(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の野生型逆転写酵素（ＲＴ）と比較して増大した熱安定性を有する変異型ＲＴであって、
ｉ）配列番号１の野生型ＲＴと比較して、
−  位置３２のＡｌａがＶａｌ（Ａ３２Ｖ）で置換され、
−  位置７２のＬｅｕがＡｒｇ（Ｌ７２Ｒ）で置換され、
−  位置２８６のＧｌｕがＡｒｇ（Ｅ２８６Ｒ）で置換され、
−  位置３０２のＧｌｕがＬｙｓ（Ｅ３０２Ｋ）で置換され、
−  位置３８８のＴｒｐがＡｒｇ（Ｗ３８８Ｒ）で置換され、および、
−  位置４３５のＬｅｕがＡｒｇ（Ｌ４３５Ｒ）で置換されている、
６個のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列、または、
ｉｉ）ｉ）のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であり、ｉ）で定義した６個のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列、
を含み、
逆転写酵素活性を示し、
変異型ＭＭ３と比較して増大した熱安定性を有し、
ＭＭ３が位置２８６のＧｌｕがＡｒｇ（Ｅ２８６Ｒ）で置換され、位置３０２のＧｌｕがＬｙｓ（Ｅ３０２Ｋ）で置換され、および位置４３５のＬｅｕがＡｒｇ（Ｌ４３５Ｒ）で置換されている、３個のアミノ酸置換のみが配列番号１のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有する、
前記変異型ＲＴ。
【請求項２】
追加的に、配列番号１のＮ末端における最大５個のアミノ酸の欠失、および／または配列番号１のＣ末端における最大５個のアミノ酸の欠失が、配列番号１のアミノ酸配列と異なる、請求項１に記載の変異型ＲＴ。
【請求項３】
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項１または２に記載の変異型ＲＴ。
【請求項４】
熱安定性が、熱処理後に測定される変異体の逆転写酵素活性の測定によって決定される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項５】
熱安定性が、６０℃で１０分間のインキュベーション後の逆転写酵素活性の測定によって決定され、および／または野生型もしくは変異型ＭＭ３と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、もしくは５０％熱安定性が増大している、請求項１〜３のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項６】
変異型ＲＴの逆転写酵素活性が、野生型の逆転写酵素活性の少なくとも５０％であり、および／または逆転写酵素活性が、３７℃でのＲＴ媒介ｄＴＴＰ取り込みによって決定される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項７】
さらなるタンパク質と融合した、請求項１〜６のいずれか一項に記載の変異型ＲＴ。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の変異型ＲＴをコードする核酸。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の変異型ＲＴまたは請求項８に記載の核酸を含む細胞。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の変異型ＲＴを含む、逆転写を実施するためのキット。
【請求項１１】
ｃＤＮＡ合成のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の変異型ＲＴの使用。
【請求項１２】
ＲＮＡを逆転写するための方法であって、請求項１〜７のいずれか一項に記載の変異型ＲＴを使用してＲＮＡからｃＤＮＡを合成する工程を含む方法。
【請求項１３】
試料中のＲＮＡマーカーを検出するための方法であって、
ａ）変異型ＲＴの活性に資する条件下で、試料を請求項１〜７のいずれか一項に記載の変異型ＲＴと接触させる工程、
ｂ）変異型ＲＴを使用してＲＮＡマーカーからｃＤＮＡを合成する工程、および、
ｃ）ステップｂ）で合成したｃＤＮＡの存在を検出し、それによって試料中のＲＮＡマーカーを検出する工程、
を含む、前記方法。
【請求項１４】
試料が、体液、血液、血漿、血清、尿、胆汁、脳脊髄液、スワブ、臨床検体、臓器試料および組織試料からなる群から選択され、ならびに／または試料が、細胞培養物、汚染の疑いがある供給源、もしくは対象から得られたものである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＲＮＡマーカーが、微生物、細胞、ウイルス、細菌、真菌、哺乳動物種、遺伝子状態または疾患を示す、請求項１３または１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、野生型と比較して増大した熱安定性を有する変異型逆転写酵素（ＲＴ）、変異型ＲＴをコードする核酸、変異型ＲＴまたは核酸を含む細胞、変異型ＲＴを含むキット、ｃＤＮＡ合成のための変異型ＲＴの使用、変異型ＲＴを使用してｃＤＮＡを合成する工程を含むＲＮＡを逆転写するための方法、および変異型ＲＴを使用して試料中のＲＮＡマーカーを検出するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
逆転写酵素（ＲＴ）［ＥＣ２．７．７．４９］はウイルスゲノム複製を担う酵素である。それはＲＮＡおよびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する。モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）およびトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）由来のＲＴはｃＤＮＡ合成において広く使用されている。それらが高い触媒活性と忠実度を有するからである。ｃＤＮＡ合成には高い反応温度が望ましい。それがＲＮＡ二次構造と非特異的プライマー結合を減らすからである。したがって、ＲＴの熱安定性の改善は重要な目的である。ＭＭＬＶ  ＲＴの熱安定性（Ｋｏｔｅｗｉｃｚら、１９８５年；Ｇｅｒａｒｄら、２００２年；Ｍｉｚｕｎｏら、２０１０年）はＲＮａｓｅ  Ｈ活性を排除することによって改善されている。近年、ＭＭＬＶ  ＲＴの熱安定性は、鋳型−プライマーとの相互作用に関与している位置への正電荷の導入（Ｙａｓｕｋａｗａら、２０１０年）によって、ランダム変異誘発（ＡｒｅｚｉおよびＨｏｇｒｅｆｅ、２００９年；Ｂａｒａｎａｕｓｋａｓら、２０１２年）、および表面疎水性残基から親水性残基への変更（Ｋｏｎｉｓｈｉら、２０１４年）によってさらに改善された。結果として、ｃＤＮＡ合成に関する反応温度は３７〜４５℃から５０〜５５℃に増大している。しかしながら、ｃＤＮＡ合成の効率を改善するため、さらなる安定化が望ましい。
【０００３】
様々な酵素に関して、部位特異的変異誘発および／またはランダム変異が広範囲で実施されており、酵素に望ましい性質、高い触媒活性または熱的安定性などをもたらす様々な変異が確認されている。これらの変異の影響が追加的である場合、多数の変異がある変異体酵素はさらに望ましい性質を有し得る。しかしながら、様々な酵素における活性と安定性の間には妥協点があることが一般に知られている。酵素活性を増大させる変異はタンパク質安定性の低下を伴い、タンパク質安定性を増大させる変異は酵素活性を低下させる（Ｓｈｏｉｃｈｅｔら、１９９５年）。さらに、現在酵素の性質に対する変異の組合せ効果を予想するのは容易ではない。ＭＭ３（Ｅ２８６Ｒ／Ｅ３０２Ｋ／Ｌ４３５Ｒ）は、正電荷の増大を目的とした３個の変異の野生型ＭＭＬＶ  ＲＴへの導入によって生成した、熱的安定性ＭＭＬＶ  ＲＴ三重変異体である（Ｙａｓｕｋａｗａら、２０１０年）。
【発明の概要】
【０００４】
しかしながら、本発明の目的は、ＭＭＬＶ由来のさらなる熱的安定性変異型逆転写酵素を提供することであった。
【０００５】
このために、２９個の変異を設計した。対応する一重変異体を大腸菌において作製し、活性と安定性を特徴付けし、６個の変異（Ａｌａ３２→Ｖａｌ、Ｌｅｕ４１→Ａｓｐ、Ｌｅｕ７２→Ａｒｇ、Ｉｌｅ２１２→Ａｒｇ、Ｌｅｕ２７２→Ｇｌｕ、およびＴｒｐ３８８→Ａｒｇ）を選択した。６個の変異の１つまたは複数と、ＭＭ３変異を組み合わせることによって１５個の多重変異体を設計した。対応する多重変異体を作製し特徴付けした。６重変異体ＭＭ３．１４（Ａ３２Ｖ／Ｌ７２Ｒ／Ｅ２８６Ｒ／Ｅ３０２Ｋ／Ｗ３８８Ｒ／Ｌ４３５Ｒ）は、野生型または変異型ＭＭ３よりも高い熱安定性を示した（実施例２ならびに図４Ｅ、図４Ｆ、図５および図６参照）。
【０００６】
したがって第１の態様では、本発明は、配列番号１の野生型逆転写酵素（ＲＴ）と比較して増大した熱安定性を有する変異型ＲＴであって、
ｉ）配列番号１の野生型ＲＴと比較して、
−  位置３２のＡｌａがＶａｌ（Ａ３２Ｖ）で置換されており、
−  位置７２のＬｅｕがＡｒｇ（Ｌ７２Ｒ）で置換されており、
−  位置２８６のＧｌｕがＡｒｇ（Ｅ２８６Ｒ）で置換されており、
−  位置３０２のＧｌｕがＬｙｓ（Ｅ３０２Ｋ）で置換されており、
−  位置３８８のＴｒｐがＡｒｇ（Ｗ３８８Ｒ）で置換されており、
−  位置４３５のＬｅｕがＡｒｇ（Ｌ４３５Ｒ）で置換されている、
６個のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列、または
ｉｉ）ｉ）のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一でありｉ）で定義した６個のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、
逆転写酵素活性を示す、変異型ＲＴに関する。
【０００７】
逆転写酵素（ＲＴ）は、ＲＮＡ鋳型からの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の生成、逆転写と呼ばれるプロセスに使用される酵素である。それは主にレトロウイルスに関する。しかしながら、非レトロウイルスもＲＴ（例えば、ｄｓＤＮＡ−ＲＴウイルスである、Ｂ型肝炎ウイルス、ヘパドナウイルス科のメンバー、一方レトロウイルスはｓｓＲＮＡウイルスである）を使用する。レトロウイルスＲＴは、３個の逐次的生化学的活性、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、リボヌクレアーゼＨ、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する。これらの活性は一本鎖ゲノムＲＮＡを二本鎖ｃＤＮＡに転換するためレトロウイルスにより使用され、これが宿主ゲノム中に組み込まれ、根絶するのが非常に困難であろう長期感染をおそらくもたらす可能性がある。分子クローニング、ＲＮＡシークエンシング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、またはゲノム解析において使用するため、同じ一連の反応を研究室で広く使用してＲＮＡをＤＮＡに転換している。当技術分野で一般に使用されている逆転写酵素は、モロニーマウス白血病ウイルス由来のＭＭＬＶ逆転写酵素である。
【０００８】
本発明によれば、変異型ＲＴは逆転写酵素活性を示す。これは変異型ＲＴが、適切な条件下でＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを生成できることを意味する。転写酵素活性を決定するための方法は本明細書中に記載しており実施例中に示す（［３Ｈ］−ｄＴＴＰを使用した逆転写アッセイ、蛍光色素ＰｉｃｏＧｒｅｅｎおよびｃＤＮＡ合成を使用した逆転写アッセイを参照）。
【０００９】
さらに、変異型逆転写酵素（ＲＴ）は、配列番号１の野生型ＲＴと比較して増大した熱安性を有する。野生型ＲＴと比較して「増大した熱的安定性」または「増大した熱安定性」という用語は、変異型ＲＴが、高温（すなわち、室温を超えるまたは特に４０℃を超える温度）で（酵素）活性を失う傾向が低いことを意味する。触媒としてのその可能性を余すところなく実現するため、変性メカニズムの排除を含めた酵素の安定化はバイオテクノロジーにおける重要な目的である。酵素適用例がますます増加するため、酵素の安定化は非常に重要である。安定性の増大は持続的有用性（例えば長期保存、長期有用性など）をもたらす。さらに、ｃＤＮＡ合成には高い反応温度が望ましい。それがＲＮＡ二次構造と非特異的プライマー結合を減らすからである。したがって、ＲＴの熱安定性の改善は望ましい。野生型と比較した変異体の安定性の増大は、例えば保存後、または特定の条件（例えば高温、乾燥、バッファー、もしくは塩）に対する曝露後に、両酵素（野生型および変異体）の残存活性を比較することによって決定することができる（絶対的残存活性）。あるいは、例えば変異体が高い相対的残存活性を有する場合、野生型と比較して安定性が改善される。相対的残存活性は、所与の条件（例えば時間、温度）でのインキュベーション後の残存または残留酸度とインキュベーション前の初期活性を比較することによって決定することができる。
【００１０】
用語「酵素活性」およびその決定は当業者にはよく知られている。酵素活性は一般に、時間あたりの基質量の転換として定義される。酵素活性に関するＳＩユニットはカタール（１カタール＝１ｍｏｌ  ｓ−１）である。より実用的で一般的に使用される値は酵素ユニット（Ｕ）＝１μｍｏｌ  ｍｉｎ−１である。１Ｕは１６．６７ナノカタールに相当し、１分間あたり１マイクロモルの基質の転換を触媒する酵素量として定義される。酵素の比活性は、１ミリグラムの全タンパク質あたりの酵素の活性である（μｍｏｌ  ｍｉｎ−１ｍｇ−１で表す）。
【００１１】
酵素活性は、基質もしくはコファクターの消費または経時的な産物の形成のいずれかを測定するアッセイで決定することができる。基質と産物の濃度を測定する多数の異なる方法が存在し、当業者に知られている幾つかの異なる方法で多くの酵素をアッセイすることができる。本発明では、問題のＲＴを例えばＲＮＡ鋳型、プライマーおよび適切なｄＮＴＰ混合物とインキュベートし、ｃＤＮＡの生成またはｄＮＴＰの消費をモニタリングする。モニタリングは、例えば、２６０ｎｍでのＵＶ吸光度、標識の取り込み（例えば［３Ｈ］−ｄＴＴＰ、実施例参照）、ＤＮＡとマーカーの結合（例えばＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標））の測定、またはＰＣＲ（実施例参照）などによって行うことができる。
【００１２】
本発明の好ましい実施形態では、変異がないそれぞれのＲＴと比較した変異型ＲＴの増大した熱安定性を決定し、ストレス状態インキュベーション前の初期活性に対する、ストレス状態インキュベーション（例えば１０分間、例えば６０℃、または実施例中に示した任意の他の条件）後の残存活性として表すことができる（実施例参照）。このため、酵素反応は前述通りまたは実施例中でモニタリングすることができ、活性の変化を計算することができる。加熱インキュベート試料に関して得た値はそれぞれの非ストレス状態試料（１００％活性に設定した値）と比較することができ、活性率（（活性（ストレス状態試料）／活性（非ストレス状態試料）＊１００））で計算することができる。したがって、野生型酵素で得た値より高い変異体の値は熱安定性の改善を表す。［変異体の残存活性％］−［野生型の残存活性％］＞０である場合、安定性は増大する。あるいは、変異体の残存活性は活性率として表すこともでき、以下のように計算することができる：［変異体の残存活性％］／［野生型の残存活性％］＊１００％。生じた値が１００％を超える場合、野生型と比較した変異体の安定性は増大する。安定性を決定するのに適した個々の試験は実施例中に記載する。リアルタイムＰＣＲを用いたｃＤＮＡ合成試験（図５参照）は最高感度試験となるようである。
【００１３】
増大した熱安定性を決定するのに適した方法は実施例に詳述する。ストレス条件の例示的条件は、４８〜６５℃（特に６０℃）で１０分間のプレインキュベーション、および［３Ｈ］−ｄＴＴＰを使用した逆転写アッセイ、蛍光色素ＰｉｃｏＧｒｅｅｎを使用した逆転写アッセイ、または好ましくはリアルタイムＰＣＲを用いたｃＤＮＡ合成試験によるその後の試験であり得る。
【００１４】
本発明のＲＴは、７５ｋＤａモノマーであるＭＭＬＶ  ＲＴに由来する。それは指、掌、親指、結合部分、およびＲＮａｓｅ  Ｈドメインで構成される。ＤＮＡポリメラーゼ反応の活性部位は指／掌／親指ドメイン中に存在し、一方ＲＮａｓｅ  Ｈ反応の活性部位はＲＮａｓｅ  Ｈドメイン中に存在する。
【００１５】
アミノ酸のナンバリングを含めた野生型ＲＴと呼ばれるＲＴのアミノ酸配列は以下の通りである：
【化１】
0006928668.tif 000002
【００１６】
対応する核酸配列は以下の通りである：
【化２】
0006928668.tif 000003
【００１７】
「変異型逆転写酵素」（ＲＴ）という用語は、そのアミノ酸配列が少なくとも６個の変異により配列番号１のアミノ酸配列と異なるＲＴ酵素に関する。前に詳述したように、本発明の変異型ＲＴには、配列番号１の野生型ＲＴと比較して、
−  位置３２のＡｌａがＶａｌ（Ａ３２Ｖ）で置換されており、
−  位置７２のＬｅｕがＡｒｇ（Ｌ７２Ｒ）で置換されており、
−  位置２８６のＧｌｕがＡｒｇ（Ｅ２８６Ｒ）で置換されており、
−  位置３０２のＧｌｕがＬｙｓ（Ｅ３０２Ｋ）で置換されており、
−  位置３８８のＴｒｐがＡｒｇ（Ｗ３８８Ｒ）で置換されており、
−  位置４３５のＬｅｕがＡｒｇ（Ｌ４３５Ｒ）で置換されている、
６個の必須的アミノ酸置換がある。
【００１８】
前述の６個の必須的変異のみが、配列番号１の野生型ＲＴと異なる変異型ＲＴのアミノ酸配列を配列番号２のアミノ酸配列と呼び、それは以下の通りである：
【化３】
0006928668.tif 000004
【００１９】
６個の必須的変異は太字と下線によって示し、それぞれのアミノ酸番号によってそれらの位置を指定する。
【００２０】
対応する核酸配列は以下の通りである：
【化４】
0006928668.tif 000005
【００２１】
しかしながら、変異型ＲＴは１つまたは複数のさらなるアミノ酸置換、付加、欠失またはこれらの組合せを有し得る。本発明によれば、本発明の変異型ＲＴは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む可能性もあり、前に定義した６個の必須的アミノ酸置換がある（Ａ３２Ｖ／Ｌ７２Ｒ／Ｅ２８６Ｒ／Ｅ３０２Ｋ／Ｗ３８８Ｒ／Ｌ４３５Ｒ）。
【００２２】
本発明の一実施形態では、本発明による変異型ＲＴは、１つまたは複数のアミノ酸置換、特に置限られた数の換（例えば最大３０、２０、または特に１０個のアミノ酸置換）、特に保存的置換を含み得る。「保存的アミノ酸置換」は、ある残基から、類似の側鎖を有する異なる残基への置換を指し、したがって典型的には、ポリペプチド中のアミノ酸から、同一または類似の規定クラスのアミノ酸内のアミノ酸への置換を指す。例えば、限定されないが、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は、別の脂肪族アミノ酸、例えばアラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンで置換することができる。ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸は、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸、例えばセリンおよびスレオニンで置換される。芳香族側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸、例えばフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびヒスチジンで置換される。塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸、例えばリシンおよびアルギニンで置換される。酸性側鎖を有するアミノ酸は、酸性側鎖を有する別のアミノ酸、例えばアスパラギン酸またはグルタミン酸で置換され、疎水性または親水性アミノ酸は、それぞれ別の疎水性または親水性アミノ酸で置き換えられる。保存的アミノ酸置換の例には以下に列挙した置換がある：
【００２３】
元の残基                        保存的置換
Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ  他の脂肪族残基（Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ）
他の無極性残基（Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ）
Ｇｌｙ、Ｍｅｔ                  他の無極性残基（Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ）
Ａｓｐ、Ｇｌｕ                  他の酸性残基（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）
Ｌｙｓ、Ａｒｇ                  他の塩基性残基（Ｌｙｓ、Ａｒｇ）
Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ  他の極性残基（Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）
Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ  他の芳香族残基（Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ）
Ｃｙｓ、Ｐｒｏ                  なし
【００２４】
本発明の一実施形態では、本発明による変異型ＲＴは、１つまたは複数のアミノ酸付加、特に少数の（例えば、最大３０、２０、または特に１０個のアミノ酸）内部または末端アミノ酸付加を含み得る。
【００２５】
本発明の一実施形態では、本発明による変異型ＲＴは、１つまたは複数のアミノ酸欠失、特にＮおよび／またはＣ末端欠失を含み得る。欠失は少数であってよい（例えば、各末端に最大５、４、３、２、特に１個のアミノ酸）。好ましい実施形態では、変異型ＲＴは、前に定義した必須的変異に加えて、配列番号１のアミノ酸配列が異なり、配列番号１のＮ末端において最大５個のアミノ酸が欠失し、かつ／または配列番号１のＣ末端において最大５個のアミノ酸が欠失している。
【００２６】
別の実施形態では、本発明による変異型ＲＴの配列は、必須的変異（置換）以外に、前に定義した１つまたは複数の欠失、置換または付加の組合せを含み得る。しかしながら変異型ＲＴは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００２７】
本明細書中で使用する「少なくとも９５％同一」または「少なくとも９５％の配列同一性」という用語は、本発明による変異型ＲＴの配列が、１００個のアミノ酸の伸張部分内で、少なくとも９５個のアミノ酸残基が配列番号２の対応配列の配列と同一であることを特徴とする、アミノ酸配列を有することを意味する。他の割合の配列同一性はそれに応じて定義する。
【００２８】
本発明による配列同一性は、例えば配列比較の型の配列アライメントの方法によって決定することができる。配列アライメントの方法は当技術分野ではよく知られており、様々なプログラムおよびアライメントアルゴリズムを含む。さらに、ｔｈｅ  ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）は、配列解析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘと共に使用するため、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を含めた幾つかの供給元、およびインターネット上から入手可能である。例えば配列番号２のアミノ酸配列と比較した本発明による変異体の配列同一率は、標準設定でＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔ  ｂｌａｓｔｐを使用して典型的に特徴付けられる。あるいは、標準設定でソフトウェアＧＥＮＥｉｏｕｓを使用して配列同一性を決定することができる。アライメントの結果は、例えばアライメントタイプとしてフリーエンドギャップ、およびコストマトリックスとしてＢｌｏｓｕｍ６２でグローバルアライメントプロトコールを使用して、ソフトウェアＧｅｎｅｉｏｕｓ（バージョンＲ８）から得ることができる。
【００２９】
前に詳述したように、本発明の変異型ＲＴは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、変異型ＲＴは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。配列同一性は前に記載したように決定することができる。
【００３０】
さらに別の好ましい実施形態では、変異型ＲＴは、変異型ＭＭ３と比較して同等またはさらに増大した熱安定性を有し、ＭＭ３は、位置２８６のＧｌｕがＡｒｇ（Ｅ２８６Ｒ）で置換されており、位置３０２のＧｌｕがＬｙｓ（Ｅ３０２Ｋ）で置換されており、位置４３５のＬｅｕがＡｒｇ（Ｌ４３５Ｒ）で置換されている、３個のアミノ酸置換のみが、配列番号１のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有する。ＭＭ３（Ｅ２８６Ｒ／Ｅ３０２Ｋ／Ｌ４３５Ｒ）は、正電荷の増大を目的とした３個の変異の野生型ＭＭＬＶ  ＲＴへの導入によって生成した、熱的安定性ＭＭＬＶ  ＲＴ三重変異体である（Ｙａｓｕｋａｗａら、２０１０年）。
【００３１】
熱安定性は、熱処理後、特に６０℃で１０分間のインキュベーション後に測定される変異体の逆転写酵素活性の測定によって決定されることが好ましい。追加的または代替的に、野生型ＲＴまたは変異型ＭＭ３と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％または４０％、好ましくは少なくとも５０％熱安定性が増大している。これらの実施形態に関する詳細は前で示している。
【００３２】
変異型ＲＴ（非ストレス状態）の逆転写酵素活性は、野生型の逆転写酵素活性の少なくとも５０％、特に少なくとも６０％、より特に少なくとも７０％、特に少なくとも８０％であることがさらに好ましい。追加的または代替的に、逆転写酵素活性は、３７℃でのＲＴ媒介ｄＴＴＰ取り込みによって決定される（実施例参照）。酵素活性の決定に関する詳細は前で示している。
【００３３】
別の実施形態では、変異型ＲＴをさらなるタンパク質と融合させることができる。融合タンパク質は、２個以上の本来別々のタンパク質またはペプチドの接合によって作製されたタンパク質である。この手順によって、原型タンパク質のそれぞれに由来する機能性があるポリペプチドが生じる。したがって、目的とするＲＴの使用に応じて、それをさらなるペプチドまたはタンパク質と組合せ融合タンパク質にすることができる。タンパク質はリンカーまたはスペーサーを介して融合させることが可能であり、それによってタンパク質が独立にフォールディングし予想通りに挙動する可能性が増大する。特にリンカーがタンパク質精製を可能にする場合、タンパク質またはペプチド融合体中のリンカーを、２つの別個のタンパク質の遊離を可能にするプロテアーゼまたは化学物質を用いて切断部位で時折遺伝子操作する。二量体または多量体融合タンパク質は、人工タンパク質二量体化または多量体化を誘導する、ペプチドドメインの原型タンパク質との融合による遺伝子操作によって製造することができる（例えば、ストレプトアビジンまたはロイシンジッパー）。融合タンパク質は、それらと結合した毒素または抗体を用いて生成することもできる。他の融合は、脂質化シグナル配列、分泌シグナル配列、グリコシル化シグナル配列、転位シグナルペプチドなどのシグナル配列の付加を含む。
【００３４】
本発明の融合タンパク質は、タグを含むことが好ましい。タグは様々な目的で、例えば精製を容易にするため、タンパク質の適切なフォールディングを支援するため、タンパク質の沈殿を予防するため、クロマトグラフィーの性質を変えるため、タンパク質を修飾するため、またはタンパク質を印付けもしくは標識するためにタンパク質に結合させる。タグの例には、Ａｒｇ−タグ、Ｈｉｓ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、Ｆｌａｇ−タグ、Ｔ７−タグ、Ｖ５−ペプチド−タグ、ＧＳＴ−タグおよびｃ−Ｍｙｃ−タグがある。本発明中で好ましいタグは、６個のヒスチジン残基からなるＨｉｓ−タグである。
【００３５】
さらなる態様では、本発明は、本発明の変異型ＲＴをコードする核酸に関する。
【００３６】
本明細書中で使用する「核酸」という用語は、一般に、本発明の変異型ＲＴをコードし様々な長さであり得る任意のヌクレオチド分子に関する。本発明の核酸の例には、それだけに限定されないが、例えばイオン交換クロマトグラフィーを含めた標準的分子生物学的手順によって単離することができる、プラスミド、ベクター、または任意の種類のＤＮＡおよび／またはＲＮＡ断片（複数可）がある。本発明の核酸は、特定の細胞または生物のトランスフェクションまたは形質導入に使用することができる。
【００３７】
本発明の核酸分子は、例えばクローニングによって得られ、または化学合成技法もしくはこれらの組合せによって生成する、ｍＲＮＡもしくはｃＲＮＡなどのＲＮＡの型、または例えばｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含めたＤＮＡの型であってよい。ＤＮＡは三本鎖、二本鎖または一本鎖であってよい。一本鎖ＤＮＡは、センス鎖としても知られるコード鎖である可能性があり、または一本鎖ＤＮＡは、アンチセンス鎖とも呼ばれる非コード鎖である可能性がある。本明細書中で使用する核酸分子は、特に一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡと二本鎖ＲＮＡの混合物であるＤＮＡ、および一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖または、より典型的には二本鎖、または三本鎖であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子、または一本鎖領域と二本鎖領域の混合物も指す。さらに、本明細書中で使用する核酸分子は、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡ両方を含む三本鎖領域を指す。
【００３８】
さらに、核酸は１つまたは複数の修飾塩基を含有し得る。このような核酸は、例えばリボース−リン酸骨格中に、生理的環境におけるこのような分子の安定性と半減期を増大させるための修飾も含有し得る。したがって、安定性または他の理由で修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、その特徴を本明細書中で目的とする「核酸分子」である。さらに、２例のみ挙げると、イノシンなどの稀な塩基、またはトリチル化塩基などの修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、本発明の文脈内では核酸分子である。当業者に知られている多くの有益な目的を果たす非常に様々な修飾が、ＤＮＡおよびＲＮＡに施されていることは理解される。本明細書中で利用する核酸分子という用語は、このような化学、酵素または代謝修飾型の核酸分子、ならびに特に単純細胞と複雑細胞を含めたウイルスおよび細胞に特徴的な化学型のＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。
【００３９】
さらに、本発明の変異型ＲＴをコードする核酸分子を、標準クローニング技法などの標準技法を使用して、制御配列、リーダー配列、異種マーカー配列または異種コード配列などの任意の所望配列に機能的に結合させ、融合タンパク質を作製することが可能である。
【００４０】
本発明の核酸を、一般に、エンドヌクレアーゼおよび／またはエクソヌクレアーゼおよび／またはポリメラーゼおよび／またはリガーゼおよび／またはリコンビナーゼによる核酸の操作、または核酸を生成するための当業者に知られている他の方法によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは細胞中、培養中に最初に形成することができる。
【００４１】
本発明の核酸は発現ベクター中に含まれる可能性があり、核酸は、宿主細胞中で核酸の発現を促進することができるプロモーター配列に作動可能に連結している。
【００４２】
本明細書中で使用する「発現ベクター」という用語は、細胞中で目的のタンパク質を発現させるために使用することができる任意の種類の核酸分子を一般に指す（本発明の核酸に関する前述の詳細も参照）。特に、本発明の発現ベクターは、それだけに限定されないが、哺乳動物細胞、細菌細胞、および酵母細胞を含めた特定の宿主細胞中でタンパク質を発現させるのに適した、当業者に知られている任意のプラスミドまたはベクターであってよい。本発明の発現構築物は本発明のＲＴをコードする核酸である可能性もあり、これを各ベクター中への後のクローニングに使用して発現を保証する。適切なベクターは実施例中に記載し図２中に例証する。タンパク質発現用のプラスミドおよびベクターは当技術分野でよく知られており、例えばＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）、Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）、またはＭｏＢｉＴｅｃ（ドイツ）を含めた多様な供給業者から市販品を購入することができる。タンパク質発現の方法は当業者にはよく知られており、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、２０００年（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、第３版）中に記載されている。
【００４３】
ベクターは、複製起点などの宿主細胞中でベクターを複製できる核酸配列、１つまたは複数の治療遺伝子および／または選択可能マーカー遺伝子、および当技術分野で知られる他の遺伝子エレメント、コードタンパク質の転写、翻訳および／または分泌を誘導する制御エレメントなどを追加的に含み得る。ベクターを使用して、細胞に形質導入、形質転換または感染し、それによってその細胞に固有なもの以外の核酸および／またはタンパク質を細胞に発現させることが可能である。ベクターは、細胞中への核酸の進入の実施を助長する物質、例えばウイルス粒子、リポソーム、タンパク質コーティングなどを任意選択で含む。標準的な分子生物学的技法によって、タンパク質発現に適した多数のタイプの発現ベクターが当技術分野で知られている。このようなベクターは、昆虫、例えばバキュロウイルス発現、または酵母、真菌、細菌またはウイルス発現系を含めた、従来のベクタータイプから選択される。その多数のタイプが当技術分野で知られている、他の適切な発現ベクターもこの目的で使用することができる。このような発現ベクターを得るための方法はよく知られている（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、上記を参照）。
【００４４】
前に詳述したように、本発明の変異型ＲＴをコードする核酸を宿主細胞中でのタンパク質の発現を駆動するのに適した配列に作動可能に連結させて、タンパク質の発現を保証する。しかしながら、特許請求する発現構築物が、適切な発現ベクター中に後にクローニングされタンパク質の発現を保証する中間産物となり得ることは本発明内に包含される。本発明の発現ベクターは、それだけに限定されないが、ポリアデニル化シグナル、スプライスドナーおよびスプライスアクセプターシグナル、介在配列、転写エンハンサー配列、翻訳エンハンサー配列、薬剤耐性遺伝子（複数可）などを含めた全種類の核酸配列をさらに含み得る。任意選択で、薬剤耐性遺伝子を、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）に作動可能に連結させることが可能であり、これは細胞周期特異的または細胞周期非依存的のいずれかであり得る。
【００４５】
本明細書中で使用する「作動可能に連結」という用語は、その意図する目的、例えば転写がプロモーターによって開始され本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を介して進行する点で、それらが共同して機能するように、遺伝子エレメントが配置することを一般に意味する。すなわち、ＲＮＡポリメラーゼは融合タンパク質をコードする配列をｍＲＮＡに転写し、次いでそれがスプライシングされタンパク質に翻訳される。
【００４６】
本発明の文脈で使用する「プロモーター配列」という用語は、下流コード配列に作動可能に連結した任意の種類の制御ＤＮＡ配列を一般に指し、前記プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼと結合し、細胞中のコードされたオープンリーディングフレームの転写を開始させ、それによって前記下流コード配列の発現を誘導することが可能である。本発明のプロモーター配列は、それだけに限定されないが、構成的プロモーター、誘導的プロモーター、細胞周期特異的プロモーター、および細胞型特異的プロモーターを含めた、当業者に知られている任意の種類のプロモーター配列であってよい。
【００４７】
さらに別の態様では、本発明は、本発明の変異型ＲＴまたは本発明の核酸を含む細胞に関する。細胞は宿主細胞であることが好ましい。本発明の「宿主細胞」は、組換えＤＮＡ技術における用途に適した任意の種類の生物であってよく、それだけに限定されないが、１つまたは複数の組換えタンパク質を発現させるのに適した全種類の細菌および酵母菌株を含む。宿主細胞の例には、例えば、様々な枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株がある。様々な大腸菌細菌宿主細胞が当業者に知られており、それだけに限定されないが、ＤＨ５−α、ＨＢ１０１、ＭＶ１１９０、ＪＭ１０９、ＪＭ１０１、またはＸＬ−１ブルーなどの菌株を含み、これらは例えばＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＣＡ、ＵＳＡ）、Ｐｒｏｍｅｇａ（ＷＩ、ＵＳＡ）またはＱｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）を含めた多様な供給業者から市販品を購入することができる。特に適切な宿主細胞、すなわち大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞は、実施例中にさらに記載する。宿主細胞として使用することができる枯草菌菌株は市販されている。
【００４８】
本発明による宿主細胞の培養は、当業者に知られている通常手順である。すなわち、本発明の変異型ＲＴをコードする核酸を、組換え手段により適切な宿主細胞（複数可）中に導入して各タンパク質を生成することができる。これらの宿主細胞は、容易に培養することができる任意の種類の適切な細胞、好ましくは大腸菌などの細菌細胞であってよい。第１の工程で、この手法は適切なプラスミドベクター中への各遺伝子のクローニングを含み得る。プラスミドベクターは遺伝子クローニング用に広く使用されており、コンピテント状態にした細菌細胞中に容易に導入、すなわち形質転換することができる。各宿主細胞中でタンパク質が発現された後、それだけに限定されないが、例えば、低張塩処理、洗浄剤処理、均質化、または超音波処理を含めた、当業者によく知られている化学的または機械的細胞溶解によって細胞を破壊することができる。
【００４９】
本発明は、本発明の変異型ＲＴを含む、逆転写を実施するためのキットも提供する。逆転写はＲＮＡ鋳型からのＤＮＡの合成であり、これは通常逆転写酵素によって媒介され、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成する。逆転写酵素は、ＲＮＡ鋳型およびＲＮＡの３’末端と相補的な短鎖プライマーを使用して、第１の鎖ｃＤＮＡの合成を誘導し、これをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用の鋳型として直接使用することができる。逆転写とＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）のこの組合せによって、試料中の少量のＲＮＡの検出および対応するｃＤＮＡの生成が可能であり、これによって低コピー遺伝子のクローニングが容易になる。あるいは第１の鎖ｃＤＮＡを、ＤＮＡポリメラーゼＩとＤＮＡリガーゼを使用して二本鎖にすることができる。これらの反応産物は、増幅なしで直接クローニングに使用することができる。この場合、ＲＴまたは外部のいずれかから供給されるＲＮａｓｅ  Ｈ活性が必要とされる。目的用途に応じて、キットは、本発明の変異型ＲＴ以外に、バッファー、１つまたは複数のプライマーおよびｄＮＴＰ混合物などのさらなる成分を含むことができる。キットは、ＰＣＲ、第２のＤＮＡ鎖の合成または増幅に必要とされる作用物質（例えばプライマー、プローブ、ポリメラーゼまたはマーカー）などの、さらなる反応に必要とされる作用物質も含むことができる。さらに、キットは説明書マニュアルを含むことができる。
【００５０】
さらなる態様では、本発明は、ｃＤＮＡ合成のための本発明の変異型ＲＴの使用に関する。例えば生存細胞中の遺伝子発現を試験するために使用される一般的な技法は、ＲＮＡの細胞補体のＤＮＡコピー（ｃＤＮＡ）を生成することである。この技法は、本来不安定なＲＮＡの直接分析を排除し、生存細胞由来のＲＮＡを試験するための手段となる。（例えば、オリゴｄＴを利用したアフィニティークロマトグラフィーなどの方法を使用した）任意選択のｍＲＮＡ単離後、典型的にはオリゴヌクレオチド配列をｍＲＮＡ分子にアニーリングさせ、鋳型としてＲＮＡ／ＤＮＡプライマーを利用し、逆転写酵素活性を有する酵素を利用してＲＮＡ配列のｃＤＮＡコピーを生成することができる。したがって、ｍＲＮＡの逆転写は多くの型の遺伝子発現解析における重要な工程である。典型的には、プライマー伸長法またはポリメラーゼ連鎖反応による後の分析用に、ｍＲＮＡがｃＤＮＡに逆転写される。本発明の使用では、ＲＮＡを本発明の変異型ＲＴおよび典型的にはプライマー配列と接触させ、それをプライマーの３’ＯＨから開始されるＤＮＡ合成用にＲＮＡ鋳型にアニーリングさせる。目的の核酸配列の各鎖の３’末端に存在する配列と相補的、または実質的に相補的であるプライマーを選択することができる。例示的実施形態では、典型的には約４２〜６５℃の逆転写酵素反応で、アニーリング温度を使用して逆転写反応を実施する。逆転写反応は、約５０℃〜６０℃または６０℃〜６５℃で実施することが好ましい。
【００５１】
本発明は、ＲＮＡを逆転写するための方法であって、本発明の変異型ＲＴを使用してＲＮＡからｃＤＮＡを合成する工程を含む方法をさらに提供する。ｃＤＮＡ合成のための本発明の変異型ＲＴの使用に関して詳述したように、この方法を実施することができる。
【００５２】
さらに本発明は、試料中のＲＮＡマーカーを検出するための方法であって、
ａ）変異型ＲＴの活性に資する条件下で、試料を本発明の変異型ＲＴと接触させる工程、
ｂ）本発明の変異型ＲＴを使用してＲＮＡマーカーからｃＤＮＡを合成する工程、および
ｃ）ステップｂ）で合成したｃＤＮＡの存在を検出し、それによって試料中のＲＮＡマーカーを検出する工程
を含む方法をさらに提供する。
【００５３】
ＲＮＡは様々な適用例においてマーカーとして使用することができる。検出されるＲＮＡはそれ自体を示す可能性があり、またはそれはＤＮＡの存在もしくは目的の遺伝子の発現を示す可能性があり、したがって疾患、病原体の存在などを示す。ＲＮＡ自体は、ウイルスＲＮＡ、特にレトロウイルスＲＮＡの存在を示し得る。レトロウイルスは、例えば、がん、ＡＩＤＳ、自己免疫疾患、中枢神経系、骨および関節の疾患、骨髄性白血病、赤白血病、リンパ性白血病、リンパ腫、肉腫、乳房癌、腎臓癌、再生不良性貧血、溶血性貧血、自己免疫疾患、免疫不全、大理石骨病、関節炎、末梢性ニューロパチー、脳症、神経変性、認知症、肺炎および腺腫症などの様々な疾患を引き起こす。このような疾患を誘導するウイルスには、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）およびマウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）がある。しかしながら、ＲＮＡマーカーは遺伝子発現を示し得る。多くの遺伝子は、（疾患状態を含めた）特定条件下、または個別の種でのみ発現される。したがって、タンパク質（または対応するｍＲＮＡ）の存在は、わずか数例を挙げると、疾患状態、細胞または病原体を示し得る。一例として、がん細胞は特定のマーカーによって特徴付けられ、がん細胞の検出と定量化においてその核酸を使用することができる。言及することができる例は、特にがん遺伝子およびｐ５３などの腫瘍抑制遺伝子、ｒａｓファミリーの遺伝子、ｅｒｂ−Ｂ２、ｃ−ｍｙｃ、ｍｄｍ２、ｃ−ｆｏｓ、ＤＰＣ４、ＦＡＰ、ｎｍ２３、ＲＥＴ、ＷＴ１など、例えばｐ５３、ＤＣＣ、ＡＰＣ、Ｒｂなどに関するＬＯＨ、およびさらに遺伝性腫瘍におけるＢＲＣＡ１とＢＲＣＡ２、ＭＳＨ２、ＭＬＨ１、ＷＴ１などのマイクロサテライト不安定性、さらにＣＥＡなどの腫瘍性ＲＮＡ、サイトケラチン、例えばＣＫ２０、ＢＣＬ−２、ＭＵＣ１、特にその腫瘍特異的スプライス変異体、ＭＡＧＥ３、Ｍｕｃ１８、チロシナーゼ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＢＡ４６、Ｍａｇｅ−１など、または他の形態形成ＲＮＡ、例えばマスピン、ｈＣＧ、ＧＩＰ、モチリン、ｈＴＧ、ＳＣＣＡ−１、ＡＲ、ＥＲ、ＰＲ、様々なホルモンなど、さらに、特に転移プロファイル、すなわち血管形成、運動性、接着およびマトリックス分解に関与する分子の発現に影響を与えるＲＮＡおよびタンパク質、例えばｂＦＧＦ、ｂＦＧＦ−Ｒ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｒ１またはＶＥＧＦ−Ｒ２などのＶＥＧＦ−Ｒ、Ｅ−カドヘリン、インテグリン、セレクチン、ＭＭＰ、ＴＩＭＰ、ＳＦ、ＳＦ−Ｒなど、細胞周期プロファイルもしくは増殖プロファイルに影響を与えるＲＮＡおよびタンパク質、例えばサイクリン（例えば、サイクリンＤ、ＥおよびＢの発現比）、Ｋｉ６７、ｐ１２０、ｐ２１、ＰＣＮＡなど、またはアポトーシスプロファイルに影響を与えるＲＮＡおよびタンパク質、例えばＦＡＳ（Ｌ＋Ｒ）、ＴＮＦ（Ｌ＋Ｒ）、パーフォリン、グランザイムＢ、ＢＡＸ、ｂｃｌ−２、カスパーゼ３などである。あるいは、ＲＮＡはレトロウイルス以外の病原体のＤＮＡを示し得る。
【００５４】
本発明の方法の第１の工程では、変異型ＲＴの活性に資する条件下で、試料を本発明の変異型ＲＴと接触させる。適切な条件は本明細書中に詳述し、当業者にはよく知られている。接触させる試料は、対象由来の試料を含めた、問題のＲＮＡを含有する疑いがある任意の試料であってよい。試料とは、その多量の材料（複数可）と同一であると考えられそれを表す限られた量の材料である。試料を得る作業は人力によって、または自動的に行われる。試料は、試験、解析、検査、調査、実証、または臨床用途のために入手または提供され得る。時折、サンプリングは連続的に進行され得る。試料は、固体、液体または気体を含むかまたはこれらからなる可能性がある。試料は、ゲルもしくは喀痰、組織、生物、またはこれらの組合せなどの、幾つかの中間的性質の材料であり得る。試料は、容易に分配し得る液体または懸濁液であることが好ましい。
【００５５】
試料材料が個々の品目として計数不能である場合でさえ、試料の量は依然として、その体積、質量、サイズ、または他のこのような寸法に関して記載可能である。固体試料は１個または数個の別々の塊にすることができ、または断片状、顆粒状、もしくは粉末状にすることができる。
【００５６】
本発明の文脈における試料は、検出または測定し定量化する１つまたは複数の核酸を含有する疑いがあるある量の材料である。本明細書中で使用するこの用語は、限定されないが、検体（例えば、生検材料または医療用検体）、培養物（例えば、微生物培養物）または水もしくは土などの環境試料を含む。試料は動物またはヒトなどの対象由来であってよく、それらは流体、固体（例えば大便）、懸濁液または組織であってよい。「対象由来の試料」という用語は、任意の所与の対象から単離した全ての生体液、排出物および組織を含む。対象は動物であることが好ましく、哺乳動物であることがより好ましく、またはヒトであることがさらにより好ましい。試料は、全ての様々な科の家畜動物、およびそれだけに限定されないが、有蹄類、クマ、魚類、げっ歯類などの動物を含めた野獣または野生動物から得ることができる。
【００５７】
前に詳述したように、「試料」は、定量化する目的の核酸を含有する疑いがある一定量の材料を意味する。本明細書中で使用するこの用語は、検体（例えば、生検材料または医療用検体）または培養物（例えば、微生物培養物）を含む。試料は植物またはヒトを含めた動物由来であってよく、試料は流体、固体（例えば大便）または組織であってよい。試料は、それだけに限定されないが、培養物、血液、唾液、脳脊髄液、胸膜液、乳、リンパ液、喀痰、精子、針吸引物などを含めた患者から得た材料を含み得る。試料は、全ての様々な科の家畜動物、およびそれだけに限定されないが、有蹄類、クマ、魚類、げっ歯類などの動物を含めた野獣または野生動物から得ることができる。ヒトに関して、試料または「組織試料」または「患者試料」または「患者細胞もしくは組織試料」または「検体」は、対象もしくは患者の組織から得た類似細胞または生物学的もしくは生化学的化合物の集合体をそれぞれ意味する。組織試料の供給源は、新鮮、凍結および／または保存臓器または組織試料または生検材料または吸引物、血液または任意の血液成分、脳脊髄液、羊水、腹膜液、または間質液などの体液、または対象の任意の摂取時もしくは発生時由来の細胞などに由来する固体組織であり得る。組織試料は、天然組織と本来混在していない化合物、例えば防腐剤、抗凝血薬、バッファー、固定剤、栄養剤、抗生物質などを含有し得る。
【００５８】
試料の例には、それだけに限定されないが、細胞または組織培養物、血液、血清、血漿、針吸引物、尿、精子、精液、精漿、前立腺液、排出液、涙、唾液、汗、生検材料、腹水、脳脊髄液、胸膜液、羊水、腹膜液、間質液、喀痰、乳、リンパ液、気管支および他の洗浄試料、または組織抽出試料がある。試料の供給源は、新鮮、凍結および／または保存臓器または組織試料または生検材料または吸引物、または対象の任意の摂取時もしくは発生時由来の細胞などに由来する固体組織であり得る。方法の好ましい実施形態では、試料は、特にヒト、動物または植物、特にヒトの、体液、血液、血漿、血清、尿、胆汁、脳脊髄液、スワブ、臨床検体、臓器試料および組織試料からなる群から選択される。あるいは、または追加的に、対象は、細胞培養物、汚染の疑いがある供給源、または対象から得られたものであり、特に対象は、ヒト、動物および植物、特にヒトからなる群から選択される。
【００５９】
工程ａ）の後、本発明の変異型ＲＴを使用してＲＮＡマーカーからｃＤＮＡを合成する。この工程に関する詳細は前に示している。その後、合成されたｃＤＮＡの存在を検出し、それによって試料中のＲＮＡマーカーを検出する。ＤＮＡを検出するための方法は当技術分野でよく知られており、ＰＣＲ法、標識（例えば、放射性もしくは蛍光）または挿入剤を用いた特異的プローブの使用を含む。好ましい実施形態では、リアルタイムＰＣＲと組み合わせて逆転写酵素を、ＲＮＡマーカーの検出に使用する。
【００６０】
本発明の方法および使用は、診断または治療モニタリングなどの医療分野において特に興味深いものがあり、これらを使用して、特異的微生物、細胞、ウイルス、細菌、真菌、哺乳動物種、遺伝子状態または疾患を示す目的の核酸を検出および／または定量化することができる。これによれば、病原体の検出において本発明の方法を使用することができる。病原体には疾患を引き起こす可能性がある。典型的には、ウイルス、細菌、プリオン、真菌、またはさらに別の微生物などの感染因子を記載するため病原体が使用される。当然ながら、本発明の方法を使用して非病原性微生物を検出することもできる。したがって、方法の好ましい別の実施形態では、ＲＮＡマーカーは微生物、細胞、ウイルス、細菌、真菌、哺乳動物種、遺伝子状態または疾患を示す。
【００６１】
例示的病原体は、限定されないが、以下のものを含む：
−  細菌：ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、シュードモナス、バークホルデリア、マイコバクテリウム、クラミドフィラ、エーリキア、リケッチア、サルモネラ、ナイセリア、ブルセラ、マイコバクテリウム、ノカルジア、リステリア、フランシセラ、レジオネラ、およびエルシニア
−  ウイルス：アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、水痘帯状ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、パピローマウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、黄熱ウイルス、デング熱ウイルス、西ナイルウイルス、ＴＢＥウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、ラッサウイルス、ロタウイルスおよびエボラウイルス
−  真菌：カンジダ、アスペルギルス、クリプトコッカス、ヒストプラズマ、ニューモシスティスおよびスタキボトリス
−  寄生体：原生動物寄生体、ぜん虫寄生体および節足動物寄生体。
【００６２】
病原体の確実な検出、および任意選択の定量化は、疾患の存在と重症度の診断において非常に関連性があり得ることは明らかである。
【００６３】
他に定義しない限り、本明細書中で使用する、全ての技術用語および科学用語ならびに任意の頭字語は、本発明の技術分野の当業者により一般的に理解されているものと同じ意味を有する。分子生物学における一般用語の定義は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓにより出版されたＢｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ  Ｖ、１９９４年（ＩＳＢＮ  ０−１９−８５４２８７−９）、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．により出版されたＫｅｎｄｒｅｗら（編）、Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９４年（ＩＳＢＮ  ０−６３２−０２１８２−９）、およびＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．により出版されたＲｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、１９９５年（ＩＳＢＮ  １−５６０８１−５６９−８）中で見ることができる。
【００６４】
本発明は、本明細書中に記載する特定の方法、プロトコール、および試薬に限られない。それらは変わり得るからである。本明細書中に記載するものと類似または同等の任意の方法および材料が本発明を実施する際に使用できるが、好ましい方法、および材料を本明細書中に記載する。さらに、本明細書中で使用する用語は単に個々の実施形態を記載する目的であり、本発明の範囲を限定する意図はない。
【００６５】
本明細書中および添付の特許請求の範囲において使用する、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他の事を示さない限り複数形の言及を含む。同様に、「含む」、「含有する」および「包含する」という語句は、排他的ではなく包括的に解釈される。同様に、「または」という語句は、文脈が明らかに他の事を示さない限り「および」を含むものとする。「複数」という用語は２個以上を指す。
【００６６】
以下の図面と実施例は、本発明の様々な実施形態を例証するものとする。このように、論じる具体的な修正は本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。様々な均等物、変更、および修正を本発明の範囲から逸脱せずに作製できることは当業者には明らかであり、したがって、こうした均等な実施形態が本明細書中に含まれることは理解される。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１−１】変異型ＲＴ  ＭＭ３．１４のヌクレオチド配列（配列番号３）とアミノ酸配列（配列番号２）の図である。野生型に対する６個の必須的変異（置換Ａ３２Ｖ、Ｌ７２Ｒ、Ｅ２８６Ｒ、Ｅ３０２Ｋ、Ｗ３８８ＲおよびＬ４３５Ｒ）を示す。
【図１−２】変異型ＲＴ  ＭＭ３．１４のヌクレオチド配列（配列番号３）とアミノ酸配列（配列番号２）の図である。野生型に対する６個の必須的変異（置換Ａ３２Ｖ、Ｌ７２Ｒ、Ｅ２８６Ｒ、Ｅ３０２Ｋ、Ｗ３８８ＲおよびＬ４３５Ｒ）を示す。
【図２】ＭＭＬＶ−ＲＴ用の発現プラスミドの図である。星印は停止コドンを示す。
【図３−１】一重変異体の活性と安定性の図である。（Ａ）比活性。ｄＴＴＰの取り込み反応は３７℃で実施した。１ユニットは、１０分間でポリ（ｒＡ）−ｐ（ｄＴ）１５中に１ｎｍｏｌのｄＴＴＰを取り込む量として定義する。相対比活性は、野生型の比活性に対する変異体の比活性の比として定義する。（Ｂ、Ｃ）熱安定性。ポリ（ｒＡ）−ｐ（ｄＴ）１５（２８μＭ）の存在下において１０分間、１００ｎＭのＲＴを４６℃（Ｂ）または４９℃（Ｃ）でインキュベートした。次いで、ｄＴＴＰの取り込み反応を３７℃で実施した。相対活性は、インキュベーションなしでの初期反応速度に対する、４６℃または４９℃における１０分間のインキュベーションでのＲＴの初期反応速度の比として定義する。
【図３−２】一重変異体の活性と安定性の図である。（Ａ）比活性。ｄＴＴＰの取り込み反応は３７℃で実施した。１ユニットは、１０分間でポリ（ｒＡ）−ｐ（ｄＴ）１５中に１ｎｍｏｌのｄＴＴＰを取り込む量として定義する。相対比活性は、野生型の比活性に対する変異体の比活性の比として定義する。（Ｂ、Ｃ）熱安定性。ポリ（ｒＡ）−ｐ（ｄＴ）１５（２８μＭ）の存在下において１０分間、１００ｎＭのＲＴを４６℃（Ｂ）または４９℃（Ｃ）でインキュベートした。次いで、ｄＴＴＰの取り込み反応を３７℃で実施した。相対活性は、インキュベーションなしでの初期反応速度に対する、４６℃または４９℃における１０分間のインキュベーションでのＲＴの初期反応速度の比として定義する。
【図４−１】多重変異体の活性と安定性の図である。（Ａ、Ｂ）比活性。（Ａ）ｄＴＴＰの取り込み反応は３７℃において５ｎＭ  ＲＴで実施した。１ユニットは、１０分間でポリ（ｒＡ）−ｐ（ｄＴ）１５中に１ｎｍｏｌのｄＴＴＰを取り込む量として定義する。相対比活性は、野生型の比活性に対する変異体の比活性の比として定義する。（Ｂ）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎの取り込み反応は３７℃において５ｎＭ  ＲＴで実施した。初期反応速度（ΔＦＩ／分）を計算し、１．０として野生型の初期反応速度で標準化した。（Ｃ〜Ｆ）熱安定性。ポリ（ｒＡ）−ｐ（ｄＴ）１５（２８μＭ）の存在下において１０分間、１００ｎＭのＲＴを４９℃または５１℃でインキュベートした。次いで、ｄＴＴＰの取り込み反応（Ｃ、Ｅ）またはＰｉｃｏＧｒｅｅｎの取り込み反応（Ｄ、Ｆ）を３７℃において１０ｎＭ  ＲＴで実施した。相対活性は、熱処理なしのＲＴの初期反応速度に対する、１０分間の熱処理をしたＲＴの初期反応速度の比として定義する。
【図４−２】多重変異体の活性と安定性の図である。（Ａ、Ｂ）比活性。（Ａ）ｄＴＴＰの取り込み反応は３７℃において５ｎＭ  ＲＴで実施した。１ユニットは、１０分間でポリ（ｒＡ）−ｐ（ｄＴ）１５中に１ｎｍｏｌのｄＴＴＰを取り込む量として定義する。相対比活性は、野生型の比活性に対する変異体の比活性の比として定義する。（Ｂ）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎの取り込み反応は３７℃において５ｎＭ  ＲＴで実施した。初期反応速度（ΔＦＩ／分）を計算し、１．０として野生型の初期反応速度で標準化した。（Ｃ〜Ｆ）熱安定性。ポリ（ｒＡ）−ｐ（ｄＴ）１５（２８μＭ）の存在下において１０分間、１００ｎＭのＲＴを４９℃または５１℃でインキュベートした。次いで、ｄＴＴＰの取り込み反応（Ｃ、Ｅ）またはＰｉｃｏＧｒｅｅｎの取り込み反応（Ｄ、Ｆ）を３７℃において１０ｎＭ  ＲＴで実施した。相対活性は、熱処理なしのＲＴの初期反応速度に対する、１０分間の熱処理をしたＲＴの初期反応速度の比として定義する。
【図４−３】多重変異体の活性と安定性の図である。（Ａ、Ｂ）比活性。（Ａ）ｄＴＴＰの取り込み反応は３７℃において５ｎＭ  ＲＴで実施した。１ユニットは、１０分間でポリ（ｒＡ）−ｐ（ｄＴ）１５中に１ｎｍｏｌのｄＴＴＰを取り込む量として定義する。相対比活性は、野生型の比活性に対する変異体の比活性の比として定義する。（Ｂ）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎの取り込み反応は３７℃において５ｎＭ  ＲＴで実施した。初期反応速度（ΔＦＩ／分）を計算し、１．０として野生型の初期反応速度で標準化した。（Ｃ〜Ｆ）熱安定性。ポリ（ｒＡ）−ｐ（ｄＴ）１５（２８μＭ）の存在下において１０分間、１００ｎＭのＲＴを４９℃または５１℃でインキュベートした。次いで、ｄＴＴＰの取り込み反応（Ｃ、Ｅ）またはＰｉｃｏＧｒｅｅｎの取り込み反応（Ｄ、Ｆ）を３７℃において１０ｎＭ  ＲＴで実施した。相対活性は、熱処理なしのＲＴの初期反応速度に対する、１０分間の熱処理をしたＲＴの初期反応速度の比として定義する。
【図５−１】野生型、ＭＭ３、またはＭＭ３．１４によるｃＤＮＡ合成に関する温度依存性の図である。ｃＤＮＡ合成反応は、５５℃で５分間の加熱インキュベーションを施したＲＴ（Ｂ）または加熱インキュベーションをしなかったＲＴ（Ａ、Ｃ〜Ｅ）を使用して、５０（Ａ）、５５（Ｂ、Ｃ）、６０（Ｄ）、または６５℃（Ｅ）で１０分間実施した。次いで、ＰＣＲを実施した。ｃＤＮＡ合成産物を使用したリアルタイムＰＣＲの蛍光を示した。クロッシングポイント（ＣＰ）は、野生型、ＭＭ３、およびＭＭ３．１４に関してそれぞれ、２８．０１、２５．２２、および２５．６７分（Ａ）、ＭＭ３およびＭＭ３．１４に関してそれぞれ、２４．９５および２６．７４分（Ｂ）、ＭＭ３．１４に関して３０．５２分（Ｃ）、ＭＭ３およびＭＭ３．１４に関してそれぞれ、２８．４８および２９．１４分（Ｄ）、ならびにＭＭ３．１４に関して３２．５１分（Ｅ）であった。
【図５−２】野生型、ＭＭ３、またはＭＭ３．１４によるｃＤＮＡ合成に関する温度依存性の図である。ｃＤＮＡ合成反応は、５５℃で５分間の加熱インキュベーションを施したＲＴ（Ｂ）または加熱インキュベーションをしなかったＲＴ（Ａ、Ｃ〜Ｅ）を使用して、５０（Ａ）、５５（Ｂ、Ｃ）、６０（Ｄ）、または６５℃（Ｅ）で１０分間実施した。次いで、ＰＣＲを実施した。ｃＤＮＡ合成産物を使用したリアルタイムＰＣＲの蛍光を示した。クロッシングポイント（ＣＰ）は、野生型、ＭＭ３、およびＭＭ３．１４に関してそれぞれ、２８．０１、２５．２２、および２５．６７分（Ａ）、ＭＭ３およびＭＭ３．１４に関してそれぞれ、２４．９５および２６．７４分（Ｂ）、ＭＭ３．１４に関して３０．５２分（Ｃ）、ＭＭ３およびＭＭ３．１４に関してそれぞれ、２８．４８および２９．１４分（Ｄ）、ならびにＭＭ３．１４に関して３２．５１分（Ｅ）であった。
【図６】ｃＤＮＡ合成によって評価した野生型、ＭＭ３、またはＭＭ３．１４の安定性の図である。ポリ（ｒＡ）−ｐ（ｄＴ）１５（２８μＭ）の存在下において１０分間、１００ｎＭのＲＴを４８、５４、５７、６０、または６３℃でインキュベートした。次いで、４５℃で３０分間、１６ｐｇ  ｃｅｓＡＲＮＡ、０．５μＭ  ＲＶ−Ｒ２６プライマーを用いてｃＤＮＡ合成を実施した。ＲＶとＦ５のプライマーの組合せを用いてＰＣＲを実施した。増幅産物は１％アガロースゲルに施し、次に臭化エチジウム（１μｇ／ｍｌ）で染色した。
【実施例】
【００６８】
方法
ＲＴ濃度および標準ＲＮＡ
標準としてウシ血清アルブミン（ナカライテスク株式会社、京都、日本）を含むプロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライテスク株式会社）を使用して、Ｂｒａｄｆｏｒｄ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、１９７６年）の方法に従いＲＴ濃度を決定した。バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）のｃｅｓＡ遺伝子のＤＮＡ配列８３５３〜９３６６（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＤＱ３６０８２５）に相当する１０１４ヌクレオチドのＲＮＡであった標準ＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって調製した。
【００６９】
プラスミドの構築
ＭＭＬＶ  ＲＴ変異体の発現プラスミドを、野生型ＭＭＬＶ  ＲＴ、ｐＥＴ−ＭＲＴＨｉｓ用の発現プラスミド（図２）、または鋳型として熱的安定性変異体ＭＭ３、ｐＥＴ−ＭＭ３、および宿主として大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）［Ｆ−、ｏｍｐＴ、ｈｓｄＳＢ（ｒＢ−ｍＢ−）ｇａｌｄｃｍ（ＤＥ３）］を使用して、部位特異的変異誘発によって構築した。変異型ＭＭＬＶ  ＲＴ遺伝子のヌクレオチド配列を立証した。
【００７０】
一重ＭＭＬＶ  ＲＴ変異体の発現および精製
５０μｇ／ｍｌ  アンピシリンを含有する３ｍｌのＬブロスを、形質転換ＢＬ２１（ＤＥ３）のグリセロールストックに接種し、３０℃で攪拌しながら１６時間インキュベートした。ＲＴ遺伝子の発現は、自動誘導システム（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）によって誘導した。ＭＭＬＶ  ＲＴは、ＨｉｓＬｉｎｋ  Ｓｐｉｎタンパク質精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して培養培地から精製した。簡単に言うと、培養物へのＦａｓｔＢｒｅａｋ細胞溶解試薬、次にＨｉｓＬｉｎｋタンパク質精製樹脂の添加によって細菌細胞を破壊した。次いで試料をＨｉｓＬｉｎｋ  Ｓｐｉｎカラムに移し、そこで非結合タンパク質を洗浄除去した。０．２ｍｌの１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ７．５）、５００ｍＭイミダゾールを用いた溶出によってＭＭＬＶ  ＲＴを回収した。５０ｍＭトリス−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．３）、２００ｍＭ  ＫＣｌ、５０％グリセロールで平衡化した事前充填ＰＤ−１０ゲル濾過カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して活性分画を脱塩処理し、−８０℃で保存した。
【００７１】
多重ＭＭＬＶ  ＲＴ変異体の発現および精製
形質転換体の一晩培養物（５ｍＬ）を、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有する５００ｍＬのＬブロスに加え、３７℃において攪拌しながらインキュベートした。ＯＤ６６０が０．６〜０．８に達したとき、０．１５ｍＬの０．５Ｍ  ＩＰＴＧを加え、３時間３０℃で増殖させ続けた。１０，０００×ｇで５分間の遠心分離後、細胞を採取し、１０ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、ｐＨ７．５を含有する１０ｍＬの０．０２Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．２）、２．０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１０％グリセロール（バッファーＡ）で懸濁し、超音波処理によって破壊した。２０，０００×ｇで４０分間の遠心分離後、上清を回収し、バッファーＡで平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＤＥＡＥ−６５０Ｍゲル（東ソー株式会社、東京、日本）充填カラム［２５ｍｍ（内径）×１２０ｍｍ］に施した。１２０ｍＭ  ＮａＣｌを含有するバッファーＡで洗浄した後、３００ｍＭ  ＮａＣｌを含有するバッファーＡで結合ＲＴを溶出した。固体（ＮＨ４）２ＳＯ４を、４０％飽和の最終濃度まで溶出液（３０ｍＬ）に加えた。溶液は５分間攪拌し、氷上に３０分間放置した。４℃における２０，０００×ｇで３０分間の遠心分離後、ペレットを回収し、１００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する１０ｍＬバッファーＡ中に溶解した。５０ｍＭトリス−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．３）、２００ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ、１０％グリセロール（バッファーＢ）で平衡化したＮｉ２＋−セファロース（ＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰ  １ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）充填カラムに溶液を施した。５０ｍＭイミダゾールを含有するバッファーＢで洗浄した後、５００ｍＭイミダゾールを含有するバッファーＢで結合ＲＴを溶出した。５０ｍＭトリス−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．３）、２００ｍＭ  ＫＣｌ、５０％グリセロールで平衡化した事前充填ＰＤ−１０ゲル濾過カラムを使用して活性分画を脱塩処理し、−８０℃で保存した。
【００７２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
還元条件下において１０％ポリアクリルアミドゲル中でＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。２．５％の２−メルカプトエタノールを用いた１００℃で１０分間の処理によりタンパク質を還元し、次いでゲル上に施した。４０ｍＡの定電流を４０分間施した。電気泳動後、クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０でタンパク質を染色した。ウサギ筋肉ホスホリラーゼＢ（９７．２ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（６６．４ｋＤａ）、ニワトリ卵白オボアルブミン（４４．３ｋＤａ）、およびウシ炭酸脱水酵素（２９．０ｋＤａ）からなる分子量マーカーキットは、タカラバイオ株式会社（大津、日本）の製品であった。
【００７３】
［３Ｈ］−ｄＴＴＰを使用した逆転写アッセイ
（ｄＴ）１５（Ｆａｓｍａｃ、東京、日本）とポリ（ｒＡ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）のアニーリングによってポリ（ｒＡ）−ｐ（ｄＴ）１５を調製した。反応は、２５ｍＭトリス−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５μＭポリ（ｒＡ）−ｐ（ｄＴ）１５（この濃度はｐ（ｄＴ）１５に基づいて表す）、０．２ｍＭ  ［３Ｈ］ｄＴＴＰ（１．８５Ｂｑ／ｐｍｏｌ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、および５または１０ｎＭ  ＭＭＬＶ  ＲＴ中で３７℃において実施した。３分と６分にアリコート（２０μｌ）を反応混合物から入手し、すぐにガラスフィルター上にスポットした。取り込まれなかった［３Ｈ］ｄＴＴＰは、それぞれ１０分間３回の冷却５％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）での洗浄、次に冷却９５％エタノールでの１回の洗浄によって除去した。２．５ｍｌのＥｃｏｓｃｉｎｔ  Ｈ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅ、ＵＫ）で、乾燥フィルター上で保持された放射活性を計測した。初期反応速度は、［３Ｈ］ｄＴＴＰの取り込みに関する時間行程から推定した。
【００７４】
蛍光色素ＰｉｃｏＧｒｅｅｎを使用した逆転写アッセイ
ＥｎｚＣｈｅｋ逆転写酵素アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用した。１９ｍｌの水を加えて１×ＴＥバッファーを作製することにより２０×ＴＥバッファー（１ｍｌ）を希釈した。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ定量化試薬（５０μｌ）は、１７．５ｍｌの１×ＴＥバッファーを加えてＰｉｃｏＧｒｅｅｎ溶液を作製することによって希釈した。加熱不活性化において使用するためのポリ（ｒＡ）−ｐ（ｄＴ）１６は以下のように調製した。ポリ（ｒＡ）（３μｌ、１００ｍＭトリス−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．１）、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ中１ｍｇ／ｍｌ、約３５０塩基）とｐ（ｄＴ）１６（３μｌ、１００ｍＭトリス−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．１）、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ中５０μｇ／ｍｌ）を混合し、室温で１時間放置し、次に１１４μｌのＰＤＧＴ（０．０１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．６）、２ｍＭ  ＤＴＴ、１０％グリセロール、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で希釈した。ＭＭＬＶ  ＲＴ（５００ｎＭの８μｌ）、ポリ（ｒＡ）−ｐ（ｄＴ）１６（８μｌ）、およびＰＤＧＴ（６４μｌ）を混合して、ＭＭＬＶ  ＲＴ濃度を５０ｎＭにした。生成した溶液（８０μｌ中４０μｌ）を４９℃または５１℃で１０分間インキュベートし、次に氷上で３０分間インキュベートした。
【００７５】
逆転写アッセイに使用するためのポリ（ｒＡ）−ｐ（ｄＴ）１６は以下のように調製した。ポリ（ｒＡ）（５μｌ）とｐ（ｄＴ）１６（５μｌ）を混合し室温で１時間放置して、次に２ｍｌの重合バッファー（６０ｍＭトリス−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．１）、６０ｍＭ  ＫＣｌ、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１３ｍＭ  ＤＴＴ、１００μＭ  ｄＴＴＰ）で希釈した。熱処理を施したかまたは施さなかった、ポリ（ｒＡ）−ｐ（ｄＴ）１６（９６μｌ）と４０μｌの２５または５０ｎＭ  ＭＭＬＶ  ＲＴを、３７℃で１０分間インキュベートした。プレインキュベートポリ（ｒＡ）−ｐ（ｄＴ）１６溶液（９６μｌ）に、プレインキュベートＭＭＬＶ  ＲＴ溶液（２４μｌ）を加えることによって反応を開始した。２．５、５．０、７．５、および１０分にアリコート（２５μｌ）を反応混合物から入手し、これに２μｌの２００ｍＭ  ＥＤＴＡをすぐに加え、次に氷上で３０分以上インキュベートした。ブランク溶液は、ポリ（ｒＡ）−ｐ（ｄＴ）１６溶液（２０μｌ）と２００ｍＭ  ＥＤＴＡ（２μｌ）を混合し、次にＭＭＬＶ  ＲＴ溶液（５μｌ）を加えることによって調製した。それぞれの溶液（２７μｌ）に、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ溶液（１７３μｌ）を加えた。試験管をアルミホイルで覆い、室温で１０分間放置した。５０２ｎｍの励起波長でＥｎＳｉｇｈｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて５２３ｎｍにおける蛍光を測定した。
【００７６】
ｃＤＮＡ合成
バチルス・セレウスのｃｅｓＡ遺伝子のＤＮＡ配列８，３５３〜９，３６６（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＤＱ３６０８２５）に相当する１，０１４ヌクレオチドのＲＮＡである標準ＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって調製した。ｃＤＮＡ合成用の反応混合物（２０μｌ）は、水（１２μｌ）、１０×ＲＴバッファー（２５０ｍＭトリス−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．３）、５００ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  ＤＴＴ、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）（２μｌ）、２．０ｍＭ  ｄＮＴＰ（１μｌ）、１６０ｐｇ／μｌ  ｃｅｓＡ  ＲＮＡ（２μｌ）、１０μＭ  ＲＶ−Ｒ２６プライマー５’−ＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＴＧＴＣＧＣＡＡＴＣＡＣＣＧＴＡＡＣＡＣＧＡＣＧＴＡＧ−３’（配列番号４）（１μｌ）および１０ｎＭ  ＭＭＬＶ  ＲＴ野生型（２μｌ）を混合することによって調製した。反応は４５℃で３０分間、および６５℃で５分間実施した。ＰＣＲ用の反応混合物（２５μｌ）は、ｃＤＮＡ合成の反応産物（２μｌ）、水（１７．７μｌ）、１０×ＰＣＲバッファー（２．５μｌ）、２ｍＭ  ｄＮＴＰ（１．５μｌ）、１０μＭ  Ｆ５プライマー５’−ＴＧＣＧＣＧＣＡＡＡＡＴＧＧＧＴＡＴＣＡＣ−３’（配列番号５）（０．５μｌ）および１０μＭ  ＲＶプライマー５’−ＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧ−３’（配列番号６）（０．５μｌ）、およびＴａｑポリメラーゼ（０．３μｌ）を混合することによって調製した。反応は、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で６０秒の３０サイクル下で実施した。増幅産物は１．０％ｗ／ｖアガロースゲル上に分離させ、臭化エチジウム（１μｇ／ｍｌ）で染色した。
【００７７】
実施例１
変異の設計および一重変異体の特徴付け
本発明者らは、鋳型−プライマーとの相互作用に関与している位置への正電荷の導入（Ｙａｓｕｋａｗａら、２０１０年）によって、熱的安定性三重ＭＭＬＶ  ＲＴ変異体ＭＭ３（Ｅ２８６Ｒ／Ｅ３０２Ｋ／Ｌ４３５Ｒ）を以前に作製した。ＭＭＬＶ  ＲＴをさらに安定化するため、本発明者らは２９個の変異を設計した（表１）。それらは、疎水性コアを安定化する目的の８個の変異、塩架橋を導入する目的の８個の変異、表面電荷を導入する目的の１０個の変異、およびジスルフィド結合を排除する目的の３個の変異である。
【００７８】
【表１】
0006928668.tif 000006
【００７９】
野生型ＭＭＬＶ  ＲＴ（ＷＴ）、２９個の一重変異体、および１個の二重変異体Ｙ１４６Ｆ／Ｄ３６１Ｌを３ｍｌ培養物において発現させ、細胞から精製した。熱的安定性四部分変異体ＭＭ４（Ｅ２８６Ｒ／Ｅ３０２Ｋ／Ｌ４３５Ｒ／Ｄ５２４Ａ）（Ｙａｓｕｋａｗａら、２０１０年）も調製した。Ａｓｐ５２４はＲＮａｓｅ  Ｈ活性の触媒残基なので、ＭＭ４にはＲＮａｓｅ  Ｈ活性がない。還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、精製ＷＴおよび変異体は７５ｋＤａの分子量を有する単一バンドを示した。
【００８０】
図３Ａは、野生型と３０個の変異体に関する逆転写反応の比活性を示す。野生型の比活性は１４，０００ユニット／ｍｇであった。全ての変異体は３グループに分類することができる。グループ１は、その比活性が野生型の比活性の１０％未満であった、Ｖ４３Ｅ、Ａ１５４Ｉ、Ｉ２６１Ｆ、Ｌ３５７Ｄ、Ｌ３６８Ｒ、およびＶ３７０Ｅを含む。グループ２は、その比活性が野生型の比活性の６０〜１４０％であった、Ｌ４１Ｄ、Ｑ６３Ｅ、Ｌ７２Ｒ、Ｌ２７２Ｅ、Ｗ３８８Ｒ、およびＬ４１０Ｒを含む。グループ３は、その比活性が野生型の比活性の１０〜６０％であった他の１８個の変異体を含む。
【００８１】
図３Ｂおよび図Ｃは、それぞれ４９℃と５１℃での、グループ２または３に属する野生型、ＭＭ４、および２４個の変異体の安定性を示す。相対活性は、インキュベーションなしの初期反応速度に対する、Ｔ／Ｐの存在下で４９℃または５１℃で１０分間のインキュベーションありの初期反応速度の比として定義した。４９℃での野生型とＤ５２４Ａの相対活性はそれぞれ６６％と１２０％であり、５１℃でのそれはそれぞれ１８％と１００％であった。４９℃または５１℃でＭＭ４より高い相対活性を示した変異体はなかった。しかしながらＡ３２Ｖ、Ｌ７２Ｒ、Ｉ２１２Ｒ、Ｌ２７２Ｅ、Ｗ３８８Ｒ、およびＣ４０９Ｒは、４９℃と５１℃の両方で野生型より高い相対活性を示した。
【００８２】
実施例２
変異の組合せの設計および多重変異体の特徴付け
図３中に表した結果に基づき、４個の変異（Ａｌａ３２→Ｖａｌ、Ｌｅｕ７２→Ａｒｇ、Ｉｌｅ２１２→Ａｒｇ、Ｌｅｕ２７２→Ｇｌｕ、およびＴｒｐ３８８→Ａｒｇ）を安定化変異として選択し、１個の変異（Ｌｅｕ４１→Ａｓｐ）を活性化変異として選択した。１０個の変異体（ＭＭ３．１〜ＭＭ３．１０）を、６個の変異中１、２、または３個とＭＭ３変異（Ｇｌｕ２８６→Ａｒｇ、Ｇｌｕ３０２→Ｌｙｓ、およびＬｅｕ４３５→Ａｒｇ）を組み合わせることによって設計した（表２）。
【００８３】
【表２】
0006928668.tif 000007
【００８４】
これらは大腸菌において発現させ精製した。還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、精製変異体は７５ｋＤａの分子量を有する一本のバンドを示した。５００ｍｌの培養物からの精製酵素の収量は０．３８〜４．２６ｍｇの範囲内であり、これは野生型の収量（２．２７ｍｇ）に匹敵した（表３）。
【００８５】
【表３】
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【００８６】
図４Ａおよび表３は、［３Ｈ］−ｄＴＴＰを使用した逆転写アッセイによる活性を示す。蛍光色素ＰｉｃｏＧｒｅｅｎを使用したアッセイにより安定性を評価した。ＭＭ３．２（Ｌ２７２Ｅ／Ｅ２８６Ｒ／Ｅ３０２Ｋ／Ｌ４３５Ｒ）は活性を欠き、Ｌｅｕ２７２→Ｇｌｕの変異はＭＭ３変異と不適合であったことを示した。他の９個の変異体（ＭＭ３．１およびＭＭ３．３〜ＭＭ３．１０）の比活性は野生型の比活性の３０〜１００％であった。
【００８７】
【表４】
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【００８８】
図４Ｃおよび表４は［３Ｈ］−ｄＴＴＰを使用したアッセイにより評価した安定性を示し、図４ＤはＰｉｃｏＧｒｅｅｎを使用したアッセイにより評価した安定性を示す。ＭＭ３．３、ＭＭ３．５、ＭＭ３．７、ＭＭ３．８、ＭＭ３．９、およびＭＭ３．１０の相対活性はＭＭ３の相対活性に匹敵し、一方ＭＭ３．１、ＭＭ３．４、およびＭＭ３．６の相対活性はＭＭ３より低かった。ＭＭ３．６（Ｌ４１Ｄ／Ｅ２８６Ｒ／Ｅ３０２Ｋ／Ｌ４３５Ｒ）の相対活性は野生型の相対活性とほぼ同じであり、Ｌｅｕ４１→Ａｓｐの変異はＭＭ３変異と不適合であったことを示した。
【００８９】
さらに、５個の変異体（ＭＭ３．１１〜ＭＭ３．１５；表２参照）を、４個の変異（Ａｌａ３２→Ｖａｌ、Ｌｅｕ７２→Ａｒｇ、Ｉｌｅ２１２→Ａｒｇ、およびＴｒｐ３８８→Ａｒｇ）の中の２個以上を組み合わせることによって設計した。ＭＭ３．１１は発現されなかったが、他の４個の変異体（ＭＭ３．１２〜ＭＭ３．１５）は大腸菌において発現させ、精製した。図４Ｅおよび図４Ｆは、それぞれ［３Ｈ］−ｄＴＴＰおよびＰｉｃｏＧｒｅｅｎを使用したアッセイにより評価したそれらの安定性を示す。ＭＭ３．１４の相対活性はＭＭ３の相対活性より高く、一方ＭＭ３．１２、ＭＭ３．１３、およびＭＭ３．１５の相対活性はＭＭ３の相対活性より低かった。
【００９０】
ＭＭ３．１４をさらに評価した。図５は、野生型、ＭＭ３、またはＭＭ３．１４によるｃＤＮＡ合成に関する温度依存性を示す。ｃＤＮＡ合成反応後、リアルタイムＰＣＲを実施した。５５、６０、または６５℃において１０分間ＭＭ３．１４でｃＤＮＡ合成反応を実施すると、ＰＣＲにおいて蛍光が増大した。他方で、野生型またはＭＭ３でｃＤＮＡ合成反応を実施すると、蛍光は増大しなかった。これは、ＭＭ３．１４はＭＭ３より熱的安定性があり、ｃＤＮＡ合成において使用するのに適していることを示す。
【００９１】
図６は、野生型、ＭＭ３、およびＭＭ３．１４の熱的安定性の比較を示す。ｃＤＮＡ合成反応は、１０分間４８〜６３℃に曝した野生型、ＭＭ３、またはＭＭ３．１４で、４５℃において３０分間実施した。反応産物はＰＣＲに、次いでアガロースゲル電気泳動に施した。ｃＤＮＡが合成された最高温度はＭＭ３に関して６０℃であった。
【００９２】
さらなる実験では、ＭＭ３．１４（Ａ３２Ｖ／Ｌ７２Ｒ／Ｅ２８６Ｒ／Ｅ３０２Ｋ／Ｗ３８８Ｒ／Ｌ４３５Ｒ）を用いた反応において６０℃と６５℃でｃＤＮＡが合成され、一方ＭＭ３（Ｅ２８６Ｒ／Ｅ３０２Ｋ／Ｌ４３５Ｒ）を用いた反応において、それは６０℃ではほとんど合成されず６５℃では全く合成されなかったことを証明し、ＭＭ３．１４はこの反応中ＭＭ３より熱的安定性があることを示した。
【００９３】
要約すると、ＭＭ３．１４はＭＭ３より熱的安定性があることを証明することができた。
【００９４】
参照文献
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【配列表】
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