(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質薬物ライブラリーであって、C種類の異なるタンパク質薬物単量体を含み、ここで、前記のタンパク質薬物単量体はタンパク質薬物エレメント部分および前記タンパク質薬物エレメント部分と連結した核酸エレメント部分を含み、かつ一つの前記タンパク質薬物単量体の前記の核酸エレメント部分は少なくとも一つの別のタンパク質薬物単量体の核酸エレメント部分と相補によって二本鎖対合構造になることによって、多量体のタンパク質薬物を構成することができ、
ここで、Cは2を超える正整数であり、
前記のタンパク質薬物単量体は、式Iで表される構造を有する、
ことを特徴とするライブラリー。
P─X─L─Y─A─Z       (I)
（式中において、
Pはタンパク質系薬物分子（すなわちタンパク質薬物エレメント部分）である。
Xはなしか、あるいは重複ペプチドである。
Lはリンカー分子である。
YおよびZはなしか、あるいは重複核酸である。
Aは一つの核酸配列で、前記核酸配列は、L-核酸、ロックド核酸、チオ修飾核酸、2'-フルオロ修飾核酸、5-ヒドロキシメチルシチジル酸、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
「─」は共役結合である。
ここで、いずれかのタンパク質薬物単量体の核酸Aは少なくとも一つの相補的対合領域を有し、前記相補的対合領域は前記タンパク質薬物ライブラリーにおける少なくとも一つのタンパク質薬物単量体の核酸Aの相補的対合領域と部分的にまたは完全に相補的である。）
【請求項２】
前記のタンパク質薬物エレメント部分と前記核酸エレメント部分は直接的に連結しているか、間接的に連結していることを特徴とする請求項1に記載のタンパク質薬物ライブラリー。
【請求項３】
前記タンパク質系薬物分子Pは、抗体、受容体またはほかのタンパク質を活性化または抑制するリガンド、生物活性酵素、またはその組み合わせからなる群から選ばれること特徴とする請求項1に記載のタンパク質薬物ライブラリー。
【請求項４】
前記抗体は、癌、自己免疫疾患、免疫チェックポイント、臓器移植拒絶、関節リウマチ、糖尿病、血友病を治療するための抗体から選ばれること特徴とする請求項1に記載のタンパク質薬物ライブラリー。
【請求項５】
前記リンカー分子Lは二重機能ヘッドを有し、核酸AまたはYの修飾基を有する修飾末端および抗体PまたはXの特異的結合部位に連結することができること特徴とする請求項1に記載のタンパク質薬物ライブラリー。
【請求項６】
個別化医療に用いられるタンパク質薬物を組み立てる方法であって、
(a) 製薬情報に基づき、請求項1に記載のタンパク質薬物ライブラリーから少なくとも2種類のタンパク質薬物単量体を選択する工程と、
(b) 前記の少なくとも2種類のタンパク質薬物単量体を混合することによって、多量体の形態の多重特異性タンパク質薬物に組み立てる工程と、
を含む方法。
【請求項７】
多量体タンパク質薬物であって、D種類のタンパク質薬物単量体が核酸の相補によって二本鎖対合構造になった多量体で、ここで、Dは2を超える正整数で、
ここで、前記のタンパク質薬物単量体はタンパク質薬物エレメント部分および前記タンパク質薬物エレメント部分と連結した核酸エレメント部分を含み、かつ一つの前記タンパク質薬物単量体の前記の核酸エレメント部分は一つの別の異なるタンパク質薬物単量体の核酸エレメント部分と相補によって二本鎖対合構造になることが可能であり、
前記の核酸エレメント部分は、L-核酸、ロックド核酸、チオ修飾核酸、2'-フルオロ修飾核酸、5-ヒドロキシメチルシチジル酸、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれ、
タンパク質薬物単量体は、請求項１に記載のタンパク質薬物ライブラリーからのタンパク質薬物単量体であることを特徴とする薬物。
【請求項８】
(i) 活性成分として請求項7に記載の多量体タンパク質薬物と
(ii) 薬学的に許容される担体と、
を含むことを特徴とする薬物組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物の分野に関する。具体的に、タンパク質薬物ライブラリー、およびその多重特異性タンパク質薬物（抗体）を構築する方法と使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来のモノクローナル抗体は特異的に一つの抗原部位に結合し、かつそのFc末端がNK細胞の表面におけるFc受容体に結合することによって、免疫細胞を活性化させることができる。しかしながら、非常に大きい殺傷力を有するT細胞を動員することができないため、免疫系を最大限に活性化させることができない。また、従来の単特異性抗体は一つの抗原部位に結合することでは、当該抗原を介するシグナル経路またはそれに関連する代償経路を十分に利用または遮断することが困難であるため、治療効果は好ましくないか、薬剤耐性が生じやすいが、たとえばCD20に対する複数の抗体はCD20表面における異なる部位を認識するため、各抗体の活性の差が顕著である。膠芽腫（GBM）細胞の表面におけるVEGFを標的とする抗体による治療は、アンジオポエチン-2（Ang-2）の発現レベルの上方調節につながることで、抗VEGF抗体に対する薬剤耐性が生じる。
【０００３】
多重特異性抗体は2種類またはそれ以上の抗体の特異性を含み、複数の抗原のエピトープ、または一つの抗原の複数のエピトープを標的として結合するため、抗原自身の下流経路またはそれとほかのタンパク質の相互作用を十分に遮断することによって、抗体の治療効果を向上させ、薬剤耐性を減少させることができる。二重特異性抗体を例とすると、全世界で現在すでに60社超の二重特異性抗体を研究・開発する企業があり、百社以上が二重特異性抗体の薬物を研究しており、その多くは、腫瘍細胞標的-T細胞動員部位の形態（たとえばCD3を介して傷害性T細胞を動員して活性化し、CD16を介してナチュラルキラー細胞（NK細胞）を動員することによって、局部的に集中する免疫細胞によって腫瘍細胞を標的として殺傷するもの）および二重標的部位の形態（たとえばVEGF-PDGF、VEGF-Ang2、Her2-Her3は、関連する二つのシグナル経路を阻害することによって、潜在的な薬剤耐性を減少させるもの）である。また、一部の二重特異性抗体は一つの抗原の複数の部位に対するもので、たとえばMedImmune社のMEDI4276は、同時にHer2のドメインIIとドメインIVを標的とする二重特異性抗体薬物複合体（Bispecific ADC）である。そのため、単特異性抗体と比べ、多重特異性抗体はより多い組み合わせの可能性、協同効果を提供し、かつ直接T細胞の関与度を増加させ、投与量を下げると同時に抗体の免疫治療効果（たとえば抗腫瘍効果）を大幅に向上させる。
【０００４】
現在、最も発展の可能性がある多重特異性（二重特異性）抗体の技術 プラットフォームは主にBiTE、DART、tandAB、Bi-nanobody、CrossMAB、Triomabなどである。これらのプラットフォームは主に異なる抗体工学の技術によって異なる抗体の認識領域を一つのタンパク質に組み込み、多重特異性の目的を実現させる。たとえばBiTEおよびBi-nanobody技術は、いずれも二つの一本鎖(scFv)またはナノ抗体(nanobody)を一つの可動性ペプチドを介して連結し、同時に二つの抗体単位の親和性の特徴を残す。Crossmabは、二つの抗体のFc重鎖領域に異なる突然変異を導入することによって、同抗体の重鎖が立体障害で組み立てることができず、異なる抗体の重鎖が空間的に相補的で、ジスルフィド結合を介して完全な抗体分子を組み立てることができるようにさせることで、二重特異性抗体の製造に成功した。しかし、タンパク質工学によって二つの抗体または断片を一つの分子に組み立てる場合、抗体の親和力の低下または喪失が生じやすい。たとえばBiTEは、異なる一本鎖抗体の組み合わせは異なる軽・重鎖の配列の順番を試さなければ、最適な二重特異性抗体分子が得られない。Crossmabなどの全長抗体は軽鎖が誤対合する問題があり、これは共通軽鎖の技術によって解決することができるが、より多くの設計、選別の工程が増え、かつ汎用の技術によって直接ほかの二重特異性抗体の組み合わせに応用することができない。Triomab、Crossmab、DVD-Ig、Ortho-Fab-IgGなどの全長抗体の形態の多重特異性抗体は哺乳動物細胞の発現系(たとえばCHO、HEK293)でしか大規模に生産することができず、プロセスは抗体断片(scFv、Fab)よりも複雑で、製造コストがより高い。
【０００５】
そのため、本分野では、個別化精密医療に適するタンパク質（たとえば抗体）薬物ライブラリーを構築するため、汎用できる、低コストで、高収率の多重特異性抗体の製造技術の開発が切望されている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の目的は、個別化精密医療に適するタンパク質薬物ライブラリーを提供することである。
具体的に、本発明は、L-核酸鎖フレームワークで複数の抗体薬物を連結して二重または多重特異性薬物を形成するプラットフォーム技術を提供し、便利かつ有効に複数の抗体薬物を複合化させ、疾患の個別化精密医療に有用な抗体薬物ライブラリーを構築することができる。
【０００７】
本発明の第一の側面では、C種類の異なるタンパク質薬物単量体を含み、前記のタンパク質薬物単量体はタンパク質薬物エレメント部分および前記タンパク質薬物エレメント部分と連結した核酸エレメント部分を含み、かつ一つの前記タンパク質薬物単量体の前記の核酸エレメント部分は少なくとも一つの別のタンパク質薬物単量体の核酸エレメント部分と相補によって二本鎖対合構造になることによって、多量体のタンパク質薬物を構成することができ、
ここで、Cは2以上の正整数である、
タンパク質薬物ライブラリーを提供する。
もう一つの好適な例において、前記の多量体のタンパク質薬物は、多重特異性タンパク質薬物である。
【０００８】
もう一つの好適な例において、Cは3〜100000、好ましくは3〜10000、より好ましくは5〜5000、最も好ましくは10〜5000のいずれかの正整数である。
もう一つの好適な例において、前記の多量体のタンパク質薬物は、耐ヌクレアーゼ分解性のものである。
もう一つの好適な例において、前記の核酸エレメント部分は、耐ヌクレアーゼ分解性のものである。
もう一つの好適な例において、前記のタンパク質薬物単量体は、耐ヌクレアーゼ分解性のものである。
【０００９】
もう一つの好適な例において、前記の多量体のタンパク質薬物は、体内で解重合する半減期H1が単独のタンパク質薬物エレメントの体内における半減期H2よりも大きい。
もう一つの好適な例において、H1/H2の比は1〜100、好ましくは10〜50、より好ましくは10〜20である。
もう一つの好適な例において、前記の「解重合」とは、多量体のタンパク質薬物が解離し、タンパク質薬物単量体になることである。
もう一つの好適な例において、前記の体内とは、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物の体内である。
もう一つの好適な例において、前記のタンパク質薬物エレメント部分と前記核酸エレメント部分は直接的に連結しているか、間接的に連結している。
【００１０】
もう一つの好適な例において、一つのタンパク質薬物単量体では、それに含まれる核酸エレメント部分E2とタンパク質薬物エレメント部分E1の比Q（すなわちE2/E1）（Qはモル比である）は10〜1、好ましくは4〜1、より好ましくは2〜1、または約1〜1である。
もう一つの好適な例において、Qは2、1.5、1.2、1.1または1.05が好ましい。
もう一つの好適な例において、前記のタンパク質薬物は、静脈内投与のタンパク質薬物である。
もう一つの好適な例において、前記のタンパク質薬物単量体は、式Iで表される構造を有する。
P─X─L─Y─A─Z       (I)
（式中において、
Pはタンパク質系薬物分子（すなわちタンパク質薬物エレメント部分）である。
Xはなしか、あるいは重複ペプチドである。
Lはリンカー分子である。
YおよびZはなしか、あるいは重複核酸である。
【００１１】
Aは一つの核酸配列で、前記核酸配列は、L-核酸、ペプチド核酸、ロックド核酸、チオ修飾核酸、2'-フルオロ修飾核酸、5-ヒドロキシメチルシチジル酸、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
「─」は共役結合である。
【００１２】
ここで、いずれかのタンパク質薬物単量体の核酸Aは少なくとも一つの相補的対合領域を有し、前記相補的対合領域は前記タンパク質薬物ライブラリーにおける少なくとも一つのタンパク質薬物単量体の核酸Aの相補的対合領域と部分的にまたは完全に相補的である。）
【００１３】
もう一つの好適な例において、前記タンパク質系薬物分子Pは、抗体、受容体またはほかのタンパク質を活性化または抑制するリガンド、生物活性酵素、またはその組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記抗体は、一本鎖抗体、ナノ抗体、Fab、モノクローナル抗体、またはその組み合わせからなる群から選ばれる。
【００１４】
もう一つの好適な例において、前記抗体は、抗PD-1一本鎖抗体、抗PD-L1一本鎖抗体、抗CTLA-4一本鎖抗体、抗CD-3一本鎖抗体、またはその組み合わせからなる群から選ばれる。
【００１５】
もう一つの好適な例において、前記抗体は、癌、自己免疫疾患、免疫チェックポイント、臓器移植拒絶、関節リウマチ、糖尿病、血友病を治療するための抗体から選ばれる。
【００１６】
もう一つの好適な例において、前記抗体の標的は、CD20、CD19、CD30、HER2、VEGFR、EGFR、RANK、VEGFR2、SLAMF7、GD2、CD33、TNF-α、IL12、IL23、IL6R、IL17、BlyS、CD11a、PD-1、CTLA-4、TIM-3、OX40、CD47、CD3、IL-2R、PCSK9、GPCRからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記抗体の標的は、TNF-α、IL17からなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記抗体の標的は、CD3、HER2、PD-1からなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記タンパク質系薬物分子Pは野生型または突然変異型である。
もう一つの好適な例において、前記突然変異は薬物の機能に影響がない。
もう一つの好適な例において、前記突然変異は抗体のカルボキシ基末端（C末端）への一つまたは複数のシステイン残基の導入を含む。
もう一つの好適な例において、Xは0〜30個のアミノ酸である。
【００１７】
もう一つの好適な例において、Xは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30個のアミノ酸である。
【００１８】
もう一つの好適な例において、前記リンカー分子Lは二重機能ヘッドを有し、核酸AまたはYの修飾基を有する修飾末端および抗体PまたはXの特異的結合部位に連結することができる。
もう一つの好適な例において、前記リンカー分子Lの活性基は、マレイミド、ハロアセチル基、チオピリジンから選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記ハロアセチル基は、ヨードアセチル基、ブロモアセチル基から選ばれる。
もう一つの好適な例において、Yは0〜30個のヌクレオチドである。
もう一つの好適な例において、前記YはL-核酸である。
【００１９】
もう一つの好適な例において、Yは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30個のヌクレオチドである。
もう一つの好適な例において、前記YはAAAA、AAAまたはAAである。
もう一つの好適な例において、Zは0〜30個のヌクレオチドである。
もう一つの好適な例において、前記ZはL-核酸である。
【００２０】
もう一つの好適な例において、Zは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30個のヌクレオチドである。
もう一つの好適な例において、前記ZはAAAA、AAAまたはAAである。
もう一つの好適な例において、前記核酸AはL-核酸である。
もう一つの好適な例において、前記核酸Aは、DNA、RNAから選ばれる。
【００２１】
もう一つの好適な例において、前記修飾基は、NH2、アルキニル基、メルカプト基(SH)、カルボキシ基(COOH)、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記修飾基はNH2である。
もう一つの好適な例において、前記修飾基の前記核酸Aおよび/またはYにおける位置は、5'末端、3'末端、中間の任意の部位から選ばれる部位である。
もう一つの好適な例において、前記核酸Aにおける任意の2つの相補的対合領域の間に長さが0〜10ntの過渡領域がある。
もう一つの好適な例において、前記過渡領域はAAAA、AAAまたはAAである。
【００２２】
もう一つの好適な例において、前記相補的対合領域の長さは5〜100nt、好ましくは8〜50nt、より好ましくは10〜30nt、さらに好ましくは12〜20nt、最も好ましくは10〜15ntである。
本発明の第二の側面では、個別化医療に用いられるタンパク質薬物を組み立てる方法であって、
(a) 製薬情報に基づき、本発明の第一の側面に記載のタンパク質薬物ライブラリーから少なくとも2種類のタンパク質薬物単量体を選択する工程と、
(b) 前記の少なくとも2種類のタンパク質薬物単量体を混合することによって、多量体の形態の多重特異性タンパク質薬物に組み立てる工程と、
を含む方法を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の組み立ては、前記核酸エレメント部分の相補によって二本鎖対合構造になることである。
【００２３】
もう一つの好適な例において、前記の多量体の形態の多重特異性タンパク質薬物では、各タンパク質薬物単量体の核酸エレメント部分は1種類または2種類または3種類の異なるタンパク質薬物単量体の核酸エレメント部分と二本鎖対合構造になる。
【００２４】
もう一つの好適な例において、前記の組み立ては、前記核酸エレメント部分と補助核酸分子（すなわち核酸T）の一本鎖相補配列の相補によって二本鎖対合構造になることである。
もう一つの好適な例において、前記の補助核酸分子は一本鎖の形態である。
もう一つの好適な例において、前記核酸Tはタンパク質薬物と連結していない核酸である。
もう一つの好適な例において、前記核酸TはL-核酸、または修飾基によって修飾された核酸である。
もう一つの好適な例において、前記核酸Tの長さはすべての（b）における単量体の核酸の対合数の合計の1〜1.5倍である。
【００２５】
もう一つの好適な例において、前記製薬情報は治療としようとする治療対象の治療に必要なタンパク質薬物の情報で、タンパク質薬物の種類、組み合わせ（たとえば抗体の組み合わせ）、比率（任意の2つのタンパク質薬物Pの比率は1：1〜1：20である）を含む。
【００２６】
もう一つの好適な例において、前記組み立ての条件は、5〜50度（好ましくは25〜40度）で、1〜15分間（好ましくは5〜10分間）反応させることである。
もう一つの好適な例において、前記組み立ての条件は、pH 6〜9である。
【００２７】
本発明の第三の側面では、多量体タンパク質薬物であって、D種類のタンパク質薬物単量体が核酸の相補によって二本鎖対合構造になった多量体で、ここで、Dは2以上の正整数で、
【００２８】
ここで、前記のタンパク質薬物単量体はタンパク質薬物エレメント部分および前記タンパク質薬物エレメント部分と連結した核酸エレメント部分を含み、かつ一つの前記タンパク質薬物単量体の前記の核酸エレメント部分は一つの別の異なるタンパク質薬物単量体の核酸エレメント部分と相補によって二本鎖対合構造になることが可能である、薬物を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の核酸エレメント部分は、耐ヌクレアーゼ分解性のものである。
【００２９】
もう一つの好適な例において、前記の核酸エレメント部分は、L-核酸、ペプチド核酸、ロックド核酸、チオ修飾核酸、2'-フルオロ修飾核酸、5-ヒドロキシメチルシチジル酸、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記のタンパク質薬物単量体は、本発明の第一の側面に記載のタンパク質薬物ライブラリーからのタンパク質薬物単量体である。
【００３０】
ここで、Dは2〜20の正整数で、好ましくは2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20である。
もう一つの好適な例において、前記の多量体のタンパク質薬物は、多重特異性タンパク質薬物である。
もう一つの好適な例において、前記の多量体のタンパク質薬物は抗癌薬物である。
【００３１】
もう一つの好適な例において、前記の多量体のタンパク質薬物は、体内で解重合する半減期H1が単独のタンパク質薬物エレメントの体内における半減期H2よりも大きい。
もう一つの好適な例において、H1/H2の比は1〜100、好ましくは10〜50、より好ましくは10〜20である。
本発明の第四の側面では、
(i) 活性成分として本発明の第三の側面に記載の多量体タンパク質薬物と
(ii) 薬学的に許容される担体と、
を含む薬物組成物を提供する。
もう一つの好適な例において、前記薬物組成物の剤形は、注射剤、冷凍乾燥製剤からなる群から選ばれる。
【００３２】
もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上記の各技術特徴および下記（たとえば実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組合せ、新しい、または好適な技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
図面の説明
【図１】図1は、L-核酸の自己組織化に基づいた多重特異性抗体の概略図である。それは複数の抗体または抗体断片、自己組織化可能な複数のL-核酸、リンカーで構成される。
【図２】図2は、四重特異性抗体のL-DNAフレームワークの形状および対合形態の概略図である。
【図３】図3は、4本のSMCC-L-DNAの自己組織化の結果の図である。3％アガロースゲル電気泳動である。第1〜第4レーンはSMCC-L-DNAの一本鎖で、ここで、第1レーンは鎖1で、第2レーンは鎖2で、第3レーンは鎖3で、第4レーンは鎖4である。第5〜第8レーンは組み立て後のバンドで、ここで、第5レーンにおけるマグネシウムイオン濃度は0 mMで、第6、7、8レーンのマグネシウムイオン濃度はそれぞれ1mM、2mMおよび4mMである。
【００３４】
【図４】図4は、四重特異性抗体の自己組織化の結果の図である。SDS-PAGEゲルを順に臭化エチジウム(EB)、クマシーブリリアントブルー法で染色し、それぞれDNAおよびタンパク質の部分を発色させた。レーン1は連結していない抗PD-1一本鎖抗体で、レーン2は鎖1(L-DNA)と連結した抗PD-L1一本鎖抗体で、レーン3は鎖2(L-DNA)と連結した抗PD-L1一本鎖抗体で、レーン4は鎖3(L-DNA)と連結した抗PD-1一本鎖抗体で、レーン5は鎖4(L-DNA)と連結した抗CD3一本鎖抗体である。レーン6は4種類の一本鎖抗体-L-DNA反応液の混合物である。
【図５】図5の左の図はMBP融合一本鎖抗体突然変異体の発現結果の概略図で、左の図では、レーン1はIPTGによる誘導なしの対照実験で、レーン2、3、4はそれぞれMBP-抗CD3一本鎖抗体、MBP-抗CEA一本鎖抗体、MBP-抗PDL1一本鎖抗体のタンパク質の発現状況である。右の図はMBP融合一本鎖抗体突然変異体の溶解状況の概要図で、右の図では、レーン1は全菌分裂液で、レーン2は可溶性成分で、レーン3は封入体成分である。
【図６】図6は、抗CD3-L-DNA2の精製結果の概略図である。左の図はSuperdex 200 10/300 GLクロマトグラフィーカラムによる精製の結果である。右の図はポリアクリルアミドゲル電気泳動技術によるタンパク質サンプルの純度の検出結果である。
【００３５】
【図７】図7は、多重特異性抗体の自己組織化の結果の概略図である。左の図はポリアクリルアミドゲル電気泳動技術による多重特異性抗体の三量体の組み立てのモニタリングの結果の概略図で、レーン1、2、3はそれぞれ抗CEA-L-DNA1、抗PDL1-L-DNA2、抗CEA-L-DNA3のタンパク質バンドで、レーン4は3種類の特異性抗体の自己組織化後のタンパク質バンドである。右の図はポリアクリルアミドゲル電気泳動技術による多重特異性抗体の四量体の組み立てのモニタリングの結果の概略図で、レーン1は抗CD3-L-DNA4との反応前の三量体で、抗CD3-L-DNA4との反応後の四量体である。
【図８】図8では、MはDNA標準品で、最小のバンドは25bpで、ほかのバンドは25bpずつ増加していく。レーン1〜4はそれぞれ4本のL-DNA（20 μM）で、仕込み量は5μlである。レーン5および6はそれぞれ室温および37度の条件において、まず三量体を組み立て、さらに4本目のL-DNAを入れる組み立て方である。レーン7は37度の条件において、そのまま4本のL-DNAを混合する組み立て方である。
【図９】図9では、レーン1はヌクレアーゼで処理されていないL-DNA四量体（上の図）およびD-DNA四量体（下の図）で、レーン2〜5はそれぞれDNAse I、エクソヌクレアーゼI（Exonuclease I）、T7 DNAエンドヌクレアーゼ（endonuclease）、S1ヌクレアーゼ（nuclease）で処理されたL-DNA四量体サンプルまたはD-DNA四量体サンプルである。核酸標準（マーカー）の最小バンドは25bpで、かつ各バンドの差は25bpである。
【００３６】
【図１０】図10では、Mは広範囲分子量タンパク質標準（マーカー）で、1〜4は1μMのL-DNA-融合タンパク質単量体で、5は1〜4で組み立てた産物で、6〜9は2μMのL-DNA-融合タンパク質単量体で、10は1〜4で組み立てた産物である。
【図１１】図11は、L-DNA四量体のフレームワーク介して組み立てた融合タンパク質四量体の分子篩による分析結果である。使用されたクロマトグラフィーカラムはSuperose 6 10/300分子排除クロマトグラフィーカラム（GE社）である。
【図１２】図12はL-DNAフレームワークに基づいて製造されたCEA/PD-L1/CD3四重特異性抗体の体外活性の結果である。大腸癌細胞系LS174TはCEA陽性で、当該体外活性実験の細胞モデルとした。
【図１３】図13は抗CEA/PD-L1/CD3四重特異性抗体によるT細胞の活性化の実験結果である。CD3陽性細胞によって分泌されたIFN-γを検出対象とした。陽性対照はDynabeads（表面に連結した抗CD28/CD3抗体のビーズで、効率的にT細胞を活性化させることができる）で、陰性対照は抗体に使用された緩衝液である。
【００３７】
具体的な実施形態
本発明者は幅広く深く研究したところ、初めて、2種類以上の異なるタンパク質薬物単量体を含み、前記のタンパク質薬物単量体はタンパク質薬物エレメント部分および前記タンパク質薬物エレメント部分と連結した核酸エレメント部分を含み、前記核酸エレメント部分は体内のヌクレアーゼによる分解に耐性がある核酸（たとえばL-核酸）で、かつ一つの前記タンパク質薬物単量体の前記の核酸エレメント部分は少なくとも一つの別のタンパク質薬物単量体の核酸エレメント部分と相補によって二本鎖対合構造になる、タンパク質薬物ライブラリーを開発し、必要によって（たとえばある個体の病状および診断結果によって）、前記タンパク質薬物ライブラリーから相応するタンパク質薬物単量体を選択し、快速に（1分間以内）、効率的に、低コストで、高収率で複数の標的に対する、体内で安定の多重特異性タンパク質薬物（たとえば多重特異性抗体）を組み立てることができ、これに基づいて本発明を完成させた。
【００３８】
用語
別途に定義しない限り、本明細書で用いられるすべての技術と科学の用語はいずれも本発明が属する分野の当業者が通常理解する意味と同様である。本明細書で用いられるように、具体的に例示される数値で使用される場合、用語「約」とは当該値が例示される数値から1％以内で変わってもよい。たとえば、本明細書で用いられるように、「約100」という記述は99と101およびその間の全部の値（たとえば、99.1、99.2、99.3、99.4など）を含む。
【００３９】
本発明の実施またはテストにおいて本発明における記載と類似または等価の任意の方法と材料を使用することができるが、本明細書で好適な方法と材料が挙げられた。
【００４０】
本明細書で用いられるように、用語「タンパク質薬物単量体」、「本発明のタンパク質薬物単量体」、「本発明の薬物単量体」は入れ替えて使用することができる。
【００４１】
本明細書で用いられるように、用語「タンパク質薬物ライブラリー」、「本発明のタンパク質薬物ライブラリー」、「本発明の薬物ライブラリー」は入れ替えて使用することができる。
【００４２】
本明細書で用いられるように、用語「本発明の多量体タンパク質薬物」、「多量体タンパク質薬物」、「多重特異性タンパク質薬物」、「本発明の多量体薬物タンパク質」、「多量体薬物タンパク質」、「本発明の多量体タンパク質」は入れ替えて使用することができる。
【００４３】
タンパク質薬物ライブラリー
本発明は、C種類の異なるタンパク質薬物単量体を含み、前記のタンパク質薬物単量体はタンパク質薬物エレメント部分および前記タンパク質薬物エレメント部分と連結した核酸エレメント部分を含み、かつ一つの前記タンパク質薬物単量体の前記の核酸エレメント部分は少なくとも一つの別のタンパク質薬物単量体の核酸エレメント部分と相補によって二本鎖の対合構造を形成することによって、多量体のタンパク質薬物を構成することができ、ここで、Cは2以上の正整数である、タンパク質薬物ライブラリーを提供する。
本発明のライブラリーは、さらに、少なくとも2種類以上のタンパク質薬物単量体を含有し、好適なタンパク質薬物単量体は上記式Iの構造を有する。
【００４４】
本発明のタンパク質薬物単量体は特定の構造を有するため、快速に多量体の形態の薬物のタンパク質に組み立てることができるのみならず、形成される多量体のタンパク質薬物は多重特異性で、同時に複数の異なる標的を持つことで、疾患の治療過程において同時にまたは先後に複数の部位を標的とする需要に満足することができる。また、本発明の多量体タンパク質薬物は、さらに、意外な体内における安定性を有し、長時間で体内に存在して活性を維持することができ、かつすぐに分解しない。
【００４５】
たとえば、癌の治療において、よく複数の標的および複数の経路に関わり、かつ患者によって病因が異なり、かつ一人の患者にも腫瘍の異質性があるため、複数の標的に対する薬物が必要な場合が多い。個別化医療または精密医療技術の発展につれ、本分野では、快速に製造することができ、低コストで、標的性がよく、安定性があるタンパク質薬物（たとえば多重特異性抗体）が切望されるようになってきた。本発明のライブラリーはこのような需要に満足する。
【００４６】
もちろん、本発明のライブラリーは本発明の上記タンパク質薬物単量体を含有するか、主に含有するか、全部含有するが、当該ライブラリーはさらにほかの治療剤、特にほかのタンパク質薬物を含有し、代表的な例は、抗体、化合物、融合タンパク質を含むが、これらに限定されない。たとえば、本発明のライブラリーは、余分に一つまたは複数の治療作用を有する通常の抗体を含有してもよい。
【００４７】
もちろん、本発明のライブラリーにおけるタンパク質薬物の単量体の数は限定されず、2以上のいずれかの正整数Cでもよい。たとえば、Cは3〜100000、好ましくは3〜10000、より好ましくは5〜5000、最も好ましくは10〜5000のいずれかの正整数である。
【００４８】
また、本発明において、タンパク質薬物単量体における抗体エレメントが特に限定されず、代表的な例は、一本鎖抗体、ナノ抗体、Fab、モノクローナル抗体、またはその組み合わせからなる群から選ばれる。
【００４９】
本発明のライブラリーには、様々な由来の抗体でタンパク質薬物単量体を製造することができる。本発明のライブラリーの一つの突出した特徴は、原核系（たとえば大腸菌）または真核系（たとえば酵母、CHO細胞）によって発現される抗体断片を使用することで、大幅に生産コストを低下させることができることである。
【００５０】
典型的に、使用時、必要によって（たとえばある個体の病状および診断結果によって）、相応するタンパク質薬物単量体を選択し、簡単に核酸の相補的なフレームワークによって多重特異性抗体を完成させることができる。たとえば、応用時、患者の疾患の標的の状況によって、相応的に単量体の種類、数または比率（たとえば2種類、3種類、4種類、または4種類以上）を決めた後、組み立てる。
【００５１】
多量体タンパク質薬物を製造する場合、ライブラリーから相応する相互に対合して結合することができるタンパク質薬物単量体を選択し、そして必要な抗体比率で混合した後、1分間内で組み立ての過程を完成させることができる。
【００５２】
本発明のライブラリーにおいて、タンパク質薬物単量体の核酸エレメントは配列の設計によって二量体、三量体、四量体などの多量体のフレームワークにすることによって、従来の抗体工学では実現しにくい三重特異性、ひいては四重特異性抗体などの多重特異性抗体の製造を完成することができる。
多重特異性の多量体タンパク質薬物に組み立てると、治療の目的によって、相応する個体に使用することができる。
【００５３】
L-核酸
L-核酸とは、自然界に存在するD-核酸に対し、鏡像的な存在で、L-DNAとL-RNAに分かれる。左旋（キラル中心）は主に核酸のデオキシリボースまたはリボースの部分に存在し、鏡像的に回転する。そのため、L-核酸は血漿のあらゆる所に存在するヌクレアーゼ（たとえばエキソリボヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ）によって分解される。
【００５４】
本発明の多量体タンパク質薬物およびその製造
本発明の多量体タンパク質薬物とは、D種類のタンパク質薬物単量体が核酸の相補によって二本鎖対合構造になった多量体で、ここで、Dは2以上の正整数で、ここで、前記のタンパク質薬物単量体はタンパク質薬物エレメント部分および前記タンパク質薬物エレメント部分と連結した核酸エレメント部分を含み、かつ一つの前記タンパク質薬物単量体の前記の核酸エレメント部分は一つの別の異なるタンパク質薬物単量体の核酸エレメント部分と相補によって二本鎖対合構造になることが可能である。
もう一つの好適な例において、前記の核酸エレメント部分は、耐ヌクレアーゼ分解性のものである。
【００５５】
もう一つの好適な例において、前記の核酸エレメント部分は、L-核酸、ペプチド核酸、ロックド核酸、チオ修飾核酸、2'-フルオロ修飾核酸、5-ヒドロキシメチルシチジル酸、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
本発明の多量体タンパク質薬物は、たとえば式Iで表されるタンパク質薬物単量体の組み立てによって形成する。
典型的に、多量体タンパク質薬物とは、多量体抗体（多重特異性抗体）、たとえば二、三、四、五または六重特異性抗体である。
【００５６】
本発明において、本発明の多量体抗体は2種類またはそれ以上の抗体の特異性を含み、複数の抗原のエピトープ、または一つの抗原の複数のエピトープを標的として結合するため、抗原自身の下流経路またはそれとほかのタンパク質の相互作用を十分に遮断することによって、抗体の治療効果を向上させ、薬剤耐性を減少させることができる。
【００５７】
一つの好適な例において、本発明のタンパク質薬物はL-核酸を使用する多重特異性抗体である。本発明の研究では、核酸は快速の特異的対合が可能な二本鎖分子であるため、抗体断片（たとえば一本鎖抗体、ナノ抗体、Fabなど）を核酸の一本鎖と結合させると、核酸配列の設計によって、二つまたはそれ以上の核酸の一本鎖が快速に対合して多量体になるようにさせることによって、抗体断片も誘導して多量体に形成させ、多重特異性抗体の製造を完成させることができることが示された。
【００５８】
本発明において、治療効果を向上させるために、特定の構造のタンパク質薬物単量体を使用する必要がある。好適な例において、D-核酸（たとえばD-DNA、D-RNAなど）の代わりにL-核酸（たとえばL-DNA、L-RNAなど）を使用する形態によって、顕著に治療効果を向上させる。一つの原因は、L-核酸は人体に存在するエキソリボヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼなどによって分解されないため、L-核酸の自己組織化による多重特異性抗体の組み合わせは体内で非常に安定である。
【００５９】
薬物組成物
さらに、本発明は組成物を提供する。好適な例において、前記の組成物は薬物組成物で、上記の抗体またはその活性断片あるいはその融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含有する。通常、これらの物質を無毒で不活性で薬学的に許容される水系担体で配合し、ここで、pH値は配合される物質の性質および治療しようとする疾患にもよるが、pH値は通常5〜8程度、好ましくは6〜8程度である。配合された薬物組成物は通常の経路で投与することができ、経口投与、気道、腫瘍内、腹膜内、静脈内、あるいは局部投与が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の薬物組成物はそのまま治療（たとえば抗腫瘍治療）に使用することができるため、薬物の半減期の延長、またほかの治療剤の併用に有用である。
【００６０】
本発明の薬物組成物は、安全有効量（たとえば0.001〜99wt％、好ましくは0.01〜90wt％、より好ましくは0.1〜80wt％）の本発明の上記のモノクローナル抗体（またはその抱合体）と薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む。このような担体は、食塩水、緩衝液、ブドウ糖、水、グリセリン、エタノール、およびこれらの組み合せを含むが、これらに限定されない。薬物の製剤は投与形態に相応する。本発明の薬物組成物は、注射剤としてもよく、たとえば生理食塩水またはブドウ糖およびほかの助剤を含有する水溶液で通常の方法によって製造することができる。薬物組成物は、注射剤、溶液の場合、無菌条件で製造する。活性成分の投与量は治療有効量、たとえば毎日約1μg／kg体重〜約10mg／kg体重である。また、本発明のポリペプチドはほかの治療剤と併用することが出来る。
【００６１】
薬物組成物の使用時、安全有効量の免疫抱合体を哺乳動物に施用するが、その安全有効量は、通常、少なくとも約10μg/kg体重で、かつ多くの場合、約50mg/kg体重未満で、好ましくは当該投与量が約10μg/kg体重〜約1mg/kg体重である。勿論、具体的な投与量は、さらに投与の様態、患者の健康状況などの要素を考えるべきで、すべて熟練の医者の技能範囲以内である。
本発明の主な利点は以下の通りである。
（1）本発明の多重特異性抗体は製造が簡単で、快速で、一分間内でL-核酸鎖を介して複数の抗体の組み立てを完成させることができる。
【００６２】
（2）本発明の多重特異性抗体は、改造の可能性が広く、任意の形態の抗体（たとえば一本鎖抗体、ナノ抗体、Fab）を多重特異性抗体に組み立てることができる。
【００６３】
（3）本発明の多重特異性抗体を製造するプラットフォーム技術は、単独で多重特異性抗体の各部分の抗体を製造した後、簡単な体外の組み立てを行うことができる。
【００６４】
（4）本発明の多重特異性抗体を製造するプラットフォーム技術は、本発明における多重特異性抗体の中間産物（L-核酸-抗体複合体）を保存し、必要によって柔軟に任意に異なる抗原または部位を標的とする抗体の組み合わせの製造、および多重特異性抗体におけるある抗体の比率の調整を行うことができる。
【００６５】
（5）本発明の多重特異性抗体を製造するプラットフォーム技術に基づいて抗体薬物ライブラリーを構築し、提供される疾患および/または製薬情報によって、快速に、簡単に個別化精密医療に適する抗体薬物を製造することができ、コストが低く、汎用性が良い。
【００６６】
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。以下の実施例で具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、たとえばSambrookら、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」(ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社、1989) に記載の条件などの通常の条件に、あるいは、メーカーのお薦めの条件に従う。特に断らない限り、％と部は、重量で計算される。本発明に係る実験材料は、特に説明しない限り、いずれも市販品として得られる。
【００６７】
共通の方法
1．L-核酸鎖フレームワークの設計と製造
本発明によれば、L-核酸鎖フレームワークは2本およびそれ以上のL-核酸一本鎖が塩基対合によって形成する。各L-核酸一本鎖の5'または3'末端はいずれも後の修飾に供する基（たとえばNH2など）活性化させた後、リンカー（たとえばSMCC、SM(PEG)、SPDPなど）の一方の末端でL-核酸一本鎖における活性化基と結合させる。リンカーを持つL-核酸は必要なL-核酸鎖フレームワークに組み立てることができる。リンカーを持つL-核酸がフレームワークに自己組織化することが可能と確認された後、リンカーを持つL-核酸一本鎖をそれぞれ抗体と連結させて後の組み立てを行う。
【００６８】
図1はL-核酸の自己組織化に基づいて製造した多重特異性抗体の構造の概略図で、ここで、ANは抗体または抗体断片、たとえば一本鎖抗体、ナノ抗体、Fabなどで、L-核酸フレームワークは異なる数の一本鎖核酸からなり、かつ一本鎖の一方の末端に活性基の修飾、たとえばNH2などがあり、一本鎖核酸の数は多重特異性抗体の種類によって調整することができ、たとえば四重特異性抗体に必要な一本鎖核酸の数は少なくとも4で、リンカーは一本鎖核酸の活性基と抗体における特異性連結部位（たとえば突然変異システイン残基におけるSH基）を連結するためのものである。
本発明のL-核酸フレームワークは基本的に以下のような工程によって製造することができる。
【００６９】
1.1  快速に自己組織化可能なL-核酸一本鎖の設計
製造しようとする多重特異性抗体の種類（たとえば三重特異性抗体）を決定し、多重特異性抗体における抗体数Nによって必要なL-核酸一本鎖の数Mを決定し、相応する数のL-核酸一本鎖配列を設計し、塩基対合数を増減することによって目的核酸フレームワークの安定性を調整し、核酸鎖間の非特異的対合の可能性を減少させる。
【００７０】
本発明の一つの好適な実施形態によれば、一つの四量体L-核酸フレームワーク（M=4）を設計するために、4本の一定の規則によって対合するL-核酸（図2に示す）を設計する。ここで、任意の1本のL-核酸一本鎖はほかの2本のL-核酸一本鎖と特異性相補的対合するが、4本目と対合しない。そして、特異性相補的対合のギブズエネルギー変化量ΔGは非特異性対合よりも遥かに小さく、たとえば当該好適な実施形態において、特異性相補的対合のギブズエネルギー変化量ΔGは約-34キロカロリー/モル（kcal/mol）で、非特異性対合はいずれも-10ロカロリー/モル（kcal/mol）よりも小さく、これは四量体の組み立て方は非特異的な2つ同士の対合よりも生じやすく、四量体の形態は反応系で最も安定であることを示す。
【００７１】
1.2  L-DNAまたはL-RNAの活性化
L-核酸の活性化はその5'末端または3'末端の活性基修飾および後のリンカー結合を含む。活性基修飾は核酸合成会社によってオーダーメードで完成されてもよい。リンカーは通常二重機能基を有し、すなわち、一方の末端は核酸の活性基に結合することができ、もう一方の末端は抗体における特異性部位（たとえばSH）に連結することができる。
【００７２】
本発明の一つの好適な実施形態によれば、フレームワークになるすべてのL-核酸は5'末端にNH2修飾を添加した後、リンカー、すなわち異種二重機能性架橋試薬SMCC（4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボン酸 N-スクシンイミジルナトリウム塩）でアミド結合を介して核酸におけるNH2に結合させる。この時、リンカーのもう一方の末端のマレイミド基は遊離状態で、後の抗体におけるメルカプト基（SH）の結合に使用することができ、これでL-核酸の活性化が完了する。
1.3  核酸フレームワークの重合度の検証
核酸フレームワークの重合度はたとえばアガロースゲル電気泳動によって検証することができる。
【００７３】
本発明の一つの好適な実施形態によれば、3％のアガロースゲル電気泳動によって核酸フレームワークの重合度を分析する。L-核酸の一本鎖の大きさを比較すると、簡単に複数のL-核酸一本鎖を混合してなるフレームワークの大きさを推算することによって、重合度を得ることができる。
【００７４】
当業者には、上記反応経路および好適な実施形態に記載の方法に従い、同じように本発明に記載のほかのL-核酸フレームワークを製造することができ、制限がないことがわかる。
【００７５】
2．抗体の選択と製造方法
本発明の抗体は多重特異性抗体の用途と目的によって選択する。固形腫瘍に使用する場合、高透過性の多重特異性抗体が必要で、比較的に小さい抗体断片（たとえば一本鎖抗体、ナノ抗体など）を選択する。血液腫瘍に使用する場合、抗体でも抗体断片でも使用することができる。具体的な選択は治療の用途と機序によって決める必要がある。抗体断片の製造には、大腸菌または酵母などの低コストの発現系を選択し、全長の抗体は哺乳動物細胞発現系が必要である。
活性化されたL-核酸と結合しやすいように、抗体に一つの特異性の部位（たとえば突然変異部位、Cys）を導入し、リンカーの結合に使用する。
【００７６】
本発明の一つの好適な実施形態によれば、抗PD-L1/PD-1/CD3の一本鎖抗体を選択して三重特異性抗体の製造に使用し、ここで、PD-1およびCD3はT細胞表面に位置する部位で、主な作用はそれぞれ抗腫瘍活性を解消する抑制作用およびCD8陽性T細胞の活性化である。また、PD-L1は一部の腫瘍細胞の表面に位置し、PD-1との作用によってT細胞のそれに対するさらなる殺傷を阻止する。そのため、二つの抗PD-L1一本鎖抗体を使用し、一つの抗PD-1一本鎖抗体および一つの抗CD3一本鎖抗体を三重特異性抗体の製造に使用し、腫瘍および免疫細胞へのターゲティングに使用される一本鎖抗体の数のバランスが取れるため、必要なL-核酸フレームワークは四量体（M=4）である。SMCC活性化のL-DNA一本鎖と結合し、各一本鎖抗体が異なるL-DNA一本鎖と連結するように、各一本鎖抗体のカルボキシ基末端（C末端）に一つのシステイン突然変異が導入され、かつT細胞を腫瘍細胞に動員しやすいように、二つの抗PD-L1一本鎖抗体は多重特異性抗体の一方の末端で、抗PD-1およびCD3の一本鎖抗体はもう一方の末端である。
【００７７】
3．抗体-L-核酸複合体の製造方法
まず、L-核酸の5'または3'末端をNH2で修飾し、さらにリンカーによって、以下のいくつかの主な製造方法でもよいが、ここで、快速にL-核酸の一方の末端のNH2基に結合するように、リンカーの一方の末端の官能基はNHS（N-ヒドロキシスクシンイミド）またはSulfo-NHS（N-ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム）である。異種二重官能基を含むリンカーはいずれもまずL-核酸のNH2と反応し、次に抗体におけるメルカプト基を還元した後、もう一方の末端の基がさらにメルカプト基と反応して安定した化学結合を形成する。
【００７８】
3.1  マレイミド(Maleimide)。リンカーの抗体におけるメルカプト基と結合するための基はマレイミドである。マレイミドは快速に抗体における遊離のメルカプト基と反応してスルフィド結合を形成する。通常のリンカーは、SMCC（4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボン酸 N-スクシンイミジル）、SM(PEG)（ポリエチレングリコールで修飾された4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボン酸 N-スクシンイミジル）などがある。
【００７９】
3.2  ハロアセチル基(Haloacetyl)。リンカーの抗体におけるメルカプト基と結合するための基はハロアセチル基、たとえばヨードアセチル基、ブロモアセチル基である。ハロゲンイオンは抗体におけるメルカプト基と求核作用によって置換してスルフィド結合を形成することができる。通常のリンカーは、SBAP（N-マレイミドメチル[4-ブロモアセチル]アミノベンゾエート）、SIAB（N-マレイミドメチル[4-ヨードアセチル]アミノベンゾエート）などがある。
【００８０】
3.3  チオピリジン(Pyridyldithiol)。リンカーの抗体におけるメルカプト基と結合するための基はチオピリジンである。チオピリジンは遊離のメルカプト基と反応してジスルフィド結合を形成することができる。通常のリンカーは、SPDP（3-(2-ピリジンジチオ)プロピオン酸 N-ヒドロキシスクシンイミドエステル）などがある。
【００８１】
実施例1：四量体DNA構造のフレームワークの設計
4本の四角形の形状で対合するL-核酸（図2に示す）を設計した。ここで、任意の1本のL-核酸一本鎖はほかの2本のL-核酸一本鎖と特異性相補的対合するが、4本目と対合しない。そして、特異性相補的対合のギブズエネルギー変化量ΔGは非特異性対合よりも遥かに小さく、特異性相補的対合のギブズエネルギー変化量ΔGは約-34キロカロリー/モル（kcal/mol）で、非特異性対合はいずれも-10ロカロリー/モル（kcal/mol）よりも小さく、これは四量体の組み立て方は非特異的な2つ同士の対合よりも生じやすく、四量体の形態は反応系で最も安定であることを示す。
以上の原則に沿って設計された4本のL-DNA一本鎖の配列は以下の通りである（5'から3'）。
鎖1（L-DNA1）：配列番号1
5’ AAAA CGACAGTCCGATGTGCC AAA CGGCTGGAAGTTGAGC AA 3’
鎖2（L-DNA2）：配列番号2
5’ AAAA GGCACATCGGACTGTCG AAA GGCGTAGCCTAGTGCC AA 3’
鎖3（L-DNA3）：配列番号3
5’ AAAA CGCTGATATGCGACCTG AAA GCTCAACTTCCAGCCG AA 3’
鎖4（L-DNA4）：配列番号4
5’ AAAA CAGGTCGCATATCAGCG AAA GGCACTAGGCTACGCC AA 3’
【００８２】
SMCCのNHSに結合するように、5'末端にNH2基修飾がある。AAAAおよびAAA以降の塩基配列はそれぞれほかの2本の鎖と相補的に対合し、各部分の対合のギブズエネルギー変化量ΔGは約-34キロカロリー/モル（kcal/mol）である。
【００８３】
実施例2：四量体DNAフレームワークの合成と検証
生物技術サービス会社によって5'末端がNH2で修飾されたL-DNA一本鎖が合成されたが、4本の一本鎖の配列は実施例1に示す通りである。
リン酸緩衝液(50 mM NaH2PO4、150mM NaCl、pH 7.0)でL-DNA一本鎖を溶解させ、最終濃度が200 μMの母液に調製した。ジメチルスルホキシド（DMSO）でSMCC粉末を溶解させ、新しく250 mMのSMCC母液を調製した。L-DNA一本鎖母液に10〜50倍モル量のSMCC母液を入れ、すぐに混合した後、室温で30min〜2h反応させた。反応完了後、反応液の10％体積の1M Tris-HCl(pH 7.0)を入れ、混合後、室温で20分間インキュベートし、過剰量のSMCCが反応し続けるのを止めた。インキュベート終了後、反応液の2倍体積の100％無水エタノールを入れ、均一に混合した後、-20度の冷蔵庫に25分間置き、L-DNAを十分に沈殿させた。遠心(12000rpm、10min)で沈殿を取り、1mLの70％エタノールで洗浄し、12000rpmで1min遠心して上清を除去し、繰り返して5回洗浄し、過剰量のSMCCを十分に除去した。残った白色沈殿を空气中で5〜10min自然乾燥した後、リン酸緩衝液で再懸濁、溶解させ、SMCC-L-DNA複合体（すなわちSMCC-L-DNA一本鎖）を得た。
【００８４】
各SMCC-L-DNA一本鎖の濃度を測定した。適量の4本の反応に供するSMCC-L-DNA一本鎖を取って40度で5 min予備加熱した後、40度の条件で等モル量の4本のSMCC-L-DNA一本鎖を混合し、1 minインキュベートした。反応系は異なるマグネシウムイオン濃度とし、マグネシウムイオン濃度のフレームワークの形成に対する影響を探った。0.25 μlのSMCC-L-DNA一本鎖および反応産物を取って3％アガロースゲル電気泳動で分析した。結果は図3に示すように、SMCC-L-DNA一本鎖の大きさは約25bp程度で、混合後形成した主なバンドは100bp程度で、これは4本の異なるSMCC-L-DNA一本鎖が四量体フレームワークになり、かつ異なるマグネシウムイオン濃度はいずれもその自己組織化に影響がなかったことを示し、非常に高い安定性を有することが示された。
【００８５】
実施例3：一本鎖抗体突然変異体の製造
一本鎖抗体のカルボキシ基末端にシステイン突然変異を導入した。一本鎖抗体にジスルフィド結合が存在するが、大腸菌の細胞質における環境はジスルフィド結合の形成に不利であるため、一本鎖抗体を大腸菌のペリプラズム空間に分泌させてフォールディングを行い、ジスルフィド結合を形成する必要がある。
【００８６】
抗PD-1/PD-L1/CD3一本鎖抗体の遺伝子配列を大腸菌が好むコドンに最適化し、かつ遺伝子の両末端にそれぞれNcoI和XhoI制限酵素切断部位を加え、そしてpET22bプラスミドにおけるNcoI/XhoI部位の間にサブクローニングした。抗PD-1/PD-L1/CD3一本鎖抗体のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号5、配列番号6および配列番号7である。
配列番号5、抗PD1一本鎖抗体突然変異体（Anti-PD1 single-chain antibody mutants）のアミノ酸配列：
【００８７】
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSAGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKC
配列番号6、抗PD-L1一本鎖抗体突然変異体（Anti-PD-L1 single-chain antibody mutants）のアミノ酸配列：
【００８８】
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKTSGDTFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGKAHYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARKFHFVSGSPFGMDVWGQGTTVTVSSAGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPTFGQGTKVEIKC
配列番号7、抗CD3一本鎖抗体突然変異体（Anti-CD3 single-chain antibody mutants）のアミノ酸配列：
【００８９】
EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWMGLINPYKGVSTYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTTLTVFSGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIRNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSKFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFAGGTKLEIKC
【００９０】
pET22bプラスミドがpelBシグナルペプチド配列を持つため、一本鎖抗体がペリプラズム空間に分泌されるように誘導する。1 μlの構築された発現ベクターを取って大腸菌BL21(DE3)を形質転換し、形質転換されたBL21(DE3)の単一の集落を取ってLB培地(100 μg/mL アンピシリン含有)に接種し、37度でOD600=0.7になるまで培養し、最終濃度が1mMのIPTGを入れて発現を誘導し、37度で続いて3〜4時間培養した。遠心で発現できた菌体を収集し、リン酸緩衝液(50 mM NaH2PO4、150mM NaCl、pH 7.0)に再懸濁させ、プロテアーゼ阻害剤cocktail(Sigma)を入れ、超音波で破砕させた 。DNaseI加水分解酵素を入れて氷の上で1時間インキュベートした。インキュベート終了後、菌液を17000rpmで20分間遠心して上清を収集した。HitrapプロテインL親和カラムによって上清における一本鎖抗体を精製し、上清に0.25 ml/minの速度でカラムを通させた後、大量のリン酸緩衝液(50 mM NaH2PO4、150mM NaCl、pH 7.0)で1ml/minの流速で不純物のタンパク質が流れなくなるまで(AKTAタンパク質クロマトグラフィーシステムにおける紫外吸収から)カラムを洗浄し、0〜100％ 溶離緩衝液(50 mM NaH2PO4、150mM NaCl、pH 2.3)勾配でカラムに結合した一本鎖抗体を溶離させた。一本鎖抗体成分を収集し、pHを7.0に調整した。
【００９１】
実施例4：一本鎖抗体-L-DNAの連結と精製
精製後の一本鎖抗体を10〜50倍モル比の過剰量の還元剤(たとえばTCEP、DTT、メルカプトエタノールなど)で室温で30minインキュベートした。インキュベート終了後、PD-10脱塩カラムで快速に反応系における還元剤を除去し、同時に緩衝液をリン酸緩衝液(50 mM NaH2PO4、150mM NaCl、pH 7.0)に置換した。一本鎖抗体の濃度を測定した後、1〜4倍モル比の過剰量のSMCC-L-DNA一本鎖（実施例2で製造された）を入れ、均一に混合した後、室温で1h反応させた。
【００９２】
DNAなどの核酸は負の電荷を持つため、アニオン交換カラム(HiTrap Q HPカラム)で一本鎖抗体-L-DNAを単離・精製し、未反応の一本鎖抗体、過剰量のSMCC-L-DNA一本鎖を除去した。単離の過程は勾配溶離で実現し、仕込み緩衝液は50 mM NaH2PO4、pH 7.0で、溶離緩衝液は50 mM NaH2PO4、1 M NaCl pH 7.0，0-100％で、溶離緩衝液で勾配溶離を行い、未反応の一本鎖抗体、一本鎖抗体-L-DNA、過剰量のSMCC-L-DNA一本鎖は順にピークが現れた。一本鎖抗体-L-DNAを収集し、濃縮後、PD-10脱塩カラムで緩衝液を50 mM NaH2PO4、150mM NaCl、pH 7.0に置換した。
【００９３】
実施例5：多重特異性抗体の自己組織化
一本鎖抗体が自己組織化で多量体になる可能性を排除するため、実施例4で連結反応が終わったばかりの一本鎖抗体-L-DNA反応液を使用して自己組織化実験を行った。反応終了後、未連結の一本鎖抗体があるように、連結反応における一本鎖抗体/SMCC-L-DNAの反応比率は1：0.5としたが、未反応のSMCC-L-DNA一本鎖を除去する必要がある。そのため、反応終了後、適量のProtein Lフィラーを入れ、10minインキュベートし、12000rpmで1min遠心して上清を除去し、1mLのリン酸緩衝液(50 mM NaH2PO4、150mM NaCl，pH 7.0)を入れてフィラーを洗浄し、遠心で上清を除去し、このように4回繰り返した。溶離緩衝液(50 mM NaH2PO4、150mM NaCl、pH 2.3)を入れ、フィラーに付着した一本鎖抗体および一本鎖抗体-L-DNAを除去するために10minインキュベートし、pHを7.0に調整した。実施例1における鎖1(L-DNA1)が抗PD-L1一本鎖抗体と、鎖2(L-DNA2)が抗PD-L1一本鎖抗体と、鎖3(L-DNA3)が抗PD-1一本鎖抗体3と、鎖4(L-DNA4)が抗CD3一本鎖抗体と連結した。
【００９４】
100μlの上記Protein Lによって精製された一本鎖抗体-L-DNA反応液を40度であらかじめ5minインキュベートした後、40度の条件において4種類の等体積の一本鎖抗体-L-DNA反応液を混合し、1minインキュベートした。反応後、30μl取ってSDS-PAGEによって分析した。電気泳動後、SDS-PAGEゲルはまず2μg/mlの臭化エチジウム溶液で20min染色し、超純水で3回洗浄した、紫外線下で呈色させると、DNAを含むバンド（たとえば一本鎖抗体-L-DNAの単量体、多重特異性抗体）が観察できた。その後、同じゲルをクマシーブリリアントブルー法で染色し、すべてのタンパク質サンプルの電気泳動の状況が観察できた。
【００９５】
結果は図4に示すように、L-DNAが連結した一本鎖抗体は未連結の一本鎖抗体と比べて顕著な遷移が生じ、かつL-DNAが連結した一本鎖抗体のみでは紫外線下で現像した。臭化エチジウム（EB）で染色した後、紫外線ランプ下で多量体の存在が観察され、分子量の大きさから四量体と二量体と判断された。二量体の存在は、抗CD3一本鎖抗体-L-DNAの量がほかの3種類の一本鎖抗体-L-DNAよりも顕著に少ないため、全部四量体に自己組織化できず、ほかの3種類の一本鎖抗体-L-DNAが2つ同士で組み合わせて二量体になる傾向にあるからである。クマシーブリリアントブルーで染色した後、何種類かの一本鎖抗体-L-DNAが混合された後、単量体のバンドがなくなったが、150kDa程度でぼんやりとしたバンドが現れ、EB染色の結果から4量体と判断された。未反応の一本鎖抗体のバンドは何らの変化もなく、これは四量体の形成はL-DNA同士の対合によるものであることを示す。そのため、当該L-DNA四量体のフレームワークは四重特異性抗体などの多重特異性抗体の快速の製造に有用である。
【００９６】
実施例6：MBP融合一本鎖抗体突然変異体の発現と製造
一本鎖抗体を大腸菌で単独で発現させると、通常、生物活性を有さない封入体になるが、一本鎖抗体の可溶性および生物活性を向上させるために、マルトース結合タンパク質MBPと3種類の一本鎖抗体（抗PD-L1/CD3/CEA一本鎖抗体、配列番号1、 2および3）を融合発現するベクターを構築し、MBP-ScFv融合タンパク質を形成した。MBPタグを切り除くために、MBPと一本鎖抗体の間にTEV酵素切断部位を導入し、そして遺伝子のの両末端にそれぞれNcoI和XhoI制限酵素切断部位を加えた後、pET21bプラスミドにおけるNcoI/XhoI部位の間にサブクローニングした。
【００９７】
1 μlの構築された発現ベクターを取って大腸菌BL21(DE3)を形質転換し、形質転換されたBL21(DE3)の単一の集落を取ってLB培地(100 μg/mL アンピシリン含有)に接種し、37度でOD600=0.7になるまで培養し、最終濃度が0.1mMのIPTGを入れて発現を誘導し、16度で続いて12〜16時間培養した。等量の菌液をすこし取り、ポリアクリルアミドゲル電気泳動技術によってタンパク質の発現状況をモニタリングし、図5の左の図に示すように、そのうち、レーン1はIPTGによる誘導なしの対照実験で、レーン2、3、4はそれぞれMBP-抗CD3一本鎖抗体、MBP-抗CEA一本鎖抗体、MBP-抗PDL1一本鎖抗体のタンパク質の発現状況で、MBP-ScFv融合タンパク質は大腸菌発現系において発現状況が安定で、発現量が高く、タンパク質の分子量が薬69kDaであったことが示された。
【００９８】
MBP-抗CEA一本鎖抗体を例とすると、遠心して発現完了後の菌体を収集し、HEPES緩衝液(20mM HEPES+150mM NaCl、pH=7.4)に再懸濁させ、プロテアーゼ阻害剤cocktail(Sigma)、還元剤であるメルカプトエタノール、DNaseI加水分解酵素を入れ、超音波で破砕し、39000gで40分間遠心して上清を収集して可溶成分とし、沈殿を同体積のHEPES緩衝液に再懸濁させて封入体成分とし、ポリアクリルアミドゲル電気泳動技術によってタンパク質の可溶状況をモニタリングし、図5の右の図に示すように、そのうち、レーン1は全菌分解液で、レーン2は可溶成分で、レーン3は封入体成分で、MBP-ScFv融合タンパク質は大腸菌発現系において可溶性が優れたことが示された。
【００９９】
ニッケルカラムアフィニティークロマトグラフィー法によってMBP融合一本鎖抗体突然変異体を初歩的に精製した。MBP-ScFv融合タンパク質をニッケルカラムに入れ、30分間付着させた後、流出液を除去し、それぞれ20mMと40mMのイミダゾールで不純物のタンパク質を除去し、400mMのイミダゾールで目的のタンパク質を溶離させ、一本鎖抗体-L-DNAの後の連結と精製に供した。
【０１００】
実施例7：一本鎖抗体-L-DNAの連結と精製
PD-10脱塩カラムで快速に初歩的に精製されたMBP融合一本鎖抗体における過剰量の還元剤であるメルカプトエタノールを除去し、すぐに1〜4倍モル比の過剰量のSMCC-L-DNA一本鎖（実施例2で製造された）を入れ、均一に混合した後、室温で1h反応させた。アミロース樹脂アフィニティクロマトグラフィーの方法によって未反応のDNAを除去し、目的のタンパク質がアミロース樹脂カラムと結合し、10CV HEPES緩衝液(20mM HEPES+150mM NaCl、pH=7.4)を入れて洗浄し、未反応のDNAを除去した。その後、TEV酵素を入れて3時間インキュベートし、アミロース樹脂カラムから融合タンパク質を切り除き、流出液はMBP融合タンパク質を切り除いた一本鎖抗体で、流出液を収集した。DNAなどの核酸は負の電荷を持つため、アニオン交換カラム(HiTrap Q HPカラム)で一本鎖抗体-L-DNAを単離・精製し、TEV酵素を除去した。単離の過程は勾配溶離で実現し、仕込み緩衝液は20 mM Tris-Cl+15mM NaCl、pH=8.5で、溶離緩衝液は20 mM Tris-Cl+1M NaCl、pH 8.5、0-100％で、溶離緩衝液で勾配溶離を行い、TEV酵素および一本鎖抗体-L-DNAは順にピークが現れ、一本鎖抗体-L-DNAを収集した。一本鎖抗体-L-DNAを高速タンパク質液体クロマトグラフィーによって精製し、サンプルをHEPES緩衝液(20mM HEPES+150mM NaCl、pH=7.4)で平衡化したSuperdex 200 10/300 GLカラム(GE Healthcare)によって精製・単離した後、紫外吸収A280でサンプリングし、ポリアクリルアミドゲル電気泳動技術によってピークの出現位置およびサンプルの純度を検出した。抗CD3-L-DNA2を例とすると、図6に示すように、最終的に生物・物理的性質が均一で、純度が高い一本鎖抗体-L-DNA連結サンプルが得られ、その分子量の大きさは約40kDaであった。
【０１０１】
実施例8：多重特異性抗体の自己組織化
実施例1における鎖1(L-DNA1)が抗CEA一本鎖抗体と、鎖2(L-DNA2)が抗PD-L1一本鎖抗体と、鎖3(L-DNA3)が抗CEA一本鎖抗体3と、鎖4(L-DNA4)が抗CD3一本鎖抗体と連結した。それぞれ300μlの抗CEA-L-DNA1、抗PDL1-L-DNA2、抗CEA-L-DNA3を取って37度で予め5min加熱した後、37の度条件において等体積で3種類の単量体を混合し、5minインキュベートした。反応後、30μlの反応液を取ってポリアクリルアミドゲル電気泳動技術によって抗体の組み立ての状況をモニタリングしたが、図7の左の図に示すように、レーン1、2、3はそれぞれ抗CEA-L-DNA1、抗PDL1-L-DNA2、抗CEA-L-DNA3のタンパク質バンドで、レーン4は3種類の特異性抗体の自己組織化後のタンパク質バンドで、そのタンパク質の分子量は抗CEA-L-DNA1、抗PDL1-L-DNA2、抗CEA-L-DNA3が自己組織化して三量体になったことを示す。三量体を高速タンパク質液体クロマトグラフィーによって精製して未反応の一本鎖抗体-L-DNA単量体を除去した。精製された三量体を最終濃度が0.1μMになるように希釈し、37度の条件において等体積・等濃度で抗CD3-L-DNA4を入れ、5minインキュベートした。反応後、30μlの反応液を取ってポリアクリルアミドゲル電気泳動技術によって抗体の組み立ての状況をモニタリングしたが、図7の右の図に示すように、レーン1は抗CD3-L-DNA4との反応前の三量体で、レーン2は抗CD3-L-DNA4との反応後の四量体で、その四量体のタンパク質の分子量は約168kDaであった。そのため、以上の実験によって、当該L-DNA四量体のフレームワークは四重特異性抗体などの多重特異性抗体の快速の製造に有用であることが証明された。
【０１０２】
実施例9：四量体DNAフレームワークの組み立ての最適化
リン酸緩衝液(50 mM NaH2PO4、150mM NaCl、pH 7.0)で4本のL-DNA一本鎖を溶解させ、最終濃度が20 μMの保存液に調製した。四量体DNAフレームワークの組み立てを最適化するために、組み立ての過程を2つの形態に分けて比較した。1．まず3本のL-DNA一本鎖を混合し、室温または37度で混合して5分間反応させ、30分間後、さらに4本目のL-DNA一本鎖を入れた。2．同時に4本のL-DNA一本鎖を混合し、37度で混合して5分間反応させた。反応終了後、各群のサンプルを5μl取って2％アガロースゲル電気泳動で分析した。
【０１０３】
結果は図8に示すように、4本のL-DNAを混合して反応させた場合、主な産物は四量体でったが、同時に多くの非特異的な高重合度の組み立て産物が存在した（レーン7）。3本のL-DNAを先に混合し、さらに4本目のL-DNAを入れた場合、室温と37度の反応結果はいずれも単一の四量体産物で、非特異的なバンドは一つもなかった（レーン5とレーン6）。当該DNAフレームワークの組み立てについて、まず三量体を組み立て、さらに4本目のL-DNAを入れる組み立て方はそのまま4本を混合する組み立て方よりも優れたことが示された。
【０１０４】
実施例10：D-DNAとL-DNAの四量体フレームワークの耐分解実験
D-DNAと比べ、L-DNAの優勢は自然界におけるDNA酵素で分解されないことにある。人体に多くのDNA酵素が存在し、L-DNA四量体フレームワークがDNA酵素で分解または解離されるか、検証するために、DNAse I、T7 DNAエンドヌクレアーゼ（endonuclease）、S1ヌクレアーゼ（nuclease）、エクソヌクレアーゼI（Exonuclease I）を選んでD-DNAとL-DNAの四量体フレームワークを処理した。D-DNAとL-DNAの4本の単量体の配列はそれぞれ対応し、かつ組み立て方は実施例9で改良されたツーステップ法で組み立てた。各酵素をD-DNAまたはL-DNAの四量体フレームワークに入れた後、37度の水浴に17時間置き、サンプリング後2％アガロースゲル電気泳動で分析した。
【０１０５】
結果は図9に示すように、L-DNA四量体フレームワークは4種類のDNA酵素による処理に耐えられ、何らの分解も存在しなかった。一方、D-DNA四量体はDNAse IおよびS1ヌクレアーゼでほとんど完全に分解され、またエクソヌクレアーゼ1和T7 DNAエンドヌクレアーゼで二重螺旋構造が破壊された。そのため、L-DNA四量体フレームワークは通常の各DNA酵素によって分解されない。
【０１０６】
実施例11：L-DNAフレームワークを使用した大分子量のタンパク質の四量体の組み立て
L-DNAフレームワークも大分子量のタンパク質の組み立てに使用できることを証明するために、実施例1におけるL-DNA四量体フレームワークをMBP（マルトース結合タンパク質）-抗PDL1一本鎖抗体融合タンパク質（以下、融合タンパク質と略し、分子量は69 kDaである）の四量体の組み立てに使用した。MBP-抗PDL1一本鎖抗体融合タンパク質は実施例6を参照して製造した。L-DNA四量体フレームワークの4本のDNAを実施例7に記載の方法によって融合タンパク質を連結して精製し、4種類のL-DNA-融合タンパク質を得た。上記4種類のL-DNA-融合タンパク質の緩衝液をリン酸緩衝液(50 mM NaH2PO4、150mM NaCl、pH 7.0)に置換し、そして最終濃度が1μMおよび2μMになるように37度で四量体の組み立てを行い、反応産物を10％ SDS-PAGEおよび分子篩によって分析した。
【０１０７】
タンパク質の電気泳動の結果は図10に示すように、融合タンパク質はL-DNAと連結した後、分子量が大きくなったため、SDS-PAGEにおけるバンドは上に遷移した。2種類の組み立ての濃度（1μMおよび2μM）において、4種類のL-DNA-融合タンパク質はいずれも特異的に融合タンパク質四量体に組み立てることができ、未反応の融合タンパク質の単量体（すなわちL-DNAが連結していない融合タンパク質）は組み立てに関与しなかった。L-DNA四量体フレームワークは融合タンパク質四量体の組み立てを仲介し、かつ融合タンパク質の分子量は当該L-DNAフレームワークの組み立て効率に影響しなかったことが示された。
【０１０８】
分子篩の結果は図11に示すように、融合タンパク質四量体は単一の溶離ピークが現れ、かつピークの形が対称で、融合タンパク質四量体は非常に均一で、一つの組み立て方しか存在しないことが示された。
【０１０９】
実施例12：L-DNAフレームワークに基づいて製造され四重特異性抗体の体外活性の評価
抗CEA/PD-L1/CD3四重特異性抗体の体外活性を分析するために、大腸癌細胞系LS174T（CEA陽性細胞）を細胞モデルとして使用した。2万個のLS174T細胞を48ウェルプレートに敷き、24時間後、3-オクタデシル-2-[3-(3-オクタデシル-2(3H)-ベンゾオキサゾール-2-イル)-1-プロペン-1-イル]ベンゾオキサゾール過塩素酸塩（DiOC18、DIO細胞膜緑色蛍光プローブ）で染色した後、40万個のPBMC（末梢血単核細胞）を入れてさらにインキュベートし、同時に濃度が勾配希釈された抗CEA/PD-L1/CD3四重特異性抗体（0.001 nM〜20 nM）を入れ、計96時間インキュベートした。ヨウ化プロピジウム（PI）で死亡細胞を標識した後、フローサイトメーターによって緑色蛍光プローブとヨウ化プロピジウム蛍光の二重シグナルの細胞数を検出した。陽性対照はTriton-X100処理、およびDynabeads（表面に連結した抗CD28/CD3抗体のビーズで、効率的にT細胞を活性化させることができる）で、陰性対照は抗体に使用された緩衝液である。Triton-X100処理群の細胞の死亡量を100％殺傷とし、緩衝液群を0％殺傷とした。
【０１１０】
結果は図12に示すように、抗CEA/PD-L1/CD3四重特異性抗体は効率的にT細胞のLS174T細胞に対する殺傷を仲介し、かつ当該殺傷の活性は投与量に依存した。抗CEA/PD-L1/CD3四重特異性抗体のEC50は約0.7 nMであった。
【０１１１】
実施例13：抗CEA/PD-L1/CD3四重特異性抗体によるT細胞の活性化の能力
抗CEA/PD-L1/CD3四重特異性抗体によるT細胞の活性化の能力を分析するために、インターフェロンγ（IFN-γ）を検出対象とした。具体的な過程は以下のとおりである。大腸癌細胞系LS174Tを細胞モデルとした。2万個のLS174T細胞を48ウェルプレートに敷き、24時間後、40万個のPBMC（末梢血単核細胞）を入れてさらにインキュベートし、同時に濃度が勾配希釈された抗CEA/PD-L1/CD3四重特異性抗体（0.001 nM〜20 nM）を入れ、計96時間インキュベートした。ブレフェルジンA（Brefeldin A）でIFN-γをT細胞の表面に固定し、さらに蛍光標識抗CD3抗体でT細胞を標識した後、フローサイトメーターによってIFN-γ/CD3二重陽性の細胞数を検出した。陽性対照はDynabeads（表面に連結した抗CD28/CD3抗体のビーズで、効率的にT細胞を活性化させることができる）で、陰性対照は抗体に使用された緩衝液である。
【０１１２】
結果は図13に示すように、各濃度の抗CEA/PD-L1/CD3四重特異性抗体はいずれもT細胞を活性化させ、IFN-γを放出させることができ、これは実施例12における体外活性の実験結果と一致した。抗CEA/PD-L1/CD3四重特異性抗体のT細胞に対する活性化能力は陽性対照（Dynabeads）に相当したが、陰性対照（緩衝液）では、顕著なIFN-γの放出がなかった。
【０１１３】
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、当業者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の形態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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