(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を配列決定する方法であって、
ａ）  Ｔ細胞から得られた１００塩基対未満のＲＮＡのショートリードを配列決定することと、
ｂ）  前記ショートリードを、ＴＣＲ遺伝子配列を含有しない基準配列と並列させて、それによってマッピングされたショートリードとマッピングされなかったショートリードとを含むリードセットを生成することと、
ｃ）  前記リードセットからマッピングされたショートリードを破棄することと、
ｄ）  前記リードセット内に残っている前記マッピングされなかったショートリードを、一つ以上のロングリードに構築することと、
ｅ）  前記一つ以上のロングリードを対応するアミノ酸配列に翻訳することと、
ｆ）  ＴＣＲ  Ｖ領域およびＴＣＲ  Ｊ領域のアミノ酸基準配列を、六個のアミノ酸のｋ−ストリングに断片化し、前記ｋ−ストリングを工程（ｅ）からの前記対応するアミノ酸配列と並列し、前記対応するアミノ酸配列に対してマッピングする、ｋ−ストリング内の一つ以上の保存されたＴＣＲ  ＣＤＲ３残基を検出し、検出された保存レベルを採点し、閾値保存スコアより高い保存スコアをもつ対応するアミノ酸配列を選択し、選択された対応するアミノ酸配列中の候補ＣＤＲ３領域アミノ酸配列を検出することと、
ｇ）  一つ以上のロングリードにおいて、候補ＣＤＲ３領域アミノ酸配列の核酸配列を特定することと、
ｈ）  前記候補ＣＤＲ３領域核酸配列の上流にある一つ以上のロングリードの核酸配列を、一つ以上のＴＣＲ  Ｖ遺伝子基準配列と並列させて、アラインメント度を採点して、閾値アラインメントスコアより高いロングリードを候補ＴＣＲ  Ｖ遺伝子配列を含むと特定することと、
ｉ）  前記候補ＣＤＲ３領域核酸配列の下流にある一つ以上のロングリードの核酸配列を、一つ以上のＴＣＲ  Ｊ遺伝子基準配列と並列させて、アラインメント度を採点して、閾値アラインメントスコアより高いロングリードを候補ＴＣＲ  Ｊ遺伝子配列を含むと特定して、それによってＴＣＲ配列を生成することとを含む、方法。
【請求項２】
前記ショートリードは、ＲＮＡのランダムプライミングから取得される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記Ｔ細胞は、ヒトまたはマウスから取得される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記基準配列は、ヒトゲノム、マウスゲノム、ヒトトランスクリプトーム、またはマウストランスクリプトームを含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記リードセットからマッピングされたショートリードを破棄することは、３５塩基対未満であるリードセットまたは低い配列分解能（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）であるリードセットからマッピングされなかったショートリードを破棄することを更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記リードセットに残っている前記マッピングされなかったショートリードを、一つ以上のロングリードに構築することが、
一つ以上のマッピングされなかったショートリードを、ＴＣＲ配列の基準データベースからの一つ以上のＴＣＲ配列に並列することと、
このアラインメントに基づいて、前記一つ以上のマッピングされなかったショートリードをロングリードに構築することと
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
ＴＣＲ  Ｃ領域核酸配列を、ＴＣＲ配列に付加することを更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記Ｔ細胞から得られた１００塩基対未満のＲＮＡのショートリードを配列決定する前に、前記Ｔ細胞が得られた対象に免疫療法を施すことを更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記免疫療法が、単剤療法または併用療法を含む、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記併用療法が、共刺激性アゴニストおよび共阻害性拮抗薬を含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
対象の第一の複数のＴ細胞に対して工程ａ〜ｉを繰り返すことであって、治療を施す前に、当該Ｔ細胞を収集することと、
前記第一の複数のＴ細胞中に存在する固有のＴＣＲ配列の発生数を決定することと、
前記対象に対して治療を施すことと、
前記対象の第二の複数のＴ細胞に対して工程ａ〜ｉを繰り返すことであって、治療を施した後に、当該Ｔ細胞を収集することと、
前記第二の複数のＴ細胞中に存在する固有のＴＣＲ配列の発生数を決定することと、
前記第一の複数のＴ細胞および前記第二の複数のＴ細胞に存在する固有のＴＣＲ配列の発生数に基づいて、クローン性増殖を経験した一つ以上の固有のＴＣＲ配列を決定することと
を更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
クローン性増殖を経験した前記一つ以上の固有のＴＣＲ配列に基づいて、Ｔ細胞クローン性増殖シグネチャを決定することを更に含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
Ｔ細胞クローン性増殖シグネチャと対応する治療応答とであるデータベースに、前記Ｔ細胞クローン性増殖シグネチャを用いて問い合わせることと、
当該問い合わせに基づいて、治療に対する対象の応答の尤度を決定することと
を更に含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
治療に対する対象の応答を判断することと、
データベースにＴ細胞クローン性増殖シグネチャを格納することと、
前記治療に対する対象の応答を、前記データベース内のＴ細胞クローン性増殖シグネチャと関連付けることと
を更に含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
治療に応じて増殖するＴ細胞クローン内にＴＣＲ配列が存在することを判断することと、
前記ＴＣＲ配列を含有する一つ以上のＴ細胞を産生することと、
前記一つ以上のＴ細胞を対象に投与することと、
前記対象に対して治療を施すことと
を更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
Ｔ細胞から得られた１００塩基対未満のＲＮＡのショートリードを配列決定することが、複数のＴ細胞から得られた１００塩基対未満のＲＮＡのショートリードのバルクシーケンシングを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
前記複数のＴ細胞のそれぞれに対して、工程ｂ〜ｉを実行することを更に含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
工程ｂ〜ｉを実行することを含む前記複数のＴ細胞のそれぞれに対して、工程ｂ〜ｉを実行することが、
工程ｂ〜ｉの一つ以上の少なくとも一部分をジョブとして分類することと、
各ジョブの作業負荷を、並列の複数のプロセッサ全体に分散することと
を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
装置であって、
一つ以上のプロセッサと、
前記一つ以上のプロセッサによって実行されるときに、前記装置に対して、
ａ）  Ｔ細胞から得られた１００塩基対未満のＲＮＡのショートリードを含む配列データを受信させて、
ｂ）  前記ショートリードを、ＴＣＲ遺伝子配列を含有しない基準配列と並列させて、それによってマッピングされたショートリードとマッピングされなかったショートリードとを含むリードセットを生成させて、
ｃ）  前記リードセットからマッピングされたショートリードを破棄させて、
ｄ）  前記リードセット内に残っている前記マッピングされなかったショートリードを、一つ以上のロングリードに構築させて、
ｅ）  前記一つ以上のロングリードを対応するアミノ酸配列に翻訳させて、
ｆ）  ＴＣＲ  Ｖ領域およびＴＣＲ  Ｊ領域のアミノ酸基準配列を、六個のアミノ酸のｋ−ストリングに断片化させ、前記ｋ−ストリングを工程（ｅ）からの前記対応するアミノ酸配列と並列させて、対応するアミノ酸配列に対してマッピングする、ｋ−ストリング内の一つ以上の保存されたＴＣＲ  ＣＤＲ３残基を検出させ、検出された保存レベルを採点させ、閾値保存スコアより高い保存スコアをもつ対応するアミノ酸配列を選択させ、選択された対応するアミノ酸配列中の候補ＣＤＲ３領域アミノ酸配列を検出させて、
ｇ）  一つ以上のロングリードにおいて、候補ＣＤＲ３領域アミノ酸配列の核酸配列を特定させて、
ｈ）  前記候補ＣＤＲ３領域核酸配列の上流にある一つ以上のロングリードの核酸配列を、一つ以上のＴＣＲ  Ｖ遺伝子基準配列と並列させて、アラインメント度を採点させて、閾値アラインメントスコアより高いロングリードを候補ＴＣＲ  Ｖ遺伝子配列を含むと特定させて、
ｉ）  前記候補ＣＤＲ３領域核酸配列の下流にある一つ以上のロングリードの核酸配列を、一つ以上のＴＣＲ  Ｊ遺伝子基準配列と並列させて、アラインメント度を採点させて、閾値アラインメントスコアより高いロングリードを候補ＴＣＲ  Ｊ遺伝子配列を含むと特定させて、それによってＴＣＲ配列を生成させる、プロセッサ実行可能命令を含むメモリとを備える、装置。
【請求項２０】
コンピュータ可読媒体であって、その上に具現化されたコンピュータ実行可能命令を有する前記コンピュータ可読媒体が、
ａ）  Ｔ細胞から得られた１００塩基対未満のＲＮＡのショートリードを含む配列データを受信することと、
ｂ）  前記ショートリードを、ＴＣＲ遺伝子配列を含有しない基準配列と並列させて、それによってマッピングされたショートリードとマッピングされなかったショートリードとを含むリードセットを生成することと、
ｃ）  前記リードセットからマッピングされたショートリードを破棄することと、
ｄ）  前記リードセット内に残っている前記マッピングされなかったショートリードを、一つ以上のロングリードに構築することと、
ｅ）  前記一つ以上のロングリードを対応するアミノ酸配列に翻訳することと、
ｆ）  ＴＣＲ  Ｖ領域およびＴＣＲ  Ｊ領域のアミノ酸基準配列を、六個のアミノ酸のｋ−ストリングに断片化し、前記ｋ−ストリングを工程（ｅ）からの前記対応するアミノ酸配列と並列し、前記対応するアミノ酸配列に対してマッピングする、ｋ−ストリング内の一つ以上の保存されたＴＣＲ  ＣＤＲ３残基を検出し、検出された保存レベルを採点し、閾値保存スコアより高い保存スコアをもつ対応するアミノ酸配列を選択し、選択された対応するアミノ酸配列中の候補ＣＤＲ３領域アミノ酸配列を検出することと、
ｇ）  一つ以上のロングリードにおいて、候補ＣＤＲ３領域アミノ酸配列の核酸配列を特定することと、
ｈ）  前記候補ＣＤＲ３領域核酸配列の上流にある一つ以上のロングリードの核酸配列を、一つ以上のＴＣＲ  Ｖ遺伝子基準配列と並列させて、アラインメント度を採点して、閾値アラインメントスコアより高いロングリードを候補ＴＣＲ  Ｖ遺伝子配列を含むと特定することと、
ｉ）  前記候補ＣＤＲ３領域核酸配列の下流にある一つ以上のロングリードの核酸配列を、一つ以上のＴＣＲ  Ｊ遺伝子基準配列と並列させて、アラインメント度を採点して、閾値アラインメントスコアより高いロングリードを候補ＴＣＲ  Ｊ遺伝子配列を含むと特定して、それによってＴＣＲ配列を生成することとを含む方法を実行するように構成された、コンピュータ可読媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１２月９日出願の米国仮特許出願第６２／４３２，５２５号、および２０１７年５月１９日出願の米国仮特許出願第６２／５０８，６６７号、に対する優先権を主張するものであり、これらの仮特許出願の内容全体はすべての目的において参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
分野
本開示は、概してバイオインフォマティクスの分野に関する。より具体的には、本開示は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を配列決定し、細胞集団におけるＴ細胞クローンを特定し、バルクシーケンシングするためのシステムならびに方法に関する。本方法は、腫瘍反応性および患者生存に関連する高頻度Ｔ細胞クローンを特定する。
【背景技術】
【０００３】
免疫チェックポイント阻害剤を用いた単剤療法または併用療法は、癌患者において有意な治療効果を示してきた。しかしながら、患者の大部分は応答しない、または一過性的にのみ応答するものであり、次世代の免疫療法の設計に関する基本的な問題を提起する。腫瘍内微小環境の免疫抑制性の性質を克服し、持続的な応答を促進するために、より強いＴ細胞活性化を誘発する共阻害性経路および共刺激経路の二重標的化を行うことができる。一部のシナリオでは、抗体を併用することが、例えば恒常性調節因子のバランスを回復し、ＣＤ８＋  Ｔ細胞エフェクター機能を相乗的に増強する可能性があり、腫瘍拒絶反応および長期応答がもたらされる。Ｔ細胞クローン性増殖は、併用療法の分子機構を示す特定の遺伝子シグネチャを提供することができる。既存のＴＣＲ配列解析技術は、ショートリードシーケンシングデータに基づいて、ＴＣＲ配列およびクローン性増殖を正確かつ確実に特定することができない。これらおよびその他の欠点が、本明細書に記載される方法およびシステムによって対処される。
【発明の概要】
【０００４】
下記の概説および下記の発明を実施するための形態は両方とも、あくまで例示的且つ説明的なものであって、限定的なものではないことを理解すべきである。Ｔ細胞から得られた約１００塩基対未満のＲＮＡのショートリードを配列決定する（および／またはそれを示す配列データを受信する）ことと、該ショートリードを、ＴＣＲ遺伝子配列を含有しない基準配列と並列させるための方法およびシステムであって、それによってマッピングされたショートリードとマッピングされなかったショートリードとを含むリードセットが生成され、当該リードセットからマッピングされたショートリードを破棄し、リードセット内に残っているマッピングされなかったショートリードを一つ以上のロングリードに構築し、当該一つ以上のロングリードから一つ以上のＴＣＲ配列を生成させる、方法およびシステムを提供する。
【０００５】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を配列決定する方法であって、Ｔ細胞から得られた約１００塩基対未満のＲＮＡのショートリードを配列決定することと、該ショートリードを、ＴＣＲ遺伝子配列を含有しない基準配列と並列させることとを含み、それによってマッピングされたショートリードとマッピングされなかったショートリードとを含むリードセットが生成され、当該リードセットからマッピングされたショートリードを破棄し、リードセット内に残っているマッピングされなかったショートリードを一つ以上のロングリードに構築し、一つ以上のロングリードを対応するアミノ酸配列に翻訳することと、ＴＣＲ  Ｖ領域およびＴＣＲ  Ｊ領域のアミノ酸配列を約六個のアミノ酸のｋ−ストリングに断片化し、該ｋ−ストリングを翻訳工程からの対応するアミノ酸配列と並列し、対応するアミノ酸配列に対してマッピングする、ｋ−ストリング内の一つ以上の保存されたＴＣＲ  ＣＤＲ３残基を検出し、検出された保存のレベルを採点し、閾値保存スコアより高い保存スコアをもつ対応するアミノ酸配列を選択し、また選択された対応するアミノ酸配列内の候補ＣＤＲ３領域アミノ酸配列を検出することと、一つ以上のロングリード内の候補ＣＤＲ３領域アミノ酸配列の核酸配列を特定することと、候補ＣＤＲ３領域核酸配列の上流にある一つ以上のロングリードの核酸配列を一つ以上のＴＣＲ  Ｖ遺伝子基準配列と並列させ、並列度を採点し、また閾値アラインメントスコアより高いロングリードを候補ＴＣＲ  Ｖ遺伝子配列を含むと特定することと、候補ＣＤＲ３領域核酸配列の下流にある一つ以上のロングリードの核酸配列を一つ以上のＴＣＲ  Ｊ遺伝子基準配列と並列して、アラインメント度を採点して、また閾値アラインメントスコアより高いロングリードを候補ＴＣＲ  Ｊ遺伝子配列を含むと特定して、それによってＴＣＲ配列を生成させることとを含む、方法を開示する。
【０００６】
一つ以上のプロセッサと、該一つ以上のプロセッサによって実行されるときに、装置に対して、Ｔ細胞から得られた約１００塩基対未満のＲＮＡのショートリードを含む配列データを受信させて、また当該ショートリードを、ＴＣＲ遺伝子配列を含有しない基準配列と並列させて、それによってマッピングされたショートリードとマッピングされなかったショートリードとを含むリードセットを生成させて、当該リードセットからマッピングされたショートリードを破棄させて、リードセット内に残っているマッピングされなかったショートリードを一つ以上のロングリードに構築させて、一つ以上のロングリードを対応するアミノ酸配列に翻訳させて、ＴＣＲ  Ｖ領域およびＴＣＲ  Ｊ領域のアミノ酸配列を約六個のアミノ酸のｋ−ストリングに断片化させて、該ｋ−ストリングを翻訳工程からの対応するアミノ酸配列と並列し、対応するアミノ酸配列に対してマッピングする、ｋ−ストリング内の一つ以上の保存されたＴＣＲ  ＣＤＲ３残基を検出し、検出された保存のレベルを採点し、閾値保存スコアより高い保存スコアをもつ対応するアミノ酸配列を選択し、また選択された対応するアミノ酸配列内の候補ＣＤＲ３領域アミノ酸配列を検出して、一つ以上のロングリード内の候補ＣＤＲ３領域アミノ酸配列の核酸配列を特定させて、候補ＣＤＲ３領域核酸配列の上流にある一つ以上のロングリードの核酸配列を一つ以上のＴＣＲ  Ｖ遺伝子基準配列と並列させ、並列度を採点し、また閾値アラインメントスコアより高いロングリードを候補ＴＣＲ  Ｖ遺伝子配列を含むと特定させ、候補ＣＤＲ３領域核酸配列の下流にある一つ以上のロングリードの核酸配列を一つ以上のＴＣＲ  Ｊ遺伝子基準配列と並列させて、アラインメント度を採点して、また閾値アラインメントスコアより高いロングリードを候補ＴＣＲ  Ｊ遺伝子配列を含むと特定して、それによってＴＣＲ配列を生成させる、プロセッサ実行可能命令を含むメモリとを備えた装置を開示する。
【０００７】
Ｔ細胞から得られた約１００塩基対未満のＲＮＡのショートリードを配列決定することと、該ショートリードを、ＴＣＲ遺伝子配列を含有しない基準配列と並列して、それによってマッピングされたショートリードとマッピングされなかったショートリードとを含むリードセットを生成することと、当該リードセットからマッピングされたショートリードを破棄することと、リードセット内に残っているマッピングされなかったショートリードを一つ以上のロングリードに構築することと、一つ以上のロングリードを対応するアミノ酸配列に翻訳することと、ＴＣＲ  Ｖ領域およびＴＣＲ  Ｊ領域のアミノ酸基準配列を約六個のアミノ酸のｋ−ストリングに断片化し、該ｋ−ストリングを翻訳工程からの対応するアミノ酸配列と並列し、対応するアミノ酸配列に対してマッピングする、ｋ−ストリング内の一つ以上の保存されたＴＣＲ  ＣＤＲ３残基を検出し、検出された保存のレベルを採点し、閾値保存スコアより高い保存スコアをもつ対応するアミノ酸配列を選択し、また選択された対応するアミノ酸配列内の候補ＣＤＲ３領域アミノ酸配列を検出することと、一つ以上のロングリード内の候補ＣＤＲ３領域アミノ酸配列の核酸配列を特定することと、候補ＣＤＲ３領域核酸配列の上流にある一つ以上のロングリードの核酸配列を一つ以上のＴＣＲ  Ｖ遺伝子基準配列と並列させ、並列度を採点し、また閾値アラインメントスコアより高いロングリードを候補ＴＣＲ  Ｖ遺伝子配列を含むと特定することと、候補ＣＤＲ３領域拡散配列の下流にある一つ以上のロングリードの核酸配列を一つ以上のＴＣＲ  Ｊ遺伝子基準配列と並列して、アラインメント度を採点して、また閾値アラインメントスコアより高いロングリードを候補ＴＣＲ  Ｊ遺伝子配列を含むと特定して、それによってＴＣＲ配列を生成させることとを含む、方法を実行するように構成された、コンピュータ可読媒体であって、当該コンピュータ可読媒体上で具体化されるコンピュータ実行可能命令を有するコンピュータ可読媒体を開示する。
【０００８】
ＢＣＲを配列決定する方法であって、Ｂ細胞から得られた約１００塩基対未満のＲＮＡのショートリードを配列決定することと、該ショートリードを、ＢＣＲ遺伝子配列を含有しない基準配列と並列させることとを含み、それによってマッピングされたショートリードとマッピングされなかったショートリードとを含むリードセットが生成され、当該リードセットからマッピングされたショートリードを破棄し、リードセット内に残っているマッピングされなかったショートリードを一つ以上のロングリードに構築し、一つ以上のロングリードを対応するアミノ酸配列に翻訳することと、ＢＣＲ  Ｖ領域およびＢＣＲ  Ｊ領域のアミノ酸基準配列を約六個のアミノ酸のｋ−ストリングに断片化し、該ｋ−ストリングを翻訳工程からの対応するアミノ酸配列と並列し、対応するアミノ酸配列に対してマッピングする、ｋ−ストリング内の一つ以上の保存されたＢＣＲ  ＣＤＲ３残基を検出し、検出された保存のレベルを採点し、閾値保存スコアより高い保存スコアをもつ対応するアミノ酸配列を選択し、また選択された対応するアミノ酸配列内の候補ＣＤＲ３領域アミノ酸配列を検出することと、一つ以上のロングリード内の候補ＣＤＲ３領域アミノ酸配列の核酸配列を特定することと、候補ＣＤＲ３領域核酸配列の上流にある一つ以上のロングリードの核酸配列を一つ以上のＢＣＲ  Ｖ遺伝子基準配列と並列させ、並列度を採点し、また閾値アラインメントスコアより高いロングリードを候補ＢＣＲ  Ｖ遺伝子配列を含むと特定することと、候補ＣＤＲ３領域核酸配列の下流にある一つ以上のロングリードの核酸配列を一つ以上のＢＣＲ  Ｊ遺伝子基準配列と並列して、アラインメント度を採点して、また閾値アラインメントスコアより高いロングリードを候補ＢＣＲ  Ｊ遺伝子配列を含むと特定して、それによってＢＣＲ配列を生成させることとを含む、方法を開示する。
【０００９】
一つ以上のプロセッサと、該一つ以上のプロセッサによって実行されるときに、装置に対して、Ｂ細胞から得られた約１００塩基対未満のＲＮＡのショートリードを含む配列データを受信させて、また当該ショートリードを、ＢＣＲ遺伝子配列を含有しない基準配列と並列させて、それによってマッピングされたショートリードとマッピングされなかったショートリードとを含むリードセットを生成させて、当該リードセットからマッピングされたショートリードを破棄させて、リードセット内に残っているマッピングされなかったショートリードを一つ以上のロングリードに構築させて、一つ以上のロングリードを対応するアミノ酸配列に翻訳させて、ＢＣＲ  Ｖ領域およびＢＣＲ  Ｊ領域のアミノ酸配列を約六個のアミノ酸のｋ−ストリングに断片化させて、該ｋ−ストリングを翻訳工程からの対応するアミノ酸配列と並列し、対応するアミノ酸配列に対してマッピングする、ｋ−ストリング内の一つ以上の保存されたＢＣＲ  ＣＤＲ３残基を検出し、検出された保存のレベルを採点し、閾値保存スコアより高い保存スコアをもつ対応するアミノ酸配列を選択し、また選択された対応するアミノ酸配列内の候補ＣＤＲ３領域アミノ酸配列を検出して、一つ以上のロングリード内の候補ＣＤＲ３領域アミノ酸配列の核酸配列を特定させて、候補ＣＤＲ３領域核酸配列の上流にある一つ以上のロングリードの核酸配列を一つ以上のＢＣＲ  Ｖ遺伝子基準配列と並列させ、アラインメント度を採点し、また閾値アラインメントスコアより高いロングリードを候補ＢＣＲ  Ｖ遺伝子配列を含むと特定し、候補ＣＤＲ３領域核酸配列の下流にある一つ以上のロングリードの核酸配列を一つ以上のＴＣＲ  Ｊ遺伝子基準配列と並列させて、アラインメント度を採点して、また閾値アラインメントスコアより高いロングリードを候補ＢＣＲ  Ｊ遺伝子配列を含むと特定して、それによってＢＣＲ配列を生成させる、プロセッサ実行可能命令を含むメモリとを備えた装置を開示する。
【００１０】
Ｂ細胞から得られた約１００塩基対未満のＲＮＡのショートリードを配列決定することと、該ショートリードを、ＢＣＲ遺伝子配列を含有しない基準配列と並列させることとを含み、マッピングされたショートリードとマッピングされなかったショートリードとを含むリードセットが生成され、当該リードセットからマッピングされたショートリードを破棄し、リードセット内に残っているマッピングされなかったショートリードを一つ以上のロングリードに構築し、一つ以上のロングリードを対応するアミノ酸配列に翻訳することと、ＢＣＲ  Ｖ領域およびＢＣＲ  Ｊ領域のアミノ酸配列を約六個のアミノ酸のｋ−ストリングに断片化し、該ｋ−ストリングを翻訳工程からの対応するアミノ酸配列と並列し、対応するアミノ酸配列に対してマッピングする、ｋ−ストリング内の一つ以上の保存されたＢＣＲ  ＣＤＲ３残基を検出し、検出された保存のレベルを採点し、閾値保存スコアより高い保存スコアをもつ対応するアミノ酸配列を選択し、また選択された対応するアミノ酸配列内の候補ＣＤＲ３領域アミノ酸配列を検出することと、一つ以上のロングリード内の候補ＣＤＲ３領域アミノ酸配列の核酸配列を特定することと、候補ＣＤＲ３領域核酸配列の上流にある一つ以上のロングリードの核酸配列を一つ以上のＢＣＲ  Ｖ遺伝子基準配列と並列させ、アラインメント度を採点し、また閾値アラインメントスコアより高いロングリードを候補ＢＣＲ  Ｖ遺伝子配列を含むと特定することと、候補ＣＤＲ３領域核酸配列の下流にある一つ以上のロングリードの核酸配列を一つ以上のＢＣＲ  Ｊ遺伝子基準配列と並列して、アラインメント度を採点して、また閾値アラインメントスコアより高いロングリードを候補ＢＣＲ  Ｊ遺伝子配列を含むと特定して、それによってＢＣＲ配列を生成させることとを含む、方法を実行するように構成された、コンピュータ可読媒体であって、当該コンピュータ可読媒体上で具体化されるコンピュータ実行可能命令を有するコンピュータ可読媒体を開示する。
【００１１】
本開示の方法、装置、およびコンピュータ可読媒体の一部の態様では、ショートリードは、ＲＮＡのランダムプライミングから取得される。
本開示の方法、装置、およびコンピュータ可読媒体の一部の態様では、Ｔ細胞は、ヒトまたはマウスから取得される。
【００１２】
本開示の方法、装置、およびコンピュータ可読媒体の一部の態様では、基準配列は、ヒトゲノム、マウスゲノム、ヒトトランスクリプトーム、またはマウストランスクリプトームを含む。
【００１３】
開示された方法、装置、およびコンピュータ可読媒体の一部の態様では、リードセットからマッピングされたショートリードを破棄することは、約３５塩基対未満であるリードセットまたは低い配列分解能であるリードセットからマッピングされなかったショートリードを破棄することをさらに含む。
【００１４】
開示された方法、装置、およびコンピュータ可読媒体の一部の態様では、リードセット内に残っているマッピングされなかったショートリードを一つ以上のロングリード内に構築することは、一つ以上のマッピングされなかったショートリードをＴＣＲ配列の参照データベースからの一つ以上のＴＣＲ配列と並列することと、当該アラインメントに基づいて、一つ以上のマッピングされなかったショートリードをロングリード内に構築することとを含む。
【００１５】
一部の態様では、ＴＣＲ  Ｃ領域核酸配列を、ＴＣＲ配列に付加することをさらに含む、方法、装置、およびコンピュータ可読媒体が開示される。
一部の態様では、Ｔ細胞から得られた約１００塩基対未満のＲＮＡのショートリードを配列決定する前に、Ｔ細胞が得られた対象に免疫療法を施すことをさらに含む、方法、装置、およびコンピュータ可読媒体が開示される。一部の態様では、免疫療法は単剤療法または併用療法を含む。一部の態様では、併用療法は共刺激性アゴニストおよび共阻害性拮抗薬を含む。
【００１６】
本開示の方法、装置、およびコンピュータ可読媒体の一部の態様では、対象の第一の複数のＴ細胞に関してすべての工程を繰り返すものであって、治療を施す前にＴ細胞を採取し、第一の複数のＴ細胞中に存在する固有のＴＣＲ配列の発生数を決定し、対象に治療を施すことと、対象の第二の複数のＴ細胞に関してすべての工程を繰り返すものであって、治療を施した後にＴ細胞を採取し、第二の複数のＴ細胞中に存在する固有のＴＣＲ配列の発生数を決定し、第一の複数のＴ細胞中および第二の複数のＴ細胞中に存在する固有のＴＣＲ配列の発生数に基づいて、クローン性増殖を経験した一つ以上の固有のＴＣＲ配列を決定することとである。
【００１７】
一部の態様では、クローン性増殖を経験した一つ以上の固有のＴＣＲ配列に基づいて、Ｔ細胞クローン性増殖シグネチャを決定することをさらに含む、方法、装置、およびコンピュータ可読媒体が開示される。
【００１８】
一部の態様では、Ｔ細胞クローン性増殖シグネチャと対応する治療応答とであるデータベースに、Ｔ細胞クローン性増殖シグネチャを用いて問い合わせることと、当該問い合わせに基づいて、当該治療に対する対象の応答の尤度を決定することをさらに含む、方法、装置、およびコンピュータ可読媒体が開示される。
【００１９】
一部の態様では、治療に対する対象の応答を判断することと、データベース内にＴ細胞クローン性増殖シグネチャを格納することと、治療に対する対象の応答を、データベース中のＴ細胞クローン性増殖シグネチャと関連付けることとである工程をさらに含む、方法、装置、およびコンピュータ可読媒体が開示される。
【００２０】
一部の態様では、治療に応じて増殖するＴ細胞クローン内にＴＣＲ配列が存在するかを判断することと、ＴＣＲ配列を含有する一つ以上のＴ細胞を産生することと、当該一つ以上のＴ細胞を対象に投与することと、対象に対して治療を施すこととをさらに含む、方法、装置、およびコンピュータ可読媒体が開示される。
【００２１】
本開示の方法、装置、およびコンピュータ可読媒体の一部の態様では、Ｔ細胞から得られた約１００塩基対未満のＲＮＡのショートリードを配列決定することが、複数のＴ細胞から得られた約１００塩基対未満のＲＮＡのショートリードのバルクシーケンシングを含む。
【００２２】
一部の態様では、候補ＣＤＲ３領域核酸配列の下流にある一つ以上のロングリードの核酸配列を、一つ以上のＴＣＲ  Ｊ遺伝子基準配列と並列させることと、アラインメント度を採点することと、閾値アラインメントスコアより高いロングリードを候補ＴＣＲ  Ｊ遺伝子配列を含むと特定して、それによって複数のＴ細胞のそれぞれに対してＴＣＲ配列を生成することとである工程を通して、ショートリードを並列する工程を実行することをさらに含む、方法、装置、およびコンピュータ可読媒体がさらに開示される。
【００２３】
開示された方法、装置、およびコンピュータ可読媒体の一部態様では、候補ＣＤＲ３領域核酸配列の下流にある一つ以上のロングリードの核酸配列を、一つ以上のＴＣＲ  Ｊ遺伝子基準配列と並列させる工程を通してショートリードを並列することと、アラインメント度を採点することと、閾値アラインメントスコアより高いロングリードを候補ＴＣＲ  Ｊ遺伝子配列を含むと特定して、それによってＴＣＲ配列を生成することとである工程を実行することを含むものである、候補ＣＤＲ３領域核酸配列の下流にある一つ以上のロングリードの核酸配列を、一つ以上のＴＣＲ  Ｊ遺伝子基準配列と並列させる工程を通してショートリードを並列することと、アラインメント度を採点することと、閾値アラインメントスコアより高いロングリードを候補ＴＣＲ  Ｊ遺伝子配列を含むと特定して、それによって複数のＴ細胞のそれぞれに対してＴＣＲ配列を生成することとである工程を実行することが、候補ＣＤＲ３領域核酸配列の下流にある一つ以上のロングリードの核酸配列を、一つ以上のＴＣＲ  Ｊ遺伝子基準配列と並列させる工程を通してショートリードを並列することと、アラインメント度を採点することと、閾値アラインメントスコアより高いロングリードを候補ＴＣＲ  Ｊ遺伝子配列を含むと特定して、それによってＴＣＲ配列をジョブとして生成することと、平行して複数のプロセッサにわたってジョブごとに作業負荷を分散することとである工程のうち一つ以上の少なくとも一部を分類することを含む。
【００２４】
本開示の方法、装置、およびコンピュータ可読媒体の一部の態様では、Ｂ細胞は、ヒトまたはマウスから取得される。
開示された方法、装置、およびコンピュータ可読媒体の一部の態様では、リードセット内に残っているマッピングされなかったショートリードを一つ以上のロングリード内に構築することは、一つ以上のマッピングされなかったショートリードをＢＣＲ配列の参照データベースからの一つ以上のＢＣＲ配列と並列することと、当該アラインメントに基づいて、一つ以上のマッピングされなかったショートリードをロングリード内に構築することとを含む。
【００２５】
一部の態様では、ＢＣＲ  Ｃ領域核酸配列を、ＢＣＲ配列に付加することをさらに含む、方法、装置、およびコンピュータ可読媒体が開示される。
一部の態様では、Ｂ細胞から得られた約１００塩基対未満のＲＮＡのショートリードを配列決定する前に、Ｂ細胞が得られた対象に免疫療法を施すことをさらに含む、方法、装置、およびコンピュータ可読媒体が開示される。一部の態様では、免疫療法は単剤療法または併用療法を含む。一部の態様では、併用療法は共刺激性アゴニストおよび共阻害性拮抗薬を含む。
【００２６】
一部の態様では、対象の第一の複数のＢ細胞に関してすべての工程を繰り返すものであって、治療を施す前にＢ細胞を採取し、第一の複数のＢ細胞中に存在する固有のＢＣＲ配列の発生数を決定し、対象に治療を施すことと、対象の第二の複数のＢ細胞に関して工程ａ〜ｉを繰り返すものであって、治療を施した後にＢ細胞を採取し、第二の複数のＢ細胞中に存在する固有のＢＣＲ配列の発生数を決定し、第一の複数のＢ細胞中および第二の複数のＢ細胞中に存在する固有のＢＣＲ配列の発生数に基づいて、クローン性増殖を経験した一つ以上の固有のＢＣＲ配列を決定することとをさらに含む、方法、装置、およびコンピュータ可読媒体が開示される。
【００２７】
一部の態様では、クローン性増殖を経験した一つ以上の固有のＢＣＲ配列に基づいて、Ｂ細胞クローン性増殖シグネチャを決定することをさらに含む、方法、装置、およびコンピュータ可読媒体が開示される。
【００２８】
一部の態様では、Ｂ細胞クローン性増殖シグネチャと対応する治療応答とであるデータベースに、Ｂ細胞クローン性増殖シグネチャを用いて問い合わせることと、当該問い合わせに基づいて、当該治療に対する対象の応答の尤度を決定することをさらに含む、方法、装置、およびコンピュータ可読媒体が開示される。
【００２９】
一部の態様では、治療に対する対象の応答を判断することと、データベース内にＢ細胞クローン性増殖シグネチャを格納することと、治療に対する対象の応答を、データベース中のＢ細胞クローン性増殖シグネチャと関連付けることとを更に含む、方法、装置、およびコンピュータ可読媒体が開示される。
【００３０】
一部の態様では、治療に応じて増殖するＢ細胞クローン内にＢＣＲ配列が存在するかを判断することと、ＢＣＲ配列を含有する一つ以上のＢ細胞を産生することと、当該一つ以上のＢ細胞を対象に投与することと、対象に対して治療を施すこととをさらに含む、方法、装置、およびコンピュータ可読媒体が開示される。
【００３１】
本開示の方法、装置、およびコンピュータ可読媒体の一部の態様では、Ｂ細胞から得られた約１００塩基対未満のＲＮＡのショートリードを配列決定することが、複数のＢ細胞から得られた約１００塩基対未満のＲＮＡのショートリードのバルクシーケンシングを含む。
【００３２】
一部の態様では、候補ＣＤＲ３領域核酸配列の下流にある一つ以上のロングリードの核酸配列を、一つ以上のＢＣＲ  Ｊ遺伝子基準配列と並列させることを通じて、ショートリードを基準配列と並列することと、アラインメント度を採点することと、閾値アラインメントスコアより高いロングリードを候補ＢＣＲ  Ｊ遺伝子配列を含むと特定して、それによって複数のＢ細胞のそれぞれに対してＢＣＲ配列を生成することとである工程を実行することをさらに含む、方法、装置、およびコンピュータ可読媒体が開示される。
【００３３】
開示された方法、装置、およびコンピュータ可読媒体の一部態様では、候補ＣＤＲ３領域核酸配列の下流にある一つ以上のロングリードの核酸配列を、一つ以上のＢＣＲ  Ｊ遺伝子基準配列と並列させることを通じて、ショートリードを基準配列と並列することと、アラインメント度を採点することと、閾値アラインメントスコアより高いロングリードを候補ＢＣＲ  Ｊ遺伝子配列を含むと特定して、それによってＢＣＲ配列を生成することとである工程を実行することを含むものである、候補ＣＤＲ３領域核酸配列の下流にある一つ以上のロングリードの核酸配列を、一つ以上のＢＣＲ  Ｊ遺伝子基準配列と並列させることを通して、ショートリードを基準配列と並列することと、アラインメント度を採点することと、閾値アラインメントスコアより高いロングリードを候補ＢＣＲ  Ｊ遺伝子配列を含むと特定して、それによって複数のＢ細胞のそれぞれに対してＢＣＲ配列を生成することとである工程を実行することが、候補ＣＤＲ３領域核酸配列の下流にある一つ以上のロングリードの核酸配列を、一つ以上のＢＣＲ  Ｊ遺伝子基準配列と並列させることを通じて、ショートリードを基準配列と並列することと、アラインメント度を採点することと、閾値アラインメントスコアより高いロングリードを候補ＢＣＲ  Ｊ遺伝子配列を含むと特定して、それによってＢＣＲ配列をジョブとして生成することと、平行して複数のプロセッサにわたってジョブごとに作業負荷を分散することとである工程のうち一つ以上の少なくとも一部を分類することを含む。
【００３４】
更なる利点は、その一部が下記説明に記載されているか、または実践によって知ることができるであろう。これらの利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘されている要素および組み合わせによって実現され、達成されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
本明細書において援用され、かつ本明細書の一部を成す添付の図面は、実施形態を例証し、説明と共に、本方法およびシステムの原理を説明する役割を果たすものである。
【図１】図１は、ＴＣＲ  ＣＤＲ３配列を特定する、ショートリピートのランダムシーケンシングおよびマッピングされなかったリードのネガティブセレクションの方法を示すフローチャートである。
【図２】図２は、治療後の腫瘍内ＣＤ８＋  Ｔ細胞における有意なクローン性増殖を示す。
【図３】図３は、単剤療法と比較してａＧＩＴＲ／ａＰＤ１の併用療法後の腫瘍内ＣＤ８＋  Ｔ細胞における有意なクローン性増殖を示す棒グラフである。
【図４】図４は、単一Ｔ細胞シーケンシングにより観察されたクローン性増殖後のＴ細胞系統を例示する。
【図５】図５は、単一細胞ソーティングしたＲＮＡｓｅｑデータに基づく腫瘍内ＣＤ８  Ｔ細胞クローン分析を例示する。
【図６Ａ】図６Ａ〜図６Ｄは、腫瘍由来ＴＣＲに対するＴ細胞活性化アッセイを図示する。
【図６Ｂ】同上。
【図６Ｃ】同上。
【図６Ｄ】同上。
【図７Ａ】図７Ａ〜図７Ｂは、単一Ｔ細胞トランスクリプトームの遺伝子発現解析を示す。
【図７Ｂ】同上。
【図８】図８は、例示的な運用環境である。
【図９Ａ】図９Ａ〜図９Ｅは、併用療法が腫瘍内高頻度ＣＤ８＋  Ｔ細胞クローンを増殖することを示す。図９ａは、腫瘍免疫療法および単一細胞ソーティング試験デザインの概略図である。図９ｂは、腫瘍攻撃後８日目および１１日目の単一細胞ソーティングしたＲＮＡｓｅｑデータに基づく腫瘍内ＣＤ８＋  Ｔ細胞クローン分析を例示する。各円は単一のＣＤ８＋  Ｔ細胞を表す。同じＴＣＲ配列を共有するＴ細胞を色分けし、数は、ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ３領域の配列が続く個別のクローンの頻度を示す。８日目は、アイソタイプが配列番号２９０、抗ＧＩＴＲが配列番号２６９、抗ＰＤ１が配列番号２７０であり；１１日目は、アイソタイプが配列番号２９１、配列番号２９２（それぞれ、はじめから終わりの方へ）、抗ＧＩＴＲが配列番号２７１〜２７３（それぞれ、はじめから終わりの方へ）、抗ＰＤ１が配列番号２７４〜２７９（それぞれ、はじめから終わりの方へ）、抗ＧＩＴＲ＋抗ＰＤ１が配列番号２８０〜２８９（それぞれ、はじめから終わりの方へ）である。図９ｃは、Ｔ細胞クローン性の定量的解析である。データは、各群からの増殖したＣＤ８＋Ｔ細胞クローンの累積頻度を示す（＊、ｐ＜０．０５、＊＊、ｐ＜０．０１、＊＊＊、ｐ＜０．００１、フィッシャーの検定）。図９ｄ、図９ｅは、腫瘍内ＣＤ８＋  Ｔ細胞クローンからのＴＣＲの特定、発現および機能的検証である。高頻度のＴＣＲクローンは、ＡＰ−１ルシフェラーゼレポーター遺伝子とともにＪ．ＲＴ３−Ｔ３．５  Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞系統にクローン化され（図９ｄ）、それらの反応性が、ＭＣ３８（腫瘍特異的）対無関連腫瘍細胞（Ｂ１６Ｆ１０．９またはＴＲＡＭＰ−Ｃ２）に対してｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験された。図９ｅは、併用療法から単離されたＭＣ３８特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンによるＡＰ−１ルシフェラーゼレポーターバイオアッセイの代表的結果を示し、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８刺激をポジティブコントロールとして使用した。
【図９Ｂ】同上。
【図９Ｃ】同上。
【図９Ｄ】同上。
【図９Ｅ】同上。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜図１０Ｄは、クローン性増殖したＣＤ８＋  Ｔ細胞における固有の遺伝子シグネチャの特定を示す。図１０ａは、併用療法からのクローン性増殖したＣＤ８＋Ｔ細胞内で上方調節された遺伝子の、アイソタイプ治療によるＣＤ８＋Ｔ細胞または併用療法による非増殖ＣＤ８＋Ｔ細胞との比較である（１１日目）。ベン図は、有意に増加した遺伝子の数を示し（ｐ＜０．０１、倍率変化≦２）、図示されたＣＤ８＋  Ｔ細胞集団と比較している。ヒートマップは、比較の間に重複する３０個の遺伝子を示す。図１０ｂは、併用療法からのクローン性増殖したＣＤ８  Ｔ細胞において特異的に上方調節された遺伝子の特定である。概略図およびベンズ図は、異なる比較を示す。図１０ｃは、累積分布関数（ＣＤＦ）プロットが、合計の、クローン性増殖または非増殖のＣＤ８＋  Ｔ細胞における、併用療法による固有に調節された遺伝子ＣＤ２２６の発現を示す。図１０ｄは、図示されたＣＤ８＋  Ｔ細胞集団間のＣＤ２２６発現レベルの倍率変化である（数字は倍率変化（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）を示す；ＮＳは、有意でない）。
【図１０Ｂ】同上。
【図１０Ｃ】同上。
【図１０Ｄ】同上。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜図１１Ｄは、抗腫瘍免疫性を好むＣＤ２２６／ＴＩＧＩＴ経路を相乗的に調節する併用療法を示す。図１１ａは、脾臓および腫瘍の抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞集団におけるＣＤ２２６発現（ＭＦＩ）のＦＡＣＳ分析であり、ＦＡＣＳプロットで示されるゲーティング戦略である。データは、二つの独立した実験のうちの代表的な一つの実験を示す（群当たりｎ＝９〜１０マウス）。グラフでは、合計ＣＤ８は左側の四本の棒であり、非特異的ＣＤ８は中央にある四本の棒であり、Ｏｖａ特異的ＣＤ８は右側の四本の棒である。図１１ｂは、概略図が、リン酸化共刺激受容体によって採用されることが知られている細胞質チロシンキナーゼｌｃｋ、Ｚａｐ７０、およびＳＬＰ７６、ＰＩ３Ｋ（ｐ８５ａ）の主要な成分と一緒になって、リポソーム上のＴ細胞シグナル伝達に関与する様々な成分（ＣＤ３およびＣＤ２２６）を再構築する、ＬＵＶ（大きな単層膜リポソーム（ｌａｒｇｅ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ））を示している。図１１ｃにおいて、ＣＤ２２６は、Ｓｈｐ２と結合したＰＤ−１に対して感受性が高いが、ＣＤ３ζはそうではない。ＰＤ−１濃度を増加させながらのＳｈｐ２含有反応は３０分で終了し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびホスホチロシンウエスタンブロット（ＷＢ）にかけた。図１１ｄは、脾臓および腫瘍のＴ細胞サブセット（腫瘍移植８日後）におけるＴＩＧＩＴ発現のＦＡＣＳ分析である。データは、二つの独立した実験のうちの代表的な一つの実験を示す（群当たりｎ＝９〜１０マウス）。（＊、ｐ＜０．０５、＊＊、ｐ＜０．０１、＊＊＊、ｐ＜０．００１、一方向ＡＮＯＶＡ、テューキーの多重比較検定）。
【図１１Ｂ】同上。
【図１１Ｃ】同上。
【図１１Ｄ】同上。
【図１２Ａ】図１２Ａ〜図１２Ｈは、併用療法によって誘発された抗腫瘍応答を媒介する際において重要な役割をするＣＤ２２６シグナル伝達経路を示す。図１２ａで、抗ＧＩＴＲ＋抗ＰＤ−１またはアイソタイプＩｇＧを用いた免疫療法の前に、ＭＣ３８腫瘍担持マウスを、ＣＤ２２６阻害ＡｂまたはアイソタイプＩｇＧのいずれかにより治療した。ここでは生存率を示している。データは、三つの独立した実験のうちの代表的な一つの実験を示す（群当たりｎ＝５マウス）。図１２ｂでは、ＣＤ２２６  ＫＯマウスまたはＷＴ同腹仔をＭＣ３８腫瘍細胞で攻撃し、腫瘍移植後の６、１３日目に抗ＧＩＴＲ  ＋  抗ＰＤ−１  ＡｂまたはアイソタイプＡｂのいずれかで治療した。データは、二つの独立した実験のうちの代表的な一つの実験を示す（群当たりｎ＝７〜８マウス）。（図１２ｃ〜図１２ｅ）併用療法の有効性は、ＣＤ２８、ＯＸ４０および４−１ＢＢ経路に依存しない。図１２ｃは、ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ（１０ｍｇ／ｋｇ）を用いたＣＤ２８伝達の阻害である。図１２ｄは、ＯＸ４０Ｌ阻止抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）を用いたＯＸ４０シグナル伝達の阻害である。図１２ｅは、４−１ＢＢＬ阻止抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）を用いた４−１ＢＢシグナル伝達の阻害である。図示されるデータは生存曲線（群当たりｎ＝１０マウス）である。図１２ｆは、抗ＰＤ１臨床試験の概略図である。図１２ｇでは、腫瘍生検のＲＮＡ−ｓｅｑ解析が、進行した癌患者の抗ＰＤ−１  Ａｂ治療後にＣＤ２２６の転写物が著しく増加したことを示している（ｎ＝４３、対応のあるｔ−検定）。図１２ｈは、図示する癌タイプの患者におけるＣＤ２２６転写物発現レベルおよび全生存についてのＴＣＧＡデータ解析である。（＊、ｐ＜０．０５、＊＊、ｐ＜０．０１、＊＊＊、ｐ＜０．００１、生存分析のためのログランク検定）。
【図１２Ｂ】同上。
【図１２Ｃ】同上。
【図１２Ｄ】同上。
【図１２Ｅ】同上。
【図１２Ｆ】同上。
【図１２Ｇ】同上。
【図１２Ｈ】同上。
【図１３】図１３は、ＴＣＲ陰性の癌または非癌細胞株を、ＭｉＴＣＲ、ＴＣＲｋｌａｓｓ、およびｒｐｓＴＣＲパイプラインに関する負の対照、ネガティブコントロール：ヒトおよびマウス非Ｔ細胞株（２×１００ｂｐ）として用いられたことを示す表である。
【図１４】図１４は、ＴＣＲ標的シーケンシングと単一細胞シーケンシングにおけるｒｐｓＴＣＲパイプラインとの間のＴＣＲ検出率の比較を示す表である。
【図１５】図１５は、１１日目の抗体治療により、クローン性増殖したＣＤ８＋Ｔ細胞中で特異的に上方調節された経路を示す表である。
【図１６Ａ】図１６Ａ〜図１６Ｊは、抗ＧＩＴＲ＋抗ＰＤ−１の併用が、定着した腫瘍を相乗的に拒絶し、機能障害性Ｔ細胞を再活性化することを示す。図１６ａでは、抗ＧＩＴＲおよび／または抗ＰＤ−１  Ａｂで治療（６日目、１３日目）した野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＭＣ３８腫瘍増殖である。結果は、個々のマウスの腫瘍増殖曲線を示す（二つの実験からの累積データ、群当たりｎ＝１７マウス）。上部の数字は、治療群のマウスの合計数に対する腫瘍のないマウスの数を表す。図１６ｂは、図示された治療での累積生存曲線である。図１６ｃ、図１６ｄでは、ＣＤ８＋  Ｔ細胞依存性の長期的な腫瘍保護が、併用療法によって媒介された。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、抗ＣＤ８、ＣＤ４、または抗ＣＤ２５の枯渇抗体を用いて治療し、その後抗ＧＩＴＲ  ＋  抗ＰＤ−１  ＡｂまたはコントロールＡｂを用いた療法を行った（方法の項を参照）。図１６ｃは代表的なＦＡＣＳプロットが、別のＡｂによる枯渇効率を示す。図１６ｄは、異なる枯渇Ａｂを用いた治療に伴う平均腫瘍増殖曲線であり、二つの実験のうち代表的な一つを示している（群当たりｎ＝５マウス）。図１６ｅ、図１６ｆでは、併用療法により、腫瘍内のエフェクターＴ細胞／Ｔｒｅｇ比が増加している。図１６ｅは、代表的なＦＡＣＳプロットであり、１１日目の腫瘍Ｔ細胞のサブセットを示す（ＦｏｘＰ３対ＣＤ８、生存／単一細胞／ＣＤ４５＋／ＣＤ３＋上で予めゲーティングされた細胞）。図１６ｆは、腫瘍攻撃後の８日目および１１日目における、ＦＡＣＳ結果の腫瘍内ＣＤ８＋  Ｔ細胞／Ｔｒｅｇ比およびＣＤ４＋  ＴＥｆｆ  細胞／Ｔｒｅｇ比をまとめている。データは、三つの独立した実験のうちの代表を示す（群当たりｎ＝６〜７マウス）。図１６ｇ〜図１６ｉでは、併用療法が、腫瘍内機能障害性Ｔ細胞を再活性化している。移植後１１〜１２日目に腫瘍を採取し、ＢＦＡの存在を用いてＰＭＡ／イオノマイシンで再刺激した単一細胞懸濁液中に解離させた。細胞を固定し、透過処理し、その後Ｋｉ６７（図１６ｇ）、グランザイムＡ（図１６ｈ）、およびグランザイムＢ（図１６ｉ）で細胞内染色を行った。示されるデータは、陽性細胞の割合である。（群当たりｎ＝５〜１０マウス）。図１６ｊでは、抗ＧＩＴＲ＋抗ＰＤ−１が、定着したマウスＲＥＮＣＡ腫瘍を相乗的に拒絶している。Ｂａｌｂ／ｃマウスを１ｘ１０６個のＲＥＮＣＡ腫瘍細胞を用いて０日目に皮下で攻撃し、腫瘍移植後６日目、１３日目、および２０日目に抗ＧＩＴＲ（５ｍｇ／ｋｇ）および、または抗ＰＤ−１（５ｍｇ／ｋｇ）のＡｂで治療した。示されるデータは生存率である（群当たりｎ＝１０マウス）。（＊、ｐ＜０．０５、＊＊、ｐ＜０．０１、＊＊＊、ｐ＜０．００１、＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１；図１６ｂ、図１６ｊはログランク検定；図１６ｆ、図１６ｇは、一方向ＡＮＯＶＡ、テューキーの多重比較検定）。
【図１６Ｂ】同上。
【図１６Ｃ】同上。
【図１６Ｄ】同上。
【図１６Ｅ】同上。
【図１６Ｆ】同上。
【図１６Ｇ−Ｉ】同上。
【図１６Ｊ】同上。
【図１７】図１７は、ｒｐｓＴＣＲパイプラインの概要を示す。ランダムプライミングのショートＲＮＡ−ｓｅｑデータを使用した、ＴＣＲレパートリー分析用のバイオインフォマティクスパイプラインであるｒｐｓＴＣＲパイプラインの概略図である。
【図１８】図１８は、ヒトおよびマウスの初代血液細胞を使用したｒｐｓＴＣＲパイプラインプラットフォームの検証を示す。健康なヒトＰＢＭＣサンプルまたはマウス全血からの標的ＴＣＲ−ｓｅｑデータを、ＴＣＲｋｌａｓｓ単独と比較した偽陽性または偽陰性率を評価するポジティブコントロールとして使用した。固有のＣＤＲ３配列の大部分は、ベン図内の数字で示されるように、ｒｐｓＴＣＲパイプライン、ＭｉＴＣＲ、およびＴＣＲｋｌａｓｓによって検出された。ｒｐｓＴＣＲパイプライン、ＭｉＴＣＲおよびＴＣＲｋｌａｓｓ間における二乗の相関関係（Ｒ２）を図に示した。
【図１９】図１９は、ＬＣＭＶ特異的Ｔ細胞クローン（Ｐ１４）からのＴＣＲが、バイオアッセイプラットフォームに対するポジティブコントロールとして使用されたことを示している。Ｐ１４  ＴＣＲ組換えレポーター細胞株は、ＬＣＭＶ感染細胞に対する特異性を示すが、腫瘍細胞株に対しては示さない。抗ＣＤ３およびＣＤ２８刺激をＴＣＲ複合体シグナル伝達のポジティブコントロールとして使用した。
【図２０−１】図２０は、併用療法からのクローン性増殖したＣＤ８＋  Ｔ細胞中で著しく強化された３０個の遺伝子の発現レベルを示すバイオリンプロットを示す。示されるデータは、個別に配列決定されたＣＤ８＋  Ｔ細胞（ｃＥｘｐ、併用療法、クローン性増殖したＴ細胞；ｃＮｏｎ、併用療法、非増殖；アイソタイプ、アイソタイプ治療群からの合計ＣＤ８）中の遺伝子発現（Ｌｏｇ２  ＲＰＭＫ）である。
【図２０−２】同上。
【図２０−３】同上。
【図２１Ａ】図２１Ａ〜図２１Ｃは、併用療法により、エフェクター機能を伴う腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞を増殖させることを示す。図２１ａは、ＦＡＣＳによるＭＣ３８−ＯＶＡ−β２ｍ−Ｋｂ細胞上のＯＶＡペプチド−Ｋｂ複合体の表面発現の検証である。ＭＣ３８−ＯＶＡ−β２ｍ−Ｋｂまたは空ベクターコントロールＭＣ３８細胞は、アイソタイプまたは抗Ｋｂ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ  Ａｂで染色される。代表的なヒストグラムを示している。図２１ｂは、抗ＧＩＴＲおよび／または抗ＰＤ−１  Ａｂで治療されたＭＣ３８−ＯＶＡ−β２ｍ−Ｋｂ担持マウスからの、腫瘍および脾臓のＯＶＡ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の、頻度（左側）および腫瘍重量に対して正規化された数（数／ｍｇ、右側）である。（二つの実験の代表。群当たりｎ＝９〜１０マウス）。図２１ｃは、併用療法による脾臓および腫瘍のＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＯＶＡ特異的リコール応答の増加である。ＢＦＡの存在下でＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを用いてまたはこれを用いずに、細胞を再刺激した。ＩＦＮγの細胞内発現をＦＡＣＳによって分析した。データは二つの実験を代表するものであり、群当たりｎ＝９〜１０マウスとした（＊、ｐ＜０．０５、＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１、図２１ｂでは一方向ＡＮＯＶＡ、図２１ｃは双方向ＡＮＯＶＡ、テューキーの多重比較検定）。
【図２１Ｂ】同上。
【図２１Ｃ】同上。
【図２２Ａ】図２２Ａ〜図２２Ｄは、様々なＴ細胞サブセットにおけるＴＩＧＩＴ／ＣＤ２２６発現レベルの単一細胞ＲＮＡレベルおよびＦＡＣＳ分析におけるＴＩＧＩＴ発現を示す。累積分布関数（ＣＤＦ）プロットにより、ＴＩＧＩＴ  ＲＮＡ発現（図２２ａ）およびＦＡＣＳ分析（図２２ｂ）を示し、二つの実験の代表であり（群当たりｎ＝９〜１０マウス）、合計の、クローン性増殖（ＯＶＡ特異的）または非増殖（ＯＶＡ非特異的）のＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるＴＩＧＩＴの発現を示している。図２２ｃ、ＭＣ３８野生型腫瘍移植後の８日目の脾臓および腫瘍のＴ細胞のサブセットに対するＴＩＧＩＴ発現のＦＡＣＳ分析、各集団内のＴＩＧＩＴ＋細胞の割合が示されている。図２２ｄでは、ＭＣ３８野生型腫瘍移植後の１１日目の脾臓および腫瘍のＴ細胞サブセットにおけるＣＤ２２６発現のＦＡＣＳ分析、各集団内のＣＤ２２６＋細胞の割合が示されている。データは二つの実験を代表するものであり、群当たりｎ＝９〜１０マウスとした（＊、ｐ＜０．０５、＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１、一方向ＡＮＯＶＡ、テューキーの多重比較検定）。
【図２２Ｂ】同上。
【図２２Ｃ】同上。
【図２２Ｄ】同上。
【図２３Ａ】図２３Ａ〜図２３Ｆは、正常なＴ細胞発生および恒常性機能を示すＣＤ２２６−／−マウスを示す。図２３ａは、ターゲティング戦略である。マウスＣＤ２２６のマウスのコーディングエクソン１〜２を、自己欠失ｅＧＦＰ−Ｎｅｏカセット（ｅＧＦＰ−ｐｏｌｙＡ−ｈＵｂ−ＥＭ７−ｎｅｏ−ｐｏｌｙＡ−Ｐｒｍ−Ｃｒｅｉ−ｐｏｌｙＡ）で置換したが、それはコーディングエクソン１内の開始ＡＴＧに対するちょうど３’ではじまり、コーディングエクソン２の３’末端の１３ｂｐ前までである。コーディングエクソン１〜２の間のイントロンも欠失している。カセット欠失後は、ｅＧＦＰ、ｐｏｌｙＡ  ＬｏｘＰ、およびクローニング部位（１１４１ｂｐ）は残存している。図２３ｂは、Ｔ細胞サブセットにおけるＣＤ２２６欠失のＦＡＣＳ検証である。図２３ｃは、胸腺におけるＴ細胞発生のＦＡＣＳ解析（Ｔｃｏｎｖは、従来のＴ細胞；ＤＰは、ＣＤ４／ＣＤ８二重陽性；ＳＰは、単一陽性；ＤＮは、ＣＤ４／ＣＤ８二重陰性）である。図２３ｄは、ＦＡＣＳによって分析された脾臓および血液中のＴ細胞サブセットである。図２３ｅは、ＴＣＲ刺激に伴う炎症性サイトカイン分泌である。ＣＤ２２６−／−マウスまたは野生型（ＷＴ）マウスからの脾細胞を１６時間、ｅｘ  ｖｉｖｏで抗ＣＤ３  ＋  抗ＣＤ２８  Ａｂで刺激した。図示されたサイトカイン放出のために上清を収集した。図２３ｆは、ＣＤ２２６−／−マウスまたはＷＴマウス由来の脾臓および血液のＴ細胞のサブセット上のＰＤ１およびＧＩＴＲの発現レベルである。示されるデータは、平均蛍光強度（ＭＦＩ）である（群当たりｎ＝３マウス）。
【図２３Ｂ】同上。
【図２３Ｃ】同上。
【図２３Ｄ】同上。
【図２３Ｅ】同上。
【図２３Ｆ】同上。
【図２４Ａ】図２４Ａ〜図２４Ｇでは、ＣＤ２２６シグナル伝達経路が、ＴＩＧＩＴ−／−マウスにおける腫瘍監視の強化に必要であったことを示す。野生型マウスまたはＴＩＧＩＴ−／−マウスをＭＣ３８腫瘍で攻撃し、抗ＣＤ２２６またはコントロールＩｇＧで予め治療し、アイソタイプコントロール（図２４ａ）または抗ＧＩＴＲ  ＋抗ＰＤ−１いずれかでの併用療法（図２４ｂ）を受けた。示されるデータは、二つの実験を代表する平均腫瘍増殖曲線を示す（群当たりｎ＝４〜５マウス）。図２４ｃでは、ＦＡＣＳにより、組換えＭＣ３８腫瘍細胞上のＣＤ１５５の過剰発現を検証する。図２４ｄでは、ＭＣ３８腫瘍細胞上でＣＤ２２６／ＴＩＧＩＴのリガンド、ＣＤ１５５が過剰発現することが、腫瘍増殖を減速し、腫瘍拒絶反応および長期生存を促進の点で抗ＧＩＴＲまたは抗ＰＤ−１  Ａｂの単剤療法（３、６、１０および１３日目での）と相乗効果を発揮する。示されるデータは、平均腫瘍増殖曲線（群当たりｎ＝１０マウス）である。図２４ｅでは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの組換えＭＣ３８腫瘍細胞上のＣＤ１５５の過剰発現が維持されている。図２４ｆでは、ＭＣ３８腫瘍細胞上のＣＤ１５５の過剰発現が、腫瘍内ではあるが脾臓ではない、ＦＡＣＳによって検出されたＴ細胞サブセットにおいて遊離ＣＤ２２６受容体を減少させる。図２４ｇでは、マウスをＭＣ３８コントロールまたはＣＤ１５５過剰発現細胞で攻撃した。腫瘍攻撃後９日目に、Ｔ細胞活性化のためにＦＡＣＳによって腫瘍細胞および脾臓細胞を分析した。ＩＦＮγ発現に関して、細胞内染色の前に、細胞をＰＭＡ／イオノマイシンで再刺激した（群当たりｎ＝１０マウス）。（＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１、一方向ＡＮＯＶＡ、テューキーの多重比較検定）。
【図２４Ｂ】同上。
【図２４Ｃ】同上。
【図２４Ｄ】同上。
【図２４Ｅ】同上。
【図２４Ｆ】同上。
【図２４Ｇ】同上。
【図２５−１】図２５は、大きい定着したＭＣ３８腫瘍に対して効能を示す、抗ＧＩＴＲ＋抗ＰＤ−１  Ａｂ療法と局所放射線照射を組み合わせることを示す。大きい定着したＭＣ３８腫瘍担持マウスを、０または８Ｇｙの局所放射線照射（１８日目）と組み合わせて、１００μｇの抗ＧＩＴＲおよび／または抗ＰＤ−１  ＡｂまたはアイソタイプＡｂで治療した（１７、２０、２４および２７日目）。ａは平均腫瘍増殖曲線であり、ｂは個別のマウス腫瘍増殖曲線である。腫瘍のないマウスの数は、左上パネルに示されている。ｃは、ｂからの生存曲線である。データは、二つの独立した実験のうちの代表である（群当たりｎ＝５〜６マウス）。（＊、ｐ＜０．０５、＊＊、ｐ＜０．０１、ログランク検定）。
【図２５−２】同上。
【図２６】図２６は、ＴＣＲα／βレパートリーシーケンシングのためのライブラリの準備で使用されるプライマーの一覧である。
【図２７】図２７は、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールのデータセットを使用した三つの方法の比較を示す。
【図２８】図２８は、５０ｂｐのプライミングリードを使用した、ｍｉＴＣＲ、ＴＣＲｋｌａｓｓ、及びｒｐｓＴＣＲパイプラインによって見出された上位のＣＤＲ３を示す。
【図２９】図２９は、５０ｂｐのプライミングリードを使用した、完全ＶＩ−Ｎｅｘｔデータセットにおいて見られる上位のＣＤＲ３を示す。
【図３０】図３０は、１００ｂｐのプライミングリードを使用した、ｍｉＴＣＲ、ＴＣＲｋｌａｓｓ、及びｒｐｓＴＣＲパイプラインによって見出された上位のＣＤＲ３を示す。
【図３１】図３１は、１００ｂｐのプライミングリードを使用した、完全ＶＩ−Ｎｅｘｔデータセットにおいて見られる上位のＣＤＲ３を示す。
【図３２】図３２は、単一細胞シーケンシング及びバルクＲＮＡシーケンシングの両方におけるＣＤＲ３の検出を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本方法およびシステムに関する開示および説明に先立って、本方法およびシステムが特定の方法、特定の構成要素または特定の実装形態に限定されないことを理解すべきである。本明細書中で使用されている用語は、もっぱら特定の実施形態の説明を目的としたものであって、限定することを意図するものではないこともまた、理解すべきである。
【００３７】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上に他の意味に解釈されることが明白な場合を除き、複数の指示対象を含む。本明細書中では、範囲を「約」の或る特定の値から且つ／または「約」の別の特定の値までとして表現する場合がある。そのような範囲を表現する場合、別の実施形態では、或る特定の値から且つ／または別の特定の値までが包含される。同様に、値が近似値として表現されている場合には、先行する「約」を使用することにより、特定の値が別の実施形態を形成することが理解されるであろう。各範囲の終点は、他の終点と関連して且つ他の終点とは独立に有意であることが、更に理解されるであろう。
【００３８】
「任意選択的な」または「任意選択的に」は、後述されている事象または状況が起こる場合もあれば起こらない場合もあることを意味すると共に、この記載には、前述の事象または状況が起こる場合の例および起こらない場合の例が包含されることを意味する。
【００３９】
この明細書の記載および特許請求の範囲を通じて、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」およびこの語の変形、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」や「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などは、「〜を含むがこれに限定されない」を意味し、例えば、他の構成要素、整数、または工程を除外することを意図するものではない。「例示的」とは、「の一例（ａｎ  ｅｘａｍｐｌｅ  ｏｆ）」を意味するものであって、好ましい実施形態または理想的な実施形態の指標を伝達することを意図するものではない。「〜など（ｓｕｃｈ  ａｓ）」は、制限的な意味で使用されるものではなく、説明を目的に使用される。
【００４０】
免疫チェックポイント阻害剤を用いた単剤または併用療法は、癌患者において有意な治療効果を示している開示に関連して観察されている。しかしながら、患者の大部分は応答しない、または一過性的にのみ応答するものであり、次世代の免疫療法の設計に関する基本的な問題を提起する。腫瘍内微小環境の免疫抑制性の性質を克服し、持続的な応答を促進するために、より強いＴ細胞活性化を誘発する共阻害性経路および共刺激経路の二重標的化を行うことができる。一部のシナリオでは、抗体を併用することが、例えば恒常性調節因子のバランスを回復し、ＣＤ８＋  Ｔ細胞エフェクター機能を相乗的に増強する可能性があり、腫瘍拒絶反応および長期応答がもたらされる。治療の結果としてのクローン性増殖の正確な測定が、単剤または併用療法に対する対象の応答を示すシグネチャを提供することができる。一態様では、対象の一つ以上のＴ細胞を配列決定することから得られたショートリードからの一つ以上のＴＣＲ配列を生成できる方法およびシステムが本明細書に開示される。この方法およびシステムは、一つ以上のＴＣＲ配列の生成に基づいてクローン性増殖を決定し、対象の応答および／または潜在的応答を示すシグネチャを提供することができる。
【００４１】
「ｒｐｓＴＣＲ」パイプラインとも称する、本開示の方法およびシステムの実施に使用可能な構成要素を開示する。これらおよび他の構成要素が本明細書に開示されるものであって、これらの構成要素の組み合わせ、サブセット、相互作用、群等が開示されているとき、これらの多様な個別および集合的な組み合わせならびにこれらの並べ替え（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）の各々の具体的な言及が、明示的には開示されていないかもしれないが、それぞれは、全ての方法およびシステムに関して本明細書中で具体的に考慮され、且つ説明されているということが理解される。これは、本開示の方法における工程を含むが、これらに限定されない、本出願の全ての態様に当てはまる。したがって、実施可能である種々の付加的工程が存在する場合には、当然のことながら、これらの付加的工程の各々を、本開示の方法の任意の特定の実施形態または実施形態の組み合わせを用いて実施できる。
【００４２】
下記の好ましい実施形態およびそれに含まれる実施例についての発明を実施するための形態、ならびに図面およびその前後の説明を参照することによって、本方法およびシステムについての理解を容易にすることができる。
【００４３】
当業者がいずれ理解するように、この方法およびシステムは、全体がハードウェアである実施形態、全体がソフトウェアである実施形態、またはソフトウェアおよびハードウェアの態様を組み合わせた実施形態の形態を取ることができる。更に、本方法およびシステムは、記憶媒体に具体化されるコンピュータ可読プログラム命令を有するコンピュータ可読記憶媒体上のコンピュータプログラム製品（例えば、コンピュータソフトウェア）の形態を取ることができる。より具体的には、本方法およびシステムは、ウェブで実行されるコンピュータソフトウェアの形態を取ることができる。ハードディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、光学式記憶デバイス、または磁気記憶デバイスを含めた、あらゆる適切なコンピュータ可読記憶媒体を利用してよい。
【００４４】
本方法およびシステムの実施形態については、方法、システム、装置およびコンピュータプログラム製品のブロック図およびフローチャート図を参照しながら、以下に説明する。ブロック図およびフローチャート図の各ブロック、ならびにブロック図およびフローチャート図中のブロックの組み合わせはそれぞれ、コンピュータプログラム命令によって実施できることが理解されるであろう。これらのコンピュータプログラム命令は、汎用コンピュータ、特殊用途向けコンピュータ、または他のプログラム可能データ処理装置にロードして、マシンを生成することが可能であり、それによって、コンピュータまたは他のプログラム可能データ処理装置上で実行される命令によって、フローチャートのブロック内に特定されている機能を実行する手段が作り出される。
【００４５】
これらのコンピュータプログラム命令はまた、コンピュータまたは他のプログラム可能データ処理装置に対し特定の方法で機能するように指示可能なコンピュータ可読メモリに格納されて、それによって、コンピュータ可読メモリ内に格納された命令によって、フローチャートブロック内に特定された機能を実行するためのコンピュータ可読命令を含む、製造品が生産されるようにすることもできる。コンピュータプログラム命令はまた、コンピュータまたは他のプログラム可能データ処理装置にロードし、コンピュータまたは他のプログラム可能装置上で一連の動作工程を実行させて、コンピュータに実行される処理を生成して、それによって、コンピュータまたは他のプログラム可能装置上で実行される命令によって、フローチャートブロック内に特定された機能を実行するための工程が提供されるようにすることもできる。
【００４６】
したがって、ブロック図およびフローチャート図のブロックは、特定された機能を実行するための手段の組み合わせ、特定された機能を実行するための工程の組み合わせ、および特定された機能を実行するためのプログラム命令手段を支持している。また、ブロック図およびフローチャート図中の各ブロック、ならびにブロック図およびフローチャート図中のブロック同士の組み合わせは、特定された機能または工程を実行する特殊用途向けハードウェアベースのコンピュータシステムまたは特殊用途向けハードウェアとコンピュータ命令との組み合わせによって実行することが可能であるということもまた理解されたい。
【００４７】
様々な例において、この詳細な開示は、一部の動作を実施する所与の実体を指す場合がある。当然のことながら、この文言は、一部の場合に、所与の実体によって所有および／または制御されるシステム（例えば、コンピュータ）が、実際には動作を実施することを意味する場合がある。
【００４８】
一態様では、図１に図示するように、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を配列決定するためのｒｐｓＴＣＲ法１００を開示する。この方法１００の工程は、任意の順序で、または同時に実行できる。方法１００は、１１０において、核酸サンプルを配列決定して配列データを生成すること及び／又は配列データを受信することを含むことができる。核酸サンプルのシーケンシングは、対象のＴ細胞から得られた約１００塩基対未満のＲＮＡのショートリード（例えば、単一末端７５塩基対のリード）を配列決定することを含むことができる。Ｔ細胞はヒトまたはマウスから取得することができる。対象に対して一つ以上の治療を施す前または後に、Ｔ細胞を取得および／または配列決定することができる。ショートリードは、ＲＮＡのランダムプライミングから取得することができる。ランダムプライマーの長さは４〜４０ヌクレオチドであり得る。一部の実例では、ランダムプライマーの長さは４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチドであり得る。核酸サンプルを配列決定することは、データ構造に格納され得る配列データを生成することができる。データ構造は、一つ以上の核酸配列および／またはサンプル識別子を含むことができる。
【００４９】
一部の実施形態では、配列データは、任意の方法を通して取得または受信することができる。例えば、配列データは、サンプル上で配列決定処理を実行することによって直接取得することができる。別の方法として、または追加的に、配列データは、例えば、第三者、データベースおよび／または刊行物から間接的に取得することができる。一部の実施形態では、配列データは、例えばデータ記憶装置から、または別のコンピュータシステムから、コンピュータシステムで受信する。
【００５０】
一部の実施形態では、配列データはバルクシーケンスデータを含むことができる。「バルクシーケンシング」または「次世代シーケンシング」または「超並列シーケンシング」という語は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡシーケンシング処理を平行化する任意のハイスループットなシーケンシング技術を指す。例えば、バルクシーケンシング法は一般に、単一アッセイにおいて、百万個を超えるポリ核酸単位複製配列を産生することができる。「バルクシーケンシング」、「超並列シーケンシング」、および「次世代シーケンシング」という語は通常の方法のみを意味し、１回の実行で百万個を超える配列タグの獲得を必ずしも意味するものではない。任意のバルクシーケンシング法は、可逆的ターミネータ法の化学（例えば、イルミナ社）、ポロニーエマルジョン液滴を使用するパイロシーケンシング（例えば、Ｒｏｃｈｅ社）、イオン半導体シーケンシング（ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ社）、単分子シーケンシング（例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、超並列シグネチャシーケンシングなど、開示された方法およびシステムで実施できる。
【００５１】
一部の実施形態では、配列データは複数のシーケンシングリードを含むことができる。一部の実施形態では、シーケンシングリードは、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００個以下のヌクレオチドの平均リード長を持つ。一部の実施形態では、シーケンシングリードは、少なくとも３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００または２５０ヌクレオチドの平均リード長を持つ。いくつかの実施形態では、シーケンシングリードのカバレッジは、１００ｘ、９０ｘ、８０ｘ、７０ｘ、６０ｘ、５０ｘ、４０ｘ、３０ｘまたは２０ｘ以下である。いくつかの実施形態では、シーケンシングリードのカバレッジは、少なくとも５０ｘ、４５ｘ、４０ｘ、３５ｘ、３０ｘ、２５ｘ、２０ｘ、１９ｘ、１８ｘ、１７ｘ、１６ｘ、１５ｘ、１４ｘ、１３ｘ、１２ｘ、１１ｘまたは１０ｘである。
【００５２】
一部の実施形態では、配列データは、当該技術分野で公知の任意のシーケンシング法によって生成され得る。例えば、いくつかの実施形態では、配列データは、Ｃｈａｉｎ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、合成によるシーケンシング、パイロシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、単分子リアルタイムシーケンシング、Ｔａｇ−ｂａｓｅｄシーケンシング、Ｄｉｌｕｔｅ−｀n｀−Ｇｏシーケンシング、及び／又は４５４シーケンシングを用いて生成される。
【００５３】
一部の実施形態では、配列データは、一つ以上のゲノム遺伝子座または転写物の少なくとも一部を増幅するために核酸増幅プロセスが実施され、その後、結果として生じる増幅産物のシーケンシングによるプロセスの結果である。本明細書に開示される方法の実行に有用な核酸増幅プロセスの例には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ストランド置換増幅（ＳＤＡ）、転写物を介した遺伝子増幅（ＴＭＡ）、自家持続配列複製法（３ＳＲ）、Ｑβ反復性増幅、ＮＡＳＢＡ法（ＮＡＳＢＡ（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ））、ＲＣＲ法（ＲＣＲ（ｒｅｐａｉｒ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＢＤＡ法（ＢＤＡ（ｂｏｏｍｅｒａｎｇ  ＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ））、および／またはローリングサークル増幅（ＲＣＡ（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ））が含まれるが、これに限定されない。
【００５４】
一部の実施形態では、方法は、サンプル上でシーケンシングプロセスを実施する工程を含む。ＴＣＲをコードすることができるＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含有する限り、任意のサンプルを使用することができる。一部の実施形態では、サンプルは、器官、細胞または組織のドナーからのものである。一部の実施形態では、サンプルは、器官、細胞または組織のレシピエントからのものである。サンプル源は、例えば、新鮮で凍結および／もしくは保存された器官、組織サンプル、生検、または吸引液からの固形組織；血液または任意の血液成分、血清、血液；脳脊髄液、羊水、腹水または間質液、尿、唾液、便、涙などの体液；または、対象の妊娠または発育におけるあらゆる時点の細胞でもよい。
【００５５】
方法１００は、１２０において、ショートリードを基準配列と並列させることを含むことができる。基準配列は、種特異的ＲＮＡ配列の基準データセットを含むことができる。基準データセットは、データ構造に格納することができる。データ構造は、一つ以上の核酸配列および／または識別子を含むことができる。基準配列は、ＴＣＲ遺伝子配列を含まない（例えば、適応免疫細胞受容体の遺伝子座位に対応する基準配列を除外する）。アラインメントによって、マッピングされたショートリードおよびマッピングされなかったショートリードから構成されるリードセットが生成される。一態様では、ショートリードを基準配列と並列させることは、Ｔｒａｐｎｅｌｌ  Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．ＴｏｐＨａｔ：ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｎｇ  ｓｐｌｉｃｅ  ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（２００９）２５（９）：１１０５−１１１１に記載されている一つ以上の技術を含むことができる。マッピングされたショートリードは、１３０において破棄することができる。得られるデータ構造は、マッピングされなかったショートリードを含んで生成することができる。方法の残りの工程は、正常に廃棄され、ＴＣＲ文脈内でさらなる分析を受けないものであるマッピングされなかったショートリードに対して実施できる。こうしたマッピングされたショートリードの除外は、当該技術分野のＴＣＲ分析の現状から逸脱していることを表すものであり、結果として正確性と精度の両方の下流の改善をもたらす。
【００５６】
方法１００はさらに、一つ以上のマッピングされなかったショートリードに対する精度管理プロセスを実施することをさらに含むことができる。一つ以上のマッピングされなかったショートリードに対する精度管理プロセスを実施することは、低品質ヌクレオチドの除去または非常に短いリードの除去のうちの一つ以上を含むことができる。非常に短いリードを除去することは、３５塩基対未満の長さのあらゆるリードを除去することを含むことができる。
【００５７】
一態様では、方法１００は、一つ以上のマッピングされなかったショートリードを、１４０におけるさらなる処理のために一つ以上のロングリードに構築することができる。一態様において、さらなる処理のために一つ以上のマッピングされなかったショートリードを一つ以上のロングリードに構築することは、一つ以上のマッピングされなかったショートリードを、ＴＣＲ配列の参照データベースからの一つ以上のＴＣＲ配列に対して並列することと、一つ以上のマッピングされなかったショートリードを、ＴＣＲ配列を参照データベースに基づいてロングリード（候補ＴＣＲ配列）に構築することを含むことができる。別の態様において、さらなる処理のために一つ以上のマッピングされなかったショートリードを一つ以上のロングリードに構築することは、一つ以上のマッピングされなかったショートリードを、ＴＣＲ配列の参照データベースを用いずに、ロングリード（候補ＴＣＲ配列）に構築することを含むことができる。
【００５８】
一態様では、さらなる処理のために一つ以上のマッピングされなかったショートリードを一つ以上のロングリードに構築することは、Ｗａｒｒｅｎ，Ｒ．Ｌ．，Ｂ．Ｈ．Ｎｅｌｓｏｎ，ａｎｄ  Ｒ．Ａ．Ｈｏｌｔ．２００９．Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｍｏｄｅｌ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅｓ  ｗｉｔｈ  ｓｈｏｒｔ  ｒｅａｄｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２５：４５８−４６４に記載の一つ以上の技術を含むことができ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる（ｉＳＳＡＫＥプラットフォーム）。一態様では、さらなる処理のために一つ以上のマッピングされなかったショートリードを一つ以上のロングリードに構築することは、一つ以上のマッピングされなかったショートリードを、所望の適応免疫細胞受容体の既知のキュレーターによるＶ遺伝子に対して並列させることを含むことができる。Ｖアライメントの一致しなかったヌクレオチド３’を有するＶ遺伝子の３’末端に対して、最良のフォワードまたはリバースの相補鎖を有する一つ以上のマッピングされなかったショートリードは、ｄｅ  ｎｏｖｏアセンブリのシードとして標識されうる。受容体Ｖ遺伝子もしくは定常領域に対して、またはＪ遺伝子と定常領域との間の可能性のある接合部に対して完全にアラインされる一つ以上のマッピングされなかったショートリードは、将来の構築から破棄することができる。
【００５９】
各シード配列は、構築物の核をなすために用いることができる。たとえば、部分列長さ（ｋ）は、構築されていない最長のリード長で開始できる。そのため、長さｋの３’末端部分列を生成することができる（ｋ−ｍｅｒ）。ｋ−ｍｅｒが、一つ以上のフォワードまたはリバース相補鎖のリードｒの５’末端塩基と一致する場合、一致するリードｒを、構築を伸長するために使用できる（ヌクレオチドの伸長が突出することでｒにわたって合致しない場合、多数決法を使用してコンセンサス構築配列を構築することができる）。一致がなく、ｋがユーザによって指定された最小配列長より長い場合、一塩基短い新しいｋでマッチングを繰り返すことができる。一致がなく、ｋがユーザによって指定された最小配列長と等しい場合、構築は完了である。すべてのシード配列および得られる構築配列が最大の伸長（例えば、ユーザーに規定された）に達すると、構築は完了である。上記の工程は、新しい構築配列を用いて繰り返すことができる。一つ以上のロングリードを含むリードセットが結果物である。
【００６０】
別の態様では、さらなる処理のために一つ以上のマッピングされなかったショートリードを一つ以上のロングリードに構築するための代替的なアプローチは、Ｇｒａｂｈｅｒｒ  ＭＧ，Ｈａａｓ  ＢＪ，Ｙａｓｓｏｕｒ  Ｍ，Ｌｅｖｉｎ  ＪＺ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＤＡ，Ａｍｉｔ  Ｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｆｒｏｍ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  ｄａｔａ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２０１１；２９（７）：６４４−５２に開示の一つ以上の技術を含むことができ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる（トリニティプラットフォーム）。さらなる処理のために一つ以上のマッピングされなかったショートリードを一つ以上のロングリードに構築することは、多段階工程のアプローチを含むことができる。第一の工程は、一つ以上のマッピングされなかったショートリードを、最長マッチを行うｋ−ｍｅｒに基づく、転写物構築のためのアプローチを用いて、転写物の固有の配列に構築すること、ｋ−ｍｅｒを共有する一組の代替的変異体（代替的スプライシング、遺伝子重複または対立遺伝子変異による）に関して単一（最良）の代表物を回収することを含むことができる。このｋ−ｍｅｒに基づくアプローチは、すべての候補ＴＣＲ配列（例として、ｋ＝２５）からのｋ−ｍｅｒのフォワードおよびリバース相補鎖配列のディクショナリーを作成することを含むことができる。ディクショナリーのうち最も頻度の高いｋ−ｍｅｒが、コンティグ構築物をシードするために選択され得、複雑性が低いまたは一回観察されただけのｋ−ｍｅｒは除外される。シードは、現在の構築物と重複するｋ−１をもつ最もよく発生するｋ−ｍｅｒを見つけること、または、その突出するヌクレオチドを現在の構築配列に連結することによっていずれかの方向に伸長することができる。ｋ−ｍｅｒが伸長のために使用されると、ディクショナリーから削除できる。構築物がそれ以上伸長できなくなるまで、シードエクステンションを繰り返すことができる。最も頻度の高いｋ−ｍｅｒの選択およびシードエクステンションは、ディクショナリーが枯渇するまで、次に頻繁の高いｋ−ｍｅｒを用いて繰り返すことができる。
【００６１】
多段階工程アプローチの第二の工程は、代替的にスプライシングされた転写物の部分に、またはそうでなければパラロガス遺伝子の固有の部分に対応する、関連するコンティグをクラスタリングすることを含むことができる。次いで、関連するコンティグの各クラスターについてｄｅ  Ｂｒｕｉｊｎグラフを構成することができるが、各グラフは変異体間の重複の複雑さを反映する。コンティグ間でｋ−１ヌクレオチドの重複が存在する場合、および（ｋ−１）−ｍｅｒ接合部の各側で（ｋ−１）／２のヌクレオチドが一致するコンティグの両方にわたる接合部に架かる最小数のリードがある場合に、コンティグがクラスタリングされ得る。コンティグをそれ以上どのグループにも追加できなくなるまで、グループ化を繰り返すことができる。代表的なノードおよびｋに対するある語長のｋ−１を使用して、各グループについてｄｅ  Ｂｒｕｉｊｎグラフを構成して、ノードを接続するエッジを画定することができる。ｄｅ  Ｂｒｕｉｊｎグラフの各エッジは、それを支持する本来のリードセット内に複数のｋ−ｍｅｒを含むことができる。各リードは、それが最大数のｋ−ｍｅｒを共有するグループに割り当てることができ、また該グループにｋ−ｍｅｒを寄与する各リード内の領域を決定することができる。
【００６２】
多段階工程アプローチの第三の工程は、対応するｄｅ  Ｂｒｕｉｊｎグラフのコンテキストにおけるリードおよびリードペアリングによって得られる経路を分析してもっともらしい転写配列を出力すること、代替的にスプライシングされたアイソフォームおよびパラロガス遺伝子から誘導された転写物を分析することを含むことができる。続いてノードの融合およびエッジの枝刈り（ｐｒｕｎｉｎｇ）を反復することにより、リードまたはリードペアによってサポートされる経路を特定して、これらの経路をロングリード（候補ＴＣＲ配列）として返すために実行することができる。ノードを融合することは、より長い配列を表すノードを形成するために、ｄｅ  Ｂｒｕｉｊｎグラフにおいて線形経路に連続的なノードを融合することを含むことができる。エッジを枝刈りすることは、シーケンシングエラーに対応する可能性がある比較的少ないリードによってサポートされるわずかな偏差を表すエッジを枝刈りすることを含むことができる。第三の工程はもっともらしい経路の採点を実行することをさらに含むことができるものであって、それは実際のリードおよびリードペアによってサポートされる、ｄｅ  Ｂｒｕｉｊｎグラフ内において、それらをサポートするリード（およびリードペア）を保持しながら当該グラフ内の潜在的な経路を横切る動的プログラミング手順を使用して、それらの経路を特定することによる。リードおよび配列断片（ペアリード）は通常、ｋよりもずっと大きいため、それらは曖昧性を分析し、そして経路の組み合わせ数を、線形配列として列挙されたずっと少ない数の実際の転写物まで減少させることができる。一つ以上のロングリードを含むリードセットが結果物である。
【００６３】
ＴＣＲ配列構築は、ｉＳＳＡＫＥプラットフォームおよびトリニティプラットフォームなどであるがこれらに限定されないいくつかのプラットフォームのうちの一つを使用して実施できる。表１は、本開示の方法およびシステムの構成要素として、単一細胞シーケンシングに関してトリニティプラットフォームおよびｉＳＳＡＫＥプラットフォームが効果的に同等であることを示しているが、ｉＳＳＡＫＥプラットフォームはバルクシーケンシングで上回っていた。ｉＳＳＡＫＥプラットフォームは、ＴＣＲのシード配列を利用し、バルク構築でのｒｐｓＴＣＲパイプラインの性能を向上させることができる。
【００６４】
【表１】
0006871382.tif 000002
方法１００は、１５０において、一つ以上のロングリードから一つ以上のＴＣＲ配列を生成することができる。一態様において、一つ以上のロングリードからの一つ以上のＴＣＲ配列を生成することは、Ｙａｎｇ、Ｘ．ｅｔ  ａｌ．ＴＣＲｋｌａｓｓ：ａ  ｎｅｗ  Ｋ−ｓｔｒｉｎｇ−ｂａｓｅｄ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｍｏｕｓｅ  ＴＣＲ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９４，４４６−４５４（２０１５）に開示される一つ以上の技術を含むことができ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。一つ以上のロングリードから一つ以上のＴＣＲ配列を生成することは、六フレームすべてにおいて一つ以上のロングリードのそれぞれを翻訳することと、各翻訳フレームを基準の可変（Ｖ）および結合（Ｊ）アミノ酸配列の３文字列プロファイルと比較することと、最大数の一致ｋ−ストリングをもつ翻訳フレームを特定することと、最大数の一致ｋ−ストリングをもつ翻訳フレームからのロングリードにおいて残基毎に保存残基支持スコア（Ｓｃｒ）を決定することによってロングリードにおける保存残基の位置を決定することと、翻訳フレームからのロングリードのＶおよびＪ遺伝子セグメントにおける最大のＳｃｒをもつ候補保存残基を特定することと、ＴＣＲ配列として、ＶおよびＪ遺伝子セグメントにおける二つの保存残基間に位置するＣＤＲ３領域を特定することとを含むことができる。一態様では、方法１００は、ＴＣＲ  Ｃ領域核酸配列をＴＣＲ配列に付加することをさらに含むことができる。
【００６５】
別の態様では、一つ以上のロングリードから一つ以上のＴＣＲ配列を生成することは、一つ以上のロングリードを対応するアミノ酸配列に翻訳することを含むことができる。ＴＣＲ  Ｖ領域およびＴＣＲ  Ｊ領域のアミノ酸基準配列を、約六アミノ酸のｋ−ストリングに分けることができる。ｋ−ストリングは、対応するアミノ酸配列と並列させることができる。一つ以上の保存されたＴＣＲ  ＣＤＲ３残基を、対応するアミノ酸配列に対してマッピングする、ｋ−ストリングにおいて検出することができる。検出された保存レベルを採点し、閾値保存スコアより高い保存スコアを有する対応するアミノ酸配列を選択することができる。次いで、選択された対応するアミノ酸配列において、候補ＣＤＲ３領域アミノ酸配列を検出することができる。
【００６６】
一つ以上のロングリードにおいて、候補ＣＤＲ３領域アミノ酸配列の核酸配列を特定することができる。候補ＣＤＲ３領域核酸配列の上流にある一つ以上のロングリードの核酸配列を、一つ以上のＴＣＲ  Ｖ遺伝子基準配列と並列させることができる。アラインメント度を採点することができ、閾値アライメントスコアより高いロングリードを、候補ＴＣＲ  Ｖ遺伝子配列を含むとして特定することができる。
【００６７】
候補ＣＤＲ３領域核酸配列の下流にある一つ以上のロングリードの核酸配列を、一つ以上のＴＣＲ  Ｊ遺伝子基準配列と並列させることができる。アラインメント度を採点することができ、閾値アライメントスコアより高いロングリードを、候補ＴＣＲ  Ｊ遺伝子配列を含むとして特定して、それによってＴＣＲ配列を生成できる。一態様では、方法１００は、ＴＣＲ  Ｃ領域核酸配列をＴＣＲ配列に付加することをさらに含むことができる。
【００６８】
方法１００は、一つ以上のＴＣＲ配列を、既知のＴＣＲ配列と一つ以上の治療に対して対応する治療応答とであるＴＣＲ配列ライブラリと比較することと、一つ以上のＴＣＲ配列のうち、ＴＣＲ配列ライブラリにおいて高度に対応する治療応答と一致するのはどれかを特定することと、当該一つ以上のＴＣＲ配列を有する対象が応答する可能性が高い一つ以上の治療を特定することをさらに含み得る。対象が、ある特定の治療に応答する可能性が高いＴＣＲ配列を有するとして特定されると、対象に当該特定の治療を施すことができる。
【００６９】
方法１００は、クローン性増殖を評価するために対象の疾患に治療を施す前および後に、方法１００を実施することをさらに含むことができる。例えば、治療を施す前に、対象の第一の複数のＴ細胞を収集することができる。第一の複数のＴ細胞を配列決定することができ、そして方法１００を実施することができる。存在する固有のＴＣＲ配列の発生数を決定することができる。対象に治療を施すことができ、そして対象の第二の複数のＴ細胞を収集することができる。第二の複数のＴ細胞を配列決定することができ、そして方法１００を実施することができる。存在する固有のＴＣＲ配列の発生数を決定することができる。次いで、第一の複数のＴ細胞と第二の複数のＴ細胞との間の発生数を決定することができる。一部の実例では、特定のＴＣＲ配列は、クローン性増殖を経験しているか判断されうる。他の例では、第一の複数のＴ細胞と第二の複数のＴ細胞との間でクローン性増殖を経験したＴＣＲ配列の一部もしく全部が、同じＴＣＲ配列であるか、または当該ＴＣＲ配列には同じＴＣＲ配列であるものはなかった。Ｔ細胞クローン性増殖シグネチャが結果物である。Ｔ細胞クローン性増殖シグネチャは、クローン性増殖を経験するＴ細胞の数、クローン性増殖を経験するＴ細胞の識別子、クローン性増殖の全体量、Ｔ細胞当たりのクローン性増殖の量、その組み合わせ等のうち一つ以上を含むことができる。治療に対する対象の応答を記録し、Ｔ細胞クローン性増殖シグネチャと関連付けることができる。複数の対象に対してプロセスを繰り返して、それによってＴ細胞クローン性増殖シグネチャと対応する治療応答とであるデータベースを生成することができる。開示された方法およびシステムは、その後、新しい対象のＴ細胞クローン性増殖シグネチャをデータベースと比較して、当該対象に関して治療に応答する可能性を確認することができる。
【００７０】
方法１００の一部の態様では、対象は、シーケンシング用のＴ細胞の収集前に免疫療法を施すことができる。免疫療法は単剤療法または併用療法とすることができる。例えば、免疫療法は、共刺激性アゴニストおよび共阻害性拮抗薬の併用とすることができる。一部の態様では、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、およびＴＩＭ３を含むがこれに限定されない腫瘍細胞上のＴ細胞阻害性受容体は、免疫療法中に標的とすることができる。したがって、一部の態様では、免疫療法は、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、およびＴＩＭ３のうちの一つ以上に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片を含むことができる。免疫療法レジメンの一部として、対象に、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、およびＴＩＭ３のうちの一つ以上に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片を投与してもよく、または二つ以上のそうした抗体またはその抗原結合性断片の任意の組み合わせを投与してもよい。
【００７１】
一部の態様では、免疫療法は、ＰＤ１に結合する抗体またはその抗原結合性断片を患者に投与することを含む。一部の好ましい実施形態では、ＰＤ１に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、少なくとも、配列番号２１の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列および配列番号２２の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列を含む。態様では、ＰＤ１に結合する抗体またはその抗原結合性断片のいずれかは、米国特許出願第１４／６０３，７７６号（米国特許出願公開第２０１５−０２０３５７９号）に記載される抗体またはその抗原結合性断片のいずれかであることが可能であり、これは参照により本明細書に組み込まれる。例えば、一部の実施形態では、ＰＤ１に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、表２に列挙された配列の中からのアミノ酸配列を有するＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む。一部の実施形態では、ＰＤ１に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、表２に列挙された配列の中からのアミノ酸配列を有するＬＣＶＲおよびＨＣＶＲを含む。一部の実施形態では、ＰＤ１に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、表２に示すようなＨＣＶＲおよびＬＣＶＲの対を含む。ＰＤ１に結合するその他の抗体（またはその抗原結合性断片）を使用することができ、これらは、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、デュルバルマブ、アテゾリズマブ、ピジリズマブ（Ｐｉｄｉｌｉｚｕｍａｂ）、カムレリズマブ、ＰＤＲ００１、ＭＥＤ１０６８０、ＪＮＪ−６３７２３２８３、およびＭＣＬＡ−１３４を含むがこれに限定されない。
【００７２】
【表２】
0006871382.tif 000003
一部の態様では、免疫療法は、ＬＡＧ３タンパク質（ＣＤ２２３としても知られる）に結合する抗体またはその抗原結合性断片を患者に投与することを含む。一部の態様では、ＬＡＧ３に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、少なくとも、配列番号９３のＨＣＶＲ配列および配列番号９４のＬＣＶＲ配列を含む。一部の態様では、ＬＡＧ３に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、米国特許出願第１５／２８９，０３２号（米国特許出願公開第  ２０１７−０１０１４７２号）に記載される抗体またはその抗原結合性断片のいずれかであることが可能であり、これは参照により本明細書に組み込まれる。例えば、一部の態様では、ＬＡＧ３に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、表３に列挙された配列の中からのアミノ酸配列を有するＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む。一部の態様では、ＬＡＧ３に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、表３に列挙された配列の中からのアミノ酸配列を有するＬＣＶＲおよびＨＣＶＲを含む。一部の実施形態では、ＬＡＧ３に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、表３に示すようなＨＣＶＲおよびＬＣＶＲの対を含む。ＬＡＧ３に結合するその他の抗体（またはその抗原結合性断片）を使用することができ、これらは、ＢＭＳ−９８６０１６及びＧＳＫ２３８１７８１を含むがこれらに限定されない。
【００７３】
【表３】
0006871382.tif 000004
一部の態様では、免疫療法は、ＰＤＬ１に結合する抗体またはその抗原結合性断片を患者に投与することを含む。一部の好ましい態様では、ＰＤＬ１に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、少なくとも、配列番号１２２のＨＣＶＲ配列および配列番号１２３のＬＣＶＲ配列を含む。一部の態様では、ＰＤＬ１に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、米国特許出願第１４／６０３，８０８号（米国特許出願公開第２０１５−０２０３５８０号）に記載される抗体またはその抗原結合性断片のいずれかであることが可能であり、これは参照により本明細書に組み込まれる。例えば、一部の態様では、ＰＤＬ１に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、表４に列挙された配列の中からのアミノ酸配列を有するＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む。一部の態様では、ＰＤＬ１に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、表４に列挙された配列の中からのアミノ酸配列を有するＬＣＶＲおよびＨＣＶＲを含む。一部の態様では、ＰＤＬ１に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、表４に示すようなＨＣＶＲおよびＬＣＶＲの対を含む。ＰＤＬ１に結合するその他の抗体（またはその抗原結合性断片）を使用することができ、これらは、アベルマブ、アテゾリズマブ、およびデュルバルマブを含むがこれらに限定されない。
【００７４】
【表４】
0006871382.tif 000005
一部の態様では、免疫療法は、ＣＴＬＡ４に結合する抗体またはその抗原結合性断片を患者に投与することを含む。一部の態様では、ＣＴＬＡ４に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、２０１７年７月２７日出願の米国仮特許出願第６２／５３７，７５３号に記載される抗体またはその抗原結合性断片のいずれかであることが可能であり、これは参照により本明細書に組み込まれる。例えば、一部の態様では、ＣＴＬＡ４に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、表５に列挙された配列の中からのアミノ酸配列を有するＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む。一部の態様では、ＣＴＬＡ４に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、表５に列挙された配列の中からのアミノ酸配列を有するＬＣＶＲおよびＨＣＶＲを含む。一部の態様では、ＣＴＬＡ４に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、表５に示すようなＨＣＶＲおよびＬＣＶＲの対を含む。ＣＴＬＡ４に結合するその他の抗体（またはその抗原結合性断片）を使用することができ、これらは、イピリムマブおよびトレメリムマブのみならず、その全てが参照により本明細書に援用される米国特許第６，９８４，７２０号、第７，６０５，２３８号、または第７，０３４，１２１号に開示の抗体またはその抗原結合性断片のいずれかのうちの一つ以上を含むがこれらに限定するものではない。
【００７５】
【表５】
0006871382.tif 000006
一部の態様では、免疫療法は、ＧＩＴＲに結合する抗体またはその抗原結合性断片を患者に投与することを含む。一部の好ましい実施形態では、ＧＩＴＲに結合する抗体またはその抗原結合性断片は、少なくとも、配列番号２６１のＨＣＶＲ配列および配列番号２５９のＬＣＶＲ配列を含む。態様では、ＧＩＴＲに結合する抗体またはその抗原結合性断片のいずれかは、米国特許出願第１５／６１９，０６８号に記載される抗体またはその抗原結合性断片のいずれかであることが可能であり、これは参照により本明細書に組み込まれる。例えば、一部の態様では、ＧＩＴＲに結合する抗体またはその抗原結合性断片は、表６に列挙された配列の中からのアミノ酸配列を有するＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む。一部の実施形態では、ＧＩＴＲに結合する抗体またはその抗原結合性断片は、表６に列挙された配列の中からのアミノ酸配列を有するＬＣＶＲおよびＨＣＶＲを含む。一部の態様では、ＧＩＴＲに結合する抗体またはその抗原結合性断片は、表６に示すようなＨＣＶＲおよびＬＣＶＲの対を含む。ＧＩＴＲに結合するその他の既知の抗体（またはその抗原結合性断片）を使用することができる。
【００７６】
【表６】
0006871382.tif 000007
一部の態様では、ＴＣＲ配列は、特定の治療に応じて増殖するＴ細胞クローン中に存在する配列として特定されうる。これらの特定されたＴＣＲ配列は、Ｔ細胞療法に使用できる。例えば、特定されたＴＣＲ配列を使用して、この特定のＴＣＲ配列を含有するＴ細胞を生成することができる。次に、特定されたＴＣＲ配列を含有するこれらのＴ細胞を対象に投与することができ、該対象は、その後、ＴＣＲ配列が応答するように決定された特定の治療で治療され得る対象である。一部の態様では、Ｔ細胞療法は、特定の治療に応答するＴ細胞の数を増やすために、ＴＣＲ配列が特定された同一の対象に施すことができる。一部の態様では、Ｔ細胞療法は、ＴＣＲ配列が特定された対象以外の対象に対して施すことができる。ＴＣＲ配列が特定された対象以外の対象にＴ細胞療法を施すことは、特定の治療に必ずしも応答しないかもしれない他の対象に、特定の治療に応答する能力を与える。
【００７７】
一部の態様では、ＴＣＲシグナル伝達は、特定されたＴＣＲ配列を含有するそれらのＴ細胞に対する特定の薬剤に対して試験できる。特定の治療に対して増殖するＴ細胞中に存在する特定のＴＣＲ配列を有するそれら受容体のＴＣＲシグナル伝達は、腫瘍免疫監視に対する洞察を提供する。
【００７８】
特定されたＴＣＲ配列の別の使用は、特定されたＴＣＲ配列を用いて対象に存在する腫瘍を治療するための標的を決定するためのものであり得る。特定されたＴＣＲ配列に結合する抗原が、その対象に存在する腫瘍の標的である。標的が特定されると、その後、治療を決定することができる。
【００７９】
一部の態様では、クローン性増殖におけるＴＣＲ配列の特定は、ウイルス感染および細菌感染の両方の予後に使用でき、癌および感染症の疾患進行を監視するために使用できる。
【００８０】
図２７〜図３３に示されるように、工程１３０でのマッピングされたショートリードを破棄することは、当技術分野のＴＣＲ分析技術の現状と比較して、正確性と精度の両方の改善に寄与する。
【００８１】
図２７〜図３３の方法は、ＴＣＲがないと予想されるネガティブコントロールのデータセットを使用する。これらサンプルはすべて、長さ１００塩基対（ｂｐ）のリードを伴うランダムプライミングＲＮＡ−Ｓｅｑである。五つのデータセットは様々なマウス腫瘍細胞株からのものである（これらは表７に示されている）。二つのデータセットは、ＴＣＲの形成に必要な遺伝子であるＲａｇ１／２をノックアウトしたマウスの脾臓サンプルからのものである。二つのデータセットは、ヒト細胞株からであり、一方が神経前駆細胞（ＮｅｕＰｒｏｇＣｅｌｌ）であり、もう一方が筋芽細胞（ＬＨＣＮ−Ｍ２）である。ポジティブコントロールのデータセット（ＶＩ−ｎｅｘｔ−マウス−Ｔ細胞）は、長さ３００ｂｐのリードを持つ健康なＢ６マウスサンプルの標的ＴＣＲシーケンシングである。このデータセットを操作して、様々なシーケンシング深度（１０００万リード、５０００万リード、１億リード、２億リード、または５億リード）およびリード長（５０ｂｐまたは１００ｂｐ）のシミュレーションされた試験データセットを作成した。
【００８２】
別の試験データセットは、マウス腫瘍サンプルからのソーティングしたＴ細胞のうちリード長８０ｂｐを有するバルクランダムプライミングＲＮＡ−Ｓｅｑである。対応するポジティブコントロールデータセットは、バルクデータセットと同一のソーティングしたＴ細胞のＣ１  Ｆｌｕｉｄｉｇｍプラットフォームからのリード長７５ｂｐを有する単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑからなる。
【００８３】
ＴＣＲパイプラインベンチマーク用のデータセットを表７に示す。
【００８４】
【表７】
0006871382.tif 000008
図２７は、ｒｐｓＴＣＲパイプラインの感度が、ＴＣＲｋｌａｓｓに極めて類似し、またｍｉＴＣＲよりも良好であることを示す。たとえあったとしても非常に少ない偽陽性が、ｒｐｓＴＣＲパイプラインにより検出される。ｒｐｓＴＣＲパイプラインは、ネガティブコントロールデータセットのいずれかにおいてＴＣＲがないことを特定する。比較すると、ＴＣＲｋｌａｓｓでは非常に少数のＴＣＲが特定され、ＭｉＴＣＲでは各データセットにおいて平均数十のＴＣＲが特定される。ｒｐｓＴＣＲパイプラインおよびＴＣＲｋｌａｓｓは、ＶＩ−ｎｅｘｔ−マウス−Ｔ細胞のポジティブコントロールデータセットにおけるＴＣＲ  ＣＤＲ３を特定するにあたり、約８０％の同等の感度を示しており、一方でＭｉＴＣＲは７５％に近い、より低い感度を有する。
【００８５】
図１８は、ＭｉＴＣＲまたはＴＣＲｋｌａｓｓによって検出されないポジティブデータを特定するためのｒｐｓＴＣＲパイプラインの能力を示す。三つのすべての方法（ＭｉＴＣＲ、ＴＣＲｋｌａｓｓ、及びｒｐｓＴＣＲパイプライン）の間でポジティブコントロールＶＩ−ｎｅｘｔデータセットにおいて特定されたＴＣＲ数に強力な相関関係があり、総ＴＣＲのうちの約１０％が、ＭｉＴＣＲによってではなく、ｒｐｓＴＣＲパイプライン法及びＴＣＲｋｌａｓｓによって特定された。
【００８６】
図２８および図３０では、マウスＴ細胞のそれぞれ５０ｂｐまたは１００ｂｐのランダムプライミングリードを使用した、ＭｉＴＣＲ、ＴＣＲｋｌａｓｓ、およびｒｐｓＴＣＲパイプライン間のＣＤＲ３検出比較を示す。見つかった上位ＣＤＲ３のそれぞれの配列を列記している。図２９および図３１は、それぞれ５０ｂｐまたは１００ｂｐを使用した、完全なＶＩ−ｎｅｘｔデータセットで発見された上記のＣＤＲ３を示している。ｒｐｓＴＣＲパイプラインはより高い感度を示す。
【００８７】
図２８および図２９は、ＶＩ−ｎｅｘｔのポジティブコントロールデータセットをサブサンプリングすることによって形成される、シミュレートされた５０塩基対（ｂｐ）のリード長のデータセットで発見されたＣＤＲ３の比較の概要である。ＭｉＴＣＲおよびＴＣＲｋｌａｓｓとは異なり、ｒｐｓＴＣＲパイプラインは、ＴＣＲ配列をより良好に特定するために、短い５０ｂｐのリードをより長いコンティグに構築することを実施する。５億リード（ＭＰ−５０ｂｐ−５００Ｍ）のデータセットにおいてＭｉＴＣＲによって発見された上位のＣＤＲ３は、ポジティブコントロールデータセットにおいていずれかの方法によって、すなわちＭＰ−５０ｂｐ−５００ＭにおいてＴＣＲｋｌａｓｓまたはｒｐｓＴＣＲパイプラインによっては発見されなかった（図２８、左表）。ＭＰ−５０ｂｐ−５００ＭにおけるＴＣＲｋｌａｓｓによって発見された上位のＣＤＲ３は、試験データセットおよびＶＩ−ｎｅｘｔデータセットの両方における他の方法によって発見された（図２８、中央表）。ｒｐｓＴＣＲパイプラインによって特定された上位のＣＤＲ３は、ＶＩ−ｎｅｘｔデータセットにおいてすべての方法によってより多数で特定され、ＭＰ−５０ｂｐ−５００Ｍデータセットにおいて他の二つの方法によっては一部特定された（図２８、右表）。ＶＩ−ｎｅｘｔデータセットにおいて発見された上位のＣＤＲ３は、最も多くの場合、５０ｂｐのリード長の１０００万〜５億リードに対するサブサンプリングされたＭＰにおけるｒｐｓＴＣＲパイプラインによって発見された（図２９）。
【００８８】
図３０および図３１は、ＶＩ−ｎｅｘｔポジティブコントロールデータセットからの２億リードをサブサンプリングして、構築工程なしのｒｐｓＴＣＲパイプライン法をＭｉＴＣＲおよびＴＣＲｋｌａｓｓと比較することによって形成された、シミュレーションされた１００ｂｐのデータセットにおいて発見されたＣＤＲ３の比較の概要である。ここでも、リード長１００ｂｐの５億リード（ＭＰ−１００ｂｐ−５００Ｍ）におけるＭｉＴＣＲによって発見された上位のＣＤＲ３は、その他任意の方法では発見されなかった（図３０、左表）。ＴＣＲｋｌａｓｓによって発見された上位二つのＣＤＲ３は、他の方法のいずれかによって発見されなかった偽陽性と見なされる（図３０、中央表）が、他のものはｒｐｓＴＣＲパイプラインによって発見された上位のＣＤＲ３に良好に対応する（図３０、右表）。すべての方法は、ＶＩ−ｎｅｘｔデータセットからの上位ＣＤＲ３を特定する際にこのリード長で同等の感度を持つ（図３１）。
【００８９】
図３２は、単一細胞シーケンシングで検出されたＣＤＲ３の半分以上もまた、バルクＲＮＡシーケンシングで検出できることを示す。三つの方法を最終的に比較するためには、同じサンプルからのバルクＲＮＡ−Ｓｅｑデータにおいて、単一細胞データにおいて発見されたＴＣＲの数がいくつ発見されるかを定量化することが関与する。単一細胞データにおいて特定された上位ＣＤＲ３は、三つのすべての方法によってほとんど特定され、かつバルクデータセットでは一貫してすべての方法にわたって特定される（図３２）。
【００９０】
ｒｐｓＴＣＲパイプライン法は、配列構築が不必要な場合、１００ｂｐのリード長のデータセットにおける既存の方法と同等である。しかしながら、ｒｐｓＴＣＲパイプラインが配列構築を実施するショートリードのデータセットでは、感度は他の方法に対して大きく向上する。
【００９１】
図２には、腫瘍移植マウスの腫瘍またはマウスの脾臓（同一の腫瘍担持マウスから）からの単離されたＴ細胞から決定されたＣＤＲ３配列を示す（実施例１）。３つ以上の単一Ｔ細胞から検出された同一のＣＤＲ３配列が、クローン性増殖したＴ細胞であると判定された。併用治療群（ａＧＩＴＲ  ＋  ａＰＤ−１）は、治療後１１日目までに、クローン性増殖したＴ細胞の多様な断片を示す腫瘍を有した（３つ以上のクローンを有するＴ細胞からの様々なＴＣＲ配列の数で示されるように）。この実施例では、特異的なＴＣＲ配列の数ではなく、増殖したＴ細胞クローンの総数が、治療後のクローン性増殖を決定するために使用される。一部の態様では、クローン性増殖は、アミノ酸レベルで同一であるが、核酸配列が変化を含むことができるＴＣＲによって決定される。脾臓から単離されたＴ細胞は、クローン性増殖しなかった。注目すべきは一部のＰＤ−１治療マウスにおいて、同じＴＣＲ  ＣＤＲ３配列が検出されたことであり、またそれらは、クローン性増殖したものとみなされなかった（検出数は＜３）。
【００９２】
図２は、既知のＴＣＲ配列と、一つ以上の治療に対して対応する治療応答とであるＴＣＲ配列ライブラリの一例を示す。図２に示されるように、ＴＣＲ配列１〜ＴＣＲ配列１０は、ａＧＩＴＲとａＰＤ１との併用療法に対して、３以上のクローン性増殖値である。クローン性増殖値は、複数の細胞のうちの特定のＴＣＲ配列の発生数を表し、細胞がクローニングされる回数を示している。ＴＣＲ配列１１〜ＴＣＲ配列１７は、ａＰＤ１単剤療法に対して、３以上のクローン性増殖値である。ＴＣＲ配列１８〜ＴＣＲ配列２０は、ａＧＩＴＲ単剤療法に対して、３以上のクローン性増殖値である。その細胞配列データが得られた対象と特定されたＴＣＲ配列とについて、特定されたＴＣＲ配列を、図２に示すようにＴＣＲライブラリと比較して、一致を決定する。一態様では、一致の数が、特定の治療に対する潜在的な応答を表すことができる。別の態様では、一治療あたりの一致に関連するクローン性増殖値の合計を使用して、対象にとってより高い累積クローン性増殖値と関連付けられる治療はどれかを決定することができる。一例として、ＴＣＲ配列１、ＴＣＲ配列２、ＴＣＲ配列１３、ＴＣＲ配列１４、ＴＣＲ配列１５、およびＴＣＲ配列１６を有する患者の配列データは、ａＧＩＴＲおよびａＰＤ１の併用では累積クローン性増殖値１４であり、ａＰＤ１単独では累積クローン性増殖値は１６である。したがって、対象は、ａＰＤ１単独に応答する可能性がより高い。
【００９３】
図３は、図２に含まれる結果のグラフィカル図である。図３は棒グラフであり、ａＧＩＴＲおよびａＰＤ１の併用についての増殖したクローンの割合は、治療後１１日目で３１．９％であり、ａＰＤ１単独についての増殖したクローンの割合は、治療後１１日目で２６．７％であり（治療後８日目で４．８％）、ａＧＩＴＲ単独についての増殖したクローンの割合は、治療後１１日目で２０．３％であることを示している。一態様では、図２の結果および図３のグラフは、一人以上の対象に対して一つ以上の治療を施した後に得られたデータを基にすることができる。方法１００は、対象に対して一つ以上の治療を施すことをさらに含むことができる。方法１００は、ＴＣＲ配列と一つ以上の治療に関連付けられた対応するクローン性増殖とであるＴＣＲ配列ライブラリを生成することをさらに含むことができる。図３は、抗ＰＤ１（ａＰＤ１）または抗ＧＩＴＲ（ａＧＩＴＲ）のいずれかを投与する単剤（モノ）療法と比較した腫瘍担持マウスの併用療法で特定されたクローン性増殖したＴ細胞の数の有意性を示す。抗ＰＤ１（ａＰＤ１）および抗ＧＩＴＲ（ａＧＩＴＲ）の両治療は、アイソタイプコントロールで治療したマウスからの腫瘍と比較して、増殖したクローンの割合に関して有意に増加する。
【００９４】
図４は図１の方法１００の一実施形態の例示的な出力を示す。図４は、クローン性増殖後のＴ細胞系統を示す。治療タイプ（例えば、ａＧＩＴＲおよびａＰＤ１の併用、ａＰＤ１単独、ａＧＩＴＲ単独）の範囲内で、例えば未感作、Ｔ細胞メモリー（Ｔｃｍ）、Ｔ細胞エフェクターメモリー（Ｔｅｍ）、Ｔ細胞エフェクター（Ｔｅｆｆ）などの様々な細胞サブタイプにわたってクローン性増殖が発生する。図４は、計数（例えば、クローン性増殖値）に加えて特定の治療に関連付けられた配列を示し、またクローン性増殖値に関連付けられた細胞サブタイプの表示を含む。図４は、クローンの各セットにおけるＴ細胞のプロファイルを示す。発現したＴＣＲ  ＣＤＲ３配列によって特定される各Ｔ細胞クローンはまた、ａ）エフェクターメモリー細胞（Ｔｅｍ）（Ｃｄ６２Ｌ−Ｃｄ４４＋Ｇｚｍｂ＋）、ｂ）エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）（Ｃｄ６２Ｌ−Ｃｄ４４−Ｇｚｍｂ＋）、ｃ）未感作Ｔ細胞（Ｃｄ６２Ｌ＋Ｃｄ４４−Ｇｚｍｂ−）、またはｄ）中央メモリＴ細胞（Ｔｃｍ）（Ｃｄ６２Ｌ＋Ｃｄ４４＋Ｇｚｍｂ−）、または別の未分類の細胞（白抜きの楕円）として特性決定した（例えば、細胞表面のマーカーによって分類した）。
【００９５】
対象の第一の細胞からの単一細胞の未加工リードを含む第一の配列データを、複数の非Ｔ細胞受容体転写物を含む第二の配列データに対して第一の配列データをマッピングするバイオインフォマティクスツールを使用して取得することにより、第一の配列データにおいて一つ以上のマッピングされなかったリードを特定することと、マッピングされなかったリードから一つ以上のＴＣＲ配列を決定することとを含む、一つ以上のＴＣＲ配列を決定する方法を開示する。一部の態様では、対象の第一の細胞から単一細胞の未加工リードを含む第一の配列データを取得することは、第一の細胞から得られた転写物に対してランダムプライマーＲＮＡシーケンシングを実施することを含む。ランダムプライマーの長さは４〜４０ヌクレオチドであり得る。一部の実例では、ランダムプライマーの長さは４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチドであり得る。一部の態様では、第一の配列データを取得する前に、対象は免疫療法を施される。免疫療法は単剤療法または併用療法とすることができる。例えば、免疫療法は、共刺激性アゴニストおよび共阻害性拮抗薬の併用とすることができる。
【００９６】
ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ３配列を含むベクターを開示する。一部の態様では、ベクターはウイルスベクターまたはプラスミドとすることができる。ウイルスベクターの例としては、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びアデノ関連ウイルスベクターが挙げることができるがこれらに限定されない。一部の態様では、ＣＤＲ３配列は、ＣＡＳＳＲＮＴＥＶＦＦ（配列番号２６９）、ＣＡＳＳＩＧＮＴＥＶＦＦ（配列番号２７０）、ＣＡＳＳＱＰＧＫＮＴＥＶＦＦ（配列番号２７１）、ＣＡＳＳＬＧＱＧＮＮＳＰＬＹＦ（配列番号２７２）、ＣＡＳＳＱＧＱＧＧＡＥＴＬＹＦ（配列番号２７３）、ＣＡＳＳＰＰＭＧＧＱＬＹＦ（配列番号２７４）、ＣＡＳＳＱＥＧＡＮＴＥＶＦＦ（配列番号２７５）、ＣＡＳＳＱＶＱＧＴＧＮＴＬＹＦ（配列番号２７６）、ＣＡＳＳＱＥＧＤＧＹＥＱＹＦ（配列番号２７７）、ＣＴＳＡＥＧＧＧＴＥＶＦＦ（配列番号２７８）、ＣＡＳＳＰＰＧＧＧＴＥＶＧＧ（配列番号２７９）、ＣＡＳＳＧＴＤＮＱＤＴＱＹＦ（配列番号２８０）、ＣＡＳＳＰＧＴＧＧＹＥＱＹＦ（配列番号２８１）、ＣＡＳＳＬＥＬＧＦＹＥＱＹＦ（配列番号２８２）、ＣＡＳＳＬＧＧＡＰＮＥＲＬＦＦ（配列番号２８３）、ＣＡＳＳＱＥＧＤＳＹＥＱＹＦ（配列番号２８４）、ＣＡＳＳＲＮＴＥＶＦＦ（配列番号２８５）、ＣＡＳＧＤＡＭＧＧＲＤＹＡＥＱＦＦ（配列番号２８６）、ＣＧＡＲＥＧＱＤＴＱＹＦ（配列番号２８７）、ＣＧＡＲＴＧＧＥＱＹＦ（配列番号２８８）、またはＣＴＣＳＡＧＮＱＡＰＬＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８９）をコードする核酸配列である。したがって、いくつかの態様では、配列番号：２６９〜２８９のいずれか一つの配列をコードする核酸配列を含むレンチウイルスベクターが開示される。
【００９７】
一態様においては、類似の結合特異性を有するＴＣＲ配列は、Ｇｕｐｔａ  Ｎ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ｃａｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｃｌｏｎｅｓ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｉｇ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｄａｔａ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８（６），２４８９−２４９９（２０１７）に開示されているようにクラスター化することが可能である。簡潔に述べると、ＴＣＲ配列のＣＤＲ３領域を、単一連鎖の階層クラスタリングを使用してクラスター化することができ、二つのＣＤＲ３配列間の距離は、二つの配列間のヌクレオチドの相違の絶対数と、一態様においては前述の参考文献に開示されるように配列データセットから推測されることが可能である閾値として規定できる。
【００９８】
配列番号２６９〜２８９のいずれか一つの配列をコードする核酸配列を含むベクターを含む組換え細胞もまた開示される。
ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ３配列を含む組換え細胞を開示する。一部の態様では、ＣＤＲ３配列は、ＣＤＲ３配列を含む組換え細胞とは異なる細胞型、細胞株、または異なる種に由来する。例えば、ＣＤＲ３配列は、初代ヒトＴ細胞由来とすることが可能であり、ＣＤＲ３配列を含む細胞は、ＣＤＲ３配列が誘導される細胞とは別のＴ細胞から誘導されるＴ細胞株とすることができる。別の例として、ＣＤＲ３配列はヒト細胞由来とすることが可能であり、ＣＤＲ３配列を含む細胞は非ヒト細胞であり得る。一部の態様では、組換え細胞は、ＣＡＳＳＲＮＴＥＶＦＦ（配列番号２６９）、ＣＡＳＳＩＧＮＴＥＶＦＦ（配列番号２７０）、ＣＡＳＳＱＰＧＫＮＴＥＶＦＦ（配列番号２７１）、ＣＡＳＳＬＧＱＧＮＮＳＰＬＹＦ（配列番号２７２）、ＣＡＳＳＱＧＱＧＧＡＥＴＬＹＦ（配列番号２７３）、ＣＡＳＳＰＰＭＧＧＱＬＹＦ（配列番号２７４）、ＣＡＳＳＱＥＧＡＮＴＥＶＦＦ（配列番号２７５）、ＣＡＳＳＱＶＱＧＴＧＮＴＬＹＦ（配列番号２７６）、ＣＡＳＳＱＥＧＤＧＹＥＱＹＦ（配列番号２７７）、ＣＴＳＡＥＧＧＧＴＥＶＦＦ（配列番号２７８）、ＣＡＳＳＰＰＧＧＧＴＥＶＧＧ（配列番号２７９）、ＣＡＳＳＧＴＤＮＱＤＴＱＹＦ（配列番号２８０）、ＣＡＳＳＰＧＴＧＧＹＥＱＹＦ（配列番号２８１）、ＣＡＳＳＬＥＬＧＦＹＥＱＹＦ（配列番号２８２）、ＣＡＳＳＬＧＧＡＰＮＥＲＬＦＦ（配列番号２８３）、ＣＡＳＳＱＥＧＤＳＹＥＱＹＦ（配列番号２８４）、ＣＡＳＳＲＮＴＥＶＦＦ（配列番号２８５）、ＣＡＳＧＤＡＭＧＧＲＤＹＡＥＱＦＦ（配列番号２８６）、ＣＧＡＲＥＧＱＤＴＱＹＦ（配列番号２８７）、ＣＧＡＲＴＧＧＥＱＹＦ（配列番号２８８）、またはＣＴＣＳＡＧＮＱＡＰＬＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８９）を含むＣＤＲ３配列を含む。
【００９９】
一部の態様では、開示される、ランダムプライミングＲＮＡシーケンシングからＴＣＲ配列を特定する方法を使用して、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）を同様に特定することができる。パイプラインの工程は、以下の手順を除いてほぼ同じである：１）ネガティブセレクション工程であって、ＢＣＲを特定することが、複数の種特異的な非Ｂ細胞受容体ＲＮＡ転写物を含む第二の基準データセットに対してショートリードをアラインメントすることに関与するものである、ネガティブ選択工程、２）構築工程であって、ＢＣＲを特定することが、さらなる処理のために一つ以上のマッピングされなかったショートリードを一つ以上のロングリードに構築することに関与するものである構築工程が、一つ以上のマッピングされなかったショートリードを、ＢＣＲ配列の参照データベースからの一つ以上のＢＣＲ配列に対して並列させることと、ＢＣＲ配列の参照データベースに基づいて、一つ以上のマッピングされなかったショートリードをロングリード（候補ＢＣＲ配列）に構築することとを含みものである、構築工程、３）アラインメント工程であって、ＢＣＲを特定することが、候補ＢＣＲ配列を、ＢＣＲ  ＶおよびＪ遺伝子の基準に対してアラインメントすることと共に、ＢＣＲ  ＣＤＲ３領域を特定することに関与するものである、アラインメント工程。一態様において、一つ以上のロングリードからの一つ以上のＢＣＲ配列を生成することは、Ａｌａｍｙａｒ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．ＩＭＧＴ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＩＧ）ａｎｄ  ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＲ）Ｖ−（Ｄ）−Ｊ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ，ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ，ａｎｄ  ＩＧ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ：ＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴ  ａｎｄ  ＩＭＧＴ／ＨｉｇｈＶ−ＱＵＥＳＴ  ｆｏｒ  ＮＧＳ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８８２，５６９−６０４（２０１２）に開示される一つ以上の技術を含むことができる。
【０１００】
例示的な態様において、方法およびシステムは、図８に図示され以下に説明されているように、コンピュータ８０１上で実施できる。同様に、開示する方法およびシステムは、一つ以上のコンピュータを利用して、一つ以上の場所で一つ以上の機能を実行できる。図８は、本開示の方法を実行するための例示的な運用環境を図示したブロック図である。この例示的な運用環境は、あくまで運用環境の一例にすぎず、運用環境アーキテクチャの使用または機能の範囲に関する何らかの制限を示唆することを意図したものではない。また、如何なる運用環境も、例示的な運用環境において図示される構成要素のいずれか一つもしくは組み合わせに関連する何らかの依存性または要件を有するものとして解釈すべきではない。
【０１０１】
本方法およびシステムは、多数の他の汎用もしくは特殊用途向けコンピューティングシステム環境または構成で動作可能でありうる。このシステムおよび方法を用いた使用に適するものとし得る周知のコンピューティングシステム、環境、および／または構成の例としては、以下に限定されないが、パーソナル・コンピュータ、サーバ・コンピュータ、ラップトップ・デバイス、およびマルチプロセッサ・システムが挙げられる。追加的な例には、セットトップボックス、プログラマブル大衆消費電子製品、ネットワークＰＣ、ミニコンピュータ、メインフレームコンピュータ、上記のシステムまたはデバイスのいずれかを含む分散コンピューティング環境等が含まれる。
【０１０２】
本開示の方法およびシステムの処理は、ソフトウェアコンポーネントを介して実行できる。本開示のシステムおよび方法は、一つ以上のコンピュータまたは他のデバイスを介して実行されるプログラムモジュールなどの、コンピュータ実行可能命令の一般的なコンテキストで記述できる。概して、プログラムモジュールは、コンピュータコード、ルーチン、プログラム、オブジェクト、コンポーネント、データ構造等を含み、それらによって特定のタスクが実行されるかまたは特定の抽象データ型が実施される。また、本開示の方法は、通信ネットワーク経由でリンクされたリモートプロセシングデバイスを介してタスクが実行されるグリッドベースおよび分散コンピューティング環境においても実施することができる。分散コンピューティング環境において、プログラムモジュールは、記憶装置を含むローカルおよびリモートコンピュータストレージ媒体の両方に配置できる。
【０１０３】
さらに、当業者は、本明細書に開示されるシステムおよび方法を、コンピュータ８０１の形態の汎用コンピューティング・デバイスを介して実施できることを認識することになる。コンピュータ８０１の構成要素には、限定されるものではないが、一つ以上のプロセッサ８０３と、システムメモリ８１２と、一つ以上のプロセッサ８０３を含む様々なシステムコンポーネントをシステムメモリ８１２に連結するシステムバス８１３と、を含めることができる。システムは並列処理を利用できる。開示された方法を実施するために並列処理を活用することができる。例えば、開示された方法の一つ以上の工程の少なくとも一部分を実行することは、ジョブとして分類することができる。例えば、本開示の方法は、複数のサンプルについて並列に実行することができる。そのためそれぞれのジョブに対する作業負荷が、いくつかのプロセッサ全体に分散されうる。ソフトウェアアプリケーションを使用して、ジョブを設計および実行してデータを処理することができる。ジョブは、例えば、一つ以上のデータソースからデータを抽出し、該データを変換し、データを一つ以上の新しい場所にロードする（例えば、別のジョブで処理するためのデータをステージする）ことができる。並行処理トポロジでは、各ジョブの作業負荷を、ノードコンピュータ（ｃｏｍｐｕｔｅ  ｎｏｄｅ）と呼ばれる一つ以上のコンピュータ上の複数のプロセッサ全体に分散することができる。一態様において、ユーザは、構成ファイルを修正するか、または複数の処理ノードを画定するように構成されたソフトウェアとのインタフェースを変更できる。これらのノードは、各ジョブを迅速かつ効率的に完了するために同時に作業する。コンダクターであるノードコンピュータは、作業を調整することができる。並列処理環境は、対称型マルチプロセッシング（ＳＭＰ）システムまたは超並列処理（ＭＰＰ）システムとして分類することができる。対称型マルチプロセッシング（ＳＭＰ）環境では、複数のプロセッサが他のハードウェアリソースを共有する。たとえば、複数のプロセッサは同じメモリおよびディスク容量を共有できるが、単一のオペレーティングシステムを使用できる。そのため、並列ジョブの作業負荷がシステム内のプロセッサ全体に分散される。ジョブが完了する際の実際の速度は、システム内の共有リソースによって制限されることとなる。システムをスケールさせるために、プロセッサの数を増やすことができ、メモリを追加することができ、またはストレージを増やすことができる。超並列処理（ＭＰＰ）システムでは、多数のコンピュータが同じシャーシ内に物理的に収容されうる。一つのＭＰＰシステムを、物理的に分散させることができる。ＭＰＰ環境では、物理的なコンピュータ間でリソースを共有する必要がないため、パフォーマンスが改善される。システムをスケールさせるために、関連するメモリとディスクリソースに加えてコンピュータを追加できる。ＭＰＰシステムでは、ファイルシステムは通常、ネットワーク全体で共有される。この構成では、プログラムファイルを、システム内の個々のノードにインストールする代わりに、共有することができる。
【０１０４】
システムバス８１３は、多様なバスアーキテクチャのいずれかを用いた、メモリバスもしくはメモリコントローラ、周辺機器用バス、アクセラレーテッドグラフィックスポート、またはローカルバスをはじめとする、幾つかの可能なタイプのバス構造のうちの一つ以上を表す。一例として、こうした構造は、産業標準アーキテクチャ（ＩＳＡ）バス、マイクロチャネルアーキテクチャ（ＭＣＡ）バス、Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＩＳＡ（ＥＩＳＡ）バス、ＶＥＳＡ（Ｖｉｄｅｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）ローカルバス、アクセラレーテッドグラフィックスポート（ＡＧＰ）バス、およびペリフェラルコンポーネントインターコネクト（ＰＣＩ）、ＰＣＩ−Ｅｘｐｒｅｓｓバス、ＰＣＭＣＩＡ（Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｍｅｍｏｒｙ  Ｃａｒｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）、ユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）および同種のものを含むことができる。バス８１３、および本明細書中に指定されている全てのバスはまた、有線または無線ネットワーク接続経由で実装することもでき、一つ以上のプロセッサ８０３、大容量記憶装置８０４、オペレーティングシステム８０５、Ｔ細胞パイプラインソフトウェア８０６、Ｔ細胞パイプラインデータ８０７、ネットワークアダプタ８０８、システムメモリ８１２、入出力インタフェース８１０、ディスプレイアダプタ８０９、ディスプレイデバイス８１１、およびヒューマンマシンインタフェース８０２を含む各サブシステムは、この形態のバスを介して接続された物理的に別個の位置にある一つ以上のリモートコンピューティングデバイス８１４ａ、ｂ、ｃ内に収容され、事実上完全に分散されたシステムを実装しうる。
【０１０５】
コンピュータ８０１は、様々なコンピュータ可読媒体を含むのが通例である。例示的な可読媒体は、コンピュータ８０１によりアクセスできる任意の利用可能な媒体であってよく、例えば、揮発性および不揮発性媒体であり、リムーバブルおよび非リムーバブル媒体の両方が挙げられるが、これらに限定されるものではない。システムメモリ８１２は、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）などの揮発性メモリ、および／またはリードオンリメモリ（ＲＯＭ）などの不揮発性メモリの形態のコンピュータ可読媒体を含む。システムメモリ８１２は、典型的には、Ｔ細胞パイプラインデータ８０７のようなデータ、および／または一つ以上のプロセッサ８０３によって直ちにアクセス可能であり、且つ／または現在操作されているオペレーティングシステム８０５およびＴ細胞パイプラインソフトウェア８０６などのプログラムモジュールを含む。
【０１０６】
別の態様では、コンピュータ８０１はまた、他のリムーバブル／非リムーバブルな、揮発性／不揮発性コンピュータストレージ媒体を含むこともできる。一例として、図８は、コンピュータコード、コンピュータ可読命令、データ構造、プログラムモジュール、およびコンピュータ８０１用の他のデータの不揮発性ストレージを提供できる、大容量記憶装置８０４が図示されている。例えば、限定されるものではないが、大容量記憶装置８０４は、ハードディスク、リムーバブル磁気ディスク、リムーバブル光学式ディスク、磁気カセットまたは他の磁気ストレージデバイス、フラッシュメモリカード、ＣＤ−ＲＯＭ、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）または他の光学式ストレージ、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リードオンリメモリ（ＲＯＭ）、電気的消去可能プログラマブルリードオンリメモリ（ＥＥＰＲＯＭ）等でありうる。
【０１０７】
任意選択的に、例えばオペレーティングシステム８０５およびＴ細胞パイプラインソフトウェア８０６を含む、任意の数のプログラムモジュールを大容量記憶装置８０４に格納できる。オペレーティングシステム８０５およびＴ細胞パイプラインソフトウェア８０６（またはそれらの幾つかの組み合わせ）の各々には、プログラミングおよびＴ細胞パイプラインソフトウェア８０６の要素を含めることができる。Ｔ細胞パイプラインデータ８０７はまた、大容量記憶装置８０４に格納できる。Ｔ細胞パイプラインデータ８０７を、当技術分野で公知の一つまたは複数のデータベースのいずれかに記憶することができる。そのようなデータベースの例としては、ＤＢ２（登録商標）、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ａｃｃｅｓｓ、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）ＳＱＬ  Ｓｅｒｖｅｒ、Ｏｒａｃｌｅ（登録商標）、ｍｙＳＱＬ、ＰｏｓｔｇｒｅＳＱＬなどが挙げられる。データベースは、集中型とすることができ、または複数のシステムにわたって分散することができる。
【０１０８】
別の態様では、ユーザは、入力デバイス（図示せず）を介して、コンピュータ８０１内にコマンドおよび情報を入力することができる。そのような入力デバイスの例としては、限定されるものではないが、キーボード、ポインティングデバイス（例えば、「マウス」）、マイクロフォン、ジョイスティック、スキャナー、グローブ等の触覚入力デバイス、および他のボディカバー等が含まれる。上記および他の入力デバイスは、システムバス８１３に接続されているヒューマンマシンインタフェース８０２を介して一つ以上のプロセッサ８０３に接続できるが、他のインタフェースおよびバス構造、例えば、パラレルポート、ゲームポート、ＩＥＥＥ１３９４ポート（別称：ファイヤーワイヤー（ＦｉｒｅＷｉｒｅ）ポート）、シリアルポートまたはユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）を介して接続できる。
【０１０９】
更に別の態様において、ディスプレイデバイス８１１はまた、ディスプレイアダプタ８０９等のインタフェースを介してシステムバス８１３に接続できる。コンピュータ８０１に複数のディスプレイアダプタ８０９を設けることもできるし、コンピュータ８０１に複数のディスプレイデバイス８１１を設けることもできることが想到される。例えば、ディスプレイデバイス８１１は、モニター、液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）、またはプロジェクターとすることができる。ディスプレイデバイス８１１に加えて、他の出力周辺デバイスには、入出力インタフェース８１０を介してコンピュータ８０１に接続できるスピーカ（不図示）およびプリンタ（不図示）等の構成要素を含めることができる。本方法の任意の工程および／または結果は、任意のフォーマットで出力デバイスに出力できる。そのような出力は、テキスト、グラフィカル、アニメーション、オーディオ、触覚（ｔａｃｔｉｌｅ）等を含むが、これらに限定されない任意のフォーマットの視覚的表象でありうる。ディスプレイ８１１およびコンピュータ８０１は、一つのデバイスの一部である場合もあれば、別々のデバイスである場合もある。
【０１１０】
コンピュータ８０１は、一つ以上のリモートコンピューティングデバイス８１４ａ、ｂ、ｃへの論理的接続を使用してネットワーク環境で動作できる。一例として、リモートコンピューティングデバイスは、パーソナルコンピュータ、ポータブルコンピュータ、スマートフォン、サーバー、ルーター、ネットワークコンピュータ、ピアデバイスまたは他の共通ネットワークノード等でありうる。コンピュータ８０１とリモートコンピューティングデバイス８１４ａ、ｂ、ｃとの間の論理的接続は、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）および／または一般的なワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）等のネットワーク８１５を介して行うことができる。そのようなネットワーク接続は、ネットワークアダプタ８０８経由でありうる。ネットワークアダプタ８０８は、有線および無線の両方の環境で実装できる。そのようなネットワーキング環境は、住宅、職場、企業全体のコンピュータネットワーク、イントラネット、およびインターネットでは、従来からあるありふれたものである。
【０１１１】
そのようなプログラムおよびコンポーネントは、コンピューティングデバイス８０１の異なるストレージコンポーネント内に様々な時間に存在し、コンピュータの一つ以上のプロセッサ８０３を介して実行されることが認識されるが、例証の便宜上、アプリケーションプログラムおよびオペレーティングシステム８０５等の他の実行可能プログラムコンポーネントは、本明細書中では離散的ブロックとして図示されている。Ｔ細胞パイプラインソフトウェア８０６の実装形態は、何らかの形態のコンピュータ可読媒体上に格納される場合もあれば、またはそのコンピュータ可読媒体を介して伝送される場合もある。本開示の方法のいずれも、コンピュータ可読媒体上に具現化されたコンピュータ可読命令によって実行できる。コンピュータ可読媒体は、コンピュータによってアクセス可能な任意の利用可能媒体とすることができる。コンピュータ可読媒体の例としては、限定されるものではないが、「コンピュータストレージ媒体」および「通信媒体」を挙げることができる。「コンピュータストレージ媒体」は、コンピュータ可読命令、データ構造、プログラムモジュールもしくは他のデータなどの情報を記憶するための任意の方法または技術で実装される揮発性および不揮発性のリムーバブル媒体および非リムーバブル媒体を具備する。例示的なコンピュータストレージ媒体は、限定されるものではないが、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュメモリもしくは他のメモリ技術、ＣＤ−ＲＯＭ、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、または他の光学式ストレージ、磁気カセット、磁気テープ、磁気ディスク記憶装置もしくは他の磁気記憶装置、または、所望の情報を格納する目的に使用でき、且つコンピュータがアクセスできる任意の他の媒体を具備する。
【０１１２】
以下の実施例は、本明細書に請求される化合物、組成物、物品、デバイス、および／または方法がどのようになされて評価されるのかに関して、当業者に完全な開示および説明を提供するように示されており、単に例示的であることを意図しており、この方法およびシステムの範囲を限定することを意図していない。数字（例えば量、温度など）に関する正確性を確保するために取り組みがなされているが、いくらかの誤差および偏差が考慮されるべきである。特に明示がない限り、部分は重量部であり、温度は℃単位であるか、または周囲温度であり、圧力は大気圧またはその近傍である。
【０１１３】
方法およびシステムは、機械学習や反復学習などの人工知能手法を採用することができる。そのような手法の例としては、以下に限定されないが、エキスパート・システム、事例に基づく推論、ベイジアン・ネットワーク、ビヘイビアベースＡＩ、ニューラル・ネットワーク、ファジーシステム、進化的計算法（例えば遺伝的アルゴリズム）、群知能（例えばアント・アルゴリズム）、およびハイブリッド知能システム（例えば、ニューラル・ネットワークを通じて生成されるエキスパート推論ルール、または統計的学習から得られるプロダクション・ルール）が挙げられる。
【０１１４】
以下の実施例は、より詳細に実施形態を説明するために提供される。これらは、請求される実施形態を例示することを意図しており、これに限定することを意図していない。
実施例１
Ｉｎ  ｖｉｖｏマウス試験
ＭＣ３８腫瘍試験のため、３ｘ１０５個または５ｘ１０５個のＭＣ３８細胞をそれぞれ、Ｃ５７ＢＬ／６またはヒト化ＧＩＴＲ／ＧＩＴＲＬ二重ノックインマウスの右脇腹に皮下注射した（０日目）。腫瘍移植後６日目に、マウスを腫瘍サイズに基づいてグループ化し、示した用量で５ｍｇ／ｋｇ−１の抗ＧＩＴＲ（ＤＴＡ１）および／または抗ＰＤ−１（ＲＰＭ１−１４）ＡｂまたはアイソタイプコントロールＩｇＧ（ラットＩｇＧ２ｂ、ＬＴＦ−２およびラットＩｇＧ２ａ、２Ａ３）を用いた腹腔内注射で治療した（ＡｂはＢｉｏ  Ｘ  Ｃｅｌｌ社から得た）。抗体を１３日目に再投与した。抗ＰＤ−１（ａＰＤ−１）と抗ＧＩＴＲ（ａＧＩＴＲ）Ａｂマウスの併用で治療したマウスは、８０日以上にわたり腫瘍を有しないままであった。これらのマウスを３ｘ１０５個のＭＣ３８細胞および２．５ｘ１０５個のＢ１６Ｆ１０．９細胞の双方で再攻撃した。未感作マウスを腫瘍移植コントロールとして使用した。
【０１１５】
Ｔ細胞サブセット枯渇実験については、併用療法またはアイソタイプコントロールＩｇＧのいずれかで治療されたマウスを、抗ＣＤ４、クローンＧＫ１．５を含む３００μｇの枯渇ｍＡｂで治療し；抗ＣＤ８クローン２．４３およびラットＩｇＧ２ｂアイソタイプ（ＢｉｏＸ  Ｃｅｌｌ社）および抗ＣＤ２５、クローンＰＣ６１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ラットＩｇＧ１アイソタイプ（ＨＰＲＮ、Ｂｉｏ  Ｘ  Ｃｅｌｌ社）枯渇Ａｂを、腫瘍攻撃の一日前（−１日目）と、週に二回、合計八投与量とを与えた。枯渇効率は、末梢血サンプルのＦＡＣＳ解析によって確認された。腫瘍の垂直直径は、デジタルキャリパー（ＶＷＲ社、ペンシルバニア州ラドナー）を使用して週当たり２〜３回盲検的に測定された。式Ｌ×Ｗ×０．５を使用して体積を計算したが、式中、Ｌは最長寸法であり、Ｗは垂直寸法である。カプラン・マイヤー法による各々の群に対して生存率の差異が決定され、Ｐｒｉｓｍバージョン６（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ社）による生存率解析を使用したログランク検定によって全体的にＰ値が計算された。腫瘍量が、罹患を最小化する最大腫瘍体積のプロトコル指定のサイズ２０００ｍｍ３に達したら、事象を死亡として規定した。
【０１１６】
実施例２
単一細胞ソーティングＲＮＡ−ｓｅｑ分析
腫瘍攻撃後８日目および１１日目に、腫瘍の単一細胞懸濁液をマウス腫瘍解離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）によって調製し、脾臓をｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ  Ｏｃｔｏ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒで分散した。同じ治療群からの腫瘍および脾臓をプールし、生存可能なＣＤ８＋  Ｔ細胞をＦＡＣＳによってソーティングした。ＦＡＣＳでソーティングしたＴ細胞を、５−から１０−μｍのＣ１集積流体回路（ＩＦＣ；フルーダイム社）にロードする前にＣ１細胞懸濁試薬（フルーダイム社）と混合した。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（生／死）染色溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を、２．５μＬエチジウムホモダイマー−１、及び０．６２５μＬカルセインＡＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を１．２５ｍＬのＣ１細胞洗浄緩衝液（フルーダイム社）に添加して調製し、２０μＬをＣ１  ＩＦＣにロードした。各捕捉部位は、細胞のダブレットおよびバイアビリティについて、明視野、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、テキサスレッドチャネルのＺｅｉｓｓ顕微鏡下で注意深く調べた。細胞溶解、逆転写、およびｃＤＮＡ増幅は、メーカーにより指定されるとおり（プロトコル１００−７１６８  Ｅ１）、Ｃ１シングルセルオートプレップＩＦＣシステム上で実施された。ＳＭＡＲＴｅｒ  Ｕｌｔｒａ  Ｌｏｗ  ＲＮＡキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を、単一細胞からのｃＤＮＡ合成に使用した。メーカーの推奨事項（プロトコル１００−７１６８  Ｅ１）に従い、Ｎｅｘｔｅｒａ  ＸＴ  ＤＮＡサンプル調製キット（イルミナ社）を使用して、イルミナＮＧＳライブラリを作成した。合計２，２２２個の単一細胞を、７５サイクルの多重化シングルリードランでイルミナＮｅｘｔＳｅｑ（イルミナ社）において配列決定した。
【０１１７】
【表８】
0006871382.tif 000009
これらの細胞のそれぞれからの未加工の配列データ（ＢＣＬファイル）を、イルミナＣａｓａｖａ  １．８．２を介してＦＡＳＴＱ形式に変換した。リードはそのバーコードに基づいて解読された。ＦａｓｔＱＣ（ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｆａｓｔｑｃ／）を使用してリード品質を評価した。ＴＣＲ解析については、ＴＣＲ配列、特にランダムプライミングショートＲＮＡシーケンシングリードからのＴＣＲ−ＣＤＲ３配列を再構築および抽出するための、ランダムプライミングショートリードＴＣＲ（ｒｐｓＴＣＲ）分析を含む開示された方法を使用した。（図１を参照されたい）。ｒｐｓＴＣＲ法は、ペアエンドおよびシングルエンドのショートリードを提供し、デフォルトパラメータによるＴｏｐＨａｔ４３を使用して、これらリードをマウスまたはヒトのゲノムおよびトランスクリプトームにマッピングするが、ＴＣＲ遺伝子座位および転写物に対してはマッピングしない。したがって、ネガティブセレクションにより、マッピングされたリードの廃棄が可能になり、マッピングされなかったリードがＴＣＲ配列の抽出にリサイクルされる。マッピングされなかったリードの低品質ヌクレオチドをトリミングした（すなわち、３５ｂｐ未満の長さのリードは、ＨＴＱＣツールキットを使用して除外した）。ＱＣが合格であったショートリードを、ｉＳＳＡＫＥのデフォルト設定を使用して、より長いリードに構築した。ＴＣＲｋｌａｓｓを使用して、デフォルトで１．７〜２に設定されたＳｃｒ（保存された残基の支持スコア）を持つＣＤＲ３配列を特定した。
【０１１８】
実施例３
腫瘍担持マウスから単離された腫瘍浸潤性Ｔ細胞の分析。
開示された方法（パイプライン）は、単一細胞ソーティングしたＲＮＡｓｅｑデータを使用してＴＣＲ配列を再構築し、抽出し、分析するために利用し、腫瘍反応性と患者生存と潜在的に関連する高頻度Ｔ細胞クローンの特定を可能にした。パイプラインは、腫瘍担持マウスから単離された１３７９  ＣＤ８＋Ｔ細胞のトランスクリプトームをプロファイルするために使用された。早期時点（８日目）では、高頻度Ｔ細胞の非常に少ないクローンが（同一のＴＣＲ配列を共有する少なくとも３個のＴ細胞として規定される）、すべての治療群で検出された（図２）。１１日目までに、アイソタイプコントロールサンプル由来の配列決定された単一ＣＤ８＋  Ｔ細胞の５．７％を表す２つの高頻度Ｔ細胞クローンを特定し、抗ＧＩＴＲサンプルについては３クローン／２０．３％、抗ＰＤ−１サンプルについては６クローン／２６．７％、併用療法サンプルについては１０クローン／３１．９％であった。この結果は、８日目〜１１日目の間で、腫瘍内ＣＤ８＋  Ｔ細胞の強いクローン性増殖が主に抗ＰＤ−１治療によって駆動されたことを示す。図３には、抗ＰＤ１（ａＰＤ１）または抗ＧＩＴＲ（ａＧＩＴＲ）のいずれかを投与する単剤（モノ）療法と比較した、腫瘍担持マウスの併用療法で特定されたクローン性増殖Ｔ細胞の数の有意性を示す。抗ＧＩＴＲおよび／または抗ＰＤ−１は、末梢または脾臓Ｔ細胞のクローン性に影響を与えず（図２）、抗ＰＤ−１（ペムブロリズマブ）治療が末梢血Ｔ細胞のクローン性に影響を与えなかったことを示す患者データと一致する。単剤療法は腫瘍内ＣＤ８＋  Ｔ細胞クローンを増殖させ、危険な遺伝子経路を調節したが、完全な腫瘍拒絶反応には不十分であった。データは、併用療法による機能障害性腫瘍浸潤性Ｔ細胞の大幅な初期化が、完全な腫瘍拒絶反応のために必要であることを示唆する。
【０１１９】
実施例４
腫瘍由来ＴＣＲに対するＴ細胞活性化アッセイ
特定されたＣＤＲ３配列を含む単離されたＴＣＲを発現するＪＲＴ３細胞株におけるルシフェラーゼ発現によって、Ｔ細胞活性化アッセイを測定した（図６Ａ〜６Ｄ）。高度に増殖した（すなわち、１０クローンが特定された）抗ＧＩＴＲ治療された腫瘍Ｔ細胞から単離されたＣＤＲ３配列を含むＴＣＲ（ＴＣＲ配列Ｓｅｑ．１７）が、ＪＲＴ３細胞株で発現された。ＪＲＴ３は、元の抗原、ＭＣ３８（図６Ａ）を発現する腫瘍の存在下で活性化に至り、トランスフェクト細胞株が抗原を認識することを示している。ＴＣＲ配列Ｓｅｑ．１７発現細胞株もまた、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８で刺激した場合に活性化に至る（図６Ｂ）。アナログ試験は、ＴＣＲ配列Ｓｅｑ．１２発現細胞株（ＴＣＲ  ＣＤＲ３配列をクローンサイズが８であるａＰＤ−１刺激Ｔ細胞から単離した）を用いた。ＴＣＲ配列Ｓｅｑ．１２発現細胞株は、元の抗原を発現する腫瘍の存在下で活性化されて（図６Ｃ）、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８の存在下で活性化された（図６Ｄ）。
【０１２０】
実施例５
遺伝子発現解析
腫瘍担持マウスから単離された１３７９ＣＤ８＋Ｔ細胞のトランスクリプトーム（配列のマッピングされた部分）をプロファイルするために、遺伝子発現解析ツールもまた利用された。併用療法サンプルからのクローン性増殖ＣＤ８＋Ｔ細胞における固有の遺伝子シグネチャを特定するために、治療群間で比較を実施した。クローン性増殖後のＴ細胞系統を、細胞表面マーカーの発現パターンに相関する、発現したＴＣＲ  ＣＤＲ３配列により特定した。図４を参照されたい。したがって、クローン性Ｔ細胞は、エフェクターメモリー細胞（Ｔｅｍ）（Ｃｄ６２Ｌ−Ｃｄ４４＋Ｇｚｍｂ＋）、エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）（Ｃｄ６２Ｌ−Ｃｄ４４−Ｇｚｍｂ＋）（または未分類の細胞、すなわち未感作ＴＣＲ細胞（Ｃｄ６２Ｌ＋Ｃｄ４４−Ｇｚｍｂ−）または中央メモリーＴ細胞（Ｔｃｍ）（Ｃｄ６２Ｌ＋Ｃｄ４４＋Ｇｚｍｂ−）等である、発現したＴＣＲを有するＴ細胞が３個未満であれば、非クローン性発現）として分類された。
【０１２１】
遺伝子発現解析ではまた、各治療群において、クローン性増殖した細胞および非クローン性増殖した細胞にわたって異なるように発現した遺伝子プロファイルが得られた。ＣＤ２２６は、異なる比較対間で共有される二つの遺伝子のうちの一つとして特定された（図５）。図５は、治療の１１日目にａＧＩＴＲ＋ａＰＤ１治療群の増殖した腫瘍内ＣＤ８＋  Ｔ細胞で好ましく発現されることが遺伝子を示すベン図である。ベン図は、治療群間のクローン性増殖／非増殖のＣＤ８＋  Ｔ細胞の遺伝子シグネチャ解析を要約する。ＣＤ２２６およびＰＤＥ４Ｄは、異なる比較対間で共有される二つの遺伝子として特定された。
【０１２２】
図５は、ａＧＩＴＲおよびａＰＤ１を用いた併用療法で発現された遺伝子を他のすべての治療と比較した場合に、二つの遺伝子が好ましく発現されることを示す。二つの遺伝子はＣＤ２２６とＰｄｅ４ｄである。ベン図の下の表は、ａＧＩＴＲおよびａＰＤ１での併用療法で発現された遺伝子を他のすべての治療と比較したときの、各遺伝子の発生を提供する。したがって、開示された方法は、腫瘍細胞に対する免疫応答の役割を果たす特異的な遺伝子を特定するために使用することができる。
【０１２３】
ＣＤ２２６は、抗腫瘍応答に重要な役割を果たす共刺激分子である。各治療群にわたる腫瘍内ＣＤ８＋Ｔ細胞の異なるサブセット（合計、クローン性増殖、または非増殖）における発現解析によって、ＣＤ２２６  ｍＲＮＡのレベルがクローン性増殖Ｔ細胞における併用療法によって著しく増加した（図７Ａ）一方で、この相違は合計および非増殖のＣＤ８＋  Ｔ細胞では希薄であったということが明らかになった。この観察は、推定の腫瘍反応性クローン（高頻度Ｔ細胞クローン）におけるゲノムプロファイリングを実施する重要性を強調するものであり、重要な遺伝子の変化を明らかにし、またＴ細胞活性に影響を及ぼす有効な治療について有益であるバイオマーカーの特定を可能にする。
【０１２４】
図７Ａに合計の、クローン性増殖または非増殖のＣＤ８  Ｔ細胞における、重要な調節遺伝子ＣＤ２２６の発現を示す累積分布関数（ＣＤＦ）プロットを図示している。クローン性増殖ＣＤ８細胞は、ＣＤ２２６の最も高い発現を示す。本開示の方法は、特定の遺伝子とより良い相関関係またはその発現を示す対象を分類するために有用である。これらのデータはまた、特定の治療中に発現がＴ細胞増殖と相関しているかどうかを知らせる予後徴候の遺伝子を特定する方法の有用性を示し、従って効能の可能性を示唆する。黒色腫、肺扁平上皮細胞癌および肉腫を有する患者のＴ細胞から分析された場合、ＣＤ２２６は生存の改善と有意に相関する（図７Ｂ）。図７Ｂは、黒色腫、肺扁平上皮細胞癌、および肉腫を有する患者のＣＤ２２６発現レベルおよび全生存のＴＣＧＡデータ解析を例示する。（＊、Ｐ＜０．０５、＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊、Ｐ０．０００１選択された関連する比較の間において）。示されるように、ＣＤ２２６は生存の改善と相関する。
【０１２５】
実施例６Ａ
ＰＤ−１およびＧＩＴＲ併用免疫療法における持続的な抗腫瘍応答を媒介するＣＤ２２６／ＴＩＧＩＴ軸
はじめに
免疫チェックポイントＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４を標的とする単剤療法または併用療法は、特定の癌患者集団において有意な臨床利益を示す。しかしながら、患者の大部分は抵抗性であるか、または一過性的にのみ応答し、患者特異的な腫瘍感度に対処するために最適な免疫調節性標的の選択について根本的な問題を提起する。強力なＴ細胞活性化を誘発するための特定の共阻害性および共刺激性経路を標的とする併用療法は、より持続的な抗腫瘍応答をもたらしうる。ここで、現在早期臨床試験において前臨床的に検証されたモダリティである、ＰＤ１およびＧＩＴＲ併用療法は、長期的な応答を駆動する分子経路を特徴付けるために使用された。２，０００個以上の腫瘍浸潤性ＣＤ８＋  Ｔ細胞から調製された単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリを配列決定し、ＧＩＴＲ抗体とＰＤ−１抗体の組み合わせが、重要な恒常性調節因子ＣＤ２２６およびＴＩＧＩＴのバランスを回復することによって、相乗的にＣＤ８＋  Ｔ細胞エフェクター機能を増強し、結果として著しい生存利益がもたらされるということがわかった。実際に、抗ＰＤ−１治療がＣＤ２２６細胞表面発現を強化した。しかしながら、ＰＤ−１単剤療法は、ＴＩＧＩＴによって媒介される阻害シグナル伝達を克服するのには不十分であった。抗ＧＩＴＲ抗体は、Ｔ細胞上のＴＩＧＩＴ発現を減少させた。従って、併用療法はＣＤ８＋  Ｔ細胞応答の強度を相乗的に調節し、強力な適応免疫性を誘発した。実際に、ＣＤ２２６の遺伝的不活性化または薬理学的阻害が、併用療法によって媒介された腫瘍退縮を逆行させたことから、ＣＤ２２６を介した共刺激は抗腫瘍免疫に不可欠であるが、一方で、その他のＴＮＦ受容体またはＢ７スーパーファミリーメンバーの阻害は影響がなかった。重要なことに、抗ＰＤ−１治療の前後の４３例の進行癌患者からの腫瘍生検に対するＲＮＡ−ｓｅｑ解析は、抗ＰＤ−１治療後にＣＤ２２６発現が著しく増加したことを明らかにした。さらなる高レベルのＣＤ２２６は、異なるタイプの癌を有する患者のより良好な予後と相関した。このようなバイオマーカーは、ＰＤ−１／ＰＤＬ−１に加えて患者選定を改善する可能性がある。恒常性調節因子を再調節することによって持続的な抗腫瘍応答を駆動する分子経路を明らかにさせる体系的なアプローチは、併用免疫療法を最適化するために重要であり得る。
【０１２６】
ＰＤ−１およびＣＴＬＡ４抗体治療の臨床的成功に続いて、免疫療法における薬剤の治療的な手段は急速に拡大している。主な目標は、癌患者の単剤療法アプローチで達成された抗腫瘍応答の限定的奏功率および／または持続性を改善することである。強力なＴ細胞活性化を誘発する、特異的な共阻害性（ＰＤ−１）および共刺激性（ＧＩＴＲ、グルココルチコイド誘発性ＴＮＦＲ関連タンパク質、ＴＮＦＲＳＦ１８）経路を標的とする併用療法が現在、転移性黒色腫および他の固形腫瘍を持つ患者のための早期臨床試験で評価されている。実際に、ヒトの癌の多様なセットの制御におけるＴ細胞の臨床的関連性は、現在のところ疑いの余地がない。ＧＩＴＲは、Ｔｒｅｇ細胞上で高レベルで恒常的に発現され、活性化して他のリンパ球上で誘発されうる。ＤＴＡ−１、拮抗的な抗マウスＧＩＴＲ  Ａｂは腫瘍内Ｔｒｅｇ細胞を減少させて、ＦｃγＲ依存性腫瘍拒絶反応を媒介する。さらに、ＧＩＴＲ受容体を拮抗的Ａｂと係合させることで、エフェクターＴ細胞に直接共刺激性信号を送達する。抗ＧＩＴＲおよび抗ＰＤ−１  Ａｂの単剤療法は大きな免疫原性腫瘍または不十分な免疫原性腫瘍において効能が制限される一方、併用療法は卵巣および乳房腫瘍モデルの長期生存を促進する。しかしながら、こうした相乗効果の下にある分子機構はわかっていない。ここで、ＰＤ１とＧＩＴＲの併用療法を使用して、マウスＭＣ３８結腸腺癌モデルにおける２０００個以上の腫瘍浸潤性ＣＤ８＋Ｔ細胞を、遺伝子的にプロファイリングした。体系的なアプローチにより、持続的な抗腫瘍応答を駆動する分子経路を明らかにし、既存の併用免疫療法を最適化し、患者の層別化および腫瘍感度を高める新しい潜在的バイオマーカーを特定する基礎が提供された。
【０１２７】
方法
細胞株および組織の培養。ＭＣ３８マウス結腸癌細胞およびＲＥＮＣＡマウス腎腺癌細胞は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手され、３７℃、５％ＣＯ２で、１０％  ＦＢＳ、１００Ｕ  ｍＬ−１のペニシリンおよび１００μｇ  ｍｌ−１のストレプトマイシン、２ｍＭＬ−グルタミン、１００μＭ  ＮＥＡＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を補ったＤＭＥＭ  培地中で培養した。内因性ＴＣＲ発現を欠いているＪ．ＲＴ３−Ｔ３．５変異Ｊｕｒｋａｔ細胞株を、ＡＴＣＣから入手し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で維持した。腫瘍細胞株を、インパクト試験（ＩＭＰＡＣＴ  ｔｅｓｔ）によりマイコプラズマ病原体および齧歯類の一般的な病原体に対して陰性試験した。ＭＣ３８−ＯＶＡ−β２ｍ−Ｋｂは、ＭＣ３８腫瘍細胞を、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド−スペーサーβ２マイクログロブリン−スペーサーＭＨＣクラスＩ（Ｋｂ）重鎖からなる単一三量体をコードするレンチウイルスベクター（ＬＶ）で形質導入することによって生成された。単一三量体の表面発現は、２５Ｄ−１．１６  Ａｂ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、図２１Ａ）により確認した。ＭＣ３８−  ＯＶＡ−β２ｍ−Ｋｂ  は、１．２５μｇ  ｍｌ−１のピューロマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を含む選択培地で維持された。ＣＤ１５５を過剰発現するＭＣ３８腫瘍細胞は、マウス完全長ＣＤ１５５をコードするＬＶで形質導入することによって生成し、ＦＡＣＳで上位５％の発現細胞をソーティングした。ＣＤ１５５の発現レベルは、ＦＡＣＳ解析によって確認された（図２４Ｃ）。
【０１２８】
マウス。六〜八週齢のメスのＣ５７ＢＬ／６マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社から入手した。Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドのＣＤ２２６−／−およびＴＩＧＩＴ−／−マウスを、ＶｅｌｏｃｉＧｅｎｅ（登録商標）法を使用してリジェネロン社（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）において生成した。簡潔に述べると、遺伝子本体の転写を妨害し、結果としてＣＤ２２６またはＴＩＧＩＴヌル対立遺伝子を生じさせる選択カセットが続くＥＧＦＰ（ＣＤ２２６用）またはＬａｃＺ  ｃＤＮＡ（ＴＩＧＩＴ用）を、開始コドンに対してインフレームに挿入した。ヘテロ接合性の標的マウスを異種交配させ、試験のためにホモ接合性ノックアウトマウスを作製した。すべての動物は、病原体のない条件下で維持され、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社の実験動物委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたプロトコルに従って実験が実施された。
【０１２９】
Ｉｎ  ｖｉｖｏマウス試験。ＭＣ３８腫瘍試験のため、３ｘ１０５個のＭＣ３８細胞を、同年齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの右脇腹に皮下注射した（０日目）。腫瘍移植後６日目に、マウス（異なる群にランダムに分配した）を腫瘍サイズに基づいてグループ化し、示した用量で５ｍｇ／ｋｇ−１の抗ＧＩＴＲ（ＤＴＡ１）および／または抗ＰＤ−１（ＲＰＭ１−１４）ＡｂまたはアイソタイプコントロールＩｇＧ（ラットＩｇＧ２ｂ、ＬＴＦ−２およびラットＩｇＧ２ａ、２Ａ３）を用いた腹腔内注射で治療した（抗体はＢｉｏ  Ｘ  Ｃｅｌｌ社から得た）。１３日目に抗体を再投与した。抗体枯渇実験については、併用療法またはアイソタイプコントロールＩｇＧのいずれかで治療されたマウスを、抗ＣＤ４（クローンＧＫ１．５）；抗ＣＤ８（クローン２．４３）およびラットＩｇＧ２ｂアイソタイプ（クローンＬＴＦ−２）、ラットＩｇＧ１アイソタイプ（クローンＨＰＲＮ、Ｂｉｏ  Ｘ  Ｃｅｌｌ社）および抗ＣＤ２５（クローンＰＣ６１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を含む、３００μｇの枯渇またはアイソタイプコントロールｍＡｂで治療した。枯渇Ａｂを、腫瘍攻撃の一日前（−１日目）と、週に二回、合計八投与量とを与えた。枯渇効率は、末梢血サンプルのＦＡＣＳ解析によって確認された（図１６Ｃ）。この試験で使用される阻止抗体には、抗ＣＤ２２６  Ａｂ（クローン１０Ｅ５、ラットＩｇＧ２ｂ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、２５ｍｇ／ｋｇ）、ＣＤ２８阻止（ＣＴＬＡ４−Ｆｃ、オレンシア（Ｏｒｅｎｃｉａ）、ＢＭＳ社、１０  ｍｇ／ｋｇ）、抗ＯＸ４０Ｌ（クローンＲＭ１３４Ｌ、ラットＩｇＧ２ｂ、Ｂｉｏ  Ｘ  Ｃｅｌｌ社、１０ｍｇ／ｋｇ）および抗４−１ＢＢＬ（クローンＴＫＳ−１、ラットＩｇＧ２ａ、Ｂｉｏ  Ｘ  Ｃｅｌｌ社、１０ｍｇ／ｋｇ）が含まれる。阻止Ａｂを、免疫療法の１〜２日前に二週間、腹腔内注射により週二回投与した。腫瘍の垂直直径は、デジタルキャリパー（ＶＷＲ社、ペンシルバニア州ラドナー）を使用して週当たり２〜３回盲検的に測定された。式Ｌ×Ｗ×０．５を使用して体積を計算したが、式中、Ｌは最長寸法であり、Ｗは垂直寸法である。カプラン・マイヤー法による各々の群に対して生存率の差異が決定され、Ｐｒｉｓｍバージョン６（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ社）による生存率解析を使用したログランク検定によって全体的にｐ値が計算された。腫瘍量が、罹患を最小化する最大腫瘍体積のプロトコル指定のサイズ２０００ｍｍ３に達したら、事象を死亡として規定した。
【０１３０】
フローサイトメトリー。ｉｎ  ｖｉｖｏ実験のフローサイトメトリー解析については、血液、脾臓、胸腺、リンパ節および腫瘍を、治療後の示した日に採取した。単一細胞懸濁液を調製し、赤血球をＡＣＫ溶解緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して溶解した。Ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ  ｆｉｘａｂｌｅ  ｂｌｕｅ  ｄｅａｄ  ｃｅｌｌ染色キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して、生／死細胞を判別した。はじめに、細胞を、４℃で２０〜３０分間、表面マーカー用Ａｂで染色した。細胞内染色を固定／透過キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて行った。ＯＶＡ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞を定量化するために、表面マーカーを染色する前に、はじめに室温で１０分間、Ｈ−２Ｋｂ／ＳＩＩＮＦＥＫＬ−ペンタマー（ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ社）で単一細胞懸濁液を染色した。細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）については、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを用いて、または用いずに細胞を３６時間刺激し、最後の４時間、タンパク質輸送阻害剤（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて細胞を刺激した。刺激後、細胞を表面および細胞内タンパク質について上述のように染色した。組織中の細胞数を定量化するために、取得前に固定数のＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ細胞絶対数計数用ビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を各サンプルに添加した。サンプルはＦｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ２０またはＬＳＲ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）上で取得され、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ社）を使用して解析された。使用される抗体リストについては、補足的方法を参照のこと。
【０１３１】
単一細胞ソーティングＲＮＡ−ｓｅｑ分析。腫瘍攻撃後８日目および１１日目に、腫瘍の単一細胞懸濁液をマウス腫瘍解離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いて調製し、脾臓をｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ  Ｏｃｔｏ分散・破砕装置で分散した。同じ治療群からの腫瘍および脾臓をプールし、生存可能なＣＤ８＋  Ｔ細胞をＦＡＣＳによってソーティングした。ＦＡＣＳでソーティングしたＴ細胞を、５−から１０−μｍのＣ１集積流体回路（ＩＦＣ；フルーダイム社）にロードする前にＣ１細胞懸濁試薬（フルーダイム社）と混合した。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（生／死）染色溶液を、２．５μＬエチジウムホモダイマー−１、及び０．６２５μＬカルセインＡＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を１．２５ｍＬのＣ１細胞洗浄緩衝液（フルーダイム社）に添加して調製し、２０μＬをＣ１  ＩＦＣにロードした。各捕捉部位は、細胞のダブレットおよびバイアビリティについて、明視野、ＧＦＰ、テキサスレッドチャネルのＺｅｉｓｓ顕微鏡下で注意深く調べた。細胞溶解、逆転写、およびｃＤＮＡ増幅は、メーカーにより指定されるとおり（プロトコル１００−７１６８  Ｅ１）、Ｃ１シングルセルオートプレップＩＦＣシステム上で実施された。ＳＭＡＲＴｅｒ  Ｕｌｔｒａ  Ｌｏｗ  ＲＮＡキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を、単一細胞からのｃＤＮＡ合成に使用した。メーカーの推奨事項（プロトコル１００−７１６８  Ｅ１）に従い、Ｎｅｘｔｅｒａ  ＸＴ  ＤＮＡサンプル調製キット（イルミナ社）を使用して、イルミナＮＧＳライブラリを作成した。合計２，２２２個の単一細胞を、７５サイクルの多重化シングルリードランでイルミナＮｅｘｔＳｅｑ（イルミナ社）において配列決定した。未加工の配列データ（ＢＣＬファイル）を、イルミナＣａｓａｖａ  １．８．２を介してＦＡＳＴＱ形式に変換した。リードはそのバーコードに基づいて解読された。ＦａｓｔＱＣ（ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｆａｓｔｑｃ／）  を使用してリード品質を評価した。
【０１３２】
ＬＵＶ（大きな単層膜リポソーム）。リン脂質（７９．７％のＰＯＰＣ＋１０％のＰＯＰＣ＋１０％のＤＧＳ−ＮＴＡ−Ｎｉ  ＋  ０．３％のローダミン−ＰＥ）を、アルゴン雰囲気下で乾かし、少なくとも１時間乾燥させ、１ｘ反応緩衝液（５０ｍＭの  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＴＣＥＰ）中で懸濁させた。ＬＵＶは、前述の通り、２００ｎｍの空孔サイズを持つ一対のポリカーボネートフィルターを通して２０回押し出すことによって調製された。
【０１３３】
ＬＵＶ再構成およびホスホチロシンウェスタンブロット。関心のタンパク質を、０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有する１×反応緩衝液中で所望の比で予混合し、次いでＬＵＶ（１ｍＭ総脂質）と混合した。タンパク質−ＬＵＶ混合物は、室温で１時間インキュベートされたが、その間、Ｈｉｓタグ付きタンパク質がリポソームに結合し、一方、その他のタンパク質は小胞外（ｅｘｔｒａｖｅｓｉｃｕｌａｒ）液中に残った。次いで、２ｍＭのＡＴＰを注入し、急速に混合し、膜表面でリン酸化、脱リン酸化およびタンパク質相互作用を誘発した。室温で３０〜６０分間反応させて、ＳＤＳ試料緩衝液で終了させた。サンプルを９５℃で５分間加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。タンパク質を、ｉＢｌｏｔＴＭ  Ｄｒｙブロッティングシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用してニトロセルロース膜に移した。膜を０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むトリス緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中で５％ＢＳＡでブロッキングし、所望のホスホチロシン特異的抗体と共にインキュベートし、ＨＲＰベースの増強化学発光を用いて検出した。以下の一次抗体を使用した：抗ｐＹ１４２−ＣＤ３ζ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、＃５５８４０２）、抗ｐＹ２０（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、＃ｓｃ−１６２４、再構成アッセイでチロシンリン酸化ＣＤ２８の検出用）、抗ｐＹ４１８−Ｓｒｃ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社  ＃５６００９５、ｐＹ３９４−Ｌｃｋの検出用）、抗ｐＹ５０５−Ｌｃｋ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社、＃２７５１）、抗ｐＹ３１５−ＺＡＰ７０（Ａｂｃａｍ社、＃ａｂ６０９７０）、抗ｐＹ４９３−ＺＡＰ７０（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社、＃２７０４）。
【０１３４】
臨床生検の取り扱い、ＲＮＡ抽出およびＲＮＡ配列（ＲＮＡ−ｓｅｑ）。生検材料は、Ｏｍｎｉ  Ｓｈｒｅｄｄｅｒ（Ｏｍｎｉ−Ｉｎｃ社）で、２２，０００  ＲＰＭで１分間、メルカプトエタノール添加の少なくとも６００ｕＬのＲＬＴＰｌｕｓ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）でホモジナイズした。ＲＮＡおよびＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  Ａｌｌｐｒｅｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、「ＡｌｌＰｒｅｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」（２００５年１１月）の第２６頁の「Ｐｒｏｔｏｃｏｌ：Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ｆｒｏｍ  Ａｎｉｍａｌ  Ｔｉｓｓｕｅｓ．（プロトコル：動物組織からのゲノムＤＮＡおよび全ＲＮＡの同時精製）」にあるプロトコルにあるメーカーの指示に従って注出した。  ＲＮＡ抽出中、付録Ｅに概説されている任意のＤＮＡｓｅ消化を使用した。２分間のスピンでさらに５００ｕＬの７０％エタノール洗浄を、緩衝液ＡＷ２洗浄の後に実行したが、最後の乾燥のためのスピンの前に、ＤＮＡ抽出物から過剰な塩を除去した。ＲＮＡをＮａｎｏｄｒｏｐ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で定量化し、その品質を、メーカーのプロトコルに従い「標準感度ＲＮＡ分析キット」（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ社）により断片分析器（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ社）で評価した。ＤＮＡは、カスタムプロトコル「Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｔｅｃａｎ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＢＲ  ｄｓＤＮＡアッセイ）」に従って、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００  Ｐｒｏ（テカン社）でＱｕｂｉｔ  ｄｓＤＮＡ  ＢＲアッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）により定量化した。完了したサンプルをバーコード付きスクリューキャップチューブ中で−８０℃で保存した。ＲＮＡ−ｓｅｑについては、鎖特異的ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリを、ＫＡＰＡ鎖ｍＲＮＡ−Ｓｅｑキット（ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用して１００ｎｇの全ＲＮＡから調製し、４００〜６００ｂｐのサイズのライブラリをＰｉｐｐｉｎシステム（Ｓａｇｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて選択した。ペアエンド２×１００ｂｐのシーケンシングを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ２５００を使用して行った。ＲＮＡ−ｓｅｑリードをＱＣして、基準ゲノムに対して並列させ、アレイスタジオ（Ｏｍｉｃｓｏｆｔ社）を使用して遺伝子発現を定量化した。
【０１３５】
統計分析。サンプルサイズは、適切な統計的出力を確保するように経験的に選択され、試験で用いられる技術の分野の標準と合っていた。Ｐ＜０．０５レベルの有意性で不等分散があると仮定して、ＡＮＯＶＡまたは対応のない両側スチューデントｔ検定で、統計的有意性が決定された（または図の凡例に示されている）。
【０１３６】
結果
併用免疫療法効果を調べるために、不完全な免疫原性腫瘍モデル（ＭＣ３８およびＲＥＮＣＡ）を使用した。腫瘍体積の可変性の縮小およびわずかに延びた生存時間が報告されてきたが、抗ＰＤ−１または抗ＧＩＴＲ  Ａｂでの単剤療法は、定着腫瘍における完全かつ持続性の腫瘍退縮の誘発には効果的ではない。ここで、腫瘍が触知可能であったときに、腫瘍攻撃の６〜１３日後に抗体を投与した。公開されているデータと一致して、抗ＧＩＴＲまたは抗ＰＤ−１治療単独では、効果はないか又はほぼなかった。併用療法により、マウスの大部分において相乗的に腫瘍が根絶され（１７例のうち１２例で腫瘍が無い）（図１６Ａ）、ＣＤ８＋  Ｔ細胞依存的な様式（図１６Ｃおよび図１６Ｄ）で、長期生存を促進し（マウスの約７０％が＞８０日間無腫瘍であった）（図１６Ｂ）、以前のデータと一致して、腫瘍内ＣＤ８＋／ＴｒｅｇおよびＣＤ４＋  Ｔエフェクター（Ｔｅｆｆ）／Ｔｒｅｇ細胞の比が増加した（図１６Ｅ、図１６Ｆ）。５０日後、単剤療法治療群では、１７例のマウスのうち０〜２例のみが腫瘍が無く、０〜１０％が生存した（図１６Ａ、図１６Ｂ）。さらに、回復したｅｘ  ｖｉｖｏ増殖力（Ｋｉ６７の発現、図１６Ｇ）およびエフェクター機能（グランザイムＡおよびグランザイムＢの発現、図１６Ｈおよび図１６Ｉ）が示すように、腫瘍内ＣＤ８＋  Ｔ細胞の機能異常状態が、併用療法のみで有意に逆行した。より良好な生存率に関連する併用療法の相乗的抗腫瘍効果も、第二のマウスＲＥＮＣＡ腫瘍モデルで確認された（図１６Ｊ）。
【０１３７】
併用療法サンプルからのクローン性増殖ＣＤ８＋  Ｔ細胞（１１日目に採取した腫瘍）における固有の遺伝子シグネチャを特定するために、異なる治療群間で包括的な比較を実施した。第一に、併用療法後の３０個の遺伝子におけるＲＮＡシグネチャの変化が観察されたが、これは増殖したＣＤ８Ｔ細胞集団内でより顕著であった（図１０Ａおよび図２０）。次に、併用療法対単剤療法の比較で特異的に調節されている遺伝子を特定するために、すべての群にわたって四方向の比較を行った（図１０Ｂ）。ＣＤ２２６は、異なる比較対間で共有される二つの遺伝子のうちの一つとして特定された（図１０Ｂ）。ＣＤ２２６は、抗腫瘍応答で重要な役割を果たす共刺激分子である。各治療群にわたる腫瘍内ＣＤ８＋Ｔ細胞の異なるサブセット（合計、クローン性増殖、または非増殖）の発現解析によって（図１０Ｃ）、ＣＤ２２６  ｍＲＮＡレベルがクローン性増殖Ｔ細胞における併用療法によって著しく増加した（倍率変化＝１０．７）一方で、この相違はバルク（倍率変化＝３．５）および非増殖（有意でない）のＣＤ８＋  Ｔ細胞では希薄であった（図１０Ｄ）。さらに、ＣＤ２２６  ｍＲＮＡレベルは、抗ＰＤ−１（倍率変化＝６．５）および抗ＧＩＴＲ（倍率変化＝９．２）と比較すると、クローン性増殖ＣＤ８  Ｔ細胞に対する併用療法によって著しく増加した（図１０Ｄ）。この観察は、推定の腫瘍反応性クローン（高頻度Ｔ細胞クローン）におけるゲノムプロファイリングを実施する重要性を強調し、重要な遺伝子の変化を明らかにしている。
【０１３８】
併用療法後、腫瘍内ＣＤ８  Ｔ細胞上のＣＤ２２６の発現レベルを評価するために、ＭＣ３８特異的ＴＣＲクローンを、最近公表された変異型ＭＣ３８腫瘍エピトープを使用してｉｎ  ｖｉｖｏで追跡した。このアプローチは成功しなかった。これらのＴ細胞クローンが以前に特徴付けられたＭＣ３８腫瘍ネオエピトープを認識できないことは、ラボ間の腫瘍細胞株の異なる突然変異ステータスを反映している可能性があり、腫瘍細胞のゲノム不安定性に起因する可能性がある。所見を機能的に検証するために、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドおよびβ２ｍ（ＯＶＡ−β２ｍ−Ｋｂ）を含む、ＭＨＣクラスＩのＨ−２Ｋｂ単鎖三量体を発現するＭＣ３８腫瘍細胞株を生成して（図２１Ａ）、ＳＩＩＮＦＥＫＬを代用腫瘍エピトープとして使用した。ＴＣＲクローン性分析と一致して、抗ＰＤ−１  Ａｂまたは抗ＧＩＴＲとの併用療法が、腫瘍浸潤性Ｔ細胞において、ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の著しいクローン性増殖を誘発したが（Ｋｂ／ＯＶＡペンタマー染色を使用）、併用療法のみがＡｇ特異的なＣＤ８＋  Ｔ細胞クローンの腫瘍内密度を著しく増加させた（図２１Ｂ）。さらに、併用療法のみが脾臓内のＯＶＡ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、コントロール群と比較して著しく増殖させたが（図２１Ｂ）、それによって以前の所見が拡張される。これらのクローン性増殖したＯＶＡ特異的Ｔ細胞は機能的であり、コントロールよりもＯＶＡペプチドで再刺激に際してより高いレベルのＩＦＮγを産生した（図２１Ｃ）。重要なことは、ＭＣ３８−ＯＶＡ−β２ｍ−Ｋｂモデルを使用して、抗ＰＤ１治療後のＣＤ２２６のベースラインレベルが脾臓ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞において最も高く（図１１Ａ）、さらに、抗ＧＩＴＲおよび抗ＰＤ−１  Ａｂを用いた併用療法によって高められたということが見出された。同じ療法で、非特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞のＣＤ２２６レベルに対する有意な効果はなかった。全体的な抗ＰＤ−１治療は、ＣＤ２２６（図１１Ａ）を増加させることにおいて主要な役割を果たし、抗腫瘍免疫性における抗ＰＤ−１の作用モードに関する重要な情報を提供する。
【０１３９】
次に、ＰＤ１分子およびＣＤ２２６分子間の会合を調査した。最近のデータが、Ｔ細胞の細胞膜を模倣するＬＵＶ（大きな単層膜リポソーム）の表面にＰＤ１の細胞質領域が結合するものである細胞遊離再構成系において、蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ベースのアッセイを使用して、ＰＤ１によるＳｈｐ２の非常に特異的な補充（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）を実証した。ＣＤ２２６が、ＰＤ１−Ｓｈｐ２複合体による脱リン酸化の標的であるかどうかを調べるために、Ｔ細胞シグナル伝達に関与する様々な成分（ＣＤ３、ＣＤ２２６、および凡例／方法）を、リポソーム上で再構成した（図１１Ｂ）。ＬＵＶ上のＰＤ−１滴定に対する各成分の感度を、ホスホチロシン（ｐＹ）ウエスタンブロットによって測定した。ＴＣＲ／ＣＤ３ζが、ＰＤ−１−Ｓｈｐ２による脱リン酸化に対して感度の高い標的でなかったことを示した以前に公表されたデータが確認された（図１１Ｃ）。重要なことに、ＣＤ２２６は、用量依存的様式でＰＤ１−Ｓｈｐ２によって非常に効率的に脱リン化されたことが見出された（図１１Ｃ）。データは、ＰＤ−１とＣＤ２２６との間の会合を示す。
【０１４０】
最近、ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答の強度が、ＣＤ２２６と共阻害受容体ＴＩＧＩＴとの間の全体的バランスによって影響を受けるということが証明された。興味深いことに、単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑを使用することで、抗ＧＩＴＲ  Ａｂ治療が高頻度Ｔ細胞クローンにおけるＴＩＧＩＴ転写物が増加させたことが見出され（図２２Ａ）、一方、ＦＡＣＳ分析により、ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞上でのＴＩＧＩＴの発現で著しい減少を示した（図２２Ｂ）。この結果は、転写後レベルでＴＩＧＩＴ発現が厳しく調節されるという以前の所見と一致している。ＴＩＧＩＴ／ＣＤ２２６シグナル伝達経路に関してシス阻害機構およびトランス阻害機構の両方が提案されてきたため、正味結果は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞上のＣＤ２２６と、両方のＣＤ８＋  Ｔ細胞上のＴＩＧＩＴとの発現レベルのバランスに起因し得、リンパ球のそばに存在し得る。実際に、併用療法によってＴＩＧＩＴ＋細胞の割合と、大きい腫瘍浸潤性のＣＤ８＋、ＣＤ４＋  Ｔｅｆｆ  およびＴｒｅｇ  細胞において細胞一個あたりの発現レベルとが著しく減少し、その効果は、主に抗ＧＩＴＲ  Ａｂ治療によって駆動された（図１１Ｄおよび図２２Ｃ）。驚くべきことに、この効果はまた、脾臓Ｔ細胞のサブセットでも見つかった（図１１Ｄおよび図２２Ｃ）。併用療法および／または単剤療法は、バルクＣＤ２２６＋  腫瘍浸潤性のまたは脾臓のＣＤ４＋およびＴｒｅｇ細胞には効果がなかった（図２２Ｄ）。全体的な単一細胞ソーティングしたＲＮＡ−ｓｅｑおよびＦＡＣＳ表現型データは、抗ＰＤ−１がＣＤ２２６の発現を助ける一方で、抗ＧＩＴＲ治療は、ＴＩＧＩＴの表面発現を下方制御し、恒常性Ｔ細胞機能を相乗的に回復することを示した。
【０１４１】
ＣＤ２２６阻止ｍＡｂを使用して、併用療法によって媒介される抗腫瘍免疫性に対してＣＤ２２６を通した共刺激シグナル伝達が必要であることが示された（図１２Ａ）。しかしながら、ＣＤ２２６  Ａｂは、ＣＤ８  Ｔ細胞のサブセットに対して潜在的な枯渇効果がある可能性があるため、ＣＤ２２６はＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドマウスにおいて遺伝学的に不活性化され、この試験が繰り返された（図２３Ａ、Ｂ）。ＣＤ２２６−／−マウスは、Ｔ細胞（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、Ｔｒｅｇｓ）の恒常性における欠損を示さず（図２３Ｃ〜Ｅ）、野生型マウスと同様にＴＣＲ活性化に対して応答した（図２３Ｆ）。重要なことに、併用療法は、ＣＤ２２６−／−マウスにおいて、抗腫瘍効果または生存利益を最早もたらさず、併用の観察された抗腫瘍効果に対してＣＤ２２６が不可欠であることを示すということが見出された（図１２Ｂ）。さらに、併用療法によって媒介された抗腫瘍効果を保存したＣＴＬＡ４−Ｉｇを用いて、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー（ＯＸ４０Ｌまたは４−１ＢＢＬ）の他のメンバーの阻害またはＢ７共刺激性分子（ＣＤ２８）の遮断として、効果を媒介するＣＤ２２６経路の特異性が検証された（図１２Ｃ〜Ｅ）。
【０１４２】
さらに、ＣＤ２２６シグナル伝達経路は、ＴＩＧＩＴ−／−マウスにおける腫瘍監視の強化に必要であった（図２４Ａ、Ｂ）。興味深いことに、ＣＤ２２６、ＣＤ１５５／ＰＶＲに対する主要なリガンドを過剰発現するＭＣ３８腫瘍細胞を担持するマウスが（図２４Ｃ）、ＭＣ３８−エンプティベクター（ＭＣ３８−ＥＶ）の腫瘍細胞またはアイソタイプコントロールで治療したマウスと比較して、抗ＰＤ−１もしくは抗ＧＩＴＲ、または併用療法において腫瘍増殖の著しい遅延を示した（図２４Ｄ）。ＭＣ３８−ＣＤ１５５が移植されたマウスの免疫プロファイリング解析により、移植後のＭ３８−ＥＶ（空のベクター）に対するＭＣ３８−ＣＤ１５５細胞上のＣＤ１５５発現レベルが持続的に高かったことが確認された（図２４Ｅ）。ＭＣ３８腫瘍細胞上でのＣＤ１５５の過剰発現は、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋  ＴおよびＴｒｅｇｓ細胞における検出可能なＣＤ２２６発現の減少と関連し、一方で、増強されたＩＦＮγによって示されるようなＴ細胞活性化と、腫瘍内Ｔ細胞上の４−１ＢＢの発現とを押し上げた（図２４Ｆ、２４Ｇ）。予想されるとおり、末梢では効果は観察されなかった。
【０１４３】
次に、臨床環境でＰＤ−１阻害とＣＤ２２６発現との関係を調査した。ＰＤ−１標的治療の前および後に、４３例の進行癌患者から採取された腫瘍生検に対して、ＲＮＡ−ｓｅｑ解析を行った（図１２Ｆ）。重要なことに、ＣＤ２２６発現は、癌患者において二回投与量の抗ｈＰＤ−１治療の後で著しく増加した（図１２Ｇ）。さらに、ＴＣＧＡ（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ）からの臨床データは、ＣＤ２２６発現レベルが全体的なＴ細胞活性化強度と相関し、癌患者におけるより良好な予後が予測できるかどうかを調べるために調査された。実際に、高いベースラインのＣＤ２２６発現を有する患者は、ここで評価した２０種類の異なるタイプの癌のうち、５種類（皮膚の皮膚黒色腫、肺腺癌、頭頸部扁平上皮癌、子宮体部扁平上皮ガン、および肉腫）において生存可能性が著しく高い（図１２Ｈおよび図２５）。全体的に、これらの結果は、最大のＴ細胞活性化に対して同時にＴＩＧＩＴを阻害しながら、ＣＤ２２６シグナル伝達を押し上げる免疫療法戦略をサポートする。
【０１４４】
ここで、共刺激性アゴニストおよび共阻害性拮抗薬の強力な相乗効果を駆動する分子機構を明らかにする技術プラットフォームの使用により、持続的な抗腫瘍応答に必要かつ、次世代の腫瘍特異的併用療法を形成する可能性のある主要な機能性Ｔ細胞調節経路に光明を投じる、パラメータが解明された。
【０１４５】
実施例６Ｂ
ＴＣＲレパートリー分析バイオインフォマティクスパイプラインｒｐｓＴＣＲおよびその検証
ＴＣＲ配列の抽出と構築。ＶおよびＪ対立遺伝子情報、およびＣＤＲ３アミノ酸配列を考慮に入れて、ＶおよびＪ対立遺伝子のアミノ酸配列をＩＭＧＴデータベース（ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）から抽出した。次に、ＣＤＲ３配列をＶ配列のＣ末端およびＪ配列のＮ末端と並列させ、連続するＶＤＪアミノ酸配列を作製した。それぞれのＶ対立遺伝子について、それが利用可能であり、ＶＤＪ配列のＣ末端にそれが付加される場合、その後リーダー配列（Ｌ）をＩＭＧＴから特定した。リーダー配列が利用可能でなかった場合には、最も頻度の高いリーダー配列を使用した。次いで、ＬＶＤＪアミノ酸配列を、ＥＭＢＯＳＳ  Ｂａｃｋｔｒａｎｓｅｑツール（ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｔ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｂａｃｋｔｒａｎｓｅｑ）を使用して、コドン最適化ヌクレオチド配列に逆翻訳した。最後に、ＴＣＲＡ／ＴＣＲＢ（ＩＭＧＴ由来）の定常（Ｃ）領域のヌクレオチド配列を、ＬＶＤＪヌクレオチド配列のＮ末端に付加して、それによってクローニングのための完全ＬＶＤＪＣ配列を得た。
【０１４６】
バイオインフォマティクスパイプラインは、ソーティングした単一細胞から生成したランダムプライミングＲＮＡｓｅｑデータを使用して、ＴＣＲ配列を抽出し、再構築し、分析するために開発および検証され、腫瘍反応性および患者生存と潜在的に関連する高頻度Ｔ細胞クローンの特定を可能にした。ロングリード（２×３００ｂｐ）との標的ＴＣＲアンプリコンシーケンシングを使用した従来のＴＣＲ−ｓｅｑ方法とは異なり、ランダムプライミングＲＮＡ−ｓｅｑリードの非常に小さい部分がＴＣＲ配列であり、リード長は短く（通常＝＜１００ｂｐ）、それは通常、ＴＣＲのＶ（Ｄ）Ｊ領域の一部のみをカバーするものである。これらの問題に対処するために、ＴＣＲ配列のネガティブセレクション工程が、パイプライン内のショートリード構築工程に組み込まれた。簡潔にいえば、このパイプラインは、ペアエンドおよびシングルエンドのショートリードを取り出して、これらリードをヒトまたはマウスのゲノムおよびトランスクリプトームにマッピングするが、ＴＣＲ遺伝子座位および転写物に対してはマッピングしない（図１７および方法の項）。結果は、この方法が、高感度であり、ランダムプライミングＲＮＡ−ｓｅｑデータのための正確なＣＤＲ３アセンブラーであることを示した（図１８、図１３および上記の実施例６Ａの方法）。最後に、パイプラインを、１，３７９個のＣＤ８＋単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑデータのライブラリに適用した。ＴＣＲＢ−ＣＤＲ３（８６％）、ＴＣＲＡ−ＣＤＲ３（７８．２％）および対のＴＣＲＢおよびＴＣＲＡ（７３．１％）の検出率は、単一Ｔ細胞からの標的ＴＣＲシーケンシングを使用して報告された検出率と同等であった（図１４）。
【０１４７】
ここで、腫瘍が触知可能であったときに、腫瘍攻撃後６日目に抗体を投与した（図９Ａ）。上記バイオインフォマティクスツールを使用して、腫瘍攻撃後８日目および１１日目に腫瘍担持マウスからソーティングした１３７９個のＣＤ８＋  Ｔ細胞の単一細胞のトランスクリプトームをプロファイリングした。早期時点（８日目）では、高頻度Ｔ細胞の非常に少ないクローンが（同一のＴＣＲ配列を共有する少なくとも３個のＴ細胞として規定される）、すべての治療群で検出された（図９Ｂ）。１１日目までに、二つの高頻度Ｔ細胞クローンを特定し、アイソタイプコントロールサンプル由来の配列決定された単一ＣＤ８＋  Ｔ細胞の５．７％を表した。抗ＧＩＴＲサンプルについては３クローン／２０．３％、抗ＰＤ−１サンプルについては６クローン／２６．７％、併用療法サンプルについては１０クローン／３１．９％であった。実際、８日目〜１１日目の間、腫瘍内ＣＤ８＋  Ｔ細胞の著しいクローン性増殖は、抗ＰＤ−１単剤療法により誘発された。この結果は、抗ＰＤ−１治療（ペムブロリズマブ）後のＴＣＲクローン性の増加を検出した、公表されたデータと一致している。この結果は、抗ＰＤ−１  Ａｂがクローン性増殖の主要な駆動源となるようであり、ＰＤ−１およびＧＩＴＲの二重標的化が腫瘍内ＣＤ８  Ｔ細胞ＴＣＲクローン性をさらに増強することを示すということによって、これらの所見を拡張している（図９Ｂおよび図９Ｃ）。抗ＧＩＴＲおよび／または抗ＰＤ−１は、末梢／脾臓Ｔ細胞のクローン性に影響を与えず（図９Ｃ）、ペムブロリズマブ治療による患者データと一致していた。
【０１４８】
併用療法の際にＭＣ３８腫瘍内で強化されるＴＣＲの腫瘍抗原特異性を検証するために、完全長の対のＴＣＲアルファ／ベータ配列を抽出して構築するためにバイオインフォマティクス解析を実施した（実施例６Ａの方法）。増殖したＣＤ８＋  Ｔ細胞に由来する完全長ＴＣＲペアをレンチウイルス構築物にクローニングし、内因性ＴＣＲ発現を欠いているＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞株に形質導入した。ＡＰ−１により駆動されるルシフェラーゼレポーターを、これらの改変Ｔ細胞株のＴＣＲ特異性のリードアウトとして使用した（図９Ｄ）。このアッセイは、良好に特徴付けられたＬＣＭＶ  ＴＣＲ（Ｐ１４）を使用して検証された（図１９）。高頻度クローン（同じＴＣＲを共有する５細胞）からのＴＣＲは、野生型ＭＣ３８腫瘍細胞によって特異的に提示されるが、無関係な同系Ｃ５７ＢＬ／６腫瘍細胞株（Ｂ１６Ｆ１０．９またはＴＲＡＭＰ−Ｃ２）によっては提示されないエピトープを認識でき（図９Ｅが代表的なＴＣＲクローンを示す）、それによってそれらの特異性を検証する。
【０１４９】
さらに、抗ＧＩＴＲおよび抗ＰＤ−１は、これらのクローン性増殖ＣＤ８＋  Ｔ細胞において別個の分子経路を調節することが判断された（図１５）。併用療法は、単剤療法によって調節される経路を相乗的に組み込み、強い適応免疫応答と、細胞サイクルおよび代謝活性に関連する経路における応答とを促進した。単剤療法は腫瘍内ＣＤ８＋  Ｔ細胞クローンを増殖させ、危険な遺伝子経路を調節したが、これは完全な長期的な腫瘍拒絶反応には不十分であった。この知見は、併用療法による機能障害性腫瘍浸潤性Ｔ細胞の大幅な初期化が、完全な腫瘍拒絶反応のために必要であることを示唆する。この結果は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞は腫瘍発生の初期段階で機能不全となり、徐々に柔軟性が少ない状態に進展するということを示す最近の研究によって支持される。
【０１５０】
次世代シーケンシング技術は、全ゲノムおよびトランスクリプトームシーケンシングルーチンを作製し、全ゲノム遺伝子発現の検出およびＴＣＲ配列の同時抽出の機会を提供している。しかしながら、ロングリード（２×３００ｂｐ）での標的ＴＣＲアンプリコンシーケンシングを使用した従来のＴＣＲ−ｓｅｑ方法とは異なり、ランダムプライミングＲＮＡ−ｓｅｑリードの非常に小さい部分がＴＣＲ配列であり、またリード長は短く（通常＝＜１００ｂｐ）、それは通常、ＴＣＲのＶ（Ｄ）Ｊ領域の一部のみをカバーするものである。ランダムプライミングＲＮＡシーケンシングのショートリードからＴＣＲ−ＣＤＲ３配列を構築および抽出するためのｒｐｓＴＣＲパイプラインが開発され、この問題に対処された（図１７）。ｒｐｓＴＣＲは、ペアエンドおよびシングルエンドのショートリードを取り出し、デフォルトパラメータによるＴｏｐｈａｔを使用して、これらリードをマウスまたはヒトのゲノムおよびトランスクリプトームにマッピングしたが、ＴＣＲ遺伝子座位および転写物に対してはマッピングしなかった。マッピングされたリードは廃棄し、マッピングされなかったリードをＴＣＲ配列の抽出用に再利用した。マッピングされなかったリードの低品質ヌクレオチドはトリミングした。その後、３５ｂｐ未満の長さのリードを、ＨＴＱＣツールキットを使用して除外した。ＱＣが合格であったショートリードを、ｉＳＳＡＫＥのデフォルト設定を使用して、より長いリードに構築した。ＴＣＲｋｌａｓｓを使用して、デフォルトで１．７〜２に設定されたＳｃｒ（保存された残基の支持スコア）を持つＣＤＲ３配列を特定した。パイプラインに導入された余分な工程がＴＣＲｋｌａｓｓ単独と比較してより高い偽陽性または偽陰性率をもたらすかどうかを評価するために、健康なヒトＰＢＭＣサンプルからの標的ＴＣＲ−ｓｅｑデータをポジティブコントロールとして使用した。ＴＣＲＢ（６４，０３１）またはＴＣＲＡ（５１，４４８）由来の固有のＣＤＲ３配列の大部分は、ｒｐｓＴＣＲおよびＴＣＲｋｌａｓｓ両方によって検出された。ｒｐｓＴＣＲとＴＣＲｋｌａｓｓとの間の二乗の相関関係は、ＴＣＲＢ−ＣＤＲ３およびＴＣＲＡ−ＣＤＲ３について、それぞれ、０．９９９９および０．９３６５であった（図１７）。六つのＴＣＲ陰性癌または非癌細胞株をネガティブコントロールとして使用した。ｒｐｓＴＣＲはＣＤＲ３配列を何も検出しなかったが、ＴＣＲｋｌａｓｓはこれらＴＣＲ陰性癌細胞株の一部からＣＤＲ３配列をいくつか抽出した（図１３）。パイプラインの性能をさらに検証するために、標的ＴＣＲ−ｓｅｑおよびランダムプライミングＲＮＡ−ｓｅｑのアプローチの両方を使用して、健康なマウスのＰＢＭＣサンプルを配列決定した（２００Ｍ、２×１００ｂｐ）。ＲＮＡ−ｓｅｑデータから構築されたＣＤＲ３配列の数は標的ＴＣＲ−ｓｅｑアプローチからのものよりもずっと少ないが、ｒｐｓＴＣＲを使用したＲＮＡ−ｓｅｑデータから特定されたＣＤＲ３配列のうちの約４５％がまた、標的ＴＣＲ−ｓｅｑからのＣＤＲ３配列の中でも観察された。標的ＴＣＲ−ｓｅｑに技術的制限があるため、ＲＮＡ−ｓｅｑデータから抽出されたＣＤＲ３配列の断片がＴＣＲ−ｓｅｑの��果に存在しなかったことは驚くべきことではない。例えば、標的ＴＣＲ−ｓｅｑに使用される５’レースアダプタの効率は概して低く、多数のＰＣＲは高頻度ＴＣＲを増幅する傾向があり、従ってＴＣＲの小さな部分のみを標的とすることができる。予想されるように、ｒｐｓＴＣＲを用いてＲＮＡ−ｓｅｑデータから特定されたＣＤＲ３配列のうちはるかに高い割合がまた（約７０％）、標的ＴＣＲ−ｓｅｑからの高頻度ＣＤＲ３配列のうちで観察されたが（＞＝０．１％）、一方、ＴＣＲｋｌａｓｓ単独を使用して抽出されたのはほんの約４０％であった。さらに、１００ｂｐのリード長を５０ｂｐのセグメントに切断し、２００Ｍのリードをランダムに選択した。標的ＴＣＲ−ｓｅｑアプローチによってランク付けされたＣＤＲ３配列の上位１０個のうち、８個のＣＤＲ３配列がｒｐｓＴＣＲによって検出され、その一方で３つのみがＴＣＲｋｌａｓｓによって検出された。次いで、異なる抗体で治療されたＭＣ３８の腫瘍内ＣＤ８  Ｔ細胞から生成された単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑデータからＣＤＲ３配列を抽出するために、ｒｐｓＴＣＲパイプラインを適用した。Ｔ細胞の単一細胞シーケンシングからＴＣＲ配列を検出する標的ＴＣＲ−ｓｅｑアプローチによる、ＣＤＲ３＿βおよびＣＤＲ３＿α配列の検出率は、公表されたデータに匹敵した（図１４）。
【０１５１】
方法およびシステムは、好ましい実施形態および特定の実施例に関連して記載されているが、その範囲は、記載されている特定の実施形態に限定されることを意図するものではない。この理由は、本明細書中の実施形態が、全ての点において限定的ではなく寧ろ例示的であることを意図したものであるからである。
【０１５２】
別途明記しない限り、本明細書中に記載されている方法は、その工程を特定の順序で実行することを必須としていると解釈すべきものではない。したがって、方法についてのある請求項が、実際にその工程に従うべき順序を列挙していない場合、または、特許請求の範囲もしくは明細書において特定の順序に限定されることが別途明記されていない場合には、如何なる点においても、順序を推定することは決して意図されない。これは、工程の配置または操作の流れの配列に関するロジックの問題；文法的な編成または句読法から導き出される明白な意味；本明細書中に記載されている実施形態の数またはタイプ等を解釈するための、あらゆる可能な非明示的基礎に対して成り立つ。
【０１５３】
本出願全体を通して、様々な刊行物が参照される。これらの全体的な刊行物の開示は、方法およびシステムが関連する当該技術分野の状態をより完全に説明するために、本出願への参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５４】
様々な改変および変形が、範囲または趣旨から逸脱することなく成され得ることが、当業者に明らかになろう。他の実施形態は、本明細書に開示される明細書および実践を考慮することにより、当業者に明らかになろう。本明細書および実施例は、もっぱら例示を目的としたものとして見なされ、真の範囲および趣旨は下記の特許請求の範囲によって示されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
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【図１２Ｈ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１６Ｇ−Ｉ】
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【図１６Ｊ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図２３Ｆ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２４Ｅ】
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【図２４Ｆ】
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【図２４Ｇ】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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