(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【化１】
0006917649.tif 000017
式中、Ｒ１は置換または非置換のＣ１~５の線状または分枝状のアルキル、Ｃ５~６の環状アルキル、ＯまたはＮの１つ以上のヘテロ原子を含有する環原子数が５〜６の環状ヘテロアルキル、置換または非置換のＣ６~１２のアリール、またはＯまたはＮの１つ以上のヘテロ原子を含有する環原子数が５〜６のヘテロアリールであり、
Ｒ２は水素、エチル、アセチル、アセトキシ、カルボキシル、ベンゾイルオキシまたは３，４，５−トリヒドロキシベンゾイルオキシであり、
Ｒ３乃至Ｒ５は、それぞれ独立して水素、ヒドロキシル、メチル、メトキシ、アセトキシ、カルボキシルまたはベンゾイルオキシである。
【請求項２】
Ｒ１は、メチル、エチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、フェニルまたはベンジルであることを特徴とする請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項３】
Ｒ１はメチルであり、
Ｒ２は水素であり、
Ｒ４はヒドロキシルまたはメトキシであり、
Ｒ３及びＲ５はそれぞれ独立して水素、ヒドロキシルまたはメトキシであることを特徴とする請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項４】
前記化合物は、下記化学式２〜５のいずれかで表されることを特徴とする請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【化２】
0006917649.tif 000018
【化３】
0006917649.tif 000019
【化４】
0006917649.tif 000020
【化５】
0006917649.tif 000021
【請求項５】
請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する、線維症の予防または治療用医薬組成物。
【請求項６】
前記線維症は、特発性肺線維症（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、骨髄線維症（ｍｙｅｌｏｆｉｂｒｏｓｉｓ）、肝線維症（ｌｉｖｅｒ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）および腎臓線維症（ｋｉｄｎｅｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）よりなる群から選ばれたいずれかであるであることを特徴とする請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する、線維症の予防または改善用食品組成物。
【請求項８】
前記線維症は、特発性肺線維症（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、骨髄線維症（ｍｙｅｌｏｆｉｂｒｏｓｉｓ）、肝線維症（ｌｉｖｅｒ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）および腎臓線維症（ｋｉｄｎｅｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）よりなる群から選ばれたいずれかであるであることを特徴とする請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する、非アルコール性脂肪肝炎（ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ、ＮＡＳＨ）の治療用医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する、非アルコール性脂肪肝炎（ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ、ＮＡＳＨ）の改善用食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規化合物及びそれを有効成分として含有する、線維症または非アルコール性脂肪肝炎の予防、改善または治療用組成物に係り、さらに詳しくは、線維症の予防、改善または治療効果に優れた化学式１の新規化合物及びそれを有効成分として含有する、線維症または非アルコール性脂肪肝炎の予防、改善または治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
線維症（ｆｉｂｒｏｓｉｓ）は、再生や発生の過程で器官や組織に過度の線維性結合組織が形成される疾患であり、このような繊維性結合組織は、正常な線維組織の形成とは対照的である。器官や組織に繊維性結合組織が過剰に形成されると、組織が硬くなり、体液の流入が減少するなど、生体内で本来の機能を十分に行うことができなくなる。その原因としては、傷害、炎症、火傷、放射線、化学療法、リンパ浮腫などが知られている。このような線維症に起因する問題は、繊維性結合組織が形成される位置によって異なるが、主に肝、分泌器官、肺などが損傷を受ける。線維症には、代表的に、特発性肺線維症（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ、ＩＰＦ）、骨髄線維症（ｍｙｅｌｏ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、肝線維症（ｌｉｖｅｒ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）および腎臓線維症（ｋｉｄｎｅｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）がある。
【０００３】
現在、このような線維症の治療剤としてピルフェニドン（Ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅ、特発性肺線維症治療剤）、ニンテダニブ（Ｎｉｎｔｅｄａｎｉｂ、特発性肺線維症治療剤）、ルキソリチニブ（Ｒｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂ、骨髄線維症治療剤）などが知られているが、より効果的であり、人体に安全で製剤化の容易さに優れた新しい治療法の開発が必要である。
【０００４】
そこで、本発明者は、新たな線維症治療剤を開発するために線維症に関連する様々な研究を行い、特に上皮間葉移行（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ、ＥＭＴ）（以下、「ＥＭＴ」という。）に注目した研究を行った。
【０００５】
ＥＭＴは、正常細胞が腫瘍細胞に変わりながら中間段階である細胞骨格の変化により、細胞が移動しやすい間葉細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｃｅｌｌ）の形状に遺伝的に再プログラミング（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）される現象をいう。したがって、ＥＭＴ関与タンパク質の発現を抑制すると、腫瘍の転移及び増殖を抑制することができると考え、様々な研究者が、腫瘍治療剤を開発するために、このようなＥＭＴに関する研究を行っている。このＥＭＴの調節因子としては、Ｔｗｉｓｔ、Ｓｎａｉｌ、Ｓｌｕｇ、Ｅ-ｃａｄｈｅｒｉｎ、ｖｉｍｅｎｔｉｎ、ｃｏｌｌａｇｅｎ１  α１など、約数百個のものが知られている。
【０００６】
このようにＥＭＴ及び該ＥＭＴの調節因子に関する研究は、ほとんど、がんまたは腫瘍についてのみ行われてきた。しかし、本発明者は、従来の一部の研究結果に基づいてＥＭＴと線維症との関連性に着目し、ＥＭＴを調節できると線維症を予防及び治療することもできるものと期待している。
【０００７】
そこで、ＥＭＴと線維症との関連性に着目して線維症を効果的に予防、改善または治療することができる新たな物質を開発するために研究した結果、本明細書に記載された化学式１で表される化合物がＥＭＴを効果的に調節して線維症に対する優れた予防、改善または治療効果を示し、また、このような効果により非アルコール性脂肪肝炎をも効果的に改善または治療することができることを確認し、本発明を完成するに至った。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｗａｎｇ  Ｙ，Ｓｈｉ，Ｃｈａｉ  Ｋ，Ｙｉｎｇ  Ｘ，Ｚｈｏｕ  ＢＰ．Ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｓｎａｉｌ  ｉｎ  ＥＭＴ  ａｎｄ  Ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃｕｒｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ．２０１３  Ｎｏｖ；１３（９）：９６３−９７２．
【非特許文献２】Ｌｉｕ  ＣＹ，Ｌｉｎ  ＨＨ，Ｔａｎｇ  ＭＪ，Ｗａｎｇ  ＹＫ．Ｖｉｍｅｎｔｉｎ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍｅｃｈａｎｉｃｓ  ｂｙ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｏｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１５  Ｊｕｎ  ３０；６（１８）：１５９６６−８３．
【非特許文献３】Ｃａｌｚａｄｉｌｌａ  Ｂｅｒｔｏｔ  Ｌ，Ａｄａｍｓ  ＬＡ．Ｔｈｅ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｆ  Ｎｏｎ−Ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  Ｆａｔｔｙ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｓｃｉ．２０１６  Ｍａｙ  ２０；１７（５）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明の主な目的は、線維症の予防、改善または治療効果に優れた新規化合物を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、前記化合物を有効成分として含有する、線維症の予防、改善または治療用組成物を提供することである。
【００１１】
本発明のまた他の目的は、前記化合物を有効成分として含有する、非アルコール性脂肪肝炎の改善または治療用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の一態様によれば、本発明は、下記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【００１３】
【化１】
0006917649.tif 000002
【００１４】
式中、Ｒ１は置換または非置換のＣ１~５の線状または分枝状のアルキル、Ｃ５~６の環状アルキル、ＯまたはＮの１つ以上のヘテロ原子を含有する環原子数が５〜６の環状ヘテロアルキル、置換または非置換のＣ６~１２のアリール、またはＯまたはＮの１つ以上のヘテロ原子を含有する環原子数が５〜６のヘテロアリールであり、Ｒ２は水素、エチル、アセチル、アセトキシ、カルボキシル、ベンゾイルオキシまたは３，４，５−トリヒドロキシベンゾイルオキシであり、Ｒ３乃至Ｒ５は、それぞれ独立して水素、ヒドロキシル、メチル、メトキシ、アセトキシ、カルボキシルまたはベンゾイルオキシである。
【００１５】
本発明の他の態様によれば、本発明は、前記化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する、線維症の予防または治療用医薬組成物を提供する。
【００１６】
本発明のまた他の態様によれば、本発明は、前記化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する、線維症の予防または改善用食品組成物を提供する。
【００１７】
本発明のまた他の態様によれば、本発明は、前記化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する、非アルコール性脂肪肝炎（ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ、ＮＡＳＨ）の治療用医薬組成物を提供する。
【００１８】
本発明のまた他の態様によれば、本発明は、前記化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する、非アルコール性脂肪肝炎の改善用食品組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の新規化合物は、上皮間葉移行（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ、ＥＭＴ）の調節因子であるｓｎａｉｌおよびｖｉｍｅｎｔｉｎの発現を効果的に調節してＥＭＴの活性化を調節し、これにより線維症を効果的に予防、改善または治療することができる。しかも、本発明の新規化合物は、薬物動態特性も非常に優れて経口投与でも体内へ薬物の迅速な送達を可能にし、体内で安定した効果を発揮することができ、大きな副作用がなく安全に使うことができる。なお、本発明の新規化合物は、肝細胞の線維化を効果的に遮断することができるので、非アルコール性脂肪肝炎も効果的に改善または治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の化合物を示すものである。
【図２】本発明の一実施例による本発明の化合物の合成過程を示すものである。
【図３】本発明の一実施例による本発明の化合物の合成過程を示すものである。
【図４】本発明の一実施例による本発明の化合物の合成過程中、７−（ベンジルオキシ）−５−ヒドロキシ−２−フェニル−４Ｈ−クロメン−４−オンを製造し、ＬＣＭＳ−ＮＭＲで確認した結果である。
【図５】本発明の一実施例による本発明の化合物の合成過程中、７−（ベンジルオキシ）−５−メトキシ−２−フェニル−４Ｈ−クロメン−４−オンを製造し、ＬＣＭＳ−ＮＭＲで確認した結果である。
【図６】本発明の一実施例による本発明の化合物の合成過程中、１−（４−（ベンジルオキシ）−２−ヒドロキシ−６−メトキシフェニル）エタン−１−オンを製造し、ＬＣＭＳ−ＮＭＲで確認した結果である。
【図７】本発明の一実施例による本発明の化合物の合成過程中、１−（４−（ベンジルオキシ）−３，６−ジヒドロキシ−２−メトキシフェニル）エタン−１−オンを製造してＬＣＭＳ−ＮＭＲで確認した結果である。
【図８】本発明の一実施例による本発明の化合物の合成過程中、１−（４−（ベンジルオキシ）−６−ヒドロキシ−２，３−ジメトキシフェニル）エタン−１−オンを製造してＬＣＭＳ−ＮＭＲで確認した結果である。
【図９】本発明の一実施例による本発明の化合物の合成過程中、（Ｅ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−６−ヒドロキシ−２，３−ジメトキシフェニル）−３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロプ−２−エン−１−オンを製造し、ＬＣＭＳ−ＮＭＲで確認した結果である。
【図１０】本発明の一実施例による本発明の化合物の合成過程中、５−（ベンジルオキシ）−２−（３，４−ジメトキシフェニル）−６，７−ジメトキシ−４Ｈ−クロメン−４−オンを製造し、ＬＣＭＳ−ＮＭＲで確認した結果である。
【図１１】本発明の一実施例による本発明の化合物の合成過程中、２−（３，４−ジメトキシフェニル）−７−ヒドロキシ−５，６−ジメトキシ−４Ｈ−クロメン−４−オンを製造し、ＬＣＭＳ−ＮＭＲで確認した結果である。
【図１２】本発明の一実施例による本発明の化合物の合成過程中、２−（３，４−ジメトキシフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−６−メトキシ−４Ｈ−クロメン−４−オンを製造し、ＬＣＭＳ−ＮＭＲで確認した結果である。
【図１３】本発明の一実施例による本発明の化合物の合成過程中、７−（２−ブロモエトキシ）−２−（３，４−ジメトキシフェニル）−５−ヒドロキシ−６−メトキシ−４Ｈ−クロメン−４−オンを製造し、ＬＣＭＳ−ＮＭＲで確認した結果である。
【図１４】本発明の一実施例による本発明の化合物の合成過程中、４−（２−（（２−（３，４−ジメトキシフェニル）−５−ヒドロキシ−６−メトキシ−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−７−イル）オキシ）エチル）ピペラジン−２−オン（化学式３の化合物）を製造し、ＬＣＭＳ−ＮＭＲで確認した結果である。
【図１５】肝星細胞（Ｈｅｐａｔｉｃ  Ｓｔｅｌｌａｔｅ  Ｃｅｌｌｓ、ＨＳＣ）由来間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ、ＭＳＣ）であるＯＮＧＨＥＰＡ１細胞の線維化に対する本発明の化合物の抑制効果を示すものである。
【図１６】ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞の線維化において上皮間葉移行（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ、ＥＭＴ）の代表的なマーカーであるα−平滑筋アクチン（ａｌｐｈａ  ｓｍｏｏｔｈｅ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎ、α−ＳＭＡ）の発現に対する本発明の化合物の抑制効果を示すものである。
【図１７】肺線維化患者から分離した線維芽細胞株（Ｄｉｓｅａｓｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｕｎｇ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ、ＤＨＬＦ：疾患ヒト肺線維芽細胞）の線維化に対する本発明の化合物の抑制効果を示すものである。
【図１８】ヒト肺腺癌細胞株Ａ５４９細胞株の線維化に対する本発明の化合物の抑制効果を示すものである。
【図１９】Ａ５４９細胞株でＥＭＴの代表的マーカーであるＳｎａｉｌおよびＶｉｍｅｎｔｉｎの発現に対する本発明の化合物の抑制効果を示すものである。
【図２０】肝ミクロソームに対する本発明の化合物の代謝的安定性を評価した結果である。
【図２１】経口投与による本発明の化合物の薬物動態特性を評価した結果である。
【図２２】本発明の化合物に対する比較化合物の細胞線維化での効果を調べた結果である。
【図２３】本発明の化合物に対する比較化合物の細胞線維化での効果を調べた結果である。
【図２４】本発明の化合物に対する比較化合物の細胞線維化での効果を調べた結果である。
【図２５】本発明の化合物の製剤化に伴う薬物動態特性を比較した結果である。
【図２６】本発明の化合物または対照化合物（ピルフェニドン：ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅ）の投与による線維症動物モデルの体重変化を示すグラフである。Ｓｈａｍ（シャム）、正常動物モデル；ビヒクルコントロール（Ｖｅｈｉｃｌｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）、３０％ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−ｂｅｔａ−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ、ＨＰＣＤ）のみを経口投与した化合物非処理の線維症動物モデル；ピルフェニドン１００ｍｐｋ  ＰＯ（３０％ＨＰＣＤ）、ピルフェニドンを３０％ＨＰＣＤに溶解し１００ｍｐｋで経口投与した線維症動物モデル；化合物（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ）１  １０〜１００ｍｐｋ  ＰＯ、本発明の化合物を３０％ＨＰＣＤに溶解し１０〜１００ｍｐｋで経口投与した線維症動物モデル。
【図２７】本発明の化合物または対照化合物（ピルフェニドン）の投与による線維症動物モデルの右肺重量の変化を示すグラフである。Ｓｈａｍ、正常動物モデル；ビヒクルコントロール、３０％ＨＰＣＤのみを経口投与した化合物非処理の線維症動物モデル；ピルフェニドン１００ｍｐｋ  ＰＯ（３０％ＨＰＣＤ）、ピルフェニドンを３０％ＨＰＣＤに溶解し１００ｍｐｋで経口投与した線維症動物モデル；化合物１  １０〜１００ｍｐｋ  ＰＯ、本発明の化合物を３０％ＨＰＣＤに溶解し１０〜１００ｍｐｋで経口投与した線維症動物モデル。
【図２８】本発明の化合物または対照化合物（ピルフェニドン）の投与による線維症動物モデルの右肺内ヒドロキシプロリン（ｈｙｄｒｏｘｙ  ｐｒｏｌｉｎｅ）量の変化を示すグラフである。Ｓｈａｍ、正常動物モデル；ビヒクルコントロール、３０％ＨＰＣＤのみを経口投与した化合物非処理の線維症動物モデル；ピルフェニドン１００ｍｐｋ  ＰＯ（３０％ＨＰＣＤ）、ピルフェニドンを３０％ＨＰＣＤに溶解し１００ｍｐｋで経口投与した線維症動物モデル；化合物１  １０〜１００ｍｐｋ  ＰＯ、本発明の化合物を３０％ＨＰＣＤに溶解し１０〜１００ｍｐｋで経口投与した線維症動物モデル。
【図２９】本発明の化合物または対照化合物（ピルフェニドン）の投与による線維症動物モデルの右肺内のコラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）量の変化を示すグラフである。Ｓｈａｍ、正常動物モデル；ビヒクルコントロール、３０％ＨＰＣＤのみを経口投与した化合物非処理の線維症動物モデル；ピルフェニドン１００ｍｐｋ  ＰＯ（３０％ＨＰＣＤ）、ピルフェニドンを３０％ＨＰＣＤに溶解し１００ｍｐｋで経口投与した線維症動物モデル；化合物１  １０〜１００ｍｐｋ  ＰＯ、本発明の化合物を３０％ＨＰＣＤに溶解し１０〜１００ｍｐｋで経口投与した線維症動物モデル。
【図３０】本発明の化合物または対照化合物（ピルフェニドン）を投与した線維症動物モデルの左側肺組織の組織病理学コラーゲン形態計測（ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ）を行った結果である。Ｓｈａｍ、正常動物モデル；ビヒクルコントロール、３０％ＨＰＣＤのみを経口投与した化合物非処理の線維症動物モデル；ピルフェニドン１００ｍｐｋ  ＰＯ（３０％ＨＰＣＤ）、ピルフェニドンを３０％ＨＰＣＤに溶解し１００ｍｐｋで経口投与した線維症動物モデル；化合物１  １０〜１００ｍｐｋ  ＰＯ、本発明の化合物を３０％ＨＰＣＤに溶解し１０〜１００ｍｐｋで経口投与した線維症動物モデル。
【図３１】本発明の化合物または対照化合物（ピルフェニドン）を投与した線維症動物モデルのプラズマに存在する化合物の濃度を調べた結果である。ピルフェニドン１００ｍｐｋ  ＰＯ（３０％ＨＰＣＤ）、ピルフェニドンを３０％ＨＰＣＤに溶解し１００ｍｐｋで経口投与した線維症動物モデル；化合物１  １０〜１００ｍｐｋ  ＰＯ、本発明の化合物を３０％ＨＰＣＤに溶解し１０〜１００ｍｐｋで経口投与した線維症動物モデル。
【図３２】本発明の化合物または対照化合物（ピルフェニドン）を投与した線維症動物モデルの右肺内に存在する化合物の濃度を調べた結果である。ピルフェニドン１００ｍｐｋ  ＰＯ（３０％ＨＰＣＤ）、ピルフェニドンを３０％ＨＰＣＤに溶解し１００ｍｐｋで経口投与した線維症動物モデル；化合物１  １０〜１００ｍｐｋ  ＰＯ、本発明の化合物を３０％ＨＰＣＤに溶解し１０〜１００ｍｐｋで経口投与した線維症動物モデル。
【図３３】実験動物モデルの左肺組織をＨ＆Ｅおよびシリウスレッド（Ｓｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ）で染色した結果である。Ｓｈａｍ、正常動物モデル；＊、肺胞腔（Ａｌｖｅｏｌａｒ  ｓｐａｃｅ）；黒矢印（ｂｌａｃｋ  ａｒｒｏｗ）、肺胞中隔（Ａｌｖｅｏｌａｒ  ｓｅｐｔａ）；＃、細気管支（Ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｅ）。
【図３４】実験動物モデルの左肺組織をＨ＆Ｅおよびシリウスレッド（Ｓｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ）で染色した結果である。ビヒクルコントロール、３０％ＨＰＣＤのみを経口投与した化合物非処理の線維症動物モデル；黄色矢尻（ｙｅｌｌｏｗ  ａｒｒｏｗ  ｈｅａｄ）、繊維化が目立つ部位；黄色矢印（ｙｅｌｌｏｗ  ａｒｒｏｗ）、炎症細胞浸潤部位。
【図３５】実験動物モデルの左肺組織をＨ＆Ｅおよびシリウスレッド（Ｓｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ）で染色した結果である。ピルフェニドン１００ｍｐｋ  ＰＯ（３０％ＨＰＣＤ）、ピルフェニドンを３０％ＨＰＣＤに溶解し１００ｍｐｋで経口投与した線維症動物モデル；黄色矢尻（ｙｅｌｌｏｗ  ａｒｒｏｗ  ｈｅａｄ）、繊維化が目立つ部位；黄色矢印（ｙｅｌｌｏｗ  ａｒｒｏｗ）、炎症細胞浸潤部位。
【図３６】実験動物モデルの左肺組織をＨ＆Ｅおよびシリウスレッド（Ｓｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ）で染色した結果である。化合物１  １０ｍｐｋ  ＰＯ、本発明の化合物を３０％ＨＰＣＤに溶解し１０ｍｐｋで経口投与した線維症動物モデル；黄色矢尻（ｙｅｌｌｏｗ  ａｒｒｏｗ  ｈｅａｄ）、繊維化が目立つ部位；黄色矢印（ｙｅｌｌｏｗ  ａｒｒｏｗ）、炎症細胞浸潤部位。
【図３７】実験動物モデルの左肺組織をＨ＆Ｅおよびシリウスレッド（Ｓｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ）で染色した結果である。化合物１  ５０ｍｐｋ  ＰＯ、本発明の化合物を３０％ＨＰＣＤに溶解し５０ｍｐｋで経口投与した線維症動物モデル；黄色矢尻（ｙｅｌｌｏｗ  ａｒｒｏｗ  ｈｅａｄ）、繊維化が目立つ部位；黄色矢印（ｙｅｌｌｏｗ  ａｒｒｏｗ）、炎症細胞浸潤部位。
【図３８】実験動物モデルの左肺組織をＨ＆Ｅおよびシリウスレッド（Ｓｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ）で染色した結果である。化合物１  １００ｍｐｋ  ＰＯ、本発明の化合物を３０％ＨＰＣＤに溶解し１００ｍｐｋで経口投与した線維症動物モデル；黄色矢尻（ｙｅｌｌｏｗ  ａｒｒｏｗ  ｈｅａｄ）、繊維化が目立つ部位；黄色矢印（ｙｅｌｌｏｗ  ａｒｒｏｗ）、炎症細胞浸潤部位。
【図３９】実験動物モデルの肝組織をＨ＆Ｅで染色した結果である。Ｓｈａｍ、正常動物モデル；ビヒクルコントロール、３０％ＨＰＣＤのみを経口投与した化合物非処理の線維症動物モデル；ＣＶ、中心静脈（Ｃｅｎｔｒａｌ  ｖｅｉｎ）；黒矢印、壊死が発生した部位。
【図４０】実験動物モデルの肝組織をＨ＆Ｅで染色した結果である。ピルフェニドン１００ｍｐｋ  ＰＯ（３０％ＨＰＣＤ）、ピルフェニドンを３０％ＨＰＣＤに溶解し１００ｍｐｋで経口投与した線維症動物モデル；化合物１  １０ｍｐｋ  ＰＯ、本発明の化合物を３０％ＨＰＣＤに溶解し１０ｍｐｋで経口投与した線維症動物モデル；黒矢印、壊死が発生した部位。
【図４１】実験動物モデルの肝組織をＨ＆Ｅで染色した結果である。化合物１  ５０ｍｐｋ  ＰＯ、本発明の化合物を３０％ＨＰＣＤに溶解し５０ｍｐｋで経口投与した線維症動物モデル；実験動物モデルの肝組織をＨ＆Ｅで染色した結果である。化合物１  １００ｍｐｋ  ＰＯ、本発明の化合物を３０％ＨＰＣＤに溶解し１００ｍｐｋで経口投与した線維症動物モデル；黒矢印、壊死が発生した部位。
【図４２】本発明の化合物または対照化合物（テルミサルタン（ｔｅｌｍｉｓａｒｔａｎ）およびオベチコール酸（ｏｂｅｔｉｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ、ＯＣＡ））を投与した非アルコール性脂肪肝炎動物モデルの肝組織をＨ＆Ｅで染色した結果、および肝の形態を示す結果である。ビヒクルコントロール、０．５％ＣＭＣ＋１％Ｔｗｅｅｎ８０水溶液のみを経口投与した化合物非処理の非アルコール性脂肪肝炎動物モデル；化合物１  ５０〜１００ｍｐｋ、本発明の化合物を０．５％ＣＭＣ＋１％Ｔｗｅｅｎ８０水溶液に溶解し５０〜１００ｍｐｋで経口投与した非アルコール性脂肪肝炎動物モデル；テルミサルタン  ３０ｍｐｋ、テルミサルタンを０．５％ＣＭＣ＋１％Ｔｗｅｅｎ８０水溶液に溶解し３０ｍｐｋで経口投与した非アルコール性脂肪肝炎動物モデル；ＯＣＡ  ５０ｍｐｋ、ＯＣＡを０．５％ＣＭＣ＋１％Ｔｗｅｅｎ８０水溶液に溶解し３０ｍｐｋで経口投与した非アルコール性脂肪肝炎動物モデル。
【図４３】本発明の化合物または対照化合物（テルミサルタンおよびＯＣＡ）を投与した非アルコール性脂肪肝炎動物モデルの肝組織の炎症の程度および繊維化の程度、肝細胞のバルーニング（ｂａｌｌｏｏｎｉｎｇ）程度および脂肪蓄積の程度に基づいて、非アルコール性脂肪肝疾患(Ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ、ＮＡＦＬＤ）活動性スコア（ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｓｃｏｒｅ）をｔ−ｔｅｓｔにより統計処理した結果である。ビヒクル、０．５％ＣＭＣ＋１％Ｔｗｅｅｎ８０水溶液のみを経口投与した化合物非処理の非アルコール性脂肪肝炎動物モデル；化合物ｌｏｗ〜ｈｉｇｈ、本発明の化合物を０．５％ＣＭＣ＋１％Ｔｗｅｅｎ８０水溶液に溶解し５０〜１００ｍｐｋで経口投与した非アルコール性脂肪肝炎動物モデル；テルミサルタン、テルミサルタンを０．５％ＣＭＣ＋１％Ｔｗｅｅｎ８０水溶液に溶解し３０ｍｐｋで経口投与した非アルコール性脂肪肝炎動物モデル；ＯＣＡ、ＯＣＡを０．５％ＣＭＣ＋１％Ｔｗｅｅｎ８０水溶液に溶解し３０ｍｐｋで経口投与した非アルコール性脂肪肝炎動物モデル。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、下記化学式２で表される新規化合物またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【００２２】
【化２】
0006917649.tif 000003
【００２３】
式中、Ｒ１は置換または非置換のＣ１~５の線状または分枝状のアルキル、Ｃ５~６の環状アルキル、ＯまたはＮの１つ以上のヘテロ原子を含有する環原子数が５〜６の環状ヘテロアルキル、置換または非置換のＣ６~１２のアリール、またはＯまたはＮの１つ以上のヘテロ原子を含有する環原子数が５〜６のヘテロアリールであり、Ｒ２は水素、エチル、アセチル、アセトキシ、カルボキシル、ベンゾイルオキシまたは３，４，５−トリヒドロキシベンゾイルオキシであり、Ｒ３乃至Ｒ５は、それぞれ独立して水素、ヒドロキシル、メチル、メトキシ、アセトキシ、カルボキシルまたはベンゾイルオキシである。
【００２４】
本発明の新規化合物またはその薬学的に許容可能な塩は、線維症を予防、改善または治療することができる。
【００２５】
本発明の化合物またはその薬学的に許容可能な塩は、α−平滑筋アクチン（ａｌｐｈａ  ｓｍｏｏｔｈｅ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎ、α−ＳＭＡ）、ＳｎａｉｌおよびＶｉｍｅｎｔｉｎのような上皮間葉移行（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ、ＥＭＴ）に関与する重要な因子の発現を抑制して細胞の線維化を抑制することができる。
【００２６】
このような効果により、本発明の化合物またはその薬学的に許容可能な塩は、器官または組織の細胞が何らかの原因により繊維化して発生する疾患である線維症を予防、改善または治療することができる。
【００２７】
また、非アルコール性脂肪肝炎（Ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ、ＮＡＳＨ）も肝細胞の線維化が発生する疾患であるため、本発明の化合物またはその薬学的に許容可能な塩は、このような非アルコール性脂肪肝炎もまた改善または治療することができる。
【００２８】
特に、本発明の化合物またはその薬学的に許容可能な塩は、予め線維化するようにプログラミングされた状態の細胞の成長および繊維化を強く抑制し、正常細胞に戻すことができ、このような効果は、線維症が進行した状態でも正常な状態に戻すことが可能であるということを意味する。これは、本発明の化合物またはその薬学的に許容可能な塩が線維症の治療に非常に強力ごうぶつな効果を発揮できることを裏付けている。
【００２９】
本発明の化合物またはその薬学的に許容可能な塩は、肝ミクロソームによって容易に分解されたり他の物質に転移されたりしないので、体内で本来の構造をより長く維持しながら持続的な効果を発揮することができる。また、一般的に使用されるリン酸緩衝液での溶解性が低くないため製剤化に有利であり、ＣＹＰ４５０に対する抑制活性が低いため人体に安全である。さらに、また、経口投与により体内に素早く吸収されるため、投与の容易さにも非常に優れている。
【００３０】
前記のような繊維化抑制効果、体内安定性、人体に対する安全性などのために、本発明の化合物またはその薬学的に許容可能な塩において、前記Ｒ１は、好ましくはメチル、エチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、フェニルまたはベンジルであり、より好ましくはメチルである。また、Ｒ２は水素であり、Ｒ４はヒドロキシルまたはメトキシであり、Ｒ３及びＲ５はそれぞれ独立して水素、ヒドロキシルまたはメトキシであることが好ましい。より好ましくは、下記化学式３〜６のいずれかで表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩である。
【００３１】
【化３】
0006917649.tif 000004
【００３２】
【化４】
0006917649.tif 000005
【００３３】
【化５】
0006917649.tif 000006
【００３４】
【化６】
0006917649.tif 000007
【００３５】
前記本発明の化合物は、下記反応式１（化７）および反応式２（化８）のような方法により製造できる。
【００３６】
【化７】
0006917649.tif 000008
【００３７】
【化８】
0006917649.tif 000009
【００３８】
前記反応式において、Ｒ１乃至Ｒ５は、前記化学式１のＲ１乃至Ｒ５に対応する。
【００３９】
前記のような効果に基づいて、本発明は、前記化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する、線維症の予防または治療用医薬組成物を提供する。
【００４０】
このとき、前記線維症は、特発性肺線維症（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、骨髄線維症（ｍｙｅｌｏｆｉｂｒｏｓｉｓ）、肝線維症（ｌｉｖｅｒ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）および腎臓線維症（ｋｉｄｎｅｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）よりなる群から選ばれたいずれかであることが好ましい。
【００４１】
また、本発明は、前記化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する、線維症の予防または改善用食品組成物を提供する。
【００４２】
このとき、前記線維症は、特発性肺線維症、骨髄線維症、肝線維症および腎臓線維症よりなる群から選ばれたいずれかであることが好ましい。
【００４３】
また、本発明は、前記化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する、非アルコール性脂肪肝炎（ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ、ＮＡＳＨ）の治療用医薬組成物を提供する。
【００４４】
また、本発明は、前記化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する、非アルコール性脂肪肝炎の改善用食品組成物を提供する。
【００４５】
本発明の医薬組成物は、本発明の化合物またはその薬学的に許容可能な塩そのもの、または薬学的に許容される担体と混合した組成物であってもよい。
【００４６】
本発明の医薬組成物は、全組成物の重量を基準として、本発明の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を０．０００１〜１００重量％で含有してもよいと判断される。
【００４７】
本発明の医薬組成物は、臨床投与の際に経口または非経口投与が可能であり、非経口投与の際に腹腔内注射、直腸内注射、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射、子宮内硬膜注射、脳血管内注射または胸部内注射によって投与でき、一般的な医薬品製剤の形で使用できると判断される。
【００４８】
本発明の医薬組成物は、単独で、または手術、放射線治療、ホルモン療法、化学療法、および生物学的反応調節剤を使う方法と併用して使用できると判断される。
【００４９】
本発明の医薬組成物の１日投与量は、組成物に含有された本発明の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を基準として、体重１ｋｇ当たり約０．０００１〜１００ｍｇ、好ましくは０．００１〜５０ｍｇであり、１日１回〜数回に分けて投与できるが、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度などによってその範囲が多様である。
【００５０】
臨床投与の際に経口または非経口の様々な剤形に製剤化することができ、このとき、一般的に使用される充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調製することができる。
【００５１】
特に、本発明の化合物は、経口投与でも体内への高速吸収が可能であり、このとき、ＮＭＰ（Ｎ−メチル−２−ピロリドン）、ＰＥＧ４００、ＳＯＬＵＴＯＬ  ＨＳおよび水を使用して製剤化するか、ＨＰＣＤ（ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン）を使用して製剤化することが、生体利用率及び体内安定性のために好ましい。前記ＮＭＰ、ＰＥＧ４００、ＳＯＬＵＴＯＬ  ＨＳ及び水の割合は、好ましくは５〜１５：１０〜３０：１０〜３０：４０〜６０（ｖ／ｖ）であり、より好ましくは８〜１２：１５〜２５：１５〜２５：４５〜５５（ｖ／ｖ）である。ＨＰＣＤを用いて製剤化する場合、好ましくは１０〜５０％（ｗ／ｖ）ＨＰＣＤ水溶液に溶解させる方法を使用し、より好ましくは２０〜４０％（ｗ／ｖ）ＨＰＣＤ水溶液を使用する。
【００５２】
前記のようなＨＰＣＤで製剤化して線維症を予防、改善または治療するために本発明の化合物を経口投与する際に、マウスを基準として、１日投与量は、好ましくは体重１ｋｇ当たり１〜５０ｍｇであり、より好ましくは５〜２０ｍｇであり、ヒトを基準として、１日投与量は、好ましくは体重１ｋｇ当たり０．０８乃至４ｍｇであり、より好まくは０．４乃至１．６ｍｇである。
【００５３】
また、カルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、ＣＭＣ）およびＴｗｅｅｎ８０を用いて製剤化することもできるが、この際、好ましくはＣＭＣの濃度を０．１〜１％（ｗ／ｖ）とし、Ｔｗｅｅｎ８０濃度を０．１〜２％とする。前記のようなＣＭＣおよびＴｗｅｅｎ８０で製剤化して非アルコール性脂肪肝炎を予防、改善または治療するために本発明の化合物を経口投与する際に、ラット（Ｒａｔ）を基準として、１日投与量は、好ましくは体重１ｋｇ当たり１〜７０ｍｇであり、より好ましくは５〜６０ｍｇであり、ヒトを基準として、１日投与量は、好ましくは体重１ｋｇ当たり０．１６乃至１１．４ｍｇであり、より好ましくは０．８乃至９．７ｍｇである。
【００５４】
本発明の医薬組成物は、本発明の化合物またはその薬学的に許容可能な塩に、同一または類似の機能を示す有効成分を１種以上さらに含有してもよい。
【００５５】
本発明の食品組成物は、本発明の化合物またはその薬学的に許容可能な塩そのもの、または食品学的に許容される担体と混合した組成物であってもよい。このとき、本発明の化合物またはその薬学的に許容可能な塩の含有量は、前記医薬組成物中の含有量および投与量を基準として通常の方法により適切に調節できる。本発明の食品組成物は、食肉加工品、魚肉製品、豆腐、ムク（韓国風のこんにゃく）、お粥、ラーメンや麺などの麺類、醤油、味噌、コチュジャン（唐辛子味噌）、混合味噌（合わせ味噌）などの調味食品、ソース、お菓子、発酵乳やチーズなどの乳加工品、キムチやジャンアチ（韓国の漬物）などの漬物食品、果物、野菜、豆乳、発酵飲料などの飲み物の食品形態が採用可能であると認められる。なお、食品学的に許容された担体としては、前記薬学的に許容された担体も使用可能である。
【００５６】
以下、実施例及び実験例により本発明をさらに詳しく説明する。しかし、下記実施例及び実験例は単に本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲はこれらの例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５７】
本発明の化合物の製造
１−１．  ７−（ベンジルオキシ）−５−ヒドロキシ−２−フェニル−４Ｈ−クロメン−４−オン（前駆体化合物２）の製造（Ｓｔｅｐ−１）
本ステップは、図２のＳｔｅｐ−１に対応するもので、以下、具体的に説明する。
【００５８】
アセトン（７００ｍｌ）に５，７−ジヒドロキシ−２−フェニル−４Ｈ−クロメン−４−オン（前駆体化合物１）（７５ｇ；０．２９４ｍｏｌ；１ｅｑｕｉｖ）を懸濁し、炭酸カリウム（１２１．８ｇ；０．４４２  ｍｏｌ；３．０ｅｑｕｉｖ）および臭化ベンジル（７５．５ｇ；０．４４２ｍｏｌ；１．５ｅｑｕｉｖ）を０℃で一滴ずつ落とした。反応混合物を常温に温め、６０℃で５時間加熱した。反応完了はＴＬＣ（８：２／ＰＥ：ＥｔＯＡｃ；Ｒｆ〜０．５）で確認した。混合物を常温に冷やしフィルタでろ過して炭酸カリウムを除去した後、生成されたケーキを、ジクロロメタン(ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ、ＤＣＭ）で生成物が完全になくなるまで洗浄してろ過した後、ろ液を乾燥させて濃縮し、生成された固形物をジエチルエーテル（２００ｍｌ）でスラリー化した後、ろ過および吸引乾燥させて、黄色固形物状態の７−（ベンジルオキシ）−５−ヒドロキシ−２−フェニル−４Ｈ−クロメン−４−オン（前駆体化合物２）を得た（収率：９０．０ｇ；８８．６％）。
【００５９】
得られた７−（ベンジルオキシ）−５−ヒドロキシ−２−フェニル−４Ｈ−クロメン−４−オン（前駆体化合物２）を、以下の条件によるＬＣＭＳ−ＮＭＲで確認した。その結果は、図４のとおりである。
ＬＣＭＳ：Ｍａｓｓ  ｆｏｕｎｄ；（３４５．０；Ｍ＋１）
移動相：Ａ−０．１％  ＨＣＯＯＨ  ｉｎ  Ｈ２Ｏ，Ｂ−ＡＣＮ；Ｆｌｏｗ  Ｒａｔｅ−１．５ｍｌ／分；＋ｖｅ  ｍｏｄｅ
カラム：Ｚｏｒｂａｘ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｃ１８（５０×４．６ｍｍ，５μｍ）
Ｒｔ（ｍｉｎ）：３．４６；Ａｒｅａ％−９７．９７
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１２．８３（ｓ，１Ｈ），８．１０−８．１２（ｍ，２Ｈ），７．６２−７．６５（ｍ，３Ｈ），７．５１−７．６２（ｍ，２Ｈ），７．４３−７．５０（ｍ，２Ｈ），７．３８−７．４１（ｍ，３Ｈ），７．０６（ｓ，１Ｈ），６．９３（ｓ，１Ｈ），６．５１（ｄ，Ｊ＝２．４０Ｈｚ，１Ｈ），５．２７（ｓ，２Ｈ）．
【００６０】
１−２．  ７−（ベンジルオキシ）−５−メトキシ−２−フェニル−４Ｈ−クロメン−４−オン（前駆体化合物３）の製造（Ｓｔｅｐ−２）
本ステップは、図２のＳｔｅｐ−２に対応するもので、以下、具体的に説明する。
【００６１】
アセトン（９００ｍｌ）に前記７−（ベンジルオキシ）−５−ヒドロキシ−２−フェニル−４Ｈ−クロメン−４−オン（前駆体化合物２）（９０ｇ；０．２６１ｍｏｌ；１ｅｑｕｉｖ）を懸濁し、ＫＯＨ（４３．９ｇ；０．７８４ｍｏｌ；３ｅｑｕｉｖ）を常温で添加した。反応混合物を６０℃に温め、硫酸ジメチル（３７．１ｍｌ；０．３９２ｍｏｌ；１．５ｅｑｕｉｖ）を、６０℃でドロップ方式で添加した後、６０℃で５時間攪拌した。反応完了はＴＬＣ（１：１／ＰＥ：ＥｔＯＡｃ；Ｒｆ〜０．２）で確認した。混合物を常温に冷やし、１０％ＨＣｌ溶液を用いてｐＨを〜２程度に調整し、その次、フィルタでろ過して沈殿物を収集し、水で洗浄した後、１２時間吸引乾燥させて、黄色固形物状態の７−（ベンジルオキシ）−５−メトキシ−２−フェニル−４Ｈ−クロメン−４−オン（前駆体化合物３）を得た（収率：９０ｇ；９６％）。
【００６２】
得られた７−（ベンジルオキシ）−５−メトキシ−２−フェニル−４Ｈ−クロメン−４−オン（前駆体化合物３）を、以下の条件によるＬＣＭＳ−ＮＭＲで確認した。その結果は、図５のとおりである。
ＬＣＭＳ：Ｍａｓｓ  ｆｏｕｎｄ；（３５９．０；Ｍ＋１）
移動相：Ａ−０．１％  ＨＣＯＯＨ  ｉｎ  Ｈ２Ｏ，Ｂ−ＡＣＮ；Ｆｌｏｗ  Ｒａｔｅ−１．５ｍｌ／分；＋ｖｅ  ｍｏｄｅ
カラム：Ｚｏｒｂａｘ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｃ１８（５０×４．６ｍｍ，５μｍ）
Ｒｔ（ｍｉｎ）：２．９４；Ａｒｅａ％−９７．８５
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ８．０４−８．０６（ｍ，２Ｈ），７．４６−７．５８（ｍ，５Ｈ），７．３８−７．４４（ｍ，３Ｈ），７．００（ｄ，Ｊ＝２．００Ｈｚ，１Ｈ），６．８０（ｄ，Ｊ＝１．６０Ｈｚ，１Ｈ），６．６２（ｄ，Ｊ＝２．００Ｈｚ，１Ｈ），５．２７（ｓ，２Ｈ），３．８３（ｓ，３Ｈ）．
【００６３】
１−３．  １−（４−（ベンジルオキシ）−２−ヒドロキシ−６−メトキシフェニル）エタン−１−オン（前駆体化合物４）の製造（Ｓｔｅｐ−３）
本ステップは、図２のＳｔｅｐ−３に対応するもので、以下、具体的に説明する。
【００６４】
水酸化ナトリウム水溶液（５０％；６８６ｍｌ；８．７９ｍｏｌ；３５ｅｑｕｉｖ）に前記７−（ベンジルオキシ）−５−メトキシ−２−フェニル−４Ｈ−クロメン−４−オン（前駆体化合物３）（９０ｇ；０．２５１  ｍｏｌ；１ｅｑｕｉｖ）を懸濁し、ピリジン（４１７．１ｍｌ；５．０２ｍｏｌ；２０ｅｑｕｉｖ）を常温で添加した。暗茶色（ｄａｒｋ  ｂｒｏｗｎ）の混合物を強く攪拌し、ジエチレングリコール（４７５ｍｌ、５．０２ｍｏｌ、２０ｅｑｕｉｖ）をドロップ方式で添加した後、混合物を１００℃で加熱し、２時間攪拌した。反応完了はＴＬＣ（１：１／ＰＥ：ＥｔＯＡｃ；Ｒｆ〜０．５）で確認した。混合物を０℃に冷やし、１２Ｎ塩酸水溶液を用いてｐＨを１に調整し、酢酸エチル（２×５００ｍｌ）で抽出した。抽出された有機相を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液、水およびブライン溶液で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で溶媒を除去した。生成された残留物をジエチルエーテル（７００ｍｌ）に再溶解し、溶解されていない暗色の粒子をろ過して除去した。ろ液を真空濃縮して淡黄色固形物状態の１−（４−（ベンジルオキシ）−２−ヒドロキシ−６−メトキシフェニル）エタン−１−オン（前駆体化合物４）を得た（収率：７０ｇ；９７％）。
【００６５】
得られた１−（４−（ベンジルオキシ）−２−ヒドロキシ−６−メトキシフェニル）エタン−１−オン（前駆体化合物４）を、以下の条件によるＬＣＭＳ−ＮＭＲで確認した。その結果は、図６の通りである。
ＬＣＭＳ：Ｍａｓｓ  ｆｏｕｎｄ；（２７３．０；Ｍ＋１）
移動相：Ａ−０．１％  ＨＣＯＯＨ  ｉｎ  Ｈ２Ｏ，Ｂ−ＡＣＮ；Ｆｌｏｗ  Ｒａｔｅ−１．５ｍｌ／分；＋ｖｅ  ｍｏｄｅ
カラム：Ｚｏｒｂａｘ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｃ１８（５０×４．６ｍｍ，５μｍ）
Ｒｔ（ｍｉｎ）：３．１５；Ａｒｅａ％−９３．７９
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１３．７７（ｓ，１Ｈ），７．３５−７．４７（ｍ，５Ｈ），６．１８−６．２１（ｄ，２Ｈ），５．１８（ｓ，２Ｈ），３．８６（ｓ，３Ｈ），２．５１（ｓ，３Ｈ）．      
【００６６】
１−４．  １−（４−（ベンジルオキシ）−３，６−ジヒドロキシ−２−メトキシフェニル）エタン−１−オン（前駆体化合物５）の製造（Ｓｔｅｐ−４）
本ステップは、図２のＳｔｅｐ−４に対応するもので、以下、具体的に説明する。
【００６７】
テトラエチルアンモニウムヒドロキシド水溶液（３５％；６３２ｍｌ；１．４３ｍｏｌ；１３ｅｑｕｉｖ）に前記１−（４−（ベンジルオキシ）−２−ヒドロキシ−６−メトキシフェニル）エタン−１−オン（前駆体化合物４）（３０ｇ；０．１１０ｍｏｌ；１ｅｑｕｉｖ）を懸濁し、ピリジン（６９．４ｍｌ；０．８３６ｍｏｌ；７．６ｅｑｕｉｖ）を常温でドロップ方式で添加した。このとき、反応混合物は、鮮やかな暗色溶液になる。別のフラスコにおいて、水（１Ｌ）にペルオキソ二硫酸カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ）（５０．４９ｇ；０．１８７ｍｏｌ；１．７ｅｑｕｉｖ）を添加し、この溶液を、前記反応混合物に常温でドロップ方式で添加した後、２４時間攪拌した。ＴＬＣで出発物質の消滅を確認した後、０℃で反応混合物にＨＣｌを添加してｐＨを１〜２に調整した。生成された茶色（ｂｒｏｗｎ）の粘着性残留物をフィルタでろ過し、ろ液をジエチルエーテル（１×１００ｍｌ）で洗浄した。
【００６８】
分離された水相を亜硫酸ナトリウム（１１．０９ｇ；０．０．０８８ｍｏｌ；０．８ｅｑｕｉｖ）、ＨＣｌ（１１０ｍｌ）およびベンゼン（２２０ｍｌ）で処理し、この反応混合物を９５℃で１時間加熱した。反応完了はＴＬＣ（８：２／ＰＥ：ＥｔＯＡｃ；Ｒｆ〜０．３）で確認した。反応混合物を０℃に冷やし、酢酸エチル（２×３００ｍｌ）で抽出した。有機相をブライン溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧下で溶媒を除去した。残留物をシリカゲル（６０〜１２０ｍｅｓｈ）カラムクロマトグラフィーに適用し、酢酸エチル（１０〜１２％）添加石油エーテルで溶出させて、溶出物としての黄色固形物状態の１−（４−（ベンジルオキシ）−３，６−ジヒドロキシ−２−メトキシフェニル）エタン−１−オン（前駆体化合物５）を得た（収率：１０ｇ；３１％）。
【００６９】
得られた１−（４−（ベンジルオキシ）−３，６−ジヒドロキシ−２−メトキシフェニル）エタン−１−オン（前駆体化合物５）を、以下の条件によるＬＣＭＳ−ＮＭＲで確認した。その結果は、図７のとおりである。
ＬＣＭＳ：Ｍａｓｓ  ｆｏｕｎｄ；（２８９．０；Ｍ＋１）
移動相：Ａ−０．１％  ＨＣＯＯＨ  ｉｎ  Ｈ２Ｏ，Ｂ−ＡＣＮ；Ｆｌｏｗ  Ｒａｔｅ−１．５ｍｌ／分；＋ｖｅ  ｍｏｄｅ
カラム：Ｚｏｒｂａｘ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｃ１８（５０×４．６ｍｍ，５μｍ）
Ｒｔ（ｍｉｎ）：２．６８；Ａｒｅａ％−９１．０１
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１２．７６（ｓ，１Ｈ），８．３７（ｓ，１Ｈ），７．４１−７．５１（ｍ，２Ｈ），７．３１−７．３８（ｍ，３Ｈ），６．３８（ｓ，１Ｈ），５．２１（ｓ，２Ｈ），３．８４（ｓ，３Ｈ），２．５１（ｓ，３Ｈ）．
【００７０】
１−５．  １−（４−（ベンジルオキシ）−６−ヒドロキシ−２，３−ジメトキシフェニル）エタン−１−オン（前駆体化合物６）の製造（Ｓｔｅｐ−５）
本ステップは、図２のＳｔｅｐ−５に対応するもので、以下、具体的に説明する。
【００７１】
アセトン（３００ｍｌ）に前記１−（４−（ベンジルオキシ）−３，６−ジヒドロキシ−２−メトキシフェニル）エタン−１−オン（前駆体化合物５）（２８ｇ；０．０９７ｍｏｌ；１ｅｑｕｉｖ）を懸濁し、Ｋ  ２  ＣＯ  ３（２０ｇ；０．１４５ｍｏｌ；１．５ｅｑｕｉｖ）を、常温で添加した。反応混合物を６０℃に温め、硫酸ジメチル（１８．２ｍｌ；０．１４５ｍｏｌ；２ｅｑｕｉｖ）を６０℃でドロップ方式で添加した後、６０℃で５時間攪拌した。反応完了をＴＬＣで確認した後、混合物を常温に冷やし、ろ過してＫ  ２  ＣＯ  ３を除去し、次いで、ケーキをＤＣＭで洗浄してろ過した後、ろ液を乾燥させて濃縮し、その次、生成された残留物をシリカゲル（６０〜１２０ｍｅｓｈ）カラムクロマトグラフィーに適用し、酢酸エチル（８〜１０％）添加石油エーテルで溶出させて、溶出物としての白色固形物状態の１−（４−（ベンジルオキシ）−６−ヒドロキシ−２，３−ジメトキシフェニル）エタン−１−オン（前駆体化合物６）を得た（収率：２５ｇ；８５％）。
【００７２】
得られた１−（４−（ベンジルオキシ）−６−ヒドロキシ−２，３−ジメトキシフェニル）エタン−１−オン（前駆体化合物６）を、以下の条件によるＬＣＭＳ−ＮＭＲで確認した。その結果は、図８のとおりである。
ＬＣＭＳ：Ｍａｓｓ  ｆｏｕｎｄ；（３０３．０；Ｍ＋１）
移動相：Ａ−０．１％  ＨＣＯＯＨ  ｉｎ  Ｈ２Ｏ，Ｂ−ＡＣＮ；Ｆｌｏｗ  Ｒａｔｅ−１．５ｍｌ／分；＋ｖｅ  ｍｏｄｅ
カラム：Ｚｏｒｂａｘ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｃ１８（５０×４．６ｍｍ，５μｍ）  
Ｒｔ（ｍｉｎ）：３．１１；Ａｒｅａ％−９９．８５
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１２．９５（ｓ，１Ｈ），７．３６−７．４８（ｍ，５Ｈ），６．４５（ｓ，１Ｈ），５．２０（ｓ，２Ｈ），３．９６（ｓ，３Ｈ），３．９２（ｓ，３Ｈ），２．５１（ｓ，３Ｈ）．
【００７３】
１−６．（Ｅ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−６−ヒドロキシ−２，３−ジメトキシフェニル）−３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロプ−２−エン−１−オン（前駆体化合物７）の製造（Ｓｔｅｐ−６）
本ステップは、図２のＳｔｅｐ−６に対応するもので、以下、具体的に説明する。
【００７４】
３，４−ジメトキシベンズアルデヒド（１６．４ｇ；０．０９９ｍｏｌ；１．２ｅｑｕｉｖ）添加エタノール（２００ｍｌ）に前記１−（４−（ベンジルオキシ）−６−ヒドロキシ−２，３−ジメトキシフェニル）エタン−１−オン（前駆体化合物６）（２５ｇ；０．０８２ｍｏｌ；１ｅｑｕｉｖ）を懸濁し、ＫＯＨ（４６ｇ；０．０．８２ｍｏｌ；１ｅｑｕｉｖ）水溶液を常温で添加した後、反応混合物を常温で２４時間撹拌した。ＴＬＣ（６：４／ＰＥ：ＥｔＯＡｃ；Ｒｆ〜０．４）で７０〜７５％の産物形成を確認し、非反応出発物質は２４時間後にも完全に残っていた。混合物を真空濃縮し、残留物を硫酸水素ナトリウム水溶液とＤＣＭとに分画した。分離された有機相を水およびブライン溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。真空濃縮して生成された残留物をジエチルエーテル（１００ｍｌ）でスラリー化し、ろ過および吸引乾燥させて、黄色固形物状態の（Ｅ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−６−ヒドロキシ−２，３−ジメトキシフェニル）−３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロプ−２−エン−１−オン（前駆体化合物７）を得た（収率：２３．０ｇ；３９％）。
【００７５】
得られた（Ｅ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−６−ヒドロキシ−２，３−ジメトキシフェニル）−３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロプ−２−エン−１−オン（前駆体化合物７）を、以下の条件によるＬＣＭＳ−ＮＭＲで確認した。その結果は、図９のとおりである。
ＬＣＭＳ：Ｍａｓｓ  ｆｏｕｎｄ；（４５０．９；Ｍ＋１）
移動相：Ａ−０．１％ＨＣＯＯＨ  ｉｎ  Ｈ２Ｏ，Ｂ−ＡＣＮ；Ｆｌｏｗ  Ｒａｔｅ-１．５ｍｌ／分；＋ｖｅ  ｍｏｄｅ
カラム：Ｚｏｒｂａｘ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｃ１８（５０×４．６ｍｍ，５μｍ）
Ｒｔ（ｍｉｎ）：３．３４；Ａｒｅａ％−９８．１６
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１１．９６（ｓ，１Ｈ），７．４９−７．５７（ｍ，３Ｈ），７．４９−７．５７（ｍ，４Ｈ），７．２９−７．３９（ｍ，２Ｈ），７．０３（ｄ，Ｊ＝８．４０Ｈｚ，１Ｈ），６．４７（ｓ，１Ｈ），５．１９（ｓ，２Ｈ），３．８５（ｓ，３Ｈ），３．８３（ｓ，３Ｈ），３．７７（ｓ，３Ｈ），３．７４（ｓ，３Ｈ）．
【００７６】
１−７．  ５−（ベンジルオキシ）−２−（３，４−ジメトキシフェニル）−６，７−ジメトキシ−４Ｈ−クロメン−４−オン（前駆体化合物８）の製造（Ｓｔｅｐ−７）
本ステップは、図３のＳｔｅｐ−７に対応するもので、以下、具体的に説明する。
【００７７】
イソアミルアルコール（３００ｍｌ）に、前記（Ｅ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−６−ヒドロキシ−２，３−ジメトキシフェニル）−３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロプ−２−エン−１−オン（前駆体化合物７）（２１ｇ；０．０４６６ｍｏｌ；１ｅｑｕｉｖ）を懸濁し、二酸化セレン（２１ｇ；０．４６６ｍｏｌ；１０ｅｑｕｉｖ）を常温で添加した後、１４０℃で加熱して７時間攪拌した。ＴＬＣ（４：６／ＰＥ：ＥｔＯＡｃ；Ｒｆ〜０．２）で反応の完了を確認した後、混合物を常温に冷やし、生成された暗色粒子をセライトパッド上でろ過して除去した。パッドをＤＣＭで洗浄したろ液を真空下で濃縮した。生成された残留物をＤＣＭ（５００ｍｌ）に溶解し、ＮａＨＣＯ３水溶液、水およびブライン溶液で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で溶媒を除去した。残留物をシリカゲル（６０〜１２０ｍｅｓｈ）カラムクロマトグラフィーに適用し、酢酸エチル（５０〜６０％）添加石油エーテルで溶出させて、溶出物としての黄色固形物状態の５−（ベンジルオキシ）−２−（３，４−ジメトキシフェニル）−６，７−ジメトキシ−４Ｈ−クロメン−４−オン（前駆体化合物８）を得た（収率：１６ｇ；７６％）。
【００７８】
得られた５−（ベンジルオキシ）−２−（３，４−ジメトキシフェニル）−６，７−ジメトキシ−４Ｈ−クロメン−４−オン（前駆体化合物８）を、以下の条件によるＬＣＭＳ−ＮＭＲで確認した。その結果は、図１０の通りである。
ＬＣＭＳ：Ｍａｓｓ  ｆｏｕｎｄ；（４４９．０；Ｍ＋１）
移動相：Ａ−０．１％ＨＣＯＯＨ  ｉｎ  Ｈ２Ｏ，Ｂ−ＡＣＮ；Ｆｌｏｗ  Ｒａｔｅ−１．５ｍｌ／分；＋ｖｅ  ｍｏｄｅ
カラム：Ｚｏｒｂａｘ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｃ１８（５０×４．６ｍｍ，５μｍ）
Ｒｔ（ｍｉｎ）：２．８３；Ａｒｅａ％−９８．６２
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ７．５４（ｄ，Ｊ＝８．４０Ｈｚ，１Ｈ），７．４５（ｔ，Ｊ＝７．６０Ｈｚ，２Ｈ），７．３７（ｄ，Ｊ＝８．４０Ｈｚ，２Ｈ），７．１３（ｄ，Ｊ＝８．８０Ｈｚ，２Ｈ），６．８２（ｓ，１Ｈ），５．３０（ｓ，２Ｈ），３．８９（ｓ，３Ｈ），３．８５（ｓ，３Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ），３．７７（ｓ，３Ｈ）．
【００７９】
１−８．  ２−（３，４−ジメトキシフェニル）−７−ヒドロキシ−５，６−ジメトキシ−４Ｈ−クロメン−４−オン（前駆体化合物９）の製造（Ｓｔｅｐ−８）
本ステップは、図３のＳｔｅｐ−８に対応するもので、以下、具体的に説明する。
【００８０】
クロロホルム（２００ｍｌ）に前記５−（ベンジルオキシ）−２−（３，４−ジメトキシフェニル）−６，７−ジメトキシ−４Ｈ−クロメン−４−オン（前駆体化合物８）（１９ｇ  ；０．０４２４ｍｏｌ；１ｅｑｕｉｖ）を懸濁し、１０％Ｐｄ／Ｃ（炭素上のパラジウム：ｐａｌｌａｄｉｕｍ  ｏｎ  ｃａｒｂｏｎ）（３．８ｇ）を添加した後、反応物をバルーン（ｂａｌｌｏｏｎ）雰囲気下で常温で６〜７時間水素化した。ＴＬＣで反応の完了を確認した後、触媒をセライトパッドでろ過した。パッドを２０％ＭｅＯＨ添加ＤＣＭで洗浄し、ろ液を真空下で濃縮して暗褐色の固形物を得た。固形物を酢酸エチル（８０ｍｌ）で粉末化し、ろ過および吸引乾燥させて、黄色固形物状態の２−（３，４−ジメトキシフェニル）−７−ヒドロキシ−５，６−ジメトキシ−４Ｈ−クロメン−４−オン（前駆体化合物９）を得た（収率：１１．０ｇ；７２％）。
【００８１】
得られた２−（３，４−ジメトキシフェニル）−７−ヒドロキシ−５，６−ジメトキシ−４Ｈ−クロメン−４−オン（前駆体化合物９）を、以下の条件によるＬＣＭＳ−ＮＭＲで確認した。その結果は、図１１のとおりである。
ＬＣＭＳ：Ｍａｓｓ  ｆｏｕｎｄ；（３５９．０；Ｍ＋１）
移動相：Ａ−０．１％ＨＣＯＯＨ  ｉｎ  Ｈ２Ｏ，Ｂ−ＡＣＮ；Ｆｌｏｗ  Ｒａｔｅ−１．５ｍｌ／ｍｉｎ；＋ｖｅ  ｍｏｄｅ
カラム：Ｚｏｒｂａｘ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｃ１８（５０×４．６ｍｍ，５μｍ）
Ｒｔ（ｍｉｎ）：２．０７；Ａｒｅａ％−９９．６３
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１０．６９（ｓ，１Ｈ），７．６１（ｄ，Ｊ＝８．４０Ｈｚ，１Ｈ），７．５１（ｓ，１Ｈ），７．１１（ｄ，Ｊ＝８．４０Ｈｚ，１Ｈ），６．９０（ｓ，１Ｈ），６．７４（ｓ，１Ｈ），３．８７（ｓ，３Ｈ），３．８４（ｓ，３Ｈ），３．８０（ｓ，３Ｈ），３．７７（ｓ，３Ｈ）．
【００８２】
１−９．  ２−（３，４−ジメトキシフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−６−メトキシ−４Ｈ−クロメン−４−オン（前駆体化合物１０）の製造（Ｓｔｅｐ−９）
本ステップは、図３のＳｔｅｐ−９に対応するもので、以下、具体的に説明する。
【００８３】
アセトニトリル（１００ｍｌ）に前記２−（３，４−ジメトキシフェニル）−７−ヒドロキシ−５，６−ジメトキシ−４Ｈ−クロメン−４−オン（前駆体化合物９）（１１ｇ；０．０３０７ｍｏｌ；１ｅｑｕｉｖ）を懸濁し、ＡｌＣｌ  ３（２０．３ｇ；０．１５３ｍｏｌ；５ｅｑｕｉｖ）を常温で少しずつ添加した後、混合物を９０℃で２時間還流した。ＴＬＣで反応の完了を確認し、溶媒を蒸発乾燥させた。生成された残留物をＨＣＬ水溶液（１０％；２００ｍｌ）及びクロロホルム（２００ｍｌ）で処理し、反応混合物が透明になるまで還流した。ＴＬＣ（７：３／ＰＥ：ＥｔＯＡｃ；Ｒｆ〜０．４）で反応の完了を確認した後、反応混合物を常温に冷やし、有機相を分離した。水相をＤＣＭで再抽出し、有機相を水およびブライン溶液で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。残留物をシリカゲル（６０〜１２０ｍｅｓｈ）カラムクロマトグラフィーに適用し、ＤＣＭで溶出させて、溶出物としての黄色固形物状態の２−（３，４−ジメトキシフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−６−メトキシエトキシ−４Ｈ−クロメン−４−オン（前駆体化合物１０）を得た（収率：７．０ｇ；６６％）。
【００８４】
得られた２−（３，４−ジメトキシフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−６−メトキシ−４Ｈ−クロメン−４−オン（前駆体化合物１０）を、以下の条件によるＬＣＭＳ−ＮＭＲで確認した。その結果は、図１２のとおりである。
ＬＣＭＳ：Ｍａｓｓ  ｆｏｕｎｄ；（３４４．９；Ｍ＋１）
移動相：Ａ−０．１％ＨＣＯＯＨ  ｉｎ  Ｈ２Ｏ，Ｂ−ＡＣＮ；Ｆｌｏｗ  Ｒａｔｅ−１．５ｍｌ／分；＋ｖｅ  ｍｏｄｅ
カラム：Ｚｏｒｂａｘ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｃ１８（５０×４．６ｍｍ，５μｍ）
Ｒｔ（ｍｉｎ）：２．４４；Ａｒｅａ％−９８．３２
ＨＰＬＣ：９７．６４％
移動相：Ａ−０．１  ％  ＴＦＡ  ｉｎ  Ｈ２Ｏ，Ｂ−ＡＣＮ；Ｆｌｏｗ  Ｒａｔｅ−１．０ｍｌ／分
カラム：Ａｔｌａｔｉｓ  ｄＣ−１８（４．６×２５０）ｍｍ；５ｕ；
Ｒｔ（ｍｉｎ）：１２．６８；Ａｒｅａ％−９７．６４．
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１３．０５（ｓ，１Ｈ），１０．７３（ｓ，１Ｈ），７．６８−７．７１（ｍ，１Ｈ），７．５８（ｄ，Ｊ＝２．０４Ｈｚ，１Ｈ），７．１４（ｄ，Ｊ＝８．６４Ｈｚ，１Ｈ），６．９９（ｓ，１Ｈ），６．６５（ｓ，１Ｈ），３．８９（ｓ，３Ｈ），３．８６（ｓ，３Ｈ），３．７６（ｓ，３Ｈ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１８２．６，１６３．８，１５７．８，１５３．１，１５２．８，１５２．５，１４９．４，１３１．８，１２３．４，１２０．４，１１２．１，１０９．９，１０４．５，１０３．８，９４．８，６０．４，５６．３，５６．２．
【００８５】
１−１０．  ７−（２−ブロモエトキシ）−２−（３，４−ジメトキシフェニル）−５−ヒドロキシ−６−メトキシ−４Ｈ−クロメン−４−オン（前駆体化合物１１）の製造（Ｓｔｅｐ−１０）
本ステップは、図３のＳｔｅｐ−１０に対応するもので、以下、具体的に説明する。
【００８６】
テトラヒドロフラン（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ、ＴＨＦ）（４００ｍｌ、４０ｖｏｌ）に前記２−（３，４−ジメトキシフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−６−メトキシ−４Ｈ−クロメン−４−オン（前駆体化合物１０）（１０ｇ、２９ｍｍｏｌ、１ｅｑｕｉｖ．）および炭酸カリウム（１２．０４ｇ、８７．１ｍｍｏｌ、３．０ｅｑｕｉｖ．）を混合攪拌し、１，２−ジブロモエタン（２７．２８ｇ、１４５．２ｍｏｌ、５ｅｑｕｉｖ）およびＴＢＡＩ（ｔｅｔｒａｂｕｔｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ）（１．０５ｇ、０．００２９ｍｏｌ、０．１ｅｑｕｉｖ．）を添加した後、生成された混合物を６０℃で１６時間還流した。ＴＬＣで反応の完了を確認した後、減圧下でＴＨＦを除去して固形物を得た。固形物を過量のＴＨＦおよびメタノールで洗浄して固形物状態の７−（２−ブロモエトキシ）−２−（３，４−ジメトキシフェニル）−５−ヒドロキシ−６−メトキシ−４Ｈ−クロメン−４−オン（前駆体化合物１１）を得た（収率：８ｇ；６１％）。その後、さらに精製せずに次のステップで使用した。
【００８７】
得られた７−（２−ブロモエトキシ）−２−（３，４−ジメトキシフェニル）−５−ヒドロキシ−６−メトキシ−４Ｈ−クロメン−４−オン（前駆体化合物１１）を、以下の条件によるＬＣＭＳ−ＮＭＲで確認した。その結果は、図１３のとおりである。
ＬＣＭＳ：Ｍａｓｓ  ｆｏｕｎｄ；（４５１．０；Ｍ＋１）
移動相：Ａ−０．１％ＨＣＯＯＨ  ｉｎ  Ｈ２Ｏ，Ｂ−ＡＣＮ；Ｆｌｏｗ  Ｒａｔｅ−１．５ｍｌ／分；＋ｖｅ  ｍｏｄｅ
カラム：Ａｔｌａｎｔｉｓ  ｄＣ１８（５０×４．６ｍｍ，５μｍ）
Ｒｔ（ｍｉｎ）：３．１４；Ａｒｅａ％−８０．４１
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１２．９１（ｓ，１Ｈ），７．７３（ｄｄ，Ｊ＝５．６，２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．６０（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．１５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．０６（ｓ，１Ｈ），７．０２（ｓ，１Ｈ），４．５１（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ），３．９１（ｓ，３Ｈ），３．８５（ｓ，３Ｈ），３．７９（ｓ，３Ｈ）．
【００８８】
１−１１．  ４−（２−（（２−（３，４−ジメトキシフェニル）−５−ヒドロキシ−６−メトキシ−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−７−イル）オキシ）エチル）ピペラジン−２−オン（化合物１）の製造（Ｓｔｅｐ−１１）
本ステップは、図３のＳｔｅｐ−１１に対応するもので、以下、具体的に説明する。
【００８９】
アセトニトリル（８０ｍｌ）に前記７−（２−ブロモエトキシ）−２−（３，４−ジメトキシフェニル）−５−ヒドロキシ−６−メトキシ−４Ｈ−クロメン−４−オン（前駆体化合物１１）（８ｇ、１７．７ｍｍｏｌ、１．０ｅｑｕｉｖ．）およびピペラジン−２−オン（５．３３ｇ、５３．３ｍｍｏｌ、３．０ｅｑｕｉｖ．）を添加し、窒素雰囲気下で１２時間還流した。ＴＬＣで反応の完了を確認した後、減圧下でアセトニトリルを除去した。生成された粘性物質をＤＣＭおよび石油エーテルで粉末化して固形物を得、メタノール、ＤＣＭおよびＴＨＦで連続洗浄し乾燥させて、淡黄色固形物状態の４−（２−（（２−（３，４−ジメトキシフェニル）−５−ヒドロキシ−６−メトキシ−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−７−イル）オキシ）エチル）ピペラジン−２−オン（化合物１）（化学式３）を得た（収率：３．２ｇ；４１％）。
【００９０】
得られた４−（２−（（２−（３，４−ジメトキシフェニル）−５−ヒドロキシ−６−メトキシ−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−７−イル）オキシ）エチル）ピペラジン−２−オン（化合物１）を、以下の条件によるＬＣＭＳ−ＮＭＲで確認した。その結果は、図１４のとおりである。
ＬＣＭＳ：Ｍａｓｓ  ｆｏｕｎｄ（４７１．２；Ｍ＋１）
移動相：Ａ−０．１％  Ｆｏｒｍｉｃ  Ａｃｉｄ  ｉｎ  Ｈ２Ｏ；Ｂ−ＡＣＮ
カラム：Ａｔｌａｎｔｉｓ  ｄＣ１８（５０×４．６ｍｍ，５μｍ）
Ｒｔ（ｍｉｎ）：１．５１５；Ａｒｅａ％−９５．４８８
ＨＰＬＣ：９７．０３％
移動相：Ａ−０．１％ＴＦＡ  ｉｎ  Ｈ２Ｏ；Ｂ−Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ
カラム：Ａｔｌａｎｔｉｓ  ｄＣ１８（５０×４．６ｍｍ，５μｍ）
Ｒｔ（ｍｉｎ）：９．７４；Ａｒｅａ％−９７．０３
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１２．８９（ｓ，１Ｈ），７．７５（ｂｒ  ｓ．１Ｈ），７．７０（ｄｄ，Ｊ＝８．０，１．６Ｈｚ，１Ｈ），７．５８（ｓ，１Ｈ），７．１３（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），７．０２（ｄ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ，２Ｈ），４．２８（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ），３．８９（ｓ，３Ｈ），３．８６（ｓ，３Ｈ），３．７５（ｓ，３Ｈ），３．１７（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），３．１１（ｓ，２Ｈ），２．８７（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ），２．７３（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：１８２．４，１６９．２，１６３．９，１５７．５，１５３．１，１５２．９，１５２．２，１４９．１，１３２．７，１２３．４，１１９．９，１１１．０，１０８．６，１０６．１，１０４．１，９１．４，６７．１，６０．７，５７．０，５６．０，５５．９，５５．５，４９．４，４１．１
【００９１】
実験例１．本発明化合物の線維症に対する効果の調査
１−１．間葉系幹細胞を  対象とする効果実験
線維症に対する本発明の化合物の効果を調べるために、まずマウスの肝星細胞（Ｈｅｐａｔｉｃ  Ｓｔｅｌｌａｔｅ  Ｃｅｌｌｓ、ＨＳＣ）に由来し、無限に増殖できる間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ、ＭＳＣ）であるＯＮＧＨＥＰＡ１（ＫＣＴＣ１３０８６ＢＰ）細胞株を使用した。この細胞株は、トランスフォーミング増殖因子-β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ、ＴＧＦ−β）または血小板由来成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＰＤＧＦ）を処理する簡単な方法により、繊維化が誘導できる。
【００９２】
ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培地に接種（ｓｅｅｄｉｎｇ）して２４時間培養した後、それにＴＧＦ−βを処理（５ｎｇ／ｍｌ）して繊維化を誘導するか、またはＴＧＦ−βおよび本発明の化合物（５０μＭ）（ｉｎ  ＤＭＳＯ）を同時に処理して２４時間培養した後、細胞の線維化の程度、すなわち、筋線維芽細胞（ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）への分化の程度を、位相差顕微鏡（２００倍）で調べた。
【００９３】
このとき、具体的な実験方法は、Ｋｉｍ等の論文（Ｈａｎ−Ｓｏｏ  Ｋｉｍ、Ｊｕｎ−Ｈｗａｎ  Ｋｉｍ、Ｊｉ  Ｙｏｎｇ  Ｌｅｅ、Ｙｏｕｎｇ−Ｍｉｎ  Ｙｏｏｎ、Ｉｋ−Ｈｗａｎ  Ｋｉｍ、Ｈｏ−Ｓｕｐ  Ｙｏｏｎ、Ｂｙｕｎｇ−Ｓｏｏ  Ｙｏｕｎ。Ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｔｈｅｒｅｂｙ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ。ｂｉｏＲｘｉｖ  ｐｒｅｐｒｉｎｔ  ｆｉｒｓｔ  ｐｏｓｔｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  Ｆｅｂ．１６、２０１７；ｄｏｉ：ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／１０６５９１）に従った。
【００９４】
その結果、図１５に示すように、ＴＧＦ−βを処理した対照群は、細長い形の筋線維芽細胞に分化して、典型的な繊維化症状を示したのに対し、本発明の化合物を同時に処理した実験群は、正常対照群と違いがないほど繊維化症状がないことが分かった。
【００９５】
また、このような効果が上皮間葉移行（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ、ＥＭＴ）（以下、「ＥＭＴ」と略す。）に対する影響によるものかどうかを確認するために、各実験群の細胞におけるＥＭＴの代表的なマーカーであるα−平滑筋アクチン（ａｌｐｈａ  ｓｍｏｏｔｈｅ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎ、α−ＳＭＡ）の発現を、免疫蛍光染色および核染色（ＤＡＰＩ染色）を比較することにより調べた。
【００９６】
その結果、図１６に示すように、ＴＧＦ−βを処理した対照群では、α−ＳＭＡの有意に高い発現を示すのに対し、本発明の化合物を同時に処理した実験群では、正常対照群と違いがないほどα−ＳＭＡの発現を阻害することがわかった。
【００９７】
このような結果は、本発明の化合物が細胞のＥＭＴに影響を及ぼし、したがって筋線維芽細胞への分化を強力に抑制し、これにより、線維症、特に肝に発生する線維症または非アルコール性脂肪肝炎（ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ、ＮＡＳＨ）を効果的に予防または治療できることを裏付けている。
【００９８】
１−２．肺線維化患者の線維芽細胞株を対象とする効果実験
肺線維化患者から分離した線維芽細胞株（Ｄｉｓｅａｓｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｕｎｇ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ、ＤＨＬＦ：疾患ヒト肺線維芽細胞）（Ｌｏｎｚａ社、Ｓｗｉｓｓ）を培地に接種し、２４時間培養した後、それにＴＧＦ−βを処理（５ｎｇ／ｍｌ）して繊維化を誘導するか、またはＴＧＦ−βおよび本発明の化合物（５０μＭ）（ｉｎ  ＤＭＳＯ）を同時に処理し、２４時間、４８時間または７２時間培養した後、筋線維芽細胞への分化の程度を位相差顕微鏡（２００倍）で調べた。
【００９９】
その結果、図１７に示すように、非処理群およびＴＧＦ−βを処理した対照群では、細長い形の筋線維芽細胞に分化することにより典型的な繊維化症状を示すのに対し、本発明の化合物を同時に処理した実験群では、線維化症状がほとんどないだけでなく、細胞の成長を抑制することが分かった。
【０１００】
このような結果は、本発明の化合物が、予め繊維化するようにプログラミングされた状態の線維芽細胞の成長および線維化を強力に抑制し、正常細胞に戻すことにより、線維症、特に特発性肺線維症などの肺に発生する線維症を効果的に予防または治療できることを裏付けている。
【０１０１】
１−３．肺腺癌細胞株を対象とする効果実験
肺のＥＭＴ関連研究モデルとして使用されるヒト肺腺癌細胞株であるＡ５４９細胞株を培地に接種し、２４時間培養した後、それにＴＧＦ−βを処理（５ｎｇ／ｍｌ）またはＴＧＦ−βおよび本発明の化合物（２５または５０μＭｉｎ  ＤＭＳＯ）を同時に処理し、２４時間または４８時間培養した後、細胞を位相差顕微鏡（２００倍）で調べた。
【０１０２】
その結果、図１８に示すように、ＴＧＦ−βを処理した場合、細長い形の筋線維芽細胞に分化するのに対し、本発明の化合物を同時に処理した実験群は、このような現象を抑制することが分かった。
【０１０３】
また、このような効果がＥＭＴに対する影響によるものかどうかを確認するために、各実験群の細胞におけるＥＭＴの代表的なマーカーであるＳｎａｉｌおよびＶｉｍｅｎｔｉｎの発現をＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲで確認した。
【０１０４】
その結果、図１９に示すように、ＴＧＦ−βを処理した対照群では、これらマーカーの有意に高い発現を示すのに対し、本発明の化合物を同時に処理した実験群では、これらのマーカーの発現を著しく抑制したことがわかった。
【０１０５】
このような結果は、本発明の化合物が細胞のＥＭＴに影響を及ぼし、したがって筋線維芽細胞への分化を強力に抑制し、これにより、線維症、特に特発性肺線維症などの肺に発生する線維症を効果的に予防または治療できることを裏付けている。
【０１０６】
実験例２．本発明の化合物の薬物動態特性の調査
２−１．代謝安定性
本発明の化合物をラットの肝ミクロソーム（ｍｉｃｒｏｓｏｍｅ）およびＮＡＤＰＨと同時に培養し、次いで化合物が消失する割合を測定することにより、化合物の固有クリアランス値（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｖａｌｕｅ、ＣＬｉｎｔ  ｖａｌｕｅ）を計算した。このとき、対照群としてベラパミル（ｖｅｒａｐａｍｉｌ）およびアテノロール（ａｔｅｎｏｌｏｌ）を使用した。
【０１０７】
その結果、本発明の化合物は、アテノールに匹敵するほど十分に代謝的に安定であることが分かった（表１及び図２０を参照）。
【０１０８】
【表１】
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【０１０９】
２−２．緩衝液溶解度
本発明の化合物をリン酸緩衝液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ７．４）に１ｍｇ／ｍｌの濃度で添加して攪拌し、次いで１６時間後に試料をフィルタでろ過し、上澄み液をＨＰＬＣ−ＵＶで分析して、溶解された化合物の含有量を測定した。このとき、対照群として、カフェイン（ｃａｆｆｅｉｎｅ）およびジエチルスチルベステロール（ｄｉｅｔｈｙｌｓｔｉｌｂｅｓｔｅｒｏｌ）を使用した。
【０１１０】
その結果、本発明の化合物の緩衝液溶解度は、カフェインに比べて低いが、ジエチルスチルベステロールに比べて高いことが分かった（表２参照）。
【０１１１】
【表２】
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【０１１２】
２−３．ＣＹＰ４５０抑制の有無
本発明の化合物のＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ９に対する抑制有無を調べた。このとき、対照群として、ケトコナゾール（ｋｅｔｏｃｏｎａｚｏｌｅ）、キニジン（ｑｕｉｎｉｄｉｎｅ）およびスルファフェナゾール（ｓｕｌｆａｐｈｅｎａｚｏｌｅ）を使用した。
【０１１３】
その結果、本発明の化合物は、ＣＹＰ２Ｃ９に対する幾らかの抑制活性を有するが、対照群であるスルファフェナゾールに比べて相対的に低い抑制活性を有し、ＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ２Ｄ６に対する抑制活性がほとんどないかまたは非常に低いことが分かった（表３参照）。
【０１１４】
【表３】
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＊ＮＡ：ｎｏｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ 
【０１１５】
２−４．経口投与による薬物動態特性
経口投与による化合物の薬物動態特性を確認するために、ラットモデルを用いた。
【０１１６】
体重２５０〜３００ｇの雄ＳＤラットを各群当たり３匹ずつ配置し、本発明の化合物を２００ｍｐｋで経口投与した後、プラズマ（ｐｌａｓｍａ）中に存在する化合物の量を経時に測定する方法を用いた。このとき、経口投与のために０．５％ＣＭＣ及び約１％Ｔｗｅｅｎ８０状態で剤形化［Ｔｗｅｅｎ８０：０．５％ＣＭＣ水溶液＝１：９９（ｖ／ｖ）］して使用した。
【０１１７】
その結果、本発明の化合物は、経口投与により体内に素早く吸収できることが分かった（表４及び図２１参照）。
【０１１８】
【表４】
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＊平均±ＳＤ（ｎ＝３ラット／グループ）
【０１１９】
比較実験例１．比較化合物の線維症に対する効果調査
前記実験例１−１と同様に、以下の比較化合物の線維症に対する効果を調べた。
【０１２０】
その結果、図２２〜図２４に示すように、本発明の化合物とは異なり、比較化合物は、細胞毒性を示し、細胞死を遮断するか、細胞の線維化進行を遮断することができないことが分かった。
【０１２１】
【化９】
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【０１２２】
実験例３．製剤化による薬物動態特性
本発明の化合物の効果的な製剤化のために、前記実験例２−４と同様に、各種製剤化方法による経口投与薬物動態特性を調べた。
【０１２３】
その結果、表５に示すように、Ｔｗｅｅｎ８０：０．５％ＣＭＣ水溶液（１：９９  ｖ／ｖ）で製剤化した場合（製剤例２）、化合物の生体利用率（バイオアベイラビリティ)は１．４％と低く、ＮＭＰ：エタノール：ＰＥＧ２００：生理食塩水（５：１０：３０：５５ｖ／ｖ）で製剤化した場合（製剤例４）、生体利用率は約３％であることが分かった。一方、ＮＭＰ：ＰＥＧ４００：ＳＯＬＵＴＯＬ  ＨＳ：水（１０：２０：２０：５０ｖ／ｖ）で製剤化した場合（製剤例３）、生体利用率は約９％に大幅に改善され、３０％ＨＰＣＤ水溶液で製剤化した場合（製剤例５）にも、生体利用率は約７％に改善されることが分かった。
【０１２４】
【表５】
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＊製剤例１−ｉｖビークル１００％ＤＭＳＯ使用
＊製剤例２−Ｔｗｅｅｎ８０：０．５％ＣＭＣ水溶液（１：９９ｖ／ｖ）使用
＊製剤例３−ＮＭＰ：ＰＥＧ４００：ＳＯＬＵＴＯＬ  ＨＳ：水（１０：２０：２０：５０ｖ／ｖ）使用
＊製剤例４−ＮＭＰ：Ｅｔｈａｎｏｌ：ＰＥＧ２００：Ｎｏｒｍａｌ  ｓａｌｉｎｅ（５：１０：３０：５５ｖ／ｖ）使用
＊製剤例５−３０％（ｗ／ｖ）ＨＰＣＤ（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−ｂｅｔａ−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）水溶液使用
【０１２５】
また、製剤例３の場合、製剤例２と比較すると、図２５に示すように、化合物は経口投与により体内に素早く吸収されるだけでなく、プラズマ上で長い間消滅せずに維持されて持続的な効果を期待できることが分かった。
【０１２６】
さらに、他の方法でも製剤化を試みたが、ほとんどの化合物は完全に溶解しなかったため、溶液は濁り、これは更なる薬物動態研究から除外された。
【０１２７】
実験例４．動物モデルを用いた本発明の化合物の線維症に対する効果の調査
５週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（体重１８．２〜２０．５ｇ）（ＫＯＡＴＥＣＨ、韓国）を実験動物として用い、実験動物は、各群当たり５匹ずつに分けた。
【０１２８】
実験動物は、ＳＰＦ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｆｒｅｅ：特定病原体除去）、ＢＳＬ（Ｂｉｏ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｌｅｖｅｌ：バイオセーフティーレベル）２等級施設でポリスルホン（ｐｏｌｙｓｕｌｆｏｎｅ）材質、３６９Ｌ×１５６Ｗ×１３２Ｈ（ｍｍ）（ＥＵ、ＵＳＡ、ＵＫ  ＧＬ  ｃｏｍｐｌｉａｎｃｅ）規格の飼育箱を使って飼育した。飼育箱当たりの収容動物の数は、検疫・馴化期間に２〜３匹、試験期間に２〜３匹とし、温度２２±２℃、相対湿度５０．０±１５．０％、換気回数１０〜２０回／時間、明暗周期（照明時間）１２時間／日（０７：００〜１９：００）、照度１５０〜３００Ｌｕｘの条件下で飼育した。
【０１２９】
肺線維化を誘導するために、Ｋｒｅｍｅｒ等、Ｌａｘｅｒ等及びＢｅｒｋｍａｎ等の気管内注入（ｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌ  ｉｎｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ、ＩＴ）の方法により、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）溶液を、気管（ｔｒａｃｈｅａ）を介して肺に直接注入した。つまり、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、７０％Ｎ２Ｏ、３０％Ｏ２ガス及び１．５％イソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）で吸入麻酔させた状態で、前頚部の皮膚を切開し、筋肉を整えて気管を露出させた後、眼科手術用ハサミで気管を少し切開した。先端を丸くした1９ゲージ（ｇａｕｇｅ）注射針を付けた１ｍｌ注射器を使って、ブレオマイシンを溶解した蒸留水溶液５０μｌを、切開した気管を介して肺中に直接一気に注入した。注入直後、切開した前頚部の皮膚をすぐに縫合し、麻酔から覚醒させ、通常の飼育ケージに入れて飼育した。ブレオマイシンの投与は、ビジュアルインスチロボット（ｖｉｓｕａｌ  ｉｎｓｔｉｌｌｏｂｏｔ）を使って行い、ブレオマイシン−ＨＣｌ４０μｇ／５０μｌを１回投与して１２日間の肺線維化疾患誘導期間を設定した。
【０１３０】
本発明の化合物は３０％ＨＰＣＤ水溶液（製剤例５）に溶かして使用し、個体ごとの投与量は最近の体重測定を基準に算出した。ブレオマイシン投与１２日後、本発明の化合物を１日１回（週５回）、２週間経口投与した。対照群として、特発性肺線維症治療剤であるピルフェニドンを同じ方法で投与した。
【０１３１】
本発明の化合物またはピルフェニドンを投与した後、０〜１５日間の体重の変化を確認した。その結果は、図２６のとおりである。
【０１３２】
化合物投与１５日目にマウスを犠牲にした後、右肺を摘出して重量を測定した。その結果、ブレオマイシンの投与により肺線維化が誘発されると、右肺の重量が増加し、本発明の化合物はこのような右肺重量の増加を有意に抑制することが分かった（図２７参照）。特に５０ｍｐｋ及び１００ｍｐｋ投与群よりも低濃度で投与された１０ｍｐｋ投与群の抑制効果は、最も高く、ピルフェニドン１００ｍｐｋ群投与群と比較して高い抑制効果を示した。
【０１３３】
摘出した右肺のヒドロキシプロリン（ｈｙｄｒｏｘｙ  ｐｒｏｌｉｎｅ、ＨＰ）およびコラーゲンの量を、公知の方法を用いて測定した。その結果、ブレオマイシンの投与により肺線維化が誘発されると、右肺のＨＰおよびコラーゲンの量が増加し、本発明の化合物はこれを有意に抑制することが分かった（図２８及び図２９参照）。ＨＰ測定結果では、１００ｍｐｋ投与群の抑制効果が最も高いが、コラーゲン測定結果では、右肺重量の測定結果と同様に、１０ｍｐｋ投与群の抑制効果が最も高いことが分かった。
【０１３４】
摘出した左肺組織の組織病理学コラーゲン形態計測（ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ）を、公知の方法（シリウスレッドで染色した肺組織試料の光学画像からコラーゲンの面積を計算する）を用いて行った。その結果、ブレオマイシンの投与により肺線維化が誘発されると、高度のコラーゲン形態が計測され、本発明の化合物はこれを有意に抑制することが分かった（表６及び図３０参照）。
【０１３５】
【表６】
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ＮＳ：ｎｏｔ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ
【０１３６】
犠牲にしたマウス（犠牲の１時間前に各化合物を最後に投与）のプラズマ及び肺に存在する化合物の量を測定した。その結果、ピルフェニドン群の場合では、プラズマ及び肺内に存在する化合物の濃度が高いのに対し、本発明の化合物投与群の場合では、相対的に化合物の濃度が非常に低いことが分かった（図３１及び図３２参照）。これは、本発明の化合物が、ピルフェニドンよりもはるかに低い濃度でプラズマ及び肺に存在するにもかかわらず、前記のように優れた線維症抑制効果を示すことを意味するもので、本発明の化合物の優秀性を裏付ける。様々な剤形化の試みにより、一層低濃度で線維症を効果的に治療することができると期待される。
【０１３７】
公知の方法を用いて摘出した左肺組織のＨ＆Ｅおよびシリウスレッド染色を行うことで、組織の病理学的な状態を調べた。その結果、ブレオマイシンの投与により肺線維化が誘発されると、肺組織の細胞および蛋白質の密度が高くなり、組織の線維化および炎症細胞の浸潤が観察され、本発明の化合物はこのような繊維化症状を有意に抑制することが分かった（図３３乃至図３８参照）。特に、この結果からも、１０ｍｐｋ投与群の抑制効果が他の濃度の投与群に比べて最も高いことに注目されている。
【０１３８】
本実験での各処理が肝に及ぼす影響を調査するために、犠牲にしたマウスの肝を摘出して肝組織のＨ＆Ｅ染色を行うことで、組織の病理学的な状態を調べた。その結果、ブレオマイシンの投与により肝組織の浸潤など肝毒性による症状が現れ、ピルフェニドン投与群および本発明の化合物５０ｍｐｋおよび１００ｍｐｋ投与群においても相変わらずブレオマイシンによる肝毒性の症状が現れるが、本発明の化合物１０ｍｐｋ投与群の場合、ブレオマイシンを処理したにもかかわらず、正常肝組織と同様な状態を示すことが分かった（図３９乃至図４１参照）。これは、本発明の化合物を１０ｍｐｋで投与する場合、肝毒性に対する予防、改善または治療効果の可能性を示唆している。
【０１３９】
実験例５．動物モデルを用いた、非アルコール性脂肪肝炎に対する本発明の化合物の効果の調査
非アルコール性脂肪肝炎動物モデルであるＳＴＡＭマウス（ＳＭＣラボラトリーズ株式会社、日本）を実験動物として使用した。この動物モデルは、生まれた直後ストレプトゾトシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ）を投与し、３週間後の高脂肪食（ｈｉｇｈ−ｆａｔ−ｄｉｅｔ）摂取後６〜９週間で非アルコール性脂肪性肝炎が発生し、９〜１２週間で肝繊維化、肝硬変、肝がんが発生する。
【０１４０】
ストレプトゾトシン投与の６〜９週間後、本発明の化合物を、Ｔｗｅｅｎ８０および０．５％ＣＭＣ水溶液を１：９９（ｖ／ｖ）で混合した溶液（製剤例２）に溶解して、１日１回（週５回）経口投与した。対照群として、テルミサルタン及びオベチコール酸（ｏｂｅｔｉｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ、ＯＣＡ）を同じ方法で投与した。
【０１４１】
ストレプトゾトシンの投与の８週間後（化合物の３週間投与時点）に、マウスを犠牲にして肝臓を摘出した後、肝組織のＨ＆Ｅ染色により炎症細胞の浸潤を観察し、シリウスレッド染色により繊維化を観察した（図４２参照）。そして、観察された炎症の程度、繊維化の程度、肝細胞のバルーニング程度および脂肪蓄積の程度を測定し、データ統合（ｄａｔａ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）によるｔ−ｔｅｓｔによりＮＡＦＬＤ（Ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）活動性スコア（ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｓｃｏｒｅ）を統計処理した。その結果、本発明の化合物５０ｍｐｋ投与群およびテルミサルタン３０ｍｐｋ投与群で統計的に有意な抗ＮＡＳＨ結果が見られることが分かった（図４３参照）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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