(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
スポロラクトバチルス科（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）に属する微生物である２９２１５−Ｂ１菌株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０３４３５）。
【請求項２】
スポロラクトバチルス科（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）に属する微生物である２９２１５−Ｂ１菌株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０３４３５）の変異株であって、２９２１５−Ｂ１菌株が有する次の１）〜１０）の特性を維持した変異株。
１）グラム染色が陽性の桿菌であり、胞子を形成する
２）好気条件でも弱い生育が観察されるものの嫌気性菌である
３）生育温度は３０〜４５℃あり、１５℃で生育しない
４）カタラーゼ反応が陽性である
５）オキシダーゼ反応が陰性である
６）グルコースから酸を産生する
７）Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−ガラクトースおよびＤ−フラクトースを発酵し、Ｌ−ソルボースおよびズルシトールを発酵しない
８）短鎖脂肪酸のうち乳酸を主に産生する
９）単独では酪酸を産生しない
１０）酪酸生産菌による発酵において酪酸の生産能を高める
【請求項３】
配列番号１に示す塩基配列からなる１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する、請求項２に記載された変異株。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載された微生物を用いて短鎖脂肪酸を製造する方法。
【請求項５】
前記短鎖脂肪酸が乳酸であることを特徴とする請求項４に記載された方法。
【請求項６】
前記短鎖脂肪酸がコハク酸であることを特徴とする請求項４に記載された方法。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載された微生物と酪酸生産菌を混合培養することにより酪酸を製造する方法。
【請求項８】
酪酸生産菌による発酵において、請求項１〜３のいずれか１項に記載された微生物を添加することにより酪酸の生産能を高める方法。
【請求項９】
前記酪酸生産菌がクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属に属する微生物であることを特徴とする請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記酪酸生産菌がクロストリジウム  ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）に属する微生物であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スポロラクトバチルス科（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）に属する新種の微生物に関する。より具体的には、天然素材から短鎖脂肪酸を製造する発酵に用いられる微生物に関する。ここで、短鎖脂肪酸とは、一般に炭素数が２から４の脂肪酸のことであるが、炭素数が６までを含めて考える場合もあり、酪酸、プロピオン酸、酢酸、乳酸、コハク酸等が含まれる。これらの短鎖脂肪酸は主に糖質の微生物発酵により産生される。
【０００２】
短鎖脂肪酸の大部分は大腸粘膜組織から吸収され、上皮細胞の増殖や粘液の分泌、水やミネラルの吸収のためのエネルギー源として利用される。また、一部は血流に乗って全身に運ばれ、肝臓や筋肉、腎臓などの組織でエネルギー源や脂肪を合成する材料として利用される。その他にも短鎖脂肪酸には、腸内を弱酸性の環境にすることで有害な菌の増殖を抑制したり、大腸の粘膜を刺激して蠕動運動を促進したり、ヒトの免疫反応を制御するなどさまざまな機能があることが知られている。特に、酪酸は腸上皮細胞の最も重要なエネルギー源であり、抗炎症作用など優れた生理効果を発揮する。
【背景技術】
【０００３】
本発明に係る酪酸、プロピオン酸、酢酸、乳酸、コハク酸などの短鎖脂肪酸については、例えば非特許文献１によると、腸内細菌による植物繊維の嫌気発酵過程で生成される短鎖脂肪酸が酪酸であり、酪酸の作用を調べたところ、酪酸は制御性Ｔ細胞の発生のみを促進することが確認されており、同文献は「慢性腸炎モデルマウスに酪酸化でんぷん飼料を与えたところ、移入細胞から制御性Ｔ細胞の発生が大腸で促進され腸内炎症の改善が認められた」と報告している。
【０００４】
また、非特許文献２には、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）には胸腺由来のｔＴｒｅｇと抹消で誘導されるｐＴｒｅｇの２種類が確認され、ｐＴｒｅｇはＴＨ１７リンパ球のマスター転写因子であるＲＯＲγｔと関連しており、ｐＴｒｅｇの誘導にはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ目のクラスターＩＶ、ＸＩＶａによって産生される酪酸が関与し、短鎖脂肪酸、特に酪酸が大腸のｐＴｒｅｇの誘導に重要であることが報告されている。
【０００５】
さらに、非特許文献３は、「短鎖脂肪酸は宿主のエネルギー源として利用されるほか、体重増加抑制、摂取、糖代謝改善、インシュリン感受性亢進など、宿主のエネルギー恒常性維持に欠かせない役割を果たしていることが近年の研究で明らかになりつつある」と報告し、短鎖脂肪酸の供給源である難消化性多糖類を含む植物繊維の摂取の重要性を指摘しており、同文献には短鎖脂肪酸の特に酪酸による脂肪酸受容体ＧＰＲ４１、ＧＰＲ４３、ＧＰＲ１０９ａおよび０１ｆｒ７８を介した様々な分子メカニズムが詳細に紹介されている。
【０００６】
そして、非特許文献４は、嫌気性環境下で赤痢菌と酪酸菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ  ＭＩＹＡＩＲＩ５８８株）との混合培養を行い少ない菌量でも赤痢菌の発育抑制が観察されたと報告している。近年、特に酪酸または酪酸菌の生体内おける炎症抑制作用が注目されていることを伝えている。
【０００７】
そしてまた、非特許文献５には、大腸内に常在する腸内細菌叢で産生される短鎖脂肪酸の内、酪酸は体調の必須栄養素であり、上皮細胞でエネルギーとして消費されるのみならず、酪酸の代謝障害が潰瘍性大腸炎の一因になるとの報告をし、また短鎖脂肪酸の生理作用として、カルシウム等のミネラル吸収促進、コレステロール合成抑制、さらに酪酸による大腸がん発症抑制など、それらの分析結果を提示している。
【０００８】
非特許文献６に記載されるように、本発明に係る新種の微生物が属するスポロラクトバチルス科（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）に含まれる公知の属であるスポロラクトバチルス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属は、有芽胞乳酸菌として知られており、分類学的には、「Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」において、Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｎｕｌｉｎｕｓのみの１属１種として記載されており、分類学上の記載が乏しいままであった。その後の遺伝子に基づく分子系統学の発展により、２００９年の「Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ」においては、スポロラクトバチルス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属は、Ｓ．ｉｎｕｌｉｎｕｓの他にＳ．ｋａｆｕｅｎｓｉｓ、Ｓ．ｌａｃｔｉｓ、Ｓ．ｌａｃｔｏｓｕｓ、Ｓ．ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｓ、Ｓ．ｎａｋａｙａｍａｅ  ｓｕｂｓｐ．  ｎａｋａｙａｍａｅ、Ｓ．ｎａｋａｙａｍａｅ  ｓｕｂｓｐ．  ｒａｃｅｍｉｃｕｓおよびＳ．ｔｅｒｒａｅの６分類群が追加して記載されている。また、その他にもＳ．ｄｅｘｔｒｕｓ、Ｓ．ｐｅｃｔｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｓ．ｐｕｔｉｄｕｓ、Ｓ．ｓｈｏｒｅａｅ、Ｓ．ｓｈｏｒｅｉｃｏｒｔｉｃｉｓ、Ｓ．ｓｐａｔｈｏｄｅａｅおよびＳ．ｖｉｎｅａｅが新種として提案されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】「制御性Ｔ細胞の発生を制御する腸内細菌代謝産物」早川盛偵  生物型薬学  Ｖｏｌ．５０  Ｎｏ．８  ２０１４  ファルマシア
【非特許文献２】「アレルギー疾患と腸内細菌叢」下条直樹  実験医学増刊Ｖｏｌ．３７−Ｎｏ．２  ２０１９『腸内細菌叢』編集＝大野博司  羊土社  ２０１９年２月１日発行
【非特許文献３】「宿主代謝制御と腸内細菌叢」木村郁夫  実験医学増刊Ｖｏｌ．３７−Ｎｏ．２  ２０１９『腸内細菌叢』編集＝大野博司  羊土社  ２０１９年２月１日発行
【非特許文献４】「酪酸菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ  ＭＩＹＡＩＲＩ５８８株）による腸管病原菌抑制作用」黒岩豊秋  小張一峰  岩永正明  感染症学雑誌  第６４巻第３号  平成２年３月２０日
【非特許文献５】「プレバイオテックスから大腸で酸性される短鎖脂肪酸の生理効果」原博（北海道大学大学院農学研究科）  腸内細菌学雑誌  １６：３５−４２、２００２
【非特許文献６】「変敗食品由来のＳｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属菌の再同定」遠田昌人  東洋食品研究所  研究報告書  ３２、５１−５５（２０１８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、酪酸に代表される短鎖脂肪酸を製造するために使用される有用な新規微生物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、新規微生物を見出し、これを単離、同定することにより、本発明を完成するに至った。
【００１２】
本発明は、例えば、以下の各発明に関する。
［１］
スポロラクトバチルス科（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）に属する新種の微生物であって、配列番号１に示す塩基配列に対して９５％以上の同一性を有する塩基配列からなる１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する新種の微生物。
［２］
スポロラクトバチルス科（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）に属する新種の微生物であって、配列番号１に示す塩基配列に対して９８．７％以上の同一性を有する塩基配列からなる１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する新種の微生物。
［３］
スポロラクトバチルス科（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）に属する新種の微生物であって、配列番号２に示すゲノムＤＮＡの塩基配列に対してＡＮＩ値９５％以上を有するゲノムＤＮＡを有する新種の微生物。
［４］
スポロラクトバチルス科（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）に属する新種の微生物であって、次の１）〜９）の特性を有する新種の微生物。
１）グラム染色が陽性の桿菌であり、胞子を形成する
２）好気条件でも弱い生育が観察されるものの嫌気性菌である
３）生育温度は３０〜４５℃あり、１５℃で生育しない
４）カタラーゼ反応が陽性である
５）オキシダーゼ反応が陰性である
６）グルコースから酸を産生する
７）Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−ガラクトースおよびＤ−フラクトースを発酵し、Ｌ−ソルボースおよびズルシトールを発酵しない
８）短鎖脂肪酸のうち乳酸を主に産生する
９）単独では酪酸を産生しない
［５］
２９２１５−Ｂ１菌株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０３４３５）およびその変異株であることを特徴とする［１］〜［４］のいずれかに記載された微生物。
［６］
［１］〜［５］のいずれかに記載された微生物を用いて短鎖脂肪酸を製造する方法。
［７］
前記短鎖脂肪酸が乳酸であることを特徴とする［６］に記載された方法。
［８］
前記短鎖脂肪酸がコハク酸であることを特徴とする［６］に記載された方法。
［９］
［１］〜［５］のいずれかに記載された微生物と酪酸生産菌を混合培養することにより酪酸を製造する方法。
［１０］
酪酸生産菌による発酵において、［１］〜［５］のいずれかに記載された微生物を添加することにより酪酸の生産能を高める方法。
［１１］
前記酪酸生産菌がクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属に属する微生物であることを特徴とする［９］または［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］
前記酪酸生産菌がクロストリジウム  ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）に属する微生物であることを特徴とする［１１］に記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によって得られた新規微生物は、スポロラクトバチルス科（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）に属する新種である。この新種微生物は、酪酸に代表される短鎖脂肪酸を産生するために有用であり、また、その他の様々な用途にも使用し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】２９２１５−Ｂ１菌株のコロニー像である。
【図２】２９２１５−Ｂ１菌株のグラム染色像である。
【図３】２９２１５−Ｂ１菌株の芽胞像（矢印）である。
【図４】１６Ｓ  ｒＤＮＡの部分塩基配列に基づき作成した２９２１５−Ｂ１菌株（ＳＩＩＤ２９２１５−Ｂ１と表示）の系統樹である。左上の線はスケールバー、系統枝の分岐に位置する数字はブートストラップ値、株名の末尾のＴはその種の基準株（Ｔｙｐｅ  ｓｔｒａｉｎ）を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１６】
（２９２１５−Ｂ１菌株）
本発明に係る２９２１５−Ｂ１菌株は、スポロラクトバチルス科（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）に属する新種の微生物であって、次の１）〜９）の特性を有する。
１）グラム染色が陽性の桿菌であり、胞子を形成する
２）好気条件でも弱い生育が観察されるものの嫌気性菌である
３）生育温度は３０〜４５℃あり、１５℃で生育しない
４）カタラーゼ反応が陽性である
５）オキシダーゼ反応が陰性である
６）グルコースから酸を産生する
７）Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−ガラクトースおよびＤ−フラクトースを発酵し、Ｌ−ソルボースおよびズルシトールを発酵しない
８）短鎖脂肪酸のうち乳酸を主に産生する
９）単独では酪酸を産生しない
【００１７】
本発明に係る２９２１５−Ｂ１菌株は、受託番号：（ＮＩＴＥ  Ｐ−０３４３５）として独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託されている。
【００１８】
本発明に係る２９２１５−Ｂ１菌株は、配列番号１で示す１４７５個の塩基配列からなる１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する。
【００１９】
本発明に係る２９２１５−Ｂ１菌株は、配列番号２で示す３９６７３２７個の塩基配列からなるゲノムＤＮＡを有する。
【００２０】
本発明に係る２９２１５−Ｂ１菌株は、実施例に記載された、形態観察および生理・生化学的性状試験、１６Ｓ  ｒＤＮＡの部分塩基配列解析並びにゲノム塩基配列のＡＮＩ解析の結果、スポロラクトバチルス科（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）に属することは確認されたものの、スポロラクトバチルス科（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）に属する公知の属に分類される公知の種には属さず、公知の属に属さない新種の微生物であることが判明した。
【００２１】
（変異株）
本発明には、２９２１５−Ｂ１菌株の変異株も含まれる。本発明における変異株とは、２９２１５−Ｂ１菌株に対して、薬剤処理及び／又は紫外線照射等の突然変異を誘発したうえでスクリーニングする手法、自然突然変異、形態変異、トランスフェクション等の遺伝子工学的手法により、その物理的特性や化学的特性が改変されたものであり、２９２１５−Ｂ１菌株の新種としての分類学的性質を維持したものである。例えば、上記１）〜９）の全ての特性を有し、後述する１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を用いた菌種同定において少なくとも９８．７％以上の同一性を維持するか、あるいはゲノムＤＮＡの塩基配列を用いたＡＮＩ解析において少なくとも９５％以上の同一性を維持しているものである。
【００２２】
（１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列解析）
ｒＲＮＡとは、リボソームを構成するＲＮＡであり、細菌では、その大きさによって２３Ｓ  ｒＲＮＡ、１６Ｓ  ｒＲＮＡ、５Ｓ  ｒＲＮＡに分類される。それらをコードするのがｒＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）である。ｒＲＮＡはウィルスを除く全生物に存在し、タンパク質合成に関わる重要な分子であるため、進化速度が比較的遅く、種のレベルにおいて高い相同性を示すことが知られている。また、分子進化中立説に基づいた塩基配列の置換率を用いることで生物の系統をより正確かつ定量的に解析することが可能である。
【００２３】
Ｗｏｏｓｅら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：４５７６−４５７９，１９９０）によりｓｍａｌｌ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ｒＲＮＡ（原核生物では１６Ｓ  ｒＲＮＡ）遺伝子配列を用いた全生物の系統分類法が提案されたことから、細菌の系統分類には、約１５００塩基の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列が用いられている。細菌分類の教科書といえるＢｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙも１６Ｓ  ｒＤＮＡの配列情報を基盤とする分子系統関係を反映させた第２版が出版されている。
【００２４】
現在では２００万配列以上の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列が決定され、日本ＤＮＡデータバンク、ＧｅｎＢａｎｋやＥＭＢＬなどの公的な遺伝子バンクに登録されている。また、ミシガン州立大学の微生物センターにより、細菌の分類のためのｒＤＮＡ配列のデータベースや解析支援アプリケーションがＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔとして提供されている。
【００２５】
細菌は、基準株とのＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションの相同性が７０％以上の場合、同種であると定義（Ｗａｙｎｅら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３７：４６３−４６４，１９８７）される。一方、１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を用いた菌種同定においては、９８．７％以上の同一性があれば、同種である可能性が高いとされている（Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ．１５２−１５５，２００６）。
【００２６】
２９２１５−Ｂ１菌株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子（配列番号１）についてＢＬＡＳＴ検索を行った結果、最も同一性が高いＳｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｔｉｄｕｓの基準株（Ｔｙｐｅ  ｓｔｒａｉｎ）の１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列（ＡＢ３７４５２２）に対する同一性（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）でさえ９２．０％しかなかった。
【００２７】
（ゲノムＤＮＡのＡＮＩ解析）
ＡＮＩ（Ａｖｅｒａｇｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｉｄｅｎｔｉｔｙ：平均ヌクレオチド同一性）解析は、対照株（検体）と比較株の完全長ゲノム配列やドラフトゲノム配列の同一性（ＡＮＩ値）をコンピュータ上で計算し、種の異同を判断する。一般に、ＡＮＩ値が９５％以上であれば同種、９５％未満であれば別種（新種）と判定される。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成試験とＡＮＩ解析には正の相関があり、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成試験における種の境界値「７０％」は、ＡＮＩ値で「９５％」に相当する（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２００７；５７：８１−９１）。
【００２８】
まず、ＡＮＩ解析に用いるゲノムＤＮＡの配列情報を取得する必要があるが、シーケンサーとして、ＰａｃＢｉｏ（商標）  ＲＳ  ＩＩ（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いることにより、完全長ゲノム配列が取得可能である。なお、ゲノムＤＮＡの抽出・精製時には断片化をなるべく抑えることが必須である。
【００２９】
ＡＮＩ値の算出方法については、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−ＲらによるＴｈｅ  ｅｎｖｅｏｍｉｃｓ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：  ａ  ｔｏｏｌｂｏｘ  ｆｏｒ  ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ａｎｄ  ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅｓ．  ＰｅｅｒＪ  Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ  ２０１６；４：ｅ１９００ｖ１（https://peerj.com/preprints/1900v1.pdf）に詳しく記載されている。
【００３０】
２９２１５−Ｂ１菌株のゲノムＤＮＡの塩基配列（配列番号２）および１６Ｓ  ｒＤＮＡの部分塩基配列解析において最も同一性の高かったＳｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｔｉｄｕｓのゲノムＤＮＡの塩基配列を対比した結果、ＡＮＩ値は７９．１０％であった。
【００３１】
（細菌形態観察および生理・生化学的性状試験）
単離された微生物の形態学的な特徴や生理・生化学的な性状を調べ、帰属分類群を同定することを目的として以下の試験を行った。
１  細菌形態観察
コロニーの色調、細胞形態、グラム染色性および芽胞形成能（培養２４〜４８時間）
２  細菌第一段階試験
コロニー性状、細胞形態、運動性観察
カタラーゼ、オキシダーゼ、Ｏ／Ｆテストなどの生理生化学的性状試験
３  細菌第二段階試験
生理・生化学的性状試験用キット（ＡＰＩ）による炭素源の資化性、酸化／発酵性および酵素活性などの試験  
帰属種・近縁種の同定に有効な追加試験
【００３２】
（有機酸測定試験）
単離された微生物を用いた発酵により取得される短鎖脂肪酸の種類とその産生量を決定するために試験を行った。
【００３３】
２９２１５−Ｂ１菌株は乳酸を主に産生している。２９２１５−Ｂ１菌株は、単独では酪酸を産生しないものの、酪酸産生菌としてよく知られたクロストリジウム  ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）の基準株の酪酸産生能を高める働きがある。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３５】
（実施例１）２９２１５−Ｂ１菌株の単離・同定
１  菌株の単離
岐阜県ハイアマウント株式会社の食品原料製造工場の途中工程で得られる発酵液から２９２１５−Ｂ１菌株を単離した。
すなわち、発酵液に含まれる微生物を探査するべくＭＲＳ寒天培地を用いて３７℃環境において嫌気培養し２９２１５−Ｂ１菌株のコロニーを単離した。
【００３６】
２  分類学的性質
２９２１５−Ｂ１菌株について形態観察および生理・生化学的性状試験（以下の「細菌第一段階試験」および「細菌第二段階試験」）を実施し、類似の性状を示す菌群を決定した。
（１）方法
ア  培養条件
・培地      ＭＲＳ寒天培地（Ｏｘｏｉｄ  ＵＫ）
・培養温度  ３７℃
・培養期間  ４日から６日間
・その他    嫌気培養
イ  細菌第一段階試験
光学顕微鏡による形態観察およびＢａｒｒｏｗおよびＦｅｌｔｈａｍらの方法（Ｃｏｗａｎ  ａｎｄ  Ｓｔｅｅｌ‘ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉａ．  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ．  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ：Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；１９９３）に基づき、カタラーゼ反応、オキシダーゼ反応、ブドウ糖からの酸／ガス産生、ブドウ糖の酸化／発酵（Ｏ／Ｆ）について試験を行った。
ウ  細菌第二段階試験
細菌第二段階試験には以下のキットを用いた。また、英国ＮＣＩＭＢ  Ｌｔｄ．との技術提携事項および分類・同定の関連文献に従い、追加試験を実施した。
・使用キット  ＡＰＩ５０ＣＨＬ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  ＦＲＡ）
【００３７】
（２）結果
２９２１５−Ｂ１菌株は、図１に示すようなコロニー像を有し、図２に示すようにグラム染色で陽性となる。また、図３に示すように芽胞（矢印）を有している。
【００３８】
２９２１５−Ｂ１菌株について、細菌第一段階試験の結果をまとめると表１のようになる。
【表１】
0006915932.tif 000002
【００３９】
２９２１５−Ｂ１菌株について、細菌第二段階試験の結果をまとめると表２のようになる。
【表２】
0006915932.tif 000003
0006915932.tif 000004
【００４０】
２９２１５−Ｂ１菌株について、追加試験の結果をまとめると表３のようになる。
【表３】
0006915932.tif 000005
【００４１】
（３）考察
細菌第一段階試験の結果、２９２１５−Ｂ１菌株は、運動性を有さないグラム陽性桿菌で、芽胞を形成し、グルコースから酸を生成し、カタラーゼ反応は陽性、オキシダーゼ反応は陰性を示した（表１、図１〜３）。
【００４２】
細菌第二段階試験の結果、２９２１５−Ｂ１菌株は、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−ガラクトースおよびＤ−フラクトースなどを発酵し、Ｌ−ソルボースおよびズルシトールなどを発酵しなかった（表２）。
【００４３】
また、追加試験の結果、２９２１５−Ｂ１菌株は、１５℃で生育せず、好気条件下では弱いながら生育した（表３）。
【００４４】
これらの性状は、実施例２に記載する１６Ｓ  ｒＤＮＡの部分塩基配列解析において、最も高い相同率が示されたスポロラクトバチルス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属の性状（Ｋｉｔａｈａｒａ  Ｋ，  Ｌａｉ  ＣＬ，  Ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｐｏｒｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｎｕｌｉｎｕｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．  １９６７；１３：１９７−２０３）と比較した結果、一致する点があるものの、相違点も確認された。特に、カタラーゼ反応で陽性を示した点は、スポロラクトバチルス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属の特徴とは異なる。
【００４５】
（実施例２）２９２１５−Ｂ１菌株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの部分塩基配列解析
ア  方法
２９２１５−Ｂ１菌株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの部分塩基配列（配列番号１）を微生物同定データベース（細菌用「ＤＢ−ＢＡ」）に対してＢＬＡＳＴ検索を行った。
【００４６】
イ  結果
ＢＬＡＳＴ検索の結果の上位３０塩基配列について相同率ととも表４に記載した。最も相同率が高いＳｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｔｉｄｕｓの基準株（Ｔｙｐｅ  ｓｔｒａｉｎ）の１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列（ＡＢ３７４５２２）に対する同一性（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）でさえ９２．０％しかなかった。
【表４】
0006915932.tif 000006
【００４７】
図４には、１６Ｓ  ｒＤＮＡの部分塩基配列に基づき作成した２９２１５−Ｂ１菌株（ＳＩＩＤ２９２１５−Ｂ１と表示）の系統樹を記載した。左上の線はスケールバー（０．０１と表示されたバーの長さは１％の相違塩基を意味する）、系統枝の分岐に位置する数字はブートストラップ値、株名の末尾のＴはその種の基準株（Ｔｙｐｅ  ｓｔｒａｉｎ）を意味する。
【００４８】
ウ  考察
２９２１５−Ｂ１菌株は、スポロラクトバチルス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属するいずれの種の基準株（Ｔｙｐｅ  ｓｔｒａｉｎ）とも９２％以下の同一性しか有しておらず、公知の属であるスポロラクトバチルス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属するとはいえない。
【００４９】
（実施例３）２９２１５−Ｂ１菌株のゲノム塩基配列のＡＮＩ解析
（１）２９２１５−Ｂ１菌株のゲノムＤＮＡの抽出・精製
陰イオン交換カラムＮｕｃｌｅｏｂｏｎｄ  ＡＸＧ２０（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ，ＤＥ）を用いて２９２１５−Ｂ１菌株のゲノムＤＮＡを抽出・精製した。得られたゲノムＤＮＡは、超微量分光光度計ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を用いて、純度：Ａ２６０／Ａ２８０≧１．８、Ａ２６０／Ａ２３０≧１．６であり、濃度：２０μｇ（１５０ｎｇ／μＬ）以上であることを確認した。また、アガロース電気泳動（０．５％アガロース、３０Ｖ、１時間）を用いて、得られたゲノムＤＮＡが次世代シーケンスに使用できる程度に断片化が少ないことを確認した。
【００５０】
（２）２９２１５−Ｂ１菌株のゲノムＤＮＡの塩基配列の決定
次世代シーケンサーＰａｃＢｉｏ  ＲＳ  ＩＩ（Ｍａｃｒｏｇｅｎ）を用いて２９２１５−Ｂ１菌株のゲノムＤＮＡの塩基配列を決定した。２９２１５−Ｂ１菌株のゲノムＤＮＡは３９６７３２７個の塩基配列からなる（配列番号２）。
【００５１】
（３）２９２１５−Ｂ１菌株のゲノムＤＮＡの塩基配列を用いたＡＮＩ解析
ア  方法
２９２１５−Ｂ１菌株のゲノムＤＮＡの塩基配列（配列番号２）および実施例２の１６Ｓ  ｒＤＮＡの部分塩基配列解析において最も相同率の高かったＳｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｔｉｄｕｓのゲノムＤＮＡの塩基配列を対比することにより、平均ヌクレオチド同一性（Ａｖｅｒａｇｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｉｄｅｎｔｉｔｙ；ＡＮＩ）値を算出した。ここで、ＡＮＩ値の算出方法については、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−ＲらによるＴｈｅ  ｅｎｖｅｏｍｉｃｓ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：  ａ  ｔｏｏｌｂｏｘ  ｆｏｒ  ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ａｎｄ  ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅｓ．  ＰｅｅｒＪ  Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ  ２０１６；４：ｅ１９００ｖ１（https://peerj.com/preprints/1900v1.pdf）に詳しく記載されている。
【００５２】
イ  結果
２９２１５−Ｂ１菌株とＳｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｔｉｄｕｓの間のＡＮＩ値は７９．１０％であった。ここで、Ｇｏｒｉｓらによる文献（ＤＮＡ−ＤＮＡ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｖａｌｕｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｔｏ  ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２００７；５７：８１−９１）によれば、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション（ＤＤＨ）値の７０％に相当するＡＮＩ値の９５％以上が同種と判断する基準値である。してみれば、２９２１５−Ｂ１菌株は、ＡＮＩ値の９５％以上ではないからＳｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｔｉｄｕｓに属する微生物とはいえず、ＡＮＩ値９５％以上とはかけ離れたＡＮＩ値７９．１０％のゲノムＤＮＡを有しており、スポロラクトバチルス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する新種の微生物であるとも言えない。
【００５３】
（実施例４）有機酸測定試験
（１）方法
２９２１５−Ｂ１菌株を含む微生物（２種の混合菌を含む）の培養液中に存在する有機酸の濃度について高速液体クロマトグラフィーを用いて測定した。測定対象の有機酸は、コハク酸、乳酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、ｉｓｏ−酪酸、ｎ−酪酸、ｉｓｏ-吉草酸、ｎ−吉草酸の９物質である。
（培養条件）
・培地  ＧＡＭ  Ｂｒｏｔｈ”Ｎｉｓｓｕｉ”（Ｎｉｓｓｕｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，Ｊａｐａｎ）
・培養温度  ３７℃
・培養時間  ７２時間
・その他条件  嫌気培養
アネロパウチ・ケンキシステム（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  Ｇａｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｊａｐａｎ）
（前処理）
培養液を孔径０．２０μｍのメンブレンフィルターでろ過し、試料溶液とした。
（測定条件）
・システム  島津有機酸分析システム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｊａｐａｎ）
・カラム  Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ  ＳＣＲ−１０２（Ｈ）、３００ｍｍ×８ｍｍ  ＩＤ、２本直列で使用
・ガードカラム  Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ  ＳＣＲ−１０２（Ｈ）、５０ｍｍ×６ｍｍ  ＩＤ
・溶離液  ５ｍｍｏｌ／Ｌ  ｐ−トルエンスルホン酸
・反応液  ５ｍｍｏｌ／Ｌ  ｐ−トルエンスルホン酸、１００μｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ
・流速  ０．８ｍＬ／ｍｉｎ
・オーブン温度  ４５℃
・検出器  電気伝導度検出器ＣＤＤ−１０Ａ
【００５４】
（２）結果
表５に記載するような有機酸の濃度が検出された。
【表５】
0006915932.tif 000007
【００５５】
（３）考察
表５に記載されたように、２９２１５−Ｂ１菌株は乳酸を主に産生している。２９２１５−Ｂ１菌株は、単独では酪酸を産生しないものの、酪酸産生菌としてよく知られたクロストリジウム  ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）の基準株（ＮＢＲＣ  １３９４９Ｔ）の酪酸産生能を高める働きがある。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明によって得られたスポロラクトバチルス科（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）に属する新種の微生物は、単独で又は酪酸生産菌との混合培養により、短鎖脂肪酸を製造するために利用することができる。
【受託番号】
【００５７】
（１）寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター
（２）連絡先：〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８
電話番号  ０４３８−２０−５５８０
（３）受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０３４３５
（４）識別の表示：ＳＩＩＤ２９２１５−Ｂ１
（５）受託日：２０２１年３月１２日
【要約】
【課題】酪酸に代表される短鎖脂肪酸を製造するために使用される有用な新規微生物を提供すること。
【解決手段】スポロラクトバチルス科（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）に属する新種の微生物（ＮＩＴＥ  Ｐ−０３４３５）を単離し、同定した。
【選択図】図４【図１】
0006915932.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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