(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：１〜４からなる群より選択され、ＨＬＡ−Ａ２亜型に特異的な細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ)により認識されることを特徴とする、ポロ様キナーゼ１（Ｐｏｌｏ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ−１；ＰＬＫ１）の抗原決定基。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞毒性Ｔリンパ球により認識されるポロ様キナーゼ１の抗原決定基を含むことを特徴とする、腫瘍の予防又は治療用組成物。
【請求項３】
腫瘍は、悪性黒色腫、リンパ種、大膓癌、神経膠腫、腎臓癌、卵巣癌、乳房癌、膠芽腫、白血病及び子宮頸部癌からなる群より選択されることを特徴とする、請求項２に記載の腫瘍の予防又は治療用組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の細胞毒性Ｔリンパ球により認識されるポロ様キナーゼ１の抗原決定基；及びＭＨＣクラスＩ抗原又はＩＩ抗原の複合体が表面に提示されたことを特徴とする、抗原提示細胞。
【請求項５】
抗原提示細胞は、樹状細胞、単核細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｂ細胞及びγδＴ（ｇａｍｍａ  ｄｅｌｔａ  Ｔ）細胞からなった群より選択された一つ以上であることを特徴とする、請求項４に記載の抗原提示細胞。
【請求項６】
ＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｂ細胞及びγδＴ細胞は、未経験（ｎａｉｖｅ）状態、活性化状態又は増幅（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）された状態であることを特徴とする、請求項５に記載の抗原提示細胞。
【請求項７】
抗原提示細胞は、細胞毒性Ｔリンパ球により認識されるポロ様キナーゼ１の抗原決定基をコーディングする核酸を抗原提示細胞に導入して製造されたものであることを特徴とする、請求項４に記載の抗原提示細胞。
【請求項８】
核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであることを特徴とする、請求項７に記載の抗原提示細胞。
【請求項９】
請求項４に記載の抗原提示細胞を含むことを特徴とする、腫瘍の予防又は治療用組成物。
【請求項１０】
請求項４に記載の抗原提示細胞に提示される請求項１に記載の細胞毒性Ｔリンパ球により認識されるポロ様キナーゼ１の抗原決定基；及びＭＨＣクラスＩ抗原又はＩＩ抗原の複合体を特異的に認識することを特徴とする、細胞毒性Ｔリンパ球。
【請求項１１】
細胞毒性Ｔリンパ球は、ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞を含むことを特徴とする、請求項１０に記載の細胞毒性Ｔリンパ球。
【請求項１２】
請求項１０に記載の細胞毒性Ｔリンパ球を含むことを特徴とする、腫瘍の予防又は治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＬＫ１タンパク質に対する抗原に特異的なＴ細胞の免疫反応を誘導するＨＬＡ−Ａ＊０２０１亜型に特異的なＰＬＫ１由来の抗原決定基に関する。
【背景技術】
【０００２】
全ての抗原に対するＴ細胞の免疫反応は、抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ、ＡＰＣ）の抗原処理過程によって抗原由来のペプチド断片（抗原決定基；ｅｐｉｔｏｐｅ）と主要組織適合性複合体（ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ；ＭＨＣ）が結合された後、抗原提示細胞の表面に提示されるＭＨＣ／ペプチド抗原複合体をＴ細胞が認識して活性化しながら始まる。
【０００３】
抗原に特異的に反応するＴ細胞は、多様なサイトカインを分泌してまた他の免疫反応を活性化するか、ＭＨＣ／ペプチド抗原複合体を提示する標的細胞を認識して殺害する細胞毒性機能を有するキラーＴ細胞に分化される。
【０００４】
このようなＴ細胞の免疫反応を誘導する最小限の抗原由来のペプチド断片を抗原決定基といい、抗原決定基とＭＨＣ分子との結合親和力によってＴ細胞の活性化程度が変わる。ＭＨＣ分子は、ヒトごとに多様な亜型が存在し、一つの抗原決定基に対してＭＨＣ分子は多様な結合親和力を有することができ、特定のペプチドは、多くの他のＭＨＣ亜型に結合されて細胞表面に提示されることが報告されている。
【０００５】
細胞毒性機能を有するキラーＴ細胞に分化されるＣＤ８＋Ｔ細胞の抗原認識は、ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ―Ｉ遺伝子の多様な対立遺伝子亜型により調節されるので、効率性が高い抗腫瘍免疫反応を誘導する腫瘍ワクチン又はＴ細胞免疫治療法の開発に用いるための候補物質の同定は多数のヒトに存在しているＭＨＣ  ｃｌａｓｓ−Ｉ亜型に反応する抗原決定基の糾明が必須に行われなければならない。ヒトに発現するＭＨＣ分子は、ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＬＡ）であって、最も多く発現／存在するＨＬＡ亜型は、ＨＬＡ−Ａ２亜型であり、その中でＨＬＡ−Ａ＊０２０１に対する研究が最も活発に進行されている。
【０００６】
ポロ様キナーゼ１（Ｐｏｌｏ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ−１；ＰＬＫ１）は、多様な細胞分裂プロセスを調節する必須的な類似分裂キナーゼであって、肺癌、乳房癌、甲状腺癌、大腸及び直膓癌、前立腺癌、卵巣癌などを含んだ固形癌で正常組織に比べて高く発現されることが報告されており、ＰＬＫ１タンパク質による標的タンパク質のリン酸化を抑制することで腫瘍細胞の死滅を誘導することができることが明かされた以後、臨床１、２、３相を通じてＰＬＫ１抑制剤が抗癌剤として普遍化される段階である。さらに、ＰＬＫ１タンパク質が腫瘍細胞で過発現されて腫瘍に特異的なＴ細胞の免疫反応を誘導する腫瘍標的抗原に用いられることが報告されている。
しかし、ＰＬＫ１タンパク質に対する特異的な抗原特異的なＴ細胞の免疫反応を誘導するＨＬＡ−Ａ２に特異的なＰＬＫ１の抗原決定基はまだ報告されたことがない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】US 2017-0037093 A1
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、ＰＬＫ１タンパク質に対する抗原特異的なＴ細胞の免疫反応を誘導するＨＬＡ−Ａ２亜型に特異的なＰＬＫ１由来の抗原決定基を提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的は、前記ＰＬＫ１由来の抗原決定基の薬剤学的用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記目的を達成するために、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：１〜４からなる群より選択され、ＨＬＡ−Ａ２亜型に特異的な細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）により認識されるポロ様キナーゼ１（Ｐｏｌｏ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ−１；ＰＬＫ１）の抗原決定基を提供する。
【００１１】
また、本発明は、細胞毒性Ｔリンパ球により認識されるポロ様キナーゼ１の抗原決定基を含む腫瘍の予防又は治療用組成物を提供する。
【００１２】
また、本発明は、有効量の細胞毒性Ｔリンパ球により認識されるポロ様キナーゼ１の抗原決定基を含む腫瘍の予防又は治療用組成物をこれを必要とする対象体に投与することを含む腫瘍治療方法を提供する。
【００１３】
また、本発明は、前記細胞毒性Ｔリンパ球により認識されるポロ様キナーゼ１の抗原決定基；及びＭＨＣクラスＩ抗原又はＩＩ抗原の複合体が表面に提示された抗原提示細胞を提供する。
【００１４】
また、本発明は、前記抗原提示細胞を含む腫瘍の予防又は治療用組成物を提供する。
【００１５】
また、本発明は、有効量の前記抗原提示細胞を含む腫瘍の予防又は治療用組成物をこれを必要とする対象体に投与する段階を含む腫瘍治療方法を提供する。
【００１６】
また、本発明は、前記抗原提示細胞に提示される上記の細胞毒性Ｔリンパ球により認識されるポロ様キナーゼ１の抗原決定基；及びＭＨＣクラスＩ抗原又はＩＩ抗原の複合体を特異的に認識する細胞毒性Ｔリンパ球を提供する。
【００１７】
また、本発明は、前記細胞毒性Ｔリンパ球を含む腫瘍の予防又は治療用組成物を提供する。
【００１８】
また、本発明は、有効量の前記細胞毒性Ｔリンパ球を含む腫瘍の予防又は治療用組成物をこれを必要とする対象体に投与する段階を含む腫瘍治療方法を提供する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明は、ＰＬＫ１タンパク質に対する抗原特異的なＴ細胞の免疫反応を誘導するＨＬＡ−Ａ２亜型に特異的なＰＬＫ１由来の抗原決定基を提供する効果がある。前記ＰＬＫ１由来の抗原決定基は、ＰＬＫ１を特異的に発現する癌の予防又は治療に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、野生型ＰＬＫ１抗原決定基と組換えのために最適化されたＰＬＫ１抗原決定基の配列（上段）、及び多数のＰＬＫ１の抗原決定基で構成された組換えＤＮＡが挿入された発現ベクター（下段）を示す。
【図２ａ】図２の（ａ）及び（ｂ）は、多数の野生型ＰＬＫ１抗原決定基で構成された組換えＤＮＡ（図２の（ａ））と、組換えのために最適化された多数のＰＬＫ１抗原決定基で構成された組換えＤＮＡ（図２の（ｂ））をＨＬＡ−Ａ２形質転換マウスに電気穿孔後に脾臓で現われる免疫反応を確認したＥｌｉＳｐｏｔ結果を示す。
【図２ｂ】図２の（ａ）及び（ｂ）は、多数の野生型ＰＬＫ１抗原決定基で構成された組換えＤＮＡ（図２の（ａ））と、組換えのために最適化された多数のＰＬＫ１抗原決定基で構成された組換えＤＮＡ（図２の（ｂ））をＨＬＡ−Ａ２形質転換マウスに電気穿孔後に脾臓で現われる免疫反応を確認したＥｌｉＳｐｏｔ結果を示す。
【図３】図３は、ＨＬＡ−Ａ２に特異的なＰＬＫ１由来の抗原決定基候補のうちＰＬＫ１１２３（ＳＤＦＶＦＶＶＬＥＬ）、ＰＬＫ１４７７（ＴＬＬＫＹＦＲＮＹＭ）、ＰＬＫ１５４１／２１（ＬＩＬＣＰＬＭＡＡＶ）のＣＤ８＋Ｔ細胞の免疫反応をＣＤ１０７ａ／ｂを通じて確認した柔細胞分析結果を示す。
【図４ａ】図４の（ａ）〜（ｃ）は、ＨＬＡ−Ａ２に特異的なＰＬＫ１由来の抗原決定基候補のうちＰＬＫ１１２３（ＳＤＦＶＦＶＶＬＥＬ）（図４の（ａ））、ＰＬＫ１４７７（ＴＬＬＫＹＦＲＮＹＭ）（図４の（ｂ））、ＰＬＫ１５４１／２１（ＬＩＬＣＰＬＭＡＡＶ）（図４の（ｃ））を樹状細胞ワクチン及びペプチド基盤ワクチン戦略でＨＬＡ−Ａ２形質転換マウスに免疫注入して現われる免疫反応を確認したＥｌｉＳｐｏｔ結果を示す。
【図４ｂ】図４の（ａ）〜（ｃ）は、ＨＬＡ−Ａ２に特異的なＰＬＫ１由来の抗原決定基候補のうちＰＬＫ１１２３（ＳＤＦＶＦＶＶＬＥＬ）（図４の（ａ））、ＰＬＫ１４７７（ＴＬＬＫＹＦＲＮＹＭ）（図４の（ｂ））、ＰＬＫ１５４１／２１（ＬＩＬＣＰＬＭＡＡＶ）（図４の（ｃ））を樹状細胞ワクチン及びペプチド基盤ワクチン戦略でＨＬＡ−Ａ２形質転換マウスに免疫注入して現われる免疫反応を確認したＥｌｉＳｐｏｔ結果を示す。
【図４ｃ】図４の（ａ）〜（ｃ）は、ＨＬＡ−Ａ２に特異的なＰＬＫ１由来の抗原決定基候補のうちＰＬＫ１１２３（ＳＤＦＶＦＶＶＬＥＬ）（図４の（ａ））、ＰＬＫ１４７７（ＴＬＬＫＹＦＲＮＹＭ）（図４の（ｂ））、ＰＬＫ１５４１／２１（ＬＩＬＣＰＬＭＡＡＶ）（図４の（ｃ））を樹状細胞ワクチン及びペプチド基盤ワクチン戦略でＨＬＡ−Ａ２形質転換マウスに免疫注入して現われる免疫反応を確認したＥｌｉＳｐｏｔ結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明者らは、ＨＬＡ−Ａ２主要組織適合性複合体を発現する形質転換マウス（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｏｕｓｅ）を用いてＰＬＫ１タンパク質に対する抗原特異的なＴ細胞免疫反応を誘導するＨＬＡ−Ａ＊０２０１亜型に特異的なＰＬＫ１由来の抗原決定基を糾明し、糾明されたＰＬＫ１由来の抗原決定基を用いて誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞のＨＬＡ−Ａ２陽性腫瘍に対して特異的に認識できることを確認することで、本発明を完成した。
【００２２】
したがって、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ  ＮＯＳ：１〜４からなる群より選択され、ＨＬＡ−Ａ２亜型に特異的な細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）により認識されるポロ様キナーゼ１（Ｐｏｌｏ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ−１；ＰＬＫ１）の抗原決定基を提供する。
【００２３】
本発明で用いられた用語「抗原決定基（ｅｐｉｔｏｐｅ）」は、ＨＬＡ−Ａ２亜型を表現する個体でＣＤ８＋Ｔ細胞の免疫反応を誘導するＣＴＬのペプチド抗原決定基を意味する。本発明は、ヒト又はマウスのＰＬＫ１で生物情報学プログラムを用いてＨＬＡ−Ａ＊０２０１と結合親和力が高いと予想されるＰＬＫ１のペプチド２８個を選定した。前記２８個の抗原決定基ペプチドは、それぞれ約９〜１０個のアミノ酸からなっている。前記結合親和力とは、「抗原決定基が抗原提示細胞表面上にある主要組織適合性複合体と結合する程度」を意味し、結合親和力が高いほどＴ細胞の活性化が効率的であると知られている。
【００２４】
本発明で用語「ＭＨＣ（Ｍａｊｏｒ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ）」は、抗原提示細胞が外部抗原をＴ細胞に示すとき外部抗原とともにＴ細胞収容体と結合することでＴ細胞分化を誘導する高度の多形性（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）を有する部位であって、臓器移植時に組織適合性を決定する重要な細胞表面分子である。ＭＨＣクラスＩ免疫反応は、腫瘍抗原に対する免疫反応でＭＨＣクラスＩ経路を経た抗原提示細胞が提示した抗原決定基により刺激されたＣＤ８＋Ｔ細胞が行う反応を意味することで、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＩＦＮ−γ分泌と細胞毒性の二つの機能を行う。
【００２５】
本発明で用語「ＨＬＡ（ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）」は、ヒトのＭＨＣであって、ヒトの白血球表面から発現される。ＨＬＡ−Ａ２の上位類型は、最も頻繁なＨＬＡのうち一つであって、東洋人と西洋人からいずれも４０〜５０％程度が発現され、Ａ＊０２０１、Ａ＊０２０２、Ａ＊０２０３、Ａ＊０２０４、Ａ＊０２０５、Ａ＊０２０６、Ａ＊０２０７、Ａ＊６８０２、Ａ＊６９０１などの亜型を含む。本発明では、ＨＬＡ−Ａ２亜型のヒトで存在するＭＨＣに反応するＰＬＫ１の抗原決定基ペプチドを選別した。
【００２６】
したがって、本発明のＰＬＫ１の抗原決定基は、ＣＴＬにより認識されるＨＬＡ−Ａ２亜型、より具体的に、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１亜型に特異的なペプチドであって、マウス又はヒトに由来したＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：１（ＰＬＫ１１２３）、２（ＰＬＫ１４７７）、３（ＰＬＫ１５４１  ２１）及び４（ＰＬＫ１５４２）に記載されたアミノ酸配列であってもよい。
【００２７】
また、本発明は、前記細胞毒性Ｔリンパ球により認識されるポロ様キナーゼ１の抗原決定基を含む腫瘍の予防又は治療用組成物を提供する。
【００２８】
本発明のＰＬＫ１の抗原決定基を有効成分で含む医薬は、例えば、本発明のＰＬＫ１の抗原決定基を単独又は細胞運搬体を用いて腫瘍患者などに投与することで腫瘍の予防、再発抑制（ｒｅｌａｐｓｅ）又は治療することができる。本発明のＰＬＫ１の抗原決定基が抗原提示細胞内でＭＨＣクラスＩ抗原又はＩＩ抗原と結合して細胞表面に高密度に提示されることで、腫瘍に特異的なＣＴＬが体内で効率的に増殖されるようになり、これによって、腫瘍の予防、再発抑制（ｒｅｌａｐｓｅ）又は治療が達成される。
【００２９】
前記腫瘍は、ＰＬＫ１を過発現するもので、例えば、悪性黒色腫、リンパ種、大膓癌、神経膠腫、腎臓癌、卵巣癌、乳房癌、膠芽腫、白血病及び子宮頸部癌を含むことが好ましいが、これに制限されない。
【００３０】
本発明の組成物は、ＰＬＫ１の抗原決定基とともに細胞性免疫が効果的に成立されるように免疫補強剤（又はアジュバント）と投与するか、粒子状の剤型にして投与することができる。
【００３１】
前記アジュバントは、 免疫細胞の初期活性化過程で非特異的に抗原に対する免疫反応を促進する物質であって、宿主に免疫原ではないが免疫系の細胞の活性を増大させることで免疫を強化する製剤、分子などを意味する（Ｗａｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ.,  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４：３６９、１９８６）。本発明の組成物とともに投与されて免疫反応を増強させ得るアジュバントは、任意の多様なアジュバントを含み、典型的なアジュバントとしては、フロイントアジュバント（（Ｆｒｅｕｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ）、アルミニウム複塩化合物（ａｌｕｍ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）、ムラミルジペプチド（ｍｕｒａｍｙｌ  ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ）、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）、モノホスホリルリピドＡ又はクイルＡなどが知られている。前記アジュバントは、腫瘍予防用組成物(ワクチン)と同時に投与されるか時間間隔を置いて順次に投与されてもよい。
【００３２】
また、本発明は、有効量の細胞毒性Ｔリンパ球により認識されるポロ様キナーゼ１の抗原決定基を含む腫瘍の予防又は治療用組成物を対象体に投与することを含む腫瘍治療方法を提供する。
【００３３】
前記対象体は、犬、猫、ラット、マウス、ヒトなどの哺乳動物であってもよいが、これに制限しない。
【００３４】
また、本発明は、前記細胞毒性Ｔリンパ球により認識されるポロ様キナーゼ１の抗原決定基；及びＭＨＣクラスＩ抗原又はＩＩ抗原の複合体が表面に提示された抗原提示細胞に関する。
【００３５】
前記抗原提示細胞は、樹状細胞、単核細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｂ細胞及びγδＴ（ｇａｍｍａ  ｄｅｌｔａ  Ｔ）細胞からなった群より選択された一つ以上であってもよく、前記ＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｂ細胞及びγδＴ細胞は、未経験（ｎａｉｖｅ）状態、活性化状態又は増幅（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）された状態であることが好ましいが、これに制限されない。
【００３６】
前記抗原提示細胞は、ＣＴＬにより認識されるＰＬＫ１の抗原決定基をコーディングする核酸を抗原提示細胞に導入して製造され得る。
【００３７】
前記核酸は、最も広義的な意味で用いられ、一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ、二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、（−）−ＲＮＡ、（＋）−ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡなどを包括する。
【００３８】
本発明の核酸を抗原提示細胞内に導入する方法でベクターによる方法を用いることができるが、これに制限されない。
【００３９】
本発明で用語「ベクター」は、自分に連結された他の核酸を運ぶことができる核酸分子を意味する。ベクターの一つの類型で「プラスミド」があるが、プラスミドとは、追加のＤＮＡ分節を結紮させ得る円形の二本鎖ＤＮＡループを意味する。ベクターのまた他の類型としては、追加的なＤＮＡ分節をウイルスゲノムで結紮させ得るウイルスベクターがある。一部のベクターは、宿主細胞に導入されるときこの宿主細胞内で自己複製できる（例えば、バクテリア複製基点を有するバクテリアベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入されるとき宿主細胞のゲノムに統合され、宿主ゲノムと一緒に複製され得る。また、一部のベクターは、これらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示することができる。本明細書でこのようなベクターを「組換え発現ベクター（又は、簡単に「発現ベクター」）」と言う。一般的に、組換えＤＮＡ技法に有用な発現ベクターは、大抵プラスミドの形態としてプラスミドが最も一般的に用いられるベクター類型であるため、「プラスミド」と「ベクター」は、互いに交換して用いられ得る。しかし、本発明は、同等な機能を提供するウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター）のような他の形態の発現ベクターも含む。好ましくは、レンチウイルスベクターを用いることができる。形質転換は、核酸を有機体、細胞、組織又は機関に導入するいかなる方法も含まれ、当分野で公知されたように宿主細胞によって適合な標準技術を選択して行うことができる。このような方法には、電気穿孔（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、原形質融合、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈澱、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈澱、シリコンカーバイド纎維を用いた撹拌、アグロバクテリアが媒介された形質転換、ＰＥＧ、デキストランスルフェート、リポフェクタミンなどが含まれるが、これに制限されない。
【００４０】
また、本発明は、前記抗原提示細胞を含む腫瘍の予防又は治療用組成物に関する。
【００４１】
また、本発明は、有効量の前記抗原提示細胞を含む腫瘍の予防又は治療用組成物を対象体に投与する段階を含む腫瘍治療方法を提供する。
【００４２】
前記抗原提示細胞は、ワクチン又は免疫治療剤で用いられ得る。
【００４３】
前記ワクチン（又は免疫原性組成物）は、動物に接種するとき抗癌免疫又は癌抑制を誘導する物質を示し、本発明のＰＬＫ１の抗原決定基は、ＰＬＫ１を発現する癌細胞に強くて特異的な免疫反応を誘導することができ、ＰＬＫ１を発現する癌は、悪性黒色腫、リンパ種、大膓癌、神経膠腫、腎臓癌、卵巣癌、乳房癌、膠芽腫、白血病及び子宮頸部癌 などを含むが、これに制限しない。
【００４４】
前記免疫治療剤は、免疫反応を増加させるか、腫瘍の治療又は予防に好ましい免疫反応の一部を選択的に上昇させ得る。本発明の抗原提示細胞は、細胞内に導入されてＰＬＫ１の抗原決定基を発現すると、ＰＬＫ１の抗原決定基が抗原提示細胞内でＭＨＣクラスＩ抗原又はＩＩ抗原と結合して細胞表面に高密度で提示されることで、腫瘍に特異的なＣＴＬｓが体内で効率的に増殖するようになり、これによって、ＰＬＫ１を発現する腫瘍の予防、再発抑制（ｒｅｌａｐｓｅ）又は治療が達成される。
【００４５】
また、本発明は、前記抗原提示細胞に提示される上記の細胞毒性Ｔリンパ球により認識されるポロ様キナーゼ１の抗原決定基；及びＭＨＣクラスＩ抗原又はＩＩ抗原の複合体を特異的に認識する細胞毒性Ｔリンパ球に関する。
【００４６】
前記ＣＴＬは、抗原提示細胞に提示されるＰＬＫ１の抗原決定基／ＭＨＣクラスＩ抗原又はＩＩ抗原の複合体を特異的に認識するＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞を含むことが好ましいが、これに制限されない。
【００４７】
前記ＣＴＬは、試験管内で誘導されたものであって、試験管内ＣＴＬと、抗原特異的方式でＣＴＬを活性化させるに十分な時間の間適合な抗原提示細胞の表面で発現されたＰＬＫ１の抗原決定基がローディングされたヒト類型Ｉ又はＩＩのＭＨＣ分子を接触させることを含む。または、自己組織腫瘍浸潤リンパ球を用いてＣＴＬを生成するか；自己末梢血液リンパ球を用いてＣＴＬを製造するか；ＰＬＫ１の抗原決定基を樹状細胞にパルスして用いるか組換えウイルスを用いて感染させることで自己ＣＴＬを生成するか；ＰＬＫ１の抗原決定基とともにパルスされるか組換えウイルスにより感染された大食細胞を自己ＣＴＬの製造に用いるか；又は人工抗原提示細胞を用いて試験管内Ｔ細胞の感作を通じて製造する方法を用いることができるが、これに制限するものではない。
【００４８】
前記ＣＴＬの誘導は、ＰＬＫ１の抗原決定基を抗原提示細胞によりＴ細胞に提示してＣＴＬ誘導を検出することで評価することができる。また、抗原提示細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、マクロファージ、好酸球（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ）及びＮＫ細胞を活性化する効果を有する。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、また抗癌免疫において重要であるので、ＰＬＫ１の抗原決定基の抗癌免疫誘導作用は前記細胞の活性化効果を指標で用いて評価することができる。
【００４９】
また、本発明は、前記細胞毒性Ｔリンパ球を含む腫瘍の予防又は治療用組成物に関する。
【００５０】
また、本発明は、有効量の前記細胞毒性Ｔリンパ球を含む腫瘍の予防又は治療用組成物を対象体に投与する段階を含む腫瘍治療方法を提供する。
【００５１】
前記ＰＬＫ１の抗原決定基により活性化されたＣＴＬは、腫瘍治療に有用である。
【００５２】
前記活性化されたＣＴＬは、ＰＬＫ１を非正常的に発現する細胞を選択的に認識する。好ましくは、ＣＴＬは、ＴＣＲを通じてＨＬＡ／ペプチド複合体と相互作用（例えば、結合）することで細胞を認識する。患者においてＣＴＬは、ＰＬＫ１を非正常的に発現する標的細胞を死滅させる方法に有用である。患者は、効果的な数の活性化されたＣＴＬの投与を受ける。患者に投与されたＣＴＬは、患者に由来するか活性化され得る（すなわち、これは自己ＣＴＬである。）。または、ＣＴＬは、患者ではない他の個体に由来する。勿論、好ましくは、供与者は元気な個体である。ここで、「元気な個体」とは、個体が一般的に良好な健康状態を有しており、好ましくは、適格免疫系を有し、より好ましくは、容易に試験されるか検出されるいかなる疾病も有しないことを意味する。
【００５３】
ここで「非正常的に発現される」とは、ＰＬＫ１の発現が正常レベルに比べて過発現されるか、遺伝子が腫瘍に由来する組織では沈黙的であるが、腫瘍では発現されることを意味する。「過発現」とは、ＰＬＫ１が正常組織に存在するレベルの１．２倍以上に存在することを意味し、より好ましくは、少なくとも２倍、さらに好ましくは、少なくとも５倍又は１０倍で正常組織に存在することを意味する。
【００５４】
生体内で、本発明のＣＴＬに対する標的細胞は、腫瘍の細胞（これはたびたびＭＨＣ類型ＩＩを発現する）及び／又は腫瘍を取り囲んでいるマトリックス細胞である（腫瘍細胞）（また、たびたびＭＨＣ類型ＩＩを発現する）。
【００５５】
したがって、本発明のＣＴＬは、治療組成物において活性成分として用いられ得る。
【００５６】
ＣＴＬの入養伝達方法は公知の方法を用いることができ、特別に制限しない。
【００５７】
本発明の腫瘍の予防又は治療用組成物は、試験管内、生体内又は生体外で診断的又は治療的用途に適合な組成物を成す活性成分及び活性又は無活性の薬学的に許容可能な担体を含むことができる。
【００５８】
前記薬学的に許容可能な担体は、リン酸緩衝化された塩水溶液、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの血清アルブミン、組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）、ゼラチン、カゼインなどを含むタンパク質賦形剤のように、Ｔ細胞と混用可能な任意の薬学的担体を含む。
【００５９】
担体、安定化剤及び補強剤の例は、Ｍａｒｔｉｎ  ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ'Ｓ  ＰＨＡＲＭ．ＳＣＩ、１８ｔｈ  Ｅｄ．（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ（１９９５））及びｔｈｅ「ＰＨＹＳＩＣＩＡＮ'Ｓ  ＤＥＳＫ  ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ」、５８ｎｄ  Ｅｄ．、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ、Ｍｏｎｔｖａｌｅ、ＮＪ．（２００４）を参照する。用語「担体」は、緩衝液又はｐＨ調整剤を含むことができ、典型的に緩衝液は、有機酸又は塩基から製造された塩である。代表的な緩衝液としては、クエン酸の塩、アスコルビン酸の塩、グルコン酸の塩、炭素酸の塩、酒石酸の塩、コハク酸の塩、酢酸の塩又はフタル酸の塩などの有機酸塩；トリス、トロメタミンヒドロクロライド又はホスフェート緩衝液を含む。追加的な担体として、ポリビニルピロリドン、フィコール（ポリマー糖）、デキストレート（例えば、シクロデキストリン、例えば、２−ヒドロキシプロピル−クワドラチャ（ｑｕａｄｒａｔｕｒｅ）−シクロデキストリン）、ポリエチレングリコール、抗酸化剤、帯電防止剤、界面活性剤（例えば、「ＴＷＥＥＮ ２０」及び「ＴＷＥＥＮ ８０」などのポリソルベート）、脂質（例えば、リン脂質、脂肪酸）、ステロイド（例えば、コレステロール）及びキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）などのポリマー性賦形剤／添加剤を含む。氷結防止剤又は降下剤も含まれ得る。
【００６０】
本発明の腫瘍の予防又は治療用組成物は、多様な適正剤型で製造され得る。例えば、腫瘍内、動脈内（関節で）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、結節内（ｉｎｔｒａｎｏｄａｌ）及び皮下経路のような非経口投与に適合な剤型と担体は、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤及び剤型を目的とする受容者の血液と等張で作る溶質及び、懸濁剤、溶解剤、増粘剤、安定化剤及び防腐剤を含むことができる水性及び非水性の滅菌懸濁液を含む。
【００６１】
静脈内又は腹腔投与が本発明の腫瘍の予防又は治療用組成物の投与に好ましい方法である。個体に投与された細胞の投与量は、時間の経過によって個体で目的とする有益な治療的反応を達成するために有効な量、又は癌細胞の成長抑制に有効な量又は感染の抑制に有効な量である。例えば、注入前に個体から血液試料を収得した後に保管して後続的な分析及び比較に用いる方式で実施され得る。一般的に、少なくとも約１×１０４〜１×１０６及び典型的に１×１０８〜１×１０１０個の細胞を７０ｋｇの患者に約６０分〜１２０分にわたって静脈内又は腹腔内に注入することができる。投与の場合、個体の全般的健康状態及び体重を考慮しながら、本発明の細胞を細胞の類型によるＬＤ−５０（又はその他毒性測定方法）及び多様な濃度での細胞の類型による副作用により決定された割合で投与する。投与は、一回投与するか又は多くの回分けて投与することができる。本発明の腫瘍の予防又は治療用組成物は、細胞毒性剤、ヌクレオチド類似体及び生物学的反応変形剤を含む公知された通常の治療法を用いて他の特定症状に対する治療を補うことができる。類似に、生物学的反応変形剤が本発明の腫瘍の予防又は治療用組成物による治療に選択的に追加され得る。
【００６２】
以下、本発明を実施例により詳しく説明する。ただし、下記実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容が下記実施例によって限定されるものではない。
【００６３】
（発明の実施のための形態）
＜実施例１＞ＰＬＫ１タンパク質に対する抗原特異的Ｔ細胞免疫反応を誘導するＨＬＡ−Ａ＊０２０１亜型特異的ＰＬＫ１由来の抗原決定基の選別
生物情報学−基盤プログラム（Ｉｍｍｕｎｅ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｄａｔａｂａｓ  ＆ａｎａｌｙｓｉｓ  ｒｅｓｏｕｃｅ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｆ）を用いてＰＬＫ１由来のＨＬＡ−Ａ２亜型特異的抗原決定基ペプチドを予測し、下記表１のように２８個を合成した。
【００６４】
【表１】
0006871432.tif 000002
【００６５】
多数抗原決定基（ｍｕｌｔｉ−ｅｐｉｔｏｐｅｓ）に特異的なＴ細胞免疫反応を誘導するＤＮＡ基盤ワクチン戦略を用いるために、予測されたＰＬＫ１由来のＨＬＡ−Ａ２多数抗原決定基のアミノ酸配列をゴルジ体のタンパク質分解酵素に敏感なｆｕｒｉｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｌｉｎｋｅｒ（ＳＧＳＧ）アミノ酸で連結してｐＣＩ発現ベクターにクローニングした（図１参照）。
【００６６】
組換えＤＮＡ、ＰＬＫＷＴとＰＬＫＯＰＴ、これらをＨＬＡ−Ａ２形質転換マウスにＥｌｅｔｒｏ  ｓｑｕｅｒｅ  ｐｏｒａｔｏｒ  ｄｅｖｉｃｅ（ＥＣＭ８３０；ＢＴＸ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ．）を用いて９５Ｖ（４×６５  ｍｓ  ｐｕｌｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｐｏｌｉｎｇ）で生体電気衝撃療法を施行した。これを７日間隔で３回進行した後、マウス脾臓のＣＤ８＋Ｔ細胞を分離した。ＨＬＡ−Ａ２分子を発現するＴ２細胞株にそれぞれの予測された抗原決定基ペプチドで感作して標的細胞として用いてＩＦＮ−γ  ＥｌｉＳｐｏｔを行った。
【００６７】
図２の（ａ）、（ｂ）に示したように、各抗原決定基ペプチドで感作されたＴ２細胞株に対するＣＤ８＋Ｔ細胞活性化によるＩＦＮ−γ生産能がＰＬＫ１由来のＰＬＫ１１２３（ＮＤＦＶＦＶＶＬＥＬ）、ＰＬＫ１４７７（ＴＬＬＫＹＦＲＮＹＭ）、ＰＬＫ１５４１ ２Ｉ（ＬＩＬＣＰＬＭＡＡＶ）とＰＬＫ１５４２（ＩＬＣＰＬＭＡＡＶ）ペプチドで感作した場合、高く示すことを観察した。
【００６８】
前記配列のペプチドがＨＬＡ−Ａ２に特異的な主要抗原決定基（Ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ）であることを確認した。
【００６９】
次に、前記ＨＬＡ−Ａ２形質転換マウスで、多数抗原決定基（Ｍｕｌｔｉ−ｅｐｉｔｏｐｅｓ）ＤＮＡ基盤ワクチン実験で主要抗原決定基で確認されたＨＬＡ−Ａ２結合ＰＬＫ１１２３（ＮＤＦＶＦＶＶＬＥＬ）、ＰＬＫ１４７７（ＴＬＬＫＹＦＲＮＹＭ）、ＰＬＫ１５４１（ＬＩＬＣＰＬＭＡＡＶ）ペプチドを選択し、ＨＬＡ−Ａ２形質転換マウスで樹状細胞ワクチン及びペプチド基盤のＴｒｉＶａｘワクチン（ＣＤ４０抗体／Ｐｏｌｙ−ＩＣ／抗原決定基）戦略で免疫注入した。これを通じて、各抗原決定基ペプチドに対する免疫反応を誘導した後に脾臓のＴ細胞を収得し、それぞれＰＬＫ１抗原と培養した後、ＩＦＮ−γとＣＤ１０７ａ／ｂを発現するＣＤ８＋Ｔ細胞をフローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いて確認した。
【００７０】
図３に示したように、ＰＬＫ１１２３抗原のペプチドで免疫注入したＨＬＡ−Ａ２形質転換マウス実験群から、ＰＬＫ１４７７、ＰＬＫ１５４１抗原のペプチドを用いた実験群と比較して相対的に高い抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が観察された。
【００７１】
ＣＤ８＋Ｔ細胞の免疫反応を調査するために、ＨＬＡ−Ａ２形質転換マウスで樹状細胞ワクチン及びペプチド基盤のワクチン戦略で免疫注入し、脾臓で現われる免疫反応をＥｌｉＳｐｏｔを通じて確認した。これのために、前記ＨＬＡ−Ａ２形質転換マウスで多数抗原決定基（Ｍｕｌｔｉ−ｅｐｉｔｏｐｅｓ）ＤＮＡ基盤のワクチン実験で主要抗原決定基で確認されたＨＬＡ−Ａ２結合のＰＬＫ１１２３（ＮＤＦＶＦＶＶＬＥＬ）、ＰＬＫ１４７７（ＴＬＬＫＹＦＲＮＹＭ）、ＰＬＫ１５４１（ＬＩＬＣＰＬＭＡＡＶ）ペプチドを選択し、ＨＬＡ−Ａ２形質転換マウスで樹状細胞ワクチン及びペプチド基盤のＴｒｉＶａｘワクチン（ＣＤ４０抗体／Ｐｏｌｙ−ＩＣ／抗原決定基）戦略で免疫注入した。これを通じて、各抗原決定基ペプチドに対する免疫反応を誘導した後、脾臓細胞からＣＤ８＋Ｔ細胞を抗体結合磁気細胞選別法（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）で獲得して抗原特異的なＴ細胞反応を確認するための効果細胞（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｃｅｌｌ）として用いた。標的細胞としては、ＨＬＡ−Ａ２陽性Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ＆  Ｌｙｍｐｈｏｍａ細胞であるＣＣＲＦ−ＳＢ、ＴＨＰ−１、ＳＫＭ−１とＭｅｌａｎｏｍａ細胞であるＳＫ−ＭＥＬ−５を用いた。また、ＨＬＡ−Ａ２陰性細胞であるＨＬ−６０（Ｌｅｕｋｅｉｍｉａ）とＳＫ−ＭＥＬ−３（Ｍｅｌａｎｏｍａ）も活用してＣＤ８＋Ｔ細胞の抗原特異的なＩＦＮ−γ分泌をＥｌｉＳｐｏｔを通じて確認した。
【００７２】
図４の（ａ）〜（ｃ）に示したように、ＰＬＫ１１２３抗原ペプチドを用いた実験群だけではなく抗原ペプチドを用いた全ての実験群でＰＬＫ１由来の抗原ペプチドが感作されたＴ２細胞株とＨＬＡ−Ａ２陽性腫瘍細胞に対して特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞免疫反応が観察された。
【００７３】
［産業上利用可能性］
本発明は、癌の予防又は治療に用いることができる。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【配列表】
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