(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞膜から細胞内の方向に順に位置する２つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン（intracellular  signaling  domain）を含むキメラ抗原受容体（chimeric  antigen  receptor）であって、前記２つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインのうちの細胞内側の細胞内シグナル伝達ドメインがＯＸ４０リガンド（ＣＤ２５２）を含むドメインである、キメラ抗原受容体。
【請求項２】
前記細胞内シグナル伝達ドメインに連結された膜貫通ドメイン（transmembrane  domain）と、
前記膜貫通ドメインに連結されたスペーサードメイン（spacer  domain）と、
前記スペーサードメインに連結された細胞外ドメイン（extracellular  domain）と、
をさらに含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体（chimeric  antigen  receptor）。
【請求項３】
前記細胞外ドメインに連結されたシグナル配列（signal  sequence）をさらに含む、請求項２に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項４】
前記シグナル配列は、ＣＤ１６またはＣＤ８αを含むものである、請求項３に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項５】
前記細胞外ドメインは、抗体の抗原結合断片、Ｆｃ受容体、ナチュラルキラー受容体（Natural  cytotoxicity  receptor）、ＮＫＧ２Ｄ、２Ｂ４およびＤＮＡＭ−１からなる群より選択されるいずれか一つを含むものである、請求項２に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項６】
前記抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片またはＦｖ断片である、請求項５に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項７】
前記Ｆｖ断片は、一本鎖抗体切片（single−chain  variable  fragment、ScFv）である、請求項６に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項８】
前記Ｆｃ受容体は、ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ２３、ＣＤ８９、及びそれらの変異体からなる群より選択される、請求項５に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項９】
前記Ｆｃ受容体は、ＣＤ１６またはその変異体である、請求項８に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１０】
前記ナチュラルキラー受容体（Natural  cytotoxicity  receptor）は、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ８０およびＮＫｐ６５受容体からなる群より選択される、請求項５に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１１】
前記スペーサードメインは、ＣＤ８αおよびＣＤ２８からなる群より選択されるいずれか一つを含むものである、請求項２に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１２】
前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８αおよびＣＤ２８からなる群より選択されるいずれか一つを含むものである、請求項２に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１３】
前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３−ｚｅｔａをさらに含むものである、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１４】
前記ＣＤ３−ｚｅｔａおよび前記ＯＸ４０リガンドは、細胞膜から細胞内の方向に順に位置する、請求項１３に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１５】
前記細胞外ドメインとスペーサードメインとの間にＡＡＡリンカーをさらに含む、請求項２に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を発現する免疫細胞。
【請求項１７】
前記免疫細胞は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ  cell）である、請求項１６に記載の免疫細胞。
【請求項１８】
請求項１６に記載の免疫細胞を有効成分として含む腫瘍治療用の薬学組成物。
【請求項１９】
前記細胞外ドメインがＦｃ受容体である場合、有効成分として抗体をさらに含む、請求項１８に記載の腫瘍治療用の薬学組成物。
【請求項２０】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キメラ抗原受容体及びそれを発現するナチュラルキラー細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトナチュラルキラー細胞（natural  killer  cells，NK  cells）は、悪性細胞（malignant  cells）に対する先天性免疫防御（innate  immune  defense）において重要な役割を果たすため、免疫細胞治療（adoptive  immune  therapy，adoptive  cellular  immunotherapy）に適したものであり得る。しかし、エクス・ビボ（ex  vivo）細胞の拡張の難しさ及び患者一人一人のナチュラルキラー細胞活性の差などにより、ナチュラルキラー細胞の使用に困難がある。
【０００３】
Ｔ細胞を用いた免疫細胞治療（T  cell  therapy）の分野では、自己免疫細胞治療のためのキメラ抗原受容体（chimeric  antigen  receptor）が開発されている。キメラ抗原受容体は、Ｔ細胞を再プログラミングして、特定のがんに対する治療効果が増大するように活性化したり、治療に対するがん細胞の抵抗性を克服することに役立つことが知られている。
【０００４】
ＯＸ４０リガンド（ＣＤ２５２）は、ＴＮＦＲ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙに属するタンパク質であり、抗原提示細胞（antigen−presenting  cells、APCs）、一部のナチュラルキラー細胞および一部のＢ細胞で発現されることが知られており、これらの細胞の活性化後の数時間から数日内に発現されることが知られている。
【０００５】
ＯＸ４０リガンド（ＣＤ２５２）の受容体であるＯＸ４０（ＣＤ１３４）は、Ｔ細胞で発現されることが知られており、Ｔ細胞が抗原とＣＤ２８によって活性化されると、２４時間後に発現されることが知られている。ＣＤ１３４の発現は、ＣＤ２８活性化によるＴ細胞反応をさらに強化して、Ｔ細胞の増殖、サイトカインの分泌及び生存を増大させることが知られている。
【０００６】
しかしながら、ナチュラルキラー細胞の抗がん活性の増大におけるＯＸ４０リガンドの役割は、よく知られておらず、また、キメラ抗原受容体にＯＸ４０リガンドを使用しようとする試みも全く報告されていない。
【０００７】
本発明者らは、ＮＫ細胞の抗腫瘍反応におけるＣＤ２５２の機能的な役割を調べるために、ＣＡＲを含有する２つの異なる天然ＮＫ受容体を構築した。まず、シグナル伝達領域にＮＫ細胞の細胞毒性を増加させることが知られている様々な補助刺激分子を遺伝的に融合させた組換えの高親和性ＦＣＲＧ３Ａ  Ｖ１５８変異型（ＣＤ１６Ｖ）をコードするレンチウイルスを生成した。様々な細胞内シグナル伝達分子を含むＣＤ１６Ｖ受容体をＮＫ細胞に形質導入して発現を検出し、イン・ビトロ（in  vitro）でリンパ腫細胞株を用いて、ＣＤ２０分子に特異的なリツキシマブ（rituximab）の存在下でそれらの抗腫瘍反応を調べた。
【０００８】
第二のアプローチとして、ＮＫＧ２Ｄ媒介抗腫瘍活性におけるＣＤ２５２の機能的な役割を試験した。ＮＫＧ２Ｄは、ＮＫ細胞活性化の主要な受容体であって、細胞ストレス、感染または細胞毒性後に優先的に発現するＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  １  ｃｈａｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  Ａ（ＭＩＣＡ）、ＭＩＣＢ、および様々なＵＬ−１６−結合タンパク質（ＵＬＢＰ）を認識することができる。
【０００９】
他のシグナル分子を含有する様々なＮＫＧ２Ｄキメラ抗原受容体を遺伝的に製造し、形質転換してＮＫ９２ＭＩ細胞で発現させた。その後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでそれらの抗腫瘍効果を評価した。
【００１０】
そこで、本発明者らは、ナチュラルキラー細胞を用いた現在の免疫細胞治療の限界を克服する一つの方策として、ＯＸ４０リガンドを含むキメラ抗原受容体が、従来知られているシグナル伝達ドメインと比較してナチュラルキラー細胞の抗がん活性を大幅に増加させることができることを見出し、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、ナチュラルキラー細胞を用いた抗がん免疫細胞治療の効率を増大させるためのキメラ抗原受容体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
１．ＯＸ４０リガンド（ＣＤ２５２）の全部または一部を含む細胞内シグナル伝達ドメイン（intracellular  signaling  domain）を含むキメラ抗原受容体（chimeric  antigen  receptor）。
【００１３】
２．前記項目１において、前記細胞内シグナル伝達ドメインに連結された膜貫通ドメイン（transmembrane  domain）と、前記膜貫通ドメインに連結されたスペーサードメイン（spacer  domain）と、前記スペーサードメインに連結された細胞外ドメイン（extracellular  domain）と、をさらに含む、キメラ抗原受容体（chimeric  antigen  receptor）。
【００１４】
３．前記項目２において、前記細胞外ドメインに連結されたシグナル配列（signal  sequence）をさらに含む、キメラ抗原受容体。
【００１５】
４．前記項目３において、前記シグナル配列は、ＣＤ１６の全部または一部及びＣＤ８ａの全部または一部をそれぞれ含むものである、キメラ抗原受容体。
【００１６】
５．前記項目２において、前記細胞外ドメインは、抗体の抗原結合断片、Ｆｃ受容体、ナチュラルキラー受容体（Natural  cytotoxicity  receptor）、ＮＫＧ２Ｄ、２Ｂ４およびＤＮＡＭ−１からなる群より選択されるいずれか一つの全部または一部を含むものである、キメラ抗原受容体。
【００１７】
６．前記項目５において、前記抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ'）２断片またはＦｖ断片である、キメラ抗原受容体。
【００１８】
７．前記項目６において、前記Ｆｖ断片は、一本鎖抗体切片（single−chain  variable  fragment、ScFv）である、キメラ抗原受容体。
【００１９】
８．前記項目５において、前記Ｆｃ受容体は、ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ２３、ＣＤ８９、及びそれらの変異体からなる群より選択される、キメラ抗原受容体。
【００２０】
９．前記項目８において、前記Ｆｃ受容体は、ＣＤ１６またはその変異体である、キメラ抗原受容体。
【００２１】
１０．前記項目５において、前記ナチュラルキラー受容体（Natural  cytotoxicity  receptor）は、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ８０およびＮＫｐ６５受容体からなる群より選択される、キメラ抗原受容体。
【００２２】
１１．前記項目２において、前記スペーサードメインは、ＣＤ８α（ＣＤ８−ａｌｐｈａ）およびＣＤ２８からなる群より選択されるいずれか一つの全部または一部を含むものである、キメラ抗原受容体。
【００２３】
１２．前記項目２において、前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８αおよびＣＤ２８からなる群より選択されるいずれか一つの全部または一部を含むものである、キメラ抗原受容体。
【００２４】
１３．前記項目１において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ（ＣＤ３−ｚｅｔａ）の全部または一部をさらに含むものである、キメラ抗原受容体。
【００２５】
１４．前記項目１３において、前記ＣＤ３ζの全部または一部及び前記ＯＸ４０リガンドの全部または一部は、細胞膜から細胞内の方向に順に位置する、キメラ抗原受容体。
【００２６】
１５．前記項目２において、前記細胞外ドメインとスペーサードメインとの間にＡＡＡリンカーをさらに含む、キメラ抗原受容体。
【００２７】
１６．下記の細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体：ＣＤ２８及び４−１ＢＢからなる群より選択されるいずれか一つの全部または一部を含む第１の細胞内シグナル伝達ドメイン；ＯＸ４０リガンド、ＯＸ４０及び４−１ＢＢからなる群より選択されるいずれか一つの全部または一部を含む第２の細胞内シグナル伝達ドメイン；および、ＣＤ３ζの全部または一部を含む第３の細胞内シグナル伝達ドメイン（前記第１、第２及び第３の細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞膜から細胞内の方向に順に位置する。）。
【００２８】
１７．前記項目１６において、前記細胞内シグナル伝達ドメインに連結された膜貫通ドメイン（transmembrane  domain）と、前記膜貫通ドメインに連結されたスペーサードメイン（spacer  domain）と、前記スペーサードメインに連結された細胞外ドメイン（extracellular  domain）と、をさらに含む、キメラ抗原受容体（chimeric  antigen  receptor）。
【００２９】
１８．前記項目１７において、前記細胞外ドメインに連結されたシグナル配列（signal  sequence）をさらに含む、キメラ抗原受容体。
【００３０】
１９．前記項目１８において、前記シグナル配列は、ＣＤ１６の全部または一部及びＣＤ８ａの全部または一部をそれぞれ含むものである、キメラ抗原受容体。
【００３１】
２０．前記項目１７において、前記細胞外ドメインは、抗体の抗原結合断片またはＦｃ受容体の全部または一部を含むものである、キメラ抗原受容体。
【００３２】
２１．前記項目１７において、前記スペーサードメインは、ＣＤ８αおよびＣＤ２８からなる群より選択されるいずれか一つの全部または一部を含むものである、キメラ抗原受容体。
【００３３】
２２．前記項目１７において、前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８αおよびＣＤ２８からなる群より選択されるいずれか一つの全部または一部を含むものである、キメラ抗原受容体。
【００３４】
２３．前記項目１６において、前記第１の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８の全部または一部を含み、前記第２の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０リガンドの全部または一部を含み、前記第３の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの全部または一部を含む、キメラ抗原受容体。
【００３５】
２４．前記項目１７において、前記細胞外ドメインとスペーサードメインとの間にＡＡＡリンカーをさらに含む、キメラ抗原受容体。
【００３６】
２５．前記項目１〜２４のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を発現する免疫細胞。
【００３７】
２６．前記項目２５において、前記免疫細胞は、ナチュラルキラー細胞（NK  cell）であることを特徴とする免疫細胞。
【００３８】
２７．前記項目２５に記載の免疫細胞を有効成分として含む腫瘍治療用の薬学組成物。
２８．前記項目２７において、前記細胞外ドメインがＦｃ受容体である場合、有効成分として抗体をさらに含む、腫瘍治療用の薬学組成物。
【００３９】
２９．前記項目１〜２４のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸配列。
【００４０】
３０．前記項目２９において、前記核酸配列は、配列番号３３、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、６９、７１、７７、８１、８３、８５、８７、８９、９１、および９３からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸配列または８０％以上の配列同一性を有するその変異体をコードする、核酸配列。
【００４１】
３１．前記項目３０において、前記核酸配列は、配列番号３２、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、６８、７０、７６、８０、８２、８４、８６、８８、９０、および９２からなる群より選択される１つ以上の核酸配列または８０％以上の配列同一性を有するその変異体を含む、核酸配列。
【００４２】
３２．前記項目２５に記載の免疫細胞を対象体に投与するステップを含む、腫瘍の治療方法。
【発明の効果】
【００４３】
本発明に係るキメラ抗原受容体は、ナチュラルキラー細胞の活性化効率に優れている。
本発明に係るキメラ抗原受容体は、標的となるがんの種類によって、様々ながん標的抗体と共に使用することができる。
【００４４】
本発明に係るキメラ抗原受容体は、様々な抗原認識部位を適用することにより、様々ながん腫に適用することができる。
【００４５】
本発明に係るキメラ抗原受容体を発現するナチュラルキラー細胞は、がん細胞に対する細胞毒性に優れている。
【００４６】
本発明に係るキメラ抗原受容体を発現するナチュラルキラー細胞は、免疫細胞治療に有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明の実施形態に係るＣＤ１６Ｖ−Ｚ  ＣＡＲ（第１世代）、ＣＤ１６Ｖ−２８Ｚ  ＣＡＲ（第２世代）、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢＺ  ＣＡＲ（第２世代）、ＣＤ１６Ｖ−ＯＸ４０Ｚ  ＣＡＲ（第２世代）、またはＣＤ１６Ｖ−２８ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ（第３世代）で形質導入されたＮＫ９２ＭＩ細胞における各々のＣＡＲの発現量を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明の実施形態に係るＣＤ１６Ｖ−Ｚ  ＣＡＲ（第１世代）、ＣＤ１６Ｖ−２８Ｚ  ＣＡＲ（第２世代）、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢＺ  ＣＡＲ（第２世代）、ＣＤ１６Ｖ−ＯＸ４０Ｚ  ＣＡＲ（第２世代）、またはＣＤ１６Ｖ−２８ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ（第３世代）で形質導入されたＮＫ９２ＭＩ細胞の内在的（instrinsic）な細胞殺害能力を、Ｋ５６２細胞に対する細胞毒性の評価により示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、本発明の実施形態に係るＣＤ１６Ｖ−Ｚ  ＣＡＲ（第１世代）、ＣＤ１６Ｖ−２８Ｚ  ＣＡＲ（第２世代）、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢＺ  ＣＡＲ（第２世代）、ＣＤ１６Ｖ−ＯＸ４０Ｚ  ＣＡＲ（第２世代）、またはＣＤ１６Ｖ−２８ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ（第３世代）で形質導入されたＮＫ９２ＭＩ細胞のＲａｍｏｓ細胞に対する抗体併用時のナチュラルキラー細胞殺害能の評価を示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、本発明の実施形態に係るＣＤ１６Ｖ−Ｚ  ＣＡＲ（第１世代）とＣＤ１６Ｖ−ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ（第２世代）で形質導入されたＮＫ９２ＭＩ細胞における各々のＣＡＲの発現量を示す。
【図１Ｅ】図１Ｅは、本発明の実施形態に係るＣＤ１６Ｖ−Ｚ  ＣＡＲ（第１世代）とＣＤ１６Ｖ−ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ（第２世代）で形質導入されたＮＫ９２ＭＩ細胞のＲａｍｏｓ細胞に対する抗体併用時のナチュラルキラー細胞殺害能の評価を示す。
【図１Ｆ】図１Ｆは、本発明の実施形態に係るＣＤ１６Ｖ−Ｚ  ＣＡＲ（第１世代）とＣＤ１６Ｖ−ＺＯＸ４０Ｌ  ＣＡＲ（第２世代）で形質導入されたＮＫ９２ＭＩ細胞における各々のＣＡＲの発現量を示す。
【図１Ｇ】図１Ｇは、本発明の実施形態に係るＣＤ１６Ｖ−Ｚ  ＣＡＲ（第１世代）とＣＤ１６Ｖ−ＺＯＸ４０Ｌ  ＣＡＲ（第２世代）で形質導入されたＮＫ９２ＭＩ細胞のＲａｍｏｓ細胞に対する抗体併用時のナチュラルキラー細胞殺害能の評価を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明の実施形態に係るＣＤ１６Ｖ−Ｚ  ＣＡＲ（第１世代）、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢＺ  ＣＡＲ（第２世代）、またはＣＤ１６Ｖ−ＢＢＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ（第３世代）で形質導入されたＮＫ９２ＭＩ細胞における各々のＣＡＲの発現量を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明の実施形態に係るＣＤ１６Ｖ−Ｚ  ＣＡＲ（第１世代）、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢＺ  ＣＡＲ（第２世代）、またはＣＤ１６Ｖ−ＢＢＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ（第３世代）を発現するＮＫ９２ＭＩ細胞のＲａｍｏｓ細胞に対する抗体併用時のナチュラルキラー細胞殺害能の評価を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、本発明の実施形態に係る第３世代ＣＡＲであるＣＤ１６Ｖ−２８ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ、ＣＤ１６Ｖ−２８ＯＸ４０Ｚ  ＣＡＲ、またはＣＤ１６Ｖ−２８ＢＢＺ  ＣＡＲで形質導入されたＮＫ９２ＭＩ細胞における各々のＣＡＲの発現量を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本発明の実施形態に係る第３世代ＣＡＲであるＣＤ１６Ｖ−２８ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ、ＣＤ１６Ｖ−２８ＯＸ４０Ｚ  ＣＡＲ、またはＣＤ１６Ｖ−２８ＢＢＺ  ＣＡＲを発現するＮＫ９２ＭＩ細胞のＲａｍｏｓ細胞に対する抗体併用時のナチュラルキラー細胞殺害能の評価を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、本発明の実施形態に係るヒンジにＣＤ２８を含む第３世代ＣＡＲであるＣＤ１６Ｖ−２８（Ｈ）ＢＢＺ  ＣＡＲ、ＣＤ１６Ｖ−２８（Ｈ）ＯＸ４０Ｚ  ＣＡＲ、またはＣＤ１６Ｖ−２８（Ｈ）ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲで形質導入されたＮＫ９２ＭＩ細胞における各々のＣＡＲの発現量を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、本発明の実施形態に係るヒンジにＣＤ２８を含む第３世代ＣＡＲであるＣＤ１６Ｖ−２８（Ｈ）ＢＢＺ  ＣＡＲ、ＣＤ１６Ｖ−２８（Ｈ）ＯＸ４０Ｚ  ＣＡＲ、またはＣＤ１６Ｖ−２８（Ｈ）ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲを発現するＮＫ９２ＭＩ細胞のＲａｍｏｓ細胞に対する抗体併用時のナチュラルキラー細胞殺害能の評価を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、本発明の実施形態に係るＮＫＧ２Ｄ−Ｚ  ＣＡＲ（第１世代）、ＮＫＧ２Ｄ−２８Ｚ  ＣＡＲ（第２世代）、ＮＫＧ２Ｄ−ＢＢＺ  ＣＡＲ（第２世代）、ＮＫＧ２Ｄ−ＯＸ４０Ｚ  ＣＡＲ（第２世代）が形質導入されたＮＫ９２ＭＩ細胞における各々のＣＡＲの発現量を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、本発明の実施形態に係るＮＫＧ２Ｄ−Ｚ  ＣＡＲ（第１世代）、ＮＫＧ２Ｄ−２８Ｚ  ＣＡＲ（第２世代）、ＮＫＧ２Ｄ−ＢＢＺ  ＣＡＲ（第２世代）、ＮＫＧ２Ｄ−ＯＸ４０Ｚ  ＣＡＲ（第２世代）が形質導入されたＮＫ９２ＭＩ細胞のヒト乳がん細胞株ＭＣＦ−７に対するナチュラルキラー細胞殺害能の評価を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、本発明の実施形態に係るＮＫＧ２Ｄ−Ｚ  ＣＡＲ（第１世代）、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインが含まれたＮＫＧ２Ｄ−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ（第３世代）、ＮＫＧ２Ｄ−２８ＯＸ４０Ｚ  ＣＡＲ（第３世代）が形質導入されたＮＫ９２ＭＩ細胞における各々のＣＡＲの発現量を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、本発明の実施形態に係るＮＫＧ２Ｄ−Ｚ  ＣＡＲ（第１世代）、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインが含まれたＮＫＧ２Ｄ−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ（第３世代）、ＮＫＧ２Ｄ−２８ＯＸ４０Ｚ  ＣＡＲ（第３世代）が形質導入されたＮＫ９２ＭＩ細胞のヒト乳がん細胞株ＭＣＦ−７に対するナチュラルキラー細胞殺害能の評価を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、本発明の実施形態に係るＮＫＧ２Ｄ−Ｚ  ＣＡＲ（第１世代）、ＮＫＧ２Ｄ−２８Ｚ  ＣＡＲ（第２世代）、ＮＫＧ２Ｄ−２８（Ｈ）ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ（第３世代）、ＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインとＣＤ２８ヒンジの間にＡＡＡ配列が含まれたＮＫＧ２Ｄ−ＡＡＡ−２８（Ｈ）ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ（第３世代）が形質導入されたＮＫ９２ＭＩ細胞における各々のＣＡＲの発現量を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、本発明の実施形態に係るＮＫＧ２Ｄ−Ｚ  ＣＡＲ（第１世代）、ＮＫＧ２Ｄ−２８Ｚ  ＣＡＲ（第２世代）、ＮＫＧ２Ｄ−２８（Ｈ）ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ（第３世代）、ＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインとＣＤ２８ヒンジの間にＡＡＡ配列が含まれたＮＫＧ２Ｄ−ＡＡＡ−２８（Ｈ）ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ（第３世代）が形質導入されたＮＫ９２ＭＩ細胞のヒト乳がん細胞株ＭＣＦ−７に対するナチュラルキラー細胞殺害能の評価を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、本発明の実施形態に係るＮＫＧ２Ｄ−Ｚ  ＣＡＲ（第１世代）、ＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインとＣＤ２８ヒンジの間にＡＡＡ配列が含まれたＮＫＧ２Ｄ−ＡＡＡ−２８（Ｈ）ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ（第３世代）が形質導入されたＮＫ９２ＭＩ細胞における各々のＣＡＲの発現量を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、本発明の実施形態に係るヒト肺がん細胞株Ｈ１２９９とＨ１９４４における様々なＮＫＧ２Ｄリガンドの発現量を示す。
【図８Ｃ】図８Ｃは、本発明の実施形態に係るＮＫＧ２Ｄ−Ｚ  ＣＡＲ（第１世代）、ＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインとＣＤ２８ヒンジの間にＡＡＡ配列が含まれたＮＫＧ２Ｄ−ＡＡＡ−２８（Ｈ）ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ（第３世代）が形質導入されたＮＫ９２ＭＩ細胞のヒト肺がん細胞株Ｈ１２９９とＨ１９４４に対するナチュラルキラー細胞殺害能の評価を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
本発明は、キメラ抗原受容体及びそれを発現するナチュラルキラー細胞に関し、ＯＸ４０リガンド（ＣＤ２５２）の全部または一部を含む細胞内シグナル伝達ドメイン（intracellular  signaling  domain）を含むことにより、免疫細胞の抗がん活性の増大効果に優れたキメラ抗原受容体（chimeric  antigen  receptor、CAR）、及びそれを発現する免疫細胞に関する。
【００４９】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のキメラ抗原受容体は、ＯＸ４０リガンド（ＣＤ２５２）の全部または一部を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【００５０】
本発明の一実施形態によると、キメラ抗原受容体は、前記細胞内シグナル伝達ドメインに連結された膜貫通ドメイン（transmembrane  domain）と、前記膜貫通ドメインに連結されたスペーサードメイン（spacer  domain）と、前記スペーサードメインに連結された細胞外ドメイン（extracellular  domain）と、をさらに含むものであり得る。また、本発明の一実施形態によると、キメラ抗原受容体は、前記細胞外ドメインの前記スペーサドメインに連結されていない末端に連結されたシグナル配列（signal  sequence）をさらに含むものであり得る。本発明の一実施形態によると、前記各々のドメインは、互いに直接連結されていてもよく、リンカーによって連結されていてもよい。
【００５１】
本発明の一実施形態によると、前記シグナル配列は、キメラ抗原受容体が発現されるとき、細胞外ドメインが免疫細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞）の細胞膜の外側に位置するようにするものであってもよい。例えば、前記シグナル配列は、ＣＤ１６の全部または一部を含むものであってもよい。
【００５２】
本発明の一実施形態によると、前記細胞外ドメインは、抗体と特異的結合をしたり、抗原を特異的に認識するためのドメインであり、例えば、Ｆｃ受容体（Fc  receptor）、一本鎖抗体切片（single−chain  variａｂle  fragment、ScFv）のような抗体の抗原結合断片、ナチュラルキラー受容体（Natural  cytotoxicity  receptor）、ＮＫＧ２Ｄ、２Ｂ４またはＤＮＡＭ−１であってもよい。このため、本発明の用語「細胞外ドメイン（extracellular  domain）」は、「抗原認識部位」、「抗原結合断片」または「抗体結合部位」と同じ意味で使用される。
【００５３】
本発明の一実施形態に係るキメラ抗原受容体は、細胞外ドメインとしてのＦｃ受容体を含むことにより、治療しようとするがんの細胞の種類によって、様々な抗体と使用することができる。一実施形態によると、前記Ｆｃ受容体は、ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ２３およびＣＤ８９からなる群より選択されるいずれか一つであってもよい。より具体的な一実施形態によると、前記Ｆｃ受容体は、ＣＤ１６  Ｖ１５８変異体（ＣＤ１６Ｖ）の全部または一部を含むものであってもよい。
【００５４】
他の一実施形態によると、本発明のキメラ抗原受容体は、抗体との併用投与なしに、細胞外ドメインとして直接抗原を認識する抗体の抗原結合断片を細胞外ドメインとして含むこともできる。一実施形態によると、前記抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ'）断片、Ｆ（ａｂ'）２断片またはＦｖ断片であってもよい。本発明の一実施形態によると、抗体は、抗原特異的に結合できる様々な種類の抗体のいずれかであってもよい。例えば、抗体は、１つの軽鎖および１つの重鎖が結合したものであってもよく、２つの軽鎖および２つの重鎖が結合したものであってもよい。例えば２つの軽鎖および２つの重鎖が結合した場合は、第１の軽鎖および第１の重鎖が結合した第１の単位体と、第２の軽鎖および第２の重鎖が結合した第２の単位体とが互いに結合したものであってもよい。ここで、結合は、ジスルフィド結合（disulfide  bond）であってもよいが、これに限定されるものではない。本発明の実施形態によると、２つの単位体は、同一のものであっても、異なるものであってもよい。例えば、第１の軽鎖および第１の重鎖を含む第１の単位体と、第２の軽鎖および第２の重鎖を含む第２の単位体とは、同一でも異なっていてもよい。このように、第１の単位体と第２の単位体が２つの互いに異なる抗原を認識できるように製造された抗体は、当業界で通常、二重抗体（bispecific  antibody）と命名される。また、例えば、抗体は前記の単位体が３つ以上結合したものであってもよい。本発明の抗原結合断片は、前述のような様々な形態の抗体に由来するものであってもよいが、これに限定されるものではない。
【００５５】
本発明のまた他の一実施形態によると、本発明で用いられる細胞外ドメインは、ナチュラルキラー受容体（Natural  cytotoxicity  receptor）であってもよい。具体的な具現例によると、前記ナチュラルキラー受容体は、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ８０およびＮＫｐ６５受容体を含むが、これに限定されるものではない。
【００５６】
本発明の一実施形態によると、前記膜貫通ドメインは、細胞膜を貫通して位置するものであり、前記細胞外ドメインおよび前記細胞内シグナル伝達ドメインの機能を妨げることなく細胞膜を貫通して位置できるものであれば、いずれでも使用可能である。例えば、前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８αおよびＣＤ２８からなる群より選択されるいずれか一つの全部または一部を含むものであってもよい。
【００５７】
本発明の一実施形態によると、前記細胞外ドメインと前記膜貫通ドメインは、スペーサードメインにより連結することができる。例えば、スペーサードメインは、ヒンジドメインであってもよい。具体的な一実施形態によると、前記スペーサードメインは、ＣＤ８αおよびＣＤ２８からなる群より選択されるいずれか一つの全部または一部を含むものであってもよい。
【００５８】
本発明の一実施形態によると、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ナチュラルキラー細胞の細胞膜の内側、すなわち細胞質に位置する部分であり、本発明の細胞外ドメインに結合された抗体がターゲット抗原に結合したとき、ナチュラルキラー細胞を活性化させるシグナルを伝達できる配列を含むことができる。
【００５９】
本発明の一実施形態によると、キメラ抗原受容体は、１つまたはそれ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含むものであってもよい。２つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含む場合には、細胞内シグナル伝達ドメインが互いに直列に連結されていてもよい。例えば、３つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む場合には、前記膜貫通ドメインの前記スペーサドメインに連結されていない末端に第１の細胞内シグナル伝達ドメインの一方の末端が連結され、前記第１の細胞内シグナル伝達ドメインの前記膜貫通ドメインに連結されていない末端に第２の細胞内シグナル伝達ドメインの一方の末端が連結され、前記第２の細胞内シグナル伝達ドメインの前記第１の細胞内シグナル伝達ドメインに連結されていない末端に第３の細胞内シグナル伝達ドメインの一方の末端が連結されたものであってもよい。すなわち、前記第１、第２及び第３の細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞膜から細胞内の方向に順に位置するものであってもよい。細胞内シグナル伝達ドメインが２つ、４つ又はそれ以上の場合にも、前述のような方法で互いに連結することができる。本発明の一実施形態によると、前記各々のドメインは、互いに直接連結されていてもよく、リンカーによって連結されていてもよい。
【００６０】
本発明の一実施形態によると、キメラ抗原受容体は、２つの細胞内シグナル伝達ドメインを含むものであってもよい。例えば、前記膜貫通ドメインに連結された第１の細胞内シグナル伝達ドメインと、前記第１の細胞内シグナル伝達ドメインの前記膜貫通ドメインに連結されていない末端に連結された第２の細胞内シグナル伝達ドメインとを含むものであってもよい。より具体的な一実施形態によると、前記第１の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ２５２）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２８、ＤＡＰ１０、ＣＤ３−ｚｅｔａ（ＣＤ３ζ）およびＤＡＰ１２からなる群より選択されるいずれか一つの全部または一部を含むものであってもよく、前記第２の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０リガンド、ＣＤ３−ｚｅｔａおよびＤＡＰ１２からなる群より選択されるいずれか一つの全部または一部を含むものであってもよい。このような場合、前記第１の細胞内シグナル伝達ドメインおよび前記第２の細胞内シグナル伝達ドメインの少なくともいずれか一つは、ＯＸ４０リガンドの全部または一部を含む。例えば、キメラ抗原受容体は、ＯＸ４０リガンドの全部または一部を含む第１の細胞内シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３−ｚｅｔａ及びＤＡＰ１２からなる群より選択されるいずれか一つの全部または一部を含む第２の細胞内シグナル伝達ドメインとを含むものであってもよい。また、例えば、キメラ抗原受容体は、ＣＤ３−ｚｅｔａおよびＤＡＰ１２からなる群より選択されるいずれか一つの全部または一部を含む第１の細胞内シグナル伝達ドメインと、ＯＸ４０リガンドの全部または一部を含む第２の細胞内シグナル伝達ドメインとを含むものであってもよい。
【００６１】
本発明のまた他の一実施形態によると、キメラ抗原受容体は、３つの細胞内シグナル伝達ドメインを含むものであってもよい。例えば、前記膜貫通ドメインに連結された第１の細胞内シグナル伝達ドメインと、前記第１の細胞内シグナル伝達ドメインの前記膜貫通ドメインに連結されていない末端に連結された第２の細胞内シグナル伝達ドメインと、前記第２の細胞内シグナル伝達ドメインの前記第１の細胞内シグナル伝達ドメインに連結されていない末端に連結された第３の細胞内シグナル伝達ドメインと、を含むものであってもよい。より具体的な一実施形態によると、前記第１の細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＯＸ４０リガンド、ＣＤ２８およびＤＡＰ１０からなる群より選択されるいずれか一つの全部または一部を含むものであってもよく、前記第２の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０リガンド、ＯＸ４０および４−１ＢＢからなる群より選択されるいずれか一つの全部または一部を含むものであってもよく、前記第３の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０リガンド、ＣＤ３−ｚｅｔａおよびＤＡＰ１２からなる群より選択されるいずれか一つの全部または一部を含むものであってもよい。この場合、前記第１の細胞内シグナル伝達ドメイン、前記第２の細胞内シグナル伝達ドメインおよび前記第３の細胞内シグナル伝達ドメインの少なくともいずれか一つは、ＯＸ４０リガンドの全部または一部を含む。
【００６２】
また、本発明は、ＣＤ２８および４−１ＢＢからなる群より選択されるいずれか一つの全部または一部を含む第１の細胞内シグナル伝達ドメインと、ＯＸ４０リガンド、ＯＸ４０および４−１ＢＢからなる群より選択されるいずれか一つの全部または一部を含む第２の細胞内シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３−ｚｅｔａの全部または一部を含む第３の細胞内シグナル伝達ドメインと、を含み、前記第１、第２及び第３の細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞膜から細胞内の方向に順に位置するキメラ抗原受容体を提供する。本発明の一実施形態によると、前記の各々のドメインは、互いに直接連結されていてもよく、リンカーによって連結されていてもよい。
【００６３】
本発明の一実施形態によると、前記キメラ抗原受容体は、前記第１の細胞内シグナル伝達ドメインに連結された膜貫通ドメイン（transmembrane  domain）と、前記膜貫通ドメインに連結されたスペーサードメイン（spacer  domain）と、前記スペーサードメインに連結された細胞外ドメイン（extracellular  domain）と、をさらに含むものであってもよい。また、前記キメラ抗原受容体は、前記細胞外ドメインに連結されたシグナル配列（signal  sequence）をさらに含むものであってもよい。本発明の一実施形態によると、前記の各々のドメインは、互いに直接連結されていてもよく、リンカーによって連結されていてもよい。
【００６４】
本発明の一実施形態によると、前記細胞外ドメインは、抗体と特異的結合をしたり、抗原を特異的に認識するためのドメインであり、例えば、Ｆｃ受容体（Fc  receptor）、一本鎖抗体切片（single−chain  variable  fragment、ScFv）のような抗体の抗原結合断片、ナチュラルキラー受容体（Natural  cytotoxicity  receptor）、ＮＫＧ２Ｄ、２Ｂ４またはＤＮＡＭ−１であってもよい。このため、本発明の用語「細胞外ドメイン（extracellular  domain）」は、「抗原認識部位」、「抗原結合断片」または「抗体結合部位」と同じ意味で使用される。
【００６５】
本発明の一実施形態に係るキメラ抗原受容体は、細胞外ドメインとしてのＦｃ受容体を含むことにより、治療しようとするがんの細胞の種類によって、様々な抗体と使用することができる。一実施形態によると、前記Ｆｃ受容体は、ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ２３、ＣＤ８９、及びそれらの変異体からなる群より選択されるいずれか一つであってもよい。より具体的な一実施形態によると、前記Ｆｃ受容体は、ＣＤ１６又はその変異体を含むことができ、最も具体的には、ＣＤ１６  Ｖ１５８変異体（ＣＤ１６Ｖ）の全部または一部を含むものであってもよい。
【００６６】
他の一実施形態によると、本発明のキメラ抗原受容体は、抗体との併用投与なしに、細胞外ドメインとして直接抗原を認識する抗体の抗原結合断片を細胞外ドメインとして含むこともできる。一実施形態によると、前記抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ'）断片、Ｆ（ａｂ'）２断片またはＦｖ断片であってもよい。本発明の一実施形態によると、抗体は、抗原特異的に結合できる様々な種類の抗体のいずれか一つであってもよい。例えば、抗体は、１つの軽鎖および１つの重鎖が結合したものであってもよく、２つの軽鎖および２つの重鎖が結合したものであってもよい。例えば、２つの軽鎖および２つの重鎖が結合した場合は、第１の軽鎖及び第１の重鎖が結合した第１の単位体と、第２の軽鎖及び第２の重鎖が結合した第２の単位体とが互いに結合したものであってもよい。ここで、結合は、ジスルフィド結合（disulfide  bond）であってもよいが、これに限定されるものではない。本発明の実施形態によると、２つの単位体は、同一のものであっても、異なるものであってもよい。例えば、第１の軽鎖および第１の重鎖を含む第１の単位体と、第２の軽鎖および第２の重鎖を含む第２の単位体とは、同一でも異なっていてもよい。このように、第１の単位体と第２の単位体が２つの互いに異なる抗原を認識できるように製造された抗体は、当業界で通常、二重抗体（bispecific  antibody）と命名される。また、例えば、抗体は前記の単位体が３つ以上結合したものであってもよい。本発明の抗原結合断片は、前述のような様々な形態の抗体に由来するものであってもよいが、これに限定されるものではない。
【００６７】
本発明のまた他の一実施形態によると、本発明で用いられる細胞外ドメインは、ナチュラルキラー受容体（Natural  cytotoxicity  receptor）であってもよい。具体的な具現例によると、前記ナチュラルキラー受容体は、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ８０およびＮＫｐ６５受容体を含むが、これらに限定されるものではない。
【００６８】
一実施形態によると、前記シグナル配列は、ＣＤ１６の全部または一部を含むものであってもよい。また他の一実施形態によると、前記細胞外ドメインは、ＣＤ１６  Ｖ１５８変異体（ＣＤ１６Ｖ）の全部または一部を含むものであってもよい。また他の一実施形態によると、前記スペーサードメインは、ＣＤ８α（ＣＤ８−ａｌｐｈａ）およびＣＤ２８からなる群より選択されるいずれか一つの全部または一部を含むものであってもよい。また他の一実施形態によると、前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８αおよびＣＤ２８からなる群より選択されるいずれか一つの全部または一部を含むものであってもよい。
【００６９】
具体的な一実施形態によると、キメラ抗原受容体は、配列番号３３、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、６９、７１、７７、８１、８３、８５、８７、８９、９１および９３からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸配列または８０％以上の配列同一性を有するその変異体を含むものであってもよい。
【００７０】
また、本発明は、前述の本発明に係るキメラ抗原受容体を発現する免疫細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞（NK  cell））を提供する。
【００７１】
本発明の免疫細胞は、腫瘍細胞に対して毒性を示すものであってもよい。本発明に係るキメラ抗原受容体は、細胞外ドメインがどのような抗体と結合するかによってどの腫瘍細胞に対して特異的に毒性を示すかが決まるため、本発明に係るキメラ抗原受容体を発現する免疫細胞が毒性を示すことができる腫瘍細胞は、特に限定されていない。一実施形態によると、本発明の免疫細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞）がリツキシマブ（rituximab）と共に使用される場合には、悪性リンパ腫（lymphoma）細胞に対して毒性を示すことができる。例えば、前記悪性リンパ腫細胞は、ＣＤ２０を発現するものであってもよい。また、例えば、前記悪性リンパ腫は、Ｂ細胞リンパ腫（B−cell  lymphoma）であってもよい。
【００７２】
また、本発明は、前述の本発明に係るキメラ抗原受容体を発現する免疫細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞）の数が治療対象内の腫瘍細胞（例えば、悪性リンパ腫細胞）数の２倍〜７．５倍含まれている、腫瘍または腫瘍転移の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【００７３】
本発明の一実施形態によると、本発明の薬学組成物は、１回投与量内に前記免疫細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞）の数が治療対象内の前記腫瘍細胞（例えば、悪性リンパ腫細胞）数の０．７５倍〜１０倍含まれたものであってもよい。例えば、１回投与量内に前記免疫細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞）の数が治療対象内の前記腫瘍細胞（例えば、悪性リンパ腫細胞）数の２倍〜７．５倍含まれたものであってもよい。
【００７４】
また、本発明は、前述の本発明に係るキメラ抗原受容体をコードする核酸配列を提供する。
【００７５】
本発明の一実施形態によると、核酸配列は、配列番号３２、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、６８、７０、７６、８０、８２、８４、８６、８８、９０および９２からなる群より選択される１つ以上のヌクレオチド配列または８０％以上の配列同一性を有するその変異体を含むものであってもよい。
【００７６】
また、本発明は、前述の本発明に係る核酸配列を含むベクターを提供する。
また、本発明は、前述の免疫細胞を対象体に投与するステップを含む、腫瘍の治療方法を提供する。
【００７７】
また、本発明は、前述の免疫細胞を対象体に投与するステップを含む、腫瘍転移の予防方法を提供する。
【００７８】
対象体は、腫瘍を持つ哺乳類であってもよく、具体的にはヒトであってもよいが、これに限定されるものではない。
【００７９】
投与は、本発明に係るキメラ抗原受容体を発現する免疫細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞）の数が治療対象内の腫瘍細胞（例えば、悪性リンパ腫細胞）数の２倍〜７．５倍の量であってもよい。
【００８０】
投与方法は特に制限されず、通常の経口または非経口の経路を介して投与することができる。
【００８１】
腫瘍は、特に限定されず、例えば悪性リンパ腫、白血病、乳がん、肺がんなどであってもよく、より具体的には、Ｂ細胞リンパ腫（B−cell  lymphoma）であってもよい。
【００８２】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、本発明を詳細に説明するためのものであり、本発明の権利範囲を限定するものではない。
【００８３】
実施例１：方法および試薬
細胞株
ヒトＢ−系細胞株Ｒａｍｏｓ、ヒト赤白血（erythroleukemic）細胞株Ｋ５６２、ヒト乳がん細胞株ＭＣＦ−７、ヒト肺がん細胞株Ｈ１２９９とＨ１９４４細胞株およびＮＫ−９２ＭＩは、ＡＴＣＣ（American  Type  Culture  Collection、Manassas、VA、USA）から供給されたものを使用した。Ｋ５６２は、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０（Gibco、Grand  Island、NY、USA）で維持された。Ｒａｍｏｓは、１０％ＦＢＳ（fetal  bovine  serum；Gibco、Grand  Island、NY、USA）を含むＲＰＭＩ−１６４０（ATCC）（Manassas、VA）で維持（maintain）された。ＭＣＦ−７は、ＥＭＥＭ（ATCC）+  １０％ＦＢＳ（Gibco）培地で維持され、Ｈ１２９９、Ｈ１９４４細胞株は、ＲＰＭＩ−１６４０（ATCC）+１０％ＦＢＳ（Gibco）で維持された。ＮＫ−９２ＭＩおよび形質転換されたＮＫ−９２ＭＩ細胞は、１％ヒト血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）無血清培地で維持された。ヒト胚腎臓繊維芽細胞（Human  embryonic  kidney  fibroblast）である２９３Ｔ細胞株は、ＡＴＣＣから供給されたものを使用し、１０％ＦＢＳ（Gibco、Grand  Island、NY、USA）を含むＤＭＥＭ（Gibco、Grand  Island、NY、USA）で維持された。
【００８４】
プラスミド
ＦＣＲＧ３Ａ  Ｖ１５８変異（ＣＤ１６Ｖ）のシグナル配列（signal  sequence）および細胞外ドメイン（extracellular  domain）；ＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメイン（extracellular  domain）；ＣＤ８αのシグナル配列、ＣＤ８αのヒンジ（hinge）および膜貫通ドメイン（transmembrane  domain）；ＣＤ２８のヒンジ（hinge）および膜貫通ドメイン；４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）およびＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメイン（intracellular  signaling  domain）は、それぞれ人工的に合成された。これらはＳＯＥ−ＰＣＲ（splicing  by  overlapping  extension  by  PCR）を用いて、様々な組み合わせで組み立て（assemble）られた。ＰＣＲ結果物は、直接配列分析（direct  sequencing）により確認された。ＰＣＲ結果物は、Ｎｈｅ１およびＥｃｏＲＩに切断された後、第３世代自己−不活性化レンチウイルス発現ベクター（third  generation  self−inactivating  lentiviral  expression  vector）であるＭＳＣＶ−ＥＦ１α−ＧＦＰベクターまたはＥＦ１a−ＭＣＳベクターのＮｈｅ１およびＥｃｏＲＩサイトに挿入（ligation）された。
【００８５】
本発明の実施形態に係るキメラ抗原受容体（chimeric  antigen  receptor、CAR）を表１にまとめた。本発明の実施形態に係るすべてのＣＡＲのドメインは、互いに直列に（in  tandem）連結されたものであり、またｉｎ  ｆｒａｍｅで連結されたものである。
【００８６】
【表１】
0006971319.tif 000002
【００８７】
ＣＤ１６Ｖ−Ｚ  ＣＡＲ（第１世代）は、ＣＤ１６のシグナル配列ドメイン（３４−８４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ５２６４５）；ＣＤ１６Ｖ（ＦＣＲＧ３Ａ  Ｖ１５８）の細胞外ドメイン（８５−６５１ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ５２６４５の５５９番ヌクレオチドのＧ突然変異）；ヒトＣＤ８α由来のヒンジおよび膜貫通ドメイン（１２９２−１５０７ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ００１７６８．６）；及び、ＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（２９９−６３４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ０００７３４．３）；とｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ  ＴＧＡが連結されたものである。
【００８８】
ＣＤ１６Ｖ−ＢＢＺ  ＣＡＲ（第２世代）は、ＣＤ１６のシグナル配列ドメイン（３４−８４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ５２６４５）；ＣＤ１６Ｖ（ＦＣＲＧ３Ａ  Ｖ１５８）の細胞外ドメイン（８５−６５１ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ５２６４５の５５９番ヌクレオチドのＧ突然変異）；ヒトＣＤ８α由来のヒンジおよび膜貫通ドメイン（１２９２−１５０７ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１７６８．６）；ＣＤ１３７由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（９０１−１０２６ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１５６１．５）；及び、ＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（２９９−６３４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ０００７３４．３）；とｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ  ＴＧＡが連結されたものである。
【００８９】
ＣＤ１６Ｖ−ＯＸ４０Ｚ  ＣＡＲ（第２世代）は、ＣＤ１６のシグナル配列ドメイン（３４−８４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ５２６４５）；ＣＤ１６Ｖ（ＦＣＲＧ３Ａ  Ｖ１５８）の細胞外ドメイン（８５−６５１ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ５２６４５の５５９番ヌクレオチドのＧ突然変異）；ヒトＣＤ８α由来のヒンジおよび膜貫通ドメイン（１２９２−１５０７ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１７６８．６）；ＣＤ１３４由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（７３３−８４０ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＢ５９０５８４．１）；及び、ＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（２９９−６３４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ０００７３４．３）；とｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ  ＴＧＡが連結されたものである。
【００９０】
ＣＤ１６Ｖ−ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ（第２世代）は、ＣＤ１６のシグナル配列ドメイン（３４−８４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ５２６４５）；ＣＤ１６Ｖ（ＦＣＲＧ３Ａ  Ｖ１５８）の細胞外ドメイン（８５−６５１ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ５２６４５の５５９番ヌクレオチドのＧ突然変異）；ヒトＣＤ８α由来のヒンジおよび膜貫通ドメイン（１２９２−１５０７ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１７６８．６）；ＣＤ２５２由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（１４１−２０６ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ００３３２６．４）；及び、ＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（２９９−６３４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ０００７３４．３）；とｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ  ＴＧＡが連結されたものである。
【００９１】
ＣＤ１６Ｖ−ＺＯＸ４０Ｌ  ＣＡＲ（第２世代）は、ＣＤ１６のシグナル配列ドメイン（３４−８４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ５２６４５）；ＣＤ１６Ｖ（ＦＣＲＧ３Ａ  Ｖ１５８）の細胞外ドメイン（８５−６５１ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ５２６４５の５５９番ヌクレオチドのＧ突然変異）；ヒトＣＤ８α由来のヒンジおよび膜貫通ドメイン（１２９２−１５０７ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１７６８．６）；ＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（２９９−６３４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ０００７３４．３）；及び、ＣＤ２５２由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（１４１−２０６ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ００３３２６．４）；とｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ  ＴＧＡが連結されたものである。ＣＤ１６Ｖ−２８Ｚ  ＣＡＲ（第２世代）は、ＣＤ１６のシグナル配列ドメイン（３４−８４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ５２６４５）；ＣＤ１６Ｖ（ＦＣＲＧ３Ａ  Ｖ１５８）の細胞外ドメイン（８５−６５１ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ５２６４５の５５９番ヌクレオチドのＧ突然変異）；ヒトＣＤ８α由来のヒンジ（１２９２−１４３５ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１７６８．６）；ＣＤ２８由来の膜貫通および細胞内シグナル伝達ドメイン（６７９−８８２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００６１３９．３）；及び、ＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（２９９−６３４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ０００７３４．３）；とｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ  ＴＧＡが連結されたものである。
【００９２】
ＣＤ１６Ｖ−２８（Ｈ）Ｚ  ＣＡＲ（第２世代）は、ＣＤ１６のシグナル配列ドメイン（３４−８４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ５２６４５）；ＣＤ１６Ｖ（ＦＣＲＧ３Ａ  Ｖ１５８）の細胞外ドメイン（８５−６５１ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ５２６４５の５５９番ヌクレオチドのＧ突然変異）；ＣＤ２８由来のヒンジ、膜貫通および細胞内シグナル伝達ドメイン（５６２−８８２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００６１３９．３）；及び、ＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（２９９−６３４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ０００７３４．３）；とｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ  ＴＧＡが連結されたものである。
【００９３】
ＣＤ１６Ｖ−ＢＢＯＸ４０Ｚ  ＣＡＲ（第３世代）は、ＣＤ１６のシグナル配列ドメイン（３４−８４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ５２６４５）；ＣＤ１６Ｖ（ＦＣＲＧ３Ａ  Ｖ１５８）の細胞外ドメイン（８５−６５１ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ５２６４５の５５９番ヌクレオチドのＧ突然変異）；ヒトＣＤ８α由来のヒンジおよび膜貫通ドメイン（１２９２−１５０７ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１７６８．６）；ＣＤ１３７由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（９０１−１０２６ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１５６１．５）；ＣＤ１３４由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（７３３−８４０ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＢ５９０５８４．１）；及び、ＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（２９９−６３４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ０００７３４．３）；とｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ  ＴＧＡが連結されたものである。
【００９４】
ＣＤ１６Ｖ−ＯＸ４０ＢＢＺ  ＣＡＲ（第３世代）は、ＣＤ１６のシグナル配列ドメイン（３４−８４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ５２６４５）；ＣＤ１６Ｖ（ＦＣＲＧ３Ａ  Ｖ１５８）の細胞外ドメイン（８５−６５１ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ５２６４５の５５９番ヌクレオチドのＧ突然変異）；ヒトＣＤ８α由来のヒンジおよび膜貫通ドメイン（１２９２−１５０７ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１７６８．６）；ＣＤ１３４由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（７３３−８４０ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＢ５９０５８４．１）；ＣＤ１３７由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（９０１−１０２６ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ００１５６１．５）；及び、ＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（２９９−６３４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ０００７３４．３）；とｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ  ＴＧＡが連結されたものである。
【００９５】
ＣＤ１６Ｖ−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ（第３世代）は、ＣＤ１６のシグナル配列ドメイン（３４−８４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ５２６４５）；ＣＤ１６Ｖ（ＦＣＲＧ３Ａ  Ｖ１５８）の細胞外ドメイン（８５−６５１ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ５２６４５の５５９番ヌクレオチドのＧ突然変異）；ＣＤ８α由来のヒンジドメイン（１２９２−１４３５ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１７６８．６）；ＣＤ２８由来の膜貫通および細胞内シグナル伝達ドメイン（６７９−８８２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００６１３９．３）；ＣＤ１３７由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（９０１−１０２６ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ００１５６１．５）；及び、ＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（２９９−６３４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ０００７３４．３）；とｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ  ＴＧＡが連結されたものである。
【００９６】
ＣＤ１６Ｖ−２８ＯＸ４０Ｚ  ＣＡＲ（第３世代）は、ＣＤ１６のシグナル配列ドメイン（３４−８４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ５２６４５）；ＣＤ１６Ｖ（ＦＣＲＧ３Ａ  Ｖ１５８）の細胞外ドメイン（８５−６５１ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ５２６４５の５５９番ヌクレオチドのＧ突然変異）；ＣＤ８α由来のヒンジドメイン（１２９２−１４３５ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１７６８．６）；ＣＤ２８由来の膜貫通および細胞内シグナル伝達ドメイン（６７９−８８２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００６１３９．３）；ＣＤ１３４由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（７３３−８４０ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＢ５９０５８４．１）；及び、ＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（２９９−６３４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ０００７３４．３）；とｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ  ＴＧＡが連結されたものである。
【００９７】
ＣＤ１６Ｖ−２８ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ（第３世代）は、ＣＤ１６のシグナル配列ドメイン（３４−８４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ５２６４５）；ＣＤ１６Ｖ（ＦＣＲＧ３Ａ  Ｖ１５８）の細胞外ドメイン（８５−６５１ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ５２６４５の５５９番ヌクレオチドのＧ突然変異）；ＣＤ８α由来のヒンジドメイン（１２９２−１４３５ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１７６８．６）；ＣＤ２８由来の膜貫通および細胞内シグナル伝達ドメイン（６７９−８８２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００６１３９．３）；ＣＤ２５２由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（１４１−２０６ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００３３２６．４）；及び、ＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（２９９−６３４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ０００７３４．３）；とｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ  ＴＧＡが連結されたものである。
【００９８】
ＣＤ１６Ｖ−２８（Ｈ）ＢＢＺ  ＣＡＲ（第３世代）は、ＣＤ１６のシグナル配列ドメイン（３４−８４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ５２６４５）；ＣＤ１６Ｖ（ＦＣＲＧ３Ａ  Ｖ１５８）の細胞外ドメイン（８５−６５１ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ５２６４５の５５９番ヌクレオチドのＧ突然変異）；ＣＤ２８由来のヒンジ、膜貫通および細胞内シグナル伝達ドメイン（５６２−８８２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００６１３９．３）；ＣＤ１３７由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（９０１−１０２６ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１５６１．５）；及び、ＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（２９９−６３４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ０００７３４．３）；とｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ  ＴＧＡが連結されたものである。
【００９９】
ＣＤ１６Ｖ−２８（Ｈ）ＯＸ４０Ｚ  ＣＡＲ（第３世代）は、ＣＤ１６のシグナル配列ドメイン（３４−８４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ５２６４５）；ＣＤ１６Ｖ（ＦＣＲＧ３Ａ  Ｖ１５８）の細胞外ドメイン（８５−６５１ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ５２６４５の５５９番ヌクレオチドのＧ突然変異）；ＣＤ２８由来のヒンジ、膜貫通および細胞内シグナル伝達ドメイン（５６２−８８２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００６１３９．３）；ＣＤ１３４由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（７３３−８４０ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＢ５９０５８４．１）；及び、ＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（２９９−６３４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ０００７３４．３）；とｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ  ＴＧＡが連結されたものである。
【０１００】
ＣＤ１６Ｖ−２８（Ｈ）ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ（第３世代）は、ＣＤ１６のシグナル配列ドメイン（３４−８４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ５２６４５）；ＣＤ１６Ｖ（ＦＣＲＧ３Ａ  Ｖ１５８）の細胞外ドメイン（８５−６５１ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ５２６４５の５５９番ヌクレオチドのＧ突然変異）；ＣＤ２８由来のヒンジ、膜貫通および細胞内シグナル伝達ドメイン（５６２−８８２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００６１３９．３）；ＣＤ２５２由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（１４１−２０６ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００３３２６．４）；及び、ＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（２９９−６３４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ０００７３４．３）；とｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ  ＴＧＡが連結されたものである。
【０１０１】
ＣＤ１６Ｖ−ＢＢＯＸ４０ＬＺ（第３世代）は、ＣＤ１６のシグナル配列ドメイン（３４−８４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ５２６４５）；ＣＤ１６Ｖ（ＦＣＲＧ３Ａ  Ｖ１５８）の細胞外ドメイン（８５−６５１ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ５２６４５の５５９番ヌクレオチドのＧ突然変異）；ヒトＣＤ８α由来のヒンジおよび膜貫通ドメイン（１２９２−１５０７ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１７６８．６）；ＣＤ１３７由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（９０１−１０２６ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１５６１．５）；ＣＤ２５２由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（１４１−２０６ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００３３２６．４）；及び、ＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（２９９−６３４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ０００７３４．３）；とｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ  ＴＧＡが連結されたものである。
【０１０２】
本発明の実施形態に係るキメラ抗原受容体（chimeric  antigen  receptor、CAR）及びその製造に使用されたドメインの配列表を表２に示す。
【０１０３】
【表２】
0006971319.tif 000003
0006971319.tif 000004
【０１０４】
また、本発明の実施形態に係るキメラ抗原受容体（chimeric  antigen  receptor、CAR）を表３にまとめた。本発明の実施形態に係るすべてのＣＡＲのドメインは、互いに直列に（in  tandem）連結されたものであり、またｉｎ  ｆｒａｍｅで連結されたものである。
【０１０５】
【表３】
0006971319.tif 000005
【０１０６】
ＮＫＧ２Ｄ−Ｚ  ＣＡＲ（第１世代）は、ＣＤ８αのシグナル配列ドメイン（８９０−９５２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１７６８．６）；ＮＫＧ２Ｄの細胞外ドメイン（７８８−１１９２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＡＦ４６１８１１．１）；ヒトＣＤ８α由来のヒンジおよび膜貫通ドメイン（１２９２−１５０７ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１７６８．６）；及び、ＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（２９９−６３４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ０００７３４．３）；とｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ  ＴＧＡが連結されたものである。
【０１０７】
ＮＫＧ２Ｄ−ＢＢＺ  ＣＡＲ（第２世代）は、ＣＤ８αのシグナル配列ドメイン（８９０−９５２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１７６８．６）；ＮＫＧ２Ｄの細胞外ドメイン（７８８−１１９２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＡＦ４６１８１１．１）；ヒトＣＤ８α由来のヒンジおよび膜貫通ドメイン（１２９２−１５０７ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１７６８．６）；ＣＤ１３７由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（９０１−１０２６ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１５６１．５）；及び、ＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（２９９−６３４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ０００７３４．３）；とｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ  ＴＧＡが連結されたものである。
【０１０８】
ＮＫＧ２Ｄ−ＯＸ４０Ｚ  ＣＡＲ（第２世代）は、ＣＤ８αのシグナル配列ドメイン（８９０−９５２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１７６８．６）；ＮＫＧ２Ｄの細胞外ドメイン（７８８−１１９２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＡＦ４６１８１１．１）；ヒトＣＤ８α由来のヒンジおよび膜貫通ドメイン（１２９２−１５０７ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１７６８．６）；ＣＤ１３４由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（７３３−８４０ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＢ５９０５８４．１）；及び、ＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（２９９−６３４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ０００７３４．３）；とｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ  ＴＧＡが連結されたものである。
【０１０９】
ＮＫＧ２Ｄ−ＺＯＸ４０Ｌ  ＣＡＲ（第２世代）は、ＣＤ８αのシグナル配列ドメイン（８９０−９５２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１７６８．６）；ＮＫＧ２Ｄの細胞外ドメイン（７８８−１１９２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＡＦ４６１８１１．１）；ヒトＣＤ８α由来のヒンジおよび膜貫通ドメイン（１２９２−１５０７ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１７６８．６）；ＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（２９９−６３４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ０００７３４．３）、及び、ＣＤ２５２由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（１４１−２０６ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００３３２６．４）と、ＣＤ３ζｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ  ＴＧＡが連結されたものである。
【０１１０】
ＮＫＧ２Ｄ−２８Ｚ  ＣＡＲ（第２世代）は、ＣＤ８αのシグナル配列ドメイン（８９０−９５２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１７６８．６）；ＮＫＧ２Ｄの細胞外ドメイン（７８８−１１９２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＡＦ４６１８１１．１）；ヒトＣＤ８α由来のヒンジ（１２９２−１４３５ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１７６８．６）；ＣＤ２８由来の膜貫通および細胞内シグナル伝達ドメイン（６７９−８８２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００６１３９．３）；及び、ＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（２９９−６３４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ０００７３４．３）；とｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ  ＴＧＡが連結されたものである。
【０１１１】
ＮＫＧ２Ｄ−２８（Ｈ）Ｚ  ＣＡＲ（第２世代）は、ＣＤ８αのシグナル配列ドメイン（８９０−９５２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１７６８．６）；ＮＫＧ２Ｄの細胞外ドメイン（７８８−１１９２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＡＦ４６１８１１．１）；ＣＤ２８由来のヒンジ、膜貫通および細胞内シグナル伝達ドメイン（５６２−８８２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００６１３９．３）；及び、ＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（２９９−６３４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ０００７３４．３）；とｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ  ＴＧＡが連結されたものである。
【０１１２】
ＮＫＧ２Ｄ−ＢＢＯＸ４０Ｚ  ＣＡＲ（第３世代）は、ＣＤ８αのシグナル配列ドメイン（８９０−９５２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１７６８．６）；ＮＫＧ２Ｄの細胞外ドメイン（７８８−１１９２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＡＦ４６１８１１．１）；ヒトＣＤ８α由来のヒンジおよび膜貫通ドメイン（１２９２−１５０７ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１７６８．６）；ＣＤ１３７由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（９０１−１０２６ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１５６１．５）；ＣＤ１３４由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（７３３−８４０ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＢ５９０５８４．１）；及び、ＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（２９９−６３４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ０００７３４．３）；とｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ  ＴＧＡが連結されたものである。
【０１１３】
ＮＫＧ２Ｄ−ＢＢＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ（第３世代）は、ＣＤ８αのシグナル配列ドメイン（８９０−９５２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１７６８．６）；ＮＫＧ２Ｄの細胞外ドメイン（７８８−１１９２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＡＦ４６１８１１．１）；ヒトＣＤ８α由来のヒンジおよび膜貫通ドメイン（１２９２−１５０７ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１７６８．６）；ＣＤ１３７由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（９０１−１０２６ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１５６１．５）；ＣＤ２５２由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（１４１−２０６ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００３３２６．４）；及び、ＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（２９９−６３４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ０００７３４．３）；とｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ  ＴＧＡが連結されたものである。
【０１１４】
ＮＫＧ２Ｄ−ＯＸ４０ＢＢＺ  ＣＡＲ（第３世代）は、ＣＤ８αのシグナル配列ドメイン（８９０−９５２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１７６８．６）；ＮＫＧ２Ｄの細胞外ドメイン（７８８−１１９２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＡＦ４６１８１１．１）；ヒトＣＤ８α由来のヒンジおよび膜貫通ドメイン（１２９２−１５０７ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１７６８．６）；ＣＤ１３４由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（７３３−８４０ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＢ５９０５８４．１）；ＣＤ１３７由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（９０１−１０２６ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１５６１．５）；及び、ＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（２９９−６３４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ０００７３４．３）；とｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ  ＴＧＡが連結されたものである。
【０１１５】
ＮＫＧ２Ｄ−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ（第３世代）は、ＣＤ８αのシグナル配列ドメイン（８９０−９５２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１７６８．６）；ＮＫＧ２Ｄの細胞外ドメイン（７８８−１１９２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＡＦ４６１８１１．１）；ＣＤ８α由来のヒンジドメイン（１２９２−１４３５ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１７６８．６）；ＣＤ２８由来の膜貫通および細胞内シグナル伝達ドメイン（６７９−８８２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００６１３９．３）；ＣＤ１３７由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（９０１−１０２６ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１５６１．５）；及び、ＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（２９９−６３４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ０００７３４．３）；とｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ  ＴＧＡが連結されたものである。
【０１１６】
ＮＫＧ２Ｄ−２８ＯＸ４０Ｚ  ＣＡＲ（第３世代）は、ＣＤ８αのシグナル配列ドメイン（８９０−９５２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１７６８．６）；ＮＫＧ２Ｄの細胞外ドメイン（７８８−１１９２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＡＦ４６１８１１．１）；ＣＤ８α由来のヒンジドメイン（１２９２−１４３５ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１７６８．６）；ＣＤ２８由来の膜貫通および細胞内シグナル伝達ドメイン（６７９−８８２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００６１３９．３）；ＣＤ１３４由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（７３３−８４０ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＢ５９０５８４．１）；及び、ＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（２９９−６３４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ０００７３４．３）；とｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ  ＴＧＡが連結されたものである。
【０１１７】
ＮＫＧ２Ｄ−２８ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ（第３世代）は、ＣＤ８αのシグナル配列ドメイン（８９０−９５２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１７６８．６）；ＮＫＧ２Ｄの細胞外ドメイン（７８８−１１９２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＡＦ４６１８１１．１）；ＣＤ８α由来のヒンジドメイン（１２９２−１４３５ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１７６８．６）；ＣＤ２８由来の膜貫通および細胞内シグナル伝達ドメイン（６７９−８８２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００６１３９．３）；ＣＤ２５２由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（１４１−２０６ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００３３２６．４）；及び、ＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（２９９−６３４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ０００７３４．３）；とｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ  ＴＧＡが連結されたものである。
【０１１８】
ＮＫＧ２Ｄ−２８（Ｈ）ＢＢＺ  ＣＡＲ（第３世代）は、ＣＤ８αのシグナル配列ドメイン（８９０−９５２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１７６８．６）；ＮＫＧ２Ｄの細胞外ドメイン（７８８−１１９２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＡＦ４６１８１１．１）；ＣＤ２８由来のヒンジ、膜貫通および細胞内シグナル伝達ドメイン（５６２−８８２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００６１３９．３）；ＣＤ１３７由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（９０１−１０２６ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１５６１．５）；及び、ＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（２９９−６３４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ０００７３４．３）；とｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ  ＴＧＡが連結されたものである。
【０１１９】
ＮＫＧ２Ｄ−２８（Ｈ）ＯＸ４０Ｚ  ＣＡＲ（第３世代）は、ＣＤ８αのシグナル配列ドメイン（８９０−９５２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１７６８．６）；ＮＫＧ２Ｄの細胞外ドメイン（７８８−１１９２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＡＦ４６１８１１．１）；ＣＤ２８由来のヒンジ、膜貫通および細胞内シグナル伝達ドメイン（５６２−８８２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００６１３９．３）；ＣＤ１３４由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（７３３−８４０ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＢ５９０５８４．１）；及び、ＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（２９９−６３４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ０００７３４．３）；とｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ  ＴＧＡが連結されたものである。
【０１２０】
ＮＫＧ２Ｄ−２８（Ｈ）ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ（第３世代）は、ＣＤ８αのシグナル配列ドメイン（８９０−９５２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１７６８．６）；ＮＫＧ２Ｄの細胞外ドメイン（７８８−１１９２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＡＦ４６１８１１．１）；ＣＤ２８由来のヒンジ、膜貫通および細胞内シグナル伝達ドメイン（５６２−８８２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００６１３９．３）；ＣＤ２５２由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（１４１−２０６ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００３３２６．４）；及び、ＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（２９９−６３４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ０００７３４．３）；とｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ  ＴＧＡが連結されたものである。
【０１２１】
ＮＫＧ２Ｄ−ＡＡＡ−２８（Ｈ）ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ（第３世代）は、ＣＤ８αのシグナル配列ドメイン（８９０−９５２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００１７６８．６）；ＮＫＧ２Ｄの細胞外ドメイン（７８８−１１９２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＡＦ４６１８１１．１）；ＡＡＡ（Triple  alanine）；ＣＤ２８由来のヒンジ、膜貫通および細胞内シグナル伝達ドメイン（５６２−８８２ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００６１３９．３）；ＣＤ２５２由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（１４１−２０６ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ  ００３３２６．４）；及び、ＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（２９９−６３４ヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ０００７３４．３）；とｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ  ＴＧＡが連結されたものである。
【０１２２】
本発明の実施形態に係るキメラ抗原受容体（chimeric  antigen  receptor、CAR）及びその製造に使用されたドメインの配列表を表４に示す。
【０１２３】
【表４】
0006971319.tif 000006
【０１２４】
ウイルスの生産および遺伝子の伝達  
ＶＳＶＧ−類似型（pseudotyped）レンチウイルスを製造するために、ＤＭＥＭ培地で培養された２９３Ｔ細胞が、様々なタイプのＰＣＤＨ１−ＭＳＣＶ−ＣＤ１６−ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ−ＥＦ１−ｃｏｐＧＦＰベクター、ＥＦ１a−ＮＫＧ２Ｄ−ｃｏｎｓｔｒｕｃｔベクター又はＰＣＤＨ１−ＭＳＣＶ−ＥＦ１−ｃｏｐＧＦＰ対照群ベクター、またはＥＦ１a−ＧＦＰ対照群ベクター（空ベクターを用いたＭｏｃｋ感染ウイルス製作用）；とＨＩＶ−ベースのｐＰＡＣＫＨ１レンチウイルスパッケージキット（System  Biosciences）で共に共形質感染され、そのために、リポフェクタミン２０００試薬（Invitrogen、Carlsbad、CA）を使用した。様々なタイプのＣＤ１６Ｖコンストラクトは、次の通りである；ＣＤ１６Ｖ−Ｚ  ＣＡＲ、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢＺ  ＣＡＲ、ＣＤ１６Ｖ−ＯＸ４０Ｚ  ＣＡＲ、ＣＤ１６Ｖ−ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ、ＣＤ１６Ｖ−ＺＯＸ４０Ｌ、ＣＤ１６Ｖ−２８Ｚ  ＣＡＲ、ＣＤ１６Ｖ−２８（Ｈ）Ｚ  ＣＡＲ、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢＯＸ４０Ｚ  ＣＡＲ、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ、ＣＤ１６Ｖ−ＯＸ４０ＢＢＺ  ＣＡＲ、ＣＤ１６Ｖ−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ、ＣＤ１６Ｖ−２８ＯＸ４０Ｚ  ＣＡＲ、ＣＤ１６Ｖ−２８ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ、ＣＤ１６Ｖ−２８（Ｈ）ＢＢＺ  ＣＡＲ、ＣＤ１６Ｖ−２８（Ｈ）ＯＸ４０Ｚ  ＣＡＲ、ＣＤ１６Ｖ−２８（Ｈ）ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ。様々なタイプのＮＫＧ２Ｄコンストラクトは、次の通りである；ＮＫＧ２Ｄ−Ｚ  ＣＡＲ、ＮＫＧ２Ｄ−ＢＢＺ  ＣＡＲ、ＮＫＧ２Ｄ−ＯＸ４０Ｚ  ＣＡＲ、ＮＫＧ２Ｄ−ＺＯＸ４０Ｌ  ＣＡＲ、ＮＫＧ２Ｄ−２８Ｚ  ＣＡＲ、ＮＫＧ２Ｄ−２８（Ｈ）Ｚ  ＣＡＲ、ＮＫＧ２Ｄ−ＢＢＯＸ４０Ｚ  ＣＡＲ、ＮＫＧ２Ｄ−ＢＢＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ、ＮＫＧ２Ｄ−ＯＸ４０ＢＢＺ  ＣＡＲ、ＮＫＧ２Ｄ−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ、ＮＫＧ２Ｄ−２８ＯＸ４０Ｚ  ＣＡＲ、ＮＫＧ２Ｄ−２８ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ、ＮＫＧ２Ｄ−２８（Ｈ）ＢＢＺ  ＣＡＲ、ＮＫＧ２Ｄ−２８（Ｈ）ＯＸ４０Ｚ  ＣＡＲ、ＮＫＧ２Ｄ−２８（Ｈ）ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ、ＮＫＧ２Ｄ−ＡＡＡ−２８（Ｈ）ＯＸ４０ＬＺ。レンチウイルスは、フラスコに８０％程度密集したＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、様々なタイプのＣＤ１６Ｖコンストラクト発現ベクター、ＮＫＧ２Ｄコンストラクト発現ベクター又は対照群プラスミド；をｐＰＡＣＫＨ１レンチウイルスパッケージングプラスミドと共に形質感染させることによって製造された。６時間後、培地は１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に入れ替えた。レンチウイルスを含むｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍは、形質感染後の４８時間後に採集し、細胞片（cell  debris）を除去するために、０．４５μｍのフィルターユニット（Milliopore、Billerica、MA、USA）を用いてフィルタリングされた。ウイルスを含む上清液（viral  supernatant）は、Ａｍｉｃｏｎ  Ｆｉｌｔｅｒ（Millipore）を用いて３０００ｒｐｍ及び４℃で２０分間遠心分離することにより、約５０倍濃縮された。濃縮されたウイルスは、−８０℃で保管された。
【０１２５】
レンチウイルス感染のために、対数増殖期にあるＮＫ９２ＭＩ細胞は、１％ヒト血漿を含むＣｅｌｌｇｒｏ（Cellgenix）を用いて１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度に調節され、その後、レンチウイルス上清液が５０−１００ＭＯＩで８μg／ｍｌポリブレン（polybrene）の存在下で追加され、１８００ｇで９０分間遠心分離された。遠心分離後、細胞は４８時間、３７℃及び５％ＣＯ２の条件の加湿インキュベーターで静置された。その後、細胞は、ＲＰＭＩ−１６４０で２回洗浄した後、次の使用時まで１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０で静置された。対照群細胞は、ベクターのみを用いて形質導入された。
【０１２６】
ＣＤ１６ＶまたはＮＫＧ２Ｄを含む受容体の発現の検出  
ＣＤ１６Ｖ  ＣＡＲ−形質導入されたＮＫ９２ＭＩ細胞、ＮＫＧ２Ｄ  ＣＡＲ−形質導入されたＮＫ９２ＭＩ細胞、対照群ベクター−形質導入されたＮＫ９２ＭＩ（NK92MI−Mock）、またはＮＫ９２ＭＩ母細胞は、ＦＡＣＳ緩衝液を用いて２回洗浄した。細胞は、７−ＡＡＤ（Beckman  coulter）、抗−ＣＤ３、抗−ＣＤ５６および抗−ＣＤ１６（BD  Biosciences）ｍＡｂｓを用いて染色した。染色された細胞の発現率および平均蛍光強度（mean  fluorescence  intensity、MFI）は、ＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａを用いて測定した。
【０１２７】
ＮＫＧ２Ｄコンストラクトを用いた形質導入の効率は、ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞の中でＮＫＧ２Ｄを発現する細胞を流細胞分析することにより測定した。ＮＫ９２ＭＩ細胞は、まず、シングルレット（singlet）に対してゲート（gate）され、その後、７ＡＡＤ−およびＣＤ３−ＣＤ５６＋に対してゲートされた。ＣＤ１６コンストラクトを用いた形質転換の効率は、ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞の中でＧＦＰおよびＣＤ１６を発現する細胞を流細胞分析することにより測定した。
【０１２８】
カルセイン放出細胞毒性アッセイ  
標的細胞は、３０μＭカルセインアセトキシメチルエステル（Calcein−acetoxymethyl  ester、Calcein−AM；Molecular  probes）を用いて、３７℃で１時間標識（label）された。洗浄後、標識された標的細胞は、９６−ウェルプレートに１ｘ１０４ｃｅｌｌｓ  ｐｅｒ  ｗｅｌｌで分配された。ＮＫ９２ＭＩ細胞は、収穫（harvest）され、洗浄された後、様々なＥ／Ｔ（effector−to−target）比および様々な濃度のリツキシマブ（rituximab）を含むか又は含まない条件にて添加された。対照群としては、リツキシマブと無関係な抗−ヒト抗体（Sigma  aldrich）が使用された。２時間後、プレートは２０００ｒｐｍで３分間遠心分離され、１００μＬの上清液が採取され、蛍光マイクロプレートリーダー（Victor3、PerkinElmer）により励起波長４８５ｎｍおよび発光波長５３５ｎｍでのカルセイン放出を測定した。具体的なカルセイン放出量は、次の式より計算した：percent  specific  lysis  =（test  release-spontaneous  release）×100/（maximal  release-spontaneous  release）。Ｍａｘｉｍａｌ  ｌｙｓｉｓには、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使用した。
【０１２９】
実施例２：ＯＸ４０リガンド（ＣＤ２５２）を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＮＫ９２ＭＩ細胞のＣＤ２０−陽性リンパ腫細胞に対する細胞毒性の評価
共同刺激モチーフと連結されたＣＤ１６Ｖを含むキメラ抗原受容体の形質導入及び発現
ＦＣＲＧ３Ａ（ＣＤ１６）のＶ１５８変異体（polymorphism）は、高親和度の免疫グロブリン（immunoglobulin）Ｆｃ受容体であり、抗体治療に良い効果を出すものと考えられている。本発明者らは、ＦＣＲＧ３Ａ（ＣＤ１６）のＶ１５８変異体（variant）を製造し、ＣＤ８αのヒンジおよび膜貫通ドメイン；Ｔ細胞刺激分子であるＣＤ３ζ；及び、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、およびＯＸ−４０リガンドを含む様々な共同刺激分子（costimulatory  molecules）の細胞内ドメインを様々な組み合わせで結合（combine）した（表１）。このようにして製造されたＣＤ１６Ｖを含むキメラ抗原受容体（ＣＤ１６Ｖ−Ｚ  ＣＡＲ（第１世代）、ＣＤ１６Ｖ−２８Ｚ  ＣＡＲ（第２世代）、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢＺ  ＣＡＲ（第２世代）、ＣＤ１６Ｖ−ＯＸ４０Ｚ  ＣＡＲ（第２世代）、またはＣＤ１６Ｖ−２８ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ（第３世代））は、ＭＳＣＶプロモーターを含むレンチウイルスベクターを使用してＮＫ９２ＭＩ細胞で発現された。各々のＣＡＲがＮＫ９２ＭＩ細胞の表面で発現されるかどうかは、単クローンマウス抗−ヒト抗体を使用してヒトＣＤ１６を検出することにより確認された。流細胞分析を用いた反復実験によって、ＮＫ９２ＭＩ細胞でＣＡＲが９０％以上の効率で形質導入されたことが確認された（図１Ａ）。このとき使用したレンチウイルスベクターの量は、感染倍数（MOI、multiple  of  infection）５０以上を使用した。
【０１３０】
ＣＤ２５２（ＯＸ４０リガンド）と結合されたＣＤ１６Ｖ受容体を発現するＮＫ９２ＭＩ細胞のＣＤ２０−陽性リンパ腫に対する細胞死滅の増加の効果
本発明に係る遺伝的変形（genetic  modification）が、がん細胞死滅の増加を誘導するかどうかを確認するために、空ベクターのみで形質導入されたＮＫ９２ＭＩ細胞およびＣＤ１６Ｖを含む受容体を発現するＮＫ９２ＭＩ細胞のＣＤ２０−陽性リンパ腫細胞（Ramos細胞）に対する細胞毒性をＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭ放出アッセイを用いて評価した。
【０１３１】
リンパ腫細胞をテストするに先立ち、標準対照群（standard  control）としてヒト赤白血（erythroleukemic）細胞株であるＫ５６２を使用して、形質導入されたＮＫ９２ＭＩ細胞の内在的（instrinsic）な細胞殺害能力を評価した。感染倍数（MOI、multiple  of  infection）５０以上のレンチウイルスを使用した形質導入によって、本発明に係る各々のＣＡＲ（ＣＤ１６Ｖ−Ｚ  ＣＡＲ（第１世代）、ＣＤ１６Ｖ−２８Ｚ  ＣＡＲ（第２世代）、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢＺ  ＣＡＲ（第２世代）、ＣＤ１６Ｖ−ＯＸ４０Ｚ  ＣＡＲ（第２世代）、またはＣＤ１６Ｖ−２８ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ（第３世代））は、９０％以上のＮＫ９２ＭＩ細胞で高いレベルで発現された（図１Ａ）。
【０１３２】
本発明に係るＣＡＲを発現するＮＫ９２ＭＩ細胞のＫ５６２に対する細胞毒性は、空ベクターのみで形質導入された対照群（Mock）のＫ５６２に対する細胞殺害能と類似していることが示された。これは、遺伝的な変形そのものに起因した副作用によって、ＮＫ９２ＭＩ細胞のターゲットに対する内在的な細胞殺害能が増加したものではないことを意味する（図１Ｂ）。図１Ｂにおいて、５：１、２．５：１、１：１および０．５：１は、作用細胞（effector  cell）であるＮＫ９２ＭＩ細胞の数と、標的細胞（target  cell）であるＫ５６２細胞の数の比を示す。
【０１３３】
様々な共同刺激分子がＣＤ１６Ｖを含む受容体を発現するＮＫ９２ＭＩ細胞の抗原特異的抗がん活性にインビトロ（in  vitro）でどのような影響を与えるかを評価するために、形質導入されたＮＫ９２ＭＩ細胞およびがん細胞（Ｂ−細胞リンパ腫細胞株であるＲａｍｏｓ）を空培養した後、がん細胞の溶解（lysis）をＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭ放出アッセイを用いて評価した（図１Ｃ）。図１Ｃにおいて、５：１、２．５：１、１：１及び０．５：１は、作用細胞（effector  cell）であるＮＫ９２ＭＩ細胞の数と、標的細胞（target  cell）であるＲａｍｏｓ細胞の数の比を示す。ＮＫ９２ＭＩ細胞自体は、ＣＤ１６を発現しないため、リツキシマブが存在してもＮＫ９２ＭＩによる細胞死滅が増加しないことが知られている。
【０１３４】
図１Ｃに示すように、リツキシマブが存在しない場合、本発明のＣＡＲのＮＫ９２ＭＩ媒介のＲａｍｏｓ細胞に対する細胞殺害能は、ＧＦＰのみを含むベクターで形質転換された対照群（Mock）と類似した程度であり、細胞殺害能をほとんど示さなかった。ＣＤ３ζのみを細胞内シグナル伝達ドメインとして含むＣＡＲ（ＣＤ１６Ｖ−Ｚ）は、従来の様々なＣＡＲ開発においてがん細胞死滅を示すことが示されたものであり、本実験では、陽性対照群として使用された。
【０１３５】
ＣＤ１６Ｖを含む受容体の細胞毒性を増加させるために、本発明者らはＣＤ２８、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、またはＣＤ２５２（ＯＸ４０リガンド）をＣＤ１６Ｖ−Ｚ  ＣＡＲに導入した。２時間インビトロ細胞殺害能試験（2−hour  in  vitro  cytotoxicity  assays）において、ＣＤ１６Ｖ−Ｚ  ＣＡＲ（第１世代）、ＣＤ１６Ｖ−２８Ｚ  ＣＡＲ（第２世代）、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢＺ  ＣＡＲ（第２世代）、ＣＤ１６Ｖ−ＯＸ４０Ｚ  ＣＡＲ  （第２世代）、またはＣＤ１６Ｖ−２８ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ（第３世代）を発現するＮＫ−９２ＭＩ細胞は、リツキシマブの存在下で、５：１及び２．５：１の作用細胞：標的細胞比においてＲａｍｏｓ細胞に強い殺害能を示した。その中でも特に、ＯＸ４０リガンドを含む第３世代ＣＡＲであるＣＤ１６Ｖ−２８ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲが、他のＣＡＲと比較して最も強い殺害能を示した（図１Ｃ）。
【０１３６】
ＯＸ４０リガンドが含まれている第２世代ＣＡＲがＮＫ９２ＭＩ細胞の抗がん活性を増強できるかどうかを調べるために、ＣＤ１６Ｖ−ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲを製作して細胞殺害能を評価した。レンチウイルスベクターを使用してＮＫ９２ＭＩ細胞にＣＤ１６Ｖ−ＯＸ４０ＬＺを形質導入したときに発現がされず（図１Ｄ）、リツキシマブの存在下でもＲａｍｏｓ細胞に対する殺害能を示さなかった（図１Ｅ）。そこで、本発明者らは、ＯＸ４０リガンドは、ｔｙｐｅＩＩタンパク質であり、ＯＸ４０リガンドに連結されたＣＤ３ζはｔｙｐｅＩタンパク質であることに着目し、両方のドメインの順序を変えて、ＣＤ３ζがＮ−末端に、ＯＸ４０リガンドがＣ−末端に位置するＣＤ１６Ｖ−ＺＯＸ４０Ｌ  ＣＡＲを製作した。ＭＳＣＶプロモーターを含むレンチウイルスベクターを使用してＮＫ９２ＭＩ細胞にＣＤ１６Ｖ−ＺＯＸ４０Ｌを形質導入したとき、ＮＫ９２ＭＩ細胞は、ＣＤ１６Ｖ−ＯＸ４０ＬＺを形質導入した場合とは異なり、ＣＤ１６Ｖ−ＺＯＸ４０Ｌを効果的に発現することを確認した（図１Ｆ）。また、ＣＤ１６Ｖ−ＺＯＸ４０Ｌが導入された第２世代ＣＡＲの抗がん活性を評価したとき、リツキシマブの存在下で１０：１、５：１および２．５：１の作用細胞：標的細胞比においてＲａｍｏｓ細胞に強い殺害能を示した（図１Ｇ）。ＯＸ４０リガンドを含むＣＤ１６Ｖ−２８ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ（第３世代）のみならず、ＣＤ１６Ｖ−ＺＯＸ４０Ｌ  ＣＡＲ（第２世代）もまた陽性対照群のＣＤ１６Ｖ−Ｚ  ＣＡＲよりも抗がん活性に優れていることを確認した。
【０１３７】
ＣＤ１６Ｖ−ＢＢＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲの効能の評価
ＣＤ１３７（４１ＢＢ）シグナル伝達ドメインを基盤とするＣＡＲにＯＸ４０リガンドを導入し、ＮＫ９２ＭＩ細胞での発現および細胞毒性を評価した。ＣＤ１６Ｖ−ＢＢＺ  ＣＡＲ（第２世代）とＣＤ１６Ｖ−ＢＢＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ（第３世代）の両方ともＮＫ９２ＭＩ細胞で高いレベルで発現された（図２Ａ）。イン・ビトロ細胞殺害能試験において、リツキシマブが存在しないときは、ＣＤ１６Ｖ−Ｚ、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢＺ、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢＯＸ４０ＬＺのすべてがＲａｍｏｓ細胞に対して低い殺害能を示したが、リツキシマブが存在するときは、すべての作用細胞：標的細胞比においてＯＸ４０リガンドが組み合わされたＣＤ１６Ｖ−ＢＢＯＸ４０ＬＺが最も強い細胞殺害能を示した（図２Ｂ）。
【０１３８】
ＣＤ１６Ｖ−２８ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲと他のＣＡＲの効能の比較
次に、本発明者らは、ＣＤ１６Ｖ−２８ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲを発現するＮＫ９２ＭＩ細胞と、これとは異なる細胞内シグナル伝達ドメインを有する第３世代ＣＡＲを発現するＮＫ９２ＭＩ細胞の細胞毒性を比較した。本実験に使用された第３世代ＣＡＲ（ＣＤ１６Ｖ−２８ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ、ＣＤ１６Ｖ−２８ＯＸ４０Ｚ  ＣＡＲ、ＣＤ１６Ｖ−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ）は、いれずもＮＫ９２ＭＩ細胞で高いレベルで発現されることを確認した（図３Ａ）。
【０１３９】
本発明に係る様々な第３世代ＣＡＲ（third  generation  chimeric  antigen  receptor）のＮＫ細胞活性化効能を比較して、その結果を図３Ｂにまとめた。図３Ｂに示すように、前記のＣＡＲは、いずれもリツキシマブが存在しないときは、Ｒａｍｏｓ細胞に対して低い細胞殺害能を示し、細胞殺害能の程度がすべて類似したが、リツキシマブが存在するときは、ＣＤ１６Ｖ−２８ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ、ＣＤ１６Ｖ−２８ＯＸ４０Ｚ  ＣＡＲおよびＣＤ１６Ｖ−２８ＢＢＺ  ＣＡＲのすべてがＲａｍｏｓ細胞に対して高い細胞殺害能を示した。中でも特に、ＯＸ４０リガンドを含むＣＤ１６Ｖ−２８ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲが最も優れた細胞殺害能を示した（図３Ｂ）。
【０１４０】
ヒンジにＣＤ２８を含むＯＸ４０リガンドを含む第３世代ＣＡＲの効能の評価
ＣＡＲ発現ナチュラルキラー細胞ががん細胞抗原を最適化された状態と認識するためには、がん細胞抗原認識受容体その自体のみならず、抗原特異的受容体と細胞膜の間のヒンジの配列及び構成（hinge  sequence  and  composition）もまた重要である。ヒンジの配列及び構成は、ターゲット分子によって異なるように設計する必要があり得る。
【０１４１】
前述の実験に使用されたＣＡＲは、いずれもスペーサードメイン（hinge）としてＣＤ８αの切片を使用したものである。これと比較して、ヒンジにＣＤ２８の切片を使用した場合に、これらのＣＡＲの細胞殺害能がどのように変化するかを評価して図４にまとめた。本発明者らは、ＣＤ１６Ｖの細胞外ドメイン（ectodomain）およびＣＤ２８のヒンジを含むレンチバイラルベクターを製造した。製造された第３世代ＣＡＲにおいて、ＣＤ２８由来のヒンジ、膜貫通および細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、またはＯＸ４０リガンド（ＣＤ２５２）のシグナル伝達モジュール（signaling  module）に連結された。このようにして製造された第３世代ＣＡＲは、レンチバイラルベクターを使用してＮＫ９２ＭＩ細胞で発現された。形質導入されたＮＫ９２ＭＩ細胞は、前記のそれぞれの第３世代ＣＡＲ  ＣＤ１６Ｖ−２８（Ｈ）ＢＢＺ  ＣＡＲ、ＣＤ１６Ｖ−２８（Ｈ）ＯＸ４０Ｚ  ＣＡＲまたはＣＤ１６Ｖ−２８（Ｈ）ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ）を高いレベルで発現することを確認した（図４Ａ）。
【０１４２】
図４Ｂに示すように、リツキシマブが存在しないときは、ＣＤ１６Ｖ−２８（Ｈ）ＢＢＺ  ＣＡＲ、ＣＤ１６Ｖ−２８（Ｈ）ＯＸ４０Ｚ  ＣＡＲおよびＣＤ１６Ｖ−２８（Ｈ）ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲのいずれも細胞殺害能を示さなかったが、リツキシマブが存在するときは、ＣＤ１６Ｖ−２８（Ｈ）ＢＢＺ  ＣＡＲ、ＣＤ１６Ｖ−２８（Ｈ）ＯＸ４０Ｚ  ＣＡＲおよびＣＤ１６Ｖ−２８（Ｈ）ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲのいずれも強い細胞殺害能を示した。中でも特に、ＯＸ４０リガンドを含むＣＤ１６Ｖ−２８（Ｈ）ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲが最も高い細胞殺害能を示した。
【０１４３】
前記の実験結果は、本発明者らが発掘した新規なＣＡＲ、特にＯＸ４０リガンドを細胞内シグナル伝達ドメインとして含むＣＡＲをナチュラルキラー細胞で発現させる場合、優れた抗がん効果を示すことができることを示す。
【０１４４】
実施例３：ＯＸ４０リガンド（ＣＤ２５２）を含むＮＫＧ２Ｄキメラ抗原受容体（ＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲ）を発現するＮＫ９２ＭＩ細胞のヒト乳がん細胞および肺がん細胞に対する細胞毒性の評価  
共同刺激モチーフと連結されたＮＫＧ２Ｄを含むキメラ抗原受容体の形質導入及び発現
本発明者らは、ヒトＮＫＧ２Ｄ遺伝子を合成し、それをＣＤ８αのヒンジおよび膜横断ドメイン、Ｔ細胞刺激分子ＣＤ３ζ、およびＴまたはＮＫ細胞の活性を大幅に強化するＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０およびＯＸ−４０リガンドを含む補助刺激分子の細胞内ドメインの様々な組み合わせと結合した（表３）。このＮＫＧ２Ｄ  ＣＡＲコンストラクトは、レンチウイルスベクターを使用してＮＫ９２ＭＩ細胞で発現された。本発明者らは、単クローンマウス抗ヒト抗体を使用して、ヒトＮＫＧ２Ｄの検出によりＮＫ９２Ｍ細胞での各ＮＫＧ２Ｄ  ＣＡＲの表面発現を確認した。流細胞分析を用いた反復実験によって、ＮＫ９２ＭＩ細胞においてＣＡＲが７０％以上の効率で形質導入されたことが確認された。
【０１４５】
様々な補助刺激分子を含むＮＫＧ２Ｄ受容体を発現するＮＫ９２ＭＩ細胞のＭＣＦ７乳がん細胞株に対する細胞死滅の増加の効果
遺伝子組み換えによる殺傷活性の変化有無を調べるために、ＮＫＧ２Ｄ  ＣＡＲを発現するＮＫ−９２ＭＩ細胞のＭＣＦ７乳がん細胞に対する細胞毒性をＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭ放出分析法により比較した。
【０１４６】
イン・ビトロでＮＫＧ２Ｄ  ＣＡＲを発現するＮＫ−９２ＭＩ細胞の抗原特異的抗腫瘍機能に対する様々な共同刺激シグナル伝達ドメインの効果を評価するために、形質導入されたＮＫ−９２ＭＩ及びがん細胞を培養し、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ放出によって腫瘍細胞溶解を測定した。以前の研究によると、キメラ受容体に共同刺激シグナル伝達ドメインを追加すると、Ｔ及びＮＫリンパ球の細胞毒性が高まることが示された。ＮＫＧ２Ｄ  ＣＡＲの細胞毒性を高めるために、本発明者らは、最もよく知られている３つの共同刺激シグナル伝達ドメインであるＣＤ２８、ＣＤ１３４（ＯＸ−４０）またはＣＤ１３７（４−１ＢＢ）のシグナル伝達領域をＮＫＧ２Ｄ  ＣＡＲに導入した。ＮＫＧ２Ｄ−Ｚ  ＣＡＲ（第１世代）、ＮＫＧ２Ｄ−２８Ｚ  ＣＡＲ、ＮＫＧ２Ｄ−ＢＢＺ  ＣＡＲおよびＮＫＧ２Ｄ−ＯＸ４０Ｚ  ＣＡＲ（第２世代）を導入したＮＫ９２ＭＩ細胞は、ＮＫＧ２Ｄを効率的に発現した（図５Ａ）。２時間のインビトロ細胞毒性分析では、ＮＫ−９２ＭＩ細胞を発現するＮＫＧ２Ｄ−Ｚ  ＣＡＲ（第１世代）、ＮＫＧ２Ｄ−２８Ｚ  ＣＡＲ、ＮＫＧ２Ｄ−ＢＢＺ  ＣＡＲおよびＮＫＧ２Ｄ−ＯＸ４０Ｚ  ＣＡＲ（第２世代）は、ＭＣＦ７乳がん細胞に対して細胞毒性を示した。しかし、ＮＫＧ２Ｄ−Ｚ  第１世代ＣＡＲの骨格（backbone）内にＣＤ３ζと共にＣＤ１３４（ＯＸ−４０）またはＣＤ１３７（４−１ＢＢ）シグナル伝達ドメインを含めることは、ＮＫＧ２Ｄ−Ｚ  ＣＡＲ（第１世代）の細胞毒性よりも高い細胞毒性を示さなかった。ＮＫＧ２Ｄ−２８Ｚ  ＣＡＲ（第２世代）を含むＮＫ−９２ＭＩ細胞による腫瘍細胞死滅能は、陽性対照群であるＮＫＧ２Ｄ−Ｚ  ＣＡＲ（第１世代）を発現するＮＫ−９２ＭＩ細胞よりも優れていた（図５Ｂ）。
【０１４７】
ＣＤ２８細胞内ドメインを含むＮＫＧ２Ｄ受容体を発現するＮＫ９２ＭＩ細胞のＭＣＦ７乳がん細胞株に対する細胞死滅の増加の効果
第３世代ＣＡＲは、抗腫瘍活性を増加させることが知られている。生理学的なＴ細胞反応において、最適のリンパ球活性化は、ＣＤ２８のような共同刺激分子と結合した一つ以上の補助刺激受容体を必要とする。補助刺激受容体の中で最も重要なのが、腫瘍壊死因子（TNFR）の一員であるＣＤ１３７（４−１ＢＢ）およびＯＸ４０（ＣＤ１３４）である。
【０１４８】
ＮＫＧ２Ｄ  ＣＡＲ（第３世代）を発現するＮＫ−９２ＭＩ細胞で様々な補助刺激分子の効果をテストするために、本発明者らは、ＮＫＧ２Ｄ−２８ＯＸ４０Ｚ  ＣＡＲ（第３世代）とＮＫＧ２Ｄ−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ（第３世代）を作製した。これらのＮＫＧ２Ｄ  ＣＡＲ（第３世代）コンストラクトは、レンチウイルスベクターを使用してＮＫ９２ＭＩ細胞で発現された。形質導入されたＮＫ９２ＭＩ細胞は、第３世代ＣＡＲを含有する様々なＮＫＧ２Ｄ受容体を効率的に発現した（図６Ａ）。対照群ベクターで形質導入されたＮＫ９２ＭＩ細胞と比較して、様々なＮＫＧ２Ｄ  ＣＡＲ（第３世代）を発現するＮＫ９２ＭＩ細胞は、イン・ビトロでＭＣＦ７細胞を効果的に死滅させた。しかし、ＮＫＧ２Ｄ−２８Ｚ  ＣＡＲ（第２世代）の骨格内にＣＤ１３４またはＣＤ１３７共同刺激シグナル伝達ドメインを含めた第３世代ＮＫＧ２Ｄ−２８ＯＸ４０Ｚ  ＣＡＲとＮＫＧ２Ｄ−２８ＢＢＺ  ＣＡＲは、ＮＫＧ２Ｄ−Ｚ  ＣＡＲ（第１世代）よりも高い細胞毒性を示さなかった（図６Ｂ）。
【０１４９】
ＮＫＧ２Ｄ−ＡＡＡ−２８（Ｈ）ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ（第３世代）と他の受容体との比較
ＣＤ２５２（ＯＸ−４０リガンド）補助刺激の影響を評価するために、ＮＫＧ２Ｄ−２８Ｚ  ＣＡＲ（第２世代）の骨格にＯＸ−４０リガンドのシグナル伝達領域を融合させてＮＫＧ２Ｄ−２８（Ｈ）ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ（第３世代）を構築した。腫瘍細胞死滅の分析において、ＭＣＦ７細胞に対するＮＫＧ２Ｄ−２８（Ｈ）ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ（第３世代）によって誘導された特異的な細胞毒性は、ＮＫＧ２Ｄ−Ｚ  ＣＡＲ（第１世代）に比べて大幅に強化されたが、ＮＫＧ２Ｄ−２８Ｚ  ＣＡＲ（第２世代）と類似していた（図７Ｂ）。
【０１５０】
最適のＣＡＲ−Ｔ細胞認識のためには、腫瘍抗原認識受容体の確認だけでなく、抗原特異的受容体と細胞膜との間のヒンジおよびリンカー配列が重要であることが明らかになった。ここでは、ＮＫＧ２Ｄ−２８（Ｈ）ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ（第３世代）の機能に対するスペーサー追加の影響を分析した。本発明者らは、ＮＫＧ２Ｄの細胞外領域とＣＤ２８ヒンジとの間にＡＡＡ（triple  alanine）リンカーを導入した。ＡＡＡリンカーが導入されたＮＫＧ２Ｄ−ＡＡＡ−２８（Ｈ）ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ（第３世代）は、レンチウイルスベクターを使用してＮＫ９２ＭＩ細胞で発現された（図７Ａ）。この実験では、ＮＫＧ２Ｄ−ＡＡＡ−２８（Ｈ）ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ（第３世代）を保有するＮＫ−９２ＭＩ細胞によるＭＣＦ７細胞殺傷を、ＮＫＧ２Ｄ−Ｚ  ＣＡＲ（第１世代）、ＮＫＧ２Ｄ−２８Ｚ  ＣＡＲ（第２世代）またはＮＫＧ２Ｄ−２８（Ｈ）ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ（第３世代）を含有するＮＫ−９２ＭＩ細胞の細胞殺傷能と比較した。特に、ＮＫＧ２Ｄ−２８（Ｈ）ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ（第３世代）のＮＫＧ２Ｄ細胞外領域とＣＤ２８ヒンジとの間へのＡＡＡリンカーの導入は、父母のＡＡＡがないＮＫＧ２Ｄ−２８（Ｈ）ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ（第３世代）、およびＮＫＧ２Ｄ−ＺＣＡＲ（第１世代）、ＮＫＧ２Ｄ−２８Ｚ  ＣＡＲ（第２世代）よりも多くの標的細胞の死滅を促進させた（図７Ｂ）。
【０１５１】
ＮＫＧ２Ｄ−ＡＡＡ−２８（Ｈ）ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ（第３世代）を発現するＮＫ９２ＭＩ細胞の肺がん細胞株の殺傷効果
ＮＫＧ２Ｄ−ＡＡＡ−２８（Ｈ）ＯＸ４０ＬＺ  ＣＡＲ（第３世代）で形質導入されたＮＫ９２ＭＩ細胞が肺がん細胞でＮＫＧ２Ｄリガンドを認識できるかどうかを評価するために、ＮＫＧ２Ｄリガンド陽性腫瘍細胞（Ｈ１２９９およびＨ１９４４）をＮＫＧ２Ｄ−ＡＡＡ−２８（Ｈ）ＯＸ４０Ｌ  ＣＡＲ（第３世代）が含まれたＮＫ９２ＭＩ細胞のターゲットとして使用した。形質導入されたＮＫ９２ＭＩ細胞は、ＮＫＧ２Ｄ−Ｚ  ＣＡＲ（第１世代）またはＮＫＧ２Ｄ−ＡＡＡ−２８（Ｈ）ＯＸ４０Ｌ  ＣＡＲ（第３世代）を効率的に発現した（図８Ａ）。次に、Ｈ１２９９及びＨ１９４４細胞でのＮＫＧ２Ｄリガンド発現を評価した。本発明者らは、ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現が流動細胞計測法によってＨ１２９９及びＨ１９４４細胞で検出されたことを確認した（図８Ｂ）。図８Ｃに示すように、ＮＫＧ２Ｄ−ＡＡＡ−２８（Ｈ）ＯＸ４０Ｌ  ＣＡＲ（第３世代）を含むＮＫ９２ＭＩ細胞は、対照群ＮＫ９２ＭＩ細胞およびＮＫＧ２Ｄ−Ｚ  ＣＡＲ（第１世代）発現ＮＫ９２ＭＩ細胞よりもインビトロでＮＫＧ２Ｄリガンドを発現する標的細胞をより効率的に死滅させることができた。ターゲット細胞死滅特異性は、コントロールとして空ベクターで形質導入され、ＮＫＧ２Ｄを発現しないＮＫ９２ＭＩ細胞がＨ１２９９およびＨ１９４４細胞を死滅させないことから明確に確認できた。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【配列表】
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