(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む２−ヒドロキシイソカプロエート−ＣｏＡ転移酵素ｈａｄＡをコードする遺伝子及び配列番号２のアミノ酸配列において、Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｌ４１２Ｍ、Ｓ４７７Ｒ、Ｓ４７７Ｈ、Ｓ４７７Ｆ、Ｓ４７７Ｙ、Ｓ４７７Ｇ、Ｑ４８１Ｍ、Ｑ４８１Ｋ及びＱ４８１Ｒからなる群から選択される１種以上の変異を含むポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）合成酵素の変異酵素をコードする遺伝子が炭素源からアセチル−ＣｏＡ生成能を有する微生物に導入されている組換え微生物であって、前記組換え微生物は、芳香族単量体又は長鎖２−ヒドロキシアルカノエート（２−ＨＡ）単量体を有するポリヒドロキシアルカノエート生成能を有し、そして前記芳香族単量体はマンデレート、４−ヒドロキシマンデレート、フェニルラクテート、４−ヒドロキシフェニルラクテート、２−ヒドロキシ−４−フェニルブチレート、３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピオネート及び４−ヒドロキシ安息香酸からなる群から選択される、組み換え微生物。
【請求項２】
前記２−ヒドロキシイソカプロエート−ＣｏＡ転移酵素はアセチル−ＣｏＡをＣｏＡ供与体として使うことを特徴とする、請求項１に記載の組み換え微生物。
【請求項３】
前記長鎖２−ＨＡ単量体は、２−ヒドロキシイソカプロエート、２−ヒドロキシヘキサノエート、２−ヒドロキシオクタノエート、２−ヒドロキシ−４−フェニルブチレート、３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピオネート、及び４−ヒドロキシ安息香酸からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の組み換え微生物。
【請求項４】
β−ケトチオラーゼをコードする遺伝子及びアセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼをコードする遺伝子がさらに導入されていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項５】
次の段階を含む芳香族単量体又は長鎖２−ＨＡを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエートの製造方法：
（ａ）請求項１〜４のいずれか一項に記載の組み換え微生物を培養して芳香族単量体又は長鎖２−ＨＡを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエートを生成させる段階；及び
（ｂ）前記生成された芳香族単量体又は長鎖２−ＨＡを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエートを取得する段階。
【請求項６】
前記組み換え微生物を芳香族単量体又は長鎖２−ＨＡを単量体として含む培地で培養することを特徴とする、請求項５に記載のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【請求項７】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む２−ヒドロキシイソカプロエート−ＣｏＡ転移酵素ｈａｄＡをコードする遺伝子、配列番号２のアミノ酸配列において、Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｇ、及びＱ４８１Ｋを含むポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）合成酵素の変異酵素をコードする遺伝子、ＤＡＨＰ（３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸）合成酵素をコードする遺伝子、コリスミ酸ムターゼ／プレフェネートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子及びＤ−ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が炭素源からアセチル−ＣｏＡ生成能を有する微生物に導入されている組換え微生物であって、前記組換え微生物は、フェニルラクテートを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエート生成能を有する、組み換え微生物。
【請求項８】
前記ＤＡＨＰ（３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸）合成酵素をコードする遺伝子は配列番号８で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子であることを特徴とする、請求項７に記載のフェニルラクテートを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエート生成能を有する組み換え微生物。
【請求項９】
前記コリスミ酸ムターゼ／プレフェネートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は配列番号９で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子であることを特徴とする、請求項７又は８に記載のフェニルラクテートを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエート生成能を有する組み換え微生物。
【請求項１０】
前記Ｄ−ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は配列番号１０で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子であることを特徴とする、請求項７〜９のいずれか一項に記載のフェニルラクテートを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエート生成能を有する組み換え微生物。
【請求項１１】
前記Ｄ−ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子はｆｌｄＨ遺伝子であることを特徴とする、請求項７〜１０のいずれか一項に記載のフェニルラクテートを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエート生成能を有する組み換え微生物。
【請求項１２】
β−ケトチオラーゼをコードする遺伝子及びアセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼをコードする遺伝子がさらに導入されていることを特徴とする、請求項７〜１１のいずれか一項に記載のポリヒドロキシアルカノエート生成能を有する組み換え微生物。
【請求項１３】
ｔｙｒＲ遺伝子、ピルビン酸酸化酵素をコードする遺伝子、ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子、アセトアルデヒド脱水素酵素をコードする遺伝子、フマル酸リダクターゼをコードする遺伝子、チロシンアミノ転移酵素をコードする遺伝子、及びアスパラギン酸アミノ転移酵素をコードする遺伝子からなる群から選択される１種以上の遺伝子が欠失されていることを特徴とする、請求項７〜１２のいずれか一項に記載のフェニルラクテートを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエート生成能を有する組み換え微生物。
【請求項１４】
次の段階を含むフェニルラクテートを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエートの製造方法：
（ａ）請求項７〜１３のいずれか一項に記載の組み換え微生物を培養してフェニルラクテートを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエートを生成させる段階；及び
（ｂ）前記生成されたフェニルラクテートを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエートを取得する段階。
【請求項１５】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む２−ヒドロキシイソカプロエート−ＣｏＡ転移酵素ｈａｄＡをコードする遺伝子、配列番号２のアミノ酸配列において、Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｇ、及びＱ４８１Ｋを含むポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）合成酵素の変異酵素をコードする遺伝子、ＤＡＨＰ（３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸）合成酵素をコードする遺伝子、コリスミ酸ムターゼ／プレフェネートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、Ｄ−ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ヒドロキシマンデレート合成酵素をコードする遺伝子、ヒドロキシマンデレート酸化酵素をコードする遺伝子及びＤ−マンデレート脱水素酵素をコードする遺伝子が炭素源からアセチル−ＣｏＡ生成能を有する微生物に導入されている組換え微生物であって、前記組換え微生物は、マンデレートを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエート生成能を有する組み換え微生物。
【請求項１６】
前記ＤＡＨＰ（３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸）合成酵素をコードする遺伝子は配列番号８で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子であることを特徴とする、請求項１５に記載のマンデレートを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエート生成能を有する組み換え微生物。
【請求項１７】
前記コリスミ酸ムターゼ／プレフェネートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は配列番号９で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子であることを特徴とする、請求項１５又は１６に記載のマンデレートを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエート生成能を有する組み換え微生物。
【請求項１８】
前記Ｄ−ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は配列番号１０で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子であることを特徴とする、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載のマンデレートを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエート生成能を有する組み換え微生物。
【請求項１９】
前記ヒドロキシマンデレート合成酵素をコードする遺伝子は配列番号１１で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子であることを特徴とする、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載のマンデレートを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエート生成能を有する組み換え微生物。
【請求項２０】
前記ヒドロキシマンデレート酸化酵素をコードする遺伝子は配列番号１２で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子であることを特徴とする、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載のマンデレートを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエート生成能を有する組み換え微生物。
【請求項２１】
前記Ｄ−マンデレート脱水素酵素をコードする遺伝子は配列番号１３で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子であることを特徴とする、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載のマンデレートを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエート生成能を有する組み換え微生物。
【請求項２２】
前記Ｄ−ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子はｆｌｄＨ遺伝子であることを特徴とする、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載のマンデレートを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエート生成能を有する組み換え微生物。
【請求項２３】
β−ケトチオラーゼをコードする遺伝子及びアセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼをコードする遺伝子がさらに導入されていることを特徴とする、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載のマンデレートを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエート生成能を有する組み換え微生物。
【請求項２４】
次の段階を含むマンデレートを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエートの製造方法：
（ａ）請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の組み換え微生物を培養してマンデレートを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエートを生成させる段階；及び
（ｂ）前記生成されたマンデレートを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエートを取得する段階。
【請求項２５】
次の段階を含む、２−ヒドロキシイソカプロエート、２−ヒドロキシヘキサノエート及び２−ヒドロキシオクタノエートからなる群から選択される化合物を単量体として含むポリヒドロキシアルカノエートの製造方法：
（ａ）請求項１〜４のいずれか一項に記載の組み換え微生物を２−ヒドロキシイソカプロエート、２−ヒドロキシヘキサノエート及び２−ヒドロキシオクタノエートからなる群から選択される化合物を含む培地で培養する段階；及び
（ｂ）２−ヒドロキシイソカプロエート、２−ヒドロキシヘキサノエート及び２−ヒドロキシオクタノエートからなる群から選択される化合物を単量体として含むポリヒドロキシアルカノエートを取得する段階。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は芳香族単量体又は長鎖２−ヒドロキシアルカノエート（２−ｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ；２−ＨＡ）を単量体として含むポリヒドロキシアルカノエートの製造方法に係り、より詳しくは２−ヒドロキシイソカプロエート−ＣｏＡ転移酵素をコードする遺伝子及びポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子が導入されており、芳香族単量体又は長鎖２−ＨＡを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエート生成能を有する組み換え微生物及び前記組み換え微生物を用いた芳香族単量体又は長鎖２−ＨＡを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエートの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリヒドロキシアルカノエート（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅｓ；ＰＨＡｓ）は多様な微生物によって合成される生物学的ポリエステル（ｐｏｌｙｅｓｔｅｒ）である。これらのポリマーは生分解性と生体適合性の特性を有する熱可塑性物質であり、石油系高分子と類似した物性を有することができるので、多様な産業的生医学的応用が可能であり、再生資源から生成される(Lee, S. Y. Biotechnol. Bioeng. 49:1 1996)。
【０００３】
ＰＨＡｓは側鎖の長さによって短い炭素数を有するＳＣＬ−ＰＨＡ（ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ−ｌｅｎｇｔｈ  ＰＨＡ）と長い炭素数を有するＭＣＬ−ＰＨＡ（ｍｅｄｉｕｍ−ｃｈａｉｎ−ｌｅｎｇｔｈ  ＰＨＡ）に区分される。Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ，ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓなどの微生物由来のＰＨＡ合成遺伝子をクローニングして組み換え微生物を製作し、これから多様なＰＨＡが合成されたことがある(Qi et al., FEMS Microbiol. Lett., 157:155, 1997; Qi et al., FEMS Microbiol. Lett., 167:89, 1998; Langenbach et al., FEMS Microbiol. Lett., 150:303, 1997; WO 01/55436; US 6,143,952; WO 98/54329; WO 99/61624)。
【０００４】
Ｒ−３−ヒドロキシ酪酸（Ｒ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ）のホモポリマーであるＰＨＢのような短い側鎖を有するものは結晶体の熱可塑性物質であり、易しく壊れる低弾性の特性を持っている。一方、長い側鎖を有するＭＣＬ−ＰＨＡはより高い弾性を有する。ＰＨＢは知られてから約７０年程度になった(Lemoigne & Roukhelman, 1925)。一方、ＭＣＬ−ＰＨＡは比較的最近に知られた(deSmet et al., J. Bacteriol.154:870-78 1983)。これらの共重合体はＰＨＢ−ｃｏ−ＨＸ（ここで、Ｘは３ヒドロキシアルカノエート又はアルカノエート又は６又はそれ以上の炭素のアルカノエートを言う）で示すことができる。特定の２種の単量体の共重合体の適当な例として、ポリ（３ＨＢ−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサノエート(Brandl et al., Int.J. Biol. Macromol. 11:49, 1989; Amos & McInerey, Arch. Microbiol., 155:103, 1991; US 5,292,860)。
【０００５】
ＰＨＡの生合成はＣｏＡ−転移酵素又はＣｏＡ−リガーゼによってヒドロキシ酸がヒドロキシアシル−ＣｏＡに転換され、転換されたヒドロキシアシル−ＣｏＡがＰＨＡシンターゼによって高分子化する過程を経る。天然ＰＨＡシンターゼの場合、２−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに対する活性が３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡより非常に低い。しかし、最近、本発明者らはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．６−１９のＰＨＡシンターゼ（ＰｈａＣ１ｐｓ６−１９）を遺伝子操作して２−ヒドロキシアシル−ＣｏＡの一種であるラクチル−ＣｏＡを基質として使えるように開発した(WO08/062996; Yang  et al.,  Biotechnol. Bioeng.,  105:150, 2010; Jung  et al., Biotechnol. Bioeng.,  105:161, 2010)。ＰｈａＣ１ｐｓ６−１９は非常に多様な基質特異性を有し、２−ヒドロキシアシル−ＣｏＡの一種であるラクチル−ＣｏＡを基質として使えるから、多様な種類の２−ヒドロキシ酸を２−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに転換することができるシステムを開発すれば多種の２−ヒドロキシ酸を含む新しいＰＨＡの合成が可能であろう。
【０００６】
したがって、本発明者らは新しい２−ヒドロキシ酸を含むＰＨＡを生合成するための方法を開発しようと鋭意努力した結果、アセチル−ＣｏＡを使う２−ヒドロキシ酸を２−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに転換する酵素をスクリーニングし、前記酵素を使う場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件で多様な種類の２−ヒドロキシアシル−ＣｏＡを生産することができ、これを用いて多様なＰＨＡを生産することができることを確認し、本発明を完成することになった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、芳香族単量体又は長鎖２−ＨＡを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエート生成能を有する組み換え微生物を提供することにある。
【０００８】
本発明の他の目的は、前記組み換え微生物を用いて、芳香族単量体又は長鎖２−ＨＡを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエートを製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記目的を達成するために、本発明は、炭素源からアセチル−ＣｏＡ生成能を有する微生物であって、２−ヒドロキシイソカプロエート−ＣｏＡ転移酵素をコードする遺伝子及びポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子が導入されており、芳香族単量体又は長鎖２−ＨＡを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエート生成能を有する組み換え微生物を提供する。
【００１０】
また、本発明は、（ａ）前記組み換え微生物を培養して芳香族単量体又は長鎖２−ＨＡを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエートを生成させる段階；及び（ｂ）前記生成された芳香族単量体又は長鎖２−ＨＡを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエートを取得する段階を含む、芳香族単量体又は長鎖２−ＨＡを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエートの製造方法を提供する。
【００１１】
また、本発明は、炭素源からアセチル−ＣｏＡ生成能を有する微生物であって、２−ヒドロキシイソカプロエート−ＣｏＡ転移酵素をコードする遺伝子、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子、ＤＡＨＰ（３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸）合成酵素をコードする遺伝子、コリスミ酸ムターゼ／プレフェネートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子及びＤ−ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が増幅されており、フェニルラクテートを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエート生成能を有する組み換え微生物を提供する。
【００１２】
また、本発明は、（ａ）前記組み換え微生物を培養して、フェニルラクテートを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエートを生成させる段階；及び（ｂ）前記生成されたフェニルラクテートを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエートを取得する段階を含む、フェニルラクテートを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエートの製造方法を提供する。
【００１３】
また、本発明は、炭素源からアセチル−ＣｏＡ生成能を有する微生物であって、２−ヒドロキシイソカプロエート−ＣｏＡ転移酵素をコードする遺伝子、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子、ＤＡＨＰ（３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸）合成酵素をコードする遺伝子、コリスミ酸ムターゼ／プレフェネートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子及びＤ−ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ヒドロキシマンデレート合成酵素をコードする遺伝子、ヒドロキシマンデレート酸化酵素をコードする遺伝子及びＤ−マンデレート脱水素酵素をコードする遺伝子が増幅されており、マンデレートを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエート生成能を有する組み換え微生物を提供する。
【００１４】
また、本発明は、（ａ）前記組み換え微生物を培養してマンデレートを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエートを生成させる段階；及び（ｂ）前記生成されたマンデレートを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエートを取得する段階を含む、マンデレートを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエートの製造方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明による芳香族ポリエステルの生合成代謝経路を示したもので、ＡはＦｌｄＡ（シンナモイル−ＣｏＡ：フェニルラクテートＣｏＡ−転移酵素）を使ったときの代謝経路を、ＢはＨａｄＡ（２−ヒドロキシイソカプロエート−ＣｏＡ転移酵素）を使ったときの代謝経路を示した図である。
【図２】ＨａｄＡとＦｌｄＡのアミノ酸配列相同性を比較した結果を示した図である。
【図３】ａはＨｉｓ−ｔａｇを用いてＨａｄＡを精製した結果を示した図、ｂはＨａｄＡがアセチル−ＣｏＡをＣｏＡ供与体として使えるかを確認した結果を示した図である。
【図４】ＨａｄＡがアセチル−ＣｏＡをＣｏＡ供与体として使用してマンデレート、４−ヒドロキシマンデレート、フェニルラクテート、４−ヒドロキシフェニルラクテート、２−ヒドロキシ−４−フェニルブチレート、３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピオネート及び４−ヒドロキシ安息香酸を該当ＣｏＡ誘導体に転換することができるかをｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素分析後、ＬＣ−ＭＳ分析で確認した結果を示した図である。
【図５】ＨａｄＡが転換することができる多様な基質のＣｏＡ転換反応を分子式で示した図である。
【図６】ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏゲノム規模代謝フラックス分析による代謝工学分析を実施して、Ｄ−フェニルラクテート生産を増加させた結果を示した図である。
【図７】大膓菌ＸＢ２０１ＴＢＡＬによって生産されたポリ（３ＨＢ−ｃｏ−Ｄ−フェニルラクテート）を分析した結果を示した図である。
【図８】大膓菌ＸＢ２０１ＴＢＡＬによって生産されたポリ（３ＨＢ−ｃｏ−Ｄ−フェニルラクテート−ｃｏ−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピオネート）とポリ（３ＨＢ−ｃｏ−Ｄ−フェニルラクテート−ｃｏ−Ｄ−マンデレート）を分析した結果を示した図である。
【図９】相異なる強度の５種のプロモーターの下でＰｈａＡＢを発現する大膓菌ＸＢ２０１ＴＢＡＬ菌株でのポリ（３ＨＢ−ｃｏ−Ｄ−フェニルラクテート）生産結果を示した図である。
【図１０】ａ及びｂはＡｒｏＧｆｂｒ、ＰｈｅＡｆｂｒ、ＦｌｄＨ、ＨａｄＡ及びＰｈａＣ１４３７を発現する大膓菌ＸＢ２０１ＴＢＡＬ菌株を３ＨＢを含むＭＲ培地で流加式発酵してポリ（３ＨＢ−ｃｏ−Ｄ−フェニルラクテート）を生産した結果を示した図、ｃ及びｄはＡｒｏＧｆｂｒ、ＰｈｅＡｆｂｒ、ＦｌｄＨ、ＨａｄＡ、ＰｈａＣ１４３７及びＢＢａ＿Ｊ２３１１４プロモーターの下でＰｈａＡＢを発現する大膓菌ＸＢ２０１ＴＢＡＬ菌株を３ＨＢ添加なしに流加式発酵してポリ（３ＨＢ−ｃｏ−Ｄ−フェニルラクテート）を生産した結果を示した図、ｅ及びｆはＡｒｏＧｆｂｒ、ＰｈｅＡｆｂｒ、ＦｌｄＨ、ＨａｄＡ、ＰｈａＣ１４３７及びＢＢａ＿Ｊ２３１１４プロモーターの下でＰｈａＡＢを発現する大膓菌ＸＢ２０１ＴＢＡＦ菌株を３ＨＢ添加なしに流加式発酵してポリ（３ＨＢ−ｃｏ−Ｄ−フェニルラクテート）を生産した結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
他に定義しない限り、本明細書で使用した全ての技術的及び科学的用語は本発明が属する技術分野で熟練した専門家によって通常的に理解されるものと同じ意味を有する。一般に、この明細書で使用した命名法は当該技術分野でよく知られており、通常に使われるものである。
【００１７】
芳香族ポリエステルは主に石油から生産される必須プラスチックである。本発明では、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）合成酵素及び補酵素Ａ（ＣｏＡ）転移酵素を発現する代謝工学的に操作された大膓菌によって、グルコースから芳香族ポリエステル又は長鎖２−ヒドロキシアルカノエートを単量体とするポリマーをワンステップで生産する方法を確立した。
【００１８】
本発明の一様態では、芳香族ポリエステルからフェニルラクテートを含むＰＨＡを生産するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析によって活性が確認されたシンナモイル−ＣｏＡ：フェニルラクテートＣｏＡ−転移酵素（ＦｌｄＡ）及び４−クマレート：ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）をＰＨＡ合成酵素とともにＤ−フェニルラクテート生産大膓菌菌株で発現させた。前記菌株は、ｉｎ  ｖｉｖｏで生成されたシンナモイル−ＣｏＡをＣｏＡ供与体として使用してポリ（１６．８ｍｏｌ％Ｄ−ラクテート−ｃｏ−８０．８ｍｏｌ％３ＨＢ−ｃｏ−１．６ｍｏｌ％Ｄ−フェニルラクテート−ｃｏ−０．８ｍｏｌ％Ｄ−４−ヒドロキシフェニルラクテート）ポリマーを乾燥細胞の重さの１２．８重量％の含量で生産した。
【００１９】
しかし、フェニルラクテートＣｏＡ−転移酵素（ＦｌｄＡ）の芳香族基質の利用範囲は非常に狭いから、ＣｏＡ供与体としてアセチル−ＣｏＡを用いて多様な芳香族ヒドロキシアシルＣｏＡを生成することができる２−イソカプレノイル−ＣｏＡ：２−ヒドロキシイソカプロエートＣｏＡ−転移酵素（ＨａｄＡ）を確認し、これを選択して芳香族ＰＨＡの生産に用いた。高いモル分率のＤ−フェニルラクテートを含む芳香族ＰＨＡを大量生産するために、先に単量体であるＤ−フェニルラクテートを過剰生成するように最適の代謝経路を設計した。
【００２０】
本発明の一様態では、Ｄ−フェニルラクテートの生産に最適の代謝経路を有するように代謝工学的に操作された大膓菌を製造するために、ｔｙｒＲ欠損大膓菌でフィードバック抵抗ａｒｏＧ、ｐｈｅＡとｆｌｄＨ遺伝子を過発現させ、競争代謝経路（ｐｆｌＢ、ｐｏｘＢ、ａｄｈＥ及びｆｒｄＢ）を欠失させ、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏゲノム規模代謝フラックス分析によってｔｙｒＢ及びａｓｐＣ遺伝子をもっと欠失させた。前記代謝工学的に操作された大膓菌は１．６２ｇ／ＬのＤ−フェニルラクテートを生産した。前記Ｄ−フェニルラクテート過剰生産菌株にＨａｄＡとＰＨＡ合成酵素を発現させた場合、乾燥細胞重さの１５．８重量％のポリ（５２．１ｍｏｌ％３ＨＢ−ｃｏ−４７．９ｍｏｌ％Ｄ−フェニルラクテート）が生成されることを確認した。また、４−ヒドロキシフェニルラクテート、マンデレート（ｍａｎｄｅｌａｔｅ）及び３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピオネートを含むポリエステルを製造することによって多様な芳香族ポリエステルを製造することができる可能性を確認した。
【００２１】
したがって、本発明は、一観点で、炭素源からアセチル−ＣｏＡ生成能を有する微生物であって、２−ヒドロキシイソカプロエート−ＣｏＡ転移酵素をコードする遺伝子及びポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子が導入されており、芳香族単量体又は長鎖２−ＨＡを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエート生成能を有する組み換え微生物に関するものである。
本発明において、長鎖２−ＨＡは炭素数６〜８の２−ヒドロキシアルカノエートを意味する。
【００２２】
本発明において、前記芳香族単量体又は長鎖２−ＨＡ単量体は、２−ヒドロキシイソカプロエート、２−ヒドロキシヘキサノエート、２−ヒドロキシオクタノエート、フェニルラクテート、２−ヒドロキシ−４−フェニルブチレート、３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピオネート、４−ヒドロキシ安息香酸及びマンデレートからなる群から選択されることを特徴とすることができる。
【００２３】
本発明において、前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素は、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．６−１９からなる群から選択される菌株由来のＰＨＡシンターゼ又は下記から選択されるアミノ酸配列を有するＰＨＡシンターゼの変異酵素であることを特徴とすることができる：
配列番号２のアミノ酸配列において、Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｌ４１２Ｍ、Ｓ４７７Ｒ、Ｓ４７７Ｈ、Ｓ４７７Ｆ、Ｓ４７７Ｙ、Ｓ４７７Ｇ、Ｑ４８１Ｍ、Ｑ４８１Ｋ及びＱ４８１Ｒからなる群から選択される１種以上の変異を含むアミノ酸配列；
配列番号２のアミノ酸配列において、Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｌ４１２Ｍ、Ｓ４７７Ｇ及びＱ４８１Ｍの変異を有するアミノ酸配列（Ｃ１３３５）；
配列番号２のアミノ酸配列において、Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｋの変異を有するアミノ酸配列（Ｃ１３１０）；及び
配列番号２のアミノ酸配列において、Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｒの変異を有するアミノ酸配列（Ｃ１３１２）。
【００２４】
本発明において、前記２−ヒドロキシイソカプロエート−ＣｏＡ転移酵素はクロストリジウムディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）６３０由来のｈａｄＡであることを特徴とすることができる。
本発明において、前記２−ヒドロキシイソカプロエート−ＣｏＡ転移酵素はアセチル−ＣｏＡをＣｏＡ供与体として使うことを特徴とすることができる。
【００２５】
本発明の微生物は、外部から３ＨＢの供給がなくもポリマーを生産するために、３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｙｌ−ＣｏＡ生合成に関与するβ−ケトチオラーゼをコードする遺伝子とアセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼをコードする遺伝子がさらに導入されていることを特徴とすることができる。
【００２６】
他の観点で、本発明は、（ａ）前記組み換え微生物を培養して芳香族単量体又は長鎖２−ＨＡを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエートを生成させる段階；及び（ｂ）前記生成された芳香族単量体又は長鎖２−ＨＡを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエートを取得する段階を含む芳香族単量体又は長鎖２−ＨＡを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエートの製造方法に関するものである。
【００２７】
本発明の一様態では、ポリヒドロキシアルカノエートの合成に使われるＰｃｔ（プロピオニル−ＣｏＡ転移酵素）がフェニルラクテートとマンデレートをそれぞれフェニルラクチル−ＣｏＡとマンデリル−ＣｏＡに活性化させることができるかを確認した。Ｐｃｔｃｐの突然変異（Ｐｃｔ５４０）はグリコール酸、乳酸、２−ヒドロキシ酪酸、２−ヒドロキシイソ吉草酸及び２−ヒドロキシ酸などの各種のヒドロキシ酸を含むポリエステルの生体内生産に成功的に使われているから、Ｐｃｔ５４０は炭素数及び水酸基の位置に対して、広い基質スペクトラムを有すると言える。しかし、Ｐｃｔ５４０はフェニルラクテート及びマンデレートに対する触媒活性は持っていないことを確認した。したがって、本発明では、芳香族共重合体の生産のために、芳香族化合物に対応するＣｏＡ誘導体を活性化することができる新規ＣｏＡ−転移酵素を捜そうとした。
【００２８】
クロストリジウムスポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）のシンナモイル−ＣｏＡ：フェニルラクテートＣｏＡ−転移酵素（ＦｌｄＡ）はシンナモイル−ＣｏＡをＣｏＡ供与体として使用してフェニルラクテートをフェニルラクチル−ＣｏＡに変換することができると報告された(Dickert, S. et al., Eur. J. Biochem. 267:3874, 2000)。シンナモイル−ＣｏＡは大膓菌の非天然代謝物質であるから、細胞内に豊かな代謝産物であるアセチル−ＣｏＡをＣｏＡ供与体として使うかを確認するために、クロストリジウムスポロゲネス（Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）のＦｌｄＡと９９．０％の相同性を有するＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ａ  ｓｔｒ．ＡＴＣＣ  ３５０２由来のＦｌｄＡを試験した。しかし、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ａ  ｓｔｒ．ＡＴＣＣ  ３５０２のＦｌｄＡはＣｏＡ供与体としてアセチル−ＣｏＡを用いてフェニルラクチル−ＣｏＡを生成する触媒活性を有しないことを確認した。
【００２９】
一方、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ４−ｃｏｕｍａｒａｔｅ：ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）がリグニン、フラボノイド、フィトアレキシンなどの植物の２次代謝物質の前駆体を生産するフェニルプロパノイド代謝に重要な役割をすることが知られている(Kaneko, M.et al, J. Bacteriol. 185:20,2003)。したがって、本発明の一様態では、４ＣＬを導入することにより、シンナメートでシンナモイル−ＣｏＡを合成する生合成経路を設計した。４ＣＬ変異体を使用して、シンナメートをシンナモイル−ＣｏＡに転換するのに使い、シンナモイル−ＣｏＡはフェニルラクチル−ＣｏＡの形成のためのＦｌｄＡのＣｏＡ供与体として使った。その結果、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで４ＣＬとＦｌｄＡの順次反応によってフェニルラクチル−ＣｏＡを成功的に合成した。このような結果から、４ＣＬ及びＦｌｄＡをフェニルラクチル−ＣｏＡの生成に使えることと芳香族ポリエステルの製造に使えることを確認した。同様に、他の有望な芳香族単量体である４−ヒドロキシフェニルラクテートも４ＣＬ変異体とＦｌｄＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ順次反応によって４−ヒドロキシフェニルラクチル−ＣｏＡに変換されることを確認した。
【００３０】
非天然ポリエステルの製造においては、該当ＣｏＡ基質の重合のためのＰＨＡ合成酵素の変異体を選択することが重要であるので、多様なＰＨＡ合成酵素の性能を調べるために、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＭＢＥＬ  ６−１９  ＰＨＡ合成酵素（ＰｈａＣＰｓ６−１９）変異体をＡｒｏＧｆｂｒ、ＰＡＬ、４ＣＬ、ＦｌｄＡ及びＰｃｔ５４０を過剰発現する大膓菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅで発現させた。製作された組み換え菌株を２０ｇ／Ｌのグルコース、１ｇ／ＬのＤ−フェニルラクテート及び１ｇ／Ｌのナトリウム３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）を添加したＭＲ培地で培養した。ナトリウム３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）はＰｃｔ５４０によってＰｈａＣの選好基質である３ＨＢ−ＣｏＡに転換され、十分な量のＰＨＡの生産ができるようにするため、ポリマーの生産を強化するために添加した。他のＰＨＡ合成酵素変異体を発現する大膓菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅは他のモノマー組成を有する多様な量のポリ（Ｄ−ラクテート−ｃｏ−３ＨＢ−ｃｏ−Ｄ−フェニルラクテート）を生産することができる。
【００３１】
前記実験結果、ＰｈａＣ変異体で、４個のアミノ酸置換（Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｇ及びＱ４８１Ｋ）を含むＰｈａＣ１４３７がポリ（１８．３ｍｏｌ％Ｄ−ラクテート−ｃｏ−７６．９ｍｏｌ％３ＨＢ−ｃｏ−４．８ｍｏｌ％Ｄ−フェニルラクテート）を乾燥細胞重さの７．８重量％で生産することから、最も適合したＰｈａＣ変異体であることが確認された。
【００３２】
次に、ｉｎ  ｖｉｖｏでグルコースからＤ−フェニルラクテートを生成するように大膓菌を操作した。芳香族化合物の生合成は３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸（ＤＡＨＰ）の合成から始まり、前記ＤＡＨＰはＤＡＨＰ合成酵素によるホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）とエリトロース−４−リン酸（Ｅ４Ｐ）の縮合によって生成される。生成されたＤＡＨＰはフェニルピルベート（ＰＰＡ）に転換された後、Ｄ−ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＦｌｄＨ）によってＤ−フェニルラクテートに転換される（図１）。芳香族化合物生合成のための代謝経路は多様な阻害機構によって複雑に制御されると知られている。ａｒｏＧによってコーディングされるＤＡＨＰ合成酵素とｐｈｅＡによってコーディングされるコリスミ酸ムターゼ／プレフェネートデヒドロゲナーゼの発現はＬ−フェニルアラニンによって阻害される(ribe, D. E. et al., J. Bacteriol. 127:1085, 1976)。
【００３３】
本発明では、Ｌ−フェニルの一フィードバック阻害を解除するために、フィードバック阻害耐性突然変異ＡｒｏＧｆｂｒ［ＡｒｏＧ（Ｄ１４６Ｎ）］及びＰｈｅＡｆｂｒ［ＰｈｅＡ（Ｔ３２６Ｐ）］を構築した(Zhou, H. Y. et al., Bioresour. Technol. 101:4151, 2010; Kikuchi, Y. et al., Appl. Environ. Microbiol. 63:761, 1997)。ＡｒｏＧｆｂｒ、ＰｈｅＡｆｂｒ及びＣ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ａ  ｓｔｒ．ＡＴＣＣ  ３５０２のＦｌｄＨを発現する大膓菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅはグルコース１５．２ｇ／ＬからＤ−フェニルラクテート０．３７２ｇ／Ｌを生成した。前記菌株のＰＡＬ、４ＣＬ、ＦｌｄＡ、Ｐｃｔ５４０及びＰｈａＣ１４３７の過剰発現はポリ（１６．８ｍｏｌ％Ｄ−ラクテート−ｃｏ−８０．８ｍｏｌ％３ＨＢ−ｃｏ−１．６ｍｏｌ％Ｄ−フェニルラクテート−ｃｏ−０．８ｍｏｌ％Ｄ−４−ヒドロキシフェニルラクテート）を乾燥細胞重さの１２．８重量％まで増加させた。Ｄ−フェニルラクテートを含む芳香族ＰＨＡを製造するのには二つの問題がある。一つ目は、高分子合成の効率及び芳香族単量体の含量が非常に低いことである。これは、シンナモイル−ＣｏＡをＣｏＡ供与体として使用するＦｌｄＡの非効率性によるものであると考えられた。二つ目は、芳香族ＰＨＡのモノマースペクトラムが非常に狭いことである。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素分析結果、ＦｌｄＡがＣｏＡをフェニルラクテート及び４−ヒドロキシフェニルラクテートに移すことができるが、マンデレート、２−ヒドロキシ−４−フェニルブチレート、３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピオネート及び４−ヒドロキシ安息香酸のような基質には移すことができないことを確認した。
【００３４】
本発明では、前記問題を解決するために、ＣｏＡ供与体としてアセチル−ＣｏＡを使って芳香族基質のスペクトラムが広い酵素を捜し出した。ＦｌｄＡに対する相同酵素を識別するために、配列類似性分析を実施し、他の起原の多様なＦｌｄＡのうちＦｌｄＡと４８％以上のアミノ酸配列同一性を有するクロストリジウムディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の２−イソカプレノイル−ＣｏＡ：２−ヒドロキシイソカプロエートＣｏＡ−転移酵素（ＨａｄＡ）をスクリーニングした（図２）。ＨａｄＡはＣｏＡ供与体としてイソカプレノイル−ＣｏＡを用いてＣｏＡを２−ヒドロキシイソカプロエートに転換すると知られている酵素であるから、本発明では、ＨａｄＡがアセチル−ＣｏＡをＣｏＡ供与体として使えるかを調査した（図３）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素分析結果、興味深いことに、ＨａｄＡがアセチル−ＣｏＡをＣｏＡ供与体として使用してフェニルラクテートをフェニルラクチル−ＣｏＡに活性化することができることを確認した（図４）。
【００３５】
また、ＨａｄＡは、マンデレート、４−ヒドロキシマンデレート、フェニルラクテート、４−ヒドロキシフェニルラクテート、２−ヒドロキシ−４−フェニルブチレート、３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピオネート及び４−ヒドロキシ安息香酸を該当ＣｏＡ誘導体に変換することができることをｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析後にＬＣ−ＭＳ分析によって確認した（図４及び図５）。したがって、ＨａｄＡはアセチル−ＣｏＡをＣｏＡ供与体として使用して多様な芳香族ポリエステルをより効率的に生産することができる可能性を持っている。
【００３６】
次に、代謝工学によって芳香族単量体の生成量を増加させるために、グルコースからＤ−フェニルラクテートを少量生産（０．３７２ｇ／Ｌ）するＡｒｏＧｆｂｒ、ＰｈｅＡｆｂｒ及びＦｌｄＨを発現する大膓菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ菌株の収率を代謝工学的操作によって上昇させた。芳香族アミノ酸生合成を抑制するように調節する二重転写調節因子であるＴｙｒＲを欠失させたＡｒｏＧｆｂｒ、ＰｈｅＡｆｂｒ及びＦｌｄＨを発現する大膓菌ＸＢＴ菌株を製作した。前記大膓菌ＸＢＴ菌株は１６．４ｇ／Ｌのグルコースから０．５ｇ／ＬのＤ−フェニルラクテートを生産するので、ＴｙｒＲを欠失させなかった前記大膓菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ菌株より３０％高い生産性を示した。Ｄ−フェニルラクテート生合成と衝突する経路を除去するために、大膓菌ＸＢＴでｐｏｘＢ（ピルビン酸酸化酵素をコードする遺伝子）、ピルビン酸酸化酵素をコードする遺伝子）、ｐｆｌＢ（ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子）、ａｄｈＥ（アセトアルデヒド脱水素酵素／アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子）及びｆｒｄＢ（フマル酸リダクターゼをコードする遺伝子）を欠失させた大膓菌ＸＢ２０１Ｔを製作した。ＡｒｏＧｆｂｒ、ＰｈｅＡｆｂｒ及びＦｌｄＨを発現する大膓菌ＸＢ２０１Ｔ菌株は１５．７ｇ／Ｌのグルコースから０．５５ｇ／ＬのＤ−フェニルラクテートを生産した。これは大膓菌ＸＢＴより１０％高い収率を示すものである。
【００３７】
追加的に、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏゲノム規模代謝フラックス分析による代謝工学分析を実施して、Ｄ−フェニルラクテート生産をもっと増加させた（図６）。チロシンアミノ転移酵素をコードするｔｙｒＢ遺伝子及びアスパラギン酸アミノ転移酵素をコードするａｓｐＣ遺伝子を前記大膓菌ＸＢ２０１Ｔ菌株から除去し、Ｌ−フェニルアラニン生合成を減少させて、Ｄ−フェニルラクテートへの炭素流れを強化した。その結果として製作されたＡｒｏＧｆｂｒ、ＰｈｅＡｆｂｒ及びＦｌｄＨを発現する大膓菌ＸＢ２０１ＴＢＡ菌株は１８．５ｇ／Ｌのグルコースから１．６２ｇ／ＬのＤ−フェニルラクテートを生産して収率が大きく高くなった。これは、同じ遺伝子を発現する大膓菌ＸＬ１  Ｂｌｕｅ菌株のＤ−フェニルラクテート生産量より４．３５倍高くなったものである。
【００３８】
ＡｒｏＧｆｂｒ、ＰｈｅＡｆｂｒ、ＦｌｄＨ、ＰｈａＣ１４３７及びＨａｄＡを発現する大膓菌ＸＢ２０１ＴＢＡＬを２０ｇ／Ｌのグルコース及び１ｇ／Ｌのナトリウム３ＨＢを含む培地で培養すれば、ポリ（５２．１ｍｏｌ％３ＨＢ−ｃｏ−４７．９ｍｏｌ％Ｄ−フェニルラクテート）を乾燥細胞重さの１５．８重量％の含量で生産した（図７）。
【００３９】
したがって、本発明は、さらに他の観点で、炭素源からアセチル−ＣｏＡ生成能を有する微生物であって、２−ヒドロキシイソカプロエート−ＣｏＡ転移酵素をコードする遺伝子、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子、ＤＡＨＰ（３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸）合成酵素をコードする遺伝子、コリスミ酸ムターゼ／プレフェネートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子及びＤ−ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入されており、フェニルラクテートを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエート生成能を有する組み換え微生物に関するものである。
【００４０】
本発明において、前記２−ヒドロキシイソカプロエート−ＣｏＡ転移酵素はクロストリジウムディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）６３０由来のｈａｄＡであることを特徴とすることができ、前記ヒドロキシアルカノエート合成酵素はＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．６−１９からなる群から選択される菌株由来のＰＨＡシンターゼ又は下記から選択されるアミノ酸配列を有するＰＨＡシンターゼの変異酵素であることを特徴とすることができる：
配列番号２のアミノ酸配列において、Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｌ４１２Ｍ、Ｓ４７７Ｒ、Ｓ４７７Ｈ、Ｓ４７７Ｆ、Ｓ４７７Ｙ、Ｓ４７７Ｇ、Ｑ４８１Ｍ、Ｑ４８１Ｋ及びＱ４８１Ｒからなる群から選択される１種以上の変異を含むアミノ酸配列；
配列番号２のアミノ酸配列において、Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｌ４１２Ｍ、Ｓ４７７Ｇ及びＱ４８１Ｍの変異を有するアミノ酸配列（Ｃ１３３５）；
配列番号２のアミノ酸配列において、Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｋの変異を有するアミノ酸配列（Ｃ１３１０）；及び
配列番号２のアミノ酸配列において、Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｒの変異を有するアミノ酸配列（Ｃ１３１２）。
【００４１】
本発明において、前記ＤＡＨＰ（３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸）合成酵素をコードする遺伝子は配列番号８で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子であることを特徴とすることができ、前記コリスミ酸ムターゼ／プレフェネートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は配列番号９で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子であることを特徴とすることができ、前記Ｄ−ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は配列番号１０で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子であることを特徴とすることができる。
【００４２】
本発明で、前記導入されるＤ−ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子はｌｄｈＡ遺伝子を取り替えるｆｌｄＨ遺伝子であることを特徴とすることができる。
【００４３】
本発明の微生物は、外部から３ＨＢの供給がなくもポリマーを生産するために、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ生合成に関与するβ−ケトチオラーゼをコードする遺伝子とアセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼをコードする遺伝子がさらに導入されていることを特徴とすることができる。
【００４４】
本発明で、導入されるβ−ケトチオラーゼをコードする遺伝子（ｐｈａＡ）とアセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼをコードする遺伝子（ｐｈａＢ）の発現量をプロモーターの強度によって調節する場合、ＰＨＡに含有されるＤ−フェニルラクテート単量体モル分率を調節することができる。
【００４５】
本発明の一様態では、相異なる強度の５種のプロモーターの下でＰｈａＡＢを発現する５個の相異なるプラスミドを製作し、ＡｒｏＧｆｂｒ、ＰｈｅＡｆｂｒ、ＦｌｄＨ、ＰｈａＣ１４３７及びＨａｄＡを発現するＸＢ２０１ＴＢＡＬ菌株に導入し、ＰｈａＡＢ発現が減少するにつれてＤ−フェニルラクテート単量体モル分率が増加することを確認した（図９ａ、図９ｂ及び表７）。このような結果は、代謝フラックスを調節することによって多様な芳香族単量体モル分率を有する芳香族ポリエステルが生成されることができることを示唆する。
【００４６】
本発明において、前記組み換え微生物は、ｔｙｒＲ遺伝子、ピルビン酸酸化酵素をコードする遺伝子、ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子、アセトアルデヒド脱水素酵素をコードする遺伝子、フマル酸リダクターゼをコードする遺伝子、チロシンアミノ転移酵素をコードする遺伝子、及びアスパラギン酸アミノ転移酵素をコードする遺伝子からなる群から選択される１種以上の遺伝子が欠失されていることを特徴とすることができる。
【００４７】
本発明は、さらに他の観点で、（ａ）前記組み換え微生物を培養して、フェニルラクテートを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエートを生成させる段階；及び（ｂ）前記生成されたフェニルラクテートを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエートを取得する段階を含む、フェニルラクテートを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエートの製造方法に関するものである。
【００４８】
前記方法が多様な芳香族重合体の製造に使えるかを確認するために、マンデレートをモノマーとして使用して試験した。マンデレートの単一ポリマーであるポリマンデレートが１００℃の比較的高いＴｇを有する熱分解抵抗性ポリマーであるとともに、物質特性はポリスチレンと類似しているからである。ポリマンデレートは石油産業で生産されるマンデレートの環状二量体の開環重合によって化学的に合成されている。ＡｒｏＧｆｂｒ、ＰｈｅＡｆｂｒ、ＦｌｄＨ、ＰｈａＣ１４３７及びＨａｄＡを発現する大膓菌ＸＢ２０１ＴＢＡＬを１ｇ／Ｌのナトリウム３ＨＢ及び０．５ｇ／ＬのＤ−マンデレートを含む培地で培養すれば、ポリ（５５．２ｍｏｌ％３ＨＢ−ｃｏ−４３ｍｏｌ％Ｄ−フェニルラクテート−ｃｏ−１．８ｍｏｌ％Ｄ−マンデレート）を乾燥細胞重さの１１．６重量％の含量で製造した（図８ａ及び図８ｂ）。本発明では、Ｄ−マンデレートを基質としてＤ−マンデレートを含む芳香族共重合体を成功的に製造し、ついで、代謝工学によってＤ−マンデレートをｉｎ  ｖｉｖｏで生産しようとした。グルコースからＤ−マンデレートを含む芳香族共重合体を生産するために、ＡｒｏＧｆｂｒ、ＰｈｅＡｆｂｒ、ＦｌｄＨ、ＰｈａＣ１４３７及びＨａｄＡを発現する大膓菌ＸＢ２０１ＴＢＡＬでアミコラトプシスオリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）由来のヒドロキシマンデレート合成酵素（ＨｍａＳ）、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのヒドロキシマンデレート酸化酵素（Ｈｍｏ）及びＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｓのＤ−マンデレート脱水素酵素（Ｄｍｄ）を発現させた。前記操作された菌株を２０ｇ／Ｌのグルコースと１ｇ／Ｌのナトリウム３ＨＢを含む培地で培養する場合、乾燥細胞重さの１６．４重量％のポリ（９２．９ｍｏｌ％の３ＨＢ−ｃｏ−６．３ｍｏｌ％Ｄ−フェニルラクテート−ｃｏ−０．８ｍｏｌ％Ｄ−マンデレート）を生産した。
【００４９】
したがって、本発明は、さらに他の観点で、炭素源からアセチル−ＣｏＡ生成能を有する微生物であって、２−ヒドロキシイソカプロエート−ＣｏＡ転移酵素をコードする遺伝子、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子、ＤＡＨＰ（３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸）合成酵素をコードする遺伝子、コリスミ酸ムターゼ／プレフェネートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、Ｄ−ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ヒドロキシマンデレート合成酵素をコードする遺伝子、ヒドロキシマンデレート酸化酵素をコードする遺伝子及びＤ−マンデレート脱水素酵素をコードする遺伝子が導入されており、マンデレートを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエート生成能を有する組み換え微生物に関するものである。
【００５０】
本発明において、前記２−ヒドロキシイソカプロエート−ＣｏＡ転移酵素はクロストリジウムディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）６３０由来のｈａｄＡであることを特徴とすることができ、前記ヒドロキシアルカノエート合成酵素はＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．６−１９からなる群から選択される菌株由来のＰＨＡシンターゼ又は下記から選択されるアミノ酸配列を有するＰＨＡシンターゼの変異酵素であることを特徴とすることができる：
配列番号２のアミノ酸配列において、Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｌ４１２Ｍ、Ｓ４７７Ｒ、Ｓ４７７Ｈ、Ｓ４７７Ｆ、Ｓ４７７Ｙ、Ｓ４７７Ｇ、Ｑ４８１Ｍ、Ｑ４８１Ｋ及びＱ４８１Ｒからなる群から選択される１種以上の変異を含むアミノ酸配列；
配列番号２のアミノ酸配列において、Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｌ４１２Ｍ、Ｓ４７７Ｇ及びＱ４８１Ｍの変異を有するアミノ酸配列（Ｃ１３３５）；
配列番号２のアミノ酸配列において、Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｋの変異を有するアミノ酸配列（Ｃ１３１０）；及び
配列番号２のアミノ酸配列において、Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｒの変異を有するアミノ酸配列（Ｃ１３１２）。
【００５１】
本発明において、前記ＤＡＨＰ（３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸）合成酵素をコードする遺伝子は配列番号８で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子であることを特徴とすることができ、前記コリスミ酸ムターゼ／プレフェネートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は配列番号９で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子であることを特徴とすることができ、前記Ｄ−ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は配列番号１０で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子であることを特徴とすることができる。
【００５２】
本発明において、前記ヒドロキシマンデレート合成酵素をコードする遺伝子は配列番号１１で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子であることを特徴とすることができ、前記ヒドロキシマンデレート酸化酵素をコードする遺伝子は配列番号１２で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子であることを特徴とすることができ、前記Ｄ−マンデレート脱水素酵素をコードする遺伝子は配列番号１３で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子であることを特徴とすることができる。
【００５３】
本発明の微生物は、外部から３ＨＢの供給がなくもポリマーを生産するために、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ生合成に関与するβ−ケトチオラーゼをコードする遺伝子とアセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼをコードする遺伝子がさらに導入されていることを特徴とすることができる。
【００５４】
本発明は、さらに他の観点で、（ａ）前記組み換え微生物を培養してマンデレートを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエートを生成させる段階；及び（ｂ）前記生成されたマンデレートを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエートを取得する段階を含む、マンデレートを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエートの製造方法に関するものである。
【００５５】
また、本発明では、本発明の組み換え菌株を用いて、多様な長鎖２−ＨＡを含むポリヒドロキシアルカノエートの製造が可能であるかを確認するために、長鎖２−ＨＡモノマーである２−ヒドロキシイソカプロエート（２ＨＩＣ）、２−ヒドロキシヘキサノエート（２ＨＨ）及び２−ヒドロキシオクタノエート（２ＨＯ）を単量体として使用してポリマー生産能を確認した。その結果、２−ヒドロキシイソカプロエート、２−ヒドロキシヘキサノエート又は２−ヒドロキシオクタノエートを含む共重合体を生成することを確認し、培地内に含有された２−ＨＡの濃度が増加するほど共重合体内に含む単量体のモル分率が増加することを確認した（表４、表５及び表６）。
【００５６】
したがって、本発明は、さらに他の観点で、（ａ）前記芳香族単量体又は長鎖２−ＨＡを単量体として含むポリヒドロキシアルカノエート生成能を有する組み換え微生物を２−ヒドロキシイソカプロエート、２−ヒドロキシヘキサノエート及び２−ヒドロキシオクタノエートからなる群から選択される化合物を含む培地で培養する段階；及び（ｂ）２−ヒドロキシイソカプロエート、２−ヒドロキシヘキサノエート及び２−ヒドロキシオクタノエートからなる群から選択される化合物を単量体として含むポリヒドロキシアルカノエートを取得する段階を含む、２−ヒドロキシイソカプロエート、２−ヒドロキシヘキサノエート及び２−ヒドロキシオクタノエートからなる群から選択される化合物を単量体として含むポリヒドロキシアルカノエートの製造方法に関するものである。
【００５７】
本発明では、ＰＨＡ生成が可能な他の芳香族単量体として３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピオネート（３ＨＰｈ）を使って芳香族ポリマーの生産を確認した。大膓菌ＸＢ２０１ＴＢＡ菌株を２０ｇ／Ｌのグルコース、０．５ｇ／Ｌの３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピオン酸及び１ｇ／Ｌのナトリウム３ＨＢを含む培地で培養すれば、ポリ（３３．３ｍｏｌ％３ＨＢ−ｃｏ−１８ｍｏｌ％Ｄ−フェニルラクテート−ｃｏ−４８．７ｍｏｌ％３ＨＰｈ）を乾燥細胞重さの１４．７重量％で生産することを確認した（図８ｃ及び図８ｄ）。このような結果は、本発明で開発されたＨａｄＡと変異されたＰＨＡ合成酵素が多様な芳香族ポリエステルの製造に広く使えることを示唆する。
【００５８】
最後に、代謝的に操作された大膓菌によって生産される芳香族ＰＨＡの物質特性を調査した。ポリ（５２．１ｍｏｌ％３ＨＢ−ｃｏ−４７．９ｍｏｌ％Ｄ−フェニルラクテート）は無晶形であり、共重合中のＤ−フェニルラクテートのモル分率が増加するにつれて分子量が減少するにもかかわらず、Ｔｇは２３．８６℃まで大きく増加した。また、ポリマー内に芳香族を含む共重合体は結晶化度が減少した。ポリマーの芳香族環がＰ（３ＨＢ）の結晶化を妨げると推測される。Ｐ（３ＨＢ）の場合、強い結晶性によって高い脆性（ｂｒｉｔｔｌｅｎｅｓｓ）を示す反面、生成された共重合体の場合、結晶化度の低下及びＴｇの向上によって機械的靭性の向上をもたらした。
【００５９】
本発明では、多様な芳香族ポリエステルの製造のために、細菌プラットフォームシステムを開発した。本発明の芳香族高分子生産システムは、芳香族化合物をそのＣｏＡ誘導体に活性化するための新しい広範囲な基質範囲を有するＣｏＡ−転移酵素を確認し、これらの芳香族ＣｏＡ誘導体を重合することができるＰＨＡ合成酵素変異体及び生体内で芳香族単量体を過剰生成する経路を代謝の設計及び最適化によって樹立した。
【００６０】
本発明の多くの様態で、いくつかの芳香族モノマーを使用して立証したように、このようなシステムは多様な芳香族重合体の製造に使われることができる。例えば、本発明によれば、ＨａｄＡ（又は関連酵素）及びＰＨＡ合成酵素が所望の芳香族モノマーを収容するように操作することができる。本発明で開発されたバクテリアプラットフォームシステムは再生可能な非食糧バイオマスから芳香族ポリエステルの製造のためのバイオプロセスを確立するのに寄与することができる。
【００６１】
本発明で、“ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）”は適した宿主内でＤＮＡを発現させることができる調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含むＤＮＡ製造物を意味する。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、又は簡単に潜在的ゲノム挿入物であってもよい。適当な宿主によって形質転換されれば、ベクターは宿主ゲノムに無関係に複製して機能することができるか、あるいは一部の場合にゲノム自体に統合されることができる。プラスミドが現在ベクターの最も通常的に使われる形態であるので、本発明の明細書で、“プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）”及び“ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）”は時々互いに交換して使われる。本発明の目的上、プラスミドベクターを用いることが好ましい。このような目的で使われることができる典型的なプラスミドベクターは、（ａ）宿主細胞当たり数百個のプラスミドベクターを含むように効率的に複製できるようにする複製開始点、（ｂ）プラスミドベクターに形質転換された宿主細胞が選発されるようにする抗生剤耐性遺伝子及び（ｃ）外来ＤＮＡ断片が挿入されることができる制限酵素切断部位を含む構造を持っている。適切な制限酵素切断部位が存在しなくても、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプター（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｄａｐｔｏｒ）又はリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を使えば、ベクターと外来ＤＮＡを容易にライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）することができる。
【００６２】
ライゲーションの後、ベクターは適切な宿主細胞に形質転換されなければならない。本発明において、選好される宿主細胞は原核細胞である。適した原核宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α、Ｅ．ｃｏｌ  ＪＭ１０１、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ１７７６、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ−１Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ２１などを含む。しかし、ＦＭＢ１０１、ＮＭ５２２、ＮＭ５３８及びＮＭ５３９のようなＥ．ｃｏｌｉ菌株及び他の原核生物の種（ｓｐｅｉｃｅｓ）及び属（ｇｅｎｅｒａ）なども使われることができる。前述したＥ．ｃｏｌｉに加え、アグロバクテリウムＡ４のようなアグロバクテリウム属菌株、バシラスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のようなバシリ（ｂａｃｉｌｌｉ）、サルモネラティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）又はセラチアマルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）のようなさらに他の場内細菌及び多様なシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属菌株が宿主細胞として用いられることができる。
【００６３】
原核細胞の形質転換はＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａの１．８２セクションに記述された塩化カルシウム方法を使って容易に達成することができる。選択的に、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）(Neumann et al., EMBO J., 1:841, 1982)もこのような細胞の形質転換に使われることができる。
【００６４】
本発明による遺伝子の過発現のために使われるベクターは当該分野に公知となった発現ベクターが使われることができ、ｐＥＴ系ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使うことが好ましい。前記ｐＥＴ系ベクターを使ってクローニングすれば、発現するタンパク質の末端にヒスチジン基が結合されて出るので、前記タンパク質を効果的に精製することができる。クローニングされた遺伝子から発現したタンパク質を分離するためには当該分野に公知となった一般的な方法を用いることができ、具体的に、Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｈｉｓ−結合レジン（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使うクロマトグラフィー方法を用いて分離することができる。本発明において、前記組み換えベクターはｐＥＴ−ＳＬＴＩ６６であることを特徴とすることができ、前記宿主細胞は大膓菌又はアグロバクテリウムであることを特徴とすることができる。
【００６５】
本発明で、“発現調節配列（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）”という表現は、特定の宿主生物で作動可能に連結されたコーディング配列の発現に必須なＤＮＡ配列を意味する。このような調節配列は、転写を実施するためのプロモーター、その転写を調節するための任意のオペレーター配列、及び適したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列及び転写及び解読の終決を調節する配列を含む。例えば、原核生物に適した調節配列は、プロモーター、任意のオペレーター配列及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを含む。プラスミドにおいて遺伝子の発現量に一番影響を及ぼす因子はプロモーターである。高発現用のプロモーターとして、ＳＲαプロモーターとサイトメガロヴィルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）由来のプロモーターなどが好ましく使われる。本発明のＤＮＡ配列を発現させるために、非常に多様な発現調節配列のいずれでもベクターに使われることができる。有用な発現調節配列には、例えばＳＶ４０又はアデノヴィルスの初期及び後期プロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣ又はＴＲＣシステム、Ｔ３及びＴ７プロモーター、ファージラムダの主要オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコードタンパク質の調節領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他のグリコール分解酵素に対するプロモーター、前記ホスファターゼのプロモーター、例えばＰｈｏ５、酵母アルファ−交配システムのプロモーター及び原核細胞又は真核細胞又はヴィルスの遺伝子発現を調節すると知られたその他の配列及びこれらの多くの組合が含まれる。Ｔ７プロモーターは大膓菌で本発明のタンパク質を発現させるのに有用に使われることができる。
【００６６】
核酸は、他の核酸配列と機能的関係で配置されるとき、“作動可能に連結（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）”される。これは、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が調節配列（等）に結合されるとき、遺伝子発現ができるようにする方式で連結された遺伝子及び調節配列（等）であり得る。例えば、前配列（ｐｒｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）又は分泌リーダー（ｌｅａｄｅｒ）に対するＤＮＡはポリペプチドの分泌に参加する前タンパク質として発現する場合、ポリペプチドに対するＤＮＡに作動可能に連結され；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コーディング配列に作動可能に連結されるか；あるいはリボソーム結合部位は、配列の転写に影響を及ぼす場合、コーディング配列に作動可能に連結されるか；あるいはリボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置される場合、コーディング配列に作動可能に連結される。一般に、“作動可能に連結された”は、連結されたＤＮＡ配列が接触し、かつ分泌リーダーの場合、接触してリーディングフレーム内に存在することを意味する。しかし、エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）は接触する必要がない。これらの配列の連結は便利な制限酵素部位でライゲーション（連結）によってなされる。その部位が存在しない場合、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプター（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｄａｐｔｏｒ）又はリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を使う。
【００６７】
本明細書で使用された用語“発現ベクター”は通常異種のＤＮＡ断片が挿入された組み換えキャリア（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｃａｒｒｉｅｒ）であり、一般的に二重鎖のＤＮＡ断片を意味する。ここで、異種ＤＮＡは宿主細胞で天然的に発見されないＤＮＡである異形ＤＮＡを意味する。発現ベクターは一旦宿主細胞内にあれば宿主染色体ＤＮＡに無関係に複製することができ、ベクターの数個のコピー及びその挿入された（異種）ＤＮＡが生成されることができる。
【００６８】
当該分野に周知されたように、宿主細胞で形質感染遺伝子の発現水準を高めるためには、該当遺伝子が、選択された発現宿主内で機能を発揮する転写及び解読発現調節配列に作動可能に連結されなければならない。好ましくは、発現調節配列及び該当遺伝子は細菌選択マーカー及び複製開始点（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｒｉｇｉｎ）をともに含んでいる一つの発現ベクター内に含まれることになる。宿主細胞が真核細胞の場合には、発現ベクターは真核発現宿主内で有用な発現マーカーをさらに含まなければならない。
【００６９】
上述した発現ベクターによって形質転換又は形質感染された宿主細胞は本発明のさらに他の側面をなす。本明細書で使用された用語“形質転換”はＤＮＡが宿主として導入され、ＤＮＡが染色体外因子として又は染色体統合完成によって複製可能になることを意味する。本明細書で使用された用語“形質感染”は任意のコーディング配列が実際に発現するかにかかわらず、発現ベクターが宿主細胞によって収容されることを意味する。
【００７０】
もちろん、全てのベクターと発現調節配列が本発明のＤＮＡ配列を発現するのに全てが同等に機能を発揮しないということを理解しなければならない。同様に、全ての宿主が同じ発現システムに対して同一に機能を発揮しない。しかし、当業者であれば、過度な実験的負担なしに本発明の範囲を逸脱しない範疇内で多くのベクター、発現調節配列及び宿主の中で適切に選択することができる。例えば、ベクターの選択においては宿主を考慮しなければならない。これはベクターがその内部で複製されなければならないからである。ベクターの複製数、複製数を調節することができる能力及び当該ベクターによってコーディングされる他のタンパク質、例えば抗生剤マーカーの発現も考慮されなければならない。発現調節配列の選定においても、さまざまな因子を考慮しなければならない。例えば、配列の相対的強度、調節可能性及び本発明のＤＮＡ配列との相性など、特に可能性ある二次構造に関連して考慮しなければならない。単細胞宿主は、選定されたベクター、本発明のＤＮＡ配列によってコーディングされる産物の毒性、分泌特性、タンパク質を正確にフォルディングすることができる能力、培養及び発酵要件、本発明のＤＮＡ配列によってコーディングされる産物を宿主から精製することにおける容易性などの因子を考慮して選定しなければならない。これらの変数の範囲内で、当業者は本発明のＤＮＡ配列を発酵又は大規模動物培養で発現させることができる各種のベクター／発現調節配列／宿主組合せを選定することができる。発現クローニングによって本発明によるタンパク質のｃＤＮＡをクローニングしようとするときのスクリーニング法として、バインディング法（ｂｉｎｄｉｎｇ法）、パニング法（ｐａｎｎｉｎｇ法）、フィルムエマルジョン法（ｆｉｌｍ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ法）などが適用されることができる。
【００７１】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものに解釈されないことは当該分野で通常の知識を有する者に明らかであろう。
【００７２】
下記の実施例では組み換え微生物として大膓菌を使ったが、炭素源からアセチル−ＣｏＡを生成する微生物であれば制限なしに使うことができ、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属などが使える。
本発明で使用又は製作された組み換え菌株、プラスミド及びプライマーを表１〜３に示した。
【００７３】
【表１】
0006854909.tif 000002
【００７４】
【表２】
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0006854909.tif 000004
0006854909.tif 000005
【００７５】
【表３】
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0006854909.tif 000008
【００７６】
実施例１：組み換え２−ヒドロキシイソカプロエートＣｏＡ−転移酵素の製作
ＣｏＡ供与体としてアセチル−ＣｏＡを使って芳香族基質のスペクトラムの広い酵素を捜し出した。ＦｌｄＡに対する相同酵素を識別するために配列類似性分析を実施し、他の起源の多様なＦｌｄＡの中でＦｌｄＡと４８％以上のアミノ酸配列同一性を有するクロストリジウムディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の２−イソカプレノイル−ＣｏＡ：２−ヒドロキシイソカプロエートＣｏＡ−転移酵素（ＨａｄＡ、配列番号１）をスクリーニングした（図２）。
【００７７】
ＨａｄＡをコードする遺伝子を含む組み換えベクターを製作するために、クロストリジウムディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）６３０菌株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、ＨａｄＡ−ｈｉｓＦ、ＨａｄＡ−ｈｉｓＲプライマーでＰＣＲを行って、Ｃ末端（Ｃ  ｔｅｒｍｉｎｕｓ）にｈｉｓ−ｔａｇが付いた２−ヒドロキシイソカプロエート−ＣｏＡ転移酵素をコードするｈｉｓ＿ＨａｄＡ遺伝子断片を製作した。
【００７８】
ついで、前記製造されたｈｉｓ＿ＨａｄＡ断片をＴ７プロモーターの強い遺伝子発現を進めるｐＥＴ２２ｂプラスミドに制限酵素（ＮｄｅＩ及びＮｏｔＩ）で処理した後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを処理して、制限酵素で切断されたｈｉｓ＿ＨａｄＡ断片及びｐＥＴ２２ｂプラスミドを接合させることにより、組み換えプラスミドであるｐＥＴ２２ｂ＿ｈｉｓＨａｄＡを製作した（図２）。
【００７９】
前記ｐＥＴ２２ｂ＿ｈｉｓＨａｄＡを大膓菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）に導入させた後、培養し、ＩＰＴＧを添加してＨａｄＡ発現を誘導した後、Ｈｉｓ−ｔａｇを用いてＮｉ−ＮＴＡスピンキット（Ｑｕｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で培養液からＨａｄＡを精製した（図３ａ）。
【００８０】
実施例２：２−ヒドロキシイソカプロエートＣｏＡ−転移酵素の基質多様性の確認
ＨａｄＡがアセチル−ＣｏＡを供与体として使えるかを確認するために、実施例１で製造したＨａｄＡを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析を遂行した。
１０μｇのＨａｄＡを０．１ｍＭアセチル−ＣｏＡ及び１０ｍＭ基質を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に添加し、３０℃で１０分間反応を遂行した。反応後、０．１ｍＭのオキサル酢酸、５μｇクエン酸生成酵素及び０．５ｍＭの５．５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）を添加した。その後、遊離したＣｏＡの量を４１２ｎｍでの吸光度を測定して分析した（図３ｂ）。
【００８１】
生成される脂肪族及び芳香族アシル−ＣｏＡの分析はＥｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ１８カラム（５μｍ、４．６×１５０ｍｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ）を備えたＬＣ−ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズ及びＬＣ／ＭＳＤ  ＶＬ、Ａｇｉｌｅｎｔ）で遂行した。
【００８２】
その結果、図４に示したように、ＨａｄＡがアセチル−ＣｏＡをＣｏＡ供与体として使用してマンデレート、４−ヒドロキシマンデレート、フェニルラクテート、４−ヒドロキシフェニルラクテート、２−ヒドロキシ−４−フェニルブチレート、３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピオネート及び４−ヒドロキシ安息香酸を基質として使用して、前記基質を該当ＣｏＡ誘導体に転換することができることを確認した。
図５にはＨａｄＡが転換することができる多様な基質のＣｏＡ転換反応を分子式で示した。
【００８３】
実施例３：芳香族単量体の生成が増加した組み換え菌株の製作
ｉｎ  ｖｉｖｏでグルコースからＤ−フェニルラクテートを生成するように大膓菌を操作した。芳香族化合物の生合成は３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸（ＤＡＨＰ）の合成から始まり、前記ＤＡＨＰはＤＡＨＰ合成酵素によるホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）とエリトロース−４−リン酸（Ｅ４Ｐ）の縮合によって生成される。生成されたＤＡＨＰはフェニルピルベート（ＰＰＡ）に転換された後、Ｄ−ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＦｌｄＨ）によってＤ−フェニルラクテートに転換される（図１）。芳香族化合物の生合成のための代謝経路は多様な阻害機構によって複雑に制御されると知られている。ａｒｏＧによってコーディングされるＤＡＨＰ合成酵素とｐｈｅＡによってコーディングされるコリスミ酸ムターゼ／プレフェネートデヒドロゲナーゼの発現はＬ−フェニルアラニンによって阻害される(ribe, D. E. et al., J. Bacteriol. 127:1085, 1976)。
【００８４】
本発明では、Ｌ−フェニルアラニンによるフィードバック阻害を解除するために、フィードバック阻害耐性突然変異ＡｒｏＧｆｂｒ［ＡｒｏＧ（Ｄ１４６Ｎ）］及びＰｈｅＡｆｂｒ［ＰｈｅＡ（Ｔ３２６Ｐ）］を構築した(Zhou, H. Y. et al., Bioresour. Technol. 101:4151, 2010; Kikuchi, Y. et al., Appl. Environ. Microbiol. 63:761, 1997)。ＡｒｏＧｆｂｒ、ＰｈｅＡｆｂｒ及びＣ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ａ  ｓｔｒ．ＡＴＣＣ  ３５０２のＦｌｄＨを発現する大膓菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅを製作した。
【００８５】
ｐＫＭ２１２−ＡｒｏＧｆｂｒを構築するために、フィードバック阻害耐性突然変異である３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート（ｈｅｐｔｕｌｏｓｏｎａｔｅ）−７−リン酸合成酵素遺伝子（ａｒｏＧ）をプライマーＡｒｏＧ−Ｆ及びＡｒｏＧ−Ｒを用いてプラスミドｐＴｙｒ−ａ(Na, D. et al., Nature Biotechnol. 31:170, 2013)を鋳型としてＰＣＲ産物を製造し、前記ＰＣＲ産物を制限酵素（ＥｃｏＲＩ／ＨｉｄＩＩＩ）を用いて、ｐＫＭ２１２−ＭＣＳ(Park, S. J. et al., Metab. Eng. 20:20, 2013)と連結して、ｐＫＭ２１２−ＡｒｏＧｆｂｒを製作した。
【００８６】
ｐＫＭ２１２−ＡｒｏＧｆｂｒＰｈｅＡｆｂｒプラスミドを次のように構築した。第一、単一変異された塩基（Ｔ９７６Ｇ）のプライマーＰｈｅＡ−Ｆ及びＰｈｅＡｍｕｔ−Ｒを用いて大膓菌のゲノムＤＮＡから９９１ｂｐのＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した。第二、単一変異された塩基（Ａ９７６Ｃ）及びＰｈｅＡ−ＲのプライマーＰｈｅＡｍｕｔ−Ｆを用いて大膓菌のゲノムＤＮＡから２００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。
【００８７】
ついで、混合された２個の断片を鋳型として使用して１１６１ｂｐのＤＮＡ断片をオーバーラップＰＣＲでプライマーＰｈｅＡ−Ｆ及びＰｈｅＡ−Ｒで増幅した。ＰＣＲ産物を、制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩ）を使用して、前記製作されたｐＫＭ２１２−ＡｒｏＧｆｂｒと連結した。
【００８８】
ｐＡＣＹＣ−ＦｌｄＨ構築のために、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ａｓｔｒ．ＡＴＣＣ  ３５０２のＤ−ラクテートデヒドロゲナーゼ（ｆｌｄＨ）を使った。ｆｌｄＨ遺伝子のコドン使用頻度は大膓菌に最適化し、大膓菌コドン最適化ｆｌｄＨ遺伝子をプライマーＦｌｄＨ−Ｆ及びＦｌｄＨ−Ｒを用いて増幅した。鋳型としてｐＵＣ５７−ＦｌｄＨｏｐｔ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）を用いて実施した。
【００８９】
ＰＣＲ産物を制限酵素（ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ）を使用して、ｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｓｗｅｄｅｎ）と連結してｐＴｒｃ−ＦｌｄＨを製作した。ついで、ｔｒｃプロモーター及びｒｒｎＢターミネーター結合したｆｌｄＨ遺伝子を、ｐＴｒｃ−ＦｌｄＨを鋳型としてプライマーＴｒｃ−Ｆ及びＴｅｒ−Ｒを用いたＰＣＲで増幅した。増幅されたＰＣＲ産物を制限酵素（ＸｈｏＩ／ＳａｃＩ）を使ってｐＡＣＹＣ１８４ＫＳ（韓国特許公開第２０１５−０１４２３０４号）と連結してｐＡＣＹＣ−ＦｌｄＨを得た。
【００９０】
前記製作されたｐＫＭ２１２−ＡｒｏＧｆｂｒＰｈｅＡｆｂｒ、ｐＡＣＹＣ−ＦｌｄＨを大膓菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅに導入して、ＡｒｏＧｆｂｒ、ＰｈｅＡｆｂｒ及びＦｌｄＨを発現する組み換え大膓菌を製作した。
前記大膓菌は、１５．２ｇ／Ｌのグルコースを含むＭＲ培地で培養したとき、０．３７２ｇ／ＬのＤ−フェニルラクテートを生産した。
【００９１】
前記ＭＲ培地は１Ｌ当たり６．６７ｇのＫＨ２ＰＯ４、４ｇの（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、０．８ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．８ｇのクエン酸塩及び５ｍｌの微量の金属溶液を含み、前記微量金属溶液は０．５Ｍ  ＨＣｌ：１０ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２ｇのＣａＣｌ２、２．２ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｇのＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ、１ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．１ｇの（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ及び０．０２ｇのＮａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏを含む。
【００９２】
代謝工学によって芳香族単量体の生成量を増加させるために、グルコースからＤ−フェニルラクテートを少量（０．３７２ｇ／Ｌ）生産する前記ＡｒｏＧｆｂｒ、ＰｈｅＡｆｂｒ及びＦｌｄＨを発現する大膓菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ菌株を代謝工学的操作して収率を上昇させた。芳香族アミノ酸生合成を抑制するように調節する二重転写調節因子であるＴｙｒＲを欠失させたＡｒｏＧｆｂｒ、ＰｈｅＡｆｂｒ及びＦｌｄＨを発現する大膓菌ＸＢＴ菌株を製作した。
【００９３】
前記ＡｒｏＧｆｂｒ、ＰｈｅＡｆｂｒ及びＦｌｄＨを発現する大膓菌でｔｙｒＲ遺伝子の欠失はワンステップ不活性化方法を使って遂行した(Datsenko, K. A. et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 97:6640, 2000)。
【００９４】
前記大膓菌ＸＢＴ菌株は、１６．４ｇ／Ｌのグルコースを含むＭＲ培地で培養した結果、０．５ｇ／ＬのＤ−フェニルラクテートを生産して、ｔｙｒＲを欠失させなかった前記大膓菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ菌株より３０％高い生産性を示した。
【００９５】
Ｄ−フェニルラクテート生合成と衝突する経路を除去するために、大膓菌ＸＢＴでｐｏｘＢ（ピルビン酸酸化酵素をコードする遺伝子）、ｐｆｌＢ（ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子）、ａｄｈＥ（アセトアルデヒド脱水素酵素／アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子）及びｆｒｄＢ（フマル酸リダクターゼをコードする遺伝子）を欠失させた大膓菌ＸＢ２０１Ｔを製作した。
【００９６】
大膓菌ＸＢ２０１Ｔ菌株は１５．７ｇ／Ｌのグルコースから０．５５ｇ／ＬのＤ−フェニルラクテートを生産した。これは大膓菌ＸＢＴより１０％高い収率を示すものである。
追加的に、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏゲノム規模代謝フラックス分析による代謝工学分析を実施して、Ｄ−フェニルラクテート生産をもっと増加させようとした。
【００９７】
ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏフラックス応答分析のためには、２２５１個の代謝反応と１１３５個の代謝産物からなる大膓菌ｉＪＯ１３６６ゲノムスケールモデルを使い、Ｄ−フェニルラクテート生産に及ぶ中心及び芳香族アミノ酸生合成反応の影響を調査した。本発明のＸＢ２０１Ｔ菌株に反映するために、Ｄ−フェニルラクテート生合成の異種代謝反応（ｆｌｄＨ遺伝子）をモデルにさらに付け加え、該当フラックスをゼロに設定することによって遺伝子ノックアウトをモデルに反映させた。Ｄ−フェニルラクテート生成速度は目的関数で極大化させた反面、中心アミノ酸及び芳香族アミノ酸生合成反応フラックス値は最小値から最大値まで徐々に増加させた。シミュレーションで、グルコース反応速度は時間当り乾燥細胞重さ１ｇ当たり１０ｍｍｏｌに設定した。全てのシミュレーションはＧｕｒｏｂｉ  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ  ６．０及びＧｕｒｏｂｉＰｙパッケージ（Ｇｕｒｏｂｉ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ、Ｉｎｃ．Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）を使ってＰｙｔｈｏｎ環境で実行した。ＣＯＢＲＡｐｙ３２を使用して、ＣＯＢＲＡ互換ＳＢＭＬファイルの読み取り、書き込み及び作業を遂行した。
【００９８】
その結果、図６に示したように、チロシンアミノ転移酵素をコードするｔｙｒＢ遺伝子及びアスパラギン酸アミノ転移酵素をコードするａｓｐＣ遺伝子を前記大膓菌ＸＢ２０１Ｔ菌株から除去し、Ｌ−フェニルアラニン生合成を減少させてＤ−フェニルラクテートへの炭素流れを強化した。
【００９９】
前記ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏフラックス応答分析の結果として製作された大膓菌ＸＢ２０１ＴＢＡ菌株は１８．５ｇ／Ｌのグルコースから１．６２ｇ／ＬのＤ−フェニルラクテートを生産して収率が大きく高くなった。これは、ＡｒｏＧｆｂｒ、ＰｈｅＡｆｂｒ及びＦｌｄＨを発現する大膓菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ菌株のＤ−フェニルラクテート生産量より４．３５倍高くなったものである。
【０１００】
実施例４：組み換え菌株を用いた芳香族単量体を含むポリヒドロキシアルカノエートの製造
ＸＢ２０１ＴＢＡでＤ−ラクテートの形成を防止するために、ｌｄｈＡ遺伝子をさらに欠失してＸＢ２０１ＴＢＡＬ菌株を製作した。芳香族単量体を含むポリヒドロキシアルカノエートを製造するために、大膓菌ＸＢ２０１ＴＢＡＬ菌株でＰｈａＣ１４３７及びＨａｄＡを発現させた。
【０１０１】
ＰｈａＣ１４３７とＨａｄＡをコードする遺伝子を含む組み換えベクターを製作するために、クロストリジウムディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）６３０菌株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、ＨａｄＡ−ｓｂＦ、ＨａｄＡ−ｎｄＲプライマーでＰＣＲを行って、２−ヒドロキシイソカプロエート−ＣｏＡ転移酵素をコードするｈａｄＡ遺伝子断片を製作した。増幅されたＰＣＲ産物を制限酵素（ＳｂｆＩ／ＮｄｅＩ）を使ってｐ６１９Ｃ１４３７−ｐｃｔ５４０(Yang, T. H. et al. Biotechnol Bioeng 105: 150, 2010)と連結してｐ６１９Ｃ１４３７−ＨａｄＡを得た。前記製作されたｐ６１９Ｃ１４３７−ＨａｄＡを大膓菌ＸＢ２０１ＴＢＡＬに導入して、ＡｒｏＧｆｂｒ、ＰｈｅＡｆｂｒ、ＦｌｄＨ、ＰｈａＣ１４３７及びＨａｄＡを発現する組み換え大膓菌を製作した。前記大膓菌を２０ｇ／Ｌのグルコース及び１ｇ／Ｌのナトリウム３ＨＢを含むＭＲ培地で培養して、ポリ（５２．１ｍｏｌ％３ＨＢ−ｃｏ−４７．９ｍｏｌ％Ｄ−フェニルラクテート）を乾燥細胞重さの１５．８重量％の含量で生産した（図７）。また、流加式発酵（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）を介してポリ（５２．３ｍｏｌ％３ＨＢ−ｃｏ−４７．７ｍｏｌ％Ｄ−フェニルラクテート）を乾燥細胞重さの２４．３重量％の含量で生産した（図１０ａ及び図１０ｂ）。
【０１０２】
実施例５：組み換え菌株を用いた多様な芳香族単量体を含むポリヒドロキシアルカノエートの製造
大膓菌ＸＢ２０１ＴＢＡＬを用いたシステムが多様な芳香族共重合体の製造に使えるかを確認するために、マンデレートをモノマーとして使用して試験した。
ＡｒｏＧｆｂｒ、ＰｈｅＡｆｂｒ、ＦｌｄＨ、ＰｈａＣ１４３７及びＨａｄＡを発現する大膓菌ＸＢ２０１ＴＢＡＬを１ｇ／Ｌのナトリウム３ＨＢ及び０．５ｇ／ＬのＤ−マンデレートを含むＭＲ培地で培養した結果、ポリ（５５．２ｍｏｌ％３ＨＢ−ｃｏ−４３．０ｍｏｌ％Ｄ−フェニルラクテート−ｃｏ−１．８ｍｏｌ％Ｄ−マンデレート）を乾燥細胞重さの１１．６重量％の含量で製造し（図８ａ、ｂ）、Ｄ−マンデレートを基質としてＤ−マンデレートを含む芳香族重合体を成功的に製造した。
【０１０３】
ついで、代謝工学によってＤ−マンデレートをｉｎ  ｖｉｖｏで生産しようとした。グルコースからＤ−マンデレートを生産するために、ＡｒｏＧｆｂｒ、ＰｈｅＡｆｂｒ、ＦｌｄＨ、ＰｈａＣ１４３７及びＨａｄＡを発現する大膓菌ＸＢ２０１ＴＢＡＬでアミコラトプシスオリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）由来のヒドロキシマンデレート合成酵素（ＨｍａＳ）、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのヒドロキシマンデレート酸化酵素（Ｈｍｏ）及びロドトルラグラミニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）のＤ−マンデレート脱水素酵素（Ｄｍｄ）を発現させた。
【０１０４】
ｐＫＭ２１２−ＨｍａＳの構築のために、Ａ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓのヒドロキシマンデル酸合成酵素遺伝子（ｈｍａＳ）を使い、そのコドンを大膓菌で合成ベクターにクローニングしてプラスミドｐＵＣ５７−ＨｍａＳｏｐｔを製作した（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）。
【０１０５】
前記ｐＵＣ５７−ＨｍａＳｏｐｔを制限酵素（ＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩ）を使用してｐＫＭ２１２−ＭＣＳに連結した。ｐＫＭ２１２−ＨｍａＳＨｍｏを製作するために、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのヒドロキシマンデレート酸化酵素遺伝子（ｈｍｏ）からコドン最適化ｈｍｏ遺伝子を合成し（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）、プライマーＨｍｏ−Ｆ及びＨｍｏ−Ｒを用いたＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物を制限酵素（ＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ）を用いてｐＫＭ２１２−ＨｍａＳと連結して、ｐＫＭ２１２−ＨｍａＳＨｍｏを製作した。
【０１０６】
ｐＫＭ２１２−ＨｍａＳＨｍｏＤｍｄを構築するために、大膓菌コドン最適化ｄｍｄ遺伝子を含むｐＵＣ５７−Ｄｍｄを合成し（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）、プライマーＤｍｄ−Ｆ及びＤｍｄ−Ｒを用いたＰＣＲによって大膓菌コドン最適化Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ  Ｄ−マンデレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｄｍｄ）を増幅した。ＰＣＲ産物を制限酵素（ＢａｍＨＩ／ＳｂｆＩ）を使用してｐＫＭ２１２−ＨｍａＳＨｍｏと連結して、ｐＫＭ２１２−ＨｍａＳＨｍｏＤｍｄを製作した。
【０１０７】
前記製作されたｐＫＭ２１２−ＨｍａＳＨｍｏＤｍｄをＡｒｏＧｆｂｒ、ＰｈｅＡｆｂｒ、ＦｌｄＨ、ＰｈａＣ１４３７及びＨａｄＡを発現する大膓菌ＸＢ２０１ＴＢＡＬに導入して、マンデレート生産能を有する組み換え菌株を製作した。
【０１０８】
前記製作されたマンデレート生産能を有する組み換え菌株を２０ｇ／Ｌのグルコースと１ｇ／Ｌのナトリウム３ＨＢを含む培地で培養した結果、乾燥細胞重さの１６．４重量％のポリ（９２．９ｍｏｌ％の３ＨＢ−ｃｏ−６．３ｍｏｌ％Ｄ−フェニルラクテート−ｃｏ−０．８ｍｏｌ％Ｄ−マンデレート）を生産した。
【０１０９】
他の可能な芳香族単量体として３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピオネート（３ＨＰｈ）を使って芳香族ポリマーの生産を確認した。大膓菌ＸＢ２０１ＴＢＡＬ菌株を２０ｇ／Ｌのグルコース、０．５ｇ／Ｌの３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピオン酸及び１ｇ／Ｌのナトリウム３ＨＢを含む培地で培養すれば、ポリ（３３．３ｍｏｌ％３ＨＢ−ｃｏ−１８．０ｍｏｌ％Ｄ−フェニルラクテート−ｃｏ−４８．７ｍｏｌ％３ＨＰｈ）を乾燥細胞重さの１４．７重量％で生産することを確認した（図８ｃ及び図８ｄ）。このような結果は、本発明で開発された２−ヒドロキシイソカプロエート−ＣｏＡ転移酵素を用いたシステムが多様な芳香族ポリエステルの製造に広く使えることを示唆する。
【０１１０】
実施例６：組み換え菌株を用いた多様な長鎖２−ＨＡを含むポリヒドロキシアルカノエートの製造
本発明の２−ヒドロキシイソカプロエート−ＣｏＡ転移酵素を用いたシステムが多様な長鎖２−ＨＡを含むポリヒドロキシアルカノエートの製造に使えるかを確認するために、多様な長鎖２−ＨＡモノマー［２−ヒドロキシイソカプロエート（２ＨＩＣ）、２−ヒドロキシヘキサノエート（２ＨＨ）及び２−ヒドロキシオクタノエート（２ＨＯ）］を単量体として使用してポリマー生産能を確認した。ＰｈａＣ１４３７及びＨａｄＡを発現する大膓菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅを１ｇ／Ｌの３ＨＢ、２０ｇ／Ｌのグルコース及び濃度別（０．２５、０．５及び１ｇ／Ｌ）長鎖２−ＨＡを含むＭＲ培地で培養した結果、２−ヒドロキシイソカプロエート、２−ヒドロキシヘキサノエート又は２−ヒドロキシオクタノエートを含む共重合体を生成した。また、培地内に含有された２−ＨＡの濃度が増加するほど共重合体内に含まれる単量体のモル分率が増加することを確認することができた（表４、表５及び表６）。
【０１１１】
【表４】
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【０１１２】
【表５】
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【０１１３】
【表６】
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【０１１４】
実施例７：合成プロモーターに基づくフラックス調節による多様なモル分率の芳香族単量体を含むポリヒドロキシアルカノエートの製造
外部から３ＨＢを添加しなくても芳香族ＰＨＡを生産する菌株を製作するために、ＸＢ２０１ＴＢＡＬ菌株でＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａ  β−ｋｅｔｏｔｈｉｏｌａｓｅ（ＰｈａＡ）とアセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ（ＰｈａＢ）をさらに発現させ、３ＨＢ補充なしにグルコースで芳香族ＰＨＡを生産するかを確認した。
【０１１５】
その結果、予想のどおり、ＡｒｏＧｆｂｒ、ＰｈｅＡｆｂｒ、ＦｌｄＨ、ＰｈａＣ１４３７及びＨａｄＡを発現するＸＢ２０１ＴＢＡＬ菌株はＭＲ培地でポリ（８６．２ｍｏｌ％３ＨＢ−ｃｏ−１３．８ｍｏｌ％Ｄ−フェニルラクテート）を乾燥細胞重さの１８．０重量％で２０ｇ／Ｌのグルコースから生産した。また、産業的応用に重要な多様な単量体モル分率を有する芳香族ＰＨＡの生産を合成アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）プロモーター（ｈｔｔｐ：／／ｐａｒｔｓ．ｉｇｅｍ．ｏｒｇ／）を使ってＰｈａＡＢの代謝フラックスを調節して試みた。相異なる強度の５種のプロモーター（配列番号８９〜９３）の下でＰｈａＡＢを発現する５個の相異なるプラスミドを製作し、ＡｒｏＧｆｂｒ、ＰｈｅＡｆｂｒ、ＦｌｄＨ、ＰｈａＣ１４３７及びＨａｄＡを発現するＸＢ２０１ＴＢＡＬ菌株に導入した。
【０１１６】
ＰｈａＡＢ発現が減少するにつれてＤ−フェニルラクテート単量体モル分率は増加した。すなわち、それぞれ１１．０ｍｏｌ％、１５．８ｍｏｌ％、２０．０ｍｏｌ％、７０．８ｍｏｌ％及び８４．５ｍｏｌ％のＤ−フェニルラクテートを有する共重合体を製造することができた（図９ａ、図９ｂ及び表７）。また、ＢＢａ＿Ｊ２３１０３プロモーターの下でＰｈａＡＢを発現させることにより、ポリ（１５．５ｍｏｌ％３ＨＢ−ｃｏ−８４．５ｍｏｌ％Ｄ−フェニルラクテート）を乾燥細胞重さの４．３重量％で生産した（図９ｂ）。このような結果は、代謝フラックスを調節することにより、多様な芳香族単量体モル分率を有する芳香族ポリエステルを生成することができることを示唆する。
【０１１７】
【表７】
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【０１１８】
実施例８：流加式発酵による芳香族ポリヒドロキシアルカノエートの製造
本実施例では、ＡｒｏＧｆｂｒ、ＰｈｅＡｆｂｒ、ＦｌｄＨ、ＨａｄＡ、ＰｈａＣ１４３７及びＢＢａ＿Ｊ２３１１４プロモーターの下でＰｈａＡＢを発現する大膓菌ＸＢ２０１ＴＢＡＬ菌株のｐＨ−ｓｔａｔ培養を３ＨＢ供給なしに遂行した。培養９６時間後、重合体の含量が乾燥細胞重さの４３．８重量％であるポリ（６７．６ｍｏｌ％３ＨＢ−ｃｏ−３２．４ｍｏｌ％Ｄ−フェニルラクテート）を２．５ｇ／Ｌで生産した（図１０ｃ及び図１０ｄ）。
【０１１９】
また、芳香族ポリヒドロキシアルカノエートの生産をもっと向上させるために、大膓菌ＸＢ２０１ＴＢＡ染色体のｌｄｈＡ遺伝子をｆｌｄＨ遺伝子に取り替えて遺伝子発現システムを最適化した。また、ｌｄｈＡ遺伝子の天然プロモーターを強いｔｒｃプロモーターに取り替えてｆｌｄＨ遺伝子の発現を増加させた。パルス供給方法を用いてグルコースを供給する流加式発酵を進めた。ＡｒｏＧｆｂｒ、ＰｈｅＡｆｂｒ、ＦｌｄＨ、ＨａｄＡ、ＰｈａＣ１４３７及びＢＢａ＿Ｊ２３１１４プロモーターの下でＰｈａＡＢを発現する大膓菌ＸＢ２０１ＴＢＡＦ菌株は重合体の含量が乾燥細胞重さの５５．０重量％であるポリ（６９．１ｍｏｌ％３ＨＢ−ｃｏ−３８．１ｍｏｌ％Ｄ−フェニルラクテート）を１３．９ｇ／Ｌで流加式発酵によって生産した（図１０ｅ及び図１０ｆ）。生産量は１３．９ｇ／Ｌで、ＡｒｏＧｆｂｒ、ＰｈｅＡｆｂｒ、ＦｌｄＨ、ＨａｄＡ、ＰｈａＣ１４３７及びＢＢａ＿Ｊ２３１１４プロモーターの下でＰｈａＡＢを発現する大膓菌ＸＢ２０１ＴＢＡＬ菌株での生産量である２．５ｇ／Ｌより５．５６倍高かく、グルコース及び３ＨＢが添加された培地でＡｒｏＧｆｂｒ、ＰｈｅＡｆｂｒ、ＦｌｄＨ、ＨａｄＡ及びＰｈａＣ１４３７を発現する大膓菌ＸＢ２０１ＴＢＡＬ菌株の流加式培養によって取得されたものよりずっと高かった。このような結果は、芳香族ポリヒドロキシアルカノエートが操作された菌株（ＡｒｏＧｆｂｒ、ＰｈｅＡｆｂｒ、ＦｌｄＨ、ＨａｄＡ、ＰｈａＣ１４３７及びＢＢａ＿Ｊ２３１１４プロモーターの下でＰｈａＡＢを発現する大膓菌ＸＢ２０１ＴＢＡＦ菌株）の流加式培養によって高濃度で成功的に生産可能であることを示す。
【０１２０】
実施例９：芳香族単量体を含むポリヒドロキシアルカノエートの物性分析
最後に、代謝的に操作された大膓菌によって生産される芳香族ＰＨＡの物質特性を調査した。
ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の含量及びモノマーの組成はＧＣ又はＧＣ−ＭＳによって決定した。採取した細胞を蒸溜水で３回洗浄した後、２４時間凍結乾燥し、凍結乾燥細胞のＰＨＡは酸触媒されたメタノリシス（ｍｅｔｈａｎｏｌｙｓｉｓ）によって対応するヒドロキシメチルエステルに転換した。得られたメチルエステルはＡｇｉｌｅｎｔ  ７６８３自動注入器、フレームイオン化検出器及び溶融シリカ毛細管カラム（ＡＴＴＭ−Ｗａｘ、３０ｍ、ＩＤ ０．５３ｍｍ、厚さ１．２０μｍ、Ａｌｌｔｅｃｈ、アメリカ）を備えたＧＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ６８９０Ｎ、Ａｇｉｌｅｎｔ、アメリカ）を用いて分析した。ポリマーはクロロホルム抽出法で抽出し、溶媒抽出法を用いて細胞で精製した。ポリマー構造、分子量及び熱的性質はそれぞれ核磁気共鳴法（ＮＭＲ）、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）及び示差走査熱量計（ＤＳＣ）を用いて測定した。
【０１２１】
その結果、図７は大膓菌ＸＢ２０１ＴＢＡＬによって生産されたポリ（３ＨＢ−ｃｏ−Ｄ−フェニルラクテート）を分析した結果を示し、図８は大膓菌ＸＢ２０１ＴＢＡＬによって生産されたポリ（３ＨＢ−ｃｏ−Ｄ−フェニルラクテート−ｃｏ−Ｄ−マンデレート）を分析した結果を示した。
【０１２２】
ポリ（５２．１ｍｏｌ％３ＨＢ−ｃｏ−４７．９ｍｏｌ％Ｄ−フェニルラクテート）は無晶形であり、共重合体のＤ−フェニルラクテートのモール分率が増加するにつれて分子量の減少にもかかわらず、Ｔｇは２３．８６℃まで大きく増加した。また、ポリマーのうち、芳香族を含む共重合体は結晶化度が減少した。ポリマーの芳香族環がＰ（３ＨＢ）（立体化学によって誘導された）の結晶化を妨げると推測される。Ｐ（３ＨＢ）の場合、強い結晶性によって高い脆性（ｂｒｉｔｔｌｅｎｅｓｓ）を示す反面、生成された共重合体の場合、結晶化度の低下及びＴｇの向上によって機械的靭性の向上をもたらした。
【０１２３】
具体的構成を参照して本発明を詳細に記載したが、このような記載は好適な具現例に関するものであり、発明の範囲を制限しないことは当業者に自明なものである。よって、本発明の実質的範囲は出願された請求項及びその等価物によって定義されると言える。
【産業上の利用可能性】
【０１２４】
本発明によれば、芳香族単量体又は長鎖２−ＨＡを単量体として含む生分解性ポリマーを製造することができる。
【０１２５】
以上で本発明内容の特定部分を詳細に記述したが、当該分野の通常の知識を有する者にとって、このような具体的技術はただ好適な実施様態であるだけで、これによって本発明の範囲が制限されるものではない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は添付の請求項及びその等価物によって定義されると言える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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