(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血漿を２つ以上の保護剤と混合し、混合物を得ること；および該混合物を凍結乾燥することを含む、血漿タンパク質活性保存のための方法であって、該２つ以上の保護剤が、グリセロールである第１の保護剤、および、トリグリセリド、アラニン、およびセリンからなる群から選択される第２の保護剤を含む、方法。
【請求項２】
該２つ以上の保護剤が、グリセロール、トリグリセリド、およびスクロースを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
混合工程において、該血漿が、デキストラン、アルブミン、およびゼラチンからなる群から選択される保護剤とさらに混合される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
混合工程において、該血漿が、デキストラン、アルブミン、およびゼラチンからなる群から選択される保護剤とさらに混合される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
血漿を２つ以上の保護剤と混合し、混合物を得ること；および該混合物を凍結乾燥することを含む、血漿タンパク質活性保存のための方法であって、該２つ以上の保護剤が、プロピレングリコールである第１の保護剤、および、トリグリセリド、グリシン、アルギン酸塩、およびスクロースからなる群から選択される第２の保護剤を含む、方法。
【請求項６】
混合工程において、該血漿が、デキストラン、アルブミン、およびゼラチンからなる群から選択される保護剤とさらに混合される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
血漿を２つ以上の保護剤と混合し、混合物を得ること；および該混合物を凍結乾燥することを含む、血漿タンパク質活性保存のための方法であって、該２つ以上の保護剤が、グリセロール、トリグリセリド、およびプロピレングリコールを含む、方法。
【請求項８】
混合工程において、該血漿が、デキストラン、アルブミン、およびゼラチンからなる群から選択される保護剤とさらに混合される、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血漿タンパク質活性保存のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血漿は、通常、懸濁状態で全血中の血球を保持する淡黄色の血液の液体成分であり；このことは、血漿を血球の細胞外マトリックスにする。それは、ほとんど水であり、溶解したタンパク質（例えば、血清アルブミン、グロブリン、およびフィブリノーゲン）、グルコース、凝固因子、電解質、ホルモン、ビタミンおよび二酸化炭素を含有する。血漿は、電解質をバランスのとれた形態に保ち、感染および他の血液障害から体を保護する血管内浸透圧効果において重要な役割を果たす。
【０００３】
血漿は、血液細胞がチューブの底に落ちるまで、抗凝固剤を含む新鮮な血液のチューブを遠心分離機で回転させることにより調製することができる。全血の代わりとしてそして輸血目的のための血漿の使用が、１９１８年に提案された。破損を減らし、輸送、包装および貯蔵をずっとより簡単にするように、軍隊のための乾燥血漿包装が開発された。朝鮮戦争中に、血清アルブミンは、戦闘での使用のための乾燥血漿に置き替わった。
【０００４】
血漿は、適切な血圧および血液の体積の維持から、血液凝固および免疫のための重要なタンパク質の供給まで、さまざまな機能を果たす。それはまた、ナトリウムおよびカリウムなどの重要なミネラルの交換のための媒体として役立ち、細胞機能に重要である体内の適切なｐＨ（酸−塩基）バランスを維持するのを助ける。献血から調製された血液産物としての血漿は、輸血において、典型的に、新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）または瀉血後２４時間以内の凍結血漿（ＰＦ２４）として使用される。凝固因子を保存するため、献血後すぐに（２４時間まで）血漿を凍結し、１年まで貯蔵し、そして使用直前に解凍する。現在は通常、過剰な出血の場合や、侵襲的手技を受けている異常な凝固検査を受けている患者における出血を防ぐため、それはトロンビンとともに使用される。それは通常、外傷患者および、肝不全、重度の感染症、重度の火傷、または複数の凝固因子欠乏症を有する患者に輸血される。医療活動におけるＦＦＰの使用は、この数年間で２０％を超えて増加しており、その臨床使用の妥当性について懸念が生じている。
【０００５】
血漿貯蔵の最新技術は、瀉血後２４時間以内に急速に血漿を凍結し、典型的に、１年まで新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）として貯蔵することである。該ＦＦＰは使用直前に解凍してもよい。しかしながら、かかる貯蔵方法は、少なくとも以下の欠点：（１）血漿は、ＦＦＰとして凍結させて超低温冷蔵庫に貯蔵しない限り、長期間貯蔵できない；および（２）フィブリノーゲン活性は、使用のための解凍後、十分に維持されることができない、を有する。
【発明の概要】
【０００６】
発明の簡単な概要
本発明は、血漿を、トリグリセリド、グリセロール、プロピレングリコール、アラニン、セリン、グリシン、アルギン酸塩、およびスクロースからなる群から選択される２つ以上の保護剤と混合し、混合物を得ること、および該混合物を凍結乾燥することを含む、血漿タンパク質活性保存のための方法を提供する。
【０００７】
本発明の特定の実施形態において、２つ以上の保護剤は、グリセロールである第１の保護剤、および、トリグリセリド、アラニンおよびセリンからなる群から選択される第２の保護剤を含む。
【０００８】
本発明の特定の実施形態において、２つ以上の保護剤は、プロピレングリコールである第１の保護剤、および、トリグリセリド、グリシン、アルギン酸塩およびスクロースからなる群から選択される第２の保護剤を含む。
【０００９】
本発明の特定の実施形態において、２つ以上の保護剤は、グリセロール、トリグリセリドおよびプロピレングリコールを含む。
【００１０】
本発明の特定の実施形態において、２つ以上の保護剤は、グリセロール、トリグリセリドおよびスクロースを含む。
【００１１】
本発明によれば、血漿は、混合工程において、デキストラン、アルブミンおよびゼラチンからなる群から選択される保護剤とさらに混合されてもよい。
【００１２】
前述の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方は例示的および説明的なものにすぎず、本発明を限定するものではないことが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
前述の概要、ならびに以下の本発明の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むとよりよく理解されるであろう。図面において：
【００１４】
図１Ａ〜１Ｃは、保護剤としてアルブミンを使用して血漿粉末から再構成された血漿中の成長因子レベルを示す。図１ＡはＰＤＧＦ−ＡＢのレベルを示し、図１ＢはＴＧＦ−β１のレベルを示し、そして図１ＣはＶＥＧＦのレベルを示す。血漿の体積に基づいて使用される保護剤の量：％は％（ｗ／ｖ）を意味する。対照：血漿のみ。異なる文字を付した同じスタイルの棒で示されたデータ（凍結乾燥後の同じ期間（１時間、１ヶ月、または６ヶ月）の後に再構成された血漿）間の違いは、統計的に有意である（Ｐ＜０．０５）。
【００１５】
図２Ａ〜２Ｃは、保護剤としてアルギン酸塩を使用して血漿粉末から再構成された血漿中の成長因子レベルを示す。図２ＡはＰＤＧＦ−ＡＢのレベルを示し、図２ＢはＴＧＦ−β１のレベルを示し、そして図２ＣはＶＥＧＦのレベルを示す。血漿の体積に基づいて使用される保護剤の量：％は％（ｗ／ｖ）を意味する。対照：血漿のみ。異なる文字を付した同じスタイルの棒で示されたデータ（凍結乾燥後の同じ期間（１時間、１ヶ月、または６ヶ月）の後に再構成された血漿）間の違いは、統計的に有意である（Ｐ＜０．０５）。
【００１６】
図３Ａ〜３Ｃは、保護剤としてデキストランを使用して血漿粉末から再構成された血漿中の成長因子レベルを示す。図３ＡはＰＤＧＦ−ＡＢのレベルを示し、図３ＢはＴＧＦ−β１のレベルを示し、そして図３ＣはＶＥＧＦのレベルを示す。血漿の体積に基づいて使用される保護剤の量：％は％（ｗ／ｖ）を意味する。対照：血漿のみ。異なる文字を付した同じスタイルの棒で示されたデータ（凍結乾燥後の同じ期間（１時間、１ヶ月、または６ヶ月）の後に再構成された血漿）間の違いは、統計的に有意である（Ｐ＜０．０５）。
【００１７】
図４Ａ〜４Ｃは、保護剤としてゼラチンを使用して血漿粉末から再構成された血漿中の成長因子レベルを示す。図４ＡはＰＤＧＦ−ＡＢのレベルを示し、図４ＢはＴＧＦ−β１のレベルを示し、そして図４ＣはＶＥＧＦのレベルを示す。血漿の体積に基づいて使用される保護剤の量：％は％（ｗ／ｖ）を意味する。対照：血漿のみ。異なる文字を付した同じスタイルの棒で示されたデータ（凍結乾燥後の同じ期間（１時間、１ヶ月、または６ヶ月）の後に再構成された血漿）間の違いは、統計的に有意である（Ｐ＜０．０５）。
【００１８】
図５Ａ〜５Ｃは、保護剤としてグルコースを使用して血漿粉末から再構成された血漿中の成長因子レベルを示す。図５ＡはＰＤＧＦ−ＡＢのレベルを示し、図５ＢはＴＧＦ−β１のレベルを示し、そして図５ＣはＶＥＧＦのレベルを示す。血漿の体積に基づいて使用される保護剤の量：％は％（ｗ／ｖ）を意味する。対照：血漿のみ。異なる文字を付した同じスタイルの棒で示されたデータ（凍結乾燥後の同じ期間（１時間、１ヶ月、または６ヶ月）の後に再構成された血漿）間の違いは、統計的に有意である（Ｐ＜０．０５）。
【００１９】
図６Ａ〜６Ｃは、保護剤としてグルタミン酸を使用して血漿粉末から再構成された血漿中の成長因子レベルを示す。図６ＡはＰＤＧＦ−ＡＢのレベルを示し、図６ＢはＴＧＦ−β１のレベルを示し、そして図６ＣはＶＥＧＦのレベルを示す。血漿の体積に基づいて使用される保護剤の量：％は％（ｗ／ｖ）を意味する。対照：血漿のみ。異なる文字を付した同じスタイルの棒で示されたデータ（凍結乾燥後の同じ期間（１時間、１ヶ月、または６ヶ月）の後に再構成された血漿）間の違いは、統計的に有意である（Ｐ＜０．０５）。
【００２０】
図７Ａ〜７Ｃは、保護剤としてグリセロールを使用して血漿粉末から再構成された血漿中の成長因子レベルを示す。図７ＡはＰＤＧＦ−ＡＢのレベルを示し、図７ＢはＴＧＦ−β１のレベルを示し、そして図７ＣはＶＥＧＦのレベルを示す。血漿の体積に基づいて使用される保護剤の量：％は％（ｖ／ｖ）を意味する。対照：血漿のみ。異なる文字を付した同じスタイルの棒で示されたデータ（凍結乾燥後の同じ期間（１時間、１ヶ月、または６ヶ月）の後に再構成された血漿）間の違いは、統計的に有意である（Ｐ＜０．０５）。
【００２１】
図８Ａ〜８Ｃは、保護剤としてグリシンを使用して血漿粉末から再構成された血漿中の成長因子レベルを示す。図８ＡはＰＤＧＦ−ＡＢのレベルを示し、図８ＢはＴＧＦ−β１のレベルを示し、そして図８ＣはＶＥＧＦのレベルを示す。血漿の体積に基づいて使用される保護剤の量：％は％（ｗ／ｖ）を意味する。対照：血漿のみ。異なる文字を付した同じスタイルの棒で示されたデータ（凍結乾燥後の同じ期間（１時間、１ヶ月、または６ヶ月）の後に再構成された血漿）間の違いは、統計的に有意である（Ｐ＜０．０５）。
【００２２】
図９Ａ〜９Ｃは、保護剤としてプロピレングリコールを使用して血漿粉末から再構成された血漿中の成長因子レベルを示す。図９ＡはＰＤＧＦ−ＡＢのレベルを示し、図９ＢはＴＧＦ−β１のレベルを示し、そして図９ＣはＶＥＧＦのレベルを示す。血漿の体積に基づいて使用される保護剤の量：％は％（ｖ／ｖ）を意味する。対照：血漿のみ。異なる文字を付した同じスタイルの棒で示されたデータ（凍結乾燥後の同じ期間（１時間、１ヶ月、または６ヶ月）の後に再構成された血漿）間の違いは、統計的に有意である（Ｐ＜０．０５）。
【００２３】
図１０Ａ〜１０Ｃは、保護剤としてスクロースを使用して血漿粉末から再構成された血漿中の成長因子レベルを示す。図１０ＡはＰＤＧＦ−ＡＢのレベルを示し、図１０ＢはＴＧＦ−β１のレベルを示し、そして図１０ＣはＶＥＧＦのレベルを示す。血漿の体積に基づいて使用される保護剤の量：％は％（ｗ／ｖ）を意味する。対照：血漿のみ。異なる文字を付した同じスタイルの棒で示されたデータ（凍結乾燥後の同じ期間（１時間、１ヶ月、または６ヶ月）の後に再構成された血漿）間の違いは、統計的に有意である（Ｐ＜０．０５）。
【００２４】
図１１Ａ〜１１Ｃは、保護剤としてトレハロースを使用して血漿粉末から再構成された血漿中の成長因子レベルを示す。図１１ＡはＰＤＧＦ−ＡＢのレベルを示し、図１１ＢはＴＧＦ−β１のレベルを示し、そして図１１ＣはＶＥＧＦのレベルを示す。血漿の体積に基づいて使用される保護剤の量：％は％（ｗ／ｖ）を意味する。対照：血漿のみ。異なる文字を付した同じスタイルの棒で示されたデータ（凍結乾燥後の同じ期間（１時間、１ヶ月、または６ヶ月）の後に再構成された血漿）間の違いは、統計的に有意である（Ｐ＜０．０５）。
【００２５】
図１２Ａ〜１２Ｃは、保護剤としてトリグリセリドを使用して血漿粉末から再構成された血漿中の成長因子レベルを示す。図１２ＡはＰＤＧＦ−ＡＢのレベルを示し、図１２ＢはＴＧＦ−β１のレベルを示し、そして図１２ＣはＶＥＧＦのレベルを示す。血漿の体積に基づいて使用される保護剤の量：％は％（ｖ／ｖ）を意味する。対照：血漿のみ。異なる文字を付した同じスタイルの棒で示されたデータ（凍結乾燥後の同じ期間（１時間、１ヶ月、または６ヶ月）の後に再構成された血漿）間の違いは、統計的に有意である（Ｐ＜０．０５）。
【００２６】
図１３Ａ〜１３Ｃは、２つの保護剤を使用して血漿粉末から再構成された血漿中の成長因子レベルを示す。図１３ＡはＰＤＧＦ−ＡＢのレベルを示し、図１３ＢはＴＧＦ−β１のレベルを示し、そして図１３ＣはＶＥＧＦのレベルを示す。血漿の体積に基づいて使用される保護剤の量：％は、トリグリセリド、グリセロールおよびプロピレングリコールについて％（ｖ／ｖ）を意味し、他の保護剤について％（ｗ／ｖ）を意味する。対照：血漿のみ。１：２％グリセロール＋２％デキストラン；２：０．１％トリグリセリド＋２％デキストラン；３：０．１６％グリセロール＋３％アルブミン；４：０．１％トリグリセリド＋２％プロピレングリコール；５：０．１％トリグリセリド＋２％グリセロール；６：０．８％グリシン＋１．６％デキストラン；７：１．６％グリシン＋１．６％プロピレングリコール；８：０．８％プロピレングリコール＋４％アルギン酸塩；９：０．４％プロピレングリコール＋２．４％アルブミン；１０：１．６％デキストラン＋１．０％プロピレングリコール；１１：１％グリセロール＋２％アラニン；１２：０．６％グリセロール＋１．２％セリン；１３：０．０８％プロピレングリコール＋２％スクロース；１４：０．０８％デキストラン＋３．２％アルブミン；および１５：０．８％グリシン＋１％トレハロース。異なる文字を付した同じスタイルの棒で示されたデータ（凍結乾燥後の同じ期間（１時間、１ヶ月、または６ヶ月）の後に再構成された血漿）間の違いは、統計的に有意である（Ｐ＜０．０５）。
【００２７】
図１４Ａ〜１４Ｃは、３つの保護剤を使用して血漿粉末から再構成された血漿中の成長因子レベルを示す。図１４ＡはＰＤＧＦ−ＡＢのレベルを示し、図１４ＢはＴＧＦ−β１のレベルを示し、そして図１４ＣはＶＥＧＦのレベルを示す。血漿の体積に基づいて使用される保護剤の量：％は、トリグリセリド、グリセロールおよびプロピレングリコールについて％（ｖ／ｖ）を意味し、他の保護剤について％（ｗ／ｖ）を意味する。対照：血漿のみ。１：４％グルタミン酸＋０．４％プロピレングリコール＋０．０４％デキストラン。２：０．４％トリグリセリド＋４％グリセロール＋０．８％デキストラン。３：０．１％トリグリセリド＋４％グリセロール＋０．３％スクロース；４：１％トリグリセリド＋１．６％グリセロール＋０．８％プロピレングリコール；５：０．４％グルタミン酸＋０．４％アルブミン＋４％ゼラチン；６：１％グルタミン酸＋４％アルブミン＋０．８％デキストラン；７：０．０１％トリグリセリド＋４％デキストラン＋０．８％アルブミン；８：０．０４％トリグリセリド＋０．０８％グリセロール＋４％アルブミン；９：４％トリグリセリド＋０．４％グリセロール＋０．８％グリシン；１０：３％トレハロース＋４％アルギン酸塩＋０．８％デキストラン；１１：０．１％グルタミン酸＋１％トレハロース＋４％デキストラン；１２：３％グルタミン酸＋３％トレハロース＋３％アルギン酸塩。異なる文字を付した同じスタイルの棒で示されたデータ（凍結乾燥後の同じ期間（１時間、１ヶ月、または６ヶ月）の後に再構成された血漿）間の違いは、統計的に有意である（Ｐ＜０．０５）。
【００２８】
図１５Ａ〜１５Ｃは、４つの保護剤を使用して血漿粉末から再構成された血漿中の成長因子レベルを示す。図１５ＡはＰＤＧＦ−ＡＢのレベルを示し、図１５ＢはＴＧＦ−β１のレベルを示し、そして図１５ＣはＶＥＧＦのレベルを示す。血漿の体積に基づいて使用される保護剤の量：％は、トリグリセリド、グリセロールおよびプロピレングリコールについて％（ｖ／ｖ）を意味し、他の保護剤について％（ｗ／ｖ）を意味する。対照：血漿のみ。１：０．４％アルブミン＋０．８％ポリエチレングリコール＋４％グリセロール＋０．４％グリシン；２：１％ポリエチレングリコール＋０．４％ゼラチン＋０．４％グルタミン酸＋０．４％グルコース；３：４％トリグリセリド＋０．４％アルブミン＋０．４％デキストラン＋０．４％グリセロール；４：０．０４％トリグリセリド＋０．４％アルブミン＋０．４％ポリエチレングリコール＋０．４％グルコース；５：０．０１％アルブミン＋２％デキストラン＋０．４％セリン＋４％スクロース；６：０．０４％トリグリセリド＋４％アルブミン＋０．４％グリシン＋０．４％トレハロース；７：４％アルブミン＋０．４％ポリエチレングリコール＋０．４％アラニン＋４％トレハロース；８：０．４％トリグリセリド＋４％ゼラチン＋０．４％アルギネート＋０．４％グリシン；９：２％ゼラチン＋２％アルギン酸塩＋０．４％グリシン＋０．４％トレハロース。異なる文字を付した同じスタイルの棒で示されたデータ（凍結乾燥後の同じ期間（１時間、１ヶ月、または６ヶ月）の後に再構成された血漿）間の違いは、統計的に有意である（Ｐ＜０．０５）。
【００２９】
発明の詳細な説明
本発明は、血漿を、トリグリセリド、グリセロール、プロピレングリコール、アラニン、セリン、グリシン、アルギン酸塩、およびスクロースからなる群から選択される２つ以上の保護剤と混合し、混合物を得ること、および該混合物を凍結乾燥することを含む、血漿タンパク質活性保存のための方法を提供する。
【００３０】
本発明によれば、保護剤を、以下の量で加えてもよい：（１）血漿の体積に基づく０．０１〜１０％（ｖ／ｖ）、好ましくは０．０５〜２％（ｖ／ｖ）のトリグリセリド；（２）血漿の体積に基づく０．０１％〜１０％（ｖ／ｖ）、好ましくは０．５〜５％（ｖ／ｖ）のグリセロール；（３）血漿の体積に基づく０．０１％〜１０％（ｖ／ｖ）、好ましくは０．５〜５％（ｖ／ｖ）のプロピレングリコール；（４）血漿の体積に基づく０．０１％〜１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．５〜５％（ｗ／ｖ）のアラニン；（５）血漿の体積に基づく０．０１％〜１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０５〜５％（ｗ／ｖ）のセリン；（６）血漿の体積に基づく０．０１％〜１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．５〜５％（ｗ／ｖ）のグリシン；（７）血漿の体積に基づく０．０１％〜１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．５〜１０％（ｗ／ｖ）のアルギン酸塩；（８）血漿の体積に基づく０．０１％〜１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．５％〜５％（ｗ／ｖ）のスクロース。
【００３１】
本発明の特定の実施形態において、２つ以上の保護剤は、グリセロールである第１の保護剤、および、トリグリセリド、アラニンおよびセリンからなる群から選択される第２の保護剤を含む。いくつかの実施形態において、２つ以上の保護剤はグリセロールおよびトリグリセリドである。いくつかの実施形態において、２つ以上の保護剤はグリセロールおよびアラニンである。いくつかの実施形態において、２つ以上の保護剤はグリセロールおよびセリンである。
【００３２】
本発明の特定の実施形態において、２つ以上の保護剤は、プロピレングリコールである第１の保護剤、および、トリグリセリド、グリシン、アルギン酸塩およびスクロースからなる群から選択される第２の保護剤を含む。いくつかの実施形態において、２つ以上の保護剤は、プロピレングリコールおよびトリグリセリドである。いくつかの実施形態において、２つ以上の保護剤は、プロピレングリコールおよびグリシンである。いくつかの実施形態において、２つ以上の保護剤は、プロピレングリコールおよびアルギン酸塩である。いくつかの実施形態において、２つ以上の保護剤は、プロピレングリコールおよびスクロースである。
【００３３】
本発明の特定の実施形態において、２つ以上の保護剤は、グリセロール、トリグリセリドおよびプロピレングリコールを含む。一実施形態において、２つ以上の保護剤は、グリセロール、トリグリセリド、およびプロピレングリコールである。例えば、以下の量の保護剤を、（血漿の体積に基づいて）加えてもよい：約１％（ｖ／ｖ）のトリグリセリド、約１．６％（ｖ／ｖ）のグリセロール、および約０．８％（ｖ／ｖ）のプロピレングリコール。
【００３４】
本発明の特定の実施形態において、２つ以上の保護剤は、グリセロール、トリグリセリドおよびスクロースを含む。一実施形態において、２つ以上の保護剤は、グリセロール、トリグリセリドおよびスクロースである。例えば、以下の量の保護剤を、（血漿の体積に基づいて）加えてもよい：約０．１％（ｖ／ｖ）のトリグリセリド、約４％（ｖ／ｖ）のグリセロール、および約２％（ｗ／ｖ）のスクロース。
【００３５】
本発明によれば、混合工程において、血漿を、デキストラン、アルブミンおよびゼラチンからなる群から選択される保護剤とさらに混合してもよい。
【００３６】
本発明を、限定ではなく実証の目的のために提供される以下の実施例により、さらに説明する。
【００３７】
実施例１：血漿の単離
【００３８】
抗凝固剤（血液１０ｍｌあたりＡｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ  Ｃｉｔｒａｔｅ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ（ＡＣＤ）  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｆｏｒｍｕｌａ  １ｍｌ）の入ったダブル血液バッグシステム（約５０ｍｌ）（ＴｅｒｕｍｏＢＣＴ、日本）を使用して、瀉血／静脈穿刺において個人的に訓練されたボランティアドナーから全血を採取した。採血後、抗凝固剤との徹底的な混合を確実にするため、チューブを数回反転させることにより血液を穏やかに混合する。クエン酸塩チューブに採取した血液をまんべんなく混合するため、チューブを３〜４回反転させることが推奨されるが、ＡＣＤチューブは８回反転させなければならない。血液試料は、温和な条件（２０〜２４℃）に維持し、採血の４時間以内に遠心しなければならない。血漿を分離するため、該血液試料を２２℃で１０分間、１２００ｘｇで遠心する。必要であれば、遠心分離機のＲＣＦを計算できる。遠心分離後、血漿層は、分離された血液の上層になり、透明な淡黄色の液体に見えるだろう。
【００３９】
実施例２：血漿凍結乾燥粉末の調製
【００４０】
適量の保護剤を新たに採取した血漿に加え、まんべんなく混合して混合物を得た。次いで、該混合物を凍結乾燥して粉末にした。
【００４１】
【表１】
0006854351.tif 000002
【００４２】
実施例３：フィブリノーゲン活性試験
【００４３】
凍結乾燥の１時間、１ヶ月および６ヶ月後に、それぞれ２０ｍｇの血漿粉末を１ｍＬの生理食塩水に溶解し、まんべんなく混合した。再構成された血漿をトロンビン溶液（３５〜４５ＩＵ／ｍＬ）と１：１の体積比で混合した。（１）凝固活性：凝固形成を観察することによりフィブリノーゲン活性を試験し、優れている（＋＋＋）、良い（＋＋）、普通（＋）、または活性なし（−）として評価した。（２）粘度：トロンビン添加血漿の粘度は、フィブリノーゲン活性と正の相関があると考えられ、優れている（＋＋＋）、良い（＋＋）、普通（＋）、または粘度なし（−）として評価する。結果を下記表２〜５に示す。
【００４４】
【表２−１】
0006854351.tif 000003
【表２−２】
0006854351.tif 000004
【００４５】
【表３−１】
0006854351.tif 000005
【表３−２】
0006854351.tif 000006
【００４６】
【表４】
0006854351.tif 000007
【００４７】
【表５】
0006854351.tif 000008
【００４８】
保護剤トリグリセリド、グリセロール、プロピレングリコール、アラニン、セリン、グリシン、アルギン酸塩、およびスクロースは、血漿凍結乾燥粉末の調製において単独で使用する場合、１ヶ月または６ヶ月までフィブリノーゲン活性を保存することができない。しかしながら、これらの保護剤を組み合わせて使用する場合、フィブリノーゲン活性は１ヶ月または６ヶ月まで保存されてもよい。
【００４９】
実施例４：成長因子レベル試験
【００５０】
凍結乾燥の１時間、１ヶ月および６ヶ月後に、それぞれ２０ｍｇの血漿粉末を１ｍＬの生理食塩水に溶解し、まんべんなく混合した。再構成後１時間以内に、市販のイムノアッセイにより試料を分析した。標準および試料を３回アッセイし、そして平均値を計算した。結果に、試料に適用した希釈係数を掛けた。
【００５１】
ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＴＧＦ−β１、およびＶＥＧＦレベルを、ＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。
【００５２】
１．ＰＤＧＦ−ＡＢ：ＤｕｅＳｅｔ（登録商標）ＥＬＩＳＡキット（＃ＤＹ２２２、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎ．）を使用して、ＰＤＧＦ−ＡＢレベルをアッセイした。試料を、Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｄｉｌｕｅｎｔで２０倍希釈した。プレートを２時間インキュベートし、洗浄し、そして室温でさらに２時間、ＰＤＧＦ−ＡＢに対する酵素結合抗体とインキュベートした。Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒを使用してウェルを洗浄し、次いでＳｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを室温で２０分間加えた。ウェルを光から保護した。Ｓｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを各ウェルに加え、そしてマイクロプレートリーダー（Ｇｅｎ５、Ｂｉｏｔｅｋ、ＶＴ、ＵＳＡ）を使用して、４５０ｎｍでの吸収を決定した。検出可能用量範囲（ｒａｎｇｅ  ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ  ｄｏｓｅ）は、１５．６〜１０００ｐｇ／ｍｌであった。
【００５３】
２．ＴＧＦ−β１：ＤｕｅＳｅｔ（登録商標）ＥＬＩＳＡキット（＃ＤＹ２４０、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により、ＴＧＦ−β１レベルを決定した。試料を、Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｄｉｌｕｅｎｔで２０倍希釈した。ＴＧＦ−β１標準の希釈系列を、ＴＧＦ−β受容体ＩＩでコーティングされた９６ウェルマイクロリットルプレート中で、１００μｌ容量で調製した。ＴＧＦ−β１の分析の前に、潜在ＴＧＦ−β１を免疫反応型に活性化するため、酸活性化および中和を実施した。該目的のため、０．５ｍｌの試料を１Ｎ  ＨＣｌ  ０．１ｍｌと混合し、室温で１０分間インキュベートし、Ｓｉｇｍａの１．２Ｎ  ＮａＯＨ／０．５Ｍ  ＨＥＰＥＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−ＮＯ−［２−エタンスルホン酸］）（Ｈ−７５２３）０．１ｍｌの添加により中和し、そして遠心分離した。次いで、上清画分を、総ＴＧＦ−β１含量についてアッセイした。アリコート（５０μｌ）を、該マイクロリットルプレートに二系にてアプライし、次いでカバーをして、室温で２時間インキュベートした。次いでウェルを洗浄し、ＴＧＦ−ｂ１に対する酵素結合ポリクローナル抗体を加え、そして室温で２時間インキュベーションを続けた。上記のように測定を完了した。ＴＧＦ−β１の検出限界範囲（ｒａｎｇｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｌｉｍｉｔ）は、３１．２０〜２０００ｐｇ／ｍｌであった。
【００５４】
３．ＶＥＧＦ：ＤｕｅＳｅｔ（登録商標）ＥＬＩＳＡキット（＃ＤＹ２９３Ｂ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎ．）を使用して、ＶＥＧＦレベルをアッセイした。試料を、Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｄｉｌｕｅｎｔで２倍希釈した。典型的に、検出可能用量範囲（ｒａｎｇｅ  ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ  ｄｏｓｅ）は、３１．２〜２０００ｐｇ／ｍｌ未満である。アッセイ試薬希釈物１００μｌを各ウェルに加え、続いて標準（ＶＥＧＦ標準）１００μｌを加えた。プレートを粘着テープでカバーし、そして室温で２時間インキュベートした。該ウェルを４回洗浄し、次いで室温で２時間、酵素結合ＶＥＧＦとインキュベートした。上記のように測定を完了した。
【００５５】
全てのテストを３回繰り返し、結果をＳＰＳＳ２２ソフトウェアによる一元配置分散分析、Ｆ検定およびダンカン検定により分析し、平均±ＳＤとして表した。異なる文字を付した同じストライプの棒で示す貯蔵時間の平均値は、有意に異なる（Ｐ＜０．０５）。結果を図１Ａ〜１５Ｃに示す。
【００５６】
広い発明概念から逸脱することなく、上記の実施形態に変更を加えることができることを、当業者は理解するであろう。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲により定義されるような本発明の精神および範囲内の修正をカバーすることを意図されることが理解される。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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