(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光画像の蛍光強度確定方法であって、
顕微鏡蛍光イメージングシステムを採用して、ターゲットサンプルに対して蛍光イメージングを行って蛍光画像を取得し、
蛍光画像内の各検出ターゲットの蛍光画像領域に対してエッジ抽出及び分割を行って、前記蛍光画像内の各検出ターゲットに対応する蛍光画像領域を取得し、
各検出ターゲットの蛍光画像領域の累積階調値を算出し、前記累積階調値を、フロークラスタリング分析で対応する蛍光チャンネルにおいて光電子増倍管によって採集された累積電圧パルス値で表される累積蛍光強度値とする操作、
各検出ターゲットの蛍光画像領域の最大階調値を算出し、前記最大階調値を、フロークラスタリング分析で対応する蛍光チャンネルにおいて光電子増倍管によって採集された最大電圧パルス値で表される最大蛍光強度値とする操作、
各検出ターゲットの蛍光画像領域の平均階調値を算出し、前記平均階調値を、フロークラスタリング分析で対応する蛍光チャンネルにおいて光電子増倍管によって採集された平均電圧パルス値で表される平均蛍光強度値とする操作、
各検出ターゲットの明視野画像領域の明視野の直径値をターゲットサイズ値として算出し、当該値を、フロークラスタリング分析を行う際に前方散乱チャネルにおいて光電子増倍管によって採集された電圧パルス値で表される検出ターゲットのサイズ値の対応する代替指数として確定する操作のうちの少なくとも一つの操作を実行し、
前記累積階調値、最大階調値、平均階調値、及び明視野の直径値のうちの少なくとも一つに基づいて、フロークラスタリング分析を行う、ことを含むことを特徴とする蛍光画像の蛍光強度確定方法。
【請求項２】
前記累積階調値、最大階調値、平均階調値、及び明視野の直径値のうちの少なくとも一つに基づいてフロークラスタリング分析を行うことは、
予め設定されたマッピングテーブルに従って、前記累積階調値、最大階調値、平均階調値、及び明視野の直径値にそれぞれ対応する累積蛍光強度値、最大蛍光強度値、平均蛍光強度値、及びターゲットサイズを検索し、テーブルを検索して得られた累積蛍光強度値、最大蛍光強度値、平均蛍光強度値、及びターゲットサイズ値に基づいてフロークラスタリング分析を行うことを含むことを特徴とする請求項１に記載の蛍光画像の蛍光強度確定方法。
【請求項３】
蛍光画像内の各検出ターゲットの蛍光画像領域に対してエッジ抽出及び分割を行うことは、
蛍光画像に対してガウス平滑化フィルタリングを行い、
平滑化フィルタリングされた蛍光画像に対して勾配エッジ検出を行い、
勾配エッジ検出の検出結果に従って、前記蛍光画像に対して蛍光ターゲット前景抽出を行い、
抽出されたターゲット前景に従って、前記蛍光画像に対して単一蛍光領域の分割を行って、各検出ターゲットの蛍光画像領域を取得することを含むことを特徴とする請求項１に記載の蛍光画像の蛍光強度確定方法。
【請求項４】
前記した顕微鏡蛍光イメージングシステムを採用してターゲットサンプルに対して蛍光イメージングを行って蛍光画像を取得することは、具体的に、顕微鏡蛍光イメージングシステムを採用してターゲットサンプルの蛍光画像及び明視野画像を採集して得ることであり、前記した蛍光画像に対してガウス平滑化フィルタリングを行う前に、さらに、
明視野画像における明視野ターゲットを認識し、認識された明視野ターゲットにおける塊領域を分離し、明視野画像内の各検出ターゲットの位置、サイズ情報を取得し、
蛍光画像を認識し、前記蛍光画像のうち明視野画像内の各検出ターゲットの位置、サイズ情報に対応する領域が空であるかどうかを判断し、空でないと、得られた明視野画像内の各検出ターゲットの位置、サイズ情報に対応する領域を採用して、前記蛍光画像から対応する各検出ターゲットの蛍光画像領域を確定し、
前記蛍光画像のうち明視野画像の検出ターゲットの位置、サイズ情報に対応する領域が空であると、蛍光画像に対してガウス平滑化フィルタリングを行い、後続の操作を実行する、ことを含むことを特徴とする請求項３に記載の蛍光画像の蛍光強度確定方法。
【請求項５】
顕微鏡蛍光イメージングシステムを採用してターゲットサンプルの蛍光画像及び明視野画像を採集して得ることは、具体的に、
顕微鏡蛍光イメージングシステムを採用してターゲットサンプルの蛍光画像を採集して得て、得られたターゲットサンプルの蛍光画像領域が予め設定された条件を満たすかどうかを判定し、満たさないと、顕微鏡蛍光イメージングシステムを採用してターゲットサンプルの明視野画像を採集して得ることであることを特徴とする請求項４に記載の蛍光画像の蛍光強度確定方法。
【請求項６】
蛍光画像の蛍光強度確定システムであって、
ターゲットサンプルに対して蛍光イメージングを行うための顕微鏡蛍光イメージングシステムと、
蛍光画像内の各検出ターゲットの蛍光画像領域に対してエッジ抽出及び分割を行って、前記蛍光画像内の各検出ターゲットに対応する蛍光画像領域を取得するためのインテリジェント認識システムと、
データ処理システムとを含み、
前記データ処理システムは、第１の算出ユニット、第２の算出ユニット、第３の算出ユニット、及び第４の算出ユニットのうちの少なくとも一つの算出ユニット、及びフロークラスタリング分析ユニットを含み、
前記第１の算出ユニットは、各検出ターゲットの蛍光画像領域の累積階調値を算出し、前記累積階調値を、フロークラスタリング分析で対応する蛍光チャンネルにおいて光電子増倍管によって採集された累積電圧パルス値で表される累積蛍光強度値とし、
前記第２の算出ユニットは、各検出ターゲットの蛍光画像領域の最大階調値を算出し、前記最大階調値を、フロークラスタリング分析で対応する蛍光チャンネルにおいて光電子増倍管によって採集された最大電圧パルス値で表される最大蛍光強度値とし、
前記第３の算出ユニットは、各検出ターゲットの蛍光画像領域の平均階調値を算出し、前記平均階調値を、フロークラスタリング分析で対応する蛍光チャンネルにおいて光電子増倍管によって採集された平均電圧パルス値で表される平均蛍光強度値とし、
前記第４の算出ユニットは、各検出ターゲットの明視野画像領域の直径値をターゲットサイズ値として算出し、当該値を、フロークラスタリング分析を行う際に前方散乱チャネルにおいて光電子増倍管によって採集された電圧パルス値で表される検出ターゲットのサイズ値の対応する代替指数として確定し、
前記フロークラスタリング分析ユニットは、前記累積階調値、最大階調値、平均階調値、及び明視野の直径値のうちの少なくとも一つに基づいて、フロークラスタリング分析を行うことを特徴とする蛍光画像の蛍光強度確定システム。
【請求項７】
前記フロークラスタリング分析ユニットは、具体的に、予め設定されたマッピングテーブルに従って、前記累積階調値、最大階調値、平均階調値及び明視野の直径値にそれぞれ対応する累積蛍光強度値、最大蛍光強度値、平均蛍光強度値、及びターゲットサイズ値を検索して、テーブルを検索して得られた累積蛍光強度値、最大蛍光強度値、平均蛍光強度値、及びターゲットサイズ値に基づいて、フロークラスタリング分析を行うことを特徴とする請求項６に記載の蛍光画像の蛍光強度確定システム。
【請求項８】
インテリジェント認識システムは、少なくとも蛍光ターゲット抽出ユニットを含み、前記蛍光ターゲット抽出ユニットは、
蛍光画像に対してガウス平滑化フィルタリングを行うためのフィルタリングユニットと、
平滑化フィルタリングされた蛍光画像に対して勾配エッジ検出を行うための勾配検出ユニットと、
勾配エッジ検出の検出結果に従って、前記蛍光画像に対して蛍光ターゲット前景抽出を行うための前景抽出ユニットと、
抽出されたターゲット前景に従って、前記蛍光画像に対して単一蛍光領域の分割を行って、各検出ターゲットの蛍光画像領域を取得するための分割ユニットとを含むことを特徴とする請求項６に記載の蛍光画像の蛍光強度確定システム。
【請求項９】
前記顕微鏡蛍光イメージングシステムは、さらに、ターゲットサンプルの明視野画像を採集し、
前記インテリジェント認識システムは、明視野細胞分離システムをさらに含み、前記明視野細胞分離システムは、
明視野画像における明視野ターゲットを認識し、認識された明視野ターゲットにおける塊領域を分離することで、明視野画像内の各検出ターゲットの位置、サイズ情報を取得するための明視野認識ユニットと、
前記蛍光画像のうち明視野画像内の各検出ターゲットの位置、サイズ情報に対応する領域が空であるかどうかを判断し、空でないと、得られた明視野画像内の各検出ターゲットの位置、サイズ情報に対応する領域を採用して、前記蛍光画像から対応する各検出ターゲットの蛍光画像領域を確定し、空であると、蛍光ターゲット抽出ユニットに蛍光ターゲット抽出ユニットの動作をトリガーするためのトリガー信号を出力するための明視野細胞分離ユニットとを含むことを特徴とする請求項８に記載の蛍光画像の蛍光強度確定システム。
【請求項１０】
前記蛍光ターゲット抽出ユニットは、得られた細胞の蛍光画像領域が予め設定された条件を満たすかどうかを判定し、満たさないと、顕微鏡蛍光イメージングシステムがターゲットサンプルの明視野画像を採集して、前記明視野細胞分離システムにトリガー信号を出力するように制御するための判断ユニットをさらに含むことを特徴とする請求項９に記載の蛍光画像の蛍光強度確定システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞検出の技術分野に関し、具体的に、蛍光画像の蛍光強度確定方法及びシステムに関する。
【０００２】
本出願は、２０１７年０７月２０日に中国専利局に提出した、出願番号がＣＮ２０１７１０５９６４４９.２であって、発明の名称が「蛍光画像の蛍光強度確定方法及びシステム」である中国特許出願の優先権を主張し、本願で、その全ての内容を援用するものとする。
【背景技術】
【０００３】
フロー分析技術は、重要な細胞分析技術であり、核となる原理は、検出ターゲット(細胞又は他の検出粒子)の蛍光強度を統計しクラスタリング分析を行うことである。フロー分析技術は、蛍光信号の電圧パルス値を記録することで蛍光強度を表すことである。現在、顕微鏡蛍光イメージング技術及びインテリジェント認識技術の発展につれて、多数の検出ターゲットに対して蛍光イメージングを行い、且つ画像認識方法により分析することにより、蛍光イメージング技術に基づくクラスタリング分析を実現することができ、このような顕微イメージング分析を基にフロークラスタリング分析をフュージョンした方法(画像クラスフロー分析方法)は、新しい分析方法となっている。
【０００４】
しかしながら、顕微鏡蛍光イメージング及びインテリジェント認識に基づく画像分析は画素及び階調を基に蛍光強度を表し、フロー分析が電圧パルスで蛍光強度を表す方式とまったく異なる。如何に両者の間の対応関係を確立し、画像で表される蛍光強度とフローで表される蛍光強度との間に比較可能性を有し、クラスフロー分析ライクを行う結果の正確性を保証するかは、画像クラスフロー分析方法で解決すべきキーワードおよび難点となっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これに鑑み、本発明の実施例は、画像で表される蛍光強度とフローで表される蛍光強度との間に比較可能性を有するように、蛍光画像の蛍光強度確定方法及びシステムを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の目的を実現するために、本発明の実施例は、以下の技術案を提供し、
蛍光画像の蛍光強度確定方法であって、
顕微鏡蛍光イメージングシステムを採用して、ターゲットサンプルに対して蛍光イメージングを行って蛍光画像を取得し、
蛍光画像内の各検出ターゲットの蛍光画像領域に対してエッジ抽出及び分割を行って、前記蛍光画像内の各検出ターゲットに対応する蛍光画像領域を取得し、
各検出ターゲットの蛍光画像領域の累積階調値を算出し、前記累積階調値を、フロークラスタリング分析で対応する蛍光チャンネルにおいて光電子増倍管によって採集された累積電圧パルス値で表される累積蛍光強度値とし、
各検出ターゲットの蛍光画像領域の最大階調値を算出し、前記最大階調値を、フロークラスタリング分析で対応する蛍光チャンネルにおいて光電子増倍管によって採集された最大電圧パルスで表される最大蛍光強度値とし、
各検出ターゲットの蛍光画像領域の平均階調値を算出し、前記平均階調値を、フロークラスタリング分析で対応する蛍光チャンネルにおいて光電子増倍管によって採集された平均電圧パルス値で表される平均蛍光強度値とし、
各検出ターゲットの明視野画像領域の直径値をターゲットサイズ値として算出し、当該値を、フロークラスタリング分析を行う際に前方散乱チャネルにおいて光電子増倍管によって採集された電圧パルス値で表される検出ターゲットのサイズ値の対応する代替指数として確定し、
前記累積階調値、最大階調値、平均階調値、及び明視野の直径値に基づいて、フロークラスタリング分析を行う、ことを含むことを特徴とする蛍光画像の蛍光強度確定方法。
上記技術案によれば、本発明の実施例で提供される蛍光画像の蛍光強度確定方法及びシステムは、顕微鏡蛍光イメージングシステムを採用してターゲットサンプルに対して蛍光イメージングを行うことで、蛍光画像を取得し、蛍光画像内の各検出ターゲットの蛍光画像領域に対してエッジ抽出及び分割を行うことで、前記蛍光画像内の各検出ターゲットに対応する蛍光画像領域を取得し、各検出ターゲットの蛍光画像領域の累積階調値、最大階調値、平均階調値、各検出ターゲットの明視野画像領域の直径値を算出して、前記累積階調値、最大階調値、平均階調値、及び明視野の直径値に基づいて、フロークラスタリング分析を行う。フロークラスタリング分析ソフトウェアに入力するか実行することで分析し、フロー分析法に対応し類似する結果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
本発明の実施例または従来技術の技術案をより明確に説明するために、以下、実施例または従来技術の説明において使用される図面を簡単に紹介する。明らかに、以下に説明する図面は、本発明のいくつかの実施例に過ぎず、他の図面を、創造的な労力をしない前提で、これらの図面に基づいて得ることができる。
【図１】本出願の実施例で開示される蛍光画像の蛍光強度確定方法の流れ模式図である。
【図２】本出願の実施例で開示される蛍光画像の蛍光強度確定方法におけるインテリジェント認識処理の流れ模式図である。
【図３】本出願の他の実施例で開示される蛍光画像の蛍光強度確定方法におけるインテリジェント認識処理の流れ模式図である。
【図４】本出願の更なる実施例で開示される蛍光画像の蛍光強度確定方法におけるインテリジェント認識処理の流れ模式図である。
【図５】本出願の別の実施例で開示される蛍光画像の蛍光強度確定システムの構造模式図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明の実施例における技術案について、本発明の実施例における図面を併用して明確、完全に説明する。明らかに、説明する実施例は、本発明の実施例の全てではなく一部のみである。本発明の実施例に基づいて、当業者によって創造的な労力をしない前提で得られるその他の実施例は、本発明の保護の範囲内に属する。
【０００９】
実際の応用において、フロー分析法は、顧客の選択のために、複数の指数を提供し、顧客は異なる側面からターゲット細胞を分析でき、主な指数は次の通りである。１、細胞が通過する際に採集された対応側方蛍光チャンネルの累積電圧パルス値を累積蛍光強度とする。２、細胞が通過する際に採集された対応側方蛍光チャンネルの最強電圧パルスを最高蛍光強度とする。３、細胞が通過する際に採集された対応側方蛍光チャンネルの平均電圧パルス値を平均蛍光強度とする。４、細胞が通過する際の前方散乱チャネルで採集された電圧パルス値をターゲットのサイズ値とする。
【００１０】
細胞蛍光画像分析において、ターゲット細胞の蛍光画像に対してエッジ抽出及び分割を行った後に、当該細胞の蛍光画素面積、蛍光画像直径、蛍光画像長軸、蛍光画像短軸、蛍光画像周長、蛍光画像真円度、蛍光画像最大階調値、最小階調値、平均階調値、累積階調値、中央値階調値、階調値落差値(最大階調値から最小階調値を減る)……などの数十種の特徴指数を分析して統計し得る。
【００１１】
しかし、細胞蛍光画像分析は、比較的に多い画像特徴値を抽出したが、どの特徴値が上記フローサイトメトリーにおける累積電圧パルス値、高さ、及び幅と対応関係を有し、その統計分析データがフロー分析に類似する結果及び精度を取得するかは、従来の画像分析方法で解決されていない問題である。これは画像分析方法とフロー分析方法結果の比較可能性を妨げる。
【００１２】
これに対して、本出願人は、多数の実験的検証を行ってフローサイトメトリー蛍光強度に対応できる四つの指数を取得した。累積蛍光階調値がフロー対応蛍光チャンネルの累積電圧パルス値に対応し、単一細胞最高蛍光階調値がフロー対応蛍光チャンネルの最強電圧パルス値に対応し、単一細胞平均蛍光階調値がフロー対応蛍光チャンネルの平均電圧パルス値に対応し、単一細胞明視野直径がフロー前方散乱チャネルで採集された電圧パルス値に対応する。
【００１３】
従来の技術における画像で表される蛍光強度とフローで表される蛍光強度とを比較できず、ユーザーが、検出結果の正確性をよりよく判断できないという問題について、本出願は、上記の四種の対応関係に基づく蛍光画像の蛍光強度確定方法を開示し、図１を参照し、当該方法は、以下のステップを含む。
【００１４】
ステップＳ１０１において、顕微鏡蛍光イメージングシステムを採用してターゲットサンプルに対して蛍光イメージングを行うことで、蛍光画像を取得する。
このステップにおいて、まず、顕微鏡蛍光イメージングシステムを採用してターゲットサンプルに対して画像クラスフロー蛍光検出を行うことで、ターゲットサンプルの蛍光画像を取得する。
【００１５】
ステップＳ１０２において、蛍光画像領域を確定する。
ターゲットサンプルの蛍光画像を得た後、さらに、インテリジェント認識システムを採用して前記蛍光画像に対して画像処理および分析を行うことで、前記蛍光画像に含まれる各細胞(検出ターゲット)の蛍光画像領域を取得してもよく、具体的に、画像処理および分析プロセスにおいて蛍光画像内の各検出ターゲットの蛍光画像領域に対してエッジ抽出及び分割を行うことで、前記蛍光画像内の各検出ターゲットに対応する蛍光画像領域を取得することが可能である。
【００１６】
ステップＳ１０３において、各検出ターゲットの蛍光画像領域の累積階調値を算出する。
このステップにおいて、得られた単一検出ターゲットの蛍光画像領域の領域範囲に従って、画像認識技術により、各検出ターゲットの蛍光画像領域の累積階調値を算出し、前記累積階調値を、フロークラスタリング分析で対応蛍光チャンネルにおいて光電子増倍管によって採集された累積電圧パルス値で表される累積蛍光強度値とし、前記累積蛍光階調値は単一検出ターゲットの蛍光画像領域内の全部の画素階調値の合計である。
【００１７】
ステップＳ１０４において、各検出ターゲットの蛍光画像領域の最大階調値を算出する。
このステップにおいて、得られた単一検出ターゲットの蛍光画像領域の領域範囲に従って、画像認識技術により、各検出ターゲットの蛍光画像領域の最大階調値を算出して、前記最大階調値を、フロークラスタリング分析で対応蛍光チャンネルにおいて光電子増倍管によって採集された最大電圧パルスで表される最大蛍光強度値とし、前記最大階調値は、単一検出ターゲットの蛍光画像領域のうち階調値が最も高い画素ドットの階調値である。
【００１８】
ステップＳ１０５において、各検出ターゲットの蛍光画像領域の平均階調値を算出する。
このステップにおいて、得られた単一検出ターゲットの蛍光画像領域の領域範囲に従って、画像認識技術により、各検出ターゲットの蛍光画像領域の平均階調値を算出して、前記平均階調値を、フロークラスタリング分析で対応蛍光チャンネルにおいて光電子増倍管によって採集された平均電圧パルス値で表される平均蛍光強度値とし、前記平均階調値は、単一検出ターゲットの蛍光画像領域内の全部の画素ドットの平均値である。
【００１９】
ステップＳ１０６において、各検出ターゲットの明視野画像領域の直径値をターゲットサイズ値として算出する。
このステップにおいて、各検出ターゲットの明視野画像を取得し、前記明視野画像に対してデータ分析を行うことで、各検出ターゲットの明視野画像領域の直径値をターゲットサイズ値として算出し、当該値を、フロークラスタリング分析を行う際に前方散乱チャネルにおいて光電子増倍管によって採集された電圧パルス値で表される検出ターゲットのサイズ値の対応する代替指数として確定する。
【００２０】
上記方法では、ステップＳ１０３-１０６の順序は、ユーザーニーズに応じて調整できる。
【００２１】
ステップＳ１０７において、前記累積階調値、最大階調値、平均階調値、及び明視野の直径値に基づいて、フロークラスタリング分析を行う。
このステップにおいて、前記累積階調値を累積蛍光強度値として、前記最大階調値を最大蛍光強度値として、前記平均階調値を平均蛍光強度値として、前記明視野画像領域の直径値を検出ターゲットのサイズ値とし、累積階調値、最大階調値、平均階調値、及び明視野の直径値を採用して、フロークラスタリング分析を行うことで、累積階調値、最大階調値、平均階調値、及び明視野の直径値の一つまたは複数に対応する蛍光検出波形図を生成し、生成した蛍光検出波形図を、直接に通常のフロー分析法を採用して得られた蛍光検出波形図と比較し、比較結果に従って、フロークラスタリング分析における検出ターゲットのサイズ値を調整することが可能であり、累積階調値、最大階調値、平均階調値、及び明視野の直径値の重み値を採用することにより、検出結果が従来の通常のフロー分析法を採用して得られた蛍光検出波形により近くなるようにし、検出結果の正確性を向上させる。
【００２２】
具体的に、実際の使用で、本出願の上記実施例で開示された方法では、光電子増倍管により前記検出ターゲットに対応する累積電圧パルス値、最大電圧パルス値、平均電圧パルス値、及び検出ターゲットのサイズ値を取得することなく、検出ターゲットに対してフロー分析を行うことができ、且つ高い精度を有する。
【００２３】
本出願の上記実施例で開示された技術案では、前記累積階調値、最大階調値、平均階調値、及び明視野の直径値に基づいて、フロークラスタリング分析を行う場合に、前記累積階調値、最大階調値、平均階調値、及び明視野の直径値を採用して直接にフロークラスタリング分析を行うことが可能であり、もちろん、累積階調値、最大階調値、平均階調値、及び明視野の直径値を採用してフロークラスタリング分析を行う前に、フロークラスタリング分析における算出式をトレーニングし、算出式における重み値を調整する必要があり、算出結果の精度を向上させる。もちろん、このステップにおいて、予め設定されたマッピングテーブルに従って、前記累積階調値、最大階調値、平均階調値、及び明視野の直径値と一対一に対応する累積蛍光強度値、最大蛍光強度値、平均蛍光強度値、及び蛍光面積値を検索してもよく、前記予め設定されたマッピングテーブルには、予め設定された累積階調値と累積蛍光強度値との間のマッピング関係、最大階調値と最大蛍光強度値との間のマッピング関係、平均階調値と平均蛍光強度値との間のマッピング関係、明視野の直径値と蛍光面積値との間のマッピング関係が記憶されている。
【００２４】
本出願の上記実施例で開示された技術案では、インテリジェント認識システムを採用して、ターゲットサンプルに対して蛍光イメージングして得られた蛍光画像に対してインテリジェント認識を行ってもよく、蛍光画像内の各検出ターゲットの蛍光画像領域に対してエッジ抽出及び分割を行って、各検出ターゲットの蛍光画像領域を取得し、図２を参照して、そのプロセスは、具体的に、以下のステップを含むことができる。
【００２５】
Ｓ１０２１において、得られた蛍光画像に対してガウス平滑化フィルタリングを行う。
このステップにおいて、まず、蛍光画像に対してガウス平滑化フィルタリングを行って、蛍光画像内の孤立したノイズポイントを除去し、画像のエッジを平滑化し、後続の境界の抽出と確定を容易にする。
【００２６】
Ｓ１０２２において、平滑化フィルタリングされた蛍光画像に対して勾配エッジ検出を行う。
このステップにおいて、フィルタリングされた蛍光画像に対して勾配エッジ検出を行い、主に、フィルタリングされた蛍光画像に対応する階調画像を利用して、蛍光画像の勾配特徴を算出し、勾配エッジの強弱に従って、背景ターゲットから認識待ち前景ターゲット領域を分離する。
【００２７】
Ｓ１０２３において、勾配エッジ検出の検出結果に従って、前記蛍光画像に対して蛍光ターゲット前景抽出を行う。
このステップにおいて、ステップＳ２０２の前景検出領域に対してターゲット抽出を行い、エッジのトラッキングを利用して、認識待ち前景ターゲット領域を連結領域の属性に従って、一つずつマーキングし、エッジの位置を記録する。
【００２８】
Ｓ１０２４において、抽出されたターゲット前景に従って、前記蛍光画像に対して単一蛍光領域の分割を行うことで、各検出ターゲットの蛍光画像領域を取得する。
【００２９】
ステップＳ１０２３の処理が終了した後、必ず多数の重複が存在する検出ターゲットを発見するので、重複する検出ターゲットを分離する必要があり、このステップは、距離変換などの一連のアルゴリズムにより、エッジをマーキングし、最終に、単一検出ターゲットを分離して各検出ターゲットの蛍光画像領域を取得してもよい。
【００３０】
本出願の他の実施例で開示される技術案では、蛍光イメージングシステムを採用してターゲットサンプルの蛍光画像を採集する他、その明視野画像を採集して得る必要があるので、上記ステップにおいて、前記した顕微鏡蛍光イメージングシステムを採用してターゲットサンプルに対して蛍光イメージングを行うことで、蛍光画像を取得することは、具体的に、顕微鏡蛍光イメージングシステムを採用してターゲットサンプルの蛍光画像及び明視野画像を採集して得ることであり、この場合、蛍光画像に対してガウス平滑化フィルタリングを行う前に、さらに以下のステップを含む。
【００３１】
ステップＳ１０１１において、明視野認識技術により明視野画像における明視野ターゲットを認識し、認識された明視野ターゲットにおける塊領域を分離することで、明視野画像内の各検出ターゲットの位置情報、及びサイズ情報を取得する。
具体的に、このステップにおいて、明視野撮像された明視野画像について、背景ターゲットから前景を分離し、具体的な方法は、明視野画像に対して階調化、輝度均一化、画像強調、二値化操作を行い、背景ターゲットから前景の検出ターゲット画像を抽出し、上記した抽出された前景の検出ターゲット画像は多数凝集する場合などがあるため、複数の検出ターゲット画像が重なり、検出ターゲット画像を分離する必要があり、単一検出ターゲット画像を取得し、単一検出ターゲット画像のエッジを求め、エッジ情報を記録する。
【００３２】
ステップＳ１０１２において、前記明視野認識技術により取得された検出ターゲットの位置情報、及びサイズ情報と、蛍光画像内の対応する領域とを比較し、蛍光画像を認識し、前記蛍光画像のうち明視野画像で検出された各検出ターゲットの位置情報、サイズ情報に対応する領域が空であるかどうかを判断し、空でないと、ステップＳ１０１３を実行し、空であると、ステップＳ１０１４を実行する。
【００３３】
ステップＳ１０１３において、前記蛍光画像における、得られた明視野画像認識技術を採用して検出された各検出ターゲットの位置、サイズ情報に対応する領域に従って、前記蛍光画像から対応する各検出ターゲットの蛍光画像領域を確定する。
【００３４】
ステップＳ１０１４において、前記述蛍光画像のうち明視野画像の検出ターゲットの位置、サイズ情報に対応する領域が空であると、前記蛍光画像に対してガウス平滑化フィルタリングを行い、後続の操作を実行する。
【００３５】
前記した蛍光画像を認識することは、具体的に、撮像された蛍光画像に対して、背景ターゲットから蛍光ターゲットが位置する領域を分離することであり、具体的な方法は、画像に対して階調化、輝度均一化、エッジ強調、及び画像の二値化操作を行ってから、画像エッジの抽出を行って、蛍光ターゲットが位置する領域をマーキングして記憶する。
【００３６】
前記明視野認識は、具体的に、明視野画像の各検出ターゲットで分割された領域(単一検出ターゲットのエッジであって、且つエッジ情報を記録する)をマークとして、明視野画像技術の分割結果を利用して蛍光画像を分割し、単一検出ターゲットの蛍光画像における領域を抽出して、つまり、ここに明視野ターゲットが存在し、蛍光ターゲットにもこの位置をマーキングし、明視野ターゲットを用いて一対一に対応して蛍光ターゲットの分離を行う。
【００３７】
上記技術案では、顕微鏡蛍光イメージングシステムを採用してターゲットサンプルの蛍光画像、及び明視野画像を採集して得ることは、具体的に、
顕微鏡蛍光イメージングシステムを採用して、ターゲットサンプルの蛍光画像を採集して得て、得られたターゲットサンプルの蛍光画像領域が予め設定された条件を満たすかどうかを判定し、満たさないと、顕微鏡蛍光イメージングシステムを採用してターゲットサンプルの明視野画像を採集して得ることである。
【００３８】
ここの蛍光ターゲットは図２で開示された方法を用いて分割すると明らかに合理でなく、例えば、エッジ分割が断片化されるか、エッジが拡散して蛍光の領域が明らかに不正確になり、システムは、自動的に図３の方法を採用して補正認識を行い、つまり、明視野ターゲットの認識結果に基づいて操作し、それに対して、本実施例において、上記の二種の実施例で開示されたインテリジェント認識処理方法を結合した処理方式をさらに開示し、当該方式は、主に図２で開示された処理方式に基づき、図３で開示された処理方式によって補足し、具体的には、図４を参照する。
【００３９】
各検出ターゲットの蛍光画像領域を取得した後、以下のステップをさらに含む。
【００４０】
ステップＳ４０１において、得られた検出ターゲットの蛍光画像領域が予め設定された条件を満たすかどうかを判定し、満たさないと、ステップＳ４０２を実行する。
【００４１】
ステップＳ４０２において、顕微鏡蛍光イメージングシステムを採用して、ターゲットサンプルの明視野画像を採集して得て、ステップＳ１０１１を実行する。
【００４２】
上記方法に対応して、本出願は、蛍光画像の蛍光強度確定システムをさらに開示し、前記方法とシステムは互いに参照でき、図５を参照して、当該システムは、
ターゲットサンプルに対して蛍光イメージングを行うための顕微鏡蛍光イメージングシステム１００と、
蛍光画像内の各検出ターゲットの蛍光画像領域に対してエッジ抽出及び分割を行って、前記蛍光画像内の各検出ターゲットに対応する蛍光画像領域を取得するためのインテリジェント認識システム２００と、
データ処理システム３００とを含み、
前記データ処理システム３００は、第１の算出ユニット３１０、第２の算出ユニット３２０、第３の算出ユニット３３０、第４の算出ユニット３４０、及びフロークラスタリング分析ユニット３５０を含み、
前記第１の算出ユニット３１０は、各検出ターゲットの蛍光画像領域の累積階調値を算出し、前記累積階調値を、フロークラスタリング分析で対応する蛍光チャンネルにおいて光電子増倍管によって採集された累積電圧パルス値で表される累積蛍光強度値とし、
前記第２の算出ユニット３２０は、各検出ターゲットの蛍光画像領域の最大階調値を算出し、前記最大階調値を、フロークラスタリング分析で対応する蛍光チャンネルにおいて光電子増倍管によって採集された最大電圧パルスで表される最大蛍光強度値とし、
前記第３の算出ユニット３３０は、各検出ターゲットの蛍光画像領域の平均階調値を算出し、前記平均階調値を、フロークラスタリング分析で対応する蛍光チャンネルにおいて光電子増倍管によって採集された平均電圧パルス値で表される平均蛍光強度値とし、
前記第４の算出ユニット３４０は、各検出ターゲットの明視野画像領域の直径値をターゲットサイズ値として算出し、当該値を、フロークラスタリング分析を行う際に前方散乱チャネルにおいて光電子増倍管によって採集された電圧パルス値で表される検出ターゲットのサイズ値の対応する代替指数とし、
前記フロークラスタリング分析ユニット３５０は、前記累積階調値、最大階調値、平均階調値、及び明視野の直径値に基づいて、フロークラスタリング分析を行う。
【００４３】
上記方法に対応して、本システムで前記第１の算出ユニット３１０、第２の算出ユニット３２０、第３の算出ユニット３３０、第４の算出ユニット３４０は何れか一つ存在してもよく、即ち、本システムにおいて、第１の算出ユニット３１０、第２の算出ユニット３２０、第３の算出ユニット３３０及び/又は第４の算出ユニット３４０を選択的に有してもよい。
【００４４】
上記方法に対応して、前記インテリジェント認識システム２００は、前記蛍光画像に対してインテリジェント認識処理を行うことで、単一検出ターゲット蛍光画像のエッジを抽出するように配置され、エッジ領域内の全部の画素は単一検出ターゲットの蛍光画像領域である。
【００４５】
上記方法に対応して、前記インテリジェント認識システム２００は、少なくとも蛍光ターゲット抽出ユニットを含み、前記蛍光ターゲット抽出ユニットは、
蛍光画像に対してガウス平滑化フィルタリングを行うためのフィルタリングユニットと、
平滑化フィルタリングされた蛍光画像に対して勾配エッジ検出を行うための勾配検出ユニットと、
勾配エッジ検出の検出結果に従って、前記蛍光画像に対して蛍光ターゲット前景抽出を行うための前景抽出ユニットと、
抽出されたターゲット前景に従って、前記蛍光画像に対して単一蛍光領域の分割を行って、各検出ターゲットの蛍光画像領域を取得するための分割ユニットとを含む。
【００４６】
上記方法に対応して、前記顕微鏡蛍光イメージングシステム１００は、さらにターゲットサンプルの明視野画像を採集する。
前記インテリジェント認識システム２００は、明視野細胞分離システムをさらに含むことができ、前記明視野細胞分離システムは、
明視野画像における明視野ターゲットを認識し、認識された明視野ターゲットにおける塊領域を分離し、明視野画像における各検出ターゲットの位置、サイズ情報を取得するための明視野認識ユニットと、
前記蛍光画像のうち明視野画像内の各検出ターゲットの位置、サイズ情報に対応する領域が空であるかどうかを判断し、空でないと、得られた明視野画像内の各検出ターゲットの位置、サイズ情報に対応する領域を採用して、前記蛍光画像から対応する各検出ターゲットの蛍光画像領域を確定し、空であると、蛍光ターゲットに蛍光ターゲット動作をトリガーするためのトリガー信号を出力するための明視野細胞分離ユニットとを含む。
【００４７】
上記方法に対応して、本出願の他の実施例で開示される技術案では、前記顕微鏡蛍光イメージングシステムは、さらに、ターゲットサンプルの明視野画像を採集する。
前記インテリジェント認識システム３００は、蛍光ターゲット抽出ユニット及び明視野細胞分離システムを含み、本実施例も蛍光ターゲット及び明視野細胞分離システムを含むが、両者の作動タイミングは上記実施例における蛍光ターゲット及び明視野細胞分離システムの作動タイミングと異なり、具体的には、以下の通りである。
本実施例において、前記蛍光ターゲットは、得られた細胞の蛍光画像領域が予め設定された条件を満たすかどうかを判定し、満たさないと、顕微鏡蛍光イメージングシステムがターゲットサンプルの明視野画像採集して、前記明視野細胞分離システムにトリガー信号を出力するように制御するための判断ユニットをさらに含む。
【００４８】
説明の便宜上、以上のシステムを記述する場合に、機能によって各種のモジュールに分けて記述した。もちろん、本出願を実施する場合に、各モジュールの機能を同一あるいは複数のソフトウェアおよび／またはハードウェアにおいて実現してもよい。
【００４９】
本明細書の各実施例は、漸進的な方法によって記述され、各実施例の間の共通または類似する部分を互いに参照すればよく、各実施例で主に説明されているのは、他の実施例との相違する箇所である。特に、システム又はシステムの実施例は、基本的に方法の実施例に類似するので、比較的に簡単に記述され、関連する部分は方法の実施例の部分の説明を参照すればよい。以上で記述されたシステムおよびシステムの実施例は例示的であり、なお、前記した分離部品として説明されたユニットは、物理的に分離されても、されなくてもよく、ユニットとして表示されている部分は、物理的なユニットであっても、なくてもよく、１つの位置に位置してもよく、または複数のネットワークユニットに分散されてもよい。実際の需要に従って、一部または全てのモジュールを選択して本実施例の方案の目的を達成してもよい。当業者は、創造的な労力をせず、理解して実施することができる。
【００５０】
当業者であれば、本明細書に開示されている実施例で記述された各例のユニットおよびアルゴリズムステップは、電子ハードウェア、コンピュータソフトウェアと電子ハードウェアとコンピュータソフトウェアとの組み合わせによって実現し得ることを想到し得て、ハードウェアとソフトウェアの互換性を明確に説明するために、上記説明において機能によって各例の構成およびステップを一般的に説明した。これらの機能をハードウェアで実行するかソフトウェアで実行するは、技術案の特定のアプリケーションおよび設計制約条件に依存する。当業者は各特定のアプリケーションに対して異なる方法を用いて記述される機能を実現することができるが、このような実現が本発明の範囲を越えると考えるべきではない。
【００５１】
本明細書に開示された実施例で記述されている方法またはアルゴリズムのステップは、ハードウェア、プロセッサによって実行されるソフトウェアモジュール、またはこれら２つの組み合わせで直接実施されてもよい。ソフトウェアモジュールは、ＲＡＭ（ＲａｎｄｏｍＡｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ）、メモリ、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ-Ｏｎｌｙ Ｍｅｍｏｒｙ）、ＥＰＲＯＭ（ＥｒａｓａｂｌｅＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ＲｅａｄＯｎｌｙ Ｍｅｍｏｒｙ）、ＥＥＰＲＯＭ (Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｌｙ Ｅｒａｓａｂｌｅ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｒｅａｄ ｏｎｌｙ ｍｅｍｏｒｙ)、レジスタ、ハードディスク、取り外し可能磁気ディスク、ＣＤ-ＲＯＭ、または当技術分野の周知の他の形態の記憶媒体に格納されてもよい。
【００５２】
さらに、説明すべきことは、本明細書において、例えば、「第１」と「第２」等などの関係用語は、ただ一つの実体又は操作と他の一つの実体又は操作と区分するための用語であり、これらの実体又は操作同士にこのような実際の関係又は順序が存在することを示唆しない。且つ、用語である「含む」や「包含」又は他の変更用語は、非排他的包含をカバーする。一連の要素を含むプロセス、方法、物品又はデバイスは、それらの要素だけでなく、明確に記載されていない他の要素や、このプロセス、方法、物品又はデバイスに固有された要素も含む。さらに限定しない場合、「一つの．．．を含む」で限定された要素は、前記要素を含むプロセス、方法、物品又はデバイスにその他の同じ要素が存在することを排除しない。
【００５３】
開示された実施例の上記説明は、当業者が本開示を実現または使用することを可能にする。これらの実施例に対する多くの変更は、当業者にとって明らかであり、本明細書で定義する一般的原理は、本発明の精神または範囲から逸脱することなく、他の実施形態において実施され得る。従って、本発明は、本明細書に開示する実施例に限定されず、本明細書に開示する原理および新規の特徴に従う最も広い範囲に従うものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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