(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
好気的条件下において培養された培地を含む培養物であって、
培地は、好気性菌と好気性菌が好気的環境下において栄養源の非存在下と比較して増殖を２倍向上させるために十分な量の栄養源と炭素源とその他の栄養素を含み、当該他の栄養素は、前記好気性菌の上記増殖に関する十分量の栄養素であり、
前記好気性菌は、ヘキソキナーゼ以外の解糖系の代謝酵素からなる群から選択されるいずれかの代謝酵素をコードする遺伝子が破壊されており、これにより、前記好気性菌において炭素源からＴＣＡサイクルへの代謝が抑制されており、前記炭素源は、破壊された代謝酵素の上流の解糖系の基質および代謝産物並びに当該上流の解糖系に流入する代謝経路の基質および代謝産物からなる群から選択されるいずれかの栄養素であり、
前記好気性菌は、栄養源の存在下において前記栄養源からのエネルギー産生が可能であり、前記栄養源は、破壊された代謝酵素の下流の解糖系の代謝産物、当該下流の解糖系に流入する代謝経路の基質および代謝産物、並びに、ＴＣＡサイクルの代謝産物およびＴＣＡサイクルに流入する代謝経路の基質および代謝産物からなる群から選択される電子伝達系においてエネルギー産生を駆動させる栄養素を含む、
培養物。
【請求項２】
前記好気性菌が、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉではない、請求項１に記載の培養物。
【請求項３】
前記好気性菌が、放線菌である、請求項１または２に記載の培養物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の培養物であって、前記好気性菌のトランスアルドラーゼをコードする遺伝子がさらに破壊されている、培養物。
【請求項５】
破壊された解糖系の酵素をコードする遺伝子は、ホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の培養物。
【請求項６】
破壊された解糖系の酵素をコードする遺伝子は、ホスホフルクトキナーゼＡ２およびＡ３をコードする遺伝子である、請求項５に記載の培養物。
【請求項７】
栄養源が、グリセロール、フルクトース−１，６ビスリン酸、グリセルアルデヒド−３リン酸、ジヒドロキシアセトンリン酸、１、３−ビスホスホグリセリン酸、３−ホスホグリセリン酸、２−ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸、酢酸、ＮＡＤＨ、リンゴ酸、コハク酸、グルタミン酸、α−ケトグルタル酸、イソクエン酸、プロトカテク酸、および、グルタミン酸以外のアミノ酸からなる群から選択される１以上の分子である、請求項５または６に記載の培養物。
【請求項８】
破壊された解糖系の酵素をコードする遺伝子は、ホスホグリセレートキナーゼである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の培養物。
【請求項９】
栄養源が、３−ホスホグリセリン酸、２−ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸、酢酸、ＮＡＤＨ、リンゴ酸、コハク酸、グルタミン酸、α−ケトグルタル酸、イソクエン酸、プロトカテク酸、およびグルタミン酸以外のアミノ酸からなる群から選択される１以上の分子である、請求項８に記載の培養物。
【請求項１０】
解糖系およびペントースリン酸経路並びにこれらから派生する代謝経路からなる群から選択される代謝経路の代謝産物を取得する方法であって、請求項１〜９のいずれか一項に記載の培養物を用意することと、用意された培養物から前記代謝産物のいずれか一つを取得することを含む、方法。
【請求項１１】
好気性菌を培養する方法であって、
前記好気性菌のヘキソキナーゼ以外の解糖系の代謝酵素からなる群から選択されるいずれかの解糖系の代謝酵素をコードする遺伝子が破壊されており、これにより、前記好気性菌において炭素源からＴＣＡサイクルへの代謝が抑制されており、前記好気性菌は、栄養源の存在下において前記栄養源からのエネルギー産生が可能であり、前記炭素源は、破壊された代謝酵素の上流の解糖系の基質および代謝産物並びに当該上流の解糖系に流入する代謝経路の基質および代謝産物からなる群から選択される栄養素であり、
好気性菌が好気的環境下において栄養源、前記炭素源およびその他の栄養素を含む培地中で好気的条件下で前記好気性菌を培養することを含み、前記栄養源は、栄養源の非存在下と比較して増殖を２倍向上させるに十分な量が培地に添加され、当該他の栄養素は、前記栄養源以外の栄養素であって、前記好気性菌の上記増殖に関する十分量の栄養素であり、前記栄養源は、破壊された代謝酵素の下流の解糖系の代謝産物、当該下流の解糖系に流入する代謝経路の基質および代謝産物、並びに、ＴＣＡサイクルの代謝産物およびＴＣＡサイクルに流入する代謝経路の基質および代謝産物からなる群から選択される電子伝達系においてエネルギー産生を駆動させる栄養素を含む、
方法。
【請求項１２】
前記好気性菌は、そのトランスアルドラーゼをコードする遺伝子がさらに破壊された好気性菌である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
破壊された解糖系の酵素をコードする遺伝子は、ホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子である、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
破壊された解糖系の酵素をコードする遺伝子は、ホスホフルクトキナーゼＡ２およびＡ３をコードする遺伝子である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
培地は、グリセロール、酢酸、フルクトース−１，６ビスリン酸、グリセルアルデヒド−３リン酸、ジヒドロキシアセトンリン酸、１、３−ビスホスホグリセリン酸、３−ホスホグリセリン酸、２−ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸、ＮＡＤＨ、リンゴ酸、コハク酸、グルタミン酸、α−ケトグルタル酸、イソクエン酸、プロトカテク酸、およびグルタミン酸以外のアミノ酸からなる群から選択される１以上の分子をさらに含む、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
破壊された解糖系の酵素をコードする遺伝子は、ホスホグリセレートキナーゼである、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１７】
培地は、３−ホスホグリセリン酸、２−ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸、酢酸、ＮＡＤＨ、リンゴ酸、コハク酸、グルタミン酸、α−ケトグルタル酸、イソクエン酸、プロトカテク酸、およびグルタミン酸以外のアミノ酸からなる群から選択される１以上の分子をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
好気的条件下において好気性菌に解糖系およびペントースリン酸経路ならびにこれらから派生する代謝経路からなる群から選択される代謝経路の代謝産物を産生させる方法であって、
前記好気性菌は、ヘキソキナーゼ以外の解糖系の代謝酵素からなる群から選択されるいずれかの解糖系の代謝酵素をコードする遺伝子が破壊されており、これにより、前記好気性菌において炭素源からＴＣＡサイクルへの代謝が抑制されており、前記好気性菌は、栄養源の存在下において前記栄養源からのエネルギー産生が可能であり、前記炭素源は、破壊された代謝酵素の上流の解糖系の基質および代謝産物並びに当該上流の解糖系に流入する代謝経路の基質および代謝産物からなる群から選択される栄養素であり、
好気性菌が好気的環境下において栄養源、炭素源、およびその他の栄養素を含む培地中で好気的条件下において前記好気性菌を培養することを含み、当該培地は、培養の途中で栄養源および／または炭素源が当該培地に添加されてもよく、前記栄養源は、栄養源の非存在下と比較して増殖を２倍向上させるに十分な量が培地に添加され、当該他の栄養素は、前記栄養源以外の栄養素であって、前記好気性菌の上記増殖に関する十分量の栄養素であり、
前記栄養源は、破壊された代謝酵素の下流の解糖系の代謝産物、当該下流の解糖系に流入する代謝経路の基質および代謝産物、並びに、ＴＣＡサイクルの代謝産物およびＴＣＡサイクルに流入する代謝経路の基質および代謝産物からなる群から選択される電子伝達系においてエネルギー産生を駆動させる栄養素を含む、
方法。
【請求項１９】
前記好気性菌は、そのトランスアルドラーゼをコードする遺伝子がさらに破壊された好気性菌である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
破壊された解糖系の酵素をコードする遺伝子は、ホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子である、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
破壊された解糖系の酵素をコードする遺伝子は、ホスホフルクトキナーゼＡ２およびＡ３をコードする遺伝子である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
培地は、グリセロール、酢酸、フルクトース−１，６ビスリン酸、グリセルアルデヒド−３リン酸、ジヒドロキシアセトンリン酸、１、３−ビスホスホグリセリン酸、３−ホスホグリセリン酸、２−ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸、ＮＡＤＨ、リンゴ酸、コハク酸、グルタミン酸、α−ケトグルタル酸、イソクエン酸、プロトカテク酸、およびグルタミン酸以外のアミノ酸からなる群から選択される１以上の分子をさらに含む、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
破壊された解糖系の酵素をコードする遺伝子は、ホスホグリセレートキナーゼである、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２４】
培地は、３−ホスホグリセリン酸、２−ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸、酢酸、ＮＡＤＨ、リンゴ酸、コハク酸、グルタミン酸、α−ケトグルタル酸、イソクエン酸、プロトカテク酸、およびグルタミン酸以外のアミノ酸からなる群から選択される１以上の分子をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
好気的条件下において好気性菌を増殖させる方法であって、
前記好気性菌は、ヘキソキナーゼ以外の解糖系の代謝酵素からなる群から選択されるいずれかの解糖系の代謝酵素をコードする遺伝子が破壊されており、これにより、前記好気性菌において炭素源からＴＣＡサイクルへの代謝が抑制されており、前記好気性菌は、栄養源の存在下において前記栄養源からのエネルギー産生が可能であり、前記炭素源は、破壊された代謝酵素の上流の解糖系の基質および代謝産物並びに当該上流の解糖系に流入する代謝経路の基質および代謝産物からなる群から選択されるいずれかの栄養素であり、
好気的条件下において栄養源、炭素源、およびその他の栄養素を含む培地中で培養することを含み、前記栄養源は、栄養源の非存在下と比較して増殖を２倍向上させるに十分な量が培地に添加され、当該他の栄養素は、前記栄養源以外の栄養素であって、前記好気性菌の上記増殖に関する十分量の栄養素であり、
前記栄養源は、破壊された代謝酵素の下流の解糖系の代謝産物、当該下流の解糖系に流入する代謝経路の基質および代謝産物、並びに、ＴＣＡサイクルの代謝産物およびＴＣＡサイクルに流入する代謝経路の基質および代謝産物からなる群から選択される電子伝達系においてエネルギー産生を駆動させる栄養素を含む、
方法。
【請求項２６】
ホスホフルクトキナーゼＡ２およびＡ３をコードする遺伝子およびトランスアルドラーゼをコードする遺伝子が破壊されている、放線菌。
【請求項２７】
培養中に栄養源が枯渇しないように栄養源を培地に添加することを含む、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
培養中に栄養源が枯渇しないように栄養源を培地に添加することを含む、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
培養中に栄養源が枯渇しないように栄養源を培地に添加することを含む、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、好気性菌の代謝酵素破壊株およびその培養法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物の二次代謝産物の中には、産業上有用な物質が多く含まれており、物質生産において微生物が用いられている。好気性菌は、好気的条件下においては、炭素源を用いて増殖し、二次代謝産物を産生する。二次代謝産物の収率は、培地に導入した炭素源（例えば、グルコース）の量に対して規定され、対糖収率と呼ばれる。微生物による物質生産において対糖収率を向上させることは一つの目標となり得る。
【０００３】
好気性菌のうち、放線菌は、抗生物質などの有用な二次代謝産物生産菌として知られている。しかし、二次代謝産物の生産量および対糖収率が低く、多くの場合、産業用途（例えば、医薬品用途など）への利用は限られている。代謝経路の酵素を破壊することにより、二次代謝産物の生産量を増加させる試みがなされている（特許文献１）が、特定の代謝産物固有の方法論であり、汎用性に乏しい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ２０１７／１５０３０４
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、好気性菌の代謝酵素破壊株およびその培養法を提供する。
【０００６】
本発明者らは、ヘキソキナーゼ以外の解糖系の代謝酵素からなる群から選択されるいずれかの代謝酵素をコードする遺伝子を破壊して、グルコースなどの炭素源の菌体増殖への利用を阻害し、かつ、炭素源の物質生産への利用を増強すると共に、当該代謝酵素の下流の解糖系の代謝産物および／または下流に流入する代謝経路の代謝産物を菌体に提供することによって、当該菌体を増殖させる方法を見出した。
【０００７】
本発明によれば、例えば、以下の発明が提供される。
［１］好気的条件下において培養された培地を含む培養物であって、
培地は、好気性菌を含み、
前記好気性菌は、ヘキソキナーゼ以外の解糖系の代謝酵素からなる群から選択されるいずれかの代謝酵素をコードする遺伝子が破壊されており、これにより、前記好気性菌において炭素源からＴＣＡサイクルへの代謝が抑制されており、前記炭素源は、破壊された代謝酵素の上流の解糖系の基質および代謝産物並びに当該上流の解糖系に流入する代謝経路の基質および代謝産物からなる群から選択されるいずれかの栄養素である、培養物。
［２］培地が、前記炭素源をさらに含む、上記［１］に記載の培養物。
［３］前記好気性菌は、ＴＣＡサイクルに対する栄養源の存在下において前記栄養源からのＴＣＡサイクルへの代謝が可能であり、前記栄養源は、破壊された代謝酵素の下流の解糖系の代謝産物、当該下流の解糖系に流入する代謝経路の基質および代謝産物、並びに、ＴＣＡサイクルの代謝産物およびＴＣＡサイクルに流入する代謝経路の基質および代謝産物からなる群から選択される栄養素を含む、上記［１］または［２］に記載の培養物。
［４］培地が、前記栄養源をさらに含む、上記［３］に記載の培養物。
［５］上記［１］〜［４］のいずれかに記載の培養物であって、前記好気性菌のトランスアルドラーゼをコードする遺伝子がさらに破壊されている、培養物。
［６］破壊された解糖系の酵素をコードする遺伝子は、ホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子である、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の培養物。
［７］破壊された解糖系の酵素をコードする遺伝子は、ホスホフルクトキナーゼＡ２およびＡ３をコードする遺伝子である、上記［６］に記載の培養物。
［８］栄養源が、グリセロール、フルクトース−１，６ビスリン酸、グリセルアルデヒド−３リン酸、ジヒドロキシアセトンリン酸、１、３−ビスホスホグリセリン酸、３−ホスホグリセリン酸、２−ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸、酢酸、ＮＡＤＨ、リンゴ酸、コハク酸、グルタミン酸、α−ケトグルタル酸、イソクエン酸、プロトカテク酸、および、グルタミン酸以外のアミノ酸からなる群から選択される１以上の分子である、上記［６］または［７］に記載の培養物。
［９］破壊された解糖系の酵素をコードする遺伝子は、ホスホグリセレートキナーゼである、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の培養物。
［１０］栄養源が、３−ホスホグリセリン酸、２−ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸、酢酸、ＮＡＤＨ、リンゴ酸、コハク酸、グルタミン酸、α−ケトグルタル酸、イソクエン酸、プロトカテク酸、およびグルタミン酸以外のアミノ酸からなる群から選択される１以上の分子である、上記［９］に記載の培養物。
［１１］解糖系およびペントースリン酸経路並びにこれらから派生する代謝経路からなる群から選択される代謝経路の代謝産物を取得する方法であって、上記［１］〜［１０］のいずれかに記載の培養物を用意することと、用意された培養物から前記代謝産物のいずれか一つを取得することを含む、方法。
［１２］好気性菌を培養する方法であって、
前記好気性菌のヘキソキナーゼ以外の解糖系の代謝酵素からなる群から選択されるいずれかの解糖系の代謝酵素をコードする遺伝子が破壊されており、これにより、前記好気性菌において炭素源からＴＣＡサイクルへの代謝が抑制されており、前記炭素源は、破壊された代謝酵素の上流の解糖系の基質および代謝産物並びに当該上流の解糖系に流入する代謝経路の基質および代謝産物からなる群から選択される栄養素であり、
好気的条件下において前記炭素源を含む培地中で前記好気性菌を培養することを含む、
方法。
［１３］前記好気性菌は、そのトランスアルドラーゼをコードする遺伝子がさらに破壊された好気性菌である、上記［１２］に記載の方法。
［１４］破壊された解糖系の酵素をコードする遺伝子は、ホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子である、上記［１２］または［１３］に記載の方法。
［１５］破壊された解糖系の酵素をコードする遺伝子は、ホスホフルクトキナーゼＡ２およびＡ３をコードする遺伝子である、上記［１４］に記載の方法。
［１６］培地は、グリセロール、酢酸、フルクトース−１，６ビスリン酸、グリセルアルデヒド−３リン酸、ジヒドロキシアセトンリン酸、１、３−ビスホスホグリセリン酸、３−ホスホグリセリン酸、２−ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸、ＮＡＤＨ、リンゴ酸、コハク酸、グルタミン酸、α−ケトグルタル酸、イソクエン酸、プロトカテク酸、およびグルタミン酸以外のアミノ酸からなる群から選択される１以上の分子をさらに含む、上記［１４］または［１５］に記載の方法。
［１７］破壊された解糖系の酵素をコードする遺伝子は、ホスホグリセレートキナーゼである、上記［１２］または［１３］に記載の方法。
［１８］培地は、３−ホスホグリセリン酸、２−ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸、酢酸、ＮＡＤＨ、リンゴ酸、コハク酸、グルタミン酸、α−ケトグルタル酸、イソクエン酸、プロトカテク酸、およびグルタミン酸以外のアミノ酸からなる群から選択される１以上の分子をさらに含む、上記［１７］に記載の方法。
［１９］好気的条件下において好気性菌に解糖系およびペントースリン酸経路ならびにこれらから派生する代謝経路からなる群から選択される代謝経路の代謝産物を産生させる方法であって、
前記好気性菌は、ヘキソキナーゼ以外の解糖系の代謝酵素からなる群から選択されるいずれかの解糖系の代謝酵素をコードする遺伝子が破壊されており、これにより、前記好気性菌において炭素源からＴＣＡサイクルへの代謝が抑制されており、前記炭素源は、破壊された代謝酵素の上流の解糖系の基質および代謝産物並びに当該上流の解糖系に流入する代謝経路の基質および代謝産物からなる群から選択される栄養素であり、
好気的条件下において炭素源を含む培地中で前記好気性菌を培養することを含み、当該培地は栄養源をさらに含んでいてもよく、または培養の途中で栄養源および／または炭素源が当該培地に添加されてもよく、
前記炭素源は、破壊された代謝酵素の上流の解糖系の基質および代謝産物並びに当該上流の解糖系に流入する代謝経路の基質および代謝産物からなる群から選択されるいずれかの栄養素であり、かつ、前記栄養源は、破壊された代謝酵素の下流の解糖系の代謝産物、当該下流の解糖系に流入する代謝経路の基質および代謝産物、並びに、ＴＣＡサイクルの代謝産物およびＴＣＡサイクルに流入する代謝経路の基質および代謝産物からなる群から選択される栄養素を含む、
方法。
［２０］前記好気性菌は、そのトランスアルドラーゼをコードする遺伝子がさらに破壊された好気性菌である、上記［１９］に記載の方法。
［２１］破壊された解糖系の酵素をコードする遺伝子は、ホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子である、上記［１９］または［２０］に記載の方法。
［２２］破壊された解糖系の酵素をコードする遺伝子は、ホスホフルクトキナーゼＡ２およびＡ３をコードする遺伝子である、上記［２１］に記載の方法。
［２３］は、グリセロール、酢酸、フルクトース−１，６ビスリン酸、グリセルアルデヒド−３リン酸、ジヒドロキシアセトンリン酸、１、３−ビスホスホグリセリン酸、３−ホスホグリセリン酸、２−ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸、ＮＡＤＨ、リンゴ酸、コハク酸、グルタミン酸、α−ケトグルタル酸、イソクエン酸、プロトカテク酸、およびグルタミン酸以外のアミノ酸からなる群から選択される１以上の分子をさらに含む、上記［２１］または［２２］に記載の方法。
［２４］破壊された解糖系の酵素をコードする遺伝子は、ホスホグリセレートキナーゼである、上記［１９］または［２０］に記載の方法。
［２５］培地は、３−ホスホグリセリン酸、２−ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸、酢酸、ＮＡＤＨ、リンゴ酸、コハク酸、グルタミン酸、α−ケトグルタル酸、イソクエン酸、プロトカテク酸、およびグルタミン酸以外のアミノ酸からなる群から選択される１以上の分子をさらに含む、上記［２４］に記載の方法。
［２６］好気的条件下において好気性菌を増殖させる方法であって、
前記好気性菌は、ヘキソキナーゼ以外の解糖系の代謝酵素からなる群から選択されるいずれかの解糖系の代謝酵素をコードする遺伝子が破壊されており、これにより、前記好気性菌において炭素源からＴＣＡサイクルへの代謝が抑制されており、前記炭素源は、破壊された代謝酵素の上流の解糖系の基質および代謝産物並びに当該上流の解糖系に流入する代謝経路の基質および代謝産物からなる群から選択されるいずれかの栄養素であり、
好気的条件下において栄養源の存在下で培養することを含み、
み、当該培地は炭素源をさらに含んでいてもよく、または培養の途中で栄養源および／または炭素源が当該培地に添加されてもよく、
栄養源は、破壊された代謝酵素の下流の解糖系の代謝産物、当該下流の解糖系に流入する代謝経路の基質および代謝産物、並びに、ＴＣＡサイクルの代謝産物およびＴＣＡサイクルに流入する代謝経路の基質および代謝産物からなる群から選択される栄養素を含む、方法。
［２７］ホスホフルクトキナーゼＡ２およびＡ３をコードする遺伝子が破壊されている、放線菌。
［２８］トランスアルドラーゼをコードする遺伝子がさらに破壊されている、上記［２７］に記載の放線菌。
［２９］ホスホグリセレートキナーゼをコードする遺伝子が破壊されている、放線菌。
【０００８】
［１Ａ］好気的条件下において培養された培地を含む培養物であって、
培地は、好気性菌を含み、
前記好気性菌は、ヘキソキナーゼ以外の解糖系の代謝酵素からなる群から選択されるいずれかの代謝酵素をコードする遺伝子が破壊されており、これにより、前記好気性菌においてグルコースからＴＣＡサイクルへの代謝が抑制されている、培養物。
［２Ａ］培地が、炭素源をさらに含み、前記炭素源は、破壊された代謝酵素の上流の解糖系の基質および代謝産物並びに当該上流の解糖系に流入する代謝経路の基質および代謝産物からなる群から選択されるいずれかの栄養素である、上記［２Ａ］に記載の培養物。
［３Ａ］前記好気性菌は、ＴＣＡサイクルに対する栄養源の存在下において前記栄養源からのＴＣＡサイクルへの代謝が可能であり、前記栄養源は、破壊された代謝酵素の下流の解糖系の代謝産物、当該下流の解糖系に流入する代謝経路の基質および代謝産物、並びに、ＴＣＡサイクルの代謝産物およびＴＣＡサイクルに流入する代謝経路の基質および代謝産物からなる群から選択される栄養素を含む、上記［１Ａ］または［２Ａ］に記載の培養物。
［４Ａ］培地が、前記栄養源をさらに含む、上記［３Ａ］に記載の培養物。
［５Ａ］上記［１Ａ］〜［４Ａ］のいずれかに記載の培養物であって、前記好気性菌のトランスアルドラーゼをコードする遺伝子がさらに破壊されている、培養物。
［６Ａ］破壊された解糖系の酵素をコードする遺伝子は、ホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子である、上記［１Ａ］〜［５Ａ］のいずれかに記載の培養物。
［７Ａ］破壊された解糖系の酵素をコードする遺伝子は、ホスホフルクトキナーゼＡ２およびＡ３をコードする遺伝子である、上記［６Ａ］に記載の培養物。
［８Ａ］栄養源が、グリセロール、フルクトース−１，６ビスリン酸、グリセルアルデヒド−３リン酸、ジヒドロキシアセトンリン酸、１、３−ビスホスホグリセリン酸、３−ホスホグリセリン酸、２−ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸、酢酸、ＮＡＤＨ、リンゴ酸、コハク酸、グルタミン酸、α−ケトグルタル酸、イソクエン酸、プロトカテク酸、および、グルタミン酸以外のアミノ酸からなる群から選択される１以上の分子である、上記［６Ａ］または［７Ａ］に記載の培養物。
［９Ａ］破壊された解糖系の酵素をコードする遺伝子は、ホスホグリセレートキナーゼである、上記［１Ａ］〜［４Ａ］のいずれかに記載の培養物。
［１０Ａ］栄養源が、３−ホスホグリセリン酸、２−ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸、酢酸、ＮＡＤＨ、リンゴ酸、コハク酸、グルタミン酸、α−ケトグルタル酸、イソクエン酸、プロトカテク酸、およびグルタミン酸以外のアミノ酸からなる群から選択される１以上の分子である、上記［９Ａ］に記載の培養物。
［１１Ａ］解糖系およびペントースリン酸経路並びにこれらから派生する代謝経路からなる群から選択される代謝経路の代謝産物を取得する方法であって、上記［１Ａ］〜［１０Ａ］のいずれかに記載の培養物を用意することと、用意された培養物から前記代謝産物のいずれか一つを取得することを含む、方法。
［１２Ａ］好気性菌を培養する方法であって、
前記好気性菌のヘキソキナーゼ以外の解糖系の代謝酵素からなる群から選択されるいずれかの解糖系の代謝酵素をコードする遺伝子が破壊されており、これにより、前記好気性菌においてグルコースからＴＣＡサイクルへの代謝が抑制されており、
好気的条件下において炭素源を含む培地中で前記好気性菌を培養することを含み、前記炭素源は、破壊された代謝酵素の上流の解糖系の基質および代謝産物並びに当該上流の解糖系に流入する代謝経路の基質および代謝産物からなる群から選択される栄養素である、
方法。
［１３Ａ］前記好気性菌は、そのトランスアルドラーゼをコードする遺伝子がさらに破壊された好気性菌である、上記［１２Ａ］に記載の方法。
［１４Ａ］破壊された解糖系の酵素をコードする遺伝子は、ホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子である、上記［１２Ａ］または［１３Ａ］に記載の方法。
［１５Ａ］破壊された解糖系の酵素をコードする遺伝子は、ホスホフルクトキナーゼＡ２およびＡ３をコードする遺伝子である、上記［１４Ａ］に記載の方法。
［１６Ａ］培地は、グリセロール、酢酸、フルクトース−１，６ビスリン酸、グリセルアルデヒド−３リン酸、ジヒドロキシアセトンリン酸、１、３−ビスホスホグリセリン酸、３−ホスホグリセリン酸、２−ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸、ＮＡＤＨ、リンゴ酸、コハク酸、グルタミン酸、α−ケトグルタル酸、イソクエン酸、プロトカテク酸、およびグルタミン酸以外のアミノ酸からなる群から選択される１以上の分子をさらに含む、上記［１４Ａ］または［１５Ａ］に記載の方法。
［１７Ａ］破壊された解糖系の酵素をコードする遺伝子は、ホスホグリセレートキナーゼである、上記［１２Ａ］または［１３Ａ］に記載の方法。
［１８Ａ］培地は、３−ホスホグリセリン酸、２−ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸、酢酸、ＮＡＤＨ、リンゴ酸、コハク酸、グルタミン酸、α−ケトグルタル酸、イソクエン酸、プロトカテク酸、およびグルタミン酸以外のアミノ酸からなる群から選択される１以上の分子をさらに含む、上記［１７Ａ］に記載の方法。
［１９Ａ］好気的条件下において好気性菌に解糖系およびペントースリン酸経路ならびにこれらから派生する代謝経路からなる群から選択される代謝経路の代謝産物を産生させる方法であって、
前記好気性菌は、ヘキソキナーゼ以外の解糖系の代謝酵素からなる群から選択されるいずれかの解糖系の代謝酵素をコードする遺伝子が破壊されており、これにより、前記好気性菌においてグルコースからＴＣＡサイクルへの代謝が抑制されており、
好気的条件下において炭素源を含む培地中で前記好気性菌を培養することを含み、当該培地は栄養源をさらに含んでいてもよく、または培養の途中で栄養源および／または炭素源が当該培地に添加されてもよく、
前記炭素源は、破壊された代謝酵素の上流の解糖系の基質および代謝産物並びに当該上流の解糖系に流入する代謝経路の基質および代謝産物からなる群から選択されるいずれかの栄養素であり、かつ、前記栄養源は、破壊された代謝酵素の下流の解糖系の代謝産物、当該下流の解糖系に流入する代謝経路の基質および代謝産物、並びに、ＴＣＡサイクルの代謝産物およびＴＣＡサイクルに流入する代謝経路の基質および代謝産物からなる群から選択される栄養素を含む、方法。
［２０Ａ］前記好気性菌は、そのトランスアルドラーゼをコードする遺伝子がさらに破壊された好気性菌である、上記［１９Ａ］に記載の方法。
［２１Ａ］破壊された解糖系の酵素をコードする遺伝子は、ホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子である、上記［１９Ａ］または［２０Ａ］に記載の方法。
［２２Ａ］破壊された解糖系の酵素をコードする遺伝子は、ホスホフルクトキナーゼＡ２およびＡ３をコードする遺伝子である、上記［２１Ａ］に記載の方法。
［２３Ａ］は、グリセロール、酢酸、フルクトース−１，６ビスリン酸、グリセルアルデヒド−３リン酸、ジヒドロキシアセトンリン酸、１、３−ビスホスホグリセリン酸、３−ホスホグリセリン酸、２−ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸、ＮＡＤＨ、リンゴ酸、コハク酸、グルタミン酸、α−ケトグルタル酸、イソクエン酸、プロトカテク酸、およびグルタミン酸以外のアミノ酸からなる群から選択される１以上の分子をさらに含む、上記［２１Ａ］または［２２Ａ］に記載の方法。
［２４Ａ］破壊された解糖系の酵素をコードする遺伝子は、ホスホグリセレートキナーゼである、上記［１９Ａ］または［２０Ａ］に記載の方法。
［２５Ａ］培地は、３−ホスホグリセリン酸、２−ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸、酢酸、ＮＡＤＨ、リンゴ酸、コハク酸、グルタミン酸、α−ケトグルタル酸、イソクエン酸、プロトカテク酸、およびグルタミン酸以外のアミノ酸からなる群から選択される１以上の分子をさらに含む、上記［２４Ａ］に記載の方法。
［２６Ａ］好気的条件下において好気性菌を増殖させる方法であって、
前記好気性菌は、ヘキソキナーゼ以外の解糖系の代謝酵素からなる群から選択されるいずれかの解糖系の代謝酵素をコードする遺伝子が破壊されており、これにより、前記好気性菌においてグルコースからＴＣＡサイクルへの代謝が抑制されており、
好気的条件下において栄養源の存在下で培養することを含み、当該培地は炭素源をさらに含んでいてもよく、または培養の途中で栄養源および／または炭素源が当該培地に添加されてもよく、
前記炭素源は、破壊された代謝酵素の上流の解糖系の基質および代謝産物並びに当該上流の解糖系に流入する代謝経路の基質および代謝産物からなる群から選択されるいずれかの栄養素であり、かつ、栄養源は、破壊された代謝酵素の下流の解糖系の代謝産物、当該下流の解糖系に流入する代謝経路の基質および代謝産物、並びに、ＴＣＡサイクルの代謝産物およびＴＣＡサイクルに流入する代謝経路の基質および代謝産物からなる群から選択される栄養素を含む、
方法。
【０００９】
本発明の方法によれば、炭素源の物質生産への利用能を高めることにより産生される物質の量を増加させることができるが、その際に生じる細胞増殖の低下を低減させることによって、産生される物質の量をさらに増加させることができる。本発明の方法によれば、上記物質生産の培養において、細胞を増殖させることに有利である。培養とは、上記物質生産する際に行う、前々培養、前培養、本培養などを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ストレプトマイセス・リビダンス  １３２６株の培養実験の結果を示す。横軸は、培養時間（ｈ）を表し、縦軸は、ＯＤ６００から算出された菌体量を表す。図１〜４において、黒丸はグルコース存在下で１３２６株を培養した場合の結果を示し、白抜きの丸はその場合に得られたセドヘプツロースの量を示し、黒三角はグリセロールを含むＴＳＢ培地で培養を開始し、グリセロールが枯渇する前にグルコースを添加して培養した場合の結果を示し、白抜きの三角はその場合に得られたセドヘプツロースの量を示す。
【図２】図２は、ストレプトマイセス・リビダンス  １３２６△ＳＬＩ＿２２４９株の結果を示す。
【図３】図３は、ストレプトマイセス・リビダンス  １３２６△ＳＬＩ＿２２４９△ＳＬＩ１４９３株の結果を示す。
【図４】図４は、ストレプトマイセス・リビダンス  １３２６△ＳＬＩ＿２２４９△ＳＬＩ＿１４９３△ＳＬＩ＿５６９５株の結果を示す。
【図５】図５は、ストレプトマイセス・リビダンス  １３２６株およびストレプトマイセス・リビダンス  １３２６△ＳＬＩ＿２２６０株の単位菌体当たりのトレハロースの産生量を示す。白抜きの丸は１３２６株をＴＳＢ培地で培養した場合の結果を示し、白抜きの三角は１３２６株を５×ＴＳＢ培地で培養した場合の結果を示し、黒塗りの丸は１３２６△ＳＬＩ＿２２６０株をＴＳＢ培地で培養した場合の結果を示し、黒塗りの三角は１３２６△ＳＬＩ＿２２６０株を５×ＴＳＢ培地で培養した場合の結果を示す。
【図６】図６は、ストレプトマイセス・リビダンス  １３２６△ＳＬＩ＿２２６０株のグルコース存在下での培養における、プロトカテク酸の増殖に対する効果を示す。
【図７】図７は、ストレプトマイセス・リビダンス  １３２６△ＳＬＩ＿２２６０株の増殖におけるアミノ酸（アラニン、セリンおよびグルタミン酸）の増殖に対する効果を示す。
【図８】図８は、ストレプトマイセス・リビダンス  １３２６△ＳＬＩ＿２２６０株のグリセロール存在下での培養における、アミノ酸（アラニン）の増殖に対する効果を示す。
【図９】図９は、ストレプトマイセス・リビダンス  １３２６△ＳＬＩ＿２２６０株のグリセロール存在下での培養における、コハク酸の増殖に対する効果を示す。
【図１０】図１０は、ストレプトマイセス・リビダンス  １３２６△ＳＬＩ＿２２６０株のキシロースおよびアミノ酸（アラニン）存在下における増殖を示す。
【図１１】図１１は、ストレプトマイセス・リビダンス  １３２６△ＳＬＩ＿２２６０株のキシロースおよびアミノ酸（アラニン）存在下における単位菌体当たりのキシルロースの産生量を示す。
【図１２】図１２は、ストレプトマイセス・リビダンス  １３２６△ＳＬＩ＿２２６０株のキシロースおよびアミノ酸（アラニン）存在下における単位菌体当たりのキシリトールの産生量を示す。
【図１３】図１３は、本発明における代謝改変法を説明する概念図である。通常（左）は、炭素源や栄養源などの栄養素は、細胞の増殖にも、物質生産にも用いられる。これに対して、本発明（右）では、解糖系の代謝酵素を破壊することによって、物質生産の原料（炭素源）が細胞の増殖に用いられることを防ぐと共に、増殖に必要な栄養素（栄養源）を別途細胞に供給することによって、栄養源により細胞増殖を促進し、および／または原料により物質生産を促進し、これによって、物質生産と細胞増殖とが栄養素を奪い合わないようにする。
【図１４】図１４は、解糖系およびペントースリン酸経路並びにこれらから派生する代謝経路と、これら経路における代謝産物の例を示す。
【図１５】図１５は、解糖系およびペントースリン酸経路における栄養源および炭素源とし得る栄養素の例を示す。
【発明の具体的な説明】
【００１１】
本明細書では、「好気性菌」とは、酸素を消費してエネルギーを産生する機構を備えた微生物である。好気性菌は、糖および脂質などからエネルギーを得るために、酸素を利用する。好気性菌としては、通性好気性菌と偏性好気性菌が挙げられる。通性好気性菌は、酸素を利用することができるが、嫌気的にエネルギーを産生することもできる。通性好気性菌の例としては、酵母、バクテリア、カビが挙げられる。代謝酵素が破壊された好気性菌は、株化されている。したがって、破壊された代謝酵素を有する好気性菌を、本明細書では、単に代謝酵素破壊株ということがある。
【００１２】
本明細書では、「放線菌」とは、アクチノバクテリア門（放線菌門）に属する細菌である。放線菌としては、特に限定されないが例えば、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の放線菌が挙げられる。放線菌は、通性好気性の細菌であり、嫌気的条件下においてエネルギーを産生することができるが、物質生産に利用される場合には、好気性条件下で培養される。ストレプトマイセス属の放線菌としては、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトマイセス・ビオラセオルーバー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ）、ストレプトマイセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・アヴェルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・アルバス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｓ）、ストレプトマイセス・アルブルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｌｕｓ）などが挙げられる。
【００１３】
本明細書では、「好気的条件」とは、好気性菌が好気的呼吸を行う条件を意味する。好気的呼吸は、解糖系とクエン酸サイクルと電子伝達系を含む代謝系が担っており、これにより通常は、糖類が酸素を消費して二酸化炭素と水とエネルギーであるＡＴＰが産生される。解糖系は、図１４および１５に示されるように、グルコースからグルコース−６リン酸を経てピルビン酸を産生する経路である。解糖系において産生されたピルビン酸は、ピルビン酸脱水素酵素複合体によってアセチルＣｏＡに変換されてクエン酸回路に導入される（便宜上、本明細書では、アセチルＣｏＡを産生する経路までを解糖系に分類する）。アセチルＣｏＡはその後クエン酸回路へと代謝される。クエン酸回路は、ＴＣＡサイクルとも呼ばれる回路である。クエン酸回路は、ＮＡＤＨ、ＦＡＤＨ2、およびＧＴＰ等を産生する。電子伝達系は、ＮＡＤＨおよびＦＡＤＨ2を酸化してＡＴＰを産生する。好気的条件下で好気性菌を培養することによって、解糖系とクエン酸回路と電子伝達系を含む代謝系において糖類からＡＴＰが産生される。これに対して、「嫌気的条件」とは、酸素を用いずに嫌気性生物がエネルギー産生と増殖を行う条件である。当業者であれば、好気性菌を好気的条件下において培養することが適宜できる。
【００１４】
本発明は、グルコースが、解糖系およびＴＣＡサイクルによって代謝されることを阻害する。阻害は、グルコースをアセチルＣｏＡに代謝する解糖系の代謝酵素のいずれか１以上の破壊によることができる。解糖系の酵素（代謝酵素を含む）の例としては、図１４に示されるように上流から下流に向けて以下の１０段階の代謝酵素が挙げられる。
・ヘキソキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１）は、グルコースのグルコース−６リン酸（Ｇ６Ｐ）への代謝（段階１）を担う代謝酵素である；グルコース−６リン酸は、ペントースリン酸経路の炭素源となり得る；
・グルコース−６リン酸イソメラーゼ（ＥＣ  ５．３．１．９）は、グルコース−６リン酸のフルクトース−６リン酸（Ｆ６Ｐ）への代謝（段階２）を担う代謝酵素である；
・ホスホフルクトキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１１）は、フルクトース−６リン酸のフルクトース−１，６ビスリン酸（ＦＢＰ）への代謝（段階３）を担う代謝酵素である；フルクトース−１，６ビスリン酸は、解糖系でしか代謝されないため、ホスホフルクトキナーゼの破壊は、解糖系のみを操作でき得る。
・フルクトース−１，６ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）は、フルクトース−１，６ビスリン酸のグリセルアルデヒド−３リン酸（ＧＡＰ）とジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）への代謝（段階４）を担う代謝酵素である；
・トリオースリン酸イソメラーゼ（ＥＣ  ５．３．１．１）は、ジヒドロキシアセトンリン酸のグリセルアルデヒド−３リン酸への変換（段階５）を担う酵素である；
・グリセルアルデヒド−３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．１２）（ｇａｐＡ）は、グリセルアルデヒド−３リン酸の１，３−ビスホスホグリセリン酸への代謝（段階６）を担う代謝酵素である；
・ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＥＣ  ２．７．２．３）は、１，３−ビスホスホグリセリン酸の３−ホスホグリセリン酸への代謝（段階７）を担う代謝酵素である；
・ホスホグリセリン酸ムターゼ（ＥＣ  ５．４．２．１）は、３−ホスホグリセリン酸の２−ホスホグリセリン酸への代謝（段階８）を担う代謝酵素である；
・ホスホピルビン酸ヒドラターゼ（ＥＣ  ４．２．１．１１）は、２−ホスホグリセリン酸のホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）への代謝（段階９）を担う代謝酵素である；および
・ピルビン酸キナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．４０）は、ホスホエノールピルビン酸からピルビン酸への代謝（段階１０）を担う代謝酵素である。その後、解糖系において、ピルビン酸は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．５１）によってアセチルＣｏＡに変換される。ホスホエノールピルビンはホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．３１）によって炭酸イオンと反応してオキサロ酢酸と無機リン酸に変換され、ピルビン酸は、ピルビン酸カルボキシラーゼ（ＥＣ  ６．４．１．１）によって炭酸イオンと反応してオキサロ酢酸に変換される。アセチルＣｏＡ（Ａｃ−ＣｏＡ）およびオキサロ酢酸は、ＴＣＡサイクルに導入される。上記が、解糖系の上流から下流に向けての酵素反応の説明である。代謝酵素は、生物種によって変わりうるが、基本的には同じ代謝経路が各生物に備わっている。好気性菌も、解糖系を有しており、段階１〜１０に対応する代謝段階の各段階を担う代謝酵素が存在する。したがって、解糖系の段階１〜１０のいずれかを停止させたい場合には、好気性菌の各段階の代謝を担う代謝酵素を破壊することができる。
【００１５】
本発明においては、解糖系におけるグルコースからピルビン酸への代謝経路の代謝酵素（但し、ヘキソキナーゼを除く）のいずれか１以上を破壊することによって、グルコースまたはグルコース−６リン酸がＴＣＡサイクルで消費されることを阻害することができる。このようにすることで、グルコースおよびグルコース−６リン酸が細胞により消費されることを防ぎ得る。そうすると、当該細胞においては、物質生産の経路であるペントースリン酸経路において消費されるグルコースやグルコース−６リン酸の量を増加させることができる。一方で、本発明においては、上記において破壊された代謝酵素の下流の代謝産物等（代謝産物、当該代謝産物に体内で変換される物質およびアミノ酸等）を補充することによって、ＴＣＡサイクルでエネルギーを産生することができる。これにより、代謝酵素を破壊したことによる細胞増殖の低下を回復させることができる。
したがって、本発明では、（ｉ）解糖系におけるグルコースからアセチルＣｏＡへの代謝経路の代謝酵素（但し、ヘキソキナーゼを除く）のいずれか１以上を破壊することによって、グルコースまたはグルコース−６リン酸がＴＣＡサイクルで消費されることを阻害し、かつ、（ｉｉ）ＴＣＡサイクルに対してはエネルギー源を提供することによって、細胞へのエネルギー供給を行うことができる。
【００１６】
本明細書では、「炭素源」とは、好気的条件下における野生型の好気性菌において解糖系およびその下流において消費される栄養素のうち、代謝酵素破壊株において、解糖系およびその下流における消費が低減または停止させられた栄養素を意味する。当該代謝酵素破壊株においては細胞のエネルギー産生に用いられる当該栄養素の量が低減されており、当該栄養素は、物質産生に用いられ易くなっている。「炭素源」は、本明細書では特に、解糖系においてアセチルＣｏＡへの代謝が阻害され、かつ、破壊された代謝酵素より上流の解糖系において、またはペントースリン酸経路において消費される栄養素を意味し得る。炭素源としてはまた、解糖系に流入する代謝経路の代謝産物も挙げられる。解糖系に流入する代謝経路（特に、破壊した代謝酵素の上流に流入する代謝経路）の代謝産物は、解糖系に流入し、炭素源を供給し得るためである。破壊された代謝酵素が複数存在するときは、炭素源は、例えば、当該破壊によって破壊された最も下流の代謝酵素より上流、または破壊された最も上流の代謝酵素より上流の栄養素であり得る。ある態様において、炭素源としては、特に限定されないが例えば、グルコースが好ましく用いられ得る。
本明細書では、「栄養源」とは、代謝酵素破壊株において、ＴＣＡサイクルにおける代謝を誘導することができる栄養素を意味する。代謝酵素破壊株においては、炭素源のエネルギー産生（例えば、ピルビン酸の産生やＴＣＡサイクルへの代謝物供給によるエネルギー産生）への使用量が低下または停止している。したがって、当該代謝酵素破壊株に対して炭素源を供給することは、当該代謝酵素破壊株の増殖やエネルギー産生には十分に有効ではないか全く有効ではない。これに対して、当該代謝酵素破壊株において、エネルギー産生に用いることができる代謝物が供給されることにより、当該代謝酵素破壊株は、エネルギー産生を可能とし、ひいては増殖を可能とすることとなる。本明細書では特に、破壊された代謝酵素を有する好気性菌において電子伝達系においてエネルギー産生を駆動させるための栄養素を意味する。栄養源としては、特に限定されないが例えば、破壊された代謝酵素より下流の解糖系の代謝産物のいずれか、アミノ酸、ＮＡＤＨ、ＦＡＤＨ2、およびＧＴＰ、並びにＴＣＡサイクルの代謝産物（例えば、ＮＡＤＨ、リンゴ酸、コハク酸、グルタミン酸、α−ケトグルタル酸、イソクエン酸、およびプロトカテク酸）が挙げられ、好ましく用いられ得る。ここで、アラニン、セリン、グリシン、スレオニン、システイン、およびメチオニンなどのアミノ酸はピルビン酸を経由してＴＣＡサイクルの栄養源となり、プロトカテク酸および芳香族アミノ酸は、スクシニルＣｏＡを経由してＴＣＡサイクルの栄養源となり、酢酸や、バリン、ロイシン、およびイソロイシンなどのアミノ酸はアセチルＣｏＡ（Ａｃ−ＣｏＡ）を経由してＴＣＡサイクルの栄養源となり、ヒスチジン、アルギニン、グルタミン、およびグルタミン酸などのアミノ酸はα−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）を経由してＴＣＡサイクルの栄養源となり、アスパラギン酸およびリジンなどのアミノ酸はオキサロ酢酸を経由してＴＣＡサイクルの栄養源となり得る。栄養源としては、解糖系に流入する代謝経路（特に、破壊した代謝経路の下流に流入する代謝経路）の代謝産物が挙げられる。解糖系に流入する代謝経路（特に、破壊した代謝経路の下流に流入する代謝経路）の代謝産物は、解糖系に流入し、栄養源を供給しうるためである。破壊された代謝酵素が複数存在するときは、栄養源は、例えば、当該破壊によって破壊された最も下流の代謝酵素より下流、または最も上流の代謝酵素より下流の栄養素であり得る。
このように本明細書では、栄養素は、「炭素源」と「栄養源」とに分けて記載することとするが、いずれの栄養素が炭素源となり、栄養源となるかは、破壊した代謝酵素によって相対的に変わることが当業者であれば理解できる。
【００１７】
本明細書では、「派生する代謝経路」とは、ある代謝経路の下流の代謝経路、またはある代謝経路から分岐した代謝経路である。例えば、ペントースリン酸経路から派生する代謝経路は、ペントースリン酸経路の下流の代謝経路、またはある代謝経路から分岐した代謝経路である。ペントースリン酸経路による炭素源の消費量が増大することによって、ペントースリン酸経路の代謝産物の収量が向上し、これによりペントースリン酸経路から派生する代謝経路（例えば、シキミ酸経路）の代謝産物の収量も向上することが期待される。例えば、解糖系から派生する代謝経路は、解糖系の下流に存在する代謝経路であって、かつ破壊した代謝酵素の上流から分岐する代謝経路である。解糖系において、破壊した代謝酵素の上流における炭素源の消費量が増大することによって、解糖系の上流における代謝産物の収量が増大し、これにより、解糖系から派生する代謝経路の代謝産物の収量も向上することが期待される。
【００１８】
本明細書では、「アミノ酸」は、好気性菌のアミノ酸であり、好気性菌が栄養源として利用することができるアミノ酸であり、例えば、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アルギニン、システイン、グルタミン、グリシン、プロリン、チロシン、アラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、およびセリンが挙げられるがこれに限定されない。
【００１９】
本発明において用いられる好気性菌は、ヘキソキナーゼ以外の解糖系の代謝酵素からなる群から選択されるいずれかの代謝酵素をコードする遺伝子が破壊されている。これにより、細胞のエネルギー産生に使われるグルコースの量が低減しているか、または細胞のエネルギー産生にグルコースを用いることができなくなっている。
したがって、（Ａ）本発明によれば、
好気的条件下において好気性菌を増殖させる方法であって、
前記好気性菌は、ヘキソキナーゼ以外の解糖系の代謝酵素からなる群から選択されるいずれかの解糖系の代謝酵素をコードする遺伝子が破壊されており、これにより、前記好気性菌において炭素源からＴＣＡサイクルへの代謝が抑制されており、
好気的条件下において栄養源のいずれか１つを含む培地中で前記好気性菌を培養することを含む、
方法
が提供される。
【００２０】
上記（Ａ）に記載の方法においては、好気性菌においては、炭素源からのＴＣＡサイクルへの代謝が抑制されており、炭素源を好気性菌のエネルギー産生に有効に用いることはできないか、十分に効率的に用いることができない。一方で、当該好気性菌は、炭素源の存在下では、炭素源を物質生産により有利に用いることができる。一方、前記炭素源のみの存在下では当該好気性菌は増殖することができないか、増殖力が低下しているので、当該好気性菌の好気的条件下の培養は、栄養源の存在下で行うことができ、これによって当該好気性菌を増殖させることができる。ここで、炭素源は、上記で定義された通りの栄養素であり、破壊された代謝酵素の上流の解糖系の基質および代謝産物並びに当該上流の解糖系に流入する代謝経路の基質および代謝産物からなる群から選択されるいずれかの栄養素であり得る。また、栄養源は、上記で定義された通りの栄養素であり、破壊された代謝酵素より下流の解糖系の代謝産物、破壊された代謝酵素より下流の解糖系に流入する代謝経路の基質または代謝産物、およびＴＣＡサイクルで消費される基質および代謝産物であり得る。栄養源としては、例えば、グルタミン酸以外のアミノ酸、アセチルＣｏＡ、ＮＡＤＨ、ＦＡＤＨ2、およびＧＴＰ、並びにＴＣＡサイクルの代謝産物（例えば、ＮＡＤＨ、リンゴ酸、コハク酸、グルタミン酸、α−ケトグルタル酸、イソクエン酸）、酢酸、並びにプロトカテク酸が挙げられる。
【００２１】
例えば、好気性菌において、ホスホフルクトキナーゼを破壊した場合には、グルコースなどのホスホグリセレートキナーゼの上流で用いられる炭素源およびその代謝産物（例えば、グルコース−６リン酸）は、ホスホフルクトキナーゼより下流の解糖系およびＴＣＡサイクルで代謝されなくなるか、その効率が低下する。したがって、ホスホフルクトキナーゼ破壊株の炭素源は、グルコースおよびグルコース−６リン酸であり得る。また、ホスホフルクトキナーゼ破壊株の栄養源は、ホスホフルクトキナーゼより下流の解糖系の代謝産物のいずれか、グルタミン酸以外のアミノ酸、アセチルＣｏＡ、ＮＡＤＨ、ＦＡＤＨ2、およびＧＴＰ、並びにＴＣＡサイクルの代謝産物（例えば、ＮＡＤＨ、リンゴ酸、コハク酸、グルタミン酸、α−ケトグルタル酸、イソクエン酸）、酢酸、並びにプロトカテク酸が挙げられる。また、グリセロールは、グリセロール−３リン酸を経てジヒドロキシアセトンリン酸に代謝され、解糖系およびその下流でエネルギー産生に利用される。したがって、グリセロールもホスホフルクトキナーゼ破壊株の栄養源であり得る。
【００２２】
好気性菌が放線菌である場合、ホスホフルクトキナーゼＡ２およびＡ３がフルクトース−６リン酸のフルクトース−１，６ビスリン酸への代謝（段階３）を担う。したがって、放線菌においては、段階３の代謝酵素を破壊することは、ホスホフルクトキナーゼＡ２およびＡ３を破壊することにより達成し得る。
【００２３】
上記（Ａ）に記載の方法においては、好気性菌は、栄養源の存在下で培養することができる。ある態様では、好気性菌は、破壊された代謝酵素の下流の代謝産物およびＴＣＡサイクルの代謝産物のいずれか１つの存在下で培養することができる。
【００２４】
上記（Ａ）に記載の方法においては、好気性菌は、炭素源の存在下で培養してもよい。炭素源の存在下で培養することによって、炭素源が、例えば、ペントースリン酸経路などの物質産生の経路に効果的に用いられ得る。
【００２５】
好気性菌は、トランスアルドラーゼをさらに破壊されていてもよい。トランスアルドラーゼが破壊されていることによってセドヘプツロース−７リン酸およびグリセルアルデヒド−３リン酸からのフルクトース−６リン酸およびエリトロース−４リン酸への代謝が阻害される。これにより、ペントースリン酸経路の産物が解糖系に流れ混む量を低減させることができる。
【００２６】
好気性菌は、ホスホグリセレートキナーゼ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）が破壊されていてもよい。例えば、放線菌は、ホスホグリセレートキナーゼが破壊されていてもよい。ホスホグリセレートキナーゼ破壊株は、上記（Ａ）の記載の方法において用いられ得る。ホスホグリセレートキナーゼ破壊株の炭素源は、グルコース、フルクトース、グリセロール、キシロース、アラビノース、グルコン酸、トレハロース、マンノース、リボースなどであり得る。ホスホグリセレートキナーゼ破壊株の栄養源は、３−ホスホグリセリン酸、２−ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸、グルタミン酸以外のアミノ酸、アセチルＣｏＡ、ＮＡＤＨ、ＦＡＤＨ2、およびＧＴＰ、並びにＴＣＡサイクルの代謝産物（例えば、ＮＡＤＨ、リンゴ酸、コハク酸、グルタミン酸、α−ケトグルタル酸、イソクエン酸）、酢酸、並びにプロトカテク酸からなる群から選択される栄養素であり得る。
【００２７】
ホスホフルクトキナーゼ破壊株において、グリセロールは、栄養源であったが、ホスホグリセレートキナーゼ破壊株において、グリセロールは栄養源たり得ず、炭素源である。したがって、破壊される代謝酵素の違いは、炭素源として用い得る栄養素、および栄養源として用い得る栄養素に違いをもたらし得る。そして、破壊する代謝酵素は、解糖系の段階２〜１０のいずれかの代謝酵素であり、当該酵素破壊株において炭素源、および栄養源は、代謝経路に鑑みて当業者であれば適宜設定することができる。
【００２８】
上記（Ａ）の方法において、栄養源の存在下で好気性菌を培養した後に、炭素源（および栄養源）の存在下で好気性菌をさらに培養することができる。栄養源の存在下では、好気性菌は、栄養源からエネルギーを産生し、活発に増殖することができる。増殖前、増殖中または増殖後に（好ましくは、増殖中に、または増殖後に）、炭素源（および栄養源）の存在下で好気性菌をさらに培養すると、好気性菌は、炭素源からペントースリン酸経路の代謝産物およびその派生代謝産物や、破壊した酵素の上流の解糖系の代謝産物およびその派生代謝産物を産生する。一方で、代謝酵素破壊株は、栄養源を用いて増殖し、炭素源からペントースリン酸経路の代謝産物およびその派生代謝産物や、破壊した酵素の上流の解糖系の代謝産物およびその派生代謝産物の産生に回されるために、増殖の低下を防ぎながら、代謝産物の収量（例えば、対糖収量）を向上させることができる（例えば、図１３参照）。
【００２９】
上記（Ａ）の方法において、好気性菌は、例えば、栄養源の存在下で培養された後に、炭素源の存在下で培養されうる。このとき、好気性菌の増殖は、栄養源の存在下によって促進され得る。また、好気性菌による物質生産は、炭素源の存在下によって促進されうる。好気性菌による物質生産は、栄養源および炭素源の存在下によって行われてもよい。このようにすることで、好気性菌の増殖を促進しながら、好気性菌による物質生産を促進し得る。
【００３０】
したがって、本発明によれば、
好気性菌を培養する方法であって、
前記好気性菌のヘキソキナーゼ以外の解糖系の代謝酵素からなる群から選択されるいずれかの解糖系の代謝酵素をコードする遺伝子が破壊されており、これにより、前記好気性菌において炭素源からＴＣＡサイクルへの代謝が抑制されており、
好気的条件下において炭素源を含む培地中で前記好気性菌を培養することを含む、
方法
が提供される。
【００３１】
本発明によれば、また、
好気的条件下において好気性菌に解糖系およびペントースリン酸経路並びにその派生代謝経路から選択される経路の代謝産物を産生させる方法であって、
前記好気性菌は、ヘキソキナーゼ以外の解糖系の代謝酵素からなる群から選択されるいずれかの解糖系の代謝酵素をコードする遺伝子が破壊されており、これにより、前記好気性菌においてグルコースからＴＣＡサイクルへの代謝が抑制されており、
好気的条件下において炭素源を含む培地中で前記好気性菌を培養することを含む、
方法
が提供される。代謝産物やその派生代謝産物は、培地から回収することができる。代謝産物やその派生代謝産物は、培地の上清（例えば、分泌される代謝産物）または培養された菌体（例えば、菌体内に蓄積する代謝産物）から回収され得る。したがって、この態様において、本願発明は、好気的条件下において炭素源の存在下で代謝酵素破壊株を培養した後には、代謝産物やその派生代謝産物を得られた培養物から回収することを含んでいてもよい。
【００３２】
得られる代謝産物やその派生代謝産物は、多くの場合、産業上有用な代謝産物である。したがって、これらの代謝産物は、培養後に回収され、有用な用途に利用され得る。ここで、「派生代謝産物」とは、示された代謝経路から派生する代謝経路における代謝産物を意味する。例えば、ペントースリン酸経路の派生代謝産物とは、ペントースリン酸経路から派生する代謝経路における代謝産物であり、解糖系の派生代謝産物とは、解糖系から派生する代謝経路における代謝産物を意味する。
【００３３】
本発明のある態様では、炭素源は、キシロースであり得、代謝産物はキシルロースおよび／またはキシリトールであり得る。本発明のある態様では、代謝産物は、セドヘプツロースであり得る。本発明のある態様では、代謝産物は、トレハロースであり得る。
【００３４】
本発明のある態様では、
好気的条件下において好気性菌にセドヘプツロースを産生させる方法であって、
前記好気性菌は、ヘキソキナーゼ以外の解糖系の代謝酵素からなる群から選択されるいずれかの解糖系の代謝酵素をコードする遺伝子が破壊されており、これにより、前記好気性菌においてグルコースからＴＣＡサイクルへの代謝が抑制されており、
好気的条件下において炭素源（例えば、グルコース）を含む培地中で前記好気性菌を培養することを含む、
方法
が提供される。培地は栄養源をさらに含んでいてもよい。破壊される代謝酵素は、例えば、ホスホフルクトキナーゼ、例えば、ホスホフルクトキナーゼＡ２およびＡ３のいずれかまたは両方であり得る。破壊される代謝酵素として、トランスアルドラーゼをさらに破壊してもよい。本発明によれば、本発明の方法によって得られる、セドヘプツロースを含む培養物が提供され得る。
【００３５】
本発明のある態様では、
好気的条件下において好気性菌にトレハロースを産生させる方法であって、
前記好気性菌は、ヘキソキナーゼ以外の解糖系の代謝酵素からなる群から選択されるいずれかの解糖系の代謝酵素をコードする遺伝子が破壊されており、これにより、前記好気性菌においてグルコースからＴＣＡサイクルへの代謝が抑制されており、
好気的条件下において炭素源（例えば、グルコース）を含む培地中で前記好気性菌を培養することを含む、
方法
が提供される。培地は栄養源をさらに含んでいてもよい。破壊される代謝酵素は、例えば、例えば、ホスホフルクトキナーゼおよび／またはホスホグリセレートキナーゼ（特に、ホスホグリセレートキナーゼ）であり得る。本発明によれば、本発明の方法によって得られる、トレハロースを含む培養物が提供され得る。
【００３６】
本発明のある態様では、
好気的条件下において好気性菌にキシルロースおよび／またはキシリトールを産生させる方法であって、
前記好気性菌は、ヘキソキナーゼ以外の解糖系の代謝酵素からなる群から選択されるいずれかの解糖系の代謝酵素をコードする遺伝子が破壊されており、これにより、前記好気性菌においてグルコースからＴＣＡサイクルへの代謝が抑制されており、
好気的条件下において炭素源（例えば、キシロース）を含む培地中で前記好気性菌を培養することを含む、
方法
が提供される。培地は栄養源をさらに含んでいてもよい。破壊される代謝酵素は、例えば、例えば、ホスホグリセレートキナーゼであり得る。本発明によれば、本発明の方法によって得られる、キシルロースおよび／またはキシリトールを含む培養物が提供されうる。
【００３７】
（Ｂ）本発明によれば、
好気的条件下において培養された培地を含む培養物であって、
培地は、好気性菌を含み、
前記好気性菌は、ヘキソキナーゼ以外の解糖系の代謝酵素からなる群から選択されるいずれかの代謝酵素をコードする遺伝子が破壊されており、これにより、前記好気性菌は、当該好気性菌の炭素源の存在条件下において前記炭素源からＴＣＡサイクルへの代謝が抑制されている、培養物
が提供される。
【００３８】
上記（Ｂ）に記載の培養物は、例えば、上記（Ａ）の培養により得られ得る。すなわち、上記（Ａ）において、栄養源の存在下で代謝酵素破壊株は培養される。これにより、上記好気性菌を増殖させ得る。増殖させていない上記代謝酵素破壊株も、炭素源存在下で物質産生を行い得るが、物質産生量を増大させるためには、上記（Ａ）において上記代謝酵素破壊株を増殖させることが好ましい。代謝酵素破壊株の増殖には、炭素源は不要である。したがって、培地は、炭素源を含まなくてもよい。また、増殖した上記代謝酵素破壊株は、炭素源存在下で物質産生を行い得る。代謝酵素破壊株による物質産生には、栄養源は不要である。したがって、培地は、栄養源を含まなくてもよい。
上記（Ｂ）に記載の培養物は、培地中に炭素源をさらに含んでいてもよいし、炭素源を含まなくてもよい。炭素源は、培養前に培地に混入されたものであり得る。上記（Ｂ）に記載の培養物は、栄養源をさらに含んでいてもよい。栄養源は、培養前に培地に混入されたものであり得る。
上記（Ｂ）に記載の培養物は、培地中に炭素源および栄養源を含んでいてもよい。上記（Ｂ）に記載の培養物は、培地中に炭素源および栄養源のいずれも含まなくてもよく、そのような培養物は、例えば、上記（Ａ）に記載の方法で栄養源が枯渇するまで培養すると得られ得、例えば、その後、炭素源存在下で培養することで物質生産に用い得る。上記（Ｂ）に記載の培養物は、炭素源からの代謝産物やその派生代謝産物（例えば、セドヘプツロース、キシルロース、キシリトール、およびトレハロースからなる群から選択される代謝産物）をさらに含んでいてもよい。
【００３９】
本発明のある態様では、上記（Ｂ）に記載の培養物は、セドヘプツロースを５ｇ／Ｌ以上、６ｇ／Ｌ以上、７ｇ／Ｌ以上、８ｇ／Ｌ以上、９ｇ／Ｌ以上、１０ｇ／Ｌ以上、１５ｇ／Ｌ以上、２０ｇ／Ｌ以上、２５ｇ／Ｌ以上、３０ｇ／Ｌ以上、３５ｇ／Ｌ以上、または４０ｇ／Ｌ以上の濃度で含み得る。
【００４０】
本発明のある態様では、上記（Ｂ）に記載の培養物は、炭素源若しくは栄養源、または炭素源および栄養源の両方を含みうる。ここで炭素源および栄養源は、代謝酵素破壊株において破壊された代謝酵素によって決定されるものである。例えば、上記（Ｂ）に記載の培養物は、グルコースを含み得る、グリセロールをさらに含み得る、アミノ酸をさらに含み得る、および／または、コハク酸酸をさらに含み得る。
【００４１】
本発明のある態様では、上記（Ｂ）に記載の培養物は、トレハロースを１３１ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００以上、１３５ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００以上、１４０ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００以上、１５０ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００以上、１６０ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００以上、１７０ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００以上、１８０ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００以上、１９０ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００以上、２００ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００以上、２５０ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００以上、３００ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００以上、３５０ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００以上、４００ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００以上、４５０ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００以上、５００ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００以上、６００ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００以上、７００ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００以上、８００ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００以上、９００ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００以上、１０００ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００以上、１１００ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００以上、１２００ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００以上、１３００ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００以上、１４００ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００以上、１５００ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００以上、１６００ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００以上、１７００ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００以上、１８００ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００以上、１９０ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００以上、または２０００ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００以上の濃度で含み得る。
【００４２】
ある態様では、上記（Ｂ）に記載の培養物は、キシルロースを２ｇ／Ｌ以上、２．５ｇ／Ｌ以上、３．０ｇ／Ｌ以上、３．５ｇ／Ｌ以上、４．０ｇ／Ｌ以上、４．５ｇ／Ｌ以上、または５ｇ／Ｌ以上の濃度で含み得る。ある態様では、（Ｂ）に記載の培養物は、キシリトールを１．５ｇ／Ｌ以上、１．６ｇ／Ｌ以上、１．７ｇ／Ｌ以上、１．８ｇ／Ｌ以上、１．９ｇ／Ｌ以上、２．０ｇ／Ｌ以上、２．５ｇ／Ｌ以上、３．０ｇ／Ｌ以上、３．５ｇ／Ｌ以上、４．０ｇ／Ｌ以上、４．５ｇ／Ｌ以上、または５．０ｇ／Ｌ以上の濃度で含み得る。
【００４３】
好気性菌の培養に用いられる培地は、当業者であれば適宜適したものを選択して用いることができる。培地は、炭素源以外の栄養素（例えば、窒素、リン、硫黄、金属イオン、および塩）については好気性菌の維持または増殖に関する十分量を含むものを用いることができる。培地は、合成培地、または半合成培地であってもよい。培地は、ＴＳＢ培地、ＬＢ培地、ＹＴ培地（または２×ＹＴ培地）、ＮＺＹ培地、Ｍ９培地、ＳＯＣ培地、およびＹＰＤ培地などの基礎培地；緩衝剤；塩；ｐＨ調整剤；カリウムイオンおよびナトリウムイオンなどのアルカリイオン；カルシウムイオンなどのアルカリ土類金属イオン；ならびにマグネシウムイオン、鉄イオン、スズイオン、コバルトイオン、マンガンイオン、および亜鉛イオンなどの金属イオン；リン、および硫黄を含んでいてもよい。培地は、窒素源として、酵母抽出物、タンパク質加水分解物、酵母自己消化物、カゼイン膵消化物、大豆パパイン消化物、トリプトン、ファイトンペプトン、肉エキス、肉ペプトン、およびトリプトースからなる群から選択される窒素源を含んでいてもよい。培地は、塩として、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、ホウ酸、硫酸銅、ヨウ化カリウム、塩化第二鉄、硫酸マンガン（ＩＩ）、モリブデン酸ナトリウム、および硫酸亜鉛からなる群から選択される塩を含んでいてもよい。培地は、炭素源として、グルコースなどの糖を含んでいてもよい。培地に添加する栄養源の量は、培養する好気性菌が好気的環境下において増殖（例えば、２倍の増殖、３倍の増殖、４倍の増殖、５倍の増殖、６倍の増殖、７倍の増殖、８倍の増殖、９倍の増殖、１０倍の増殖）をするに十分な量とすることができる。培地に添加する栄養源の量はまた、栄養源の非存在下と比較して存在下でより増殖を向上させる（例えば、２倍の増殖、３倍の増殖、４倍の増殖、５倍の増殖、６倍の増殖、７倍の増殖、８倍の増殖、９倍の増殖、１０倍の増殖）に十分な量とすることができる。培地に添加する炭素源の量は、物質生産のための有効量であり得る。培地に添加する炭素源の量は、生産する物質の量や生産効率に合わせて当業者であれば適宜決定することができる。また、培地に添加する炭素源の種類についても、生産する物質の量や生産効率に合わせて当業者であれば適宜決定することができる。
【００４４】
好気性菌の培養に適した培養条件は、当業者であれば適宜決定することができる。特に、物質生産に用いられている好気性菌（物質生産に適した好気性菌、および培養に適した好気性菌）の培養条件は、当業者に周知である。本発明では、好気性菌として、物質生産に適した好気性菌を用いることができる。培養時間は、好気性菌の増殖の状況および物質生産量に照らして当業者は適宜決定することができる。培養時間は、特に限定されないが例えば、１２時間〜５００時間、２４時間〜４００時間、２４時間〜３００時間、２４時間〜２００時間、１００時間〜３００時間、１００時間〜２００時間、または２４時間〜１００時間とすることができる。培養中に培地には、炭素源および／または栄養源が枯渇しないように炭素源および／または栄養源を添加することもできる。
【実施例】
【００４５】
（実施例１）
１．ストレプトマイセスを用いたセドヘプツロースの産生
本発明者らは、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）のセドヘプツロース産生株を作製し、培養液中における菌体濁度およびセドヘプツロース量を検討した。
【００４６】
１−１．代謝遺伝子破壊
１−１−１．ストレプトマイセス・リビダンスのトランスアルドラーゼ遺伝子破壊
ストレプトマイセス・リビダンス  １３２６株（ＮＩＴＥ寄託番号：ＮＢＲＣ  １５６７５）のトランスアルドラーゼ遺伝子（ＳＬＩ＿２２４９）を相同組換えによって破壊した。ストレプトマイセス・リビダンスの形質転換は、従来公知の方法に従って行った。
【００４７】
１−１−２．ストレプトマイセス・リビダンスのホスホフルクトキナーゼＡ３遺伝子破壊
ストレプトマイセス・リビダンス  １３２６株のトランスアルドラーゼ遺伝子（ＳＬＩ＿２２４９）破壊株を宿主に用いて、ホスホフルクトキナーゼＡ３遺伝子（ＳＬＩ＿１４９３）を相同組換えによって破壊した。ストレプトマイセス・リビダンスの形質転換は、従来公知の方法に従って行った。
【００４８】
１−１−３．ストレプトマイセス・リビダンスのホスホフルクトキナーゼＡ２遺伝子破壊
ストレプトマイセス・リビダンス  １３２６株のトランスアルドラーゼ遺伝子（ＳＬＩ＿２２４９）、ホスホフルクトキナーゼＡ３遺伝子（ＳＬＩ＿１４９３）破壊株を宿主に用いて、ホスホフルクトキナーゼＡ２遺伝子（ＳＬＩ＿５６９５）を相同組換えによって破壊した。ストレプトマイセス・リビダンスの形質転換は、従来公知の方法に従って行った。
【００４９】
１−２．ストレプトマイセス・リビダンスの前培養
１０ｍＬのＴＳＢ培地（以下、表１を参照のこと）に、上記１−１で作製したストレプトマイセス・リビダンス  １３２６株またはストレプトマイセス・リビダンス  １３２６△ＳＬＩ＿２２４９株またはストレプトマイセス・リビダンス  １３２６△ＳＬＩ＿２２
４９△ＳＬＩ＿１４９３株またはストレプトマイセス・リビダンス  １３２６△ＳＬＩ＿
２２４９△ＳＬＩ＿１４９３△ＳＬＩ＿５６９５株のグリセロールストックを添加した。
２８℃、１６０ｒｐｍで４８〜７２時間、これらの放線菌を振盪培養した。
【００５０】
１−３．ストレプトマイセス・リビダンスの本培養
１−３−１．ストレプトマイセス・リビダンスのグルコース培養
０．１％量の前培養液を、５００ｍＬバッフル付フラスコ中の５０ｍＬのＴＳＢ培地（以下、表１を参照のこと）に添加した。なお、グルコースの初期濃度が８０ｇ／Ｌとなるように、培養開始時にＴＳＢ培地へグルコースをさらに追加した。培養中、グルコースが枯渇しないようにグルコースを追添加しながら、２８℃、１６０ｒｐｍで１０〜１２日間、振盪培養した。
【００５１】
１−３−２．ストレプトマイセス・リビダンスのグリセロール培養
０．１％量の前培養液を、５００ｍＬバッフル付フラスコ中の５０ｍＬのＴＳＢ培地に添加した。なお、グリセロールの初期濃度が５０ｇ／Ｌとなるように、培養開始時にＴＳＢ培地へグリセロールをさらに追加した。培養中、グリセロールが枯渇する前にグルコースを追添加し、その後はグルコースが枯渇しないようにグルコースを追添加しながら、２８℃、１６０ｒｐｍで１０〜１２日間、振盪培養した。
【００５２】
【表１】
0006917434.tif 000002
【００５３】
１−４．セドヘプツロースの測定
本培養の間、所定の時間に培養液１ｍＬを採取し、６００ｎｍでの濁度を測定した。採取した培養液を１４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、培養液サンプルを得た。培養液サンプルの、セドヘプツロースの生産量を、ＨＰＬＣにより測定した。ＨＰＬＣ測定条件は以下の表の通りである。
【００５４】
【表２】
0006917434.tif 000003
【００５５】
１−５．結果
ストレプトマイセス・リビダンス  １３２６株の結果を図１、ストレプトマイセス・リビダンス  １３２６△ＳＬＩ＿２２４９株の結果を図２、ストレプトマイセス・リビダン
ス  １３２６△ＳＬＩ＿２２４９△ＳＬＩ＿１４９３株の結果を図３、ストレプトマイセ
ス・リビダンス  １３２６△ＳＬＩ＿２２４９△ＳＬＩ＿１４９３△ＳＬＩ＿５６９５株
の結果を図４に示す。
ストレプトマイセス・リビダンス１３２６株では、グルコース培養およびグリセロール＋グルコース培養１２日間でいずれもセドヘプツロース生産は確認できなかった。一方ストレプトマイセス・リビダンス  １３２６△ＳＬＩ＿２２４９株をグルコースのみで培養
した際は培養２８１時間でＯＤ６００値が３１．６、セドヘプツロース量は１．６ｇ／Ｌ、対糖収率１．３％であったのに対し、グリセロールとグルコースで培養した際は、培養２５５時間でＯＤ６００値が３７．６、セドヘプツロース量は２．９ｇ／Ｌ、対糖収率２．５％であった。また、ストレプトマイセス・リビダンス  １３２６△ＳＬＩ＿２２４９
△ＳＬＩ＿１４９３株をグルコースのみで培養した際は培養２８１時間でＯＤ６００値は
３７．２、セドヘプツロース量は２．６ｇ／Ｌ、対糖収率１．７％、グリセロールとグルコースで培養した際は培養２５５時間でＯＤ６００値が４０．８、セドヘプツロース量は４．８ｇ／Ｌ、対糖収率３．１％、ストレプトマイセス・リビダンス  １３２６△ＳＬＩ
＿２２４９△ＳＬＩ＿１４９３△ＳＬＩ＿５６９５株はグルコースのみで培養した際は培
養２５５時間でＯＤ６００値は８．９、セドヘプツロース量は１２．２ｇ／Ｌ、対糖収率２１．７％、グリセロールとグルコースで培養した際は、培養２５５時間でＯＤ６００値はそれぞれ１７．９、セドヘプツロース量は４３．３ｇ／Ｌ、対糖収率４１．３％であった。
１３２６△ＳＬＩ＿２２４９株、１３２６△ＳＬＩ＿２２４９△ＳＬＩ＿１４９３株、１
３２６△ＳＬＩ＿２２４９△ＳＬＩ＿１４９３△ＳＬＩ＿５６９５株はいずれもグルコー
ス培養した場合と比較して、グリセロール＋グルコース培養した場合はＯＤ６００値、セドヘプツロース量およびセドヘプツロースの対糖収率はいずれも向上した。
【００５６】
（実施例２）
２．ストレプトマイセスを用いたトレハロースの産生
本発明者らは、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）のトレハロース産生株を作製し、菌体当たりのトレハロース生産能を検討した。
【００５７】
２−１．代謝遺伝子破壊
２−１−１．ストレプトマイセス・リビダンスのホスホグリセレートキナーゼ遺伝子破壊
ストレプトマイセス・リビダンス  １３２６株（ＮＩＴＥ寄託番号：ＮＢＲＣ  １５６７５）のホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（ＳＬＩ＿２２６０）を相同組換えによって破壊した。ストレプトマイセス・リビダンスの形質転換は、従来公知の方法に従って行った。
【００５８】
２−２．ストレプトマイセス・リビダンスの前培養
１０ｍＬのＴＳＢ培地に、ストレプトマイセス・リビダンス  １３２６株または上記２−１で作製したストレプトマイセス・リビダンス  １３２６△ＳＬＩ＿２２６０株のグリ
セロールストックを添加した。２８℃、１６０ｒｐｍで７２〜９６時間、これらの放線菌を振盪培養した。
【００５９】
２−３．ストレプトマイセス・リビダンスの本培養
２−３−１．ストレプトマイセス・リビダンスのＴＳＢ＋グルコース培養
０．１％量の前培養液を、５００ｍＬバッフル付フラスコ中の５０ｍＬのＴＳＢ培地に添加した。なお、グルコースの初期濃度が５０ｇ／Ｌとなるように、培養開始時にＴＳＢ培地へグルコースをさらに追加した。培養中、グルコースが枯渇しないようにグルコースを追添加しながら、２８℃、１６０ｒｐｍで１０〜１２日間、振盪培養した。
【００６０】
２−３−２．ストレプトマイセス・リビダンスの５×ＴＳＢ＋グルコース培養
０．１％量の前培養液を、５００ｍＬバッフル付フラスコ中の５倍濃縮した５０ｍＬのＴＳＢ培地に添加した。なお、グルコースの初期濃度が５０ｇ／Ｌとなるように、培養開始時に培地へグルコースをさらに追加した。培養中、グルコースが枯渇しないようにグルコースを追添加しながら、２８℃、１６０ｒｐｍで１０〜１２日間、振盪培養した。
【００６１】
２−４．トレハロースの測定と菌体当たりのトレハロース生産能の計算
本培養の間、所定の時間に培養液１ｍＬを採取し、６００ｎｍでの濁度を測定した。採取した培養液を１４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、培養液サンプルを得た。培養液サンプルの、トレハロースの生産量を、ＨＰＬＣにより測定した。ＨＰＬＣ測定条件は以下の表の通りである。
生産したトレハロース量を菌体濁度で割ることで、単位菌体当たりのトレハロース生産能を算出した。
【００６２】
【表３】
0006917434.tif 000004
【００６３】
２−５．結果
ストレプトマイセス・リビダンス  １３２６株およびストレプトマイセス・リビダンス  １３２６△ＳＬＩ＿２２６０株の単位菌体当たりの生産能を図５に示す。
ストレプトマイセス・リビダンス１３２６株は、ＴＳＢ培地で培養した際には、培養２８１時間でのトレハロース生産能が９８ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００であったのに対し、５×ＴＳＢ培地で培養するとトレハロース生産能は１３０ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００に向上した。一方ストレプトマイセス・リビダンス  １３２６△ＳＬＩ＿２２６０株はＴＳＢ培地で培養
した際はトレハロース生産能が２２６ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００であったのに対し、５×ＴＳＢ培地で培養すると８０８ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００に大きく向上した。
【００６４】
（実施例３）
３−１．ストレプトマイセス・リビダンス  １３２６△ＳＬＩ＿２２６０株の増殖試験
代謝抑制株であるストレプトマイセス・リビダンス  １３２６△ＳＬＩ＿２２６０株を
培養する際に、破壊した代謝酵素の下流物質の添加効果を検討し、炭素源としてグルコース、およびグリセロールをそれぞれ単独で添加した際と比較した。
【００６５】
３−２．ストレプトマイセス・リビダンスの前培養
１０ｍＬのＴＳＢ培地に、ストレプトマイセス・リビダンス  １３２６株、または上記２−１で作製したストレプトマイセス・リビダンス  １３２６△ＳＬＩ＿２２６０株のグ
リセロールストックを添加した。２８℃、１６０ｒｐｍで７２〜９６時間、これらの放線菌を振盪培養した。
【００６６】
３−３．ストレプトマイセス・リビダンスの本培養
３−３−１．ストレプトマイセス・リビダンスのＴＳＢ＋グルコース培養
０．１％量の前培養液を、５００ｍＬバッフル付フラスコ中の５０ｍＬのＴＳＢ培地に添加した。なお、グルコースの初期濃度が５０ｇ／Ｌとなるように、培養開始時にＴＳＢ培地へグルコースをさらに追加した。培養中、グルコースが枯渇しないようにグルコースを追添加しながら、２８℃、１６０ｒｐｍで７日間、振盪培養した。
【００６７】
３−３−２．ストレプトマイセス・リビダンスのＴＳＢ＋グルコース＋プロトカテク酸培養
０．１％量の前培養液を、５００ｍＬバッフル付フラスコ中の５０ｍＬのＴＳＢ培地に添加した。なお、プロトカテク酸の初期濃度が０．７６ｇ／Ｌとなるように、培養開始時にＴＳＢ培地へ追加した。培養開始１，２，３日後に、プロトカテク酸７．６ｇ／Ｌ溶液５ｍＬを追添加、４日後にグルコース５００ｇ／Ｌ溶液６ｍＬを追添加した。その後培養中、グルコースが枯渇しないようにグルコースを追添加しながら、２８℃、１６０ｒｐｍで７日間、振盪培養した。
【００６８】
３−３−３．ストレプトマイセス・リビダンスのＴＳＢ＋グルコース＋アラニン培養
０．１％量の前培養液を、５００ｍＬバッフル付フラスコ中の５０ｍＬのＴＳＢ培地に添加した。なお、グルコースの初期濃度が５０ｇ／Ｌとなるように、アラニンの初期濃度が５ｇ／Ｌとなるように、培養開始時にＴＳＢ培地へ追加した。培養開始２，３、４日後に、アラニン１００ｇ／Ｌ溶液２．５ｍＬを追添加した。培養中、グルコースが枯渇しないようにグルコースを追添加しながら、２８℃、１６０ｒｐｍで７日間、振盪培養した。
【００６９】
３−３−４．ストレプトマイセス・リビダンスのＴＳＢ＋グルコース＋セリン培養
０．１％量の前培養液を、５００ｍＬバッフル付フラスコ中の５０ｍＬのＴＳＢ培地に添加した。なお、グルコースの初期濃度が５０ｇ／Ｌとなるように、セリンの初期濃度が５ｇ／Ｌとなるように、培養開始時にＴＳＢ培地へ追加した。培養開始２，３、４日後に、セリン１００ｇ／Ｌ溶液２．５ｍＬを追添加した。培養中、グルコースが枯渇しないようにグルコースを追添加しながら、２８℃、１６０ｒｐｍで７日間、振盪培養した。
【００７０】
３−３−５．ストレプトマイセス・リビダンスのＴＳＢ＋グルコース＋グルタミン酸１ナトリウム培養
０．１％量の前培養液を、５００ｍＬバッフル付フラスコ中の５０ｍＬのＴＳＢ培地に添加した。なお、グルコースの初期濃度が５０ｇ／Ｌとなるように、グルタミン酸１ナトリウムの初期濃度が５ｇ／Ｌとなるように、培養開始時にＴＳＢ培地へ追加した。培養開始２，３、４日後に、グルタミン酸１ナトリウム１００ｇ／Ｌ溶液２．５ｍＬを追添加した。培養中、グルコースが枯渇しないようにグルコースを追添加しながら、２８℃、１６０ｒｐｍで７日間、振盪培養した。
【００７１】
３−３−６．ストレプトマイセス・リビダンスのＴＳＢ＋グリセロール培養
０．１％量の前培養液を、５００ｍＬバッフル付フラスコ中の５０ｍＬのＴＳＢ培地に添加した。なお、グリセロールの初期濃度が５０ｇ／Ｌとなるように、培養開始時にＴＳＢ培地へグリセロールをさらに追加した。培養中、グリセロールが枯渇しないようにグリセロールを追添加しながら、２８℃、１６０ｒｐｍで１０日間、振盪培養した。
【００７２】
３−３−７．ストレプトマイセス・リビダンスのＴＳＢ＋グリセロール＋アラニン培養
０．１％量の前培養液を、５００ｍＬバッフル付フラスコ中の５０ｍＬのＴＳＢ培地に添加した。なお、グリセロールの初期濃度が５０ｇ／Ｌとなるように、アラニンの初期濃度が５ｇ／Ｌとなるように、培養開始時にＴＳＢ培地へ追加した。培養開始１、２日後に、アラニン１００ｇ／Ｌ溶液５ｍＬを追添加した。培養中、グリセロールが枯渇しないようにグリセロールを追添加しながら、２８℃、１６０ｒｐｍで１０日間、振盪培養した。
【００７３】
３−３−８．ストレプトマイセス・リビダンスのＴＳＢ＋グリセロール＋コハク酸２ナトリウム培養
０．１％量の前培養液を、５００ｍＬバッフル付フラスコ中の５０ｍＬのＴＳＢ培地に添加した。なお、グリセロールの初期濃度が５０ｇ／Ｌとなるように、コハク酸２ナトリウムの初期濃度が５ｇ／Ｌとなるように、培養開始時にＴＳＢ培地へ追加した。培養開始１、２日後に、コハク酸２ナトリウム１００ｇ／Ｌ溶液５ｍＬを追添加した。培養中、グリセロールが枯渇しないようにグリセロールを追添加しながら、２８℃、１６０ｒｐｍで１０日間、振盪培養した。
【００７４】
３−４．菌体濁度の測定
本培養の間、所定の時間に培養液１ｍＬを採取し、６００ｎｍでの濁度を測定した。
３−５．結果
図６、図７に示すようにグルコースのみを栄養源としてストレプトマイセス・リビダンス  １３２６△ＳＬＩ＿２２６０株を培養した場合と比較して、プロトカテク酸、アラニ
ン、セリン、グルタミン酸１ナトリウムを栄養源として添加して培養した場合では菌体濁度が向上した。
また、図８、図９に示すように、グリセロールのみを栄養源としてストレプトマイセス・リビダンス  １３２６△ＳＬＩ＿２２６０株を培養した場合と比較して、アラニン、コ
ハク酸２ナトリウムを栄養源として添加して培養した場合では、菌体濁度が向上した。
【００７５】
（実施例４）
４−１．ストレプトマイセス・リビダンスを用いた物質生産
ストレプトマイセス・リビダンス  １３２６および代謝抑制株であるストレプトマイセス・リビダンス  １３２６△ＳＬＩ＿２２６０株をキシロースを炭素源として培養する際
に、アラニンを添加し増殖と代謝物を比較した。
【００７６】
４−２．ストレプトマイセス・リビダンスの前培養
１０ｍＬのＴＳＢ培地に、ストレプトマイセス・リビダンス  １３２６株または上記２−１で作製したストレプトマイセス・リビダンス  １３２６△ＳＬＩ＿２２６０株のグリ
セロールストックを添加した。２８℃、１６０ｒｐｍで７２〜９６時間、これらの放線菌を振盪培養した。
【００７７】
４−３．ストレプトマイセス・リビダンスの本培養
４−３−１ストレプトマイセス・リビダンスのＴＳＢ＋キシロース＋アラニン培養
０．１％量の前培養液を、５００ｍＬバッフル付フラスコ中の５０ｍＬのＴＳＢ培地に添加した。なお、キシロースの初期濃度が５０ｇ／Ｌとなるように、培養開始時にＴＳＢ培地へキシロースをさらに追加し、アラニンの初期濃度が５ｇ／Ｌとなるように培養開始時にＴＳＢ培地へ追加した。培養開始２日後にアラニン１００ｇ／Ｌ溶液５ｍＬを追添加し、ｐＨ調整のため１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）５ｍＬを添加した。培養中、キシロースが枯渇しないようにキシロースを追添加しながら、２８℃、１６０ｒｐｍで１０日間、振盪培養した。
【００７８】
４−４．菌体濁度の測定
本培養の間、所定の時間に培養液１ｍＬを採取し、６００ｎｍでの濁度を測定した。
４−５．代謝産物の測定
本培養の間、所定の時間に培養液１ｍＬを採取し、６００ｎｍでの濁度を測定した。採取した培養液を１４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、培養液サンプルを得た。培養液サンプルの代謝産物生産量を、ＨＰＬＣにより測定した。ＨＰＬＣ測定条件は以下の通りである。
【００７９】
【表４】
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【００８０】
４−６．結果
菌体増殖を図１０に、菌体増殖を示す。ストレプトマイセス・リビダンス  １３２６株のみならずストレプトマイセス・リビダンス  １３２６△ＳＬＩ＿２２６０株もキシロー
ル＋アラニン培養では良好に増殖した。
培養の結果得られた代謝産物量のうちキシルロースの結果を図１１に、キシリトールの結果を図１２に示す。キシルロース、キシリトール共に、ストレプトマイセス・リビダンス  １３２６株と比較してストレプトマイセス・リビダンス  １３２６△ＳＬＩ＿２２６０
株では生産量が向上した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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