(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルにおけるマラリアの感染の可能性を検出する方法であって、
−  デジタル光学顕微鏡を準備する工程、
−  マラリアに侵されていると疑われる少なくとも１つの赤血球を含むサンプルを準備する工程、
−  少なくとも１つの赤血球を含むサンプルを緩衝溶液と混合し、少なくとも１つの赤血球を球状に形成して球状赤血球を形成し、少なくとも１つの球状赤血球を含む緩衝溶液を微小流体デバイスに導入する工程であって、微小流体デバイスのチャネルの少なくとも一部はデジタル光学顕微鏡の焦点領域に含まれる、前記工程、
および／または
少なくとも１つの赤血球を含むサンプルを微小流体デバイスに導入し、少なくとも１つの赤血球を含むサンプルを緩衝溶液と混合し、少なくとも１つの赤血球を球状に形成して球状赤血球を形成する工程であって、微小流体デバイスのチャネルの少なくとも一部はデジタル光学顕微鏡の焦点領域に含まれる、前記工程、
−  少なくとも１つの球状赤血球をデジタル光学顕微鏡の焦点領域に誘導する工程、
−  デジタル光学顕微鏡を用いて少なくとも１つの球状赤血球を検出する工程、ならびに−  少なくとも１つの赤血球がマラリアに侵されているかどうかを決定して、サンプルにマラリア感染が存在するかどうかを決定する工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
デジタル光学顕微鏡を用いて少なくとも１つの球状赤血球を検出する工程は、デジタル光学顕微鏡によって得られる位相および振幅画像の再構成を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つの球状赤血球の細胞体積および／または細胞直径は、マラリア寄生生物の発生段階および種を同定するためにデジタル光学顕微鏡を用いて決定される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１つの球状赤血球の体積の少なくとも２／３は、デジタル光学顕微鏡を用い
て検出される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
３日熱マラリア、熱帯熱マラリアおよび４日熱マラリアは、デジタル光学顕微鏡測定を使用して識別される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
多数の赤血球がデジタル光学顕微鏡を使用して検出され、マラリア種の異なる段階が多数の赤血球について決定される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
全細胞の数に対する感染細胞の数の比を決定する工程を含む、多数の赤血球の寄生虫血が決定される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
１×１０4〜１×１０6個の赤血球が検出される、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つの赤血球を患者の元のサンプルから単離して、少なくとも１つの赤血球を含むサンプルを準備する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
患者の元のサンプルが血液サンプルである、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デジタル光学顕微鏡（ｄｉｇｉｔａｌ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）（ＤＨＭ）を使用して患者におけるマラリアの感染の可能性を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マラリア検出は、（１）迅速な検出を必要とし（分子診断検査は十分に迅速ではなく、典型的には３時間を要する）、（２）非常に高い感度（ｇｏｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）を必要とし（寄生虫血＜０．１‰；ゴールドスタンダード厚膜診断）、（３）特異的でなければならず（現在、薄膜顕微鏡検査によってのみ定量的に達成可能である）、（４）特にコストの低さがもっぱら要求されるべきである（ラテラルフローアッセイに基づいた一次定性的迅速検査；１ＵＳＤ／検査）ことから、一般的な測定問題に悩まされている。興味深いことに、特にアフリカ諸国におけるマラリア迅速検査により、顕微鏡検査の使用の減少につながり、その結果、診断情報が失われている。他方で、マラリア感染は、通常、白血球（ＷＢＣ）または血小板の、正常な血液からの装置固有の偏差を使用して血液分析器により間接的にのみ決定することができる。
【０００３】
今日までに臨床的に関連したものの中には、治療における初期診断および鑑別診断のための薄い（特異度）および厚い（感度）膜の手動による顕微鏡検査がある。資源が少ない地域では、好ましくは迅速検査が初期診断のために使用される。一般に、寄生虫血は厚膜の溶解および染色、ならびに乾燥され、染色された赤血球の顕微鏡検査による特異度によって検出される。
【０００４】
しかしながら、上記の方法は上記の問題に悩まされ、上記の基準の全てを満たすことができない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、信頼性があり、迅速で、比較的安価であり、定量的な結果を達成することができる、患者におけるマラリアの感染の可能性を検出する改善された方法に対する必要性が存在したままである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の要旨
本発明者らは、特に簡単な微小流体フロースキームにより、デジタルホログラフィック顕微鏡検査（ｄｉｇｉｔａｌ  ｈｏｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）（ＤＨＭ）を使用したマラリア検出のためのワークフローを決定するための特定の順序の方法工程を開発し、これにより、特にほとんどサンプル調製を必要とせずに、臨床的に関連のある性能で上記の態様（１）〜（４）の全ての測定が可能となる。この測定は、将来の血液学的ルーチン診断に重要な役割を果たす、イメージングフローサイトメトリーに組み込むことができる。
【０００７】
本発明は、患者におけるマラリアの感染の可能性を検出する方法であって、
−  デジタル光学顕微鏡（ＤＨＭ）を準備する工程、
−  マラリアに侵されていると疑われる少なくとも１つの赤血球を含むサンプルを、患者から取得するまたは準備する工程、
−  少なくとも１つの赤血球を含むサンプルを緩衝溶液と混合し、少なくとも１つの赤血球を球状に形成して球状赤血球を形成し、少なくとも１つの球状赤血球を含む緩衝溶液を微小流体デバイスに導入する工程であって、微小流体デバイスのチャネルの少なくとも一部はＤＨＭの焦点領域に含まれる、工程、
および／または
少なくとも１つの赤血球を含むサンプルを微小流体デバイスに導入し、少なくとも１つの赤血球を含むサンプルを緩衝溶液と混合し、少なくとも１つの赤血球を球状に形成して球状赤血球を形成する工程であって、微小流体デバイスのチャネルの少なくとも一部はＤＨＭの焦点領域に含まれる、工程、
−  少なくとも１つの球状赤血球をＤＨＭの焦点領域に誘導する工程、
−  ＤＨＭを用いて少なくとも１つの球状赤血球を検出する工程、ならびに
−  少なくとも１つの赤血球がマラリアに侵されているかどうかを決定して、患者がマラリアに感染しているかどうかを決定する工程
を含む、方法に関する。
【０００８】
本発明のさらなる態様および実施形態は従属請求項に開示されており、以下の記述、図面および実施例から理解することができるが、これらに限定されるものではない。
【０００９】
添付の図面は本発明の実施形態を例示し、そのさらなる理解を伝えるべきである。記述に関連して、それらは本発明の概念および原理の説明として役立つ。他の実施形態および記載された利点の多くは図面に関連して導き出すことができる。図面の要素は必ずしも互いに縮尺通りではない。同一の、機能的に等価であり、作用する等しい特徴および構成要素は、特に断りのない限り、同じ参照番号を用いて図面に示されている。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＤＨＭによる異なるマラリア種の識別がどのようにして可能になるかを概略的に示す図である。
【図２】赤血球の球状化を概略的に示す図である。
【図３】種識別の概略図を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
定義
別段の定義がない限り、本明細書に使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
【００１２】
本発明の文脈において、「サンプル」はマラリアの感染の可能性について分析されるサンプルであり、これは、少なくとも１つの赤血球（ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）／赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）、例えば、１、２、３、４、５、６、７、１０、１００、１０００、１００００、１０００００個またはそれ以上の赤血球を含む。赤血球の形態およびそのときのサンプルの状態は特に限定されず、それは、例えば、世界のいずれかの場所の温度、例えばまた、−２０℃〜５０℃もしくはそれ以上の温度未満、例えば−１０℃〜４５℃、または０℃〜４０℃、または１０℃〜３５℃の範囲であるが、また２０〜２５℃の室温であってもよい温度で取得されるまたは与えられるサンプルであってもよい。
【００１３】
サンプルは特に限定されず、天然または合成起源のものであってもよく、少なくとも１つの赤血球を含む限り、例えば、対象、例えば脊椎動物、例えばヒトまたは動物由来であり得る、例えば、単純または複雑なマトリクス由来のサンプルを含んでもよい。それはまた、赤血球を濃縮するためまたは元のサンプルから赤血球を分離するために予め濃縮され、抽出され、濾過され、または任意の他の手段で処理されているサンプルであってもよい。サンプルはまた、水を含まないか、または水をほとんど含まないものであってもよい。サンプルはさらに、例えば、元のサンプルから遠心分離された後の、本質的に赤血球のみを含有するサンプル、または血球のみを含有するサンプルなどであってもよい。ある特定の実施形態によれば、少なくとも１つの赤血球は、患者の元のサンプル、好ましくは血液サンプルから分離され、好ましくは少なくとも１つの赤血球を本質的に含む、または好ましくは多数の赤血球を本質的に含むサンプルを準備する。
【００１４】
ある特定の実施形態によれば、サンプルは水性サンプル、すなわち水を含有するサンプルである。例えば、サンプルは対象の体液であってもよい。したがって、体液は、対象の体内、特に生きている対象に由来する液体である。それらは、体から排泄され得るもしくは分泌され得る、および／または体内を循環する流体、ならびに体内水分を含む。それらは、液体、エマルションまたは懸濁液の状態であってもよい。本発明における体液の例は、少なくとも１つの赤血球を少なくとも含む場合、特に血液およびそれに由来するサンプルである。ある特定の実施形態によれば、サンプルは患者サンプル（臨床分離物）である。例示的なサンプルは患者の全血である。
【００１５】
ある特定の実施形態によれば、サンプルから物質を抽出する、サンプル中の物質を濃縮する、および／またはサンプル中の物質を検出する本発明の方法における対象は、脊椎動物、好ましくはヒトまたは動物、より好ましくは哺乳動物、および最も好ましくはヒトであってもよく、それぞれヒト患者であってもよい。
【００１６】
本発明における脊椎動物とは、ヒトを含む哺乳動物、鳥類、は虫類、両生類および魚類を含む、脊椎のある動物を指す。したがって、本発明は、ヒトおよびヒトの医療分野に適しているだけでなく、獣医学にも適している。このことはまた、動物、例えば、マラリアが発生しやすい地域から、例えば、航空機、船舶などに乗って移動した後の家畜動物のマラリアによる感染の可能性が検出されることを意味する。
【００１７】
本発明において、微小流体デバイスは、少なくとも１つのマイクロチャネル、すなわち、少なくとも１から１０００μｍ未満の間の幅および／または深さを有するチャネルを含む任意のデバイスであり、そのデバイスにおいて、分析される流体、例えば、緩衝溶液と混合することによって本発明による方法において処理されたサンプルを流すことができる。これは、流すための少なくとも１つの入口および出口、物体を処理および／または操作するためのさらなるチャネルおよび／または構造化領域などを含んでもよい。
【００１８】
ＤＨＭの焦点領域は、ＤＨＭの検出ビームによって照射される光の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、９８％、９９％またはさらに１００％までを検出することができる、ＤＨＭの焦点の周囲の領域である。
【００１９】
本発明の記述において、量に関する全ての数値は、特に断りのない限り、または文脈から他の何かが意図されることが明らかでない限り、ｗｔ．％で与えられることが理解される。
【００２０】
本発明を例示的に詳細に記載する前に、本明細書に記載される方法は変更できるので、本発明は、そのような方法の方法工程の特定の構成要素部分に限定されないことを理解されたい。また、本明細書に使用される用語は、特定の実施形態のみを記載することを目的としており、限定することを意図していないことを理解されたい。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に別様を指示しない限り、単数および／または複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。例えば、本明細書に使用される「１つの（ａ）」という用語は、単一の実体として、または「１つまたはそれ以上」の実体の意味で理解することができる。また、複数形は、文脈が明確に別様を指示しない限り、単数および／または複数の指示対象を含むことも理解されたい。さらに、数値によって定められるパラメータ範囲が与えられる場合、その範囲は、これらの制限値を含むものとみなされることを理解されたい。
【００２１】
本発明は、患者におけるマラリアの感染の可能性を検出する方法であって、
−  デジタル光学顕微鏡（ＤＨＭ）を準備する工程、
−  マラリアに侵されていると疑われる少なくとも１つの赤血球を含むサンプルを、患者から取得するまたは準備する工程、
−  少なくとも１つの赤血球を含むサンプルを緩衝溶液と混合し、少なくとも１つの赤血球を球状に形成して球状赤血球を形成し、少なくとも１つの球状赤血球を含む緩衝溶液を微小流体デバイスに導入する工程であって、微小流体デバイスのチャネルの少なくとも一部はＤＨＭの焦点領域に含まれる、工程、
および／または
少なくとも１つの赤血球を含むサンプルを微小流体デバイスに導入し、少なくとも１つの赤血球を含むサンプルを緩衝溶液と混合し、少なくとも１つの赤血球を球状に形成して球状赤血球を形成する工程であって、微小流体デバイスのチャネルの少なくとも一部はＤＨＭの焦点領域に含まれる、工程、
−  少なくとも１つの球状赤血球をＤＨＭの焦点領域に誘導する工程、
−  ＤＨＭを用いて少なくとも１つの球状赤血球を検出する工程、ならびに
−  少なくとも１つの赤血球がマラリアに侵されているかどうかを決定して、患者がマラリアに感染しているかどうかを決定する工程
を含む、方法に関する。
【００２２】
本発明の方法において、ＤＨＭおよびデジタルホログラフィック顕微鏡自体の準備は、特に限定されず、任意の形態であってもよい。コヒーレント光源および少なくともビームスプリッターを使用することにより、サンプルのホログラフィック画像を、デジタルホログラフィック顕微鏡を使用して構成することができ、その設定は特に限定されない。デジタルホログラフィック顕微鏡は、例えば、軸上、軸外、垂直などの異なるビーム設定において適切に設定することができる参照ビームおよび検出ビームを使用して動作する。必要に応じて、対物レンズ、さらなるビームスプリッター、集光器などが存在してもよい。
【００２３】
ＤＨＭを使用するデジタルホログラフィック顕微鏡検査は、例えば、透過モードまたは任意選択の反射モードで実施することができ、共通のビーム設定で参照的に実施することができる。コントラストは、媒質と細胞との間、ならびに細胞内成分の間のわずかな屈折率変化の散乱効果の結果である。細胞内成分の定量および積分位相情報は、ミー散乱に関連する。
【００２４】
好ましくは、測定は、より単純でよりロバストな干渉設定を達成することができ、測定距離が短く、したがってノイズを最小限に抑えるように軸外で実施される。したがって、ある特定の実施形態によれば、デジタルホログラフィック顕微鏡デバイスの参照ビームおよび検出ビームは軸外である。また、好ましくは、測定は透過モードで行われる。
【００２５】
被写界深度は、好ましくは５．７μｍまたはそれ以下、より好ましくは４．７μｍまたはそれ以下、例えば３もしくは２μｍまたはそれ以下、特に好ましくは１．５μｍまたはそれ以下である。被写界深度を低減させることにより、良好な横方向分解能を同様に達成することができ、細胞区別を容易にする。低被写界深度では、白血球中の顆粒のような細胞内のさらなる細胞区画を容易に観察し、区別することができ、細胞の区別を改善することを可能にする。また、位相情報のようなさらなる情報を、低減された被写界深度でより良好に得ることができる。
【００２６】
微小流体デバイス／システムの使用は、検出される赤血球の集束を達成することができ、その結果、低減された被写界深度を通して赤血球を容易に誘導することさえでき、したがって、好ましくは、流動状態においてさえも定量化することさえできる。
【００２７】
さらに、適用される微小流体デバイスは、異なる細胞数、例えば１×１０３〜１×１０６個超の細胞、例えば１×１０７個までのスケーラブルな記録を達成することができる。ある特定の実施形態によれば、１×１０４〜１×１０６個の赤血球が検出される。このように、ｐｐｂ範囲の非常にわずかな寄生虫血も検出することができる。したがって、分析は、例えば、迅速検査またはＰＣＲのような以前の検出方法とは対照的に、さらなる労力を必要とせずに意図される診断または処置に個別に適応させることができる。特に、同調に起因する感染後の異なる時点での既存の循環段階の変動数も解決することができる（ＮＪ  Ｗｈｉｔｅら、１９９２年、「Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｔｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｒａｓｉｔｅｓ  ｉｎ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｍａｌａｒｉａ」、Ｔｒａｎｓ  Ｒ  Ｓｏｃ  Ｔｒｏｐ  Ｍｅｄ  Ｈｙｇ、８６（６）、５９０．７頁を参照のこと）。
【００２８】
ある特定の実施形態によれば、少なくとも１つの球状赤血球、例えば１つより多い赤血球の検出は、少なくとも１つの赤血球を含む緩衝溶液を微小流体デバイスに流している間に実施される。少なくとも１つの赤血球が、十分なコントラストを有する画像を得るために、例えば、照射時間などに依存する、ぼやけていないその画像を撮影することを可能にする速度でデジタルホログラフィック顕微鏡／顕微鏡デバイスを通過して流れている限り、流れは特に限定されない。また、十分なスループットを達成するために、遅すぎる流れは好ましくは回避されなければならない。流れは、デジタルホログラフィック顕微鏡および微小流体デバイスのパラメータ、例えば、微小流体チャネルの寸法、その表面条件などに応じて適切に設定することができる。
【００２９】
ある特定の実施形態によれば、微小流体デバイスにおける流れは、少なくとも１つの細胞の画像が得られる領域において少なくとも層流である。層流を用いて、細胞を容易に検出することができるように好ましい配向に設定することができる。層流は、例えば微小流体デバイス内の寸法に応じて適切に設定することができる。
【００３０】
ある特定の実施形態によれば、微小流体デバイスは、好ましくは、少なくとも１つのシース流（ｓｈｅａｔｈ  ｆｌｏｗ）によって層流が生成される、少なくとも１つの赤血球が検出される領域にマイクロチャネルを含む。ここでマイクロチャネルの大きさおよび形状は特に限定されない。ある特定の実施形態によれば、マイクロチャネルは、断面において、特に少なくとも、少なくとも１つの赤血球がＤＨＭによって検出される領域において矩形または正方形である。
【００３１】
マイクロチャネルを用いて、流れを容易に設定し、決定することができ、その結果、定量化を簡単にすることができる。また、シース流はマイクロチャネルにおいて容易に実行することができる。好ましくは、シース流は、検出される赤血球の集束を達成するために、マイクロチャネルにおける少なくとも２つの対向する部位について実行される。さらに好ましくは、シース流は、適切な集束および細胞配向を達成するために、マイクロチャネルにおいて、特に矩形または正方形のマイクロチャネル（例えば、上部、底部、左および右）において、２つ、特に４つの方向、好ましくは垂直方向から実行される。シース流は、例えば、主要チャネルに対して異なる入口からさらなる微小流体の流れを流すことによって実行することができる。
【００３２】
ある特定の実施形態によれば、デジタルホログラフィック顕微鏡デバイスの視野は、少なくとも１つの赤血球が検出される領域、例えば、少なくとも１つの赤血球の画像が得られる領域においてマイクロチャネルの幅の最大１．０倍である。
【００３３】
ある特定の実施形態によれば、マイクロチャネルは、デジタルホログラフィック顕微鏡の参照および／または検出ビームの波面に対して垂直な少なくとも１つの表面、好ましくは少なくとも２つの表面を含む。
【００３４】
ある特定の実施形態によれば、デジタルホログラフィック顕微鏡デバイスの参照および／または検出ビームの波面に対して垂直なマイクロチャネルの表面は本質的に平面である。これにより、参照ビームおよび／または検出ビームの波面の乱れおよび／または反射を回避することができ、信号解析および画像再構成を容易にすることができ、さらに、このような乱れ、反射などに起因する計算の調整を本質的に伴わずに、位相情報のようなさらなる情報を取得することができる。
【００３５】
さらに、マラリアに侵されていると疑われる少なくとも１つの赤血球を含むサンプルの患者からの取得または準備は特に限定されない。これは、ある特定の実施形態に従って、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏで取得することができるか、または準備することができる。上述したように、サンプルは、サンプルの準備のこの取得の前に処理されたサンプルであることを除外するものではない。
【００３６】
本発明において、少なくとも１つの赤血球を含むサンプルと緩衝溶液との混合は、微小流体デバイスの外側および／または微小流体デバイスの内側で実施することができる。したがって混合は特に限定されず、例えば、振とう器、撹拌器などによって微小流体デバイスの外側で行ってもよく、または混合構造などによって微小流体デバイスの内側で行ってもよい。
【００３７】
混合に関して、緩衝溶液は、球状赤血球を生成できるものであれば特に限定されない。それは、例えば血液分析器における赤血球（ＲＢＣ）の分析のために通常適用される緩衝溶液であってもよい。例えば、サンプル中の赤血球は、適切な緩衝物質および場合によりキレート剤（これらの両方は限定されない）とは別に、例えば約０．０１〜約０．５Ｖｏｌ．％、例えば約０．１Ｖｏｌ．％のグルタルアルデヒドおよび／または別の固定剤、ならびに約０．０２〜０．０５ｍｍｏｌ／ＬのＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）および／または別の界面活性剤を含む標準緩衝溶液で球状化される。緩衝溶液に関して、溶媒は特に限定されず、例えば水を含んでもよく、または水であってもよい。
【００３８】
例示的な水性緩衝溶液は以下の通りである（緩衝溶液に関して与えられる量）：
−  細胞膜に影響を及ぼすＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．０３５ｍｍｏｌ／Ｌ
−  例えば、リン酸水素／リン酸二水素に基づく緩衝液（ｐＨ７．４）
−  塩化ナトリウム（１０９．３ｍｍｏｌ／Ｌ）
−  グルタルアルデヒド（０．１１Ｖｏｌ．％）
−  Ｎａ２ＥＤＴＡ（４．０３ｍｍｏｌ／Ｌ）
−  Ｎａ４ＥＤＴＡ（３．３６ｍｍｏｌ／Ｌ）
【００３９】
緩衝溶液により、赤血球を含むサンプルを希釈することができ、その結果、ＤＨＭによって赤血球をより容易に観察することができる。サンプルの残りを含んでいるかもしれない緩衝溶液中の赤血球の希釈は、例えば１：１０〜１：２０００、好ましくは１：２０〜１：２０００、さらに好ましくは１：２５〜１：７００、例えば１：２８〜１：６００、例えば１：２９〜１：２００、例えば１：３０〜１：７０、例えば１：３０〜１：５０の範囲であってもよい。
【００４０】
ＲＢＣを含む緩衝溶液またはＲＢＣを含むサンプルおよび緩衝溶液の微小流体デバイスへの導入は特に限定されず、例えば、ポンプおよびチューブ、毛細管、シリンジ、または微小流体デバイスのための任意の他の適切な導入手段を介して行うことができる。
【００４１】
ＤＨＭの焦点領域への少なくとも１つの球状赤血球の誘導もまた、特に限定されず、例えば上述のように、微小流体デバイス内に適切な流れを設定することによって行うことができる。これに関して、対物レンズを、代替的にまたは追加的に、焦点領域で微小流体の流れに向けることができるので、このことも排除されないことにも留意されたい。
【００４２】
また、ＤＨＭによる少なくとも１つの球状赤血球の検出も、上述したように、特に限定されない。
【００４３】
患者がマラリアに感染しているかどうかを決定するために少なくとも１つの赤血球がマラリアに侵されているかどうかを決定することは、例えば、本発明のある特定の実施形態に関して以下にも記載されているように、異なる基準を使用して実施することができる。少なくとも１つの赤血球がマラリアに侵されているかどうかを決定するために、マラリア感染および／または寄生虫血に特異的な細胞段階の存在を考慮して、例えば、第１段階においてマラリア感染が存在し得るかどうかを決定することができる。
【００４４】
ある特定の実施形態によれば、ＤＨＭによる少なくとも１つの球状赤血球の検出は、ＤＨＭによって得られる位相および振幅画像の再構成を含む。このように、マラリアに特異的な細胞段階、例えばリング段階または以下により詳細に記載されてもいる他の段階の存在を検出することを可能にする細胞形状とは別に、マラリア感染に特有の異なるさらなる特定のパラメータを、以下により詳細に記載されているように、さらに決定することができる。
【００４５】
マラリア診断の改善に関して、３日熱マラリア、熱帯熱マラリアおよび４日熱マラリアの間の明確な識別が有益である。したがって、ある特定の実施形態によれば、３日熱マラリア、熱帯熱マラリアおよび４日熱マラリアは、ＤＨＭ測定を使用して識別される。さらに、ある特定の実施形態によれば、感染細胞（寄生虫血）のパーセンテージは本発明の方法において決定される。
【００４６】
異なるマラリア種を識別するために、以下の基準を適用することができる：
１．ＤＨＭの位相画像を使用して、球状化した感染赤血球の直径、およびしたがってそれらの体積（球の体積：Ｖ＝４／３×π×ｒ３）を決定することができる。決定した体積を使用して、第１の分類を実施することができる：３日熱マラリア原虫（Ｐ．ビバックス（ｖｉｖａｘ）またはオバレ（ｏｖａｌｅ））は、８〜１０μｍのサイズ（両凹型）を有する網状赤血球および若い赤血球のみに感染する。熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ファルシパルム（ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ））は、７〜８μｍのサイズ（両凹型）を有する正赤血球のみに感染する。４日熱マラリア原虫（Ｐ．マラリアエ（ｍａｌａｒｉａｅ））は、７μｍ未満のサイズ（両凹型）を有する小赤血球のみに感染する。
【００４７】
したがって、ある特定の実施形態によれば、少なくとも１つの球状赤血球の細胞体積および／または細胞直径は、マラリア原虫の発生段階および種を同定するためにＤＨＭを用いて決定される。ある特定の実施形態によれば、少なくとも１つの球状赤血球の体積の少なくとも２／３はＤＨＭを用いて検出される。球状化したＲＢＣおよび／または網状赤血球の体積の２／３超が対物レンズの焦点領域内にある場合、ＤＨＭ測定は特に感度が高い。典型的に、球状化したＲＢＣおよび網状赤血球の直径は４μｍ超である。本発明のマラリア診断方法は、細胞の粘弾性特性、細胞内のヘモグロビン濃度およびサンプル、例えば懸濁液中のＲＢＣの配向とは無関係であることに留意されたい。特に、この最後の態様は、フローサイトメトリーを使用したＲＢＣの血液検査において同様に適用されるような、簡単なハイスループット分析を可能にする。
【００４８】
しかしながら、感染した赤血球のサイズのみに基づく明確な識別は、網状赤血球、正赤血球および小赤血球の間の移行が流動的であるので、誤診断を導く可能性がある。誤った診断を除外するために、さらなる識別特徴を、ＤＨＭ結果から使用することができる。
【００４９】
２．末梢血中の異なるマラリア段階の存在もまた、異なるマラリア種の識別を可能にする。３日熱マラリアおよび４日熱マラリアに関しては、原虫発生の段階が末梢血中の循環および隔離された状態において存在する。急な同調は、病気が自己限定的になったときのみに起こる。熱帯熱マラリアに関しては、リング段階および起こり得る場合、栄養体段階を循環中に見ることができる。さらに、リング段階での多重侵襲も典型的である。極めて高度の寄生虫血では、また（まれに）隔離された段階が見つかることがある。誤った診断を回避するために、第３の識別基準を使用することができる。
【００５０】
したがって、ある特定の実施形態によれば、多数の赤血球がＤＨＭを使用して検出され、マラリア種の異なる段階が多数の赤血球について決定される。
【００５１】
図１は、プラスモジウム感染の最も早期に検出可能な成長段階であるリング段階を含む、完全なマラリア生活環が、ＤＨＭ標識を含まない状態で検出可能であることを示す。本発明の方法では、特定のマラリア情報を臨床的に関連する成長段階で提供することができる。
【００５２】
図１は、異なるマラリア段階と、通常の光学顕微鏡（左；４０倍の倍率での入射光マイクロコピー；ＮＡ＝０．５５）から得られた画像およびＤＨＭ（右；透過光；４０倍の倍率；ＮＡ＝０．５５）から得られた画像との比較を示す。これは、赤血球（Ｅ）、リング（Ｒ）、栄養体（Ｔ）、赤血球分裂体（ＥＳ）および破裂赤血球（ＲＥ）段階において観察された細胞の差異を示す。これらから明らかなように、ＤＨＭは光学顕微鏡と同様に異なる細胞段階の識別を可能にする。
【００５３】
３．寄生虫血は、異なるマラリア型の識別についてのさらなる特徴である。３日熱マラリアに関しては、感染が網状赤血球に限定されているため、寄生虫血は２％を超えて増加することは決してなく、典型的には赤血球の多くとも２％を占める。４日熱マラリアに関してもまた、少しの赤血球しか感染しないため、寄生虫血は２％を超えて増加することは決してない。対照的に、顕著に高い寄生虫血（極端な場合、１０％よりかなり高い）が熱帯熱マラリアに関して発生することがあり、したがってこれは識別についての重要な特徴を表す。
【００５４】
したがって、ある特定の実施形態によれば、全細胞の数に対する感染細胞の数の比を決定することを含む、多数の赤血球の寄生虫血が決定される。寄生虫血は、検出された細胞の総数に対する感染細胞の数を使用して決定することができる。
【００５５】
３つ全ての識別基準を任意の順序で適用することができるが、３つ全ての基準の組合せが明確な診断のために有益である。以下により詳細に記載している図３は、異なるマラリア種のＤＨＭによる識別がどのように可能であるかを示す。
【００５６】
ある特定の実施形態によれば、マラリア型の決定は、特に限定されない機械学習プログラムを活用して行うことができ、例えば、異なるマラリア種に感染したいくつかの参照細胞型のいくつかの画像を使用してプログラムを訓練することができる。
【００５７】
特にマラリア識別のための画像分析を実施するために、機械学習に基づく技術を使用することができ、これは特に限定されるものではない。このような技術では、分析は一般に２つの主要な段階：訓練段階および試験段階において実施される。これらは、例えばＤＨＭ測定の画像分析において通常のように実施することができる。
【００５８】
上記実施形態は、適宜、任意に組み合わせることができる。本発明のさらなる可能な実施形態および実現は、上述または本発明の実施例に関して以下に明示的に言及されていない特徴の組合せも含む。特に、当業者はまた、個々の態様を、本発明のそれぞれの基本的な形態に対して改良または追加として加えるであろう。
【実施例】
【００５９】
ここで本発明を、そのいくつかの実施例を参照して詳細に記載する。しかしながら、これらの実施例は説明のためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００６０】
第１の例では、３日熱マラリア（Ｐ．オバレおよびＰ．ビバックス）、熱帯熱マラリア（Ｐ．ファルシパルム）および４日熱マラリア（Ｐ．マラリアエ）に感染した赤血球を最初に、以下の通りの水性標準緩衝溶液により別々に球状化した：
−  細胞膜に影響を及ぼすＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．０３５ｍｍｏｌ／Ｌ
−  例えば、リン酸水素／リン酸二水素に基づく緩衝液（ｐＨ７．４）
−  塩化ナトリウム（１０９．３ｍｍｏｌ／Ｌ）
−  グルタルアルデヒド（０．１１Ｖｏｌ．％）
−  Ｎａ２ＥＤＴＡ（４．０３ｍｍｏｌ／Ｌ）
−  Ｎａ４ＥＤＴＡ（３．３６ｍｍｏｌ／Ｌ）
【００６１】
非球状化ＲＢＣおよび球状化ＲＢＣの画像を比較のために撮影し、図２に示し（４０倍の倍率での入射光マイクロコピー；ＮＡ＝０．５５）、右側に球状化ＲＢＣを示す。
【００６２】
次いで別々に感染したＲＢＣを用いて、異なるマラリア種間の識別を、ＤＨＭ検出（透過光；倍率４０倍；ＮＡ＝０．５５）を使用して実施することができた。
【００６３】
緩衝溶液中のＲＢＣの希釈を、この実施例における球状化ＲＢＣの鮮明な写真を取得するために約１：６００になるように調節したが、その場での分析環境におけるハイスループットのための最終希釈係数は、１：２０〜１：２００、例えば１：３０〜１：５０であることを目的とした。
【００６４】
微小流体デバイスとして、１つの入口および出口を有する単純な矩形マイクロチャネル（幅５００μｍ、高さ５０μｍ）を採用し、マイクロチャネルの一部をＤＨＭの焦点領域に配置した。
【００６５】
マイクロチャネルにおいて、球状化ＲＢＣを、微小流体誘導によってＤＨＭの対物レンズの焦点領域（倍率４０倍；ＮＡ＝０．５５）に誘導し、ホログラフィック画像を記録した。
【００６６】
ホログラフィック画像の画像再構成の後、マラリア感染の異なる段階を、位相および振幅画像ならびに細胞内コントラストから識別することができた。この驚くべき結果は、マラリア診断がイメージング方法のみを使用して球状化細胞に対して実施できることが以前には知られていなかったので、予想されなかった。
【００６７】
さらに、ＤＨＭベースのマラリア診断は、上記し、以下により詳細に示しているように、異なるマラリア病原体が赤血球の特異的感染パターンを示しているので、特に機械アルゴリズムを活用して赤血球の高コントラストおよび体積測定を使用して、発生段階および病原体種の同定を可能にした。
【００６８】
これに関して、寄生生物種の発生段階の同定は、機械アルゴリズムを使用する代わりに、物理的パラメータのみを評価することによってもさらに可能であることに留意されたい。
【００６９】
物理的パラメータによる異なるマラリア種の識別の詳細な記述は以下に与えられ、特に図３に関しても、より良い理解のために与えられる。ここで図３は種識別の概略図を示す。
【００７０】
Ｉに示すように、ＤＨＭ測定は、８〜１０μｍの直径を有する網状赤血球（ＲＣ）、７〜８μｍの直径を有する正赤血球（ＮＣ）、および７μｍ未満の直径を有する小赤血球（ＭＣ）の間の識別を可能にした。
【００７１】
さらに、ＩＩに示すように、３つの異なるＲＢＣに関して、異なるマラリア段階を観察することができ、リング段階（Ｒ）および栄養体段階（Ｔ）は３つ全て（ＲＣ、ＮＣおよびＭＣ）について観察されたが、分裂体段階（ＥＳ）および割体段階（Ｓ）はＲＣおよびＭＣについてのみ観察された。
【００７２】
さらに、基準ＩＩＩに示すように、寄生虫血Ｐの定量によって、さらなる差異が観察され、ＲＣおよびＭＣは２％未満の寄生虫血を示し、ＮＣは２％超の寄生虫血および多重感染を示した。
【００７３】
したがって、４つ全ての段階を有し、Ｐ＜２％のＲＢＣの優勢な感染は３日熱マラリアに起因し得、段階ＲおよびＴのみを有し、Ｐ＞２％のＮＣの優勢な感染は熱帯熱マラリアに起因し得、４つ全ての段階を有し、Ｐ＜２％のＭＣの極めて稀な感染は４日熱マラリアに起因し得る。参照測定のために、感染細胞の定量を、顕微鏡下で細胞数を計数することによって実施した。
【実施例２】
【００７４】
本発明の方法では、機械アルゴリズムを自動評価のために適用することもできる。
【００７５】
例示的な実施形態では、アルゴリズムの訓練は、実施例１の設定における規定した細胞段階においてＰ．ファルシパルムに感染した細胞を使用して実施した。マラリア感染細胞を、参照実験室の同調培養物から手動により選択し、実施例１のように球状化し、検出した。異なるマラリア段階の分類のためにニューラルネットワークを使用した。各細胞型について１００個の細胞を訓練のために使用した。その後、無作為に選択した２００個の細胞を使用してニューラルネットワークの試験を実施した。コンフュージョンマトリックスを取得するために、全ての段階を考慮し、互いに対して評価した。訓練の結果を以下の表１に示す。
【００７６】
【表１】
0006950087.tif 000002
【００７７】
さらなる実験では、健康な細胞およびリング状態の細胞のみを考慮したことを除いて、表１の結果に関して上記と同じ訓練および試験のルーチンを実施した。結果を表２に示す。
【００７８】
【表２】
0006950087.tif 000003
【００７９】
表２から理解することができるように、健康な細胞は９５．２％の確率でリング状態から識別することができ、その結果、これはマラリア感染についてのルーチンな試験の基礎となすことができる。
【００８０】
赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）／赤血球（ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）（ＲＢＣ）のみの単純な固定および球状化によって、マラリア感染は、プラスモジウムが存在する場合の光学的厚さの変化を通してデジタルホログラフィック顕微鏡検査を使用して、最も早期のリング段階にて既に検出することができた。微小流体デバイスと組み合わせて、厚膜検査において達成可能な感度に匹敵する感度を、ハイスループットで達成することができる。さらに、寄生生物の細胞周期は位相コントラストの変化によって決定することができる。デジタルホログラフィック顕微鏡検査はさらに、赤血球の細胞体積の測定を可能にし、プラスモジウム種に関するさらなる特異度を達成する。
【００８１】
本発明の方法は、マラリアの感染の可能性が迅速に決定される必要がある状況、例えば赤外線カメラなどを使用して検出されるような、例えば発熱している患者について空港において、流行地域において、またはマラリアの感染の可能性を有する患者のサンプルが検査される研究所において、容易に適用することができる。患者の血液サンプルを採取してから感染を決定するための結果を得るまでにかかる時間は約３０分という短時間で可能であり、本発明の方法における測定自体は３分ほどの速さで実施することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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