(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学的変異源遺伝子組換えで生産される、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２３９１である、セルラーゼ及びキシラナーゼを生産するための変異株アスペルギルス・アクレアツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）Ｅ１４−２９２。
【請求項２】
請求項１に記載の変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２を生産する遺伝子組換えプロセスであって、前記プロセスが
ａ）１〜３時間、２０〜３０ｍＭ対胞子１０７個の範囲のエタンスルホン酸メチル対真菌の比でアスペルギルス・アクレアツスＢＣＣ１９９（野性型）をエタンスルホン酸メチル（ＥＭＳ）に接触させる段階と、
ｂ）ａ）で生産された変異株アスペルギルス・アクレアツスを培養する段階と、
ｃ）段階ｂ）で培養された変異株アスペルギルス・アクレアツスを単離する段階と
を含む遺伝子組換えプロセス。
【請求項３】
段階ａ）のエタンスルホン酸メチル対真菌の比が２５〜２６ｍＭ対胞子１０７個の範囲である、請求項２に記載の遺伝子組換えプロセス。
【請求項４】
段階ａ）が３時間行われる、請求項２又は３に記載の遺伝子組換えプロセス。
【請求項５】
段階ａ）が水酸化ナトリウム又はチオ硫酸ナトリウムから選択される解毒剤を添加する段階を更に含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載の遺伝子組換えプロセス。
【請求項６】
前記解毒剤がチオ硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ３）である、請求項５に記載の遺伝子組換えプロセス。
【請求項７】
前記プロセスが２回行われる、請求項２〜６のいずれか一項に記載の遺伝子組換えプロセス。
【請求項８】
請求項１に記載の変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２を培養する段階を含む、固相発酵プロセスによるセルラーゼ及びキシラナーゼの生産プロセスであって、変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２対培養培地の比が７２〜１２０時間、２５〜３２℃の温度で胞子１０９〜１０１１個／ｋｇの範囲である、プロセス。
【請求項９】
前記変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２対培養培地の前記比が胞子１×１０１０〜５×１０１０個／ｋｇの範囲である、固相発酵プロセスによってセルラーゼ及びキシラナーゼを生産する、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１０】
３０℃の温度で行われる、固相発酵プロセスによってセルラーゼ及びキシラナーゼを生産する、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１１】
９６時間行われる、固相発酵プロセスによってセルラーゼ及びキシラナーゼを生産する、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１２】
ａ）培地において請求項１に記載の変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２を培養することによって種菌を準備する段階であって、変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２対培養培地の比が３６〜６０時間、２５〜３２℃の温度下で胞子１０７〜１０９個／Ｌの範囲である、段階と、
ｂ）１０〜１５％（ｗ／ｖ）の濃度に達するようにａ）で得られた種菌を培養培地に移植し、９６〜１４４時間、２５〜３２℃の温度下で発酵する段階と
を含む、深部発酵プロセスによってセルラーゼ及びキシラナーゼを生産するプロセス。
【請求項１３】
段階ａ）における変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２対培養培地の前記比が胞子１×１０８〜５×１０８個／Ｌの範囲である、深部発酵プロセスによってセルラーゼ及びキシラナーゼを生産する、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１４】
段階ａ）が３０℃の温度で行われる、深部発酵プロセスによってセルラーゼ及びキシラナーゼを生産する、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１５】
段階ａ）が４８時間行われる、深部発酵プロセスによってセルラーゼ及びキシラナーゼを生産する、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１６】
段階ｂ）における前記種菌の濃度が１２〜１３％（ｗ／ｖ）の範囲である、深部発酵プロセスによってセルラーゼ及びキシラナーゼを生産する、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１７】
段階ｂ）が３０℃の温度で行われる、深部発酵プロセスによってセルラーゼ及びキシラナーゼを生産する、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１８】
段階ｂ）が１２０時間行われる、深部発酵プロセスによってセルラーゼ及びキシラナーゼを生産する、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１９】
炭素源はセルロース粉末又は稲わら、バガス、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ茎などのリグノセルロース系材料から選択される、深部発酵プロセスによってセルラーゼ及びキシラナーゼを生産する、請求項８から１８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２０】
前記炭素源がトウモロコシ穂軸である、深部発酵プロセスによってセルラーゼ及びキシラナーゼを生産する、請求項１９に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
バイオテクノロジーは、セルラーゼ及びキシラナーゼを生産するための変異株アスペルギルス・アクレアツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）並びにその調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
効率的なバイオリファイナリー産業は、燃料、化学物質、材料及び原料の価値を最大にする廃棄物ほぼゼロのプロセスでバイオマス化学成分の副生成物を含むバイオマス化学成分由来のエネルギーの集成であるため、現在、石油の代用であるリグノセルロース系バイオマスからのバイオ燃料及び塩基性化学物質の製造により関心がより高まっている。これは、技術及び経済の両面において非常に興味深いことである。したがって、適切な生物学的及び化学的プロセスによるバイオ燃料の製造における糖化プロセスにより関心がより高まっている。
【０００３】
リグノセルロース系バイオマスは、複雑にかつ強固に配列するセルロース、ヘミセルロース及びリグニンの３つの主成分を含む。したがって、リグノセルロース系バイオマスの前処理プロセスでは、分解可能なバイオマスを生産するためにリグニン構造を破壊することが求められる。
【０００４】
バイオマスの酵素糖化は、燃料及び他の生化学的物質の製造でバイオマスから糖を生産するために、多くの関心を得ている分解プロセスの１つである。このプロセスでは、触媒作用を及ぼす際に補助因子又は他の金属を必要としない、程度の外れた化学物質、温度又はエネルギーを必要としないためである。このように、多くの関心がバイオマスの酵素糖化に向けられてきた。
【０００５】
糖化プロセスでは、セルラーゼ群及びヘミセルラーゼ群である２つ主要な群の酵素を使用する。セルラーゼ群は、１）エンドグルカナーゼ、２）エキソグルカナーゼ又はセロビオヒドラーゼ及び３）β−グルコシダーゼの３種類の酵素を含み、これらはセルロースを分解してグルコースにする。ヘミセルラーゼ群は、エンドキシラナーゼ及びβ−キシロシダーゼを含み、これらはヘミセルロースの主成分であるキシランを分解する。さらに、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、α−グルクロニダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ及びβ−マンナナーゼなどのヘミセルロースを分解する他の酵素も存在する。
【０００６】
セルラーゼ及びヘミセルラーゼの相乗作用は、効率的な糖化プロセスにおいて重要な因子である。これらの酵素は、遊離酵素及び様々な酵素を含むセルロソームの２つの主要な形状に分けることができる。セルロソームは、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、バチラス属（ｂａｃｉｌｌｕｓ）、エロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）又はトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アクレモニウム属及びアスペルギルス属などの様々な属の細菌及び真菌から産生され得る。
【０００７】
現在、誘発された変異、組換え及び遺伝子クローニングなどの真菌株を改良する多くの方法が存在する。化学的に誘発された変異は容易かつ非常に有効であることから、株改良の一般的な方法の１つである。以下のように真菌のタンパク質又は酵素生産を増加させるための化学的変異源を用いる真菌の遺伝子組換えに関する各種報告及び特許文献がある。
【０００８】
ＥＰ２１５０６１５Ｂ１では、大量のセルラーゼを生産することができるアクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＣＦ−２６１２並びに得られた酵素による糖化方法を含む、上記株からのセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼの調製プロセスを開示する。
【０００９】
ＷＯ２０１３／０２８９２７Ａ１では、大量のセルロース系酵素を生産し、バイオマスの糖化を改良するために、トリコデルマ宿主細胞及びアスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）のポリヌクレオチドのリコンビナント遺伝子組換えプロセスを開示する。
【００１０】
ＪＰ２０１６０１５８９４Ａでは、遺伝子コード６８、６９、９８、９９、２００、２０１、２０４、２４８、３０５、３５８、４３６、４３７及び５１１でヌクレオチド配列のアミノ酸置換により変異株アスペルギルス・アクレアツスから得られるβ−グルコシダーゼを開示する。
【００１１】
ＥＰ１４７９７６５Ａ３では、植物細胞壁の糖化のための組換え方法によって変異株アスペルギルス・アクレアツスＣＢＳ１０１．４３から得られる有効なキシラナーゼを開示する。
【００１２】
ＪＰ２０１２２００１８４Ａでは、組換え方法による変異株アスペルギルス・アクレアツスからのセルラーゼの調製を開示する。タンパク質の生産性を向上させるために、セルラーゼ及びヘミセルラーゼの生産に関連した遺伝子がアスペルギルス・アクレアツスの壁宿主に付加され、ＪＰ２０１１２２３９６２Ａでも同様に組換え方法によって変異株アスペルギルス・アクレアツスによって生産されるセルラーゼを開示する。
【００１３】
にもかかわらず、酵素糖化プロセスの問題の１つは、微生物から酵素を生産するコストが高いことである。より多く酵素を生産することができる微生物を研究し、開発するという試みがある。上述した理由から、大規模産業における有益性及び農業素材からの糖の更なる生産へ酵素の適用に、セルラーゼ及びキシラナーゼを大量に生産することができる微生物が求められている。
【００１４】
上記で開示された情報から、より多くセルラーゼ及びキシラナーゼを生産するためのアスペルギルス・アクレアツスと共に、化学的に誘発された遺伝子組換えは実施されていなかった。したがって、本発明は変異株アスペルギルス・アクレアツスに大量のセルラーゼ及びキシラナーゼを生産させることを可能にする、容易かつ安価である化学的誘発で変異株アスペルギルス・アクレアツスを調製することを目的とする。
【発明の概要】
【００１５】
本発明は、新規な変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２及び上記真菌の遺伝子組換えプロセスに関し、新規な変異株は受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３９１でＮＩＴＥ特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（日本）に保存される。
【００１６】
効率的に糖を更に生産するために、上記変異株は、バイオマスを分解するために用いられ得るセルラーゼ及びキシラナーゼを生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】変異株アスペルギルス・アクレアツスＢＣＣ１９９（野性株）と比較して、変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２の形態を示す。
【００１８】
【図２】１０世代後の変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２によるセルラーゼ及びキシラナーゼの生産の安定性を示す。
【００１９】
【図３】変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２及びＢＣＣ１９９（野性型）間の遺伝的分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
［定義］
明記しない限り、本明細書に使用される専門用語又は科学的用語は、当業者による定義を有する。
【００２１】
本明細書で命名される任意のツール、機器、方法又は化学物質は、本発明にのみ特有のツール、機器、方法又は化学物質であると明記しない限り、当業者によって通常使用されているツール、機器、方法又は化学物質を意味する。
【００２２】
特許請求の範囲又は明細書中で「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と単数名詞又は単数代名詞の併用は、「１」を意味し、「１又は複数」、「少なくとも１」及び「１又は１より大きい」を含む。
【００２３】
本出願に開示されたすべての成分及び／又は方法並びに特許請求の範囲は、本発明と著しく異なるいかなる実験も無しに任意の作用、性能、変更又は調整からの実施形態を網羅し、特許請求の範囲に具体的に記載されていないけれども、有用性と共に当業者により本実施形態と同じ結果を得ることを目的としている。したがって、当業者によって明確に理解される任意の若干の変更又は調整を含む本実施形態に代用可能な又は同様の目的は、添付の特許請求の範囲で見られるように、発明の精神、範囲及び概念に存続すると解釈すべきである。
【００２４】
本出願を通して、用語「約」は機器、方法又は上記機器若しくは方法を使用する人の任意の誤差から変わる又は逸脱し得ることを本明細書に見られた又は示された任意の数字を意味する。
【００２５】
以下に、本発明の任意の範囲を制限するいかなる目的も無しに、発明の実施形態が示される。
【００２６】
本発明は、大量のセルラーゼ及びキシラナーゼを生産することができる新規な株を生産するために、化学的誘発によって遺伝子が組み換えられるアスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２株に関し、遺伝子組換えの方法及びバイオマスの糖化における得られた酵素の使用を含む。
【００２７】
本発明によるアスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２は、ブダペスト条約の規則に従いＮＩＴＥ特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（日本）に保存され、上記株は受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３９１で２０１６年１２月１９日に寄託された。
【００２８】
本発明において使用される用語「培養」は、液体培養又は固体培養を含むことを意味するが、本発明による株を培養することができる限り上記方法に限定されない。
【００２９】
用語「糖化」は、バイオマスにおけるセルロース及び／又はヘミセルロースのオリゴ糖、二糖、単糖又はそれらの混合物への糖化を含むことを意味する。同様に、バイオマスの糖化はセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼによる多糖とのグリコシド結合の加水分解を含むことを意味する。
【００３０】
一実施形態では、アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２である変異株アスペルギルス・アクレアツスが、アスペルギルス・アクレアツスＢＣＣ１９９（野性型）の化学的誘発遺伝子組換えから得られる。
【００３１】
本発明の一態様では、変異株アスペルギルス・アクレアツスを得るために、遺伝子組換えプロセスがａ）１〜３時間、２０〜３０ｍＭ対胞子１０７個の範囲のエタンスルホン酸メチル対真菌の比でアスペルギルス・アクレアツスＢＣＣ１９９（野性型）をエタンスルホン酸メチル（ＥＭＳ）に接触させる段階と、ｂ）ａ）で得られた変異株アスペルギルス・アクレアツスを培養する段階と、ｃ）段階ｂ）で培養された変異株アスペルギルス・アクレアツスを単離する段階とを含む。
【００３２】
エタンスルホン酸メチル対アスペルギルス・アクレアツスＢＣＣ１９９（野性型）の比が３時間、２５〜２６ｍＭ対胞子１０７個の範囲あることが好ましい。
【００３３】
本発明の一態様では、変異株アスペルギルス・アクレアツスを産生するために、遺伝子組換えプロセスが解毒剤を添加し、化学的変異源の毒性を除去する段階を更に含み、解毒剤が水酸化ナトリウム又はチオ硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ３）から選択される。
【００３４】
解毒剤はチオ硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ３）であり、最終濃度３．３３％（ｗ／ｖ）に達するように添加することが好ましい。
【００３５】
本発明の一態様では、変異株アスペルギルス・アクレアツスを生産する遺伝子組換えプロセスの段階ｂ）で得られる培養プロセスは、１２〜２４時間、好ましくは２０〜２４時間、２０〜４０℃の範囲、好ましくは３０℃の温度で行われる。
【００３６】
本発明の一態様では、段階ｂ）の培養プロセスは、４．０ｇ／Ｌのジャガイモデンプン、２０ｇ／Ｌのデキストロース及び１５ｇ／Ｌの寒天を含むジャガイモデキストロース寒天（ＰＤＡ）において実施され得る。
【００３７】
本発明の一態様では、段階ｃ）の変異株アスペルギルス・アクレアツスの単離は、１００〜１３０時間、好ましくは１２０時間、２０〜４０℃の範囲、好ましくは３０℃の温度でＭａｎｄｅｌｓによる固体培地において段階ｂ）で得られる真菌を培養することによって、実施され得る。得られた真菌をコンゴ−レッドで染色し、当該単離用コロニーのクリアゾーン及び直径を測定する。変異株のコロニーに対するクリアゾーンの直径の比は、野性型のものよりも大きい。
【００３８】
Ｍａｎｄｅｌｓによる固体培養培地は、０．３ｇ／Ｌの尿素、１．４ｇ／Ｌの硫酸ジアンモニウム、２．０ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム、０．４ｇ／Ｌの塩化カルシウム、０．３ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム七水和物、１．０ｇ／Ｌのペプトン、０．２ｇ／ＬのＴｗｅｅｎ８０、５．０ｍｇ／Ｌの硫酸鉄七水和物、１．６ｍｇ／Ｌのマンガン一水和物、１．４ｍｇ／Ｌの硫酸亜鉛七水和物、２．０ｍｇ／Ｌの塩化コバルト六水和物、１０ｇ／Ｌのアビセル及び１７．５ｇ／Ｌのゼラチンを含有する。
【００３９】
本発明の一態様では、変異株アスペルギルス・アクレアツスを生産する遺伝子組換えプロセスが２回行われることが好ましい。
【００４０】
本発明の一態様では、タンパク質分泌に関連した遺伝子が３個の遺伝子のｔ−ＳＮＡＲＥタンパク質、Ｒｈｏ低分子量ＧＴＰａｓｅの５個の遺伝子の生産に関連した遺伝子及びＲａｂ１１／ＹＰＴ３低分子量ＧＴＰａｓｅの生産に関連した遺伝子などの変異体を有する前に、上記プロセスで生産された変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２は、１０００塩基対で当該遺伝子のヌクレオチド配列を有する。  
【００４１】
本発明の一態様では、変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２からのセルラーゼ及びキシラナーゼの生産プロセスは、固相発酵（ＳＳＦ）及び深部発酵（ＳｍＦ）条件下で発酵と共に実施され得る。
【００４２】
本発明の一態様では、深部発酵用培養培地は、３５〜４０ｇ／Ｌのトウモロコシ穂軸、１０〜１５ｇ／Ｌの大豆かす、０．１〜０．２ｇ／Ｌの塩化カリウム、０．０１〜０．０４ｇ／Ｌの硫酸亜鉛七水和物、０．０００１〜０．００１１ｇ／Ｌの塩化ニッケル六水和物、０．００５〜０．０２０ｇ／Ｌの硫酸鉄七水和物及び０．５〜１．５ｇ／ＬのＴｗｅｅｎ２０を含有する培地から選択される。
【００４３】
本発明の一態様では、固相発酵用培養培地は、７００〜８００ｇ／ｋｇの固形培地トウモロコシ穂軸、２００〜３００ｇ／ｋｇの固形培地大豆かす、１〜２ｇ／ｋｇの固形培地塩化カリウム、０．０５〜０．２ｇ／ｋｇの固形培地硫酸亜鉛七水和物、５〜７ｍｇ／ｋｇの固形培地塩化ニッケル六水和物、０．０５〜０．２ｇ／ｋｇの固形培地硫酸鉄七水和物及び５〜１２ｇ／ｋｇの固形培地Ｔｗｅｅｎ２０を含有する培地から選択される。
【００４４】
本発明の一態様では、固相発酵は請求項１に記載の変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２を培養する段階を含み、変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２対培養培地の比が７２〜１２０時間、２５〜３２℃の範囲の温度下で胞子１０９〜１０１１個／ｋｇの範囲である。
【００４５】
変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２対培養培地の比は胞子１×１０１０〜５×１０１０個／ｋｇの範囲であり、９６時間、３０℃の温度で行われることが好ましい。
【００４６】
本発明の一態様では、深部発酵プロセスは変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２を培地で培養することによって種菌を準備することから開始し、変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２対培養培地の比は３６〜６０時間、２５〜３２℃の範囲の温度下で胞子１０７〜１０９個／Ｌの範囲である。次に、１０〜１５％（ｗ／ｖ）の濃度に達するように得られた種菌を培養培地に移植し、９６〜１４４時間、２５〜３２℃の範囲の温度下で発酵する。
【００４７】
種菌準備段階は、変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２対培養培地の比を４８時間、３０℃の温度で胞子１×１０８〜５×１０８個／Ｌにして、変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２を培養培地で培養することによって実施されることが好ましい。
【００４８】
酵素発酵段階は、濃度が１２〜１３％（ｗ／ｖ）の範囲内に達するまで種菌を培養培地に移植し、１２０時間、３０℃の温度下で発酵することによって実施されることが好ましい。
【００４９】
本発明の一態様では、炭素源はセルロース粉末又は稲わら、バガス、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ茎などのリグノセルロース系材料から選択される。炭素源がトウモロコシ穂軸であることが好ましい。
【００５０】
本発明の一態様では、遠心分離、濾過又は関連方法などの当業者に既知の一般的な単離方法よって、真菌により生産される酵素を含有する培養培地から当該真菌を単離することができる。粗酵素として、セルラーゼ及びキシラナーゼを含有する培養液を直接使用することができる。
【００５１】
本発明の一態様では、当業者に既知の方法によってセルラーゼ及びキシラナーゼを含有する上澄みを更に精製してもよく、２つ以上の精製方法を共に用いてもよい。
【００５２】
本発明の一態様では、変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２から生産される酵素は、１）セロビオヒドラーゼ、エンドグルカナーゼ及びβ−グルコシダーゼなどのセルロース分解酵素、並びに２）キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−アラビノフラノシダーゼ及びペクチンエステラーゼなどのヘミセルロース分解酵素を含む。
【００５３】
本発明の一態様では、バイオマスの糖化において変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２から生産される酵素を用いることができ、好ましいバイオマスはバガスである。
【００５４】
本発明の一態様では、糖化用バイオマスを湿った又は乾いた形状で用いてもよい。
【００５５】
本発明の一態様では、１）塩基触媒方法を用いる水蒸気爆発、２）有機溶媒分離法、３）アセトン中の水酸化ナトリウムによる方法及び４）メタノール中のナトリウムメトキシドによる方法から選択される前処理プロセスを糖化用バイオマスに対して行ってもよいし、又は酵素糖化の前に２つ以上の前処理方法を用いてもよい。
【００５６】
本発明の一態様では、変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２から生産される酵素を、混合酵素として他の酵素と共に又はバイオマスの糖化性能を向上するために界面活性剤と共に用いることができる。
【００５７】
以下の部分は、本発明の範囲を決して限定するためではなく、本発明の実施形態を説明することだけを目的とする。
【００５８】
実施例１：化学的誘発によるアスペルギルス・アクレアツスの遺伝子組換え及び大量のセルラーゼ及びキシラナーゼを生産する変異株の選択
【００５９】
最終濃度２５．４ｍＭに達するまでエタンスルホン酸メチル（ＥＭＳ）を添加することによって、胞子約１×１０７個／ｍＬの濃度のアスペルギルス・アクレアツスＢＣＣ１９９（野性型）に対して化学的誘発遺伝子組換えを行い、約３時間保持した。次に、最終濃度３．３３％（ｗ／ｖ）に達するまでチオ硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ３）を添加した。その後、２４時間、３０℃の温度でポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）で変異株を培養した。０．３ｇ／Ｌの尿素、１．４ｇ／Ｌの硫酸ジアンモニウム、２．０ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム、０．４ｇ／Ｌの塩化カルシウム、０．３ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム七水和物、１．０ｇ／Ｌのペプトン、０．２ｇ／ＬのＴｗｅｅｎ８０、５．０ｍｇ／Ｌの硫酸鉄七水和物、１．６ｍｇ／Ｌのマンガン一水和物、１．４ｍｇ／Ｌの硫酸亜鉛七水和物、２．０ｍｇ／Ｌの塩化コバルト六水和物、１０ｇ／Ｌのアビセル及び１７．５ｇ／Ｌのゼラチンを含有するＭａｎｄｅｌｓによる固体培地で培養することによって、得られた株を選択するために、得られた株を単一コロニーのために単離した。次に、１２０時間、３０℃の温度で当該株をインキュベートした。得られた真菌をコンゴ−レッドで染色し、当該単離用クリアゾーン及びコロニーの直径を測定した。変異株のコロニーに対するクリアゾーンの直径の比は、更なる実験のための野性型ものより大きい。
【００６０】
実施例２：変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２の物性
【００６１】
変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２及びその野性型をＰＤＡ培地で培養し、約１７０時間、３０℃の温度でインキュベートした。得られた真菌をその形態について顕微鏡で調べた。図１から、変異株のコロニー径が野性型のものよりも小さいことが分かった。変異株及び野性型の直径は、それぞれ約２７〜３０ｃｍ及び８０〜８３ｃｍであった。真菌が生産した黄灰色の閉鎖子嚢果及び褐色分生子頭の両方が単列に配列した。縞はなめらかで、壁が無かった。小胞は２７．５〜３０マイクロメートルの大きさの卵円形であった。フィアライドは幅が１０マイクロメートル、長さが７．５マイクロメートルであった。分生子は円形であり、４〜７マイクロメートルの直径を有する棘を含んでいた。０．４〜０．５ｍｍの直径を有する淡黄色のスクレロティニア属の菌が存在した。
【００６２】
実施例３：変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２のセルラーゼ及びキシラナーゼの生産性の調査
【００６３】
変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２及び野性型の酵素生産性について、それぞれ約７００及び３００ｇ／ｋｇの固形培地でのトウモロコシ穂軸及び大豆かすを含有する固相発酵（ＳＳＦ）により調べた。塩基性培地は、２０ｇ／ｋｇの固形培地酵母抽出物、１０ｇ／ｋｇの固形培地リン酸カリウム、２２ｇ／ｋｇの固形培地リン酸水素二ナトリウム、１．５ｇ／ｋｇの固形培地塩化カリウム及び微量元素を含む。この混合物を約１２０時間、３０℃の温度でインキュベートした。約０．１体積％のＴｗｅｅｎ２０を含有する、ｐＨ約５．０、５０ｍＭの酢酸ナトリウム５０ｍＬを添加することによって、得られた酵素を保持した。その後、得られた混合物を６０分間、２００ｒｐｍで振盪した。９，０００ｒｐｍで遠心分離機により固体部分を分離した。分離した酵素溶液に対して、以下の試験を行った。
【００６４】
１．ＢＩＯＲＡＤタンパク質アッセイを用い、標準タンパク質溶液としてウシ血清アルブミンを用いるＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイによって、総タンパク質濃度を分析した。
【００６５】
２．基質として１×６ｃｍの濾紙を用いて、ＦＰａｓｅを分析し、標準条件（５０ｍＭのクエン酸緩衝液、ｐＨ４．８、５０℃）下で反応を行った。６０分間、標準条件下で還元糖含有量を測定したとき、１ＦＰＵ（濾紙セルラーゼ単位）が１μＭ／分のグルコースに触媒作用を及ぼす酵素含有量に等しくなるように設定することによって、ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）を用いて、還元糖含有量を分析した。
【００６６】
３．標準条件下でアビセラーゼを測定したとき、１酵素活性単位が１μＭ／分のグルコースに触媒作用を及ぼす酵素含有量に等しくなるように設定することによって、基質として１．２５％（ｗ／ｖ）のアビセラーゼ溶液を用いてアビセラーゼを分析し、標準条件（５０ｍＭのクエン酸緩衝液、ｐＨ４．８、５０℃）下でアビセラーゼに対して反応を行った。
【００６７】
４．エンドグルカナーゼの基質としてカルボキシメチセルロース（ＣＭＣ）を用い、キシラナーゼの基質としてブナ材由来の１％（ｗ／ｖ）のキシランを用いてＣＭＣａｓｅ及びキシラナーゼを分析した。上記基質をｐＨ５．０、５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液に溶解した。１０分間、５０℃の温度で反応が実施された。その後、ジニトロサリチル酸を用いて、得られた還元糖を測定し、標準条件下で測定したとき、エンドグルカーゼ又はキシラナーゼの１単位が１μＭ／分の還元糖に触媒作用を及ぼす酵素含有量に等しくなるように設定した。
【００６８】
５．β−グルコシダーゼ及びβ−キシロシダーゼの基質として、それぞれ５ｍＭの４−ニトロフェニルβ−Ｄ−グルコピラノシド及び４−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを用いて、β−グルコシダーゼ及びβ−キシロシダーゼを分析した。１０分間、５０℃の温度でｐＨ５．０、１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液を含有する条件下で反応が実施された。最終濃度１００ｍＭに達するように炭酸ナトリウムを添加し、反応を停止した。４０５ｎｍでｐ−ニトロフェノールに関して、得られた物質を分析し、標準条件下で測定したとき、β−グルコシダーゼ及びβ−キシロシダーゼの１単位が１μＭ／分のｐ−ニトロフェノールに触媒作用を及ぼす酵素含有量に等しくなるように設定した。
表１：野性型と比較した、変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２から生産されたセルラーゼ及びヘミセルラーゼ含有量
【表１】
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【００６９】
表１から、変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２のセルラーゼ及びキシラナーゼの生産が野性型アスペルギルス・アクレアツスのものよりも高いことが分かった。さらに、生産の酵素安定性について試験したところ、図２に示すように変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２が１０世代まで生産性が高いことが分かった。
【００７０】
実施例４：変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２の深部発酵及び固相発酵下での酵素生産の比較
【００７１】
酵素生産における経済的な条件に最適化するために、深部発酵及び固相発酵下での酵素生産を調べた。
【００７２】
７６０ｇ／ｋｇの固体培地トウモロコシ穂軸、２４０ｇ／ｋｇの固体培地大豆かす、１．５ｇ／ｋｇの固体培地塩化カリウム、０．１４４ｇ／ｋｇの固体培地硫酸亜鉛七水和物、６ｍｇ／ｋｇの固体培地塩化ニッケル六水和物、０．１３８ｇ／ｋｇの固体培地硫酸鉄七水和物及び１０ｇ／ｋｇの固体培地Ｔｗｅｅｎ２０から成るＳＢ１．２培地を含有するフラスコに胞子１×１０１０個／ｋｇのアスペルギルス・アクレアツス野性型の固体培地を添加することによって、固相発酵（ＳＳＦ）を実施した。得られた混合物を初期水分量６５％を有するように調整し、約９６時間、３０℃の温度でインキュベートした。水又は固体対液体が１：１０の比の０．２５重量％のルテンゾールＡＯ８溶液を添加することによって、得られた酵素を保持した。得られた混合物を１時間、２００ｒｐｍで振盪し、５分間、４℃の温度で９，０００ｒｐｍで遠心分離した。更なる調査のために、酵素を含有する上澄みを分離した。
【００７３】
３８ｇ／Ｌのトウモロコシ穂軸、１２ｇ／Ｌの大豆かす、０．１５ｇ／Ｌの塩化カリウム、０．０１４４ｇ／Ｌの硫酸亜鉛七水和物、０．０００６ｇ／Ｌの塩化ニッケル六水和物、０．０１３８ｇ／Ｌの硫酸鉄七水和物及び１ｇ／ＬのＴｗｅｅｎ２０を含有する、５０％のＳＢ１．２培地を含有するフラスコに胞子１×１０５個／ｍＬのアスペルギルス・アクレアツスを移植して、種菌を準備することによって、深部発酵（ＳｍＦ）を実施した。得られた混合物を３０℃の温度でインキュベートし、４８時間、２００ｒｐｍで振盪した。フラスコに準備された同じ培地５０ｍＬに得られた種菌を移植し、１２０分間、３０℃の温度で１２９ｒｐｍで振盪した。５分間、４℃の温度で９，０００ｒｐｍで遠心分離することによって、発酵後得られた酵素を分離した。更なる調査のために、酵素を含有する上澄みを分離した。
【００７４】
酵素活性及びタンパク質含有量について、液体（ＳｍＦ）及び固体（ＳＳＦ）培地から得られた酵素を試験した。結果を表２に示した。
【００７５】
固相発酵後の水又はルテンゾールＡＯ８溶液で、変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２が野性型よりも約１．３３〜１．５０倍多くセルラーゼを生産できることが分かった。さらに、総タンパク質含有量を分析したところ、変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２から得られた酵素溶液が野性型のものよりも約１．１７〜１．２９倍多くタンパク質含有量を有することが分かった。
【００７６】
深部発酵については、変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２が野性型よりも約１．７５倍多くセルラーゼを生産できたことが分かった。さらに、総タンパク質含有量を分析したところ、変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２から得られた酵素溶液が野性型のものよりも約１．７６倍多くタンパク質含有量を有することが分かった。
【００７７】
上記から、変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２は、野性型よりも多い量のセルラーゼの生産の可能性があり、深部発酵及び固相発酵の両方において酵素を生産することができることが分かった。
表２：ＳＳＦ及びＳｍＦ下で培養したところ、変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２及びＢＣＣ１９９によって生産されたセルラーゼ及びタンパク質収量
【表２】
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【００７８】
実施例５：変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２の遺伝物質のヌクレオチド配列の比較
【００７９】
改変ＣＴＡＢ法による両真菌の遺伝物質の分離によって、変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２の遺伝物質のヌクレオチド配列の比較を実施した。次に、イオンパーソナルゲノムマシーン（ＰＧＭ）を用いるｉｏｎ  ｔｏｒｒｅｎｔシーケンシング法によって、塩基シーケンシングについて、抽出した遺伝物質約５ｇを探索した。野性型及び変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２の得られた塩基シーケンシングを、両者の差について、参照遺伝物質としてアスペルギルス・アクレアツスＡＴＣＣ１６８７２株の情報を用いるバイオインフォマティクス法によって分析した。変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２及び野性型のゲノムにおける塩基配列の異なる分析の詳細をバイオインフォマティクス法によって分析し、図３に示した。
【００８０】
変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２及び野性型の塩基配列を比較したところ、２４箇所のタンパク質分泌に関連した塩基配列又は変異遺伝子について相違があり、プロモーター遺伝子前の１０００塩基対における塩基配列の相違が遺伝子の発現の制御に応答したことが分かった。表３に示すように、９個の遺伝子、すなわち、３個のｔ−ＳＮＡＲＥタンパク質遺伝子（タンパク質コード２１０２５、４３５７９、６３６７０）、５個のＲｈｏ低分子量ＧＴＰａｓｅ産生遺伝子（タンパク質コード２７９７３、３８５４５、４２１８５、５１３７８、５１６５４）及び１個のＲａｂ１１／ＹＰＴ３低分子量ＧＴＰａｓｅ産生遺伝子（タンパク質コード５８８９８）としてカウントされ、これはセルラーゼ及びヘミセルラーゼの高分泌に影響を与えると推測された。総タンパク質含有量は、野性型のものよりも１．７６倍多かった。
表３：変異株アスペルギルス・アクレアツスから生産された細胞の外側へのタンパク質及び酵素の輸送に関連したセルロース分解酵素及びキシロース分解酵素並びにタンパク質の生産に関連した遺伝子
【表３】
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【００８１】
実施例６：バガスの糖化における変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２により生産された酵素の使用
【００８２】
好適な酵素含有量並びに深部発酵及び固相発酵の両方からの酵素生産の種類を含む、界面活性剤などの他の化学物質の使用の両方における、バガスの酵素糖化の条件を調べた。
【００８３】
２．５〜２０ｍｇタンパク質／ｇ基質に達するまで、変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２から生産された酵素に水蒸気爆発で前処理されたバガス５％（ｗ／ｖ）を添加した。次に、濃度が５０ｍＭ、ｐＨが５．０に達するまでリン酸塩−クエン酸塩緩衝液を添加し、濃度が０．１％に達するまで上記混合物にアジ化ナトリウムを添加した。界面活性剤の調査のため、濃度が基質の０．１７５％（ｖ／ｗ）に達するまで上記混合物にルテンゾール界面活性剤を添加した。得られた混合物を２００ｒｐｍで振盪しながら、７２時間、４５℃の温度でインキュベートした。結果を表４に示した。  表４：界面活性剤を用いる又は用いない、変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２によって生産された酵素の様々な条件での水蒸気爆発法で前処理されたバガスの糖化で得られたグルコース含有量
【表４】
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【００８４】
表４から、２．５ｍｇ／ｇ基質から５ｍｇ／ｇ基質に酵素含有量が増加すると、糖類がより多く明らかに生産されることと、反応中に界面活性剤を添加すると、酵素によって糖類がより多く生産されることが分かった。
【００８５】
５〜２０ｍｇタンパク質／ｇ基質に達するまで水蒸気爆発法で前処理された５％（ｗ／ｖ）のバガスに変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２によって生産された酵素を添加することによって、深部発酵及び固相発酵で生産された酵素の性能の調査を実施した。次に、濃度が５０ｍＭ、ｐＨが５．０に達するまでリン酸塩−クエン酸塩緩衝液を添加した。濃度が０．１％に達するまで上記混合物にアジ化ナトリウムを添加した。得られた混合物を２００ｒｐｍで振盪しながら、７２時間、４５℃の温度でインキュベートした。結果を表５に示した。
表５：様々な量での深部発酵及び固相発酵で調製された変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２によって生産された酵素の水蒸気爆発法で前処理されたバガスの糖化で得られたグルコース含有量
【表５】
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【００８６】
表５から、深部発酵及び固相発酵を用いて酵素糖化で得られた糖含有量は類似していることが分かった。これは、深部発酵及び固相発酵で調製された変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２から生産された酵素が同様の有効性を有することを意味する。
【００８７】
５％（ｗ／ｖ）で様々な方法を用いて前処理したバガスから開始した糖化について、１）塩基触媒方法を用いる水蒸気爆発、２）有機溶媒分離法、３）アセトン中の水酸化ナトリウムによる方法及び４）メタノール中のナトリウムメトキシドによる方法である様々な前処理法が行われたバガスを調べた。変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２から生産された酵素によって、５ｍｇタンパク質／ｇ基質に達するまでバガスを添加した。次に、濃度が５０ｍＭ、ｐＨが５．０に達するまでリン酸塩−クエン酸塩緩衝液を添加した。濃度が０．１％に達するまで上記混合物にアジ化ナトリウムを添加した。その後、濃度が基質の０．１７５％（ｖ／ｗ）に達するまで混合物にルテンゾール界面活性剤を添加した。混合物を２００ｒｐｍで振盪しながら、７２時間、４５℃の温度でインキュベートした。結果を表６に示した。
【００８８】
表６から、変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２によって生産された酵素により、様々な前処理法が行われたバガスが効率的に糖化されることが分かった。
表６：変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２によって生産された酵素を用いて様々な前処理法が行われたバガスから得られたグルコース含有量
【表６】
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【００８９】
Ｃｅｌｌｉｃ  ＣＴＥＣ  ２（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、デンマーク）、Ｃｅｌｌｕｃｌａｓｔ  １．５Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、デンマーク）及びＡｃｃｅｌｅｒａｓｅ  １５００（ＤｕＰｏｎｔ、ＵＳＡ）である市販の酵素と比較した、変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２から生産された酵素の有効性も調査のために採用した。５ｍｇタンパク質／ｇ基質に達するまで、変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２によって生産された酵素又は市販の酵素と共に、様々な前処理法が行われたバガス（５％（ｗ／ｖ））を添加した。次に、濃度が５０ｍＭ、ｐＨが５．０に達するまでリン酸塩−クエン酸塩緩衝液を添加した。濃度が０．１％に達するまで上記混合物にアジ化ナトリウムを添加した。その後、濃度が基質の０．１７５％（ｖ／ｗ）に達するまで混合物にルテンゾール界面活性剤を添加した。混合物を２００ｒｐｍで振盪しながら、７２時間、４５℃の温度でインキュベートした。結果を表７に示した。
【００９０】
表７から、変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２によって生産された酵素により、市販の酵素Ｃｅｌｌｉｃ  ＣＴＥＣ  ２並びにより良好な市販の酵素Ｃｅｌｌｕｃｌａｓｔ  １．５Ｌ及びＡｃｃｅｌｅｒａｓｅ  １５００と同様に、様々な前処理法が行われたバガスが効率的に糖化されることが分かった。
表７：塩基触媒を用いて水蒸気爆発で前処理されたバガスの糖化において、市販の酵素と比較した、変異株アスペルギルス・アクレアツスＥ１４−２９２によって生産された酵素の有効性
【表７】
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【００９１】
発明の好ましい実施形態
本発明の好ましい実施形態は、発明の説明に記載された通りである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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