(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む形質転換植物、該植物の種子又は該植物のカルスの作製方法：
（１−１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムを対象の植物体に接触させることによりアグロバクテリウムを接種する工程、
（１−２）植物体を切断する工程、及び
（１−３）目的遺伝子が導入された部位を含む切断した植物体を多湿・暗条件下にして、目的遺伝子が導入された植物体を得る工程、
又は、
（２−１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムを対象の植物体に接触させることによりアグロバクテリウムを接種する工程、
（２−２）植物体を切断する工程、
（２−３）目的遺伝子が導入された部位を含む切断した植物体を多湿・暗条件下にする工程、及び
（２−４）種子を収穫できるまで生育し、目的遺伝子が導入された種子を得る工程、
又は、
（３−１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムを対象の植物体に接触させることによりアグロバクテリウムを接種する工程、
（３−２）接種した植物体を多湿・暗条件下にする工程、
（３−３）植物体を切断する工程、
（３−４）目的遺伝子が導入された部位を含む切断した植物体を多湿・暗条件下にする工程、及び
（３−５）該植物体からカルスを作製する工程、
ここで、該植物体がキヌアであり、かつ、該アグロバクテリウムがMAFF311303株、GV3101株、又はMAFF301276株である、方法。
【請求項２】
前記アグロバクテリウムが、MAFF311303株である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アグロバクテリウムが、MAFF301276株である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
以下の工程を含む形質転換植物、該植物の種子又は該植物のカルスの作製方法：
（１−１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムを対象の植物体に接触させることによりアグロバクテリウムを接種する工程、
（１−２）植物体を切断する工程、及び
（１−３）目的遺伝子が導入された部位を含む切断した植物体を多湿・暗条件下にして、目的遺伝子が導入された植物体を得る工程、
又は、
（２−１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムを対象の植物体に接触させることによりアグロバクテリウムを接種する工程、
（２−２）植物体を切断する工程、
（２−３）目的遺伝子が導入された部位を含む切断した植物体を多湿・暗条件下にする工程、及び
（２−４）種子を収穫できるまで生育し、目的遺伝子が導入された種子を得る工程、
又は、
（３−１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムを対象の植物体に接触させることによりアグロバクテリウムを接種する工程、
（３−２）接種した植物体を多湿・暗条件下にする工程、
（３−３）植物体を切断する工程、
（３−４）目的遺伝子が導入された部位を含む切断した植物体を多湿・暗条件下にする工程、及び
（３−５）該植物体からカルスを作製する工程、
ここで、該アグロバクテリウムが、植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクター及びT-DNA領域を除去したアグロバクテリウムMAFF301276株由来のTiプラスミドが形質転換されたアグロバクテリウムMAFF311303株である、方法。
【請求項５】
さらに工程（１−１）若しくは工程（２−１）の前に、工程（１−１）若しくは工程（２−１）と同時に、又は、工程（１−１）及び工程（１−２）の間若しくは（２−１）及び工程（２−２）の間に、アブシジン酸を対象の植物体に接触させる工程を含む、請求項１〜３のいずれか１に記載の方法。
【請求項６】
病原性アグロバクテリウム株由来のTiプラスミド及びキヌアで目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムMAFF311303株。
【請求項７】
T-DNA領域を除去したアグロバクテリウムMAFF301276株由来のTiプラスミド及び植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムMAFF311303株。
【請求項８】
病原性アグロバクテリウム株由来のTiプラスミド及び植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムMAFF311303株を含む形質転換剤。
【請求項９】
T-DNA領域を除去したアグロバクテリウムMAFF301276株由来のTiプラスミド及び植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムMAFF311303株を含む形質転換剤。
【請求項１０】
アグロバクテリウムMAFF311303株を含むキヌア用形質転換剤。
【請求項１１】
アグロバクテリウムMAFF311303株を含むキヌア用雌性器官特異的形質転換剤。
【請求項１２】
キヌアで目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムMAFF311303株を含むキヌア用形質転換剤。
【請求項１３】
アグロバクテリウムMAFF301276株を含むキヌア用形質転換剤。
【請求項１４】
以下の工程を含む形質転換植物の作製方法：
（１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクター及びT-DNA領域を除去したアグロバクテリウムMAFF301276株由来のTiプラスミドが形質転換されたアグロバクテリウムMAFF311303株を対象の植物体に接触させることによりアグロバクテリウムを接種する工程。
【請求項１５】
以下の工程を含む形質転換植物の作製方法：
（１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクター及びT-DNA領域を除去したアグロバクテリウムMAFF301276株由来のTiプラスミドが形質転換されたアグロバクテリウムMAFF311303株を対象の植物体に接触させることによりアグロバクテリウムを接種する工程、及び
（２）工程（１）の前に、工程（１）と同時に、又は工程（１）の後に、アブシジン酸を対象の植物体に接触させる工程。
【請求項１６】
以下の工程を含む形質転換植物の種子の作製方法：
（１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムを対象の植物体に接触させることによりアグロバクテリウムを接種する工程、及び
（２）工程（１）の前に、工程（１）と同時に、又は工程（１）の後に、アブシジン酸を対象の植物体に接触させる工程、及び
（３）種子を収穫できるまで生育し、目的遺伝子が導入された種子を得る工程、
ここで、該アグロバクテリウムが、植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクター及びT-DNA領域を除去したアグロバクテリウムMAFF301276株由来のTiプラスミドが形質転換されたアグロバクテリウムMAFF311303株である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、形質転換植物の作製方法及び形質転換剤に関する。
本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願2019-053945号優先権を請求する。
【背景技術】
【０００２】
キヌア(Chenopodium quinoa)は、ヒユ科アカザ亜科アカザ属に属するアンデス発祥の異質倍数性植物である。
キヌアの種子は、タンパク質、必須アミノ酸およびミネラルを豊富に含み、米の代替的な存在になりうるとして期待されている（非特許文献１、非特許文献２）。
さらに、キヌアの耐塩性、耐寒性といった優れた環境ストレス耐性は、劣悪環境下での栽培が期待でき（非特許文献３）、国際連合食糧農業機関（FAO）は世界の食料危機の重要な解決手段になり得ると評価した（非特許文献４）。アンデスの重要な食糧であったキヌアは、今や世界へと広がり、研究および商業用栽培が行われている。さらに、キヌアのゲノムが解読されたことを契機に（非特許文献５）、キヌアの優れた環境ストレス耐性に関与する遺伝子の研究が進められている（非特許文献６）。形質転換技術を用いることにより、キヌアにさらなる環境ストレス耐性能力を付与できると考えられる。【０００３】
現在、植物の形質転換法は、細菌のDNA を植物細胞へ組み込む能力を利用したアグロバクテリウム（Rhizobium radiobacter；旧称Agrobacteriumtumefaciens）法が主流となっている。このアグロバクテリウムにより植物細胞へ組み込まれるDNAは、T-DNA（Transferred DNA）と呼ばれ、T-DNAの移行はプラスミド上のvir（virulence）遺伝子群の働きにより行われる。宿主植物の損傷によりフェノール化合物が分泌されると、アグロバクテリウムは植物細胞に誘引され、植物表面に付着する。菌体内では、フェノール化合物を感知したVirAがVirGをリン酸化し、他のvir遺伝子群を活性化する。活性化されたVirD1/D2はプラスミド上のT-DNA領域に切り込みを入れ、その5’末端にVirD2が結合する。さらに、T複合体の保護の役割を担うVirE2が結合する。T鎖とVirD2、VirE2の複合体はVirBの働きにより、植物細胞へと輸送され、植物の核内へ移行し、最終的に染色体へと組み込まれる（非特許文献７）。【０００４】
アグロバクテリウム法による形質転換系の多くは、in vitroの無菌条件下で目的植物に遺伝子導入を行い、薬剤耐性遺伝子を用いて選抜を行う。そして、遺伝子導入細胞を組織培養技術により再分化する必要がある。再分化には、高度な技術や多くの時間を要すること、再分化の過程で遺伝子に変異が生じること、そして、適用できる植物種が制限されるといった欠点がある（非特許文献８）。
キヌアを含むアカザ属においても再分化系を用いたアグロバクテリウムによる形質転換が試みられてきた。バイナリーベクターを用いたキヌア培養細胞への形質転換（非特許文献９）、アカバアカザ（Chenopodium rubrum）実生への超音波（SAAT）法を用いたアグロバクテリウムによる形質転換（非特許文献１０）、そしてアカバアカザおよびミナトアカザ（Chenopodium murale L）のRhizobium rhizogenesによる毛状根誘導が報告されている（非特許文献１１、非特許文献１２）。これらの研究において、スーパービルレンスもしくはハイパービルレンスと呼ばれる形質転換効率が高いアグロバクテリウムA281株が用いられたことにより、遺伝子導入に成功している（非特許文献９、非特許文献１３）。しかし、キヌアの再分化系が確立されておらず、キヌアの形質転換法は未だ確立されていない。【０００５】
タバコで初めての形質転換植物体が報告されて以降（非特許文献１４、非特許文献１５）、モデル植物を中心に、様々な植物で高効率かつ安定的な形質転換系が確立され、植物科学において不可欠な方法となっている。キヌアは潜在的に優れた形質を持つ。そして、未知遺伝子の機能解明や環境的、社会的変化に対応するため、一層優れた形質の付与が望まれる。キヌア研究の進展のために、形質転換法の確立が必須と考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Vega-Galvez A, Miranda M, Vergara J, Uribe E,Puente L, Martinez EA(2010) Nutrition facts and functional potential of quinoa(Chenopodium quinoa willd.), an ancient Andean grain: a review. Journal of theScience of Food and Agriculture 90: 2541-2547
【非特許文献２】Mota C, Santos M, Mauro R, Samman N, MatosAS, Torres D, Castanheira I (2016) Protein content and amino acids profile ofpseudocereals. Food Chemistry 193:55-61
【非特許文献３】Hinojosa L, Gonzalez JA, Barrios-Masias FH,Fuentes F, Murphy KM (2018)Quinoa Abiotic Stress Responses: A Review. Plants7(4)
【非特許文献４】Food and Agriculture Organization of theUnited Nations (2013) State of the Art Report on Quinoa Around the World in 2013.
【非特許文献５】Jarvis DE, Ho YS, Lightfoot DJ, Schmockel SM,Li B, Borm TJ, Ohyanagi H, Mineta K, Michell CT, Saber N, Kharbatia NM, RupperRR, Sharp AR, Dally N, Boughton BA, Woo YH, Gao G, Schijlen EG, Guo X, MominAA, Negrao S, Al-Babili S, Gehring C, Roessner U, Jung C, Murphy K, Arold ST,Gojobori T, Linden CG, van Loo EN, Jellen EN, Maughan PJ, Tester M (2017) Thegenome of Chenopodium quinoa. Nature 542(7641):307-312
【非特許文献６】Morton MJL, Awlia M, Al-Tamimi N, Saade S,Pailles Y, Negrao S, Tester M (2019) Salt stress under the scalpel - dissectingthe genetics of salt tolerance. The Plant Journal 97(1):148-163
【非特許文献７】Zupan JR, Zambryski P (1995) Transfer ofT-DNA from Agrobacterium to the plant cell. Plant Physiol 107(4):1041-1047
【非特許文献８】清水碩, 久保田進, 藤森嶺, (1987) 植物バイオテクノロジー, オーム社
【非特許文献９】Komari T (1990) Transformation of culturedcells of Chenopodiumquinoa by binary vectors that carry a fragment of DNA fromthe virulenceregion of pTiBo542. Plant Cell Reports 9:303-306
【非特許文献１０】Flores Solis J.I, Mlejnek P, Studena K,Prochazka S (2003)Application of sonication-assisted Agrobacterium-mediatedtransformation inChenopodium rubrum L. Plant, Soil and Environment 49:255-260
【非特許文献１１】Mitic N, Dmitrovic S, Djordjevic M,Zdravkovic-Korac S, Nikolic, Raspor M, Djordjevic T, Maksimovic V, Zivkovic S,Krstic-Milosevic D, StanisicM, Ninkovic S, (2012) Use of Chenopodium murale L.transgenic hairy root invitro culture system as a new tool for allelopathicassays. Journal of Plant Physiology 169:1203-1211
【非特許文献１２】Dmitrovic S, Mitic N, Zdravkovic-Korac S,Vinterhalter B, Ninkovic Sand Culafic L.J (2010) Hairy roots formation inrecalcitrant-to-transform plant Chenopodium rubrum. Biologia Plantarum 54(3):566-570
【非特許文献１３】Jin SG, Komari T, Gordon MP, Nester EW(1987) Genes responsible for the supervirulence phenotype of Agrobacteriumtumefaciens A281. Journal of Bacteriology 169(10):4417-4425
【非特許文献１４】Block MD, Herrera-Estrella L, Montagu MV,Schell J, Zambryski1 P(1984) Expression of foreign genes in regenerated plantsand in their progeny. The EMBO Journal 3(8): 1681-1689
【非特許文献１５】Horsch RB, Fraley RT, Rogers SG, Sanders PR,Lloyd A, Hoffmann N(1984) Inheritance of functional foreign genes in plants.Science 223(4635):496-498
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述したような従来の技術の問題を解消するために、本発明は、キヌアの形質転換法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、floral dip法に密閉処理を加えることにより、キヌアの雌性器官に形質転換できることを見出し、さらに、該形質転換によって導入された遺伝子は後代に遺伝させることができることを確認して、本発明を完成した。【０００９】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
１．以下の工程を含む形質転換植物、該植物の種子又は該植物のカルスの作製方法：
（１−１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムを対象の植物体に接触させることによりアグロバクテリウムを接種する工程、
（１−２）植物体を切断する工程、及び
（１−３）目的遺伝子が導入された部位を含む切断した植物体を多湿・暗条件下にして、目的遺伝子が導入された植物体を得る工程、
又は、
（２−１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムを対象の植物体に接触させることによりアグロバクテリウムを接種する工程、
（２−２）植物体を切断する工程、
（２−３）目的遺伝子が導入された部位を含む切断した植物体を多湿・暗条件下にする工程、及び
（２−４）種子を収穫できるまで生育し、目的遺伝子が導入された種子を得る工程、
又は、
（３−１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムを対象の植物体に接触させることによりアグロバクテリウムを接種する工程、
（３−２）接種した植物体を多湿・暗条件下にする工程、
（３−３）植物体を切断する工程、
（３−４）目的遺伝子が導入された部位を含む切断した植物体を多湿・暗条件下にする工程、及び
（３−５）該植物体からカルスを作製する工程。
２．前記アグロバクテリウムが、MAFF301276株又はMAFF311303株である、前項１に記載の方法。
３．前記アグロバクテリウムが、さらにT-DNA領域を除去したアグロバクテリウムMAFF301276株由来のTiプラスミドを形質転換されたアグロバクテリウムである、前項１又は２に記載の方法。
４．前記植物体がキヌアである、前項１〜３のいずれか１に記載の方法。
５．前記植物体がキヌア変異体ghy又はキヌア変異体ghy/rebcである、前項１〜４のいずれか１に記載の方法。
６．  さらに工程（１−１）若しくは工程（２−１）の前に、工程（１−１）若しくは工程（２−１）と同時に、又は、工程（１−１）及び工程（１−２）の間若しくは（２−１）及び工程（２−２）の間に、アブシジン酸を対象の植物体に接触させる工程を含む、前項１〜５のいずれか１に記載の方法。
７．T-DNA領域を除去したアグロバクテリウムMAFF301276株由来のTiプラスミド及び植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムMAFF311303株を含む形質転換剤。
８．アグロバクテリウムMAFF311303株を含む雌性器官特異的形質転換剤。
９．アブシジン酸を含むアグロバクテリウムを使用した植物用形質転換補助剤。
１０．アグロバクテリウムMAFF301276株を含むキヌア用形質転換剤。
１１．以下の工程を含む形質転換植物の作製方法：
（１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクター及びT-DNA領域を除去したアグロバクテリウムMAFF301276株由来のTiプラスミドが形質転換されたアグロバクテリウムMAFF311303株を対象の植物体に接触させることによりアグロバクテリウムを接種する工程。
１２．以下の工程を含む形質転換植物の作製方法：
（１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムを対象の植物体に接触させることによりアグロバクテリウムを接種する工程、及び
（２）工程（１）の前に、工程（１）と同時に、又は工程（１）の後に、アブシジン酸を対象の植物体に接触させる工程。
１３．以下の工程を含む形質転換植物の作製方法：
（１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクター及びT-DNA領域を除去したアグロバクテリウムMAFF301276株由来のTiプラスミドが形質転換されたアグロバクテリウムMAFF311303株を対象の植物体に接触させることによりアグロバクテリウムを接種する工程、及び
（２）工程（１）の前に、工程（１）と同時に、又は工程（１）の後に、アブシジン酸を対象の植物体に接触させる工程。
１４．前記アグロバクテリウムが、MAFF301276株又はMAFF311303株である、前項１２に記載の方法。
１５．以下の工程を含む形質転換植物の種子の作製方法：
（１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムを対象の植物体に接触させることによりアグロバクテリウムを接種する工程、及び
（２）工程（１）の前に、工程（１）と同時に、又は工程（１）の後に、アブシジン酸を対象の植物体に接触させる工程、及び
（３）種子を収穫できるまで生育し、目的遺伝子が導入された種子を得る工程。
１６．前記アグロバクテリウムが、MAFF301276株又はMAFF311303株である、前項１５に記載の方法。
１７．前記植物体がキヌアである、前項１１〜１６のいずれか１に記載の方法。
１８．前記植物体がキヌア変異体ghy又はキヌア変異体ghy/rebcである、前項１１〜１７のいずれか１に記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、形質転換植物の作製方法及び形質転換剤を提供することができた。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】GUS発現個体計測方法。
【図２】種まき培土で生育したKd系統。（a）キヌア全長；（b）穂；（c）本葉。スケールバーは1cmを示している。
【図３】種まき培土で生育した変異体ghy。（a）キヌア全長；（b）穂；（c）本葉。スケールバーは1cmを示している。
【図４】種まき培土で生育した変異体rebc。（a）キヌア全長；（b）穂；（c）本葉。スケールバーは1 cmを示している。
【図５】種まき培土で生育した変異体ghy/rebc。（a）キヌア全長；（b）穂；（c）本葉。スケールバーは1cmを示している。
【図６】本実施例に用いたベクター一覧。Bar：ビアラホス耐性遺伝子、Gus：β-グルクロニダーゼ遺伝子、CqCYP76AD1-1：キヌアベタレイン合成関連遺伝子、HPT：ハイグロマイシン耐性遺伝子、35S-P：CaMV 35Sプロモーター、35S-T：CaMV 35Sターミネーター、NOS-T：NOSターミネーター、RB：rightborder、LB：left border。
【図７】設計したプライマーの位置。矢印（1-5）は、設計したプライマー（1-5）の位置を示している。
【図８】floral dip実験（切断・密閉処理−）を行ったキヌア穂のGUS非発現。
【図９】floral dip法（切断・密閉処理＋）を行ったキヌア穂のGUS発現。
【図１０】Kd系統の雌性器官におけるGUS発現。（a）非感染個体の雌性器官；（b）GUS発現が認められた雌性器官。
【図１１】floral dip法を改良した「floraldip切断密閉法」の手順。切断・密閉処理（−）の区においては感染処理後2週目にGUS染色を実施した。切断・密閉処理（+）の区においては感染処理後2週間目に切断・密閉処理を行い、その後、GUS染色を実施した。
【図１２】アグロバクテリウム7菌株を感染したKd系統胚軸切片より誘導したカルス。（a）GV3101株を感染したカルス；（b）ATCC15834株を感染したカルス；（c）MAFF301276株を感染したカルス；（d）MAFF212033株を感染したカルス；（e）MAFF311303株を感染したカルス；（f）MAFF211729株を感染したカルス；（g）MAFF663001株を感染したカルス。図は感染処理後6週目のカルスである。スケールバーは1cmを示している。
【図１３】アグロバクテリウム7菌株を感染したKd系統胚軸切片より誘導したカルスのGUS発現。（a）GV3101株を感染したKd系統形質転換カルス；（b）MAFF301276株を感染したKd系統形質転換カルス。GUS染色は感染処理後6週目のカルスに実施した。スケールバーは1cmを示している。
【図１４】アグロバクテリウム7菌株を感染したKd系統胚軸切片の形質転換カルス形成率。GUS染色は感染処理後6週目のカルスに実施した。＊＊は、1％水準で統計的に有意な差があることを示している（T検定）。グラフは、キヌアの胚軸切片（n=30）を供試した3回の感染実験の平均値±標準偏差を示している。
【図１５】アグロバクテリウムGV3101株を感染したキヌア胚軸切片より誘導したカルス。（a）Kd系統カルス；（b）85系統カルス；（c）108系統カルス；（d）変異体rebcカルス（胚軸切片）；（e）変異体ghyカルス；（f）変異体ghy/rebcカルス（胚軸切片）。図は感染処理後6週目のカルス（胚軸切片）である。スケールバーは1cmを示している。
【図１６】アグロバクテリウムGV3101株を感染したキヌア胚軸切片より誘導したカルスのGUS発現。（a）85系統カルス；（b）変異体rebcカルス；（c）変異体ghyカルス。GUS染色は感染処理後6週目のカルスに実施した。スケールバーは1 cmを示している。
【図１７】アグロバクテリウムGV3101株を感染したキヌア6系統の形質転換カルス形成率。GUS染色は感染処理後6週目のカルスに実施した。グラフは、キヌアの胚軸切片（n=30）を供試した3回の感染実験の平均値±標準偏差を示している。
【図１８】アグロバクテリウムMAFF301276株を感染したキヌア胚軸切片より誘導したカルス。（a）Kd系統カルス；（b）85系統カルス；（c）108系統カルス；（d）変異体rebcカルス；（e）変異体ghyカルス；（f）変異体ghy/rebcカルス。図は感染処理後6週目のカルス（胚軸切片）である。スケールバーは1cmを示している。
【図１９】アグロバクテリウムMAFF301276株を感染したキヌア胚軸切片より誘導したカルスのGUS発現。（a）Kd系統カルス；（b）85系統カルス；（c）108系統カルス；（d）変異体rebcカルス；（e）変異体ghyカルス；（f）変異体ghy/rebcカルス。GUS染色は感染処理後6週目のカルスに実施した。スケールバーは1cmを示している。
【図２０】アグロバクテリウムMAFF301276株を感染したキヌア6系統の形質転換カルス形成率。GUS染色は感染処理後6週目のカルスに実施した。グラフは、キヌアの胚軸切片（n=30）を供試した3回の感染実験の平均値±標準偏差を示している。
【図２１】アグロバクテリウムMAFF301276株により変異体ghy/rebc実生に誘導された癌腫。（a）バイナリーベクターpCAMBIA1301を保有する菌株を感染した実生；（b）バイナリーベクターpCAMBIA-CqCYP76AD1-1を保有する菌株を感染した実生。図は感染処理後6週目の実生である。スケールバーは1 cmを示している。
【図２２】MAFF301276pTiプラスミドおよびpCAMBIA1301由来プラスミドのキヌアゲノムへの導入様式。バイナリーベクターpCAMBIA1301のT-DNA領域とMAFF301276株由来のT-DNAが融合した形でキヌアゲノム挿入されている。
【図２３】キヌア4系統および7菌株を用いたfloral dip切断密閉法により、雌性器官におけるGUS発現が認められた個体の割合。（a）切断・密閉処理（−）のGUS染色結果；（b）切断・密閉処理（＋）のGUS染色結果。計測方法は図１に記す。
【図２４】floral dip切断密閉実験を行ったKd系統キヌア。（a）MAFF301276株によりGUS発現が認められたがく；（b）MAFF311303株によりGUS発現が認められた雌性器官。矢印はキヌアの雌性器官を示している。
【図２５】MAFF311303株を用いてfloral dip切断密閉実験を行ったKd系統。（a）GUS染色前のキヌア；（b）GUS染色後のキヌア；（c）GUS発現が認められた雌性器官。スケールバーは1cmを示している。矢印はキヌアの雌性器官を示している。
【図２６】キヌア4系統および7菌株を用いたfloral dip切断密閉法により，穂におけるGUS発現が認められた個体の割合。（a）切断・密閉処理（−）のGUS染色結果；（b）切断・密閉処理（＋）のGUS染色結果。計測方法は図 2に記す。
【図２７】MAFF311303pTi301276ΔT-DNAを用いてfloral dip実験を行った変異体ghy。（a）GUS染色前のキヌア；（b）GUS染色後のキヌア；（c）GUS発現が認められた雌性器官。スケールバーは（a）及び（b）は1 cm、（c）は1 mmを示している。
【図２８】MAFF311303pTi301276ΔT-DNAを用いてfloral dip実験を行った変異体ghy/rebc。（a）GUS染色前のキヌア；（b）GUS染色後のキヌア；（c）GUS非発現の雌性器官；（d）GUS発現が認められた雌性器官。スケールバーは（a）及び（b）は1 cm、（c）及び（d）は1 mmを示している。
【図２９】MAFF311303pTiMAFF301276ΔT-DNAを用いたfloral dip実験により雌性器官のGUS染色が認められた個体の割合。キヌア４系統を用いて感染実験を行い、各系統10個体をGUS染色に供試した。キヌア系統名上もしくはグラフ上に示す数字は、雌性器官においてGUS発現が認められた個体の割合を示している。
【図３０】MAFF311303pTiMAFF301276ΔT-DNAおよび500 mMのABA を用いたfloraldip実験を行った変異体ghy/rebc。（a）GUS染色前のキヌア；（b）GUS染色後のキヌア；（c）及び（d）GUS発現が認められた雌性器官。スケールバーは（a）及び（b）は1 cm、（c）及び（d）は1 mmを示している。
【図３１】MAFF311303pTiMAFF301276ΔT-DNAおよび500 mMのABAを用いたfloraldip実験により雌性器官のGUS染色が認められた個体の割合。キヌア４系統を用いて感染実験を行い、各系統10個体をGUS染色に供試した。キヌア系統名上もしくはグラフ上に示す数字は、雌性器官においてGUS発現が認められた個体の割合を示している。
【図３２】GV3101株を用いて感染したKd系統および変異体ghyの実生切片より誘導したカルス。（a）Kd系統カルス、（b）変異体ghyカルス、（c）Kd系統カルスのGUS発現、（d）変異体ghyカルスのGUS発現。GUS染色は感染処理後6週目に実施した。スケールバーは1 cmを示している。
【図３３】アグロバクテリウム6菌株を感染したKd系統実生のGUS発現。（a）ATCC15834株を感染した実生；（b），（c）MAFF301276株を感染した実生；（d）MAFF212033株を感染した実生；（e）MAFF311303株を感染した実生；（f）MAFF211729株を感染した実生；（g）MAFF663001株を感染した実生。GUS染色は感染処理後5週目の実生に実施した。スケールバーは1 cmを示している。
【図３４】floral dip切断・密閉法によるrebc変異体キヌアへの野生型REBC遺伝子の形質転換の概要。
【図３５】floral dip切断・密閉法によるrebc変異体キヌアへの野生型REBC遺伝子の形質転換の結果。上段はブラッダーをもつ野生型の表現型である形質転換体（rebc変異相補個体）、下段は野生型及びrebc変異体を示す。形質転換体でブラッダーが復活した。
【図３６】形質転換体のREBC遺伝子の配列決定の結果。
【図３７】形質転換体の次世代シークエンサーを用いた解析の結果。目的遺伝子のキヌアゲノムへの導入を確認した。
【図３８】形質転換体後代の表現型調査の結果。上段は形質転換体（後代）、下段は野生型及びrebc変異体を示す。上段左側の形質転換後代はブラッダーをもつ野生型（導入遺伝子あり）であり、上段右側の形質転換後代はrebc変異型（導入遺伝子なし）であった。形質転換体の表現型は遺伝することを確認した。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の形質転換植物の作製方法（floral dip切断密閉法）は、（１）植物体を切断することによりアグロバクテリウムが感染しやすくする、（２）植物体を密閉容器内等に設置することにより多湿条件を保ち、多湿にすることによりアグロバクテリウムの生育・増殖を高め、アグロバクテリウムを感染しやすくさせる、（３）暗条件にすることにより、植物体のアグロバクテリウムに対する抵抗性および生育を低下させ、アグロを感染しやすくさせると共に光による切断した植物体への損傷を抑える、ことを目的とする方法である。すなわち、（１）〜（３）のいずれか１、２又は全部を実施することができれば方法・工程は特に限定できない。
【００１３】
［本発明の形質転換植物の作製方法］
本発明の形質転換植物の作製方法は、以下のいずれか１以上を対象とする。
（floral dip切断密閉法）
以下の工程を含む形質転換植物、該植物の種子又は該植物のカルスの作製方法：
（１−１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子、又は目的遺伝子及び薬剤耐性遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムを対象の植物体に接触させることによりアグロバクテリウムを接種する工程、
（１−２）植物体を切断する工程、及び
（１−３）目的遺伝子が導入された部位を含む切断した植物体を多湿・暗条件下にして、目的遺伝子が導入された植物体を得る工程、
又は
（２−１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子、又は目的遺伝子及び薬剤耐性遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムを対象の植物体に接触させることによりアグロバクテリウムを接種する工程、
（２−２）植物体を切断する工程、
（２−３）目的遺伝子が導入された部位を含む切断した植物体を多湿・暗条件下にする工程、及び
（２−４）種子を収穫できるまで生育し、目的遺伝子が導入された種子を得る工程。
【００１４】
工程（１−１）及び／又は（２−１）の対象の植物体は、発芽後の日数は特に限定されない。栽培条件によっても異なるが、発芽後１０〜１００日、３０〜６０日でもよく、発芽後４０〜５０日が好ましい。
工程（１−１）及び／又は（２−１）の「接触させることによりアグロバクテリウムを接種」は、前記アグロバクテリウムを対象の植物体に接触することで植物体内に導入する。接触方法は、特に限定されないが、例えばアグロバクテリウムを液体（例えば滅菌水、スクロース溶液。例えばSilwet L-77等の任意の添加物を含んでもよい）に懸濁した菌懸濁液を植物体の雌性器官（例えば穂）に滴下する、植物体の雌性器官を浸漬する、あるいは該菌懸濁液を植物体の雌性器官に噴霧又は塗布することにより接触させる。
アグロバクテリウムは、懸濁前に例えばＬＢ培地等の液体培地で任意のＯＤ（例えばOD600:約2.0）まで培養し、遠心分離により集菌したものを用いてもよい。
工程（１−１）及び／又は（２−１）のアグロバクテリウムは、さらにT-DNA領域を除去したアグロバクテリウムMAFF301276株由来のTiプラスミドを形質転換されていてもよい。
前記形質転換植物の作製方法は、さらに工程（１−１）及び／又は（２−１）の前に、工程（１−１）及び／又は（２−１）と同時に、又は工程（１−１）及び／又は（２−１）と工程（１−２）及び／又は（２−２）の間に、アブシジン酸を対象の植物体に接触させる工程を含んでもよい。
【００１５】
工程（１−３）及び／又は（２−３）の「多湿・暗条件下にする」は、アグロバクテリウムを接触した植物体を以下のような多湿・暗条件下にできればよく、例えば以下のような多湿・暗条件下において放置、設置又は撹拌してもよく、好ましくは以下のような多湿・暗条件下において放置する。
多湿（多湿条件）とは、湿度５０％以上であればよく、湿度９０％〜１００％が好ましい。
暗条件とは、特に限定されないが、例えば０〜０．５ルクス、０〜１ルクス、０〜２ルクス等の植物にダメージがなく抵抗性が低下する暗さが挙げられる。
多湿・暗条件を実現する方法は特に限定されないが、密閉容器等の通気性の低い容器内に植物体と水を設置（放置）することにより多湿かつ暗条件にすることが好ましく、密閉容器内に植物体（植木鉢、土、肥料等を含んでもよい）を設置し、密閉容器内に5 mL〜5000 mL、10 mL〜2000 mL、50 mL〜1000mL、100 mL〜1000 mL又は500 mL〜1000 mLの水を張ることがより好ましい。
密閉容器は、容器内の湿度を９０〜１００％に保持できかつ暗所にできれば特に限定されないが、例えばミッペール（富士システムパック）等のゴムパッキンにより密閉された容器が挙げられる。
多湿・暗条件下にする温度は、植物が生存可能な温度であれば特に限定されないが、１５℃〜３０℃が好ましく、２０℃〜２５℃がより好ましく、約２２℃が最も好ましい。
多湿・暗条件下にする期間は、特に限定されないが、１時間〜２週間、１２時間〜１週間でもよく、１〜６日間が好ましく、１〜５日間がより好ましく、１〜４日間がさらに好ましい。
【００１６】
本発明の形質転換植物の作製方法は、工程（１−１）と工程（１−２）の間、工程（２−１）と工程（２−２）の間に、「該植物体を任意の条件で生育する工程」をさらに含んでもよい。「任意の条件で生育」は、植物体を目的遺伝子が発現するまで生育させることができれば特に限定されないが、好ましくは蕾がつくまで生育する。
生育の温度条件は、植物が生存可能な温度であれば特に限定されないが、１５℃〜３０℃が好ましく、２０℃〜２５℃がより好ましく、約２２℃が最も好ましい。
生育の明暗条件は、植物が生存可能であれば特に限定されない。例えば、８〜１６時間明条件（Light条件）／１６〜８時間暗条件（Dark条件）、９〜１３時間明条件（Light条件）／１５〜１１時間暗条件（Dark条件）であってもよく、１１時間明条件／１３時間暗条件が好ましい。
【００１７】
工程（１−２）及び／又は（２−２）の「植物体を切断する工程」は特に限定されないが、目的遺伝子を導入された部位及び／又は雌性器官（例えば穂）を含むように切断することが好ましい。目的遺伝子を導入された部位及び／又は雌性器官（例えば穂）を含むように切断する方法として、例えば植物体を茎中心付近で切断してもよく、好ましくは植物体を茎の先端（茎頂）から８〜１５ｃｍを含むように切断する。
【００１８】
工程（２−４）の「種子を収穫できるまで生育」は、植物体を、種子を収穫できるまで生育させることができれば特に限定されないが、得られる種子の数を増やす観点から受粉させる工程を含むことが望ましい。受粉は、自家受粉及び他家受粉を含み、好ましくは他家受粉である。
生育の温度条件は、植物体を種子を収穫できるまで生育させることが可能な温度であれば特に限定されないが、１５℃〜３０℃が好ましく、２０℃〜２５℃がより好ましく、約２２℃が最も好ましい。
生育の明暗条件は、植物体を種子を収穫できるまで生育させることが可能であれば特に限定されない。例えば、８〜１６時間明条件（Light条件）／１６〜８時間暗条件（Dark条件）、９〜１３時間明条件（Light条件）／１５〜１１時間暗条件（Dark条件）であってもよく、１１時間明条件／１３時間暗条件が好ましい。
工程（２−４）の「目的遺伝子が導入された種子」は、細胞内、好ましくはゲノム内に目的遺伝子の塩基配列を含む核酸分子を有すれば特に限定されないが、目的遺伝子のホモ接合体及び／又はヘテロ接合体を含む。
本発明の形質転換植物の作製方法は、工程（２−４）の後に、「目的遺伝子が導入された種子から目的遺伝子のホモ接合体を含む種子を選抜する工程を含んでもよい。
【００１９】
（floral dip非切断密閉法１）
以下の工程を含む形質転換植物の作製方法：
（１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子、又は目的遺伝子及び薬剤耐性遺伝子を担持した発現ベクター及びT-DNA領域を除去したアグロバクテリウムMAFF301276株由来のTiプラスミドが形質転換されたアグロバクテリウムMAFF311303株を対象の植物体に接触させることにより菌を接種する工程。
【００２０】
（floral dip非切断密閉法２）
以下の工程を含む形質転換植物の作製方法：
（１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子、又は目的遺伝子及び薬剤耐性遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムを対象の植物体に接触させることにより菌を接種する工程、及び
（２）工程（１）の前に、工程（１）と同時に、又は工程（１）の後に、アブシジン酸を対象の植物体に接触させる工程。
【００２１】
（floral dip非切断密閉法３）
以下の工程を含む形質転換植物の作製方法：
（１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子、又は目的遺伝子及び薬剤耐性遺伝子を担持した発現ベクター及びT-DNA領域を除去したアグロバクテリウムMAFF301276株由来のTiプラスミドが形質転換されたアグロバクテリウムMAFF311303株を対象の植物体に接触させることにより菌を接種する工程、及び
（２）工程（１）の前に、工程（１）と同時に、又は工程（１）の後に、アブシジン酸を対象の植物体に接触させる工程。
【００２２】
［本発明の形質転換剤、形質転換補助剤］
本発明は、以下の形質転換剤を対象とする。
T-DNA領域を除去したアグロバクテリウムMAFF301276株由来のTiプラスミド及び植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子及び薬剤耐性遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムMAFF311303株を含む形質転換剤。
また、本発明は、アブシジン酸を含むアグロバクテリウムを使用した植物用形質転換補助剤も対象とする。
アブシジン酸を含むアグロバクテリウムを使用した植物用形質転換補助剤は、アグロバクテリウムを用いた植物の形質転換法（例えばfloral dip法）に使用できる。使用態様は特に限定されないが、アグロバクテリウムを対象の植物体に接触させることにより菌を接種する工程の前、同時、又は後に、アブシジン酸を含む植物用形質転換補助剤を対象の植物体に接触させることにより使用できる。例えば、目的遺伝子を有するアグロバクテリウムを含む懸濁液に、アブシジン酸を含む植物用形質転換補助剤を混合し、混合液を形質転換する植物体に接触、塗布又は噴霧することにより形質転換できる。
【００２３】
（植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター）
植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーターは、特に限定されないが、例えば、CaMV 35Sプロモーター、アグロバクテリウム由来のプロモーター（例えばNos (Nopaline synthase) promoter等）、薬剤誘導プロモーター（例えばアルコール脱水素酵素（alcA）プロモーター、UASプロモーター等）、植物遺伝子のプロモーター（例えばユビキチンプロモーター等）等が挙げられ、好ましくはCaMV 35Sプロモーターである。
【００２４】
（目的遺伝子）
目的遺伝子は、植物細胞内で発現可能な遺伝子であれば、特に限定されない。例えば、塩ストレス等の環境ストレス耐性遺伝子、ベタレイン色素等の有用2次代謝物質合成酵素遺伝子、開花誘導遺伝子、草丈を制御する遺伝子、エタノールで活性化される転写因子遺伝子、エストロジェンで転写活性される転写因子遺伝子、デキサメタゾンで活性化される転写因子遺伝子等の有用遺伝子が挙げられる。有用遺伝子は、ゲノム編集や目的遺伝子の過剰発現及び／又は発現抑制等を行うことにより単離・利用できる。
【００２５】
（薬剤耐性遺伝子）
薬剤耐性遺伝子は、形質転換植物から目的遺伝子が導入された種子の選抜ができれば特に限定されないが、例えばハイグロマイシン耐性遺伝子（hygromycin phosphotransferase；HPT）、ビアラホス（ビアラフォス）耐性遺伝子（phosphinothricinN-acetyltransferase；Bar）、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００２６】
（発現ベクター）
発現ベクターは、植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター及び薬剤耐性遺伝子を担持した発現ベクターであれば、特に限定されない。例えば、pCAMBIA1301、pCAMBIA-CqCYP76AD1-1、pBIC35BP、pBI121、pER8、pTA70001、pBICERToMV等が挙げられるが、pCAMBIA1301が好ましい。
発現ベクターの植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を挿入することにより、植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子及び薬剤耐性遺伝子を担持した発現ベクターを作製できる。
【００２７】
（アグロバクテリウム）
アグロバクテリウムは、発現ベクターを植物細胞内に組み込む能力を有する。アグロバクテリウムは、発現ベクターを好ましくは核内に、より好ましくは染色体に、組み込む能力を有する。
本発明に使用するアグロバクテリウムは特に限定されないが、例えばRhizobium radiobacter（例えばGV3101株（参照：Bioimpacts. 2017;7(4):247-254.doi: 10.15171/bi.2017.29. Epub 2017 Sep 18.）、MAFF301276株、MAFF212033株、MAFF311303株等（農業生物資源ジーンバンクhttps://www.gene.affrc.go.jp/databases-micro_search.phpにてMAFF番号から検索可能））、Rhizobiumrhizogenes（例えばATCC15834株（アメリカ・タイプカルチャーコレクションから入手可能）、MAFF211729株等）およびRhizobium vitis（例えばMAFF663001株等）等が挙げられ、floral dip切断密閉法及びfloral dip非切断密閉法においてMAFF301276株、MAFF311303株が好ましい。後述する実施例において、MAFF301276はキヌア植物において他の菌株よりきわめて高い形質転換能力を持つこと、MAFF311303は非病原性にもかかわらず雌性器官にのみ特異的に感染できることを確認した。
本発明の形質転換作製方法は、２種類のアグロバクテリウム株を混合して用いてもよい。
２種類のアグロバクテリウム株の組み合わせは、特に限定されないが、floral dip切断密閉法では、Kd系統においてはGV3301株×ATCC15834株、GV3301株×MAFF211729株、GV3301株×MAFF663001株、MAFF212033株×MAFF311303株、MAFF311303株×MAFF211729株が好ましく、変異体ghy又は変異体ghy/rebcにおいてはGV3301株×MAFF311303株、MAFF301276株×MAFF311303株、MAFF311303株×MAFF211729株、MAFF211729株×MAFF663001株が好ましい。
【００２８】
（対象の植物体）
本発明の形質転換植物の作製方法及び本発明の形質転換剤を使用する対象の植物体は、特に限定されない。例えば、被子植物、裸子植物、双子葉植物、単子葉植物、ヒユ科植物、イネ科植物、アカザ属植物、キヌア（Chenopodium quinoa）、イネ、オオムギ、コムギ、ホウレンソウ、ビート、シロイヌナズナ、アマランサス、シロザ、タルウマゴヤシ等が挙げられ、被子植物が好ましく、キヌアがより好ましい。
キヌアは、特に限定されないが、Kd系統、85系統、108系統、変異体green hypocotyl（ghy）（Imamura T, Takagi H, Miyazato A, OhkiS, Mizukoshi H, Mori M (2018)Biochemical and Biophysical ResearchCommunications 496(2):280-286）、変異体reducedepidermalbladder cells 1（rebc：全長482アミノ酸残基からなり、139から432番目まで領域にWD40ドメインを持つタンパク質（Acc.No. XP_021715187）をコードするREBC遺伝子の1139番目のG(グアニン)がA(アデニン)に変化することにより380番目のアミノ酸であるTrp(トリプトファン)がSTOPに変化している変異体）、並びに、ghyおよび変異体rebcを交配して得た変異体ghy/rebcであってもよく、変異体ghy、変異体ghy/rebcが好ましい。
【００２９】
（T-DNA領域を除去したアグロバクテリウムMAFF301276株由来のTiプラスミド）
T-DNA領域を除去したアグロバクテリウムMAFF301276株由来のTiプラスミドは、T-DNA領域が除去されていれば特に限定されない。
【実施例】
【００３０】
以下に具体例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されない。【００３１】
［植物材料］
本実施例で用いたキヌアKd系統は京都大学、85系統および108系統はU.S. Department of Agriculture（USDA）（Independence Avenue、 Washington DC、 USA）から入手した。また、108系統由来のEMS突然変異種子（M1）を、M3世代が得られるまで生育し、その中からgreen hypocotyl（ghy）（Imamura T, Takagi H, Miyazato A, OhkiS, Mizukoshi H, Mori M (2018) Biochemicaland Biophysical ResearchCommunications 496(2):280-286）およびreduced epidermal bladder cells（rebc）を得た。さらに変異体ghyおよび変異体rebcを交配しghy/rebcを作出した（図２〜図５）。【００３２】
［菌株およびプラスミド］
実験に使用した菌株は、Rhizobium radiobacter（GV3101株、MAFF301276株、MAFF212033株、MAFF311303株）、Rhizobium rhizogenes（ATCC15834株、MAFF211729株）およびRhizobium vitis（MAFF663001株）の7菌株を使用した（表１）。本実施例で新たに使用したMAFF301276株、MAFF212033株、MAFF311303株、MAFF211729株、MAFF663001株は、農業生物資源ジーンバンク（つくば、日本）より入手した日本産の野生株である。
バイナリーベクターpBIC35BP（Mori M,Kaindo M, Okuno T, Frusawa I (1993) Federation BiochemicalSocieties336(1):171-174）はカリフラワーモザイクウイルス（Cauliflower mosaic virus：CaMV）の35Sプロモーター制御下にビアラホス耐性遺伝子（phosphinothricin N-acetyltransferase；Bar）、バイナリーベクターpCAMBIA1301はCaMV 35Sプロモーター制御下にイントロン-gusA遺伝子（β-glucuronidase；GUS ）（Jefferson RA,Kavanagh TA, Bevan MW(1987) The EMBO Journal 6(13):3901-3907）およびハイグロマイシン耐性遺伝子（hygromycinphosphotransferase；HPT）、バイナリーベクターpCAMBIA-CqCYP76AD1-1は、CaMV 35Sプロモーター制御下にベタレイン色素合成関連遺伝子CqCYP76AD1-1を保有する（図６）（Imamura T, Takagi H,Miyazato A, Ohki S, Mizukoshi H, Mori M (2018) Biochemicaland BiophysicalResearch Communications 496(2):280-286）。MAFF301276株にはバイナリーベクターpCAMBIA1301およびバイナリーベクターpCAMBIA-CqCYP76AD1-1、その他の6菌株にはバイナリーベクターpCAMBIA1301をtriparental mating法（Wise AA, Liu Z,Binns AN(2006) Methods in Molecular Biology 343:43-53）により形質転換し、感染実験に使用した。【００３３】
【表１】
0006876877.tif 000002
本実施例に用いた菌株一覧。GV3101株およびATCC15834株を除く5菌株は日本産の野生株である。（Ti）はTiプラスミド、（Ri）はRiプラスミドを保持することを示している。また、（nonpasogenic）は非病原性であることを示している。【００３４】
［組織培養技術を用いた実験］
（無菌キヌア植物体の育成）
キヌア種子（約10粒）を、1 mLの滅菌溶液（20 ml/L Plant Preservative Mixture；PPM（Plant Cell Technology、 Jefferson、 Washington DC、 USA）、20 ml/L Tween20、1 ml/L 1 M MgCl2）に入れ、プチローター（ワケンビーテック、京都、日本）を用いて6時間攪拌した（1.5 mLエッペンチューブ使用）。その後、チューブ中の滅菌溶液を除去し、同じ組成の滅菌溶液を500 μL加え、ピペットを用いて攪拌し洗浄した。同様の操作を1回行った後、クリーンベンチ内で発芽培地へ置床した（表２）。そして20℃、8時間Light/16時間Dark条件下で生育した。 【００３５】
【表２】
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培地組成。＊1は2,4-ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-dichlorophenoxyacetic acid）を示す。MS培地を基本として用いた。pHは5.9に調整した。液体培地はゲルライト無添加。【００３６】
（アグロバクテリウムによる癌腫形成の誘導）
実験に用いた菌株は、100 mg/Lカナマイシンおよび100mg/Lハイグロマイシンを添加したLB固形培地に画線を引き、26℃、24時間Dark条件下で2日間培養した（表３）。増殖した菌を、白金耳を用いて100 mg/Lカナマイシンおよび100 mg/Lハイグロマイシンを添加した50 mL LB液体培地（300 mL三角フラスコ使用）へ移植し、振とう式恒温水槽BW201（ヤマト科学、東京、日本）を用いて、26℃、約24時間、約130 rpmの条件で培養した（表２）。培養後、菌培養液（OD600＝約2.0）を50 mL コニカルチューブに移し、Mx-301 Highspeed Refrigerated Micro Centrifuge（トミー精工、東京、日本）を用いて遠心分離した（10分間、60,000rpm）。上清を破棄後、10 mLの滅菌水を加えてVORTEX-GENIE2（Scientific Industries、 Bohemia、 NY、 USA）を用いて再懸濁し、菌懸濁液を作成した。1.6 mLの菌懸濁液とともに無菌状態で生育した播種後3日目のキヌアをプラスチックシャーレに入れ、菌懸濁液に浸しながらキヌアの胚軸中央部をメスで切断した。切断後、感染キヌアを共存培地へ置床し、20℃、24時間Dark条件下で4日間、共存培養を行った（表２）。共存培養を行ったキヌアを、滅菌水に100 mg/L カルベニシリンを添加した洗浄液の入った300 mL ビーカーへ入れ、軽く振盪させながら洗浄した。新しい洗浄液と交換し、同様の洗浄操作を、さらに2回行った。洗浄後、キヌアに付着した洗浄液を滅菌ろ紙で除去し、癌腫誘導培地へ置床した（表２）。その後、20℃、8時間Light/16時間Dark条件下で培養した。【００３７】
【表３】
0006876877.tif 000004
LB培地組成一覧。液体培地は、アガロース無添加。【００３８】
（形質転換カルス実験）
実験に用いた菌株は、100 mg/Lの抗生物質（バイナリーベクターpBIC35BP を保有する菌株の培養にはカナマイシンおよびビアラホス、バイナリーベクターpCAMBIA1301を保有する菌株の培養にはカナマイシンおよびハイグロマイシン）を添加したLB固形培地に画線を引き、26℃、24時間Dark条件下で2日間培養した（表３）。増殖した菌を薬さじでかき取り、50 mL 共存培養液体培地（100 mL三角フラスコ内）へ移植した（表２）。移植後、振とう式恒温水槽BW201を用いて26℃、約30分間、約120 rpmの条件で培養した。植物培養試験管に、菌培養液（OD600＝約0.2）を4 mL入れ、その中で無菌キヌア切片を2分間感染させた。滅菌ろ紙を用いて、胚軸切片に付着した過剰な菌培養液を除去し、共存培養固体培地へ置床した（表２）。置床後、20℃、24時間Dark条件下で2日間培養した。共存培養を行った切片を、滅菌水に100 mg/L カルベニシリンを添加した洗浄液が約10 mL入った植物培養試験管に入れ、P1000ピペットマン（Gilson、 Manhattan、NY、 USA）で攪拌しながら洗浄した。新しい洗浄液と交換し、同様の洗浄操作を、さらに1回行った。洗浄後、切片に付着した洗浄液を滅菌ろ紙で除去し、カルス誘導選抜培地へ置床した（表２）。その後、20℃、8時間Light/16時間Dark条件下で培養し、3週間ごとに新しい培地へ移植した。（本手法は、形質転換プロトコール「植物編」に記載の大谷によるサツマイモの形質転換法を一部改変して実施した（田部井豊 (2012) 形質転換プロトコール. 化学同人, pp.71-78）。）【００３９】
（GUS染色によるgusAの確認）
GUS遺伝子の発現を確認するため、感染したキヌア実生切片（「アグロバクテリウムによる癌腫形成の誘導」）、もしくは誘導したカルス（「形質転換カルス実験」参照）を5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronidecyclohexylamine salt（X-Gluc）染色液へ浸漬した（Jefferson RA, Kavanagh TA,Bevan MW (1987) The EMBO Journal6(13):3901-3907）（表４）。この時、組織間へ染色液が入るようにvacuum infiltrationを行った。その後、37℃、24時間Dark条件下で培養した。培養後、染色液を除去し、70％エタノールへ浸漬した。【００４０】
【表４】
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X-Gluc染色液組成。＊1は5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルβ-D-グルクロニドシクロヘキシルアンモニウム(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide)、＊2はN,N-ジメチルホルムアミド （N,N-dimethylformamide)、＊3はフェリシアン化カリウム（potassiumferricyanide）、＊4はフェロシアン化カリウム（Potassium ferrocyanide）を示す。【００４１】
［floral dip法を用いた実験］
（キヌアの育生）
種まき培土（タキイ種苗、京都、日本）へ播種し（200穴トレイを使用）、22℃、11時間Light/13時間Dark条件下の植物培養室内で生育した。【００４２】
（floral dip法を用いたキヌア穂への菌接種実験）
実験に用いた菌は、100 mg/Lカナマイシンおよび100mg/Lハイグロマイシンを添加したLB固形培地に画線を引き、26℃、24時間Dark条件下で2日間培養した（表３）。増殖した菌を、100 mg/Lカナマイシンおよび100 mg/Lハイグロマイシンを添加した50 mL LB液体培地（300 mL三角フラスコ内）へ移植し、振とう式恒温水槽BW201を用いて26℃、約24時間、約130 rpmの条件で培養した。培養後、菌培養液（OD600＝約2.0）を50 mL コニカルチューブに移し、Mx-301 Highspeed Refrigerated Micro Centrifugeを用いて遠心分離した（10分間、60,000rpm）。上清を破棄後、Silwet L-77を含む5%（w/v）スクロース溶液20 mLを加え、VORTEX-GENIE2を用いて再懸濁し、菌懸濁液を作成した（実施例１に示す結果は0.02%（v/v）、実施例３に示す結果は0.04％（v/v）のSilwet L-77を使用して接種実験を行った）。菌懸濁液の接種時、使用するキヌアを、水を張った密閉容器（ミッペール（富士システムパック、東京、日本））へ入れ、P200ピペットマン（Gilson、Manhattan、 NY、 USA）を用いて穂へ菌懸濁液を滴下した。接種後、密閉容器の蓋を閉じてDark条件とし、22℃の植物培養室内で2日間放置した。その後は、22℃、11時間Light/13時間Dark条件下の植物培養室内で育生した。【００４３】
（菌を接種した穂の切断および密閉処理）
菌接種後2週間目にキヌアを胚軸中心付近で切断した。切断後、キヌアをシャーレやタッパーの中に入れ、ビニールテープで容器の隙間を塞ぎ、3日間、多湿条件下に置いた。その後、育苗培土（タキイ種苗）の入った育苗用ポリポット（6cm）に挿し、22℃、11時間Light/13時間Dark条件下で種子が収穫できるまで生育した。【００４４】
（GUS発現個体の計測）
切断・密閉処理（−）の場合、接種処理後2週目のキヌアに、前述の「GUS染色によるgusAの確認」と同じ手順でGUS染色を行った。切断・密閉処理（＋）の場合、接種処理後2週目のキヌアに、切断・密閉処理（「菌を接種した穂の切断および密閉処理」参照）を行い、その後、「GUS染色によるgusAの確認」と同じ手順でGUS染色を行った。GUS染色および脱色処理後、発現が認められる個体数を計測した。「GUS発現を示す１個体」は、穂においてはGUS発現を１か所以上、雌性器官においては器官全体的にGUS発現を示す雌性器官を1つ以上有する個体とし、穂および雌性器官において、GUS染色率を計測した（図１）。雌性器官におけるGUS発現の計測は、実体顕微鏡Stemi2000-C（Carl Zeiss、 Jena、 Germany）を用いて行った。【００４５】
［菌および癌腫の解析］
（癌腫誘導）
MAFF301276株にバイナリーベクターpCAMBIA1301又はバイナリーベクターpCAMBIA-CqCYP76AD1-1を導入した形質転換株を作成した（図６）。これらの菌は、100 mg/Lカナマイシンおよび100 mg/Lハイグロマイシンを添加したLB固形培地に画線を引き、26℃、24時間暗Dark条件下で2日間培養した（表３）。増殖した菌を、100 mg/Lカナマイシンおよび100 mg/Lハイグロマイシンを添加した50 mL LB液体培地（300 mL三角フラスコ使用）へ移植し、振とう式恒温水槽BW201を用いて、26 ℃、約24時間、約130 rpmの条件で培養した。そして菌培養液（OD600＝約2.0）を50 mL コニカルチューブに移し、Mx-301 Highspeed Refrigerated Micro Centrifugeを用いて遠心分離した（10分間、60,000 rpm）。上清を破棄後、10 mLの共存液体培地を加えて、VORTEX-GENIE2を用いて再懸濁し、菌懸濁液を作成した（表２）。1.6 mLの菌懸濁液とともに無菌状態で生育した播種後7日目のキヌアをプラスチックシャーレに入れ、菌懸濁液に浸しながらキヌアの胚軸中央部をメスで切断した。切断後、「アグロバクテリウムによる癌腫形成の誘導」と同様の操作を行った。 【００４６】
（アグロバクテリウムMAFF301276株およびキヌアに生じた癌腫のDNA抽出）
MAFF301276株および3.5.1の実験で誘導した癌腫より、DNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN、 Valencia、 CA、 USA）を用いて付属のプロトコールに従い、DNAを抽出した。【００４７】
（MinIONおよびサンガーシーケンスによる塩基配列の解析）
抽出したDNAをPCRにより増幅した。この増幅断片をExoSAP-IT Express PCR Cleanup Reagents（ThermoFisher Scientific、 Waltham、 MA、 USA）を用いて付属のプロトコールに従い精製した。精製断片を鋳型DNAとし、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（ThermoFisherScientific）を用いてサンプルを調整し、96℃・1 分間、続いて96℃・10秒間、50℃・10秒間、60℃・2.5分間を35サイクルの条件でPCRを行った。シーケンス反応後、エタノールおよびホルムアルデヒドを用いてサンプルを精製し、ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer（AppliedBiosystems、 Foster City、 CA、 USA）を用いて塩基配列の解析を行った。さらに、同じDNAを石川県立大学の植物遺伝子機能学研究室に依頼し、MinION（Oxford Nanopore Technologies、 Oxford、 UK）による解析を行った（Lu H, Giordano F, Ning Z (2016) Genomics ProteomicsBioinformatics14(5): 265-279）。これらの解析結果とBlastおよびBlastx （https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）を用いて、導入した遺伝子とキヌアゲノムを共に保持するリードの有無を分析した。【００４８】
（PCR解析）
5種類のプライマーを設計し（図７、表５）、BlastによってT-DNAの挿入が予想されるキヌアゲノム領域（Quinoa genomedatabase Contig: Cqu_c08939）にMAFF301276株由来のTiプラスミドのT-DNA領域が導入されていることを調べるため、サーマルサイクラーBiometra TAdvanced（Analytik Jena, Jena、 Germany）を使用し、初期の熱変性は98.0℃・2分間、続いて98.0℃・10秒、51.6℃・30秒間、72.0℃・5分間を45サイクルの条件でPCRを行った。【００４９】
【表５】
0006876877.tif 000006
（ ）内の1-5の数字は，図７のプライマー（1-5）に対応している。【００５０】
（キヌアにおけるfloral dip法に適した菌の作成および感染実験）
MAFF301276株およびMAFF311303株の特性を利用して、floral dip法に適した菌株を以下の手順で作成した。（１）MAFF301276株が保持しているTiプラスミド（pTiMAFF301276株T-DNA）からT-DNA領域を除去。（２）T-DNAを除去したTiプラスミド（pTiMAFF301276株ΔT-DNA）をMAFF311303株に導入。（３）pTiMAFF301276株ΔT-DNAを保持したMAFF311303 株（MAFF311303pTiMAFF301276ΔT-DNA）に、バイナリーベクターpCAMBIA1301を導入。
作成した菌株を使用し、「floral dip法を用いたキヌア穂への菌接種実験」の手順でキヌアへのfloral dip実験を行った。その後、「GUS発現個体の計測」の手順でGUS染色およびGUS発現個体の計測を行った。
【実施例１】
【００５１】
［floral dip切断密閉法の構築］
floral dip法を用いて遺伝子導入を試みた。
バイナリーベクターpCAMBIA1301が導入されたGV3101株を用いて、従来のfloral dip法で播種後30、40、45、50、55日目のKd系統の穂にGUS遺伝子の形質転換を試みた。その結果、穂におけるGUS染色は認められなかった（図８）。そこで、GV3101株の接種処理後2週目に、菌を接種したキヌアの茎を切断し、3日間の多湿密閉処理を行った。その結果、播種後40、45、50日目に接種実験を行ったキヌアの穂で、GUS発現が認められた（図９、表６）。穂の染色部位を解体すると、雌性器官でGUS染色が認められた（図１０）。MAFF301276株、MAFF212033株、MAFF311303株、ATCC15834株、MAFF211729株MAFF663001株においても同様の方法でGUS遺伝子の形質転換を試みた結果、同様の結果が得られた。
floral dip法に多湿・暗所条件（密閉）処理を加えた本手法を、「floral dip切断密閉法」とした（図１１）。【００５２】
【表６】
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切断・密閉処理および供試する成長ステージの異なるキヌアのGUS染色による比較
【実施例２】
【００５３】
［脱分化細胞（カルス）の形質転換実験］
（Kd系統におけるアグロバクテリウム7菌株の形質転換カルス形成能力の比較）
バイナリーベクターpCAMBIA1301を持つアグロバクテリウム7菌株（GV3101株、ATCC15834株、MAFF301276株、MAFF212033株、MAFF311303株、MAFF211729株、MAFF663001株）を、Kd系統の胚軸切片に感染し、形質転換カルスの誘導を試みた。その結果、GV3101株およびMAFF301276株により誘導したカルスで、GUS発現が認められた（図１２、図１３）。GV3101株およびMAFF301276株の形質転換効率は、それぞれ4.4 ± 7.7%および85.6 ± 1.9%であった（平均値 ± 標準偏差）（図１４、表７）。【００５４】
【表７】
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アグロバクテリウム7菌株を感染したKd系統の形質転換カルス形成率。GUS染色は感染処理後6週目のカルスに実施した。各値は、キヌアの胚軸切片（n=30）を供試した3回の感染実験の平均値±標準偏差を示している。【００５５】
（アグロバクテリウムGV3101株およびMAFF301276株により感染実験を行ったキヌア6系統における形質転換カルス形成能力の比較）
キヌアは、ストレス耐性に関与するブラッダー細胞を茎頂や葉表面に形成する。ブラッダー細胞によるキヌアの形質転換への影響も考慮し、これらの組織形成能力が低下した変異体（rebc）、およびベタレイン色素合成能力とブラッダー細胞形成能力がともに低下した変異体（ghy/rebc）も形質転換効率を調査した。GV3101株をキヌアKd系統、85系統、108系統、変異体ghy、変異体rebcおよび変異体ghy/rebcの6系統に感染した場合、変異体ghy/rebc以外の5系統でカルスが形成された（図１５）。その中でGUS発現が確認できた系統は、85系統、変異体rebcおよび変異体ghyであり、GUS発現カルス形成率は、それぞれ21.1 ± 6.9%、6.7 ± 3.3%および1.1 ± 1.9%であった（平均値 ± 標準偏差）（図１６、図１７、表８）。一方、MAFF301276株をキヌア6系統に感染した場合、すべてのキヌア系統で形質転換カルスが形成され、GV3101株を用いた感染実験と比較して、GUS発現カルスの形成率は全系統で増加した（図１８−図２０、表９）。 Kd系統、85系統および変異体rebcは60％以上の形質転換効率が認められ、85系統は80.0±5.8%と最も高かった（平均値 ± 標準偏差）。【００５６】
【表８】
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アグロバクテリウムGV3101株を感染したキヌア6系統の形質転換カルス形成率。GUS染色は感染処理後6週目のカルスに実施した。各値は、キヌアの胚軸切片（n=30）を供試した3回の感染実験の平均値±標準偏差を示している。【００５７】
【表９】
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アグロバクテリウムMAFF301276株を感染したキヌア6系統の形質転換カルス形成率。GUS染色は感染処理後6週目のカルスに実施した。各値は、キヌアの胚軸切片（n=30）を供試した3回の感染実験の平均値±標準偏差を示している。【００５８】
（次世代シーケンサーおよびPCRを用いたキヌア実生癌腫組織におけるT-DNA挿入部位の解析）
MAFF301276株によるキヌアゲノムへの遺伝子導入部位を決定するために、MAFF301276株のゲノムDNAおよびMAFF301276株により誘導された癌腫（図２１）のゲノムDNAを、石川県立大学の植物遺伝子機能学研究室へ委託し、次世代シーケンサーMinIONを用いた解析を行った。癌腫より抽出したゲノムDNAを解析した結果、300万リード（約8 Gbp）の中に、バイナリーベクターpCAMBIA1301とキヌアゲノムが融合したリードが1リード存在した（図２２）。ゲノム挿入領域をBlastxで解析すると、バイナリーベクターpCAMBIA1301由来のハイグロマイシン遺伝子、MAFF301276株pTiプラスミド由来の2つオーキシン合成遺伝子（iaaH、iaaM）およびサイトカイニン合成酵素遺伝子（ipt）が存在しており、2種類のT-DNAが融合した状態でゲノムに挿入されていた。また、バイナリーベクターpCAMBIA-CqCYP76AD1-1を有するMAFF301276株を感染したキヌア癌腫のゲノムDNAで、同様の解析を行った結果、バイナリーベクターpCAMBIA1301と同様に、2種類のT-DNAが融合した状態でキヌアゲノムへ挿入されていた。MAFF301276株のT-DNAとキヌアゲノムが隣接する部分に5種類のプライマーを設計し、6つのペアでPCR解析を行った結果（図７、表５）、菌とキヌアのゲノムの連結部を示すプライマーセット1、2、4および5で、遺伝子の増幅が認められた。PCRおよび次世代シーケンサーを用いた解析の結果、MAFF301276株は、キヌアゲノムに遺伝子を導入できることが明らかとなった。
【実施例３】
【００５９】
［floral dip切断密閉法による形質転換キヌアの作出］
（floral dip切断密閉法におけるキヌア4系統へのアグロバクテリウム7菌株のGUS遺伝子導入能力の比較）
雌性器官への遺伝子導入が可能であるfloral dip切断密閉法に適したキヌア系統およびアグロバクテリウム株の評価を行った。播種後50〜60日目のキヌア4系統（Kd、ghy、rebc、ghy/rebc）、およびバイナリーベクターpCAMBIA1301を導入したアグロバクテリウム7菌株（GV3101、ATCC15834、MAFF301276、MAFF212033、MAFF311303、MAFF211729、MAFF663001）を種々の組み合わせでfloral dip切断密閉法を行い、遺伝子の導入をGUS染色により評価した（表１０）。その結果、MAFF212033株、MAFF311303株およびMAFF211729株を用いた個体で、雌性器官においてGUS発現が認められ、特にMAFF311303株を用いた場合に、高い割合でGUS発現が認められた（図２３b、図２４、図２５）。これらの GUS発現は、がくや葯組織でも生じていたことから、雌性器官非特異的なGUS発現であると考えられた。これまでの実験では、切断・密閉処理が、floral dip法によるキヌアへの遺伝子導入に必要であったが、MAFF15834株、MAFF301276株、MAFF311303株、MAFF663001株を用いた感染実験では、切断・密閉処理（−）で、穂におけるGUS発現が認められ、形質転換カルス形成能力が最も高かったMAFF301276株は（図１４、表８）、供試したキヌア全系統の穂でGUS発現が認められた（図２６）。また、ブラッダー形成が抑制されているキヌア変異体2系統は、GUS発現個体の割合が高い傾向にあった。しかし、これらの切断・密閉処理（−）条件では、雌性器官におけるGUS発現は認められなかった（図２３a）。【００６０】
【表１０】
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floral dip切断密閉実験で用いた感染溶液一覧。太枠は実施例３で使用した菌株を示し、その他の枠には共接種実験における菌株の組合せを示している。【００６１】
（floral dip切断密閉法におけるアグロバクテリウム2菌株の共接種による形質転換効率への影響）
抗菌物質を生産するPseudomonas fluorescens LRB3W1株と、細胞壁溶解酵素を生産するSerratia marcescensstrain B2株の共接種により、糸状菌の生育抑止効果が増加したことが報告されている（Someya N, Tsuchiya K, Yoshida T, T. Noguchi M, Akuthu K, SawadaH(2007) Biocontrol Science. 12(1):1-6；吉田重信 (2009) 異種微生物間の相互作用およびその生物防除への活用の可能性. 植物防疫 63(10):619-623）。このような相互作用が、アグロバクテリウム株間に存在していれば、アグロバクテリウム2菌株の共接種により、雌性器官への遺伝子導入効率の向上が期待できる。そこで、実施例３で用いたアグロバクテリウム7菌株のうち、2菌株の菌懸濁液を、1：1で混合した21の組合せで、播種後50〜60日目のKd系統および変異体ghyへの接種実験を行った（表１０）。その結果、雌性器官で染色を確認した組合せは、Kd系統においては、GV3301株×ATCC15834株、GV3301株×MAFF211729株、GV3301株×MAFF663001株、MAFF212033株×MAFF311303株、MAFF311303株×MAFF211729株の5試験区であり（表１１）、変異体ghyにおいては、GV3301株×MAFF311303株、MAFF301276株×MAFF311303株、MAFF311303株×MAFF211729株、MAFF211729株×MAFF663001株の4試験区であった（表１２）。これらの雌性器官のGUS染色は、実施例３の結果と同様、がくや葯組織でも生じていたことから、雌性器官非特異的な発現であると考えられた。一方、切断・密閉処理（−）で、穂におけるGUS発現を確認した組合せは、Kd系統においてはGV3301株×MAFF301276株、GV3301株×MAFF663001株、ATCC15834株×MAFF211729株、MAFF301276株×MAFF211729株、MAFF301276株×MAFF663001株の5試験区であり（表１１）、変異体ghyにおいては、GV3301株×MAFF301276株、ATCC15834株×MAFF301276株、ATCC15834株×MAFF211729株、MAFF301276株×MAFF212033株、MAFF301276株×MAFF311303株、MAFF301276株×MAFF211729株、MAFF301276株×MAFF663001株の7試験区であった（表１２）。2菌株の共接種実験においても切断・密閉処理（−）条件における雌性器官のGUS発現は認めらなかった。【００６２】
【表１１】
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Kd系統へのfloral dip切断・密閉法による2菌株の共接種実験の結果。＊切断・密閉処理において、−：切断・密閉処理無し、切断・密閉処理＋：切断・密閉処理有りを示す。枠で示した行は雌性器官でGUS染色が認められた区を示している．計測方法は「GUS発現個体の計測」（図１）に示す。【００６３】
【表１２】
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変異体ghyへのfloral dip切断・密閉法による2菌株の共接種実験の結果。＊切断・密閉処理において、−：切断・密閉処理無し、切断・密閉処理＋：切断・密閉処理有りを示す。枠で示した行は雌性器官でGUS染色が認められた区を示している．計測方法は「GUS発現個体の計測」（図１）に示す．
【実施例４】
【００６４】
［改良菌（MAFF311303pTiMAFF301276ΔT-DNA）を用いたfloral dip非切断・密閉法による形質転換キヌアの作出］
（改良菌（MAFF311303pTiMAFF301276ΔT-DNA）を用いたfloral dip非切断・密閉法によるキヌア4系統へのgusA遺伝子の導入）
MAFF311303株は、floral dip切断密閉法により、雌性器官におけるGUS発現が、高い割合で認められた（図２３b）。しかし、MAFF311303株は非病原性のため、vir遺伝子を保持しておらず、遺伝子導入能力は低いと考えられる。一方、MAFF301276株は、キヌアカルスおよびキヌアの穂に、高効率でT-DNAを導入した（図１４、表８、図２６）。しかしMAFF301276株は、雌性器官への遺伝子導入が認められなかった（図２３）。さらに、MAFF301276株とMAFF311303株の共接種を行った場合においても、切断・密閉処理を行わない場合には、雌性器官のGUS発現が認められなかった（表１１、表１２）。そこで、MAFF301276株とMAFF311303株の特性を併せ持つMAFF311303pTiMAFF301276ΔT-DNAを作成した。この菌株にバイナリーベクターpCAMBIA1301を導入した後、従来のfloral dip法（切断・密閉処理無し）によりキヌア4系統（Kd、ghy、rebc、ghy/rebc）へ接種した。その結果、変異体ghyおよび変異体ghy/rebcにおいて、雌性器官特異的なGUS発現を確認した（図２７〜図２９）。【００６５】
（改良菌（MAFF311303pTiMAFF301276ΔT-DNA）を用いたfloral dip非切断・密閉法におけるアブシジン酸による形質転換効率への影響）
アブシジン酸（abscisic acid；ABA）は、植物の全身抵抗性（SAR）の誘導に関与するサリチル酸（SA）と拮抗関係にある（Durner J, Shah J, Klessig DF (1997) Trends inPlantScience.2(7):266-274：Yasuda M, Ishikawa A,Jikumaru Y, Seki M, Umezawa T, Asami T,Maruyama-Nakashita A, Kudo T, ShinozakiK, Yoshida S, Nakashita H (2008) PlantCell 20(6): 1678-1692.）。したがって、ABAを添加することにより、SARを抑制し、キヌアのfloral dip実験における形質転換効率が増加するのではないかと考えた。バイナリーベクターpCAMBIA1301を保有するMAFF311303pTiMAFF301276ΔT-DNAの菌懸濁液に500 mMのABAを添加し、従来のfloraldip法（切断・密閉処理無し）によりキヌア4系統（Kd、ghy、rebc、ghy/rebc）へ接種した。その結果、変異体ghy/rebcは、ABA無添加の場合と比較して6倍である、60％の個体で、雌性器官特異的なGUS発現を確認した（図３０、図３１）。
【実施例５】
【００６６】
（変異体ghyにおける再分化条件の評価）
文献（包 金花 (2009) アグロバクテリウム法によるホウレンソウの形質転換系の確立と有用遺伝子の導入、千葉大学大学院博士論文）により報告されたホウレンソウの再分化培地組成を一部改変した培地を作成し、実験に用いた（表２）。Kd系統実生切片から誘導した非形質転換カルスを、設定した表１３の条件下で培養した。再分化誘導光条件が＋の区は20℃、8時間Light/16時間Dark条件のインキュベーター中で培養し、−の区は同条件のインキュベーター中で、スチール缶に入れ、遮光した状態で培養した。GA濃度が1の区は1 mg/L、2の区は2 mg/Lのジベレリンを添加した再分化培地上に非形質転換カルスを置床した。
ベタレイン色素を合成しない変異体ghy系統で形質転換カルスの形成に成功した。そこで、変異体ghyのカルスより、再分化の誘導を試みた。オーキシン様の作用を持つ植物ホルモンとして2,4-ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-D）、サイトカイニン様の作用を持つ植物ホルモンとしてベンジルアデニンおよびカイネチンを種々の濃度で組み合わせ、再分化を試みた。サイトカイニン様の植物ホルモンを含む培地に置床したカルスは緑色となり、ベンジルアデニンを含む培地に置床したカルスはより濃い緑色を呈した。また、2,4-Dとサイトカイニン様の植物ホルモン（ベンジルアデニン、カイネチン）の濃度を共に高めると、硬く丸みを帯びたカルスとなった。さらに0.01 mg/Lもしくは0.1 mg/Lの2,4-Dのみ、0 mg/L−0.1mg/Lの2,4-Dとカイネチン、1 mg/Lもしくは2 mg/Lのベンジルアデニンのみを含む培地では不定根が再分化した。特に、1 mg/Lカイネチンと0.01mg/L 2,4-D、1 mg/L カイネチンのみを含む培地に置床したカルスは、不定根の伸長が顕著であった。しかし、その他の器官の再分化は認められなかった。【００６７】
【表１３】
0006876877.tif 000014
カルス誘導設定条件。光条件＋：20℃、8時間Light /16時間Dark条件、光条件−：20℃、8時間Light /16時間Dark条件のインキュベーター中でスチール缶に入れて遮光。菌感染処理+：感染処理（「形質転換カルス実験」参照）を実施、菌感染処理−：感染処理無実施。ビアラホス+：5 mg/Lのビアラホスを添加したカルス誘導培地を使用、ビアラホス−：ビアラホス無添加のカルス誘導培地を使用。
【実施例６】
【００６８】
［floral dip切断・密閉法によるrebc変異体キヌアへの野生型REBC遺伝子の形質転換］
形質転換に用いる植物体として、本発明者らがキヌア種子の0.2％EMS（Ethylmethanesulfonate）処理により作出した、ブラッダー細胞が著しく減少した形質を有するrebc変異体キヌア（ブラッダー形成制御に関与するREBC遺伝子（Acc.No.XP_021715187をコードする遺伝子）にc.1139G>A（p.Trp380*）の変異を有することが確認された個体）を用いた。
rebc変異体キヌアのM3世代の種子を播種して、約2ヶ月後（開花期）の個体に、REBCプロモーター（配列番号１３）を接続した野生型REBC遺伝子を（配列番号１４）を挿入したバイナリーベクターpCAMBIA1301が導入された改良菌（MAFF311303pTiMAFF301276ΔT-DNA）を用いて、本発明のfloral dip切断・密閉法により、形質転換した（図３４）。【００６９】
形質転換の結果、ブラッダーが回復している形質転換体を得られた（図３５）。
得られた形質転換体について、REBC遺伝子の配列決定を行い、REBC遺伝子の塩基配列が変異型であることを確認した（図３６、配列番号１５）。
このことから、形質転換によるブラッダーの回復は、導入された遺伝子による可能性が高いことが考えられた。
そこでブラッダーが回復した形質転換植物について、次世代シークエンサーを利用して形質転換体のゲノム配列を解読した。
その結果、形質転換植物ゲノム内に、REBC遺伝子が導入されたことを確認することができた（図３７）。同時に導入箇所も特定（Chr16, 75355785bp）した。
以上の結果より、本発明のfloral dip切断・密閉法を用いた形質転換では、植物体のブラッダーを発現させる（ブラッダー発現機能を回復させる）ことができ、該植物体は、形質転換体（rebc変異相補個体）であることを確認した。【００７０】
得られた形質転換体同士を受粉（交配）させた後、該形質転換体から収穫された種子（形質転換後代）を播種し、育成した。
その結果、後代の表現型は、ブラッダーをもつ野生型（導入遺伝子あり）と、rebc変異型（導入遺伝子なし）に分離した（図３８）。
この結果から、本発明のfloral dip切断・密閉法を用いた形質転換では、形質転換によって導入された遺伝子（例、ブラッダー発現機能遺伝子）は後代に遺伝させることができることを確認した。【００７１】
［総論］
本実施例では当初、キヌアKd系統およびアグロバクテリウム（Rhizobiumradiobacter）GV3101株を用いて、組織培養による形質転換植物の作出を試みたが、再分化系の構築および遺伝子導入に成功しなかった。
キヌアの再分化系が未確立のため、floral dip法による形質転換実験を実施した。しかし、シロイヌナズナで汎用されているfloral dip法では（Clough SJ and Bent AF (1998)The Plant Journal 16(6):735-743）、穂のGUS発現は認められなかった（図８）。そこで、GV3101株を感染した穂に、切断・多湿密閉処理を行った。その結果、キヌアの穂でGUS発現を確認した（図９）。この結果から、切断・密閉処理により、キヌアへの遺伝子導入が可能となることが明らかとなった。さらに、雌性器官におけるGUS発現を確認した（図１０）。シロイヌナズナのfloral dip法において、アグロバクテリウムは雌性生殖器官を標的とすることが報告されている（Desfeux C, Clough SJ, Bent AF (2000) Plant physiology 123(3):895-904）。したがって、floral dip切断密閉法の適用により（図１１）、キヌアにおいても形質転換種子が得られる。
Kogaらは、イネ（Oryza sativa L.）葉鞘の切断により、イネいもち病原菌Magnaporthe griseaの感染に対する抵抗性WPSR（whole plant specific resistance）が低下することを明らかにしている（Koga H, Dohi H, Nakayachi O, Mori M (2004) PhysiologicalandMolecular Plant Pathology 64(2):67-72）。この現象は、切断処理により植物体内で合成されるアブシジン酸（ABA）が関与しており（Koga H, Dohia K, Mori M (2004)Physiological and Molecular PlantPathology 65(1):3-9）、ABAは植物の全身抵抗性（SAR）を誘導するサリチル酸と拮抗的に作用する（Yasuda M, IshikawaA, Jikumaru Y, Seki M, Umezawa T, Asami T,Maruyama-Nakashita A, Kudo T,Shinozaki K, Yoshida S, Nakashita H (2008) PlantCell 20(6): 1678-1692.）。すなわち、切断処理により、サリチル酸を介した植物の抵抗性が抑制され、GV3101株による遺伝子導入が可能になったと考えられる。
floral dip切断密閉法を行った穂のGUS発現は、播種後40〜50日目のキヌアでのみ認められた（表６）。シロイヌナズナのfloral dip実験では、形質転換種子が得られるのは開花の5日以上前に感染処理を行った場合に限られ、遺伝子導入が可能な時期は限定されることが明らかとなっている（Desfeux C,Clough SJ, Bent AF (2000) Plant physiology 123(3):895-904）。これは、開花3日前に、シロイヌナズナ雌性器官の柱頭に生じるキャップ構造が、アグロバクテリウムが胚珠へアクセスすることを妨害していることによると考えられている（Smyth DR, Bowman JL, Meyerowitz EM (1990) The Plant Cell 2:755-767）。キヌアのfloral dip実験においても同様に遺伝子導入時期が限られていたことから（表６）、シロイヌナズナとキヌアにおける植物体への遺伝子導入様式は類似していると考えられる。
形質転換カルスの形成率を指標に、キヌアの形質転換に適したキヌア系統およびアグロバクテリウム株の選抜を行った。GV3101株を用いて、Kd系統実生切片および変異体ghy実生切片への感染実験の結果、Kd系統では6.98％および変異体ghyでは6.78%のカルスでGUS発現を確認した（図３２、表１４）。そして、Kd系統の全ての形質転換カルスにおいてスポット状のGUS発現、変異体ghy形質転換カルスにおいて1個体でスポット状のGUS発現、3個体で2 mm2以上のGUS発現を確認した。スポット状の一過性のGUS発現は形質転換されておらず、変異体ghyにおいてのみ形質転換されていると考えられる。真菌類および細菌類への抗菌活性をもつベタレイン色素は（Polturak G, Grossman N, Vela-Corcia D, Dong Y, Nudel A, PlinerM,Levy M, Rogachev I, Aharoni A (2017) Proceedings of the National AcademyofSciences of the United States of America 114(34):9062-9067；Canadanovic-BrunetJM, Savatovic SS, Cetkovic GS (2011) Czech Journalof Food Sciences29(6):575-585）、Kd系統の形質転換において、阻害的に作用している可能性が示唆された。両系統の遺伝子発現頻度は同程度であり（表１４）、ベタレインはアグロバクテリウムの植物体への接近、および遺伝子導入におそらく影響はないと考えられる。これらのことから、ベタレイン色素はキヌアゲノムへのT-DNAの組込みに影響していることが考えられる。
キヌアの形質転換において、ベタレイン色素が阻害的に働くことが示唆された。一方で、キヌア85系統は、GV3101株およびMAFF301276株による形質転換実験で、最も高い形質転換効率を示した（図１７、図２０、表９、表１０）。したがって、85系統は、アグロバクテリウムによる形質転換に、有用なキヌア系統であると考えられる。形質転換カルス実験に供試した85系統の胚軸（播種後5日目）は、Kd系統や108系統と同様に赤色を呈している。しかし、成熟した85系統の穂は、オレンジ色を呈する。キヌアは、系統によって合成するフェノール化合物の量が異なると報告されている（Tang Y, Li X, Zhang B, Chen PX, Liu R, Tsao R6 (2015) FoodChemistry166:380-388）。フェノール類は、一般的にストレス耐性や抗菌活性を有するが、アセトシリンゴンを含む複数のフェノール化合物は、アグロバクテリウムのvir遺伝子を誘導することが報告されている（Bhattacharya A, SoodP, Citovsky V (2010) Molecular Plant Pathology11(5):705-719）。85系統の合成するフェノール化合物の詳しい機能は未解明であるが、85系統がGV3101株およびMAFF301276株のvir遺伝子を活性化するような物質を含む可能性が考えられる。
MAFF301276株およびMAFF311303株をキヌア実生に接種した場合に、茎頂付近で遺伝子導入が認められた（図３３）。この2菌株は、遺伝的な性質による分類（genomovar）では、G1に属する。このグループに属する菌株は、植物に生じた癌腫から頻繁に分離され（PortierP, Saux ML, Mougel C, Lerondelle C, Chapulliot D, ThioulouseJ, Nesme X (2006)Applied and Environmental Microbiology 72(11):7123-7131）、広い宿主範囲を持つと予測される。特にMAFF301276株は、Kd系統の胚軸切片への感染実験において、高い形質転換効率（85.6 ± 1.1%）を示した（図１４、表８）。また、キヌア6系統の胚軸切片への感染実験では、供試した全系統で形質転換カルスを形成した（図２０、表１０）。これらの結果は、MAFF301276株がキヌアへの強い感染能力および広域な宿主範囲を有することを示している。Jinらは、アグロバクテリウムの病原性および宿主範囲の拡大に、vir遺伝子の発現増加が関与していることを示唆している（Jin SG, Komari T, Gordon MP, Nester EW (1987) Journal ofBacteriology169(10):4417-4425）。したがって、MAFF301276株の優れた特性には、Tiプラスミド上のvir遺伝子が関与していると推測した。MAFF301276株によるキヌアゲノムへの遺伝子の導入は、次世代シーケンサーを用いた遺伝子解析およびPCR解析の結果により証明された（図２２）。また、これらの解析により、MAFF301276株由来のpTiプラスミドとバイナリーべクターpCAMBIA1301の一部が、融合して組み込まれていることが明らかとなった（図２２）。2つのT-DNAの融合が、菌体内で生じたのか、あるいは宿主植物への遺伝子導入の過程で生じたのかは不明である。しかし、T-DNAの融合が、MAFF301276株の優れた感染能力に関与している可能性が考えられる。
一方、MAFF311303株は遺伝子導入に不可欠なvir遺伝子群を欠損しており非病原性に分類されている。非病原性とされるMAFF311303株が、GUS遺伝子をどのようにして植物細胞内へ導入しているかは興味深い。アグロバクテリウムの感染には、宿主植物側の作用も重要であり、植物の損傷部位から分泌されるアセトシリンゴンは、vir遺伝子の活性化に関与する（Bhattacharya A, Sood P,Citovsky V (2010) Molecular Plant Pathology11(5):705-719）。また、シロイヌナズナのVIP1タンパク質は、宿主核内へのT-DNA移行に関与することが知られている（Tzfira T, Vaidya M, Citovsky V (2001) The EMBO Journal20(13):3596-3607）。しかし、アグロバクテリウムの感染における、宿主植物側の働きは完全に解明されていない。したがって、非病原性MAFF311303株によるGUS遺伝子の導入は、植物側の新規作用により生じたと推測した。また、Kd系統胚軸切片への感染実験において、MAFF311303株は形質転換カルスを形成できなかったことから（図１４、表８）、この作用は、茎頂付近の組織特異的に起こると推測した。MAFF301276株およびMAFF311303株は野生株であり、研究報告が少ない（太田光輝, 西山 幸司(1984) 花き類の根頭がんしゅ病に関する研究.病害の発生ならびに病原細菌の細菌学的性質. 日本植物病理学会報 (日植病報) 50: 197-204）。次世代シーケンサー技術の進展が著しい現在、未知のゲノム情報を、短時間かつ容易に入手できるようになった。各菌株のゲノム解析やRNA解析により、MAFF301276株の持つ優れた形質転換能力、およびMAFF311303株の遺伝子導入のメカニズムが解明され、形質転換効率の高い新規アグロバクテリウム菌株の構築に寄与できると考えている。そして、アグロバクテリウムによる遺伝子導入が困難な植物種において、強力な遺伝子導入ツールとしての利用が期待される。
MAFF301276株による形質転換カルスの作出により、残された課題は再分化系の確立である。そこで、再分化への影響が考えられるベタレイン色素を合成しない変異体ghyを用いて再分化培地の検討を行った。その結果、Kd系統の再分化検討では認められなかった、不定根の再分化が確認できた。このことから、ベタレイン色素が根の形成に関与していると考えられる。カルス誘導の期間や、再分化培地の植物ホルモンの種類および濃度、光や温度といった培養条件、そして供試する組織などの検討により、ghyカルスの再分化を誘導できる可能性が示唆された。
キヌア4系統およびアグロバクテリウム7菌株を用いたfloral dip切断密閉法において、MAFF301276株は、切断・密閉処理の有無に関わらず、供試したキヌア全系統の穂でGUS発現が認められた（図２６）。この結果は、形質転換カルス形成実験の結果と一致する（図２０、表１０）。したがって、MAFF301276株は、キヌアの系統を問わず、SARを打破する強い病原性を有すると考えられる。一方で、floral dip切断密閉法による、雌性器官へのGUS遺伝子導入は認められなかった（図２３）。雌性器官へのGUS発現が認められた菌株は、MAFF212033、MAFF311303およびMAFF211729であり、組織培養およびfloral dip法による遺伝子導入実験の結果から、弱毒性菌株であると考えられる（図１４、図２６a、表８）。これらの結果は、病原性の強さと雌性器官へのアプローチ能力に相関関係が存在しないということを示唆している。
切断・密閉処理の有無に関わらず、ブラッダー細胞抑制変異体（rebc、ghy/rebc）の穂におけるGUS発現率が高かった（図２６）。したがって、変異体rebcおよび変異体ghy/rebcはfloral dip法による遺伝子導入に有効であることが示唆された。この2つの変異体が欠損しているブラッダー細胞はキヌアの穂を覆うように存在している（図２〜図５）。そのため、アグロバクテリウムの植物表面への接近に、物理的障害となっているのではないかと推測した。この推測は、GUS遺伝子や緑色蛍光タンパク質（green fluorescent protein；GFP）を使用し、アグロバクテリウムの挙動を可視化することで明らかにできるのではないかと推測した。
組織培養およびfloral dip切断密閉法により選抜したアグロバクテリウム2菌株（MAFF301276株、MAFF311303株）を用いて、MAFF311303pTiMAFF301276ΔT-DNA株を作出した。この菌株を、floraldip法（切断・密閉処理無し）により、変異体ghyおよび変異体ghy/rebcへ接種した結果、雌性器官特異的なGUS発現が認められた（図２７〜図２９）。この結果は、MAFF311303株が、MAFF301276株の強い病原性を獲得したことにより、SARを打破し、雌性器官への遺伝子導入が可能になったということを示唆している。すなわち、MAFF311303pTiMAFF301276ΔT-DNA株およびキヌア変異体を用いることにより、切断・密閉処理を行わない、汎用的なfloral dip法が適用でき、キヌアの形質転換種子が得られる。そして、SARを抑制するABAの適用により（Koga H, Dohia K, Mori M (2004)Physiological and Molecular PlantPathology 65(1):3-9；YasudaM, Ishikawa A, Jikumaru Y, Seki M, Umezawa T, Asami T,Maruyama-Nakashita A, KudoT, Shinozaki K, Yoshida S, Nakashita H (2008) PlantCell 20(6): 1678-1692.）、変異体ghy/rebcで形質転換効率の増加が認められた（図３０、図３１）。したがって、本手法による、キヌア雌性器官の形質転換効率の向上に、ABAの使用は有効である可能性がある。種子の選抜という最終段階まで到達した。
本実施例で構築したキヌアの新規形質転換法には、キヌア変異体および新しいアグロバクテリウム菌株の存在が重要である。しかし、キヌア85系統が合成するベタレイン色素や、MAFF301276株およびMAFF311303株のキヌアへの優れた形質転換能力の解析を進めることにより、汎用的なキヌア形質転換法の確立が期待できる。そして、キヌアの形質転換法の確立により、キヌア研究が一層進展し、新しい特性を持つキヌアの作出が期待できる。例えば、キヌアはサポニンという植物毒を種子に含み、塩地で栽培したキヌアはサポニン含有量が高くなる場合がある（山本紀夫（2014）中央アンデス農耕文化論―とくに高地部を中心として―. 国立民族学博物館調査報告117）。加えて、脱粒性を有するため、大量生産を目指した機械化が困難である（藤倉雄司,本江昭夫,山本紀夫 (2009) 植物のドメスティケーション:キヌアは栽培植物か? ―アンデス産雑穀の栽培化に関する一試論―. 国立民族学博物館調査報告 84:225-244）。そこで、これらの形質を欠損させることにより、キヌアの優れた特性を食料危機の改善策として十分に発揮できる。本実施例の成果により遺伝子レベルのキヌア研究の進展に貢献できる。
加えて、本実施例で構築したキヌアの新規形質転換法によって導入された遺伝子は後代に遺伝させることができることを確認した。すなわち、本実施例で構築したキヌアの新規形質転換法により、目的遺伝子が導入された種子（目的遺伝子の機能が発現する種子）を得ることができる。【００７２】
【表１４】
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GV3101株を用いたKd系統およびghyへの感染実験結果。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明により、キヌアの形質転換法を提供することが可能になった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【配列表】
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