(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆの両者に結合し、ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆの両者の活性を阻害する抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体であり、配列番号１で表されるＣＤＲ１Ｈ、配列番号２で表されるＣＤＲ２Ｈ、配列番号３で表されるＣＤＲ３Ｈ、配列番号４で表されるＣＤＲ１Ｌ、配列番号５で表されるＣＤＲ２Ｌ、及び、配列番号６で表されるＣＤＲ３Ｌを含む、抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体。
【請求項２】
配列番号７で表される可変重鎖ドメイン（ＶＨ１−１）並びに配列番号８で表される可変軽鎖ドメイン（ＶＬ５）又は配列番号９で表される可変軽鎖ドメイン（ＶＬ２−１）を含む、請求項１に記載の抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体。
【請求項３】
ヒトＩｇＧクラスに属する、請求項１に記載の抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体。
【請求項４】
マウス、キメラ又はヒト化バリアントである、請求項１に記載の抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体。
【請求項５】
配列番号１０で表される重鎖と配列番号１１で表される軽鎖とを含む、請求項１に記載の抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の組換え発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項９】
被験体におけるＩＬ−１７Ａ及び／又はＩＬ−１７Ｆ関連疾病を治療するための医薬組成物であって、治療に有効な量の請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体及び医薬的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１０】
前記ＩＬ−１７Ａ及び／又はＩＬ−１７Ｆ関連疾病が、自己免疫疾患又は炎症性疾患から選択される、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記ＩＬ−１７Ａ及び／又はＩＬ−１７Ｆ関連疾病が乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス、変形性関節症又は炎症性腸疾患（ＩＢＤ）から選択される、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
被験体が哺乳類である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記被験体が、ラット、マウス、サル又はヒトから選択される、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
被験体がヒトである、請求項１３に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆの両者に反応する抗体、及びその使用に関する。具体的には、本発明は、ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆの両者に結合し、ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆの両者の活性を阻害する抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体、及びその抗体の使用を提供することである。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン１７（ＩＬ−１７）サイトカインファミリーには、ＩＬ−１７Ａ（通常、ＩＬ−１７という）、ＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｄ、ＩＬ−１７Ｅ（ＩＬ−２５ともいう）及びＩＬ−１７Ｆの６つのメンバーを含まれている。ＩＬ−１７Ａ（ＣＴＬＡ−８、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ  Ｑ１６５５２）、ＩＬ−１７Ｆ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ＃Ｑ９６ＰＤ４  ＳＥＱ  ＩＤ＃ＮＰ＿４４３１０４）は、前記メンバーの全部の中でその生物学的機能とそれに対する調節メカニズムが最も既知されている。この２つのサイトカインの間には、最も高い配列相同性（５５％の同一性）を有している。ＩＬ−１７Ａ又はＩＬ−１７Ｆをコードする遺伝子は、マウスとヒトにおいても互いに近い状態で同じ染色体に存在する。それらが共有する発現パターンはハイライトされる（非特許文献１）。ＩＬ−１７ＡとＩＬ−１７Ｆは、機能の面からいずれも炎症誘発反応を介導するが、炎症の種類と部位によって一定の違いがある（非特許文献２、３）。ＩＬ−２５は、ＩＬ−１７Ａとの配列相同性は最も低いでおり、ＩＬ−１７Ｆの場合の５０％と比べて、ただ１６％の配列相同性を有する。したがって、ＩＬ−２５は免疫学的にユニークな役割を果たし、蠕虫寄生虫及びアレルギー性炎症に応対するＴヘルパー（Ｔｈ）２応答を主に調節する（非特許文献４）。ＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、及びＩＬ−１７Ｄは、炎症誘発性サイトカインの産生を引き起こすことが知られているが、それらの生物学的機能はほとんど知られない（非特許文献５〜７）。３つの異なる研究グループによる近来の研究は、ＩＬ−１７Ｃが粘膜免疫と自己免疫反応での作用をハイライトしている（非特許文献８〜１０）。ＩＬ−１７ファミリーのサイトカインは、標的細胞の表面受容体を介して生物学的機能を調節している。ＩＬ−１７ＲＡは最初に同定されたＩＬ−１７受容体である。ＩＬ−１７ＲＢ、ＩＬ−１７ＲＣ、ＩＬ−１７ＲＤ及びＩＬ−１７ＲＥを含む他の４つのＩＬ−１７Ｒファミリーのメンバーは、後で主にＩＬ−１７ＲＡとの配列相同性に基づいて同定された。ＩＬ−１７ファミリーのサイトカインに対応する機能的受容体は、通常、ヘテロ二量体の形で存在し、共通のサブユニットとしてＩＬ−１７ＲＡを有している。例えば、ＩＬ−１７ＲＡとＩＬ−１７ＲＣからなる受容体複合体はＩＬ−１７ＡとＩＬ−１７Ｆとを認識しており、一方、ＩＬ−１７ＲＡはＩＬ−１７ＲＢと対形成してＩＬ−２５に結合する（非特許文献１１、１２）。
【０００３】
ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆの産生が調節不全した場合には、炎症誘発性サイトカインの過剰な発現と慢性炎症に導き、その結果、組織の損傷と自己免疫が引き起こされる。ＩＬ−１７ファミリーのサイトカインは、多発性硬化症（ＭＳ）、関節リウマチ（ＲＡ）、炎症性腸疾患、乾癬などの多くの自己免疫疾患に関連している。Ｔｈ１７細胞とＩＬ−１７ファミリーのサイトカインがＭＳの発展における重要な役割が、ヒトのＭＳに類似なマウスモデルであるＥＡＥを用いた研究で解明されるまで、長い間、ＭＳはＴｈ１依存性の疾患とみなされた（非特許文献１３、１４）。Ｔｈ１７細胞及び関わるサイトカインは、それらに関連する中枢神経系の炎症及び病変形成を促進する主要な働きを持つ（非特許文献１３、１４）。ＩＬ−１７Ａは、ＲＡ患者の滑液や、滑膜で容易に検出される（非特許文献１５）。ＲＡのマウスモデルを用いた複数の研究により、ＩＬ−１７Ａが疾患の進展における重要な働きを持つことは実証している（非特許文献１６〜２０）。疾患が発症した後に、ＩＬ−１７に対してブロックすることで、骨や軟骨の侵食を効果的に防ぎ、臨床状態の重症度を軽減になる（非特許文献１９）。サイトカインであるＩＬ−１７Ａは、多くの自己免疫疾患に汎用するので、理想的な薬物ターゲットになっている。実際上、ヒト化したＩＬ−１７Ａ抗体はもうＲＡ、乾癬、ぶどう膜炎の治療のために開発されており、良好な成果が得られた（非特許文献２１、２２）。
【０００４】
要約すると、ＩＬ−１７ＡとＩＬ−１７Ｆは共通の受容体を有し、両者は炎症促進の面で重複に機能する。ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆは、複数の炎症性サイトカイン、ケモカイン及び接着分子の産生を誘導でき、好中球及びマクロファージを炎症部位にリクルートできる。ＩＬ−１７ＡとＩＬ−１７Ｆは、同じように、ヒト、ヒト疾患に対応する動物モデルが有する関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、変形性関節症及び炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を含む多様な自己免疫疾患及び炎症性疾患の進展、病理に寄与した医薬品に関連付けた。ＲＡ患者の滑膜組織では、高レベルのＩＬ−１７Ａが検出された（非特許文献２３）。ＩＬ−１７ＡはＭＳ患者の脳脊髄液で過剰に発現している（非特許文献２４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｗａｎｇ  Ｘ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２０１２；  ３６：  ２３−３１
【非特許文献２】Ｉｓｈｉｇａｍｅ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２００９；  ３０：  １０８−１１９
【非特許文献３】Ｙａｎｇ  ＸＯ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２００８；  ２０５：  １０６３−１０７５
【非特許文献４】Ｆａｌｌｏｎ  ＰＧ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２００６；  ２０３：  １１０５−１１１６
【非特許文献５】Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００７；  １７９：  ７１２８−７１３６
【非特許文献６】Ｗｕ  Ｑ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ  ２００７；  ９：  ７８−８６
【非特許文献７】Ｌｉ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２０００；  ９７：  ７７３−７７８
【非特許文献８】Ｒａｍｉｒｅｚ−Ｃａｒｒｏｚｚｉ  Ｖ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１１；  １２：  １１５９−１１６６
【非特許文献９】Ｓｏｎｇ  Ｘ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１１；  １２：１１５１−１１５８
【非特許文献１０】Ｃｈａｎｇ  ＳＨ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２０１１；  ３５：  ６１１−６２１
【非特許文献１１】Ｉｗａｋｕｒａ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２０１１；  ３４：  １４９−１６２
【非特許文献１２】Ｃｈａｎｇ  ＳＨ，  Ｄｏｎｇ  Ｃ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ  ２０１１；  ２３：  １０６９−１０７５
【非特許文献１３】Ｌａｎｇｒｉｓｈ  ＣＬ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２００５；  ２０１：  ２３３−２４０
【非特許文献１４】Ｐａｒｋ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００５；  ６：  １１３３−１１４１
【非特許文献１５】Ｃｈａｂａｕｄ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９８；  １６１：４０９−４１４
【非特許文献１６】Ｍｕｒｐｈｙ  ＣＡ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２００３；  １９８：  １９５１−１９５７
【非特許文献１７】Ｎａｋａｅ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００３；  １７１：  ６１７３−６１７７
【非特許文献１８】Ｎａｋａｅ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００３；  １００：  ５９８６−５９９０
【非特許文献１９】Ｌｕｂｂｅｒｔｓ  Ｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２００４；  ５０：  ６５０−６５９
【非特許文献２０】Ｒｕｄｄｙ  ＭＪ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ２００４；  ７６：  １３５−１４４
【非特許文献２１】Ｇｅｎｏｖｅｓｓｅ  ＭＣ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２０１０；  ６２：  ９２９−９３９
【非特許文献２２】Ｈｕｅｂｅｒ  Ｗ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ２０１０；  ２：  ５２−７２
【非特許文献２３】Ｃｈａｂａｕｄ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００３；  １７１：  ６１７３−６１７７
【非特許文献２４】Ｈｅｌｌｉｎｇｓ，  Ｐ．Ｗ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｒｅｓｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２８  （２００３）４２−５０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＩＬ−１７Ａアンタゴニスト及びＩＬ１７Ｆアンタゴニストの必要性、臨床用または治療用の可能性は、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆの両者の免疫活性を実証することによって示されている。具体的には、ＩＬ−１７ＡとＩＬ−１７Ｆの両者とを結合でき、そしてＩＬ−１７ＡとＩＬ−１７Ｆの両者の活性を遮断可能な抗体は、新しい及び／又はより良い治療プロパティを備えることが望ましい。したがって、ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆの両者を結合可能なアンタゴニストが必要となる。ＩＬ−１７ＡとＩＬ−１７Ｆの両者を一つのモノクローナル抗体でブロックすることは、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎の治療に使用したＩＬ−１７Ａアゴニストよりも優れた臨床的な又は治療的な可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ヒトＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆの両者に特異的に結合可能な抗体（本明細書では、「交差反応性抗体」、「ＩＬ−１７Ａ／Ｆ抗体」などと呼ばれることがある）を提供する。前記抗体は、ＩＬ−１７ＡとＩＬ−１７Ｆの両者の活性を調節できるので、免疫関連疾患や炎症性疾患などの様々な疾患や病態の治療に有用である。前記抗体は、配列番号１で表されるＣＤＲ１Ｈ、配列番号２で表されるＣＤＲ２Ｈ、配列番号３で表されるＣＤＲ３Ｈ、配列番号４で表されるＣＤＲ１Ｌ、配列番号５で表されるＣＤＲ２Ｌ、配列番号６で表されるＣＤＲ３Ｌを含むことを特徴とする。
【０００８】
一実施形態では、上述した抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体は、マウス、キメラ又はヒト化バリアントである。前記抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体は、二重特異性を持つモノクローナル抗体である。
【０００９】
一実施形態では、前記抗体は、配列番号７で表される可変重鎖ドメイン（ＶＨ１−１）、及び配列番号８で表される可変軽鎖ドメイン（ＶＬ５）又は配列番号９で表される可変軽鎖ドメイン（ＶＬ２−１）を含むことを特徴とする。
【００１０】
一実施形態では、前記抗体は、配列番号７で表される可変重鎖ドメイン（ＶＨ１−１）、及び配列番号８で表される可変軽鎖ドメイン（ＶＬ５）を含むことを特徴とする。
【００１１】
一実施形態では、前記抗体は、ヒトＩｇＧクラスに属することを特徴とする。
【００１２】
一実施形態では、前記抗体は、配列番号１０で表される重鎖、及び配列番号１１で表される軽鎖を含むことを特徴とする。
【００１３】
ＩＬ−１７Ａ／Ｆ抗体は、特にＩＬ−１７Ａ及び／又はＩＬ−１７Ｆの存在に関連する病態、または哺乳類細胞に対するインビトロ、インサイチュ、またはインビボ診断または治療中の作用を見つけてしまう。一実施形態において、ＩＬ−１７Ａ及び／又はＩＬ−１７Ｆ関連疾病は、例えば、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス、変形性関節症又は炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を含む自己免疫疾患又は炎症性疾患であるが、これらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、親抗体が非還元及び還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果を示す図である。各レーンに約２μｇのタンパク質をロードした。（Ａ）マーカー：ページルーラーで事前に染色したタンパク質ラダー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、製品番号：２６６１６）；ＢＳＡ−Ｎ：非還元条件；ＱＨ＿ＶＨ１−１＋ＱＨ＿ＶＬ２−１−Ｎ、非還元条件で；ＱＨ＿ＶＨ１−１＋ＱＨ＿ＶＬ５−Ｎ、非還元条件；ＱＨ＿ＶＨ１−１＋ＱＨ＿ＶＬ２−１−Ｒ、還元条件；ＱＨ＿ＶＨ１−１＋ＱＨ＿ＶＬ５−Ｒ、還元条件；ＢＳＡ−Ｒ、還元条件で；（Ｂ）分子量はマーカーで示された。
【図２】図２は、ＨＦＦ−１細胞においてＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ及びＩＬ−１７Ａ／ＦによるＩＬ−６誘導に対して、抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体の阻害効果（ＩＣ５０が、ｎＭレベル）、即ち、本発明の抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体について機能的なアッセイの結果を示す図である。（Ａ）ＩＬ−１７Ａで誘導したＩＬ−６の産生が、抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体であるＶＨ１−１／ＶＬ５  ｍＡｂによって阻害され、ＩＣ５０は１．７２７ｎＭである。（Ｂ）ＩＬ−１７Ｆで誘導したＩＬ−６の産生が、抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体であるＶＨ１−１／ＶＬ５  ｍＡｂによって阻害され、ＩＣ５０は１．７７ｎＭである。（Ｃ）ＩＬ−１７Ａ／Ｆヘテロダイマーで誘導したＩＬ−６の産生が、抗ＩＬ−１７Ａ／Ｆ抗体であるＶＨ１−１／ＶＬ５  ｍＡｂによって阻害され、ＩＣ５０は０．９９ｎＭである。対照抗体として、ヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）を使用した。
【図３】図３は、抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体が、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７ＦまたはＩＬ−Ａ／ＦとＩＬ−１７受容体との間のインタラクションに対する遮断作用を示す図である。（Ａ）ＩＬ−１７ＡとＩＬ−１７ＲＡの間のインタラクションが、抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体、抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ  ＶＨ１−１／ＶＬ５抗体によってブロックされる。（Ｂ）ＩＬ−１７ＦとＩＬ−１７ＲＡの間のインタラクションが、抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体、抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ  ＶＨ１−１／ＶＬ５抗体によってブロックされる。（Ｃ）ＩＬ−１７Ａ／ＦとＩＬ−１７ＲＡの間のインタラクションが、抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体、抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ  ＶＨ１−１／ＶＬ５抗体によってブロックされる。対照抗体として、ヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）を使用した。
【図４】図４は、ｈＩｇＧ  ＶＨ１−１／ＶＬ５が、ヒトＩＬ−１７ファミリーのメンバーへの結合プロパティを示す図である。２μｇ／ｍｌのヒトＩＬ−１７Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦは、それぞれ、ＥＬＩＳＡプレートにコーティングされ、連続濃度のｈＩｇＧ  ＶＨ１−１／ＶＬ５抗体（Ａ〜Ｆ）で培養した。対照抗体としてヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）を用いた。結合プロパティはＯＤ４５０ｎｍで示された。ＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍで算出された。
【図５】図５は、ｈＩｇＧ  ＶＨ１−１／ＶＬ５が、カニクイザルＩＬ−１７Ａ及びＦへの結合プロパティを示す図である。２μｇ／ｍｌのカニクイザルＩＬ−１７Ａ（Ａ）及び１７Ｆ（Ｂ）が、それぞれ、ＥＬＩＳＡプレートにコーティングされ、ｈＩｇＧ  ＶＨ１−１／ＶＬ５抗体（抗体濃度、０．３ｎＭ〜６６．６７ｎＭ）で培養した。対照抗体としてヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）を用いた。ＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍによって算出された。
【図６】図６は、薬力学的マウスモデルにおいて、抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体はヒトＩＬ−１７で誘導したＣＸＣＬ１分泌を阻害する図である。各マウスに２０μｇの抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体を静脈内注射（ｉ．ｖ．）した１時間後、各マウスにヒトＩＬ−１７Ａ（３μｇ）を皮下投与（ｓ．ｃ．）した。ＫＣレベルは、ヒトＩＬ−１７Ａ注射した２時間後にＥＬＩＳＡにて測定した。各群にはｎ＝５マウスにする。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明についてさらに詳細に説明する。以下の段落には、本発明の不同の態様をより詳細に明確化されている。反対の意味を明らかに示されていない限り、前記明確化された各態様は、任意の他の態様と組み合わせることができる。特に、好ましい又は利点と見なされた特徴が、他の好ましい又は利点と見なされた特徴と組み合わせることができ、その組み合わせも請求の範囲によって定義する本発明の範囲から逸脱することはない。
【００１６】
特に明記しない限り、本発明を実施するためには、当分野での分子生物学、化学、生化学及び組換えＤＮＡ技術、バイオインフォマティクスの常法である技術を使用する。そのような技術は、本発明で完全に説明されている。
【００１７】
本発明の第１の態様は、ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆの両者に結合し、ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆの両者の活性を阻害する抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体を提供する。前記抗体は、配列番号１で表されるＣＤＲ１Ｈ、配列番号２で表されるＣＤＲ２Ｈ、配列番号３で表されるＣＤＲ３Ｈ、配列番号４で表されるＣＤＲ１Ｌ、配列番号５で表されるＣＤＲ２Ｌ、配列番号６で表されるＣＤＲ３Ｌを含む。
【００１８】
本発明の抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体は、二重特異な結合活性を持つモノクローナル抗体である。
【００１９】
前記抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体は、ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆと、両者の受容体との結合を阻害できる。
【００２０】
一実施形態では、上述した抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体は、マウス、キメラ又はヒト化バリアントである。一実施形態において、前記抗体は、配列番号７で表される可変重鎖ドメイン（ＶＨ１−１）、及び配列番号８で表される可変軽鎖ドメイン（ＶＬ５）又は配列番号９で表されるＶＬ２−１を含む。一実施形態では、前記抗体は、配列番号７で表される可変重鎖ドメイン（ＶＨ１−１）、及び配列番号８で表される可変軽鎖ドメイン（ＶＬ５）を含む。
【００２１】
一実施形態では、前記抗体は、ヒトＩｇＧクラスに属することを特徴とする。一実施形態では、前記ヒト化抗体は、配列番号１０で表される重鎖、及び配列番号１１で表される軽鎖を含む。
【００２２】
第２の態様では、本発明は、第１の態様の抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体をコードするヌクレオチド配列を提供する。当分野で知られているように、ヌクレオチド配列は、抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体を発現するために、コドンが用いた細胞の種類によって最適化し得る。
【００２３】
本出願はまた、第１の態様の抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体の重鎖可変ドメイン、及び／又は軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を提供する。
【００２４】
第１の態様の抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターも、本発明の範囲に含まれる。前記組換え発現ベクターは、原核生物又は真核生物の宿主細胞において前記ヌクレオチド配列を発現することができる。
【００２５】
当分野で知られているように、第１の態様の抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体をコードする発現ベクター、またはヌクレオチド配列を含む宿主細胞も、本発明の範囲に含まれる。前記宿主細胞は、本発明の抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体を産生することができる。前記宿主細胞は、前記ヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを細胞に形質転換又はトランスフェクトすることによって作成することができる。前記宿主細胞にヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを含んでいてもよく、相同組換えすることで宿主細胞のゲノムにヌクレオチド配列を組み込まれることもよい。前記宿主細胞は、原核生物又は真核生物に由来の宿主細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、または骨髄腫細胞などの哺乳類に由来する細胞株であってもよい。前記哺乳類は、ラット、マウス、サル、及びヒトからなる群より選択されるものであるが、これらに限定されない。宿主細胞は、好ましくはヒト細胞である。
【００２６】
この面で、本発明の抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体は、発現ベクターまたは第１の態様の抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体をコードするヌクレオチド配列を含む宿主細胞によって発現させることができる。発現した抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体は、従来のタンパク質の精製法により、前記細胞又は細胞培養上清液から回収することができる。抗体の組換え産生については、当分野で公知されている。もう一つの態様で、本発明の抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体は、適切な抗原で動物を免疫して、免疫された動物から収集した腹水液から抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体を回収することで、合成または産生されることができる。
【００２７】
一実施形態では、本発明は以下のステップを含む第１の態様の抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体を産生する方法を提供する：抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体の発現は、発現ベクターまたは第１の態様の抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体をコードするヌクレオチド配列を含む宿主細胞を培養し、宿主細胞又は細胞培養上清液から抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体を回収することによって行った。
【００２８】
第３の態様では、本発明は、被験体においてＩＬ−１７Ａ及び／又はＩＬ−１７Ｆ関連疾病の治療に使用する医薬品の製造における、第１の態様の抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体の使用に関する。一実施形態において、ＩＬ−１７Ａ及び／又はＩＬ−１７Ｆ関連疾病は、例えば、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス、変形性関節症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を含む自己免疫疾患又は炎症性疾患であるが、これらに限定されない。被験体は、ラット、マウス、サル、又はヒトなどの哺乳類であってもよい。被験体は、好ましくはヒトである。
【００２９】
第４の態様において、本発明は、治療的有効な量の第１の態様の抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体と、医薬的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物であり、被験体においてＩＬ−１７Ａ及び／又はＩＬ−１７Ｆ関連疾病の治療に使用する医薬組成物を提供する。医薬組成物に適した賦形剤は、当業者が選択することができる。一実施形態において、ＩＬ−１７Ａ及び／又はＩＬ−１７Ｆ関連疾病は、例えば、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス、変形性関節症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を含む自己免疫疾患又は炎症性疾患であるが、これらに限定されない。被験体は、ラット、マウス、サル、又はヒトなどの哺乳類であってもよい。被験体は、好ましくはヒトである。
【００３０】
第５の態様では、本発明は、治療的有効な量の本発明の第４の態様の医薬組成物を投与することを含む、被験体においてＩＬ−１７Ａ及び／又はＩＬ−１７Ｆ関連疾病を治療する方法を提供する。一実施形態において、ＩＬ−１７Ａ及び／又はＩＬ−１７Ｆ関連疾病は、例えば、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス、変形性関節症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を含む自己免疫疾患又は炎症性疾患であるが、これらに限定されない。被験体は、ラット、マウス、サル、又はヒトなどの哺乳類であってもよい。被験体は、好ましくはヒトである。
【００３１】
上記した内容で、本発明の範囲内に含まれる主題、本発明のことを製造又は使用する方法、及びその方法の最も好ましい形態を含む主旨に関する一般的な説明を提供した。以下、当業者がより効率的実施するために、実施例を提供され、本発明について完全な記述を提供する。なお、当業者であっては、これらの実施例の詳細は本発明の範囲を何ら限定することを意図するものではないと理解すべき、その範囲は本開示に添付した請求の範囲及びその均等物とするのを理解すべきである。本開示の観点から、本発明の様々なさらなる態様及び実施形態が当業者には明らかであろう。
【００３２】
本明細書で使用される「及び／又は」は、２つの具体的な特徴または構成要素が、一種単独で又は両者ともに採用していることを具体的に開示したと解する。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ及び（ｉｉｉ）Ａ及びＢともに採用していることを具体的に開示したとみなされ、本明細書で個別に示されることと同様に理解される。
【００３３】
特記しない限り、上記の特徴の説明及び定義は、本発明の特定の態様または実施形態に限定されるものではない、説明した全部の態様及び実施形態に等しく適用できる。
【００３４】
本発明、及び本明細書で又は本発明の審査中に引用した全ての書類と配列アクセッション番号（「ａｐｐｌｎ引用書類」）、及びａｐｐｌｎ引用書類で引用又は参照した全ての書類、及びここで引用した又は参照した全ての書類（「引用書類」）、及び本明細書に引用した書類で引用又は参照された全ての書類は、本明細書で言及した製品又はここで参照により組み込まれた書類中の製造元からの指示、紹介、製品仕様書、及び製品説明書とともに、参照することにより本明細書に包含され、本発明の実施に使用する。より具体的には、本明細書において参照した全ての文書は、その全体が、各々の文書が具体的にかつ個別に記載されたのと同じ程度に、本明細書において参照として援用される。
【実施例】
【００３５】
実施例１  抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体の生成
ヒトＩＬ−１７Ａ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ＃８９２８ＳＦ、ｗｗｗ．ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌ．ｃｏｍ）と、ＩＬ−１７Ｆ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ＃８９０６ＬＣ、ｗｗｗ．ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌ．ｃｏｍ）（１０μｇずつ）と、完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ＃Ｆ６８８１）とを、ＢＡＬＢ／ｃマウス（１６−１８ｇ、６週齢、北京バイタルリバーラボラトリーアニマルテクノロジー社から購入）に皮下注射して免疫を行った。免疫は３日間隔で５回繰り返した。最終ブーストの３日後、注射部位に近いリンパ節を慎重に切り取した。リンパ球は、ＰＥＧ１５００（ポリエチレングリコール１５００、Ｒｏｃｈｅ  ＴＭ．Ｃａｔ＃：７８３６４１、１０×４ｍｌで７５  ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ液に含まれ、ＰＥＧ  ５０％Ｗ／Ｖである）によりＡｇ  ８．６５３骨髄腫細胞（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ＃８５０１１４２０）と融合させ、ＨＡＴ  セレクション（Ｓｉｇｍａ  ｃａｔ  ＃：Ｈ０２６２）とＨＦＣＳ（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｆｕｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、５０ｘ、Ｒｏｃｈｅ  ｃａｔ＃：１１−３６３−７３５−００１）でクローンした。ヒトＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆの両者とを結合できる抗体の産生は、ＥＬＩＳＡ及びサイトカイン放出アッセイにて、ハイブリドーマ上清液を用いてスクリーニングを行った（実施例５を参照）。選択されたマウス抗ＩＬ１７Ａ／Ｆクローン（１−１５−Ｘ）は、ＣＤＲ−移植と復帰突然変異（ｂａｃｋ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）を使用してヒト化した。
【００３６】
ＣＤＲ−移植による抗体のヒト化：アクセプターのフレームワークの選択が行った。親抗体の可変ドメイン配列は、ＮＣＢＩ  Ｉｇ−Ｂｌａｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｉｇｂｌａｓｔ／）を用いてヒト生殖細胞系のデータベースにおいて検索したものである。各重鎖及び軽鎖については、５つ異なるヒトアクセプター（即ち、親抗体と高い相同性を有するヒト可変ドメイン）を選択した。前記ヒトアクセプターのＣＤＲは、対応するマウスのものに置き換えられることで、ヒト化可変ドメイン配列にした。重鎖及び軽鎖のＣＤＲ配列（配列番号１〜６）をそれぞれ以下に示す。５つのヒト化した重鎖と、５つのヒト化した軽鎖を設計、合成して、発現ベクターに挿入された。前記ヒト化した抗体を発現させて、親和性ランキング試験に用いた。最も強い結合親和性を持つ抗体（ＶＨ１−ＶＬ５及びＶＨ１−ＶＬ２）を選択し、復帰突然変異に用いた。さらなる特徴付けのため、バリアントの中から、ＶＨ１−１／ＶＬ５及びＶＨ１−１／ＶＬ２−１を選択した。ＶＨ１−１／ＶＬ５は最も高い結合親和性を示した。
【００３７】
ＣＤＲ１Ｈアミノ酸配列（配列番号１）
ＤＹＮＬＮ
【００３８】
ＣＤＲ２Ｈアミノ酸配列（配列番号２）
ＶＩＨＰＤＹＧＴＴＳＹＮＱＫＦＫＤ
【００３９】
ＣＤＲ３Ｈアミノ酸配列（配列番号３）
ＹＤＹＧＤＡＭＤＹ
【００４０】
ＣＤＲ１Ｌアミノ酸配列（配列番号４）
ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨ
【００４１】
ＣＤＲ２Ｌアミノ酸配列（配列番号５）
ＫＶＳＮＲＦＳ
【００４２】
ＣＤＲ３Ｌアミノ酸配列（配列番号６）
ＳＱＳＴＨＶＰＬＴ
【００４３】
可変重鎖ドメイン（ＶＨ１−１）のアミノ酸配列（配列番号７）
ＱＦＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＮＬＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＶＩＨＰＤＹＧＴＴＳＹＮＱＫＦＫＤＲＶＴＭＴＶＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＶＲＹＤＹＧＤＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【００４４】
可変軽鎖ドメイン（ＶＬ５）のアミノ酸配列（配列番号８）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＳＶＴＰＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＰＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＳＱＳＴＨＶＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
【００４５】
可変軽鎖ドメイン（ＶＬ２−１）のアミノ酸配列（配列番号９）
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＳＳＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨＷＬＱＱＲＰＧＱＰＰＲＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＡＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＳＱＳＴＨＶＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
【００４６】
実施例２  抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体の発現と精製
ヒト化ＩｇＧ重鎖（配列番号１０のアミノ酸配列）、軽鎖（配列番号１１のアミノ酸配列）をコードするＤＮＡ配列を合成し、ｐＴＧＥ５ベクター（Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔから購入可能）に挿入されて、全長ＩｇＧの発現プラスミドを構築した。親抗体の発現は、１００ｍｌのＨＥＫ２９３細胞培養で行われ（ＨＥＫ２９３細胞はＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入可能）、その上清液をプロテインＡアフィニティーカラムで精製した。精製した抗体は、ＰＤ−１０脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入可能）を用いてＰＢＳにバッファーを交換した。精製したタンパク質の濃度と純度は、それぞれ、ＯＤ２８０とＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した。ヒト化した抗体は、３０  ｍｌの  ＨＥＫ  ２９３細胞培養で発現した。細胞はスピンダウンした。上清液をろ過し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行いた（図１）。
【００４７】
ＶＨ１−１を含む重鎖アミノ酸配列（配列番号１０、完全長配列）
ＱＦＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＮＬＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＶＩＨＰＤＹＧＴＴＳＹＮＱＫＦＫＤＲＶＴＭＴＶＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＶＲＹＤＹＧＤＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【００４８】
ＶＬ５を含む軽鎖アミノ酸配列（配列番号１１、完全長配列）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＳＶＴＰＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＰＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＳＱＳＴＨＶＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【００４９】
実施例３  抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体がヒトＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７ＦへのＳＰＲ分析による結合親和性
抗ヒトＦｃガンマ特異抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ロット番号１２４４４８、コード１０９−００８−０９８）をアミンカップリング法にてセンサーチップに固定した。培地に分泌された４つの抗体、及び親抗体を注入され、それぞれ抗ヒトＦｃ抗体によってＦｃ（捕捉相）を介して捕捉された。平衡させた後、３００秒かけてＩＬ−１７を注入し（結合相）、次に、１２００秒かけてランニングバッファーを注入した（解離相）。参照フロー細胞（フロー細胞１）の応答は、サイクルごとにヒト化した抗体のフロー細胞の応答から差し引かれた。次のヒト化した抗体を注入する前に、その表面は再生させた。このプロセスが、全ての抗体を分析したまで繰り返された。ヒト化した抗体の解離率は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００エバリュエーションソフトを用いて、実験データをローカルマシンで１：１インタラクションモデルにフィットすることで取得した。前記抗体は、それらの解離速度定数（解離率、Ｋｄ）によって順位付けされた。ＩＬ−１７とインタラクションする時に、親抗体と類似の親和性を有するバインダーを選択した。
【００５０】
【表１】
0006876156.tif 000002
【００５１】
実施例４  ＥＬＩＳＡで測定したヒトＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆへの結合
ＭａｘｉＳｏｒｐ  ９６  ｗｅｌｌプレート（ＮＵＮＣ＃４４９８２４、ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ）は、２μｇ／ｍｌのヒトＩＬ−１７Ａ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ＃８９２８ＳＦ、ｗｗｗ．ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌ．ｃｏｍ）又はヒトＩＬ−１７Ｆ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ＃８９０６ＬＣ、  ｗｗｗ．ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌ．ｃｏｍ）を含む１ｘＰＢＳ（５０μｌ／ｗｅｌｌ）を用してコートされた。プレートは４℃で一晩培養した。コーティング液を除去し、プレートを２００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳＴ（０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０を含む１ｘＰＢＳ）で１回洗浄した。次に、２００μｌ／ｗｅｌｌのブロッキングバッファー（０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０を含む１ｘ  ＰＢＳ、３％ＢＳＡ）を添加し、室温で１時間培養した。ブロッキングバッファーを除去し、プレートを２００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳＴ（０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０を含む１ｘ  ＰＢＳ）で３回洗浄した。１ｘＰＢＳで抗ＩＬ−１７Ａ／Ｆ抗体（実施例２で作製した）を１０、３．３３、１．１１、０．３７、０．１２３、０．０４１、０．０１３７、０．００４６、０．００１５、０．０００３１、０．０００１０２、０．００００３４μｇ／ｍｌに希釈し、プレートに加えた（５０μｌ／ｗｅｌｌ）。プレートを室温で２時間培養した。ウェルの中に存在した抗体を除去し、プレートを２００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳＴ（０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０を含む１ｘＰＢＳ）で３回洗浄した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）−ＨＲＰ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ＃１０９−０３５−０８８、ｗｗｗ．ｊａｃｋｓｏｎｉｍｍｕｎｏ．ｃｏｍ）を１ｘＰＢＳで１：５０００に希釈して、各ウェルに追加した（５０μｌ／ｗｅｌｌ）。プレートを室温で１時間培養した。二次抗体を除去し、プレートを２００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳＴ（０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０を含む１ｘＰＢＳ）で７回洗浄した。５０μｌ／ｗｅｌｌのＴＭＢ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＃８５−００−４２０１−５６、ｗｗｗ．ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ）を加えて、プレートを室温で数分間培養した。次に、５０μｌ／ｗｅｌｌの２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止させた。光学密度（吸光度）は、ヒトＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆへの結合に関連する４５０ｎｍで測定された。平衡定数であるＥＣ５０（ｎＭ）を表２に示す。以上の結果から、抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体は、ヒトＩＬ−１７ＡとＩＬ−１７Ｆの両者に対して高い親和性で結合できることを示す。
【００５２】
【表２】
0006876156.tif 000003
【００５３】
実施例５  抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体は、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ１７Ｆ又はＩＬ１７Ａ／Ｆヘテロダイマーによって誘導した炎症性サイトカインの産生をブロックする。
【００５４】
ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆに対応する受容体は、それぞれ、ＩＬ−１７ＲＡ及びＩＬ−１７ＲＣである。これらの受容体は、線維芽細胞及び上皮細胞に遍在的に発現している。ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆは、細胞上の受容体に結合して、前記細胞でのＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−αなどの複数のサイトカインの産生及び放出を誘導することができる。ＩＬ−１７Ａ又はＩＬ−１７Ｆ特異的な抗体は、可溶性ＩＬ−１７Ａ又はＬ−１７Ｆに結合して、それらのＩＬ−１７ＲＡ又はＩＬ−１７ＲＣへの結合をそれぞれブロックすることができる。これより、サイトカインの誘導は抑制され、そしてさらに炎症の発生が抑制される。
【００５５】
前記アッセイは、抗ＩＬ−１７Ａ／Ｆ抗体（実施例２で作成したもの）を用いた予備培養することによりｈＩＬ−１７Ａ、ｈＩＬ−１７Ｆ、またはＩＬ１７−Ａ／Ｆヘテロダイマー（Ｒ＆ＤシステムＣａｔ＃５８３７−ＩＬ）での刺激を行ったＨＦＦ−１細胞（ヒト皮膚線維芽細胞は、中国科学アカデミー幹細胞バンク、＃ＳＣＳＰ−１０９）において、ｈＩＬ−６の産生の検出することで行った。ＨＦＦ−１細胞は細胞表面にＩＬ−１７受容体を発現している。可溶性ｈＩＬ−１７Ａ又はｈＩＬ−１７Ｆは、受容体に結合し、ＨＦＦ−１細胞のｈＩＬ−６サイトカインの発現及び放出を誘導している。ｈＩＬ−１７Ａ及びｈＩＬ−１７Ｆに反応する抗ＩＬ−１７Ａ／Ｆ抗体は、サイトカインとＩＬ−１７受容体との結合をブロックして、ＩＬ−１７Ａ／Ｆで誘導したｈＩＬ−６の発現を阻害する。培養上清液に放出されたｈＩＬ−６は、ＥＬＩＳＡで検出することができる。ｈＩＬ−６についての測定は、抗ＩＬ−１７Ａ／Ｆ抗体の阻害作用を示すことができる。
【００５６】
ＨＦＦ−１細胞は、１５％ＦＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入可能）、１％ペニシリン・ストレプトマイシン（ＰＳ、市販品）を含む０．３ｍｌ／ウェルＤＭＥＭ培地で１．５ｘ１０５細胞／ウェルの細胞密度にした後、４８ウェルプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入可能）に播種し、３７℃、５％ＣＯ２で１２時間インキュベートした。次に、ウェルの中の培地を除去し、細胞をＰＢＳで１回洗浄した（３００μｌ／ｗｅｌｌ）。前記細胞に３００μｌ／ｗｅｌｌの無血清ＤＭＥＭ培地を加えて、３７℃で６時間飢餓状態にした。６時間の飢餓状態後、ウェルの中の無血清ＤＭＥＭ培地を細胞から除去した。細胞に３０％ＦＢＳ、２％ＰＳを含むＤＭＥＭ培地１５０μｌ／ｗｅｌｌを加えた。その後、抗ＩＬ−１７Ａ／Ｆ抗体と、ｈＩＬ−１７Ａ、ＩＬ１７Ｆとの、又はＩＬ−１７Ａ／Ｆヘテロダイマーとの１５０μｌ／ｗｅｌｌ混合物を対応するウェルに加えた。プレートを３７℃で２４時間培養した。次に、上清液を回収してｈＩＬ−６のＥＬＩＳＡに用いた。ｈＩＬ−６の測定は、ヒトＩＬ−６  ＥＬＩＳＡ  Ｒｅａｄｙ−ＳＥＴ−Ｇｏのキット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＃８８−７０６６−８８）を用いて実施した。結果を図２に示し、抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体（ＶＨ１−１−ＶＬ５  ｍＡｂ）が、サイトカイン、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、及びＩＬ−ＩＬ１７Ａ／Ｆヘテロダイマーによって誘導して刺激したＩＬ−６の産生をブロックすることを表す（図２において、Ａ、Ｂ、Ｃ）。
【００５７】
実施例６  抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体は、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ又はＩＬ１７Ａ／ＦのＩＬ−１７受容体への結合をブロックする。
抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体（実施例２で作製した）は、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ又はＩＬ１７Ａ／ＦのＩＬ−１７受容体への結合に対する作用をＥＬＩＳＡにて検査した。ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、又はＩＬ−１７Ａ／Ｆは、９６ｗｅｌｌプレートにおいて５０μｌ／ｗｅｌｌのタンパク質溶液（タンパク質濃度は０．５μｇ／ｍｌ）で、４℃で一晩コートされた。前記ウェルは、２００μｌ／ｗｅｌｌの１％ＢＳＡ（０．０５％のｔｗｅｅｎ）を含むＰＢＳＴにより、室温で１時間ブロックされた。ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄した。抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体、及びアイソタイプ対照抗体としてのヒトＩｇＧ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ｃａｔ＃４０３１０２）をＰＢＳで、３０μｇ／ｍｌから０．０００５μｇ／ｍｌまで（３０、１０、３．３３、１．１１、０．３７、０．１２３、０．０４１、０．０１３７、０．００４６、０．００１５、０．０００５μｇ／ｍｌ）に希釈した。抗体を対応するウェルに加えて（５０μｌ／ｗｅｌｌ）、室温で４時間培養した。ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄した。ｈＩＬ１７ＲＡ−ｍＩｇＧ２ａＦｃ（１０μｇ／ｍｌ、標準分子生物学技術、Ｃａｒｓｏｎ  Ｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２０１２に基づく内製した）を各ウェルに加えて（５０μｌ／ｗｅｌｌ）、室温で１時間培養した。ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（１：５０００でＰＢＳに含まれ、ＥＡＳＹＢＩＯ  Ｃａｔ＃ＢＥ０１０２）を各ウェルに（５０μｌ／ｗｅｌｌ）加えて、室温で３０分間培養した。ウェルをＰＢＳＴで６回洗浄した。各ウェルにＴＭＢ基質を加えて（ウェルずつ５０μｌ）、反応は各ウェルに５０μｌの２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を加えることで停止させた。プレートは４５０ｎｍと５７０ｎｍで読み取られた。図３に示すように、抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体は、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ１７Ｆ、さらにはＩＬ−１７Ａ／ＦのＩＬ−１７受容体への結合をブロックする。上記データから、抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体はサイトカインとその受容体との間のインタラクションを遮断することにより、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ及びＩＬ１７Ａ／Ｆの活性を阻害することをさらに実証する。
【００５８】
実施例７  ＥＬＩＳＡで測定したヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆへの結合、及び他のＩＬ−１７のファミリーのメンバーとの交差反応性
ＭａｘｉＳｏｒｐ  ９６ｗｅｌｌプレート（ＮＵＮＣ＃４４９８２４、ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ）は、２μｇ／ｍｌのヒトＩＬ−１７Ａ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ＃８９２８ＳＦ、ｗｗｗ．ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌ．ｃｏｍ）、ヒトＩＬ−１７Ｆ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ＃８９０６ＬＣ、ｗｗｗ．ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌ．ｃｏｍ）、ヒトＩＬ−１７Ｂ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ＃２００−２８、ｗｗｗ．ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ）、ヒトＩＬ−１７Ｃ（Ｒ＆Ｄシステム＃１２３４−ＩＬ−０２５／ＣＦ、ｗｗｗ．ｒｎｄｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ）、ヒトＩＬ  −１７Ｄ（（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ＃２００−２７、ｗｗｗ．ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ）、ヒトＩＬ−１７Ｅ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ＃１２５８−ＩＬ−０２５／ＣＦ、ｗｗｗ．ｒｎｄｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ）、それぞれを含む１ｘ  ＰＢＳ（５０μｌ／ｗｅｌｌ）を用いてコートされた。プレートは４℃で一晩培養した。コーティング液を除去し、プレートを２００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳＴ（０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０を含む１ｘＰＢＳ）で１回洗浄した。次に、２００μｌ／ｗｅｌｌのブロッキングバッファー（０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０を含む１ｘ  ＰＢＳ、３％ＢＳＡ）を加えて、室温で１時間培養した。ブロッキングバッファーを除去し、プレートを２００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳＴ（０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０を含む１ｘＰＢＳ）で３回洗浄した。１ｘ  ＰＢＳで抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体、ｈＩｇＧ  ＶＨ１−１／ＶＬ５を１０、３．３３、１．１１、０．３７、０．１２３、０．０４１、０．０１３７、０．００４６、０．００１５、０．０００３１、０．０００１０２、０．００００３４μｇ／ｍｌに希釈し、プレートに加えた（５０μｌ／ｗｅｌｌ）。プレートを室温で２時間培養した。ウェルの中に存在した抗体を除去し、プレートを２００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳＴ（０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０を含む１ｘＰＢＳ）で３回洗浄した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）−ＨＲＰ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ＃１０９−０３５−０８８、ｗｗｗ．ｊａｃｋｓｏｎｉｍｍｕｎｏ．ｃｏｍ）を１ｘＰＢＳで１：５０００に希釈したものを、各ウェルに追加した（５０μｌ／ｗｅｌｌ）。プレートを室温で１時間培養した。二次抗体を除去し、プレートを２００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳＴ（０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０を含む１ｘＰＢＳ）で７回洗浄した。５０μｌ／ｗｅｌｌのＴＭＢ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＃８５−００−４２０１−５６、ｗｗｗ．ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ）を加えて、プレートを室温で数分間培養した。次に、５０μｌ／ｗｅｌｌの２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止させた。プレートを４５０  ｎｍで読み取った。結果を表３に示す。抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体であるｈＩｇＧ  ＶＨ１−１／ＶＬ５は、ヒトＩＬ−１７Ａ及び１７Ｆの両者との結合能を持つ（図４のＡとＦ）、ＥＣ５０はそれぞれ、０．０４６、０．０４７ｎＭである。それ以外、ｈＩｇＧ  ＶＨ１−１／ＶＬ５はヒトＩＬ−１７Ｂ、１７Ｃ、１７Ｄ及び１７Ｅに結合しなかった（図４、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ）。したがって、ｈＩｇＧ  ＶＨ１−１／ＶＬ５抗体は、ヒトＩＬ−１７Ａ及び１７Ｆへの結合特異���を持つ、他のＩＬ−１７ファミリーのメンバーとは交差反応性を有しない。
【００５９】
【表３】
0006876156.tif 000004
【００６０】
実施例８  カニクイザルＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆとの交差反応性（結合能アッセイ）
抗ＩＬ−１７Ａ／Ｆ抗体がカニクイザルＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆへの結合能は、ＥＬＩＳＡにて測定した。なお、ヒトＩＬ−１７Ａ及びＦをそれぞれ、カニクイザルＩＬ−１７Ａ（ＧｅｎｅＩＤ：ＸＭ＿００５５５２７５９．２、標準分子生物学技術、Ｃａｒｓｏｎ  Ｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２０１２による内製した）及びＩＬ−１７Ｆ（ＧｅｎｅＩＤ：ＸＭ＿００５５５２７５７．２、標準分子生物学技術、Ｃａｒｓｏｎ  Ｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２０１２による内製した）に置き換えた以外、実施例７と同様の方法でアッセイを実施した。
ｈＩｇＧ  ＶＨ１−１−ＶＬ５抗体は、カニクイザルＩＩ−１７Ａ及び１７Ｆへの結合能を持つ、ＥＣ５０はそれぞれ０．０６、０．１８ｎＭである（表４、及び図５のＡ、Ｂ）。
【００６１】
【表４】
0006876156.tif 000005
【００６２】
カニクイザルは、カニクイザルＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆへの交差反応性を有することから、抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体に関する薬物動態学、薬力学、及び毒物学研究に適したことを示している。よって、抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体は医薬組成物としての開発が望まれている。
【００６３】
実施例９  抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体の作用のｉｎ  ｖｉｖｏ動物研究
ヒトＩＬ−１７（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｃａｔ＃８９２８ＳＦ、３μｇ／マウス）を皮下注射する１時間前に、抗ＩＬ−１７Ａ／Ｆ抗体（実施例２で作製したＶＨ１−１／ＶＬ５、２０μｇ／マウス）をＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスに（群各ｎ  ＝  ５、８週齢、体重：１８−２０ｇ  、Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｖｉｔａｌ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．、Ｌｔｄ．から購入可能）静脈内投与した。ＩＬ−１７を投与したから２時間の時点で血液サンプルを採取し、血漿中のＣＸＣＬ１ケモカインのレベルをＥＬＩＳＡ（マウスＣＸＣＬ１／ＧＲＯアルファＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡキット、Ｒ＆Ｄシステム、ＤＹ３４５）を用いて測定した。アイソタイプ対照抗体としては、ヒトＩｇＧ１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  Ｃａｔ＃４０３１２）を用いた。図６に示すように、抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体（実施例２で作製した）は、アイソタイプ対照抗体と比較して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの血漿におけるヒトＩＬ−１７Ａで誘導したケモカインの分泌を低下させることができる。この結果から、抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体が、ＩＬ−１７の活性を阻害、遮断、または中和するための医薬品として使用できることを示唆している。
【００６４】
Iｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究では、被験体においてＩＬ−１７Ａ及び／又はＩＬ−１７Ｆ関連疾病の治療に使用する医薬品の製造のための、抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体の使用を実証した。ＩＬ−１７Ａ及び／又はＩＬ−１７Ｆ関連疾病は、例えば、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス、変形性関節症及び炎症性腸疾患（ＩＢＤ）などを含む自己免疫疾患及び炎症性疾患からなる群より選択できる。被験体は、ラット、マウス、サル、又はヒトなどの哺乳類であってもよい。好ましくは、被験体はヒトである。
【図１】
0006876156.tif 000006
【図２】
0006876156.tif 000007
【図３】
0006876156.tif 000008
【図４】
0006876156.tif 000009
【図５】
0006876156.tif 000010
【図６】
0006876156.tif 000011
【配列表】
0006876156000001.app