(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
各マイクロ流路が形成される対向面をそれぞれ含む、互いに対向する一対の流路部材と、
多孔膜を厚さ方向に貫通する複数の貫通孔を含み、一対の流路部材の対向面の間に配置され、マイクロ流路間を画定する前記多孔膜と、
を備え、
前記多孔膜には、血管内皮細胞層が設けられ、前記血管内皮細胞層は、マイクロ流路のうちの一つに対向する一面を覆い、
前記貫通孔の平均開口直径は１μｍ〜２０μｍであり、
前記貫通孔の開口率は３０％〜７０％であり、
前記多孔膜の膜厚は、前記貫通孔の平均開口直径の半分以下である、
血管モデル。
【請求項２】
前記多孔膜の膜厚は、０．５μｍ〜１０μｍである、請求項１に記載の血管モデル。
【請求項３】
前記多孔膜の内側に形成される、前記貫通孔同士を連通させる連通孔を更に含み、
前記貫通孔はハニカム状に配列され、
前記貫通孔の開口直径の変動係数は１０％以下であり、
前記多孔膜の空隙率は５０％以上である、
請求項１に記載の血管モデル。
【請求項４】
他の一つの前記マイクロ流路に対向する前記多孔膜の他の面に設けられている、平滑筋細胞、間葉系幹細胞、ペリサイト、及び線維芽細胞からなる群の中から選択された細胞の細胞層を更に含む、請求項１に記載の血管モデル。
【請求項５】
前記多孔膜の引張破断伸度が５０％以上であり、
前記多孔膜の１０％の伸長に必要な応力が１０００ｇｆ／ｍｍ２以下である、請求項１に記載の血管モデル。
【請求項６】
前記貫通孔は、平面視で偏平な形状を有し、長軸及び短軸を含む、請求項１に記載の血管モデル。
【請求項７】
前記多孔膜は、前記貫通孔が形成される多孔性領域及び前記貫通孔が形成されていない非多孔性領域を含む、請求項１に記載の血管モデル。
【請求項８】
請求項１の血管モデルを提供し、
血管内皮細胞層が設けられる前記多孔膜の面に対向する前記マイクロ流路で薬物を含む血液希釈液を流し、
前記多孔膜の他の面に対向する前記マイクロ流路内へ漏出される赤血球の数を数える、
こと含む、薬物を含んだ血液希釈液を用いて出血評価を行う方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、血管モデルに関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、マイクロメートル単位の幅を有する流路であるマイクロ流路と呼ばれるものを含む装置を用いて、血管、内臓、肝臓及び肺のような臓器をモデリングしようとする試みがある。例えば、米国特許出願第２０１１／００５３２０７号公報、日本特許第５４１５５３８号公報、及び日本特許第５８１５６４３号のそれぞれには、表面に細胞層が設けられた多孔膜、及び多孔膜によって画定された少なくとも２つのマイクロ流路を含む臓器モデルが開示されている。
【０００３】
米国特許出願第２０１１／００５３２０７号公報、日本特許第５４１５５３８号公報、及び日本特許第５８１５６４３号に開示されたような臓器モデルを用いて多様な実験及び試験を行うことができる。例えば、マイクロ流路のうちの一つを通じて薬物を含む血液を流した後、多孔膜を通じて一つのマイクロ流路から他のマイクロ流路に移動した赤血球、バイオマーカーなどの数又は量を測定することで、出血評価（ｅｘｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ）と呼ばれる試験を行うことができる。この出血評価は、多孔膜の表面に設けられた細胞層に対する薬物性損傷レベルの評価を可能にし、薬物毒性試験を行うことができる。
【０００４】
しかし、従来の臓器モデルに用いられる多孔膜の細孔はトラックエッチング法として知られる工程を用いて生成されるが、ここで、例えば、多孔膜を構成する物質に重イオンが照射される。従って、膜の細孔の開口率は、例えば２％乃至２０％で低く、また膜も厚いため赤血球などの通過は多孔膜によって妨げられる。すなわち、従来の臓器モデルでは、多孔膜の表面に設けられた細胞層に対する薬物性損傷レベルが正確に評価されない場合があった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本開示は、出血評価中に赤血球などの移動が多孔膜によって妨げられることを抑制することができる血管モデルを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示の第１態様に係る血管モデルは、各マイクロ流路が形成される対向面をそれぞれ含む、互いに対向する一対の流路部材；及び厚さ方向に貫通する複数の貫通孔を含み、一対の流路部材の対向面の間に配置され、マイクロ流路間を画定する多孔膜を含み、ここで、多孔膜には血管内皮細胞層が設けられ、マイクロ流路のうちの一つに対向する一面を覆い、貫通孔の平均開口直径は１μｍ乃至２０μｍであり、貫通孔の開口率は３０％乃至７０％である。
【０００７】
上記構成において、マイクロ流路間を画定する多孔膜の貫通孔の平均開口直径は１μｍ乃至２０μｍであり、貫通孔の開口率は３０％乃至７０％である。従って、出血評価中に、赤血球などが多孔膜の貫通孔を通じて移動してマイクロ流路のうちの一つからマイクロ流路のうちの他の一つに移動する時、赤血球などの移動が多孔膜によって妨げられることを抑制することができる。
【０００８】
本開示の第２態様において、第１態様で、多孔膜の膜厚は、貫通孔の平均開口直径の半分以下であってもよい。
【０００９】
上記第２態様において、多孔膜の膜厚は、貫通孔の平均開口直径の半分以下であるため、多孔膜の膜厚が貫通孔の開口の平均開口直径の半分より大きい場合に比べて、赤血球などが多孔膜の貫通孔をより容易に通過することができる。従って、第２態様は、出血評価の精度を更に改善することができる。
【００１０】
本開示の第３態様において、第１又は第２態様で、貫通孔同士を連通させる連通孔が多孔膜の内側に形成されてもよく；貫通孔は、ハニカム状に配列されていてもよく；貫通孔の開口直径の変動係数は、１０％以下であってもよく；多孔膜の空隙率は５０％以上であってもよい。
【００１１】
上記第３態様において、貫通孔はハニカム状に配列され、連通孔を通じて互いに連通される。貫通孔の開口の開口直径の変動係数は１０％以下であり、多孔膜の空隙率は５０％以上である。これにより、第３態様では赤血球などをより均一に通過させることができる。従って、第３態様は、出血評価の精度を更に改善することができる。
【００１２】
本開示の第４態様において、第１乃至第３態様で、細胞の細胞層は平滑筋細胞、間葉系幹細胞、ペリサイト、及び線維芽細胞からなる群の中から選択でき、他の一つのマイクロ流路に対向する多孔膜の他の面に設けられていてもよい。
【００１３】
上記第４態様において、血管内皮細胞層が形成される面とは反対側の多孔膜の他の面に平滑筋細胞、間葉系幹細胞、ペリサイト、及び線維芽細胞からなる群由来の細胞の細胞層を形成することに起因して、実際の血管とより類似した血管モデルを達成することができる。
【００１４】
本開示の第５態様において、第１態様乃至第４態様で、多孔膜の引張破断伸度は５０％以上であり；多孔膜の１０％の伸長に必要な応力は１０００ｇｆ／ｍｍ２以下であってもよい。
【００１５】
上記第５態様において、多孔膜は、引張破断伸度が５０％以上であり、１０％の伸長に必要な応力が１０００ｇｆ／ｍｍ２以下である可撓性材料から形成されるため、実際の血管とより類似した血管モデルを達成することができる。
【００１６】
本開示の第６態様において、第１態様乃至第５態様で、貫通孔は平面視で偏平な形状を有していてもよく、長軸及び短軸を含んでもよい。
【００１７】
上記第６態様において、貫通孔は、平面視で楕円形のような偏平形状を有するため、赤血球などは貫通孔をより容易に通過することができる。従って、第６態様は、出血評価の精度を更に改善することができる。
【００１８】
本開示の第７態様において、第１態様乃至第６態様で、多孔膜は貫通孔が形成される多孔性領域及び貫通孔が形成されていない非多孔性領域を含むことができる。
【００１９】
上記第７態様において、例えば、マイクロ流路の入口付近及び出口付近に配置された多孔膜の一部は、貫通孔が形成されていない非多孔性領域として構成されるため、マイクロ流路内部の赤血球などの流れを調節することができる。従って、第７態様は、出血評価の精度を更に改善することができる。
【発明の効果】
【００２０】
上記態様によれば、本開示は、出血評価中の赤血球などの移動が多孔膜によって妨げられることを抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】例示的な実施態様の血管モデルの全体構成を示す斜視図である。
【図２】例示的な実施態様の血管モデルの全体構成を示す分解斜視図である。
【図３】例示的な実施態様の血管モデルの多孔膜を示す拡大断面図である。
【図４】例示的な実施態様の血管モデルの多孔膜を示す平面図である。
【図５】変形例の血管モデルの多孔膜を示す平面図である。
【図６】変形例の血管モデルの多孔膜を示す平面図である。
【図７Ａ】実施例１の多孔膜の顕微鏡写真である。
【図７Ｂ】比較例１の多孔膜の顕微鏡写真である。
【図８Ａ】実施例３の細胞層付着血管モデルのマイクロ流路内の画像蛍光の結果である。
【図８Ｂ】比較例３の細胞層付着血管モデルのマイクロ流路内の画像蛍光の結果である。
【図９Ａ】実施例３の細胞層付着血管モデルにおけるＦＩＴＣ−デキストラン透過性試験の結果である。
【図９Ｂ】比較例３の細胞層付着血管モデルにおけるＦＩＴＣ−デキストラン透過性試験の結果である。
【図１０Ａ】実施例４の多孔膜の顕微鏡写真である。
【図１０Ｂ】図１０Ａの部分拡大図である。
【図１１】実施例５の多孔膜の顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
図１〜図６を参照して、本開示の例示的な実施態様の実施例及び変形例について説明する。以下の例示的な実施態様は、本開示の一例に過ぎず、本開示の範囲を限定するものではない。また、図面における多様な構成の寸法は、多様な構成を容易にするため、適宜に修正される。従って、図面の縮尺は実際の縮尺と異なる場合がある。
【００２３】
図１及び図２に示すように、例示的な実施態様の血管モデル１０は、互いに積層された上部流路部材１２と下部流路部材１４とを含む。上部流路部材１２及び下部流路部材１４は、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）のような弾性物質で構成されており、略長方形の板形状を有する。
【００２４】
ＰＤＭＳの他に、上部流路部材１２と下部流路部材１４とを構成する材料の他の例は、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、エポキシ樹脂、ウレタン樹脂、スチレン系熱可塑性エラストマー、オレフィン系熱可塑性エラストマー、アクリル系熱可塑性エラストマー、ポリビニルアルコールなどを含む。
【００２５】
上部マイクロ流路１６を画定する凹部１８は、上部流路部材１２の下面、すなわち、下部流路部材１４に対向する対向面１２Ａに形成されている。凹部１８は、入口１８Ａ、出口１８Ｂ、及び入口１８Ａと出口１８Ｂとを連通させる流路部１８Ｃを含む。
【００２６】
貫通孔２０Ａ、２０Ｂは、上部流路部材１２に形成され、上部流路部材１２を厚さ方向に貫通し、入口１８Ａ及び出口１８Ｂとそれぞれ連通する下端部を有する。貫通孔２０Ａ、２０Ｂの上端部は、上部流路部材１２の上面に開口している。貫通孔２０Ａ、２０Ｂの上端部には、液体供給管（図示せず）が接続されている。
【００２７】
同様に、下部マイクロ流路２２を画定する凹部２４は、下部流路部材１４の上面、すなわち、上部流路部材１２に対向する対向面１４Ａに形成されている。凹部２４は、入口２４Ａ、出口２４Ｂ、及び入口２４Ａと出口２４Ｂとを連通させる流路部２４Ｃを含む。
【００２８】
下部流路部材１４の入口２４Ａと出口２４Ｂ及び上部流路部材１２の入口１８Ａと出口１８Ｂは、平面視で重ならない位置に設けられている。これに対して、下部流路部材１４の流路部２４Ｃ及び上部流路部材１２の流路部１８Ｃは、平面視で重なる位置に設けられている。
【００２９】
貫通孔２６Ａ、２６Ｂも上部流路部材１２に形成され、上部流路部材１２を厚さ方向に貫通し、入口２４Ａ及び出口２４Ｂとそれぞれ連通される下端部を有する。貫通孔２６Ａ、２６Ｂの上端部は、上部流路部材１２の上面に開口している。貫通孔２６Ａ、２６Ｂの上端部には、液体供給管（図示せず）が接続されている。
【００３０】
多孔膜２８は、上部流路部材１２と下部流路部材１４との対向面１２Ａ、１４Ａの間に設けられている。上部流路部材１２及び下部流路部材１４は、間に挟んだ状態で多孔膜２８と接合される。また、上部流路部材１２と下部流路部材１４とを接合する方法としては、接着剤を用いて接合する方法以外に、溶着、吸着（自己吸着）、又はボルトによる接合などの多様な方法を採用することができる。
【００３１】
多孔膜２８は、例えば、疎水性有機溶媒に溶解される疎水性ポリマーである。疎水性有機溶媒は、２５℃の水で１０以下（ｇ／１００ｇ水）の溶解度を有する液体である。
【００３２】
疎水性ポリマーの例は、ポリブタジエン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエステル（例えば、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリ乳酸−ポリカプロラクトン共重合体、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリエチレンサクシネート、ポリブチレンサクシネート、及びポリ−３−ヒドロキシブチレート）、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルクロライド、ポリビニリデンクロライド、ポリビニリデンフロライド、ポリヘキサフルオロプロペン、ポリビニルエーテル、ポリビニルカルバゾール、ポリビニルアセテート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリラクトン、ポリアミド、ポリイミド、ポリウレタン、ポリウレア、多環芳香族化合物、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリシロキサン誘導体、及びセルロースアシレート（例えば、トリアセチルセルロース、セルロースアセテートプロピオネート、及びセルロースアセテートブチレート）のようなポリマーを含む。例えば、日本特許第４７３４１５７号に開示された製造方法を利用してハニカム膜を製造する観点から、疎水性有機溶媒に溶解されるポリマーが好ましい。
【００３３】
例えば、溶媒に対する溶解度、光学特性、電気的特性、膜強度、及び弾性の観点から、これらポリマーは必要に応じてホモポリマー、コポリマー、ポリマーブレンド又はポリマーアロイの形態を取ることができる。これら重合体は、単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。多孔膜２８の材料は、疎水性ポリマーに限定されず、細胞の接着性などの観点から多様な材料が選択できる。
【００３４】
多孔膜２８の上面２８Ａ及び下面２８Ｂ（以下、上面２８Ａ及び下面２８Ｂは総称して「主面」と称される場合がある）は、上部マイクロ流路１６及び下部マイクロ流路２２の流路部１８Ｃ、２４Ｃを実質的に覆うような大きさに決められており、上部マイクロ流路１６が下部マイクロ流路２２から画定される。
【００３５】
具体的に、多孔膜２８の上面２８Ａ、すなわち、上部流路部材１２に対向する主面は、上部流路部材１２の凹部１８とともに、上部マイクロ流路１６を画定する。多孔膜２８の下面２８Ｂ、すなわち、下部流路部材１４に対向する主面は、下部流路部材１４の凹部２４とともに、下部マイクロ流路２２を画定する。
【００３６】
図３に示すように、例えば血管内皮細胞層３６が多孔膜２８の上面２８Ａに設けられ、上面２８Ａを完全に覆う。これにより、上部マイクロ流路１６の内部は、血管の内部と非常に類似した環境を構成する。血管内皮細胞の例は、臍帯静脈、臍帯動脈、大動脈、冠動脈、肺動脈、肺微小血管、又は真皮微小血管に由来する血管内皮細胞；及び多能性幹細胞から分化された血管内皮細胞を含む。
【００３７】
例えば、平滑筋細胞、間葉系幹細胞、ペリサイト、及び線維芽細胞からなる群の中から選択された細胞から構成された細胞層３８が多孔膜２８の下面２８Ｂに設けられ、下面２８Ｂを完全に覆う。これにより、下部マイクロ流路２２は、血管外部と非常に類似した環境を構成する。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、筋肉細胞、脂肪細胞、軟骨細胞などに分裂することができる体性幹細胞である。
【００３８】
多孔膜２８の上面２８Ａには、平滑筋細胞、間葉系幹細胞、ペリサイト、及び線維芽細胞からなる群の中から選択された細胞の細胞層３８が設けられてもよく、多孔膜２８の下面２８Ｂには血管内皮細胞層３６が設けられてもよい。更に、多孔膜２８の主面のうちの少なくとも一つに血管内皮細胞層３６が設けられることで十分である。多孔膜２８の他の一つの主面には、細胞層３８が設けられないように構成されてもよい。
【００３９】
細胞の接着性の観点から、多孔膜２８の上面２８Ａ及び下面２８Ｂのうちの少なくとも一つに細胞が播種される領域は、フィブロネクチン、コラーゲン（例えば、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン又はＶ型コラーゲン）、ラミニン、ビトロネクチン、ゼラチン、パーレカン、ニドゼン、プロテオグリカン、オステオポンチン、テネシン、ネフロネクチン、基底膜マトリックス、及びポリリジンからなる群の中から選択された少なくとも一つによって被覆されることが好ましい。また、多孔膜２８及び後述する貫通孔３０の内部は、これらの少なくとも一つによってコーティングされていることが好ましい。
【００４０】
血管内皮細胞層３６及び細胞層３８を多孔膜２８の各主面に設けるために、例えば、細胞懸濁液を上部マイクロ流路１６及び下部マイクロ流路２２に注ぎ、多孔膜２８の主面に細胞を播種する方法を採用することができる。更に、別の培養装置内で多孔膜２８の主面に細胞を播種して培養した後、血管内皮細胞層３６及び細胞層３８が形成されている多孔膜２８を血管モデル１０に装着する方法も採用することができる。
【００４１】
図３及び図４に示すように、多孔膜２８を厚さ方向に貫通する複数の貫通孔３０が多孔膜２８に形成されている。貫通孔３０の開口３０Ａが多孔膜２８の上面２８Ａ及び下面２８Ｂのそれぞれに設けられている。図４に示すように、開口３０Ａは、平面視で円形である。開口３０Ａは、互いに分離して設けられる。扁平部３２は、隣接した開口３０Ａの間で延びる。開口３０Ａは円形に限定されず、多角形で構成されてもよい。
【００４２】
複数の開口３０Ａは、規則的に配列され、本例示的な実施態様では、図４に示すように、例えば、ハニカム状に配列される。ハニカム状配列は、開口３０Ａの中心が平行六角形の単位（正六角形が好ましい）又はこれに近い形状に対する、頂点の位置と対角線が交差する地点に配置される配列である。ここで、「開口の中心」とは、平面視で開口３０Ａの中心を意味する。
【００４３】
開口３０Ａの配列は、ハニカム状に制限されない。開口３０Ａは、格子状又は面心格子状で構成することができる。格子状配列は、開口の中心が平行四辺形（正方形、長方形、菱形が含まれることは言うまでもなく、正方形が好ましい）又はこれに近い形状の単位に対する頂点の位置に配置される配列である。面心格子状配列は、開口の中心が平行四辺形（正方形、長方形、菱形が含まれることは言うまでもなく、正方形が好ましい）又はこれに近い形状の単位に対する頂点の位置及び対角線が交差する地点に配置される配列である。
【００４４】
開口３０Ａの配列は、任意であってよい。しかし、多孔膜２８の上面２８Ａ及び下面２８Ｂの開口３０Ａの密度を均一にする観点から、複数の開口３０Ａは規則的に配置されることが好ましい。規則的な配列は、上記配列の平行六角形又は平行四辺形単位の表面積の変動係数が、例えば１０％以下の配列である。開口３０Ａのうち一部は欠落しているか、開口３０Ａは整列されていない可能性がある。しかし、開口３０Ａは連続隙間なく全方向に配置されていることが好ましい。「変動係数」とは、所定の母集団の標準偏差をその平均で割った値であり、母集団の分散位を百分率で表す指標である。
【００４５】
図３に示すように、多孔膜２８の各貫通孔３０は、球欠形状を有し、これは球体の上端及び下端が切断された形状である。互いに隣接する貫通孔３０は、多孔膜２８内部の各連通孔３４を通じて互いに連通されている。
【００４６】
各貫通孔３０は、隣接するすべての貫通孔３０と連通することが好ましい。本例示的な実施態様のように、複数の貫通孔３０の開口３０Ａがハニカム状に配列されている場合、各貫通孔３０は６個の連通孔３４を通じて隣接する６個の貫通孔３０とそれぞれ連通される。貫通孔３０は筒状、円柱状、多角柱状などを有していてもよく、連通孔３４は隣接した貫通孔３０同士を連結する筒状の空隙であってもよい。
【００４７】
貫通孔３０の各開口３０Ａの開口直径Ｄは、例えば、血液内の赤血球が通過することができる大きさである。具体的には、平均開口直径は、好ましくは１μｍ乃至２０μｍであり、より好ましくは３μｍ乃至１０μｍである。平均開口直径を１μｍ以上に設定すると、貫通孔３０は赤血球が通過できるサイズになり、平均開口直径を２０μｍ以下に設定すると、多孔膜２８の主面に血管内皮細胞層３６及び細胞層３８の保有ができるようになる。
【００４８】
ここで、「開口直径Ｄ」は、開口３０Ａの長軸であり、「平均開口直径」は、任意に選択された１０個以上の開口３０Ａについて測定された開口直径Ｄの計算平均である。「長軸」とは、開口の輪郭上の任意に選択された２点間の最長距離を意味する。しかし、方向が特定された場合「長軸」とは、その方向に沿って任意に選択された２点間の最長距離を意味する。
【００４９】
貫通孔３０の開口３０Ａの開口率は、好ましくは３０％乃至７０％であり、より好ましくは４０％乃至６０％である。開口率を３０％以上に設定すると、多孔膜２８によって赤血球の移動が妨げられることを抑制することができ、開口率を７０％以下に設定すると、多孔膜２８に必要な強度が達成できる。
【００５０】
ここで、「開口率」とは、百分率でＳ２対Ｓ１の割合を示し、Ｓ１は多孔膜２８の主面が平滑であるという仮定の下に（すなわち、多孔膜２８に開口３０Ａがないと仮定の下に）、多孔膜２８の表面積の単位を示し、Ｓ２は単位表面当たりで設けられた開口３０Ａの表面積の合計を示し、ここで、Ｓ１及びＳ２に対して等しい測定単位が用いられる。
【００５１】
多孔膜２８の膜厚Ｔは、好ましくは貫通孔３０の開口３０Ａの平均開口直径の半分以下である。具体的には、厚さＴは、好ましくは０．５μｍ乃至１０μｍであり、より好ましくは１μｍ乃至１０μｍである。多孔膜２８の膜厚Ｔを貫通孔３０の平均開口直径の半分以下の厚さに設定すると、多孔膜２８によって赤血球の移動が妨げられることを抑制することができる。
【００５２】
また、多孔膜２８は細胞が付着して成長する足場であるため、多孔膜２８の一方の面の細胞と多孔膜２８の他の面の細胞との間の細胞間相互作用、すなわち、体液因子を通じた情報送信、又は細胞間接触の少なくとも一つは、多孔膜２８上の開口率が大きくなるほど、及び多孔膜２８の膜厚が薄くなるほど、より活性化する。多孔膜２８の主面に血管内皮細胞層３６及び細胞層３８を提供するための細胞培養間細胞間相互作用がより活発になるほど、生体内組織の物と類似した機能性を有する血管モデルがよりよく生成できる。
【００５３】
開口３０Ａの開口直径Ｄの変動係数は、好ましくは１０％以下であり、変動係数が小さいほどより好ましい。開口直径Ｄの変動係数が小さいほど、より均一に赤血球などが多孔膜２８内の複数の貫通孔３０を通過することができる。
【００５４】
多孔膜２８の空隙率は、好ましくは５０％以上である。空隙率を５０％以上に設定すると、多孔膜２８によって赤血球の移動が妨げられることを抑制することができる。空隙率が大きすぎると、多孔膜２８の強度は、そのために必要な強度に関して不十分になるため、空隙率は９５％以下が好ましい。
【００５５】
ここで、「空隙率」とは、Ｖ２とＶＩとの比率を百分率で表したものであり、Ｖ１は多孔膜２８の主面が平滑であるという仮定の下に（すなわち、多孔膜２８に開口３０Ａがないと仮定の下に）、多孔膜２８の嵩の単位を示し、Ｖ２は単位嵩当たりで設けられた貫通孔３０及び連通孔３４の嵩の合計を示し、ここで、Ｖ１及びＶ２に対して等しい測定単位が用いられる。
【００５６】
多孔膜２８の引張破断伸度は、好ましくは５０％以上であり、より好ましくは１００％であり、更に好ましくは２００％以上である。多孔膜２８の１０％の伸長に必要な応力は、好ましくは１０００ｇｆ／ｍｍ２以下である。引張破断伸度が増加し、１０％の伸長に必要な応力が減少することによって材料はより可撓性になる。従って、多孔膜２８を曲げ、引き伸ばし、圧縮することが可能であり、血管モデル１０を実際の血管により近づけることができる。
【００５７】
ここで、「引張破断伸度」は、ＪＩＳ  Ｋ  ６２５１：２０１０に規定された方法によって多孔膜２８の引張破断伸びを測定することで評価できる。「１０％の伸長に必要な応力」は、ＪＩＳ  Ｋ  ６２５１：２０１０に規定された方法によって多孔膜２８が１０％伸長する時に多孔膜２８に加えられる応力を測定することで評価できる。
【００５８】
貫通孔３０が形成された多孔膜２８を製造する方法の例には、ナノプリント法、結露法、エッチング法、サンドブラスト工程、又はプレス成形工程を含む。ナノプリント法は、多孔膜２８を構成する材料を突出部及び凹部を有するモールドに注ぐか、又はこのようなモールドを多孔膜２８を構成する材料に対して加圧することで貫通孔３０を生成する方法である。結露法とは、多孔膜２８を構成する材料の表面に凝結を誘導し、水滴をモールドにして貫通孔３０を形成する方法である。
【００５９】
他の方法と比べて、結露法は、多孔膜２８の膜厚をより薄くすることができ、開口３０Ａの空隙率及び開口率を増加させることができ、また連通孔３４を多孔膜２８内に設けることができる。従って、本例示的な実施態様において、多孔膜２８は結露法を利用して製造される。結露法は、例えば、日本特許第４９４５２８１号公報、日本特許第５４２２２３０号公報、日本特許第５４０５３７４号公報、及び日本特開第２０１１−７４１４０号公報に詳細に記載されている。
【００６０】
次に、本例示的な実施態様の血管モデル１０を用いて薬物毒性評価が行われる場合を例として説明する。薬物毒性試験を行う際に、まず、上部流路部材１２及び下部流路部材１４は、間に挟んだ状態で多孔膜２８と接合され、図２に示すように上部マイクロ流路１６及び下部マイクロ流路２２を含む血管モデル１０を生成する。血管内皮細胞層３６及び細胞層３８は、多孔膜２８の主面に設けられている。
【００６１】
そして、ポンプを用いて薬物を含む血液希釈液を管（図示せず）及び貫通孔２０Ａを通過し上部マイクロ流路１６内へ流し、上部マイクロ流路１６の内部を通過した後、貫通孔２０Ｂ及び管（図示せず）を通過して血管モデル１０から流出させる。
【００６２】
一方、ポンプを用いて培養液又は生理食塩水溶液を管（図示せず）及び貫通孔２６Ａを通過し下部マイクロ流路２２内へ流し、下部マイクロ流路２２の内部を通過した後、貫通孔２６Ｂ及び管（図示せず）を通過して血管モデル１０から流出させる。血液希釈液が流れる上部マイクロ流路１６の圧力は、培養液又は生理食塩水溶液が流れる下部マイクロ流路２２の圧力より高い。
【００６３】
毒性試験の開始時に、図３に示すように、多孔膜２８の上面２８Ａの全体及び下面２８Ｂの全体が、血管内皮細胞層３６及び細胞層３８によってそれぞれ覆われている。従って、血液内の赤血球は、多孔膜２８を通過することができす、下部マイクロ流路２２内へ漏出されない。
【００６４】
しかし、毒性試験の開始から一定の時間が経過すると、血管内皮細胞層３６は薬物の毒性によって損傷される。血管内皮細胞層３６に加えて、細胞層３８も薬物によって損傷される。このような損傷された部分によって多孔膜２８を通過し、下部マイクロ流路２２に流入された赤血球の数を測定することで、すなわち出血評価を行うことで、血管内皮細胞層３６及び細胞層３８に対する薬物性損傷のレベルを評価することができる。
【００６５】
また、薬物の毒性によって血管内皮細胞層３６が損傷される場合、血管内皮細胞層３６と細胞層３８との間の細胞間相互作用によって細胞層３８を構成する細胞の状態が変化し、その結果、細胞層３８に隙間が形成される可能性がある。隙間を通過し下部マイクロ流路２２に流入された赤血球の数を測定することで、すなわち出血評価を行うことで、血管内皮細胞層３６に対する薬物性損傷のレベル及び細胞層３８の反応のレベルを評価することができる。
【００６６】
血管内皮細胞層３６と細胞層３８との間の細胞間相互作用は、多孔膜２８上の開口率が大きくなるほど、及び多孔膜２８の膜厚が薄くなるほどより活性化にするため、この試験では高い感度で行われることができる。
【００６７】
また、上記毒性試験において、血液希釈液の代わりに、上部マイクロ流路１６を通じて薬物及びトレーサーを含む溶液を流してもよい。トレーサーの例には、蛍光−標識化学物質、放射性同位元素含有化学物質、染料化合物など、より具体的にはデキストラン、エバンスブルー、フルオレセインナトリウム及びＦＩＴＣマイクロビーズからなる群の中から選択される少なくとも１つが含まれる。蛍光染料は、好ましくは励起波長／蛍光波長が５８０ｎｍ／６０５ｎｍであり、赤色である。
【００６８】
血管内皮細胞層３６及び細胞層３８に対する薬物性損傷のレベルは、トレーサーのタイプによって蛍光強度、放射線又は色度を測定してトレーサーを定量化し、多孔膜２８を通過し上部マイクロ流路１６から下部マイクロ流路２２内へ流入されたトレーサーの量を測定することで評価できる。
【００６９】
本例示的な実施態様は、下部マイクロ流路２２から上部マイクロ流路１６を画定する多孔膜２８において、貫通孔３０の開口３０Ａの平均開口直径が１μｍ乃至２０μｍであり、貫通孔３０の開口３０Ａの開口率が３０％乃至７０％であるように構成される。従って、上部マイクロ流路１６を通じて流れる赤血球が多孔膜２８の貫通孔３０を通過し下部マイクロ流路２２に移動する出血評価の間、多孔膜２８によって赤血球の移動が妨げられることを抑制することができる。
【００７０】
また、本例示的な実施態様は、多孔膜２８の膜厚が貫通孔３０の開口３０Ａの平均開口直径の半分以下になるように構成される。従って、多孔膜２８の膜厚が貫通孔３０の開口３０Ａの平均開口直径の半分より大きい場合と比べて、赤血球が多孔膜２８内の貫通孔３０をより容易に通過することができる。従って、本例示的な実施態様は、出血評価の精度を更に改善することができる。
【００７１】
また、本例示的な実施態様は、ハニカム状に配列された貫通孔３０の開口部３０Ａで構成されており、多孔膜２８内の貫通孔３０は連通孔３４を通じて互いに連通される。貫通孔３０の開口３０Ａの開口直径の変動係数は１０％以下であり、多孔膜２８の空隙率は５０％以上である。従って、赤血球は多孔膜２８内の複数の貫通孔３０をより均一に通過することができる。従って、本例示的な実施態様は、出血評価の精度を更に改善することができる。
【００７２】
また、本例示的な実施態様は、多孔膜２８の上面２８Ａに設けられた血管内皮細胞層３６、及び多孔膜２８の下面２８Ｂに設けられた細胞層３８で構成される。細胞層３８は、平滑筋細胞、間葉系幹細胞、ペリサイト、及び線維芽細胞からなる群の中から選択された細胞で構成される。また、多孔膜２８は引張破断伸度が５０％以上で、１０％の伸長に必要な応力が１０００ｇｆ／ｍｍ２以下である可撓性材料で構成される。それにより、本例示的な実施態様において、血管モデル１０は、実際の血管により近づけるように構成することができる。
【００７３】
本開示の例示的な実施態様の例について説明した。しかし、本開示は、上記に制限されるものでなく、本開示の趣旨を逸脱しない範囲内で上記以外にも多様な変形で具現できる。
【００７４】
例えば、上記の例示的な実施態様の多孔膜２８の貫通孔３０の開口３０Ａは、平面視で円形形状を有するが、図５に示すように、多孔膜４８の貫通孔５０の開口５０Ａは、平面視で楕円形の形状を有することができる。貫通孔５０の開口５０Ａを楕円形に構成することで、例えば、円盤状赤血球が貫通孔５０の開口５０Ａを容易に通過することができ、血液中の他の細胞はこれを通過しにくくすることができる。
【００７５】
貫通孔５０の開口５０Ａの開口５０Ａを楕円形で形成する方法の例は、多孔膜４８に図４に示すような円形開口３０Ａを形成した後、多孔膜４８を一方向（図４の左右方向）に沿って延伸する方法を含む。この方法は、同じ方向（図５の左右方向）に沿って長軸方向を有する複数の楕円形開口５０Ａが形成される可能性がある。
【００７６】
また、多孔膜４８を延伸せず、プレス成形などを用いて多孔膜４８に楕円形の開口５０Ａを直接形成してもよい。また、開口５０Ａの形状が平面視で長軸及び短軸を有する偏平な形状である限り、開口５０Ａの形状は、例えば、多角形を延伸させることでなる偏平な多角形状であってもよい。
【００７７】
上記の例示的な実施態様の多孔膜２８において、貫通孔３０の開口３０Ａは、多孔膜２８の主面の全体にわたり規則的に配置される。しかし、図６に示すように、多孔膜５８は、貫通孔６０の開口６０Ａが形成される多孔性領域６２及び貫通孔６０の開口６０Ａが形成されていない非多孔性領域６４（図６で二点鎖線で表示された領域）を設けることができる。
【００７８】
具体的には、多孔膜５８において、図１に示した上部マイクロ流路１６を構成する凹部１８の入口１８Ａ付近及び出口１８Ｂ付近、及び図１に示した下部マイクロ流路２２を構成する凹部２４の入口２４Ａ付近及び出口２４Ｂ付近に配置された部分は、例えば非多孔性領域６４として構成される。
【００７９】
一般的に、血液のような液体の流れは、入口１８Ａ、２４Ａ及び出口１８Ｂ、２４Ｂで容易に攪乱される。従って、非多孔性領域６４として入口１８Ａ、２４Ａ付近及び出口１８Ｂ、２４Ｂ付近に多孔膜５８を構成することで、上部マイクロ流路１６及び下部マイクロ流路２２での血液のような液体の流れを調節することができる。従って、多孔膜５８は出血評価の精度を更に改善することができる。
【００８０】
本開示の血管モデルは、薬物毒性に伴う赤血球などの漏出物質の血管外への移動が多孔膜により妨げられることを抑制した状態で、出血評価を行うことができる。従って、本開示の血管モデルは、高い正確度で毒性試験を行うことができる血管モデルとして用いることができる。
【００８１】
以下に、本開示の例示的な実施態様の例について詳細に説明する。本開示の例示的な実施態様は、以下に例示された例によって制限されるものと解釈されてはならない。
【００８２】
図７Ａは、実施例１の多孔膜の顕微鏡写真を示す。実施例１では、複数の貫通孔の開口はハニカム状に配列され、貫通孔は連通孔を通じて連通され、上記の例示的な実施態様の多孔膜２８と同様にポリカーボネートで形成された多孔膜が用いられた。実施例１の多孔膜の開口の平均開口直径は５μｍであり、開口の開口率は５５％であり、多孔膜の膜厚は２．２μｍであり、開口の開口直径の変動係数は３．５％であり、多孔膜の空隙率は７５％であり、引張破断伸びは２５０％であり、１０％の伸長に必要な応力は１００ｇｆ／ｍｍ２であった。
【００８３】
製造された多孔膜の微細構造は、プロファイル走査型レーザー顕微鏡（製品名：ＶＫ−Ｘ１００、Ｋｅｙｅｎｃｅ,Ｊａｐａｎ製）を用いて測定した。単一のスクリーンに５０個以上の開口が現れる倍率を用いて観察した。観察された顕微鏡写真に基づいて、各開口直径Ｄを測定し、平均開口直径ＤＡＶ及び開口直径Ｄの変動係数σＤを求めるために、一つのスクリーン上に存在する開口に対して画像分析を実施した。開口直径の変動係数（百分率で指定）は、計算（σＤ／ＤＡＶ）×１００を用いて達成できる。
【００８４】
平均開口直径及び開口率は、２Ｄ画像分析ソフトウェアＷｉｎＲＯＯＦ（三谷商事株式会社製）を用いて、顕微鏡写真に対して、２値化処理及び画像処理を施すことで達成された。多孔膜の膜厚は、プロファイル走査型レーザー顕微鏡を用いて１０箇所で測定した開口部の厚さの平均値である。
【００８５】
多孔膜の断面を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ、製品名：ＳＵ８０３０、Ｈｉｔａｃｈｉ，Ｊａｐａｎ製）を用いて観察し、貫通孔と同等の球体の直径を多孔膜の空隙率として計算した。評価される多孔膜サンプルをミクロトーム（製品名：ＦＣＳ、オーストリアＲｅｉｃｈｅｒｔ社製）でスライスして断面観察用サンプルを作成し、断面観察用サンプルの表面をＯｓ層で厚さ６ｎｍにコーティングし、サンプルを２ｋＶの加速電圧を用いてＳＥＭで観察した。多孔膜の引張破断伸び及び１０％の伸長に必要な応力は、ＦＵＤＯＨ  ＲＨＥＯ  ＭＥＴＥＲ  ＲＴ−２００２Ｄ・Ｄ（株式会社レオテック製）を用いて測定された。
【００８６】
図７Ｂは、比較例１の多孔膜の顕微鏡写真を示す。比較例１ではトラックエッチング法によって開口を形成するポリカーボネートで形成された従来技術の多孔膜が用いられた。また、比較例１の多孔膜における開口の平均開口直径は５．７μｍであり、開口の開口率は１２．４％であり、多孔膜の膜厚は１０．６μｍであり、開口の開口直径の変動係数は３５％であり、多孔膜の空隙率は１５％であり、引張破断伸度は１５０％であり、１０％の伸長に必要な応力は５８００ｇｆ／ｍｍ２であった。
【００８７】
多孔膜は、両面に医療用紙が付着されて製造される。多孔膜の一面の医療用紙をピンセットを用いて取り除き、医療用紙を取り除いた面は下部流路部材に下向きに設定する。次に、多孔膜を綿棒を用いてエタノールに浸漬し、多孔膜と下部流路部材とを接合させる。
【００８８】
次に、多孔膜の他の面の医療用紙をピンセットを用いて取り除き、上部流路部材を多孔膜の他の面に積層する。上部流路部材と下部流路部材の位置を顕微鏡でチェックしながら整列させ、上部流路部材と下部流路部材とを接合させる。それにより、実施例１の血管モデル及び比較例１の血管モデルがそれぞれ製造された。
【００８９】
実施例１及び比較例１で、多孔膜の赤血球に対する透過性を評価するために、用いられる多孔膜は、その主面に設けられた血管内皮細胞層３６又は平滑筋細胞、間葉系幹細胞、ペリサイト、及び線維芽細胞からなる群から選択された細胞の細胞層を有していない。
【００９０】
実施例２では、実施例１の血管モデルを取り、多孔膜の上面にラット血管内皮細胞層を形成し、多孔膜の下面にラット平滑筋細胞で構成された細胞層を形成することで、細胞層が付着した血管モデルを製造した。
【００９１】
比較例２では、比較例１の血管モデルを取り、多孔膜の上面にラット血管内皮細胞層を形成し、多孔膜の下面にラット平滑筋細胞で構成された細胞層を形成することで、細胞層が付着した血管モデルを製造した。
【００９２】
実施例２及び比較例２において、ラット血管内皮細胞にはＡｎｇｉｏ−Ｐｒｏｔｅｏｍｉｅ製のラット動脈内皮細胞が用いられ、ラット平滑筋細胞にはＬｏｎｚａ製のラット大動脈平滑筋細胞が用いられた。下部マイクロ流路を、初期の細胞濃度が３×１０６細胞／ｍｌであるラット平滑筋細胞の細胞懸濁液１００μＬで播種した。培養１日後、上部マイクロ流路に細胞濃度が３×１０６細胞／ｍｌであるラット血管内皮細胞の細胞懸濁液１００μＬで播種した。培養２日後、実施例２及び比較例２の細胞層付着血管モデルが得られた。
【００９３】
３．７×１０５細胞／ｍｌの赤血球数を有する血液希釈液を、実施例１及び比較例１で製造された血管モデルの上部マイクロ流路を通じて流し、生理食塩水溶液を下部マイクロ流路を通じて流した。血液希釈液及び生理食塩水溶液の流体伝達速度は５００μＬ／分で設定し、上部マイクロ流路の内部圧力は約８．７ｋＰａで設定し、下部マイクロ流路の内部圧力は約１．３ｋＰａに設定し、実際の血管内部の血流及び血圧条件に近接したパラメータを確立した。
【００９４】
流体伝達を開始してから一定の時間が経過した後、下部マイクロ流路内部、すなわち生理食塩水溶液内部の赤血球の数は、実施例１では９．２×１０４細胞／ｍｌの赤血球数を提供し、比較例１の血管モデルでは２．２×１０４細胞／ｍｌの赤血球数を提供した。
【００９５】
この試験では、実施例１及び比較例１の多孔膜が共に、血圧の条件と同等の条件下で赤血球に対する透過性を有することを確認できた。また、比較例１の多孔膜と比べて、実施例１の多孔膜は赤血球透過性が高く、本例示的な実施態様の多孔膜により赤血球の移動が妨げられることを抑制できることを確認できた。
【００９６】
トレーサーに対して１．８１×１０６ビーズ／ｍｌ濃度の蛍光ビーズを含む培養培地希釈液を、実施例２及び比較例２で製造された細胞層付着血管モデルの上部マイクロ流路を通じて流し、蛍光ビーズを含まない培養培地を下部マイクロ流路を通じて流した。蛍光ビーズは直径が４μｍであり、励起波長が５８０ｎｍで蛍光波長が６０５ｎｍである赤色蛍光染料に標識された。蛍光ビーズを含む培養培地希釈液及び蛍光ビーズを含まない培養培地の流体伝達速度は５００μＬ／分に設定し、上部マイクロ流路の内部圧力は約８．７ｋＰａに設定し、下部マイクロ流路の内部圧力は約１．３ｋＰａに設定し、実際の血管内部の血流及び血圧条件に近接したパラメータを確立した。
【００９７】
流体伝達を開始してから一定の時間が経過した後、下部マイクロ流路内部、すなわち培養培地内部の蛍光ビーズの数は、実施例２では６．５×１０４ビーズ／ｍｌの蛍光ビーズ数を提供し、比較例２では９．２×１０３ビーズ／ｍｌの蛍光ビーズ数を提供した。１．８１×１０６ビーズ／ｍｌで蛍光ビーズを含む生理食塩水希釈液を、実施例１及び比較例１で製造された血管モデルの上部マイクロ流路を通じて流し、生理食塩水を下部マイクロ流路を通じて流した。流体伝達速度は、５００μＬ／分に設定された。下部マイクロ流路内部の蛍光ビーズの数は、実施例１では１．７×１０５ビーズ／ｍｌの蛍光ビーズ数を提供し、比較例１では４．３×１０４ビーズ／ｍｌの蛍光ビーズ数を提供した。この試験では、多孔膜の両面に細胞層を形成すると、多孔膜の蛍光ビーズに対する透過性を低減させ、多孔膜にバリア特性を付与することを確認できた。
【００９８】
薬物であるサイトカラシンを上部マイクロ流路と下部マイクロ流路のそれぞれを通じて５０μｇ／ｍｌの濃度及び０．７μＬ／ｍｉｎの流速で１日間流すことで、実施例２及び比較例２で製造された細胞層付着血管モデルの多孔膜の両面にある細胞層を薬物に露出させた。
【００９９】
薬物露出後、上述の細胞層付着血管モデルに対する蛍光ビーズ透過性試験と同じ方法を用いて蛍光ビーズ透過性試験を実施した。流体伝達を開始してから一定の時間が経過した後、下部マイクロ流路内部、すなわち培養培地内部の蛍光ビーズの数は、実施例２では１．７×１０５ビーズ／ｍｌの蛍光ビーズ数を提供し、比較例２では６．７×１０３ビーズ／ｍｌの蛍光ビーズ数を提供した。
【０１００】
この試験では、薬物によって細胞層が損傷された後、実施例２及び比較例２の細胞層付着血管モデルにおいて、蛍光ビーズが多孔膜を通過できることを確認できた。また、比較例２の多孔膜に比べて、実施例２の多孔膜は、蛍光ビーズに対する透過性が高く、本例示的な実施態様の多孔膜は、蛍光ビーズの移動が妨げられることを抑制することを確認できた。従って、本例示的な実施態様の多孔膜は、高感度で血管モデルにおける薬物毒性の評価が可能であることが確認された。
【０１０１】
実施例３では、実施例２と同様に、細胞層付着血管モデルを多孔膜の上面に形成されたラット血管内皮細胞層と多孔膜の下面に形成されたラット平滑筋細胞層で製造した。
【０１０２】
比較例３では、比較例２と同様に、細胞層付着血管モデルを多孔膜の上面に形成されたラット血管内皮細胞層と多孔膜の下面に形成されたラット平滑筋細胞層で製造した。
【０１０３】
実施例３及び比較例３で使用した細胞は、実施例２及び比較例で使用した細胞と同じであった。細胞層を形成するために、下部マイクロ流路を、初期の細胞濃度が３×１０６細胞／ｍｌであるラット平滑筋細胞の細胞懸濁液１００μＬで播種した。培養１日後、上部マイクロ流路を細胞濃度が１×１０６細胞／ｍｌであるラット血管内皮細胞の細胞懸濁液１００μＬで播種し、６時間かけて培養した。次に、各培養培地（ラットＥＣ培地／ＳＭＣ培地）をポンプを用いて、０．７μＬ／分の流体伝達速度で各流路を通じて流した。培養２日後、実施例３及び比較例３の細胞層付着血管モデルが得られた。
【０１０４】
実施例３及び比較例３で製造された細胞層付着血管モデルの下部マイクロ流路を閉じ、トレーサーに対して１２．５μｇ／５０μｌの濃度でＦＩＴＣ−デキストラン（４６９４５、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含む培養培地希釈液を上部マイクロ流路を通じて流した。ＦＩＴＣ−デキストランを含む培養培地希釈液の流体伝達速度は７μＬ／分に設定した。
流路を通じてＦＩＴＣ−デキストランを流してから２分後、倒立顕微鏡（製品名：ＥｃｌｉｐｓｅＴｓ２、Ｎｉｋｏｎ社製）を用いてマイクロ流路での蛍光を画像化した。画像化パラメータに対して、倍率：４倍、ゲイン：１６００、及び露出時間：６０ｍｓが用いられた。これらの結果は、図８Ａ及び図８Ｂに示している。実施例３及び比較例３の両方において、下部流路で蛍光が観察されなかった。これはＦＩＴＣ−デキストランが上部流路から下部流路に浸透しなかったことを示す。この試験では、多孔膜の両面に細胞層を形成すると、ＦＩＴＣ−デキストラン透過を抑制し、多孔膜にバリア特性を付与することを確認できた。
【０１０５】
薬物であるフェノルドパムを上部マイクロ流路を通じて５００ｎｇ／ｍｌの濃度及び０．７μＬ／ｍｉｎの流速で１日間流すことで、実施例３及び比較例３で製造された細胞層付着血管モデルの多孔膜の血管内皮細胞層を薬物に露出させた。
薬物露出後、上述の細胞層付着血管モデルに対するＦＩＴＣ−デキストラン透過性試験と同じ方法を用いてＦＩＴＣ−デキストラン透過性試験を実施した。これらの結果は、図９Ａ及び図９Ｂに示した。実施例３の細胞層付着血管モデルでは、上部マイクロ流路に加えて、下部マイクロ流路を含んで広範囲にわたり蛍光が観察された。比較例３の細胞層付着血管モデルでは、下部マイクロ流路で観察された蛍光は最小限であった。この試験では、薬物によって細胞層が損傷された後、実施例３及び比較例３の両方の細胞層付着血管モデルにおけるＦＩＴＣ−デキストランが多孔膜を通過できることを確認できた。また、実施例３の多孔膜は、比較例３の多孔膜よりＦＩＴＣ−デキストランに対して透過性であったので、本例示的な実施態様の多孔膜は、ＦＩＴＣ−デキストランの移動を妨げないことを確認できた。従って、本例示的な実施態様の多孔膜は、高感度で血管モデルにおける薬物毒性の評価が可能であることが確認された。
【０１０６】
実施例４では、実施例１の血管モデルの上部及び下部流路の直線部分に１２ｍｍ×０．２ｍｍ開口を提供することで血管モデルを製造した。開口は、下部流路部材と多孔膜との間に０．２ｍｍ幅のスリットが形成されたポリプロピレン補強部材を挿入することで形成された。補強部材は１００μｍの厚さを有する。図１０Ａ及び図１０Ｂは、実施例４の多孔膜の顕微鏡写真を示す。
【０１０７】
実施例５では、実施例１の血管モデルの多孔膜に６０℃で１５分間コラーゲン（５００５−１００ＭＬ、ＡｄｖａｎｃｅｄＢｉｏＭａｔｒｉｘ社製）を噴霧した後、コラーゲンを乾燥させて厚いコーティングを形成し、その後、多孔膜の上面にラット血管内皮細胞層を形成し、多孔膜の下面にラット平滑筋細胞層を形成することで、細胞層付着血管モデルを製造した。図１１は実施例５の多孔膜の顕微鏡写真を示す。
【０１０８】
実施例６では、実施例４の血管モデルを取り、多孔膜の上面にラット血管内皮細胞層を形成することで、単一の細胞層が付着した血管モデルを製造した。
【０１０９】
トレーサーに対して１．８１×１０６ビーズ／ｍｌ濃度の蛍光ビーズを含む培養培地希釈液を、実施例６で製造された単一の細胞層付着血管モデルの上部マイクロ流路を通じて流し、蛍光ビーズを含まない培養培地を下部マイクロ流路を通じて流した。蛍光ビーズは直径が４ｕｍであり、励起波長が５８０ｎｍであり、蛍光波長が６０５ｎｍである赤色蛍光染料に標識された。蛍光ビーズを含む培養培地希釈液及び蛍光ビーズを含まない培養培地の流体伝達速度は５００μＬ／分に設定し、上部マイクロ流路の内部圧力は約８．７ｋＰａに設定し、下部マイクロ流路の内部圧力は約１．３ｋＰａに設定し、実際の血管内部の血流及び血圧条件に近接したパラメータを確立した。
【０１１０】
流体伝達を開始してから一定の時間が経過した後、下部マイクロ流路内部、すなわち培養培地内部の蛍光ビーズの数は、実施例６で２．６７×１０４ビーズ／ｍｌの蛍光ビーズ数を提供した。実施例４の血管モデルの上部流路を通じて１．８１×１０６ビーズ／ｍｌの蛍光ビーズを含む生理食塩水希釈液を流すこと、及び５００μＬ／分の流体伝達速度で下部流路を通じて生理食塩水を流すことは、実施例４で７．２３×１０５ビーズ／ｍｌの蛍光ビーズ数を提供した。この試験では、多孔膜の単一の面に細胞層を形成すると、多孔膜の蛍光ビーズに対する透過性を低減させ、多孔膜にバリア特性を付与することを確認できた。
【０１１１】
実施例７では、実施例１の血管モデルを取り、多孔膜の上面に誘導多能性幹細胞由来のヒト血管内皮細胞層を形成し、多孔膜の下面にヒト間葉系幹細胞を形成することで、細胞層付着血管モデルを生成した。
【０１１２】
実施例８では、複数の貫通孔の開口がハニカム状に配列されて貫通孔が連通孔を通じて連通される、上記の例示的な実施態様の多孔膜２８と同様にポリカーボネートで形成された多孔膜が用いられた。実施例８の多孔膜の開口の平均開口直径は３μｍであり、開口の開口率は５２％であり、多孔膜の膜厚は１．２μｍであり、開口の開口直径の変動係数は５．０％であり、多孔膜の空隙率は８０％であった。
【０１１３】
実施例９では、実施例８の血管モデルを取り、多孔膜の上面にラット血管内皮細胞を形成し、多孔膜の下面にラット平滑筋細胞を形成することで、細胞層付着血管モデルを製造した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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