(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
成熟型のｍｉＲ−１８ｂまたは前駆体型のｍｉｒ−１８ｂを有効成分として含有する、遺伝子突然変異によって誘発された筋肉疾患の予防または治療用の薬学組成物。
【請求項２】
前記成熟型のｍｉＲ−１８ｂまたは前駆体型のｍｉｒ−１８ｂは、ベクターに含まれるか、あるいは、細胞に取り込まれた形で与えられることを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子突然変異によって誘発された筋肉疾患の予防または治療用の薬学組成物。
【請求項３】
前記成熟型のｍｉＲ−１８ｂの塩基配列は、配列番号１または配列番号２に示され、前記前駆体型のｍｉｒ−１８ｂの塩基配列は、配列番号３に示されることを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子突然変異によって誘発された筋肉疾患の予防または治療用の薬学組成物。
【請求項４】
前記筋肉疾患は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、ベッカー型筋ジストロフィー（Ｂａｃｋｅｒ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、筋萎縮症（ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）及び筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子突然変異によって誘発された筋肉疾患の予防または治療用の薬学組成物。
【請求項５】
被検体から分離された試料から成熟型のｍｉＲ−１８ｂまたは前駆体型のｍｉｒ−１８ｂの発現レベルを測定し、正常対照群と比較するステップを含む、遺伝子突然変異によって誘発された筋肉疾患の診断情報を提供する方法。
【請求項６】
前記試料は、組織、細胞、血漿、血清、血液、唾液および小便よりなる群から選ばれるいずれか１種であることを特徴とする、請求項５に記載の遺伝子突然変異によって誘発された筋肉疾患の診断情報を提供する方法。
【請求項７】
前記発現レベルは、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッティング（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、転写体（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ）の解析よりなる群から選ばれるいずれか１つ以上の方法で測定することを特徴とする、請求項５に記載の遺伝子突然変異によって誘発された筋肉疾患の診断情報を提供する方法。
【請求項８】
前記試料からＨｉｆ１α（ｈｙｐｏｘｉａ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒ  １  ａｌｐｈａ）、Ｍｅｆ２ｃ（ｍｙｏｃｙｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｆａｃｔｏｒ  ２ｃ）、Ｍｃｔｐ１（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｃ２  ｄｏｍａｉｎｓ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）、Ｒａｒｂ（ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ）およびｍｉＲ−２０６よりなる群から選ばれるいずれか１種以上の発現レベルを測定し、正常対照群と比較するステップをさらに含む、請求項５に記載の遺伝子突然変異によって誘発された筋肉疾患の診断情報を提供する方法。
【請求項９】
前記筋肉疾患は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、ベッカー型筋ジストロフィー（Ｂａｃｋｅｒ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、筋萎縮症（ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）及び筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項５に記載の遺伝子突然変異によって誘発された筋肉疾患の診断情報を提供する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、筋肉疾患もしくは神経筋肉疾患の予防、治療または診断のためのｍｉＲ−１８ｂの用途に関し、より具体的には、ｍｉＲ−１８ｂを有効成分として含有する筋肉疾患の予防または治療用の薬学組成物およびｍｉＲ−１８ｂを用いた筋肉疾患の診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
筋肉疾患は、遺伝性および退行性、炎症性、内分泌性、代謝性の原因などによって上肢または下肢の筋力の弱化、それによる全般的な筋委縮、筋の緊張性の減少、筋痙攣、筋の激しい痛症などを訴える疾患である。特に、遺伝性および退行性の原因によって筋ジストロフィー（ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ；ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ｓｐｉｎａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｍｙｏｔｒｏｐｈｙ）、球脊髄性筋萎縮症（ｓｐｉｎｏｂｕｌａｒ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）、シャルコー・マリー・トゥース病（Ｃｈａｒｃｏｔ  Ｍａｒｉｅ  Ｔｏｏｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＣＭＴ）、ポンペ病（Ｐｏｍｐｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）、サルコペニア（筋肉減少症）（ｓａｃｏｐｅｎｉａ）、カナバン病（Ｃａｎａｖａｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ジストニア（筋緊張異常）（ｄｙｓｔｏｎｉａ）、サルコペニア（筋肉減少症）（ｓａｃｏｐｅｎｉａ）、筋肉退化症などが現れる。
【０００３】
例えば、筋萎縮性側索硬化症は、次の遺伝子突然変異によって発症される：ＳＯＤ１（Ｃｕ／Ｚｎ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ  １）、ＴＡＦ１５（ＴＡＴＡ−Ｂｏｘ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｆａｃｔｏｒ  １５）、ＥＷＳＲ１（Ｅｗｉｎｇ  ｓａｒｃｏｍａ  ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ  １）、ＦＵＳ（Ｆｕｓｅｄ  ｉｎ  Ｓａｒｃｏｍａ）およびＴＤＰ−４３（ＴＡＲ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４）。なお、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、初期には筋機能の障害を進ませ、究極的に筋肉の麻痺をきたす上位および下位の運動ニューロンの退行性疾患であって、不幸にも、ＡＬＳ患者の疾病の進行を遅らせたり、生活の質を向上させたりするオプションはほとんどない。
【０００４】
また、デュシェンヌ型およびベッカー型の筋ジストロフィーの場合、Ｘ染色体に存在するジストロフィン（Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ）遺伝子の異常によって発症され、約１／３は自然突然変異、残りは伴性遺伝に起因し、筋力の低下、心筋機能の障害などが現れる。
【０００５】
さらに、脊髄性筋萎縮症の場合、真核生物においてＳＭＮ（ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎ）タンパク質を暗号化するＳＭＮ１遺伝子突然変異によって発症され、ＳＭＮタンパク質の減少により脊髄と腦幹との間に存在する運動神経細胞の機能損傷を引き起こし、筋肉の動作を指令する信号を受け取ることができないために筋肉が放置され、筋力の低下、筋委縮および線維束性攣縮などを引き起こす。
【０００６】
このような筋肉疾患の発病の原因となる遺伝子突然変異は、オートファジー（自食作用）（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）、タンパク質の凝集、ミトコンドリア・ストレスおよびＲＮＡ代謝などといった多種多様な細胞プロセスと関わりがある。
【０００７】
一方、マイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）は、ＲＮＡ依存的な転写後遺伝子を調節することで、タンパク質の合成を調節する小さな非コード一本鎖ＲＮＡ分子であって、ｍｉＲＮＡは、２ステップ手順を経て生成される。具体的に、核内においてＤｒｏｓｈａとＤＧＣＲ８によって最初の転写体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）からｍｉＲＮＡｓ前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）として作成され、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは細胞質に送り出された後、ＤｉｃｅｒによってｍｉＲＮＡとして作成される。近年、ｍｉＲＮＡもまた、ミトコンドリア遺伝子の発現、カルシウムシグナル伝達、細胞分化、細胞死滅などの細胞プロセスと関わりがあり、遺伝子突然変異がｍｉＲＮＡの生合成を調節するということが知られてから、遺伝子突然変異によって誘発される疾患の発病機序においてｍｉＲＮＡの役割を判明させ、これを疾患の診断または治療に利用しようとする取り組みが行われている。しかしながら、これまで遺伝的な原因に起因する筋肉疾患における遺伝子突然変異とｍｉＲＮＡとの特異的な相互作用のメカニズムは完全に判明していない。
【０００８】
そのため、本発明者らは、筋肉疾患の診断および治療に利用可能なｍｉＲＮＡを見出すために鋭意努力したところ、遺伝子突然変異による筋肉疾患モデルにおいて遺伝子突然変異がｍｉＲ−１８ｂの発現を減少させてｍｉＲ−１８ｂシグナル伝達経路の調節障害を引き起こし、それにより、カルシウムシグナル伝達と細胞分化の抑制および細胞死滅を誘導することを確認して、ｍｉＲ−１８ｂをＡＬＳ、ＤＭＤのように遺伝子突然変異によって誘発される筋肉疾患の診断および治療のためのターゲット因子として用いることができることを判明させることで、本発明を完成するに至った。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Rosen DR, Siddique T, Patterson D, Figlewicz DA, Sapp P, Hentati A, Donaldson D, Goto J, O'Regan JP, Deng HX, et al. Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis. Nature. 1993 Mar 4;362(6415):59-62.
【非特許文献２】Narozna B, Langwinski W, Szczepankiewicz A. Non-Coding RNAs in Pediatric Airway Diseases. Genes (Basel). 2017 Nov 27;8(12).
【非特許文献３】Chen Z, Li Y, Zhang H, Huang P, Luthra R. Hypoxia-regulated microRNA-210 modulates mitochondrial function and decreases ISCU and COX10 expression. Oncogene. 2010 Jul 29;29(30):4362-8.
【非特許文献４】Choi E, Cha MJ, Hwang KC. Roles of Calcium Regulating MicroRNAs in Cardiac Ischemia-Reperfusion Injury. Cells. 2014 Sep 11;3(3):899-913.
【非特許文献５】Makeyev EV, Zhang J, Carrasco MA, Maniatis T. The MicroRNA miR-124 promotes neuronal differentiation by triggering brain-specific alternative pre-mRNA splicing. Mol Cell. 2007 Aug 3;27(3):435-48.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、ｍｉＲ−１８ｂを有効成分として含有する、筋肉疾患の予防または治療用の薬学組成物を提供することである。
【００１１】
本発明の別の目的は、ｍｉＲ−１８ｂを用いた筋肉疾患の診断方法を提供することである。
【００１２】
本発明のさらに別の目的は、薬学的に有効な量のｍｉＲ−１８ｂを個体に投与するステップを含む筋肉疾患の予防または治療方法を提供することである。
【００１３】
本発明のさらに別の目的は、筋肉疾患の予防または治療用の薬学的組成物として用いるためのｍｉＲ−１８ｂの用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の目的を達成するために、本発明は、ｍｉＲ−１８ｂを有効成分として含有する、筋肉疾患の予防または治療用の薬学組成物を提供する。
【００１５】
また、本発明は、被検体から分離された試料からｍｉＲ−１８ｂの発現レベルを測定し、正常対照群と比較するステップを含む筋肉疾患の診断方法を提供する。
【００１６】
さらに、本発明は、薬学的に有効な量のｍｉＲ−１８ｂを個体に投与するステップを含む筋肉疾患の予防または治療方法を提供する。
【００１７】
併せて、本発明は、筋肉疾患の予防または治療用の薬学的組成物として用いるためのｍｉＲ−１８ｂの用途を提供する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、遺伝子突然変異による筋肉疾患モデルにおいて遺伝子突然変異がｍｉＲ−１８ｂの発現を減少させてｍｉＲ−１８ｂシグナル伝達経路の調節障害を引き起こし、それにより、カルシウムシグナル伝達と細胞分化の抑制および細胞死滅を誘導することを確認した。なお、ｍｉＲ−１８ｂの発現を増加させて遺伝子突然変異によって誘導された細胞死滅が抑えられ、カルシウムシグナル伝達と細胞分化が修復されることを確認した。したがって、本発明のｍｉＲ−１８ｂをＡＬＳ、ＤＭＤのように遺伝子突然変異によって誘発される筋肉疾患の診断および治療のためのターゲット因子として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の一実施例に係るヒトＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）を発現させるＮＳＣ−３４運動神経細胞（ｍｔＮＳＣ−３４細胞）、および対照群であって、ヒトＳＯＤ１を発現させるＮＳＣ−３４運動神経細胞（ｗｔＮＳＣ−３４細胞）において、ＲＮＡの生合成の変化、ｍｔＮＳＣ−３４細胞およびｗｔＮＳＣ−３４細胞の間に発現差がある４種の遺伝子、Ｈｉｆ１α（ｈｙｐｏｘｉａ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒ  １  ａｌｐｈａ）、Ｍｅｆ２ｃ（ｍｙｏｃｙｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｆａｃｔｏｒ  ２ｃ）、Ｍｃｔｐ１（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｃ２  ｄｏｍａｉｎｓ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）およびＲａｒｂ（ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ）の発現変化を確認した図である。
【図２】本発明の一実施例に係るｍｔＮＳＣ−３４細胞、ｗｔＮＳＣ−３４細胞およびマウスＳＯＤ１を発現させる運動神経細胞（ＮＳＣ−３４  ｃｏｎｔ細胞）において細胞内のカルシウムシグナル伝達、細胞分化および細胞死滅の変化を確認した図である。
【図３】Ｈｉｆ１αを調節するターゲットｍｉＲＮＡでｍｉＲ−１８ｂを確認し、且つ、Ｍｃｔｐ１とＲａｒｂを調節するターゲットｍｉＲＮＡでｍｉＲ−２０６を確認した図である。
【図４】本発明の一実施例に従ってｍｉＲ−１８ｂの発現を減少させたＮＳＣ−３４  ｃｏｎｔ細胞において、Ｈｉｆ１α、Ｍｅｆ２ｃ、Ｍｃｔｐ１、ＲａｒｂおよびｍｉＲ−２０６の発現変化、ＬＤＨの放出変化を確認し、本発明の一実施例に係るｍｉＲ−１８ｂの発現を減少させた神経幹細胞（Ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ；ＮＳＣ）において細胞死滅の変化を確認した図である。
【図５】本発明の一実施例に従ってｍｉＲ−１８ｂの発現を増加させたｍｔＮＳＣ−３４細胞において、Ｈｉｆ１α、Ｍｅｆ２ｃ、Ｍｃｔｐ１、ＲａｒｂおよびｍｉＲ−２０６の発現変化、細胞内のカルシウムシグナル伝達、細胞分化および細胞死滅の変化を確認した図である。
【図６】本発明の一実施例に従ってＨｉｆ１αの発現を減少させたｍｔＮＳＣ−３４細胞において、Ｍｅｆ２ｃ、Ｍｃｔｐ１、ＲａｒｂおよびｍｉＲ−２０６の発現変化および細胞死滅の変化を確認した図である。
【図７】本発明の一実施例に従ってｍｉＲ−２０６の発現を増加させたＮＳＣ−３４  ｃｏｎｔ細胞において、Ｍｃｔｐ１およびＲａｒｂの発現変化を確認した図である。
【図８】本発明の一実施例に従ってｍｉＲ−２０６の発現を増加させたＮＳＣ−３４  ｃｏｎｔ細胞において、細胞内のカルシウムシグナル伝達、細胞分化を確認し、本発明の一実施例に従ってｍｉＲ−２０６の発現を増加させたＮＳＣ−３４  ｃｏｎｔ細胞およびＮＳＣのそれぞれにおいて細胞死滅の変化を確認した図である。
【図９】本発明の一実施例に従ってｍｉＲ−２０６の発現を減少させたｍｔＮＳＣ−３４細胞において、Ｍｃｔｐ１およびＲａｒｂの発現変化および細胞死滅の変化を確認した図である。
【図１０】本発明の一実施例に従ってＭｃｔｐ１および／またはＲａｒｂの発現を減少させたＮＳＣ−３４  ｃｏｎｔ細胞において、細胞内のカルシウムシグナル伝達および細胞分化の変化を確認した図である。
【図１１】本発明の一実施例に従ってＭｃｔｐ１および／またはＲａｒｂの発現を減少させたＮＳＣ−３４  ｃｏｎｔ細胞および神経幹細胞のそれぞれにおいて細胞死滅の変化を確認した図である。
【図１２】本発明の一実施例に従ってＭｃｔｐ１および／またはＲａｒｂの発現を増加させたｍｔＮＳＣ−３４細胞において、細胞内のカルシウムシグナル伝達、細胞分化および細胞死滅の変化を確認した図である。
【図１３】本発明の一実施例に従って突然変異されたＳＯＤ１（Ｇ８５Ｒ）およびＳＯＤ１（Ｄ９０Ａ）の発現を増加させたＮＳＣ−３４  ｃｏｎｔ細胞において、Ｈｉｆ１α、Ｍｅｆ２ｃ、Ｍｃｔｐ１、Ｒａｒｂ、ｍｉＲ−１８ｂおよびｍｉＲ−２０６の発現変化および細胞死滅の変化を確認した図である。
【図１４】本発明の一実施例に係る筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）疾患マウスモデルの脊髄（ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ）組織サンプルにおいて、Ｈｉｆ１α、Ｍｅｆ２ｃ、Ｍｃｔｐ１、Ｒａｒｂ、ｍｉＲ−１８ｂおよびｍｉＲ−２０６の発現変化および細胞死滅の変化を確認した図である。
【図１５】本発明の一実施例に係る家族性ＡＬＳ（ｆＡＬＳ（Ｇ８６Ｓ））患者の脊髄サンプルにおいて、Ｈｉｆ１α、Ｍｅｆ２ｃ、Ｍｃｔｐ１、Ｒａｒｂ、ｍｉＲ−１８ｂおよびｍｉＲ−２０６の発現変化および細胞死滅の変化を確認した図である。
【図１６】本発明の一実施例に従ってＳＯＤ１（Ｇ１７Ｓ）ｆＡＬＳ患者の血液サンプルから誘導されたｈｉＰＳＣから神経幹細胞（ｈＮＳＣｓ）を分化し、前記分化されたｈＮＳＣｓから誘導された運動ニューロン（ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎ；ＭＮ）を確認した図である。
【図１７】本発明の一実施例に係るＳＯＤ１（Ｇ１７Ｓ）ｆＡＬＳ患者のｈｉＰＳＣ由来ＭＮにおいて、Ｈｉｆ１α、Ｍｅｆ２ｃ、Ｍｃｔｐ１、Ｒａｒｂ、ｍｉＲ−１８ｂおよびｍｉＲ−２０６の発現変化、細胞内のカルシウムシグナル伝達、細胞分化および細胞死滅の変化を確認した図である。
【図１８】本発明の一実施例に従ってジストロフィンの発現を減少させた筋芽細胞においてｍｉＲ−１８ｂの発現変化を確認した図である。
【図１９】本発明の一実施例に係るデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）マウスモデルにおいてｍｉＲ−１８ｂの発現変化を確認した図である。
【図２０】遺伝子突然変異によるｍｉＲ−１８ｂシグナル伝達経路の調節障害の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
【００２１】
本発明は、ｍｉＲ−１８ｂを有効成分として含有する、筋肉疾患の予防または治療用の薬学組成物を提供する。
【００２２】
本発明において、前記ｍｉＲ−１８ｂは、ヒトをはじめとする動物、例えば、サル、チンパンジー、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ネズミ、ウサギなどに由来してもよい。
【００２３】
本発明において、前記ｍｉＲ−１８ｂを構成する核酸分子は、１８〜１００ｎｔ（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）の長さを有してもよい。具体的に、前記核酸分子は、１９〜２５ｎｔの長さ、より具体的に、２１、２２または２３ｎｔの長さの成熟ｍｉＲＮＡ型であってもよい。なお、前記核酸分子は、５０〜１００ｎｔ、より具体的に、６５〜９５ｎｔの長さの前駆体ｍｉＲＮＡ型であってもよい。
【００２４】
また、前記成熟ｍｉＲＮＡ型のｍｉＲ−１８ｂは、具体的に、ｍｉＲ−１８ｂ−５ｐもしくはｍｉＲ−１８ｂ−３ｐであってもよく、より具体的に、ｍｉＲ−１８ｂ−５ｐであってもよい。
【００２５】
前記成熟ｍｉＲＮＡ型または前駆体ｍｉＲＮＡ型のｍｉＲ−１８ｂにおいて、核酸分子の塩基配列情報はアメリカ国立衛生研究所の遺伝子銀行（ＮＩＨ  ＧｅｎＢａｎｋ）およびｍｉＲＢＡＳＥ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／）などの公知の遺伝子データベースから確認することができる。例えば、ヒトｍｉＲ−１８ｂの成熟型の塩基配列は、遺伝子登録番号ＭＩＭＡＴ０００１４１２（配列番号１）またはＭＩＭＡＴ０００４７５１（配列番号２）として登録されており、且つ、前駆体型は、ＭＩ０００１５１８（配列番号３）として登録されている。
【００２６】
【表１】
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【００２７】
さらに、本発明において用いられるｍｉＲ−１８ｂは、これを構成する核酸分子の作用性等価物、例えば、ｍｉＲＮＡ核酸分子の一部の塩基配列が欠失、置換または挿入によって変形されたとしても、前記ｍｉＲＮＡ核酸分子と機能的に同等な作用ができる変異体を含む概念である。例えば、本発明のｍｉＲ−１８ｂは、各当該配列番号の塩基配列と８０％以上の相同性を示すことができ、具体的に、９０％、より具体的に、９５％以上の相同性を示すものを含んでいてもよい。このような相同性は、当分野に広く知れ渡っているコンピューターアルゴリズム、例えば、ＡｌｉｇｎまたはＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いてヌクレオチドの配列をターゲット遺伝子の対応する部分と比較して容易に決定することができる。
【００２８】
さらにまた、本発明において用いられるｍｉＲ−１８ｂは、一本鎖または二本鎖の形で存在してもよい。成熟ｍｉＲＮＡ分子は、主として一本鎖として存在するが、前駆体ｍｉＲＮＡ分子は、二本鎖を形成し得る部分的な自己−相補的な構造（例えば、ステム−ルーフの構造）を含んでいてもよい。なお、本発明の核酸分子は、ＲＮＡまたはＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）などのタイプで構成されてもよい。
【００２９】
さらにまた、本発明において用いられるｍｉＲ−１８ｂは、標準分子生物学技術、例えば、化学的な合成方法または組み換え方法を用いて分離または製造してもよく、市販中のものを用いてもよい。
【００３０】
本発明において、前記ｍｉＲ−１８ｂそのものを含んでいてもよいが、これと機能的に同等な断片を含んでいてもよく、前記ｍｉＲＮＡの断片は、前記ｍｉＲＮＡのシード配列（ｓｅｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含むポリヌクレオチドであってもよい。シード配列（ｓｅｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）とは、ｍｉＲＮＡがターゲットを認識するとき、完全な相補性をもって結合するｍｉＲＮＡ内の一部の領域のヌクレオチド配列を意味し、これは、ｍｉＲＮＡがターゲットに結合するために欠かせない部分である。
【００３１】
さらにまた、前記ｍｉＲ−１８ｂは、その生物学的等価効能を生じさせる様々なｍｉＲＮＡ誘導体（ｍｉＲＮＡ  ｍｉｍｉｃ）の形で用いてもよいが、同じシード領域（ｓｅｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）を含むｍｉＲＮＡ配列を含む変形されたｍｉＲＮＡを用いてもよい。前記ｍｉＲＮＡに対するｍｉＲＮＡ誘導体としては、ＲＮＡリン酸骨格構造（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を硫黄などの他の元素に置換したタイプであるホスホロチオラート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏｌａｔｅ）構造を部分的に含んでいてもよく、ＲＮＡの代わりにＤＮＡおよびＰＮＡ（ｐｅｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）分子への全体的にまたは部分的に置換した形で使用可能であり、且つ、ＲＮＡ糖の２'水酸化基を様々な機能性構造に置換した形で使用可能であるが、これは、メチル化、メトキシ化、フルオロ化などを含むが、このような変形に制限されるものではない。
【００３２】
本発明において、前記ｍｉＲ−１８ｂは、ベクターに含まれるか、あるいは、細胞に取り込まれた形で与えられてもよい。
【００３３】
具体的に、前記ｍｉＲ−１８ｂは、細胞内の伝達のための発現ベクターに含まれて与えられてもよい。前記発現ベクターとしては、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターが両方とも使用可能である。ウイルスベクター（ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ）として、例えば、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ  ｖｉｒｕｓ）またはアビポックスウイルス（ａｖｉｐｏｘ  ｖｉｒｕｓ）ベクターなどが使用可能であるが、これに制限されるものではない。
【００３４】
前記発現ベクターは、形質導入された細胞の選別を容易にするために、選別マーカーをさらに含んでいてもよい。例えば、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤への耐性または表面タンパク質の発現などの選択可能表現型を与えるマーカー、例えば、緑色蛍光タンパク質、ピューロマイシン、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ｈｉｓＤ）およびグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｇｐｔ）などが挙げられる。
【００３５】
これらに加えて、前記ｍｉＲ−１８ｂは、細胞に取り込まれた形で与えられてもよい。このような細胞は、ｍｉＲ−１８ｂを高いレベルで発現可能にする。細胞内に取り込む方法としては、例えば、Ｇ−フェクチン、Ｍｉｒｕｓ  ＴｒａｓＩＴ−ＴＫＯ脂質親和性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン（ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ）、カチオン性リン脂質ナノ粒子、カチオン性高分子、カチオン性ミセル、カチオン性エマルジョンまたはリポゾームを含む伝達試薬とともに細胞内に取り込まれるか、あるいは、ポリエチレングリコールなどの生体適合性高分子を接合するなどの方法を採用して、細胞内への吸収を増加させることができる。
【００３６】
本発明において、前記筋肉疾患は、遺伝子突然変異によって誘発された筋肉疾患であってもよいが、これに制限されるものではない。
【００３７】
また、前記筋肉疾患は、重症筋無力症（ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ  ｇｒａｖｉｓ）、進行性筋ジストロフィー（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、筋強直性筋ジストロフィー（ｍｙｏｔｏｎｉｃ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、ベッカー型筋ジストロフィー（Ｂａｃｋｅｒ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、肢帯型筋ジストロフィー（Ｌｉｍｂ  Ｇｉｒｄｌｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ｆａｃｉｏｓｃａｐｕｌｏｈｕｍｅｒａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、脊髄性筋萎縮症（ｓｐｉｎａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｍｙｏｔｒｏｐｈｙ）、筋萎縮症（ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、球脊髄性筋萎縮症（ｓｐｉｎｏｂｕｌｂａｒ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）、シャルコー・マリー・トゥース病（Ｃｈａｒｃｏｔ  Ｍａｒｉｅ  Ｔｏｏｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＣＭＴ）、ポンペ病（Ｐｏｍｐｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）、カナバン病（Ｃａｎａｖａｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ジストニア（筋緊張異常）（ｄｙｓｔｏｎｉａ）、サルコペニア（筋肉減少症）（ｓａｃｏｐｅｎｉａ）または筋肉退化症であってもよいが、これに制限されるものではない。
【００３８】
本発明の具体的な実施例において、本発明者らは、遺伝子突然変異による筋肉疾患モデルとしての筋萎縮性側索硬化症において遺伝子突然変異がｍｉＲ−１８ｂの発現を減少させてｍｉＲ−１８ｂシグナル伝達経路の調節障害を引き起こし、ｍｉＲ−１８ｂの調節障害がＨｉｆ１αの上向き調節を誘導し、上向き調節されたＨｉｆ１αがＭｅｆ２ｃを上向き調節し、Ｍｅｆ２ｃがｍｉＲ−２０６の発現を誘導し、ｍｉＲ−２０６がＭｃｔｐ１とＲａｒｂの転写後調節に自ら関与して、カルシウムシグナル伝達と神経細胞分化の抑制および細胞死滅を誘導することを確認した。なお、ｍｉＲ−１８ｂの発現を増加させて遺伝子突然変異によって誘導された細胞死滅が抑えられ、カルシウムシグナル伝達と細胞分化が修復されることを確認した。
【００３９】
さらに、本発明者らは、遺伝子突然変異による筋肉疾患モデルとしてのデュシェンヌ型筋ジストロフィーにおいて遺伝子突然変異によってｍｉＲ−１８ｂシグナル伝達経路の調節障害が引き起こされることを確認した。
【００４０】
したがって、本発明者らは、遺伝子突然変異による筋肉疾患モデルにおいて遺伝子突然変異がｍｉＲ−１８ｂの発現を減少させてｍｉＲ−１８ｂシグナル伝達経路の調節障害を引き起こし、それにより、カルシウムシグナル伝達と細胞分化の抑制および細胞死滅が誘導され、ｍｉＲ−１８ｂの発現を増加させて遺伝子突然変異によって誘導された細胞死滅が抑えられ、カルシウムシグナル伝達と細胞分化が修復されることを確認したので、本発明のｍｉＲ−１８ｂを筋肉疾患の予防または治療に用いることができる。
【００４１】
本発明の組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含んでいてもよく、担体とともに製剤化されてもよい。
【００４２】
前記薬学的に許容可能な担体とは、生物体を刺激せずに投与化合物の生物学的活性および特性を阻害しない担体または希釈剤のことをいう。例えば、液状溶液として製剤化される組成物において許容される薬剤学的担体としては、滅菌および生体に適したものであって、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールおよびこれらの成分のうちの１種の成分以上を混合して用いてもよく、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液、靜菌剤など他の通常の添加剤を添加してもよい。なお、溶液または懸濁液（例えば、マイクロ粒子、リポソーム、または細胞と合わせられた）の形態に製剤化されてもよい。
【００４３】
本発明の組成物は、これを有効成分として含むいかなる剤形にも適用可能であり、経口用または非経口用の剤形に製造されて投与されてもよい。投与とは、ある適宜な方法で患者に本発明の組成物を取り込むことを意味し、核酸分子のウイルス性または非ウイルス性の技術による運搬または核酸分子を発現させる細胞の移植を含む。本発明の組成物の投与経路は、狙いの組織に到達できる限り、経口または非経口の様々な経路を介して投与可能である。例えば、経口投与、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与、腔内投与、腹腔内投与、硬膜内投与が行われてもよいが、これに制限されるものではない。
【００４４】
本発明の組成物および治療方法は、筋肉疾患が発病可能な任意の動物に適用可能であり、動物は、ヒトおよび霊長類だけではなく、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌおよびネコなどの家畜を含む。
【００４５】
本発明の組成物の有効量の範囲または好適な一日当たりの総使用量は、正しい医学的な判断範囲内において処置医によって決定可能であるということは当業者にとって自明である。特定の患者に対する具体的な治療的有効量は、達成しようとする反応の種類と度合い、場合によっては他の製剤が用いられるか否かをはじめとする具体的な組成物、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別および食餌、投与時間、投与経路および組成物の分泌率、治療期間、および照射される放射線量をはじめとする多種多様な因子と医薬分野によく知られている類似因子に応じて異ならせて適用することが好ましい。例えば、一日当たりに０．００１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）で使用可能であるが、これに制限されるものではない。本発明の目的に適した薬学組成物の有効量は、前述した事項を考慮した上で決定することが好ましい。
【００４６】
また、本発明は、被検体から分離された試料からｍｉＲ−１８ｂの発現レベルを測定し、正常対照群と比較するステップを含む、筋肉疾患の診断情報を提供する方法を提供する。
【００４７】
本発明の方法において、前記試料は、組織、細胞、血漿、血清、血液、唾液または小便であってもよいが、これらに制限されるものではない。
【００４８】
本発明の方法において、前記発現レベルは、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ；逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッティング（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）または転写体（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ）の解析方法を用いて測定してもよいが、これに制限されるものではない。
【００４９】
本発明の方法において、前記試料からｍｉＲ−１８ｂの発現レベルが正常対照群と比較して減少することを確認して、筋肉疾患であると診断してもよい。
【００５０】
これに加えて、前記試料からさらにＨｉｆ１α、Ｍｅｆ２ｃ、Ｍｃｔｐ１、ＲａｒｂまたはｍｉＲ−２０６の発現レベルを測定し、正常対照群と比較して筋肉疾患を診断してもよい。具体的に、前記試料からＨｉｆ１α、Ｍｅｆ２ｃまたはｍｉＲ−２０６の発現レベルが正常対照群と比較して増加することを確認して筋肉疾患を診断してもよく、Ｍｃｔｐ１またはＲａｒｂの発現レベルが正常対照群と比較して減少することを確認して筋肉疾患を診断してもよい。
【００５１】
本発明の方法において、前記筋肉疾患は、遺伝子突然変異によって誘発された筋肉疾患であってもよいが、これに制限されるものではない。
【００５２】
また、前記筋肉疾患は、重症筋無力症（ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ  ｇｒａｖｉｓ）、進行性筋ジストロフィー（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、筋強直性筋ジストロフィー（ｍｙｏｔｏｎｉｃ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、ベッカー型筋ジストロフィー（Ｂａｃｋｅｒ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、肢帯型筋ジストロフィー（Ｌｉｍｂ  Ｇｉｒｄｌｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ｆａｃｉｏｓｃａｐｕｌｏｈｕｍｅｒａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、脊髄性筋萎縮症（ｓｐｉｎａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｍｙｏｔｒｏｐｈｙ）、筋萎縮症（ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、球脊髄性筋萎縮症（ｓｐｉｎｏｂｕｌｂａｒ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）、シャルコー・マリー・トゥース病（Ｃｈａｒｃｏｔ  Ｍａｒｉｅ  Ｔｏｏｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＣＭＴ）、ポンペ病（Ｐｏｍｐｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）、カナバン病（Ｃａｎａｖａｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ジストニア（筋緊張異常）（ｄｙｓｔｏｎｉａ）、サルコペニア（筋肉減少症）（ｓａｃｏｐｅｎｉａ）または筋肉退化症であってもよいが、これに制限されるものではない。
【００５３】
本発明者らは、遺伝子突然変異による筋肉疾患モデルにおいて、遺伝子突然変異がｍｉＲ−１８ｂの発現を減少させてｍｉＲ−１８ｂシグナル伝達経路の調節障害を引き起こし、ｍｉＲ−１８ｂの調節障害がＨｉｆ１αの上向き調節を誘導し、上向き調節されたＨｉｆ１αがＭｅｆ２ｃを上向き調節し、Ｍｅｆ２ｃがｍｉＲ−２０６の発現を誘導し、ｍｉＲ−２０６がＭｃｔｐ１とＲａｒｂの転写後調節に自ら関与して、カルシウムシグナル伝達と神経細胞分化の抑制および細胞死滅を誘導することを確認したので、本発明のｍｉＲ−１８ｂおよびｍｉＲ−１８ｂによって調節される前記因子を筋肉疾患診断のためのターゲット因子として用いることができる。
【００５４】
さらに、本発明は、薬学的に有効な量のｍｉＲ−１８ｂを個体に投与するステップを含む筋肉疾患の予防または治療方法を提供する。
【００５５】
併せて、本発明は、筋肉疾患の予防または治療用の薬学的組成物として用いるためのｍｉＲ−１８ｂの用途を提供する。
【００５６】
本発明において、前記ｍｉＲ−１８ｂは、ヒトをはじめとする動物、例えば、サル、チンパンジー、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ネズミ、ウサギなどに由来してもよい。
【００５７】
本発明において、前記ｍｉＲ−１８ｂを構成する核酸分子は、１８〜１００ｎｔ（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）の長さを有してもよい。具体的に、前記核酸分子は、１９〜２５ｎｔの長さ、より具体的に、２１、２２または２３ｎｔの長さの成熟ｍｉＲＮＡ型であってもよい。なお、前記核酸分子は、５０〜１００ｎｔ、より具体的に、６５〜９５ｎｔの長さの前駆体ｍｉＲＮＡ型であってもよい。
【００５８】
また、前記成熟ｍｉＲＮＡ型のｍｉＲ−１８ｂは、具体的に、ｍｉＲ−１８ｂ−５ｐもしくはｍｉＲ−１８ｂ−３ｐであってもよく、より具体的に、ｍｉＲ−１８ｂ−５ｐであってもよい。
【００５９】
さらに、本発明において用いられるｍｉＲ−１８ｂは、一本鎖または二本鎖の形で存在してもよい。
【００６０】
さらにまた、本発明において用いられるｍｉＲ−１８ｂは、標準分子生物学技術、例えば、化学的な合成方法または組み換え方法を用いて分離または製造してもよく、市販中のものを用いてもよい。
【００６１】
本発明において、前記ｍｉＲ−１８ｂそのものを含んでいてもよいが、これと機能的に同等な断片を含んでいてもよく、前記ｍｉＲＮＡの断片は、前記ｍｉＲＮＡのシード配列（ｓｅｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含むポリヌクレオチドであってもよい。
【００６２】
また、前記ｍｉＲ−１８ｂは、その生物学的等価効能を生じさせる様々なｍｉＲＮＡ誘導体（ｍｉＲＮＡ  ｍｉｍｉｃ）の形で用いてもよいが、同じシード領域（ｓｅｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）を含むｍｉＲＮＡ配列を含む変形されたｍｉＲＮＡを用いてもよい。
【００６３】
本発明において、前記ｍｉＲ−１８ｂは、ベクターに含まれるか、あるいは、細胞に取り込まれた形で与えられてもよい。
【００６４】
さらに、前記ｍｉＲ−１８ｂは、細胞に取り込まれた形で与えられてもよい。このような細胞は、ｍｉＲ−１８ｂを高いレベルで発現可能にする。
【００６５】
本発明において、前記筋肉疾患は、遺伝子突然変異によって誘発された筋肉疾患であってもよいが、これに制限されるものではない。
【００６６】
さらにまた、前記筋肉疾患は、重症筋無力症（ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ  ｇｒａｖｉｓ）、進行性筋ジストロフィー（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、筋強直性筋ジストロフィー（ｍｙｏｔｏｎｉｃ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、ベッカー型筋ジストロフィー（Ｂａｃｋｅｒ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、肢帯型筋ジストロフィー（Ｌｉｍｂ  Ｇｉｒｄｌｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ｆａｃｉｏｓｃａｐｕｌｏｈｕｍｅｒａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、脊髄性筋萎縮症（ｓｐｉｎａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｍｙｏｔｒｏｐｈｙ）、筋萎縮症（ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、球脊髄性筋萎縮症（ｓｐｉｎｏｂｕｌｂａｒ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）、シャルコー・マリー・トゥース病（Ｃｈａｒｃｏｔ  Ｍａｒｉｅ  Ｔｏｏｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＣＭＴ）、ポンペ病（Ｐｏｍｐｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）、カナバン病（Ｃａｎａｖａｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ジストニア（筋緊張異常）（ｄｙｓｔｏｎｉａ）、サルコペニア（筋肉減少症）（ｓａｃｏｐｅｎｉａ）または筋肉退化症であってもよいが、これに制限されるものではない。
【００６７】
本発明者らは、遺伝子突然変異による筋肉疾患モデルにおいて遺伝子突然変異がｍｉＲ−１８ｂの発現を減少させてｍｉＲ−１８ｂシグナル伝達経路の調節障害を引き起こし、それにより、カルシウムシグナル伝達と細胞分化の抑制および細胞死滅が誘導され、ｍｉＲ−１８ｂの発現を増加させて遺伝子突然変異によって誘導された細胞死滅が抑えられ、カルシウムシグナル伝達と細胞分化が修復されることを確認したので、本発明のｍｉＲ−１８ｂを筋肉疾患の予防または治療に用いることができる。
【００６８】
以下、本発明について実施例によって詳しく説明する。
【００６９】
但し、下記の実施例は、単に本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容が下記の実施例によって限定されるものではない。
【００７０】
＜実施例１＞  細胞の培養
＜１−１＞  ＳＯＤ１突然変異運動神経細胞の培養
遺伝子突然変異による筋肉疾患としての筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、ＳＯＤ１突然変異によって発病し、運動神経細胞が失われることがよく知られている。そのため、ＡＬＳの診断および治療に利用可能なターゲットｍｉＲＮＡを調べるために、ＳＯＤ１突然変異運動神経細胞を下記のようにして培養した。
【００７１】
具体的に、マウスＳＯＤ１を発現させる運動神経細胞株であるＮＳＣ−３４  ｃｏｎｔ細胞、ヒトＳＯＤ１を発現させる運動神経細胞株であるＮＳＣ−３４ｈＳＯＤ１細胞（ｗｔＮＳＣ−３４）およびヒトＳＯＤ１Ｇ９３Ａ突然変異を発現させるＳＯＤ１突然変異運動神経細胞株であるＮＳＣ−３４ｈＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）細胞（ｍｔＮＳＣ−３４）を韓国科学技術研究院（ＫＩＳＴ）から入手した。次いで、１０％  ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ）が含まれているＤＭＥＭ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ）において培養した。なお、１％  ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび２０ｕＭのａｌｌ−ｔｒａｎｓ−ＲＡ（Ｓｉｇｍａ）が含まれているＤＭＥＭ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ）において分化させた。
【００７２】
＜１−２＞  神経幹細胞の分離および培養
ＡＬＳの診断および治療に利用可能なターゲットｍｉＲＮＡを調べるために、神経幹細胞（Ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ；ＮＳＣ）を下記のようにして分離および培養した。
【００７３】
具体的に、動物実験は、実験動物の保護および使用のためのソウル大学の動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ；ＩＡＣＵＣ）のガイドラインに従って行われた。９週齢のマウスの脳室下帯（ｓｕｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｚｏｎｅ）の脳組織を摘出した後、ＨＢＳＳを含有するプレートで破砕し、トリプシン処理を施した後に３７℃で１５分間細胞を培養した。次いで、遠心分離および１％  ＰＳＡ（ペニシリン−ストレプトマイシン−アムホテリシン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２％  Ｂ２７補充剤（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、１０ｎｇ／ｍ  ＬＥＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地で再懸濁した後、６ウェルプレートに細胞を接種してＮＳＣを培養した。細胞分化を誘導するために、細胞が約直径５０〜１００μｍの大きさの神経球（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ）を形成するとき、再懸濁し、滅菌済みの１５ｍｌのチューブに移した。室温下、５分間１００ｘｇで遠心分離して神経球入りペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を取得し、前記ペレットを分化培養培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１％  ＰＳＡ、２％  Ｂ２７および５％  ＦＢＳ）で再懸濁して培養した。
【００７４】
＜１−３＞  ジストロフィン（Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ）発現抑制筋芽細胞の培養
遺伝子突然変異による筋肉疾患としてのデュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ；ＤＭＤ）は、ジストロフィン遺伝子変異によるジストロフィンの欠乏によって発病することがよく知られている。そのため、筋ジストロフィーの診断および治療に利用可能なターゲットｍｉＲＮＡを調べるために、ジストロフィンの発現抑制筋芽細胞を下記のようにして作成および培養した。
【００７５】
具体的に、マウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）を抗生剤入りＤＭＥＭ培地（１０％のＦＢＳ入り）に培養した。培養したＣ２Ｃ１２細胞にＣＯＳＭＯ  ＧＥＮＥＴＥＣＨに頼んで作成したマウス用のｓｉジストロフィン（５'−ＧＧＣＣＵＵＡＣＡＧＧＧＣＡＡＡＡＡＣＴＴ−３'、配列番号４）をＲＮＡｉＭａｘ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてメーカーの手順に従って形質導入し、ジストロフィン発現抑制のＣ２Ｃ１２細胞を作成および培養した。
【００７６】
＜実施例２＞  ＳＯＤ１突然変異運動神経細胞における非正常的な遺伝子発現の確認
遺伝子突然変異は、ＲＮＡの生合成と関わりがあるので、ＲＮＡの生合成に関与するｍｉＲＮＡを遺伝子突然変異による筋肉疾患としてのＡＬＳの診断および治療のためのターゲット因子として用いることができる。そのため、ＳＯＤ１突然変異によるＲＮＡの生合成の変化を調べるために、ｍｔＮＳＣ−３４細胞を核および細胞質に分画化し、核分画および細胞質分画を用いて、転写体（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ）の解析を行った後、ｍｔＮＳＣ−３４細胞の核と細胞質との発現差がある遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲおよびｑＲＴ−ＰＣＲを行って確認した。
【００７７】
具体的に、前記実施例＜１−１＞において取得したｍｔＮＳＣ−３４細胞およびｗｔＮＳＣ−３４細胞のそれぞれを３組にして１０ｃｍのディッシュで培養した後、４５０μlの冷たいバッファーＡ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴおよび０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））を用いて回収した。ｍｔＮＳＣ−３４細胞およびｗｔＮＳＣ−３４細胞のそれぞれを再懸濁し、氷の上で２５分間反応させた。次いで、５μlの１０％  ＮＰ−４０を添加し、氷の上で２分間反応させた後、４℃で３分間５０００ｒｐｍにて遠心分離した。ペレットを分離して核分画を取得し、上澄み液を分離して細胞質分画を取得した。マクロゼン（Ｍａｃｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．）に頼んで前記合計で１２サンプルの転写体（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ）を用いてＲＮＡ−ｓｅｑの解析を行った（図１Ａ）。
【００７８】
また、ｍｔＮＳＣ−３４細胞およびｗｔＮＳＣ−３４細胞間の発現差がある４種の遺伝子、Ｈｉｆ１α（ｈｙｐｏｘｉａ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒ  １  ａｌｐｈａ；低酸素誘導因子１α）、Ｍｅｆ２ｃ（ｍｙｏｃｙｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｆａｃｔｏｒ  ２ｃ；筋細胞特異的増強因子２ｃ）、Ｍｃｔｐ１（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｃ２  ｄｏｍａｉｎｓ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １；多重Ｃ２ドメイン膜貫通型タンパク質１）およびＲａｒｂ（ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ；レチノイン酸受容体ベータ）ｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲおよび定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）で確認した。具体的に、核と細胞質との発現差がある２種の遺伝子、Ｍｃｔｐ１およびＲａｒｂ  ｍＲＮＡの発現変化を確認するために、前記方法と同様にして、ｍｔＮＳＣ−３４細胞およびｗｔＮＳＣ−３４細胞のそれぞれから核分画および細胞質分画を取得した後、ＴＲＩｚｏｌ試薬（ＭＲＣ）を用いて総ＲＮＡを抽出し、下記表２のプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った（図１Ｂ）。なお、ｍｔＮＳＣ−３４細胞からＨｉｆ１α、Ｍｅｆ２ｃ、Ｍｃｔｐ１およびＲａｒｂ  ｍＲＮＡの発現変化を確認するために、ＴＲＩｚｏｌ試薬（ＭＲＣ）を用いて、ｍｔＮＳＣ−３４細胞およびｗｔＮＳＣ−３４細胞のそれぞれの総ＲＮＡを抽出し、５０ｎｇ  ＲＮＡを鋳型とし、下記表３のプライマーおよびＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｔｏｙｏｂｏ）を用いてメーカーの手順に従ってｑＲＴ−ＰＣＲを行った。マウスＧＡＰＤＨを対照群として用いた（図１Ｃおよび図１Ｄ）。
【００７９】
【表２】
0006928179.tif 000003
【００８０】
【表３】
0006928179.tif 000004
【００８１】
その結果、図１に示すように、Ｈｉｆ１αおよびＨｉｆ１αによって調節されるＭｅｆ２ｃがｍｔＮＳＣ−３４細胞の核および細胞質において増加することを確認した（図１Ａ）。また、ｍｔＮＳＣ−３４細胞においてカルシウムシグナル伝達と関わりがあると知られているＭｃｔｐ１および細胞分化と関わるＲａｒｂのレベルが変化し、特に、Ｍｃｔｐ１およびＲａｒｂ  ｍＲＮＡが核において上向き調節されたものの、細胞質では格段に下向き調節されることを確認した（図１Ａおよび図１Ｂ）。なお、ｍｔＮＳＣ−３４細胞において、Ｈｉｆ１αとＭｅｆ２ｃ  ｍＲＮＡの発現レベルが増加し、Ｍｃｔｐ１とＲａｒｂ  ｍＲＮＡの発現レベルが減少することを確認した（図１Ｃおよび図１Ｄ）。
【００８２】
前記の結果から、ＳＯＤ１突然変異によってＨｉｆ１αおよびＭｅｆ２ｃが上向き調節され、Ｍｃｔｐ１とＲａｒｂが下向き調節され、特に、Ｍｃｔｐ１およびＲａｒｂは、細胞質において転写後調節されることを確認した。
【００８３】
＜実施例３＞  ＳＯＤ１突然変異運動神経細胞においてＳＯＤ１突然変異が細胞に及ぼす影響の確認
ＳＯＤ１突然変異が細胞に及ぼす影響を調べるために、ｍｔＮＳＣ−３４細胞において、細胞内のカルシウムシグナル伝達、細胞分化および細胞死滅の変化を確認した。
【００８４】
Ｍｃｔｐ１がカルシウムシグナル伝達と関わっていることが知られているため、ＳＯＤ１突然変異によるＭｃｔｐ１の発現変化が細胞内のカルシウムシグナル伝達に及ぼす影響を調べるために、細胞内のＣａ２＋の解析を行った。具体的に、前記実施例＜１−１＞において取得したｍｔＮＳＣ−３４細胞およびｗｔＮＳＣ−３４細胞のそれぞれを４×１０４〜８×１０４細胞／ウェルで９６ウェルプレートに処理し、成長培地で一日間培養した。４８時間後に、ＦＬＵＯＦＯＲＴＥ  Ｄｙｅ−Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを各ウェルに処理し、３７℃で４５分間、室温で１５分間培養した。次いで、蛍光測定機を用いて、４９０／５２５ｎｍにおいて蛍光を測定した（図２Ａにおける右上）。
【００８５】
また、Ｒａｒｂが細胞分化と関わっていることが知られているため、ＳＯＤ１突然変異によるＲａｒｂの発現変化がＳＯＤ１突然変異が細胞分化に及ぼす影響を調べるために、軸索生成の解析を行った。具体的に、前記実施例＜１−１＞において取得したｍｔＮＳＣ−３４細胞およびｗｔＮＳＣ−３４細胞のそれぞれを４×１０４〜８×１０４細胞／ウェルで９６ウェルプレートに処理し、成長培地で一日間培養した。次いで、免疫蛍光染色法と共焦点顕微鏡を用いて視覚化した後、軸索生成を確認した（図２Ａにおける右下）。
【００８６】
併せて、ＳＯＤ１突然変異が細胞死滅に及ぼす影響を調べるために、ウェスターンブロッティングおよびｑＲＴ−ＰＣＲを行って細胞死滅関連因子の発現を確認し、ＬＤＨ（Ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；乳酸脱水素酵素）の放出変化を確認した。具体的に、ウェスターンブロッティングを行うために、前記実施例＜１−１＞において取得したｍｔＮＳＣ−３４細胞、ｗｔＮＳＣ−３４細胞およびＮＳＣ−３４  ｃｏｎｔ細胞を氷で３０分間溶解バッファー（ｐＨ７．４の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０の１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５００ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を処理して溶解し、前記細胞のタンパク質溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動した後、ニトロセルロース膜（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）（ＰＡＬＬ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に伝達させた。次いで、一次抗体としてのマウス抗Ｈｉｆ１α抗体（ＮＯＶＵＳ）、ウサギ抗Ｍｅｆ２ｃ抗体（ＬＳＢｉｏ）、マウス抗Ｍｃｔｐ１抗体（ａｂｃａｍ）、ウサギ抗Ｒａｒｂ抗体（ＬＳＢｉｏ）、ウサギ抗Ｂａｘ抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ウサギ抗Ｂｃｌ２抗体（ａｂｃａｍ）、およびマウス抗β−ａｃｔｉｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ウサギ抗ＳＯＤ１（Ｅｎｚｏ）抗体を処理して反応させた後、前記膜に付いた一次抗体にＨＲＰ−接合二次抗体を貼り付け、これをＥＣＬ（Ｐｉｅｒｃｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏ，ＵＳＡ）を用いて確認した（図２Ｂ）。なお、前記＜実施例２＞に記載の方法と同様にして、ｍｔＮＳＣ−３４細胞、ｗｔＮＳＣ−３４細胞およびＮＳＣ−３４  ｃｏｎｔ細胞のそれぞれからＲＮＡを抽出し、下記表４のプライマーを用いてｑＲＴ−ＰＣＲを行った（図２Ｃ）。
【００８７】
【表４】
0006928179.tif 000005
【００８８】
さらに、ＬＤＨ（Ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の放出変化を確認するために、前記実施例＜１−１＞において取得したｍｔＮＳＣ−３４細胞およびｗｔＮＳＣ−３４細胞の細胞培養培地を回収および遠心分離して上澄み液を取得した後、９６ウェルプレートに移した。同量のＬＤＨ解析基質（ＳＩＧＭＡ）、酵素および染料溶液を混合した。前記混合物の半分の体積を１体積の培地上澄み液に添加した。室温で３０分間反応させた後、各ウェルに１／１０体積の１Ｎ  ＨＣｌを添加して反応を終了した。次いで、分光光度計を用いて、波長４９０ｎｍ／６９０ｎｍにおいて吸光度を測定した（図２Ｄ）。その結果、図２に示すように、ｍｔＮＳＣ−３４細胞において、細胞内のＣａ２＋のレベルが増加し、総神経突起の成長は、ＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）タンパク質の凝集とともに有意に減少することを確認した（図２Ａ）。なお、ｍｔＮＳＣ−３４細胞において、Ｈｉｆ１αおよびＭｅｆ２ｃのタンパク質のレベルが有意に上昇し、Ｍｃｔｐ１およびＲａｒｂのタンパク質のレベルが有意に減少することを確認した（図２Ｂ）。なお、ｍｔＮＳＣ−３４細胞においてＢａｘのタンパク質およびｍＲＮＡのレベルが増加し、Ｂｃｌ２のタンパク質およびｍＲＮＡのレベルが減少し（図２Ｂおよび図２Ｃ）、ＬＤＨの放出が増加して（図２Ｄ）、細胞死滅が誘導されることを確認した。
【００８９】
前記の結果から、ＳＯＤ１突然変異によって細胞死滅が誘導され、Ｍｃｔｐ１とＲａｒｂのレベルが下向き調節されて、それぞれカルシウムシグナル伝達と細胞分化の変化を誘発することを確認した。
【００９０】
＜実施例４＞  Ｈｉｆ１α、Ｍｅｆ２ｃ、Ｍｃｔｐ１およびＲａｒｂを調節するターゲットｍｉＲＮＡの確認
ｍｉＲＮＡは、最も代表的な転写後調節子（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｌｒｅｇｕｌａｔｏｒ）の一つであることがよく知られている。そのため、ｍｔＮＳＣ−３４細胞において、Ｈｉｆ１αおよびＭｅｆ２ｃが上向き調節され、Ｍｃｔｐ１とＲａｒｂが下向き調節されることを確認したので、Ｍｅｆ２ｃの上位調節子であるＨｉｆ１αを調節可能なｍｉＲＮＡおよびＭｃｔｐ１とＲａｒｂを調節可能なｍｉＲＮＡを調べるために、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ解析を行った。
【００９１】
具体的に、Ｈｉｆ１αと共通塩基配列を有するｍｉＲＮＡ、Ｍｃｔｐ１およびＲａｒｂと共通塩基配列を有するｍｉＲＮＡをＴａｒｇｅｔＳｃａｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ．ｏｒｇ）を用いて解析した（図３Ａおよび図３Ｂ）。
【００９２】
また、ｍｔＮＳＣ−３４細胞およびｗｔＮＳＣ−３４細胞においてＴａｒｇｅｔＳｃａｎで確認したターゲットｍｉＲＮＡの発現変化を確認するために、前記＜実施例２＞に記載の方法と同様にして、ｍｔＮＳＣ−３４細胞、ｗｔＮＳＣ−３４細胞およびＮＳＣ−３４  ｃｏｎｔ細胞のそれぞれからＲＮＡを抽出し、ｍｍｕ−ｍｉＲ−１８ｂおよびｍｍｕ−ｍｉＲ−２０６に対するプライマー（ＧｅｎｏＳｅｎｓｏｒ）のそれぞれを用いてｑＲＴ−ＰＣＲを行った（図３Ｃおよび図３Ｄ）。
【００９３】
その結果、図３に示すように、ｍｉＲ−２０６がＭｃｔｐ１およびＲａｒｂの転写後調節子になり得ることを確認し（図３Ａ）、ｍｉＲ−２０６がｍｔＮＳＣ−３４細胞において格段に上向き調節されることを確認した（図３Ｃ）。なお、ｍｉＲ−１８ｂがＨｉｆ１αをターゲットとすることができることを確認し（図３Ｂ）、ｍｔＮＳＣ−３４細胞においてｍｉＲ−１８ｂが格段に減少したことを確認した（図３Ｄ）。
【００９４】
Ｍｅｆ２ｃは、ｍｉＲ−２０６の転写調節因子として働くことが知られているため、前記の結果から、ＳＯＤ１突然変異によってｍｉＲ−１８ｂの発現が減少するｍｉＲ−１８ｂの調節障害が引き起こされ、ｍｉＲ−１８ｂの調節障害によってＨｉｆ１α、Ｍｅｆ２ｃ、ｍｉＲ−２０６、Ｍｃｔｐ１およびＲａｒｂの発現を順次に調節することができることを確認した。
【００９５】
＜実施例５＞  ｍｉＲ−１８ｂによるＨｉｆ１αの調節および細胞死滅の変化の確認
＜５−１＞  ｍｉＲ−１８ｂの発現の抑制によるＨｉｆ１αの上向き調節および細胞死滅の誘導の確認
ＳＯＤ１突然変異によるｍｉＲ−１８ｂの調節障害が下位機序の調節および細胞死滅と関わっているかどうかを調べるために、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ；ロックド核酸）阻害剤（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を用いて、ｗｔＮＳＣ−３４細胞においてｍｉＲ−１８ｂを減少させた後、ウェスターンブロッティングおよびｑＲＴ−ＰＣＲを行って関連因子の発現を確認し、細胞死滅の変化を確認した。
【００９６】
具体的に、前記実施例＜１−１＞において取得したＮＳＣ−３４  ｃｏｎｔ細胞にｍｉＲ−１８ｂのＬＮＡ（ａｎｔｉ−１８ｂ、ＣＯＳＭＯＧＥＮＴＥＣＨ）をＲＮＡｉＭａｘ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてメーカーの手順に従って形質感染し、４８時間後に回収した。次いで、前記＜実施例２＞ないし＜実施例４＞に記載の方法と同様にして、ウェスターンブロッティング（図４Ａ）、ｑＲＴ−ＰＣＲ（図４Ｂないし図４Ｇ、図４Ｉおよび図４Ｊ）、ＬＤＨの放出の解析（図４Ｈ）を行った。対照群として、ＮＳＣ−３４  ｃｏｎｔ細胞を用いた。
【００９７】
また、細胞死滅の変化を確認するために、さらにＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣおよびＰＩの解析を行った。具体的に、前記実施例＜１−２＞において培養したＮＳＣを６ウェル組織培養プレートに接種し、ｍｉＲ−１８ｂのＬＮＡ（ａｎｔｉ−１８ｂ）を処理し、４８時間後に付着した細胞をＴｒｉｐｌｅＥｘｐｒｅｓｓで分離し、培養培地を添加してトリプシンを非活性化した。次いで、１，５００ｘｇで５分間遠心分離し、上澄み液を除去した。細胞をＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ−ＦＩＴＣおよびＰＩ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてメーカーの手順に従ってＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣおよびＰＩで染色した。染色後に、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて解析した。蛍光は、緑色または赤色のチャンネルを用い、データは、Ｆｌｏｗｗｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．５．１、Ｕｎｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｕｒｋｕ、Ｆｉｌａｎｄ）を用いて解析した（図４Ｋ）。
【００９８】
その結果、図４に示すように、ｍｉＲ−１８ｂのＬＮＡ（ａｎｔｉ−１８ｂ）はＨｉｆ１αおよびＭｅｆ２ｃのタンパク質およびｍＲＮＡの発現を増加させ、Ｍｃｔｐ１およびＲａｒｂのタンパク質およびｍＲＮＡの発現を減少させることを確認した（図４Ａないし図４Ｅ）。なお、ｍｉＲ−２０６がｍｉＲ−１８ｂの欠乏下で速やかに誘導されることを確認した（図４Ｉおよび図４Ｊ）。なお、ｍｉＲ−１８ｂの欠乏下に細胞死滅が増加することを確認した（図４Ａ、図４Ｆないし図４Ｈ、図４Ｋ）。
【００９９】
前記の結果から、ＳＯＤ１突然変異によるｍｉＲ−１８ｂの調節障害でＨｉｆ１αが上向き調節され、次いで、下位機序によって細胞死滅が誘導されることを確認し、したがって、ｍｉＲ−１８ｂをＡＬＳの診断のためのターゲットｍｉＲＮＡとして用いることができることを確認した。
【０１００】
＜５−２＞  ｍｉＲ−１８ｂの過剰発現によるＨｉｆ１αの下向き調節および細胞死滅の抑制の確認
ｍｉＲ−１８ｂの過剰発現がＳＯＤ−１突然変異によって誘発されたＨｉｆ１αの上向き調節および細胞死滅を抑えることができるかどうかを調べるために、ｍｔＮＳＣ−３４細胞にｍｉＲ−１８ｂを過剰発現させた後、ウェスターンブロッティングおよびｑＲＴ−ＰＣＲを行って関連因子の発現を確認した。なお、細胞内のカルシウムシグナル伝達、細胞分化および細胞死滅の変化を確認した。
【０１０１】
具体的に、前記実施例＜１−１＞において取得したＮＳＣ−３４  ｃｏｎｔ細胞からｃＤＮＡを取得し、前記ｃＤＮＡを鋳型として下記表５のプライマーを用いてＰＣＲを行ってｍｉＲ−１８ｂを増幅させた。増幅させたｍｉＲ−１８ｂ  ＰＣＲ産物は、ＢａｍＨ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢｉｏＬａｂｓ）制限酵素部位を有するｐＣＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でクローニングして、ｍｉＲ−１８ｂプラスミドコンストラクトを製造した。
【０１０２】
【表５】
0006928179.tif 000006
【０１０３】
ｍｉＲ−１８ｂを過剰発現させるｍｔＮＳＣ−３４細胞を製造するために、ｍｔＮＳＣ−３４細胞に前記ｍｉＲ−１８ｂプラスミドコンストラクトをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）を用いてメーカーの手順に従って形質感染し、４８時間後に回収した。次いで、前記＜実施例２＞ないし＜実施例４＞に記載の方法と同様にして、ウェスターンブロッティング（図５Ａ）、ｑＲＴ−ＰＣＲ（図５Ｂないし図５Ｆ）、細胞内のＣａ２＋の解析（図５Ｈにおける右上）、軸索生成の解析（図５Ｈにおける右下）、ＬＤＨの放出の解析（図５Ｇ）を行った。対照群としてｍｔＮＳＣ−３４細胞を用いた。その結果、図５に示すように、ｍｔＮＳＣ−３４細胞においてｍｉＲ−１８ｂの過剰発現によってＨｉｆ１αとＭｅｆ２ｃの発現が減少するのに対し、Ｍｃｔｐ１とＲａｒｂの発現が増加することを確認した（図５Ａないし図５Ｃ）。なお、ｍｉＲ−２０６は、過剰発現したｍｉＲ−１８ｂによって下向き調節されることを確認した（図５Ｅおよび図５Ｆ）。そして、過剰発現したｍｉＲ−１８ｂは、ｍｔＮＳＣ−３４細胞において細胞死滅を抑えることを確認した（図５Ａ、図５Ｄ、図５Ｇ）。一方、ｍｔＮＳＣ−３４細胞においてＳＯＤ１の凝集が現れるにも拘わらず、過剰発現したｍｉＲ−１８ｂによって細胞内のＣａ２＋のレベルが減少し、神経細胞分化が活性化されることを確認した（図５Ｈ）。
【０１０４】
前記の結果から、ｍｉＲ−１８ｂを過剰発現させることで、ＳＯＤ−１突然変異によって誘発された細胞死滅が抑えられることを確認し、したがって、ｍｉＲ−１８ｂをＡＬＳの予防および治療に用いることができることを確認した。
【０１０５】
＜実施例６＞  Ｈｉｆ１αによるＭｅｆ２ｃの調節および細胞死滅の変化の確認
ｍｉＲ−１８ｂがＨｉｆ１αのターゲットｍｉＲＮＡとして働き、ｍｉＲ−１８ｂの調節障害によってＨｉｆ１αの発現が上向き調節されることを確認したので、ｍｉＲ−１８ｂ経路においてＨｉｆ１αが上向き調節された後の機序を調べるために、ＲＮＡｉを用いてｍｔＮＳＣ−３４細胞において、Ｈｉｆ１αの発現を減少させた後、ウェスターンブロッティングおよびｑＲＴ−ＰＣＲを行って関連因子の発現および細胞死滅の変化を確認した。
【０１０６】
具体的に、前記実施例＜１−１＞において取得したｍｔＮＳＣ−３４細胞にＣＯＳＭＯ  ＧＥＮＥＴＥＣＨに頼んで作成したマウス用のｓｉＨｉｆ１α（５'−ＡＡＧＣＡＵＵＵＣＵＣＵＣＡＵＵＵＣＣＵＣＡＵＧＧ−３'、配列番号３３）をＲＮＡｉＭａｘ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてメーカーの手順に従って形質感染し、４８時間後に回収した。次いで、前記＜実施例２＞ないし＜実施例４＞に記載の方法と同様にして、ウェスターンブロッティング（図６Ａ）、ｑＲＴ−ＰＣＲ（図６Ｂないし図６Ｈ）、ＬＤＨの放出の解析（図６Ｉ）を行った。対照群として、ｍｔＮＳＣ−３４細胞を用いた。
【０１０７】
その結果、図６に示すように、ｍｔＮＳＣ−３４細胞において、Ｈｉｆ１αの欠乏下、Ｍｅｆ２ｃタンパク質およびｍＲＮＡのレベルが減少し（図６Ａないし図６Ｃ）、Ｍｃｔｐ１とＲａｒｂタンパク質およびｍＲＮＡのレベルが増加することを確認した（図６Ａ、図６Ｄ、図６Ｅ）。なお、Ｈｉｆ１αの欠乏によるＭｅｆ２ｃの発現の抑制がｍｉＲ−２０６のレベルを減少させることを確認した（図６Ｈ）。なお、Ｈｉｆ１αの欠乏状態で細胞死滅が抑えられることを確認した（図６Ｆ、図６Ｇ、図６Ｉ）。
【０１０８】
前記の結果から、ＳＯＤ１突然変異によるｍｉＲ−１８ｂの調節障害がＨｉｆ１αの上向き調節を誘導し、上向き調節されたＨｉｆ１αがＭｅｆ２ｃを上向き調節して細胞死滅が誘導されることを確認した。
【０１０９】
＜実施例７＞  ｍｉＲ−２０６によるＭｃｔｐ１とＲａｒｂの転写後調節および細胞死滅の変化の確認
＜７−１＞  ｍｉＲ−２０６の過剰発現によるＭｃｔｐ１とＲａｒｂの下向き調節および細胞死滅の誘導の確認
ＳＯＤ１突然変異の条件下でｍｉＲ−２０６の役割を調べるために、ｍｉＲ−２０６が過剰発現するＮＳＣ−３４  ｃｏｎｔ細胞において、Ｍｃｔｐ１とＲａｒｂの３'ＵＴＲを用いてルシフェラーゼレポーターの解析を行った。なお、ウェスターンブロッティングおよびｑＲＴ−ＰＣＲを行って関連因子の発現を確認した。なお、細胞内のカルシウムシグナル伝達、細胞分化および細胞死滅の変化を確認した。
【０１１０】
具体的に、前記実施例＜１−１＞において取得したＮＳＣ−３４  ｃｏｎｔ細胞からｃＤＮＡを取得し、前記ｃＤＮＡを鋳型として下記表７のプライマーを用いてＰＣＲを行ってｍｉＲ−２０６を増幅させた。ｍｉＲ−２０６  ＰＣＲ産物は、ＢａｍＨ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢｉｏＬａｂｓ）制限酵素部位を有するｐＣＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でクローニングして、ｍｉＲ−２０６プラスミドコンストラクトを製造した。なお、下記表６のプライマーを用いてＰＣＲを行ってＭｃｔｐ１とＲａｒｂの３'ＵＴＲのそれぞれを増幅させた。増幅させたＭｃｔｐ１  ３'ＵＴＲ、Ｒａｒｂ  ３'ＵＴＲ  ＰＣＲ産物のそれぞれは、Ｘｈｏ  ＩおよびＸｂａ  Ｉ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢｉｏＬａｂｓ）制限酵素部位を有するｐｍｉｒＧＬＯ二重ルシフェラーゼベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）でクローニングして、Ｍｃｔｐ１  ３'ＵＴＲプラスミドコンストラクトおよびＲａｒｂ  ３'ＵＴＲプラスミドコンストラクトを製造した。
【０１１１】
【表６】
0006928179.tif 000007
【０１１２】
次いで、前記ｍｉＲ−２０６プラスミドコンストラクト、Ｍｃｔｐ１  ３'ＵＴＲプラスミドコンストラクトおよびＲａｒｂ  ３'ＵＴＲプラスミドコンストラクトをＮＳＣ−３４  ｃｏｎｔ細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）を用いてメーカーの手順に従って形質感染し、４８時間後に回収してルシフェラーゼの活性を測定した（図７Ａおよび図７Ｃ）。また、前記＜実施例２＞ないし＜実施例４＞に記載の方法と同様にして、ウェスターンブロッティング（図７Ｅ）、ｑＲＴ−ＰＣＲ（図７Ｂ、図７Ｄ、図７Ｆ、図８Ｃ）、細胞内のＣａ２＋の解析（図８Ａにおける右上）、軸索生成の解析（図８Ａにおける右下）、ＬＤＨの放出の解析（図８Ｄ）を行った。対照群として、ＮＳＣ−３４  ｃｏｎｔ細胞を用いた。なお、前記ｍｉＲ−２０６プラスミドコンストラクトを前記実施例＜１−２＞において培養したＮＳＣに形質感染し、前記実施例＜５−１＞に記載の方法と同様にして、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ−ＦＩＴＣおよびＰＩの解析（図８Ｅ）を行った。対照群として、ＮＳＣを用いた。
【０１１３】
その結果、図７および図８に示すように、過剰発現したｍｉＲ−２０６によってＭｃｔｐ１のレベルが減少し、細胞内のＣａ２＋のレベルが増加することを確認した。また、過剰発現したｍｉＲ−２０６によってＲａｒｂのレベルが減少し、神経細胞分化が抑えられることを確認した（図７Ａないし図７Ｅ、図８Ａ）。なお、ｍｉＲ−２０６の過剰発現によって細胞死滅が誘導されることを確認した（図８Ｂないし図８Ｅ）。
【０１１４】
＜７−２＞  ｍｉＲ−２０６の発現の抑制によるＭｃｔｐ１とＲａｒｂの上向き調節および細胞死滅の抑制の確認
ＳＯＤ１突然変異条件下でｍｉＲ−２０６の役割を調べるために、ＬＮＡ方法を用いてｍｔＮＳＣ−３４細胞においてｍｉＲ−２０６の発現を減少させた後、ウェスターンブロッティングおよびｑＲＴ−ＰＣＲを行って関連因子の発現を確認し、細胞死滅の変化を確認した。
【０１１５】
具体的に、前記実施例＜１−１＞において取得したｍｔＮＳＣ−３４細胞にｍｉＲ−２０６のＬＮＡ（ａｎｔｉ−２０６、ＣＯＳＭＯＧＥＮＴＥＣＨ）をＲＮＡｉＭａｘ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてメーカーの手順に従って形質感染し、４８時間後に回収した。次いで、前記＜実施例２＞ないし＜実施例４＞に記載の方法と同様にして、ウェスターンブロッティング（図９Ａ）、ｑＲＴ−ＰＣＲ（図９Ｂないし図９Ｅ、図９Ｇ）、ＬＤＨの放出の解析（図９Ｆ）を行った。対照群として、ｍｔＮＳＣ−３４細胞を用いた。
【０１１６】
その結果、図９に示すように、ｍｔＮＳＣ−３４細胞においてｍｉＲ−２０６の発現の抑制によってＭｃｔｐ１とＲａｒｂのタンパク質およびｍＲＮＡの量が有意に増加することを確認した（図９Ａないし図９Ｃ）。なお、ｍｉＲ−２０６の発現の抑制によって細胞死滅が抑えられることを確認した（図９Ｄないし図９Ｆ）。
【０１１７】
前記の結果から、ＳＯＤ１突然変異によるｍｉＲ−１８ｂの調節障害がＨｉｆ１αの上向き調節を誘導し、上向き調節されたＨｉｆ１αがＭｅｆ２ｃを上向き調節し、Ｍｅｆ２ｃがｍｉＲ−２０６の転写調節因子として働いてｍｉＲ−２０６の発現を誘導し、ｍｉＲ−２０６がＭｃｔｐ１とＲａｒｂの転写後調節に自ら関与して細胞死滅を誘導することを確認した。
【０１１８】
＜実施例８＞  Ｍｃｔｐ１およびＲａｒｂの転写後調節が細胞に及ぼす影響の確認
＜８−１＞  Ｍｃｔｐ１およびＲａｒｂの発現の減少による細胞死滅の誘導の確認
前述の実施例から、ｍｉＲ−１８ｂの調節障害によってＨｉｆ１αの発現が誘導され、Ｈｉｆ１αによってＭｅｆ２ｃの発現が誘導され、Ｍｅｆ２ｃによってｍｉＲ−２０６の発現が誘導され、ｍｉＲ−２０６によってＭｃｔｐ１およびＲａｒｂが転写後調節されることを確認した。そのため、Ｍｃｔｐ１およびＲａｒｂの欠乏が細胞死滅を自ら誘導するか否かを調べるために、ＲＮＡｉを用いてＮＳＣ−３４  ｃｏｎｔ細胞において、Ｍｃｔｐ１および／またはＲａｒｂの発現を減少させた後、ウェスターンブロッティングおよびｑＲＴ−ＰＣＲを行って関連因子の発現を確認した。なお、細胞内のカルシウムシグナル伝達、細胞分化および細胞死滅の変化を確認した。
【０１１９】
具体的に、前記実施例＜１−１＞において取得したＮＳＣ−３４  ｃｏｎｔ細胞にＣＯＳＭＯ  ＧＥＮＥＴＥＣＨに頼んで作成したマウス用のｓｉＭｃｔｐ１（５'−ＧＣＣＡＣＵＡＵＡＵＡＵＣＡＡＧＧＵＡＴＴ−３'、配列番号４０）および／またはマウス用のｓｉＲａｒｂ（５'−ＧＧＡＧＣＣＵＵＣＡＡＡＧＣＡＧＧＡＡＴＴ−３'、配列番号４１）をＲＮＡｉＭａｘ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてメーカーの手順に従って形質感染し、４８時間後に回収した。次いで、前記＜実施例２＞ないし＜実施例４＞に記載の方法と同様にして、ウェスターンブロッティング（図１０Ａ）、ｑＲＴ−ＰＣＲ（図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１１Ａ、図１１Ｂ）、細胞内のＣａ２＋の解析（図１０Ｄにおける右上）、軸索生成の解析（図１０Ｄにおける右下）およびＬＤＨの放出の解析（図１１Ｃ）を行った。対照群として、ＮＳＣ−３４  ｃｏｎｔ細胞を用いた。
【０１２０】
また、前記ｓｉＭｃｔｐ１およびｓｉＲａｒｂを前記実施例＜１−２＞において培養したＮＳＣに形質感染し、前記実施例＜５−１＞に記載の方法と同様にして、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ−ＦＩＴＣおよびＰＩの解析（図１１Ｄ）を行った。対照群として、ＮＳＣを用いた。
【０１２１】
その結果、図１０および図１１に示すように、Ｍｃｔｐ１の発現が抑えられて細胞内のＣａ２＋の濃度が増加するのに対し、ＢａｘとＢｃｌ２の発現には影響を及ぼさないことを確認した。また、Ｒａｒｂの発現が抑えられて細胞分化が抑えられるのに対し、ＢａｘおよびＢｃｌ２の発現の有意的な変化は現れないことを確認した。一方、Ｍｃｔｐ１およびＲａｒｂの発現が同時に抑えられた場合、Ｂａｘの発現が増加し、Ｂｘ１２の発現が減少し、ＬＤＨの放出が増加して細胞死滅が誘導されることを確認した（図１０Ａないし図１０Ｄ、図１１Ａないし図１１Ｄ）。
【０１２２】
＜８−２＞  Ｍｃｔｐ１およびＲａｒｂの発現の増加による細胞死滅の抑制の確認
Ｍｃｔｐ１とＲａｒｂの発現の誘導によって細胞死滅が直接的に抑えられるかどうかを調べるために、ｍｔＮＳＣ−３４細胞にＭｃｔｐ１および／またはＲａｒｂを過剰発現させた後、ウェスターンブロッティングおよびｑＲＴ−ＰＣＲを行って関連因子の発現を確認した。なお、細胞内のカルシウムシグナル伝達、細胞分化および細胞死滅の変化を確認した。
【０１２３】
具体的に、前記実施例＜１−１＞において取得したＮＳＣ−３４  ｃｏｎｔ細胞からｃＤＮＡを取得し、前記ｃＤＮＡを鋳型として下記表７のプライマーを用いてＰＣＲを行ってＭｃｔｐ１およびＲａｒｂを増幅させた。増幅させたＭｃｔｐ１  ＰＣＲ産物は、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢｉｏＬａｂｓ）制限酵素部位を有するｍＣｈｅｒｒｙ  Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）でクローニングして、Ｍｃｔｐ１プラスミドコンストラクトを製造した。増幅させたＲａｒｂ  ＰＣＲ産物は、Ｎｈｅ  ＩおよびＡｇｅ  Ｉ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢｉｏＬａｂｓ）制限酵素部位をｅＧＦＰ  Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）でクローニングして、Ｒａｒｂプラスミドコンストラクトを製造した。
【０１２４】
【表７】
0006928179.tif 000008
【０１２５】
Ｍｃｔｐ１および／またはＲａｒｂを過剰発現させるｍｔＮＳＣ−３４細胞を製造するために、ｍｔＮＳＣ−３４細胞に前記Ｍｃｔｐ１プラスミドコンストラクトおよび／またはＲａｒｂプラスミドコンストラクトをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）を用いてメーカーの手順に従って形質感染し、４８時間後に回収した。次いで、前記＜実施例２＞ないし＜実施例４＞に記載の方法と同様にして、ウェスターンブロッティング（図１２Ａ）、ｑＲＴ−ＰＣＲ（図１２Ｂ、図１２Ｃ、図１２Ｅにおける右側、図１２Ｆにおける右側）、細胞内のＣａ２＋の解析（図１２Ｅにおける左側）、軸索生成の解析（図１２Ｆにおける左側）、ＬＤＨの放出の解析（図１２Ｄ）を行った。対照群として、ｍｔＮＳＣ−３４細胞を用いた。その結果、図１２に示すように、Ｍｃｔｐ１およびＲａｒｂを同時に過剰発現させた場合、細胞死滅が減少することを確認した（図１２Ａないし図１２Ｄ）。なお、ｍｔＮＳＣ−３４細胞において、Ｍｃｔｐ１の発現の増加によって細胞内のＣａ２＋のレベルが減少し、Ｒａｒｂの発現の増加によって神経細胞分化が活性化されることを確認した（図１２Ｅないし図１２Ｇ）。
【０１２６】
前記の結果から、ＳＯＤ１突然変異によるｍｉＲ−１８ｂの調節障害でＭｃｔｐ１とＲａｒｂの転写後調節が誘導されてＭｃｔｐ１とＲａｒｂが減少し、それにより、カルシウムシグナル伝達と神経細胞分化が抑えられ、細胞死滅が誘導されることを確認した。
【０１２７】
＜実施例９＞  ＳＯＤ１突然変異によるｍｉＲ−１８ｂシグナル伝達経路の調節障害の確認
突然変異の種類によらずに、ＳＯＤ１突然変異がｍｉＲ−１８ｂシグナル伝達経路の調節障害に中枢的な役割を果たすかどうかを調べるために、ＮＳＣ−３４  ｃｏｎｔ細胞において突然変異されたＳＯＤ１（Ｇ８５Ｒ）およびＳＯＤ１（Ｄ９０Ａ）のそれぞれを過剰発現させた後、ウェスターンブロッティングおよびｑＲＴ−ＰＣＲを行って関連因子の発現および細胞死滅の変化を確認した。
【０１２８】
具体的に、前記実施例＜１−１＞において培養したＮＳＣ−３４  ｃｏｎｔ細胞にＳＯＤ１（Ｇ８５Ｒ）突然変異遺伝子付きプラスミドコンストラクトおよびＳＯＤ１（Ｄ９０Ａ）突然変異遺伝子付きプラスミドコンストラクトのそれぞれをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）を用いてメーカーの手順に従って形質感染し、４８時間後に回収した。次いで、前記＜実施例２＞ないし＜実施例４＞に記載の方法と同様にして、ウェスターンブロッティング（図１３Ａ）、ｑＲＴ−ＰＣＲ（図１３Ｂないし図１３Ｇ）解析を行った。対照群として、ＮＳＣ−３４  ｃｏｎｔ細胞を用いた。
【０１２９】
その結果、図１３に示すように、突然変異されたＳＯＤ１が過剰発現したＮＳＣ−３４  ｃｏｎｔ細胞において、Ｈｉｆ１αとＭｅｆ２ｃのタンパク質およびｍＲＮＡのレベルが増加し、Ｍｃｔｐ１とＲａｒｂのタンパク質およびｍＲＮＡのレベルが減少することを確認した（図１３Ａないし図１３Ｃ）。また、突然変異されたＳＯＤ１が過剰発現したＮＳＣ−３４  ｃｏｎｔ細胞においてｍｉＲ−１８ｂが減少し、それにより、ｍｉＲ−２０６が上向き調節されることを確認した（図１３Ｅないし図１３Ｇ）。なお、突然変異されたＳＯＤ１が過剰発現したＮＳＣ−３４  ｃｏｎｔ細胞において細胞死滅が増加することを確認した（図１３Ｄ）。
【０１３０】
前記の結果から、ＳＯＤ１突然変異の種類によらずに、ＳＯＤ１突然変異がｍｉＲ−１８ｂシグナル伝達経路の調節障害を引き起こし、ｍｉＲ−１８ｂの調節障害がＨｉｆ１αの上向き調節を誘導し、上向き調節されたＨｉｆ１αがＭｅｆ２ｃを上向き調節し、Ｍｅｆ２ｃがｍｉＲ−２０６の転写調節因子として働いてｍｉＲ−２０６の発現を誘導し、ｍｉＲ−２０６がＭｃｔｐ１とＲａｒｂの転写後調節に自ら関与してカルシウムシグナル伝達と神経細胞分化の抑制および細胞死滅を誘導することを確認した。
【０１３１】
＜実施例１０＞  ＡＬＳにおけるｍｉＲ−１８ｂシグナル伝達経路の調節障害の確認
＜１０−１＞  ＡＬＳ動物モデルおよび家族性ＡＬＳ患者におけるｍｉＲ−１８ｂシグナル伝達経路の調節障害の確認
ＡＬＳにおいて遺伝子突然変異によってｍｉＲ−１８ｂシグナル伝達経路の調節障害が引き起こされるかどうかを調べるために、ＡＬＳマウスモデルおよび家族性ＡＬＳ（ｆＡＬＳ）患者のサンプルを採取し、ウェスターンブロッティングおよびｑＲＴ−ＰＣＲを行ってｍｉＲ−１８ｂシグナル伝達経路関連因子の発現および細胞死滅の変化を確認した。
【０１３２】
具体的に、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＢａｒＨａｒｂｏｒ，Ｍｅ，ＵＳＡより提供された、ヒトＧ９３Ａ突然変異ＳＯＤ１遺伝子を発現させるＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ形質転換マウス（Ｂ６ＳＪＬ−Ｔｇ（ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊ）を用いた。対照群として、一般（Ｂ６）の正常マウス（ＷＴ）を用いた。出生してから１２０日目に前記ＷＴおよびＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ形質転換マウスのそれぞれの脊髄（ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ）組織を摘出してマウスの脊髄組織サンプルを取得した。また、正常人および家族性ＡＬＳ（ｆＡＬＳ（Ｇ８６Ｓ））患者の脊髄サンプルのそれぞれをＮＢＢより提供された。次いで、前記脊髄組織サンプル（図１４）および脊髄サンプル（図１５）のそれぞれを用いて、前記＜実施例２＞ないし＜実施例４＞に記載の方法と同様にして、ウェスターンブロッティング（図１４Ａ、図１５Ａ）およびｑＲＴ−ＰＣＲ（図１４Ｂ、図１４Ｃ、図１５Ｂ、図１５Ｃ）を行った。脊髄サンプルの場合、下記表８のプライマーを用いてｑＲＴ−ＰＣＲを行った。なお、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ｂおよびｈｓａ−ｍｉＲ−２０６に対するプライマー（ＧｅｎｏＳｅｎｓｏｒ）のそれぞれを用いてｑＲＴ−ＰＣＲを行った。
【０１３３】
【表８】
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【０１３４】
その結果、図１４および図１５に示すように、ＡＬＳマウスモデルにおいて、Ｈｉｆ１αおよびＭｅｆ２ｃのタンパク質およびｍＲＮＡの発現はＧ９３Ａ  Ｔｇマウスにおいて有意に増加するのに対し、Ｍｃｔｐ１およびＲａｒｂのタンパク質およびｍＲＮＡの発現は有意に減少することを確認した。また、増加したＢａｘおよび減少したＢｃｌ２の発現から、Ｇ９３Ａ  Ｔｇマウスにおいて細胞死滅が誘導されることを確認した（図１４Ａおよび図１４Ｂ）。なお、ｍｉＲ−１８ｂがＧ９３Ａ  Ｔｇマウスにおいて下向き調節され、ｍｉＲ−２０６が上向き調節されることを確認した（図１４Ｃ）。ｆＡＬＳ（Ｇ８６Ｓ）患者脊髄サンプルにおいても前記と同じ結果を確認した（図１５Ａないし図１５Ｃ）。
【０１３５】
＜１０−２＞  ＳＯＤ１（Ｇ１７Ｓ）ｆＡＬＳ患者のｈｉＰＳＣ由来運動ニューロン（ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎ）におけるｍｉＲ−１８ｂシグナル伝達経路の調節障害の確認
ｍｉＲ−１８ｂシグナル伝達経路がヒト運動ニューロン（ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎ；ＭＮ）に中枢的な役割を果たすかどうかを調べるために、家族性ＡＬＳ（ｆＡＬＳ（Ｇ１７Ｓ））患者の血液を採取し、血液からヒト誘導万能幹細胞（ｈｕｍａｎ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ；ｈｉＰＳＣ）を誘導し、前記ｈｉＰＳＣから神経幹細胞（ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ；ｈＮＳＣｓ）への分化後に運動ニューロンに分化させ、ｑＲＴ−ＰＣＲを行って、ｍｉＲ−１８ｂシグナル伝達経路関連因子の発現を確認した。なお、細胞内のカルシウムシグナル伝達、細胞分化および細胞死滅の変化を確認した。
【０１３６】
具体的に、血液からｈｉＰＳＣを誘導するために、正常人およびｆＡＬＳ  ＳＯＤ１（Ｇ１７Ｓ）患者の血液サンプルのそれぞれをソウル大学病院神経科（ＩＲＢ  ｎｕｍｂｅｒ  １００９−０５９−３３２）より寄贈された。次いで、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、全血から末梢血単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ；ＰＢＭＣ）を分離し、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、ｈＳＣＦ  １００ｎｇ／ｍＬ、ｈＦＬＴ−３  １００ｎｇ／ｍＬ、ｈＩＬ−３  ２０ｎｇ／ｍＬ、およびｈＩＬ−６  ２０ｎｇ／ｍＬが含まれているＳｔｅｍＰｒｏ−３４培地において培養および増殖した。１×１０６  ＰＢＭＣをＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃＭｙｃ（ＣｙｔｏＴｕｎｅ(R)−ｉＰＳ  Ｓｅｎｄａｉ  Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有しているセンダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ）（ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）＝５）を用いて形質導入した。３日後、形質導入された細胞を、サイトカイン未含有ＳｔｅｍＰｒｏ−３４培地が含まれ、ディッシュに１．５×１０５細胞／ディッシュの濃度の２０ｕｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ処理の施されたＨＦＦ（Ｈｕｍａｎ  Ｓｃｒｏｔｕｍ  ｆｏｒｅｓｋｉｎ  ｆｉｂｒｉｎ）が接種されたＣｅｌｌ  Ｓｔａｒｔ−ｃｏａｔｅｄ  ３５ｍｍのディッシュに処理し、ｈｉＰＳＣが転移され始めるまで毎日培地を交換した。次いで、１５％のノックアウトＳＲ、４０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、１％の非必須アミノ酸、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍlのストレプトマイシンおよび０．１ｍＭの２−メルカプトエタノールが含まれているＤＭＥＭ  Ｆ／１２をベースとするｉＰＳＣ培地と１／２体積のサイトカイン未含有ＳｔｅｍＰｒｏ−３４培地に交換した。転移を完了するために、ｉＰＳＣ培地を毎日交換した。３０日またはそれ以降に、コロニーを回収し、新たなｍｉｔｏｔｉｃａｌｌｙ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＨＦＦｓに継代培養してｈｉＰＳＣを増殖した。なお、多能性マーカーを用いて免疫細胞化学染色法およびＲＴ−ＰＣＲ解析を行って、正常ｈｉＰＳＣおよびｆＡＬＳ  ＳＯＤ１（Ｇ１７Ｓ）ｈｉＰＳＣが誘導されることを確認した（図１６Ａおよび図１６Ｂ）。
【０１３７】
次いで、神経幹細胞（Ｎｅｕｒｏｎ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ；ＮＳＣ）を生成するために、前記コロニーを２ｍｇ／ｍｌのディスパーゼ（ｄｉｓｐａｓｅ、Ｇｉｂｃｏ）を用いて分離し、６０ｍｍのコーティングなしバクテリアプレートに処理し、５〜７日間３７℃で１５％のノックアウトＳＲ（Ｇｉｂｃｏ）、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン、５０ｕｇ／ｍｌのストレプトマイシンが含まれているＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ６培地を含有するＥＢ（ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ；胚様体）培地に毎日交換した。次いで、形成されたＥＢをＣｅｌｌ  Ｓｔａｒｔ−ｃｏａｔｅｄ  ３５ｍｍの培養ディッシュに移した。２〜３日後にＥＢがディッシュに付着すれば、神経構造が現れるまで、０．５％Ｎ２補充剤入りＤＭＥＭ／Ｆ１２（１％の非必須アミノ酸、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン、５０ｕｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび０．１ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む）培地において１％のＮ２補充剤と４０ｂＦＧＦが含まれているＤＭＥＭ／Ｆ１２（１％の非必須アミノ酸、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０ｕｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノールを含む）培地に一日につき２回ずつ交換した。次いで、神経構造を分離し、浮遊した状態で培養して神経球を取得した。取得した神経球を断片化し、一日間Ｃｅｌｌ  ｓｔａｒｔ−ｃｏａｔｅｄ培養ディッシュにおいて一日間培養し、３７℃で１時間Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｇｉｂｃｏ）を処理した。ＮＳＣを１％の非必須アミノ酸、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０ｕｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノールと０．５％  Ｎ２補充剤および４０ｎｇ／ｍｌｂ−繊維芽細胞成長因子が含まれているＤＭＥＭ／Ｆ１２培地において培養した。なお、ＮＳＣマーカーを用いて免疫細胞化学染色法を行って、正常ＮＳＣおよびｆＡＬＳ  ＳＯＤ１（Ｇ１７Ｓ）ＮＳＣが生成されることを確認した（図１６Ｃ）。
【０１３８】
ＮＳＣから運動ニューロン（ＭＮ）に分化するために、ＮＳＣを１μｇ／ｍｌのラミニンおよび５ｕｇ／ｍｌのヘパリンコーティングプレートを有するＣｅｌｌ  Ｓｔａｒｔにおいて２日間非必須アミノ酸、ペニシリン／ストレプトマイシン、２−メルカプトエタノール、Ｎ２およびｂ−ＦＧＦを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２において培養した後、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．５％のＮ２補充剤および４０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦが含まれているＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で培養し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地および神経繊維培地（０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．５％のＮ２補充剤、４０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌの神経成長因子（ｎｅｕｒａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、１０ｎｇ／ｍｌのソニック・ヘッジホッグ（ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１０μＭのホルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ、Ｓｉｇｍａ）および１μＭのレチノイン酸（ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ、Ｓｉｇｍａ）、１０ｎｇ／ｍｌのグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ：ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）、１０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦ（ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ；脳由来神経栄養因子）、１０ｎｇ／ｍｌの繊毛様神経栄養因子（ｃｉｌｉａｒｙ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）、１０ｎｇ／ｍｌのインシュリン様成長因子１（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ１）および１０ｎｇ／ｍｌのＮＴ３（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ−３））の混合物を毎日または一週間にかけて毎日投与した。なお、ＭＮマーカーを用いて免疫細胞化学染色法を行って、正常ＭＮおよびｆＡＬＳ  ＳＯＤ１（Ｇ１７Ｓ）ＭＮに分化されることを確認した（図１６Ｄ）。
【０１３９】
前記分化された正常ＭＮおよびｆＡＬＳ  ＳＯＤ１（Ｇ１７Ｓ）ＭＮのそれぞれを用いて、前記実施例＜１０−１＞に記載の方法と同様にして、ｑＲＴ−ＰＣＲ（図１７Ａないし図１７Ｄ、図１７Ｆ）、細胞内のＣａ２＋の解析（図１７Ｃ）、軸索生成の解析（図１７Ｄ）、ＬＤＨの放出の解析（図１７Ｇ）を行った。
【０１４０】
その結果、図１７に示すように、ｆＡＬＳ  ＳＯＤ１（Ｇ１７Ｓ）ＭＮにおいて、Ｈｉｆ１αおよびＭｅｆ２ｃのｍＲＮＡの発現が有意に増加するのに対し、Ｍｃｔｐ１とＲａｒｂのｍＲＮＡのレベルは格段に減少することを確認した（図１７Ａおよび図１７Ｂ）。また、ｆＡＬＳ  ＳＯＤ１（Ｇ１７Ｓ）ＭＮｓにおいてｍｉＲ−１８ｂとｍｉＲ−２０６のレベルを測定し、ｍｉＲ−１８ｂは有意に減少し、ｍｉＲ−２０６は有意的に増加することを確認した（図１７Ｄ）。なお、ｆＡＬＳ  ＳＯＤ１（Ｇ１７Ｓ）ＭＮｓにおいてＣａ２＋が蓄積され、神経細胞分化が抑えられ、細胞死滅が誘導されることを確認した（図１７Ｃ、図１７Ｅないし図１７Ｇ）。
【０１４１】
前記の結果から、ｍｉＲ−１８ｂシグナル伝達経路がＳＯＤ１突然変異関係のＡＬＳに関与し、ＳＯＤ１突然変異関係のＡＬＳにおいてｍｉＲ−１８ｂシグナル伝達経路の調節障害によって細胞死滅が誘導されることを確認した。
【０１４２】
＜実施例１１＞  デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ；ＤＭＤ）におけるｍｉＲ−１８調節障害の確認
＜１１−１＞  ジストロフィン（Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ）発現抑制筋芽細胞におけるｍｉＲ−１８調節障害の確認
他の遺伝子突然変異による筋肉疾患として、ＤＭＤにおいて遺伝子変異によってｍｉＲ−１８ｂ調節障害が引き起こされるかどうかを調べるために、ｑＲＴ−ＰＣＲを行い、ジストロフィン発現抑制筋芽細胞においてｍｉＲ−１８の発現を確認した。
【０１４３】
具体的に、前記実施例＜１−３＞において取得したジストロフィン発現抑制のＣ２Ｃ１２細胞を回収して、前記＜実施例２＞に記載の方法と同様にして、ｑＲＴ−ＰＣＲを行った（図１８）。対照群として、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌを形質導入したＣ２Ｃ１２細胞を用いた。
【０１４４】
その結果、図１８に示すように、ジストロフィン発現抑制のＣ２Ｃ１２細胞においてｍｉＲ−１８の発現が減少することを確認した（図１８）。
【０１４５】
＜１１−２＞  ＤＭＤ動物モデルにおけるｍｉＲ−１８調節障害の確認
ＤＭＤにおいて遺伝子変異によってｍｉＲ−１８ｂ調節障害が引き起こされるかどうかを調べるために、ｑＲＴ−ＰＣＲを行い、ＤＭＤ動物モデルにおいてｍｉＲ−１８の発現を確認した。
【０１４６】
具体的に、ＤＭＤ動物モデルであるｍｄｘマウス（生後２〜４週齢）をジャクソン研究所（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）より提供された。ｍｄｘマウスから筋肉組織を摘出し、前記＜実施例２＞に記載の方法と同様にして、ｑＲＴ−ＰＣＲを行った（図１９）。
【０１４７】
その結果、図１９に示すように、ＤＭＤマウスにおいてｍｉＲ−１８の発現が減少することを確認した（図１９）。
【０１４８】
前記の結果から、ジストロフィン突然変異関係のＤＭＤにおいてｍｉＲ−１８ｂシグナル伝達経路の調節障害が引き起こされることを確認し、したがって、ｍｉＲ−１８ｂをＤＭＤの診断のためのターゲットｍｉＲＮＡとして用いることができ、ＤＭＤの予防および治療に用いることができることを確認した。
【０１４９】
前記＜実施例１＞ないし＜実施例１１＞の結果から、図２０の模式図のように、遺伝子突然変異がｍｉＲ−１８ｂの発現を減少させてｍｉＲ−１８ｂシグナル伝達経路の調節障害を引き起こし、ｍｉＲ−１８ｂ調節障害がＨｉｆ１αの上向き調節を誘導し、上向き調節されたＨｉｆ１αがＭｅｆ２ｃを上向き調節し、Ｍｅｆ２ｃがｍｉＲ−２０６の発現を誘導し、ｍｉＲ−２０６がＭｃｔｐ１とＲａｒｂの転写後調節に自ら関与してカルシウムシグナル伝達と神経細胞分化の抑制および細胞死滅を誘導することを確認した。したがって、ＡＬＳ、ＤＭＤのように遺伝子突然変異によって誘発される筋肉疾患の診断および治療においてｍｉＲ−１８ｂをターゲット因子として用いることができる。
【産業上の利用可能性】
【０１５０】
本発明のｍｉＲ−１８ｂは、ＡＬＳ、ＤＭＤのように遺伝子突然変異によって誘発される筋肉疾患の診断および治療のためのターゲット因子として用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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