(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノポアベースの配列決定チップのセル内の脂質膜の状態を検出する方法であって、
脂質膜を積分コンデンサに連結させるステップであって、ここで、前記脂質膜は作用電極と対電極との間にあるものである、前記ステップ；
交流（ＡＣ）電圧を、前記対電極に印加するステップ；
前記積分コンデンサの両端間の電圧を、アナログデジタル変換器（ＡＤＣ）によって、定期的にサンプリングするステップ；
前記ＡＣ電圧の中間変化を、前記ＡＣ電圧の２つの振幅の間に挿入するステップ；
前記ＡＣ電圧の前記中間変化に応答して、前記積分コンデンサの両端間の前記サンプリングされた電圧の変化を判定するステップ；および、
前記ＡＣ電圧の前記中間変化に応答して、前記積分コンデンサの両端間の前記サンプリングされた電圧の前記判定された変化に基づいて、前記脂質膜の状態を検出するステップ；
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記ＡＣ電圧が第１の段階から第２の段階に切り替わるとき、または前記ＡＣ電圧が前記第２の段階から前記第１の段階に切り替わるとき、前記ＡＣ電圧の前記中間変化に応答して、前記積分コンデンサの両端間の前記サンプリングされた電圧の前記変化を判定するステップをさらに含み、ここで、前記ＡＣ電圧の第１段階振幅が、前記ＡＣ電圧の第２段階振幅よりも大きいものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＡＣ電圧が第１の段階から第２の段階に切り替わるとき、または前記ＡＣ電圧が前記第２の段階から前記第１の段階に切り替わるとき、前記ＡＣ電圧の前記中間変化に応答して、前記積分コンデンサの両端間の前記サンプリングされた電圧の前記変化を判定するステップをさらに含み、ここで、前記第１の段階は正の方形波を含み、前記第２の段階は負の方形波を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＡＣ電圧が中間監視振幅にあるとき、前記ＡＣ電圧の前記中間変化に応答して、前記積分コンデンサの両端間の前記サンプリングされた電圧の前記変化を判定するステップをさらに含み、ここで、前記中間監視振幅は前記第１段階振幅より小さいが、前記第２段階振幅より大きいものである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記中間監視振幅を、前記ＡＤＣのＡＤＣ参照ウィンドウに少なくとも部分的に基づいて選択するステップをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記積分コンデンサの両端間の前記サンプリングされた電圧の前記変化を、１つまたは複数の所定の閾値と比較するステップ；および、
前記１つまたは複数の所定の閾値との前記比較に基づいた前記脂質膜の前記状態を検出するステップであって、ここで、前記脂質膜の状態は、２つより多い脂質分子層を有する脂質膜、脂質二重層、および破裂した脂質二重層からなる群から選択される、前記ステップ；
をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記セルが、ナノポアベースの配列決定チップ内の複数のセルのうちの１つであり、
前記方法が、
前記積分コンデンサを、定電圧予備充電電源に包括的予備充電信号を用いて接続することによって予備充電するステップであって、ここで、前記包括的予備充電信号が前記複数のセル内の前記積分コンデンサの予備充電のタイミングを制御するために使用される、前記ステップ；
前記積分コンデンサが、前記定電圧予備充電電源の値に充電されたあと、前記予備充電電源を、前記包括的予備充電信号を用いて前記積分コンデンサから切断するステップであって、ここで、前記包括的予備充電信号が前記予備充電電源を前記複数のセル内の積分コンデンサから切断するタイミングを制御するために使用される、前記ステップ；
前記脂質二重層に関連付けられたキャパシタンスを通して、前記積分コンデンサが充電または放電する、所定の期間待機するステップ；および、
前記積分コンデンサの両端間の前記電圧を、前記所定の待機期間のあと、サンプリングするステップ；
をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記脂質二重層が破裂させられたことの検出に応答して前記セル内のスイッチを開路することによって、さらに電気的刺激が前記脂質二重層を横断して印加されないようにするステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ナノポアベースの配列決定チップのセル内の脂質膜の状態を検出するためのシステムまたは器具であって、
積分コンデンサ；
前記積分コンデンサに連結した作用電極；
対電極であって、前記作用電極と前記対電極との間に堆積された脂質膜が、前記積分コンデンサと連結したた、前記対電極；
交流（ＡＣ）電圧を前記対電極に印加するＡＣ電源；
前記積分コンデンサの両端間の電圧を定期的にサンプリングする、アナログデジタル変換器（ＡＤＣ）；
プロセッサまたは回路であって、
前記ＡＣ電圧の中間変化を、前記ＡＣ電圧の２つの振幅の間に挿入し、
前記ＡＣ電圧の前記中間変化に応答して、前記積分コンデンサの両端間の前記サンプリングされた電圧の変化を判定し、
前記ＡＣ電圧の前記中間変化に応答して、前記積分コンデンサの両端間の前記サンプリングされた電圧の前記判定された変化に基づいて、前記脂質膜の状態を検出するように構成された、
前記プロセッサまたは回路；
を備える、前記システムまたは器具。
【請求項１０】
前記プロセッサまたは前記回路が、
前記ＡＣ電圧が第１の段階から第２の段階に切り替わるとき、または前記ＡＣ電圧が前記第２の段階から前記第１の段階に切り替わるとき、前記ＡＣ電圧の前記中間変化に応答して、前記積分コンデンサの両端間の前記サンプリングされた電圧の前記変化を判定するようにさらに構成され、ここで、前記ＡＣ電圧の第１段階振幅が、前記ＡＣ電圧の第２段階振幅よりも大きいものである、請求項９に記載のシステムまたは器具。
【請求項１１】
前記プロセッサまたは前記回路が、
前記ＡＣ電圧が第１の段階から第２の段階に切り替わるとき、または前記ＡＣ電圧が前記第２の段階から前記第１の段階に切り替わるとき、前記ＡＣ電圧の前記中間変化に応答して、前記積分コンデンサの両端間の前記サンプリングされた電圧の前記変化を判定するようにさらに構成され、ここで、前記第１の段階は正の方形波を含み、前記第２の段階は負の方形波を含む、請求項１０に記載のシステムまたは器具。
【請求項１２】
前記プロセッサまたは前記回路が、
前記ＡＣ電圧が中間監視振幅にあるとき、前記ＡＣ電圧の前記中間変化に応答して、前記積分コンデンサの両端間の前記サンプリングされた電圧の前記変化を判定するようにさらに構成され、ここで、前記中間監視振幅は、前記第１段階振幅より小さいが、前記第２段階振幅より大きいものである、請求項１０に記載のシステムまたは器具。
【請求項１３】
前記プロセッサまたは前記回路が、
前記中間監視振幅を、前記ＡＤＣのＡＤＣ参照ウィンドウに少なくとも部分的に基づいて選択するようにさらに構成された、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
前記プロセッサまたは前記回路が、
前記積分コンデンサの両端間の前記サンプリングされた電圧の前記変化を、１つまたは複数の所定の閾値と比較し、前記１つまたは複数の所定の閾値との前記比較に基づいた前記脂質膜の前記状態を検出するようにさらに構成され、ここで、前記脂質膜の状態は、２以上の脂質分子層を有する脂質膜、脂質二重層、および破裂した脂質二重層とからなる群から選択されるものである、請求項１２に記載のシステムまたは器具。
【請求項１５】
前記セルが、ナノポアベースの配列決定チップ内の複数のセルのうちの１つであり、
定電圧予備充電電源をさらに備え、
前記プロセッサまたは前記回路が、
前記積分コンデンサを、前記定電圧予備充電電源に、包括的予備充電信号を用いて接続することによって予備充電し、前記包括的予備充電信号が、前記複数のセル内の前記積分コンデンサの予備充電のタイミングを制御するために使用され、
前記積分コンデンサが、前記定電圧予備充電電源の値に充電されたあと、前記予備充電電源を、前記包括的予備充電信号を用いて前記積分コンデンサから切断し、前記包括的予備充電信号が、前記予備充電電源を前記複数のセル内の積分コンデンサから切断するタイミングを制御するために使用され、
前記脂質二重層に関連付けられたキャパシタンスを通して、前記積分コンデンサが充電または放電する所定の期間待機し、
前記ＡＤＣに、前記積分コンデンサの両端間の前記電圧を、前記所定の待機期間のあと、サンプリングさせるようにさらに構成された、
請求項１２に記載のシステムまたは器具。
【請求項１６】
前記プロセッサまたは回路によって制御されるセル内のスイッチをさらに備え、
前記プロセッサまたは前記回路が、
前記脂質二重層が破裂させられたことの検出に応答して、前記セル内の前記スイッチを開路することによって、さらに電気的刺激が前記脂質二重層を横断して印加されないようにさらに構成された、請求項１２に記載のシステムまたは器具。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
近年の半導体産業における超小型化の進歩によって、生物工学者は、従来の大きな検出ツールをますます小さいフォームファクタに、いわゆるバイオチップ上にパッケージングすることを始められるようになった。バイオチップは、ナノポアベースの配列決定のために用いられ得る。
【０００２】
ナノポアを脂質二重層内に挿入するステップは、脂質二重層がナノポアベースの配列決定チップのセル内に適切に形成されたことが判定されたあとに実行される。いくつかの技術では、脂質二重層がセル内で適切に形成されたか否かを判定するプロセスは、適切に形成済みの脂質二重層を破壊させ得る。すなわち、脂質二重層をテストする刺激電圧は、脂質二重層に対して破壊的であり得る。適切に形成済みの脂質二重層が刺激電圧によって破壊された場合では、非常に高い電流が短絡状態の結果として電極を横断して流れ始める。それに応じて、システムは再び特定のセル内に新たな脂質二重層を再形成することを試行するが、このことは時間を要し効率的でもない。加えて、脂質二重層は、連続する試行での特定のセル内で再形成しない可能性がある。結果として、適切に形成された脂質二重層およびナノポアを有するナノポアベースの配列決定チップ内のセル全体の割合（すなわち、ナノポアベースの配列決定チップの収量）は低減される。バイオチップをより頑丈に、効率的にかつ費用効果的にするナノポアベースの配列決定バイオチップの技術を開発することが望ましいであろう。
【０００３】
本発明の各種実施形態は、以下の詳細な説明および添付の図面において開示される。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】ナノポアベースの配列決定チップ内のセル１００の一実施形態を示す図である。
【図２】ナノ−ＳＢＳ技術を用いてヌクレオチド配列決定を実行するセル２００の一実施形態を示す図である。
【図３】予め装填されたタグを用いたヌクレオチド配列決定を実行しようとしているセルの一実施形態を示す図である。
【図４】予め装填されたタグを用いた核酸配列決定のためのプロセス４００の一実施形態を示す図である。
【図５】ナノポアベースの配列決定チップ内のセル５００の一実施形態を示す図である。
【図６Ａ】ナノポアベースの配列決定チップのセル内の回路６００の一実施形態を示す図であり、回路は、形成済みの脂質二重層が破壊しないように、脂質二重層がセル内に構成されるか否かを検出するように構成され得る。
【図６Ｂ】図６Ａに示した図と同様の、ナノポアベースの配列決定チップのセル内の回路６００を示す図である。図６Ａと比較すると、作用電極と対電極との間に、脂質膜／二重層を示す代わりに、作用電極および脂質膜／二重層の電気特性を表す電気モデルを示す。
【図７】システムの脂質二重層測定段階中の回路６００の一部の電気特性を表す電気モデル７００を示す図である。
【図８Ａ】正／負の電圧変化±ΔＶｌｉｑに応答した小さな観測された正／負の電圧変化±ΔＶＡＤＣが、脂質二重層がセル内で形成されなかったことを検出することを示す図である。
【図８Ｂ】正／負の電圧変化±ΔＶｌｉｑに応答した大きな観測された正／負の電圧変化±ΔＶＡＤＣが、脂質二重層がセル内で形成されたことを検出することを示す図である。
【図９Ａ】脂質二重層がセル内部で形成される前後の、時間に対するＶＡＤＣの例示的なプロットを示す図である。
【図９Ｂ】脂質二重層が形成されなかったときの期間ｔ１の間の、時間に対するＶＡＤＣの例示的なプロット（図９Ａ参照のこと）の拡大図である。
【図９Ｃ】脂質二重層が形成されたときの期間ｔ２の間の、時間に対するＶＡＤＣの例示的なプロット（図９Ａ参照のこと）の拡大図である。
【図１０】システムの配列決定段階中の回路６００の一部の電気特性を表す電気モデル１０００を示す図である。
【図１１Ａ】正／負の電圧変化±ΔＶｌｉｑに応答した大きな観測された正／負の電圧変化±ΔＶＡＤＣが、脂質二重層がセル内でまだ損なわれていないことを示すことを示す図である。図１１Ａは、図８Ｂと同一である。
【図１１Ｂ】正／負の電圧変化±ΔＶｌｉｑに応答した観測された正／負の電圧変化±ΔＶＡＤＣのさらなる増大が、脂質二重層がセル内でまさに破裂させられたことを示すことを示す図である。
【図１２】システムの（配列決定段階を含む）異なる段階中のナノポアベースの配列決定チップのセル内の脂質膜の状態を検出するための改善されたＶｌｉｑの波形１２００の例示的なプロットを示す図である。
【図１３】配列決定段階の間に短絡状態にあるセルを検出するために、回路６００は、Ｖｌｉｑが明の振幅から監視信号の振幅に切り替わるときの、脂質膜／二重層と接触するバルク液体に印加されるデルタ電圧変化（ΔＶｌｉｑ）に応答した積分コンデンサ６０８（ｎｃａｐ）におけるデルタ電圧変化ΔＶＡＤＣを監視し得ることを示す図である。
【図１４】セルバンクの任意の所定の行内のセルが同一の積分時間間隔を共有するが、隣接する行の積分時間間隔が、互いに時間差を設けられ、破裂させられた脂質二重層の検出の全体的な性能を劣化させる行依存効果をもたらすことを示す図である。
【図１５】Ｖｌｉｑが中間監視信号に切り替わろうとしているとき、包括的予備充電信号１５０２が、セルバンクの異なる行内のセルの積分を同期させるために使用されることを示す図である。
【図１６】Ｖｌｉｑが中間監視信号に切り替わろうとしているとき、修正された包括的予備充電信号１６０２が、セルバンクの異なる行内のセルの積分を同期させるために使用されることを示す図である。
【図１７Ａ】破裂させられた脂質二重層の検出技術の行依存効果を示す図である。
【図１７Ｂ】図１６で包括的予備充電信号を使用することによって、行依存効果が、著しく低減されることを示す図である。
【図１８Ａ】破裂させられた脂質二重層が検出されたときの、セルバンクの異なる行に属するセル内の監視信号に応答する、観察された電圧変化ΔＶＡＤＣのプロットを示す図である。
【図１８Ｂ】破裂させられた脂質二重層が検出されたときの、応答信号の分布を示すヒストグラムを示す図である。
【図１８Ｃ】破裂させられた脂質二重層が検出されなかったときの、セルバンクの異なる行に属するセル内の監視信号に応答する、観察された電圧変化ΔＶＡＤＣのプロットを示す図である。
【図１８Ｄ】破裂させられた脂質二重層が検出されなかったときの、応答信号の分布を示すヒストグラムを示す図である。
【図１９】ナノポアベースの配列決定チップのセル内の脂質層を形成する改善された技術のプロセス１９００の一実施形態を示す図である。
【図２０】液体およびガスが、チップ表面上のセンサの上を通過し接触することを可能にする、シリコンチップを取り囲む改善された流動室を有する、ナノポアベースの配列決定システム２０００の上面図である。
【図２１Ａ】異なるΔＶＡＤＣ値を有するセルの初期分布である。
【図２１Ｂ】プロセス１０００の脂質薄膜化刺激段階および塩類緩衝溶液流動段階が何回か繰り返されたあとの、異なるΔＶＡＤＣ値を有するセルの初期分布を示す図である。
【図２１Ｃ】プロセス１０００の脂質薄膜化刺激段階および塩類緩衝溶液流動段階がさらに何回か繰り返されたあとの、異なるΔＶＡＤＣ値を有するセルの初期分布を示す図である。
【図２２】二重層測定段階、電気的な脂質薄膜化刺激段階、および塩類緩衝溶液流動段階のタイミング図の一実施形態を示す図である。
【発明の概要】
【０００５】
ある態様では、本発明は、ナノポアベースの配列決定チップのセル内の脂質膜の状態の検出方法を提供する。ある実施形態では、本方法は、脂質膜を積分コンデンサで連結するステップを含む。追加の実施形態では、脂質膜は、作用電極と対電極との間に配置される。別の実施形態では、本方法は、交流（ＡＣ）電圧を対電極に印加するステップをさらに含む。ある他の実施形態では、積分コンデンサの両端間の電圧を、アナログデジタル変換器（ＡＤＣ）により定期的にサンプリングするステップをさらに含む。さらなる実施形態では、本方法は、ＡＣ電圧の中間変化をＡＣ電圧の２つの振幅間に挿入するステップをさらに含む。別の実施形態では、本方法は、積分コンデンサの両端間のサンプリングされた電圧の変化を判定するステップをさらに含む。ある追加の実施形態では、判定された変化はＡＣ電圧の中間変化に応答する。ある実施形態では、本方法は、脂質膜の状態を積分コンデンサの両端間のサンプリングされた電圧の判定された変化に基づいて検出するステップをさらに含む。ある追加の実施形態では、判定された変化はＡＣ電圧の中間変化に応答する。
【０００６】
ある他の実施形態では、本方法は、脂質二重層が破裂させられたことの検出に応答して、セル内のスイッチを開路することによって、さらに電気的刺激が脂質二重層を横断して印加されないようにするステップをさらに含む。
【０００７】
ある他の実施形態では、本方法は、ＡＣ電圧の中間変化に応答して、積分コンデンサの両端間のサンプリングされた電圧の変化を判定するステップをさらに含む。ある実施形態では、判定するステップは、（ｉ）ＡＣ電圧が第１の段階から第２の段階に切り替わるとき、または（ｉｉ）ＡＣ電圧が第２の段階から第１の段階に切り替わるとき実行される。あるさらなる実施形態では、ＡＣ電圧の第１の段階は第１段階振幅を有し、ＡＣ電圧の第２の段階は第２段階振幅を有する。ある追加の実施形態では、ＡＣ電圧の第１段階振幅は、ＡＣ電圧の第２段階振幅よりも大きい。別の実施形態では、第１の段階は正の方形波を含み、第２の段階は負の方形波を含む。ある他の実施形態では、ＡＣ電圧は、中間監視振幅に存在し、中間監視振幅は、第１段階振幅より小さいが、第２段階振幅より大きい。ある追加の実施形態では、本方法は、中間監視振幅を、ＡＤＣのＡＤＣ参照ウィンドウに少なくとも部分的に基づいて選択するステップをさらに含む。
【０００８】
ある実施形態では、本方法は、積分コンデンサの両端間のサンプリングされた電圧の変化を、１つまたは複数の所定の閾値と比較するステップをさらに含む。別の実施形態では、本方法は、１つまたは複数の所定の閾値との比較に基づいた脂質膜の状態を検出するステップをさらに含む。ある他の実施形態では、脂質膜の状態は、２つより多い脂質分子層を有する脂質膜と、脂質二重層と、破裂させられた脂質二重層とからなる群から選択される。さらなる実施形態では、本方法は、積分コンデンサの両端間のサンプリングされた電圧が、脂質二重層が破裂した事象ではＡＤＣのＡＤＣ参照ウィンドウ内に存在するように、中間監視振幅を選択するステップをさらに含む。
【０００９】
ある他の態様では、本発明は、ＡＣ電圧の中間変化に応答して、積分コンデンサの両端間のサンプリングされた電圧の変化を判定するステップを含みセルは、ナノポアベースの配列決定チップ内の複数のセルのうちの１つである方法を提供する。ある実施形態では、判定するステップは、（ｉ）ＡＣ電圧が第１の段階から第２の段階に切り替わるとき、または（ｉｉ）ＡＣ電圧が第２の段階から第１の段階に切り替わるとき実行される。あるさらなる実施形態では、ＡＣ電圧の第１の段階は第１段階振幅を有し、ＡＣ電圧の第２の段階は第２段階振幅を有する。ある追加の実施形態では、ＡＣ電圧の第１段階振幅は、ＡＣ電圧の第２段階振幅よりも大きい。ある他の実施形態では、本方法は、積分コンデンサを、定電圧予備充電電源に、包括的予備充電信号を用いて接続することによって、予備充電するステップをさらに含む。別の実施形態では、包括的予備充電信号は、複数のセル内の積分コンデンサの予備充電のタイミングを制御するために使用される。ある追加の実施形態では、本方法は、積分コンデンサが定電圧予備充電電源の値に充電されたあと、予備充電電源を、包括的予備充電信号を用いて積分コンデンサから切断するステップをさらに含む。ある他の実施形態では、包括的予備充電信号は、予備充電電源を、複数のセル内の積分コンデンサから切断するタイミングを制御するために使用される。さらなる実施形態では、本方法は、脂質二重層に関連付けられたキャパシタンスを通して、積分コンデンサが充電または放電する所定の期間待機するステップをさらに含む。ある他の実施形態では、本方法は、所定の待機期間のあと、積分コンデンサの両端間の電圧を、サンプリングするステップをさらに含む。ある実施形態では、予備充電電源を複数のセル内の積分コンデンサから切断するタイミングは、ＡＣ電圧が中間監視振幅に切り替えられるタイミングと、実質的に同一になるように構成される。別の実施形態では、複数のセル内の積分コンデンサの予備充電するタイミングは、複数のセルからの配列決定データのフレームが読み出されたあとになるように構成される。追加の実施形態では、フレームは、ＡＣ電圧が中間監視振幅に切り替えられるときのフレームに先行する１フレームである。
【００１０】
ある追加の態様では、本発明は、ナノポアベースの配列決定チップのセル内の脂質膜の状態を検出するための、システムおよび器具を提供する。ある実施形態では、システムは、積分コンデンサと、積分コンデンサに連結された作用電極と、対電極と、ここで作用電極と対電極との間に堆積された脂質膜は積分コンデンサに連結され、交流（ＡＣ）電圧を対電極に印加するＡＣ電源と、積分コンデンサの両端間の電圧を定期的にサンプリングするアナログデジタル変換器（ＡＤＣ）と、プロセッサまたは回路とを、備える。別の実施形態では、プロセッサまたは回路は、ＡＣ電圧の中間変化を、ＡＣ電圧の２つの振幅間に挿入するように構成される。ある他の実施形態では、プロセッサまたは回路は、ＡＣ電圧の中間変化に応答して、積分コンデンサの両端間のサンプリングされた電圧の変化を判定するようにさらに構成される。追加の実施形態では、プロセッサまたは回路は、ＡＣ電圧の中間変化に応答して、積分コンデンサの両端間のサンプリングされた電圧の判定された変化に基づいて、脂質膜の状態を検出するようにさらに構成される。別の実施形態では、プロセッサまたは回路は、ＡＣ電圧が第１の段階から第２の段階に切り替わるとき、またはＡＣ電圧が第２の段階から第１の段階に切り替わるとき、ＡＣ電圧の中間変化に応答して、積分コンデンサの両端間のサンプリングされた電圧の変化を、判定するようにさらに構成される。あるさらなる実施形態では、ＡＣ電圧の第１の段階は第１段階振幅を有し、ＡＣ電圧の第２の段階は第２段階振幅を有する。ある追加の実施形態では、ＡＣ電圧の第１段階振幅は、ＡＣ電圧の第２段階振幅よりも大きい。別の実施形態では、第１の段階は、正の方形波を含み、第２の段階は、負の方形波を含む。追加の実施形態では、プロセッサまたは回路は、ＡＣ電圧が中間監視振幅に存在するとき、ＡＣ電圧の中間変化に応答して、積分コンデンサの両端間のサンプリングされた電圧の変化を判定するようにさらに構成される。ある他の実施形態では、中間監視振幅は、第１段階振幅より小さいが、第２段階振幅より大きい。別の実施形態では、プロセッサまたは回路は、積分コンデンサの両端間のサンプリングされた電圧が、脂質二重層が破裂した事象ではＡＤＣのＡＤＣ参照ウィンドウ内に存在するように、中間監視振幅を選択するようにさらに構成される。追加の実施形態では、プロセッサまたは回路は、積分コンデンサの両端間のサンプリングされた電圧の変化を、１つまたは複数の所定の閾値と比較するようにさらに構成される。ある実施形態では、プロセッサまたは回路は、１つまたは複数の所定の閾値との比較に基づいた脂質膜の状態を検出するようにさらに構成される。ある追加の実施形態では、脂質膜の状態は、２つより多い脂質分子層を有する脂質膜と、脂質二重層と、破裂させられた脂質二重層とからなる群から、選択される。別の実施形態では、プロセッサ回路は、積分コンデンサの両端間のサンプリングされた電圧が、脂質二重層が破裂した事象ではＡＤＣのＡＤＣ参照ウィンドウ内に存在するように、中間監視振幅を選択するようにさらに構成される。
【００１１】
別の態様では、本発明は、ナノポアベースの配列決定チップのセル内の脂質膜の状態を検出するための、システムおよび器具を提供し、システムは、ＡＣ電圧の中間変化に応答して、積分コンデンサの両端間のサンプリングされた電圧の変化を判定するように構成されたプロセッサまたは回路であって、セルは、ナノポアベースの配列決定チップ内の複数のセルのうちの１つである、プロセッサまたは回路を備える。ある実施形態では、中間監視振幅は、第１段階振幅より小さいが、第２段階振幅より大きい。別の実施形態では、システムは、定電圧予備充電電源をさらに備える。ある追加の実施形態では、プロセッサまたは回路は、定電圧予備充電電源に接続することによって、包括的予備充電信号を用いて、積分コンデンサを予備充電するようにさらに構成される。ある実施形態では、包括的予備充電信号は、複数のセル内の積分コンデンサの予備充電のタイミングを制御するために使用される。別の実施形態では、プロセッサまたは回路は、積分コンデンサが定電圧予備充電電源の値に充電されたあと、予備充電電源を、包括的予備充電信号を用いて積分コンデンサから切断するようにさらに構成される。さらなる実施形態では、包括的予備充電信号は、予備充電電源を、複数のセル内の積分コンデンサから切断するタイミングを制御するために使用される。追加の実施形態では、プロセッサまたは回路は、脂質二重層に関連付けられたキャパシタンスを通して、積分コンデンサが充電または放電する、所定の期間待機するようにさらに構成される。ある他の実施形態では、プロセッサまたは回路は、積分コンデンサの両端間の電圧を、所定の待機期間のあと、ＡＤＣにサンプリングさせるようにさらに構成される。ある追加の実施形態では、予備充電電源を複数のセル内の積分コンデンサから切断するタイミングは、タイミングが、ＡＣ電圧が中間監視振幅に切り替えられるタイミングと、実質的に同一になるように構成される。ある実施形態では、複数のセル内の積分コンデンサの予備充電するタイミングは、タイミングが複数のセルからの配列決定データのフレームが読み出されたあとになるように構成される別の実施形態では、フレームは、ＡＣ電圧が中間監視振幅に切り替えられるときのフレームに先行する１フレームである。
【００１２】
さらなる実施形態では、ナノポアベースの配列決定チップのセル内の脂質膜の状態を検出するための、システムまたは器具は、プロセッサまたは回路によって制御されるセル内のスイッチをさらに備える。ある実施形態では、プロセッサまたは回路は、脂質二重層が破裂させられたことの検出に応答して、セル内のスイッチを開路することによって、電気的刺激がさらに脂質二重層を横断して印加されないようにさらに構成される。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、多数の方法で実装可能であり、多数の方法は、プロセス、装置、システム、組成物、コンピュータ可読記憶媒体上で具現化されるコンピュータプログラム製品、および／または、プロセッサ、例えばプロセッサに連結されたメモリに記憶されるおよび／またはメモリによって提供される命令を実行するように構成されたプロセッサを含む。この明細書では、これらの実施態様または本発明がとり得る他の任意の形は、技術と称されることがある。一般に、開示されたプロセスのステップの順序は、本発明の範囲内で変更されてもよい。別途記載されていない限り、タスクを実行するように構成されたものとして記載されるプロセッサまたはメモリのような構成要素は、そのタスクを所定の時間に実行するように一時的に構成される一般的な構成要素またはそのタスクを実行するために製造された特定の構成要素として実施されてもよい。本明細書において、「プロセッサ」という用語は、データ、例えばコンピュータプログラム命令を処理するように構成された１つまたは複数の装置、回路および／または処理コアを意味する。
【００１４】
以下、本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細な説明が、本発明の原理を示す添付の図面と共に提供される。本発明は、この種の実施形態に関連して記載されているが、本発明は、任意の実施形態に限定されるものではない。本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ限定され、本発明は、多数の代替物、変更物および均等物を包含する。多数の具体的な詳細は、以下の説明に記載され、本発明の完全な理解を提供する。これらの詳細は、例のために提供され、本発明は、これらの具体的な詳細の一部または全部を用いずに特許請求の範囲に従って実施され得る。明確性のために、本発明に関連する技術分野において公知である技術的な材料は、本発明が不必要に不明瞭にならないように詳述されていない。
【００１５】
内径が１ナノメートル程度のポアサイズを有するナノポア膜装置は、迅速なヌクレオチド配列決定において見込みを示してきた。電位が導電性流体に浸漬されたナノポア全体に印加されたとき、ナノポア全体のイオンの伝導に起因するわずかなイオン電流が観察可能である。電流の量は、ポアサイズに影響される。
【００１６】
ナノポアベースの配列決定チップは、ＤＮＡ配列決定のために用いられてもよい。ナノポアベースの配列決定チップは、アレイとして構成される多数のセンサセルを組み込む。例えば、１００万個のセルのアレイは、１０００行×１０００列のセルを含み得る。
【００１７】
図１は、ナノポアベースの配列決定チップ内のセル１００の一実施形態を示す。膜１０２は、セルの表面にわたって形成される。いくつかの実施形態では、膜１０２は、脂質二重層である。可溶性タンパク質ナノポア膜貫通分子複合体（ＰＮＴＭＣ）および対象の分析物を含むバルク電解質１１４は、セルの表面上に直接配置される。単一のＰＮＴＭＣ１０４は、電気穿孔法によって膜１０２内に挿入される。アレイ内の個々の膜は、化学的にも電気的にも互いに接続されていない。それゆえ、アレイ内の各セルは、独立した配列決定機械であり、ＰＮＴＭＣと連結した単一のポリマー分子に固有のデータを生成する。ＰＮＴＭＣ１０４は、分析物に対して作用し、そうでなければ不透過性の二重層を介してイオン電流を調節する。
【００１８】
図１を続けて参照すると、アナログ測定回路１１２は、電解質の薄膜１０８によって覆われた金属電極１１０に接続されている。電解質の薄膜１０８は、イオン不浸透性膜１０２によって、バルク電解質１１４から分離される。ＰＮＴＭＣ１０４は、膜１０２を横切り、イオン電流がバルク液体から作用電極１１０へと流れるための唯一の経路を提供する。セルは、電気化学的電位センサである対電極（ＣＥ）１１６も含む。セルは、参照電極１１７も含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、ナノポアアレイは、合成による単分子ナノポアベースの配列決定（ナノ−ＳＢＳ）技術を用いる並行配列決定を可能にする。図２は、ナノ−ＳＢＳ技術を用いてヌクレオチド配列決定を実行するセル２００の一実施形態を示す。ナノ−ＳＢＳ技術では、配列決定されるべき鋳型２０２およびプライマーは、セル２００に導入される。この鋳型−プライマー複合体に対して、異なってタグ付けされた４つのヌクレオチド２０８は、バルク水相に添加される。正しくタグ付けされたヌクレオチドがポリメラーゼ２０４と複合体を形成すると、タグの尾部は、ナノポア２０６の筒内に位置決めされる。ナノポア２０６の筒内に保たれるタグは、固有のイオン遮断信号２１０を生成し、それにより、付加された塩基を、タグの異なる化学構造により電子的に同定する。
【００２０】
図３は、予め装填されたタグを用いたヌクレオチド配列決定を実行しようとしているセルの一実施形態を示す。ナノポア３０１は、膜３０２内に形成される。酵素３０３（例えば、ＤＮＡポリメラーゼのようなポリメラーゼ）は、ナノポアと結合している。いくつかの場合では、ポリメラーゼ３０３は、ナノポア３０１に共有結合している。ポリメラーゼ３０３は、配列決定されるべき核酸分子３０４と結合している。いくつかの実施形態では、核酸分子３０４は環状である。いくつかの場合では、核酸分子３０４は線状である。いくつかの実施形態では、核酸プライマー３０５は、核酸分子３０４の一部にハイブリダイズしている。ポリメラーゼ３０３は、ヌクレオチド３０６のプライマー３０５上への、一本鎖核酸分子３０４を鋳型として用いる取り込みを触媒する。ヌクレオチド３０６は、タグ種（「タグ」）３０７を備える。
【００２１】
図４は、予め装填されたタグを用いた核酸配列決定のためのプロセス４００の一実施形態を示す。段階Ａは、図３において説明したような構成要素を示す。段階Ｃは、ナノポア内に装填されるタグを示す。「装填された」タグは、認識可能な長さの時間、例えば、０．１ミリ秒（ｍｓ）から１００００ｍｓの間、ナノポア内に位置決めされる、および／または、ナノポア内または近くに留まるタグでもよい。いくつかの場合では、予め装填されるタグは、ヌクレオチドから放出される前に、ナノポア内に装填される。いくつかの例では、タグが、ヌクレオチド組み込み事象の際に放出されたあとにナノポアを通過する（および／またはナノポアにより検出される）確率が適度に高い、例えば９０％から９９％である場合、タグは予め装填される。
【００２２】
段階Ａにおいて、タグ付けされたヌクレオチド（４つの異なるタイプ：Ａ、Ｔ、ＧまたはＣのうちの１つ）は、ポリメラーゼと結合していない。段階Ｂにおいて、タグ付けされたヌクレオチドは、ポリメラーゼと結合している。段階Ｃにおいて、ポリメラーゼは、ナノポアにドッキングする。タグは、ドッキングの間、電気的な力、例えば、膜および／またはナノポア全体に印加される電圧により生成される電界の存在下で生成される力によってナノポア内に引き込まれる。
【００２３】
結合したタグ付けされたヌクレオチドのいくつかは、核酸分子と塩基対合しない。これらの塩基対合しなかったヌクレオチドは、典型的には、正しく対合したヌクレオチドがポリメラーゼと結合したままである時間スケールより短い時間スケール内で、ポリメラーゼによって拒絶される。対合しなかったヌクレオチドは、一時的にのみポリメラーゼと結合するので、図４に示すプロセス４００は、典型的には、段階Ｄを越えて進行しない。例えば、対合しなかったヌクレオチドは、段階Ｂにおいて、または、プロセスが段階Ｃに入った少しあとに、ポリメラーゼによって拒絶される。
【００２４】
ポリメラーゼがナノポアにドッキングする前、ナノポアのコンダクタンスは、約３００ピコジーメンス（３００ｐＳ）である。段階Ｃにおいて、ナノポアのコンダクタンスは、約６０ｐＳ、８０ｐＳ、１００ｐＳまたは１２０ｐＳであり、それぞれは、タグ付けされたヌクレオチドの４つのタイプのうちの１つに対応する。ポリメラーゼは、異性化およびリン酸基転移反応を経て、ヌクレオチドを成長している核酸分子内に組み込み、タグ分子を放出する。特に、タグがナノポア内に保たれるとき、固有のコンダクタンス信号（例えば、図２の信号２１０を参照）は、タグの異なる化学構造により生成され、それにより、付加された塩基を電子的に同定する。サイクル（すなわち、段階ＡからＥまたは段階ＡからＦ）を繰り返すことにより、核酸分子の配列決定が可能になる。段階Ｄにおいて、放出されたタグは、ナノポアを通過する。
【００２５】
いくつかの場合では、図４の段階Ｆに見られるように、成長している核酸分子内に組み込まれていないタグ付けされたヌクレオチドも、ナノポアを通過することになる。組み込まれていないヌクレオチドは、いくつかの例では、ナノポアによって検出され得るが、その方法は、組み込まれたヌクレオチドと組み込まれなかったヌクレオチドとを、ヌクレオチドがナノポア内で検出される時間に少なくとも部分的に基づいて区別するための手段を提供する。組み込まれなかったヌクレオチドに結合したタグは、ナノポアを迅速に通過し、短期間（例えば、１０ｍｓ未満）の間検出され、一方、組み込まれたヌクレオチドに結合したタグは、ナノポア内に装填され、長期間（例えば、少なくとも１０ｍｓ）の間検出される。
【００２６】
図５は、ナノポアベースの配列決定チップ内のセル５００の一実施形態を示す。セル５００は、誘電体層５０１を含む。誘電体層５０１を形成するために使用される誘電体材料は、ガラス、酸化物、窒化物、その他を含む。セル５００は、誘電体層５０１の上層の誘電体層５０４を含む。誘電体層５０４は、作用電極５０２が底部に配置されている、ウェル５０５を囲む側壁を形成する。誘電体層５０４を形成するために使用される誘電体材料は、ガラス、酸化物、シリコン一窒化物（ＳｉＮ）、その他を含む。誘電体層５０４の上面は、シラン処理され得る。シラン処理は、誘電体層５０４の上面の上に疎水性層５２０を形成する。いくつかの実施形態では、疎水性層５２０は、約１．５ナノメートル（ｎｍ）の厚さを有する。
【００２７】
誘電体層壁５０４によって形成されるウェル５０５は、作用電極５０２の上層の塩類溶液５０６薄膜をさらに含む。塩類溶液５０６は、以下の、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、グルタミン酸リチウム、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン酸カリウム、酢酸リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、塩化ストロンチウム（ＳｒＣｌ２）、塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、および塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、のうちの１つを含み得る。いくつかの実施形態では、塩類溶液５０６の薄膜は、約３マイクロメートル（μｍ）の厚さを有する。
【００２８】
図５に示すように、膜は、誘電体層５０４の上面に形成され、ウェル５０５全体に及ぶ。例えば、膜は、疎水性層５２０の上面に形成された脂質単一層５１８を含む。膜がウェル５０５の開口に達したとき、脂質単一層は、ウェルの開口全体に及ぶ脂質二重層５１４に移行する。タンパク質ナノポア膜貫通分子複合体（ＰＮＴＭＣ）および対象の分析物を含むバルク電解質５０８は、ウェルの上に直接配置される。単一のＰＮＴＭＣ／ナノポア５１６は、電気穿孔法によって、脂質二重層５１４内に挿入される。ナノポア５１６は、脂質二重層５１４を横切り、バルク電解質５０８から作用電極５０２へのイオン流のための唯一の経路を提供する。バルク電解質５０８は、以下の、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、グルタミン酸リチウム、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン酸カリウム、酢酸リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、塩化ストロンチウム（ＳｒＣｌ２）、塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、および塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、のうちの１つをさらに含み得る。
【００２９】
セル５００は、電気化学的電位センサである対電極（ＣＥ）５１０を含む。セル５００は、参照電極５１２も含む。いくつかの実施形態では、対電極５１０は、複数のセル間で共有され、それゆえ、共通電極とも称される。共通電極は、共通の電位を、測定セル内のナノポアと接触するバルク液体に印加するように構成可能である。共通の電位および共通電極は、測定セルの全てに共通である。
【００３０】
いくつかの実施形態では、作用電極５０２は、金属電極である。非ファラデー性伝導のために、作用電極５０２は、腐食および酸化に耐性を示す、例えば、白金、金などの金属、チタン窒化物、およびグラファイトで形成され得る。例えば、作用電極５０２は、電気めっきを用いた白金電極であってもよい。例えば、作用電極５０２は、チタン窒化物（ＴｉＮ）作用電極であってもよい。
ナノポアを脂質二重層内に挿入するステップは、脂質二重層がナノポアベースの配列決定チップのセル内に適切に形成されたことが判定されたあとに、実行される。いくつかの技術では、脂質二重層がセル内で適切に形成されたか否かを判定するプロセスは、適切に形成済みの脂質二重層を破壊させ得る。例えば、刺激電圧が印加され、電流は電極を横断して流れることになり得る。測定される刺激電圧への応答が、適切に形成された脂質二重層を有する（すなわち、脂質分子厚の２層である脂質二重層）セルを、適切に形成された脂質二重層を有さないセル（例えば、セルのウェル全体に及ぶ、厚い脂質および溶媒の複合膜を有するセル）と区別するために使用され得るが、いくつかの例では、刺激電圧レベルは、十分に高く、適切に形成済みの脂質二重層を壊すことになる。すなわち、脂質二重層をテストする刺激電圧は、脂質二重層に対して破壊的であり得る。適切に形成済みの脂質二重層が刺激電圧によって破壊された場合では、非常に高い電流が、短絡状態の結果として、電極を横断して流れ始める。それに応じて、システムは、再び特定のセル内に新たな脂質二重層を再形成することを試行するが、このことは、時間を要し効率的でもない。加えて、脂質二重層は、連続する試行での特定のセル内で再形成しない可能性がある。結果として、適切に形成された脂質二重層およびナノポアを有するナノポアベースの配列決定チップ内のセル全体の割合（すなわち、ナノポアベースの配列決定チップの収量）は、低減される。
【００３１】
ナノポアベースの配列決定チップのセル内に形成される脂質二重層を検出する非破壊技術が、開示される。脂質二重層を検出する非破壊技術は、ナノポアベースの配列決定チップの効率および収量を増加させることを含む、多くの利点を有する。
【００３２】
図６Ａは、ナノポアベースの配列決定チップのセル内の回路６００の一実施形態を示し、回路は、形成済みの脂質二重層が破壊しないように、脂質二重層がセル内に形成されるか否かを検出するように構成され得る。
【００３３】
図６Ａは、セルの作用電極６１４と対電極６１６との間にあり、その結果、電圧が脂質膜／二重層６１２を横断して印加される脂質膜すなわち脂質二重層６１２を示す。脂質二重層は、脂質分子の２層からなる薄膜である。脂質膜は、脂質分子の（２より多い）数層からなる薄膜である。脂質膜／二重層６１２は、バルク液体／電解質６１８とも接触する。なお、作用電極６１４、脂質膜／二重層６１２、および対電極６１６が、図１の作用電極、脂質二重層、および対電極と比較して、上下反対に描かれていることに留意されたい。いくつかの実施形態では、対電極は、複数のセル間で共有され、それゆえ、共通電極とも称される。共通電極は、共通電極を電圧源Ｖｌｉｑ６２０に接続することによって、共通の電位を、測定セル内の脂質膜／二重層と接触するバルク液体に印加するように構成可能である。共通の電位および共通電極は、測定セルの全てに共通である。共通電極とは対照的に、作用セル電極は、各測定セル内に存在し、作用セル電極６１４は、他の測定セル内の作用セル電極から独立して、異なる電位を印加するように構成可能である。
【００３４】
図６Ｂは、図６Ａに示した図と同様の、ナノポアベースの配列決定チップのセル内の回路６００を示す。図６Ａと比較して、作用電極と対電極との間に、脂質膜／二重層を示す代わりに、作用電極および脂質膜／二重層の電気特性を表す電気モデルを示す。
【００３５】
電気モデル６２２は、作用電極６１４の電気特性を表すコンデンサ６２４を含む。作用電極６１４に関連付けられたキャパシタンスは、２重層キャパシタンス（Ｃ２重層）とも称される。電気モデル６２２は、脂質膜／二重層に関連付けられたキャパシタンスをモデル化するコンデンサ６２６（Ｃ二重層）と、脂質膜／二重層に関連付けられた抵抗をモデル化する抵抗器６２８（Ｒ二重層）とをさらに含む。脂質膜／二重層に関連付けられた抵抗は、非常に高く、それゆえＲ二重層は、開回路によって置換され得て、電気モデル６２２をＣ２重層とＣ二重層の直列に簡略化できる。
【００３６】
電圧源Ｖｌｉｑ６２０は、交流（ＡＣ）電圧源である。対電極６１６は、バルク液体６１８に浸漬され、ＡＣ非ファラデー性モードが利用され、方形波電圧Ｖｌｉｑを調節し、それを測定セル内の脂質膜／二重層と接触するバルク液体に印加する。いくつかの実施形態では、Ｖｌｉｑは、±２００〜２５０ｍＶの振幅および２５〜１００Ｈｚの周波数を有する方形波である。
【００３７】
パスデバイス６０６は、脂質膜／二重層および電極を測定回路６００と接続または切断するために使用され得るスイッチである。スイッチは、セル内の脂質膜／二重層を横断して印加され得る電圧刺激を有効化または無効化する。脂質が、脂質二重層を形成するためにセルに堆積される前では、２つの電極間のインピーダンスは、セルのウェルが封止されていないため、非常に低く、それゆえスイッチ６０６は、短絡状態を回避するために開路に維持される。スイッチ６０６は、脂質溶媒がセルに堆積されてセルのウェルを封止したあと、閉じられ得る。
【００３８】
回路６００は、チップ上に作り込まれた積分コンデンサ６０８（ｎｃａｐ）をさらに含む。積分コンデンサ６０８は、リセット信号６０３を使用しスイッチ６０１を閉じ、その結果、積分コンデンサ６０８が電圧源Ｖｐｒｅ６０５に接続されることによって、予備充電される。いくつかの実施形態では、電圧源Ｖｐｒｅ６０５は、９００ｍＶの大きさの固定の正電圧を供給する。スイッチ６０１が閉じられているとき、積分コンデンサ６０８は、電圧源Ｖｐｒｅ６０５の正電圧レベルまで予備充電される。
【００３９】
積分コンデンサ６０８が予備充電されたあと、リセット信号６０３が使用されスイッチ６０１が開路され、その結果、積分コンデンサ６０８は、電圧源Ｖｐｒｅ６０５から切断される。この時点では、Ｖｌｉｑのレベルにより、対電極６１６の電位は、作用電極６１４の電位より高いレベルにあるか、その反対でもあり得る。例えば、方形波Ｖｌｉｑの正位相の間（すなわち、ＡＣ電圧源信号サイクルの暗期間）、対電極６１６の電位は、作用電極６１４の電位より高いレベルにある。同様に、方形波Ｖｌｉｑの負位相の間（すなわち、ＡＣ電圧源信号サイクルの明期間）、対電極６１６の電位は、作用電極６１４の電位より低いレベルにある。この電位差により、積分コンデンサ６０８は、ＡＣ電圧源信号サイクルの暗期間中に充電され、ＡＣ電圧源信号サイクルの明期間中に放電され得る。
【００４０】
アナログデジタル変換器（ＡＤＣ）６１０のサンプリング速度により、積分コンデンサ６０８は、一定の期間中、充電または放電し、次に、積分コンデンサ６０８内に蓄えられる電圧は、ＡＤＣ６１０によって読み出され得る。ＡＤＣ６１０によるサンプリングのあと、積分コンデンサ６０８は、リセット信号６０３を使用しスイッチ６０１を閉じ、その結果、積分コンデンサ６０８が電圧源Ｖｐｒｅ６０５に再接続されることによって、再び予備充電される。いくつかの実施形態では、ＡＤＣ６１０のサンプリング速度は、１５００〜２０００Ｈｚである。いくつかの実施形態では、ＡＤＣ６１０のサンプリング速度は、最高で５ｋＨｚである。例えば、１ｋＨｚのサンプリング速度で、積分コンデンサ６０８は、約１ｍｓの期間中、充電または放電し、次に、積分コンデンサ６０８内に蓄えられる電圧は、ＡＤＣ６１０によって読み出される。ＡＤＣ６１０によるサンプリングのあと、積分コンデンサ６０８は、リセット信号６０３を使用しスイッチ６０１を閉じ、その結果、積分コンデンサ６０８が電圧源Ｖｐｒｅ６０５に再接続されることによって、再び予備充電される。積分コンデンサ６０８を予備充電するステップと、積分コンデンサ６０８が充電または放電する一定の期間を待機するステップと、積分コンデンサ内に蓄えられた電圧をＡＤＣ６１０によってサンプリングするステップとが、次に、システムの脂質二重層測定段階の間中サイクルで繰り返される。
【００４１】
回路６００は、脂質膜／二重層と接触するバルク液体に印加されるデルタ電圧変化（ΔＶｌｉｑ）に応答した積分コンデンサ６０８（ｎｃａｐ）におけるデルタ電圧変化ΔＶＡＤＣを監視することによって、脂質二重層がセル内に形成されるか否かを検出するために、使用され得る。以下で詳述するように、脂質二重層測定段階中、回路６００は、直列に接続されたＣ二重層６２６、Ｃ２重層６２４、およびｎｃａｐ６０８を有する電圧分割器としてモデル化され得て、電圧分割器の中間点で取り出される電圧変化は、脂質二重層が形成されたか否かを判定するＡＤＣ６１０によって、読み出され得る。
【００４２】
図７は、システムの脂質二重層測定段階中の回路６００の一部分の電気特性を表す電気モデル７００を示す。図７に示すように、Ｃ２重層６２４は、Ｃ二重層６２６と直列に接続されているが、Ｒ二重層６２８（図６Ｂ参照のこと）は、電気モデル７００から除去されている。Ｒ二重層６２８は、脂質膜／二重層に関連付けられた抵抗が、非常に高く、それゆえＲ二重層が、開回路として近似され得るので、電気モデル７００から除去することができる。図７に示すように、Ｃ２重層６２４およびＣ二重層６２６は、ｎｃａｐ６０８と直列にさらに接続される。
【００４３】
ＡＣモードで動作するとき、ＡＤＣによって読み出される電圧（ＶＡＤＣ）は、以下の式で決定される。
【数１】
0006893582.tif 000002
ここで、Ｚ＝１／（ｊωＣ）であり、
Ｚ（ｎｃａｐ）は、ｎｃａｐに関連付けられた交流インピーダンスであり、
Ｚ（２重層）は、作用電極に関連付けられた交流インピーダンスであり、
Ｚ（二重層）は、脂質膜／二重層に関連付けられた交流インピーダンスである。
【００４４】
２重層の交流インピーダンスであるＺ（２重層）は、Ｃ２重層がＣ二重層すなわちｎｃａｐのキャパシタンスよりもかなり大きいので、Ｚ（二重層）およびＺ（ｎｃａｐ）と比べて非常に低い値を有する。したがって、Ｚ（ｎｃａｐ）＝１／（ｊωＣｎｃａｐ）、Ｚ（二重層）＝１／ｊωＣ二重層、およびＺ（２重層）＝０を代入すると、式（１）は、以下のように簡易化される。
【数２】
0006893582.tif 000003
ここで、Ｃ（ｎｃａｐ）は、ｎｃａｐに関連付けられたキャパシタンスであり、
Ｃ（二重層）は、脂質膜／二重層に関連付けられたキャパシタンスである。
【００４５】
脂質がまず脂質二重層を形成するためにセル内に堆積されるとき、セルのいくつかは、自然に形成される脂質二重層を有するが、そのセルのいくつかは単に、セルのウェルの各々の全体に広がる厚い脂質膜（脂質分子の複数の層および共に組み合わされた溶媒を伴う）を有するにすぎない。脂質二重層に関連付けられたキャパシタンスは、脂質膜／二重層のキャパシタンスがその厚さに反比例するので、厚さが脂質分子の２層より多い、脂質膜に関連付けられたキャパシタンスよりも大きい。脂質膜が薄膜化され、脂質二重層になるように移行するにつれて、厚さは減少し、その付随するキャパシタンスは増加する。上記の式（２）では、脂質二重層がセル内で形成し始めるにつれて、Ｃ（二重層）は増加し、一方、Ｃ（ｎｃａｐ）は一定で、その結果、ＶＡＤＣ全体では増加する。ＶＡＤＣの増加は、それゆえ脂質二重層がセル内で形成されたことの指標として使用され得る。
【００４６】
いくつかの実施形態では、脂質膜／二重層と接触するバルク液体に印加されるデルタ電圧変化（ΔＶｌｉｑ）に応答する積分コンデンサ６０８（ｎｃａｐ）でのデルタ電圧変化ΔＶＡＤＣは、脂質二重層がセル内で形成されたか否かを検出するために、監視される。例えば、式（２）は、以下のように書き直され得る。
【数３】
0006893582.tif 000004
ここで、ΔＶＡＤＣは、ＡＤＣによって読み出される積分コンデンサ６０８（ｎｃａｐ）での電圧変化である。
ΔＶｌｉｑは、バルク液体に印加される電圧変化であり、
Ｃ（ｎｃａｐ）は、ｎｃａｐに関連付けられたキャパシタンスであり、
Ｃ（二重層）は、脂質膜／二重層に関連付けられたキャパシタンスである。
【００４７】
上記の式（３）では、Ｃ（ｎｃａｐ）が一定に留まり、一方、Ｃ（二重層）は、脂質二重層がセル内で形成し始めるにつれて増加するので、ΔＶＡＤＣも同様に増加する。ΔＶＡＤＣは、脂質膜／二重層に関連付けられたキャパシタンスであるＣ（二重層）におおよそ比例する。ΔＶＡＤＣの増加は、それゆえ脂質二重層がセル内で形成されたことの指標として使用され得る。
【００４８】
いくつかの実施形態では、より確かに脂質二重層を検出する観測可能なΔＶＡＤＣを最大化するために、脂質膜／二重層（最大ΔＶｌｉｑ）と接触するバルク液体に印加される最大電圧変化に応答するΔＶＡＤＣは、脂質二重層がセル内で形成されたか否かを検出するために、監視される。
【００４９】
図８Ａは、正／負の電圧変化±ΔＶｌｉｑに応答した小さな観測された正／負の電圧変化±ΔＶＡＤＣによって、脂質二重層のセル内での形成が検出されないことを示す。図８Ｂは、正／負の電圧変化±ΔＶｌｉｑに応答した大きな観測された正／負の電圧変化±ΔＶＡＤＣによって、脂質二重層のセル内での形成が検出されることを示す。
【００５０】
図８Ａでは、方形波Ｖｌｉｑが負位相から正位相に変化するとき、正の最大電圧変化＋ΔＶｌｉｑが発生し、一方、方形波Ｖｌｉｑが正位相から負位相に変化するとき、負の最大電圧変化−ΔＶｌｉｑが発生する。図８Ａでは、ΔＶｌｉｑが正の最大値にある段階において、脂質二重層がセル内で形成されていない場合、小さな＋ΔＶＡＤＣのみが観測され得て、ΔＶｌｉｑが負の最大値にある段階において、脂質二重層がセル内で形成されていない場合、小さな−ΔＶＡＤＣのみが観測され得る。
【００５１】
図８Ｂでは、ΔＶｌｉｑが正の最大値にある段階において、脂質二重層が既にセル内で形成されている場合、大きな正の電圧変化＋ΔＶＡＤＣが観測され得る。そして、ΔＶｌｉｑが負の最大値にある段階において、脂質二重層が既にセル内で形成されている場合、大きな負の電圧変化−ΔＶＡＤＣが観測され得る。
【００５２】
いくつかの実施形態では、ΔＶｌｉｑの絶対値（｜ΔＶｌｉｑ｜）が最大であるとき観測されるΔＶＡＤＣの絶対値（｜ΔＶＡＤＣ｜）は、所定の閾値と比較される。｜ΔＶＡＤＣ｜＞所定の閾値の場合、そのとき脂質二重層が検出されたと判定される。逆に、｜ΔＶＡＤＣ｜＜所定の閾値の場合、そのとき脂質二重層が検出されないと判定される。
【００５３】
図９Ａは、脂質二重層がセル内部で形成される前後の、時間に対するＶＡＤＣの例示的なプロットを示す。図９Ａのプロットは、実際の試験データに基づく。図９Ａに示すように、Ｙ軸のＶＡＤＣの単位は、ＡＤＣのカウントである。しかしながら、他の単位が同様に用いられてもよい。図９Ａに示すように、脂質二重層が形成されていない期間ｔ１の間に記録される｜ΔＶＡＤＣ｜の値は、脂質二重層がセル内で形成された期間ｔ２の間に記録される値よりも小さい。
【００５４】
図９Ｂは、脂質二重層が形成されなかったときの期間ｔ１の間の、時間に対するＶＡＤＣの例示的なプロット（図９Ａ参照のこと）の拡大図を示す。図９Ｂで示した結果は、図８Ａと一致する。図９Ｂでは、方形波Ｖｌｉｑが負位相から正位相に変化するとき、最大＋ΔＶｌｉｑが発生し、一方、方形波Ｖｌｉｑが正位相から負位相に変化するとき、最大−ΔＶｌｉｑが発生する。図９Ｂでは、ΔＶｌｉｑが正の最大値にある段階において、脂質二重層がセル内で形成されていないので、小さな＋ΔＶＡＤＣのみが観測され得て、ΔＶｌｉｑが負の最大値にある段階において、脂質二重層がセル内で形成されていないので、小さな−ΔＶＡＤＣのみが観測され得る。
【００５５】
図９Ｃは、脂質二重層が形成されたときの期間ｔ２の間の、時間に対するＶＡＤＣの例示的なプロット（図９Ａ参照のこと）の拡大図を示す。図９Ｃで示した結果は、図８Ｂと一致する。図９Ｃでは、ΔＶｌｉｑが正の最大値にある段階において、脂質二重層が既にセル内で形成されているので、２つの連続したサンプル点の間に、大きな＋ΔＶＡＤＣが観測され得る。ΔＶｌｉｑが負の最大値にある段階において、脂質二重層が既にセル内で形成されているので、大きな−ΔＶＡＤＣが観測され得る。なお、方形波Ｖｌｉｑがある位相から別の位相に変化した少しあと、ΔＶｌｉｑは、ゼロに留まり、それに応じてＶＡＤＣは、ゼロに低下することに留意されたい。図９Ｃに示すように、脂質二重層がセル内で既に形成されているとき、ＶＡＤＣの正または負のスパイクが観測され得る。正または負のスパイクのあとには、より小さいＶＡＤＣの値が続く。
【００５６】
脂質二重層が、上述の技術を用いて、ナノポアベースの配列決定チップのセル内に適切に形成されたと判定されたあと、ナノポアは、脂質二重層内に挿入され得て、挿入されたナノポアを有するセルは、核酸配列決定のために使用され得る。配列決定段階の間、ナノポアベースの配列決定チップ内のいくつかのセル内の脂質二重層は、浸透性の不均衡または他の理由により破裂し得る。セル内の破裂させられた脂質二重層は、それが非常に大きい電流が電極を横切って流れ、結果として短絡に似た状態となる原因となり、大電流はさらに、近隣のセルでのデータ収集に影響を及ぼし得るので、望ましくない。したがって、配列決定段階の間に、破裂させられた脂質二重層による短絡状態にあるセルを検出するための技術が、所望される。技術は、ナノポアベースの配列決定チップが検出されたセルを無力化し、それによりチップの全体的な性能を改善することを、可能にする。
【００５７】
短絡状態にあるセルを無力化することは、図６Ａまたは図６Ｂに示すようにパスデバイス６０６を制御することによって、達成され得る。パスデバイス６０６は、電圧刺激がもはやセル内の破裂させられた脂質二重層／膜を横断して印加されないように、電極を測定回路６００から切断することによって、セルを無力化するスイッチとして使用され得る。
【００５８】
配列決定段階の間に短絡状態にあるセルを検出することは、脂質膜／二重層と接触するバルク液体に印加されるデルタ電圧変化（ΔＶｌｉｑ）に応答した積分コンデンサ６０８（ｎｃａｐ）におけるデルタ電圧変化ΔＶＡＤＣを監視するために、回路６００を使用することによって、達成され得て、これは、セル内の脂質二重層の形成を検出するための上述した技術と同様である。以下で詳述するように、配列決定段階の間、回路６００は、作用電極および脂質二重層／膜に関連付けられるインピーダンスＺ１００２と直列に接続されたｎｃａｐを有する、電圧分割器としてモデル化され得て、これは、脂質二重層測定段階中のモデル化回路６００のために上で説明したモデル７０００と同様である。電圧分割器の中間点で取り出される電圧変化は、セル内に破裂させられた脂質二重層により短絡状態が存在するか否かを判定するＡＤＣ６１０によって、読み出され得る。
【００５９】
図１０は、システムの配列決定段階中の回路６００の一部の電気特性を表す電気モデル１０００を示す。図１０に示すように、インピーダンスＺ１００２は、作用電極および脂質二重層／膜をモデル化するために使用され、Ｚ１００２は、ｎｃａｐ６０８と直列に接続される。
【００６０】
ＡＣモードで動作するとき、ＡＤＣによって読み出される電圧（ＶＡＤＣ）は、以下の式で決定される。
【数４】
0006893582.tif 000005
ここで、Ｚ＝１／（ｊωＣ）であり、
Ｚ（ｎｃａｐ）はｎｃａｐに関連付けられた交流インピーダンスであり、
Ｚ１００２は、作用電極および脂質二重層／膜に関連付けられる交流インピーダンスである。
【００６１】
上の式（４）において、脂質二重層が破裂するとき、Ｚ１００２は、短絡状態により著しく減少し、その結果、ＶＡＤＣはＶｌｉｑに近い値を有する。ＶＡＤＣのさらなる増加は、それゆえ脂質二重層がセル内で破裂させられたことの指標として使用され得る。
【００６２】
いくつかの実施形態では、脂質膜／二重層と接触するバルク液体に印加されるデルタ電圧変化（ΔＶｌｉｑ）に応答する積分コンデンサ６０８（ｎｃａｐ）でのデルタ電圧変化ΔＶＡＤＣは、脂質二重層がセル内で破裂させられたか否かを検出するために、監視される。例えば、式（４）は、以下のように書き直され得る。
【数５】
0006893582.tif 000006
ここで、ΔＶＡＤＣは、ＡＤＣによって読み出される積分コンデンサ６０８（ｎｃａｐ）での電圧変化であり、
ΔＶｌｉｑは、バルク液体に印加される電圧変化であり、
Ｚ（ｎｃａｐ）はｎｃａｐに関連付けられる交流インピーダンスであり、
Ｚ１００２は、作用電極および脂質二重層／膜に関連付けられる交流インピーダンスである。
【００６３】
上の式（５）において、セル内の脂質二重層が破裂するとき、Ｚ１００２は、減少するので、ΔＶＡＤＣはΔＶｌｉｑに近い値まで増大する。ΔＶＡＤＣのさらなる増加は、それゆえ脂質二重層がセル内でまさに破裂させられたことの指標として使用され得る。
【００６４】
いくつかの実施形態では、より確かに破裂させられた脂質二重層を検出する観測可能なΔＶＡＤＣを最大化するために、脂質膜／二重層と接触するバルク液体に印加される最大電圧変化（最大ΔＶｌｉｑ）に応答するΔＶＡＤＣは、脂質二重層がセル内でまさに破裂させられたか否かを検出するために、監視される。
【００６５】
図１１Ａは、正／負の電圧変化±ΔＶｌｉｑに応答した大きな観測された正／負の電圧変化±ΔＶＡＤＣが、脂質二重層がセル内でまだ損なわれていないことを示すことを示す。図１１Ａは、図８Ｂと同一である。図１１Ｂは、正／負の電圧変化±ΔＶｌｉｑに応答した観測された正／負の電圧変化±ΔＶＡＤＣのさらなる増大が、脂質二重層がセル内でまさに破裂させられたことを示すことを示す。
【００６６】
図１１Ｂでは、ΔＶｌｉｑが正の最大値にある事例において、脂質二重層がまさにセル内で破裂させられた場合、正の電圧変化＋ΔＶＡＤＣの振幅のさらなる増大が観測され得る。そして、ΔＶｌｉｑが負の最大値にある事例において、脂質二重層がまさにセル内で破裂させられた場合、負の電圧変化−ΔＶＡＤＣの振幅のさらなる増大が観測され得る。
【００６７】
図８Ａ、８Ｂ、１１Ａ、および１１Ｂを考慮すると、ΔＶｌｉｑの絶対値（｜ΔＶｌｉｑ｜）が最大であるときに観測されるΔＶＡＤＣの絶対値（｜ΔＶＡＤＣ｜）は、脂質膜の状態を判定するために、１つまたは複数の所定の閾値と比較され得る。例えば、２つの閾値レベルは、脂質膜の状態を判定するために使用され得て、ここで閾値１＜閾値２である。（｜ΔＶＡＤＣ｜＜閾値１）である場合、脂質膜は、脂質分子の複数の層および共に組み合わされた溶媒を有し、まだ脂質二重層ではないと、判定される。（閾値１＜＝｜ΔＶＡＤＣ｜＜閾値２）である場合、脂質二重層が形成されたと判定される。（｜ΔＶＡＤＣ｜＞＝閾値２）の場合、脂質二重層が破裂させられたと判定される。
【００６８】
しかしながら、上述の診断技術を、システムの配列決定段階の間に、ナノポアベースの配列決定チップのセル内の、破裂させられた脂質二重層を検出するために、適用することは、多くの課題を有する。課題のうちの１つは、核酸配列決定（主要な試験）および診断試験の両方に良好に機能する、好適なＡＤＣ参照ウィンドウおよび好適なＶｌｉｑの振幅を選択することである。ＡＤＣ参照ウィンドウは、ＡＤＣが変換可能である、最小から最大までのアナログ値の範囲である。ＡＤＣ参照ウィンドウは、＋Ｖｒｅｆから−Ｖｒｅｆミリボルト／ボルトなどの、全体の測定範囲を指定し、ＡＤＣチップでプログラム可能である。ナノポアベースの配列決定チップの配列決定段階の間、核酸配列決定に有用な信号は、非常に小さく、それゆえＡＤＣ参照ウィンドウは、小信号が別のはっきり区別されるレベルへと分解され得るように、小さな電圧ウィンドウにプログラムされる。しかしながら、破裂させられた脂質二重層を有するセルの方形波Ｖｌｉｑの段階変化に応答する｜ΔＶＡＤＣ｜は、核酸配列決定に有用な信号よりもかなり大きい。結果的に、核酸配列決定に好適な小さなＡＤＣ参照ウィンドウはおそらく、ＡＤＣによって読み出されるΔＶＡＤＣ信号が飽和することの原因となり得る。Ｖｌｉｑの振幅をΔＶＡＤＣ信号の飽和を防止するために低くすることは、Ｖｌｉｑの振幅が、核酸配列決定の生化学によって制約されるので、実行可能な解決策ではない。結果として、上述の診断技術は、特にＶｌｉｑの変調周波数が、閾値レベル、例えば８０Ｈｚまたは１００Ｈｚを超える場合、セル内の損なわれていない脂質二重層と、破裂させられたものとを、もはや確実には区別し得ない。したがって、システムの異なる段階中に、ナノポアベースの配列決定チップのセル内の脂質膜の状態を検出する改善された技術が、所望されるであろう。
【００６９】
図１２は、システムの（配列決定段階を含む）異なる段階中のナノポアベースの配列決定チップのセル内の脂質膜の状態を検出するための改善されたＶｌｉｑの波形１２００の例示的なプロットを示す。状態は、脂質分子の複数の層および共に組み合わされた溶媒を伴う脂質膜と、脂質二重層と、破裂させられた脂質二重層とを含む。改善されたＶｌｉｑの波形１２００は、図６Ａの回路６００に適用され得る。波形が正の段階から負の段階へ変化するときまたはその逆のとき、２つの振幅間を切り替わる方形波である、最初のＶｌｉｑの波形（例えば、図１１Ｂを参照のこと）と異なり、改善されたＶｌｉｑの波形１２００は、追加の監視信号１２０２を含む。図１２では、ｘ軸は、フレームをプロットし、ｙ軸は、Ｖｌｉｑの波形をｍＶ単位でプロットしている。この特定の実施形態では、追加の監視信号１２０２は、Ｖｌｉｑの波形１２００が明期間から暗期間に切り替わるとき、挿入される。具体的には、Ｖｌｉｑは、それが暗振幅（フレーム６番または１７番での１０ｍＶ）に切り替わる前に、明振幅（フレーム４番または１５番での８０ｍＶ）から中間の監視信号振幅（フレーム５番または１６番での６０ｍＶ）に切り替わる。ＶｌｉｑのＡＣ電圧の中間変化は、ＡＣ電圧の２つの振幅、明振幅と暗振幅との間に挿入される。いくつかの他の実施形態では、追加の監視信号は、波形が、暗期間から明期間に切り替わるとき、挿入される。これらの実施形態では、Ｖｌｉｑは、それが明振幅レベルに切り替わる前に、暗振幅レベルから中間の監視信号振幅に切り替わる。中間の監視信号振幅は、監視信号以前の電圧レベルからの小さな電圧のデルタ（例えば、図１２に示すような−２０ｍＶ）であり得る。ＶｌｉｑのＡＣ電圧の中間変化は、ＡＣ電圧の２つの振幅、暗振幅と明振幅との間に挿入される。いくつかの実施形態では、電圧のデルタ変化は、波形が段階間で切り替わるとき、Ｖｌｉｑの振幅の全体変化の一部分（例えば、図１２に示すような２／７）であり得る。図１２では、Ｖｌｉｑの波形１２００の明期間から暗期間への振幅変化は、７０ｍＶである。他の実施形態では、振幅範囲は、核酸配列決定のための生化学により、より小さくまたはより大きく、例えば、５０ｍＶから５００ｍＶに、なり得る。サンプリングレートまたはフレームレートは、１から１０ｋＨｚの範囲であり得る。
【００７０】
図１３は、配列決定段階の間に短絡状態にあるセルを検出するために、回路６００は、Ｖｌｉｑが明の振幅から監視信号の振幅に切り替わるときの、脂質膜／二重層と接触するバルク液体に印加されるデルタ電圧変化（ΔＶｌｉｑ）に応答した積分コンデンサ６０８（ｎｃａｐ）におけるデルタ電圧変化ΔＶＡＤＣを監視し得ることを示す。図１３の上のグラフでは、ｘ軸は、フレームをプロットし、ｙ軸は、Ｖｌｉｑの波形１３００をｍＶ単位でプロットしている。図１３の下のグラフでは、ｘ軸は、ＡＤＣのサンプルをプロットし、ｙ軸は、積分コンデンサ６０８でＡＤＣによって読み出されたＡＤＣのカウントをプロットしている。上のグラフで示すように、狭いＡＤＣ参照ウィンドウ１３１０（−２５ｍＶから＋２５ｍＶ）は、核酸配列決定用に使用される比較的小さな信号用の改善された分解能のためのＡＤＣにプログラムされる。狭いＡＤＣ参照ウィンドウ１３１０は、ＡＤＣ値１３０６およびＡＤＣ値１３０８を、０および２５５カウントで、それぞれ飽和させる。しかしながら、波形が段階間で切り替わるとき、監視信号１３０２が、Ｖｌｉｑの振幅の全体変化のほんの一部分である電圧変化をもたらすので、監視信号への応答１３０４は飽和せず、対応するデルタ電圧変化は、脂質二重層が損なわれていないかまたは破裂させられたかを、より確実に検出するために用いられ得る。例えば、２つの閾値レベルは、脂質膜の状態を判定するために使用され得て、ここで閾値１＜閾値２である。（｜ΔＶＡＤＣ｜＜閾値１）である場合、脂質膜は、脂質分子の複数の層および共に組み合わされた溶媒を有し、まだ脂質二重層ではないと、判定される。（閾値１＜＝｜ΔＶＡＤＣ｜＜閾値２）である場合、脂質二重層が損なわれていないと判定される。（｜ΔＶＡＤＣ｜＞＝閾値２）の場合、脂質二重層が破裂させられたと判定される。
【００７１】
図１３に示すように、監視信号１３０２によってもたらされる電圧のデルタ変化は、波形が段階間で切り替わるとき、Ｖｌｉｑの振幅の全体変化の約１／５である。しかしながら、選択されたＡＤＣ参照ウィンドウにより、監視信号の振幅は、Ｖｌｉｑの波形が段階間を切り替わるとき、監視信号への応答が飽和せずに留まるという条件のもと、Ｖｌｉｑの振幅の全体変化の任意の適切な一部分へと増減され得る。
【００７２】
ナノポアベースの配列決定チップのいくつかの実施形態では、ナノポアアレイは、セルバンクに分割される。例えば、各セルバンクは、セルのＭ行×Ｎ列を含み得る。行列選択ラインは、個々のセルの状態を制御するために使用される。ＭおよびＮは、任意の整数であり得る。例えば、サイズが８ｋのセルバンク（バンク８ｋと呼ばれる）は、６４行と１２８列の積として構成され得て、全部で６４×１２８のセルを有する。各セルバンクは、独立しているので、ナノポアアレイは、追加のバンクを付加することによって、増減され得る。例えば、１２８ｋのアレイは、１６のバンク８ｋ成分として、実装され得る。５１２ｋのアレイは、バンク８ｋ成分の８×８アレイとして、実装され得る。いくつかの実施形態では、ナノポアアレイは、数百万のセルを含むために拡大され得る。
【００７３】
いくつかの実施形態では、セルバンクの任意の所定の行のセルも同一の積分時間間隔を共有し、すなわち、同一の行内のセルの各々は、その積分を同時に開始、終了し、隣接する行の積分時間間隔は、互いに時間差を設けられる。隣接する行の積分時間間隔は、互いに時間的にずれており、上述した監視信号を用いた検出技術は、行依存効果を有し、検出技術の全体的な性能は、結果的に劣化する。以下で詳述するように、行依存効果は、Ｖｌｉｑが監視信号に切り替わろうとしているときに、セルバンクの異なる行内のセルの積分を同期するための包括的予備充電信号を導入することによって、軽減され得て、それにより検出技術の全体的な性能を改善する。
【００７４】
図１４は、セルバンクの任意の所定の行内のセルも同一の積分時間間隔を共有するが、隣接する行の積分時間間隔が、互いに時間差を設けられ、脂質膜の状態の検出の全体的な性能を劣化させる行依存効果をもたらすことを示す。図１４の上の部分は、Ｖｌｉｑの波形１３００の拡大版を示す（図１３参照のこと）。Ｖｌｉｑ１３００は、明振幅１４２２から開始し、中間監視信号振幅１４２４に切り替わり、その後暗振幅１４２６に切り替わる。
【００７５】
図１４の下の部分は、フレームと、セルバンクの異なる行（例えば、行０、行１、および行６３）の積分時間間隔と、ＡＤＣの読出しタイミングとを示す、タイミング図を示す。
【００７６】
垂直の矢印１４０１〜１４０５は、Ｖｌｉｑの波形１３００のフレームの先頭を定めており、それらは、システムがＶｌｉｑの振幅をその電流値に維持するか、異なる値に切り替えるかを判定し得る、時間の事例である。フレーム１４０１および１４０２で、Ｖｌｉｑ１３００は、明振幅１４２２に維持される。フレーム１４０３で、Ｖｌｉｑ１３００は、中間監視信号振幅１４２４に切り替わる。フレーム１４０４で、Ｖｌｉｑ１３００は、暗振幅１４２６に切り替わる。フレーム１４０５で、Ｖｌｉｑ１３００は、暗振幅１４２６で維持される。
【００７７】
水平の矢印の各々は、セルバンクの個々の行内のセルの積分時間間隔を示す。例えば、水平の矢印の一番上の組は、行０内のセルの積分時間間隔を示し、水平の矢印の２番目の組は、行１内のセルの積分時間間隔を示し、水平の矢印の一番下の組は、行６３内のセルの積分時間間隔を示す。図に示すように、隣接する行の積分時間間隔は、互いに時間的にずれている。例えば、行０の積分時間間隔の開始および行１の積分時間間隔の開始は、わずかなデルタ時間差によってずらされ、行１の積分時間間隔の開始および行２の積分時間間隔の開始は、わずかなデルタ時間差によってずらされる、など以下同様である。
【００７８】
セルバンクの任意の所定の行内のセルも同一の積分時間間隔を共有するが、隣接する行の積分時間間隔は、１つの行内のセルの積分コンデンサ６０８（図６Ａ参照のこと）の予備充電をトリガするために使用されるリセット信号６０３のタイミングが他の行のそれらと異なるので、互いに時間差を設けられる。
【００７９】
例えば、時間１４１７では、行０内のセルの各々はその、セルのスイッチ６０１を閉路する、リセット信号６０３を有し、その結果、その積分コンデンサ６０８は、電源Ｖｐｒｅ６０５に接続される。積分コンデンサ６０８が予備充電されたあと、リセット信号６０３が使用されスイッチ６０１が開路され、その結果、積分コンデンサ６０８は、電源Ｖｐｒｅ６０５から切断される。この時点で、積分コンデンサ６０８は、放電を開始し、行０の積分時間間隔１４１１が始まる。行０の積分時間間隔１４１１が経過したあと、行０内のセルの各々の積分コンデンサ６０８内に蓄えられた電圧が、時間１４１４でＡＤＣ６１０によって読み出され得る。ＡＤＣ６１０によるサンプリングのあと、積分コンデンサ６０８は、リセット信号６０３を使用しスイッチ６０１を閉路し、その結果、積分コンデンサ６０８が電源Ｖｐｒｅ６０５に再接続されることによって、再び予備充電される。積分コンデンサ６０８を予備充電するステップと、積分コンデンサ６０８が積分する一定の期間を待機するステップと、積分コンデンサ６０８内に蓄えられた電圧をＡＤＣ６１０によってサンプリングするステップとが、次に、サイクルで繰り返される。
【００８０】
行１内のセルの予備充電および積分をトリガするために使用されるリセット信号６０３は、時間１４１８で、行０のそれにわずかなデルタ時間差だけ遅れる。行１の積分時間間隔１４１２が経過したあと、行１内のセルの各々の積分コンデンサ６０８内に蓄えられた電圧が、時間１４１５でＡＤＣ６１０によって読み出され得る。同様に、行２内のセルの予備充電および積分をトリガするために使用されるリセット信号６０３は、行１のそれに、わずかなデルタ時間差だけ遅れ、行３内のセルのリセット信号６０３は、行２のそれに、わずかなデルタ時間差だけ遅れる、など以下同様である。このパターンが、行６３まで繰り返される。具体的には、時間１４１９で、行６３内のセルの各々はその、セルの予備充電および積分をトリガするリセット信号６０３を有する。行６３の積分時間間隔１４１３が経過したあと、行６３内のセルの各々の積分コンデンサ６０８内に蓄えられた電圧が、時間１４１６でＡＤＣ６１０によって読み出される。
【００８１】
セルの異なる行の積分時間間隔が時間的にずれているので、Ｖｌｉｑ１３００が明振幅１４２２から中間監視信号振幅１４２４に切り替わるとき、２つの異なる行内のセルは、それらのそれぞれの積分時間間隔内で、異なる回数だけ監視電圧の変化をもたらされ、それにより２つの異なる行のＡＤＣ出力は、異なることになる。例えば、行０内のセルは、積分時間間隔１４１１の後の方の部分で、監視電圧の変化をもたらされ、一方、行６３内のセルは、積分時間間隔１４１３のより早い部分で、監視電圧の変化をもたらされる。それゆえ、行６３内のＡＤＣ出力に対する行０内のそれらは、同一の行内のＡＤＣ出力より大きな変化量を有し、それにより行依存効果がもたらされる。
【００８２】
図１５は、Ｖｌｉｑが中間監視信号に切り替わろうとしているとき、包括的予備充電信号１５０２が、セルバンクの異なる行内のセルの積分を同期させるために使用されることを示す。図１４および図１５は、少数の差異を除いては、同等である。１つの差異は、以下により詳細に説明するように、包括的予備充電信号１５０２の導入である。別の差異は、図１５ではＶｌｉｑ１３００が中間監視信号振幅１４２４に切り替わるとき、隣接する行の積分時間間隔がもはや、それらが図１４であったように（積分時間間隔１５１１、１５１２、および１５１３を参照のこと）、互いに時間差を設けられない。例えば、行０の積分時間間隔１５１１の開始、行１の積分時間間隔１５１２の開始、および行６３の積分時間間隔１５１３の開始がここで、同時に発生する。
【００８３】
包括的予備充電信号１５０２は、スイッチ６０１を、セルバンク内のセルの全てに渡って、制御するために使用される予備充電信号である。対照的に、リセット信号６０３は、単一のセル、またはセルバンクの単一の列内の唯一のセル内の、スイッチ６０１を制御するために使用される予備充電信号である。図１５に示すように、包括的予備充電信号１５０２は、フレーム１４０２（Ｖｌｉｑ１３００が中間監視振幅１４２４に切り替えられる前のフレーム）で高に設定され、セルバンクのセル内の全てのスイッチ６０１を閉路し、その結果、全ての積分コンデンサ６０８が電源Ｖｐｒｅ６０５に接続され、Ｖｐｒｅ電圧レベルに予備充電される。包括的予備充電信号１５０２は次に、フレーム１４０３（Ｖｌｉｑ１３００が中間監視振幅１４２４に切り替えられるフレーム）で低に設定され、セルバンクのセル内の全てのスイッチ６０１を開路し、その結果、全ての積分コンデンサ６０８が電源Ｖｐｒｅ６０５から切断され、放電が開始され、同時に積分が開始される（積分時間間隔１５１１、１５１２、および１５１３を参照のこと）。
【００８４】
行０の積分時間間隔１５１１が経過したあと、行０内のセルの各々の積分コンデンサ６０８内に蓄えられた電圧が、時間１５１４でＡＤＣ６１０によって読み出され得る。行０が読み出されたあと、行１の積分時間間隔１５１２が経過し、行１内のセルの各々の積分コンデンサ６０８内に蓄えられた電圧が、時間１５１５でＡＤＣ６１０によって読み出され得る。同様に、後続の行は、行６３が時間１５１６で読み出されるまで、順次読み出される。
【００８５】
異なる行の積分時間間隔の長さは、Ｖｌｉｑ１３００が中間監視信号振幅１４２４にあるとき、同一でない（例えば、１５１１、１５１２、および１５１３の長さが異なる）が、全てのセルは、それらがどの行に属しているかに関わらず、Ｖｌｉｑの振幅が中間監視信号振幅１４２４に維持される間、積分する。結果的に、異なる行でのＡＤＣ出力は、分散がより低くなり、それにより行依存効果を低減する。
【００８６】
しかしながら、包括的予備充電信号１５０２を用いる１つの欠点は、包括的予備充電信号１５０２が１４０２と１４０３との間で高に設定されるとき、配列決定データの１組が失われることである。データ点１５０７は、セルバンク内の全てのセルの積分コンデンサ６０８内に蓄えられた電圧がＶｐｒｅ電圧レベルに予備充電されるので、無効である。
【００８７】
図１６は、Ｖｌｉｑが中間監視信号に切り替わろうとしているとき、修正された包括的予備充電信号１６０２が、セルバンクの異なる行内のセルの積分を同期させるために使用されることを示す図である。図１５および図１６は、少数の差異を除いては、同等である。１つの差異は、以下により詳細に説明するように、包括的予備充電信号１６０２の修正である。別の差異は、図１６では配列決定目的に有用であるデータ点１６０７が包括的予備充電信号１６０２によってもはや破損されないことである。
【００８８】
包括的予備充電信号１６０２は、スイッチ６０１を、セルバンク内のセルの全てに渡って、制御するために使用される予備充電信号である。対照的に、リセット信号６０３は、単一のセル、またはセルバンクの単一の列内の唯一のセル内の、スイッチ６０１を制御するために使用される予備充電信号である。図１６に示すように、包括的予備充電信号１６０２は、時間１６２１で高に設定され、セルバンクのセル内の全てのスイッチ６０１を閉路し、その結果、全ての積分コンデンサ６０８が電源Ｖｐｒｅ６０５に接続され、Ｖｐｒｅ電圧レベルに予備充電される。包括的予備充電信号１６０２は次に、時間１６２０で低に設定され、セルバンクのセル内の全てのスイッチ６０１を開路し、その結果、全ての積分コンデンサ６０８が電源Ｖｐｒｅ６０５から切断され、放電が開始され、同時に積分が開始される（積分時間間隔１６１１、１６１２、および１６１３を参照のこと）。
【００８９】
行０の積分時間間隔１６１１が経過したあと、行０内のセルの各々の積分コンデンサ６０８内に蓄えられた電圧が、時間１６１４でＡＤＣ６１０によって読み出され得る。行０が読み出されたあと、行１の積分時間間隔１６１２が経過し、行１内のセルの各々の積分コンデンサ６０８内に蓄えられた電圧が、時間１６１５でＡＤＣ６１０によって読み出され得る。同様に、後続の行は、行６３が時間１６１６で読み出されるまで、順次読み出される。
【００９０】
異なる行の積分時間間隔の長さは、Ｖｌｉｑ１３００が中間監視信号振幅１４２４にあるとき、同一でない（例えば、１６１１、１６１２、および１６１３の長さは異なる）が、全てのセルは、それらがどの行に属しているかに関わらず、Ｖｌｉｑの振幅が中間監視信号振幅１４２４に維持される間、積分する。結果的に、異なる行でのＡＤＣ出力は、分散がより低くなり、それにより行依存効果を低減する。
【００９１】
加えて、配列決定目的に有用であるデータ点１６０７は、包括的予備充電信号１６０２によってもはや破損されない。包括的予備充電信号１６０２は、フレーム１４０２（電圧を監視するステップに先行するフレーム）中の読出しが完了する時間１６２２のあとに起きる時間１６２１で高に設定され、それにより配列決定目的に有用であるデータ点１６０７を保存する。包括的予備充電信号１６０２は次に、時間１６２０で低に設定される。いくつかの実施形態では、時間１６２０は、Ｖｌｉｑ１３００が中間監視振幅１４２４に切り替えられるフレームである、フレーム１４０３と同じ時間である。いくつかの実施形態では、時間１６２０は、フレーム１４０３と実質的に同じ時間であり、フレーム１４０３の直前またはフレーム１４０３の直後の何れかである。
【００９２】
図１７Ａは、脂質膜状態の検出技術の行依存効果を示す図である。図１７Ａでは、下部は、破裂させられた脂質二重層が検出されたときの、セルバンクの異なる行に属するセル内の監視信号に応答する、観察された電圧変化ΔＶＡＤＣのプロットである。ｘ軸上で、行番号０〜６３は、セルバンク１内の行番号０〜６３に対応し、行番号６４〜１２７は、セルバンク２内の行番号０〜６３に対応し、行番号１２８〜１９１は、セルバンク３内の行番号０〜６３に対応し、行番号１９２〜２５５は、セルバンク４内の行番号０〜６３に対応する。ｙ軸上で、監視信号への応答が、ＡＤＣカウントでプロットされている。図１７Ａの下部に示すように、応答信号は、行番号の増大と共に、徐々に増大する。応答信号の大部分は、１５から４０のＡＤＣカウントの辺りに分布する。図１７Ａの上部は、応答信号の分布を示すヒストグラムである。応答信号は、０から約４０のＡＤＣカウントに分布する。
【００９３】
図１７Ｂは、図１６で包括的予備充電信号を使用することによって、行依存効果が、著しく低減されることを示す。図１７Ｂでは、下部は、破裂させられた脂質二重層が検出されたときの、セルバンクの異なる行に属するセル内の監視信号に応答する、観察された電圧変化ΔＶＡＤＣのプロットである。ｘ軸上で、行番号０〜６３は、セルバンク１内の行番号０〜６３に対応し、行番号６４〜１２７は、セルバンク２内の行番号０〜６３に対応し、行番号１２８〜１９１は、セルバンク３内の行番号０〜６３に対応し、行番号１９２〜２５５は、セルバンク４内の行番号０〜６３に対応する。ｙ軸上で、監視信号への応答が、ＡＤＣカウントでプロットされている。図１７Ｂの下部に示すように、応答信号は、行番号の増大と共に、わずかだけ増大する。応答信号の大部分は、４０から６０のＡＤＣカウントの辺りに分布する。図１７Ｂの上部は、応答信号の分布を示すヒストグラムである。応答信号は、４０から約６０のＡＤＣカウントに分布し、約５０のＡＤＣカウントが、最も確からしいＡＤＣ値である。
【００９４】
図１８Ａは、破裂させられた脂質二重層が検出されたときの、セルバンクの異なる行に属するセル内の監視信号に応答する、観察された電圧変化ΔＶＡＤＣのプロットである。図１８Ｂは、破裂させられた脂質二重層が検出されたときの、応答信号の分布を示すヒストグラムである。図１８Ｃは、破裂させられた脂質二重層が検出されなかったときの、セルバンクの異なる行に属するセル内の監視信号に応答する、観察された電圧変化ΔＶＡＤＣのプロットである。図１８Ｄは、破裂させられた脂質二重層が検出されなかったときの、応答信号の分布を示すヒストグラムである。
【００９５】
図１８Ｄに示すように、応答信号は、破裂させられた脂質二重層が検出されないとき、０からおよそ４５のＡＤＣカウントに分布し、図１８Ｂに示すように、応答信号は、破裂させられた脂質二重層が検出されるとき、およそ５５から１２０のＡＤＣカウントに分布する。２つの脂質二重層の状態の応答信号の分布は、互いに重ならないので、検出技術は、脂質二重層が損なわれていないか破裂させられたかを確実に判定するために、使用され得る。
【００９６】
上に開示された検出技術は、多くの利点を有する。監視信号振幅の選択は、Ｖｌｉｑの明／暗振幅の選択から切り離される。ＡＤＣ参照ウィンドウは、核酸配列決定のために用いられる信号の分解能を、監視信号への応答信号を飽和させることなく、増大させるように選択され得る。当技術は、配列決定段階の間であっても、二重層の状態を検出するために、使用され得る。加えて、当技術は、Ｖｌｉｑの変調周波数が１００Ｈｚを超えるとき、二重層の状態を、確実に検出し得る。
【００９７】
上述のように、脂質および溶媒の混合物がまず脂質二重層を形成するためにセル内に堆積されるとき、セルのいくつかは、自然に形成される脂質二重層を有するが、そのセルのいくつかは単に、セルのウェルの各々の全体に広がる、溶媒と組み合わされた脂質分子の複数の層を伴う厚い脂質膜を有するにすぎない。ナノポアベースの配列決定チップの収量（すなわち、適切に形成された脂質二重層およびナノポアを有するナノポアベースの配列決定チップ内のセルの割合）を増加させるために、ナノポアベースの配列決定チップは、追加のセル内の脂質二重層の形成を支援するためにさらなるステップを実行し得る。例えば、その内部にまだ脂質二重層を形成させていないセルへ、電気的な脂質薄膜化刺激を印加するステップは、厚い脂質膜上を液体が流れる効率を向上させ得て、それにより任意の過剰な脂質溶媒の除去を支援し、その結果、厚い脂質膜は、薄膜化され、より効果的に脂質二重層へと移行され得る。その内部にまだ脂質二重層を形成させていないセルへ、電気的な脂質薄膜化刺激を印加するステップはまた、過剰な脂質溶媒を絞り出し、厚い脂質膜を脂質二重層へと薄膜化する結果につながる静電力を発生させ得る。一方、電気的刺激により薄い脂質二重層のいくらかは破壊することになり得るので、その内部に既に脂質二重層を適切に形成させたセルは、同一の電気的な脂質薄膜化刺激にさらに露出させるべきではない。したがって、その内部に脂質二重層を形成させたナノポアベースの配列決定チップ内のセルの部分を、その内部にまだ脂質二重層を適切に形成させていないセルの部分から検出し、分離するために、本出願で説明した非破壊技術を使用することは、有益である。セルを異なるグループに分割することによって、異なるグループのセルは、別々に処理され得て、それにより、より大きな効率を実現し、ナノポアベースの配列決定チップの全体の収量を増大させる。
【００９８】
図１９は、ナノポアベースの配列決定チップのセル内の脂質層を形成する改善された技術のプロセス１９００の一実施形態を示す。いくつかの実施形態では、図１９のナノポアベースの配列決定チップは、複数の図１のセル１００を含む。いくつかの実施形態では、図１９のナノポアベースの配列決定チップは、複数の図５のセル５００を含む。いくつかの実施形態では、図１９のナノポアベースの配列決定チップは、複数の図６Ａおよび６Ｂの回路６００を含む。
【００９９】
プロセス１９００は、ステップを含み、その中では異なるタイプの流体が流動室を介してナノポアベースの配列決定チップのセルを通り流される。著しく異なる特性（例えば、圧縮性、疎水性、および粘性）を有する複数の流体が、ナノポアベースの配列決定チップ表面上のセンサアレイの上を流される。改善された効率のために、アレイ内のセンサの各々は、流体へ安定した方法で露出させられなければならない。例えば、異なるタイプの流体の各々は、流体が、セルの各々の表面を均一に覆い接触するようにチップへ送達され、次に、チップ外に送達され得るように、ナノポアベースの配列決定チップ上を流されなければならない。上述のように、ナノポアベースの配列決定チップは、アレイとして構成される多数のセンサセルを組み込む。ナノポアベースの配列決定チップは、ますます多くのセルを含むために拡大されるので、チップのセル全体を異なるタイプの流体の均一な流れを達成することは、さらに難しくなる。
【０１００】
いくつかの実施形態では、図１９のプロセス１９００を実行するナノポアベースの配列決定システムは、流体をチャネルの長さ方向に沿ったチップの異なるセンサ上を横切るように誘導するヘビ状流体流路を有する改善された流動室を含む。図２０は、液体およびガスが、チップ表面上のセンサの上を通過し接触することを可能にする、シリコンチップを取り囲む改善された流動室を有する、ナノポアベースの配列決定システム２０００の上面図を示す。流動室は、ヘビ状または曲がりくねった流路２００８を備え、それにより、流体をセンサバンク２００６（各バンクが数千のセンサセルを含む）の１つの列（または１つの行）の直上をチップの一方の端部から反対の端部まで流れるように誘導し、次に、流体を繰り返し折り返して、全てのセンサバンクが、少なくとも１回横切られるまで、センサバンクの他の隣接した列の直上を流れるように誘導する。図２０に示すように、システム２０００は、入口２００２および出口２００４を含む。
【０１０１】
図２０を参照すると、流体は、入口２００２を通りシステム２０００内へと誘導される。入口２００２は、管または針であってもよい。例えば、管または針は、１ミリメートルの直径を有し得る。液体またはガスを直接、単一の連続した空間を有する広い流動室内へ給送する代わりに、入口２００２は、液体またはガスをヘビ状流路２００８内へと給送し、それにより、液体またはガスをセンサバンク２００６の単一の列の直上を流れるように誘導する。ヘビ状流路２００８は、上板と、流動室をヘビ状流路になるように仕切る仕切り２０１０とを互いに積層してフローセルを形成し、次に、フローセルをチップの上に取付けることによって、形成され得る。液体またはガス流れは、ヘビ状流路２００８を通過し流れたあとに、液体またはガスは、出口２００４に至るまで導かれ、システム２０００の外に導かれる。
【０１０２】
システム２０００によって、流体が、チップ表面上の全てのセンサの上を、より均一に流れることが可能になる。流路幅は、十分狭く、毛細管現象が効果をもつように構成される。より詳細には、流体と取り囲む表面との間の表面張力（これは流体内の凝集によって生じる）および粘着力が、流体をまとめて保持する役割を果たし、それにより流体または気泡が崩壊しデッド領域が形成されることを防止する。例えば、流路は、１ミリメートルまたはそれより短い幅を有し得る。狭小な流路は、流体の制御された流動を可能にし、先行する流体またはガスの流動からの残余を最小化する。
【０１０３】
図１９を参照すると、１９０２では、塩類／電解質緩衝溶液が、セル内のウェルを塩類緩衝溶液で実質的に充填するために、流動室を介してナノポアベースの配列決定チップのセルを通し流される。塩類緩衝溶液は、以下の、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、グルタミン酸リチウム、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン酸カリウム、酢酸リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、塩化ストロンチウム（ＳｒＣｌ２）、塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、および塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、のうちの１つを含み得る。いくつかの実施形態では、塩類緩衝溶液の濃度は、３００ｍＭ（ミリモル）である。
【０１０４】
１９０４では、脂質および溶媒の混合物が、流動室を介してナノポアベースの配列決定チップのセルを通し流される。いくつかの実施形態では、脂質および溶媒の混合物は、ジフィタノイルホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）などの脂質分子を含む。いくつかの実施形態では、脂質および溶媒の混合物は、デカンまたはトリデカンを含む。脂質および溶媒の混合物がまず脂質二重層を形成するためにセル内に堆積されるとき、セルのいくつかは、自然に形成される脂質二重層を有するが、そのセルのいくつかは単に、セルのウェルの各々の全体に広がる厚い脂質膜（脂質分子の複数の層および共に組み合わされた溶媒を伴う）を有するにすぎない。ナノポアベースの配列決定チップの収量（すなわち、適切に形成された脂質二重層およびナノポアを有するナノポアベースの配列決定チップ内のセルの割合）を増加させるために、ナノポアベースの配列決定チップは、追加のセル内の脂質二重層の形成を支援するために、２つの段階すなわち電気的な脂質薄膜化刺激段階および緩衝液流動段階を繰り返し通過することになる。
【０１０５】
プロセス１９００の電気的な脂質薄膜化刺激段階は、ステップ１９０６、１９０８、および１９１０を含む。いくつかの実施形態では、この段階中、ステップ１９０６、１９０８、および１９１０は、図１９に示すような順序で実行され得る。いくつかの実施形態では、ステップ１９０６、１９０８、および１９１０は、別の順序で実行されてもよい。いくつかの実施形態では、ステップは、同時に実行されてもよい。
【０１０６】
１９０６では、本出願で説明した非破壊技術が使用され、脂質二重層が図６Ａおよび図６Ｂの回路６００を使用してセル内に形成されたか否かを検出する。検出は、脂質膜／二重層と接触するバルク液体に印加される電圧変化（ΔＶｌｉｑ）に応答した積分コンデンサ６０８（ｎｃａｐ）における電圧変化ΔＶＡＤＣを監視することを含む。検出された脂質二重層を有するセルは、検出された脂質二重層を有さないセルと別のグループに分離される。検出された脂質二重層を有するセルの各々の内部で、パスデバイス６０６が、脂質二重層および電極を測定回路６００から切断するために開路され、その結果、電気的な脂質薄膜化刺激のセルへの印加は、無力化される。
【０１０７】
１９０８では、電気的な脂質薄膜化刺激は、ナノポアベースの配列決定チップのセルに印加される。その内部にまだ脂質二重層を形成させていないセルへ、電気的な脂質薄膜化刺激を印加するステップは、厚い脂質膜上を液体が流れる効率を向上させ得て、それにより任意の過剰な脂質溶媒の除去を支援し、その結果、厚い脂質膜は、薄膜化され、より効果的に脂質二重層へと移行され得る。その内部にまだ脂質二重層を形成させていないセルへ、電気的な脂質薄膜化刺激を印加するステップはまた、過剰な脂質溶媒を絞り出し、厚い脂質膜を脂質二重層へと薄膜化する結果につながる静電力を発生させ得る。いくつかの実施形態では、図６Ａおよび図６Ｂの同一の回路６００が、電気的な脂質薄膜化刺激を印加するために使用され得る。脂質二重層検出と脂質薄膜化との間の、回路６００の設定での唯一の違いは、脂質二重層を検出するＶｌｉｑの絶対振幅がより低いことである。例えば、脂質二重層を検出する絶対振幅Ｖｌｉｑは、１００ｍＶ〜２５０ｍＶであり得て、一方、脂質を薄膜化する絶対振幅Ｖｌｉｑは、２５０ｍＶ〜５００ｍＶであり得る。
【０１０８】
ステップ１９１０では、電気的な脂質薄膜化刺激段階が終了したか否かが判定される。いくつかの実施形態では、電気的な脂質薄膜化刺激は、２秒間でその内部に脂質二重層を有するとして検出されなかった任意のセルに印加される。しかしながら、他の所定の期間が同様に用いられてもよい。段階がまだ終了しない場合、プロセス１９００は、時限が終了するまでステップ１９０６および１９０８に再び戻り、そうでない場合、プロセス１９００は、次に塩類緩衝溶液流動段階に進む。
【０１０９】
プロセス１９００の塩類緩衝溶液流動段階は、ステップ１９１２、１９１４、および１９１６を含む。いくつかの実施形態では、この段階中、ステップ１９１２、１９１４、および１９１６は、図１９に示すような順序で実行され得る。いくつかの実施形態では、ステップ１９１２、１９１４、および１９１６は、別の順序で実行されてもよい。いくつかの実施形態では、ステップは、同時に実行されてもよい。
【０１１０】
１９１２では、ステップ１９０６で使用された同様の非破壊技術が使用され、脂質二重層が図６Ａおよび図６Ｂの回路６００を使用してセル内に形成されたか否かを検出する。検出された脂質二重層を有するセルは、検出された脂質二重層を有さないセルと別のグループに分離される。検出された脂質二重層を有するセルの各々の内部で、パスデバイス６０６が、脂質二重層および電極を測定回路６００から切断するために開路される。
【０１１１】
１９１４では、塩類／電解質緩衝溶液が、流動室を介してナノポアベースの配列決定チップのセルを通し流される。塩類緩衝溶液をセル上に流動させる目的は、各セル上の脂質二重層の形成を支援するためである。塩類緩衝溶液がセル上を流動するとき、セル上に堆積される脂質および溶媒の混合物の厚さは、減少し、脂質二重層の形成を支援する。
【０１１２】
１９１６では、塩類緩衝溶液流動段階が終了したか否かが判定される。いくつかの実施形態では、塩類緩衝溶液は、２秒間流動される。しかしながら、他の所定の期間が同様に用いられてもよい。段階がまだ終了しない場合、プロセス１９００は、時限が終了するまでステップ１９１２および１９１４に再び戻り、そうでない場合、プロセス１９００は、ステップ１９１８に進む。
【０１１３】
１９１８では、プロセス１９００の電気的な脂質薄膜化刺激段階および塩類緩衝溶液流動段階が繰り返されるべきか否かが判定される。別の基準が、このステップで用いられてもよい。いくつかの実施形態では、電気的な脂質薄膜化刺激段階および塩類緩衝溶液流動段階は、所定の回数だけ実行される。いくつかの実施形態では、２つの段階は、ナノポアベースの配列決定チップの目標収量に到達するまで繰り返される。いくつかの実施形態では、刺激および緩衝溶液流動による薄膜化の最終回中に形成された脂質二重層を有するとしてまさに検出されたばかりのセルの増加数または割合が、所定の閾値よりも低い場合、プロセス１０００は、終了する。いくつかの実施形態では、２つの段階は、最近印加された電気的な脂質薄膜化刺激レベルが、例えば５００ｍＶの所定の最大閾値に到達するまで繰り返される。
【０１１４】
プロセス１９００は、プロセス１９００の電気的な脂質薄膜化刺激段階および塩類緩衝溶液流動段階が次に繰り返されることになる場合、ステップ１９２０へ進む。ステップ１９２０では、印加されることになる次の電気的な脂質薄膜化刺激が決定される。いくつかの実施形態では、電気的な脂質薄膜化刺激レベルは、例えば１００ｍＶ増加の一定の所定の量だけ増大される。いくつかの実施形態では、最終の繰り返し中に形成された脂質二重層を有するとしてまさに検出されたばかりのセルの増加数または割合が、所定の閾値よりも低い場合、電気的な脂質薄膜化刺激レベルは、一定の所定の量だけ増大され、そうでない場合は、先行の電気的な脂質薄膜化刺激は、有効であると見なされ、したがって、同一の電気的な脂質薄膜化刺激レベルが再び使用される。
【０１１５】
図２１Ａ、２１Ｂ、および２１Ｃは、プロセス１９００の電気的な脂質薄膜化刺激段階および塩類緩衝溶液流動段階が、何回か繰り返されるにつれて、適切に形成された脂質二重層を有するナノポアベースの配列決定チップ内のセル全体の割合（すなわち、ナノポアベースの配列決定チップの収量）が、増大されることを示すヒストグラムである。
各々の図で、ｘ軸は、脂質膜／二重層と接触するバルク液体に印加される電圧変化（ΔＶｌｉｑ）に応答した積分コンデンサ６０８（ｎｃａｐ）における電圧変化ΔＶＡＤＣであり、一方、ｙ軸は、あるΔＶＡＤＣの値域内にそのΔＶＡＤＣ値を有するセル数である。図２１Ａは、異なるΔＶＡＤＣ値を有するセルの初期分布を示す。図２１Ｂは、プロセス１０００の脂質薄膜化刺激段階および塩類緩衝溶液流動段階が何回か繰り返されたあとの、異なるΔＶＡＤＣ値を有するセルの初期分布を示す。図２１Ｃは、プロセス１０００の脂質薄膜化刺激段階および塩類緩衝溶液流動段階がさらに何回か繰り返されたあとの、異なるΔＶＡＤＣ値を有するセルの初期分布を示す。この例では、５０以上のΔＶＡＤＣ値を有するセルは、その内部に形成された脂質二重層を有するとして決定される。図２１Ａに示すように、初期において、少数のセルのみが検出される脂質二重層を有する。図２１Ｂに示すように、プロセス１９００の脂質薄膜化刺激段階および塩類緩衝溶液流動段階が何回か繰り返されたあと、検出される脂質二重層を有するセルの数は、増大する。最終的に、図２１Ｃに示すように、プロセス１９００の脂質薄膜化刺激段階および塩類緩衝溶液流動段階がさらに何回か繰り返されたあと、ナノポアベースの配列決定チップ内のセルの大部分は、検出される脂質二重層を有する。
【０１１６】
図２２は、二重層測定段階、電気的な脂質薄膜化刺激段階、および塩類緩衝溶液流動段階のタイミング図の一実施形態を示す。この例では、脂質がセル内に堆積されたあと、二重層測定段階が開始される。二重層測定段階は、約２秒間継続する。この段階中、セルの全てが有効化される。Ｖｌｉｑの絶対値は、２５０ｍＶである。
【０１１７】
二重層測定段階は、約２秒間継続する電気的な脂質薄膜化刺激段階へと続く。この段階中、ΔＶＡＤＣの絶対値（｜ΔＶＡＤＣ｜）がセル内で閾値１を超えるとき、次に、脂質二重層は、セル内で検出され、セルは、電圧源から切断される。Ｖｌｉｑの絶対値は、２５０〜５００ｍＶである。
【０１１８】
電気的な脂質薄膜化刺激段階は、塩類緩衝溶液流動段階へと続き、後者は、約２〜１０秒間継続する。この段階中、ΔＶＡＤＣの絶対値（｜ΔＶＡＤＣ｜）がセル内で閾値２を超えるとき、次に、脂質二重層は、セル内で検出され、セルは、電圧源から切断される。Ｖｌｉｑの絶対値は、２５０ｍＶである。
【０１１９】
上述した実施形態は、理解の明確性のために多少詳細に記載されてきたが、本発明は、提供された詳細に限定されるものではない。本発明を実施する多くの代替の方法が存在する。開示された実施形態は、例示的であり限定的ではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２】
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