(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物細胞において標的ＤＮＡのメチル化を抑制する方法であって、ＲＮＡ指令型ＤＮＡメチル化機構において、前記標的ＤＮＡの転写により産生されるスキャフォールドＲＮＡを切断することを含み、前記スキャフォールドＲＮＡの切断が、前記スキャフォールドＲＮＡに特異的な１又は複数のリボザイムを前記植物細胞内で発現させることにより行われる、方法。
【請求項２】
前記１又は複数のリボザイムの発現が一過性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的ＤＮＡが、植物細胞において所望の形質を発現する遺伝子を制御するプロモーターである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記所望の形質を発現する遺伝子が、植物由来の機能性成分の合成もしくは蓄積を制御する酵素のアミノ酸配列をコードする遺伝子である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記１又は複数のリボザイムの植物細胞への導入が、植物ウイルスベクター法、アグロインフィルトレーション法、ｍａｇｎＩＣＯＮ（登録商標）システム、又はパーティクル・ガン法により行われる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記植物細胞が植物体の非単離細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記植物細胞が培養細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
所望の形質を有する植物を作出する方法であって、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法を用いて、植物において所望の形質の発現に関与するＤＮＡのメチル化を抑制することを含む、方法。
【請求項９】
植物由来の機能性成分を製造する方法であって、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法を用いて、植物由来の機能性成分の合成もしくは蓄積に関与するＤＮＡのメチル化を抑制することにより前記植物細胞内で機能性成分を蓄積させ、そして、前記植物細胞から前記機能性成分を回収することを含む、方法。
【請求項１０】
植物由来の機能性成分を蓄積させるための発現系であって、
（Ａ）ＲＮＡ指令型ＤＮＡメチル化機構において、植物由来の機能性成分の合成もしくは蓄積に関与するＤＮＡの転写により産生されるスキャフォールドＲＮＡを産生する植物体又は植物細胞、及び
（Ｂ）前記スキャフォールドＲＮＡに特異的な１又は複数のリボザイム、
を含む、発現系。
【請求項１１】
ＲＮＡ指令型ＤＮＡメチル化機構において、標的ＤＮＡの転写により産生されるスキャフォールドＲＮＡに特異的な１又は複数のリボザイムをコードするヌクレオチド配列を含む、リボザイム発現ベクター。
【請求項１２】
前記スキャフォールドＲＮＡに特異的なリボザイムをコードするヌクレオチド配列の３’及び５’末端に自己切断可能な別のリボザイムをコードするヌクレオチド配列が隣接している、請求項１１に記載のリボザイム発現ベクター。
【請求項１３】
前記スキャフォールドＲＮＡに特異的なリボザイムをコードするヌクレオチド配列がトランス型であり、かつ、前記自己切断可能な別のリボザイムをコードするヌクレオチド配列がシス型である、請求項１２に記載のリボザイム発現ベクター。
【請求項１４】
所望の形質を有する植物を作出するための、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のリボザイム発現ベクターの使用。
【請求項１５】
植物由来の機能性成分を製造するための、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のリボザイム発現ベクターの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物における標的ＤＮＡのメチル化を抑制する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物の遺伝子発現は、エピジェネティクス制御と呼ばれるＤＮＡメチル化やヒストンの化学的修飾によって調節されている。これは、ＲＮＡサイレンシングによって引き起こされる現象で、ＲＮＡサイレンシングは転写後型遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）及び転写型遺伝子サイレンシング（ＴＧＳ）の２つに大別される。植物は機能性成分の蓄積レベルの調節をこのエピジェネティクス制御に依存しており、これらの有用成分を植物に高レベルに蓄積させるためには、このエピジェネティクスを自在に操る技術が必要となる。しかしながら、エピジェネティクス制御は複雑すぎて、標的ＤＮＡのメチル化を特異的に解除することは不可能と考えられていた。【０００３】
これまでに、ＤＮＡ配列特異的に脱メチル化を誘導する技術はほとんど存在しておらず、近年になってようやく、ｄＣＡＳ融合ＴＥＴ１を用いて脱メチル化を誘導する技術が報告されたに過ぎない（非特許文献１）。しかしながら、ｄＣＡＳ融合ＴＥＴ１を用いて脱メチル化を誘導する場合には、組み換え技術が必須であるため、簡便かつ迅速に脱メチル化を誘導することはできないといった問題が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際特許公報第ＷＯ２０１４／１２９５６０号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Gallego-Bartolome J et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 55, E2125-E2134 (2018)
【非特許文献２】Gallusci P et al., Trends in Plant Science 22, 610-623 (2017)
【非特許文献３】Matzke M. A and Mosher R. A, Nature Reviews Genetics 15, 394-408 (2014)
【非特許文献４】Puerta-Fernandez E et al., FEMS Microbiology Reviews 27, 75-97 (2003)
【非特許文献５】Liu G et al., Organic & Biomolecular Chemistry 15, 4681-4685 (2017)
【非特許文献６】Bussiere F et al., Plant Biotechnology Journal 1, 423-435 (2003)
【非特許文献７】Otagaki S et al., Plant Biotechnology 23, 259-265 (2006)
【非特許文献８】Matsunaga W et al., BMC Plant Biology 19, 24 (2019)
【非特許文献９】Philips J. G et al., PloS one, 12, e0171311 (2017)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、組み換え技術を用いて、あるいは、組み換え技術を用いることなく、簡便かつ迅速に植物における標的ＤＮＡのメチル化を抑制し、これにより、所望の形質を有する植物を作出することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、ＲＮＡ指令型ＤＮＡメチル化機構において、前記標的ＤＮＡの転写により産生されるスキャフォールドＲＮＡを切断すること、とりわけ、前記スキャフォールドＲＮＡに特異的な１又は複数のリボザイムを前記植物細胞内で発現させることにより当該スキャフォールドＲＮＡを切断することによって、植物において標的ＤＮＡのメチル化を特異的に抑制することができるという驚くべき知見を見出した。【０００８】
即ち、本発明の主旨は、以下に存する。
（１）  植物細胞において標的ＤＮＡのメチル化を抑制する方法であって、ＲＮＡ指令型ＤＮＡメチル化機構において、前記標的ＤＮＡの転写により産生されるスキャフォールドＲＮＡを切断することを含む、方法。
（２）  前記スキャフォールドＲＮＡの切断が、前記スキャフォールドＲＮＡに特異的な１又は複数のリボザイムを前記植物細胞内で発現させることにより行われる、１に記載の方法。
（３）  前記１又は複数のリボザイムの発現が一過性である、２に記載の方法。
（４）  前記標的ＤＮＡが、植物細胞において所望の形質を発現する遺伝子を制御するプロモーターである、１〜３のいずれかに記載の方法。
（５）  前記所望の形質を発現する遺伝子が、植物由来の機能性成分の合成もしくは蓄積を制御する酵素のアミノ酸配列をコードする遺伝子である、４に記載の方法。
（６）  前記１又は複数のリボザイムの植物細胞内での発現が、植物ウイルスベクター法、アグロインフィルトレーション法、ｍａｇｎＩＣＯＮ（登録商標）システム、又はパーティクル・ガン法により行われる、１〜５のいずれかに記載の方法。
（７）  前記植物細胞が植物体の非単離細胞である、１〜６のいずれかに記載の方法。
（８）  前記植物細胞が培養細胞である、１〜６のいずれかに記載の方法。
（９）  所望の形質を有する植物を作出する方法であって、１〜８のいずれかに記載の方法を用いて、植物において所望の形質の発現に関与するＤＮＡのメチル化を抑制することを含む、方法。
（１０）  植物由来の機能性成分を製造する方法であって、１〜８のいずれかに記載の方法を用いて、植物由来の機能性成分の合成もしくは蓄積に関与するＤＮＡのメチル化を抑制することにより前記植物細胞内で機能性成分を蓄積させ、そして、前記植物細胞から前記機能性成分を回収することを含む、方法。
（１１）  植物由来の機能性成分を蓄積させるための発現系であって、
（Ａ）ＲＮＡ指令型ＤＮＡメチル化機構において、植物由来の機能性成分の合成もしくは蓄積に関与するＤＮＡの転写により産生されるスキャフォールドＲＮＡを産生する植物体又は植物細胞、及び
（Ｂ）前記スキャフォールドＲＮＡに特異的な１又は複数のリボザイム、
を含む、発現系。
（１２）  ＲＮＡ指令型ＤＮＡメチル化機構において、標的ＤＮＡの転写により産生されるスキャフォールドＲＮＡに特異的な１又は複数のリボザイムをコードするヌクレオチド配列を含む、リボザイム発現ベクター。
（１３）  前記スキャフォールドＲＮＡに特異的なリボザイムをコードするヌクレオチド配列の３’及び５’末端に自己切断可能な別のリボザイムをコードするヌクレオチド配列が隣接している、１２に記載のリボザイム発現ベクター。
（１４）  前記スキャフォールドＲＮＡに特異的なリボザイムをコードするヌクレオチド配列がトランス型であり、かつ、前記自己切断可能な別のリボザイムをコードするヌクレオチド配列がシス型である、１３に記載のリボザイム発現ベクター。
（１５）  所望の形質を有する植物を作出するための、１２〜１４に記載のリボザイム発現ベクターの使用。
（１６）  植物由来の機能性成分を製造するための、１２〜１４に記載のリボザイム発現ベクターの使用。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によって、植物における標的ＤＮＡのメチル化を抑制することで、簡便かつ迅速に標的ＤＮＡのＴＧＳを特異的に制御することができる。これにより所望の形質を有する植物を得ることが可能となり、例えば、植物での有用タンパク質の生産や機能性成分の蓄積レベルの向上に大きく貢献する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ＲｄＤＭ経路におけるＤＮＡメチル化モデルを示す。
【図２】図２は、リボザイムによるスキャフォールドＲＮＡの切断を介したＤＮＡメチル化解除モデルを示す。
【図３】図３は、３５Ｓプロモーターの配列を含むＣＭＶ−Ａ１ベクターの構築方法及びこれをベンタミアーナＧＦＰ遺伝子導入系統（１６Ｃ）に接種した後代（２０８  Ｓ１）での３５ＳプロモーターのＤＮＡメチル化率を示す。
【図４】図４は、３５Ｓプロモーター配列、及び３５Ｓプロモーターから生じるスキャフォールドＲＮＡの検出結果を示す。矢印で示すバンドは、検出されたスキャフォールドＲＮＡを示す。なお、３５Ｓプロモーター配列中、一重線及び二重線で示した配列は検出されたスキャフォールドＲＮＡのプラス鎖及びマイナス鎖に対応する領域をそれぞれ示す。
【図５】図５は、リボザイムの標的となる３５Ｓプロモーター（−鎖）の配列、及びリボザイムの配列を示す。
【図６】図６は、リボザイムにより切断されたスキャフォールドＲＮＡの５’末端の位置を示す。黒色の矢印はリボザイム発現個体（２０８  Ｓ１  Ｒｚ）の切断位置を示し、グレーの矢印はコントロール（２０８  Ｓ１）の切断位置を示す。
【図７】図７は、ＣＭＶベクターによってリボザイムを発現させたベンタミアーナの後代でのＧＦＰ蛍光と３５Ｓプロモーター領域のメチル化を示す。図７Ｃ中、転写開始点付近のＤＮＡメチル化が特に減少している領域を枠で示す。
【図８】図８は、シロイヌナズナ導入用リボザイムの標的配列を示す。３５ＳプロモーターのスキャフォールドＲＮＡプラス鎖に存在する３箇所のＧＵＣをそれぞれＡ、Ｂ及びＣとする。
【図９】図９は、シロイヌナズナ導入用リボザイム３５Ｓ（＋）Ａ２ＢＣカセットの配列を示す。
【図１０】図１０は、シス−トランス−シス型リボザイムの構造とシス型リボザイムの自己切断部位を示す。
【図１１】図１１は、シロイヌナズナの形質転換に用いた発現ベクターｐＢＧＧＮの構造を示す。
【図１２】図１２は、シロイヌナズナ導入用リボザイムのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける切断活性を調べた結果を示す。
【図１３】図１３は、シロイヌナズナＣｏｌ−０  ＧＦＰ−ＴＧＳ系統に導入されたリボザイムＡ２ＢＣカセットをＰＣＲで検出した結果を示す。電気泳動写真において、上段は、形質転換植物に組み込まれたリボザイムの有無を確認するためのＰＣＲプライマーの位置を示す。下段のレーンはそれぞれの組換え個体を示す。＋の印はリボザイムを確認したものを示す。
【図１４】図１４は、リボザイムを導入したシロイヌナズナＣｏｌ−０  ＧＦＰ−ＴＧＳ系統におけるＧＦＰ遺伝子の発現変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［１．諸言］
植物の遺伝子発現は、エピジェネティクス制御によって調節されている。「エピジェネティクス」とは、ＤＮＡの配列に変化を起こさず、かつ細胞分裂を経て伝達される遺伝子機能の変化やその仕組みを意味する。エピジェネティクスの１つとしては、ＤＮＡメチル化が知られている（非特許文献２）。この反応には、シトシンのピリミジン環の５位炭素原子又はアデニンのプリン環の６位窒素原子へのメチル基付加反応があるが、植物における遺伝子の発現は主にシトシンのメチル化によって制御されていると考えられている。すなわち、ＤＮＡのシトシンにおけるメチル化・脱メチル化により、塩基配列情報自体は変化することなく遺伝子発現のオン／オフが切り替わることになる。このようなＤＮＡメチル化による遺伝子発現の抑制は転写型遺伝子サイレンシング（ＴＧＳ）と呼ばれる。
本発明は、植物におけるエピジェネティクス制御を人為的にコントロールすることによって、遺伝子組み換えを行うことなく所望の植物の表現型を変化させることが可能となる、という基本思想に基づく。
【００１２】
モデル植物であるシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）におけるＤＮＡメチル化の理解が大きく進んでいる。植物では、ＣｐＧ、ＣｐＨｐＧ及びＣｐＨｐＨ部位（Ｈはグアニン以外のヌクレオチドを表す）においてメチル化され、ＤＮＡにメチル基を転移させ共有結合させる主要なＤＮＡメチルトランスフェラーゼ酵素としては、ＤＲＭ２、ＭＥＴ１、ＣＭＴ３及びＣＭＴ２が知られている。現在、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼは、ＤＮＡに新たなメチル標識を作成するｄｅ  ｎｏｖｏ酵素とＤＮＡの親鎖のメチル化位置を認識しＤＮＡ複製の後の娘鎖に新たなメチル化を伝達する維持酵素の２種類に分類されるが、この中でＤＲＭ２のみがｄｅ  ｎｏｖｏ  ＤＮＡメチルトランスフェラーゼであるとされている。細胞がどのようにしてｄｅ  ｎｏｖｏ  ＤＮＡメチル化の位置を決定しているかは明らかではないが、これまでの証拠から、多くの位置で、ＲＮＡ指令型ＤＮＡメチル化（RNA-directed DNA methylation：ＲｄＤＭ）機構が関わっていることが示唆されている。
【００１３】
上述のとおり、本発明は、ＲＮＡ指令型ＤＮＡメチル化機構において、前記標的ＤＮＡの転写により産生されるスキャフォールドＲＮＡを切断すること、とりわけ、前記スキャフォールドＲＮＡに特異的な１又は複数のリボザイムを前記植物細胞内で発現させることにより当該スキャフォールドＲＮＡを切断することによって、植物において標的ＤＮＡのメチル化を特異的に抑制することができるという知見に基づくものである。したがって、まず、本発明の前提となるＲＮＡ指令型ＤＮＡメチル化機構及びリボザイムについて説明する。
【００１４】
［１−１．ＲｄＤＭ機構］
図１に示されるように、ＲｄＤＭ機構では、まずＰｏｌＩＶがメチル化された標的ゲノム領域にリクルートされ、標的領域のＲＮＡを転写する。ＰｏｌＩＶの転写産物は、その場でＲＮＡ−ＤＥＰＥＮＤＥＮＴ  ＲＮＡ  ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ  ２（ＲＤＲ２）によって２本鎖ＲＮＡに変換され、ＲＮａｓｅＩＩＩ様の酵素であるＤＩＣＥＲ−ＬＩＫＥ３（ＤＣＬ３）によって２４ヌクレオチドのｓｉＲＮＡに切断される（非特許文献３）。このｓｉＲＮＡは、ＨＵＡ  ＥＮＨＡＮＣＥＲ１（ＨＥＮ１）により３’末端にメチル化修飾を受けた後、ＡＲＧＯＮＡＵＴ  ４（ＡＧＯ４）に取り込まれサイレンシングエフェクター複合体を形成する。サイレンシングエフェクター複合体に取り込まれた相補的なｓｉＲＮＡは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＶ（ＰｏｌＶ）によって転写されるＲＮＡ（以降、「スキャフォールドＲＮＡ」と称する）と塩基対を形成して複合体をリクルートする。次に当該サイレンシングエフェクター複合体を介して、ｓｉＲＮＡに対応したＤＮＡの領域にｄｅ  ｎｏｖｏメチルトランスフェラーゼであるＤＯＭＡＩＮＳ  ＲＥＡＲＲＡＮＧＥＤ  ＭＥＴＨＹＬＴＲＡＮＳＦＥＲＡＳＥ（ＤＲＭ２）がリクルートされ、ＤＮＡをメチル化する。ＡＧＯ４、ＤＲＭ２、及びメチル化したＤＮＡとの結合能を有するＲＮＡ−ＤＩＲＥＣＴＥＤ  ＤＮＡ  ＭＥＴＨＹＬＡＴＩＯＮ  １（ＲＤＭ１）、ＤＥＦＥＣＴＩＶＥ  ＩＮ  ＲＮＡ−ＤＩＲＥＣＴＥＤ  ＤＮＡ  ＭＥＴＨＹＬＡＴＩＯＮ  １（ＤＲＤ１）そしてＤＥＦＥＣＴＩＶＥ  ＩＮ  ＭＥＲＩＳＴＥＭ  ＳＩＬＥＮＣＩＮＧ  ３（ＤＭＳ３）がリクルートに重要な役割を果たすと考えられる。
【００１５】
標的ＤＮＡからＰｏｌＩＶやＰｏｌＶによって転写されるＲＮＡ（これらは同じ領域から転写されるため配列がほぼ同じであるが、ＰｏｌＶによって転写されるＲＮＡは特にスキャフォールドＲＮＡと呼ばれる）は、ＲｄＤＭ経路においてｓｉＲＮＡの生成及びメチル基転移酵素ＤＲＭ２を標的ＤＮＡへ呼び込む働きがある。図２に示されるとおり、標的となるＤＮＡはスキャフォールドＲＮＡとそれに結合するｓｉＲＮＡの配列によって指定されるため、特定のスキャフォールドＲＮＡを切断して経路から除外すれば、スキャフォールドＲＮＡに対応するＤＮＡのみのメチル化が阻害され、その後脱メチル化の方向へ進む。これに対し、ＲｄＤＭ経路に関わるその他のタンパクの機能を阻害することはＲｄＤＭ経路全体を破壊することになるため、植物に有害であり好ましくない。
なお、スキャフォールドＲＮＡの切断箇所については配列により制限があり、リボザイムによる切断効率が高い例えばＧＵＣ、ＧＵＡ、ＧＵＵなどの配列を含むことが必要であるが（非特許文献１）、この条件を満たしていれば切断箇所は任意に選択することが可能である。
【００１６】
［１−２．リボザイム］
上記スキャフォールドＲＮＡを除去する手段としては、アンチセンスＲＮＡを核に大量に送り込み、スキャフォールドＲＮＡを捕捉する方法が考えられる。しかしながら、アンチセンスＲＮＡがターゲットと２本鎖を形成してしまうと、そこからｓｉＲＮＡが生成する可能性があり、逆にＴＧＳを促進することになりかねない。このような問題に鑑み、本発明者は、鋭意検討した結果、近年、細胞内で大量に生産されるＲＮＡウイルスの切断などに応用されているリボザイムでスキャフォールドＲＮＡを切断することにより、植物における標的ＤＮＡのメチル化を抑制することに成功した。リボザイムはスキャフォールドＲＮＡと８塩基の相補性しか有していないため、２本鎖を形成することなく、ｓｉＲＮＡを生成しない。
リボザイムは、核酸配列を部位特異的に切断する酵素活性を持った特殊なＲＮＡ分子であり、１９８１年の発見以来、その構造や機能について活発な研究が進められてきた。その結果、酵素活性部位の構造（形状及び核酸配列）が解明され、現在では、化学合成で任意の配列部位を特異的に切断するリボザイムが得られるようになっており、多様な分野において利用されている。本発明において用いられるリボザイムは、標的ＤＮＡの転写により産生されるスキャフォールドＲＮＡを配列特異的に切断・分解できる限り特に制限されない。このようなリボザイムは、当業者に周知な手法によって設計することができる。生体内で標的ＲＮＡを切断するリボザイムとしては、ハンマーヘッド型リボザイム、ヘアピン型リボザイム及びシュードノット型リボザイムが知られており、この中でもとりわけ、ハンマーヘッド型リボザイムを基盤とする機能性ＲＮＡが開発されてきた。ハンマーヘッド型リボザイムは、特定部位のＲＮＡホスホジエステル結合を切断でき、トランス型の最小のハンマーヘッド型リボザイムが、天然のハンマーヘッド型リボザイムを基にして作成され、ＲＮＡを媒介した遺伝子制御によりｉｎ  ｖｉｖｏでの標的遺伝子発現を抑制するために利用されている。ハンマーヘッド型リボザイムは、中央部の保存された触媒活性を有するコア配列からなる活性領域（ヘリックスＩＩ）と、その活性領域の３’側及び５’側に存在する標的配列を認識する２個のハイブリッド形成アーム配列からなる認識領域（ヘリックスＩＩＩ及びヘリックスＩ）から構成される（非特許文献４）。標的特異的なハンマーヘッド型リボザイムは、標的ＲＮＡに対する上記ハイブリッド形成アーム配列を単純なワトソン−クリック塩基対合ルールにしたがい変換させることによって作製することができる。また、標的ＲＮＡに対して様々に異なるコア配列を有するハンマーヘッド型リボザイムが設計でき、標的ＲＮＡの特定のトリプレットを挟むハイブリッド形成配列と相補関係にある配列を使用することによって、標的ＲＮＡに結合でき、該トリプレットの３’側に存在するホスホジエステル結合を切断することができる。
【００１７】
リボザイムの基質として要求される配列は２番目のヌクレオチドがＵのトリプレットであり、ＤＷＨ（Ｄ＝Ａ／Ｕ／Ｇ、Ｗ＝Ａ／Ｕ、Ｈ＝Ａ／Ｕ／Ｃ）が特に切断されやすい（非特許文献５）。したがって、ＤＷＨに該当する配列を標的となるＲＮＡ上に探し、その両側の配列に相補的になるような一方の部分を合成すれば、この部分は標的ＲＮＡをＤＷＨの３’側で切断するＲＮＡ切断酵素となる。このように、当業者は、スキャフォールドＲＮＡの標的配列との相同性に基づき、これを配列特異的に切断・分解可能なリボザイムを自在に設計することができる。
したがって、本発明においては、植物における所望の形質の発現に関与し、かつメチル化によって抑制されているＤＮＡ配列を切断箇所として選択し、これを標的とするリボザイムが設計される。
【００１８】
［２．植物細胞において標的ＤＮＡのメチル化を抑制する方法］
本発明の第１の観点によれば、植物細胞において標的ＤＮＡのメチル化を抑制する方法であって、ＲＮＡ指令型ＤＮＡメチル化機構において、前記標的ＤＮＡの転写により産生されるスキャフォールドＲＮＡを切断することを含む、方法が提供される。
【００１９】
植物において所望の形質の発現を抑制するＤＮＡメチル化の引き金となるスキャフォールドＲＮＡを特異的に切断することによって、ｓｉＲＮＡに対応したＤＮＡの領域に対するＤＲＭ２のリクルートが阻害されるため、植物において標的ＤＮＡのメチル化を特異的に抑制することが可能となる。前記スキャフォールドＲＮＡの特異的な切断は、例えば、前記スキャフォールドＲＮＡに特異的な１又は複数のリボザイムを前記植物細胞に導入し、前記１又は複数のリボザイムを前記植物細胞内で発現させることにより行われる。
【００２０】
前記標的ＤＮＡは、植物における所望の形質の発現に関与し、かつメチル化によって抑制されているＤＮＡであれば特に制限されないが、例えば、植物細胞において所望の形質を発現する遺伝子を制御するプロモーターが挙げられる。所望の形質には、例えば、形、色、大きさなどの外観（形態）として観察される性質や、開花期など観察できる生理的な性質の他、病原菌や温度に対する抵抗性などの生理的な性質なども含まれるが、好ましくは、植物内における機能性成分（代謝成分）の蓄積に関する性質である。したがって、前記所望の形質を発現する遺伝子は、好ましくは、植物由来の機能性成分の合成あるいは蓄積を制御する酵素のアミノ酸配列をコードする遺伝子である。
【００２１】
植物由来の機能性成分は、例えば、アセチレン、チオフェン、グリコシド、グルコシネート、プリン、ピリミジン、アルカロイド、フェノリックス（例えば、キノン）、精油、ビタミン類、テルペノイド（例えば、イリドイド、セスキテルペン、ジテルペノイド及びトリテルペノイド）、リグナン及びフラボノイド等が挙げられる。
【００２２】
植物細胞内におけるリボザイムの発現は、組み換え技術を用いること、あるいは、これを簡便かつ迅速に行うために一過性発現系を用いることが好ましい。例えば、植物ウイルスベクター法、アグロインフィルトレーション法、ｍａｇｎＩＣＯＮ（登録商標）システム、パーティクル・ガン法、又はこれらの組み合わせにより行われる。
【００２３】
植物ウイルスベクター法は、目的のＤＮＡを挿入した植物ウイルスゲノムのｃＤＮＡを試験管内転写し、得られたＲＮＡをベクターとして植物に接種して感染させ、ウイルス自身の増殖能及び全身移行能を利用して、目的遺伝子を植物に発現させる手法である。この手法は、ウイルスの自己複製能を利用して目的遺伝子を発現させるため、特に増殖能の高いＣＭＶやＴＭＶに基づくベクターを使用すれば、植物細胞当たりの目的遺伝子の発現量を高めることができる。
【００２４】
アグロインフィルトレーション法は、目的遺伝子を挿入したＴ−ＤＮＡベクターで形質転換したアグロバクテリウムの培養液を、物理的手法（シリンジ等による注入や減圧等による浸透などの手法）で植物組織内に導入し、植物に感染させることにより、目的遺伝子を植物に一過性に発現させる手法である。この手法によれば、感染能の強いアグロバクテリウムを植物体の全身に物理的手法（注入又は浸透）で普く移行させて感染させ、植物の全組織で一様に目的遺伝子を発現させることができる。アグロバクテリウム（Agrobacterium）は、グラム陰性菌に属する土壌細菌であるリゾビウム属（Rhizobium）のうち、植物に対する病原性を有するものの総称であり、アグロバクテリウムの例としては、根頭癌腫病に関連するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）が挙げられる。アグロバクテリウム由来のベクターを利用して植物に外来遺伝子を一過性発現させる場合、通常はベクターを物理的手法（シリンジ等による注入や減圧等による浸透などの手法）で植物組織内に導入し、植物に感染させる。アグロバクテリウム由来のベクターはＴ−ＤＮＡ領域の作用により強い感染能を有するため、植物体の全身に物理的手法（注入や浸透等）で普く移行させて感染させれば、植物の全組織でムラなく一様に外来遺伝子を発現させることができる。
【００２５】
ｍａｇｎＩＣＯＮ（登録商標）システムは、目的遺伝子を挿入したＴＭＶ又はＰＶＸゲノムのｃＤＮＡをＴ−ＤＮＡベクター内に導入し、得られたＴ−ＤＮＡベクターで形質転換したアグロバクテリウムの培養液を、物理的手法（シリンジ等による注入又は減圧による浸透）で植物組織内に導入し、植物に感染させることにより、目的遺伝子を植物に一過性発現させる手法である。すなわち、ベクターを植物体の全身に物理的手法（注入又は浸透）で行き渡らせて感染させ、植物の全組織で目的遺伝子を発現させることができる。また、ウイルス（ＴＭＶ又はＰＶＸ）の自己複製能を利用して目的遺伝子を発現させるため、植物細胞当たりの目的遺伝子の発現量を高めることができる。このように、本手法は、上述の植物ウイルスベクター法及びアグロインフィルトレーション法の利点を兼ね備えた手法である。
また、２ｂタンパク質を２ｂタンパク質をコードする遺伝子の一部又は全部が外来遺伝子に置換されたキュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）のＲＮＡ２ゲノムに相当する配列を、アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ配列と機能的に組み合わせた核酸分子を、別途ＣＭＶのＲＮＡ１ゲノム及びＲＮＡ３ゲノム並びにタンパク質２ｂを機能的に発現する宿主植物に導入し、当該植物を栽培して外来遺伝子を発現させることにより、植物体の全身の細胞に外来遺伝子を普く移行させて発現させることができるとともに、各細胞での外来遺伝子の発現効率を高め、植物体全体として高発現を達成することができる（特許文献１）。本手法を用いることより、ＴＭＶやＰＶＸを用いた上述のｍａｇｎＩＣＯＮ（登録商標）システムに匹敵する技術になり、宿主植物の種類や導入可能な外来遺伝子サイズの自由度を高めることが可能となる。
【００２６】
パーティクル・ガン（パーティクル・ボンバードメント）法は、ＤＮＡ又はベクターをコーティングした金やタングステンなどの金属の微粒子を高速で射出することにより、目的ＤＮＡを細胞内に導入する手法である。
【００２７】
本発明において用いられるリボザイム発現ベクターは、標的ＤＮＡの転写により産生されるスキャフォールドＲＮＡに特異的な１又は複数のリボザイムをコードするヌクレオチド配列を含み、植物細胞内でリボザイムを発現させることができる限り、特に制限されないが、典型的には、植物ウイルスベクター又はＴ−ＤＮＡベクターであり、特に好ましくは、植物ウイルスベクターである。植物ウイルスベクターは、植物細胞の核に侵入できる限り特に制限されないが、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）、ジャガイモＸウイルス（ＰＶＸ）、クローバ葉脈黄化ウイルス（ＣlＹＶＶ）等の各種の一本鎖ＲＮＡウイルス、ビーンイエロードワーフウイルス（Bean yellow dwarf virus）（ＢｅＹＤＶ）、ビートカーリートップウイルス（Beet curly top virus）（ＢＣＴＶ）、キャベジリーフカールウイルス（Cabbage leaf-curl virus）（ＣａＬＣｕＶ）、ウィートドワーフウイルス（Wheat dwarf virus）（ＷＤＶ）、トマトイエローリーフカールチャイナウイルス（Tomato yellow leaf curl China virus）（ＴＹＬＣＣＮＶ）等の各種の一本鎖ＤＮＡウイルス及びカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）等の二本鎖ＤＮＡウイルス由来のベクター等が挙げられる。中でもＲＮＡウイルスであるキュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）由来のベクターが特に好ましく、例えばＣＭＶ−Ａ１ベクターなどが挙げられる。
【００２８】
本発明を適用可能な植物の種は特に制限されないが、典型的には、イネ科、マメ科、アブラナ科、キク科、ナス科、バラ科、ウリ科、ヒルガオ科などの植物が挙げられる。好ましい植物としては、例えば、アルファルファ、オオムギ、インゲンマメ、カノーラ、ササゲ、綿、トウモロコシ、クローバー、ハス、レンズマメ、ルピナス、キビ、オートムギ、エンドウマメ、落花生、イネ、ライムギ、スイートクローバー、ヒマワリ、スイートピー、ダイズ、モロコシ、ライコムギ、クズイモ、ハッショウマメ、ソラマメ、コムギ、フジ、堅果植物等、シロイヌナズナ、コヌカグサ、ネギ、キンギョソウ、オランダミツバ、ナンキンマメ、アスパラガス、ロウトウ、カラスムギ、ホウライチク、アブラナ、ブロムグラス、ルリマガリバナ、ツバキ、アサ、トウガラシ、ヒヨコマメ、ケノポジ、キクニガナ、カンキツ、コーヒーノキ、ジュズダマ、キュウリ、カボチャ、ギョウギシバ、カモガヤ、チョウセンアサガオ、ジギタリス、ヤマノイモ、アブラヤシ、オオシバ、フェスキュ、イチゴ、フクロウソウ、ダイズ、ヒマワリ、キスゲ、パラゴムノキ、ヒヨス、サツマイモ、レタス、ヒラマメ、ユリ、アマ、ライグラス、ハス、トマト、マヨラナ、リンゴ、マンゴー、イモノキ、ウマゴヤシ、アフリカウンラン、タバコ、イガマメ、テンジクアオイ、チカラシバ、ツクバネアサガオ、アワガエリ、イチゴツナギ、サクラ、キンポウゲ、ラディッシュ、スグリ、トウゴマ、キイチゴ、サトウキビ、サルメンバナ、セネシオ、セタリア、シロガラシ、ナス、ソルガム、イヌシバ、カカオ、ジャジクソウ、レイリョウコウ、ブドウ等が挙げられる。
【００２９】
植物細胞の形態は任意であり、植物体内に存在する非単離の細胞でもよく、植物体から単離された組織培養物等の培養細胞でもよい。培養細胞の場合、分化した状態の細胞でも、脱分化を生じた細胞でも、再分化した細胞でもよい。
【００３０】
［３．所望の形質を有する植物を作出する方法］
上記の標的ＤＮＡのメチル化を抑制する方法を用いて、植物において所望の形質の発現に関与するＤＮＡのメチル化を抑制することにより、所望の形質を有する植物を作出することが可能となる。したがって、本発明の第２の観点において、所望の形質を有する植物を作出する方法であって、上述の方法を用いて、植物において所望の形質の発現に関与するＤＮＡのメチル化を抑制することを含む方法が提供される。
【００３１】
［４．植物由来の機能性成分を製造する方法］
また、上記の標的ＤＮＡのメチル化を抑制する方法を用いて、植物由来の機能性成分の合成・蓄積に関与するＤＮＡのメチル化を抑制することにより、簡便かつ迅速に植物由来の機能性成分を製造することが可能となる。したがって、本発明の第３の観点において、植物由来の機能性成分を製造する方法であって、上述の方法を用いて、植物由来の機能性成分の合成・蓄積に関与するＤＮＡのメチル化を抑制することにより前記植物細胞内で機能性成分を蓄積させ、そして、前記植物細胞から前記機能性成分を回収することを含む方法、ならびに、植物由来の機能性成分を合成・蓄積させるための発現系であって、（Ａ）ＲＮＡ指令型ＤＮＡメチル化機構において、植物由来の機能性成分の合成・蓄積に関与するＤＮＡの転写により産生されるスキャフォールドＲＮＡを産生する植物体又は植物細胞、及び（Ｂ）前記スキャフォールドＲＮＡに特異的な１又は複数のリボザイムを含む発現系が提供される。
【００３２】
［５．リボザイム発現ベクター］
本発明の第４の観点によれば、ＲＮＡ指令型ＤＮＡメチル化機構において、標的ＤＮＡの転写により産生されるスキャフォールドＲＮＡに特異的な１又は複数のリボザイムをコードするヌクレオチド配列を含む、リボザイム発現ベクターが提供される。かかるリボザイム発現ベクターは、上述のとおり、所望の形質を有する植物を作出するため、及び／又は植物由来の機能性成分を製造するために用いることができる。
【００３３】
本発明において用いられるリボザイム発現ベクターは、スキャフォールドＲＮＡに特異的なリボザイムをコードするヌクレオチド配列の３’及び５’末端に自己切断可能な別のリボザイムをコードするヌクレオチド配列が隣接している構造を有してもよい。前記スキャフォールドＲＮＡに特異的なリボザイムをコードするヌクレオチド配列はトランス型として、また、前記自己切断可能な別のリボザイムをコードするヌクレオチド配列はシス型とすることで、自己切断型リボザイムにより、標的リボザイムのモノマーが切り出される（非特許文献６）。このようにトランス型の標的リボザイムをシス型のリボザイムで挟んで複数配置することにより、同種の標的リボザイムの発現量を増やすことや異種の標的リボザイムを同時に発現させることが可能になる。
【００３４】
また、前記リボザイム発現ベクターは、スキャフォールドＲＮＡに特異的な１又は複数のリボザイムとその３’及び５’末端に接する自己切断可能な別のリボザイムをコードするヌクレオチド配列に作動式に連結されたプロモーター及び／又はターミネーターを含んでもよい。
【００３５】
前記プロモーターは、植物細胞内でリボザイムが発現できる限り特に制限されないが、例えば、Ｕ６プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、キャッサバモザイクウイルスプロモーター、ゴマノハグサモザイクウイルスプロモーター、バドナウイルス（Badnavirus）プロモーター、ストロベリーベインバインディングウイルス（ＳＶＢＶ）プロモーター、ミラビリス（Mirabilis）モザイクウイルスプロモーター（ＭＭＶ）、ルビスコ（Rubisco）プロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター等が挙げられる。中でも、Ｕ６プロモーターが好ましい。
【００３６】
前記ターミネーターは、植物細胞内でリボザイムが発現できる限り特に制限されないが、例えば、Ｕ６ターミネーター、アグロバクテリウム由来のｎｏｓターミネーターや、ヒートショックプロテイン（ｈｓｐ）ターミネーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓターミネーター等が挙げられる。
【００３７】
以下、実施例を示し、本発明を更に詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、適宜変更を加えて実施することが可能である。
【実施例】
【００３８】
［実験１］  ３５Ｓプロモーターの部分配列を含むＣＭＶ−Ａ１ベクターによるＤＮＡメチル化誘導
（１）３５Ｓプロモーターの部分配列を含むＣＭＶ−Ａ１ベクターの構築
転写開始点から上流２０８ｂｐまでの３５Ｓプロモーターの部分配列（３５Ｓ−２０８）の末端にＳｔｕＩ及びＭｌｕＩ制限サイトを付加した配列を人工合成し、これをＣＭＶ−Ａ１ベクター（非特許文献７を参照のこと）の感染性ｃＤＮＡクローンプラスミドのクローニングサイト（ＳｔｕＩ及びＭｌｕＩ制限サイト）に常法に従って組み込んだ（図３ａ）。３５Ｓ−２０８は、ｐＢＩ１２１（Clontech）よりＰＣＲ増幅し、クローニングすることにより作成した。ｐＢＩ１２１の中にある３５Ｓプロモーターの全長は３４５塩基であるが、この中からａｓ−１サイトを含む２０８塩基を増幅、クローニングしたものが３５Ｓ−２０８である（非特許文献８を参照のこと）。
（２）３５Ｓ−２０８を組み込んだＣＭＶ−Ａ１のベンタミアーナ１６Ｃ系統への接種
３５Ｓ−２０８を組み込んだＣＭＶ−Ａ１ベクター（ＲＮＡ２）をＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写した。これをＣＭＶ−Ｙ  ＲＮＡ１感染性クローンｐＣＹ１及びＲＮＡ３感染性クローンｐＣＹ３よりｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写したＲＮＡ１及びＲＮＡ３と混合し、ベンタミアーナ（Nicotiana benthamiana）のＧＦＰ遺伝子導入系統１６Ｃ（非特許文献９を参照のこと）（図３ｂ）に機械接種した。ＣＭＶに感染した１６Ｃ個体からＴＧＳによりＧＦＰ蛍光が消失した個体を選び、開花後、種子を収穫した。この種子由来の個体を２０８  Ｓ１とした。
（３）２０８  Ｓ１の３５Ｓプロモーター領域におけるＤＮＡメチル化
１６Ｃ及び２０８  Ｓ１の葉からｉｌｌｕｓｔｒａ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｎｕｃｌｅｏｎ  Ｐｈｙｔｏｐｕｒｅ（GE Healthcare）を用いてＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡに対してＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Zymo Research）を用いてバイサルファイト処理を行い、メチル化されていないシトシンのウラシルへの変換を行った。バイサルファイト処理を行ったＤＮＡから３５Ｓプロモーター領域をＴａＫａＲａ  ＥｐｉＴａｑ  ＨＳ  ｆｏｒ  ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ｔｒｅａｔｅｄ  ＤＮＡ（TaKaRa）を用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ用のプライマーとして３５Ｓ−３４６Ｆ−ｂｉｓｕＴ（5’-ATTGAGAYTTTTYAAYAAAGGGTA-3’：配列番号７）及び３５Ｓ＋１Ａ−ｂｉｓｕＡ（5’-CTCTCCAAATGAAATGAACTTC-3’：配列番号８）を用いた。得られたＰＣＲ産物はＤｙｎａ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＴＡ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Bio Dynamics Laboratory）を使用し、ｐＴＡＣ１ベクターにライゲーションした。これをＥ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（TaKaRa）にトランスフォーメーションし、増殖後プラスミドを抽出した。抽出したプラスミドを常法に従いシークエンスした。シークエンス結果に基づき、３５Ｓプロモーター領域のシトシンにおけるメチル化頻度をＣＧ、ＣＨＧ（Ｈ＝Ａ／Ｃ／Ｔ）及びＣＨＨサイト別に１６Ｃと２０８  Ｓ１で比較した結果、いずれのサイトにおいても２０８  Ｓ１でシトシンのメチル化が誘導されていることが確認された（図３ｃ）。【００３９】
［実験２］  ３５ＳプロモーターのスキャフォールドＲＮＡの検出
３５Ｓプロモーターから転写されるスキャフォールドＲＮＡの検出を目的に、２０８  Ｓ１系統の葉からＲＮＡｚｏｌ  ＲＴ（Molecular Research Center）を用いてＲＮＡ抽出を行い、抽出した全ＲＮＡに対してＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Invitrogen）を用い、以下のＲＴ−ＰＣＲを行った。まず、ＲＮＡのプラス鎖検出用としてＴ７−３５Ｓ−５−３４５（5’-ATTGAGACTTTTCAACAAAG-3’：配列番号９）、マイナス鎖検出用として３５Ｓ＋１Ｒ（5’-GTTCTCTCCAAATGAAATGAAC-3’：配列番号１０）プライマーをそれぞれ用いてＲＴ反応を行い、次にプラス鎖検出用としてＴ７−３５Ｓ−５−３４５、３５Ｓ−３−１３０（5’-GCAGAGGCATCTTCAACGATG-3’：配列番号１１）のプライマー対、マイナス鎖検出用として３５Ｓ−５−１６０（5’-CCACCCACGAGGAGCATCGTG-3’：配列番号１２）、３５Ｓ＋１Ｒのプライマー対をそれぞれ用いてＰＣＲを行った。ＲＴ−ＰＣＲの結果、プラス鎖、マイナス鎖両鎖から増幅産物が得られ、それらのシークエンスが３５Ｓプロモーターの配列と一致したことから（図４）、３５Ｓプロモーターのプラス鎖、マイナス鎖両鎖から転写が行われていることが確認された。【００４０】
［実験３］  リボザイム発現ＣＭＶベクターの構築
（１）リボザイムの設計
リボザイムの標的配列及びリボザイムの配列を図５に示す。実験２の結果より、３５Ｓプロモーター領域からプラス鎖及びマイナス鎖のスキャフォールドＲＮＡが転写されていることが確認されたが、リボザイムの基質となるトリプレットのうちもっとも切断されやすいＧＵＣはマイナス鎖のスキャフォールドＲＮＡに多く存在することから、マイナス鎖のスキャフォールドＲＮＡを対象にリボザイムの設計を行った。標的とするＧＵＣは、リボザイムが結合する配列におけるＧＣ含量及び繰り返し配列の有無を考慮し、転写開始点から上流７９ｂｐに存在するＧＵＣを選択、このＧＵＣを切断するリボザイムを設計した。
（２）リボザイム発現ＣＭＶベクターの作成
（１）で設計したリボザイムをコードする２本鎖ＤＮＡを合成し、クローニングするため、５’末端にそれぞれＳｔｕＩ及びＭｌｕＩ制限サイトを付加したオリゴＤＮＡ  ３５Ｓ（−）−５ＲＺ−４５（5’-CGAGGCCTGATCTCCACTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGTA-3’：配列番号１３）及び３５Ｓ（−）−３ＲＺ−３２（5’-CGCACGCGTCCTTACGTTTCGTCCTCACGGAC-3’：配列番号１４）を合成し、これらをＰＣＲによって２本鎖にした。これをＣＭＶ−Ａ１ベクターの感染性ｃＤＮＡクローンプラスミドのクローニングサイト（ＳｔｕＩ及びＭｌｕＩ制限サイト）に常法に従って組み込んだ。【００４１】
［実験４］  リボザイムによるスキャフォールドＲＮＡ切断位置の特定
（１）リボザイムを組み込んだＣＭＶ−Ａ１の２０８  Ｓ１系統への接種
リボザイムを組み込んだＣＭＶ−Ａ１ベクター（ＲＮＡ２）をＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写した。これをＣＭＶ−Ｙ  ＲＮＡ１感染性クローンｐＣＹ１及びＲＮＡ３感染性クローンｐＣＹ３よりｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写したＲＮＡ１及びＲＮＡ３と混合し、２０８  Ｓ１系統に機械接種した。２０８  Ｓ１は３５Ｓプロモーターにメチル化が誘導され、安定してＧＦＰのＴＧＳを起こしているものである。Ｓ１とはＴＧＳ個体の自殖第１世代である。
（２）スキャフォールドＲＮＡマイナス鎖の切断位置の特定
健全な２０８  Ｓ１個体（２０８  Ｓ１）及びリボザイムを発現するＣＭＶ−Ａ１ベクターに感染した２０８  Ｓ１個体（２０８  Ｓ１  Ｒｚ（−））の葉からＲＮＡｚｏｌ  ＲＴ（Molecular Research Center）を用いてＲＮＡを抽出し、抽出された全ＲＮＡを用いて５’ＲＡＣＥを行いスキャフォールドＲＮＡマイナス鎖の５’末端の配列を特定した。５’ＲＡＣＥは５’／３’ＲＡＣＥ  Ｋｉｔ，２ｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（Roche）を用いて行った。コントロールとして用いた２０８  Ｓ１のスキャフォールドＲＮＡマイナス鎖における５’末端は１７クローン中１３クローンでＧＦＰ遺伝子の転写開始点上流８ｂｐ、４クローンでＧＦＰ転写開始点下流１５１ｂｐに検出された（図６）。この結果は、３５Ｓプロモーター領域を含むスキャフォールドＲＮＡマイナス鎖の転写がＧＦＰ遺伝子の中から開始されていることを示している。一方、２０８  Ｓ１  Ｒｚ（−）個体では１５クローン中６クローンでＧＦＰ転写開始点上流８０ｂｐ、６クローンで上流８３ｂｐ、３クローンで２４０ｂｐの箇所に５’末端が検出された（図６）。この位置はコントロールにおけるスキャフォールドＲＮＡマイナス鎖の転写開始位置から見て下流になることから、２０８  Ｓ１  Ｒｚ（−）個体ではリボザイムによってスキャフォールドＲＮＡマイナス鎖が切断されていると考えられた。このスキャフォールドＲＮＡマイナス鎖の切断により２０８  Ｓ１  Ｒｚ（−）個体では３５Ｓプロモーターの脱メチル化が誘導されていると期待された。次に、２０８  Ｓ１  Ｒｚ（−）個体から自殖種子を採種し、ウイルスに感染していない次世代（２０８  Ｒｚ（−）Ｓ２）で３５Ｓプロモーター領域のＤＮＡメチル化を解析した（実験５）。【００４２】
［実験５］  ＣＭＶベクターによってリボザイムを発現させたベンタミアーナ１６Ｃ系統の後代でのＧＦＰ蛍光と３５Ｓプロモーター領域のメチル化
２０８  Ｒｚ（−）  Ｓ２及びコントロールの２０８  Ｓ１の次世代（２０８  Ｓ２）におけるＧＦＰ蛍光を比較したところ、ＣＭＶベクターによってリボザイムを発現させたベンタミアーナの後代においてＧＦＰ蛍光の復活が見られた（図７ａ）。２０８  Ｓ２と比べ２０８  Ｒｚ（−）  Ｓ２でＧＦＰ蛍光が復活していることから、実験１（３）で行った方法と同じ方法で３５Ｓプロモーター領域におけるシトシンメチル化の頻度を解析した。その結果、２０８  Ｓ２と比較して２０８  Ｒｚ（−）  Ｓ２ではＣＧ、ＣＨＧ、及びＣＨＨいずれのサイトにおいてもメチル化頻度が低下していることが明らかとなった（図７ｂ）。また、３５Ｓプロモーター領域におけるメチル化パターンを見ると、２０８  Ｒｚ（−）Ｓ２では特に転写開始点付近の脱メチル化が顕著であった（図７ｃ）。これらの結果から、ＣＭＶベクターによって発現させたリボザイムによりスキャフォールドＲＮＡを切断し、３５Ｓプロモーター領域の脱メチル化を誘導してＧＦＰ遺伝子の発現を増加させることが可能であること並びにこの方法により誘導された３５Ｓプロモーター領域における脱メチル化状態が次世代に安定して遺伝することが明らかとなった。【００４３】
［実験６］  シロイヌナズナ導入用リボザイム発現プラスミドベクターの構築
（１）リボザイムの設計
リボザイムの標的配列及びリボザイムカセットの配列を図８及び図９に示す。３５ＳプロモーターのスキャフォールドＲＮＡプラス鎖に存在する３箇所のＧＵＣ（Ａ、Ｂ及びＣとする）を同時に切断するため、シス−トランス−シス型のリボザイムを設計した。シス−トランス−シス型のリボザイムは、図１０に示すように標的配列をトランスに切断するリボザイム（トランス型）を自己切断するリボザイム（シス型）で挟んだ構造をしており、個々のトランス型リボザイムは隣接するシス型リボザイムの自己切断によってモノマーとなり活性を示す。ここではＡ、Ｂ及びＣの位置にあるＧＵＣをそれぞれ切断するトランス型リボザイムを１個ずつシス型で挟んだものを設計した（リボザイム３５Ｓ（＋）−Ａ２ＢＣ）。
（２）リボザイム発現プラスミドベクターの作成
（１）で設計したリボザイム３５Ｓ（＋）−Ａ２ＢＣのＤＮＡ配列５’側にＵ６プロモーター、３’側にＵ６ターミネーターを付加し、さらにその両末端にそれぞれＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｃＩ制限サイトを付加した２本鎖ＤＮＡを人工合成した（図９）。これを発現ベクターｐＢＧＧＮ（株式会社インプランタイノベーションズ）のクローニングサイト（ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｃＩ制限サイト）に常法に従って組み込んだ（図１１）。ｐＢＧＧＮベクターには選択マーカーの一つとしてＢＡＳＴＡ耐性遺伝子（ｂａr遺伝子）が組み込まれており、０．０１％ＢＡＳＴＡ溶液を植物体に噴霧処理することで形質転換植物を選抜することができる。【００４４】
［実験７］  シロイヌナズナ導入用リボザイムのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける切断活性
３５Ｓプロモーター配列及びリボザイム３５Ｓ（＋）−Ａ２ＢＣをそれぞれＴ７プロモーター配列を付加したプライマー（３５Ｓプロモーター配列用フォワードプライマー：5’-CTAATACGACTCACTATAGGGAGACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGC-3’（配列番号１５）; ３５Ｓプロモーター配列用リバースプライマー：5’-ACCATGGATCCTCTAGAGTCGACTG-3’（配列番号１６）；リボザイム３５Ｓ（＋）−Ａ２ＢＣ用フォワードプライマー：5’-CTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGTAGTGATTGGGCGGAC-3’（配列番号１７）；リボザイム３５Ｓ（＋）−Ａ２ＢＣ用リバースプライマー：5’-CGCCATTGGGATGAGCTCAA-3’（配列番号１８））を用いてＰＣＲ増幅し、得られたＰＣＲ産物を鋳型としてＴ７  ＲＮＡ  ポリメラーゼ（ＣＵＧＡ７  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔ）による転写を行った。リボザイムの転写産物１０μｇを５０μＬの反応液中（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）で９５°Ｃ、２分間変性処理して急冷し、続いてＭｇＣｌ２を終濃度５０ｍＭになるよう添加後、３７°Ｃで３時間インキュベートしてシス型リボザイムを自己切断させた。終濃度が５０ｍＭになるようＴｒｉｓ−ＨＣｌが添加された１０μＬの反応液中で、３５Ｓ  プロモーターＲＮＡ断片９００ｎｇに対してモノマー化したリボザイムを２．１μｇ加え、９５°Ｃ、２分間変性処理し、急冷した。ＭｇＣｌ２（終濃度５０ｍＭ）の添加により反応を開始し、３７°Ｃ、３時間インキュベートすることで、トランス型リボザイムによる３５ＳプロモーターＲＮＡ断片の切断を行なった（図１２）。【００４５】
［実験８］  リボザイム導入シロイヌナズナの作出
遺伝子組換えによって導入された場合のスキャフォールドＲＮＡ切断リボザイムの効果を調べるため、まずＧＦＰ遺伝子の３５Ｓプロモーター領域がメチル化された系統を以下のようにして作成した。発現ベクターｐＢＥ２１１３の３５Ｓプロモーター下流にＧＦＰ遺伝子を組み込んだコンストラクトを作成し、これをアグロバクテリウム法によりシロイヌナズナＣｏｌ−０系統に導入した。形質転換体はカナマイシン（５０μｇ/ｍｌ）培地上で選抜した。次に形質転換された個体（Ｔ１世代）の中から、ＧＦＰ遺伝子が３コピー以上導入され発現量が過剰になった結果、３５Ｓプロモーターのメチル化が誘導、Ｔ４世代においてＧＦＰ遺伝子の発現がほぼ抑制された系統（Ｃｏｌ−０  ＧＦＰ−ＴＧＳ）を選抜した。このＣｏｌ−０  ＧＦＰ−ＴＧＳ系統に、実験６で作成したリボザイム発現ベクターをアグロバクテリウム法により導入した。形質転換個体の選抜は、播種後約２週間目に０．０１％ＢＡＳＴＡの噴霧処理により行った。ＢＡＳＴＡの噴霧処理による選抜では偽陽性個体が得られやすいことから、選抜した個体から常法に従ってＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡに対してｒｉｂｏ−ｉｎｓｅｒｔ−ｃｈｅｃｋ−Ｆ（5’-CCCCTAAGTGGGATATTAAGTCAAG-3’：配列番号１９）及びｒｉｂｏ−ｉｎｓｅｒｔ−ｃｈｅｃｋ−Ｒ（5’-TATCCCACTTAGGGGTTTGGAAAC-3’：配列番号２０）のプライマー対を用いてＰＣＲ行い、リボザイム３５Ｓ−Ａ２ＢＣの導入を確認した（図１３）。【００４６】
［実験９］  リボザイムを導入したＣｏｌ−０  ＧＦＰ−ＴＧＳ個体におけるＧＦＰ遺伝子の発現解析
実験８で得られたリボザイム３５Ｓ−Ａ２ＢＣ導入Ｔ１個体では、３５ＳプロモーターのスキャフォールドＲＮＡプラス鎖がリボザイムによって切断されることにより３５Ｓプロモーター領域の脱メチル化が誘導され、ＧＦＰ遺伝子の発現量が増加していることが予想される。リボザイム３５Ｓ−Ａ２ＢＣ導入個体と非導入個体の間でＧＦＰ遺伝子の発現量を比較した結果、リボザイム３５Ｓ−Ａ２ＢＣ導入個体においてＧＦＰ発現量が非導入個体よりも最大で２倍程度増加していることが確認された（図１４）。ＧＦＰ遺伝子の発現量は、ＲＮＡｚｏｌ  ＲＴ（Molecular Research Center）を用いて葉から抽出した全ＲＮＡに対して定量ＲＴ−ＰＣＲ（ＧｅＸＰ発現解析システム、ＡＢサイエックス）を行い測定した。内部標準として用いた遺伝子はＵＢＱ１０遺伝子で、ＧＦＰ及びＵＢＱ１０遺伝子のＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマー対はそれぞれＧｅＸＰ−ＧＦＰ−Ｆ（5’-AGGTGACACTATAGAATATATATCATGGCCGACAAGCA-3’：配列番号２１）、ＧｅＸＰ−ＧＦＰ−Ｒ（5’-GTACGACTCACTATAGGGATGGGTGCTCAGGTAGTGGTT-3’：配列番号２２）及びＧｅＸＰ−Ａｔｕｂｑ１０−Ｆ（5’-AGGTGACACTATAGAATATTGGCCGACTACAACATTCA-3’：配列番号２３）、ＧｅＸＰ−Ａｔｕｂｑ１０−Ｒ（5’-GTACGACTCACTATAGGGAAAGTGATGGTCTTTCCGGTG-3’：配列番号２４）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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