(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
寄託番号ＫＣＣＭ１１１４３Ｐで寄託されたバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）菌株、その培養液、その濃縮液またはその乾燥物を有効成分として含む、急性肝膵臓壊死症（ＡＨＰＮＤ）の予防または治療用飼料組成物。
【請求項２】
前記バチルス・サブチリスが、有効成分の１ｇ当たりに１×１０４〜1×１０１１ ＣＦＵの菌数を有するものである、請求項１に記載の飼料組成物。
【請求項３】
有効成分としてバチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）またはこれらの組み合わせをさらに含む、請求項１または２に記載の飼料組成物。
【請求項４】
前記急性肝膵臓壊死症（ＡＨＰＮＤ）が、腸炎ビブリオ菌（Vibrio parahaemolyticus）によって誘発されるものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の飼料組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の飼料組成物を個体に投与する段階を含む、急性肝膵臓壊死症の予防または治療方法。
【請求項６】
前記個体が、エビである、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バチルス・サブチリス菌株、その培養液、その濃縮液またはその乾燥物を有効成分として含む、急性肝膵臓壊死症（ＡＨＰＮＤ）またはホワイトスポット病症候群（ＷＳＳ）の予防または治療用飼料組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＥＭＳ（Early mortality syndrome、早期死亡症候群）/ＡＨＰＮＤ（Acute hepatopancreatic necrosis disease、急性肝膵臓壊死症）/ＡＨＰＮＳ（Acute hepatopancreatic necrosis syndrome、急性肝膵臓壊死症候群）は、エビ養殖において最近急増する病気であって、ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus）細菌が原因体であり、昆虫毒素を生成して早くは６時間以内、または一週間以内に１００％致死を起こす（非特許文献１）。昆虫毒素（すなわち、Photorhabdus insect-related toxins、Pir toxin）は、細菌内の特定のプラスミドに存在する特異遺伝子の発現により生成され、したがって、あちこちを簡単に移動する、すなわち、運動性を有するため、この疾病は、従来関心を持たれたホワイトスポット病ウイルス（ＷＳＳＶ）、タウラ症候群ウイルス（ＴＳＶ）及び感染性筋壊死ウイルス（ＩＭＮＶ）などのウイルス性のエビの病気よりも速く伝播される。ＡＨＰＮＤは、２００９年に中国で始まり、タイ、マレーシア、ベトナムで１年以内にアジア各国に急速に広がって、アジア以外の国としてはメキシコで発生し、他の中米諸国に伝播されて、エビの市場のほとんどが被害を受けている。韓国にも２０１５〜２０１６年に最初に発生して大きな被害を負わせたことがあり、この疾病に対する予防及び管理のための研究が進められている。
【０００３】
最近、安全な生産物に対する消費者のニーズと継続的な養殖のための生産戦略により、従来の病原菌を治療するために用いられた治療剤などは、養殖関連規定により制限されている。したがって、エビ養殖において、種苗の品質と飼育方法だけではなく、疾病を制御する重要な因子を考慮する必要がある。
【０００４】
一方、プロバイオティクスは、抗生物質を意味する抗生剤（antibiotics）とは対立する語源的意味を有するもので、腸内の微生物のバランスを助ける微生物製剤または微生物成分として定義され、代表的に、ラクトバチルス菌とビフィズス菌などの乳酸菌がこれに該当する。また、プロバイオティクスは、ヒトや動物に対する毒性遺伝子を保有せず、病原性物質も生産しないためＧＲＡＳ（generally recognized as safe）として分類される。したがって、安定性が証明されたプロバイオティクスを用いた飼料添加剤の開発が活発に行われている。
【０００５】
一例として、特許文献１は、新規なバチルス属ＣＭＢ Ｌ１及びラクトバチルス属ＣＭＢ２０１の混合菌株及びこれを用いた抗がん及び免疫増強用食品組成物及び抗菌活性のある微生物製剤を開示しており、特許文献２は、動物の主要な貪食細胞である好中球の各種活性を増加させて、病原性細菌の攻撃接種に対する非特異的な防御能を増進させるザイゴサッカロミセス・ベイリー（Zygosaccharomyces bailii）の溶菌抽出物を含有する動物用免疫増強剤及び飼料添加剤を開示している。しかし、プロバイオティクスを用いた飼料添加剤の実際の免疫活性は不備で、まだ免疫活性に優れたプロバイオティクスを用いた飼料添加剤に対する研究が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】韓国公開特許第１０-２０１１‐０３５５５４号
【特許文献２】韓国登録特許第１０‐０９７７４０７号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Tran et.al.2013.Dis aquat Org 105:45-55
【非特許文献２】Trends Biochem. Sci, 2009, 34: 324-331
【非特許文献３】Cell, 2006, 124: 783-801
【非特許文献４】Folch et al. (1957)
【非特許文献５】Zhang et al. (2013)
【非特許文献６】Swain et al. (2007)
【非特許文献７】Hernandez-Lopez et al. (1996)
【非特許文献８】Ellis (1990)
【非特許文献９】Verdouw et al. (1978)
【非特許文献１０】Divakaran et al.  (2002)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らはエビＡＨＰＮＤ予防のためのプロバイオティクス（Bacillus sp.）を添加したエビ飼料を開発しようと鋭意努力した結果、バチルス・サブチリスが添加された飼料組成物をエビに給餌した場合、ＡＨＰＮＤ感染（２０１３年のベトナム被害地域から単離された菌株に起因する。非特許文献１）またはＷＳＳＶ感染によるエビ生存率を改善し、エビの成長率及び非特異的免疫力を高めるだけでなく、水質が改善されて高タンパクのエビ生産が可能であることを確認することにより、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一つの目的は、バチルス・サブチリス菌株、その培養液、その濃縮液またはその乾燥物を有効成分として含む急性肝膵臓壊死症（ＡＨＰＮＤ）の予防または治療用飼料組成物を提供することにある。
【００１０】
本発明のもう一つの目的は、前記飼料組成物を個体に投与する段階を含む急性肝膵臓壊死症の予防または治療方法を提供することにある。
【００１１】
本発明の一つの目的は、バチルス・サブチリス菌株、その培養液、その濃縮液またはその乾燥物を有効成分として含むホワイトスポット病症候群（ＷＳＳ）の予防または治療用飼料組成物を提供することにある。
【００１２】
本発明のもう一つの目的は、前記飼料組成物を個体に投与する段階を含むホワイトスポット病症候群の予防または治療方法を提供することにある。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、バチルス・サブチリスＫＣＣＭ１１１４３Ｐ菌株は、これを有効成分として含む組成物がエビ養殖において問題となるＡＨＰＮＤを誘発させる腸炎ビブリオ菌に対する抗菌活性、ＷＳＳを誘発させるホワイトスポット病症候群ウイルスに対する抗ウイルス活性、及びエビの肝膵臓の免疫増進効果を有するため、エビ飼料組成物または飼料添加剤として用いてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】腸炎ビブリオ菌に感染されたエビの生存率を示すグラフである。
【図２】エビの肝膵臓中のＡＨＰＮＤ含有分析を示すグラフである。
【図３】エビの肝膵臓の病理学的特徴を示す図である。
【図４】エビの成長率を示すグラフであり、（ａ）〜（ｄ）はそれぞれ、最終体重、増体率、日間成長率及び飼料変換率を示す。
【図５】エビの非特異的免疫力を分析したグラフであり、（ａ）〜（ｅ）はそれぞれ、マクロファージ、フェノール酸化酵素、抗タンパク分解酵素、リゾチーム及びスーパーオキシドジスムターゼの活性を示す。
【図６】無交換飼育水中の水質分析の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
これを具体的に説明すると、次の通りである。一方、本出願で開示された各説明及び実施形態は、それぞれの他の説明及び実施形態にも適用されうる。すなわち、本出願で開示された様々な要素の任意の組み合わせが本発明の範囲に属する。また、下記記述された具体的な叙述によって、本発明の範囲が限定されるべきではない。
【００１６】
前記課題を解決するための一実施様態として、本発明は、バチルス・サブチリス菌株、その培養液、その濃縮液またはその乾燥物を有効成分として含む急性肝膵臓壊死症（ＡＨＰＮＤ）の予防または治療用飼料組成物を提供する。
【００１７】
本発明の用語、「バチルス・サブチリス（Bacillus subtilus、枯草菌）」とは、好気性菌の一種であって、毒性がなく胞子を生成する細菌である。乾いた草、土、下水、空気中などの自然界に広く分布している。酵素を生産して牛乳を凝固させ、デンプンを糖化して油脂を分解するので、工業的な分野に多く用いられている。生育の最適な状態は、ｐＨ７〜８．５、温度３７〜４０℃である。バチルス属菌株の特性上、ヒトや動物に対する毒性遺伝子を保有せず、それ自体で非病原性であるというだけでなく、病原性物質を生産することもなく、生体内で早い成長率を表す。ブドウ糖などが存在する環境では、嫌気的な棲息をして、内生胞子はバチルスが高温や低温など極端に悪い環境でも生存可能にする。
【００１８】
本発明において、前記バチルス・サブチリスは、寄託番号ＫＣＣＭ１１１４３Ｐで寄託された菌株であってもよい。
【００１９】
本発明では、前記バチルス・サブチリスＫＣＣＭ１１１４３Ｐを含む飼料組成物を製造した。
【００２０】
本発明の前記組成物は、全体有効成分の１ｇ当たりに１×１０４〜1×１０１１ ＣＦＵの菌数を有するバチルス・サブチリスＫＣＣＭ１１１４３Ｐを含んでもよく、具体的には、１×１０４〜1×１０１０ ＣＦＵ／gであってもよく、より具体的には、１×１０８〜1×１０１０ ＣＦＵ／gのバチルス・サブチリスＫＣＣＭ１１１４３Ｐを含んでもよい。
【００２１】
本発明の目的上、前記飼料組成物に有効成分として含まれるバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）は、バチルス・サブチリスＫＣＣＭ１１１４３Ｐのみを含みうる。
【００２２】
本発明の用語、「急性肝膵臓壊死症（ＡＨＰＮＤ ）」とは、早期死亡症候群（ＥＭＳ、Early mortality syndrome）または急性肝膵臓壊死症候群（ＡＨＰＮＳ、Acute hepatopancreatic necrosis syndrome）と命名される疾病であり、養殖場に入植 時３０日以内に病原体によって発生する大量斃死を包括的に通称する。韓国の養殖エビの約９６％程度を占めるシロアシエビでの感染例が多く、海水に常存している病原体である腸炎ビブリオ菌（Vibrio parahaemolyticus）に起因して発生する疾病である。幼い時期に致死率が高いため、エビに致命的な被害を与えるが、人体には無害である。
【００２３】
前記「腸炎ビブリオ菌（Vibrio parahaemolyticus）」とは、ビブリオ属（Genus）に属するグラム陰性桿菌であって、人体には急性食中毒及び腸炎を起こし、魚類にはビブリオ病（Vibriosis）を起こす細菌である。最近では、エビ養殖産業における大量斃死を引き起こす急性肝膵臓壊死症（ＡＨＰＮＤ、Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease）の原因菌として明らかになった。
【００２４】
本発明の前記組成物は、有効成分としてバチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、またはこれらの組み合わせをさらに含んでもよい。前記バチルス・プミルスは寄託番号ＫＣＣＭ１１１４４Ｐで寄託された菌株であってもよく、前記バチルス・リケニフォルミスは寄託番号ＫＣＣＭ１１２７０Ｐで寄託された菌株であってもよい。
【００２５】
本発明の用語、「予防」とは、本発明に係るバチルス・サブチリスを含む組成物の投与でエビの急性肝膵臓壊死症（ＡＨＰＮＤ）による症状を抑制または遅延させるすべての行為をいう。
【００２６】
本発明の用語、「治療」とは、本発明に係るバチルス・サブチリスＫＣＣＭ１１１４３Ｐを含む組成物の投与でエビの急性肝膵臓壊死症（ＡＨＰＮＤ）による症状が好転したり、完治されるすべての行為を意味する。
【００２７】
前記組成物には、有効成分として含む前記菌株に加えて、薬学的、食品学的または飼料用に許容される公知の担体または添加剤が含まれてもよい。本発明におけるバチルス・サブチリスＫＣＣＭ１１１４３Ｐを含む腸炎ビブリオ菌に対する抗菌活性を有するプロバイオティクス製剤として、品質の低下を防止するために添加する結着剤、乳化剤、保存剤などがあり、効用増大のために飼料に添加するアミノ酸剤、ビタミン剤、酵素剤、香味剤、非タンパク質態窒素化合物、ケイ酸塩剤、緩衝剤、抽出剤、オリゴ糖などがある。その他にも、飼料混合剤などをさらに含んでもよく、これに限定されるものではない。
【００２８】
本発明の一実施例で、前記飼料組成物をエビに給餌した場合にＡＨＰＮＤ病に対する免疫力を増加させ、疾患予防効果を示すことができるか確認した結果、本発明のバチルス・サブチリス（ＫＣＣＭ１１１４３Ｐ、以下「ＢＳ」と呼ぶ）菌株を含む飼料組成物（実施例１及び２）を投与した群（ＢＳグループ１及び２）は、比較例１（プロバイオティクスを含まない）及び比較例２（商業的に販売されているプロバイオティクス（バチルス３種混合製剤（B. subtilis、B. pumilus、B. licheniformis）を含む）を投与した群（対照群１及び２）に比べて、腸炎ビブリオ菌（Vibrio parahaemolyticus）感染に対するエビの疾病抵抗性を増進させうることのみならず、エビ肝膵臓内のＡＨＰＮＤ毒素量を大きく下げることができる。
【００２９】
本発明の他の一実施例では、前記菌株を含む飼料組成物の非特異的免疫力分析を行った結果、マクロファージ（ＮＢＴ）活性、グルタチオンペルオキシダーゼ （ＧＰｘ）活性、リゾチーム活性、フェノール酸化酵素（ＰＯ）活性、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）活性及び抗タンパク分解酵素の活性が比較例に比べて有意的に高いことを確認し、これにより、前記組成物はエビの非特異的免疫反応の増加または免疫力の向上に有用しうる。
【００３０】
本発明は、前記で言及した飼料組成物を含むエビ養殖用の飼料添加剤を提供する。
【００３１】
本発明の飼料添加剤は、前記有効成分に加えて、薬学的、食品学的または飼料用に許容される公知の担体または安定剤などを加えてもよく、必要に応じてビタミン、アミノ酸類、ミネラルなどの各種養分、抗酸化剤及び他の添加剤などを加えてもよく、その形状としては、粉体、顆粒、ペレット、懸濁液などの適当な状態であってもよい。本発明の飼料添加剤を供給する場合は、非反芻動物に対して単独で、または飼料に混合して供給してもよい。
【００３２】
また、本発明は、前記言及した飼料添加剤を含むエビ養殖用の飼料を提供する。
【００３３】
本発明のバチルス・サブチリスＫＣＣＭ１１１４３Ｐ菌株は、胞子形成が可能なグラム陽性菌であるため、胞子の形態で剤形化することが好ましいが、これに制限されるものではない。本発明の飼料は、特に限定されるものではなく、粉末飼料、固形飼料、モイストペレット飼料、ドライペレット飼料、ＥＰ（Extruder Pellet）飼料、生エサなどいかなる飼料であってもよい。
【００３４】
前述したように、バチルス属は内生胞子を形成して熱に非常に安定した特徴を有している。したがって、本発明のバチルス・サブチリスＫＣＣＭ１１１４３Ｐは飼料添加剤の形態で別に製造して飼料に混合させたり、飼料製造時に直接添加して製造してもよい。本発明の飼料内のバチルス・サブチリスは液状または乾燥状態であってもよく、好ましくは、乾燥された粉末形態である。乾燥方法は、通風乾燥、自然乾燥、噴霧乾燥及び凍結乾燥が可能であるが、これに制限されるものではない。本発明のバチルス・サブチリスＫＣＣＭ１１１４３Ｐは、粉末形態で飼料重量の０．０５〜１０重量％、好ましくは０．１％〜１重量％の成分比で混合してもよい。また、前記飼料は水産養殖用であって、本発明のバチルス・サブチリスＫＣＣＭ１１１４３Ｐの他に飼料の保存性を向上させうる通常の添加剤をさらに含んでもよい。
【００３５】
前記課題を解決するためのもう一つの実施様態として、本発明の飼料組成物を個体に投与する段階を含む急性肝膵臓壊死症の予防または治療方法を提供する。
【００３６】
このとき、本発明の急性肝膵臓壊死症、予防及び治療は、前記で説明した通りである。
【００３７】
本発明の用語、「個体」とは、急性肝膵臓壊死症が発症したり、発症する可能性がある養殖可能な魚類または甲殻類を意味してもよいが、本発明の目的上、エビを意味してもよい。
【００３８】
前記飼料は、通常の飼料と同様の量及び給餌の間隔で供給されることが好ましく、前記病原菌は、エビ養殖においてＡＨＰＮＤを誘発させることで、エビの大量斃死を引き起こす菌を指し、具体的には、腸炎ビブリオ菌（vibrio parahaemolyticus）を意味してもよい。
【００３９】
前記エビ養殖における集団斃死を引き起こす原因としては、前記腸炎ビブリオ菌だけでなく、さまざまなウイルスによる感染及び飼育水中のアンモニア濃度も含まれる。エビ養殖中の飼育水内のアンモニアは、主にエビの排泄物、飼料かすなどのタンパク質の代謝産物で発生し、ｐＨ及び水温の上昇に応じて大きく変わる。高濃度のアンモニアは、エビの急性斃死の直接の原因となって、大量斃死につながり、低い濃度でも長期的にはエビの成長及び摂食能力などを低下させ、免疫力を低下させて結果的に様々な疾病の発生を誘発させうる。
【００４０】
本発明の一実施例では、本発明の飼料組成物を給餌したエビの飼育水を採取してその水質分析を行った結果、対照区に比べて総アンモニア濃度が有意的に低いことを確認することにより、本発明のバチルス・サブチリスＫＣＣＭ１１１４３Ｐ菌株はエビ飼育水の水質を改善しうることを確認した。
【００４１】
前述したように、本発明のバチルス・サブチリスＫＣＣＭ１１１４３Ｐはエビの疾病抵抗性を増進させることができるのみならず、エビ肝膵臓内のＡＨＰＮＤ毒素量を抑制しうるため、前記菌株を用いると、前記疾病を誘発する腸炎ビブリオ菌を予防する効果を得ることができ、より安全にエビを養殖しうる。
【００４２】
前記課題を解決するためのもう一つの実施様態として、本発明は、バチルス・サブチリス菌株、その培養液、その濃縮液またはその乾燥物を有効成分として含むホワイトスポット病症候群（ＷＳＳ）の予防または治療用飼料組成物を提供する。
【００４３】
本発明の用語バチルス・サブチリス（Bacillus subtilus、枯草菌）、予防及び治療は、前記で説明した通りである。
【００４４】
本発明の前記組成物は、全体の有効成分の１ｇ当たりに１×１０４〜1×１０１１ ＣＦＵの菌数を有するバチルス・サブチリスＫＣＣＭ１１１４３Ｐを含んでもよく、具体的には、１×１０４〜1×１０１０ ＣＦＵ／gであってもよく、より具体的には、１×１０８〜1×１０１０ ＣＦＵ／gのバチルス・サブチリスＫＣＣＭ１１１４３Ｐを含んでもよい。
【００４５】
前記「ホワイトスポット病症候群ウイルス（ＷＳＳＶ）」とは、全世界で幅広く分布しているウイルスであって、バイロン末端部位に尾に類似した付着物を有し、ロッド（rod）形態のキャプシド（capsid）及び被膜（envelop）が存在する卵形のバチルスと類似した形態を有しており、バキュロウイルスまたはバチルス様ウイルス（bacillus-like formed virus）と呼ばれたが、最近では、遺伝学的に新しいウイルスグループであるウィスポウイルス（whispovirus）と命名されている。このウイルスの長さは約２７５ｎｍであり、直径が約１２０ｎｍであり、約２９０ｋｂの大きさを有する２重螺旋ＤＮＡ（double-stranded DNA）で構成されている。
【００４６】
前記組成物には、有効成分として含む前記菌株に加えて、薬学的、食品学的または飼料用に許容される公知の担体または添加剤が含まれてもよい。本発明でのバチルス・サブチリスＫＣＣＭ１１１４３Ｐを含むホワイトスポット病症候群ウイルスに対する抗ウイルス活性を有するプロバイオティクス製剤として、品質の低下を防止するために添加する結着剤、乳化剤、保存剤などがあり、効用増大のために飼料に添加する、アミノ酸剤、ビタミン剤、酵素剤、香味剤、非タンパク質態窒素化合物、ケイ酸塩剤、緩衝剤、抽出剤、オリゴ糖などがある。その他にも、飼料混合剤などをさらに含んでもよいが、これに限定されない。
【００４７】
本発明の一実施例では、前記飼料組成物をエビに給餌した場合にホワイトスポット病症候群ウイルス（ＷＳＳＶ）に対する抵抗性を増加させて、疾患の予防効果を示すことができるかを確認した結果、本発明のバチルス・サブチリスＫＣＣＭ１１１４３Ｐ菌株を含む飼料組成物（実施例１）を投与した群（ＢＳグループ１）は、比較例１（プロバイオティクスを含まない）を投与した群（対照群１）に比べてＷＳＳＶ感染に対するエビの疾病抵抗性を増進させることができた。
【００４８】
本発明の他の一実施例では、前記飼料組成物をエビに給餌した場合にホワイトスポット病症候群ウイルス（ＷＳＳＶ）及び急性肝膵臓壊死症（ＡＨＰＮＤ）の複合感染に対する抵抗性を増加させて、生存率の向上効果を示すことができるかどうかを確認した結果、本発明のバチルス・サブチリスＫＣＣＭ１１１４３Ｐ菌株を含む飼料組成物（実施例１）を投与した群（ＢＳグループ１）は、比較例１（プロバイオティクスを含まない）を投与した群（対照群１）に比べて、ＷＳＳＶ及びＡＨＰＮＤの複合感染に対するエビの疾病抵抗性を増進させることができた。
【００４９】
本発明は、前記言及した飼料組成物を含むエビ養殖用の飼料添加剤を提供する。
【００５０】
本発明の飼料添加剤は、前記有効成分に加えて、薬学的、食品学的または飼料用に許容される公知の担体または安定剤などを加えてもよく、必要に応じてビタミン、アミノ酸類、ミネラルなどの各種養分、抗酸化剤及び他の添加剤などを加えてもよく、その形状としては、粉体、顆粒、ペレット、懸濁液などの適当な状態であってもよい。本発明の飼料添加剤を供給する場合は、非反芻動物に対して単独で、または飼料に混合して供給してもよい。
【００５１】
また、本発明は、前記言及した飼料添加剤を含むエビ養殖用の飼料を提供する。
【００５２】
本発明のバチルス・サブチリスＫＣＣＭ１１１４３Ｐ菌株は胞子形成が可能なグラム陽性菌なので、胞子の形態で剤形化することが好ましいが、これに制限されるものではない。本発明の飼料は、特に限定されるものではなく、粉末飼料、固形飼料、モイストペレット飼料、ドライペレット飼料、ＥＰ（Extruder Pellet）飼料、生エサなどいかなる飼料であってもよい。
【００５３】
前述したように、バチルス属は内生胞子を形成して熱に非常に安定的な特徴を有している。したがって、本発明のバチルス・サブチリスＫＣＣＭ１１１４３Ｐは飼料添加剤の形態で別に製造して飼料に混合したり、飼料製造時に直接添加して製造してもよい。本発明の飼料内バチルス・サブチリスは、液状または乾燥状態であってもよく、好ましくは、乾燥された粉末形態である。乾燥方法は、通風乾燥、自然乾燥、噴霧乾燥、及び凍結乾燥が可能であるが、これに制限されるものではない。本発明のバチルス・サブチリスＫＣＣＭ１１１４３Ｐは、粉末形態で飼料重量の０．０５〜１０重量％、好ましくは０．１％〜１重量％の成分比で混合してもよい。また、前記飼料は水産養殖用であって、本発明のバチルス・サブチリスＫＣＣＭ１１１４３Ｐの他に飼料の保存性を向上させうる通常の添加剤をさらに含んでもよい。
【００５４】
前記課題を解決するためのもう一つの実施様態として、本発明の飼料組成物を個体に投与する段階を含むホワイトスポット病症候群の予防または治療方法を提供する。
【００５５】
このとき、本発明の用語、ホワイトスポット病症候群、予防、治療、及び個体は、前記で説明した通りである。
【００５６】
エビ養殖における集団斃死を引き起こす原因には、前記腸炎ビブリオ菌だけでなく、さまざまなウイルスによる感染も含まれる。具体的には、前記ウイルスはホワイトスポット病症候群ウイルス（ＷＳＳＶ）を意味してもよい。
【００５７】
前述したように、本発明のバチルス・サブチリスＫＣＣＭ１１１４３Ｐは、ホワイトスポット病症候群ウイルスに対する耐性を増強させる効果を得ることができ、より安全にエビを養殖することができる。
【実施例】
【００５８】
以下、本発明の実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５９】
製造例１．抗菌活性を有するプロバイオティクスの選別
エビにＡＨＰＮＤを誘発する腸炎ビブリオ菌（Vibrio parahaemolyticus）に対する抗菌活性を有する菌株を選抜するために、生育阻害環分析を行った。０．５％寒天（agar）３ｍｌと病原性細菌の振とう培養液（２．０×１０９ ＣＦＵ／ｍｌ）１００μｌを混合してＴＳＡ＋培地に分注してトップアガーを製造した。前記製造されたトップアガーの上に１２種のバチルス・サブチリス（ＣＪ自体保有菌株及び商業用菌株）微生物培養液をそれぞれ１０μｌ滴下し、３０℃で１８時間培養した後に形成される生育阻害環の有無を観察した。商業的に入手可能なバチルス・サブチリスと複合ファージの抗菌力を一緒に評価した。
【表１】
0006898989.tif 000002
【００６０】
前記表１に示すように、インビトロ上ＡＨＰＮＤ誘発菌株である腸炎ビブリオ菌に対する抗菌効果は、バチルス・サブチリス１微生物（ＣＪＢＳ‐０１）が最も優れていた。しかし、インビトロ上で特定の病原体に抗菌活性を示す微生物だとしても、これはインビトロ上の効果であるだけで、動物がこれを摂取するとしてもその病原体に関する免疫力または予防効果があると見ることはできない。
【００６１】
したがって、以下の実験では前記バチルス・サブチリス１（ＣＪＢＳ‐０１）微生物をエビに給餌した場合、ＡＨＰＮＤ病に対する免疫力の改善及び疾患の予防効果を示すかを確認した。また、前記バチルス・サブチリス１（ＣＪＢＳ‐０１）がエビの増体及び消化率に影響があるかも確認した。
【００６２】
前記バチルス・サブチリス１（ＣＪＢＳ‐０１）は、寄託番号ＫＣＣＭ１１１４３Ｐとして２０１０．１２．１４日付で韓国微生物保存センターに寄託された菌株である。
【００６３】
製造例２．バチルス・サブチリスを含むエビ飼料組成物の製造
前記製造例１で選別されたバチルス・サブチリス１（Bacillus Subtilis：寄託番号ＫＣＣＭ１１１４３Ｐ、以下「ＢＳ」と呼ぶ）を含む飼料組成物を製造した。
【００６４】
具体的には、バチルス・サブチリスを含まない比較例１、商業的に販売されているバチルス属（Bacillus３種の混合製剤（B. subtilis、B. pumilus、B.licheniformis）を含む比較例２、前記選別されたバチルス・サブチリス１（ＢＳ）を１０１０×０．２ ＣＦＵ/ gを含む実施例１及び前記ＢＳを１０９×０．２ ＣＦＵ／gを含む実施例２の組成物を魚油（fish oil）及び水を添加して混合した後、ペレット形態で製造した。前記比較例１、２及び実施例１及び２の飼料組成物は、乾燥機を使用して約２４時間、２５℃で乾燥した後、実験前まで−２０℃で保管した。
【表２】
0006898989.tif 000003
【００６５】
実験例１．ＡＨＰＮＤに対する飼料組成物の予防効果の評価
１−１．エビの準備及び成長率の評価
水槽当たり３０匹ずつ、合計４０個の水槽にシロアシエビを準備した。すべての試験水槽には溶存酸素を維持するためにエアストーンを設置し、全試験期間中の飼育水温は２８〜３２℃の範囲に維持した。飼料は１日４回に限定的に供給した（魚体重の４〜１２％）。
【００６６】
エビの重量は２週間ごとに測定し、成長率及び飼料効率に関連する評価項目と計算式は以下の通りである：
【数１】
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【数２】
0006898989.tif 000005
【数３】
0006898989.tif 000006
【００６７】
実験飼料の配置は完全確率計画法（Completely randomized design）を行い、成長及び分析の結果は、ＳＰＳＳ Ｖｅｒｓｉｏｎ１８．０プログラム用いて、一元配置分散分析（One-way ANOVA）で統計分析した。データ値の有意差はダンカンの新多重範囲検定（Duncan's multiple range test）で平均間の有意性（Ｐ＜０．０５）を比較した。データは、平均値±標準偏差（mean±SD）で示し、パーセントデータはａｒｃｓｉｎｅ変形値で計算して統計分析した。
【表３】
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【００６８】
表３に示すように、試験結果、比較例１及び２の飼料組成物が投与された対照群１及び２に比べて、製造例１で選別されたバチルス・サブチリスを含む実施例１の飼料組成物が提供されるＢＳグループ１で有意的に高い成長率が表されることを確認した。また、実施例１が投与された群は、比較例１及び２が投与された群に比べて有意的に高い日間成長率が表されることを確認した。
【００６９】
１−２．腸炎ビブリオ菌の攻撃試験１
腸炎ビブリオ菌のエビに対する攻撃試験は、全２回に分けて行った。前記ビブリオ菌株の場合、２０１３年度のベトナム地域で分離したＡＨＰＮＤ（ＥＭＳ）誘発菌株を試験に用いた。攻撃試験の場合、実施例の飼料組成物をエビに２週間供給した後、同様の重量（平均重量：２．３２ｇ）のエビをグループごとに９６匹ずつ４つ反復して配置した。前記細菌はＴＳＢ＋培地を用いて３０℃、１５０ｒｐｍで２４時間培養し、タンク当たり３．１×１０５ ＣＦＵ／ｍｌの濃度で腸炎ビブリオ菌の懸濁液を浸漬した。浸漬後１時間ごとにエビの斃死及び遊泳状態を確認し、８時間後に９５％の還水を行った。試験飼料は１日３回（８：３０、１３：３０、及び１８：３０）に分けて制限供給（魚体重の１０〜１２％）し、７０時間の間、斃死程度を観察した。これに対する結果を下記の表４に示した。
【表４】
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【００７０】
表４に示すように、製造例１で選別されたバチルス・サブチリスを含む飼料組成物が提供されるＢＳグループ１は、腸炎ビブリオ菌のエビに対する攻撃試験において、対照群１及び２に比べて高い生存率を示した。
【００７１】
また、図１に示すように、２回の試験の両方に共通で腸炎ビブリオ菌を浸漬した直後にはエビの動きが鈍くなり、遊泳活動をせずに水槽の底に沈んでいる様子が観察され、飼料摂餌も活発でなかった。浸漬後８時間には急激な斃死が発生し始め、ＢＳグループ１の生存率は、対照群１または２の生存率に比べて１７％以上高いことを確認した。
【００７２】
１−３.腸炎ビブリオ菌の攻撃試験２
腸炎ビブリオ菌のエビに対する攻撃試験は、１回行った。前記ビブリオ菌株の場合、２０１３年のベトナム地域で分離したＡＨＰＮＤ（ＥＭＳ）誘発菌株を試験に用いた。攻撃試験の場合、実施例の飼料組成物をエビに４週間供給した後、同様の重量（平均重量：２．３０ｇ）のエビをグループごとに９６匹ずつ４つ反復して配置した。前記細菌はＴＳＢ＋培地を用いて３０℃、１５０ｒｐｍで２４時間培養し、タンク当たり６．３×１０５ ＣＦＵ／ｍｌの濃度で腸炎ビブリオ菌の懸濁液を浸漬した。浸漬後１時間ごとにエビの斃死及び遊泳状態を確認し、８時間後に９５％の還水を行った。試験飼料は１日３回（８：３０、１３：３０、及び１８：３０）に分けて制限供給（魚体重の１０〜１２％）し、７０時間の間、斃死程度を観察した。これに対する結果を下記の表５に示した。
【表５】
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【００７３】
表５に示すように、腸炎ビブリオ菌のエビの攻撃試験において、製造例１で選別されたバチルス・サブチリスを含む実施例１及び２の飼料組成物が提供されたＢＳグループ１及び２は、比較例１の飼料組成物が提供された対照群１に比べて高い生存率を示した。
【００７４】
１−４．サンプルの収集方法及び病理組織学的分析の方法
腸炎ビブリオ菌のエビに対する攻撃試験の開始（感染前）、中間（感染）、終了時にグループごとに２匹のエビをランダムに選別して肝膵臓を分離した。分離された肝膵臓の一部は、ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ‐ｔｉｍｅ ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析のためにエチルアルコール（１００％）にすぐに保管し、一部は病理組織学的検査のためにＤａｖｉｄｓｏｎ固定液に２４時間固定した後、エチルアルコール（７０％）に保管した。
【００７５】
より具体的には、病理組織学的分析は、次のような方法で行われた。前記分離した肝膵臓組織の破壊を最小限に抑えるために、水槽からサンプリングした直後、１ｍｌの注射器を用いてＤａｖｉｄｓｏｎ固定液をエビの肝膵臓に注入した後、分離した。その後、Ｄａｖｉｓｏｎ固定液が含まれている１．５ｍｌエッペンドルフチューブで２４時間固定し、エチルアルコール（７０％）に保管した後、分析に用いた。固定が完了した臓器を組織標本の製作に適したサイズの形態（約２〜３ｍｍ）の厚さで削正した後、カセットに入れて１３時間組織処理を行なった。約４μｍの厚さで薄切して、発生した切片は筆を用いて採取し、スライドにしわがないように付着した後、空気中で約５分程度放置し、Ｈ＆Ｅ染色を行なった。染色が終了したスライドは、位相差顕微鏡（BX50、Olympus）を用いて顕微鏡専用プログラム（TCapture、Tucen Photonics）で２００倍撮影した。その後、サンプリングした肝膵臓内のＡＨＰＮＤ毒素量に対するｑＰＣＲ分析を行なった。
【００７６】
その結果を図２に示した。ここで、Ｃｔ値は低いほど毒素量が多いことを意味する。
【００７７】
攻撃試験前（０ｈ）のサンプリングした肝膵臓では、すべてのグループでＡＨＰＮＤ毒素が検出されておらず、斃死個体が最も多かった１０時間にサンプリングした肝膵臓ではすべての試験区でＡＨＰＮＤ毒素が検出された。しかし、本出願によるバチルス・サブチリスを含む飼料組成物が提供されるＢＳグループ１は対照群１及び２に比べて有意的に高いＣｔ値を示し、２４時間にサンプリングした肝膵臓では、ＢＳグループ１でＡＨＰＮＤ毒素を最も少なく検出することが確認された。また、攻撃接種終了時点（１９３ｈ）にはＢＳグループ２と対照群２でＡＨＰＮＤ毒素が検出されなかった。
【００７８】
また、肝膵臓の病理組織学的分析の結果を図３に示した。
【００７９】
攻撃試験前（０ｈ）でサンプリングした肝膵臓は、すべてのグループで正常の組織形態が観察された。１０時間後にサンプリングした肝膵臓は対照群１のグループで損傷度が最もひどく、対照群２及びＢＳグループ１でも組織壊死が進んでいることが観察された。２４時間後にサンプリングした肝膵臓はＡＨＰＮＤ毒素による組織壊死よりは炎症所見が観察された。攻撃接種終了時点（１９３ｈ）には、対照群１で既に１００％斃死が発生（３７ｈ）したためサンプリングが不可能であり、対照群２及びＢＳのグループでは、一部炎症細胞が観察された。
【００８０】
前記結果から、本出願によるバチルス・サブチリスを含む飼料組成物は、腸炎ビブリオ菌（Vibrio parahaemolyticus）感染に対するエビの疾病抵抗性を増進させることができるのみならず、エビ肝膵臓内のＡＨＰＮＤ毒素量を大きく下げうることを確認した。
【００８１】
実験例２．バチルス・サブチリスの濃度による成長率及び免疫力の評価
前記製造例２を参考にして、製造例１で選別されたバチルス・サブチリス（ＫＣＣＭ１１１４３Ｐ、以下「ＢＳ」と呼ぶ）の濃度を異にした飼料組成物（実施例１及び３）を製造した。これを表６に示した。
【表６−１】
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【表６−２】
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【００８２】
前記表６の各グループの組成物は、魚油（fish oil）及び水を添加して混合した後、ペレットの形態で製造し、前記各グループの飼料組成物は、乾燥機を用いて約２４時間、２５℃で乾燥させた後、実験前まで−２０℃で保管した。
【００８３】
２−１．エビの準備及び成長率の評価
水槽当たり３０匹ずつ、合計２８個の水槽にシロアシエビを準備した。すべての試験水槽には溶存酸素を維持するためにエアストーンを設置し、全試験期間中の飼育水温は２８〜３２℃の範囲に維持した。飼料は８週間、１日４回に限定的に供給した（魚体重の６〜１２％、初期平均重量：０．１４ｇ）。
【００８４】
エビの重量は２週間ごとに測定し、成長率及び飼料効率関連の評価項目と計算式は以下の通りである；
【数４】
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【数５】
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【数６】
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【００８５】
その結果を表７に示した。
【表７】
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【００８６】
表７及び図４に示すように、８週間飼料が供給されたすべてのグループのエビは、飼料供給前に比べて約７０００％以上の成長率を示した。特に、ＢＳグループ１とＢＳグループ３の最終平均重量は、対照群１の最終平均重量に比べて、それぞれ１５．７％及び１６．７％高かった。また、日間成長率でもＢＳグループ１とＢＳグループ３は、対照群１と比較して、それぞれ３．４％及び４．１％高かった。ＢＳグループ１とＢＳグループ３の飼料効率は、対照群１の飼料効率と比較して、それぞれ２７．５％及び２６．１％向上した。ただし、エビの生存率は、すべてのグループで有意な差がなかった。
【００８７】
２−２．サンプルの収集
試験エビの重量測定は、２週間ごとに実施し、測定１８時間前に試験エビのストレスを軽減するために、すべての試験エビを絶食させた。最終重量測定後に水槽当たり７匹のエビをランダムに選別して氷水で麻酔した後、ＡＬＳＥＶＥＲ’Ｓ溶液が処理された注射器を用いてｈｅｍｏｌｙｍｐを採血した。採血したｈｅｍｏｌｙｍｐは、マクロファージ活性（ＮＢＴ; nitroblue-tetrazolium activity）の分析に用い、遠心分離機で（８００ｇ、１０分、４℃）血漿を分離したサンプルは、非特異的免疫力の分析に用いた。消化率の分析のためのエビの糞便（feces）の収集は飼料供給３０分後、サイフォン（siphoning）及び還水を介して水槽に残った飼料と異物質をきれいに掃除して、その後３時間から排泄される糞便をサイフォンで収集した。収集された糞便は、蒸留水で洗浄した後、ろ紙を用いてフィルタした後、分析用サンプルとして使用するまで−４０℃の低温冷凍庫に保管した。
【００８８】
２−３．統計学的分析
実験飼料の配置は完全確率計画法（Completely randomized design）を行い、成長及び分析の結果は、ＳＰＳＳ Ｖｅｒｓｉｏｎ１８．０プログラム用いて、一元配置分散分析で統計分析した。データ値の有意差は ダンカンの新多重範囲検定（Duncan's multiple range test）で平均間の有意性（Ｐ＜０．０５）を比較した。データは、平均値±標準偏差（mean±SD）で示し、パーセントデータはａｒｃｓｉｎｅ変形値で計算して統計分析した。
【００８９】
２−４．一般成分の分析
試験飼料及び前記分の一般成分の分析は、ＡＯＡＣ（２００５）の方法に基づいて、水分は常圧加熱乾燥法（１２５℃、３ｈ）、粗灰分は直接灰化炉法（５５０℃、４ｈ）、粗タンパク質は自動粗タンパク分析機（Kejltec system 2300、Sweden）で分析し、粗脂肪は非特許文献４の方法に基づいて分析して表８に示した。
【表８】
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【００９０】
表８に示すように、粗灰分及び粗脂肪の含量は、グループ間の有意的な差を示さなかったが、ＢＳグループ３の粗タンパク質含量は、対照群１及び対照群２に比べて有意的に高かった。すなわち、本出願による飼料組成物がエビに提供される場合、エビのタンパク含量を高めうるという点を確認した。
【００９１】
２−５．非特異的免疫力の関連分析
２−５−１． ＮＢＴ（Nitroblue tetrazolium）活性の分析
呼吸爆発中の好中球による酸化ラジカル生成量を測定するために、非特許文献５の分析方法を応用した。
【００９２】
具体的には、まずｈｅｍｏｌｙｍｐｈ５０μｌを２００μｌＨＢＳＳ（Hank's balanced salt solution）溶液と混合した後、２５℃で反応させた。３０分後、ｚｙｍｏｓａｎ（0.1％ Hank's solution）１００μｌを添加し、３７℃で２時間反応させた。 ＮＢＴ溶液（０．３％）を１００μｌずつ入れた後、３７℃で２時間反応させた。６００μｌの１００％メタノールを入れて１０分間遠心分離（６５００ｒｐｍ）した後、上清液を捨てて、７０％メタノール１００μｌで３回洗浄した後、５分間乾燥させた。その後、２Ｍ ＫＯＨ ７００μｌとＤＭＳＯ ８００μｌを添加した後、６２０ｎｍで吸光度を測定した。
【００９３】
２‐５‐２．グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ；Glutathione peroxidase）活性の分析
血清中のＧＰｘ活性を分析するために、ＧＰｘ ｋｉｔ（Biovision、Inc. California）を用いた。
【００９４】
具体的には、クメンヒドロペルオキシド（Cumenehydroperoxide）はペルオキシダーゼ基質（ＲＯＯＨ；peroxide substrate）、グルタチオンレダクターゼ（ＧＳＳＧ-Ｒ；glutathione reductas）及びＮＡＤＰＨ（b-Nicotinamide Adenine Denucleotide Phosphate、Reduced）が混ざった反応混合物を用いた。まず、 ｈｅｍｏｌｙｍｐｈサンプル５０μｌをマイクロプレートに入れ、反応混合物４０μｌを添加して、１５分間反応させた。その後クメンヒドロペルオキシド１０μｌを添加し、３４０ｎｍで吸光度を測定した。５分後に３４０ｎｍで再び吸光度を測定し、ＧＰｘ活性はｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｌで計算した。
【００９５】
２‐５‐３．リゾチーム活性の分析
リゾチーム活性の分析は、非特許文献６の方法を基に分析した。
【００９６】
具体的には、リゾチームは非特異的（先天的）免疫反応に属する抗菌酵素の一つであって、特定細菌に対する特異的な抗菌作用ではなく、非特異的にさまざまな菌に対する抗菌作用を示す酵素である。病原菌に対する抗菌メカニズムは、細菌細胞壁の構成成分であるｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎのβ‐１,４‐グルコシド結合を加水分解して細菌の細胞壁を破壊することにより抗菌作用を示す。リゾチームは、特にグラム陽性菌に対する抗菌効果が優れている。これらのメカニズムに起因してリゾチーム活性（lysozyme activity）は魚類を含むエビにおける非特異的免疫反応を測定する分析項目として広く用いられており、エビ飼料内の免疫活性因子（ascorbic acid、β-glucan、probioticsなど）の添加時のエビのｈｅｍｏｌｙｍｐｈ及び組織において増加したリゾチーム活性を確認することができ、これらの結果は、非特異的免疫反応の増加または魚類（エビ）の免疫力の向上を示す結果と解釈される。
【００９７】
２‐５‐４．フェノールオキシダーゼ（ＰＯ；Phenoloxidase）活性の分析
ＰＯ活性の分析は、非特許文献７の方法を基に分析した。
【００９８】
具体的には、フェノールオキシダーゼは甲殻類の防御メカニズムに非常に重要な役割をする酵素であって、血球細胞内のプロフェノールオキシダーゼ（prophenoloxidase）形態で存在している途中プロフェノールオキシダーゼ活性化システム（Prophenoloxidase activating system）によって活性化される。活性化されたフェノールオキシダーゼはオプソニンを生産して血球の食細胞活動と外来抗原に対する被覆作用を促進させ、血液凝固反応に参与する。したがってｈｅｍｏｌｙｍｐｈ内のフェノールオキシダーゼ活性はエビの先天性免疫の重要な指標として用いられる。
【００９９】
２‐５‐５．スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ；Superoxide dismutases）活性の分析
ＳＯＤ活性はＳＯＤ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Sigma-aldrich、19160、St. Louis、USA）を用いて分析した。
【０１００】
具体的には、９６ウェルプレートに２０μlのｒａｄｉｃａｌ ｄｅｔｅｃｔｏｒを添加した後、血液サンプルを１０μlずつ入れた。その後、２０μlキサンチンオキシダーゼ（xanthine oxidase）を添加して２０分間反応させた後、マイクロプレートリーダー（Themo）を用いて、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【０１０１】
２‐５‐６．アンチプロテアーゼ（Antiproteases）活性の分析
Ｈｅｍｏｌｙｍｐｈ内のアンチプロテアーゼの活性は非特許文献８の分析方法に基づいて分析した。
【０１０２】
具体的には、Ｈｅｍｏｌｙｍｐｈ ２０μlとｓｔａｎｄａｒｄ ｔｒｙｐｓｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Type II-S、from porcine pancreas、Sigma-aldrich、A2765、St. Louis、USA）２０μlを混合した後、１０分間２２℃で培養した。リン酸緩衝液 （０．１Ｍ、ｐＨ ７．０）２００μlとａｚｏｃａｓｅｉｎ（２％）（Sigma-Aldrich）２５０μlを添加し、２２℃で１時間培養した後、トリクロロ酢酸 （１０%）（ＴＣＡ）５００μlを再び添加し２２℃で３０分間培養した。前記培養された溶液を遠心分離（６０００ｇ、５分）し、１００μlを９６ウェルプレートに分注した後、１００μlのＮａＯＨ（１Ｎ）を添加して、マイクロプレートリーダーを用いて４３０ｎｍで吸光度を測定した。
【０１０３】
前記非特異的免疫力の分析を行った２‐５‐１〜２‐５‐６の結果を下記表９に示した。
【表９−１】
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【表９−２】
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【０１０４】
表９及び図５に示すように、ＮＢＴ活性及びＰＯ活性はＢＳグループ１及びＢＳグループ３の両方が対照群１及び対照群２に比べて有意的に高い数値を示し、特に、ＰＯ活性の場合、ＢＳグループ１は対照群１より２６．８％高い数値を示した。抗タンパク分解酵素活性は、ＢＳグループ１及びＢＳグループ３の両方対照群１及び対照群２に比べて有意的に高い数値を示しており、特にＢＳグループ１は対照群１より１５．８％高い数値を示した。リゾチーム活性及びＳＯＤ活性は、ＢＳグループ１及びＢＳグループ３の両方は対照群１に比べて有意的に高かった。ＧＰｘ活性はＢＳグループ１及びＢＳグループ３の両方が対照群１及び対照群２に比べて有意的に高い数値を示し、特に対照群１に比べて、それぞれ２７．７％及び２８．８％の高い値を示すことを確認した。
【０１０５】
２−６．水質分析及び飼育水無交換実験
８週間の飼養試験期間中に５日ごとに１回、各水槽で飼育水サンプルを採取して水質分析を行った。サンプルは、各タンクごとに同じ位置で収集し、溶存酸素（Dissolve oxygen；ＤＯ）、塩分、ｐＨ、アンモニア（Ammonium；ＮＨ４＋）の濃度を測定した。ＤＯはＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｏｒｉｏｎ Ｓｔａｒ Ａ２１６ Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ｍｅｔｅｒ（Thermoscientific）、塩分はＭａｓｔｅｒ Ｒｅｆｒａｃｔｏｍｅｔｅｒ（ATAGO）を用いて測定した。ｐＨはＳｅｖｅｎ Ｃｏｍｐａｃｔ（METTLER TOLEDO）を用いて測定した。ＮＨ４＋は、非特許文献９の方法を用いて分析した。
【０１０６】
飼育水無交換（zero water change）の方式で、平均体重２．８７（±０．０８）ｇのシロアシエビ（L. vannamei）を合計１４個の９６Ｌの水槽に各水槽当り１２匹ずつランダムに配置した。試験区当り２繰り返しを置き、１日４回（０８:３０、１２:００、１５:３０及び１９:００）に分けて、体重の１２%の試験飼料を給餌した。非特許文献９の方法に基づいて、毎日１回採水して飼育水の総アンモニア濃度を１０日間測定した。これに対する結果を表１０に示した。
【表１０】
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【０１０７】
表１０及び図６に示すように、興味深いことに、７日目から対照区に比べてすべての試験区が総アンモニア濃度で低い結果を見せ始めており、１０日目では、すべての試験区が対照区に比べて有意的に低いアンモニア濃度を示した。
【０１０８】
２−７．消化率の分析
２‐７‐１．指示剤（Ｃｒ２Ｏ３）分析
試験飼料と糞便サンプルにおける酸化クロム（chromium oxide）の含量を分析するために、非特許文献１０の方法を用いた。
【０１０９】
具体的には、試験飼料及び糞便サンプルは、灰化炉で（５５０℃）で４時間灰化させた後に得られた試料を分析に用いた。まず、酸化クロムをｍｏｎｏｃｈｒｏｍａｔｅ形態で酸化させるために、糞便サンプル５〜１０ｍｇを測定してガラス試験管に移した。試料が入ったガラス試験管に過塩素化試薬（ＨＣｌＯ４；perchloric reagent）４ｍｌを添加した。過塩素化試薬（７０％）は、１００ｍｌの蒸留水に２００ｍｌの硝酸を混合して冷却させた後、７０％過塩素化試薬２００ｍｌを混合して作った。前記試料と過塩素化試薬が添加されたガラス試験管を加熱板に入れて、３００℃で１５分間加熱した後、室温で放冷させた。前処理が終了したサンプルは、５０ｍｌガラスフラスコに移し、３次蒸留水に２５ｍｌになるよう定量した。その後、分光光度計（Beckman DU-730）を用いて３５０ｎｍで吸光度を測定した。測定した吸光度は、試料分析のように前処理されたｓｔａｎｄａｒｄ溶液で作られたｓｔａｎｄａｒｄ方程式を用いて、試料の酸化クロム含量を計算した。
【０１１０】
２‐７‐２．乾物及びタンパク質消化率の分析
試験飼料の乾物及びタンパク質の消化率は、次のような方法で計算した。
【数７】
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【０１１１】
飼養実験終了後に行った消化率の分析結果は、表１１に示した。
【表１１】
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【０１１２】
表１１に示すように、乾物の消化率及びタンパク質の消化率では、すべての試験区は対照区に比べて有意に高い結果を示した。
【０１１３】
実験例３．ＷＳＳＶに対する飼料組成物の予防効果の評価
バチルス・サブチリスを含有する飼料組成物の抗ウイルス効果を確認するために、ホワイトスポット病症候群ウイルス（ＷＳＳＶ）のエビに対する攻撃試験を行った。前記ホワイトスポット病症候群ウイルスの場合には、２０１７年に韓国の養殖場でＷＳＳＶに感染したシロアシエビ（Litopenaues vannamei）から分離したウイルスを用いた。攻撃試験の場合、実施例の飼料組成物をエビに６週間供給した後、同じ重量（平均重量：６．２５ｇ）のエビをグループごとに９６匹ずつ４つ反復して配置した。ウイルスの接種濃度は４．１×１０５コピー／μｌでエビ一匹あたり１００μｌを、注射器を用いてエビの筋肉に接種した。一匹あたり最終接種濃度は４．１×１０７コピー／μｌである。
【０１１４】
接種後エビの斃死及び遊泳状態を確認した。試験飼料は１日３回（８:３０、１３:３０及び１８:３０）に分けて制限供給（魚体重の１０〜１２%）し、１２５時間斃死程度を観察した。これに対する結果を下記の表１２に示した。
【表１２】
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【０１１５】
表１２に示すように、バチルス・サブチリスを含む実施例２の飼料組成物が提供されるＢＳグループ１は、ホワイトスポット病症候群ウイルスのエビに対する攻撃試験において、比較例１の飼料組成物が投与された対照群１に比べて高い生存率を示した。
【０１１６】
実験例４．ＷＳＳＶ及びＡＨＰＮＤの複合感染に対する飼料組成物の予防効果の評価
バチルス・サブチリスを含有する飼料組成物の抗菌及び抗ウイルス効果を確認するために、腸炎ビブリオ菌及びホワイトスポット病症候群ウイルスのエビに対する攻撃試験を行った。前記ビブリオ菌株の場合、２０１３年にベトナムの地域で分離したＡＨＰＮＤ（ＥＭＳ）誘発菌株を試験に用いた。前記ホワイトスポット病症候群ウイルスの場合、２０１７年に韓国の養殖場でＷＳＳＶに感染したシロアシエビ（Litopenaues vannamei）から分離したウイルスを用いた。攻撃試験の場合、実施例の飼料組成物をエビに６週間供給した後、同じ重量（平均重量：４．５２ｇ）のエビをグループごとに９６匹ずつ４つ反復して配置した。ウイルスの接種濃度は８．３×１０３ コピー／μｌでエビ１匹当り５０μｌを注射器を用いてエビ筋肉に接種した。１匹当り最終接種濃度は４．１×１０４ コピー／μｌである。ウイルス接種して２日経過後、ビブリオ細菌感染を行った。
【０１１７】
前記細菌はＴＳＢ＋培地を用いて３０℃、１５０ｒｐｍで２４時間培養し、タンクごとに１．３×１０５ ＣＦＵ／ｍｌの濃度で腸炎ビブリオ菌懸濁液を浸漬した。浸漬後１時間ごとにエビの斃死及び遊泳状態を確認した。試験飼料は１日３回（８:３０、１３:３０及び１８:３０）に分けて制限供給（魚体重の１０〜１２%）し、７日間の斃死の程度を観察した。これに対する結果を下記の表１３に示した。
【表１３】
0006898989.tif 000023
【０１１８】
表１３に示すように、バチルス・サブチリスを含む実施例１の飼料組成物が提供されたＢＳグループ１は、腸炎ビブリオ菌及びホワイトスポット病症候群ウイルスのエビに対する攻撃試験において、比較例１の飼料組成物が投与された対照群１に比べて高い生存率を示した。
【０１１９】
以上の実施例を介して、本出願に係るバチルス・サブチリスを含む飼料組成物は、シロアシエビの成長、飼料効率、消化率、飼育水質及び非特異的免疫力を高めることができ、また、高タンパクのシロアシエビの生産を可能にすることにより、エビの商品性を高めると期待できる。
【受託番号】
【０１２０】
寄託機関名：韓国微生物保存センター（国外）
受託番号：ＫＣＣＭ１１１４３Ｐ
受託日：２０１０１２１４
寄託機関名：韓国微生物保存センター（国外）
受託番号：ＫＣＣＭ１１１４４Ｐ
受託日：２０１０１２１４
寄託機関名：韓国微生物保存センター（国外）
受託番号：ＫＣＣＭ１１２７０Ｐ
受託日：２０１２０３２２
【０１２１】
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【０１２２】
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【０１２３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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