(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
(a)サンプル中のモノクローナル抗体を捕捉して多孔質体の細孔内に固定化するステップ、
(b)該モノクローナル抗体を固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化したナノ粒子とを接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を行うステップ、及び
(c)選択的プロテアーゼ消化によって得られたペプチド断片を液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）によって検出するステップ
を含む、サンプル中のモノクローナル抗体の検出方法であって、ステップ(a)の後に、
(a')還元剤を追加して酸性条件下での還元反応を行うステップ、及び
(a'')還元反応を行った後、選択的プロテアーゼ消化を行う前に還元剤を除去するステップ
を更に含む、上記方法。
【請求項２】
ステップ(a')を、有機リン系還元剤の存在下でのインキュベーションによって実施する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
有機リン系還元剤が、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（Tris(2-carboxyethyl)phosphine, TCEP）又はその塩酸塩である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
TCEPの濃度が100〜500 mMである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
pH2.5以下の強酸性条件下でステップ(a')を実施する、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
ステップ(a')の還元反応の時間が10〜60分間である、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
LC-MSによって検出するペプチド断片が重鎖由来のものである、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
以下のステップ：
(a)サンプル中のモノクローナル抗体を捕捉して多孔質体の細孔内に固定化するステップ、
(b)該モノクローナル抗体を固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化したナノ粒子とを接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を行うステップ、及び
(c)選択的プロテアーゼ消化によって得られたペプチド断片を液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）によって検出するステップ
を含む、サンプル中のモノクローナル抗体の検出方法であって、ステップ(a)の後に、
(a')酸性条件下での還元反応を行うステップ
を更に含む、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、質量分析を利用したモノクローナル抗体の定量における検出結果を向上する方法に関する。より具体的には、本発明は、モノクローナル抗体の定量のために既に確立されたプロトコールの改良に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ELISA法に代わる定量法として、LC-MS/MS法を用いた抗体医薬のバイオアナリシスの開発が盛んに行われている。【０００３】
本発明者等のグループは、測定対象のモノクローナル抗体と、これを基質として消化し得るプロテアーゼの両方を固相に固定化することで、位置選択的な固相-固相反応によるモノクローナル抗体のプロテアーゼ消化が可能であることを見出し、個々のモノクローナル抗体特有のペプチドを取得することに成功している（特許文献１〜６及び非特許文献１〜８）。この方法は、モノクローナル抗体を細孔内に固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化したナノ粒子とを液体中で接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を行う質量分析の前処理方法であり、得られたペプチド断片を液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）によって効果的に検出及び定量することができる画期的な技術である。本発明者等は本方法を「ナノ表面及び分子配向制限的タンパク分解（nano-surface and molecular-orientation limited proteolysis）方法（nSMOL法）」と命名している。【０００４】
nSMOL法による血中抗体医薬の定量は、抗体医薬の特異的配列を有するFab領域のみを限定的にトリプシン消化し、LC-MS/MS分析において最も問題視される、イオンサプレッション効果を抑制し、より安定した信頼性の高い定量値を提供することが可能な方法である。本発明者等は既に、nSMOL法及びLC-MS/MS法を組み合わせて用いたモノクローナル抗体の検出方法が、15種類以上にわたる抗体医薬の血中濃度測定において、日本、米国及び欧州における生物学的分析方法のバリデーションのためのガイドラインの基準を満たすものであることを確認している。【０００５】
一方、生体高分子であるタンパク質には、非常に特徴的な硬い（リジッドな）構造をもつタンパク質が存在することが知られている。例えば、アミロイドベータ、トランスフェリン、複数回膜貫通型タンパク質（ロドプシン、トランスポーター等）では、メカニズムは異なるものの、リジッドな構造をとることで、それぞれその作用が制御されていることが知られている。【０００６】
タンパク質構造をリジッドに保つ構造の１つとして、SS結合により結び目のような構造が生じたシステインノット構造がある。システインノット構造を持ち、特異的なシグナル伝達に寄与する分子として、血管内皮増殖因子(VEGF)やインターロイキン等のサイトカイン類が挙げられる。【０００７】
抗体分子は、重鎖2本および軽鎖2本からなる4量体高分子量タンパク質であり、それぞれの鎖に抗体特異的なアミノ酸配列を有し、抗体構造の多様性、機能を定義する可変領域、及び分子構造が同一である定常領域が存在する。可変領域の中でも特に変異の頻度が高く、抗原との結合性を決定する領域が相補性決定領域(CDR)であり、また、重鎖定常領域のCH1ドメインとCH2ドメインの間にはヒンジと呼ばれる非常にフレキシビリティの高い構造が存在する。【０００８】
抗体分子中のヒンジの存在により、抗体結合部位（Fab, fragment antigen binding）の立体構造学的ゆらぎが確保されており、NMR分析等で分子動力学的解析を行うと、Fc部位はほぼ三次元的に固定されているにも関わらず、Fab部位は三次元的にアサインすることができないほど、おおきく揺らいでいることが解っている。抗原が結合するとそのゆらぎは収束し、リジッドな構造へと変化する。【０００９】
また、抗体分子には、分子内および分子間にSS結合が多数存在し、それぞれの領域を保持する役割を持っている。抗体分子自身や周囲の微細構造環境により、SS結合に関わる硫黄原子の酸化還元電位が異なり、SS結合強度にも差があると考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開WO2015/033479号
【特許文献２】国際公開 WO2016/194114号
【特許文献３】国際公開 WO2016/143224号
【特許文献４】国際公開 WO2016/143223号
【特許文献５】国際公開 WO2016/143226号
【特許文献６】国際公開 WO2016/143227号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Analyst. 2014 Feb 7; 139(3): 576-80. doi: 10.1039/c3an02104a
【非特許文献２】Anal. Methods, 2015; 21: 9177-9183. doi:10.1039/c5ay01588j
【非特許文献３】Drug Metabolism and Pharmacokinetics, 2016; 31: 46-50. doi:10.1016/j.dmpk.2015.11.004
【非特許文献４】Bioanalysis. 2016; 8(10):1009-20. doi: 10.4155. bio-2016-0018
【非特許文献５】Biol Pharm Bull, 2016;39(7):1187-94. doi: 10.1248/bpb.b16-00230
【非特許文献６】J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci; 2016; 1023-1024:9-16. doi: 10.1016/j.jchromb.2016.04.038
【非特許文献７】Clin Pharmacol Biopharm 2016; 5:164. doi:10.4172/2167-065X.1000164
【非特許文献８】J. Pharm Biomed Anal; 2017; 145:33-39. doi:10.1016/j.jpba.2017.06.032
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
nSMOL法は、直径約200 nmのナノ粒子表面に固相したプロテアーゼが、細孔径約100 nmの多孔質体に固定したイムノグロブリン分子に接触することで、制限された反応場において、イムノグロブリン分子のFabを選択的に切断する反応メカニズムを持っている。nSMOL法は精度・感度・再現性に優れており、nSMOL法の実施のために、LC/MS/MS用前処理キット「nSMOL Antibody BA Kit」（島津製作所）が既に市販されており、キットと合わせてプロトコールも提供されているが、本発明者等はnSMOL法の汎用性の更なる拡大のために、プロトコールの改良等の検討を行っている。【００１３】
その中で、本発明者等は、抗体医薬として使用されるモノクローナル抗体の中で、他のモノクローナル抗体と比較して検出結果が極端に低くなる分子があることを確認した。nSMOL法の精度及び感度からすれば、臨床的な使用において問題がない場合が多いと考えられるが、微量の抗体濃度をより高い信頼性で検出するために、手順を更に改良し得る可能性が考えられた。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
理論に拘束されるものではないが、本発明者等は、検出結果が低くなる状況が、測定対象の抗体分子の硬さに由来するプロテアーゼ耐性から生じている可能性を予想した。すなわち、そのような抗体分子において、何らかのメカニズムで、例えばSS結合によるシステインノット構造の存在によって、非常にリジッドな領域が存在してプロテアーゼに対する耐性が生じ、その結果、nSMOL法において予測されるようなプロテアーゼ消化が進行しない可能性が考えられた。【００１５】
nSMOL法は、原理的にはプロテアーゼと基質の接触部位を立体構造的に制御するため、すべての抗体のFab領域に対し、選択的にプロテアーゼ反応が進むことが想定される。抗体の多様性に依存しない反応が確実に進む事も既に証明されている。しかしながら、抗体分子そのものが非常にリジッドであった場合、基質には接触しても、抗体定量が可能な部位へのプロテアーゼによる加水分解が進まない可能性がある。【００１６】
あらゆるモノクローナル抗体医薬に対してnSMOL法を適用するため、上記のようなリジッドなモノクローナル抗体に対する分析条件を種々検討した結果、本発明者等は、サンプルから抗体分子を分画した後に、酸性還元条件によりSS結合を素早く解離することで、立体的なゆらぎを持たせることができ、nSMOL法での検出結果が顕著に向上することを見出した。酸性還元条件ではprotein AとFcの結合は解離しないため、抗体分子を多孔質体上に保持したままシステインノット構造をほぐすことが可能となると考えられる。【００１７】
すなわち、本発明は以下を提供するものである。
１．  以下のステップ：
(a)サンプル中のモノクローナル抗体を捕捉して多孔質体の細孔内に固定化するステップ、
(b)該モノクローナル抗体を固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化したナノ粒子とを接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を行うステップ、及び
(c)選択的プロテアーゼ消化によって得られたペプチド断片を液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）によって検出するステップ
を含む、サンプル中のモノクローナル抗体の検出方法であって、ステップ(a)の後に、
(a')酸性条件下での還元反応を行うステップ
を更に含む、上記方法。
２．  ステップ(a')を、有機リン系還元剤の存在下でのインキュベーションによって実施する、上記１記載の方法。
３．  有機リン系還元剤が、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（Tris(2-carboxyethyl)phosphine, TCEP）又はその塩酸塩である、上記２記載の方法。
４．  TCEPの濃度が100〜500 mMである、上記３記載の方法。
５．  pH2.5以下の強酸性条件下でステップ(a')を実施する、上記１〜４のいずれか記載の方法。
６．  ステップ(a')の還元反応の時間が10〜60分間である、上記１〜５のいずれか記載の方法。
７．  LC-MSによって検出するペプチド断片が重鎖由来のものである、上記１〜６のいずれか記載の方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、構造化学的にリジッドであると予想されたモノクローナル抗体、例えばトシリズマブとモガムリズマブにおいて、分析バリデーションが可能な定量方法が確立され、従来よりさらに広い範囲の抗体に対して、nSMOL法の適用が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】トシリズマブ由来の複数のペプチドのnSMOL法による検出結果がTCEPの添加によって向上することを示す。
【図２】TCEPの存在下での反応によって多孔質体からの抗体の脱離が生じないことを示す。
【図３】250mM TCEP存在下（pH1.5及びpH7）又は不存在下でのVTMLR（配列番号１）の検出結果を示す。
【図４】TCEP添加による還元反応時間に依存してトシリズマブ由来のペプチドの検出量が増大することを示す。
【図５】本発明の方法におけるトシリズマブの検出で作成された検量線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、以下のステップ：
(a)サンプル中のモノクローナル抗体を捕捉して多孔質体の細孔内に固定化するステップ、
(b)該モノクローナル抗体を固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化したナノ粒子とを接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を行うステップ、及び
(c)選択的プロテアーゼ消化によって得られたペプチド断片を液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）によって検出するステップ
を含む、サンプル中のモノクローナル抗体の検出方法であって、ステップ(a)の後に、
(a')酸性条件下での還元反応を行うステップ
を更に含む、上記方法を提供する。
【００２１】
＜ステップ(a)＞
本発明の方法のステップ(a)は、サンプル中のモノクローナル抗体を捕捉して多孔質体の細孔内に固定化するステップに相当する。
【００２２】
本明細書において、「サンプル」とは、モノクローナル抗体の存在を検出すべき液体サンプルであって、特に限定するものではないが、一般的にはマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウシ、ヒト等の哺乳動物、特にヒト被験者、主としてヒト患者由来の生物学的サンプルであり、好ましくは血漿または血清、もしくは組織ホモジネート抽出液である。あるいは、サンプルは、例えば発明の効果を実証するために、人為的に添加されたモノクローナル抗体と血漿とを含む液体サンプルであり得る。本発明の方法におけるモノクローナル抗体の検出のためには、サンプル中のモノクローナル抗体の濃度は、0.05〜300μg/mlの範囲内であれば良い。
【００２３】
測定対象となり得るモノクローナル抗体としては、限定するものではないが、例えばパニツムマブ、オファツムマブ、ゴリムマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、ラムシルマブ、アダリムマブ等のヒト抗体；トシリズマブ、トラスツズマブ、トラスツズマブ-DM1、ベバシズマブ、オマリズマブ、メポリズマブ、ゲムツズマブ、パリビズマブ、ラニビズマブ、セルトリズマブ、オクレリズマブ、モガムリズマブ、エクリズマブ、トリシズマブ、メポリズマブ等のヒト化抗体；リツキシマブ、セツキシマブ、インフリキシマブ、バシリキシマブ、等のキメラ抗体等が挙げられる。
【００２４】
また、モノクローナル抗体の特異性を維持しつつ更なる機能を付加した複合体、例えばFc融合タンパク質（エタネルセプト、アバタセプト等）、抗体-薬物複合体（例えばブレンツキシマブベドチン、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、トラスツズマブ-エムタンシン等）も測定対象のモノクローナル抗体となり得る。測定に先立って複合体の結合を解離させ、抗体部分のみを分析に供しても良いが、複合体の形態のままで分析に供することもできる。
【００２５】
モノクローナル抗体のアミノ酸配列の情報等は、例えば京都遺伝子ゲノム百科事典（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）から取得することができる。
【００２６】
本発明の方法に使用する多孔質体としては、多数の細孔を有し、抗体を部位特異的に結合可能なものを使用することができる。多孔質体の平均細孔径は、１０ｎｍ〜２００ｎｍ程度の範囲で、かつナノ粒子の平均粒径よりも小さい範囲で適宜に設定される。
【００２７】
本発明のステップ(a)では、測定対象のモノクローナル抗体を多孔質体の細孔内に固定化する。この目的で、多孔質体の細孔内に、抗体と部位特異的に相互作用するリンカー分子が固定化されたものが好ましく用いられる。
【００２８】
リンカー分子としては、抗体のFcドメインと部位特異的に結合するProtein AやProtein G等が好ましく用いられる。細孔内にこれらのリンカー分子が固定化された多孔質体を用いることにより、細孔内に抗体のFcドメインが固定化され、Fabドメインが細孔の表層付近に位置するため、プロテアーゼによるFabドメインの位置選択的消化が可能となる。
【００２９】
本発明において好適に使用可能な多孔質体として、特に限定するものではないが、例えばProtein G Ultralink樹脂（Pierce社製）、トヨパール TSKgel（TOSOH社製）、トヨパール AF-rProtein A HC-650F resin（TOSOH社製）、Protein A Sepharose（GEヘルスケア）、KanCapA（KANEKA）等が挙げられる。
【００３０】
抗体を多孔質体の細孔内に固定化する方法は特に限定されず、例えば、細孔内にProtein AやProtein Gが固定化された多孔質体に抗体を固定化する場合は、多孔質体の懸濁液と抗体を含む溶液とを混合することにより、細孔内に抗体を容易に固定化できる。多孔質体と抗体の量比は、目的に応じて適宜に設定できる。
【００３１】
＜ステップ(a')＞
本発明の方法では、上記のステップ(a)の後で、酸性条件下での還元反応を行うステップ(a')を実施する。
【００３２】
酸性条件下での還元反応は、例えば有機リン系還元剤の存在下でのインキュベーションによって実施することができる。有機リン系還元剤としては、例えばトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（Tris(2-carboxyethyl)phosphine, TCEP）又はその塩酸塩、トリブチルホスフィン等が挙げられ、これらの還元剤は、シグマ・アルドリッチ、ナカライテスク株式会社、フナコシ株式会社等から入手することができる。好適に使用できるTCEPの濃度は反応液中100〜500 mMの範囲とすることが好ましい。
【００３３】
ステップ(a')の還元反応は、pH2.5以下の強酸性条件下、例えばpH1.5、pH2.0、PH2.5等で実施することが好ましい。また、還元反応の時間は、限定するものではないが、10〜60分間の範囲であれば十分であり、例えば20分間、30分間、40分間、45分間、50分間であり得る。60分間を超えて還元反応を行うことも可能であるが、その場合、測定のための作業時間が長くなってしまうため、現実的ではない。反応温度は、限定するものではないが、例えば15〜30℃の範囲であれば良く、室温で反応を実施することができる。好適には、反応温度は約25℃である。
【００３４】
尚、本発明の方法の理解を目的として、本明細書において、ステップ(a')をステップ(a)の後で行うと記載しているが、当業者には理解されるように、各ステップには、試薬の添加及び除去、洗浄等のための様々な操作が含まれることが通常であり、ステップ(a')として記載した酸性条件下での還元反応が、場合によってはステップ(a)の一部として説明される操作に先立って実施されることがあり得る。しかしながら、ステップ(a)として記載した「サンプル中のモノクローナル抗体を捕捉して多孔質体の細孔内に固定化するステップ」の後、ステップ(b)として以下に記載する「該モノクローナル抗体を固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化したナノ粒子とを接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を行うステップ」に先立って、ステップ(a')として記載した「酸性条件下での還元反応を行うステップ」が実施されることは、理解されるであろう。
【００３５】
＜ステップ(b)＞
本発明の方法のステップ(b)は、上記ステップ(a)で得られたモノクローナル抗体を固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化したナノ粒子とを接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を行うステップに相当する。
【００３６】
ナノ粒子に固定化させるプロテアーゼの種類は、質量分析による定量又は同定の対象となるモノクローナル抗体の種類に応じて適宜選択すればよく、限定はされないが、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リジルエンドペプチダーゼ、V8プロテアーゼ、AspNプロテアーゼ（Asp-N）、ArgCプロテアーゼ（Arg-C）、パパイン、ペプシン、ジペプチジルペプチダーゼを単独又は組み合わせて使用することができる。プロテアーゼとして、特にトリプシンが好ましく用いられる。本発明の方法において好適に使用できるプロテアーゼとして、例えばTrypsin Gold（プロメガ社製）、Trypsin TPCK-treated（シグマ社製）等が挙げられる。
【００３７】
ナノ粒子は、その平均粒径が、多孔質体の平均細孔径よりも大きいものであり、形状は特に限定されないが、多孔質体の細孔へのプロテアーゼのアクセスの均一化の観点から、球状のナノ粒子が好ましい。また、ナノ粒子は、分散性が高く、平均粒径が均一であることが好ましい。
【００３８】
ナノ粒子の種類としては、水性媒体に分散又は懸濁することができ、分散液又は懸濁液から磁気分離または磁性沈殿分離により容易に回収することができる磁気ナノ粒子が好ましい。また、凝集が起こりにくいという点において、その表面が有機ポリマーで被覆された磁気ナノ粒子がより好ましい。有機ポリマーで被覆された磁性ナノビーズの具体例としては、FGビーズ、SGビーズ、Adembeads、nanomag等が挙げられる。市販品としては、例えば、多摩川精機株式会社製のFG beads（フェライト粒子をポリグリシジルメタクリレート（ポリGMA）で被覆した粒径約２００ｎｍのポリマー磁性ナノ粒子）が好適に用いられる。
【００３９】
上記ナノ粒子は、非特異的なタンパク質の吸着抑制と、プロテアーゼの選択的な固定化のために、プロテアーゼと結合可能なスペーサ分子で修飾されていることが好ましい。スペーサ分子を介してプロテアーゼを固定化することにより、ナノ粒子表面からのプロテアーゼの脱離が抑制され、プロテアーゼ消化の位置選択性が高められる。また、スペーサの分子サイズを調整することにより、抗体の所望の位置にプロテアーゼを選択的にアクセスさせ、位置選択性を高めることもできる。
【００４０】
このようなスペーサ分子で表面修飾されたナノ粒子もまた市販されており、例えば、N-ヒドロキシスクシンイミドで活性化されたエステル基（活性エステル基）を有するスペーサ分子で修飾されたナノ粒子は、商品名「FG beads NHS」（多摩川精機株式会社）として市販されている。
【００４１】
プロテアーゼをナノ粒子の表面に固定化する方法は特に限定されず、プロテアーゼとナノ粒子（あるいはナノ粒子表面を修飾するスペーサ分子）の特性等に応じて適宜の方法を採用できる。尚、上記のLC/MS/MS用前処理キット「nSMOL Antibody BA Kit」（島津製作所）には、プロテアーゼとしてトリプシンが固定化されたナノ粒子であるFG beads Trypsin DART（登録商標）が含まれており、本発明の方法に好適に用いることができる。
【００４２】
上記モノクローナル抗体を固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化したナノ粒子とを接触させることにより、モノクローナル抗体が選択的にプロテアーゼ消化され、ペプチド断片が産生される。
【００４３】
プロテアーゼ消化は、例えば、プロテアーゼの至適ｐＨ近傍に調整された緩衝溶液中で実施する。プロテアーゼ消化のための反応温度は３７℃程度であって良いが、飽和蒸気圧下、約５０℃で行うことが好適である。反応時間は、３０分間〜２０時間、例えば１時間〜８時間、３〜５時間の範囲とすることができる。限定するものではないが、反応液の蒸発を防ぐために、反応を飽和蒸気圧下で維持することが好ましい。
【００４４】
ステップ(b)は、反応液を撹拌することで、多孔質体とナノ粒子との接触を促進することができるが、反応時間全体にわたって撹拌しても、反応時間の一部のみ、例えば反応初期のみに撹拌しても良く、特に限定するものではない。
【００４５】
プロテアーゼ消化によって消化されたペプチドは、反応液中に溶解して放出される。従って、目的のペプチド断片を質量分析に供するためには、多孔質体及びナノ粒子を除去することが必要である。これは、プロテアーゼ消化後のサンプルに対して濾過、遠心分離、磁気分離、透析等の操作を行うことで達成できる。
【００４６】
例えばポリフッ化ビニリデン（PVDF）製のろ過膜（Low-binding hydrophilic PVDF、孔径0.2μm、ミリポア社製）、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）製のろ過膜（Low-binding hydrophilic PTFE、孔径0.2μm、ミリポア社製）等を用いてろ過することにより、多孔質体及びナノ粒子を簡便に除去することができる。ろ過は、遠心ろ過とすると迅速かつ簡便なろ過が可能である。
【００４７】
＜ステップ(c)＞
本発明の方法のステップ(c)は、選択的プロテアーゼ消化によって得られたペプチド断片を液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）によって検出するステップに相当する。
【００４８】
質量分析におけるイオン化法、及びイオン化された試料の分析方法は特に限定されない。また、三連四重極型質量分析装置等を用いて、MS/MS分析、あるいはMS3以上の多段階質量分析、多重反応モニタリング（multiple reaction monitoring, MRM）を行うことができる。
【００４９】
本発明の方法において特に適した装置は、特に限定するものではないが、例えばLCMS-8030、LCMS-8040、LCMS-8050、LCMS-8060（いずれも島津製作所）、LCMS-IT-TOF（島津製作所）を挙げることができる。
【００５０】
質量分析等により、目的のモノクローナル抗体に特異的なFab領域、例えば重鎖及び／又は軽鎖のCDR1領域、CDR2領域、CDR3領域のアミノ酸配列を含むペプチド断片を検出することで、目的のモノクローナル抗体の同定・定量が可能である。
【００５１】
抗体医薬として使用することが意図されるモノクローナル抗体は、そのアミノ酸配列情報等が公開されており、重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列、Fab及びFcドメイン、相補性決定領域（CDR）、ジスルフィド結合等の情報を入手することが可能である。従って、nSMOL法によるプロテアーゼ消化で複数のペプチドが得られるが、それぞれのペプチドについてのアミノ酸配列情報が得られれば、そのペプチドがモノクローナル抗体のいずれの位置に存在するものであるかを容易に理解することができる。従って、Fab領域由来の複数のペプチドのうち、特に好適なペプチドを分析対象として選択することができる。このように選択されるペプチドは「シグネチャーペプチド」と呼ばれている。
特に限定するものではないが、本発明の方法においては、LC-MSによって検出するペプチド断片を重鎖由来のものとすることが好ましい。
【００５２】
nSMOL法の詳細は、例えばWO2015/033479号；WO2016/143223号；WO2016/143224号；WO2016/143226号；WO2016/143227号；WO2016/194114号；Analyst. 2014 Feb 7; 139(3): 576-80. doi: 10.1039/c3an02104a；Anal. Methods, 2015; 21: 9177-9183. doi:10.1039/c5ay01588j；Drug Metabolism and Pharmacokinetics, 2016; 31: 46-50. doi:10.1016/j.dmpk.2015.11.004；Bioanalysis. 2016; 8(10):1009-20. doi: 10.4155. bio-2016-0018；Biol Pharm Bull, 2016;39(7):1187-94. doi: 10.1248/bpb.b16-00230；J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci; 2016; 1023-1024:9-16. doi: 10.1016/j.jchromb.2016.04.038；Clin Pharmacol Biopharm 2016; 5:164. doi:10.4172/2167-065X.1000164；及びJ. Pharm Biomed Anal; 2017; 145:33-39. doi:10.1016/j.jpba.2017.06.032等に開示されている。これらの文献の開示内容は、参照により本明細書に組み入れるものとする。
【００５３】
取り扱い説明書と共に島津製作所から「nSMOL Antibody BA Kit」として市販されているnSMOL（登録商標）Antibody BA Kitには、以下の試薬が含まれている。
Immunoglobulin Collection Resin（本発明における多孔質体の懸濁液）
Wash Solution 1（洗浄溶液）
Wash Solution 2（洗浄溶液）
Reaction Solution（反応溶液）
Enhanced Reaction Solution（反応促進溶液）
Reaction Stop Solution（反応停止溶液）
FG Beads Trypsin DART（登録商標、プロテアーゼを固定したナノ粒子(粒径200nm)の懸濁液）
【００５４】
従来のnSMOL法のプロトコールの例は以下のようなものである。
＜ステップ(a)＞
1．モノクローナル抗体が含まれる生物学的サンプル5-10μLを約10-20倍量のPBS+0.1% n-オクチルチオグリコシド (OTG)に希釈する。
2．Immunoglobulin Collection Resin (TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F, 50% slurry)を25μL加える。
3．5分程度穏やかにボルテックス攪拌する。
4．ウルトラフリーlow-protein binding Durapore PFDF (0.22μm)に全量回収する。
5．上清を遠心除去する（10,000g x 1分間）。
6．PBS+0.1% OTGを300μL加え、上清を遠心除去する（10,000g x 1分間）。
7．ステップ6を繰り返す。
8．界面活性剤を除くため、PBSを300μL加え、上清を遠心除去する（10,000g x 1分間）。
9．ステップ8を繰り返す。
10．Reaction solutionもしくはEnhanced Reaction Solutionを75-100μL加える。この溶液には10 fmol/μLのP14R合成ペプチドを添加しておく。
【００５５】
＜ステップ(b)＞
11．化学修飾トリプシンを固相したFG beads（0.5 mg/ml FGbeads懸濁液）を5-10μL加える。
12．飽和蒸気圧下50℃にて、穏やかに攪拌しながら4-6時間反応を行う。
13．反応液に10%ギ酸を10μL加えることで反応を停止する。
14．遠心ろ過（10,000g x 1分間）し、溶液を回収する。
15．磁気スタンドに立て、約1-2分間静置し、余剰樹脂を除去する。
【００５６】
＜ステップ(c)＞
16．LCMS分析に供する。
【００５７】
本発明の方法におけるステップ(a')は、上記のステップ(a)の後に実施することができる。厳密には、ステップ(a')を実施するための還元剤の添加は、上記のステップ(a)において、生物学的サンプル中のモノクローナル抗体の多孔質体（Immunoglobulin Collection Resin）の細孔内への固定化が達成されたと考えられる上記「4.」以降「8.」の操作の間のいずれの時点で行っても良い。これにより、多孔質体の細孔内に固定化されたモノクローナル抗体が還元剤により反応を受けると共に、ステップ(b)のプロテアーゼ消化前に還元剤が除去される。必要に応じて、更なる洗浄工程等の追加の工程を含めることができる。
【００５８】
リジッドな構造を有するモノクローナル抗体の一例として本明細書中に記載するトシリズマブは、インターロイキン-6に対して特異的に結合し得るヒト化モノクローナル抗体であり、アクテムラの商品名で入手することができる。
【００５９】
同様にリジッドな構造を有すると想定されるモガムリズマブは、CCケモカイン受容体4に対して特異的に結合し得るヒト化モノクローナル抗体であり、ポテリジオの商品名で入手することができる。
【００６０】
同様にリジッドな構造を有すると想定されるメポリズマブは、インターロイキン-5に対して特異的に結合し得るヒト化モノクローナル抗体であり、ヌーカラの商品名で入手することができる。
【００６１】
上記したように、本発明の方法は、リジッドな構造を有するモノクローナル抗体のnSMOL法による検出のために特に有利であるが、モノクローナル抗体全般に対して実施することができる。しかしながら、従来の方法に追加のステップを組み込むことで、測定時間が長くなってしまい、また余分な試薬を使用することにもなるため、例えば、従来のnSMOL法での検出結果が想定される結果よりも顕著に低い場合、あるいは予めモノクローナル抗体のFab領域にリジッドな構造が含まれることが予想される場合に、本発明の方法を選択することが推奨される。
【００６２】
本発明の方法は、限定するものではないが、例えば従来のnSMOL法を用いた場合に、0.5μg/mL以下、1μg/mL以下、5μg/mL以下、又は10μg/mL以下の濃度で検出が困難であって、薬物動態試験の結果より予想される定量範囲よりも十分低い濃度範囲を検出できないモノクローナル抗体、あるいは検出できるモノクローナル抗体のいずれにも好適に適用することができる。
【００６３】
本発明の方法を好適に適用できる具体的なモノクローナル抗体としては、限定するものではないが、例えば以下の実施例にも記載する上記のトシリズマブ、モガムリズマブ、及びメポリズマブが挙げられる。
【実施例】
【００６４】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。【００６５】
［実施例１］
測定対象としてトシリズマブを用い、「nSMOL Antibody BA Kit」（島津製作所）を使用して、サンプル中のトシリズマブの検出方法のためのプロトコルを検討した。【００６６】
キットに含まれるImmunoglobulin Collection Resin懸濁液12.5μLにWash Solution 1を90μL加え、これにトシリズマブ（中外製薬）をヒト血漿(コージンバイオ株式会社製、5μmのフィルターで濾過後、0.8μmのフィルターで濾過したもの)に100μg/mLで添加したサンプルを5μL加え、5分程度軽く攪拌した（ステップ(a)）。
得られた懸濁液をフィルターカップに移し、遠心分離（10,000 g x 1 分間）して上清を除去した。【００６７】
これに、5 mM、50 mM、100 mM、250 mM、又は500 mM TCEP-HCL（シグマアルドリッチ）水溶液を加え、あるいは加えずに、30分間室温で静置した（pH1.5〜2.5、ステップ(a')）。【００６８】
遠心分離（10,000 g x 1 分間）して上清を除去した後、Wash Solution 1を300μL加えて遠心分離する操作を3回繰り返した。
Wash Solution 2を300μL加えて遠心分離する操作を3回繰り返した。【００６９】
Reaction Solutionを80μL加え、更にFG beads Trypsin DARTを5μL加えて、飽和蒸気圧下、50℃にて、5時間反応を行った（ステップ(b)）。
Reaction Stop Solutionを5μL加え、遠心ろ過をして、磁気分離によって溶液を回収した。【００７０】
NexeraX2 システム（島津製作所）及びLCMS-8050/8060（島津製作所）を使用してLCMS分析を行った（ステップ(c)）。
測定は、トシリズマブの重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列に基づいて、以下の表１に示す5種のペプチドをFab領域に存在するモニターペプチドとして選択し、それぞれについて実施した。【００７１】
【表１】
0006933267.tif 000002
【００７２】
図１に結果を示すように、いずれのペプチドの検出結果も、TCEPを添加しない場合と比較して、添加したTCEP濃度に依存して向上し、250mM TCEPを添加したサンプルで最も高い相対ピーク強度が得られた。【００７３】
［実施例２］
TCEP添加による多孔質体からの抗体分子（トシリズマブ）の脱離の有無を確認するために、抗体分子を保持したImmunoglobulin Collection Resin懸濁液に250 mM TCEP（pH1.5又はpH7.0）を添加して30分間室温で静置した後、溶液（フロースルー）及びプロテインAビーズ上のタンパク質をSDS-PAGEにより分離した。対照として、25 mM Tris-HCl（pH8.0）を添加して同様に静置したものを泳動した。結果を図２に示す。【００７４】
図２(A)に示す重鎖及び軽鎖のバンドから、重鎖ではいずれの条件においても多孔質体からの分離はほとんど確認されなかった（図２(B)）。軽鎖では、pH1.5の条件で250 mM TCEPを共存させた場合に若干の脱離が確認されたが、pH7.0ではほとんど脱離しなかった（図２(C)）。このことから、強酸性条件では、SS結合によって重鎖に結合している軽鎖が約30％程度脱離する可能性が示される。【００７５】
［実施例３］
実施例１において良好な検出結果をもたらし、重鎖由来のペプチドであるVTMLR（配列番号２）をシグネチャーペプチドとして選択し、実施例１と同様の条件で、250 mM TCEP（pH1.5又はpH7.0）を添加したサンプルで測定を行った。【００７６】
その結果、図３に示すように、pH7.0の中性条件下ではTCEPを添加しない場合と比較して検出結果に大きな違いを得ることができなかったが、pH1.5の強酸性条件下では、検出結果が大きく向上することが実証された。【００７７】
［実施例４］
250 mM TCEP（pH1.5）を添加したサンプルで、室温で静置する時間（還元反応時間）を変えて、検出結果を比較した。測定は、VTMLR（配列番号２）をシグネチャーペプチドとして実施例１と同様にして行った。【００７８】
その結果、図４に示すように、10分間の還元反応で、TCEPを添加しない場合と比較して検出結果の大きな増大が確認され、更に反応時間を長くすることで、60分間までの範囲で反応時間に依存してより高い検出値を得ることが確認された。【００７９】
［実施例５］
血漿へのトシリズマブの添加量を変更して、250 mM TCEP（pH1.5）の添加による検出結果が低い抗体濃度においても向上することを確認した。測定は、VTMLR（配列番号２）をシグネチャーペプチドとして実施例１と同様にして行った。【００８０】
表２に示すように、250 mM TCEP（pH1.5）の代わりに反応促進溶液（キット中のEnhanced Reaction Solution）を添加して30分間静置するステップを入れた場合には、サンプル中1μg/mLまでの低濃度では、nSMOL法による検出ができなかった。これに対して、250 mM TCEP（pH1.5）を添加して30分間静置するステップ（本発明のステップ(a')）を入れた場合には、0.25μg/mL以上の濃度のトシリズマブの検出定量が可能であることが示された。【００８１】
【表２】
0006933267.tif 000003
【００８２】
［実施例６］
250 mM TCEP（pH1.5）を添加して30分間静置するステップを含める以外は実施例１と同様の条件で、0.25〜300μg/mLの濃度範囲のトシリズマブを含有するサンプルを分析した。測定は、VTMLR（配列番号２）をシグネチャーペプチドとして実施例１と同様にして行った。【００８３】
その結果、図５に示すように、濃度に比例したほぼ直線状の定量結果（r=0.99）がもたらされ、かつ分析ガイドライン基準を達成した。本発明の方法が、信頼性の高い分析方法であることが実証された。【００８４】
［実施例７］
種々の抗体を用いて、250 mM TCEP（pH1.5）を添加して30分間静置するステップを含める以外は実施例１と同様の条件で測定を行った。セツキシマブ（ブリストル・マイヤーズスクイブ社）、リツキシマブ（全薬工業株式会社）、ブレンツキシマブ（武田薬品工業株式会社）、イピリムマブ（小野薬品工業株式会社）、ニボルマブ（小野薬品工業株式会社）、ベバシズマブ（中外製薬株式会社）、アダリムマブ（アッヴィ合同会社）、トラスツズマブ（中外製薬株式会社）、ラムシルマブ（日本イーライリリー株式会社）、インフリキシマブ（田辺三菱製薬株式会社）、メポリズマブ（グラクソ・スミスクライン株式会社）、モガムリズマブ（協和発酵キリン株式会社）のそれぞれについて、アミノ酸配列情報等に基づいて表３に示すシグネチャーペプチドを選択し、250 mM TCEP（pH1.5）の添加の有無での検出結果を比較した。【００８５】
表３の結果は、それぞれの抗体について、250 mM TCEP（pH1.5）を添加しない場合（コントロール）の検出結果を１として、添加した場合の相対的な結果を示すものである。【００８６】
表３から明らかなように、トシリズマブ、並びにメポリズマブ及びモガリズマブは、250 mM TCEP（pH1.5）の添加による酸性条件下での還元反応により、検出結果が数十倍も増大した。このことは、比較的リジッドな構造を有し、nSMOL法におけるプロテアーゼ消化に対して耐性を示すこれらの分子が、強酸性下でのTCEPの存在によって消化を受けやすい状態となり、検出結果の大きな向上がもたらされたことを示す。これに対して他の抗体では、若干の検出結果の向上を示すものも存在するものの、大きな効果を示すものではなかった。しかしながら、これらの抗体は、従来のnSMOL法で十分信頼性の高い検出が得られ、既に生物学的分析方法のバリデーションのためのガイドラインの基準を満たすことが確認されたものである。尚、コントロールと比較して低い値が得られたアダリムマブ及びラムシルマブは、シグネチャーペプチドが軽鎖由来のものであるため、強酸性下でのTCEPの存在によってプロテアーゼ消化前に軽鎖が多孔質体から脱離した可能性も示唆される。【００８７】
【表３】
0006933267.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明により、nSMOL法のプロトコールが改良され、質量分析を用いたモノクローナル抗体の検出方法の更なる応用が期待できる。特に薬物動態試験、治療薬物モニタリング試験において、広く応用が可能となる。【００８９】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
0006933267.tif 000005
【図２】
0006933267.tif 000006
【図３】
0006933267.tif 000007
【図４】
0006933267.tif 000008
【図５】
0006933267.tif 000009
【配列表】
0006933267000001.app