(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性成分として、ヒアルロン酸−カルシウム及びポリリシンのみを含み、
前記ヒアルロン酸とポリリシンとは架橋されておらず、
ヒアルロン酸−カルシウムとポリリシンとの重量比は４：１〜１：１．５である、創傷被覆材。
【請求項２】
ヒアルロン酸−カルシウムとポリリシンを２：１〜４：３の重量比で含む、請求項１に記載の創傷被覆材。
【請求項３】
ヒアルロン酸−カルシウムとポリリシンを２：１〜１：１．５の重量比で含む、請求項１に記載の創傷被覆材。
【請求項４】
前記ヒアルロン酸の分子量が２×１０６〜３×１０６Ｄａである、請求項１に記載の創傷被覆材。
【請求項５】
液体状、フォーム状又はフィルム状を呈する、請求項１に記載の創傷被覆材。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の創傷被覆材を製造する方法であって、
（１）ｐＨを８．４以上に調整したヒアルロン酸カルシウム塩の水溶液を、ｐＨを８．４以上に調整したポリリシン水溶液と混合するステップ、および
（２）前記ステップ（１）で得られる混合液から創傷被覆材を得ること
を含む、創傷被覆材の製造方法。
【請求項７】
前記ステップ（１）において、ヒアルロン酸カルシウム塩の水溶液及びポリリシン水溶液のｐＨをそれぞれ８．４〜９．０の範囲に調節する、請求項６に記載の創傷被覆材の製造方法。
【請求項８】
前記ステップ（２）において、混合液から液体状創傷被覆材を得る、請求項６に記載の創傷被覆材の製造方法。
【請求項９】
前記ステップ（２）において、混合液を凍結乾燥させてフォーム状創傷被覆材を得る、請求項６に記載の創傷被覆材の製造方法。
【請求項１０】
前記ステップ（２）において、混合液を基材上に塗布するか、あるいは型枠に注型し、乾燥させてフィルム状創傷被覆材を得る、請求項６に記載の創傷被覆材の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸−カルシウム及びポリリシンを含む創傷被覆材及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
外科的な施術および身体的外傷に起因する血管の損傷は出血を引き起こす。軽い表面の出血は血管、血小板および血漿因子の間の複合的な連鎖作用である生理学的止血により最終的に停止する。しかし、出血が深刻な場合には、外科的および内科的止血手段が必要となる。外科的止血では破裂した血管の縫合や止血スポンジなどを傷部位に塗布することにより、外科的止血を補助することができる。このような止血スポンジまたは組成物は、外科手術や血管、歯科手術などに有用である。
【０００３】
従来の開発された止血製品としては、生体内止血凝固因子を含有して血液凝固を促進させることができるスポンジの形のＴａｃｈｃｏｍｂ（登録商標）Ｔｏｐｉｃａｌ  Ｔｈｒｏｍｂｉｎ、血液を吸収して血液凝固効果を示すＳｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）、Ａｖｉｔｅｎｅ（登録商標）、ＣｈｉｔｏＣｌｏｔ（登録商標）などがある。Ｔａｃｈｃｏｍｂ（登録商標）Ｔｏｐｉｃａｌ  Ｔｈｒｏｍｂｉｎは牛や人間の血液から抽出されたフィブリノゲン、トロンビン、コラーゲンなどを含有していて処置時に感染の危険性と過敏反応があらわれることがあるという問題がある。Ｓｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）、Ａｖｉｔｅｎｅ（登録商標）、ＣｈｉｔｏＣｌｏｔ（登録商標）は、血液凝固能力と傷への付着力が多少落ちる欠点があり、生体適合性が低いため、出血部位の再生効果が微々たるという限界がある。これにより、優れた止血能を有する、損傷した傷の治療のための様々な創傷被覆材が開発された。
【０００４】
一般的な皮膚の傷を治癒することが目的で使用される外部創傷被覆材は、治癒に適切な湿潤環境を提供し、感染防止、保温効果、傷面への付着防止、使いやすさ、経済性、吸水性、透湿性などの要件を満たさなければならない。しかしながら、深部体腔創傷被覆材は、生体内部の傷部位に適用されるものなので、上記のような一般的な創傷被覆材の要件に加えて、生体内で水和して傷の治癒期間中に傷を保護するが、治癒が完了した後には自然に吸収、除去されて正常な組織に影響を与えないし、癒着防止機能も保有しなければならない。
【０００５】
癒着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）とは、炎症、創傷、摩擦、手術等による傷の治癒過程において治癒反応が長時間続く場合、繊維組織（ｆｉｂｒｏｕｓ  ｔｉｓｓｕｅ）が過度に生成されたり、血液が流出して凝固したりして、これにより互いに分離されているべき周辺臓器又は組織が互いにくっつく現象をいい、あらゆる種類の手術後に発生することがある。一般に、手術後の長期癒着の発生率は５５％から９３％に達することが知られている。
【０００６】
癒着防止のためのいくつかの方法の１つは、組織の傷が治癒される間に物理的なバリアを形成して隣接する組織の間の癒着が形成されることを防ぐ癒着防止材を使用することである。癒着防止材は、形態上大きく分けて二つに分類できるが、一つはフィルム、不織布、スポンジなどの膜状のものであり、もう一つはゲル状などの溶液状のものである。従来の開発された製品としては、インターガード（ＩｎｔｅｒＧｕａｒｄ）、ハイフェンス（ＨｙＦｅｎｃｅ）、ハイバリー（Ｈｉｂａｒｒｙ）、ゼンターＱ（Ｇｅｎｔａ  Ｑ）、メディカーテン（Ｍｅｄｉｃｕｒｔａｉｎ）、コーラタンプＧ（Ｃｏｌｌａｔａｍｐ  Ｇ）、ＲｅｇｅｎＰａｃｋ、ガーディックス（Ｇｕａｒｄｉｘ）などがある。従来の膜状の癒着防止材は癒着抑制効果が卓越するが、最近拡大している腹腔鏡などを利用する顕微鏡的手術の形態には適用し難いという限界がある。溶液状の癒着防止材は、手術後に発生する血液などの滲出物のために防止材の付着が困難となり、滲出物除去の際に同時に除去されたり、腹腔内で急速に吸収されたりして癒着を防止するためのバリア（障壁）の役割が十分に持続しないという欠点がある。
【０００７】
現在最も多く使用されている癒着防止材は、生体適合性に優れたものと知られている生体高分子であるコラーゲンとヒアルロン酸を原料として使用する。しかし、コラーゲンはほとんど牛や豚の皮膚又は筋肉から抽出されたので、免疫反応に関与するコラーゲン蛋白質が免疫反応を引き起こす可能性があることが報告されており、さらに牛由来のコラーゲンは、牛海綿状脳症（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ  Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ、ＢＳＥ）因子による安全性の問題が議論されている。他の動物から抽出されたコラーゲンも動物ウイルス感染という危険性を持っている。ヒアルロン酸は、単独で使用する場合、生体内では比較的早い時間内に分解され、短時間に傷の表面から拡散して流れるという問題がある。このようなヒアルロン酸の物性を補完するためにＢＤＤＥ、ＤＶＳ、ＥＤＣ／ＨｏＢｔなどを使用する化学的架橋によってヒアルロン酸ゲル組成物を製造する方法が提案されたが、架橋剤を除去する複雑な工程が必要とされ、カルボキシメチルセルロースなどの添加剤を使用する場合には、生分解性などで安全性が問題になることがある。
【０００８】
したがって、従来の創傷被覆材の欠点を克服することができ、生体への適用に優れ、血液の吸収、止血効果および癒着防止効果を示し、生体外の創傷はもとより深部体腔創傷にも短い時間内に傷を効果的に治癒するのに使用できる創傷被覆材の開発が求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記のような従来技術の問題を解決するためのものであり、その目的は、適切な空隙と支持体構造を維持し、血液の吸収が早く、周辺の組織の創傷治癒効果を示し、生分解性を持っていて人体内部にも適用可能であり、止血効果を極大化することができる創傷被覆材及びその製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の前記技術的課題を解決するための手段は、以下の通りである。
【００１１】
１．ヒアルロン酸−カルシウム及びポリリシンを含む、創傷被覆材。
【００１２】
２．ヒアルロン酸−カルシウムとポリリシンを４：１〜１：１．５の重量比で含む、前記１に記載の創傷被覆材。
【００１３】
３．ヒアルロン酸−カルシウムとポリリシンを２：１〜４：３の重量比で含む、前記１に記載の創傷被覆材。
【００１４】
４．ヒアルロン酸−カルシウムとポリリシンを２：１〜１：１．５の重量比で含む、前記１に記載の創傷被覆材。
【００１５】
５．ヒアルロン酸の分子量が２×１０６〜３×１０６Ｄａである、前記１に記載の創傷被覆材。
【００１６】
６．液体状、フォーム状又はフィルム状を呈する、前記１に記載の創傷被覆材。
【００１７】
７．前記１から６のいずれかに記載の創傷被覆材を製造する方法であって、（１）ｐＨを８．４以上に調整したヒアルロン酸カルシウム塩の水溶液を、ｐＨを８．４以上に調整したポリリシン水溶液と混合するステップ、および（２）前記ステップ（１）で得られる混合液から創傷被覆材を得ることを含む、創傷被覆材の製造方法。
【００１８】
８．ヒアルロン酸カルシウム塩の水溶液及びポリリシン水溶液のｐＨをそれぞれ８．４〜９．０の範囲に調節する、前記７に記載の創傷被覆材の製造方法。
【００１９】
９．前記ステップ（２）において、得られる混合液から液体状創傷被覆材を得る、前記７に記載の創傷被覆材の製造方法。
【００２０】
１０．前記ステップ（２）において、混合液を凍結乾燥させてフォーム状創傷被覆材を得る、前記７に記載の創傷被覆材の製造方法。
【００２１】
１１．前記ステップ（２）において、混合液を基材上に塗布するか、あるいは型枠に注型し、乾燥させてフィルム状創傷被覆材を得る、前記７に記載の創傷被覆材の製造方法。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、ヒアルロン酸−カルシウム及びポリリシンを含む液状、フォーム状及びフィルム状の創傷被覆材及びその製造方法を提供することができる。
【００２３】
本発明によれば、それぞれｐＨを８．４以上に調整したヒアルロン酸のカルシウム塩水溶液とポリリシン水溶液とを混合した混合液から、生体内／外の傷部位に適用可能な創傷被覆材として液状、フォーム状及びフィルム状の創傷被覆材を簡単に製造することができる。
【００２４】
本発明によるヒアルロン酸−カルシウム及びポリリシンを含む創傷被覆材は、深部体腔創傷被複製としての要件を具備しており、化学的架橋のない生体由来物質であるヒアルロン酸を使用することにより、異物反応を最小限に抑えることができ、残留毒性の問題がなく、一定時間体内に留まった後、分解および吸収され、手術後の傷が癒されることを妨げず、手術部位に適用する際、容易に使用することができる癒着防止機能を有している。また、カルシウムおよびポリリシンを用いて優れた止血機能を持たせることにより、血液流出による凝固により発生率が高くなる組織の癒着の発生を抑えることもできる。これに加えて、ポリリシンが持つ抗菌力による傷の感染抑制効果も有するので、従来の製品と差別化されていることがわかる。
【００２５】
本発明による液体状創傷被覆材は、カルシウムによる止血作用とヒアルロン酸の創傷治癒効果及び剤形の特性による使用の利便性を図ることができるというメリットがある。
【００２６】
フォーム（ｆｏａｍ）状創傷被覆材は、適切な空隙と支持体の構造を維持することができるので、血液の吸収が速く、接着力を有し、血液凝固を促進させて止血効果を極大化することができる。また、周辺の組織に対する創傷治癒効果を示し、生分解性があるため人体内部への適用が可能である。また、フォーム状創傷被覆材は、柔らかな質感および均一な表面形状を有し、傷部位の血液と滲出物を急速に吸収し、傷部位に対する固定能と優れた止血性能を有するので、創傷感染の抑制および傷治癒が必要な様々な分野に適用することができる。
【００２７】
フィルム状創傷被覆材は、前述した特性に加えて、湿潤状態で一定時間形状を維持するため、創傷部位の保護および治療に役立つことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の実施例によるヒアルロン酸−カルシウム及びポリリシンを含むパッドのヒアルロン酸とポリリシンの重量比に応じた外形を観察した結果である。
【図２】本発明の実施例２及び比較例１によるヒアルロン酸−カルシウム及びポリリシンを含むパッドの高分解能走査型電子顕微鏡（透過型電子顕微鏡、ＳＥＭ）写真である。
【図３】本発明の実施例によるヒアルロン酸−カルシウム及びポリリシンを含むパッド（ＨＡ含有量０．５％）及び比較例の血液凝固特性の評価結果を示すグラフである。
【図４】本発明の実施例によるヒアルロン酸−カルシウム及びポリリシンを含むパッド（ＨＡ含有量１．０％）及び比較例の血液凝固特性の評価結果を示すグラフである。
【図５】本発明の実施例によるヒアルロン酸−カルシウム及びポリリシンを含むパッド及び比較例の血液凝固特性の評価結果を示す写真である。
【図６】本発明の実施例によるヒアルロン酸−カルシウム及びポリリシンを含むパッド（ＨＡ含有量０．５％）及び比較例の凝固時間の変化による血液凝固特性を評価したグラフである。
【図７】本発明の実施例によるヒアルロン酸−カルシウム及びポリリシンを含むパッド（ＨＡ含有量１．０％）及び比較例の凝固時間の変化による血液凝固特性を評価したグラフである。
【図８】本発明の実施例によるヒアルロン酸−カルシウム及びポリリシンを含むパッド及び比較例の試験片に血液が完全に吸収されたときの結果を示す写真である。
【図９】ヒアルロン酸カルシウム塩（ＨＡ−Ｃａ）、ヒアルロン酸ナトリウム塩（ＨＡ−Ｎａ）、ヒアルロン酸−カルシウム及びポリリシン含有パッド（ＨＡ−Ｃａ−ＰＬＬ）、ヒアルロン酸−ナトリウムおよびポリリシン含有パッド（ＨＡ−Ｎａ−ＰＬＬ）及び比較例の止血性能を示すグラフである。
【図１０】ヒアルロン酸カルシウム塩（ＨＡ−Ｃａ）、ヒアルロン酸ナトリウム塩（ＨＡ−Ｎａ）、ヒアルロン酸−カルシウム及びポリリシン含有パッド（ＨＡ−Ｃａ−ＰＬＬ）、ヒアルロン酸−ナトリウム及びポリリシン含有パッド（ＨＡ−Ｎａ−ＰＬＬ）及び比較例について、肝門脈損傷モデルを用いて止血効果を評価した結果を示すグラフである。
【図１１】ヒアルロン酸とポリリシンを架橋結合させて製造したパッドの外形写真である。
【図１２】本発明の実施例によるヒアルロン酸−カルシウム及びポリリシンを含む液体状創傷被覆材を充填したプレフィールドシリンジ（ｐｒｅｆｉｌｌｅｄ  ｓｙｒｉｎｇｅ）の外形写真である。
【図１３】本発明の実施例によるヒアルロン酸−カルシウム及びポリリシンを含むフィルム状創傷被覆材の外形写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
ヒアルロン酸（以下、「ＨＡ」と呼ばれる場合もある）は、β−Ｄ−グルクロン酸（β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）とβ−ＤＮ−アセチルグルコサミン（β−ＤＮ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）が交互にβ結合した長い直鎖型の多糖類であって、分子量が１，０００Ｄａ〜１０，０００，０００Ｄａの広い分布を持つ、自然界に広く存在している生分解性および生体適合性の天然高分子である。
【００３０】
ヒアルロン酸は、大量の水と結合して高い粘性を呈するゲル状態で、目の硝子体、関節液、軟骨および皮膚に多く存在して、関節の潤滑作用、皮膚への柔軟性付与および高い粘性によって細菌の皮膚への浸透を防ぐ保護の役割をすると知られている。したがって、現在までに、退行性関節炎、白内障、シワの改善、薬物送達、幹細胞支持体、化粧品保湿など多くの分野で使用されている。また、組織の細胞外基質に多量に存在して、細胞の分化と増殖を調節し、傷治癒効果（Ｅｒｉｋａ  Ｎｙｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｌａｓｒ  Ｓｕｒｇ  Ｈａｎｄ  Ｓｕｒｇ．２０１３；４７；８９−９２）及び傷治癒メカニズム（Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｄ  Ｐｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ；２００５；６（６）３９３−４０２）が報告されている。
【００３１】
最近の研究では、低分子量のヒアルロン酸が損傷した組織の周辺の血管の再生を誘導し、これにより、傷を効率的に治癒させることができるという薬理作用も報告されている。このような特性に基づいて、ヒアルロン酸は、創傷治療剤、関節炎治療剤、薬物送達システム及び組織工学の分野で広く活用されている。これに加えて、優れた生体適合性、生分解性、組織癒着を防止する特性のために、それ自体で癒着防止材として使用されることもある。しかし、ナトリウム塩の形で提供される従来のヒアルロン酸は、止血作用はないと知られている。
【００３２】
ポリリシン（ε−Ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ、ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ、以下、「ＰＬＬ」と呼ばれる場合もある）は、強塩基性アミノ酸であるＬ−リシン（Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ）が２５〜３５個結合して陽イオン電荷を帯びる。このように陽イオン電荷を帯びているポリリシンは、陰（−）イオン電荷を帯びる微生物の細胞膜とイオン結合し、これにより微生物の増殖を抑制する抗菌力を示す。かかる特性により、ＰＬＬは、天然抗菌剤（天然保存剤、天然防腐剤）や天然の食品保存料（ｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅｓ）として広く使用されている。ポリリシンは、広い抗菌スペクトルを持っていて、すべての菌（グラム陽性、グラム陰性、真菌）の抗菌性を示し、ｐＨの変化にも安定していて、弱酸性〜中性（ｐＨ４．０〜８．０）の領域で最小抑制濃度（ＭＩＣ）の大きな変更せずに抗菌活性が維持される。熱に対しても安定していて、熱による抗菌力の減少もない。そのほかにも、ポリリシンは、血小板の凝集を誘導するということ、また、分子の大きさに応じて血小板の凝集誘導能が異なるということが知られている。
【００３３】
カルシウムは、創傷の治療に重要な因子として知られている。マグネシウムと共にタンパク質の合成とコラゲナーゼの活性（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）に必要であり、傷の出血を止めるための凝固効果を促進したり、角質形成細胞分化を促進したりする生体因子としても知られている。このようなカルシウムの創傷治癒の効能を利用する市販のドレッシングとしては、アルギン酸カルシウムがある。
【００３４】
本発明では、生体適合性および傷治癒能力があるヒアルロン酸ナトリウム塩のナトリウムイオンをカルシウムイオンで置換して止血効果を付与し、ここで抗菌力及び血小板凝集能力を有するポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）を配合して、使用しやすい溶液状のゲルだけでなく、生体外はもとより生体内に存在する傷部位への付着が可能であるフォーム状パッドまたはフィルム状被覆材を提供する。このようなフォーム状パッド及びフィルム状被覆材は、生体適合性、血液の吸収および止血効果、癒着防止効果を示すことにより、生体外の創傷はもちろん、深部体腔創傷に対しても短い時間内に傷を効果的に治癒することができるということを明らかにして本発明を完成するに至った。
【００３５】
したがって、本発明は、ヒアルロン酸−カルシウム及びポリリシン（以下、「ＨＡ−ＰＬＬ」または「ＨＡ−Ｃａ−ＰＬＬ」と呼ばれる場合もある）を含む創傷被覆材に関するものである。
【００３６】
本発明において、前記ヒアルロン酸の分子量は、深部体腔創傷に適用され、傷治癒が完了した後に生体内で分解されて除去されるのに適した範囲、好ましくは、適切な体内半減期を有して物理的なバリアの役割を果たすのに適していると知られている２×１０６〜３×１０６Ｄａの範囲にある。
【００３７】
前記創傷被覆材は、ヒアルロン酸−カルシウムとポリリシンを４：１〜１：１．５の重量比、好ましくは２：１〜４：３の重量比、より好ましくは２：１〜１：１．５の重量比で含む。
【００３８】
本発明では、ヒアルロン酸−カルシウムとポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）の混合比率を前記のような範囲に調整することにより、創傷被覆材として使用するのに適した質感および強度を有し、最適の空隙が維持されて血液の吸収速度と止血効果を最大化することができるフォーム状又はフィルム状の創傷被覆材を得ることができる。
【００３９】
本発明による創傷被覆材は、前記ヒアルロン酸−カルシウム及びポリリシンを含む液状のもの、好ましくは、前記ヒアルロン酸−カルシウム及びポリリシンの水溶液であってもよい。
【００４０】
また、本発明は、ヒアルロン酸−カルシウム及びポリリシンを含む創傷被覆材の製造方法に関するものであり、前記方法は、（１）ｐＨを８．４以上に調整したヒアルロン酸カルシウム塩の水溶液を、ｐＨを８．４以上に調整したポリリシン水溶液と混合するステップ、および（２）前記ステップ（１）で得られる混合液から創傷被覆材を得ることを含む。
【００４１】
前記ステップ（２）においては、得られる混合液はそのまま液体状創傷被覆材として使用することができる。前記混合液を凍結乾燥させる場合、フォーム状又はパッド状の創傷被覆材を得ることができ、前記混合液を基材上に塗布するか、あるいは型枠に注型し、乾燥させてフィルム状創傷被覆材を得ることができる。
【００４２】
本発明で使用されるヒアルロン酸は、分子量が非常に大きい高分子であり、通常、ヒアルロン酸はヒアルロン酸ナトリウム塩を意味する。前記ステップ（１）で使用されるヒアルロン酸カルシウム塩は、ヒアルロン酸ナトリウム塩の水溶液にカルシウム塩水溶液を加えてナトリウムイオンをカルシウムイオンで置換したものであってもよい。ヒアルロン酸ナトリウム塩をカルシウム塩に変換するにあたっては、従来の公知の方法であればいずれの方法でもよい。例えば、このような置換において、ヒアルロン酸の水溶液の濃度を０．５〜１．０重量％とし、カルシウム塩水溶液の濃度を０．１〜０．２重量％としてもよい。ヒアルロン酸水溶液とカルシウム塩水溶液を混合し、混合液を室温で撹拌してヒアルロン酸カルシウム塩を得る。カルシウム塩水溶液は、ヒアルロン酸水溶液中のナトリウムイオンをカルシウムイオンで置換するのに十分な量、すなわち、ヒアルロン酸水溶液に対して１当量以上であればよい。前記置換に使用可能なカルシウム塩は、例えば、塩化カルシウム、酢酸カルシウム等の無機酸塩または有機酸塩であってもよいが、これらに限定されるものではなく、本発明の分野で公知の無機酸または有機酸のカルシウム塩であればいかなるものを使用してもよい。
【００４３】
前記ステップ（１）では、ヒアルロン酸カルシウム塩とポリリシン水溶液のｐＨをそれぞれ８．４以上に調整した後、混合して混合液を作る。
【００４４】
ヒアルロン酸からフォーム状のパッドを製造するためには、凍結乾燥プロセスを行う必要があり、この場合、パッドがばさばさしているか粗い表面を持つ場合が多いため、均一な表面を持たせるのが難しいと言われている。また、ヒアルロン酸をポリ−Ｌ−リシンと混合すると、均一に分散されず、互いに絡み合って沈殿物を形成するため、フォーム状にするのが難しい。
【００４５】
本発明では、ヒアルロン酸カルシウム塩とポリ−Ｌ−リシンを混合する際に、混合液のｐＨを塩基性の範囲、好ましくはｐＨ８．４以上、さらに好ましくはｐＨ８．４から９．０の範囲に調整することにより、反応物が沈殿されず、均一な混合液を作成できるようにする。ｐＨ８．４未満では、ヒアルロン酸カルシウム塩とポリ−Ｌ−リシンが均一に混ざらず沈殿物を形成する。ｐＨ９．０を超える場合は、フォームの形成は可能であるが、人体に安全でない可能性があるので、人体に使用するための用途には望ましくない場合がある。
【００４６】
一方、ヒアルロン酸水溶液とポリ−Ｌ−リシン水溶液のそれぞれのｐＨを調整せずに混合する場合には沈殿物が形成されるが、混合後にｐＨを８．４以上に調整すると、ヒアルロン酸水溶液とポリ−Ｌ−リシン水溶液が互いに混合される。しかし、すでに形成された沈殿物が均質混合液を作ることを妨げ、このため、均質な微細構造を持つパッドの形のフォームが形成されない結果となる。本発明では、ヒアルロン酸カルシウム塩を塩基溶液のｐＨ８．４以上に調整し、ここにｐＨ８．４以上に調整したポリ−Ｌ−リシンの水溶液を添加することにより、このような問題を回避することができる。ｐＨ調節のための塩基溶液としてはＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＮａＨＣＯ３などの水溶液を使用できるが、これらに限定されるものではなく、本発明の分野の公知のものであればいかなるものであってもよい。
【００４７】
前記ステップ（２）では、ステップ（１）で得られた混合液をプレフィールドシリンジに充填し、液体状創傷被覆材を得ることもでき、ヒアルロン酸カルシウム塩とポリ−Ｌ−リシンの混合液を冷蔵温度、好ましくは０〜４℃で６〜１０時間安定化させた後、通常の凍結乾燥条件、例えば−１０〜−２０℃で１０〜１２時間冷凍した後、４８〜６０時間凍結乾燥させてフォーム状創傷被覆材を得ることもできる。また、前記混合液を基材上に塗布するか、あるいは型枠に注型し、４０℃〜６０℃で１２〜１６時間乾燥させてフィルム状創傷被覆材を得ることもできる。
【実施例】
【００４８】
実施例
以下、実施例を通じて本発明を更に詳しく説明するが、下記実施例は単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００４９】
実施例１〜６および比較例１、２：フォーム状創傷被覆材（パッド）の製造
ヒアルロン酸５ｇを精製水４５０ｍｌに加え、２時間攪拌した。ＣａＣｌ２１．１ｇを精製水５０ｍｌに溶解させて、前記溶液に加え、室温で３時間ゆっくり攪拌してヒアルロン酸カルシウム塩を生成した。次に、全１０ｍｌ体積の製造液に下記表１に示す量でそれぞれｐＨ８．４に調整したＨＡとＰＬＬの混合液を、０〜４℃で６〜１０時間安定化した後、−１０〜−２０℃で１０〜１２時間冷凍し、凍結乾燥させてＨＡ−ＰＬＬフォーム状創傷被覆材（以下、「ＨＡ−ＰＬＬパッド」または「ＨＡ−Ｃａ−ＰＬＬパッド」と呼ばれる場合もある）を製造し、フォームが形成されるかどうかを観察した。その結果は下記表１に示す通りである。表１において比較例１および２は、ＰＬＬ無しでカルシウム塩で置換されたＨＡだけで製造したパッドである。
【００５０】
【表１】
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【００５１】
実施例７：液体状創傷被覆材の製造
実施例２の組成の混合液に０．８％になるように塩化ナトリウムを添加してプレフィールドシリンジに入れ、液体状創傷被覆材の試料を準備した。
【００５２】
実施例８：フィルム状創傷被覆材の製造
実施例２の組成の混合液を１０ｃｍ×１０ｃｍの大きさの型枠に注型し、４０℃のインキュベータで１２時間〜１６時間放置してフィルム状創傷被覆材を製造した。
【００５３】
図１は、実施例１〜６、比較例１および２で製造したパッドの外形を示す写真である。前記表１及び図１に示すように、製造例１〜６の組成の両方ともパッドは形成された。しかし、ＨＡ含有量が高いほどパッドがより硬くなり、ＰＬＬ含有量が増加する場合にもパッドが硬くなる傾向を示した。一方、製造液に対して、ＰＬＬ含有量が０．７５％（ｗ／ｖ）を超えるか、ＨＡ含有量が１％（ｗ／ｖ）を超える場合、硬化の程度が大きくなり砕け散ってしまうことがわかる。したがって、創傷被覆材をフォーム状またはフィルム状で提供する場合、ＨＡ含有量は１．０％を超えなく、ＰＬＬ含有量は０．７５％を超えないほうがよいと評価された。
【００５４】
最高の止血効果を有することが確認された実施例２と比較例１で製造したパッドの空隙構造を観察するために、高分解能走査型電子顕微鏡（透過型電子顕微鏡、ＳＥＭ）を用いて観察し、その結果を図２に示した。図２は、０．５％ＨＡ−Ｃａ（製造液の全体積に対するＨＡ−Ｃａ含有量が０．５％（ｗ／ｖ）である場合）で製造したパッドに比べて、ここに０．５％ＰＬＬをさらに混合（製造液の全体積に対して、ＨＡ−Ｃａ含有量が０．５％（ｗ／ｖ）、ＰＬＬ含有量が０．５％（ｗ／ｖ）である場合）して製造したパッドの空隙がより密になることを示す。
【００５５】
実験例１：カルシウム（Ｃａ）含有量の測定
前記実施例２、５、比較例１および２で製造したパッドのカルシウム置換率を、以下のような手順に従って、ＥＤＴＡによるＣａ定量法で測定した。
【００５６】
パッド約０．１ｇをとり、蒸留水２５ｍＬ、緩衝溶液（ｐＨ１０．０）３ｍＬに溶かした後、ＥＢＴ指示薬６滴を加え、ＥＤＴＡ試薬を用いて、赤い色が青に変わる時点まで滴定した。ＥＤＴＡ試薬は、０．３ｇＮａ２Ｈ２ＥＤＴＡ×２Ｈ２Ｏ（８０℃で１時間乾燥させ、デシケータに保管したもの）を２５０ｍＬの蒸留水に溶かして準備した。緩衝溶液（ｐＨ１０．０）は、２８ｗｔ％ＮＨ４ＯＨ１４２ｍＬにＮＨ４Ｃｌ１７．５ｇを入れて２次蒸留水で最終体積が２５０ｍＬになるように合わせた。ＥＢＴ（Ｅｒｉｏｃｈｒｏｍｅ  ｂｌａｃｋ  Ｔ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）試薬は、ＥＢＴ０．２ｇをトリエタノールアミン１５ｍＬとエタノール（ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｅｔｈａｎｏｌ）５ｍＬの混合溶液に溶かして準備した。ヒアルロン酸カルシウムとポリリシンの混合質量によるパッドのカルシウムの質量および含有量（重量％）を、それぞれ下記式１および２で計算し、その結果を下記表２に示した。
【００５７】
【数１】
0006868314.tif 000003
【００５８】
【数２】
0006868314.tif 000004
【００５９】
【表２】
0006868314.tif 000005
【００６０】
表２に示すように、ＰＬＬを混合した場合、ＨＡのみで製造したパッドに比べて、カルシウム含有量が５０％程度減少したことが分かった。
【００６１】
実験例２：血液凝固特性（吸光度）の評価
１ｃｍ×１ｃｍ（横×縦）の大きさに切断した試験片に、それぞれ血液と抗凝固剤（クエン酸ナトリウム、３．８ｗ／ｖ％）を９：１の体積比で混合した。混合液１００μｌを滴下し、０．２ＭＣａＣｌ２水溶液１０μｌを添加して１０分間３７℃のインキュベータで凝固させた後、凝固に関与しない血液を再び蒸留水１２．５ｍｌに溶出した。その溶出液１ｍｌを採取して５４０ｎｍの波長で吸光度［ＡＢ］を測定し、蒸留水１ｍｌをとり、５４０ｎｍの波長で吸光度［ＡＷ］を測定した。血液溶出液に含まれている蒸留水の吸光度の影響を排除するために、下記式１に基づいて血液凝固特性（吸光度）を計算した。
【００６２】
【数３】
0006868314.tif 000006
【００６３】
一般ガーゼ（比較例３）、市販されているサードパーティ製の創傷被覆材Ａｌｇｅ  Ｄｅｒｍ（韓国、（株)ジジョン、比較例４）及びＲｅｇｅｎＰａｃｋ（韓国、Ｇｅｎｅｗｅｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、比較例５）について、同様の方法で吸光度を測定して同時に表示した。Ａｌｇｉ  Ｄｅｒｍはアルギン酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ  ａｌｇｉｎａｔｅ）を含むものであり、ＲｅｇｅｎＰａｃｋはコラーゲンを含むフォーム状創傷被覆材である。血液（ｂｌｏｏｄ）については、止血ドレッシングを使用せずに、血液単独だけで前記と同様の方法で吸光度を測定した。
【００６４】
ＨＡ−ＰＬＬフォーム状パッドのＨＡとＰＬＬの混合比率に応じた血液凝固特性の測定結果を表３、図３（ＨＡ含有量０．５％）及び図４（ＨＡ含有量１．０％）に示した。図５は、純粋な血液（Ｂｌｏｏｄ）、ＰＬＬ含有量に応じた０．５％ヒアルロン酸−カルシウム及びポリリシン含有パッドおよび比較例１、３〜５の血液溶出実験の結果を示す写真である。
【００６５】
【表３】
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【００６６】
＊血液凝固能の指標は、血液凝固特性の評価吸光度（Ｏ．Ｄ．）の測定結果に応じて、次のような基準に基づいて評価した：１：０．１以下；２：０．１超過０．２以下；３：０．２超過０．２５以下；４：０．２５超過０．３以下；５：０．３以上。
【００６７】
実験例３：血液凝固速度（吸光度）の評価
３７℃インキュベータでの血液凝固時間をそれぞれ１、２、３、５、および１０分間凝固させた試料を用いたことを除いては、実験例２と同様の方式で血液溶出液の吸光度を測定して血液凝固速度を評価し、その結果を図６および７に示した。図６は、ＨＡ含有量が０．５％である場合、ＰＬＬ含有量に応じた吸光度（Ｏ．Ｄ．）の計算結果を示すグラフであり、図７は、ＨＡ含有量が１．０％である場合、ＰＬＬ含有量に応じた吸光度（Ｏ．Ｄ．）の計算結果を示すグラフである。
【００６８】
実験例４：血液吸収速度の評価
血液の吸収速度を、１ｃｍ×１ｃｍ（横×縦）大きさのヒアルロン酸−カルシウム及びポリリシン含有パッドに１００μｌの血液を滴下した後、完全に吸収されるまでの時間で評価し、そこから止血用パッドとしての適合性を判断した。対照群として、市販されているＡｌｇｉ  ＤｅｒｍとＲｅｇｅｎＰａｃｋ二つの製品について、同一の方式で比較実験を行った。その結果を下記の表４及び図８に示した。図８は、ＨＡ含有量が０．５％であるフォーム状パッドの血液滴下後５秒以内に撮影した写真である。
【００６９】
表４及び図８に示すように、１％ＨＡ−Ｃａと０．５％ＨＡ−Ｃａは、両方ともＰＬＬが混合した場合により良好な止血能を有し、ＰＬＬ含有量が０．５％である場合に最良の止血能を示した。ＰＬＬ含有量が０．５％以上である場合、止血能がむしろ低くなる結果を示した。１％ＨＡと０．５％ＨＡは、両方とも同様な止血能を有するが、血液の吸収速度の場合には０．５％ＨＡの方が速かった。コストの観点では、０．５％ＨＡがよりよいと判断された。Ａｌｇｉ  ＤｅｒｍとＲｅｇｅｎＰａｃｋは両方とも優れた止血能を示す傾向があるが、本発明の実施例によるパッドの方が、これらの市販製品に比べてより高い止血能を示した。ＲｅｇｅｎＰａｃｋ製品は、血液吸収速度が低下するという欠点があった。
【００７０】
【表４】
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＊血液吸収速度の指標は、血液が完全に吸収される時間に応じて、次のような基準に基づいて評価した：１：１０秒以内；２：３０秒以内；３：１分以上。
【００７１】
実験例５：血液凝固特性に及ぼすＣａとＰＬＬの影響評価
カルシウムとＰＬＬが血液凝固に及ぼす影響を調べるため、実施例と同様の方法でヒアルロン酸カルシウム塩（ＨＡ−Ｃａ）、ヒアルロン酸ナトリウム塩（ＨＡ−Ｎａ）、ヒアルロン酸−カルシウム及びポリリシン（ＨＡ−Ｃａ−ＰＬＬ）、およびヒアルロン酸−ナトリウムおよびポリリシン（ＨＡ−Ｎａ−ＰＬＬ）含有フォーム状パッドを製造し、実験例２による方式で血液溶出液の吸光度を測定し、その結果を図９に示した。
【００７２】
図９に示すように、カルシウムで置換していないヒアルロン酸のパッド（ＨＡ−Ｎａ）は、止血能を示さないが、カルシウムだけで置換したヒアルロン酸のパッド（ＨＡ−Ｃａ）は、止血能を示した。したがって、カルシウムが止血能を向上させたことがわかる。カルシウムで置換せずにＰＬＬだけを混合して製造したパッド（ＨＡ−Ｎａ−ＰＬＬ）の場合も、ある程度の止血能を示した。カルシウムで置換したヒアルロン酸から製造したパッドの場合も止血能を示したが、ここにＰＬＬを混合して製造した場合（ＨＡ−Ｃａ−ＰＬＬ）、止血能がより向上したことがわかる。この結果から、ＰＬＬも止血機能に影響を及ぼしていることがわかる。
【００７３】
実験例６：肝門脈の損傷モデルを用いた止血効果の評価
ヒアルロン酸カルシウム塩（ＨＡ−Ｃａ）、ヒアルロン酸ナトリウム塩（ＨＡ−Ｎａ）、ヒアルロン酸−カルシウム及びポリリシン（ＨＡ−Ｃａ−ＰＬＬ）、およびヒアルロン酸−ナトリウムおよびポリリシン（ＨＡ−Ｎａ−ＰＬＬ）含有パッドの止血性能を、それぞれマウス（ｍｏｕｓｅ）という肝門脈損傷モデルを用いた方法で評価した。麻酔された８週齢の雄マウスを、肝門脈がよく見えるように腹部の中央を切開した。１８Ｇ針で血管に穴を開けてから、出血部位に１ｃｍ×１ｃｍ大きさの試験片を覆って止血されるまでの時間（ｃｌｏｏｔｉｎｇ  ｔｉｍｅ）を測定した。止血作用を示すと言われているカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を、ヒアルロン酸ナトリウム塩と混合して作成されたパッド（ＨＡ−ＣＭＣ）を、比較例として追加して実験を行った。その結果を図１０に示した。
【００７４】
結果は、実験例５で確認されたものと一致した。カルシウムで置換していないヒアルロン酸は、止血能を示さないが、カルシウムだけで置換したヒアルロン酸は、止血能を示した。カルシウムで置換せずにＰＬＬだけを混合して製造したパッドの場合も、ある程度の止血能を示した。カルシウムで置換したヒアルロン酸から製造したパッドの場合も止血能を示したが、ここにＰＬＬを混合して製造した場合、止血能がより向上したことがわかる。予想とは異なり、ＣＭＣ混合パッドは特別な止血能を示さないし、ＲｅｇｅｎＰａｃｋも本発明のパッドに比べて止血能が低かった。
【００７５】
実験例７：ラットの盲腸／腹壁擦過傷モデルにおける癒着防止試験
前記実施例で製造された創傷被覆材の癒着防止性能を評価するために、ラット盲腸／腹壁擦過傷モデルを用いた。実験動物としては、７週齢雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ  ｒａｔ（ＳＬＣ、Ｊａｐａｎ）を各群当たり５匹ずつ使用した。癒着を誘発させるために、実験動物にＫｅｔａｍｉｎｅ−ＨＣｌを腹腔に注射（０．１ｍｌ／１００ｇ）して麻酔した後、腹部を除毛して７０％エタノールで消毒した後、４−５ｃｍ程度を中央線に沿って開腹した。その後、盲腸を取り出して１．２ｃｍ×１．２ｃｍ大きさの滅菌ガーゼを用いて出血が起こるほどに漿膜に損傷を加え、向かい合う腹腔膜に同一の大きさで試薬用スプーンを用いて損傷を加えた。両損傷面を当接するようにして摩擦損傷部位から１ｃｍ離れた２ヶ所を５−０ナイロン縫合糸で固定することで、癒着の形成を促進した。
【００７６】
陰性対照群に対しては、損傷部位に生理食塩水を点滴し、実験群に対しては、損傷部位に実施例１〜３、８、比較例１、４、５の創傷被覆材をそれぞれ１ｃｍ×１ｃｍの大きさに切って付着するか、実施例７の液体状創傷被覆材を１ｍｌ点滴し、腹腔膜と皮膚を縫合した。手術後の動物は、水と餌を十分に摂取させて１週間飼育した後、犠牲にして、癒着評価システムを用いてその成績を合算して平均値を得た（Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．，１４６，８８−９２，１９８３）。その結果を下記表５に示した。すべての結果は、各実験群の平均・標準誤差で表示し、各群の有意性は、ｐ＜０．０５レベルで検定した。
【００７７】
癒着の程度に対する評価は、基準に基づいて０〜５に分類した（０：癒着がない場合、１：１つの薄いフィルム状の癒着、２：２つ以上の薄いフィルム状の癒着、３：点状の集中化した厚い癒着、４：板状の集中化した癒着、５：血管が形成された非常に厚い癒着あるいは１つ以上の板状の厚い癒着）。
【００７８】
癒着の強度に対する評価は、基準に基づいて１〜４に分類した（１：フィルム状であり、非常に弱い力でも離れる癒着、２：中程度の力が要求される癒着、３:相当な圧力によって離れる癒着、４:癒着が非常に強いため、離れにくいか、または極めて大きな圧力が要求される癒着）。
【００７９】
【表５】
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【００８０】
前記表５に示すように、ポリリシンを混合せず、ヒアルロン酸だけで製造した創傷パッドである比較例１の場合にも、市販されている創傷パッドである比較例４、５よりも高い癒着防止効果を示し、ポリリシンを０．２５％、０．５％、０．７５％で混合して製造した本発明の実施例１〜実施例３の創傷パッドを適用した群では、対照群に比べて組織の癒着が顕著に減少した。これは、前記実験例で確認した止血効果の実験結果に一致するものであり、ポリリシンを０．５％で混合した場合の癒着防止効果が最も高かった。また、実施例７の液体状のもの及び実施例８のフィルム状のものも癒着防止に効果的であることが確認された。
【００８１】
比較例６：架橋結合型ＨＡ−ＰＬＬパッドの製造
本発明によるＨＡ及びＰＬＬを含むフォーム状創傷被覆材と比較するために、架橋剤を使用してＨＡとＰＬＬを架橋させてパッドを製造した。
【００８２】
架橋剤としては、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を使用した。ヒアルロン酸の濃度を３％（ｗ／ｖ）とし、ポリリシンと架橋剤（ＥＤＣ）とヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）を、ヒアルロン酸と同じモル数で入れてから、ＰＬＬのＨＣｌ量と同じモル比でＮａＯＨ水溶液を添加して中和した。２０分間室温で１５０〜２００ｒｐｍで均一に混合した。その後、３０℃で２０〜２５時間機械撹拌機を用いて混合した後、１％ＰＢＳ溶液１００ｍｌを入れて希釈し、エタノールを添加して沈殿させた架橋重合体をろ過および凍結乾燥させて、架橋結合されたＨＡ−ＰＬＬを得た。架橋結合されたＨＡ−ＰＬＬを蒸留水１０ｍｌに溶かした水溶液を、６０パイ皿に入れて０〜４℃で６時間安定化させた後、−１０〜−２０℃で１０時間冷凍し、凍結乾燥させてパッドを製造した。このように製造したパッドの写真を図１１に示した。
【００８３】
図１１に示すように、ＨＡ−ＥＤＣ−ＰＬＬの混合液では均一な液状とならなく、水中で絡まってしまうため、パッド形状が得られなかった。
【００８４】
以上で説明したように、本発明の属する技術の分野における通常の技術者は、本発明が多様な形態に実施できるということが理解可能である。従って、上述した実施例などは、全ての面において例示的なものであり、限定的なものではないと理解するべきである。本発明の範囲は、詳細な説明よりも後述する特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の意味及び範囲、そして等価概念から導出される全ての変更、又は変形された形態が、本発明の範囲に含まれるものとして解釈されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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