(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパク質を含む抗原であって、
前記組換えＲＳＶ  Ｆタンパク質は、両末端がＨＲＮ領域およびＨＲＣ領域と接する抗原性領域を含有し、
前記ＨＲＮ領域およびＨＲＣ領域は、それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列との一致度が少なくとも９０％であり、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と同じ機能を有するアミノ酸配列を含有し、
前記抗原性領域は、部位φ、部位ＩＩ、および部位ＩＶからなる群から選ばれる複数の抗原性部位を含有し、
前記部位φ、部位ＩＩ、および部位ＩＶは、それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のアミノ酸配列との一致度が少なくとも８０％であり、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５の抗原特異性を維持するアミノ酸配列を含有し、
前記抗原性部位はリンカーにより互いに連結し、
前記リンカーは、出現ごとに独立に２〜２０個のアミノ酸からなり、前記リンカーは、ＧＳＧＳ、ＧＧＧＳ、ＧＧＳＧ、ＳＧＳＧおよびＧＧのうちのいずれか一つのアミノ酸配列を含む、
抗原。
【請求項２】
前記抗原性領域は、リンカーにより前記ＨＲＮ領域に連結する複数の部位φを含む、請求項１に記載の抗原。
【請求項３】
前記抗原性領域は、部位ＩＩ、および部位ＩＶを含む、請求項１に記載の抗原。
【請求項４】
前記ＨＲＮ領域はリンカーにより部位ＩＩに連結し、部位ＩＶは前記リンカーにより前記ＨＲＣ領域に連結する、請求項３に記載の抗原。
【請求項５】
前記組換えＲＳＶ  Ｆタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸配列との一致度が少なくとも９０％であり、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８と同じ機能を有するアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の抗原。
【請求項６】
前記抗原性領域は、三つの部位φを含む、請求項１に記載の抗原。
【請求項７】
前記組換えＲＳＶ  Ｆタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のアミノ酸配列との一致度が少なくとも９０％であり、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７と同じ機能を有するアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の抗原。
【請求項８】
前記抗原は、５Ｃ４、Ｄ２５、またはＡＭ２２融合前特異的な抗体に特異的に結合する、請求項１に記載の抗原。
【請求項９】
請求項１に記載の抗原をコードするものである、核酸分子。
【請求項１０】
コドンが最適化されて原核細胞内で発現するためのものである、請求項９に記載の核酸分子。
【請求項１１】
前記原核細胞は、大腸菌細胞である、請求項１０に記載の核酸分子。
【請求項１２】
前記核酸分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の核酸配列との一致度が少なくとも９０％である核酸配列を含む、請求項１１に記載の核酸分子。
【請求項１３】
コドンが最適化されて真核細胞内で発現するためのものである、請求項９に記載の核酸分子。
【請求項１４】
前記真核細胞は、酵母細胞または哺乳動物細胞である、請求項１３に記載の核酸分子。
【請求項１５】
前記哺乳動物細胞は、ヒト細胞である、請求項１４に記載の核酸分子。
【請求項１６】
有効量の請求項１に記載の抗原を含む、ワクチン組成物。
【請求項１７】
さらに、医薬上許容できるキャリアおよび／またはアジュバントを含む、請求項１６に記載のワクチン組成物。
【請求項１８】
前記アジュバントは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドまたはＢ型肝炎コアウイルス様粒子である、請求項１７に記載のワクチン組成物。
【請求項１９】
Ｔｈｌ免疫応答を促進する、請求項１８に記載のワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、２０１６年１１月２２日付けて出願した米国の仮出願ＵＳ６２／４２５，０７８の優先権を主張しており、ここに参照することによって、その全体が本明細書中へ組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、抗原、核酸分子、および免疫応答、特に、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対抗する免疫応答を引き起こすためのワクチン組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＲＳＶは、乳幼児の下気道感染の最もよく見られる原因とされている。世界保健機関の報告によると、ＲＳＶは、世界中で毎年およそ１９９，０００の死亡例を引き起こし、そのうちの９９％は発展途上国で出現している（Ｎａｉｒ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ＲＳＶは、全年齢層の人に感染させて疾患を発生させることができ、老人や免疫力低下の個体が最も重篤である。大部分の幼児は、二歳の前に少なくとも一回感染されることがあり、また、ＲＳＶに対する不完全な免疫性により、全生命過程において再び感染され続ける可能性がある（Ｈａｌｌ，Ｃ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。
【０００４】
ＲＳＶによる疾病負荷が高いにもかかわらず、現時点では、ＲＳＶに用いられる予防性および治療性の方法は非常に限られている。例えば、ヒト化モノクローナル抗体であるパリビズマブ（Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ）（ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標）；ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．）は、９５％のヒト抗体配列および５％のマウス抗体配列を含む。パリビズマブは、ＲＳＶのＦサブユニットのＡ抗原部位におけるエピトープに結合することで、ＲＳＶによる下気道疾患を治療できる。しかしながら、パリビズマブは、高リスクの乳児での使用のみが許可されている。また、抗ウイルス剤リバビリン（ｒｉｂａｖｉｒｉｎ）は、ＲＳＶ肺炎および細気管支炎に対して治療効果があることが示されており、また、リバビリンは、小児科群のＲＳＶ感染の治療のみに使用されている。さらに、リバビリンは、多くの副作用、例えば、不眠症、呼吸困難、頭痛、吐き気、筋肉痛、情緒不安定、溶血性貧血、ヘモグロビン減少、アレルギー反応および肝臓問題を伴う。なお、リバビリンは胎児への潜在的危険性があるため、妊婦に使用することはおすすめできない。
【０００５】
１９６０年代の末期では、ホルマリンで不活化したＲＳＶ（ＦＩＲＳＶ）ワクチンの乳幼児に対する免疫効果を評価した。ＦＩＲＳＶワクチンは、高いレベルの血清抗体を発生させたにもかかわらず、ＲＳＶによる疾患の予防または治療を成功させることはなかった。逆に、幼児早期でＦＩＲＳＶワクチンを受けた人は、後でＲＳＶに感染される際に、ワクチン未接種の個体よりも重篤な下気道疾患を経験することになる。また、今までの研究は、ＲＳＶチャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）マウスの体内では、ＦＩＲＳＶがに顕著な肺胞隔炎（ａｌｖｅｏｌｉｔｉｓ）および血管周囲炎（ｐｅｒｉｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ）を誘発したことが示されている。
【０００６】
ウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）、サブユニットおよび弱毒化生ワクチンを含むＲＳＶワクチンを開発するための研究は多く実施されてきた。しかしながら、未だに、ＲＳＶ感染に対抗するワクチンは承認されていない。巨大な疾病負荷と限られた予防方法のため、現在は、以前よりも安全かつ有効なＲＳＶワクチンが求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前記事情に鑑みて、本発明は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパク質の天然の三量体構造を模擬するために、組換えＲＳＶ  Ｆタンパク質を含む抗原を提供する。
【０００８】
前記組換えＲＳＶ  Ｆタンパク質は、両末端がＨＲＮ領域およびＨＲＣ領域と接する抗原性領域を含み、前記抗原性領域は、部位φ、部位ＩＩ、および部位ＩＶからなる群から選ばれる一つまたは複数の抗原性部位を含有し、但し、前記抗原性領域が一つを超える抗原性部位を含有すると、前記抗原性部位はリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）により互いに連結し、前記リンカーは出現ごとに独立に２〜２０個のアミノ酸からなる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の具体的な実施態様において、前記抗原性部位は、部位φ、部位ＩＩ、および部位ＩＶを含む。本発明のもう一つの具体的な実施態様において、前記ＨＲＮ領域は部位φに直接に連結し、部位ＩＶはリンカーにより前記ＨＲＣ領域に連結する。
【００１０】
本発明のまた一つの態様によれば、本発明は、上記組換えＲＳＶ  Ｆ抗原をコードする核酸分子を提供する。
【００１１】
本発明のまたもう一つの態様によれば、本発明は、有効量の上記抗原または核酸分子を含むワクチン組成物を提供する。
【００１２】
もう一つの具体的な実施態様において、被験者体内のＲＳＶ感染を十分に予防または緩和する条件で、一種類または複数種類の有効量の上記抗原、前記抗原をコードまたは発現する核酸分子またはプラスミドを含むワクチン組成物を前記被験者に投与する。前記ワクチン組成物は、前記被験者体内で、ＲＳＶ抗原、例えば、ＲＳＶ  Ｆタンパク質に対抗する免疫応答を十分に引き起こす量で投与する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、組換えＲＳＶ  Ｆタンパク質、および前記組換えＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする核酸分子を提供する。また、本発明は、有効量の前記抗原または前記核酸分子を含むワクチン組成物を提供する。本発明の抗原、核酸分子およびワクチン組成物は、ＲＳＶに特異的な抗体応答を誘導し、前記被験者をＲＳＶ感染から保護することができ、副作用を引き起こさない。また、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質と比べて、本発明の組換えＲＳＶ  Ｆタンパク質は、長さがより短く、より良い発現レベルをもたらせる。よって、本発明の抗原、核酸分子、およびワクチン組成物は、大規模な生産が相対的に容易であり、抗体を区別する特異性を増加させるのに寄与し、不必要な反応、例えば、アレルギーを避ける。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
下記の具体的な実施態様の詳細な説明と図面を参照することで、本発明をより完全に理解できる。
【図１】図１Ａ〜１Ｃは、それぞれ、ＨＲφ２４、ＨＲφおよびＨＲφ−３φ組換えタンパク質を示す概略図である。
【図２】図２Ａ〜２Ｉは、ＨＲφ２４、ＨＲφ、ＨＲφ−３φ組換えタンパク質およびＨＢｃのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果である。図２Ａ、２Ｃ、２Ｅ、および２Ｇは、それぞれ、精製したＨＲφ２４、ＨＲφ、ＨＲφ−３φ組換えタンパク質およびＨＢｃについての、クマシーブリリアントブルー染色を示し；図２Ｂ、２Ｄ、および２Ｆは、それぞれ、精製したＨＲφ２４、ＨＲφ、およびＨＲφ−３φ組換えタンパク質についての、抗Ｈｉｓ抗体を使用したウェスタンブロッティングを示し；図２Ｈは、精製したＨＢｃについての、ウサギポリクローナル抗ＨＢｃ抗体を使用したウェスタンブロッティングを示し；また、図２Ｉは、精製したＨＢｃおよびＨＲφ２４組換えタンパク質についての、マウスモノクローナル抗ＲＳＶ抗体を使用したウェスタンブロッティングを示す。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、それぞれ、精製したＨＢｃおよびＨＲφ２４組換えタンパク質のＴＥＭ画像を示す。
【図４】図４は、鼻内（ＩＮ）免疫接種スケジュールを示す。候補ワクチンを使用して、各群のマウスに免疫接種を０、３、および６週間目で合計３回行い、９週間目でマウスにＲＳＶチャレンジを受けさせる。さらに、もう一つの群は、ＲＳＶチャレンジの前に、ホルマリンで固定したＲＳＶ（ＦＩＲＳＶ）を筋肉（ｉ．ｍ）経由で免疫接種を行う。ＲＳＶチャレンジの２日前に、同じ投与スキームを使用した各群から、マウス血清、ＢＡＬＦおよび脾臓を採集する。
【図５】図５Ａ〜５Ｅは、ＨＢｃもしくはＣｐＧと混合したか、または混合していないＨＲφ２４、ＨＲφもしくはＨＲφ−３φの鼻内投与を３服受けたマウスの体内におけるＨＲφ２４特異的抗体応答を示す。ＲＳＶチャレンジの２日前に、各群からマウス血清を採集する。図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、および５Ｅは、それぞれ、血清から測定したＨＲφ２４特異的全ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、およびＩｇＡ応答を示し；また、図５Ｄは、ＢＡＬＦから測定したＨＲφ２４特異的分泌型ＩｇＡ（ｓＩｇＡ）応答を示す。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、ＲＳＶチャレンジ後のマウス体重変化を示す。ＲＳＶチャレンジを行った後、対照群または鼻内投与を４服受けてワクチンを接種したマウスの体重変化を５日間観察する。体重変化は、０日目の体重に対して減少した百分率で示す。
【図７】図７は、肺組織病理学を示す。ＲＳＶチャレンジを行った５日後、対照群またはワクチンを接種したマウスの肺組織を採集し、組織学的分析を行う。
【図８】図８は、肺部ウイルス負荷を示す。ＲＳＶチャレンジを行った５日後、対照群またはワクチンを接種したマウスの肺組織を採集し、ＲＳＶ  Ｎ遺伝子をターゲットとするｑＲＴ−ＰＣＲで肺部ウイルス負荷分析を行う。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明を下記の具体的な実施態様で例示的に説明する。当業者は、本発明の開示および説明に基づいて、本発明の他の利点を予想できる。本発明は、異なる具体的な実施態様に開示されているように実施または応用できる。本発明の精神と範疇に反せず、異なる態様および応用において本発明を実施するように、上記の実施態様を修飾および／または変更できる。
【００１６】
本明細書において、明記されていない限り、単数形式の「一つ」および「前記」は複数の対象を含む。よって、例えば、記載されている「一つの抗原」は抗原の混合物を含み、記載されている「一つの医薬上許容できるキャリア」は２種類または複数種類のこのようなキャリアの混合物等を含む。このように、用語の「一つ」、「一つまたは複数の」、および「少なくとも一つ」は本明細書で互換に使用できる。
【００１７】
また、本明細書で使用されている「および／または」は、２種類の特定の特徴または成分のうちの一方または両方の詳細な説明に使用される。よって、本明細書において、文型の「Ａおよび／またはＢ」に使用される用語である「および／または」は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ（のみ）」および「Ｂ（のみ）」の意味を含む。
【００１８】
本発明は、組換えＲＳＶ  Ｆタンパク質を含む抗原を提供する。前記組換えＲＳＶ  Ｆタンパク質は、両末端がＨＲＮ領域およびＨＲＣ領域と接する抗原性領域を含有し、前記抗原性領域は、部位φ、部位ＩＩ、および部位ＩＶからなる群から選ばれる一つまたは複数の抗原性部位を含有する。
【００１９】
本明細書において、ＲＳＶは、三つの連続遺伝子（ＳＨ−Ｇ−Ｆ）でコードされる小疎水性糖タンパク質（ＳＨ）、付着糖タンパク質（Ｇ）、および融合糖タンパク質（Ｆ）という三種類の表面糖タンパク質を有する。ＲＳＶワクチンの研究開発において、主要なターゲット抗原がＲＳＶ  ＦおよびＧであるのは、これらの抗原が各々に中和抗体およびＴ細胞応答を発生させることができるためである。特にＦは、ＲＳＶ隔離群ではかなりの保守性を有するため、注目されている。従来、ＲＳＶ  Ｆの融合前と融合後の二つの構造に発見され、中和（ＮＴ）活性に関連する周知の二種類の主な抗原性部位が存在している。これらは、最初はネズミ科動物のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）に結合する１１２９（部位ＩＩ）（Ｂｅｅｌｅｒ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ａｒｂｉｚａ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９２）、および１０１Ｆ（部位ＩＶ）（Ｗｕ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，２００７）により同定された。部位ＩＩは、パリビズマブのターゲットとして知られており、パリビズマブは、高リスク群の乳児群における重篤なＲＳＶ疾患を低減できる。ＭｃＬｅｌｌａｎら（ＭｃＬｅｌｌａｎ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１３）は、ＲＳＶを有効に中和するが、融合後のＦタンパク質に結合しないことを示すマウス抗体５Ｃ４を単離した。５Ｃ４は、免疫接種されたＰＢＭＣｓから単離したＤ２５およびＡＭ２２の他の二種類の抗体とこのような性質を共有し、この抗体は、ＲＳＶを中和することにおいて、パリビズマブより１００倍大きい効果を示す（ＭｃＬｅｌｌａｎ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。Ｄ２５およびＡＭ２２は、部位φをターゲットとし、前記部位は、融合前のＲＳＶ  Ｆ三量体の表面に位置する準安定状態抗原性部位である（Ｓｐｉｔｓ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｂｅａｕｍｏｎｔ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。Ｆタンパク質の融合前の晶体構造と融合後の晶体構造は、二つの構造のいずれにも部位ＩＩおよび部位ＩＶが発見されているが、部位φが融合前の形式のみに特異性を有することを示唆している（ＭｃＬｅｌｌａｎ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【００２０】
ＲＳＶ  Ｆの融合ペプチド領域は、Ｆ１サブユニットのアミノ基末端に位置し（Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｐ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、その膜貫通セグメントは、４，３−疎水性７塩基繰り返し配列（ＨＲ）、およびコイルドコイル構造を思わせる配列モチーフ（Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｓｉｎｇｈ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９９）という二つの領域を含む。これらの領域は、それぞれ、ＨＲＮおよびＨＲＣを指し、約２７０個のアミノ酸の中間領域で隔てられている。ＨＲＮおよびＨＲＣは、三量体であるヘアピン様構造を形成し、前記ＨＲＣ領域は、ＨＲＮ領域によって形成されたコイルドコイルと反平行になるように封入する（Ｂａｋｅｒ，Ｋ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。
【００２１】
本発明の具体的な実施態様において、前記ＨＲＮ領域およびＨＲＣ領域は、それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（ＭＡＶＳＫＶＬＨＬＥＧＥＶＮＫＩＫＳＡＬＬＳＴＮＫＡＶＶＳＬＳＮＧＶＳＶＬＴＳＫＶＬＤＬＫＮＹＩＤＫＱＬＬＰＩＶＮＫＱＳ）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（ＮＦＹＤＰＬＶＦＰＳＤＥＦＤＡＳＩＳＱＶＮＥＫＩＮＱＳＬＡＦＩＲＫＳＤＥＬＬＨＮＶＮＡＧＫ）のアミノ酸配列とは少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の一致性を有し、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と同じ機能を有するアミノ酸配列を含む。本発明のもう一つの具体的な実施態様において、前記抗原性領域に含まれている抗原性部位は、部位φ、部位ＩＩ、および部位ＩＶからなる群から選ばれる。前記部位φ、部位ＩＩ、および部位ＩＶは、それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（ＫＮＹＩＤＫＱＬＬＰＩＶＮＫ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４（ＮＳＥＬＬＳＬＩＮＤＭＰＩＴＮＤＱＫＫＬＭＳＮ）、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５（ＫＮＲＧＩＩＫＴＦＳ）のアミノ酸配列とは少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の一致性を有し、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５と同じ機能を有するアミノ酸配列を含む。本発明のもう一つの具体的な実施態様において、前記抗原性領域が一つを超える抗原性部位を含有すると、前記抗原性部位はリンカーにより互いに連結し、前記リンカーは出現ごとに独立に２〜２０個のアミノ酸からなる。
【００２２】
本明細書において、用語の「配列一致性」または、例えば、「８０％の配列が一致する」を含むこととは、比較ウィンドウ全体において、ヌクレオチドが一対一またはアミノ酸が一対一であることを基準とする場合の配列の一致性の程度を示す。よって、「配列一致性の百分率」は、比較ウィンドウ内で、二つの最も適切に対応する配列を比較して、二つの配列に出現している一致した核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または一致したアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓおよびＭｅｔ）の位置数を確認し、整合位置数を得って、前記整合位置数を比較ウィンドウ内の位置の総数（すなわち、ウィンドウのサイズ）で割った結果に１００を掛けることで、配列一致性の百分率を得ることにより、算出できる。含まれているのは、本明細書に開示されているいずれの参考配列（例えば、配列表を参照）と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列一致性を有するヌクレオチドおよびポリペプチドであり、典型的には、前記ポリペプチドの変異体は、その参考ポリペプチドの少なくとも一種の生物学活性または機能を保持している。
【００２３】
本発明の具体的な実施態様において、前記抗原性領域は、リンカーによりＨＲＮ領域に連結する少なくとも一つの部位φを含む。
【００２４】
本発明のもう一つの具体的な実施態様において、ＨＲＮ領域は、リンカーによりＨＲＣ領域に連結する（例えば、図１Ｂを参照）。さらにもう一つの具体的な実施態様において、前記組換えＲＳＶ  Ｆタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６（ＭＡＶＳＫＶＬＨＬＥＧＥＶＮＫＩＫＳＡＬＬＳＴＮＫＡＶＶＳＬＳＮＧＶＳＶＬＴＳＫＶＬＤＬＫＮＹＩＤＫＱＬＬＰＩＶＮＫＱＳＧＳＧＳＧＳＥＦＧＧＳＧＮＦＹＤＰＬＶＦＰＳＤＥＦＤＡＳＩＳＱＶＮＥＫＩＮＱＳＬＡＦＩＲＫＳＤＥＬＬＨＮＶＮＡＧＫＬＥＨＨＨＨＨＨ）のアミノ酸配列との一致度が少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であり、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６と同じ機能を有するアミノ酸配列を含む。
【００２５】
本発明のもう一つの具体的な実施態様において、前記抗原性領域は、三つの部位φを含む（例えば、図１Ｃを参照）。さらにもう一つの具体的な実施態様において、前記組換えＲＳＶ  Ｆタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７（ＭＡＶＳＫＶＬＨＬＥＧＥＶＮＫＩＫＳＡＬＬＳＴＮＫＡＶＶＳＬＳＮＧＶＳＶＬＴＳＫＶＬＤＬＫＮＹＩＤＫＱＬＬＰＩＶＮＫＱＳＧＳＧＳＡＳＳＮＩＫＥＮＫＣＮＡＡＫＮＹＩＤＫＱＬＬＰＩＶＮＫＧＧＧＳＳＮＩＫＥＮＫＣＮＡＡＫＮＹＩＤＫＱＬＬＰＩＶＮＫＧＧＥＦＳＮＩＫＥＮＫＣＮＡＡＫＮＹＩＤＫＱＬＬＰＩＶＮＫＫＬＧＧＳＧＮＦＹＤＰＬＶＦＰＳＤＥＦＤＡＳＩＳＱＶＮＥＫＩＮＱＳＬＡＦＩＲＫＳＤＥＬＬＨＮＶＮＡＧＫＬＥ）のアミノ酸配列との一致度が少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であり、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７と同じ機能を有するアミノ酸配列を含む。
【００２６】
本発明のもう一つの具体的な実施態様において、前記抗原性領域は、部位ＩＩ、および部位ＩＶを含む。本発明のもう一つの具体的な実施態様において、前記ＨＲＮ領域はリンカーにより部位ＩＩに連結し、部位ＩＶはリンカーによりＨＲＣ領域に連結する（例えば、図１Ａを参照）。さらにもう一つの具体的な実施態様において、前記組換えＲＳＶ  Ｆタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８（ＭＡＶＳＫＶＬＨＬＥＧＥＶＮＫＩＫＳＡＬＬＳＴＮＫＡＶＶＳＬＳＮＧＶＳＶＬＴＳＫＶＬＤＬＫＮＹＩＤＫＱＬＬＰＩＶＮＫＱＳＧＳＧＳＮＳＥＬＬＳＬＩＮＤＭＰＩＴＮＤＱＫＫＬＭＳＮＮＶＱＩＶＲＱＧＧＧＳＣＴＡＳＮＫＮＲＧＩＩＫＴＦＳＮＧＧＧＳＧＮＦＹＤＰＬＶＦＰＳＤＥＦＤＡＳＩＳＱＶＮＥＫＩＮＱＳＬＡＦＩＲＫＳＤＥＬＬＨＮＶＮＡＧＫ）のアミノ酸配列との一致度が少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であり、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８と同じ機能を有するアミノ酸配列を含む。
【００２７】
本発明の具体的な実施態様において、前記リンカーは、出現ごとに独立に２〜２０個のアミノ酸からなり、また、前記リンカーは、独立に、ＧＳＧＳ、ＧＧＧＳ、ＧＧＳＧ、ＳＧＳＧおよびＧＧのうちのいずれ一つのアミノ酸配列を含んでもよいが、これらに限定されない。
【００２８】
本発明の具体的な実施態様において、前記抗原は、５Ｃ４、Ｄ２５、またはＡＭ２２融合前特異的な抗体に特異的に結合する。
【００２９】
本発明のまた一つの態様によれば、本発明は、上記抗原をコードする核酸分子を提供する。
【００３０】
本発明の具体的な実施態様において、前記核酸分子は、コドンが最適化されて原核細胞内で発現するためのものである。もう一つの具体的な実施態様において、前記原核細胞は、大腸菌細胞である。さらにもう一つの具体的な実施態様において、前記核酸分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の核酸配列との一致度が少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である核酸配列を含む。
【００３１】
本発明の具体的な実施態様において、前記核酸分子は、コドンが最適化されて真核細胞内で発現するためのものである。もう一つの具体的な実施態様において、前記真核細胞は、酵母細胞または哺乳動物細胞である。さらにもう一つの具体的な実施態様において、前記哺乳動物はヒトである。
【００３２】
本発明のまたもう一つの態様によれば、本発明は、有効量の上記抗原または核酸分子を含むワクチン組成物を提供する。
【００３３】
一つの具体的な実施態様において、前記ワクチン組成物は、被験者体内で、ＲＳＶに対する免疫応答の誘導に使用できる。そのため、いくつかの具体的な実施態様において、治療有効量の一種類または複数種類の本発明の抗原、または前記抗原をコードまたは発現する核酸分子またはプラスミドを含むワクチン組成物を被験者に投与し、ＲＳＶに対する免疫応答を引き起こすことができる。
【００３４】
もう一つの具体的な実施態様において、被験者体内のＲＳＶ感染を十分に予防または緩和する条件で、治療有効量の一種類または複数種類の本発明の抗原、または前記抗原をコードまたは発現する核酸分子またはプラスミドを含むワクチン組成物を、必要のある被験者に投与する。前記ワクチン組成物は、被験者体内で、ＲＳＶ抗原、例えば、ＲＳＶ  Ｆタンパク質に対抗する免疫応答を十分に引き起こす量で投与する。本発明の具体的な実施態様において、本発明のワクチン組成物は、鼻内または筋肉経由で被験者に投与できる。
【００３５】
本発明の具体的な実施態様において、前記ワクチン組成物は、さらに、医薬上許容できるキャリアおよび／またはアジュバントを含んでもよい。
【００３６】
本明細書において、「医薬上許容できるキャリア」は、本発明のワクチン組成物の投与に適用し得る任意または全ての溶剤、分散媒体、抗菌剤や抗真菌剤、等張化剤や吸収遅延剤等を含む。本発明に用いられる医薬上許容できるキャリアは、防腐剤、懸濁剤、増粘剤、等張化剤、緩衝剤、および湿潤剤を含んでもよいが、これらに限定されない。
【００３７】
本発明のもう一つの具体的な実施態様において、本発明に用いられるアジュバントは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよびＢ型肝炎コアウイルス様粒子（ＨＢｃ  ＶＬＰ）を含むが、これらに限定されない。
【００３８】
もう一つの具体的な実施態様において、被験者に投与するワクチン組成物は、含有量比が１０：１〜１：１０である抗原とアジュバントとの混合物を含む。
【００３９】
本発明のもう一つの具体的な実施態様において、前記ワクチン組成物は、Ｔｈｌ免疫応答を促進する。
【００４０】
複数の実施態様で例示的に本発明を説明した。本発明の範疇は、下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４１】
実施例１：組換えＲＳＶキメラＦタンパク質発現ベクターの構築
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．  ｃｏｌｉ）））で発現するための最適化されたコドンを有するＲＳＶ  Ｆタンパク質の完全長ｃＤＮＡ配列（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＢｉｏＳｃｉ＆Ｔｅｃｈ）を合成した。この配列をＰＣＲテンプレートとして使用し、ＨＲＮ（部位φを含む。）を含有するヌクレオチド４５７〜６３３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、部位ＩＩを含有するヌクレオチド７６０〜８４９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、部位ＩＶを含有するヌクレオチド１２６４〜１３１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）、およびそのＣ末端α−ヘリックス（ＨＲＣ）を含有するヌクレオチド１４２６〜１５６０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）を含む、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の４種類の遺伝子断片を増幅した。
【００４２】
この４種類のＰＣＲアンプリコンを部分オーバーラップＰＣＲにより連結し、ＧＳＧＳ、ＧＧＧＳ、ＧＧＳＧ、ＳＧＳＧおよびＧＧのようなグリシンリッチリンカーにより連結して、構築した遺伝子（ＨＲφ２４と命名する）を形成し、その後、前記遺伝子を、６−ＨｉｓでＣ末端にタグを付加したｐＥＴ２８ｂのＮｃｏＩ−ＸｈｏＩ制限酵素部位に挿入することによって、ＨＲφ２４プラスミドを得た。
【００４３】
ＨＲφ、ＨＲφ−３φおよびＨＢｃプラスミドの構築過程は、ＨＲφ２４プラスミドとは類似しているが、以下のような差異がある。
【００４４】
ＨＲφプラスミドの構築については、ＲＳＶ  Ｆタンパク質のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３で表される遺伝子断片を増幅した。その後、その２種類のＰＣＲアンプリコンを、６−ＨｉｓでＣ末端にタグを付加してグリシンリッチリンカーにより連結したｐＥＴ２８ａのＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ制限酵素部位に挿入することによって、ＨＲφプラスミドを得た。
【００４５】
ＨＲφ−３φプラスミドの構築については、ＲＳＶ  Ｆタンパク質のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３で表される遺伝子断片を増幅した。さらに、ＰＣＲにより、ＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩ、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ、またはＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位のそれぞれを含む３種類の部位φ断片を製作した。その後、その５種類のＰＣＲアンプリコンを、６−ＨｉｓでＣ末端にタグを付加してグリシンリッチリンカーにより連結したｐＥＴ２８ａのＮｃｏＩ  ＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ制限酵素部位に挿入することによって、ＨＲφ−３φプラスミドを得た。
【００４６】
上記で得られたプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞内に形質転換して、タンパク質発現を行った。ＨＲφ２４、ＨＲφ、およびＨＲφ−３φ組換えタンパク質の概略図を、それぞれ、図１Ａ〜１Ｃに示す。
【００４７】
実施例２：組換えＨＢｃ  ＶＬＰ発現ベクターの構築
大腸菌で発現するための最適化されたコドンを有するＨＢｃタンパク質の完全長ｃＤＮＡ配列（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＢｉｏＳｃｉ＆Ｔｅｃｈ）を合成した。この配列をＰＣＲテンプレートとして使用し、ＨＢｃのヌクレオチド１〜４４４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）を増幅した後、６−ＨｉｓでＣ末端にタグを付加したｐＥＴ２８ａのＮｃｏＩ−ＸｈｏＩ制限酵素部位に挿入することによって、組換えＨＢｃ  ＶＬＰプラスミドを得た。得られたプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞内に形質転換して、タンパク質発現に使用した。
【００４８】
実施例１および２のＰＣＲに使用されたプライマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４で表され、表１に示されている。
【００４９】
【表１−１】
0006903351.tif 000002
【表１−２】
0006903351.tif 000003
【００５０】
実施例３：組換えタンパク質発現および精製
実施例１および２で得られた形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）において、組換えＲＳＶ  Ｆタンパク質−６ＨｉｓおよびＨＢｃ−６Ｈｉｓをそれぞれ発現させ、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーで精製した。２００体積部の溶出緩衝液（３５０ｍＭ、１５０ｍＭから０ｍＭまでのイミダゾール、１×ＰＢＳの中）に対する１体積部のサンプルのグラジエント溶出により、溶出した（５００ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．０を使用）タンパク質に緩衝液交換を行い、工程ごとに１２時間行った。遠心濃縮機（１０，０００ＭＷＣＯ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用することにより、溶出したタンパク質−６Ｈｉｓを約１ｍｇ／ｍＬの濃度まで濃縮した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで前記タンパク質の分子サイズおよび純度を測定した。
【００５１】
抗Ｈｉｓタグであると指向された抗体を使用したウェスタンブロッティングにより、同じ移動度のバンドを検出し、その結果を図２Ｂ、２Ｄ、および２Ｆに示す。抗ＨＢｃと抗ＲＳＶであると指向された抗体を使用したウェスタンブロッティングにより、同じ移動度のバンドを検出し、その結果をそれぞれ図２Ｈおよび２Ｉに示す。クマシーブリリアントブルーで染色したゲルに対する光学密度スキャンは、精製したタンパク質ＨＲφ２４、ＨＲφ、ＨＲφ−３φおよびＨＢｃが全タンパク質の９０％以上に相当すること（図２Ａ、２Ｃ、２Ｅ、および２Ｇ）を示し、その純度は十分に免疫接種を行える。
【００５２】
実施例４：ＨＲφ２４および組換えＨＢｃタンパク質の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像
室温で、ＰＢＳにおける８μｇの精製したＨＢｃ  ＶＬＰを、銅メッシュ（３００メッシュ）に３分間吸着させた。その後、ろ紙を用いてメッシュを軽く優しく拭った。１％酢酸ウラニル水溶液で３０秒間染色した後、過量の液体を除去した。ＪＥＭ−１４００電子顕微鏡を使用して、８０ｋＶでメッシュを検査した。
【００５３】
ＨＢｃ  ＶＬＰがウイルス様粒子を形成することはＴＥＭで証明された（図３Ａ）。ＴＥＭは、さらに、組換えＨＲφ２４タンパク質が約５０ｎｍの重合したナノ粒子を形成したこと（図３Ｂ）を示した。
【００５４】
実施例５：動物免疫分析
１．ＲＳＶ  Ａ２株の原液の製作
ＡＴＣＣからＲＳＶ  Ａ２株を得た。ＨＥｐ−２細胞ＡＴＣＣにおいてウイルスの繁殖を実施した。ＲＳＶ  Ａ２を使用して、０．２のｍ．ｏ．ｉ（感染多重度）で、１００ｍｍのペトリ皿（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において成長した融合度が８０％と高い細胞を接種した。３７℃のＣＯ２インキュベーターにおいて、血清を含まないダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ））でウイルスの吸着を行った。２時間後、培地を、２％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭに交換し、ペトリ皿を再び４８〜７２時間培養した。３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、細胞破片から、前記ウイルスを含有する上清液を分離した。その後、遠心濃縮機（１００，０００ＭＷＣＯ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）でウイルスを濃縮した。
【００５５】
２．ＲＳＶプラーク試験
プラーク試験により、ＲＳＶウイルス力価（ｔｉｔｅｒ）を測定した。１×ＰＢＳで１２ウェルプレート中のＨＥｐ−２細胞融合単層を洗浄した後、複数種類の希釈度（１０−３〜１０−７）のＲＳＶ  Ａ２ウイルスで前記細胞を感染させた。２時間のウイルス吸着を行った後、上清液を除去し、１×ＰＢＳで細胞の単層を洗浄した後、ＤＭＥＭ＋２％ウシ胎児血清＋０．３％アガロースで覆った。３７℃でＣＯ２インキュベーターにおいて５日間培養した後、細胞を１０％ホルマリンで固定し、０．０５％クリスタルバイオレットで染色して、プラーク定量を行った。
【００５６】
３．ワクチン投与およびＲＳＶチャレンジ
病原体のないＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌性マウス（６〜８週齢）を、ランダムで複数群に分け、鼻内（ｉ．ｎ）経路で候補ワクチンを使用して０、２１および４２日目で免疫接種を行い、６３日目で（図４）マウスに１×１０６ｐ．ｆ．ｕ  ＲＳＶチャレンジさせた。候補ワクチンは、５０μｇ  ＨＲφ２４、２５μｇ  ＨＢｃ  ＶＬＰ＋２５μｇ  ＨＲφ２４、２５μｇ  ＨＢｃ  ＶＬＰ＋２５μｇ  ＨＲφ２４＋２０μｇ  ＣｐＧ（ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３７）（台湾のＧｅｎｏｍｉｃｓ社）、２５μｇ  ＨＢｃ  ＶＬＰ＋５０μｇ  ＨＲφ２４、２５μｇ  ＨＢｃ  ＶＬＰ＋５０μｇ  ＨＲφ２４＋２０μｇ  ＣｐＧ、５０μｇ  ＨＲφ、２５μｇ  ＨＢｃ  ＶＬＰ＋５０μｇ  ＨＲφ、２５μｇ  ＨＢｃ  ＶＬＰ＋５０μｇ  ＨＲφ＋２０μｇ  ＣｐＧ、５０μｇ  ＨＲφ−３φ、２５μｇ  ＨＢｃ  ＶＬＰ＋５０μｇ  ＨＲφ−３φ、および２５μｇ  ＨＢｃ  ＶＬＰ＋５０μｇ  ＨＲφ−３φ＋２０μｇ  ＣｐＧを含む。さらに、対照群、２５μｇ  ＨＢｃ  ＶＬＰのみを使用して０、２１、および４２日目で鼻内経路で免疫接種を行った群を含む。さらに、１×１０５ｐ．ｆ．ｕホルマリンで固定したＲＳＶ（ＦＩＲＳＶ）を使用して筋肉内（ｉ．ｍ）免疫接種を行った群を含む。
【００５７】
ＲＳＶチャレンジ前、６１日目で同じ投与スキームを使用した各群から、マウス血清、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）および脾臓を採集した。ＲＳＶチャレンジについては、６３日目で１．５％イソフルランで動物を麻酔した後、１×１０６  ｐ．ｆ．ｕ  ＲＳＶの鼻内接種で感染させた。ＲＳＶチャレンジを行った後、マウスの体重変化を５日間観察した。最後に、６８日目でマウスを犠牲にし、個体の肺を採集して、ウイルス負荷および組織病理学実験を行った。
【００５８】
実施例６：候補ワクチンで引き起こした抗体応答についての評価
酵素結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）により、実施例５に記載されている免疫接種したマウスから採集した血清およびＢＡＬＦの抗体応答を検査した。簡単に説明すれば、４℃で、５０μＬの精製ＨＲφ２４（１０μｇ／ｍｌ）を９６ウェルプレートに塗布して、一晩放置した。２％ＢＳＡで前記プレートを３７℃で１時間ブロッキングし、血清サンプルの試験希釈剤（１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、１×ＰＢＳの中）における段階希釈液（１０−２〜５．１２×１０−４）またはＢＡＬＦの段階希釈液（１０−１〜１．２８×１０−３）を使用して室温で２時間培養した。サンプルごとに希釈曲線を作成し、最も優れた濃度となる希釈物の逆数を終点力価として算出し、前記の最も優れた濃度は、バックグラウンド値（集めた元免疫血清に１／５０の希釈を行ったもの、または集めた対照ＢＡＬＦに１／５の希釈を行ったもの）より、０．１Ｕ高い。５０より低い（陰性サンプル）ＩｇＧ力価、または５より低い分泌型ＩｇＡ（ｓＩｇＡ）力価を、任意に５０または５とした。
【００５９】
図５Ａ〜５Ｅを参照して、これらの図はＨＲφ２４、ＨＲφおよびＨＲφ−３φの投与が血清ＨＲφ２４特異的全ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよび肺ＨＲφ２４特異的ｓＩｇＡを引き起こせることが示されている。また、アジュバントとしてＨＢｃを使用することで、ＨＲφ２４、ＨＲφ、およびＨＲφ−３φは顕著に高い血清ＨＲφ２４特異的全ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよび肺ＨＲφ２４特異的ｓＩｇＡを引き起こせることを示し、特に、ＨＢｃ／ＨＲφ２４群では最も高い終点力価が観察された。また、アジュバントとしてＨＢｃとＣｐＧとの混合物を使用することで、ＨＲφ２４もより高い血清ＨＲφ２４特異的全ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＡ、および肺ＨＲφ２４特異的ｓＩｇＡを引き起こせる。
【００６０】
実施例７：候補ワクチンの、マウスを保護してＲＳＶ感染に対抗することにおける效果
前記候補ワクチンを３回投与する際の効果を評価するために、実施例５に記載されている生ＲＳＶ  Ａ２株チャレンジの免疫接種したマウスを使用した。
【００６１】
１．ＲＳＶチャレンジを行った後のマウス体重変化
マウスがチャレンジ感染された後の体重変化は、ワクチンの防御効果の評価における最も重要な指標である。図６Ａおよび６Ｂを参照して、チャレンジの２日後、対照群と比べて、ＨＲφ２４／ＨＢｃ、ＨＲφ２４／ＨＢｃ／ＣｐＧ、ＨＲφ−３φ、ＨＲφ−３φ／ＨＢｃ、ＨＲφ−３φ／ＨＢｃ／ＣｐＧ、ＨＲφ／ＨＢｃまたはＨＲφ／ＨＢｃ／ＣｐＧを使用して免疫接種を行ったマウスの体重減少は少なかった。より具体的には、図６Ａは、ＨＢｃと混合したＨＲφ２４を受けた群のマウスの体重減少が約８〜１１％であることを示す。また、チャレンジの３日後、ＨＢｃ／ＣｐＧと混合した２５μｇおよび５０μｇ  ＨＲφ２４を使用して免疫接種を行ったマウスは、それぞれ、約１６％および１２％の体重減少を示す。さらに、図６Ｂでは、ＨＲφ／ＨＢｃまたはＨＲφ−３φ／ＨＢｃ混合物を使用して免疫接種を行ったマウスは約１２％または１０％の体重減少を示すことが明らかになった。逆に、筋肉注射でＦＩＲＳＶを受けたマウスは、いずれも最も高い毎日の体重減少を示し、また、チャレンジの３日後では約２５％の体重減少を示す。
【００６２】
そのため、本発明は、より良い防御を提供することにより、マウスの体重減少を予防し、さらに、生ＲＳＶチャレンジ後の最初の体重減少からの迅速な回復を提供する。これにより、本願の抗原による抗ウイルス性免疫は、生ＲＳＶ  Ａ２ウイルス株に対抗するための防御を提供することが証明されている。
【００６３】
２．ＲＳＶチャレンジを行った後の肺組織病理学
組織学的分析について、肺部サンプルを１０％中性緩衝ホルマリンで２４時間固定し、パラフィンに包埋され、厚さ５μｍの切片を切り出し、ヘマトキシリン−エオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。
【００６４】
図７を参照して、対照群またはＨＢｃ、ＨＲφ２４、ＨＲφ、ＨＲφ−３φあるいはＦＩＲＳＶワクチン接種したマウスの体内では、肺組織病理学的な変化が観察され、そのうち、ＦＩＲＳＶで免疫接種したマウスでは、重篤レベルの組織病理学を示す。それに対して、ＨＲφ２４／ＨＢｃ、ＨＲφ／ＨＢｃまたはＨＲφ−３φ／ＨＢｃ混合物を受けたマウスは、ＲＳＶチャレンジを行った際に、中度レベルの肺部病理学を示す。
【００６５】
３．定量ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）により肺ウイルス負荷の分析を行う
自然的または実験的な感染過程において、ウイルス複製と臨床疾患とは正の相関があるため、肺ウイルス負荷に対する制御は、ワクチン効果の評価における重要なパラメータである（ＤｅＶｉｎｃｅｎｚｏ，Ｊ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｋａｒｒｏｎ，Ｒ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。よって、ＲＳＶ  Ｎ遺伝子をターゲットとするｑＲＴ−ＰＣＲを実施し、肺組織におけるｍＲＮＡレベルを定量した。
【００６６】
曇りガラススライドを用いて、肺抽出物のホモジェネートを調製した。Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙキットにより、ホモジェネートサンプルから全ＲＮＡを調製した。二段階ｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、２μｇの全ＲＮＡから、第一鎖ｃＤＮＡを増幅した。ＲＳＶサブグループＡ型ウイルスに用いられるＲＳＶ−Ａ−Ｎ−Ｆ７３０：ＧＣＡＧＧＡＴＴＧＴＴＴＡＴＧＡＡＴＧＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）およびＲＳＶ−Ａ−Ｎ−Ｒ８５７：ＴＣＣＡＣＡＡＣＴＴＧＴＴＣＣＡＴＴＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）というプライマー対を使用してｑＲＴ−ＰＣＲを行った。その後、最適化し、その反応は、プライマーごとに、２００ｎＭ、１×Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ予混液（ＡＢＩ）、１μＬのｃＤＮＡ、および水が含まれ、総量が１０μＬであった。ＡＢＩ機器を使用して、９５℃、１０ｍｉｎ（１×）；９５℃、１５秒；６０℃、６０秒（４０×）の条件で、リアルタイムＰＣＲを実施した。前記ＤＮＡ鎖を、各ＰＣＲサイクルの成果の証明に使用し、また、実験サンプルの定量分析の促進に使用した。
【００６７】
図８を参照して、対照群と比べて、ＨＲφ２４、ＨＲφ２４／ＨＢｃ、ＨＲφ２４／ＨＢｃ／ＣｐＧまたはＦＩＲＳＶを使用して免疫接種を行ったマウスの肺内で、より低いレベルのウイルス力価が観察された。ＦＩＲＳＶ群と比べて、ＨＲφ２４／ＨＢｃ／ＣｐＧ群またはＨＲφ２４（５０）／ＨＢｃ群における肺ウイルス力価は顕著に低かった。これらの結果は、鼻内経由でＨＲφ２４／ＨＢｃ混合物およびＨＲφ２４／ＨＢｃ／ＣｐＧ混合物で免疫接種を行った動物の肺は顕著に低いウイルス負荷を新たに得たことを示す。
【００６８】
よって、これらの結果により、本発明の抗原は、ＲＳＶに特異的な全身性および黏膜抗体応答を誘導できることが明らかになった。本発明の抗原を使用して免疫接種を行ったマウスは、ＲＳＶに対抗するように保護されることが示されるため、肺疾患を引き起こさない。また、ＦＩＲＳＶと比べて、マウスモデルにおいて、本発明の抗原は、リンパ細胞を過度に刺激せず、潜在的、かつ、安全なＲＳＶ候補ワクチンを提供する。
【００６９】
また、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質と比べて、本発明の抗原の配列は比較的に短いので、大規模な生産が相対的に容易である。さらに、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質と比べて、本発明の抗原は重要な抗原部位のみを保留しているので、抗体を区別する特異性を増加させるのに寄与し、不必要な反応、例えば、アレルギーを避ける。
【００７０】
上記の内容では、例示的に好ましい具体的な実施態様により本発明を詳細に記載している。しかしながら、本発明の範疇は、記載された具体的な実施態様に限定されるものではない。逆に、本発明は、様々な修飾および類似的な調整を意図的に含んでいる。したがって、特許請求の範囲は、最も広い解釈により規定されるため、このような修飾および類似的な調整を全て含んでいる。
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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