(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むまたは前記アミノ酸配列からなる、または
ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされる、
ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）ウイルスタンパク質２（ＶＰ２）。
【請求項２】
請求項１に記載のＰＰＶ  ＶＰ２を含む免疫原性組成物。
【請求項３】
薬学的に許容される担体をさらに含み、前記薬学的に許容される担体がカルボマーである、請求項２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
ワクチンである、請求項２または３に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
請求項１に記載のＰＰＶ  ＶＰ２をコードする配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５に記載のポリヌクレオチドを含むバキュロウイルスベクター。
【請求項７】
請求項５に記載のポリヌクレオチドまたは請求項６に記載のベクターを含む細胞。
【請求項８】
請求項１に記載のＰＰＶ  ＶＰ２を含むウイルス様粒子。
【請求項９】
細胞を請求項６に記載のベクターでトランスフェクトするステップを含む、請求項１に記載のＰＰＶ  ＶＰ２を製造する方法。
【請求項１０】
請求項２から４までのいずれか１項に記載の免疫原性組成物を非ヒト対象に投与するステップを含む、非ヒト対象を免疫する方法。
【請求項１１】
必要な非ヒト対象においてＰＰＶ感染によって引き起こされる臨床徴候を治療および／または予防する方法であって、治療上有効量の請求項２から４までのいずれか１項に記載の免疫原性組成物を前記非ヒト対象に投与するステップを含む方法。
【請求項１２】
同じ種の非免疫対照群の非ヒト対象と比較して非ヒト対象における生殖障害を減少させる方法であって、治療上有効量の請求項２から４までのいずれか１項に記載の免疫原性組成物を前記非ヒト対象に投与するステップを含む、前記方法。
【請求項１３】
同じ種の非免疫対照群の非ヒト対象と比較して、非ヒト対象における胚および胎児死亡を減少させる方法であって、治療上有効量の請求項２から４までのいずれか１項に記載の免疫原性組成物を前記非ヒト対象に投与するステップを含む、前記方法。
【請求項１４】
非ヒト対象がブタ類である、請求項１０から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ブタ類が未経産雌ブタおよび／または経産雌ブタである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
免疫原性組成物が３０日間の懐胎から未経産雌ブタおよび／または経産雌ブタにとって安全である、請求項１０から１５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
免疫原性組成物が４０日間の懐胎から未経産雌ブタおよび／または経産雌ブタにとって安全である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
免疫原性組成物が同種および／または異種チャレンジから防御する、請求項１０から１７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
同じ種の非免疫対照群の対象と比較して、胚および／または胎児感染および死亡を特徴とする一過性白血球減少症および生殖障害の減少、またはこれらの組合せからなる群から選択される有効性パラメータの改善をもたらす、請求項１０から１８までのいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本出願は、米国特許法施行規則１．８２１〜１．８２５による配列表を含む。本出願に付随する配列表は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
ブタパルボウイルスは、約５１００ヌクレオチドの一本鎖ＤＮＡ分子を含むパルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）科内のプロトパルボウイルス（Ｐｒｏｔｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）属のパルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅ）亜科の自律複製ウイルスである（Cotmore et al., 2014: Arch Virol.: 159(5): 1239-1247；Molitor et al., 1984: Virology: 137(2):241-54.）。ＤＮＡのマイナス鎖のみがビリオンにパッケージングされる。ウイルスのゲノムは、３つのカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）および１つの非構造タンパク質（ＮＳ１）をコードする。パルボウイルスのカプシドは直径約２２〜２５ｎｍであり、ＶＰ１およびＶＰ２サブユニットで構成される。これらのタンパク質は、同じＲＮＡ分子の選択的スプライシングバージョンに由来するので、配列が重複する。さらに、ブタパルボウイルスは、ネコ汎血球減少症ウイルス、イヌパルボウイルスおよびげっ歯類パルボウイルスとの高レベルの配列類似性を示す（Ranz et al., 1989: J. gen. Virol: 70:2541-2553）。
ブタパルボウイルス株には違いがあり、あるものは極めて病原性であり、他のものはあまり病原性でないまたは完全に非病原性であるが、ウイルスがある国で定着するまたは地方病になると、病原性株が集団に広まる。
【０００３】
ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）感染は、世界中の繁殖ブタにおける生殖障害の一般的な原因である。血清学的研究は、ブタパルボウイルスが世界の全ブタ生産地域で広まっており、動物の最大８０％が血清転換を示していることを示している。
ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）はブタ類の生殖障害を引き起こし、妊娠成獣雌ブタにおいて死亡および胎児ミイラ化、死産および他の生殖障害をもたらす（Joo & Johnson. 1976. Veterinary Bulletin 46, 653-660；Mengeling. 1978. J. Am. Vet. Med. Assoc. 172, 1291-1294）。
ＰＰＶは、感受性（非免疫）未経産雌ブタおよび（成獣）経産雌ブタが妊娠中に感染すると、生殖障害を誘発する。これが、ウイルスが疾患を引き起こす唯一の時である。ブタにおける感染は、ウイルスの接種および吸入後に起こる。次いで、ＰＰＶが血流中を循環し、妊娠ブタで胎盤を通過し、発達中の胚および胎児に感染する。自然感染後、おそらくブタの一生にわたって続く能動免疫が発達する。能動免疫が妊娠前に生じれば、発育中の子ブタは罹患しない。生まれた時に、子ブタは成獣雌ブタから初乳で母子免疫を受け取り、この母子免疫が最大２０週齢まで続く。成獣雌ブタの能動免疫のレベルが高いほど、経産雌ブタが子ブタに伝える母子免疫が大きくなる。その後、ＰＰＶの自然感染が起こり得る。
【０００４】
ブタにおいてＰＰＶによって引き起こされる疾患は、ＳＭＥＤＩ（死産、ミイラ化、胚死および不妊の頭字語）と呼ばれることがある。感染が妊娠０〜３０日に起こると、胚死亡が起こり、産仔数減少がもたらされ得る。妊娠３０〜７０日目での感染後の最も明らかな特徴は、ミイラ化した子ブタの出生である。ミイラ化は、骨格が凝固し始めた後の、子宮内で死亡した子ブタの組織の無菌消化の過程である。感染が妊娠の後期で起こると、ＰＰＶ感染は死産および弱って産まれたブタにも関連する。流産もＰＰＶ感染の結果であり得るが、この疾患の一般的な臨床徴候ではない。全体として、ＰＰＶ感染は１年当たり成獣雌ブタ１匹当たりに産まれるブタの数を減少させる。
現在利用可能なＰＰＶワクチンは、ブタ起源の初代細胞または確立された細胞株で天然ウイルスを増殖させることによって生成されている。この後、感染性ウイルスを単離し、化学薬品で不活性化すると、全細胞死滅ウイルスワクチンとなる。しかしながら、天然感染性ウイルスを増殖させるこのような方法は、バイオセキュリティ（ｂｉｏｓｅｃｕｒｉｔｙ）および安全性の配慮にとって問題となる。そのため、組換えＰＰＶワクチンが必要である。
【０００５】
組換えタンパク質に基づくサブユニットワクチンは、標的タンパク質の不正確な折り畳みまたは免疫系に対する不十分な提示のために、不十分な免疫原性に悩まされ得る。さらに、全細胞死滅ワクチンは天然ウイルスの全抗原を提示するが、サブユニットワクチンでは、特異的アミノ酸配列への限定がある。
組換えＰＰＶワクチンは先行技術で既に記載されているが、今までのところ、全細胞死滅ワクチンのみが商業的に入手可能である。よって、今まで適切な組換えＰＰＶサブユニットワクチンは開発されておらず、有効で安全であることを示しているものはないように思われる。今まで記載されている組換えＰＰＶサブユニットワクチンは、制御された実験室チャレンジ実験で試験されていない。評価された組換えＰＰＶサブユニットワクチンは、全細胞死滅ＰＰＶワクチンほどよく働かず、組換えＰＰＶサブユニットワクチンは安全でもなかった（副作用を示した）。そのため、高度に有効で安全な組換えＰＰＶサブユニットワクチンが依然として必要である。
【０００６】
ワクチン株とは遺伝的にも抗原的にも異なるブタパルボウイルス（ＰＰＶ）の野外単離株が同定されている。ＰＰＶ遺伝子型２ウイルス、ＰＰＶ−２７ａは、ＰＰＶの他の株、例えばＰＰＶ−ＮＡＤＬ−２に感染している経産雌ブタと比較してＰＰＶ−２７ａに感染している経産雌ブタの胎児間での高い死亡率（８５％）によって実証されているように、実験感染後に妊娠未経産雌ブタにおいて高度に毒性である。しかしながら、ＰＰＶに対する現在利用可能な市販のワクチンは、約３０年前に分離されたＰＰＶ遺伝子型１株の不活性化全ウイルス調製物に基づいている（Jozwik et al 2009; Journal of General Virology; 90; 2437-2441）。よって、野外のＰＰＶにより適合するＰＰＶの新たな高度毒性病原性株から防御する新たなワクチンが必要である。
【０００７】
さらなる先行技術は以下の通りである：
欧州特許第０５５１４４９号は、ブタパルボウイルスに対するＶＰ２サブユニットワクチンを製造する方法を開示している。
Ｃａｄａｒ  Ｄら（Infection, Genetics and Evolution 2012, 12: 1163-1171）は、イノシシにおけるブタパルボウイルスの系統発生および進化遺伝学を記載している。
Ｓｔｒｅｃｋ  ＡＦら（Journal of General Virology 2011, 92: 2628-2636）は、ブタパルボウイルスのカプシドタンパク質におけるウイルス進化が高速であることを記載している。
国際公開第８８／０２０２６号は、中空ウイルスカプシドワクチンに関する。
Ｍａｒｔｉｎｅｚ  Ｃら（Vaccine 1992, 10(10): 684-690）は、高い免疫原性活性を有するブタパルボウイルス中空カプシドの製造を開示している。
Ｘｕ  Ｆら（Applied and Environmental Microbiology 2007, 73(21): 7041-7047）は、ブタパルボウイルスＶＰ２タンパク質を産生するラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）の胃内投与後のマウスにおける免疫応答の誘導を記載している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
さらに、ＰＰＶの異なる（異種）株に対する広範な防御（交差防御）を与えるＰＰＶの極めて病原性の株に対する新たな、より良いワクチンが必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の態様を記載する前に、文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除いて、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は複数言及を含むことに留意しなければならない。よって、例えば、「抗原（ａｎ  ａｎｔｉｇｅｎ）」への言及は複数の抗原を含み、「ウイルス」への言及は１つまたは複数のウイルスおよび当業者に公知のその等価物への言及であり、以下同様である。特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるのと類似または同等の任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法、装置および材料をここで記載する。本明細書で言及される全ての刊行物は、本発明に関して使用され得る刊行物に報告される細胞株、ベクターおよび方法論を記載および開示する目的のために参照により本明細書に組み込まれる。本明細書中のいずれも、本発明が先行発明によってこのような開示に先立つ権利がないことの自認として解釈されるべきではない。
【００１０】
本発明は、先行技術に固有の課題を解決し、技術水準における明確な進歩を提供する。概して、本発明は、
−  アミノ酸２２８位のグルタミン酸残基もしくはグルタメート残基、および／または
−  アミノ酸４１４位のセリン残基、および／または
−  アミノ酸４１９位のグルタミン残基、および／または
−  アミノ酸４３６位のスレオニン残基
を有するブタパルボウイルス（ＰＰＶ）ウイルスタンパク質２（ＶＰ２）であって、
アミノ酸位置の番号付けは野生型ＰＰＶ  ＶＰ２のアミノ酸配列を参照する、ＰＰＶ  ＶＰ２を提供する。
有利なことに、本発明によって提供される実験データは、本発明のＰＰＶ  ＶＰ２サブユニットワクチンが、胎児におけるウイルス血症およびＰＰＶ感染の予防において安全で有効であることを開示している。さらに、本発明によって提供される実験データは、本発明のワクチンが異種北米ならびに異種欧州ＰＰＶチャレンジ株から防御するので、広範な防御範囲を有することを開示している。
【００１１】
有利なことに、本発明によって提供される実験データは、本発明のＰＰＶ  ＶＰ２サブユニットワクチンが全死滅ウイルスと同じくらい有効であり、これは驚くべき効果であることを開示している。しかしながら、ＰＰＶ  ＶＰ２で構成される組換えサブユニットワクチンを利用することによって、大規模な不活性化工程（全死滅ウイルスワクチンを生成する際に、天然ＰＰＶを不活性化するのに必要である）を回避することができた。
「ブタパルボウイルス」または「ＰＰＶ」という用語は当業者に周知である。しかしながら、「ブタパルボウイルス」は、一本鎖ＤＮＡ分子を含むパルボウイルス科内のパルボウイルス属の自律複製ウイルスである。ウイルスのゲノムは３つのカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）および１つの非構造タンパク質（ＮＳ１）をコードする。ブタにおいてＰＰＶによって引き起こされる疾患は通常、ＳＭＥＤＩ（死産、ミイラ化、胚死および不妊の頭字語）と呼ばれる。「ブタパルボウイルス」という用語は、ブタパルボウイルスの全ての可能な株、遺伝子型、表現型および血清型を包含する。
【００１２】
「ウイルスタンパク質２」または「ＶＰ２」という用語は、ブタパルボウイルスのカプシドタンパク質ＶＰ２に関する。「ウイルスタンパク質２」または「ＶＰ２」という用語は当業者に周知である。
「タンパク質」、「アミノ酸」および「ポリペプチド」という用語は互換的に使用される。「タンパク質」という用語は、天然アミノ酸ならびにその誘導体で構成されるアミノ酸の配列を指す。天然アミノ酸は当技術分野で周知であり、生化学の標準的な教科書に記載されている。アミノ酸配列内で、アミノ酸残基はペプチド結合によって連結されている。さらに、アミノ酸配列の２つの末端は、カルボキシル末端（Ｃ末端）およびアミノ末端（Ｎ末端）と呼ばれる。「タンパク質」という用語は、本質的に精製されたタンパク質またはさらに他のタンパク質を含むタンパク質調製物を包含する。さらに、この用語はまた、タンパク質断片に関する。さらに、これは化学的に修飾されたタンパク質を含む。このような修飾は人工的修飾または天然修飾、例えばリン酸化、グリコシル化、ミリスチル化などであり得る。
【００１３】
「アミノ酸位置の番号付けは野生型ＰＰＶ  ＶＰ２のアミノ酸配列を参照する」という用語は、完全長野生型ＰＰＶ  ＶＰ２タンパク質のアミノ酸配列を参照したアミノ酸位置の番号付けに関する。好ましくは、本明細書で言及されるアミノ位置の番号付けは、（Ｎ末端）アミノ酸１位のメチオニン残基を含む５７９アミノ酸残基を有する野生型ＰＰＶ  ＶＰ２タンパク質配列に関連する。「アミノ酸位置の番号付けは野生型ＰＰＶ  ＶＰ２のアミノ酸配列を参照する」という用語は、配列番号１に代表的に示される野生型ＰＰＶ  ＶＰ２（ＰＰＶ２７ａ  ＶＰ２）を包含する。
【００１４】
本発明の一態様では、ＰＰＶ  ＶＰ２がさらに、
−  アミノ酸２５位のイソロイシン残基、および／または
−  アミノ酸３６位のセリン残基、および／または
−  アミノ酸３７位のイソロイシン残基
を有する。
よって、本発明は、
−  アミノ酸２２８位のグルタミン酸残基もしくはグルタメート残基、および／または
−  アミノ酸４１４位のセリン残基、および／または
−  アミノ酸４１９位のグルタミン残基、および／または
−  アミノ酸４３６位のスレオニン残基
を有するブタパルボウイルス（ＰＰＶ）ウイルスタンパク質２（ＶＰ２）であって、
アミノ酸位置の番号付けは野生型ＰＰＶ  ＶＰ２のアミノ酸配列を参照し、
さらに
−  アミノ酸２５位のイソロイシン残基、および／または
−  アミノ酸３６位のセリン残基、および／または
−  アミノ酸３７位のイソロイシン残基
を有する、ＰＰＶ  ＶＰ２を提供する。
【００１５】
本発明の一態様では、アミノ酸位置の番号付けが配列番号１に示されるアミノ酸配列を参照する。よって、本発明は、
−  アミノ酸２２８位のグルタミン酸残基もしくはグルタメート残基、および／または
−  アミノ酸４１４位のセリン残基、および／または
−  アミノ酸４１９位のグルタミン残基、および／または
−  アミノ酸４３６位のスレオニン残基
を有するブタパルボウイルス（ＰＰＶ）ウイルスタンパク質２（ＶＰ２）であって、
アミノ酸位置の番号付けは野生型ＰＰＶ  ＶＰ２のアミノ酸配列を参照し、アミノ酸位置の番号付けは配列番号１に示されるアミノ酸配列を参照する、ＰＰＶ  ＶＰ２を提供する。
よって、本発明は、
−  アミノ酸２２８位のグルタミン酸残基もしくはグルタメート残基、および／または
−  アミノ酸４１４位のセリン残基、および／または
−  アミノ酸４１９位のグルタミン残基、および／または
−  アミノ酸４３６位のスレオニン残基
を有するブタパルボウイルス（ＰＰＶ）ウイルスタンパク質２（ＶＰ２）であって、アミノ酸位置の番号付けは配列番号１に示されるアミノ酸配列を参照する、ＰＰＶ  ＶＰ２を提供する。
【００１６】
本発明の一態様では、ＰＰＶ  ＶＰ２が組換えＰＰＶ  ＶＰ２である。
本明細書で使用される「組換え」という用語は、特に組換えＤＮＡ分子から発現されるタンパク質分子、例えば組換えＤＮＡ技術によって産生されるポリペプチドを指す。このような技術の例としては、発現されるタンパク質（例えば、ＰＰＶ  ＶＰ２）をコードするＤＮＡを適切な発現ベクター、好ましくはバキュロウイルス発現ベクターに挿入し、今度はこれを使用して宿主細胞をトランスフェクト、またはバキュロウイルス発現ベクターの場合には、宿主細胞を感染させて、ＤＮＡによってコードされるタンパク質またはポリペプチドを産生する場合が挙げられる。よって、本明細書で使用される「組換えＰＰＶ  ＶＰ２」という用語は特に、組換えＤＮＡ分子から発現されるタンパク質分子を指す。
本発明の一態様では、ＰＰＶ  ＶＰ２が組換えバキュロウイルス発現ＰＰＶ  ＶＰ２である。
「バキュロウイルス」または「バキュロウイルス系」という用語は当業者に周知である。さらに、「バキュロウイルス」という用語を以下でさらに特定する。
本発明の一態様では、前記ＰＰＶ  ＶＰ２が、配列番号１、配列番号２または配列番号５〜１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはアミノ酸配列からなる。
【００１７】
本発明の一態様では、前記ＰＰＶ  ＶＰ２が、配列番号１、配列番号２または配列番号５〜１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはアミノ酸配列からなる。よって、本発明は、
−  アミノ酸２２８位のグルタミン酸残基もしくはグルタメート残基、および／または
−  アミノ酸４１４位のセリン残基、および／または
−  アミノ酸４１９位のグルタミン残基、および／または
−  アミノ酸４３６位のスレオニン残基
を有するブタパルボウイルス（ＰＰＶ）ウイルスタンパク質２（ＶＰ２）であって、
アミノ酸位置の番号付けは野生型ＰＰＶ  ＶＰ２のアミノ酸配列を参照し、
配列番号１、配列番号２または配列番号５〜１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはアミノ酸配列からなるＰＰＶ  ＶＰ２を提供する。
【００１８】
本発明の一態様では、前記ＰＰＶ  ＶＰ２が配列番号１または配列番号２または配列番号５〜１６のアミノ酸配列を含むまたはアミノ酸配列からなる、あるいは配列番号１、配列番号２または配列番号５〜１６の少なくとも２１０個、少なくとも２５０個または少なくとも３００個の連続アミノ酸残基を有する任意の断片含むまたは断片からなる。よって、本発明は、
−  アミノ酸２２８位のグルタミン酸残基もしくはグルタメート残基、および／または
−  アミノ酸４１４位のセリン残基、および／または
−  アミノ酸４１９位のグルタミン残基、および／または
−  アミノ酸４３６位のスレオニン残基
を有するブタパルボウイルス（ＰＰＶ）ウイルスタンパク質２（ＶＰ２）であって、
アミノ酸位置の番号付けは野生型ＰＰＶ  ＶＰ２のアミノ酸配列を参照し、
配列番号１または配列番号２または配列番号５〜１６のアミノ酸配列を含むまたはアミノ酸配列からなる、あるいは配列番号１、配列番号２または配列番号５〜１６の少なくとも２１０個、少なくとも２５０個または少なくとも３００個の連続アミノ酸残基を有する任意の断片を含むまたは断片からなるＰＰＶ  ＶＰ２を提供する。
【００１９】
本発明の一態様では、前記ＰＰＶ  ＶＰ２が、配列番号１、配列番号２または配列番号５〜１６のアミノ酸配列を含むまたはアミノ酸配列からなる。よって、本発明は、
−  アミノ酸２２８位のグルタミン酸残基もしくはグルタメート残基、および／または
−  アミノ酸４１４位のセリン残基、および／または
−  アミノ酸４１９位のグルタミン残基、および／または
−  アミノ酸４３６位のスレオニン残基
を有するブタパルボウイルス（ＰＰＶ）ウイルスタンパク質２（ＶＰ２）であって、
アミノ酸位置の番号付けは野生型ＰＰＶ  ＶＰ２のアミノ酸配列を参照し、
配列番号１または配列番号２または配列番号５〜１６のアミノ酸配列を含むまたはアミノ酸配列からなるＰＰＶ  ＶＰ２を提供する。
【００２０】
本発明の一態様では、前記ＰＰＶ  ＶＰ２が、配列番号１、配列番号２または配列番号５〜１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされる。
【００２１】
本発明の一態様では、前記ＰＰＶ  ＶＰ２が、配列番号１、配列番号２または配列番号５〜１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされる。よって、本発明は、
−  アミノ酸２２８位のグルタミン酸残基もしくはグルタメート残基、および／または
−  アミノ酸４１４位のセリン残基、および／または
−  アミノ酸４１９位のグルタミン残基、および／または
−  アミノ酸４３６位のスレオニン残基
を有するブタパルボウイルス（ＰＰＶ）ウイルスタンパク質２（ＶＰ２）であって、
アミノ酸位置の番号付けは野生型ＰＰＶ  ＶＰ２のアミノ酸配列を参照し、
配列番号１、配列番号２または配列番号５〜１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされるＰＰＶ  ＶＰ２を提供する。
【００２２】
本発明の一態様では、前記ＰＰＶ  ＶＰ２が、配列番号１、配列番号２または配列番号５〜１６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされる。よって、本発明は、
−  アミノ酸２２８位のグルタミン酸残基もしくはグルタメート残基、および／または
−  アミノ酸４１４位のセリン残基、および／または
−  アミノ酸４１９位のグルタミン残基、および／または
−  アミノ酸４３６位のスレオニン残基
を有するブタパルボウイルス（ＰＰＶ）ウイルスタンパク質２（ＶＰ２）であって、
アミノ酸位置の番号付けは野生型ＰＰＶ  ＶＰ２のアミノ酸配列を参照し、
配列番号１、配列番号２または配列番号５〜１６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされるＰＰＶ  ＶＰ２を提供する。
【００２３】
配列番号４は、グリシンリピートで構成されるＶＰ２コード領域に隣接するように２つのＣｌａＩ制限酵素部位を有するようにさらに修飾されたコドン最適化ＰＰＶ  ２７ａ  ＶＰ２ヌクレオチド配列（アミノ酸２５位はイソロイシン残基であり、アミノ酸３６位はセリン残基であり、アミノ酸３７位はイソロイシン残基である）である。しかしながら、ＣｌａＩ制限酵素部位を、ＶＰ２コード領域を破壊しないように導入した。配列番号２は配列番号４に対応するタンパク質配列である。配列番号３はコドン最適化ＰＰＶ  ２７ａ  ＶＰ２ヌクレオチド配列（ＣｌａＩ制限酵素部位を含まない）である。配列番号１は配列番号３に対応するタンパク質配列である。配列番号５〜１６は、ＣｌａＩ制限酵素部位を含む（配列番号５〜１０）または含まない（配列番号１１〜１６）さらなるＰＰＶ  ＶＰ２タンパク質配列を開示している。
【００２４】
「核酸」または「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」または「ポリヌクレオチド」という用語は本明細書で互換的に使用され、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子または誘導体を含むポリヌクレオチドを指す。この用語は一本鎖ならびに二本鎖ポリヌクレオチドを包含する。本発明の核酸は、単離ポリヌクレオチド（すなわち、その自然環境から単離された）および遺伝子組換え形態を包含する。さらに、天然修飾ポリヌクレオチド、例えばグリコシル化もしくはメチル化ポリヌクレオチドまたは人工修飾ポリヌクレオチド、例えばビオチン化ポリヌクレオチドを含む化学修飾ポリヌクレオチドも含まれる。さらに、「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は互換的であり、任意の核酸を指す。「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語はまた具体的には、５つの生物学的に生じる塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル）以外の塩基で構成された核酸も含む。
【００２５】
「同一性」または「配列同一性」という用語は当技術分野で公知であり、２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列、すなわち参照配列と、参照配列と比較される所与の配列間の関係を指す。配列同一性は、所与の配列と参照配列の列間の一致によって決定される最高の配列類似性をもたらすよう最適に整列させた後に、所与の配列を参照配列と比較することによって決定される。このようなアラインメントで、配列同一性は、ポジション・バイ・ポジション（ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ）に基づいて確認される、例えば、特定の位置で、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基が同一であれば、その位置で配列が「同一である」。次いで、このような位置同一性の総数を参照配列中のヌクレオチドまたは残基の総数で割って、配列同一性％を得る。配列同一性は、それだけに限らないが、その教示が参照により本明細書に組み込まれる、Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988)、Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993)；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987)；Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991)；およびCarillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)に記載されるものを含む公知の方法によって容易に計算することができる。配列同一性を決定するための好ましい方法は、試験する配列間の最大の一致をもたらすよう設計される。配列同一性を決定するための方法は、所与の配列間の配列同一性を決定する公的に入手可能なコンピュータプログラムで体系化される。このようなプログラムの例としては、それだけに限らないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)が挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムはＮＣＢＩおよび他の供給元から公的に入手可能である（その教示が参照により本明細書に組み込まれる、BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)）。これらのプログラムは、所与の配列と参照配列との間の最高レベルの配列同一性をもたらすために、デフォルトギャップ質量を用いて配列を最適に整列させる。実例として、参照ヌクレオチド配列と少なくとも例えば８５％、好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％の「配列同一性」を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによって、所与のポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチド当たり最大１５個、好ましくは最大１０個、さらにより好ましくは最大５個の点突然変異を含み得ることを除いて、所与のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることを意図している。換言すれば、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドでは、参照配列中のヌクレオチドの最大１５％、好ましくは１０％、さらにより好ましくは５％が欠失され得るまたは別のヌ��レオチドで置換され得る、あるいは参照配列中の全ヌクレオチドの最大１５％、好ましくは１０％、さらにより好ましくは５％のいくつかのヌクレオチドが参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの突然変異は、参照ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端位置、または参照配列もしくは参照配列内の１つもしくは複数の連続した群中のヌクレオチド間に個別に散在して、これらの末端位置の間のどこかに生じ得る。同様に、参照アミノ酸配列と少なくとも例えば８５％、好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％の配列同一性を有する所与のアミノ酸配列を有するポリペプチドによって、所与のポリペプチド配列が参照アミノ酸配列の各１００アミノ酸当たり最大１５個、好ましくは最大１０個、さらにより好ましくは最大５個のアミノ酸変化を含み得ることを除いて、ポリペプチドの所与のアミノ酸配列が参照配列と同一であることを意図している。換言すれば、参照アミノ酸配列と少なくとも８５％、好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％の配列同一性を有する所与のポリペプチド配列を得るために、参照配列中のアミノ酸残基の最大１５％、好ましくは最大１０％、さらにより好ましくは最大５％が欠失され得るまたは別のアミノ酸で置換され得る、あるいは参照配列中のアミノ酸残基の総数の最大１５％、好ましくは最大１０％、さらにより好ましくは最大５％のいくつかのアミノ酸が参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸配列のアミノもしくはカルボキシ末端位置、または参照配列もしくは参照配列内の１つもしくは複数の連続した群中の残基間に個別に散在して、これらの末端位置の間のどこかに生じ得る。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。しかしながら、配列同一性を決定する場合、保存的置換を一致として含めない。
【００２６】
「同一性」、「配列同一性」および「同一性％」という用語は本明細書で互換的に使用される。本発明の目的のために、ここでは、２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性％を決定するために、配列を最適な比較目的のために整列させる（例えば、第２のアミノまたは核酸配列との最適なアラインメントのために、第１のアミノ酸または核酸の配列にギャップを導入することができる）ことが定義される。次いで、対応するアミノ酸またはヌクレオチド位置のアミノ酸またはヌクレオチド残基を比較する。第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸またはヌクレオチド残基によって占められていれば、分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性％は、それらの配列によって共有される同一の位置の数の関数である［すなわち、同一性％＝同一の位置の数／位置（すなわち、重複する位置）の総数×１００］。好ましくは、２つの配列が同じ長さである。
配列比較は、比較する２つの配列の全長にわたって、または２つの配列の断片にわたって行うことができる。典型的には、比較を、比較する２つの配列の全長にわたって行う。しかしながら、配列同一性を、例えば、２０、５０、１００またはそれ以上の連続アミノ酸残基の領域にわたって行うことができる。
【００２７】
当業者であれば、２つの配列間の相同性を決定するためにいくつかの異なるコンピュータプログラムが利用可能であるという事実に気づくだろう。例えば、２つの配列間の配列の比較および同一性％の決定を、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。好ましい実施形態では、２つのアミノ酸または核酸配列間の同一性％を、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｇｃｇ／で入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ［J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)］アルゴリズムを使用して、Ｂｌｏｓｕｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、およびギャップ質量１６、１４、１２、１０、８、６または４および長さ質量１、２、３、４、５または６を使用して決定する。当業者であれば、異なるアルゴリズムを使用した場合、これらの全ての異なるパラメータがわずかに異なる結果をもたらすが、２つの配列の全体的な同一性％は有意には変化しないことを認識するだろう。
【００２８】
本発明のタンパク質配列または核酸配列をさらに「クエリー配列（ｑｕｅｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」として使用して、公的データベースに対して検索を行って、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定することができる。このような検索は、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰプログラム（バージョン２．０）を使用して行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＢＬＡＳＴＰプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で行って、本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためのギャップ入りアラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴをAltschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402に記載されるように利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（例えば、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ）を使用することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／の国立バイオテクノロジー情報センターのホームページを参照されたい。
【００２９】
さらに、本発明は、本明細書に記載されるＰＰＶ  ＶＰ２を含む免疫原性組成物を提供する。よって、本発明は、
−  アミノ酸２２８位のグルタミン酸残基もしくはグルタメート残基、および／または
−  アミノ酸４１４位のセリン残基、および／または
−  アミノ酸４１９位のグルタミン残基、および／または
−  アミノ酸４３６位のスレオニン残基
を有するブタパルボウイルス（ＰＰＶ）ウイルスタンパク質２（ＶＰ２）を含む免疫原性組成物であって、
アミノ酸位置の番号付けは野生型ＰＰＶ  ＶＰ２のアミノ酸配列を参照する、組成物を提供する。
【００３０】
「免疫原性組成物」という用語は、免疫原性組成物が投与された宿主において免疫学的応答を誘発する少なくとも１つの抗原を含む組成物を指す。このような免疫学的応答は、本発明の免疫原性組成物に対する細胞および／または抗体媒介免疫応答であり得る。好ましくは、免疫原性組成物は免疫応答を誘導し、より好ましくは、ＰＰＶ感染の臨床徴候の１つまたは複数に対する防御免疫を与える。宿主は「対象」とも記載される。好ましくは、本明細書に記載または言及される宿主または対象のいずれもブタ類（イノシシ科動物の総称）である。
【００３１】
通常、「免疫学的応答」には、それだけに限らないが、以下の効果の１つまたは複数が含まれる：本発明の免疫原性組成物に含まれる１つまたは複数の抗原に特異的に向けられた、抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞および／または細胞傷害性Ｔ細胞および／またはγ−δＴ細胞の産生または活性化。好ましくは、宿主は防御免疫学的応答または治療的応答のいずれかを示す。
「防御免疫学的応答」または「防御免疫」は、感染宿主によって通常示される臨床徴候の減少もしくは欠如、より速い回復時間および／または感染宿主の組織もしくは体液もしくは排泄物中の感染力の持続時間の低下もしくは病原体力価の低下によって実証される。
【００３２】
新たな感染に対する耐性が増強されるおよび／または疾患の臨床的重症度が減少するように宿主が防御免疫学的応答を示す場合、免疫原性組成物は「ワクチン」として記載される。
本発明の一態様では、免疫原性組成物が単回投与用に製剤化される。
単回投与のための体積は本明細書の他で定義されている。
免疫原性組成物は、好ましくは、局所または全身投与される。従来から使用される適切な投与経路は、経口または非経口投与、例えば鼻腔内、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下ならびに吸入である。しかしながら、化合物の性質および作用様式に応じて、免疫原性組成物を他の経路でも投与することができる。しかしながら、最も好ましくは、免疫原性組成物は筋肉内投与される。
【００３３】
本発明の一態様では、免疫原性組成物が筋肉内投与される。
本発明の一態様では、免疫原性組成物が、妊娠および授乳中の未経産雌ブタおよび／または経産雌ブタにとって安全である。
本発明の一態様では、免疫原性組成物が、３０日間の懐胎、好ましくは４０日間の懐胎から未経産雌ブタおよび／または経産雌ブタにとって安全である。
本発明の一態様では、免疫原性組成物が、薬学的に許容される担体をさらに含む。
「薬学的に許容される担体」という用語は、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、安定剤、希釈剤、保存剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、吸着遅延剤、アジュバント、免疫刺激剤ならびにこれらの組合せを含む。
【００３４】
「希釈剤」には水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセリンなどが含まれ得る。等張剤には塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースなどが含まれ得る。安定剤にはアルブミンおよびエチレンジアミン四酢酸のアルカリ塩などが含まれる。
本発明の一態様では、薬学的に許容される担体がカルボマーである。
好ましくは、免疫原性組成物は、１種または複数の他の免疫調節剤、例えばインターロイキン、インターフェロンまたは他のサイトカインをさらに含むことができる。本発明の文脈で有用なアジュバントおよび添加剤の量および濃度は当業者によって容易に決定され得る。
いくつかの態様では、本発明の免疫原性組成物がアジュバントを含有する。本明細書で使用される「アジュバント」には、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム、サポニン、例えばＱｕｉｌ  Ａ、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＭＡ）、ＧＰＩ−０１００（Ｇａｌｅｎｉｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）、油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョン、水中油中水型エマルジョンが含まれ得る。エマルジョンは、特に、軽質流動パラフィン油（ヨーロッパ薬局方（Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅａ）型）；イソプレノイド油、例えばスクアランまたはスクアレン；アルケン、特にイソブテンまたはデセンのオリゴマー化から生じる油；直鎖アルキル基を含む酸またはアルコールのエステル、より具体的には植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールジ（カプリレート／カプレート）、グリセリルトリ（カプリレート／カプレート）またはプロピレングリコールジオレエート；分岐脂肪酸またはアルコールのエステル、特にイソステアリン酸エステルに基づき得る。油を乳化剤と組み合わせて使用してエマルジョンを形成する。乳化剤は、好ましくは非イオン性界面活性剤、特にソルビタンのエステル、マンニド（ｍａｎｎｉｄｅ）のエステル（例えば、アンヒドロマンニトールオレエート）、グリコールのエステル、ポリグリセロールのエステル、プロピレングリコールのエステル、およびエトキシル化されていてもよいオレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸またはヒドロキシステアリン酸のエステル、およびポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンコポリマーブロック、特にＰｌｕｒｏｎｉｃ製品、特にＬ１２１である。Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.), JohnWiley and Sons, NY, pp51-94 (1995)およびTodd et al., Vaccine 15:564-570 (1997)を参照されたい。代表的なアジュバントは、“Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach” edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995の１４７頁に記載されているＳＰＴエマルジョンおよびこの同じ本の１８３頁に記載されているエマルジョンＭＦ５９である。
【００３５】
アジュバントのさらなる例は、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマー、および無水マレイン酸とアルケニル誘導体のコポリマーから選択される化合物である。有利なアジュバント化合物は、特に糖またはポリアルコールのポルアルケニルエーテルと架橋したアクリル酸またはメタクリル酸のポリマーである。これらの化合物はカルボマーという用語で知られている（Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996）。当業者であれば、少なくとも３個、好ましくは８個以下のヒドロキシル基を有し、少なくとも３個のヒドロキシルの水素原子が少なくとも２個の炭素原子を有する不飽和脂肪族基によって置き換えられているポリヒドロキシル化化合物と架橋したこのようなアクリルポリマーを記載する米国特許第２９０９４６２号も参照することができる。好ましい基は、２〜４個の炭素原子を含有するもの、例えばビニル、アリルおよび他のエチレン性不飽和基である。不飽和基自体が他の置換基、例えばメチルを含有していてもよい。Ｃａｒｂｏｐｏｌ；（ＢＦ  Ｇｏｏｄｒｉｃｈ、Ｏｈｉｏ、米国）という名称で販売されている製品が特に適している。これらはアリルスクロースまたはアリルペンタエリスリトールと架橋している。中でも、Ｃａｒｂｏｐｏｌ  ９７４Ｐ、９３４Ｐおよび９７１Ｐを挙げることができる。Ｃａｒｂｏｐｏｌ  ９７１Ｐの使用が最も好ましい。無水マレイン酸とアルケニル誘導体のコポリマーの中には、無水マレイン酸とエチレンのコポリマーである、コポリマーＥＭＡ（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）がある。これらのポリマーの水への溶解によって酸溶液が得られ、これは、免疫原性組成物、免疫学的組成物またはワクチン組成物自体を組み込むアジュバント溶液を得るために、好ましくは生理的ｐＨに中和される。
【００３６】
さらなる適切なアジュバントには、それだけに限らないが、ＲＩＢＩアジュバント系（Ｒｉｂｉ  Ｉｎｃ．）、Ｂｌｏｃｋコポリマー（ＣｙｔＲｘ、Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡ）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）、モノホスホリル脂質Ａ、アブリジン脂質−アミンアジュバント、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（組換えまたはその他）由来の熱不安定性エンテロトキシン、コレラ毒素、ＩＭＳ  １３１４もしくはムラミルジペプチド、または天然もしくは組換えサイトトキシンもしくはその類似物、または内因性サイトカイン放出の刺激剤などが含まれる。
【００３７】
アジュバントを、１投与量当たり約１００μｇ〜約１０ｍｇの量、好ましくは１投与量当たり約１００μｇ〜約１０ｍｇの量、より好ましくは１投与量当たり約５００μｇ〜約５ｍｇの量、さらにより好ましくは１投与量当たり約７５０μｇ〜約２．５ｍｇの量、最も好ましくは１投与量当たり約１ｍｇの量で添加することができると予想される。あるいは、アジュバントは、最終製品の約０．０１体積％〜５０体積％の濃度、好ましくは約２体積％〜３０体積％の濃度、より好ましくは約５体積％〜２５体積％の濃度、さらにより好ましくは約７体積％〜２２体積％の濃度、最も好ましくは１０体積％〜２０体積％の濃度であり得る。
【００３８】
本発明の一態様では、免疫原性組成物が約０．１μｇ〜５０μｇのＰＰＶ  ＶＰ２抗原を含む。好ましくは、免疫原性組成物が、約０．２μｇ〜４０μｇ、より好ましくは約０．３μｇ〜３０μｇ、より好ましくは約０．４μｇ〜２０μｇ、さらにより好ましくは約０．５μｇ〜１０μｇを含み、０．５μｇ、０．７５μｇ、１μｇ、１．２５μｇ、１．５μｇ、２μｇ、２．５μｇ、３μｇ、３．５μｇ、４μｇ、４．５μｇ、５μｇ、５．５μｇ、６μｇ、６．５μｇ、７μｇ、７．５μｇ、８μｇ、８．５μｇ、９μｇ、９．５μｇまたは１０μｇのＰＰＶ  ＶＰ２抗原が最も好ましい。
本発明の一態様では、免疫原性組成物がワクチンである。
「ワクチン」という用語は、本明細書の他で既に記載されている。しかしながら、新たな感染に対する耐性が増強されるおよび／または疾患の臨床的重症度が減少するように宿主が防御免疫学的応答を示す場合、免疫原性組成物は「ワクチン」として記載される。
【００３９】
本発明の一態様では、免疫原性組成物が同種および／または異種チャレンジから防御する。有利なことには、本発明によって提供される実験データが、本発明のワクチンが異種北米ならびに異種欧州チャレンジ株から防御するので、広範な防御範囲を有することを開示している。
「防御する」および「予防」および「予防すること」という用語は本出願で互換的に使用される。これらの用語は他で定義されている。
本発明の一態様では、免疫原性組成物が北米および／または欧州単離株によるチャレンジから防御する。
「北米および欧州単離株」という用語は当業者に周知である。「北米および／または欧州単離株」という用語は、北米および欧州で分離されたまたは分離される全ての単離株を包含する。
【００４０】
本発明の一態様では、免疫原性組成物が北米および／または欧州単離株に対して交差防御性である。
本発明の一態様では、免疫原性組成物が、必要な対象においてＰＰＶ感染によって引き起こされる臨床徴候の治療および／または予防において有効である。「治療および／または予防」、「臨床徴候」および「必要な」という用語は他で定義されている。
さらに、本発明は、本明細書に記載されるＰＰＶ  ＶＰ２をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
さらに、本発明は、配列番号３または配列番号４のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％または少なくとも９９．９％の配列を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００４１】
さらに、本発明は、配列番号３または配列番号４のヌクレオチド配列を含むまたはヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを提供する。
さらに、本発明は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
本発明の一態様では、ベクターが発現ベクターである。
本発明の一態様では、ベクターがバキュロウイルスである。
「ベクター」という用語は当業者に周知である。「ベクター」という用語は、当技術分野で知られているように、遺伝物質を宿主細胞に伝達するために使用されるポリヌクレオチド構築物、典型的にはプラスミドまたはウイルスを指す。ベクターは、例えば、ウイルス、プラスミド、コスミドまたはファージであり得る。本明細書で使用されるベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかで構成され得る。いくつかの実施形態では、ベクターがＤＮＡで構成される。「発現ベクター」は、適切な環境中に存在する場合に、ベクターによって保有される１つまたは複数の遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を指示することができるベクターである。ベクターは、好ましくは自律複製可能である。典型的には、発現ベクターは転写プロモーター、遺伝子および転写ターミネーターを含む。遺伝子発現は通常、プロモーターの制御下に置かれ、遺伝子はプロモーターと「作動可能に連結している（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ）」と言われる。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結している」という用語は、調節エレメントと遺伝子またはそのコード領域との間の連結を記載するために使用される。典型的には、遺伝子発現は、１つまたは複数の調節エレメント、例えば、限定されないが、構成的または誘導性プロモーター、組織特異的調節エレメントおよびエンハンサーの制御下に置かれる。遺伝子またはコード領域は、調節エレメントと「作動可能に連結している（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏまたはｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ）」または「作動可能に会合している（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ）」と言われ、これは遺伝子またはコード領域が調節エレメントによって制御されているまたは影響を受けることを意味する。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現をもたらす場合、プロモーターはコード配列と作動可能に連結している。
【００４３】
発現用のベクター（または組換え体）を作製および／または使用するためのベクターおよび方法は、特にＤＮＡ発現ベクターに関して、米国特許第４６０３１１２号、同第４７６９３３０号、同第５１７４９９３号、同第５５０５９４１号、同第５３３８６８３号、同第５４９４８０７号、同第４７２２８４８号、同第５９４２２３５号、同第５３６４７７３号、同第５７６２９３８号、同第５７７０２１２号、同第５９４２２３５号、同第３８２４２５号、ＰＣＴ公開国際公開第９４／１６７１６号、国際公開第９６／３９４９１号、国際公開第９５／３００１８号；Paoletti, "Applications of pox virus vectors to vaccination: An update, "PNAS USA 93: 11349-11353, October 1996；Moss, "Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety," PNAS USA 93: 11341-11348, October 1996；Ｓｍｉｔｈらの米国特許第４７４５０５１号（組換えバキュロウイルス）；Richardson, C. D. (Editor), Methods in Molecular Biology 39, "Baculovirus Expression Protocols" (1995 Humana Press Inc.)；Smith et al., "Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector", Molecular and Cellular Biology, December, 1983, Vol. 3, No. 12, p. 2156-2165；Pennock et al., "Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector, "Molecular and Cellular Biology March 1984, Vol. 4, No. 3, p. 406；欧州特許第０３７０５７３号；１９８６年１０月１６日に出願された米国特許出願番号第９２０１９７号；欧州特許公開番号第０２６５７８５号；米国特許第４７６９３３１号（組換えヘルペスウイルス）；Roizman, "The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors," PNAS USA 93:11307-11312, October 1996；Andreansky et al., "The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors," PNAS USA 93: 11313-11318, October 1996；Robertson et al., "Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes", PNAS USA 93: 11334-11340, October 1996；Frolov et al., "Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications," PNAS USA 93: 11371-11377, October 1996；Kitson et al., J. Virol. 65, 3068-3075, 1991；米国特許第５５９１４３９号、同第５５５２１４３号；国際公開第９８／００１６６号；共に１９９６年７月３日に出願された許可された米国出願番号第０８／６７５５５６号および同第０８／６７５５６６号（組換えアデノウイルス）；Grunhaus et al., 1992, "Adenovirus as cloning vectors," Seminars in Virology (Vol. 3) p. 237-52, 1993；Ballay et al. EMBO Journal, vol. 4, p. 3861-65、Graham, Tibtech 8, 85-87, April, 1990；Prevec et al., J. Gen Virol. 70, 42434；ＰＣＴ国際公開第９１／１１５２５号；Felgner et al. (1994), J. Biol. Chem. 269, 2550-2561、Science, 259: 1745-49, 1993；およびMcClements et al., "Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease", PNAS USA 93: 11414-11420, October 1996；ならびに米国特許第５５９１６３９号、同第５５８９４６６号および同第５５８０８５９号ならびに国際公開第９０／１１０９２号、国際公開第９３／１９１８３号、国際公開第９４／２１７９７号、国際公開第９５／１１３０７号、国際公開第９５／２０６６０号；Tang et al., Nature, and Furth et al., Analytical Biochemistryに開示される方法により得るまたはこれと同様であり得る。国際公開第９８／３３５１０号；Ju et al., Diabetologia, 41: 736-739, 1998（レンチウイルス発��系）；Ｓａｎｆｏｒｄらの米国特許第４９４５０５０号；Ｆｉｓｃｈｂａｃｈｅｔら（Ｉｎｔｒａｃｅｌ）；国際公開第９０／０１５４３号；Robinson et al., Seminars in Immunology vol. 9, pp. 271-283 (1997)、（ＤＮＡベクター系）；Ｓｚｏｋａらの米国特許第４３９４４４８号（ＤＮＡを生細胞中に挿入する方法）；ＭｃＣｏｒｍｉｃｋらの米国特許第５６７７１７８号（細胞変性ウイルスの使用）；および米国特許第５９２８９１３号（遺伝子送達用ベクター）；ならびに本明細書に引用される他の文献も参照されたい。
【００４４】
「調節エレメント」および「発現制御エレメント」という用語は互換的に使用され、特定の宿主生物中の作動可能に連結したコード配列の発現に影響を及ぼすことができる核酸分子を指す。これらの用語は広義に使用され、プロモーター、ＲＮＡポリメラーゼと転写因子の基本的な相互作用に必要なコアエレメント、上流エレメント、エンハンサーおよび応答エレメントを含む、転写を促進または調節する全てのエレメントを網羅する。原核生物の代表的な調節エレメントには、プロモーター、オペレーター配列およびリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞で使用される調節エレメントには、限定されないが、宿主細胞におけるコード配列の発現および／またはコードされるポリペプチドの産生をもたらすおよび／または調節する、転写および翻訳制御配列、例えばプロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナル、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、２Ａ配列などが含まれ得る。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を可能にし、遺伝子の転写を指示するヌクレオチド配列である。典型的には、プロモーターは、遺伝子の転写開始部位の近位の、遺伝子の５’非コード領域に位置する。転写の開始において機能するプロモーター内の配列エレメントは通常、コンセンサスヌクレオチド配列によって特徴付けられる。プロモーターの例としては、それだけに限らないが、細菌、酵母、植物、ウイルスおよび哺乳動物（ヒトを含む）由来のプロモーターが挙げられる。プロモーターは誘導性、抑制性および／または構成的であり得る。誘導性プロモーターは、温度変化などの培養条件のある変化に応じて、その制御下でＤＮＡからの増加したレベルの転写を開始する。
本明細書で使用する場合、「エンハンサー」という用語は、転写開始部位に対するエンハンサーの距離または配向にかかわらず、転写効率を増加させることができるタイプの調節エレメントを指す。
【００４６】
限定されないが、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1989)）に記載される制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製およびＤＮＡ配列決定の標準的な技術を含む、当技術分野で周知の任意の適切な遺伝子工学技術を使用して、ウイルスベクターの作製を達成することができる。
【００４７】
「バキュロウイルス」という用語は当業者に周知である。しかしながら、本明細書で使用する場合、「バキュロウイルス」は特に、所望のタンパク質を発現するように設計された組換えバキュロウイルスベクターを使用して昆虫細胞内で所望のタンパク質を産生するための系を意味する。バキュロウイルス発現系は、一般に、昆虫細胞内での組換えタンパク質発現を達成するのに必要な全てのエレメントを含み、典型的には、所望のタンパク質を発現させるためのバキュロウイルスベクターの操作、操作したバキュロウイルスベクターの昆虫細胞への導入、所望のタンパク質が発現されるように操作したバキュロウイルスベクターを含む昆虫細胞の適切な増殖培地中での培養、およびタンパク質の回収を含む。典型的には、バキュロウイルスベクターの操作は、選択された遺伝子のコード配列を非必須ウイルス遺伝子のプロモーターの後ろに挿入した組換えバキュロウイルスの構築および単離を含み、現在使用されているバキュロウイルス発現系のほとんどがオートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）（（Virology 202 (2), 586-605 (1994)、ＮＣＢＩ受託番号：ＮＣ＿００１６２３）の配列に基づく。バキュロウイルス発現系は当技術分野で周知であり、例えば、“Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual” by David R. O'Reilly, Lois Miller, Verne Luckow, pub. by Oxford Univ. Press (1994)、“The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide” by Linda A. King, R. D. Possee, published by Chapman & Hall (1992)に記載されている。組換えタンパク質を産生するためのバキュロウイルス系の代表的な非限定的な例は、例えば国際公開第２００６／０７２０６５号に記載されている。
【００４８】
好ましいバキュロウイルスベクターには、特に産生細胞が昆虫細胞であるならば、ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）またはＤｉａｍｏｎｄＢａｃ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）などのバキュロウイルスが含まれる。バキュロウイルス発現系が好ましいが、他の発現系が本発明の目的のために働くことが当業者によって理解される。
さらに、本発明は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドまたはベクターを含む細胞を提供する。好ましくは、ベクターがバキュロウイルスである。
「細胞」という用語は、当業者に周知である。「細胞」という用語は、動物細胞、原生生物細胞、植物細胞または真菌細胞などの真核細胞を包含する。好ましくは、真核細胞は哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ、ＢＨＫもしくはＣＯＳ、または真菌細胞、例えば出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、または昆虫細胞、例えばＳｆ９である。
【００４９】
本発明の一態様では、細胞が昆虫細胞である。
本明細書で使用される「昆虫細胞」は、昆虫種に由来する細胞または細胞培養物を意味する。ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）およびイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）種由来の昆虫細胞が本発明に関して特に興味深い。
好ましくは、本明細書で言及される昆虫細胞は、ヨトウガ（Ｓｆ）細胞またはヨトウガ由来の細胞株の細胞であり、より好ましくはＳｆ９細胞およびＳｆ＋細胞からなる群から選択される。それぞれ、本明細書で言及される昆虫細胞は、好ましくはヨトウガ（Ｓｆ）細胞またはヨトウガ由来の細胞株の細胞であり、より好ましくはＳｆ９細胞およびＳｆ＋細胞からなる群から選択される。
【００５０】
本発明の一態様では、昆虫細胞がＳｆ９細胞およびＳｆ＋細胞からなる群から選択される。
さらに、本発明は、本明細書に記載されるＰＰＶ  ＶＰ２を含むウイルス様粒子を提供する。
「ウイルス様粒子」（ＶＬＰ）という用語は、ウイルス由来の非複製空ウイルスシェルを包含する。ＶＬＰは一般的に、それだけに限らないが、カプシド、コート、シェル、表面および／またはエンベロープタンパク質、あるいはこれらのタンパク質由来の粒子形成ポリペプチドと呼ばれるタンパク質などの１つまたは複数のウイルスタンパク質で構成される。ＶＬＰは、適切な発現系におけるタンパク質の組換え発現で自発的に形成し得る。ウイルスタンパク質の組換え発現後のＶＬＰの存在は、当技術分野で公知の従来の技術を使用して、例えば電子顕微鏡、Ｘ線結晶構造解析などによって検出することができる。例えば、Baker et al., Biophys. J. (1991) 60: 1445-1456；Hagensee et al., J. Virol. (1994) 68:4503-4505を参照されたい。例えば、低温電子顕微鏡法を当のＶＬＰ調製物のガラス化水性試料に行い、画像を適切な露光条件下で記録することができる。
【００５１】
「ウイルス様粒子」（ＶＬＰ）という用語はまた、複数のＰＰＶ  ＶＰ２で構成されたＶＬＰを包含する。
本発明の一態様では、ウイルス様粒子が本明細書に記載される複数のＰＰＶ  ＶＰ２で構成される。
さらに、本発明は、細胞を本明細書に記載されるベクターでトランスフェクトするステップを含む、本明細書に記載されるＰＰＶ  ＶＰ２を作製する方法を提供する。
さらに、本発明は、細胞、好ましくは昆虫細胞を、本明細書に記載されるバキュロウイルスで感染させるステップを含む、本明細書に記載されるＰＰＶ  ＶＰ２を産生する方法を提供する。
【００５２】
組成物を、所望であれば、有効成分を含有する１つまたは複数の単位剤形を含有し得るパックまたはディスペンサー装置で提供することができる。パックは例えば、金属またはプラスチック箔を含む、例えばブリスターパックである。パックまたはディスペンサー装置に、投与、好ましくは動物、特にブタ類への投与のための説明書を付随させることができる。ヒト投与についての製造、使用または販売の政府機関による承認を反映する、医薬品または生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定される形態の通知を１つまたは複数のこのような容器に付随させることができる。
よって、本発明は、本明細書に記載されるＰＰＶ  ＶＰ２または免疫原性組成物を含むキットを提供する。
本発明の一態様では、キットが、ブタ類の疾患の治療および／または予防のための指示書面をさらに含む。
【００５３】
本発明の一態様では、キットが、ＰＰＶ感染の治療および／または予防のための指示書面をさらに含む。
本発明の別の態様では、本発明のＰＰＶウイルスが不活性化されて、本明細書に記載されるウイルスタンパク質２（ＶＰ２）による全不活性化ウイルスが得られる。
よって、本発明はまた、
−  アミノ酸２２８位のグルタミン酸残基もしくはグルタメート残基、および／または
−  アミノ酸４１４位のセリン残基、および／または
−  アミノ酸４１９位のグルタミン残基、および／または
−  アミノ酸４３６位のスレオニン残基
を有するウイルスタンパク質２（ＶＰ２）を有する不活性化ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）であって、
アミノ酸位置の番号付けは野生型ＰＰＶ  ＶＰ２のアミノ酸配列を参照する、ＰＰＶに言及する。
【００５４】
さらに、本発明はまた、配列番号１、配列番号２または配列番号５〜１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはアミノ酸配列からなるウイルスタンパク質２（ＶＰ２）を有する不活性化ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）に言及する。
さらに、本発明はまた、本明細書に記載されるウイルスタンパク質２（ＶＰ２）を有する不活性化ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）を含む免疫原性組成物に言及する。
よって、本発明はまた、
−  アミノ酸２２８位のグルタミン酸残基もしくはグルタメート残基、および／または
−  アミノ酸４１４位のセリン残基、および／または
−  アミノ酸４１９位のグルタミン残基、および／または
−  アミノ酸４３６位のスレオニン残基
を有するウイルスタンパク質２（ＶＰ２）を有する不活性化ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）を含む免疫原性組成物であって、
アミノ酸位置の番号付けは野生型ＰＰＶ  ＶＰ２のアミノ酸配列を参照する、組成物に言及する。
【００５５】
よって、本発明はまた、配列番号１、配列番号２または配列番号５〜１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはアミノ酸配列からなるウイルスタンパク質２（ＶＰ２）を有する不活性化ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）を含む免疫原性組成物に言及する。
任意の従来の不活性化法を本発明の目的のために使用することができる。よって、不活性化を、当業者に公知の化学的および／または物理的処理によって行うことができる。好ましい不活性化法には、バイナリーエチレンイミン（ｂｉｎａｒｙ  ｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）（ＢＥＩ）に環化された２−ブロモエチレンアミンヒドロブロミド（ＢＥＡ）の溶液の添加を含む環化バイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）の添加が含まれる。好ましいさらなる化学不活性化剤は、それだけに限らないが、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、デオキシコール酸ナトリウム、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、β−プロピオラクトン、チメロサール、フェノールおよびホルムアルデヒド（ホルマリン）を含む。しかしながら、不活性化は中和ステップも含み得る。好ましい中和剤には、それだけに限らないが、チオ硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウムなどが含まれる。
【００５６】
好ましいホルマリン不活性化条件には、約０．０２％（ｖ／ｖ）〜２．０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約０．１％（ｖ／ｖ）〜１．０％（ｖ／ｖ）、さらにより好ましくは約０．１５％（ｖ／ｖ）〜０．８％（ｖ／ｖ）、さらにより好ましくは約０．１６％（ｖ／ｖ）〜０．６％（ｖ／ｖ）、最も好ましくは約０．２％（ｖ／ｖ）〜０．４％（ｖ／ｖ）のホルマリン濃度が含まれる。インキュベーション時間はＰＰＶの耐性に依存する。一般に、適切な培養系でＰＰＶの増殖を検出することができなくなるまで、不活性化工程を行う。
好ましくは、本発明の不活性化ＰＰＶは、好ましくは本明細書の上に記載される濃度を使用してホルマリン不活性化される。
本発明の不活性化ＰＰＶを、Nature, 1974, 252, 252-254 or Journal of Immunology, 1978, 120, 1109-13に記載されるような公知の技術を使用してリポソームに組み込むことができる。本発明の別の実施形態では、本発明の不活性化ＰＰＶを、多糖、ペプチド、タンパク質などまたはこれらの組合せなどの適切な生物学的化合物にコンジュゲートすることができる。
【００５７】
本発明はまた、医薬品、好ましくはワクチンを調製するための、
−  本明細書に記載されるＰＰＶ  ＶＰ２、
−  本明細書に記載される免疫原性組成物、
−  本明細書に記載されるポリヌクレオチド、
−  本明細書に記載されるベクター、
−  本明細書に記載される細胞、
−  本明細書に記載されるバキュロウイルス、および／または
−  本明細書に記載されるウイルス様粒子
の使用に言及する。
本発明はまた、ＰＰＶによる感染の治療および／または予防、ＰＰＶによる感染によって引き起こされる臨床徴候の減少、予防および／または治療、ならびにＰＰＶによる感染によって引き起こされる疾患の治療および／または予防のための医薬品を調製するための、本明細書に記載されるＰＰＶ  ＶＰ２または本明細書に記載される免疫原性組成物の使用に言及する。
【００５８】
さらに、本発明は、本明細書に記載される免疫原性組成物を対象に投与するステップを含む、対象を免疫する方法を提供する。
「免疫すること」という用語は、免疫原性組成物を免疫する対象に投与し、それによってこのような免疫原性組成に含まれる抗原に対する免疫学的応答を引き起こすことによる能動免疫に関する。
好ましくは、免疫が群れの特定のＰＰＶ感染の発生率を低下させる、および／または特定のＰＰＶ感染によって引き起こされるもしくは特定のＰＰＶ感染に関連する臨床徴候の重症度を減少させる。
【００５９】
さらに、本明細書で提供される免疫原性組成物による必要な対象の免疫化は、ＰＰＶ感染による対象の感染の予防をもたらす。さらにより好ましくは、免疫化はＰＰＶ感染に対する有効で長期持続性の免疫学的応答をもたらす。前記期間は、１カ月超、好ましくは２カ月超、好ましくは３カ月超、より好ましくは４カ月超、より好ましくは５カ月超、より好ましくは６カ月超の間続くことが理解されるだろう。免疫化が免疫した全ての対象において有効となり得るわけでないことが理解されるべきである。しかしながら、この用語は、群れの対象のかなりの部分が有効に免疫化されることを要する。
【００６０】
好ましくは、通常、すなわち、免疫なしでは、ＰＰＶ感染によって引き起こされるまたはＰＰＶ感染に関連する臨床徴候を発症するであろう対象の群れが本明細書において想起される。群れの対象が有効に免疫されているかどうかは、当業者によってさらなる面倒なしに決定することができる。好ましくは、所与の群れの対象の少なくとも３３％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％における臨床徴候が、免疫されていないまたは本発明の前に入手可能であった免疫原性組成物で免疫されているが、その後特定のＰＰＶによって感染した対象と比較して少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、さらにより好ましくは少なくとも３０％、さらにより好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％、発生率または重症度において減少する場合、免疫が有効であるとする。
【００６１】
さらに、本発明は、必要な対象においてＰＰＶ感染によって引き起こされる臨床徴候を治療および／または予防する方法であって、治療上有効量の本明細書に記載される免疫原性組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
有利なことに、本明細書の実施例節に示されるように、本明細書で提供される免疫原性組成物が、必要な対象においてＰＰＶ感染によって引き起こされる臨床徴候を治療および／または予防するのに有効であることが判明した。
「治療および／または予防」という用語は、群れにおける特定のＰＰＶ感染の発生率の減少および／または特定のＰＰＶ感染によって引き起こされるもしくは特定のＰＰＶ感染に関連する臨床徴候の重症度の減少を指す。よって、「治療および／または予防」という用語はまた、有効量の本明細書で提供される免疫原性組成物を受けていない動物の群と比較した、このような有効量の免疫原性組成物を受けた動物の群における、特定のＰＰＶに感染した群れの中の動物の数の減少（＝特定のＰＰＶ感染の発生率の減少）および／または通常ＰＰＶ感染に関連するもしくはＰＰＶ感染によって引き起こされる臨床徴候の重症度の減少を指す。
【００６２】
「治療および／または予防」は一般的に、有効量の本発明の免疫原性組成物を、このような治療／予防を必要とするまたはこのような治療／予防から利益を得ることができるであろう対象または対象の群れに投与することを含む。「治療」という用語は、いったん対象または群れの少なくともいくらかの動物が当該ＰＰＶに既に感染しており、当該ＰＰＶ感染によって引き起こされるまたは当該ＰＰＶ感染に関連するある臨床徴候を既に示したら、有効量の免疫原性組成物を投与することを指す。「予防」という用語は、対象がＰＰＶに感染する前または少なくともこのような動物もしくは動物の群の中のいずれもＰＰＶによる感染によって引き起こされるもしくはＰＰＶによる感染に関連する臨床徴候を示していない場合の対象への投与を指す。「予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」および「予防すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」という用語は本出願で互換的に使用される。
【００６３】
本明細書で使用される「有効量」という用語は、対象において免疫応答を誘発するまたは誘発することができる抗原の量を意味するが、これに限られない。このような有効量は、群れにおける特定のＰＰＶ感染の発生率を減少させるおよび／または特定のＰＰＶ感染の臨床徴候の重症度を減少させることができる。
好ましくは、処置されていないまたは本発明の前に入手可能であった免疫原性組成物によって処置されているがその後特定のＰＰＶに感染した対象と比較して、臨床徴候が、少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、さらにより好ましくは少なくとも３０％、さらにより好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％、発生率または重症度において減少する。
【００６４】
本明細書で使用される「臨床徴候」という用語は、ＰＰＶからの対象の感染の徴候を指す。感染の臨床徴候は選択される病原体に依存する。このような臨床徴候の例としては、それだけに限らないが、胚および／または胎児感染および死亡を特徴とする一過性白血球減少症および生殖障害、またはこれらの組合せが挙げられる。直接観察可能な臨床徴候の例としては、産仔数減少、同腹仔当たりの胚もしくは胎児のミイラ化の増加、胚もしくは胎児の自己溶解、胚もしくは胎児のサイズの減少、胚もしくは胎児の質量減少などまたはこれらの組合せが挙げられる。このような臨床徴候のさらなる例としては、それだけに限らないが、ウイルス血症の増加、標的組織および血液中のウイルス量の増加、同畜舎内の動物（ｐｅｎｍａｔｅ）へのＰＰＶの伝播／拡散の増加など、またはこれらの組合せが挙げられる。
好ましくは、処置されていないまたは本発明の前に入手可能であった免疫原性組成物によって処置されているが、その後特定のＰＰＶに感染した対象と比較した、処置対象における発生率または重症度において減少した臨床徴候は、胚および／または胎児感染および死亡を特徴とする一過性白血球減少症および生殖障害、またはこれらの組合せを指す。
【００６５】
本明細書で使用される「必要とする（ｉｎ  ｎｅｅｄ）」または「必要な（ｏｆ  ｎｅｅｄ）」という用語は、投与／治療が、健康もしくは臨床徴候における増強もしくは改善、または本発明による免疫原性組成物を受ける動物（その胚または胎児を含む）の健康に対する任意の他のプラスの医学的効果に関連することを意味する。
「減少させること（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）」または「減少した（ｒｅｄｕｃｅｄ）」または「減少（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」または「低下させる（ｌｏｗｅｒ）」という用語は、本出願で互換的に使用される。「減少」という用語は、臨床徴候が、処置されていない（免疫されていない）が、その後特定のＰＰＶに感染した対象と比較して、少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、さらにより好ましくは少なくとも３０％、さらにより好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％減少することを意味する。
【００６６】
さらに、本発明は、同じ種の非免疫対照群の対象と比較して、対象における生殖障害を減少させる方法であって、治療上有効量の本明細書に記載される免疫原性組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
有利なことに、本明細書の実施例部分に示されるように、本明細書で提供される免疫原性組成物は、生殖障害を減少させるのに有効であることが判明した。
さらに、本発明は、同じ種の非免疫対照群の対象と比較して、対象における胚および胎児死亡を減少させる方法であって、治療上有効量の本明細書に記載される免疫原性組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
有利なことに、本明細書の実施例節に示されるように、本明細書で提供される免疫原性組成物は、胚および胎児死亡を減少させるのに有効であることが判明した。
【００６７】
さらに、本発明は、胚および胎児をブタパルボウイルス感染から防御するために繁殖ブタ（経産雌ブタおよび未経産雌ブタ）を能動免疫する方法であって、治療上有効量の本明細書に記載される免疫原性組成物を前記ブタ（経産雌ブタおよび未経産雌ブタ）に投与するステップを含む方法を提供する。
本発明の一態様では、前記対象がブタ類（イノシシ科動物の総称）、ウシ、ネコおよびイヌからなる群から選択される。
好ましくは、前記対象がブタ類である。ブタ類は雌および雄動物を含むことが理解されるべきである。精液はＰＰＶを含有し得、そのために、雌および雄繁殖動物が「ブタ類」という単語に包含される。よって、「ブタ類」という単語は、雄ブタなどの雄動物ならびに未経産雌ブタおよび雌ブタなどの雌動物を含む。
本明細書で使用される「未経産雌ブタ」という用語は、最初の懐胎／妊娠前および中のイノシシ・ブタ類（ｐｏｒｃｉｎｅ）、好ましくは（家畜）ブタ（ｐｉｇ）を指す。対照的に、本明細書で使用される「経産雌ブタ」という用語は、最初の懐胎／妊娠のプラスの結果としての最初の分娩後のイノシシ・ブタ類、好ましくは（家畜）ブタを指す。
【００６８】
本発明の一態様では、前記対象はブタ類、好ましくは未経産雌ブタおよび／または経産雌ブタである。
本発明の一態様では、免疫原性組成物が１回投与される。
単回投与は１回だけ投与されると理解される。
【００６９】
１対象当たりの投与体積は、ワクチン接種経路および対象の年齢に依存する。好ましくは、単回投与が、約０．２ｍｌ〜２．５ｍｌ、より好ましくは約０．２ｍｌ〜２．０ｍｌ、さらにより好ましくは約０．２ｍｌ〜１．７５ｍｌ、さらにより好ましくは約０．２ｍｌ〜１．５ｍｌ、さらにより好ましくは約０．４ｍｌ〜１．２５ｍｌ、さらにより好ましくは約０．４ｍｌ〜１．０ｍｌの総体積を有し、単回０．５ｍｌ投与または１．０ｍｌ投与が最も好ましい。最も好ましくは、単回投与が０．５ｍｌ、１ｍｌ、１．５ｍｌまたは２ｍｌの総体積を有する。
本発明の一態様では、免疫原性組成物が２回投与以上投与される。
本明細書の実施例節で示されるように、本明細書で提供される免疫原性組成物は、２回投与の必要な対象への投与後に有効であることが判明した。
【００７０】
しかしながら、免疫原性組成物を２回投与以上投与することができ、初回投与を２回目の（ブースター）投与の投与前に投与する。好ましくは、２回目の投与を、初回投与の少なくとも１５日後に投与する。より好ましくは、２回目の投与を、初回投与の１５日〜４０日後に投与する。さらにより好ましくは、２回目の投与を、初回投与の少なくとも１７日後に投与する。さらにより好ましくは、２回目の投与を、初回投与の１７日〜３０日後に投与する。さらにより好ましくは、２回目の投与を、初回投与の少なくとも１９日後に投与する。さらにより好ましくは、２回目の投与を、初回投与の１９日〜２５日後に投与する。最も好ましくは、２回目の投与を、初回投与の少なくとも２１日後に投与する。さらにより好ましくは、２回目の投与を、初回投与の約２１日後または初回投与後２１日目に投与する。２回投与レジメンの好ましい態様では、初回投与と２回目の投与の両方の免疫原性組成物を同じ量投与する。好ましくは、各投与が上に指定される好ましい量内にあり、初回投与および２回目の投与について１ｍｌまたは２ｍｌの用量が最も好ましい。初回投与および２回目の投与レジメンに加えて、代替実施形態は、さらなるその後の投与を含む。例えば、これらの態様では、３回目、４回目または５回目の投与が投与され得るだろう。好ましくは、その後の３回目、４回目および５回目の投与レジメンが初回投与と同じ量投与され、投与間の時間枠が上述の初回投与と２回目の投与との間のタイミングと一致している。
【００７１】
１対象当たりの投与体積はワクチン接種経路および対象の年齢に依存する。好ましくは、総体積が、１投与当たり約０．２ｍｌ〜５ｍｌ、より好ましくは約０．５ｍｌ〜３．０ｍｌ、さらにより好ましくは約１．０ｍｌ〜２．５ｍｌ、さらにより好ましくは約１．０ｍｌ〜２．０ｍｌである。最も好ましくは、体積が１投与当たり１ｍｌ、１．５ｍｌ、２ｍｌまたは２．５ｍｌである。
免疫原性組成物は、好ましくは局所または全身投与される。従来から使用される適切な投与経路は経口または非経口投与、例えば鼻腔内、静脈内、皮内、経皮、筋肉内、腹腔内、皮下ならびに吸入である。しかしながら、化合物の性質および作用様式に応じて、免疫原性組成物を他の経路によっても投与することができる。例えば、このような他の経路には、皮内、静脈内、血管内、動脈内、腹腔内、髄腔内、気管内、皮内、心臓内、小葉内（ｉｎｔｒａｌｏｂａｌｌｙ）、肺葉内、髄内、肺内、直腸内および膣内が含まれる。しかしながら、より好ましくは、免疫原性組成物が皮下または筋肉内投与される。最も好ましくは、免疫原性組成物が筋肉内投与される。
【００７２】
本発明の一態様では、前記免疫原性組成物が筋肉内投与される。
本発明の一態様では、前記免疫原性組成物が未経産雌ブタおよび／または経産雌ブタに投与される。
好ましくは、免疫原性組成物が、少なくとも３カ月齢、より好ましくは少なくとも４カ月齢、最も好ましくは少なくとも５カ月齢の未経産雌ブタおよび／または経産雌ブタに投与される。
【００７３】
本発明の一態様では、免疫原性組成物が少なくとも３カ月齢の未経産雌ブタおよび／または経産雌ブタに投与される。
本発明の一態様では、前記免疫原性組成物が妊娠前の未経産雌ブタおよび／または経産雌ブタに投与される。
２ショット体制では、前記免疫原性組成物の２回目の投与が、好ましくは交配／授精の２、３、４または５週間前、最も好ましくは交配／授精の約３週間前に未経産雌ブタおよび／または経産雌ブタに投与される。好ましくは、前記免疫原性組成物の初回投与が、２回目の投与の２、３、４、５または６週間前、最も好ましくは２回目の投与の約３週間前に未経産雌ブタおよび／または経産雌ブタに投与される。しかしながら、２ショット体制を適用した後、好ましくは、未経産雌ブタおよび／または経産雌ブタに３、４、５、６、７または８カ月毎、最も好ましくは約６カ月毎に再ワクチン接種する。
【００７４】
本発明の一態様では、前記免疫原性組成物が、妊娠および授乳中の未経産雌ブタおよび／または経産雌ブタに投与される。
本発明の一態様では、免疫原性組成物が、妊娠および授乳中の未経産雌ブタおよび／または経産雌ブタにとって安全である。
本発明の一態様では、免疫原性組成物が、３０日間の懐胎、好ましくは４０日間の懐胎から未経産雌ブタおよび／または経産雌ブタにとって安全である。
好ましくは、本発明の免疫原性組成物が、０．１μｇ〜５０μｇ、好ましくは０．２５μｇ〜２５μｇ、より好ましくは０．５μｇ〜１２．５μｇ、さらにより好ましくは０．５μｇ〜５μｇ、最も好ましくは０．５μｇ〜２μｇのＰＰＶ  ＶＰ２抗原を含む。より好ましくは、本発明の免疫原性組成物が、約０．２５μｇ、０．５μｇ、０．７５μｇ、１μｇ、１．２５μｇ、１．５μｇ、１．７５μｇ、２μｇ、２．２５μｇ、２．５μｇ、２．７５μｇ、３μｇ、３．５μｇ、４μｇ、４．５μｇまたは５μｇの量の本発明のＰＰＶ  ＶＰ２抗原を含む。
【００７５】
本発明の一態様では、免疫原性組成物が、０．１μｇ〜５０μｇのＰＰＶ  ＶＰ２抗原、好ましくは０．５μｇ〜１０μｇのＰＰＶ  ＶＰ２抗原を含む。
本発明の一態様では、免疫原性組成物が同種および／または異種チャレンジから防御する。
本発明の一態様では、免疫原性組成物が北米および／または欧州単離株によるチャレンジから防御する。
本発明の一態様では、免疫原性組成物が北米および／または欧州単離株に対して交差防御性である。
本発明の一態様では、前記方法が、同じ種の非免疫対照群の対象と比較して、胚および／または胎児感染および死亡を特徴とする一過性白血球減少症および生殖障害の減少、またはこれらの組合せからなる群から選択される有効性パラメータの改善をもたらす。
本発明の一態様では、前記方法が、同じ種の非免疫対照群の対象と比較して、産仔数減少、同腹仔当たりの胚もしくは胎児のミイラ化の増加、胚もしくは胎児の自己溶解、胚もしくは胎児のサイズの減少、胚もしくは胎児の質量減少、ウイルス血症の増加、標的組織および血液中のウイルス量の増加、同畜舎内の動物へのＰＰＶの伝播／拡散の増加、またはこれらの組合せからなる群から選択される有効性パラメータの改善をもたらす。
【発明を実施するための形態】
【００７６】
実施形態
以下の項目も本明細書に記載される：
１．
−  アミノ酸２２８位のグルタミン酸残基もしくはグルタメート残基、および／または
−  アミノ酸４１４位のセリン残基、および／または
−  アミノ酸４１９位のグルタミン残基、および／または
−  アミノ酸４３６位のスレオニン残基
を有するブタパルボウイルス（ＰＰＶ）ウイルスタンパク質２（ＶＰ２）であって、
アミノ酸位置の番号付けは野生型ＰＰＶ  ＶＰ２のアミノ酸配列を参照する、ＰＰＶ  ＶＰ２。
【００７７】
２．
−  アミノ酸２５位のイソロイシン残基、および／または
−  アミノ酸３６位のセリン残基、および／または
−  アミノ酸３７位のイソロイシン残基
をさらに有する、項目１に記載のＰＰＶ  ＶＰ２。
３．アミノ酸位置の番号付けが配列番号１に示されるアミノ酸配列を参照する、項目１または２に記載のＰＰＶ  ＶＰ２。
４．組換えＰＰＶ  ＶＰ２である、項目１から３のいずれか１項目目に記載のＰＰＶ  ＶＰ２。
【００７８】
５．組換えバキュロウイルス発現ＰＰＶ  ＶＰ２である、項目１から４のいずれか１項目に記載のＰＰＶ  ＶＰ２。
６．配列番号１、配列番号２または配列番号５〜１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むまたは前記アミノ酸配列からなる、項目１から５のいずれか１項目に記載のＰＰＶ  ＶＰ２。
７．配列番号１、配列番号２または配列番号５〜１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むまたは前記アミノ酸配列からなる、項目１から６のいずれか１項目に記載のＰＰＶ  ＶＰ２。
【００７９】
８．配列番号１または配列番号２または配列番号５〜１６のアミノ酸配列を含むまたは前記アミノ酸配列からなる、あるいは配列番号１、配列番号２または配列番号５〜１６の少なくとも２１０個、少なくとも２５０個または少なくとも３００個の連続アミノ酸残基を有する任意の断片を含むまたは前記任意の断片からなる、項目１から６のいずれか１項目に記載のＰＰＶ  ＶＰ２。
９．配列番号１、配列番号２または配列番号５〜１６のアミノ酸配列を含むまたは前記アミノ酸配列からなる、項目１から６のいずれか１項目に記載のＰＰＶ  ＶＰ２。
１０．配列番号１、配列番号２または配列番号５〜１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされる、項目１から９のいずれか１項目に記載のＰＰＶ  ＶＰ２。
【００８０】
１１．配列番号１、配列番号２または配列番号５〜１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされる、項目１から１０のいずれか１項目に記載のＰＰＶ  ＶＰ２。
１２．配列番号１、配列番号２または配列番号５〜１６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされる、項目１から１１のいずれか１項目に記載のＰＰＶ  ＶＰ２。
【００８１】
１３．項目１から１２のいずれか１項目に記載のＰＰＶ  ＶＰ２を含む免疫原性組成物。
１４．単回投与用に製剤化される、項目１３に記載の免疫原性組成物。
１５．筋肉内投与される、項目１３または１４に記載の免疫原性組成物。
１６．妊娠および授乳中の未経産雌ブタおよび／または経産雌ブタにとって安全である、項目１３から１５のいずれか１項目に記載の免疫原性組成物。
１７．３０日間の懐胎、好ましくは４０日間の懐胎から未経産雌ブタおよび／または経産雌ブタにとって安全である、項目１３から１６のいずれか１項目に記載の免疫原性組成物。
１８．薬学的に許容される担体をさらに含む、項目１３から１７のいずれか１項目に記載の免疫原性組成物。
１９．薬学的に許容される担体がカルボマーである、項目１８に記載の免疫原性組成物。
【００８２】
２０．０．１μｇ〜５０μｇのＰＰＶ  ＶＰ２抗原、好ましくは０．５μｇ〜１０μｇのＰＰＶ  ＶＰ２抗原を含む、項目１３から１９のいずれか１項目に記載の免疫原性組成物。
２１．ワクチンである、項目１３から２０のいずれか１項目に記載の免疫原性組成物。
２２．同種および／または異種チャレンジから防御する、項目１３から２１のいずれか１項目に記載の免疫原性組成物。
２３．北米および／または欧州単離株によるチャレンジから防御する、項目１３から２２のいずれか１項目に記載の免疫原性組成物。
２４．北米および／または欧州単離株に対して交差防御性である、項目１３から２３のいずれか１項目に記載の免疫原性組成物。
２５．必要な対象においてＰＰＶ感染によって引き起こされる臨床徴候の治療および／または予防に有効である、項目１３から２４のいずれか１項目に記載の免疫原性組成物。
【００８３】
２６．項目１から１２のいずれか１項目に記載のＰＰＶ  ＶＰ２をコードする配列を含むポリヌクレオチド。
２７．配列番号３または配列番号４のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
２８．配列番号３または配列番号４のヌクレオチド配列を含むまたは前記ヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
２９．項目２６から２８のいずれか１項目に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【００８４】
３０．発現ベクターである、項目２９に記載のベクター。
３１．バキュロウイルスである、項目２９または３０に記載のベクター。
３２．項目２６から２８のいずれか１項目に記載のポリヌクレオチドまたは項目２９から３１のいずれか１項目に記載のベクターを含む細胞。
３３．昆虫細胞である、項目３２に記載の細胞。
３４．Ｓｆ９細胞およびＳｆ＋細胞からなる群から選択される、項目３３に記載の昆虫細胞。
３５．項目１から１２のいずれか１項目に記載のＰＰＶ  ＶＰ２を含むウイルス様粒子。
３６．項目１から１２のいずれか１項目に記載の複数のＰＰＶ  ＶＰ２で構成される、項目３５に記載のウイルス様粒子。
３７．細胞を項目２９から３１のいずれか１項目に記載のベクターでトランスフェクトするステップを含む、項目１から１２のいずれか１項目に記載のＰＰＶ  ＶＰ２を製造する方法。
【００８５】
３８．細胞、好ましくは昆虫細胞を、項目３１のバキュロウイルスで感染させるステップを含む、項目１から１２のいずれか１項目に記載のＰＰＶ  ＶＰ２を製造する方法。
３９．項目１から２５のいずれか１項目に記載のＰＰＶ  ＶＰ２または免疫原性組成物を含むキット。
４０．ブタ類の疾患の治療および／または予防のための指示書面をさらに含む、項目３９に記載のキット。
４１．ＰＰＶ感染の治療および／または予防のための指示書面をさらに含む、項目３９に記載のキット。
【００８６】
４２．医薬品、好ましくはワクチンを調製するための、
−  項目１から１２のいずれか１項目に記載のＰＰＶ  ＶＰ２、
−  項目１３から２５のいずれか１項目に記載の免疫原性組成物、
−  項目２６から２８のいずれか１項目に記載のポリヌクレオチド、
−  項目２９から３１のいずれか１項目に記載のベクター、
−  項目３２から３４のいずれか１項目に記載の細胞、
−  項目３１に記載のバキュロウイルス、および／または
−  項目３５または３６に記載のウイルス様粒子
の使用。
４３．ＰＰＶによる感染の治療および／または予防、ＰＰＶによる感染によって引き起こされる臨床徴候の減少、予防および／または治療、ならびに／あるいはＰＰＶによる感染によって引き起こされる疾患の治療および／または予防のための医薬品を調製するための、項目１から１２のいずれか１項目に記載のＰＰＶ  ＶＰ２または項目１３から２５のいずれか１項目に記載の免疫原性組成物の使用。
【００８７】
４４．項目１３から２５のいずれか１項目に記載の免疫原性組成物を対象に投与するステップを含む、対象を免疫する方法。
４５．必要な対象においてＰＰＶ感染によって引き起こされる臨床徴候を治療および／または予防する方法であって、治療上有効量の項目１３から２５のいずれか１項目に記載の免疫原性組成物を対象に投与するステップを含む方法。
４６．同じ種の非免疫対照群の対象と比較して、対象における生殖障害を減少させる方法であって、治療上有効量の項目１３から２５のいずれか１項目に記載の免疫原性組成物を対象に投与するステップを含む方法。
４７．同じ種の非免疫対照群の対象と比較して、対象における胚および胎児死亡を減少させる方法であって、治療上有効量の項目１３から２５のいずれか１項目に記載の免疫原性組成物を対象に投与するステップを含む方法。
４８．前記対象がブタ類、ウシ、ネコおよびイヌからなるリストから選択される、項目４４から４７のいずれか１項目に記載の方法。
４９．前記対象がブタ類、好ましくは未経産雌ブタおよび／または経産雌ブタである、項目４４から４８のいずれか１項目に記載の方法。
【００８８】
５０．免疫原性組成物が１回投与される、項目４４から４９のいずれか１項目に記載の方法。
５１．免疫原性組成物が２回投与以上投与される、項目４４から４９のいずれか１項目に記載の方法。
５２．免疫原性組成物が筋肉内投与される、項目４４から５１のいずれか１項目に記載の方法。
５３．免疫原性組成物が未経産雌ブタおよび／または経産雌ブタに投与される、項目４４から５２のいずれか１項目に記載の方法。
５４．免疫原性組成物が少なくとも３カ月齢の未経産雌ブタおよび／または経産雌ブタに投与される、項目４４から５３のいずれか１項目に記載の方法。
【００８９】
５５．免疫原性組成物が妊娠前の未経産雌ブタおよび／または経産雌ブタに投与される、項目４４から５４のいずれか１項目に記載の方法。
５６．免疫原性組成物が妊娠および授乳中の未経産雌ブタおよび／経産雌ブタに投与される、項目４４から５４のいずれか１項目に記載の方法。
５７．免疫原性組成物が妊娠および授乳中の未経産雌ブタおよび／経産雌ブタにとって安全である、項目４４から５６のいずれか１項目に記載の方法。
５８．免疫原性組成物が３０日間の懐胎、好ましくは４０日間の懐胎から未経産雌ブタおよび／または経産雌ブタにとって安全である、項目４４から５７のいずれか１項目に記載の方法。
５９．免疫原性組成物が０．１μｇ〜５０μｇのＰＰＶ  ＶＰ２抗原、好ましくは０．５μｇ〜１０μｇのＰＰＶ  ＶＰ２抗原を含む、項目４４から５８のいずれか１項目に記載の方法。
【００９０】
６０．免疫原性組成物が同種および／または異種チャレンジから防御する、項目４４から５９のいずれか１項目に記載の方法。
６１．免疫原性組成物が北米および／または欧州単離株によるチャレンジから防御する、項目４４から６０のいずれか１項目に記載の方法。
６２．免疫原性組成物が北米および／または欧州単離株に対して交差防御性である、項目４４から６１のいずれか１項目に記載の方法。
６３．同じ種の非免疫対照群の対象と比較して、胚および／または胎児感染および死亡を特徴とする一過性白血球減少症および生殖障害の減少、またはこれらの組合せからなる群から選択される有効性パラメータの改善をもたらす、項目４４から６２のいずれか１項目に記載の方法。
６４．同じ種の非免疫対照群の対象と比較して、産仔数減少、同腹仔当たりの胚もしくは胎児のミイラ化の増加、胚もしくは胎児の自己溶解、胚もしくは胎児のサイズの減少、胚もしくは胎児の質量減少、ウイルス血症の増加、標的組織および血液中のウイルス量の増加、同畜舎内の動物へのＰＰＶの伝播／拡散の増加、またはこれらの組合せからなる群から選択される有効性パラメータの改善をもたらす、項目４４から６３のいずれか１項目に記載の免疫原性組成物。
【００９１】
６５．免疫原性組成物を対象に投与するステップを含む、対象を免疫する方法に使用するための項目１３から２５のいずれか１項目に記載の免疫原性組成物。
６６．必要な対象においてＰＰＶ感染によって引き起こされる臨床徴候を治療または予防する方法であって、治療上有効量の免疫原性組成物を対象に投与するステップを含む方法に使用するための項目１３から２５のいずれか１項目に記載の免疫原性組成物。
６７．同じ種の非免疫対照群の対象と比較して、対象における生殖障害を減少させる方法であって、治療上有効量の免疫原性組成物を対象に投与するステップを含む方法に使用するための項目１３から２５のいずれか１項目に記載の免疫原性組成物。
６８．同じ種の非免疫対照群の対象と比較して、対象における胚および胎児死亡を減少させる方法であって、治療上有効量の免疫原性組成物を対象に投与するステップを含む方法に使用するための項目１３から２５のいずれか１項目に記載の免疫原性組成物。
６９．前記対象がブタ類、ウシ、ネコおよびイヌからなるリストから選択される、項目６５から６８のいずれか１項目に記載の免疫原性組成物。
【００９２】
７０．前記対象がブタ類、好ましくは未経産雌ブタおよび／または経産雌ブタである、項目６５から６９のいずれか１項目に記載の免疫原性組成物。
７１．１回投与される、項目６５から７０のいずれか１項目に記載の免疫原性組成物。
７２．２回投与以上投与される、項目６５から７０のいずれか１項目に記載の免疫原性組成物。
７３．筋肉内投与される、項目６５から７２のいずれか１項目に記載の免疫原性組成物。
７４．未経産雌ブタおよび／または経産雌ブタに投与される、項目６５から７３のいずれか１項目に記載の免疫原性組成物。
【００９３】
７５．少なくとも３カ月齢の未経産雌ブタおよび／または経産雌ブタに投与される、項目６５から７４のいずれか１項目に記載の免疫原性組成物。
７６．妊娠前の未経産雌ブタおよび／または経産雌ブタに投与される、項目６５から７５のいずれか１項目に記載の免疫原性組成物。
７７．妊娠および授乳中の未経産雌ブタおよび／または経産雌ブタに投与される、項目６５から７５のいずれか１項目に記載の免疫原性組成物。
７８．妊娠および授乳中の未経産雌ブタおよび／または経産雌ブタにとって安全である、項目６５から７７のいずれか１項目に記載の免疫原性組成物。
７９．３０日間の懐胎、好ましくは４０日間の懐胎から未経産雌ブタおよび／または経産雌ブタにとって安全である、項目６５から７８のいずれか１項目に記載の免疫原性組成物。
【００９４】
８０．０．１μｇ〜５０μｇのＰＰＶ  ＶＰ２抗原、好ましくは０．５μｇ〜１０μｇのＰＰＶ  ＶＰ２抗原を含む、項目６５から７８のいずれか１項目に記載の免疫原性組成物。
８１．同種および／または異種チャレンジから防御する、項目６５から８０のいずれか１項目に記載の免疫原性組成物。
８２．北米および／または欧州単離株によるチャレンジから防御する、項目６５から８１のいずれか１項目に記載の免疫原性組成物。
８３．北米および／または欧州単離株に対して交差防御性である、項目６５から８２のいずれか１項目に記載の免疫原性組成物。
８４．前記方法が同じ種の非免疫対照群の対象と比較して、胚および／または胎児感染および死亡を特徴とする一過性白血球減少症および生殖障害の減少、またはこれらの組合せからなる群から選択される有効性パラメータの改善をもたらす、項目６５から８３のいずれか１項目に記載の免疫原性組成物。
【００９５】
８５．前記方法が同じ種の非免疫対照群の対象と比較して、産仔数減少、同腹仔当たりの胚もしくは胎児のミイラ化の増加、胚もしくは胎児の自己溶解、胚もしくは胎児のサイズの減少、胚もしくは胎児の質量減少、ウイルス血症の増加、標的組織および血液中のウイルス量の増加、同畜舎内の動物へのＰＰＶの伝播／拡散の増加、またはこれらの組合せからなる群から選択される有効性パラメータの改善をもたらす、項目６５から８４のいずれか１項目に記載の免疫原性組成物。
８６．胚および胎児をブタパルボウイルス感染から防御するために繁殖ブタ（経産雌ブタおよび／または未経産雌ブタ）を能動免疫する方法であって、治療上有効量の項目１３から２５のいずれか１項目に記載の免疫原性組成物を前記ブタ（経産雌ブタおよび未経産雌ブタ）に投与するステップを含む方法。
８７．胚および胎児をブタパルボウイルス感染から防御するために繁殖ブタ（経産雌ブタおよび未経産ブタ）を能動免疫する方法であって、治療上有効量の免疫原性組成物を前記ブタ（経産雌ブタおよび未経産雌ブタ）に投与するステップを含む方法に使用するための項目１３から２５のいずれか１項目に記載の免疫原性組成物。
【００９６】
実施例
以下の実施例を、本発明の具体的な実施形態を例示するために以下に示す。これらの実施例は単なる例示であり、本発明の範囲も根底にある原則も制限しないと理解される。
【実施例１】
【００９７】
サブユニットＰＰＶワクチンの調製
ＰＰＶ  ＶＰ２抗原を、ドイツＰＰＶ  ２７ａ単離株に基づいてバキュロウイルス感染昆虫細胞で発現されるように選択する。ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）２７ａ  ＶＰ２ヌクレオチド配列を、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ６８４８７１．１から得る。ＰＰＶ  ２７ａ  ＶＰ２コード領域を、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）について逆翻訳およびコドン最適化する（配列番号４および配列番号３）。コドン最適化ＰＰＶ  ２７ａ  ＶＰ２遺伝子をＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓで化学合成する。次いで、ＰＰＶ  ２７ａ遺伝子をバキュロウイルス導入ベクターｐＶＬ１３９３にサブクローニングし、線形化バキュロウイルスＤｉａｍｏｎｄＢａｃ（登録商標）骨格と共にＳｆ９昆虫細胞にコトランスフェクトして、ポリヘドリンプロモーターの制御下でＰＰＶ  ２７ａ  ＶＰ２遺伝子を含む組換えバキュロウイルスを生成する。
Ｓｆ９昆虫細胞で発現すると、ＰＰＶ  ＶＰ２は非エンベロープＶＬＰに自己アッセンブルする（データは示さない）。
ＰＰＶ  ＶＰ２抗原にカルボマー（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）アジュバント添加する（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）。
【実施例２】
【００９８】
ＰＰＶワクチンの概念試験実証
全ての動物試験において、試験を開始する前に、動物は健康で栄養状態が良い。無作為化手順の前に、健康検査を行う。試験期間を通して、非薬用飼料を使用する。給餌量は、施設標準操作手順により、試験動物の年齢、状態および種にとって適切なものとする。水は試験を通して自由に提供する。
このワクチン接種チャレンジ試験の目的は、繁殖前サブユニットブタパルボウイルス（ＰＰＶ）ワクチンについての概念実証用量決定有効性を確立することである（例１参照）。未経産雌ブタにワクチン接種し、約４０日間の懐胎（ｄＧ）で生きた毒性ＰＰＶ単離株（ＰＰＶ００２３４６−５；北米株）によるチャレンジの前に繁殖させる。約９０ｄＧでＰＰＶ感染について胎児を評価する。
【００９９】
試験設計を表１に記載する。
【表１】
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【０１００】
以前の生殖疾患歴もＰＰＶに対するワクチン接種もない以前試験したＰＰＶについて陰性の群れに由来する６７匹の未経産雌ブタを使用する。未経産雌ブタを、Ｄ０にワクチン接種を受け、Ｄ２１に追加免疫した３匹の家畜に混合したｎ＝９の６つの処置群（Ｔ）に無作為化する：Ｔ１  ＮＣ（注射用水の陰性対照）、Ｔ２  ＰＰＶ１０μｇ、Ｔ３  ＰＣ（陽性対照；全不活性化ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）、ブタ丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、イヌレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｃａｎｉｃｏｌａ）、レプトスピラ・グリポティフォーサ（Ｌ．ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ）、レプトスピラ・ハージョ（Ｌ．ｈａｒｄｉｏ）、レプトスピラ・イクテロヘモラジー（Ｌ．ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）およびレプトスピラ・ポモナ（Ｌ．Ｐｏｍｏｎａ）；商業的に入手可能；製造業者のマニュアルに従って使用）。３つの非処置対照（ＮＴＸ）未経産雌ブタを含める（家畜１匹当たり１）。ワクチン接種後、未経産雌ブタを同期化し（１４連続日、Ｄ１８〜Ｄ３１の間１ラベル当たり、Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）；アルテノゲスト、Ｉｎｔｅｒｖｅｔ  Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈの投与を介して）、次いで、Ｄ３５〜Ｄ４２に繁殖させる。６７匹の未経産雌ブタのうちの５４匹が妊娠する。Ｄ８０（約４０ｄＧ）に、ＮＴＸ未経産雌ブタを剖検し、残っている未経産雌ブタに、１投与当たり４．２５ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50でＰＰＶ株ＰＰＶ００２３４６−５（北米株）６ｍＬを接種する（２ｍＬ筋肉内および１鼻孔当たり２ｍＬ鼻腔内）。未経産雌ブタを同期化および繁殖中（Ｄ３５〜Ｄ７０）を除いて毎週採血する。血清学をＤ０、Ｄ７、Ｄ１４、Ｄ２１、Ｄ２８およびＤ７３からの血清に行う；血清学およびウイルス血症についてのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Jozwik et al. 2009; Journal of General Virology, 90, 2437-2441に記載）をＤ８０、Ｄ８７、Ｄ９４、Ｄ１０１、Ｄ１０８、Ｄ１１５、Ｄ１２２およびＤ１２８からの血清に行う。未経産雌ブタをＤ１２９またはＤ１３０（約９０ｄＧ）に剖検する。剖検時、各生殖器系を取り出し、子宮内の胎児の位置、胎児の状態、サイズおよび体重を記録する。各胎児からの胸部洗液および肺の試料を回収する。胸部洗液試料を各胎児から無菌的に回収する。手短に言えば、無菌ＰＢＳ３ｍｌを無菌針および注射器で胸腔に注入する。液体を注射器に吸入し、適切なサイズの適切な無菌ＳＳＴ（血清分離管）に注入する。胸部洗液をＰＣＲによってＰＰＶの存在について、および赤血球凝集阻害（ＨＩ）によってＰＰＶ抗体の存在について試験する。肺組織を凍結保存する。
【０１０１】
未経産雌ブタのウイルス血症（ＰＰＶ）
Ｄ０、Ｄ７３（データは示さない）およびＤ８０のチャレンジ前に、全ての未経産雌ブタがＰＰＶウイルス血症について陰性である（表２）。Ｄ８７で全ての陰性対照がウイルス血症であり、Ｄ９４で４／７がウイルス血症である。
【０１０２】
ワクチン接種後、Ｔ３未経産雌ブタはブースターワクチン接種後に血清転換する。Ｔ２は初回ワクチン接種に対する血清学的応答を有し、ブースターワクチン接種後に血清陽性のままである。Ｔ１対照未経産雌ブタは、チャレンジまでＰＰＶについて血清学的に陰性のままである。チャレンジ後、Ｄ８７（チャレンジ７日後）に全ての陰性対照未経産雌ブタがウイルス血症である。Ｄ８７に、１匹のＴ３未経産雌ブタがウイルス血症である。他の全ての未経産雌ブタはこれらの時点でウイルス血症でない（表２参照）。
【０１０３】
胸部洗液試料についてのＰＣＲにより、ＮＴＸ未経産雌ブタは血清陰性のままであり、その胎児は全てＰＰＶ陰性であった。
【表２】
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【０１０４】
胎児の結果
ＮＴＸ胎児の全てがＤ８０剖検時に正常とみなされる（表３）。Ｄ１２９およびＤ１３０の最終剖検時、Ｔ１（陰性対照）胎児の２２．５％が正常である一方、Ｔ３の胎児の９８．３９％およびＴ２の胎児の９７．６２％が正常である。Ｔ１（陰性対照）胎児の平均サイズおよび体重はそれぞれ１１．５ｃｍおよび１６８．８ｇである一方、Ｔ２の胎児の平均サイズおよび体重はそれぞれ１７．５ｃｍおよび５９０．１ｇである。
【０１０５】
全てのＴ４（ＮＴＸ）胎児が、胸部洗液試料についてのＰＣＲにより決定するとＰＰＶ陰性である（表３参照）。６７／８０のＴ１陰性対照胎児（８３．７５％）でＰＰＶ感染が確認される。ＰＰＶに感染していると確認された６７匹の陰性対照胎児のうちの６２匹がミイラである。対照的に、Ｔ２胎児の０．７９％でのみＰＰＶ感染が確認される。
【０１０６】
欧州薬局方（研究書０１／２００８：０９６５）で明言されている有効性を確立するための結論パラメータに基づいて、全てのワクチン［陽性対照（全細胞不活性化ＰＰＶ）を含む］が感染からの防御についての基準を満たす（８０％超の胎児がＰＰＶについて陰性）。
【表３】
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【０１０７】
結論：
本発明のＰＰＶワクチンは、毒性異種ＰＰＶチャレンジ後の胎児の防御を示した。試験結果は、ワクチンが、繁殖前に投与した場合に安全であり、ウイルス血症および胎児への経胎盤感染を有意に減少させるのに有効であることを示している。さらに、ワクチンが、異種北米ＰＰＶチャレンジ株から防御することが示された。さらに、サブユニットＰＰＶ  ＶＰ２タンパク質が全死滅ウイルスと同程度有効であることが示された。
【実施例３】
【０１０８】
異種北米ＰＰＶ株に対するＰＰＶワクチン防御の最小免疫投与量の確立
このワクチン接種−チャレンジ試験の目的は、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）ワクチンについての最小免疫投与量（ＭＩＤ）を確立することである。未経産雌ブタを、約４０日間の懐胎（ｄＧ）時に生きた毒性ＰＰＶ血清型１単離株（ＰＰＶ００２３４６−５）でチャレンジする。ワクチン接種群の胎児の８０％以上がチャレンジ後にＰＰＶについて陰性であれば、ワクチンを有効とみなす。支持パラメータには、胎児サイズ、体重および状態、チャレンジ後の未経産雌ブタのウイルス血症状態および未経産雌ブタの血清学的状態が含まれる。
未経産雌ブタ（以前の生殖疾患歴もＰＰＶに対するワクチン接種もない）を処置群に無作為化する：Ｔ０１陰性対照（製品一致プラセボ（ＰＭＰ））およびＴ０２＝１．０μｇ  ＰＰＶ／２ｍＬ用量）。非処置／非チャレンジ（ＮＴＸ）未経産雌ブタを、全身健康状態について対照としての家畜に無作為に割り当てる。
【０１０９】
Ｄ０およびＤ２１に、未経産雌ブタに２ｍＬの適切な処置を筋肉内に与える。ワクチン接種後、未経産雌ブタをＤ３７〜Ｄ５０で繁殖させ、次いで、Ｄ７４に妊娠状態について評価する。Ｄ８１に、懐胎している未経産雌ブタを、６．７７ｌｏｇ10ＴＣＩＤ５０／６ｍＬのＰＶＶ血清型１で筋肉内および鼻腔内チャレンジする。未経産雌ブタを発情同期化および繁殖中（Ｄ３６〜Ｄ７３）を除いて毎週繁殖させる。赤血球凝集阻害（ＨＩ）アッセイをＤ７、Ｄ１４、Ｄ２１、Ｄ２８およびＤ３５からの血清に行う；ＨＩおよびウイルス血症についてのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例２参照）をＤ３、Ｄ７４、Ｄ８０、Ｄ８８、Ｄ９５、Ｄ１０２およびＤ１２７からの血清に行う。未経産雌ブタをＤ１２８およびＤ１２９（約９０ｄＧ）に剖検する。剖検時、各雌ブタの生殖器系を取り出し、子宮内の各胎児の位置、胎児の状態、サイズおよび体重を記録する。胸部洗液試料（例２参照）を各胎児から回収し、ＰＣＲによってＰＰＶの存在について試験する。
【０１１０】
未経産雌ブタのウイルス血症（ＰＰＶ）
動物はワクチン接種２４時間後にも４８時間後にも異常な体温を示さず、いかなる異常な局所反応もワクチンに起因せず、いかなる臨床徴候もワクチン接種に関連しない（データは示さない）ので、ワクチンは安全とみなされる。
ワクチン接種前、Ｄ７４およびＤ８０のチャレンジ前に、全ての未経産雌ブタがＰＰＶウイルス血症について陰性である。よって、ワクチン接種後、ワクチン投与に関連する臨床徴候は観察されない。Ｄ８８で、全１０匹のＴ０１家畜がウイルス血症であり、全てのワクチン接種した未経産雌ブタが陰性である。全ての処置群についてＤ９５、Ｄ１０２およびＤ１２７の全ての他の血液試料が、ＰＰＶウイルス血症について陰性である（表４）。
【表４】
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【０１１１】
胎児の結果
Ｄ１２８およびＤ１２９の最終剖検時、Ｔ０１（陰性対照）胎児の３８％が正常な状態である一方で、ワクチン群の胎児の９５％が正常な状態である。Ｔ０１（陰性対照）胎児の平均サイズおよび体重はそれぞれ１４．４ｃｍおよび２４５．９ｇである一方で、ワクチン接種した雌親からの胎児の平均サイズおよび体重はそれぞれ１９．３ｃｍおよび５５０ｇである（表５）。よって、欧州薬局方０１／２００８：０９６５によって確立されたＰＰＶ有効性についての結論パラメータは、処置群中の８０％超の胎児がＰＰＶについて陰性でなければならないというものであるので、ワクチン群はＰＰＶによる感染からの防御についての基準を満たす。
【０１１２】
陰性対照（Ｔ０１）胎児の１１３／１４６（７７％）でＰＰＶ感染が確認される。しかしながら、ワクチン接種群（Ｔ０２）のＰＰＶ感染はわずか１０％である。
【表５】
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【０１１３】
結論：
本発明のＰＰＶ  ＶＰ２サブユニットワクチンは、毒性異種ＰＰＶによるチャレンジ後の胎児の防御を示す。この試験結果は、ワクチンが安全であり、わずか１μｇのＰＰＶ  ＶＰ２サブユニットワクチンを使用した場合に未経産雌ブタのウイルス血症および胎児のＰＰＶ感染を予防するのに有効であることを明らかにしている。さらに、ワクチンが、異種北米チャレンジ株から防御することが示されている。
【実施例４】
【０１１４】
異種欧州ＰＰＶ株に対するＰＰＶワクチン防御の最小免疫投与量の確立
この試験の目的は、ブタパルボウイルスワクチン（本明細書ではＰＰＶまたはＰＰＶ  ＶＰ２ワクチンとも呼ばれる）の免疫の開始を評価することである。さらに、無作為化、盲検、陰性対照ワクチン接種−チャレンジ試験設計を使用して、安全性および有効性を評価する。
未経産雌ブタを３つの群に無作為に割り当てる。１群および２群では、未経産雌ブタに３週間間隔（Ｄ０およびＤ２１）で２回ワクチン接種する。２回目の投与は交配の３週間前に与える。全ての処置を２ｍＬの体積で筋肉内（ＩＭ）経路によって投与する。２群にＰＰＶワクチンを受けさせる一方で、１群は対照製品としての無菌希釈液を受けるプラセボ群であり、３群はいかなる処置もない、厳密な対照として働く。
【０１１５】
未経産雌ブタを発情同期化し、２回目のワクチン接種の３週間後、人工授精する。妊娠した動物を、懐胎の３９日目〜４２日目の間のＤ８４に毒性異種ＰＰＶ株でチャレンジする。
Ｄ１３２〜１３５の懐胎約９０日目に、未経産雌ブタを安楽死させ、剖検し、胎児を評価する。
【表６】
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【０１１６】
ＰＣＲによるチャレンジ前およびチャレンジ後の未経産雌ブタにおけるＰＰＶウイルス血症の評価
包含基準を満たすワクチン接種前のＤ−６およびＤ−１でのＰＣＲにより、全ての動物はＰＰＶについて陰性である。ワクチン接種後、厳密な対照および対照製品群の全ての動物がチャレンジまでＰＰＶ抗原について陰性であり、そのため、チャレンジ前のＰＰＶ感染を除外することができる。
【０１１７】
チャレンジ７日後（Ｄ９０）、１４日後（Ｄ９７）および２１日後（Ｄ１０４）ならびに剖検の日に、ウイルス血症を調べる。チャレンジ後、ワクチン接種動物ではウイルス血症が検出されず、ウイルス血症は非ワクチン接種対照動物でのみ生じる。
Ｄ９０（チャレンジ７日後）に、既に非ワクチン接種対照動物の９５％がＰＰＶについて陽性である。Ｄ９７に、これらの動物のまだ６０％が陽性結果を有する一方、Ｄ１０４で、全ての動物がＰＰＶについて陰性と試験される。対照的に、ワクチン接種群では、Ｄ９０、Ｄ９７またはＤ１０４に試験した全ての動物がＰＰＶについて陰性である。
【表７】
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【０１１８】
胎児の結果
ＰＰＶ感染胎児の割合は対照群では９１．４％であったが、ＰＰＶ群ではわずか４．３％であった（表８参照）。
【表８】
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【０１１９】
胎児の状態の評価
全ての胎児をその状態について評価し、３つのカテゴリーに割り当てる：正常、ミイラ化および自己溶解。
ミイラ化および自己溶解胎児の大部分が対照群で見られる。この群の胎児のわずか３９．８％が正常な状態である一方で、ワクチン接種群では、胎児の９７．４％（ＰＰＶ群）が正常な状態である（表９参照）。
【表９】
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【０１２０】
結論：
本発明のＰＰＶワクチンは、毒性異種ＰＰＶチャレンジ後に胎児の防御を示し、ワクチンが安全で、わずか１μｇのワクチンを使用した場合に胎児におけるウイルス血症およびＰＰＶ感染を予防するのに有効であることを示している。さらに、ワクチンはＰＰＶの異種欧州チャレンジ株からも防御することが示されている。よって、ワクチンは異種北米ならびに異種欧州チャレンジ株に対して防御するので、ワクチンは広範な防御範囲を有する。
【０１２１】
本明細書で開示および請求される組成物および方法の全てが、本開示に照らして不要な実験をすることなく、作製および実施することができる。本発明の組成物および方法を好ましい実施形態に関して記載してきたが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載される組成物および方法ならびに方法のステップまたはステップの順序において変更を適用することができることが当業者に明らかであるだろう。より具体的には、化学的にも生理的にも関連する一定の薬剤を本明細書に記載される薬剤に代えることができるが、同じまたは同様の結果が達成されることが明らかであるだろう。当業者に明らかな全てのこのような同様の置換および修正が、以下の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲および概念の中にあるとみなされる。
【配列表】
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