(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
断片化された細胞外マトリックス成分を含み、
前記断片化された細胞外マトリックス成分の少なくとも一部が架橋されており、
前記断片化された細胞外マトリックス成分が、細胞外マトリックス成分をホモジナイズしたものであり、
前記断片化された細胞外マトリックス成分が断片化されたコラーゲン成分であり、
前記断片化された細胞外マトリックス成分の平均長が１０μｍ〜４００μｍである、細胞外マトリックス含有組成物。
【請求項２】
前記断片化された細胞外マトリックス成分が、細胞外マトリックス成分を水性媒体中でホモジナイズしたものである、請求項１に記載の細胞外マトリックス含有組成物。
【請求項３】
前記断片化された細胞外マトリックス成分が、細胞外マトリックス成分の凍結乾燥体を熱架橋したものを、水性媒体中でホモジナイズしたものである、請求項１又は２に記載の細胞外マトリックス含有組成物。
【請求項４】
前記断片化された細胞外マトリックス成分は、少なくとも一部が繊維状である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞外マトリックス含有組成物。
【請求項５】
水性媒体中で分散可能である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞外マトリックス含有組成物。
【請求項６】
ＴＮＢＳ法による架橋度が２％以上である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞外マトリックス含有組成物。
【請求項７】
粉末状である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞外マトリックス含有組成物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞外マトリックス含有組成物を含む、三次元組織体形成剤。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞外マトリックス含有組成物と、細胞と、を含む、三次元組織体。
【請求項１０】
断片化された細胞外マトリックス成分を含む細胞外マトリックス含有組成物の製造方法であって、
少なくとも一部が架橋された細胞外マトリックス成分を水性媒体中で断片化する断片化工程を備え、
前記断片化工程が、前記少なくとも一部が架橋された細胞外マトリックス成分をホモジナイズすることにより行われ、
前記断片化された細胞外マトリックス成分が断片化されたコラーゲン成分であり、
前記断片化された細胞外マトリックス成分の平均長が１０μｍ〜４００μｍである、製造方法。
【請求項１１】
断片化工程前に、細胞外マトリックス成分を加熱して、細胞外マトリックス成分の少なくとも一部を架橋する架橋工程を備える、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記架橋工程における加熱温度が、１００℃以上である、請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
断片化工程後に、断片化された細胞外マトリックス成分を乾燥する乾燥工程を備える、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞外マトリックス含有組成物及びその製造方法、並びに三次元組織体、三次元組織体形成剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体外で細胞の三次元組織体を構築する技術が開発されている。例えば、培養細胞の表面全体が接着膜で被覆された被覆細胞を培養することによって、三次元組織体を製造する方法（特許文献１）、ポリ乳酸等を材料とした足場に細胞を播種して三次元組織体を製造する方法（非特許文献１）等が提案されている。また、本発明者らはこれまで、コラーゲン成分、フィブロネクチン成分等の細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされた細胞を三次元に配置して、三次元組織体を形成することを含む、三次元組織体を製造する方法（特許文献２）、細胞の表面に被膜が形成された被覆細胞を形成すること、及び被覆細胞を三次元に配置することを含む三次元組織体の製造方法であって、被覆細胞の形成は、被膜成分を含有する液に細胞を浸漬させること、及び浸漬させた細胞と被膜成分を含有する液とを液透過性膜によって分離することを含む、三次元組織体の製造方法（特許文献３）等を提案している。このような三次元組織体は、実験動物の代替品、移植材料等としての利用が期待されている。【０００３】
細胞の三次元培養の手法には、細胞が接着可能な足場材料を使った手法、足場材料を用いずに細胞を積層させる手法等の様々な手法が検討されているが、いずれの細胞培養手法においても、コラーゲン成分等の細胞外マトリックス成分の共存化で細胞と培養することが一般的に行われている。これは、細胞外マトリックス成分が細胞間質において組織構造を物理的に支持する材料として機能していることに加え、細胞の発生、分化、形態形成等において生物学的に重要な役割を担っていると考えられているためである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１２−１１５２５４号公報
【特許文献２】国際公開第２０１５／０７２１６４号
【特許文献３】国際公開第２０１６／０２７８５３号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Nature Biotechnology, 2005,Vol.23, NO.7, p.879-884
【非特許文献２】Acta Biomaterialia, 2015, Vol.25,p.131-142
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
細胞外マトリックス成分は一般的に不溶性であり多量の細胞外マトリックス成分を水性媒体に溶解させることは困難であった。そのため、細胞外マトリックス成分を含む溶液と細胞とを懸濁することによって三次元組織体を形成する方法では、形成できる組織の厚み、及び、組織体中に占める細胞外マトリックス成分の質量含有率には限界があった。【０００７】
そこで、本発明者らは、断片化された細胞外マトリックス成分（断片化細胞外マトリックス成分）を水性媒体に懸濁することによって、より高濃度の細胞外マトリックス成分を含む分散液を調整し、その分散液中に細胞を懸濁することによって、従来の手法では到達し得なかった厚み及び細胞外マトリックス成分の質量含有率を有する組織体が形成できることを見出した。【０００８】
断片化細胞外マトリックス成分を含む組織化材料及びこれを用いて組織化する手法は有効なものである一方、断片化細胞外マトリックス成分は、乾燥保存後に水性媒体中に分散させることが困難であった。そのため、断片化細胞外マトリックス成分は用事調製する必要があることから、作業負担増大の一因となっていた。【０００９】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、乾燥保存後の分散性に優れる細胞外マトリックス含有組成物及びその製造方法並びに当該細胞外マトリックス含有組成物を含む三次元組織体及び三次元組織体形成剤の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、乾燥保存後の分散性を改善するという新規な課題を解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、以下に示す発明によって、当該課題が解決できることを見出した。【００１１】
すなわち、本発明は、例えば以下の［１］〜［１３］を提供する。
［１］断片化された細胞外マトリックス成分を含み、断片化された細胞外マトリックス成分の少なくとも一部が架橋されている、細胞外マトリックス含有組成物。
［２］断片化された細胞外マトリックス成分は、少なくとも一部が繊維状である、（１）に記載の細胞外マトリックス含有組成物。
［３］水性媒体中で分散可能である、（１）又は（２）に記載の細胞外マトリックス含有組成物。
［４］断片化された細胞外マトリックス成分の平均長が１００ｎｍ〜４００μｍである、（１）〜（３）のいずれかに記載の細胞外マトリックス含有組成物。
［５］断片化された細胞外マトリックス成分が断片化されたコラーゲン成分を含む、（１）〜（４）のいずれかに記載の細胞外マトリックス含有組成物。
［６］ＴＮＢＳ法による架橋度が２％以上である、（１）〜（５）のいずれかに記載の細胞外マトリックス含有組成物。
［７］粉末状である、（１）〜（６）のいずれかに記載の細胞外マトリックス含有組成物。
［８］（１）〜（７）のいずれかに記載の細胞外マトリックス含有組成物を含む、三次元組織体形成剤。
［９］（１）〜（７）のいずれかに記載の細胞外マトリックス含有組成物と、細胞と、を含む、三次元組織体。
［１０］断片化された細胞外マトリックス成分を含む細胞外マトリックス含有組成物の製造方法であって、少なくとも一部が架橋された細胞外マトリックス成分を水性媒体中で断片化する断片化工程を備える、製造方法。
［１１］断片化工程前に、細胞外マトリックス成分を加熱して、細胞外マトリックス成分の少なくとも一部を架橋する架橋工程を備える、（１０）に記載の製造方法。
［１２］架橋工程における加熱温度が、１００℃以上である、（１１）に記載の製造方法。
［１３］断片化工程後に、断片化された細胞外マトリックス成分を乾燥する乾燥工程を備える、（１０）〜（１２）のいずれかに記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、乾燥保存後の分散性に優れる細胞外マトリックス含有組成物及びその製造方法並びに当該細胞外マトリックス含有組成物を含む三次元組織体及び三次元組織体形成剤の提供が可能となる。本発明の細胞外マトリックス含有組成物は、断片化した状態で凍結乾燥を行った場合であっても、再分散可能であるため、長期間保存可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は凍結乾燥前の断片化架橋コラーゲン成分の写真である。
【図２】図２は凍結乾燥後の断片化架橋コラーゲン成分の写真である。
【図３】図３は凍結乾燥前及び凍結乾燥後の断片化非架橋コラーゲン成分の写真である。
【図４】図４（Ａ）はＴＮＢＳ法による架橋度の測定結果を示すグラフであり、図４（Ｂ）は、架橋時間に応じたＴＮＢＳ法による架橋度の変化を示すグラフである。
【図５】図５は三次元組織体の製造方法及び断片化架橋コラーゲン成分を含む三次元組織体を示す図である。
【図６】図６（Ａ）〜（Ｂ）はそれぞれ断片化工程における水分散安定性の結果を示す写真及びグラフである。
【図７】図７は、断片化非架橋コラーゲン成分又は断片化架橋コラーゲン成分を用いて構築した三次元組織体の蛍光観察結果を示す写真である。
【図８】図８は、撹拌式又は超音波式ホモジナイザーによる断片化架橋コラーゲン成分の観察結果を示す写真である。
【図９】図９は、凍結乾燥後の分散性の確認結果を示すグラフ及び写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１５】
＜細胞外マトリックス含有組成物＞
本実施形態に係る細胞外マトリックス含有組成物は、断片化された細胞外マトリックス成分（断片化細胞外マトリックス成分）を含み、断片化された細胞外マトリックス成分の少なくとも一部が架橋されている。
【００１６】
本実施形態に係る細胞外マトリックス含有組成物は、乾燥保存後の分散性（再分散性）に優れている。再分散性に優れていることから、濃度が均一である分散液の調製が容易であるため、三次元組織体を形成するための足場材等として好適に利用することができる。
【００１７】
細胞外マトリックス含有組成物は、断片化及び架橋されている細胞外マトリックス成分を少なくとも含んでいる。細胞外マトリックス含有組成物は、断片化されており、架橋されていない細胞外マトリックス成分を含んでいてもよく、少なくとも一部が架橋されており、断片化されていない細胞外マトリックス成分を含んでいてもよい。
【００１８】
細胞外マトリックス成分は、複数の細胞外マトリックス分子によって形成されている、細胞外マトリックス分子の集合体である。細胞外マトリックス分子とは、生物において細胞の外に存在する物質を意味する。細胞外マトリックス分子としては、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、任意の物質を用いることができる。細胞外マトリックス分子として、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、テネイシン、エンタクチン、フィブリリン、及びプロテオグリカン等が挙げられるが、これらに限定されない。細胞外マトリックス成分は、これらを１種単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。なお、細胞外マトリックス分子は、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、上述の細胞外マトリックス分子の改変体及びバリアントであってもよい。
【００１９】
コラーゲンとしては、例えば、線維性コラーゲン及び非線維性コラーゲンが挙げられる。線維性コラーゲンとは、コラーゲン線維の主成分となるコラーゲンを意味し、具体的には、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン等が挙げられる。非線維性コラーゲンとしては、例えば、ＩＶ型コラーゲンが挙げられる。
【００２０】
プロテオグリカンとして、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ケラタン硫酸プロテオグリカン、デルマタン硫酸プロテオグリカンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
細胞外マトリックス成分は、コラーゲン、ラミニン及びフィブロネクチンからなる群より選択される少なくとも１種を含んでいてよく、コラーゲンを含むことが好ましい。コラーゲンは好ましくは繊維性コラーゲンであり、より好ましくはＩ型コラーゲンである。線維性コラーゲンは、市販されているコラーゲンを用いてもよく、その具体例としては、日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来Ｉ型コラーゲン凍結乾燥体が挙げられる。コラーゲンは、テロペプチドが除去されたコラーゲンであるアテロコラーゲンであることが好ましい。アテロコラーゲンは、例えば、トロポコラーゲンをペプシン処理することにより得ることができる。
【００２２】
細胞外マトリックス成分は、動物由来の細胞外マトリックス成分であってよい。
細胞外マトリックス成分の由来となる動物種は、哺乳類、鳥類、爬虫類、又は魚類等であってよく、哺乳類であることが好ましい。細胞外マトリックス成分の由来となる動物種として、例えば、ヒト、ブタ、ウシ等が挙げられるが、これらに限定されない。細胞外マトリックス成分の由来となる動物種は、哺乳類であってよく、ブタであってよい。細胞外マトリックス成分は、一種類の動物に由来する成分を用いてもよいし、複数種の動物に由来する成分を併用して用いてもよい。細胞外マトリックス成分の由来となる動物種は、三次元組織化する細胞の由来と同じであっても異なっていてもよい。
【００２３】
断片化細胞外マトリックス成分は、上述の細胞外マトリックス成分を物理的な力の印加により細分化した成分である。断片化細胞外マトリックス成分は、細胞外マトリックス分子の結合を切断することなく、細胞外マトリックス成分を解繊して得られる解繊された細胞外マトリックス成分（解繊細胞外マトリックス成分）であることが好ましい。断片化細胞外マトリックス成分が、解繊された細胞外マトリックス成分である場合、足場材料としてより効果的に用いることが可能となる。
【００２４】
細胞外マトリックス成分を断片化する方法としては、特に制限されない。例えば、超音波式ホモジナイザー、撹拌式ホモジナイザー、及び高圧式ホモジナイザー等の物理的な力の印加によって細胞外マトリックス成分を断片化（又は解繊）してもよい。撹拌式ホモジナイザーを用いる場合、細胞外マトリックス成分をそのままホモジナイズしてもよいし、生理食塩水等の水性媒体中でホモジナイズしてもよい。また、ホモジナイズする時間、回数等を調整することでミリメートルサイズ、ナノメートルサイズの断片化細胞外マトリックス成分を得ることも可能である。断片化細胞外マトリックス成分は、凍結融解を繰り返すことで断片化することにより得ることもできる。
【００２５】
断片化細胞外マトリックス成分は、断片化されたコラーゲン成分（断片化コラーゲン成分）を含むことが好ましい。断片化コラーゲン成分は、水性媒体に分散させることにより、水性媒体中で細胞と接触しやすくなり、三次元組織体の形成を促進し得る。断片化されたコラーゲン成分は解繊されたコラーゲン成分であることが好ましい。
【００２６】
断片化細胞外マトリックス成分は、天然由来であってよい。天然由来である断片化細胞外マトリックス成分は、天然の細胞外マトリックス成分を断片化したものであり、天然由来である断片化細胞外マトリックス成分には、化学的処理により天然の細胞外マトリックス分子の構造を改変した成分は含まれない。化学的処理としては、例えば、アルカリ処理による加水分解等が挙げられる。
【００２７】
断片化細胞外マトリックス成分の形状としては、例えば、繊維状が挙げられる。繊維状とは、糸状の細胞外マトリックス成分で構成される形状、又は糸状の細胞外マトリックス成分が架橋して構成される形状を意味する。例えば、断片化コラーゲン成分は、コラーゲンに由来する三重らせん構造（繊維状）を維持していることが好ましい。再分散性がより一層優れたものとなる観点から、断片化細胞外マトリックス成分の少なくとも一部は、繊維状であることが好ましい。
【００２８】
一実施形態において、断片化細胞外マトリックス成分の平均長は、１００ｎｍ〜４００μｍであることが好ましく、厚い組織が形成しやすくなる観点から、より好ましくは、５μｍ〜４００μｍ、１０μｍ〜４００μｍ、２２μｍ〜４００μｍ、又は１００μｍ〜４００μｍである。他の実施形態において、断片化細胞外マトリックス成分の平均長は、組織形成が安定しやすくなる観点及び再分散性がより一層優れたものとなる観点から、１００μｍ以下であってよく、好ましくは５０μｍ以下であり、より好ましくは３０μｍ以下であり、更に好ましくは２５μｍ以下、又は２０μｍ以下であり、１５μｍ以下、１０μｍ以下、又は１μｍ以下であってよく、１００ｎｍ以上であってもよい。断片化細胞外マトリックス成分全体のうち、大部分の断片化細胞外マトリックス成分の平均長が上記数値範囲内であることが好ましい。具体的には、断片化細胞外マトリックス成分全体のうち９５％の断片化細胞外マトリックス成分の平均長が上記数値範囲内であることが好ましい。断片化細胞外マトリックス成分は、平均長が上記範囲内である断片化コラーゲン成分であることが好ましい。
【００２９】
断片化細胞外マトリックス成分の平均径は、５０ｎｍ〜３０μｍであることが好ましく、４μｍ〜３０μｍであることがより好ましく、２０μｍ〜３０μｍであることがさらにより好ましい。断片化細胞外マトリックス成分は、平均径が上記範囲内である断片化コラーゲン成分であることが好ましい。
【００３０】
なお、上述の平均長及び平均径の範囲は、組織形成の観点から至適化されたものであるため、後述する乾燥工程後、断片化細胞外マトリックス成分を再度水性媒体に懸濁し組織形成する段階で上記の平均長又は平均径の範囲内に収まっていることが望ましい。
【００３１】
断片化細胞外マトリックス成分平均長及び平均径は、光学顕微鏡によって個々の断片化コラーゲン成分を測定し、画像解析することによって求めることが可能である。なお、本明細書において、「平均長」は、測定した試料の長手方向の長さの平均値を意味し、「平均径」は、測定した試料の長手方向に直交する方向の長さの平均値を意味する。
【００３２】
本実施形態に係る細胞外マトリックス含有組成物において、断片化された細胞外マトリックス成分の少なくとも一部は架橋されている。細胞外マトリックス成分は、細胞外マトリックス成分を構成する細胞外マトリックス分子の分子内又は分子間で架橋されていてよい。
【００３３】
架橋する方法としては、例えば、熱、紫外線、放射線等の印加による物理架橋、架橋剤、酵素反応等による化学架橋等による方法が挙げられるが、その方法は特に限定されない。細胞外マトリックス成分にできるだけ人工的な要素を付加しないでよいため、熱の印加による物理架橋が好ましい。架橋（物理架橋及び化学架橋）は、共有結合を介した架橋であってよい。
【００３４】
細胞外マトリックス成分がコラーゲン成分を含む場合、架橋は、コラーゲン分子（三重らせん構造）の間で形成されていてもよく、コラーゲン分子によって形成されたコラーゲン細繊維の間で形成されていてもよい。架橋は、熱による架橋（熱架橋）が好ましい。熱架橋は、例えば、真空ポンプを使って減圧下で、加熱処理を行うことにより実施することができる。コラーゲン成分の熱架橋を行う場合、細胞外マトリックス成分は、コラーゲン分子のアミノ基が、同一又は他のコラーゲン分子のカルボキシ基とペプチド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）を形成することにより、架橋されていてよい。
【００３５】
細胞外マトリックス成分は架橋剤を使用することによっても、架橋することができる。架橋剤は、例えば、カルボキシル基とアミノ基を架橋可能なもの、又はアミノ基同士を架橋可能なものであってよい。架橋剤としては、例えば、アルデヒド系、カルボジイミド系、エポキシド系及びイミダゾール系架橋剤が経済性、安全性及び操作性の観点から好ましく、具体的には、グルタルアルデヒド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミド・スルホン酸塩等の水溶性カルボジイミドを挙げることができる。
【００３６】
架橋度は、ＴＮＢＳ（２，４，６−ｔｒｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅ  ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）法で測定される架橋度であってよい。ＴＮＢＳ法による架橋度は、細胞外マトリックス成分が有するアミノ基のうち架橋に使われているアミノ基の割合をいう。ＴＮＢＳ法による架橋度は、非特許文献２等に記載されているＴＮＢＳ法に基づき定量することが可能である。
【００３７】
ＴＮＢＳ法による架橋度は、１％以上、２％以上、４％以上、８％以上、又は１２％以上であってよく、３０％以下、２０％以下、又は１５％以下であってもよい。ＴＮＢＳ法による架橋度が上記範囲にあることにより、細胞外マトリックス分子が適度に分散することができ、また、乾燥保存後の再分散性が良好である。熱による架橋を行う場合、例えば、加熱処理を行う際の温度を高くすると、ＴＮＢＳ法による架橋度が高くなる傾向がある。
【００３８】
細胞外マトリックス成分がコラーゲン成分を含む場合、ＴＮＢＳ法により測定される架橋度が上記範囲内であることが好ましい。
【００３９】
架橋度は、カルボキシル基を定量することにより、算出してもよい。例えば、水に不溶性の細胞外マトリックス成分の場合、ＴＢＯ（トルイジンブルーＯ）法により定量してもよい。
【００４０】
細胞外マトリックス含有組成物の形態は、秤量が容易になりやすい観点から、固形状又は粉末状であってよく、好ましくは粉末状である。細胞外マトリックス含有組成物は、水分を含んでいなくてよい。細胞外マトリックス含有組成物中の水分は、例えば、凍結乾燥法により除去することができる。水分を含んでいないとは、一切の水分子を含んでいないことを意味するものではなく、凍結乾燥法等の乾燥手法により常識的に達することができる程度に水分を含んでいないことを意味する。
【００４１】
一実施形態に係る細胞外マトリックス含有組成物は、水性媒体中において分散可能である。「水性媒体」とは、水を必須構成成分とする液体を意味する。水性媒体としては、細胞外マトリックス成分が安定に存在できるものであれば、特に制限はない。例えば、水性媒体として、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の生理食塩水、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）、血管内皮細胞専用培地（ＥＧＭ２）等の液体培地が挙げられるがこれに制限されない。
【００４２】
水性媒体中において分散可能であることは、例えば、以下の方法により判定される。すなわち、細胞外マトリックス含有組成物５０ｍｇを超純水５ｍＬ中に添加して懸濁したときに超純水中で細胞外マトリックス含有組成物が分散した場合（凝集、沈降等が生じない場合）、水性媒体中において分散可能であると判定できる。超純水中で細胞外マトリックス含有組成物を分散させる際の温度は、培養温度（例えば、３７℃）以下の温度であってよく、室温であってもよい。分散している状態とは、目視にて凝集、沈降等が生じていない状態を意味する。なお、分散可能であることは、例えば、波長５００ｎｍの光に対する透過率の測定によっても判別することができる。波長５００ｎｍの光に対する透過率が、５０％以下、好ましくは３５％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、さらにより好ましくは１５％以下、さらによりまた好ましくは１２％以下の場合に、分散可能であると判別することができる。透過率は、細胞外マトリックス含有組成物及び水（超純水等）からなる水溶液を被測定試料として測定してよい。被測定試料中の細胞外マトリックス含有組成物の含有量は、細胞外マトリックス含有組成物及び水からなる水溶液の全質量を基準として、０．５質量％であってよい。透過率は、細胞外マトリックス含有組成物を超純水に添加した直後に測定されてもよい。透過率の測定は、例えば、紫外可視近赤外分光光度計を用い、波長５００ｎｍの光に対する透過率を測定することにより実施することができる。透過率は、具体的には後述する実施例に記載の方法で測定することができる。
【００４３】
水性媒体のｐＨは細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない範囲が好ましい。水性媒体のｐＨは、細胞に投入した際の細胞への負荷を軽減する観点から、例えば、７．０以上であってよく、８．０以下であってよい。具体的には、水性媒体のｐＨは、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、又は８．０であってよい。水性媒体は、上記ｐＨの範囲において緩衝能を有することが好ましく、より好ましくは液体培地である。液体培地は特に制限はなく、培養する細胞の種類に応じて好適な培地を選択できる。当該培地としては、例えば、Ｅａｇｌｅ’ｓ  ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ培地（ＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ培地、ＲＰＭＩ、及びＧｌｕｔａＭａｘ培地等が挙げられる。培地は、血清を添加した培地であってもよいし、無血清培地であってもよい。更に、液体培地は二種類以上の培地を混合した混合培地であってもよい。
【００４４】
＜細胞外マトリックス含有組成物の製造方法＞
細胞外マトリックス含有組成物は、細胞外マトリックス成分を架橋した後、断片化することにより、製造してもよく、細胞外マトリックス成分を断片化した後、架橋することにより製造してもよい。本実施形態に係る細胞外マトリックス含有組成物は、細胞外マトリックス分子を架橋した後、断片化することにより製造することが好ましい。これにより、乾燥保存後の再分散性が向上するため、細胞と混合しやすく、三次元組織体を形成しやすい。
【００４５】
以下、細胞外マトリックス含有組成物の製造方法の一例として、細胞外マトリックス分子を架橋した後に断片化することにより、細胞外マトリックス含有組成物を製造する方法について説明する。
【００４６】
一実施形態に係る細胞外マトリックス含有組成物の製造方法は、少なくとも一部が架橋された細胞外マトリックス成分を水性媒体中で断片化する断片化工程を備える。
【００４７】
少なくとも一部が架橋された細胞外マトリックス成分を断片化する方法は、上記例示した方法と同様の方法であってよい。また、水性媒体は、上述の水性媒体と同様であってよい。
【００４８】
本実施形態に係る製造方法は、断片化工程前に、細胞外マトリックス成分を加熱して、細胞外マトリックス成分の少なくとも一部を架橋する架橋工程を備えていてよい。
【００４９】
架橋工程において、細胞外マトリックス成分を加熱する際の温度（加熱温度）及び時間（加熱時間）は適宜定めることができる。架橋工程における、加熱温度は、例えば１００℃以上であってよく、２００℃以下であってよい。加熱温度は、具体的には、例えば、１００℃、１１０℃、１２０℃、１３０℃、１４０℃、１５０℃、１６０℃、１７０℃、１８０℃、１９０℃、２００℃、２２０℃等であってよい。加熱時間（上記加熱温度で保持する時間）は、加熱温度により適宜設定することができる。加熱時間は、例えば、１００℃〜２２０℃で加熱する場合、６時間以上７２時間以下であってよく、より好ましくは２４時間以上４８時間以下である。架橋工程では、溶媒非存在下で加熱してよく、また、減圧条件下で加熱してもよい。
【００５０】
本実施形態に係る製造方法は、断片化工程後に、断片化された細胞外マトリックス成分を乾燥する乾燥工程を備えていてよい。
【００５１】
乾燥工程では、断片化された細胞外マトリックス成分を乾燥する。乾燥は、例えば、凍結乾燥法により実施してよい。断片化工程後に、乾燥工程を行うことで、断片化細胞外マトリックス成分及び水性媒体を含む液から、水性媒体が除去される。水性媒体が除去されるとは、断片化された細胞外マトリックス成分中に一切の水分が付着していないことを意味するものではなく、上述の一般的な乾燥手法により、常識的に達することができる程度に水分が付着していないことを意味する。
【００５２】
細胞外マトリックス含有組成物は、三次元組織体を形成するための足場材として好適に用いることができる。したがって、細胞外マトリックス含有組成物は、三次元組織体形成用途に好適に用いられる。
【００５３】
＜三次元組織体形成剤＞
細胞外マトリックス含有組成物は、三次元組織体を形成するための足場材等として好適であるため、本発明の一実施形態において、上述の細胞外マトリックス含有組成物を含む、三次元組織体形成剤が提供される。
【００５４】
本実施形態に係る三次元組織体形成剤は、上述の断片化細胞外マトリックス成分を含んでいるため、より厚い三次元組織体を形成することができる。
【００５５】
三次元組織形成剤は、保存する際には粉末の状態であってよく、また、三次元組織体の形成段階においては、水性媒体に分散させた分散液の状態であることが好ましい。
【００５６】
＜三次元組織体＞
本実施形態に係る三次元組織体は、上述の細胞外マトリックス含有組成物と、細胞と、を含む。細胞の少なくとも一部が細胞外マトリックス含有組成物に接着していてよい。「三次元組織体」とは、細胞外マトリックス成分を介して細胞が三次元的に配置されている細胞の集合体であって、細胞培養によって人工的に作られる集合体を意味する。三次元組織体の形状には特に制限はなく、例えば、シート状、球体状、楕円体状、直方体状等が挙げられる。ここで、生体組織は、血管、汗腺、リンパ管、脂腺等を含み、構成が三次元組織体より複雑である。そのため、三次元組織体と生体組織とは容易に区別可能である。
【００５７】
細胞は、特に限定されないが、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス、ラット等の動物に由来する細胞であってよい。細胞の由来部位も特に限定されず、骨、筋肉、内臓、神経、脳、骨、皮膚、血液等に由来する体細胞であってもよく、生殖細胞であってもよい。さらに、細胞は、誘導多能性幹細胞細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）であってもよく、また、初代培養細胞、継代培養細胞及び細胞株細胞等の培養細胞であってもよい。具体的には、細胞として、例えば、神経細胞、樹状細胞、免疫細胞、血管内皮細胞（例えば、ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ））、リンパ管内皮細胞、線維芽細胞、大腸がん細胞（例えば、ヒト大腸がん細胞（ＨＴ２９））、肝癌細胞等の癌細胞、上皮細胞（例えば、ヒト歯肉上皮細胞）、角化細胞、心筋細胞（例えば、ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞（ｉＰＳ−ＣＭ））、肝細胞、膵島細胞、組織幹細胞、平滑筋細胞（例えば、大動脈平滑筋細胞（Ａｏｒｔａ−ＳＭＣ）等が挙げられるが、これらに限定されない。細胞は、一種単独で用いてもよいし、複数種類の細胞を組み合わせて用いてもよい。
【００５８】
細胞として、線維性コラーゲン等のコラーゲンを分泌するコラーゲン分泌細胞を含むことが好ましい。コラーゲン分泌細胞としては、例えば、線維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞等の間葉系細胞が挙げられ、好ましくは、線維芽細胞である。好ましい線維芽細胞としては、例えば、ヒト皮膚由来線維芽細胞（ＮＨＤＦ）、ヒト心臓線維芽細胞（ＮＨＣＦ）及びヒト歯肉線維芽細胞（ＨＧＦ）が挙げられる。
【００５９】
三次元組織体が細胞としてコラーゲン分泌細胞を含む場合、三次元組織体は内因性コラーゲンを含んでいてよい。「内因性コラーゲン」とは、三次元組織体を構成するコラーゲン産生細胞が産生するコラーゲンを意味する。内因性コラーゲンは、線維性コラーゲンであってもよいし、非線維性コラーゲンであってもよい。
【００６０】
三次元組織体が細胞としてコラーゲン分泌細胞を含む場合、三次元組織体は、コラーゲン分泌細胞を含む細胞と、細胞外マトリックス含有組成物と、内因性コラーゲン成分とを含んでいてよい。この場合、コラーゲン分泌細胞を含む細胞の少なくとも一部は細胞外マトリックス含有組成物及び／又は内因性コラーゲン成分に接着していてよい。従来の三次元組織体は、コラーゲンの濃度が低く、且つ細胞密度が高いものであった。そのため、培養中又は培養後に細胞のけん引力によって三次元組織体が収縮したり、培養中又は培養後に細胞が産生する酵素によって三次元組織体が容易に分解される等の問題があった。一実施形態に係る三次元組織体は、コラーゲンの濃度が従来のものより高く、収縮が起きにくく安定である。
【００６１】
三次元組織体は、細胞として、コラーゲン分泌細胞と、コラーゲン分泌細胞以外の細胞と、を含んでいてよい。コラーゲン産生細胞以外の細胞としては、血管内皮細胞（例えば、ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ））、大腸がん細胞（例えば、ヒト大腸がん細胞（ＨＴ２９））、肝がん細胞等のがん細胞、心筋細胞（例えば、ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞（ｉＰＳ−ＣＭ））、上皮細胞（例えば、ヒト歯肉上皮細胞）、角化細胞、リンパ管内皮細胞、神経細胞、肝細胞、組織幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、接着性細胞（例えば、免疫細胞）、平滑筋細胞（例えば、大動脈平滑筋細胞（Ａｏｒｔａ−ＳＭＣ））等が挙げられる。好ましくは、上記三次元組織体を構成する細胞が、血管内皮細胞、がん細胞及び心筋細胞からなる群から選ばれる、一種又は複数種の細胞を更に含む。
【００６２】
三次元組織体におけるコラーゲンの含有率は、上記三次元組織体（乾燥重量）を基準として０．０１〜９０質量％であってよく、１０〜９０質量％であることが好ましく、１０〜８０質量％であることが好ましく、１０〜７０質量％であることが好ましく、１０〜６０質量％であることが好ましく、１〜５０質量％であることが好ましく、１０〜５０質量％であることが好ましく、１０〜３０質量％であることがより好ましく、２０〜３０質量％であることがより好ましい。
【００６３】
ここで、「三次元組織体におけるコラーゲン」とは、三次元組織体を構成するコラーゲンを意味し、内因性コラーゲンであってもよいし、断片化コラーゲン成分に由来するコラーゲン（外因性コラーゲン）であってもよい。すなわち、三次元組織体が内因性コラーゲン成分及び断片化コラーゲン成分を含む場合、上記三次元組織体を構成するコラーゲンの濃度は、内因性コラーゲン成分及び上記断片化コラーゲン成分の合計濃度を意味する。上記コラーゲンの濃度は、得られた三次元組織体の体積、及び脱細胞化した三次元組織体の質量から算出することが可能である。
【００６４】
三次元組織体におけるコラーゲンの量を定量する方法としては、例えば、以下のようなヒドロキシプロリンを定量する方法が挙げられる。三次元組織体を溶解した溶解液に、塩酸（ＨＣｌ）を混合し、高温で所定の時間インキュベートした後に室温に戻し、遠心分離した上澄みを所定の濃度に希釈することでサンプルを調製する。ヒドロキシプロリンスタンダード溶液をサンプルと同様に処理した後、段階的に希釈してスタンダードを調製する。サンプル及びスタンダードのそれぞれに対してヒドロキシプロリンアッセイバッファ及び検出試薬で所定の処理をし、５７０ｎｍの吸光度を測定する。サンプルの吸光度をスタンダードと比較することでコラーゲン量を算出する。なお、三次元組織体を、高濃度の塩酸に直接懸濁して溶解した溶解液を遠心分離して上澄みを回収し、コラーゲン定量に用いてもよい。また、溶解させる三次元組織体は、培養液から回収したままの状態であってもよいし、回収後に乾燥処理を行い、液体成分を除去した状態で溶解させてもよい。但し、培養液から回収したままの状態の三次元組織体を溶解してコラーゲン定量を行う場合、三次元組織体が吸収している培地成分、及び実験手技の問題による培地の残りの影響で、三次元組織体重量の計測値がばらつくことが予想されるため、組織体の重量及び単位重量あたりに占めるコラーゲン量を安定して計測する観点からは、乾燥後の重量を基準とすることが好ましい。
【００６５】
コラーゲンの量を定量する方法として、より具体的には、例えば、以下のような方法が挙げられる。
【００６６】
（サンプルの調製）
凍結乾燥処理を行った三次元組織体の全量を６ｍｏｌ／ｌ  ＨＣｌと混合し、ヒートブロックで９５℃、２０時間以上インキュベートした後、室温に戻す。１３０００ｇで１０分遠心分離した後、サンプル溶液の上澄みを回収する。後述する測定において結果が検量線の範囲内に収まるように６ｍｏｌ／ｌ  ＨＣｌで適宜希釈した後、２００μＬを１００μＬの超純水で希釈することでサンプルを調製する。サンプルは３５μＬ用いる。
【００６７】
（スタンダードの調製）
スクリューキャップチューブに１２５μＬのスタンダード溶液（１２００μｇ／ｍＬ  ｉｎ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）と、１２５μＬの１２ｍｏｌ／ｌ  ＨＣｌを加え混合し、ヒートブロックで９５℃、２０時間インキュベートした後、室温に戻す。１３０００ｇで１０分遠心分離した後、上澄みを超純水で希釈して３００μｇ／ｍＬのＳ１を作製し、Ｓ１を段階的に希釈してＳ２（２００μｇ／ｍＬ）、Ｓ３（１００μｇ／ｍＬ）、Ｓ４（５０μｇ／ｍＬ）、Ｓ５（２５μｇ／ｍＬ）、Ｓ６（１２．５μｇ／ｍＬ）、Ｓ７（６．２５μｇ／ｍＬ）を作製する。４ｍｏｌ／ｌ  ＨＣｌ９０μＬのみのＳ８（０μｇ／ｍＬ）も準備する。
【００６８】
（アッセイ）
３５μＬのスタンダード及びサンプルをそれぞれプレート（ＱｕｉｃｋＺｙｍｅ  Ｔｏｔａｌ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ａｓｓａｙキット付属、ＱｕｉｃｋＺｙｍｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に加える。７５μＬのアッセイバッファ（上記キット付属）をそれぞれのウェルに加える。シールでプレートを閉じ、２０分シェイキングしながら室温でインキュベートする。シールをはがし、７５μＬのｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ  （ｒｅａｇｅｎｔ  Ａ：Ｂ＝３０μＬ：４５μＬ、上記キット付属）をそれぞれのウェルに加える。シールでプレートを閉じ、シェイキングで溶液を混合し、６０℃で６０分インキュベートする。氷上で十分に冷まし、シールをはがして５７０ｎｍの吸光度を測定する。サンプルの吸光度をスタンダードと比較することでコラーゲン量を算出する。
【００６９】
また、三次元組織体中に占めるコラーゲンを、その面積比又は体積比によって規定してもよい。「面積比又は体積比によって規定する」とは、例えば三次元組織体中のコラーゲンを既知の染色手法（例えば、抗コラーゲン抗体を用いた免疫染色、又はマッソントリクローム染色）等で他の組織構成物と区別可能な状態にした上で、肉眼観察、各種顕微鏡及び画像解析ソフト等を用いて、三次元組織体全体に占めるコラーゲンの存在領域の比率を算出することを意味する。面積比で規定する場合、三次元組織体中の如何なる断面もしくは表面によって面積比を規定するかは限定されないが、例えば三次元組織体が球状体等である場合には、その略中心部を通る断面図によって規定してもよい。
【００７０】
例えば、三次元組織体中のコラーゲンを面積比によって規定する場合、その面積の割合は、上記三次元組織体の全体の面積を基準として０．０１〜９９％であり、１〜９９％であることが好ましく、５〜９０％であることが好ましく、７〜９０％であることが好ましく、２０〜９０％であることが好ましく、５０〜９０％であることがより好ましい。「三次元組織体におけるコラーゲン」については、上述したとおりである。三次元組織体が外因性コラーゲンを含む場合、上記三次元組織体を構成するコラーゲンの面積の割合は、内因性コラーゲン及び外因性コラーゲンを合わせた面積の割合を意味する。上記コラーゲンの面積の割合は、例えば、得られた三次元組織体をマッソントリクロームで染色し、三次元組織体の略中心部を通る断面の全体の面積に対する、青く染色したコラーゲンの面積の割合として算出することが可能である。
【００７１】
上記三次元組織体は、トリプシンの濃度０．２５％、温度３７℃、ｐＨ７．４、反応時間１５分でトリプシン処理を行った後の残存率が７０％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることが更により好ましい。このような三次元組織体は、培養中又は培養後において酵素による分解が起きにくく、安定である。上記残存率は、例えば、トリプシン処理の前後における三次元組織体の質量から算出できる。
【００７２】
上記三次元組織体は、コラゲナーゼの濃度０．２５％、温度３７℃、ｐＨ７．４、反応時間１５分でコラゲナーゼ処理を行った後の残存率が７０％以上であってもよく、８０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることが更により好ましい。このような三次元組織体は、培養中又は培養後における酵素による分解が起きにくく、安定である。
【００７３】
上記三次元組織体の厚さは１０μｍ以上であることが好ましく、１００μｍ以上であることがより好ましく、１０００μｍ以上であることが更により好ましい。このような三次元組織体は、生体組織により近い構造であり、実験動物の代替品、及び移植材料として好適なものとなる。三次元組織体の厚さの上限は、特に制限されないが、例えば、１０ｍｍ以下であってもよいし、３ｍｍ以下であってもよいし、２ｍｍ以下であってもよいし、１．５ｍｍ以下であってもよいし、１ｍｍ以下であってもよい。
【００７４】
ここで、「三次元組織体の厚さ」とは、三次元組織体がシート状、又は直方体状である場合、主面に垂直な方向における両端の距離を意味する。上記主面に凹凸がある場合、厚さは上記主面の最も薄い部分における距離を意味する。
【００７５】
また、三次元組織体が球体状である場合、その直径を意味する。さらにまた、三次元組織体が楕円体状である場合、その短径を意味する。三次元組織体が略球体状又は略楕円体状であって表面に凹凸がある場合、厚さは、三次元組織体の重心を通る直線と上記表面とが交差する２点間の距離であって最短の距離を意味する。
【００７６】
＜三次元組織体の製造方法＞
本実施形態に係る三次元組織体の製造方法は、（１）水性媒体中において、上述の細胞外マトリックス含有組成物と細胞とを接触させる工程（工程（１））、及び（２）上述の細胞外マトリックス含有組成物が接触した細胞を培養する工程（工程（２））を備えている。
【００７７】
三次元組織体の製造方法において、細胞は、コラーゲン産生細胞を含む細胞であることが好ましい。コラーゲン分泌細胞を含む細胞を用いることで、より安定で、細胞が均一に分布している三次元組織体が得られる。このような三次元組織体が得られるメカニズムの詳細は不明であるが、以下のように推測される。
【００７８】
従来の足場を利用した三次元組織体の製造方法では、予め用意された足場に目的の細胞を注入するため、足場の内部にまで均一に細胞を分布させることが困難であった。細胞がコラーゲン産生細胞を含む細胞である場合、まず、細胞が細胞外マトリックス含有組成物上に接触して接着する。その後、細胞は自分自身で細胞外マトリックス成分を構成するタンパク質（例えば、線維性コラーゲン等のコラーゲン）を産生する。産生されたタンパク質は細胞外マトリックス含有組成物上に接触して接着することで、細胞外マトリックス含有組成物間の架橋剤として働き、細胞が均一に存在する環境下で細胞外マトリックス成分を構成するタンパク質等の構造化が進む。その結果、より安定で、細胞が均一に分布している三次元組織体が得られる。ただし、上記推測は本発明を限定するものではない。
【００７９】
また、特許文献１〜３に記載の製造方法では、三次元組織体を製造するための工程数が多く、１時間程度の作業時間が必要であった。本実施形態に係る製造方法によれば、短い作業時間で三次元組織体を製造できる。さらに、本実施形態に係る製造方法によれば、簡便に三次元組織体を製造できる。特許文献２に記載の製造方法では、厚さが１ｍｍ程度の三次元組織体を製造するために、細胞が少なくとも１０６ｃｅｌｌｓ必要であった。本実施形態に係る製造方法によれば、比較的少ない細胞数で、厚さが１ｍｍ以上である、サイズが大きい三次元組織体を製造できる。
【００８０】
工程（１）では、水性媒体中において、細胞外マトリックス含有組成物と細胞とを接触させる。水性媒体中において、細胞外マトリックス含有組成物と細胞とを接触させる方法は特に制限されない。例えば、細胞を含む培養液に、細胞外マトリックス含有組成物を加える方法、細胞外マトリックス含有組成物に水性媒体と細胞を加える方法、又は予め用意した水性媒体に、細胞外マトリックス含有組成物及び細胞をそれぞれ加える方法が挙げられる。
【００８１】
工程（１）においては、コラーゲン産生細胞及びコラーゲン産生細胞以外の他の細胞を含む細胞を用いてよい。コラーゲン産生細胞、及びコラーゲン産生細胞以外の他の細胞としては、上述した細胞をそれぞれ用いることができる。コラーゲン産生細胞及びコラーゲン産生細胞以外の他の細胞を共に用いて三次元組織体を製造することで、種々のモデル組織を製造することが可能になる。例えば、ＮＨＣＦ及びＨＵＶＥＣを用いた場合、内部に毛細血管を有する三次元組織体を得ることが可能になる。ＮＨＣＦ及び大腸がん細胞を用いた場合、大腸がんのモデル組織を得ることが可能になる。また、ＮＨＣＦ及びｉＰＳ−ＣＭを用いた場合、同期拍動を示す心筋のモデル組織を得ることが可能になる。
【００８２】
工程（１）における細胞外マトリックス含有組成物の濃度は、目的とする三次元組織体の形状、厚さ、培養器のサイズ等に応じて適宜決定できる。例えば、工程（１）における水性媒体中の細胞外マトリックス含有組成物の濃度は、０．１〜９０質量％であってもよいし、１〜３０質量％であってもよい。
【００８３】
工程（１）における細胞外マトリックス含有組成物の量は、１×１０５ｃｅｌｌｓの細胞に対して、０．１〜１００ｍｇであってもよいし、１〜５０ｍｇであってもよい。
【００８４】
工程（１）において、細胞外マトリックス含有組成物と細胞との質量比（細胞外マトリックス含有組成物／細胞）は、１／１〜１０００／１であることが好ましく、９／１〜９００／１であることがより好ましく、１０／１〜５００／１であることがさらに好ましい。
【００８５】
コラーゲン産生細胞とその他の細胞とを共に用いる場合、その他の細胞の比率に対する工程（１）におけるコラーゲン産生細胞の細胞数の比（工程（１）におけるコラーゲン産生細胞／その他の細胞の比）は、９／１〜９９／１であってもよく、５０／５０〜８０／２０であってもよく、２０／８０〜５０／５０であってもよく、１０／９０〜５０／５０であってもよい。
【００８６】
工程（１）及び工程（２）の間に、水性媒体中における細胞外マトリックス含有組成物と細胞とを共に沈降させる工程を更に含んでもよい。このような工程を行うことで、三次元組織体における細胞外マトリックス含有組成物及び細胞の分布が、より均一になる。具体的な方法としては、特に制限はないが、例えば細胞外マトリックス含有組成物と細胞とを含む培養液を遠心操作する方法が挙げられる。
【００８７】
工程（１）は、水性媒体中で細胞の層を形成させた後、細胞外マトリックス含有組成物を接触させることにより行われてもよい。細胞の層を細胞外マトリックス含有組成物と接触させる前に形成することで、下層部の細胞密度が高い三次元組織体を作製することができる。また、コラーゲン産生細胞を含む細胞の層を細胞外マトリックス含有組成物と接触させる前に形成することで、コラーゲン産生細胞を含む細胞の下層部の細胞密度が高い三次元組織体を作製することができる。用いる細胞の種類（例えば、大動脈平滑筋細胞）によっては、この方法により、より生体に近い組織を作製することができる。
【００８８】
工程（２）の後、工程（３）として、さらに細胞を接触させ、細胞を培養する工程を含んでもよい。上記細胞は、工程（１）で用いた細胞と同種であってよく、異種であってもよい。例えば、工程（１）で用いる細胞がコラーゲン産生細胞以外の細胞を含む場合に、工程（３）で用いる細胞はコラーゲン産生細胞を含んでもよい。また例えば、工程（１）で用いる細胞がコラーゲン産生細胞を含む場合に、工程（３）で用いる細胞はコラーゲン産生細胞以外の細胞を含んでもよい。工程（１）で用いる細胞及び工程（３）で用いる細胞の両方がコラーゲン産生細胞を含んでもよく、工程（１）で用いる細胞及び工程（３）で用いる細胞の両方がコラーゲン産生細胞以外の細胞を含んでもよい。上記工程（３）により、二層構造の三次元組織体を作製することができる。例えば、大動脈平滑筋細胞及び血管内皮細胞を用いた場合、並びにヒト皮膚由来線維芽細胞及びヒト表皮角化細胞を用いた場合には、この方法により、より生体に近い組織を作製することができる。また、例えば、ヒト歯肉線維芽細胞と歯肉上皮細胞を用いた場合には、この方法により、組織収縮及び組織割れのない二層構造の三次元組織体を作製することができる。
【００８９】
細胞外マトリックス含有組成物が接触した細胞を培養する方法は、特に制限はなく、培養する細胞の種類に応じて好適な培養方法で行うことができる。例えば、培養温度は２０℃〜４０℃であってもよく、３０℃〜３７℃であってもよい。培地のｐＨは、６〜８であってもよく、７．２〜７．４であってもよい。培養時間は、１日〜２週間であってもよく、１週間〜２週間であってもよい。
【００９０】
培地は特に制限はなく、培養する細胞の種類に応じて好適な培地を選択できる。培地としては、例えば、Ｅａｇｌｅ’ｓ  ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ培地（ＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ培地、ＲＰＭＩ、及びＧｌｕｔａＭａｘ培地等が挙げられる。培地は、血清を添加した培地であってもよいし、無血清培地であってもよい。更に、液体培地は二種類以上の培地を混合した混合培地であってもよい。
【００９１】
工程（２）における培地中の細胞密度は、目的とする三次元組織体の形状、厚さ、培養器のサイズ等に応じて適宜決定できる。例えば、工程（２）における培地中の細胞密度は、１〜１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌであってもよいし、１０３〜１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌであってもよい。また、工程（２）における培地中の細胞密度は、工程（１）における水性媒体中の細胞密度と同じであってもよい。
【００９２】
上記三次元組織体は、培養中の収縮率が２０％以下であることが好ましく、１５％以下であることがより好ましく、１０％以下であることがさらに好ましい。上記収縮率は、例えば、以下の式で算出できる。式中Ｌ１は、培養後１日目の三次元組織体のもっとも長い部分の長さを示し、Ｌ３は、培養後３日目の三次元組織体における対応する部分の長さを示す。
収縮率（％）＝｛（Ｌ１―Ｌ３）／Ｌ１｝×１００
【００９３】
上述の製造方法により例えば、細胞と、細胞外マトリックス成分とを含む三次元組織体であって、コラーゲンの含有率が、上記三次元組織体を基準として１０質量％〜９０質量％である、三次元組織体を製造することができる。
【実施例】
【００９４】
以下に、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００９５】
（実施例１：架橋コラーゲン成分の作製）
日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来Ｉ型コラーゲン凍結乾燥体１００ｍｇを、真空検体乾燥器ＨＤ−１５Ｈ（石井理化機器製作所製）で、減圧状態にしながら、２００℃で２４時間加熱を行った。これにより、乾燥体として、少なくとも一部が架橋されているコラーゲン成分（架橋コラーゲン成分）を得た。なお、２００℃の加熱前後において、コラーゲンに外見上の大きな変化は確認されなかった。【００９６】
（実施例２：架橋コラーゲン成分の断片化）
実施例１で作製した架橋コラーゲン成分５０ｍｇを５ｍＬの超純水に懸濁し、撹拌式ホモジナイザーを用いて２分間ホモジナイズすることにより、少なくとも一部が架橋されている断片化コラーゲン成分（断片化架橋コラーゲン成分）を含有する分散液を得た。図１は、当該分散液中の断片化架橋コラーゲン成分を示す写真である。得られた断片化架橋コラーゲン成分の平均長（長さ）は、３７４±１６２μｍであった（サンプル数：２０）。【００９７】
（実施例３：断片化架橋コラーゲン成分の凍結乾燥及び再分散）
実施例２で作製した断片化架橋コラーゲン成分を含有する分散液を３日間凍結乾燥し、水分を除去した。凍結乾燥後、再度、超純水中に懸濁した。その結果を図２に示す。図２に示す通り、断片化架橋コラーゲン成分は、凍結乾燥後も再度超純水中に分散させることが可能であった。凍結乾燥後の断片化架橋コラーゲン成分の平均長（長さ）は、２６１±１２８μｍであった（サンプル数：２０）。【００９８】
（比較例１：非架橋コラーゲン成分の断片化及び凍結乾燥後の再分散能）
架橋処理を行っていない日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来Ｉ型コラーゲン凍結乾燥体５０ｍｇを超純水５ｍＬに懸濁して２分間ホモジナイズすることにより、架橋されていない断片化コラーゲン成分（断片化非架橋コラーゲン成分）を含有する分散液を得た。断片化非架橋コラーゲン成分の平均長（長さ）は、２１０±９０μｍであった（サンプル数：２０）。【００９９】
断片化非架橋コラーゲン成分を含有する分散液をＦＤＵ−２２００型（東京理化器械製）により３日間凍結乾燥し、水分を除去した。凍結乾燥後、再度、超純水中での分散を試みた。その結果を図３に示す。図３に示す通り、断片化非架橋コラーゲン成分は、凍結乾燥前の段階では、断片化架橋コラーゲン成分と同程度のサイズに断片化し超純水中に分散していた。しかし、凍結乾燥後では超純水と懸濁しても乾燥体が超純水中に分散せず、分散液を得ることができなかった。【０１００】
（実施例４：熱架橋コラーゲンの架橋度の測定）
加熱温度２００℃で架橋を行った際のコラーゲンの架橋度を、ＴＮＢＳ法によって測定した。ＴＮＢＳ法は非特許文献２に記載の方法に基づき行った。すなわち、まず、４ｍｇの熱架橋コラーゲン成分に０．５ｍＬの４％ＮａＨＣＯ３溶液（炭酸水素ナトリウム（Ｗａｋｏ，１９１−０１３０５）と超純水により調製）と０．５ｍＬの０．５％トリニトロベンゼンスルホン酸溶液（２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム（ナカライテスク，３５２１１−４４）と超純水により調製）を加えて、４０℃で２時間反応後、１．５ｍＬの６Ｍ塩酸（塩酸（Ｗａｋｏ，０８０−０１０６６）を２倍希釈）を加え、６０℃で９０分間静置した。その後、反応液を１ｍＬ取り出して、６ｍＬの超純水で希釈し、紫外可視近赤外分光光度計（ＪＡＳＣＯ，Ｖ−６７０Ｍ）を用いて３４５ｎｍにおける吸光度（Ａｂｓ３４５ｎｍ）を測定した。アミノ基の架橋度を、架橋度＝１−（Ａｂｓ３４５ｎｍ／重量架橋）／（Ａｂｓ３４５ｎｍ／重量未架橋）の式より求めた。【０１０１】
図４（Ａ）は、架橋コラーゲン及び非架橋コラーゲンの吸収スペクトル測定結果を示し、図４（Ｂ）は、加熱時間及び架橋度の関係を示す。吸光スペクトルの波形については、加熱温度２００℃及び非加熱のコラーゲンで大きな差異は無かった。即ち、加熱の前後においては、ゼラチン化のようなその物理的特性を大きく変化させ得る構造変化は生じていないことが示唆された。また、２００℃の加熱温度にて２４時間加熱した際の架橋度は約１２％であった。更に、２００℃の加熱温度で５時間〜４８時間加熱した場合における各サンプルの架橋度を確認した。その結果、加熱時間２４時間以上では、生成する架橋コラーゲン成分の架橋度に大きな違いは生じなかった。【０１０２】
（実施例５：断片化架橋コラーゲン成分を用いた組織形成）
日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来Ｉ型コラーゲン凍結乾燥体を、実施例１と同様にして２００℃で２４時間加熱し、架橋コラーゲン成分を得た。得られた架橋コラーゲン成分を１０倍濃度のリン酸緩衝生理食塩水（Ｘ１０  ＰＢＳ）に分散し、撹拌式ホモジナイザーを用いて２分間ホモジナイズし、断片化架橋コラーゲン成分を得た。断片化架橋コラーゲン成分をＦＤＵ−２２００型（東京理化器械製）により３日間凍結乾燥し、水分を除去した後、凍結乾燥体の状態で断片化架橋コラーゲン成分８ｍｇを秤量し、Ｄ―ＭＥＭとＥＢＭ−２の混合培地３００μｌに懸濁して断片化架橋コラーゲン成分を含有する分散液を得た。【０１０３】
更に、図５に示すように、断片化架橋コラーゲン成分（凍結乾燥熱架橋ＣＭＦ）の分散液に、正常ヒト皮膚由来線維芽細胞（ＮＨＤＦ  Ｌｏｎｚａ製）１．０ｘ１０６ｃｅｌｌ及びヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ  Ｌｏｎｚａ製）２．０ｘ１０５ｃｅｌｌを懸濁し、２４ウェルセルカルチャーインサート（コーニング製）に添加して、２ｍＬの混合培地中で１日間培養した。その後、６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ製）に移し、１２ｍＬの混合培地中で更に４日間培養を行った。培養後の三次元組織体に対して、ａｎｔｉ−ＣＤ３１抗体（ＤＡＫＯ社製、Ｍ０８２３）とＡｌｅｘａ６４７標識二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、Ａ−２１２３５）を用いた蛍光免疫染色を行い、当該三次元組織体中の血管を蛍光標識した。この蛍光標識された三次元組織体を、共焦点定量イメージサイトメーターＣＱ１ (横河電機製)で観察して血管網形成有無を確認した。その結果を図５に示す。図５に示す通り、断片化架橋コラーゲン成分を用いた三次元組織体の形成により、血管網が形成されていることを確認した。【０１０４】
（実施例６：断片化工程における水分散安定性への架橋度の効果）
断片化非架橋コラーゲン成分は、断片化工程（ホモジナイズ）を長時間続けたときに溶媒中に断片化コラーゲン成分が溶解する場合があった。断片化架橋コラーゲン成分が、断片化工程において、水分散安定性を有しているか否かを確認した。水分散安定性とは、細胞外マトリックス成分を、水を主成分とする溶媒（好ましくは超純水）に含有させた際に、溶解せずに分散状態となる性質のことを指す。【０１０５】
日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来Ｉ型コラーゲン凍結乾燥体１００ｍｇを、真空検体乾燥器ＨＤ−１５Ｈ（石井理化機器製作所製）で、減圧状態にしながら、１００℃、１５０℃、又は２００℃で２４時間加熱を行った（架橋工程）。これにより、架橋コラーゲン成分を得た。得られた各架橋コラーゲン成分５０ｍｇを５ｍＬの超純水に懸濁し、撹拌式ホモジナイザーを用いて２分間ホモジナイズすることにより、断片化架橋コラーゲン成分を含有する分散液を得た（断片化工程）。【０１０６】
加熱温度１００℃、１５０℃及び２００℃の条件で調製した架橋コラーゲン成分のＴＮＢＳ法による架橋度はそれぞれ３％、４％及び１２％であった。【０１０７】
図６（Ａ）は、断片化非架橋コラーゲン成分、ＴＮＢＳ法による架橋度が３％、４％又は１２％である、断片化架橋コラーゲン成分を、濃度１質量％で超純水に含有させてから、４℃で、２４時間経過した時点の写真を示す。図６（Ｂ）は、各種コラーゲン成分の回収率の測定結果を示す。ＴＮＢＳ法による架橋度を高くすると、断片化工程において、水に溶解しにくくなり、断片化工程後に回収することが容易になることが示された。これによって、ＴＮＢＳ法による架橋度を高くすることによって、製造効率が向上することが示された。【０１０８】
（実施例７：断片化架橋コラーゲンを用いた三次元組織体の構築）
実施例５と同様にして、得た凍結乾燥体の状態で断片化架橋コラーゲン成分（ｃＣＭＦ）８ｍｇを秤量し、Ｄ―ＭＥＭとＥＢＭ−２の混合培地３００μｌに懸濁して断片化架橋コラーゲン成分（ｃＣＭＦ）を含有する分散液を得た。これと同様にして、断片化非架橋コラーゲン成分（ＣＭＦ）を含有する分散液を得た。【０１０９】
断片化架橋コラーゲン成分（ｃＣＭＦ）又は断片化非架橋コラーゲン成分（ＣＭＦ）を含有する分散液に、正常ヒト皮膚由来線維芽細胞（ＮＨＤＦ  Ｌｏｎｚａ製）１．０ｘ１０６ｃｅｌｌ及びヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ  Ｌｏｎｚａ製）５．０ｘ１０５ｃｅｌｌを懸濁し、２４ウェルセルカルチャーインサート（コーニング製）に添加して、２ｍＬの混合培地中で１日間培養した。その後、６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ製）に移し、１２ｍＬの混合培地中で更に４日間培養を行った。培養後の三次元組織体に対して、ａｎｔｉ−ＣＤ３１抗体（ＤＡＫＯ社製、Ｍ０８２３）とＡｌｅｘａ６４７標識二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、Ａ−２１２３５）を用いた蛍光免疫染色を行い、当該三次元組織体中の血管を蛍光標識した。この蛍光標識された三次元組織体を、共焦点定量イメージサイトメーターＣＱ１ (横河電機製)で観察して血管網形成を観察した。その結果を図７に示す。図７に示すように、架橋の有無によって、三次元組織体の構築における細胞の活動に大きな影響は出ていないことが示された。【０１１０】
（実施例８：超音波処理による断片化架橋コラーゲンの作製）
実施例１で作製した架橋コラーゲン成分５０ｍｇを５ｍＬの超純水に懸濁した。この懸濁液が入ったチューブを氷上で、超音波式ホモジナイザー（Ｓｏｎｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ社  ＶＣ５０）により２０秒間超音波処理した後、１０秒間静置することを、１００回繰り返した。これにより、少なくとも一部が架橋されている断片化コラーゲン成分（断片化架橋コラーゲン成分）を含有する分散液を得た。【０１１１】
図８は、撹拌式ホモジナイザーによる断片化架橋コラーゲン成分（ｃＣＭＦ）及び超音波式ホモジナイザー（超音波処理）による断片化架橋コラーゲン成分（ｓｃＣＭＦ）の外観を示す写真及び顕微鏡写真である。超音波処理による断片化架橋コラーゲン成分（ｓｃＣＭＦ）の平均長は、１４．８±８．２μｍ（Ｎ＝２０）であった。超音波処理によって、よりサイズの小さい断片化架橋コラーゲンが得られることが示された。【０１１２】
ｃＣＭＦ又はｓｃＣＭＦを含有する分散液を凍結させ、３日間乾燥し、水分を除去した。これによって、乾燥体として、ｃＣＭＦ及びｓｃＣＭＦを得た（図９（Ａ））。【０１１３】
凍結乾燥後、ｃＣＭＦ及びｓｃＣＭＦそれぞれを再度２ｍＬの超純水に、濃度０．５質量％、温度２０℃の条件で懸濁した。凍結乾燥後懸濁開始時点を０ｓとして、１時間各懸濁液の状態を観察した。結果を図９（Ｂ）に示す。図９（Ｂ）に示す通り、凍結乾燥後懸濁開始時点を０ｓにおいて、ｃＣＭＦ及びｓｃＣＭＦを懸濁させた超純水の波長５００ｎｍの光に対する透過率はそれぞれ１１％及び８％となり、ｃＣＭＦ及びｓｃＣＭＦいずれも凍結乾燥後に再分散可能であることが確認された。ｓｃＣＭＦを用いた場合、より長時間分散された状態が維持されていた。これによって、断片化熱架橋コラーゲン成分のサイズ（平均長）を小さくすること（例えば、５０μｍ以下、好ましくは２０μｍ以下にすること）によって、高い分散性が維持されやすくなることが示された。なお、透過率の測定は、Ｖ−６７０  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｊａｓｃｏ）を用い、波長５００ｎｍの光に対する透過率を測定することにより実施した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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