(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−Ｓｙｎの凝集体に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、
前記抗体または抗原結合断片は、（ｉ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３の相補性決定領域を含む重鎖可変領域；および（ｉｉ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３の相補性決定領域を含む軽鎖可変領域を含み、
前記重鎖可変領域のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３；および前記軽鎖可変領域のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３の配列は、以下：
（ａａ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号１、１５、および２９、そして前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号４３、５７および７１；
（ａｂ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号２、１６、および３０、そして前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号４４、５８および７２；
（ａｃ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号３、１７、および３１、そして前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号４５、５９および７３；
（ａｅ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号５、１９、および３３、そして前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号４７、６１および７５；
（ａｆ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号６、２０、および３４、そして前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号４８、６２および７６；
（ａｈ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８、２２、および３６、そして前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号５０、６４および７８；
（ａｉ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号９、２３、および３７、そして前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号５１、６５および７９；
（ａｊ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号１０、２４、および３８、そして前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号５２、６６および８０；
（ａｋ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号１１、２５、および３９、そして前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号５３、６７および８１；
（ａｌ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号１２、２６、および４０、そして前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号５４、６８および８２；
（ａｍ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号１３、２７、および４１、そして前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号５５、６９および８３；または
（ａｎ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号１４、２８、および４２、そして前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号５６、７０および８４
のいずれか１つである、α−Ｓｙｎの凝集体に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
前記重鎖可変領域は、
配列番号８５〜８７、８９及び９０、及び９２〜９８から選択されるアミノ酸配列；
配列番号８５〜８７、８９及び９０、及び９２〜９８から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有する配列；または
配列番号８５〜８７、８９及び９０、及び９２〜９８から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の相同性を有する配列を含む、請求項１に記載のα−Ｓｙｎの凝集体に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
前記軽鎖可変領域は、
配列番号９９〜１０１、１０３及び１０４、及び１０６〜１１２から選択されるアミノ酸配列；
配列番号９９〜１０１、１０３及び１０４、及び１０６〜１１２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上；または
配列番号９９〜１０１、１０３及び１０４、及び１０６〜１１２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の相同性を有する配列を含む、請求項１に記載のα−Ｓｙｎの凝集体に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
前記重鎖可変領域および軽鎖可変領域はそれぞれ、
配列番号８５および９９；
配列番号８６および１００；
配列番号８７および１０１；
配列番号８９および１０３；
配列番号９０および１０４；
配列番号９２および１０６；
配列番号９３および１０７；
配列番号９４および１０８；
配列番号９５および１０９；
配列番号９６および１１０；
配列番号９７および１１１；または
配列番号９８および１１２で表される配列を含むものである、請求項１に記載のα−Ｓｙｎの凝集体に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
前記抗体または抗原結合断片は、モノクローナル抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ｄｉａｂｏｄｙまたはｓｃＦＶである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のα−Ｓｙｎの凝集体に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
前記モノクローナル抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である、請求項５に記載のα−Ｓｙｎの凝集体に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
前記モノクローナル抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４型である、請求項５に記載のα−Ｓｙｎの凝集体に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
前記抗体は、次のいずれか１つの重鎖および軽鎖を含む、請求項１に記載のα−Ｓｙｎの凝集体に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片：
前記軽鎖および重鎖はそれぞれ、
配列番号１１３および配列番号１４１；
配列番号１１４および配列番号１４２；
配列番号１１５および配列番号１４３；
配列番号１１７および配列番号１４５；
配列番号１１８および配列番号１４６；
配列番号１２０および配列番号１４８；
配列番号１２１および配列番号１４９；
配列番号１２２および配列番号１５０；
配列番号１２３および配列番号１５１；
配列番号１２４および配列番号１５２；
配列番号１２５および配列番号１５３；または
配列番号１２６および配列番号１５４；
で表されるアミノ酸配列を有するものである、α−Ｓｙｎの凝集体に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
前記抗体は、次のいずれか１つの重鎖および軽鎖を含む、請求項１に記載のα−Ｓｙｎの凝集体に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、
前記軽鎖および重鎖はそれぞれ、
配列番号１２７および配列番号１５５；
配列番号１２８および配列番号１５６；
配列番号１２９および配列番号１５７；
配列番号１３１および配列番号１５９；
配列番号１３２および配列番号１６０；
配列番号１３４および配列番号１６２；
配列番号１３５および配列番号１６３；
配列番号１３６および配列番号１６４；
配列番号１３７および配列番号１６５；
配列番号１３８および配列番号１６６；
配列番号１３９および配列番号１６７；
または配列番号１４０および配列番号１６８
である、α−Ｓｙｎの凝集体に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片は、α−Ｓｙｎ凝集体の細胞間伝達の抑制；α−Ｓｙｎ凝集体を分解；またはα−Ｓｙｎ凝集体の形成を抑制する、α−Ｓｙｎの凝集体に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片をコーディングする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、組成物。
【請求項１３】
前記組成物は、薬学的に許容可能な担体または賦形剤を追加的に含むα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙの治療用である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片を含む、インビボまたはインビトロにおいて生物学的試料におけるα−Ｓｙｎ凝集体の検出のための剤。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片を含む、対象におけるα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙを診断するための剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、抗−α−ｓｙｎ抗体およびその使用に関する技術である。
【背景技術】
【０００２】
アルファ−シヌクレイン（α−Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）は、ニューロンの前シナプス末端で主に発現する、１４０個のアミノ酸からなる蛋白質で、正常状態では自然に折り畳まれない状態の単量体として存在する。アルファ−シヌクレインは、前シナプス末端でシナプスベシクルの供給を維持し、随意または不随意運動を調節するニューロトランスミッターのドーパミンの放出を調節することが知られている。
【０００３】
しかし、病的な状態において、アルファ−シヌクレインは、液滴（ｄｒｏｐｌｅｔ）、リン脂質二重膜または脂質膜などとの結合および相互作用により構造的変化を起こして折り畳み、またはフォールディングされたα−ヘリカル形態の２次構造を形成して、二量体（ｄｉｍｅｒ）、オリゴマー（ｏｌｉｇｏｍｅｒ）および／または線維状形態の分子を含む凝集体を形成する。このような凝集体は細胞に毒性を誘発することが知られており、パーキンソン病、レビー小体痴呆、その他多様な疾患の神経細胞内で発見される異常な蛋白質凝集体であるレビー小体の主成分である。また、アルファ−シヌクレインのリン酸化、またはユビキチン化のような翻訳後修飾も、アルファ−シヌクレインの凝集および神経毒性と関連があることが知られている。
【０００４】
このようなアルファ−シヌクレイン凝集は、パーキンソン疾患（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ、ＰＤ）、パーキンソン疾患性痴呆（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｄｅｍｅｎｔｉａ、ＰＤＤ）、レビー小体痴呆（ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｗｉｔｈ  Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｉｅｓ、ＤＬＢ）、多系統萎縮症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｔｒｏｐｈｙ、ＭＳＡ）およびその他多数の神経軸索疾患を含むα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｉｅｓと呼ばれる一群の神経退行性疾患の病因に関連があることが知られている（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｔｈｅｒａｐｙ２０１４，６：７３）。
【０００５】
さらに、パーキンソン疾患患者の脳脊髄液および血漿サンプルからオリゴマー形態およびモノマー形態のアルファ−シヌクレインがすべて発見されたが、これは、小さい分子量のアルファ−シヌクレイン凝集体が細胞膜を透過して細胞外空間に接近しうることを示す。また、フォールディングされたアルファ−シヌクレインがエキソサイトーシスにより細胞から放出された後、プリオンタンパク質のように、細胞間伝達によって脳の一領域から他の領域に伝達されうることが明らかになった（Ｂｒｕｎｄｉｎ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ２０１０，１１：３０１−３０７）。
【０００６】
よって、アルファ−シヌクレインがパーキンソン疾患のようなα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙの治療剤開発の標的になっている。主な開発戦略は、凝集体形成抑制、遺伝子サイレンシングおよび凝集体除去を含む。前者の場合、Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−ｇａｌｌａｔｅ（ＥＧＣＧ）（Ｂｉｅｓｃｈｋｅ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ２０１０  １０７：７７１０−７７１５）、３−（１，３−ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｏｌ−５−ｙｌ）−５−（３−ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｙｌ）−１Ｈ−ｐｙｒａｚｏｌｅ（ａｎｌｅ１３８ｂ）（Ｗａｇｎｅｒ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ２０１３，１２５：７９５−８１３）、ＣＬＲ０１２０（Ｐｒａｂｈｕｄｅｓａｉ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ２０１２，９：４６４−４７６）、およびプロリルオリゴペプチダーゼ抑制剤ＫＹＰ−２０４７９（Ｍｙｏｈａｎｅｎ  Ｔ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｒｉｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ２０１２，１６６：１０９７−１１１３）を含む。アルファ−シヌクレインに結合する抗体は、特許ＵＳ８，６０９，８２０、およびＵＳ８，９４０，２７６などに開示されている。
【０００７】
低分子化合物の場合、標的特異的結合力が低下し、低い半減期によって高い用量を投与しなければならない。抗体は、低分子化合物と比較して標的特異的であり、高い半減期を示すが、疾患治療の可能性を高めるためには、高い結合力で凝集体に選好的に結合する抗体が必要である。
【０００８】
したがって、α−ｓｙｎ凝集体の異常な蓄積に関連付けられた疾患の治療のために、アルファシヌクレイン、特に凝集体に選好的に結合できる抗体の開発が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本願は、アルファ−シヌクレイン、特に、α−Ｓｙｎ凝集体を高い結合力で特異的に認識できる抗体を提供しようとする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
一様態において、本願は、α−Ｓｙｎの凝集体に結合する分離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体または抗原結合断片は、（ｉ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３の相補性決定部位を含む重鎖可変領域；および（ｉｉ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３の相補性決定部位を含む重鎖可変領域を含み、前記ＣＤＲＨ１は配列番号１〜１４から構成される群より選択され；前記ＣＤＲＨ２は配列番号１５〜２８から構成される群より選択され；前記ＣＤＲＨ３は配列番号２９〜４２から構成される群より選択され；前記ＣＤＲＬ１は配列番号４３〜５６から構成される群より選択され；前記ＣＤＲＬ２は配列番号５７〜７０から構成される群より選択され；前記ＣＤＲＬ３は配列番号７１〜８４から構成される群より選択されるものである、α−Ｓｙｎの凝集体に結合する分離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００１１】
一部の実施形態において、前記重鎖可変領域のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３；および前記軽鎖可変領域のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３の配列は、次のいずれか１つである、α−Ｓｙｎの凝集体に結合する分離された抗体またはその抗原結合断片を提供する：（ａａ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号１、１５、および２９、そして前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号４３、５７および７１；（ａｂ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号２、１６、および３０、そして前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号４４、５８および７２；（ａｃ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号３、１７、および３１、そして前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号４５、５９および７３；（ａｄ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号４、１８、および３２、そして前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号４６、６０および７４；（ａｅ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号５、１９、および３３、そして前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号４７、６１および７５；（ａｆ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号６、２０、および３４、そして前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号４８、６２および７６；（ａｇ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号７、２１、および３５、そして前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号４９、６３および７７；（ａｈ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８、２２、および３６、そして前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号５０、６４および７８；（ａｉ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号９、２３、および３７、そして前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号５１、６５および７９；（ａｊ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号１０、２４、および３８、そして前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号５２、６６および８０；（ａｋ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号１１、２５、および３９、そして前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号５３、６７および８１；（ａｌ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号１２、２６、および４０、そして前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号５４、６８および８２；（ａｍ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号１３、２７、および４１、そして前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号５５、６９および８３；または（ａｎ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号１４、２８、および４２、そして前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号５６、７０および８���。
【００１２】
一部の実施形態において、本願によるα−Ｓｙｎの凝集体に結合する分離された抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域は、配列番号８５〜９８から選択されるアミノ酸配列；配列番号８５〜９８から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有する配列；または配列番号８５〜９８から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の相同性を有する配列を含む。
【００１３】
一部の実施形態において、本願によるα−Ｓｙｎの凝集体に結合する分離された抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域は、配列番号９９〜１１２から選択されるアミノ酸配列；配列番号９９〜１１２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上；または配列番号９９〜１１２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の相同性を有する配列を含む。
【００１４】
一部の実施形態において、本願によるα−Ｓｙｎの凝集体に結合する分離された抗体またはその抗原結合断片の前記重鎖可変領域および軽鎖可変領域はそれぞれ、配列番号８５および９９；配列番号８６および１００；配列番号８７および１０１；配列番号８８および１０２；配列番号８９および１０３；配列番号９０および１０４；配列番号９１および１０５；配列番号９２および１０６；配列番号９３および１０７；配列番号９４および１０８；配列番号９５および１０９；配列番号９６および１１０；配列番号９７および１１１；または配列番号９８および１１２で表される配列を含む。
【００１５】
一部の抗体または抗原結合断片は、モノクローナルまたはｓｃＦＶ抗体である、α−Ｓｙｎの凝集体に結合する分離された抗体またはその抗原結合断片である。
【００１６】
前記任意の本願による抗体は、モノクローナル抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である。
【００１７】
前記任意の本願によるモノクローナル抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４型である。
【００１８】
前記任意の抗体または抗原結合断片は、モノクローナル抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ｄｉａｂｏｄｙまたはｓｃＦＶである。
【００１９】
一部の実施形態において、本願によるα−Ｓｙｎの凝集体に結合する分離された抗体は、次のいずれか１つの重鎖および軽鎖を含むα−Ｓｙｎの凝集体に結合する分離された抗体またはその抗原結合断片である：前記軽鎖および重鎖はそれぞれ、配列番号１１３および配列番号１４１；配列番号１１４および配列番号１４２；配列番号１１５および配列番号１４３；配列番号１１６および配列番号１４４；配列番号１１７および配列番号１４５；配列番号１１８および配列番号１４６；配列番号１１９および配列番号１４７；配列番号１２０および配列番号１４８；配列番号１２１および配列番号１４９；配列番号１２２および配列番号１５０；配列番号１２３および配列番号１５１；配列番号１２４および配列番号１５２；配列番号１２５および配列番号１５３；または配列番号１２６および配列番号１５４；で表されるアミノ酸配列を含む。前記抗体は、不変域としてマウスＩｇＧ２ａを含む。
【００２０】
一部の実施形態において、本願によるα−Ｓｙｎの凝集体に結合する分離された抗体は、次のいずれか１つの重鎖および軽鎖を含むα−Ｓｙｎの凝集体に結合する分離された抗体またはその抗原結合断片である：前記軽鎖および重鎖はそれぞれ、配列番号１２７および配列番号１５５；配列番号１２８および配列番号１５６；配列番号１２９および配列番号１５７；配列番号１３０および配列番号１５８；配列番号１３１および配列番号１５９；配列番号１３２および配列番号１６０；配列番号１３３および配列番号１６１；配列番号１３４および配列番号１６２；配列番号１３５および配列番号１６３；配列番号１３６および配列番号１６４；配列番号１３７および配列番号１６５；配列番号１３８および配列番号１６６；配列番号１３９および配列番号１６７；または配列番号１４０および配列番号１６８。前記抗体は、不変領域としてヒトＩｇＧ１を含む。
【００２１】
前記本願による任意の抗体または抗原結合断片は、α−Ｓｙｎ凝集体の細胞間伝達の抑制；α−Ｓｙｎ凝集体を分解；またはα−Ｓｙｎ凝集体の形成を抑制することができる。
【００２２】
他の様態において、本願はまた、本願による前記抗体または抗原結合断片をコーディングする分離されたポリヌクレオチドを提供する。このようなポリヌクレオチドの例としては、配列番号１６９〜２２４で表される配列が挙げられる。
【００２３】
他の様態において、本願はさらに、本願による前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
【００２４】
さらに他の様態において、本願はさらに、本願による前記発現ベクターで形質転換された原核または真核細胞または細胞株を提供する。
【００２５】
さらに他の様態において、本願はさらに、前記本願による細胞を前記抗体または抗原結合断片が発現するのに十分な条件で培養する段階；および前記細胞株から抗体またはその抗原結合断片を分離する段階を含む、α−Ｓｙｎに特異的に結合する分離された抗体またはその抗原結合断片の製造方法を提供する。
【００２６】
さらに他の様態において、本願はさらに、本願による任意の抗体またはその抗原結合断片を含む組成物またはキットを提供し、前記組成物は、薬学または診断組成物として提供され、薬学組成物は、薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含むことができ、診断組成物は、診断または検出に必要な試薬を追加的に含んでもよい。
【００２７】
本願による薬学組成物またはキットは、α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙの治療用であって、例えば、前記α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙは、パーキンソン疾患（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ、ＰＤ）、パーキンソン疾患性痴呆（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｄｅｍｅｎｔｉａ、ＰＤＤ）、レビー小体痴呆（ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｗｉｔｈ  Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｉｅｓ、ＤＬＢ）、アルツハイマーレビー小体疾患（Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｙ  ｖａｒｉａｎｔ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ（ＬＢＶ））、複合性アルツハイマーおよびパーキンソン病（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）、または多系統萎縮症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｔｒｏｐｈｙ、ＭＳＡ）を含む。
【００２８】
さらに他の様態において、本願による抗体または抗原結合断片を提供する段階；および前記抗体または抗原結合断片をα−Ｓｙｎ凝集体の検出が必要な生物学的試料と接触する段階を含む、生物学的試料におけるα−Ｓｙｎ凝集体の検出方法を提供する。生物学的試料は、α−Ｓｙｎ凝集体の検出が必要な多様な試料を含み、例えば、脳脊髄液、血漿を含む血液または小便を含み、また、細胞、組織または器官を含む。前記方法は、インビトロまたはインビボで行われる。インビボイメージングは、例えば、ＰＥＴ（ｐｏｓｉｔｒｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）、ＳＰＥＣＴ（ｓｉｎｇｌｅ  ｐｈｏｔｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）、ＮＩＲ（ｎｅａｒ  ｉｎｆｒａｒｅｄ）光学イメージングまたはＭＲＩ（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ）を利用して行われる。
【００２９】
さらに他の様態において、本願による抗体または抗原結合断片またはこれを含む組成物をα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙの治療および／またはα−ｓｙｎ凝集体の濃度調節が必要な対象体に投与する段階を含む、前記対象体のα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙの治療または前記対象体におけるα−ｓｙｎ凝集体の濃度を調節する方法を提供する。
【００３０】
さらに他の様態において、本願は、α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙの診断が必要な対象体におけるα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙを診断する方法であって、前記方法は、前記対象体におけるα−Ｓｙｎ凝集体の濃度または細胞内の位置を本願による任意の抗体または抗原結合断片で測定／検出する段階；および前記対象体で測定された前記α−Ｓｙｎ凝集体の濃度または細胞内位置を対照群試料の結果と比較する段階を含み、前記対照群の結果と類似または差は、前記対象体がα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙにかかっていることを示す。前記方法において、対照群は、正常またはα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙ疾患にかかった試料であってもよい。
【００３１】
さらに他の様態において、本願は、本願による抗体または抗原結合断片またはこれを含む組成物のα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙ対象体の前記疾患治療用使用を提供し、前記抗体または抗原結合断片またはこれを含む組成物は、前記対象体、または対象体の脳における、α−Ｓｙｎ凝集体の細胞間伝達の抑制；α−Ｓｙｎ凝集体の分解；またはα−Ｓｙｎ凝集体の形成を抑制する。
【００３２】
さらに他の様態において、本願は、本願による抗体または抗原結合断片またはこれを含む組成物の脳細胞におけるα−Ｓｙｎ凝集体の濃度調節用使用であって、前記抗体または抗原結合断片またはこれを含む組成物は、前記対象体の脳における、α−Ｓｙｎ凝集体の細胞間伝達の抑制；α−Ｓｙｎ凝集体の分解；またはα−Ｓｙｎ凝集体の形成を抑制することができる。
【発明の効果】
【００３３】
本願に開示された抗体は、α−Ｓｙｎ、特にα−Ｓｙｎ凝集体に高い結合力で選好的に結合する。高い親和度を有する本願による抗体または抗原結合断片は、α−Ｓｙｎ凝集体の形成を減少させられて、脳の凝集体の濃度を低下させることができる。また、α−Ｓｙｎ凝集体に対する高い親和度を有する本願による抗体または抗原結合断片は、中枢神経系の外側におけるα−Ｓｙｎ凝集体の形成を減少させられて、結局、脳血管障壁を境界としたα−Ｓｙｎ形態間の平衡状態を変更させて、中枢神経系内の凝集体の濃度を低下させる効果をもたらすことができる。
【００３４】
また、高い親和度によって低い投与量で投与できるという利点がある。これは、抗体を、例えば、これに限るものではないが、より簡便な皮下注射のような方式で投与しても十分な効能が得られるため、臨床において大きな利点がある。
【００３５】
本願に開示された抗体は、α−Ｓｙｎ凝集体を効果的に除去したり、分解を促進することができ、α−Ｓｙｎの細胞間伝達を抑制できて、α−Ｓｙｎの凝集体の蓄積に関連する疾患の治療に有用に使用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、本願による一実施形態で製造された単クローン抗体が凝集した形態のｎａｔｉｖｅ  α−ｓｙｎを特異的に認識するか否かを測定したドットブロット結果で、α−ｓｙｎ凝集体に選好的に結合することを示す。
【図２】図２は、本願による一実施形態で製造された単クローン抗体の親和度をＥＬＩＳＡで測定した結果である。本願による抗体は、α−ｓｙｎ凝集体に高い親和度で選好的に結合し、単一体に対しては凝集体より低いかまたは結合しないため、親和度を導出することができなかった。この結果は、パーキンソン病のようなアルファシヌクレイン病因を有する神経退行性疾患の原因物質を効果的に除去できたり、活動を抑制できることを示すものである。
【図３ａ】図３Ａは、本願による一実施形態で製造された単クローン抗体がα−Ｓｙｎ凝集体に対する選好的結合特異性および親和度をＢＩＡｃｏｒｅで分析した結果である。本願による抗体が高い親和度で凝集体に結合することを示す。この結果は、パーキンソン病のようなアルファシヌクレイン病因を有する神経退行性疾患の原因物質を効果的に除去できたり、活動を抑制できることを示すものである。
【図３ｂ】図３Ｂは、図３Ａの結果を表で示すものである。
【図４】図４は、本願による一実施形態で製造された単クローン抗体がα−Ｓｙｎ凝集体に選好的結合特異性をＯｃｔｅｔで分析した結果で、α−ｓｙｎ凝集体に選好的に結合することを示し、図１の結果と一致するものである。比較群として使用された＃２７４抗体の場合、単量体および凝集体にすべてよく結合することが明らかになった。
【図５】図５は、本願による一実施形態においてファージディスプレイにより選別された抗体が凝集した形態のｎａｔｉｖｅ  α−ｓｙｎを特異的に認識するか否かを測定したドットブロット結果で、α−ｓｙｎ凝集体に選好的に結合することを示す。
【図６】図６は、図５の抗体のα−Ｓｙｎ凝集体に対する親和度をＯｃｔｅｔで分析した結果である。これは、本願による抗体が高い親和度で凝集体に結合することを示す。この結果は、パーキンソン病のようなアルファシヌクレイン病因を有する神経退行性疾患の原因物質を効果的に除去できたり活動を抑制できることを示すものである。
【図７】図７は、本願による一実施形態で製造された単クローン抗体がα−ｓｙｎの細胞間伝播（ｃｅｌｌ  ｔｏ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）を抑制するかを分析する原理（上）および実験結果を示すものである。ここで、青色は核であり、緑色は細胞外部に出たα−ｓｙｎが他の細胞内に伝播されて他のα−ｓｙｎに接して凝集体を作った時の信号である。本願による抗体９Ｂ１１、３Ａ９および１１Ｆ１１処理群では、陰性対照群のＩｇＧ対比、緑色シグナルを示す細胞の個数が顕著に減少し、これは、凝集体に高い親和度で特異的に結合する本願による抗体がα−ｓｙｎの細胞間伝播を効果的に抑制できることを示すものである。
【図８ａ】図８Ａは、本願による一実施形態で製造された単クローン抗体がヒトα−Ｓｙｎを過発現するマウス動物モデル（ＴＧ）においてα−Ｓｙｎ凝集体を除去できるかを、マウスに抗体投与後、ｐ−１２９  α−Ｓｙｎ抗体を用いてマウス脳組織を染色して測定した結果である。図にて、ＨＰはＨｉｐｐｏｃａｍｐｕｓであり、ｐ−１２９  α−ｓｙｎは１２９番目の残基がリン酸化された形態の凝集体のマーカーであり、矢印はリン酸化されたα−ｓｙｎを示す。これは、本願による抗体がα−Ｓｙｎを顕著に除去できることを示す結果である。ＷＴおよびＩｇＧは陰性対照群であり、抗体２７４は単量体と凝集体ともに結合する比較群である。この結果は、本願による抗体は凝集体α−ｓｙｎの蓄積を効果的に抑制できて、α−ｓｙｎ病因に関連する疾患の予防および／または治療に効果的に使用できることを示す。
【図８ｂ】図８Ｂは、図８Ａと同一の実験であるが、マーカーとして、総α−ｓｙｎに対する抗体を用いて染色した結果である。矢印はヒトα−ｓｙｎを示す。９Ｂ１１、１１Ｆ４、１１Ｆ１１抗体は総α−ｓｙｎの蓄積を効果的に抑制した。総α−ｓｙｎの検出は、本願による抗体がｓｙｎｕｃｌｅｉｎ自体の除去能（ｃｌｅａｒｉｎｇ）および抗体の細胞間伝達（ｃｅｌｌ  ｔｏ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）抑制能があることを示すものである。また、他の側面から、単量体の凝集体への形成の抑制、または単量体をすべて除去できると解釈される。
【図９ａ】図９Ａは、本願による一実施形態で製造された単クローン抗体がインビボでｍｉｃｒｏｇｌｉｏｓｉｓを減少させられるかを、マウスに抗体投与後、マーカーとしてＩｂａ−１（ｍｉｃｒｏｇｌｉｏｓｉｓ）抗体を用いてマウスの脳組織を染色で測定した結果である。矢印は活性化されたミクログリアを意味するもので、３Ａ９、９Ｂ１１、１１Ｆ１１抗体を投与したネズミの脳でミクログリアの活性化が顕著に減少していることが分かる。
【図９ｂ】図９Ｂは、本願による一実施形態で製造された単クローン抗体がインビボでａｓｔｒｏｇｌｉｏｓｉｓを減少させられるかを、マウスに抗体投与後、マーカーとしてＧＦＡＰ（ａｓｔｒｏｇｌｉｏｓｉｓ）抗体を用いてマウスの脳組織を染色で測定した結果である。矢印は活性化されたアストロサイトを意味するもので、３Ａ９、９Ｂ１１、１１Ｆ１１抗体が効果的に有意な水準にａｓｔｒｏｇｌｉｏｓｉｓを抑制することを確認することができた。
【図９ｃ】図９Ｃは、本願による一実施形態で製造された単クローン抗体がインビボで炎症性サイトカインを減少させられるかを、マウスに抗体投与後、マーカーとしてＩＬ−１ベータ抗体を用いてマウスの脳組織を染色で測定した結果である。矢印はＩＬ−１ベータを発現している細胞を示す。ＩＬ−１ベータは、炎症を誘発して多様な神経細胞の死滅および炎症反応を誘導するが、本願による抗体を投与したネズミの脳組織でＩＬ−１ベータが顕著に減少したことを示す。
【図９ｄ】図９Ｄは、本願による一実施形態で製造された単クローン抗体がインビボで炎症性サイトカインを減少させられるかを、マウスに抗体投与後、マーカーとしてＩＬ−６抗体を用いてマウスの脳組織を染色で測定した結果である。矢印は炎症性サイトカインのＩＬ−６を発現する細胞を示す。本願による抗体を投与したネズミの脳組織でＩＬ−６が減少したことを示す。
【図１０ａ】図１０Ａおよび図１０Ｂはそれぞれ、本願による一実施形態で製造された単クローン抗体３Ａ９および１１Ｆ１１がヒト脳組織でレビー小体（Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｙ）およびレビー神経突起（Ｌｅｗｙ  ｎｅｕｒｉｔｅｓ）を特異的に認識できるかをそれぞれ測定した結果である。本願による抗体がレビー小体（矢印）およびレビー神経突起（左下の糸のような形状）に結合することを示す。この結果は、本願の抗体が実際のヒト脳組織に存在するα−ｓｙｎ凝集体と特異的に結合できることを示すもので、α−ｓｙｎ病因に関連する疾患の予防および／または治療に効果的に使用できることを示す。
【図１０ｂ】図１０Ａおよび図１０Ｂはそれぞれ、本願による一実施形態で製造された単クローン抗体３Ａ９および１１Ｆ１１がヒト脳組織でレビー小体（Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｙ）およびレビー神経突起（Ｌｅｗｙ  ｎｅｕｒｉｔｅｓ）を特異的に認識できるかをそれぞれ測定した結果である。本願による抗体がレビー小体（矢印）およびレビー神経突起（左下の糸のような形状）に結合することを示す。この結果は、本願の抗体が実際のヒト脳組織に存在するα−ｓｙｎ凝集体と特異的に結合できることを示すもので、α−ｓｙｎ病因に関連する疾患の予防および／または治療に効果的に使用できることを示す。
【図１１】図１１は、本願で製造された抗体のエピトープマッピング結果を図式的に示すもので、本願による抗体はほとんどＣ−末端部位に結合することが明らかになった。Ｎ−末端を認識するα−ｓｙｎ抗体は、α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ関連疾患を通称するｓｙｎｕｃｌｅｉｏｎｏｐａｔｈｙに属する多系統萎縮症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｔｒｏｐｈｙ、ＭＳＡ）のような他の疾病の凝集体は認識できないのに対し、Ｃ−末端部位を認識するα−ｓｙｎ抗体は、パーキンソン病のみならず、その他多様なｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙ疾患の凝集体も認識するという利点を有する。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本願は、α−ｓｙｎ、特に凝集体に高い結合力で特異的に結合可能で、α−ｓｙｎ凝集体の検出はもちろん、α−ｓｙｎ凝集体の減少および／またはα−ｓｙｎ凝集体形成の抑制および／またはα−ｓｙｎ凝集体の細胞間伝達を抑制できる抗体の開発に基づくものである。
【００３８】
本項目で使用された題名は、明細書記載の利便性のためのものに過ぎず、本発明をこれに限定するものではない。
本願で別途に定義しない限り、本願で使用された科学および技術的用語は、本技術分野における当業者が通常理解する通りの意味を有する。さらに、文脈上特に要求されない限り、単数は複数を含み、複数は単数を含む。
【００３９】
定義
本願において、「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、単一または二重鎖のヌクレオチドポリマーを含む。このようなポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド、またはこれらの変形した形態であってもよい。
【００４０】
本願で別途に明示されなければ、本願で言及されたポリヌクレオチドの左側末端は５’末端であり、右側末端は３’末端を示す。
【００４１】
本願において、「分離された核酸分子」は、その全部または一部が自然に存在するポリヌクレオチドと関連性がないか、または自然から観察されないポリヌクレオチドに連結されている、遺伝体起源のＤＮＡまたはＲＮＡ、または合成起源のｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはこれらの組み合わせを意味する。本願の目的下、特定の核酸配列を含む核酸分子は、無傷の（ｉｎｔａｃｔ）染色体を含まない。その代わりに、特定の核酸配列を含む分離された核酸分子は、その特定の配列に付加して、最小数個の付加的なタンパク質コーディング配列を包むか、または前記特定の核酸配列の発現のための調節配列および／またはベクターを追加的に含んでもよい。
【００４２】
本願において、用語「調節配列」は、これに作動可能に連結されてコーディング配列の発現とプロセシングに影響を与えうるポリヌクレオチド配列を意味する。このような調節配列の特徴は、宿主の種類によって左右される。例えば、原核細胞で作用可能な調節配列は、プロモーター、場合によって、オペレータ、リボソーム結合部位、および転写終結配列を含むことができる。真核細胞における調節配列は、転写因子が結合する複数の認識部位を含むプロモーター、転写エンハンサー、ポリアデニル化配列および転写終結配列を含むことができる。調節配列をリーダー配列および／または融合パートナー配列をさらに含んでもよい。
【００４３】
本願において、「ベクター」は、タンパク質をコーディングする核酸分子を宿主細胞に伝達するのに使用される、例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージまたはウイルスを含む任意の分子を意味する。
【００４４】
本願において、「発現ベクター」は、宿主細胞の形質転換に適合し、発現ベクターに作動可能に連結され、目的のタンパク質をコーディングする異種配列の発現を調節する核酸配列を含むベクターを意味する。このような発現ベクターはさらに、コーディング配列に作動可能に連結され、その転写、翻訳、そしてイントロンが存在する場合、ＲＮＡスプライシングを調節したり、これに影響を及ぼす配列を含むことができる。
【００４５】
本願において、「作動可能に連結された」は、連結される核酸配列が適切な条件下で目的の機能を果たせるように位置することを意味する。例えば、コーディング配列および調節配列を含むベクターにおいて適切な条件で前記コーディング配列の転写が前記調節配列によって影響されると、作動可能に連結されたのである。
【００４６】
本願において、「宿主細胞」は、目的の核酸配列で形質転換されたか、または形質転換されうる、目的遺伝子を発現できる細胞を意味する。前記用語は、前記宿主細胞と形態および遺伝的構成の同一性の有無にかかわらず、目的の遺伝子を発現する限り、前記宿主細胞の子孫も含む。
【００４７】
本願において、「形質導入」は、通常、バクテリオファージによる、１つの細菌から他の細菌への核酸の移動を意味する。例えば、複製できないレトロウイルスを用いた真核細胞への核酸の移動を含む。
【００４８】
本願において、「伝達移入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」は、細胞、特に真核細胞が外来または外因性ＤＮＡを取ることを意味し、この場合、ＤＮＡは、細胞膜を通して細胞内に導入される。これは、当該技術分野で公知の方法、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０１２），Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓを参照することができる。
【００４９】
本願において、「形質転換」は、細胞が新しいＤＮＡまたはＲＮＡを含むように変形した、細胞の遺伝的特徴の変化を意味する。例えば、細胞は、伝達移入、形質導入、またはその他の技術により新しい遺伝物質が導入され、遺伝的特徴が変化して、形質転換される。形質導入または伝達移入を含む方法などによって形質転換されたＤＮＡは、細胞の染色体内に物理的に統合されて存在したり、複製なしにエピゾーム形態、または複製可能なプラスミドとして一時的に存在しうる。形質転換されたＤＮＡが宿主細胞分裂と共に複製される時、安定して形質転換されたと見なされる。
【００５０】
本願において、「アミノ酸」は、当該技術分野で理解される通常の意味を含む。２０個の自然−発生アミノ酸およびこれらの略語は、当業界で通用するものによる（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ，ｅｄｓ．，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．１９９１）。アミノ酸は、典型的なアミノ酸はもちろん、典型的な２０個のアミノ酸の立体異性体（Ｄ−アミノ酸）、非−自然アミノ酸、例えば、α−、α−二置換されたアミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、およびその他の非−典型的なアミノ酸を含む。非−典型的なアミノ酸の例としては、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、ε−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、およびその他類似のアミノ酸とイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が含まれる。本願に使用されたポリペプチドの表記において、当業界で一般に通用するように、配列の左側はアミノ末端であり、右側はカルボキシ末端を示す。
【００５１】
本願において、「ポリペプチド」または「タンパク質」は、アミノ酸残基の重合体を意味するもので、本願で相互交換的に使用される。これはまた、自然に発生したアミノ酸残基の重合体だけでなく、その類似体または模倣体のアミノ酸の重合体を含む。また、ポリペプチドまたはタンパク質は、リン酸化または糖化のための炭水化物の追加などの変形を含むことができる。さらに、ポリペプチドまたはタンパク質は、組換えまたは自然から発見される細胞から生産される。また、ポリペプチドまたはタンパク質は、野生型配列、または前記アミノ酸配列の一部が欠失、付加および／または置換されたものを含む。さらに、ポリペプチドまたはタンパク質は、抗体、例えば、抗−α−Ｓｙｎ抗体（またはα−Ｓｙｎ抗体）、α−Ｓｙｎ結合タンパク質、または抗原結合断片の１つ以上のアミノ酸が欠失、付加および／または置換された配列を含む。また、「ポリペプチド断片」は、全長タンパク質と比較して、アミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失および／または内部欠失を有するポリペプチドを意味する。これらの断片はさらに、全長タンパク質と比較して、変形したアミノ酸を含むことができる。一実施形態において、断片は、長さが約５個〜５００個のアミノ酸、例えば、断片は、少なくとも長さが５、６、８、１０、１４、２０、５０、７０、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、または４５０個のアミノ酸であってもよい。本願の目的を考慮すれば、有用なポリペプチド断片は、抗原結合ドメインを含む抗体の免疫学的機能性断片が含まれる。α−Ｓｙｎ結合抗体の場合に、この有用な断片は、重鎖または軽鎖の１個、２個または３個を含むＣＤＲ配列、重鎖または軽鎖の可変領域、または抗体鎖の一部を含むが、これに限るものではない。
【００５２】
本願において、「分離されたポリペプチド、抗体またはタンパク質」は、これらと通常一緒に発見されうる他のタンパク質が存在せず、自然にこれらと結合している脂質、炭水化物、ポリヌクレオチドの少なくとも約５０％以上が除去されたものである。典型的に分離されたタンパク質、ポリペプチドまたは抗体は、所定の組成物において、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、または少なくとも約５０％を構成する。このようなポリペプチドは、合成起源のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはその他のＲＮＡ、またはこれらの任意の組み合わせによってコーディングされる。特に、分離されたタンパク質のポリペプチドまたは抗体は、その治療的、診断的、予防的研究またはその他の使用への適用を妨げる他のタンパク質または他のポリペプチドの汚染物質が実質的に存在しない。
【００５３】
本願において、例えば、抗原結合断片、タンパク質、または抗体のようなポリペプチドの「変異体」は、他のポリペプチド配列と比較して、１つ以上のアミノ酸残基に挿入、欠失、付加および／または置換が発生したポリペプチドや、本願に開示された抗体の生物学的活性を維持するもので、融合ポリペプチドを含む。また、タンパク質変異体は、タンパク質酵素の切断、リン酸化またはその他の翻訳後修飾によって変形したが、本願に開示された抗体の生物学的活性、例えば、アルファ−シヌクレイン凝集体に結合を維持するものを含む。変異体は、本願に開示された抗体またはその抗原結合断片の配列と約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、または８０％同一のものであってもよい。
【００５４】
本願において、ポリペプチドの「誘導体」は、挿入、欠失、付加または置換変異体とは異なる、他の化学的モイエティとのコンジュゲーションにより化学的に変形したポリペプチドを意味する。
【００５５】
本願において、ポリペプチド、核酸、宿主細胞などに関連して使用された用語「自然から発見される」は、自然に存在する物質を意味する。
【００５６】
本願において、「α−Ｓｙｎ」は、ＳＮＣＡ遺伝子によってコーディングされる１４０個の残基アミノ酸から構成されたネイティブα−Ｓｙｎ（ＮＣＢＩ  ＩＤ：ＮＰ＿０００３３６）で、全長の非処理されたものはもちろん、処理された多様な形態のものを含む。また、自然に現れるα−Ｓｙｎの変異体、例えば、突然変異、スプライス変異体または対立変異体をさらに含むものである。変異体としては、１４０個の残基タンパク質のほか、エクソン３およびエクソン５が欠失した１２６個および１１２個の残基タンパク質形態も存在する（ＣＡＧ３３３９．１）。また、ＳＮＣＡ遺伝子の特定の多形成（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）またはミスセンス（ｍｉｓｓｅｎｓｅ）突然変異がパーキンソン疾患の発生と関連性があることが知られ（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ＡＢ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２００３，３０２：８４１）ており、このような突然変異体も含まれる。α−Ｓｙｎのホモログインベータ−およびガンマ−Ｓｙｎが存在する。一実施形態において、本願による抗体は、α−Ｓｙｎを特異的に認識する。α−Ｓｙｎのアミノ酸配列は、配列番号２２５で表される。
【００５７】
本願において、「α−Ｓｙｎ凝集体」は、α−Ｓｙｎの構造（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の変化によるもので、オリゴマー、プロトフィブリル、フィブリルおよび／または前記構造のうちの１つ以上を含む構造または凝集体を含む。
【００５８】
本願において、「同一性」は、２個以上のポリペプチドまたは２個以上のポリヌクレオチド配列を整列し、比較して決定される、２個以上のポリペプチドまたは２個以上のポリヌクレオチドの配列類似性を意味する。このような配列間同一性は、一般に「同一性パーセント」で表され、これは、比較される分子間の同一のアミノ酸またはヌクレオチド比率を意味し、比較される分子のうち、最も小さいサイズの分子に基づいて計算される。核酸またはポリペプチドを整列して多分子間の同一性を計算するのに用いられる方法は、次の文献を参照することができる：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．），１９８８，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．），１９９３，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．），１９９４，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，１９８７，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．），１９９１，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ；ａｎｄ  Ｃａｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．４８：１０７３。
【００５９】
同一性パーセントを計算する時、比較される配列は、配列の間に最大マッチングを提供する方式で整列され、整列された配列には、ギャップ、マッチングおよびミス−マッチが存在し、これは、特定の数学的モデルまたはコンピュータアルゴリズムで処理される。一実施形態において、このような同一性パーセントは、ＮｅｅｄｌｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈアルゴリズムを用いて、比較される配列間のマッチは最大化し、ギャップの数は最小化する方式で２つの配列を整列するＧＡＰプログラムを含むＧＣＧプログラムパッケージを用いて決定される（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９８４，１２：３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）。コンピュータアルゴリズムＧＡＰは、比較される２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列においてこれらの間のマッチは最大化し、ギャップの数は最小化する方式で２つの配列を整列して「マッチング区間（ｓｐａｎ）」を決定する。前記アルゴリズムはさらに、ギャップ開放ペナルティ（ｇａｐ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｐｅｎａｌｔｙ）［これは、３×平均項（ａｖｅｒａｇｅ  ｄｉａｇｏｎａｌ）で計算され、ここで、「平均項（ａｖｅｒａｇｅ  ｄｉａｇｏｎａｌ）」は、使用される比較マトリックス（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｍａｔｒｉｘ）の項の平均であり；「項」は、特定の比較マトリックスによるそれぞれの完全なアミノ酸マッチに割り当てられたスコアまたは数字である］およびギャップ拡張ペナルティ（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）（これは通常、ギャップ開放ペナルティの１／１０倍である）、そして、例えば、ＰＡＭ２５０またはＢＬＯＳＵＭ６２のような比較マトリックスを共に使用する。特定の実施形態において、標準比較マトリックス（ＰＡＭ２５０比較マトリックスは、Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ１９７８，５：３４５−３５２参照；ＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリックスは、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９２，８９：１０９１５−１０９１９参照）を使用する。一実施形態において、ＧＡＰプログラムを用いたポリペプチドまたはポリヌクレオチドの同一性パーセントを決定するために推奨されるパラメータは、次の通りである：アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９７０，４８：４４３−４５３；比較マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，ｓｕｐｒａ）；ギャップペナルティ：１２（末端ギャップに対するペナルティなし）；ギャップ長さペナルティ：４；類似性閾値：０。
【００６０】
特定のパラメータを用いて２つの配列を整列する時、２つの配列の間に有意な関連性がないにもかかわらず、短い配列領域において高い同一性でマッチングされる結果が導出される。この場合、２つの配列が最小５０個の連続的アミノ酸にわたって整列されるように、ＧＡＰプログラムのような、使用されるアルゴリズムのパラメータを修正すると良い。
【００６１】
本願で使用された「実質的に純粋な」は、目的の対象分子が優勢な種として存在することである。つまり、モル基準で、同一の混合物内で任意のその他の個別種より濃度がさらに高いことを意味する。一実施形態において、実質的に純粋な分子は、組成物に含まれているすべての高分子種類の最小約５０％（モル基準）、最小約８０％、約８５％、最小約９０％、最小約９５％、または最小約９９％含まれる。他の実施形態において、目的の対象分子は、公知の方法を用いてそれ以上汚染物が検出されない程度まで実質的に均質に精製され、これにより、組成物は均質な１種類の高分子物質のみを含む。
【００６２】
一態様において、本願は、α−Ｓｙｎタンパク質、またはヒトα−Ｓｙｎに結合する組換え抗体またはその抗原結合断片に関する。この側面において、「組換えタンパク質」は、組換え技術を用いて、例えば、本願に記載のような組換え核酸の発現により製造されたタンパク質である。組換えタンパク質の生産のための方法と技術は、当該技術分野で幅広く公知である。
【００６３】
本願において、「親和性」または「親和度」または「結合力」は、抗体またはその抗原結合断片と抗原との間の相互作用の強度であり、抗原の大きさ、形状および／または電荷のような抗原の特徴および抗体または抗原結合断片のＣＤＲ配列によって決定される。このような親和度を決定する方法は、当業界で公知であり、また、下記を参照することができる。
【００６４】
抗体またはその抗原結合断片は、解離定数（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ、ＫＤ）が≦１０−６Ｍの親和度で結合する時、抗原のようなその標的に「特異的に結合する」といえる。抗体は、ＫＤが≦１×１０−８Ｍの時、「高い親和性」で標的に特異的に結合する。本願による抗体または抗原結合断片の凝集体に対する親和度は、≦１×１０−９Ｍ、特に≦１×１０−１０Ｍ、特に≦１×１０−１１Ｍの高い親和度を有する。
【００６５】
本願において、「選好的に結合」は、α−ｓｙｎ凝集体にのみ結合するか、またはα−ｓｙｎ凝集体および単量体にすべて結合するが、単量体よりは凝集体により高い親和度で結合することを含む。一実施形態において、本願による抗体またはその抗原結合断片は、α−Ｓｙｎ単量体には結合せず、凝集体のみ高い親和度で特異的に結合する。他の実施形態では、本願による抗体またはその抗原結合断片は、単量体または凝集体にすべて結合するが、単量体と比較して、α−Ｓｙｎ凝集体により高い親和度で結合する。一実施形態において、α−Ｓｙｎ凝集体に対する親和度は、α−Ｓｙｎ単量体に対する親和度より最小２倍以上高く、または抗体として特異的に結合すると判断できない低い結合力で、または実験可能な濃度範囲の抗体では測定可能でない結合力で結合する。
【００６６】
本願による一実施形態では、本願による抗体または抗原結合断片のα−Ｓｙｎ凝集体に対する高い結合力は、ＫＤ≦１．０×１０−８Ｍ；他の実施形態において、ＫＤ≦１．０×１０−９Ｍ；さらに他の実施形態において、ＫＤ≦１．０×１０−１０Ｍ；さらに他の実施形態において、ＫＤ≦１×１０−１１Ｍ、さらに他の実施形態において、ＫＤ≦１×１０−１２Ｍである。このような高い親和度を有する本願による抗体または抗原結合断片は、これより低い親和度、例えば、ＫＤが１０−７Ｍまたは１０−８Ｍより大きい抗体と比較してより低い投与量で投与できるという利点がある。これは、抗体を、例えば、これに限るものではない。より簡便な皮下注射のような方式で投与しても十分な効能が得られるため、臨床において大きな利点がある。さらに、α−Ｓｙｎ凝集体に対する高い親和度を有する本願による抗体または抗原結合断片は、α−Ｓｙｎ凝集体の形成を減少させられて、脳の凝集体の濃度を低下させることができる。また、α−Ｓｙｎ凝集体に対する高い親和度を有する本願による抗体または抗原結合断片は、中枢神経系の外側におけるα−Ｓｙｎ凝集体の形成を減少させられて、結局、脳血管障壁を境界としたα−Ｓｙｎ形態間の平衡状態を変更させて、中枢神経系内の凝集体の濃度を低下させる効果をもたらすことができる。
【００６７】
本願において、「抗原結合領域または部位」は、特定の抗原に特異的に結合するタンパク質またはタンパク質の部分を意味する。これは、例えば、抗原と相互作用して、抗体に抗原に対する特異性および親和性を提供するアミノ酸残基を含む抗体の一部がこれに相当する。このような抗原結合領域は典型的に、１つ以上の「相補性決定部位」（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎ、またはＣＤＲ）を含む。特定の抗原結合領域はさらに、１つ以上の「フレームワーク」領域を含む。ＣＤＲは、抗原結合の特異性と親和性に寄与するアミノ酸配列である。フレームワーク領域は、これらＣＤＲの適切な形態（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を維持するのに役立ち、抗原結合領域と抗原との間に結合を促進することができる。
【００６８】
本願において、「抗体」は、任意のアイソタイプの無傷の免疫グロブリン、または標的抗原への結合のために無傷の抗体と競争できる抗原結合断片を意味する。例えば、キメラ、ヒト化、完全ヒトまたは二重特異的抗体またはこれらの抗原結合断片を含む。抗体は、それ自体で抗原結合タンパク質の一種でもある。無傷の抗体は、一般に少なくとも２個の全長重鎖と２個の全長軽鎖とを含むが、ラクダ科動物から自然に発見されるように、一部の場合に抗体が単に重鎖のみを含むこともある。抗体またはその抗原結合断片は、単に単一源（ｓｏｕｒｃｅ）に由来するか、またはキメラであってもよい。キメラ抗体は、２種類の異なる抗体に由来する部分を含み、以下、より詳細に記述される。抗体またはその抗原結合断片は、ハイブリドーマ、組換えＤＮＡ技術または無傷の抗体の酵素的または化学的切断によって生産される。別の言及がなければ、本願において、用語、抗体は、２個の全長重鎖と２個の全長軽鎖とを含む抗体はもちろん、これらの誘導体、変異体、断片、および突然変異体を含み、これらの例は、以下の記述の通りである。
【００６９】
本願において、「軽鎖」は、抗原またはエピトープに対する結合特異性を提供するのに十分な可変領域配列を有する全長の軽鎖およびその断片を含む。全長軽鎖は、可変領域ドメインＶＬ、および不変領域ドメインＣＬを含む。軽鎖の可変領域ドメインは、軽鎖ポリペプチドのアミノ末端に存在する。軽鎖の種類には、カッパおよびラムダ鎖が含まれる。
【００７０】
本願において、「重鎖」は、抗原またはエピトープに対する結合特異性を提供するのに十分な可変領域配列を有する全長重鎖およびその断片を含む。全長重鎖は、可変領域ドメインＶＨおよび３個の不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。ＶＨドメインは、重鎖ポリペプチドのアミノ末端に存在し、ＣＨドメインは、カルボキシ末端に存在し、ＣＨ３がカルボキシ−末端に最も近く位置する。重鎖は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４サブタイプを含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２サブタイプを含む）、ＩｇＭおよびＩｇＥのアイソタイプを含む。
【００７１】
本願に使用された、抗体または免疫グロブリンの鎖（重鎖または軽鎖）の「抗原結合断片」は、全長鎖と比較して一部のアミノ酸が欠如したが、抗原に特異的に結合できる抗体の一部を含むものである。このような断片は、標的抗原に特異的に結合可能であり、または他の抗体または抗原結合断片と特定のエピトープに結合するために競争できるという側面から、生物学的に活性があるといえる。一態様において、このような断片は、全長軽鎖または重鎖内に存在する少なくとも１つのＣＤＲを含み、一部の実施形態において、単鎖重鎖および／または軽鎖、またはその一部を含む。このような生物学的活性断片は、組換えＤＮＡ技術によって生産されるか、または、例えば、無傷の抗体を酵素的または化学的切断して生産される。免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片には、これに限るものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体および単鎖抗体を含む。また、これに限るものではないが、ヒト、マウス、ラット、カメリドまたはウサギを含む任意の哺乳動物に由来しうる。本願に開示された１つ以上のＣＤＲのような抗体の機能的な部分は、第２のタンパク質または低分子化合物と共有結合で連結され、特定の標的に対する標的治療剤として使用できる。
【００７２】
本願において、「Ｆａｂ断片」は、１個の軽鎖と、ＣＨ１および可変領域のみを含む１個の重鎖とから構成される。Ｆａｂ分子の重鎖は、他の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。
【００７３】
本願において、「Ｆｃ」領域は、抗体のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む重鎖断片を２分子含む。これら２個の重鎖断片は、２個以上のジスルフィド結合およびＣＨ３ドメインの疎水性相互作用によって互いに結合している。
【００７４】
本願において、「Ｆａｂ’断片」は、Ｆａｂ断片に重鎖のＣＨ１とＣＨ２ドメインとの間に存在する領域を追加的に含むことで、２分子のＦａｂ’断片の２つの重鎖間における鎖間ジスルフィド結合が形成されて、Ｆ（ａｂ’）２分子を形成することができる。
【００７５】
本願において、「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、先に述べたように、２個の軽鎖、および可変領域、ＣＨ１と、ＣＨ１とＣＨ２ドメインとの間における不変領域の一部を含む重鎖２分子を含むことで、２分子の重鎖間における鎖間ジスルフィド結合が形成される。したがって、Ｆ（ａｂ’）２断片は、２個のＦａｂ’断片から構成され、前記２個のＦａｂ’断片は、これらの間のジスルフィド結合によって会合されている。
【００７６】
本願において、「Ｆｖ領域」は、重鎖および軽鎖の可変領域を含むが、不変領域は含まない抗体である。
【００７７】
本願において、「単鎖抗体」は、重鎖および軽鎖可変領域が柔軟なリンカーによって連結された抗原結合領域の単一ポリペプチド鎖である。単鎖抗体は、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号を参照することができる。
【００７８】
本願において、「ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含む免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片である。一実施形態では、２個以上のＶＨ領域がペプチドリンカーによる共有結合で連結され、２価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）のドメイン抗体を形成する。このような２価のドメイン抗体の２個のＶＨ領域は、同一または異なる抗原を標的にすることができる。
【００７９】
本願において、「２価の抗原結合タンパク質」または「２価の抗体」は、２個の抗原結合部位を含む。このような２価の抗体に含まれている２個の抗原結合部位は、同一の抗原特異性を有するか、またはそれぞれ異なる抗原に結合する二重特異的抗体であってもよい。
【００８０】
本願において、「多重特異的抗原結合タンパク質」または「多重特異的抗体」は、２個以上の抗原またはエピトープを標的にするものである。
【００８１】
本願において、「二特異的」、「二重特異的」抗原結合タンパク質または抗体は、２個の異なる抗原結合部位を有するハイブリッド抗原結合タンパク質または抗体である。このような二特異的抗体は、多重特異的抗原結合タンパク質または多重特異的抗体の一種で、公知の多様な方法、例えば、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結によって生産される。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ａｎｄ  Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９０，７９：３１５−３２１；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２，１４８：１５４７−１５５３などを参照することができる。二特異的抗原結合タンパク質または抗体の２個の抗原結合部位が結合する２個の互いに異なるエピトープは、同一または異なるタンパク質の標的に位置することができる。
【００８２】
本願において、用語「抗原」または「免疫原」は、例えば、抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその免疫学的に機能的な抗原結合断片）が結合可能であり、動物において抗原に結合可能な抗体の生産に用いられる分子または分子の一部を意味する。抗原は、異なる抗体またはその断片と相互作用可能な１つ以上のエピトープを含むことができる。本願による一実施形態において、抗原は、全長α−ＳｙｎまたはＣ−末端が欠失した残基１−１２０アミノ酸残基を含むα−Ｓｙｎである。
【００８３】
本願において、「エピトープ」は、抗原結合タンパク質または抗体によって結合する、またはこれらが認識する分子の部分で、例えば、抗体またはＴ−細胞受容体のような抗原結合タンパク質に特異的に結合可能な任意の決定因子を含む。エピトープは、連続的または非連続的であってもよいし、例えば、ポリペプチド配列では互いに連続的ではないが、分子の側面からは、構造的（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）エピトープのように、１つの抗原結合タンパク質によって結合するが、互いに離れた位置のアミノ酸残基であってもよい。一実施形態において、エピトープは、抗体の生産に使用されるエピトープと類似の３次元構造を含むが、前記エピトープから発見される残基を全く含まないか、または一部の残基のみを含みうるとの側面から、模倣体であってもよい。一般に、エピトープはタンパク質であるが、核酸のような他の種類の物質であってもよい。エピトープ決定因子は、例えば、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基またはスルホニル基のような分子によって表面に形成された化学的活性グループであるか、または特定の３次元構造特徴および／または特定の電荷特徴を有することができる。一般に、特定の標的抗原に特異的な抗体は、タンパク質および／または高分子の複合体内に存在する標的抗原上のエピトープを認識する。本願による抗体は、Ｃ−末端を認識することが明らかになった。一実施形態において、本願による抗体は、α−Ｓｙｎタンパク質のＣ−末端、特に１１０−１２０残基；または他の実施形態では１１１−１２２残基を認識する。特に１１０〜１２２の間を認識する場合、凝集体選好的な結合を示すことが明らかになった。
【００８４】
本願において、「コンジュゲート」は、本願に開示された抗体またはその抗原結合断片とは異なる分子、特に後述する血管脳障壁伝達体または治療剤とのキメラ分子を称するものである。コンジュゲートにおいて、本願による抗体またはその抗原結合断片は、他の分子と、例えば、共有結合またはファンデルワールスまたは疎水性相互作用による物理的力、カプセル化、埋め込み化（ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ）または前記組み合わせを含む方法によって物理的に結合する。一実施形態によるコンジュゲートにおいて、本願による抗体またはその抗原結合断片は、ペプチドリンカーを介して連結される。また、コンジュゲートにおいて、本願による抗体またはその抗原結合断片は、治療剤と既存の化学合成方法（例えば、ＵＳ２０１０／００２８３７０）を用いてアルコール基酸基、カルボニル基、チオール基またはアミン基を介して連結される。本願において、本願による抗体またはその抗原結合断片は、他のペプチドに共有結合またはペプチドを介して連結される場合は、融合タンパク質を形成する。
【００８５】
本願において、「血管脳障壁」またはＢＢＢは、脳および脊椎とその周辺循環系との間に存在する脳の毛細血管内皮細胞膜内にタイト結合（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）によって形成された障壁である。このような障壁は非常に強固で、約６０Ｄａ分子量の低分子物質が脳に通過することも制限する。脳の血管脳障壁、脊椎の血管脊髄障壁、そして網膜の血管網膜障壁は、中枢神経系内の連続的な毛細血管障壁で、通常、ＢＢＢと称する。
【００８６】
本願において、「血管脳障壁伝達体」は、このような血管脳障壁を通過して、本願による抗体または抗原結合断片を伝達できる分子、例えば、ペプチドおよびポリペプチドを含むタンパク質、核酸、抗体、または低分子化合物を含む。
【００８７】
本願において、「治療剤」は、目的の治療効果のために対象体に投与される分子を称する。対象体は、非ヒト哺乳類、例えば、霊長類またはヒトを含む。治療剤の例としては、ペプチドおよびポリペプチドを含むタンパク質、核酸、抗体、または低分子化合物を含む。他の側面において、治療剤は、一実施形態において、本願による抗体と結合して、α−Ｓｙｎ凝集体に関連する疾患の治療剤として使用できる。
【００８８】
本願において、用語「治療する」は、例えば、負傷、疾患、または疾患症状または状態の減少、緩和、軽減、または患者が負傷、疾病、または疾患の症状または病的状態をより良く耐えられる状態にすること、負傷、疾患、または疾患の症状または病的状態の悪化速度を遅らせること、または精神的または身体的に患者の生活の質の向上を含む任意の客観的または主観的パラメータを含む、負傷、疾患、または疾患の症状または病的状態の軽減または治療を意味する。このような負傷、疾患、または疾患の症状または病的状態の治療または改善は、身体検査、疾患に関連付けられた各種指標検査および映像学的検査結果に基づいて判断される。一実施形態において、本願による方法において、α−Ｓｙｎに関連付けられた疾患の治療、疾患発生頻度の減少、疾患の深刻性を減少させ／させたり、α−Ｓｙｎに関連付けられた疾患の症状を軽減させることを含む。
【００８９】
本願において、「α−Ｓｙｎ凝集体に関連する疾患」は、レビー小体疾患またはα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙと呼ばれる一群の神経退行性疾患で、ニューロンおよびグリア集団を含む病巣からα−Ｓｙｎ凝集体が発見され、ドーパミン性システムの退化、運動能力の変化、認知障害およびレビー小体および／またはレビーニューライトの形成のような特徴を有する（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｔｈｅｒａｐｙ２０１４，６：７３；ＭｃＫｅｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（１９９６）４７：１１１３−２４）。このような疾患には、パーキンソン疾患（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ、ＰＤ）、パーキンソン疾患性痴呆（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｄｅｍｅｎｔｉａ、ＰＤＤ）、レビー小体痴呆（ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｗｉｔｈ  Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｉｅｓ、ＤＬＢ）、アルツハイマーレビー小体疾患（Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｙ  ｖａｒｉａｎｔ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ（ＬＢＶ））、複合性アルツハイマーおよびパーキンソン病（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）、多系統萎縮症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｔｒｏｐｈｙ、ＭＳＡ）およびその他の多数の神経軸索疾患を含むが、これに限るものではない。一実施形態において、本願による抗体は、ＰＤの治療に効果的に使用される。
【００９０】
本願において、「有効量」は、一般に、疾患、特にα−Ｓｙｎに関連付けられた疾患による症状の深刻性および／または発生頻度の減少、疾患、特にα−Ｓｙｎに関連付けられた疾患による症状および／または疾患発生の根本的な原因の除去、または疾患、特にα−Ｓｙｎに関連付けられた疾患による症状および／または根本的な原因の発生の予防、および／または疾患、特にα−Ｓｙｎに関連付けられた疾患による損傷を改善または矯正するのに十分な量を意味する。一部の実施形態において、有効量は、治療的有効量または予防的有効量である。「治療的有効量」は、疾患、特にα−Ｓｙｎに関連付けられた状態または症状を治療したり、または疾患、特にα−Ｓｙｎに関連付けられた状態または症状の予防、遅滞、またはその進行を逆転させるほど十分な量である。「予防的有効量」は、対象体に投与される時、意図された通り、疾患、特にα−Ｓｙｎに関連付けられた疾患の発病または再発、または疾患、特にα−Ｓｙｎに関連付けられた疾患または関連する症状を予防または遅延させ、その発生の可能性を減少させる量である。完全な治療的または予防的効果は、服用量の１回投与によって発生するよりは、服用量の数回投与によって発生できる。したがって、治療的または予防的有効量は、１回以上の投与によって伝達される。
【００９１】
抗体または抗原結合断片
本願は、ヒトα−Ｓｙｎタンパク質を含むα−Ｓｙｎタンパク質に結合する抗体または抗原結合断片を開示する。本願による抗体は、本願に開示されているように、１つ以上の相補性決定領域または部位（ＣＤＲ）を含むポリペプチドである。
【００９２】
一実施形態において、ＣＤＲは、「フレームワーク」領域に含まれ、フレームワークは、このようなＣＤＲ（ら）が適切な抗原結合特性を有しうるようにＣＤＲ（ら）を配向する。
【００９３】
本願による抗体は、ヒト由来の脳から発見されるα−Ｓｙｎ、特にα−Ｓｙｎ凝集体に高い親和度で特異的に結合することができる。
【００９４】
一実施形態において、本願による抗体は、特にα−Ｓｙｎ凝集体に高い親和度で選好的に結合し、その濃度を減少させることができる。本願による抗体または抗原結合断片によるα−Ｓｙｎ凝集体の減少または分解は、抗原抗体複合体が細胞内でリソソームによる分解を促進して病因物質を効果的に除去分解することを含む。
【００９５】
他の実施形態において、本願による抗体またはその抗原結合断片は、α−Ｓｙｎ凝集体に高い親和度で選好的に結合して、α−Ｓｙｎ凝集体が追加的に形成されることを妨げ、その濃度を低下させ、細胞間転移を抑制することができ、また、薬物への開発時、有効投与量を低下させることができる。
【００９６】
さらに他の実施形態において、本願による抗体またはその抗原結合断片は、α−Ｓｙｎ凝集体に高い親和度で選好的に結合して、α−Ｓｙｎ凝集体が１つの細胞から他の細胞に伝達されることを抑制または防止する。
【００９７】
一実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体、二重特異的抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、抗体模倣体（または合成抗体）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合体（または抗体接合体）、およびその断片を含むが、これに限らず、本願に開示された多様な形態の抗体を含む。一実施形態において、本願に開示された抗体の抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ジアボディまたは重鎖可変領域と軽鎖可変領域とがスペーサーを介して連結された単鎖の単鎖抗体分子であってもよい。他の実施形態において、本願に開示された抗体は、表１ａおよび表１ｂに開示された可変領域を含む軽鎖のみの、または重鎖のみのポリペプチドからなってもよい。
【００９８】
本願に開示された抗体は、本願に開示された他の抗体と特定の領域または配列を共有する。一実施形態では、抗体または抗原結合断片の不変領域を共有することができる。他の実施形態では、Ｆｃ領域を共有することができる。さらに他の実施形態では、可変領域のフレームを共有することができる。
【００９９】
本願に開示された抗体は、ヒトα−Ｓｙｎ凝集体に高い親和度で結合することが確認された。以下、実施例で追加的に記載されているように、多数の抗体クローンをテストした結果、Ｃ−末端の１１０−１２０または１１１−１２２残基にエピトープが存在することが明らかになった。本理論に限定するものではないが、既存のＣ末端の１２１−１３０残基を認識する抗体と比較して、本願の抗体の凝集体に対する選好的結合および高い親和度は、１１０−１２０部位を認識することに起因しうる。
【０１００】
一実施形態において、本願による抗体は、自然から発見される抗体の典型的な構造を有する。このような抗体の構造的単位体は、ラクダ科動物が単一重鎖から構成された抗体を生産するが、一般に四量体ポリペプチドを含み、四量体は、異なる２つのポリペプチド鎖から構成された一対のポリペプチド鎖体を２個含む。典型的な抗体において、前記一対のポリペプチド鎖体は、１つの全長軽鎖（約２５ｋＤａ）および１つの全長重鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を含む。各鎖は、特徴的な折り畳みパターンを示し、約９０〜１１０個のアミノ酸からなる、数個の免疫グロブリンドメインから構成されている。このようなドメインは、抗体ポリペプチドを構成している基本単位体である。各鎖のアミノ−末端部分は、典型的に抗原を認識する部分である可変領域またはＶ領域と称される部分を含む。カルボキシ−末端部分は、アミノ−末端より進化的により保存され、不変領域またはＣ領域と称される部分を含む。ヒト軽鎖は、一般にカッパ（κ）およびラムダ（λ）軽鎖として分類され、これらのそれぞれは、１つの可変領域および１つの不変領域を含む。重鎖は、典型的にミュー（μ）、デルタ（δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）またはエプシロン（ε）鎖として分類され、これらはそれぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥイソタイプで定義される。ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むが、これに限らない多数のサブタイプをさらに含む。ＩｇＭサブタイプは、ＩｇＭおよびＩｇＭ２を含む。ＩｇＡサブタイプは、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む。ヒトにおいて、ＩｇＡおよびＩｇＤアイソタイプは、４個の重鎖および４個の軽鎖を含み；ＩｇＧおよびＩｇＥアイソタイプは、２個の重鎖および２個の軽鎖を含み、ＩｇＭアイソタイプは、５個の重鎖および５個の軽鎖を含む。重鎖不変領域は、典型的に効果器機能を示す１つ以上のドメインを含む。重鎖不変領域ドメインの数はアイソタイプによって異なる。ＩｇＧ重鎖は、例えば、それぞれＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３として公知の３個のＣ領域ドメインを含む。本願に開示された抗体は、このようなアイソタイプおよびサブタイプのうちの任意の１つであってもよい。一実施形態において、本願によるα−Ｓｙｎ抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプを有することができる。
【０１０１】
本願による重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、ヒト不変領域の少なくとも一部に連結される。不変領域の選択は、部分的に抗体依存的細胞媒介細胞毒性、抗体依存的細胞食菌作用および／または補体依存的細胞毒性が要求されるかによって決定される。例えば、ヒト同種型ＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、補体依存的細胞毒性を有し、ヒト同種型ＩｇＧ２およびＩｇＧ４は、このような細胞毒性を有しない。また、ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、ヒトＩｇＧ２およびＩｇＧ４よりも強い細胞媒介エフェクター機能を誘導する。軽鎖不変領域は、ラムダまたはカッパであってもよい。
【０１０２】
他の実施形態において、本願に提供された抗体は、ヒト抗体であり、重鎖不変領域は、ＩｇＧ１−、ＩｇＧ２−、ＩｇＧ３−またはＩｇＧ４−型であってもよい。追加の実施形態において、本願の抗体は、ＩｇＧ１−またはＩｇＧ２−型である。
【０１０３】
全長の軽鎖および重鎖において、可変領域および不変領域は、約１２個以上のアミノ酸長さの「Ｊ」領域によって結合し、重鎖はまた、約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．）１９８９，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓを参照することができる。典型的に、抗体の軽鎖／重鎖対の可変領域が抗原結合部位を形成する。
【０１０４】
免疫グロブリン鎖の可変領域は、一般に全体的構造が同一であり、「相補的決定部位または領域またはドメイン」またはＣＤＲと称される３個の超可変領域によってつながる比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。重鎖／軽鎖対を構成する各鎖由来の可変領域のＣＤＲは、典型的にフレームワーク領域によって整列されて標的タンパク質（α−Ｓｙｎ）の特定のエピトープと特異的に結合する構造を形成する。自然発生軽鎖および重鎖可変領域のかかる要素は、Ｎ−末端からＣ−末端まで典型的に次の順に含まれる：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４。可変領域においてこれらのそれぞれに相当するアミノ酸配列の位置は、Ｋａｂａｔナンバリングシステム（Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８７ａｎｄ１９９１，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）、またはＣｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９８７，１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．１９８９，Ｎａｔｕｒｅ１９８９，３４２：８７８−８８３に記載のものによる。
【０１０５】
本願の一実施形態による抗体または抗原結合断片の重鎖および軽鎖可変領域およびＣＤＲ配列は、表１ａおよび表１ｂに開示される。各可変領域において、ＣＤＲ配列は下線で表し、前から後の順にそれぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を示す。
【表１ａ】
0006908709.tif 000002
【表１ｂ】
0006908709.tif 000003
【０１０６】
他の実施形態において、前記表１ａおよび表１ｂに開示された重鎖および軽鎖の可変領域は、多様な形態の抗体の製造のために自由に組み合わされる。また、前記表１ａおよび表１ｂに開示された軽鎖の各可変領域のＣＤＲと重鎖の各可変領域のＣＤＲとは自由に組み合わされる。
【０１０７】
本願に開示されたそれぞれの可変領域は、無傷の抗体のそれぞれの重鎖および軽鎖を形成するために、目的の多様な重鎖および軽鎖不変領域に結合できる。また、このように不変領域に結合したそれぞれの重鎖および軽鎖配列はさらに、無傷の抗体構造を形成するために組み合わされる。
【０１０８】
抗体の重鎖および軽鎖可変領域は、不変領域の少なくとも一部に連結される。不変領域は、抗体依存性細胞媒介細胞毒性、抗体依存性細胞性飽食作用および／または補体依存性細胞毒性などが必要であるかによって選択される。例えば、ヒトアイソタイプＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、補体依存性細胞毒性を有し、ヒトアイソタイプＩｇＧ２およびＩｇＧ４は、細胞毒性を有しない。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３はさらに、ヒトＩｇＧ２およびＩｇＧ４より強い細胞媒介効果器機能を誘導する。例えば、重鎖可変領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むＩｇＧ不変領域に、軽鎖可変領域はカッパまたはラムダ不変領域と結合できる。前記不変領域は、目的のところによって適切なものが用いられ、例えば、ヒトまたはマウス由来のものが用いられる。
【０１０９】
一実施形態において、本願に開示された重鎖可変領域は、マウスＩｇＧ２ａ不変領域、またはヒトＩｇＧ１不変領域に連結され、これはそれぞれ、配列番号１１３〜１２６（マウスＩｇＧ２ａ不変領域を含む）または配列番号１２７〜１４０（ヒトＩｇＧ１不変領域を含む）で表すことができる。
【０１１０】
他の実施形態において、本願に開示された軽鎖可変領域は、マウスカッパまたはヒトカッパ不変領域に連結され、これはそれぞれ、配列番号１４１〜１５４（マウスカッパ不変領域）および配列番号１５５〜１６８（ヒトカッパ不変領域）で表すことができる。
【０１１１】
また、本願に開示された可変領域と組み合わされるかかる不変領域配列は例示的なものであり、当業者であれば、安定性、発現、製造の可能性または他の目的の特徴などのために変形した不変領域を含む他の不変領域が用いられることが分かる。
【０１１２】
本願はさらに、本願に開示された１つ以上のアミノ酸配列と実質的な配列同一性を有する１つ以上のアミノ酸配列を含む。実質的同一性とは、本願は、配列変異が存在する本願に開示された効果を維持することを意味する。一実施形態において、表１に開示された重鎖可変領域と約９０％、９５％、または９９％の同一性を有する。他の実施形態において、表１に開示された軽鎖可変領域と約９０％、９５％、または９９％の同一性を有する。例えば、本願に開示された抗体または抗原結合断片の配列と９０％、９５％、または９９％の同一性を示す変異体の場合、任意の変異は、ＣＤＲよりは可変領域の骨格で発生する。
【０１１３】
本願はさらに、本願に開示された抗体またはその抗原結合断片の全部または一部をコーディングする核酸が開示される。前記核酸は、抗体各鎖、または前記抗体の断片、その突然変異、誘導体、または変異体をコーディングするポリヌクレオチド、軽鎖または重鎖可変領域または単にＣＤＲをコーディングするポリヌクレオチド、混成化プローブとして使用するのに十分なポリヌクレオチド、ポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドを増幅、究明、分析または突然変異の誘発に使用されるＰＣＲまたは塩基配列分析プライマーを含む。核酸は、任意の長さであってもよい。これらは、例えば、長さが５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１，０００、１，５００個以上のポリヌクレオチドであり／るか、１つ以上の追加の配列、例えば、調節配列を包み／むか、より大きい核酸、例えば、ベクターの一部であってもよい。核酸は、単鎖または二重鎖であってもよく、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡポリヌクレオチド、およびその人工変異体（例、ペプチド核酸）を含むことができる。
【０１１４】
一実施形態において、本願に開示された抗体をコーディングする核酸は、本願に開示されたＣＤＲ、前記ＣＤＲを含む可変領域、可変領域および不変領域を含む全長抗体をコーディングする核酸である。アミノ酸配列が決定されると、核酸配列は、公知の逆転写プログラムおよびコドン使用頻度（ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ）などを考慮して容易に決定される。例示的な核酸配列は、配列番号１６９〜１８２（マウスＩｇＧ２ａ不変領域を含む重鎖）、配列番号１８３〜１９６（ヒトＩｇＧ１不変領域を含む重鎖）、配列番号１９７〜２１０（マウスカッパ不変領域を含む軽鎖）および配列番号２１１〜２２４（ヒトカッパ不変領域を含む軽鎖）が挙げられる。
【０１１５】
本願はさらに、本願に開示された１つ以上の核酸配列と実質的な配列同一性を有する１つ以上の核酸配列を含む。実質的同一性とは、核酸の変異がアミノ酸置換を伴わない保存的置換またはアミノ酸の変異をもたらす場合でも、前記核酸によってコーディングされる抗体または抗原結合断片が本願に開示された効果を維持することを意味する。
【０１１６】
抗体の凝集体に対する特異性および親和度
本願による抗体または抗原結合断片は、特にα−Ｓｙｎ凝集体に対する特異性および高い親和度を有する。一実施形態において、図６によれば、凝集体に対する親和度は、ＫＤ≦１．０×１０−９Ｍ；他の実施形態において、ＫＤ≦１．０×１０−１０Ｍ；さらに他の実施形態において、ＫＤ≦１×１０−１１Ｍである。このような高い親和度を有する本願による抗体または抗原結合断片は、これより低い親和度、例えば、親和度が１０−７Ｍまたは１０−８Ｍより大きい抗体と比較してより低い投与量で投与できるという利点がある。これは抗体を、例えば、これに限るものではないが、より簡便な皮下注射のような方式で投与しても十分な効能が得られるため、臨床において大きな利点がある。さらに、α−Ｓｙｎ凝集体に対する高い親和度を有する本願による抗体または抗原結合断片は、α−Ｓｙｎ凝集体の形成および／または蓄積および／または細胞間伝達を抑制および／または減少させられて、脳における凝集体の濃度を低下させることができる。また、α−Ｓｙｎ凝集体に対する高い親和度を有する本願による抗体または抗原結合断片は、中枢神経系の外側におけるα−Ｓｙｎ凝集体の形成を減少させられて、結局、脳血管障壁を境界としたα−Ｓｙｎ形態間の平衡状態を変更させて、中枢神経系内の凝集体の濃度を低下させる効果をもたらすことができる。さらに、本理論に限定するものではないが、本願による抗体または抗原結合断片は、単量体の除去による凝集体形成の抑制、または単量体と凝集体をすべて除去することができる。
【０１１７】
抗体の可変領域
本願はさらに、前記表１ａおよび表１ｂに示すような抗体軽鎖可変領域または抗体重鎖可変領域およびこのような軽鎖および重鎖可変領域の免疫学的機能的断片、誘導体、突然変異タンパク質および変異体を含む抗体（および相応する核酸配列）が開示される。
【０１１８】
また、表１ａおよび表１ｂに示す可変領域をコーディングする核酸配列が含まれる。このような核酸配列は、本願に開示された配列番号１６９〜１８２（マウスＩｇＧ２ａ不変領域を含む重鎖）、配列番号１８３〜１９６（ヒトＩｇＧ１不変領域を含む重鎖）、配列番号１９７〜２１０（マウスカッパ不変領域を含む軽鎖）および配列番号２１１〜２２４（ヒトカッパ不変領域を含む軽鎖）に開示された全長抗体をコーディングする核酸配列に含まれるため、別途に記載されず、当業者であれば、表１に開示された可変領域のタンパク質配列に基づいて、これをコーディングする核酸配列を容易に確認することができる。
【０１１９】
本願による重鎖および軽鎖の可変領域は、多様に組み合わされる。このように多様に組み合わされた抗体は、「ＶＨｘ／ＶＬｙ」で表すことができ、ここで、「ｘ」は、重鎖可変領域の配列番号に相応し、「ｙ」は、軽鎖可変領域の配列番号に相応する。一実施形態において、本願による可変領域は、次の組み合わせを含むことができるが、これに限るものではない：ＶＨ８５／ＶＬ９９、ＶＨ８５／ＶＬ１００、ＶＨ８５／ＶＬ１０１、ＶＨ８５／ＶＬ１０２、ＶＨ８５／ＶＬ１０３、ＶＨ８５／ＶＬ１０４、ＶＨ８５／ＶＬ１０５、ＶＨ８５／ＶＬ１０６、ＶＨ８５／ＶＬ１０７、ＶＨ８５／ＶＬ１０８、ＶＨ８５／ＶＬ１０９、ＶＨ８５／ＶＬ１１０、ＶＨ８５／ＶＬ１１１、ＶＨ８５／ＶＬ１１２；ＶＨ８６／ＶＬ９９、ＶＨ８６／ＶＬ１００、ＶＨ８６／ＶＬ１０１、ＶＨ８６／ＶＬ１０２、ＶＨ８６／ＶＬ１０３、ＶＨ８６／ＶＬ１０４、ＶＨ８６／ＶＬ１０５、ＶＨ８６／ＶＬ１０６、ＶＨ８６／ＶＬ１０７、ＶＨ８６／ＶＬ１０８、ＶＨ８６／ＶＬ１０９、ＶＨ８６／ＶＬ１１０、ＶＨ８６／ＶＬ１１１、ＶＨ８６／ＶＬ１１２；ＶＨ８７／ＶＬ９９、ＶＨ８７／ＶＬ１００、ＶＨ８７／ＶＬ１０１、ＶＨ８７／ＶＬ１０２、ＶＨ８７／ＶＬ１０３、ＶＨ８７／ＶＬ１０４、ＶＨ８７／ＶＬ１０５、ＶＨ８７／ＶＬ１０６、ＶＨ８７／ＶＬ１０７、ＶＨ８７／ＶＬ１０８、ＶＨ８７／ＶＬ１０９、８７／ＶＬ１１０、ＶＨ８７／ＶＬ１１１、ＶＨ８７／ＶＬ１１２；ＶＨ８８／ＶＬ９９、ＶＨ８８／ＶＬ１００、ＶＨ８８／ＶＬ１０１、ＶＨ８８／ＶＬ１０２、ＶＨ８８／ＶＬ１０３、ＶＨ８８／ＶＬ１０４、ＶＨ８８／ＶＬ１０５、ＶＨ８８／ＶＬ１０６、ＶＨ８８／ＶＬ１０７、ＶＨ８８／ＶＬ１０８、ＶＨ８８／ＶＬ１０９、ＶＨ８８／ＶＬ１１０、ＶＨ８８／ＶＬ１１１、ＶＨ８８／ＶＬ１１２；ＶＨ８９／ＶＬ９９、ＶＨ８９／ＶＬ１００、ＶＨ８９／ＶＬ１０１、ＶＨ８９／ＶＬ１０２、ＶＨ８９／ＶＬ１０３、ＶＨ８９／ＶＬ１０４、ＶＨ８９／ＶＬ１０５、ＶＨ８９／ＶＬ１０６、ＶＨ８９／ＶＬ１０７、ＶＨ８９／ＶＬ１０８、ＶＨ８９／ＶＬ１０９、ＶＨ８９／ＶＬ１１０、ＶＨ８９／ＶＬ１１１、ＶＨ８９／ＶＬ１１２；ＶＨ９０／ＶＬ９９、ＶＨ９０／ＶＬ１００、ＶＨ９０／ＶＬ１０１、ＶＨ９０／ＶＬ１０２、ＶＨ９０／ＶＬ１０３、ＶＨ９０／ＶＬ１０４、ＶＨ９０／ＶＬ１０５、ＶＨ９０／ＶＬ１０６、ＶＨ９０／ＶＬ１０７、ＶＨ９０／ＶＬ１０８、ＶＨ９０／ＶＬ１０９、ＶＨ９０／ＶＬ１１０、ＶＨ９０／ＶＬ１１１、ＶＨ９０／ＶＬ１１２；ＶＨ９１／ＶＬ９９、ＶＨ９１／ＶＬ１００、ＶＨ９１／ＶＬ１０１、ＶＨ９１／ＶＬ１０２、ＶＨ９１／ＶＬ１０３、ＶＨ９１／ＶＬ１０４、ＶＨ９１／ＶＬ１０５、ＶＨ９１／ＶＬ１０６、ＶＨ９１／ＶＬ１０７、ＶＨ９１／ＶＬ１０８、ＶＨ９１／ＶＬ１０９、ＶＨ９１／ＶＬ１１０、ＶＨ９１／ＶＬ１１１、ＶＨ９１／ＶＬ１１２；ＶＨ９２／ＶＬ９９、ＶＨ９２／ＶＬ１００、ＶＨ９２／ＶＬ１０１、ＶＨ９２／ＶＬ１０２、ＶＨ９２／ＶＬ１０３、ＶＨ９２／ＶＬ１０４、ＶＨ９２／ＶＬ１０５、ＶＨ９２／ＶＬ１０６、ＶＨ９２／ＶＬ１０７、ＶＨ９２／ＶＬ１０８、ＶＨ９２／ＶＬ１０９、ＶＨ９２／ＶＬ１１０、ＶＨ９２／ＶＬ１１１、ＶＨ９２／ＶＬ１１２；ＶＨ９３／ＶＬ９９、ＶＨ９３／ＶＬ１００、ＶＨ９３／ＶＬ１０１、ＶＨ９３／ＶＬ１０２、ＶＨ９３／ＶＬ１０３、ＶＨ９３／ＶＬ１０４、ＶＨ９３／ＶＬ１０５、ＶＨ９３／ＶＬ１０６、ＶＨ９３／ＶＬ１０７、ＶＨ９３／ＶＬ１０８、ＶＨ９３／ＶＬ１０９、ＶＨ９３／ＶＬ１１０、ＶＨ９３／ＶＬ１１１、ＶＨ９３／ＶＬ１１２；ＶＨ９４／ＶＬ９９、ＶＨ９４／ＶＬ１００、ＶＨ９４／ＶＬ１０１、ＶＨ９４／ＶＬ１０２、ＶＨ９４／ＶＬ１０３、ＶＨ９４／ＶＬ１０４、ＶＨ９４／ＶＬ１０５、ＶＨ９４／ＶＬ１０６、ＶＨ９４／ＶＬ１０７、ＶＨ９４／ＶＬ１０８、ＶＨ９４／ＶＬ１０９、ＶＨ９４／ＶＬ１１０、ＶＨ９４／ＶＬ１１１、ＶＨ９４／ＶＬ１１２；ＶＨ９５／ＶＬ９９、ＶＨ９５／ＶＬ１００、ＶＨ９５／ＶＬ１０１、ＶＨ９５／ＶＬ１０２、ＶＨ９５／ＶＬ１０３、ＶＨ９５／ＶＬ１０４、ＶＨ９５／ＶＬ１０５、ＶＨ９５／ＶＬ１０６、ＶＨ９５／ＶＬ１０７、ＶＨ９５／ＶＬ１０８、ＶＨ９５／ＶＬ１０９、ＶＨ９５／ＶＬ１１０、ＶＨ９５／ＶＬ１１１、ＶＨ９５／ＶＬ１１２；ＶＨ９６／ＶＬ９９、ＶＨ９６／ＶＬ１００、ＶＨ９６／ＶＬ１０１、ＶＨ９６／ＶＬ１０２、ＶＨ９６／ＶＬ１０３、ＶＨ９６／ＶＬ１０４、ＶＨ９６／ＶＬ１０５、ＶＨ９６／ＶＬ１０６、ＶＨ９６／ＶＬ１０７、ＶＨ９６／ＶＬ１０８、ＶＨ９６／ＶＬ１０９、ＶＨ９６／ＶＬ１１０、ＶＨ９６／ＶＬ１１１、ＶＨ９６／ＶＬ１１２；ＶＨ９７／ＶＬ９９、ＶＨ９７／ＶＬ１００、ＶＨ９７／ＶＬ１０１、ＶＨ９７／ＶＬ１０２、ＶＨ９７／ＶＬ１０３、ＶＨ９７／ＶＬ１０４、ＶＨ９７／ＶＬ１０５、ＶＨ９７／ＶＬ１０６、ＶＨ９７／ＶＬ１０７、ＶＨ９７／ＶＬ１０８、ＶＨ９７／ＶＬ１０９、ＶＨ９７／ＶＬ１１０、ＶＨ９７／ＶＬ１１１、ＶＨ９７／ＶＬ１１２；ＶＨ９８／ＶＬ９９、ＶＨ９８／ＶＬ１００、ＶＨ９８／ＶＬ１０１、ＶＨ９８／ＶＬ１０２、ＶＨ９８／ＶＬ１０３、ＶＨ９８／ＶＬ１０４、ＶＨ９８／ＶＬ１０５、ＶＨ９８／ＶＬ１０６、ＶＨ９８／ＶＬ１０７、ＶＨ９８／ＶＬ１０８、ＶＨ９８／ＶＬ１０９、ＶＨ９８／ＶＬ１１０、ＶＨ９８／ＶＬ１１１、またはＶＨ９８／ＶＬ１１２。
【０１２０】
先に言及したような前記多様な可変領域の組み合わせは、無傷の抗体またはｓｃＦＶなどを含む多様な形態の抗体として使用できる。
【０１２１】
ＣＤＲ
本願に開示された抗体は、１つ以上のＣＤＲがグラフト、挿入および／または連結されたポリペプチドである。一実施形態において、抗体は、１、２、３、４、５または６つのＣＤＲを有することができる。抗体はこのため、例えば、１つの重鎖ＣＤＲ１（「ＣＤＲＨ１」）、および／または１つの重鎖ＣＤＲ２（「ＣＤＲＨ２」）、および／または１つの重鎖ＣＤＲ３（「ＣＤＲＨ３」）、および／または１つの軽鎖ＣＤＲ１（「ＣＤＲＬ１」）、および／または１つの軽鎖ＣＤＲ２（「ＣＤＲＬ２」）、および／または１つの軽鎖ＣＤＲ３（「ＣＤＲＬ３」）を有することができる。
【０１２２】
一般に、抗体の相補的決定部位（ＣＤＲ）およびフレーム領域（ＦＲ）は、文献（参照：Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＰＨＳ，ＮＩＨ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．９１−３２４２、１９９１）に記載のシステムを用いて識別することができる。
【０１２３】
本願による抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲは、表１ａおよび１ｂ（または重鎖ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１〜１４、Ｈ２は配列番号１５〜２８、Ｈ３は配列番号２９〜４２で表され、軽鎖ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号４３〜５６、Ｌ２は配列番号５７〜７０、Ｌ３は配列番号７１〜８４）に開示されている。
【０１２４】
本願はさらに、表１ａおよび１ｂに開示された１つ以上のアミノ酸配列と実質的な配列同一性を有する１つ以上のアミノ酸配列を含む。実質的同一性とは、本願は、配列変異が存在する本願に開示された効果を維持することを意味する。
【０１２５】
自然発生抗体のＣＤＲの構造および特性は、先に言及した通りである。簡単に、典型的な抗体において、ＣＤＲは、抗原結合および認識に関与する領域を構成する重鎖および軽鎖可変領域中のフレームワーク内に含まれる。可変領域は、フレームワーク領域内に少なくとも３つの重鎖または軽鎖ＣＤＲを含む（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｎ．Ｉ．Ｈ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ；また、Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９８７，１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．１９８９，Ｎａｔｕｒｅ１９８９，３４２：８７７−８８３）。しかし、本願に開示されたように、ＣＤＲは、典型的な抗体構造の抗原結合ドメインを定義するために用いられ、また、本願に記載されているように、他の多様なポリペプチド構造に含まれて用いられる。
【０１２６】
当業者であれば、抗体が本願に開示された１つ以上のＣＤＲを含む場合、開示された各ＣＤＲは、互いに独立して選択されて組み合わされうることを理解するであろう。したがって、１、２、３、４、５、または６つの独立して選択されたＣＤＲを有する抗体が生成される。また、組み合わせのためにＣＤＲが選択される時、同じ種類のＣＤＲが繰り返し使用されず、例えば、抗体は、一般に２つのＣＤＲＨ２領域を含んで製造されないことを当業者であれば分かるであろう。
【０１２７】
モノクローナル抗体
本願に開示された抗体は、α−Ｓｙｎ、特にその凝集体に結合するモノクローナル抗体を含む。モノクローナル抗体は、当該技術分野で公知の任意の技術を用いて製造される。例えば、免疫化された形質転換動物から収穫された脾臓細胞を不滅化させることにより生産される。脾臓細胞は、当該技術分野で公知の任意の技術を用いて、例えば、これらを骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを生産することにより不滅化させることができる。ハイブリドーマ−生産融合手順に用いるための骨髄腫細胞は、好ましくは非−抗体−生産性であり、高い融合効率を有し、そして、特定の酵素が欠如して、これらが目的の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの成長を支援する特定の選択培地中で成長できないようにする。マウス融合に用いるための適切な細胞株の例としては、Ｓｐ−２０、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ４１、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ１．７およびＳ１９４／５ＸＸＯ  Ｂｕｌが含まれ；ラット融合に使用される細胞株の例としては、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ１．２．３、ＩＲ９８３Ｆおよび４Ｂ２１０が含まれる。細胞融合に有用な他の細胞株は、Ｕ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２およびＵＣ７２９−６が挙げられる。
【０１２８】
一部の場合に、ハイブリドーマ細胞株は、動物（例えば、ヒト免疫グロブリン配列を有する形質転換動物、α−Ｓｙｎ免疫原で免疫化された動物から脾臓細胞を収穫し；収穫された脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合してハイブリドーマ細胞を生成し；ハイブリドーマ細胞からハイブリドーマ細胞株を確立し、α−Ｓｙｎに結合する抗体を生産するハイブリドーマ細胞株を識別することにより生産される。
【０１２９】
ハイブリドーマ細胞株によって分泌されたモノクローナル抗体は、当該技術分野で公知の技術を用いて精製することができる。
【０１３０】
キメラおよびヒト化抗体
抗体はまた、多様な目的のために多様な方式で変形できる。キメラおよびヒト化抗体がさらに提供される。キメラ抗体は、異なる抗体に由来するポリペプチド断片が共有結合で連結され、免疫学的に機能的な軽鎖、重鎖またはその断片を形成する抗体である。一般に、キメラ抗体の軽鎖および／または重鎖の一部分は、特定の種または特定のクラスまたはサブタイプに属する配列であり、残りの配列は、他の種または他のクラスまたはサブタイプに属する。キメラ抗体の製造方法について、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９８５，８１：６８５１−６８５５を参照することができる。ＣＤＲ移植（ｇｒａｆｔｉｎｇ）は、例えば、米国特許第６，１８０，３７０号、第５，６９３，７６２号、第５，６９３，７６１号、第５，５８５，０８９号および第５，５３０，１０１号を参照することができる。
【０１３１】
一般に、キメラ抗体を製造する目的は、抗体が使用される生物体から発見されるアミノ酸の数を最大に含むことである。一例は、「ＣＤＲ−移植（ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｅｄ）」抗体であるが、ここで、前記抗体は、特定の一種、または特定のクラスまたはサブタイプ由来の１つ以上のＣＤＲを含み、残りの部分は、他の種、または他のクラスまたはサブタイプ抗体由来である。ヒトに使用するために、齧歯類抗体の可変領域または選択されたＣＤＲがヒト抗体内に移植され、ヒト抗体の自然に現れる可変領域またはＣＤＲを代替する。
【０１３２】
キメラ抗体の一つの有用な類型は、「ヒト化」抗体である。一般に、ヒト化抗体は、非−ヒト動物で最初に生成されたモノクローナル抗体から生産される。このようなモノクローナル抗体において、典型的に抗体の非−抗原認識部分を構成する特定のアミノ酸残基がヒト抗体の相応するアイソタイプの相応する残基と相同性がなされるように変形する。ヒト化は、例えば、公知の多様な方法を利用して、齧歯類可変領域の少なくとも一部をヒト抗体の相応する領域に置換することにより行われる（米国特許第５，５８５，０８９号および第５，６９３，７６２号；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ１９８６，３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ１９８８，３３２：３２３−２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ１９８８，２３９：１５３４−１５３６）。
【０１３３】
一側面において、本願に開示された抗体の軽鎖および重鎖可変領域のＣＤＲは、系統発生的に同一または異なる種に由来する抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）に移植される。例えば、本願に開示された重鎖および軽鎖可変領域のＣＤＲは、保存されたヒトＦＲに移植される。保存されたヒトＦＲを生成するために、様々な種類のヒトの重鎖または軽鎖アミノ酸配列を整列し、これからＦＲがコンセンサスアミノ酸配列を導出することができる。他の実施形態において、本願に開示された重鎖または軽鎖のＦＲは、異なる重鎖または軽鎖のＦＲに代替される。一態様において、抗−α−Ｓｙｎ抗体の重鎖および軽鎖のＦＲ内にのみ発見される特異なアミノ酸は代替されないのに対し、残りのＦＲアミノ酸は代替される。特別なアミノ酸は、通常、ＦＲ内で観察されない位置に存在する特定のアミノ酸である。代案的に、１つの重鎖または軽鎖から移植された可変領域は、本願に開示されたような特別な重鎖または軽鎖の不変領域とは異なる不変領域と共に使用できる。他の実施形態において、移植された可変領域は、単鎖Ｆｖ抗体の一部である。本願に開示された抗体の軽鎖および重鎖可変領域のＣＤＲは、すべての抗体に移植されて使用できる。
【０１３４】
また、一実施形態において、ヒト以外の種に由来する不変領域は、ヒト由来の可変領域と組み合わされたハイブリッド抗体が使用できる。
【０１３５】
完全ヒト抗体
完全ヒト抗体がさらに開示される。ヒトを抗原に露出させることなく所定の抗原（「完全ヒト抗体」）に特異的な完全ヒト抗体を製造することができる。完全ヒト抗体を生成する一つの方法は、マウス体液性免疫系を「ヒト化」することである。内因性Ｉｇ遺伝子が不活性化されたマウスにヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座を導入して、マウスで完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を生成することができる。完全ヒト抗体を用いると、マウスまたはマウス−由来のｍＡｂをヒトに投与することによって誘発されうる免疫原性反応およびアレルギー反応を最小化することができる。
【０１３６】
完全ヒト抗体は、内因性免疫グロブリンの生成が欠乏してヒト抗体を生成できる形質転換動物（通常、マウス）を免疫化させることにより生成される。この目的のための抗原は典型的に、６個またはそれ以上の連続的アミノ酸を有し、任意に担体、例えば、ハプテンに接合される。例えば、次を参照することができる：Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９９３，９０：２５５１−２５５５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ１９９３，３６２：２５５−２５８；そしてＢｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９３，７：３３。一例として、この方法で形質転換動物はマウスの重鎖および軽鎖免疫グロブリン鎖をコーディングする内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座位が無力化し、ヒトの重鎖および軽鎖タンパク質をコーディングするヒトゲノムＤＮＡを含む遺伝子座（ｌｏｃｉ）断片がマウスゲノム内に挿入されて生成される。ヒト免疫グロブリン遺伝子座を部分的に含む部分的に変形したマウスを交差交配して無傷のヒト免疫グロブリン遺伝子座が導入されたマウスを生成する。前記動物に免疫原が投与されると、前記免疫原に免疫特異的であるが、可変領域を含む抗体がミューリンではないヒトアミノ酸配列を有する。この方法は、例えば、ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９４／０２６０２を参照する。ヒト抗体を製造するための形質転換マウスに関連する方法は、米国特許第５，５４５，８０７号；第６，７１３，６１０号；第６，６７３，９８６号；第６，１６２，９６３号；第５，５４５，８０７号；第６，３００，１２９号；第６，２５５，４５８号；第５，８７７，３９７号；第５，８７４，２９９号および第５，５４５，８０６号；ＷＯ９１／１０７４１号、第ＷＯ９０／０４０３６号、およびＥＰ第５４６０７３Ｂ１号を参照することができる。
【０１３７】
次に、ハイブリドーマ技術を用いて、目的の特異性を有する抗原−特異的ヒトｍＡｂが遺伝子導入マウス、例えば、先に記述されたものから生成され選択される。このような抗体は、適切なベクターおよび宿主細胞を用いてクローニングされ発現するか、または前記抗体は培養されたハイブリドーマ細胞から収穫される。
【０１３８】
完全ヒト抗体はまた、ファージ−ディスプレイライブラリー（ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ）に由来できる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９１，２２７：３８１；そしてＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９１，２２２：５８１）。ファージディスプレイ技術は、フィラメント（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ）バクテリオファージの表面上で抗体レパートリーをディスプレイして、これから目的の抗原に結合するファージを選別する一種の免疫選択（ｉｍｍｕｎｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）を模倣した方法である。かかる一つの技術は、本願の実施例またはＰＣＴ公開公報第ＷＯ９９／１０４９４号を参照することができる。一実施形態において、本願のヒト化α−Ｓｙｎ抗体は、ファージディスプレイ方法により選別される（Ｋｒｅｂｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９７，２０１：３５）。
【０１３９】
二重特異的または二重機能性抗体
本願に開示された抗体はまた、前記のような１つ以上のＣＤＲまたは１つ以上の可変領域を含む二重特異的抗体および二重機能性抗体を含む。一部の場合に、二重特異的または二重機能性抗体は、２個の異なる重鎖／軽鎖対および２個の異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異的抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結のような多様な方法を利用して製造される（Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ａｎｄ  Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９０，７９：３１５−３２１；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２，１４８：１５４７−１５５３）。
【０１４０】
本願による一実施形態において、本願による抗体は、血管脳障壁を通過して伝達されるために伝達体に対する結合を追加的に含む二重特異的抗体の形態を取ることができる。血管脳障壁を通して薬物を伝達するための一つの方法は、細胞に内在したグリコースおよびアミノ酸伝達体、インスリンまたはトランスフェリンの受容体媒介トランスサイトーシスのような伝達システムの使用を含む。例えば、受容体媒介トランスサイトーシスのシステムの受容体の例は、次の通りである：ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ｅ．ｇ．，ｈｕｍａｎ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＬＲＰ（ｅ．ｇ．，ＬＲＰ１、ＬＲＰ６  ａｎｄ  ＬＲＰ８）、ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＶＡＣＭ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＩＧＦＲ、ＥＰＣＲ、ＥＧＦＲ、ＴＮＦＲ、Ｌｅｐｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｍ６ＰＲ、Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＮＣＡＭ、ＬＩＦＲ、ＬｆＲ、ＭＲＰ１、ＡｃｈＲ、ＤＴｒ、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ、ＳＲ−Ｂ１、ＭＹＯＦ、ＴＦＲＣ、ＥＣＥ１、ＬＤＬＲ、ＰＶＲ、ＣＤＣ５０Ａ、ＳＣＡＲＦ１、ＭＲＣ１、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＲＡＭＰ２、ＶＬＤＬＲ、ＳＴＡＢ１、ＴＬＲ９、ＣＸＣＬ１６、ＮＴＲＫ１、ＣＤ７４、ＤＰＰ４、ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ１、２ａｎｄ３、ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｉｏｎｏｔｒｏｐｉｃ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｍ３  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ａｒｙｌ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＧＬＵＴ−１、ｉｎｏｓｉｔｏｌ−１，４，５−ｔｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＩＰ３）ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ａｓｐａｒｔａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｓ１Ｐ１、Ｐ２Ｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＭＥＭ３０Ａ、ＲＡＧＥ。
【０１４１】
多様な抗体変異体
本願に開示された抗体はまた、前記本願に開示された抗体の変異体である。例えば、抗原の一部は、前記開示された重鎖または軽鎖、可変領域またはＣＤＲ配列の１つ以上の残基で保存的（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）アミノ酸置換を含む。自然−発生アミノ酸は、側鎖特性における共通的特徴に基づいて次のように分類される。１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；５）鎖方向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１４２】
保存的アミノ酸置換は、前記分類のうち同一の分類に属する他の残基への置換を称する。保存的アミノ酸置換はまた、ペプチド模倣体のような非−自然−発生アミノ酸残基を含むことができ、このような残基は、典型的に細胞ではない、化学的合成によって導入される。
【０１４３】
非−保存的置換は、前記分類のうち他の分類に属する残基への置換を含む。このような置換は、ヒト抗体と相同性である抗体の領域または非−相同性領域内に導入される。
【０１４４】
このような置換を導入するにあたり、一実施形態において、アミノ酸の疎水性または親水性を示す指数（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｄｅｘ）が考慮される。タンパク質の指数プロファイル（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｅ）は、各アミノ酸に指数を指定し、この後、ポリペプチドに応じてこれらの値を繰り返し平均することにより計算される。各アミノ酸の指数は、疎水性と電荷特性に基づいて次のように指定される：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタメート（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパルテート（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【０１４５】
タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与するにあたり、指数プロファイルの重要性は当業界で知られたものである（Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９８２，１５７：１０５−１３１）。特定のアミノ酸はこれと類似の数値指数またはスコアを有する他のアミノ酸で置換されてもよいし、類似の生物学的活性を維持できることが知られている。一実施形態において、指数に基づく変化を行うにあたり、指数が±２内、±１内、または±０．５内にあるアミノ酸の置換が含まれる。
【０１４６】
また、類似のアミノ酸同士の置換、特に置換によって生成されるタンパク質が本願に開示されたような免疫学的に活性があるタンパク質の場合に、親水性に基づいて行われる。一実施形態において、隣接アミノ酸の親水性によって決定される、タンパク質の最大ローカル平均親水性値が免疫原性および抗原−結合性のようなタンパク質の生物学的特性と関連性がある。
【０１４７】
アミノ酸残基の親水性値は、次の通りである：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパルテート（＋３．０±１）；グルタメート（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）およびトリプトファン（−３．４）。類似の親水性値に基づいて置換をする場合、一実施形態において、親水性値が±２内、±１内、または±０．５内にあるアミノ酸の置換が含まれる。また、親水性に基づいて１次アミノ酸配列からエピトープを識別することもできる。これらの領域はさらに、「エピトープコア領域」と称される。
例示的な保存性アミノ酸置換は、表２に示す。
【表２】
0006908709.tif 000004
【０１４８】
当業者であれば、公知の技術を用いて本願に開示されたポリペプチドの適切な変異体を決定することができる。当業者であれば、ポリペプチドにおいて活性に重要と考えられない領域を変異体の標的にして、活性を破壊することなくタンパク質を変化させられる部位を探し出すことができる。当業者であれば、また、類似のポリペプチド間で保存される残基および部分を識別することができる。さらに、他の実施形態において、生物学的活性または構造に重要と考えられる部分も、生物学的活性を破壊することなく、またはポリペプチド構造に否定的な影響を与えることなく保存的アミノ酸置換が行われる。
【０１４９】
さらに、当業者は、類似のポリペプチドにおいて活性または構造に重要な残基を識別するために構造−機能的分析を行うことができる。このような分析により、あるタンパク質において、これと類似のタンパク質の活性または構造に重要なアミノ酸残基に相応する残基を探して、目的のタンパク質において重要なアミノ酸残基を予測することができる。当業者は、このように予測された重要なアミノ酸残基をこれと化学的に類似のアミノ酸に置換可能である。
【０１５０】
当業者はまた、類似のポリペプチドの３次元構造とこれに関連付けられたアミノ酸配列分析に基づいて抗体の３次元構造に関連するアミノ酸残基を予測することができる。当業者は、タンパク質の表面に存在すると予測されるアミノ酸残基は、他の分子との重要な相互作用に関与できるため、急激な変化を導入しない。しかも、当業者はそれぞれの目的のアミノ酸残基において単一のアミノ酸置換を含む試験変異体を生成することができる。これらの変異体はこの後、抗原に対する結合力を利用してスクリーニングされて、どのアミノ酸置換が目的に符合するかに関する情報を得ることができる。このような情報を用いて、当業者であれば、当業者は、置換される位置、回避されなければならない位置を容易に決定できる。
【０１５１】
また、タンパク質の２次構造に基づいて置換される位置を決定できる。例えば、２次構造を予測する一つの方法は、相同性モデリング（ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ）に基づく。例えば、３０％超過の配列同一性、または４０％超過の類似性を有する２個のポリペプチドまたはタンパク質は、類似の構造的位相を有することができる（Ｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１９９９，２７：２４４−２４７）。２次構造を予測する付加的な方法には、「スレディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」（Ｊｏｎｅｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１９７７，７：３７７−３８７；Ｓｉｐｐｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ１９９６，４：１５−１９）、「プロピル分析」（Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９１，２５３：１６４−１７０；Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１９９０，１８３：１４６−１５９；Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９８７，８４：４３５５−４３５８）、および「進化的連鎖（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｌｉｎｋａｇｅ）」（Ｈｏｌｍ，１９９９，ｉｂｉｄ；およびＢｒｅｎｎｅｒ，１９９７，ｉｂｉｄ）が含まれる。
【０１５２】
一部の実施形態において、アミノ酸置換は、（１）タンパク質の分解に対する敏感性を減少、（２）酸化に対する敏感性を減少、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変更、（４）抗原結合親和性を変更および／または、（４）タンパク質に他の物理化学的または機能的特性を付与するように変更が行われる。例えば、保存的置換を含む単一または複数のアミノ酸置換は、抗体において、分子間接触に関与するドメインではない、その他の部分で置換が行われる。このような実施形態において、親配列の構造的特徴を実質的に変化させない保存的アミノ酸置換、例えば、親抗体の２次構造を変更させない１つ以上のアミノ酸への置換が使用できる。当該技術分野で知られたポリペプチド２次および３次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｅｄ．），１９８４，Ｗ．Ｈ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｂｒａｎｄｅｎ  ａｎｄ  Ｔｏｏｚｅ，ｅｄｓ．），１９９１，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ；およびＴｈｏｒｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ１９９１，３５４：１０５を参照することができる。
【０１５３】
追加の好ましい抗体変異体には、親配列内において１つ以上のシステイン残基が欠失するか、またはシステイン残基がセリンのような他のアミノ酸に置換された変異体が含まれる。システイン変異体は、特に抗体が生物学的活性を有する構造で再びフォールディング（ｆｏｌｄｉｎｇ）されなければならない時に有用である。システイン変異体は、親抗体と比較して少ない数のシステイン残基を有することができ、ペアのないシステインによる相互作用を最小化させるために一般に偶数で含まれる。
【０１５４】
本願に開示された重鎖および軽鎖、可変領域ドメインおよびＣＤＲは、α−Ｓｙｎに特異的に結合可能な抗原結合領域を含むポリペプチドを製造するのに使用できる。例えば、表１に開示されたＣＤＲのうちの１つ以上は、ポリペプチドのような分子に非共有または共有結合して、免疫性接着分子として使用できる。このような免疫接着分子は、ＣＤＲが大きな高分子内に統合されたものであるか、ＣＤＲが他のポリペプチドに連結されたものであってもよい。このような免疫接着分子は、これに連結されたポリペプチドまたはその他の物質を目的の抗原、例えば、α−Ｓｙｎまたはエピトープに特異的結合を可能にする。
【０１５５】
本願に開示された可変領域およびＣＤＲに基づくペプチド模倣体がさらに提供される。このような模倣体は、ペプチド、非−ペプチド、またはペプチドと非−ペプチドとの組み合わせであってもよいし、次を参照することができる：Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１９８６，１５：２９；Ｖｅｂｅｒ  ａｎｄ  Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，１９８５，ＴＩＮＳ  ｐ．３９２；およびＥｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９８７，３０：１２２９。ある有用なポリペプチドと構造的に類似のペプチド模倣体は、元のポリペプチドと類似の効果を有する。このような化合物は、コンピュータ分子モデリング（ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ）を利用して開発される。一般に、ペプチド模倣体は、目的の生物学的活性、例えば、本願においてα−Ｓｙｎに特異的に結合する能力を示す抗体に構造的に類似しているが、１つ以上のペプチド結合が当該技術分野で幅広く公知の方法によって、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ−ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−およびＣＨ２ＳＯ−から選択される結合に代替される。より安定したタンパク質の生産のために、１つ以上の保存配列の残基を同一の類型のＤ−アミノ酸（例えば、Ｌ−リシンの代わりにＤ−リシン）に置換してもよい。また、ペプチドを環化できる分子が架橋形成システイン残基を内部に導入して保存的配列に構造的に制約を加えるペプチドを生成することができる（Ｒｉｚｏ  ａｎｄ  Ｇｉｅｒａｓｃｈ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９２，６１：３８７）。
【０１５６】
本願はさらに、本願に開示された抗体の誘導体を提供する。誘導体化された抗体は、抗体またはその断片に目的の特性、例えば、特定の使用で増加した半減期を提供する任意の分子または物質を含むことができる。誘導体化された抗体は、例えば、検出可能（または標識化）残基（例：放射性、比色性、抗原性または酵素分子、検出可能なビーズ（例：磁気または電子密度（例：金）ビーズ）、または他の分子（例：ビオチンまたはストレプトアビジン）に結合する分子）、治療的または診断的残基（例：放射性、細胞毒性、または薬学的活性残基）、または特別な使用（例えば、対象体、例えば、ヒト対象体に投与、またはその他の生体内または試験管内使用）のための抗体の適合性を増加させる分子を含むことができる。抗体を誘導体化させるのに使用できる分子の例には、アルブミン（例：ヒト血清アルブミン）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。抗体のアルブミン−連結されたおよびペギル化された誘導体は、当該技術分野で幅広く公知の技術を用いて製造することができる。一実施形態では、ペギル化単鎖ポリペプチドを含む。他の実施形態において、抗体は、トランスサイレチン（ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ、ＴＴＲ）またはＴＴＲ変異体に接合されるか、または連結される。ＴＴＲまたはＴＴＲ変異体は、例えば、デキストラン、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）、ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコール単独重合体、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリビニルアルコールからなるグループより選択される化学物質で化学的に変形できる。
【０１５７】
他の誘導体は、例えば、α−Ｓｙｎタンパク質のＮ−末端またはＣ−末端に融合した異種ポリペプチドを含む組換え融合タンパク質の発現によって製造できるα−Ｓｙｎ結合タンパク質と他のタンパク質またはポリペプチドとの共有または凝集接合体を含む。例えば、接合されたペプチドは、異種信号（またはリーダー）ポリペプチド、例えば、酵母アルファ−因子リーダー、またはペプチド、例えば、エピトープタグであってもよい。α−Ｓｙｎ抗体−を含む融合タンパク質は、α−Ｓｙｎ結合タンパク質（例：ポリ−Ｈｉｓ）の精製または識別を容易にするために追加されたペプチドを含むことができる。α−Ｓｙｎ結合タンパク質はまた、Ｈｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１９８８，６：１２０４；および米国特許第５，０１１，９１２号に記載されているようなＦＬＡＧペプチドに連結される。ＦＬＡＧペプチドは、抗原性に優れて、特定のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）によって可逆的に結合できるエピトープとして作用して、組換えタンパク質の迅速な確認および容易な精製を可能にする。
【０１５８】
一実施形態において、α−Ｓｙｎ結合タンパク質に融合したペプチド残基間の共有または非−共有相互作用により結合する複数のα−Ｓｙｎ−結合ポリペプチドを含むオリゴマーに関する。この結合するペプチドは、ペプチドリンカー（スペーサー）、またはオリゴマー化を促進する性質を有するロイシンジッパー（ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒ）のようなペプチドであってもよい。一実施形態において、オリゴマーは、２個〜４個のα−Ｓｙｎ結合タンパク質を含む。オリゴマーのα−Ｓｙｎ結合タンパク質残基は、前記のような任意の形態、例えば、変異体または断片であってもよい。好ましくは、オリゴマーは、α−Ｓｙｎ結合活性を有するα−Ｓｙｎ結合タンパク質を含む。
【０１５９】
一実施形態において、オリゴマーは、免疫グロブリンに由来するポリペプチドを用いて製造される。抗体−由来のポリペプチドの多様な部位（Ｆｃドメインを含む）に融合した異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の製造は、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９９１，８８：１０５３５；Ｂｙｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ１９９０，３４４：６７７；およびＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」，ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌ．４，ｐａｇｅｓ１０．１９．１−１０．１９．１１を参照することができる。
【０１６０】
他の実施形態は、抗体のＦｃ領域にα−Ｓｙｎ結合タンパク質が融合した２個の融合タンパク質を含む二量体に関する。前記二量体は、例えば、融合タンパク質をコーディングする遺伝子融合体を適切な発現ベクター内に挿入し、組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞内で遺伝子融合体を発現させ、発現した融合タンパク質が抗体分子と類似に組み合わされるようにすることで製造され、ここで、鎖間ジスルフィド結合がＦｃ残基の間に形成されて二量体が得られる。
【０１６１】
本願で使用された用語「Ｆｃポリペプチド」は、抗体のＦｃ領域に由来するポリペプチドで、野生型または突然変異形態を含む。二量体化を促進するヒンジ領域を含む切断された形態のポリペプチドもさらに含まれる。Ｆｃ残基を含む融合タンパク質およびこれから形成されたオリゴマーは、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇカラムを用いた親和性クロマトグラフィーで容易に分離できるという利点がある。
【０１６２】
適切なＦｃポリペプチドの例としては、米国特許第５，４２６，０４８号および第５，２６２，５２２号、第５，４５７，０３５号およびＢａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９４，１３：３９９２−４００１に記載のものが挙げられる。このような突然変異タンパク質のアミノ酸配列は、野生型アミノ酸１９番目の残基がＬｅｕからＡｌａに置換され、アミノ酸２０番目の残基がＬｅｕからＧｌｕに置換され、アミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａに置換された。突然変異タンパク質は、Ｆｃ受容体に対する親和性が減少する。
【０１６３】
他の実施形態において、本願に開示されているようなα−Ｓｙｎ結合タンパク質の重鎖および／または軽鎖の可変領域は、他の抗体の重鎖および／または軽鎖の可変領域に置換されて入ることができる。
【０１６４】
標識および効果器グループ
一部の実施形態において、本願による抗体または抗原結合断片は、１つ以上の標識（ｌａｂｅｌ）を含むことができる。「標識」は、任意の検出可能な物質を意味する。適切な標識基の例には、放射性同位元素または放射性核種（例：３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光性基（例：ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタン族蛍光体）、酵素基（例：ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ）、化学発光性グループ、ビオチニルグループ、または２次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、２次抗体結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）が含まれるが、これに限らない。一部の実施形態において、標識化基は、潜在的な立体障害（ｓｔｅｒｉｃ  ｈｉｎｄｒａｎｃｅ）を減少させるために、多様な長さのスペーサーアーム（ａｒｍ）を介して抗体にカップリングされる。タンパク質を標識するための多様な方法は当該技術分野で公知であり、当業者であれば、特定の目的のために適切な標識および適切な方法を選択することができる。
【０１６５】
本願において、用語「効果器グループ」は、抗体にカップリングされる細胞毒性剤として機能する物質で任意の物質を意味する。適切な効果器グループの例は、放射性同位元素または放射性核種（例：３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）である。一部の実施形態において、効果器グループは、潜在的な立体障害を減少させるために、多様な長さのスペーサーアームを介して抗体にカップリングされる。
【０１６６】
一般に、標識は検出方法によって分類される：ａ）放射性または同位元素標識；ｂ）磁気標識（例：磁気粒子）；ｃ）酸化還元活性残基；ｄ）光学染料；酵素グループ（例としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ）；ｅ）ビオチニル基；およびｆ）２次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例：ロイシンジッパー対配列、２次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグなど）。一部の実施形態において、標識化グループは、潜在的な立体障害を減少させるために、多様な長さのスペーサーアームを介して抗体にカップリングされる。タンパク質を標識化するための多様な方法は、当該技術分野で公知である。
【０１６７】
一実施形態において、標識は、発色団、燐光体および蛍光体を含む光学性染料が含まれるが、これに限るものではない。蛍光体は、低分子蛍光物質またはタンパク質性蛍光物質であってもよい。
【０１６８】
「蛍光標識」は、物質が有する蛍光特性により検出可能な任意の分子を意味する。蛍光標識の例としては、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチル−クマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルージェイ（Ｃａｓｃａｄｅ  ＢｌｕｅＪ）、テキサスレッド、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＬＣレッド６４０、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＬＣレッド７０５、オレゴングリーン、アレキサ−フルオル染料（アレキサフルオル３５０、アレキサフルオル４３０、アレキサフルオル４８８、アレキサフルオル５４６、アレキサフルオル５６８、アレキサフルオル５９４、アレキサフルオル６３３、アレキサフルオル６４７、アレキサフルオル６６０、アレキサフルオル６８０）、カスケードブルー、カスケードイエローおよびＲ−フィコエリスリン（ＰＥ）、ＦＩＴＣ、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、およびＣｙ７などが含まれるが、これに限るものではない。多様な光学的染料は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄを参照することができる。
【０１６９】
タンパク質性蛍光標識物質には、レニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）、プチロサルカス（Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ）またはオワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ）種のＧＦＰを含む緑色蛍光タンパク質（Ｃｈａｌｆｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９４，２６３：８０２−８０５）、ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｓ．，Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ５５７６２）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ；Ｓｔａｕｂｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１９９８，２４：４６２−４７１；Ｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１９９６，６：１７８−１８２）、向上した黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｓ．，Ｉｎｃ．）、ルシフェラーゼ（Ｉｃｈｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：５４０８−５４１７）、βガラクトシダーゼ（Ｎｏｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２６０３−２６０７）を含むが、これに限るものではない。
【０１７０】
核酸
一態様において、本願は、特定の混成化条件で本願に開示された核酸に交雑する核酸に関する。核酸の混成化方法は、当該技術分野で幅広く公知である。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６を参照することができる。本願において、厳しい混成化条件は、５ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）を含む前洗浄溶液、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）；約５０％ホルムアミドの混成化緩衝剤、６ｘＳＳＣ、および５５℃の混成化温度（または他の類似の混成化溶液、例えば、約５０％ホルムアミドを含む溶液、４２℃の混成化温度）、および０．５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６０℃の洗浄条件を使用する。厳しい混成化条件は、４５℃で６ｘＳＳＣ、その後に６８℃で０．１ｘＳＳＣ、０．２％ＳＤＳで１回以上の洗浄によって混成化される。さらに、当業者は、配列間に少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一のヌクレオチド配列を含む核酸が典型的に互いに混成化された状態を維持するのに必要な適切な混成化条件を選択することができる。
【０１７１】
混成化条件の選択に影響を与える基本パラメータおよび適切な条件は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，前記；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，セクション２．１０および６．３−６．４を参照することができる。このような条件は、例えば、核酸の長さおよび／または塩基組成（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴ（Ｕ）の構成）などに基づいて、当業者によって容易に決定される。
【０１７２】
本願に開示された核酸は、突然変異体をさらに含む。核酸内に突然変異によって前記核酸がコーディングするポリペプチド（抗体または抗体誘導体）のアミノ酸配列で変化を誘導することができる。突然変異は、当該技術分野における公知の任意の技術を用いて導入される。例えば、部位−指示された突然変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）方法、ランダム突然変異誘発（ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）方法が使用できる。このように製造された核酸突然変異体は、目的の特徴を有するポリペプチドに対して選別される。
【０１７３】
核酸によってコーディングされるポリペプチドの生物学的活性を顕著に変化させることなく、突然変異が核酸内に導入される。例えば、非−必須アミノ酸残基でアミノ酸置換を誘発するヌクレオチド置換を行うことができる。代案的に、核酸によってコーディングされるポリペプチドの生物学的活性を選択的に変化させる１つ以上の突然変異が前記核酸内に導入される。例えば、突然変異は、生物学的活性を定量的にまたは定性的に変化させることができる。定量的変化の例には、活性の増加、減少または除去が含まれる。定性的変化の例には、抗体の抗原に対する特異性変化が含まれる。一実施形態において、本願で開示された任意の抗体をコーディングする核酸は、当該技術分野で広く知られた分子生物学技術を用いてアミノ酸配列が変更されるように突然変異化される。
【０１７４】
他の様態において、本願はさらに、本願に開示された核酸配列の検出のためのプライマーまたは混成化プローブとしての使用に適した核酸分子に関する。このような核酸分子は、例えば、プローブまたはプライマーとして使用可能な全長ポリペプチドをコーディングする核酸の断片またはポリペプチドの活性部分（α−Ｓｙｎ結合部分）をコーディングする断片核酸のような全長核酸配列の部分を含むことができる。
【０１７５】
核酸配列に基づいて製造されたプライマーおよびプローブは、本願に開示された核酸または類似の核酸、またはポリペプチドをコーディングする転写体を検出するのに使用できる。一実施形態において、このようなプローブは、本願によるポリペプチドを発現する細胞を識別するのに使用できる。プライマーまたはプローブは、放射性同位元素、蛍光性化合物、酵素、または酵素補助−因子のような標識物質で標識される。
【０１７６】
他の様態において、本願はさらに、本願によるポリペプチドまたはその部分（例えば、１つ以上のＣＤＲまたは１つ以上の可変領域ドメインを含む断片）をコーディングする核酸を含むベクターを提供する。ベクターの例には、プラスミド、ウイルスベクター、非−エピゾーム哺乳動物ベクターおよび（組換え）発現ベクターなどを含むが、これに限るものではない。組換え発現ベクターは、宿主細胞において核酸の発現に適した形態の核酸を含むことができる。組換え発現ベクターは、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択される１つ以上の調節配列を含み、このような調節配列は、発現する核酸配列に作動可能に連結される。調節配列には、多くの種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列の発現を調節できる、例えば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー、ラウス肉腫ウイルスプロモーターおよびサイトメガロウイルスプロモーターのようなプロモーター；または特定の宿主細胞内でのみヌクレオチド配列の発現を調節する、例えば、組織−特異的調節配列（Ｖｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１１：２８７，Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３６：１２３７）、および特別な処理または条件に反応してヌクレオチド配列の誘導性の発現を指示する、例えば、哺乳動物細胞で作用するメタロチオネインプロモーター、および原核生物および真核生物システムの両方で作用するｔｅｔ−反応性および／またはストレプトマイシン反応性プロモーター参照：上同）が含まれる。当業者であれば、形質転換される宿主細胞の種類、目的のタンパク質の発現程度のような要素を考慮して適切なベクターおよび調節配列を選択することができる。選択された発現ベクターは、宿主細胞内に伝達されて、本願に開示されているような核酸によってコーディングされるタンパク質の生産に使用できる。
【０１７７】
他の側面において、本願は、組換え発現ベクターが導入された宿主細胞を提供する。宿主細胞は、任意の原核細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または真核細胞（例えば、酵母、昆虫、または哺乳動物細胞）であってもよい。ベクターＤＮＡは、公知の形質転換または伝達移入技術により原核または真核細胞内に導入される。哺乳動物細胞における安定した伝達移入の場合、使用される発現ベクターの種類および形質感染技術により、少ない数の細胞のみが伝達移入によって伝達されるＤＮＡをそのゲノム内に統合できることが知られている。したがって、伝達移入された細胞を識別し選択するために、一般に抗生剤耐性マーカーのような選択可能なマーカーをコーディングする遺伝子が目的の遺伝子と共に宿主細胞内に導入される。好ましい選択可能なマーカーには、薬物、例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキサートに対する耐性を提供するものが含まれる。目的の核酸が安定的に導入された細胞の選別は、薬物処理により生存する細胞のみを選択することにより達成される。
【０１７８】
抗体の製造
本願において、非−ヒト抗体は、例えば、任意の抗体−生成動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ロバ、または非−ヒト霊長類（例えば、シノモルグスまたはアカゲザルのようなサル）または類人猿（例えば、チンパンジー）に由来できる。非ヒト抗体は、当該技術分野で公知の方法を用いて動物を免疫化させることにより生成される。抗体は、ポリクローナル、モノクローナルであるか、または組換えＤＮＡを発現させることによって宿主細胞内で合成される。完全ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む形質転換動物に抗原を投与するか、またはヒト抗体のレパートリーを発現するファージディスプレイライブラリーを抗原として処理して、目的の抗体を選択することにより製造される。
【０１７９】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、従来のモノクローナル抗体方法、例えば、文献（参照：Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５）の標準体細胞混成化技術をはじめとする多様な技術によって生成される。代案的には、例えば、Ｂ−リンパ球をウイルスまたは腫瘍遺伝子で形質転換させて使用する方法が用いられる。ミューリンシステムはハイブリドーマ細胞の生産に幅広く使用される動物システムである。免疫化プロトコルおよび融合のための免疫化されたマウスの脾臓細胞の分離機術は、当該技術分野で幅広く公知である。この方法において、免疫化されたマウスに由来するＢ細胞は、例えば、ミューリン骨髄腫細胞株のような不滅化融合パートナー細胞と融合する。必要に応じて、マウスの代わりにラットまたは他の哺乳動物が免疫化され、このような動物由来のＢ細胞をミューリン骨髄腫細胞株と融合して、ハイブリドーマを生成することができる。代案的に、融合に使用される骨髄腫細胞株は、マウス以外の動物由来のものが使用できる。このようなハイブリドーマを製造するための融合手順も幅広く公知である。
【０１８０】
本願に開示された単鎖抗体は、アミノ酸架橋（短いペプチドリンカー）を用いて、重鎖および軽鎖可変ドメイン（Ｆｖ領域）断片を連結して生成される。このような単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、２個の可変ドメインポリペプチド（ＶＬおよびＶＨ）をコーディングするＤＮＡの間にペプチドリンカーをコーディングするＤＮＡを融合することにより製造される。製造されたポリペプチドは、折り畳みによって抗原−結合単量体を形成するか、または２個の可変ドメインの間に柔軟性リンカーの長さに応じて、多量体（例えば、二量体、三量体または四量体）を形成することができる（Ｋｏｒｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：４２３；Ｋｏｒｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８：９５−１０８）。異なるＶＬとＶＨ−を含むポリペプチドを組み合わせることによって、異なるエピトープに結合する多量体性ｓｃＦｖを形成することができる（Ｋｒｉａｎｇｋｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８：３１−４０）。さらに、追加の単鎖抗体の生成のための技術は、例えば、下記を参照することができる：米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：５８７９；Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ３３４：５４４、ｄｅ  Ｇｒａａｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１７８：３７９−３８７。本願に開示された単鎖抗体は、表１ａおよび１ｂに記載の重鎖および軽鎖可変領域のドメイン組み合わせを含むｓｃＦｖ、または表１に開示されたＣＤＲを含む軽鎖および重鎖可変ドメインの組み合わせが含まれるが、これに限るものではない。
【０１８１】
本願に開示された抗体はまた、サブタイプスイッチングにより、異なるサブタイプ抗体に変更可能である。したがって、ＩｇＧ抗体は、例えば、ＩｇＭ抗体に由来し、その逆も可能である。このような技術により親抗体と抗原結合特性は同一であるが、親抗体とは異なる変化したサブタイプに特徴的な生物学的特性を有する新しい抗体の製造が可能である。このようなスイッチングに組換えＤＮＡ技術が用いられる。例えば、目的のアイソタイプ抗体の不変ドメインをコーディングするＤＮＡがこのような抗体の製造に用いられる。例えば、Ｌａｎｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８：３０３−３１６を参照することができる。また、ＩｇＧ４のスイッチングの場合、ＩｇＧ４抗体で異質性を誘発しうる重鎖内ジスルフィド結合を形成する傾向を軽減させるために、文献Ｂｌｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ６：４０７に記述されているように、ヒンジ領域内に点突然変異（ＣＰＳＣＰ−＞ＣＰＰＣＰ）を導入することが好ましい。
【０１８２】
したがって、本願に開示された抗体には、例えば、目的のアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、およびＩｇＤ）にスイッチングされた本願に開示された可変ドメイン組み合わせ抗体が含まれる。
【０１８３】
また、抗原に対する多様な親和性を有する抗体のような異なる特徴を有する抗体を製造する技術も公知である。このような技術は、例えば、ファージディスプレイと呼ばれるフィラメントバクテリオファージの表面に免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーをディスプレイして行われる鎖シャッフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）が挙げられる。追加の技術は、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：７７９に記載のものを参照することができる。
【０１８４】
目的の好ましい機能的および生化学的特徴を有するα−Ｓｙｎ結合タンパク質を生成するために、表１aおよび１bに記載の重鎖および軽鎖可変領域、またはＣＤＲに保存的変形（およびコーディング核酸に相応する変形）が行われる。このような変形を行う方法は上述した通りである。
【０１８５】
α−Ｓｙｎ抗体は、多様な方式で追加的に変形できる。例えば、治療目的に使用される場合、血清半減期を増加させるか、タンパク質伝達を向上させるためにポリエチレングリコールと接合、つまり、ペギル化される。代案的に、本願の抗体またはその断片の可変領域は、異なる抗体分子のＦｃ領域と融合できる。このような目的に使用されるＦｃ領域は、補体に結合せず、このため、融合タンパク質が治療剤として使用される時、患者内で細胞融解（ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ）の発生が減少する方向に変形する。また、本願の抗体またはその機能的断片は、抗体またはその抗原結合断片の血清半減期を向上させるためにヒト血清アルブミンと接合される。抗体またはその抗原結合断片への他の有用な融合パートナーは、トランスサイレチン（ＴＴＲ）である。ＴＴＲは四量体を形成する能力を有し、よって、抗体−ＴＴＲ融合タンパク質は、融合するタンパク質の結合親和力（ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｖｉｄｉｔｙ）が増加した多価抗体（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を形成することができる。
【０１８６】
代案的に、本願に開示された抗体の機能的および／または生化学的特徴における実質的な変更は、例えば、（ａ）シートまたは螺旋状形態のような置換部位内における分子骨格の構造、（ｂ）標的部位における前記分子の電荷または疎水性程度、または（ｃ）側鎖のバルク性に有意な影響を与える、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列内での置換により達成される。
【０１８７】
本願に開示された抗体のアミノ酸置換（保存的または非−保存的）は、通常の技術を適用することにより当業者によって行われる。アミノ酸置換は、本願に開示された抗体の重要な残基を識別するか、またはヒトα−Ｓｙｎに対するこれらの抗体の親和性を増加または減少させるか、または本願で開示された他の抗体の結合親和性を変化させるのに用いられる。
【０１８８】
抗体を発現する方法
本願はさらに、上述したような少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むプラスミド、発現ベクター、転写または発現カセットの形態の発現システムおよび構築物、そして、前記発現システムまたは構築物を含む宿主細胞を提供する。
【０１８９】
本願に開示された抗体は多数の従来の技術を用いて製造される。例えば、α−Ｓｙｎ抗体は、当該技術分野で公知の任意の技術を用いて組換え発現システムによって生成される。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｋｅｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）を参照することができる。
【０１９０】
抗体は、ハイブリドーマ細胞株またはハイブリドーマ以外の細胞株で発現できる。抗体をコーディングする発現構築物は、哺乳動物、昆虫または微生物宿主細胞を形質転換させるのに使用できる。プラスミドのような構築物は、先に記述されているように、ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための多様な任意の公知の方法を用いて行われる。具体的な方法は、宿主細胞の種類によって異なる。異種ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞内に導入する方法は、当該技術分野で幅広く公知であり、例えば、デキストラン媒介伝達移入、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介伝達移入、原形質体（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ）融合、電気穿孔、リポソームを用いた伝達されるポリヌクレオチドのカプセル化、核酸と正に荷電した脂質の混合、および核内へのＤＮＡの直接的な微細注入によって行われるが、これに限るものではない。
【０１９１】
組換え発現構築物は、典型的に次の１つ以上を含むポリペプチドをコーディングする核酸分子を含む：本願に開示された１つ以上のＣＤＲ；軽鎖不変領域；軽鎖可変領域；重鎖不変領域（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３）；および／またはα−Ｓｙｎ抗体のその他のスキャフォールド（ｓｃａｆｆｏｌｄ）部分。これらの核酸配列は、標準ライゲーション技術を用いて適切な発現ベクター内に挿入される。一実施形態において、重鎖または軽鎖不変領域は、抗−α−Ｓｙｎ−特異的重鎖または軽鎖可変領域のＣ−末端に連結され発現ベクター内にライゲーションされる。ベクターは、ベクターが使用される特定の宿主細胞内で機能できるように選択される。つまり、ベクターは、使用される宿主細胞の機構を用いてベクターに含まれている遺伝子の増幅および／または発現が可能でなければならない。一実施形態において、タンパク質レポーター、例えば、米国特許第６，２７０，９６４号に開示されたジヒドロフォレートレダクターゼを用いたタンパク質−断片相補性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）分析を用いるベクターが使用される。適切な発現ベクターを市中から、例えば、Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓまたはＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのような会社から購入すると良い。抗体および断片をクローニングし発現するのに有用な他のベクターの例は、Ｂｉａｎｃｈｉ  ａｎｄ  ＭｃＧｒｅｗ，２００３，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８４：４３９−４４；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，ｖｏｌ．１８５（Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ，ｅｄ．），１９９０，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓに開示されたものを参照することができる。
【０１９２】
典型的に、任意の宿主細胞に使用される発現ベクターは、プラスミド維持および外因性ヌクレオチド配列のクローニングと発現に必要な基本配列を含む。特定の実施形態において、このような基本配列は、典型的に１つ以上の次のヌクレオチド配列を含む：プロモーター、１つ以上のエンハンサー配列、複製起源、転写終結配列、供与者と受容者のスプライシング部位を含む無傷のイントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコーディングする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現するポリペプチドをコーディングする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、および選択可能なマーカー配列。
【０１９３】
選択的に、ベクターは、「タグ」−エンコーディング配列、つまり、α−Ｓｙｎ結合タンパク質コーディング配列の５’または３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子を含むことができる；前記オリゴヌクレオチド配列は、ｐｏｌｙＨｉｓ（例：ｈｅｘａＨｉｓ）、または市販の抗体に存在する他の「タグ」、例えば、ＦＬＡＧＲ、ＨＡ（ヘマグルチニンインフルエンザウイルス）、またはｍｙｃをコーディングすることができる。このようなタグは、典型的にポリペプチドに融合し発現し、宿主細胞におけるα−Ｓｙｎ結合タンパク質の分離時に親和性精製または検出の手段として機能することができる。親和性精製は、例えば、親和性マトリックスとしてタグに対する抗体を用いたカラムクロマトグラフィーによって達成される。選択的に、このようなタグは、後に特定ペプチダーゼの使用を含む多様な手段によって精製されたα−Ｓｙｎ結合タンパク質から除去される。
【０１９４】
上述した基本配列は、同種、異種、またはハイブリッド、合成または固有のものであってもよい。このように、基本配列は、宿主細胞機構で活性化され、機能できれば、任意の原核または真核生物、任意の脊椎動物または無脊椎生物、または任意の植物由来のものが使用できる。
【０１９５】
ベクターに含まれている有用な基本配列は、当該技術分野で幅広く公知の様々な方法によって得られる。典型的に、本願に使用される基本配列は、マッピング（ｍａｐｐｉｎｇ）および／または制限酵素の切断により予め確認されて、適切な制限酵素を用いて適切な組織供給源から分離される。一部の場合に、基本配列の全体ヌクレオチド配列は公知のものであってもよいし、基本配列は、本願に開示された核酸合成またはクローニング方法を用いて合成される。
【０１９６】
基本配列の全部または一部配列の公知の有無にかかわらず、基本配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、および／または適切なプローブ、例えば、同一または異なる種からオリゴヌクレオチドおよび／または基本配列断片でゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより得られる。基本配列が知られていなければ、基本配列を含むＤＮＡの断片は、例えば、コーディング配列または、さらには他の遺伝子（ら）を包みうるより大きいＤＮＡの断片から分離される。目的の断片は、制限酵素処理、アガロースゲル精製およびカラムクロマトグラフィーまたは当業者に公知のその他の方法を用いて分離される。当業者であれば、このような目的を達成するための適切な酵素を選択できることが自明である。
【０１９７】
複製起源は、宿主細胞内でベクターの増幅に必要なもので、典型的には、市販の原核発現ベクターに含まれている。選択ベクターが複製起源を含まなければ、公知の配列に基づいて化学的に合成され、ベクター内にライゲーションされる。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）の複製起源は、大部分のグラム−陰性細菌に適合し、多様なウイルス起源（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、または乳頭腫ウイルス、例えば、ＨＰＶまたはＢＰＶ）は、哺乳動物細胞内でベクターをクローニングするのに有用である。一般に、複製起源は、哺乳動物発現ベクターには必要でない（例えば、ＳＶ４０起源はさらに、ウイルスの初期プロモーターを含むので使用される）。
【０１９８】
転写終結配列は、典型的にポリペプチドコーディング領域の３’末端に位置し、転写を終結させる機能をする。一般に、原核細胞における転写終結配列は、ポリ−Ｔ配列が伴うＧ−Ｃの豊富な断片である。このような配列は、ライブラリーから容易にクローニングされるか、または市中から購入、または本願に開示されているような核酸合成方法を用いて得られる。
【０１９９】
選択マーカー遺伝子は、宿主細胞の選択培養培地で生存および成長に必要なタンパク質をコーディングする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）抗生剤またはその他の毒素、例えば、原核宿主細胞の場合に、アンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシンに対する耐性を提供；（ｂ）細胞の栄養要求性欠陥（ａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）を補完；または（ｃ）複合培地または規定培地から得られない重要な栄養分を供給するタンパク質をコーディングする。一実施形態において、選択可能なマーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、およびテトラサイクリン耐性遺伝子である。ネオマイシン耐性遺伝子はまた、原核および真核宿主細胞の両方での選択のために使用できる。
【０２００】
他の選択遺伝子は、発現する遺伝子の増幅に使用できる。増幅は、細胞の成長または生存に重要なタンパク質の生産に必要な遺伝子が後続世帯の組換え細胞の染色体内で直列式で繰り返される過程である。哺乳動物細胞に適した選択マーカーの例としては、ジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）およびプロモーターのないチミジンキナーゼ遺伝子が含まれる。哺乳動物細胞形質転換体には、形質転換体のみがベクター内に存在する選択遺伝子によって生存可能に作用する選択圧力（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）が加えられる。選択圧力は、培地に含まれている選択剤の濃度を次第に増加させて、選択遺伝子および他の遺伝子、例えば、α−Ｓｙｎに結合する抗体をコーディングする遺伝子ともを増幅させる条件下で細胞を培養することにより加えられる。したがって、増幅したＤＮＡによって発現するポリペプチド、例えば、抗体の量が増加する。
【０２０１】
リボソーム−結合部位は、一般に、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（シャイン−ダルガノ）配列（原核生物）またはコザック（Ｋｏｚａｋ）配列（真核生物）を特徴とする。これは、典型的にプロモーターの３’および発現するポリペプチドのコーディング配列の５’に位置する。
【０２０２】
真核宿主細胞発現システムにおいてグリコシル化が必要な場合、グリコシル化または収率を改善するために、多様なプレ（ｐｒｅ）−またはプロ（ｐｒｏ）−配列を操作することができる。例えば、特定の信号ペプチドのペプチダーゼ切断部位を変更するか、またはグリコシル化に影響を及ぼしうるプロ配列（ｐｒｏｓｅｑｕｅｎｃｅ）を追加することができる。最終タンパク質生成物は、これらのアミノ酸は完全に除去されず、−１位置（成熟タンパク質の１番目のアミノ酸に対して）で１つ以上の追加のアミノ酸を有することができる。例えば、最終タンパク質生成物は、アミノ−末端に付加されたペプチダーゼ切断部位から発見される１個または２個のアミノ酸残基を有することができる。代案的に、タンパク質切断酵素を用いると、切断部位が目的のタンパク質内に含まれている場合には、切断された形態のタンパク質が生産される。
【０２０３】
発現およびクローニングは、典型的に宿主生物体によって認識されるα−Ｓｙｎ結合タンパク質をコーディングする分子に作動可能に連結されるプロモーターの使用を含む。プロモーターは、構造遺伝子の転写を調節する（一般に、約１００〜１０００ｂｐ内の）構造遺伝子の開始コドンの上流つまり、５’に位置する非転写配列である。プロモーターは、誘導性プロモーターおよび常時プロモーターに分類される。誘導性プロモーターは、培養条件の変化例えば、培地の特定成分の存在または不在、または温度の変化に反応してこれに連結されたＤＮＡから転写を開始または調節する。一方、常時プロモーターは、これに作動可能に連結された遺伝子の転写を調節せず、一定に発現する。多様な宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが広く知られている。適切なプロモーターは、制限酵素を用いて鋳型ＤＮＡからプロモーターを除去した後、これをベクター内に挿入することによって、α−Ｓｙｎ結合タンパク質を含む重鎖または軽鎖をコーディングするＤＮＡに作動可能に連結される。
【０２０４】
酵母宿主と共に使用するのに適したプロモーターも、当該技術分野で幅広く公知である。酵母プロモーターと共に酵母エンハンサーがさらに使用できる。哺乳動物宿主細胞での使用に適したプロモーターとしては、ウイルス、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘（ｐｈａｒｙｎｘ）ウイルス、アデノウイルス（例、アデノウイルス２）、牛乳頭腫ウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および類人猿ウイルス４０（ＳＶ４０）のゲノムから得られたものが含まれるが、これに限るものではない。他の適切な哺乳動物プロモーターの例としては、異種哺乳動物プロモーター、例えば、熱−ショックプロモーターおよびアクチンプロモーターが含まれる。
【０２０５】
追加のプロモーターには、ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ２９０：３０４−３１０）；ＣＭＶプロモーター（Ｔｈｏｒｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６５９−６６３）；ラウス肉腫ウイルスの３’長末端リピート（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）に含まれているプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ２２：７８７−７９７）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４４−１４４５）；メタロチオネイン遺伝子のプロモーターおよび調節配列（Ｐｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ２９６：３９−４２）；および原核プロモーター、例えば、ベータ−ラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７−３７３１）；またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５）が含まれるが、これに限るものではない。また、組織特異性を示す形質転換動物に使用される、次のような動物の転写調節領域が使用できる：膵臓腺房細胞で活動性のエラスターゼＩ遺伝子調節領域（Ｓｗｉｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ３８：６３９−６４６；Ｏｒｎｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ７：４２５−５１５）；膵臓ベータ細胞で活動性のインスリン遺伝子調節領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ３１５：１１５−１２２）；リンパ系細胞で活動性の免疫グロブリン遺伝子調節領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ３８：６４７−６５８；Ａｄａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ３１８：５３３−５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６−１４４４）；睾丸、乳房、リンパ系および肥満（ｍａｓｔ）細胞で活動性のマウス乳腺腫瘍ウイルス調節領域（Ｌｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ４５：４８５−４９５）；肝で活動性のアルブミン遺伝子調節領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−２７６）；肝で活動性のアルファ−フェト−タンパク質遺伝子調節領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９−１６４８；Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５３：５３−５８）；肝で活動性のアルファ１−アンチトリプシン遺伝子調節領域（Ｋｅｌｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−１７１）；骨髄細胞で活動性のベータ−グロビン遺伝子調節領域（Ｍｏｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ３１５：３３８−３４０）；Ｋｏｌｌｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ４��：８９−９４）；脳内の希突起膠細胞（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）で活動性のミエリン塩基性タンパク質遺伝子調節領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ４８：７０３−７１２）；骨格筋で活動性のミオシン軽鎖−２遺伝子調節領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ３１４：２８３−２８６）；および視床下部で活動性の性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子調節領域（Ｍａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３４：１３７２−１３７８）。
【０２０６】
エンハンサー配列は、高等真核生物でヒトα−Ｓｙｎ結合タンパク質を含む軽鎖または重鎖をコーディングするＤＮＡの転写を増加させるためにベクター内に挿入される。エンハンサーは、プロモーターに作用して転写を増加させる、通常約１０−３００ｂｐの長さを有するＤＮＡのシス−作用要素である。エンハンサーは、転写単位体の５’および３’位置ともにおいて観察され、相対的に位置および方向に影響されない。哺乳動物遺伝子で多数のエンハンサー配列が知られている（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ−フェト−タンパク質およびインスリン）。しかし、典型的に、ウイルス由来のエンハンサーが使用される。当該技術分野で公知のプロモーターの活性化のための例示的エンハンサーは、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを含む。真核プロモーターの活性化のためのエンハンサーは、ベクター内でコーディング配列の５’または３’に配置されるが、典型的にプロモーターの５’部位に位置する。適切な固有のまたは異種信号配列（リーダー配列または信号ペプチド）をコーディングする配列は、抗体の細胞外分泌を促進するために発現ベクター内に統合される。信号ペプチドまたはリーダー配列の選択は、抗体が生産される宿主細胞の種類によって決定され、固有信号配列を異種信号配列に代替することができる。哺乳動物宿主細胞における機能的な信号ペプチドの例には、米国特許第４，９６５，１９５号に記載のインターロイキン−７（ＩＬ−７）に対する信号配列；文献Ｃｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ３１２：７６８に記載のインターロイキン−２受容体に対する信号配列；ＥＰ特許第０３６７５６６号に記載のインターロイキン−４受容体信号ペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号に記載の類型Ｉインターロイキン−１受容体信号ペプチド；ＥＰ特許第０４６０８４６号に記載の類型ＩＩインターロイキン−１受容体信号ペプチドが含まれる。
【０２０７】
本願において、発現ベクターは、市販のベクターを用いて作製される。このようなベクターは、目的の基本配列の全部または一部を含むか、全く含まないことがある。本願で記載された基本配列の１つ以上がベクター内に予め存在しない場合に、これらは個別的に得られてベクター内にライゲーションされる。基本配列に含まれている各配列を得る方法は、当業者に幅広く公知である。
【０２０８】
ベクターを製造して、軽鎖、重鎖、またはα−Ｓｙｎ抗原結合配列を含む軽鎖および重鎖をコーディングする核酸分子を前記ベクターの適切な部位内に挿入された後、このような組換えベクターは、増幅および／またはポリペプチド発現のために適切な宿主細胞内に導入される。抗体発現ベクターを選択された宿主細胞内に導入する方法は、伝達移入、感染、リン酸カルシウム空洞−沈殿、電気穿孔、微細注入、リポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介伝達移入、またはその他幅広く公知の方法によって達成される。導入方法は、主に使用される宿主細胞の種類によって決定される。この方法は、当業者に幅広く公知であり、例えば、上述した文献Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１を参照することができる。
【０２０９】
次に、宿主細胞を適切な条件で培養した後、抗体を培養培地から（宿主細胞が抗体を培地内に分泌する場合）、またはこれを生成する宿主細胞から直接的に（抗体が分泌されない場合）得る。適切な宿主細胞の選択は、多様な要素、例えば、目的の発現水準、活性のために好ましいか、必須のポリペプチド変形（例えば、グリコシル化またはホスホリル化）、および生物学的活性分子の生成のための折り畳みの容易性などに左右される。
【０２１０】
発現のための利用可能な哺乳動物細胞株としては、当該技術分野で幅広く公知であり、例えば、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から購入可能な不滅化細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌腫細胞（例、Ｈｅｐ  Ｇ２）、および多数のその他細胞株が含まれるが、これに限らない。一実施形態において、細胞株は、α−Ｓｙｎ結合特性を有する抗体を継続して、高い発現量で発現するかによって決定される。他の実施形態では、自らの抗体を製造できないものの、異種抗体を製造し分泌する能力を有するＢ細胞系統からの細胞株が選択される。
【０２１１】
疾患におけるα−Ｓｙｎの役割
α−Ｓｙｎは、ニューロンの前シナプス末端に主に発現する、１４０個のアミノ酸からなるタンパク質で、正常状態では、細胞質に自然に折り畳まれない状態の単量体として存在する。α−Ｓｙｎの正確な機能は明らかにされていないが、シナプスが発達した後にのみ検出されることから、成熟した前シナプス末端でシナプスベシクルの供給維持に重要な役割（Ｍｕｒｐｈｙ  ＤＤ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ２０００、２０：３２１４−３２２０）をし、不随意または随意運動を調節するドーパミンの放出を調節するか、または記憶および認知機能に影響を及ぼしうる（Ｋｏｋｈａｎ  ＶＳ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｅｈａｖ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ２０１２，２３１：２２６２３０）。特に、α−Ｓｙｎの機能は、シナプス活動の増加および加齢に伴って重要であり、神経退化の重要な因子である。
【０２１２】
病的な状態において、α−ｓｙｎは、脂質微滴（ｄｒｏｐｌｅｔ）、リン脂質二重膜または脂質膜などとの結合および相互作用により構造的変化を起こしてフォールディングされたα−ヘリカル２次構造を形成して、二量体（ｄｉｍｅｒ）、オリゴマー（ｏｌｉｇｏｍｅｒ）および線維状形態の分子を含む凝集体を形成する。
【０２１３】
特に、α−ｓｙｎ凝集は、パーキンソン疾患（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ、ＰＤ）、パーキンソン疾患性痴呆（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｄｅｍｅｎｔｉａ、ＰＤＤ）、レビー小体痴呆（ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｗｉｔｈ  Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｉｅｓ、ＤＬＢ）、多系統萎縮症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｔｒｏｐｈｙ、ＭＳＡ）およびその他多数の神経軸索疾患を含むα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙと呼ばれる一群の神経退行性疾患の病因と関連があることが知られており、二次的にアルツハイマー疾患からも発見される（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｔｈｅｒａｐｙ２０１４，６：７３）。
【０２１４】
さらに、パーキンソン疾患患者の脳脊髄液および血漿サンプルからオリゴマー形態およびモノマー形態のアルファ−シヌクレインがすべて発見され、これは、小さい分子量のアルファ−シヌクレイン凝集体が細胞膜を透過して細胞外空間に接近できることを示す。また、誤ってフォールディングされたアルファ−シヌクレインがエキソサイトーシスにより細胞から放出された後、プリオンタンパク質のように、細胞間伝達によって脳の一領域から他の領域に伝達されることが明らかになった（Ｂｒｕｎｄｉｎ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ２０１０，１１：３０１−３０７）。
【０２１５】
α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙは、細胞内（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕａｒｌｙ）にα−ｓｙｎ凝集体を含むエンティティー（ｅｎｔｉｔｙ）または小体（ｂｏｄｙ）が存在することを特徴とする一群の神経退行性疾患である。このような小体は、疾患によって外観がある程度異なり、パーキンソン疾患およびレビー小体痴呆（ＤＬＢ）ではレビー小体、ＭＳＡではグリア細胞質小体、神経軸索疾患では軸索スフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）と呼ばれる。本願による抗体は、α−ｓｙｎ凝集体を選好的および特異的に認識するため、このような小体を認識することができる。
【０２１６】
レビー小体疾患（Ｌｅｗｙ  Ｂｏｄｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ、ＬＢＤ）またはアルファ−シヌクレイン神経疾患は、ドーパミンシステムの変性、運動障害、認知損傷およびレビー小体（ＬＢ）の形成を特徴とする（ＭｃＫｅｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ１９９６，４７：１１１３−２４）。レビー小体は、神経細胞から発見される球状のタンパク質沈着物である。レビー小体は、脳でアセチルコリンとドーパミンを含む化学的メッセンジャーの作用を妨げて脳の正常的機能を妨げる。レビー小体疾患には、パーキンソン病（特発性パーキンソン病（ＰＤ）を含む）、レビー小体痴呆（ＤＬＢ）とも呼ばれる拡散性レビー小体疾患（ＤＬＢＤ）、アルツハイマー病およびパーキンソン病複合疾患および多発性萎縮症（ＭＳＡ）を含む。ＤＬＢＤは、アルツハイマーおよびパーキンソン疾患と症状が同一であるが、レビー小体の位置がパーキンソン疾患と異なる。ＤＬＢＤにおいてレビー小体は主に皮質に存在し、パーキンソン疾患では主に黒質に存在する。
【０２１７】
他のレビー小体疾患は、Ｐｕｒｅ  Ａｕｔｏｎｏｍｉｃ  Ｆａｉｌｕｒｅ、レビー小体障害（ｄｙｓｐｈａｇｉａ）、Ｉｎｃｉｄｅｎｔａｌ  ＬＢＤ、Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  ＬＢＤ（例えば、α−ｓｙｎ遺伝子ＰＡＲＫ３およびＰＡＲＫ４遺伝子突然変異）および多系統萎縮症（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ａｔｒｏｐｈｙ、ＭＳＡ、例えば、Ｏｌｉｖｏｐｏｎｔｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  Ａｔｒｏｐｈｙ、Ｓｔｒｉａｔｏｎｉｇｒａｌ  ＤｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎおよびＳｈｙ−Ｄｒａｇｅｒ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）を含む。
【０２１８】
本願によるα−Ｓｙｎ凝集体を高い親和度で特異的に認識し、α−Ｓｙｎ抗体がこのような疾患の診断、または検出に有用に使用できることを示す。さらに、本願によるα−Ｓｙｎ凝集体を特異的に認識するα−Ｓｙｎ抗体は、α−Ｓｙｎ凝集体の形成を抑制するか、または凝集体を分解し、細胞間凝集体の伝達を抑制して、α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙ、特にレビー小体疾患、パーキンソン病の治療に効果的に使用できることを示す。
【０２１９】
治療および診断の目的のためのヒトα−Ｓｙｎ抗体の使用
本願に開示された抗体は、生物学的試料においてα−Ｓｙｎ、特にレビー小体のようなα−Ｓｙｎ凝集体の検出およびα−Ｓｙｎ凝集体を含む細胞または組織の識別に有用である。例えば、α−Ｓｙｎ抗体は、診断、例えば、生物学的試料、例えば、血漿を含む血液、脳脊髄液（ＣＳＦ、Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ）または小便、組織または細胞内で発現したα−Ｓｙｎ凝集体を検出し／したり定量する分析、およびこれに基づくα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙの診断に使用できる。
【０２２０】
また、特に凝集体に特異的に結合する本願による抗体は、α−Ｓｙｎ凝集体に関連する疾患の治療、診断、および／または検出が必要な対象体におけるα−Ｓｙｎ凝集体関連疾患の治療に使用できる。本願による抗体または抗原結合断片は、α−Ｓｙｎ凝集体の生成を抑制し、分解を促進し、細胞間伝達を抑制して、上述のようなα−Ｓｙｎ凝集体に関連する疾患の治療に有用に使用できる。
【０２２１】
診断方法
本願に開示された抗体は、α−Ｓｙｎに関連する疾患および／または症状を検出、診断、またはモニタリングするための診断の目的に使用できる。一実施形態において、本願による方法は、α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙの診断が必要な対象体におけるα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙを診断する方法であって、前記方法は、前記対象体におけるα−Ｓｙｎ凝集体の濃度または細胞内位置を本願による抗体または抗原結合断片で測定する段階；および前記対象体で測定された前記α−Ｓｙｎ凝集体の濃度または細胞内位置を対照群試料の結果と比較する段階を含み、前記対照群の結果と類似または差は、前記対象体がα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙにかかったことを示すものである。
【０２２２】
前記方法において、対象体は、症状がないか、または症状が現れる前の患者を含むものである。一実施形態において、対照群は、ＰＤ、ＤＬＢまたはＭＳＡを含むα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙ患者であってもよいし、この場合、前記比較段階で対照群との類似性は、前記対象体をα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙ患者と診断する。他の実施形態において、対照群は、正常人由来の試料の場合、前記比較段階で対照群との差、例えば、凝集体濃度の増加は、前記対象体をα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙと診断する。さらに他の実施形態において、前記対象体と対照群の年齢がマッチされる。前記方法は、インビボまたは対象体から分離された生物学的試料、例えば、血液、脳脊髄液（ＣＳＦ、Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ）または小便試料で行われる。
【０２２３】
前記方法は、インビボイメージングで行われる。インビボイメージングは、例えば、ＰＥＴ（ｐｏｓｉｔｒｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）、ＳＰＥＣＴ（ｓｉｎｇｌｅ  ｐｈｏｔｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）、ＮＩＲ（ｎｅａｒ  ｉｎｆｒａｒｅｄ）光学イメージングまたはＭＲＩ（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ）を用いて行われる。
【０２２４】
前記方法は、インビトロで行われる。前記方法は、当業者に広く知られたウェスタンブロット、免疫沈殿、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｉｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）、放射性免疫分析法（Ｒａｄｉｏ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ａｓｓａｙ、ＲＩＡ）または免疫組織化学的方法を用いて行われる（例えば、Ｔｉｊｓｓｅｎ，１９９３，Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｖｏｌ１５（Ｅｄｓ  Ｒ．Ｈ．Ｂｕｒｄｏｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ｈ．ｖａｎ  Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）；Ｚｏｌａ，１９８７，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｊａｌｋａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５；Ｊａｌｋａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６）。
【０２２５】
診断使用のために、抗体は、典型的に検出可能な標識物質で標識される。適切な標識物質は、放射性同位元素または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光物質（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタン族蛍光体）、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ）、化学発光基、ビオチニル基、または２次レポーターによって認識されるポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、２次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）が含まれるが、これに限るものではない。一部の実施形態において、標識物質は、潜在的な立体障害を減少させるために、多様な長さのスペーサーアームを介して抗体にカップリングされる。タンパク質を標識化するための多様な方法が当該技術分野で公知であり、本願に適用可能である。
【０２２６】
他の様態において、本願の抗体は、α−Ｓｙｎ凝集体を含む組織の識別に使用できる。特定の実施形態において、抗体は標識物質で標識され、標識された抗体のα−Ｓｙｎ凝集体に対する結合が検出される。一実施形態において、α−Ｓｙｎ凝集体に対する抗体の結合は、生体内で検出される。
【０２２７】
他の様態において、本願は、本願に開示された抗体とα−Ｓｙｎ凝集体への結合に対して競争する試験物質を検出または選別することを開示する。例えば、試験物質の存在または不在下、α−Ｓｙｎ凝集体を含む溶液内で遊離抗体の量を検出する段階を含む。遊離抗体、つまり、α−Ｓｙｎ凝集体に結合しない抗体濃度の増加は、試験分子がα−Ｓｙｎ凝集体の結合に対して抗体と競争できることを指示する。一実施形態において、抗体は、標識基で標識される。代案的に、試験物質は標識され、遊離した試験物質の量は、抗体の存在および不在でモニタリングする。
【０２２８】
その他、本願に開示された抗体または抗原結合断片は、多様な有用性を有する。例えば、特異的結合分析、親和度に基づくα−Ｓｙｎ精製、またはα−Ｓｙｎ拮抗剤の究明のためのスクリーニング方法などに使用できる。
【０２２９】
治療方法：薬学的剤形、投与経路
本願による抗体または抗原結合断片は、α−Ｓｙｎ凝集体の生成を抑制し、分解を促進し、細胞間伝達を抑制して、上述したようなα−Ｓｙｎ凝集体に関連する疾患の治療に有用である。
【０２３０】
そこで、本願による抗体または抗原結合断片を用いた治療方法がさらに提供される。一実施形態において、抗体は患者に提供される。本願による抗体または抗原結合断片が使用されて効果を奏しうる疾患の種類および患者は先に言及した通りである。
【０２３１】
一実施形態において、本願による抗体は、血管脳障壁通過のために伝達体に連結されて使用できる。血管脳障壁を介して薬物を伝達するための多数の方法が開示されている。例えば、ブラジキニン、またはＨＩＦＵ（Ｈｉｇｈ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｆｏｕｃｕｅｓ  ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ）のような方法を用いてＢＢＢの浸透圧を崩す方法がある。また、細胞に内在したグリコースおよびアミノ酸伝達体、インスリンまたはトランスフェリンの受容体媒介トランスサイトーシスのような伝達システムの使用または糖タンパク質の活性流出伝達（ｅｆｆｌｕｘ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）を遮断することを含む。例えば、受容体媒介トランスサイトーシスのシステムの受容体の例は、次の通りである：ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ｅ．ｇ．，ｈｕｍａｎ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＬＲＰ（ｅ．ｇ．，ＬＲＰ１、ＬＲＰ６  ａｎｄ  ＬＲＰ８、ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＶＡＣＭ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＩＧＦＲ、ＥＰＣＲ、ＥＧＦＲ、ＴＮＦＲ、Ｌｅｐｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｍ６ＰＲ、Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＮＣＡＭ、ＬＩＦＲ、ＬｆＲ、ＭＲＰ１、ＡｃｈＲ、ＤＴｒ、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ、ＳＲ−Ｂ１、ＭＹＯＦ、ＴＦＲＣ、ＥＣＥ１、ＬＤＬＲ、ＰＶＲ、ＣＤＣ５０Ａ、ＳＣＡＲＦ１、ＭＲＣ１、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＲＡＭＰ２、ＶＬＤＬＲ、ＳＴＡＢ１、ＴＬＲ９、ＣＸＣＬ１６、ＮＴＲＫ１、ＣＤ７４、ＤＰＰ４、ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ１、２ａｎｄ３、ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｉｏｎｏｔｒｏｐｉｃ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｍ３  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ａｒｙｌ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＧＬＵＴ−１、ｉｎｏｓｉｔｏｌ−１，４，５−ｔｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＩＰ３）ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ａｓｐａｒｔａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｓ１Ｐ１、Ｐ２Ｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＭＥＭ３０Ａ、ＲＡＧＥ。
【０２３２】
他の実施形態において、本願による抗体は、他の治療剤に連結されて併合使用され、α−Ｓｙｎ凝集体に関連する疾患の治療に使用できる。
【０２３３】
抗体の治療的有効量、および薬学的に許容可能な希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤および／または補助剤を含む薬学的組成物もさらに提供される。また、例えば、このような薬学的組成物を投与することによって、α−Ｓｙｎに関連付けられた患者を治療する方法が含まれる。用語「患者」は、ヒト患者を含む。
【０２３４】
許容可能な剤形物質は、使用される用量および濃度で受容者に無毒性である。特定の実施形態において、治療的有効量のヒトα−Ｓｙｎ抗体を含む薬学的組成物が提供される。
【０２３５】
特定の実施形態において、許容可能な剤形物質は、好ましくは、使用される用量および濃度で患者に無毒性である。一実施形態において、薬学的組成物は、例えば、組成物のｐＨ、浸透圧濃度、粘度、透明度、色、等張性、香り、無菌性、安定性、溶解または放出の速度、吸収または浸透の変更、維持または保存のための特定剤形物質を含むことができる。このような実施形態において、適切な剤形物質には、アミノ酸（例：グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシン）；抗微生物剤；酸化防止剤（例：アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウム）；緩衝剤（例：ホウ酸塩、重炭酸塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩または他の有機酸）；バルク化剤（例：マンニトールまたはグリシン）；キレート化剤（例：エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ））；錯化剤（例：カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン）；充填剤；単糖類；二糖類；およびその他の炭水化物（例：グリコース、マンノースまたはデキストリン）；タンパク質（例：血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；着色剤、風味剤および希釈剤；乳化剤；親水性重合体（例：ポリビニルピロリドン）；低分子量ポリペプチド；塩−形成反対イオン（例：ナトリウム）；防腐剤（例：ベンザルコニウムクロライド、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素）；溶媒（例：グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）；糖アルコール（例：マンニトールまたはソルビトール）；懸濁剤；界面活性剤または湿潤剤（例：プルロニックス（Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ）、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポール）；安定性増進剤（例：スクロースまたはソルビトール）；強壮増進剤（例：アルカリ性金属ハライド、好ましくは、塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトールソルビトール）；伝達ビヒクル；希釈剤；賦形剤および／または薬学的補助剤が含まれるが、これに限るものではないが、例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８”Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｒｍｏ，ｅｄ．），１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙを参照することができる。
【０２３６】
特定の実施形態において、最適な薬学的組成物は、例えば、目的の投与経路、伝達方法および目的の用量に応じて当業者によって決定される（前記ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、参照）。特定の実施形態において、これらの組成物は、本願に開示された抗体の物理的状態、安定性、生体内放出速度および生体内クリアランス（ｃｌｅａｒａｎｃｅ）の速度に影響を与えることができる。特定の実施形態において、薬学的組成物中の主なビヒクルまたは担体は、水性または非−水性であってもよい。例えば、適切なビヒクルまたは担体は、可能には、非経口投与用組成物で通常の他の物質で補充された注射用水、生理塩水溶液であってもよい。また、中性の緩衝された塩水または血清アルブミンと混合された塩水は、ビヒクルとして使用できる。特定の実施形態において、薬学的組成物は、約ｐＨ７．０−８．５のＴｒｉｓ緩衝剤、または約ｐＨ４．０−５．５のアセテート緩衝剤を含み、ソルビトールまたは適切な代替物を追加的に含んでもよい。特定の実施形態において、ヒトα−Ｓｙｎ抗体組成物は、保存のために、凍結乾燥したケークまたは水溶液の形態で目的とする程度の純度を有する選択された組成物を任意の剤形化剤（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、参照）と混合して製造される。追加的に、特定の実施形態において、ヒトα−Ｓｙｎ抗体は、適切な賦形剤、例えば、スクロースを用いて凍結乾燥物（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｅ）として剤形化される。
【０２３７】
薬学的組成物は、非経口伝達される。代案的に、組成物は、消化管を通した、例えば、経口で吸入または伝達される。このような薬学的に許容可能な組成物の製造は、当該技術分野における技術水準の範囲内である。
【０２３８】
剤形に必要な成分は、好ましくは、投与部位に許容される濃度で存在する。特定の実施形態において、緩衝剤が組成物を生理学的ｐＨまたは若干低いｐＨ、典型的に約５〜約８のｐＨ範囲内に維持するために使用される。
【０２３９】
非経口投与の場合、治療的組成物は、目的のヒトα−Ｓｙｎ結合タンパク質を薬学的に許容可能なビヒクル内に含み、パイロジェンを含まない非経口で許容される水溶液の形態で提供される。非経口注入に特に適したビヒクルは、無菌蒸留水であり、ここで、ヒトα−Ｓｙｎ抗体は、適切に保存された無菌等張性溶液に剤形化される。特定の実施形態において、このような剤形は、デポ注入（ｄｅｐｏｔ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）により伝達可能な、組成物の調節放出または徐放型放出を提供できる製剤、例えば、注射可能な微小球（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）、生体−腐食性粒子、重合体性化合物（例：ポリ乳酸またはポリグリコール酸）、ビーズまたはリポソームを用いた剤形化を伴うことができる。特定の実施形態において、血液での持続時間を増加させる効果を有するヒアルロン酸がさらに使用できる。特定の実施形態において、目的の抗体を伝達するために移植可能な薬物伝達装置（ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｄｅｖｉｃｅ）がさらに使用できる。
【０２４０】
また、薬学的組成物は、吸入用に剤形化される。一部の実施形態において、ヒトα−Ｓｙｎ抗体は、乾性の吸入可能な粉末として剤形化される。特定の実施形態において、ヒトα−Ｓｙｎ抗体吸入溶液はさらに、エアロゾール伝達用推進剤に剤形化される。特定の実施形態において、溶液は、噴霧される。このような肺投与および剤形化方法は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５号に追加的に記載されている。一部の剤形は経口投与される。このような方式で投与されるヒトα−Ｓｙｎ抗体は、固形投薬体、例えば、錠剤およびカプセルの製造に通常使用される担体と共に、またはこれらの担体なしに剤形化される。特定の実施形態において、カプセルは生体利用率が極大化され、前−全身分解（ｐｒｅ−ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）が最小化される胃腸管内の地点で剤形の活性部分を放出するように設計される。ヒトα−Ｓｙｎ抗体の吸収を促進させるために、追加の製剤が含まれる。希釈剤、風味剤、低融点ワックス、植物性オイル、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、および結合剤もさらに使用できる。
【０２４１】
一部の薬学的組成物は、錠剤の製造に適した無毒性賦形剤と混合された有効量のヒトα−Ｓｙｎ抗体を含む。無菌水、または他の適切なビヒクルに錠剤を溶解させることによって、溶液は単位投薬体（ｕｎｉｔ−ｄｏｓｅ  ｆｏｒｍ）で製造される。適切な賦形剤には、不活性希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、ラクトースまたはリン酸カルシウム；または結合剤、例えば、デンプン、ゼラチンまたはアカシア；または潤滑剤、例えば、マグネシウムステアレート、ステアリン酸、または滑石が含まれるが、これに限るものではない。
【０２４２】
持続された−または調節された−伝達剤形を含むその他のヒトα−Ｓｙｎ抗体を含む剤形をはじめとする追加の薬学的組成物は当業者に明らかであろう。多様な他の持続−または調節−伝達手段、例えば、リポソーム担体、生物−腐食性微粒子または多孔性ビーズおよびデポ注入物を剤形化する技術もさらに当業者に公知である。例えば、多孔性重合体性微粒子の調節された放出を記載しているＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９号が参照される。持続−放出製剤は、成形された物品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセル形態の半透過性重合体マトリックスを含むことができる。持続放出マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号および欧州特許出願公報第ＥＰ０５８４８１号に開示）、Ｌ−グルタミン酸およびガンマエチル−Ｌ−グルタメートの共重合体（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ２：５４７−５５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−インエタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７；およびＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５）、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，前記）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシブチル酸（欧州特許出願公報第ＥＰ１３３，９８８号）を含むことができる。持続放出組成物はまた、当該技術分野で公知の様々な方法の一つによって製造可能なリポソームを含むことができる。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：３６８８−３６９２；欧州特許出願公報第ＥＰ０３６，６７６号；第ＥＰ０８８，０４６号および第ＥＰ１４３，９４９号を参照することができる。
【０２４３】
生体内投与に使用される薬学的組成物は、典型的に無菌製剤として提供される。無菌は、無菌ろ過膜を通したろ過によって達成される。組成物が凍結乾燥する時、凍結乾燥時はもちろん、これを溶液に溶かす過程が無菌的に行われなければならない。非経口投与用組成物は、凍結乾燥した形態または溶液として保存される。非経口組成物は、例えば、皮下注射針の入れる蓋付きバイアルまたは静脈投与用溶液バッグのような、一般に無菌の接近ポート（ｓｔｅｒｉｌｅ  ａｃｃｅｓｓ  ｐｏｒｔ）を有する容器に含まれる。
【０２４４】
特定の実施形態において、本願に開示されているような組換え抗体を発現する細胞は、伝達のためにカプセル化される（Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ４３：３２９２−３２９８，２００２；およびＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓ１０３：３８９６−３９０１，２００６）。
特定の剤形において、抗体は、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌまたは１５０ｍｇ／ｍｌの濃度を有する。一部の剤形は、緩衝剤、スクロースおよびポリソルベートを含む。剤形の一例は、５０−１００ｍｇ／ｍｌの抗体、５−２０ｍＭナトリウムアセテート、５−１０％ｗ／ｖスクロース、および０．００２−０．００８％ｗ／ｖポリソルベートを含むものである。特定の錠剤は、例えば、９−１１ｍＭナトリウムアセテート緩衝剤中の６５−７５ｍｇ／ｍｌの抗体、８−１０％ｗ／ｖスクロース、および０．００５−０．００６％ｗ／ｖポリソルベートを含む。このような特定剤形のｐＨは、４．５−６の範囲内である。他の剤形は、５．０−５．５のｐＨ（例えば、５．０、５．２または５．４のｐＨ）を有する。
【０２４５】
まず、薬学的組成物が剤形化されると、これは、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、結晶、または脱水されたり凍結乾燥した粉末として無菌バイアル内に保存される。このような剤形は、直ちに使用可能な形態、または投与直前に再構成される形態（例えば、凍結乾燥する）で保存される。単一−用量投与単位体を生成するためのキットもさらに提供される。このようなキットは、乾燥したタンパク質を有する第１容器と、水性剤形を有する第２容器とを含む。特定の実施形態において、単一および複数−チャンバーがある、予め−充填されたシリンジを含むキットが提供される。使用されるヒトα−Ｓｙｎ抗体−を含む薬学的組成物の治療的有効量は、例えば、治療的状況および目的に左右される。当業者であれば、治療に適切な用量は、少なくとも部分的にヒトα−Ｓｙｎ抗体が使用される疾患、投与経路、および患者の身体状態（体重、体表面または器官の大きさ）および／または状態（年齢および全般的な健康）に応じて異なることを理解するであろう。特定の実施形態において、臨床医は、最適な治療効果を得るために最適な用量を決定し、投与経路を変更することができる。
【０２４６】
典型的な投与量は、前記言及した要素を考慮して、約１μｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の範囲であってもよい。特定の実施形態において、用量は、１０μｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、選択的に０．１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、または代案的に０．３ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。一部の場合に、用量は、０．５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇである。一部の場合に、抗体は、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、または２０ｍｇ／ｋｇで投与される。
投与頻度は、使用された剤形のヒトα−Ｓｙｎ抗体の薬物動態学的パラメータに左右される。典型的に、臨床医は目的の効果を達成する用量に到達する時まで組成物を投与する。したがって、組成物は、時間にかけて単一服用量（ｓｉｎｇｌｅｄｏｓｅ）、または２回またはそれ以上の服用量として投与されるか、または移植可能な装置またはカテーテルを通した連続注入として投与される。適切な用量は、適切な用量−反応データの使用により確認される。特定の実施形態において、抗体は、長い時間にかけて患者に投与される。抗体の慢性的投与は、完全ヒトではない抗体、例えば、非−ヒト動物においてヒト抗原に対して生成された抗体、例えば、非−完全ヒト抗体または非−ヒト動物で生成された非−ヒト抗体は、通常それに伴う有害な免疫反応またはアレルギー反応を最小化する。
【０２４７】
薬学的組成物の投与経路は、公知の方法、例えば、経口；静脈内、腹膜内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼球内、動脈内、門脈内、または病巣内経路を通した注射；持続放出システムまたは移植装置が使用できる。特定の実施形態において、組成物は、ボルス注射によって、または注入または移植装置によって連続的に投与される。
【０２４８】
組成物はまた、目的の分子が吸収されたりカプセル化されている膜、スポンジまたはその他の適切な物質を移植して局所投与される。特定の実施形態において、移植装置が用いられる場合に、前記装置は、任意の適切な組織または器官内に移植され、目的の分子の伝達は、拡散、時間に合わせたボルスまたは連続投与により達成される。
【０２４９】
また、生体外でヒトα−Ｓｙｎ抗体薬学的組成物を使用することが好ましい。この場合に、患者から除去された細胞、組織または器官はヒトα−Ｓｙｎ抗体薬学的組成物に露出し、この後、細胞、組織および／または器官は後続的に患者内に移植される。
【０２５０】
特に、ヒトα−Ｓｙｎ抗体は、ポリペプチドを発現し分泌するために、本願に記載されているような方法を用いて遺伝子操作された特定細胞を移植することにより伝達される。特定の実施形態において、このような細胞は、動物またはヒト細胞であってもよく、自家組織、他家組織、または異種由来であってもよい。特定の実施形態において、細胞は不滅化される。他の実施形態において、免疫反応を減少させるために、細胞は、周辺組織への浸透を防ぐためにカプセル化される。追加の実施形態において、カプセル化物質は、典型的にタンパク質生成物の放出を可能にするが、患者の免疫系または周辺組織から他の有害因子による細胞の破壊を防止する生物適合性の半−透過性重合性エンクロージャーまたは膜である。
【０２５１】
以下、本発明の理解のために好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記の実施例によって本発明の内容が限定されるわけではない。
【０２５２】
本願において、細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学およびタンパク質および核酸化学および混成化などに関連して、本願に使用された用語および技術は本技術分野で幅広く用いられ、知られたものである。本願に開示された方法および技術は、特に言及のない細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝子形質転換技術、微生物学、ＤＮＡ組換え技術、免疫学の当業者における技術水準内である通常の技術を用いて実施される。一般的な技術に関するより詳しい説明は、次の本および文献を参照することができる。分子生物学および生化学に関する一般的な方法に関しては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ２００１）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ１９９９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．，１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｇａｉｔ  ｅｄ．，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ  ａｎｄ  Ａｌａｎ，Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．）；およびＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（Ｗｕ，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）、などを参照することができる。タンパク質反応および精製技術は、当業界における通常または本願に記載されたように、製造者の方法により行われる。本願において、分析化学、合成有機化学および医薬および薬学化学実験技術および方法に関連して使用される用語は、当業界で幅広く公知であり、通常使用されるものである。化学合成、化学分析、薬学製剤、薬学剤形および投与、患者治療などには標準技術を使用することができる。
【０２５３】
実施例１：α−ｓｙｎ抗体の製造
実施例１−１：マウスモノクローナル抗体
免疫化
抗原としては、全長（１４０残基）またはＣ−末端２１個の残基が切断されたα−ｓｙｎ単量体を３７度のｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ  Ｃに入れて、１４日間１０５０ｒｐｍで振って凝集化させ、ソニケーションして使用した。前記製造された１ｍｇ／ｍｌの濃度の１４０個および１１９個の残基のα−ｓｙｎ  ｆｉｂｒｉｌそれぞれをアジュバントと１：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）で混合してよく混ぜた。
【０２５４】
次に、前記用意した混合物２００μＬを５〜７週齢ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスの皮下に注射し、２週後に、同様の方法で製造した混合物２００μＬを追加的に皮下注射してブースティングさせた。ブースティング１週間後に血液を採取して、投与抗原を付けたＥＬＩＳＡ方法を用いて免疫化滴定（ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｔｉｔｅｒａｔｉｏｎ）を行った。次に、３次ブースティングは抗原のみを皮下注射した。
【０２５５】
ハイブリドーマ生産
次に、前記のように免疫完了したマウスの脾臓な除去して、これから細胞を確保した。次に、脾臓細胞を１０％ＦＢＳの添加されたＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）に懸濁させた。ハイブリドーマを製造するために、ミューリン骨髄腫細胞のＳＰ２／０−Ａｇ１４と脾臓細胞を血清の含まれていないＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地で混合した後、遠心分離をして培地を除去した。次に、細胞ペレットにＰＥＧを添加した後、３７℃で１分間培養して細胞融合を誘導した。
【０２５６】
単細胞クローニング
融合２週後に、細胞培養培地を用いてマウスに投与した抗原を付けたＥＬＩＳＡ方法を用いて抗体を生産するマウスＢ細胞との融合を確認した。次に、ハイブリドーマを用いて単細胞クローニングを行って、単クローン抗体を生産するハイブリドーマを計１６個選別した。全長（１４０残基）α−ｓｙｎ凝集体を抗原として用いて１Ｅ４および９Ｂ１１（それぞれＩｇＧ１  ｋａｐｐａ、ＩｇＧ３  ｋａｐｐａおよびＩｇＧ３  ｋａｐｐａ）クローンを得て、Ｃ−末端２１個の残基が切断されたα−ｓｙｎ凝集体を抗原として用いて３Ａ９、１０Ｆ１０および１１Ｆ１１（それぞれＩｇＧ２ｂ  ｋａｐｐａ、ＩｇＧ２ａ  ｋａｐｐａ、ＩｇＧ２ｂ  ｋａｐｐａ）のクローンを得た。
【０２５７】
抗体の精製
１０％ＦＢＳの含まれているＲＰＭＩ１６４０培地で各ハイブリドーマを培養し、抗体生産のためにｓｅｒｕｍのないＳＦＭ培地に培養培地を入れ替えた後、４日程度培養する。細胞培養上層液を分離して遠心分離した後、０．２２μｍフィルタで濾過した後、ＩｇＧ１タイプはｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｃｏｌｕｍｎで、残りの抗体はｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｃｏｌｕｍｎで精製した。
【０２５８】
可変領域配列決定
可変領域およびＣＤＲ配列は、Ａｈｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ２００４，１８（２）：２３７−２４１論文を参照して決定した。ハイブリドーマを培養した後、遠心分離して細胞のみを分離した。分離されたハイブリドーマにトリゾールを入れてＲＮＡを分離し、これをテンプレートにしてｃＤＮＡを合成した後、塩基配列分析により可変領域およびＣＤＲ配列を確認した。
アミノ酸配列は表１、ヌクレオチド配列は表２に開示されている。
【０２５９】
実施例１−２．ファージライブラリースクリーニング
ライブラリーファージ（Ｌｉｂｒａｒｙ  ｐｈａｇｅ）の用意
多様性を有するヒト由来ＳｃＦｖ（Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）ライブラリーｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ（梨花女子大学から導入）１×１０１０個をクロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ、Ｃ０８５７）３４μｇ／ｍｌ、２％グリコース（Ｓｉｇｍａ、Ｇ５４００）および５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ、Ｍ２３９３）の含まれている２Ｘ  ＹＴ［Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（ＣＯＮＤＡ、１６１２．００）１７ｇ、イースト抽出物（ＣＯＮＤＡ、１７０２．００）１０ｇ、ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ、Ｓ７６５３）５ｇ］培地に接種後、３７℃で３時間程度培養してＯＤ６００値が０．５から０．７となるようにした後、ヘルパーファージ（ｈｅｌｐｅｒ  ｐｈａｇｅ）を感染させた後、クロラムフェニコール３４μｇ／ｍｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、カナマイシン（Ｓｉｇｍａ、Ｋ１８７６）７０μｇ／ｍｌ、１ｍＭ  ＩＰＴＧ（ＥＬＰＩＳＢＩＯ、ＩＰＴＧ０２５）を添加した２Ｘ  ＹＴ培地で３０℃、１６時間培養してファージパッキングを誘導した。次に、培養液を４５００ｒｐｍ、４℃の条件で１５分間遠心分離した後、上澄液に４％ＰＥＧ６０００（Ｆｌｕｋａ、８１２５３）と３％ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ、Ｓ７６５３）を添加してよく溶かした後、氷で１時間反応させた。これを再び４℃の条件で８０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離した後、ペレットをＰＢＳで懸濁した後、再び４℃の条件で１２０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して、ライブラリーファージを含む上澄液を得て、新しいチューブに入れて使用時まで４℃で保管した。
【０２６０】
ファージディスプレイパニング（ｐａｎｎｉｎｇ）
次に、アルファ−シヌクレイン凝集体を単量体対比選好して結合する抗体を選別するために、実施例１で用意した全長アルファ−シヌクレイン凝集体を用いてパニングを進行させ、計３回パニングを次のように進行させた。
具体的には、免疫試験管（ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅ、ｍａｘｉｓｏｒｐ４４４２０２）に１０μｇ／ｍｌの濃度の組換えシヌクレイン凝集体と単量体をＰＢＳに添加して、４℃で一晩、試験管表面にタンパク質を吸着させた後、牛血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）３％溶液を試験管に添加して、シヌクレイン凝集体または単量体が吸着しない表面を保護した。試験管を空けた後、ＢＳＡ３％溶液に分散した１０１２ＣＦＵの抗体ファージライブラリーをシヌクレイン単量体タンパク質の吸着している免疫試験管に入れて、常温で１時間反応させた（ネガティブ選別）。シヌクレイン単量体に非結合したファージを回収して、シヌクレイン凝集体の付着した免疫試験管に常温で２時間結合させた。次に、非特異的に結合したファージをＰＢＳ−Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）溶液で５回〜３０回洗い落とした後、残っている抗原特異的ファージ抗体を１００ｍＭトリエチルアミン溶液を用いて回収した。回収されたファージを１Ｍトリスバッファー（ｐＨ７．４）で中和させた後、ＥＲ２５３７大腸菌に３７℃で１時間感染させ、感染した大腸菌をカルベニシリンを含有する２Ｘ  ＹＴ寒天培地に塗抹して、３７℃で一晩培養した。翌日、培養された大腸菌を４ｍｌの２Ｘ  ＹＴカルベニシリン培養液に懸濁し、１５％グリセロールを添加して、一部は−８０℃に保管し、残りは次のラウンドのパニングのためにファージを製造した。この過程を計３ラウンド繰り返して抗原特異的な抗体を増幅させた。パニングラウンドが進行するほど、ＰＢＳ−Ｔを用いた洗浄回収を増加させて抗原特異的ファージを増幅および濃縮した。
【０２６１】
単クローンファージ抗体選別（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｌｏｎｅ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）
前記パニングにより得たファージプール（ｐｈａｇｅ  ｐｏｏｌ）からシヌクレイン凝集体に特異的に結合する単クローン抗体を選別するために、次の実験を行った。
濃縮されたプールから単クローンを分離するために、ＬＢ−テトラサイクリン／カルベニシリン寒天培地に前記ファージプールを塗抹した後、培養して単一コロニーを確保した。次に、単クローンをウェルあたり４００μｌの２Ｘ  ＹＴ−テトラサイクリン／カルベニシリン培地の入った９６の深いウェルプレートに接種して一晩育てた後、培養液１０μｌを、新しい３９０μｌの２Ｘ  ＹＴ−テトラサイクリン／カルベニシリン培地の含まれている９６の深いウェルプレートに入れて、３７℃で４時間培養した。前記培養液に１ｍＭ  ＩＰＴＧとなるように入れて、３０℃で一晩培養した。一晩培養した培養液を遠心分離して上澄液を取った。
【０２６２】
次に、以下のようにＥＬＩＳＡ方法を用いてシヌクレイン凝集体と結合する単クローン可溶性ｓｃＦｖを発現するクローンを選択した（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ．Ｒａｄｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｒｂａｓ  ＩＩＩ．２０００．Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｉｎ：Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．１ｓｔｅｄ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ．ＮＹ．ＵＳＡ．ｐｐ．１１．９−１１．１２）。具体的には、９６ウェルプレートに実施例１−１で選別された７Ｂ７抗体を入れて、４℃で一晩コーティングした。３％ＢＳＡを各ウェルあたり２００μＬずつ入れて、３７℃で２時間ブロッキングした。次に、シヌクレイン凝集体と単量体を１００ｎｇ／ｗｅｌｌの濃度でそれぞれローディングした後、３７℃で２時間反応させた。次に、ＰＢＳ−Ｔ３００μＬで５回洗浄した。前記用意された単クローン上澄液は３％ＢＳＡと１：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）で混合した後、これを前記凝集体および単量体と結合させたプレートに１００μＬずつローディングした後、３７℃で２時間反応させた。次に、ＰＢＳ−Ｔ３００μＬで５回洗浄した後、抗−ＨＡ  ＨＲＰ結合抗体を入れて、３７℃で１時間反応させた後、ＰＢＳ−Ｔで５回洗浄した。ＴＭＢ（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、Ｓｉｇｍａ、Ｔ０４４０）１００μＬを入れて発色した後、１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４  ５０μＬを入れて反応を停止した後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。吸光度が０．５以上のクローンを結合による陽性反応で見なし、ＢＳＡ非特異的に結合するクローンは排除させた。
【０２６３】
これからシヌクレイン凝集体に特異的に結合するＡＣ８、ＡＥ８、ＡＡ９、ＤＧ５、ＡＤ２、ＡＤ７、ＤＧ１１、ＤＧ８およびＤＡ９抗体クローンを選別し、これらのクローンはタンパク質および塩基配列を分析した。前記クローンの核酸配列は、本文の配列番号１６９〜２２４に開示されている。
【０２６４】
実施例２．α−Ｓｙｎ抗体を用いた抗原結合特異性および結合力分析
実施例２−１：マウスモノクローナル抗α−Ｓｙｎ抗体を用いたＤｏｔ  ｂｌｏｔ分析
本願による抗体がネイティブ状態での単量体または凝集体に結合するかを分析するために、Ｄｏｔ  ｂｌｏｔ実験を行った。このために、抗原として５０ｎｇあるいは１００ｎｇのα−ｓｙｎモノマーまたはフィブリルタンパク質（ソウル大学のイ・スンジェ教授ｌａｂで製造；Ｂａｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ３２：１３４５４、２０１２）をＤｏｔ  ｂｌｏｔ  ａｐｐａｒａｔｕｓ（ＢｉｏＲａｄ）を用いてニトロセルロースメンブレンにスポットローディングした。２倍ずつ希釈したモノマーまたはフィブリルタンパク質は、メンブレンの右から左へ順次にローディングした（１２．５、２５、５０、１００ｎｇ）。メンブレンをＴＢＳＴ組成の５％ｎｏｎ−ｆａｔ  ｄｒｙ  ｍｉｌｋで１時間常温でブロッキングした後、実施例１で製造したα−ｓｙｎ抗体を１ｍｇ／ｍｌの濃度で１％ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ含有ＴＢＳＴに入れて、メンブレンと当該抗体を１時間常温でインキュベーションした。次に、ＴＢＳＴで洗浄した後、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が結合した２次抗体および基質としてｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｓｃｅｎｃｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＮＥＮ）を製造者の方法通りに使用して信号を分析した。結果はＬＡＳ−３０００  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてイメージングした。結果は図１に記載されている。これに示されているように、本願によるα−ｓｙｎ抗体は、α−ｓｙｎモノマーと比較して、凝集体にのみ選好的に結合することが明らかになった。特に、１Ｅ４、９Ｂ１１、３Ａ９および１１Ｆ１１は凝集体にのみ結合し、１０Ｆ１０は凝集体および単量体にすべて結合することが明らかになった。２７４抗体（Ｂａｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  ＮｅｕｒｏＳｃｉ．２０１２Ｓｅｐ２６；３２（３９）：１３４５４−１３４６９）は単量体および凝集体にすべて結合する比較抗体である。
【０２６５】
実施例２−２：マウスモノクローナル抗α−Ｓｙｎ抗体を用いたＥＬＩＳＡ分析
本願による抗体の抗原に対する結合力を定量的に分析するために、ＥＬＩＳＡを行った。このために、本願によるアルファ−シヌクレイン抗体を１ｍｇ／ｍｌの濃度で９６ウェルプレートにコーティングした後、これに１０、１００、１０００、１０，０００ｎｇ／ｍｌの濃度のアルファ−シヌクレインフィブリル凝集体を処理した後、ＰＢＳで洗浄し、次に、ビオチンの結合した２次抗体およびＨＲＰの結合したストレプトアビジンを処理した後、基質としてＴＭＢと反応した後、吸光度を測定した。結果は図２に記載されている。これに示されているように、本願による抗体は凝集体に高い結合力で選好的に結合することが明らかになった。ＥＬＩＳＡ結果により抗体を分析してみれば、凝集体選好的に結合する抗体は０．１〜２×１０−９Ｍ程度の親和力を示し、単量体および凝集体にすべて結合する抗体はこれより高い〜１×１０−１０Ｍ値を示した。
【０２６６】
実施例２−３．マウスモノクローナル抗α−Ｓｙｎ抗体を用いたＢＩＡｃｏｒｅ分析
次に、実施例１で製造されたアルファ−シヌクレイン抗体の単量体および凝集体の抗原結合に対する定量的分析をＢＩＡｃｏｒｅを用いて行った。
【０２６７】
機器はＴ２００（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓ／Ｎ：１５６５８８８）を用いた。ＣｈｉｐはＰｒｏｔｅｉｎ  Ａを使用し（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ．２９−１２７５−５６）、Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒは１０ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ  ｐＨ１．５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ．ＢＲ−１００３−５４）、Ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒとａｎａｌｙｔｅ希釈、サンプル希釈緩衝液としてはＨＢＳ−ＥＰを使用した。実施例１で製造されたα−ｓｙｎ抗体（３Ａ９、９Ｂ１１、１１Ｆ１１）は１Ｘ  ＨＢＳ−ＥＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ．ＢＲ−１００６−６９）に希釈し、α−ｓｙｎ単量体（１ｍｇ／ｍｌ）またはフィブリルタンパク質（３ｍｇ／ｍｌ）（ａｎａｌｙｔｅ）は２倍ずつ順次に希釈して、０ｎＭを含む計６つの濃度（０、０．３９、１．５６、６．２５、２５、１００ｎＭ）で分析した。キャプチャの場合、単量体は標的ＲＵを８００（ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ）、フィブリルは標的ＲＵを１００（ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ）とし、キャプチャｐｈａｓｅをｃｏｎｔａｃｔ  ｔｉｍｅを６０秒、ｆｌｏｗ  ｒａｔｅを３０μｌ／ｍｉｎ、ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｐｅｒｉｏｄを１８０秒で進行させた。ａｓｓｏｃａｔｉｏｎ  ｐｈａｓｅでは、ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅを１２０秒、ｆｌｏｗ  ｒａｔｅを３０μｌ／ｍｉｎとし、ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｐｈａｓｅでは、ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅを３６０秒、ｆｌｏｗ  ｒａｔｅを３０μｌ／ｍｉｎとした。Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｐｈａｓｅでは、ｆｌｏｗ  ｒａｔｅを３０μｌ／ｍｉｎとしてｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅを２４０秒（１次）、６０秒（２次）の、２回にわたって進行させた。１：１ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｅｌを用いてｆｉｔｔｉｎｇし、ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅはＢＩＡＣｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いた（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。結果は図３Ａおよび図３Ｂに記載されている。分析した４つのアルファ−シヌクレイン抗体のうち、上述した他の方法で凝集体に選好的に結合する抗体である、３Ａ９、９Ｂ１１、および１１Ｆ１１がＢＩＡｃｏｒｅでも凝集体にのみ結合することが明らかになり、約１〜３×１０−９Ｍの高い親和度を有することが明らかになった。
【０２６８】
実施例２−４．マウスモノクローナル抗α−Ｓｙｎ抗体を用いたＯｃｔｅｔ分析
実施例１で製造されたアルファ−シヌクレイン抗体（３Ａ９、９Ｂ１１、１１Ｆ１１）の単量体および凝集体の抗原結合に対する定量的分析をＯｃｔｅｔを用いて行った。
具体的には、ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒは１Ｘ  ＫＢ  ｂｕｆｆｅｒ（ｃａｔ．１８−１０９２）あるいは１Ｘ  ＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒを１０００ｒｐｍで使用し、ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒはｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ、ｐＨ５（１０ｍＭ、Ｃａｔ．１８−１０６８）を使用した。α−ｓｙｎモノマーはα−ｓｙｎ抗原をｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎさせ、フィブリルの場合、テスト抗体をｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎさせた。ｔａｒｇｅｔ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎは、モノマーの場合に２０μｇ／ｍｌ、フィブリルの場合に０．４μｇ／ｍｌとし、ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎは、モノマーの場合に５０ｎＭから、フィブリルの場合に１００ｎＭから２倍ずつ順次に希釈して計７個のポイントを設定した。Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ／Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ時間は、モノマーの場合に５分／２０分、フィブリルは５分／２５分であり、ＢｉｏｓｅｎｓｏｒはＡＲＧ２を、ｆｉｔｔｉｎｇは１：１ｆｉｔｔｉｎｇを使用した。
【０２６９】
結果は図４に記載されている。これに示されているように、３Ａ９、９Ｂ１１および１１Ｆ１１の場合、単量体にはほとんど結合せず（赤い点線ボックス）、凝集体にはよく結合することが明らかになった（赤い点線ボックス内のグラフが上がる）。この結果は、Ｄｏｔ  ｂｌｏｔ、Ｏｃｔｅｔ、ＥＬＩＳＡでの結果と類似あるいは一致する結果で、テストした４つのα−ｓｙｎ抗体のうち、前記他の方法で凝集体に選好的に結合する抗体である、３Ａ９、９Ｂ１１および１１Ｆ１１がＯｃｔｅｔでも凝集体にのみ結合することが明らかになった。
【０２７０】
実施例２−５．ＳｃＦＶ抗α−Ｓｙｎ抗体を用いたＤｏｔ  ｂｌｏｔ
実施例１−２で選別されたＳｃＦＶ抗α−Ｓｙｎ抗体を用いて、実施例２−１に記載されているように、Ｄｏｔ  ｂｌｏｔを行った。抗原は左の１番目ラインから６．２５ｎｇ、１２．５ｎｇ、２５ｎｇおよび５０ｎｇの順にローディングした。抗体は１μｇ／ｍｌの濃度で処理し、ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ｆｃ−ＨＲＰ  ２ｎｄ  Ａｂを用いて確認した。
【０２７１】
結果は図５に開示されている。Ｍは単量体抗原、Ａは凝集体抗原を示す。各抗体の単量体または凝集体に対する選択的結合を右側に表に示した。ＡＡ９、ＡＤ２、ＡＤ７、ＡＣ８、ＤＧ８、ＤＧ１１、ＤＡ９、ＤＧ５は凝集体にのみ結合することが明らかになり、ＡＥ８は凝集体に選好的に結合し、単量体には非常に弱く結合することが明らかになった。
【０２７２】
実施例２−６．ＳｃＦＶ抗α−Ｓｙｎ抗体を用いたＯｃｔｅｔ分析
実施例１−２で選別されたＳｃＦＶ抗α−Ｓｙｎ抗体を用いて、実施例２−４に記載されているように、Ｏｃｔｅｔ分析を行った。結果は図６に開示されている。これらの抗体はα−ｓｙｎ凝集体に〜１０−９〜〜１０−１１Ｍ水準の高い親和度を有することが明らかになった。
【０２７３】
実施例３．マウスモノクローナル抗α−Ｓｙｎ抗体の細胞間アルファ−シヌクレイン凝集体伝達抑制効果分析
アルファ−シヌクレイン凝集体の細胞間伝達がアルファ−シヌクレイン凝集体関連疾患の１つの病因として提示されているため、これを抑制できる抗体は治療剤として有用に使用できるはずである。このために、ＢｉＦＣ（ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）分析を次のように行った。ＢｉＦｃ原理は図７の上に図式的に示した。
【０２７４】
ＢｉＦＣ分析のための細胞培養
アルファ−シヌクレインと半分のＶｅｎｕｓ蛍光タンパク質（Ｖｅｎｕｓ  １−α  Ｓｙｎ（Ｖ１Ｓ）、αＳｙｎ−Ｖｅｎｕｓ２（ＳＶ２））をそれぞれ発現するＳＨ−ＳＹ５Ｙヒトニューロブラストーマ細胞株は、実験前まで従来に記述されたように培養された（Ｌｅｅ  Ｈ−Ｊ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．ＮｅｕｒｏＳｃｉ．２００４；２４：１８８８−１８９６）。実験に先立ち、Ｖ１Ｓ、ＳＶ２を発現する細胞１８０，０００個をカバースリップ上に混合して敷いた後、３日間培養した。継続的なアルファ−シヌクレインの細胞間移動を確認するために、ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅは毎４８時間ごとにｓｕｂ−ｃｕｌｔｕｒｅされた。別途の実験にて、６継代（ｐａｓｓａｇｅ）程度で伝達の程度が最大であることを確認したので（データに示していない）、本実施例において、抗体の細胞間伝達抑制効能は６継代のｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅを用いて分析した。
【０２７５】
ＢｉＦＣ実験／抗体処理
イメージング前日、ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅに５０μｇ／ｍｌのＩｇＧまたはテスト抗体（３Ａ９、９Ｂ１１、１１Ｆ１１）を追加した。各ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅに現れるＶｅｎｕｓ  ｃｈａｎｎｅｌでの信号はアルファ−シヌクレインの凝集による凝集体を示し、これは、α−ｓｙｎが１つの細胞から他の細胞に移動して生成された凝集体と見なした。このような信号はＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）で自動分析した（機器設定：ｐｕｎｃｔａ  ｓｉｚｅ：０．１〜０．４μｍ、ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ：４０００−７０００）。
【０２７６】
結果は図７に開示されている。これに示されているように、青色は核、緑色は１つの細胞から外に出たアルファ−シヌクレインが他の細胞内のα−ｓｙｎに接して凝集体を形成したことを示す。右グラフはシグナルの強さを示したものである。９Ｂ１１、１１Ｆ１１、および３Ａ９の各処理群では、陰性対照群のＩｇＧ対比、緑色シグナルを示す細胞の個数が減少することが分かり、これは、本願による抗体が凝集体の細胞間伝達を効果的に抑制できることを示すものである。
【０２７７】
実施例４．マウスモノクローナル抗α−Ｓｙｎ抗体のインビボでのアルファ−シヌクレイン凝集体除去効果分析
本願で製造されたα−Ｓｙｎ抗体のインビボでの効果を分析するために、ヒトアルファ−シヌクレインを過発現する形質転換マウス（ｍＴｈｙ−１  ｈｕｍａｎ  α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ、ＵＣ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）に１０ｍｇ／ｋｇの本願による抗体またはＩｇＧを、３ヶ月間、毎週腹腔投与した。グループあたり６匹のハツカネツミを用い、非形質転換ハツカネズミ（ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ）を対照群として用いた。次に、かん流を次のように行った。
【０２７８】
最後の投与が完了した後、脳内の病理分析のために、人道的規定によって、当該動物はｃｈｌｏｒａｌ  ｈｙｄｒａｔｅで麻酔させた後、０．９％の生理食塩水で心臓かん流した。次に、かん流した脳の半分（ｓａｇｇｉｔａｌ  ｓｅｃｔｉｏｎ）はリン酸緩衝液中の４％パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．４、４℃）に分析時点まで保管し、他の半分は直ちに冷凍状態で保管した（７０℃）。
【０２７９】
病理学的分析は次のように行われた。パラホルムアルデヒドに固定された脳の半分はＶｉｂｒａｔｏｍｅを用いてｆｒｅｅ−ｆｌｏａｔｉｎｇ方式で４０μｍの厚さの連続切片で切り出した。各投与群の脳内α−ｓｙｎの発現程度を確認するために、ｃｏｒｔｅｘ、ｓｔｒｉａｔｕｍ、ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓを含む切片をα−ｓｙｎ抗体（凝集体のマーカーであるｐ１２９  α−ｓｙｎ抗体、ａｂｃａｍ、ａｂ５９２６４または総α−ｓｙｎ抗体、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、＃２６４２）と４℃で一晩培養した。あるいは、星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）の活性程度、小膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）の活性程度確認のために、前記切片をＧＦＡＰ（ｇｌｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＡＢ５８０４、ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）あるいはＩｂａ１に対する抗体（０１９−１９７４１、Ｗａｋｏ）をそれぞれ処理した。また、脳炎症（ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）の程度を確認するために、ＩＬ−６（ＮＢ６００−１１３１、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）またはＩＬ−１βに対する抗体（ａｂ９７２２、ａｂｃａｍ）をそれぞれ処理した。１次抗体との培養後に、ビオチンの結合したｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（１：１００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびＡｖｉｄｉｎ  Ｄ−ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（１：２００、ＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を処理し、ＤＡＢ（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）で検出した。免疫染色された各切片は明視野顕微鏡で観察して光学密度を測定した。
【０２８０】
結果は図８Ａおよび図８Ｂに開示されている。図８Ａは、α−Ｓｙｎ凝集体のマーカーであるｐ−１２９  α−Ｓｙｎ抗体（Ｓｅｒ１２９番にリン酸化が起こったα−ｓｙｎを認識する抗体）で分析した結果で、本願による抗体が投与されたＴＧ（ＴｒａｎｓＧｅｎｉｃ）マウスは、ＩｇＧのみ投与された対照群マウスと比較して、ｃｏｒｔｅｘおよびｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓのＣＡ１およびＣＡ３で凝集体に量が顕著に減少したことが明らかになった（当該部位はＩｇＧ試料において矢印頭で表される）。図８Ｂは、総α−Ｓｙｎ抗体で染色した結果である。ＴＧ  ｍｏｕｓｅで増加したヒトα−ｓｙｎは抗体投与によって効果的に除去され、この結果は、本願による抗体がα−ｓｙｎ凝集体を効果的に減少させて、パーキンソン疾患のようなα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙの治療に効果的に使用できることを示すものである。
【０２８１】
実施例５．マウスモノクローナル抗α−Ｓｙｎ抗体のＭｉｃｒｏｇｌｉｏｓｉｓおよびＡｓｔｒｏｇｌｉｏｓｉｓの減少および炎症性サイトカインの放出減少効果分析
グリオーシス（ｇｌｉｏｓｉｓ）はＢＢＢの損傷、ＴＧＦ−ベータまたはインターロイキンのような物質によって触発する、中枢神経系に損傷がある場合、これに対する反応でグリア細胞（ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）で起る非特異的反応である。代表的なものとして、ＭｉｃｒｏｇｌｉｏｓｉｓおよびＡｓｔｒｏｇｌｉｏｓｉｓを含み、それぞれＩｂａ−１およびＧＦＡＰタンパク質がマーカーとして使用される。
【０２８２】
これにより、実施例４に記述されたように、本願による抗体をマウスに投与してＭｉｃｒｏｇｌｉｏｓｉｓおよびＡｓｔｒｏｇｌｉｏｓｉｓの減少およびこれを触発する炎症性サイトカインの放出減少に及ぼす影響を分析した。
結果は図９Ａ、図９Ｂ、図９Ｃおよび図９Ｄに開示されている。これに示されているように、本願による抗体は、対照群と比較して、ＭｉｃｒｏｇｌｉｏｓｉｓおよびＡｓｔｒｏｇｌｉｏｓｉｓを減少させ、これを触発する炎症性サイトカインＩＬ−１ｂｅｔａおよびＩＬ−６の放出を減少させることが明らかになった。
【０２８３】
実施例６．マウスモノクローナル抗α−Ｓｙｎ抗体のヒト脳組織におけるレビー小体検出分析
十マイクロメートルの厚さのパラフィン包埋されたパーキンソン疾患で死亡した患者の脳組織（Ｄｒ．Ｈａｌｌｉｄａｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｙｄｎｅｙ）切片を、実施例５に使用された本願による抗体を用いて組織切片内のレビー小体とレビー神経突起（ｎｅｕｒｉｔｅ）を次のように染色した。９０％ギ酸で組織切片を３分間処理してａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌを進行させた後、１％Ｈ２Ｏ２（５０％ｅｔｈａｎｏｌ  ｂａｓｅ）を用いて組織自体のｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ活性を抑制した。組織のｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇを防止するために、１０％ｎｏｒｍａｌ  ｈｏｒｓｅ  ｓｅｒｕｍを処理した。次に、リン酸緩衝液で洗浄した後、本願による３Ａ９、１１Ｆ１１および１１Ｆ１１抗体をａｄｊａｃｅｎｔ  ｓｅｃｔｉｏｎに４℃で一晩処理した。リン酸緩衝液で洗浄後、ビオチンの結合したａｎｔｉ−ヒトＩｇＧ抗体を３７℃で３０分間処理した後、ａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘを常温で３０分間反応させた（Ｖｅｃｔａｓｔａｔｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ｋｉｔ；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。次に、０．００５％Ｈ２Ｏ２を含むＤＡＢで発色し、当該ｓｅｃｔｉｏｎを０．５％ｃｒｅｓｙｌ  ｖｉｏｌｅｔでカウンター染色して各細胞を区分した。
【０２８４】
結果は図１０Ａおよび図１０Ｂに開示されている。これに示されているように、本願による抗体はレビー小体およびレビー神経突起に効果的に結合（矢印で表示）することが明らかになった。この結果は、ヒト脳組織にあるレビー小体の構成成分であるα−ｓｙｎ凝集体に効果的に結合できることを意味するのである。ヒト脳に伝達された抗体が効果的にα−ｓｙｎ凝集体に特異的に結合できることを表すものである。
【０２８５】
実施例７．マウスモノクローナル抗α−Ｓｙｎ抗体のエピトープ分析
本願による３Ａ９および１１Ｆ１１抗体に対するエピトープマッピングはＰＥＰＳＣＡＮ（Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）にペプチドアレイ分析を依頼して行われた。
【０２８６】
結果は図１１に開示されている。これに示されているように、本願による抗体はＣ−末端を認識することが明らかになった。特に、先に説明したように、１１０〜１２２の間を認識する場合、凝集体選好的な結合を示した。
【０２８７】
上述した説明は例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的な思想や必須の特徴を変更することなく他の具体的な形態に容易に変形可能であることを理解するであろう。
＜さらなる実施態様＞
［実施態様１］
α−Ｓｙｎの凝集体に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、
前記抗体または抗原結合断片は、（ｉ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３の相補性決定部位を含む重鎖可変領域；および（ｉｉ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３の相補性決定部位を含む重鎖可変領域を含み、
前記ＣＤＲＨ１は配列番号１〜１４から選択され；前記ＣＤＲＨ２は配列番号１５〜２８から選択され；前記ＣＤＲＨ３は配列番号２９〜４２から選択され、
前記ＣＤＲＬ１は配列番号４３〜５６から選択され；前記ＣＤＲＬ２は配列番号５７〜７０から選択され；前記ＣＤＲＬ３は配列番号７１〜８４から選択されるものである、α−Ｓｙｎの凝集体に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片。
［実施態様２］
前記重鎖可変領域のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３；および前記軽鎖可変領域のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３の配列は、次のいずれか１つである、実施態様１に記載のα−Ｓｙｎの凝集体に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片：
（ａａ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号１、１５、および２９、そして前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号４３、５７および７１；
（ａｂ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号２、１６、および３０、そして前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号４４、５８および７２；
（ａｃ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号３、１７、および３１、そして前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号４５、５９および７３；
（ａｄ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号４、１８、および３２、そして前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号４６、６０および７４；
（ａｅ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号５、１９、および３３、そして前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号４７、６１および７５；
（ａｆ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号６、２０、および３４、そして前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号４８、６２および７６；
（ａｇ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号７、２１、および３５、そして前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号４９、６３および７７；
（ａｈ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８、２２、および３６、そして前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号５０、６４および７８；
（ａｉ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号９、２３、および３７、そして前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号５１、６５および７９；
（ａｊ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号１０、２４、および３８、そして前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号５２、６６および８０；
（ａｋ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号１１、２５、および３９、そして前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号５３、６７および８１；
（ａｌ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号１２、２６、および４０、そして前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号５４、６８および８２；
（ａｍ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号１３、２７、および４１、そして前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号５５、６９および８３；または
（ａｎ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号１４、２８、および４２、そして前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号５６、７０および８４。
［実施態様３］
前記重鎖可変領域は、
配列番号８５〜９８から選択されるアミノ酸配列；
配列番号８５〜９８から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有する配列；または
配列番号８５〜９８から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の相同性を有する配列を含むものである、実施態様１に記載のα−Ｓｙｎの凝集体に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片。
［実施態様４］
前記軽鎖可変領域は、
配列番号９９〜１１２から選択されるアミノ酸配列；
配列番号９９〜１１２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上；または
配列番号９９〜１１２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の相同性を有する配列を含むものである、実施態様１に記載のα−Ｓｙｎの凝集体に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片。
［実施態様５］
前記重鎖可変領域および軽鎖可変領域はそれぞれ、
配列番号８５および９９；
配列番号８６および１００；
配列番号８７および１０１；
配列番号８８および１０２；
配列番号８９および１０３；
配列番号９０および１０４；
配列番号９１および１０５；
配列番号９２および１０６；
配列番号９３および１０７；
配列番号９４および１０８；
配列番号９５および１０９；
配列番号９６および１１０；
配列番号９７および１１１；または
配列番号９８および１１２で表される配列を含むものである、実施態様１に記載のα−Ｓｙｎの凝集体に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片。
［実施態様６］
前記抗体または抗原結合断片は、モノクローナル抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ｄｉａｂｏｄｙまたはｓｃＦＶである、実施態様１に記載のα−Ｓｙｎの凝集体に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片。
［実施態様７］
前記モノクローナル抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である、実施態様６に記載のα−Ｓｙｎの凝集体に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片。
［実施態様８］
前記モノクローナル抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４型である、実施態様６に記載のα−Ｓｙｎの凝集体に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片。
［実施態様９］
前記抗体は、次のいずれか１つの重鎖および軽鎖を含む、実施態様１に記載のα−Ｓｙｎの凝集体に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片：
前記軽鎖および重鎖はそれぞれ、配列番号１１３および配列番号１４１；配列番号１１４および配列番号１４２；配列番号１１５および配列番号１４３；配列番号１１６および配列番号１４４；配列番号１１７および配列番号１４５；配列番号１１８および配列番号１４６；配列番号１１９および配列番号１４７；配列番号１２０および配列番号１４８；配列番号１２１および配列番号１４９；配列番号１２２および配列番号１５０；配列番号１２３および配列番号１５１；配列番号１２４および配列番号１５２；配列番号１２５および配列番号１５３；または配列番号１２６および配列番号１５４；で表されるアミノ酸配列を有するものである、α−Ｓｙｎの凝集体に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片。
［実施態様１０］
前記抗体は、次のいずれか１つの重鎖および軽鎖を含む、実施態様１に記載のα−Ｓｙｎの凝集体に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片：
前記軽鎖および重鎖はそれぞれ、配列番号１２７および配列番号１５５；配列番号１２８および配列番号１５６；配列番号１２９および配列番号１５７；配列番号１３０および配列番号１５８；配列番号１３１および配列番号１５９；配列番号１３２および配列番号１６０；配列番号１３３および配列番号１６１；配列番号１３４および配列番号１６２；配列番号１３５および配列番号１６３；配列番号１３６および配列番号１６４；配列番号１３７および配列番号１６５；配列番号１３８および配列番号１６６；配列番号１３９および配列番号１６７；または配列番号１４０および配列番号１６８。
［実施態様１１］
実施態様１〜１０のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片は、α−Ｓｙｎ凝集体の細胞間伝達の抑制；α−Ｓｙｎ凝集体を分解；またはα−Ｓｙｎ凝集体の形成を抑制する、α−Ｓｙｎの凝集体に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片。
［実施態様１２］
実施態様１〜１０のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片をコーディングする単離されたポリヌクレオチド。
［実施態様１３］
実施態様１２に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
［実施態様１４］
実施態様１３に記載の発現ベクターで形質転換された細胞。
［実施態様１５］
実施態様１４に記載の細胞を培養する段階；および
前記細胞株から抗体またはその抗原結合断片を単離する段階を含む、α−Ｓｙｎに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片の製造方法。
［実施態様１６］
実施態様１〜１０のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、組成物。
［実施態様１７］
前記組成物は、薬学的に許容可能な担体または賦形剤を追加的に含むα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙの治療用である、実施態様１６に記載の組成物。
［実施態様１８］
前記α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙは、パーキンソン疾患（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ、ＰＤ）、パーキンソン疾患性痴呆（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｄｅｍｅｎｔｉａ、ＰＤＤ）、レビー小体痴呆（ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｗｉｔｈ  Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｉｅｓ、ＤＬＢ）、アルツハイマーレビー小体疾患（Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｙ  ｖａｒｉａｎｔ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ（ＬＢＶ））、複合性アルツハイマーおよびパーキンソン病（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）、または多系統萎縮症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｔｒｏｐｈｙ、ＭＳＡ）を含むものである、実施態様１７に記載の組成物。
［実施態様１９］
実施態様１〜１０のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片を提供する段階；および
前記抗体または抗原結合断片をα−Ｓｙｎ凝集体の検出が必要な生物学的試料と接触する段階を含む、生物学的試料におけるインビボまたはインビトロでのα−Ｓｙｎ凝集体の検出方法。
［実施態様２０］
薬学的に有効な量の実施態様１〜１０のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片またはこれを含む組成物をα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙの治療および／またはα−ｓｙｎ凝集体の濃度調節が必要な対象体に投与する段階を含む、前記対象体のα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙの治療または前記対象体におけるα−Ｓｙｎ凝集体の濃度を調節する方法。
［実施態様２１］
前記α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙは、パーキンソン疾患（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ、ＰＤ）、パーキンソン疾患性痴呆（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｄｅｍｅｎｔｉａ、ＰＤＤ）、レビー小体痴呆（ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｗｉｔｈ  Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｉｅｓ、ＤＬＢ）、アルツハイマーレビー小体疾患（Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｙ  ｖａｒｉａｎｔ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ（ＬＢＶ））、複合性アルツハイマーおよびパーキンソン病（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）、または多系統萎縮症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｔｒｏｐｈｙ、ＭＳＡ）を含むものである、実施態様２０に記載の方法。
［実施態様２２］
対象体におけるα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙを診断する方法であって、前記方法は、
前記対象体におけるα−Ｓｙｎ凝集体の濃度および／または細胞内位置を実施態様１〜１０のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片で測定する段階；および
前記対象体で測定された前記α−Ｓｙｎ凝集体の濃度および／または細胞内位置を対照群試料の結果と比較する段階を含み、前記対照群の結果と類似または差は、前記対象体がα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙにかかったことを示すものである、方法。
［実施態様２３］
前記α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙは、パーキンソン疾患（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ、ＰＤ）、パーキンソン疾患性痴呆（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｄｅｍｅｎｔｉａ、ＰＤＤ）、レビー小体痴呆（ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｗｉｔｈ  Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｉｅｓ、ＤＬＢ）、アルツハイマーレビー小体疾患（Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｙ  ｖａｒｉａｎｔ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ（ＬＢＶ））、複合性アルツハイマーおよびパーキンソン病（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）、または多系統萎縮症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｔｒｏｐｈｙ、ＭＳＡ）を含むものである、実施態様２２に記載の方法。
［実施態様２４］
実施態様１〜１０のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片またはこれを含む組成物のα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙ対象体の前記疾患治療用使用であって、前記抗体または抗原結合断片またはこれを含む組成物は、前記対象体の脳における、α−Ｓｙｎ凝集体の細胞間伝達の抑制；α−Ｓｙｎ凝集体の分解；またはα−Ｓｙｎ凝集体の形成を抑制するものである、使用。
［実施態様２５］
前記α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙは、パーキンソン疾患（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ、ＰＤ）、パーキンソン疾患性痴呆（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｄｅｍｅｎｔｉａ、ＰＤＤ）、レビー小体痴呆（ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｗｉｔｈ  Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｉｅｓ、ＤＬＢ）、アルツハイマーレビー小体疾患（Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｙ  ｖａｒｉａｎｔ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ（ＬＢＶ））、複合性アルツハイマーおよびパーキンソン病（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）、または多系統萎縮症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｙｓｔｅ  ｍａｔｒｏｐｈｙ、ＭＳＡ）を含むものである、実施態様２４に記載の使用。
［実施態様２６］
実施態様１〜１０のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片またはこれを含む組成物の脳細胞におけるα−Ｓｙｎ凝集体の濃度調節用使用であって、前記抗体または抗原結合断片またはこれを含む組成物は、前記対象体の脳における、α−Ｓｙｎ凝集体の細胞間伝達の抑制；α−Ｓｙｎ凝集体の分解；またはα−Ｓｙｎ凝集体の形成を抑制するものである、使用。
［実施態様２７］
脳における、α−Ｓｙｎ凝集体の細胞間伝達の抑制；α−Ｓｙｎ凝集体の分解；またはα−Ｓｙｎ凝集体の形成を抑制する、脳細胞におけるα−Ｓｙｎ凝集体の濃度調節用の実施態様１〜１０のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
［実施態様２８］
α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙの治療に使用される、実施態様１〜１０のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
［実施態様２９］
第２８項において、
前記α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙは、パーキンソン疾患（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ、ＰＤ）、パーキンソン疾患性痴呆（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｄｅｍｅｎｔｉａ、ＰＤＤ）、レビー小体痴呆（ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｗｉｔｈ  Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｉｅｓ、ＤＬＢ）、アルツハイマーレビー小体疾患（Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｙ  ｖａｒｉａｎｔ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ（ＬＢＶ））、複合性アルツハイマーおよびパーキンソン病（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）、または多系統萎縮症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｔｒｏｐｈｙ、ＭＳＡ）を含むものである、実施態様１〜１０のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
【図１】
0006908709.tif 000005
【図２】
0006908709.tif 000006
【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
0006908709.tif 000010
【図６】
0006908709.tif 000011
【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図９ｄ】
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【図１０ａ】
0006908709.tif 000019
【図１０ｂ】
0006908709.tif 000020
【図１１】
0006908709.tif 000021
【配列表】
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