(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍関連抗原に結合する抗体またはその断片であって、抗原に結合する断片；
リンカー；および
ＣＸＣＬ１６のナチュラルキラー細胞誘導タンパク質を含む融合ポリペプチドであって、
前記腫瘍関連抗原は、メソテリン（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、ＰＤ−Ｌ１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ−ｌｉｇａｎｄ  １）、Ｈｅｒ２（ｈｕｍａｎ  ＥＧＦＲ−ｒｅｌａｔｅｄ  ２）、ＣＤ１９、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ２、Ｂ７Ｈ３、ＢＴ−０６２、ＢＴＬＡ、ＣＡＩＸ、４−１ＢＢ、５Ｔ４、ＡＧＳ−５及びＡＧＳ−１６からなる群より選択されるいずれか一つ以上であり、
前記リンカーはフューリン切断部位を含む、融合ポリペプチド。
【請求項２】
前記抗体は一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３】
前記フューリン切断部位は配列番号１５のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
前記ＣＸＣＬ１６は配列番号１７のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合ポリペプチドをコードする核酸。
【請求項６】
請求項５に記載の融合ポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項８】
前記宿主細胞は、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよび骨髄腫細胞株からなる群より選択されるいずれか一つである、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
腫瘍関連抗原に結合する抗体またはその断片であって、抗原に結合する断片；
リンカー；および
ＣＸＣＬ１６のナチュラルキラー細胞誘導タンパク質を含む融合ポリペプチドを含む癌の予防または治療用の医薬組成物であって、
前記腫瘍関連抗原は、メソテリン、ＰＤ−Ｌ１、Ｈｅｒ２、ＣＤ１９、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ２、Ｂ７Ｈ３、ＢＴ−０６２、ＢＴＬＡ、ＣＡＩＸ、４−１ＢＢ、５Ｔ４、ＡＧＳ−５及びＡＧＳ−１６からなる群より選択されるいずれか一つ以上であり、
前記リンカーはフューリン切断部位を含む、癌の予防または治療用の医薬組成物。
【請求項１０】
前記癌は、膵臓癌、乳癌、前立腺癌、胃癌、肝臓癌及び肺癌からなる群より選択されるいずれか一つである、請求項９に記載の癌の予防または治療用の医薬組成物。
【請求項１１】
前記ＣＸＣＬ１６は配列番号１７のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の癌の予防または治療用の医薬組成物。
【請求項１２】
腫瘍関連抗原に結合する抗体またはその断片であって、抗原に結合する断片；リンカー；およびＣＸＣＬ１６のナチュラルキラー細胞誘導タンパク質を含む融合ポリペプチド；および
ナチュラルキラー細胞（Ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ）を含む癌の予防または治療用の医薬組成物であって、
前記腫瘍関連抗原は、メソテリン、ＰＤ−Ｌ１、Ｈｅｒ２、ＣＤ１９、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ２、Ｂ７Ｈ３、ＢＴ−０６２、ＢＴＬＡ、ＣＡＩＸ、４−１ＢＢ、５Ｔ４、ＡＧＳ−５及びＡＧＳ−１６からなる群より選択されるいずれか一つ以上であり、
前記リンカーはフューリン切断部位を含む、癌の予防または治療用の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナチュラルキラー細胞の癌への流入の増大および抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）の極大化のための融合タンパク質およびナチュラルキラー細胞を用いた新規な癌免疫細胞治療に関する。
【０００２】
また、本発明は、融合タンパク質を用いて癌を治療する方法および融合タンパク質の様々な用途に関する。
【背景技術】
【０００３】
ナチュラルキラー細胞（Ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ；ＮＫ  ｃｅｌｌ）は、抗原による前感作なしに腫瘍細胞、バクテリア、細胞内寄生生物またはウイルスに感染した宿主細胞を除去する機能をし、不適切な骨髄移植を拒否し、Ｔ細胞の免疫反応を調節するなど、生体内免疫系の防御機構の第一線で作用する行動細胞である。
【０００４】
ナチュラルキラー細胞の免疫学的機能は、その殺傷機能を誘発する活性化シグナル（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｓｉｇｎａｌ）および殺傷機能を抑制する非活性化シグナル（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｓｉｇｎａｌ）の均衡によって左右される。具体的には、活性化シグナルを強く受けたナチュラルキラー細胞は標的細胞を攻撃および除去し、非活性化シグナルを強く受けたナチュラルキラー細胞は標的細胞を生かすようになる。
【０００５】
ナチュラルキラー細胞の殺傷機能としては、ＡＤＣＣ（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）およびＮＫ（Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｉｎｇ）が挙げられる。ＡＤＣＣとＮＫは、いずれもＰＴＫ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅ）の活性化を必要とし、ナチュラルキラー細胞の非活性化受容体により伝達される非活性化シグナルによって遮断されるという共通点を有する。ＮＫ細胞の殺傷機能が活性化シグナルおよび非活性化シグナルの均衡によって左右されるため、ナチュラルキラー細胞は、正常な宿主細胞と感染または腫瘍化した細胞を区分して除去できるようになる。
【０００６】
ナチュラルキラー細胞はＣＤ５６の発現程度に応じて分類することができ、ＣＤ５６ｄｉｍナチュラルキラー細胞は末梢血（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ）ナチュラルキラー細胞に９０％以上分布している。ＣＤ５６ｄｉｍは、他のＣＤ５６発現ナチュラルキラー細胞より細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）が高いことが知られており、ナチュラルキラー細胞の活性化受容体（ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）であるｋｉｌｌｅｒ  Ｉｇ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（ＫＩＲ）およびパーフォリン（ｐｅｒｆｏｒｉｎ）の発現が高いことが知られている。ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔナチュラルキラー細胞は、ＣＤ５６ｄｉｍナチュラルキラー細胞よりその数が少なく、細胞毒性能力も低いことが知られている。しかし、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔナチュラルキラー細胞は、免疫調節機能（ＩＦＮ−ｇａｍｍａ、ＴＮＦ−ａｌｐｈａなど）が高いだけでなく、ＡＤＣＣ（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）機能が高いことが報告されている（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０１１、１８６：６７５３−６７６１）。特に、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔナチュラルキラー細胞は、抗体と癌に対する併合治療時に上昇する効果があると期待される。
【０００７】
一方、腫瘍は、その悪性表現型と関連した独特のタンパク質を発現できるか、または特定のタンパク質を正常細胞より多い数に過多発現できることがよく知られている。腫瘍細胞の表面上における特有なタンパク質の発現は、腫瘍の表現型的アイデンティティ（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）および生化学的組成および活性をプローブすることによって疾患を診断し特性化する機会を提供するか、または腫瘍関連抗原を標的にして腫瘍に対する新しい治療方法を開発させる。
【０００８】
前記腫瘍関連抗原に対して特異的抗原抗体反応を示す抗体は、様々な生体免疫反応（抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）など）を誘導して癌細胞を攻撃して細胞死を誘導することが知られているため、腫瘍の治療に有用な抗体などが開発されているが、その治療効能を増進させるための研究開発に不備な現状にある。
【０００９】
このような背景下、癌細胞表面に特異的に発現される癌抗原およびナチュラルキラー細胞を用いて効果的に癌を治療できる方法に関する研究開発が行われる必要性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】大韓民国公開特許第１０−２００６−００７９１８０号
【特許文献２】大韓民国公開特許第１０−２０１５−００６３１４５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、腫瘍関連抗原に結合する抗体またはその断片；
リンカー；および
ＣＸＣＬ１６のナチュラルキラー細胞誘導タンパク質を含む融合ポリペプチドを提供する。
【００１２】
また、本発明は、前記融合ポリペプチドを暗号化する核酸、それを含むベクターまたは前記ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００１３】
また、本発明は、腫瘍関連抗原に結合する抗体またはその断片；
リンカー；および
ＣＸＣＬ１６のナチュラルキラー細胞誘導タンパク質を含む融合ポリペプチドを含む癌の予防または治療用の医薬組成物を提供する。
【００１４】
また、本発明は、腫瘍関連抗原に結合する抗体またはその断片；
リンカー；および
ＣＸＣＬ１６のナチュラルキラー細胞誘導タンパク質を含む融合ポリペプチド、およびナチュラルキラー細胞（Ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ細胞、ＮＫ細胞）を含む癌の予防または治療用の医薬組成物を提供する。
【００１５】
また、本発明は、癌の治療に用いるための前記融合ポリペプチドを含む組成物を提供する。
【００１６】
また、本発明は、癌を治療するための薬剤の製造における前記融合ポリペプチドの用途を提供する。
【００１７】
また、本発明は、癌を治療するための前記融合ポリペプチドの用途を提供する。
【００１８】
また、本発明は、前記融合ポリペプチドを含む組成物の薬剤学的に有効な量を患者に投与して癌を治療する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者は、免疫細胞治療剤であるナチュラルキラー細胞を癌組織内に効果的に流入させるための方法に関して研究開発を行った結果、ナチュラルキラー細胞表面に発現される活性誘導物質のレセプターのうちナチュラルキラー細胞の表面にＣＸＣＲ３とＣＸＣＲ６が過発現されることを確認し、そのリガンドのうちＣＸＣＬ１６がナチュラルキラー細胞の移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）に効果的であることを確認した後、ナチュラルキラー細胞誘導特性を有したＣＸＣＬ１６と腫瘍関連抗原に特異的な抗体の融合タンパク質を製造し、それを投与することにより、ナチュラルキラー細胞の癌への誘導を顕著に増強させ、癌の治療に顕著な効果があることを確認し、本発明を完成するに至った。
【００２０】
本発明において、「腫瘍関連抗原」という用語は、正常細胞においては発現されないかまたは正常細胞と対比して腫瘍細胞にのみ過多発現される、腫瘍細胞上に、好ましくは腫瘍細胞の表面上に特異的に発現される抗原であり、腫瘍細胞から生成された抗原性物質をいう。
【００２１】
これらに制限されるものではないが、腫瘍において特異的に発現される腫瘍関連抗原としては、例えば、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、５Ｔ４、ＡＧＳ−５、ＡＧＳ−１６、アンジオポイエチン（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）２、ＣＤ１９（Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  １９）、Ｂ７．１（ＣＤ８０）、Ｂ７．２（ＣＤ８６）、Ｂ７ＤＣ、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ２、Ｂ７Ｈ３、ＢＴ−０６２、ＢＴＬＡ、ＣＡＩＸ、癌胎児性（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ）抗原、ＣＴＬＡ４、クリプト（Ｃｒｉｐｔｏ）、ＥＤ−Ｂ、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥＧＦＬ７、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＢ２、ＦＡＰ、フィブロネクチン、葉酸受容体、ガングリオシド（Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ）ＧＭ３、ＧＤ２、グルココルチコイド−誘導の腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）、ｇｐｌＯＯ、ｇｐＡ３３、ＧＰＮＭＢ、ＩＣＯＳ、ＩＧＦＩＲ、インテグリンαυ、インテグリンαυβ、ＫＩＲ、ＬＡＧ−３、ルイス（Ｌｅｗｉｓ）Ｙ、メソテリン（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、ｃ−ＭＥＴ、Ｈｅｒ２（ｈｕｍａｎ  ＥＧＦＲ−ｒｅｌａｔｅｄ  ２）、ＭＮ炭酸脱水酵素ＩＸ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ネクチン（Ｎｅｃｔｉｎ）−４、ＮＫＧＤ２、ＮＯＴＣＨ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ−ｌｉｇａｎｄ  １）、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＳＬＣ４４Ａ４、シンデカン（Ｓｙｎｄｅｃａｎ）−１、ＴＡＣＩ、ＴＡＧ−７２、テネイシン（Ｔｅｎａｓｃｉｎ）、ＴＩＭ３、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２またはＶＥＧＦＲ−３などを含むことができる。本発明の一実施例においては、メソテリン、ＰＤ−Ｌ１、Ｈｅｒ２、ＣＤ１９、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲおよびＶＥＧＦＲに対して、本発明の融合ポリペプチドの効果を確認した。
【００２２】
本発明において、「抗体」という用語は、全体抗体、抗原認識および結合能力を有する抗体断片、モノクロナール抗体、ポリクロナール抗体および抗体類似物質を含む。前記抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）、ＩｇＤ、ＩｇＡまたはＩｇＥであってもよい。
【００２３】
本発明において、「抗体断片」という用語は、完全な抗体の一部、一般に前記完全な抗体の抗原結合または可変領域を含む分子を意味する。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片；単一ドメイン抗体を含む。
【００２４】
前記「抗体またはその断片」は、非腫瘍細胞または正常細胞と比較して、腫瘍細胞、好ましくは腫瘍において特異的に発現される腫瘍関連抗原と特異的にまたは望ましく結合することができる。ここで、「特異的に結合する」または「望ましく結合する」とは、二つの結合パートナー間（例えば、抗体およびその結合パートナーである抗原）の結合は、前記二つの結合パートナーに選択的であり、望まないかまたは非特異的な相互作用とは区分できることを意味する。
【００２５】
本発明において、「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）」という用語は、伝統的な二本鎖抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインが結合して一つの鎖を形成する抗体をいう。典型的に、リンカーペプチドが前記二つの鎖の間に挿入されて好適な折り畳み（ｆｏｌｄｉｎｇ）および活性結合部位の生成を許容する。
【００２６】
本発明において、「抗原に結合する抗体」という用語は、十分な親和性で抗原と結合することによって前記抗体が抗原を標的化する治療性製剤として有用な抗体をいう。
【００２７】
本発明において、「リンカー」という用語は、第１分子（例えば、腫瘍関連抗原に結合する抗体またはその断片）を第２分子（ＣＸＣＬ１６のナチュラルキラー細胞誘導タンパク質）に化学結合などにより連結するペプチドを意味する。
【００２８】
本発明において、「癌」または「腫瘍」という用語は、非調節的な細胞増殖により特性化されるヒトにおける病理学的状態を意味する。これらに制限されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫および白血病を含む。癌のより特定な例示としては、非制限的に：肺癌（小細胞および非小細胞）、乳癌、前立腺癌、カルチノイド、膀胱癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌（肝細胞性）、肝芽腫、結腸癌、頭頸部扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ）細胞癌腫、食道癌、卵巣癌、子宮頸部癌、子宮内膜癌、中皮腫、黒色腫、肉腫、骨肉腫、脂肪肉腫、甲状腺癌、類腱腫、急性（ａｃｕｔｅ）骨髄性白血病（ＡＭＬ）および慢性（ｃｈｒｏｎｉｃ）骨髄性白血病（ＣＭＬ）を含む。
【００２９】
本発明において、「発現ベクター」という用語は、プロモーターに作動的に結合する関心分子を暗号化するヌクレオチド配列を含む。
【００３０】
本発明で用いられたように、「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は互換的に用いられるものであり、アミノ酸残基の重合体に対する言及を含む。前記用語を、天然アミノ酸重合体だけでなく、一つ以上のアミノ酸残基が相応する天然アミノ酸の人工的な化学的類似体であるアミノ酸重合体に適用する。また、前記用語をタンパク質が作用性として残っているように保存的なアミノ酸置換を含有する前記重合体に適用する。
【００３１】
本発明において、「宿主細胞」とは、前記発現ベクターの複製または発現を支持できる細胞を意味する。宿主細胞は、原核生物細胞、例えば、大腸菌、または真核生物細胞、例えば、酵母、昆虫、両生類または哺乳動物細胞であってもよい。
【００３２】
腫瘍または癌の成長または進行に関して「抑制する」、「減少させる」、「減らす」という用語は、当該分野で公知の任意の方法を用いて、測定可能な量まで患者の腫瘍または癌の成長、拡散、転移を抑制させることをいう。腫瘍または癌の成長、進行または拡散は、前記腫瘍の大きさが、例えば、本発明の融合ポリペプチドと免疫細胞治療体であるナチュラルキラー細胞との共投与前、または融合ポリペプチド投与前の腫瘍の大きさに比べて、約１０％、２０％、３０％、５０％、８０％または１００％以上減少する場合に、抑制するか、減少するか、または減る。
【００３３】
本発明は、腫瘍関連抗原に結合する抗体またはその断片；リンカー；およびＣＸＣＬ１６のナチュラルキラー細胞誘導タンパク質を含む融合ポリペプチドを提供する。
【００３４】
本発明に係る融合ポリペプチドは、腫瘍関連抗原に結合する抗体またはその断片を含んで腫瘍の細胞表面に特異的に結合することができ、抗原−抗体結合後に切断されて放出されるナチュラルキラー細胞誘導タンパク質であるＣＸＣＬ１６を介してナチュラルキラー細胞を目的とする腫瘍細胞に誘導することができる。
【００３５】
本発明に係る融合ポリペプチドは、腫瘍関連抗原に特異的に結合する抗体またはその断片を含んで腫瘍標的表面抗原に結合する。腫瘍標的表面抗原は、当該分野で広く公知されており、例えば、メソテリン、ＰＤ−Ｌ１、Ｈｅｒ２、ＣＤ１９、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ２、Ｂ７Ｈ３、ＢＴ−０６２、ＢＴＬＡ、ＣＡＩＸ、４−１ＢＢ、５Ｔ４、ＡＧＳ−５またはＡＧＳ−１６であってもよく、これらに制限されるものではない。
【００３６】
前記腫瘍関連抗原に特異的に結合する抗体またはその断片は、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ジスルフィド安定化抗体などを含み、具体的には、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）であってもよい。
【００３７】
前記腫瘍関連抗原に特異的に結合する抗体またはその断片の製造は、当業界で周知の製造方法により製造できる。
【００３８】
本発明に係る実施様態において、前記抗体は一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。ｓｃＦｖ抗体のＶＨおよびＶＬ領域は、折り畳まれて二本鎖抗体の中から発見されるものと類似した抗原結合部位を生成させる一本鎖を含む。一旦折り畳まれると、非共有相互作用が前記一本鎖抗体を安定化させる。より具体的な実施様態において、前記ｓｃＦｖを組換えによって生成させる。本発明の抗体の保存変体は通常的に製造されることができ、ｓｃＦｖ断片に用いられる保存変体は前記ＶＨおよびＶＬ領域間の正確な折り畳みおよび安定化に必要な重要なアミノ酸残基を保持することができるであろう。
【００３９】
本発明の一実施様態によれば、ｓｃＦｖは、メソテリンのｓｃＦＶであり、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有し、具体的には、配列番号２で表される塩基配列によりコードされることができる。
【００４０】
本発明の他の実施様態によれば、ｓｃＦＶは、ＰＤ−Ｌ１のｓｃＦＶであり、配列番号３で表されるアミノ酸配列、具体的には、配列番号４で表される塩基配列によりコードされる重鎖（ＶＨ）；配列番号５で表されるアミノ酸配列、具体的には、配列番号６で表される塩基配列によりコードされる軽鎖（ＶＬ）を含むことができ、前記腫瘍関連抗原であるＰＤ−Ｌ１は、配列番号７で表される塩基配列によりコードされるものであってもよいが、これに制限されるものではない。
【００４１】
本発明のまた他の実施様態によれば、ｓｃＦＶは、Ｈｅｒ２のｓｃＦＶであり、配列番号８で表されるアミノ酸配列、具体的には、配列番号９で表される塩基配列によりコードされる重鎖；配列番号１０で表されるアミノ酸配列、具体的には、配列番号１１で表される塩基配列によりコードされる軽鎖を含むことができ、前記腫瘍関連抗原であるＨｅｒ２は、配列番号１２で表される塩基配列によりコードされるものであってもよいが、これに制限されるものではない。
【００４２】
本発明のまた他の実施様態によれば、ｓｃＦＶは、ＣＤ１９のｓｃＦＶであり、配列番号２８で表されるアミノ酸配列、具体的には、配列番号２９で表される塩基配列によりコードされる重鎖；および配列番号３０で表されるアミノ酸配列、具体的には、配列番号３１で表される塩基配列によりコードされる軽鎖を含むことができ、これに制限されるものではない。
【００４３】
本発明のまた他の実施様態によれば、ｓｃＦＶは、ＭＵＣ−１のｓｃＦＶであり、配列番号３２で表されるアミノ酸配列、具体的には、配列番号３３で表される塩基配列によりコードされる重鎖；および配列番号３４で表されるアミノ酸配列、具体的には、配列番号３５で表される塩基配列によりコードされる軽鎖を含むことができ、これに制限されるものではない。
【００４４】
本発明のまた他の実施様態によれば、ｓｃＦＶは、ＥＧＦＲのｓｃＦＶであり、配列番号３６で表されるアミノ酸配列、具体的には、配列番号３７で表される塩基配列によりコードされる重鎖；および配列番号３８で表されるアミノ酸配列、具体的には、配列番号３９で表される塩基配列によりコードされる軽鎖を含むことができ、これに制限されるものではない。
【００４５】
本発明のまた他の実施様態によれば、ｓｃＦＶは、ＶＥＧＦＲのｓｃＦＶであり、配列番号４０で表されるアミノ酸配列、具体的には、配列番号４１で表される塩基配列によりコードされる重鎖；および配列番号４２で表されるアミノ酸配列、具体的には、配列番号４３で表される塩基配列によりコードされる軽鎖を含むことができ、これに制限されるものではない。
【００４６】
前記ｓｃＦｖ抗体を軽鎖を介してペプチドリンカーに直接結合させることができ、ｓｃＦｖが結合されたＦｃ領域を介して結合させることができる。
【００４７】
本発明の一実施様態によれば、Ｆｃ（不変領域）は、配列番号１３のアミノ酸配列を有することができ、具体的には、配列番号１４で表される塩基配列によりコードされることができるが、これに制限されるものではない。
【００４８】
本発明に係るリンカーは、ペプチドリンカーであって、前記領域を結合させるかまたはこれらの間の一部の最小距離または他の空間的関係を保存する以外には特定の生物活性を有しないが、構成アミノ酸は、前記分子の一部の性質、例えば、折り畳み、正味荷電または疎水性に影響を及ぼすように選択されることができる。また、リンカーは、腫瘍関連抗原に抗体が結合した後にＣＸＣＬ１６が分離されるように切断配列を含むことができる。腫瘍関連抗原に特異的に結合する抗体またはその断片は、５０個以下のアミノ酸、一般には４０個以下のアミノ酸、好ましくは３０個以下のアミノ酸、およびより好ましくは２０個以下のアミノ酸の長さ、さらに好ましくは１〜１０個のアミノ酸の長さを有するペプチドリンカーを介して連結されることができる。
【００４９】
例えば、前記ペプチドリンカーは、任意のプロテアーゼにより切断される配列を含むことができ、具体的には、フューリンにより切断されるＲＶＫＲの連続したアミノ酸残基を含むペプチドリンカーであってもよく、これに制限されるものではない。
【００５０】
本発明の一実施様態によれば、本発明に係る融合ポリペプチドは、フューリンにより切断されるフューリン切断部位、すなわち、フューリンにより切断できる連続したアミノ酸残基を含むフューリン切断部位を含んで、ナチュラルキラー細胞誘導タンパク質が癌細胞から放出されるようにする。
【００５１】
フューリン切断部位は、フューリンにより切断可能な任意のポリペプチド部位であってもよい。Ｄｕｃｋｅｒｔら（文献［Ｄｕｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｄｅｓｉｇｎ  ＆  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  １７（１）：１０７−１１２（２００４）］、本文献にその内容の全体が参照として含まれる）により報告されているように、フューリンは、「サブチリシン／ケキシン様のプロタンパク質転換酵素」と呼ばれる進化的に保存されている二塩基性および一塩基性に特異的なＣＡ２＋依存性セリンプロテアーゼ系」の酵素である。
【００５２】
前記文献などで知られたフューリン切断部位配列は本明細書に含まれ、具体的には、配列番号１５のアミノ酸配列を有し、配列番号１６で表される塩基配列によりコードされることができるが、これに制限されるものではない。
【００５３】
前記腫瘍関連抗原に結合する抗体またはその断片は、フューリン切断部位のアミノ末端を介してフューリン切断配列に結合されることができ、前記抗体の重鎖、軽鎖、Ｆｃ（不変領域）またはフレームワーク領域に直接結合させることもできる。
【００５４】
本発明の融合タンパク質は、ＣＸＣＬ１６のナチュラルキラー細胞誘導タンパク質を含んで、腫瘍関連抗原と結合された抗体を有した腫瘍細胞にナチュラルキラー細胞を誘導することができる。
【００５５】
本発明に係る「ナチュラルキラー細胞誘導タンパク質」とは、腫瘍細胞にナチュラルキラー細胞の流入を誘導するタンパク質、すなわち、ケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）であって、ナチュラルキラー細胞を癌細胞にｍｉｇｒａｔｉｏｎさせることのできるタンパク質であるＣＸＣＬ１６を意味する。
【００５６】
具体的には、前記ＣＸＣＬ１６は、配列番号１７のアミノ酸配列を有することができる。ＣＸＣＬ１６は、配列番号１８の塩基配列によりコードされることができる。
【００５７】
前記ナチュラルキラー細胞誘導タンパク質は、ペプチドリンカーを介して抗体またはその断片に連結されることができる。本発明に係るリンカーは、ペプチドリンカーであって、前記領域を結合させるかまたはこれらの間の一部の最小距離または他の空間的関係を保存する以外には特定の生物活性を有しないが、構成アミノ酸は、前記分子の一部の性質、例えば、折り畳み、正味荷電または疎水性に影響を及ぼすように選択されることができる。また、リンカーは、腫瘍関連抗原に抗体が結合した後にＣＸＣＬ１６が分離されるように切断配列、例えば、任意のプロテアーゼにより切断配列を含むことができる。
【００５８】
本発明の一実施様態によれば、前記ペプチドリンカーは、フューリンにより切断されるフューリン切断部位、すなわち、フューリンにより切断できる連続したアミノ酸残基を含むフューリン切断部位を含む。
【００５９】
本発明に係る融合ポリペプチドは、当業界で周知の非組換え方法または組換え方法により製造することができ、好ましくは、組換え方法により製造することができる。
【００６０】
すなわち、前記腫瘍関連抗原に結合する抗体またはその断片；リンカー；およびＣＸＣＬ１６のナチュラルキラー細胞誘導タンパク質を暗号化するｃＤＮＡをベクターに挿入することにより発現ベクターが製造できる。
【００６１】
本発明の一実施様態によれば、メソテリンｓｃＦｖおよびＦｃを含む塩基配列をベクター、具体的にはｐｃＤＮＡ３．１ベクターに挿入し、フューリン切断部位およびナチュラルキラー細胞誘導タンパク質を暗号化する塩基配列を免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）配列の後ろに挿入して発現ベクターを製造する。製造された発現ベクターの例は図２に記載された通りである。
【００６２】
製造された発現ベクターは、細菌、植物、酵母、昆虫および哺乳動物細胞において発現させることができる。当業者であれば、大腸菌、他の細菌宿主、酵母および様々な高等真核生物細胞、例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよび骨髄腫細胞株を含んでタンパク質の発現に利用できる複数の発現システムを用いて融合ポリペプチドを製造することができる。
【００６３】
本発明の一実施様態によれば、前記発現ベクターをフューリンが除去されたＣＨＯ細胞にトランスフェクションして、融合ポリペプチドを製造することができる。
【００６４】
製造された融合ポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈殿、親和性カラム、カラムクロマトグラフィーなどを含む当該分野の標準過程により精製されて、目的とする融合ポリペプチドを提供することができる。
【００６５】
本発明は、融合ポリペプチドを暗号化する核酸を提供する。
【００６６】
本発明は、前記融合ポリペプチドを暗号化する核酸配列を含む発現ベクターを提供する。具体的には、図２に表示された構造を有した発現ベクターを提供することができ、配列番号１９の塩基配列を有することができる。
【００６７】
本発明は、前記発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。具体的には、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよび骨髄腫細胞株から選択されるいずれか一つの細胞であってもよく、これらに制限されるものではない。
【００６８】
本発明は、腫瘍関連抗原に結合する抗体またはその断片；
リンカー；およびＣＸＣＬ１６のナチュラルキラー細胞誘導タンパク質を含む融合ポリペプチドを含む癌の予防または治療用の医薬組成物を提供する。
【００６９】
本発明に係る癌の予防または治療用の医薬組成物は、免疫細胞治療剤であって、具体的には、ナチュラルキラー細胞の癌への誘導を通じて癌の予防または治療に顕著な効果を有する。本発明に係る癌の予防または治療用の医薬組成物は、直接的な治療効果だけでなく、抗癌補助剤としての作用を全て含む。
【００７０】
本発明の一実施様態によれば、本発明により製造された融合ポリペプチドのＣＸＣＬ１６によりナチュラルキラー細胞のＣＤ５６ｄｉｍからＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔに細胞の分布が変化することが確認され、ＣＤ５６ｄｉｍに比べてＡＤＣＣ効果の大きいＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔに分化させることにより、本発明の医薬組成物は癌の予防または治療に効果的であることを確認した。
【００７１】
また、本発明は、腫瘍関連抗原に結合する抗体またはその断片；リンカー；およびＣＸＣＬ１６のナチュラルキラー細胞誘導タンパク質を含む融合ポリペプチド、およびナチュラルキラー細胞（Ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ）を含む癌の予防または治療用の医薬組成物を提供する。
【００７２】
本発明により免疫細胞治療剤であるナチュラルキラー細胞と融合ポリペプチドとの共投与時、癌へのナチュラルキラー細胞の流入を大幅に増強させることにより、癌の予防または治療に顕著な効果を有する。
【００７３】
本発明に用いるための前記医薬組成物を、一つ以上の生理学的に許容可能な担体または賦形剤を用いて、標準技法により剤形化することができる。好適な薬学担体は、本発明および文献（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、２１ｓｔ  Ｅｄ．、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００５））に開示される。
【００７４】
本発明の融合ポリペプチドおよび／またはナチュラルキラー細胞を任意の好適な経路、例えば、吸入を通じて、局所、鼻、経口、非経口または直腸により投与するために剤形化することができる。したがって、前記言及された医薬組成物の投与を、皮内、皮下、静脈内、筋肉内、鼻内、吸入によって、大脳内、器官内、動脈内、腹腔内、膀胱内、胸膜内、冠状動脈内、皮下または腫瘍内注射により、注射器または他の装置を用いて行うことができる。また、経皮投与も、吸入またはエアロゾル投与と共に考慮される。錠剤およびカプセルを経口、直腸または膣内投与することができる。
【００７５】
前記医薬組成物は、通常、薬学的に許容可能な担体、好ましくは、水性担体中に溶解された融合ポリペプチド、または融合ポリペプチドおよびナチュラルキラー細胞を含むであろう。融合ポリペプチドおよびナチュラルキラー細胞は、共にまたは別個に提供されてもよい。様々な水性担体、例えば、緩衝塩水などを用いることができる。これらの溶液は、殺菌性であり、好ましくはない物質が一般的にない。これらの組成物を、通常、広く公知された殺菌技法により殺菌させることができる。前記組成物は、生理学的条件に近接するために求められる薬学的に許容可能な補助物質、例えば、ｐＨ調節および緩衝剤、毒性調節剤など、例えば、ナトリウムアセテート、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ナトリウムラクテートなどを含有することもできる。これらの剤形中の融合ポリペプチドの濃度は、広範囲に様々であってもよく、選択された特定の投与モードおよび患者の必要に応じて主に流体の体積、粘度、体重などに基づいて選択されるであろう。
【００７６】
本発明の医薬組成物は、静脈内投与または体腔内投与を含めて非経口投与に好適である。
【００７７】
本発明の融合ポリペプチドおよび／またはナチュラルキラー細胞を注射、例えば、一時注射または連続注入による非経口投与のために剤形化することができる。注射用剤形は、単位投与型、例えば、アンプルまたは数回用量の容器中に、添加された保存剤と共に存在することができる。注射可能な組成物は、好ましくは水性等張溶液または懸濁液であり、坐薬を好ましくは脂肪乳化液または懸濁液から製造する。前記組成物を殺菌し／するか、または前記組成物が補助剤、例えば、保存剤、安定剤、湿潤または乳化剤、溶解促進剤、浸透圧調節用の塩および／または緩衝剤を含有することができる。一方では、前記活性成分は、使用前に、好適なビヒクル、例えば、滅菌性の発熱源を含まない水により組成される粉末形態に存在することができる。また、前記活性成分は、他の治療学的に貴重な物質を含有することもできる。前記組成物を通常的な各々の混合、顆粒化またはコーティング方法により製造し、これらは約０．１〜７５％、好ましくは約１〜５０％の活性成分を含有する。
【００７８】
経口投与の場合、医薬組成物または薬剤は、薬学的に許容可能な賦形剤と共に、例えば、通常の手段により製造された錠剤またはカプセルの形態を取ることができる。活性成分、すなわち、本発明の組成物を（ａ）希釈剤または充填剤、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース（例えば、エチルセルロース、微晶質セルロース）、グリシン、ペクチン、ポリアクリレートおよび／またはリン酸水素カルシウム、硫酸カルシウム、（ｂ）潤滑剤、例えば、シリカ、タルカム、ステアリン酸、そのマグネシウムまたはカルシウム塩、金属性ステアレート、コロイド状二酸化ケイ素、水素化植物性オイル、トウモロコシデンプン、ナトリウムベンゾエート、ナトリウムアセテートおよび／またはポリエチレングリコールと共に；錠剤の場合、また、（ｃ）結合剤、例えば、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、デンプンペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンおよび／またはヒドロキシプロピルメチルセルロース；場合により、（ｄ）崩壊剤、例えば、デンプン（例えば、ジャガイモデンプンまたはナトリウムデンプン）、グリコレート、寒天、アルギン酸またはそのナトリウム塩または発泡混合物；（ｅ）湿潤剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、および／または（ｆ）吸収剤、着色剤、風味剤および甘味剤と共に含む錠剤およびゼラチンカプセルが好ましい。
【００７９】
本発明は、医薬組成物を癌のような疾病またはその悪性状態を予防、治療または抑制するための治療有効用量として患者に投与する。前記医薬組成物を患者から有効な治療または診断反応を導き出すのに十分な量をもって前記患者に投与する。有効な治療または診断反応は、前記疾病または悪性状態の症状または合併症を少なくとも部分的に阻止するかまたは遅らせる反応である。それを果たすのに好適な量を「治療学的に有効な量」と定義する。
【００８０】
投与される融合ポリペプチドおよび／またはナチュラルキラー細胞の投与量は、哺乳動物の種、体重、年齢、個別的な条件、治療しようとする領域の表面積および投与形態に応じて異なる。また、前記用量の大きさは、特定患者から特定化合物の投与に伴う任意の副作用の存在、性質および程度に応じて決定されるであろう。
【００８１】
約５０〜８０ｋｇの哺乳動物、好ましくは、ヒトに投与するための単位投与量は、融合ポリペプチドに対して約１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの量を含有することができ、ナチュラルキラー細胞に対して約１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｋｇ〜２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｋｇの量を含有することができる。
【００８２】
典型的に、本発明の組成物の投与量は、目的とする効果を果たすのに十分な投与量である。最適な投与スケジュールを融合ポリペプチドおよび／またはナチュラルキラー細胞の測定、患者の身体中の累積から計算できる。一日に、一週間に、１ヶ月にまたは１年に１回以上提供されることができる。当該分野の熟練した者であれば、最適投与量、投与方法および繰り返し比率を容易に決定することができる。当該分野の熟練した者であれば、当該分野で公知、且つ本発明に開示された確立したプロトコルに従ってヒトに融合ポリペプチドおよび／またはナチュラルキラー細胞を投与するための最適投与を決定することができるであろう。しかし、有効成分の実際投与量は治療しようとする疾患、疾患の重症度、投与経路、患者の体重、年齢および性別などの種々の関連因子に照らして決定しなければならず、よって、前記投与量はいかなる面でも本発明の範囲を限定するものではない。
【００８３】
また、本発明は、癌の治療に用いるための前記融合ポリペプチドを含む組成物を提供する。
【００８４】
また、本発明は、癌を治療するための薬剤の製造における前記融合ポリペプチドの用途を提供する。
【００８５】
また、本発明は、癌を治療するための前記融合ポリペプチドの用途を提供する。
【００８６】
また、本発明は、前記融合ポリペプチドを含む組成物の薬剤学的に有効な量を患者に投与して癌を治療する方法を提供する。前記癌の治療方法は、ナチュラルキラー細胞を共に投与することができ、それにより、上昇した治療効果を示すことができる。
【００８７】
本発明の用途、組成物、治療方法に言及された事項は、互いに矛盾しない限り同様に適用される。
【発明の効果】
【００８８】
本発明の癌の予防または治療用の融合タンパク質は、腫瘍関連抗原に結合する抗体またはその断片；リンカー；およびＣＸＣＬ１６のナチュラルキラー細胞誘導タンパク質を含む融合ポリペプチドを含んで免疫細胞治療剤であるナチュラルキラー細胞と共投与時に、特定の抗原を発現する癌へのナチュラルキラー細胞の流入を大幅に増強させることにより、特異的に癌の予防または治療に顕著な効果を示す。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】ケモカイン種類に応じた、増幅培養した（Ｅｘｐａｎｄｅｄ）ナチュラルキラー細胞の移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）程度を確認した結果を示す。
【図２】本発明に係る融合ポリペプチドを製造するための発現ベクターの模式図を示す。
【図３】本発明により製造された融合ポリペプチドがメソテリン認識部位により膵臓癌細胞株の表面に存在するメソテリンを認識して結合することを確認した結果を示す。
【図４】本発明により製造された融合ポリペプチドがＰＤ−Ｌ１認識部位により膵臓癌細胞株の表面に存在するＰＤ−Ｌ１を認識して結合することを確認した結果を示す。
【図５】本発明により製造された融合ポリペプチドがＨｅｒ２認識部位により膵臓癌細胞株の表面に存在するＨｅｒ２を認識して結合することを確認した結果を示す。
【図６】本発明により製造された融合ポリペプチドが膵臓癌細胞株に結合してＣＸＣＬ１６を放出することを確認した結果を示す図である。
【図７】メソテリンに結合する抗体を含む本発明の融合ポリペプチドを様々な癌細胞株に処理することに応じたナチュラルキラー細胞の移動能が増加したことを確認した結果を示す図である。
【図８】ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体を含む本発明の融合ポリペプチドをＰａｎｃ−１細胞株に処理することに応じたナチュラルキラー細胞の流入が増加したことを確認した結果を示す図である。
【図９】ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体を含む本発明の融合ポリペプチドをＨＴ−２９細胞株に処理することに応じたナチュラルキラー細胞の流入が増加したことを確認した結果を示す図である。
【図１０】Ｈｅｒ２に結合する抗体を含む本発明の融合ポリペプチドをＰａｎｃ−１細胞株に処理することに応じたナチュラルキラー細胞の流入が増加したことを確認した結果を示す図である。
【図１１】Ｈｅｒ２に結合する抗体を含む本発明の融合ポリペプチドをＭＣＦ７細胞株に処理することに応じたナチュラルキラー細胞の流入が増加したことを確認した結果を示す図である。
【図１２】ＣＤ１９に結合する抗体を含む本発明の融合ポリペプチドを様々な癌細胞株に処理することに応じたナチュラルキラー細胞の移動能が増加したことを確認した結果を示す図である。
【図１３】ＭＵＣ−１に結合する抗体を含む本発明の融合ポリペプチドを様々な癌細胞株に処理することに応じたナチュラルキラー細胞の移動能が増加したことを確認した結果を示す図である。
【図１４】ＥＧＦＲに結合する抗体を含む本発明の融合ポリペプチドを様々な癌細胞株に処理することに応じたナチュラルキラー細胞の移動能が増加したことを確認した結果を示す図である。
【図１５】ＶＥＧＦＲに結合する抗体を含む本発明の融合ポリペプチドを様々な癌細胞株に処理することに応じたナチュラルキラー細胞の移動能が増加したことを確認した結果を示す図である。
【図１６】メソテリンに結合する抗体を含む本発明の融合ポリペプチドを様々な癌細胞株に処理することに応じたナチュラルキラー細胞の浸潤能が増加したことを確認した結果を示す図である。
【図１７】ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体を含む本発明の融合ポリペプチドをＰａｎｃ−１細胞株に処理することに応じたナチュラルキラー細胞の浸潤能が増加したことを確認した結果を示す図である。
【図１８】ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体を含む本発明の融合ポリペプチドをＨＴ−２９細胞株に処理することに応じたナチュラルキラー細胞の浸潤能が増加したことを確認した結果を示す図である。
【図１９】Ｈｅｒ２に結合する抗体を含む本発明の融合ポリペプチドをＰａｎｃ−１細胞株に処理することに応じたナチュラルキラー細胞の浸潤能が増加したことを確認した結果を示す図である。
【図２０】Ｈｅｒ２に結合する抗体を含む本発明の融合ポリペプチドをＭＣＦ７細胞株に処理することに応じたナチュラルキラー細胞の浸潤能が増加したことを確認した結果を示す図である。
【図２１】ＣＤ１９に結合する抗体を含む本発明の融合ポリペプチドを様々な癌細胞株に処理することに応じたナチュラルキラー細胞の浸潤能が増加したことを確認した結果を示す図である。
【図２２】ＭＵＣ−１に結合する抗体を含む本発明の融合ポリペプチドを様々な癌細胞株に処理することに応じたナチュラルキラー細胞の浸潤能が増加したことを確認した結果を示す図である。
【図２３】ＥＧＦＲに結合する抗体を含む本発明の融合ポリペプチドを様々な癌細胞株に処理することに応じたナチュラルキラー細胞の浸潤能が増加したことを確認した結果を示す図である。
【図２４】ＶＥＧＦＲに結合する抗体を含む本発明の融合ポリペプチドを様々な癌細胞株に処理することに応じたナチュラルキラー細胞の浸潤能が増加したことを確認した結果を示す図である。
【図２５】本発明によりＨｅｒ２を認識できるように製造された融合ポリペプチド（Ｈｅｒ２  ｓｃＦｖ  ＮＲＰ−ｂｏｄｙ）によりナチュラルキラー細胞の浸潤能が増加したことを確認した結果を示す図である。
【図２６】本発明により製造された融合ポリペプチドおよびナチュラルキラー細胞の投与に応じた癌組織へのナチュラルキラー細胞の誘導を示す図である。
【図２７】本発明により製造されたメソテリンｓｃＦｖ融合ポリペプチドを膵臓癌移植動物モデルにおいてナチュラルキラー細胞と共に投与して治療効果を確認した結果を示す図である。
【図２８】本発明により製造されたＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖ融合ポリペプチドを膵臓癌移植動物モデルにおいてナチュラルキラー細胞と共に投与して治療効果を確認した結果を示す図である。
【図２９】本発明により製造されたＨｅｒ２  ｓｃＦｖ融合ポリペプチドを膵臓癌移植動物モデルにおいてナチュラルキラー細胞と共に投与して治療効果を確認した結果を示す図である。
【図３０】ナチュラルキラー細胞にＣＸＣＬ１６およびＩＬ−２を短期間で処理時におけるナチュラルキラー細胞の分布変化を示す図である。
【図３１】ナチュラルキラー細胞にＣＸＣＬ１６およびＩＬ−２を長期間で処理時におけるナチュラルキラー細胞の分布変化を示す図である。
【図３２】本発明により製造された融合ポリペプチドをＮＫ細胞に処理時に分布されるＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞による細胞死滅増進を確認した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００９０】
以下では、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。但し、下記の実施例は本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記の実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
【００９１】
＜実施例１＞ケモカインによる増幅培養した（Ｅｘｐａｎｄｅｄ）ナチュラルキラー細胞の  移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）の確認
ケモカイン種類に応じて増幅培養した（Ｅｘｐａｎｄｅｄ）ナチュラルキラー細胞の移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）程度を確認するために、増幅培養した（Ｅｘｐａｎｄｅｄ）  ＮＫ  ｃｅｌｌを回収した後に１，５００ｒｐｍで遠心分離した。その次に、上層液を除去し、ＰＢＳで洗浄した後に細胞数をカウントした。Ｂｏｙｄｅｎ  ｃｈａｍｂｅｒ  ｐｌａｔｅのｂｏｔｔｏｍ  ｌａｙｅｒにケモカインとしてＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１およびＣＸＣＬ１６を１０ｎＭずつ分株し、Ｂｏｙｄｅｎ  ｃｈａｍｂｅｒ  ｐｌａｔｅのｕｐｐｅｒ  ｌａｙｅｒにＥｘｐａｎｄｅｄ  ＮＫ  ｃｅｌｌ  ２×１０５ｃｅｌｌｓを分株した。その後、３７℃のＣＯ２培養器で２時間培養し、Ｂｏｔｔｏｍ  ｌａｙｅｒを回収して１，５００ｒｐｍで遠心分離した。その次に、ＰＢＳで洗浄した後、ＣＤ５６−ＰＥ染色を４℃で３０分間行い、ＰＢＳで洗浄した。ＦＡＣ分析のためにＣｏｕｎｔ  Ｂｒｉｇｈｔ  Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を５０ｕｌすつ分株し、ＦＡＣＳ分析を行った。
【００９２】
その結果を図１に示す。
【００９３】
図１から確認できるように、他のケモカインに比べてＣＸＣＬ１６の方がＥｘｐａｎｄｅｄナチュラルキラー細胞のｍｉｇｒａｔｉｏｎに顕著な効果を示すことが確認された。
【００９４】
＜実施例２＞融合ポリペプチド［ＮＫ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＮＲＰ）−ｂｏｄｙ］の製造および精製
癌標的抗原を認識するｓｃＦｖ配列、リンカーの役割をするフューリン配列、および最も高い効率でナチュラルキラー細胞の流入を誘導するＣＸＣＬ１６（ＮＫ  ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＮＲＰ）が結合された組換えベクターを製造した。
【００９５】
標的抗原としてメソテリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）を認識するｓｃＦｖ配列が結合された具体的な組換えベクターの構造を図２に示す。
【００９６】
ｐｃＤＮＡ３．１ベクターをＳｆｉ１酵素で２時間分解させ、精製して結紮ベクターを製造した。メソテリンｓｃＦｖを製造するために、下記表１のプライマー配列を基にＰＣＲで増幅して、配列番号２のメソテリンｓｃＦｖ塩基配列を得、ベクターおよび挿入物サンプルとＴ４リガーゼを混合して２５℃で２時間培養してベクターと挿入物の結紮を行った。それをｐｃＤＮＡ３．１ベクターのＳｆｉ１  ｅｎｚｙｍｅ  ｓｉｔｅに挿入した。
【００９７】
【表１】
0006933724.tif 000002
【００９８】
ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖを製造するために、下記表２のプライマー配列を基にＰＣＲで増幅して、配列番号４の重鎖および配列番号６の軽鎖を含むＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖ塩基配列を得、前記メソテリンｓｃＦｖが結合されたベクターの製造方法と同様の方法によりベクターと挿入物の結紮を行い、それをｐｃＤＮＡ３．１ベクターのＳｆｉ１  ｅｎｚｙｍｅ  ｓｉｔｅに挿入した。
【００９９】
【表２】
0006933724.tif 000003
【０１００】
Ｈｅｒ２  ｓｃＦｖを製造するために、下記表３のプライマー配列を基にＰＣＲで増幅して、配列番号９の重鎖および配列番号１１の軽鎖を含むＨｅｒ２  ｓｃＦｖ塩基配列を得、前記メソテリンｓｃＦｖが結合されたベクターの製造方法と同様の方法によりベクターと挿入物の結紮を行い、それをｐｃＤＮＡ３．１ベクターのＳｆｉ１  ｅｎｚｙｍｅ  ｓｉｔｅに挿入した。
【０１０１】
【表３】
0006933724.tif 000004
【０１０２】
また、ＣＤ１９、ＭＵＣ−１、ＥＦＧＲおよびＶＥＧＦＲ  ｓｃＦｖを製造するために、各ｓｃＦｖのアミノ酸配列を基にｓｃＦｖに対する塩基配列（配列番号２９の重鎖および配列番号３１の軽鎖を含むＣＤ１９  ｓｃＦｖ；配列番号３３の重鎖および配列番号３５の軽鎖を含むＭＵＣ−１  ｓｃＦｖ；配列番号３７の重鎖および配列番号３９の軽鎖を含むＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ；配列番号４１の重鎖および配列番号４３の軽鎖を含むＶＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ）を合成し、前記メソテリンｓｃＦｖが結合されたベクターの製造方法と同様の方法によりベクターと挿入物の結紮を行い、それをｐｃＤＮＡ３．１ベクターのＳｆｉ１  ｅｎｚｙｍｅ  ｓｉｔｅに挿入した。
【０１０３】
ＣＸＣＬ１６およびフューリン切断部位は、下記表４のプライマー配列を基にＰＣＲで増幅してベクターに存在する免疫グロブリン後ろのＮｏｔ１  ｅｎｚｙｍｅ  ｓｉｔｅを用いた。標的抗原を認識するｓｃＦＶが挿入されたベクターにＮｏｔ１酵素で２時間分解させて精製をした後、ベクターと挿入物であるＣＸＣＬ１６サンプルをリガーゼ酵素を混合して２５℃で２時間培養してベクターと挿入物の結紮を行った。
【０１０４】
【表４】
0006933724.tif 000005
【０１０５】
製造された発現ベクターでフューリンが除去されたＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）細胞に形質転換させて融合ポリペプチド（ＮＲＰ−ｂｏｄｙ）を大量生産した。前記発現ベクターがトランスフェクションされたＣＨＯ細胞を１５０ｍｍプレートで培養し、ローラボトル（ｒｏｌｌｅｒ  ｂｏｔｔｌｅ）培養器で７２時間培養して回収した。回収した培養液は、遠心分離後に、上層液だけをＡＫＴＡタンパク質精製システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）のプロテインＡ−アガロースカラムを用いて、精製を行うことにより融合ポリペプチドを生産した。
【０１０６】
＜実施例３＞融合ポリペプチドの抗原に対する結合の確認
膵臓癌細胞株であるＰａｎｃ−１細胞２×１０５個に前記実施例２で製造されたメソテリン認識融合ポリペプチド（Ｍｅｓｏｔｈｌｉｎ  ｓｃＦＶ  ＮＲＰ−ｂｏｄｙ）（０．１〜２μｇ／ｍｌ）を分株して４℃で２０分間培養した。その後、細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄した後、ＦＩＴＣが結合されたＦＣ抗体（１μｇ／ｍｌ）を分株し、４℃で２０分間培養した。その後、さらに細胞を回収した後にＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳで分析を行った。
【０１０７】
その結果を図３に示す。
【０１０８】
図３から確認できるように、前記実施例２で製造された融合ポリペプチドのメソテリン認識部位を介して、膵臓癌細胞株の表面に存在するメソテリンが認識されて細胞の表面に融合ポリペプチドが結合されることが確認された。
【０１０９】
また、抗原認識部位が異なっても本願発明の融合ポリペプチドが標的細胞株の表面に結合されることを確認するために、前記実施例２で製造されたＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖ融合ポリペプチドおよびＨｅｒ２  ｓｃＦｖ融合ポリペプチドに対しても前記メソテリンｓｃＦＶ融合ポリペプチドの抗原結合実験と同様の条件でＦＡＣＳ分析を行い、その結果を図４（ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖ  ＮＲＰ−ｂｏｄｙ）および図５（Ｈｅｒ２  ｓｃＦｖ  ＮＲＰ−ｂｏｄｙ）に示す。
【０１１０】
図４および５から確認できるように、ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖ  ＮＲＰ−ｂｏｄｙおよびＨｅｒ２  ｓｃＦｖ  ＮＲＰ−ｂｏｄｙは、抗原認識部位を介して各々膵臓癌細胞株の表面に存在するＰＤ−Ｌ１またはＨｅｒ２を認識して細胞の表面に融合ポリペプチドが特異的に結合されることが確認され、それにより、本発明の融合ポリペプチドは、標的とする腫瘍関連抗原に応じて標的抗原に特異的に結合する抗体を異に適用できることを確認した。
【０１１１】
＜実施例４＞ＣＸＣＬ１６放出特性の確認
前記実施例２で製造された融合ポリペプチド（ＮＲＰ−ｂｏｄｙ）のフューリン切断部位が癌細胞株のフューリンにより切断され、ＣＸＣＬ１６が放出されるかをヒトＣＸＣＬ１６  ＥＬＩＳＡにより確認した。
【０１１２】
ＣＸＣＬ１６  ＥＬＩＳＡはＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍのヒトＣＸＣＬ１６  ＥＬＩＳＡキット（＃ＤＣＸ１６０）の方法に従って行った。ＥＬＩＳＡ分析には、メソテリンｓｃＦＶ融合ポリペプチド（Ｍｅｓｏｔｈｌｉｎ  ｓｃＦＶ  ＮＲＰ−ｂｏｄｙ）を９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレート（Ｒ＆Ｄ）に０．５μｇ／ｍＬ、５０μＬ／Ｗｅｌｌで分株して、室温で２時間放置して吸着させたものを用いた。前記プレートを洗浄した後、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識を２００μＬ／ｗｅｌｌで加えて室温で２時間放置した。前記プレートをＴｗｅｅｎ（登録商標）−ＰＢＳで洗浄した後、ＡＢＴＳ基質液を添加し、発色させてＯＤ  ４１５ｎｍの吸光度をプレート読み取り機を用いて測定した。
【０１１３】
その結果を図６に示す。
【０１１４】
図６から確認できるように、融合ポリペプチド（ＮＲＰ−ｂｏｄｙ）が膵臓癌細胞株Ｐａｎｃ−１のメソテリンに結合され、融合ポリペプチドのフューリン切断部位が癌細胞のフューリンにより切断されてＣＸＣＬ１６が放出されることが確認された。
【０１１５】
＜実施例５＞融合ポリペプチドから放出されるＣＸＣＬ１６によるナチュラルキラー細胞の移動能（流入）の増進の確認
前記実施例２で製造された融合ポリペプチドが標的抗原を発現する癌を認識して結合した後、ナチュラルキラー細胞流入誘導タンパク質であるＣＸＣＬ１６が放出されてナチュラルキラー細胞の流入が増加するかをＢｏｙｄｅｎ  ｃａｈａｍｂｅｒ  ｓｙｓｔｅｍを用いて確認した。
【０１１６】
ＨＰＤＥ、Ｐａｎｃ−１（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ．ＣＲＬ−１４６９）、ＨＣＴ１１６（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ．ＣＣＬ−２４７）、ＭＣＦ７（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ．ＨＴＢ−２２）およびＨＴ−２９（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ．ＨＴＢ−３８）細胞株を２×１０５個でＢｏｙｄｅｎ  Ｃｈａｍｂｅｒ  ａｓｓａｙ  ｐｌａｔｅ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃０７−２００−１５５）のｂｏｔｔｏｍ  ｌａｙｅｒに分株した後、３７℃、ＣＯ２培養器で２時間培養した。メソテリンｓｃＦｖ−融合ポリペプチド１μｇ／ｍｌを前記各細胞株に分株し、３７℃、ＣＯ２培養器で４時間培養した。ナチュラルキラー細胞はＣＦＳＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃ＲＵＯ  ４２３８０１）でラベリングし、ｕｐｐｅｒ  ｌａｙｅｒに２×１０５個で分株し、３７℃、ＣＯ２培養器で４時間培養した。その後、Ｂｏｔｔｏｍ  ｌａｙｅｒ細胞を回収し、ＦＡＣＳによりＣＦＳＥ−ｌａｂｅｌｉｎｇナチュラルキラー細胞の分布を確認した。
【０１１７】
その結果を図７に示す。
【０１１８】
図７から確認できるように、増幅培養したヒトＮＫ  ｃｅｌｌの移動能がメソテリンｓｃＦＶ融合ポリペプチドから放出されるＣＸＣＬ１６により増加することが確認され、さらには、癌細胞株の種類に応じてナチュラルキラー細胞の流入増加程度が異なることを確認した。
【０１１９】
また、前記実施例２で製造されたＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖ−融合ポリペプチドおよびＨｅｒ２  ｓｃＦｖ−融合ポリペプチドをＰａｎｃ−１、ＨＴ−２９またはＭＣＦ７細胞株に分株して前記メソテリンｓｃＦｖ−融合ポリペプチド実験と同様の条件でＢｏｙｄｅｎ  ｃａｈａｍｂｅｒ  ｓｙｓｔｅｍを通じてナチュラルキラー細胞の流入増加を確認し、その結果を図８（Ｐａｎｃ−１に対するＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦＶ  ＮＲＰ−ｂｏｄｙ）、図９（ＨＴ−２９に対するＰＤ−Ｌ１  ＮＲＰ−ｂｏｄｙ）、図１０（Ｐａｎｃ−１に対するＨｅｒ２  ＮＲＰ−ｂｏｄｙ）および図１１（ＭＣＦ７に対するＨｅｒ２  ｓｃＦＶ  ＮＲＰ−ｂｏｄｙ）に示す。
【０１２０】
図８〜１１から確認できるように、メソテリンｓｃＦＶ−融合ポリペプチドと同様に、増幅培養したヒトＮＫ  ｃｅｌｌの移動能が各融合ポリペプチドから放出されるＣＸＣＬ１６により増加することが確認された。
【０１２１】
また、前記実施例２で製造されたＣＤ−１９、ＭＵＣ−１、ＥＧＦＲおよびＶＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ−融合ポリペプチドをＨＰＤＥ、Ｋ５６２（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ．ＣＣＬ−２４３）、ＨＣＴ１１６（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ．ＣＣＬ−２４７）、Ｐａｎｃ−１（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ．ＣＲＬ−１４６９）またはＭＣＦ７（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ．ＨＴＢ−２２）細胞株に分株して前記メソテリンｓｃＦｖ実験と同様の条件でＢｏｙｄｅｎ  ｃａｈａｍｂｅｒ  ｓｙｓｔｅｍを通じてナチュラルキラー細胞の流入増加有無を確認し、その結果を各々図１２（ＣＤ１９  ｓｃＦＶ  ＮＲＰ−ｂｏｄｙ）、図１３（ＭＵＣ−１  ｓｃＦＶ  ＮＲＰ−ｂｏｄｙ）、図１４（ＥＧＦＲ  ｓｃＦＶ  ＮＲＰ−ｂｏｄｙ）および図１５（ＶＥＧＦＲ  ｓｃＦＶ  ＮＲＰ−ｂｏｄｙ）に示す。
【０１２２】
図１２〜１５から確認できるように、増幅培養したヒトＮＫ  ｃｅｌｌの移動能が融合ポリペプチドから放出されるＣＸＣＬ１６により増加することが確認され、さらには、癌細胞株の種類に応じてナチュラルキラー細胞の流入増加程度が異なることを確認した。
【０１２３】
＜実施例６＞融合ポリペプチドから放出されるＣＸＣＬ１６によるナチュラルキラー細胞の浸潤能の確認
前記実施例２で製造された各融合ポリペプチドが癌細胞において発現される標的抗原を認識して結合した後、ナチュラルキラー細胞流入誘導タンパク質であるＣＸＣＬ１６が放出されて癌細胞に対するナチュラルキラー細胞の浸潤能が増加するかを浸潤分析（ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ）を用いて確認した。
【０１２４】
具体的には、ＨＰＤＥ、Ｐａｎｃ−１、ＨＣＴ１１６、ＭＣＦ７、ＨＴ−２９およびＫ５６２細胞株を２×１０５個でＢｏｙｄｅｎ  Ｃｈａｍｂｅｒ  ａｓｓａｙ  ｐｌａｔｅ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃０７−２００−１５５）のｂｏｔｔｏｍ  ｌａｙｅｒに分株した後、３７℃、ＣＯ２培養器で２時間培養し、実施例２で製造された融合ポリペプチド１μｇ／ｍｌを前記各細胞株に分株した。Ｕｐｐｅｒ  ｌａｙｅｒにｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ、＃３５４２３４）を処理した後、ナチュラルキラー細胞２×１０５個で分株し、３７℃、ＣＯ２培養器で４８時間培養した。その後、Ｕｐｐｅｒ  ｌａｙｅｒを回収し、クリスタルバイオレット（ｃｒｙｓｔａｌ  ｖｉｏｌｅｔ）に１時間染色した後、ｕｐｐｅｒ  ｌａｙｅｒを任意に三つの部分を撮影してｉｍａｇｅ  Ｊ  ｐｒｏｇｒａｍでナチュラルキラー細胞の浸潤能を測定した。
【０１２５】
各融合ポリペプチドに対する結果を各々図１６〜２４に示す。
【０１２６】
図１６〜２４から確認できるように、増幅培養したヒトＮＫ  ｃｅｌｌの浸潤性が融合ポリペプチドから放出されるＣＸＣＬ１６により増加することが確認され、さらには、癌細胞株の種類に応じてナチュラルキラー細胞の浸潤能の増加程度が異なることを確認した。
【０１２７】
＜実施例７＞流入が増加したナチュラルキラー細胞による癌細胞株の死滅誘導の確認
前記実施例２で製造された融合ポリペプチドからＣＸＣＬ１６が放出された後、流入が増加したナチュラルキラー細胞により癌細胞株の死滅を誘導するＡＤＣＣ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）効能を確認した。
【０１２８】
Ｐａｎｃ−１細胞株２×１０５個を９６ウェルプレートに分株した後、３７℃、ＣＯ２培養器で２時間培養した。メソテリンｓｃＦＶ−融合ポリペプチド１μｇ／ｍｌを標的細胞（ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌ）に処理した後、３７℃、ＣＯ２培養器で２時間培養した。標的細胞  と効果細胞（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｃｅｌｌ）の比率が１：１になるようにナチュラルキラー細胞を２×１０５個で添加し、３７℃、ＣＯ２培養器で４時間培養した。細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄した後、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ（１μｇ／ｍｌ）とＰＩ（１μｇ／ｍｌ）で３０分間染色し、ＦＡＣＳで分析を行った。
【０１２９】
その結果を図２５に示す。
【０１３０】
図２５から確認できるように、ＣＸＣＬ１６が放出された後、流入が増加したナチュラルキラー細胞により癌細胞の死滅が顕著に増加したことが確認された。
【０１３１】
＜実施例８＞癌移植動物モデルにおける融合ポリペプチドの治療効能の確認
実施例２で製造された融合ポリペプチドを癌移植動物モデルに注入してｉｎ  ｖｉｖｏで効果を確認した。
【０１３２】
イン・ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）実験のために、６週齢の雌ＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウスを用いた。マウスの管理は、韓国生命工学研究院の実験動物資源センターのＡｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅに基づいて行った。Ｐａｎｃ−１をマウスの膵臓に注入して２週間腫瘍を形成し、メソテリン、ＰＤ−Ｌ１またはＨｅｒ２  ｓｃＦＶ融合ポリペプチド（５ｍｇ／ｋｇ）を５日間隔で腹腔に注入した。
【０１３３】
腫瘍成長（Ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ）実験のために、ナチュラルキラー細胞を１×１０７／マウスでＩ．Ｖ注入した。腫瘍成長の観察は、ＩＶＩＳ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ３．０  ｐｒｏｇｒａｍを用いてルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）を発現するＰａｎｃ−１の成長を観察し、ナチュラルキラー細胞の移動能実験は、ＤｉＲで染色したナチュラルキラー細胞を１×１０７／マウスで静脈投与してＩＶＩＳ  ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｍａｇｅ  ｐｒｏｇｒａｍおよびＦＡＣＳで観察した。
【０１３４】
その結果を図２６〜２９に示す。図２６は前記実施例２で製造された融合ポリペプチドおよびナチュラルキラー細胞の投与に応じた癌組織へのナチュラルキラー細胞の誘導を示すものであり、図２７はメソテリンｓｃＦＶ  ＮＲＰ−ｂｏｄｙ、図２８はＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦＶ  ＮＲＰ−ｂｏｄｙ、および図２９はＨｅｒ２  ｓｃＦＶ  ＮＲＰ−ｂｏｄｙをナチュラルキラー細胞と共に投与して治療効果を確認した結果を示すものである。
【０１３５】
図２６のＡから確認できるように、ＮＲＰ−ｂｏｄｙによりナチュラルキラー細胞の癌組織への流入が大幅に増加し、図２６のＢのようにこのような作用効果はＮＲＰ−ｂｏｄｙの添加によってのみ発生した。
【０１３６】
また、図２７〜２９から確認できるように、実施例２で製造された融合ポリペプチドをナチュラルキラー細胞と共に投与する場合、腫瘍成長が顕著に抑制され、腫瘍組織内にナチュラルキラー細胞の移動が大幅に増加した。
【０１３７】
前記結果から、本発明の融合ポリペプチドが免疫細胞治療剤であるナチュラルキラー細胞の流入を増強させることにより癌治療に顕著な効果を示すことを確認した。
【０１３８】
＜実施例９＞ＣＸＣＬ１６処理に応じたナチュラルキラー細胞の特性変化の確認
ナチュラルキラー細胞が融合ポリペプチドから放出されるＣＸＣＬ１６により変化する特性を確認するために、ナチュラルキラー細胞の成長を促進するＩＬ−２とＣＸＣＬ１６を共に各々２００Ｕおよび１００ｎＭの濃度で０、１、２、８または１６時間処理し、ＣＤ５６ｄｉｍおよびＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔの分布をＦＡＣＳを通じて確認し、その結果を図３０に示し、右側上段の四角形内の細胞はＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ細胞を示す。
【０１３９】
図３０から確認できるように、ＣＸＣＬ１６処理に応じた時間経過に伴い、ＣＤ５６ｄｉｍからＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔに細胞の分布が変化することが確認された。
【０１４０】
また、上記の実験方法と同様に、長期間（１４日間）ＩＬ−２とＣＸＣＬ１６を同時に処理した後にＣＤ５６の発現変化を確認し、その結果を図３１に示す。
【０１４１】
図３１から確認できるように、ＩＬ２およびＣＸＣＬ１６を共に投与した実験群（図３１  ＡのＩＬ−２＋ＣＸＣＬ１６、図３１  ＢのＣＸＣＬ１６）では、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ細胞への変化が確認された。
【０１４２】
上記の結果により、ＣＸＣＬ１６がＣＤ５６ｄｉｍをＡＤＣＣ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）効果の大きいＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔに変化させることによりナチュラルキラー細胞の特性に影響を及ぼすことが確認された。
【０１４３】
＜実施例１０＞融合ポリペプチド（ＮＲＰ−ｂｏｄｙ）処理に応じたナチュラルキラー細胞の特性変化
ＣＸＣＬ１６により変化したナチュラルキラー細胞の分布に応じて癌細胞の死滅を誘導するＡＤＣＣ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）効能変化を確認した。
【０１４４】
Ｐａｎｃ−１細胞株２×１０５個を９６ウェルプレートに分株した後、３７℃、ＣＯ２培養器で２時間培養した。標的細胞と効果細胞の比率が１：１になるようにナチュラルキラー細胞を２×１０５個で添加し、３７℃、ＣＯ２培養器で４時間培養した。細胞の回収後にＰＢＳで洗浄した後、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ（１μｇ／ｍｌ）とＰＩ（１μｇ／ｍｌ）で３０分間染色し、ＦＡＣＳで分析を行った。
【０１４５】
その結果を図３２に示す。
【０１４６】
図３２から確認できるように、融合ポリペプチドのＣＸＣＬ１６により増加したＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞により癌細胞の死滅が増加したことが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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