(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脱毛治療用薬物が封入された、ナノリポソーム−マイクロバブル結合体であって、ここで、
前記脱毛治療用薬物は、フィナステリド、ミノキシジル及びデュタステリドからなる群から１種以上が選択され、
前記ナノリポソームは、レシチン、コレステロール及びカチオン性リン脂質を含み、
前記マイクロバブルは、両性リン脂質、アニオン性リン脂質、コレステロール、カチオン性リン脂質、及びジスルフィド基を有する脂質を含む、
ナノリポソーム−マイクロバブル結合体。
【請求項２】
前記脱毛治療用薬物は、２型５−α還元酵素の発現または活性を抑制してテストステロンからジヒドロテストステロンへの転換を阻害する効能、または毛乳頭真皮細胞の死滅を抑制する効能がある、請求項１に記載のナノリポソーム−マイクロバブル結合体。
【請求項３】
請求項１に記載のナノリポソーム−マイクロバブル結合体を含有する、脱毛の改善又は治療用組成物。
【請求項４】
レシチン、コレステロール及びカチオン性リン脂質をクロロホルムで混合して脂質フィルム組成物を製造する第１ステップ、
前記脂質フィルム組成物に脱毛治療用薬物溶液を入れて超音波処理する第２ステップ、
前記超音波処理された脂質フィルム組成物を凍結し、融解した後、再び超音波処理する第３ステップ、及び
前記第３ステップで超音波処理された脂質フィルム組成物を遠心分離し、沈殿物状態のナノリポソームを回収する第４ステップを含んで製造されたナノリポソームと、
両性リン脂質、コレステロール、アニオン性脂質、アミン基を有する脂質、及びジスルフィドを有する脂質をクロロホルムで混合して脂質フィルム組成物を製造する第Ａステップ、
前記第Ａステップにグルコース溶液を入れて超音波処理する第Ｂステップ、
前記第Ｂステップで超音波処理された脂質フィルム組成物を凍結し、融解した後、再び超音波処理する第Ｃステップ、及び
前記第Ｃステップで超音波処理された脂質フィルム組成物に疎水性気体を注入してマイクロバブルを製造する第Ｄステップを含んで製造されたマイクロバブルと、を混合してナノリポソーム−マイクロバブル結合体を形成することを特報とする、請求項１に記載のナノリポソーム−マイクロバブル結合体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脱毛治療用薬物が封入されたナノリポソーム−マイクロバブル結合体及びこれを含有する脱毛改善または治療用組成物に関する。
【０００２】
より具体的には、本発明は、フィナステリド（ｆｉｎａｓｔｅｒｉｄ）、ミノキシジル（Ｍｉｎｏｘｉｄｉｌ）、デュタステリド（Ｄｕｔａｓｔｅｒｉｄｅ）などの脱毛治療用薬物が封入されたナノリポソームに、疎水性気体を含むマイクロバブルが化学的に安定な状態で結合されている、ナノリポソーム−マイクロバブル結合体及びこれを含有した脱毛改善または治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
脱毛は、一般に、頭皮の太くて黒い髪の毛が抜けることを意味する。脱毛の原因はさまざまであるが、遺伝的な原因と男性ホルモンであるアンドロゲン（ａｎｄｒｏｇｅｎ）が重要な因子として考えられている。その中でも６０〜７０％程度と大きな割合を占めている男性型脱毛症（ａｎｄｒｏｇｅｎｉｃ  ａｌｏｐｅｃｉａ）は、テストステロン（ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）が５−α還元酵素（５−ａｌｐｈａ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、ＳＲＤ５Ａ）によってジヒドロテストステロン（ｄｉｈｙｄｒｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ、ＤＨＴ）に変換され、過剰に生成されたジヒドロテストステロンが毛乳頭真皮細胞（ｄｅｒｍａｌ  ｐａｐｉｌｌａ  ｃｅｌｌ、ＤＰＣ）の男性ホルモン受容体（ａｎｄｒｏｇｅｎｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＡＲ）に結合してアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を誘発し、毛髪の小型化により脱毛が進行するのである。５−α還元酵素のうち、毛包の毛乳頭と外側毛根鞘に主に分布する２型５−α還元酵素（５−ａｌｐｈａ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｔｙｐｅ  ２、ＳＲＤ５Ａ２）自体が多く発現している男性や、２型５−α還元酵素の活性度が高いヒトは、ジヒドロテストステロンの量が一般な男性よりも相対的に多いため、脱毛の発生可能性が大きくなる。よって、男性型脱毛症の治療核心は、２型５−α還元酵素の量又は活性度を低下させてテストステロンからジヒドロテストステロンへの転換を防ぐことにある。
【０００４】
現在、脱毛治療剤としてプロペシア（Ｐｒｏｐｅｃｉａ）、ミノキシジル（Ｍｉｎｏｘｉｄｉｌ）、デュタステリド（Ｄｕｔａｓｔｅｒｉｄｅ）などの薬物が開発されている。プロペシアは、フィナステリド（ｆｉｎａｓｔｅｒｉｄ）成分の薬物であって、２型５−α還元酵素を直接抑制し、デュタステリドは、１型、２型５−α還元酵素を抑制してテストステロンからジヒドロテストステロンへの転換を抑制して脱毛の進行を緩和させる。フィナステリドは、経口用脱毛治療剤であって、元々前立腺肥大症の治療薬であった。服用患者の発毛副作用が観察され、後で男性脱毛治療剤として開発された。しかし、これらの薬物は、服用患者に性欲減退や勃起不全などの副作用が発生し、服用中止時に脱毛が再び進行するという欠点を持つ。特に、米国ＦＤＡでは、不妊又は精子数の少ない男性の場合、薬物の服用を中止することを勧告している(Myscore  V  et  al.,2012)。
【０００５】
一方、細胞内薬物送達システムに要求される重要な二つの性質は、効率性と細胞毒性（安全性）であって、コレステロールや脂質などで構成されたナノリポソーム送達体技術が幅広く使用されている(Zuris  JA  et  al.,2015)。しかし、このようなナノリポソーム技術のみでは、皮膚バリアの役割を果たす角質層の下に存在する真皮内への薬物送達が容易ではない(Nemes  Z  et  al.,1999)。
【０００６】
マイクロバブルは、ＦＤＡに承認された診断超音波造影剤であって、疎水性気体で充填されたマイクロサイズの気泡形状を持っている。超音波にさらされたマイクロバブルは、空洞現象（ｃａｖｉｔａｔｉｏｎ）が生じて周辺細胞の細胞膜が一時的に気孔を形成し、この気孔を介して細胞内へ物質が透過する超音波穿孔法（ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）でナノリポソームが細胞内へ送達されることにより、他の細胞送達法よりもさらに効果的に送達することができる。
【０００７】
そこで、本発明者らは、フィナステリドが封入されたナノリポソームを真皮層まで効率よく送達するために、フィナステリドをナノリポソームに封入し、これをマイクロバブルと結合させた組成物を製造した。よって、このような技術によって真皮内への薬物送達効率が良い送達体を製造し、これを脱毛改善または治療用組成物として用いることにより、本発明を完成することができた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】韓国登録特許第１０−１６８３４６３号（発明の名称：マイクロバブル−リポソーム−メラニンナノ粒子複合体及びこれを含む造影剤、出願人：ソウル大学産学協力団、登録日：２０１６年１２月１日）
【特許文献２】韓国登録特許第１０−１０８２３９１号（発明の名称：ビタミンＣを含む脱毛防止及び発毛促進用ナノハイブリッド複合体及び発毛促進用組成物、出願人：（株）シエンファーム及び梨花女子大学産学協力団、登録日：２０１１年１１月４日）
【特許文献３】韓国登録特許第１０−１０５４７３１号（発明の名称：難溶性発毛及び育毛生理活性物質であるフィナステリドを含むナノ粒子及びこれを含有する皮膚外用剤組成物、出願人：（株）アモーレパシフィック、登録日：２０１１年８月１日）
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Myscore  V  et  al.,Finasteride  and  sexual  side  effects,Indian  Dermatol  Online  J,2012,3(1),62-65.
【非特許文献２】Zuris  JA  et  al.,Cationic  lipid-mediated  delivery  of  proteins  enables  efficient  protein-based  genome  editing  in  vitro  and  in  vivo,Nat  Biotechnol,2015,33(1),73-80.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、脱毛治療用薬物が封入されたナノリポソーム−マイクロバブル結合体及びこれを含有する脱毛改善または治療用組成物を提供することにある。
【００１１】
より具体的には、本発明の目的は、フィナステリド（ｆｉｎａｓｔｅｒｉｄ）、ミノキシジル（Ｍｉｎｏｘｉｄｉｌ）、デュタステリド（Ｄｕｔａｓｔｅｒｉｄｅ）などの脱毛治療用薬物が封入されたナノリポソームに、疎水性気体を含むマイクロバブルが化学的に安定的に結合されているナノリポソーム−マイクロバブル結合体と、これを含有して口腔投与による副作用なしに脱毛の改善または治療効果に優れる組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、脱毛治療用薬物が封入されたナノリポソーム−マイクロバブル結合体に関するものである。
【００１３】
前記脱毛治療用薬物は、フィナステリド（ｆｉｎａｓｔｅｒｉｄ）、ミノキシジル（Ｍｉｎｏｘｉｄｉｌ）及びデュタステリド（Ｄｕｔａｓｔｅｒｉｄｅ）よりなる群から１種以上選択されて含まれたものであり得る。
【００１４】
また、前記脱毛治療用薬物は、２型５−α還元酵素の発現または活性を抑制してテストステロンからジヒドロテストステロンへの転換を阻害する効能、または毛乳頭真皮細胞の死滅を抑制する効能があるものであり得る。
【００１５】
前記ナノリポソームは、レシチン、コレステロール及びカチオン性リン脂質を含むことができる。
【００１６】
前記マイクロバブルは、両性リン脂質、アニオン性リン脂質、コレステロール、カチオン性リン脂質、及びジスルフィド基を有する脂質を含むことができる。
【００１７】
前記ナノリポソーム−マイクロバブル結合体は、１１００〜２１００ｎｍの粒子サイズを有することができる。
【００１８】
本発明は、前記ナノリポソーム−マイクロバブル結合体を含有する脱毛の改善または治療用組成物を提供することができる。
【００１９】
また、本発明は、下記の毛乳頭真皮細胞を選択的に認識することができるナノリポソーム−マイクロバブル結合体の製造方法を提供する。より好ましくは、ナノリポソームとマイクロバブルをそれぞれ製造した後、これを混合してナノリポソーム−マイクロバブル結合体を製造することができる。
【００２０】
前記ナノリポソームは、下記の方法で製造することができる。
【００２１】
好ましくは、レシチン、コレステロール及びカチオン性リン脂質をクロロホルムで混合して脂質フィルム組成物を製造する第１ステップと、
前記脂質フィルム組成物に脱毛治療用薬物溶液を入れて超音波処理する第２ステップと、
前記超音波処理された脂質フィルム組成物を凍結し、融解した後、再び超音波処理する第３ステップと、
前記第３ステップで超音波処理された脂質フィルム組成物を遠心分離し、沈殿物状態のナノリポソームを回収する第４ステップとを含んで、前記ナノリポソームを製造することができる。
【００２２】
また、前記マイクロバブルは、下記の方法で製造することができる。
【００２３】
両性リン脂質、コレステロール、アニオン性脂質、アミン基を有する脂質、及びジスルフィドを有する脂質をクロロホルムで混合して脂質フィルム組成物を製造する第Ａステップと、
前記第Ａステップにグルコース溶液を入れて超音波処理する第Ｂステップと、
前記第Ｂステップで超音波処理された脂質フィルム組成物を凍結し、融解した後、再び超音波処理する第Ｃステップと、
前記第Ｃステップで超音波処理された脂質フィルム組成物に疎水性気体を注入してマイクロバブルを製造する第Ｄステップと、を含んで、前記マイクロバブルを製造することができる。
【００２４】
このように製造されたマイクロバブルにナノリポソームを混合してナノリポソーム−マイクロバブル結合体を形成することができる。
【００２５】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００２６】
本発明は、脱毛治療用薬物が封入されたナノリポソーム−マイクロバブル結合体及びこれを含有する脱毛改善または治療用組成物に関する。
【００２７】
前記脱毛治療用薬物は、フィナステリド（ｆｉｎａｓｔｅｒｉｄ）、ミノキシジル（Ｍｉｎｏｘｉｄｉｌ）、デュタステリド（Ｄｕｔａｓｔｅｒｉｄｅ）などから選択できるが、これらの薬物と同じメカニズムの脱毛治療用薬物であれば利用可能である。また、前記脱毛治療用薬物は、好ましくは、２型５−α還元酵素の発現または活性を抑制してテストステロンからジヒドロテストステロンへの転換を阻害する効能があるものであればいずれも選択できる。
【００２８】
前記ナノリポソームは、レシチン（ｌｅｃｉｔｈｉｎ、α−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎ）、カチオン性リン脂質及びコレステロールを含むことができ、これにより、前記レシチン、カチオン性リン脂質及びコレステロールがナノリポソームを形成する膜を成すことができる。
【００２９】
レシチンは、動／植物界に広く分布しており、生体適合性に優れるうえ、その安定性においても既に検証されて食品と製薬の送達体技術に広く活用されている。また、ナノリポソームのサイズ調節及び変形を容易にする材料として使用できる。
【００３０】
前記カチオン性リン脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｈＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、及び１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）よりなる群から１種以上選択できる。好ましくは、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）を使用するのが良い。
【００３１】
本発明のナノリポソームは、中性の水、細胞培養液、血液などで数時間以上安定的に分散できる。
【００３２】
本発明のマイクロバブルは、両性リン脂質、アニオン性リン脂質、コレステロール、カチオン性リン脂質、及びジスルフィド基を有する脂質を含むことができ、これらの混合物からなる脂質フィルム組成物に投入された疎水性気体を介してバブルを形成する膜をなすことにより、マイクロバブルが製造される。
【００３３】
前記両性リン脂質は、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１，２−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ、ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１，２−ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ、ＤＳＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ、ＤＭＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ、ＤＯＰＣ）、１−ミリストイル−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１−ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−２−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ、ＭＰＰＣ）、及び１−ミリストイル−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１−ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−２−ｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ、ＭＳＰＣ）よりなる群の中から選択できる。好ましくは、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１，２−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ、ＤＰＰＣ）を使用するのが良い。
【００３４】
前記アニオン性リン脂質は、ジセチルホスフェート（ｄｉｃｅｔｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＤＣＰ）、１，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（１，２−ｄｉｅｒｕｃｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＤＥＰＡ）、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（１，２−ｄｉｌａｕｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＤＬＰＡ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＤＭＰＡ）、及び１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＤＯＰＡ）よりなる群から１種以上選択できる。好ましくは、ジセチルホスフェート（ＤＣＰ）を使用するのが良い。
【００３５】
前記カチオン性リン脂質としては、ナノリポソームの製造時に使用するものを同一に使用することができ、より詳しくは、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｈＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、及び１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）よりなる群から１種以上選択できる。好ましくは、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）を使用するのが良い。
【００３６】
前記ジスルフィド基を有する脂質としては、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ｓＰＤＰとも呼ばれる１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−ポリ（エチレングリコール）−２０００−Ｎ−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートを使用するのが良い。
【００３７】
＊ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ｓＰＤＰ：１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−ポリ（エチレングリコール）−２０００−Ｎ−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ｓＰＤＰ脂質は、下記（化学式１）の化学構造を有する脂質である。
【００３８】
【化１】
0006876202.tif 000002
マイクロバブルの製造のための両性リン脂質：アニオン性リン脂質：コレステロール：カチオン性リン脂質：ジスルフィド基を有する脂質の混合割合は、１〜３ｍＭ：０．１〜０．３ｍＭ：０．５〜２ｍＭ：０．１〜０．３ｍＭ：０．１〜０．３ｍＭであり得る。このとき、両性リン脂質：アニオン性リン脂質：コレステロール：カチオン性リン脂質：ジスルフィド基を有する脂質として、ＤＰＰＣ：ＤＣＰ：コレステロール：ＤＰＰＥ：ｓＰＤＰが使用でき、好ましくは、ＤＰＰＣ：ＤＣＰ：コレステロール：ＤＰＰＥ：ｓＰＤＰが２．０ｍＭ：０．１８ｍＭ：０．９ｍＭ：０．１７ｍＭ：０．１７ｍＭで混合できる。
【００３９】
マイクロバブル内の前記ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ｓＰＤＰ脂質は、ナノリポソームと結合するときに架橋剤になり、ナノリポソーム−マイクロバブル結合体に結合できる。
【００４０】
前記マイクロバブルは、両性リン脂質、アニオン性リン脂質、コレステロール、カチオン性リン脂質、及びジスルフィド基を有する脂質の混合物のバブリングにより誘導されたものであり得る。また、前記マイクロバブルの内部は、ＳＦ６、ＣＯ２、ＣＦ４及びＣ３Ｆ８から選択される疎水性気体が内包されたものであり得る。前記疎水性気体は、好ましくはＳＦ６であることがさらに良い。
【００４１】
前記ナノリポソームは、１００〜２００ｎｍの粒子サイズを有することができる。ナノリポソームのサイズが１００ｎｍ未満である場合には、脱毛治療用薬物が前記ナノリポソームに封入され難く、体内に注入される場合に安定性が低くなることがあって好ましくない。また、２００ｎｍを超える場合にも、前記ナノリポソームの含まれた組成物が体内に注入される場合に安定性が低くなることがあって好ましくない。また、前記マイクロバブルは、１０００〜２０００ｎｍの粒子サイズを有することができる。このため、前記ナノリポソーム−マイクロバブル結合体は、約１１００〜２２００ｎｍの粒子サイズを有することができる。
【００４２】
本発明は、前記ナノリポソーム−マイクロバブル結合体組成物を含有する脱毛改善または治療用組成物を提供することができる。前記ナノリポソーム−マイクロバブル結合体組成物は、男性ホルモンである５−α還元酵素を抑制してジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）の濃度を減少させることにより、脱毛の治療に有効である。
【００４３】
本発明のナノリポソーム−マイクロバブル結合体組成物の製造方法において、ナノリポソームを製造し、マイクロバブルを製造してこれを混合することにより、前記結合体を製造することができる。
【００４４】
ナノリポソームの製造において、前記第１ステップのレシチン、コレステロール及びカチオン性リン脂質は、２：０．０１〜０．５：０．０１〜０．５のモル比で混合できる。このときの混合比から外れると、ナノリポソームを構成する脂質がうまく製造できない。
【００４５】
第２ステップで、脱毛治療用薬物は０．０１〜１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で脂質フィルム組成物に添加できる。脱毛治療用薬物溶液の溶媒は、水またはアルコールであり、前記アルコールは、好ましくはエタノールまたはその水溶液であり得る。
【００４６】
前記第３ステップで凍結し融解する過程は、１〜１２回繰り返し行うことができる。脂質フィルム組成物を凍結し融解するステップを繰り返し行うことにより、より均一な大きさのナノリポソーム分散液が形成でき、ナノリポソームの薬物封入効率を高めることができる。ただし、１２回を超える場合には、ナノリポソームの封入効率がむしろ減少するおそれがあるので、１２回以内が望ましい。
【００４７】
ナノリポソームとマイクロバブルとの結合のために、本発明でマイクロバブルを製造するとき、第Ｂステップで、マイクロバブルはグルコース溶液、グリセロール及びプロピレングリコールのうちの１種以上の溶液を用いて安定化した後、ナノリポソームと混合することができる。好ましくは、グルコース溶液を使用するのが良い。このとき、グルコース溶液は、１〜２０％（ｗ／ｖ）になることができる。グルコースの濃度が２０％（ｗ／ｖ）を超える場合には、粘性が生じてマイクロバブルの合成ができないことがある。
【００４８】
また、本発明は、前記ナノリポソーム−マイクロバブル結合体を含有する医薬組成物を提供することができるが、前記医薬組成物は、それぞれ通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの経口型剤形、外用剤、坐剤、及び滅菌注射溶液の形で製剤化して使用できる。前記医薬組成物に含まれ得る担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び鉱物油を挙げることができる。製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調製される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれる。このような固形製剤は、本発明の組成物に少なくとも一つの賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロースまたはラクトース、ゼラチンなどを混ぜることにより調剤される。また、単純な賦形剤以外にステアリン酸マグネシウム、タルクなどの潤滑剤も使用される。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、よく使用される単純希釈剤である水、流動パラフィン以外にさまざまな賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれ得る。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、オレイン酸エチルなどの注射可能なエステルなどが使用できる。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用できる。
【００４９】
本発明の医薬組成物の投与量は、治療を受ける対象の年齢、性別、体重、治療する特定の疾患または病理状態、疾患または病理状態の重症度、投与経路、及び処方者の判断によって異なる。これらの因子に基づいた投与量の決定は当業者のレベル内にあり、一般に、投与量は０．０１ｍｇ／ｋ／日乃至約２０００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。さらに好ましい投与量は、１ｍｇ／ｋｇ／日乃至５００ｍｇ／ｋｇ／日である。投与は、１日１回投与することも、１日数回に分けて投与することもできる。前記投与量は、いかなる面でも、本発明の範囲を限定するものではない。
【００５０】
本発明の医薬組成物は、マウス、家畜、ヒトなどの哺乳動物に多様な経路で投与できる。投与の全ての方式は予想できるが、例えば、皮膚塗布、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜または脳血管内注射によって投与できる。
【発明の効果】
【００５１】
本発明は、フィナステリド（ｆｉｎａｓｔｅｒｉｄ）、ミノキシジル（Ｍｉｎｏｘｉｄｉｌ）、デュタステリド（Ｄｕｔａｓｔｅｒｉｄｅ）などの脱毛治療用薬物が封入されたナノリポソーム−マイクロバブル結合体及びこれを含有する脱毛改善または治療用組成物に関するものである。現在、脱毛治療剤として使用されているフィナステリドなどの経口投与剤は、口腔投与による様々な副作用が発生して頭皮塗布による薬物送達が最も好ましいが、頭皮塗布のみでは薬物自体が毛包細胞までうまく送達されないという欠点がある。この他に、皮膚外用剤として使用される脱毛治療用薬物においても各種副作用があり、その使用濃度をさらに下げなければならない必要性がある。
【００５２】
したがって、送達支持体を活用してフィナステリドの薬物送達効率を高めることが重要である。本発明のナノリポソーム−マイクロバブル結合体を用いる場合には、低い濃度で処理される脱毛治療用薬物の送達効率を増強させることができるため、男性型脱毛の治療を非常に効果的に行うことができる。
【００５３】
韓国登録特許第１０−１６８３４６３号には、マイクロバブルを用いた細胞内薬物送達体技術が開示されているが、これは、抗がん剤に適用することができる技術のみに制限されている。韓国登録特許第１０−１０５４７３１号には、フィナステリドを含むナノ粒子とこれを含有した皮膚外用剤組成物が開示されているが、ナノリポソームの構造が本発明とは異なり、本発明は、上記の技術とは差別化された技術であることを確認することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】毛乳頭真皮細胞（ｄｅｒｍａｌ  ｐａｐｉｌｌａ  ｃｅｌｌ、ＤＰＣ）に本発明のナノリポソーム−マイクロバブル結合体を送達して超音波を加えたとき、細胞膜に穿孔が生じ、マイクロバブルが崩壊しながらナノリポソームが細胞内に入ることを示す模式図である。
【図２】左の写真は２００ｎｍ以下のサイズを示すリポソームのＣｒｙｏ−ＥＭ分析イメージであり、右の写真はサイズ１〜２μｍのバブルの光学顕微鏡分析イメージを示す。
【図３】右の写真はナノリポソーム−マイクロバブル結合体（ＨＴＰ）を介して細胞内に薬物（蛍光を含む）が浸透したことを示す写真であり、左の写真はこれに対する対照群処理細胞の写真である。このとき、細胞写真の上側写真はマイクロバブル（ＨＴＰ）の超音波活性イメージを示す。
【図４】左のグラフは３Ｔ３細胞とＤＰＣ細胞にそれぞれテストステロン（ＴＳ）を処理してＤＰＣに細胞毒性があることを提示する結果であり、右のグラフはＤＰＣ細胞にＨＴＰを単独で処理しても、またはＨＴＰ及びテストステロン（ＴＳ）を処理しても、細胞毒性が殆どないことを提示する結果である。
【図５】マウスで脱毛を誘導し、本発明のナノリポソーム−マイクロバブル（ＨＴＰ）をマウスに５回処理した後、発毛効果が現れるかを１週間隔で写真によって確認した結果である（対照群は薬物無処理群、ＴＳ：テストステロン、ＨＴＳ：実施例２のナノリポソーム−マイクロバブル、ＮＬ：比較例１のリポソーム）。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
以下、本発明の好適な実施例を詳細に説明する。しかし、本発明は、ここで説明される実施例に限定されず、他の形態で具体化されることも可能である。むしろ、ここで紹介される内容が徹底かつ完全たるものとなるように、当業者に本発明の思想を十分に伝えるために提供するのである。
【００５６】
＜実施例１．ナノリポソーム−マイクロバブル結合体の製作＞
実施例１−１．ナノリポソームの製作
レシチン（Ｌｅｃｉｔｈｉｎ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、コレステロール（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）及びカチオン性リン脂質としてのＤＰＰＥ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を２：０．１：０．０５のモル比でクロロホルム（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）で混ぜた後、回転濃縮器を活用して脂質フィルム（ｌｉｐｉｄｆｉｌｍ）化した。
【００５７】
ここにフィナステリドを仕込み、超音波を加えながら混合した。液体窒素を活用して凍結し融解する過程（ｆｒｅｅｚｅ  ｔｈａｗ  ｃｙｃｌｅ）を５回繰り返し行い、その後、超音波（プローブ方式）処理してより小さなサイズの均一な状態のナノリポソーム組成物を製作した。
【００５８】
その後、遠心分離方法で沈殿したナノリポソーム組成物（脂質の総量２０．４３ｍｇ）を回収して５％（ｗ／ｖ）グルコース水溶液に分散させた。一方、ナノリポソーム製造前のフィナステリド溶液とナノリポソームの製造後に残される溶液におけるフィナステリド濃度を確認してナノリポソーム内の薬物封入率を計算したところ、６０％以上であることが確認された。
【００５９】
実施例２−２．マイクロバブルの製作
両性リン脂質としてのＤＰＰＣ（１，２−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）１５．４ｍｇ、コレステロール（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）３．４８ｍｇ、アニオン性リン脂質としてのＤＣＰ（ｄｉｃｅｔｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）１ｍｇ、カチオン性リン脂質としてのＤＰＰＥ（１，２−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）１．２ｍｇ、及びジスルフィド基を有する脂質としてのＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ｓＰＤＰ（１，２−ｄｉｓｔｅａｒｏｌｙ−ｓｎ−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−Ｎ−［ＰＤＰ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）］、Ａｖａｎｔｉ  ｐｏｌａｒ）５ｍｇをクロロホルム（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）１ｍＬで混合した後、回転濃縮器を用いてマイクロバブルの合成のための脂質フィルム（ｌｉｐｉｄ  ｆｉｌｍ）化した。
【００６０】
その後、５％（ｗ／ｖ）グルコース水溶液１ｍｌを入れ、超音波を加えて混合した。液体窒素を用いて凍結し融解する過程（ｆｒｅｅｚｅ  ｔｈａｗ  ｃｙｃｌｅ）を３回繰り返し行い、超音波（プローブ方式）処理した後、ＳＦ６ガスを充填して分散状態のマイクロバブル組成物を製造した。
【００６１】
実施例２−３．ナノリポソーム−マイクロバブルの製作
実施例２−１で製造されたナノリポソーム（２０．５３ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬと実施例２−２のマイクロバブル（２６．０８ｍｇ／ｍＬ）０．５ｍＬを混合（２：１の体積比）して、ナノリポソームとマイクロバブルがグルコース水溶液に分散した状態となるようにした。
【００６２】
その後、装備（Ｔｉａｎｊｉｎ  Ｉｒｉｓ）を用いて１５秒間強い振動効果［Ｍｉｘｉｎｇ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ：４５００ｔｒ／ｍｎ（ｃｐｍ；分あたりｍ３送り量の単位）］を与え、ナノリポソーム−マイクロバブル結合体を形成させた後、５％グルコース水溶液に分散した状態で冷蔵保管した。
【００６３】
このように最終製造されたナノリポソーム−マイクロバブル結合体を、以下「実施例２のナノリポソーム−マイクロバブル結合体」またはＨＴＰ（Ｈａｉｒ  ｌｏｓｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）という。
【００６４】
＜比較例１．ナノリポソーム＞
実施例２−１に記載された方法でナノリポソームを製造して（マイクロバブル未結合）比較例１の組成物として使用した。
【００６５】
＜実験例１．ナノリポソーム−マイクロバブル結合体のサイズ及び表面電荷の確認＞
実施例２−１と２−２で製造したナノリポソーム、マイクロバブルをイメージ化して図２に示した。図２の左側はナノリポソーム、右側はマイクロバブルを撮影した写真であって、それぞれ適切なサイズに製造されたことが分かる。
【００６６】
また、このナノリポソームとマイクロバブルとを結合したナノリポソーム−マイクロバブル結合体のサイズをＤＬＳ（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）で測定したところ、平均サイズは１１００ｎｍ前後と確認された。表面電荷は＋２．２５ｍＶであった。比較例１（実施例２−１）のマイクロバブル結合体が付いていないナノリポソーム自体だけのサイズは９８ｎｍであり、その表面電荷は＋１．７５ｍＶであった。毛乳頭真皮細胞内にナノリポソームを送達するためには、表面電荷値が正電荷であることが良いが、マイクロバブル結合体自体が−０．９１ｍＶであることが確認されたにも拘らず、本発明のナノリポソーム−マイクロバブル結合体の表面電荷を下げずに、むしろさらに高い正電荷値を有することが分かる。このため、本発明のナノリポソーム−マイクロバブル結合体が細胞送達用組成物としての利用に適することを判断することができる。
【００６７】
＜実験例２．細胞の生存及び浸透有無の確認＞
実施例２のナノリポソーム−マイクロバブル結合体の毛乳頭真皮細胞への流入を確認するために、実施例２のナノリポソーム−マイクロバブル結合体をＤＰＣ細胞に２時間フィナステリドを基準に１００ｎｇ／ｍｌの濃度で処理した後、図３に共焦点蛍光顕微鏡写真を示した。このとき、ナノリポソーム−マイクロバブル結合体の製造中にナノリポソーム脂質に蛍光体ＲＩＴＣ（ｒｅｄ）蛍光色素（ｄｙｅ）を導入し、これを確認した。
【００６８】
図３において、青色はＤＮＡの染色写真、赤色はＲＩＴＣの蛍光写真であって、対照群では、赤色が全く現れないが、右側では細胞質内の赤色と核（ＤＮＡ）内の青色がマージ（ｍｅｒｇｅ）されて現れる。よって、実施例２のナノリポソーム−マイクロバブル結合体処理により毛乳頭真皮細胞内にフィナステリドが封入されたナノリポソームがうまく注入されていることが分かる。
【００６９】
一方、製造されたナノリポソーム−マイクロバブル結合体（ＨＴＰ）にマイクロバブルが完全に結合された状態であることを確認するために、超音波映像で確認したが、ＨＴＰの溶液にマイクロバブルによる褐色の帯が現れることが確認された（図３の上側写真）。
【００７０】
＜実験例３．細胞生存率の確認＞
細胞生存率の確認は、ＷＳＴ−１アッセイ（ＥＺ−ｃｙｔｏｘ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ）によって行った。毛乳頭真皮細胞（ＤＰＣ）と３Ｔ３線維芽細胞を９６ウェルプレートに１ｘ１０４／ｗｅｌｌの密度で２４時間培養した。ここにテストステロンが２００μＭで処理された培地で交換し、さらに２４時間後、そのままＷＳＴ−１試薬を添加した。ＷＳＴ−１試薬を培養液の１０％仕込み、１時間後に４６０ｎｍで吸光度を測定して細胞の生存及び増殖を対照群（非処理群）と比較した。細胞生存評価は、テストステロン処理後４日間、２４時間の周期で測定した。
【００７１】
その結果は図４の左側に示したが、ＤＰＣ細胞は、３Ｔ３細胞に比べて、時間経過に伴って死滅程度が大幅に増加して、テストステロンの増加による脱毛過程を提示することができるモデルが十分に確立されたことが分かる。
【００７２】
次に、同じ方法においてテストステロンの処理前、本発明のナノリポソーム−マイクロバブル結合体（ＨＴＰ）の処理後、テストステロンが２００μＭで処理された培地で交換し、以後の過程を同様にして細胞の状態を確認した。比較群には、ナノリポソーム−マイクロバブル結合体（ＨＴＰ）のみを単独処理した。
【００７３】
このため、図４の右側のグラフを確認すると、このとき、ナノリポソーム−マイクロバブル結合体（ＨＴＰ）単独処理群でも、ナノリポソーム−マイクロバブル結合体とテストステロンがすべて処理された群（ＴＳ＋ＨＴＰ）でも、毒性なしに細胞がよく育つのを示している。
【００７４】
したがって、このような結果は、本発明の実施例２のナノリポソーム−マイクロバブル結合体内にフィナステリドがよく封入され、この薬物が持つ機能性を最適に発揮することができる状態であることを示し、また、前記結合体が毛乳頭細胞でテストステロンによるアポトーシスに起因する脱毛過程を効果的に抑制することができることを意味する。
【００７５】
＜実験例４．マウスモデルにおけるナノリポソーム−マイクロバブル結合体の脱毛抑制効果の確認＞
６週齢のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）を動物用除毛器（ｐｈｉｌｉｐｓ製）と除毛クリーム（Ｖｅｅｔ製）を用いてマウスなどの毛を除毛した後、テストステロンをプロピレングリコールとエタノールの混合溶液（３：７（ｖ：ｖ））に溶かすが、３０μｇ／ｍｌの濃度で毎日塗布してヒトの脱毛と同様の環境に作った。
【００７６】
この実験で、各実験群は下記のとおりである（テストステロンはいずれも皮膚塗布する）。
【００７７】
（１）対照群（無処理群）；
（２）テストステロン処理群；
（３）テストステロン処理後、実施例２のナノリポソーム−マイクロバブル結合体の皮膚塗布処理群；
（４）テストステロン処理後、市販のフィナステリド溶液の経口投与処理群；
（５）テストステロン処理後、市販のフィナステリド溶液の皮膚塗布処理群；
（６）テストステロン処理後、比較例１のナノリポソームの皮膚塗布処理群；
（７）実施例２のナノリポソーム−マイクロバブル結合体の皮膚塗布処理群；
ナノリポソーム−マイクロバブル結合体（ＨＴＰ）としては、ナノリポソームとマイクロバブルが２：１の割合で結合されて分散したものを使用した。これをフィナステリド総量で１μｇずつマウスの除毛された背中全体にプラスチックスパチュラで２００μｋずつ塗布し、３分後、医療用超音波機器を用いて超音波にさらした。このとき、前記ナノリポソーム−マイクロバブル結合体は、１日おきに５回処理した。同じ条件であるが、実施例２又は比較例１の溶液の代わりに市販のフィナステリド溶液を処理した群では、総フィナステリドの含有量を合わせた。
【００７８】
市販のフィナステリド溶液が経口投与剤であるため、これを比較するための経口投与群には、塗布用量よりも１０倍の用量を投与し、皮膚に塗布するのと投与時間及び回数を同一にした。
【００７９】
これに対する結果は図５に示したが、図５において、対照群は薬物無処理群であり、各略語の中でも、ＴＳ：テストステロン、ＨＴＳ：実施例２のナノリポソーム−マイクロバブル、ＮＬ：比較例１のリポソームを示す。
【００８０】
図５の結果を参照すると、対照群（１）では、何らの処理もされていないため、時間の流れに沿って毛が自然に育ち、テストステロンのみを処理した群（２）では、毛が殆ど育っていない。
【００８１】
一方、テストステロンの処理後、実施例２の組成物を処理した群（３）では、毛がよく育っていることを確認することができた。
【００８２】
これとは異なり、テストステロンの処理後、市販のフィナステリド薬物を経口投与した群（４）または皮膚塗布した群（５）は、７週目に毛が育とうとすることが見えただけであった。
【００８３】
テストステロンの処理後、マイクロバブルが結合されていない比較例１のリポソームを処理した群（６）では、テストステロンのみを処理した比較群のように毛が殆ど育っていないことが分かるが、これは、脱毛治療薬物がリポソームに封入されており、市販の薬物よりも体内送達力がむしろ低下するためであることが確認された。この結果から、リポソームがマイクロバブルを介して生体膜内に送達されるので薬物の送達過程が必須的であることを証明することができる。
【００８４】
図５の写真上には示されていないが、実施例２の組成物（ＨＴＰ）のみを処理した群も、対照群と同様に毛が育って特別な毒性などの副作用は示さないことが分かった。
【００８５】
したがって、上述した結果は、本発明のナノリポソーム−マイクロバブル結合体が男性型脱毛の治療に非常に効果的であることを提示する。
【図１】
0006876202.tif 000003
【図２】
0006876202.tif 000004
【図３】
0006876202.tif 000005
【図４】
0006876202.tif 000006
【図５】
0006876202.tif 000007