(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
３Ｄマトリックスと、細胞嚢と、細胞嚢管とを含んでなる組成物であって、細胞嚢および細胞嚢管が、前記３Ｄマトリックスの上部に単一細胞懸濁液を埋め込むことにより発生するものである、組成物。
【請求項２】
前記細胞嚢および細胞嚢管が、前記細胞嚢および細胞嚢管を発生させる前記細胞を封入する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記細胞嚢および細胞嚢管が、周囲環境から前記細胞嚢および細胞嚢管に侵入する複数の細胞をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記細胞嚢および細胞嚢管が細胞を欠く、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記３Ｄマトリックスが生分解性である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記３Ｄマトリックスが、エラスチン、ラミニン、コラーゲン、プロテオグリカン、または非プロテオグリカン多糖を含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記プロテオグリカンが、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、およびケラチン硫酸を含んでなる、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記非プロテオグリカン多糖がヒアルロン酸を含んでなる、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記３Ｄマトリックスが、線維性タンパク質、ＦＡＣＩＴタンパク質、短鎖タンパク質および基底膜タンパク質をさらに含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記３Ｄマトリックスが、焦点接着キナーゼ（ＦＡＫ）、タリン、ビンキュリン、パキシリン(paxllin)、α−アクチニン、およびＧＴＰアーゼを含むシグナルタンパク質をさらに含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記３Ｄマトリックスがマトリゲルである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記３Ｄマトリックスの重合、密度、タンパク質濃度、および粘弾性が、前記細胞嚢および細胞嚢管の発生に影響を及ぼす、請求項１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞嚢（cytocapsulae）および細胞嚢管（cytocapsular tubes）の発生の分野、ならびにその方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞境界は、細胞を外部環境から引き離すことにより、細胞内活性および細胞内含量を可能とし、それらを環境因子の望まれない影響から保護する。細胞境界は、細胞のセンシング、遊走、浸潤、再配置、増殖、成長、分化、環境との情報交換および環境に対する応答、栄養素および酸素の摂取、代謝廃棄物の排除、ならびに環境ストレスに対する保護に必須である。
【０００３】
多細胞生物における細胞の移動運動は、胚発生（Le Douarin NM (1984) Cell migrations in embryos. Cell 38(2):353-360; Reig G, Pulgar E, & Concha ML (2014) Cell migration: from tissue culture to embryos. Development 141(10):1999-2013; Richardson BE & Lehmann R (2010) Mechanisms guiding primordial germ cell migration: strategies from different organisms. Nat Rev Mol Cell Biol 11(1):37-49）、器官のホメオスタシス（Acloque H, Adams MS, Fishwick K, Bronner-Fraser M, & Nieto MA (2009) Epithelial-mesenchymal transitions: the importance of changing cell state in development and disease. The Journal of clinical investigation 119(6):1438-1449）、組織再生（Bryant DM & Mostov KE (2008) From cells to organs: building polarized tissue. Nat Rev Mol Cell Biol 9(11):887-901）、免疫応答（Woodland DL & Kohlmeier JE (2009) Migration, maintenance and recall of memory T cells in peripheral tissues. Nat Rev Immunol 9(3):153-161; Weninger W, Biro M, & Jain R (2014) Leukocyte migration in the interstitial space of non-lymphoid organs. Nat Rev Immunol 14(4):232-246）、創傷修復（Gurtner GC, Werner S, Barrandon Y, & Longaker MT (2008) Wound repair and regeneration. Nature 453(7193):314-321）、および腫瘍播種（Friedl P & Alexander S (2011) Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity. Cell 147(5):992-1009; Friedl P & Wolf K (2003) Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer 3(5):362-374; Barbolina MV, et al. (2009) Microenvironmental regulation of ovarian cancer metastasis. Cancer Treat Res 149:319-334）にとって極めて重要である。三次元（３Ｄ）微小環境における細胞遊走は、不均一な細胞と、支持足場および移動運動の方向を導く手がかりを提供する一方で、細胞運動性を妨害する環境障害物を実質的に形成する細胞外マトリックス（ＥＣＭ）とを経験する（Thiery JP, Acloque H, Huang RY, & Nieto MA (2009) Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell 139(5):871-890; Franz CM, Jones GE, & Ridley AJ (2002) Cell migration in development and disease. Dev Cell 2(2):153-158）。運動性を亢進するために、細胞は、ラメリポディア（Murphy DA & Courtneidge SA (2011) The ’ins’ and ’outs’ of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function. Nat Rev Mol Cell Biol 12(7):413-426）、フィロポディア（Mattila PK & Lappalainen P (2008) Filopodia: molecular architecture and cellular functions. Nat Rev Mol Cell Biol 9(6):446-454）、ポドソーム（Tarone G, Cirillo D, Giancotti FG, Comoglio PM, & Marchisio PC (1985) Rous sarcoma virus-transformed fibroblasts adhere primarily at discrete protrusions of the ventral membrane called podosomes. Exp Cell Res 159(1):141-157）、浸潤突起(Chen WT (1989) Proteolytic activity of specialized surface protrusions formed at rosette contact sites of transformed cells. J Exp Zool 251(2):167-185）、ブレブ（Fackler OT & Grosse R (2008) Cell motility through plasma membrane blebbing. J Cell Biol 181(6):879-884; Ridley AJ (2011) Life at the leading edge. Cell 145(7):1012-1022）、焦点接着(Wehrle-Haller B (2012) Structure and function of focal adhesions. Current opinion in cell biology 24(1):116-124）、樹状仮足突起、およびＩＩ型上皮橋（Zani BG, Indolfi L, & Edelman ER (2010) Tubular bridges for bronchial epithelial cell migration and communication. PLoS One 5(1):e8930）を含む、時間空間的な表面に結合した細胞小器官および区画を適応的に発生させる。従って、多細胞生物における細胞の再配置の力学は不明である。
【０００４】
３Ｄ細胞遊走における細胞形態、用いられる細胞小器官、ならびに機械的制御およびシグナル伝達の制御は、それらの２Ｄ対応物とはしばしば異なる(Baker BM & Chen CS (2012) Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J Cell Sci 125(Pt 13):3015-3024; Wu PH, Giri A, Sun SX, & Wirtz D (2014) Three-dimensional cell migration does not follow a random walk. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 111(11):3949-3954; Friedl P, Sahai E, Weiss S, & Yamada KM (2012) New dimensions in cell migration. Nat Rev Mol Cell Biol 13(11):743-747）。コラーゲンに富む３Ｄマトリックス中の移動運動における細胞は、ラメリポディアまたはフィロポディアを示さないが、剛性板の表面上では存在しない高樹状仮足突起を示す(Jayatilaka H, et al. (2017) Synergistic IL-6 and IL-8 paracrine signalling pathway infers a strategy to inhibit tumour cell migration. Nature communications 8:15584; Giri A, et al. (2013) The Arp2/3 complex mediates multigeneration dendritic protrusions for efficient 3-dimensional cancer cell migration. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology 27(10):4089-4099）。
【０００５】
３Ｄ細胞外マトリックスおよび３Ｄ微小環境における細胞の移動運動を理解するのに有用な方法および組成物のニーズが、当技術分野において継続して存在する。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、このニーズに取り組んでおり、３Ｄ細胞外マトリックスなどの制御された３Ｄ微小環境における細胞は、少なくとも２種の新規な膜性細胞小器官、すなわち、細胞嚢（cytocapsulae）および細胞嚢管（cytocapsular tubes）を発生させ得るという発見に基づいている。細胞嚢管は、定方向の細胞輸送のための管状経路を提供する。複数の細胞嚢管が相互接続し、様々な方向の定方向の細胞輸送のための管状の網のネットワークを形成する。ＩＴＧＢ−２を含むタンパク質の亢進したｃａｐ依存性翻訳の開始および発現の増加は、細胞嚢および細胞嚢管の形成ならびに細胞嚢管の伸長と関連することが認められている。制御された３Ｄ細胞外マトリックスにおいて細胞嚢および細胞嚢管を発生させるための方法および組成物は、３Ｄ微小環境における細胞遊走の根底にある機序を理解するための強力なツールを提供する。このことは、細胞遊走、細胞センシング、細胞ストレス保護、細胞増殖、細胞分化、腫瘍成長、腫瘍発生、腫瘍転移、腫瘍再発、および薬剤耐性に関連する広範囲の疾患に対する有効な治療法の開発の必要条件である。
【０００７】
本開示の一態様によれば、３Ｄ細胞外マトリックスと、細胞嚢と、細胞嚢管とを含んでなる組成物が提供される。上記細胞嚢および細胞嚢管は、上記３Ｄマトリックスの中または上部に埋め込まれた細胞により発生する。
【０００８】
本開示の別の態様によれば、細胞嚢および細胞嚢管の発生方法が提供される。上記方法は、３Ｄマトリックスの中または上部に細胞を埋め込むこと、ならびに該細胞が上記細胞嚢および細胞嚢管を発生させるような条件下で、上記細胞が埋め込まれた３Ｄマトリックスをインキュベートすることを含む。
【０００９】
本開示のさらに別の態様によれば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞嚢および細胞嚢管の製造方法が提供される。上記方法は、単一細胞懸濁液中の細胞を３Ｄマトリックスの上層に埋め込む工程；および上記細胞が上記３Ｄマトリックスにおいて細胞嚢および細胞嚢管を発生させるような条件下で、上記細胞が埋め込まれた３Ｄマトリックスを培養する工程を含む。
【００１０】
本開示のなおさらに別の態様によれば、細胞嚢および細胞嚢管の発生に好適な３Ｄマトリックスの調製方法が提供される。上記方法は、上記３Ｄマトリックスを凍結させること、および上記３Ｄマトリックスを好適な温度で解凍することを含む。
【００１１】
本開示ならびに特に請求項および／または段落において、「を含んでなる(comprises)」、「に含まれる(comprised)」、「を含んでなる(comprising)」などの用語は、米国特許法においてそれに帰属する意味を有し得、例えば、それらは、「を含む(includes)」、「に含まれる(included)」、「を含む(including)」などを意味し得ること、ならびに、「から実質的になる(consisting essentially of)」および「から実質的になる(consists essentially of)」などの用語は、米国特許法においてそれらに帰する意味を有し、例えば、それらは、明示的に列挙されない要素を許容するが、従来技術において認められる要素または本発明の基本的または新規な特徴に影響を及ぼす要素を排除することに注意されたい。
【００１２】
これらのおよび他の実施形態は、以下の発明の詳細な説明に開示されているか、その発明の詳細な説明から明らかであり、それに包含される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
本特許または出願書類は、色付きで作成された少なくとも１つの図面を含有する。色付きの図面を伴う本特許または特許出願公報の写しは、要求および必要な手数料の支払いに応じて、特許庁により提供される。本実施形態の前述およびその他の特徴および利点は、以下の内容を含む添付図面と併せて、以下の例示的実施形態の詳細な説明からより十分に理解されるであろう。
【図１Ａ】細胞嚢および細胞嚢管の発生に関する像を示す図である。図１Ａは、細胞嚢および伸長した細胞嚢管の発生の像を示す。示した条件下で厚い３Ｄのマトリゲルゲル上に埋め込まれたヒト乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）は、膜性の細胞質外の細胞嚢および伸長した細胞嚢管を発生させる。細胞嚢管とともに、ＥＧＦＰ−ＰＭＣＡ２およびｍＣｈｅｒｒｙ−β−アクチンを一過性に過剰発現している単一のＨＭＥＣの細胞嚢管の蛍光(fluoresence)像が示されている。ＨＭＥＣ（赤色の矢印）、細胞嚢（ＣＣ、白色の矢印）、細胞嚢膜（ＣＣＭ、橙黄色の矢印）が示されている。スケールバー＝１０μｍ。
【図１Ｂ】細胞嚢および細胞嚢管の発生に関する像を示す図である。図１Ｂは、細胞嚢管の長さの定量分析を示す。スケールバー＝１０μｍ。
【図１Ｃ】細胞嚢および細胞嚢管の発生に関する像を示す図である。図１Ｃは、細胞嚢の脱細胞(ecellularization)の倒立位相差明視野顕微鏡像を示す。青色の矢印で示された単一のＨＭＥＣは、細胞を包む巨大細胞嚢（ＣＣ、赤色の矢印）を発生させる。１時間後、ＨＭＥＣは細胞嚢から離れ、内側に細胞を有さない脱細胞された(ecellulated)細胞嚢（ｅＣＣ、白色の矢印）が残る。細胞嚢膜（ＣＣＭ、橙黄色の矢印）が示されている。スケールバー＝１０μｍ。
【図１Ｄ】細胞嚢および細胞嚢管の発生に関する像を示す図である。図１Ｄは、細胞嚢の脱細胞(ecellularization)の概略図を示す。スケールバー＝１０μｍ。
【図１Ｅ】細胞嚢および細胞嚢管の発生に関する像を示す図である。図１Ｅは、直径での細胞嚢のサイズの定量アッセイを示す。スケールバー＝１０μｍ。
【図１Ｆ】細胞嚢および細胞嚢管の発生に関する像を示す図である。図１Ｆは、巨大な膜性の細胞嚢（ＣＣ、赤色の矢印）のＤＩＣ像（左パネル）および蛍光(fluoresence)像（右パネル）を示す。スケールバー＝１０μｍ。
【図２】ＨＭＥＣの細胞嚢管ネットワークを示す図である。細胞嚢管におけるＨＭＥＣの遊走およびネットワーク形成。細胞嚢管（ＣＴ、赤色の矢印）、細胞嚢管結合節（ＣＴＮ）、単一細胞嚢管において遊走する複数の細胞（橙黄色の矢印）、および細胞嚢管を有さない細胞集団（黒色の矢印）が示されている。
【図３Ａ】細胞嚢管ネットワークの構造を示す図である。（図３Ａ）複数のＢＣＳＣの細胞嚢管が交差している。複数のＢＣＳＣの細胞嚢管が、細胞嚢管節（ＣＴＮ）を介して相互接続しており、交差した形態を形成している。細胞嚢管ネットワークにおいて細胞が遊走している。スケールバー＝１０μｍ。
【図３Ｂ】細胞嚢管ネットワークの構造を示す図である。（図３Ｂ）基本的な形態のＢＣＳＣの細胞嚢管（ＣＴ、赤色の矢印）ネットワーク。最大５個の細胞嚢管が、細胞嚢管節（ＣＴＮ）を介して接続している。様々な形態の細胞嚢管ネットワークにおいて、複数の細胞が遊走している。スケールバー＝１０μｍ。
【図４】ＢＣＳＣ細胞嚢管ネットワーク系の細胞溶解分析による即時イメージングを示す図である。細胞溶解を用いた即時イメージングによる細胞嚢管ネットワークの明視野像。細胞嚢管ネットワークにおける入れ子状の細胞嚢管（ＣＴ、赤色の矢印）および細胞嚢管節（ＣＴＮ）が示されている。細胞溶解緩衝剤による処理の１〜２秒後に撮像した。溶解緩衝剤による処理の３秒後に、総ての細胞嚢管および細胞形質膜が溶解し、消失した。
【図５Ａ】細胞嚢の合併および細胞の侵入を示す図である。（図５Ａ）２個の細胞により発生された２本の細胞嚢管により結合した合併細胞嚢管の明視野像。細胞２は、合併細胞嚢管の中に位置している。合併細胞嚢管（ＭＴＰ、赤色の矢印）、合併細胞嚢管膜（ＭＴＭ、橙黄色の矢印）が示されている。
【図５Ｂ】細胞嚢の合併および細胞の侵入を示す図である。（図５Ｂ）合併巨大細胞嚢の中に位置する複数の細胞（細胞集団）を有する巨大合併細胞嚢のＤＩＣ像および蛍光顕微鏡像。合併細胞嚢管膜（ＭＴＭ、橙黄色の矢印）が示されている。
【図５Ｃ】細胞嚢の合併および細胞の侵入を示す図である。（図５Ｃ）細胞の侵入の定量化。
【図５Ｄ】細胞嚢の合併および細胞の侵入を示す図である。（図５Ｄ）ＨＭＥＣにおける内在性シンシチン１の免疫蛍光(immunofluoresence)顕微鏡像。
【図５Ｅ】細胞嚢の合併および細胞の侵入を示す図である。（図５Ｅ）細胞嚢管の発生中におけるシンシチン１の発現のウェスタンブロット像。
【図５Ｆ】細胞嚢の合併および細胞の侵入を示す図である。（図５Ｆ）シンシチン１のノックダウンは、ＨＭＥＣの細胞嚢管の合併を減少させる。
【図５Ｇ】細胞嚢の合併および細胞の侵入を示す図である。（図５Ｇ）シンシチン１のノックダウンは、ＨＭＥＣの細胞嚢管のイニシエーションに影響を及ぼさない。
【図６Ａ】細胞嚢管の伸長を調節するＩＴＧＢ−２を示す図である。（図６Ａ）細胞嚢管の発生中における２６個のインテグリン遺伝子の転写変化のヒートマップ。
【図６Ｂ】細胞嚢管の伸長を調節するＩＴＧＢ−２を示す図である。（図６Ｂ）細胞嚢の発生および細胞嚢管の伸長に対するＩＴＧＢ−２の効果。
【発明の具体的説明】
【００１４】
本開示の態様は、細胞が、制御された３Ｄ細胞外マトリックスに埋め込まれ、培養された際、本明細書において細胞嚢（cytocapsulae）および細胞嚢管（cytocapsular tubes）と呼ばれる２種の新規な細胞外膜性細胞小器官を発生させ得るという従来未発見の観察所見に基づいている。細胞は、細胞嚢において遊走し、細胞嚢管を発生させ、これは、多面的な生体機能を示し、マトリックス内での定方向の細胞輸送のための管状経路を提供する。複数の細胞嚢管が形成され、相互接続して、マトリックス内での様々な方向の定方向の細胞輸送を支持するネットワークを発生させる。本開示は、３Ｄ微小環境における細胞嚢管を介した定方向の細胞トランスロケーションの機序を提案する。細胞嚢および細胞嚢管を発生させるための本開示の方法および組成物は、多細胞生物の胚発生、器官のホメオスタシス、組織再生、および免疫応答の根底にある機序の理解、ならびに、限定されるものではないが、細胞遊走、細胞センシング、細胞ストレス保護、細胞増殖、細胞分化、腫瘍成長、腫瘍発生、腫瘍転移、腫瘍再発、および薬剤耐性を含む広範囲の疾患および生物学的過程の処置および管理のための治療法の開発を促進するであろう。
【００１５】
観察されるように、本明細書に記載の方法に従って３Ｄ細胞外マトリックスに発生された細胞嚢および細胞嚢管の生活環は、以下のように概説することができる。最初の段階では、単一／個々の細胞が、細胞を封入する小型、円形で、細胞外の膜性細胞嚢を発生させる。続いて、細胞嚢が、複数の発達相を経験する。最初に、細胞嚢は、脱細胞(ecellularization)の段階に入る。脱細胞(ecellularization)の結果、細胞嚢は、排出された細胞と完全に分離され、無細胞の細胞嚢となっていく。細胞嚢と排出された細胞との不完全な分離も観察されている。不完全な分離の場合、排除された細胞は、無細胞の細胞嚢と接続したままであり、接続された無細胞の細胞嚢に自己侵入により再度侵入し得、内腔内の細胞とともに閉鎖した細胞嚢を再形成し得る。２番目に、細胞嚢は成長し、巨大な（直径／長軸で約１００〜２５０μｍ）円形または卵形の細胞嚢を形成する。巨大細胞嚢は、わずかに縮み得、腔内細胞を封入する縮んだ細胞嚢を形成し得る。他方、周囲環境からのその他の細胞が、細胞を含有する単一の巨大細胞嚢に侵入し得、複数の細胞を内部に有する単一細胞嚢に至る。これらの巨大細胞嚢の脱細胞(ecellularization)は、巨大な無細胞の細胞嚢を発生させ、この細胞嚢は、縮み、収縮し、巨大な収縮した凹形の（または不整な形態の）円板を形成する。３番目に、細胞が、細胞嚢において遊走し、細胞嚢膜を変形させ、伸長した細胞嚢管を発生させる。周囲の細胞の非自己侵入により、細胞嚢管に複数の細胞が侵入し、遊走することが可能となる。均一なおよび膜に封入された細胞嚢管における（単一細胞または複数の細胞の）細胞遊走は、不均一な細胞外(extracelluar)マトリックス（ＥＣＭ）ならびにその他の細胞および構造から構成される不均一な環境において認められるものより速い。おそらく、細胞嚢管内では、細胞遊走は、ＥＣＭ、細胞および構造の妨害がない。細胞嚢管は、相互接続し、分岐した、継ぎ目のない、膜性の管状ネットワークを形成し、様々な方向の定方向の３Ｄ細胞輸送／移動運動のための管状の網の系を提供する。脱細胞(ecellularization)の過程は、無細胞の細胞嚢および細胞嚢管を発生させる。総ての無細胞の細胞嚢および細胞嚢管は、急速な自己分解の段階に入る。
【００１６】
一態様によれば、３Ｄ細胞外マトリックスと、細胞嚢と、細胞嚢管とを含んでなる組成物が提供される。一実施形態では、上記細胞嚢および細胞嚢管は、上記３Ｄマトリックスの中または上部に埋め込まれた単一細胞により発生する。一実施形態では、上記細胞は、上記３Ｄマトリックスの上部表面に埋め込まれる。埋め込み前に、上記細胞は、約１×１０〜約１×１０５個／ｍｌの密度の単一細胞懸濁液に加工される。
【００１７】
一態様によれば、上記細胞嚢および細胞嚢管は、該細胞嚢および細胞嚢管を発生させる上記細胞を封入する。別の態様によれば、上記細胞嚢および細胞嚢管は、周囲環境から該細胞嚢および細胞嚢管に侵入する複数の細胞を含む。さらに別の態様によれば、上記細胞嚢および細胞嚢管は、脱細胞(ecellularization)を受け、封入された細胞を支持し、細胞を欠いた無細胞の細胞嚢および細胞嚢管を形成する。
【００１８】
特定の態様によれば、およそ単一の細胞懸濁液中の複数の細胞が、３Ｄマトリックスの中または上層に加えられた、３Ｄマトリックスが提供される。制御された条件下での細胞が埋め込まれた３Ｄマトリックスのインキュベーションは、細胞嚢および細胞嚢管を発生させる単一細胞をもたらす。
【００１９】
一態様によれば、上記３Ｄマトリックスは多孔質である。多孔性は、マトリックス材料の作製に用いられる分子の重合および／または架橋の結果、得られ得る。多孔性は、当業者に既知の方法に従って、共重合された分枝モノマーの架橋密度、鎖長およびパーセンテージを変えることにより制御される。一態様によれば、上記３Ｄマトリックスは、追加の試薬が拡散することができるか、そうでなければマトリックスを移動できる程度まで、多孔質である。多孔質マトリックスは、当業者に既知の方法に従って作製してもよい。分子ふるいサイズおよび密度のさらなる制御は、官能化ポリエチレングリコールなどの追加の架橋剤を加えることにより、達成される。
【００２０】
別の態様によれば、上記３Ｄマトリックスは粘性である。上記３Ｄマトリックスの粘度は、当技術分野で既知の任意の手段に従って調整することができる。
【００２１】
一態様によれば、３Ｄマトリックス材料は、化学的に不活性であり、種々の温度を可能とするために熱的に安定である。一態様によれば、上記３Ｄマトリックス材料は、光学的に透明である。一態様によれば、上記３Ｄマトリックス材料は、当業者に既知の３Ｄイメージング技術を可能とするために光学的に透明である。一態様によれば、上記マトリックスは、十分に光学的に透明であるか、そうでなければ、ハイスループットな情報の読み取りのためのディープ３Ｄイメージングに好適な光学特性を有する。
【００２２】
一態様によれば、上記マトリックスの形成に用いられる材料は、生分解性である。別の態様によれば、上記マトリックスの形成に用いられる材料は、広範囲なｉｎ  ｓｉｔｕでの生物および非生物標本と適合する。
【００２３】
一態様によれば、上記マトリックス材料は、ポリアクリルアミド、セルロース、アルギン酸塩、ポリアミド、架橋アガロース、架橋デキストランまたは架橋ポリエチレングリコールからなり得る半流動培地であり得る。特定の態様において、上記半流動培地は、顕微鏡スライドガラス、培養プレート、またはフローセルなどの固体支持体に付着させることができる。上記固体支持体は、上記半流動培地の底部表面に付着させることができる。
【００２４】
マトリックス形成材料は、限定されるものではないが、ポリアクリルアミド、セルロース、アルギン酸塩、ポリアミド、架橋アガロース、架橋デキストランまたは架橋ポリエチレングリコールを含む。上記マトリックス形成材料は、該マトリックス形成材料に特異的な方法ならびに当業者に既知の方法、試薬および条件を用いた、上記マトリックス形成材料の重合および／または架橋により、マトリックスを形成することができる。
【００２５】
マトリックス形成材料は、限定されるものではないが、エラスチン、ラミニン、プロテオグリカン（ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、およびケラチン硫酸など）、ならびに非プロテオグリカン多糖（ヒアルロン酸など）をさらに含む。特定の実施形態では、マトリックス形成材料は、限定されるものではないが、線維性、ＦＡＣＩＴ、短鎖、および基底膜タンパク質を含むタンパク質も含み得る。他の実施形態では、マトリックス形成材料は、限定されるものではないが、焦点接着キナーゼ（ＦＡＫ）、タリン、ビンキュリン、パキシリン(paxllin)、α−アクチニン、およびＧＴＰアーゼを含むシグナルタンパク質をさらに含み得る。生分解性、生体適合性ポリマーは、例えば、限定されるものではないが、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物(polyanhydridcs)、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸およびポリ乳酸・ポリグリコール酸共重合体（ＰＬＧ）を含む、マトリックス材料として使用され得る。
【００２６】
特定の態様によれば、マトリックスは、固体支持体とともに使用される。例えば、上記マトリックスは、該マトリックスの一方の表面が固体支持体（例えば、ガラス表面）に付着し、一方で、該マトリックスの他方の表面が露出している、または２つの固体支持体に挟まれるように、重合され得る。一態様によれば、上記マトリックスは、容器内に含有され得る。
【００２７】
本開示の固体支持体は、種々の形状に作製され得る。特定の実施形態では、上記固体支持体は、実質的に平面状である。固体支持体の例としては、スライド、マイクロタイタープレート、フローセル、カバーガラス、マイクロチップなどのプレート、微量遠心管、試験管などの容器、管、シート、パッド、フィルムなどが挙げられる。さらに、上記固体支持体は、例えば、生物学的、非生物学的、有機、無機、またはその組合せであり得る。
【００２８】
上記マトリックスの特定の特徴は、該マトリックスにおける上記細胞嚢および細胞嚢管の発生にとって極めて重要であることが見出されている。例えば、上記マトリックスの重合度、タンパク質濃度および粘弾性は、細胞嚢および細胞嚢管の発生に影響を及ぼす。本開示は、低い約１０％の重合から完全な１００％の重合まで、広範囲のマトリックスの重合度を企図する。マトリックスの重合度は、マトリックスの密度および粘弾性とも関連している。さらに、上記マトリックスに存在する、または上記マトリックスにその後加えられるタンパク質も、細胞嚢および細胞嚢管の発生に影響を及ぼす。本開示は、約２〜１２ｍｇ／ｍｌの間の範囲にある上記マトリックス内の最終タンパク質濃度を企図する。本開示は、上記マトリックスに対してｐＨ４〜８の範囲をさらに企図する。上記マトリックスの重合度、勾配、密度および粘弾性(viscoelasiticity)は、該マトリックス内の細胞遊走の硬領域指向性運動に影響を及ぼす。一実施形態では、上記３Ｄマトリックスはマトリゲルである。
【００２９】
本開示による細胞は、真核細胞、動物細胞、植物細胞、限定されるものではないが、ショウジョウバエ細胞を含む昆虫細胞、Ｃ．エレガンス(C. elegant)細胞などを含む。例示的細胞は、異常細胞または正常細胞を含む、ヒトまたはそれ以外のいずれかの細胞を含む。特定の細胞は、ヒト細胞、非ヒト細胞、ヒト幹細胞、分化細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、遺伝子改変細胞、ヒト多能性細胞、上皮細胞、内皮細胞、免疫細胞、筋細胞、マウス幹細胞、初代細胞株、不死化細胞株、初代および不死化線維芽細胞、ＨｅＬａ細胞およびニューロン、ならびに腫瘍細胞を含む。一実施形態では、上記細胞は哺乳類細胞である。別の実施形態では、上記細胞はヒト乳腺上皮細胞である。特定の実施形態では、上記細胞は、成体または胚性を問わず幹細胞である。一実施形態では、上記細胞は多能性幹細胞である。別の実施形態では、上記細胞は人工多能性幹細胞である。さらに別の実施形態では、上記細胞はヒト人工多能性幹細胞である。特定の態様によれば、上記細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏである。
【００３０】
別の態様によれば、本開示は、細胞嚢および細胞嚢管の発生方法を提供する。一実施形態では、上記方法は、３Ｄマトリックスの中または上部に細胞を埋め込む工程、ならびに上記細胞嚢および細胞嚢管の発生に好適な温度で上記細胞が埋め込まれた３Ｄマトリックスをインキュベートする工程を含む。上記細胞嚢および細胞嚢管の発生に好適なインキュベーション温度は、およそ３７℃であり、特定の細胞型に対しては変動する。一実施形態では、上記３Ｄマトリックスは、埋め込み前に凍結される。特定の実施形態では、埋め込みは、約１〜４５℃、１〜３７℃、１〜６℃、および２〜４℃の間の範囲の温度で行われる。他の実施形態では、上記３Ｄマトリックスの厚さは、約１〜１０００μｍ、２〜１００μｍ、５〜５０μｍ、および５〜１０μｍの間の範囲である。
【００３１】
特定の態様によれば、上記細胞嚢および細胞嚢管は、該細胞嚢および細胞嚢管を発生させる上記細胞を封入する。他の態様によれば、上記細胞嚢および細胞嚢管は、該細胞嚢および細胞嚢管を発生させる上記封入された細胞の流出を可能とする。さらに別の態様によれば、上記細胞嚢および細胞嚢管は、周囲環境からの複数の細胞の侵入を可能とする。
【００３２】
一態様によれば、上記細胞は、埋め込み前に、約１×１０〜１×１０５個／ｍｌの間の密度の単一細胞懸濁液として提示される。
【００３３】
上記細胞嚢および細胞嚢管の膜は、特定の特徴を有する。一態様によれば、上記細胞嚢および細胞嚢管の膜は、形質膜タンパク質Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ２を含んでなる。別の態様によれば、シンシチン１は、細胞嚢管の合併および細胞の侵入を調節する。さらに別の態様によれば、成長因子は、細胞嚢の発生および細胞嚢管の発生を調節する。なおさらに別の態様によれば、ＩＴＧＢ−２は、細胞嚢管における細胞遊走を媒介し、かつ、細胞嚢管の伸長を調節する。さらに別の態様によれば、マトリックスメタロプロテイナーゼは、細胞嚢管の伸長を媒介する。
【００３４】
特定の実施形態では、上記３Ｄマトリックスは、限定されるものではないが、コラーゲン、マトリゲルマトリックス材料、エラスチン、ラミニン、プロテオグリカン（ヘパラン(heparun)硫酸、コンドロイチン硫酸、およびケラチン硫酸など）、非プロテオグリカン多糖（ヒアルロン酸など）、タンパク質（線維性、ＦＡＣＩＴ、短鎖、および基底膜タンパク質など）ならびにシグナルタンパク質（ＦＡＫ、タリン、ビンキュリン、パキシリン(paxllin)、α−アクチニン、およびＧＴＰアーゼなど）を含む生物活性および／または生物不活性薬剤を含んでなる。
【００３５】
別の態様によれば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞嚢および細胞嚢管の製造方法が提供される。一実施形態では、上記方法は、単一細胞懸濁液中の細胞を３Ｄマトリックスの上層に埋め込む工程；および各単一細胞が上記３Ｄマトリックスにおいて細胞嚢および細胞嚢管を発生させる好適な培地および好適な温度において、上記埋め込まれた細胞を培養する工程を含む。
【００３６】
さらに別の態様によれば、細胞嚢および細胞嚢管の発生に好適な３Ｄマトリックスの調製方法が提供される。一実施形態では、上記方法は、上記３Ｄマトリックスを凍結させること、および上記３Ｄマトリックスを好適な温度で解凍することを含む。上記マトリックスを解凍するのに好適な温度は、約１〜４５℃、１〜３７℃、１〜６℃、および２〜４℃の間である。
【実施例】
【００３７】
以下の実施例は、本発明の種々の実施形態を説明する目的で示すものであり、いずれの様式でも本発明を限定することを意味するものではない。本実施例は、本明細書に記載の方法とともに、好ましい実施形態の現在の代表であり、例示的なものであり、かつ、本発明の範囲を限定するものとして意図したものではない。請求項の範囲に定義される本発明の趣旨に包含されるこれらの変更およびその他の使用は、当業者により行われるであろう。
【００３８】
実施例Ｉ
細胞嚢および細胞嚢管の発生
細胞境界および３Ｄの細胞の移動運動の力学を調べるため、正常初代ヒト乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）を、本開示の特定の実施形態に従って、再構成された細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の代替である３Ｄマトリゲルマトリックスに埋め込んだ。３Ｄマトリゲル中の単一の球状のＨＭＥＣは、細胞を封入する様々なサイズの円形／不整な形状で細胞外気泡様の嚢を発生させているが、２Ｄ環境における細胞は、それらを発生させなかった（図１Ａ）。およそ９６％の単一ＨＭＥＣ（６ウェルプレート中で１×１０３個／ウェル、ｎ＝３）が、１２時間において細胞外嚢を発生させた。細胞外球状／卵形嚢の直径／長軸は有意に増加し、最大２５０μｍに達した。嚢表面が膜性であるかどうかを確認するために、我々は、ＨＭＥＣにおいて、改良緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）と形質膜タンパク質Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ２との融合物（ＥＧＦＰ−ＰＭＣＡ２）を一過性に過剰発現した。実際に、ＥＧＦＰ−ＰＭＣＡ２は、細胞の形質膜および細胞外嚢膜の双方に分布しており、このことは、細胞外嚢は膜により封入されていることを立証した（図１Ａ）。これらの細胞外細胞嚢は、伸長して、様々な長さの長い管を形成し得る（図１Ｂ）。経時的に、単一の嚢は、自動的に脱細胞し(ecellularized)、緊張した膜を有する複数の形態（球状、卵形、または不整）の無細胞の閉鎖した嚢を残す（図．１Ｃ〜１Ｄ）。これらの細胞嚢は、様々なサイズであり、最大直径１００μｍまで大きくなり得る（図１Ｅ）。これらの細胞嚢は、膜性である（図１Ｆ）。これらの観察所見は、嚢膜は形質膜の外側に独立して位置すること、および無細胞の嚢は細胞なしで存在し得ることを証明した。このこれまで価値を認められなかった、単一の哺乳類細胞により発生する細胞外の膜性の嚢は、細胞嚢と命名した。
【００３９】
実施例ＩＩ
細胞嚢の脱細胞(ecellularization)
ほとんどの場合において、細胞嚢の脱細胞(ecellularization)後、細胞は、その無細胞の細胞嚢から完全に分離する。上記無細胞の細胞嚢は、崩壊して、収縮した凹形の円板を形成する（図１Ｃ）。時折、細胞嚢の脱細胞(ecellularization)は、排出された細胞のその無細胞の細胞嚢からの不完全な分離をもたらす。
【００４０】
脱細胞(ecellularization)後、無細胞の細胞嚢の成長は終結し、細胞嚢の発生および成長は、腔内細胞に依存することが強く示唆された。一方、形質膜と細胞外嚢膜との間の巨大なギャップ／距離は、腔内細胞に由来する嚢成分が、細胞嚢の構築のために形質膜の外側に放出／送達されることを示した（図１Ｃ）。その後、無細胞の細胞嚢は、継続して縮み、収縮し、細胞嚢膜が折り畳まれ、巨大な収縮した凹形の円板、または短い平らな管を形成する。約０．５〜１時間後、無細胞の細胞嚢の膜は分解し、細胞嚢は自己分解した。これらの観察所見は、細胞嚢の生活環は、いくつかの連続的かつ別個の相：イニシエーションから、成長、脱細胞(ecellularization)、収縮および縮み、膜分解、自己分解までを経ることを示唆した。
【００４１】
高細胞密度での細胞接触は、細胞嚢の発生を減少させ、細胞嚢の分解を有意に増加させる。高細胞密度での細胞接触の阻害は、細胞嚢の発生を完全には抑制せず、かつ、細胞嚢の分解を完全には誘発しない。高細胞密度での細胞接触は、直径でみた細胞嚢の成長を減少させる。
【００４２】
経時的に、単一細胞は、その細胞嚢において双方向的に遊走し、細胞嚢膜を変形させ、伸長した細胞嚢を発生させることにより、様々な長さの膜性の管を形成する（図２）。その後、腔内細胞は、細胞嚢管から排出された。細胞嚢管の脱細胞(ecellularization)により、無細胞の細胞嚢管が発生した。次に、長い無細胞の細胞嚢管が自動的に縮み、膜が著しく折り畳まれ、収縮した、コイル状の、ねじれた、膜凝縮した糸状体を形成する。その後、長い、縮んだ無細胞の細胞嚢管の膜が分解し、次いで、管の自己分解が生じる。これらの細胞嚢管の逐次的な発達段階は、細胞嚢管の生活環は、その細胞嚢における単一細胞の遊走から、細胞嚢膜の変形、細胞嚢の伸長、細胞嚢管の形成、脱細胞(ecellularization)、および無細胞の細胞嚢管の自己分解へと連続的に進むことを実証した。
【００４３】
単一のＨＭＥＣにより発生された細胞嚢管は、長さが最大８２０μｍに達し得る。増加した細胞密度は、細胞嚢管の平均長さを減少させるが、平均幅を減少させない（およそ直径／幅で１１μｍ）。さらに、高細胞密度は、細胞嚢管の平均寿命の減少をもたらす。さらに、高細胞密度は、細胞嚢管の平均密度（長さおよび数において）を減少させる。一部の細胞嚢管は、圧縮された微小環境に耐えることができる。
【００４４】
次に、我々は、細胞嚢の発生に関するＨＭＬＥＲ（ＣＤ４４高／ＣＤ２４低）ＦＡ部分集団（Yi T, et al. (2014) Quantitative phosphoproteomic analysis reveals system-wide signaling pathways downstream of SDF-1/CXCR4 in breast cancer stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 111(21):E2182-2190）の乳癌幹細胞を評価した。１×１０２および１×１０３個／ウェルという低細胞密度では、およそ９９％のＢＣＳＣが、３Ｄマトリゲルにおいて１５時間で細胞嚢を発生させた。ＢＣＳＣの細胞嚢は、細胞接触の阻害に耐えるより高い能力を有する。ＢＣＳＣの細胞嚢管は、ＨＭＥＣの細胞嚢管よりも統計的に長く、単一のＢＣＳＣの細胞嚢管は、長さが最大１０００μｍに達し得る。
【００４５】
実施例ＩＩＩ
細胞嚢および細胞嚢管は形質膜外の細胞小器官である
本発明者らは、細胞嚢および細胞嚢管は、形質膜の伸長でも、接続された細胞表面でもないことを発見した。それらは、単一細胞により発生され、形質膜とは異なるそれら自身が発生させた膜に囲まれており、それらを発生させた細胞を封入している。細胞嚢および細胞嚢管は、多面的な生体機能に加え、細胞を包む細胞外の膜性の嚢（または管）、ならびに脱細胞(ecellularization)および細胞の侵入の許可を含む独特な特徴を有する。他方、細胞嚢管は、複数の細胞を定方向に輸送するための長い管状の道を提供するが、細胞嚢はそれらを提供しない。細胞嚢および細胞嚢管は、形質膜の伸長ではなく、細胞を包む細胞外の膜性の細胞小器官である。細胞嚢および細胞嚢管は、２Ｄ細胞培養においては存在しない。細胞嚢および細胞嚢管は、支持足場および封入された細胞のための被覆の提供、ならびに脱細胞(ecellularization)および細胞の侵入の許可を含む多面的な生体機能を有する。細胞は、細胞嚢、細胞嚢管、および細胞嚢管ネットワークにおいて遊走することができる。細胞嚢および細胞嚢管の自己分解は、細胞の生存、増殖および成長に影響を及ぼさない。脱細胞された(ecellularized)細胞嚢および細胞嚢管は、最大９８時間存在することができる。細胞嚢および細胞嚢管は、数十のなどの複数の細胞を収容することができる。細胞嚢管は相互接続し、複数の方向の定方向の細胞トランスロケーションのための開いた管状ネットワークを形成する。上記細胞嚢および細胞嚢管のこれらの特徴は、それらは、総てのこれまでに述べられた細胞小器官とは異なる２種の新規な通性細胞小器官であることを実証した。
【００４６】
実施例ＩＶ
細胞嚢管ネットワークの形成
６時間において、単一初代正常ＨＭＥＣは、示したマトリゲルマトリックスにおいて巨大な膜性の短い細胞嚢管を発生させた（図２）。１０時間において、ＨＭＥＣは、短い細胞嚢管において遊走し、伸長した細胞嚢管を発生させた（図２）。３６時間において、複数のＨＭＥＣの長い細胞嚢管は、相互接続し、結合節を介してネットワークを形成した（図２）。６８時間において、ＨＭＥＣは凝集し、細胞集団を形成し、総てのＨＭＥＣの細胞嚢管は分解し、残存した細胞嚢管はなかった（図２）。
【００４７】
４時間において、乳癌幹細胞（ＢＣＳＣ）は、示した３Ｄマトリゲルマトリックスにおいて、巨大な短い細胞嚢管をすでに発生させた（図３Ａ）。ＢＣＳＣは、上記細胞嚢管において双方向的に遊走し、細胞嚢膜を変形させ、管の形態を形づくり、長い湾曲した細胞嚢管を発生させた（図３Ｂ）。複数のＢＣＳＣの細胞嚢管が接続し、閉鎖した環を含む種々の形態を形成した。多くの癌細胞が、流動形および線形を含む様々な形態の細胞嚢管において遊走した（図３）。その後、ＢＣＳＣは凝集し、球状または不整な形状の腫瘍球を形成した。次に、我々は、経時的なＢＣＳＣの細胞嚢管の長さを定量化した。ＢＣＳＣの細胞嚢管は、長さが最大１０００μｍに達し得る。複数の細胞嚢管が接続し、より長い管を形成し得る。細胞嚢管の数は経時的に減少し、細胞嚢管の長さは動的および厳重に制御されることが示された（図４）。
【００４８】
前述のデータは、細胞嚢管は一般に、連続的であるが別個の相：細胞嚢のイニシエーション、細胞嚢における細胞遊走、細胞嚢の伸長および細胞嚢管の形成、複数の細胞嚢管(cytocapsular tune)の接続およびネットワーク形成、細胞嚢管ネットワークにおける細胞遊走、細胞の凝集および細胞集団／塊の形成、ならびに細胞嚢管の分解を経ることを実証した。
【００４９】
様々な長さの２つ以上のＨＭＥＣの細胞嚢管が、相互接続し、結合節を介して管状ネットワークを形成する。３８時間において、ＢＣＳＣは、ＨＭＥＣよりも多くの細胞嚢管結合節を発生させた。さらに、ＢＣＳＣの結合節あたりの細胞嚢管の平均数は、ＨＭＥＣのものよりも大きい。ＢＣＳＣの細胞嚢管の密度は、ＨＭＥＣのものよりも約３倍高い。これらのデータは、ＢＣＳＣは、相互接続した細胞嚢管ネットワークを発生させるより積極的な能力を有することを実証した。隔離したまたは接続された細胞を有するＢＣＳＣ細胞嚢管の寿命は、無細胞のＢＣＳＣ細胞嚢管よりかなり長く、このことは、腔内細胞は、分解に対する管の維持を促進することを示している。細胞を有する隔離したＢＣＳＣ細胞嚢管と比較して、細胞を有する接続されたＢＣＳＣ細胞嚢管は、長い期間統計的に無傷のままである。これらの結果は、細胞嚢管の維持は、腔内細胞により厳重に制御され、媒介されることを示唆した。重要なことに、ＢＣＳＣの細胞嚢管は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍において相互接続し、管状ネットワークを形成し、複数の細胞が、これらの管状ネットワークにおいて遊走する。これらのデータは、細胞嚢管ネットワークは、様々な方向の定方向の細胞移動運動のための膜性の管状の網を提供することを実証した。
【００５０】
実施例Ｖ
細胞輸送のための細胞嚢管の幹線道路
細胞は、管状細胞嚢管が細胞トランスロケーションのための幹線道路を提供する膜性の細胞嚢管ネットワークにおいて遊走する（図２〜３）。我々は、急速な細胞溶解および即時画像技術を用いて、細胞嚢管ネットワーク構造を調べた。ＢＣＳＣの細胞嚢管は、広範囲かつ積極的に相互接続し、交差、開環、閉環、および多くの他の不整な形態を有意に形成し、複数の方向の離れた目的地までの癌細胞の定方向の細胞再配置のための超巨大な管状ネットワークを提供する（図４）。単一細胞および複数の細胞の双方とも、３Ｄ環境におけるものよりも、細胞嚢管において速く遊走する。細胞嚢管は、定方向の３Ｄ細胞輸送のための幹線道路を形成する。
【００５１】
実施例ＶＩ
シンシチン１は細胞嚢管の合併および細胞の侵入を調節する
異なる細胞の細胞嚢は、合併して、巨大な細胞嚢を形成し得、細胞は、他の細胞の細胞嚢に侵入し得る（図５Ａ）。細胞は、他の細胞の細胞嚢に侵入し得、その結果、複数の細胞または細胞集団を内部に有する単一の巨大細胞嚢が生じる（図５Ｂ〜５Ｃ）。次に、我々は、細胞嚢管の融合、合併および細胞の侵入の根底にある分子機序を探索した。内在性の膜融合タンパク質シンシチン１が、ＨＭＥＣ、細胞嚢および細胞嚢管において発現した。ＨＭＥＣにおけるシンシチン１の一過性のノックダウンは、細胞嚢管の伸長、接続を有意に減少させたが、細胞嚢のイニシエーションを有意に減少させなかった（図５Ｄ〜５Ｆ）。さらに、シンシチン１のタンパク質レベルは、細胞嚢管の伸長中に増加した（図５Ｇ）。これらのデータは、シンシチン１は、細胞嚢管の合併および細胞の侵入を調節することを実証した。
【００５２】
実施例ＶＩＩ
インテグリンサブユニットβ−２（ＩＴＧＢ−２）は細胞嚢管の発生を促進する
インテグリンは、細胞の接着、付着、遊走および浸潤に必須の細胞表面支持分子である。我々は、細胞嚢管の発生中におけるＢＭ−ＭＳＣ、ＨＭＥＣおよびＢＣＳＣにおける２６個のインテグリン遺伝子転写物を調べた。ＩＴＧＢ−２は、細胞嚢管の伸長の過程で有意に増加する（図６Ａ）。さらに、遺伝子特異的ｓｈＲＮＡを用いたＩＴＧＢ−２の一過性のノックダウンは、細胞嚢管の伸長の有意な減少をもたらしたが、ＩＴＧＡ−８のノックダウンではみられなかった（図６Ｂ）。これらのデータは、ＩＴＧＢ−２は、細胞嚢管における細胞遊走を媒介し、かつ、細胞嚢管の伸長を調節することを実証した。
【００５３】
要約すると、本開示は、単一細胞は、２種の新規な細胞小器官、細胞外の膜性の細胞嚢および細胞嚢管を発生させること、ならびに、細胞嚢管は、３Ｄ細胞輸送のための管状の高速道路を提供すること、を提供する。多細胞生物における細胞の移動運動は、胚発生、組織形成、器官のホメオスタシス、免疫応答、創傷治癒、組織再生、および腫瘍転移にとって極めて重要である。
【００５４】
細胞嚢および細胞嚢管の発生および発達は、３Ｄ環境および細胞活動の双方に強く依存し、本研究では、３Ｄマトリックスの生化学的、生物物理学的および生体力学的特徴（重合、密度および粘弾性(viscoelasiticity)など）が正確に制御された様式にある場合にのみ、それらに焦点を当てている。細胞嚢および細胞嚢管の時間空間的な外観、自己分解(self-degradation)および自己分解(auto-decomposition)は総て、これらのこれまで未知の細胞小器官を認識および同定することの困難さに寄与している。
【００５５】
細胞嚢膜は、細胞の接着、付着、分離、形態転移および運動可塑性を支持する実質的な生体膜性の足場を提供する。他方、細胞嚢は、細胞を包み、それらを細胞嚢外の微小環境から物理的に遮蔽する。このことは、緊縮性の球状細胞が弛緩した不整な形態に相互変換するのを促進し、環境ストレスに対する保護被覆としての役割を果たし得る。細胞嚢管は、複数の細胞の定方向の遊走および双方向的な移動運動に対応する膜性の管を供給する。より重要なことに、細胞嚢管は、相互接続し、管状ネットワークを形成するが、このことは、細胞遊走の方向を有意に増加させ、細胞伝播領域を増幅し、定方向の３Ｄ細胞遊走の効率を増大させる。高細胞密度での細胞接触の阻害は、細胞嚢の発生を減少させ、細胞嚢の分解を増加させ、細胞嚢管の持続期間を減少させるが、それでも、細胞嚢を発生させ、複数の細胞の定方向の遊走のための長い嚢管を発生させる正常細胞（ＨＭＥＣ）はおよそ１．２‰、乳癌幹細胞は最大１．１％存在する。従って、総ての細胞が、圧縮され、不均一な３ＤのＥＣＭおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞に由来する不均一な障害物に不可避的に曝露し、経験する形態と比較して、小さな割合の細胞が、複数の細胞の定方向の輸送のための幹線道路としての役割を果たす均一な膜性の細胞嚢管を発生させる形態は、効率的な形態であり、少なくとも代替のパターンである。細胞嚢および細胞嚢管は、多面的な生体機能の可能性を示しており、他の機能を解明するようにさらに研究する必要がある。
【００５６】
細胞嚢の肥大は、腔内細胞の活性に依存し、無細胞の細胞嚢は、成長を終結させる。他方、無細胞の細胞嚢および細胞嚢管は、急速な自己分解(auto-degradation)および自己分解(self-decomposition)を受ける。真核細胞は、細胞内細胞小器官に加え、エキソソームなどの、微小環境に放出されるまたは流される細胞外細胞小器官を含有する(Keller S, Sanderson MP, Stoeck A, & Altevogt P (2006) Exosomes: from biogenesis and secretion to biological function. Immunology letters 107(2):102-108)。興味深いことに、細胞嚢管の内腔には、多数の種々の単層の膜に封入された小胞が存在する。従って、これらの膜性の小胞は、細胞起源の細胞嚢成分を送達／往復輸送する担体またはカーゴと、その放出が細胞嚢および細胞嚢管の厳重に制御された自己分解をもたらすライセートを含む容器とに機能的に連結し得る。
【００５７】
脱細胞(ecellularization)の後、無細胞の細胞嚢管が縮み、収縮して、収縮した、短縮された、ねじれたおよび折り畳まれた糸状体となるという現象は、細胞嚢管内に腔内骨格がないことと一致する。細胞嚢管の内腔にマイクロフィラメントネットワークがないことは、単一および複数の細胞が細胞嚢管において積極的に遊走することと一致する。他方、細胞嚢管膜の下にマイクロフィラメントの足場が存在することは、長い細胞嚢管が細胞によって引っ張られ、切断、中断または妨害なくＥＣＭ表面を横断し得るという事実と一致する。
【００５８】
その細胞嚢における細胞遊走は、細胞嚢膜の変形および伸長、ならびに細胞嚢管の形成および伸長を誘発する。細胞嚢および細胞嚢管における膜およびその他の成分の構築は、多くの様々なタンパク質を必要とすることから、細胞嚢および細胞嚢管の発達には、ｍＲＮＡの翻訳および／またはタンパク質の生合成が必須であることが示唆された。
【００５９】
要約すると、本研究において明らかにされた細胞嚢および細胞嚢管という２種の新規な細胞小器官は、細胞の輸送、再配置および遊走のための管状経路およびネットワークの供給を含む多面的な生体機能を示し、このことは、腫瘍転移を含む疾患の発症および病因における細胞の保護およびトランスロケーションが関与する過程の理解についての洞察を提供し得る。
【００６０】
実施例ＶＩＩＩ
材料と方法
細胞および試薬。初代正常ヒト乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）を、ＡＴＣＣ（ＰＣＳ−６００−０１０（商標））から注文した。ＨＭＬＥＲ（ＣＤ４４高／ＣＤ２４低）ＦＡ部分集団細胞のＢＣＳＣを、以前の記載のとおりに調製した（27）。ＦＩＴＣ抱合抗ＣＤ４４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｇ４４−２６）抗体およびフィコエリトリン抱合抗ＣＤ２４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＭＬ１５）抗体を、フローサイトメトリーを用いたセルソーティングに使用した。ＭＥＧＭ（商標）乳腺上皮細胞成長培地ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（商標）（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（商標）ＭＥＧＭ（商標）乳腺上皮細胞成長培地およびＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ（商標）キットパッケージ）を、Ｌｏｎｚａ（ＣＣ−３１５０）から注文した。マトリゲル（商標）基底膜マトリックス（ＣＢ−４０２３４）を、Ｃｏｒｎｉｎｇから購入した。ＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｄｕｃｅｄ（ＧＦＲ、カタログ番号３５６２３０）をＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから注文した。
【００６１】
タイムラプスＤＩＣ顕微鏡法、一過性トランスフェクション、定量的リアルタイムＰＣＲ、および一過性遺伝子ノックダウン。ニコンＴｉ電動倒立顕微鏡および２０倍レンズを備えたデジタル浜松ＯＲＣＡ−ＥＲ冷却ＣＣＤカメラを用いて、細胞嚢の伸長および細胞遊走のタイムラプスＤＩＣ（微分干渉（differentiation interference contrast)）顕微鏡分析を行った。マトリゲルマトリックス（深さ４０μｍ超）中の細胞嚢を有するＨＭＥＣ培養液を、ＴＥＭにより分析した。ＥＧＦＰ−ｈＰＭＣＡ２ｚ／ｂ（Ａｄｄｇｅｎｅ、＃４７５８４）および／またはｍＣｈｅｒｒｙ−β−アクチン（＃５４９６７）のプラスミドを、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｔｉｎｅ（登録商標）２０００を用いて、ＨＭＥＣにコトランスフェクトした。遺伝子特異的プライマー（ＩＤＴ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、ｉＱ  ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、および７９００ＨＴ高速リアルタイムＰＣＲを用いて、定量的リアルタイムＰＣＲアッセイを行った。
【００６２】
試薬および抗体。ＥＧＦＰ−ｈＰＭＣＡ２ｚ／ｂ（＃４７５８４）およびｍＣｈｅｒｒｙ−β−アクチン（＃５４９６７）プラスミドを、Ａｄｄｇｅｎｅから注文した。抗ＧＡＰＤＨ（カタログ番号２１１８Ｓ、ウェスタンブロットアッセイにおいて１：１０００希釈）抗体を、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから注文した。ＤＡＰＩ（４，６−ジアミジノ(diamidine)−２−フェニルインドール二塩酸塩、免疫蛍光アッセイにおいて１：１０００希釈）を、ＫＰＬから注文した。抗γ−アクチン（γアクチン、モノクローナル、ａｂ１２３０３４、免疫蛍光アッセイにおいて１：１０００希釈）、抗ｐａｎ−カドヘリン（ポリクローナル、ａｂ１４０３３８、免疫蛍光アッセイにおいて１：１０００希釈）抗体を、Ａｂｃａｍから注文した。
【００６３】
一過性トランスフェクション。ＨＭＥＣを、５％ＣＯ２の加湿雰囲気で、３７℃にてＭＥＧＭを用いて培養した。ＥＧＦＰ−ｈＰＭＣＡ２ｚ／（Ａｄｄｇｅｎｅ、＃４７５８４）および／またはｍＣｈｅｒｒｙ−β−アクチン（＃５４９６７）のプラスミドを、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｔｉｎｅ（登録商標）２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃１１６６８０２７）を用いて、マニュアルに従ってＨＭＥＣにコトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、細胞をアッセイに用いた。
【００６４】
細胞嚢および細胞嚢管の発生。ＨＭＥＣ（トランスフェクションあり／なし）、ＢＭ−ＭＳＣ、およびＨＭＬＥＲ（ＣＤ４４高／ＣＤ２４低）ＦＡ部分集団のＢＣＳＣを、ＭＥＧＭ培地において、示した細胞密度（すなわち、６ウェルプレート中で５×１０２個／ウェル、または示されていない場合は、１０ｃｍディッシュ中で１．２×１０４個）で、マトリゲルマトリックス層に蒔いた。事前に冷却した６ウェルプレート（低温マイクロカバーガラスあり／なし）に、低温の解凍したマトリゲルマトリックス（４℃の低温室にて氷中で一晩解凍した。タンパク質濃度４〜１２ｍｇ／ｍｌ）を迅速に加えることにより、３Ｄマトリゲル層（深さ４０μｍ超）を調製し、次いで、低温ＭＥＧＭ（４℃）を加え、室温（２５℃）にてフード中で５〜２５分インキュベートした。次に、細胞を３Ｄマトリゲルゲル表面に埋め込み、加湿インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中で培養した。様々な層におけるマトリゲルゲル中（またはその中に侵入した）細胞は、細胞嚢および細胞嚢管を発生させる。様々な段階の発生した細胞嚢および細胞嚢管を、本研究に使用した。
【００６５】
タイムラプスＤＩＣ顕微鏡法および映像。ニコンＴｉ電動倒立顕微鏡および２０倍レンズを備えたデジタル浜松ＯＲＣＡ−ＥＲ冷却ＣＣＤカメラを用いて、細胞嚢の伸長および細胞遊走のタイムラプスＤＩＣ（微分干渉（differentiation interference contrast)）顕微鏡分析を行った。タイムラプス顕微鏡は、ＤＩＣ、位相差、ならびに落射蛍光光学、Ｐｒｉｏｒ  Ｐｒｏｓｃａｎ  ＩＩＩ電動ステージおよびシャッター、完全焦点システム、ならびにＯｋｏＬａｂ  ３７℃、５％ＣＯ２ケージ顕微鏡インキュベーター（ＯＫＯ  Ｌａｂ）を備えていた。画像は、１０〜３６時間にわたり３０秒毎に取得した。総ての画像は、ＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウエアを用いて取得した。細胞嚢の伸長の２時間までのトラックは、ＭｅｔａＭｏｒｐｈおよびＩｍａｇｅＪソフトウエアを用いて取得した。細胞嚢の伸長速度も、長さおよび時間の測定値を用いて算出した。映像は、タイムラプスおよびＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウエアを介して取得した画像を用いて作成した（１５フレーム／秒、ｆｐｓ）。
【００６６】
画像取得。固定した細胞（細胞嚢あり／なし）の微分干渉（ＤＩＣ）像および蛍光像を、８０ｉ正立顕微鏡および２０倍または４０倍レンズを備えたデジタル浜松ＯＲＣＡ−ＥＲ冷却ＣＣＤカメラを用いて取得した。明視野位相差像は、ニコンデジタルカメラを用いて取得した。細胞嚢のイニシエーション比／高性能視野（ＨＰＦ、２００倍）および伸長した細胞嚢数／ＨＰＦを定量化した。総ての画像は、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ画像取得ソフトウエアを用いて取得し、ＩｍａｇｅＪソフトウエアを用いて解析した。
【００６７】
全ＲＮＡの抽出および定量的リアルタイムＰＣＲ。ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、示した時間において、検出可能な細胞嚢を有するおよび有さないＨＭＥＣおよびＢＣＳＣ（１．２×１０４個／１０ｃｍディッシュ）から、全ＲＮＡを抽出した。用いたサンプルは、マトリゲルマトリックス層（約１０μｍ厚）に蒔いたものであった。記載のマニュアルどおりに、全ＲＮＡを抽出した。遺伝子特異的プライマー（ＩＤＴ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、ｉＱ  ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、および７９００ＨＴ高速リアルタイムＰＣＲを用いて、製造業者の指示に従って定量的リアルタイムＰＣＲアッセイを行った。ＧＡＰＤＨを対照として使用し、３回の独立した実験を行った。データ分析およびヒートマップ図は、以前の記載のとおりに計算および作成した。
【００６８】
ウェスタンブロット。放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）緩衝剤（２５ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．６、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ）およびプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、示した時間において、双方とも細胞嚢を有するおよび有さないＨＭＥＣおよびＢＣＳＣ（１．２×１０４個／１０ｃｍディッシュ）から、総タンパク質を抽出した。用いたサンプルは、マトリゲルマトリックス層に埋め込んだものであった。総タンパク質は、１０％または１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド(polyacrylamide)ゲルで電気泳動し(eletrophoresed)、ポリフッ化ビニリデンイモビロン（商標）−Ｐメンブレンに転写した。ポリフッ化ビニリデンメンブレンを、一次抗体（抗ＧＡＰＤＨ（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２１１８、１：１０００）で４℃にて４時間プローブし、次いで、０．１％ツイーン／ＴＢＳで洗浄した。メンブレンを、適当なペルオキシダーゼ抱合二次抗体で２５℃にてまたは１時間インキュベートし、シグナル検出の前に３回洗浄した。展開には、ＥＣＬ（商標）ウェスタンブロット検出試薬を用いた。
【００６９】
定量化および統計解析
総ての図において：有意差なし、ｎｓ、Ｐ＞０．０５；＊  Ｐ＜０．０５；＊＊  Ｐ＜０．０１；＊＊＊  Ｐ＜０．００１。
【００７０】
他の実施形態は、当業者には明らかであろう。前述の記載は、明瞭さのみのために提供されるものであり、単に例示的なものであることが理解されるべきである。本発明の趣旨および範囲は、上記の実施例に限定されるものではないが、以下の請求項に包含される。上記に引用した総ての出版物および特許出願は、各個別の出版物または特許出願が、そのように引用することにより本明細書の一部とされると具体的に示されるのと同じ程度まで、総ての目的のために、その全体が引用することにより本明細書の一部とされる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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