(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチドを含む組換えアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、
前記ポリヌクレオチドが、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含み、
前記遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、配列番号１６からなる認識配列と結合して切断し、
前記遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、第１のサブユニット及び第２のサブユニットを含み、
前記第１のサブユニットが、前記認識配列の第１の認識した半分の部位に結合し、
前記第２のサブユニットが、前記認識配列の第２の認識した半分の部位に結合し、
前記遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、配列番号３３と少なくとも９６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする前記核酸配列が、プロモータと作動可能に連結されており、
前記プロモータが肝特異的プロモータである、組換えＡＡＶベクター。
【請求項２】
血清型２、８、又は９を含む、請求項１に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項３】
血清型８である、請求項１又は２に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項４】
自己制限ＡＡＶベクターである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項５】
自己相補的ＡＡＶベクターである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項６】
前記第１のサブユニットが、配列番号３３の残基１９８〜３４４に対して少なくとも９６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のサブユニットが、配列番号３３の残基７〜１５３に対して少なくとも９６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項７】
前記第１のサブユニットが、配列番号３３の残基１９８〜３４４を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項８】
前記第２のサブユニットが、配列番号３３の残基７〜１５３を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項９】
前記遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、配列番号３３のアミノ酸配列を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍学、分子生物学、及び組換え核酸技術の分野に関する。特に、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスゲノムの少なくとも２つの遺伝子型の中の認識配列に対する特異性を有する遺伝子操作されたメガヌクレアーゼに関する。そのような遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、Ｂ型肝炎ウイルスの感染及びＢ型肝炎ウイルスによって引き起こされる肝細胞がんを治療するための方法において有用である。
【０００２】
ＥＦＳ−ＷＥＢを介したテキストファイルとして提出された配列表への言及
本願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩのフォーマットで提出された配列表を含み、その全体は参照により本明細書に組み入れられる。２０１７年１０月１３日に作成された上記のＡＳＣＩＩのコピーは、Ｐ１０９０７００１８ＷＯ００−ＳＥＱ−ＭＪＴ．ｔｘｔという名前で、サイズは１６９，０１１バイトである。
【背景技術】
【０００３】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は世界的に大きな健康問題であり、３億５千万人を超える人々が慢性的なキャリアである。ＨＢＶ感染症は、肝臓の深刻且つ一般的な感染症である。慢性感染症は、肝硬変及びヒトのがんの最も一般的な形態の１つである肝細胞がん（ＨＣＣ）を含む、重篤な肝疾患を発症するリスクの増大と関連している。慢性ＨＢＶキャリアにおけるＨＣＣの推定のリスクは、感染していない個人におけるよりも約１００倍大きい。世界の人口の約３分の１が、生きている一時点で感染しており、それは２億４千万人から３億５千万人の慢性感染症を含んでいる。毎年７５万人を超える人々がＢ型肝炎で死亡している。これらのうち約３０万人が肝がんによる。現在入手可能な抗ＨＢＶ薬には限界がある。例えば、インターフェロンアルファの投与は重篤な有害反応と関連している。ヌクレオシド類似体は、静ウイルス性であり、長期の投与が必要となる。
【０００４】
ＨＢＶゲノムは、１つの部位あたり１年につき１．４〜３．２×１０−５ヌクレオチド置換という推定速度での遺伝的多様性を示す。ウイルスのポリメラーゼによるいずれかのプルーフリーディング能力の不在下でヌクレオチドを誤った取り込んだ結果として、複製している間、多数のウイルス変異体が生じる。その多様性により、ウイルスのよく認識されている亜型が生じた。ＨＢＶは、完全なゲノムの配列における８％以上の群間の相違に基づいた明確な遺伝子型に分類されており、それぞれ異なる地理的分布を有する。例えば、遺伝子型Ａは、サハラ以南のアフリカ、北ヨーロッパ、及び西アフリカで広く見られる。遺伝子型ＢとＣはアジアで一般的である。遺伝子型Ｃは主に東南アジアで観察される。遺伝子型Ｄは、アフリカ、ヨーロッパ、地中海諸国、及びインドで優勢である。遺伝子型Ｇはフランス、ドイツ、アメリカ合衆国で報告されている。また、遺伝子型Ｈは中南米でよく見られる。遺伝子型Ｉは最近ベトナムとラオスで報告されている。最新のＨＢＶ遺伝子型、遺伝子型Ｊは、日本の琉球諸島で確認されている。
【０００５】
ＨＢＶは、ヘパドナウイルス科に属するエンベロープＤＮＡウイルスである。それは、ＲＮＡ中間体、プレゲノムＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）の逆転写によって複製する、小さい、部分的に二本鎖（ＤＳ）の、弛緩型環状ＤＮＡ（ｒｃＤＮＡ）ゲノムを含む。ＨＢＶの環状ＤＮＡゲノムは珍しい。ＤＮＡが完全に二本鎖であるわけではないからである。全長の鎖の一端が、ウイルスＤＮＡポリメラーゼに結合している。ゲノムは約３０２０〜３３２０ヌクレオチド長（全長の鎖）、１７００〜２８００ヌクレオチド長（長さの短い鎖）である。ネガティブセンス（非コード）は、ウイルスｍＲＮＡに相補的である。
【０００６】
Ｃ、Ｘ、Ｐ、及びＳと呼ばれる、ゲノムによってコードされる４つの既知の遺伝子がある。コアタンパク質は遺伝子Ｃ（ＨＢｃＡｇ）によってコードされ、その開始コドンは上流のフレーム内ＡＵＧ開始コドンが先行し、そこからプレコアタンパク質が産生される。ＨＢｅＡｇはプレコアタンパク質のタンパク質分解処理によって産生される。ＤＮＡポリメラーゼは、表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に対する遺伝子Ｐ．Ｇｅｎｅ  Ｓコードによりコードされる。ＨＢｓＡｇ遺伝子は１つの長いオープンリーディングフレームであるが、遺伝子を３つの部分、即ちｐｒｅ−Ｓ１、ｐｒｅ−Ｓ２、及びＳに分割する３つのインフレームの「開始」（ＡＴＧ）コドンを含む。複数の開始コドンにより、大（表面から内側への順序で、ｐｒｅ−Ｓ１／ｐｒｅ−Ｓ２／Ｓ）、中（ｐｒｅ−Ｓ２／Ｓ）、及び小（Ｓ）と呼ばれる３つの異なる大きさのポリペプチドが生成される。遺伝子Ｘによってコードされるタンパク質の機能は完全には理解されていないが、それは肝がんの発症と関連している。それは細胞の増殖を促進する遺伝子を刺激して、増殖調節分子を不活化する。
【０００７】
ウイルスのＤＮＡは、細胞の感染直後、核にて見出される。部分的に二本鎖のＤＮＡは、（＋）センスの鎖の完成及び（−）のセンスの鎖からのタンパク質分子の除去、並びに（＋）センスの鎖からの短いＲＮＡ配列の除去によって完全に二本鎖にされる。非コードの塩基が（−）センスの鎖の末端から除去され、末端は再結合される。
【０００８】
ＨＢＶのライフサイクルは、ウイルスが宿主細胞に付着して、内在化すると始まる。最近の研究は、タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド（ＮＴＣＰ）がＨＢＶの感染における機能的受容体であることを証明している。ビリオン弛緩型環状ＤＮＡ（ｒｃＤＮＡ）は核に送達され、そこでそれは修復されて共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）を形成する。エピソームｃｃｃＤＮＡは、宿主ＲＮＡポリメラーゼＩＩによるプレゲノムＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）及び他のウイルスｍＲＮＡの転写のための鋳型として機能する。転写物は次に細胞質に輸送され、そこでウイルスタンパク質の翻訳が起こる。逆転写酵素（ＲＴ）はｐｇＲＮＡに結合し、コアタンパク質の未成熟なＲＮＡ含有ヌクレオカプシドへの集合を引き起こす。未成熟なヌクレオカプシドは次に成熟の過程を経る。それによってｐｇＲＮＡがＲＴによって逆転写されて、成熟ｒｃＤＮＡが作られる。ヘパドナウイルス逆転写の独特の特徴は、マイナス鎖ＤＮＡ合成のＲＴにプライミングされた開始であり、これはマイナス鎖ＤＮＡの５’末端へのＲＴの共有結合をもたらす。
【０００９】
次いで、成熟したｒｃＤＮＡ含有ヌクレオカプシドは、ウイルス表面タンパク質によってエンベロープされ、ビリオンとして分泌される（分泌経路）か、別法として、ｃｃｃＤＮＡのプールを更に増幅するために核に再循環される（再循環経路）。肝細胞におけるｃｃｃＤＮＡの持続性は、ウイルスの持続性、抗ウイルス療法の中止後のウイルス複製の再活性化、及び治療に対する抵抗性において、重要な役割を果たす。
【００１０】
ホーミングエンドヌクレアーゼは、植物及び真菌のゲノムに一般的に見られる１５〜４０塩基対の切断部位を認識する一群の天然のヌクレアーゼである。それらは、グループ１自己スプライシングイントロンやインテイン等の寄生のＤＮＡの要素と関連していることが多い。それらは、染色体にて二本鎖の切断を生じさせることによって宿主ゲノムの特定の位置で相同組換え又は遺伝子挿入を自然に促進し、これは細胞のＤＮＡ修復機構を動員する（非特許文献１）。ホーミングエンドヌクレアーゼは一般に４つのファミリーに分類される：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号２）ファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスファミリー及びＨＮＨファミリーである。これらのファミリーは、触媒の活性及び認識配列に影響を及ぼす構造モチーフによって特徴付けられる。例えば、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号２）ファミリーのメンバーは、保存されたＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号２）モチーフの１つ又は２つのコピーを有することを特徴とする（非特許文献２を参照）。単一コピーのＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号２）モチーフを有するＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号２）ホーミングエンドヌクレアーゼはホモ二量体を形成し、一
方、２コピーのＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号２）モチーフを有するメンバーは単量体として見出される。ホーミングエンドヌクレアーゼを産生する方法は、当技術分野において公知である。
【００１１】
Ｉ−ＣｒｅＩ（配列番号１）は、緑藻クラミドモナスの葉緑体染色体にある２２塩基対の認識配列を認識し切断する、ホーミングエンドヌクレアーゼのＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号２）ファミリーのメンバーである。遺伝的選択技術を用いて、野生型Ｉ−ＣｒｅＩ切断部位選択性を改変した（非特許文献３〜６）。哺乳動物、酵母、植物、細菌、及びウイルスゲノムの部位を含む、広範囲に異なるＤＮＡの部位を標的とするためにＩ−ＣｒｅＩ及び他のホーミングエンドヌクレアーゼを包括的に再設計することができる、モノ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号２）ホーミングエンドヌクレアーゼを合理的に設計する方法が記載された（特許文献１）。
【００１２】
特許文献２に最初に記載されているように、Ｉ−ＣｒｅＩ及びその遺伝子操作された誘導体は、通常二量体であるが、第１のサブユニットのＣ末端を第２のサブユニットのＮ末端に結合する短いペプチドリンカーを用いて、単一ポリペプチドに融合できる（非特許文献７、非特許文献８）。従って、機能的な「一本鎖」メガヌクレアーゼは、単一の転写物から発現させることができる。
【００１３】
ＨＢＶ感染の治療のために遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを使用することが、示されている。例えば、特許文献３は、非ゲノム組み込み型ウイルスのゲノムを切断するための遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの使用を示唆している。そのようなメガヌクレアーゼは、Ｉ−ＣｒｅＩの変異体を含む。特許文献３は、１つのＨＢＶ株のゲノムに存在する多数の２２塩基対メガヌクレアーゼ認識配列を開示している。しかし、特許文献３は、ＨＢＶゲノムの複数の遺伝子型の中に存在するいずれの認識配列も同定しない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際公開第２００７／０４７８５９号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００９／０５９１９５号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２０１０／１３６８４１号パンフレット
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｓｔｏｄｄａｒｄ（２００６），Ｑ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３８：４９−９５
【非特許文献２】Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９（１８）：３７５７−３７７４
【非特許文献３】Ｓｕｓｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４２：３１−４１
【非特許文献４】Ｃｈａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００５），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：ｅ１７８
【非特許文献５】Ｓｅｌｉｇｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：３８７０−９
【非特許文献６】Ａｒｎｏｕｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００６），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５５：４４３−５８
【非特許文献７】Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３７：１６５０−６２
【非特許文献８】Ｇｒｉｚｏｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３７：５４０５−１９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、部分的には、ＨＢＶゲノムの少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内及びＨＢＶのゲノムの少なくとも２つの異なる遺伝子型内のＤＮＡ配列を認識するように遺伝子操作される部位特異的な希少切断エンドヌクレアーゼの開発に依存する。本発明者らは、ウイルスの複数の遺伝子型を不活化するために、組換えメガヌクレアーゼによって標的とされ得る遺伝子型にわたって保存されている特定の認識配列を同定した。
【００１７】
本発明はいくつかの態様で従来技術を改良する。本発明者らは驚くべきことに、認識配列がＨＢＶゲノムのいくつかの遺伝子型のＯＲＦ内で同定され得ることを見出した。ウイルスのいくつかの遺伝子型を標的とすることによって、世界の局所的な領域に存在する異なる遺伝子型に対して使用することができる単一の医薬組成物を調製することができる。従って、本明細書に開示されている方法及び組成物は、世界中の感染した個人におけるＨＢＶの増殖を治療又は低減するのに有用である。肝臓におけるＨＢＶの複製の抑制又は根絶は、肝病理の改善、及び肝硬変や肝細胞がんへの進行の減少をもたらす。従って、本発明は、ＨＢＶ感染に対する更なる遺伝子治療アプローチに対する当技術分野における必要性を満たすものである。更に、本発明は、ＨＣＣ細胞のＨＢＶゲノムへの「自殺遺伝子」の相同組換えによる挿入を標的とする手段を提供することによって肝細胞がんを治療する方法を提供する。自殺遺伝子は、がん細胞を直接死滅させる毒素若しくはアポトーシス促進タンパク質、又はがん細胞を死滅させるように対象自身の免疫系に指示する細胞表面抗原若しくはＭＨＣクラスＩ抗原ポリペプチドをコードすることができる。
【００１８】
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の治療に有用な遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを提供する。本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、少なくとも２つのＢ型肝炎ウイルスの遺伝子型のゲノムのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内の認識配列を認識して切断する。本明細書において開示される遺伝子操作されたメガヌクレアーゼによるそのような認識配列での切断は、切断部位での非相同末端結合（ＮＨＥＪ）に起因して、１以上のウイルスタンパク質の発現を乱し得る。ＮＨＥＪは、挿入、欠失を引き起こす可能性がある、又は遺伝子の発現を妨げる可能性のあるフレームシフト突然変異を引き起こす可能性がある。従って、正常な遺伝子発現を妨害することによって、ＨＢＶの感染及び増殖は、本明細書に開示されている方法に従って、減少又は排除することができる。本発明はまた、Ｂ型肝炎ウイルスの少なくとも２つの遺伝子型のゲノムのＯＲＦ内に位置する認識配列に対する特異性を有する遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを利用するＨＢＶの治療のための医薬組成物及び方法を提供する。本発明は更に、ＨＢＶのレベルを低下させる、及び／又はＨＢＶの感染に関連する症状を低下させるために、本明細書に開示される遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをＨＢＶに感染した対象に送達する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
従って、一態様において、本発明は、少なくとも２つのＢ型肝炎ウイルスの遺伝子型のゲノムのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内の認識配列を認識して切断する、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを提供する。遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、第１のサブユニット及び第２のサブユニットを含み、第１のサブユニットが認識配列の第１の認識した半分の部位に結合し、第１の超可変（ＨＶＲ１）領域を含み、第２のサブユニットは、認識配列の第２の認識した半分の部位に結合し、第２の超可変（ＨＶＲ２）領域を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、認識配列は、Ｂ型肝炎ウイルスの少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又は少なくとも６つの遺伝子型のＯＲＦ内に見出される。その
ような一実施形態では、認識配列はＢ型肝炎ウイルスの遺伝子型Ａ（配列番号３）のＯＲＦ内にある。そのような実施形態は、配列番号３と異なるが本明細書に記載の１又は複数のＨＢＶメガヌクレアーゼ認識配列を含む、遺伝子型ＡのＢ型肝炎ウイルス単離体を含む。更なるそのような態様において、認識配列は遺伝子型ＡのＯＲＦ並びに遺伝子型Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧ（それぞれ配列番号４〜９）の１又は複数のＯＲＦ内にある。そのような実施形態は、配列番号３〜９と異なるが本明細書に記載の１又は複数のＨＢＶメガヌクレアーゼ認識配列を含む、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧのＢ型肝炎ウイルス単離体を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、認識配列は、ポリメラーゼ（Ｐ）タンパク質、大表面（ｐｒｅＳ１／ｐｒｅＳ２／Ｓ）タンパク質、中表面（ｐｒｅＳ２／Ｓ）タンパク質、及び小表面（Ｓ）タンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする、少なくとも１つのＯＲＦ内にある。いくつかの実施形態において、認識配列は、配列番号１０（即ち、ＨＢＶ１−２認識配列）、配列番号１２（即ち、ＨＢＶ５−６認識配列）、配列番号１４（即ち、ＨＢＶ７−８認識配列）、又は配列番号１６（即ち、ＨＢＶ１１−１２認識配列）を含み得る。
【００２２】
いくつかの実施形態では、認識配列が配列番号１０を含み、ＨＶＲ１領域は、配列番号１８若しくは１９の残基２４〜７９、又は配列番号２０若しくは２１の残基２１５〜２７０に対応するアミノ酸配列に対する少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかのこのような実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号１８若しくは１９の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する残基、又は配列番号２０若しくは２１の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する残基を含み得る。特定の実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号１８若しくは１９の残基２４〜７９、又は配列番号２０若しくは２１の残基２１５〜２７０を含み得る。
【００２３】
いくつかのこのような実施形態では、認識配列が配列番号１０を含み、ＨＶＲ２領域は、配列番号１８若しくは１９の残基２１５〜２７０、又は配列番号２０若しくは２１の残基２４〜７９に対応するアミノ酸配列に対する少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかのこのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号１８若しくは１９の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する残基、又は配列番号２０若しくは２１の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する残基を含み得る。特定の実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号１８若しくは１９の残基２１５〜２７０、又は配列番号２０若しくは２１の残基２４〜７９を含み得る。
【００２４】
このような実施形態では、認識配列が配列番号１０を含み、第１のサブユニットは、配列番号１８若しくは１９の残基７〜１５３、又は配列番号２０若しくは２１の残基１９８〜３４４に対する少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、第２のサブユニットは、配列番号１８若しくは１９の残基１９８〜３４４、又は配列番号２０若しくは２１の残基７〜１５３に対する少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、第１のサブユニットは、配列番号１８若しくは１９の残基７〜１５３、又は配列番号２０若しくは２１の残基１９８〜３４４を含み得る。同様に、いくつかの
実施形態において、第２のサブユニットは、配列番号１８若しくは１９の残基１９８〜３４４、又は配列番号２０若しくは２１の残基７〜１５３を含み得る。
【００２５】
このような特定の実施形態では、認識配列が配列番号１０を含み、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼはリンカーを含むことができ、リンカーは第１のサブユニットと第２のサブユニットを共有結合で結合させる。特定の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号１８〜２１のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み得る。
【００２６】
他の実施形態では、認識配列が配列番号１２を含み、ＨＶＲ１領域は、配列番号２２〜２４のいずれか１つの残基２１５〜２７０、又は配列番号２５〜２８のいずれか１つの残基２４〜７９に対応するアミノ酸配列に対する少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかのこのような実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号２２〜２４のいずれか１つの残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する残基、又は配列番号２５〜２８のいずれか１つの残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する残基を含み得る。特定の実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号２２〜２４のいずれか１つの残基２１５〜２７０、又は配列番号２５〜２８のいずれか１つの残基２４〜７９を含み得る。
【００２７】
いくつかのこのような実施形態では、認識配列が配列番号１２を含み、ＨＶＲ２領域は、配列番号２２〜２４のいずれか１つの残基２４〜７９、又は配列番号２５〜２８のいずれか１つの残基２１５〜２７０に対応するアミノ酸配列に対する少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかのこのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号２２〜２４のいずれか１つの残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する残基、又は配列番号２５〜２８のいずれか１つの残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する残基を含み得る。特定の実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号２２〜２４のいずれか１つの残基２４〜７９、又は配列番号２５〜２８のいずれか１つの残基２１５〜２７０を含み得る。
【００２８】
いくつかのこのような実施形態では、認識配列が配列番号１２を含み、第１のサブユニットは、配列番号２２〜２４のいずれか１つの残基１９８〜３４４又は配列番号２５〜２８のいずれか１つの残基７〜１５３に対する少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、第２のサブユニットは、配列番号２２〜２４のいずれか１つの残基７〜１５３又は配列番号２５〜２８のいずれか１つの残基１９８〜３４４に対する少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、第１のサブユニットは、配列番号２２〜２４のいずれか１つの残基１９８〜３４４又は配列番号２５〜２８のいずれか１つの残基７〜１５３を含み得る。同様に、いくつかの実施形態において、第２のサブユニットは、配列番号２２〜２４のいずれか１つの残基７〜１５３又は配列番号２５〜２８のいずれか１つの残基１９８〜３４４を含み得る。
【００２９】
このような特定の実施形態では、認識配列が配列番号１２を含み、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼはリンカーを含むことができ、リンカーは第１のサブユニットと第２のサブユニットとを共有結合で結合させる。特定の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号２２〜２８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み得る。
【００３０】
いくつかの実施形態では、認識配列が配列番号１４を含み、ＨＶＲ１領域は、配列番号２９〜３２のいずれか１つの残基２１５〜２７０に対応するアミノ酸配列に対する少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかのこのような実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号２９〜３２のいずれか１つの残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する残基を含み得る。特定の実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号２９〜３２のいずれか１つの残基２１５〜２７０を含み得る。
【００３１】
いくつかのこのような実施形態では、認識配列が配列番号１４を含み、ＨＶＲ２領域は、配列番号２９〜３２のいずれか１つの残基２４〜７９に対応するアミノ酸配列に対する少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかのこのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号２９〜３２のいずれか１つの残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する残基を含み得る。特定の実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号２９〜３２のいずれか１つの残基２４〜７９を含み得る。
【００３２】
いくつかのこのような実施形態では、認識配列が配列番号１４を含み、第１のサブユニットは、配列番号２９〜３２のいずれか１つの残基１９８〜３４４に対する少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、第２のサブユニットは、配列番号２９〜３２のいずれか１つの残基７〜１５３に対する少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、第１のサブユニットは、配列番号２９〜３２のいずれか１つの残基１９８〜３４４を含み得る。同様に、いくつかの実施形態において、第２のサブユニットは、配列番号２９〜３２のいずれか１つの残基７〜１５３を含み得る。
【００３３】
このような特定の実施形態では、認識配列が配列番号１４を含み、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼはリンカーを含むことができ、リンカーは第１のサブユニットと第２のサブユニットとを共有結合で結合させる。特定の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号２９〜３２のいずれか１つのアミノ酸配列を含み得る。
【００３４】
いくつかの実施形態では、認識配列が配列番号１６を含み、ＨＶＲ１領域は、配列番号３３〜３９のいずれか１つの残基２１５〜２７０に対する少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかのこのような実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号３３〜３９のいずれか１つの残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する残基を含み得る。特定の実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号３３〜３９のいずれか１つの残基２１５〜２７０を含み得る。
【００３５】
いくつかのこのような実施形態では、認識配列が配列番号１６を含み、ＨＶＲ２領域は、配列番号３３〜３９のいずれか１つの残基２４〜７９に対する少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかのこのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号３３〜３９のいずれか１つの残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する残基を含み得る。特定の実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号３３〜３９のいずれか１つの残基２４〜
７９を含み得る。
【００３６】
このような実施形態では、認識配列が配列番号１６を含み、第１のサブユニットは、配列番号３３〜３９のいずれか１つの残基１９８〜３４４に対する少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、第２のサブユニットは、配列番号３３〜３９のいずれか１つの残基７〜１５３に対する少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、第１のサブユニットは、配列番号３３〜３９のいずれか１つの残基１９８〜３４４を含み得る。同様に、いくつかの実施形態において、第２のサブユニットは、配列番号３３〜３９のいずれか１つの残基７〜１５３を含み得る。
【００３７】
特定の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼはリンカーを含むことができ、リンカーは第１のサブユニットと第２のサブユニットとを共有結合で結合させる。特定の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号３３〜３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含み得る。
【００３８】
別の態様において、本発明は、本明細書に開示されている任意の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。特定の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドはｍＲＮＡであり得る。
【００３９】
更なる実施形態では、ｍＲＮＡは、本明細書に記載の１又は複数の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードするポリシストロニックｍＲＮＡであり得る。特定の実施形態において、本発明のポリシストロニックｍＲＮＡは、限定するものではなく、本明細書に記載の２つの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードするバイシストロンｍＲＮＡ、本明細書に記載の３つの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードするトリシストロンｍＲＮＡ、又は本明細書に記載の４つの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードするクアドシストロンｍＲＮＡであり得る。そのような実施形態において、２以上の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼがポリシストロニックｍＲＮＡによってコードされ、それぞれのコードされた遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、異なるＨＢＶ認識配列に対する特異性を有する。更に、そのような実施形態では、本発明のポリシストロニックｍＲＮＡは、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの任意の組み合わせをコードし得る。特定の実施形態において、ポリシストロニックｍＲＮＡは、ＨＢＶ１−２メガヌクレアーゼ、ＨＢＶ５−６メガヌクレアーゼ、ＨＢＶ７−８メガヌクレアーゼ、及びＨＢＶ１１−１２メガヌクレアーゼをコードし得る。別の特定の実施形態では、ポリシストロニックｍＲＮＡは、ＨＢＶ５−６メガヌクレアーゼ及びＨＢＶ１１−１２メガヌクレアーゼをコードするバイシストロンｍＲＮＡであり得る。
【００４０】
更なる実施形態において、本発明のポリシストロニックｍＲＮＡは、本明細書に記載の１以上の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ、並びにＨＢＶ感染細胞及び／又はＨＢＶ感染対象において治療上有益な効果を誘導する１以上の更なるタンパク質をコードし得る。
【００４１】
別の態様において、本発明は、本発明の任意の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む組換えＤＮＡ構築物を提供する。いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は、プロモータと、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列とを含むカセットを含む。他の実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は、２以上のカセットを含み、各カセットがプロモータと、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含み、各遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、本明細書に開示の異なるＨＢＶ認識配列に対する特異性を有する。特定の実施形態において、組換えＤＮＡ構築物は、２つのカセット、３つのカセット、４つのカセット
、又はそれ以上を含み得る。
【００４２】
他の実施形態において、組換えＤＮＡ構築物は、プロモータ及びポリシストロニック核酸配列を含むカセットを含み、プロモータが、ポリシストロニック核酸配列の発現を駆動して、標的細胞において本明細書に記載のポリシストロニックｍＲＮＡを生成する。
【００４３】
特定の実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は、本明細書に開示されている任意の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むウイルスベクターをコードする。そのような実施形態では、ウイルスベクターはレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり得る。特定の実施形態では、ウイルスベクターは組換えＡＡＶベクターであり得る。
【００４４】
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、プロモータと、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列とを含むカセットとを含む。他の実施形態では、ウイルスベクターは、２つ以上のカセットを含み、各カセットがプロモータと、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列とを含み、各遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、本明細書に開示の異なるＨＢＶ認識配列に対する特異性を有する。
【００４５】
他の実施形態では、ウイルスベクターは、プロモータ及びポリシストロニック核酸配列を含む１つのカセットを含み、プロモータが、ポリシストロニック核酸配列の発現を駆動して、標的細胞において本明細書に記載のポリシストロニックｍＲＮＡを生成する。
【００４６】
別の態様において、本発明は、本発明の任意の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むウイルスベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり得る。特定の実施形態では、ウイルスベクターは組換えＡＡＶベクターであり得る。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、プロモータと、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列とを含むカセットを含む。他の実施形態では、ウイルスベクターは、２以上のカセットを含み、各カセットがプロモータと、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列とを含み、各遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、本明細書に開示の異なるＨＢＶ認識配列に対する特異性を有する。
【００４７】
更なる実施形態においてウイルスベクターは、プロモータ及びポリシストロニック核酸配列を含む１つのカセットを含み、プロモータが、ポリシストロニック核酸配列の発現を駆動して、標的細胞において本明細書に記載のポリシストロニックｍＲＮＡを生成する。
【００４８】
別の態様では、本発明は、ＨＢＶによって引き起こされるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）又は肝細胞がんを有する対象を治療するための医薬組成物であって、医薬的に許容される担体と、（ａ）本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸、又は（ｂ）本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼタンパク質とを含む医薬組成物を提供し、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、Ｂ型肝炎ウイルスの少なくとも２つの遺伝子型のゲノムのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内の認識配列に対する特異性を有する。いくつかの実施形態では、認識配列は、Ｂ型肝炎ウイルスの少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又は少なくとも６つの遺伝子型のＯＲＦ内にある。そのような一実施形態では、認識配列は、ＨＢＶ遺伝子型Ａ（配列番号３）のＯＲＦ内にあるか、認識配列、及びＨＢＶの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又は少なくとも６つの他の遺伝子型を含むその単離体である。様々な実施形態において、更なるＨＢＶ遺伝子型は、遺伝子型Ｂ、Ｃ、Ｄ、
Ｅ、Ｆ、及び／若しくはＧ（それぞれ配列番号４〜９）、又は本明細書に記載の１以上のＨＢＶ認識配列を含むその単離体を含み得る。
【００４９】
いくつかの実施形態において、医薬組成物の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ又は医薬組成物の核酸配列によってコードされるものは、ポリメラーゼ（Ｐ）タンパク質、大表面（ｐｒｅＳ１／ｐｒｅＳ２／Ｓ）タンパク質、中表面（ｐｒｅＳ２／Ｓ）タンパク質、及び小表面（Ｓ）タンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする、少なくとも１つのＯＲＦ内の認識配列に対する特異性を有する。いくつかの実施形態では、認識配列は配列番号１０、１２、１４、又は１６を含み得る。
【００５０】
一実施形態において、本明細書に開示されている遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする医薬組成物の核酸配列は、本明細書に記載されているｍＲＮＡであり得る。いくつかのそのような実施形態において、ｍＲＮＡは、本明細書に記載のポリシストロニックｍＲＮＡであり得、その結果、本明細書に記載の２以上の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、インビボで標的細胞において発現される。
【００５１】
別の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に開示されている遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む本明細書に記載される組換えＤＮＡ構築物を含む。いくつかのそのような実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は、プロモータと、本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列とを含むカセットを含む。他の実施形態では、医薬組成物の組換えＤＮＡ構築物は、２以上のカセットを含み、各カセットがプロモータと、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列とを含み、各遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、本明細書に開示の異なるＨＢＶ認識配列に対する特異性を有する。特定の実施形態において、医薬組成物の組換えＤＮＡ構築物は、２つのカセット、３つのカセット、４つのカセット、又はそれ以上を含み得る。
【００５２】
他の実施形態では、医薬組成物の組換えＤＮＡ構築物は、プロモータ及びポリシストロニック核酸配列を含むカセットを含み、プロモータが、ポリシストロニック核酸配列の発現を駆動して、標的細胞においてインビボで本明細書に記載のポリシストロニックｍＲＮＡを生成し、本明細書に記載の２以上の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが標的細胞において発現されるようにする。
【００５３】
別の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に開示されている遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むウイルスベクターを含む。そのような一実施形態では、ウイルスベクターはレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、又はＡＡＶであり得る。特定の実施形態では、ウイルスベクターは組換えＡＡＶベクターであり得る。
【００５４】
いくつかのそのような実施形態では、ウイルスベクターは、プロモータと、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列とを含むカセットを含む。他の実施形態では、ウイルスベクターは、２以上のカセットを含み、各カセットがプロモータと、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列とを含み、各遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、本明細書に開示の異なるＨＢＶ認識配列に対する特異性を有する。
【００５５】
他のそのような実施形態では、ウイルスベクターは、プロモータ及びポリシストロニック核酸配列を含む１つのカセットを含み、プロモータが、ポリシストロニック核酸配列の発現を駆動して、標的細胞においてインビボで、本明細書に記載のポリシストロニックｍＲＮＡを生成し、本明細書に記載の２以上の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが標的細
胞において発現されるようにする。
【００５６】
そのような一実施形態では、医薬組成物は、配列番号１０を認識して切断する、本明細書に開示の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ（又はそれをコードする核酸）を含むことができる。特定の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号１８〜２１のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み得る。
【００５７】
別の実施形態では、医薬組成物は、配列番号１２を認識して切断する、本明細書に開示の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ（又はそれをコードする核酸）を含むことができる。特定の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号２２〜２８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み得る。
【００５８】
別の実施形態では、医薬組成物は、配列番号１４を認識して切断する、本明細書に開示の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ（又はそれをコードする核酸）を含むことができる。特定の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号２９〜３２のいずれか１つのアミノ酸配列を含み得る。
【００５９】
別の実施形態では、医薬組成物は、配列番号１６を認識して切断する、本明細書に開示の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ（又はそれをコードする核酸）を含むことができる。特定の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号３３〜３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含み得る。
【００６０】
様々な実施形態において、医薬組成物は、本明細書に記載の２以上の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼタンパク質を含むことができ、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、本明細書に記載の異なるＨＢＶ認識配列に対する特異性を有する。他の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする２以上の核酸を含むことができ、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、本明細書に記載の異なるＨＢＶ認識配列に対する特異性を有する。そのような実施形態では、２以上の核酸は、本明細書に記載のｍＲＮＡ、本明細書に記載の組換えＤＮＡ構築物、及び／又は本明細書に記載のウイルスベクターに含まれ得る。他の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の１以上の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼタンパク質、及び本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする１以上の核酸（即ち、ｍＲＮＡ、組換えＤＮＡ構築物、又はウイルスベクター）を含み得、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ及びコードされる遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、本明細書に記載された異なるＨＢＶ認識配列に対して特異性を有する。
【００６１】
更なる実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼタンパク質の組み合わせ、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸の組み合わせ（即ち、ｍＲＮＡ、組換えＤＮＡ構築物、ウイルスベクター）、又は遺伝子操作されたメガヌクレアーゼタンパク質と遺伝子操作されたメガヌクレアーゼタンパク質をコードする核酸の組み合わせを含み得、医薬組成物の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ及び／又はコードされた遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの組み合わせは、ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧ（配列番号３〜９）のそれぞれにおける認識配列、並びに本明細書に記載のＨＢＶ認識配列を含む各遺伝子型の単離体を認識して切断することができる。
【００６２】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、脂質ナノ粒子内に封入された本明細書に記載の１又は複数のｍＲＮＡを含むことができる。特定の実施形態において、医薬組成物の脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の異なるＨＢＶ認識配列に対する特異性を有する本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをそれぞれコードする、本明細書に記載の２以上のｍ
ＲＮＡを含み得る。特定の実施形態で、脂質ナノ粒子は、それぞれが異なるＨＢＶ認識配列に対して特異性を有する本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする、本明細書に記載の２つ、３つ、又は４つのｍＲＮＡを含み得る。他の実施形態では、医薬組成物の脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の異なるＨＢＶ認識配列に対する特異性を有する本発明の２以上の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをそれぞれコードする、本明細書に記載の１以上のポリシストロニックｍＲＮＡを含み得る。特定の実施形態で、脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の２つ、３つ、又は４つの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードするポリシストロニックｍＲＮＡを含むことができる。他の特定の実施形態で、脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の２以上のポリシストロニックｍＲＮＡを含むことができ、各々本発明の２以上の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、肝臓、特に肝細胞内での送達及び取り込みを増強する組成を有する。
【００６３】
別の態様において、本発明は、ＨＢＶを有する対象を治療するための方法を提供する。同様に、本明細書で提供されるのは、ＨＢＶのレベル及び／又は増殖を減少させるため、あるいはＨＢＶに関連する症状を減少させるための方法である。方法は、対象の標的細胞に、（ａ）遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸であって、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが標的細胞においてインビボで発現される核酸、又は（ｂ）遺伝子操作されたメガヌクレアーゼタンパク質を送達することを含み、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、Ｂ型肝炎ウイルスの少なくとも２つの遺伝子型のゲノムのＯＲＦ中の認識配列に対する特異性を有し、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、認識配列を認識して切断し、そのため標的細胞のＨＢＶゲノムを切断する。この方法は、対象におけるＨＢＶの感染及び／又は増殖を減少又は排除することができる。
【００６４】
別の態様において、本発明は、ＨＢＶによって引き起こされたＨＣＣを有する対象を治療するための方法を提供する。方法は、対象の標的細胞に、（１）（ａ）遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸であって、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが標的細胞においてインビボで発現される核酸、又は（ｂ）遺伝子操作されたメガヌクレアーゼタンパク質、及び（２）自殺遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列及びメガヌクレアーゼ切断部位に隣接する配列と相同な配列を含む核酸を送達することを含み、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、Ｂ型肝炎ウイルスの少なくとも２つの遺伝子型のゲノムのＯＲＦ中の認識配列に対する特異性を有し、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、認識配列を認識して切断し、そのため標的細胞のＨＢＶゲノムを切断し、自殺遺伝子は、相同組換えによって切断されたＨＢＶゲノムに挿入され、自殺遺伝子の発現は標的細胞を死滅させる。
【００６５】
いくつかの実施形態では、自殺遺伝子は標的細胞に対して直接致死性である。いくつかのそのような態様において、直接致死性な自殺遺伝子は、毒性ポリペプチド又はアポトーシス促進タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、自殺遺伝子は標的細胞に対して間接致死性であり、標的細胞を死滅させるように対象自身の免疫系に指示する。いくつかのそのような態様において、間接致死性な自殺遺伝子は、対象の免疫系によって異物であると認識され、体液性又は細胞性免疫応答によって標的化される細胞表面タンパク質をコードする。他のそのような実施形態において、間接致死性な自殺遺伝子は、ＭＨＣクラスＩ分子によって提示され、対象の免疫系によって異物であると認識され、細胞傷害性免疫応答によって標的化されるポリペプチドをコードする。
【００６６】
ＨＢＶ感染又はＨＣＣの治療方法のいくつかの実施形態では、認識配列は少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又は少なくとも６つの遺伝子型のＢ型肝炎ウイルスのＯＲＦ内に見られる。そのような一実施形態では、認識配列はＢ型肝炎ウイルスの遺伝子型Ａ（配列番号３）のＯＲＦ内にある。そのような実施形態は、配列番号３と異なる
が本明細書に記載の１又は複数のＨＢＶメガヌクレアーゼ認識配列を含む、遺伝子型ＡのＢ型肝炎ウイルス単離体を含む。更なるそのような態様において、認識配列は遺伝子型ＡのＯＲＦ並びに遺伝子型Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧ（それぞれ配列番号４〜９）の１又は複数のＯＲＦ内にある。そのような実施形態は、配列番号３〜９と異なるが本明細書に記載の１又は複数のＨＢＶメガヌクレアーゼ認識配列を含む、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧのＢ型肝炎ウイルス単離体を含む。
【００６７】
ＨＢＶ感染又はＨＣＣの治療方法のそのような実施形態において、認識配列は、ポリメラーゼ（Ｐ）タンパク質、大表面（ｐｒｅＳ１／ｐｒｅＳ２／Ｓ）タンパク質、中表面（ｐｒｅＳ２／Ｓ）タンパク質、及び小表面（Ｓ）タンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする、少なくとも１つのＯＲＦ内にあってよい。いくつかの実施形態において、認識配列は、配列番号１０（即ち、ＨＢＶ１−２認識配列）、配列番号１２（即ち、ＨＢＶ５−６認識配列）、配列番号１４（即ち、ＨＢＶ７−８認識配列）、又は配列番号１６（即ち、ＨＢＶ１１−１２認識配列）を含み得る。
【００６８】
ＨＢＶ感染症又はＨＣＣの治療方法の特定の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼタンパク質又はコードされた遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼである。
【００６９】
更なる実施形態において、ＨＢＶ感染又はＨＣＣの治療方法は、少なくとも、医薬的に許容される担体、及び（ａ）本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸であって、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが標的細胞においてインビボで発現される核酸、又は（ｂ）本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼタンパク質を含む本明細書に記載の本発明の任意の医薬組成物を対象に投与することを含む。
【００７０】
ＨＢＶ感染又はＨＣＣの治療方法のいくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ又は遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸を標的肝細胞の細胞に送達することができる。特定の実施形態では、有効量の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ又は遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸を、標的肝細胞の細胞に送達することができる。
【００７１】
特定の実施形態では、肝細胞の細胞への送達はエクスビボで生じ、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ又は遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸が送達された有効量の肝細胞の細胞が、対象に投与される。
【００７２】
いくつかの実施形態では、肝毒性タンパク質、又は肝毒性タンパク質をコードする核酸若しくはＡＡＶが、本明細書に開示されている医薬組成物と共に投与される。
【００７３】
本方法の特定の実施形態では、第１の認識配列は配列番号１０を含み得る。いくつかのそのような実施形態において、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号１０を認識し切断する本発明のいずれかの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼであり得る。特定の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号１８〜２１のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み得る。
【００７４】
方法の別の実施形態では、第１の認識配列は配列番号１２を含み得る。いくつかのそのような実施形態において、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号１２を認識し切断する本発明のいずれかの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼであり得る。特定の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号２２〜２８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み得る。
【００７５】
方法の他の実施形態では、第１の認識配列は配列番号１４を含み得る。いくつかのそのような実施形態において、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号１４を認識し切断する本発明のいずれかの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼであり得る。特定の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号２９〜３２のいずれか１つのアミノ酸配列を含み得る。
【００７６】
方法の他の実施形態では、第１の認識配列は配列番号１６を含み得る。いくつかのそのような実施形態において、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号１６を認識し切断する本発明のいずれかの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼであり得る。特定の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号３３〜３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含み得る。
【００７７】
本方法の特定の実施形態では、対象はヒト等の哺乳動物であり得る。
【００７８】
別の態様では、本発明は医薬品として使用するための本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを提供する。本発明は更に、ＨＢＶを治療するため、ＨＢＶのレベル若しくは増殖を減少させるため、ＨＢＶに関連する症状を減少させるため、又はＨＣＣを治療するための医薬品の製造において、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを使用することを提供する。
【００７９】
別の態様では、本発明は医薬品として使用するための単離されたポリヌクレオチドを提供し、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に開示されている遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む。本発明は更に、ＨＢＶを治療するため、ＨＢＶのレベル若しくは増殖を減少させるため、ＨＢＶに関連する症状を減少させるため、又はＨＣＣを治療するための医薬品の製造において、単離されたポリヌクレオチドを使用することを提供する。
【００８０】
別の態様では、本発明は、医薬品として使用するための組換えＡＡＶベクターを提供し、組換えＡＡＶベクターは単離されたポリヌクレオチドを含み、単離されたポリヌクレオチドは本明細書に開示の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む。本発明は更に、ＨＢＶを治療するため、ＨＢＶのレベル若しくは増殖を減少させるため、ＨＢＶに関連する症状を軽減するため、又はＨＣＣを治療するための医薬品の製造において組換えＡＡＶベクターを使用することを提供し、組換えＡＡＶベクターは、単離されたポリヌクレオチドを含み、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に開示されている遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む。
【００８１】
本発明の前述及び他の態様及び実施形態は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲を参照することによって、より十分に理解することができる。明確にするために別々の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供することもできる。実施形態の全ての組み合わせは、本発明によって具体的に包含され、あたかもそれぞれの、また全ての組み合わせが個別に且つ明示的に開示されているかのように、本明細書に開示されている。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈で説明されている本発明の様々な特徴は、別々に又は任意の適切なサブコンビネーションで提供することもできる。実施形態に列挙された特徴の全てのサブコンビネーションはまた、本発明によって具体的に包含され、あたかもそれぞれの、また全てのそのようなサブコンビネーションが本明細書に個々にそして明示的に開示されたかのように、本明細書に開示される。本明細書に開示された本発明の各態様の実施形態は、必要な変更を加えて本発明の他の各々の態様に適用される。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】ＨＢＶゲノムのゲノム地図を示し、全てのＯＲＦを同定する。ウイルス粒子は、各鎖の５’領域にまたがって、直接反復配列（ＤＲ１及びＤＲ２）が隣接している凝集性の重複を有する、部分的に二本鎖のゲノム（破線で示す）を有する。遺伝子Ｓは、ウイルスエンベロープ内の膜貫通タンパク質である主要Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）タンパク質及びそのグリコシル化パートナーをコードする。Ｓ遺伝子の上流のインフレーム配列はｐｒｅ−Ｓドメインをコードし、これはＳ配列と共に翻訳されて、肝細胞感染のためのウイルス受容体を含むｐｒｅ−Ｓ及びＳポリペプチド（中型及び大型タンパク質）を作る。遺伝子Ｃはウイルスのヌクレオカプシドを形成するＢ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）をコードする。Ｐ領域は、ウイルスの複製に必要なＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性及びＲＮａｓｅ  Ｈ活性も有するウイルス逆転写酵素をコードする。ＨＢＶはＤＮＡウイルスであるが、プレゲノムＲＮＡ中間体を介して複製する。最後に、Ｘ遺伝子はウイルスの小さな調節タンパク質、Ｂ型肝炎ｘ（ＨＢｘ）抗原をコードする。ＨＢｘは、ウイルス遺伝子の発現及び複製を刺激し、ウイルス感染細胞を免疫介在性の破壊から保護し、肝細胞がんの発症に寄与するトランス活性化タンパク質である。
【図２】ＨＢＶゲノムの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ認識配列。Ａ）本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼによって標的化された各認識配列は、２つの認識した半分の部位を含む。各々の認識した半分の部位は、４塩基対の中央配列によって分離された９塩基対を含む。ＨＢＶ１−２認識配列（配列番号１０）は、ＨＢＶ１及びＨＢＶ２と呼ばれる２つの認識した半分の部位を含む。ＨＢＶ５−６認識配列（配列番号１２）は、ＨＢＶ５及びＨＢＶ６と呼ばれる２つの認識した半分の部位を含む。ＨＢＶ７−８認識配列（配列番号１４）は、ＨＢＶ７及びＨＢＶ８と呼ばれる２つの認識した半分の部位を含む。ＨＢＶ１１−１２認識配列（配列番号１６）は、ＨＢＶ１１及びＨＢＶ１２と呼ばれる２つの認識した半分の部位を含む。
【図３】ＨＢＶ遺伝子型Ａのゲノム並びにゲノム内のＨＢＶ１−２、ＨＢＶ５−６、ＨＢＶ７−８、及びＨＢＶ１１−１２の認識配列の位置の図解。ＨＢＶ１−２及びＨＢＶ５−６認識配列は両方とも、ＨＢＶゲノムの４つのＯＲＦ内、Ｐ、ｐｒｅＳ１／ｐｒｅＳ２／Ｓ、ｐｒｅＳ２／Ｓ、及びＳに位置している。ＨＢＶ７−８及びＨＢＶ１１−１２認識配列はそれぞれ、ポリメラーゼをコードするＯＲＦ内に位置する。
【図４】ＨＢＶ遺伝子型Ａ〜ＧにおけるＨＢＶ認識配列のアラインメント。本発明の標的となる認識配列は、複数のＨＢＶ遺伝子型にわたって保存されている。ＨＢＶ１−２認識配列は、配列番号３に示されるＨＢＶ遺伝子型Ａの残基１８５〜２０６にわたり、この認識配列は遺伝子型Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、及びＧにおいて完全に保存されている。遺伝子型Ｄは、第１の半分の部位の−４位におけるＧとＴの単一ヌクレオチドの相違を含む。ＨＢＶ５−６認識配列は、配列番号３に示されるＨＢＶ遺伝子型Ａの残基７４２〜７６３にわたり、この認識配列は遺伝子型Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、及びＧにおいて完全に保存されている。遺伝子型Ｆは、第１の半分の部位の−３位におけるＧとＣの単一ヌクレオチドの相違を含む。ＨＢＶ７−８認識配列は、配列番号３に示されるＨＢＶ遺伝子型Ａの残基１１８３〜１２０４にわたり、この認識配列は遺伝子型Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、及びＧにおいて完全に保存されている。遺伝子型Ｅは、第１の半分の部位の−１位におけるＧとＣの単一ヌクレオチドの相違を含む。ＨＢＶ１１−１２認識配列は、配列番号３に示されるＨＢＶ遺伝子型Ａの残基１２５９〜１２８０にわたり、この認識配列は遺伝子型Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧにおいて完全に保存されている。
【図５】本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは２つのサブユニットを含み、ＨＶＲ１領域を含む第１のサブユニットは第１の認識した半分の部位（例えばＨＢＶ１、ＨＢＶ５、ＨＢＶ７、又はＨＢＶ１１）に結合し、ＨＶＲ２領域を含む第２のサブユニットは第２の認識した半分の部位（例えば、ＨＢＶ２、ＨＢＶ６、ＨＢＶ８、又はＨＢＶ１２）に結合する。遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが一本鎖メガヌクレアーゼである実施形態では、ＨＶＲ１領域を含む第１のサブユニットは、Ｎ末端又はＣ末端サブユニットのいずれかとして位置付けることができる。同様に、ＨＶＲ２領域を含む第２のサブユニットは、Ｎ末端又はＣ末端サブユニットのいずれかとして位置付けることができる。
【図６】Ｂ型肝炎ウイルスの少なくとも２つの遺伝子型のゲノムのＯＲＦを標的とする遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを評価するためのＣＨＯ細胞におけるレポーターアッセイの概略図。本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼについて、レポーターカセットが細胞のゲノムに安定的に組み込まれているＣＨＯ細胞株が産生された。レポーターカセットは、５’から３’への順序で、ＳＶ４０早期プロモータ；ＧＦＰ遺伝子の５’２／３；本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの認識配列（例えば、ＨＢＶ１−２認識配列）；ＣＨＯ−２３／２４メガヌクレアーゼの認識配列（国際公開第２０１２／１６７１９２号パンフレット）；及びＧＦＰ遺伝子の３’２／３を含んだ。このカセットで安定に形質移入された細胞は、ＤＮＡ切断誘導剤の非存在下ではＧＦＰを発現しなかった。メガヌクレアーゼは、各メガヌクレアーゼをコードするプラスミドＤＮＡ又はｍＲＮＡの形質導入によって導入された。メガヌクレアーゼ認識配列のいずれかにおいてＤＮＡの切断が誘導された場合、ＧＦＰ遺伝子の重複領域は互いに組換えられて機能的ＧＦＰ遺伝子を生成した。次に、メガヌクレアーゼによるゲノム切断の頻度の間接的な尺度として、ＧＦＰ発現細胞の割合をフローサイトメトリーによって判定することができた。
【図７】ＣＨＯ細胞レポーターアッセイにおける遺伝子、少なくとも２つの遺伝子型のＢ型肝炎ウイルスのゲノムのＯＲＦ中の認識配列を認識して切断するための遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの効率。配列番号１８〜３９に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＨＢＶ１−２認識配列（配列番号１０）、ＨＢＶ５−６認識配列（配列番号１２）、ＨＢＶ７−８認識配列（配列番号１４）又はＨＢＶ１１−１２認識配列（配列番号１６）を標的とするように遺伝子操作され、ＣＨＯ細胞レポーターアッセイにおける有効性についてスクリーニングした。示された結果は、各アッセイにおいて観察されたＧＦＰ発現細胞の割合を提供し、これは標的認識配列又はＣＨＯ−２３／２４認識配列を切断するための各メガヌクレアーゼの有効性を示す。陰性対照（ｂｓ）を各アッセイに更に含めた。図７Ａ；ＨＢＶ１−２認識配列を標的とするメガヌクレアーゼを示す。図７Ｂ；ＨＢＶ５−６認識配列を標的とするメガヌクレアーゼを示す。図７Ｃ；ＨＢＶ７−８認識配列を標的とするメガヌクレアーゼを示す。図７Ｄ；ＨＢＶ１１−１２認識配列を標的とするメガヌクレアーゼを示す。
【図８】ＣＨＯ細胞レポーターアッセイにおける遺伝子、少なくとも２つの遺伝子型のＢ型肝炎ウイルスのゲノムのＯＲＦ中の認識配列を認識して切断するための遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの効率。配列番号１８〜３９に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＨＢＶ１−２認識配列（配列番号１０）、ＨＢＶ５−６認識配列（配列番号１２）、ＨＢＶ７−８認識配列（配列番号１４）又はＨＢＶ１１−１２認識配列（配列番号１６）を標的とするように遺伝子操作され、ヌクレオフェクション後１２日にわたる複数の時点でＣＨＯ細胞レポーターアッセイにおける有効性についてスクリーニングした。示された結果は、１２日間の分析期間にわたって各アッセイにおいて観察されたＧＦＰ発現細胞のパーセンテージを提供し、これは時間の関数として標的認識配列又はＣＨＯ−２３／２４認識配列を切断するための各メガヌクレアーゼの有効性を示す。図８Ａ；ＨＢＶ１−２認識配列を標的とするメガヌクレアーゼを示す。図８Ｂ；ＨＢＶ５−６認識配列を標的とするメガヌクレアーゼを示す。図８Ｃ；ＨＢＶ７−８認識配列を標的とするメガヌクレアーゼを示す。図８Ｄ；ＨＢＶ１１−１２認識配列を標的とするメガヌクレアーゼを示す。
【図９】ＨＢＶメガヌクレアーゼの、大腸菌レポーターシステムにおいてエピソームＤＮＡプラスミド内の認識配列を認識して切断する能力についての評価。図９Ａ；プラスミドｐＡＲＣＵＳ及びプラスミドｐＨＢＶａを示す。図９Ｂ；各選択プレートに存在するコロニーの数を示しており、ＨＢＶメガヌクレアーゼがｐＨＢＶａプラスミドを切断し得る証拠が得られた。
【図１０】ＡＤ３８細胞におけるＨＢＶメガヌクレアーゼの評価。ＨＢＶゲノムを発現し、ＨＢｓＡｇを分泌するＡＤ３８細胞を、ＨＢＶ５−６×．３３又はＨＢＶ１１−１２×．２６メガヌクレアーゼをコードするプラスミドＤＮＡで形質移入した。この実験では、対照として、赤色蛍光タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡを使用した。形質移入後３日目及び７日目に、細胞の上清を回収し、ＥＬＩＳＡによってＨＢｓＡｇの存在についてアッセイした。
【図１１】ＡＤ３８細胞におけるＨＢＶメガヌクレアーゼの評価。ＨＢＶゲノムを発現し、ＨＢｓＡｇを分泌するＡＤ３８細胞を、ＨＢＶ５−６×．３３メガヌクレアーゼ又はＨＢＶ１１−１２×．２６メガヌクレアーゼをコードするレンチウイルスで形質導入するか、その２つの組み合わせで形質導入した。この実験では、対照として、赤色蛍光タンパク質をコードするレンチウイルスを使用した。１、２、及び４のＭＯＩを調べた。形質導入後７日目に、細胞の上清を回収し、ＥＬＩＳＡによりＨＢｓＡｇの存在についてアッセイした。
【図１２】ＡＤ３８細胞におけるＨＢＶメガヌクレアーゼの評価。ＨＢＶゲノムを発現し、ＨＢｓＡｇを分泌するＡＤ３８細胞を、ＨＢＶ５−６×．３３メガヌクレアーゼ（ＬＶ２２４）、ＨＢＶ１１−１２×．２６メガヌクレアーゼ（ＬＶ２２５）、又は赤色蛍光タンパク質（ＬＶ２１２）をコードするレンチウイルスで形質導入した。４のＭＯＩを調べ、形質導入後７日目に細胞上清を回収し、ＨＢｓＡｇの存在及び細胞外ＨＢＶ  ＤＮＡのコピー数についてアッセイした。更に、細胞溶解物を形質導入後７日目に得て、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡの細胞内のコピー数について分析した。図１２Ａ；細胞培養培地中のＨＢｓＡｇ濃度を示す。図１２Ｂ；細胞培養培地中の細胞外ＨＢＶ  ＤＮＡのコピー数を示す。図１２Ｃ；細胞溶解物中の細胞内ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡコピー数を示す。
【図１３】ＨＢＶ感染初代ヒト肝細胞におけるＨＢＶメガヌクレアーゼの評価。ＲＦＰ、ＨＢＶ５−６×．３３又はＨＢＶ１１−１２×．２６を発現するレンチウイルスを作製し、ＨＢＶ感染初代ヒト肝細胞を形質導入して、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの産生に対するメガヌクレアーゼの影響を判定した。初代ヒト肝細胞を播種し、２４時間後にＨＢＶに感染させた。感染後１日目に細胞を洗浄し、２４時間後（感染後２日目）に、ＲＦＰ、ＨＢＶ５−６×．３３、ＨＢＶ１１−１２×．２６をコードするレンチウイルス、又はＨＢＶメガヌクレアーゼをコードするレンチウイルスの１：１の混合物のいずれかで形質導入した。更なる対照として、感染させた細胞をＤＭＳＯで処理した。細胞の上清を回収し、形質導入後４日目、８日目、１１日目、及び１３日目に培地を交換した。各時点で、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇをＥＬＩＳＡにより細胞の上清で測定した。また、上清の中の細胞外ＤＮＡを感染後１３日目に測定した。一般に、レンチウイルス形質導入がＨＢｓＡｇ又はＨＢｅＡｇのいずれかの分泌に影響を及ぼすかどうかを判断するために、ＲＦＰをコードするレンチウイルスで形質導入した細胞から得た細胞の上清を、ＤＭＳＯで処理した細胞と比較した。図１３Ａ；ＲＦＰをコードするレンチウイルスによる形質導入が、ＭＯＩ又は１．２５、２．５、若しくは５でＨＢｓＡｇの発現にほとんど影響を及ぼさなかったことを示す。図１３Ｂ；ＲＦＰをコードするレンチウイルスによる形質導入が、ＭＯＩ又は１．２５、２．５、若しくは５でＨＢｅＡｇの発現にほとんど影響を及ぼさなかったことを示す。図１３Ｃ；ＲＦＰをコードするレンチウイルスによる形質導入が、ＭＯＩ又は１．２５、２．５、若しくは５でＨＢＶ  ＤＮＡの発現にほとんど影響を及ぼさなかったことを示す。
【図１４】ＨＢＶ感染初代ヒト肝細胞におけるＨＢＶメガヌクレアーゼの評価。ＲＦＰ、ＨＢＶ５−６×．３３又はＨＢＶ１１−１２×．２６を発現するレンチウイルスを作製し、ＨＢＶ感染初代ヒト肝細胞を形質導入して、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの産生に対するメガヌクレアーゼの影響を判定した。初代ヒト肝細胞を播種し、２４時間後にＨＢＶに感染させた。感染後１日目に細胞を洗浄し、２４時間後（感染後２日目）に、ＲＦＰ、ＨＢＶ５−６×．３３、ＨＢＶ１１−１２×．２６をコードするレンチウイルス、又はＨＢＶメガヌクレアーゼをコードするレンチウイルスの１：１の混合物のいずれかで形質導入した。更なる対照として、感染させた細胞をＤＭＳＯで処理した。細胞の上清を回収し、形質導入後４日目、８日目、１１日目、及び１３日目に培地を交換した。各時点で、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇをＥＬＩＳＡにより細胞の上清で測定した。図１４Ａ；２．５のＭＯＩでの形質導入後の細胞培養培地におけるＨＢｓＡｇを示す。図１４Ｂ；１．２５のＭＯＩでの形質導入後の細胞培養培地におけるＨＢｓＡｇを示す。図１４Ｃ；２．５のＭＯＩでの形質導入後の細胞培養培地におけるＨＢｅＡｇを示す。図１４Ｄ；１．２５のＭＯＩでの形質導入後の細胞培養培地におけるＨＢｅＡｇを示す。
【図１５】脂質ナノ粒子封入ｍＲＮＡの肝臓への送達。マウスの肝臓で発現されるマウスＣＭＰ−ＮｅｕＡｃヒドロラーゼ（Ｃｍａｈ）遺伝子の認識配列に対して特異性を有する遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを発現させた。ＣｍａｈメガヌクレアーゼをコードするＡＲＣＡでキャップされたｍＲＮＡを、３つの異なる市販のＬＮＰ製剤に封入した。ＬＮＰ封入ｍＲＮＡを、ＩＶ注射によりＣＤ−１マウスに投与し、６日後に肝臓を採取した。全肝臓ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を単離し、Ｃｍａｈ遺伝子における挿入／欠失（インデル）突然変異の頻度を、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７Ｅ）アッセイ及びディープシーケンシングを用いて判定した。
【００８３】
配列の簡単な説明
配列番号１は、緑藻クラミドモナスからの野生型Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
【００８４】
配列番号２は、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧのアミノ酸配列を示す。
【００８５】
配列番号３は、ＨＢＶ遺伝子型Ａのアミノ酸配列を示す。
【００８６】
配列番号４は、ＨＢＶ遺伝子型Ｂのアミノ酸配列を示す。
【００８７】
配列番号５は、ＨＢＶ遺伝子型Ｃのアミノ酸配列を示す。
【００８８】
配列番号６は、ＨＢＶ遺伝子型Ｄのアミノ酸配列を示す。
【００８９】
配列番号７は、ＨＢＶ遺伝子型Ｅのアミノ酸配列を示す。
【００９０】
配列番号８は、ＨＢＶ遺伝子型Ｆのアミノ酸配列を示す。
【００９１】
配列番号９は、ＨＢＶ遺伝子型Ｇのアミノ酸配列を示す。
【００９２】
配列番号１０は、ＨＢＶ１−２認識配列（センス）のアミノ酸配列を示す。
【００９３】
配列番号１１は、ＨＢＶ１−２認識配列（アンチセンス）のアミノ酸配列を示す。
【００９４】
配列番号１２は、ＨＢＶ５−６認識配列（センス）のアミノ酸配列を示す。
【００９５】
配列番号１３は、ＨＢＶ５−６認識配列（アンチセンス）のアミノ酸配列を示す。
【００９６】
配列番号１４は、ＨＢＶ７−８認識配列（センス）のアミノ酸配列を示す。
【００９７】
配列番号１５は、ＨＢＶ７−８認識配列（アンチセンス）のアミノ酸配列を示す。
【００９８】
配列番号１６は、ＨＢＶ１１−１２認識配列（センス）のアミノ酸配列を示す。
【００９９】
配列番号１７は、ＨＢＶ１１−１２認識配列（アンチセンス）のアミノ酸配列を示す。
【０１００】
配列番号１８は、ＨＢＶ１−２×．２メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
【０１０１】
配列番号１９は、ＨＢＶ１−２×．１４メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
【０１０２】
配列番号２０は、ＨＢＶ１−２×．６８メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
【０１０３】
配列番号２１は、ＨＢＶ１−２×．９３メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
【０１０４】
配列番号２２は、ＨＢＶ５−６×．３３メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
【０１０５】
配列番号２３は、ＨＢＶ５−６×．８４メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
【０１０６】
配列番号２４は、ＨＢＶ５−６×．９０メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
【０１０７】
配列番号２５は、ＨＢＶ５−６×．４メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
【０１０８】
配列番号２６は、ＨＢＶ５−６×．５メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
【０１０９】
配列番号２７は、ＨＢＶ５−６×．６８メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
【０１１０】
配列番号２８は、ＨＢＶ５−６×．７９メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
【０１１１】
配列番号２９は、ＨＢＶ７−８×．２メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
【０１１２】
配列番号３０は、ＨＢＶ７−８×．９メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
【０１１３】
配列番号３１は、ＨＢＶ７−８×．１７メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
【０１１４】
配列番号３２は、ＨＢＶ７−８×．４４メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
【０１１５】
配列番号３３は、ＨＢＶ１１−１２×．２６メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
【０１１６】
配列番号３４は、ＨＢＶ１１−１２×．９メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
【０１１７】
配列番号３５は、ＨＢＶ１１−１２×．１３メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
【０１１８】
配列番号３６は、ＨＢＶ１１−１２×．１６メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
【０１１９】
配列番号３７は、ＨＢＶ１１−１２×．２７メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
【０１２０】
配列番号３８は、ＨＢＶ１１−１２×．４１メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
【０１２１】
配列番号３９は、ＨＢＶ１１−１２×．４８メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
【０１２２】
配列番号４０は、ＨＢＶ１−２×．２メガヌクレアーゼＨＢＶ１結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
【０１２３】
配列番号４１は、ＨＢＶ１−２×．１４メガヌクレアーゼＨＢＶ１結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
【０１２４】
配列番号４２は、ＨＢＶ１−２×．６８メガヌクレアーゼＨＢＶ１結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
【０１２５】
配列番号４３は、ＨＢＶ１−２×．９３メガヌクレアーゼＨＢＶ１結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
【０１２６】
配列番号４４は、ＨＢＶ１−２×．２メガヌクレアーゼＨＢＶ２結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
【０１２７】
配列番号４５は、ＨＢＶ１−２×．１４メガヌクレアーゼＨＢＶ２−結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
【０１２８】
配列番号４６は、ＨＢＶ１−２×．６８メガヌクレアーゼＨＢＶ２結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
【０１２９】
配列番号４７は、ＨＢＶ１−２×．９３メガヌクレアーゼＨＢＶ２結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
【０１３０】
配列番号４８は、ＨＢＶ５−６×．３３メガヌクレアーゼＨＢＶ５結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
【０１３１】
配列番号４９は、ＨＢＶ５−６×．８４メガヌクレアーゼＨＢＶ５結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
【０１３２】
配列番号５０は、ＨＢＶ５−６×．９０メガヌクレアーゼＨＢＶ５結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
【０１３３】
配列番号５１は、ＨＢＶ５−６×．４メガヌクレアーゼＨＢＶ５結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
【０１３４】
配列番号５２は、ＨＢＶ５−６×．５メガヌクレアーゼＨＢＶ５結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
【０１３５】
配列番号５３は、ＨＢＶ５−６×．６８メガヌクレアーゼＨＢＶ５結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
【０１３６】
配列番号５４は、ＨＢＶ５−６×．７９メガヌクレアーゼＨＢＶ５結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
【０１３７】
配列番号５５は、ＨＢＶ５−６×．３３メガヌクレアーゼＨＢＶ６結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
【０１３８】
配列番号５６は、ＨＢＶ５−６×．８４メガヌクレアーゼＨＢＶ６結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
【０１３９】
配列番号５７は、ＨＢＶ５−６×．９０メガヌクレアーゼＨＢＶ６結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
【０１４０】
配列番号５８は、ＨＢＶ５−６×．４メガヌクレアーゼＨＢＶ６結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
【０１４１】
配列番号５９は、ＨＢＶ５−６×．５メガヌクレアーゼＨＢＶ６結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
【０１４２】
配列番号６０は、ＨＢＶ５−６×．６８メガヌクレアーゼＨＢＶ６結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
【０１４３】
配列番号６１は、ＨＢＶ５−６×．７９メガヌクレアーゼＨＢＶ６結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
【０１４４】
配列番号６２は、ＨＢＶ７−８×．２メガヌクレアーゼＨＢＶ７結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
【０１４５】
配列番号６３は、ＨＢＶ７−８×．９メガヌクレアーゼＨＢＶ７結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
【０１４６】
配列番号６４は、ＨＢＶ７−８×．１７メガヌクレアーゼＨＢＶ７結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
【０１４７】
配列番号６５は、ＨＢＶ７−８×．４４メガヌクレアーゼＨＢＶ７結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
【０１４８】
配列番号６６は、ＨＢＶ７−８×．２メガヌクレアーゼＨＢＶ８結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
【０１４９】
配列番号６７は、ＨＢＶ７−８×．９メガヌクレアーゼＨＢＶ８結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
【０１５０】
配列番号６８は、ＨＢＶ７−８×．１７メガヌクレアーゼＨＢＶ８−結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
【０１５１】
配列番号６９は、ＨＢＶ７−８×．４４メガヌクレアーゼＨＢＶ８結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
【０１５２】
配列番号７０は、ＨＢＶ１１−１２×．２６メガヌクレアーゼＨＢＶ１１結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
【０１５３】
配列番号７１は、ＨＢＶ１１−１２×．９メガヌクレアーゼＨＢＶ１１結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
【０１５４】
配列番号７２は、ＨＢＶ１１−１２×．１３メガヌクレアーゼＨＢＶ１１結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
【０１５５】
配列番号７３は、ＨＢＶ１１−１２×．１６メガヌクレアーゼＨＢＶ１１結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
【０１５６】
配列番号７４は、ＨＢＶ１１−１２×．２７メガヌクレアーゼＨＢＶ１１結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
【０１５７】
配列番号７５は、ＨＢＶ１１−１２×．４１メガヌクレアーゼＨＢＶ１１結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
【０１５８】
配列番号７６は、ＨＢＶ１１−１２×．４８メガヌクレアーゼＨＢＶ１１結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
【０１５９】
配列番号７７は、ＨＢＶ１１−１２×．２６メガヌクレアーゼＨＢＶ１２結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
【０１６０】
配列番号７８は、ＨＢＶ１１−１２×．９メガヌクレアーゼＨＢＶ１２結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
【０１６１】
配列番号７９は、ＨＢＶ１１−１２×．１３メガヌクレアーゼＨＢＶ１２結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
【０１６２】
配列番号８０は、ＨＢＶ１１−１２×．１６メガヌクレアーゼＨＢＶ１２結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
【０１６３】
配列番号８１は、ＨＢＶ１１−１２×．２７メガヌクレアーゼＨＢＶ１２結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
【０１６４】
配列番号８２は、ＨＢＶ１１−１２×．４１メガヌクレアーゼＨＢＶ１２結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
【０１６５】
配列番号８３は、ＨＢＶ１１−１２×．４８メガヌクレアーゼＨＢＶ１２結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
【０１６６】
配列番号８４は、第１の半分の部位の−４位でのＧからＣへの置換を伴うＨＢＶ遺伝子型ＡのＨＢＶ１−２認識配列に対応する、ＨＢＶ遺伝子型Ｄに存在する認識配列の核酸配列を示す。
【０１６７】
配列番号８５は、第１の半分の部位の−３位にてＧからＣへの置換を伴うＨＢＶ遺伝子型ＡのＨＢＶ５−６認識配列に対応する、ＨＢＶ遺伝子型Ｆに存在する認識配列の核酸配列を示す。
【０１６８】
配列番号８６は、第１の半分の部位の−１位にてＣからＴへの置換を伴うＨＢＶ遺伝子型ＡのＨＢＶ７−８認識配列に対応する、ＨＢＶ遺伝子型Ｅに存在する認識配列の核酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１６９】
１．１  基準及び定義
【０１７０】
本明細書で言及している特許及び科学文献は、当業者に利用可能な知識を確立する。本明細書に引用されている、発行された米国特許、許可出願、公開された外国出願、及びＧｅｎＢａｎｋデータベースの配列を含む参考文献は、あたかも各々が具体的且つ個別に参照により組み込まれることが示されているような程度で、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７１】
本発明は様々な形で具現化することができ、本明細書に記載の実施形態に限定されるものと解釈されるべきではない。むしろ、本開示が徹底的且つ完全なものであり、本発明の範囲を当業者に十分に伝えるようにするために、これらの実施形態が提供されている。例えば、一実施形態に関して例示した特徴を他の実施形態に組み込むことができ、特定の実施形態に関して例示した特徴を、当該の実施形態から削除することができる。更に、本明細書で示唆している実施形態に対する多数の変形及び追加は、本開示からみて当業者には
明らかであり、それらは本発明から逸脱しない。
【０１７２】
他に定義されない限り、本明細書で使用している全ての専門用語及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本明細書の本発明の説明で使用している専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、本発明を限定することを意図してはいない。
【０１７３】
本明細書に記載の全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１７４】
本明細書で使用しているとき、「ａ」、「ａｎ」、又は「ｔｈｅ」は、１又は複数を意味し得る。例えば、「ａ  ｃｅｌｌ（細胞）」は、単一の細胞又は多数の細胞を意味し得る。
【０１７５】
本明細書で使用しているとき、他に具体的に示されない限り、「又は」という語は、「及び／又は」の包括的な意味で使用しており、「いずれか／又は」の排他的な意味では使用していない。
【０１７６】
本明細書で使用しているとき、「ヌクレアーゼ」及び「エンドヌクレアーゼ」の用語は、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断する天然に存在する又は遺伝子操作された酵素について言及するために、互換的に使用されている。
【０１７７】
本明細書で使用しているとき、「メガヌクレアーゼ」の用語は、１２塩基対より大きい認識配列で二本鎖ＤＮＡに結合するエンドヌクレアーゼのことを示す。好ましくは、本発明のメガヌクレアーゼの認識配列は２２塩基対である。メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＣｒｅＩに由来するエンドヌクレアーゼであり得、例えば、ＤＮＡの結合特異性、ＤＮＡの切断活性、ＤＮＡの結合親和性、又は二量体化の特性に関して、天然のＩ−ＣｒｅＩに対して改変されているＩ−ＣｒｅＩの遺伝子操作された変異体を示すことができる。そのような改変されたＩ−ＣｒｅＩの変異体を産生するための方法は、当技術分野において公知である（例えば、国際公開第２００７／０４７８５９号パンフレット）。本明細書で使用しているとき、メガヌクレアーゼは、ヘテロ二量体として二本鎖ＤＮＡに結合する。メガヌクレアーゼはまた、ペプチドリンカーを用いて一対のＤＮＡ結合ドメインが単一のポリペプチドに結合されている「一本鎖メガヌクレアーゼ」であってもよい。「ホーミングエンドヌクレアーゼ」の用語は、「メガヌクレアーゼ」という用語と同義である。本発明のメガヌクレアーゼは、細胞内で発現したとき細胞の生存率に対する有害な影響を観察せずに実質的に無毒であるか、本明細書に記載の方法を用いて測定したときにメガヌクレアーゼ切断活性の顕著な低下がある。
【０１７８】
本明細書で使用しているとき、「一本鎖メガヌクレアーゼ」の用語は、リンカーによって結合された一対のヌクレアーゼサブユニットを含むポリペプチドをいう。一本鎖メガヌクレアーゼは、Ｎ末端サブユニット−リンカー−Ｃ末端サブユニットという構成を有する。２つのメガヌクレアーゼサブユニットは一般にアミノ酸配列において同一ではなく、非同一ＤＮＡ配列を認識する。従って、一本鎖メガヌクレアーゼは、典型的には、擬似パリンドローム認識配列又は非パリンドローム認識配列を切断する。一本鎖メガヌクレアーゼは実際には二量体ではないが、「一本鎖ヘテロ二量体」又は「一本鎖ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ」と呼ばれることがある。明確にするために、特に明記しない限り、「メガヌクレアーゼ」の用語は、二量体又は一本鎖メガヌクレアーゼを示すことができる。
【０１７９】
本明細書で使用しているとき、「リンカー」の用語は、２つのメガヌクレアーゼサブユニットを単一のポリペプチドに結合するために使用する外因性ペプチド配列をいう。リン
カーは、天然タンパク質に見られる配列を有しても、いかなる天然タンパク質にも見られない人工的な配列であってもよい。リンカーは柔軟で二次構造を欠いていることがあり、又は生理学的条件下で特定の三次元構造を形成する傾向を有していることがある。リンカーとしては、米国特許第８，４４５，２５１号及び米国特許第９，４３４，９３１号に包含されるものを挙げることができるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、リンカーは、配列番号１８〜３９のいずれか１つの残基１５４〜１９５を含むアミノ酸配列を有し得る。
【０１８０】
本明細書で使用しているとき、タンパク質に関する、「組換え」又は「遺伝子操作された」の用語は、タンパク質をコードする核酸、及びタンパク質を発現する細胞又は生物へ遺伝子工学技術を適用した結果として、改変させたアミノ酸配列を有することを意味する。核酸に関する、「組換え」又は「遺伝子操作された」の用語は、遺伝子工学技術を適用した結果として、改変させた核酸配列を有することを意味する。遺伝子工学技術としては、ＰＣＲ及びＤＮＡクローニング技術；形質移入、形質転換、及び他の遺伝子導入技術；相同組換え；部位特異的変異誘発；並びに遺伝子融合が挙げられるが、これらに限定されない。この定義によれば、天然に存在するタンパク質と同一のアミノ酸配列を有するが、異種の宿主におけるクローニング及び発現によって産生されるタンパク質は、組換えとは見なされない。
【０１８１】
本明細書で使用しているとき、「野生型」の用語は、同じ型の遺伝子の対立遺伝子集団において最も一般的な、天然に存在する対立遺伝子（即ち、ポリヌクレオチド配列）をいい、この場合野生型対立遺伝子によってコードされるポリペプチドは、その本来の機能を有する。「野生型」の用語はまた、野生型対立遺伝子によってコードされるポリペプチドも示す。野生型対立遺伝子（即ち、ポリヌクレオチド）及びポリペプチドは、野生型配列に対して１又は複数の突然変異及び／又は置換を含む突然変異型又は変異型の対立遺伝子及びポリペプチドと、区別可能である。野生型対立遺伝子又はポリペプチドは生物に正常な表現型を付与することができるが、突然変異型又は変異型の対立遺伝子又はポリペプチドは、場合によっては、変化した表現型を付与することができる。野生型ヌクレアーゼは、組換えヌクレアーゼ又は天然に存在しないヌクレアーゼと区別可能である。「野生型」の用語はまた、特定の遺伝子の野生型対立遺伝子を有する細胞、生物、及び／又は対象、あるいは比較する目的のために使用する細胞、生物、及び／又は対象を示すことができる。
【０１８２】
本明細書で使用しているとき、「遺伝子改変」の用語は、細胞又は生物において、あるいはその先祖において、ゲノムＤＮＡ配列が組換え技術によって意図的に改変されている細胞又は生物をいう。本明細書で使用しているとき、「遺伝子改変」の用語は、「トランスジェニック」という用語を包含する。
【０１８３】
組換えタンパク質に関して本明細書で使用しているとき、「改変」の用語は、参照配列（例えば、野生型又は天然の配列）に対する組換え配列のアミノ酸残基の任意の挿入、欠失、又は置換を意味する。
【０１８４】
本明細書で使用しているとき、「認識配列」の用語は、エンドヌクレアーゼによって結合及び切断されるＤＮＡ配列をいう。メガヌクレアーゼの場合、認識配列は、４塩基対によって分離されている一対の反転した９塩基対の「半分の部位」を含む。一本鎖メガヌクレアーゼの場合、タンパク質のＮ末端ドメインが第１の半分の部位と接触し、タンパク質のＣ末端ドメインが第２の半分の部位と接触する。メガヌクレアーゼによる切断は、４塩基対の３’の「オーバーハング」を生じる。「オーバーハング」又は「粘着性の末端」は、二本鎖ＤＮＡ配列のエンドヌクレアーゼの切断によって産生され得る短い一本鎖ＤＮＡセグメントである。Ｉ−ＣｒｅＩ由来のメガヌクレアーゼ及び一本鎖メガヌクレアーゼの
場合、オーバーハングは２２塩基対認識配列の１０〜１３塩基を含む。
【０１８５】
本明細書で使用しているとき、「標的部位」又は「標的配列」の用語は、ヌクレアーゼの認識配列を含む細胞の染色体ＤＮＡの領域をいう。
【０１８６】
本明細書で使用しているとき、「ＤＮＡ結合親和性」又は「結合親和性」の用語は、メガヌクレアーゼが参照ＤＮＡ分子と非共有結合で会合する傾向（例えば、認識配列又は任意の配列）を意味する。結合親和性は解離定数Ｋｄによって測定される。本明細書で使用しているとき、参照認識配列に対するヌクレアーゼのＫｄが、参照ヌクレアーゼに対して統計的に有意な（ｐ＜０．０５）量だけ増加又は減少する場合、ヌクレアーゼは「変化した」結合親和性を有する。
【０１８７】
本明細書で使用しているとき、「特異性」の用語は、認識配列と呼ばれる特定の塩基対の配列においてのみ、又は特定の認識配列の組においてのみ、メガヌクレアーゼが二本鎖ＤＮＡ分子を認識して切断できることを意味する。認識配列の組は、特定の保存された位置又は配列のモチーフを共有するが、１以上の位置で変性している場合もある。非常に特異的なメガヌクレアーゼは、１つのみ又はごく少数の認識配列を切断することができる。特異性は当技術分野において公知の任意の方法により判断することができる。本明細書で使用しているとき、メガヌクレアーゼが、生理学的条件下で参照メガヌクレアーゼ（例えば野生型）に結合せずまた切断されない認識配列に、結合及び切断する場合、又は認識配列の切断の速さが、参照メガヌクレアーゼと比較して生物学的に顕著な量（例えば、少なくとも２倍、又は２倍〜１０倍）増加又は減少する場合、メガヌクレアーゼは「改変した」特異性を有する。
【０１８８】
本明細書で使用しているとき、「相同組換え」又は「ＨＲ」の用語は、修復テンプレートとして相同ＤＮＡ配列を使用して二本鎖ＤＮＡの切断が修復される自然の細胞のプロセスをいう（例えば、Ｃａｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００６），Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１１：１９５８−１９７６を参照）。相同ＤＮＡ配列は、内因性染色体配列又は細胞に送達された外因性核酸であり得る。
【０１８９】
本明細書で使用しているとき、「非相同末端結合」又は「ＮＨＥＪ」の用語は、二本鎖ＤＮＡの切断が２つの非相同ＤＮＡセグメントの直接的な結合によって修復される自然の細胞のプロセスをいう（例えば、Ｃａｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００６），Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１１：１９５８−１９７６を参照）。非相同末端結合によるＤＮＡの修復には誤りがありがちで、修復部位でのＤＮＡ配列の非鋳型化（ｕｎｔｅｍｐｌａｔｅｄ）付加又は欠失が頻繁にもたらされる。いくつかの例において、標的認識配列での切断が、標的認識部位でのＮＨＥＪを生じている。遺伝子のコード配列中の標的部位のヌクレアーゼ誘導性の切断、続くＮＨＥＪによるＤＮＡの修復は、遺伝子の機能を破壊するフレームシフトの突然変異などの突然変異を、コード配列に導入することができる。従って、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、細胞集団の遺伝子を効果的にノックアウトするために使用できる。
【０１９０】
アミノ酸の配列と核酸の配列の両方に関して本明細書で使用しているとき、「パーセントの同一性」、「配列同一性」、「パーセントの類似性」、「配列の類似性」等の用語は、整列したアミノ酸の残基又はヌクレオチド間の類似性を最大限にする配列の整列、同一又は類似している残基又はヌクレオチドの数、全体の残基又はヌクレオチドの数、並びに配列の整列における空隙の存在及び長さの関数である配列の整列に基づいた、２つの配列の類似性の程度の尺度を示す。標準的なパラメータを使用して配列の類似性を判断するための様々なアルゴリズム及びコンピュータプログラムが利用可能である。本明細書で使用しているとき、配列の類似性は、アミノ酸の配列についてのＢＬＡＳＴｐプログラム、及
び核酸の配列についてのＢＬＡＳＴｎプログラムを使用して測定され、これらは両方とも、国立生物工学情報センター（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して利用でき、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ｇｉｓｈ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｅｓ  （１９９３），Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２；Ｍａｄｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３  ８９−３４０２）；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０００），Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．７（１−２）：２０３−１４に記載されている。本明細書で使用しているとき、２つのアミノ酸配列のパーセントの類似性は、ＢＬＡＳＴｐアルゴリズムについての、ワードサイズ＝３、ギャップオープニングペナルティ＝−１１、ギャップエクステンションペナルティ＝−１、スコアリングのマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２というパラメータに基づくスコアである。本明細書で使用しているとき、２つの核酸配列のパーセントの類似性は、ＢＬＡＳＴｎアルゴリズムについての、ワードサイズ＝１１、ギャップオープニングペナルティ＝−５、ギャップエクステンションペナルティ＝−２、マッチした報酬＝１、及びミスマッチのペナルティ＝−３というパラメータに基づくスコアである。
【０１９１】
２つのタンパク質又はアミノ酸の配列の改変に関して本明細書で使用している場合、「対応する」の用語は、第１のタンパク質における特定の改変が第２のタンパク質における改変と同じアミノ酸残基の置換であること、及び第１のタンパク質における改変のアミノ酸の位置が、２つのタンパク質が標準的な配列の整列に曝されたとき（例えば、ＢＬＡＳＴｐプログラムを使用したとき）に、第２のタンパク質の改変のアミノ酸の位置と対応しているか整列していることを示すために使用される。従って、残基Ｘ及びＹが配列の整列において互いに対応している場合、ＸとＹが異なる数であり得るという事実にもかかわらず、第１のタンパク質における残基「Ｘ」のアミノ酸「Ａ」への改変は、第２のタンパク質におけるアミノ酸「Ａ」への残基「Ｙ」の改変に対応している。
【０１９２】
本明細書で使用しているとき、「認識した半分の部位」、「認識配列の半分の部位」又は単に「半分の部位」の用語は、ホモ二量体又はヘテロ二量体のメガヌクレアーゼの単量体によって、あるいは一本鎖メガヌクレアーゼの１つのサブユニットによって認識される二本鎖ＤＮＡ分子の核酸の配列を意味する。
【０１９３】
本明細書で使用しているとき、「超可変領域」の用語は、比較的高い可変性を有するアミノ酸を含む、メガヌクレアーゼの単量体又はサブユニット内の局在化された配列をいう。超可変領域は、約５０〜６０の隣接残基、約５３〜５７の隣接残基、又は好ましくは約５６の残基を含み得る。いくつかの実施形態では、超可変領域の残基は、配列番号１８〜３９のいずれか１つの２４〜７９位又は２１５〜２７０位に対応し得る。超可変領域は、認識配列におけるＤＮＡ塩基と接触する１以上の残基を含むことができ、単量体又はサブユニットの塩基の選択性を変えるために改変することができる。超可変領域はまた、メガヌクレアーゼが二本鎖ＤＮＡ認識配列と会合するときに、ＤＮＡ骨格に結合する１以上の残基を含み得る。そのような残基は、ＤＮＡ骨格及び標的認識配列に対するメガヌクレアーゼの結合親和性を変えるために改変することができる。本発明の異なる実施形態では、超可変領域は、１〜２０個の残基を含むことができ、それは可変性を示し、塩基の選択性及び／又はＤＮＡ結合親和性に影響を及ぼすように改変することができる。いくつかの実施形態において、超可変領域内の可変残基は、配列番号１８〜３９のいずれか１つの２４位、２６位、２８位、３０位、３２位、３３位、３８位、４０位、４２位、４４位、４６位、４９位、５０位、５４位、６４位、６８位、７０位、７５位、及び７７位の１以上に対応する。他の実施形態では、超可変領域内の可変残基は、配列番号１８〜３９のいずれか１つの２１５位、２１７位、２１９位、２２１位、２２３位、２２４位、２２９位、２３１位、２３３位、２３５位、２３７位、２４０位、２４１位、２４５位、２５５位、２
５９位、２６１位、２６６位、及び２６８位の１以上に対応する。
【０１９４】
「組換えＤＮＡ構築物」、「組換え構築物」、「発現カセット」、「発現構築物」、「キメラ構築物」、「構築物」、及び「組換えＤＮＡ断片」の用語は、本明細書で互換的に用いられ、核酸の断片である。組換え構築物は、天然には一緒に見出さない調節及びコード配列を含むがこれらに限定されない、核酸断片の人工的な組み合わせを含む。例えば、組換えＤＮＡ構築物は、異なる供給源に由来する調節配列及びコード配列、又は同じ供給源に由来して天然に見出せる様式とは異なる様式で配置されている調節配列及びコード配列を含み得る。そのような構築物はそれ自体で使用しても、ベクターと共に使用してもよい。
【０１９５】
本明細書で使用しているとき、「ベクター」又は「組換えＤＮＡベクター」は、複製のシステム、及び所与の宿主細胞におけるポリペプチドコード化配列の転写及び翻訳が可能である配列を含む構築物であり得る。ベクターが使用される場合、ベクターの選択は、当業者に周知のように、宿主細胞を形質転換するために使用する方法に依拠する。ベクターは、制限なく、プラスミドベクター及び組換えＡＡＶベクター、又は本発明のメガヌクレアーゼをコードする遺伝子を標的細胞に送達するのに適した、当技術分野で公知の他の任意のベクターを含み得る。当業者は、本発明の単離されたヌクレオチド又は核酸配列のいずれかを含む宿主細胞を首尾よく形質転換、選択及び増殖させるために、ベクターに存在していなければならない遺伝的な要素を十分に知っている。
【０１９６】
本明細書で使用しているとき、「ベクター」はまた、ウイルスベクターを示すことができる。ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）を含み得るが、これらに限定されない。
【０１９７】
本明細書で使用しているとき、「ポリシストロニック」ｍＲＮＡとは、２つ以上のコード配列（即ち、シストロン）を含み、２以上のタンパク質をコードする単一のメッセンジャーＲＮＡをいう。ポリシストロニックｍＲＮＡは、ＩＲＥＳ要素、Ｔ２Ａ要素、Ｐ２Ａ要素、Ｅ２Ａ要素、及びＦ２Ａ要素を含むがこれらに限定されない、同じｍＲＮＡ分子に由来する２つ以上の遺伝子の翻訳を可能にする、当技術分野において公知の任意の要素を含み得る。
【０１９８】
本明細書で使用しているとき、「対照」又は「対照細胞」とは、遺伝子改変細胞の遺伝子型又は表現型の変化を測定するための基準点を提供する細胞をいう。対照細胞は、例えば、（ａ）野生型細胞、即ち、遺伝子変化細胞をもたらした遺伝子改変用の出発材料と同じ遺伝子型のもの；（ｂ）遺伝子改変細胞と同じ遺伝子型であるが、ヌルの構築物（即ち、対象となる形質に既知の効果を及ぼさない構築物）で形質転換された細胞；又は（ｃ）遺伝子改変細胞と遺伝的に同一であるが、改変した遺伝子型又は表現型の発現を誘導する条件又は刺激又は更なる遺伝子改変に曝されない細胞を含み得る。
【０１９９】
２つのタンパク質又はアミノ酸の配列の改変に関して本明細書で使用している場合、「対応する」の用語は、第１のタンパク質における特定の改変が第２のタンパク質における改変と同じアミノ酸残基の置換であること、及び第１のタンパク質における改変のアミノ酸の位置が、２つのタンパク質が標準的な配列の整列に曝されたとき（例えば、ＢＬＡＳＴｐプログラムを使用したとき）に、第２のタンパク質の改変のアミノ酸の位置と対応しているか整列していることを示すために使用される。従って、残基Ｘ及びＹが配列の整列において互いに対応している場合、ＸとＹが異なる数であり得るという事実にもかかわらず、第１のタンパク質における残基「Ｘ」のアミノ酸「Ａ」への改変は、第２のタンパク質におけるアミノ酸「Ａ」への残基「Ｙ」の改変に対応している。
【０２００】
本明細書で使用しているとき、「治療」又は「対象を治療する」の用語は、少なくとも１つのＨＢＶ粒子のゲノムを切断することによってウイルスのＨＢＶ増殖速度を緩徐化又は停止させる目的で、本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ、又は本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸を、ＨＢＶに感染した対象へ投与することをいう。そのような治療は、対象におけるＨＢＶの形質移入及び複製を低減又は防止し、対象におけるＨＢＶの１又は複数の症状を部分的又は完全に取り除く。ＨＢＶ感染の症状の軽減を評価するための手段は、酵素アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）のレベルを判定すること、又は血清の転換、即ちＨｂｅＡｇの消失を測定することによる、肝機能の測定を含み得る。更に、ＨＢＶの症状の軽減又は低減は、肝生検で検査し、当技術分野で周知の方法で組織線維症のレベルを測定することによって判断できる。循環ウイルス粒子の数は、例えば、ＰＣＲを用いてＨＢＶ  ＤＮＡのレベルを測定することによって、又は血中のＨＢｓＡｇレベルを検出することによって、判断することができる。「治療」又は「対象を治療する」の用語は更に、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸を含む細胞（例えば肝細胞）の投与を示すことができ、この場合細胞は標的組織（例えば肝臓）に送達され、対象においてＨＢＶの感染を治療するのに十分な量で遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを産生し、それによりＨＢＶの１以上の症状の部分的又は完全な軽減をもたらす。いくつかの態様では、本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ、それをコードする核酸、又は本発明の遺伝子改変細胞は、本発明の医薬組成物の形態で、治療中に投与される。
【０２０１】
「Ｂ型肝炎ウイルス感染」の用語は、慢性肝疾患／障害、炎症、線維症の状態、及び肝がんをはじめとした増殖性障害等の、Ｂ型肝炎ウイルスによる感染に関連する、又は感染に起因するいずれかの状態を示す。持続性の慢性ＨＢＶ感染は、疲労、肝障害、肝硬変、及び原発性肝がんである肝細胞がんを引き起こし得る。
【０２０２】
本明細書で使用しているとき、「増殖する」及び「増殖」の用語は、活発に分裂してヒト細胞に感染するＨＢＶ細胞を示す。従って、増殖の減少は、本明細書に開示の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ、又は遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸を投与していない適切な対照と比較したとき少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％の減少を含む、ＨＢＶの増殖の任意の減少を示す。本願を通して、「増殖性障害」の用語は、組織の望まれない又は異常な増殖によって特徴付けられるいずれかの疾患／障害を示す。また、本明細書で使用しているとき、「増殖性障害」の用語は、細胞の調節されていない及び／又は異常な増殖が、がん性又は非がん性であり得る望まれない状態又は疾患の発症をもたらし得る状態をいう。
【０２０３】
「有効量」又は「治療有効量」の用語は、有益な又は望ましい生物学的及び／又は臨床的な結果をもたらすのに十分な量を示す。治療有効量は、メガヌクレアーゼ製剤又は組成物、疾患及びその重症度、並びに治療される対象の年齢、体重、健康状態、及び反応性に応じて変わる。特定の実施形態では、本明細書に開示される有効量の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ又は医薬的組成物は、ＨＢＶに感染している対象におけるＨＢＶのレベル又は増殖を減少させるか、ＨＢＶの少なくとも１つの症状を低減させる。
【０２０４】
「脂質ナノ粒子」の用語は、平均直径が１０〜１０００ナノメートルの典型的には球形の構造を有する脂質組成物を示す。いくつかの製剤において、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのカチオン性脂質、少なくとも１つの非カチオン性脂質、及び少なくとも１つの複合脂質を含み得る。ｍＲＮＡ等の核酸を封入するのに適している、当技術分野において公知の脂質ナノ粒子が、本発明にて使用するために企図される。
【０２０５】
本明細書で使用するとき、変数に対する数値範囲の記載は、その範囲内の任意の値に等しい変数で本発明を実施できることを伝えることを意図している。従って、本質的に離散的な変数については、その変数は、範囲の端点を含んだ数値範囲内の任意の整数の値に等しくなり得る。同様に、本質的に連続的な変数については、その変数は、範囲の端点を含んだ数値範囲内の任意の実数の値に等しくなり得る。限定するものではなく例として、０〜２の値を有すると記載された変数は、その変数が本質的に離散的である場合には０、１又は２の値を取り得、変数が本質的に連続的である場合には、０．０、０．１、０．０１、０．００１の値、又は０以上２以下の他のいずれかの実数の値を取り得る。
【０２０６】
２．１  発明の原理
【０２０７】
本発明は、部分的に、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、ＨＢＶゲノム内のＯＲＦを切断することによってＨＢＶのレベルを低下させる、又はＨＢＶの増殖を遅くするために使用され得るという仮説に基づく。より具体的には、メガヌクレアーゼは、複数のＨＢＶ遺伝子型のゲノム内に存在する認識配列を認識して切断するように遺伝子操作することができる。従って、単一の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを利用して、ＨＢＶのレベル又は増殖を減少させたり、Ｂ型肝炎ウイルスの複数の遺伝子型のＨＢＶ感染の症状を低減させたりすることができる。
【０２０８】
従って、本発明は、ＨＢＶゲノムの少なくとも２つの遺伝子型のＯＲＦ内の認識配列を認識して切断する遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを包含する。また、本発明は、そのような遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを、医薬組成物中で、及びＨＢＶ感染を治療するための方法において使用する方法を包含する。更に、本発明は、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼのタンパク質、又は遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸を含む医薬組成物、及びＨＢＶの感染を治療するためのそのような組成物を使用することを包含する。
【０２０９】
２．２  ＨＢＶのゲノム内の認識配列を認識して切断するためのメガヌクレアーゼ
【０２１０】
部位特異的ヌクレアーゼを使用してウイルスのゲノムにてＤＮＡを切断することは可能であるという点、及びそのようなＤＮＡの切断がＮＨＥＪを介したゲノムの永続的な改変をもたらすことができて、その結果ＨＢＶビリオンがヒトの細胞を分裂させたり感染させることはもはやできなくなるという点は、当技術分野において公知である。従って、一実施形態では、本発明は、遺伝子操作された組換えメガヌクレアーゼを使用して実施することができる。
【０２１１】
好ましい実施形態では、本発明を実施するために使用されるヌクレアーゼは一本鎖メガヌクレアーゼである。一本鎖メガヌクレアーゼは、リンカーペプチドによって結合されたＮ末端サブユニット及びＣ末端サブユニットを含む。２つのドメインのそれぞれは、認識配列の半分（即ち、認識した半分の部位）を認識し、ＤＮＡ切断の部位は、２つのサブユニットの界面付近の認識配列の中にある。ＤＮＡ鎖の切断は、４塩基対によって相殺させて、メガヌクレアーゼによるＤＮＡの切断が一対の４塩基対、３’一本鎖オーバーハングを生成するようにする。
【０２１２】
いくつかの例において、本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＨＢＶ１−２認識配列（配列番号１０）を認識し切断するように遺伝子操作されている。ＨＢＶ１−２認識配列は、複数のＨＢＶ遺伝子型のＰタンパク質、Ｓ、ｐｒｅＳ２／Ｓ、及びｐｒｅＳ１／ｐｒｅＳ２のＯＲＦの中に位置している。ＨＢＶ１−２認識配列は、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、及びＧを含む複数のＨＢＶ遺伝子型（例えば、それぞれ配列番号３〜５及び７〜９）のゲノムに少なくとも見出すことができる。そのような遺伝子操作されたメガ
ヌクレアーゼは、本明細書において集合的に「ＨＢＶ１−２メガヌクレアーゼ」と呼ばれる。例示的なＨＢＶ１−２メガヌクレアーゼは、配列番号１８〜２１に提供されている。
【０２１３】
更なる例では、本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＨＢＶ５−６認識配列（配列番号１２）を認識し切断するように遺伝子操作されている。ＨＢＶ５−６認識配列は、複数のＨＢＶ遺伝子型のＰタンパク質、Ｓ、ｐｒｅＳ２／Ｓ、及びｐｒｅＳ１／ｐｒｅＳ２のＯＲＦの中に位置している。ＨＢＶ５−６認識配列は、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、及びＧを含む複数のＨＢＶ遺伝子型（例えば、それぞれ配列番号３〜７及び９）のゲノムに少なくとも見出すことができる。そのような遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、本明細書において集合的に「ＨＢＶ５−６メガヌクレアーゼ」と呼ばれる。例示的なＨＢＶ５−６メガヌクレアーゼは、配列番号２２〜２８に提供されている。
【０２１４】
更なる例では、本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＨＢＶ７−８認識配列（配列番号１４）を認識し切断するように遺伝子操作されている。ＨＢＶ７−８認識配列は、複数のＨＢＶ遺伝子型のＰタンパク質のＯＲＦの中に位置している。ＨＢＶ７−８認識配列は、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、及びＧを含む複数のＨＢＶ遺伝子型（例えば、それぞれ配列番号３〜６、８、及び９）のゲノムに少なくとも見出すことができる。そのような遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、本明細書において集合的に「ＨＢＶ７−８メガヌクレアーゼ」と呼ばれる。例示的なＨＢＶ７−８メガヌクレアーゼは、配列番号２９〜３２に提供されている。
【０２１５】
更なる例では、本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＨＢＶ１１−１２認識配列（配列番号１６）を認識し切断するように遺伝子操作されている。ＨＢＶ１１−１２認識配列は、複数のＨＢＶ遺伝子型のＰタンパク質ＯＲＦの中に位置している。ＨＢＶ１１−１２認識配列は、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧを含む複数のＨＢＶ遺伝子型（例えば、それぞれ配列番号３〜９）のゲノムに少なくとも見出すことができる。そのような遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、本明細書において集合的に「ＨＢＶ１１−１２メガヌクレアーゼ」と呼ばれる。例示的なＨＢＶ１１〜１２メガヌクレアーゼは、配列番号３４〜４０に提供されている。
【０２１６】
本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、第１の超可変（ＨＶＲ１）領域を含む第１のサブユニット及び第２の超可変（ＨＶＲ２）領域を含む第２のサブユニットを含む。更に、第１のサブユニットは認識配列の第１の認識した半分の部位（例えば、ＨＢＶ１、ＨＢＶ５、ＨＢＶ７、又はＨＢＶ１１の半分の部位）に結合し、第２のサブユニットは認識配列の第２の認識した半分の部位（例えば、ＨＢＶ２、ＨＢＶ６、ＨＢＶ８、又はＨＢＶ１２の半分の部位）に結合する。遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが一本鎖メガヌクレアーゼである実施形態では、第１及び第２のサブユニットは、ＨＶＲ１領域を含み第１の半分の部位と結合する第１のサブユニットが、Ｎ末端サブユニットとして位置し、ＨＶＲ２領域を含み第２の半分の部位と結合する第２のサブユニットが、Ｃ末端サブユニットとして位置するように配向できる。別の実施形態では、第１及び第２のサブユニットは、ＨＶＲ１領域を含み第１の半分の部位と結合する第１のサブユニットが、Ｃ末端サブユニットとして位置し、ＨＶＲ２領域を含み第２の半分の部位と結合する第２のサブユニットが、Ｎ末端サブユニットとして位置するように配向できる。本発明の例示的なＨＢＶ１−２メガヌクレアーゼを表１に提示する。本発明の例示的なＨＢＶ５−６メガヌクレアーゼを表２に提示する。本発明の例示的なＨＢＶ７−８メガヌクレアーゼを表３に提示する。本発明の例示的なＨＢＶ１１−１２メガヌクレアーゼを表４に提示する。
【０２１７】
表１；ＨＢＶ１−２認識配列（配列番号１０）を認識し切断するように遺伝子操作された例示的な遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ
【表１】
0006919049.tif 000002
【０２１８】
＊「ＨＢＶ１サブユニット（％）」及び「ＨＢＶ２サブユニット（％）」は、各メガヌクレアーゼのＨＢＶ１結合及びＨＢＶ２結合サブユニット領域と、ＨＢＶ１−２×．２メガヌクレアーゼの各ＨＢＶ１結合及びＨＢＶ２結合サブユニット領域との間のアミノ酸の配列の同一性を表す。
【０２１９】
表２；ＨＢＶ５−６認識配列（配列番号１２）を認識し切断するように遺伝子操作された例示的な遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ
【表２】
0006919049.tif 000003
【０２２０】
＊「ＨＢＶ５サブユニット（％）」及び「ＨＢＶ６サブユニット（％）」は、各メガヌクレアーゼのＨＢＶ５結合及びＨＢＶ６結合サブユニット領域と、ＨＢＶ５−６×．３３メガヌクレアーゼの各ＨＢＶ５結合及びＨＢＶ６結合サブユニット領域との間のアミノ酸の配列の同一性を表す。
【０２２１】
表３；ＨＢＶ７−８認識配列（配列番号１４）を認識し切断するように遺伝子操作された例示的な遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ
【表３】
0006919049.tif 000004
【０２２２】
＊「ＨＢＶ７サブユニット（％）」及び「ＨＢＶ８サブユニット（％）」は、各メガヌクレアーゼのＨＢＶ７結合及びＨＢＶ８結合サブユニット領域と、ＨＢＶ７−８×．２メガヌクレアーゼの各ＨＢＶ７結合及びＨＢＶ８結合サブユニット領域との間のアミノ酸の配列の同一性を表す。
【０２２３】
表４；ＨＢＶ１１−１２認識配列（配列番号１６）を認識し切断するように遺伝子操作された例示的な遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ
【表４】
0006919049.tif 000005
【０２２４】
＊「ＨＢＶ１１サブユニット（％）」及び「ＨＢＶ１２サブユニット（％）」は、各メガヌクレアーゼのＨＢＶ１１結合及びＨＢＶ１２結合サブユニット領域と、ＨＢＶ１１−１２×．２６メガヌクレアーゼの各ＨＢＶ１１結合及びＨＢＶ１２結合サブユニット領域との間のアミノ酸の配列の同一性を表す。
【０２２５】
２．３  エンドヌクレアーゼの送達及び発現方法
【０２２６】
本明細書に開示されているのは、対象のＨＢＶ感染又はＨＣＣを治療するための方法である。同様に、対象におけるＨＢＶ感染の症状の軽減及びＨＢＶの量の減少、ＨＢＶの増殖速度の低下又はＨＣＣの治療の方法が提供されており、医薬的に許容される担体及び本明細書に開示される遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ（又は遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸）を含む医薬組成物を投与することを含む。本発明の方法において、本明細書に開示されている遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをＨＢＶゲノムに与えることができる標的細胞のＤＮＡ／ＲＮＡに送達され、及び／又はそれから発現され得る。
【０２２７】
本明細書に開示される遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、タンパク質の形態で、又は好ましくは遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸として、細胞内に送達され得る。そのような核酸は、ＤＮＡ（例えば、環状又は線状化プラスミドＤＮＡ又はＰＣＲ産物）又はＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）であり得る。遺伝子操作されたメガヌクレアーゼコード配列がＤＮＡの形態で送達される実施形態について、それはヌクレアーゼ遺伝子の転写を促進するためにプロモータに作動可能に連結させるべきである。本発明に適した哺乳動物プロモータには、サイトメガロウイルス初期（ＣＭＶ）プロモータ（Ｔｈｏｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４），Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．８１（３）：６５９−６３）、又はＳＶ４０初期プロモータ（Ｂｅｎｏｉｓｔ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｂｏｎ（１９８１），Ｎａｔｕｒｅ．２９０（５８０４）：３０４−１０）、並びに誘導性プロモータ、例えばテトラサイクリン誘導性プロモータ（Ｄｉｎｇｅｒｍａｎｎ
ｅｔ  ａｌ．（１９９２），Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２（９）：４０３８−４５）等の構成的プロモータが含まれる。また、本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、合成プロモータに作動可能に連結され得る。合成プロモータは、限定することなく、ＪｅＴプロモータを挙げることができる（国際公開第２００２／０１２５１４号パンフレット）。特定の実施形態では、本明細書に開示される場合の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列は、肝特異的プロモータに作動可能に連結され得る。肝特異的プロモータの例としては、限定することなく、ヒトα−１アンチトリプシンプロモータ及びアポリポタンパク質Ａ−ＩＩプロモータが挙げられる。
【０２２８】
特定の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列が、組換えＤＮＡ構築物又は発現カセットに送達される。例えば、組換えＤＮＡ構築物は、プロモータと、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列とを含む発現カセット（即ち、「カセット」）を含むことができる。他の実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は、２以上のカセットを含み、各カセットがプロモータと、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含み、各遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、本明細書に開示の異なるＨＢＶ認識配列に対する特異性を有する。特定の実施形態において、組換えＤＮＡ構築物は、２つのカセット、３つのカセット、４つのカセット、又はそれ以上を含み得る。例えば、カセット又はカセットの組み合わせは、ＨＢＶ１−２メガヌクレアーゼ、ＨＢＶ５−６メガヌクレアーゼ、ＨＢＶ７−８メガヌクレアーゼ、及びＨＢＶ１１−１２メガヌクレアーゼの任意の数又は組み合わせをコードすることができる。いくつかの実施形態において、単一のカセットは、ＨＢＶ１−２メガヌクレアーゼ、ＨＢＶ５−６メガヌクレアーゼ、ＨＢＶ７−８メガヌクレアーゼ、及びＨＢＶ１１−１２メガヌクレアーゼをコードし得る。別の特定の実施形態では、カセット又はカセットの組み合わせは、ＨＢＶ５−６メガヌクレアーゼ及びＨＢＶ１１−１２メガヌクレアーゼをコードし得る。
【０２２９】
他の実施形態において、組換えＤＮＡ構築物は、プロモータ及びポリシストロニック核酸配列を含むカセットを含み、プロモータが、ポリシストロニック核酸配列の発現を駆動して、標的細胞において本明細書に記載のポリシストロニックｍＲＮＡを生成する。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡが細胞に送達されるが、その理由は、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする遺伝子が、細胞のゲノムに組み込まれる可能性を低下させるためである。遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードするそのようなｍＲＮＡは、インビトロでの転写といった、当技術分野において公知の方法を利用して産生され得る。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは７−メチル−グアノシンを用いてキャップされている。いくつかの態様において、ｍＲＮＡはポリアデニル化されていてもよい。
【０２３１】
特定の実施形態では、本発明の遺伝子操作されたヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡは
、細胞内で同時に発現される２以上のヌクレアーゼをコードするポリシストロニックｍＲＮＡであってよい。いくつかの実施形態において、ポリシストロニックｍＲＮＡは、ＨＢＶゲノムが複数の部位で切断されるように、ＨＢＶゲノムの異なる認識配列を標的とする、本明細書に記載の２以上のメガヌクレアーゼをコードし得る。いくつかの実施形態において、ポリシストロニックｍＲＮＡは、本明細書に記載されている２以上のメガヌクレアーゼ、及び細胞において治療上有益な効果を誘導する少なくとも１つの更なるタンパク質をコードし得る。本発明のポリシストロニックｍＲＮＡは、ＩＲＥＳ要素、Ｔ２Ａ要素、Ｐ２Ａ要素、Ｅ２Ａ要素、及びＦ２Ａ要素を含むがこれらに限定されない、同じｍＲＮＡ分子に由来する２以上の遺伝子の翻訳を可能にする、当技術分野において公知の任意の要素を含み得る。特定の実施形態において、ポリシストロニックｍＲＮＡは、本明細書に記載の２つのメガヌクレアーゼをコードするバイシストロンｍＲＮＡ、本明細書に記載の３つのメガヌクレアーゼをコードするトリシストロンｍＲＮＡ、又は本明細書に記載の４つのメガヌクレアーゼをコードするクアドシストロンｍＲＮＡであり、この場合、各ｍＲＮＡによってコードされるヌクレアーゼは、ＨＢＶゲノムの異なる認識配列に対して特異性を有する。例えば、ポリシストロニックｍＲＮＡは、ＨＢＶ１−２メガヌクレアーゼ、ＨＢＶ５−６メガヌクレアーゼ、ＨＢＶ７−８メガヌクレアーゼ、及びＨＢＶ１１−１２メガヌクレアーゼの任意の数又は組み合わせをコードすることができる。いくつかの実施形態において、ポリシストロニックｍＲＮＡは、ＨＢＶ１−２メガヌクレアーゼ、ＨＢＶ５−６メガヌクレアーゼ、ＨＢＶ７−８メガヌクレアーゼ、及びＨＢＶ１１−１２メガヌクレアーゼをコードし得る。別の特定の実施形態では、ポリシストロニックｍＲＮＡは、ＨＢＶ５−６メガヌクレアーゼ及びＨＢＶ１１−１２メガヌクレアーゼをコードするバイシストロンｍＲＮＡであり得る。
【０２３２】
別の特定の実施形態では、本発明のエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、一本鎖ＤＮＡの鋳型を用いて細胞に導入することができる。一本鎖ＤＮＡは、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする配列の上流及び／又は下流に５’及び／又は３’ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）を更に含み得る。他の実施形態では、一本鎖ＤＮＡは、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする配列の上流及び／又は下流に５’及び／又は３’相同性アームを更に含み得る。
【０２３３】
別の特定の実施形態では、本発明のエンドヌクレアーゼをコードする遺伝子は、線状化ＤＮＡの鋳型を用いて細胞に導入することができる。いくつかの例では、エンドヌクレアーゼをコードするプラスミドＤＮＡは、１以上の制限酵素により消化させることができ、環状プラスミドＤＮＡが細胞に導入される前に線状化されるようにする。
【０２３４】
精製されたヌクレアーゼタンパク質は、本明細書において以下に更に詳述されるものを含む、当技術分野において公知の様々な異なるメカニズムによってゲノムＤＮＡを切断するために、細胞内に送達し得る。
【０２３５】
本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを送達するための標的組織は、限定することなく肝臓の細胞、例えば肝細胞、又は好ましくは初代肝細胞、より好ましくはヒト肝細胞又はヒト初代肝細胞、ＨｅｐＧ２．２．１５又はＨｅｐＧ２−ｈＮＴＣＰ細胞を含む。論じたように、本発明のメガヌクレアーゼは、精製タンパク質として、又はメガヌクレアーゼをコードするＲＮＡ若しくはＤＮＡとして送達することができる。一実施形態では、メガヌクレアーゼタンパク質、又はエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、又はＤＮＡベクターは、標的組織への直接的な注入によって、標的細胞（例えば、肝臓の細胞）に供給される。あるいは、エンドヌクレアーゼタンパク質、ｍＲＮＡ、又はＤＮＡを、循環系を介して全身的に送達することができる。
【０２３６】
いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼタンパク質、又はエンドヌクレアー
ゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、全身投与、又は標的組織への投与のために、公知の技術に従って、医薬的に許容される担体用に処方される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２１ｓｔｅｄ．２００５）を参照されたい。本発明による医薬製剤の製造において、タンパク質／ＲＮＡ／ｍＲＮＡは、典型的には医薬的に許容される担体と混合される。担体は当然、製剤の他のいずれかの成分と相溶性であるという意味で許容されなければならず、また患者にとって有害であってはならない。担体は、固体又は液体、あるいはその両方であり得、単位用量の製剤として化合物と共に製剤化できる。
【０２３７】
いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼタンパク質、又はエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、細胞の取り込みを容易にするために細胞透過性ペプチド又は標的化リガンドに結合する。当技術分野において公知の細胞透過性ペプチドの例には、ポリアルギニン（Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．１６：１６２４−９）、ＨＩＶウイルス由来のＴＡＴペプチド（Ｈｕｄｅｃｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００５），Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．２５：６７９−７３６）、ＭＰＧ（Ｓｉｍｅｏｎｉ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２７１７−２７２４）、Ｐｅｐ−１（Ｄｅｓｈａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：７６９８−７７０６、及びＨＳＶ−１
ＶＰ−２２（Ｄｅｓｈａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．６２：１８３９−４９）が含まれる。別の実施形態において、エンドヌクレアーゼタンパク質、又はエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、標的細胞にて発現される特定の細胞表面の受容体を認識する抗体に共有結合又は非共有結合で結合させて、エンドヌクレアーゼタンパク質／ＤＮＡ／ｍＲＮＡが標的細胞に結合し、標的細胞によって内在化されるようにする。あるいは、エンドヌクレアーゼタンパク質／ＤＮＡ／ｍＲＮＡを、そのような細胞表面の受容体の天然のリガンド（又は天然のリガンドの一部）に共有結合又は非共有結合で結合させることができる（ＭｃＣａｌｌ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｔｉｓｓｕｅ  Ｂａｒｒｉｅｒｓ．２（４）：ｅ９４４４４９；Ｄｉｎｄａ，  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１２６４−７４；Ｋａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（３）：２２０−３０；Ｑｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．１０（１１）：１４９１−５０８）。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼタンパク質、又はエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、（例えば、肝類洞壁内皮細胞又は造血内皮細胞、あるいはそれに分化する前駆細胞の近傍において）肝臓の所望の領域内への注射又は移植のために生分解性ヒドロゲル内に封入される。ヒドロゲルは、頻繁な注入を必要とせずに標的組織の所望の領域へ治療用ペイロードの持続する調整可能な放出をもたらすことができ、刺激応答材料（例えば温度応答性及びｐＨ応答性ヒドロゲル）は、環境的又は外部から適用された合図に反応してペイロードを放出するように設計され得る（Ｋａｎｇ  Ｄｅｒｗｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｔｒａｎｓ  Ａｍ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｓｏｃ．１０６：２０６−２１４）。
【０２３９】
いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼタンパク質、又はエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、ナノ粒子に共有結合で、又は好ましくは非共有結合で結合されるか、当技術分野で公知の方法を用いてそのようなナノ粒子内に封入される（Ｓｈａｒｍａ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｉｎｔ．２０１４）。ナノ粒子は、その長さスケールが＜１μｍ、好ましくは＜１００ｎｍであるナノスケール送達システムである。そのようなナノ粒子は、金属、脂質、ポリマー、又は生体高分子から構成されるコアを用いて設計することができ、エンドヌクレアーゼタンパク質、ｍＲＮ
Ａ、又はＤＮＡの複数のコピーをナノ粒子コアに付着又は封入することができる。これにより、各細胞に送達されるタンパク質／ｍＲＮＡ／ＤＮＡのコピー数が増加し、従って、各エンドヌクレアーゼの細胞内での発現が増加して標的認識配列が切断される可能性が最大になる。そのようなナノ粒子の表面をポリマー又は脂質（例えば、キトサン、カチオン性ポリマー、又はカチオン性脂質）で更に改変して、その表面が細胞の送達及びペイロードの取り込みを増強する追加の機能性を付与するコア−シェルナノ粒子を形成し得る（Ｊｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．３３（３０）：７６２１−３０）。ナノ粒子を適切な細胞型に向かわせるために、及び／又は細胞の取り込みの可能性を高めるために、有利にもナノ粒子を更に標的化分子に結合させることができる。そのような標的化分子の例には、細胞表面の受容体に特異的な抗体及び細胞表面受容体に天然のリガンド（又は天然のリガンドの一部）が含まれる。
【０２４０】
いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼタンパク質、又はエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、リポソーム内に封入されるか、カチオン性脂質を用いて複合体化される（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ
ｒｅａｇｅｎｔ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；Ｚｕｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３：７３−８０；Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．２０１１：８６３７３４を参照）。リポソーム及びリポプレックス製剤は、ペイロードを分解しないよう保護し、標的部位での蓄積及び保持を増強し、標的細胞の細胞膜との融合及び／又は細胞膜の破壊を介して、細胞の取り込み及び送達の効率を高めることができる。
【０２４１】
いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼタンパク質、又はエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、ポリマー足場（例えばＰＬＧＡ）内に封入されるか、カチオンポリマー（例えばＰＥＩ、ＰＬＬ）を用いて複合体化される（Ｔａｍｂｏｌｉ
ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｔｈｅｒ  Ｄｅｌｉｖ．２（４）：５２３−５３６）。ポリマー担体は、ポリマーの侵食及び薬物の拡散の制御を通じて調整可能な薬物放出速度をもたらすように設計することができ、また高い薬物封入効率により、所望の標的細胞集団へ細胞内の送達をするまで、治療ペイロードの保護を提供することができる。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼタンパク質、又は遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、ミセルに自己集合する両親媒性分子と組み合わされる（Ｔｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．９（１１）：９５６−６６）。ポリマーのミセルは、凝集を防ぎ、電荷の相互作用をマスクし、非特異的な相互作用を減少させることができる親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）で形成されたミセルのシェルを含み得る。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼタンパク質、又はエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、標的細胞への投与及び／又は送達のために、エマルジョン又はナノエマルジョン（即ち、＜１ｎｍの平均粒径を有する）に処方される。「エマルション」の用語は、限定することなく、水不混和性の相を水相と混合させたときに、無極性残基（例えば炭化水素の長鎖）を水及び極性の頭部の基から水に向けて遠ざける疎水性の力の結果として形成することができる脂質の構造を含んだ、任意の水中油型、油中水型、水中油中水型、又は油中水中油型の分散液又は液滴を示す。これらの他の脂質構造としては、単層、小層、及び多層脂質小胞、ミセル、及びラメラ相が挙げられるが、これらに限定されない。エマルジョンは、水相と親油性相（典型的には油と有機溶媒を含有する）で構成される。また、エマルジョンは、１以上の界面活性剤を頻繁に含有する。ナノエマルション配合物は、例えば、米国特許出願公開第２００２／００４５６６７号及び第２００４／００４３０４１号、並びに米国特許第６，０１５，８３２号、第６，５０６，８０３号、第６，６３５，６７６号、及び第６，５５９，１８９号に記載されているように周
知であり、その各々は全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０２４４】
いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼタンパク質、又はエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、多機能ポリマーコンジュゲート、ＤＮＡデンドリマー、及びポリマーデンドリマーに共有結合で接着するか、非共有結合で関連させられる（Ｍａｓｔｏｒａｋｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｎａｎｏｓｃａｌｅ．７（９）：３８４５−５６；Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．９７（１）：１２３−４３）。デンドリマーの発生は、ペイロードの容量及びサイズを制御でき、また高い薬物ペイロード容量をもたらすことができる。更に、複数の表面の基の表示を利用して、安定性を向上させ、非特異的な相互作用を低減し、細胞特異的な標的化及び薬物放出を増強することができる。
【０２４５】
いくつかの態様において、エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子はウイルスベクターを用いて送達される。そのようなベクターは当技術分野において公知であり、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが含まれる（Ｖａｎｎｕｃｃｉ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎｅｗ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：１−２２に概説）。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは標的組織（例えば、肝組織）に直接注射される。別の実施形態において、ウイルスベクターは循環系を介して全身的に送達される。異なるＡＡＶベクターが異なる組織に位置付けられる傾向があることは、当技術分野において公知である。肝臓標的組織において、肝細胞の効果的な形質導入は、例えば、ＡＡＶ血清型２、８、及び９で示されている（Ｓａｎｄｓ（２０１１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８０７：１４１−１５７）。また、ＡＡＶベクターは、それらが宿主細胞で第二鎖のＤＮＡの合成を必要としないように、自己相補的であり得る（ＭｃＣａｒｔｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ．８：１２４８−５４）。
【０２４６】
一実施形態では、エンドヌクレアーゼ遺伝子送達に使用されるウイルスベクターは、自己制限ウイルスベクターである。自己制限ウイルスベクターは、ベクター内の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼについての認識配列の存在に起因して、細胞又は生物において限られた持続時間を有し得る。従って、自己制限ウイルスベクターは、プロモータ、本明細書に記載のエンドヌクレアーゼ、及びＩＴＲ内のエンドヌクレアーゼ認識部位をコードするように遺伝子操作することができる。自己制限ウイルスベクターは、エンドヌクレアーゼが発現され、ゲノム内の内因性認識配列で細胞のゲノムを切断することができるように、エンドヌクレアーゼ遺伝子を細胞、組織、又は生物に送達する。送達されたエンドヌクレアーゼはまた、自己制限ウイルスベクター自体の中で標的部位を見つけて、その標的部位でベクターを切断する。一旦切断されると、ウイルスゲノムの５’及び３’末端が露出されてエキソヌクレアーゼによって分解され、そのためウイルスを死滅させて、エンドヌクレアーゼの産生を止める。
【０２４７】
エンドヌクレアーゼ遺伝子が、ＤＮＡの形態（例えばプラスミド）で、及び／又はウイルスベクター（例えばＡＡＶ）を介して送達される場合、それらはプロモータに作動可能に連結されなければならない。いくつかの実施形態において、これは、ウイルスベクター由来の内因性プロモータ（例えば、レンチウイルスベクターのＬＴＲ）又は周知のサイトメガロウイルス若しくはＳＶ４０ウイルス初期プロモータ等のウイルスプロモータであり得る。好ましい実施形態において、メガヌクレアーゼ遺伝子は、標的細胞において優先的に遺伝子発現を駆動するプロモータに作動可能に連結されている。肝特異的プロモータの例としては、限定することなく、ヒトα−１アンチトリプシンプロモータ及びアポリポタンパク質Ａ−ＩＩプロモータが挙げられる。
【０２４８】
特定の実施形態では、ウイルスベクターは、プロモータと、本明細書に記載の遺伝子操
作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列とを含むカセットを含む。また、ウイルスベクターは、２以上のカセットを含み得、各カセットがプロモータと、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含み、各遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、本明細書に開示の異なるＨＢＶ認識配列に対する特異性を有する。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、プロモータ及びポリシストロニック核酸配列を含む１つのカセットを含み、プロモータが、ポリシストロニック核酸配列の発現を駆動して、標的細胞において本明細書に記載のポリシストロニックｍＲＮＡ、例えば遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードするポリシストロニックｍＲＮＡを生成する。
【０２４９】
本明細書に開示のメガヌクレアーゼをＨＢＶに感染した対象の肝臓に送達するための方法及び組成物が提供される。一実施形態では、哺乳動物から取り出された生来の肝細胞は、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードするベクターで形質導入することができる。あるいは、ＨＢＶ感染対象の生来の肝細胞は、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ及び／又は肝の再生を刺激する分子、例えば肝毒素をコードするアデノウイルスベクターで、エクスビボで形質導入され得る。好ましくは、肝毒素はｕＰＡであり、ウイルスベクターによって発現されると、肝細胞からのその分泌を阻害するように改変されている。別の実施形態では、ベクターはｔＰＡをコードし、これは肝細胞の再生をデノボで刺激することができる。哺乳動物から取り出した形質導入された肝細胞は、次いで哺乳動物に戻すことができ、その場合、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの発現に資する条件が付与される。典型的には、形質導入された肝細胞は、脾臓又は門脈脈管構造を通して注入することによって患者に戻すことができ、投与は、１〜５日以上の期間にわたって、単回又は複数回であり得る。
【０２５０】
本発明の方法のインビボの態様では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードし、対象に投与されるレトロウイルス、シュードタイプ又はアデノウイルス関連ベクターが構築されている。遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードするベクターの投与は、分泌障害の肝毒素をコードする、又はｔＰＡをコードするアデノウイルスベクターの投与と共に起こり得、それは肝毒素として作用することなく肝細胞の再生を刺激する。
【０２５１】
適切な用量は、他の要因の中でも、選択された任意のＡＡＶベクターの詳細（例えば、血清型等）、投与経路、治療される対象（即ち、年齢、体重、性別、及び対象の全身状態）、及び投与の様式に依存する。従って、適切な投与量は患者ごとに異なり得る。適切な有効量は、当業者が容易に判断することができる。投薬治療は、単回投与計画又は複数回投与計画であり得る。更に、対象は、極力適切な多さの用量を投与され得る。当業者は適切な用量数を容易に判断することができる。投与量は、別の投与経路を考慮に入れるか、治療の利益と任意の副作用とのバランスをとるために調整する必要があり得る。
【０２５２】
２．４  医薬組成物
【０２５３】
いくつかの実施形態において、本発明は、医薬的に許容される担体及び本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ、又は医薬的に許容される担体及び本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドを含む医薬組成物を提供する。他の実施形態において、本発明は、医薬的に許容される担体と、本明細書に開示されるような遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを細胞が発現する標的組織に送達することができる本発明の細胞とを含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、ＨＢＶを有する対象を治療すること、ＨＢＶのレベル若しくは増殖を低減させること、ＨＢＶの少なくとも１つの症状を減少させること、又はＨＣＣを治療することに有用であり得る。
【０２５４】
医薬組成物は、標的ＨＢＶ株の遺伝子型に従って、設計又は選択することができる。本
明細書に詳細に記載されるように、本発明のメガヌクレアーゼは、ＨＢＶの特定の遺伝子型における認識配列を認識して切断するように遺伝子操作されている。例えば、ＨＢＶ１−２メガヌクレアーゼ（例えば、配列番号１８〜２１）は、少なくともＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、及びＧ（例えば、それぞれ配列番号３〜５及び７〜９）のゲノムに見出されるＨＢＶ１−２認識配列を認識し切断する。更に、本明細書に開示される遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの認識配列は、配列番号３〜９において提供される各遺伝子型の例に対して１００％の配列同一性を共有してはいないＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧの単離体にて見出すことができる。本明細書で使用しているとき、ＨＢＶの「単離体」は、配列番号３〜９のいずれかにおいて提供される、対応する遺伝子型の例と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれより多くの配列同一性を共有し得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される医薬組成物は、配列番号１０、１２、１４、又は１６に定められる認識配列を含むＨＢＶの任意の遺伝子型を有する対象に投与することができる。
【０２５５】
そのような医薬組成物は公知の技術に従って調製することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２１ｓｔｅｄ．２００５）を参照されたい。本発明による医薬製剤の製造において、エンドヌクレアーゼポリペプチド（又はそれをコードするＤＮＡ／ＲＮＡ）は、典型的には、医薬上許容される担体と混合され、得られる組成物は対象に投与される。担体は当然、製剤の他のいずれかの成分と相溶性であるという意味で許容されなければならず、また対象にとって有害であってはならない。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、対象における疾患の治療に有用な１又は複数の追加の薬剤又は生体分子を更に含むことができる。同様に、追加の薬剤及び／又は生体分子を別々の組成物として同時投与することができる。
【０２５６】
特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ（又は遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸）の組み合わせを含むことができ、この場合それぞれの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、異なるＨＢＶ認識配列に対する特異性を有し、その結果、単一の医薬組成物が、対象における広範なアレイのＨＢＶ遺伝子型及び／又は遺伝子型単離体の治療に広範囲に有用となる。同様に、他の実施形態では、本発明の医薬組成物は、異なるＨＢＶ認識配列に対する特異性を有する本明細書に記載の複数の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードするポリシストロニックｍＲＮＡ（又は発現時にポリシストロニックｍＲＮＡを産生するカセットを有する組換えＤＮＡ構築物又はウイルスベクター）を含み得る。そのような医薬組成物はまた、対象における広範なアレイのＨＢＶ遺伝子型及び／又は遺伝子型単離体の治療に広範囲に有用となる。いずれの場合も、そのような医薬組成物は、特定のＨＢＶ遺伝子型又は単離体が対象において既知であるか未知であるときの単一の治療として有用であり得る。
【０２５７】
例えば、本明細書に開示の複数の異なる組換えメガヌクレアーゼを含む、又は本明細書に開示の複数の異なる組換えメガヌクレアーゼをコードする核酸分子を含む医薬組成物は、ＨＢＶの複数の遺伝子型に感染した、又はＨＢＶの未知の遺伝子型に感染した患者に投与できる。従って、複数の異なる組換えメガヌクレアーゼを含む医薬組成物を準備すること、又は複数の異なる組換えメガヌクレアーゼをコードする核酸分子を含むことで、資源によりＨＢＶの正確な遺伝子型判定ができず、また迅速で広い治療の解決が望まれるＨＢＶ感染の治療及び制御に対する柔軟な選択肢が得られる。
【０２５８】
本発明の特定の実施形態では、医薬組成物は、脂質ナノ粒子内に封入された本明細書に記載の１以上のｍＲＮＡを含むことができ、それは本明細書の他の箇所に記載されている
。特定の実施形態において、脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の異なるＨＢＶ認識配列に対する特異性を有する本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをそれぞれコードする、本明細書に記載の２以上のｍＲＮＡを含み得る。特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、それぞれが異なるＨＢＶ認識配列に対して特異性を有する本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする、本明細書に記載の２、３、又は４つのｍＲＮＡを含み得る。他の実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の異なるＨＢＶ認識配列に対する特異性を有する本発明の２以上の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをそれぞれコードする、本明細書に記載の１以上のポリシストロニックｍＲＮＡを含み得る。特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の２、３、又は４つの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードするポリシストロニックｍＲＮＡを含むことができる。他の特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の２以上のポリシストロニックｍＲＮＡを含むことができ、各々本発明の２以上の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする。
【０２５９】
本発明での使用が企図されるいくつかの脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのカチオン性脂質、少なくとも１つの非カチオン性脂質、及び少なくとも１つの複合脂質を含む。より特定の例では、脂質ナノ粒子は、約５０モル％〜約８５モル％のカチオン性脂質、約１３モル％〜約４９．５モル％の非カチオン性脂質、及び約０．５モル％〜約１０モル％の脂質コンジュゲートを含み得、非ラメラ（即ち、非二層）の形態を有するような方法で製造される。他の特定の例では、脂質ナノ粒子は、約４０モル％〜約８５モル％のカチオン性脂質、約１３モル％〜約４９．５モル％の非カチオン性脂質、及び約０．５モル％〜約１０モル％の脂質コンジュゲートを含み得、非ラメラ（即ち、非二層）の形態を有するような方法で製造される。
【０２６０】
カチオン性脂質は、例えば、以下の１以上を含み得る：パルミトイル−オレオイル−ノル−アルギニン（ＰＯＮＡ）、ＭＰＤＡＣＡ、ＧＵＡＤＡＣＡ、（（６Ｚ、９Ｚ、２８Ｚ、３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタン酸）（ＭＣ３）；ＬｅｎＭＣ３、ＣＰ−ＬｅｎＭＣ３、γ−ＬｅｎＭＣ３、ＣＰ−γーＬｅｎＭＣ３、ＭＣ３ＭＣ、ＭＣ２ＭＣ、ＭＣ３エーテル、ＭＣ４エーテル、ＭＣ３アミド、Ｐａｎ−ＭＣ３、Ｐａｎ−ＭＣ４、及びＰａｎＭＣ５、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ；「ＸＴＣ２」）、２，２−ジリノレイル−４−（３−ジメチルアミノプロピル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ３−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−（４−ジメチルアミノブチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ４−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−５−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキサン（ＤＬｉｎ−Ｋ６−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−Ｎ−メチルペジアジノ−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＭＰＺ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルカルバモイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ）、１，２−ジリノレイオキシ−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＣ）、１，２−ジリノレイオキシ−３−モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ−ＭＡ）、１，２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）、１−リノレオイル−２−リノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ−ＭＰＺ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジリノレイルアミノ）−１，２−プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジオレイルアミノ）−１，２−プロパン
ジオ（ＤＯＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキソ−３−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２−ジオレオイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジステアリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、３−（Ｎ−（Ｎ´，Ｎ´−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロプ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、２，３−ジオレオイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミン−カルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロ酢酸塩（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、３−ジメチルアミノ−２−（コレスト−５−エン−３−ベータ−オキシブタン−４−オキシ）−１−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９，１２−オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、２−［５´−（コレスタ−５−エン−３−ベータ−オキシ）−３´−オキサペントキシ）−３−ジメチル−１−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９’，１−２´−オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）、１，２−Ｎ，Ｎ’−ジオレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ）、１，２−Ｎ，Ｎ’−ジリノレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ）、又はそれらの混合物。カチオン性脂質はまた、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ（「ＸＴＣ２」）、ＭＣ３、ＬｅｎＭＣ３、ＣＰ−ＬｅｎＭＣ３、γ−ＬｅｎＭＣ３、ＣＰ−γ−ＬｅｎＭＣ３、ＭＣ３ＭＣ、ＭＣ２ＭＣ、ＭＣ３エーテル、ＭＣ４エーテル、ＭＣ３アミド、Ｐａｎ−ＭＣ３、Ｐａｎ−ＭＣ４、ＰａｎＭＣ５、又はそれらの混合物であってよい。
【０２６１】
様々な実施形態において、カチオン性脂質は、粒子に存在する総脂質の約５０ｍｏｌ％〜約９０ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％〜約８５ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％〜約８０ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％〜約７５ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％〜約７０ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％〜約６５ｍｏｌ％、又は約５０ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％を含み得る。
【０２６２】
他の実施形態では、カチオン性脂質は、粒子に存在する総脂質の約４０ｍｏｌ％〜約９０ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％〜約８５ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％〜約８０ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％〜約７５ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％〜約７０ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％〜約６５ｍｏｌ％、又は約４０ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％を含み得る。
【０２６３】
非カチオン性脂質は、例えば、１以上のアニオン性脂質及び／又は中性脂質を含み得る。好ましい実施形態では、非カチオン性脂質は、以下の中性脂質の成分のうちの１つを含む：（１）コレステロール若しくはその誘導体；（２）リン脂質；又は（３）リン脂質とコレステロール若しくはその誘導体との混合物。コレステロール誘導体の例には、コレスタノール、コレスタノン、コレステノン、コプロスタノール、コレステリル−２’−ヒドロキシエチルエーテル、コレステリル−４’−ヒドロキシブチルエーテル、及びそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。リン脂質は、中性脂質、例えば非限定的に、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジパルミトイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−
ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル−ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル−ホスファチジルエタノールアミン、ジエライドイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、ステアロイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、及びそれらの混合物であってよい。ある好ましい態様において、リン脂質は、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、又はそれらの混合物である。
【０２６４】
いくつかの実施形態において、非カチオン性脂質（例えば、１以上のリン脂質及び／又はコレステロール）は、粒子に存在する総脂質の約１０ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％〜約５５ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％〜約５５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％〜約５５ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％〜約５５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約５５ｍｏｌ％、約１３ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％、又は約２０ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％を含み得る。非カチオン性脂質がリン脂質とコレステロール又はコレステロール誘導体との混合物である場合、混合物は粒子に存在する総脂質の最大約４０、５０、又は６０モル％を含んでもよい。
【０２６５】
粒子の凝集を阻害する複合脂質は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質コンジュゲート、ポリアミド（ＡＴＴＡ）−脂質コンジュゲート、カチオン性ポリマー−脂質コンジュゲート（ＣＰＬ）、又はそれら混合物の１以上を含み得る。１つの好ましい態様において、核酸−脂質粒子は、ＰＥＧ−脂質コンジュゲート又はＡＴＴＡ−脂質コンジュゲートのいずれかを含む。特定の実施形態では、ＰＥＧ−脂質コンジュゲート又はＡＴＴＡ−脂質コンジュゲートはＣＰＬと一緒に使用される。粒子の凝集を阻害する複合脂質は、例えば、ＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ−リン脂質、ＰＥＧ−セラミド（Ｃｅｒ）、又はそれらの混合物を含むＰＥＧ−脂質を含み得る。ＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートは、ＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）、ＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）、又はそれらの混合物であり得る。
【０２６６】
本発明における使用に適した更なるＰＥＧ−脂質コンジュゲートとしては、ｍＰＥＧ２０００−１，２−ジ−Ｏ−アルキル−ｓｎ３−カルボモイルグリセリド（ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ）が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧの合成は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０８／８８６７６号に記載されている。本発明での使用に適した更に追加のＰＥＧ−脂質コンジュゲートとしては、限定されないが、１−［８’−（１，２−ジミリストイル−３−プロパノキシ）−カルボキサミド−３’，６’−ジオキサオクタニル］カルバモイル−ω−メチル−ポリ（エチレングリコール）（２ＫＰＥＧ−ＤＭＧ）が挙げられる。２ＫＰＥＧ−ＤＭＧの合成は、米国特許第７，４０４，９６９号に記載されている。
【０２６７】
場合によっては、粒子の凝集を阻害する複合脂質（例えば、ＰＥＧ−脂質コンジュゲート）は、粒子に存在する総脂質の約０．１ｍｏｌ％〜約２ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％〜約２ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％〜約２ｍｏｌ％、約０．６ｍｏｌ％〜約１．９ｍｏｌ％、約０．７ｍｏｌ％〜約１．８ｍｏｌ％、約０．８ｍｏｌ％〜約１．７ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％〜約１．８ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％〜約１．８ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％〜約１．７ｍｏｌ％、約１．３ｍｏｌ％〜約１．６ｍｏｌ％、約１．４ｍｏｌ％〜約１．５ｍｏｌ％、又は約１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、又は２ｍｏｌ％（又はその任意の画分もしくはその範囲）を含むことができる。典型的には、そのような場合、ＰＥＧ部分は約２，０００ダルトンの平均分子量を有する。他の場合において、粒子の凝集を阻害する複合脂質（例えば、ＰＥＧ−脂質コンジュゲ
ート）は、粒子に存在する総脂質の約５．０ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％〜約９ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％〜約８ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％〜約９ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％〜約８ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％、６ｍｏｌ％、７ｍｏｌ％、８ｍｏｌ％、９ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％（又はその任意の画分もしくはその範囲）を含むことができる。典型的には、そのような場合、ＰＥＧ部分は約７５０ダルトンの平均分子量を有する。
【０２６８】
他の実施形態では、組成物は、正電荷とは異なる、少なくとも１つの正電荷担体と少なくとも１つの負電荷担体とを含む両性リポソームを含むことができ、リポソームの等電点は４〜８である。この目的は、リポソームをｐＨ依存性の変化する電荷で準備するという事実により達成される。
【０２６９】
所望の特性を有するリポソームの構造は、例えば、膜形成又は膜ベースのカチオン電荷担体の量が、低いｐＨではアニオン電荷担体の量を超え、その比がより高いｐＨでは逆転するときに形成される。これは、イオン性成分のｐＫａ値が４〜９の場合に常に当てはまる。媒体のｐＨが低下すると、全てのカチオン電荷担体がより荷電し、全てのアニオン電荷担体はその電荷を失う。
【０２７０】
両性リポソームに有用なカチオン性化合物には、本明細書において既に上記したカチオン性化合物が含まれる。限定するものではないが、カチオン性の強い化合物には、例えば、ＤＣ−Ｃｈｏｌ  ３−β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルメタン）カルバモイル］コレステロール、ＴＣ−Ｃｈｏｌ  ３−β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−トリメチルアミノエタン）カルバモイルコレステロール、ＢＧＳＣビスグアニジニウム−スペルミジン−コレステロール、ＢＧＴＣビス−グアジニウム−トレン−コレステロール、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイルオキシプロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、ＤＯＳＰＥＲ（１，３−ジオレオイルオキシ−２−（６−カルボキシ−スペルミル）−プロピルアミド）、ＤＯＴＭＡ（１，２−ジオレオイルオキシプロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）（リポフェクチン（登録商標））、ＤＯＲＩＥ１，２−ジオレオイルオキシプロピル）−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、ＤＯＳＣ（１，２−ジオレオイル−３−スクシニル−ｓｎ−グリセリルコリンエステル）、ＤＯＧＳＤＳＯ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−スクシニル−２−ヒドロキシエチルジスルフィドオルニチン（ｏｍｉｔｈｉｎｅ））、ＤＤＡＢジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、ＤＯＧＳ（（Ｃ１８）２ＧｌｙＳｐｅｒ３＋）Ｎ，Ｎ−ジオクタデシルアミド−グリコール−スペルミン（トランスフェクタム（登録商標））（Ｃ１８）２Ｇｌｙ＋Ｎ，Ｎ−ジオクタデシルアミド−グリシン、ＣＴＡＢセチルトリメチルアンモニウムブロミド、ＣｐｙＣセチルピリジニウムクロリド、ＤＯＥＰＣ１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン又は他のＯ−アルキル−ホスファチジルコリン又はエタノールアミン、リジンからのアミド、アルギニン又はオルニチン（ｏｍｉｔｈｉｎｅ）、及びホスファチジルエタノールアミンを含むことができる。
【０２７１】
カチオン性の弱い化合物の例としては、限定するものではないが、Ｈｉｓ−Ｃｈｏｌ（ヒスタミニル−コレステロールヘミスクシネート）、Ｍｏ−Ｃｈｏｌ（モルホリン−Ｎ−エチルアミノ−コレステロールヘミスクシネート）、又はヒスチジニル−ＰＥが挙げられる。
【０２７２】
中性化合物の例としては、コレステロール、セラミド、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、テトラエーテル脂質、又はジアシルグリセロールが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２７３】
両性リポソームに有用なアニオン性化合物には、本明細書において既に記載した非カチオン性化合物が含まれる。限定されないが、弱アニオン性化合物の例には、ＣＨＥＭＳ（
コレステロールヘミスクシネート）、８〜２５個の炭素原子を有するアルキルカルボン酸、又はジアシルグリセロールヘミスクシネートが含まれ得る。追加の弱アニオン性化合物には、アスパラギン酸、又はグルタミン酸とＰＥ及びＰＳのアミド、並びにグリシン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、セリン、システイン、トレオニン、チロシン、グルタミン酸、アスパラギン酸若しくは他のアミノ酸、又はアミノジカルボン酸とのそのアミドが含まれ得る。同じ原理に従うと、ヒドロキシカルボン酸又はヒドロキシジカルボン酸とＰＳとのエステルも弱アニオン性化合物である。
【０２７４】
いくつかの実施形態では、両性リポソームは、本明細書の上記に記したものなどの複合脂質を含み得る。有用な複合脂質の特定の例には、ＰＥＧ改変ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジン酸、ＰＥＧ−セラミドコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４又はＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ改変ジアルキルアミン及びＰＥＧ改変１，２−ジアシルオキシプロパン−３−アミンが含まれるが、これらに限定されない。特に好ましいのは、ＰＥＧ改変ジアシルグリセロール及びジアルキルグリセロールである。
【０２７５】
いくつかの実施形態において、中性脂質は、粒子に存在する総脂質の約１０ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％〜約５５ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％〜約５５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％〜約５５ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％〜約５５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約５５ｍｏｌ％、約１３ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％、又は約２０ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％を含み得る。
【０２７６】
場合によっては、粒子の凝集を阻害する複合脂質（例えば、ＰＥＧ−脂質コンジュゲート）は、粒子に存在する総脂質の約０．１ｍｏｌ％〜約２ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％〜約２ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％〜約２ｍｏｌ％、約０．６ｍｏｌ％〜約１．９ｍｏｌ％、約０．７ｍｏｌ％〜約１．８ｍｏｌ％、約０．８ｍｏｌ％〜約１．７ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％〜約１．８ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％〜約１．８ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％〜約１．７ｍｏｌ％、約１．３ｍｏｌ％〜約１．６ｍｏｌ％、約１．４ｍｏｌ％〜約１．５ｍｏｌ％、又は約１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、又は２ｍｏｌ％（又はその任意の画分もしくはその範囲）を含むことができる。典型的には、そのような場合、ＰＥＧ部分は約２，０００ダルトンの平均分子量を有する。他の場合において、粒子の凝集を阻害する複合脂質（例えば、ＰＥＧ−脂質コンジュゲート）は、粒子に存在する総脂質の約５．０ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％〜約９ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％〜約８ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％〜約９ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％〜約８ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％、６ｍｏｌ％、７ｍｏｌ％、８ｍｏｌ％、９ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％（又はその任意の画分もしくはその範囲）を含むことができる。典型的には、そのような場合、ＰＥＧ部分は約７５０ダルトンの平均分子量を有する。
【０２７７】
中性及び複合脂質の総量を考慮すると、両性リポソームの残りの残余は、様々な比率で処方されたカチオン性化合物とアニオン性化合物の混合物を含み得る。カチオン性脂質とアニオン性脂質の比率は、核酸封入の所望の特性、ゼータ電位、ｐＫａ、又は荷電脂質成分の存在に少なくとも部分的に依拠する他の物理化学的特性を成し遂げるために選択され得る。
【０２７８】
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、肝臓、特に肝細胞内での送達及び取り込みを特異的に増強する組成を有する。
【０２７９】
２．５組換えＡＡＶベクターの作製方法
【０２８０】
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の方法で使用するための組換えＡＡＶベクターを提供する。組換えＡＡＶベクターは、典型的には、ＨＥＫ−２９３等の哺乳動物細胞株において産生される。ウイルスのｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子は、ベクターから除去されて治療遺伝子（例えばエンドヌクレアーゼ遺伝子）を送達するための空間を設けるために自己複製を防止するので、これらをパッケージングする細胞株にイントランス（ｉｎ  ｔｒａｎｓ）で供給する必要がある。更に、複製を支持するのに必要な「ヘルパー」（例えばアデノウイルス）成分を供給することが必要である（Ｃｏｔｓ  Ｄ，Ｂｏｓｃｈ  Ａ，Ｃｈｉｌｌｏｎ  Ｍ（２０１３）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１３（５）：３７０−８１）。多くの場合、組換えＡＡＶベクターは、「ヘルパー」成分をコードする第１のプラスミド、ｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子を含む第２のプラスミド、並びにウイルスにパッケージングされる介在するＤＮＡ配列を含むウイルスＩＴＲを含む第３のプラスミドで、細胞株を形質移入する、トリプル形質移入を用いて産生される。次いで、カプシドに包まれたゲノム（ＩＴＲ及び対象の介在する遺伝子）を含むウイルス粒子を、凍結融解サイクル、超音波処理、界面活性剤、又は当技術分野で公知の他の手段によって細胞から単離する。次いで、粒子を塩化セシウム密度勾配遠心分離又はアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製し、続いて細胞、組織、又はヒトである患者等の生物に対して、目的の遺伝子に送達する。
【０２８１】
組換えＡＡＶ粒子は典型的には細胞で産生（作製）されるので、部位特異的エンドヌクレアーゼがパッケージング細胞にて発現されないことを確実にするために、本発明を実施する際に注意を払わなければならない。本発明のウイルスゲノムはエンドヌクレアーゼの認識配列を含むので、パッケージング細胞株で発現される任意のエンドヌクレアーゼは、ウイルス粒子にパッケージングされ得る前に、ウイルスゲノムを切断することができる。これはパッケージング効率の低下及び／又は断片化したゲノムのパッケージングをもたらす。パッケージング細胞におけるエンドヌクレアーゼの発現を防ぐために、以下のようないくつかのアプローチを用いることができる。
【０２８２】
エンドヌクレアーゼは、パッケージング細胞で活性ではない組織特異的プロモータの制御下に置くことができる。例えば、ウイルスベクターがエンドヌクレアーゼ遺伝子を筋肉組織に送達するように開発されている場合、筋肉特異的プロモータを使用することができる。筋肉特異的プロモータの例は、Ｃ５−１２（Ｌｉｕ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１５：７８３−９２）、筋肉特異的クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモータ（Ｙｕａｓａ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：１５７６−８８）、又は平滑筋２２（ＳＭ２２）プロモータ（Ｈａａｓｅ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：４９−５４）を含む。ＣＮＳ（ニューロン）特異的プロモータの例には、ＮＳＥ、シナプシン、及びＭｅＣＰ２プロモータが含まれる（Ｌｅｎｔｚ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ｄｉｓ．４８：１７９−８８）。肝臓特異的プロモータの例には、アルブミンプロモータ（Ｐａｌｂ等）、ヒトα１−アンチトリプシン（Ｐａ１ＡＴ等）、及びヘモペキシン（Ｐｈｐｘ等）が含まれる（Ｋｒａｍｅｒ，ＭＧ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：３７５−８５）。眼特異的プロモータの例には、オプシン、及び角膜上皮特異的Ｋ１２プロモータが含まれる（Ｍａｒｔｉｎ  ＫＲＧ，Ｋｌｅｉｎ  ＲＬ，ａｎｄ  Ｑｕｉｇｌｅｙ
ＨＡ（２００２）Ｍｅｔｈｏｄｓ（２８）：２６７−７５）（Ｔｏｎｇ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ，９：９５６−６６）。これらのプロモータ又は当技術分野で公知の他の組織特異的プロモータは、ＨＥＫ−２９３細胞において高度に活性であるわけではなく、従って、本発明のウイルスベクターに組み込まれた場合、パッケージング細胞において顕著なレベルのエンドヌクレアーゼ遺伝子発現を生じないと予想される。同様に、本発明のウイルスベクターは、不適合な組織特異的プロモータ（即ち、周知のＨｅＬａ細胞系（ヒト上皮細胞）の使用、及び肝臓特異的ヘモペキシンプロモータの使用）を用いる他の細胞系の使用を企図する。組織特異的プロモータの他の例には、滑
膜肉腫ＰＤＺＤ４（小脳）、Ｃ６（肝臓）、ＡＳＢ５（筋肉）、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｂ（心臓）、ＳＬＣ５Ａ１２（腎臓）、コレステロール調節ＡＰＯＭ（肝臓）、及びＡＤＰＲＨＬ１（心臓）、及び単一遺伝子奇形症候群ＴＰ７３Ｌ（筋肉）が含まれる。（Ｊａｃｏｘ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ｖ．５（８）：ｅ１２２７４）。
【０２８３】
あるいは、ベクターは、エンドヌクレアーゼが発現される見込みのない、異なる種由来の細胞にパッケージングされ得る。例えば、ウイルス粒子は、哺乳動物以外のパッケージング細胞では活性ではない、周知のサイトメガロウイルス又はＳＶ４０ウイルス初期プロモータ等の哺乳動物のプロモータを用いて、微生物、昆虫、又は植物細胞にて産生することができる。好ましい態様において、ウイルス粒子は、Ｇａｏら（Ｇａｏ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３１（２）：１３８−４３）によって記載されているように、バキュロウイルス系を用いて昆虫細胞にて産生される。哺乳動物のプロモータの制御下にあるエンドヌクレアーゼは、これらの細胞において発現される可能性は低いＡｉｒｅｎｎｅ，ＫＪ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２１（４）：７３９−４９）。更に、昆虫細胞は哺乳動物細胞とは異なるｍＲＮＡスプライシングモチーフを利用する。従って、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）のイントロン又はＳＶ４０ラージＴ抗原のイントロン等の哺乳動物のイントロンを、エンドヌクレアーゼのコード配列に組み込むことが可能である。これらのイントロンは昆虫細胞のプレｍＲＮＡ転写物から効率的にはスプライシングされないので、昆虫細胞は機能的なエンドヌクレアーゼを発現せず、ゲノム全長をパッケージングする。対照的に、得られた組換えＡＡＶ粒子が送達される哺乳動物の細胞は、プレｍＲＮＡを適切にスプライスし、機能的なエンドヌクレアーゼタンパク質を発現する。Ｈａｉｆｅｎｇ  Ｃｈｅｎは、昆虫パッケージング細胞における毒性のタンパク質バルナーゼ及びジフテリア毒素フラグメントＡの発現を減弱するために、ＨＧＨ及びＳＶ４０ラージＴ抗原イントロンの使用を報告しており、これらの毒素遺伝子を運ぶ組換えＡＡＶベクターの産生を可能にする（Ｃｈｅｎ，Ｈ（２０１２）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．１（１１）：ｅ５７）。
【０２８４】
エンドヌクレアーゼ遺伝子は、小分子インデューサーがエンドヌクレアーゼの発現に必要とされるように誘導性プロモータに作動可能に連結され得る。誘導性プロモータの例には、Ｔｅｔ−Ｏｎシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｃｈｅｎ  Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（１）：４））、及びＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈシステム（Ｉｎｔｒｅｘｏｎ；Ｓｏｗａ  Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｓｐｉｎｅ，  ３６（１０）：Ｅ６２３−８）が含まれる。両方のシステム及び当技術分野で公知の類似のシステムは、小分子アクチベータ（それぞれ、ドキシサイクリン又はエクジソン）に応答して転写を活性化するリガンド誘導性転写因子（それぞれ、Ｔｅｔレプレッサー及びエクジソン受容体の変異体）に依存する。このようなリガンド誘導性転写活性化因子を用いて本発明を実施することは、１）対応する転写因子に応答するプロモータの制御下にエンドヌクレアーゼ遺伝子を配置し、エンドヌクレアーゼ遺伝子は転写因子に対する結合部位を有すること、及び２）パッケージされたウイルスゲノムに転写因子をコードする遺伝子を含むことを含む。転写アクチベータが同様に同じ細胞に提供されない場合、エンドヌクレアーゼは組換えＡＡＶ送達後に標的細胞又は組織において発現されないため、後者の工程が必要である。次いで転写アクチベータは、同族の小分子アクチベータで処理された細胞又は組織においてのみ、エンドヌクレアーゼの遺伝子の発現を誘導する。このアプローチは、いつ、どの組織に小分子インデューサーを送達するかを選択することによって、エンドヌクレアーゼの遺伝子の発現を時空間的様式で調節することを可能にするため、有利である。しかし、ウイルスゲノムにインデューサーを含める必要性は、運搬能力を著しく制限するものであり、このアプローチに対する欠点を生み出している。
【０２８５】
別の好ましい実施形態では、エンドヌクレアーゼの発現を妨げる転写リプレッサを発現する哺乳動物細胞株において、組換えＡＡＶ粒子が産生される。転写リプレッサは当技術
分野において公知であり、Ｔｅｔリプレッサ、Ｌａｃリプレッサ、Ｃｒｏリプレッサ、及びλリプレッサが含まれる。エクジソン受容体等の多くの核ホルモン受容体はまた、それらの同族ホルモンリガンドの非存在下で、転写リプレッサとしても作用する。本発明を実施するために、パッケージングする細胞を、転写リプレッサをコードするベクターで形質移入／形質導入し、ウイルスゲノムのエンドヌクレアーゼ遺伝子（パッケージングベクター）を、リプレッサに対する結合部位を含むように改変したプロモータに作動可能に連結させ、リプレッサはプロモータをサイレンシングするようにする。転写リプレッサをコードする遺伝子は様々な位置に配置することができる。それは、別のベクトルにコードすることができる。それはＩＴＲ配列の外部でパッケージングベクターに組み込むことができる。それはｃａｐ／ｒｅｐベクター又はアデノウイルスヘルパーベクターに組み込むことができる。あるいは、最も好ましくは、それは構成的に発現されるように、パッケージングする細胞のゲノムに安定して組み込むことができる。転写リプレッサ部位を組み込むために一般的な哺乳動物プロモータを改変する方法は、当技術分野において公知である。例えば、Ｃｈａｎｇ及びＲｏｎｉｎｓｏｎは、強力で構成的なＣＭＶ及びＲＳＶプロモータを、Ｌａｃリプレッサ用のオペレータを含むように改変し、改変したプロモータによる遺伝子発現が、リプレッサを発現する細胞で非常に減弱されることを示した（Ｃｈａｎｇ  ＢＤ，ａｎｄ  Ｒｏｎｉｎｓｏｎ  ＩＢ（１９９６）Ｇｅｎｅ１８３：１３７−４２）。非ヒト転写リプレッサを使用することで、エンドヌクレアーゼ遺伝子の転写が、リプレッサを発現するパッケージングする細胞においてのみ抑制され、得られた組換えＡＡＶベクターで形質導入された標的細胞又は組織においては抑制されないことが確実になる。
【０２８６】
２．６  遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ変異体
【０２８７】
本発明の実施形態は、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ及びその変異体を包含する。本発明の更なる実施形態は、本明細書に記載のエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド及びそのようなポリヌクレオチドの変異体を包含する。
【０２８８】
本明細書で使用しているとき、「変異体」は実質的に類似の配列を意味することを意図している。「変異体」ポリペプチドは、天然タンパク質の１以上の内部の部位における１以上のアミノ酸の欠失若しくは付加、及び／又は天然ポリペプチドの１以上の部位における１以上のアミノ酸の置換によって、「天然」ポリペプチドから誘導されるポリペプチドを意味することを意図している。本明細書で使用しているとき、「天然の」ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、変異体が由来する親の配列を含む。実施形態に包含される変異体ポリペプチドは、生物学的に活性である。即ち、それらは天然のタンパク質の所望の生物学的活性を保有し続けている。即ち、Ｂ型肝炎ウイルスの少なくとも２つの遺伝子型のゲノムのＯＲＦ内の認識配列、例えばＨＢＶ１−２認識配列（配列番号１０）、ＨＢＶ５−６認識配列（配列番号１２）、ＨＢＶ７−８認識配列（配列番号１４）、又はＨＢＶ１１−１２認識配列（配列番号１６）を認識して切断する能力を保有し続けている。そのような変異体は、例えば、人間の操作から生じ得る。実施形態の天然のポリペプチドの生物学的に活性な変異体（例えば、配列番号１８〜３９）、又は本明細書に記載の認識した半分の部位の結合サブユニットの生物学的に活性な変異体は、本明細書の他の箇所に記載されている配列アラインメントプログラム及びパラメータによって判定されるように、天然のポリペプチド又は天然のサブユニットのアミノ酸配列に対して、少なくとも約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の配列同一性を有する。実施形態のポリペプチド又はサブユニットの生物学的に活性な変異体は、そのポリペプチド又はサブユニットと約１〜４０程度のアミノ酸残基、約１〜２０程度、約１〜１０程度、約５程度、４、３、２、又は１アミノ酸残基程度少なくて、異なることがあり得る。
【０２８９】
実施形態のポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失、切断、及び挿入を含む様々な方法で改変することができる。そのような操作のための方法は、当技術分野で一般的に知られている。例えば、アミノ酸配列変異体は、ＤＮＡの突然変異によって作製することができる。突然変異誘発及びポリヌクレオチドの改変のための方法は、当技術分野において周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２；米国特許第４，８７３，１９２号；Ｗａｌｋｅｒ  ａｎｄ  Ｇａａｓｔｒａ，ｅｄｓ．（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
Ｃｏｍｐａｎｙ，ニューヨーク州）及びそれに引用されている参考文献を参照されたい。目的のタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸の置換に関する指針は、参照により本明細書に組み入れられる、Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９７８）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルに見出すことができる。１つのアミノ酸を類似した特性を有する他のものと交換するといった保存的な置換が最適であり得る。
【０２９０】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、本明細書に開示されているＨＶＲ１及びＨＶＲ２領域の変異体を含み得る。親ＨＶＲ領域は、例えば、例示の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの残基２４〜７９又は残基２１５〜２７０を含み得る。従って、変異体ＨＶＲは、本明細書に例示の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの残基２４〜７９又は残基２１５〜２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、その結果変異体ＨＶＲ領域が、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの生物学的活性（即ち、認識配列への結合及び切断）を維持するようになる。更に、本発明のいくつかの実施形態では、変異型ＨＶＲ１領域又は変異型ＨＶＲ２領域は、親ＨＶＲ内の特定の位置に見られるアミノ酸残基に対応する残基を含み得る。これに関連して、「に対応する」とは、変異体ＨＶＲのアミノ酸残基が、同じ対応する位置で（即ち、親配列の残りのアミノ酸に関連して）親ＨＶＲ配列に存在する同じアミノ酸残基（即ち、別の同一の残基）であることを意味する。例として、親ＨＶＲ配列が２６位にセリン残基を含む場合、残基２６に「対応する残基を含む」変異型ＨＶＲはまた、親の２６位に対応する位置にセリンを含む。
【０２９１】
野生型Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼのＤＮＡ認識ドメインに対するかなりの数のアミノ酸の改変が、以前に同定されており（例えば、米国特許第８，０２１，８６７号）、それは単独で又は組み合わせて、ＤＮＡの認識配列の半分の部位の中の個々の塩基において特異性が改変された、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを生じ、得られた合理的に設計されたメガヌクレアーゼが、野生型酵素とは異なる半分の部位の特異性を有するようにする。表５は、認識した半分の部位の各々の半分の部位の位置（−１〜−９）に存在する塩基に基づいて特異性を増強するために遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ単量体又はサブユニットにおいてなされ得る潜在的な置換を提供する。
【０２９２】
【表５】
0006919049.tif 000006
【０２９３】
太字のエントリは野生型の接触残基であり、本明細書で使用している「改変」を構成してはいない。アスタリスクは、残基がアンチセンス鎖の塩基と接触していることを示す。
【０２９４】
ポリヌクレオチドの場合、「変異体」は、天然のポリヌクレオチド内の１以上の部位における１以上のヌクレオチドの欠失及び／又は付加を含む。当業者は、実施形態の核酸の変異体が、オープンリーディングフレームを維持するように構築されることを認識する。ポリヌクレオチドに関して、保存的な変異体は、遺伝暗号の縮重のために、実施形態のポリペプチドのうちの１つのアミノ酸配列をコードするそれらの配列を含む。変異体のポリヌクレオチドには、例えば部位志向的な突然変異誘発を用いることによって生成されるが、それでも実施形態の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードするもの等の、合成由来のポリヌクレオチドが含まれる。一般に、実施形態の特定のポリヌクレオチドの変異体は、本明細書の他の箇所に記載されている配列アラインメントプログラム及びパラメータによって定まる特定の当該のポリヌクレオチドに少なくとも約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又はそれ以上の配列同一性を有する。実施形態の特定のポリヌクレオチド（即ち、参照ポリヌクレオチド）の変異体はまた、変異体のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと、参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドとの間のパーセントの配列同一性の比較によって評価することができる。
【０２９５】
本明細書に包含されるタンパク質の配列の欠失、挿入、及び置換は、ポリペプチドの特徴に根本的な変化を生じさせるとは予想されない。しかし、置換、欠失、又は挿入の正確な効果を実行する前に予測することが困難である場合、当業者は、その効果が、Ｂ型肝炎ウイルスの少なくとも２つの遺伝子型のゲノムのＯＲＦ内の認識配列を優先的に認識して切断する能力についてポリペプチドをスクリーニングすることによって評価されるということを認識する。
【実施例】
【０２９６】
本発明を以下の実施例によって更に説明するが、これらは限定するものとして解釈されるべきではない。当業者は、日常的な実験のみを利用して、本明細書に記載の特定の物質や手順に対する多数の等価物を認識する、又は確認することができる。そのような均等物は、以下の実施例に続く特許請求の範囲に包含されることを意図している。
【０２９７】
実施例１；ＨＢＶ認識配列を認識して切断するメガヌクレアーゼの特性決定
【０２９８】
ＨＢＶ１−２認識配列を認識し切断するメガヌクレアーゼ
【０２９９】
本明細書において、まとめて「ＨＢＶ１−２メガヌクレアーゼ」と呼ばれる遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ（配列番号１８〜２１）は、ＨＢＶ１−２認識配列（配列番号１０）を認識して切断するように遺伝子操作され、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、及びＧ（例えば、それぞれ配列番号３〜５及び７〜９）を含む複数のＨＢＶ遺伝子型のＰタンパク質、Ｓ、ｐｒｅＳ２／Ｓ、及びｐｒｅＳ１／ｐｒｅＳ２  ＯＲＦ内に位置付けられる。各ＨＢＶ１−２遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＳＶ４０由来のＮ末端ヌクレアーゼ局在化シグナル、第１のメガヌクレアーゼサブユニット、リンカー配列、及び第２のメガヌクレアーゼサブユニットを含む。各ＨＢＶ１−２メガヌクレアーゼの第１のサブユニットは、配列番号１０のＨＢＶ１の認識した半分の部位に結合し、一方第２のサブユニットは、ＨＢＶ２の認識した半分の部位に結合する（図２参照）。
【０３００】
ＨＢＶ１結合サブユニット及びＨＢＶ２結合サブユニットはそれぞれ、ＨＶＲ１及びＨＶＲ２とそれぞれ呼ばれる５６塩基対の超可変領域を含む。ＨＢＶ１結合サブユニットは
ＨＶＲ１領域外で高度に保存されている。同様に、ＨＢＶ２結合サブユニットもまた、ＨＶＲ２領域外で高度に保存されている。配列番号１８〜２１のＨＢＶ１結合領域は、それぞれ配列番号４０〜４３として提供される。配列番号４０〜４３のそれぞれは、メガヌクレアーゼＨＢＶ１〜２×．２（配列番号１８）のＨＢＶ１結合領域である配列番号４０と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。配列番号１８〜２１のＨＢＶ２結合領域は、それぞれ配列番号４４〜４７として提供されている。配列番号４４〜４７のそれぞれは、メガヌクレアーゼＨＢＶ１〜２×．２（配列番号１８）のＨＢＶ２結合領域である配列番号４４と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。
【０３０１】
ＨＢＶ  ５−６認識配列を認識し切断するメガヌクレアーゼ
【０３０２】
本明細書において、まとめて「ＨＢＶ５−６メガヌクレアーゼ」と呼ばれる遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ（配列番号２２〜２８）は、ＨＢＶ５−６認識配列（配列番号１２）を認識して切断するように遺伝子操作され、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、及びＧ（例えば、それぞれ配列番号３〜７及び９）を含む複数のＨＢＶ遺伝子型のＰタンパク質、Ｓ、ｐｒｅＳ２／Ｓ、及びｐｒｅＳ１／ｐｒｅＳ２  ＯＲＦ内に位置付けられる。各ＨＢＶ５−６遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＳＶ４０由来のＮ末端ヌクレアーゼ局在化シグナル、第１のメガヌクレアーゼサブユニット、リンカー配列、及び第２のメガヌクレアーゼサブユニットを含む。各ＨＢＶ５−６メガヌクレアーゼの第１のサブユニットは、配列番号１２のＨＢＶ５の認識した半分の部位に結合し、一方第２のサブユニットは、ＨＢＶ６の認識した半分の部位に結合する（図２参照）。
【０３０３】
ＨＢＶ５結合サブユニット及びＨＢＶ６結合サブユニットはそれぞれ、ＨＶＲ１及びＨＶＲ２とそれぞれ呼ばれる５６塩基対の超可変領域を含む。ＨＢＶ５結合サブユニットはＨＶＲ１領域外で高度に保存されている。同様に、ＨＢＶ６結合サブユニットもまた、ＨＶＲ２領域外で高度に保存されている。配列番号２２〜２８のＨＢＶ５結合領域は、それぞれ配列番号４８〜５４として提供される。配列番号４８〜５４のそれぞれは、メガヌクレアーゼＨＢＶ５〜６×．３３（配列番号２２）のＨＢＶ５結合領域である配列番号４９と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。配列番号２２〜２８のＨＢＶ６結合領域は、それぞれ配列番号５５〜６１として提供されている。配列番号５５〜６１のそれぞれは、メガヌクレアーゼＨＢＶ５〜６×．３３（配列番号２２）のＨＢＶ５結合領域である配列番号５５と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。
【０３０４】
ＨＢＶ  ７−８認識配列を認識し切断するメガヌクレアーゼ
【０３０５】
本明細書において、まとめて「ＨＢＶ７−８メガヌクレアーゼ」と呼ばれる遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ（配列番号２９〜３２）は、ＨＢＶ７−８認識配列（配列番号１４）を認識して切断するように遺伝子操作され、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、及びＧ（例えば、それぞれ配列番号３〜６、８、及び９）を含む複数のＨＢＶ遺伝子型のＰタンパク質ＯＲＦ内に位置付けられる。各ＨＢＶ７−８遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＳＶ４０由来のＮ末端ヌクレアーゼ局在化シグナル、第１のメガヌクレアーゼサブユニット、リンカー配列、及び第２のメガヌクレアーゼサブユニットを含む。各ＨＢＶ７−８メガヌクレアーゼの第１のサブユニットは、配列番号１４のＨＢＶ７の認識した半分の部位に結合し、一方第２のサブユニットは、ＨＢＶ８の認識した半分の部位に結合する（図２参照）。
【０３０６】
ＨＢＶ７結合サブユニット及びＨＢＶ８結合サブユニットはそれぞれ、ＨＶＲ１及びＨＶＲ２とそれぞれ呼ばれる５６塩基対の超可変領域を含む。ＨＢＶ７結合サブユニットはＨＶＲ１領域外で高度に保存されている。同様に、ＨＢＶ８結合サブユニットもまた、ＨＶＲ２領域外で高度に保存されている。配列番号２９〜３２のＨＢＶ７結合領域は、それ
ぞれ配列番号６２〜６５として提供される。配列番号６２〜６５のそれぞれは、メガヌクレアーゼＨＢＶ７〜８×．２（配列番号２９）のＨＢＶ７結合領域である配列番号６２と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。配列番号２９〜３２のＨＢＶ８結合領域は、それぞれ配列番号６６〜６９として提供されている。配列番号６６〜６９のそれぞれは、メガヌクレアーゼＨＢＶ７〜８×．２（配列番号２９）のＨＢＶ８結合領域である配列番号６６と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。
【０３０７】
ＨＢＶ  １１−１２認識配列を認識し切断するメガヌクレアーゼ
【０３０８】
本明細書において、まとめて「ＨＢＶ１１−１２メガヌクレアーゼ」と呼ばれる遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ（配列番号３３〜３９）は、ＨＢＶ  １１−１２認識配列（配列番号１６）を認識して切断するように遺伝子操作され、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧ（例えば、それぞれ配列番号３〜９）を含む複数のＨＢＶ遺伝子型のＰタンパク質ＯＲＦ内に位置付けられる。各ＨＢＶ１１−１２遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＳＶ４０由来のＮ末端ヌクレアーゼ局在化シグナル、第１のメガヌクレアーゼサブユニット、リンカー配列、及び第２のメガヌクレアーゼサブユニットを含む。各ＨＢＶ  １１−１２メガヌクレアーゼの第１のサブユニットは、配列番号１６のＨＢＶ１１の認識した半分の部位に結合し、一方第２のサブユニットは、ＨＢＶ１２の認識した半分の部位に結合する（図２参照）。
【０３０９】
ＨＢＶ１１結合サブユニット及びＨＢＶ１２結合サブユニットはそれぞれ、ＨＶＲ１及びＨＶＲ２とそれぞれ呼ばれる５６塩基対の超可変領域を含む。ＨＢＶｓ１１結合サブユニットはＨＶＲ１領域外で高度に保存されている。同様に、ＨＢＶ１２結合サブユニットもまた、ＨＶＲ２領域外で高度に保存されている。配列番号３３〜３９のＨＢＶ１１結合領域は、それぞれ配列番号７０〜７６として提供される。配列番号７０〜７６のそれぞれは、メガヌクレアーゼＨＢＶ１１−１２ｘ．２６（配列番号３３）のＨＢＶ１１結合領域である配列番号７０と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。配列番号３３〜３９のＨＢＶ１２結合領域は、それぞれ配列番号７７〜８３として提供されている。配列番号７７〜８３のそれぞれは、メガヌクレアーゼＨＢＶ１１−１２ｘ．２６（配列番号３３）のＨＢＶ１２結合領域である配列番号７７と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。
【０３１０】
ＣＨＯ細胞レポーターアッセイにおけるＨＢＶ認識配列の切断
【０３１１】
ＨＢＶ１−２、ＨＢＶ５−６、ＨＢＶ７−８、及びＨＢＶ１１−１２メガヌクレアーゼがそれらのそれぞれの認識配列（それぞれ配列番号１０、１２、１４、及び１６）を認識し切断することができるかどうかを判断するために、それぞれ遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを、以前に記載したＣＨＯ細胞レポーターアッセイを使用して評価した（国際公開第２０１２／１６７１９２号パンフレット、図６を参照）。アッセイを実施するために、細胞のゲノムに組み込まれた非機能的緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子発現カセットを保有するＣＨＯ細胞レポーター株を作製した。メガヌクレアーゼによるいずれかの認識配列の細胞内切断が相同組換え事象を刺激して機能的なＧＦＰ遺伝子を生じるように、各細胞株のＧＦＰ遺伝子を一対の認識配列によって中断した。
【０３１２】
この研究のために発現させたＣＨＯレポーター細胞株において、ＧＦＰ遺伝子に挿入された１つの認識配列は、ＨＢＶ１−２認識配列（配列番号１０）、ＨＢＶ５−６認識配列（配列番号１２）、ＨＢＶ７−８認識配列（配列番号１２）、及びＨＢＶ１１−１２認識配列（配列番号１６）であった。ＧＦＰ遺伝子に挿入された第２の認識配列は、ＣＨＯ−２３／２４認識配列であったが、これは「ＣＨＯ−２３／２４」と呼ばれる対照メガヌクレアーゼによって認識され切断されるものである。ＨＢＶ１−２認識配列及びＣＨＯ−２３／２４認識配列を含むＣＨＯレポーター細胞は、「ＨＢＶ１−２細胞」と呼ばれる。Ｈ
ＢＶ５−６認識配列及びＣＨＯ−２３／２４認識配列を含むＣＨＯレポーター細胞は、「ＨＢＶ５−６細胞」と呼ばれる。ＨＢＶ７−８認識配列及びＣＨＯ−２３／２４認識配列を含むＣＨＯレポーター細胞は、「ＨＢＶ７−８細胞」と呼ばれる。ＨＢＶ１１−１２認識配列及びＣＨＯ−２３／２４認識配列を含むＣＨＯレポーター細胞は、「ＨＢＶ１１−１２細胞」と呼ばれる。
【０３１３】
ＣＨＯレポーター細胞を、それらの対応する遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードするプラスミドＤＮＡ（例えば、ＨＢＶ１−２細胞を、ＨＢＶ１−２メガヌクレアーゼをコードするプラスミドＤＮＡで形質移入した）、又はＣＨＯ−２３／３４メガヌクレアーゼをコードするプラスミドＤＮＡで、形質移入した。各アッセイにおいて、４ｅ５のＣＨＯレポーター細胞を、製造元の説明書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、９６ウェルプレートにおける５０ｎｇのプラスミドＤＮＡで形質移入した。形質移入の４８時間後に、細胞をフローサイトメトリーにより評価して、形質移入されていない陰性の対照（ＨＢＶ  ｂｓ）と比較し、ＧＦＰ陽性細胞の割合を判定した。図７Ａ〜図７Ｄに示しているように、全てのＨＢＶメガヌクレアーゼは、陰性の対照を有意に超える頻度で、それらの対応する認識配列を含む細胞株においてＧＦＰ陽性細胞を産生することが見出された。
【０３１４】
また、ＨＢＶ１−２、ＨＢＶ５−６、ＨＢＶ７−８、及びＨＢＶ１１−１２メガヌクレアーゼの有効性は、メガヌクレアーゼをＣＨＯレポーター細胞に導入した後２、５、７、９、及び１２日後に時間依存的に判定した。この研究では、製造元の説明書に従ってＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌを使用して、ＨＢＶ１−２、ＨＢＶ５−６、ＨＢＶ７−８、又はＨＢ１１−１２細胞（１．０×１０６）に１細胞あたり１×１０６コピーのメガヌクレアーゼｍＲＮＡをエレクトロポレーションした。形質移入後の指定の時点で、細胞をフローサイトメトリーによって評価して、ＧＦＰ陽性細胞の割合を判定した。ＣＨＯ−２３／２４メガヌクレアーゼもまた、各時点で陽性対照として含めた。
【０３１５】
図８Ａ〜図８Ｄに示すように、異なるＨＢＶメガヌクレアーゼによって産生された％ＧＦＰは、経時的に変化した。ＨＢＶ５−６及びＨＢＶ１１−１２メガヌクレアーゼが、分析した１２日間にわたって実質的に一致していた（図８Ｂ及び図８Ｄ）のに対し、ＨＢＶ１−２及びＨＢＶ７−８メガヌクレアーゼは、実験の過程で減少した初期の時点にて、高レベルのＧＦＰ陽性細胞を産生した。
【０３１６】
結論
【０３１７】
これらの研究は、本発明に包含されているＨＢＶメガヌクレアーゼが細胞内のそれぞれの認識配列を効率的に標的化して切断することができ、その効果が経時的に一定であるか、一過性であり得ることを示した。
【０３１８】
実施例２；ＨＢＶ特異的ヌクレアーゼは大腸菌のプラスミドＤＮＡを除去する
【０３１９】
エピソームＤＮＡを利用した細菌レポーターシステム
【０３２０】
本実験の目的は、本発明のＨＢＶメガヌクレアーゼを、大腸菌レポーターシステムにおいてエピソームＤＮＡプラスミド内の認識配列を認識して切断する能力について評価することであった。
【０３２１】
「ｐＡＲＣＵＳ」と呼ばれるプラスミドを、ＡＲＣＵＳヌクレアーゼの誘導性発現を駆動するために作製した（図９Ａ）。ｐＡＲＣＵＳでは、ＡＲＣＵＳヌクレアーゼ（ここでは、ＨＢＶ５−６×．３３又はＨＢＶ１１−１２×のいずれか）をＩＰＴＧ誘導性プロモ
ータの制御下に置く。更に、形質転換した細菌の選択を可能にするために、ｐＡＲＣＵＳはアンピシリン耐性遺伝子をコードする。ｐＡＲＣＵＳは、低コピーのプラスミドであるので、ＡＲＣＵＳヌクレアーゼの誘導した発現は、過剰な発現を引き起こさない。
【０３２２】
「ｐＨＢＶａ」と呼ばれる追加のプラスミドが生成された（図９Ａ）。ｐＨＢＶａは、ＨＢＶ５−６及びＨＢＶ１１−１２の認識配列を含む、ＨＢＶゲノムの大きな断片を保有している。このプラスミドはまた、カナマイシン耐性遺伝子及びＳａｃＢ遺伝子をコードする。カナマイシン耐性遺伝子は、形質転換させた細菌の選択を可能にするものであり、ＳａｃＢ遺伝子はスクロースの存在下で活性である毒素である。従って、ｐＨＢＶａで形質転換された細菌は、培地のカナマイシンの存在下では生存するが、カナマイシン及びスクロースの存在下では生存しない。ｐＨＢＶａは、ＨＢＶゲノムの多くのコピーがあり得るＨＢＶ感染細胞を複製する試みにおいて、高コピーのプラスミドであるように設計した。重要なことに、ｐＨＢＶａは、ｐＡＲＣＵＳとは異なる複製の起点を利用しており、細菌と両方のプラスミドとの同時の形質転換が可能になる。
【０３２３】
細菌をこれらのプラスミドで同時に形質転換し、選択的な圧力の様々な組み合わせを含有する培地において増殖させた（アンピシリン、カナマイシン、又はスクロース）場合、複数の可能な結果が存在している。ｐＡＲＣＵＳで形質転換され、アンピシリンの存在下で増殖される細菌は、ｐＡＲＣＵＳプラスミドを保有するであろうが、増殖培地がＩＰＴＧを補充されないと、コードされたヌクレアーゼを発現しない。ＩＰＴＧで誘導すると、コードされたヌクレアーゼが発現される。ｐＨＢＶａで形質転換された細菌はカナマイシンの存在下で増殖するが、カナマイシン及びスクロースの場合は増殖しない。アンピシリン及び／又はカナマイシンの存在下にてｐＡＲＣＵＳ及びｐＨＢＶａで同時に形質転換された細菌は、スクロースに対して感受性がある。ｐＡＲＣＵＳ及びｐＨＢＶで同時に形質転換された細菌において、ＩＰＴＧを用いたＡＲＣＵＳヌクレアーゼの誘導は、ヌクレアーゼの発現をもたらし、それが次にｐＨＢＶａにてコードされた標的部位を切断し得ることが予測された。当該の部位での切断がｐＨＢＶａプラスミドの線状化をもたらすと予想したが、それは細菌のヌクレアーゼによって急速に分解されるはずである。ｐＨＢＶプラスミドの分解は、細菌がカナマイシンに対する耐性を失うこと、その一方でスクロースの存在下で生き残ることができること、という２つの結果をもたらすであろう。
【０３２４】
同時の形質転換の結果を検証するために、細菌をｐＡＲＣＵＳ及びｐＨＢＶａで（エレクトロポレーションにより）同時に形質転換し、播種前に３時間アンピシリンの存在下で培養した。並行する培養において、同時に形質転換させた細胞をＩＰＴＧで処理し（３時間）、ヌクレアーゼの発現を誘導し、ｐＨＢＶａの切断を可能にした。次いで、細胞を、アンピシリン、アンピシリン及びスクロース、又はアンピシリン及びカナマイシンの存在下で、寒天プレートに蒔いた。プレートを一晩インキュベートし、コロニーを数えて細菌の生存を評価した。
【０３２５】
結果
【０３２６】
各選択プレートに存在するコロニーの数により、ＡＲＣＵＳヌクレアーゼがｐＨＢＶａプラスミドを切断し得ることの劇的な証拠が得られた。対照のアンピシリンプレートでは、非誘導培養物又はＩＰＴＧ誘導培養物のいずれかからのコロニー数は、ｐＨＢＶａ及びいずれかのｐＡＲＣＵＳプラスミドで同時に形質転換された細胞について、同等であった（図９Ｂ）。ＨＢＶ５−６×．３３をコードするｐＡＲＣＵＳで同時に形質転換した細菌と、ＨＢＶ１１−１２×．２６をコードするｐＡＲＣＵＳで同時に形質転換した細菌との間にコロニー数の差があったが、これは形質転換の効率を反映していると思われる。
【０３２７】
著しく対照的に、アンピシリンとスクロースの両方を含むプレートでの非ＩＰＴＧ誘導
培養物からのコロニー数は劇的に少なくなっており、これはスクロースが利用可能である場合にＳａｃＢ遺伝子が細胞殺傷に有効であることを示している（図９Ｂ）。しかし、ＩＰＴＧで誘導された培養物は、アンピシリンとスクロースの両方を含有するプレートで非常によく成長しており、このことは、ＳａｃＢ遺伝子を除去したことを示している。ｐＨＢＶａ、及びＨＢＶ１１−１２ｘ．２６をコードするｐＡＲＣＵＳで同時に形質転換された（しかしＩＰＴＧで誘導されていない）細菌のコロニー数は、アンピシリン対照プレートのものと同じであり、ｐＡＲＣＵＳ５−６ｘ．３３で同時に形質転換された細菌は、対照プレートと比較して、ほんのわずかに減少した。
【０３２８】
非ＩＰＴＧ誘導培養物は、アンピシリンとカナマイシンの両方を含有するプレートで増殖することができた（図９Ｂ）。ＨＢＶ  １１−１２×．２６をコードするｐＡＲＣＵＳで同時に形質転換した細菌からのコロニー数は、対照のアンピシリンのみのプレートとほぼ等しく、ｐＡＲＣＵＳ  ＨＢＶ５−６×．３３で同時に形質転換した細胞は、対照と比較して、ほんのわずかに減少した。しかし、アンピシリン及びカナマイシンを含有するプレートでＩＰＴＧ誘導細胞を増殖させた場合、コロニー数はゼロに近く、これはカナマイシン耐性遺伝子を保有するプラスミドの排除を示していた（図９Ｂ）。
【０３２９】
結論
【０３３０】
これらのデータは、ＨＢＶゲノムの部位を認識する本発明のＨＢＶメガヌクレアーゼがｐＨＢＶａプラスミドを切断することができ、その結果ｐＨＢＶａプラスミドが排除されることを明白に実証している。ＩＰＴＧ誘導培養物では、細胞はスクロースの存在下で増殖しており、これはＳａｃＢ含有プラスミドを効率的に除去したことを示している。同様に、ＩＰＴＧ誘導培養物において、細胞はカナマイシンの存在下で死滅し、これはまた、ｐＨＢＶａプラスミドを破壊したことを強く示唆している。ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを切断するために本発明のＨＢＶメガヌクレアーゼを使用して、ＨＢＶ感染哺乳動物細胞において同様の結果が起こり得る可能性がある。細菌では、直鎖状ＤＮＡはすぐに除去される。哺乳動物細胞での線状化ｃｃｃＤＮＡも、細胞のヌクレアーゼによって消化されると考えられる。切断がｃｃｃＤＮＡの線状化及び排除につながらないとしても、ＨＢＶ  ＡＲＣＵＳヌクレアーゼによって引き起こされるインデルの突然変異は、コードする領域を破壊し、ｃｃｃＤＮＡが機能的ＨＢＶタンパク質を産生することを不可能にする見込みがある。従って、ＨＢＶゲノムの部位を標的とする本発明のメガヌクレアーゼは、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを排除又は不活性化するための有効な方法であるはずである。
【０３３１】
実施例３；細胞でのＨＢＶウイルスゲノムの標的化
【０３３２】
ＨＢＶゲノムを発現するＡＤ３８細胞の治療
【０３３３】
これらの実施例の主な目的は、本発明のメガヌクレアーゼがＨＢＶ感染哺乳動物細胞のＨＢＶゲノムを不活性化及び／又は排除することができるかどうかを評価することであった。
【０３３４】
第１の研究では、メガヌクレアーゼの有効性は、Ｔｅｔプロモータ下でＨＢＶゲノムを安定的に発現するＡＤ３８細胞系において評価された。このＡＤ３８細胞系は活性ウイルス粒子を生成しないが、細胞培地で検出可能であるＨＢＶ  Ｓ抗原（ＨＢｓＡｇ）を生成する。本研究では、細胞にＨＢＶ５−６×．３３又はＨＢＶ１１−１２×．２６をコードするＤＮＡプラスミドで形質移入した。これらの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは両方とも、重複するＳ（ＨＢｓＡｇ遺伝子）及びＰ（ポリメラーゼ遺伝子）リーディングフレーム内の配列を標的とするＨＢＶ５−６×．３３、及びＰ遺伝子を標的とするＨＢＶ１１−１２×．２６を用い、ＨＢＶゲノムに特異的な配列を標的とする。対照として、ＡＤ
３８細胞を、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）遺伝子をコードするプラスミドで形質移入した。細胞を播種し、２４時間後にリポソームベースの形質移入プロトコルを用いてプラスミドで形質移入した。形質移入の２４時間後、ＡＤ３８細胞を洗浄して、残っているリポソーム複合体を除去した。形質移入後３日目及び７日目に、細胞の上清を回収し、ＥＬＩＳＡによってＨＢｓＡｇの存在についてアッセイした。
【０３３５】
結果
【０３３６】
ＥＬＩＳＡのデータを、形質移入後３日目及び７日目に、ＲＦＰ形質移入のＡＤ３８細胞の上清に存在するＨＢｓＡｇの量に対して正規化した。形質移入後３日目に、ＨＢＶ１１−１２ｘ．２６をコードするプラスミドで形質移入した細胞は、ＲＦＰ形質移入の細胞と比較して、上清に約２５％少ないＨＢｓＡｇを示した（図１０）。同じ時点で、ＨＢＶ
５−６×．３３をコードするプラスミドで形質移入した細胞は、ＲＦＰ形質移入の細胞と比較して、上清に約５０％少ないＨＢｓＡｇを示した（図１０）。非形質移入の対照細胞は、ＲＦＰ形質移入の細胞と本質的に同じであった。ＨＢｓＡｇの減少は形質移入後７日目で更に明白であった。ＨＢＶ１１−１２ｘ．２６で形質移入したＡＤ３８細胞は、ＲＦＰで形質移入した細胞よりも約５０％低いＨＢｓＡｇのレベルを示し、ＨＢＶ５−６ｘ．３３で形質移入した細胞は、ＲＦＰ対照より約７５％低いレベルを示した（図１０）。形質移入後７日目に、ＲＦＰで形質移入した細胞は、非形質移入細胞と比較して上清のＨＢｓＡｇが有意に少なく、これは形質移入のプロセスが細胞のＨＢｓＡｇ産生能に悪影響を及ぼしたことを示唆している。それにもかかわらず、その影響は、ＨＢＶメガヌクレアーゼをコードするプラスミドで形質移入された細胞において、はるかに顕著であり、上清のＨＢｓＡｇレベルの減少がメガヌクレアーゼの活性によるものであることを強く示唆している。
【０３３７】
結論
【０３３８】
これらのデータは、ＨＢＶ５−６×．３３又はＨＢＶ１１−１２×．２６のいずれかをコードするプラスミドで形質移入されたＡＤ３８細胞が、非形質移入細胞又はＲＦＰレポーター遺伝子で形質移入された細胞と比較して、上清のＨＢｓＡｇが劇的に減少したことを示している。ＨＢＶメガヌクレアーゼのいずれかで形質移入した細胞における上清のＨＢｓＡｇレベルの減少は、その減少がＡＤ３８細胞のＨＢＶゲノムに対するメガヌクレアーゼ活性に起因することを強く示唆している。
【０３３９】
実施例４；細胞でのＨＢＶウイルスゲノムの標的化
【０３４０】
ＨＢＶゲノムを発現するＡＤ３８細胞の治療
【０３４１】
上記の実施例３の研究は、ＨＢＶゲノム発現ＡＤ３８細胞系からのＨＢｓＡｇの分泌を減少させることにおけるメガヌクレアーゼの有効性を実証している。ＨＢｓＡｇの分泌の更に大きな減少が、プラスミドの形質移入の代わりにレンチウイルスの送達を用いて達成され得るかどうかを判断するために、ＨＢＶ１１−１２ｘ．２６及びＨＢＶ５−６ｘ．３３メガヌクレアーゼを個々に又は組み合わせて用いるレンチウイルスの送達で、この研究を繰り返した。
【０３４２】
ＲＦＰ、ＨＢＶ５−６×．３３又はＨＢＶ１１−１２×．２６のいずれかを発現するレンチウイルスを作製し、ＡＤ３８細胞を形質導入して、ＨＢｓＡｇの産生に対するメガヌクレアーゼの影響を判定した。ＡＤ３８細胞を播種し、２４時間後に、ＲＦＰ、ＨＢＶ５−６×．３３、ＨＢＶ１１−１２×．２６をコードするレンチウイルス、又はＨＢＶメガヌクレアーゼをコードするレンチウイルスの１：１の混合物のいずれかで形質導入した。
細胞に、１、２、又は４のＭＯＩで単一のレンチウイルスで形質導入した。ＨＢＶメガヌクレアーゼをコードするレンチウイルスの１：１の混合物で形質導入された細胞は、２及び４の総ＭＯＩで形質導入された。形質導入細胞の培地は、形質導入後１日目及び３日目に交換した。形質導入後７日目に細胞の上清を回収し、ＥＬＩＳＡによりＨＢｓＡｇの存在についてアッセイした。
【０３４３】
結果
【０３４４】
ＥＬＩＳＡのデータを、形質移入後７日目に、ＲＦＰ形質導入のＡＤ３８細胞の上清に存在するＨＢｓＡｇの量に対して正規化した。ＭＯＩが１の場合、ＨＢＶ５−６×．３３で形質導入されたＡＤ３８細胞は、ＲＦＰ発現レンチウイルスで形質導入されたＡＤ３８細胞よりも上清に約６０％少ないＨＢｓＡｇを示した（図１１）。また、ＭＯＩが１の場合、ＨＢＶ１１−１２ｘ．２６はＲＦＰよりも約４０％少ないＨＢｓＡｇを示した。より高いＭＯＩでは、ＨＢＶメガヌクレアーゼの影響はより顕著であった。ＭＯＩが２の場合、ＨＢＶ５−６×．３３をコードするレンチウイルスで形質導入された細胞は、ＲＦＰで形質導入された細胞と比較して約８０％のＨＢｓＡｇの減少を示し、ＭＯＩが４の場合、減少は比較すると約９０％であった。同様に、ＭＯＩが２の場合、ＨＢＶ１１−１２×．２６をコードするレンチウイルスで形質導入された細胞は、ＲＦＰで形質導入された細胞よりも約７０％少ないＨＢｓＡｇを示し、ＭＯＩが４の場合、ＨＢｓＡｇは約８０％低かった。また最後に、ＨＢＶメガヌクレアーゼをコードするレンチウイルスの１：１の混合物で形質導入された細胞は、ＲＦＰ形質導入の対照の細胞と比較して、上清のＨＢｓＡｇのレベルが劇的に減少したことを示した（図１１）。総ＭＯＩが２の場合、ＨＢＶ発現レンチウイルスは、ＨＢｓＡｇの発現を約８０％減少させ、総ＭＯＩが４の場合、発現は約９０％減少した。
【０３４５】
結論
【０３４６】
これらのデータは、ＲＦＰ発現レンチウイルスで形質導入された細胞と比較して、ＨＢＶ  ５−６×．３３若しくはＨＢＶ１１−１２×．２６、又は両方の組み合わせをコードするレンチウイルスで形質導入されたＡＤ３８細胞が、上清のＨＢｓＡｇの劇的な減少を示すことを実証する。ＨＢＶメガヌクレアーゼのいずれか又は両方を発現するレンチウイルスで形質導入された細胞における上清のＨＢｓＡｇのレベルの減少は、その減少がＡＤ３８細胞のＨＢＶゲノムに対するメガヌクレアーゼの活性に起因することを強く示唆している。更に、これらのデータは、ＨＢＶメガヌクレアーゼの共発現がＨＢｓＡｇの発現を効果的に減少させることを実証し、このことは共発現されたメガヌクレアーゼがＨＢＶゲノムを効果的にすることができることを強く示唆している。
【０３４７】
実施例５；細胞でのＨＢＶウイルスゲノムの標的化
【０３４８】
ＨＢＶゲノムを発現するＡＤ３８細胞の治療
【０３４９】
更なる研究において、ＨＢｓＡｇの分泌に対するメガヌクレアーゼの処理の効果、細胞培養培地に存在するＨＢＶ  ＤＮＡコピー、及び細胞内のＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡコピーを観察するために、ＡＤ３８細胞を、ＨＢＶ５−６×．３３又はＨＢＶ１１−１２×．２６メガヌクレアーゼをコードするレンチウイルスで形質導入した。
【０３５０】
上記の実施例４と同様に、ＲＦＰ（ＬＶ２１２）、ＨＢＶ５−６×．３３（ＬＶ２２４）、又はＨＢＶ１１−１２×．２６（ＬＶ２２５）のいずれかを発現するレンチウイルスを生成し、ＡＤ３８細胞を形質導入して、メガヌクレアーゼの各実験結果に与える影響を判定した。ＡＤ３８細胞をテトラサイクリンの存在下で播種し、２４時間後に、４のＭＯ
Ｉで、ＲＦＰ、ＨＢＶ５−６×．３３又はＨＢＶ１１−１２×．２６をコードするレンチウイルスで形質導入した。形質導入細胞の培地を形質導入２４時間後に交換した。形質導入後７日目に、細胞の上清を回収し、ＥＬＩＳＡによりＨＢｓＡｇの存在についてアッセイした。細胞培養液５μＬ当たりの細胞外ＨＢＶ  ＤＮＡのコピーを定量的ＰＣＲにより判断した。細胞溶解物を得て、５μＬの細胞溶解物当たりのＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡの細胞内のコピーを、定量的ＰＣＲによって判定した。
【０３５１】
結果
【０３５２】
４のＭＯＩにおいて、ＨＢＶ５−６×．３３及びＨＢＶ１１−１２×．２６で形質導入されたＡＤ３８細胞は、形質導入後７日で、ＲＦＰ発現レンチウイルスで形質導入されたＡＤ３８細胞よりも、細胞培養培地においてそれぞれ約５８％及び２５％少ないＨＢｓＡｇを示した（図１２Ａ）。細胞外のＨＢＶ  ＤＮＡのコピー数もまた、ＲＦＰ発現レンチウイルスによる形質導入と比較した場合、ＨＢＶ５−６×．３３及びＨＢＶ１１−１２×．２６メガヌクレアーゼによる形質導入によって、それぞれ約２８％及び５０％減少した（図１２Ｂ）。最終的に、細胞内のＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡのコピー数もまた、ＲＦＰ発現レンチウイルスによる形質導入と比較した場合、ＨＢＶ５−６×．３３及びＨＢＶ１１−１２×．２６メガヌクレアーゼによる形質導入によって、それぞれ約７１％及び６０％減少した（図１２Ｃ）。
【０３５３】
結論
【０３５４】
これらのデータは更に、ＨＢＶ５−６ｘ．３３又はＨＢＶ１１−１２ｘ．２６メガヌクレアーゼのいずれかをコードするレンチウイルスで形質導入したＡＤ３８細胞が、ＲＦＰ発現レンチウイルスで形質導入した細胞と比較して、上清のＨＢｓＡｇの劇的な減少を示すことを実証している。更に、これらのデータは、本発明のＨＢＶメガヌクレアーゼがまた細胞外のＨＢＶ  ＤＮＡのコピー数を減少させ、重要なことに、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡの細胞内のコピー数を有意に減少させることを実証している。
【０３５５】
実施例６；ＨＢＶ感染初代ヒト肝細胞の治療
【０３５６】
ＨＢＶ感染初代ヒト肝細胞の治療
【０３５７】
上記の実施例の研究は、ＨＢＶゲノム発現ＡＤ３８細胞系からのＨＢｓＡｇの分泌を減少させることにおけるメガヌクレアーゼの有効性を実証する。本実施例の研究は、ＨＢＶ感染初代ヒト肝細胞における本発明のＨＢＶメガヌクレアーゼの有効性を判定するために行われた。
【０３５８】
ＲＦＰ、ＨＢＶ５−６×．３３又はＨＢＶ１１−１２×．２６を発現するレンチウイルスを作製し、ＨＢＶ感染初代ヒト肝細胞を形質導入して、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの産生に対するメガヌクレアーゼの影響を判定した。簡潔には、初代ヒト肝細胞を播種し、２４時間後にＨＢＶに感染させた。感染後１日目に細胞を洗浄し、２４時間後（感染後２日目）に、ＲＦＰ、ＨＢＶ５−６×．３３、ＨＢＶ１１−１２×．２６をコードするレンチウイルス、又はＨＢＶメガヌクレアーゼをコードするレンチウイルスの１：１の混合物のいずれかで形質導入した。更なる対照として、感染させた細胞をＤＭＳＯで処理した。細胞の上清を回収し、形質導入後４日目、８日目、１１日目、及び１３日目に培地を交換した。各時点で、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇをＥＬＩＳＡにより細胞の上清で測定した。また、上清の中の細胞外ＤＮＡを感染後１３日目に測定した。
【０３５９】
結果
【０３６０】
一般に、レンチウイルス形質導入がＨＢｓＡｇ又はＨＢｅＡｇのいずれかの分泌に影響を及ぼすかどうかを判断するために、ＲＦＰをコードするレンチウイルスで形質導入した細胞から得た細胞の上清を、ＤＭＳＯで処理した細胞と比較した（図１３）。ＲＦＰをコードするレンチウイルスを用いたＨＢＶ感染初代ヒト肝細胞の形質導入は、ＨＢｓＡｇ又はＨＢｅＡｇの分泌に対する影響があったとしてもわずかであった（図１３Ａ及び図１３Ｂ）。５又は２．５のＭＯＩでは、ＨＢｓＡｇのレベルはＤＭＳＯで処理した細胞と同一であり、１．２５のＭＯＩではわずかな減少しかない（図１３Ａ）。同様に、ＲＦＰ−レンチウイルス形質導入細胞の上清のＨＢｅＡｇのレベルは、ＤＭＳＯで処理した細胞と比較した場合に、１．２５、２．５、又は５のＭＯＩでほんのわずかな減少を示している（図１３Ｂ）。更に、ＨＢＶ感染初代ヒト肝細胞の上清にて検出された細胞外のＨＢＶの量は、ＤＭＳＯで処理した細胞と、ＲＦＰをコードするレンチウイルスで形質導入された細胞との間にほとんど差異を示していない（図１３Ｃ）。
【０３６１】
レンチウイルス形質導入は、一般に、感染した初代ヒト肝細胞におけるＨＢＶ機能に影響を及ぼさないことを示したので、ＨＢＶメガヌクレアーゼをコードするレンチウイルスをＲＦＰレンチウイルスと比較した。ＨＢｓＡｇのＥＬＩＳＡのデータを、形質導入後３日目、８日目、１１日目、及び１３日目に、ＲＦＰ形質導入ＨＢＶ感染初代ヒト肝細胞の上清に存在するＨＢｓＡｇの量に対して正規化した（図１４）。２．５及び１．２５のＭＯＩの両方で、ＨＢＶ５−６×．３３をコードするレンチウイルスで形質導入した細胞は、実験の経過にわたってＨＢｓＡｇの着実な減少を示し、ＲＦＰ対照と比較したときに、３日目にわずかにレベルの減少、８日目までに約５０〜６０％の減少、並びに１１日目及び１３日目までに約９０％の減少を示した（図１４Ａ及び１４Ｂ）。ＨＢＶ１１−１２ｘ．２６で形質導入した感染細胞は、ＭＯＩが２．５と１．２５の両方で同様のパターンを示し、３日目の時点でより顕著な減少（約５０％の減少）を示し、それでも依然、形質導入後１１日目及び１３日目までに約９０％の減少を達成した（図１４Ａ及び図１４Ｂ）。感染細胞を、ＨＢＶメガヌクレアーゼをコードするレンチウイルスの１：１混合物で形質導入した場合、ＨＢｓＡｇの同様の減少が経時的に観察された。２．５のＭＯＩでは、レベルは形質導入後３日目に約５０％減少し、減少は継続して、形質導入後１１日目及び１３日目までに９０％に達した（図１４Ａ及び図１４Ｂ）。
【０３６２】
また、ＨＢｅＡｇのＥＬＩＳＡのデータを、形質導入後３日目、８日目、１１日目、及び１３日目に、ＲＦＰ形質導入ＨＢＶ感染初代ヒト肝細胞の上清に存在するＨＢｅＡｇの量に対して正規化した（図１４）。２．５及び１．２５のＭＯＩの両方で、ＨＢＶ５−６×．３３をコードするレンチウイルスで形質導入した細胞は、実験の経過にわたってＨＢｅＡｇの着実な減少を示し、ＲＦＰ対照と比較したときに、３日目に約２５％のレベルの減少、８日目までに約５０％の減少、並びに１１日目及び１３日目までに約９０％の減少を示した（図１４Ｃ及び図１４Ｄ）。ＨＢＶ１１−１２ｘ．２６で形質導入した感染細胞は、ＭＯＩが２．５と１．２５の両方で同様のパターンを示し、３日目の時点で類似した減少（約３０％の減少）を示し、それでも依然、形質導入後１１日目及び１３日目までにＨＢｅＡｇの約９０％の減少を達成した（図１４Ｃ及び図１４Ｄ）。感染細胞を、ＨＢＶメガヌクレアーゼをコードするレンチウイルスの１：１混合物で形質導入した場合、ＨＢｅＡｇの同様の減少が経時的に観察された。２．５及び１．２５のＭＯＩでは、レベルは形質導入後３日目に約５０％減少し、減少は継続して、形質導入後１１日目及び１３日目までに９０％に達した（図１４Ｃ及び図１４Ｄ）。
【０３６３】
結論
【０３６４】
これらのデータは、ＲＦＰ発現レンチウイルスで形質導入された細胞と比較して、ＨＢＶ  ５−６×．３３若しくはＨＢＶ１１−１２×．２６、又はその２つの組み合わせをコ
ードするレンチウイルスで形質導入されたＨＢＶ感染初代ヒト肝細胞が、上清のＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの劇的な減少を示すことを実証する。感染させた細胞の上清のＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇのレベルにおける減少は、ＨＢＶメガヌクレアーゼのいずれか又は両方を発現するレンチウイルスで形質導入され、その減少が感染性ウイルスに対するメガヌクレアーゼの活性に起因することを強く示唆している。
【０３６５】
実施例７；ＬＮＰ封入ヌクレアーゼｍＲＮＡの肝臓への送達
【０３６６】
脂質ナノ粒子でのｍＲＮＡの封入とマウスへの送達
【０３６７】
この研究の目的は、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）封入ｍＲＮＡを作製してインビボで投与でき、肝臓における遺伝子編集が起こり、観察され得ることを実証することである。
【０３６８】
マウスの肝臓で発現されるマウスＣＭＰ−ＮｅｕＡｃヒドロラーゼ（Ｃｍａｈ）遺伝子の認識配列に対して特異性を有する遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを発現させた。ＣｍａｈメガヌクレアーゼをコードするＡＲＣＡキャップｍＲＮＡをＴｒｉＬｉｎｋ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＬＬＣ（カリフォルニア州サンディエゴ）が作製し、３つの異なる市販のＬＮＰ製剤に封入しており、各々は様々な比率のイオン性カチオン性脂質、ＰＥＧ脂質、及びコレステロールを含む。ＬＮＰ封入ｍＲＮＡを、１．０ｍｇ／ｋｇの用量で、ＩＶ注射によりＣＤ−１マウスに投与した。投与の６日後に肝臓を採取した。臓器採取の前に、動物を食塩水で灌流した。全肝臓ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を単離し、Ｃｍａｈ遺伝子における挿入／欠失（インデル）突然変異の頻度を、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７Ｅ）アッセイ及びディープシーケンシングを用いて判定した。Ｔ７Ｅのアッセイでは、Ｃｍａｈ認識配列を含むゲノムの領域をＰＣＲ増幅し、その結果、野生型と突然変異の増幅対立遺伝子の異種混合物が得られた。ＰＣＲ産物を変性させ、ゆっくりと再アニーリングさせ、野生型と突然変異の対立遺伝子の間のヘテロ二本鎖の形成を可能にした。そのようなヘテロ二本鎖は、ミスマッチで切断するＴ７エンドヌクレアーゼＩによる切断を受けやすい。Ｔ７Ｅ切断産物をゲルで可視化すると、ヘテロ二本鎖のＴ７Ｅ切断に起因して複数のバンドが存在するが、野生型のサンプルには単一のバンドが存在する。切断されていない産物に対する切断された産物の比率は、ヌクレアーゼ切断活性のレベルの尺度を提供する。
【０３６９】
結果
【０３７０】
本研究の結果を図１５に示す。レーン１及び２に示されるように、ルシフェラーゼをコードするＬＮＰ封入ｍＲＮＡを投与された対照マウスから得られたｇＤＮＡは、Ｃｍａｈ認識配列での切断の証拠を示さなかった。ルシフェラーゼｍＲＮＡ処置動物において観察された切断と非切断の比は、ｍＲＮＡを投与されていない動物において観察された比に匹敵した（レーン８）。対照的に、レーン３〜７及び９〜１８はそれぞれ、各レーンに複数のバンドが存在することによって示されるように、動物に、ＣｍａｈメガヌクレアーゼをコードするＬＮＰ封入ｍＲＮＡを投与した場合のＣｍａｈ認識配列での改変を示す。Ｃｍａｈ認識配列における遺伝子改変の割合を確認及び定量化するために、各肝臓から得られたｇＤＮＡについてディープシーケンシングも行った。ディープシーケンシングによって得られた割合は、％ＫＯとして各レーンの下に、図１５に示されている。レーン３〜７は、ＬＮＰ製剤＃１を投与した複製動物における３．４１％〜２１．４９％の範囲の改変を示す。レーン９〜１３は、ＬＮＰ製剤＃２を投与した複製動物における１８．４％から２３．２％の範囲の改変を示す。レーン１４〜１８は、ＬＮＰ製剤＃３を投与した複製動物における５１．１％〜６４．８％の範囲の改変を示す。
【０３７１】
結論
【０３７２】
この研究は、本発明のＨＢＶ特異的メガヌクレアーゼのような遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡが、ＬＮＰにて封入され、インビボで標的肝細胞（即ち、肝細胞）に送達され得、ゲノムの標的化された認識配列で遺伝子編集を誘導し得ることを明白に示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【配列表】
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