(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
導電性に基づいて種子発芽プロファイルの指標をコンピュータを用いて得る方法において、
（Ａ）植物種子から派生した活性医薬成分（ＡＰＩ:Active Pharmaceutical Ingredient ）のターゲット・プロファイルをターゲット発芽ステージに相関づけるターゲット−プロファイル相関関係を用いるステップと、
前記ターゲット・プロファイルは、必須化学成分の特別確認特性（specific identifying charcteristic）を含み、前記ターゲット発芽ステージは、前記ターゲット・プロファイルが対応する種子−発芽プロセスの進展ポイントに関連し、
（Ｂ）前記種子−発芽プロセスの間、発芽−プロセス・プロファイルをそれぞれのプロセス発芽ステージに相関づけるプロセス−プロファイル相関関係を用いるステップと、
前記発芽−プロセス・プロファイルの各々は、前記プロセス発芽ステージの間植物種子から抽出された種子材料に関連し、前記発芽−プロセス・プロファイル各々は、前記必須化学成分の特別確認特性を含み、前記それぞれのプロセス発芽ステージは、前記発芽−プロセス・プロファイルが対応する発芽プロセスの進展ポイントに関連し、
（Ｃ）前記ターゲット・プロファイルの前記特別確認特性を前記発芽−プロセス・プロファイル内の対応する特徴と比較するステップと、
（Ｄ）前記ステップ（Ｃ）に基づいて、前記ＡＰＩ量を最大にする前記ターゲット発芽ステージを最適状態として指定し選択するステップと、
（Ｅ）前記最適状態を、温度依存性のある発芽停止状態を特定するために、所定の温度範囲で浸漬水内の前記植物種子用の導電性の範囲に相互相関させるステップと
を有することを特徴とする導電性に基づいて種子発芽プロセスの指標を得る方法。
【請求項２】
前記ステップ（Ａ）は、前記ターゲット・プロファイルを解析技術を用いて提供することにより行われ、前記ステップ（Ｂ）は、前記発芽−プロセス・プロファイルを解析技術を用いて提供することにより行われる
ことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記解析技術は、高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）である
ことを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記必須化学成分は、前記ＡＰＩの誘導体又は前駆体である
ことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記植物種子は大豆である
ことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
導電性に基づいて種子発芽プロファイルの指標を得る装置において、
（ａ）計算を実行するＣＰＵと、
（ｂ）データを記憶するメモリ・モジュールと、
（ｃ）導電性データを受領する導電性モジュールと、
（ｄ）温度データを取り出す温度センサー・モジュールと、
（ｅ）下記ステップ（ｅｉ）（ｅｉｉ）を実行する発芽−プロファイル・モジュールと、
（ｅｉ）植物種子から派生した活性医薬成分（ＡＰＩ:Active Pharmaceutical Ingredient ）のターゲット・プロファイルをターゲット発芽ステージに相関づけるターゲット−プロファイル相関関係を用いるステップと、
前記ターゲット・プロファイルは、必須化学成分の特別確認特性（specific identifying charcteristic）を含み、前記ターゲット発芽ステージは、前記ターゲット・プロファイルが対応する種子−発芽プロセスの進展ポイントに関連し、
（ｅｉｉ）前記種子−発芽プロセスの間、発芽−プロセス・プロファイルをそれぞれのプロセス発芽ステージに相関づけるプロセス−プロファイル相関関係を用いるステップと、
前記発芽−プロセス・プロファイルの各々は、前記プロセス発芽ステージの間植物種子から抽出された種子材料に関連し、前記発芽−プロセス・プロファイル各々は、前記必須化学成分の特別確認特性を含み、前記それぞれのプロセス発芽ステージは、前記発芽−プロセス・プロファイルが対応する発芽プロセスの進展ポイントに関連し、
（ｆ）下記ステップ（ｆｉ）（ｆｉｉ）を実行する比較モジュールと、
（ｆｉ）前記ターゲット・プロファイルの前記特別確認特性を前記発芽−プロセス・プロファイル内の対応する特徴と比較するステップと、
（ｆｉｉ）前記ステップ（Ｃ）に基づいて、前記ＡＰＩ量を最大にする前記ターゲット発芽ステージを最適状態として指定し選択するステップと、
（ｇ）下記ステップ（ｇｉ）を実行する導電性相互相関モジュールと
（ｇｉ）前記最適状態を、温度依存性のある発芽停止状態を特定するために、所定の温度範囲で浸漬水内の前記植物種子用の導電性の範囲に相互相関させるステップ
を有することを特徴とする導電性に基づいて種子発芽プロファイルの指標を得る装置。
【請求項７】
前記ステップ（Ａ）は、前記ターゲット・プロファイルを解析技術を用いて提供することにより行われ、前記ステップ（Ｂ）は、前記発芽プロセス・プロファイルを解析技術を用いて提供することにより行われる
ことを特徴とする請求項６記載の装置。
【請求項８】
前記解析技術は、高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）である
ことを特徴とする請求項７記載の装置。
【請求項９】
前記必須化学成分は、前記ＡＰＩの誘導体又は前駆体である
ことを特徴とする請求項６記載の装置。
【請求項１０】
前記植物種子は大豆である
ことを特徴とする請求項６記載の装置。
【請求項１１】
導電性に基づいて種子発芽プロファイルの指標を得る為に、コンピュータに下記ステップ（Ａ）〜（Ｅ）を実行させるコンピュータで読み取り可能なコードを記憶する非揮発性の記憶媒体において、
（Ａ）植物種子から派生した活性医薬成分（ＡＰＩ:Active Pharmaceutical Ingredient ）のターゲット・プロファイルをターゲット発芽ステージに相関づけるターゲット−プロファイル相関関係を用いるステップと、
前記ターゲット・プロファイルは、必須化学成分の特別確認特性（specific identifying charcteristic）を含み、前記ターゲット発芽ステージは、前記ターゲット・プロファイルが対応する種子−発芽プロセスの進展ポイントに関連し、
（Ｂ）前記種子−発芽プロセスの間、発芽−プロセス・プロファイルをそれぞれのプロセス発芽ステージに相関づけるプロセス−プロファイル相関関係を用いるステップと、
前記発芽−プロセス・プロファイルの各々は、前記プロセス発芽ステージの間植物種子から抽出された種子材料に関連し、前記発芽−プロセス・プロファイル各々は、前記必須化学成分の特別確認特性を含み、前記それぞれのプロセス発芽ステージは、前記発芽−プロセス・プロファイルが対応する発芽プロセスの進展ポイントに関連し、
（Ｃ）前記ターゲット・プロファイルの前記特別確認特性を前記発芽−プロセス・プロファイル内の対応する特徴と比較するステップと、
（Ｄ）前記ステップ（Ｃ）に基づいて、前記ＡＰＩ量を最大にする前記ターゲット発芽ステージを最適状態として指定し選択するステップと、
（Ｅ）前記最適状態を、温度依存性のある発芽停止状態を特定するために、所定の温度範囲で浸漬水内の前記植物種子用の導電性の範囲に相互相関させるステップと
コンピュータで読み取り可能なコードを記憶する非揮発性の記憶媒体。
【請求項１２】
前記ステップ（Ａ）を実行させるコードは、解析技術を用いて前記ターゲット・プロファイルから得られたデータを用いて行われ、前記ステップ（Ｂ）を実行させるコードは、解析技術を用いて前記発芽プロセス・プロファイルから得られたデータを用いて行われる
ことを特徴とする請求項１１記載の記憶媒体。
【請求項１３】
前記解析技術は、高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）である
ことを特徴とする請求項１２記載の記憶媒体。
【請求項１４】
前記必須化学成分は、前記ＡＰＩの誘導体又は前駆体である
ことを特徴とする請求項１１記載の記憶媒体。
【請求項１５】
前記植物種子は大豆である
ことを特徴とする請求項１１記載の記憶媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、導電性／率（以下「導電性」と総称する）に基づいて種子発芽プロファイルの指標／インディケータ（以下「指標」と総称する）を得る方法と装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
研究室レベルにおける発芽とは、ＡＯＳＡ（Association of Official Seed analysts）で次のように定義している。「関連する種類の種子において、必須構造の種子の胚（seed embryo）からの発芽と生育が、好ましい環境下で通常の植物を生成する能力を示すことである」
【０００３】
種子発芽（seed germination）のプロセスは周りの環境に非常に影響される。この様な影響は、発芽ステージが小根（植物の胚根(embryonic root of plant)）の発生に寄与する進展の速度と、発芽を越えて発芽植物の生育への現象に見いだされる。発芽の様々な段階を特定することは、農業プロセス、広くは生化学プロセス、誘導体化プロセス(derivative process)、医薬産業に関連する業界において非常に重要な目標である。
【０００４】
発芽プロセスの間、種子は、発芽を伴う生物化学のプロセスにおける変化を反映する材料を放出する。この様な変化の中心は、発芽の第１段階の間栄養源（nutrient sources）を生成する（後続の変化が起きるにつれて性質が瞬間に変化するにも関わらず）ことにある。この様な発芽の変質（germination transformation）のプロセスにおいては、種子が浸される水（以下「浸漬水」と称する）もまた特徴的な変化を示す。特にこの浸漬水の導電性は、種の生長と活性の態様に相関関係を示す。
【特許文献１】米国特許第５６５９６２３号明細書
【０００５】
従来技術において特許文献１は、浸漬水の導電性を測定する導電性テストを用いて種子のロット毎の品質を評価する方法を教示する。この手法は、弱く漏れやすい膜構造を有する低活性の種子に対し行われていた。このような弱い膜構造を有する種子は、水を吸収した時には、電解質例えばアミノ酸、有機酸を失い、それにより浸漬水の導電性を増加させている。この様な確立されたテストの他の一例は非特許文献１にも記載されている。
【非特許文献１】"Electrical Conductivity Vigour Test: Physiological Basis and Use,” Matthews and Powell, Seed Testing International, No. 131, pp. 32-35, April 2006 and “Seed-borne pathogens and electrical conductivity of soybean seeds,” Wain-Tassi et al., Sci. Agric., v. 69, n. 1, pp. 19-25, January/February 2012.
【０００６】
ＤＴ５６ａ（Femarelle：登録商標）は、大豆植物から抽出された固有の非ホルモン系の活性医薬成分（ＡＰＩ：Active Pharmaceutical Ingredient：以下「ＡＰＩ」と称する）であり、これは閉経症候群の緩和と閉経後の骨粗鬆症の阻止における新規のＳＥＲＭ（Selective Estrogen Receptor Modulator）として機能することが示されている。しかしこれは、子宮内膜の再生組織と胸部組織に影響せず、またホルモン系の血液プロファイルを変化させることはない。
【０００７】
ＳＣ０１２（Brizo：登録商標）は、大豆植物から抽出された固有のＡＰＩであり、これは良性の前立腺肥大（ＢＰＨ：Benign Prostate Hyperplasia）に伴う頻尿症候群を患う男性患者を治癒する。ＳＣ０１２は、前立腺内のアンドロゲンとエストロゲンの受容体に選択的に作用し、前立腺の大きさを減少させる。これにより服用１月後には尿道にかる圧力を減らし、男性を不必要なリスクにさらす例えばインポテンツにするおそれはない。
【０００８】
ＤＴ５６ａとＳＣ０１２の製造プロセスは、温度制御された浸漬水用桶に大豆を浸すことにより開始する。種子発芽の間、材料は、活性発芽ステージと植物の進展に生物学的滋養を与える生化学的変化を受ける。ＤＴ５６ａとＳＣ０１２の材料内に存在する成分は、発芽プロセスの特定のステージで見出される物質に基づく。大豆の発芽プロセス全体は、温度依存性があり、数時間に渡って起きるが、所望の成分が出現する前記のステージは、一過性であり、数分から最大３０分程度しか持続しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
挑戦的事項は、温度と時間を変えた様々な条件下で、所望の成分が高濃度で見出されるステージ／段階を、発芽のバッチ毎に種子内の成分を解析するために、種子（即ち豆華（legume）状態の大豆）をサンプリングせずに、特定することである。
【００１０】
本発明の目的は、導電性に基づいて種子発芽プロファイルの指標を得る方法と装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、非侵襲性（種子を分解することなく）で大量の種子の発芽ステージ／段階を特定することである。これは、発芽プロセスの間過渡的成分の化学プロファイル（chemical profile of transient component）を浸漬水の導電性に関連付けることにより行われる。このプロセスは、温度制御することもでき、また温度制御されていない周囲環境では、工業用の浸漬水用桶の周囲温度の変動を補正する為に校正をして調整される。発芽プロセスの間ほぼリアルタイムで得られたこの様な情報で、生化学変化を停止して、最大濃度で所望成分を「収穫」する。
【００１２】
本発明によれば、導電性に基づいて種子発芽プロファイルの指標を得る本発明の方法は、
（Ａ）植物種子から派生した活性医薬成分のターゲット・プロファイルをターゲット発芽ステージに相関づけるターゲット−プロファイル相関関係を用いるステップと、
前記ターゲット・プロファイルは、必須化学成分の特別確認特性（specific identifying charcteristic）を含み、前記ターゲット発芽ステージは、前記ターゲット・プロファイルが対応する種子−発芽プロセスの進展ポイントに関連し、
（Ｂ）前記種子−発芽プロセスの間、発芽−プロセス・プロファイルをそれぞれのプロセス発芽ステージに相関づけるプロセス−プロファイル相関関係を用いるステップと、
前記発芽−プロセス・プロファイルの各々は、前記プロセス発芽ステージの間植物種子から抽出された種子材料に関連し、前記発芽−プロセス・プロファイル各々は、前記必須化学成分の特別確認特性を含み、前記それぞれのプロセス発芽ステージは、前記発芽−プロセス・プロファイルが対応する発芽プロセスの進展ポイントに関連し、
（Ｃ）前記ターゲット・プロファイルの前記特別確認特性を前記発芽−プロセス・プロファイル内の対応する特徴と比較するステップと、
（Ｄ）前記ステップ（Ｃ）に基づいて、前記ＡＰＩ量を最大にする前記ターゲット発芽ステージを最適状態として指定し選択するステップと、
（Ｅ）前記最適状態を、温度依存性のある発芽停止状態を特定するために、所定の温度範囲で浸漬水内の前記植物種子用の導電性の範囲に相互相関させるステップとを有する。
更に前記ステップ（Ａ）は前記ターゲット・プロファイルを解析技術を用いて提供することにより行われ、前記ステップ（Ｂ）は前記発芽−プロセス・プロファイルを解析技術を用いて提供することにより行われる。更に前記解析技術は高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）である。更に前記必須化学成分は前記ＡＰＩの誘導体又は前駆体である。更に前記植物種子は大豆である。
【００１３】
本発明によれば、導電性に基づいて種子発芽プロファイルの指標を得る本発明の装置は、
（ａ）計算を実行するＣＰＵと、（ｂ）データを記憶するメモリ・モジュールと、（ｃ）導電性データを受領する導電性モジュールと、（ｄ）温度データを取り出す温度センサー・モジュールと、（ｅ）下記ステップ（ｅｉ）（ｅｉｉ）を実行する発芽−プロファイル・モジュールと、（ｆ）下記ステップ（ｆｉ）（ｆｉｉ）を実行する比較モジュールと、（ｇ）下記ステップ（ｇｉ）を実行する導電性相互相関モジュールとを有する。
（ｅｉ）植物種子から派生した活性医薬成分のターゲット・プロファイルをターゲット発芽ステージに相関づけるターゲット−プロファイル相関関係を用いるステップ、
前記ターゲット・プロファイルは、必須化学成分の特別確認特性（specific identifying charcteristic）を含み、前記ターゲット発芽ステージは、前記ターゲット・プロファイルが対応する種子−発芽プロセスの進展ポイントに関連し、
（ｅｉｉ）前記種子−発芽プロセスの間、発芽−プロセス・プロファイルをそれぞれのプロセス発芽ステージに相関づけるプロセス−プロファイル相関関係を用いるステップ、
前記発芽−プロセス・プロファイルの各々は、前記プロセス発芽ステージの間植物種子から抽出された種子材料に関連し、前記発芽−プロセス・プロファイル各々は、前記必須化学成分の特別確認特性を含み、前記それぞれのプロセス発芽ステージは、前記発芽−プロセス・プロファイルが対応する発芽プロセスの進展ポイントに関連し、
（ｆｉ）前記ターゲット・プロファイルの前記特別確認特性を前記発芽−プロセス・プロファイル内の対応する特徴と比較するステップ、
（ｆｉｉ）前記ステップ（Ｃ）に基づいて、前記ＡＰＩ量を最大にする前記ターゲット発芽ステージを最適状態として指定し選択するステップ、
（ｇｉ）前記最適状態を、温度依存性のある発芽停止状態を特定するために、所定の温度範囲で浸漬水内の前記植物種子用の導電性の範囲に相互相関させるステップ。
更に、前記ステップ（ｅｉ）は前記ターゲット・プロファイルを解析技術を用いて提供することにより行われ、前記ステップ（ｅｉｉ）は前記発芽−プロセス・プロファイルを解析技術を用いて提供することにより行われる。更に前記解析技術は高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）である。更に前記必須化学成分は前記ＡＰＩの誘導体又は前駆体である。更に前記植物種子は大豆である。
【００１４】
更に、本発明は導電性に基づいて種子発芽プロファイルの指標を得る為に、コンピュータに下記ステップ（Ａ）〜（Ｅ）を実行させるコンピュータで読み取り可能なコードを記憶する非揮発性の本発明の記憶媒体である。
（Ａ）植物種子から派生した活性医薬成分（ＡＰＩ:Active Pharmaceutical Ingredient 以下「ＡＰＩ」と称する）のターゲット・プロファイルをターゲット発芽ステージに相関づけるターゲット−プロファイル相関関係を用いるステップと、
前記ターゲット・プロファイルは、必須化学成分の特別確認特性（specific identifying charcteristic）を含み、前記ターゲット発芽ステージは、前記ターゲット・プロファイルが対応する種子−発芽プロセスの進展ポイントに関連し、
（Ｂ）前記種子−発芽プロセスの間、発芽−プロセス・プロファイルをそれぞれのプロセス発芽ステージに相関づけるプロセス−プロファイル相関関係を用いるステップと、
前記発芽−プロセス・プロファイルの各々は、前記プロセス発芽ステージの間植物種子から抽出された種子材料に関連し、前記発芽−プロセス・プロファイル各々は、前記必須化学成分の特別確認特性を含み、前記それぞれのプロセス発芽ステージは、前記発芽−プロセス・プロファイルが対応する発芽プロセスの進展ポイントに関連し、
（Ｃ）前記ターゲット・プロファイルの前記特別確認特性を前記発芽−プロセス・プロファイル内の対応する特徴と比較するステップと、
（Ｄ）前記ステップ（Ｃ）に基づいて、前記ＡＰＩ量を最大にする前記ターゲット発芽ステージを最適状態として指定し選択するステップと、
（Ｅ）前記最適状態を、温度依存性のある発芽停止状態を特定するために、所定の温度範囲で浸漬水内の前記植物種子用の導電性の範囲に相互相関させるステップ。
更に前記ステップ（Ａ）を実行させるコードは、解析技術を用いて、前記ターゲット・プロファイルから得られたデータを用いて行われ、前記ステップ（Ｂ）を実行させるコードは、解析技術を用いて、前記発芽−プロセス・プロファイルから得られたデータを用いて行われる。更に前記解析技術は高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）である。更に前記必須化学成分は前記ＡＰＩの誘導体又は前駆体である。更に前記植物種子は大豆である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の一実施例により、所定の発芽ステージの大豆から抽出された種子材料のクロマトグラフィ分離を示すＤＴ５６ａサンプルのＨＰＬＣのクロマトグラム・フィンガープリント（指紋）の一例である。
【図２】本発明の一実施例により、所定の発芽ステージの大豆から抽出された種子材料のクロマトグラフィ分離を示すＳＣ０１２サンプルのＨＰＬＣのクロマトグラム・フィンガープリント（指紋）の一例である。
【図３】本発明の一実施例により、導電性に基づいて、種子発芽プロファイルの指標を得る主ステップを示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
大豆の発芽プロセス（sprouting process）は種子内への水の吸収から始まる。即ち発芽に関連する生化学プロセスを開始する、発生／遺伝子材料（genetic material）と植物栄養素（botanical nutrient）の保存プロセスから、発芽プロセス（process of germination）への移行を開始する。初期の水の透過／浸漬は臍（hilum）（即ち、大豆種子の「芽（eye）」即ち種子(seed)が莢（pod）に付着する点である）を通して行われ、水を種子の皮（即ち豆）内に吸収させ、皮を柔らかい材料に変える。この様に皮が柔らかくなったことにより、皮を通した双方向の拡散が可能となり、これにより種子内の成分が浸漬水内に放出する。
【００１７】
浸漬水内に放出される物質の一部は、浸漬水の導電性を直接変化させるミネラルであり、他の放出物質は、間接的に浸漬水の導電性に影響を及ぼす。一般的に、浸漬水内の物質の量と質と発芽成分（germination component）との間の直接相関関係が確立されている。
【００１８】
温度制御された発芽桶内で、浸漬水の導電性が５分間隔で測定され、種子発芽のステージに対応する導電性のレベルを決定する。これによりユーザは、発芽ステージ（germination stage ）を特定できるようになる。この発芽ステージでは、活性ＤＴ５６ａ材料とＳＣ０１２材料を得るために、種子材料内で所望の成分への必要な移行が起きる。所望の発芽ステージが特定されると、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ：High-Pressure Liquid Chromatography）が、最終生成物のＡＰＩの形態の抽出された種子材料のサンプルに対し施される。導電性の測定の間いつでも発芽プロセス（germination process）を終了させて、所定の発芽ステージで存在する過渡的生化学成分（transient biochemical component）を分離することができる。
【００１９】
この指標技術（indicator technique）はＨＰＬＣの使用に限定されない。ＡＰＩ内に存在する化学物質の「シグネチャー（特徴）」あるいは「フィンガープリント（指紋）」のプロファイルを得るあらゆる解析技術を用いて、相互相関導電性テスト指標を発展させるベースとして機能するターゲット・プロファイルを得ることができる。
【００２０】
一般的な発芽桶は数１００ｋｇの種子を入れることができる。この様な一回で大量の種子の解析は現実的ではない、しかし種子の桶サンプル（vat sample of the seed）を用いると許容できない不一致と誤差を測定値に導入してしまう。かくして本明細書に記載した発芽用桶の容量全体を計算に入れる非侵襲性の発芽プロファイル指標は、この様な問題を解決し高い信頼性、精度、効率、ほぼリアルタイムでの繰り返し、品質制御、品質保証を提供することができる。
【００２１】
発芽プロセスの間に種子材料が主成分内に抽出される生化学成分を解析することが、この様なテスト指標を得るため必要である。浸漬水の導電性を指標として用いることにより、発芽を停止させる正確な時間を特定し、所望の生化学成分を評価し最適化することができる。これは導電性と抽出されたサンプル材料の解析プロファイルとを関連付ける（相関をとる）ことにより行われる。この様な化学プロファイルは、サンプリング時の発芽ステージの成分を含み、これにより、発芽ステージの間変換の直接生成物である材料をピンポイントで特定するテストを可能にする。
【００２２】
ＨＰＬＣは進歩しており、アミノ酸のような化学物質の高精度の解析を日常的に可能とする。クロマトグラフィー・カラム上での分離されたアミノ酸解析への移動相勾配溶離（mobile-phase gradient elution）の機能は公知である。
【００２３】
ＤＴ５６ａとＳＣ０１２サンプルは、大豆の抽出物であるが、導電性のテスト指標用の相関関係の基礎となる所望の特性プロファイル用の基準材料として用いられた。最初は、２０メッシュの篩い（即ち０．５ｍｍ未満の粉末）を介して挽いたサンプルが用意される。このサンプルをサンプル認可のために品質制御システムを用いてチェックし、乾燥室温（一般的には室温は１８℃−２４℃、相対湿度は０．５％、室温の露点は約−３７℃）で貯蔵する。ＤＴ５６ａとＳＣ０１２は、追加物例えば、添加剤、冷却剤、臭化剤、芳香剤、保存剤を含まない。
【００２４】
ＨＰＬＣ−ＵＶ解析を用いて、サンプル中のＤＴ５６ａとＳＣ０１２バイオマーカーをそれぞれ決定した。それが発芽プロファイルの基礎を形成する。ＤＴ５６ａとＳＣ０１２のサンプルの全ての解析は個別かつ独立して行われた。サンプル処理は、メタノール溶液（二重蒸留水（ＤＤＷ）中のＨＰＬＣグラジエント・グレード・メタノール）を用いたＨＰＬＣカラム内に抽出されたバイオマーカーに関連する。このメタノール溶液は、ＵＶ−Ｖｉｓディテクタ（２５４ｎｍ）を具備したＨＰＬＣ装置（Dionex社製 HPLC 1100 シリーズ）内に注入された。
【００２５】
クロマトグラフィ分離は、逆相ＨＰＬＣカラム（reversed-phase HPLC column）を用いて実施された。これは、線形水溶液グラジエント溶離剤、ＰＴＦＥシリンジ・フィルタ（直径１３ｍｍ、孔径０．４５μｍ）、ＨＰＬＣカラム（LiChroCART登録商標、4.6-250mmID Purospher 登録商標  SART RP-18 エンドキャップ（５μｍ））、プレ−カラム（LiChroCART、4-4 HPLC ガードカラムRP-18e（５μｍ）)を介して行われた。
【００２６】
サンプルの準備は、正確に測定した量のサンプルを入れた試験管にメタノールを入れる。このメタノールの溶液を回転機の中で室温で２４時間撹拌した。試験管内の上部溶液が透明になり粒子が無くなるまで約１５分間放置した後、試験管内のサンプルの上部溶液が、１．５ｍｌのEppendorf pipettesを用いて抽出され、Eppendorf 試験管内に移される。その後遠心分離器に配置し、２４００ｒｐｍで１分間回転し遠心分離させた。遠心分離したサンプルから上部相が１ｍｌの校正済みシリンジを用いて抽出された。その後この抽出された溶液をＰＴＦＥシリンジ・フィルタを濾過した。その後この濾過されたサンプルＨＰＬＣガラス瓶に集められ、ＨＰＬＣ自動サンプリング器に入れられ、解析器に注入された。
【００２７】
ＨＰＬＣ解析は、下記注入パラメータを用いて２５℃のコラム温度で実行された。サンプルボリュームが２０μｌ、サンプル温度が２５℃、スプリット・ループ注入技術、１０％メタノール水溶液の溶離剤Ａと、１００％メタノール溶離剤Ｂである。表１はＨＰＬＣの溶離剤の校正データを示す。
表１：溶離剤Ａ（１０％メタノール水溶液）と溶離剤Ｂ（１００％メタノール）のＨＰＬＣ溶離剤校正データ
時間 (分)     % A         % B  
0.00      100.0         0.0
20.00       43.0        57.0
26.00        0.0       100.0
30.00      100.0         0.0
35.00      100.0         0.0
【００２８】
図１は、本発明の一実施例による、所望の活性材料の存在を特定する為に、所定の発芽ステージの大豆から抽出された種子材料のクロマトグラフィ分離を示すＤＴ５６ａのＨＰＬＣのクロマトグラム指紋を示す。ピーク保持時間（peak retention time）はこのクロマトグラム内に示されている。ｍＡＵ（即ち、milli-Absorbance Units）強度に基づく４つの主ピーク１−４（即ち、ＤＴ５６ａサンプルのバイオマーカー）が示されている。
【００２９】
ピークは、最終生成物の（図１．図２の）ＡＰＩ成分を表すが、発芽の所定のステージに表れる化学成分は、処理後の生成物との同一性を問わない。しかしターゲット・プロファイルの相関関係データを得る／展開するためには、関連すると見なされた特定されたピークは、最終生成物の成分（例、最終生成物成分のプリカーサ又は誘導体）に達するものであると確立することが必要である。かくして発芽が所望の発芽ステージで中断された後でも、変化は、様々なポスト発芽処理に起因して、成分プロファイル（component profile）で依然として起こる。この様なポスト発芽処理を既に受けたサンプルを用いて、この様な処理に起因する成分プロファイル変動も考慮に入れられる。
【００３０】
表２は、所定の発芽ステージの大豆から抽出されたＤＴ５６ａの４つの主ピーク（Ｐ１−Ｐ４）のプロファイル・データである。ピーク高さとカーブ（ＡＵＣ）下のピーク面積が示されている。相対高さと相対面積は、それぞれＰ２／Ｐ１の割合（ＲＨ１）とＰ３／Ｐ４の割合（ＲＨ２）で示している。
表２：所定の発芽ステージの大豆から抽出されたＤＴ５６ａサンプルの特定された主ピーク（Ｐ１−Ｐ４）のＨＰＬＣのプロファイル・データ
保持時間  ピーク   高さ    相対高さ   面積(AUC as    相対面積 
(分min)           (mAU)      (%)       mAU x min.)   ＲＡ (%)     
19.16      1     171.076    ----        34.398      ----
16.83      2      94.115     55.01       16.828       48.92
(RH1=P2/P1)               (RA1=P2/P1)
24.24      3     210.001     ----        38.443      ----
25.91      4     339.582     61.84       56.683      67.82 
(RH2=P3/P4)              (RA2=P3/P4)
【００３１】
表２（表３も）の例示的なプロファイル・データは、ＲＡ（相対面積）をテスト指標の導電性に対し相互相関関係を確立するベースとして用いているが、他のプロファイル・データでも適切であるとして、化学プロファイルを得るために採用される解析技術に依存した相関関係の質を改善してもよい。かくしてＡＵＣは、表２のＲＡを計算することなく単に使用することができる。同様にピーク間の他の比率も用いることができる。この様なテスト指標を展開することに興味を有するユーザは、以下のことを見なすことができる。（１）ＡＰＩが、関連した即ち意図した診療効果を既に特定し、（２）ＡＰＩに関連するターゲット・プロファイルを、ＡＰＩ（又はその誘導体又はプリカーサ）を含む解析対象の種子の浸漬水の導電率に相関関係付ける開始点として十分に特定している。
【００３２】
実際に、表２のＲＡに関し、生成プロセスの継続（即ち：発芽を継続又は中止すべきか）は、種子抽出物に保持されている所望の材料の量と、発芽プロセスの更なる進展に起因して生成される所望材料の量との比率に依存する。ＲＡの解析を用いて、この比率を最適にするが、これは２つの生成物ピーク（Ｐ１，Ｐ３）とこの生成物から得られた２つの中間ピーク（Ｐ２，Ｐ４）を比較することにより行われる。
【００３３】
前記したように、ターゲット・プロファイルからの相関関係に対するベースの決定において、ターゲット・プロファイルの特徴（即：化学成分と解析対象のプロセスにおけるその役割）が完全に理解されていると、仮定できる。かくして発芽ステージは、所望の生成物を生成するために用いられる種子内の反応物が完全に消費された時に停止する必要がある。Ｐ１〜Ｐ４は、発芽の開始時から最終ＡＰＩまで見いだされる最大に安定したピークであり、これは、所望の効率プロファイルを特定する信頼できるマーカーとして機能する。この効率プロファイルは、ＤＴ５６ａ（図１と表２）と、ＳＣ０１２（図２と表３）の両方に対するラットに対する診療前モデルに関連する。
【００３４】
一連のＨＰＬＣの結果の累積解析によれば以下が確認できる。即ち、ＤＴ５６ａの最終生成物は、ＲＡ１は４５．５２−７９．２５％の範囲内にあり、ＲＡ２は５５．２３−７３．３％の範囲内にある。
【００３５】
図２は、本発明の一実施例による、所望の活性材料の存在を特定する為に、所定の発芽ステージの大豆から抽出された種子材料のクロマトグラフィ分離を示す実施例のＳＣ０１２サンプルのＨＰＬＣのクロマトグラム指紋を示す。ピーク保持時間はこのクロマトグラム内に示されている。ｍＡＵ強度に基づいた４つのピークが示されている。ピーク１−４（即：ＳＣ０１２サンプルのバイオマーカー）として特定される。
【００３６】
表３は、所定の発芽ステージの大豆から抽出されたＳＣ０１２の４つの主ピーク（Ｐ１−Ｐ４）のプロファイル・データである。ピーク高さはＡＵＣで示されている。相対高さと相対面積は、それぞれＰ２／Ｐ１の割合とＰ３／Ｐ４の割合で示されている。
表３：所定の発芽ステージの大豆から抽出されたＳＣ０１２サンプルの特定された主ピーク（Ｐ１−Ｐ４）のＨＰＬＣのプロファイル・データ
保持時間   ピーク   高さ    相対高さ   面積(AUC as    相対面積 
(分)                (mAU)      (%)         mAU x min.)  ＲＡ (%)
19.51       1       232.63１ ----       54.072      ----
17.19       2       144.994   62.33       28.104      51.97
(P2/P1)                  (P2/P1)
24.48       3       129.681     ----       21.018      ----
26.05       4       201.762   64.27       36.694       57.28 
(P3/P4)                  (P3/P4)
【００３７】
一連のＨＰＬＣの結果の累積解析によれば以下が確認できる。ＳＣ０１２の最終生成物において、ＲＡ１は５０．６５−５６．２２％の範囲内にあり、ＲＡ２は５６．２−６８．６７％の範囲内にある。
【００３８】
幅広い温度範囲で種子発芽の浸漬水の導電性の測定が行われた。表４は、複数の温度範囲における導電性の範囲（milliSiemen）を示し、これは浸漬水温度の関数として発芽停止値を特定するために用いられる。発芽開始時の種子と最初に接触した浸漬水に対する基準線の導電性は、０．７２−０．９ｍＳであった。
【００３９】
この導電性の範囲は、上記のピーク比率の割合をベースにした所望の化学プロファイルに相関関係付けられ、所望の発芽停止値の範囲を決定するために用いられる。この導電性の範囲を、表４に示すデータの温度依存性を得るためのベースとして使用する。テスト指標の「温度校正」により正確な温度制御が可能となり、所望の発芽ステージが起きる割合を調整し（所望の発芽ステージの行き過ぎを阻止し）、未制御の温度環境において工業用の浸漬水用桶の季節毎の周囲温度の変動を調整することができる。この様な技術により、ほぼリアルタイムで非侵襲性で種子のバルク量の発芽ステージを、導電性をベースにして決定できる。
表４：発芽停止状態を決定する為に、「温度校正」として採用するための様々な温度範囲における種子発芽の浸漬水用桶の導電性の測定値
温度 (°C)   導電性(mS)
18-19    3.08-3.32
20-21    3.33-3.45
22-23    3.46-3.59
24-25    3.60-3.87
26-27    3.88-4.19
28-30    4.19-4.51
【００４０】
表４は発芽「停止」状態／条件を提供する。例えば、所望の材料（代表的な所定のターゲット・プロファイルを有する）を得るための時間ウィンドウが短すぎる場合には、オペレータは桶内の浸漬水の温度を低下させて、発芽のプロセスを中止させるよう、制御できる。オペレータが浸漬水の所望の温度を選択すると、テスト指標装置が、表４をベースにして停止導電性ファイルを適宜調整する。実際には、停止導電性範囲に達すると、種子（とその浸漬水）は、発芽用桶内でグラインドされ、発芽のプロセスを急停止させる。
【００４１】
図３は、本発明の一実施例により、導電性に基づいた種子発芽プロセスの指標を得る主ステップを示すフローチャートである。上記したように、所望の材料とそれに関連する使用に関する情報は最初に知られているものとする。このプロセスは、植物種子から得られたターゲット・プロファイルをターゲット・発芽ステージに相関づけるターゲット・プロファイル相関関係を用いることから始まる（ステップ２）。このターゲット・プロファイルは、ＡＰＩの化学成分の特別確認特性（spcific identifying characteristics）を含む。ターゲット発芽ステージは、ターゲット・プロファイルが対応する種子−発芽プロセスのポイントに関連する。
【００４２】
その後、本発明のプロセスは、種子−発芽プロセスの間、発芽−プロセス・プロファイルを対応するプロセス発芽ステージに相関付けるプロセス−プロファイル相関を用いる（ステップ４）。発芽−プロセス・プロファイルの各々は、前記それぞれのプロセス発芽ステージの間、植物種子から抽出された種子材料に関連する。その後、ターゲット・プロファイルの特別確認特性を前記発芽−プロセス・プロファイル内の対応する特徴と比較する（ステップ６）。プロセス発芽ステージの内ＡＰＩ量を最大にするものを、ターゲット発芽ステージとして選択し指定する（ステップ８）。この最適状態を、所定の温度範囲で浸漬水内の前記植物種子用の導電性の範囲に相互相関させ、温度依存性のある発芽停止状態を特定する（ステップ１０）。
【００４３】
前記ステップ２は、前記ターゲット・プロファイルを解析技術を用いて提供することにより行われ（ステップ１２）、ステップ４は、前記発芽−プロセス・プロファイルを解析技術を用いて提供することにより行われる（ステップ１４）。
【００４４】
本発明は様々な豆華をテストする技術にも用いられる。広範囲の種子植物に幅広く利用できる。種子発芽のプロセスは多くの種子に対し予測可能な均一性を提供する。一般的に種子は、保護外側カバーに囲まれた胚植物として特徴付けられ、浸漬水内の同一の成熟プロセスを経るよう修正可能である。発芽プロセスの間移行成分の化学プロファイルを導電率に相関づける技術は、他の種類の種子にも当業者は本明細書を参照することにより容易に適用することができる。
【００４５】
以上の説明は、本発明の一実施例に関するもので、この技術分野の当業者であれば、本発明の種々の変形例を考え得るが、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。特に用語「別法として」は「実施例」と同意である。特許請求の範囲の構成要素の後に記載した括弧内の番号は、図面の部品番号に対応し、発明の容易なる理解の為に付したものであり、発明を限定的に解釈するためのものではない。また同一番号でも明細書と特許請求の範囲の部品名は必ずしも同一ではない。これは上記した理由による。「少なくとも１つ或いは複数」、「と／又は」は、それらの内の１つに限定されない。例えば「Ａ，Ｂ，Ｃの内の少なくとも１つ」は「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」単独のみならず「Ａ，Ｂ或いはＢ，Ｃ更には又Ａ，Ｂ，Ｃ」のように複数のもの、ＡとＢの組合せＡとＢとＣの組合せでもよい。「Ａ，Ｂと／又はＣ」は、Ａ，Ｂ，Ｃ単独のみならず、ＡとＢの２つ、或いはＡとＢとＣの全部を含んでもよい。本明細書において「Ａを含む」「Ａを有する」は、Ａ以外のものを含んでもよい。特に記載のない限り、装置又は手段の数は、単数か複数かを問わない。
【要約】 
【課題】導電性に基づいて種子発芽プロファイルの指標を得る方法と装置を提供する。
【解決手段】  本発明の方法は、（Ａ）植物種子から派生した活性医薬成分（ＡＰＩ）のターゲット・プロファイルをターゲット発芽ステージに相関づけるターゲット−プロファイル相関関係を用いるステップと、（Ｂ）前記種子−発芽プロセスの間発芽−プロセス・プロファイルをそれぞれのプロセス発芽ステージに相関づけるプロセス−プロファイル相関関係を用いるステップと、（Ｃ）前記ターゲット・プロファイルの前記特別確認特性を前記発芽−プロセス・プロファイル内の対応する特徴と比較するステップと、（Ｄ）前記ＡＰＩ量を最大にする前記ターゲット発芽ステージを最適状態として指定するステップと、（Ｅ）前記最適状態を温度依存性のある発芽停止状態を特定するために所定の温度範囲で浸漬水内の前記植物種子用の導電性の範囲に相互相関させるステップとを有する。
【選択図】  図３【図１】
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【図２】
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【図３】
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