(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＬＡＧ３に結合する単離された抗体であって、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、
抗体。
【請求項２】
ヒトＬＡＧ３に結合する単離された抗体であって、
配列番号７のＶＨ配列と配列番号８のＶＬ配列とを含む、
抗体。
【請求項３】
ヒトＬＡＧ３に結合する単離された抗体であって、
ｉ）ＬＡＧ３への結合について、配列番号７のアミノ酸配列を持つＶＨと配列番号８のアミノ酸配列を持つＶＬとを含む抗ＬＡＧ３抗体と競合し、且つ／又は
ｉｉ）ヒト及びカニクイザルＬＡＧ３に結合し、且つ／又は
ｉｉｉ）ヒトＡ３７５腫瘍細胞で発現したＭＨＣ−ＩＩの結合を阻害し、且つ／又は
ｉｖ）混合リンパ球反応（ｍＭＬＲ）アッセイでグランザイムＢ又はＩＬ−２の放出を増加させる
抗体。
【請求項４】
ヒト、ヒト化又はキメラ抗体である、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有する完全長ＩｇＧ１抗体である、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体をコードする、単離された核酸。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項８】
抗体が生成されるように請求項７に記載の宿主細胞を培養することを含む、抗体を生成する方法。
【請求項９】
宿主細胞から抗体を回収することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的製剤。
【請求項１１】
がんの治療における使用のための、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
医薬としての使用のための、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１３】
がんの治療における使用のための、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１４】
医薬の製造における、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項１５】
医薬ががんの治療のためである、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体の有効量を含む、がんを有する個体を治療するための医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＬＡＧ３抗体、並びに該分子の製造方法及び使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３又はＣＤ２２３）は、ＩＬ−２依存性ＮＫ細胞株に発現する分子を選択的に単離するように設計された実験で最初に発見された（Triebel F et al., Cancer Lett. 235 (2006), 147-153）。ＬＡＧ−３は、４つの細胞外免疫グロブリンスーパーファミリー様ドメイン（Ｄ１−Ｄ４）を持つＣＤ４と構造的相同性を有する、独特の膜貫通タンパク質である。膜遠位ＩｇＧドメインには、短いアミノ酸配列、いわゆる他のＩｇＧスーパーファミリータンパク質には見られない余分なループが含まれている。細胞内ドメインには、ＬＡＧ−３がＴ細胞機能に負の効果を及ぼすのに必要な独特のアミノ酸配列（KIEELE）が含まれている。ＬＡＧ−３は、メタロプロテアーゼによってＣペプチド（ＣＰ）において切断され、血清中で検出可能な可溶性形態を生成する。ＣＤ４と同様に、ＬＡＧ３タンパク質はＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するが、それはＣＤ４とは異なる部位において、より高いアフィニティーでの結合である（Huard et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), 5744-5749）。ＬＡＧ３はＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、及び形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）によって発現され、Ｔ細胞活性化後に上方制御される。それは、Ｔ細胞の恒常性の他にＴ細胞の機能も調節する。アネルギーであるか又は機能障害を示す従来のＴ細胞のサブセットは、ＬＡＧ３を発現する。ＬＡＧ３＋  Ｔ細胞は、腫瘍部位において、慢性ウイルス感染中に濃縮される（Sierro et al Expert Opin. Ther. Targets 15 (2011), 91-101）。ＬＡＧ３はＣＤ８  Ｔ細胞の枯渇に役割を果たすことが示されている（Blackburn et al. Nature Immunol. 10 (2009), 29-37）。したがって、ＬＡＧ３の活性に拮抗し、腫瘍に対する免疫応答を生成及び回復するために使用可能な抗体に対するニーズが存在する。
【０００３】
ＬＡＧ３に対するモノクローナル抗体は、例えば国際公開第２００４／０７８９２８号に記載されており、そこではＣＤ２２３及び抗がんワクチンに特異的に結合する抗体を含む組成物がクレームされている。国際公開第２０１０／０１９５７０号には、ＬＡＧ３に結合するヒト抗体、例えば抗体２５Ｆ７及び２６Ｈ１０が開示されている。米国特許出願公開第２０１１／０７０２３８号は、臓器移植拒絶及び自己免疫疾患の治療又は予防において有用な細胞傷害毒性抗ＬＡＧ３抗体に言及している。国際公開第２０１４／００８２１８号には、抗体２５Ｆ７と比較して最適化された機能特性（すなわち脱アミド化部位の減少）を備えたＬＡＧ３抗体が記載されている。ＬＡＧ３抗体は、さらに国際公開第２０１５／１３８９２０号（例えばＢＡＰ０５０）、国際公開第２０１４／１４０１８０号、国際公開第２０１５／１１６５３９号、国際公開第２０１６／０２８６７２号、国際公開第２０１６／１２６８５８号、国際公開第２０１６／２００７８２号、及び国際公開第２０１７／０１５５６０号に開示されている。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、抗ＬＡＧ３抗体及びその使用方法を提供する。
【０００５】
本発明は、ヒトＬＡＧ３に結合する単離された抗体であって、
Ａ）（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、又は
Ｂ）（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、又は
Ｃ）（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、又は
Ｄ）（ａ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、又は
Ｅ）（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む抗体を提供する。
【０００６】
本発明は、ヒトＬＡＧ３に結合する単離された抗体であって、
Ａ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｂ）（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号１１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｃ）（ａ）（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列番号１１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｄ）ａ）（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列番号２７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｅ）（ａ）（ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列番号３５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインと
を含む抗体をさらに提供する。
【０００７】
本発明は、ヒトＬＡＧ３に結合する単離された抗体であって、
ｉ）配列番号７のＶＨ配列と配列番号８のＶＬ配列とを含むか、
ｉｉ）配列番号１５のＶＨ配列と配列番号１６のＶＬ配列とを含むか、
ｉｉｉ）配列番号２３のＶＨ配列と配列番号２４のＶＬ配列とを含むか、
ｉｖ）配列番号３１のＶＨ配列と配列番号３２のＶＬ配列とを含むか、又は
ｖ）配列番号３９のＶＨ配列と配列番号４０のＶＬ配列とを含む
抗体をさらに提供する。
【０００８】
本発明は、ヒトＬＡＧ３に結合する単離された抗体であって、
ｉ）ＬＡＧ３への結合について、配列番号７のアミノ酸配列を持つＶＨと配列番号８のアミノ酸配列を持つＶＬとを含む抗ＬＡＧ３抗体と競合し、且つ／又は
ｉｉ）ヒト及びカニクイザルＬＡＧ３に結合し、且つ／又は  
ｉｉｉ）ヒトＡ３７５腫瘍細胞で発現したＭＨＣ−ＩＩの結合を阻害し、且つ／又は
ｉｖ）混合リンパ球反応（ｍＭＬＲ）アッセイでグランザイムＢ又はＩＬ−２の放出を増加させる
抗体をさらに提供する。
【０００９】
一実施様態では、本発明による抗ＬＡＧ３抗体は、モノクローナル抗体である。
【００１０】
一実施態様において、本発明による抗体は、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体である。
【００１１】
一実施様態では、本発明による抗ＬＡＧ３抗体は、ＬＡＧ３に結合する抗体断片である。
【００１２】
一実施様態では、本発明による抗ＬＡＧ３抗体は、Ｆａｂ断片である。
【００１３】
本発明は、前述の請求項（preceding claims）のいずれか一項に記載の抗体をコードする、単離された核酸を提供する。
【００１４】
本発明は、当該核酸を含む宿主細胞を提供する。
【００１５】
本発明は、抗体が産生されるように宿主細胞を培養することを含む、抗体を産生する方法を提供する。
【００１６】
本発明は、抗体を産生するこのような方法を提供し、宿主細胞から該抗体を回収することをさらに含む。
【００１７】
本発明は、本明細書に記載の抗体と薬学的許容される担体とを含む薬学的製剤を提供する。
【００１８】
本発明は、医薬としての使用のための、本明細書に記載の抗体を提供する。
【００１９】
本発明は、がんの治療における使用のための、本明細書に記載の抗体を提供する。
【００２０】
本発明は、医薬の製造における、本明細書に記載の抗体の使用を提供する。一実施態様では、該医薬は、がんの治療のため、腫瘍免疫などの免疫関連疾患を治療するため若しくはその進行を遅延させるため、又は免疫応答若しくは機能（Ｔ細胞活性など）を刺激するためである。
【００２１】
本発明は、がんを有する個体を治療する方法であって、本明細書に記載の抗体の有効量を該個体に投与することを含む方法を提供する。
【００２２】
本発明の抗体は、ヒトＣＤ４  Ｔ細胞による価値のある特性、グランザイムＢ放出、ＩＦＮ−γ放出及びＩＬ−２分泌の誘導を示し、したがって、単独又はＰＤ１阻害剤との併用で、Ｔ細胞を介する免疫応答を刺激することができる（腫瘍抗原特異的Ｔ細胞エフェクター機能の向上）。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】アロジェネイックな成熟樹状細胞と共に共培養されたヒトＣＤ４  Ｔ細胞による細胞傷害性グランザイムＢ放出及びＩＬ−２分泌に対する抗ＬＡＧ−３抗体の効果  図１Ａ：グランザイムＢ分泌
【図１Ｂ】アロジェネイックな成熟樹状細胞と共に共培養されたヒトＣＤ４  Ｔ細胞による細胞傷害性グランザイムＢ放出及びＩＬ−２分泌に対する抗ＬＡＧ−３抗体の効果  図１Ｂ：ＩＬ−２分泌
【図２】Ｂ細胞リンパ芽球様細胞株（ＡＲＨ７７）と共に共培養されたヒトＣＤ４  Ｔ細胞による細胞傷害性グランザイムＢ放出に対する抗ＬＡＧ−３抗体の効果
【図３Ａ】照射されたアロジェネイックなＰＢＭＣと共に共培養されたヒトＣＤ４  Ｔ細胞によるグランザイムＢのＴｒｅｇ抑制及びＩＦＮ−γ放出に対する抗ＬＡＧ−３抗体の効果  図３Ａ：グランザイムＢ放出
【図３Ｂ】照射されたアロジェネイックなＰＢＭＣと共に共培養されたヒトＣＤ４  Ｔ細胞によるグランザイムＢのＴｒｅｇ抑制及びＩＦＮ−γ放出に対する抗ＬＡＧ−３抗体の効果  図３Ｂ：ＩＦＮ−γ放出
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本明細書において、「アクセプターヒトフレームワーク」とは、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「から得られる」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでもよく、又はそれはアミノ酸配列の変化を含んでもよい。いくつかの実施態様において、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。いくつかの実施態様において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
【００２５】
「アフィニティー」とは、分子（例えば抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）との間の非共有結合相互作用の総和の強度を指す。特に断らない限り、本明細書で使用する「結合アフィニティー」とは、結合対（例えば抗体と抗原）のメンバー間の１対１の相互作用を反映する、固有の結合アフィニティーを指す。一般に、分子ＸのそのパートナーＹに対するアフィニティーは、解離定数（ｋｄ）によって表すことができる。アフィニティーは、本明細書に記載のものを含め、当技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。結合アフィニティーを測定するための特定の例示的な実施態様は、以下で説明される。
【００２６】
「アフィニティー成熟」抗体とは、超可変領域（ＨＶＲ）に変更を有しない親抗体と比較して、１つ以上の超可変領域に１つ以上の変更があり、当該変更が抗体の抗原に対するアフィニティーの改善をもたらす抗体を指す。
【００２７】
特に断らない限り、本明細書で使用される用語「ＬＡＧ３」は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えばマウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源の任意の天然ＬＡＧ３を指す。用語「完全長」は、細胞内でのプロセシングから生じる任意の形態のＬＡＧ３の他に、プロセシングされていないＬＡＧ３も包含する。この用語は、天然に存在するＬＡＧ３のバリアント、例えばスプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。一つの好ましい実施態様では、用語「ＬＡＧ３」は、ヒトＬＡＧ３を指す。プロセシングされた（シグナル配列なし）例示的なＬＡＧ３のアミノ酸配列を配列番号５４に示す。例示的な細胞外ドメイン（ＥＣＤ）ＬＡＧ３のアミノ酸配列を配列番号に示す。
【００２８】
用語「抗ＬＡＧ３抗体」及び「ＬＡＧ３に結合する抗体」は、ＬＡＧ３を標的とする際に診断薬及び／又は治療剤として抗体が有用であるように、十分なアフィニティーでＬＡＧ３に結合可能な抗体を指す。一実施態様において、抗ＬＡＧ３抗体の、無関係な、非ＬＡＧ３タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される場合、抗体のＬＡＧ３への結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、ＬＡＧ３に結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。特定の実施態様では、抗ＬＡＧ３抗体は、異なる種からのＬＡＧ３間で保存されているＬＡＧ３のエピトープに結合する。好ましい一実施態様では、「抗ＬＡＧ３抗体」、「ヒトＬＡＧ３に特異的に結合する抗体」、及び「ヒトＬＡＧ３に結合する抗体」とは、ヒトＬＡＧ３抗原又はその細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に、ＫＤ値が１．０×１０−８ｍｏｌ／ｌ以下、一実施態様ではＫＤ値が１．０×１０−９ｍｏｌ／ｌ以下、一実施態様ではＫＤ値が１．０×１０−９ｍｏｌ／ｌから１．０×１０−１３ｍｏｌ／ｌの結合アフィニティーで特異的に結合する抗体を指す。これに関連して、結合アフィニティーは、例えばＬＡＧ３細胞外ドメインを使用して、例えば表面プラズモン共鳴法（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、スウェーデン、ウプサラのＧＥヘルスケア社）などの標準的な結合アッセイで決定される。
【００２９】
本明細書における用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
【００３０】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合し、インタクトな抗体の一部分を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨは、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。
【００３１】
用語「エピトープ」とは、抗ＬＡＧ３抗体が結合する抗原上のタンパク性又は非タンパク性の部位をいう。エピトープは、連続したアミノ酸ストレッチから形成されることも（直鎖状エピトープ）、又は、例えば抗原の折り畳みにより、すなわちタンパク性抗原の３次折り畳みにより空間的に近接している、非連続的なアミノ酸を含むことも（立体構造エピトープ）可能である。直鎖状エピトープは通常、タンパク性抗原を変性剤にさらした後も抗ＬＡＧ３抗体によって結合されているが、一方、立体構造エピトープは通常、変性剤で処理すると破壊される。エピトープは、独特の空間的立体構造の中に少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、又は少なくとも８〜１０のアミノ酸を含む。
【００３２】
特定のエピトープに結合する抗体（すなわち同じエピトープに結合する抗体）のスクリーニングは、例えば、非限定的に、アラニンスキャニング、ペプチドブロット（Meth. Mol. Biol. 248 (2004) 443-463参照）、ペプチド切断解析、エピトープ切除、エピトープ抽出、抗原の化学修飾（Prot. Sci. 9 (2000) 487-496参照）、及びクロスブロッキング（”Antibodies,” Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY参照）等、当該技術分野で日常的な方法を使用して行うことができる。
【００３３】
修飾支援プロファイリング（Modification-Assisted Profiling）（ＭＡＰ）としても知られる、抗原構造ベースの抗体プロファイリング（Antigen Structure-based Antibody Profiling）（ＡＳＡＰ）は、多数の抗体の中の各抗体の、化学的又は酵素的に修飾された抗原表面に対する結合プロファイルに基づいて、ＬＡＧ３に特異的に結合する多数のモノクローナル抗体をグループ（bin）に分けることを可能にする（例えば米国特許出願公開第２００４／０１０１９２０号参照）。各グループの複数の抗体は、同じエピトープに結合するが、このエピトープは、別のビンで表されるエピトープと明確に異なっているか又は部分的に重複する固有のエピトープであってよい。
【００３４】
また、競合結合を使用して、ある抗体がＬＡＧ３の、参照抗ＬＡＧ３抗体と同じエピトープに結合するか、又は結合に関して該参照抗体と競合するかどうかを簡単に判定することができる。例えば、参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」とは、 競合アッセイにおいて参照抗ＬＡＧ３抗体のその抗原への結合を５０％以上ブロックする抗体を指し、逆に、該参照抗体は、競合アッセイにおいて該抗体のその抗原への結合を５０％以上ブロックする。また、例えば、抗体が参照抗ＬＡＧ３抗体と同じエピトープに結合するかどうかを判定するために、参照抗体を飽和条件下でＬＡＧ３に結合させることができる。過剰の参照抗ＬＡＧ３抗体を除去した後、問題の抗ＬＡＧ３抗体のＬＡＧ３への結合能力を評価する。参照抗ＬＡＧ３抗体の飽和結合の後に抗ＬＡＧ３抗体がＬＡＧ３結合できる場合、問題の抗ＬＡＧ３抗体は参照抗ＬＡＧ３抗体とは異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。しかし、問題の抗ＬＡＧ３抗体が参照抗ＬＡＧ３抗体の飽和結合後にＬＡＧ３に結合できない場合、問題の抗ＬＡＧ３抗体は、参照抗ＬＡＧ３抗体が結合したエピトープと同じエピトープに結合する可能性がある。問題の抗体が同じエピトープに結合するのか、それとも立体上の理由により結合が妨げられているだけなのかを確認するのに、日常的な実験を用いることができる（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー、又は当該技術分野で利用可能なその他任意の定量的若しくは定性的抗体結合アッセイ）。このアッセイは、２つのセットアップ、すなわち両方の抗体が飽和抗体である状態で、実行する必要がある。両方のセットアップで、第１の（飽和）抗体のみがＬＡＧ３に結合できる場合は、問題の抗ＬＡＧ３抗体と参照抗ＬＡＧ３抗体はＬＡＧ３への結合について競合していると結論付けることができる。
【００３５】
いくつかの実施態様では、２つの抗体は、１、５、１０、２０又は１００倍過剰の一方の抗体がもう一方の抗体の結合を、競合結合アッセイで測定して少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％又は９９％以上阻害する場合、同じエピトープか又は重複するエピトープに結合するとみなされる（例えばJunghans et al., Cancer Res. 50 (1990) 1495-1502参照）。
【００３６】
いくつかの実施態様では、２つの抗体は、一方の抗体の結合を減少させるか又は排除する抗原中の本質的に全てのアミノ酸変異が他方の結合も減少させるか又は排除する場合、同じエピトープに結合するとみなされる。２つの抗体は、一方の抗体の結合を減少させるか又は排除するアミノ酸変異のサブセットのみが他方の抗体の結合を減少させるか又は排除する場合、「重複するエピトープ」を有するとみなされる。
【００３７】
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種に由来する一方、重鎖及び／又は軽鎖の残りは異なる起源又は種に由来する抗体を指す。
【００３８】
抗体の「クラス」は、その重鎖が有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体には５つの主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。特定の実施態様では、抗体は、ヒンジ領域にＳ２２８Ｐ変異を有するＩｇＧ４アイソタイプのものであり、ＩｇＧ４抗体の安定性を改善する。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００３９】
本明細書で用いられる「細胞傷害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害若しくは妨害し、且つ／又は細胞死若しくは細胞破壊を生ずる物質を指す。細胞傷害性剤は、限定されるものではないが、放射性同位体（例えばＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位体）：化学療法剤又は薬物（例えばメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤）；増殖阻害剤；酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素；抗生物質；小分子毒素等の毒素、又は細菌、真菌、植物若しくは動物由来の酵素活性毒素（それらの断片及び／又はバリアントを含む）、及び以下に開示される種々の抗腫瘍剤又は抗癌剤を含む。
【００４０】
「エフェクター機能」とは、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；貪食；細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）のダウンレギュレーション；並びにＢ細胞の活性化が含まれる。
【００４１】
薬剤、例えば薬学的組成物の「有効量」とは、所望の治療的又は予防的結果を得るのに必要な用量及び期間での有効な量を指す。
【００４２】
本明細書において用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために用いられる。この用語は、天然配列Ｆｃ領域とバリアントＦｃ領域とを含む。一実施態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、重鎖のＣｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０からカルボキシル末端にまで及ぶ。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在してもしなくてもよい。一実施態様において、本明細書に記載の抗ＬＡＧ３抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプのものであり、配列番号５１又は配列番号５２の定常重鎖ドメインを含む。一実施態様において、それは、Ｃ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）をさらに含む。一実施態様において、本明細書に記載の抗ＬＡＧ３抗体は、ＩｇＧ４アイソタイプのものであり、配列番号５３の定常重鎖ドメインを含む。一実施態様において、それは、Ｃ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）をさらに含む。本明細書において別段の定めがない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載のＥＵ番号付けシステム（別名ＥＵインデックス）に従う。
【００４３】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４で構成される。したがって、ＨＶＲ配列及びＦＲ配列は一般に、ＶＨ（又はＶＬ）の配列：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４に現れる。
【００４４】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、又は、本明細書で定義されている、Ｆｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
【００４５】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は互換可能に使用され、外因性の核酸が導入されている細胞を指し、該細胞の子孫を含む。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、これらには、初代形質転換細胞及び、継代の数に関係なく、それに由来する子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一ではないかもしれないが、突然変異が含まれる場合がある。本明細書には、最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物学的活性を有する突然変異型子孫が含まれる。
【００４６】
「ヒト」抗体は、ヒト若しくはヒト細胞により産生された抗体の、又はヒト抗体レパートリーを利用する非ヒト源に由来する抗体のアミノ酸配列、或いは他のヒト抗体をコードする配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。特定の実施態様では、ヒト抗体は、非ヒトトランスジェニック哺乳動物、例えばマウス、ラット又はウサギに由来する。特定の実施態様では、ヒト抗体は、ハイブリドーマ細胞株に由来する。
【００４７】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般的には、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからなされる。一般的には、配列のサブグループは、  Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ（１９９１），１−３巻にあるようなサブグループである。一実施態様において、ＶＬについて、該サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるようなサブグループカッパＩである。一実施態様において、ＶＨについて、該サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるようなサブグループＩＩＩである。
【００４８】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲのアミノ酸残基及びヒトＦＲのアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＨＶＲ（例えばＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、場合によって、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば非ヒト抗体は、ヒト化を遂げた抗体を指す。
【００４９】
本明細書で用いられる「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、配列が超可変である抗体可変ドメインの領域（「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」）及び／又は構造的に規定されるループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの領域及び／又は抗原に接触する残基（「抗原コンタクト（antigen contact）」を含有する抗体可変ドメインの領域のそれぞれを指す。    一般的に、抗体は、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）、計６つのＨＶＲを含む。本明細書において、例示的なＨＶＲは、
（ａ）アミノ酸残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、９１〜９６（Ｌ３）、２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、及び９６〜１０１（Ｈ３）に生じる超可変ループ（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）；
（ｂ）アミノ酸残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、８９〜９７（Ｌ３）、３１〜３５ｂ（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、及び９５〜１０２（Ｈ３）に生じるＣＤＲ（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ〜３６（Ｌ１）、４６〜５５（Ｌ２）、８９〜９６（Ｌ３）、３０〜３５ｂ（Ｈ１）、４７〜５８（Ｈ２）、及び９３−１０１（Ｈ３）に生じる抗原コンタクト（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)）；及び
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６〜５６（Ｌ２）、４７〜５６（Ｌ２）、４８〜５６（Ｌ２）、４９〜５６（Ｌ２）、２６〜３５（Ｈ１）、２６〜３５ｂ（Ｈ１）、４９〜６５（Ｈ２）、９３〜１０２（Ｈ３）、及び９４〜１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）の組み合わせ
を含む。
【００５０】
一実施態様では、ＨＶＲ残基は、下記のアミノ酸配列の説明で特定されるものを含む。
【００５１】
特に断らない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えばＦＲ残基）は、本明細書では、上掲のＫａｂａｔらに従って番号付けされる。
【００５２】
「イムノコンジュゲート」とは、細胞傷害性剤を含むがそれに限定されない、１以上の異種分子にコンジュゲートされた抗体である。
【００５３】
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物（例えばウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えばヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）が含まれる。特定の実施態様では、個体又は対象はヒトである。
【００５４】
「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から分離されたものである。いくつかの実施態様において、抗体は、例えば電気泳動（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えばイオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により決定される場合、９５％以上又は９９％を超える純度まで精製される。抗体純度の評価法の総説としては、例えばＦｌａｔｍａｎら，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ  ８４８：７９−８７（２００７）を参照のこと。
【００５５】
「単離された」核酸とは、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、その核酸分子は、染色体外に、又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。
【００５６】
「抗ＬＡＧ３抗体をコードする単離された核酸」は、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする１以上の核酸分子（又はその断片）を指し、これには、単一のベクター又は別個のベクター中の当該核酸分子（複数可）、及び宿主細胞の１つ以上の場所に存在する当該核酸分子が含まれる。
【００５７】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体集団、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、一般に少量で存在し得るバリアント抗体（例えば自然発生の突然変異を含んでいるか、又はモノクローナル抗体調製物の製造時に発生するもの）を除いて、同一であり、且つ／又は同じエピトープに結合する集団から得られる抗体を意味する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の製造を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない様々な技術によって作製することができ、モノクローナル抗体を作製するためのこれらの方法及びその他の例示的な方法は本明細書に記載されている。
【００５８】
「ネイキッド抗体」とは、異種の部分（例えば細胞傷害性部分）又は放射標識にコンジュゲートしていない抗体を指す。ネイキッド抗体は薬学的製剤中に存在してもよい。
【００５９】
「天然抗体」とは、天然に存在する、様々な構造を有する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖から構成される約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端にかけて各重鎖は、可変領域（ＶＨ）（可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる）、続いて３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を有する。    同様に、Ｎ末端からＣ末端にかけて各軽鎖は、可変領域（ＶＬ）（可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる）、続いて定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる２つの型のうちのいずれかに割り当てることができる。
【００６０】
「添付文書」という用語は、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すのに用いられ、適応症、用法、用量、投与、併用療法、当該治療製品の使用に関する禁忌及び／又は注意事項についての情報を含む。
【００６１】
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、これらの配列を整列させ、最大の配列同一性パーセントを得るために必要に応じてギャップを導入した後の、該参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一の、候補配列中のアミノ酸残基の割合と定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、当分野の技術範囲内にある様々な方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア又はＦＡＳＴＡプログラムパッケージなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して得ることができる。当業者であれば、比較する配列の全長にわたって最大のアライメントを得るのに必要な任意のアルゴリズムを含めた、配列を整列させるための適切なパラメーターを決定することができる。ただし、本明細書において、アミノ酸配列同一性％値は、ＢＬＯＳＵＭ５０比較マトリックスを備えたＦＡＳＴＡパッケージバージョン３６．３．８ｃ以降のｇｇｓｅａｒｃｈプログラムを使用して生成される。ＦＡＳＴＡプログラムパッケージは、Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ及びＤ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９８８），「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」，ＰＮＡＳ  ８５：２４４４−２４４８；Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９６）「Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ」Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：２２７−２５８；並びにＰｅａｒｓｏｎら（１９９７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４６：２４−３６によって作成され、現在ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｄｏｗｎ．ｓｈｔｍｌから公的に入手可能である。或いは、ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉからアクセスできるパブリックサーバーを使い、ｇｇｓｅａｒｃｈ（ｇｌｏｂａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ｐｒｏｔｅｉｎ）プログラム及びデフォルトオプション（ＢＬＯＳＵＭ５０；ｏｐｅｎ：−１０；ｅｘｔ：−２；Ｋｔｕｐ＝２）を使用して（ローカルではなく）グローバルアライメントを実行することで、これらの配列を比較することも可能である。アミノ酸の同一性パーセントは、出力アライメントヘッダーに示される。
【００６２】
用語「薬学的製剤」とは、中に含まれる活性成分の生物学的活性が有効になるような形態の調製物であり、且つ、製剤が投与される対象にとって許容できないほど毒性である追加の成分を含まない調製物を指す。
【００６３】
「薬学的に許容される担体」は、薬学的製剤中の活性成分以外の成分であって、対象に対して非毒性である成分を指す。薬学的に許容される担体は、限定されるものではないが、バッファー、添加剤、安定剤又は保存剤を含む。
【００６４】
本明細書で用いられる場合、「治療（treatment）」（及び「治療する（treat）」又は「治療すること（treating）」など、その文法的変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために行うことも、臨床病理の過程において行うこともできる。治療の望ましい効果には、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患の状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。いくつかの実施態様において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅くするために使用される。
【００６５】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。通常、天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ、ＶＬ）は、一般的に類似の構造を有し、各ドメインが４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）備える。（例えば、Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., p. 91 (2007)を参照されたい。）抗原結合特異性を付与するには、単一のＶＨ又はＶＬドメインで十分である。さらに、特定の抗原に結合する抗体を、その抗原に結合する抗体のＶＨ又はＶＬドメインを用いて単離し、相補的なＶＬドメイン又はＶＨドメインそれぞれのライブラリーをスクリーニングすることができる。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０−８８７（１９９３）；Ｃｌａｒｋｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）を参照されたい。
【００６６】
本明細書で使用される用語「ベクター」は、それが連結されている別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター及び導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それが作動可能に連結されている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と言う。
【００６７】
Ｉ．組成物及び方法
一態様において、本発明は、ＬＡＧ３に結合する単離された抗体を提供する。
【００６８】
ある実施態様において、ヒトＬＡＧ３に結合する抗体が提供される。本発明の抗体は、例えば、がんの診断若しくは治療に、腫瘍免疫などの免疫関連疾患の治療若しくはその進行を遅延させるのに、又はＴ細胞活性などの免疫応答若しくは機能を刺激するのに有用であり、或いは免疫刺激剤としての使用のためのものであるか、或いはグランザイムＢ（ＧｒｚＢ）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮガンマ）及び／又はインターロイキン２（ＩＬ−２）の分泌／放出を刺激するためのものである。
【００６９】
Ａ．例示的抗ＬＡＧ３抗体
特定の実施態様では、以下の抗ＬＡＧ３抗体が提供される。
ｉ）ＬＡＧ３への結合について、配列番号７のアミノ酸配列を持つＶＨと配列番号８のアミノ酸配列を持つＶＬとを含む抗ＬＡＧ３抗体（ａＬＡＧ３（０４１４）のＶＨ及びＶＬを含む）と競合する抗体、及び／又は
ｉｉ）ヒト及びカニクイザルＬＡＧ３に結合する抗体、及び／又は
ｉｉｉ）ヒトＡ３７５腫瘍細胞で発現したＭＨＣ−ＩＩの結合を阻害する抗体、及び／又は
ｉｖ）（実施例３に示すように）混合リンパ球反応（ｍＭＬＲ）アッセイでグランザイムＢ又はＩＬ−２の放出を増加させる
抗体。
【００７０】
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのＨＶＲを含む抗ＬＡＧ３抗体を提供する。
【００７１】
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＨ  ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様において、該抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。一実施態様において、該抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを含む。さらなる実施態様では、該抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。さらなる実施態様において、該抗体は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【００７２】
別の態様では、本発明は、（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＬ  ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様では、該抗体は、（ａ）−配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００７３】
別の態様では、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＨ  ＨＶＲ配列を含むＶＨドメインと；（ｂ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＬ  ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインとを含む。
【００７４】
別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号６から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。
【００７５】
上記実施態様のいずれにおいても、抗ＬＡＧ３抗体は、ヒトであるか、又はヒト化されている。一実施態様では、抗ＬＡＧ３抗体は、上記実施態様のいずれかにあるようなＨＶＲを含み、アクセプターヒトフレームワークワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークをさらに含む。
【００７６】
別の態様では、抗ＬＡＧ３抗体は、配列番号７のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入又は削除を含むが、その配列を含む抗ＬＡＧ３抗体は、ＬＡＧ３に結合する能力を保持する。ある実施態様において、配列番号７において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は削除されている。特定の実施態様において、置換、挿入又は削除は、ＨＶＲの外側の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。場合によって、抗ＬＡＧ３抗体は、配列番号７にＶＨ配列を、この配列の翻訳後修飾を含め、含む。特定の一実施態様では、このＶＨは、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、１つ、２つ又は３つのＨＶＲを含む。
【００７７】
別の態様において、配列番号８のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、抗ＬＡＧ３抗体が提供される。特定の実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入又は削除を含むが、この配列を含む抗ＬＡＧ３抗体は、ＬＡＧ３に結合する能力を保持する。特定の実施態様では、配列番号８において、合計１から１０のアミノ酸が置換、挿入及び／又は削除されている。特定の実施態様において、この置換、挿入又は削除は、ＨＶＲの外側の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。場合によって、抗ＬＡＧ３抗体は、配列番号８にＶＬ配列を、この配列の翻訳後修飾を含め、含む。特定の一実施態様では、このＶＬは、（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、１つ、２つ又は３つのＨＶＲを含む。
【００７８】
別の態様では、上記実施態様のいずれかにあるようなＶＨ、及び上記実施態様のいずれかにあるようなＶＬを含む抗ＬＡＧ３抗体が提供される。一実施態様では、該抗体は、配列番号７及び配列番号８のそれぞれＶＨ及びＶＬ配列を、これらの配列の翻訳後修飾も含め、含む。
【００７９】
さらなる態様において、本発明は、本明細書で提供される抗ＬＡＧ３抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。例えば、ある実施態様において、配列番号７のＶＨ配列及び配列番号８のＶＬ配列を含む抗ＬＡＧ３抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。ある実施態様において、ＬＡＧ３内のエピトープクラスターＥ３のエピトープに結合する抗体が提供される（実施例２参照）。
【００８０】
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのＨＶＲを含む抗ＬＡＧ３抗体を提供する。
【００８１】
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＨ  ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様において、該抗体は、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。一実施態様において、該抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３と、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを含む。さらなる実施態様では、該抗体は、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。さらなる実施態様において、該抗体は、（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【００８２】
別の態様では、本発明は、（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＬ  ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様において、該抗体は、（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００８３】
別の態様では、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号１１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＨ  ＨＶＲ配列を含むＶＨドメインと；（ｂ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＬ  ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインとを含む。
【００８４】
別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１４から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。
【００８５】
上記実施態様のいずれにおいても、抗ＬＡＧ３抗体は、ヒトであるか、又はヒト化されている。一実施態様では、抗ＬＡＧ３抗体は、上記実施態様のいずれかにあるようなＨＶＲを含み、アクセプターヒトフレームワークワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークをさらに含む。
【００８６】
別の態様では、抗ＬＡＧ３抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入又は削除を含むが、その配列を含む抗ＬＡＧ３抗体は、ＬＡＧ３に結合する能力を保持する。ある実施態様において、配列番号１５において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。特定の実施態様において、置換、挿入又は削除は、ＨＶＲの外側の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。場合によって、抗ＬＡＧ３抗体は、配列番号１５にＶＨ配列を、この配列の翻訳後修飾を含め、含む。特定の一実施態様では、このＶＨは、（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、１つ、２つ又は３つのＨＶＲを含む。
【００８７】
別の態様において、配列番号１６のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、抗ＬＡＧ３抗体が提供される。特定の実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入又は削除を含むが、この配列を含む抗ＬＡＧ３抗体は、ＬＡＧ３に結合する能力を保持する。特定の実施態様では、配列番号１６において、合計１から１０のアミノ酸が置換、挿入及び／又は削除されている。特定の実施態様において、この置換、挿入又は削除は、ＨＶＲの外側の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。場合によって、抗ＬＡＧ３抗体は、配列番号１６にＶＬ配列を、この配列の翻訳後修飾を含め、含む。特定の一実施態様では、このＶＬは、（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、１つ、２つ又は３つのＨＶＲを含む。
【００８８】
別の態様では、上記実施態様のいずれかにあるようなＶＨ、及び上記実施態様のいずれかにあるようなＶＬを含む抗ＬＡＧ３抗体が提供される。一実施態様では、該抗体は、配列番号１５及び配列番号１６のそれぞれＶＨ及びＶＬ配列を、これらの配列の翻訳後修飾も含め、含む。
【００８９】
さらなる態様において、本発明は、本明細書で提供される抗ＬＡＧ３抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。例えば、ある実施態様において、配列番号１５のＶＨ配列及び配列番号１６のＶＬ配列を含む抗ＬＡＧ３抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。ある実施態様において、ＬＡＧ３内のエピトープクラスターＥ３のエピトープに結合する抗体が提供される（実施例２参照）。
【００９０】
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのＨＶＲを含む抗ＬＡＧ３抗体を提供する。
【００９１】
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＨ  ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様において、該抗体は、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。一実施態様において、該抗体は、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３と、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを含む。さらなる実施態様では、該抗体は、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。さらなる実施態様において、該抗体は、（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【００９２】
別の態様では、本発明は、（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＬ  ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様において、該抗体は、（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００９３】
別の態様では、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号１９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＨ  ＨＶＲ配列を含むＶＨドメインと；（ｂ）（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＬ  ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインとを含む。
【００９４】
別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号２２から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。
【００９５】
上記実施態様のいずれにおいても、抗ＬＡＧ３抗体は、ヒトであるか、又はヒト化されている。一実施態様では、抗ＬＡＧ３抗体は、上記実施態様のいずれかにあるようなＨＶＲを含み、アクセプターヒトフレームワークワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークをさらに含む。
【００９６】
別の態様では、抗ＬＡＧ３抗体は、配列番号２３のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入又は削除を含むが、その配列を含む抗ＬＡＧ３抗体は、ＬＡＧ３に結合する能力を保持する。ある実施態様において、配列番号２３において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は削除されている。特定の実施態様において、置換、挿入又は削除は、ＨＶＲの外側の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。場合によって、抗ＬＡＧ３抗体は、配列番号２３にＶＨ配列を、この配列の翻訳後修飾を含め、含む。特定の一実施態様では、このＶＨは、（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、１つ、２つ又は３つのＨＶＲを含む。
【００９７】
別の態様において、配列番号２４のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、抗ＬＡＧ３抗体が提供される。特定の実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入又は削除を含むが、この配列を含む抗ＬＡＧ３抗体は、ＬＡＧ３に結合する能力を保持する。特定の実施態様では、配列番号２４において、合計１から１０のアミノ酸が置換、挿入及び／又は削除されている。特定の実施態様において、この置換、挿入又は削除は、ＨＶＲの外側の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。場合によって、抗ＬＡＧ３抗体は、配列番号２４にＶＬ配列を、この配列の翻訳後修飾を含め、含む。特定の一実施態様では、このＶＬは、（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、１つ、２つ又は３つのＨＶＲを含む。
【００９８】
別の態様では、上記実施態様のいずれかにあるようなＶＨ、及び上記実施態様のいずれかにあるようなＶＬを含む抗ＬＡＧ３抗体が提供される。一実施態様では、該抗体は、配列番号２３及び配列番号２４のそれぞれＶＨ及びＶＬ配列を、これらの配列の翻訳後修飾も含め、含む。
【００９９】
さらなる態様において、本発明は、本明細書で提供される抗ＬＡＧ３抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。例えば、ある実施態様において、配列番号２３のＶＨ配列及び配列番号２４のＶＬ配列を含む抗ＬＡＧ３抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。ある実施態様において、ＬＡＧ３内のエピトープクラスターＥ３のエピトープに結合する抗体が提供される（実施例２参照）。
【０１００】
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのＨＶＲを含む抗ＬＡＧ３抗体を提供する。
【０１０１】
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＨ  ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様において、該抗体は、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。一実施態様において、該抗体は、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３と、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを含む。さらなる実施態様では、該抗体は、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。さらなる実施態様において、該抗体は、（ａ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【０１０２】
別の態様では、本発明は、（ａ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＬ  ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様において、該抗体は、（ａ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１０３】
別の態様では、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号２７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＨ  ＨＶＲ配列を含むＶＨドメインと；（ｂ）（ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＬ  ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインとを含む。
【０１０４】
別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号３０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。
【０１０５】
上記実施態様のいずれにおいても、抗ＬＡＧ３抗体は、ヒトであるか、又はヒト化されている。一実施態様では、抗ＬＡＧ３抗体は、上記実施態様のいずれかにあるようなＨＶＲを含み、アクセプターヒトフレームワークワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークをさらに含む。
【０１０６】
別の態様では、抗ＬＡＧ３抗体は、配列番号３１のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入又は削除を含むが、その配列を含む抗ＬＡＧ３抗体は、ＬＡＧ３に結合する能力を保持する。ある実施態様において、配列番号３１において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は削除されている。特定の実施態様において、置換、挿入又は削除は、ＨＶＲの外側の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。場合によって、抗ＬＡＧ３抗体は、配列番号３１にＶＨ配列を、この配列の翻訳後修飾を含め、含む。特定の一実施態様では、このＶＨは、（ａ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、１つ、２つ又は３つのＨＶＲを含む。
【０１０７】
別の態様において、配列番号３２のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、抗ＬＡＧ３抗体が提供される。特定の実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入又は削除を含むが、この配列を含む抗ＬＡＧ３抗体は、ＬＡＧ３に結合する能力を保持する。特定の実施態様では、配列番号３２において、合計１から１０のアミノ酸が置換、挿入及び／又は削除されている。特定の実施態様において、この置換、挿入又は削除は、ＨＶＲの外側の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。場合によって、抗ＬＡＧ３抗体は、配列番号３２にＶＬ配列を、この配列の翻訳後修飾を含め、含む。特定の一実施態様では、このＶＬは、（ａ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、１つ、２つ又は３つのＨＶＲを含む。
【０１０８】
別の態様では、上記実施態様のいずれかにあるようなＶＨ、及び上記実施態様のいずれかにあるようなＶＬを含む抗ＬＡＧ３抗体が提供される。一実施態様では、該抗体は、配列番号３１及び配列番号３２のそれぞれＶＨ及びＶＬ配列を、これらの配列の翻訳後修飾も含め、含む。
【０１０９】
さらなる態様において、本発明は、本明細書で提供される抗ＬＡＧ３抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。例えば、ある実施態様において、配列番号３１のＶＨ配列及び配列番号３２のＶＬ配列を含む抗ＬＡＧ３抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。ある実施態様において、ＬＡＧ３内のエピトープクラスターＥ３のエピトープに結合する抗体が提供される（実施例２参照）。
【０１１０】
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのＨＶＲを含む抗ＬＡＧ３抗体を提供する。
【０１１１】
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＨ  ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様において、該抗体は、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。一実施態様において、該抗体は、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３と、配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを含む。さらなる実施態様では、該抗体は、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。さらなる実施態様において、該抗体は、（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【０１１２】
別の態様では、本発明は、（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＬ  ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様において、該抗体は、（ａ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１１３】
別の態様では、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＨ  ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン；（ｂ）（ｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、並びに（ｃ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＬ  ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
【０１１４】
別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号３８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。
【０１１５】
上記実施態様のいずれにおいても、抗ＬＡＧ３抗体は、ヒトであるか、又はヒト化されている。一実施態様では、抗ＬＡＧ３抗体は、上記実施態様のいずれかにあるようなＨＶＲを含み、アクセプターヒトフレームワークワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークをさらに含む。
【０１１６】
別の態様では、抗ＬＡＧ３抗体は、配列番号３９のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入又は削除を含むが、その配列を含む抗ＬＡＧ３抗体は、ＬＡＧ３に結合する能力を保持する。ある実施態様において、配列番号３９において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は削除されている。特定の実施態様において、置換、挿入又は削除は、ＨＶＲの外側の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。場合によって、抗ＬＡＧ３抗体は、配列番号３９にＶＨ配列を、この配列の翻訳後修飾を含め、含む。特定の一実施態様では、このＶＨは、（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、１つ、２つ又は３つのＨＶＲを含む。
【０１１７】
別の態様において、配列番号４０のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、抗ＬＡＧ３抗体が提供される。特定の実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入又は削除を含むが、この配列を含む抗ＬＡＧ３抗体は、ＬＡＧ３に結合する能力を保持する。ある実施態様では、配列番号４０において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は削除されている。特定の実施態様において、この置換、挿入又は削除は、ＨＶＲの外側の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。場合によって、抗ＬＡＧ３抗体は、配列番号４０にＶＬ配列を、この配列の翻訳後修飾を含め、含む。特定の一実施態様では、このＶＬは、（ａ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、１つ、２つ又は３つのＨＶＲを含む。
【０１１８】
別の態様では、上記実施態様のいずれかにあるようなＶＨ、及び上記実施態様のいずれかにあるようなＶＬを含む抗ＬＡＧ３抗体が提供される。一実施態様では、該抗体は、配列番号３９及び配列番号４０のそれぞれＶＨ及びＶＬ配列を、これらの配列の翻訳後修飾も含め、含む。
【０１１９】
本発明のさらなる態様において、上記の実施態様のいずれかに記載の抗ＬＡＧ３抗体は、キメラ、ヒト化又はヒト抗体を含めたモノクローナル抗体である。一実施態様において、抗ＬＡＧ３抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、又はＦ（ａｂ’）２断片である。別の実施態様では、該抗体は全長抗体であり、例えば、置換がヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域から得られるＦｃ領域のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡ−ＰＧ）である（例えば国際公開第２０１２／１３０８３１号を参照）。
【０１２０】
さらなる態様において、上記の実施態様のいずれかに記載の抗ＬＡＧ３抗体は、以下のセクション１〜７に記載されている任意の機能を一つずつ又は組み合わせて組み込むことができる。
【０１２１】
１．抗体親和性
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。
【０１２２】
一実施態様において、Ｋｄは、放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）により測定される。一実施態様において、ＲＩＡは、目的の抗体のＦａｂバージョン及びその抗原を用いて実施される。例えば、抗原に対するＦａｂの溶液結合アフィニティーは、非標識抗原の力価測定系の存在下で、最小濃度の（１２５Ｉ）標識抗原を用いてＦａｂを均衡化し、次いで抗Ｆａｂ抗体をコーティングしたプレートを用いて結合した抗原を捕捉することによって測定する（例としてChen, et al., J. Mol. Biol.293:865-881(1999)を参照）。アッセイ条件を確立するために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、５μｇ／ｍｌの捕捉抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ）を含む５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）で一晩コーティングし、その後２％（ｗ／ｖ））のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳで２〜５時間室温（およそ２３℃）でブロックする。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ＃２６９６２０）内で、段階希釈した目的のＦａｂと１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を混合する（例えば、Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一致する）。その後、目的のＦａｂを一晩インキュベートするが、インキュベーションは、平衡状態に達したことを確認するためにさらに長い時間にわたって（例えば約６５時間）継続してもよい。その後、混合物を捕捉プレートに移し、室温で（例えば１時間）インキュベートする。次いで、溶液を除去し、０．１％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））を含むＰＢＳでプレートを８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０ＴＭ；Ｐａｃｋａｒｄ）を加え、そのプレートをＴＯＰＣＯＵＮＴＴＭガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）で１０分間カウントする。最大結合の２０％以下が得られる各Ｆａｂの濃度が、競合結合アッセイに用いるために選択される。
【０１２３】
他の実施態様によると、Ｋｄは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ニュージャージー州ピスカタウェイのＢＩＡｃｏｒｅ社）を用いるアッセイは、約１０反応単位（ＲＵ）の固定化抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃で実施される。一実施態様では、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ社）が、供給業者の指示書に従い、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化される。抗原を、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）に希釈した後、およそ１０反応単位（ＲＵ）の結合タンパク質を得るように、５μｌ／分の流速で注入する。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために、１Ｍのエタノールアミンを注入する。カイネティクス測定のために、Ｆａｂの２倍の段階希釈（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を、０．０５％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０ＴＭ）界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに、２５℃、約２５μｌ／分の流速で注入する。結合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は、単純な１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を使用して、結合及び解離センサーグラムを同時にフィッテイングさせることによって計算される。平衡解離定数（Ｋｄ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として計算算出される。例えば、Ｃｈｅｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照。上記の表面プラズモン共鳴アッセイによる結合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）が１０６Ｍ−１ｓ−１を上回る場合、結合速度は、漸増濃度の抗原の存在下で分光計（例えばストップフロー分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯＴＭ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ））で測定される、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の２５℃での蛍光発光強度の増減を測定する（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、バンドパス＝１６ｎｍ）蛍光消光技術を用いて測定することができる。
【０１２４】
２．抗体断片
特定の実施態様において、本明細書に提供される抗体は、抗体断片である。「抗体断片」という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する、インタクトな抗体の一部分を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）；一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、及び単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）が含まれる。特定の抗体断片の総説については、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ及びＨｕｄｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３：１１２６−１１３６（２００５）を参照されたい。
【０１２５】
一実施態様では、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ又はＦ（ａｂ’）２断片、特にＦａｂ断片である。インタクトな抗体のパパイン消化は、各々が重鎖及び軽鎖可変ドメインと、さらには軽鎖の定常ドメインと重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片を生成する。よって、用語「Ｆａｂ断片」は、軽鎖のＶＬドメイン及び定常ドメイン（ＣＬ）と、重鎖のＶＨドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む軽鎖断片を含む抗体断片を指す。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に残基が付加されている点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を持つＦａｂ’断片である。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位（２つのＦａｂ断片）とＦｃ領域の一部とを有するＦ（ａｂ’）２断片を生成する。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、且つ増加したｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有するＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。
【０１２６】
別の実施態様において、抗体断片は、ダイアボディ、トリアボディ又はテトラボディである。ダイアボディは、２つの抗原結合部位を有する抗体断片であって、二価又は二重特異性であり得る。例えば、ＥＰ４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Ｈｕｄｓｏｎら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照。トリアボディ及びテトラボディもＨｕｄｓｏｎら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）に記載されている。
【０１２７】
さらなる実施態様において、抗体断片は、一本Ｆａｂ断片である。「一本鎖Ｆａｂ断片」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーから成るポリペプチドであり、前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に次の順序：ａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、ｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、ｃ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１、又はｄ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬのうちの１つを有する。特に、前記リンカーは、少なくとも３０個のアミノ酸、好ましくは３２から５０個のアミノ酸から成るポリペプチドである。前記一本鎖Ｆａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然ジスルフィド結合によって安定化されている。加えて、これらの一本鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基（例えばＫａｂａｔ番号付けによる可変重鎖の４４位及び可変軽鎖の１００位）の挿入による鎖間ジスルフィド結合の生成により、さらに安定化する可能性もある。
【０１２８】
別の実施態様において、抗体断片は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。「一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）」は、抗体の、リンカーと連結している重鎖（ＶＨ）と軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。特に、リンカーは１０から２５個のアミノ酸から成る短いポリペプチドで、通常は柔軟性のためにグリシンに、溶解度のためにセリン又はスレオニンに富み、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に接続することができ、又はその逆も可能である。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にも関わらず、元の抗体の特異性を保持している。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，１１３巻，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），ｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；並びに米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号も参照。
【０１２９】
別の実施態様では、抗体断片は、単一ドメイン抗体である。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部、或いは軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。特定の実施態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体（マサチューセッツ州ウォルサムのＤｏｍａｎｔｉｓ社；例えば米国特許第６２４８５１６号参照）である。
【０１３０】
抗体断片は、本明細書に記載のように、組換え宿主細胞（例えば大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）又はファージ）による産生の他、インタクトな抗体のタンパク質消化を含むがこれらに限定されない種々の技術で作製することができる。
【０１３１】
３．キメラ抗体及びヒト化抗体
特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。いくつかのキメラ抗体が、例えば米国特許第４８１６５６７号及びＭｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）に記載されている。一例として、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ又は非ヒト霊長類（サルなど）由来の可変領域）とヒト定常領域とを含む。さらなる例として、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のものから変更されている「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体には、その抗原結合断片も含まれる。
【０１３２】
特定の実施態様において、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減するために、親の非ヒト抗体の特異性とアフィニティーを保持したままヒト化されている。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ（例えばＣＤＲ）（又はその一部）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（又はその一部）がヒト抗体配列に由来する、１つ以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、場合によってヒト定常領域の少なくとも一部を含むであろう。いくつかの実施態様では、ヒト化抗体のいくつかのＦＲ残基は、例えば抗体特異性又はアフィニティーを回復又は改善するために、非ヒト抗体（例えばＨＶＲ残基が由来する抗体）の対応する残基で置換される。
【０１３３】
ヒト化抗体及びその製造方法は、例えばＡｌｍａｇｒｏ及びＦｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）にて総説されており、さらに、例えばＲｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９−１００３３（１９８９）；米国特許第５８２１３３７号、同第７５２７７９１号、同第６９８２３２１号、及び同第７０８７４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：２５−３４（２００５）（特異性決定領域（ＳＤＲ）のグラフティングを記述）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９−４９８（１９９１）（「リサーフェシング」を記述）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：４３−６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」を記述）、並びにＯｓｂｏｕｒｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：６１−６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａら，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２−２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングに対する「誘導選択」アプローチを記述）に記載されている。
【０１３４】
ヒト化に用いることができるヒトフレームワーク領域には、限定されないが、「ベストフィット」法を用いて選択されるフレームワーク領域（例えばSims et al. J. Immunol.151:2296 (1993)を参照)；軽鎖又は重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域(例えばCarter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992);及びPresta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)を参照）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域又はヒトの生殖細胞系フレームワーク領域（例えばAlmagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照）；及びＦＲライブラリーをスクリーニングすることから得られるフレームワーク領域（例えばBaca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)及びRosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)を参照）が含まれる。
【０１３５】
４．ヒト抗体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野において既知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は、ｖａｎ  Ｄｉｊｋ及びｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８−７４（２００１）、並びにＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０−４５９（２００８）に一般的に記載されている。
【０１３６】
ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してインタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することによって調製することができる。このような動物は、典型的には内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、又は染色体外に存在するか若しくは動物の染色体にランダムに組み込まれているヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含む。このようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、通常は不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７−１１２５（２００５）を参照。また、例えばＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術を記載している米国特許第６０７５１８１号及び第６１５０５８４号、ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載している米国特許第５７７０４２９号、Ｋ−Ｍ  ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許第７０４１８７０号、及びＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号も参照されたし。このような動物により生成される、インタクトな抗体のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることにより、さらに改変され得る。
【０１３７】
ヒト抗体は、ハイブリドーマベースの方法によって作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体の製造のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒト異種骨髄腫細胞株が記述されている。（例えばKozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, p. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；及びBoerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)を参照）また、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により生成されるヒト抗体もＬｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７−３５６２（２００６）に記載されている。さらなる方法には、例えば米国特許第７１８９８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の作製について記載）及びＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ  Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５−２６８（２００６）（ヒト−ヒトハイブリドーマについて記載）に記載されているものが含まれる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）もまた、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ及びＢｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７−９３７（２００５）、並びにＶｏｌｌｍｅｒｓ及びＢｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５−９１（２００５）に記載されている。
【０１３８】
ヒト抗体はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成することもできる。その後、このような可変ドメイン配列を、所望のヒト定常ドメインと組み合わせてもよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術を以下に記載する。
【０１３９】
５．ライブラリーから得られる抗体
本発明の抗体は、所望の活性（複数可）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするための方法は、例えばＬｅｒｎｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １６：４９８−５０８（２０１６）に総説されている。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作成して所望の結合特性を有する抗体の当該ライブラリーをスクリーニングするための様々な方法が、当技術分野で知られている。当該方法は、例えばＦｒｅｎｚｅｌら，ｍＡｂｓ  ８：１１７７−１１９４（２０１６）；Ｂａｚａｎら，Ｈｕｍａｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ８：１８１７−１８２８（２０１２）及びＺｈａｏら，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３６：２７６−２８９（２０１６）、及びＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７（O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001）、並びにＭａｒｋｓ及びＢｒａｄｂｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４８：１６１−１７５（Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003）に総説されている。
【０１４０】
特定のファージディスプレイ法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により個別にクローニングされ、ファージライブラリーにランダム内でランダムに再組換えされ、その後、ＷｉｎｔｅｒらのＡｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２：４３３−４５５（１９９４）に記載のように、抗原結合ファージについてスクリーニングされ得る。ファージは通常、抗体断片を、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片又はＦａｂ断片のいずれかとして表示する。免疫化された供給源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要性を伴うことなく免疫原に対する高アフィニティー抗体を提供する。代替的に、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら，ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １２：７２５−７３４（１９９３）に記載のように、ナイーブレパートリーを（例えばヒトから）クローニングして、全く免疫化せずに、広範囲の非自己抗原及び自己抗原に対する抗体の単一の供給源を提供することもできる。最後に、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１−３８８（１９９２）によって記載されているように、幹細胞由来の再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを用いて可変性に富むＣＤＲ３領域をコードし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの再配列を達成することにより、ナイーブライブラリーを合成的に作成することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーを記載している特許公報には、例えば米国特許第５７５０３７３号、同第７９８５８４０号、同第７７８５９０３号及び同第８６７９４９０号、並びに米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、同第２００７／０１１７１２６号及び同第２００７／０２９２９３６号が含まれる。
【０１４１】
所望の活性（複数可）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするための当技術分野で既知の方法のさらなる例には、リボソーム及びｍＲＮＡディスプレイ、並びに細菌、哺乳動物細胞、昆虫細胞又は酵母細胞での抗体ディスプレイ及び選択のための方法が含まれる。酵母表面ディスプレイのための方法は、例えばＳｃｈｏｌｌｅｒら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５０３：１３５−５６（２０１２）及びＣｈｅｒｆら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １３１９：１５５−１７５（２０１５）、及びＺｈａｏら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８８９：７３−８４（２０１２）に総説されている。リボソームディスプレイのための方法は、例えばＨｅら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５：５１３２−５１３４（１９９７）及びＨａｎｅｓら，ＰＮＡＳ  ９４：４９３７−４９４２（１９９７）に記載されている。
【０１４２】
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体又は抗体断片は、本明細書においてヒト抗体又はヒト抗体の断片とみなされる。
【０１４３】
６．多重特異性抗体
特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位、すなわち異なる抗原上の異なるエピトープ又は同じ抗原上の異なるエピトープに対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施態様では、多重特異性抗体は、３つ以上の結合特異性を有する。特定の実施態様において、結合特異性の１つはＬＡＧ３に対してであり、その他（２つ以上）の特異性は他の任意の抗原に対するものである。ある実施態様において、二重特異性抗体は、ＬＡＧ３の２つ（又はそれ以上）の異なるエピトープに結合することができる。多重特異性（例えば二重特異性）抗体はまた、ＬＡＧ３を発現する細胞に細胞傷害性剤又は細胞を限局化するために用いることもできる。多重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
【０１４４】
多重特異性抗体を作製するための技術には、限定されないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現（Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)参照）及び「ノブ・イン・ホール」法（例えば米国特許第５７３１１６８号及びAtwell et al., J. Mol. Biol. 270:26 (1997)を参照）が含まれる。また、多重特異抗体は、抗体のＦｃ−ヘテロ二量体分子を作成するための静電ステアリング効果を操作すること（例えば国際公開第２００９／０８９００４号参照）；２つ以上の抗体又は断片を架橋すること（例えば米国特許第４６７６９８０号、及びBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)を参照）；ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体を生成すること（例えばKostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992）及び国際公開第２０１１／０３４６０５号参照）；共通軽鎖の技術を使用して軽鎖の誤対合問題を回避すること（例えば国際公開第９８／５０４３１号参照）；「ダイアボディ」技術を使用して、二重特異性抗体断片を作製すること（例えばHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)参照）；及び一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用すること（例えばGruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)参照）；例えばＴｕｔｔらのＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載されているように三重特異性抗体を調製することによって作製することもできる。
【０１４５】
例えば「オクトパス抗体」又はＤＶＤ−Ｉｇなど、３つ以上の抗原結合部位を有する操作抗体も本明細書に含まれる（例えば国際公開第２００１／７７３４２号及び同第２００８／０２４７１５号を参照）。３つ以上の抗原結合部位を有する多重特異性抗体の他の例は、国際公開第２０１０／１１５５８９号、国際公開第２０１０／１１２１９３号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１０／１４５７９２号、及び国際公開第２０１３／０２６８３１号に見出すことができる。また、二重特異性抗体又はその抗原結合断片には、ＬＡＧ３及び別の異なる抗原又はＬＡＧ３の２つの異なるエピトープに結合する抗原結合部位を含む「二重作用（Dual Acting）Ｆａｂ」若しくは「ＤＡＦ」が含まれる（例えば米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号参照）。
【０１４６】
多重特異性抗体は、同じ抗原特異性の１つ以上の結合アームにドメインクロスオーバーを持つ非対称の形で、すなわちＶＨ／ＶＬドメインを（例えば国際公開第２００９／０８０２５２号及び同第２０１５／１５０４４７号参照）、ＣＨ１／ＣＬドメインを（例えば国際公開第２００９／０８０２５３号参照）、又は完全なＦａｂアームを（例えば国際公開第２００９／０８０２５１号、同第２０１６／０１６２９９号、並びにSchaefer et al, PNAS, 108 (2011) 1187-1191及びKlein at al., MAbs 8 (2016) 1010-20参照）を交換することによっても提供され得る。一実施態様では、多重特異性抗体は、クロスＦａｂ断片を含む。用語「クロスＦａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」はＦａｂ断片であって、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換されているものを指す。クロスオーバーＦａｂ断片は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖定常領域（ＣＨ１）から構成されているポリペプチド鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成されているポリペプチド鎖とを含む。非対称Ｆａｂアームは、荷電又は非荷電アミノ酸変異をドメイン境界面に導入して、正しいＦａｂ対合を誘導することによっても作製され得る。例えば、国際公開第２０１６／１７２４８５号を参照のこと。
【０１４７】
多重特異性抗体の様々なさらなる分子形式が当技術分野で知られており、本明細書に含まれる（例えばSpiess et al., Mol Immunol 67 (2015) ９５−１０６参照）。
【０１４８】
７．抗体バリアント
特定の実施態様では、本明細書で提供されている抗体のアミノ酸配列バリアントが企図されている。例えば、抗体の結合アフィニティー及び／又は他の生物学的特性を改善することが望まれ得る。抗体のアミノ酸配列バリアントは、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより、又はペプチド合成により調製することができる。このような改変には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又は該残基への挿入、及び／又は該残基の置換が含まれる。削除、挿入、及び置換の任意の組み合わせを行って、最終コンストラクトに到達することができるが、但し、これは最終コンストラクトが所望の特性、例えば抗原結合を有する場合に限る。
【０１４９】
ａ）置換、挿入、及び欠失バリアント
ある実施態様では、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗体バリアントが提供される。置換変異誘発の対象部位には、ＨＶＲ及びＦＲが含まれる。保存的置換は、表１の「好ましい置換」の見出しの下に示されている。より実質的な変更を、表１の「例示的置換」の見出しの下に示し、アミノ酸側鎖のクラスに従って下記にさらに説明する。アミノ酸置換を目的の抗体に導入することができ、その産物は、所望の活性、例えば抗原結合の保持／増強、免疫原性の低下、又はＡＤＣＣ若しくはＣＤＣの改善についてスクリーニングすることができる。
0006871415.tif 000002
0006871415.tif 000003
アミノ酸は以下の共通の側鎖特性に従ってグループ化することができる。
（１）疎水性：ノルロイシン，Ｍｅｔ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ａｓｎ，Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ
（４）塩基性：Ｈｉｓ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ，Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
【０１５０】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つの要素を別のクラスの要素と交換することを必然的に伴うものである。
【０１５１】
ある種類の置換バリアントは、親抗体（例えばヒト化又はヒト抗体）の１以上の超可変領域残基を置換することを伴う。一般的には、結果として得られ、さらなる研究のために選択されたバリアント（複数可）は、親抗体と比較して、特定の生物学的特性の改変（例えば改善）（例えばアフィニティーの向上、免疫原性の低下）を有し、且つ／又は親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持するであろう。例示的な置換バリアントは、アフィニティー成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載されるようなファージディスプレイベースのアフィニティー成熟技術を用いて、簡便に生成することができる。簡潔に言えば、１以上のＨＶＲ残基が変異し、バリアント抗体がファージ上に表示されて、特定の生物学的活性（例えば結合アフィニティー）についてスクリーニングされる。
【０１５２】
変更（例えば置換）は、例えば抗体のアフィニティーを向上させるために、ＨＶＲ内で行うことができる。このような変更は、ＨＶＲ内の「ホットスポット」、すなわち体細胞成熟過程中に高頻度で変異を受けるコドンによってコードされた残基（例えばChowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)を参照）、及び／又は抗原に接する残基内で行うことができ、結果として得られたバリアントＶＨ又はＶＬの結合アフィニティーが試験される。二次ライブラリーから構築し選択し直すことによるアフィニティー成熟が、例えばＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７（O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)）に記載されている。アフィニティー成熟のいくつかの実施態様において、多様性が、様々な方法（例えばエラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発）のいずれかにより、成熟のために選択された可変遺伝子に導入される。次いで、二次ライブラリーが作成される。次いで、該ライブラリーをスクリーニングして、所望のアフィニティーを持つ任意の抗体バリアントを同定する。多様性を導入する別の方法は、複数のＨＶＲ残基（例えば、一度に４〜６個の残基）がランダム化されるＨＶＲ特異的手法（HVR-directed approach）を伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えばアラニンスキャニング突然変異誘発又はモデリングを用いて、特異的に同定することができる。特に、ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３が多くの場合標的とされる。
【０１５３】
特定の実施態様では、 これらの変更が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限り、１つ以上のＨＶＲ内で置換、挿入又は欠失が起こり得る。例えば、実質的に結合アフィニティーを低下させない保存的変更（例えば本明細書で提供されている保存的置換）をＨＶＲ内で行うことができる。このような変更は、例えば、ＨＶＲ内の残基に接する抗原の外側で生じる。上で提供されているバリアントＶＨ及びＶＬ配列の特定の実施態様において、各ＨＶＲは変化しないか、又はわずか１つ、２つ若しくは３つのアミノ酸置換を含む。
【０１５４】
突然変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５により記載されているように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、残基又は標的残基のグループ（例えばａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕ等の荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを判定するために、中性又は負荷電アミノ酸（例えばアラニン又はポリアラニン）により置き換えられる。さらなる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入され得る。代替的に又は追加的には、抗体と抗原の接点を特定するための抗原−抗体複合体の結晶構造。そのような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的とされてもよいし、又は排除されてもよい。バリアントは、所望の特性を含むかどうかを判定するためにスクリーニングされ得る。
【０１５５】
アミノ酸配列挿入物には、長さが残基１つから、１００個以上の残基を有するポリペプチドに及ぶアミノ及び／又はカルボキシル末端融合体、 並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入物が含まれる。末端挿入物の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入バリアントは、抗体の血清半減期を延長させる酵素（例えばＡＤＥＰＴのための）又はポリペプチドに対する抗体のＮ末端又はＣ末端への融合物を含む。
【０１５６】
ｂ）グリコシル化バリアント
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増大又は低下させるように変更される。グリコシル化部位の抗体への付加又は削除は、１つ以上のグリコシル化部位が創出又は除去されるようにアミノ酸配列を変更することにより、簡便に達成することができる。
【０１５７】
抗体がＦｃ領域を含む場合には、それに結合するオリゴ糖を変更することができる。哺乳動物細胞によって産生された天然抗体は、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７へのＮ結合によって通常結合している分岐状の二分岐オリゴ糖を典型的に含む。例えばＷｒｉｇｈｔらＴＩＢＴＥＣＨ  １５：２６−３２（１９９７）を参照。オリゴ糖には、様々な炭水化物、例えばマンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース及びシアル酸の他、二分岐オリゴ糖構造の「幹」においてＧｌｃＮＡｃに結合したフコースが含まれ得る。いくつかの実施態様において、本発明の抗体におけるオリゴ糖の修飾は、特定の改善された特性を有する抗体バリアントを作製するためになされ得る。
【０１５８】
一実施態様において、抗体バリアントは、非フコシル化オリゴ糖、すなわちＦｃ領域に（直接的に又は間接的に）結合したフコースを欠くオリゴ糖構造を有して提供される。このような非フコシル化オリゴ糖（「アフコシル化」オリゴ糖とも呼ばれる）は、特に、二分岐オリゴ糖構造の幹内の最初のＧｌｃＮＡｃに結合したフコース残基を欠くＮ結合型オリゴ糖である。一実施態様では、天然又は親抗体と比較して、Ｆｃ領域に増加した割合の非フコシル化オリゴ糖を有する抗体バリアントが提供される。例えば、非フコシル化オリゴ糖の割合は、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％又はさらに約１００％（すなわちフコシル化オリゴ糖は存在しない）であってもよい。非フコシル化オリゴ糖のパーセンテージは、例えば国際公開第２００６／０８２５１５号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法で測定される、Ａｓｎ２９７に結合した全ての糖構造（例えば複合体、ハイブリッド及び高マンノース構造）の合計に対する、フコース残基を欠くオリゴ糖の（平均）量である。Ａｓｎ２９７とは、Ｆｃ領域内のおよそ２９７位（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）に位置するアスパラギン残基を指すが、Ａｓｎ２９７は、抗体のわずかな配列変異に起因して、２９７位から上流又は下流に±３アミノ酸、すなわち２９４位から３００位の間に位置する場合もある。Ｆｃ領域に増加した割合の非フコシル化オリゴ糖を有するこのような抗体は、改善されたＦｃγＲＩＩＩａ受容体結合及び／又は改善されたエフェクター機能、特に改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；同第２００４／００９３６２１号を参照のこと。
【０１５９】
フコシル化が低下した抗体を産生できる細胞株の例には、タンパク質のフコシル化が欠損しているＬｅｃ１３  ＣＨＯ細胞（Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；及び国際公開第２００４／０５６３１２号、特に実施例１１）及びノックアウト細胞株、例えばアルファ−１、６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えばYamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87:614-622 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照）、又はＧＤＰ−フコース合成若しくは輸送タンパク質の活性が低下若しくは停止されている細胞（例えば米国特許第２００４２５９１５０号、同第２００５０３１６１３号、同第２００４１３２１４０号、同第２００４１１０２８２号参照）が含まれる。
【０１６０】
さらなる実施態様では、抗体バリアントは、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている、二分オリゴ糖を有する。このような抗体バリアントは、上述のとおり、低下したフコシル化及び／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。このような抗体バリアントの例は、例えばＵｍａｎａら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７，１７６−１８０（１９９９）；Ｆｅｒｒａｒａら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎ  Ｂｉｏｅｎｇ  ９３，８５１−８６１（２００６）；国際公開第９９／５４３４２号、国際公開第２００４／０６５５４０号、国際公開第２００３／０１１８７８号に記載されている。
【０１６１】
Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を持つ抗体バリアントも提供される。このような抗体バリアントは、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。このような抗体バリアントは、例えば国際公開第１９９７／３００８７号；同第１９９８／５８９６４号；及び同第１９９９／２２７６４号に記載されている。
【０１６２】
ｃ）Ｆｃ領域バリアント
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に１つ以上のアミノ酸修飾を導入し、それによりＦｃ領域バリアントを生成することができる。Ｆｃ領域バリアントは、１つ以上のアミノ酸位置でアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域）を含み得る。
【０１６３】
ある実施態様において、本発明は、全てではないがいくつかのエフェクター機能を有する抗体バリアントを企図しており、これらの機能は、該抗体バリアントを、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗体の半減期は重要であっても、ある種のエフェクター機能（例えば補体及びＡＤＣＣなど）は不要又は有害である用途のための望ましい候補とならしめる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏ細胞傷害性アッセイを実施して、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣの活性の低下／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実施して、抗体がＦｃガンマＲ結合を欠く（したがって恐らくはＡＤＣＣ活性を欠く）が、ＦｃＲｎ結合能を保持していることを確認することができる。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞であるＮＫ細胞がＦｃガンマＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃガンマＲＩ、ＦｃガンマＲＩＩ及びＦｃガンマＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲの発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ及びＫｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）の４６４頁の表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの非限定的な例は、米国特許第５５００３６２号（例えばHellstrom, I et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)を参照）及びHellstrom, I et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (Bruggemann, M. et al.,J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)を参照）に記載されている。或いは、非放射性アッセイ法を用いてもよい（例えばフローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（カリフォルニア州マウンテンビューのＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、及びＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（ウィスコンシン州マディソンのＰｒｏｍｅｇａ社）参照）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。代替的に又は追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、例えばＣｌｙｎｅｓらのＰｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されているような動物モデルにおいて評価することができる。また、Ｃ１ｑ結合アッセイを行って、抗体がＣ１ｑに結合できないこと、それ故ＣＤＣ活性を欠くことを確認することもできる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施することができる（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)、Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003)、及びCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)を参照）。また、ＦｃＲｎ結合及びｉｎ  ｖｉｖｏクリアランス／半減期の決定も、当分野で既知の方法を用いて行うことができる（例えばPetkova, S.B. et al., Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)；国際公開第２０１３／１２０９２９号参照）。
【０１６４】
エフェクター機能が低下した抗体には、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９のうちの１つ以上の置換を伴うものが含まれる（米国特許第６７３７０５６号）。このようなＦｃ突然変異体には、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体を含め、アミノ酸２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７位のうちの２つ以上において置換を有するＦｃ突然変異体が含まれる（米国特許第７３３２５８１号）。
【０１６５】
ＦｃＲへの結合が改善又は減少した特定の抗体バリアントが記載されている。（例えば米国特許第６７３０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びShields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)を参照）。
【０１６６】
特定の実施態様では、抗体バリアントは、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えばＦｃ領域の２９８、３３３及び／又は３３４位（残基のＥＵ番号付け）における置換を有するＦｃ領域を含む。
【０１６７】
特定の実施態様では、抗体バリアントは、ＦｃＲｎ結合を増加させる１つ以上のアミノ酸置換、例えばＦｃ領域の２５２及び／又は２５４及び／又は２５６位（残基のＥＵ番号付け）における置換を有するＦｃ領域を含む。特定の実施態様では、抗体バリアントは、２５２、２５４及び２５６位にアミノ酸置換を有するＦｃ領域を含む。ある実施態様では、これらの置換は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域のＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅである。
【０１６８】
特定の実施態様では、抗体バリアントは、ＦｃγＲ結合を減少させるアミノ酸置換、例えばＦｃ領域の２３４位及び２３５位（残基のＥＵ番号付け）における置換を有するＦｃ領域を含む。ある実施態様では、これらの置換は、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）である。特定の実施態様では、抗体バリアントは、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域にＤ２６５Ａ及び／又はＰ３２９Ｇをさらに含む。ある実施態様では、これらの置換は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡ−ＰＧ）である。（例えば国際公開第２０１２／１３０８３１号参照）別の実施態様では、これらの置換は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＤ２６５Ａ（ＬＡＬＡ−ＤＡ）である。
【０１６９】
いくつかの実施態様では、Ｆｃ領域において、例えば米国特許第６１９４５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びＩｄｕｓｏｇｉｅらのＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８−４１８４（２０００）に記載のように、変更された（すなわち改善されたか減少した）Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をもたらす変更がなされる。
【０１７０】
半減期が延長され、母体ＩｇＧの胎児への移行に関与する（Guyer et al.,J. Immunol. 117:587 (1976)及びＫｉｍet al.,J. Immunol. 24:249 (1994)）新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号（Hinton et al.）に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する１つ以上の置換を伴うＦｃ領域を含む。このようなＦｃバリアントには、Ｆｃ領域残基２３８、２５２、２５４、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４のうちの１又は複数における置換を有するものが含まれる（例えば米国特許第７３７１８２６号；Dall’Acqua, W.F., et al. J. Biol. Chem. 281 (2006) 23514-23524参照）。
【０１７１】
マウスＦｃ−マウスＦｃＲｎ相互作用に重要なＦｃ領域残基は、部位特異的突然変異誘発によって同定されている（例えばDall’Acqua, W.F., et al. J. Immunol 169 (2002) 5171-5180参照）。この相互茶寮には、残基Ｉ２５３、Ｈ３１０、Ｈ４３３、Ｎ４３４及びＨ４３５（ＫａｂａｔによるＥＵ番号付け）が関与している（Medesan, C., et al., Eur. J. Immunol. 26 (1996) 2533; Firan, M., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993; Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 24 (1994) 542）。残基Ｉ２５３、Ｈ３１０及びＨ４３５は、ヒトＦｃとマウスＦｃＲｎの相互作用に重要であることが判明した（Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999 ; 2819）。ヒトＦｃ−ヒトＦｃＲｎ複合体の研究により、この相互作用には残基Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｈ４３５及びＹ４３６が重要であることが示されている（Firan, M., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993; Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604）。Ｙｅｕｎｇ，Ｙ．Ａ．らのＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８２（２００９）７６６７−７６７１には、残基２４８〜２５９及び３０１〜３１７及び３７６〜３８２及び４２４〜４３７の様々な突然変異体が報告及び調査されている。
【０１７２】
特定の実施態様では、抗体バリアントは、ＦｃＲｎ結合を減させる１つ以上のアミノ酸置換、例えばＦｃ領域の２５３位及び／又は３１０位及び／又は４３５位（残基のＥＵ番号付け）における置換を有するＦｃ領域を含む。特定の実施態様では、抗体バリアントは、２５３、３１０及び４３５位にアミノ酸置換を有するＦｃ領域を含む。ある実施態様では、これらの置換は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域のＩ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａである。例えばＧｒｅｖｙｓ，Ａ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９４（２０１５）５４９７−５５０８を参照されたい。
【０１７３】
特定の実施態様では、抗体バリアントは、ＦｃＲｎ結合を減させる１つ以上のアミノ酸置換、例えばＦｃ領域の３１０位及び／又は４３３位及び／又は４３６位（残基のＥＵ番号付け）における置換を有するＦｃ領域を含む。特定の実施態様では、抗体バリアントは、３１０、４３３及び４３６位にアミノ酸置換を有するＦｃ領域を含む。ある実施態様では、これらの置換は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域のＨ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａである例えば国際公開第２０１４／１７７４６０号参照）。
【０１７４】
Ｆｃ領域バリアントのその他の例に関しては、Ｄｕｎｃａｎ  ＆  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：７３８−４０（１９８８）、米国特許第５６４８２６０号、米国特許第５６２４８２１号、及び国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと。
【０１７５】
Ｂ．組換え方法及び組成物
抗体は、例えば米国特許第４８１６５６７号に記載されているような組換え方法及び組成物を用いて製造することができる。これらの方法のために、抗体をコードする１つ以上の単離された核酸が提供される。
【０１７６】
天然抗体又は天然抗体断片の場合、２つの核酸が必要であり、１つは軽鎖又はその断片用で、もう１つは重鎖又はその断片用である。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び／又はＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖（複数可））をコードする。これらの核酸は、同じ発現ベクター上にあっても、異なる発現ベクター上にあってもよい。
【０１７７】
ヘテロ二量体重鎖を有する二重特異性抗体の場合、４つの核酸、すなわち、第１の軽鎖に１つ、第１のヘテロ単量体Ｆｃ領域ポリペプチドを含む第２の軽鎖に１つ、第２の軽鎖に１つ、及び第２のヘテロ単量体Ｆｃ領域ポリペプチドを含む第２の重鎖に１つ、必要である。４つの核酸は、１つ以上の核酸分子又は発現ベクターの中に含まれ得る。このような核酸（複数可）は、抗体の第１のＶＬを含むアミノ酸配列、及び／又は第１のヘテロ単量体Ｆｃ領域を含む第１のＶＨを含むアミノ酸配列、及び／又は第２のＶＬを含むアミノ酸配列、及び／又は第２のヘテロ単量体Ｆｃ領域を含む第２のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の第１及び／若しくは第２の軽鎖、並びに／又は第１及び／若しくは第２の重鎖）をコードする。これらの核酸は、同じ発現ベクター上にあっても、異なる発現ベクター上にあってもよく、通常、これらの核酸は、２つ又は３つの発現ベクター上に位置し、すなわち、１つのベクターがこれらの核酸を２つ以上含んでもよい。これらの二重特異性抗体の例は、ＣｒｏｓｓＭａｂ及びＴ細胞二重特異性物（bispecifics）である（例えばSchaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-1191参照）。例えば、ヘテロ単量体重鎖の一方は、いわゆる「ノブ突然変異」（Ｔ３６６Ｗ、場合によってはこれに加えて、Ｓ３５４Ｃ又はＹ３４９Ｃの一方）を含み、他方は、いわゆる「ホール突然変異」（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ、場合によってはこれらに加えてＹ３４９Ｃ又はＳ３５４Ｃ）を含む（例えばCarter, P. et al., Immunotechnol. 2 (1996 ; 73参照）。
【０１７８】
一実施態様では、本明細書で報告される方法で使用される抗体をコードする単離された核酸が提供される。
【０１７９】
さらなる実施態様において、このような核酸を含む１以上のベクター（例えば発現ベクター）が提供される。
【０１８０】
さらなる実施態様では、このような核酸（複数可）を含む宿主細胞が提供される。
【０１８１】
一実施態様では、宿主細胞は以下を含む（例えば、以下で形質転換されている）：
−  ジスルフィド結合した２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖から構成される抗体又はその断面を含むＶＨとＶＬの場合、
（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列と抗体のＶＨを含むアミノ酸配列とをコードする核酸を含むベクター、又は
（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクターと、抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクター；
−  ヘテロ二量体重鎖を持つ二重特異性抗体の場合、
（１）一方が抗体の第１のＶＬを含み他方が第１のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする第１の核酸対を含む第１の核酸対を含む第１のベクターと、一方が抗体の第２のＶＬを含み他方が第２のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする第２の核酸対とを含む第２のベクター；又は
（２）可変ドメインの１つ（好ましくは軽鎖可変ドメイン）を含むアミノ酸配列をコードする第１の核酸を含む第１のベクター、一方が軽鎖可変ドメインを含み他方が第１の重鎖可変ドメインを含むアミノ酸配列をコードする核酸対を含む第２のベクター、及び一方が、第２のベクターにあるように、対応する他方の軽鎖可変ドメインを含みもう一方は第２の重鎖可変ドメインを含むアミノ酸配列をコードする核酸対を含む第３のベクター、又は
（３）抗体の第１のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター、抗体の第１のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクター、抗体の第２のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第３のベクター、及び抗体の第２のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第４のベクター。
【０１８２】
一実施態様において、宿主細胞は、真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はリンパ系細胞（例えばＹ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施態様において、上述のように、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を抗体の発現に適した条件下で培養することと、任意選択的に宿主細胞（又は宿主細胞培地）から抗体を回収することとを含む、抗ＬＡＧ３抗体を作製する方法が提供される。
【０１８３】
抗ＬＡＧ３抗体の組換え生産のために、抗体をコードする核酸が、例えば上述のように単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニング及び／又は発現のために、１以上のベクターに挿入される。このような核酸は、容易に単離することができ、一般的な手順を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定することができる。
【０１８４】
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適した宿主細胞は、本明細書に記載の原核生物細胞又は真核細胞を含む。例えば、特に、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要ない場合には、抗体は細菌内で生産され得る。細菌内での抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば米国特許第５６４８２３７号、同第５７８９１９９号、及び同第５８４０５２３号を参照。（また、大腸菌における抗体断片の発現を記載しているCharlton, K.A., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), p. 245-254も参照）。発現後、抗体は、可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離し、さらに精製することができる。
【０１８５】
原核生物に加えて、グリコシル化経路が「ヒト化」されていて、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす、真菌株及び酵母株を含めた糸状菌類又は酵母などの有用真核微生物も、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング宿主又は発現宿主である。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｔ．Ｕ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２（２００４）１４０９−１４１４；及びＬｉ，Ｈ．ら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４（２００６）２１０−２１５を参照のこと。
【０１８６】
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）からも得られる。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス株が同定されており、これらは特にヨトウガ（Spodoptera frugiperda）細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と併せて使用することができる。
【０１８７】
植物細胞培養物を宿主として利用することもできる。例えば、米国特許第５９５９１７７６号、同第６０４０４９８号、同第６４２０５４８号、同第７１２５９７８号及び同第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体産生のためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。
【０１８８】
脊椎動物細胞も宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は、有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（例えば、Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74）に記載された２９３細胞又は２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスのセルトリ細胞（例えば、Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252)に記載されるＴＭ４細胞）；サル腎細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；例えばＭａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．ら，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３（１９８２）４４−６８に記載のＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220）；並びにＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が含まれる。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞株の総説については、例えばＹａｚａｋｉ，Ｐ．及びＷｕ，Ａ．Ｍ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２４８巻，Ｌｏ，Ｂ．Ｋ．Ｃ．（編），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（２００４），ｐ．２５５−２６８を参照。
【０１８９】
Ｃ．アッセイ
本明細書で提供される抗ＬＡＧ３抗体が、同定され、当技術分野で既知の様々なアッセイによってその物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性について同定、スクリーニング又は特徴付けされ得る。
【０１９０】
１．結合アッセイ及びその他のアッセイ
一態様において、本発明の抗体は、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットなどの周知の方法により、その抗原結合活性について試験される。
【０１９１】
別の態様では、ＬＡＧ３への結合についてａＬＡＧ３（０４１４）と競合する抗体を同定するために、競合アッセイが使用され得る。特定の実施態様では、このような競合抗体は、ａＬＡＧ３（０４１４）によって結合される同じエピトープ（例えば直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的な方法が、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）「Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６６巻（ニュージャージー州トトワのＨｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）に提供されている。
【０１９２】
例示的な競合アッセイでは、ＬＡＧ３に結合する第１の標識化抗体と、ＬＡＧ３への結合について第１の抗体と競合する能力について試験される第２の非標識化抗体とを含む溶液中で、固定化ＬＡＧ３（例えばａＬＡＧ３（０４１４））をインキュベートする。第２の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在してもよい。コントロールとして、固定化ＬＡＧ３が、第１の標識化抗体を含むが第２の非標識化抗体は含まない溶液中でインキュベートされる。第１の抗体のＬＡＧ３への結合を許容する条件下でインキュベートした後、結合していない過剰な抗体が除去され、固定化ＬＡＧ３に結合した標識の量が測定される。固定化ＬＡＧ３に結合した標識の量が、コントロール試料と比較して、試験試料中で実質的に減少している場合、それは、ＬＡＧ３への結合について第２の抗体が第１の抗体と競合していることを示している。Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｃｈ．１４（ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバーのＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を参照。
【０１９３】
２．活性アッセイ
一態様では、アッセイは、生物学的活性を有するその抗（ＬＡＧ３）抗体（anti-LAG3 antibodies thereof）を同定するために提供される。生物学的活性には、混合リンパ球反応（ｍＭＬＲ）ａｓｓａにおけるヒトＣＤ４  Ｔ細胞による細胞傷害性グランザイムＢ放出及びＩＬ−２分泌に対する抗ＬＡＧ３抗体（単独又は抗ＰＤＬ１抗体との組み合わせ）の効果、又はヒトＣＤ４  Ｔ細胞によるグランザイムＢのＴｒｅｇ抑制及びＩＦＮ−γ放出に対する抗ＬＡＧ３抗体の効果、又は抗ＬＡＧ３抗体によるヒトＡ３７５腫瘍細胞で発現したＭＨＣ−ＩＩへのＬＡＧ−３結合の阻害が含まれ得る。ｉｎ  ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでこのような生物学的活性を有する抗体が提供される。
【０１９４】
ある実施態様では、本発明の抗体は、このような生物学的活性について試験される。詳細については、下記の実施例２及び３を参照されたい。
【０１９５】
Ｄ．診断及び検出のための方法及び組成物
特定の実施態様では、本明細書において提供される抗ＬＡＧ３抗体のいずれもが、生物学的試料中のＬＡＧ３の存在を検出するために有用である。本明細書で使用する「検出」という用語は、定量的又は定性的検出を包含する。特定の実施態様において、生物学的試料は、細胞又は組織を含む。
【０１９６】
一実施態様では、診断又は検出の方法における使用のための抗ＬＡＧ３抗体が提供される。さらなる態様では、生物学的試料におけるＬＡＧ３の存在を検出する方法が提供される。特定の実施態様では、該方法は、生物学的試料を、抗ＬＡＧ３抗体のＬＡＧ３への結合を許容する条件下で本明細書に記載される抗ＬＡＧ３抗体と接触させること、及び抗ＬＡＧ３抗体とＬＡＧ３の間に複合体が形成されているかどうかを検出することを含む。このような方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法又はｉｎ  ｖｉｖｏ法であり得る。一実施態様では、抗ＬＡＧ３抗体は、抗ＬＡＧ３抗体を用いる療法に適した対象を選択するために使用され、例えばＬＡＧ３は患者の選択のためのバイオマーカーである。
【０１９７】
本発明の抗体を用いて診断され得る例示的な障害には、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）乳がんなどの様々な形態のがんが含まれる（下記のがんのリストも参照）。
【０１９８】
特定の実施態様では、標識化抗ＬＡＧ３抗体が提供される。標識には、限定されないが、（例えば蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、放射性標識等の）直接検出される標識又は部分、及び、例えば酵素反応又は分子間相互作用を介して間接的に検出される酵素又はリガンドなどの部分が含まれる。例示的な標識には、限定されないが、ラジオアイソトープ３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシェフェラーゼ、例えばホタルルシェフェラーゼ及び細菌ルシェフェラーゼ（米国特許第４７３７４５６号）、ルシェフェリン、２，３−ジヒドロフタルジネジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ（例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、色素前駆体（例えばＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ又はマイクロペルオキシダーゼ等）を酸化させるため過酸化水素を利用し、酵素とカップリングさせた複素環式オキシダーゼ（例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ）、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定な遊離ラジカル等が含まれる。
【０１９９】
Ｅ．薬学的製剤
本明細書に記載の抗ＬＡＧ３抗体の薬学的製剤は、所望の程度の純度を有する当該抗体を１種以上の任意選択的な薬学的に許容される担体と混合することによって（Remington’s Pharmaceutical Sciencesth 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) edition, Osol, A. Ed. (1980)）、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態に調製される。通常、薬学的に許容される担体は、用いられる用量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、限定されるものではないが、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（例えばオクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド；ベンゼトニウムクロリド、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及びその他の糖質；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体には、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）などの介在性薬物分散剤、例えばｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質がさらに含まれる。ｒＨｕＰＨ２０を含む特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法については、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１種以上のさらなるグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
【０２００】
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性抗体製剤には、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤にはヒスチジン−酢酸バッファーが含まれる。
【０２０１】
本明細書中の製剤はまた、治療される特定の適応症に必要な２種以上の活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものを含有してもよい。例えば、抗ＰＤ１若しくは抗ＰＤＬ１抗体又は抗ＴＩＭ３抗体をさらに提供することが望ましい場合がある。そのような活性成分は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
【０２０２】
活性成分は、例えばコアセルベーション技術又は界面重合法によって調製されたマイクロカプセル（例えばそれぞれ、ヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセル又はゼラチン−マイクロカプセル、ポリ−（メチルメタクリレート）（poly-(methylmethacylate)）マイクロカプセル）に、コロイド薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）に、又はマクロエマルジョンに封入することができる。これらの技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１６版  Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０）に開示されている。
【０２０３】
徐放性調製物が調製されてもよい。徐放性調製物の好適な例には、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、このマトリックスは成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。
【０２０４】
通常、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は、滅菌されている。滅菌状態は、例えば滅菌濾過膜を通す濾過により容易に達成することができる。
【０２０５】
Ｆ．治療方法及び組成物
本明細書に提供される抗ＬＡＧ３抗体のいずれも、治療方法において使用され得る。
【０２０６】
一態様では、医薬としての使用のための抗ＬＡＧ３抗体が提供される。さらなる一態様では、抗ＬＡＧ３抗体又はがんを治療することにおける使用が提供される。ある実施態様において、治療の方法における使用のための抗ＬＡＧ３抗体が提供される。ある実施態様において、本発明は、がんを有する個体に抗ＬＡＧ３抗体の有効量を投与することを含む、該個体を治療する方法における使用のための抗ＬＡＧ３抗体を提供する。一実施態様では、該抗体は、腫瘍免疫などの免疫関連疾患を治療すること、又はその進行を遅延させることにおける使用のためのものである。一実施態様では、該抗体は、Ｔ細胞活性などの免疫応答又は機能の刺激における使用のためのものである。
【０２０７】
さらなる実施態様において、本発明は、免疫刺激剤としての使用のため／或いはグランザイムＢ（ＧｒｚＢ）；インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）及び／又はインターロイキン２（ＩＬ−２）の分泌／放出を刺激するための抗ＬＡＧ３抗体を提供する。特定の実施態様では、本発明は、個体におけるグランザイムＢ（ＧｒｚＢ）、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）及び／又はインターロイキン２（ＩＬ−２）の分泌／放出の方法であって、グランザイムＢ（ＧｒｚＢ）、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）及び／又はインターロイキン２（ＩＬ−２）の分泌／放出のための有効量の抗ＬＡＧ３抗体（an effective of the the anti-LAG3 antibody）を該個体に投与することを含む方法における使用のための抗ＬＡＧ３抗体を提供する。
【０２０８】
上記のいずれの実施態様に記載の「個体」も、好ましくはヒトである。さらなる態様では、本発明は、医薬の製造又は調製における抗ＬＡＧ３抗体の使用を提供する。一実施態様において、該医薬は、がんの治療のためのものである。さらなる実施態様において、該医薬は、がんを有する個体に該医薬の有効量を投与することを含む、がんを治療する方法における使用のためのものである。さらなる実施態様において、該医薬は、がん細胞の細胞媒介性溶解を誘導するためのものである。さらなる実施態様において、該医薬は、がん細胞におけるアポトーシスを誘導するため／又はがん細胞増殖を阻害するために有効量の該医薬をがんに罹患している個体に投与することを含む、該個体におけるがん細胞の細胞媒介性溶解を誘導する方法における使用のためのものである。上記のいずれの実施態様に記載の「個体」も、ヒトであってよい。
【０２０９】
本明細書で使用される用語「がん」は、例えば、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞上皮細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚黒色腫又は眼球内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん（stomach cancer）、胃がん（gastric cancer）、結腸がん、乳がん、子宮がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓又は尿管のがん、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞がん、胆道がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍、脊椎腫瘍、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫、リンパ腫、リンパ性白血病（任意の、上記がんの難治性型、又は上記がんの１又は複数の組み合わせを含む）であり得る。好ましい一実施態様では、そのようながんは、乳がん、結腸直腸がん、黒色腫、頭頚部がん、肺がん又は前立腺がんである。好ましい一実施態様では、そのようながんは、乳がん、卵巣がん、子宮頚がん、肺がん又は前立腺がんである。別の好ましい実施態様では、そのようながんは、乳がん、肺がん、結腸がん、卵巣がん、黒色腫がん、膀胱がん、腎がん、腎臓がん、肝臓がん、頭頚部がん、結腸直腸がん、膵臓がん、胃がん、食道がん、中皮腫、前立腺がん、白血病、リンパ腫、骨髄腫である。好ましい一実施態様では、そのようながんは、ＬＡＧ３発現又は過剰発現によってさらに特徴付けられる。
【０２１０】
さらなる態様において、本発明は、がんを治療するための方法を提供する。一実施態様では、該方法は、がんを有する個体に有効量の抗ＬＡＧ３を投与することを含む。上記のいずれの実施態様に記載の「個体」も、ヒトであってよい。
【０２１１】
さらなる態様では、本発明は、がんに罹患している個体における癌細胞の細胞媒介性溶解を誘導するための方法を提供する。一実施態様では、該方法は、がんに罹患している個体におけるがん細胞の細胞媒介性溶解を誘導するために、有効量の抗ＬＡＧ３を該個体に投与することを含む。一実施態様において、「個体」はヒトである。
【０２１２】
さらなる態様では、本発明は、例えば、上記治療方法のいずれかにおける使用のための、本明細書で提供されている抗ＬＡＧ３抗体のいずれかを含む薬学的製剤を提供する。一実施態様において、薬学的製剤は、本明細書で提供されている抗ＬＡＧ３抗体のいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。
【０２１３】
さらなる態様では、本発明は、例えば、上記治療方法のいずれかにおける使用のための、本明細書で提供されている抗ＬＡＧ３抗体のいずれかを含む薬学的製剤を提供する。一実施態様において、薬学的製剤は、本明細書で提供されている抗ＬＡＧ３抗体のいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。別の実施態様では、薬学的製剤は、本明細書で提供されている抗ＬＡＧ３抗体のいずれかと、例えば後述のような少なくとも１種の追加的な治療剤とを含む。
【０２１４】
本発明の抗体は、単独で又は他の薬剤と組み合わせて治療において使用することができる。例えば、本発明の抗体は、少なくとも１種の追加の治療剤と共投与され得る。特定の実施態様では、追加の治療剤は、抗ＬＡＧ３又は抗ＰＤＬ１又はＴＩＭ３抗体である。
【０２１５】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体に加えて、化学療法剤も投与可能である。一実施態様では、そのような追加の化学療法剤は、本明細書に記載の抗ＬＡＧ３抗体と共に投与することができ、限定されないが、以下の抗腫瘍薬、すなわち、アルキル化剤：例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン及びクロラムブシル等のナイトロジェンマスタード類；カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）及びセムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）等のニトロソウレア類；テモダール（Temodal）（ＴＭ）（テモゾロミド（temozolamide））、トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、トリエチレン、チオホスホラミド（チオテパ）、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ、アルトレタミン）等のエチレンイミン類／メチルメラミン；ブスルファンなどのアルキルスルホネート；ダカルバジン（ＤＴＩＣ）などのトリアジン類、代謝拮抗薬：例えば、メトトレキサート及びトリメトレキサートなどの葉酸アナログ；５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、フルオロデオキシウリジン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ、シタラビン）、５−アザシチジン、２，２’−ジフルオロデオキシシチジン等のピリミジンアナログ；６−メルカプトプリン（6-merca.rho.topurine）、６−チオグアニン（thioguamne）、アザチオプリン、Ｔ−デオキシコホルマイシン（ペントスタチン）、エリトロヒドロキシノニルアデニン（ＥＨＮＡ）、リン酸フルダラビン及び２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン、２−ＣｄＡ）等のプリンアナログ、天然物：例えば、パクリタキセルなどの有糸分裂阻害剤；ビンブラスチン（ＶＬＢ）、ビンクリスチン及びビノレルビン等のビンカアルカロイド類；タキソテール、エストラムスチン及びエストラムスチンホスフェート；エトポシド及びテニポシドなどのポドフィロトキシン（pipodophylotoxins）；アクチノマイシンＤ、ダウノマイシン（ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ミトキサントロン、イダルビシン、ブレオマイシン類、プリカマイシン（ミトラマイシン）、マイトマイシンＣ及びアクチノマイシン等の抗生物質；Ｌ−アスパラギナーゼなどの酵素；インターフェロン−アルファ、ＩＬ−２、Ｇ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦ等の生体応答調節物質、その他の薬剤：例えば、オキサリプラチン、シスプラチン及びカルボプラチンなどの白金配位錯体；ミトキサントロンなどのアントラセンジオン類；ヒドロキシウレアなどの置換尿素；Ｎ−メチルヒドラジン（ＭＩＨ）及びプロカルバジンを含むメチルヒドラジン誘導体；ミトタン（ｏ、ｐ−ＤＤＤ）及びアミノグルテチミドなどの副腎皮質抑制剤、ホルモン及び拮抗薬：例えばプレドニゾン及びその等価物などの副腎皮質ステロイド拮抗薬；デキサメタゾン及びアミノグルテチミド；ジェムザール（ＴＭ）（ゲムシタビン）；ヒドロキシプロゲステロンカプロン酸エステル、メドロキシプロゲステロン酢酸エステル及び酢酸メゲストロールなどのプロゲスチン；ジエチルスチルベストロール及びエチニルエストラジオール等価物などのエストロゲン；タモキシフェンなどの抗エストロゲン；テストステロンプロピオン酸エステル及びフルオキシメステロン／等価物などのアンドロゲン；フルタミド、ゴナドトロピン放出ホルモンアナログ及びロイプロリド等の抗アンドロゲン；フルタミドなどの非ステロイド性抗アンドロゲンを含む。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、脱メチル化剤（例えばＶｉｄａｚａ）及び転写抑制解除（release of transcriptional repression）（ＡＴＲＡ）療法を含むがこれらに限定されないエピジェネティックなメカニズムを標的とする療法も、抗原結合タンパク質と組み合わせることができる。一実施態様では、化学療法剤は、タキサン類（例えばパクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテール）、改変された（modified）パクリタキセル（例えばアブラキサン及びオパキシオ））、ドキソルビシン、スニチニブ（スーテント）、ソラフェニブ（ネクサバール）及び他の多種キナーゼ阻害剤、オキサリプラチン、シスプラチン及びカルボプラチン、エトポシド、ゲムシタビン及びビンブラスチンから成る群より選択される。一実施態様では、化学療法剤は、タキサン類（例えばタキソール（パクリタキセル）、ドセタキセル（タキソテール）、改変されたパクリタキセル（例えばアブラキサン及びオパキシオ）から成る群より選択される。一実施態様では、追加的化学療法剤は、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコボリン、イリノテカン又はオキサリプラチンから選択される。一実施態様では、化学療法剤は、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、及びイリノテカン（ＦＯＬＦＩＲＩ）である。一実施態様では、化学療法剤は、５−フルオロウラシル及びオキサリプラチン（ＦＯＬＦＯＸ）である。
【０２１６】
上記のこうした併用療法は、併用投与（同じ又は別々の製剤に２種以上の治療剤が含まれている）及び単独投与（これは、追加の治療剤の投与前、投与と同時、及び／又は投与後に本発明の抗体の投与が起こり得る）を包含する。一実施態様において、抗ＬＡＧ３抗体の投与と追加の治療剤の投与は約１か月、又は約１、２若しくは３週間、又は１、２、３、４、５若しくは６日の間隔で生じる。本発明の抗体は、放射線療法と組み合わせて使用することもできる。
【０２１７】
本発明の抗体（及び任意の追加の治療剤）は、非経口、肺内、及び鼻腔内を含めた任意の適切な手段により投与することができ、また、局所治療が望まれるのであれば、病巣内投与であってもよい。非経口点滴は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与を含む。投薬は、その投与が短期間か又は長期であるかどうかに部分的に依存して、任意の適切な経路、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射により行うことができる。本明細書では、単回投与又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含むがこれらに限定されない様々な投与スケジュールが想定される。
【０２１８】
本発明の抗体は、医療実施基準に一致した様式で製剤化、調薬及び投与される。この観点において考慮すべき要素には、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程、及び医療従事者が知るその他の要素が含まれる。本発明の抗体は、必要ではないが任意選択的に、問題の障害の予防又は治療のために現在使用されている１種以上の薬剤と共に製剤化される。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害又は治療の種類、及び上述のその他の要素に応じて決まる。このような他の薬剤は一般に、本明細書に記載されているのと同じ用量及び投与経路で、又は本明細書に記載の投与量の約１％〜９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の投与量及び経路で使用される。
【０２１９】
疾患の予防又は治療に関し、本発明の抗体の（単独での使用又は１種以上の他の追加的治療剤との併用の際の）適切な投与量は、治療される疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体が予防又は治療のどちらの目的で投与されるか、従前の治療、患者の病歴及び抗体に対する応答、並びに主治医の裁量によって決定されるであろう。本発明の抗体は、単回又は一連の治療にわたって患者へ適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば単回又は複数回の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が患者への投与のための初期候補用量となり得る。１つの典型的な１日用量は、上記の要素に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である。数日以上にわたる反復投与に関しては、病状に応じて、治療は一般に疾患症状の望まれる抑制が起こるまで継続されるものとする。抗体の１つの例示的な投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ（又はこれらの任意の組み合わせ）の１又は複数の用量を患者に投与することができる。このような用量は断続的に、例えば毎週又は３週毎（例えば患者が約２〜約２０用量、又は例えば約６用量の抗体を受けるように）投与してもよい。初回の高負荷用量の後、それより低い用量を１以上投与してもよい。例示的な投与レジメンは、投与することを含む。しかしながら、他の投与レジメンも有用であり得る。この療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニターされる。
【０２２０】
上記の製剤又は治療方法のいずれも、抗ＬＡＧ３抗体の代わりに又はそれに加えて本発明のイムノコンジュゲートを用い、行うことができる。
【０２２１】
Ｇ．製造品
本発明の別の態様では、上述した障害の治療、予防及び／又は診断に有用な物質を含有する製造品が提供される。製造品は、容器と、容器に貼られているか又は付随しているラベル又は添付文書とを備える。好適な容器には、例えば瓶、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグ等が含まれる。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、病状の治療、予防及び／又は診断に効果的である、単独の又は別の組成物と併用の組成物を収容し、滅菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってもよい）。該組成物中の少なくとも１種の活性剤は、本発明の抗体である。ラベル又は添付文書は、最適な病状の治療のために該組成物が使用されることを示している。さらに、製造品は、（ａ）本発明の抗体を含む組成物が中に収容されている第１の容器；及び（ｂ）さらなる細胞傷害性又はその他の治療剤を含む組成物が中に収容されている第２の容器を備え得る。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の病状を治療するために使用できることを示す添付文書をさらに備えてもよい。代替的に又は追加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー（例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液）を収容する第２（又は第３）の容器をさらに備えてもよい。製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む、商業的及びユーザーの観点から望ましい他の材料をさらに備えてもよい。
【０２２２】
0006871415.tif 000004
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【０２２３】
以下に、抗ＬＡＧ３抗体ａＬＡＧ３（０４０３）からａＬＡＧ３（０４１７）のマークされたＨＶＲ（太字、下線付き文字のＨＶＲ）を含むＶＨ及びＶＬドメインのアミノ酸配列を列挙する。
１）ａＬＡＧ３（０４０３）
配列番号１５：ＶＨ
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYTMHWVRQAPGKGLEWVSLVSWDGGGTYYTNSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAKAITDTSLYGYDYWGQGILVTVSS
配列番号１６：ＶＨ
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGNAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYSTPLTFGGGTKVEIK
２）ａＬＡＧ３（０４１１）
配列番号２３：ＶＨ
EVHLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFIVDDYTMNWVRQAPGKGLEWVSVISWDGGATYYADSVKGRFTISRDDFKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGLTDDTLYGSDYWGQGTLVTVSS
配列番号２４：ＶＬ
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIVSYLNWYQQKPGKAPKLLIYASSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYSTPLTFGGGTKVEIK
３）ａＬＡＧ３（０４１４）
配列番号７：ＶＨ
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFIFDDYTMNWVRQAPGKGLEWVAVISWDGGGTYYTDSVKGRFTISRDDFKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGLTDTTLYGSDYWGQGTLVTVSS
配列番号８：ＶＬ
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYSSPLTFGGGTKVEIK
４）ａＬＡＧ３（０４１６）
配列番号３９：ＶＨ
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLACAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVSGIDNSGYYTYYTDSVKGRFTISRDDVKNTLYLQMNSLRAEDTAVYLCTKTHSGLIVNDAFDIWGQGTMVTVSS
配列番号４０：ＶＬ
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDATLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK
５）  ａＬＡＧ３（０４１７）
配列番号３１：ＶＨ
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLACAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVSGIDNSGYYTYYTDSVKGRFTISRDDVKNTLYLQMNSLRAEDTAVYLCTKTHSGLIVNDAFDIWGQGTMVTVSS
配列番号３２：ＶＬ
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYSTPLTFGGGTKVEIK
【０２２４】
本発明の特定の実施態様を以下に列挙する。
１．ヒトＬＡＧ３に結合する単離された抗体であって、
Ａ）（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、又は
Ｂ）（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、又は
Ｃ）（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、又は
Ｄ）（ａ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、又は
Ｅ）（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む抗体。
【０２２５】
２．ヒトＬＡＧ３に結合する単離された抗体であって、
Ａ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｂ）（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号１１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｃ）（ａ）（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列番号１９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｄ）（ａ）（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列番号２７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
Ｅ）（ａ）（ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列番号３５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインと
を含む抗体。
【０２２６】
３．ヒトＬＡＧ３に結合する単離された抗体であって、
ｉ）配列番号７の配列と比較して９５％、９６％、９７％又は９８％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨドメインと、配列番号８の配列と比較して９５％、９６％、９７％又は９８％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬドメインとを含むか、
ｉｉ）配列番号１５の配列と比較して９５％、９６％、９７％又は９８％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨドメインと、配列番号１６の配列と比較して９５％、９６％、９７％又は９８％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬドメインとを含むか、
ｉｉｉ）配列番号２３の配列と比較して９５％、９６％、９７％又は９８％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨドメインと、配列番号２４の配列と比較して９５％、９６％、９７％又は９８％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬドメインとを含むか、
ｉｖ）配列番号３１の配列と比較して９５％、９６％、９７％又は９８％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨドメインと、配列番号３２の配列と比較して９５％、９６％、９７％又は９８％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬドメインとを含むか、又は
ｖ）配列番号３９の配列と比較して９５％、９６％、９７％又は９８％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨドメインと、配列番号４０の配列と比較して９５％、９６％、９７％又は９８％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬドメインとを含む抗体。
【０２２７】
４．ヒトＬＡＧ３に結合する単離された抗体であって、
Ａ）（ａ）配列番号７の配列と比較して９５％、９６％、９７％又は９８％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨドメイン及び配列番号８の配列と比較して９５％、９６％、９７％又は９８％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬドメインであって、ＶＨドメインが（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、（ｂ）ＶＬドメインが（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、
ＶＨドメイン及びＶＬドメインを含むか、
Ｂ）（ａ）配列番号１５の配列と比較して９５％、９６％、９７％又は９８％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨドメイン及び配列番号１６の配列と比較して９５％、９６％、９７％又は９８％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬドメインであって、ＶＨドメインが（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号１１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、（ｂ）ＶＨドメインが（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、
ＶＨドメイン及びＶＬドメインを含むか、
Ｃ）（ａ）配列番号２３の配列と比較して９５％、９６％、９７％又は９８％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨドメイン及び配列番号２４の配列と比較して９５％、９６％、９７％又は９８％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬドメインであって、ＶＨドメインが（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号１９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、（ｂ）ＶＬドメインが（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、
ＶＨドメイン及びＶＬドメインを含むか、
Ｄ）（ａ）配列番号３１の配列と比較して９５％、９６％、９７％又は９８％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨドメイン及び配列番号３２の配列と比較して９５％、９６％、９７％又は９８％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬドメインであって、ＶＨドメインが（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号２７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、（ｂ）ＶＬドメインが（ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、
ＶＨドメイン及びＶＬドメインを含むか、
Ｅ）（ａ）配列番号３９の配列と比較して９５％、９６％、９７％又は９８％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨドメイン及び配列番号４０の配列と比較して９５％、９６％、９７％又は９８％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬドメインであって、ＶＨドメインが（ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号３５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、（ｂ）ＶＬドメインが（ｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２及び（ｉｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、
ＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む、抗体。
【０２２８】
５．ヒトＬＡＧ３に結合する単離された抗体であって、
ｉ）配列番号７のＶＨ配列と配列番号８のＶＬ配列とを含むか、
ｉｉ）配列番号１５のＶＨ配列と配列番号１６のＶＬ配列とを含むか、
ｉｉｉ）配列番号２３のＶＨ配列と配列番号２４のＶＬ配列とを含むか、
ｉｖ）配列番号３１のＶＨ配列と配列番号３２のＶＬ配列とを含むか、又は
ｖ）配列番号３９のＶＨ配列と配列番号４０のＶＬ配列とを含む、
抗体。
【０２２９】
６．配列番号７のＶＨ配列と配列番号８のＶＬ配列とを含む、ヒトＬＡＧ３に結合する単離された抗体。
【０２３０】
７．配列番号１５のＶＨ配列と配列番号１６のＶＬ配列とを含む、ヒトＬＡＧ３に結合する単離された抗体。
【０２３１】
８．配列番号２３のＶＨ配列と配列番号２４のＶＬ配列とを含む、ヒトＬＡＧ３に結合する単離された抗体。
【０２３２】
９．配列番号３１のＶＨ配列と配列番号３２のＶＬ配列とを含む、ヒトＬＡＧ３に結合する単離された抗体。
【０２３３】
１０．配列番号３９のＶＨ配列と配列番号４０のＶＬ配列とを含む、ヒトＬＡＧ３に結合する単離された抗体。
【０２３４】
１１．先行する実施形態のいずれか１つによる抗ＬＡＧ３抗体であって、以下の特性：
ｉ）ＬＡＧ３への結合について、配列番号７のアミノ酸配列を持つＶＨと配列番号８のアミノ酸配列を持つＶＬとを含む抗ＬＡＧ３抗体と競合する
ｉｉ）ヒト及びカニクイザルＬＡＧ３に結合する
ｉｉｉ）ヒトＡ３７５腫瘍細胞で発現したＭＨＣ−ＩＩの結合を阻害する
ｉｖ）（実施例３に示すように）混合リンパ球反応（ｍＭＬＲ）アッセイでグランザイムＢ又はＩＬ−２の放出を増加させる
のうちの１つ以上によって独立に特徴付けられる抗体。
【０２３５】
１２．ヒトＬＡＧ３に結合する単離された抗体であって、
ｉ）ＬＡＧ３への結合について、配列番号７のアミノ酸配列を持つＶＨと配列番号８のアミノ酸配列を持つＶＬとを含む抗ＬＡＧ３抗体と競合し、且つ／又は
ｉｉ）ヒト及びカニクイザルＬＡＧ３に結合し、且つ／又は
ｉｉｉ）ヒトＡ３７５腫瘍細胞で発現したＭＨＣ−ＩＩの結合を阻害し、且つ／又は
ｉｖ）（実施例３に示すように）混合リンパ球反応（ｍＭＬＲ）アッセイでグランザイムＢ又はＩＬ−２の放出を増加させる
抗体。
【０２３６】
１３．モノクローナル抗体である、先行する実施態様のいずれか一つに記載の抗体。
【０２３７】
１４．ヒト、ヒト化又はキメラ抗体である、先行する実施態様のいずれか一つに記載の抗体。
【０２３８】
１５．ＬＡＧ３に結合する抗体断片である、先行する実施態様のいずれか一つに記載の抗体。
【０２３９】
１６．完全長ＩｇＧ１抗体である、先行する実施態様のいずれか一つに記載の抗体。
【０２４０】
１７．突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有する完全長ＩｇＧ１抗体である、先行する実施態様のいずれか一つに記載の抗体。
【０２４１】
１８．先行する実施態様のいずれか一つに記載の抗体をコードする、単離された核酸。
【０２４２】
１９．実施態様１８に記載の核酸を含む宿主細胞。
【０２４３】
２０．抗体が産生されるように実施態様１９に記載の宿主細胞を培養することを含む、抗体を産生する方法。
【０２４４】
２１．宿主細胞から抗体を回収することをさらに含む、実施態様２０に記載の方法。
【０２４５】
２２．実施態様１から１７のいずれか一つに記載の抗体と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的製剤。
【０２４６】
２３．医薬としての使用のための、実施態様１から１７のいずれか一つに記載の抗体。
【０２４７】
２４．がんの治療における使用のための、実施態様１から１７のいずれか一つに記載の抗体。
【０２４８】
２５．医薬の製造における、実施態様１から１７のいずれか一つに記載の抗体の使用。
【０２４９】
２６．医薬ががんの治療のためである、実施態様２５に記載の使用。
【０２５０】
２７．がんを有する個体を治療する方法であって、実施態様１に記載の抗体の有効量を該個体に投与することを含む、方法。
【０２５１】
２８．腫瘍免疫などの免疫関連疾患を治療する方法又は該疾患の進行を遅延させる方法であって、実施態様１に記載の抗体の有効量を該個体に投与することを含む、方法。
【０２５２】
２９．Ｔ細胞活性などの免疫応答又は機能を刺激する方法であって、実施態様１に記載の抗体の有効量を該個体に投与することを含む、方法。
【実施例】
【０２５３】
ＩＩＩ．実施例
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施されうることが理解される。
【０２５４】
前述の発明は明確な理解のために例示及び実例によって幾分詳細に説明されているが、これらの説明及び実例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書に引用されるすべての特許及び科学文献の開示内容は、その全体が出典明示により本明細書に援用される。
【０２５５】
実施例１：抗ＬＡＧ３抗体の生成
ウサギの免疫化
ヒト化抗体レパートリーを発現するロシュ独自のトランスジェニックウサギを、プラスミドＤＮＡを発現するＬＡＧ３で免疫した。
【０２５６】
３匹のウサギのセットを、完全長ヒトＬＡＧ３をコードするプラスミド発現ベクター（１５３５２＿ｐＩｎｔｒｏｎＡ＿ｆｌ−ｈＬａｇ３＿ＤＮＡ−ＩＭＳ）を使用して、４００μｇのベクターＤＮＡの皮内塗布とそれに続くエレクトロポレーション（７５０Ｖ／ｃｍの５スクエアパルス、持続時間１０ミリ秒、間隔１秒）によって、遺伝的に免疫した。ウサギは、０、１４、２８、４９、７０、９８及び１２６日目に７回連続して免疫を受けた。血液（推定総血液量の１０％）が５、７７、１０５、１３３日目に採取された。ＥＬＩＳＡによる力価測定に使用される血清を調製し（下記参照）、末梢単核細胞を単離し、それを以下のＢ細胞クローニング法において抗原特異的Ｂ細胞の供給源として使用した。
【０２５７】
血清力価の測定（ＥＬＩＳＡ）
９６ウェルＮＵＮＣ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート上に、１００μｌ／ウェルＰＢＳでヒト組換えＬＡＧ３タンパク質２μｇ／ｍｌを固定し、その後に、プレートを２％Ｃｒｏｔｅｉｎ  Ｃを含む２００μｌ／ウェルＰＢＳ中でブロッキング；抗血清の段階希釈液を、２回繰り返して０．５％Ｃｒｏｔｅｉｎ  Ｃを含む１００μｌ／ウェルＰＢＳに塗布；それぞれが０．５％Ｃｒｏｔｅｉｎ  Ｃを含む１００μｌ／ウェルＰＢＳで希釈された（１）ＨＲＰコンジュゲートロバ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ／Ｄｉａｎｏｖａ  ７１１−０３６−１５２；１／１６  ０００）、又は（２）ＨＲＰコンジュゲートウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ３１４２３；１／５０００）、又は（３）ビオチン化ヤギ抗ヒトカッパ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ／Ｂｉｏｚｏｌ  ２０６３−０８，１／５  ０００）のいずれか及びストレプトアビジン−ＨＲＰで検出する工程が続いた。全工程について、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。各工程の合間に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳでプレートを３回洗浄した。シグナルは、ＢＭ  Ｂｌｕｅ  ＰＯＤ可溶性基質（ロッシュ）１００μｌ／ウェルの添加により現れ、１Ｍ  ＨＣｌを１００μｌ／ウェル添加することによって停止された。６９０ｎｍを基準として、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。力価は、最大シグナルの半分をもたらす血清の希釈と定義された。
【０２５８】
ウサギ末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離
免疫トランスジェニックウサギの血液試料を採取した。全血を含むＥＤＴＡを１×ＰＢＳ（オーストリア、パッシングのＰＡＡ社）で２倍希釈した後、製造業者の仕様書に従って、哺乳動物のリンパ球を用いる密度遠心分離を行った。ＰＢＭＣを１×ＰＢＳで２回洗浄した。
【０２５９】
ＥＬ−４  Ｂ５培地
１０％ＦＣＳ（米国ユタ州ローガンのＨｙｃｌｏｎｅ社）、２ｍＭグルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（オーストリア、パッシングのＰＡＡ社）、２ｍＭ  ピルピン酸ナトリウム、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ドイツ、アイデンバッハのＰＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）及び０，０５ｍＭ  ｂ−メルカプトエタノール（スコットランド、ペイズリーのＧｉｂｃｏ社）を補充したＲＰＭＩ  １６４０（ドイツ、アイデンバッハのＰａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を使用した。
【０２６０】
タンパク質抗原によるプレートのコーティング
滅菌細胞培養６ウェルプレートを、炭酸バッファー（０，１Ｍ重炭酸ナトリウム、３４ｍＭ炭酸水素二ナトリウム（Disodiumhydrogencarbonate）、ｐＨ９，５５）中、ヒトＦｃ部分（２μｇ／ｍｌ）にコンジュゲートしたヒトＬＡＧ３  ＥＣＤで、４℃で一晩コーティングした。プレートを使用前に、滅菌ＰＢＳで３回洗浄した。
【０２６１】
細胞の枯渇
（ａ）ＣＨＯ細胞のコンフルエントな単層で覆われた滅菌６ウェルプレート（細胞培養グレード）を使用して、非特異的接着及び非特異的結合リンパ球を介してマクロファージ／単球を枯渇させた。
（ｂ）空の滅菌６ウェルプレート（細胞培養グレード）を使用して、マクロファージ、単球及びその他の細胞を非特異的接着により枯渇させた。
ＰＢＭＣ試料の半分を（ａ）に、残りの半分を（ｂ）に使用した。
各ウェルに最大で４ｍｌの培地と最大６×１０６の免疫ウサギからのＰＢＭＣを充填し、インキュベーター内で３７℃で１時間結合させた。上清中の細胞（末梢血リンパ球（ＰＢＬ））を抗原パニング工程に使用した。
【０２６２】
ＬＡＧ３抗原上のＢ細胞の濃縮
タンパク質抗原
ＬＡＧ３−ＥＣＤ−ｈｕＦｃタンパク質でコーティングされた６ウェル組織培養プレートに、空の６ウェルプレートを使用した枯渇工程からの培地４ｍｌあたり最大６×１０ｅ６  ＰＢＬを播種し、インキュベーター内で３７℃で１時間結合させた。ウェルを慎重に１×ＰＢＳで１〜２回洗浄することにより、非接着細胞を除去した。インキュベーター内で３７℃で１０分間、トリプシンによって残りの粘着細胞を剥離した。トリプシン処理はＥＬ−４  Ｂ５培地で停止させた。免疫蛍光染色まで細胞を氷上に保持した。
【０２６３】
細胞表面抗原
ヒトＬＡＧ３陽性ＣＨＯ細胞の単層で覆われた６ウェル組織培養プレートに、ＣＨＯで覆われた６ウェルプレートを使用した枯渇工程からの培地４ｍｌあたり最大６×１０６  ＰＢＬを播種し、インキュベーター内で３７℃で１時間結合させた。ウェルを慎重に１×ＰＢＳで１〜２回洗浄することにより、非接着細胞を除去した。インキュベーター内で３７℃で１０分間、トリプシンによって残りの粘着細胞を剥離した。トリプシン処理はＥＬ−４  Ｂ５培地で停止させた。免疫蛍光染色まで細胞を氷上に保持した。
【０２６４】
免疫蛍光染色とフローサイトメトリー
抗ＩｇＧ  ＦＩＴＣ（ドイツ、デュッセルドルフのＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）及び抗ｈｕＣｋ  ＰＥ（ドイツ、ハンブルグのＤｉａｎｏｖａ）抗体を単一細胞ソーティングのために使用した。表面染色のために、枯渇及び濃縮（enrichment）工程からの細胞を、ＰＢＳ中の抗ＩｇＧ  ＦＩＴＣ及び抗ｈｕＣｋ  ＰＥ抗体と共にインキュベートし、４℃の暗所で４５分間インキュベートした。染色後、ＰＢＭＣを氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。最後に、ＰＢＭＣを氷冷ＰＢＳに再懸濁させ、すぐにＦＡＣＳ解析にかけた。５μｇ／ｍｌの濃度のヨウ化プロピジウム（米国カリフォルニア州サンディエゴのＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）をＦＡＣＳ解析の前に添加して、死細胞と生細胞を区別した。
コンピューターとＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（米国、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を装備したＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＡｒｉａを単一細胞ソーティングに使用した。
【０２６５】
Ｂ細胞培養
ウサギＢ細胞の培養は、Ｓｅｅｂｅｒら（S Seeber et al.  PLoS One 9 (2), e86184. 2014 Feb 04）によって説明されている方法で実施した。簡単に言えば、単一のソートされたウサギＢ細胞を、９６ウェルプレートで、Ｐａｎｓｏｒｂｉｎ細胞（１：１０００００）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（ドイツ、ダルムシュタットのメルク社））、５％ウサギ胸腺細胞上清（ドイツ、ベルンリートのＭｉｃｒｏＣｏａｔ社）及びガンマ線照射マウスＥＬ−４  Ｂ５胸腺腫細胞（５×１０ｅ５細胞／ウェル）を含む２００μｌ／ウェルＥＬ−４  Ｂ５培地と共に、インキュベーター内で３７℃で７日間インキュベートした。Ｂ細胞培養物の上清をスクリーニングのために除去し、残りの細胞をすぐに回収し、ＲＬＴバッファー（ドイツ、ヒルデンのＱｉａｇｅｎ）１００μｌ中、−８０℃で凍結させた。
【０２６６】
ＬＡＧ３抗体のＶドメインの単離
［ＶドメインのＰＣＲ増幅］
ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ８／９６  ＲＮＡキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ；７４０７０９．４，７４０６９８）を使用して、製造業者のプロトコールに従い、Ｂ細胞ライセート（ＲＬＴバッファー−Ｑｉａｇｅｎ−カタログ番号７９２１６に再懸濁）から全ＲＮＡを調製した。６０μｌのＲＮａｓｅフリー水でＲＮＡを溶出した。６μのＲＮＡを使用し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １８０８０−４００）と製造業者の指示書に従ってオリゴｄＴプライマーとを使用した逆転写酵素反応により、ｃＤＮＡを生成した。全工程がＨａｍｉｌｔｏｎ  ＭＬ  Ｓｔａｒ  Ｓｙｓｔｅｍで実施された。４μｌのｃＤＮＡを使用し、プライマーのｒｂＨＣ．ｕｐ及びｒｂＨＣ．ｄｏを重鎖に、ＢｃＰＣＲ＿ＦＨＬＣ＿ｌｅａｄｅｒ．ｆｗ及びＢｃＰＣＲ＿ｈｕＣｋａｐｐａ．ｒｅｖを軽鎖に用いる、最終量５０μｌのＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １２３４４−０４０）で、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖可変領域（ＶＨ及びＶＬ）を増幅した（表１．１）。全てのフォワードプライマーは（それぞれＶＨ及びＶＬの）シグナルペプチドに特異的であったが、リバースプライマーは（それぞれＶＨ及びＶＬの）定常領域に特異的であった。ＲｂＶＨのＰＣＲ条件は次のとおり：９４℃で５分間のホットスタート；９４℃で２０秒、７０℃で２０秒、６８℃で４５秒の３５サイクル、及び６８℃で７分間の最終伸展。ＨｕＶＬのＰＣＲ条件は次のとおり：９４℃で５分間のホットスタート；９４℃で２０秒、５２℃で２０秒、６８℃で４５秒の４０サイクル、及び６８℃で７分間の最終伸展。
0006871415.tif 000008
８μｌの５０μｌ  ＰＣＲ溶液を４８  Ｅ−Ｇｅｌ  ２％（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇ８００８−０２）に充填した。製造業者のプロトコールに従いＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ；７４０６０９２５０）を使用して陽性ＰＣＲ反応物を洗浄し、５０μｌの溶出バッファーで溶出した。全洗浄工程がＨａｍｉｌｔｏｎ  ＭＬ  Ｓｔａｒ  Ｓｙｓｔｅｍで実施された。
【０２６７】
［ウサギモノクローナル二価抗体の組換え発現］
ウサギモノクローナル二価抗体の組換え発現のために、ＶＨ又はＶＬをコードするＰＣＲ産物をオーバーハングクローニング法（RS Haun et al., Biotechniques (1992) 13, 515-518; MZ Li et al., Nature Methods (2007) 4, 251-256）によりｃＤＮＡとして発現ベクターにクローニングした。発現ベクターは、イントロンＡを含む５’ＣＭＶプロモーターと、３’ＢＧＨポリアデニル化配列とからなる発現カセットを含有していた。発現カセットに加えて、プラスミドは、ｐＵＣ１８由来の複製起点と、大腸菌（E.coli）でのプラスミド増幅のためにアンピシリン耐性を付与するベータラクタマーゼ遺伝子とを含有していた。基本的なプラスミドの３つのバリアントを使用したが、１つは、ＶＬ領域を受け入れるヒトカッパＬＣ定常領域を含みながら、ＶＨ領域を受け入れるように設計されたウサギＩｇＧ定常領域を含むプラスミドであった。
カッパ又はガンマ定常領域及びＶＬ／ＶＨインサートをコードする直鎖化発現プラスミドを、オーバーラッププライマーを使用するＰＣＲで増幅した。
精製されたＰＣＲ産物は、一本鎖オーバーハングを生成するＴ４  ＤＮＡポリメラーゼとインキュベートされた。反応は、ｄＣＴＰ添加により停止された。
次の工程では、プラスミドとインサートを組み合わせて、部位特異的組換えを誘導するｒｅｃＡとインキュベートした。組換えプラスミドを大腸菌に形質転換した。翌日、増殖したコロニーを採取し、プラスミド調製、制限分析、及びＤＮＡ配列シーケンシングにより正しい組み換えプラスミドについて試験した。
抗体発現のために、単離されたＨＣ及びＬＣプラスミドを一時的にＨＥＫ２９３細胞にコトランスフェクトし、上清を１週間後に収集した。
【０２６８】
実施例２：抗ＬＡＧ３抗体の特徴付け
0006871415.tif 000009
【０２６９】
ヒトＬａｇ３のＥＬＩＳＡ
Ｎｕｎｃ  ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ  ４６４７１８）をタンパク質濃度８００ｎｇ／ｍｌの２５μ／ウェルの組換えヒトＬＡＧ−３  Ｆｃキメラタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、２３１９−Ｌ３）でコーティングし、４℃で一晩又は室温で１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴバッファーで３×９０μｌ／ウェル）、各ウェルを９０μｌのブロッキングバッファー（ＰＢＳ＋２％  ＢＳＡ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）と共に室温で１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴバッファーで３×９０μｌ／ウェル）、１〜９μｇ／ｍｌの濃度（ＯＳＥＰバッファーで１：３希釈）の抗Ｌａｇ３試料２５μｌを加え、室温で１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴバッファーで３×９０μｌ／ウェル）、ヤギ抗ヒトＩｇ  κ鎖抗体−ＨＲＰコンジュゲート（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ、ＡＰ５０２Ｐ）２５μｌ／ウェルを１：２０００希釈で添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴバッファーで３×９０μｌ／ウェル）、ＴＭＢ基質（ロッシュ、１１８３５０３３００１）２５μｌ／ウェルを添加し、２〜１０分間インキュベートした。測定は、３７０／４９２ｎｍでＴｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅ  ２装置で行われた。
【０２７０】
細胞表面Ｌａｇ３結合ＥＬＩＳＡ
２５μｌ／ウェルのＬａｇ３細胞（Ｌａｇ３を発現する組換えＣＨＯ細胞、１００００細胞／ウェル）を、組織培養処理した３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３７０１）に播種し、３７℃で１日又は２日間インキュベートした。培地を除去した翌日、２５μｌの抗Ｌａｇ３試料（ＯＳＥＰバッファーでの１：３希釈液、６〜４０ｎＭの濃度で開始）を添加し、４℃で２時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴで１×９０μｌ）、細胞を３０μｌ／ウェルのグルタルアルデヒドを、最終濃度０，０５％（Ｓｉｇｍａ  カタログ番号Ｇ５８８２）まで、室温で１０分間添加することにより、固定した。洗浄後（ＰＢＳＴバッファーで３×９０μｌ／ウェル）、ヤギ抗ヒトＩｇ  κ鎖抗体−ＨＲＰコンジュゲート（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ、ＡＰ５０２Ｐ）２５μｌ／ウェルを１：１０００希釈で添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴバッファーで３×９０μｌ／ウェル）、ＴＭＢ基質（ロッシュ、１１８３５０３３００１）２５μｌ／ウェルを添加し、６〜１０分間インキュベートした。測定は、３７０／４９２ｎｍでＴｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅ  ２装置で行われた。
【０２７１】
抗ＬＡＧ３抗体のＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ）特徴付け
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）ベースのアッセイを使用して、２５℃での一価Ｆａｂ断片である抗Ｌａｇ３抗体とヒトＦｃタグ付きヒトＬａｇ３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）間の結合のカイネティックパラメーターを決定した。
したがって、「固定化ウィザード」を使用して、酢酸バッファーｐＨ４．５で２５μｇ／ｍｌに希釈したニュートラアビジンを固定化することにより、Ｃ１バイオセンサーチップの２つのフローセルをＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００で調製した。これにより、約１９００ＲＵの固定化レベルが得られた。その後、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔＴＭビオチン抗ＩｇＧ−Ｆｃ（ヒト）コンジュゲートを、ランニングバッファー（ＨＢＳ−ＥＰ＋、ＧＥヘルスケア）での２０μｇ／ｍｌ希釈液を用いニュートラアビジンに結合させた。
この方法自体は、サイクルごとに４つのコマンドで構成されていた。第１のコマンド：約４６ＲＵのｈｕＬａｇ３−Ｆｃの捕捉（２０秒、１０μｌ／分）。第２のコマンド：試料を１２０秒間注入した後、流速３０μｌｌ／分で１２００秒間の解離。第３及び第４のコマンド：グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ１．５）を３０秒間注入することによる再生。
次いで、各抗体Ｆａｂ断片の希釈系列（３．１３ｎＭ〜２００ｎＭ、ランニングバッファーでの２倍希釈）及び追加のブランクサイクルを前述の方法を使用して測定した。その後、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウェアを利用し、捕捉レベルが完全に再現可能ではなかったため、Ｒｍａｘフィットパラメーターを「ローカル」に設定した１：１ラングミュアフィットを適用することによって、カイネティック値を得た。結果を表２に示す。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）ベースのアッセイを使用して、２５℃での二価型ａＬａｇ３バインダーとヒトＬａｇ３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の間の相互作用の見かけの親和性を決定した。
したがって、Ｂｉａｃｏｒｅバイオセンサーチップは、標準のアミンカップリング条件を利用して、最小約８００ＲＵのＰ３２９Ｇ点突然変異特異的抗体を固定化することにより、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００で調製された。
その後、各サイクルで試料抗体を捕捉し、ｈｕＬａｇ３  ＥＣＤ濃度系列（合計４つの濃度から成る）の１濃度をこの系に２０分間適用し、その後１２００秒間の解離を行った。その後、バイオセンサーチップが再生された。
結果として得られた実験データは、Ｒｉｄｇｅｖｉｅｗ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＴｒａｃｅＤｒａｗｅｒソフトウェアが提供する「相互作用マップ」機能を使用して評価され、各試料の個々の見かけのアフィン結合寄与が計算された。
結果を表２に示す。
【０２７２】
エピトープマッピング
エピトープビニングは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）ベースのアッセイを使用して実施された。したがって、ａＬａｇ３バインダーは、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００装置でｈｕＬａｇ３に結合された。その後、先に形成されたａＬａｇ３バインダーである、ｈｕＬａｇ３複合体に対する他のバインダーのアクセシビリティーを評価した。
ＳＡ  ＣＡＰキット（ＧＥヘルスケア）を使用してこのアッセイを実施した。特に記載がない場合、ＳＡ  ＣＡＰキットのマニュアルに従ってアッセイを行った。
ランには１つのサイクルタイプのみが含まれていた。ハイブリダイゼーション後、ビオチン化された、ｈｕＦｃタグ付きｈｕＬａｇ３の１０ｎＭ希釈液を、センサーチップ上のストレプトアビジンに１０μｌ／分の流速で２０秒間結合させた。その後、ランニングバッファーで希釈した第１の２００ｎＭ試料を３０μｌ／分の流速で１８０秒間注入し、すぐに同じ条件下で第２の試料が続いた。その後、表面が再生された。
その後、試料を類似の競合パターンを持つ様々なエピトープグループに割り当てた。６．１ＲＵの閾値を使用した２回目の注入の相対応答に基づいて、最初の大まかな分類が行われた。全ての値と決定は、センサーグラムの目視検査によって最終的に検証された。
結果を表２に示す。３つの主要なエピトープパターン（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３）が同定された。ａＬａｇ３−０４１６とヒト化ＢＡＰ  ０５０はグループが同じであるが、互いに完全に阻害するわけではないため、サブグループＥ２ｂとＥ２ｃに割り当てられた。
【０２７３】
Ｔｇウサギ由来の抗Ｌａｇ３抗体の、組換えカニクイザルＬａｇ３陽性ＨＥＫ細胞への結合
表面にヒトＬａｇ３を組換え的に発現するＨＥＫ細胞を使用した結合分析に加えて、カニクイザルＬａｇ３陽性ＨＥＫ細胞への結合も評価された。この実験では、先に一時的にカニクイザル−ＬＡＧ−３をトランスフェクトした凍結ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を解凍し、遠心分離し、ＰＢＳ／２％ＦＢＳを再補充した。１．５ｘ１０５細胞／ウェルを９６ウェルプレートに播種した。抗Ｌａｇ３抗体を１０μｇ／ｍｌの最終正規化濃度まで加えた。参照用及びコントロールとして、自家蛍光及び陽性コントロール（Ｍｅｄａｒｅｘ  ２５Ｆ７）、並びにアイソタイプコントロール（シグマ社製ｈｕＩｇＧ１、カタログ番号＃Ｉ５１５４、データは示していない）抗体を実験で調製および測定した。ＨＥＫ細胞を示されている抗体と氷上で４５分間インキュベートし、２％ＦＢＳを含む２００μｌの氷冷ＰＢＳバッファーで２回洗浄した後、二次抗体（ＡＰＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ−κ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号＃ＭＨ１０５１５）を添加し（ＦＡＣＳ−Ｐｕｆｆｅｒ／ｗｅｌｌで１：５０希釈）、氷上でさらに３０分間インキュベートした。細胞を２００μｌの氷冷ＰＢＳ／２％ＦＢＳバッファーで２回洗浄した後、最終的に試料を１５０μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁させ、ＦＡＣＳ  ＣＡＮＴＯ−ＩＩ  ＨＴＳモジュールで結合を測定した。
【０２７４】
結果
以下の表に、カニクイザルＬＡＧ３を発現するＨＥＫ２９３細胞に対する様々な抗Ｌａｇ３抗体の結合及び交差反応性を示す。結合により、陽性細胞のパーセンテージ又はシグナル強度の幾何平均（ＧｅｏＭｅａｎ）が得られる。
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【０２７５】
ｔｇウサギ由来抗Ｌａｇ３抗体の、Ｌａｇ３を発現する（活性化された）カニクイザルＰＢＭＣ／Ｔ細胞への結合
組換えＬａｇ３タンパク質、及び哺乳類細胞上で組換え的に発現されたＬａｇ３への結合後、活性化カニクイザルＴ細胞上で発現されたＬａｇ３への結合を評価／確認した。
カニクイザルＴ細胞又はＰＢＭＣの細胞表面に発現されたＬａｇ３に対する、新規に生成された抗Ｌａｇ３抗体（ロシュのトランスジェニックウサギ由来）の結合特性は、ＦＡＣＳ解析によって確認された。Ｌａｇ３はナイーブＴ細胞では発現していないが、活性化の際に、及び／又は消耗したＴ細胞上ではアップレギュレートされる。よって、カニクイザル末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を新鮮なカニクイザルの血液から調製し、その後ＣＤ３／ＣＤ２８前処理（１μｇ／ｍｌ）によって２〜３日間活性化した。続いて、活性化細胞をＬａｇ３発現について分析した。簡単に言えば、１〜３×１０５個の活性化細胞を、示されている抗Ｌａｇ３抗体及び最終濃度１０μｇ／ｍｌの各コントロール抗体で氷上で３０〜６０分間染色した。結合した抗Ｌａｇ３抗体は、蛍光コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ又は抗ウサギＩｇＧ二次抗体により検出された。染色後、細胞をＰＢＳ／２％ＦＣＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ）で分析した。
【０２７６】
結果
次の表は、活性化カニクイザルＰＢＭＣ内のＬａｇ３陽性細胞の割合をまとめたものである。
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活性化されたカニクイザルＴ細胞では、全てのウサギ抗Ｌａｇ３抗体がＬａｇ３＋細胞への有意な結合を示した。これにより、新規に生成された全ての抗体は、ヒト抗Ｌａｇ３参照抗体（例えばＭＤＸ２５Ｆ７、ＢＭＳ−９８６０１６など）と比較して陽性細胞のパーセンテージが増加したことを示した。
【０２７７】
ヒトＡ３７５腫瘍細胞に発現したＭＨＣ−ＩＩへのＬＡＧ−３結合の阻害（ＥＬＩＳＡによる）
２５μｌ／ウェルのＡ３７５細胞（１００００細胞／ウェル）を、組織培養処理した３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３７０１）に播種し、３７℃で一晩インキュベートした。抗Ｌａｇ３抗体を、３μｇ／ｍｌの抗体濃度から開始してビオチン化Ｌａｇ３（２５０ｎｇ／ｍｌ）を含む１：３希釈の細胞培養培地と共に１時間プレインキュベートした。播種した細胞を含むウェルから培地を除去した後、２５μｌの抗体−Ｌａｇ３プレインキュベーション混合物をそのウェルに移し、４℃で２時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴで１×９０μｌ）、細胞を３０μｌ／ウェルのグルタルアルデヒドを、最終濃度０，０５％（Ｓｉｇｍａ  カタログ番号Ｇ５８８２）まで、室温で１０分間添加することにより、固定した。洗浄後（ＰＢＳＴバッファーで３×９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのポリ−ＨＲＰ４０−ストレプトアビジン（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、６５Ｒ−Ｓ１０４ＰＨＲＰｘ）を１：２０００又は１：８０００希釈で添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄後（ＰＢＳＴバッファーで３×９０μｌ／ウェル）、ＴＭＢ基質（ロッシュ、１１８３５０３３００１）２５μｌ／ウェルを添加し、２〜１０分間インキュベートした。測定は、３７０／４９２ｎｍでＴｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅ  ２装置で行われた。
【０２７８】
ヒトＡ３７５腫瘍細胞に発現したＭＨＣ−ＩＩへのＬＡＧ−３結合の阻害（ＦＡＣＳ解析による）
アッセイ原理
抗Ｌａｇ３抗体のアンタゴニスト機能を研究するため、ＭＨＣＩＩ：Ｌａｇ３競合アッセイを実施した。抗Ｌａｇ３抗体とのプレインキュベーションの有無にかかわらず、社内で生成したビオチン化Ｌａｇ３：Ｆｃ融合タンパク質で、ＭＨＣＩＩ＋  ヒトＡ３７５細胞を染色した。この分析は、ＦＡＣＳ競合実験で研究された：Ａ３７５細胞（ＡＴＣＣ、＃ＣＲＬ−１６１９）を、ＥＢＳＳ（ＰＡＮ、カタログ番号＃Ｐ０４−００５０９）、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１×ＮＥＡＡ及び１×ピルビン酸ナトリウムを補充したＥＭイーグル培地で２〜３継代培養した。全ての抗体を、ＦＡＣＳバッファーで希釈し、２５μｌで２０μｇ／ｍｌの最終濃度にした（９６ウェルＵ底プレート）。社内で生成したビオチン化組換えＬＡＧ−３：Ｆｃ融合タンパク質２５μｌを最終濃度１０μｇ／ｍｌまで培地又は抗Ｌａｇ３抗体又はコントロールに添加し、室温で３０分間プレインキュベートした。Ａ３７５細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中３×１０６細胞／ｍｌに調整した。９６ウェルＶ底プレートに、１ウェルあたり１００μｌを播種した。プレートを遠心分離し、上清を除去した。次に、プレインキュベートしたＬＡＧ−３：Ｆｃ融合タンパク質／抗体混合物（５０μｌ／ウェル）を細胞に加え、室温で１時間インキュベートした。この後、細胞を２００μｌのＦＡＣＳバッファーで洗浄した。細胞ＭＨＣＩＩに結合したビオチン化Ｌａｇ３：Ｆｃタンパク質の検出のために、ＡＰＣコンジュゲートヤギ抗ビオチン抗体を３μｌ／試料で使用し（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号＃１３０−０９０−８５６）、さらに１０〜１５分間インキュベートした。染色後、細胞を１５０μｌのＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ／２％ＦＢＳ）で再度洗浄し、Ｕ底プレートに移し、ＨＴＳモジュールを使用してＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ−ＩＩで分析した。
２種の抗Ｌａｇ３抗体（クローン２５Ｆ７及び２６Ｈ１０；Ｍｅｄａｒｅｘ）は陽性コントロールとして、ヒトＩｇＧ１（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号＃Ｉ５１５４）は適切なアイソタイプコントロールとして使用した。全ての抗体は、最終濃度１０μｇ／ｍｌで使用した。
【０２７９】
結果
下の表に示すのは、細胞上のＭＨＣ−ＩＩへのＬａｇ３タンパク質の結合の阻害率を示すＦＡＣＳ解析の結果である（ブロッキング抗体の非存在下での最大値を参照し、減少した結合シグナルとして計算）。
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これらのデータは、Ｌａｇ３との機能的な相互作用と、試験された全ての抗体の細胞間相互作用の遮断をサポートしている。
【０２８０】
標準的なＬＡＧ３遮断バイオ／レポーターアッセイにおける新規抗Ｌａｇ３抗体の中和効力
抑制されたＴ細胞応答をｉｎ  ｖｉｔｒｏで復元する際の新規抗Ｌａｇ３抗体の中和効力を試験するために、市販のレポーターシステムを使用した。このシステムは、Ｌａｇ３＋  ＮＦＡＴ  Ｊｕｒｋａｔエフェクター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号＃ＣＳ１９４８０１）、ＭＨＣ−ＩＩ＋  ラージ細胞（ＡＴＣＣ、＃ＣＬＬ−８６）、及びスーパー抗原で構成されている。簡単に言えば、このレポーターシステムは、次の３つの工程に基づいている：（１）スーパー抗原誘導ＮＦＡＴ細胞活性化、（２）ＭＨＣＩＩ（ラージ細胞）とＬａｇ３＋  ＮＦＡＴ  Ｊｕｒｋａｔエフェクター細胞との間の阻害相互作用により媒介される活性化シグナルの阻害、（３）Ｌａｇ３アンタゴニスト／中和ａＶＨ−Ｆｃ融合コンストラクトによるＮＦＡＴ活性化シグナルの回復。
この実験では、ラージ及びＬａｇ−３＋  Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ−ｌｕｃ２エフェクターＴ細胞を、供給業者の記載に従って培養した。いくつかの抗Ｌａｇ３及び参照抗体の段階希釈液（４０ｐｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ）を、平らな白底の９６ウェル培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号＃３９１７）において、アッセイ培地（ＲＰＭＩ  １６４０（ＰＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号＃Ｐ０４−１８０４７）、１％ＦＣＳ）中で調製した。１×１０５  Ｌａｇ３＋  ＮＦＡＴ−Ｊｕｒｋａｔ細胞／ウェル）を抗体溶液に加えた。この工程の後、２．５ｘ１０４  Ｒａｊｉ細胞／ウェルをＪｕｒａｋｔ細胞／抗体混合物に加え、５０ｎｇ／ｍｌの最終濃度のＳＥＤスーパー抗原（Ｔｏｘｉｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号ＤＴ３０３）にも加えた。３７℃、５％ＣＯ２で６時間インキュベートした後、Ｂｉｏ−Ｇｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｇ７９４０）を室温まで温め、１ウェルあたり７５μｌを加え、５〜１０分間インキュベートし、キットの製造元の推奨に従って全体の発光をＴｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅリーダーで測定した。
図に示すのは、ＳＥＤ刺激時の様々な抗Ｌａｇ３抗体によるＮＦＡＴルシフェラーゼシグナルのＭＨＣＩＩ／Ｌａｇ３を介した抑制の回復である（ＥＣ５０値として示す）。   
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【０２８１】
実施例３：様々なアッセイでの生物活性：様々な抗ＬＡＧ３抗体の効果（単独又は抗ＰＤ１抗体と組み合わせて）
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【０２８２】
アロジェネイック成熟樹状細胞と共培養されたヒトＣＤ４  Ｔ細胞による細胞傷害性グランザイムＢ放出及びＩＬ−２分泌に対するＰＤ−１及びＬＡＧ−３遮断の効果
本発明者らは、アロジェネイック環境で抗ＰＤ−１と組み合わせて抗ＬＡＧ−３ブロッキング抗体をスクリーニングするために、単球由来のアロジェネイック成熟樹状細胞（ｍＤＣ）の存在下で、新たに精製したＣＤ４  Ｔ細胞を５日間共培養するアッセイを開発した。１週間前に、プラスチック接着によって、新鮮なＰＢＭＣから単球を単離し、続いて非接着細胞を除去にした。その後、ＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−４（１００ｎｇ／ｍｌ）を含む培地で５日間培養することにより、単球から未成熟ＤＣを生成した。ｉＤＣの成熟を誘導するために、ＴＮＦアルファ、ＩＬ−１ベータ及びＩＬ−６（各５０ｎｇ／ｍｌ）をさらに２日間培養培地に加えた。その後、フローサイトメトリー（ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓで主要組織適合制遺伝子複合体クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）、ＣＤ８０、ＣＤ８３及びＣＤ８６の表面発現を測定することにより、ＤＣの成熟を評価した。
最小混合リンパ球反応（ｍＭＬＲ）の日に、無関係のドナーから取得した１０８個のＰＢＭＣから、マイクロビーズキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を介してＣＤ４  Ｔ細胞を濃縮した。培養前に、ＣＤ４  Ｔ細胞を５μＭのカルボキシ−フルオレセイン−スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識した。その後、ブロッキング抗ＰＤ−１抗体ａＰＤ１（＝ＰＤ１−０１０３−０３１２、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７３２４８より）の存在下又は非存在下で、１０５個のＣＤ４  Ｔ細胞を単独で、又はキメラ抗ＬＡＧ−３抗体（ａＬＡＧ３（０４０３）からａＬＡＧ（０４１８）（（０４０３）から（０４１８））又は参照抗体（ヒト化ＢＡＰ０５０（ＬＡＧ５２５）及びＢＭＳ  ９８６０１６）と１０μｇ／ｍｌの濃度で．組み合わせて、成熟アロＤＣ（５：１）と共に９６ウェルプレートに播種した。ＤＰ４７は、ＦｃγＲによる認識を避けるためにＦｃ部分にＬＡＬＡ突然変異を持つ非結合ヒトＩｇＧであり、陰性コントロールとして使用された。
５日後、細胞培養上清を収集し、後でＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄシステム）によってＩＬ−２レベルを測定するために使用し、Ｇｏｌｇｉ  Ｐｌｕｇ（ブレフェルジンＡ）とＧｏｌｇｉ  Ｓｔｏｐ（モネンシン）の存在下で細胞をさらに５時間３７℃で放置した。その後、細胞を洗浄し、Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で固定／透過処理する前に、抗ヒトＣＤ４抗体とＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ固定可能色素Ａｑｕａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で表面を染色した。グランザイムＢ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）とＩＦＮ−γ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の細胞内染色を実施した。結果を図１ＡとＢに示す。
【０２８３】
Ｂ細胞リンパ芽球様細胞株（ＡＲＨ７７）と共に培養されたヒトＣＤ４  Ｔ細胞による、細胞傷害性グランザイムＢ放出に対するＰＤ−１Ｂ及びＬＡＧ−３遮断の効果
機能的研究では、ＣＤ−４  Ｔ細胞を腫瘍細胞株ＡＲＨ７７（すなわちｍＤＣよりも低いレベルのＰＤＬ−１を発現するＢ細胞リンパ芽球様細胞株)と共培養し、ＰＤ−１遮断に対するＬＡＧ−３拮抗作用の寄与をよりよく特徴付けた。この実験のセットアップの残りと読み出しは、ｍＭＬＲから変更されなかった。抗ＰＤ−１抗体と組み合わせた本発明の抗ＬＡＧ−３抗体（ｍＬＲでＩＬ−２とグランザイムＢを共分泌する能力に基づいて選択されたａＬＡＧ３（０４１４）及びａＬＡＧ３（０４１６））は、ＣＤ４  Ｔ細胞によるグランザイムＢの分泌について、参照抗ＬＡＧ−３抗体（（ヒト化ＢＡＰ０５０（ＬＡＧ５２５）及びＢＭＳ  ９８６０１６））よりも（Ｐ＜０．０５）、及び抗ＰＤ−１単独より（Ｐ＜０．０１）も有意な増加を示した（図２）。
【０２８４】
照射されたアロジェネイックＰＢＭＣと共培養されたヒトＣＤ４  Ｔ細胞によるグランザイムＢのＴｒｅｇ抑制及びＩＦＮ−β放出に対するＰＤ−１及びＬＡＧ−３遮断の効果。
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）抑制アッセイを含む機能研究では、同じドナーのＰＢＭＣを２つの試料に分けた。１つはＣＤ４  Ｔ細胞で、もう１つは、マイクロビーズキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）によってＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７ｌｏｗ  Ｔ細胞と定義されるＴｒｅｇで濃縮された。２つの集団を精製したら、ＣＤ４  Ｔ細胞を５μＭのカルボキシ−フルオレセイン−スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識し、Ｔｒｅｇを５μＭのＣｅｌｌ−Ｔｒａｃｅ−Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）で標識して、後でＦＡＣＳで識別できるようにした。
その後、ＣＤ４  Ｔ細胞（１０５）とＴｒｅｇ（１０５）の両方を、本発明の抗ＬＡＧ−３抗体（ａＬＡＧ３（０４１４）及びａＬＡＧ３（０４１６））又は参照抗ＬＡＧ−３抗体（ヒト化ＢＡＰ０５０（ＬＡＧ５２５）及びＢＭＳ９８６０１６）の存在下又は非存在下で、本発明の抗ＰＤ−１抗体と１０μｇ／ｍｌの濃度で組み合わせて、関係のないドナーからの照射ＰＢＭＣ（１０５）と共に１：１の比率で９６ウェルプレートに共培養した。また、ＴｒｅｇｓによるＣＤ４  Ｔ細胞エフェクター機能の抑制の大きさを推定する対照として、ＣＤ４  Ｔ細胞（１０５）は、Ｔｒｅｇの非存在下で照射されたＰＢＭＣ（１０５）とも共培養された。
５日後、細胞培養上清を収集し、後でＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄシステム）でＩＦＮ−γレベルを測定するために使用し、Ｇｏｌｇｉ  Ｐｌｕｇ（ブレフェルジンＡ）とＧｏｌｇｉ  Ｓｔｏｐ（モネンシン）の存在下で細胞をさらに５時間３７℃で放置した。その後、細胞を洗浄し、Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で固定／透過処理する前に、抗ヒトＣＤ４抗体とＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ固定可能色素Ａｑｕａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で表面を染色した。グランザイムＢ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）とＩＦＮ−γ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の細胞内染色を実施した。結果を図３ＡとＢに示す。
抗ＬＡＧ−３抗体（ａＬＡＧ３（０４１４）及びａＬＡＧ３（０４１６）、抗ＰＤ−１抗体ａＰＤ１（０３７６）（＝ＰＤ１−０１０３−０３１２、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７３２４８より）との組み合わせで、抗ＰＤ−１単独の存在下（Ｐ＜０．０５）又はチェックポイント阻害剤の非存在下（Ｐ＜０．００１）でのＴｃｏｎｖよりも有意に高い量のグランザイムＢの分泌により示されるように、制御性Ｔ細胞の厳しい制御からのＴｃｏｎｖｎ回避を誘発した。抗ＰＤ−１と組み合わせた参照抗ＬＡＧ−３抗体（ヒト化ＢＡＰ０５０（ＬＡＧ５２５）及びＢＭＳ  ９８６０１６）は、Ｔｒｅｇ抑制からＴｃｏｎｖエフェクター機能を有意にレスキューしなかった。ＩＦＮ−ｇについても、わずか４名のドナーで差が統計的有意に達しなかったとはいえ、同様の結果が得られた。
【０２８５】
免疫原性黒色腫抗原ペプチドプールでの想起後の黒色腫患者ＰＢＭＣからのＣＤ４  Ｔ細胞によるグランザイムＢ及びＩＦＮ−ガンマ分泌に対するＰＤ−１及びＬＡＧ−３遮断の効果。
黒色腫患者のＰＢＭＣには、検出可能な頻度の腫瘍抗原特異的Ｔ細胞が含まれていることが以前に記載されている。したがって、ＰＯＣについて、本発明者らは、免疫原性黒色腫関連抗原ペプチドプールで一晩再刺激した黒色腫患者ＰＢＭＣで、抗ＬＡＧ−３抗体（０４１４）プラス抗ＰＤ−１  ｖ．ｓ．抗ＰＤ−１、又は抗ＰＤ−１単独を試験した。
飽和濃度（１０μｇ／ｍｌ）の抗ＰＤ−１単独（０３７６）の存在下又は非存在下で、抗ＬＡＧ−３（ａＬＡＧ３（０４１４）＝（０４１４）、１０μｇ／ｍｌ）抗体と組み合わせて、室温でインキュベートした黒色腫患者の１０５〜１０６のＰＢＭＣ。Ｔ細胞は、タンパク質輸送阻害剤Ｇｏｌｇｉ  Ｐｌｕｇ（ブレフェルジンＡ）及びＧｏｌｇｉ  Ｓｔｏｐ（モネンシン）の存在下、ＭＡＧＥＡ１、ＭＡＧＥＡ３、ＭＡＧＥＡ４、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、ＮＹＥＳＯ−１、メラノサイトタンパク質Ｐｍｅｌ  １７  ｇｐ１００、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質２等の免疫原性腫瘍関連抗原のプールで一晩再刺激された。
その後、細胞を洗浄し、Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で固定／透過処理する前に、抗ヒトＣＤ４抗体とＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ固定可能色素Ａｑｕａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で表面を染色した。グランザイムＢ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）とＩＦＮ−γ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の細胞内染色を実施した。
抗ＬＡＧ−３抗体と抗ＰＤ−１抗体の組み合わせ（Ｐ＜０．０１及びＰ＜０．００１）は、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞エフェクター機能（すなわち、グランザイムＢ及びＩＦＮ−γ分泌）が有意に向上したが、ＰＤ−１遮断のみでは全く効果がなかった（データは示していない）。
同様に、当業者は、実施例３の細胞培養／動物研究に基づいて、上記をヒトの治療方法に拡張することができるであろう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【配列表】
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