルギー及び熱エネルギーを挙げることができる。誘導性系の例には、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｔｅｔ−Ｏｎ又はＴｅｔ−Ｏｆｆ）、小分子２ハイブリッド転写活性化システム（ＦＫＢＰ、ＡＢＡ等）、又は光誘導性系（フィトクロム、ＬＯＶドメイン、又はクリプトクロム）が含まれる。一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、配列特異的に転写活性の変化を導く光誘導性転写エフェクター（ＬＩＴＥ）の一部であり得る。光の構成成分には、ＣＲＩＳＰＲ酵素、光応答性シトクロムヘテロ二量体（例えばシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来）、及び転写活性化／抑制ドメインが含まれ得る。誘導性ＤＮＡ結合タンパク質及びその使用方法の更なる例は、米国仮特許出願第６１／７３６，４６５号明細書及び米国仮特許出願第６１／７２１，２８３号明細書、及び国際公開第２０１４／０１８４２３  Ａ２号パンフレット（本明細書によって全体として参照により援用される）に提供される。
【０６１７】
自己不活性化システム
細胞内のゲノムにおける遺伝子の全てのコピーが編集された後は、それ以上当該細胞においてＣＲＩＳＲＰ／Ｃｐｆ１ｐ発現が続行する必要はない。実際、発現が持続すれば、意図しないゲノム部位でオフターゲット効果が起こる場合等、望ましくないこともある。従って時限的発現が有用となり得る。誘導性発現は一つの手法を提供するが、更に本出願人らは、ＣＲＩＳＰＲベクターそれ自体の中の非コードガイド標的配列の使用に頼る自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ系をエンジニアリングしている。従って、発現開始後、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系はそれ自体の破壊をもたらし得るが、しかし破壊が完了する前に、標的遺伝子のゲノムコピーを編集する時間があり得る（二倍体細胞における通常の点突然変異では、これに必要となるのは高々２つの編集である）。単純に、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、ＣＲＩＳＰＲ酵素それ自体のコード配列を標的化するか、又は以下の１つ以上に存在するユニーク配列に相補的な１つ以上の非コードガイド標的配列を標的化する追加的なＲＮＡ（即ち、ガイドＲＮＡ）を含む：
（ａ）非コードＲＮＡエレメントの発現を駆動するプロモーター内、
（ｂ）Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質遺伝子の発現を駆動するプロモーター内、
（ｃ）Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質コード配列におけるＡＴＧ翻訳開始コドンから１００ｂｐ以内、
（ｄ）例えばＡＡＶゲノムにおける、ウイルス送達ベクターの逆方向末端反復配列（ｉＴＲ）内。
【０６１８】
更に、当該のＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ複合体をコードするベクター、例えば別個のベクター又は同じベクターで送達することができる。別個のベクターにより提供される場合、Ｃａｓ発現を標的化するＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡは、逐次的に又は同時に投与することができる。逐次的に投与される場合、Ｃａｓ発現を標的とするＣＲＩＳＰＲＲＮＡは、例えば遺伝子編集又は遺伝子エンジニアリングが意図されるＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡの後に送達されるべきである。この期間は数分の期間であってもよい（例えば、５分、１０分、２０分、３０分、４５分、６０分）。この期間は数時間の期間であってもよい（例えば、２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、２４時間）。この期間は数日の期間であってもよい（例えば、２日、３日、４日、７日）。この期間は数週の期間であってもよい（例えば、２週間、３週間、４週間）。この期間は数ヵ月の期間であってもよい（例えば、２ヵ月、４ヵ月、８ヵ月、１２ヵ月）。この期間は数年の期間であってもよい（２年、３年、４年）。このようにして、Ｃａｓ酵素は、１つ又は複数の目的のゲノム遺伝子座などの第１の標的にハイブリダイズ可能な第１のｇＲＮＡと会合し、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の所望の１つ又は複数の機能（例えば遺伝子エンジニアリング）を受け持ち；及び続いてＣａｓ酵素は、次にＣａｓ又はＣＲＩＳＰＲカセットの少なくとも一部を含む配列にハイブリダイズ可能な第２のｇＲＮＡと会合し得る。Ｃａｓタンパク質の発現をコードする配列がガイドＲＮＡの標的である場合、酵素は妨げられ、系が自己不活性化する。同じように、本明細書に説明されるとおり、例えばリポソーム、リポフェクション、粒子、微小胞を介して適用されるＣａｓ発現を標的とするＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡが、逐次的又は同時に投与されてもよい。同様に、１つ以上の標的を標的化するために用いられる１つ以上のガイドＲＮＡの不活性化に自己不活性化が用いられ得る。
【０６１９】
一部の態様において、ＣＲＩＳＰＲ酵素開始コドンの下流の配列にハイブリダイゼーション可能なシングルｇＲＮＡが提供され、それによって幾らかの時間の後、ＣＲＩＳＰＲ酵素発現が失われる。一部の態様において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系をコードするポリヌクレオチドの１つ以上のコード又は非コード領域にハイブリダイゼーション可能な１つ以上のｇＲＮＡが提供され、それによって幾らかの時間の後、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の１つ以上、又は場合によっては全てが不活性化する。この系の一部の態様において、及び理論によって制限されることなく、細胞は複数のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体を含むことができ、ここでＣＲＩＳＰＲ複合体の第１のサブセットが、編集しようとする１つ又は複数のゲノム遺伝子座を標的化可能な第１のガイドＲＮＡを含み、及びＣＲＩＳＰＲ複合体の第２のサブセットが、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系をコードするポリヌクレオチドを標的化可能な少なくとも１つの第２のガイドＲＮＡを含み、ここでＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体の第１のサブセットが１つ又は複数の標的ゲノム遺伝子座の編集を媒介し、及びＣＲＩＳＰＲ複合体の第２のサブセットが最終的にＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を不活性化し、それにより細胞における更なるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ発現が不活性化される。
【０６２０】
従って本発明は、真核細胞に送達するための１つ以上のベクターを含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供し、ここで１つ又は複数のベクターは、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ酵素；（ｉｉ）細胞内の標的配列にハイブリダイズ可能な第１のガイドＲＮＡ；（ｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするベクター内の１つ以上の標的配列にハイブリダイズ可能な第２のガイドＲＮＡコードし、細胞内で発現すると：第１のガイドＲＮＡが、細胞内の標的配列への第１のＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導き；第２のガイドＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするベクター内の標的配列への第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導き；ＣＲＩＳＰＲ複合体は、ガイドＲＮＡに結合したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、そのためガイドＲＮＡはその標的配列にハイブリダイズすることができ；及び第２のＣＲＩＳＰＲ複合体はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を不活性化して、細胞によるＣＲＩＳＰＲ酵素の発現の継続を妨げる。
【０６２１】
様々なコード配列（ＣＲＩＳＰＲ酵素及びガイドＲＮＡ）が単一のベクターに含まれてもよく、又は複数のベクターに含まれてもよい。例えば、あるベクター上の酵素及び別のベクター上の様々なＲＮＡ配列をコードすること、又はあるベクター上の酵素及び１つのガイドＲＮＡ、及び別のベクター上の残りのガイドＲＮＡをコードすること、又は任意の他の並べ替えが可能である。一般に、合計１つ又は２つの異なるベクターを使用する系が好ましい。
【０６２２】
複数のベクターを使用する場合、それらを不均衡な数で、及び理想的には、第２のガイドＲＮＡと比べて第１のガイドＲＮＡをコードするベクターを過剰として送達することが可能であり、それによりゲノム編集が起こる機会が得られるまでＣＲＩＳＰＲ系の最終的な不活性化を遅らせる助けとなる。
【０６２３】
第１のガイドＲＮＡは、本明細書の他の部分に記載されるとおり、ゲノム内の任意の目的の標的配列を標的化することができる。第２のガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃｐｆ１酵素をコードするベクター内の配列を標的化し、それにより当該のベクターからの酵素の発現を不活性化する。従ってベクター内の標的配列は発現を不活性化可能でなければならない。好適な標的配列は、例えば、Ｃｐｆ１ｐコード配列の翻訳開始コドンの近傍又はその範囲内、非コード配列内、非コードＲＮＡエレメントの発現をドライブするプロモーター内、Ｃｐｆ１ｐ遺伝子の発現をドライブするプロモーターの範囲内、Ｃａｓコード配列におけるＡＴＧ翻訳開始コドンから１００ｂｐ以内、及び／又は例えばＡＡＶゲノムにおける、ウイルス送達ベクターの逆方向末端反復配列（ｉＴＲ）の範囲内にあり得る。この領域近傍での二本鎖切断はＣａｓコード配列のフレームシフトを引き起こし得るため、タンパク質発現の喪失が生じ得る。「自己不活性化」ガイドＲＮＡの代替的な標的配列は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の発現又はベクターの安定性に必要な調節領域／配列を編集し／不活性化することを目的としたものであり得る。例えば、Ｃａｓコード配列のプロモーターが破壊された場合、転写が阻害又は防止され得る。同様に、ベクターが複製、維持又は安定性用の配列を含む場合、それらを標的化することが可能である。例えば、ＡＡＶベクターにおいて有用な標的配列はｉＴＲ内にある。標的化に有用な他の配列は、プロモーター配列、ポリアデニル化部位（ｐｏｌｙａｄｅｎｌｙａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ）等であり得る。
【０６２４】
更に、ガイドＲＮＡがアレイフォーマットで発現する場合、両方のプロモーターを同時に標的化する「自己不活性化」ガイドＲＮＡにより、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ発現構築物内から介在するヌクレオチドが切り出されることになり、事実上その完全な不活性化につながる。同様に、ガイドＲＮＡが両方のＩＴＲを標的化する場合に、又は２つ以上の他のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ構成成分を同時に標的化する場合に、介在ヌクレオチドが切り出され得る。本明細書に説明されるとおりの自己不活性化は、一般に、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓの調節をもたらすためＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系と共に適用可能である。例えば、本明細書に説明されるとおりの自己不活性化を、本明細書に説明されるとおりの突然変異、例えば増大障害のＣＲＩＳＰＲ修復に適用してもよい。この自己不活性化の結果として、ＣＲＩＳＰＲ修復の活性はあくまでも一過性である。
【０６２５】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓが停止する前に標的ゲノム遺伝子座が編集されることを確実にする手段として、「自己不活性化」ガイドＲＮＡの５’末端（例えば１〜１０ヌクレオチド、好ましくは１〜５ヌクレオチド）への非ターゲティングヌクレオチドの付加を用いてそのプロセシングを遅らせ、及び／又はその効率を改変することができる。
【０６２６】
自己不活性化ＡＡＶ−ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の一態様において、１つ以上の目的のガイドＲＮＡターゲティングゲノム配列（例えば１〜２、１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜３０個）を共発現するプラスミドが、エンジニアリングされたＡＴＧ開始部位又はその近傍（例えば５ヌクレオチド以内、１５ヌクレオチド以内、３０ヌクレオチド以内、５０ヌクレオチド以内、１００ヌクレオチド以内）でＳｐＣａｓ９配列を標的化する「自己不活性化」ガイドＲＮＡを含んで作製され得る。Ｕ６プロモーター領域における調節配列もまた、ガイドＲＮＡで標的化することができる。Ｕ６ドライブ型ガイドＲＮＡは、複数のガイドＲＮＡ配列を同時にリリースすることができるようなアレイフォーマットで設計し得る。初めに標的組織／細胞へと送達されると（細胞を離れた）ガイドＲＮＡが蓄積し始める一方、核内のＣａｓレベルが上昇する。Ｃａｓは全てのガイドＲＮＡと複合体を形成してＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓプラスミドのゲノム編集及び自己不活性化を媒介する。
【０６２７】
自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の一態様は、単独での、又は１〜４個まで又はそれより多い異なるガイド配列；例えば約２０又は約３０個までのガイド配列のタンデム（ｔａｎｄａｍ）アレイフォーマットでの発現である。個別の自己不活性化ガイド配列毎に異なる標的を標的化し得る。これは、例えば１つのキメラｐｏｌ３転写物からプロセシングされ得る。Ｕ６又はＨ１プロモーターなどのＰｏｌ３プロモーターが用いられ得る。本明細書において全体を通して言及されるものなどのＰｏｌ２プロモーター。逆方向末端反復（ｉＴＲ）配列がＰｏｌ３プロモーター−１つ又は複数のガイドＲＮＡ−Ｐｏｌ２プロモーター−Ｃａｓに隣接し得る。
【０６２８】
タンデムアレイ転写物の一態様は、１つ以上のガイドが１つ以上の標的を編集する一方で１つ以上の自己不活性化ガイドがＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を不活性化するというものである。従って、例えば、増大障害を修復するための記載されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を本明細書に記載される自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系と直接組み合わせてもよい。かかる系は、例えば、修復のための標的領域に向けられた２つのガイド並びにＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓの自己不活性化に向けられた少なくとも第３のガイドを有し得る。国際公開第２０１５／０８９３５１号パンフレットとして２０１４年１２月１２日に公開された「ヌクレオチドリピート障害におけるＣｒｉｓｐｒ−Ｃａｓ系の組成物及び使用方法（Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  Ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｏｆ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｃｒｉｓｐｒ−Ｃａｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）」と題される出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６９８９７号明細書が参照される。
【０６２９】
ガイドＲＮＡは制御ガイドであり得る。例えばそれは、米国特許出願公開第２０１５２３２８８１号明細書Ａ１（その開示は本明細書によって参照により援用される）に記載されるとおり、ＣＲＩＳＰＲ酵素それ自体をコードする核酸配列を標的化するようにエンジニアリングされ得る。一部の実施形態において、本系又は組成物には、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列を標的化するようにエンジニアリングされたガイドＲＮＡだけが提供され得る。加えて、本系又は組成物には、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列を標的化するようにエンジニアリングされたガイドＲＮＡ、並びにＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列、及び任意選択で第２のガイドＲＮＡ、及び更に任意選択で修復鋳型が提供され得る。第２のガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ系又は組成物の一次標的であり得る（本明細書に定義するとおり、治療用、診断用、ノックアウト等）。このように、本系又は組成物は自己不活性化する。これは、本明細書の他の部分で参照される米国特許出願公開第２０１５２３２８８１号明細書Ａ１（国際公開第２０１５０７００８３号パンフレット（Ａ１）としても公開されている）にＣａｓ９に関連して例示され、Ｃｐｆ１に当てはめることができる。
【０６３０】
多重（タンデム）ターゲティング手法において用いられる本発明に係る酵素
本発明者らは、本明細書に定義するとおりのＣＲＩＳＰＲ酵素が活性を失うことなく２つ以上のＲＮＡガイドを用い得ることを示している。これにより、本明細書に定義するとおりの単一の酵素、系又は複合体で、複数のＤＮＡ標的、遺伝子又は遺伝子座のターゲティングに本明細書に定義するとおりのＣＲＩＳＰＲ酵素、系又は複合体を使用することが可能となる。ガイドＲＮＡはタンデムに配置されてもよく、任意選択で本明細書に定義するとおりのダイレクトリピートなどのヌクレオチド配列によって分離されていてもよい。これらの異なるガイドＲＮＡの位置はタンデムであり、活性に影響を及ぼさない。用語「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系」、「ＣＲＩＳＰ−Ｃａｓ複合体」「ＣＲＩＳＰＲ複合体」及び「ＣＲＩＳＰＲ系」は同義的に使用されることが注記される。また、用語「ＣＲＩＳＰＲ酵素」、「Ｃａｓ酵素」、又は「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ酵素」も同義的に使用することができる。好ましい実施形態において、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素、ＣＲＩＳＰ−Ｃａｓ酵素又はＣａｓ酵素はＣｐｆ１であり、又は本明細書の他の部分に記載される改変した又は突然変異させたその変異体のいずれか一つである。
【０６３１】
一態様において、本発明は、タンデム又は多重ターゲティングに使用される天然に存在しない又はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ酵素、好ましくはクラス２  ＣＲＩＳＰＲ酵素、好ましくは本明細書に記載されるとおりのＶ型又はＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、限定なしに、本明細書の他の部分に記載されるとおりのＣｐｆ１を提供する。本明細書の他の部分に記載されるとおりの本発明に係るＣＲＩＳＰＲ（又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ又はＣａｓ）酵素、複合体、又は系のいずれも、かかる手法に使用し得ることが理解されるべきである。本明細書の他の部分に記載されるとおりの方法、産物、組成物及び使用のいずれも、以下に更に詳述する多重又はタンデムターゲティング手法で等しく適用可能である。更なる指針として、以下の詳細な態様及び実施形態を提供する。
【０６３２】
一態様において、本発明は、複数の遺伝子座を標的化するための、本明細書に定義するとおりのＣｐｆ１酵素、複合体又は系の使用を提供する。一実施形態において、これは、複数の（タンデム又は多重）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列を使用することによって構築し得る。
【０６３３】
一態様において、本発明は、タンデム又は多重ターゲティングへの本明細書に定義するとおりのＣｐｆ１酵素、複合体又は系の１つ以上のエレメントの使用方法を提供し、ここで前記ＣＲＩＳＰ系は複数のガイドＲＮＡ配列を含む。好ましくは、前記ｇＲＮＡ配列は、本明細書の他の部分に定義するとおりのダイレクトリピートなどのヌクレオチド配列によって分離されている。
【０６３４】
本明細書に定義するとおりのＣｐｆ１酵素、系又は複合体は、複数の標的ポリヌクレオチドを改変する有効な手段を提供する。本明細書に定義するとおりのＣｐｆ１酵素、系又は複合体は、非常に多数の細胞型において１つ以上の標的ポリヌクレオチドの改変（例えば、欠失、挿入、転位、不活性化、活性化）を含めた多種多様な有用性を有する。そのため本発明の本明細書に定義するとおりのＣｐｆ１酵素、系又は複合体は、単一のＣＲＩＳＰＲ系内で複数の遺伝子座を標的化することを含め、例えば、遺伝子療法、薬物スクリーニング、疾患診断、及び予後判定において、広範な適用性を有する。
【０６３５】
一態様において、本発明は、本明細書に定義するとおりのＣｐｆ１酵素、系又は複合体、即ち、少なくとも１つの不安定化ドメインが会合したＣｐｆ１タンパク質と、ＤＮＡ分子など、複数の核酸分子を標的化する複数のガイドＲＮＡであって、それによって各々がその対応する核酸分子、例えばＤＮＡ分子を特異的に標的化する複数のガイドＲＮＡとを有するＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体を提供する。各核酸分子標的、例えばＤＮＡ分子は遺伝子産物をコードし、又は遺伝子座を包含することができる。ひいては複数のガイドＲＮＡを使用することにより、複数の遺伝子座又は複数の遺伝子を標的化することが可能になる。一部の実施形態において、Ｃｐｆ１酵素は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を切断し得る。一部の実施形態において、遺伝子産物の発現が変化する。Ｃｐｆ１タンパク質及びガイドＲＮＡは天然では一緒に存在しない。本発明は、タンデムに配置されたガイド配列を含むガイドＲＮＡを包含する。本発明は更に、真核細胞での発現にコドンが最適化されたＣｐｆ１タンパク質のコード配列を包含する。好ましい実施形態において、真核細胞は哺乳類細胞、植物細胞又は酵母細胞であり、より好ましい実施形態において哺乳類細胞はヒト細胞である。遺伝子産物の発現は減少し得る。Ｃｐｆ１酵素はＣＲＩＳＰＲ系又は複合体の一部を形成してもよく、ＣＲＩＳＰＲ系又は複合体は更に、各々が細胞内の目的のゲノム遺伝子座にある標的配列に特異的にハイブリダイズすることが可能な一連の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２５、２５、３０個、又は３０個超のガイド配列を含むタンデムに配置されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。一部の実施形態において、本機能性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系又は複合体は複数の標的配列に結合する。一部の実施形態において、本機能性ＣＲＩＳＰＲ系又は複合体は複数の標的配列を編集することができ、例えば、標的配列がゲノム遺伝子座を含んでもよく、及び一部の実施形態では遺伝子発現の変化があり得る。一部の実施形態において、本機能性ＣＲＩＳＰＲ系又は複合体は更なる機能ドメインを含み得る。一部の実施形態において、本発明は、複数の遺伝子産物の発現を変化させる又は改変する方法を提供する。本方法は、前記標的核酸、例えばＤＮＡ分子を含有するか、又は標的核酸、例えばＤＮＡ分子を含有して発現する細胞に導入するステップを含んでもよく；例えば、標的核酸は遺伝子産物をコードするか、又は遺伝子産物の発現を提供し得る（例えば調節配列）。
【０６３６】
好ましい実施形態において、多重ターゲティングに使用されるＣＲＩＳＰＲ酵素はＣｐｆ１であり、又はＣＲＩＳＰＲ系又は複合体がＣｐｆ１を含む。一部の実施形態において、多重ターゲティングに使用されるＣＲＩＳＰＲ酵素はＡｓＣｐｆ１であり、又は多重ターゲティングに使用されるＣＲＩＳＰＲ系又は複合体がＡｓＣｐｆ１を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＬｂＣｐｆ１であり、又はＣＲＩＳＰＲ系又は複合体がＬｂＣｐｆ１を含む。一部の実施形態において、多重ターゲティングに使用されるＣｐｆ１酵素はＤＮＡの両方の鎖を切断して二本鎖切断（ＤＳＢ）を作り出す。一部の実施形態において、多重ターゲティングに使用されるＣＲＩＳＰＲ酵素はニッカーゼである。一部の実施形態において、多重ターゲティングに使用されるＣｐｆ１酵素はデュアルニッカーゼである。一部の実施形態において、多重ターゲティングに使用されるＣｐｆ１酵素は、本明細書の他の部分に定義するとおりのＤＤ  Ｃｐｆ１酵素などのＣｐｆ１酵素である。
【０６３７】
一部の一般的な実施形態において、多重ターゲティングに使用されるＣｐｆ１酵素は１つ以上の機能ドメインと会合される。一部のより具体的な実施形態において、多重ターゲティングに使用されるＣＲＩＳＰＲ酵素は、本明細書の他の部分に定義するとおりのデッドＣｐｆ１である。
【０６３８】
ある態様において、本発明は、本明細書に定義するとおりのマルチターゲティングに用いられるＣｐｆ１酵素、系若しくは複合体又は本明細書に定義されるポリヌクレオチドを送達する手段を提供する。かかる送達手段の非限定的な例は、例えば、複合体の１つ又は複数の構成成分を送達する１つ又は複数の粒子、本明細書で考察される１つ又は複数のポリヌクレオチド（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードし、ＣＲＩＳＰＲ複合体をコードするヌクレオチドを提供する）を含む１つ又は複数のベクターである。一部の実施形態において、ベクターはプラスミド又はウイルスベクター、例えばＡＡＶ、又はレンチウイルスであってもよい。特に、ＡＡＶのサイズ制限、及びＣｐｆ１がＡＡＶに収まる一方で追加のガイドＲＮＡによって上限に達し得ることを所与とすれば、プラスミドによる例えばＨＥＫ細胞への一過性トランスフェクションが有利であり得る。
【０６３９】
また、多重ターゲティングに用いられる本明細書で使用されるとおりのＣｐｆ１酵素、複合体又は系を構成的に発現するモデルも提供される。生物はトランスジェニックであってもよく、本ベクターをトランスフェクトされていてもよく、又はそのようにトランスフェクトされた生物の子孫であってもよい。更なる態様において、本発明は、本明細書に定義するとおりのＣＲＩＳＰＲ酵素、系及び複合体を含む組成物又は本明細書に記載されるポリヌクレオチド若しくはベクターを提供する。また、複数のガイドＲＮＡを好ましくはタンデム配置のフォーマットで含むＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系又は複合体も提供される。前記異なるガイドＲＮＡは、ダイレクトリピートなどのヌクレオチド配列によって分離されていてもよい。
【０６４０】
また、対象、例えばそれを必要としている対象を治療する方法も提供され、この方法は、Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系若しくは複合体をコードするポリヌクレオチド又は本明細書に記載される任意のポリヌクレオチド若しくはベクターで対象を形質転換してそれらを対象に投与することにより遺伝子編集を誘導するステップを含む。好適な修復鋳型もまた提供されてよく、これは例えば、前記修復鋳型を含むベクターによって送達される。また、対象、例えばそれを必要としている対象を治療する方法も提供され、この方法は、本明細書に記載されるポリヌクレオチド又はベクターで対象を形質転換することにより複数の標的遺伝子座の転写活性化又は抑制を誘導するステップを含み、前記ポリヌクレオチド又はベクターは、好ましくはタンデムに配置された複数のガイドＲＮＡを含むＣｐｆ１酵素、複合体又は系をコードするか又はそれを含む。任意の治療がエキソビボで、例えば細胞培養下で行われる場合、用語「対象」を語句「細胞又は細胞培養物」によって置き換え得ることが理解されるであろう。
【０６４１】
本明細書の他の部分に定義するとおりの治療方法に用いられる、好ましくはタンデムに配置された複数のガイドＲＮＡを含むＣｐｆ１酵素、複合体又は系を含むか、又は好ましくはタンデムに配置された複数のガイドＲＮＡを含む前記Ｃｐｆ１酵素、複合体又は系をコードするか又はそれを含むポリヌクレオチド又はベクターを含む組成物もまた提供される。かかる組成物を含むキット・オブ・パーツが提供されてもよい。かかる治療方法のための医薬の製造における前記組成物の使用もまた提供される。スクリーニング、例えば機能獲得スクリーニングにおけるＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系の使用もまた本発明によって提供される。遺伝子を過剰発現するように人工的に強制された細胞は、時間とともに遺伝子を例えば負のフィードバックループによって下方制御する（平衡を取り戻す）ことが可能である。スクリーニングの開始時までに、未制御の遺伝子は再び減少し得る。誘導性Ｃｐｆ１アクチベーターを使用すると、スクリーニングの直前に転写を誘導することが可能であり、従って偽陰性ヒットの可能性が最小限となる。従って、スクリーニング、例えば機能獲得スクリーニングにおいて本発明を用いることにより、偽陰性結果の可能性を最小限に抑え得る。
【０６４２】
一態様において、本発明は、Ｃｐｆ１タンパク質と、細胞内の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を各々が特異的に標的化する複数のガイドＲＮＡとを含むエンジニアリングされた天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ系を提供し、それによって複数のガイドＲＮＡが、各々、遺伝子産物をコードするその特異的なＤＮＡ分子を標的化し、Ｃｐｆ１タンパク質が、遺伝子産物をコードする標的ＤＮＡ分子を切断し、それによって遺伝子産物の発現が変化し；及び、ここでＣＲＩＳＰＲタンパク質及びガイドＲＮＡは天然では一緒に存在しない。本発明は、好ましくはダイレクトリピートなどのヌクレオチド配列によって分離された、複数のガイド配列を含む複数のガイドＲＮＡを包含する。本発明のある実施形態において、ＣＲＩＳＰＲタンパク質はＶ型又はＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質であり、より好ましい実施形態においてＣＲＩＰＳＲタンパク質はＣｐｆ１タンパク質である。本発明は更に、真核細胞での発現にコドンが最適化されたＣｐｆ１タンパク質を包含する。好ましい実施形態において真核細胞は哺乳類細胞であり、より好ましい実施形態において哺乳類細胞はヒト細胞である。本発明の更なる実施形態において、遺伝子産物の発現は減少する。
【０６４３】
別の態様において、本発明は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を各々が特異的に標的化する複数のＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系ガイドＲＮＡに作動可能に連結された第１の調節エレメントと、ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする作動可能に連結された第２の調節エレメントとを含む１つ以上のベクターを含むエンジニアリングされた天然に存在しないベクター系を提供する。両方の調節エレメントとも、系の同じベクター上に位置しても、又は異なるベクター上に位置してもよい。複数のガイドＲＮＡが、細胞内の複数の遺伝子産物をコードする複数のＤＮＡ分子を標的化し、ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、遺伝子産物をコードする複数のＤＮＡ分子を切断することができ（これは一方又は両方の鎖を切断し得るか、又は実質的にヌクレアーゼ活性を有しないこともある）、それによって複数の遺伝子産物の発現が変化し；及び、ここでＣＲＩＳＰＲタンパク質及び複数のガイドＲＮＡは天然では一緒に存在しない。好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、任意選択で真核細胞での発現にコドン最適化された、Ｃｐｆ１タンパク質である。好ましい実施形態において、真核細胞は哺乳類細胞、植物細胞又は酵母細胞であり、より好ましい実施形態において哺乳類細胞はヒト細胞である。本発明の更なる実施形態において、複数の遺伝子産物の各々の発現が変化し、好ましくは減少する。
【０６４４】
一態様において、本発明は、１つ以上のベクターを含むベクター系を提供する。一部の実施形態において、この系は、（ａ）ダイレクトリピート配列と、ダイレクトリピート配列の上流又は下流（いずれか適用可能な方）に１つ以上のガイド配列を挿入するための１つ以上の挿入部位とに作動可能に連結された第１の調節エレメント（１つ以上のガイド配列は、発現すると、真核細胞内の１つ以上の標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導き、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、１つ以上の標的配列にハイブリダイズする１つ以上のガイド配列と複合体を形成したＣｐｆ１酵素を含む）；及び（ｂ）好ましくは少なくとも１つの核局在化配列及び／又は少なくとも１つのＮＥＳを含む、前記Ｃｐｆ１酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に連結された第２の調節エレメント、を含み；ここで構成成分（ａ）及び（ｂ）は系の同じ又は異なるベクター上に位置する。一部の実施形態において、構成成分（ａ）は、第１の調節エレメントに作動可能に連結された２つ以上のガイド配列を更に含み、これらの２つ以上のガイド配列の各々は、発現すると、真核細胞内の異なる標的配列へのＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導く。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、真核細胞の核内又は核外に検出可能な量の前記Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ複合体の蓄積をドライブするのに十分な強度の１つ以上の核局在化配列及び／又は１つ以上のＮＥＳを含む。一部の実施形態において、第１の調節エレメントはポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。一部の実施形態において、第２の調節エレメントはポリメラーゼＩＩプロモーターである。一部の実施形態において、ガイド配列の各々は少なくとも１６、１７、１８、１９、２０、２５ヌクレオチド、又は１６〜３０、又は１６〜２５、又は１６〜２０ヌクレオチド長である。
【０６４５】
組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に好適な形態の（これはつまり、組換え発現ベクターが、発現させる核酸配列に作動可能に連結された、発現に使用する宿主細胞に基づき選択され得る１つ以上の調節エレメントを含むことを意味する）本明細書に定義するとおりのマルチターゲティングに用いられるＣｐｆ１酵素、系又は複合体をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。組換え発現ベクターの範囲内で、「作動可能に連結された」は、ヌクレオチド配列の（例えば、インビトロ転写／翻訳系における、又はベクターが宿主細胞に導入される場合に宿主細胞における）発現が可能となる形で目的のヌクレオチド配列が１つ又は複数の調節エレメントに連結されていることを意味するように意図される。
【０６４６】
一部の実施形態において、宿主細胞には、本明細書に定義するとおりのマルチターゲティングに用いられるＣｐｆ１酵素、系又は複合体をコードするポリヌクレオチドを含む１つ以上のベクターが一過性に又は非一過性にトランスフェクトされる。一部の実施形態において、細胞は、それが対象に天然に存在するとおりトランスフェクトされる。一部の実施形態において、トランスフェクトされる細胞は対象から採取される。一部の実施形態において、細胞は、細胞株など、対象から採取された細胞に由来する。組織培養用の多種多様な細胞株が当該技術分野において公知であり、本明細書の他の部分に例示される。細胞株は、当業者に公知の種々の供給元から入手可能である（例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓｕｓ，Ｖａ．）を参照）。一部の実施形態において、本明細書に定義するとおりのマルチターゲティングに用いられるＣｐｆ１酵素、系又は複合体をコードするポリヌクレオチドを含む１つ以上のベクターをトランスフェクトされた細胞を使用して、１つ以上のベクター由来配列を含む新規細胞株が樹立される。一部の実施形態において、本明細書に記載されるとおりのマルチターゲティングに用いられるＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系又は複合体の構成成分を（１つ以上のベクターの一過性トランスフェクション、又はＲＮＡによるトランスフェクションによるなどして）一過性にトランスフェクトされた、且つＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系又は複合体の活性によって改変された細胞を使用して、改変を含むがいかなる他の外因性配列も欠く細胞を含む新規細胞株が樹立される。一部の実施形態において、本明細書に定義するとおりのマルチターゲティングに用いられるＣｐｆ１酵素、系又は複合体をコードするポリヌクレオチドを含む１つ以上のベクターを一過性に又は非一過性にトランスフェクトされた細胞、又はかかる細胞に由来する細胞株を使用して、１つ以上の試験化合物が評価される。
【０６４７】
用語「調節エレメント」は、本明細書の他の部分に定義するとおりである。
【０６４８】
有利なベクターとしては、レンチウイルス及びアデノ随伴ウイルスが挙げられ、かかるベクターのタイプもまた、特定のタイプの細胞を標的化するように選択することができる。
【０６４９】
一態様において、本発明は、（ａ）ダイレクトリピート配列と、ダイレクトリピート配列の上流又は下流（いずれか適用可能な方）に１つ以上のガイドＲＮＡ配列を挿入するための１つ以上の挿入部位とに作動可能に連結された第１の調節エレメント（１つ又は複数のガイド配列は、発現すると、真核細胞内のそれぞれの１つ又は複数の標的配列へのＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導き、ここでＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ複合体は、それぞれの１つ又は複数の標的配列にハイブリダイズする１つ以上のガイド配列と複合体を形成したＣｐｆ１酵素を含む）；及び／又は（ｂ）好ましくは少なくとも１つの核局在化配列及び／又はＮＥＳを含む前記Ｃｐｆ１酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に連結された第２の調節エレメントを含む真核生物宿主細胞を提供する。一部の実施形態において、この宿主細胞は構成成分（ａ）及び（ｂ）を含む。一部の実施形態において、構成成分（ａ）、構成成分（ｂ）、又は構成成分（ａ）及び（ｂ）は、宿主真核細胞のゲノムに安定に組み込まれる。一部の実施形態において、構成成分（ａ）は、第１の調節エレメントに作動可能に連結された、且つ任意選択でダイレクトリピートによって分離されている２つ以上のガイド配列を更に含み、ここでこれらの２つ以上のガイド配列の各々は、発現すると、真核細胞内の異なる標的配列へのＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導く。一部の実施形態において、Ｃｐｆ１酵素は、真核細胞の核内における及び／又は核外への検出可能な量の前記ＣＲＩＳＰＲ酵素の蓄積をドライブするのに十分な強度の１つ以上の核局在化配列及び／又は核外移行配列又はＮＥＳを含む。
【０６５０】
一部の実施形態において、Ｃｐｆ１酵素はＶ型又はＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素である。一部の実施形態において、Ｃｐｆ１酵素はＣｐｆ１酵素である。一部の実施形態において、Ｃｐｆ１酵素は、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）１、野兎病菌亜種ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）、プレボテラ・アルベンシス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ａｌｂｅｎｓｉｓ）、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＣ２０１７  １、ブチリビブリオ・プロテオクラスチカス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ）、ペレグリニバクテリア細菌（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、パルクバクテリア細菌（Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、スミセラ属種（Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ  ｓｐ．）ＳＣＡＤＣ、アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＡ２０２０、カンディダタス・メタノプラズマ・テルミツム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ  ｔｅｒｍｉｔｕｍ）、ユーバクテリウム・エリゲンス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ）、モラクセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ）２３７、レプトスピラ・イナダイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ）、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６、ポルフィロモナス・クレビオリカニス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ）３、プレボテラ・ディシエンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ）、又はポルフィロモナス・マカカエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅ）Ｃｐｆ１に由来し、本明細書の他の部分に定義するとおりのＣｐｆ１の更なる変化又は突然変異を含むことができ、及びキメラＣｐｆ１であってもよい。一部の実施形態において、Ｃｐｆ１酵素は真核細胞での発現にコドン最適化される。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は標的配列の位置における１本又は２本の鎖の切断を導く。一部の実施形態において、第１の調節エレメントはポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。一部の実施形態において、第２の調節エレメントはポリメラーゼＩＩプロモーターである。一部の実施形態において、１つ以上のガイド配列は（各々が）少なくとも１６、１７、１８、１９、２０、２５ヌクレオチド、又は１６〜３０、又は１６〜２５、又は１６〜２０ヌクレオチド長である。複数のガイドＲＮＡが使用される場合、それらは好ましくはダイレクトリピート配列によって分離されている。ある態様において、本発明は、記載される実施形態のいずれかに係る真核生物宿主細胞を含む非ヒト真核生物；好ましくは多細胞真核生物を提供する。他の態様において、本発明は、記載される実施形態のいずれかに係る真核生物宿主細胞を含む真核生物；好ましくは多細胞真核生物を提供する。これらの態様の一部の実施形態における生物は、動物；例えば哺乳類であってもよい。また、生物は、昆虫などの節足動物であってもよい。生物はまた、植物であってもよい。更に、生物は真菌であってもよい。
【０６５１】
一態様において、本発明は、本明細書に記載される構成成分の１つ以上を含むキットを提供する。一部の実施形態において、本キットはベクター系とキットの使用説明書とを含む。一部の実施形態において、ベクター系は、（ａ）ダイレクトリピート配列と、ダイレクトリピート配列の上流又は下流（いずれか適用可能な方）に１つ以上のガイド配列を挿入するための１つ以上の挿入部位とに作動可能に連結された第１の調節エレメント（ガイド配列は、発現すると、真核細胞内の標的配列へのＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導き、ここでＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的配列にハイブリダイズするガイド配列と複合体を形成したＣｐｆ１酵素を含む）；及び／又は（ｂ）核局在化配列を含む前記Ｃｐｆ１酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に連結された第２の調節エレメントを含む。一部の実施形態において、本キットは、系の同じ又は異なるベクター上に位置する構成成分（ａ）及び（ｂ）を含む。一部の実施形態において、構成成分（ａ）は、第１の調節エレメントに作動可能に連結された２つ以上のガイド配列を更に含み、ここでこれらの２つ以上のガイド配列の各々は、発現すると、真核細胞内の異なる標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導く。一部の実施形態において、Ｃｐｆ１酵素は、真核細胞の核内における検出可能な量の前記ＣＲＩＳＰＲ酵素の蓄積をドライブするのに十分な強度の１つ以上の核局在化配列を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＶ型又はＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣｐｆ１酵素である。一部の実施形態において、Ｃｐｆ１酵素は、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）１、野兎病菌亜種ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）、プレボテラ・アルベンシス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ａｌｂｅｎｓｉｓ）、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＣ２０１７  １、ブチリビブリオ・プロテオクラスチカス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ）、ペレグリニバクテリア細菌（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、パルクバクテリア細菌（Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、スミセラ属種（Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ  ｓｐ．）ＳＣＡＤＣ、アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＡ２０２０、カンディダタス・メタノプラズマ・テルミツム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ  ｔｅｒｍｉｔｕｍ）、ユーバクテリウム・エリゲンス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ）、モラクセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ）２３７、レプトスピラ・イナダイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ）、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６、ポルフィロモナス・クレビオリカニス（Ｐｏｒｐｈｙｒ��ｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ）３、プレボテラ・ディシエンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ）、又はポルフィロモナス・マカカエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅ）Ｃｐｆ１（例えば、少なくとも１つのＤＤを有するか又はそれと会合するように改変されている）に由来し、Ｃｐｆ１の更なる変化又は突然変異を含むことができ、及びキメラＣｐｆ１であってもよい。一部の実施形態において、ＤＤ−ＣＲＩＳＰＲ酵素は真核細胞での発現にコドン最適化される。一部の実施形態において、ＤＤ−ＣＲＩＳＰＲ酵素は標的配列の位置における１本又は２本の鎖の切断を導く。一部の実施形態において、ＤＤ−ＣＲＩＳＰＲ酵素はＤＮＡ鎖切断活性を欠いているか、又は実質的に欠いている（例えば、野生型酵素又はヌクレアーゼ活性を減少させる突然変異若しくは変化を有しない酵素と比較したとき５％以下のヌクレアーゼ活性）。一部の実施形態において、第１の調節エレメントはポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。一部の実施形態において、第２の調節エレメントはポリメラーゼＩＩプロモーターである。一部の実施形態において、ガイド配列は少なくとも１６、１７、１８、１９、２０、２５ヌクレオチド、又は１６〜３０、又は１６〜２５、又は１６〜２０ヌクレオチド長である。
【０６５２】
一態様において、本発明は、真核細胞などの宿主細胞における複数の標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、Ｃｐｆ１ＣＲＩＳＰＲ複合体を複数の標的ポリヌクレオチドに結合させて、例えば前記複数の標的ポリヌクレオチドの切断を生じさせ、それにより複数の標的ポリヌクレオチドを改変するステップを含み、ここでＣｐｆ１ＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の特定の標的配列に各々ハイブリダイズする複数のガイド配列と複合体を形成したＣｐｆ１酵素を含み、前記複数のガイド配列はダイレクトリピート配列に連結されている。一部の実施形態において、前記切断は、前記Ｃｐｆ１酵素によって標的配列の各々の位置にある１本又は２本の鎖を切断することを含む。一部の実施形態において、前記切断は複数の標的遺伝子の転写の減少をもたらす。一部の実施形態において、本方法は、前記切断された標的ポリヌクレオチドの１つ以上を外因性鋳型ポリヌクレオチドによる相同組換えによって修復するステップを更に含み、前記修復は、前記標的ポリヌクレオチドの１つ以上における１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、又は置換を含む突然変異をもたらす。一部の実施形態において、前記突然変異は、標的配列の１つ以上を含む遺伝子から発現するタンパク質に１つ以上のアミノ酸変化をもたらす。一部の実施形態において、本方法は、前記真核細胞に１つ以上のベクターを送達するステップを更に含み、ここで１つ以上のベクターは、Ｃｐｆ１酵素及びダイレクトリピート配列に連結された複数のガイドＲＮＡ配列のうちの１つ以上の発現をドライブする。一部の実施形態において、前記ベクターは対象の真核細胞に送達される。一部の実施形態において、前記改変は細胞培養物中の前記真核細胞で起こる。一部の実施形態において、本方法は、前記改変の前に対象から前記真核細胞を単離するステップを更に含む。一部の実施形態において、本方法は、前記真核細胞及び／又はそれに由来する細胞を前記対象に戻すステップを更に含む。
【０６５３】
一態様において、本発明は、真核細胞における複数のポリヌクレオチドの発現を改変する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ複合体を複数のポリヌクレオチドに結合させて、前記結合により前記ポリヌクレオチドの発現の増加又は減少をもたらすステップを含み；ここでＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記ポリヌクレオチド内の固有の標的配列に各々が特異的にハイブリダイズする複数のガイド配列と複合体を形成したＣｐｆ１酵素を含み、前記ガイド配列はダイレクトリピート配列に連結されている。一部の実施形態において、本方法は、前記真核細胞に１つ以上のベクターを送達するステップを更に含み、ここで１つ以上のベクターは、Ｃｐｆ１酵素及びダイレクトリピート配列に連結された複数のガイド配列のうちの１つ以上の発現をドライブする。
【０６５４】
一態様において、本発明は、ダイレクトリピート配列の上流又は下流（いずれか適用可能な方）に複数のガイドＲＮＡ配列を含む組換えポリヌクレオチドを提供し、ここでガイド配列の各々は、発現すると、真核細胞に存在するその対応する標的配列へのＣｐｆ１ＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導く。一部の実施形態において、標的配列は真核細胞に存在するウイルス配列である。一部の実施形態において、標的配列は癌原遺伝子又は癌遺伝子である。
【０６５５】
本発明の態様は、細胞の目的のゲノム遺伝子座にある標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、少なくとも１つ以上の核局在化配列を含み得る本明細書に定義するとおりのＣｐｆ１酵素とを含み得る天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を包含する。
【０６５６】
本発明のある態様は、本明細書に記載される組成物のいずれかを細胞に導入することにより、目的のゲノム遺伝子座を改変して細胞における遺伝子発現を変化させる方法を包含する。
【０６５７】
本発明のある態様は、上記のエレメントが単一の組成物に含まれるか、又は個別の組成物に含まれることである。これらの組成物は、有利には、宿主に適用されるとゲノムレベルで機能的効果を誘発し得る。
【０６５８】
本明細書で使用されるとき、用語「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」は本明細書の他の部分で使用されるとおりの意味（ｌｅａｎｉｎｇ）を有し、標的核酸配列とハイブリダイズして標的核酸配列への核酸ターゲティング複合体の配列特異的結合を導くのに十分な標的核酸配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列を含む。各ｇＲＮＡは、同じ又は異なるアダプタータンパク質に特異的な複数の結合認識部位（例えばアプタマー）を含むように設計され得る。各ｇＲＮＡは、転写開始部位（即ちＴＳＳ）の−１０００〜＋１核酸、好ましくは−２００核酸上流のプロモーター領域に結合するように設計され得る。このように位置させると、遺伝子活性化（例えば転写アクチベーター）又は遺伝子阻害（例えば転写リプレッサー）に影響を及ぼす機能ドメインが改善される。改変されたｇＲＮＡは、組成物に含まれる１つ以上の標的遺伝子座を標的化する１つ以上の改変されたｇＲＮＡ（例えば、少なくとも１個のｇＲＮＡ、少なくとも２個のｇＲＮＡ、少なくとも５個のｇＲＮＡ、少なくとも１０個のｇＲＮＡ、少なくとも２０個のｇＲＮＡ、少なくとも３０個のｇＲＮＡ、少なくとも５０個のｇＲＮＡ）であってもよい。前記複数のｇＲＮＡ配列はタンデムに配置され、好ましくはダイレクトリピートによって分離されている。
【０６５９】
従って、本明細書に定義するとおりのｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ酵素は各々が個別に組成物中に含まれ、個別に又はまとめて宿主に投与され得る。或いは、これらの構成成分は、宿主への投与用の単一の組成物中に提供されてもよい。宿主への投与は、宿主への送達用の当業者に公知の又は本明細書に記載されるウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクター）を介して実施され得る。本明細書に説明されるとおり、異なる選択マーカー（例えば、レンチウイルスｇＲＮＡ選択用）及びｇＲＮＡ濃度（例えば、複数のｇＲＮＡが使用されるかどうかに依存する）を使用することが、効果の向上を生じさせるのに有利であり得る。この概念に基づけば、ＤＮＡ切断、遺伝子活性化、又は遺伝子失活を含めたゲノム遺伝子座イベントを誘発するのに幾つかのバリエーションが適切である。当業者は、提供される本組成物を用いて、同じ又は異なる機能ドメインを有する単一又は複数の遺伝子座を有利に且つ特異的に標的化して、１つ以上のゲノム遺伝子座イベントを誘発することができる。本組成物は、細胞のライブラリにおけるスクリーニング及びインビボでの機能モデリング（例えば、ｌｉｎｃＲＮＡの遺伝子活性化及び機能の同定；機能獲得モデリング；機能喪失モデリング；最適化及びスクリーニング目的の細胞株及びトランスジェニック動物を樹立するための本発明の組成物の使用）のための多種多様な方法に適用され得る。
【０６６０】
本発明は、条件的又は誘導性ＣＲＩＳＰＲトランスジェニック細胞／動物を樹立し及び利用するための本発明の組成物の使用を包含する；例えば、Ｐｌａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２０１４），１５９（２）：４４０−４５５、又は国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）などの本明細書に引用されるＰＣＴ特許公報を参照のこと。例えば、細胞又は動物、例えば非ヒト動物、例えば脊椎動物又は哺乳類、例えばげっ歯類、例えばマウス、ラット、又は他の実験動物若しくは野外動物、例えば、ネコ、イヌ、ヒツジなどが「ノックイン」されてもよく、それによって動物が、Ｐｌａｔｔ  ｅｔ  ａｌのようにＣｐｆ１を条件的に又は誘導性に発現する。従って標的細胞又は動物はＣＲＩＳＰＲ酵素（例えばＣｐｆ１）を条件的に又は誘導性に（例えばＣｒｅ依存性構築物の形態で）含み、標的細胞に導入されたベクターの発現時、ベクターは、標的細胞におけるＣＲＩＳＰＲ酵素（例えば、Ｃｐｆ１）発現を誘導し、又はその条件を生じるように発現する。ＣＲＩＳＰＲ複合体を作成する公知の方法と共に本明細書に定義するとおりの教示及び組成物を適用することにより、誘導性ゲノムイベントもまた本発明の態様である。かかる誘導性イベントの例は、本明細書の他の部分に記載されている。
【０６６１】
一部の実施形態において、特に治療方法の中で遺伝性疾患が標的化されるとき、好ましくは表現型の変化がゲノム改変の結果であり、好ましくはここで表現型を修正し又は変化させるため修復鋳型が提供される。
【０６６２】
一部の実施形態において、標的となり得る疾患としては、疾患を引き起こすスプライス欠損に関係しているものが挙げられる。
【０６６３】
一部の実施形態において、細胞標的としては、造血幹／前駆細胞（ＣＤ３４＋）；ヒトＴ細胞；及び眼（網膜細胞）−例えば光受容前駆細胞が挙げられる。
【０６６４】
一部の実施形態において、遺伝子標的としては、ヒトβグロビン−ＨＢＢ（鎌状赤血球貧血の治療用、遺伝子変換の（内因性鋳型として近縁のＨＢＤ遺伝子を使用した）刺激によることを含む）；ＣＤ３（Ｔ細胞）；及びＣＥＰ９２０−網膜（眼）が挙げられる。
【０６６５】
一部の実施形態において、疾患標的としてはまた、スプライス欠損を引き起こす癌；鎌状赤血球貧血（点突然変異に基づく）；ＨＢＶ、ＨＩＶ；β−サラセミア；及び眼科的疾患又は眼疾患−例えばレーベル先天黒内障（ＬＣＡ）−も挙げられる。一部の実施形態において、送達方法には、酵素−ガイド複合体（リボ核タンパク質）のカチオン性脂質媒介性「直接」送達及びプラスミドＤＮＡの電気穿孔が含まれる。
【０６６６】
本明細書に記載される方法、生成物及び使用は、非治療目的に用いられ得る。更に、本明細書に記載される方法のいずれもインビトロ及びエキソビボで適用し得る。
【０６６７】
ある態様において、
Ｉ．２つ以上のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ポリヌクレオチド配列であって、
（ａ）ポリヌクレオチド遺伝子座の第１の標的配列にハイブリダイズ可能な第１のガイド配列、
（ｂ）ポリヌクレオチド遺伝子座の第２の標的配列にハイブリダイズ可能な第２のガイド配列、
（ｃ）ダイレクトリピート配列、
を含むポリヌクレオチド配列、及び
ＩＩ．Ｃｐｆ１酵素又はそれをコードする第２のポリヌクレオチド配列
を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物が提供され、
第１及び第２のガイド配列は、転写されると、それぞれ第１及び第２の標的配列への第１及び第２のＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導き、
第１のＣＲＩＳＰＲ複合体は、第１の標的配列にハイブリダイズ可能な第１のガイド配列と複合体を形成したＣｐｆ１酵素を含み、
第２のＣＲＩＳＰＲ複合体は、第２の標的配列にハイブリダイズ可能な第２のガイド配列と複合体を形成したＣｐｆ１酵素を含み、
第１のガイド配列が第１の標的配列近傍におけるＤＮＡ二重鎖の一方の鎖の切断を導き、且つ第２のガイド配列が第２の標的配列近傍における他方の鎖の切断を導いて二本鎖切断が誘導され、それにより生物又は非ヒト若しくは非動物生物が改変される。同様に、例えば各々が１つの標的に特異的な、且つ本明細書に記載されるとおりの組成物又はＣＲＩＳＰＲ系又は複合体においてタンデムに配置された２つより多いガイドＲＮＡを含む組成物を想定することができる。
【０６６８】
別の実施形態において、Ｃｐｆ１はタンパク質として細胞に送達される。別の特に好ましい実施形態において、Ｃｐｆ１はタンパク質として、又はそれをコードするヌクレオチド配列として細胞に送達される。タンパク質としての細胞への送達には、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の送達が含まれてもよく、ここでタンパク質は複数のガイドと複合体を形成している。
【０６６９】
ある態様において、幹細胞、及びその子孫を含め、本発明の組成物、系又は改変酵素によって改変されているか又はそれを含む宿主細胞及び細胞株が提供される。
【０６７０】
ある態様において、細胞治療方法が提供され、ここでは、例えば、単一細胞又は細胞集団が試料採取又は培養され、ここで当該の１つ又は複数の細胞は本明細書に記載されるとおりエキソビボで改変されるか又は改変されており、次に生物に再導入（試料採取した細胞）又は導入（培養細胞）される。幹細胞もまた、胚性幹細胞であれ、又は人工多能性若しくは全能性幹細胞であれ、この点で特に好ましい。しかし、当然ながら、インビボ実施形態もまた想定される。
【０６７１】
本発明の方法は、ｄｓＯＤＮ又はｓｓＯＤＮ（以下参照）であってもよい修復鋳型などの鋳型の送達を更に含むことができる。鋳型の送達は、ＣＲＩＳＰＲ酵素又はガイドＲＮＡの一部又は全部の送達と同時であっても又は別個であってもよく、且つ同じ又は異なる送達機構によってもよい。一部の実施形態において、鋳型はガイドＲＮＡと共に、好ましくはＣＲＩＳＰＲ酵素もまた共に送達されることが好ましい。一例はＡＡＶベクターであってもよく、ここでＣＲＩＳＰＲ酵素はＡｓＣｐｆ１又はＬｂＣｐｆ１である。
【０６７２】
本発明の方法は、（ａ）前記二本鎖切断によって生じたオーバーハングに相補的なオーバーハングを含む二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）を細胞に送達するステップであって、前記ｄｓＯＤＮが目的の遺伝子座に組み込まれるステップ；又は−（ｂ）一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）を細胞に送達するステップであって、前記ｓｓＯＤＮが前記二本鎖切断の相同依存性修復の鋳型として働くステップを更に含むことができる。本発明の方法は個体の疾患の予防又は治療方法であってもよく、任意選択で前記疾患は前記目的の遺伝子座の欠陥によって引き起こされる。本発明の方法は個体においてインビボで行うか又は個体から採取した細胞上でエキソビボで行うことができ、任意選択で前記細胞は個体に戻される。
【０６７３】
本発明はまた、本明細書に定義するとおりのタンデム又はマルチターゲティングに用いられる、ＣＲＩＳＰＲ酵素又はＣａｓ酵素又はＣｐｆ１酵素又はＣＲＩＳＰＲ−ＣＲＩＳＰＲ酵素又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系を使用して得られる産物も包含する。
【０６７４】
キット
一態様において、本発明は、上記の方法及び組成物に開示されるエレメントの任意の１つ以上を含むキットを提供する。一部の実施形態において、本キットは、本明細書に教示されるとおりのベクター系とキットの使用説明書とを含む。要素は個々に又は組み合わせで提供されてもよく、及び任意の好適な容器、例えば、バイアル、ボトル、又はチューブに提供されてもよい。本キットは、本明細書に記載されるとおりのｇＲＮＡ及び未結合の保護鎖を含み得る。本キットは、保護鎖がガイド配列に少なくとも部分的に結合したｇＲＮＡ（即ちｐｇＲＮＡ）を含み得る。従って本キットは、本明細書に記載されるとおりの部分的に二本鎖ヌクレオチド配列の形態のｐｇＲＮＡを含み得る。一部の実施形態において、本キットは１つ以上の言語、例えば２つ以上の言語による説明書を含む。取扱説明書は本明細書に記載される適用及び方法に特異的であってもよい。
【０６７５】
一部の実施形態において、キットは、本明細書に記載されるエレメントの１つ以上を利用する方法に用いられる１つ以上の試薬を含む。試薬は任意の好適な容器に入れて提供され得る。例えば、キットは１つ以上の反応緩衝液又は保存緩衝液を提供し得る。試薬は、特定のアッセイにおいて利用可能な形態で提供されても、又は使用前に１つ以上の他の構成成分の添加を必要とする形態（例えば、濃縮形態又は凍結乾燥形態）で提供されてもよい。緩衝液は、限定はされないが、炭酸ナトリウム緩衝液、重炭酸ナトリウム緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、トリス緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、及びこれらの組み合わせを含めた任意の緩衝液であってよい。一部の実施形態において、緩衝液はアルカリ性である。一部の実施形態において、緩衝液は約７〜約１０のｐＨを有する。一部の実施形態において、本キットは、ガイド配列及び調節エレメントを作動可能に連結するためベクターに挿入されるガイド配列に対応する１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、本キットは相同組換え鋳型ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、本キットは、本明細書に記載されるベクターの１つ以上及び／又はポリヌクレオチドの１つ以上を含む。本キットは、有利には本発明のシステムの全てのエレメントを提供することが可能である。
【０６７６】
一態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントの使用方法を提供する。本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチドを改変する有効な手段を提供する。本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、多種多様な細胞型の標的ポリヌクレオチドを改変（例えば、欠失、挿入、転位、不活性化、活性化）することを含め、幅広い有用性を有する。そのため本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、例えば、遺伝子療法、薬物スクリーニング、疾患診断、及び予後判定において、広範な適用性を有する。例示的ＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズするガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を含む。特定の実施形態において、ガイド配列にダイレクトリピート配列が連結されている。
【０６７７】
一実施形態において、本発明は、標的ポリヌクレオチドを切断する方法を提供する。本方法は、標的ポリヌクレオチドに結合して前記標的ポリヌクレオチドの切断を生じさせるＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して標的ポリヌクレオチドを改変することを含む。典型的には、本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、細胞に導入されると、ゲノム配列に切断（例えば、一本鎖又は二本鎖切断）を作り出す。例えば、本方法を用いて細胞内の疾患遺伝子を切断することができる。
【０６７８】
ＣＲＩＳＰＲ複合体によって作り出された切断は、エラープローン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路又は高フィデリティ相同性組換え修復（ＨＤＲ）などの修復プロセスによって修復され得る。これらの修復過程でゲノム配列に外因性ポリヌクレオチド鋳型を導入することができる。一部の方法において、ＨＤＲプロセスを用いてゲノム配列が改変される。例えば、上流配列及び下流配列が隣接する組み込もうとする配列を含む外因性ポリヌクレオチド鋳型が細胞に導入される。上流及び下流配列は、染色体における組込み部位の両側と配列類似性を共有する。
【０６７９】
望ましい場合、ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、例えばＤＮＡプラスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ウイルスベクター、線状ＤＮＡ片、ＰＣＲ断片、ネイキッド核酸、又はリポソーム又はポロキサマーなどの送達ビヒクルと複合体化した核酸であってもよい。
【０６８０】
外因性ポリヌクレオチド鋳型は、組み込まれる組み込もうとする配列（例えば変異遺伝子）を含む。組込み配列は、細胞にとって内因性又は外因性の配列であってもよい。組み込もうとする組込み配列の例としては、タンパク質をコードするポリヌクレオチド又は非コードＲＮＡ（例えばマイクロＲＮＡ）が挙げられる。従って、組込み配列は、１つ又は複数の適切な制御配列に作動可能に結合連結され得る。或いは、組み込もうとする組込み配列が調節機能を提供し得る。
【０６８１】
外因性ポリヌクレオチド鋳型中の上流及び下流配列は、目的の染色体配列とドナーポリヌクレオチドとの間の組換えを促進するように選択される。上流配列は、標的組込み部位の上流のゲノム配列と配列類似性を共有する核酸配列である。同様に、下流配列は、標的組込み部位の下流の染色体配列と配列類似性を共有する核酸配列である。外因性ポリヌクレオチド鋳型中の上流及び下流配列は、標的ゲノム配列と７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の配列同一性を有し得る。好ましくは、外因性ポリヌクレオチド鋳型中の上流及び下流配列は、標的ゲノム配列と約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する。一部の方法において、外因性ポリヌクレオチド鋳型中の上流及び下流配列は、標的ゲノム配列と約９９％又は１００％の配列同一性を有する。
【０６８２】
上流又は下流配列は、約２０ｂｐ〜約２５００ｂｐ、例えば、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、又は２５００ｂｐを含み得る。一部の方法において、例示的上流又は下流配列は、約２００ｂｐ〜約２０００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約１０００ｂｐ、又はより詳細には約７００ｂｐ〜約１０００ｂｐを有する。
【０６８３】
一部の方法において、外因性ポリヌクレオチド鋳型はマーカーを更に含み得る。かかるマーカーは標的組込みのスクリーニングを容易にし得る。好適なマーカーの例としては、制限部位、蛍光タンパク質、又は選択可能マーカーが挙げられる。本発明の外因性ポリヌクレオチド鋳型は組換え技術を用いて構築することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６を参照）。
【０６８４】
外因性ポリヌクレオチド鋳型を組み込むことによる標的ポリヌクレオチドを改変する例示的方法では、ＣＲＩＳＰＲ複合体によってゲノム配列に二本鎖切断が導入され、外因性ポリヌクレオチド鋳型との相同組換えによってこの切断が修復されると、鋳型がゲノムに組み込まれる。二本鎖切断の存在が鋳型の組込みを促進する。
【０６８５】
他の実施形態では、この発明は、真核細胞におけるポリヌクレオチドの発現を改変する方法を提供する。本方法は、ポリヌクレオチドに結合するＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して標的ポリヌクレオチドの発現を増加又は低下させることを含む。
【０６８６】
一部の方法において、標的ポリヌクレオチドを不活性化させることにより細胞に発現の改変を生じさせ得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体が細胞内の標的配列に結合すると、標的ポリヌクレオチドが不活性化され、そのためその配列が転写されないか、コードされたタンパク質が産生されないか、又は配列が野生型配列のようには機能しなくなる。例えば、タンパク質又はマイクロＲＮＡをコードする配列を不活性化してタンパク質が産生されないようにし得る。
【０６８７】
一部の方法において、制御配列を不活性化して、それがもはや制御配列として機能しないようにし得る。本明細書で使用されるとき、「制御配列」は、核酸配列の転写、翻訳、又は接触可能性を実現する任意の核酸配列を指す。制御配列の例としては、プロモーター、転写ターミネーターが挙げられ、及びエンハンサーが制御配列である。不活性化された標的配列は、欠失突然変異（即ち、１つ以上のヌクレオチドの欠失）、挿入突然変異（即ち、１つ以上のヌクレオチドの挿入）、又はナンセンス突然変異（即ち、終止コドンが導入されるような単一のヌクレオチドの別のヌクレオチドとの置換）を含み得る。一部の方法において、標的配列を不活性化すると、標的配列の「ノックアウト」がもたらされる。
【０６８８】
ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系の例示的使用方法
本発明は、標的細胞をインビボ、エキソビボ又はインビトロで改変するのに用いられる、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、又は前記組成物の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、又は前記組成物の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含むベクター又は送達系を提供し、及び、改変後はＣＲＩＳＰＲにより改変された細胞の子孫又は細胞株が変化した表現型を保持するように細胞を変化させる方法で行われ得る。改変された細胞及び子孫は、ＣＲＩＳＰＲ系が所望の細胞型にエキソビボ又はインビボ適用された植物又は動物などの多細胞生物の一部であり得る。本ＣＲＩＳＰＲ発明は、療法的治療方法であり得る。療法的治療方法には、遺伝子又はゲノム編集、又は遺伝子療法が含まれ得る。
【０６８９】
ＦＩＳＨなどの検出方法への不活性化されたＣＲＩＳＰＲ  Ｃｐｆ１酵素の使用
一態様において、本発明は、本明細書に記載される触媒的に不活性なＣａｓタンパク質、好ましくは不活性Ｃｐｆ１（ｄＣｐｆ１）を含むエンジニアリングされた天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系、及び蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）などの検出方法におけるこの系の使用を提供する。ＤＮＡ二本鎖切断を生じさせる能力を欠くｄＣｐｆ１を高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＥＧＦＰ）などの蛍光タンパク質などのマーカーと融合させて、小さいガイドＲＮＡと共発現させることにより、インビボで挟動原体、動原体及びテロメアリピートを標的化し得る。ｄＣｐｆ１系を使用してヒトゲノムの反復配列及び個々の遺伝子の両方を可視化することができる。標識されたｄＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ系のかかる新規適用は、細胞のイメージング及び機能的核構造の研究において、特に核内低分子容積又は複合体三次元構造を含む場合に重要であり得る（Ｃｈｅｎ  Ｂ，Ｇｉｌｂｅｒｔ  ＬＡ，Ｃｉｍｉｎｉ  ＢＡ，Ｓｃｈｎｉｔｚｂａｕｅｒ  Ｊ，Ｚｈａｎｇ  Ｗ，Ｌｉ  ＧＷ，Ｐａｒｋ  Ｊ，Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ  ＥＨ，Ｗｅｉｓｓｍａｎ  ＪＳ，Ｑｉ  ＬＳ，Ｈｕａｎｇ  Ｂ．２０１３．「最適化ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によるヒト生細胞のゲノム遺伝子座の動的イメージング（Ｄｙｎａｍｉｃ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｌｏｃｉ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａｎ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ）」．Ｃｅｌｌ  １５５（７）：１４７９−９１．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１３．１２．００１）。
【０６９０】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系又は複合体による標的の改変（例えば、Ｃｐｆ１−ＲＮＡ複合体）
一態様において、本発明は、真核細胞内の標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供し、これはインビボ、エキソビボ又はインビトロであってもよい。一部の実施形態において、本方法は、ヒト又は非ヒト動物から細胞又は細胞集団を試料採取するステップ、及び１つ又は複数の細胞を改変するステップを含む。培養は任意の段階でエキソビボで行われ得る。この１つ又は複数の細胞が、更には非ヒト動物又は植物に再導入されてもよい。再導入される細胞について、細胞は幹細胞であることが特に好ましい。
【０６９１】
一部の実施形態において、本方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて前記標的ポリヌクレオチドの切断を生じさせ、それにより標的ポリヌクレオチドを改変するステップを含み、ここでＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズする又はそれにハイブリダイズ可能なガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む。
【０６９２】
一態様において、本発明は、真核細胞内のポリヌクレオチドの発現を改変する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体をポリヌクレオチドに結合させて、前記結合により前記ポリヌクレオチドの発現の増加又は減少を生じさせるステップを含み；ここでＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズする又はそれにハイブリダイズ可能なガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む。同様の考察及び条件が、標的ポリヌクレオチドを改変する方法にも上記のとおり適用される。実際上、これらの試料採取、培養及び再導入の選択肢は本発明の全態様に適用される。
【０６９３】
実際、本発明の任意の態様において、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的配列にハイブリダイズする又はそれにハイブリダイズ可能なガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含むことができる。同様の考察及び条件が、標的ポリヌクレオチドを改変する方法にも上記のとおり適用される。
【０６９４】
従って本明細書に記載される天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素の任意のものにおいて少なくとも１つの改変を含み、それによって酵素は、ある種の向上した能力を有する。詳細には、これらの酵素のいずれも、ガイドＲＮＡとＣＲＩＳＰＲ複合体を形成可能である。かかる複合体の形成時、ガイドＲＮＡは標的ポリヌクレオチド配列に結合可能であり、酵素は標的遺伝子座を改変可能である。加えて、ＣＲＩＳＰＲ複合体中の酵素は、非改変酵素と比較したとき１つ以上のオフターゲット遺伝子座を改変する能力が低下している。
【０６９５】
加えて、本明細書に記載される改変ＣＲＩＳＰＲ酵素（ｅｍｚｙｍｅ）には、ＣＲＩＳＰＲ複合体において非改変酵素と比較したとき１つ以上の標的遺伝子座を改変する能力が増加した酵素が包含される。かかる機能は、１つ以上のオフターゲット遺伝子座を改変する能力の低下の上述の機能と別個に提供されてもよく、又はそれと組み合わせて提供されてもよい。任意のかかる酵素が、１つ以上の会合した異種機能ドメインによって提供される任意の活性との組み合わせ、ヌクレアーゼ活性を低下させる任意の更なる突然変異など、本明細書に記載されるとおりのＣＲＩＳＰＲ酵素に対する更なる改変のいずれかと共に提供されてもよい。
【０６９６】
本発明の有利な実施形態において、非改変酵素と比較したとき１つ以上のオフターゲット遺伝子座を改変する能力の低下及び非改変酵素と比較したとき１つ以上の標的遺伝子座を改変する能力の増加を伴う改変ＣＲＩＳＰＲ酵素（ｅｍｚｙｍｅ）が提供される。酵素に対する更なる改変との組み合わせで、特異性の大幅な増強が実現し得る。例えば、かかる有利な実施形態と１つ以上の追加の突然変異の組み合わせが提供され、ここで１つ以上の追加の突然変異は１つ以上の触媒活性ドメインにある。かかる更なる触媒的突然変異は、本明細書の他の部分で詳細に記載されるとおりのニッカーゼ機能を付与し得る。かかる酵素では、酵素活性の点で特異性が改善されるため、特異性の増強が実現し得る。
【０６９７】
上記に記載したとおりのオフターゲット効果を低下させ、及び／又はオンターゲット効果を増強する改変は、ＲｕｖＣ−ＩＩＩドメインとＨＮＨドメインとの間にある正電荷領域／溝に位置するアミノ酸残基に行われ得る。上記に記載される機能的効果のいずれも、前述の溝内のアミノ酸の改変によって実現し得るが、当該の溝に隣接するか又は溝外にあるアミノ酸の改変によってもまた実現し得ることは理解されるであろう。
【０６９８】
本明細書に記載されるとおりの改変ＣＲＩＳＰＲ酵素となるようにエンジニアリングし得る更なる機能としては、以下が挙げられる。１．タンパク質三次又は二次構造に影響を及ぼすことなくＤＮＡ：タンパク質相互作用を破壊する改変ＣＲＩＳＰＲ酵素。これには、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖の任意の部分と接触する残基が含まれる。２．Ｃｐｆ１がＤＮＡ結合（オン又はオフターゲット）に応答したヌクレアーゼ切断に必須のコンホメーションをとるよう担持するタンパク質間相互作用を弱める改変ＣＲＩＳＰＲ酵素。例えば：ＨＮＨドメイン（切れ易いリン酸に位置する）のヌクレアーゼコンホメーションを少し阻害するものの、なおも許容する改変。３．Ｃｐｆ１がＤＮＡ結合（オン又はオフターゲット）に応答したヌクレアーゼ活性を阻害するコンホメーションをとるよう保持するタンパク質間相互作用を強める改変ＣＲＩＳＰＲ酵素。例えば：ＨＮＨドメインを切れ易いリン酸から遠ざけるコンホメーションで安定化させる改変。任意のかかる追加的な機能増強が、本明細書の他の部分で詳細に記載されるとおりのＣＲＩＳＰＲ酵素に対する任意の他の改変と組み合わせて提供されてもよい。
【０６９９】
本明細書に記載される向上した機能のいずれも、Ｃｐｆ１酵素など、任意のＣＲＩＳＰＲ酵素に加えることができる。しかしながら、本明細書に記載される機能のいずれも、複数のオルソログからの断片を含むキメラ酵素を含め、他のオルソログからのＣｐｆ１酵素にエンジニアリングし得ることが理解されるであろう。
【０７００】
核酸、アミノ酸及びタンパク質、調節配列、ベクター等
本発明は核酸を使用して標的ＤＮＡ配列を結合する。核酸はタンパク質と比べて作製するのがはるかに容易で安価であり、且つ相同性が求められるストレッチの長さに応じて特異性を変化させることができるため、これは有利である。例えば、複数のフィンガーを複雑に三次元配置させる必要はない。用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、及び「オリゴヌクレオチド」は同義的に使用される。これらの用語は、デオキシリボヌクレオチドであれ又はリボヌクレオチドであれ、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチド、又はその類似体を指す。ポリヌクレオチドは任意の三次元構造を有することができ、既知又は未知の任意の機能を果たし得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子又は遺伝子断片のコード領域又は非コード領域、連鎖解析によって定義される複数の遺伝子座（１つの遺伝子座）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマー。この用語はまた、合成骨格を有する核酸様構造も包含し、例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，１９９１；Ｂａｓｅｒｇａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｍｉｌｌｉｇａｎ，１９９３；国際公開第９７／０３２１１号パンフレット；国際公開第９６／３９１５４号パンフレット；Ｍａｔａ，１９９７；Ｓｔｒａｕｓｓ−Ｓｏｕｋｕｐ，１９９７；及びＳａｍｓｔａｇ，１９９６を参照のこと。ポリヌクレオチドは、１つ以上の改変ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体を含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造の改変はポリマーをアセンブルする前又はその後に付与することができる。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド構成成分で中断されていてもよい。ポリヌクレオチドは、重合後に、標識構成成分とのコンジュゲーションによるなどして更に改変されてもよい。本明細書で使用されるとき、用語「野生型」は、当業者によって理解される当該技術分野の用語であり、突然変異体又は変異体形態とは区別されるものとして天然に存在するとおりの、典型的な形態の生物、菌株、遺伝子、又は特徴を意味する。「野生型」はベースラインであり得る。本明細書で使用されるとき、用語「変異体」は、天然に存在するものから逸脱したパターンを有する質の呈示を意味するものと解釈されなければならない。用語「天然に存在しない」又は「エンジニアリングされた」は同義的に使用され、人間の手が加えられていることを示す。この用語は、核酸分子又はポリペプチドに言及するとき、核酸分子又はポリペプチドが、自然中ではそれと天然に結び付いている、且つ自然中に見られるとおりの少なくとも１つの他の構成成分を少なくとも実質的に含まないことを意味する「相補性」は、従来のワトソン・クリック塩基対合又は他の非従来型の対合のいずれかによって核酸が別の核酸配列と１つ又は複数の水素結合を形成する能力を指す。「��補性」は、従来のワトソン・クリック塩基対合又は他の非従来型のいずれかによって核酸が別の核酸配列と１つ又は複数の水素結合を形成する能力を指す。パーセント相補性は、核酸分子中で第２の核酸配列と水素結合を形成（例えばワトソン・クリック塩基対合）することのできる残基のパーセンテージを示す（例えば、１０個のうち５、６、７、８、９、１０個は、それぞれ、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の相補性である）。「完全に相補的」とは、核酸配列の全ての連続する残基が第２の核酸配列中の同じ数の連続する残基と水素結合することを意味する。「実質的に相補的」は、本明細書で使用されるとき、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド、又はそれ以上の領域にわたって少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性の程度を指し、又はストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。本明細書で使用されるとき、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェントな条件」とは、標的配列と相補性を有する核酸が標的配列に優先的にハイブリダイズし、且つ非標的配列とは実質的にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は概して配列依存性であり、幾つもの要因に応じて異なる。一般に、配列が長いほど、配列がその標的配列に特異的にハイブリダイズする温度が高くなる。ストリンジェントな条件の非限定的な例が、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３），Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｃｈａｐｔｅｒ  “Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．に詳述されている。ポリヌクレオチド配列に言及する場合、相補配列又は部分的相補配列も想定される。これらは、好ましくは、高度にストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイズ可能なものである。概して、ハイブリダイゼーション速度を最大にするには、比較的低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件（熱融点（Ｔｍ）より約２０〜２５℃低い）が選択される。Ｔｍは、特定の標的配列の５０％が規定のイオン強度及びｐＨの溶液中で完全に相補的なプローブにハイブリダイズする温度である。概して、ハイブリダイズした配列の少なくとも約８５％のヌクレオチド相補性を要求する場合、Ｔｍより約５〜１５℃低くなるよう高度にストリンジェントな洗浄条件が選択される。ハイブリダイズした配列の少なくとも約７０％のヌクレオチド相補性を要求する場合、Ｔｍより約１５〜３０℃低くなるよう中程度にストリンジェントな洗浄条件が選択される。高度に許容的な（極めて低いストリンジェンシーの）洗浄条件はＴｍより５０℃も低いものであってよく、ハイブリダイズした配列間���高レベルのミスマッチが許容される。当業者は、ハイブリダイゼーション段階及び洗浄段階における他の物理的及び化学的パラメーターもまた、標的配列とプローブ配列との間の特定の相同性レベルからの検出可能なハイブリダイゼーションシグナルの結果に影響を与えるよう変更し得ることを認識するであろう。好ましい高度にストリンジェントな条件は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、及び１％  ＳＤＳ中４２℃でのインキュベーション、又は５×ＳＳＣ及び１％  ＳＤＳ中６５℃でのインキュベーションと、０．２×ＳＳＣ及び０．１％  ＳＤＳ中６５℃での洗浄を含む。「ハイブリダイゼーション」とは、１つ以上のポリヌクレオチドが反応することによりヌクレオチド残基の塩基間の水素結合によって安定した複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン・クリック塩基対合、フーグステイン（Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ）結合によるか、又は任意の他の配列特異的様式で起こり得る。複合体には、二重鎖構造を形成する２本の鎖、多重鎖複合体を形成する３本以上の鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖、又はこれらの任意の組み合わせが含まれ得る。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲの開始、又は酵素によるポリヌクレオチドの切断など、より大規模なプロセスで一ステップを構成し得る。所与の配列とハイブリダイズ可能な配列は、その所与の配列の「相補体」と称される。本明細書で使用されるとき、用語「ゲノム遺伝子座（ｇｅｎｏｍｉｃ  ｌｏｃｕｓ）」又は「遺伝子座（ｌｏｃｕｓ）」（複数形ｌｏｃｉ）は、染色体上の遺伝子又はＤＮＡ配列の特定の位置である。「遺伝子」は、ポリペプチドをコードする一続きのＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又は生物において機能的役割を果たし、従って生体における分子的遺伝単位であるＲＮＡ鎖を指す。本発明の目的上、遺伝子は、遺伝子産物の産生を調節する領域を含むと（かかる調節配列がコード配列及び／又は転写配列に隣接しているか否かに関わらず）見なし得る。従って、遺伝子には、必ずしも限定されないが、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位及び配列内リボソーム進入部位などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位及び遺伝子座制御領域が含まれる。本明細書で使用されるとき、「ゲノム遺伝子座の発現」又は「遺伝子発現」は、機能的遺伝子産物の合成に遺伝子からの情報が用いられる過程である。遺伝子発現の産物は、多くの場合にタンパク質であるが、ｒＲＮＡ遺伝子又はｔＲＮＡ遺伝子などの非タンパク質コード遺伝子では、産物は機能性ＲＮＡである。遺伝子発現の過程は、あらゆる既知の生命−真核生物（多細胞生物を含む）、原核生物（細菌及び古細菌）、及びウイルスによって生存のための機能性産物の産生に用いられている。本明細書で使用されるとき、遺伝子又は核酸の「発現」には、細胞遺伝子発現のみならず、クローニング系及び任意の他のコンテクストにおける１つ又は複数の核酸の転写及び翻訳もまた包含される。本明細書で使用されるとき、「発現」はまた、ポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（ｍＲＮＡ又は他のＲＮＡ転写物などに）転写される過程及び／又は転写されたｍＲＮＡが続いてペプチド、ポリペ��チド、又はタンパク質に翻訳される過程も指す。転写物及びコードされたポリペプチドは、まとめて「遺伝子産物」と称される。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現には真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングが含まれ得る。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書では、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指して同義的に使用される。ポリマーは線状又は分枝状であってよく、それは修飾アミノ酸を含んでもよく、及びそれは非アミノ酸が割り込んでいてもよい。これらの用語はまた、改変されているアミノ酸ポリマー（例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又はその他任意の、標識成分とのコンジュゲーションなどの操作）も包含する。本明細書で使用されるとき、用語「アミノ酸」には、グリシン及びＤ又はＬの両方の光学異性体、及びアミノ酸類似体及びペプチド模倣体を含め、天然及び／又は非天然又は合成のアミノ酸が含まれる。本明細書で使用されるとき、用語「ドメイン」又は「タンパク質ドメイン」は、タンパク質配列のうち残りのタンパク質鎖と独立に存在し及び機能し得る一部分を指す。本発明の態様に記載されるとおり、配列同一性は配列相同性と関係する。相同性比較は目測で行われてもよく、又はより通例では、容易に利用可能な配列比較プログラムの助けを借りて行われてもよい。これらの市販のコンピュータプログラムは、２つ以上の配列間のパーセント（％）相同性を計算することができ、また２つ以上のアミノ酸配列又は核酸配列が共有する配列同一性も計算することができる。
【０７０１】
本発明の態様において用語「ガイドＲＮＡ」は、推定上の又は同定されたｃｒＲＮＡ配列又はガイド配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。
【０７０２】
本明細書で使用されるとき、用語「野生型」は、当業者によって理解される当該技術分野の用語であり、突然変異体又は変異体の形態とは区別されるものとして天然に存在するとおりの、典型的な形態の生物、菌株、遺伝子、又は特徴を意味する。「野生型」はベースラインであり得る。
【０７０３】
本明細書で使用されるとき、用語「変異体」は、天然に存在するものから逸脱したパターンを有する質の呈示を意味するものと解釈されなければならない。
【０７０４】
用語「天然に存在しない」又は「エンジニアリングされた」は同義的に使用され、人間の手が加えられていることを示す。この用語は、核酸分子又はポリペプチドに言及しているとき、核酸分子又はポリペプチドが、自然中ではそれと天然に結び付いている、且つ自然中に見られるとおりの少なくとも１つの他の構成成分を少なくとも実質的に含まないことを意味する。これらの用語を含むか否かに関わらず、あらゆる態様及び実施形態において、好ましくはｔｈｅは任意選択であってよく、従って好ましくは含まれ、又は含まれないことは好ましくないことは理解されるであろう。更に、用語「天然に存在しない」及び「エンジニアリングされた」は同義的に用いられてもよく、そのため、従って単独で又は組み合わせで用いることができ、いずれか一方を両方とも併せた記述に置き換えてもよい。詳細には、「天然に存在しない」又は「天然に存在しない及び／又はエンジニアリングされた」の代わりに「エンジニアリングされた」が好ましい。
【０７０５】
配列相同性は、当該技術分野において公知の幾つものコンピュータプログラムのいずれか、例えばＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどによって求めることができる。かかるアラインメントの実施に好適なコンピュータプログラムは、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ；Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：３８７）である。配列の比較を行うことができる他のソフトウェアの例としては、限定はされないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  前掲−Ｃｈａｐｔｅｒ  １８を参照）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４０３−４１０）、及び比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳスイートが挙げられる。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡは、いずれもオフライン及びオンライン検索が利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  前掲，７−５８〜７−６０頁を参照）。しかしながら、ＧＣＧ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。パーセンテージ（％）配列相同性は連続配列に関して計算されてもよく、即ち、一方の配列を他方の配列とアラインメントして、一方の配列の各アミノ酸又はヌクレオチドが他方の配列の対応するアミノ酸又はヌクレオチドと１残基ずつ直接比較される。これは「ギャップなし」アラインメントと呼ばれる。かかるギャップなしアラインメントは比較的少数の残基にのみ行われる。これは極めて単純で一貫した方法であるが、例えば、本来は同一の配列ペアにおいて、一つの挿入又は欠失があるために以降のアミノ酸残基がアラインメントから外れる点を考慮に入れることができず、従って大域的アラインメントを行うと潜在的に％相同性が大きく低下し得る。結果的に、ほとんどの配列比較法は、全体的な相同性又は同一性スコアに過度のペナルティーを与えることなく、可能性のある挿入又は欠失を考慮に入れる最適アラインメントを生成するように設計される。これは、局所的な相同性又は同一性を最大化しようと配列アラインメントに「ギャップ」を挿入することによって達成される。しかしながら、これらの複雑性の高い方法は、アラインメント内に出現する各ギャップに「ギャップペナルティー」を割り当てるため、同数の同一アミノ酸について、ギャップが可能な限り少ない配列アラインメント（２つの比較される配列間の高い関連性を反映する）の方が、ギャップの多い配列よりも高いスコアを達成し得る。典型的には、あるギャップの存在に比較的高いコストを課し、且つそのギャップにおけるそれぞれの後続残基のペナルティーを小さくする「アフィニティギャップコスト（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｇａｐ  ｃｏｓｔｓ）」が用いられる。これが、最も一般的に用いられているギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティーは、当然ながらギャップがより少ない最適化されたアラインメントを生成し得る。多くのアラインメントプログラムで、ギャップペナルティーを変更することが可能である。しかしながら、配列比較にかかるソフトウェアを使用する場合、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧ  ���ｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを使用する場合、アミノ酸配列のデフォルトのギャップペナルティーは、ギャップが−１２で各伸長が−４である。従って、最大％相同性の計算には、初めにギャップペナルティーを考慮して最適アラインメントを生成する必要がある。かかるアラインメントの実行に好適なコンピュータプログラムは、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４  Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２  ｐ３８７）である。配列の比較を行うことができる他のソフトウェアの例としては、限定はされないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄ．−Ｃｈａｐｔｅｒ  １８を参照）、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３−４１０）、及び比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳスイートが挙げられる。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡは、いずれもオフライン及びオンライン検索が利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，７−５８〜７−６０頁を参照）。しかしながら、一部の適用には、ＧＣＧ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。ＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと呼ばれる新規ツールもまた、タンパク質及びヌクレオチド配列の比較に利用可能である（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１９９９  １７４（２）：２４７−５０；ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１９９９  １７７（１）：１８７−８及び米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｈｅａｌｔｈ）のウェブサイトにある国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のウェブサイトを参照）。最終的な％相同性は同一性の点で計測され得るが、アラインメント過程それ自体は、典型的にはオール・オア・ナッシングのペア比較に基づくわけではない。代わりに、化学的類似性又は進化距離に基づき各ペアワイズ比較にスコアを割り当てるスケーリング型類似性スコア行列が概して用いられる。一般的に用いられるかかる行列の例は、ＢＬＯＳＵＭ６２行列−ＢＬＡＳＴプログラムスイートのデフォルト行列−である。ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、概して公式のデフォルト値か、又は供給がある場合にはカスタムの記号比較テーブルかのいずれかを使用する（更なる詳細についてはユーザマニュアルを参照）。適用によっては、ＧＣＧパッケージについて公式のデフォルト値を使用し、又は他のソフトウェアの場合、ＢＬＯＳＵＭ６２などのデフォルト行列を使用することが好ましい。或いは、パーセンテージ相同性は、ＣＬＵＳＴＡＬ（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＤＧ  ＆  Ｓｈａｒｐ  ＰＭ（１９８８），Ｇｅｎｅ  ７３（１），２３７−２４４）と同様のアルゴリズムに基づくＤＮＡＳＩＳ（商標）（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）の多重アラインメント機能を用いて計算してもよい。ソフトウェアが最適アラインメントを生成すると、％相同性、好ましくは％配列同一性を計算することが可能になる。ソフトウェアは、典型的には配列比較の一部としてこれを行い、数値的な結果を出す。配列はまた、サイレントな変化を生じて機能的に等価な物質をもたらすようなアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換も有し得る。アミノ酸特性（残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性の性質など）の類似性に基づき計画的なアミノ酸置換が作製されてもよく、従ってアミノ酸を機能的なグループにまとめることが有用である。アミノ酸は、その側鎖の特性のみに基づきまとめてもよい。しかしながら、突然変異データも同様に含めることが更に有用である。このように得られた一組のアミノ酸は、構造上の理由から保存されているものと思われる。これらの組はベン図の形式で記述することができる（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ  Ｃ．Ｄ．ａｎｄ  Ｂａｒｔｏｎ  Ｇ．Ｊ．（１９９３）「タンパク質配列アラインメント：残基保存の階層分析戦略（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ：ａ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ）」Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．９：７４５−７５６）（Ｔａｙｌｏｒ  Ｗ．Ｒ．（１９８６）「アミノ酸保存の分類（Ｔｈｅ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ）」Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．１１９；２０５−２１８）。保存的置換は、例えば、一般に認められているベン図によるアミノ酸分類を記載する下記の表に従い作製し得る。
【０７０６】
【表３】
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【０７０７】
用語「対象」、「個体」、及び「患者」は、本明細書では、脊椎動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトを指して同義的に使用される。哺乳類としては、限定はされないが、ネズミ科動物、サル類、ヒト、農業動物、競技動物、及びペットが挙げられる。インビボで得られたか又はインビトロで培養された生物学的実体の組織、細胞及びそれらの子孫もまた包含される。
【０７０８】
用語「療法薬剤」、「療法的能力のある薬剤」又は「治療薬剤」は同義的に使用され、対象への投与時に何らかの有益な効果を付与する分子又は化合物を指す。有益な効果には、診断上の判断の実施可能性；疾患、症状、障害、又は病的状態の改善；疾患、症状、障害又は病態の発症の低減又は予防；及び疾患、症状、障害又は病的状態への一般的な対抗が含まれる。
【０７０９】
本明細書で使用されるとき、「治療」又は「治療する」、又は「緩和する」又は「改善する」は同義的に使用される。これらの用語は、限定はされないが治療利益及び／又は予防利益を含めた有益な又は所望の結果を達成するための手法を指す。治療利益とは、治療下の１つ以上の疾患、病態、又は症状における任意の治療的に関連性のある向上又はそれに対する効果を意味する。予防的利益については、組成物は、特定の疾患、病態、又は症状を発症するリスクのある対象、又は疾患、病態、又は症状がまだ現れていないことがあり得るにしろ、疾患の生理学的症状の１つ以上を訴えている対象に投与され得る。
【０７１０】
用語「有効量」又は「治療有効量」は、有益な又は所望の結果を生じさせるのに十分な薬剤の量を指す。治療有効量は、治療下の対象及び疾患状態、対象の体重及び年齢、疾患状態の重症度、投与方法などのうちの１つ以上に応じて異なり得るが、当業者はこれを容易に判断することができる。この用語はまた、本明細書に記載されるイメージング方法のいずれか１つによる検出用の画像を提供し得る用量にも適用される。具体的な用量は、詳細な選択の薬剤、従うべき投与レジメン、他の化合物と併用して投与されるかどうか、投与タイミング、イメージングする組織、及びそれが担持される物理的送達系のうちの１つ以上に応じて異なり得る。
【０７１１】
本発明の幾つかの態様は、１つ以上のベクターを含むベクター系、又はベクターそれ自体に関する。ベクターは、原核細胞又は真核細胞でのＣＲＩＳＰＲ転写物（例えば、核酸転写物、タンパク質、又は酵素）の発現用に設計することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ転写物は、細菌細胞、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用）、酵母細胞、又は哺乳類細胞で発現させることができる。好適な宿主細胞については、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に詳述されている。或いは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列及びＴ７ポリメラーゼを用いてインビトロで転写及び翻訳されてもよい。
【０７１２】
本発明の実施形態は、起こり得る相同置換（置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）及び置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）は両方ともに、本明細書では既存のアミノ酸残基又はヌクレオチドと代替の残基又はヌクレオチドとの相互交換を意味して用いられる）、即ち、アミノ酸の場合に塩基性同士、酸性同士、極性同士等、同種のもの同士の置換を含み得る配列（ポリヌクレオチド又はポリペプチドの両方）を含む。非相同置換、即ち、あるクラスから別のクラスの残基への置換、或いは、オルニチン（以下、Ｚと称する）、ジアミノ酪酸オルニチン（以下、Ｂと称する）、ノルロイシンオルニチン（以下、Ｏと称する）、ピリイルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン及びフェニルグリシンなどの非天然アミノ酸の取り込みが関わる置換もまた起こり得る。変異体アミノ酸配列は、グリシン又はβ−アラニン残基などのアミノ酸スペーサーに加え、メチル基、エチル基又はプロピル基などのアルキル基を含む配列の任意の２つのアミノ酸残基の間に挿入され得る好適なスペーサー基を含み得る。更に別の形態（これにはペプトイド形態の１つ以上のアミノ酸残基の存在が関わる）については、当業者は十分に理解し得る。誤解を避けるため、「ペプトイド形態」は、α−炭素置換基がα−炭素上ではなく、むしろ残基の窒素原子上にある変異体アミノ酸残基を指して使用される。ペプトイド形態のペプチドの調製方法は当該技術分野において公知である（例えばＳｉｍｏｎ  ＲＪ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９２）８９（２０），９３６７−９３７１及びＨｏｒｗｅｌｌ  ＤＣ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９５）１３（４），１３２−１３４）。
【０７１３】
相同性モデリング：他のＣｐｆ１オルソログにおける対応する残基は、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２（Ｎａｔｕｒｅ；４９０（７４２１）：５５６−６０）及びＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５（ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ；１１（５）：ｅ１００４２４８）の方法−ドメイン−モチーフ界面によって媒介される相互作用を予測する計算的タンパク質間相互作用（ＰＰＩ）方法によって同定することができる。構造に基づくＰＰＩ予測方法であるＰｒｅＰＰＩ（予測ＰＰＩ）は、ベイズ統計学の枠組みを用いて構造的エビデンスを非構造的エビデンスと組み合わせる。この方法は、クエリタンパク質のペアをとり、構造アラインメントを用いることにより、それらの実験的に決定された構造又は相同性モデルのいずれかに対応する構造表現を同定することを含む。構造アラインメントは、更に、大域的及び局所的幾何学関係を考慮することによって近く及び遠くの両方の隣接構造を同定するのに用いられる。構造表現の２つの隣接構造がタンパク質データバンクに報告されている複合体を形成する場合は常に、これが、これらの２つのクエリタンパク質間の相互作用をモデル化するための鋳型を定義付ける。複合体のモデルは、鋳型内の対応する隣接構造上の代表的な構造を重ね合わせることにより作成される。この手法は、Ｄｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３（Ｐｒｏｔ  Ｓｃｉ；２２：３５９−６６）に更に記載される。
【０７１４】
本発明の目的上、増幅は、妥当なフィデリティで標的配列を複製する能力を有するプライマー及びポリメラーゼを用いる任意の方法を意味する。増幅は、天然又は組換えＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＴａｑＧｏｌｄ（商標）、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片、及び逆転写酵素によって行われ得る。好ましい増幅方法はＰＣＲである。
【０７１５】
特定の態様において、本発明はベクターに関する。本明細書で使用されるとき、「ベクター」は、ある実体を一つの環境から別の環境に移すことを可能にする又は促進するツールである。これは、別のＤＮＡセグメントが挿入されて挿入セグメントの複製をもたらし得るレプリコン、例えば、プラスミド、ファージ、又はコスミドである。概して、ベクターは適切な制御エレメントと会合しているとき複製能を有する。一般に、用語「ベクター」は、それに連結されている別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。ベクターとしては、限定はされないが、一本鎖、二本鎖、又は部分的二本鎖の核酸分子；１つ以上の遊離末端を含む、遊離末端のない（例えば環状の）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は両方を含む核酸分子；及び当該技術分野において公知の他の種類のポリヌクレオチドが挙げられる。ある種のベクターは「プラスミド」であり、これは、標準的な分子クローニング技術によるなどして追加のＤＮＡセグメントを挿入することのできる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、ここでベクターには、ウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ））へのパッケージングのためのウイルス由来ＤＮＡ又はＲＮＡ配列が存在する。ウイルスベクターはまた、宿主細胞へのトランスフェクションのためのウイルスによって担持されるポリヌクレオチドも含む。特定のベクターは、それが導入される宿主細胞での自己複製能を有する（例えば、細菌性複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム哺乳類ベクター）は宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより宿主ゲノムと共に複製される。更に、特定のベクターは、それが作動可能に連結された遺伝子の発現を導くことが可能である。かかるベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。組換えＤＮＡ技法において有用な一般的な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。
【０７１６】
組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に好適な形態の本発明の核酸を含むことができ、これはつまり、組換え発現ベクターが、発現させる核酸配列に作動可能に連結された１つ以上の調節エレメント（これは、発現に用いられる宿主細胞に基づき選択されてもよい）を含むことを意味する。組換え発現ベクターの範囲内において、「作動可能に連結された」は、ヌクレオチド配列の（例えば、インビトロ転写／翻訳系における、又はベクターが宿主細胞に導入される場合に宿主細胞における）発現が可能となる形で目的のヌクレオチド配列が１つ又は複数の調節エレメントに連結されていることを意味するように意図される。組換え及びクローニング方法に関しては、２００４年９月２日に米国特許出願公開第２００４−０１７１１５６  Ａ１号明細書として公開された米国特許出願第１０／８１５，７３０号明細書（この内容は、本明細書において全体として参照により援用される）が挙げられる。
【０７１７】
本発明の態様は、ガイドＲＮＡ及び（任意選択で改変若しくは突然変異）ＣＲＩＳＰＲ酵素（例えばＣｐｆ１）用のバイシストロニックベクターに関する。ガイドＲＮＡ及び（任意選択で改変若しくは突然変異）ＣＲＩＳＰＲ酵素用のバイシストロニック発現ベクターが好ましい。概して、及び特に、この実施形態において（任意選択で改変又は突然変異）ＣＲＩＳＰＲ酵素は好ましくはＣＢｈプロモーターによってドライブされる。ＲＮＡは、好ましくはＵ６プロモーターなどのＰｏｌ  ＩＩＩプロモーターによってドライブされ得る。理想的にはこの２つが組み合わされる。
【０７１８】
一部の実施形態において、ガイドＲＮＡ中のループが提供される。これは、ステムループ又はテトラループであり得る。ループは好ましくはＧＡＡＡであるが、この配列に限定されるものではなく、又は実際には、４ｂｐ長であることのみに限定されるものではない。実際には、ヘアピン構造における使用に好ましいループ形成配列は４ヌクレオチド長であり、最も好ましくは配列ＧＡＡＡを有する。しかしながら、代替的な配列であってよいとおり、より長い又は短いループ配列が使用され得る。配列は好ましくはヌクレオチドトリプレット（例えばＡＡＡ）、及び更なるヌクレオチド（例えばＣ又はＧ）を含む。ループ形成配列の例にはＣＡＡＡ及びＡＡＡＧが含まれる。本明細書に開示される任意の方法の実施においては、限定なしに、マイクロインジェクション、電気穿孔、ソノポレーション、微粒子銃、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクション、カチオン性トランスフェクション、リポソームトランスフェクション、デンドリマートランスフェクション、熱ショックトランスフェクション、ヌクレオフェクショントランスフェクション、マグネトフェクション、リポフェクション、インペイルフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、光学的トランスフェクション、専売薬剤により増強される核酸取り込み、及びリポソーム、免疫リポソーム、ビロソーム、又は人工ビリオンを介した送達を含めた当該技術分野で公知の１つ以上の方法によって細胞又は胚に好適なベクターを導入することができる。一部の方法において、ベクターはマイクロインジェクションによって胚に導入される。１つ又は複数のベクターが胚の核又は細胞質に微量注入され得る。一部の方法において、１つ又は複数のベクターはヌクレオフェクションによって細胞に導入され得る。
【０７１９】
用語「調節エレメント」には、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、及び他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル及びポリＵ配列などの転写終結シグナル）が含まれることが意図される。かかる調節エレメントについては、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載される。調節エレメントには、多くの種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を導くもの及び特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を導くもの（例えば、組織特異的調節配列）が含まれる。組織特異的プロモーターは、主として、所望の目的組織、例えば、筋肉、ニューロン、骨、皮膚、血液、特定の臓器（例えば、肝臓、膵臓）、又は特定の細胞型（例えば、リンパ球）において発現を導き得る。調節エレメントはまた、細胞周期依存的又は発生段階依存的様式など、時間依存的様式で発現を導いてもよく、この発現もまた組織又は細胞型特異的であることも又はそうでないこともある。一部の実施形態において、ベクターは、１つ以上のｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター（例えば、１、２、３、４、５個、又はそれより多いｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌ  ＩＩプロモーター（例えば、１、２、３、４、５個、又はそれより多いｐｏｌ  ＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌ  Ｉプロモーター（例えば、１、２、３、４、５個、又はそれより多いｐｏｌ  Ｉプロモーター）、又はこれらの組み合わせを含む。ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの例としては、限定はされないが、Ｕ６及びＨ１プロモーターが挙げられる。ｐｏｌ  ＩＩプロモーターの例としては、限定はされないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意選択でＲＳＶエンハンサーと共に）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意選択でＣＭＶエンハンサーと共に）［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１−５３０（１９８５）を参照］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、及びＥＦ１αプロモーターが挙げられる。また、用語「調節エレメント」には、ＷＰＲＥなどのエンハンサーエレメント；ＣＭＶエンハンサー；ＨＴＬＶ−ＩのＬＴＲにおけるＲ−Ｕ５’セグメント（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．８（１），ｐ．４６６−４７２，１９８８）；ＳＶ４０エンハンサー；及びウサギβ−グロビンのエクソン２と３との間のイントロン配列（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．７８（３），ｐ．１５２７−３１，１９８１）も包含される。当業者によれば、発現ベクターの設計が、形質転換する宿主細胞の選択、所望の発現レベルなどの要因に依存し得ることが理解されるであろう。ベクターは宿主細胞に導入することができ、それにより、本明細書に記載されるとおりの核酸によってコードされる転写物、タンパク質、又はペプチドが、融合タンパク質又はペプチド（例えば、クラスター��した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）転写物、タンパク質、酵素、それらの突然変異型、それらの融合タンパク質等）を含め、産生され得る。調節配列に関しては、米国特許出願第１０／４９１，０２６号明細書（その内容は全体として参照により本明細書に援用される）が挙げられる。プロモーターに関しては、国際公開第２０１１／０２８９２９号パンフレット及び米国特許出願第１２／５１１，９４０号明細書（その内容は全体として参照により本明細書に援用される）が挙げられる。
【０７２０】
ベクターは、原核細胞又は真核細胞でのＣＲＩＳＰＲ転写物（例えば、核酸転写物、タンパク質、又は酵素）の発現用に設計することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ転写物は、細菌細胞、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用）、酵母細胞、又は哺乳類細胞で発現させることができる。好適な宿主細胞については、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に詳しく考察されている。或いは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列及びＴ７ポリメラーゼを用いてインビトロで転写及び翻訳されてもよい。
【０７２１】
ベクターは、原核生物又は原核細胞に導入して増殖させてもよい。一部の実施形態において、真核細胞に導入するベクターのコピーを増幅させるため、又は真核細胞に導入するベクターの産生における中間ベクターとして（例えば、ウイルスベクターパッケージング系の一部としてプラスミドを増幅する）、原核生物が使用される。一部の実施形態において、原核生物を用いてベクターのコピーを増幅し、１つ以上の核酸を発現させて、それにより例えば宿主細胞又は宿主生物に送達するための１つ以上のタンパク質の供給源を提供する。原核生物でのタンパク質の発現は、多くの場合に、融合タンパク質又は非融合タンパク質のいずれかの発現を導く構成的プロモーター又は誘導プロモーターを含むベクターを用いて大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）で行われる。融合ベクターが、そこでコードされるタンパク質、例えば組換えタンパク質のアミノ末端に幾つものアミノ酸を付加する。かかる融合ベクターは、（ｉ）組換えタンパク質の発現の増加；（ｉｉ）組換えタンパク質の溶解度の増加；及び（ｉｉｉ）アフィニティー精製でリガンドとして作用することによる組換えタンパク質の精製の促進など、１つ以上の目的を果たし得る。多くの場合に、融合発現ベクターでは、融合タンパク質の精製後に組換えタンパク質を融合部分と分離することができるように、融合部分と組換えタンパク質との接合部にタンパク質分解切断部位が導入される。かかる酵素及びそのコグネイト認識配列には、第Ｘａ因子、トロンビン、及びエンテロキナーゼが含まれる。融合発現ベクターの例としては、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９８８．Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）、及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられ、これらはそれぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、又はプロテインＡを標的組換えタンパク質に融合させる。好適な誘導性非融合大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５）及びｐＥＴ  １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が挙げられる。一部の実施形態において、ベクターは酵母発現ベクターである。酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｉｖｉｓａｅ）における発現用のベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ，ｅｔ  ａｌ．，１９８７．ＥＭＢＯ  Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｉｊａｎ  ａｎｄ  Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，１９８２．Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７．Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、及びｐｉ��Ｚ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。一部の実施形態において、ベクターは、バキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞でのタンパク質発現をドライブする。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）でのタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，１９８３．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）及びｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ，１９８９．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９）が挙げられる。
【０７２２】
一部の実施形態において、ベクターは、哺乳類発現ベクターを用いて哺乳類細胞での１つ以上の配列の発現をドライブする能力を有する。哺乳類発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，１９８７．Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０）及びｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９８７．ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳類細胞で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、典型的には１つ以上の調節エレメントによって提供される。例えば、一般的に用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、シミアンウイルス４０、及び本明細書に開示される及び当該技術分野において公知の他のウイルスに由来する。原核細胞及び真核細胞の両方に好適な他の発現系については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ．２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９のＣｈａｐｔｅｒｓ  １６及び１７を参照のこと。
【０７２３】
一部の実施形態において、組換え哺乳類発現ベクターは、特定の細胞型で優先的に核酸の発現を導くことが可能である（例えば、組織特異的調節エレメントが核酸の発現に使用される）。組織特異的調節エレメントは当該技術分野において公知である。好適な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ．，１９８７．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、リンパ系特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ  ａｎｄ  Ｅａｔｏｎ，１９８８．Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、詳細にはＴ細胞受容体（Ｗｉｎｏｔｏ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８９．ＥＭＢＯ  Ｊ．８：７２９−７３３）及び免疫グロブリン（Ｂａｎｅｉｊｉ，ｅｔ  ａｌ．，１９８３．Ｃｅｌｌ  ３３：７２９−７４０；Ｑｕｅｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８３．Ｃｅｌｌ  ３３：７４１−７４８）のプロモーター、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；Ｂｙｒｎｅ  ａｎｄ  Ｒｕｄｄｌｅ，１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ，ｅｔ  ａｌ．，１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９１２−９１６）、及び乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号明細書、及び欧州特許出願公開第２６４，１６６号明細書）が挙げられる。発生的に調節されるプロモーター、例えば、マウスｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ  ａｎｄ  Ｇｒｕｓｓ，１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３７４−３７９）及びαフェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓ  ａｎｄ  Ｔｉｌｇｈｍａｎ，１９８９．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３：５３７−５４６）もまた包含される。これらの原核生物及び真核生物ベクターに関しては、米国特許第６，７５０，０５９号明細書（その内容は全体として参照により本明細書に援用される）が挙げられる。本発明の他の実施形態はウイルスベクターの使用に関してもよく、それについては米国特許出願第１３／０９２，０８５号明細書（その内容は全体として参照により本明細書に援用される）が挙げられる。組織特異的調節エレメントは当該技術分野において公知であり、この点で、米国特許第７，７７６，３２１号明細書（その内容は全体として参照により本明細書に援用される）が挙げられる。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントの発現をドライブするため、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントに調節エレメントが作動可能に連結される。一般に、ＳＰＩＤＲ（ＳＰａｃｅｒ  Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｒｅｐｅａｔ、スペーサー散在型ダイレクトリピート）としても知られるＣＲＩＳＰＲ（クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復）は、通常特定の細菌種に特異的なＤＮＡ遺伝子座のファミリーを構成する。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｉｓｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９：５４２９−５４３３［１９８７］；及びＮａｋａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７１：３５５３−３５５６  ［１９８９］）に認めら��た特徴的なクラスの散在型短鎖配列リピート（ＳＳＲ）、及び関連遺伝子を含む。同様の散在型ＳＳＲが、ハロフェラックス・メディテラネイ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）、及び結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）において同定されている（Ｇｒｏｅｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１０：１０５７−１０６５［１９９３］；Ｈｏｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，５：２５４−２６３［１９９９］；Ｍａｓｅｐｏｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３０７：２６−３０［１９９６］；及びＭｏｊｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１７：８５−９３［１９９５］を参照）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、典型的にはリピートの構造が他のＳＳＲと異なり、短い規則的な間隔のリピート（ＳＲＳＲ）と呼ばれている（Ｊａｎｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＯＭＩＣＳ  Ｊ．Ｉｎｔｅｇ．Ｂｉｏｌ．，６：２３−３３［２００２］；及びＭｏｊｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３６：２４４−２４６［２０００］）。一般に、このリピートは、実質的に一定長さのユニークな介在配列によって規則的な間隔が置かれたクラスター内に存在する短いエレメントである（Ｍｏｊｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．，［２０００］、前掲）。リピート配列は株間で高度に保存されているが、散在するリピートの数及びスペーサー領域の配列は、典型的には株毎に異なる（ｖａｎ  Ｅｍｂｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８２：２３９３−２４０１［２０００］）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、限定はされないが、アエロピルム属（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ）、ピロバキュラム属（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）、スルホロブス属（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）、アーケオグロブス属（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロアーキュラ属（Ｈａｌｏｃａｒｃｕｌａ）、メタノバクテリウム属（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メタノコッカス属（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノサルシナ属（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）、メタノピュルス属（Ｍｅｔｈａｎｏナシ属（Ｐｙｒｕｓ））、パイロコッカス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ピクロフィルス属（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ）、サーモプラズマ属（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アクウィフェクス属（Ａｑｕｉｆｅｘ）、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、クロロビウム属（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、サーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、サーモアナエロバクター属（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、フゾバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アゾアルカス属（Ａｚａｒｃｕｓ）、クロモバクテリウム属（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）、デスルホビブリオ属（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）、ジオバクター属（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ）、ミキソコッカス属（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ウォリネラ属（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、メチロコッカス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、フォトバクテリウム属（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ザントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、及びサーモトガ属（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）を含め、４０を超える原核生物において同定されている（例えば、Ｊａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４３：１５６５−１５７５  ［２００２］；及びＭｏｊｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．，［２００５］を参照）。
【０７２４】
一般に、「核酸ターゲティング系」は、本願で使用されるとき、まとめて、核酸ターゲティングＣａｓ（エフェクター）タンパク質及びガイドＲＮＡをコードする配列又は他の配列及び核酸ターゲティングＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの転写物を含めた、核酸ターゲティングＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子（本明細書ではエフェクタータンパク質とも称される）の発現又はその活性の誘導に関わる転写物及び他のエレメントを指す。一部の実施形態において、核酸ターゲティング系の１つ以上のエレメントがＶ型／ＶＩ型核酸ターゲティングＣＲＩＳＰＲ系に由来する。一部の実施形態において、核酸ターゲティング系の１つ以上のエレメントは、内因性核酸ターゲティングＣＲＩＳＰＲ系を含む特定の生物に由来する。一般に、核酸ターゲティング系は、標的配列の部位における核酸ターゲティング複合体の形成を促進するエレメントによって特徴付けられる。核酸ターゲティング複合体の形成の文脈では、「標的配列」は、ガイド配列がそれと相補性を有するように設計される配列を指し、ここで標的配列とガイドＲＮＡとの間のハイブリダイゼーションが、ＤＮＡ又はＲＮＡターゲティング複合体の形成を促進する。ハイブリダイゼーションを生じさせ且つ核酸ターゲティング複合体の形成を促進するのに十分な相補性があるならば、完全な相補性は必ずしも必要でない。標的配列はＲＮＡポリヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態において、標的配列は細胞の核又は細胞質に位置する。一部の実施形態において、標的配列は真核細胞の細胞小器官内、例えばミトコンドリア又は葉緑体内にあってもよい。標的配列を含む標的遺伝子座への組換えに用いられ得る配列又は鋳型は、「編集用鋳型」又は「編集用ＲＮＡ」又は「編集用配列」と称される。本発明の態様では、外因性鋳型ＲＮＡが編集用鋳型と称され得る。本発明のある態様では、組換えは相同組換えである。
【０７２５】
典型的には、内因性核酸ターゲティング系のコンテクストでは、核酸ターゲティング複合体（標的配列にハイブリダイズし、且つ１つ以上の核酸ターゲティングエフェクタータンパク質と複合体を形成したガイドＲＮＡを含む）が形成されると、標的配列にあるか又はその近傍（例えば、標的配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０塩基対、又はそれ以上の範囲内）にある一方又は両方のＲＮＡ鎖の切断が生じる。一部の実施形態において、核酸ターゲティング系の１つ以上のエレメントの発現をドライブする１つ以上のベクターが宿主細胞に導入され、核酸ターゲティング系のエレメントが発現すると、１つ以上の標的部位において核酸ターゲティング複合体の形成が導かれる。例えば、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質及びガイドＲＮＡが、各々別個のベクター上で別個の調節エレメントに作動可能に連結されてもよい。或いは、同じ又は異なる調節エレメントから発現するエレメントのうちの２つ以上が単一のベクターに組み合わされてもよく、１つ以上の追加のベクターが、第１のベクターに含まれない核酸ターゲティング系の任意の構成成分を提供する。単一のベクターに組み合わされる核酸ターゲティング系エレメントは、あるエレメントが第２のエレメントに対して５’側（その「上流」）に位置し、又はそれに対して３’側（その「下流」）に位置するなど、任意の好適な向きで配置されてもよい。あるエレメントのコード配列は第２のエレメントのコード配列と同じ鎖上又は逆鎖上に位置してもよく、同じ又は逆の方向に向いていてもよい。一部の実施形態において、単一のプロモーターが、１つ以上のイントロン配列内に組み込まれた（例えば、各々が異なるイントロンにあるか、２つ以上が少なくとも１つのイントロンにあるか、又は全てが単一のイントロンにある）核酸ターゲティングエフェクタータンパク質及びガイドＲＮＡをコードする転写物の発現をドライブする。一部の実施形態において、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質とガイドＲＮＡとは同じプロモーターに作動可能に連結され、それから発現する。
【０７２６】
一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズして標的配列への核酸ターゲティング複合体の配列特異的結合を導くのに十分な標的ポリヌクレオチド配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを用いて最適にアラインメントしたとき、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％以上であるか、又はそれより高い。最適アラインメントは、配列のアラインメントに好適な任意のアルゴリズムを用いて決定することができ、その非限定的な例としては、スミス−ウォーターマンアルゴリズム、ニードルマン−ブンシュアルゴリズム、バローズ・ホイーラー変換に基づくアルゴリズム（例えばバローズ−ホイーラーアライナー）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎにおいて利用可能）、及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔにおいて利用可能）が挙げられる。一部の実施形態において、ガイド配列は、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５ヌクレオチド長以上であるか、又はそれより長い。一部の実施形態において、ガイド配列は、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２ヌクレオチド長未満か、又はそれより短い。ガイド配列が標的配列への核酸ターゲティング複合体の配列特異的結合を導く能力は、任意の好適なアッセイによって評価し得る。例えば、核酸ターゲティング複合体を形成するのに十分な核酸ターゲティング系の構成成分が、試験しようとするガイド配列を含め、対応する標的配列を有する宿主細胞へと、核酸ターゲティングＣＲＩＳＰＲ配列の構成成分をコードするベクターのトランスフェクションによるなどして提供されてもよく、続いて本明細書に記載されるとおりのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイなどにより、標的配列内又はその近傍における優先的な切断を評価し得る。同様に、標的ポリヌクレオチド配列（又はその近傍にある配列）の切断は、標的配列、試験しようとするガイド配列を含めた核酸ターゲティング複合体の構成成分、及び供試ガイド配列と異なる対照ガイド配列を提供して、それらの供試ガイド配列と対照ガイド配列との反応間で標的配列又はその近傍における結合又は切断速度を比較することにより、試験管内で判定することができる。他のアッセイも可能であり、当業者には想起されるであろう。
【０７２７】
ガイド配列は、任意の標的配列を標的化するように選択することができる。一部の実施形態において、標的配列は、遺伝子転写物又はｍＲＮＡ内の配列である。
【０７２８】
一部の実施形態において、標的配列は細胞のゲノム内の配列である。
【０７２９】
一部の実施形態において、ガイド配列は、ガイド配列内の二次構造度が低下するように選択される。二次構造は、任意の好適なポリヌクレオチド折り畳みアルゴリズムによって決定することができる。一部のプログラムは最小ギブズ自由エネルギーの計算に基づく。かかる一つのアルゴリズムの例は、Ｚｕｋｅｒ  ａｎｄ  Ｓｔｉｅｇｌｅｒ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９（１９８１），１３３−１４８）により記載されるとおりのｍＦｏｌｄである。別の例示的な折り畳みアルゴリズムは、ウィーン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｖｉｅｎｎａ）のＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙにおいて開発された、セントロイド構造予測アルゴリズムを用いるオンラインウェブサーバーＲＮＡｆｏｌｄである（例えば、Ａ．Ｒ．Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃｅｌｌ  １０６（１）：２３−２４；及びＰＡ  Ｃａｒｒ  ａｎｄ  ＧＭ  Ｃｈｕｒｃｈ，２００９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２７（１２）：１１５１−６２を参照）。更なるアルゴリズムについて、米国出願第ＴＢＡ号（代理人整理番号４４７９０．１１．２０２２；Ｂｒｏａｄ参照番号ＢＩ−２０１３／００４Ａ）（参照により本明細書に援用される）を参照することができる。
【０７３０】
一部の実施形態において、組換え鋳型もまた提供される。組換え鋳型は、別個のベクターに含まれるか、又は別個のポリヌクレオチドとして提供される、本明細書に記載されるとおりの別のベクターの構成成分であり得る。一部の実施形態において、組換え鋳型は、核酸ターゲティング複合体の一部としての核酸ターゲティングエフェクタータンパク質によってニッキング又は切断される標的配列内又はその近傍などで、相同組換えにおける鋳型として働くように設計される。鋳型ポリヌクレオチドは、約１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、５００、１０００ヌクレオチド長以上、又はそれより長いなど、任意の好適な長さであってもよい。一部の実施形態において、鋳型ポリヌクレオチドは、標的配列を含むポリヌクレオチドの一部分に相補的である。最適にアラインメントしたとき、鋳型ポリヌクレオチドは標的配列の１つ以上のヌクレオチド（例えば約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００ヌクレオチド以上又はそれより長い）と重複し得る。一部の実施形態において、鋳型配列と標的配列を含むポリヌクレオチドとが最適にアラインメントされたとき、鋳型ポリヌクレオチドのうち最も近いヌクレオチドは、標的配列から約１、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、５０００、１００００ヌクレオチド以内、又はそれを超える範囲内にある。
【０７３１】
一部の実施形態において、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質は、１つ以上の異種タンパク質ドメイン（例えば、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質に加えて約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上、又はそれより多いドメイン）を含む融合タンパク質の一部である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、１つ以上の異種タンパク質ドメイン（例えばＣＲＩＳＰＲ酵素に加えて約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上、又はそれより多いドメイン）を含む融合タンパク質の一部である。ＣＲＩＳＰＲ酵素融合タンパク質は、任意の追加的なタンパク質配列、及び任意選択で任意の２つのドメイン間のリンカー配列を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素に融合させ得るタンパク質ドメインの例としては、限定なしに、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、及び以下の活性：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写解除因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性及び核酸結合活性のうちの１つ以上を有するタンパク質ドメインが挙げられる。エピトープタグの非限定的な例としては、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、及びチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが挙げられる。レポーター遺伝子の例としては、限定はされないが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）  β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、及び青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自己蛍光タンパク質が挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ分子に結合するか、又は限定はされないが、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓタグ、Ｌｅｘ  Ａ  ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合物、ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン融合物、及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合物を含めた他の細胞分子に結合するタンパク質又はタンパク質の断片をコードする遺伝子配列に融合させてもよい。ＣＲＩＳＰＲ酵素を含む融合タンパク質の一部を形成し得る追加的なドメインは、米国特許出願公開第２０１１００５９５０２号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載される。一部の実施形態では、タグ付加ＣＲＩＳＰＲ酵素を用いて標的配列の位置が同定される。
【０７３２】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は誘導性系の一成分を形成し得る。この系の誘導可能な性質により、エネルギーの形態を用いた遺伝子編集又は遺伝子発現の時空間的制御が可能となり得る。エネルギーの形態としては、限定はされないが、電磁放射線、音響エネルギー、化学エネルギー及び熱エネルギーを挙げることができる。誘導性系の例には、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｔｅｔ−Ｏｎ又はＴｅｔ−Ｏｆｆ）、小分子２ハイブリッド転写活性化システム（ＦＫＢＰ、ＡＢＡ等）、又は光誘導性系（フィトクロム、ＬＯＶドメイン、又はクリプトクロム）が含まれる。一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、配列特異的に転写活性の変化を導く光誘導性転写エフェクター（ＬＩＴＥ）の一部であり得る。光の構成成分には、ＣＲＩＳＰＲ酵素、光応答性シトクロムヘテロ二量体（例えばシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来）、及び転写活性化／抑制ドメインが含まれ得る。誘導性ＤＮＡ結合タンパク質及びその使用方法の更なる例は、米国仮特許出願第６１／７３６４６５号明細書及び米国仮特許出願第６１／７２１，２８３号明細書及び国際公開第２０１４／０１８４２３号パンフレット及び米国特許第８８８９４１８号明細書、米国特許第８８９５３０８号明細書、米国特許出願公開第２０１４０１８６９１９号明細書、米国特許出願公開第２０１４０２４２７００号明細書、米国特許出願公開第２０１４０２７３２３４号明細書、米国特許出願公開第２０１４０３３５６２０号明細書、国際公開第２０１４０９３６３５号パンフレット（本明細書によって全体として参照により援用される）に提供される。
【０７３３】
送達
一部の態様において、本発明は、１つ以上のポリヌクレオチド、例えば、又は本明細書に記載されるとおりの１つ以上のベクター、その１つ以上の転写物、及び／又はそれから転写されるもの又はタンパク質を、宿主細胞に送達するステップを含む方法を提供する。一部の態様において、本発明は、かかる方法によって作製される細胞、及びかかる細胞を含むか、又はそれから作製される生物（動物、植物、又は真菌類など）を更に提供する。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡと組み合わせた（及び任意選択でそれと複合体を形成した）核酸ターゲティングエフェクタータンパク質が細胞に送達される。哺乳類細胞又は標的組織における核酸の導入には、従来のウイルスベース及び非ウイルスベースの遺伝子導入方法を用いることができる。かかる方法を用いて、核酸ターゲティング系の構成成分をコードする核酸を培養下の細胞に、又は宿主生物中の細胞に投与することができる。非ウイルスベクター送達系には、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば本明細書に記載されるベクターの転写物）、ネイキッド核酸、及び送達ビヒクルと複合体を形成した核酸、例えばリポソームが含まれる。ウイルスベクター送達系にはＤＮＡ及びＲＮＡウイルスが含まれ、これは細胞への送達後にエピソームゲノム又は組込みゲノムのいずれかを有する。遺伝子療法手順のレビューに関しては、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：８０８−８１３（１９９２）；Ｎａｂｅｌ  ＆  Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：２１１−２１７（１９９３）；Ｍｉｔａｎｉ  ＆  Ｃａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１６２−１６６（１９９３）；Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１６７−１７５（１９９３）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：４５５−４６０（１９９２）；Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６（１０）：１１４９−１１５４（１９８８）；Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ８：３５−３６（１９９５）；Ｋｒｅｍｅｒ  ＆  Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ５１（１）：３１−４４（１９９５）；Ｈａｄｄａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｄｏｅｒｆｌｅｒ  ａｎｄ  Ｂｏｅｈｍ（ｅｄｓ）（１９９５）；及びＹｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：１３−２６（１９９４）を参照のこと。
【０７３４】
核酸の非ウイルス送達方法には、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン又は脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、及び薬剤で促進するＤＮＡ取込みが含まれる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号明細書、同第４，９４６，７８７号明細書；及び同第４，８９７，３５５号明細書に記載され）、及びリポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性及び中性脂質には、Ｆｅｌｇｎｅｒ、国際公開第９１／１７４２４号パンフレット；国際公開第９１／１６０２４号パンフレットのものが含まれる。送達は、細胞に対してであってもよく（例えばインビトロ又はエキソビボ投与）、又は標的組織に対してであってもよい（例えば生体内投与）。
【０７３５】
脂質：核酸複合体の調製は、免疫脂質複合体などの標的リポソームを含め、当業者に周知されている（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４０４−４１０（１９９５）；Ｂｌａｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：２９１−２９７（１９９５）；Ｂｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８９（１９９４）；Ｒｅｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：６４７−６５４（１９９４）；Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：７１０−７２２（１９９５）；Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：４８１７−４８２０（１９９２）；米国特許第４，１８６，１８３号明細書、同第４，２１７，３４４号明細書、同第４，２３５，８７１号明細書、同第４，２６１，９７５号明細書、同第４，４８５，０５４号明細書、同第４，５０１，７２８号明細書、同第４，７７４，０８５号明細書、同第４，８３７，０２８号明細書、及び同第４，９４６，７８７号明細書を参照）。
【０７３６】
ＲＮＡ又はＤＮＡウイルスベースの系を使用した核酸の送達では、ウイルスを体内の特定の細胞に標的化してウイルスペイロードを核に輸送する高度に進化したプロセスが利用される。ウイルスベクターは患者に直接投与してもよく（インビボ）、又はインビトロでの細胞の処理に使用してもよく、任意選択でその改変細胞が患者に投与され得る（エキソビボ）。従来のウイルスベースの系は、遺伝子導入用にレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴及び単純ヘルペスウイルスベクターを含み得る。レトロウイルス、レンチウイルス、及びアデノ随伴ウイルス遺伝子導入方法では宿主ゲノムにおける組込みが可能であり、多くの場合に挿入されたトランス遺伝子の長期発現がもたらされる。加えて、多くの異なる細胞型及び標的組織で高い形質導入効率が観察されている。
【０７３７】
レトロウイルスの向性は外来性エンベロープタンパク質の取込みによって変えることができ、標的細胞の潜在的標的集団が拡大し得る。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入し、又は感染させることが可能な、且つ典型的には高いウイルス価を生じるレトロウイルスベクターである。従ってレトロウイルス遺伝子導入系の選択は、標的組織に依存し得る。レトロウイルスベクターは、６〜１０ｋｂまでの外来配列のパッケージング能力を有するシス作用性長末端反復配列で構成される。ベクターの複製及びパッケージングには、最小のシス作用性ＬＴＲが十分であり、次にはこれを用いて治療遺伝子を標的細胞に組み込むと、永続的なトランス遺伝子発現がもたらされる。広く使用されているレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、及びそれらの組み合わせをベースとするものが含まれる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１−２７３９（１９９２）；Ｊｏｈａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５−１６４０（１９９２）；Ｓｏｍｍｎｅｒｆｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９（１９９０）；Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８（１９８９）；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４（１９９１）；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００号明細書を参照）。一過的発現が好ましい適用には、アデノウイルスベースの系を使用することができる。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型で極めて高い形質導入効率を示すことができ、細胞分裂が不要である。このようなベクターで、高い力価及び発現レベルが得られている。このベクターは、比較的単純な系で大量に産生することができる。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターもまた、例えば、核酸及びペプチドのインビトロ産生において、並びにインビボ及びエキソビボ遺伝子療法手順のため、標的核酸による細胞の形質導入に使用することができる（例えば、Ｗｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６０：３８−４７（１９８７）；米国特許第４，７９７，３６８号明細書；国際公開第９３／２４６４１号パンフレット；Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３−８０１（１９９４）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）を参照のこと。組換えＡＡＶベクターの構築は、多数の刊行物、例として、米国特許第５，１７３，４１４号明細書；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０（１９８５）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ  ＆  Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ  ８１：６４６６−６４７０（１９８４）；及びＳａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２−３８２８（１９８９）に記載されている。
【０７３８】
ＤＮＡ／ＲＮＡ又はＤＮＡ／ＤＮＡ又はＲＮＡ／ＲＮＡ又はタンパク質／ＲＮＡの選択肢
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ系の構成成分は、ＤＮＡ／ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＲＮＡの組み合わせ又はタンパク質ＲＮＡなど、様々な形態で送達し得る。例えば、Ｃｐｆ１は、ＤＮＡコードポリヌクレオチド又はＲＮＡコードポリヌクレオチドとして、又はタンパク質として送達してもよい。ガイドはＤＮＡコードポリヌクレオチド又はＲＮＡとして送達してもよい。混合型の送達を含め、可能なあらゆる組み合わせが想定される。
【０７３９】
一部の実施形態において、かかる組み合わせの全て（ＤＮＡ／ＲＮＡ又はＤＮＡ／ＤＮＡ又はＲＮＡ／ＲＮＡ又はタンパク質／ＲＮＡ）。
【０７４０】
一部の実施形態において、Ｃｐｆ１がタンパク質形態で送達される場合、それを１つ以上のガイドと予めアセンブルすることが可能である。
【０７４１】
ナノクリュー
更に、ＣＲＩＳＰＲ系は、例えば、Ｓｕｎ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ，「抗癌薬送達用の繭様自己分解性ＤＮＡナノクリュー（Ｃｏｃｏｏｎ−ｌｉｋｅ  ｓｅｌｆ−ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ＤＮＡ  ｎａｎｏｃｌｅｗ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２０１４  Ｏｃｔ  ２２；１３６（４２）：１４７２２−５．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊａ５０８８０２４．Ｅｐｕｂ  ２０１４  Ｏｃｔ  １３．；又はＳｕｎ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ，「ゲノム編集用ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を効率的に送達するための自己集合ＤＮＡナノクリュー（Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ＤＮＡ  Ｎａｎｏｃｌｅｗｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｄｉｔｉｎｇ）」．，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．２０１５  Ｏｃｔ  ５；５４（４１）：１２０２９−３３．ｄｏｉ：１０．１００２／ａｎｉｅ．２０１５０６０３０．Ｅｐｕｂ  ２０１５  Ａｕｇ  ２７に記載されるとおりのナノクリューを用いて送達し得る。
【０７４２】
本発明の実施では、特に指示されない限り、当該分野の技術の範囲内にある免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクス及び組換えＤＮＡの従来技術を利用する。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，（１９８７））；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ  ２：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ  ｅｄｓ．（１９９５））、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，ａｎｄ  ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））を参照のこと。
【０７４３】
遺伝的及び後成的状態のモデル
本発明の方法を用いることにより、目的の突然変異のモデル又は疾患モデルによるなどの、目的の遺伝的又は後成的条件のモデル化及び／又は研究に使用し得る植物、動物又は細胞を作り出すことができる。本明細書で使用されるとき、「疾患」は、対象における疾患、障害、又は徴候を指す。例えば、本発明の方法を用いて、疾患に関連する１つ以上の核酸配列に改変を含む動物若しくは細胞、又は疾患に関連する１つ以上の核酸配列の発現が変化している植物、動物若しくは細胞を作り出すことができる。かかる核酸配列は疾患関連タンパク質配列をコードしてもよく、又は疾患関連制御配列であってもよい。従って、本発明の実施形態において植物、対象、患者、生物又は細胞は、非ヒトの対象、患者、生物又は細胞であり得ることが理解される。従って、本発明は、本方法により作製された植物、動物若しくは細胞、又はその子孫を提供する。子孫は、作製された植物又は動物のクローンであってもよく、又は更に望ましい形質をその子孫に遺伝子移入させるため同じ種の他の個体と交配させることによる有性生殖から生じてもよい。細胞は、多細胞生物、特に動物又は植物の場合にインビボ又はエキソビボであってよい。細胞が培養下にある例では、適切な培養条件が満たされる場合、且つ好ましくは細胞がこの目的に好適に適合する場合（例えば幹細胞）、細胞系が樹立され得る。本発明によって作製される細菌細胞系もまた想定される。ひいては細胞系もまた想定される。
【０７４４】
一部の方法において、疾患モデルを使用することにより、疾患の研究で一般的に用いられる手段を用いて突然変異が動物又は細胞及び疾患の発症及び／又は進行に及ぼす効果を研究することができる。或いは、かかる疾患モデルは、薬学的に活性な化合物が疾患に及ぼす効果の研究に有用である。
【０７４５】
一部の方法において、疾患モデルを使用して、見込みのある遺伝子治療戦略の有効性を評価することができる。即ち、疾患の発症及び／又は進行が阻害又は軽減されるように疾患関連遺伝子又はポリヌクレオチドを改変することができる。詳細には、本方法は、変化したタンパク質が産生され、結果として動物又は細胞が変化した反応を有するように疾患関連遺伝子又はポリヌクレオチドを改変することを含む。従って、一部の方法において、遺伝子治療イベントの効果を評価し得るように、遺伝子改変を受けた動物が、疾患を発症する素因のある動物と比較され得る。
【０７４６】
別の実施形態において、本発明は、疾患遺伝子に関連する細胞シグナル伝達イベントを調節する生物学的に活性な薬剤を開発する方法を提供する。本方法は、ＣＲＩＳＰＲ酵素、及びダイレクトリピート配列に結合したガイド配列の１つ以上の発現をドライブする１つ以上のベクターを含む細胞に試験化合物を接触させるステップ；及び例えば細胞に含まれる疾患遺伝子の突然変異に関連する細胞シグナル伝達イベントの減少又は増加を示す読み取り値の変化を検出するステップを含む。
【０７４７】
細胞機能の変化をスクリーニングするため本発明の方法と組み合わせて細胞モデル又は動物モデルを構築することができる。かかるモデルを使用して、本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体により改変されたゲノム配列が目的の細胞機能に及ぼす効果を研究し得る。例えば、細胞機能モデルを使用して、改変ゲノム配列が細胞内シグナル伝達又は細胞外シグナル伝達に及ぼす効果を研究することができる。或いは、細胞機能モデルを使用して、改変ゲノム配列が感覚認知に及ぼす効果を研究することができる。一部のかかるモデルにおいては、モデルにおける生化学的シグナル伝達経路に関連する１つ以上のゲノム配列が改変される。
【０７４８】
いくつかの疾患モデルが特に研究されている。それらには、デノボ自閉症リスク遺伝子ＣＨＤ８、ＫＡＴＮＡＬ２、及びＳＣＮ２Ａ；並びに症候性自閉症（アンジェルマン症候群）遺伝子ＵＢＥ３Ａが含まれる。これらの遺伝子及び得られる自閉症モデルは当然ながら好ましいが、遺伝子及び対応するモデル全体にわたる本発明の広範な適用性を明らかにすることに役立つ。生化学的シグナル伝達経路に関連する１つ以上のゲノム配列の発現の変化は、候補薬剤に接触させたときの試験モデル細胞と対照細胞との間における対応する遺伝子のｍＲＮＡレベルの差をアッセイすることにより決定され得る。或いは、生化学的シグナル伝達経路に関連する配列の発現の差は、コードされたポリペプチド又は遺伝子産物のレベルの差を検出することにより決定される。
【０７４９】
ｍＲＮＡ転写物又は対応するポリヌクレオチドのレベルの薬剤により引き起こされた変化をアッセイするため、初めに試料中に含まれる核酸が当該技術分野の標準方法に従い抽出される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）に示される手順に従い種々の溶菌酵素又は化学溶液を使用してｍＲＮＡを単離することができ、又は製造者により提供される付属の説明書に従い核酸結合樹脂で抽出することができる。抽出した核酸試料に含まれるｍＲＮＡは、次に当該技術分野において広く知られている方法に従うか又は本明細書に例示する方法に基づき、増幅手順又は従来のハイブリダイゼーションアッセイ（例えばノーザンブロット解析）により検出される。
【０７５０】
本発明の目的上、増幅は、妥当なフィデリティで標的配列を複製する能力を有するプライマー及びポリメラーゼを用いる任意の方法を意味する。増幅は、天然又は組換えＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＴａｑＧｏｌｄ（商標）、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片、及び逆転写酵素によって行われ得る。好ましい増幅方法はＰＣＲである。詳細には、単離されたＲＮＡが、生化学的シグナル伝達経路に関連する配列の発現レベルを定量化するため定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）と組み合わされた逆転写アッセイに供され得る。
【０７５１】
遺伝子発現レベルの検出は、増幅アッセイ中にリアルタイムで行うことができる。一態様では、増幅産物が、蛍光ＤＮＡ結合剤、例えば限定はされないがＤＮＡインターカレート剤及びＤＮＡ溝結合剤で直接可視化され得る。二本鎖ＤＮＡ分子に組み込まれるインターカレート剤の量は、典型的には増幅されたＤＮＡ産物の量に比例するため、好都合には、当該技術分野における従来の光学的システムを使用してインターカレート色素の蛍光を定量化することにより、増幅産物の量を決定することができる。この適用に好適なＤＮＡ結合色素としては、ＳＹＢＲグリーン、ＳＹＢＲブルー、ＤＡＰＩ、プロピジウムヨウ素、Ｈｏｅｓｔｅ、ＳＹＢＲゴールド、臭化エチジウム、アクリジン、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリフラビン、蛍光クマリン（ｆｌｕｏｒｃｏｕｍａｎｉｎ）、エリプチシン、ダウノマイシン、クロロキン、ジスタマイシンＤ、クロモマイシン、ホミジウム、ミトラマイシン、ルテニウムポリピリジル、アントラマイシンなどが挙げられる。
【０７５２】
別の態様では、配列特異的プローブなどの他の蛍光標識を増幅反応に用いて増幅産物の検出及び定量化を促進し得る。プローブベースの定量的増幅は、所望の増幅産物の配列特異的検出に頼る。この増幅は、特異性及び感度の増加をもたらす蛍光性の標的特異的プローブ（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ）を利用する。プローブベースの定量的増幅を実施する方法は当該技術分野で十分に確立されており、米国特許第５，２１０，０１５号明細書に教示される。
【０７５３】
更に別の態様では、生化学的シグナル伝達経路に関連する配列と配列相同性を共有するハイブリダイゼーションプローブを使用して従来のハイブリダイゼーションアッセイを実施し得る。典型的には、プローブは、被験対象から得られた生体試料内に含まれる生化学的シグナル伝達経路に関連する配列と安定した複合体をハイブリダイゼーション反応で形成することが可能である。アンチセンスがプローブ核酸として使用される場合、試料中に提供される標的ポリヌクレオチドがアンチセンス核酸の配列と相補的であるように選択されることは、当業者に理解されるであろう。逆に、ヌクレオチドプローブがセンス核酸である場合、標的ポリヌクレオチドはセンス核酸の配列と相補的であるように選択される。
【０７５４】
ハイブリダイゼーションは、種々のストリンジェンシーの条件下で実施することができる。本発明の実施に好適なハイブリダイゼーション条件は、プローブと生化学的シグナル伝達経路に関連する配列との間の認識相互作用が十分に特異的であるとともに十分に安定しているものである。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーが増加する条件は当該技術分野で広く知られており、発表されている。例えば、（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）；Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）を参照のこと。ハイブリダイゼーションアッセイは、限定はされないが、ニトロセルロース、ガラス、ケイ素、及び種々の遺伝子アレイを含めた任意の固体支持体上に固定化されたプローブを使用して形成され得る。好ましいハイブリダイゼーションアッセイは、米国特許第５，４４５，９３４号明細書に記載されるとおりの高密度遺伝子チップで実施される。
【０７５５】
ハイブリダイゼーションアッセイ中に形成されるプローブ−標的複合体を好都合に検出するため、ヌクレオチドプローブが検出可能標識にコンジュゲートされる。本発明における使用に好適な検出可能標識には、光化学的、生化学的、分光学的、免疫化学的、電気的、光学的又は化学的手段で検出可能な任意の組成物が含まれる。幅広い種類の適切な検出可能標識が当該技術分野において公知であり、それには、蛍光又は化学発光標識、放射性同位元素標識、酵素又は他のリガンドが含まれる。好ましい実施形態では、ジゴキシゲニン、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼ、アビジン／ビオチン複合体など、蛍光標識又は酵素タグを用いることが所望されるものと思われる。
【０７５６】
ハイブリダイゼーション強度の検出又は定量化に用いられる検出方法は、典型的には上記で選択される標識に依存することになる。例えば、放射標識は、写真フィルム又はホスフォイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ）を使用して検出し得る。蛍光マーカーは、放出される光を検出するため光検出器を使用して検出及び定量化し得る。酵素標識は、典型的には酵素に基質を提供し、基質に対する酵素の作用によって産生された反応産物を計測することにより検出される；及び最後に、比色標識は、単純に、着色した標識を可視化することにより検出される。
【０７５７】
薬剤により引き起こされる、生化学的シグナル伝達経路に関連する配列の発現の変化はまた、対応する遺伝子産物を調べることによっても決定し得る。タンパク質レベルの決定には、典型的には、ａ）生体試料中に含まれるタンパク質を、生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質に特異的に結合する薬剤と接触させるステップ；及び（ｂ）そのようにして形成された任意の薬剤：タンパク質複合体を同定するステップが関わる。この実施形態の一態様において、生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質に特異的に結合する薬剤は、抗体、好ましくはモノクローナル抗体である。
【０７５８】
反応は、薬剤と生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質との間で複合体が形成されることを可能にする条件下で、被験試料から得られた生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質の試料に薬剤を接触させることにより実施される。複合体の形成は、当該技術分野の標準的手順に従い直接的又は間接的に検出することができる。直接的な検出方法では、薬剤に検出可能標識が提供され、複合体から未反応薬剤が除去され得る；従って残る標識の量が、形成された複合体の量を示す。かかる方法には、ストリンジェントな洗浄条件の中にあっても薬剤に結合したまま留まる標識を選択することが好ましい。標識は結合反応を妨げないことが好ましい。代替として、間接的な検出手順では、化学的に、或いは酵素的に導入された標識を含む薬剤を使用し得る。望ましい標識は、概して得られる薬剤：ポリペプチド複合体の結合又は安定性を妨げない。しかしながら、標識は典型的には、有効な結合、ひいては検出可能なシグナルの生成のため抗体に接触可能であるように設計される。
【０７５９】
タンパク質レベルの検出に好適な幅広い種類の標識が当該技術分野において公知である。非限定的な例としては、放射性同位元素、酵素、コロイド金属、蛍光化合物、生物発光化合物、及び化学発光化合物が挙げられる。
【０７６０】
結合反応中に形成された薬剤：ポリペプチド複合体の量は、標準的な定量アッセイにより定量化することができる。上記に説明したとおり、薬剤：ポリペプチド複合体の形成は、結合部位に残る標識の量によって直接計測することができる。代替例では、生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質が、特定の薬剤上の結合部位に関して標識類似体と競合するその能力に関して試験される。この競合アッセイでは、捕捉される標識の量は、被験試料中に存在する生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質配列の量に反比例する。
【０７６１】
上記に概説した一般的原理に基づく多くのタンパク質分析技術は、当該技術分野において利用可能である。これには、限定はされないが、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノラジオメトリックアッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、インサイチュイムノアッセイ（例えば、コロイド金、酵素又は放射性同位元素標識を使用する）、ウエスタンブロット分析、免疫沈降アッセイ、免疫蛍光アッセイ、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥが含まれる。
【０７６２】
前述のタンパク質分析の実施には、生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質を特異的に認識し又は結合する抗体が好ましい。望ましい場合、特定のタイプの翻訳後改変（例えば、生化学的シグナル伝達経路誘導性改変）を認識する抗体を使用することができる。翻訳後改変としては、限定はされないが、グリコシル化、脂質化、アセチル化、及びリン酸化が挙げられる。これらの抗体は、商業的な供給業者から購入してもよい。例えば、チロシンリン酸化タンパク質を特異的に認識する抗ホスホチロシン抗体が、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ及びＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒを含む多くの供給業者から入手可能である。抗ホスホチロシン抗体は、ＥＲストレスに応答してそのチロシン残基で別様にリン酸化されるタンパク質の検出において特に有用である。かかるタンパク質としては、限定はされないが、真核生物翻訳開始因子２α（ｅＩＦ−２α）が挙げられる。或いは、これらの抗体は、従来のポリクローナル又はモノクローナル抗体技術を用いて、所望の翻訳後改変を呈する標的タンパク質で宿主動物又は抗体産生細胞を免疫することにより作成し得る。
【０７６３】
主題の方法を実施するにおいて、異なる体組織、異なる細胞型、及び／又は異なる細胞内構造における生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質の発現パターンを識別することが望ましいこともある。こうした試験は、特定の組織、細胞型、又は細胞内構造で優先的に発現するタンパク質マーカーと結合する能力を有する組織特異的、細胞特異的又は細胞内構造特異抗体を使用して実施することができる。
【０７６４】
生化学的シグナル伝達経路に関連する遺伝子の発現の変化はまた、対照細胞と比べた遺伝子産物の活性の変化を調べることにより決定し得る。薬剤により引き起こされる、生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質の活性の変化に関するアッセイは、調べている生物学的活性及び／又はシグナル伝達経路に依存し得る。例えば、タンパク質がキナーゼである場合、下流の１つ又は複数の基質をリン酸化するその能力の変化を当該技術分野において公知の種々のアッセイにより決定することができる。代表的なアッセイとしては、限定はされないが、リン酸化タンパク質を認識する抗ホスホチロシン抗体などの抗体による免疫ブロット及び免疫沈降が挙げられる。加えて、キナーゼ活性は、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒから入手可能）及びｅＴａｇ（商標）アッセイ（Ｃｈａｎ−Ｈｕｉ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １１１：１６２−１７４）などのハイスループット化学発光アッセイにより検出することができる。
【０７６５】
生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質が細胞内ｐＨ条件の変動をもたらすシグナル伝達カスケードの一部である場合、蛍光ｐＨ色素などのｐＨ感受性分子をレポーター分子として使用することができる。生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質がイオンチャネルである別の例では、膜電位及び／又は細胞内イオン濃度の変動をモニタすることができる。多くの市販キット及びハイスループット装置が、イオンチャネルの調節因子に関する迅速且つロバストなスクリーニングに特に適している。代表的な機器としては、ＦＬＩＰＲ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．）及びＶＩＰＲ（Ａｕｒｏｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が挙げられる。これらの機器は、マイクロプレートの１０００個を超えるサンプルウェルで同時に反応を検出し、且つ１秒又は更には１ミリ秒（ｍｉｎｉｓｅｃｏｎｄ）以内にリアルタイムの計測値及び機能データを提供する能力を有する。
【０７６６】
本明細書に開示される任意の方法の実施においては、限定なしに、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ソノポレーション、微粒子銃、リン酸カルシウム媒介性形質移入、カチオン性形質移入、リポソーム形質移入、デンドリマー形質移入、熱ショック形質移入、ヌクレオフェクション形質移入、マグネトフェクション、リポフェクション、インペイルフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、光学的トランスフェクション、専売薬剤により増強される核酸取り込み、及びリポソーム、免疫リポソーム、ビロソーム、又は人工ビリオンを介した送達を含めた当該技術分野で公知の１つ以上の方法によって細胞又は胚に好適なベクターを導入することができる。一部の方法において、ベクターはマイクロインジェクションにより胚に導入される。１つ又は複数のベクターが胚の核又は細胞質に微量注入され得る。一部の方法において、１つ又は複数のベクターはヌクレオフェクションにより細胞に導入され得る。
【０７６７】
ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドは、真核細胞にとって内因性又は外因性の任意のポリヌクレオチドであってもよい。例えば、標的ポリヌクレオチドは、真核細胞の核内に存在するポリヌクレオチドであってもよい。標的ポリヌクレオチドは、遺伝子産物（例えばタンパク質）をコードする配列、又は非コード配列（例えば調節ポリヌクレオチド又はジャンクＤＮＡ）であってもよい。  
【０７６８】
標的ポリヌクレオチドの例としては、生化学的シグナル伝達経路に関連する配列、例えば、生化学的シグナル伝達経路関連遺伝子又はポリヌクレオチドが挙げられる。標的ポリヌクレオチドの例としては、疾患関連遺伝子又はポリヌクレオチドが挙げられる。「疾患関連」遺伝子又はポリヌクレオチドとは、非疾患対照の組織又は細胞と比較して罹患組織に由来する細胞において異常なレベルで又は異常な形態で転写又は翻訳産物を産生している任意の遺伝子又はポリヌクレオチドを指す。それは異常に高いレベルで発現するようになる遺伝子であってもよく；異常に低いレベルで発現するようになる遺伝子であってもよく、ここで発現の変化は疾患の発生及び／又は進行と相関する。疾患関連遺伝子はまた、疾患の原因に直接関与するか又はそれに関与する１つ又は複数の遺伝子との連鎖不平衡がある１つ又は複数の突然変異又は遺伝的変異を有する遺伝子も指す。転写又は翻訳された産物は既知であっても又は未知であってもよく、及び正常レベルであっても又は異常レベルであってもよい。
【０７６９】
ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドは、真核細胞にとって内因性又は外因性の任意のポリヌクレオチドであってもよい。例えば、標的ポリヌクレオチドは、真核細胞の核内に存在するポリヌクレオチドであってもよい。標的ポリヌクレオチドは、遺伝子産物（例えばタンパク質）をコードする配列、又は非コード配列（例えば調節ポリヌクレオチド又はジャンクＤＮＡ）であってもよい。理論によって拘束されることを望むものではないが、標的配列はＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）、即ちＣＲＩＳＰＲ複合体によって認識される短い配列を伴わなければならないと考えられる。ＰＡＭの正確な配列及び長さ要件は、用いられるＣＲＩＳＰＲ酵素に応じて異なるが、ＰＡＭは、典型的にはプロトスペーサー（即ち標的配列）に隣接する２〜５塩基対の配列である。ＰＡＭ配列の例は以下の実施例の節に示され、当業者は、所与のＣＲＩＳＰＲ酵素と共に使用される更なるＰＡＭ配列を同定することができるであろう。更に、ＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインをエンジニアリングすることにより、ＰＡＭ特異性をプログラムし、標的部位認識の忠実度を向上させ、且つＣａｓ、例えばＣａｓ９ゲノムエンジニアリングプラットフォームの多用途性を増加させることが可能となり得る。Ｃａｓ９タンパク質などのＣａｓタンパク質は、例えば、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ  ＢＰ  ｅｔ  ａｌ．「ＰＡＭ特異性が変化したエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｌｔｅｒｅｄ  ＰＡＭ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ．２０１５  Ｊｕｌ  ２３；５２３（７５６１）：４８１−５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１４５９２に記載されるとおり、そのＰＡＭ特異性が変化するようにエンジニアリングし得る。
【０７７０】
ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドとしては、両方ともにＳＹＳＴＥＭＳ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮと題される、それぞれ２０１２年１２月１２日及び２０１３年１月２日に出願された、それぞれＢｒｏａｄ参照番号ＢＩ−２０１１／００８／ＷＳＧＲ  代理人整理番号４４０６３−７０１．１０１及びＢＩ−２０１１／００８／ＷＳＧＲ  代理人整理番号４４０６３−７０１．１０２を有する米国仮特許出願第６１／７３６，５２７号明細書及び同第６１／７４８，４２７号明細書、及び２０１３年１２月１２日に出願されたＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＡＮＤ  ＯＰＴＩＭＩＺＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＳＹＳＴＥＭＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳと題されるＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書（これらの内容は全て、本明細書において全体として参照により援用される）に挙げられるとおりの幾つもの疾患関連遺伝子及びポリヌクレオチド並びに生化学的シグナル伝達経路関連遺伝子及びポリヌクレオチドが含まれ得る。
【０７７１】
標的ポリヌクレオチドの例としては、生化学的シグナル伝達経路に関連する配列、例えば、生化学的シグナル伝達経路関連遺伝子又はポリヌクレオチドが挙げられる。標的ポリヌクレオチドの例としては、疾患関連遺伝子又はポリヌクレオチドが挙げられる。「疾患関連」遺伝子又はポリヌクレオチドとは、非疾患対照の組織又は細胞と比較して罹患組織に由来する細胞において異常なレベルで又は異常な形態で転写又は翻訳産物を産生している任意の遺伝子又はポリヌクレオチドを指す。それは異常に高いレベルで発現するようになる遺伝子であってもよく；異常に低いレベルで発現するようになる遺伝子であってもよく、ここで発現の変化は疾患の発生及び／又は進行と相関する。疾患関連遺伝子はまた、疾患の原因に直接関与するか又はそれに関与する１つ又は複数の遺伝子との連鎖不平衡がある１つ又は複数の突然変異又は遺伝的変異を有する遺伝子も指す。転写又は翻訳された産物は既知であっても又は未知であってもよく、及び正常レベルであっても又は異常レベルであってもよい。
【０７７２】
ゲノムワイドノックアウトスクリーニング
本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲタンパク質及び系は、効率的で対費用効果の高い機能性ゲノムスクリーニングの実施に用いることができる。かかるスクリーニングは、ゲノムワイドライブラリベースのＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を用いることができる。かかるスクリーニング及びライブラリにより、遺伝子の機能、遺伝子が関与する細胞経路、及び遺伝子発現の任意の変化が如何に特定の生物学的過程をもたらし得るかを決定することが可能となり得る。本発明の利点は、ＣＲＩＳＰＲ系がオフターゲット結合及びその結果として生じる副作用を回避することである。これは、標的ＤＮＡに対して高度な配列特異性を有するように構成された系を用いて達成される。本発明の好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質複合体はＣｐｆ１エフェクタータンパク質複合体である。
【０７７３】
本発明の実施形態において、ゲノムワイドライブラリは、本明細書に記載されるとおりの、真核細胞集団内の複数のゲノム遺伝子座における複数の標的配列を標的化可能なガイド配列を含む複数のＣｐｆ１系ガイドＲＮＡを含み得る。細胞集団は胚性幹（ＥＳ）細胞集団であってもよい。ゲノム遺伝子座にある標的配列は非コード配列であってもよい。非コード配列は、イントロン、調節配列、スプライス部位、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、又はポリアデニル化シグナルであり得る。前記標的化により、１つ以上の遺伝子産物の遺伝子機能が変化し得る。標的化は遺伝子機能のノックアウトをもたらし得る。遺伝子産物の標的化は２つ以上のガイドＲＮＡを含み得る。遺伝子産物は、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のガイドＲＮＡ、好ましくは遺伝子当たり３〜４個によって標的化され得る。オフターゲット改変は、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質複合体によって作成される付着末端型の二本鎖切断を利用することによるか、又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系で用いられるものと類似の方法を利用することにより、最小限に抑えることができる（例えば、参照により本明細書に援用される「ＲＮＡガイド下Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＤＮＡターゲティング特異性（Ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｍａｙ  ｂｅ  ｍｉｎｉｍｉｚｅｄ（Ｓｅｅ，ｅ．ｇ．，ＤＮＡ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  Ｃａｓ９  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）」．Ｈｓｕ，Ｐ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｄ．，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．，Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ａｇａｒｗａｌａ，Ｖ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｆｉｎｅ，Ｅ．，Ｗｕ，Ｘ．，Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，Ｃｒａｄｉｃｋ，ＴＪ．，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，ＬＡ．，Ｂａｏ，Ｇ．，＆  Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２６４７（２０１３）を参照）。約１００個以上の配列の標的化であってもよい。約１０００個以上の配列の標的化であってもよい。約２０，０００個以上の配列の標的化であってもよい。ゲノム全体の標的化であってもよい。関連性のある又は望ましい経路に焦点を置いた標的配列のパネルの標的化であってもよい。経路は免疫経路であってもよい。経路は細胞分裂経路であってもよい。
【０７７４】
本発明の一態様は、複数のゲノム遺伝子座の複数の標的配列を標的化可能なガイド配列を含み得る複数のＣｐｆ１ガイドＲＮＡを含み得るゲノムワイドライブラリを包含し、ここで前記標的化により遺伝子機能のノックアウト／ノックダウンが生じる。このライブラリは、生物のゲノム内の一つ一つの遺伝子を標的化するガイドＲＮＡを潜在的に含み得る。
【０７７５】
本発明の一部の実施形態において、生物又は対象は真核生物（ヒトを含めた哺乳動物を含む）又は非ヒト真核生物又は非ヒト動物又は非ヒト哺乳動物である。一部の実施形態において、生物又は対象は非ヒト動物であり、節足動物、例えば昆虫であってもよく、又は線虫であってもよい。本発明の一部の方法において、生物又は対象は植物である。本発明の一部の方法において、生物又は対象は哺乳動物又は非ヒト哺乳動物である。非ヒト哺乳動物は、例えばげっ歯類（好ましくはマウス又はラット）、有蹄類、又は霊長類であってもよい。本発明の一部の方法において、生物又は対象は微細藻類を含む藻類であり、又は真菌類である。
【０７７６】
遺伝子機能のノックアウト／ノックダウンには、Ｉ．Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質、及びＩＩ．１つ以上のガイドＲＮＡを含むエンジニアリングされた天然に存在しないＣｐｆ１エフェクタータンパク質系を含む１つ以上のベクターのベクター系を細胞集団における各細胞に導入するステップ［構成成分Ｉ及びＩＩは系の同じ又は異なるベクター上にあってもよい］、構成成分Ｉ及びＩＩを各細胞に組み込むステップ［ガイド配列は各細胞内のユニークな遺伝子を標的化し、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質は調節エレメントに作動可能に連結されており、ガイド配列を含むガイドＲＮＡは、転写されると、ユニークな遺伝子のゲノム遺伝子座に対応する標的配列へのＣｐｆ１エフェクタータンパク質系の配列特異的結合を導く］、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質によるゲノム遺伝子座の切断を誘導するステップ、及び細胞集団の各細胞内の複数のユニークな遺伝子における異なるノックアウト／ノックダウン突然変異を確認するステップが含まれてもよく、それにより遺伝子ノックアウト／ノックダウン細胞ライブラリが生成される。本発明は、細胞集団が真核細胞集団であり、及び好ましい実施形態において、細胞集団が胚性幹（ＥＳ）細胞の集団であることを包含する。
【０７７７】
１つ以上のベクターはプラスミドベクターであってもよい。ベクターは、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質、ｇＲＮＡ、及び任意選択で選択マーカーを含む標的細胞への単一のベクターであってもよい。理論によって拘束されないが、単一のベクターでＣｐｆ１エフェクタータンパク質及びｇＲＮＡを同時に送達可能であることにより、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質を発現する細胞株を初めに作成する必要なしに、いかなる目的の細胞型にも適用することができる。調節エレメントは誘導性プロモーターであってもよい。誘導性プロモーターはドキシサイクリン誘導性プロモーターであってもよい。本発明の一部の方法において、ガイド配列の発現はＴ７プロモーターの制御下にあり、Ｔ７ポリメラーゼの発現によってドライブされる。種々のノックアウト／ノックダウン突然変異の確認は全エクソームシーケンシングによることができる。ノックアウト／ノックダウン突然変異は１００個以上のユニークな遺伝子において実現し得る。ノックアウト／ノックダウン突然変異は１０００個以上のユニークな遺伝子において実現し得る。ノックアウト／ノックダウン突然変異は２０，０００個以上のユニークな遺伝子において実現し得る。ノックアウト／ノックダウン突然変異はゲノム全体で実現し得る。遺伝子機能のノックアウト／ノックダウンは、特定の生理学的経路又は条件において機能する複数のユニークな遺伝子に実現してもよい。経路又は条件は免疫経路又は条件であってもよい。経路又は条件は細胞分裂経路又は条件であってもよい。
【０７７８】
本発明はまた、本明細書に記載するゲノムワイドライブラリを含むキットも提供する。本キットは、本発明のライブラリを含むベクター又はプラスミドを含む単一の容器を含み得る。本キットはまた、本発明のライブラリからのガイド配列を含むユニークなＣｐｆ１エフェクタータンパク質系ガイドＲＮＡの選択された一部を含むパネルも含むことができ、ここで選択された一部は、特定の生理的条件を示すものである。本発明は、標的化が約１００配列以上、約１０００配列以上又は約２０，０００配列以上又はゲノム全体であることを包含する。更に、標的配列のパネルは、免疫経路又は細胞分裂など、関連性のある又は望ましい経路に焦点が置かれ得る。
【０７７９】
本発明の更なる態様において、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質酵素は１つ以上の突然変異を含んでもよく、機能ドメインへの融合を伴う又は伴わない一般的なＤＮＡ結合タンパク質として用いられ得る。突然変異は人工的に導入された突然変異か又は機能獲得型若しくは機能喪失型突然変異であってもよい。本明細書に記載のとおり突然変異が特徴付けられている。本発明の一態様において、機能ドメインは転写活性化ドメインであってもよく、これはＶＰ６４であり得る。本発明の他の態様において、機能ドメインは転写リプレッサードメインであってもよく、これはＫＲＡＢ又はＳＩＤ４Ｘであり得る。本発明の他の態様は、限定はされないが、転写アクチベーター、リプレッサー、リコンビナーゼ、トランスポザーゼ、ヒストンリモデラー、デメチラーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、クリプトクロム、光誘導性／制御性ドメイン又は化学物質誘導性／制御性ドメインを含むドメインに融合した変異Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質酵素に関する。本発明の一部の方法は、標的遺伝子の発現を誘導するステップを含み得る。一実施形態において、真核細胞集団内の複数のゲノム遺伝子座における複数の標的配列を標的化することによる発現の誘導は、機能ドメインの使用による。
【０７８０】
Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質複合体を利用する本発明の実施では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系で用いられる方法が有用であり、以下が参照される。
【０７８１】
・「ヒト細胞におけるゲノム規模のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ノックアウトスクリーニング（Ｇｅｎｏｍｅ−Ｓｃａｌｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌｓ）」．Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，Ｓａｎｊａｎａ，ＮＥ．，Ｈａｒｔｅｎｉａｎ，Ｅ．，Ｓｈｉ，Ｘ．，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ．，Ｍｉｋｋｅｌｓｏｎ，Ｔ．，Ｈｅｃｋｌ，Ｄ．，Ｅｂｅｒｔ，ＢＬ．，Ｒｏｏｔ，ＤＥ．，Ｄｏｅｎｃｈ，ＪＧ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｅｃ  １２．（２０１３）．［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］；最終的な改訂版が以下として発表された：Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１４  Ｊａｎ  ３；３４３（６１６６）：８４−８７。
【０７８２】
・Ｓｈａｌｅｍ  ｅｔ  ａｌ．は、ゲノムワイド規模で遺伝子機能を探索する新規方法に関する。彼らの研究は、６４，７５１個のユニークなガイド配列で１８，０８０個の遺伝子を標的化するゲノム規模のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ノックアウト（ＧｅＣＫＯ）ライブラリを送達することにより、ヒト細胞におけるネガティブ選択及びポジティブ選択の両方のスクリーニングが可能になったことを示した。第一に、この著者らは、ＧｅＣＫＯライブラリを用いて癌及び多能性幹細胞における細胞生存能力に必須の遺伝子を同定することを示した。次に、この著者らはメラノーマモデルにおいて、その欠損がベムラフェニブ（突然変異プロテインキナーゼＢＲＡＦを阻害する治療薬）に対する耐性に関わる遺伝子をスクリーニングした。彼らの研究は、最も上位に位置付けられる候補には、既に検証されている遺伝子ＮＦ１及びＭＥＤ１２並びに新規ヒットＮＦ２、ＣＵＬ３、ＴＡＤＡ２Ｂ、及びＴＡＤＡ１が含まれたことを明らかにした。この著者らは、同じ遺伝子を標的化する独立したガイドＲＮＡ間における高度な一貫性及び高いヒット確認率を観察し、従ってＣａｓ９によるゲノム規模のスクリーニングの有望さを実証した。
【０７８３】
また、米国特許出願公開第２０１４０３５７５３０号明細書；及び国際公開第２０１４０９３７０１号パンフレット（本明細書によって参照により本明細書に援用される）も参照される。「研究者がＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓゲノム編集ツールの代替となる可能性のあるものを特定する：ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の進化に光を当てる新規Ｃａｓ酵素（Ｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｏ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｔｏｏｌｓ：Ｎｅｗ  Ｃａｓ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｓｈｅｄ  ｌｉｇｈｔ  ｏｎ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ）」と題される２０１５年１０月２２日のＮＩＨプレスリリース（参照により援用される）もまた参照される。
【０７８４】
機能的変化及びスクリーニング
別の態様において、本発明は、遺伝子の機能的評価及びスクリーニング方法を提供する。機能ドメインを正確に送達するため、遺伝子を活性化若しくは抑制するため又は目的の特定の遺伝子座上のメチル化部位を正確に変化させることによりエピジェネティック状態を変化させるための本発明のＣＲＩＳＰＲ系の使用は、単細胞又は細胞集団に適用される１つ以上のガイドＲＮＡを伴うか、又は複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むライブラリの投与又は発現を含む、エキソビボ又はインビボで細胞のプール内のゲノムに適用されるライブラリを伴うことができ、及びここでスクリーニングはＣｐｆ１エフェクタータンパク質の使用を更に含み、ここでＣｐｆ１エフェクタータンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ複合体は、異種機能ドメインを含むように改変される。ある態様において、本発明は、ライブラリの宿主への投与又は宿主におけるインビボ発現を含む、ゲノムのスクリーニング方法を提供する。ある態様において、本発明は、宿主に投与される又は宿主で発現するアクチベーターを更に含む、本明細書に考察されるとおりの方法を提供する。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここでアクチベーターはＣｐｆ１エフェクタータンパク質に付加される。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここでアクチベーターはＣｐｆ１エフェクタータンパク質のＮ末端又はＣ末端に付加される。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここでアクチベーターはｇＲＮＡループに付加される。ある態様において、本発明は、宿主に投与される又は宿主で発現するリプレッサーを更に含む、本明細書に考察されるとおりの方法を提供する。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここでスクリーニングは、遺伝子活性化、遺伝子阻害、又は遺伝子座における切断に影響を及ぼし、及びそれを検出することを含む。
【０７８５】
ある態様において、本発明は、効率的なオンターゲット活性を提供し、且つオフターゲット活性を最小限に抑える。ある態様において、本発明は、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質による効率的なオンターゲット切断を提供し、且つＣｐｆ１エフェクタータンパク質によるオフターゲット切断を最小限に抑える。ある態様において、本発明は、ＤＮＡ切断のない、遺伝子座におけるＣｐｆ１エフェクタータンパク質のガイド特異的結合を提供する。従って、ある態様において、本発明は、標的特異的遺伝子調節を提供する。ある態様において、本発明は、ＤＮＡ切断のない、遺伝子座におけるＣｐｆ１エフェクタータンパク質のガイド特異的結合を提供する。従って、ある態様において、本発明は、単一のＣｐｆ１エフェクタータンパク質を使用したある遺伝子座における切断及び別の遺伝子座における遺伝子調節を提供する。ある態様において、本発明は、１つ以上のＣｐｆ１エフェクタータンパク質及び／又は酵素を使用した複数の標的の直交性の活性化及び／又は阻害及び／又は切断を提供する。
【０７８６】
ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここで宿主は真核細胞である。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここで宿主は哺乳類細胞である。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここで宿主は非ヒト真核生物である。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここで非ヒト真核生物は非ヒト哺乳類である。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここで非ヒト哺乳類はマウスである。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、この方法は、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質複合体又はその１つ又は複数の構成成分又はそれをコードする１つ又は複数の核酸分子の送達を含み、ここで前記１つ又は複数の核酸分子は１つ又は複数の調節配列に作動可能に連結され、且つインビボで発現する。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここでインビボ発現は、レンチウイルス、アデノウイルス、又はＡＡＶを介する。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここで送達は、粒子、ナノ粒子、脂質又は細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を介する。
【０７８７】
ある態様において、本発明は、細胞の目的のゲノム遺伝子座にある標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を各々が含む、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ複合体の対を提供し、ここで各ｇＲＮＡの少なくとも１つのループは、１つ以上のアダプタータンパク質に結合する１つ又は複数の個別のＲＮＡ配列の挿入によって改変され、及びここでアダプタータンパク質は１つ以上の機能ドメインと会合し、ここで各Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質複合体の各ｇＲＮＡは、ＤＮＡ切断活性を有する機能ドメインを含む。ある態様において、本発明は、本明細書において考察するとおりの対のＣｐｆ１エフェクタータンパク質複合体を提供し、ここでＤＮＡ切断活性はＦｏｋ１ヌクレアーゼに起因する。
【０７８８】
ある態様において、本発明は、目的のゲノム遺伝子座にある標的配列の切断方法を提供し、この方法は、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質複合体又はその１つ又は複数の構成成分又はそれをコードする１つ又は複数の核酸分子を細胞に送達することを含み、ここで前記１つ又は複数の核酸分子は１つ又は複数の調節配列に作動可能に連結され、且つインビボで発現する。ある態様において、本発明は、本明細書において考察するとおりの方法を提供し、ここで送達は、レンチウイルス、アデノウイルス、又はＡＡＶを介する。ある態様において、本発明は、本明細書において考察するとおりの方法又は本明細書において考察するとおりの対のＣｐｆ１エフェクタータンパク質複合体を提供し、ここで対のうちの第１の複合体の標的配列は二本鎖ＤＮＡの第１の鎖上にあり、且つ対のうちの第２の複合体の標的配列は二本鎖ＤＮＡの第２の鎖上にある。ある態様において、本発明は、本明細書において考察するとおりの方法又は本明細書において考察するとおりの対のＣｐｆ１エフェクタータンパク質複合体を提供し、ここで第１及び第２の複合体の標的配列は互いに近接しているため、ＤＮＡが相同依存性修復を促進する形で切断される。ある態様において、本明細書における方法は、細胞に鋳型ＤＮＡを導入するステップを更に含むことができる。ある態様において、本明細書における方法又は本明細書における対のＣｐｆ１エフェクタータンパク質複合体は、突然変異していないＣｐｆ１エフェクター酵素のヌクレアーゼ活性の約５％以下を有するように突然変異しているＣｐｆ１エフェクター酵素を各Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質複合体が有することを含み得る。
【０７８９】
ある態様において、本発明は、本明細書において考察するとおりのライブラリ、方法又は複合体を提供し、ここでｇＲＮＡは、少なくとも１つの非コード機能性ループを有するように改変され、例えば少なくとも１つの非コード機能性ループが抑制性であり；例えば少なくとも１つの非コード機能性ループがＡｌｕを含む。
【０７９０】
一態様において、本発明は、遺伝子産物の発現を変化させ又は改変する方法を提供する。前記方法は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含有し及び発現する細胞に、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質とＤＮＡ分子を標的化するガイドＲＮＡとを含むエンジニアリングされた天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ系を導入するステップを含むことができ、それによってガイドＲＮＡが、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を標的化し、及びＣｐｆ１エフェクタータンパク質が、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を切断し、それによって遺伝子産物の発現が変化し；及び、ここでＣｐｆ１エフェクタータンパク質とガイドＲＮＡとは天然では一緒に存在しない。本発明は、ダイレクトリピート配列に連結されたガイド配列を含むガイドＲＮＡを包含する。本発明は更に、真核細胞での発現にコドン最適化されたＣｐｆ１エフェクタータンパク質を包含する。好ましい実施形態において真核細胞は哺乳類細胞であり、より好ましい実施形態において哺乳類細胞はヒト細胞である。本発明の更なる実施形態において、遺伝子産物の発現は減少する。
【０７９１】
一部の実施形態において、１つ以上の機能ドメインがＣｐｆ１エフェクタータンパク質に会合する。一部の実施形態において、１つ以上の機能ドメインが、例えばＫｏｎｎｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  ５１７，５８３−５８８，２９  Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１５）の改変ガイドと共に使用されるとおり、アダプタータンパク質に会合する。一部の実施形態において、１つ以上の機能ドメインがデッドｇＲＮＡ（ｄＲＮＡ）に会合する。一部の実施形態において、例えばＤａｈｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，「触媒活性Ｃａｓ９ヌクレアーゼによる直交性遺伝子制御（Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｇｅｎｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  Ｃａｓ９  ｎｕｃｌｅａｓｅ）」（印刷中）によるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系に類似的に記載のとおり、活性Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質を含むｄＲＮＡ複合体が、ある遺伝子座上で機能ドメインによる遺伝子調節を導く一方、ｇＲＮＡが別の遺伝子座で活性Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質によるＤＮＡ切断を導く。一部の実施形態において、ｄＲＮＡは、オフターゲット調節と比較して目的の遺伝子座に関する調節の選択性が最大となるように選択される。一部の実施形態において、ｄＲＮＡは、標的遺伝子調節が最大となり、且つ標的切断が最小限に抑えられるように選択される。
【０７９２】
以下の考察の目的上、機能ドメインへの言及は、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質と会合した機能ドメイン又はアダプタータンパク質と会合した機能ドメインのことであり得る。
【０７９３】
本発明の実施では、個別的な１つ又は複数のＲＮＡループ又は個別的な１つ又は複数の配列に結合することのできるアダプタータンパク質をリクルートし得る個別的な１つ又は複数のＲＮＡループ又は個別的な（ｄｉｓｃｔｉｎｃｔ）１つ又は複数の配列の挿入により、Ｃｐｆ１タンパク質と衝突することなく、ｇＲＮＡのループを伸長させてもよい。アダプタータンパク質には、限定はされないが、バクテリオファージコートタンパク質の多様性の範囲内にある直交性のＲＮＡ結合タンパク質／アプタマーの組み合わせが含まれ得る。かかるコートタンパク質のリストには、限定はされないが、以下が含まれる：Ｑβ、Ｆ２、ＧＡ、ｆｒ、ＪＰ５０１、Ｍ１２、Ｒ１７、ＢＺ１３、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、ＭＸ１、ＴＷ１８、ＶＫ、ＳＰ、ＦＩ、ＩＤ２、ＮＬ９５、ＴＷ１９、ＡＰ２０５、φＣｂ５、φＣｂ８ｒ、φＣｂ１２ｒ、φＣｂ２３ｒ、７ｓ及びＰＲＲ１。これらのアダプタータンパク質又は直交性ＲＮＡ結合タンパク質は、１つ以上の機能ドメインを含むエフェクタータンパク質又は融合物を更にリクルートし得る。一部の実施形態において、機能ドメインは、トランスポザーゼドメイン、インテグラーゼドメイン、リコンビナーゼドメイン、リゾルバーゼドメイン、インベルターゼドメイン、プロテアーゼドメイン、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメイン、ＤＮＡヒドロキシルメチラーゼドメイン、ＤＮＡデメチラーゼドメイン、ヒストンアセチラーゼドメイン、ヒストンデアセチラーゼドメイン、ヌクレアーゼドメイン、リプレッサードメイン、アクチベータードメイン、転写調節タンパク質（又は転写複合体リクルート）ドメイン、細胞取込み活性関連ドメイン、核酸結合ドメイン、抗体提示ドメイン、ヒストン修飾酵素、ヒストン修飾酵素のリクルーター；ヒストン修飾酵素の阻害因子、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデメチラーゼ、ヒストンキナーゼ、ヒストンホスファターゼ、ヒストンリボシラーゼ、ヒストンデリボシラーゼ、ヒストンユビキチナーゼ、ヒストンデユビキチナーゼ、ヒストンビオチナーゼ及びヒストンテールプロテアーゼからなる群から選択され得る。一部の好ましい実施形態では、機能ドメインは転写活性化ドメイン、例えば、限定なしに、ＶＰ６４、ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡ、ＳＥＴ７／９又はヒストンアセチルトランスフェラーゼである。一部の実施形態において、機能ドメインは転写抑制ドメイン、好ましくはＫＲＡＢである。一部の実施形態において、転写抑制ドメインはＳＩＤ、又はＳＩＤのコンカテマー（例えばＳＩＤ４Ｘ）である。一部の実施形態において、機能ドメインは後成的に改変されるドメインであり、後成的に改変される酵素が提供される。一部の実施形態において、機能ドメインは活性化ドメインであり、これはＰ６５活性化ドメインであってもよい。
【０７９４】
一部の実施形態において、１つ以上の機能ドメインはＮＬＳ（核局在化配列）又はＮＥＳ（核外移行シグナル）である。一部の実施形態において、１つ以上の機能ドメインは転写活性化ドメインであり、ＶＰ６４、ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡ、ＳＥＴ７／９及びヒストンアセチルトランスフェラーゼを含む。ＣＲＩＳＰＲ酵素と会合したものに関する活性化（又はアクチベーター）ドメインへの本明細書中の他の言及には、任意の公知の転写活性化ドメイン及び具体的には、ＶＰ６４、ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡ、ＳＥＴ７／９又はヒストンアセチルトランスフェラーゼが含まれる。
【０７９５】
一部の実施形態において、１つ以上の機能ドメインは転写リプレッサードメインである。一部の実施形態において、転写リプレッサードメインはＫＲＡＢドメインである。一部の実施形態において、転写リプレッサードメインは、ＮｕＥドメイン、ＮｃｏＲドメイン、ＳＩＤドメイン又はＳＩＤ４Ｘドメインである。
【０７９６】
一部の実施形態において、１つ以上の機能ドメインは、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写解除因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性、ＤＮＡ切断活性、ＤＮＡ組込み活性又は核酸結合活性を含む１つ以上の活性を有する。
【０７９７】
ヒストン修飾ドメインもまた、一部の実施形態において好ましい。例示的ヒストン修飾ドメインは以下で考察する。トランスポザーゼドメイン、ＨＲ（相同組換え）機構ドメイン、リコンビナーゼドメイン、及び／又はインテグラーゼドメインもまた、本機能ドメインとして好ましい。一部の実施形態において、ＤＮＡ組込み活性は、ＨＲ機構ドメイン、インテグラーゼドメイン、リコンビナーゼドメイン及び／又はトランスポザーゼドメインを含む。ヒストンアセチルトランスフェラーゼが一部の実施形態において好ましい。
【０７９８】
一部の実施形態において、ＤＮＡ切断活性はヌクレアーゼに起因する。一部の実施形態において、ヌクレアーゼはＦｏｋ１ヌクレアーゼを含む。「高度に特異的なゲノム編集のための二量体ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡガイド下ＦｏｋＩヌクレアーゼ（Ｄｉｍｅｒｉｃ  ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ＦｏｋＩ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ）」，Ｓｈｅｎｇｄａｒ  Ｑ．Ｔｓａｉ，Ｎｉｃｏｌａｓ  Ｗｙｖｅｋｅｎｓ，Ｃｙｄ  Ｋｈａｙｔｅｒ，Ｊｅｎｎｉｆｅｒ  Ａ．Ｆｏｄｅｎ，Ｖｉｓｈａｌ  Ｔｈａｐａｒ，Ｄｅｅｐａｋ  Ｒｅｙｏｎ，Ｍａｔｈｅｗ  Ｊ．Ｇｏｏｄｗｉｎ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｊ．Ａｒｙｅｅ，Ｊ．Ｋｅｉｔｈ  Ｊｏｕｎｇ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３２（６）：５６９−７７（２０１４）を参照されたく、これは、伸長配列を認識し、且つヒト細胞において内因性遺伝子を高効率で編集することのできる二量体ＲＮＡガイド下ＦｏｋＩヌクレアーゼに関する。
【０７９９】
一部の実施形態において、１つ以上の機能ドメインは、ｓｇＲＮＡ及び標的への結合時に機能ドメインがその帰属機能で機能することが可能な空間的配置に機能ドメインが置かれるようにＣｐｆ１エフェクタータンパク質に付加される。
【０８００】
一部の実施形態において、１つ以上の機能ドメインは、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質がｇＲＮＡ及び標的に結合すると、機能ドメインがその帰属機能で機能することが可能な空間的配置に機能ドメインが置かれるようにアダプタータンパク質に付加される。
【０８０１】
ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの組成物を提供し、ここで１つ以上の機能ドメインは、本明細書で考察するとおりのリンカー、任意選択でＧｌｙＳｅｒリンカーを介してＣｐｆ１エフェクタータンパク質又はアダプタータンパク質に付加される。
【０８０２】
内因性転写抑制は、多くの場合に、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）及びデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）などのクロマチン修飾酵素によって媒介される。抑制性ヒストンエフェクタードメインについては公知であり、以下に例示的一覧を提供する。この例示的な表中では、効率的なウイルスパッケージング（例えばＡＡＶによる）を促進するため、小さいサイズのタンパク質及び機能的トランケーションを優先した。しかしながら、一般に、これらのドメインには、ＨＤＡＣ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）、及びヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）阻害因子、並びにＨＤＡＣ及びＨＭＴリクルートタンパク質が含まれ得る。機能ドメインは、一部の実施形態において、ＨＤＡＣエフェクタードメイン、ＨＤＡＣリクルーターエフェクタードメイン、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）エフェクタードメイン、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）リクルーターエフェクタードメイン、又はヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害因子エフェクタードメインであってもよく、又はそれを含み得る。
【０８０３】
【表４】
0006898865.tif 000007
【０８０４】
従って、本発明のリプレッサードメインは、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）阻害因子、並びにＨＤＡＣ及びＨＭＴリクルートタンパク質から選択され得る。
【０８０５】
ＨＤＡＣドメインは、上記の表中にあるもの、即ち：ＨＤＡＣ８、ＲＰＤ３、ＭｅｓｏＬｏ４、ＨＤＡＣ１１、ＨＤＴ１、ＳＩＲＴ３、ＨＳＴ２、ＣｏｂＢ、ＨＳＴ２、ＳＩＲＴ５、Ｓｉｒ２Ａ、又はＳＩＲＴ６のうちのいずれかであってもよい。
【０８０６】
一部の実施形態では、機能ドメインはＨＤＡＣリクルーターエフェクタードメインであってもよい。好ましい例としては、以下の表中にあるもの、即ち、ＭｅＣＰ２、ＭＢＤ２ｂ、Ｓｉｎ３ａ、ＮｃｏＲ、ＳＡＬＬ１、ＲＣＯＲ１が挙げられる。本実施例ではＮｃｏＲが例示され、好ましいものの、このクラス内の他のものもまた有用となり得ることが想定される。
【０８０７】
【表５】
0006898865.tif 000008
【０８０８】
一部の実施形態では、機能ドメインはメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）エフェクタードメインであってもよい。好ましい例としては、以下の表中にあるもの、即ち、ＮＵＥ、ｖＳＥＴ、ＥＨＭＴ２／Ｇ９Ａ、ＳＵＶ３９Ｈ１、ｄｉｍ−５、ＫＹＰ、ＳＵＶＲ４、ＳＥＴ４、ＳＥＴ１、ＳＥＴＤ８、及びＴｇＳＥＴ８が挙げられる。本実施例ではＮＵＥが例示され、好ましいものの、このクラス内の他のものもまた有用となり得ることが想定される。
【０８０９】
【表６】
0006898865.tif 000009
【０８１０】
一部の実施形態では、機能ドメインはヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）リクルーターエフェクタードメインであってもよい。好ましい例としては、以下の表中にあるもの、即ち、Ｈｐ１ａ、ＰＨＦ１９、及びＮＩＰＰ１が挙げられる。
【０８１１】
【表７】
0006898865.tif 000010
【０８１２】
一部の実施形態では、機能ドメインはヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害因子エフェクタードメインであってもよい。好ましい例としては、以下の表中に掲載されるＳＥＴ／ＴＡＦ−１βが挙げられる。
【０８１３】
【表８】
0006898865.tif 000011
【０８１４】
また、プロモーター又はプロモーター近位エレメントに加え、内因性（調節）制御エレメント（エンハンサー及びサイレンサーなど）を標的化することも好ましい。従って、本発明はまた、プロモーターの標的化に加え、内在性対照エレメント（エンハンサー及びサイレンサーを含む）の標的化にも用いることができる。これらの制御エレメントは、転写開始部位（ＴＳＳ）の上流及び下流に、ＴＳＳから２００ｂｐを始端として１００ｋｂ離れたところまで位置し得る。公知の制御エレメントの標的化を用いて目的の遺伝子を活性化又は抑制し得る。場合によっては、単一の制御エレメントが複数の標的遺伝子の転写に影響を及ぼし得る。従って、単一の制御エレメントの標的化を用いて、複数の遺伝子の転写を同時に制御することができる。
【０８１５】
他方で推定制御エレメントの（例えば推定制御エレメントの領域並びにエレメントの周囲２００ｂｐ〜１００ｋＢをタイリングすることによる）標的化は、かかるエレメントの確認手段（目的の遺伝子の転写を計測することによる）又は新規制御エレメントの検出手段（例えば目的の遺伝子のＴＳＳの１００ｋｂ上流及び下流をタイリングすることによる）として用いることができる。加えて、推定制御エレメントの標的化は、疾患の遺伝的原因を解明する文脈において有用であり得る。疾患表現型に関連する多くの突然変異及び共通ＳＮＰ変異体が、コード領域外に位置する。本明細書に記載される活性化系又は抑制系のいずれかによるかかる領域の標的化は、その後に、ａ）一組の推定標的（例えば制御エレメントにごく近接して位置する一組の遺伝子）又はｂ）例えばＲＮＡｓｅｑ又はマイクロアレイによる全トランスクリプトーム読取りのいずれかの転写の読取りが続き得る。これにより、疾患表現型に関わると見込まれる候補遺伝子の同定が可能となり得る。かかる候補遺伝子は、新規薬物標的として有用であり得る。
【０８１６】
ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）阻害因子が本明細書において言及される。しかしながら、一部の実施形態における代替例は、１つ以上の機能ドメインがアセチルトランスフェラーゼ、好ましくはヒストンアセチルトランスフェラーゼを含むものである。これらはエピゲノミクスの分野において、例えばエピゲノムの探索方法で有用である。エピゲノムの探索方法には、例えばエピゲノム配列の標的化が含まれ得る。エピゲノム配列の標的化には、ガイドがエピゲノム標的配列に向けられることが含まれ得る。エピゲノム標的配列には、一部の実施形態において、プロモーター、サイレンサー又はエンハンサー配列が含まれ得る。
【０８１７】
本明細書に記載されるとおりのＣｐｆ１エフェクタータンパク質、好ましくはデッドＣｐｆ１エフェクタータンパク質、より好ましくはデッドＦｎＣｐｆ１エフェクタータンパク質に連結した機能ドメインを用いることによるエピゲノム配列の標的化は、プロモーター、サイレンサー又はエンハンサーを活性化し又は抑制するために用いることができる。
【０８１８】
アセチルトランスフェラーゼの例は公知であり、しかし一部の実施形態ではヒストンアセチルトランスフェラーゼを含み得る。一部の実施形態において、ヒストンアセチルトランスフェラーゼはヒトアセチルトランスフェラーゼｐ３００の触媒コアを含み得る（Ｇｅｒｂａｓｃｈ  ＆  Ｒｅｄｄｙ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ６ｔｈ  Ａｐｒｉｌ  ２０１５）。
【０８１９】
一部の好ましい実施形態では、機能ドメインがデッドＣｐｆ１エフェクタータンパク質に連結され、プロモーター又はエンハンサーなどのエピゲノム配列を標的化及び活性化する。かかるプロモーター又はエンハンサーに向けられる１つ以上のガイドもまた提供されて、かかるプロモーター又はエンハンサーへのＣＲＩＳＰＲ酵素の結合を導き得る。
【０８２０】
用語「〜と会合している」は、ここでは機能ドメインとＣｐｆ１エフェクタータンパク質又はアダプタータンパク質の会合に関して用いられる。これは、例えばアダプタータンパク質と機能ドメインとの間、又はＣｐｆ１エフェクタータンパク質と機能ドメインとの間で、一つの分子がどのように別の分子と「会合」しているかに関して用いられる。かかるタンパク質間相互作用の場合、この会合は、抗体がエピトープを認識する方法における認識の観点で考えられてもよい。或いは、一つのタンパク質が別のタンパク質と、それら２つの融合物を介して会合していてもよく、例えば一つのサブユニットが別のサブユニットに融合していてもよい。融合は典型的には、例えば、各タンパク質又はサブユニットをコードするヌクレオチド配列を併せてスプライシングすることにより、一方のアミノ酸配列を他方のアミノ酸配列に加えることによって起こる。或いは、これは、本質的に、融合タンパク質など、２つの分子間の結合又は直接的な連結と考えられてもよい。いずれにしろ、融合タンパク質は２つの目的のサブユニット間（即ち酵素と機能ドメインとの間又はアダプタータンパク質と機能ドメインとの間）にリンカーを含んでもよい。従って、一部の実施形態において、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質又はアダプタータンパク質は機能ドメインへの結合によってそれと会合している。他の実施形態において、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質又はアダプタータンパク質は機能ドメインと、それらの２つが任意選択で中間リンカーを介して一体に融合されているため、会合している。リンカーの例としては、本明細書で考察されるＧｌｙＳｅｒリンカーが挙げられる。
【０８２１】
機能ドメイン又は融合タンパク質の結合は、リンカー、例えば可動性グリシン−セリン（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）若しくは（ＧＧＧＳ）３か、又は（Ａｌａ（ＧｌｕＡｌａＡｌａＡｌａＬｙｓ）Ａｌａ）などの強固なα−ヘリックスリンカーを介することができる。本明細書では、タンパク質又はペプチドドメインを分離するため、（ＧＧＧＧＳ）３などのリンカーが好ましくは使用される。（ＧＧＧＧＳ）３は、比較的長いリンカー（１５アミノ酸）であるため好ましい。グリシン残基は最も可動性が高く、及びセリン残基はリンカーがタンパク質の外側にある可能性を高める。（ＧＧＧＧＳ）６  （ＧＧＧＧＳ）９又は（ＧＧＧＧＳ）１２が、好ましくは代替として用いられ得る。他の好ましい代替例は、（ＧＧＧＧＳ）１、（ＧＧＧＧＳ）２、（ＧＧＧＧＳ）４、（ＧＧＧＧＳ）５、（ＧＧＧＧＳ）７、（ＧＧＧＧＳ）８、（ＧＧＧＧＳ）１０、又は（ＧＧＧＧＳ）１１である。代替的なリンカーが利用可能であり、しかしＣｐｆ１の２つのパートが一緒になり、ひいてはＣｐｆ１活性が元に戻る機会を最大限にするには、高度に可動性のリンカーが最も良好に働くと考えられる。一つの代替例は、ヌクレオプラスミンのＮＬＳをリンカーとして使用し得ることである。例えば、Ｃｐｆ１と任意の機能ドメインとの間にもリンカーを使用することができる。この場合もまた、ここに（ＧＧＧＧＳ）３リンカー（又はその６、９、又は１２リピートバージョン）を使用してもよく、又はＣｐｆ１と機能ドメインとの間にヌクレオプラスミンのＮＬＳをリンカーとして使用することができる。
【０８２２】
飽和突然変異誘発
本明細書に記載される１つ又は複数のＣｐｆ１エフェクタータンパク質系は、例えば、遺伝子発現、薬剤耐性、及び疾患の好転に必要な機能性エレメントの重要な最小限の特徴及び個別的な脆弱性を決定するための、細胞表現型と併せたゲノム遺伝子座における飽和又はディープスキャニング突然変異誘発の実施に用いることができる。飽和又はディープスキャニング突然変異誘発とは、ゲノム遺伝子座内であらゆる又は本質的にあらゆるＤＮＡ塩基が切断されることを意味する。Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質ガイドＲＮＡのライブラリが細胞集団に導入される。このライブラリは、各細胞がシングルガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を受け取るように導入され得る。本明細書に記載されるとおり、ライブラリがウイルスベクターの形質導入によって導入される場合、低い感染多重度（ＭＯＩ）が用いられる。ライブラリは、ゲノム遺伝子座において（プロトスペーサー隣接モチーフ）（ＰＡＭ）配列の上流にある全ての配列を標的化するｇＲＮＡを含み得る。ライブラリは、ゲノム遺伝子座内の１０００塩基対毎にＰＡＭ配列の上流に少なくとも１００個の非重複ゲノム配列を含み得る。ライブラリは、少なくとも１つの異なるＰＡＭ配列の上流の配列を標的化するｇＲＮＡを含み得る。１つ又は複数のＣｐｆ１エフェクタータンパク質系は２つ以上のＣｐｆ１タンパク質を含み得る。異なるＰＡＭ配列を認識するオルソログ又はエンジニアリングされたＣｐｆ１エフェクタータンパク質を含め、本明細書に記載されるとおりの任意のＣｐｆ１エフェクタータンパク質を用いることができる。ｇＲＮＡに関するオフターゲット部位の頻度は５００未満であり得る。オフターゲットスコアを作成して、最も低いオフターゲット部位のｇＲＮＡを選択し得る。単一の実験で同じ部位を標的化するｇＲＮＡを用いることにより、ｇＲＮＡ標的部位における切断に関連すると決定された任意の表現型を確認し得る。標的部位の検証はまた、本明細書に記載されるとおりの改変Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質、及び目的のゲノム部位を標的化する２つのｇＲＮＡを用いることにより行ってもよい。理論によって拘束されないが、標的部位は、検証実験で表現型の変化が観察された場合に真のヒットである。
【０８２３】
ゲノム遺伝子座は少なくとも１つの連続ゲノム領域を含み得る。少なくとも１つの連続ゲノム領域とは、ゲノム全体に至るまでを含み得る。少なくとも１つの連続ゲノム領域は、ゲノムの機能性エレメントを含み得る。機能性エレメントは、非コード領域、コード遺伝子、イントロン領域、プロモーター、又はエンハンサーの範囲内にあってもよい。少なくとも１つの連続ゲノム領域は、少なくとも１ｋｂ、好ましくは少なくとも５０ｋｂのゲノムＤＮＡを含み得る。少なくとも１つの連続ゲノム領域は転写因子結合部位を含み得る。少なくとも１つの連続ゲノム領域はＤＮアーゼＩ高感受性領域を含み得る。少なくとも１つの連続ゲノム領域は転写エンハンサー又はリプレッサーエレメントを含み得る。少なくとも１つの連続ゲノム領域は、エピジェネティックシグネチャがエンリッチされた部位を含み得る。少なくとも１つの連続ゲノムＤＮＡ領域はエピジェネティックインスレーターを含み得る。少なくとも１つの連続ゲノム領域は、物理的に相互作用する２つ以上の連続ゲノム領域を含み得る。相互作用するゲノム領域は「４Ｃ技術」によって決定し得る。４Ｃ技術によれば、Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．（（２００６）Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ３８，１３４１−７）及び米国特許第８，６４２，２９５号明細書（両方ともに全体として参照により本明細書に援用される）に記載されるとおり、選択のＤＮＡ断片と物理的に相互作用するＤＮＡセグメントに関して偏りのない方法でゲノム全体をスクリーニングすることが可能である。エピジェネティックシグネチャは、ヒストンアセチル化、ヒストンメチル化、ヒストンユビキチン化、ヒストンリン酸化、ＤＮＡメチル化、又はそれらの欠如であり得る。
【０８２４】
飽和又はディープスキャニング突然変異誘発のために１つ又は複数のＣｐｆ１エフェクタータンパク質系を細胞集団で使用することができる。１つ又は複数のＣｐｆ１エフェクタータンパク質系は、限定はされないが哺乳類細胞及び植物細胞を含め、真核細胞で使用することができる。細胞集団は原核細胞であってもよい。真核細胞集団は胚性幹（ＥＳ）細胞、神経細胞、上皮細胞、免疫細胞、内分泌細胞、筋細胞、赤血球、リンパ球、植物細胞、又は酵母細胞の集団であってもよい。
【０８２５】
一態様において、本発明は、表現型の変化に関連する機能性エレメントのスクリーニング方法を提供する。Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質を含むように適合された細胞集団にライブラリを導入し得る。細胞を表現型に基づき少なくとも２つの群に分類し得る。表現型は、遺伝子の発現、細胞成長、又は細胞生存度であってもよい。各群に存在するガイドＲＮＡの相対的表現を決定し、それによって表現型の変化に関連するゲノム部位を、各群に存在するガイドＲＮＡの表現によって決定する。表現型の変化は、目的の遺伝子の発現の変化であってもよい。目的の遺伝子は上方制御され、下方制御され、又はノックアウトされ得る。細胞は高発現群と低発現群とに分類され得る。細胞集団は、表現型の決定に用いられるレポーター構築物を含み得る。レポーター構築物は検出可能なマーカーを含み得る。細胞は、検出可能なマーカーを用いることによって分類し得る。
【０８２６】
別の態様において、本発明は、化学的化合物耐性に関連するゲノム部位のスクリーニング方法を提供する。化学的化合物は薬物又は農薬であり得る。Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質を含むように適合された細胞集団にライブラリを導入することができ、ここで集団の各細胞は１つ以下のガイドＲＮＡを含有する；細胞集団を化学的化合物で処理する；及び化学的化合物による処理後、早い時点と比較した遅い時点におけるガイドＲＮＡの表現を決定し、それによって化学的化合物耐性に関連するゲノム部位をガイドＲＮＡのエンリッチメントによって決定する。ｇＲＮＡの表現はディープシーケンシング方法によって決定してもよい。
【０８２７】
Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質複合体を利用する本発明の実施では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系で用いられる方法が有用であり、「Ｃａｓ９媒介インサイチュー飽和突然変異誘発によるＢＣＬ１１Ａエンハンサー分析（ＢＣＬ１１Ａ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｃａｓ９−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｓａｔｕｒａｔｉｎｇ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）」と題される論文が参照される。Ｃａｎｖｅｒ，Ｍ．Ｃ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｅ．Ｃ．，Ｓｈｅｒ，Ｆ．，Ｐｉｎｅｌｌｏ，Ｌ．，Ｓａｎｊａｎａ，Ｎ．Ｅ．，Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，Ｃｈｅｎ，Ｄ．Ｄ．，Ｓｃｈｕｐｐ，Ｐ．Ｇ．，Ｖｉｎｊａｍｕｒ，Ｄ．Ｓ．，Ｇａｒｃｉａ，Ｓ．Ｐ．，Ｌｕｃ，Ｓ．，Ｋｕｒｉｔａ，Ｒ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｙ．，Ｍａｅｄａ，Ｔ．，Ｙｕａｎ，Ｇ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．，Ｏｒｋｉｎ，Ｓ．Ｈ．，＆  Ｂａｕｅｒ，Ｄ．Ｅ．ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１５５２１，オンライン発行  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １６，２０１５が参照され、この論文は本明細書において参照により援用され、及び以下に簡単に考察する。
【０８２８】
・Ｃａｎｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．は、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）レベルに関連する且つそのマウスオルソログが赤血球ＢＣＬ１１Ａ発現に必要であるエンハンサーとして既に同定されたヒト及びマウスＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサーのインサイチュ飽和突然変異誘発を実施するための新規プールＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ガイドＲＮＡライブラリについて包含している。この手法から、これらのエンハンサーの重要な最小限の特徴及び個別的な脆弱性が明らかになった。この著者らは、初代ヒト前駆細胞の編集及びマウストランスジェネシスを用いて、ＨｂＦ再誘導の標的としてのＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサーを実証した。この著者らは、治療的ゲノム編集についての情報を与える詳細なエンハンサーマップを作成した。
【０８２９】
Ｃｐｆ１系を用いて細胞又は生物（ｏｇａｎｉｓｍ）を改変する方法
一部の実施形態における本発明は、細胞又は生物を改変する方法を包含する。細胞は原核細胞又は真核細胞であってもよい。細胞は哺乳類細胞であってもよい。哺乳類細胞は、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、げっ歯類又はマウス細胞であってもよい。細胞は、家禽、魚類又はエビなどの非哺乳類真核細胞であってもよい。細胞はまた、植物細胞であってもよい。植物細胞は、キャッサバ、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、又はコメなどの作物植物であってもよい。植物細胞はまた、藻類、樹木又は野菜であってもよい。本発明によって細胞に導入される改変は、抗体、デンプン、アルコール又は他の所望の細胞産出物などの生物学的産物の産生向上のため細胞及び細胞の子孫を変化させるようなものであり得る。本発明によって細胞に導入される改変は、産生される生物学的産物を変える変化が細胞及び細胞の子孫に含まれるようなものであり得る。
【０８３０】
本系は１つ以上の異なるベクターを含み得る。本発明のある態様において、Ｃａｓタンパク質は、所望の細胞型、優先的に真核細胞、好ましくは哺乳類細胞又はヒト細胞での発現にコドンが最適化されている。
【０８３１】
パッケージング細胞は、典型的には、宿主細胞への感染能を有するウイルス粒子の形成に使用される。かかる細胞としては、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、及びレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞又はＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子療法に使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子中にパッケージングする細胞株を作製することにより作成される。ベクターは、典型的には、パッケージング及び続く宿主中への組込みに必要な最小限のウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現させるポリヌクレオチド用の発現カセットに置き換えられる。欠損ウイルス機能は、典型的には、パッケージング細胞株によってトランスで供給される。例えば、遺伝子療法に使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、パッケージング及び宿主ゲノム中への組込みに必要なＡＡＶゲノム由来のＩＴＲ配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、即ちｒｅｐ及びｃａｐをコードするもののＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含有する細胞株中にパッケージングされる。この細胞株もまた、ヘルパーとしてアデノウイルスに感染させ得る。ヘルパーウイルスはＡＡＶベクターの複製及びヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドはＩＴＲ配列がないため、大きい量でパッケージングされることはない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも高い感受性を有する熱処理によって低減することができる。
【０８３２】
送達
本発明は、少なくとも１つのナノ粒子複合体によって送達されるＣＲＩＳＰＲ複合体の少なくとも１つの構成成分、例えばＲＮＡに関する。一部の態様において、本発明は、１つ以上のポリヌクレオチド、例えば、又は本明細書に記載されるとおりの１つ以上のベクター、その１つ以上の転写物、及び／又はそれから転写されるもの又はタンパク質を、宿主細胞に送達するステップを含む方法を提供する。一部の態様において、本発明は、かかる方法によって作製される細胞、及びかかる細胞を含むか、又はそれから作製される動物を更に提供する。一部の実施形態では、ガイド配列と組み合わせた（及び任意選択でそれと複合体を形成した）ＣＲＩＳＰＲ酵素が細胞に送達される。哺乳類細胞又は標的組織における核酸の導入には、従来のウイルスベース及び非ウイルスベースの遺伝子導入方法を用いることができる。かかる方法を用いて、ＣＲＩＳＰＲ系の構成成分をコードする核酸を培養下の細胞に、又は宿主生物中の細胞に投与することができる。非ウイルスベクター送達系には、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば本明細書に記載されるベクターの転写物）、ネイキッド核酸、及び送達ビヒクルと複合体を形成した核酸、例えばリポソームが含まれる。ウイルスベクター送達系にはＤＮＡ及びＲＮＡウイルスが含まれ、これは細胞への送達後にエピソームゲノム又は組込みゲノムのいずれかを有する。遺伝子療法手順のレビューに関しては、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：８０８−８１３（１９９２）；Ｎａｂｅｌ  ＆  Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：２１１−２１７（１９９３）；Ｍｉｔａｎｉ  ＆  Ｃａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１６２−１６６（１９９３）；Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１６７−１７５（１９９３）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：４５５−４６０（１９９２）；Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６（１０）：１１４９−１１５４（１９８８）；Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ８：３５−３６（１９９５）；Ｋｒｅｍｅｒ  ＆  Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ５１（１）：３１−４４（１９９５）；Ｈａｄｄａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｄｏｅｒｆｌｅｒ  ａｎｄ  Ｂｏｅｈｍ（ｅｄｓ）（１９９５）；及びＹｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：１３−２６（１９９４）を参照のこと。
【０８３３】
核酸の非ウイルス送達方法には、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン又は脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、及び薬剤で促進するＤＮＡ取込みが含まれる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号明細書、同第４，９４６，７８７号明細書；及び同第４，８９７，３５５号明細書に記載され）、及びリポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性及び中性脂質には、Ｆｅｌｇｎｅｒ、国際公開第９１／１７４２４号パンフレット；国際公開第９１／１６０２４号パンフレットのものが含まれる。送達は、細胞に対してであってもよく（例えばインビトロ又はエキソビボ投与）、又は標的組織に対してであってもよい（例えば生体内投与）。
【０８３４】
脂質：核酸複合体の調製は、免疫脂質複合体などの標的リポソームを含め、当業者に周知されている（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４０４−４１０（１９９５）；Ｂｌａｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：２９１−２９７（１９９５）；Ｂｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８９（１９９４）；Ｒｅｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：６４７−６５４（１９９４）；Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：７１０−７２２（１９９５）；Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：４８１７−４８２０（１９９２）；米国特許第４，１８６，１８３号明細書、同第４，２１７，３４４号明細書、同第４，２３５，８７１号明細書、同第４，２６１，９７５号明細書、同第４，４８５，０５４号明細書、同第４，５０１，７２８号明細書、同第４，７７４，０８５号明細書、同第４，８３７，０２８号明細書、及び同第４，９４６，７８７号明細書を参照）。
【０８３５】
ＲＮＡ又はＤＮＡウイルスベースの系を使用した核酸の送達では、ウイルスを体内の特定の細胞に標的化してウイルスペイロードを核に輸送する高度に進化したプロセスが利用される。ウイルスベクターは患者に直接投与してもよく（ｉｎ  ｖｉｖｏ）、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞の処理に使用してもよく、任意選択でその改変細胞が患者に投与され得る（ｅｘ  ｖｉｖｏ）。従来のウイルスベースの系は、遺伝子導入用にレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴及び単純ヘルペスウイルスベクターを含み得る。レトロウイルス、レンチウイルス、及びアデノ随伴ウイルス遺伝子導入方法では宿主ゲノムにおける組込みが可能であり、多くの場合に挿入されたトランス遺伝子の長期発現がもたらされる。加えて、多くの異なる細胞型及び標的組織で高い形質導入効率が観察されている。
【０８３６】
レトロウイルスの向性は外来性エンベロープタンパク質の取込みによって変えることができ、標的細胞の潜在的標的集団が拡大し得る。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入し、又は感染させることが可能な、且つ典型的には高いウイルス価を生じるレトロウイルスベクターである。従ってレトロウイルス遺伝子導入系の選択は、標的組織に依存し得る。レトロウイルスベクターは、６〜１０ｋｂまでの外来配列のパッケージング能力を有するシス作用性長末端反復配列で構成される。ベクターの複製及びパッケージングには、最小のシス作用性ＬＴＲが十分であり、次にはこれを用いて治療遺伝子を標的細胞に組み込むと、永続的なトランス遺伝子発現がもたらされる。広く使用されているレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、及びそれらの組み合わせをベースとするものが含まれる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１−２７３９（１９９２）；Ｊｏｈａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５−１６４０（１９９２）；Ｓｏｍｍｎｅｒｆｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９（１９９０）；Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８（１９８９）；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４（１９９１）；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００号明細書を参照）。
【０８３７】
別の実施形態において、コーカル（Ｃｏｃａｌ）ベシクロウイルスエンベロープ偽型レトロウイルスベクター粒子が企図される（例えば、フレッド・ハッチンソン癌研究センター（Ｆｒｅｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）に譲渡された米国特許出願公開第２０１２０１６４１１８号明細書を参照）。コーカルウイルスはベシクロウイルス属（Ｖｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）であり、哺乳動物における水疱性口内炎の原因病原体である。コーカルウイルスは、当初はトリニダードでダニから分離されたもので（Ｊｏｎｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．２５：２３６−２４２（１９６４））、トリニダード、ブラジル、及びアルゼンチンで昆虫、ウシ、及びウマから感染が同定されている。哺乳動物に感染するベシクロウイルスの多くは、自然感染した節足動物から分離されており、それがベクター媒介性であることが示唆される。ベシクロウイルスに対する抗体は農村地域に住む人々によく見られ、そこではこのウイルスが地方病性であり、実験室内感染性である；ヒトにおける感染は、通常はインフルエンザ様症状をもたらす。コーカルウイルスエンベロープ糖タンパク質はアミノ酸レベルでＶＳＶ−Ｇインディアナと７１．５％の同一性を共有し、ベシクロウイルスのエンベロープ遺伝子の系統発生学的比較では、ベシクロウイルスの中でコーカルウイルスがＶＳＶ−Ｇインディアナ株と血清学的には異なるものの最も近縁であることが示される。Ｊｏｎｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．２５：２３６−２４２（１９６４）及びＴｒａｖａｓｓｏｓ  ｄａ  Ｒｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐｉｃａｌ  Ｍｅｄ．＆  Ｈｙｇｉｅｎｅ  ３３：９９９−１００６（１９８４）。コーカルベシクロウイルスエンベロープ偽型レトロウイルスベクター粒子には、例えば、レトロウイルスのＧａｇ、Ｐｏｌ、及び／又は１つ以上のアクセサリータンパク質及びコーカルベシクロウイルスエンベロープタンパク質を含み得るレンチウイルス、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、デルタレトロウイルス、及びイプシロンレトロウイルスベクター粒子が含まれ得る。これらの実施形態の特定の態様の範囲内において、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びアクセサリータンパク質はレンチウイルス及び／又はガンマレトロウイルスのものである。本発明は、ＣＲＩＳＰＲ系をコードする外来性核酸分子、例えば、プロモーターと、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質（推定ヌクレアーゼ又はヘリカーゼタンパク質）、例えばＣｐｆ１をコードする核酸分子と、ターミネーターとを含む又はそれから本質的になる第１のカセット、及びプロモーターと、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸分子と、ターミネーターとを含む又はそれから本質的になる２つ、又はそれ以上の、有利にはベクターのパッケージングサイズ限界に至るまでの、例えば合計で（第１のカセットを含めて）５つのカセット（例えば、各カセットは概略的に、プロモーター−ｇＲＮＡ１−ターミネーター、プロモーター−ｇＲＮＡ２−ターミネーター．．．プロモーター−ｇＲＮＡ（Ｎ）−ターミネーター（式中、Ｎは、ベクターのパッケージングサイズ限界の上限である挿入可能な数である）と表される）を含む又はそれからなる複数のカセットを含む又はそれから本質的になるＡＡＶ、又は２つ以上の個々のｒＡＡＶであって、各々がＣＲＩＳＰＲ系の１つ又は２つ以上のカセットを含み、例えば、第１のｒＡＡＶが、プロモーターと、Ｃａｓ、例えばＣａｓ（Ｃｐｆ１）をコードする核酸分子と、ターミネーターとを含む又はそれから本質的になる第１のカセットを含み、及び第２のｒＡＡＶが、プロモーターと、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸分子と、ターミネーターとを含む又はそれから本質的になる複数の４つのカセット（例えば、各カセットは概略的に、プロモーター−ｇＲＮＡ１−ターミネーター、プロモーター−ｇＲＮＡ２−ターミネーター．．．プロモーター−ｇＲＮＡ（Ｎ）−ターミネーター（式中、Ｎは、ベクターのパッケージングサイズ限界の上限である挿入可能な数である）と表される）を含むｒＡＡＶを提供する。ｒＡＡＶはＤＮＡウイルスであるため、ＡＡＶ又はｒＡＡＶに関する本明細書の考察における核酸分子は、有利にはＤＮＡである。プロモーターは、一部の実施形態では、有利にはヒトシナプシンＩプロモーター（ｈＳｙｎ）である。核酸を細胞に送達する更なる方法は、当業者に公知である。例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２００３００８７８１７号明細書を参照のこと。
【０８３８】
一部の実施形態において、宿主細胞が本明細書に記載の１つ以上のベクターによって一過性に又は非一過性にトランスフェクトされる。一部の実施形態では、細胞は、それが対象において天然に存在するとおりにトランスフェクトされる。一部の実施形態において、トランスフェクトされる細胞は対象から採取される。一部の実施形態において、細胞は、細胞株など、対象から採取された細胞に由来する。組織培養向けの広範な細胞株が、当技術分野において公知である。細胞株の例としては、限定はされないが、Ｃ８１６１、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＭＯＬＴ、ｍＩＭＣＤ−３、ＮＨＤＦ、ＨｅＬａ−Ｓ３、Ｈｕｈ１、Ｈｕｈ４、Ｈｕｈ７、ＨＵＶＥＣ、ＨＡＳＭＣ、ＨＥＫｎ、ＨＥＫａ、ＭｉａＰａＣｅｌｌ、Ｐａｎｃ１、ＰＣ−３、ＴＦ１、ＣＴＬＬ−２、Ｃ１Ｒ、Ｒａｔ６、ＣＶ１、ＲＰＴＥ、Ａ１０、Ｔ２４、Ｊ８２、Ａ３７５、ＡＲＨ−７７、Ｃａｌｕ１、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＳＫＯＶ３、ＳＫ−ＵＴ、ＣａＣｏ２、Ｐ３８８Ｄ１、ＳＥＭ−Ｋ２、ＷＥＨＩ−２３１、ＨＢ５６、ＴＩＢ５５、ジャーカット、Ｊ４５．０１、ＬＲＭＢ、Ｂｃｌ−１、ＢＣ−３、ＩＣ２１、ＤＬＤ２、Ｒａｗ２６４．７、ＮＲＫ、ＮＲＫ−５２Ｅ、ＭＲＣ５、ＭＥＦ、Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨｅＬａ  Ｂ、ＨｅＬａ  Ｔ４、ＣＯＳ、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−６、ＣＯＳ−Ｍ６Ａ、ＢＳ−Ｃ−１サル腎臓上皮、ＢＡＬＢ／３Ｔ３マウス胚線維芽細胞、３Ｔ３スイス、３Ｔ３−Ｌ１、１３２−ｄ５ヒト胎児線維芽細胞；１０．１マウス線維芽細胞、２９３−Ｔ、３Ｔ３、７２１、９Ｌ、Ａ２７８０、Ａ２７８０ＡＤＲ、Ａ２７８０ｃｉｓ、Ａ１７２、Ａ２０、Ａ２５３、Ａ４３１、Ａ−５４９、ＡＬＣ、Ｂ１６、Ｂ３５、ＢＣＰ−１細胞、ＢＥＡＳ−２Ｂ、ｂＥｎｄ．３、ＢＨＫ−２１、ＢＲ２９３、ＢｘＰＣ３、Ｃ３Ｈ−１０Ｔ１／２、Ｃ６／３６、Ｃａｌ−２７、ＣＨＯ、ＣＨＯ−７、ＣＨＯ−ＩＲ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｋ２、ＣＨＯ−Ｔ、ＣＨＯ  Ｄｈｆｒ−／−、ＣＯＲ−Ｌ２３、ＣＯＲ−Ｌ２３／ＣＰＲ、ＣＯＲ−Ｌ２３／５０１０、ＣＯＲ−Ｌ２３／Ｒ２３、ＣＯＳ−７、ＣＯＶ−４３４、ＣＭＬ  Ｔ１、ＣＭＴ、ＣＴ２６、Ｄ１７、ＤＨ８２、ＤＵ１４５、ＤｕＣａＰ、ＥＬ４、ＥＭ２、ＥＭ３、ＥＭＴ６／ＡＲ１、ＥＭＴ６／ＡＲ１０．０、ＦＭ３、Ｈ１２９９、Ｈ６９、ＨＢ５４、ＨＢ５５、ＨＣＡ２、ＨＥＫ−２９３、ＨｅＬａ、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７、ＨＬ−６０、ＨＭＥＣ、ＨＴ−２９、ジャーカット、ＪＹ細胞、Ｋ５６２細胞、Ｋｕ８１２、ＫＣＬ２２、ＫＧ１、ＫＹＯ１、ＬＮＣａｐ、Ｍａ−Ｍｅｌ１−４８、ＭＣ−３８、ＭＣＦ−７、ＭＣＦ−１０Ａ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＣＫ  ＩＩ、ＭＤＣＫ  ＩＩ、ＭＯＲ／０．２Ｒ、ＭＯＮＯ−ＭＡＣ６、ＭＴＤ−１Ａ、ＭｙＥｎｄ、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＣＰＲ、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ１０、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ２０、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ４、ＮＩＨ−３Ｔ３、ＮＡＬＭ−１、ＮＷ−１４５、ＯＰＣＮ／ＯＰＣＴ細胞株、Ｐｅｅｒ、ＰＮＴ−１Ａ／ＰＮＴ２、ＲｅｎＣａ、ＲＩＮ−５Ｆ、ＲＭＡ／ＲＭＡＳ、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｓｆ−９、ＳｋＢｒ３、Ｔ２、Ｔ−４７Ｄ、Ｔ８４、ＴＨＰ１細胞株、Ｕ３７３、Ｕ８７、Ｕ���３７、ＶＣａＰ、ベロ細胞、ＷＭ３９、ＷＴ−４９、Ｘ６３、ＹＡＣ−１、ＹＡＲ、及びそれらのトランスジェニック変種が挙げられる。細胞株は、当業者に公知の種々の供給元から入手可能である（例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓｕｓ，Ｖａ．）を参照）。一部の実施形態において、本明細書に記載される１つ以上のベクターによってトランスフェクトされた細胞を使用して、１つ以上のベクター由来配列を含む新規の細胞株が樹立される。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ系の構成成分によって一過性にトランスフェクトされ（例えば、１つ以上のベクターの一過性のトランスフェクション、又はＲＮＡによるトランスフェクションによる）、且つＣＲＩＳＰＲ複合体の活性を通して改変された細胞を使用して、改変は含むものの他のあらゆる外因性配列を欠く細胞を含む新規の細胞株が樹立される。一部の実施形態において、本明細書に記載される１つ以上のベクターによって一過性に又は非一過性にトランスフェクトされた細胞、又はかかる細胞から誘導される細胞株が、１つ以上の試験化合物の評価において使用される。
【０８３９】
一部の実施形態では、本明細書に記載される１つ以上のベクターを用いて非ヒトトランスジェニック動物又はトランスジェニック植物が作製される。一部の実施形態において、トランスジェニック動物は、マウス、ラット、又はウサギなどの哺乳動物である。トランスジェニック動物及び植物の作製方法は当該技術分野において公知であり、一般には、本明細書に記載されるものなど、細胞トランスフェクション方法から始まる。別の実施形態において、針のアレイを備える流体送達装置（例えば、フレッド・ハッチンソン癌研究センター（Ｆｒｅｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）に譲渡された米国特許出願公開第２０１１０２３０８３９号明細書を参照）が、固形組織に対するＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓの送達に企図され得る。流体を固形組織に送達するための米国特許出願公開第２０１１０２３０８３９号明細書の装置は、アレイ状に配置された複数の針と；各々が複数の針のそれぞれ１つと流体連通している複数のリザーバと；複数のリザーバのそれぞれ１つに動作可能に結合され且つリザーバ内の流体圧力を制御するように構成された複数のアクチュエータとを含み得る。特定の実施形態では、複数のアクチュエータの各々が複数のプランジャの１つを含むことができ、複数のプランジャの各々の第１の端部が複数のリザーバのそれぞれ１つに受け入れられ、及び特定の別の実施形態では複数のプランジャのプランジャがそれぞれの第２の端部で一体に動作可能に結合され、同時に押し下げることが可能である。特定の更に別の実施形態は、複数のプランジャの全てを選択的に変更可能な速度で押し下げるように構成されたプランジャ駆動装置を含み得る。他の実施形態では、複数のアクチュエータの各々が、第１の端部と第２の端部とを有する複数の流体送出路の１つを含むことができ、複数の流体送出路の各々の第１の端部が複数のリザーバのそれぞれ１つに結合される。他の実施形態では、この装置は流体圧力源を含むことができ、及び複数のアクチュエータの各々が流体圧力源と複数のリザーバのそれぞれ１つとの間の流体継手を含む。更なる実施形態において、流体圧力源は、圧縮機、真空アキュムレータ、蠕動ポンプ、マスターシリンダー、マイクロ流体ポンプ、及びバルブのうちの少なくとも１つを含み得る。別の実施形態において、複数の針の各々は、その長さに沿って配置された複数のポートを含み得る。
【０８４０】
一態様において、本発明は、真核細胞内の標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、核酸ターゲティング複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて前記標的ポリヌクレオチドの切断を生じさせ、それにより標的ポリヌクレオチドを改変するステップを含み、ここで核酸ターゲティング複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズするガイドＲＮＡと複合体を形成した核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を含む。
【０８４１】
一態様において、本発明は、真核細胞内のポリヌクレオチドの発現を改変する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、核酸ターゲティング複合体をポリヌクレオチドに結合させて、前記結合により前記ポリヌクレオチドの発現の増加又は減少を生じさせるステップを含み；ここで核酸ターゲティング複合体は、前記ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズするガイドＲＮＡと複合体を形成した核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を含む。
【０８４２】
ＣＲＩＳＰＲ複合体構成成分は、輸送部分とコンジュゲートし又は会合させることにより送達し得る（例えば、米国特許第８，１０６，０２２号明細書；同第８，３１３，７７２号明細書に記載される手法を応用する）。核酸送達戦略は、例えば、ガイドＲＮＡ、又はＣＲＩＳＰＲ複合体構成成分をコードするメッセンジャーＲＮＡ又はコードＤＮＡの送達の向上に用いられ得る。例えば、ＲＮＡに改変ＲＮＡヌクレオチドを取り込むことにより、安定性が向上し、免疫刺激が低下し、及び／又は特異性が向上し得る（Ｄｅｌｅａｖｅｙ，Ｇｌｅｎ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １９，Ｉｓｓｕｅ  ８，９３７−９５４；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，１９９５，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １６：１５７−１８２；Ｃａｌｉｃｅｔｉ  ａｎｄ  Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，２００３，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５５：１２６１−１２７７を参照）。疎水性を高め且つ非アニオン性にして、それにより細胞への侵入を改善するためのｇＲＮＡの改変に適し得る可逆的電荷中和リン酸トリエステル骨格修飾など、より効率的な送達に向けたｇＲＮＡなどの核酸の改変に使用し得る様々な構築物が記載されている（Ｍｅａｄｅ  ＢＲ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３２，１２５６−１２６１）。更なる代替的実施形態において、選択されるＲＮＡモチーフは、細胞トランスフェクションの媒介に有用なものであってよい（Ｍａｇａｌｈａｅｓ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１２）；２０  ３，６１６−６２４）。同様に、例えばｇＲＮＡにアプタマーを付加することにより、ＣＲＩＳＰＲ複合体構成成分の送達にアプタマーを適合させ得る（Ｔａｎ  Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２０１１，Ｖｏｌ．２９，Ｎｏ．１２）。
【０８４３】
一部の実施形態において、トリアンテナリーＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）とオリゴヌクレオチド構成成分のコンジュゲーションが、送達、例えば、選択の細胞型、例えば肝細胞への送達の向上に用いられ得る（国際公開第２０１４１１８２７２号パンフレット（参照により本明細書に援用される）；Ｎａｉｒ，ＪＫ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １３６（４９），１６９５８−１６９６１を参照）。これは糖ベースの粒子と見なすことができ、他の粒子送達系及び／又は製剤に関する更なる詳細は本明細書に提供される。従ってＧａｌＮＡｃは、本明細書に記載される他の粒子の意味における粒子と見なすことができ、一般的な使用及び他の考察、例えば前記粒子の送達が、ＧａｌＮＡｃ粒子にも同様に適用される。例えば溶相コンジュゲーション戦略を用いて、ＰＦＰ（ペンタフルオロフェニル）エステルとして活性化したトリアンテナリーＧａｌＮＡｃクラスター（分子量約２０００）を５’−ヘキシルアミノ修飾オリゴヌクレオチド（５’−ＨＡ  ＡＳＯ、分子量約８０００Ｄａ；Φｓｔｅｒｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２０１５，２６（８），ｐｐ  １４５１−１４５５）に付加し得る。同様に、インビボ核酸送達にポリ（アクリレート）ポリマーが記載されている（国際公開第２０１３１５８１４１号パンフレット（参照により本明細書に援用される）を参照）。更なる代替的実施形態において、ＣＲＩＳＰＲナノ粒子（又はタンパク質複合体）を天然に存在する血清タンパク質と予め混合したものが、送達の向上に用いられ得る（Ａｋｉｎｃ  Ａ  ｅｔ  ａｌ，２０１０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｖｏｌ．１８  ｎｏ．７，１３５７−１３６４）。
【０８４４】
送達エンハンサーを例えば化学的ライブラリをスクリーニングすることによって同定するスクリーニング技法が利用可能である（Ｇｉｌｌｅｒｏｎ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４３（１６）：７９８４−８００１）。脂質ナノ粒子などの送達ビヒクルの効率を評価するための手法もまた記載されており、これはＣＲＩＳＰＲ構成成分に有効な送達ビヒクルを同定するために用いられ得る（Ｓａｈａｙ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１，６５３−６５８を参照）。
【０８４５】
一部の実施形態において、例えばインビボでの機能性を向上させるため、タンパク質の疎水性を変えるペプチドなど、機能性ペプチドをタンパク質に加えることにより、タンパク質ＣＲＩＳＰＲ構成成分の送達を促進し得る。ＣＲＩＳＰＲ構成成分タンパク質も同様に、続く化学反応を促進するように改変し得る。例えば、クリック化学を起こす基を有するアミノ酸がタンパク質に加えられてもよい（Ｎｉｋｉｃ  Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １０，７８０−７９１）。この種の実施形態において、次にはクリック化学基を用いて、安定性のためのポリ（エチレングリコール）、細胞透過性ペプチド、ＲＮＡアプタマー、脂質、又は炭水化物、例えばＧａｌＮＡｃなどの多種多様な代替的構造を加え得る。更なる代替例において、ＣＲＩＳＰＲ構成成分タンパク質は、細胞への侵入にタンパク質を適合させるため（Ｓｖｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．４を参照）、例えばタンパク質に細胞透過性ペプチドを加えることにより改変し得る（Ｋａｕｆｆｍａｎ，Ｗ．Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ４０，Ｉｓｓｕｅ  １２，７４９−７６４；Ｋｏｒｅｎ  ａｎｄ  Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，２０１２，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．７を参照）。更なる代替的実施形態において、患者又は対象は、ＣＲＩＳＰＲ構成成分の後の送達を促進する化合物又は製剤で予め処理されてもよい。
【０８４６】
Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質複合体は植物で使用することができる
Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質系（例えば単一の又は多重化した）は、作物ゲノミクスにおける近年の進歩と併せて用いることができる。本明細書に記載される系を使用して、効率的で且つ対費用効果の高い植物遺伝子又はゲノムの探索又は編集又は操作を−例えば、植物遺伝子又はゲノムの迅速な調査及び／又は選択及び／又は探索及び／又は比較及び／又は操作及び／又は形質転換のため、実施することができ；例えば、１つ又は複数の形質又は１つ又は複数の特徴を作出し、同定し、開発し、最適化し、又は１つ又は複数の植物に付与し、又は植物ゲノムを形質転換することができる。従って、植物の生産の向上、新規組み合わせの形質又は特徴を有する新規植物、又は形質が増強された新規植物があり得る。Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質系は、植物に関して、部位特異的組込み（ＳＤＩ）又は遺伝子編集（ＧＥ）又は任意の準逆育種（ＮＲＢ）又は逆育種（ＲＢ）技術において使用することができる。本明細書に記載されるＣｐｆ１エフェクタータンパク質系を利用する態様は、植物におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ（例えばＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９）系の使用と同様であってもよく、アリゾナ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｒｉｚｏｎａ）ウェブサイト「ＣＲＩＳＰＲ−ＰＬＡＮＴ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｒｉｚｏｎａ．ｅｄｕ／ｃｒｉｓｐｒ／）（後援Ｐｅｎｎ  Ｓｔａｔｅ及びＡＧＩ）が挙げられる。本発明の実施形態（ｅｍｏｄｉｍｅｎｔｓ）は、植物におけるゲノム編集で、又はＲＮＡｉ若しくは同様のゲノム編集技法が既に用いられているところで用いることができる；例えば、Ｎｅｋｒａｓｏｖ，「容易になった植物ゲノム編集：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用したモデル及び作物植物における標的突然変異誘発（Ｐｌａｎｔ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｍａｄｅ  ｅａｓｙ：ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｍｏｄｅｌ  ａｎｄ  ｃｒｏｐ  ｐｌａｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ）」，Ｐｌａｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１３，９：３９（ｄｏｉ：１０．１１８６／１７４６−４８１１−９−３９）；Ｂｒｏｏｋｓ，「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用した第一世代のトマトにおける効率的遺伝子編集（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｔｏｍａｔｏ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍ）」，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１４  ｐｐ  １１４．２４７５７７；Ｓｈａｎ，「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を使用した作物植物の標的ゲノム改変（Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｒｏｐ  ｐｌａｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ）」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１，６８６−６８８（２０１３）；Ｆｅｎｇ，「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用した植物における効率的なゲノム編集（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ）」，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１３）２３：１２２９−１２３２．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃ��．２０１３．１１４；オンライン発行  ２０  Ａｕｇｕｓｔ  ２０１３；Ｘｉｅ，「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を使用した植物におけるＲＮＡガイド下ゲノム編集（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ）」，Ｍｏｌ  Ｐｌａｎｔ．２０１３  Ｎｏｖ；６（６）：１９７５−８３．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｍｐ／ｓｓｔ１１９．Ｅｐｕｂ  ２０１３  Ａｕｇ  １７；Ｘｕ，「コメにおけるアグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を使用した遺伝子ターゲティング（Ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｒｉｃｅ）」，Ｒｉｃｅ  ２０１４，７：５（２０１４）、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，「木本多年生植物ポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）の外交配における両アレルＣＲＩＳＰＲ突然変異へのＳＮＰの利用により、４−クマル酸：ＣｏＡリガーゼ特異性及び冗長性が明らかになる（Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ  ＳＮＰｓ  ｆｏｒ  ｂｉａｌｌｅｌｉｃ  ＣＲＩＳＰＲ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｏｕｔｃｒｏｓｓｉｎｇ  ｗｏｏｄｙ  ｐｅｒｅｎｎｉａｌ  Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ４−ｃｏｕｍａｒａｔｅ：ＣｏＡ  ｌｉｇａｓｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）」，Ｎｅｗ  Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ（２０１５）（Ｆｏｒｕｍ）１−４（ｗｗｗ．ｎｅｗｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ．ｃｏｍにおいてオンラインでのみ入手可能）；Ｃａｌｉａｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ，「宿主ゲノムを安定に担持するＣＲＩＳＰＲデバイスを使用した標的ＤＮＡ分解（Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ＤＮＡ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ＣＲＩＳＰＲ  ｄｅｖｉｃｅ  ｓｔａｂｌｙ  ｃａｒｒｉｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｏｓｔ  ｇｅｎｏｍｅ）」，ＮＡＴＵＲＥ  ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ  ６：６９８９，ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ７９８９，ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｎａｔｕｒｅｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ７９８９；米国特許第６，６０３，０６１号明細書−アグロバクテリウム属媒介性植物形質転換方法（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｐｌａｎｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄ）；米国特許第７，８６８，１４９号明細書−植物ゲノム配列及びその使用（Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ）及び米国特許出願公開第２００９／０１００５３６号明細書−農業形質が増強されたトランスジェニック植物（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｐｌａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ａｇｒｏｎｏｍｉｃ  Ｔｒａｉｔｓ）（これらの各々の内容及び開示は全て、本明細書において全体として参照により援用される）を参照のこと。本発明の実施では、Ｍｏｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ「作物ゲノミクス：進展と応用（Ｃｒｏｐ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ：ａｄｖａｎｃｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．２０１１  Ｄｅｃ  ２９；１３（２）：８５−９６の内容及び開示；その各々が、本明細書における実施形態が植物に関してどのように用いられ得るかに関してを含め、参照により本明細書に援用される。従って、本明細書において動物細胞への言及はまた、特に明らかでない限り、適宜修正して植物細胞にも適用し得る；及び、オフターゲット効果が低下した本明細書における酵素及びかかる酵素を利用する系は、本明細書に記載するものを含め、植物適用（ａｐｐｌｃｉａｔｉｏｎｓ）に用いることができる。
【０８４７】
植物及び酵母への適用；バイオ燃料への適用
植物及び酵母へのＣｐｆ１−ＣＲＩＳＰＲ系の適用
定義：
一般に、用語「植物」は、細胞分裂によって特徴的に成長し、葉緑体を含有し、及びセルロースで構成される細胞壁を有する植物界（Ｐｌａｎｔａｅ）の任意の様々な光合成生物、真核生物、単細胞生物又は多細胞生物に関する。用語の植物には単子葉及び双子葉植物が包含される。具体的には、植物には、限定なしに、アカシア、アルファルファ、アマランス、リンゴ、アンズ、チョウセンアザミ、トネリコの木、アスパラガス、アボカド、バナナ、オオムギ、マメ類、テンサイ、カバノキ、ブナノキ、クロイチゴ、ブルーベリー、ブロッコリー、メキャベツ、キャベツ、キャノーラ、カンタループ、ニンジン、キャッサバ、カリフラワー、ヒマラヤスギ、穀物、セロリ、クリ、サクランボ、ハクサイ、柑橘類、クレメンタイン、クローバ、コーヒー、トウモロコシ、ワタ、ササゲ、キュウリ、イトスギ、ナス、ニレ、エンダイブ、ユーカリ、ウイキョウ、イチジク、モミ、ゼラニウム、ブドウ、グレープフルーツ、ラッカセイ類、ホオズキ、ガムヘムロック（ｇｕｍ  ｈｅｍｌｏｃｋ）、ヒッコリー、ケール、キーウィフルーツ、コールラビ、カラマツ、レタス、ニラ、レモン、ライム、ニセアカシア、マツ、メイデンヘア、トウモロコシ、マンゴー、カエデ、メロン、キビ、キノコ、カラシ、堅果類、オーク、オートムギ、油ヤシ、オクラ、タマネギ、オレンジ、観賞植物又は装飾花又は観賞樹、パパイヤ、ヤシ、パセリ、パースニップ、エンドウマメ、モモ、ピーナッツ、セイヨウナシ、ピート、コショウ、カキ、キマメ、マツ、パイナップル、オオバコ、セイヨウスモモ、ザクロ、ジャガイモ、カボチャ、赤チコリ、ダイコン、ナタネ、キイチゴ、コメ、ライムギ、モロコシ、ベニバナ、サルヤナギ、ダイズ、ホウレンソウ、エゾマツ、カボチャ、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、サツマイモ、スイートコーン、タンジェリン、茶、タバコ、トマト、樹木、ライ小麦、芝草、カブ、つる植物、クルミ、オランダガラシ、スイカ、コムギ、ヤムイモ、イチイ、及びズッキーニなどの被子植物及び裸子植物が含まれることが意図される。用語の植物にはまた、それらに根、葉及び高等植物を特徴付ける他の器官がないことによって主に統一された、大部分が光独立栄養生物である藻類も包含される。
【０８４８】
本明細書に記載されるとおりのＣｐｆ１系を使用したゲノム編集方法を用いることにより、本質的にいかなる植物にも所望の形質を付与することができる。本明細書に記載される所望の生理学的及び農学的特性について、本開示の核酸構築物及び上述の様々な形質転換方法を用いて多種多様な植物及び植物細胞系をエンジニアリングし得る。好ましい実施形態において、エンジニアリングの標的となる植物及び植物細胞としては、限定はされないが、穀類作物（例えば、コムギ、トウモロコシ、コメ、キビ、オオムギ）、果実作物（例えば、トマト、リンゴ、セイヨウナシ、イチゴ、オレンジ）、飼料作物（例えば、アルファルファ）、根菜作物（例えば、ニンジン、ジャガイモ、サトウダイコン、ヤムイモ）、葉菜作物（例えば、レタス、ホウレンソウ）；顕花植物（例えば、ペチュニア、バラ、キク）、針葉樹及びマツの木（例えば、モミ、エゾマツ）；ファイトレメディエーションで用いられる植物（例えば、重金属蓄積植物）；油料作物（例えば、ヒマワリ、ナタネ）及び実験目的で用いられる植物（例えば、アラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ））を含めた作物など、単子葉及び双子葉植物が挙げられる。従って、本方法及びＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は広範囲の植物にわたり、例えば、モクレン目（Ｍａｇｎｉｏｌａｌｅｓ）、シキミ目（Ｉｌｌｉｃｉａｌｅｓ）、クスノキ目（Ｌａｕｒａｌｅｓ）、コショウ目（Ｐｉｐｅｒａｌｅｓ）、ウマノスズクサ目（Ａｒｉｓｔｏｃｈｉａｌｅｓ）、スイレン目（Ｎｙｍｐｈａｅａｌｅｓ）、キンポウゲ目（Ｒａｎｕｎｃｕｌａｌｅｓ）、ケシ目（Ｐａｐｅｖｅｒａｌｅｓ）、サラセニア科（Ｓａｒｒａｃｅｎｉａｃｅａｅ）、ヤマグルマ目（Ｔｒｏｃｈｏｄｅｎｄｒａｌｅｓ）、マンサク目（Ｈａｍａｍｅｌｉｄａｌｅｓ）、トチュウ目（Ｅｕｃｏｍｉａｌｅｓ）、レイトネリア目（Ｌｅｉｔｎｅｒｉａｌｅｓ）、ヤマモモ目（Ｍｙｒｉｃａｌｅｓ）、ブナ目（Ｆａｇａｌｅｓ）、モクマオウ目（Ｃａｓｕａｒｉｎａｌｅｓ）、ナデシコ目（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｌｅｓ）、バティス目（Ｂａｔａｌｅｓ）、タデ目（Ｐｏｌｙｇｏｎａｌｅｓ）、イソマツ目（Ｐｌｕｍｂａｇｉｎａｌｅｓ）、ビワモドキ目（Ｄｉｌｌｅｎｉａｌｅｓ）、ツバキ目（Ｔｈｅａｌｅｓ）、アオイ目（Ｍａｌｖａｌｅｓ）、イラクサ目（Ｕｒｔｉｃａｌｅｓ）、サガリバナ目（Ｌｅｃｙｔｈｉｄａｌｅｓ）、スミレ目（Ｖｉｏｌａｌｅｓ）、ヤナギ目（Ｓａｌｉｃａｌｅｓ）、フウチョウソウ目（Ｃａｐｐａｒａｌｅｓ）、ツツジ目（Ｅｒｉｃａｌｅｓ）、イワウメ目（Ｄｉａｐｅｎｓａｌｅｓ）、カキノキ目（Ｅｂｅｎａｌｅｓ）、サクラソウ目（Ｐｒｉｍｕｌａｌｅｓ）、バラ目（Ｒｏｓａｌｅｓ）、マメ目（Ｆａｂａｌｅｓ）、カワゴケソウ目（Ｐｏｄｏｓｔｅｍａｌｅｓ）、アリノトウグサ目（Ｈａｌｏｒａｇａｌｅｓ）、フトモモ目（Ｍｙｒｔａｌｅｓ）、ミズキ目（Ｃｏｒｎａｌｅｓ）、ヤマモガシ目（Ｐｒｏｔｅａｌｅｓ）、ビャクダン目（Ｓａｎ  ｔａｌｅｓ）、ラフレシア目（Ｒａｆｆｌｅｓｉａｌｅｓ）、ニシキギ目（Ｃｅｌａｓｔｒａｌｅｓ）、トウダイグサ目（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｌｅｓ）、クロウメモドキ目（Ｒｈａｍｎａｌｅｓ）、ムクロジ目（Ｓａｐｉｎｄ���ｌｅｓ）、クルミ目（Ｊｕｇｌａｎｄａｌｅｓ）、フウロソウ目（Ｇｅｒａｎｉａｌｅｓ）、ヒメハギ目（Ｐｏｌｙｇａｌａｌｅｓ）、セリ目（Ｕｍｂｅｌｌａｌｅｓ）、リンドウ目（Ｇｅｎｔｉａｎａｌｅｓ）、ハナシノブ目（Ｐｏｌｅｍｏｎｉａｌｅｓ）、シソ目（Ｌａｍｉａｌｅｓ）、オオバコ目（Ｐｌａｎｔａｇｉｎａｌｅｓ）、ゴマノハグサ目（Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａｌｅｓ）、キキョウ目（Ｃａｍｐａｎｕｌａｌｅｓ）、アカネ目（Ｒｕｂｉａｌｅｓ）、マツムシソウ目（Ｄｉｐｓａｃａｌｅｓ）、及びキク目（Ａｓｔｅｒａｌｅｓ）に属する双子葉植物などで用いることができる；本方法及びＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、オモダカ目（Ａｌｉｓｍａｔａｌｅｓ）、トチカガミ目（Ｈｙｄｒｏｃｈａｒｉｔａｌｅｓ）、イバラモ目（Ｎａｊａｄａｌｅｓ）、ホンゴウソウ目（Ｔｒｉｕｒｉｄａｌｅｓ）、ツユクサ目（Ｃｏｍｍｅｌｉｎａｌｅｓ）、ホシクサ目（Ｅｒｉｏｃａｕｌａｌｅｓ）、サンアソウ目（Ｒｅｓｔｉｏｎａｌｅｓ）、イネ目（Ｐｏａｌｅｓ）、イグサ目（Ｊｕｎｃａｌｅｓ）、カヤツリグサ目（Ｃｙｐｅｒａｌｅｓ）、ガマ目（Ｔｙｐｈａｌｅｓ）、パイナップル目（Ｂｒｏｍｅｌｉａｌｅｓ）、ショウガ目（Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｌｅｓ）、ヤシ目（Ａｒｅｃａｌｅｓ）、パナマソウ目（Ｃｙｃｌａｎｔｈａｌｅｓ）、タコノキ目（Ｐａｎｄａｎａｌｅｓ）、サトイモ目（Ａｒａｌｅｓ）、ユリ目（Ｌｉｌｌｉａｌｅｓ）、及びラン目（Ｏｒｃｈｉｄ  ａｌｅｓ）に属するものなどの単子葉植物、又は裸子植物類（Ｇｙｍｎｏｓｐｅｒｍａｅ）に属する植物、例えば、マツ目（Ｐｉｎａｌｅｓ）、イチョウ目（Ｇｉｎｋｇｏａｌｅｓ）、ソテツ目（Ｃｙｃａｄａｌｅｓ）、ナンヨウスギ目（Ａｒａｕｃａｒｉａｌｅｓ）、ヒノキ目（Ｃｕｐｒｅｓｓａｌｅｓ）及びグネツム目（Ｇｎｅｔａｌｅｓ）に属するもので用いることができる。
【０８４９】
本明細書に記載されるＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系及び使用方法は、以下の双子葉類、単子葉類又は裸子植物の属の非限定的なリストに含まれる広範囲にわたる植物種に用いることができる：オオカミナスビ属（Ａｔｒｏｐａ）、アルセオダフネ属（Ａｌｓｅｏｄａｐｈｎｅ）、カシューナットノキ属（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ）、ラッカセイ属（Ａｒａｃｈｉｓ）、ベイルシュミエディア属（Ｂｅｉｌｓｃｈｍｉｅｄｉａ）、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、ベニバナ属（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ）、アオツヅラフジ属（Ｃｏｃｃｕｌｕｓ）、クロトン属（Ｃｒｏｔｏｎ）、ククミス属（Ｃｕｃｕｍｉｓ）、ミカン属（Ｃｉｔｒｕｓ）、スイカ属（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ）、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、ニチニチソウ属（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ）、ココヤシ属（Ｃｏｃｏｓ）、コーヒーノキ属（Ｃｏｆｆｅａ）、ククルビタ属（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ）、ニンジン属（Ｄａｕｃｕｓ）、ドゥグエティア属（Ｄｕｇｕｅｔｉａ）、ハナビシソウ属（Ｅｓｃｈｓｃｈｏｌｚｉａ）、イチジク属（Ｆｉｃｕｓ）、オランダイチゴ属（Ｆｒａｇａｒｉａ）、ツノゲシ属（Ｇｌａｕｃｉｕｍ）、ダイズ属（Ｇｌｙｃｉｎｅ）、ワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）、ヒマワリ属（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）、パラゴムノキ属（Ｈｅｖｅａ）、ヒヨス属（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ）、アキノノゲシ属（Ｌａｃｔｕｃａ）、ランドルフィア属（Ｌａｎｄｏｌｐｈｉａ）、アマ属（Ｌｉｎｕｍ）、ハマビワ属（Ｌｉｔｓｅａ）、トマト属（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）、ルピナス属（Ｌｕｐｉｎｕｓ）、キャッサバ属（Ｍａｎｉｈｏｔ）、マジョラナ属（Ｍａｊｏｒａｎａ）、リンゴ属（Ｍａｌｕｓ）、ウマゴヤシ属（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、オリーブ属（Ｏｌｅａ）、パルセニウム属（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ）、ケシ属（Ｐａｐａｖｅｒ）、ワニナシ属（Ｐｅｒｓｅａ）、インゲンマメ属（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）、カイノキ属（Ｐｉｓｔａｃｉａ）、エンドウ属（Ｐｉｓｕｍ）、ナシ属（Ｐｙｒｕｓ）、サクラ属（Ｐｒｕｎｕｓ）、ダイコン属（Ｒａｐｈａｎｕｓ）、トウゴマ属（Ｒｉｃｉｎｕｓ）、キオン属（Ｓｅｎｅｃｉｏ）、ツヅラフジ属（Ｓｉｎｏｍｅｎｉｕｍ）、ハスノハカヅラ属（Ｓｔｅｐｈａｎｉａ）、シロガラシ属（Ｓｉｎａｐｉｓ）、ナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ）、カカオ属（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）、ジャジクソウ属（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ）、フェヌグリーク属（Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ）、ソラマメ属（Ｖｉｃｉａ）、ツルニチニチソウ属（Ｖｉｎｃａ）、ブドウ属（Ｖｉｌｉｓ）、及びササゲ属（Ｖｉｇｎａ）；及びネギ属（Ａｌｌｉｕｍ）、ウシクサ属（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ）、スズメガヤ属（Ａｒａｇｒｏｓｔｉｓ）、アスパラガス属（Ａｓｐａｒａｇｕｓ）、カラスムギ属（Ａｖｅｎａ）、ギョウギシバ属（Ｃｙｎｏｄｏｎ）、アブラヤシ属（Ｅｌａｅｉｓ）、ウシノケグサ属（Ｆｅｓｔｕｃａ）、フェストロリウム属（Ｆｅｓｔｕｌｏｌｉｕｍ）、ワスレグサ属（Ｈｅｔｅｒｏｃａｌｌｉｓ）、オオムギ属（Ｈｏｒｄｅｕｍ）、アオウキクサ属（Ｌｅｍｎａ）、ドクムギ属（Ｌｏｌｉｕｍ）、バショウ属（Ｍｕｓａ）、イネ属（Ｏｒｙｚａ）、キビ属（Ｐａｎｉｃｕｍ）、チカラシバ属（Ｐａ���ｎｅｓｅｔｕｍ）、アワガエリ属（Ｐｈｌｅｕｍ）、イチゴツナギ属（Ｐｏａ）、ライムギ属（Ｓｅｃａｌｅ）、モロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）、コムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）、トウモロコシ属（Ｚｅａ）、モミ属（Ａｂｉｅｓ）、コウヨウザン属（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｉａ）、マオウ属（Ｅｐｈｅｄｒａ）、トウヒ属（Ｐｉｃｅａ）、マツ属（Ｐｉｎｕｓ）、及びトガサワラ属（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ）。
【０８５０】
Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系及び使用方法はまた、例えば、紅藻植物門（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）（紅藻類）、緑藻植物門（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）（緑藻類）、褐藻植物門（Ｐｈａｅｏｐｈｙｔａ）（褐藻類）、珪藻植物門（Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｔａ）（珪藻類）、真正眼点藻植物門（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔａ）及び渦鞭毛藻類を含む幾つかの真核生物の門、並びに原核生物の門、藍色植物門（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）（藍藻類）から選択される藻類（ａｌｇｅａ）を含め、広範囲にわたる「藻類」又は「藻類細胞」にも用いることができる。用語「藻類」には、例えば、アンフォラ属（Ａｍｐｈｏｒａ）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）、アンキストロデスムス属（Ａｎｉｋｓｔｒｏｄｅｓｍｉｓ）、ボトリオコッカス属（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ）、キートケロス属（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ）、クラミドモナス属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、クロロコックム属（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ）、キクロテラ属（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）、シリンドロテカ属（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ）、ドナリエラ属（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）、エミリアニア属（Ｅｍｉｌｉａｎａ）、ユーグレナ属（Ｅｕｇｌｅｎａ）、ヘマトコッカス属（Ｈｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）、イソクリシス属（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）、モノクリシス属（Ｍｏｎｏｃｈｒｙｓｉｓ）、モノラフィディウム属（Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ）、ナンノクロリス属（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ）、ナンノクロロプシス属（Ｎａｎｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）、フナガタケイソウ属（Ｎａｖｉｃｕｌａ）、ネフロクロリス属（Ｎｅｐｈｒｏｃｈｌｏｒｉｓ）、ネフロセルミス属（Ｎｅｐｈｒｏｓｅｌｍｉｓ）、ニッチア属（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）、ノドゥラリア属（Ｎｏｄｕｌａｒｉａ）、ノストック属（Ｎｏｓｔｏｃ）、オクロモナス属（Ｏｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ）、オオキスティス属（Ｏｏｃｙｓｔｉｓ）、オシラトリア属（Ｏｓｃｉｌｌａｒｔｏｒｉａ）、パブロバ属（Ｐａｖｌｏｖａ）、フェオダクチラム属（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）、プラチモナス属（Ｐｌａｙｔｍｏｎａｓ）、プレウロクリシス属（Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ）、アマノリ属（Ｐｏｒｈｙｒａ）、シュードアナベナ属（Ｐｓｅｕｄｏａｎａｂａｅｎａ）、ピラミモナス属（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ）、スチココッカス属（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、テトラセルミス属（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）、タラシオシラ属（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）、及びアイアカシオ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ）から選択される藻類が含まれる。
【０８５１】
植物の一部、即ち「植物組織」を本発明の方法に従い処理して改良された植物を作り出し得る。植物組織は植物細胞も包含する。用語「植物細胞」は、本明細書で使用されるとき、インタクトな全植物であるか、或いはインビトロ組織培養下に培地又は寒天上で、成長培地又は緩衝液中の懸濁液中で、又は高度に組織化された単位、例えば、植物組織、植物器官、又は全植物などの一部として成長した単離された形態であるかのいずれかの、生きている植物の個々の単位を指す。
【０８５２】
「プロトプラスト」は、その細胞壁を再形成し、増殖し及び再生して適切な成長条件下で全植物に成長することのできる生きている植物のインタクトな生化学的にコンピテントな単位が生じるようにその保護細胞壁が例えば機械的又は酵素的手段を用いて完全に又は部分的に除去された植物細胞を指す。
【０８５３】
用語「形質転換」は、広義には、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）又は種々の化学的若しくは物理的方法の一つを用いたＤＮＡの導入によって植物宿主が遺伝子改変される方法を指す。本明細書で使用されるとき、用語「植物宿主」は、植物の任意の細胞、組織、器官、又は子孫を含め、植物を指す。多くの好適な植物組織又は植物細胞を形質転換することができ、限定はされないが、プロトプラスト、体細胞胚、花粉、葉、実生、茎、カルス、走根、微小管、及び苗条が挙げられる。植物組織はまた、有性生殖的に生成されたか、それとも無性生殖的に生成されたかに関わらず、かかる植物、種子、子孫、ムカゴの任意のクローン、及び挿し木又は種子など、これらのいずれかの子孫も指す。
【０８５４】
用語「形質転換された」は、本明細書で使用されるとき、構築物などの外来性ＤＮＡ分子が導入されている細胞、組織、器官、又は生物を指す。導入されたＤＮＡ分子は、導入されたＤＮＡ分子が後続の子孫に伝わるようにレシピエント細胞、組織、器官、又は生物のゲノムＤＮＡに組み込まれてもよい。これらの実施形態において、「形質転換」又は「トランスジェニック」細胞又は植物にはまた、その細胞又は植物の子孫、及び交雑でかかる形質転換植物を親として用いる育種計画から作り出された、且つ導入されたＤＮＡ分子の存在によって生じる表現型の変化を呈する子孫も含まれ得る。好ましくは、トランスジェニック植物は稔性であり、導入されたＤＮＡを有性生殖を通じて子孫に伝えることが可能である。
【０８５５】
トランスジェニック植物の子孫など、用語「子孫」は、植物又はトランスジェニック植物から生まれるか、それから作り出されたか、又はそれに由来するものである。導入ＤＮＡ分子はまた、レシピエント細胞に一過性に導入されてもよく、そのため導入ＤＮＡ分子は後続の子孫によって受け継がれないことになり、従って「トランスジェニック」とは見なされない。従って、本明細書で使用されるとき、「非トランスジェニック」植物又は植物細胞は、そのゲノムに安定に組み込まれた外来ＤＮＡを含有しない植物である。
【０８５６】
用語「植物プロモーター」は、本明細書で使用されるとき、その起源が植物細胞であるか否かに関わらず、植物細胞において転写を開始させる能力を有するプロモーターである。例示的な適した植物プロモーターとしては、限定はされないが、植物、植物ウイルス、及び植物細胞で発現する遺伝子を含むアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）又はリゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）などの細菌から得られるものが挙げられる。
【０８５７】
本明細書で使用されるとき、「真菌細胞」は、真菌類の界内にある任意の種類の真核細胞を指す。真菌類の界内にある門としては、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、コウマクノウキン門（Ｂｌａｓｔｏｃｌａｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、ツボカビ門（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、グロムス門（Ｇｌｏｍｅｒｏｍｙｃｏｔａ）、微胞子虫門（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ）、及びネオカリマスティクス門（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｇｏｍｙｃｏｔａ）が挙げられる。真菌細胞には、酵母、カビ、及び糸状菌類が含まれ得る。一部の実施形態において、真菌細胞は酵母細胞である。
【０８５８】
本明細書で使用されるとき、用語「酵母細胞」は、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）及び担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）の範囲内にある任意の真菌細胞を指す。酵母細胞には、出芽酵母細胞、分裂酵母細胞、及びカビ細胞が含まれ得る。これらの生物に限定されないが、研究室及び工業環境で使用される多くの種類の酵母が、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）の一部である。一部の実施形態において、酵母細胞はＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｒｖｉｓｉａｅ）、クルイベロミセス・マルクシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、又はイサチェンキア・オリエンタリス（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）細胞である。他の酵母細胞としては、限定なしに、カンジダ属種（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．）（例えば、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ））、ヤロウイア属種（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐｐ．）（例えば、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））、ピキア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．）（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））、クルイベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）（例えば、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）及びクルイベロミセス・マルクシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ））、アカパンカビ属種（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｓｐｐ．）（例えば、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ））、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）（例えば、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ））、及びイサチェンキア属種（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ  ｓｐｐ．）（例えば、イサチェンキア・オリエンタリス（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、別名ピキア・クドリャフツェフィイ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）及びカンジダ・アシドサーモフィルム（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ））を挙げることができる。一部の実施形態において、真菌細胞は糸状菌細胞である。本明細書で使用されるとき、用語「糸状菌細胞」は、フィラメント状に、即ち菌糸又は菌糸体として成長する任意の種類の真菌細胞を指す。糸状菌細胞の例としては、限定なしに、アスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）（例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ））、トリコデルマ属種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．）（例えば、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ））、リゾプス属種（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐｐ．）（例えば、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ））、及びモルティエレラ属種（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．）（例えば、モルティエレラ・イザベリナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ））を挙げることができる。
【０８５９】
一部の実施形態において、真菌細胞は工業用菌株である。本明細書で使用されるとき、「工業用菌株」は、工業的プロセス、例えば商業的又は工業的規模での製品の生産において使用されるか又はそれから単離される真菌細胞の任意の株を指す。工業用菌株は、典型的に工業的プロセスで使用される真菌種を指してもよく、又はそれは、非工業目的（例えば実験研究）にもまた用いられ得る真菌種の分離株を指してもよい。工業的プロセスの例としては、発酵（例えば、食品又は飲料製品の生産における）、蒸留、バイオ燃料生産、化合物の生産、及びポリペプチドの生産を挙げることができる。工業用菌株の例としては、限定なしに、ＪＡＹ２７０及びＡＴＣＣ４１２４を挙げることができる。
【０８６０】
一部の実施形態において、真菌細胞は倍数体細胞である。本明細書で使用されるとき、「倍数体」細胞は、ゲノムが２つ以上のコピーで存在する任意の細胞を指し得る。倍数体細胞は、天然で倍数体状態で見られる種類の細胞を指してもよく、又はそれは、倍数体状態で存在するように（例えば、減数分裂、細胞質分裂、又はＤＮＡ複製の特定の調節、変化、不活性化、活性化、又は改変によって）誘導された細胞を指してもよい。倍数体細胞は、ゲノム全体が倍数体である細胞を指してもよく、又はそれは、特定の目的のゲノム遺伝子座において倍数体である細胞を指してもよい。理論に拘束されることを望むものではないが、一倍体細胞と比べて倍数体細胞のゲノムエンジニアリングにおいてはより多くの場合にガイドＲＮＡの存在量が律速成分となり得るため、本明細書に記載されるＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系を用いた方法は特定の真菌細胞タイプを使用することの利点を生かし得ると考えられる。
【０８６１】
一部の実施形態において、真菌細胞は二倍体細胞である。本明細書で使用されるとき、「二倍体」細胞は、ゲノムが２つのコピーで存在する任意の細胞を指し得る。二倍体細胞は、天然で二倍体状態で見られる種類の細胞を指してもよく、又はそれは、二倍体状態で存在するように（例えば、減数分裂、細胞質分裂、又はＤＮＡ複製の特定の調節、変化、不活性化、活性化、又は改変によって）誘導された細胞を指してもよい。例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株Ｓ２２８Ｃは、一倍体又は二倍体状態で維持され得る。二倍体細胞は、ゲノム全体が二倍体である細胞を指してもよく、又はそれは、特定の目的のゲノム遺伝子座において二倍体である細胞を指してもよい。一部の実施形態において、真菌細胞は一倍体細胞である。本明細書で使用されるとき、「一倍体」細胞は、ゲノムが１つのコピーで存在する任意の細胞を指し得る。一倍体細胞は、天然で一倍体状態で見られる種類の細胞を指してもよく、又はそれは、一倍体状態で存在するように（例えば、減数分裂、細胞質分裂、又はＤＮＡ複製の特定の調節、変化、不活性化、活性化、又は改変によって）誘導された細胞を指してもよい。例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株Ｓ２２８Ｃは、一倍体又は二倍体状態で維持され得る。一倍体細胞は、ゲノム全体が一倍体である細胞を指してもよく、又はそれは、特定の目的のゲノム遺伝子座において一倍体である細胞を指してもよい。
【０８６２】
本明細書で使用されるとき、「酵母発現ベクター」は、ＲＮＡ及び／又はポリペプチドをコードする１つ以上の配列を含有する核酸であって、且つその１つ又は複数の核酸の発現を制御する任意の所望のエレメント、並びに酵母細胞内部における発現ベクターの複製及び維持を可能にする任意のエレメントを更に含有し得る核酸を指す。多くの好適な酵母発現ベクター及びそれらの特徴が当該技術分野において公知である；例えば、様々なベクター及び技法が、Ｙｅａｓｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｘｉａｏ，Ｗ．，ｅｄ．（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００７）及びＢｕｃｋｈｏｌｚ，Ｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｇｌｅｅｓｏｎ，Ｍ．Ａ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９（１１）：１０６７−７２に例示されている。酵母ベクターは、限定なしに、セントロメア（ＣＥＮ）配列、自己複製配列（ＡＲＳ）、目的の配列又は遺伝子に作動可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどのプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩターミネーターなどのターミネーター、複製起点、及びマーカー遺伝子（例えば、栄養要求体、抗生物質、又は他の選択可能マーカー）を含有し得る。酵母において用いられる発現ベクターの例としては、プラスミド、酵母人工染色体、２μプラスミド、酵母組込みプラスミド、酵母複製プラスミド、シャトルベクター、及びエピソームプラスミドを挙げることができる。
【０８６３】
植物及び植物細胞のゲノムにおけるＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系構成成分の安定組込み
詳細な実施形態では、植物細胞のゲノムに安定に組み込むためＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系の構成成分をコードするポリヌクレオチドを導入することが想定される。これらの実施形態において、形質転換ベクター又は発現系の設計は、いつ、どこで、及びどのような条件下でガイドＲＮＡ及び／又はＣｐｆ１遺伝子を発現させるかに応じて調整し得る。
【０８６４】
詳細な実施形態では、Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系の構成成分を植物細胞のゲノムＤＮＡに安定に導入することが想定される。それに加えて又は代えて、限定はされないがプラスチド、ミトコンドリア又は葉緑体などの植物細胞小器官のＤＮＡに安定に組み込むためＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系の構成成分を導入することが想定される。
【０８６５】
植物細胞のゲノムに安定に組み込むための発現系は、以下のエレメントの１つ以上を含有し得る：植物細胞においてＲＮＡ及び／又はＣｐｆ１酵素を発現させるために使用し得るプロモーターエレメント；発現を増強する５’非翻訳領域；単子葉植物細胞など、特定の細胞における発現を更に増強するイントロンエレメント；ガイドＲＮＡ及び／又はＣｐｆ１遺伝子配列及び他の所望のエレメントを挿入するのに好都合な制限部位を提供する多クローニング部位；及び発現した転写物の効率的な終結をもたらす３’非翻訳領域。
【０８６６】
発現系のエレメントは、プラスミド又は形質転換ベクターなどの環状か、又は線状二本鎖ＤＮＡなどの非環状かのいずれかである１つ以上の発現構築物上にあってもよい。
【０８６７】
詳細な実施形態では、Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ発現系は、少なくとも：
（ａ）植物の標的配列とハイブリダイズするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列であって、ガイドＲＮＡがガイド配列とダイレクトリピート配列とを含む、ヌクレオチド配列、及び
（ｂ）Ｃｐｆ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列、
を含み、
ここで構成成分（ａ）又は（ｂ）は同じ又は異なる構築物上に位置し、及びそれによって異なるヌクレオチド配列が、植物細胞において作動可能な同じ又は異なる調節エレメントの制御下にあることができる。
【０８６８】
Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系の構成成分、及び適用可能な場合には鋳型配列を含有する１つ又は複数のＤＮＡ構築物は、種々の従来技術によって植物、植物部位、又は植物細胞のゲノムに導入し得る。このプロセスには、概して、好適な宿主細胞又は宿主組織を選択するステップ、宿主細胞又は宿主組織に１つ又は複数の構築物を導入するステップ、及びそれから植物細胞又は植物を再生するステップが含まれる。
【０８６９】
詳細な実施形態では、ＤＮＡ構築物は、限定はされないが、電気穿孔、マイクロインジェクション、植物細胞プロトプラストのエアロゾルビーム注入などの技法を用いて植物細胞に導入してもよく、又はＤＮＡ構築物は、ＤＮＡパーティクルボンバードメントなどの微粒子銃法を用いて植物組織に直接導入することもできる（Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０００  Ｆｅｂ；９（１）：１１−９もまた参照）。パーティクルボンバードメントの基本は、１つ又は複数の目的の遺伝子で被覆された粒子を細胞に向けて加速させることにより粒子を原形質に侵入させて、典型的にはゲノムへの安定組込みを得るというものである（例えば、Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）、Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｈ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）、Ｃａｓａｓ  ｅｔ  ａｈ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）を参照）。
【０８７０】
詳細な実施形態では、Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系の構成成分を含有するＤＮＡ構築物は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性形質転換によって植物に導入し得る。ＤＮＡ構築物を好適なＴ−ＤＮＡフランキング領域と組み合わせて、従来のアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）宿主ベクターに導入し得る。外来ＤＮＡは、植物を感染させることによるか、又は植物プロトプラストを、１つ以上のＴｉ（腫瘍誘発）プラスミドを含有するアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細菌と共にインキュベートすることにより、植物のゲノムに取り入れることができる（例えば、Ｆｒａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５），Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）及び米国特許第５，５６３，０５５号明細書を参照）。
【０８７１】
植物プロモーター
植物細胞における適切な発現を確実にするため、本明細書に記載されるＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系の構成成分は、典型的には植物プロモーター、即ち植物細胞において作動可能なプロモーターの制御下に置かれる。異なる種類のプロモーターの使用が想定される。
【０８７２】
構成的植物プロモーターは、それが制御するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を植物の全て又はほぼ全ての発生段階において全て又はほぼ全ての植物組織中で発現（「構成的発現」と称される）させることが可能なプロモーターである。構成的プロモーターの非限定的な一つの例はカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターである。「調節型プロモーター」は、構成的でないものの時間的及び／又は空間的に調節された形で遺伝子発現を導くプロモーターを指し、組織特異的、組織優先的及び誘導性プロモーターが含まれる。異なるプロモーターは、異なる組織又は細胞型において、又は異なる発生段階で、又は異なる環境条件に応答して遺伝子の発現を導き得る。詳細な実施形態では、Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ構成成分の１つ以上がカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターなどの構成的プロモーターの制御下で発現し、組織優先的プロモーターを利用することにより、特定の植物組織内のある種の細胞型、例えば葉又は根の維管束細胞又は種子の特異細胞における発現の増強を標的化することができる。Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系において用いられる詳細なプロモーターの例については、Ｋａｗａｍａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ３８：７９２−８０３；Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｊ  １２：２５５−６５；Ｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ，（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２０：２０７−１８、Ｋｕｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９：７５９−７２、及びＣａｐａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２５：６８１−９１が参照される。
【０８７３】
誘導性で、且つ遺伝子編集又は遺伝子発現を時空間的に制御することが可能なプロモーターの例は、ある形態のエネルギーを使用し得る。エネルギーの形態としては、限定はされないが、音響エネルギー、電磁放射線、化学エネルギー及び／又は熱エネルギーを挙げることができる。誘導性系の例としては、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｔｅｔオン又はＴｅｔオフ）、小分子２ハイブリッド転写活性化システム（ＦＫＢＰ、ＡＢＡ等）、又は光誘導性系（フィトクロム、ＬＯＶドメイン、又はクリプトクロム）、例えば転写活性の配列特異的変化を導く光誘導性転写エフェクター（ＬＩＴＥ）が挙げられる。光誘導性系の構成成分には、Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ酵素、光応答性シトクロムヘテロ二量体（例えばシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来）、及び転写活性化／抑制ドメインが含まれ得る。誘導性ＤＮＡ結合タンパク質及びその使用方法の更なる例が、米国仮特許出願第６１／７３６４６５号明細書及び米国仮特許出願第６１／７２１，２８３号明細書（本明細書によって全体として参照により援用される）に提供される。
【０８７４】
詳細な実施形態では、一過性又は誘導性発現は、例えば化学物質調節型プロモーターを使用して実現することができ、即ちそれによって外因性化学物質を加えると遺伝子発現が誘導される。遺伝子発現の調節はまた、化学物質抑制性プロモーターによっても達成することができ、ここでは化学物質を加えると遺伝子発現が抑制される。化学物質誘導性プロモーターとしては、限定はされないが、ベンゼンスルホンアミド系除草剤解毒剤によって活性化するトウモロコシｌｎ２−２プロモーター（Ｄｅ  Ｖｅｙｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ３８：５６８−７７）、発芽前除草剤として使用される疎水性求電子化合物によって活性化するトウモロコシＧＳＴプロモーター（ＧＳＴ−ＩＩ−２７、国際公開第９３／０１２９４号パンフレット）、及びサリチル酸によって活性化するタバコＰＲ−１ａプロモーター（Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６８：８０３−７）が挙げられる。テトラサイクリン誘導性及びテトラサイクリン抑制性プロモーターなど、抗生物質によって調節されるプロモーターもまた（Ｇａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２２７：２２９−３７；米国特許第５，８１４，６１８号明細書及び同第５，７８９，１５６号明細書）、本明細書において使用することができる。
【０８７５】
特定の植物細胞小器官への転位及び／又はそこでの発現
発現系は、特定の植物細胞小器官に転位し及び／又はそこで発現するためのエレメントを含み得る。
【０８７６】
葉緑体ターゲティング
詳細な実施形態では、Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系を用いて葉緑体遺伝子を特異的に改変し、又は葉緑体における発現を確実にすることが想定される。この目的で、葉緑体形質転換方法又はＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ構成成分の葉緑体への区画化が用いられる。例えば、プラスチドゲノムに遺伝子改変を導入すると、花粉を通じた遺伝子流動などのバイオセーフティ問題を軽減することができる。
【０８７７】
葉緑体形質転換方法は当該技術分野において公知であり、パーティクルボンバードメント、ＰＥＧ処理、及びマイクロインジェクションが挙げられる。加えて、国際公開第２０１００６１１８６号パンフレットに記載されるとおり、核ゲノムからプラスチドへの形質転換カセットの転位が関わる方法を用いることができる。
【０８７８】
或いは、Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ構成成分の１つ以上を植物葉緑体に標的化することが想定される。これは、Ｃｐｆ１タンパク質をコードする配列の５’領域に作動可能に連結された、葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）又はプラスチド輸送ペプチドをコードする配列を発現構築物に取り込むことにより実現する。ＣＴＰは葉緑体への転位中にプロセシング段階で除去される。発現タンパク質の葉緑体ターゲティングは当業者に周知である（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｉｎｔｏ  Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ，２０１０，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６１：１５７−１８０を参照）。かかる実施形態では、ガイドＲＮＡを植物葉緑体に標的化することもまた望ましい。葉緑体局在化配列を用いてガイドＲＮＡを葉緑体に転位させるために用いることのできる方法及び構築物については、例えば、米国特許出願公開第２００４０１４２４７６号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載されている。かかる各種の構築物を本発明の発現系に取り込むことにより、Ｃｐｆ１−ガイドＲＮＡを効率的に転位させることができる。
【０８７９】
藻類細胞におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系をコードするポリヌクレオチドの導入
トランスジェニック藻類（又は他の植物、例えばセイヨウアブラナ）が、植物油又はバイオ燃料、例えばアルコール（特にメタノール及びエタノール）又は他の生産物の生産において特に有用であり得る。これらは、油又はバイオ燃料産業で使用される油又はアルコールを高度に発現又は過剰発現するようにエンジニアリングされ得る。
【０８８０】
米国特許第８９４５８３９号明細書は、Ｃａｓ９を用いた微細藻類（コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）細胞）種）のエンジニアリング方法について記載している。類似のツールを使用して、本明細書に記載されるＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系の方法をクラミドモナス属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）種及び他の藻類に適用することができる。詳細な実施形態では、Ｈｓｐ７０Ａ−Ｒｂｃ  Ｓ２又はβ２−チューブリンなどの構成的プロモーターの制御下でＣｐｆ１を発現するベクターを使用して発現する藻類にＣａｓ９及びガイドＲＮＡが導入される。ガイドＲＮＡは、任意選択で、Ｔ７プロモーターを含有するベクターを使用して送達される。或いは、藻類細胞にＣａｓ９  ｍＲＮＡ及びインビトロ転写ガイドＲＮＡが送達されてもよい。当業者には、ＧｅｎｅＡｒｔクラミドモナスエンジニアリングキットからの標準的な推奨プロトコルなど、電気穿孔プロトコルが利用可能である。
【０８８１】
詳細な実施形態では、本明細書で使用されるエンドヌクレアーゼはスプリットＣｐｆ１酵素である。スプリットＣｐｆ１酵素は、国際公開第２０１５０８６７９５号パンフレット中のＣａｓ９の記載のとおり、標的ゲノム改変のため藻類で優先的に使用される。Ｃｐｆ１スプリット系の使用は、誘導性のゲノムターゲティング方法に特に好適であり、藻類細胞内におけるＣｐｆ１過剰発現の潜在的な毒性作用が回避される。詳細な実施形態において、前記１つ又は複数のスプリットＣｐｆ１ドメインが藻類細胞内の標的核酸配列をプロセシングするように、前記Ｃｐｆ１スプリットドメイン（ＲｕｖＣ及びＨＮＨドメイン）を細胞に同時に又は逐次的に導入することができる。スプリットＣｐｆ１は野生型Ｃｐｆ１と比較してサイズが小さいため、本明細書に記載されるとおりの細胞透過性ペプチドの使用など、ＣＲＩＳＰＲ系を細胞に送達する他の方法が可能である。この方法は、遺伝子改変藻類の作成に特に有益である。
【０８８２】
酵母細胞におけるＣｐｆ１構成成分をコードするポリヌクレオチドの導入
詳細な実施形態では、本発明は、酵母細胞のゲノム編集のためのＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系の使用に関する。Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系構成成分をコードするポリヌクレオチドの導入に用いることのできる酵母細胞の形質転換方法は当該技術分野において周知であり、Ｋａｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｂｉｏｅｎｇ  Ｂｕｇｓ．２０１０  Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；１（６）：３９５−４０３）によってレビューされている。非限定的な例としては、酢酸リチウム処理による酵母細胞の形質転換（これはキャリアＤＮＡ及びＰＥＧ処理を更に含み得る）、ボンバードメント又は電気穿孔によるものが挙げられる。
【０８８３】
植物及び植物細胞におけるＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰ系構成成分の一過性発現
詳細な実施形態では、植物細胞においてガイドＲＮＡ及び／又はＣｐｆ１遺伝子を一過性に発現させることが想定される。これらの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系により、細胞内にガイドＲＮＡ及びＣｐｆ１タンパク質の両方が存在するときに限った標的遺伝子の改変が確実となり、従ってゲノム改変を更に制御することができる。Ｃｐｆ１酵素の発現は一過性であるため、かかる植物細胞から再生した植物は典型的には外来ＤＮＡを含有しない。詳細な実施形態では、Ｃｐｆ１酵素は植物細胞によって安定に発現し、及びガイド配列は一過性に発現する。
【０８８４】
詳細な実施形態では、Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系構成成分は、植物ウイルスベクターを使用して植物細胞に導入することができる（Ｓｃｈｏｌｔｈｏｆ  ｅｔ  ａｌ．１９９６，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．１９９６；３４：２９９−３２３）。更なる詳細な実施形態では、前記ウイルスベクターはＤＮＡウイルス由来のベクターである。例えば、ジェミニウイルス（例えば、キャベツ巻葉ウイルス、マメ萎黄ウイルス、コムギ萎縮ウイルス、トマト巻葉ウイルス、トウモロコシ条斑ウイルス、タバコ巻葉ウイルス、又はトマトゴールデンモザイクウイルス）又はナノウイルス（例えば、ソラマメ黄化えそウイルス）。他の詳細な実施形態では、前記ウイルスベクターはＲＮＡウイルス由来のベクターである。例えば、トブラウイルス（例えば、タバコ茎えそウイルス、タバコモザイクウイルス）、ポルテクスウイルス（例えば、ジャガイモＸウイルス）、又はホルデイウイルス（例えば、ムギ斑葉モザイクウイルス）。植物ウイルスの複製ゲノムは非組込みベクターである。
【０８８５】
詳細な実施形態では、Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ構築物の一過性発現に使用されるベクターは、例えばｐＥＡＱベクターであり、これはプロトプラストにおけるアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介一過性発現に合わせて調整されているものである（Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｊ．２００９  Ｓｅｐ；７（７）：６８２−９３）。ＣＲＩＳＰＲ酵素を発現する安定トランスジェニック植物においてｇＲＮＡを発現する改変キャベツ巻葉ウイルス（ＣａＬＣｕＶ）ベクターを使用して、ゲノム位置の正確なターゲティングが実証された（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ５，Ａｒｔｉｃｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ：１４９２６（２０１５），ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ１４９２６）。
【０８８６】
詳細な実施形態では、ガイドＲＮＡ及び／又はＣｐｆ１  遺伝子をコードする二本鎖ＤＮＡ断片を植物細胞に一過性に導入することができる。かかる実施形態において、導入される二本鎖ＤＮＡ断片は、細胞を改変するのに十分な、しかし企図された時間が経った後又は１回以上の細胞分裂後には残らない量で提供される。植物においてＤＮＡ移入を導く方法は当業者に公知である（例えば、Ｄａｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９８９  Ｓｅｐ；１３（３）：２７３−８５を参照）。
【０８８７】
他の実施形態では、Ｃｐｆ１  タンパク質をコードするＲＮＡポリヌクレオチドが、細胞を（少なくとも１つのガイドＲＮＡの存在下で）改変するのに十分な、しかし企図された時間が経った後又は１回以上の細胞分裂後には残らない量で植物細胞に導入され、次にはこれが、タンパク質を生成する宿主細胞によって翻訳及びプロセシングされる。一過性発現のため植物プロトプラストにｍＲＮＡを導入する方法は当業者に公知である（例えば、Ｇａｌｌｉｅ，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ（１９９３），１３；１１９−１２２を参照）。
【０８８８】
上記に記載される異なる方法の組み合わせもまた想定される。
【０８８９】
植物細胞へのＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ構成成分の送達
詳細な実施形態では、Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上の構成成分を植物細胞に直接送達することが有益である。これは特に、非トランスジェニック植物の作成に有益である（下記参照）。詳細な実施形態では、Ｃｐｆ１構成成分の１つ以上が植物又は植物細胞の外部で調製され、細胞に送達される。例えば詳細な実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質がインビトロで調製された後、植物細胞に導入される。Ｃｐｆ１タンパク質は当業者に公知の、組換え産生を含めた様々な方法によって調製することができる。発現後、Ｃｐｆ１タンパク質が単離され、必要に応じて再び折り畳まれ、精製され、及び任意選択でＨｉｓタグなどの任意の精製タグを除去するため処理される。粗製の、部分的に精製された、又はより完全に精製されたＣｐｆ１タンパク質が得られたところで、タンパク質が植物細胞に導入され得る。
【０８９０】
詳細な実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質が目的の遺伝子を標的化するガイドＲＮＡと混合され、予めアセンブルされたリボ核タンパク質が形成される。
【０８９１】
個々の構成成分又は予めアセンブルされたリボ核タンパク質は、電気穿孔を用いるか、Ｃｐｆ１関連遺伝子産物で被覆した粒子のボンバードメントによるか、化学的トランスフェクションによるか、又は細胞膜を越えて輸送する他の何らかの手段によって植物細胞に導入することができる。例えば、予めアセンブルされたＣＲＩＳＰＲリボ核タンパク質による植物プロトプラストのトランスフェクションは、植物ゲノムの標的化した改変を確実にすることが実証されている（Ｗｏｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１５；ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３３８９による記載のとおり）。
【０８９２】
詳細な実施形態では、Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系構成成分はナノ粒子を用いて植物細胞に導入される。構成成分は、タンパク質又は核酸としてであれ、或いはそれらの組み合わせであれ、ナノ粒子上にアップロードするか又はそれにパッケージングして植物に適用することができる（例えば国際公開第２００８０４２１５６号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１３０１８５８２３号明細書の記載など）。詳細には、本発明の実施形態は、国際公開第２０１５０８９４１９号パンフレットに記載されるとおり、Ｃｐｆ１タンパク質をコードする１つ又は複数のＤＮＡ分子、ガイドＲＮＡ及び／又は単離ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ分子がアップロードされた又はそれでパッケージングされたナノ粒子を含む。
【０８９３】
Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上の構成成分を植物細胞に導入する更なる手段は、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を用いることによるものである。従って、詳細には、本発明の実施形態は、Ｃｐｆ１タンパク質に連結された細胞透過性ペプチドを含む組成物を含む。本発明の詳細な実施形態において、Ｃｐｆ１タンパク質及び／又はガイドＲＮＡは、それらを植物プロトプラストの内部に有効に輸送する１つ以上のＣＰＰにカップリングされる（ヒト細胞におけるＣａｓ９については、Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ（２０１４０Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２０１４  Ｊｕｎ；２４（６）：１０２０−７）も参照。他の実施形態において、Ｃｐｆ１遺伝子及び／又はガイドＲＮＡは、植物プロトプラスト送達のための１つ以上のＣＰＰにカップリングされた１つ以上の環状又は非環状ＤＮＡ分子によってコードされる。次に植物プロトプラストは、植物細胞、及び更には植物に再生される。ＣＰＰは、概して、生体分子を受容体非依存的に細胞膜を越えて輸送する能力を有するタンパク質又はキメラ配列のいずれかに由来する３５アミノ酸未満の短鎖ペプチドとして記載される。ＣＰＰは、カチオン性ペプチド、疎水性配列を有するペプチド、両親媒性ペプチド、プロリンリッチな抗微生物性の配列を有するペプチド、及びキメラ又は二部ペプチドであってもよい（Ｐｏｏｇａ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅｌ  ２００５）。ＣＰＰは生体膜を透過することが可能であり、そのため様々な生体分子の細胞膜を越えて細胞質に入る移動を引き起こし、及びそれらの細胞内輸送を改善することが可能であり、ひいては生体分子と標的の相互作用を促進する。ＣＰＰの例としては、中でも特に、ＨＩＶ  １型によるウイルス複製に必要な核内転写活性化タンパク質であるＴａｔ、ペネトラチン、カポジ線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナルペプチド配列、インテグリンβ３シグナルペプチド配列；ポリアルギニンペプチドＡｒｇｓ配列、グアニンリッチ分子輸送体、スイートアローペプチド等が挙げられる。
【０８９４】
Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系を用いた遺伝子改変非トランスジェニック植物の作成
詳細な実施形態では、本明細書に記載される方法は、ＣＲＩＳＰＲ構成成分をコードするものを含めた任意の外因性遺伝子を植物のゲノムに永久的に導入することなく、そのようにして植物のゲノムに外来ＤＮＡが存在することを回避しつつ内因性遺伝子を改変し、又はそれらの発現を改変するために用いられる。非トランスジェニック植物に求められる規制上の要件は厳しさが緩和されるため、これは有益であり得る。
【０８９５】
詳細な実施形態では、これは、Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ構成成分の一過性発現によって確実となる。詳細な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ構成成分の１つ以上は、本明細書に記載される方法による目的の遺伝子の改変を一貫して常に確実に行うのに十分なＣｐｆ１タンパク質及びガイドＲＮＡを産生する１つ以上のウイルスベクター上で発現する。
【０８９６】
詳細な実施形態では、Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ構築物の一過性発現は植物プロトプラストで確実に起こり、従ってゲノムに組み込まれない。Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系が本明細書に記載されるとおりの標的遺伝子の改変を確実に行うことを可能にするには、限られた発現ウィンドウで十分であり得る。
【０８９７】
詳細な実施形態では、Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系の種々の構成成分は、本明細書において上記に記載されるとおりのナノ粒子又はＣＰＰ分子などの粒子状送達分子の助けを借りて、別々に、或いは混合して、植物細胞、プロトプラスト又は植物組織に導入される。
【０８９８】
Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ構成成分が発現すると、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼの直接的な活性及び任意選択で鋳型ＤＮＡの導入によるか、或いは本明細書に記載されるとおりのＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系を用いた標的化した遺伝子の改変により、ゲノムの標的改変が誘導され得る。本明細書において上記に記載される種々の戦略により、Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ構成成分を植物ゲノムに導入する必要なしに、Ｃｐｆ１媒介性標的ゲノム編集が可能となる。植物細胞に一過性に導入される構成成分は、典型的には交配時に除去される。
【０８９９】
植物ゲノムにおける改変の検出−選択可能マーカー
詳細な実施形態において、方法が植物ゲノムの内因性標的遺伝子改変を伴う場合、植物、植物部位又は植物細胞にＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系を感染させ又はトランスフェクトした後、任意の好適な方法を用いることにより、標的部位で遺伝子ターゲティング又は標的突然変異誘発が起こるかどうかを決定することができる。方法がトランス遺伝子の導入を伴う場合、エンジニアリングされた植物材料をトランス遺伝子の存在又はトランス遺伝子によってコードされる形質に関して選択又はスクリーニングすることにより、形質転換された植物細胞、カルス、組織又は植物を同定し、単離し得る。挿入された遺伝子構築物又は内因性ＤＮＡ改変を含有する植物又は植物細胞形質転換体の同定には、物理的及び生化学的方法を用い得る。これらの方法としては、限定はされないが：１）組換えＤＮＡインサート又は改変された内因性遺伝子の構造を検出及び決定するサザン解析又はＰＣＲ増幅；２）遺伝子構築物のＲＮＡ転写物を検出して調べるノーザンブロット、Ｓ１  ＲＮアーゼ保護、プライマー伸長又は逆転写酵素ＰＣＲ増幅；３）酵素又はリボザイム活性を検出する酵素アッセイ（かかる遺伝子産物が遺伝子構築物によってコードされるか、又は発現が遺伝子改変によって影響を受ける場合）；４）タンパク質ゲル電気泳動、ウエスタンブロット法、免疫沈降、又は酵素結合免疫測定法（遺伝子構築物又は内因性遺伝子産物がタンパク質である場合）が挙げられる。インサイチュハイブリダイゼーション、酵素染色、及び免疫染色などの更なる技法もまた、組換え構築物の存在若しくは発現の検出、又は特定の植物器官及び組織における内因性遺伝子の改変の検出に用いることができる。これらの全てのアッセイを行う方法は当業者に周知である。
【０９００】
それに加えて（又は代えて）、Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ構成成分をコードする発現系は、典型的には、Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系を含有する細胞及び／又はそれによって改変された細胞を初期段階で且つ大規模に単離し又は効率的に選択する手段を提供する１つ以上の選択可能又は検出可能マーカーを含むように設計される。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性形質転換の場合、マーカーカセットはフランキングＴ−ＤＮＡ境界に隣接するか又はそれらの間にあり、且つバイナリーベクター内に含まれ得る。別の実施形態において、マーカーカセットはＴ−ＤＮＡの外部にあってもよい。選択可能マーカーカセットはまた、発現カセットと同じＴ−ＤＮＡ境界内にあるか又はそれに隣接してもよく、又はバイナリーベクター（例えば２Ｔ−ＤＮＡ系）上の第２のＴ−ＤＮＡ内のどこか別のところにあってもよい。
【０９０１】
パーティクルボンバードメントについては、又はプロトプラスト形質転換では、発現系は１つ以上の単離された線状断片を含むことができ、又は細菌複製エレメント、細菌選択可能マーカー若しくは他の検出可能エレメントを含有し得る大型構築物の一部であってもよい。ガイド及び／又はＣｐｆ１をコードするポリヌクレオチドを含む１つ又は複数の発現カセットは、マーカーカセットに物理的に連結されてもよく、又はマーカーカセットをコードする第２の核酸分子と混合されてもよい。マーカーカセットは、形質転換細胞の効率的な選択を可能にする検出可能又は選択可能マーカーの発現に必須のエレメントを含む。
【０９０２】
選択可能マーカーに基づく細胞の選択手順は、マーカー遺伝子の性質に依存することになる。詳細な実施形態では、選択可能マーカー、即ち、マーカーの発現に基づき細胞を直接選択することを可能にするマーカーが使用される。選択可能マーカーはポジティブ選択又はネガティブ選択をもたらすことができ、外部基質の存在に関して条件的又は非条件的である（Ｍｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．２００４，１０７（３）：１９３−２３２）。最も一般的には、抗生物質又は除草剤抵抗性遺伝子がマーカーとして用いられ、それにより、マーカー遺伝子が付与する抵抗性の対象となる抗生物質又は除草剤の阻害量を含有する培地上でエンジニアリングした植物材料を成長させることによって選択が行われる。かかる遺伝子の例は、ハイグロマイシン（ｈｐｔ）及びカナマイシン（ｎｐｔＩＩ）など、抗生物質耐性を付与する遺伝子、及びホスフィノトリシン（ｂａｒ）及びクロルスルフロン（ｃｈｌｏｒｏｓｕｌｆｕｒｏｎ）（ａｌｓ）など、除草剤抵抗性を付与する遺伝子である。
【０９０３】
形質転換植物及び植物細胞はまた、可視マーカー、典型的には着色基質（例えば、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、Ｂ又はＣ１遺伝子）をプロセシングする能力を有する酵素の活性に関してスクリーニングすることによって同定されてもよい。かかる選択及びスクリーニング方法は当業者に周知である。
【０９０４】
植物培養物及び再生
詳細な実施形態では、改変ゲノムを有し、且つ本明細書に記載される方法のいずれかによって作製又は入手される植物細胞は、培養することにより、形質転換され又は改変された遺伝子型を備えた、ひいては所望の表現型を備えた全植物を再生することができる。従来の再生技法は当業者に周知である。かかる再生技法の詳細な例は、組織培養成長培地中でのある種の植物ホルモンの操作に頼るものであり、及び典型的には所望のヌクレオチド配列と共に導入された殺生物剤及び／又は除草剤マーカーに頼るものである。更なる詳細な実施形態では、植物再生は、培養したプロトプラスト、植物カルス、外植片、器官、花粉、胚又はそれらの一部から得られる（例えば、Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３），Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｋｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ（１９８７）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓを参照）。
【０９０５】
詳細な実施形態では、本明細書に記載されるとおりの形質転換植物又は改良植物は、自家受粉により本発明のホモ接合改良植物（ＤＮＡ改変に関してホモ接合性）の種子を提供するか、又は非トランスジェニック植物又は別の改良植物との交雑によりヘテロ接合植物の種子を提供することができる。植物細胞に組換えＤＮＡが導入された場合、かかる交雑により得られる植物は、組換えＤＮＡ分子に関してヘテロ接合の植物である。改良植物からの交雑によって得られた、遺伝子改変（組換えＤＮＡであり得る）を含むかかるホモ接合植物及びヘテロ接合植物は、両方ともに、本明細書では「子孫」と称される。子孫植物は、元のトランスジェニック植物に由来する、且つ本明細書に提供される方法によって導入されたゲノム改変又は組換えＤＮＡ分子を含有する植物である。或いは、遺伝子改変植物は、外来ＤＮＡがゲノムに取り込まれないＣｐｆ１酵素を用いる上述の方法のうちの１つによって得ることができる。更なる育種によって得られたかかる植物の子孫もまた、その遺伝子改変を含有し得る。育種は、種々の作物に一般に用いられている任意の育種方法によって実施される（例えば、Ａｌｌａｒｄ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｕ．ｏｆ  ＣＡ，Ｄａｖｉｓ，ＣＡ，５０−９８（１９６０）。
【０９０６】
農業形質が増強された植物の生成
本明細書に提供されるＣｐｆ１ベースのＣＲＩＳＰＲ系は標的二本鎖又は一本鎖切断の導入に用いることができ、及び／又は遺伝子アクチベーター及び／又はリプレッサー系を導入することができ、及び限定なしに、遺伝子ターゲティング、遺伝子置換、標的突然変異誘発、標的欠失又は挿入、標的逆位及び／又は標的転座に用いることができる。単一細胞において複数の改変を実現するために行われるマルチターゲティングＲＮＡの共発現により、多重化ゲノム改変を確実に行うことができる。この技術は、栄養価、病害抵抗性並びに生物的及び非生物的ストレスに対する抵抗性の増加、及び商業的に有用な植物製品又は異種化合物の生産増加を含め、改良された特徴を備える植物の高精度エンジニアリングに用いることができる。
【０９０７】
詳細な実施形態では、本明細書に記載されるとおりのＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系を用いて内因性ＤＮＡ配列に標的二本鎖切断（ＤＳＢ）が導入される。ＤＳＢによって細胞ＤＮＡ修復経路が活性化し、これを利用して切断部位の近傍に所望のＤＮＡ配列改変を実現することができる。これは、内因性遺伝子の不活性化が所望の形質を付与し得るか、又はそれに寄与し得る場合に有益である。詳細な実施形態では、目的の遺伝子を導入するため、ＤＳＢの部位で鋳型配列との相同組換えが促進される。
【０９０８】
詳細な実施形態では、Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系は、内因性植物遺伝子を活性化及び／又は抑制するための機能ドメインと融合した又はそれに作動可能に連結された一般的核酸結合タンパク質として用いられ得る。例示的機能ドメインとしては、限定はされないが、翻訳開始因子、翻訳活性化因子、翻訳抑制因子、ヌクレアーゼ、詳細にはリボヌクレアーゼ、スプライソソーム、ビーズ、光誘導性／制御性ドメイン又は化学物質誘導性／制御性ドメインを挙げることができる。典型的には、これらの実施形態においてＣｐｆ１タンパク質は少なくとも１つの突然変異を含み、そのためこれは、少なくとも１つの突然変異を有しないＣｐｆ１タンパク質の５％以下の活性を有する；ガイドＲＮＡは、標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含む。
【０９０９】
本明細書に記載される方法は、概して、野生型植物と比較して１つ以上の望ましい形質を有するという点で「改良植物」の生成をもたらす。詳細な実施形態では、得られる植物、植物細胞又は植物部位はトランスジェニック植物であり、植物の細胞の全て又は一部のゲノムに取り込まれた外因性ＤＮＡ配列を含む。詳細な実施形態では、植物のいずれの植物細胞のゲノムにも外因性ＤＮＡ配列が取り込まれないという点で、非トランスジェニック遺伝子改変植物、植物部位又は細胞が得られる。かかる実施形態において、改良植物は非トランスジェニックである。内因性遺伝子の改変のみが確実に起こり、外因性遺伝子は植物ゲノムに導入又は維持されない場合、得られる遺伝子改変作物は外因性遺伝子を含まず、従って基本的に非トランスジェニックと見なし得る。植物ゲノム編集へのＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系の種々の適用について、以下に更に詳細に説明する。
【０９１０】
ａ）１つ以上の外因性遺伝子の導入による目的の農業形質の付与
本発明は、目的の標的遺伝子座に関連する又はそこにある配列のゲノム編集又は改変方法を提供し、この方法は、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質複合体を植物細胞に導入するステップであって、それによりＣｐｆ１エフェクタータンパク質複合体が植物細胞のゲノムへのＤＮＡインサート（例えば目的の外因性遺伝子をコードする）の組込みに有効に機能するステップを含む。好ましい実施形態において、ＤＮＡインサートの組込みは、外因的に導入されたＤＮＡ鋳型又は修復鋳型とのＨＲによって促進される。典型的には、外因的に導入されたＤＮＡ鋳型又は修復鋳型は、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質複合体若しくは１つの構成成分又は複合体の構成成分を発現するポリヌクレオチドベクターと共に送達される。本明細書に提供されるＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系は標的遺伝子送達を可能にする。目的の遺伝子の発現効率はゲノムへの組込み位置によって決まるところが大きいことが次第に明らかになりつつある。本方法は、外因性遺伝子をゲノムの所望の位置に標的化して組み込むことが可能である。位置は、これまでに生じたイベントの情報に基づき選択することができ、又は本明細書の他の部分に開示される方法によって選択することができる。
【０９１１】
詳細な実施形態では、本明細書に提供される方法は、（ａ）ガイドＲＮＡ（ダイレクトリピートとガイド配列とを含む）を含むＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ複合体を細胞に導入するステップであって、植物細胞にとって内因性の標的配列にガイド配列がハイブリダイズするステップ；（ｂ）ガイド配列が標的配列にハイブリダイズしたときガイドＲＮＡと複合体を形成し、ガイド配列の標的である配列又はその近傍に二本鎖切断を誘導するＣｐｆ１エフェクター分子を植物細胞に導入するステップ；及び（ｃ）目的の遺伝子をコードし、且つＨＤＲの結果としてＤＳ切断位置に導入されるＨＤＲ修復鋳型をコードするヌクレオチド配列を細胞に導入するステップを含む。詳細な実施形態では、導入するステップは、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質とガイドＲＮＡと修復鋳型とをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを植物細胞に送達することを含み得る。詳細な実施形態では、ポリヌクレオチドはＤＮＡウイルス（例えばジェミニウイルス）又はＲＮＡウイルス（例えばトブラウイルス）によって細胞に送達される。詳細な実施形態では、導入するステップは、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質とガイドＲＮＡと修復鋳型とをコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列を含有するＴ−ＤＮＡを植物細胞に送達することを含み、ここで送達はアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）による。Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質をコードする核酸配列は、構成的プロモーター（例えばカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター）、又は細胞特異的若しくは誘導性プロモーターなど、プロモーターに作動可能に連結されてもよい。詳細な実施形態では、ポリヌクレオチドはマイクロプロジェクタイルボンバードメントによって導入される。詳細な実施形態では、本方法は、導入するステップの後に植物細胞をスクリーニングして修復鋳型、即ち目的の遺伝子が導入されたかどうかを決定するステップを更に含む。詳細な実施形態では、本方法は、植物細胞から植物を再生するステップを含む。更なる実施形態において、本方法は、植物を交雑育種して遺伝的に望ましい植物系統を得るステップを含む。目的の形質をコードする外因性遺伝子の例を以下に挙げる。
【０９１２】
ｂ）内因性遺伝子の編集による目的の農業形質の付与
本発明は、目的の標的遺伝子座に関連する又はそこにある配列のゲノム編集又は改変方法を提供し、この方法は、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質複合体を植物細胞に導入するステップであって、それによりＣｐｆ１複合体が植物の内因性遺伝子の発現を改変するステップを含む。これは様々な方法で実現することができ、詳細な実施形態では、内因性遺伝子の発現の除去が望ましく、Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ複合体を用いて内因性遺伝子を標的化し、切断することにより、遺伝子発現が改変される。これらの実施形態において、本明細書に提供される方法は、（ａ）ガイドＲＮＡ（ダイレクトリピートとガイド配列とを含む）を含むＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ複合体を植物細胞に導入するステップ［ガイド配列は植物細胞のゲノムにおける目的の遺伝子内の標的配列にハイブリダイズする］；及び（ｂ）ガイドＲＮＡとの結合時に、標的配列にハイブリダイズするガイド配列を含み、ガイド配列が標的とする配列又はその近傍で二本鎖切断を確実に行うＣａｓ９エフェクタータンパク質を細胞に導入するステップを含み；詳細な実施形態では、導入するステップは、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質及びガイドＲＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを植物細胞に送達することを含み得る。
【０９１３】
詳細な実施形態では、ポリヌクレオチドはＤＮＡウイルス（例えばジェミニウイルス）又はＲＮＡウイルス（例えばトブラウイルス）によって細胞に送達される。詳細な実施形態では、導入するステップは、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質及びガイドＲＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列を含有するＴ−ＤＮＡを植物細胞に送達することを含み、ここで送達はアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）による。Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系の構成成分をコードするポリヌクレオチド配列は、構成的プロモーター（例えばカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター）、又は細胞特異的若しくは誘導性プロモーターなど、プロモーターに作動可能に連結されてもよい。詳細な実施形態では、ポリヌクレオチドはマイクロプロジェクタイルボンバードメントによって導入される。詳細な実施形態では、本方法は、導入するステップの後に植物細胞をスクリーニングして目的の遺伝子の発現が改変されたかどうかを決定するステップを更に含む。詳細な実施形態では、本方法は、植物細胞から植物を再生するステップを含む。更なる実施形態において、本方法は、植物を交雑育種して遺伝的に望ましい植物系統を得るステップを含む。
【０９１４】
上記に記載される方法の詳細な実施形態では、罹病性遺伝子又は植物防御遺伝子の負の調節因子をコードする遺伝子（例えばＭｌｏ遺伝子）の標的突然変異によって病害抵抗性作物が得られる。詳細な実施形態では、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）及びプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）をコードするものなど、植物遺伝子における特異的ヌクレオチドの標的複製によって除草剤耐性作物が生成される。詳細な実施形態では、非生物的ストレス耐性の負の調節因子をコードする遺伝子の標的突然変異による耐乾性及び耐塩性作物、Ｗａｘｙ遺伝子の標的突然変異による低アミロース穀物、アリューロン層における主要リパーゼ遺伝子の標的突然変異による低酸敗性のコメ又は他の穀物等。詳細な実施形態において。目的の形質をコードする内因性遺伝子のより包括的なリストを以下に挙げる。
【０９１５】
ｃ）Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系による内因性遺伝子の調節による目的の農業形質の付与
また、本明細書には、本明細書に提供されるＣｐｆ１タンパク質を用いて内因性遺伝子発現を調節（即ち活性化又は抑制）する方法も提供される。かかる方法では、Ｃｐｆ１複合体によって植物ゲノムに標的化される１つ又は複数の個別のＲＮＡ配列を利用する。より詳細には、１つ又は複数の個別のＲＮＡ配列は２つ以上のアダプタータンパク質（例えばアプタマー）に結合し、それにより各アダプタータンパク質は１つ以上の機能ドメインと会合し、及びここでアダプタータンパク質と会合した１つ以上の機能ドメインの少なくとも１つは、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写解除因子活性、ヒストン修飾活性、ＤＮＡ組込み活性、ＲＮＡ切断活性、ＤＮＡ切断活性又は核酸結合活性を含む１つ以上の活性を有する；機能ドメインを使用して、所望の形質が得られるように内因性植物遺伝子の発現が調節される。典型的には、これらの実施形態において、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質は１つ以上の突然変異を有し、そのため少なくとも１つの突然変異を有しないＣｐｆ１エフェクタータンパク質の５％以下のヌクレアーゼ活性を有する。
【０９１６】
詳細な実施形態では、本明細書に提供される方法は、（ａ）ガイドＲＮＡ（ダイレクトリピートとガイド配列とを含む）を含むＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ複合体を細胞に導入するステップ［ガイド配列は植物細胞にとって内因性の標的配列にハイブリダイズする］；（ｂ）ガイド配列が標的配列にハイブリダイズするとガイドＲＮＡと複合体を形成するＣｐｆ１エフェクター分子を植物細胞に導入するステップを含み；及びここではガイドＲＮＡが、機能ドメインに結合する個別のＲＮＡ配列（アプタマー）を含むように改変されているか、及び／又はＣｐｆ１エフェクタータンパク質が、機能ドメインに連結されている点で改変されているかのいずれかである。詳細な実施形態では、導入するステップは、（改変）Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質及び（改変）ガイドＲＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを植物細胞に送達することを含み得る。これらの方法に用いられるＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系の構成成分の詳細については、本明細書の他の部分に記載される。
【０９１７】
詳細な実施形態では、ポリヌクレオチドはＤＮＡウイルス（例えばジェミニウイルス）又はＲＮＡウイルス（例えばトブラウイルス）によって細胞に送達される。詳細な実施形態では、導入するステップは、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質及びガイドＲＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列を含有するＴ−ＤＮＡを植物細胞に送達することを含み、ここで送達はアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）による。Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上の構成成分をコードする核酸配列は、構成的プロモーター（例えばカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター）、又は細胞特異的若しくは誘導性プロモーターなど、プロモーターに作動可能に連結されてもよい。詳細な実施形態では、ポリヌクレオチドはマイクロプロジェクタイルボンバードメントによって導入される。詳細な実施形態では、本方法は、導入するステップの後に植物細胞をスクリーニングして目的の遺伝子の発現が改変されたかどうかを決定するステップを更に含む。詳細な実施形態では、本方法は、植物細胞から植物を再生するステップを含む。更なる実施形態において、本方法は、植物を交雑育種して遺伝的に望ましい植物系統を得るステップを含む。目的の形質をコードする内因性遺伝子のより包括的なリストを以下に挙げる。
【０９１８】
倍数体植物を改変するためのＣｐｆ１の使用
多くの植物は倍数体であり、つまり、それらはそのゲノムの二重のコピー（時にコムギの場合のように６個にも上る）を有するということである。Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を利用する本発明に係る方法は「多重化」されるため、遺伝子の全てのコピーに影響を及ぼすことができ、又は何十個もの遺伝子を一度に標的化することができる。例えば、詳細な実施形態では、本発明の方法を用いて、病害に対する防御の抑制に関与する種々の遺伝子で機能喪失突然変異が同時に起こることが確実にされる。詳細な実施形態では、本発明の方法を用いてコムギ植物細胞におけるＴａＭＬＯ−Ａｌ、ＴａＭＬＯ−Ｂｌ及びＴａＭＬＯ−Ｄｌ核酸配列の発現が同時に抑制され、及びそれからコムギ植物が再生されて、コムギ植物がうどんこ病に抵抗性となるよう確実にされる（国際公開第２０１５１０９７５２号パンフレットもまた参照）。
【０９１９】
農業形質を付与する例示的遺伝子
本明細書において上記に記載されるとおり、詳細な実施形態では、本発明は、１つ以上の植物発現性遺伝子を含めた目的のＤＮＡの挿入ための、本明細書に記載されるとおりのＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系の使用を包含する。更なる詳細な実施形態では、本発明は、１つ以上の植物発現遺伝子を部分的又は完全に欠失させるための、本明細書に記載されるとおりのＣｐｆ１系を用いた方法及びツールを包含する。他の更なる詳細な実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるとおりのＣｐｆ１系を用いて１つ以上のヌクレオチドの突然変異、置換、挿入による１つ以上の植物発現遺伝子の改変を確実に行う方法及びツールを包含する。他の詳細な実施形態では、本発明は、前記遺伝子の発現を導く調節エレメントの１つ以上を特異的に改変することによる１つ以上の植物発現遺伝子の発現の改変を確実に行うための本明細書に記載されるとおりのＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系の使用を包含する。
【０９２０】
詳細な実施形態では、本発明は、以下に挙げるものなどの、外来遺伝子の導入及び／又は内因性遺伝子及びそれらの調節エレメントの標的化が関わる方法を包含する。
【０９２１】
１．害虫又は病害に対する抵抗性を付与する遺伝子：
・植物病害抵抗性遺伝子。植物をクローン抵抗性遺伝子で形質転換することにより、特定の病原菌株に対して抵抗性の植物をエンジニアリングすることができる。例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７８９（１９９４）（トマト葉かび病菌（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｆｕｌｖｕｍ）に対する抵抗性のためのトマトＣｆ−９遺伝子のクローニング）；Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１４３２（１９９３）（トマト斑葉細菌病菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．ｔｏｍａｔｏ）に対する抵抗性のためのトマトＰｔｏ遺伝子はプロテインキナーゼをコードする）；Ｍｉｎｄｒｉｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ７８：１０８９（１９９４）（アラビドプス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓ）はトマト斑葉細菌病菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ）に対する抵抗性のためのＲＳＰ２遺伝子であり得る））を参照のこと。
・ダイズシスト線虫などの害虫に対する抵抗性を付与する遺伝子。例えば、ＰＣＴ出願国際公開第９６／３０５１７号パンフレット；ＰＣＴ出願国際公開第９３／１９１８１号パンフレットを参照のこと。
・バチルス・チューリンジエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）タンパク質、例えば、Ｇｅｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ４８：１０９（１９８６）を参照のこと。
・レクチン、例えば、Ｖａｎ  Ｄａｍｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２４：２５（１９９４を参照のこと。
・アビジンなどのビタミン結合タンパク質、ＰＣＴ出願ＵＳ９３／０６４８７号明細書を参照のこと、害虫に対する幼虫撲滅剤としてのアビジン及びアビジンホモログの使用を教示している。
・プロテアーゼ又はプロテイナーゼ阻害薬又はアミラーゼ阻害薬などの酵素阻害薬。例えば、Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１６７９３（１９８７）、Ｈｕｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１：９８５（１９９３））、Ｓｕｍｉｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：１２４３（１９９３）及び米国特許第５，４９４，８１３号明細書を参照のこと。
・エクジステロイド又は幼若ホルモン、それらの変異体、それらをベースとする模倣体、又はそれらの拮抗薬若しくは作動薬など、昆虫特異的ホルモン又はフェロモン。例えば、Ｈａｍｍｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：４５８（１９９０）を参照のこと。
・発現時に、罹病源の害虫の生理機能を破壊する昆虫特異的ペプチド又は神経ペプチド。例えば、Ｒｅｇａｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９（１９９４）及びＰｒａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６３：１２４３（１９８９）。また米国特許第５，２６６，３１７号明細書も参照のこと。
・ヘビ、スズメバチ、又は任意の他の生物によって天然で産生される昆虫特有の毒液。例えば、Ｐａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １１６：１６５（１９９２）を参照のこと。
・モノテルペン、セスキテルペン、ステロイド、ヒドロキサム酸、フェニルプロパノイド誘導体又は殺虫活性を有する別の非タンパク質分子の過剰な蓄積に関与する酵素。
・翻訳後修飾を含め、生物学的に活性な分子の改変に関わる酵素；例えば、解糖酵素、タンパク質分解酵素、脂肪分解酵素、ヌクレアーゼ、シクラーゼ、トランスアミナーゼ、エステラーゼ、ヒドロラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、ホスホリラーゼ、ポリメラーゼ、エラスターゼ、キチナーゼ及びグルカナーゼ（天然か又は合成かに関わらない）。ＰＣＴ出願国際公開第９３／０２１９７号パンフレット、Ｋｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２３：６９１（１９９３）及びＫａｗａｌｌｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１：６７３（１９９３）を参照のこと。
・シグナル伝達を刺激する分子。例えば、Ｂｏｔｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２４：７５７（１９９４）、及びＧｒｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０４：１４６７（１９９４）を参照のこと。
・ウイルス侵入性タンパク質又はそれに由来する複合体毒素。Ｂｅａｃｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．ｒｅｖ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．２８：４５１（１９９０）を参照のこと。
・病原体又は寄生虫によって天然で産生される発生抑止性タンパク質。Ｌａｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１４３６（１９９２）及びＴｏｕｂａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２：３６７（１９９２）を参照のこと。
・植物によって天然で産生される発生抑止性タンパク質。例えば、Ｌｏｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：３０５（１９９２）。
・植物では、病原体は多くの場合に宿主特異的である。例えば、あるフザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種はトマト萎凋病を引き起こし得るが、攻撃するのはトマトのみであり、他のフザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種はコムギのみを攻撃する。植物は既存の誘導防御を有して多くの病原体に抵抗する。特に病原体が植物よりも高い頻度で複製することに伴い、植物世代間での突然変異及び組換えイベントが、感受性を生じさせる遺伝的変異性をもたらす。植物には非宿主抵抗性が存在することもあり、例えばその宿主と病原体とが適合しないか、又は典型的には多くの遺伝子によって制御される、あらゆる病原体系統に対する部分抵抗性、及び／又は、また、他の系統に対しては存在しない、一部の病原体系統に対する完全抵抗性も存在し得る。かかる抵抗性は、典型的には数個の遺伝子によって制御される。ＣＲＩＳＰ−ｃｐｆ１系の方法及び構成成分を用いることにより、ここで特異的突然変異をそれを見越して誘導する新規ツールが存在する。従って、抵抗性遺伝子の供給源のゲノムを分析し、且つ所望の特性又は形質を有する植物において、Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系の方法及び構成成分を用いることにより、抵抗性遺伝子の産生を誘発することができる。本系は、これまでの突然変異誘発物質より高い精度でそれを行うことができ、ひいては植物育種プログラムを加速させ、及び改善することができる。
【０９２２】
２．国際公開第２０１３０４６２４７号パンフレットに挙げられるものなど、植物病害に関与する遺伝子：
・イネの病害：イネいもち病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）、イネごま葉枯病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｍｉｙａｂｅａｎｕｓ）、イネ紋枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、イネばか苗病菌（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）；コムギの病害：コムギうどんこ病菌（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、コムギ赤かび病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、コムギ赤かび病菌（Ｆ．ａｖｅｎａｃｅｕｍ）、コムギ赤かび病菌（Ｆ．ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、コムギ赤かび病菌（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｎｉｖａｌｅ）、コムギ黄さび病菌（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ）、コムギ黒さび病菌（Ｐ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）、コムギ赤さび病菌（Ｐ．ｒｅｃｏｎｄｉｔａ）、コムギ紅色雪腐病菌（Ｍｉｃｒｏｎｅｃｔｒｉｅｌｌａ  ｎｉｖａｌｅ）、コムギ雪腐小粒菌核病菌（Ｔｙｐｈｕｌａ  ｓｐ．）、コムギ裸黒穂病菌（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｔｒｉｔｉｃｉ）、コムギなまぐさ黒穂病菌（Ｔｉｌｌｅｔｉａ  ｃａｒｉｅｓ）、コムギ眼紋病菌（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒｅｌｌａ  ｈｅｒｐｏｔｒｉｃｈｏｉｄｅｓ）、コムギ葉枯病菌（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、コムギふ枯病菌（Ｓｔａｇｏｎｏｓｐｏｒａ  ｎｏｄｏｒｕｍ）、コムギ黄斑病菌（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ  ｔｒｉｔｉｃｉ−ｒｅｐｅｎｔｉｓ）；オオムギの病害：オオムギうどんこ病菌（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、オオムギ赤かび病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、オオムギ赤かび病菌（Ｆ．ａｖｅｎａｃｅｕｍ）、オオムギ赤かび病菌（Ｆ．ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、オオムギ赤かび病菌（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｎｉｖａｌｅ）、オオムギ黄さび病菌（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ）、オオムギ黒さび病菌（Ｐ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）、オオムギ小さび病菌（Ｐ．ｈｏｒｄｅｉ）、オオムギ裸黒穂病菌（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｎｕｄａ）、オオムギ雲形病菌（Ｒｈｙｎｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｅｃａｌｉｓ）、オオムギ網斑病菌（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ  ｔｅｒｅｓ）、オオムギ斑点病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ）、オオムギ斑葉病菌（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ  ｇｒａｍｉｎｅａ）、オオムギ紋枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）；トウモロコシの病害：トウモロコシ黒穂病菌（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）、トウモロコシごま葉枯病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ）、トウモロコシひょう紋病菌（Ｇｌｏｅｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｓｏｒｇｈｉ）、トウモロコシ南方さび病菌（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｐｏｌｙｓｏｒａ）、トウモロコシ灰斑病菌（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｚｅａｅ−ｍａｙｄｉｓ）、トウモロコシ根朽病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）；
・柑橘類の病害：カンキツ黒点病菌（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ  ｃｉｔｒｉ）、カンキツそうか病菌（Ｅｌｓｉｎｏｅ  ｆａｗｃｅｔｔｉ）、カンキツ緑かび病菌（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄｉｇｉｔａｔｕｍ）、カンキツ青かび病菌（Ｐ．ｉｔａｌｉｃｕｍ）、カンキツ疫病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｐａｒａｓｉｔｉｃａ）、カンキツ褐色腐敗病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃｉｔｒｏｐｈｔｈｏｒａ）；リンゴの病害：リンゴモニリア病菌（Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ  ｍａｌｉ）、リンゴ腐らん病菌（Ｖａｌｓａ  ｃｅｒａｔｏｓｐｅｒｍａ）、リンゴうどんこ病菌（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ  ｌｅｕｃｏｔｒｉｃｈａ）、リンゴ斑点落葉病菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ  ａｐｐｌｅ  ｐａｔｈｏｔｙｐｅ）、リンゴ黒星病菌（Ｖｅｎｔｕｒｉａ  ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ）、リンゴ炭疽病菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ａｃｕｔａｔｕｍ）、リンゴ疫病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｏｒａ  ｃａｃｔｏｒｕｍ）；
・セイヨウナシの病害：ナシ黒星病菌（Ｖｅｎｔｕｒｉａ  ｎａｓｈｉｃｏｌａ）、セイヨウナシ黒星病（Ｖ．ｐｉｒｉｎａ）、ナシ黒斑病菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｐｅａｒ  ｐａｔｈｏｔｙｐｅ）、ナシ赤星病菌（Ｇｙｍｎｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｈａｒａｅａｎｕｍ）、ナシ疫病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｏｒａ  ｃａｃｔｏｒｕｍ）；
・モモの病害：モモ灰星病菌（Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ  ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ）、モモ黒星病菌（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｃａｒｐｏｐｈｉｌｕｍ）、モモホモプシス腐敗病菌（Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ  ｓｐ．）；
・ブドウの病害：ブドウ黒とう病菌（Ｅｌｓｉｎｏｅ  ａｍｐｅｌｉｎａ）、ブドウ晩腐病菌（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｃｉｎｇｕｌａｔａ）、ブドウうどんこ病菌（Ｕｎｉｎｕｌａ  ｎｅｃａｔｏｒ）、ブドウさび病菌（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ  ａｍｐｅｌｏｐｓｉｄｉｓ）、ブドウ黒腐病菌（Ｇｕｉｇｎａｒｄｉａ  ｂｉｄｗｅｌｌｉｉ）、ブドウべと病菌（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ  ｖｉｔｉｃｏｌａ）；
・カキの病害：カキ炭疽病菌（Ｇｌｏｅｓｐｏｒｉｕｍ  ｋａｋｉ）、カキ角斑落葉病菌（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｋａｋｉ）、カキ円星落葉病菌（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌａ  ｎａｗａｅ）；
・ウリ類の病害：ウリ類炭疽病菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｌａｇｅｎａｒｉｕｍ）、ウリ類うどんこ病菌（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｌｉｇｉｎｅａ）、ウリ類つる枯病菌（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ  ｍｅｌｏｎｉｓ）、ウリ類つる割病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、ウリ類べと病菌（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｃｕｂｅｎｓｉｓ）、ウリ類疫病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｐ．）、ウリ類苗立枯病菌（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｓｐ．）；
・トマトの病害：トマト輪紋病菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、トマト葉かび病菌（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｆｕｌｖｕｍ）、トマト疫病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）；
・ナスの病害：ナス褐紋病菌（Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ  ｖｅｘａｎｓ）、ナスうどんこ病菌（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍ）；
アブラナ科野菜の病害：アブラナ科植物黒斑病菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、アブラナ科植物白斑病菌（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒｅｌｌａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、アブラナ科植物根こぶ病菌（Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、アブラナ科植物べと病菌（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｐａｒａｓｉｔｉｃａ）；
・ネギの病害：ネギさび病菌（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ａｌｌｉｉ）、ネギべと病菌（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）；
・ダイズの病害：ダイズ斑病菌（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｋｉｋｕｃｈｉｉ）、ダイズ黒とう病菌（Ｅｌｓｉｎｏｅ  ｇｌｙｃｉｎｅｓ）、ダイズ黒点病菌（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ  ｐｈａｓｅｏｌｏｒｕｍ  ｖａｒ．ｓｏｊａｅ）、ダイズ褐紋病菌（Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｇｌｙｃｉｎｅｓ）、ダイズ斑点病菌（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｓｏｊｉｎａ）、ダイズさび病菌（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ  ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉ）、ダイズ茎疫病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ）、ダイズリゾクトニア根腐病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、ダイズ褐色輪紋病菌（Ｃｏｒｙｎｅｓｐｏｒａ  ｃａｓｉｉｃｏｌａ）、ダイズ菌核病菌（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）；
・インゲンマメの病害：インゲンマメ炭疽病菌（Ｃｏｌｌｅｔｒｉｃｈｕｍ  ｌｉｎｄｅｍｔｈｉａｎｕｍ）；
・ピーナッツの病害：ラッカセイ黒渋病菌（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｐｅｒｓｏｎａｔａ）、ラッカセイ褐斑病菌（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ａｒａｃｈｉｄｉｃｏｌａ）、ラッカセイ白絹病菌（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ  ｒｏｌｆｓｉｉ）；
・エンドウマメの病害エンドウマメ：エンドウうどんこ病菌（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｐｉｓｉ）；
・ジャガイモの病害：ジャガイモ夏疫病菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、ジャガイモ疫病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）、ジャガイモ緋色腐敗病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒｏｓｅｐｔｉｃａ）、ジャガイモ粉状そうか病菌（Ｓｐｏｎｇｏｓｐｏｒａ  ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａｎ，ｆ．ｓｐ．Ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａｎ）；
・イチゴの病害：イチゴうどんこ病菌（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ  ｈｕｍｕｌｉ）、イチゴ炭疽病菌（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｃｉｎｇｕｌａｔａ）；
・チャノキの病害：チャ網もち病菌（Ｅｘｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、チャ白星病菌（Ｅｌｓｉｎｏｅ  ｌｅｕｃｏｓｐｉｌａ）、チャ輪斑病菌（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ  ｓｐ．）、チャ炭疽病菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｔｈｅａｅ−ｓｉｎｅｎｓｉｓ）；
・タバコの病害：タバコ赤星病菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｌｏｎｇｉｐｅｓ）、タバコうどんこ病菌（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍ）、タバコ炭疽病菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｔａｂａｃｕｍ）、タバコべと病菌（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｔａｂａｃｉｎａ）、タバコ疫病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）；
・ナタネの病害：ナタネ菌核病菌（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）、ナタネ立枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）；
・綿の病害：ワタ腰折病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）；
・テンサイの病害：テンサイ褐斑病菌（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｂｅｔｉｃｏｌａ）、テンサイ根腐病菌（Ｔｈａｎａｔｅｐｈｏｒｕｓ  ｃｕｃｕｍｅｒｉｓ）、テンサイ葉腐病菌（Ｔｈａｎａｔｅｐｈｏｒｕｓ  ｃｕｃｕｍｅｒｉｓ）、テンサイ苗立枯病菌（Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｃｈｌｉｏｉｄｅｓ）；
・バラの病害：バラ黒星病菌（Ｄｉｐｌｏｃａｒｐｏｎ  ｒｏｓａｅ）、バラうどんこ病菌（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ  ｐａｎｎｏｓａ）、バラべと病菌（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｓｐａｒｓａ）；
・キク及びキク科植物の病害：キク類べと病菌（Ｂｒｅｍｉａ  ｌａｃｔｕｃａ）、キク類褐斑病菌（Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ−ｉｎｄｉｃｉ）、キク類白さび病菌（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｈｏｒｉａｎａ）；
・様々な植物の病害：フィチウム・アファニデルマツム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）、苗立枯病菌（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｄｅｂａｒｉａｎｕｍ）、フィチウム・グラミニコラ（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、フィチウム・イレギュラレ（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ）、フィチウム・ウルチマム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ）、灰色かび病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）、菌核病菌（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）；
・ダイコンの病害：ダイコン黒斑病菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ）；
・シバの病害：シバダラースポット病菌（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｈｏｍｅｏｃａｒｐａ）、シバ葉腐病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）；
・バナナの病害：バナナブラックシガトカ病菌（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ  ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ）、バナナ斑葉病菌（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ  ｍｕｓｉｃｏｌａ）；
・ヒマワリの病害：ヒマワリべと病菌（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ  ｈａｌｓｔｅｄｉｉ）；
・アスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、ペニシリウム属種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐｐ．）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、ジベレラ属種（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、トリコデルマ属種（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．）、チエラビオプシス属種（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ  ｓｐｐ．）、リゾプス属種（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐｐ．）、ムコール属種（Ｍｕｃｏｒ  ｓｐｐ．）、コルチシウム属種（Ｃｏｒｔｉｃｉｕｍ  ｓｐｐ．）、ロマ属種（Ｒｈｏｍａ  ｓｐｐ．）、リゾクトニア属種（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｐｐ．）、ジプロジア属種（Ｄｉｐｌｏｄｉａ  ｓｐｐ．）などによって引き起こされる様々な植物の種子の病害又は生育初期段階における病害；
・ポリミキサ属種（Ｐｏｌｙｍｉｘａ  ｓｐｐ．）、フクロカビ属種（Ｏｌｐｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．）などによって媒介される様々な植物のウイルス性病害。
【０９２３】
３．除草剤抵抗性を付与する遺伝子の例：
・成長点又は分裂組織を阻害する除草剤に対する抵抗性、例えば、それぞれ、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．７：１２４１（１９８８）、及びＭｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８０：４４９（１９９０）によるイミダゾリノン又はスルホニル尿素など。
・グリホセート耐性（例えば、それぞれ、突然変異５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰ）遺伝子、ａｒｏＡ遺伝子及びグリホセートアセチルトランスフェラーゼ（ＧＡＴ）遺伝子によって付与される抵抗性）、又はグルホシネートによるなどの他のホスホノ化合物に対する抵抗性（ストレプトミセス・ヒグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）及びストレプトミセス・ビリドクロメオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｉｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）を含めたストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種由来のホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子）、及びＡＣＣアーゼ阻害薬コード遺伝子によるピリジノキシ又はフェノキシプロピオン酸（ｐｒｏｐｒｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）及びシクロヘキソンに対する抵抗性。例えば、米国特許第４，９４０，８３５号明細書及び米国特許第６，２４８，８７６号明細書、米国特許第４，７６９，０６１号明細書、ＥＰ０  ３３３  ０３３号明細書及び米国特許第４，９７５，３７４号明細書を参照のこと。また、ＥＰ０２４２２４６号明細書、ＤｅＧｒｅｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：６１（１９８９）、Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８３：４３５（１９９２）、Ｃａｓｔｌｅ  ｅｔ．ａｌ．に対する国際公開第２００５０１２５１５号パンフレット、及び国際公開第２００５１０７４３７号パンフレットも参照のこと。
・Ｐｒｚｉｂｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ３：１６９（１９９１）、米国特許第４，８１０，６４８号明細書、及びＨａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８５：１７３（１９９２）におけるトリアジン（ｐｓｂＡ及びｇｓ＋遺伝子）又はベンゾニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）、及びグルタチオンＳ−トランスフェラーゼなど、光合成を阻害する除草剤抵抗性。
・除草剤を解毒する酵素又は阻害に対して抵抗性の突然変異グルタミンシンターゼ酵素をコードする遺伝子、例えば米国特許出願第１１／７６０，６０２号明細書。又は解毒酵素は、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種由来のｂａｒ又はｐａｔタンパク質など）をコードする酵素である。ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼについては、例えば、米国特許第５，５６１，２３６号明細書；同第５，６４８，４７７号明細書；同第５，６４６，０２４号明細書；同第５，２７３，８９４号明細書；同第５，６３７，４８９号明細書；同第５，２７６，２６８号明細書；同第５，７３９，０８２号明細書；同第５，９０８，８１０号明細書及び同第７，１１２，６６５号明細書に記載されている。
・ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）阻害薬、即ち、天然に存在するＨＰＰＤ抵抗性酵素、又は国際公開第９６／３８５６７号パンフレット、国際公開第９９／２４５８５号パンフレット、及び国際公開第９９／２４５８６号パンフレット、国際公開第２００９／１４４０７９号パンフレット、国際公開第２００２／０４６３８７号パンフレット、又は米国特許第６，７６８，０４４号明細書に記載されるとおりの突然変異又はキメラＨＰＰＤ酵素をコードする遺伝子。
【０９２４】
４．非生物的ストレス耐性に関わる遺伝子の例：
・国際公開第００／０４１７３号パンフレット、又は国際公開第２００６／０４５６３３号パンフレットに記載されるとおりの、植物細胞又は植物におけるポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）遺伝子の発現及び／又は活性を低下させることが可能なトランス遺伝子。
・例えば国際公開第２００４／０９０１４０号パンフレットに記載されるとおりの、植物又は植物細胞のＰＡＲＧコード遺伝子の発現及び／又は活性を低下させることが可能なトランス遺伝子。
・例えば、ＥＰ０４０７７６２４．７号明細書、国際公開第２００６／１３３８２７号パンフレット、ＰＣＴ／ＥＰ０７／００２，４３３号明細書、ＥＰ１９９９２６３号明細書、又は国際公開第２００７／１０７３２６号パンフレットに記載されるとおりの、ニコチンアミダーゼ、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドシンテターゼ又はニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼを含めた、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ｎｉｃｏｔｉｎｅａｍｉｄｅ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）サルベージ合成経路の植物機能性酵素をコードするトランス遺伝子。
・炭水化物生合成に関わる酵素としては、例えば、ＥＰ０５７１４２７号明細書、国際公開第９５／０４８２６号パンフレット、ＥＰ０７１９３３８号明細書、国際公開第９６／１５２４８号パンフレット、国際公開第９６／１９５８１号パンフレット、国際公開第９６／２７６７４号パンフレット、国際公開第９７／１１１８８号パンフレット、国際公開第９７／２６３６２号パンフレット、国際公開第９７／３２９８５号パンフレット、国際公開第９７／４２３２８号パンフレット、国際公開第９７／４４４７２号パンフレット、国際公開第９７／４５５４５号パンフレット、国際公開第９８／２７２１２号パンフレット、国際公開第９８／４０５０３号パンフレット、国際公開第９９／５８６８８号パンフレット、国際公開第９９／５８６９０号パンフレット、国際公開第９９／５８６５４号パンフレット、国際公開第００／０８１８４号パンフレット、国際公開第００／０８１８５号パンフレット、国際公開第００／０８１７５号パンフレット、国際公開第００／２８０５２号パンフレット、国際公開第００／７７２２９号パンフレット、国際公開第０１／１２７８２号パンフレット、国際公開第０１／１２８２６号パンフレット、国際公開第０２／１０１０５９号パンフレット、国際公開第０３／０７１８６０号パンフレット、国際公開第２００４／０５６９９９号パンフレット、国際公開第２００５／０３０９４２号パンフレット、国際公開第２００５／０３０９４１号パンフレット、国際公開第２００５／０９５６３２号パンフレット、国際公開第２００５／０９５６１７号パンフレット、国際公開第２００５／０９５６１９号パンフレット、国際公開第２００５／０９５６１８号パンフレット、国際公開第２００５／１２３９２７号パンフレット、国際公開第２００６／０１８３１９号パンフレット、国際公開第２００６／１０３１０７号パンフレット、国際公開第２００６／１０８７０２号パンフレット、国際公開第２００７／００９８２３号パンフレット、国際公開第００／２２１４０号パンフレット、国際公開第２００６／０６３８６２号パンフレット、国際公開第２００６／０７２６０３号パンフレット、国際公開第０２／０３４９２３号パンフレット、ＥＰ０６０９０１３４．５号明細書、ＥＰ０６０９０２２８．５号明細書、ＥＰ０６０９０２２７．７号明細書、ＥＰ０７０９０００７．１号明細書、ＥＰ０７０９０００９．７号明細書、国際公開第０１／１４５６９号パンフレット、国際公開第０２／７９４１０号パンフレット、国際公開第０３／３３５４０号パンフレット、国際公開第２００４／０７８９８３号パンフレット、国際公開第０１／１９９７５号パンフレット、国際公開第９５／２６４０７号パンフレット、国際公開第９６／３４９６８号パンフレット、国際公開第９８／２０１４５号パンフレット、国際公開第９９／１２９５０号パンフレット、国際公開第９９／６６０５０号パンフレット、国際公開第９９／５３０７２号パンフレット、米国特許第６，７３４，３４１号明細書、国際公開第００／１１１９２号パンフレット、国際公開第９８／２２６０４号パンフレット、国際公開第９８／３２３２６号パンフレット、国際公開第０１／９８５０９号パンフレット、国際公開第０１／９８５０９号パンフレット、国際公開第２００５／００２３５９号パンフレット、米国特許第５，８２４，７９０号明細書、米国特許第６，０１３，８６１号明細書、国際公開第９４／０４６９３号パンフレット、国際公開第９４／０９１４４号パンフレット、国際公開第９４／１１５２０号パンフレット、国際公開第９５／３５０２６号パンフレット又は国際公開第９７／２０９３６号パンフレットに記載されるもの、又はＥＰ０６６３９５６号明細書、国際公開第９６／０１９０４号パンフレット、国際公開第９６／２１０２３号パンフレット、国際公開第９８／３９４６０号パンフレット、及び国際公開第９９／２４５９３号パンフレットに開示されるとおりの、ポリフルクトース、特にイヌリン及びレバン型のポリフルクトースの産生、国際公開第９５／３１５５３号パンフレット、米国特許出願公開第２００２０３１８２６号明細書、米国特許第６，２８４，４７９号明細書、米国特許第５，７１２，１０７号明細書、国際公開第９７／４７８０６号パンフレット、国際公開第９７／４７８０７号パンフレット、国際公開第９７／４７８０８号パンフレット及び国際公開第００／１４２４９号パンフレットに開示されるとおりのα−１，４−グルカン類の産生、国際公開第００／７３４２２号パンフレットに開示されるとおりのα−１，６分枝α−１，４−グルカンの産生、例えば、国際公開第００／４７７２７号パンフレット、国際公開第００／７３４２２号パンフレット、ＥＰ０６０７７３０１．７号明細書、米国特許第５，９０８，９７５号明細書及びＥＰ０７２８２１３号明細書に開示されるとおりのアルテルナンの産生、例えば、国際公開第２００６／０３２５３８号パンフレット、国際公開第２００７／０３９３１４号パンフレット、国際公開第２００７／０３９３１５号パンフレット、国際公開第２００７／０３９３１６号パンフレット、特開２００６−３０４７７９号公報、及び国際公開第２００５／０１２５２９号パンフレットに開示されるとおりのヒアルロナンの産生に関わる酵素が挙げられる。
・耐乾性を改善する遺伝子。例えば、国際公開第２０１３１２２４７２号パンフレットは、機能性ユビキチンタンパク質リガーゼタンパク質（ＵＰＬ）タンパク質、より具体的にはＵＰＬ３が存在しないか又はそのレベルが低下すると、前記植物の水要求の減少又は耐乾性の向上につながることを開示している。耐乾性が増加したトランスジェニック植物の他の例が、例えば、米国特許出願公開第２００９／０１４４８５０号明細書、米国特許出願公開第２００７／０２６６４５３号明細書、及び国際公開第２００２／０８３９１１号パンフレットに開示されている。米国特許出願公開第２００９／０１４４８５０号明細書は、ＤＲ０２核酸の発現の変化に起因して耐乾性表現型を呈する植物について記載している。米国特許出願公開第２００７／０２６６４５３号明細書は、ＤＲ０３核酸の発現の変化に起因して耐乾性表現型を呈する植物について記載し、及び国際公開第２００２／０８３９１１号パンフレットは、孔辺細胞で発現するＡＢＣトランスポーターの活性の低下に起因して干ばつストレスに対する抵抗性が増加した植物について記載している。別の例はＫａｓｕｇａ及び共著者ら（１９９９）による研究であり、彼らは、トランスジェニック植物におけるＤＲＥＢ１  ＡをコードするｃＤＮＡの過剰発現が、正常な生育条件下で多くのストレス耐性遺伝子の発現を活性化し、耐乾性、食塩負荷耐性、及び耐凍性の改善をもたらしたことを記載している。しかしながら、ＤＲＥＢ１Ａの発現はまた、正常な生育条件下で重大な成長遅延ももたらした（Ｋａｓｕｇａ（１９９９）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７（３）２８７−２９１）。
【０９２５】
更なる詳細な実施形態では、特定の植物形質に影響を及ぼすことにより、作物植物を改良することができる。例えば、農薬抵抗性植物の開発、植物における病害抵抗性の改善、植物の昆虫及び線虫抵抗性の改善、寄生雑草に対する植物の抵抗性の改善、植物の耐乾性の改善、植物の栄養価の改善、植物のストレス耐性の改善、自家受粉の回避、植物飼料消化性バイオマス、穀粒収量等による。幾つかの具体的な非限定例は、本明細書で以下に提供する。
【０９２６】
単一遺伝子の標的突然変異に加えて、Ｃｐｆ１ＣＲＩＳＰＲ複合体は、植物における複数の遺伝子の標的突然変異、染色体断片の欠失、トランス遺伝子の部位特異的組込み、インビボでの部位特異的突然変異誘発、及び正確な遺伝子置換又は対立遺伝子スワッピングが可能となるように設計することができる。従って、本明細書に記載される方法は、遺伝子の発見及び検証、突然変異及びシスジェニック育種、及びハイブリッド育種において幅広い適用性を有する。これらの適用は、除草剤抵抗性、病害抵抗性、非生物的ストレス耐性、高収率、及び高品質など、様々な改良された農業形質を有する新世代の遺伝子改変作物の生産を促進する。
【０９２７】
雄性不稔植物を作出するためのＣｐｆ１遺伝子の使用
雑種植物は、典型的には純系植物と比較して有利な農業形質を有する。しかしながら、自家受粉植物については、雑種の生成には難題が伴い得る。種々の植物タイプにおいて、植物の稔性、より詳細には雄性稔性に重要な遺伝子が同定されている。例えば、トウモロコシでは、稔性において重大な少なくとも２つの遺伝子が同定されている（Ａｍｉｔａｂｈ  Ｍｏｈａｎｔｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｎｅｗ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，Ｏｃｔ  ９−１０，２０１４，Ｊａｉｐｕｒ，Ｉｎｄｉａ；Ｓｖｉｔａｓｈｅｖ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１５  Ｏｃｔ；１６９（２）：９３１−４５；Ｄｊｕｋａｎｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２０１３  Ｄｅｃ；７６（５）：８８８−９９）。本明細書に提供される方法は、容易に交雑させて雑種を生成し得る雄性不稔植物を生成するため雄性稔性に必要な遺伝子を標的化するのに用いることができる。詳細な実施形態では、本明細書に提供されるＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系がシトクロムＰ４５０様遺伝子（ＭＳ２６）又はメガヌクレアーゼ遺伝子（ＭＳ４５）の標的突然変異誘発に用いられ、それによりトウモロコシ植物に雄性不稔が付与される。このように遺伝的に変化したトウモロコシ植物は、雑種育種計画に使用することができる。
【０９２８】
植物における稔性期の増加
詳細な実施形態では、本明細書に提供される方法を用いてコメ植物などの植物の稔性期が延長される。例えば、Ｅｈｄ３などのコメ稔性期遺伝子を標的化することによりその遺伝子に突然変異を生成することができ、延長された再生植物稔性期に関して小植物を選択することができる（ＣＮ  １０４００４７８２号明細書に記載されるとおり）
【０９２９】
目的の作物に遺伝的変異を生成するためのＣｐｆ１の使用
作物植物における野生生殖質の利用可能性及び遺伝的変異は作物改良計画の鍵であるが、作物植物からの利用可能な生殖質の多様性は限られている。本発明は、目的の生殖質に遺伝的変異の多様性を生じさせる方法を想定する。Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系のこの適用では、植物ゲノム内の種々の位置を標的化するガイドＲＮＡのライブラリが提供され、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質と共に植物細胞に導入される。このようにして、ゲノム規模の点突然変異及び遺伝子ノックアウトのコレクションを生成することができる。詳細な実施形態では、本方法は、そのように得られた細胞から植物部位又は植物を生成するステップ、及び目的の形質に関して細胞をスクリーニングするステップを含む。標的遺伝子はコード領域及び非コード領域の両方を含み得る。詳細な実施形態では、形質はストレス耐性であり、本方法は、ストレス耐性作物品種の生成方法である。
【０９３０】
果実の熟成に影響を及ぼすためのＣｐｆ１の使用
熟成は、果実及び野菜の成熟過程における通常の段階である。熟成が始まると、それにより僅か数日で果実又は野菜は食べるのに適さないものとなる。この過程は農業従事者及び消費者の双方に著しい損失をもたらす。詳細な実施形態では、本発明の方法を用いてエチレン産生を低下させる。これは、以下の１つ以上を確実にすることにより確実にされる：ａ．ＡＣＣシンターゼ遺伝子発現の抑制。ＡＣＣ（１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸）シンターゼは、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）からＡＣＣへの変換；エチレン生合成における２番目から最後への段階に関与する酵素である。植物のゲノムにシンターゼ遺伝子のアンチセンス（「鏡像」）又はトランケート型コピーが挿入されると、酵素発現が妨げられる；ｂ．ＡＣＣデアミナーゼ遺伝子の挿入。この酵素をコードする遺伝子は、一般的な非病原性土壌細菌であるシュードモナス・クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）から得られる。これはＡＣＣを別の化合物に変換し、それによりエチレン産生に利用可能なＡＣＣ量を低下させる；ｃ．ＳＡＭヒドロラーゼ遺伝子の挿入。この手法はＡＣＣデアミナーゼと同様であり、ここではその代謝産物前駆体の量を低下させるとエチレン産生が妨げられる；この場合ＳＡＭはホモセリンに変換される。この酵素をコードする遺伝子は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔ３バクテリオファージから得られる、及びｄ．ＡＣＣオキシダーゼ遺伝子発現の抑制。ＡＣＣオキシダーゼは、エチレン生合成経路の最後の段階であるＡＣＣからエチレンへの酸化を触媒する酵素である。本明細書に記載される方法を用いてＡＣＣオキシダーゼ遺伝子を下方制御すると、エチレン産生が抑制されることになり、それにより果実の熟成が遅延する。詳細な実施形態では、上記に記載される改変に加えて又は代えて、本明細書に記載される方法はエチレン受容体の改変に用いられ、それにより果実が得るエチレンシグナルを妨害する。詳細な実施形態では、エチレン結合タンパク質をコードするＥＴＲ１遺伝子の発現が改変され、より詳細には抑制される。詳細な実施形態では、上記に記載される改変に加えて又は代えて、本明細書に記載される方法は、植物細胞壁の完全性を維持する物質ペクチンの分解に関与する酵素であるポリガラクツロナーゼ（ＰＧ）をコードする遺伝子の発現の改変に用いられる。ペクチン分解は熟成過程の始めに起こり、果実の軟化をもたらす。従って、詳細な実施形態では、本明細書に記載される方法を用いてＰＧ遺伝子に突然変異を導入するか、又はＰＧ遺伝子の活性化を抑制することによりＰＧ酵素の産生量を低下させて、それによりペクチン分解を遅延させる。
【０９３１】
従って詳細な実施形態では、本方法は、上記に記載したものなど、植物細胞のゲノムの１つ以上の改変を確実にするためのＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系の使用、及びそれから植物を再生することを含む。詳細な実施形態では、植物はトマト植物である。
【０９３２】
植物の貯蔵寿命の増加
詳細な実施形態では、本発明の方法を用いて、植物又は植物部位の貯蔵寿命に影響を及ぼす化合物の産生に関わる遺伝子が改変される。より詳細には、改変は、ジャガイモ塊茎における還元糖の蓄積を防止する遺伝子における改変である。高温処理を行うと、これらの還元糖が遊離アミノ酸と反応し、褐色の苦味がある生産品となり、且つ潜在的発癌物質であるアクリルアミドレベルが上昇する。詳細な実施形態では、本明細書に提供される方法を用いて液胞型インベルターゼ遺伝子（ＶＩｎｖ）（スクロースをグルコースとフルクトースとに分解するタンパク質をコードする）の発現を低下させ、又は阻害する（Ｃｌａｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．ＤＯＩ：１０．１１１１／ｐｂｉ．１２３７０）。
【０９３３】
付加価値形質を確保するためのＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系の使用
詳細な実施形態では、Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系を用いて、栄養的に改良された農業作物が作製される。詳細な実施形態では、本明細書に提供される方法は、「機能性食品」、即ちそれが含有する従来の栄養素を超えた健康上の利益を提供し得る改変された食品又は食品成分、及び／又は「ニュートラシューティカルズ」、即ち食品又は食品の一部と見なすことができ、且つ疾患の予防及び治療を含めた健康上の利益を提供する物質を生成するように適合される。詳細な実施形態では、ニュートラシューティカルズは、癌、糖尿病、心血管疾患、及び高血圧症のうちの１つ以上の予防及び／又は治療に有用である。
【０９３４】
栄養的に改良された作物の例としては、以下が挙げられる（Ｎｅｗｅｌｌ−ＭｃＧｌｏｕｇｈｌｉｎ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｌｙ  ２００８，Ｖｏｌ．１４７，ｐｐ．９３９−９５３）：
・バヒアグラス（Ｌｕｃｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．２００５，Ｆｌｏｒｉｄａ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  Ｐｏｓｔｅｒ）、キャノーラ（Ｒｏｅｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １１３  ７５−８１）、トウモロコシ（Ｃｒｏｍｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ，１９６７，１９６９  Ｊ  Ａｎｉｍ  Ｓｃｉ  ２６  １３２５−１３３１、Ｏ’Ｑｕｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２０００  Ｊ  Ａｎｉｍ  Ｓｃｉ  ７８  ２１４４−２１４９、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００２，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ  １１  １１−２０、Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００４，Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ３８  ９１０−９２２）、ジャガイモ（Ｙｕ  Ｊ  ａｎｄ  Ａｏ，１９９７  Ａｃｔａ  Ｂｏｔ  Ｓｉｎ  ３９  ３２９−３３４；Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．２０００，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７  ３７２４−３７２９；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２００１）Ｃｈｉｎ  Ｓｃｉ  Ｂｕｌｌ  ４６  ４８２−４８４、コメ（Ｋａｔｓｕｂｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９９，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １２０  １０６３−１０７４）、ダイズ（Ｄｉｎｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．２００１，Ｒａｐｐ  ２００２，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ｐｌａｎｔ  ３７  ７４２−７４７）、サツマイモ（Ｅｇｎｉｎ  ａｎｄ  Ｐｒａｋａｓｈ  １９９７，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ３３  ５２Ａ）に関して記載されているものなど、改変されたタンパク質品質、含有量及び／又はアミノ酸組成。
・キャノーラ（Ｆａｌｃｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９５，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３  ５７７−５８２）、ルピナス（Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．２００１，Ｊ  Ｓｃｉ  Ｆｏｏｄ  Ａｇｒｉｃ  ８１  １４７−１５４）、トウモロコシ（Ｌａｉ  ａｎｄ  Ｍｅｓｓｉｎｇ，２００２，Ａｇｂｉｏｓ  ２００８  ＧＭ  ｃｒｏｐ  ｄａｔａｂａｓｅ（Ｍａｒｃｈ  １１，２００８））、ジャガイモ（Ｚｅｈ  ｅｔ  ａｌ．２００１，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １２７  ７９２−８０２）、モロコシ（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．２００３，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，ｐｐ  ４１３−４１６）、ダイズ（Ｆａｌｃｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９５  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３  ５７７−５８２；Ｇａｌｉｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２００２  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ  ２１  １６７−２０４）に関して記載されているものなど、必須アミノ含有量。
・キャノーラ（Ｄｅｈｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ９  １６７−１７２  ［ＰｕｂＭｅｄ］；Ｄｅｌ  Ｖｅｃｃｈｉｏ（１９９６）ＩＮＦＯＲＭ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｗｓ  ｏｎ  Ｆａｔｓ，Ｏｉｌｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ７  ２３０−２４３；Ｒｏｅｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １１３  ７５−８１  ［ＰＭＣ  ｆｒｅｅ  ａｒｔｉｃｌｅ］［ＰｕｂＭｅｄ］；Ｆｒｏｍａｎ  ａｎｄ  Ｕｒｓｉｎ（２００２，２００３）Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  Ｐａｐｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ２２３  Ｕ３５；Ｊａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  ７７  １１４０−１１４５［ＰｕｂＭｅｄ］；Ａｇｂｉｏｓ（２００８，上記）；ワタ（Ｃｈａｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）．Ｊ  Ａｍ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  ７８  ９４１−９４７；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｎｕｔｒ  ２１  ２０５Ｓ−２１１Ｓ  ［ＰｕｂＭｅｄ］；Ｏ’Ｎｅｉｌｌ（２００７）Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃｈｎｅｗｓ．ｃｏｍ．ａｕ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ／ｉｄ；８６６６９４８１７；ｆｐ；４；ｆｐｉｄ；２（Ｊｕｎｅ  １７，２００８））、リンシード（Ａｂｂａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １６：２７３４−２７４８）、トウモロコシ（Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ３８  ９１０−９２２）、油ヤシ（Ｊａｌａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９７，Ｊ  Ａｍ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  ７４  １４５１−１４５５；Ｐａｒｖｅｅｚ，２００３，ＡｇＢｉｏｔｅｃｈＮｅｔ  １１３  １−８）、コメ（Ａｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  ２１  ９８８−９９２）、ダイズ（Ｒｅｄｄｙ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍａｓ，１９９６，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４  ６３９−６４２；Ｋｉｎｎｅｙ  ａｎｄ  Ｋｗｏｌｔｏｎ，１９９８，Ｂｌａｃｋｉｅ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  ａｎｄ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐｐ  １９３−２１３）、ヒマワリ（Ａｒｃａｄｉａ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２００８）に関するなどの、油及び脂肪酸
・チコリ（Ｓｍｅｅｋｅｎｓ（１９９７）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ  ２  ２８６−２８７、Ｓｐｒｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４００  ３５５−３５８、Ｓｅｖｅｎｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １６  ８４３−８４６）、トウモロコシ（Ｃａｉｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １１０  ３５５−３６３）、ジャガイモ（Ｈｅｌｌｗｅｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７  Ｐｌａｎｔ  Ｊ  １２  １０５７−１０６５）、サトウダイコン（Ｓｍｅｅｋｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９７，上記）に関して記載されるフルクタン、ジャガイモに関して記載されるなどのイヌリン（Ｈｅｌｌｅｗｅｇｅ  ｅｔ  ａｌ．２０００，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７  ８６９９−８７０４）、コメに関して記載されるなどのデンプン（Ｓｃｈｗａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １８  ５５１−５５４、Ｃｈｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ  Ｂｒｅｅｄ  １５  １２５−１４３）など、炭水化物、
・キャノーラ（Ｓｈｉｎｔａｎｉ  ａｎｄ  ＤｅｌｌａＰｅｎｎａ（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２  ２０９８−２１００）、トウモロコシ（Ｒｏｃｈｅｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）．Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｎｕｔｒ  ２１  １９１Ｓ−１９８Ｓ，Ｃａｈｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２１  １０８２−１０８７、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００  ３５２５−３５３０）、カラシ種子（Ｓｈｅｗｍａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ２０  ４０１−４１２、ジャガイモ（Ｄｕｃｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｏｔ  ５６  ８１−８９）、コメ（Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７  ３０３−３０５、イチゴ（Ａｇｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３），Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２１  １７７−１８１）、トマト（Ｒｏｓａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ２４  ４１３−４１９、Ｆｒａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ  Ｓｃｉ  Ｆｏｏｄ  Ａｇｒｉｃ  ８１  ８２２−８２７、Ｍｅｈｔａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０  ６１３−６１８、Ｄｉａｚ  ｄｅ  ｌａ  Ｇａｒｚａ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１  １３７２０−１３７２５、Ｅｎｆｉｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｊ  ３  １７−２７、ＤｅｌｌａＰｅｎｎａ（２００７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０４  ３６７５−３６７６に関して記載されるなどのビタミン類及びカロテノイド類。
・リンゴ（スチルベン類、Ｓｚａｎｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  ２２：１４１−１４９）、アルファルファ（レスベラトロール、Ｈｉｐｓｋｉｎｄ  ａｎｄ  Ｐａｉｖａ（２０００）Ｍｏｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ  １３  ５５１−５６２）、キーウィ（レスベラトロール、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  １９  ９０４−９１０）、トウモロコシ及びダイズ（フラボノイド類、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １２４  ７８１−７９４）、ジャガイモ（アントシアニン及びアルカロイドグリコシド、Ｌｕｋａｓｚｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ  ５２  １５２６−１５３３）、コメ（フラボノイド類及びレスベラトロール、Ｓｔａｒｋ−Ｌｏｒｅｎｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  １６  ６６８−６７３、Ｓｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｊ  ４  ３０３−３１５）、トマト（＋レスベラトロール、クロロゲン酸、フラボノイド類、スチルベン；Ｒｏｓａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）上記、Ｍｕｉｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  １９  ４７０−４７４、Ｎｉｇｇｅｗｅｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２  ７４６−７５４、Ｇｉｏｖｉｎａｚｚｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｊ  ３  ５７−６９）、コムギ（コーヒー酸及びフェルラ酸、レスベラトロール；Ｕｎｉｔｅｄ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（２００２））に関して記載されるなどの機能性二次代謝産物；及び
・アルファルファ（フィターゼ、Ａｕｓｔｉｎ−Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｏｌｅｃｕｌａｒｆａｒｍｉｎｇ．ｃｏｍ／ｎｏｎｍｅｄｉｃａｌ．ｈｔｍｌ）、レタス（ｌｅｔｔｕｓｅ）（鉄、Ｇｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ  １００  ６５８−６６４）、コメ（鉄、Ｌｕｃｃａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｎｕｔｒ  ２１  １８４Ｓ−１９０Ｓ）、トウモロコシ、ダイズ及びコムギ（ｗｈｅａｔｅ）（フィターゼ、Ｄｒａｋａｋａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ５９  ８６９−８８０、Ｄｅｎｂｏｗ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｏｕｌｔ  Ｓｃｉ  ７７  ８７８−８８１、Ｂｒｉｎｃｈ−Ｐｅｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ  Ｂｒｅｅｄ  ６  １９５−２０６）に関して記載されるなどのミネラル利用可能性。
【０９３５】
詳細な実施形態では、付加価値形質は、植物中に存在する化合物の想定される健康上の利益に関する。例えば、詳細な実施形態では、付加価値作物は、本発明の方法を適用して以下の１つ以上の化合物の改変を確実に起こし、又はその合成を誘導し／増加させることによって得られる：
・ニンジンに存在するα−カロチン（細胞に損傷を引き起こし得るフリーラジカルを中和する）又は様々な果実及び野菜に存在するβ−カロチン（フリーラジカルを中和する）など、カロテノイド類
・緑色野菜に存在するルテイン（健康な視力の維持に寄与する）、
・トマト及びトマト製品に存在するリコペン（前立腺癌のリスクを低減すると考えられている）
・柑橘類及びトウモロコシに存在するゼアキサンチン（健康な視力の維持に寄与する）、
・小麦ふすまに存在する不溶性繊維などの食物繊維（乳癌及び／又は結腸癌のリスクを低減し得る）及びオートムギに存在するβ−グルカン、サイリウム及び全粒穀物に存在する可溶性繊維（心血管疾患（ＣＶＤ）のリスクを低減し得る）
・ω−３脂肪酸などの脂肪酸（ＣＶＤのリスクを低減し、且つ精神機能及び視覚機能を改善し得る）、共役リノール酸（体組成を改善し得る、ある種の癌のリスクを減少させ得る）、及びＧＬＡ（癌及びＣＶＤの炎症リスクを低減し得る、体組成を改善し得る）
・抗酸化剤様活性を有するコムギに存在するヒドロキシ桂皮酸などのフラボノイド類は、変性疾患のリスクを低減し得る、果実及び野菜に存在するフラボノール類、カテキン類及びタンニン類（フリーラジカルを中和し、且つ癌のリスクを低減し得る）
・アブラナ科の野菜（ブロッコリー、ケール）、セイヨウワサビに存在する、スルホラファンなど、グルコシノレート類、インドール類、イソチオシアネート類（フリーラジカルを中和し、癌のリスクを低減し得る）
・ブドウに存在するスチルベン類などのフェノール類（変性疾患、心疾患、及び癌のリスクを低減し得る、長寿効果を有し得る）並びに野菜及び柑橘類に存在するコーヒー酸及びフェルラ酸（抗酸化剤様活性を有する）、変性疾患、心疾患、及び眼疾患のリスクを低減し得る、及びカカオに存在するエピカテキン（抗酸化剤様活性を有する、変性疾患及び心疾患のリスクを低減し得る）
・トウモロコシ、ダイズ、コムギ及び木由来のオイル（ｗｏｏｄｅｎ  ｏｉｌ）に存在する植物スタノール／ステロール（血中コレステロール値を下げることにより冠動脈心疾患のリスクを低減し得る）
・キクイモ、エシャロット、オニオンパウダーに存在するフルクタン類、イヌリン類、フラクトオリゴ糖類（胃腸の健康を改善し得る）
・ダイズに存在するサポニン類（ＬＤＬコレステロールを下げ得る）
・ダイズに存在するダイズタンパク質（心疾患のリスクを低減し得る）
・ダイズに存在するイソフラボン類などのフィトエストロゲン類（のぼせなどの閉経症状を低減し得る、骨粗鬆症及びＣＶＤを低減し得る）及び亜麻、ライムギ及び野菜に存在するリグナン類（心疾患及び幾つかの癌から保護し得る、ＬＤＬコレステロール、総コレステロールを下げ得る）。
・タマネギ、ニンニク、オリーブ、ニラ及びワケギ（ｓｃａｌｌｏｎ）に存在する硫化ジアリルなどの硫化物及びチオール類、並びにアブラナ科の野菜に存在するアリルメチルトリスルフィド、ジチオールチオン類（ＬＤＬコレステロールを下げ得る、健康な免疫系を維持する助けとなる）
・クランベリー、ココアに存在するプロアントシアニジン類などのタンニン類（尿路の健康を改善し得る、ＣＶＤ及び高血圧のリスクを低減し得る）
・等。
【０９３６】
加えて、本発明の方法はまた、タンパク質／デンプン機能、貯蔵寿命、味／美しさ、繊維品質、並びにアレルゲン、抗栄養素、及び毒素低減形質を改変することも想定する。
【０９３７】
従って、本発明は、栄養上の付加価値のある植物を作製する方法を包含し、前記方法は、栄養的付加価値の構成成分の産生に関与する酵素をコードする遺伝子を本明細書に記載されるとおりのＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系を用いて植物細胞に導入するステップ、及び前記植物細胞から植物を再生するステップを含み、前記植物は、栄養的付加価値の前記構成成分の発現の増加を特徴とする。詳細な実施形態では、Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系を用いて、例えば化合物の代謝を制御する１つ以上の転写因子を改変することにより、これらの化合物の内因性合成が間接的に改変される。Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系を用いて目的の遺伝子を植物細胞に導入する方法及び／又は内因性遺伝子を改変する方法は、本明細書において上記に記載される。
【０９３８】
付加価値形質を付与するため改変された植物における改変の幾つかの具体的な例は、例えば、ステアリル−ＡＣＰデサチュラーゼのアンチセンス遺伝子で植物を形質転換して植物のステアリン酸含有量を増加させることによる、脂肪酸代謝が改変された植物である。Ｋｎｕｌｔｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：２６２４（１９９２）を参照のこと。別の例は、例えば、低レベルのフィチン酸によって特徴付けられるトウモロコシ突然変異体に関与し得る単一対立遺伝子に関連するＤＮＡをクローニングして、次に再導入することによる、フィチン酸塩含有量を減少させることを伴うものである。Ｒａｂｏｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｍａｙｄｉｃａ  ３５：３８３（１９９０）を参照のこと。
【０９３９】
同様に、強力なプロモーターの制御下でトウモロコシアリューロン層中のフラボノイド類の産生を調節するトウモロコシ（ゼア・マイス（Ｚｅａ  ｍａｙｓ））Ｔｆｓ  Ｃ１及びＲを発現させると、アラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）（シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ））において恐らくは経路全体の活性化によってアントシアニン類の高蓄積率が得られた（Ｂｒｕｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １２：６５−８０）。ＤｅｌｌａＰｅｎｎａ（Ｗｅｌｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００７  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ  ５７：７１１−７３８）は、Ｔｆ  ＲＡＰ２．２及びその相互作用パートナーＳＩＮＡＴ２がアラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の葉におけるカロチン生成を増加させることを見出した。Ｔｆ  Ｄｏｆ１の発現は、トランスジェニックアラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）において炭素骨格生成酵素をコードする遺伝子の上方制御、アミノ含有量の顕著な増加、及びＧｌｃレベルの低下を誘導し（Ｙａｎａｇｉｓａｗａ，２００４  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ４５：３８６−３９１）、及びＤＯＦ  Ｔｆ  ＡｔＤｏｆ１．１（ＯＢＰ２）は、アラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）におけるグルコシノレート生合成経路の全ての段階を上方制御した（Ｓｋｉｒｙｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００６  Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ４７：１０−２４）。
【０９４０】
植物におけるアレルゲンの低減
詳細な実施形態では、本明細書に提供される方法を用いて、植物が消費者にとってより安全なものとなるよう、アレルゲンレベルが低下した植物が作成される。詳細な実施形態では、本方法は、植物アレルゲンの生成に関与する１つ以上の遺伝子の発現を改変するステップを含む。例えば、詳細な実施形態では、本方法は、ライグラス植物細胞などの植物細胞のＬｏｌ  ｐ５遺伝子の発現を下方制御するステップ、及び前記植物の花粉のアレルゲン性を低下させるためそれらの植物細胞から植物を再生するステップを含む（Ｂｈａｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  Ｖｏｌ．９６：１１６７６−１１６８０）。
【０９４１】
ピーナッツアレルギー及び一般にマメ科植物に対するアレルギーは、実際に存在する重大な健康問題である。本発明のＣｐｆ１エフェクタータンパク質系を用いると、かかるマメ科植物のアレルゲンタンパク質をコードする遺伝子を同定し、次にそれを編集し又はサイレンシングすることができる。かかる遺伝子及びタンパク質に関して限定なしに、Ｎｉｃｏｌａｏｕ  ｅｔ  ａｌ．が、ピーナッツ、ダイズ、レンズマメ、エンドウマメ、ルピナス、サヤマメ、及びヤエナリのアレルゲンタンパク質を同定している。Ｎｉｃｏｌａｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０１１；１１（３）：２２２）を参照のこと。
【０９４２】
目的の内因性遺伝子のスクリーニング方法
本明細書に提供される方法は、更に、栄養的付加価値のある構成成分の産生に関与する価値コード酵素の遺伝子、又は一般に種、門、及び植物界にわたって目的の農業形質に影響を及ぼす遺伝子の同定を可能にする。例えば植物における代謝経路の酵素をコードする遺伝子を本明細書に記載されるとおりのＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系を用いて選択的に標的化することにより、植物のある種の栄養的側面に関与する遺伝子を同定することができる。同様に、望ましい農業形質に影響を及ぼし得る遺伝子を選択的に標的化することにより、関連性のある遺伝子を同定することができる。従って、本発明は、特定の栄養価及び／又は農業形質を有する化合物の生成に関与する酵素をコードする遺伝子のスクリーニング方法を包含する。
【０９４３】
植物及び酵母におけるＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系の更なる適用
バイオ燃料生成におけるＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系の使用
用語「バイオ燃料」は、本明細書で使用されるとき、植物及び植物由来の資源から作られる代替燃料である。再生可能バイオ燃料は、エネルギーが炭素固定の過程を通じて得られてきた有機物から抽出することができ、又はバイオマスの使用若しくは変換によって作られる。このバイオマスはバイオ燃料に直接使用してもよく、又は熱変換、化学変換、及び生化学変換によって好都合なエネルギー含有物質に変換されてもよい。このバイオマス変換により、固体、液体、又は気体の形態の燃料が得られ得る。バイオ燃料には、バイオエタノールとバイオディーゼルとの２種類がある。バイオエタノールは、主として、大部分がトウモロコシ及びサトウキビに由来するセルロース（デンプン）の糖発酵プロセスによって生産される。他方でバイオディーゼルは、主として、ナタネ、ヤシ、及びダイズなどの油料作物から生産される。バイオ燃料は主として輸送機関に用いられる。
【０９４４】
バイオ燃料生成のための植物特性の増強
詳細な実施形態では、発酵に際して糖類がより効率的に放出されるよう主要な加水分解剤によるアクセスを容易にするため、本明細書に記載されるとおりのＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系を使用する本方法を用いて細胞壁の特性を変化させる。詳細な実施形態では、セルロース及び／又はリグニンの生合成が改変される。セルロースは細胞壁の主要な構成成分である。セルロース及びリグニンの生合成は共調節される。植物中のリグニンの割合を低下させることにより、セルロースの割合を増加させることができる。詳細な実施形態では、本明細書に記載される方法を用いて植物におけるリグニン生合成が下方制御され、それにより発酵性糖質を増加させる。より詳細には、国際公開第２００８０６４２８９  Ａ２号パンフレットに開示されるとおり、本明細書に記載される方法を用いて、４−クマル酸３−ヒドロキシラーゼ（Ｃ３Ｈ）、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、桂皮酸−４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）、ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ（ＨＣＴ）、コーヒー酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）、カフェオイルＣｏＡ３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＣｏＡＯＭＴ）、フェルラ酸５−ヒドロキシラーゼ（Ｆ５Ｈ）、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）、シンナモイルＣｏＡ−レダクターゼ（ＣＣＲ）、４−クマル酸−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）、モノリグノール−リグニン特異的グリコシルトランスフェラーゼ、及びアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）からなる群から選択される少なくとも第１のリグニン生合成遺伝子が下方制御される。
【０９４５】
詳細な実施形態では、本明細書に記載される方法を用いて、発酵中に発生する酢酸レベルがより低い植物マスが作製される（国際公開第２０１００９６４８８号パンフレットもまた参照のこと）。より詳細には、本明細書に開示される方法を用いてＣａｓｌＬのホモログに突然変異が生成され、多糖アセチル化が低減される。
【０９４６】
バイオ燃料生成のための酵母の改変
詳細な実施形態において、本明細書に提供されるＣｐｆ１酵素は組換え微生物によるバイオエタノールの生産に用いられる。例えば、Ｃｐｆ１を用いて酵母などの微生物をエンジニアリングすることにより、発酵性糖類からバイオ燃料又は生体高分子を作成することができ、及び任意選択で発酵性糖類の供給源としての農業廃棄物から得られた植物由来のリグノセルロースを分解することが可能である。より詳細には、本発明は、Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ複合体を用いてバイオ燃料生成に必要な外因性遺伝子を微生物に導入し、及び／又はバイオ燃料合成を妨げ得る内因性遺伝子を改変する方法を提供する。より詳細には、本方法は、ピルビン酸からエタノール又は別の目的の産物への変換に関与する酵素をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を酵母などの微生物に導入するステップを含む。詳細な実施形態では、本方法は、セルラーゼなど、微生物によるセルロースの分解を実現する１つ以上の酵素の導入を確実にする。更に別の実施形態では、Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ複合体を用いて、バイオ燃料生成経路と競合する内因性代謝経路が改変される。
【０９４７】
従って、より詳細な実施形態では、本明細書に記載される方法を用いて以下のとおり微生物が改変される：
−植物細胞壁分解酵素をコードする少なくとも１つの異種核酸が導入され、又は少なくとも１つの内因性核酸の発現が増加し、従って前記微生物は前記核酸の発現、並びに前記植物細胞壁分解酵素の産生及び分泌が可能となる；
−任意選択で、アセトアルデヒドをエタノールに変換する酵素をコードする少なくとも１つの異種核酸との組み合わせで、ピルビン酸をアセトアルデヒドに変換する酵素をコードする少なくとも１つの異種核酸が導入され、又は少なくとも１つの内因性核酸の発現が増加し、そのため前記宿主細胞は前記核酸の発現が可能となり；及び／又は
−前記宿主細胞における代謝経路の酵素をコードする少なくとも１つの核酸が改変され（ここで前記経路はピルビン酸からアセトアルデヒド又はアセトアルデヒドからエタノール以外の代謝産物を産生し、及び前記改変は前記代謝産物の産生の低下をもたらす）、又は前記酵素の阻害因子をコードする少なくとも１つの核酸が導入される。
【０９４８】
植物油又はバイオ燃料を生成するための藻類及び植物の改変
トランスジェニックの藻類又はセイヨウアブラナなどの他の植物は、例えばアルコール類（特にメタノール及びエタノール）など、植物油又はバイオ燃料の生成に特に有用であり得る。これらは、油又はバイオ燃料産業で使用される高レベルの油又はアルコールを発現又は過剰発現するようにエンジニアリングされ得る。
【０９４９】
本発明の詳細な実施形態によれば、Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系を用いて、バイオ燃料生成に有用な脂質リッチ珪藻類が生成される。
【０９５０】
脂肪酸産生能を有する微生物の作成におけるＣａｓ９の使用
詳細な実施形態では、本発明の方法を用いて、脂肪酸メチルエステル類（「ＦＡＭＥ」）及び脂肪酸エチルエステル類（「ＦＡＥＥ」）など、脂肪酸エステル類の産生能を有する遺伝子操作微生物が作成される。詳細な実施形態では、藻類細胞によって産生される脂質の量及び／又は脂質の質の改変に関与する遺伝子を特異的に改変することが想定される。脂肪酸合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子は、例えば、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、脂肪酸シンターゼ、３−ケトアシルアシルキャリアータンパク質シンターゼＩＩＩ、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｐｈｏｓｐａｔｅ  ｄｅｓｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）（Ｇ３ＰＤＨ）、エノイルアシルキャリアータンパク質レダクターゼ（エノイル−ＡＣＰ−レダクターゼ）、グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ又はジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼ（ｐｈｏｓｈａｔｉｄａｔｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、パルミトイル（ｐａｌｍｉｔｏｙｉ）タンパク質チオエステラーゼなどの脂肪酸チオエステラーゼ、又はリンゴ酸酵素活性を有するタンパク質をコードすることができる。更なる実施形態では、脂質蓄積が増加した珪藻類を作成することが想定される。これは、脂質異化を減少させる遺伝子を標的化することによって実現し得る。トリアシルグリセロール及び遊離脂肪酸の両方の活性化に関わる遺伝子、並びにアシル−ＣｏＡシンテターゼ、３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性及びホスホグルコムターゼなどの脂肪酸のβ酸化に直接関わる遺伝子が、本発明の方法で用いるのに特に有益である。本明細書に記載されるＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系及び方法を用いると、その脂質含有量が増加するように珪藻類のかかる遺伝子を特異的に活性化させることができる。
【０９５１】
微細藻類などの生物は、合成生物学に広く用いられている。Ｓｔｏｖｉｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．Ｃｏｍｍ．，２０１５；２：１３は、工業生産用のロバストな株を効率的に作製するための工業用酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）のゲノム編集について記載している。Ｓｔｏｖｉｃｅｋは、酵母にコドン最適化されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を使用して内因性遺伝子の両方の対立遺伝子を同時に破壊し、異種遺伝子をノックインした。ゲノム又はエピソーム２μ系ベクター位置からＣａｓ９及びｇＲＮＡを発現させた。この著者らはまた、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡ発現レベルを最適化することにより遺伝子破壊効率を改善できたことも示した。Ｈｌａｖｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．２０１５）は、挿入突然変異誘発及びスクリーニングのため核及び葉緑体遺伝子を標的化するＣＲＩＳＰＲなどの技法を用いた微細藻類の種又は株の開発を考察している。Ｓｔｏｖｉｃｅｋ及びＨｌａｖｏｖａの方法は、本発明のＣｐｆ１エフェクタータンパク質系に適用し得る。
【０９５２】
米国特許第８９４５８３９号明細書は、Ｃａｓ９を用いた微細藻類（コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）細胞）種）のエンジニアリング方法について記載している。同様のツールを用いて、本明細書に記載されるＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系の方法をクラミドモナス属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）種及び他の藻類に適用することができる。詳細な実施形態では、Ｈｓｐ７０Ａ−Ｒｂｃ  Ｓ２又はβ２−チューブリンなどの構成的プロモーターの制御下でＣｐｆ１を発現するベクターを用いて発現させて、藻類にＣｐｆ１及びガイドＲＮＡが導入される。ガイドＲＮＡは、Ｔ７プロモーターを含有するベクターを用いて送達されることになる。或いは、Ｃｐｆ１  ｍＲＮＡ及びインビトロ転写されたガイドＲＮＡが藻類細胞に送達されてもよい。電気穿孔プロトコルは、ＧｅｎｅＡｒｔクラミドモナスエンジニアリングキットの標準的な推奨プロトコルに従う。
【０９５３】
脂肪酸産生能を有する微生物の作成におけるＣｐｆ１の使用
詳細な実施形態では、本発明の方法は、脂肪酸メチルエステル類（「ＦＡＭＥ」）及び脂肪酸エチルエステル類（「ＦＡＥＥ」）など、脂肪酸エステル類の産生能を有する遺伝子操作された微生物の作成に用いられる。
【０９５４】
典型的には、宿主細胞は、チオエステラーゼをコードする遺伝子、アシル−ＣｏＡシンターゼをコードする遺伝子、及びエステルシンターゼをコードする遺伝子の発現又は過剰発現により、アルコールなど、培地中に存在する炭素源から脂肪酸エステル類を産生するようにエンジニアリングすることができる。従って、本明細書に提供される方法を用いて、チオエステラーゼ遺伝子、アシル−ＣｏＡシンターゼをコードする遺伝子、及びエステルシンターゼをコードする遺伝子を過剰発現するか又は導入するように微生物が改変される。詳細な実施形態では、チオエステラーゼ遺伝子は、ｔｅｓＡ、’ｔｅｓＡ、ｔｅｓＢ、ｆａｔＢ、ｆａｔＢ２、ｆａｔＢ３、ｆａｔＡｌ、又はｆａｔＡから選択される。詳細な実施形態では、アシル−ＣｏＡシンターゼをコードする遺伝子は、ｆａｄＤＪａｄＫ、ＢＨ３１０３、ｐｆｌ−４３５４、ＥＡＶ１５０２３、ｆａｄＤｌ、ｆａｄＤ２、ＲＰＣ＿４０７４、ｆａｄＤＤ３５、ｆａｄＤＤ２２、ｆａａ３９、又は同じ特性を有する酵素をコードする同定された遺伝子から選択される。詳細な実施形態では、エステルシンターゼをコードする遺伝子は、ホホバ（Ｓｉｍｍｏｎｄｓｉａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、アシネトバクター属種（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＡＤＰ、アルカニボラックス・ボルクメンシス（Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、フンディバクター・ジャデンシス（Ｆｕｎｄｉｂａｃｔｅｒ  ｊａｄｅｎｓｉｓ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、又はアルカリゲネス・ユートロフス（Ａｌｋａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、又はその変異体由来のシンターゼ／アシル−ＣｏＡ：ジアシルグリセロール（ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｌ）アシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子である。それに加えて又は代えて、本明細書に提供される方法を用いると、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、外膜タンパク質受容体をコードする遺伝子、及び脂肪酸生合成の転写調節因子をコードする遺伝子のうちの少なくとも１つの前記微生物における発現が減少する。詳細な実施形態では、これらの遺伝子のうちの１つ以上が、突然変異の導入によるなどして不活性化される。詳細な実施形態では、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子はｆａｄＥである。詳細な実施形態では、脂肪酸生合成の転写調節因子をコードする遺伝子は、ＤＮＡ転写リプレッサー、例えばｆａｂＲをコードする。
【０９５５】
それに加えて又は代えて、前記微生物は、ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のうちの少なくとも一方、又は両方の発現が低下するように改変される。詳細な実施形態において、ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子はｐｆｌＢである。詳細な実施形態において、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子はＩｄｈＡである。詳細な実施形態において、これらの遺伝子のうちの１つ以上が、そこに突然変異を導入することによるなどして不活性化される。
【０９５６】
詳細な実施形態では、微生物は、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｙｓｔｉｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アカパンカビ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、リゾムコール属（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロカエテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、プレウロタス属（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、ホウロクタケ属（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ステノトロホモナス属（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈａｍｏｎａｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、又はストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）から選択される。
【０９５７】
有機酸産生能を有する微生物の作成におけるＣｐｆ１の使用
本明細書に提供される方法は、有機酸産生能、より詳細にはペントース又はヘキソース糖類からの有機酸産生能を有する微生物のエンジニアリングに更に用いられる。詳細な実施形態では、本方法は、外因性ＬＤＨ遺伝子を微生物に導入するステップを含む。詳細な実施形態では、それに加えて又は代えて、目的の有機酸以外の代謝産物を産生する内因性代謝経路であって、有機酸を消費する内因性代謝経路に関わるタンパク質をコードする内因性遺伝子を不活性化することにより、前記微生物における有機酸産生を増加させる。詳細な実施形態では、この改変により、目的の有機酸以外の代謝産物の産生が低下することが確実となる。詳細な実施形態によれば、本方法は、有機酸が消費される内因性経路の少なくとも１つのエンジニアリングされた遺伝子欠失及び／又は不活性化、又は目的の有機酸以外の代謝産物を作り出す内因性経路に関わる産物をコードする遺伝子の導入に用いられる。詳細な実施形態では、少なくとも１つのエンジニアリングされた遺伝子欠失又は不活性化は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ｐｄｃ）、フマル酸レダクターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈ）、ａｃｅｔアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｄ−ｌｄｈ）、Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌ−ｌｄｈ）、乳酸２−モノオキシゲナーゼからなる群から選択される酵素をコードする１つ以上の遺伝子にある。更なる実施形態において、少なくとも１つのエンジニアリングされた遺伝子欠失及び／又は不活性化は、ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする内因性遺伝子（ｐｄｃ）にある。
【０９５８】
更なる実施形態において、微生物は乳酸を産生するようにエンジニアリングされ、及び少なくとも１つのエンジニアリングされた遺伝子欠失及び／又は不活性化は、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする内因性遺伝子にある。それに加えて又は代えて、微生物は、シトクロムＢ２依存性Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼなどのシトクロム依存性乳酸デヒドロゲナーゼをコードする内因性遺伝子の少なくとも１つのエンジニアリングされた遺伝子欠失又は不活性化を含む。
【０９５９】
酵母株を利用した改良キシロース又はセロビオースの生成におけるＣｐｆ１の使用
詳細な実施形態では、Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系は、酵母株を利用した改良キシロース又はセロビオースの選択に適用し得る。エラープローンＰＣＲを用いて、キシロース利用又はセロビオース利用経路に関わる１つ（又は複数）の遺伝子を増幅することができる。キシロース利用経路及びセロビオース利用経路に関わる遺伝子の例としては、限定なしに、Ｈａ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０８（２）：５０４−９及びＧａｌａｚｋａ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３０（６０００）：８４−６に記載されるものを挙げることができる。各々がかかる選択の遺伝子にランダム突然変異を含む得られた二本鎖ＤＮＡ分子ライブラリは、Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系の構成成分と共に酵母株（例えばＳ２８８Ｃ）に共形質転換してもよく、国際公開第２０１５１３８８５５号パンフレットに記載されるとおり、キシロース又はセロビオース利用能が増強された株を選択することができる。
【０９６０】
イソプレノイド生合成に用いられる改良酵母株の作成におけるＣｐｆ１の使用
Ｔａｄａｓ  Ｊａｋｏｃｉｕｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．は、パン酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において１回の形質転換ステップで最大５つの異なるゲノム遺伝子座をゲノムエンジニアリングすることへの多重Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系の適用に成功したことについて記載しており（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｖｏｌｕｍｅ  ２８，Ｍａｒｃｈ  ２０１５，Ｐａｇｅｓ  ２１３−２２２）、工業的に重要なイソプレノイド生合成経路にとって鍵となる中間体であるメバロン酸高産生株が得られている。詳細な実施形態では、イソプレノイド合成に用いられる更なる高産生酵母株を同定するため、本明細書に記載されるとおりの多重ゲノムエンジニアリング方法においてＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系が適用されてもよい。
【０９６１】
乳酸産生酵母株の作成におけるＣａｓ９の使用
別の実施形態において、多重Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系の適用の成功が企図される。Ｖｒａｔｉｓｌａｖ  Ｓｔｏｖｉｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２０１５，Ｐａｇｅｓ  １３−２２）と同様に、改良乳酸産生株を設計し、単一の形質転換イベントで得ることができる。詳細な実施形態では、Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系を用いて異種乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の挿入と２つの内因性遺伝子ＰＤＣ１及びＰＤＣ５遺伝子の破壊とが同時に行われる。
【０９６２】
植物におけるＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系の更なる適用
詳細な実施形態では、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ系、及び好ましくはＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系を用いて遺伝因子ダイナミクスを視覚化することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲイメージングは、反復ゲノム配列又は非反復ゲノム配列のいずれかを視覚化し、テロメア長の変化及びテロメアの動きを報告し、及び全細胞周期を通じた遺伝子座のダイナミクスをモニタすることができる（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１３）。これらの方法はまた、植物にも適用し得る。
【０９６３】
本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ系、及び好ましくはＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系の他の適用は、インビトロ及びインビボでの標的遺伝子破壊ポジティブ選択スクリーニングである（Ｍａｌｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０１３）。これらの方法はまた、植物にも適用し得る。
【０９６４】
詳細な実施形態では、不活性Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼをヒストン修飾酵素と融合させることにより、複合体エピゲノムにカスタムの変化を導入することができる（Ｒｕｓｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１４）。これらの方法はまた、植物にも適用し得る。
【０９６５】
詳細な実施形態では、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ系、及び好ましくはＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系を用いることによりクロマチンの特定の位置を精製して関連タンパク質を同定し、そのようにして転写におけるそれらの調節的役割を解明することができる（Ｗａｌｄｒｉｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１４）。これらの方法はまた、植物にも適用し得る。
【０９６６】
詳細な実施形態では、本発明は、ウイルスＤＮＡ及びＲＮＡの両方を切断することが可能であるため、植物系におけるウイルス除去用治療薬として使用することができる。ヒト系における先行研究は、一本鎖ＲＮＡウイルス、Ｃ型肝炎（Ａ．Ｐｒｉｃｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，２０１５）並びに二本鎖ＤＮＡウイルス、Ｂ型肝炎（Ｖ．Ｒａｍａｎａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ，２０１５）の標的化におけるＣＲＩＳＰＲの利用の成功を実証している。これらの方法はまた、植物におけるＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系の使用にも適合させ得る。
【０９６７】
詳細な実施形態では、本発明を用いてゲノムの複雑さを変化させてもよい。更なる詳細な実施形態では、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ系、及び好ましくはＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系を用いて染色体数を破壊し、又は変化させて、一倍体植物（一方の親からの染色体のみを含有する）を生成することができる。かかる植物は染色体重複を起こすように誘導して、ホモ接合対立遺伝子のみを含有する二倍体植物に変換することができる（Ｋａｒｉｍｉ−Ａｓｈｔｉｙａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，２０１５；Ａｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｕｓ，２０１４）。これらの方法はまた、植物にも適用し得る。
【０９６８】
詳細な実施形態では、本明細書に記載されるＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系を自己切断に用いることができる。記載されるとおり、Ｃｐｆ１酵素及びｇＲＮＡのプロモーターは構成的プロモーターであることができ、同じ形質転換カセットに、但し誘導性プロモーターによる制御下に第２のｇＲＮＡが導入される。この第２のｇＲＮＡは、非機能性Ｃｐｆ１を作り出すためＣｐｆ１遺伝子に部位特異的切断を誘導するように設計することができる。更なる詳細な実施形態では、第２のｇＲＮＡが形質転換カセットの両端での切断を誘導し、宿主ゲノムからのカセットの除去をもたらす。この系はＣａｓ酵素への制御された細胞曝露時間を提供し、更にオフターゲット編集を最小限に抑える。更に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓカセットの両端の切断を用いて二対立遺伝子突然変異を有するトランス遺伝子フリーＴ０植物を作成することができる（Ｃａｓ９についての記載のとおり、例えば、Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１４；Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１５）。Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．の方法は、本明細書に記載されるＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系に適用し得る。Ｓｕｇａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１４  Ｍａｒ；５５（３）：４７５−８１．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｐｃｐ／ｐｃｕ０１４．Ｅｐｕｂ  ２０１４  Ｊａｎ  １８）は、陸上植物進化の研究向けのモデル種として浮上しているゼニゴケのマルカンティア・ポリモルファ・Ｌ．（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ  Ｌ．）における標的突然変異誘発へのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の適用を報告している。Ｍ．ポリモルファ（Ｍ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）のＵ６プロモーターが同定及びクローニングされ、ｇＲＮＡが発現された。ｇＲＮＡの標的配列は、Ｍ．ポリモルファ（Ｍ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）のオーキシン応答因子１（ＡＲＦ１）をコードする遺伝子を破壊するように設計された。Ｓｕｇａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性形質転換を用いてＭ．ポリモルファ（Ｍ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）の配偶体世代における安定突然変異体を単離した。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ベースのインビボ部位特異的突然変異誘発が、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ又はＭ．ポリモルファ（Ｍ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）ＥＦ１αのいずれかのプロモーターを用いてＣａｓ９を発現させることにより達成された。オーキシン耐性表現型を示す単離された突然変異個体はキメラではなかった。更に、Ｔ１植物の無性生殖によって安定突然変異体が産生された。ＣＲＩＰＳＲ−Ｃａｓ９ベースの標的突然変異誘発を用いて複数のａｒｆ１対立遺伝子が容易に構築された。Ｓｕｇａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．の方法は、本発明のＣｐｆ１エフェクタータンパク質系に適用し得る。
【０９６９】
Ｋａｂａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１４  Ｏｃｔ  ２９；４２（１９）：ｅ１４７．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｕ７４９．Ｅｐｕｂ  ２０１４  Ａｕｇ  １３）は、好都合なゴールデンゲートクローニング方法によってベクターに取り込まれた独立したＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターからＣａｓ９変異体、レポーター遺伝子及び最大４つのｓｇＲＮＡを発現する単一レンチウイルス系を開発した。各ｓｇＲＮＡが効率的に発現しており、不死化及び初代ヒト細胞において多重遺伝子編集及び持続的な転写活性化を媒介することができる。Ｋａｂａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．の方法は、本発明のＣｐｆ１エフェクタータンパク質系に適用し得る。
【０９７０】
Ｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（ＢＭＣ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１４，１４：３２７）は、ｐＧｒｅｅｎ又はｐＣＡＭＢＩＡ骨格、並びにｇＲＮＡをベースとしてＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９バイナリーベクターセットを開発した。このツールキットは、ＢｓａＩの他には制限酵素を必要とすることなしに、トウモロコシコドン最適化Ｃａｓ９及び１つ以上のｇＲＮＡを持つ最終構築物を僅か１回のクローニングステップで効率良く生成する。このツールキットはトウモロコシプロトプラスト、トランスジェニックトウモロコシ株、及びトランスジェニックアラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）株を用いて実証され、高い効率及び特異性を呈することが示された。更に重要なことには、このツールキットを使用して、Ｔ１世代のトランスジェニック実生で３つのアラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）遺伝子の標的突然変異が検出された。更に、複数の遺伝子突然変異を次世代に受け継ぐことができた。植物における多重ゲノム編集用のツールキットとして、（ガイドＲＮＡ）モジュールベクターセット。Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．のツールボックスは、本発明のＣｐｆ１エフェクタータンパク質系に適用し得る。
【０９７１】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１による標的化した植物ゲノム編集用のプロトコルもまた、シリーズＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｐｐ  ２３９−２５５  １０  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２０１５の第１２８４巻においてＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系に関して開示されているものに基づき利用可能である。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）及びベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）プロトプラストｓモデル細胞系を用いて植物コドン最適化Ｃａｓ９（ｐｃｏＣａｓ９）媒介性ゲノム編集用のデュアルｇＲＮＡを設計し、構築し、及び評価する詳細な手順が記載されている。全植物における標的ゲノム改変の生成にＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を適用する戦略もまた考察される。この章に記載されるプロトコルは、本発明のＣｐｆ１エフェクタータンパク質系に適用し得る。
【０９７２】
Ｐｅｔｅｒｓｅｎ（「正確にグリコールエンジニアリングされた植物に向けて（Ｔｏｗａｒｄｓ  ｐｒｅｃｉｓｅｌｙ  ｇｌｙｃｏｌ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｐｌａｎｔｓ）」，Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｄｅｎｍａｒｋ  Ａｎｎｕａｌ  ｍｅｅｔｉｎｇ  ２０１５，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）は、所望の翻訳後修飾を有するタンパク質及び産物の産生のため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いてアラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）におけるゲノム変化をエンジニアリングする方法、例えばアラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）を糖鎖エンジニアリングする方法を開発した。Ｈｅｂｅｌｓｔｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．（Ｆｒｏｎｔ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．２０１５  Ａｐｒ  ２３；６：２４７）は、デンプン修飾酵素を発現し、且つ通常はデンプンを工業的に化学処理及び／又は物理処理することによって作られる生産物を直接産生する作物を提供するインプランタでのデンプンバイオエンジニアリングを概説している。Ｐｅｔｅｒｓｅｎ及びＨｅｂｅｌｓｔｒｕｐの方法は、本発明のＣｐｆ１エフェクタータンパク質系に適用し得る。
【０９７３】
Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ  Ｐｌａｎｔ．２０１５  Ａｕｇ  ３；８（８）：１２７４−８４．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｐ．２０１５．０４．００７）は、単子葉及び双子葉植物における簡便で高効率な多重ゲノム編集のための、植物コドン最適化Ｃａｓ９遺伝子を利用したロバストなＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ベクター系を報告している。Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．は、複数のｓｇＲＮＡ発現カセットを迅速に作成するためのＰＣＲベースの手順を設計しており、これはゴールデンゲートライゲーション又はギブソンアセンブリによる１ラウンドのクローニングでバイナリーＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ベクターにアセンブルすることができるものである。この系で、Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．はコメの４６ヵ所の標的部位を編集し、平均８５．４％の突然変異率で、ほとんどが二対立遺伝子及びホモ接合状態であった。Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．は、ある遺伝子ファミリーの複数の（最大８個の）メンバー、ある生合成経路の複数の遺伝子、又はある単一遺伝子内の複数の部位を同時に標的化することによる、Ｔ０コメ及びＴ１アラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物の機能喪失型遺伝子突然変異の例を提供している。Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．の方法は、本発明のＣｐｆ１エフェクタータンパク質系に適用し得る。
【０９７４】
Ｌｏｗｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１５  Ａｕｇ  ２１．ｐｉｉ：ｐｐ．００６３６．２０１５）もまた、植物における発現した、サイレンシングされた又は非コードの遺伝子の多重ゲノム編集及び転写調節を可能にするＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ツールボックスを開発した。このツールボックスは、単子葉類及び双子葉類について、ゴールデンゲート及びゲートウェイクローニング方法を用いて機能性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  Ｔ−ＤＮＡ構築物を迅速且つ効率的にアセンブルするためのプロトコル及び試薬を研究者に提供する。これは、植物内因性遺伝子の多重化した遺伝子編集及び転写活性化又は抑制を含め、完全な一揃いの能力を備えている。Ｔ−ＤＮＡベースの形質転換技術は、現代の植物バイオテクノロジー、遺伝学、分子生物学及び生理学にとって基礎である。そのため、出願人らは、Ｃａｓ９（ＷＴ、ニッカーゼ又はｄＣａｓ９）及び１つ又は複数のｇＲＮＡを目的のデスティネーションＴ−ＤＮＡベクターにアセンブルする方法を開発した。このアセンブル方法は、ゴールデンゲートアセンブリ及びマルチサイトゲートウェイ組換えの両方に基づく。アセンブリには３つのモジュールが必要である。第１のモジュールはＣａｓ９エントリーベクターであり、これは、ａｔｔＬ１及びａｔｔＲ５部位が隣接したプロモーターレスＣａｓ９又はその誘導遺伝子を含有する。第２のモジュールはｇＲＮＡエントリーベクターであり、これは、ａｔｔＬ５及びａｔｔＬ２部位が隣接したエントリーｇＲＮＡ発現カセットを含有する。第３のモジュールは、Ｃａｓ９発現用に選択されたプロモーターを提供するａｔｔＲ１−ａｔｔＲ２含有デスティネーションＴ−ＤＮＡベクターを含む。Ｌｏｗｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．のツールボックスは、本発明のＣｐｆ１エフェクタータンパク質系に適用し得る。
【０９７５】
有利な実施形態において、植物は樹木であってもよい。本発明はまた、本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系を草本系にも利用し得る（例えば、Ｂｅｌｈａｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９：３９及びＨａｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２８：１８５９−１８７２を参照）。特に有利な実施形態において、本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系は樹木における一塩基変異多型（ＳＮＰ）を標的化し得る（例えば、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２０８，Ｉｓｓｕｅ  ２，ｐａｇｅｓ  ２９８−３０１，Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０１５を参照）。Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．の研究では、著者らは事例研究として４−クマル酸：ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）遺伝子ファミリーを用いて木本多年生ポプルス属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）でＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系を適用し、標的化した２つの４ＣＬ遺伝子について１００％の突然変異効率を達成しており、ここで調べた形質転換体は全て、二対立遺伝子改変を有していた。Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．の研究では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系は一塩基変異多型（ＳＮＰ）に対する感受性が極めて高く、標的配列中のＳＮＰに起因して３番目の４ＣＬ遺伝子の切断が無効になった。これらの方法は、本発明のＣｐｆ１エフェクタータンパク質系に適用し得る。
【０９７６】
Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｅｗ  Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２０８，Ｉｓｓｕｅ  ２，ｐａｇｅｓ  ２９８−３０１，Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０１５）の方法は、以下のとおり本発明に適用し得る。それぞれリグニン及びフラボノイド生合成に関連する２つの４ＣＬ遺伝子、４ＣＬ１及び４ＣＬ２が、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９編集の標的とされる。ルーチンで形質転換に用いられるポプルス・トレムラ×アルバクローン（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌａ  ｘ  ａｌｂａ  ｃｌｏｎｅ）７１７−１Ｂ４は、ゲノムシーケンシングされたポプルス・トリコカルパ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）からの分岐である。従って、参照ゲノムから設計された４ＣＬ１及び４ＣＬ２  ｇＲＮＡをインハウスの７１７  ＲＮＡ−Ｓｅｑデータで調べることにより、Ｃａｓ効率を制限し得るＳＮＰがないことを確認する。４ＣＬ５用に設計された、４Ｌ１のゲノムデュプリケートである第３のｇＲＮＡもまた含める。対応する７１７配列は各対立遺伝子のＰＡＭの近傍／その内部に１つのＳＮＰを持ち、これらは両方ともに、４ＣＬ５−ｇＲＮＡによるターゲティングを無効にするものと思われる。３つ全てのｇＲＮＡ標的部位が第１のエクソン内に位置する。７１７形質転換については、ウマゴヤシ属（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）Ｕ６．６プロモーターからｇＲＮＡが、バイナリーベクター中でＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターの制御下にあるコドン最適化ヒトＣａｓと共に発現する。Ｃａｓのみのベクターによる形質転換が対照として働き得る。無作為に選択した４ＣＬ１及び４ＣＬ２株をアンプリコンシーケンシングに供する。次にデータを処理し、全ての場合において二対立遺伝子突然変異を確認する。これらの方法は、本発明のＣｐｆ１エフェクタータンパク質系に適用し得る。
【０９７７】
植物では、病原体は多くの場合に宿主特異的である。例えば、フザリウム・オキシスポラム・ｆ・エスピー・リコペルシシ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ．ｓｐ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）はトマト萎凋病を引き起こすが、攻撃するのはトマトのみであり、Ｆ．オキシスポラム・ｆ・ジアンチ（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ．ｄｉａｎｔｈｉｉ）、プクシニア・グラミニス・ｆ・エスピー・トリチシ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｆ．ｓｐ．ｔｒｉｔｉｃｉ）はコムギのみを攻撃する。植物は既存の誘導防御を有して多くの病原体に抵抗する。特に病原体が植物より高い頻度で複製することに伴い、植物世代間での突然変異及び組換えイベントが、感受性を生じさせる遺伝的変異性をもたらす。植物には非宿主抵抗性が存在することもあり、例えばその宿主と病原体とが適合しない。また、水平抵抗性、例えば、典型的には多くの遺伝子によって制御される、あらゆる病原体系統に対する部分抵抗性、及び垂直抵抗性、例えば、典型的には数個の遺伝子によって制御される、他の系統に対しては存在しない、一部の病原体系統に対する完全抵抗性も存在し得る。遺伝子対遺伝子レベルでは、植物と病原体とは共に進化し、一方の遺伝的変化が他方の変化と均衡する。従って、育種家は自然変異性を用いて、収穫量、品質、均一性、耐寒性、抵抗性に関して最も有用な遺伝子をかけ合わせる。抵抗性遺伝子の供給源には、天然又は外来品種、在来品種、野生植物の近縁種、及び誘発突然変異（例えば突然変異誘発物質による植物材料の処理）が含まれる。本発明を用いることで、突然変異を誘発する新規の手段が植物育種家に提供される。従って、当業者は抵抗性遺伝子の供給源のゲノムを分析し、且つ所望の特性又は形質を有する品種において本発明を用いることにより、これまでの突然変異誘発物質より高い精度で抵抗性遺伝子の産生を誘発し、ひいては植物育種プログラムを加速させ、及び改善することができる。
【０９７８】
改良された植物及び酵母細胞
本発明はまた、本明細書に提供される方法によって得ることのできる及びそれによって得られた植物及び酵母細胞も提供する。本明細書に記載される方法によって得られた改良植物は、例えば、植物害虫、除草剤、乾燥、低温又は高温、過剰な水等に対する耐性を確実にする遺伝子の発現により、食品又は飼料製造において有用となり得る。
【０９７９】
本明細書に記載される方法によって得られた改良植物、特に作物及び藻類は、例えば、通常野生型に見られるであろうよりも高いタンパク質、炭水化物、栄養素又はビタミンレベルの発現により、食品又は飼料製造において有用となり得る。この点で、改良植物、特に豆類及び塊茎が好ましい。
【０９８０】
改良藻類又はセイヨウアブラナなどの他の植物は、例えばアルコール類（特にメタノール及びエタノール）など、植物油又はバイオ燃料の生成において特に有用であり得る。これらは、油又はバイオ燃料産業で使用される高レベルの油又はアルコールを発現又は過剰発現するようにエンジニアリングされ得る。
【０９８１】
本発明はまた、植物の改良された一部分も提供する。植物部位としては、限定はされないが、葉、茎、根、塊茎、種子、胚乳、胚珠、及び花粉が挙げられる。本明細書において想定されるとおりの植物部位は、生育可能、生育不能、再生可能、及び／又は再生不能であってもよい。
【０９８２】
また、本明細書では、本発明の方法によって作成された植物細胞及び植物を提供することも包含される。従来の育種方法によって作製された、遺伝子改変を含む植物の配偶子、種子、胚（接合胚であれ又は体細胞胚であれ）、子孫又は雑種もまた、本発明の範囲内に含まれる。かかる植物は、標的配列に挿入されるか又はそれの代わりに挿入された異種又は外来性ＤＮＡ配列を含有し得る。或いは、かかる植物は、１つ以上のヌクレオチドに、ある変化（突然変異、欠失、挿入、置換）のみを含有し得る。そのため、かかる植物はその前駆植物と特定の改変の存在だけが異なるに過ぎないことになる。
【０９８３】
従って、本発明は、本方法によって作製される植物、動物又は細胞、又はそれらの子孫を提供する。子孫は、作製された植物又は動物のクローンであってもよく、又は更に望ましい形質をその子孫に遺伝子移入させるため同じ種の他の個体と交配させることによる有性生殖から生じてもよい。細胞は、多細胞生物、特に動物又は植物の場合にインビボ又はエキソビボであってよい。
【０９８４】
Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質複合体は非ヒト生物／動物において使用することができる
ある態様において、本発明は、記載される実施形態のいずれかに係る真核生物宿主細胞を含む非ヒト真核生物；好ましくは多細胞真核生物を提供する。他の態様において、本発明は、記載される実施形態のいずれかに係る真核生物宿主細胞を含む真核生物；好ましくは多細胞真核生物を提供する。これらの態様の一部の実施形態における生物は、動物；例えば哺乳類であってもよい。また、生物は、昆虫などの節足動物であってもよい。生物はまた、植物であってもよい。更に、生物は真菌であってもよい。
【０９８５】
本発明はまた、例えば家畜及び生産動物など、他の農業適用にも関し得る。例えば、ブタは、それを特に再生医学における生物医学モデルとして魅力的なものにする多くの特徴を備えている。詳細には、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）のブタが、再生医学、異種移植（本明細書のいずれかにもまた記載される）、及び腫瘍発生の有用なモデルを提供し得るとともに、ヒトＳＣＩＤ患者に対する治療薬の開発の助けとなり得る。Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．、（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１４  Ｍａｙ  ２０；１１１（２０）：７２６０−５）はレポーター−ガイド下転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）系を利用して、両方の対立遺伝子に影響を及ぼすものを含め、高効率で体細胞に組換え活性化遺伝子（ＲＡＧ）２の標的改変を作成した。Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質を同様の系に適用し得る。
【０９８６】
Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１４  Ｍａｙ  ２０；１１１（２０）：７２６０−５）の方法は、以下のとおり類似的に本発明に適用し得る。胎児線維芽細胞におけるＲＡＧ２の標的改変と、それに続くＳＣＮＴ及び胚移植によって突然変異ブタを作製する。ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ及びレポーターをコードする構築物を胎児由来の線維芽細胞に電気穿孔処理する。４８時間後、緑色蛍光タンパク質を発現するトランスフェクト細胞を９６ウェルプレートの個々のウェル中に１ウェル当たり推定希釈の単一細胞で保存する。ＲＡＧ２の標的改変は、任意のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ切断部位に隣接するゲノムＤＮＡ断片を増幅し、続いてＰＣＲ産物をシーケンシングすることによりスクリーニングする。スクリーニングし、オフサイト突然変異がないことを確認した後、ＲＡＧ２の標的改変を有している細胞をＳＣＮＴに使用する。極体を卵母細胞の隣接細胞質の一部分（恐らく第二分裂中期の中期板を含有する）と共に除去し、及びドナー細胞を卵黄周囲に置く。次に再構成された胚を電気穿孔処理してドナー細胞を卵母細胞と融合させ、次に化学的に活性化させる。活性化した胚を０．５μＭスクリプタイド（Ｓ７８１７；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）含有ブタ接合子培地３（ＰＺＭ３）中で１４〜１６時間インキュベートする。次に胚を洗浄してスクリプタイドを除去し、胚が代理母ブタの卵管に移されるまでＰＺＭ３中で培養する。
【０９８７】
本発明はまた、雌ウシなどの他の動物のＳＮＰの改変にも適用可能である。Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１３  Ｏｃｔ  ８；１１０（４１）：１６５２６−１６５３１）は、プラスミド、ｒＡＡＶ、及びオリゴヌクレオチド鋳型を使用した転写アクチベーター様（ＴＡＬ）エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）刺激性及びクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９刺激性相同依存性修復（ＨＤＲ）を含むように家畜遺伝子編集ツールボックスを展開した。遺伝子特異的ｇＲＮＡ配列が彼らの方法によってＣｈｕｒｃｈ  ｌａｂ  ｇＲＮＡベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＩＤ：４１８２４）にクローニングされた（Ｍａｌｉ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）「Ｃａｓ９によるＲＮＡガイド下ヒトゲノムエンジニアリング（ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｖｉａ  Ｃａｓ９）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９（６１２１）：８２３−８２６）。ｈＣａｓ９プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＩＤ：４１８１５）又はＲＣＩＳｃｒｉｐｔ−ｈＣａｓ９から合成されたｍＲＮＡのいずれかのコトランスフェクションによってＣａｓ９ヌクレアーゼが提供された。このＲＣＩＳｃｒｉｐｔ−ｈＣａｓ９は、ｈＣａｓ９プラスミド（ｈＣａｓ９  ｃＤＮＡを包含する）からＲＣＩＳｃｒｉｐｔプラスミドにＸｂａＩ−ＡｇｅＩ断片をサブクローニングすることにより構築された。
【０９８８】
Ｈｅｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．２０１５  Ｆｅｂ  １；２４（３）：３９３−４０２．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｓｃｄ．２０１４．０２７８．Ｅｐｕｂ  ２０１４  Ｎｏｖ  ３）は、ウシ多能性細胞及びクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９ヌクレアーゼを用いたウシゲノムにおける極めて効率的な遺伝子ターゲティングを報告した。第一に、Ｈｅｏ  ｅｔ  ａｌ．はウシ体細胞線維芽細胞から山中因子の異所性発現並びにＧＳＫ３β及びＭＥＫ阻害因子（２ｉ）処理によって人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作成した。Ｈｅｏ  ｅｔ  ａｌ．は、これらのウシｉＰＳＣが遺伝子発現及び奇形腫発生可能性の点でナイーブ多能性幹細胞に極めて類似していることを観察した。更に、ウシＮＡＮＯＧ遺伝子座に特異的なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、ウシｉＰＳＣ及び胚においてウシゲノムの極めて効率的な編集を示した。
【０９８９】
Ｉｇｅｎｉｔｙ（登録商標）は、屠体組成、屠体品質、母系及び繁殖形質並びに平均１日増体量など、経済的重要性のある経済的形質の形質を実施し及び伝達するための、雌ウシなどの動物のプロファイル解析を提供している。網羅的Ｉｇｅｎｉｔｙ（登録商標）プロファイルの解析は、ＤＮＡマーカー（ほとんどの場合一塩基変異多型又はＳＮＰ）の発見から始まる。Ｉｇｅｎｉｔｙ（登録商標）プロファイルの背後にあるマーカーは全て、大学、研究組織、及びＵＳＤＡなどの政府機関を含めた研究機関の独立した科学者らによって発見された。次にバリデートされた集団においてＩｇｅｎｉｔｙ（登録商標）でマーカーが解析される。Ｉｇｅｎｉｔｙ（登録商標）は、様々な作製環境及び生物学的タイプを代表する複数のリソース集団を使用し、一般に入手可能でない表現型を収集するため牛肉産業のシードストック、雌ウシ−仔ウシ、フィードロット及び／又はパッキングセグメントからの工業的パートナーと協働することも多い。ウシゲノムデータベースは広く利用可能であり、例えば、ＮＡＧＲＰウシゲノムコーディネーションプログラム（Ｃａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｎｉｍａｌｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／ｃａｔｔｌｅ／ｍａｐｓ／ｄｂ．ｈｔｍｌ）を参照のこと。従って、本発明は、ウシＳＮＰの標的化に適用し得る。当業者は、例えば、Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．又はＨｅｏ  ｅｔ  ａｌ．によるとおり、上記のプロトコルをＳＮＰの標的化に利用して、及びそれらをウシＳＮＰに適用し得る。
【０９９０】
Ｑｉｎｇｊｉａｎ  Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅ  Ａｃｃｅｓｓ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ｏｃｔｏｂｅｒ  １２，２０１５）は、イヌミオスタチン（ＭＳＴＮ）遺伝子（骨格筋量の負の調節因子）の第１のエクソンを標的化することによりイヌにおける筋量の増加を実証した。第一に、ＭＳＴＮを標的化するｓｇＲＮＡをＣａｓ９ベクターと共にイヌ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）にコトランスフェクトすることを用いてｓｇＲＮＡの効率が検証された。その後、正常な形態の胚にＣａｓ９  ｍＲＮＡとＭＳＴＮ  ｓｇＲＮＡとの混合物をマイクロインジェクションし、及び接合子を同じ雌イヌの卵管に自家移植することにより、ＭＳＴＮ  ＫＯイヌが作成された。ノックアウト仔イヌはその野生型同腹姉妹と比較して大腿上に明らかな筋肉表現型を示した。これはまた、本明細書に提供されるＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系を用いて実施することもできる。
【０９９１】
家畜−ブタ
家畜におけるウイルス標的には、一部の実施形態において、例えばブタマクロファージ上のブタＣＤ１６３が含まれ得る。ＣＤ１６３は、ＰＲＲＳｖ（アルテリウイルスであるブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス）による感染に関連する（ウイルスの細胞への侵入を介すると考えられている）。ＰＲＲＳｖが特にブタ肺胞マクロファージ（肺に見られる）に感染すると、飼育ブタの生殖障害、体重減少及び高死亡率を含めた被害をもたらす、以前は不治であったブタ症候群（「ミステリーブタ病」又は「青耳病」）が引き起こされる。マクロファージ活性が失われることによる免疫不全に起因して、流行性肺炎、髄膜炎及び耳浮腫などの日和見感染症が見られることが多い。また、抗生物質の使用増加及び金銭的損失に起因して、経済的及び環境的影響も大きい（毎年推定６億６千万ドル）。
【０９９２】
Ｇｅｎｕｓ  Ｐｌｃと共同でミズーリ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）のＫｒｉｓｔｉｎ  Ｍ  Ｗｈｉｔｗｏｒｔｈ及びＤｒ  Ｒａｎｄａｌｌ  Ｐｒａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ３４３４  オンライン発行  ０７  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２０１５）によって報告されるとおり、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を用いてＣＤ１６３が標的化されており、編集されたブタの子孫はＰＲＲＳｖへの曝露時に抵抗性であった。１匹のファウンダー雄及び１匹のファウンダー雌（両方ともにＣＤ１６３のエクソン７に突然変異を有した）を繁殖させて子孫が作製された。ファウンダー雄は一方の対立遺伝子上のエクソン７に１１ｂｐの欠失を有したが、これはフレームシフト突然変異及びドメイン５のアミノ酸４５におけるミスセンス翻訳及びアミノ酸６４の続く未成熟終止コドンをもたらす。他方の対立遺伝子はエクソン７に２ｂｐの付加及び先行するイントロンに３７７ｂｐの欠失を有したが、これらはドメイン５の初めの４９アミノ酸の発現と、続くアミノ酸８５の未成熟終止コードをもたらすと予想された。雌ブタは一方の対立遺伝子に７ｂｐの付加を有し、これにより翻訳時にドメイン５の初めの４８アミノ酸が発現し、それにアミノ酸７０の未成熟終止コドンが続くと予想された。雌ブタの他方の対立遺伝子は増幅不能であった。選択された子孫はヌル動物（ＣＤ１６３−／−）、即ちＣＤ１６３ノックアウトであると予想された。
【０９９３】
従って、一部の実施形態において、ブタ肺胞マクロファージがＣＲＩＳＰＲタンパク質によって標的化され得る。一部の実施形態において、ブタＣＤ１６３がＣＲＩＳＰＲタンパク質によって標的化され得る。一部の実施形態において、ブタＣＤ１６３は、ＤＳＢの誘導によるか、又は上記に記載されるものの１つ以上を含め、例えばエクソン７の欠失若しくは改変を標的化するなど、挿入若しくは欠失によるか、又は遺伝子の他の領域における、例えばエクソン５の欠失又は改変によりノックアウトされ得る。
【０９９４】
編集されたブタ及びその子孫、例えばＣＤ１６３ノックアウトブタもまた想定される。これは、家畜、育種又はモデル化目的（即ちブタモデル）であり得る。遺伝子ノックアウトを含む精液もまた提供される。
【０９９５】
ＣＤ１６３は、スカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）スーパーファミリーのメンバーである。インビトロ研究に基づけば、このタンパク質のＳＲＣＲドメイン５は、ウイルスゲノムのアンパッケージング及び放出に関与するドメインである。そのため、ＳＲＣＲスーパーファミリーの他のメンバーもまた、他のウイルスに対する抵抗性を評価するため標的化され得る。ＰＲＲＳＶはまた、哺乳類アルテリウイルス群（これにはマウス乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス、サル出血熱ウイルス及びウマ動脈炎ウイルスもまた含まれる）のメンバーである。アルテリウイルスは、マクロファージ向性及び重症疾患及び持続感染の両方を引き起こす能力を含め、重要な病因特性を共有する。従って、アルテリウイルス、及び詳細にはマウス乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス、サル出血熱ウイルス及びウマ動脈炎ウイルスが、例えばブタＣＤ１６３又は他の種、及びマウス、サル及びウマモデルにおけるそのホモログを介して標的化されてもよく、及びノックアウトもまた提供される。
【０９９６】
実際、この手法は、インフルエンザＣ型並びにＨ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ２Ｎ１、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、及びＨ２Ｎ３として知られるインフルエンザＡ型のサブタイプを含むブタインフルエンザウイルス（ＳＩＶ）株など、ヒトに伝染し得る他の家畜疾患並びに上述の肺炎、髄膜炎及び浮腫を引き起こすウイルス又は細菌にまで拡張し得る。
【０９９７】
ＲＮＡガイド下Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質複合体による治療的ターゲティング
明らかなとおり、本系を用いていかなる目的のポリヌクレオチド配列も標的化し得ることが想定される。本発明は、標的細胞をインビボ、エキソビボ又はインビトロで改変するために用いられる、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、又は前記組成物の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、又は前記組成物の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含むベクター若しくは送達系を提供し、及び改変後はＣＲＩＳＰＲにより改変された細胞の子孫又は細胞株が変化した表現型を保持するように細胞を変化させる形で行われ得る。改変された細胞及び子孫は、ＣＲＩＳＰＲ系が所望の細胞型にエキソビボ又はインビボ適用された植物又は動物などの多細胞生物の一部であり得る。本ＣＲＩＳＰＲ発明は、療法的治療方法であり得る。療法的治療方法には、遺伝子又はゲノム編集、又は遺伝子療法が含まれ得る。
【０９９８】
細菌、真菌及び寄生虫病原体などの病原体の治療
本発明はまた、細菌、真菌及び寄生虫病原体の治療にも適用され得る。大部分の研究が新規抗生物質の開発に注力しているが、それにも関わらず、新規抗生物質は、開発後は同じ薬剤耐性問題に曝される。本発明は、それらの難題を解消する新規ＣＲＩＳＰＲベースの代替案を提供する。更に、既存の抗生物質と異なり、ＣＲＩＳＰＲベースの治療は病原体特異的なものとすることができ、有益な細菌を回避しながらも標的病原体の細菌細胞死を誘導し得る。
【０９９９】
Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を使用した細菌ゲノムのＲＮＡガイド下編集（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ）」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．３１，ｐ．２３３−９，Ｍａｒｃｈ  ２０１３）は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を用いて肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を突然変異させ又は死滅させた。ゲノムに正確な突然変異を導入したこの研究は、標的ゲノム部位におけるデュアルＲＮＡ：Ｃａｓ９が導く切断によって非突然変異細胞を死滅させることに頼り、及び選択可能マーカー又は対抗選択系の必要性を回避するものである。ＣＲＩＳＰＲ系を用いて抗生物質耐性を逆転させ、株間での抵抗性の移し替えをなくすことが行われている。Ｂｉｃｋａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．は、ビルレンス遺伝子を標的化するように再プログラム化されたＣａｓ９が、毒性のある、しかし無毒性ではない黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を死滅させることを示した。ヌクレアーゼが抗生物質耐性遺伝子を標的化するように再プログラム化すると、抗生物質耐性遺伝子を含むブドウ球菌プラスミドが破壊され、プラスミドが運ぶ抵抗性遺伝子の広がりに対して免疫された（Ｂｉｋａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓヌクレアーゼを利用した配列特異的抗菌薬の作製（Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｔｏ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｓ）」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．３２，１１４６−１１５０，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３０４３，オンライン発行  ０５  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０１４を参照）。Ｂｉｋａｒｄは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９抗菌薬がマウス皮膚コロニー形成モデルにおいてインビボで黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を死滅させるように機能することを示した。同様に、Ｙｏｓｅｆ  ｅｔ  ａｌがＣＲＩＳＰＲ系を用いて、β−ラクタム抗生物質に対する抵抗性を付与する酵素をコードする遺伝子を標的化した（Ｙｏｕｓｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，「抗生物質抵抗性細菌を感作させて死滅させるようにプログラム化した溶原及び溶菌バクテリオファージ（Ｔｅｍｐｅｒａｔｅ  ａｎｄ  ｌｙｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｔｏ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅ  ａｎｄ  ｋｉｌｌ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ）」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．１１２，ｐ．７２６７−７２７２，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１５００１０７１１２  オンライン発行  Ｍａｙ  １８，２０１５を参照）。
【１０００】
ＣＲＩＳＰＲ系を用いて他の遺伝学的手法に抵抗性の寄生虫のゲノムを編集することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系は、ヨーエリマラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ）ゲノムに二本鎖切断を導入することが示された（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を用いたマラリア寄生虫ゲノムの効率的編集（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｅｄｉｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｍａｌａｒｉａ  Ｐａｒａｓｉｔｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  Ｓｙｓｔｅｍ）」，ｍＢｉｏ．ｖｏｌ．５，ｅ０１４１４−１４，Ｊｕｌ−Ａｕｇ  ２０１４を参照）。Ｇｈｏｒｂａｌ  ｅｔ  ａｌ．（「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を用いたヒトマラリア寄生虫、熱帯熱マラリア原虫におけるゲノム編集（Ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｍａｌａｒｉａ  ｐａｒａｓｉｔｅ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍ）」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３２，ｐ．８１９−８２１，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２９２５，オンライン発行  Ｊｕｎｅ  １，２０１４）は、２つの遺伝子、ｏｒｃ１及びｋｅｌｃｈ１３（それぞれ遺伝子サイレンシング及びアルテミシニンに対する抵抗性の出現において推定上の役割を有する）の配列を改変した。改変に関して直接的な選択はなかったにも関わらず、適切な部位で変化した寄生虫は極めて高い効率で回復したことから、このシステムを用いて中立突然変異又は更には有害突然変異を生成し得ることが示唆される。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９はまた、トキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）を含めた他の病原性寄生虫のゲノムの改変にも用いられる（Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，「種々のトキソプラズマ原虫株における効率的な遺伝子破壊（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ  ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９）」，ｍＢｉｏ  ｖｏｌ．５：ｅ０１１１４−１４，２０１４；及びＳｉｄｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用したトキソプラズマ原虫の効率的なゲノムエンジニアリング（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ  Ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）」，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ｖｏｌ．９，ｅ１００４５０，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１００４５０，オンライン発行  Ｊｕｎｅ  ２７，２０１４を参照）。
【１００１】
Ｖｙａｓ  ｅｔ  ａｌ．（「カンジダ・アルビカンスＣＲＩＳＰＲ系が必須遺伝子及び遺伝子ファミリーの遺伝子工学を可能にする（Ａ  Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ＣＲＩＳＰＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ｐｅｒｍｉｔｓ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｉｅｓ）」，Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｄｖａｎｃｅｓ，ｖｏｌ．１，ｅ１５００２４８，ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉａｄｖ．１５００２４８，Ａｐｒｉｌ  ３，２０１５）は、ＣＲＩＳＰＲ系を用いてＣ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）における遺伝子工学の長年の障害を解消したとともに、単一の実験で幾つかの異なる遺伝子の両方のコピーを効率的に突然変異させる。幾つかの機構が薬剤耐性に寄与する生物において、Ｖｙａｓは、親の臨床分離株Ｃａｎ９０が示すフルコナゾール又はシクロヘキシミドに対する超抵抗性をもはや示さないホモ接合二重突然変異体を作製した。Ｖｙａｓはまた、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）の必須遺伝子に条件的対立遺伝子を作り出すことによりホモ接合機能喪失型突然変異も得た。リボソームＲＮＡプロセシングに必要なＤＣＲ１のヌル対立遺伝子は、低温で致死性であるが、高温では生存可能である。Ｖｙａｓはナンセンス突然変異を導入する修復鋳型を使用し、１６℃で成長できないｄｃｒ１／ｄｃｒ１突然変異体を単離した。
【１００２】
染色体座を破壊することにより熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）に用いられる本発明のＣＲＩＳＰＲ系。Ｇｈｏｒｂａｌ  ｅｔ  ａｌ．（「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を用いたヒトマラリア寄生虫、熱帯熱マラリア原虫におけるゲノム編集（Ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｍａｌａｒｉａ  ｐａｒａｓｉｔｅ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍ）」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３２，８１９−８２１（２０１４），ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２９２５，Ｊｕｎｅ  １，２０１４）は、ＣＲＩＳＰＲ系を用いてマラリアゲノムに特異的遺伝子ノックアウト及び単一ヌクレオチド置換を導入した。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）に適合させるため、Ｇｈｏｒｂａｌ  ｅｔ  ａｌ．は、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＰｆＤＨＯＤＨ）阻害因子であるＤＳＭ１に対する抵抗性を付与する薬物選択可能マーカーｙｄｈｏｄｈもまた有するｐＵＦ１−Ｃａｓ９エピソームにおいてマラリア原虫の（ｐｌａｓｍｏｉｄａｌ）調節エレメントの制御下となるように発現ベクターを作成し、及びｓｇＲＮＡの転写用に、ガイドＲＮＡ及び相同組換え修復用のドナーＤＮＡ鋳型を同じプラスミド、ｐＬ７上に置いて熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）Ｕ６核内低分子（ｓｎ）ＲＮＡ調節エレメントを使用した。また、Ｚｈａｎｇ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を用いたマラリア寄生虫ゲノムの効率的編集（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｏｆ  ｍａｌａｒｉａ  ｐａｒａｓｉｔｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍ）」，ＭＢｉｏ，２０１４  Ｊｕｌ  １；５（４）：Ｅ０１４１４−１４，ｄｏｉ：１０．１１２８／ＭｂＩＯ．０１４１４−１４）及びＷａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（「熱帯熱マラリア原虫における効率的なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介性ゲノム編集（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １１，９１５−９１８（２０１４），ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．３０６３）も参照のこと。
【１００３】
ＨＩＶ等のウイルス性病原体などの病原体の治療
Ｃａｓ媒介性ゲノム編集を用いれば、体細胞組織に保護突然変異を導入して非遺伝的疾患又は複合疾患と闘うことができる。例えば、リンパ球におけるＣＣＲ５受容体のＮＨＥＪ媒介性不活性化（Ｌｏｍｂａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７  Ｎｏｖ；２５（１１）：１２９８−３０６）は、ＨＩＶ感染を回避するのに実行可能な戦略であり得る一方、ＰＣＳＫ９（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２００５  Ｆｅｂ；３７（２）：１６１−５）又はアンジオポエチン（Ｍｕｓｕｎｕｒｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２０１０  Ｄｅｃ  ２；３６３（２３）：２２２０−７）を欠失させると、スタチン抵抗性高コレステロール血症又は高脂血症に対する治療効果がもたらされ得る。これらの標的はまた、ｓｉＲＮＡ媒介性タンパク質ノックダウンを用いても対処し得るが、ＮＨＥＪ媒介性遺伝子不活性化のユニークな利点は、治療を継続する必要なしに永久的な治療利益を実現する能力である。全ての遺伝子療法と同様に、当然ながら、各提案される治療使用が有利なリスク・ベネフィット比を有するよう確立することが重要となり得る。
【１００４】
Ｃａｓ９及びガイドＲＮＡをコードするプラスミドＤＮＡを修復鋳型と共に成体マウスチロシン血症モデルの肝臓にハイドロダイナミクス送達すると、２５０個中約１個の細胞での突然変異Ｆａｈ遺伝子の修正、及び野生型Ｆａｈタンパク質の発現のレスキューが可能であることが示された（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４  Ｊｕｎ；３２（６）：５５１−３）。加えて、臨床試験では、ＺＦヌクレアーゼを用いてＣＣＲ５受容体のエキソビボノックアウトによりＨＩＶ感染に対抗することに成功した。全ての患者においてＨＩＶ  ＤＮＡレベルが減少し、４人中１人の患者でＨＩＶ  ＲＮＡが検出不能になった（Ｔｅｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２０１４  Ｍａｒ  ６；３７０（１０）：９０１−１０）。これらの結果はいずれも、新規治療プラットフォームとしてのプログラム可能なヌクレアーゼの有望さを実証している。
【１００５】
別の実施形態において、ＨＩＶ  ｔａｔ／ｒｅｖが共有する共通エクソンを標的化するｓｉＲＮＡ、核小体局在ＴＡＲデコイ、及び抗ＣＣＲ５特異的ハンマーヘッド型リボザイムを含む自己不活性化レンチウイルスベクター（例えば、ＤｉＧｉｕｓｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ２：３６ｒａ４３を参照）を本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に使用し及び／又は適合させてもよい。患者の体重１キログラム当たり最低でも２．５×１０６個のＣＤ３４＋細胞を収集し、２μｍｏｌ／Ｌ−グルタミン、幹細胞因子（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）（１００ｎｇ／ｍｌ）、及びトロンボポエチン（１０ｎｇ／ｍｌ）（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）を含有するＸ−ＶＩＶＯ  １５培地（Ｌｏｎｚａ）中において２×１０６細胞／ｍｌの密度で１６〜２０時間予備刺激し得る。フィブロネクチン（２５ｍｇ／ｃｍ２）（ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ，Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．）で被覆された７５ｃｍ２組織培養フラスコにおいて、予備刺激した細胞をレンチウイルスによって感染多重度５で１６〜２４時間形質導入し得る。
【１００６】
当該技術分野における知識及び本開示の教示を用いて、当業者は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳなどの免疫不全症条件に関してＨＳＣを修正することができ、ＣＣＲ５を標的化してノックアウトするＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系にＨＳＣを接触させるステップを含む。ＣＣＲ５−及び−Ｃｐｆ１タンパク質を含有する粒子を標的化してノックアウトするガイドＲＮＡ（及び有利にはデュアルガイド手法、例えば異なるガイドＲＮＡのペア；例えば、初代ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞及びＣＤ３４＋造血幹及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）において２つの臨床的に関連する遺伝子、Ｂ２Ｍ及びＣＣＲ５を標的化するガイドＲＮＡ）をＨＳＣに接触させる。このように接触させた細胞は投与し；及び任意選択で処理／拡大することができる；Ｃａｒｔｉｅｒを参照。また、Ｋｉｅｍ，「ＨＩＶ疾患の造血幹細胞ベースの遺伝子療法（Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ＨＩＶ  ｄｉｓｅａｓｅ）」，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．Ｆｅｂ  ３，２０１２；１０（２）：１３７−１４７（それが引用する文献と共に参照により本明細書に援用される）；Ｍａｎｄａｌ  ｅｔ  ａｌ，「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いたヒト造血幹及びエフェクター細胞における遺伝子の効率的なアブレーション（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ａｂｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  ａｎｄ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）」，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌｕｍｅ  １５，Ｉｓｓｕｅ  ５，ｐ６４３−６５２，６  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２０１４（それが引用する文献と共に参照により本明細書に援用される）も参照のこと。また、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系を用いてＨＩＶ／ＡＩＤＳに対抗する別の手段として、Ｅｂｉｎａ，「ＨＩＶ−１組込みプロウイルスＤＮＡを編集することによりＨＩＶ−１発現を抑制するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｏ  ｓｕｐｐｒｅｓｓ  ＨＩＶ−１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ＨＩＶ−１  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｐｒｏｖｉｒａｌ  ＤＮＡ）」ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ  ＲＥＰＯＲＴＳ｜３：２５１０｜ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ０２５１０（それが引用する文献と共に参照により本明細書に援用される）も挙げられる。
【１００７】
ＨＩＶ治療のためのゲノム編集の論理的根拠は、ウイルスに対する細胞共受容体であるＣＣＲ５における機能喪失突然変異がホモ接合の個体は感染に対して極めて高い抵抗性を示すとともにその他健康であり、ゲノム編集でこの突然変異を模倣することが安全且つ有効な治療ストラテジーであり得ることが示唆されるという観察に由来する［Ｌｉｕ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ８６，３６７−３７７（１９９６）］。この考えは、ＨＩＶ感染患者が機能喪失型ＣＣＲ５突然変異に関してホモ接合のドナーから同種骨髄移植を受けたとき、検出不能なレベルのＨＩＶ及び正常なＣＤ４  Ｔ−細胞数の回復がもたらされたことにより、臨床的に妥当性が確認された［Ｈｕｔｔｅｒ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３６０，６９２−６９８（２００９）］。骨髄移植は、費用がかかること及び移植片対宿主病の可能性があることから、多くのＨＩＶ患者にとって現実的な治療ストラテジーではないが、患者自身のＴ細胞をＣＣＲ５に変換するＨＩＶ治療薬は望ましい。
【１００８】
ヒト化マウスＨＩＶモデルにおいてＺＦＮ及びＮＨＥＪを用いてＣＣＲ５をノックアウトする初期の研究から、ＣＣＲ５編集ＣＤ４  Ｔ細胞を移植するとウイルス負荷及びＣＤ４  Ｔ細胞数が改善することが示された［Ｐｅｒｅｚ，Ｅ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６，８０８−８１６（２００８）］。重要なことに、これらのモデルはまた、ＨＩＶ感染がＣＣＲ５ヌル細胞に関する選択をもたらしたことも示したことから、編集によって適応度優位性が付与され、且つ潜在的に少数の編集細胞が治療効果を生み出すことが可能になることが示唆される。
【１００９】
この及び他の有望な前臨床試験の結果として、患者Ｔ細胞のＣＣＲ５をノックアウトするゲノム編集療法が現在ヒトで試験されている［Ｈｏｌｔ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８，８３９−８４７（２０１０）；Ｌｉ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２１，１２５９−１２６９（２０１３）］。最近の第Ｉ相臨床試験では、ＨＩＶ患者からＣＤ４＋  Ｔ細胞が取り出され、ＣＣＲ５遺伝子をノックアウトするように設計されたＺＦＮで編集されて、自家移植で患者に戻された［Ｔｅｂａｓ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３７０，９０１−９１０（２０１４）］。
【１０１０】
別の試験では（Ｍａｎｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌｕｍｅ  １５，Ｉｓｓｕｅ  ５，ｐ６４３−６５２，６  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２０１４）、ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞及びＣＤ３４＋造血幹及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）において２つの臨床的に関連性のある遺伝子、Ｂ２Ｍ及びＣＣＲ５がＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９によって標的化されている。シングルＲＮＡガイドを使用すると、ＨＳＰＣでは極めて高い効率の突然変異誘発が得られたが、Ｔ細胞では得られなかった。デュアルガイド手法では両方の細胞型で遺伝子欠失の有効性が向上した。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９によるゲノム編集が起こったＨＳＰＣは、多分化能を保持していた。ＨＳＰＣにおいて予想されたオンターゲット及びオフターゲット突然変異をターゲットキャプチャーシーケンシングによって調べたところ、僅か１つの部位にのみ低いレベルのオフターゲット突然変異誘発が観察された。これらの結果は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９が、オフターゲット突然変異誘発を最小限に抑えつつ、ＨＳＰＣにおいて効率的に遺伝子をアブレーションできることを実証しており、これは造血細胞ベースの治療法に幅広い適用性がある。
【１０１１】
Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１４  Ｄｅｃ  ２６；９（１２）：ｅ１１５９８７．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１１５９８７）は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）及びシングルガイド下ＲＮＡ（ガイドＲＮＡ）によって、Ｃａｓ９及びＣＣＲ５ガイドＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターでＣＣＲ５をサイレンシングした。Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．は、Ｃａｓ９及びＣＣＲ５ガイドＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターのＨＩＶ−１感受性ヒトＣＤ４＋細胞への１ラウンドの形質導入により、高頻度でＣＣＲ５遺伝子破壊が生じることを示した。ＣＣＲ５遺伝子が破壊された細胞は、伝播／ファウンダー（Ｔ／Ｆ）ＨＩＶ−１分離株を含め、Ｒ５向性ＨＩＶ−１に抵抗性であるのみならず、Ｒ５向性ＨＩＶ−１感染時にＣＣＲ５遺伝子が破壊されていない細胞に対して選択的優位性もまた有する。安定に形質導入された細胞では、形質導入の８４日後であっても、これらのＣＣＲ５ガイドＲＮＡと高度な相同性を示す潜在的なオフターゲット部位のゲノム突然変異はＴ７エンドヌクレアーゼＩアッセイにおいて検出されなかった。
【１０１２】
Ｆｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．２０１５  Ｊｕｌ  １；５：１０７７７．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ１０７７７）は、細胞内で一緒にスプライシングを起こして部位特異的ＤＮＡ切断が可能な機能タンパク質を形成する化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）タンパク質片を発現する２カセット系を同定した。Ｆｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．は、特異的ＣＲＩＳＰＲガイド鎖を用いて、ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞でのＨＢＢ及びＣＣＲ５遺伝子の切断におけるシングルＣａｓ９としての、及びＣａｓ９ニッカーゼ対としてのこの系の有効性を実証した。トランススプライシングを受けたＳｐＣａｓ９（ｔｓＳｐＣａｓ９）は、標準的なトランスフェクション用量で野生型ＳｐＣａｓ９（ｗｔＳｐＣａｓ９）と比較して約３５％のヌクレアーゼ活性を示したが、それより低い投与レベルでは実質的に活性が低下した。ｔｓＳｐＣａｓ９はｗｔＳｐＣａｓ９と比べてオープンリーディングフレーム長さが大幅に減少しているため、潜在的に、組織特異的プロモーター、多重化したガイドＲＮＡの発現、及びＳｐＣａｓ９とのエフェクタードメイン融合物を含むＡＡＶベクターへのより複雑でより長い遺伝因子のパッケージングが可能である。Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．２０１５  Ａｕｇ；９６（８）：２３８１−９３．ｄｏｉ：１０．１０９９／ｖｉｒ．０．０００１３９．Ｅｐｕｂ  ２０１５  Ａｐｒ  ８）は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９が細胞株におけるＣＣＲ５遺伝子座の編集を効率的に媒介することができ、細胞表面上のＣＣＲ５発現のノックアウトをもたらし得ることを実証した。次世代シーケンシングから、ＣＣＲ５の予想切断部位の周りに様々な突然変異が導入されたことが明らかになった。分析した３つの最も有効なガイドＲＮＡの各々について、１５個の上位スコアの潜在的な部位で有意なオフターゲット効果は検出されなかった。Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９構成成分を有するキメラＡｄ５Ｆ３５アデノウイルスを構築することにより、初代ＣＤ４＋  Ｔリンパ球を効率的に形質導入してＣＣＲ５発現を破壊しており、形質導入陽性細胞にはＨＩＶ−１抵抗性が付与された。
【１０１３】
当業者は、本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系によるＣＣＲ５の標的化について、例えば、Ｈｏｌｔ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８，８３９−８４７（２０１０）、Ｌｉ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２１，１２５９−１２６９（２０１３）、Ｍａｎｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌｕｍｅ  １５，Ｉｓｓｕｅ  ５，ｐ６４３−６５２，６  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２０１４、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１４  Ｄｅｃ  ２６；９（１２）：ｅ１１５９８７．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１１５９８７）、Ｆｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．２０１５  Ｊｕｌ  １；５：１０７７７．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ１０７７７）及びＬｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．２０１５  Ａｕｇ；９６（８）：２３８１−９３．ｄｏｉ：１０．１０９９／ｖｉｒ．０．０００１３９．Ｅｐｕｂ  ２０１５  Ａｐｒ  ８）の上記の研究を利用し得る。
【１０１４】
ＨＢＶ等のウイルス性病原体などの病原体の治療
本発明はまた、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の治療にも適用することができる。しかしながら、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系は、内因性低分子ＲＮＡ経路が過飽和（ｏｖｅｒｓａｔｒｉｎｇ）になるリスクなどのＲＮＡｉの欠点を回避するように、例えば用量及び配列を最適化するなどして適合させなければならない（例えば、Ｇｒｉｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｖｏｌ．４４１，２６  Ｍａｙ  ２００６を参照）。例えば、ヒト当たり約１〜１０×１０１４粒子などの低用量が企図される。別の実施形態において、ＨＢＶを標的とするＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系が、安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）などのリポソームで投与され得る（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．８，Ａｕｇｕｓｔ  ２００５を参照）。ＳＮＡＬＰ中約１、３又は５ｍｇ／ｋｇ／日の、ＨＢＶ  ＲＮＡに標的化されたＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓを毎日静脈内注射することが企図される。毎日の治療は約３日間にわたり、次に毎週、約５週間にわたり得る。別の実施形態において、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．のシステム（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２００７）１４，１１−１９）を本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系に使用し及び／又は適合させることができる。Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．は二本鎖アデノ随伴ウイルス８型偽型ベクター（ｄｓＡＡＶ２／８）を使用してｓｈＲＮＡを送達する。ＨＢＶ特異的ｓｈＲＮＡを担持するｄｓＡＡＶ２／８ベクターの単回投与（マウス当たり１×１０１２ベクターゲノム）が、ＨＢＶトランスジェニックマウスの肝臓における安定したレベルのＨＢＶタンパク質、ｍＲＮＡ及び複製ＤＮＡを有効に抑制し、循環中ＨＢＶ負荷の最大２〜３ｌｏｇ１０の低下がもたらされた。有意なＨＢＶ抑制はベクター投与後少なくとも１２０日間持続した。ｓｈＲＮＡの治療効果は配列依存的で、インターフェロンの活性化は伴わなかった。本発明には、ＨＢＶを指向するＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ  系をＡＡＶ２／８ベクターなどのＡＡＶベクターにクローニングし、例えばヒト当たり約１×１０１５ベクターゲノム〜約１×１０１６ベクターゲノムの投薬量でヒトに投与し得る。別の実施形態において、Ｗｏｏｄｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｖｏｌ．２１  ｎｏ．５，９７３−９８５  Ｍａｙ  ２０１３）を、本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系に使用し及び／又は適合させることができる。Ｗｏｏｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．は、肝細胞標的化Ｎ−アセチルガラクトサミンコンジュゲートメリチン様ペプチド（ＮＡＧ−ＭＬＰ）と、凝固第ＶＩＩ因子（Ｆ７）を標的化する肝臓向性コレステロールコンジュゲートｓｉＲＮＡ（ｃｈｏｌ−ｓｉＲＮＡ）との単純な共注入が、マウス及び非ヒト霊長類において臨床化学の変化又はサイトカインの誘導なしに効率的なＦ７ノックダウンをもたらすことを示す。Ｗｏｏｄｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．は、ＨＢＶ感染症の一過性のトランスジェニックマウスモデルを使用して、ＮＡＧ−ＭＬＰと、保存されたＨＢＶ配列を標的化する強力なｃｈｏｌ−ｓｉＲＮＡとの単回共注入が、ウイルスＲＮＡ、タンパク質、及びウイルスＤＮＡのマルチログ（ｍｕｌｔｉｌｏｇ）抑制をもたらし、効果が長時間にわたったこ���を示す。本発明には、例えば約６ｍｇ／ｋｇのＮＡＧ−ＭＬＰと６ｍｇ／ｋｇのＨＢＶ特異的ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓとの静脈内（ｉｎｔｒａｖｅｉｎｏｕｓ）共注入が想定され得る。代替例では、１日目に約３ｍｇ／ｋｇのＮＡＧ−ＭＬＰ及び３ｍｇ／ｋｇのＨＢＶ特異的ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓが送達され、続いて２週間後に約２〜３ｍｇ／ｋｇのＮＡＧ〜ＭＬＰ及び約２〜３ｍｇ／ｋｇのＨＢＶ特異的ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓが投与されてもよい。
【１０１５】
Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．２０１４  Ａｕｇ  １９；３：ｅ１８６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１４．３８）は、遺伝子型ＡのＨＢＶに対する８個のｇＲＮＡを設計した。ＨＢＶ特異的ｇＲＮＡを伴い、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系は、ＨＢＶ発現ベクターをトランスフェクトしたＨｕｈ−７細胞におけるＨＢＶコア及び表面タンパク質の産生を有意に低下させた。８個のスクリーニングしたｇＲＮＡの中で、２個の有効なものが同定された。保存されたＨＢＶ配列を標的化する１個のｇＲＮＡは、種々の遺伝子型に対して作用した。Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．は、ハイドロダイナミクス−ＨＢＶ持続マウスモデルを用いて、この系が肝内ＨＢＶゲノム含有プラスミドを切断し、且つインビボでのそのクリアランスを促進することにより、血清表面抗原レベルの低下が得られ得ることを更に実証した。これらのデータは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系がインビトロ及びインビボの両方でＨＢＶ発現鋳型を破壊し得ることを示唆しており、持続性ＨＢＶ感染の根絶におけるその潜在的能力が示される。
【１０１６】
Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．２０１５  Ｊｕｎ；１１８：１１０−７．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｎｔｉｖｉｒａｌ．２０１５．０３．０１５．Ｅｐｕｂ  ２０１５  Ａｐｒ  ３）は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を用いてＨＢＶゲノムを標的化し、ＨＢＶ感染を効率的に阻害した。Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．は、ＨＢＶの保存領域を標的化する４個のシングルガイドＲＮＡ（ガイドＲＮＡ）を合成した。これらのガイドＲＮＡをＣａｓ９と共に発現させると、Ｈｕｈ７細胞並びにＨＢＶ複製細胞ＨｅｐＧ２．２．１５でウイルス産生が低下した。Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．は、更に、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９が切断を導き、トランスフェクト細胞のＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡにおいて切断媒介性突然変異誘発が起こったことを実証した。ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを有するマウスモデルでは、ガイドＲＮＡ−Ｃａｓ９プラスミドを急速尾静脈注射すると、ｃｃｃＤＮＡ及びＨＢＶタンパク質レベルが低下した。
【１０１７】
Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．２０１５  Ａｕｇ；９６（８）：２２５２−６１．ｄｏｉ：１０．１０９９／ｖｉｒ．０．０００１５９．Ｅｐｕｂ  ２０１５  Ａｐｒ  ２２）は、種々のＨＢＶ遺伝子型の保存領域を標的化する８個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を設計し、これらはインビトロ及びインビボの両方でＨＢＶ複製を有意に阻害することができ、それによりＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を用いてＨＢＶ  ＤＮＡ鋳型を破壊する可能性が調査された。ＨＢＶ特異的ｇＲＮＡ／Ｃｐｆ１系は細胞における種々の遺伝子型のＨＢＶの複製を阻害することができたとともに、単一のｇＲＮＡ／Ｃｐｆ１系によってウイルスＤＮＡが有意に低下し、種々のｇＲＮＡ／Ｃｐｆ１系の組み合わせによって除去された。
【１０１８】
Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２０１５  Ａｕｇ  ２８；２１（３２）：９５５４−６５．ｄｏｉ：１０．３７４８／ｗｊｇ．ｖ２１．ｉ３２．９５５４）は、遺伝子型Ａ〜ＤのＨＢＶに対する１５個のｇＲＮＡを設計した。ＨＢＶの調節領域を網羅する２つの上記のｇＲＮＡの１１個の組み合わせ（デュアルｇＲＮＡ）が選択された。培養上清中のＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）又はｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）を計測することにより、ＨＢＶ（遺伝子型Ａ〜Ｄ）複製の抑制に対する各ｇＲＮＡ及び１１個のデュアルｇＲＮＡの効率が調べられた。デュアルｇＲＮＡ及びＨＢＶ発現ベクターをコトランスフェクトしたＨｕＨ７細胞においてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びシーケンシング方法を用いてＨＢＶ発現ベクターの破壊が調べられ、及びＨｅｐＡＤ３８細胞においてＫＣｌ沈殿、プラスミドセーフＡＴＰ依存性ＤＮアーゼ（ＰＳＡＤ）消化、ローリングサークル増幅及び定量ＰＣＲの組み合わせ方法を用いてｃｃｃＤＮＡの破壊が調べられた。これらのｇＲＮＡの細胞傷害性は、ミトコンドリアテトラゾリウムアッセイによって評価された。ｇＲＮＡは全て、培養上清中のＨＢｓＡｇ又はＨＢｅＡｇ産生を有意に低下させることができ、この産生はｇＲＮＡの対象領域に依存した。デュアルｇＲＮＡは全て、遺伝子型Ａ〜ＤのＨＢＶについてＨＢｓＡｇ及び／又はＨＢｅＡｇ産生を効率的に抑制することができ、及びＨＢｓＡｇ及び／又はＨＢｅＡｇ産生の抑制におけるデュアルｇＲＮＡの有効性が、シングルｇＲＮＡの単独使用と比較したとき有意に増加した。更に、この出願人らは、ＰＣＲダイレクトシーケンシングによって、これらのデュアルｇＲＮＡが使用した２つのｇＲＮＡの切断部位間の断片を除去することによりＨＢＶ発現鋳型を特異的に破壊可能であったことを確認した。最も重要なことには、ｇＲＮＡ−５及びｇＲＮＡ−１２の組み合わせはＨＢｓＡｇ及び／又はＨＢｅＡｇ産生を効率的に抑制することができたのみならず、ＨｅｐＡＤ３８細胞におけるｃｃｃＤＮＡリザーバを破壊することもできた。
【１０１９】
Ｋａｒｉｍｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．２０１５  Ｓｅｐ  ３；５：１３７３４．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ１３７３４）は、ＨＢＶゲノムのＳ及びＸ領域に、Ｃａｓ９ニッカーゼによる特異的且つ有効な切断の標的となった交差遺伝子型保存ＨＢＶ配列を同定した。この手法は、レポーター細胞株におけるエピソームｃｃｃＤＮＡ及び染色体に組み込まれたＨＢＶ標的部位のみならず、慢性的に及びデノボで感染させた肝細胞癌細胞株におけるＨＢＶ複製もまた破壊した。
【１０２０】
当業者は、本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系によるＨＢＶの標的化について、例えば、Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．２０１４  Ａｕｇ  １９；３：ｅ１８６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１４．３８）、Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．２０１５  Ｊｕｎ；１１８：１１０−７．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｎｔｉｖｉｒａｌ．２０１５．０３．０１５．Ｅｐｕｂ  ２０１５  Ａｐｒ  ３）、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．２０１５  Ａｕｇ；９６（８）：２２５２−６１．ｄｏｉ：１０．１０９９／ｖｉｒ．０．０００１５９．Ｅｐｕｂ  ２０１５  Ａｐｒ  ２２）、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２０１５  Ａｕｇ  ２８；２１（３２）：９５５４−６５．ｄｏｉ：１０．３７４８／ｗｊｇ．ｖ２１．ｉ３２．９５５４）及びＫａｒｉｍｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．２０１５  Ｓｅｐ  ３；５：１３７３４．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ１３７３４）の上記の研究を利用し得る。
【１０２１】
慢性Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染は蔓延しており、致命的で、且つ感染細胞においてウイルスエピソームＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）が持続的であるためめったに治癒しない。Ｒａｍａｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｒａｍａｎａｎ  Ｖ，Ｓｈｌｏｍａｉ  Ａ，Ｃｏｘ  ＤＢ，Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ＲＥ，Ｍｉｃｈａｉｌｉｄｉｓ  Ｅ，Ｂｈａｔｔａ  Ａ，Ｓｃｏｔｔ  ＤＡ，Ｚｈａｎｇ  Ｆ，Ｒｉｃｅ  ＣＭ，Ｂｈａｔｉａ  ＳＮ，．Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．２０１５  Ｊｕｎ  ２；５：１０８３３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ１０８３３，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ２ｎｄ  Ｊｕｎｅ  ２０１５．）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系がＨＢＶゲノムの保存領域を特異的に標的化して切断し、ウイルス遺伝子発現及び複製のロバストな抑制をもたらし得ることを示した。この発明者らは、Ｃａｓ９及び適切に選択されたガイドＲＮＡの持続発現時にｃｃｃＤＮＡがＣａｓ９によって切断されること及びｃｃｃＤＮＡとウイルス遺伝子発現及び複製の他のパラメータとの両方が劇的に低下することを示した。従って、この発明者らは、ウイルスエピソームＤＮＡを直接標的化することが、ウイルスを制御し及び可能性として患者を治癒する新規治療手法であることを示した。これはまた、Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（この内容は本明細書によって参照により援用される）の名義の国際公開第２０１５０８９４６５  Ａ１号パンフレットにも記載されている。
【１０２２】
従ってＨＢＶにおけるウイルスエピソームＤＮＡの標的化が、一部の実施形態では好ましい。
【１０２３】
本発明はまた、病原体、例えば細菌、真菌及び寄生虫病原体の治療にも適用され得る。大部分の研究が新規抗生物質の開発に注力しているが、それにも関わらず、新規抗生物質は、開発後は同じ薬剤耐性問題に曝される。本発明は、それらの難題を解消する新規ＣＲＩＳＰＲベースの代替案を提供する。更に、既存の抗生物質と異なり、ＣＲＩＳＰＲベースの治療は病原体特異的なものとすることができ、有益な細菌を回避しながらも標的病原体の細菌細胞死を誘導し得る。
【１０２４】
本発明はまた、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）にも適用され得る。Ｒｏｅｌｖｉｎｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｖｏｌ．２０  ｎｏ．９，１７３７−１７４９  Ｓｅｐ  ２０１２）の方法は、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系に適用し得る。例えば、ＡＡＶ８などのＡＡＶベクターが企図されるベクターであってもよく、例えば体重１キログラム当たり約１．２５×１０１１〜１．２５×１０１３ベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の投薬量が企図され得る。本発明はまた、病原体、例えば細菌、真菌及び寄生虫病原体の治療にも適用され得る。大部分の研究が新規抗生物質の開発に注力しているが、それにも関わらず、新規抗生物質は、開発後は同じ薬剤耐性問題に曝される。本発明は、それらの難題を解消する新規ＣＲＩＳＰＲベースの代替案を提供する。更に、既存の抗生物質と異なり、ＣＲＩＳＰＲベースの治療は病原体特異的なものとすることができ、有益な細菌を回避しながらも標的病原体の細菌細胞死を誘導し得る。
【１０２５】
Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を使用した細菌ゲノムのＲＮＡガイド下編集（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ）」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．３１，ｐ．２３３−９，Ｍａｒｃｈ  ２０１３）は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を用いて肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を突然変異させ又は死滅させた。ゲノムに正確な突然変異を導入したこの研究は、標的ゲノム部位におけるデュアルＲＮＡ：Ｃａｓ９が導く切断によって非突然変異細胞を死滅させることに頼り、及び選択可能マーカー又は対抗選択系の必要性を回避するものである。ＣＲＩＳＰＲ系を用いて抗生物質耐性を逆転させ、株間での抵抗性の移し替えをなくすことが行われている。Ｂｉｃｋａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．は、ビルレンス遺伝子を標的化するように再プログラム化されたＣａｓ９が、毒性のある、しかし無毒性ではない黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を死滅させることを示した。ヌクレアーゼが抗生物質耐性遺伝子を標的化するように再プログラム化すると、抗生物質耐性遺伝子を含むブドウ球菌プラスミドが破壊され、プラスミドが運ぶ抵抗性遺伝子の広がりに対して免疫された（Ｂｉｋａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓヌクレアーゼを利用した配列特異的抗菌薬の作製（Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｔｏ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｓ）」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．３２，１１４６−１１５０，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３０４３，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ０５  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０１４を参照）。Ｂｉｋａｒｄは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９抗菌薬がマウス皮膚コロニー形成モデルにおいてインビボで黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を死滅させるように機能することを示した。同様に、Ｙｏｓｅｆ  ｅｔ  ａｌがＣＲＩＳＰＲ系を用いて、β−ラクタム抗生物質に対する抵抗性を付与する酵素をコードする遺伝子を標的化した（Ｙｏｕｓｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，「抗生物質抵抗性細菌を感作させて死滅させるようにプログラム化した溶原及び溶菌バクテリオファージ（Ｔｅｍｐｅｒａｔｅ  ａｎｄ  ｌｙｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｔｏ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅ  ａｎｄ  ｋｉｌｌ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ）」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．１１２，ｐ．７２６７−７２７２，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１５００１０７１１２  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  Ｍａｙ  １８，２０１５を参照）。
【１０２６】
ＣＲＩＳＰＲ系を用いて他の遺伝学的手法に抵抗性の寄生虫のゲノムを編集することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系は、ヨーエリマラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ）ゲノムに二本鎖切断を導入することが示された（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を用いたマラリア寄生虫ゲノムの効率的編集（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｅｄｉｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｍａｌａｒｉａ  Ｐａｒａｓｉｔｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  Ｓｙｓｔｅｍ）」，ｍＢｉｏ．ｖｏｌ．５，ｅ０１４１４−１４，Ｊｕｌ−Ａｕｇ  ２０１４を参照）。Ｇｈｏｒｂａｌ  ｅｔ  ａｌ．（「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を用いたヒトマラリア寄生虫、熱帯熱マラリア原虫におけるゲノム編集（Ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｍａｌａｒｉａ  ｐａｒａｓｉｔｅ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍ）」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３２，ｐ．８１９−８２１，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２９２５，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  Ｊｕｎｅ  １，２０１４）は、２つの遺伝子、ｏｒｃ１及びｋｅｌｃｈ１３（それぞれ遺伝子サイレンシング及びアルテミシニンに対する抵抗性の出現において推定上の役割を有する）の配列を改変した。改変に関して直接的な選択はなかったにも関わらず、適切な部位で変化した寄生虫は極めて高い効率で回復したことから、このシステムを用いて中立突然変異又は更には有害突然変異を生成し得ることが示唆される。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９はまた、トキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）を含めた他の病原性寄生虫のゲノムの改変にも用いられる（Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，「種々のトキソプラズマ原虫株における効率的な遺伝子破壊（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ  ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９）」，ｍＢｉｏ  ｖｏｌ．５：ｅ０１１１４−１４，２０１４；及びＳｉｄｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用したトキソプラズマ原虫の効率的なゲノムエンジニアリング（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ  Ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）」，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ｖｏｌ．９，ｅ１００４５０，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１００４５０，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  Ｊｕｎｅ  ２７，２０１４を参照）。
【１０２７】
Ｖｙａｓ  ｅｔ  ａｌ．（「カンジダ・アルビカンスＣＲＩＳＰＲ系が必須遺伝子及び遺伝子ファミリーの遺伝子工学を可能にする（Ａ  Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ＣＲＩＳＰＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ｐｅｒｍｉｔｓ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｉｅｓ）」，Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｄｖａｎｃｅｓ，ｖｏｌ．１，ｅ１５００２４８，ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉａｄｖ．１５００２４８，Ａｐｒｉｌ  ３，２０１５）は、ＣＲＩＳＰＲ系を用いてＣ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）における遺伝子工学の長年の障害を解消したとともに、単一の実験で幾つかの異なる遺伝子の両方のコピーを効率的に突然変異させる。幾つかの機構が薬剤耐性に寄与する生物において、Ｖｙａｓは、親の臨床分離株Ｃａｎ９０が示すフルコナゾール又はシクロヘキシミドに対する超抵抗性をもはや示さないホモ接合二重突然変異体を作製した。Ｖｙａｓはまた、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）の必須遺伝子に条件的対立遺伝子を作り出すことによりホモ接合機能喪失型突然変異も得た。リボソームＲＮＡプロセシングに必要なＤＣＲ１のヌル対立遺伝子は、低温で致死性であるが、高温では生存可能である。Ｖｙａｓはナンセンス突然変異を導入する修復鋳型を使用し、１６℃で成長できないｄｃｒ１／ｄｃｒ１突然変異体を単離した。
【１０２８】
遺伝的又は後成的態様による疾患の治療
Ｇｌｕｃｋｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．の国際公開第２０１５／０４８５７７号パンフレット「ＣＲＩＳＰＲ関連方法及び組成物（ＣＲＩＳＰＲ−ＲＥＬＡＴＥＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ）」；Ｇｌｕｃｋｓｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌの国際公開第２０１５／０７００８３号パンフレット「統率ｇＲＮＡを伴うＣＲＩＳＰＲ関連方法及び組成物（ＣＲＩＳＰＲ−ＲＥＬＡＴＥＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＷＩＴＨ  ＧＯＶＥＲＮＩＮＧ  ｇＲＮＡＳ）」を含めた、標的遺伝子座にＣａｓ９系を使用して遺伝子療法で疾患に治療的に対処する方法について記載しているＥｄｉｔａｓ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅの公開出願にあるものを含め、これまでＴＡＬＥＮ及びＺＦＮを使用して試みられたが成功は限られていた、且つＣａｓ９系の潜在的な標的と同定されている遺伝子突然変異を、本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を用いて補修することができる；一部の実施形態において、原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）の治療、予防又は診断が提供される。標的は、好ましくはＭＹＯＣ遺伝子である。これは、国際公開第２０１５１５３７８０号パンフレット（その開示は本明細書によって参照により援用される）に記載される。
【１０２９】
Ｍａｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の国際公開第２０１５／１３４８１２号パンフレット「アッシャー症候群及び網膜色素変性症の治療のためのＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ関連方法及び組成物（ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ−ＲＥＬＡＴＥＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＴＲＥＡＴＩＮＧ  ＵＳＨＥＲ  ＳＹＮＤＲＯＭＥ  ＡＮＤ  ＲＥＴＩＮＩＴＩＳ  ＰＩＧＭＥＮＴＯＳＡ）」が挙げられる。本明細書の教示を通じて、本発明は、本明細書の教示と併せて適用されるこれらの文献の方法及び材料を包含する。眼及び聴覚遺伝子療法のある態様において、アッシャー症候群及び網膜色素変性症（ｒｅｔｉｎｉｓ−ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ）の治療のための方法及び組成物を本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に適合させてもよい（例えば、国際公開第２０１５／１３４８１２号パンフレットを参照）。ある実施形態において、国際公開第２０１５／１３４８１２号パンフレットは、遺伝子編集、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介方法を用いてＵＳＨ２Ａ遺伝子の位置２２９９のグアニン欠失を修正する（例えば、ＵＳＨ２Ａ遺伝子の位置２２９９の欠失したグアニン残基を置き換える）ことによる、アッシャー症候群ＩＩＡ型（ＵＳＨ２Ａ、ＵＳＨ１１Ａ）及び網膜色素変性症３９型（ＲＰ３９）の治療又は発症若しくは進行を遅延させることを含む。同様の効果が、Ｃｐｆ１で達成することができる。関連する態様において、１つ以上のヌクレアーゼ、１つ以上のニッカーゼ、又はこれらの組み合わせのいずれかで切断し、例えば、それにより点突然変異（例えば、単一のヌクレオチド、例えばグアニンの欠失）を修正するドナー鋳型を含むＨＤＲを誘導することにより、突然変異が標的化される。突然変異ＵＳＨ２Ａ遺伝子の変化又は修正は、任意の機構によって媒介されてもよい。突然変異ＨＳＨ２Ａ遺伝子の変化（例えば修正）に関連し得る例示的機構としては、限定はされないが、非相同末端結合、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、相同依存性修復（例えば、内因性ドナー鋳型媒介性）、ＳＤＳＡ（合成依存性鎖アニーリング）、一本鎖アニーリング又は一本鎖インベージョンが挙げられる。ある実施形態において、アッシャー症候群及び網膜色素変性症（Ｒｅｔｉｎｉｓ−Ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ）の治療に用いられる方法は、対象が有する突然変異の情報を、例えばＵＳＨ２Ａ遺伝子の適切な一部分のシーケンシングによって入手するステップを含み得る。
【１０３０】
また、国際公開第２０１５／１３８５１０号パンフレットも挙げられ、及び本明細書の教示を通じて本発明（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を用いる）は、レーベル先天性黒内障１０型（ＬＣＡ  １０）の治療又は発症若しくは進行を遅延させることを提供することを包含する。ＬＣＡ  １０は、ＣＥＰ２９０遺伝子の突然変異、例えば、イントロン２６にクリプティックスプライス部位を生じさせるＣＥＰ２９０遺伝子のｃ．２９９１＋１６５５、アデニンからグアニンへの突然変異によって引き起こされる。これは、ＣＥＰ２９０のイントロン２６のヌクレオチド１６５５における突然変異、例えばＡからＧへの突然変異である。ＣＥＰ２９０は、ＣＴ８７；ＭＫＳ４；ＰＯＣ３；ｒｄ１６；ＢＢＳ１４；ＪＢＴＳ５；ＬＣＡＪＯ；ＮＰＨＰ６；ＳＬＳＮ６；及び３Ｈ１１Ａｇとしても知られる（例えば、国際公開第２０１５／１３８５１０号パンフレットを参照）。遺伝子療法のある態様において、本発明は、ＣＥＰ２９０遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子においてＬＣＡ標的位置の部位の近傍に１つ以上の切断点を導入することを含む（例えば、ｃ．２９９１＋１６５５；ＡからＧ）。ＬＣＡ１０標的位置の変化とは、（１）ＬＣＡ１０標的位置にごく接近した又はそれを含む切断誘導性のインデル導入（本明細書ではＮＨＥＪ媒介インデル導入とも称される）（例えば、ｃ．２９９１＋１６５５ＡからＧ）、又は（２）ＬＣＡ１０標的位置における突然変異（例えば、ｃ．２９９１＋１６５５ＡからＧ）を含めた、ゲノム配列の切断誘導性の欠失（本明細書ではＮＨＥＪ媒介欠失とも称される）を指す。両手法とも、ＬＣＡ  １０標的位置における突然変異に起因するクリプティックスプライス部位の欠損又は破壊を生じる。従って、ＬＣＡの治療におけるＣｐｆ１の使用が特に想定される。
【１０３１】䥄㹖 钠ꧧ薀苣꾁胣颧胣ꪁ雧ꎂ臣뮲駧ꮁ臩鶼귥芙돦銂铧蒁뻥讂臣ꦁ臣讁苣膼鯥鞁臣蒁苣芀駩骮臣閁苣ꪁ臣貁胣뒛臣设ꓧ閁苣讂꣦蒚꿧늛苣ꮐ苣膀臣讁苣뮲駧ꢔ胩ꮁ臣蒁臣膀迥뎁믤许臣ꢁ臣誂臣膀臩릖돦ꞁ胣ꎼ뷯蚽볯ꢂ菣Ꞃ苣뾂菣뾂菣醃苣ꪳ苣馃菣릂臣馁苣겜駧躘臣ꎼ볯ꦼ볯낼볯뮳臣뎃껥閁苣㲌牢ਾ苣芀鳦뮳苣ꢔ臣ꚁ鳦ꢔ臣뮲駧鞁뻥讂臣芁苣蚁韧讅迥꾁雧ꎂ臣肸菩꺁뻤꾁胣겜飦내鯦ꮁ郥뺁苣讂臩鶼귥꺁뻤誏臣芏胨螖賧ꮁ郥뺁苣膀迥뎁臣貂苣꺁韧讅臣뺏鳥ꊖ胩颻臣覂苣膀郥颧臣鶁臣ꮁ迦鮾臣貂苣芀뻤몤臣貂苣몁볤邭迥뎁韧讅臣늶뻧蒚臣꾁臣蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯邼볯銼胣㲑䐯噉ਾ뻥낒돧뺖苦꺁닦芙戼㹲 겜駧躘臣뺁臣膀볯늼볯뎼볯늼裢ꎼ뷯鎽돧膀藥鎽髧ꮁ臣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣貂苣낖ꛨꎼ볯ꦼ볯낼볯ꢂ菣Ꞃ苣뾂菣뾂菣醃苣ꪳ돧銂ꇨ늶迥꾁胩股맥내菨袼뷯薽뷯膽뷯辽뷯辽뷯钽뷯莽†뷯钽뷯趽†뷯薽뷯貽볯ꮁ胩钁臣讂臣ꢁ苣膼鯥馁苣芀볯膽뷯貽뷯銽뷯躽†뷯钽†뷯貽볯꺁ꇨ뾼苣궂苣붂菣ꂃ볯꺼뷯莽뷯薽뷯莽†볯莽뷯蒽뷯ₓ늼뷯鎽뷯膽뷯莽뷯貼볯邼볯銼볯뚼뷯貽볯钼볯貼볯辽볯醼볯ₗ薽볯鎼볯覼臣ꖻ觥風볨閁苣ꚁ臣誂胣鎁苣銂裥ꢔ臣ꚁ볯늼볯뎼볯늼†볯膽뷯뮳苣股뛦ꮁ胩钁臣鞾苣芀鳦몙飦꺁ꃦ뢅苣벃苣蚃苣뎃苣뮳臣膀闧뢸菣ꊃ苣궃菣뎃韧膀뻤袁臣떂菣뮂菣ꊂ迥뎁軩뚊뗨股郧螗苣뮲駧馁苣鎁臣节볤뎛臣貂苣芀뻤袁臣膀鳦몙飦꺁볯늼볯뎼볯늼†볯膽뷯뮳臣袂苣馨髧隌臣鞾苣鲽鳥蒚꣦蒚臣ꒁ臣ꚁ臣膀鯥鮚藥讖곧銼볯醼볯込볯銼볯鞼볯钼迥醃菣閃菣莃菣銂迥ꞅ臣鎁臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 ꒼뷯膽뷯辽뷯辽뷯貽뷯閽볯貀菣鎃菣벃ꯨ螖胣캁떂菣뮂菣ꊂ臣뺯臣讂胩股맥내菨馃菣릂臣몁볤邭駧閳臣늀ꇨ궸臣늪ꇩ袼볯薽뷯覽뷯鞽†볯銽뷯覽뷯貽뷯貼볯袽뷯₅꾼뷯螽뷯覽뷯螽†볯袽뷯貽뷯薽뷯螽뷯₅辽뷯₆ꢼ뷯趽뷯钽뷯邽뷯覽뷯钽뷯莽†볯钽뷯趽†볯薽뷯貽裢ꊼ뷯鎽뷯蒽†볯薽뷯薽†볯袽뷯銽뷯邽뷯ₙ蚽뷯銽†닎裢뒼뷯膽뷯膽뷯鎽뷯趽뷯膽볯趀볯뎼뷯薽뷯₍ꎼ뷯貽뷯鎽†볯躽뷯薽뷯躽뷯钽뷯辽뷯膽뷯貼볯辽뷯閽뷯薽†볯邼볯醼볯ꆼ뷯钽뷯莽뷯薽†볯꒼†볯颼볯馼볯邼볯醼볯ₐ邽뷯螽뷯鎽볯蒽뷯覽볯醼볯躼볯邼볯醼볯銼볯醼볯込볯颼볯馼볯邼볯鶁臣閼铧螖賧ꢁ藥ꮁ胣ꢅ臣貁ꓧ閁苣龁苣꺁臣鞁臣芏藧ꮁ苣誂鳦躘듧뢛臣蒵臣ꖅ苣覂苣讂볯꾁胣캁銈苣궃菣뎃迥꾁돎裢낂菣鎃菣꺁臩鶼귥銂胩钁臣讂菣뎃菣Ꚃ苣ꮃ苣銂뷤ꢔ臣龁볯뎼볯꺁铦覤苣莀꿥鞁臣蒁苣芀菣뎃菣Ꚃ苣ꮃ苣銂뷤ꢔ臣讂臣ꢁ臣뺯藧蒚臣膀뷥궥胨꾁胣鎽ꧨ肊ꇨ蚈蟩ꮁ臣醁苣ꖟ귨誏臣겜雩몤臣馕ꓧꮁ鿥ꖁ臣膀닎苣ꦃ苣龃苣ꮁ雩鞁臣膀ꫧ뚄ꓥ낕苣馨髧隌臣ꚁ뿤ꎭ臣讂볯늼볯뎼볯늼裢ꎼ뷯鎽돧袼뻤袁臣膀닎裢낂菣鎃菣袏臣캯銈苣궃菣뎃胣覜裥ꮁ臣麝뗨股郧貎諧隌닎裢낂菣鎃菣袏臣캯銈苣궃菣뎃臣뎂菣覃藩鞈苣膀臩馁苣붥臩ꪁ볯꒼볯뎋黥銂郥肂볯銂뷤ꢔ臣ꚁ볯뎼볯銂뿤ꎭ臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣鮼藥鎽髧ꮁ臣膀苣ꒂ菣늼볯ꆼ臣膀닎苣ꦃ苣龃苣銂铧颁臣鮁苣膪蓧覤闧銂꣦蒚賥馁苣鎁臣貁臣趁胣誏臣ꢼ볯늼臣膀臩螈臣캪銈苣궃菣뎃迥꾁돎裢낂菣鎃菣몙迧꺁苣벃菣ꎂ菣낂苣节臣覂臣鎁臣貁臣趁苣芀ꫧ뚄ꓥ낕苣覜臣讂볯뎼볯ꮁ胣膪蓧覤闧銈迥뎁裢ꎼ뷯鎽苣뎃菣꾂돨銂郥覜臣讂닧邭苣馨髧隌臣讂苣ꒂ菣늼볯ꆼ苣ꖎ꟨閁臣讂胣銲귥꾁臣龁胣캁銈苣궃菣뎃迥꾁돎裢낂菣鎃菣꺁臩ꎭ臣몙迧꺁臣膂ꫧ뚄ꓥ낕苣꺿귦馁苣꺁臣붥臩ꪁ볯꒼볯뎋黥节郥覜臣鞾苣鮼迥꾁볯뎼볯꾁胣ꢼ볯늼诩讞苣ꮐ鳦馁苣讁迥꾁臣貂苣膀臩馁苣견볯꺁닧邭迥꾁菣꾂苣벃臣ꖎ꟨閁臣ꚁ苣袂臣芀臣꺁苣蚁臣ꖎ꟨閁臣龁듧麃臣閊룤鞁볯誏臣뮻蓦뢁諦ꞁ蟥蚐볯ꆋꓥ馁苣鎁臣貁臣趁苣鮼볯膽뷯钽뷯薽뷯銂迥ꞅ胣鎁苣ꮁ雩鞁臣膀볯膽뷯膽뷯骽뷯躽뷯貼胣ꢂ苣붂菣鲃臣것菣膃苣ꒂ菣릂닎猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ꆼ裢뒼볯鞼볯㲱猯灵銈苣궃菣뎃菣꾂苣벃臣袂臣ꚁ뷥ꪳ냥ꖅ臣龁蟨뚮胩股맥내菨꺁꟧趤臣袂苣趇韧讞닎苣ꦃ苣龃苣꺁臩鶼귥芙돦꺁뗧鲞볯꾼뷯钽뷯辽뷯薽뷯ₓ辽뷯₆Ꞽ뷯躽뷯₅뒼뷯薽뷯膽뷯馽†뷯辽뷯ₒ츠銈볯袽뷯貽뷯鎽뷯薽뷯覽뷯₁궼뷯誽뷯銽†뷯覽뷯₁뒼뷯膽뷯鎽뷯貽뷯躽뷯膽뷯覽뷯躽†뷯蚽†볯閽뷯辽뷯辽뷯辽뷯鎽†볯薽뷯膽뷯辽뷯辽뷯薽뷯覽뷯₃뎼뷯薽뷯₍ꎼ뷯貽뷯鎽†볯銽뷯躽뷯蒽뷯莽뷯蒽†볯颽†볯覽뷯辽†뷯覽뷯袽†뷯₁겼뷯躽뷯覽뷯覽뷯膽뷯₌츠㲲畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯銈볯颼볯놼⼼畳㹰裢Ꞽ뷯辽뷯覽뷯₎뚼뷯莽뷯辽뷯覼胣躼뷯覽뷯銼볯醼볯躼뷯銽뷯込뷯芽뷯钽뷯膽뷯钽볯覽뷯薽뷯込볯薽뷯躽볯銼볯ꆼ뷯钽뷯覽뷯薽볯銼볯늼뷯芽뷯覽뷯뾼볯芽뷯钽뷯膽뷯钽볯邽뷯蚽볯ꎼ뷯隽뷯骽뷯膽뷯膽裢ꎼ뷯貽뷯辽볯貀菣袃닎苣ꦃ苣龃苣꺁臩鶼귥芙돦貾臣뢼ꇨ麝뻤颭胦誏臣ꢼ볯Ꞽ볯銼듦Ꞁ賥袼볯銽뷯躽뷯蚽뷯鎽뷯辽뷯₎覽뷯蒽뷯邽뷯躽뷯薽뷯莽뷯₅膽뷯蒽†볯궼볯ꆼ볯ₒ膽뷯钽뷯隽뷯钽뷯辽뷯₎膽뷯钽뷯銽†뷯薽뷯薽†뷯袽뷯銽뷯邽뷯ₙ辽뷯₆袽뷯趽뷯躽†닎裢钽뷯膽뷯膽뷯鎽뷯薽뷯覽뷯覼胣貼볯膽뷯閽뷯薽††볯隼볯貼볯醼볯銈볯銼볯袼볯隼†볯薽뷯钽뷯趽뷯薽뷯ₒ銼볯醼볯覼뷯辽뷯骼볯邼볯醼볯鎼볯込뷯膽뷯閽뷯薽볯馼볯銼볯鮼볯覽뷯躽뷯閽뷯鎽볯貀苣ꦃ苣龃苣ꮁ꿥馁苣몁볤邭駧閳臣讖駧袼볯薽뷯薽뷯辽뷯趽뷯躽뷯ₔ辽뷯₆Ꞽ뷯躽뷯₅뒼뷯薽뷯膽뷯馽†뷯辽뷯ₒ뒼뷯膽뷯膽뷯鎽뷯趽뷯膽볯趀볯ꎼ뷯貽뷯₄뎼뷯銽뷯躽뷯₇ꢼ뷯銽뷯辽뷯ₒ낼뷯銽뷯邽뷯莽뷯覽뷯薽뷯ₓ覽뷯₎궼뷯蒽뷯莽뷯躽뷯貼뷯辽뷯骼볯邼볯醼볯邼볯込뷯鎽뷯邽뷯銽뷯邽뷯莽뷯躼뷯邼볯醼볯鎼볯袼볯邼볯銼볯膀볯薽뷯钽뷯Ꞽ뷯辽뷯覽뷯₎ꊼ볯鎼볯閼胣ꢂ菣뢂菣ꊂ菣뎃苣閁苣龁닎裢낂菣鎃菣몁볤邭볯캈㲲畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯銈볯颼볯놼⼼畳㹰볯銂郥肂菣뎃菣Ꚃ苣ꮃ苣馃苣뾂菣鮼迥뎁볯覽뷯₅薽뷯ₔ膽뷯躼볯貀볯늼볯뎼볯늼볯ꎼ뷯鎽볯誏臣钃苣벃菣莃苣銂뷤ꢔ臣龁苦薀觧낕髧覽볯뎼볯ꮁ臣醁苣캋떂菣뮂菣ꊂꫧ뚄ꓥ낕臣랂菣ꂃ菣릂臩鶼귥꺿귦袼볯薽뷯趽뷯薽뷯鎽†뷯薽뷯薽†뷯辽뷯銽뷯莽뷯覽뷯躽†뷯蚽†닎裢钽뷯膽뷯膽뷯鎽뷯薽뷯覽뷯₁趽뷯钽뷯钽뷯辽뷯鎽†뷯躽†뷯膽뷯覽뷯躽뷯銈뷯邽뷯莽뷯蚽뷯莽†뷯낼볯ꎼ뷯ₓ閽뷯覽뷯螽†볯늼볯뎼볯늼볯ꎼ뷯鎽볯ₙ膽뷯蒽†뷯覽뷯螽뷯芽뷯莽뷯覼胣Ꞽ뷯躽뷯趽뷯₅늼뷯鎽뷯膽뷯莽뷯₈螽뷯躼볯鞼볯钼볯鞼볯醼볯钼볯銼볯醼볯覼뷯钽뷯邽볯込볯鞽뷯鞽볯螽뷯躽뷯趽뷯躼뷯銽뷯込뷯螽뷯込뷯辽뷯込볯邼볯醼볯邼볯込뷯銽볯醼볯鎼볯銼볯躼볯醼볯袼볯辽뷯蒽†볯邽뷯覽뷯螽†볯膽뷯芽뷯銽†볯膽뷯辽뷯膽뷯辽뷯馽†볯銽뷯鎽뷯覼볯鎁苣꾁胣銃菣캈떂菣뮂菣ꊂ苣ꮐ苣ꎼ뷯隽뷯骽뷯膽뷯膽臣钠ꧧ뮸ꇩ誏臣뢼뷯薽臣钠ꧧ뮸ꇩꞁ臣讂볯貁賦銁苣貂胣鎁苣覂臣蒁臣貂苣膀臣꺁藥ꚁ臣閼铧螖賧袏臣ꊖ胩螖賧ꢁ藥ꮁ迥ꞅ臣袂苣겜飦내鯦ꮁ뗧뾁藥貂苣貂苣芀鳦몙飦ꮁ臣蒁臣膀볯꒼볯뎋黥꾁胣ꢂ菣뢂菣ꊂ菣뎃苣閁苣龁닎裢낂菣鎃菣몁볤邭볯设臣낁닎猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ꆼ裢뒼볯鞼볯㲱猯灵覼胣袏臣뢼뷯薽臣芁苣ꢁ臣誂臣캮銈苣궃菣뎃苣몙迧馁苣ꢼ볯ꎼ苣邏뻤馁苣鎁臣貁臣趁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 뢼뷯ₕ薽뷯ₔ膽뷯躼볯뎼뷯覽†볯薽뷯躼볯邼볯閼†볯閽뷯₌馼볯閼볯醼볯邼볯閼볯蒽뷯覽볯醼볯躼볯邼볯颼볯鎽뷯薽뷯醼볯邼볯閼볯꾁胣낂菣鎃菣몁볤邭臣ꒂ菣袃菣뎃볯膪蓧覤闧ꢃ뷤ꦼ볯뎼볯銈볯閼볯銂鯧ꖎ꣦蒚賥馁苣袂臣ꮁ볯ꆼ볯ꖼ볯誏臣ꎼ볯ꦼ볯낼볯銈볯膽뷯馼苣궨꣨鞁臣蒁苣芀볯閽†뷯钽†뷯貽볯꾁胣뒼볯겼볯꺼迥뎁볯늼볯뎼볯늼裢ꎼ뷯鎽볯銂铧蒁臣ꦼ볯뎼볯銈볯閼볯몁볤邭뫥ꮁ闧ꪁ苣뮠뫥꺁뫤겜軩螈雦袼볯뎼볯覼苣뎦꿥鞁臣誁苣膀뷯覽뷯螽뷯ꊼ뷯莽菣ꦃ菣릂菣뺂菣覃菣벃臣蒵臣袐苣鮁臣ꢁ臣뒼볯겼볯꺼臣ꎼ볯ꦼ볯낼볯銈볯膽뷯馼臣钯볨鞁臣袂苣颫臣뢛郥몁볤邭苣벃苣蚃苣뎃苣릊軧銂ꫥ讻臣龁胣ꂊ臣ꚁ胣뒼볯겼볯꺼臣钯볨鞁臣ꎼ볯ꦼ볯낼볯銈볯膽뷯馼臣꾁苣誂飦覂臣ꪁ苣閃苣벃苣莃菣ꒂ菣뎃菣貁ꛨ龯臣貂臣芀鳦貾臣膀볯ꆼ볯ꖼ볯꺁뿤ꎭ苣鞏臣龁뷯낼볯ꎼ苣궃菣뎃臣꾼볯馼藥릟ꓩ뮳苣뾽铧鞁臣꒵諨莐裥隌臣ꊖ臣ꚁ臩麊臣貂胣麝뿤ꎭ듧麃臣钯臣ꚁ꿦莼髧颫臣ꢼ볯ꊼ臣ꊻ蛥貁ꓦ몇臣貂臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 뎼뷯躽뷯₇薽뷯ₔ膽뷯躼볯뎼뷯薽뷯₍ꎼ뷯貽뷯鎽†볯薽뷯躼볯邼볯閼†볯膽뷯ₙ醼볯銼볯袼볯覼볯醼볯閼볯銈볯閼볯蒽뷯覽볯醼볯躼볯邼볯馼볯鎽뷯蒽볯銼볯醼볯躼볯鎼볯鞼볯ꖼ뷯閽뷯₂銼볯醼볯ₕꚼ뷯芽†볯覼臣膀볯늼볯뎼볯늼볯ꎼ뷯鎽볯銂铧蒁臣캦銈볯袽뷯貽†뷯낼볯ꎼ苣꺿귦鞁臣鮼菣袃菨Ꞁ맥내菨袼뷯ꖼ볯ꎼ볯꾁苣閃苣벃苣莃菣릊黦銂ꓧ閁臣讁臣龁臣膂胣몁볤邭뿤ꎭ臣貂臣내菨꾁귦뢸臣뢠黥誏臣貮藥ꪁꓥ붃胦銂釥鞁臣芀곦ꮁ胣뎼뷯躽뷯₇薽뷯ₔ膽뷯躼臣몁볤邭뿤ꎭ臣貂臣캟銈볯袽뷯貽†뷯낼볯ꎼ臣蚈賥릊軧銂ꧨꆾ臣龁胣뎼뷯躽뷯₇薽뷯ₔ膽뷯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鎼볯馼迥躘듧뢛胣貐곧颼볯鞼볯醼볯馼볯閼迥躘듧뢛胣貐곧颼볯鞼볯閼볯馼볯閼迥躘듧뢛胣貐곧颼볯颼볯閼볯钼볯隼迥躘듧뢛胣貐곧颼볯颼볯醼볯钼볯閼迥躘듧뢛胣貐곧颼볯颼볯馼볯鎼볯隼迥躘듧뢛胣貐곧颼볯颼볯馼볯钼볯颼迥躘듧뢛胣貐곧颼볯颼볯閼볯鎼볯颼迥躘듧뢛胣貐곧颼볯馼볯隼볯隼볯隼迥躘듧뢛胣貐곧颼볯馼볯銼볯颼볯钼迥躘듧뢛胣貐곧颼볯馼볯閼볯颼볯馼迥躘듧뢛胣貐곧颼볯馼볯鎼볯銼볯鎼迥躘듧뢛迥뎁郥견볯貼볯馼볯貼볯钼볯랏飦내鯦鮼뇧붛觧놨蟥颡藥讖곧銼볯醼볯銈볯鎼볯邼볯鎼볯랏飦내鯦袼뇧붛觧놨蟥颡곧醼볯込볯邼볯貼볯鎼볯랏飦내鯦覼胣뎱鯥릉꣨몇ꇩ겅雩견볯邼볯钼裢邼볯颼볯馼볯颼†볯醼迥躘듧뢛볯뎱鯥릉꣨몇ꇩ견볯钼볯銼볯鎼볯馼볯醼迥躘듧뢛볯膀뇧붛觧놨蟥颡藥讖곧銼볯醼볯銈볯銼볯鎼볯鎼볯ₔꆼ볯랏飦내鯦袼뇧붛觧놨蟥颡곧醼볯込볯馼볯貼볯鞼볯랏飦내鯦覼胣뎱鯥릉꣨몇ꇩ겅雩견볯邼볯钼裢邼볯鞼볯銼볯銼†볯醼迥躘듧뢛볯뎱鯥릉꣨몇ꇩ견볯钼볯銼볯邼볯閼볯閼迥躘듧뢛볯膀뇧붛觧놨蟥颡藥讖곧銼볯醼볯銈볯銼볯鎼볯鎼볯랏飦내鯦袼뇧붛觧놨蟥颡곧醼볯込볯閼볯貼볯銼볯랏飦내鯦覼胣뎱鯥릉꣨몇ꇩ겅雩견볯邼볯钼裢邼볯閼볯邼볯隼†볯醼迥躘듧뢛볯뎱鯥릉꣨몇ꇩ견볯钼볯銼볯隼볯銼볯钼迥躘듧뢛볯膀뇧붛觧놨蟥颡藥讖곧銼볯醼볯銈볯銼볯颼볯邼볯ₒꆼ볯랏飦내鯦袼뇧붛觧놨蟥颡곧醼볯込볯閼볯貼볯閼볯랏飦내鯦覼胣뎱鯥릉꣨몇ꇩ겅雩견볯邼볯钼裢邼볯钼볯鞼볯邼†볯醼迥躘듧뢛볯뎱鯥릉꣨몇ꇩ견볯钼볯銼볯銼볯馼볯邼迥躘듧뢛볯膀뇧붛觧놨蟥颡藥讖곧銼볯醼볯銈볯銼볯銼볯馼볯ₙꆼ볯랏飦내鯦袼뇧붛觧놨蟥颡곧醼볯込볯颼볯貼볯醼볯랏飦내鯦覼胣뎱鯥릉꣨몇ꇩ겅雩견볯邼볯钼裢邼볯钼볯隼볯钼†볯醼迥躘듧뢛볯뎱鯥릉꣨몇ꇩ견볯钼볯醼볯钼볯馼볯邼迥躘듧뢛볯膀뇧붛觧놨蟥颡藥讖곧銼볯醼볯銈볯銼볯钼볯鞼볯ₒꆼ볯랏飦내鯦袼뇧붛觧놨蟥颡곧醼볯込볯颼볯貼볯鞼볯랏飦내鯦覼胣뎱鯥릉꣨몇ꇩ겅雩견볯邼볯钼裢邼볯銼볯鞼볯鞼†볯醼迥躘듧뢛볯뎱鯥릉꣨몇ꇩ견볯钼볯銼볯隼볯馼볯銼迥躘듧뢛볯膀뇧붛觧놨蟥颡藥讖곧銼볯醼볯銈볯醼볯馼볯馼볯ₖꆼ볯랏飦내鯦袼뇧붛觧놨蟥颡곧醼볯込볯邼볯貼볯鎼볯랏飦내鯦覼胣뎱鯥릉꣨몇ꇩ겅雩견볯邼볯钼裢邼볯颼볯馼볯颼迥躘듧뢛볯뎱鯥릉꣨몇ꇩ견볯钼볯醼볯閼볯邼볯鞼迥躘듧뢛볯膀뇧붛觧놨蟥颡藥讖곧銼볯醼볯銈볯醼볯隼볯醼볯ₙꆼ볯랏飦내鯦袼뇧붛觧놨蟥颡곧醼볯込볯邼볯貼볯鞼볯랏飦내鯦覼胣뎱鯥릉꣨몇ꇩ겅雩견볯邼볯钼裢邼볯颼볯颼볯鎼†볯醼迥躘듧뢛볯뎱鯥릉꣨몇ꇩ견볯钼볯醼볯钼볯馼볯邼迥躘듧뢛볯膀뇧붛觧놨蟥颡藥讖곧銼볯醼볯銈볯醼볯馼볯鞼볯ₐꆼ볯랏飦내鯦袼뇧붛觧놨蟥颡곧醼볯込볯邼볯貼볯鎼볯랏飦내鯦覼迥뎁뇧붛觧놨蟥颡藥讖곧銼볯醼볯銈볯醼볯馼볯邼볯ₖꆼ볯랏飦내鯦袼뇧붛觧놨蟥颡곧醼볯込볯颼볯貼볯颼볯랏飦내鯦覼胣뎱鯥릉꣨몇ꇩ겅雩견볯邼볯钼裢邼볯鞼볯鞼볯鎼迥躘듧뢛볯뎱鯥릉꣨몇ꇩ견볯钼볯醼볯鎼볯钼볯馼迥躘듧뢛볯鮼뇧붛觧놨蟥颡藥讖곧銼볯醼볯銈볯醼볯钼볯鎼볯랏飦내鯦袼뇧붛觧놨蟥颡곧醼볯込볯銼볯貼볯隼볯랏飦내鯦覼볯뎱鯥릉꣨몇ꇩ견볯钼볯邼볯钼볯钼볯钼迥躘듧뢛†곦麷觧놨蟥颡볯낼볯ₒ鞼볯醼†볯隼볯랏飦내鯦袼볯낼볯鎼볯醼볯閼볯邼볯鞼迥躘듧뢛볯膀볯낼볯ₒ鞼볯钼†볯邼볯랏飦내鯦袼볯낼볯鎼볯銼볯銼볯銼볯隼迥躘듧뢛볯膀迥뎁볯낼볯ₒ鞼볯钼†볯隼볯랏飦내鯦袼볯낼볯钼볯鞼볯鎼볯鎼볯閼迥躘듧뢛볯鮼迥뎁鯥鮚藥讖곧銼볯醼볯込볯馼볯隼볯醼迥醃菣閃菣莃菣袼볯ꎼ볯込볯뎼볯邼볯鎼볯邼볯钼볯钼볯랏飦내鯦覼胣붛髩겅雩견볯邼볯钼볯邼볯鎼볯馼볯랏菣뎃菣것菣袃볯낼볯뒼볯떼볯銼볯醼볯込볯鞼볯鞼볯邼迥躘듧뢛볯膀鯥鮚藥讖곧銼볯醼볯込볯馼볯閼볯閼迥醃菣閃菣莃菣袼볯ꎼ볯込볯뎼볯邼볯鎼볯邼볯钼볯醼볯랏飦내鯦覼胣붛髩겅雩견볯邼볯钼볯邼볯鎼볯醼볯랏菣뎃菣것菣袃볯낼볯뒼볯떼볯銼볯醼볯込볯鞼볯颼볯閼迥躘듧뢛볯膀鯥鮚藥讖곧銼볯醼볯込볯馼볯鞼볯馼迥醃菣閃菣莃菣袼볯ꎼ볯込볯뎼볯邼볯鎼볯邼볯钼볯醼볯랏飦내鯦覼胣붛髩겅雩견볯邼볯钼볯邼볯鎼볯銼볯랏菣뎃菣것菣袃볯낼볯뒼볯떼볯銼볯醼볯込볯鞼볯隼볯鞼迥躘듧뢛볯膀鯥鮚藥讖곧銼볯醼볯込볯馼볯隼볯閼迥醃菣閃菣莃菣袼볯ꎼ볯込볯뎼볯邼볯鎼볯邼볯钼볯馼볯랏飦내鯦覼胣붛髩겅雩견볯邼볯钼볯邼볯鎼볯閼볯랏菣뎃菣것菣袃볯낼볯뒼볯떼볯銼볯醼볯込볯鞼볯鞼볯隼迥躘듧뢛볯膀鯥鮚藥讖곧銼볯醼볯込볯馼볯鞼볯銼迥醃菣閃菣莃菣袼볯ꎼ볯込볯뎼볯邼볯鎼볯邼볯钼볯醼볯랏飦내鯦覼胣붛髩겅雩견볯邼볯钼볯邼볯鎼볯邼볯랏菣뎃菣것菣袃볯낼볯뒼볯떼볯銼볯醼볯込볯鞼볯颼볯邼迥躘듧뢛볯膀鯥鮚藥讖곧銼볯醼볯込볯醼볯钼볯鎼迥醃菣閃菣莃菣袼볯ꎼ볯込볯뎼볯邼볯鎼볯邼볯醼볯醼볯랏飦내鯦覼胣붛髩겅雩견볯邼볯钼볯銼볯钼볯銼볯랏菣뎃菣것菣袃볯낼볯뒼볯떼볯銼볯醼볯込볯钼볯鞼볯邼迥躘듧뢛볯膀鯥鮚藥讖곧銼볯醼볯込볯邼볯鞼볯钼迥醃菣閃菣莃菣袼볯ꎼ볯込볯뎼볯邼볯钼볯邼볯醼볯邼볯랏飦내鯦覼胣붛髩겅雩견볯邼볯钼볯銼볯钼볯銼볯랏菣뎃菣것菣袃볯낼볯뒼볯떼볯銼볯醼볯込볯钼볯颼볯鎼迥躘듧뢛볯膀鯥鮚藥讖곧銼볯醼볯込볯邼볯鞼볯隼迥醃菣閃菣莃菣袼볯ꎼ볯込볯뎼볯邼볯钼볯邼볯醼볯邼볯랏飦내鯦覼胣붛髩겅雩견볯邼볯钼볯銼볯钼볯銼볯랏菣뎃菣것菣袃볯낼볯뒼볯떼볯銼볯醼볯込볯钼볯颼볯隼迥躘듧뢛볯膀鯥鮚藥讖곧銼볯醼볯込볯邼볯鞼볯颼迥醃菣閃菣莃菣袼볯ꎼ볯込볯뎼볯邼볯钼볯邼볯醼볯邼볯랏飦내鯦覼胣붛髩겅雩견볯邼볯钼볯銼볯钼볯銼볯랏菣뎃菣것菣袃볯낼볯뒼볯떼볯銼볯醼볯込볯钼볯颼볯馼迥躘듧뢛볯膀鯥鮚藥讖곧銼볯醼볯込볯颼볯鎼볯醼迥醃菣閃菣莃菣袼볯ꎼ볯込볯뎼볯邼볯钼볯邼볯馼볯馼볯랏飦내鯦覼胣붛髩겅雩견볯邼볯閼볯邼볯馼볯閼볯랏菣뎃菣것菣袃볯낼볯뒼볯떼볯銼볯醼볯込볯隼볯馼볯銼迥躘듧뢛볯膀鯥鮚藥讖곧銼볯醼볯込볯颼볯鎼볯钼迥醃菣閃菣莃菣袼볯ꎼ볯込볯뎼볯邼볯钼볯邼볯馼볯銼볯랏飦내鯦覼胣붛髩겅雩견볯邼볯閼볯邼볯馼볯銼볯랏菣뎃菣것菣袃볯낼볯뒼볯떼볯銼볯醼볯込볯鞼볯邼볯颼迥躘듧뢛볯膀鯥鮚藥讖곧銼볯醼볯込볯颼볯钼볯銼迥醃菣閃菣莃菣袼볯ꎼ볯込볯뎼볯邼볯钼볯邼볯邼볯銼볯랏飦내鯦覼胣붛髩겅雩견볯邼볯閼볯邼볯馼볯醼볯랏菣뎃菣것菣袃볯낼볯뒼볯떼볯銼볯醼볯込볯鞼볯邼볯鞼迥躘듧뢛볯膀鯥鮚藥讖곧銼볯醼볯込볯颼볯钼볯閼迥醃菣閃菣莃菣袼볯ꎼ볯込볯뎼볯邼볯钼볯邼볯邼볯鎼볯랏飦내鯦覼胣붛髩겅雩견볯邼볯閼볯邼볯馼볯颼볯랏菣뎃菣것菣袃볯낼볯뒼볯떼볯銼볯醼볯込볯鞼볯醼볯閼迥躘듧뢛볯膀볯ꎼ볯込볯뎼볯邼볯閼볯邼볯醼볯馼볯랏飦내鯦膀볯ꎼ볯込볯뎼볯邼볯閼볯邼볯醼볯鎼볯랏飦내鯦貁迥ꞅ臣貂苣芀臣龁胣鶁苣麁苣銼볯醼볯뒹볯袜볯邼韦鮼볯邼볯鎼맥鎼鳦醼볯ꖗ볯銼볯醼볯뒹볯袜볯颼韦鮼볯邼볯鎼맥钼鳦銼볯ꖗ볯銼볯醼볯뒹볯袜볯ꖗ迥뎁볯邼볯鎼맥閼鳦銼볯ꖗ臣몇ꇩ閁苣龁뇧붛믤릉꣨몇ꇩ견볯醼볯鞼볯颼볯钼볯颼迥躘듧뢛볯貐곧隼볯込볯邼볯貼볯鞼볯랏飦내鯦鮼郥견볯醼볯颼볯隼볯鎼볯閼迥躘듧뢛볯貐곧隼볯込볯醼볯貼볯隼볯랏飦내鯦鮼郥견볯醼볯颼볯馼볯颼볯鎼迥躘듧뢛迥뎁郥견볯醼볯颼볯颼볯醼볯邼迥躘듧뢛苣芏藧閁苣讂胣뺁臣膀볯邼볯鎼맥隼鳦醼볯ꖗ臣몇ꇩ閁苣龁뇧붛믤릉꣨몇ꇩ견볯醼볯颼볯隼볯醼볯鎼迥躘듧뢛苣芏藧閁苣讂胣뒛臣膀郥薀볯邼볯鎼맥隼鳦醼볯ꖗ臣몇ꇩ閁苣龁뇧붛믤릉꣨몇ꇩ견볯醼볯颼볯閼볯馼볯醼迥躘듧뢛胣貐곧隼볯込볯鎼볯貼볯鎼볯랏飦내鯦膀郥견볯醼볯颼볯閼볯馼볯鎼迥躘듧뢛胣貐곧隼볯込볯鎼볯貼볯颼볯랏飦내鯦膀郥견볯醼볯颼볯隼볯醼볯醼迥躘듧뢛胣誏臣貐곧隼볯込볯鎼볯貼볯銼볯랏飦내鯦貁迥ꞅ臣貂苣芀鯦ꮁ臣膀볯邼볯鎼맥颼鳦閼韦ꮁ蟥颡臣貂臣뎱鯥꺻觧놨蟥颡곧隼볯込볯隼볯貼볯隼볯랏飦내鯦誏臣貐곧隼볯込볯隼볯貼볯閼볯랏飦내鯦鮼볯邼볯鎼맥颼鳦銼볯ꖗ臣몇ꇩ閁苣龁郥견볯醼볯颼볯醼볯鎼볯醼迥躘듧뢛볯銼볯醼볯뒹볯袜볯閼韦ꮁ蟥颡臣貂臣貐곧隼볯込볯隼볯貼볯鞼볯랏飦내鯦誏臣銼볯醼볯뒹볯邼鳦銼볯ꖗ臣몇ꇩ閁苣龁郥견볯醼볯馼볯醼볯馼볯邼迥躘듧뢛臣芏藧閁苣讂胣ꪁ臣节鯦ꮁ臣膀볯邼볯钼맥醼볯袜볯颼韦ꮁ蟥颡臣貂臣낼볯뒼볯떼볯銼볯醼볯込볯銼볯閼볯랏飦내鯦膀迥뎁郥薀볯邼볯鎼맥醼볯袜볯銼韦ꮁ蟥颡臣貂臣뎱鯥꺻觧놨蟥颡곧隼볯込볯醼볯貼볯钼볯랏飦내鯦膀郥견볯醼볯馼볯閼볯醼볯邼迥躘듧뢛胣貐곧隼볯込볯醼볯貼볯閼볯랏飦내鯦膀郥견볯醼볯馼볯閼볯銼볯鎼迥躘듧뢛胣貐곧隼볯込볯醼볯貼볯閼볯랏飦내鯦膀郥견볯醼볯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