(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え菌であって、アエロモナス・ベロニのアエロリシン遺伝子をノックアウトすることによって得られたものである、ことを特徴とする組換え菌。
【請求項２】
前記ノックアウトは、オープンリーディングフレーム全体をノックアウトするか、又は一部の遺伝子セグメントをノックアウトすることである、ことを特徴とする請求項１に記載の組換え菌。
【請求項３】
組換え菌であって、特異的なＤＮＡ断片をアエロモナス・ベロニに導入し相同組換えを行った後に得られた前記特異的なＤＮＡ断片を有する組換え菌であり、前記特異的なＤＮＡ断片は、アエロリシン遺伝子の上流ホモロジーアーム及び下流ホモロジーアームを含み、前記上流ホモロジーアームは、配列表の配列３の５’末端から第３０９２〜４２７６番目のヌクレオチドで示され、前記下流ホモロジーアームは、配列表の配列３の５’末端から第４２７７〜５４０８番目のヌクレオチドで示される、ことを特徴とする組換え菌。
【請求項４】
寄託番号がＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．１４７７６であるアエロモナス・ベロニ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｖｅｒｏｎｉｉ）Ｈｍ０９１△ａｅｒ。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換え菌を含むワクチンであって、以下の（ｂ１）〜（ｂ４）のいずれかである、ことを特徴とするワクチン。
（ｂ１）水産動物アエロモナス・ベロニワクチン、
（ｂ２）水産動物アエロモナス・ハイドロフィラワクチン、
（ｂ３）水産動物アエロモナスワクチン、
（ｂ４）水産動物出血性疾患ワクチン
【請求項６】
請求項４に記載のアエロモナス・ベロニ（Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ）Ｈｍ０９１△ａｅｒを含むワクチンであって、以下の（ｂ１）〜（ｂ４）のいずれかである、ことを特徴とするワクチン。
（ｂ１）水産動物アエロモナス・ベロニワクチン、
（ｂ２）水産動物アエロモナス・ハイドロフィラワクチン、
（ｂ３）水産動物アエロモナスワクチン、
（ｂ４）水産動物出血性疾患ワクチン
【請求項７】
ワクチンを調製する方法であって、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換え菌をワクチンの活性成分として包装するステップを含み、前記ワクチンは、以下の（ｂ１）〜（ｂ４）のいずれかである、ことを特徴とする方法。
（ｂ１）水産動物アエロモナス・ベロニワクチン、
（ｂ２）水産動物アエロモナス・ハイドロフィラワクチン、
（ｂ３）水産動物アエロモナスワクチン、
（ｂ４）水産動物出血性疾患ワクチン
【請求項８】
ワクチンを調製する方法であって、請求項４に記載のアエロモナス・ベロニ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｖｅｒｏｎｉｉ）Ｈｍ０９１△ａｅｒをワクチンの活性成分として包装するステップを含み、前記ワクチンは、以下の（ｂ１）〜（ｂ４）のいずれかである、ことを特徴とする方法。
（ｂ１）水産動物アエロモナス・ベロニワクチン、
（ｂ２）水産動物アエロモナス・ハイドロフィラワクチン、
（ｂ３）水産動物アエロモナスワクチン、
（ｂ４）水産動物出血性疾患ワクチン
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換え菌を用いて、製品を調製するための使用であって、以下の（ｃ１）〜（ｃ５）の少なくとも１つである、ことを特徴とする使用。
（ｃ１）水産動物アエロモナス・ベロニ感染の予防及び／又は治療、
（ｃ２）水産動物アエロモナス・ハイドロフィラ感染の予防及び／又は治療、
（ｃ３）水産動物アエロモナス感染の予防及び／又は治療、
（ｃ４）水産動物出血性疾患の感染の予防及び／又は治療、
（ｃ５）水産動物の免疫力の改善
【請求項１０】
請求項４に記載のアエロモナス・ベロニ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｖｅｒｏｎｉｉ）Ｈｍ０９１△ａｅｒを用いて、製品を調製するための使用であって、以下の（ｃ１）〜（ｃ５）の少なくとも１つである、ことを特徴とする使用。
（ｃ１）水産動物アエロモナス・ベロニ感染の予防及び／又は治療、
（ｃ２）水産動物アエロモナス・ハイドロフィラ感染の予防及び／又は治療、
（ｃ３）水産動物アエロモナス感染の予防及び／又は治療、
（ｃ４）水産動物出血性疾患の感染の予防及び／又は治療、
（ｃ５）水産動物の免疫力の改善
【請求項１１】
水産動物アエロモナス・ベロニワクチンであって、その活性成分は、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換え菌、又は、請求項４に記載のアエロモナス・ベロニ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｖｅｒｏｎｉｉ）Ｈｍ０９１△ａｅｒである、ことを特徴とする水産動物アエロモナス・ベロニワクチン。
【請求項１２】
水産動物アエロモナス・ハイドロフィラワクチンであって、その活性成分は、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換え菌、又は、請求項４に記載のアエロモナス・ベロニ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｖｅｒｏｎｉｉ）Ｈｍ０９１△ａｅｒである、ことを特徴とする水産動物アエロモナス・ハイドロフィラワクチン。
【請求項１３】
水産動物アエロモナスワクチンであって、その活性成分は、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換え菌、又は、請求項４に記載のアエロモナス・ベロニ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｖｅｒｏｎｉｉ）Ｈｍ０９１△ａｅｒである、ことを特徴とする水産動物アエロモナスワクチン。
【請求項１４】
水産動物出血性疾患ワクチンであって、その活性成分は、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換え菌、又は、請求項４に記載のアエロモナス・ベロニ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｖｅｒｏｎｉｉ）Ｈｍ０９１△ａｅｒである、ことを特徴とする水産動物出血性疾患ワクチン。
【請求項１５】
製品であって、その活性成分は、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換え菌、又は、請求項４に記載のアエロモナス・ベロニ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｖｅｒｏｎｉｉ）Ｈｍ０９１△ａｅｒであり、前記製品の用途は、以下の（ｄ１）〜（ｄ５）の少なくとも１つである、ことを特徴とする製品。
（ｄ１）水産動物アエロモナス・ベロニ感染の予防及び／又は治療、
（ｄ２）水産動物アエロモナス・ハイドロフィラ感染の予防及び／又は治療、
（ｄ３）水産動物アエロモナス感染の予防及び／又は治療、
（ｄ４）水産動物出血性疾患の感染の予防及び／又は治療、
（ｄ５）水産動物の免疫力の改善
【請求項１６】
以下の（ｆ１）〜（ｆ５）の少なくとも１つである請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換え菌の使用。
（ｆ１）水産動物アエロモナス・ベロニ感染の予防及び／又は治療、
（ｆ２）水産動物アエロモナス・ハイドロフィラ感染の予防及び／又は治療、
（ｆ３）水産動物アエロモナス感染の予防及び／又は治療、
（ｆ４）水産動物出血性疾患の感染の予防及び／又は治療、
（ｆ５）水産動物の免疫力の改善
【請求項１７】
以下の（ｆ１）〜（ｆ５）の少なくとも１つである請求項４に記載のアエロモナス・ベロニ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｖｅｒｏｎｉｉ）Ｈｍ０９１△ａｅｒの使用。
（ｆ１）水産動物アエロモナス・ベロニ感染の予防及び／又は治療、
（ｆ２）水産動物アエロモナス・ハイドロフィラ感染の予防及び／又は治療、
（ｆ３）水産動物アエロモナス感染の予防及び／又は治療、
（ｆ４）水産動物出血性疾患の感染の予防及び／又は治療、
（ｆ５）水産動物の免疫力の改善
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水産養殖動物におけるアエロモナス出血性疾患の予防及び制御のための弱毒生ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
中国は世界最大の水産養殖生産国であり、世界の水産養殖生産量の６０％以上を占めている。生産実践における水産養殖の強化と商業化の増加に伴い、病気の大発生は魚類養殖業の大きな問題となっている。特に、アエロモナスによって引き起こされる魚類出血性疾患は、水産養殖業の発展において非常に際立った問題となっている。魚類の病気の大発生は、世界の水産養殖業で年間数億ドルの経済を引き起こすと推定されている。例えば、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）による運動性アエロモナス敗血症（ＭＡＳ）の大発生は、通常、世界の水産養殖における魚類の高い死亡率につながり、深刻な経済的損失を引き起こす。過去数十年間、抗生物質は、水産養殖における魚類の病気の管理と制御、及び魚類の成長の促進のための伝統的な戦略として機能してきた。しかしながら、病原菌の耐薬性の問題及び動物製品における抗生物質の残留の問題は世界中の人々の関心事になっており、水産養殖業における抗生物質の禁止は不可欠となっている。現在、抗生物質の使用に加えて、不活化ワクチンは、アエロモナスによる出血性疾患の主な予防と治療方法であるが、不活化ワクチンによる抗原の破壊は、不安定な免疫応答と長期的な免疫原性の欠如につながる。従って、病原菌ワクチンの開発は、アエロモナス出血性疾患の予防と治療のための重要な抗生物質なしの予防と治療方法の１つとなる。
【０００３】
現在、細菌性敗血症に対するワクチン予防と治療は、早期発症機序が不明であるため、主に腸管／鰓バリアの破壊後に侵入する感染細菌であるアエロモナス・ハイドロフィラのワクチンの研究開発に注目している。一方、宿主の物理的バリアを破壊する主要な細菌であるアエロモナス・ベロニのワクチンの開発に関する報告は非常に少なく、主に従来の強毒性株の不活化ワクチンを含む。さらに、アエロモナス・ベロニゴースト、及び特異的なアプタマーペプチドを導入したアエロモナス・ベロニワクチンが報告されているが、それらのほとんどは注射によって免疫化され、次の欠点がある。１）不活性化プロセスにより、保護抗原が部分的又は完全に失われ、不安定又は低レベルの免疫応答のみを引き起こし、さらに、正しい免疫反応を刺激することさえできず、副作用を引き起こす可能性がある。２）アエロモナス・ベロニゴーストには、生産量が低く、溶菌遺伝子の毒性があるという欠点がある。３）特異的なアプタマーペプチドのアエロモナス・ベロニワクチンは、それ自体の病原性遺伝子発現が病因となるという欠点を回避することはできない。４）魚類の注射免疫には、作業量が多いという欠点がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、水産養殖動物におけるアエロモナス出血性疾患の予防及び制御のための弱毒生ワクチンを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の発明者は、中国水産科学研究院珠江水産研究所と協力して、その研究所による２００９年から２０１４年の期間における中国南部のコイ科養殖魚類のアエロモナス病の究明分析を参照し、アエロモナス・ベロニ  Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ感染の割合が最も高く（５０％）、アエロモナス・ハイドロフィラ感染は２０．８％に過ぎず、さらに、両方の混合感染が感染全体の１６．７％を占めていることを発見した。研究者らは、浸漬チャレンジの方式で無菌ゼブラフィッシュシステムにおいてこれら２つの種の複数の分離株を測定して、アエロモナス・ベロニの毒性が一般的にアエロモナス・ハイドロフィラの毒性よりも高いことを発見した。さらに、トランスポゾンノックアウトスクリーニングにより、アエロモナス・ベロニＩＩ型分泌システムによって分泌されるアエロリシン（Ａｅｒｏｌｙｓｉｎ）が主要な病原性因子であることが確認された。アエロモナス・ハイドロフィラは、アエロモナス・ベロニとの混合感染及びストレスでバリア損傷を引き起こした場合にのみ感染を確立できる。これは、養殖魚類のアエロモナス敗血症の病気の予防と制御に新しいアイデアを提供し、その病気に対する既存の対策の効果が不明確な状況を変えることが期待される。
【０００６】
本発明は、アエロモナス・ベロニのアエロリシン遺伝子をノックアウトすることによって得られた組換え菌をまず提供する。
【０００７】
前記アエロリシン遺伝子は、アエロリシンタンパク質をコードする遺伝子である。
【０００８】
前記アエロリシンタンパク質は、以下の（１）又は（２）である。
（１）は、配列表の配列６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
（２）は、配列表の配列６で示されるアミノ酸配列が、１つ又は幾つかのアミノ酸残基の置換及び／又は欠損及び／又は付加を受けて、同じ機能を有する、配列６に由来するタンパク質である。
【０００９】
前記アエロリシン遺伝子は、以下の（ａ１）又は（ａ２）又は（ａ３）又は（ａ４）である。
（ａ１）は、配列表の配列５で示されるＤＮＡ分子である。
（ａ２）は、コード領域が配列表の配列５で示されるＤＮＡ分子である。
（ａ３）は、（ａ１）又は（ａ２）により限定されるＤＮＡ配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズし、同じ機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ分子である。
（ａ４）は、（ａ１）又は（ａ２）又は（ａ３）により限定されるＤＮＡ配列と９０％以上の相同性を有し、同じ機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ分子である。
【００１０】
前記ノックアウトは、オープンリーディングフレーム全体をノックアウトするか、又は一部の遺伝子セグメントをノックアウトすることである。
【００１１】
具体的には、前記ノックアウトは、アエロモナス・ベロニゲノムＤＮＡの配列表の配列５を５’末端から第９１〜１３８１番目でノックアウトすることであり得る。
【００１２】
前記ノックアウトは、相同組換えによって実現される。
【００１３】
前記相同組換えは、特異的なＤＮＡ断片をアエロモナス・ベロニに導入することによって実現される。前記特異的なＤＮＡ断片は、アエロリシン遺伝子の上流ホモロジーアーム及び下流ホモロジーアームを含み、前記上流ホモロジーアームは、配列表の配列３の５’末端から第３０９２〜４２７６番目のヌクレオチドで示され、前記下流ホモロジーアームは、配列表の配列３の５’末端から第４２７７〜５４０８番目のヌクレオチドで示される。前記特異的なＤＮＡ断片は、配列表の配列３の５’末端から第３０９２〜５４０８番目のヌクレオチドで示される。
【００１４】
前記相同組換えは、前記特異的なＤＮＡ断片を含む組換えベクターをアエロモナス・ベロニに導入することによって実現される。前記組換えベクターは、線状化プラスミドベクター、断片Ａ及び断片Ｂを連結することによって得られる。前記断片Ａは、配列表の配列１で示される。前記断片Ｂは、配列表の配列２で示される。前記連結は、シームレスクローニングによって実現される。前記プラスミドベクターはプラスミドｐＲＥ１１２である。具体的には、前記組換えベクターは、配列表の配列３で示される。
【００１５】
本発明は組換え菌を更に保護する。その組換え菌は、特異的なＤＮＡ断片をアエロモナス・ベロニに導入し相同組換えを行った後に得られた前記特異的なＤＮＡ断片を有する組換え菌である。前記特異的なＤＮＡ断片は、アエロリシン遺伝子の上流ホモロジーアーム及び下流ホモロジーアームを含み、前記上流ホモロジーアームは、配列表の配列３の５’末端から第３０９２〜４２７６番目のヌクレオチドで示され、前記下流ホモロジーアームは、配列表の配列３の５’末端から第４２７７〜５４０８番目のヌクレオチドで示される。
【００１６】
前記相同組換えは、前記特異的なＤＮＡ断片を含む組換えベクターをアエロモナス・ベロニに導入することによって実現される。前記組換えベクターは、線状化プラスミドベクター、断片Ａ及び断片Ｂを連結することによって得られる。前記断片Ａは、配列表の配列１で示される。前記断片Ｂは、配列表の配列２で示される。前記連結は、シームレスクローニングによって実現される。前記プラスミドベクターはプラスミドｐＲＥ１１２である。具体的には、前記組換えベクターは、配列表の配列３で示される。
【００１７】
上記いずれかのアエロモナス・ベロニは、具体的にはアエロモナス・ベロニ  Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１であってもよい。
【００１８】
上記いずれかの組換え菌は、具体的にはアエロモナス・ベロニ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｖｅｒｏｎｉｉ）Ｈｍ０９１△ａｅｒであってもよい。
【００１９】
アエロモナス・ベロニ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｖｅｒｏｎｉｉ）Ｈｍ０９１△ａｅｒは、２０１７年１０月０９日に中国微生物菌種寄託管理委員会普通微生物センター（略称ＣＧＭＣＣ；住所：北京市朝陽区北辰西路１号院３号、中国科学院微生物研究所；郵便番号１００１０１）に、寄託番号ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．１４７７６で寄託された。
【００２０】
本発明は、ワクチンを調製するための上記いずれかの組換え菌の用途をさらに保護する。前記ワクチンは、以下の（ｂ１）〜（ｂ４）のいずれかである。
（ｂ１）水産動物アエロモナス・ベロニワクチン、
（ｂ２）水産動物アエロモナス・ハイドロフィラワクチン、
（ｂ３）水産動物アエロモナスワクチン、
（ｂ４）水産動物出血性疾患ワクチン
【００２１】
本発明は、ワクチンを調製する方法をさらに保護する。この方法は、上記いずれかの組換え菌をワクチンの活性成分として包装するステップを含む。前記ワクチンは、以下の（ｂ１）〜（ｂ４）のいずれかである。
（ｂ１）水産動物アエロモナス・ベロニワクチン、
（ｂ２）水産動物アエロモナス・ハイドロフィラワクチン、
（ｂ３）水産動物アエロモナスワクチン、
（ｂ４）水産動物出血性疾患ワクチン
【００２２】
本発明は、製品を調製するための上記いずれかの組換え菌の用途をさらに保護する。前記製品の用途は以下の（ｃ１）〜（ｃ５）の少なくとも１つである。
（ｃ１）水産動物アエロモナス・ベロニ感染の予防及び／又は治療、
（ｃ２）水産動物アエロモナス・ハイドロフィラ感染の予防及び／又は治療、
（ｃ３）水産動物アエロモナス感染の予防及び／又は治療、
（ｃ４）水産動物出血性疾患の感染の予防及び／又は治療、
（ｃ５）水産動物の免疫力の改善
【００２３】
本発明は、活性成分が上記いずれかの組換え菌である水産動物アエロモナス・ベロニワクチンをさらに保護する。本発明は、活性成分が上記いずれかの組換え菌である水産動物アエロモナス・ハイドロフィラワクチンをさらに保護する。
【００２４】
本発明は、活性成分が上記いずれかの組換え菌である水産動物アエロモナスワクチンをさらに保護する。
【００２５】
本発明は、活性成分が上記いずれかの組換え菌である水産動物出血性疾患ワクチンをさらに保護する。
【００２６】
本発明は、活性成分が上記いずれかの組換え菌である製品をさらに保護する。前記製品の用途は以下の（ｄ１）〜（ｄ５）の少なくとも１つである。
（ｄ１）水産動物アエロモナス・ベロニ感染の予防及び／又は治療、
（ｄ２）水産動物アエロモナス・ハイドロフィラ感染の予防及び／又は治療、
（ｄ３）水産動物アエロモナス感染の予防及び／又は治療、
（ｄ４）水産動物出血性疾患の感染の予防及び／又は治療、
（ｄ５）水産動物の免疫力の改善
【００２７】
本発明はまた、上記組換え菌のいずれか１つの用途を保護する。用途は、以下の（ｆ１）〜（ｆ５）のうちの少なくとも１つである。
（ｆ１）水産動物アエロモナス・ベロニ感染の予防及び／又は治療、
（ｆ２）水産動物アエロモナス・ハイドロフィラ感染の予防及び／又は治療、
（ｆ３）水産動物アエロモナス感染の予防及び／又は治療、
（ｆ４）水産動物出血性疾患の感染の予防及び／又は治療、
（ｆ５）水産動物の免疫力の改善
【００２８】
上記ワクチンのいずれかの使用方法は、具体的には、経口又は浸漬であってもよい。
【００２９】
上記製品のいずれかは、具体的には、水産動物飼料添加物であってもよい。
【００３０】
上記アエロモナスのいずれかは、具体的には、アエロモナス・ベロニ又はアエロモナス・ハイドロフィラであってもよい。
【００３１】
上記アエロモナス・ベロニのいずれかは、具体的には、アエロモナス・ベロニ  Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１であってもよい。
【００３２】
上記アエロモナス・ハイドロフィラのいずれかは、具体的には、アエロモナス・ハイドロフィラ  Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ  ＮＪ−１であってもよい。
【００３３】
上記水産動物のいずれかは、具体的には、ゼブラフィッシュ、草魚、フナ、レンギョ、ハクレン、ケツギョ、鯉、アオウオ、ティラピア、ウナギ、ゲンゴロウブナ、ギンブナ、チョウザメ、
0006971378.tif 000002
、ヒラウオ、アメリカナマズ、金魚、タウナギ、ヒラメなどの魚類、又は蛙、サンショウウオ、蝦、蟹、スッポン、亀などの水生動物であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】実施例１のノックアウトプラスミドの構築プロセスの模式図である。
【図２】実施例１のノックアウト菌の同定結果である。
【図３】実施例２の蛍光局在化の結果である。
【図４】実施例３の安全性試験の結果である。
【図５】実施例４の免疫保護效果の統計結果である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
以下の実施例は、本発明のさらなる理解を促進するためのものであり、本発明を限定しない。以下の実施例における実験方法は、特に説明しない限り従来の方法である。以下の実施例で使用される試験材料は、特に説明しない限り、従来の生化学試薬店から購入したものである。以下の実施例の定量試験では、いずれも３回の反復実験を設定し、結果として平均値を求めた。
【００３６】
アエロモナス・ベロニアエロリシン遺伝子のゲノムＤＮＡ参照配列は、配列表の配列５で示される。配列５で示されるＤＮＡは、配列６で示されるタンパク質をコードする。
【００３７】
プラスミドｐＲＥ１１２：ＢｉｏＶｅｃｔｏｒプラスミドベクター菌種細胞遺伝子寄託センター、カタログ番号：３５７３４１０
【００３８】
アエロモナス・ベロニ  Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１：参考文献：張徳鋒、劉礼輝、李寧求など．我国南方地区魚源アエロモナスの異なる種類の疫学的特徴［Ｊ］．水産科学，２０１５，３４（１１）：６７３−６８２．；公衆は、中国農業科学院飼料研究所からそれを入手することができる。
【００３９】
アエロモナス・ハイドロフィラ  Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ  ＮＪ−１：参考文献：Ｌｉ  Ｊ，Ｎｉ  Ｘ  Ｄ，Ｌｉｕ  Ｙ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｇｅｎｅｓ  ａｌｔ，  ａｈｐ  ａｎｄ  ａｅｒＡ  ｉｎ  Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｗｉｔｈ  ａｃｔｕａｌ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｔｏ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ［Ｊ］．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１１，１１０（３）：８２３−３０．；公衆は、中国農業科学院飼料研究所からそれを入手することができる。
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＣ１０６１：ＢｉｏＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＣＣ典型培養物寄託センター、番号：ＭＣ１０６１
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｓ１７−１（λ  ｐａｉｒ）：ＢｉｏＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＣＣ典型培養物寄託センター、番号：ｓ１７−１
【００４０】
ＭＣ１０６１コンピテント細胞：Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＣ１０６１シングルコロニーを５０ｍｌのＬＢ液体培地に接種し、３７℃、２００ｒｐｍで一晩培養し、５００ｍｌのＬＢ液体培地を含む１Ｌのコニカルフラスコに５％の接種量で接種し、３７℃、２５０ｒｐｍで培養した。ＯＤ６００ｎｍ値が０．３５〜０．４となる場合、コニカルフラスコを１５〜３０分間氷浴した（期間中、コニカルフラスコを揺動して菌液を均一に冷却した）。その後、菌液を、氷浴で予冷した遠心管に移し、１０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、上清を廃棄し、５００ｍｌの氷浴で予冷した脱イオン水に菌体を再懸濁し、１０００ｇ、４℃で２０分間遠心分離し、上清を除去し、菌体を収集し、２５０ｍｌの氷浴で予冷した１０％（前述の百分率）グリセロール水溶液に再懸濁し、１０００ｇ、４℃で２０分間遠心分離し、上清を除去し、１ｍｌの氷浴で予冷したＧＹＴ液体培地に菌体を再懸濁した。菌液を、氷浴で予冷した１．５ｍｌの滅菌ＥＰ管に、管あたり５０μｌで分注し、液体窒素で急速冷却した後、−８０℃の冷蔵庫に保存した。
【００４１】
Ｓ１７（λ）コンピテント細胞：Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｓ１７−１（λ  ｐａｉｒ）シングルコロニーを５０ｍｌのＬＢ液体培地に接種し、３７℃、２００ｒｐｍで一晩培養し、５００ｍｌのＬＢ液体培地を含む１Ｌのコニカルフラスコに５％の接種量で接種し、３７℃、２５０ｒｐｍで培養した。ＯＤ６００ｎｍ値が０．３５〜０．４となる場合、コニカルフラスコを１５〜３０分間氷浴した（期間中、コニカルフラスコを揺動して菌液を均一に冷却した）。その後、菌液を、氷浴で予冷した遠心管に移し、１０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、上清を廃棄し、５００ｍｌの氷浴で予冷した脱イオン水に菌体を再懸濁し、１０００ｇ、４℃で２０分間遠心分離し、上清を除去し、菌体を収集し、２５０ｍｌの氷浴で予冷した１０％（前述の百分率）グリセロール水溶液に再懸濁し、１０００ｇ、４℃で２０分間遠心分離し、上清を除去し、１ｍｌの氷浴で予冷したＧＹＴ液体培地に菌体を再懸濁した。菌液を、氷浴で予冷した１．５ｍｌの滅菌ＥＰ管に、管あたり５０μｌで分注し、液体窒素で急速冷却した後、−８０℃の冷蔵庫に保存した。
【００４２】
ゼブラフィッシュ：北京大学ゼブラフィッシュ水体実験室が提供したＴｕ系統ゼブラフィッシュ
【００４３】
＜実施例１＞アエロモナス・ベロニノックアウト菌の構築
一、ノックアウトプラスミドの構築
ノックアウトプラスミドの構築プロセスの模式図を図１に示す。具体的なステップは次のとおりである。
１、ＰＣＲ法（反応手順：９８℃、５分、３２×［９８℃、２０秒；５８℃、２０秒；７２℃、１分］、７２℃、５分）によってプラスミドｐＲＥ１１２を線状化して、線状化プラスミド断片を得た。
【００４４】
２、アエロモナス・ベロニ  Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、プライマーＡｅｒ−ｕｐ−Ｆ及びプライマーＡｅｒ−ｕｐ−Ｒからなるプライマーペアを採用してＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲ増幅産物（配列表の配列１、上流ホモロジーアームを有する）を得た。
Ａｅｒ−ｕｐ−Ｆ：５’−ＴＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＡＧＡＡＴＧＡＴＣＴＣＧＧＣＧＧＴＡＣＣＴＧＧ−３’；
Ａｅｒ−ｕｐ−Ｒ：５’−ＧＡＴＣＣＡＣＡＣＣＧＧＴＡＡＡＴＣＡＧＧＧＴＡＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧ−３’。
【００４５】
３、アエロモナス・ベロニ  Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、プライマーＡｅｒ−ｄｏｗｎ−Ｆ及びプライマーＡｅｒ−ｄｏｗｎ−Ｒからなるプライマーペアを採用してＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲ増幅産物（配列表の配列２、下流ホモロジーアームを有する）を得た。
Ａｅｒ−ｄｏｗｎ−Ｆ：５’−ＣＣＴＧＴＣＴＡＣＣＣＴＧＡＴＴＴＡＣＣＧＧＴＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＡＣ−３’；
Ａｅｒ−ｄｏｗｎ−Ｒ：５’−ＧＣＴＴＣＴＴＣＴＡＧＡＧＧＴＴＧＡＧＴＧＡＡＧＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧ−３’。
【００４６】
４、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒR  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＮＥＢ、カタログ番号：Ｅ２６２１Ｌ）を用いて、ステップ１で得られた線状化プラスミド、ステップ２で得られたＰＣＲ増幅産物及びステップ３で得られたＰＣＲ増幅産物を相同組換えして連結し（方法はキットの説明書を参照）、ノックアウトプラスミド（配列表の配列３で示される環状プラスミド、配列決定によって検証された）を得た。
【００４７】
二、ノックアウト菌の構築及び同定
１、ステップ１で得られたノックアウトプラスミドで、ＭＣ１０６１コンピテント細胞を形質転換し、２５ｕＦ、２．５ｋＶ、２００ｏｈｍで電気形質転換を行った。電気形質転換の直後に、１ｍｌのＬＢ液体培地を加え、３７℃、２００ｒ／ｍｉｎで１〜１．５時間シェーカーで培養した後、遠心分離し、９００μｌを除去し、１００μｌを残し再懸濁し、その後すべてを３０ｕｇ／ｍｌのクロロマイセチン（Ｃｍ）を含むＬＢ固体プレート上に塗布し、３７℃で一晩培養した。一晩後に増殖したシングルコロニーについて、コロニーＰＣＲ検出により陽性コロニーをスクリーニングした（プライマーＡｅｒ−ｕｐ−Ｆ及びプライマーＡｅｒ−ｕｐ−Ｒを用いてＰＣＲ検出を行い、サイズが２３４８ｂｐのバンドを得た）。
【００４８】
２、ステップ１で陽性と同定したシングルコロニーを、３０ｕｇ／ｍｌのクロロマイセチン（Ｃｍ）を含む３０ｍｌのＬＢ液体培地に接種し、３７℃、２００ｒ／ｍｉｎで１２時間シェーカーで培養し、シングルコロニーを選び取りプラスミドを抽出し、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ制限酵素により酵素切断で同定し、サイズが８０２９ｂｐのバンドの陽性プラスミドを得た。
【００４９】
３、ステップ２で正しいと同定した陽性プラスミドで、Ｓ１７（λ）コンピテント細胞を形質転換し、２５ｕＦ、２．５ｋＶ、２００ｏｈｍで電気形質転換を行った。電気形質転換の直後に、１ｍｌのＬＢ液体培地を加え、３７℃、２００ｒ／ｍｉｎで１〜１．５時間シェーカーで培養した後、遠心分離し、９００μｌを除去し、１００μｌを残し再懸濁し、その後すべてを３０ｕｇ／ｍｌのクロロマイセチン（Ｃｍ）を含むＬＢ固体プレート上に塗布し、３７℃で一晩培養した。一晩後に増殖したシングルコロニーについて、コロニーＰＣＲ検出により陽性コロニーをスクリーニングした（プライマーＡｅｒ−ｕｐ−Ｆ及びプライマーＡｅｒ−ｕｐ−Ｒを用いてＰＣＲ検出を行い、サイズが２３４８ｂｐのバンドを得た）。
【００５０】
４、ステップ３で陽性と同定したシングルコロニーを、接種ループにより３０ｕｇ／ｍｌのクロロマイセチン（Ｃｍ）を含むＬＢ固体プレート上に再画線し、３７℃で２４時間培養した。
【００５１】
５、アエロモナス・ベロニ  Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１を、３０ｕｇ／ｍｌのクロロマイセチン（Ｃｍ）を含むＬＢ固体プレート上に画線して接種し、３７℃で２４時間培養した。
【００５２】
６、ステップ４で得られたコロニー及びステップ５で得られたコロニーをそれぞれ掻き取って結合し（ステップ４で得られたコロニーを掻き取って、ステップ５のプレート上に画線し）、３７℃で８時間結合した。
【００５３】
７、ステップ６の完了後に、コロニーを掻き取って、ＬＢ液体培地で希釈してから、３０μｇ／ｍｌのクロロマイセチン（Ｃｍ）＋１００μｇ／ｍｌのアンピシリン（Ａｍｐ）を含むＬＢ固体プレート上に塗布し、３７℃で２４時間培養した。
【００５４】
８、ステップ７の完了後に、シングルコロニーを選び取り、３０μｇ／ｍｌのクロロマイセチン（Ｃｍ）＋１００μｇ／ｍｌのアンピシリン（Ａｍｐ）を含むＬＢ固体プレート上に接種し、３７℃で２４時間培養した。
【００５５】
９、ステップ８の完了後に、シングルコロニーを選び取り、抗生物質を含まないＬＢ固体プレート上に接種し、３７℃で２４時間培養した。
【００５６】
１０、ステップ９の完了後に、適量のコロニーを接種ループで掻き取って、１５％（質量パーセント）のスクロースを含むＬＢ固体プレート上に画線し、１５〜２５℃で３日間低温培養し、プラスミド喪失株をスクリーニングした。
【００５７】
１１、ステップ１０の完了後に、５０〜８０個のモノクローナルを選び取って、３０μｇ／ｍｌのクロロマイセチン（Ｃｍ）＋１００μｇ／ｍｌのアンピシリン（Ａｍｐ）を含むＬＢ固体プレート上にそれぞれ画線し、３７℃で２４時間培養した。
【００５８】
１２、ステップ１１の完了後に、シングルコロニーを選び取り、コロニーＰＣＲ検出によりノックアウト変異株をスクリーニングした。
【００５９】
アエロモナス・ベロニ  Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１（ＷＴ）を対照として採用した。プライマーＡｅｒ−ｕｐ−ＦとプライマーＡｅｒ−ｄｏｗｎ−Ｒからなるプライマーペア、及びプライマーＡｅｒ−ｃｏｎｆｉｒｍ−ＦとプライマーＡｅｒ−ｃｏｎｆｉｒｍ−Ｒからなるプライマーペアをそれぞれ採用して同定を行った。プライマー配列と予想される産物断片の長さを表１に示す。
【００６０】
0006971378.tif 000003
【００６１】
結果を図２に示す。プライマーＡｅｒ−ｃｏｎｆｉｒｍ−Ｆ及びプライマーＡｅｒ−ｃｏｎｆｉｒｍ−Ｒは、Ａｅｒ遺伝子に関して設計されたプライマーである。野生型菌（ＷＴ）は目的断片１７２２ｂｐまで増幅し、ノックアウト菌（Ｈｍ０９１△ａｅｒ）は目的断片に増幅しなかった。プライマーＡｅｒ−ｕｐ−Ｆ及びプライマーＡｅｒ−ｄｏｗｎ−Ｒは、Ａｅｒ遺伝子の上流配列及び下流配列に関して設計されたプライマーである。野生型菌（ＷＴ）の増幅断片の配列は約４０００ｂｐであり、ノックアウト菌（Ｈｍ０９１△ａｅｒ）の増幅断片の配列は約２３００ｂｐであり、ちょうど野生型菌よりもＡｅｒ遺伝子断片のサイズ（約１７００ｂｐ）少ない。
【００６２】
野生型菌及びノックアウト菌を配列決定した。その結果、ノックアウト菌は、配列表の配列４で示されるＤＮＡ断片に野生型菌ゲノムアエロリシン遺伝子の対応する断片を置換して得られたものであることが明らかになった。
【００６３】
上記方法で得られたすべてのノックアウト菌の一株はアエロモナス・ベロニ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｖｅｒｏｎｉｉ）Ｈｍ０９１△ａｅｒと命名され、アエロモナス・ベロニ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｖｅｒｏｎｉｉ）Ｈｍ０９１△ａｅｒはアエロモナス・ベロニ  Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１△ａｅｒと略称された。そのうちの一株が寄託されている。
【００６４】
三、アエロモナス・ベロニ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｖｅｒｏｎｉｉ）Ｈｍ０９１△ａｅｒの寄託
アエロモナス・ベロニ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｖｅｒｏｎｉｉ）Ｈｍ０９１△ａｅｒは、２０１７年１０月０９日に中国微生物菌種寄託管理委員会普通微生物センター（略称ＣＧＭＣＣ；住所：北京市朝陽区北辰西路１号院３号、中国科学院微生物研究所；郵便番号１００１０１）に、寄託番号ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．１４７７６で寄託された。
【００６５】
＜実施例２＞ゼブラフィッシュにおけるアエロモナス・ベロニ  Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１△ａｅｒの局在
１、アエロモナス・ベロニ  Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１を３０ｍｌのＬＢ液体培地に接種し、３７℃、２００ｒ／ｍｉｎで１８時間シェーカーで培養した。２ｍｌの菌液を取り、５０００ｒ／ｍｉｍで１０分間遠心分離し、上清を除去し、ＰＢＳで２回洗浄し、遠心分離で上清を除去し、１ｍｌの０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液を加えて菌体を再懸濁し、Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１炭酸水素ナトリウム緩衝液を得た。
【００６６】
２、アエロモナス・ハイドロフィラ  Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ  ＮＪ−１を３０ｍｌのＬＢ液体培地に接種し、３７℃、２００  ｒ／ｍｉｎで１８時間シェーカーで培養した。２ｍｌの菌液を取り、５０００ｒ／ｍｉｍで１０分間遠心分離し、上清を除去し、ＰＢＳで２回洗浄し、遠心分離で上清を除去し、１ｍｌの０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液を加えて菌体を再懸濁し、Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ  ＮＪ−１炭酸水素ナトリウム緩衝液を得た。
【００６７】
３、アエロモナス・ベロニ  Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１△ａｅｒを３０ｍｌのＬＢ液体培地に接種し、３７℃、２００ｒ／ｍｉｎで１８時間シェーカーで培養した。２ｍｌの菌液を取り、５０００ｒ／ｍｉｍで１０分間遠心分離し、上清を除去し、ＰＢＳで２回洗浄し、遠心分離で上清を除去し、１ｍｌの０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液を加えて菌体を再懸濁し、Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１△ａｅｒ炭酸水素ナトリウム緩衝液を得た。
【００６８】
４、赤色蛍光染料（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）−Ｘ）（サーモフィッシャーサイエンティフィックＴ７４７１）をＤＭＳＯに１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解して、赤色蛍光染料溶液を得た。青色蛍光染料（Ｐａｃｉｆｉｃ  ＢｌｕｅＴＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｐ１０１６３）をＤＭＳＯに１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解して、青色蛍光染料溶液を得た。
【００６９】
５、ステップ４で得られた赤色蛍光染料溶液を５０μｌ取り、ステップ２で得られたＡ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ  ＮＪ−１炭酸水素ナトリウム緩衝液に加え、室温遮光で軽く揺動しながら１．５時間インキュベートした後、遠心分離し上清を取り、ＰＢＳで２回洗浄し、遠心分離し上清を除去し、最後に１ｍｌのＰＢＳで再懸濁して、Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ  ＮＪ−１赤色蛍光標識溶液を得た。
【００７０】
６、ステップ４で得られた赤色蛍光染料溶液を５０μｌ取り、ステップ１で得られたＡ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１炭酸水素ナトリウム緩衝液に加え、室温遮光で軽く揺動しながら１．５時間インキュベートした後、遠心分離し上清を取り、ＰＢＳで２回洗浄し、遠心分離し上清を除去し、最後に１ｍｌのＰＢＳで再懸濁して、Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１赤色蛍光標識溶液を得た。
【００７１】
７、ステップ４で得られた青色蛍光染料溶液を５０μｌ取り、ステップ１で得られたＡ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１炭酸水素ナトリウム緩衝液に加え、室温遮光で軽く揺動しながら１．５時間インキュベートした後、遠心分離し上清を取り、ＰＢＳで２回洗浄し、遠心分離し上清を除去し、最後に１ｍｌのＰＢＳで再懸濁して、Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１青色蛍光標識溶液を得た。
【００７２】
８、ステップ４で得られた赤色蛍光染料溶液を５０μｌ取り、ステップ３で得られたＡ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１△ａｅｒ炭酸水素ナトリウム緩衝液に加え、室温遮光で軽く揺動しながら１．５時間インキュベートした後、遠心分離し上清を取り、ＰＢＳで２回洗浄し、遠心分離し上清を除去し、最後に１ｍｌのＰＢＳで再懸濁して、Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１△ａｅｒ赤色蛍光標識溶液を得た。
【００７３】
９、エロモナス・ハイドロフィラＡ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ  ＮＪ−１を３０  ｍｌのＬＢ液体培地に接種し、３７℃、２００  ｒ／ｍｉｎで１８時間シェーカーで培養した。２ｍｌの菌液を取り、５０００ｒ／ｍｉｍで１０分間遠心分離し、上清を除去し、ＰＢＳで２回洗浄し、遠心分離で上清を除去し、ＰＢＳを加えて菌体を再懸濁し、Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ  ＮＪ−１溶液を得た。
【００７４】
１０、エロモナス・ベロニＡ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１△ａｅｒを３０ｍｌのＬＢ液体培地に接種し、３７℃、２００ｒ／ｍｉｎで１８時間シェーカーで培養した。２ｍｌの菌液を取り、５０００ｒ／ｍｉｍで１０分間遠心分離し、上清を除去し、ＰＢＳで２回洗浄し、遠心分離で上清を除去し、ＰＢＳを加えて菌体を再懸濁し、Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１△ａｅｒ溶液を得た。
【００７５】
１１、孵化後２日目のゼブラフィッシュを、次の５つの群にランダムに分けた（魚の各群を６ウェルプレートに入れ、ウェルあたり１０ｍｌの水、１５匹の魚）。
群Ａ（対照群）：ＰＢＳにゼブラフィッシュを感染させた。
群Ｂ（Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ  ＮＪ−１赤色蛍光標識感染群）：Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ  ＮＪ−１赤色蛍光標識溶液にゼブラフィッシュを感染させ、感染ウェル内のＡ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ  ＮＪ−１の濃度は４×１０７ＣＦＵ／ｍｌであった。
群Ｃ（Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１赤色蛍光標識感染群）：Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１赤色蛍光標識溶液にゼブラフィッシュを感染させ、感染ウェル内のＡ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１の濃度は４×１０７ＣＦＵ／ｍｌであった。
群Ｄ（Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ  ＮＪ−１赤色蛍光標識＋無標識Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１感染群）：Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ  ＮＪ−１赤色蛍光標識溶液及びＡ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１溶液にゼブラフィッシュを感染させ、感染ウェル内のＡ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ  ＮＪ−１の濃度は４×１０７ＣＦＵ／ｍｌであり、感染ウェル内のＡ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１の濃度は４×１０７ＣＦＵ／ｍｌであった。
群Ｅ（Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ  ＮＪ−１赤色蛍光標識＋Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１青色蛍光標識）：Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ  ＮＪ−１赤色蛍光標識溶液及びＡ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１青色蛍光標識液にゼブラフィッシュを感染させ、感染ウェル内のＡ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ  ＮＪ−１の濃度は４×１０７ＣＦＵ／ｍｌであり、感染ウェル内のＡ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１の濃度は４×１０７ＣＦＵ／ｍｌであった。
群Ｆ（Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１△ａｅｒ赤色蛍光標識感染群）：Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１△ａｅｒ赤色蛍光標識溶液にゼブラフィッシュを感染させ、感染ウェル内のＡ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１△ａｅｒの濃度は４×１０７ＣＦＵ／ｍｌであった。
群Ｇ（Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ  ＮＪ−１赤色蛍光標識＋無標識Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１△ａｅｒ感染群）：Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ  ＮＪ−１赤色蛍光標識溶液及びＡ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１△ａｅｒ溶液にゼブラフィッシュを感染させ、感染ウェル内のＡ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ  ＮＪ−１の濃度は４×１０７ＣＦＵ／ｍｌであり、感染ウェル内のＡ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１△ａｅｒの濃度は４×１０７ＣＦＵ／ｍｌであった。
【００７６】
上記各群を４時間感染させた後に、４％のパラホルムアルデヒドで稚魚をそれぞれ固定した。固定された稚魚をレーザー共焦点顕微鏡で撮影して、ゼブラフィッシュの細菌の局在を観察した。
【００７７】
結果を図３に示す。対照群のゼブラフィッシュ稚魚では、蛍光信号（Ａ）は観察されなかった。赤色蛍光標識のアエロモナス・ハイドロフィラＡ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ  ＮＪ−１感染群（Ｂ）、赤色蛍光標識のアエロモナス・ベロニ  Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１△ａｅｒ感染群（Ｆ）、赤色蛍光標識のアエロモナス・ハイドロフィラＡ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ  ＮＪ−１＋アエロモナス・ベロニ  Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１△ａｅｒ感染群（Ｇ）では、ゼブラフィッシュ稚魚の腸管内で赤色蛍光信号を観察することができるが、腸腔内に限られる。しかしながら、赤色蛍光標識又は青色蛍光標識のアエロモナス・ベロニ  Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１感染群では、ゼブラフィッシュの腸管内で強い蛍光信号を観察することができるだけでなく、腸管の周囲及び頭部で蛍光信号を検出することもできる（Ｃ及びＥ）。興味深いことに、赤色蛍光標識のアエロモナス・ハイドロフィラＮＪ−１＋有／無青色蛍光標識のアエロモナス・ベロニ  Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１感染群では、同様に、ＮＪ−１の蛍光信号は、ゼブラフィッシュの腸管の周囲及び頭部で検出することができる（Ｄ及びＥ）。これらのデータは、アエロモナス・ベロニによって分泌されたアエロリシンがゼブラフィッシュの腸管バリアを破壊することができ、それ自体及び他のアエロモナス、特にアエロモナス・ハイドロフィラが魚の体内に入り、魚の溶血及び死亡をもたらすことを示す。一方、アエロモナス・ベロニ  Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１△ａｅｒは、ゼブラフィッシュの腸管バリアを破壊する能力を持っていない。
【００７８】
＜実施例３＞アエロモナス・ベロニ  Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１△ａｅｒワクチンの安全性
１、アエロモナス・ベロニ  Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１をＬＢ固体培地に接種し、３７℃で１２時間培養し、その後モノクローナルを選び取って、３０ｍｌのＬＢ液体培地に接種し、３７℃、２００ｒ／ｍｉｎで１８時間シェーカーで培養した。
【００７９】
２、アエロモナス・ベロニ  Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１△ａｅｒをＬＢ固体培地に接種し、３７℃で１２時間培養し、その後モノクローナルを選び取って、３０ｍｌのＬＢ液体培地に接種し、３７℃、２００ｒ／ｍｉｎで１８時間シェーカーで培養した。
【００８０】
３、ステップ１及びステップ２で培養されたアエロモナス・ベロニ  Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１及びアエロモナス・ベロニ  Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１△ａｅｒをそれぞれ異なる濃度（２．５×１０８ＣＦＵ／ｍｌ、１．０×１０８ＣＦＵ／ｍｌ、５．０×１０７ＣＦＵ／ｍｌ、３．３３×１０７ＣＦＵ／ｍｌ、２．５×１０７ＣＦＵ／ｍｌ及び１．６７×１０７ＣＦＵ／ｍｌ）で、孵化後５日目のゼブラフィッシュ（浸漬）に感染させて、９６時間以内のゼブラフィッシュの死亡状況を統計した。
【００８１】
結果を図４に示す。図４では、図４Ａは３．３×１０７ＣＦＵ／ｍｌの浸漬濃度での生存時間統計結果であり、図４Ｂは２．５×１０７ＣＦＵ／ｍｌの浸漬濃度での生存時間統計結果であり、図４Ｃは１．６７×１０７ＣＦＵ／ｍｌの浸漬濃度での生存時間統計結果である。その結果、次のことが明らかになった。
アエロモナス・ベロニ  Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１△ａｅｒがそれぞれ３．３×１０７ＣＦＵ／ｍｌ、２．５×１０７ＣＦＵ／ｍｌ、１．６７×１０７ＣＦＵ／ｍｌの浸漬濃度では、ゼブラフィッシュは死亡しなかったが、野生型株による感染後２４時間以内にゼブラフィッシュは１００％死亡する可能性がある。その結果、Ａｅｒをノックアウトすると、アエロモナス・ベロニの毒性は著しく低下し、アエロモナス・ベロニ  Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１△ａｅｒの感染濃度≦３．３×１０７ＣＦＵ／ｍｌの浸漬は安全であることが明らかになった。
【００８２】
実施例４、アエロモナス・ベロニ  Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１△ａｅｒワクチン保護の研究
一、ゼブラフィッシュの血清免疫グロブリン含有量に対するアエロモナス・ベロニ  Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１△ａｅｒワクチンの影響
生後３ヶ月のゼブラフィッシュを次の３つの群にランダムに分けた。
群１（対照群）：ゼブラフィッシュを２週間正常に飼育し、基礎飼料を１日２回飽食給餌した。
群２（給餌免疫群）：ゼブラフィッシュを２週間正常に飼育し、アエロモナス・ベロニ  Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１△ａｅｒ（２×１０７ＣＦＵ／ｇ）を含む基礎飼料を１日２回飽食給餌した。
群３（浸漬免疫群）：ゼブラフィッシュを２週間正常に飼育し、アエロモナス・ベロニ  Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１△ａｅｒ含有の水に週に１回浸漬し（２×１０７ＣＦＵ／ｍｌ、浸漬時間は１２時間）、基礎飼料を１日２回飽食給餌した。
【００８３】
各群の処理後、各群のゼブラフィッシュを尾静脈から採血し、魚ＩＧＭキット（南京建成生物工程研究所から購入）の説明書に従ってゼブラフィッシュ免疫グロブリンの指標を検出した。
【００８４】
キットの方法に従ってロジスティック曲線を測定し、免疫グロブリン方程式ｙ＝（Ａ−Ｄ）／［１＋（ｘ／Ｃ）Ｂ］＋Ｄ（Ａ＝５．６１３７８；Ｂ＝０．３６２１７；Ｃ＝０．１４１４７；Ｄ＝−０．１２１７６；ｒ２＝０．９９３９４）を得た。３つの群のゼブラフィッシュの免疫グロブリン濃度の平均値は次のように測定された。対照群：７．３０４１７５ｎｇ／ｍｌ；給餌免疫群：１３．６４６９４５ｎｇ／ｍｌ；浸漬免疫群：１６．００４６６ｎｇ／ｍｌ。その結果、ワクチンで免疫された後にゼブラフィッシュの血清免疫グロブリン含有量はある程度増加したことが明らかになった。
【００８５】
二、アエロモナス・ベロニ  Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１△ａｅｒワクチンゼブラフィッシュの血清抗体の凝集力価
【００８６】
生後３ヶ月のゼブラフィッシュを次の３つの群にランダムに分けた。
群１（対照群）：ゼブラフィッシュを２週間正常に飼育し、基礎飼料を１日２回飽食給餌した。
群２（給餌免疫群）：ゼブラフィッシュを２週間正常に飼育し、アエロモナス・ベロニ  Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１△ａｅｒ（２×１０７ＣＦＵ／ｇ）を含む基礎飼料を１日２回飽食給餌した。
群３（浸漬免疫群）：ゼブラフィッシュを２週間正常に飼育し、アエロモナス・ベロニ  Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１△ａｅｒ含有の水に週に１回浸漬し（４×１０７ＣＦＵ／Ｌ、浸漬時間は１２時間）、基礎飼料を１日２回飽食給餌した。
【００８７】
各群の処理後、各群のゼブラフィッシュを尾静脈から採血し、血清を取って血清抗体価を測定した。９６ウェル血凝集板法を使用した。アエロモナス・ベロニ  Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１培養液を１２０００ｒｐｍで遠心分離した後、等量の生理食塩水に再懸濁し、菌懸濁液（濃度は４×１０７ＣＦＵ／ｍｌ）を得た。マイクロピペットで生理食塩水を第１ウェルに８０μｌ加え、残りの各ウェルに５０μｌ加えた。測定する血清を第１ウェルに２０μｌ加え、ピペッティングにより均一に混合した後５０μｌ取り出して第２ウェルに加え（１：２希釈）、再度均一に混合した後第２ウェルから５０μｌ取り出して第３ウェルに加え（１：４希釈）、このように第９ウェル（１：２５６希釈）まで操作して、５０μｌ廃棄した。第１０ウェルは対照として使用した。各ウェルに５０μｌのアエロモナス・ベロニ懸濁液を加え、ピペッティングにより均一に混合し、３７℃のインキュベーターで１時間インキュベートし、４℃の条件下で一晩静置し検出した。
【００８８】
実験は２回繰り返した（第１群と第２群）。結果を表２に示す。アエロモナス・ベロニ  Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１△ａｅｒワクチンは、給餌と浸漬の２つの方式により成体ゼブラフィッシュを免疫化した。対照群、給餌群及び浸漬群の血清抗体凝集力価はそれぞれ２３〜２４、２４〜２５及び２４であった。給餌群の血清抗体レベルは、対照群の血清抗体レベルよりもわずかに高かった。
【００８９】
0006971378.tif 000004
【００９０】
三、浸漬及び経口のアエロモナス・ベロニ  Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１△ａｅｒワクチンによるゼブラフィッシュの相対的免疫保護率
群１（対照群、ＣＫ）：ゼブラフィッシュを２週間正常に飼育し、基礎飼料を１日２回飽食給餌した。
群２（給餌免疫群、Ｔ１）：ゼブラフィッシュを２週間正常に飼育し、アエロモナス・ベロニ  Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１△ａｅｒ（２×１０７ＣＦＵ／ｇ）を含む基礎飼料を１日２回飽食給餌した。
群３（浸漬免疫群、Ｔ２）：ゼブラフィッシュを２週間正常に飼育し、アエロモナス・ベロニ  Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１△ａｅｒ含有の水に週に１回浸漬し（３×１０７ＣＦＵ／ｍｌ、浸漬時間は１２時間）、基礎飼料を１日２回飽食給餌した。
各群の処理後、各群のゼブラフィッシュを次の３つの群にランダムに分けた。
群Ａ（Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ  ＮＪ−１＋塩化アンモニウム）：２００ｍｇ／Ｌの塩化アンモニウムにゼブラフィッシュを感染させ（浸漬）、１２時間後、２×１０７ＣＦＵ／ｍｌのアエロモナス・ベロニ  Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１を加えた。
群Ｂ（Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１）：２×１０７ＣＦＵ／ｍｌの濃度のアエロモナス・ベロニ  Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１にゼブラフィッシュを感染させた（浸漬）。
群Ｃ（Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１＋  Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ  ＮＪ−１）：それぞれの菌の濃度が２×１０７ＣＦＵ／ｍｌのアエロモナス・ベロニ  Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ  Ｈｍ０９１及びアエロモナス・ハイドロフィラ  Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ  ＮＪ−１にゼブラフィッシュを感染させた（浸漬）。
９６時間以内のゼブラフィッシュの死亡状況を統計し、式（ＲＰＳ＝（１−免疫群死亡数／対照死亡数）×１００％）に従って免疫保護率（ＲＰＳ）を計算した。
結果を図５及び表３に示す。
【００９１】
0006971378.tif 000005
【００９２】
図５では、図５ＡはＮＪ−１＋塩化アンモニウムチャレンジの場合の各群の生存率の統計結果であり、図５ＢはＨＭ０９１チャレンジの場合の各群の生存率の統計結果であり、図５ＣはＨＭ０９１＋ＮＪ−１チャレンジの場合の各群の生存率の統計結果である。図５の結果は、浸漬免疫群のゼブラフィッシュの死亡時間が延長されたが、明らかな保護効果がなかったことを示す。一方、給餌免疫方式は、ＮＪ−１＋塩化アンモニウム、Ｈｍ０９１、Ｈｍ０９１＋ＮＪ−１浸漬チャレンジに対して明らかな免疫保護作用を果たし、ゼブラフィッシュの生存率が明らかに改善された。
【００９３】
表３の結果は、浸漬免疫群の免疫保護率が低く、明らかな保護作用を果たさなかったことを示す。給餌免疫群は、ＮＪ−１＋ＨＭ０９１免疫保護率が３３％に達し、一定の保護作用があった。ＮＪ−１＋塩化アンモニウム群の場合、ＨＭ０９１免疫保護率は８０％に達し、非常に強い免疫保護作用があった。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明は以下の利点を有する。
??１）本発明は、アエロモナス・ベロニのアエロリシンがゼブラフィッシュの感染部位に損傷を引き起こし、さらに関連する細菌の魚体内への侵入を促進することが出血性疾患の大発生を引き起こす主な原因となるという発症メカニズムに基づき、感染症を引き起こすアエロモナス・ベロニから、出血性疾患を予防／治療するワクチンを開発する。それにより、長い間アエロモナス出血性疾患の病因が不明であるため後期に感染を引き起こす細菌を重視する一方、損傷を引き起こす主要な細菌のワクチンの開発を無視することで、長い間細菌性敗血症のワクチン予防／制御効果が低下するという現状が回避される。
２）本発明は相同組換えの原理を採用し、特定の遺伝子断片を標的として欠損させて遺伝子不活性化を引き起こすことによって、得られた遺伝子欠損株はより良好な遺伝的安定性を有し、トランスポゾンなどの不安定な遺伝子工学的手法により構築される弱毒株による遺伝的不安定性のリスクが回避される。本発明の弱毒生ワクチンは、抗生物質標識を一切含まず、耐性株又は抗生物質耐性遺伝子を環境に放出することによって引き起こされる潜在的な害がない。
３）本発明では、遺伝子ノックアウトの方法を使用して、アエロリシン（Ａｅｒｏｌｙｓｉｎ）の主要な毒性因子をノックアウトして弱毒株を取得し、その毒性は親株よりも著しく低下する。同時に、不活化ワクチンの不十分な不活化による安全性の問題、及び不活化試薬による副作用がよく回避される。
４）本発明の弱毒生ワクチンは、様々な供給源からのアエロモナスに対して一定の交差保護力を有し、幅広い適応性を有する。
５）本発明の弱毒生ワクチンは、ゼブラフィッシュにおいて一定の免疫保護力を有し、本発明の弱毒生ワクチンがゼブラフィッシュの免疫応答を効果的に活性化できることを示している。
６）本発明により提供されるワクチンを使用することによって、水産動物の免疫力を著しく増強し、耐病性発現型を改善することができる。
【００９５】
本発明は、抗生物質標識なしで主要な毒性因子をノックアウトする技術で構築された経口又は浸漬弱毒生ワクチンを採用することによって、免疫抗原性を保持しながら病原菌の病原性を低下させることができ、免疫保護の効果が顕著であり、自然免疫系反応及び細胞免疫が強化され、他の病原菌により感染に抵抗する能力が向上し、免疫作業の量が大幅に削減される。
【図１】
0006971378.tif 000006
【図２】
0006971378.tif 000007
【図３】
0006971378.tif 000008
【図４】
0006971378.tif 000009
【図５】
0006971378.tif 000010
【配列表】
0006971378000001.app