(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の細胞非接着部と、前記第１の細胞非接着部中に配置された細胞培養部を含む表面を有する細胞培養基材であって、
前記細胞培養部が、第２の細胞非接着部と、前記第２の細胞非接着部の周縁に沿って連続的に又は、１以上の中断部分を介して断続的に延在し、前記第２の細胞非接着部を囲う細胞接着部とを含み、前記第２の細胞非接着部中に細胞接着部が存在せず、
前記１以上の中断部分の各々の長さが前記第２の細胞非接着部の全周の６分の１以下であり、且つ、前記１以上の中断部分の合計の長さが前記第２の細胞非接着部の全周の６分の１以下である、
細胞培養基材上に幹細胞を播種すること、並びに
播種された前記幹細胞を培養して、前記幹細胞の一部を小腸上皮細胞に分化させることを含む、小腸上皮細胞を含む細胞構造物の製造方法。
【請求項２】
前記細胞接着部の内周上の前記第２の細胞非接着部を介して対向する最も離れた２つの点の中間点を通る直線と、前記細胞接着部の内周との２つの交点の間の距離が、８０μｍ超、且つ、８８０μｍ以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞接着部の、前記細胞接着部の内周上の前記第２の細胞非接着部を介して対向する最も離れた２つの点の中間点を通る直線に沿った方向の幅が、３０μｍ超、且つ、４００μｍ以下である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞構造物が、
前記細胞構造物のＡＢＣＧ２トランスポーターの発現量及びＡＢＣＢ１トランスポーターの発現量を、それぞれ、起源動物の小腸組織でのＡＢＣＧ２トランスポーターの発現量及びＡＢＣＢ１トランスポーターの発現量に対する相対値として表したとき、前記細胞構造物でのＡＢＣＧ２トランスポーターの発現量の前記相対値が、ＡＢＣＢ１トランスポーターの発現量の前記相対値に対して、９０倍以上である、小腸上皮細胞を含む細胞構造物である、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記発現量が、それぞれ、ｍＲＮＡ量に基づく発現量である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞構造物が、内胚葉系細胞、外胚葉系細胞及び中胚葉系細胞を含む、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
第１の細胞非接着部と、前記第１の細胞非接着部中に配置された細胞培養部とを含む表面を有する細胞培養基材であって、
前記細胞培養部が、第２の細胞非接着部と、前記第２の細胞非接着部の周縁に沿って連続的に又は、１以上の中断部分を介して断続的に延在し、前記第２の細胞非接着部を囲う細胞接着部とを含み、前記第２の細胞非接着部中に細胞接着部が存在せず、
前記１以上の中断部分の各々の長さが前記第２の細胞非接着部の全周の６分の１以下であり、且つ、前記１以上の中断部分の合計の長さが前記第２の細胞非接着部の全周の６分の１以下である、
細胞培養基材、並びに
前記細胞培養部上に接着された、小腸上皮細胞を含む細胞構造物
を含む、細胞構造物保持基材。
【請求項８】
前記表面の法線方向に沿って前記細胞構造物保持基材を見た場合に、少なくとも前記細胞接着部と重なる位置に前記小腸上皮細胞が存在する、請求項７に記載の細胞構造物保持基材。
【請求項９】
前記表面の法線方向に沿って前記細胞構造物保持基材を見た場合に、前記細胞構造物が、前記細胞接着部及び前記第２の細胞非接着部と重なり、
前記小腸上皮細胞が、前記第２の細胞非接着部と重なる位置よりも前記細胞接着部と重なる位置に多く存在する、請求項８に記載の細胞構造物保持基材。
【請求項１０】
前記細胞構造物が、内胚葉系細胞、外胚葉系細胞及び中胚葉系細胞を含む、請求項７〜９のいずれか１項に記載の細胞構造物保持基材。
【請求項１１】
前記細胞接着部の内周上の前記第２の細胞非接着部を介して対向する最も離れた２つの点の中間点を通る直線と、前記細胞接着部の内周との２つの交点の間の距離が、８０μｍ超、且つ、８８０μｍ以下である、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の細胞構造物保持基材。
【請求項１２】
前記細胞接着部の、前記細胞接着部の内周上の前記第２の細胞非接着部を介して対向する最も離れた２つの点の中間点を通る直線に沿った方向の幅が、３０μｍ超、且つ、４００μｍ以下である、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の細胞構造物保持基材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、小腸上皮細胞を含む細胞構造物、小腸上皮細胞を含む細胞構造物の製造方法に関する。
本開示はまた、小腸上皮細胞を含む細胞構造物を保持する基材に関する。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹細胞(ES細胞)、人工多能性幹細胞(iPS細胞)等の多能性幹細胞は目的細胞に分化誘導することができ、再生医療の分野での応用が期待されている。多能性幹細胞を培養して分化誘導させ、ヒトの組織に近いオルガノイドと呼ばれる構造物を得る方法が研究されている。【０００３】
例えば、特許文献１では、胚性幹細胞から腸管上皮オルガノイドを作製する方法が記載されている。【０００４】
また非特許文献２にあるようにＴＮＦ−αを培地中に投与してオルガノイドから上皮以外の細胞を誘導する技術も確立されている。【０００５】
人工多能性幹細胞から小腸上皮細胞を分化誘導する他の方法としては、特許文献２に記載されている方法が挙げられる。【０００６】
一方、特許文献３及び非特許文献３には細胞接着部のパターンが形成された基材上で多能性幹細胞を培養し腸管組織を分化誘導する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２０１１／１４０４４１
【特許文献２】特許第６２９６３９９号公報
【特許文献３】特許第６１５１０９７号公報
【特許文献４】特開２０１２−１２０４４３号公報
【特許文献５】特開２０１３−１７９９１０号公報
【特許文献６】特許第５０７０５６５号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Workman et al., Nature Medicine 第23巻 49〜59ページ 2017年
【非特許文献２】Hahn et al., Scientific Reports 第7巻2435 2017年
【非特許文献３】Uchida et al., JCI Insight 第2巻e86492 2017年
【非特許文献４】Lee et al., Stem Cell Reports 第6巻257〜272ページ  2016年
【非特許文献５】Okeyo et al., Tissue Eng PartC 第21巻1105〜1115ページ2015年
【非特許文献６】Golos et al., Placenta 第34S巻S56〜S61ページ2013年
【非特許文献７】Chen et al., Biochemical and Biophysical Research Communications第436巻677〜684ページ2013年
【非特許文献８】Kojima et al., Laboratory Investigation 第97巻1188〜1200ページ2017年
【非特許文献９】Niwa et al., Nature Genetics 第24巻  372〜376ページ  2000年
【非特許文献１０】Onozato et al., Drug and Metabolism Disposition Epub ahead of print 2018年
【非特許文献１１】角田ら  日本レーザー医学会誌  第28巻 355〜361ページ  2008年
【非特許文献１２】Mao et al., Pharmaceutical Research 第25巻 1244〜1255ページ 2008年
【非特許文献１３】Mustata et al., Cell Reports 第5巻 421〜432ページ 2013年
【非特許文献１４】Boyd, Placenta 第27巻S24〜S26ページ 2013年
【非特許文献１５】Han et al., Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology 第14巻 817-829ページ 2018年
【非特許文献１６】Kabeya et al., Drug Metabolism and Disposition 第46巻 1411〜1419ページ 2018年
【非特許文献１７】Singh et al., Cell Stem Cell 第10巻 312〜326ページ 2012年
【非特許文献１８】Akutsu et al., Regenerative Therapy 第1巻 18〜29ページ 2015年
【非特許文献１９】Okochi et al., Langmuir  第25巻  6947〜6953ページ 2009年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
腸は三胚葉（内胚葉、外胚葉、中胚葉）に由来する細胞を含む複雑な器官である。腸は、内胚葉に由来する小腸上皮細胞（腸細胞、杯細胞、内分泌細胞、刷子細胞、パネート細胞、M細胞等）、中胚葉に由来するリンパ組織、平滑筋細胞、カハール介在細胞、外胚葉に由来する腸管神経叢等が複雑に組み合わされて、分泌、吸収、蠕動運動等の機能を奏する。【００１０】
特許文献１記載の方法で得られた組織は小腸上皮細胞のみを含む。また胚性幹細胞からの分化誘導にアクチビンを使用しているがゆえにほぼ単一の胚葉由来の細胞、ここでは内胚葉由来細胞しかできてない。このため、中胚葉や外胚葉由来の他種細胞を含む腸組織を得るためには、他種細胞を、非特許文献１にあるように別途分化誘導する必要があった。また特許文献１記載の方法は、上皮分化誘導のためにマトリゲルに包埋して培養する工程を含み、この点からも生産性に課題があった。【００１１】
非特許文献２に記載の方法に関しても培養の手間が課題となっていた。
特許文献２に記載の方法で得られた組織もまた、小腸上皮細胞のみを含むため、特許文献１に記載の方法と同様の課題があった。【００１２】
一方、特許文献３及び非特許文献３に記載の方法によれば、単一の培養により腸管上皮組織のみならず筋組織や神経組織なども分化誘導することができる。この方法はまた、多くのパターンが形成された一つの基材上で同時に多くの腸管組織を培養することできるため、生産効率が高い。また生物由来物質を用いずに培養を達成しているため移植用途にも適用しやすい。【００１３】
しかしながら、特許文献３及び非特許文献３に記載の方法は、培養期間が長い、腸組織の収率が低いといった点で、均一性が求められる工業的生産への応用のためには、なお改善の余地があった。【００１４】
すなわち、小腸上皮細胞を含む細胞構造物を、比較的短い培養期間で、高収率で製造するための手段が求められていた。【００１５】
また、腸関連疾患を予防又は治療するための薬剤の開発や、腸関連疾患の病理研究を目的とした試験に利用するのに適した形態の、小腸上皮細胞を含む細胞構造物は従来提供されていなかった。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本開示は、以下の発明を包含する。
（１）細胞培養部を含む表面を有する細胞培養基材であって、
前記細胞培養部が、細胞非接着部と、前記細胞非接着部の周縁に沿って連続的に又は断続的に延在し、前記細胞非接着部を囲う細胞接着部とを含む、
細胞培養基材上に幹細胞を播種すること、並びに
播種された前記幹細胞を培養して、前記幹細胞の一部を小腸上皮細胞に分化させることを含む、小腸上皮細胞を含む細胞構造物の製造方法。
（２）前記細胞接着部の内周上の前記細胞非接着部を介して対向する最も離れた２つの点の中間点を通る直線と、前記細胞接着部の内周との２つの交点の間の距離が、８０μｍ超、且つ、８８０μｍ以下である、（１）に記載の方法。
（３）前記細胞接着部の、前記細胞接着部の内周上の前記細胞非接着部を介して対向する最も離れた２つの点の中間点を通る直線に沿った方向の幅が、３０μｍ超、且つ、４００μｍ以下である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記細胞接着部の内周上の前記細胞非接着部を介して対向する最も離れた２つの点の中間点を通る直線と、前記細胞接着部の内周との２つの交点の間の距離Ｘ’の、前記細胞接着部の、前記細胞非接着部を通る直線に沿った方向の幅Ｗ’に対する比Ｘ’／Ｗ’が、好ましくは０．５以上、より好ましくは１．０以上、より好ましくは１．３以上であり、好ましくは２０．０以下、より好ましくは１５．０以下、より好ましくは１０．０以下である、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記細胞非接着部の周縁と前記細胞非接着部の重心を通る直線との２つの交点の間の距離が、８０μｍ超、且つ、８８０μｍ以下である、（１）に記載の方法。
（６）前記細胞接着部の、前記細胞非接着部の重心を通る直線に沿った方向の幅が、３０μｍ超、且つ、４００μｍ以下である、（１）又は（５）に記載の方法。
（７）前記細胞非接着部の周縁と前記細胞非接着部の重心を通る直線との２つの交点の間の距離Ｘの、前記細胞接着部の、前記細胞非接着部の重心を通る直線に沿った方向の幅Ｗに対する比Ｘ／Ｗが、好ましくは０．５以上、より好ましくは１．０以上、より好ましくは１．３以上であり、好ましくは２０．０以下、より好ましくは１５．０以下、より好ましくは１０．０以下である、（１）、（５）又は（６）に記載の方法。
（８）第１の細胞非接着部と、
前記第１の細胞非接着部中に配置された１以上の細胞培養部と
を含む表面を有する支持基材を含む細胞培養基材であって、
前記１以上の細胞培養部の各々が、第２の細胞非接着部である中央部と、前記中央部の周縁に沿って連続的に又は断続的に延在し、前記中央部を囲う細胞接着部とを含む、
細胞培養基材上に幹細胞を播種すること、並びに
播種された前記幹細胞を培養して、前記幹細胞の一部を小腸上皮細胞に分化させることを含む、小腸上皮細胞を含む細胞構造物の製造方法。
（９）前記細胞接着部の内周上の前記中央部を介して対向する最も離れた２つの点の中間点を通る直線と、前記細胞接着部の内周との２つの交点の間の距離が、８０μｍ超、且つ、８８０μｍ以下である、（８）に記載の方法。
（１０）前記細胞接着部の、前記細胞接着部の内周上の前記中央部を介して対向する最も離れた２つの点の中間点を通る直線に沿った方向の幅が、３０μｍ超、且つ、４００μｍ以下である、（８）又は（９）に記載の方法。
（１１）前記細胞接着部の内周上の前記中央部を介して対向する最も離れた２つの点の中間点を通る直線と、前記細胞接着部の内周との２つの交点の間の距離Ｘ’の、前記細胞接着部の、前記中央部を通る直線に沿った方向の幅Ｗ’に対する比Ｘ’／Ｗ’が、好ましくは０．５以上、より好ましくは１．０以上、より好ましくは１．３以上であり、好ましくは２０．０以下、より好ましくは１５．０以下、より好ましくは１０．０以下である、（８）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）前記中央部の周縁と前記中央部の重心を通る直線との２つの交点の間の距離が、８０μｍ超、且つ、８８０μｍ以下である、（８）に記載の方法。
（１３）前記細胞接着部の、前記中央部の重心を通る直線に沿った方向の幅が、３０μｍ超、且つ、４００μｍ以下である、（８）又は（１２）に記載の方法。
（１４）前記中央部の周縁と前記中央部の重心を通る直線との２つの交点の間の距離Ｘの、前記細胞接着部の、前記中央部の重心を通る直線に沿った方向の幅Ｗに対する比Ｘ／Ｗが、好ましくは０．５以上、より好ましくは１．０以上、より好ましくは１．３以上であり、好ましくは２０．０以下、より好ましくは１５．０以下、より好ましくは１０．０以下である、（８）、（１２）又は（１３）に記載の方法。
（１５）小腸上皮細胞を含む細胞構造物であって、
前記細胞構造物のＡＢＣＧ２トランスポーターの発現量及びＡＢＣＢ１トランスポーターの発現量を、それぞれ、起源動物の小腸組織でのＡＢＣＧ２トランスポーターの発現量及びＡＢＣＢ１トランスポーターの発現量に対する相対値として表したとき、前記細胞構造物でのＡＢＣＧ２トランスポーターの発現量の前記相対値が、ＡＢＣＢ１トランスポーターの発現量の前記相対値に対して、９０倍以上である、小腸上皮細胞を含む細胞構造物。
（１６）小腸上皮細胞を含む細胞構造物であって、
前記細胞構造物のＣＵＢＮの発現量及びＶｉｌｌｉｎの発現量を、それぞれ、起源動物の小腸組織でのＣＵＢＮの発現量及びＶｉｌｌｉｎの発現量に対する相対値として表したとき、前記細胞構造物でのＣＵＢＮの発現量の前記相対値が、Ｖｉｌｌｉｎの発現量の前記相対値に対して、０．２〜１．８の範囲にある、小腸上皮細胞を含む細胞構造物。
（１７）前記発現量が、それぞれ、ｍＲＮＡ量に基づく発現量である、（１５）又は（１６）に記載の細胞構造物。
（１８）内胚葉系細胞、外胚葉系細胞及び中胚葉系細胞を含む、（１５）〜（１７）のいずれかに記載の細胞構造物。
（１９）細胞培養部を含む表面を有する細胞培養基材であって、
前記細胞培養部が、細胞非接着部と、前記細胞非接着部の周縁に沿って連続的に又は断続的に延在し、前記細胞非接着部を囲う細胞接着部とを含む、
細胞培養基材、並びに
前記細胞培養部上に接着された、小腸上皮細胞を含む細胞構造物
を含む、細胞構造物保持基材。
（２０）前記表面の法線方向に沿って前記細胞構造物保持基材を見た場合に、少なくとも前記細胞接着部と重なる位置に前記小腸上皮細胞が存在する、（１９）に記載の細胞構造物保持基材。
（２１）前記表面の法線方向に沿って前記細胞構造物保持基材を見た場合に、前記細胞構造物が、前記細胞接着部及び前記細胞非接着部と重なり、
前記小腸上皮細胞が、前記細胞非接着部と重なる位置よりも前記細胞接着部と重なる位置に多く存在する、（２０）に記載の細胞構造物保持基材。
（２２）前記細胞構造物が、内胚葉系細胞、外胚葉系細胞及び中胚葉系細胞を含む、（１９）〜（２１）のいずれかに記載の細胞構造物保持基材。
（２３）前記細胞接着部の内周上の前記細胞非接着部を介して対向する最も離れた２つの点の中間点を通る直線と、前記細胞接着部の内周との２つの交点の間の距離が、８０μｍ超、且つ、８８０μｍ以下である、（１９）〜（２２）のいずれかに記載の細胞構造物保持基材。
（２４）前記細胞接着部の、前記細胞接着部の内周上の前記細胞非接着部を介して対向する最も離れた２つの点の中間点を通る直線に沿った方向の幅が、３０μｍ超、且つ、４００μｍ以下である、（１９）〜（２３）のいずれかに記載の細胞構造物保持基材。
（２５）前記細胞接着部の内周上の前記細胞非接着部を介して対向する最も離れた２つの点の中間点を通る直線と、前記細胞接着部の内周との２つの交点の間の距離Ｘ’の、前記細胞接着部の、前記細胞非接着部を通る直線に沿った方向の幅Ｗ’に対する比Ｘ’／Ｗ’が、好ましくは０．５以上、より好ましくは１．０以上、より好ましくは１．３以上であり、好ましくは２０．０以下、より好ましくは１５．０以下、より好ましくは１０．０以下である、（１９）〜（２４）のいずれかに記載の細胞構造物保持基材。【００１７】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１９−０１４７６６号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００１８】
本開示の方法によれば、小腸上皮細胞を含む細胞構造物を、比較的短い培養期間で、高収率で製造することができる。【００１９】
本開示の細胞構造物は腸オルガノイドとして、腸関連疾患を予防又は治療するための薬剤の開発や、腸関連疾患の病理研究に用いることができる。【００２０】
本開示の細胞構造物保持基材は、小腸上皮細胞を含む細胞構造物を、腸関連疾患を予防又は治療するための薬剤の開発や、腸関連疾患の病理研究に利用する際の取り扱いが容易である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、実施例１、実施例８で用いた、複数の環状の細胞接着部を備える細胞培養基材の、細胞接着部が支持基材の露出した表面である実施形態の模式図である。図１（Ａ）は細胞培養基材の平面図であり、図１（Ｂ）は図１（Ａ）におけるＡ−Ａ線に沿った断面模式図である。
【図２】図２は、実施例１での、内径の異なる環状細胞接着部を有する各細胞培養基材を用いて培養したときの培養１日目、６日目、１１日目、１８日目の培養物の観察像を示す。
【図３】図３は、実施例１での、内径の異なる環状細胞接着部を有する各細胞培養基材を用いて培養したときの培養３週間の培養物の観察像を示す。
【図４】図４は、内径３８０μｍの環状細胞接着部を有する基材上で形成され剥離した袋状構造を有する組織の観察像（左がディッシュ全体の写真、右が組織の観察像）を示す。
【図５】図５は、比較例１、比較例２、比較例３の各基材上での培養開始後３週間の培養物の顕微鏡観察像を示す。
【図６】図６は、実施例２での、培養４日目、９日目、１３日目、２０日目の各時点での１つの環状細胞接着部周辺の細胞の観察像を示す。
【図７】図７は、実施例３での、内径の異なる細胞培養基材を用いた培養の培養物の培養１日目及び７日目の観察像と、内径２８０μｍの環状細胞接着部を有する細胞培養基材を用いた培養で培養３週間後に回収された袋状構造を有する組織の観察像を示す。
【図８】図８は、実施例４での、免疫染色した培養物の培養４日目の観察像を示す。
【図９】図９は、実施例４での、免疫染色した培養物の培養７日目の観察像を示す。
【図１０】図１０は、実施例５での、内径２８０μｍ又は３８０μｍ、幅６０μｍの環状細胞接着部を備える細胞培養基材上で幹細胞を培養し形成された組織の、抗ＣＤＸ２抗体、抗Ｖｉｌｌｉｎ抗体及びＤＡＰＩによる染色の結果を示す。
【図１１】図１１は、実施例５での、内径３８０μｍ、幅６０μｍの環状細胞接着部を備える細胞培養基材上で培養し形成された組織の、抗平滑筋アクチン（Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ａｃｔｉｎ）抗体、抗ＰＧＰ９．５抗体及びＤＡＰＩによる染色の結果を示す。
【図１２】図１２は、実施例６での、各寸法の環状細胞接着部を備える細胞培養基材上での培養１８日目の観察像である。
【図１３】図１３は、実施例６での、各寸法の環状細胞接着部を備える細胞培養基材上での培養の評価結果を示す。
【図１４】図１４は、実施例６での、内径５８０μｍ、幅６０μｍの環状細胞接着部を備える細胞培養基材上での培養により得られた袋状構造を有する組織の観察像を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、実施例７で用いた、内寸が一辺２８０μｍ〜３００μｍの正方形で、幅５０μｍ〜６０μｍの細胞接着部を示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、実施例７で用いた、内径２８０μｍ、幅６０μｍの環状で、周方向の１／８が欠落している、細胞接着部を示す。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、実施例７で用いた、内寸が長辺６００μｍ、短辺３００μｍの長方形で、幅５０μｍの細胞接着部を示す。
【図１５Ｄ】図１５Ｄは、実施例７で用いた、内寸が一辺６００μｍの正方形で、幅５０μｍの細胞接着部を示す。
【図１６Ａ】図１６Ａは、図１５Ａに示す形状の細胞接着部を備える細胞培養基材を用いて幹細胞を培養した培養物の観察像を示す。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、図１５Ｂに示す形状の細胞接着部を備える細胞培養基材を用いて幹細胞を培養した培養物の観察像を示す。
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、図１５Ｃに示す形状の細胞接着部を備える細胞培養基材を用いて幹細胞を培養した培養物の観察像を示す。
【図１６Ｄ】図１６Ｄは、図１５Ｄに示す形状の細胞接着部を備える細胞培養基材を用いて幹細胞を培養した培養物の観察像を示す。
【図１７】図１７は、実施例８での、内径２８０μｍ又は３８０μｍ、幅６０μｍの環状細胞接着部を備える細胞培養基材上で幹細胞を培養した培養物の培養１日目、７日目、１１日目の観察像を示す。
【図１８】図１８は、実施例８での、内径２８０μｍ又は３８０μｍ、幅６０μｍの環状細胞接着部を備える細胞培養基材上で幹細胞を３週間培養して得られた袋状構造を有する組織の観察像を示す。
【図１９】図１９は、実施例９で求めた各条件の細胞培養基板上で得た細胞構造物でのＡＢＣＧ２／ＡＢＣＢ１比の平均値を示す。
【図２０】図２０は、実施例９で求めた各条件の細胞培養基板上で得た細胞構造物でのＣＵＢＮ／Ｖｉｌｌｉｎ比の平均値を示す。
【図２１】図２１は、実施例１０での、直径１５００μｍの円形の細胞接着部を有する細胞培養基材上でＥｄｏｍ  ｉＰＳ幹細胞を培養したときの、細胞接着部に接着した細胞の免疫染色の観察像である。
【図２２】図２２は、実施例１０での、直径３．５ｃｍの細胞培養用ディッシュ（培養ディッシュ）、パターンの無いガラス基材（共に１．５ｃｍ×２．５ｃｍサイズ）（素ガラス）、直径１５００μｍの円形の細胞接着部を有する基材（パターン基材）の各細胞培養基材上で、Ｅｄｏｍ  ｉＰＳ幹細胞を培養したときの、基材上に接着した細胞の免疫染色の観察像である。
【図２３】図２３は、直径１５００μｍの円形の細胞接着部を有する基材上でＥｄｏｍ  ｉＰＳ細胞を培養したときの、培養７日目の組織の観察像を示す。
【図２４】図２４は、実施例１１での、凝集部及び非凝集部の各試料について、Ｏｃｔ３／４の発現量を、ＧＡＰＤＨの発現量で補正した補正値として求め、非凝集部の試料でのＯｃｔ３／４の発現量を１としたときの、凝集部の試料のＯｃｔ３／４の発現量の相対値を示す。
【図２５】図２５は、実施例１２での免疫染色の結果を示す。
【図２６】図２６は、複数の環状の細胞接着部を備える細胞培養基材の、細胞接着部が細胞接着層の表面である実施形態の模式図である。図２６（Ａ）は細胞培養基材の平面図であり、図２６（Ｂ）は図２６（Ａ）におけるＡ−Ａ線に沿った断面模式図である。
【図２７】図２７は、実施例４において、内径６００μｍ、幅１００μｍの環状細胞接着部を備える細胞培養基材上でＥｄｏｍ  ｉＰＳ細胞を培養したときの、培養９日目の培養物の、神経細胞及び筋肉細胞の免疫染色の結果を示す写真である。スケールバーは１００μｍを示す。
【図２８】図２８は、実施例４において、内径６００μｍ、幅１００μｍの環状細胞接着部を備える細胞培養基材上でＥｄｏｍ  ｉＰＳ細胞を培養したときの、培養９日目の培養物の、神経細胞及び腸上皮系内胚葉細胞の免疫染色の結果を示す写真である。スケールバーは１００μｍを示す。
【図２９】図２９は、実施例１３における培養１週間後の凝集部を用いた検討結果を示す。スケールバーは４０μｍを示す。
【図３０】図３０は、実施例１３における培養２週間後の凝集部を用いた検討結果を示す。スケールバーは４０μｍを示す。
【図３１】図３１は、実施例１４における培地置換後の培養４日目の観察結果を示す。
【図３２】図３２は、実施例１４における培地置換後の培養１０日目の観察結果を示す。
【図３３】図３３は、細胞非接着部（中央部）及びそれを囲う環状の細胞接着部を有する細胞培養基材と、小腸上皮細胞を含む細胞構造物とを含む細胞構造物保持基材の、前記細胞構造物が細胞接着部と重なる位置に存在する実施形態の模式図である。図３３（Ａ）は細胞構造物保持基材を、表面Ｓの法線方向に沿って見た平面図であり、図３３（Ｂ）は図３３（Ａ）におけるＡ−Ａ線に沿った断面模式図である。
【図３４】図３４は、細胞非接着部（中央部）及びそれを囲う環状の細胞接着部を有する細胞培養基材と、小腸上皮細胞を含む細胞構造物とを含む細胞構造物保持基材の、前記細胞構造物が細胞接着部及び前記細胞非接着部（中央部）と重なる位置に存在する実施形態の模式図である。図３４（Ａ）は細胞構造物保持基材を、表面Ｓの法線方向に沿って見た平面図であり、図３４（Ｂ）は図３４（Ａ）におけるＡ−Ａ線に沿った断面模式図である。
【図３５】図３５は、複数の突出部の上面のそれぞれに、細胞非接着部（中央部）とその周囲を囲う細胞接着部とを含む細胞培養部を備える細胞培養基材の一実施形態の模式図である。図３５（Ａ）は細胞培養基材の平面図であり、図３５（Ｂ）は図３５（Ａ）におけるＡ−Ａ線に沿った断面模式図である。
【図３６】図３６は、複数の窪み部の底面のそれぞれに、細胞非接着部（中央部）とその周囲を囲う細胞接着部とを含む細胞培養部を備える細胞培養基材の一実施形態の模式図である。図３６（Ａ）は細胞培養基材の平面図であり、図３６（Ｂ）は図３６（Ａ）におけるＡ−Ａ線に沿った断面模式図である。
【図３７】図３７は、細胞非接着部（中央部）とその周囲を囲う細胞接着部と含む細胞培養部が１つの表面の全体を占める細胞培養基材の一実施形態の模式図である。図３７（Ａ）は細胞培養基材の平面図であり、図３７（Ｂ）は図３７（Ａ）におけるＡ−Ａ線に沿った断面模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
＜１．幹細胞＞
本開示で用いる幹細胞としては、小腸上皮細胞への分化能を有する幹細胞であればよいが、好ましくは、内胚葉系細胞（小腸上皮細胞等）、外胚葉系細胞及び中胚葉系細胞への分化能を有する幹細胞であり、より好ましくは、多能性幹細胞である。多能性幹細胞としては特に、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が好適である。
【００２３】
本開示において使用される胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、好ましくは哺乳動物由来のＥＳ細胞であり、例えば、マウスなどのげっ歯類又はヒトなどの霊長類由来のＥＳ細胞などを使用することができる。特に好ましくは、マウス又はヒト由来のＥＳ細胞を使用する。ＥＳ細胞は、動物の発生初期段階である胚盤胞期の胚の一部に属する内部細胞塊より作られる幹細胞株を指し、生体外にて、理論上すべての組織に分化する分化多能性を保ちつつ、ほぼ無限に増殖させることができる。ＥＳ細胞としては、例えば、その分化の程度の確認を容易とするために、Ｐｄｘ１遺伝子付近にレポーター遺伝子を導入した細胞を用いることができる。例えば、Ｐｄｘ１座にＬａｃＺ遺伝子を組み込んだ１２９／Ｓｖ由来ＥＳ細胞株又はＰｄｘ１プロモーター制御下のＧＦＰレポータートランスジーンをもつＥＳ細胞ＳＫ７株などを使用することができる。あるいは、Ｈｎｆ３β内胚葉特異的エンハンサー断片制御下のｍＲＦＰ１レポータートランスジーン及びＰｄｘ１プロモーター制御下のＧＦＰレポータートランスジーンを有するＥＳ細胞ＰＨ３株を使用することもできる。また、国立成育医療研究センターの生殖・細胞医療研究部で樹立し、Akutsu H, et al. Regen Ther. 2015;1:18-29 に開示したＥＳ細胞株である、ＳＥＥＳ１、ＳＥＥＳ２、ＳＥＥＳ３、ＳＥＥＳ４、ＳＥＥＳ５、ＳＥＥＳ６又はＳＥＥＳ７や、これらのＥＳ細胞株に更なる遺伝子を導入した細胞株を使用することもできる。
【００２４】
本開示において使用される人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、体細胞を初期化することによって得られる多能性を有する細胞である。人工多能性幹細胞の作製は、京都大学の山中伸弥教授らのグループ、マサチューセッツ工科大学のルドルフ・ヤニッシュ（Ｒｕｄｏｌｆ  Ｊａｅｎｉｓｃｈ）らのグループ、ウイスコンシン大学のジェームス・トムソン（Ｊａｍｅｓ  Ｔｈｏｍｓｏｎ）らのグループ、ハーバード大学のコンラッド・ホッケドリンガー（Ｋｏｎｒａｄ  Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ）らのグループなどを含む複数のグループが成功している。例えば、国際公開ＷＯ２００７／０６９６６６号公報には、Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子及びＭｙｃファミリー遺伝子の遺伝子産物を含む体細胞の核初期化因子、並びにＯｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｓｏｘファミリー遺伝子及びＭｙｃファミリー遺伝子の遺伝子産物を含む体細胞の核初期化因子が記載されており、さらに体細胞に上記核初期化因子を接触させる工程を含む、体細胞の核初期化により誘導多能性幹細胞を製造する方法が記載されている。
【００２５】
ｉＰＳ細胞の作製に用いる体細胞の種類は特に限定されず、任意の体細胞を用いることができる。即ち、本開示で言う体細胞とは、生体を構成する細胞の内生殖細胞以外の全ての細胞を包含し、分化した体細胞でもよいし、未分化の幹細胞でもよい。体細胞の由来は、哺乳動物、鳥類、魚類、爬虫類、両生類の何れでもよく特に限定されないが、好ましくは哺乳動物（例えば、マウスなどのげっ歯類、又はヒトなどの霊長類）であり、特に好ましくはマウス又はヒトである。また、ヒトの体細胞を用いる場合、胎児、新生児又は成人の何れの体細胞を用いてもよい。体細胞の具体例としては、例えば、線維芽細胞（例えば、皮膚線維芽細胞）、上皮細胞（例えば、胃上皮細胞、肝上皮細胞、肺胞上皮細胞）、内皮細胞（例えば血管、リンパ管）、神経細胞（例えば、ニューロン、グリア細胞）、すい臓細胞、血球細胞、骨髄細胞、筋肉細胞（例えば、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞）、肝実質細胞、非肝実質細胞、脂肪細胞、骨芽細胞、歯周組織を構成する細胞（例えば、歯根膜細胞、セメント芽細胞、歯肉線維芽細胞、骨芽細胞）、腎臓・眼・耳を構成する細胞などが挙げられる。
【００２６】
ｉＰＳ細胞は、所定の培養条件下（例えば、ＥＳ細胞を培養する条件下）において長期にわたって自己複製能を有し、また所定の分化誘導条件下において外胚葉、中胚葉及び内胚葉への多分化能を有する幹細胞のことを言う。また、本開示におけるｉＰＳ細胞はマウスなどの試験動物に移植した場合にテラトーマを形成する能力を有する幹細胞でもよい。
【００２７】
体細胞からｉＰＳ細胞を製造するためには、まず、少なくとも１種類以上の初期化遺伝子を体細胞に導入する。初期化遺伝子とは、体細胞を初期化してｉＰＳ細胞とする作用を有する初期化因子をコードする遺伝子である。初期化遺伝子の組み合わせの具体例としては、以下の組み合わせを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
（ｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、Ｍｙｃ遺伝子
（ｉｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子
（ｉｉｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、Ｍｙｃ遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＳＶ４０  ｌａｒｇｅＴ遺伝子
（ｉｖ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子
【００２８】
＜２．細胞培養基材の細胞非接着部及び細胞接着部＞
本開示で用いる細胞培養基材は、細胞培養部を含む表面を有する。
【００２９】
そして、前記細胞培養部が、細胞非接着部と、前記細胞非接着部の周縁に沿って連続的に又は断続的に延在し、前記細胞非接着部を囲う細胞接着部とを含む。
前記細胞培養部は、前記細胞培養基材の表面上に１以上含まれる。２以上の細胞培養部が含まれる場合、各々が前記特徴を備えていてもよい。
前記細胞培養部中の前記細胞非接着部は、前記細胞培養部以外の部分に存在する細胞非接着部（後述する第１の細胞非接着部）と区別するために、「第２の細胞非接着部」或いは「中央部」と称する場合がある。
【００３０】
すなわち、本開示で用いる細胞培養基材は、その表面に、細胞非接着部と細胞接着部とが、所定の形状となるように形成されたものである。
【００３１】
以下の説明では、本開示で用いる細胞培養基材の、細胞非接着部及び細胞接着部を含む細胞培養部以外の特徴を説明するために、前記細胞培養基材のうち前記細胞接着部以外の部分を指して「支持基材」と称する場合がある。すなわち、本開示の一以上の実施形態で用いる細胞培養基材は、前記一以上の細胞接着部を含む表面を有する支持基材を含む、ということができる。
【００３２】
そこで先ず、支持基材の実施形態、並びに、細胞非接着部と細胞接着部の形状以外の特徴について以下に説明する。
【００３３】
細胞培養基材に用いられる支持基材としては、その表面に、細胞非接着部と細胞接着部を形成することが可能な材料で形成された支持基材であれば特に限定されるものではない。具体的には、ガラス、金属、セラミック、シリコン等の無機材料、エラストマー、プラスチック（例えば、ポリスチレン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）で代表される有機材料を含む支持基材を挙げることができる。特に、ガラス基材を支持基材として用いることが好ましい。支持基材の形状も限定されず、例えば、平板、平膜、フィルム、多孔質膜等の平坦な形状や、シリンダ、スタンプ、マルチウェルプレート、マイクロ流路等の立体的な形状が挙げられる。
【００３４】
本開示において「細胞接着性」とは、細胞を接着する強度、すなわち細胞の接着しやすさを意味する。「細胞接着部」とは細胞接着性が良好な表面上の領域を意味し、「細胞非接着部」とは、細胞の接着性が悪い表面上の領域を意味する。従って、細胞接着部と細胞非接着部とが所定のパターンで配置された表面上に細胞を播種すると、細胞接着部には細胞が接着するが、細胞非接着部には細胞が接着しないため、細胞培養基材の表面に細胞がパターン状に配列されることになる。
【００３５】
「細胞接着部」は、実際に培養する細胞、好ましくは幹細胞、を細胞培養基材に播種した際に接着する部分と定義され、「細胞非接着部」は、実際に培養する細胞、好ましくは幹細胞、を播種した際に接着しない部分と定義される。細胞培養基材に細胞を播種する際に、細胞培養基材の表面は、タンパク質等でコーティングされ、細胞接着性が高められた状態であってもよい。「幹細胞」の具体例は本明細書に記載の通りである。細胞非接着部は、細胞接着部に接着し増殖した細胞により被覆されてもよい。
【００３６】
細胞接着部であるか細胞非接着部であるかを判断する指標として、実際に細胞培養した際の細胞接着伸展率を用いることができる。細胞接着性を有する細胞接着部の表面は、細胞接着伸展率が６０％以上の表面であることが好ましく、細胞接着伸展率が８０％以上の表面であることが更に好ましい。細胞接着伸展率が高いと、効率的に細胞を培養することができる。本開示における細胞接着伸展率は、播種密度が４０００  ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上３００００  ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２未満の範囲内で培養しようとする細胞を測定対象表面に播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％のインキュベータ内に保管し、１４．５時間培養した時点で接着伸展している細胞の割合（｛（接着している細胞数）／（播種した細胞数）｝×１００（％））と定義する。
【００３７】
上記測定において、細胞の播種は、１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地に懸濁させて測定対象表面上に播種し、その後、細胞ができるだけ均一に分布するよう、細胞が播種された測定対象表面をゆっくりと振とうすることにより行うものである。さらに、細胞接着伸展率の測定は、測定直前に培地交換を行って接着していない細胞を除去した後に行う。細胞接着伸展率の測定では、細胞の存在密度が特異的になりやすい箇所（例えば、存在密度が高くなりやすい所定領域の中央、存在密度が低くなりやすい所定領域の周縁）を除いた箇所を測定箇所とする。
【００３８】
細胞接着部は、支持基材の表面に細胞接着層が形成された領域であってもよいし、支持基材の表面が細胞接着性である場合（例えばガラス基材の表面）は、支持基材の表面が露出した領域であってもよいが、好ましくは、支持基材の細胞接着性の表面が露出した領域である。細胞非接着部は、支持基材の表面に細胞非接着層が形成された領域であることができる。細胞接着部および細胞非接着部は、種々の材料や方法により形成可能である。好ましくは、細胞非接着部は、支持基材の表面が、親水性ポリマー等の親水性有機化合物を含む層等の細胞非接着層により被覆された部分である。細胞非接着部を構成する細胞非接着層の平均厚さは、特許文献４に記載されているように、０．８ｎｍ〜５００μｍが好ましく、０．８ｎｍ〜１００μｍがより好ましく、１ｎｍ〜１０μｍがより好ましく、１．５ｎｍ〜１μｍが最も好ましい。平均厚さが０．８ｎｍ以上であれば、タンパク質の吸着や細胞の接着において、支持基材の細胞非接着層で覆われていない領域の影響を受けにくいため好ましい。また、平均厚さが５００μｍ以下であればコーティングが比較的容易である。特に、特許文献５に記載されているように、細胞非接着層を、ポリエチレングリコールの層により形成する場合、その膜厚の一例として５ｎｍ〜１０ｎｍが例示できる。親水性有機化合物の具体例は、後述する通りである。
【００３９】
細胞非接着層として親水性ポリマーとしてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む細胞培養基材の製造方法としては、特許文献４及び非特許文献１０に記載された方法を用いることができる。
【００４０】
細胞接着部および細胞非接着部の形成方法の特に好ましい形態として、以下の２つの形態が挙げられる。
【００４１】
第１の形態では、支持基材の表面に細胞非接着層を形成し、次いで、細胞非接着層の一部に所定の処理を施し、細胞接着性を発現させて細胞接着部とする形態である。具体的には、支持基材の表面に、親水性ポリマー等の親水性有機化合物を含む細胞非接着性の親水性膜を細胞非接着層として形成し、次いで、細胞非接着層である前記親水性膜の一部を選択的に、酸化処理及び／又は分解処理を施して、前記一部を、細胞接着性を有する細胞接着部に改質する例が挙げられる。この形態では細胞非接着性の親水性膜を形成し、次いで、細胞の接着が望まれる部位に対して、酸化処理及び／又は分解処理を施すことにより、当該部位を、細胞接着性を有する部位に転換して細胞接着部とする。第１の形態により形成された細胞培養基材では、細胞非接着部が、支持基材の表面が、親水性ポリマー等の親水性有機化合物を含む層により被覆された部分であり、細胞接着部が、親水性ポリマー等の親水性有機化合物を含む層が酸化処理及び／又は分解処理により除去されて支持基材の表面が露出した部分、或いは、親水性ポリマー等の親水性有機化合物を含む層が酸化処理及び／又は分解処理を受けて細胞接着性に改質された層（＝細胞接着層）により被覆された部分である。
【００４２】
第２の形態は、支持基材の表面上での有機化合物の密度の高低によって細胞接着部および細胞非接着部とする形態である。第２の形態により形成された細胞培養基材では、細胞接着部が、親水性ポリマー等の親水性有機化合物の密度が低い（親水性有機化合物を含まない場合も包含する）表面であり、細胞非接着部が、親水性ポリマー等の親水性有機化合物の密度が高い表面である形態である。第２の形態は、親水性ポリマー等の親水性有機化合物を高密度で含む支持基材の表面が細胞非接着性を有するのに対して、前記化合物の密度が低い支持基材の表面が細胞接着性を有することを利用したものである。支持基材表面に前記化合物が結合しやすい第１領域と結合しにくい第２領域とを設け、該基材表面に前記化合物の膜を形成すると、第１領域は細胞非接着部となり、第２領域は細胞接着領域となる。或いは、支持基材表面の一部をフォトレジスト等で選択的にマスキングし、マスキングされていない領域に前記親水性有機化合物の膜を形成して細胞非接着部を形成し、その後マスキングを除去して支持基材の表面を露出させることで細胞接着部を形成することができる。
【００４３】
また、上記の形態に限らず、細胞非接着性の表面（細胞非接着性層の表面であってよい）を有する支持基材を用意し、前記表面の一部をコラーゲンやフィブロネクチンなどの細胞接着性タンパク質をパターニングして被覆し、細胞接着性のパターンを形成してもよい。或いは、細胞接着性の表面（細胞接着性層の表面であってもよい）を有する支持基材を用意し、前記表面の一部をシリコーンゴム（例えば三菱ケミカル製  珪樹（登録商標））等の細胞非接着性の樹脂により被覆し、残部を細胞接着性のパターンとしてもよい。或いは、表面に所定のパターンの導電性層が設けられた支持基材を用意し、該支持基材の表面に細胞非接着性層を積層し、前記導電性層への電圧印加により、前記導電性層上を被覆する前記細胞非接着性層を剥離させて、露出した前記導電性層を細胞接着部としてもよい（具体的には特開２０１２−１２０４４３号公報、特開２０１３−１７９９１０号公報参照）。
【００４４】
以下では、支持基材表面上に細胞接着部と細胞非接着部を形成して、細胞接着部と細胞非接着部とを含む表面を有する細胞培養基材を製造する上記の第１の形態及び第２の形態について、順に説明する。
【００４５】
まず、第１の形態について説明する。
第１の形態では、まず、支持基材表面に、細胞非接着層として、親水性有機化合物、好ましくは親水性ポリマー、を含む親水性膜を設ける。当該親水性膜は、水溶性や水膨潤性を有する薄膜であり、酸化及び／又は分解される前は細胞非接着性を有し、酸化及び／又は分解された後の支持基材の露出した表面、或いは、酸化処理及び／又は分解処理を受けて改質された薄膜の表面が細胞接着性を呈するものであれば特に限定されない。
【００４６】
細胞非接着層が、親水性有機化合物により形成される親水性膜である場合、支持基材の表面と親水性膜との間には、必要に応じて結合層を設けることが好ましい。結合層は、親水性膜の前記有機化合物が有する官能基と結合可能な官能基（結合性官能基）を有する材料を含む層であることが好ましい。結合層の材料が有する結合性官能基と、親水性有機化合物が有する官能基との組み合わせとしては、エポキシ基と水酸基、フタル酸無水物と水酸基、カルボキシル基とＮ−ハイドロキシスクシイミド、カルボキシル基とカルボジイミド、アミノ基とグルタルアルデヒド等が挙げられる。それぞれの組み合わせにおいて、いずれが結合層側の官能基であってもよい。これらの方法においては、親水性有機化合物によるコーティングを行う前に、支持基材上に、所定の官能基を有する材料により結合層を形成する。細胞非接着層における、親水性有機化合物の薄膜を形成する前の結合層の表面の水接触角は、結合性官能基を有する材料としてエポキシ基を末端に有するシランカップリング剤を使用する場合を例にとると、典型的には４５°以上、望ましくは４７°以上である。このような結合層は、結合性官能基を有する材料の被膜を支持基材の表面に形成することにより得られる。
【００４７】
親水性有機化合物としては、親水性ポリマー（親水性オリゴマーを包含する）、水溶性有機化合物、界面活性物質、両親媒性物質等が挙げられ、親水性ポリマーが特に好ましい。
【００４８】
具体的な親水性ポリマーとしては、ポリアルキレングリコール、リン脂質極性基を有する両性イオンポリマー、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリビニルアルコール、多糖類等を挙げることができる。親水性ポリマーのこれらの具体例は、その誘導体の形態のものも包含する。親水性ポリマーの分子形状は、直鎖状、分岐を有するもの、デンドリマー等を挙げることができる。
【００４９】
ポリアルキレングリコールとしては具体的には、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールの共重合体、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１０８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７等が好ましい。
【００５０】
リン脂質極性基を有する両性イオンポリマーとしては具体的には、ポリ（メタクリロイルオキシエチルフォスフォリルコリン）（＝ＭＰＣポリマー）、メタクリロイルオキシエチルフォスフォリルコリンとアクリルモノマーの共重合体等が好ましい。
【００５１】
ポリアクリルアミドとしては具体的にはポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）が例示できる。
【００５２】
ポリメタクリル酸としては具体的にはポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）が例示できる。
多糖類としては具体的にはデキストラン、ヘパリン等が例示できる。
【００５３】
細胞非接着層を備える支持基材の表面は、細胞非接着層により被覆された状態では高い細胞非接着性を有し、細胞非接着層の酸化処理及び／又は分解処理後には、露出した支持基材の表面が、或いは、細胞非接着層が酸化処理及び／又は分解処理により改質されて形成される層の表面が細胞接着性を示すものであることが望ましい。
【００５４】
親水性ポリマーとしては特にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が好ましい。ＰＥＧは、１つ以上のエチレングリコール単位（（ＣＨ２）２−Ｏ）からなるエチレングリコール鎖（ＥＧ鎖）を少なくとも含むが、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。エチレングリコール鎖は、例えば、次式：
−（（ＣＨ２）２−Ｏ）ｍ−
（ｍは重合度を示す整数である）
で表される構造を指す。ｍは、好ましくは１〜１３の整数であり、より好ましくは１〜１０の整数である。
【００５５】
ＰＥＧにはエチレングリコールオリゴマーも包含される。また、ＰＥＧには、官能基が導入されたものも包含される。官能基としては、例えば、エポキシ基、カルボキシル基、Ｎ−ハイドロキシスクシイミド基、カルボジイミド基、アミノ基、グルタルアルデヒド基、（メタ）アクリロイル基等が挙げられる。官能基は、場合によりリンカーを介して、好ましくは末端に導入されたものである。官能基が導入されたＰＥＧとして、例えば、ＰＥＧ（メタ）アクリレート、ＰＥＧジ（メタ）アクリレートが挙げられる。
【００５６】
細胞接着部は、支持基材の表面に形成された親水性有機化合物を含む細胞非接着層に酸化処理及び／又は分解処理を施して、細胞接着性を有する支持基材の表面を露出させる、或いは、細胞非接着層を改質して細胞接着層に転換することで形成することができる。
【００５７】
本開示において「酸化」とは狭義の意味であり、有機化合物が酸素と反応して酸素の含有量が反応以前よりも多くなる反応を意味する。
【００５８】
本開示において「分解」とは有機化合物の結合が切断されて１種の有機化合物から２種以上の有機化合物が生じる変化を指す。「分解処理」としては典型的には、酸化処理による分解、紫外線照射による分解などが挙げられるがこれらには限定されない。「分解処理」が酸化を伴う分解（つまり酸化分解）である場合、「分解処理」と「酸化処理」とは同一の処理を指す。また細胞非接着層を分解して除去することも「分解処理」に含まれる。
【００５９】
紫外線照射による分解とは、有機化合物が紫外線を吸収し、励起状態を経て分解することを指す。なお、有機化合物が、酸素を含む分子種（酸素、水など）とともに存在している系中に紫外線を照射すると、紫外線が化合物に吸収されて分解が起こる以外に、該分子種が活性化して有機化合物と反応する場合がある。後者の反応は「酸化」に分類できる。そして活性化された分子種による酸化により有機化合物が分解する反応は、「紫外線照射による分解」ではなく「酸化による分解」に分類できる。
【００６０】
以上のように「酸化処理」と「分解処理」は操作としては重複する場合があり、両者を明確に区別することはできない。そこで本明細書では「酸化処理及び／又は分解処理」という用語を使用する。
【００６１】
次に、第２の形態について説明する。第２の形態により形成される細胞培養基材では、支持基材の表面のうち、細胞接着部が、親水性ポリマー等の親水性有機化合物の密度が低い（親水性有機化合物を含まない場合も包含する）表面であり、細胞非接着部が、親水性有機化合物の密度が高い表面である。すなわち、細胞接着部と細胞非接着部とは、親水性有機化合物の密度が相違する。同密度が高いほど細胞は接着しにくくなる傾向がある。細胞接着部では、親水性有機化合物の密度が、細胞が接着できる程度に低い。親水性有機化合物及び親水性ポリマーの好ましい例は第１の形態について既述の通りである。
【００６２】
第２の形態では、細胞接着部及び細胞非接着部を、密度を制御した親水性膜により形成する場合には、支持基材との密着性を高めるために支持基材上に必要に応じて結合層を形成し、次いで親水性有機化合物からなる親水性膜を形成するのが好ましい。結合層は、親水性有機化合物が有する官能基と結合可能な官能基（結合性官能基）を含む材料を含む層であることが好ましい。結合層の材料が有する官能基と、親水性有機化合物が有する官能基との組み合わせとしては、エポキシ基と水酸基、フタル酸無水物と水酸基、カルボキシル基とＮ−ハイドロキシスクシイミド、カルボキシル基とカルボジイミド、アミノ基とグルタルアルデヒド等が挙げられる。それぞれの組み合わせにおいて、いずれが結合層側の官能基であってもよい。これらの方法においては、親水性材料によるコーティングを行う前に、支持基材上に、所定の官能基を有する材料により結合層を形成する。結合層における前記材料の密度は結合力を規定する重要な因子である。前記密度は、結合層の表面における水の接触角を指標として簡便に評価することができる。なお、水接触角は、協和界面科学社製  ＣＡ−Ｚを用い、マイクロシリンジから純水を滴下して３０秒後に測定した値である。
【００６３】
細胞接着部の結合層における、結合性官能基を有する材料の密度は低い。細胞接着部における、親水性有機化合物の薄膜を形成する前の結合層の表面の水接触角は、結合層を構成する結合性官能基を有する材料として、エポキシ基を末端に有するシランカップリング剤を使用する場合を例にとると、典型的には、１０°〜４３°、望ましくは１５°〜４０°である。このような結合層を形成する方法としては、結合性官能基を有する材料の被膜（結合層）を支持基材の表面に形成した後、当該結合層の表面を酸化処理及び／又は分解処理する方法が挙げられる。結合層表面を酸化処理及び／又は分解処理する方法としては、結合層表面を紫外線照射処理する方法、光触媒処理する方法、酸化剤で処理する方法などが挙げられる。結合層表面の全面を酸化処理及び／又は分解処理してもよいし、部分的に処理してもよい。部分的な処理は、フォトマスクやステンシルマスク等のマスクを用いたり、スタンプを用いるたりすることにより行うことができる。また、紫外線レーザー等のレーザーを用いた方式等の直描方式で酸化処理及び／又は分解処理を施してもよい。諸条件などについても、親水性膜の酸化処理及び／又は分解処理により細胞接着部を形成する方法の場合と同様の条件を適用できる。こうして形成された結合層上に親水性有機化合物の薄膜を形成することにより、細胞接着部が形成できる。
【００６４】
細胞非接着部の結合層における、結合性官能基を有する材料の密度は高い。細胞非接着部における、親水性有機化合物の薄膜を形成する前の結合層の表面の水接触角は、結合性官能基を有する材料としてエポキシ基を末端に有するシランカップリング剤を使用する場合を例にとると、典型的には４５°以上、望ましくは４７°以上である。このような結合層は、結合性官能基を有する材料の被膜を支持基材の表面に形成することにより得られる。結合層表面を部分的に酸化処理及び／又は分解処理した場合には、処理を受けない残余の部分が前記水接触角を有する結合層となる。こうして形成された結合層上に親水性有機化合物の薄膜を形成することにより、細胞非接着層が形成できる。
【００６５】
第２の形態ではまた、支持基材表面の一部を選択的に感光性フォトレジスト等によりマスキングし、マスキングされていない領域に前記親水性有機化合物の膜を形成して細胞非接着部を形成し、その後マスキングを除去して支持基材の表面を露出させることで細胞接着部を形成してもよい。
【００６６】
続いて、上記の第１の形態又は第２の形態、或いは他の方法により形成された細胞接着部と細胞非接着部の特徴について更に説明する。
【００６７】
細胞接着部（結合層が存在する場合には結合層も含む）の炭素量は、細胞非接着部（結合層が存在する場合には結合層も含む）の炭素量と比較して低いことが好ましい。具体的には、細胞接着部の炭素量が、細胞非接着部の炭素量に対して２０〜９９％であることが好ましい。この範囲内に該当することは、細胞接着部及び細胞非接着部に含まれる親水性有機化合物層の厚さ（結合層が存在する場合には結合層の厚さと親水性膜の厚さの合計）が１０μｍ以下の場合に特に好適である。「炭素量（ａｔｏｍｉｃ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、％）」は下記に定義する通りである。
【００６８】
また、細胞接着部（結合層が存在する場合には結合層も含む）における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値は、細胞非接着部（結合層が存在する場合には結合層も含む）における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値に対して小さい値であることが好ましい。具体的には、細胞接着部における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値が、細胞非接着部における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値に対して３５〜９９％であることが好ましい。この範囲内に該当することは、親水性膜の厚さ（結合層が存在する場合には結合層の厚さと親水性膜の厚さの合計）が１０μｍ以下の場合に特に好適である。「酸素と結合している炭素の割合（ａｔｏｍｉｃ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、％）」は下記に定義する通りである。
【００６９】
細胞接着部及び細胞非接着部に含まれる親水性有機化合物層（結合層が存在する場合には結合層も含む）の評価手法としては、接触角測定、エリプソメトリー、原子間力顕微鏡観察、電子顕微鏡観察、オージェ電子分光測定、Ｘ線光電子分光測定、各種質量分析法などを用いることができる。これらの手法の中で、最も定量性に優れているのはＸ線光電子分光測定（ＸＰＳ／ＥＳＣＡ）である。この測定方法で求められるのは相対的定量値であり、一般的に元素濃度（ａｔｏｍｉｃ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、％）で算出される。以下、本開示におけるＸ線光電子分光分析方法を詳細に説明する。
【００７０】
細胞接着部及び細胞非接着部の「炭素量」は、「Ｘ線光電子分光装置を用いて得られるＣ１ｓピークの解析値から求められる炭素量」と定義される。また、本開示において細胞接着部及び細胞非接着部の「酸素と結合している炭素の割合」は、「Ｘ線光電子分光装置を用いて得られるＣ１ｓピークの解析値から求められる酸素と結合している炭素の割合」と定義される。具体的な測定は、特開２００７−３１２７３６に記載されるとおりに実施できる。
【００７１】
＜３．細胞培養基材の細胞培養部の形状の特徴＞
本開示で用いる細胞培養基材の特徴について主に図１を参照して説明する。
【００７２】
本開示で用いる細胞培養基材１は、
細胞培養部２０を含む表面Ｓを有する。
【００７３】
そして、細胞培養部２０は、細胞非接着部（中央部）２１と、細胞非接着部２１の周縁Ｐに沿って連続的に又は断続的に延在し（図１では連続的に延在している例を示す）、細胞非接着部２１を囲う細胞接着部２２とを備える。本実施形態は、細胞培養基材１の表面Ｓ上に細胞培養部２０が１以上含まれ、１以上の細胞培養部２０の各々が、上記の特徴を有する例である。
【００７４】
図１に示す例では、１以上の細胞培養部２０は、細胞非接着部１０中に島状に点在している。この例では、細胞非接着部１０を「第１の細胞非接着部」と称し、細胞接着部２０の細胞非接着部２１を「第２の細胞非接着部」と称する場合がある。また、以下の説明では「細胞非接着部２１」を「中央部２１」或いは「細胞非接着部である中央部２１」と称する場合がある。第１の細胞非接着部１０は必須の構成ではなく、第１の細胞非接着部１０を備えていない細胞培養基材の例は図３５〜３７を参照して別途説明する。
【００７５】
また、細胞培養基材１のうち、第１の細胞非接着部１０及び細胞接着部２０が表面に配置される部分を「支持基材３０」とする。
【００７６】
図１に示す例では、第１の細胞非接着部１０、第２の細胞非接着部である中央部２１は、支持基材３０の表面上に積層された第１の細胞非接着層１０Ａ、第２の細胞非接着層２１Ａの表面である。
【００７７】
図１に示す例では、細胞接着部２２は、露出した支持基材３０の表面である。なお図２１に示す例のように、細胞接着部２２は、支持基材３０の表面上に積層された細胞接着層２２Ａの表面であってもよい。
【００７８】
図１（Ｂ）及び図２１（Ｂ）では、説明の便宜上、細胞非接着層１０Ａ、細胞非接着層２１Ａ及び細胞接着層２２Ａの厚さ、並びに、細胞接着部２２と、細胞非接着層１０Ａ又は細胞非接着層２１Ａとの段差を強調して示しているが、培養される細胞及び細胞構造物の寸法に対して、前記厚さ及び段差は十分に小さいため、１以上の細胞培養部２０を含む表面Ｓは実質的に平坦な表面として細胞を支持することができる。
【００７９】
図１（Ｂ）では、支持基材３０と、第１の細胞非接着層１０Ａ、第２の細胞非接着層２１Ａとは直接接している例を示しているが、既述のように結合層が間に介在していてもよい。同様に、図２６（Ｂ）では、支持基材３０と、第１の細胞非接着層１０Ａ、第２の細胞非接着層２１Ａ、細胞接着層２２Ａとは直接接している例を示しているが、既述のように結合層が間に介在していてもよい。
【００８０】
支持基材３０、第１の細胞非接着部１０、第１の細胞非接着層１０Ａ、第２の細胞接着部２１、第２の細胞非接着層２１Ａ、細胞接着部２２、細胞接着層２２Ａの具体例及び製造方法は既述の通りである。
【００８１】
本発明者らは驚くべきことに、このような構造の細胞培養基材１上で幹細胞を培養するとき、細胞非接着部（中央部）２１を囲う細胞接着部２２に幹細胞が接着し増殖することで細胞が密に凝集した凝集部が形成され、形成された細胞の凝集部において栄養外胚葉細胞のマーカーを発現する腸上皮細胞に分化でき袋状の細胞構造物（組織）が形成され易いことを見出した。得られた細胞構造物は、小腸上皮細胞を含み、腸オルガノイドとしての機能を有する。上記構造の細胞培養基材を用いて幹細胞の分化誘導を行うと、小腸上皮細胞を含む細胞構造物が比較的短時間で細胞培養基材から遊離し回収することができ、しかも、回収効率が極めて高いことを本発明者らは見出した。
【００８２】
細胞培養部２０の形状及び寸法は特に限定されないが、好ましい実施形態では、中央部２１の周縁Ｐと、中央部２１の重心Ｃを通る直線Ｌとの二つの交点Ａ１、Ａ２の間の距離Ｘが、８０μｍ超８８０μｍ以下であり、より好ましくは、１８０μｍ以上８８０μｍ以下、特に好ましくは１８０μｍ以上６００μｍ以下である。距離Ｘが小さすぎると、増殖培養時に栄養外胚葉細胞によりすぐに中央部２１が被覆されてしまい、細胞構造物の外周部に特異的な袋状構造が得られにくい。一方、距離Ｘが大きすぎると、細胞が増殖して中央部２１を完全に被覆するまでの時間が長時間になるため、細胞構造物の生産効率が低下する。距離Ｘが上記の範囲にあるとき、袋状構造の細胞構造物を比較的短時間に高収率で培養することができる。前記距離Ｘは、中央部２１の形状が図１及び図１５Ｂに示すように円である場合は円の直径を指し、円が真円である場合は、直線Ｌをどのようにとっても距離Ｘは同じである。図１５Ａ、１５Ｃ、１５Ｄに示すように中央部２１が矩形である場合は距離Ｘは、直線Ｌが対角線方向の場合に最大になり、直線Ｌが短手方向の場合に最小になる。本開示では好ましくは、全周に亘り（すなわち全ての直線Ｌに対して）距離Ｘが上記範囲である。
【００８３】
細胞培養部２０の別の好ましい実施形態では、細胞接着部２２の、中央部２１の重心Ｃを通る直線Ｌに沿った方向の幅Ｗが、３０μｍ超４００μｍ以下であり、より好ましくは４０μｍ以上４００μｍ以下であり、特に好ましくは６０μｍ以上３００μｍ以下である。幅Ｗが小さすぎると培養中に細胞が剥離し易いという問題がある。また、袋状の細胞構造物の誘導のためには、細胞接着部２２の幅方向に複数個の細胞が接着して凝集部を形成することが望ましく、そのためには幅Ｗは大きいほうが好ましいことから、上記の通り幅Ｗは４０μｍ以上が好ましく、６０μｍ以上がより好ましい。一方、幅Ｗが大きすぎると、細胞接着部２２に接着した細胞の密度の偏りが生じ易く、幅方向に均一な細胞の凝集部が形成され難くなり、均一な構造の細胞構造物が得られにくい。幅Ｗが上記の範囲にあるとき、細胞構造物を比較的短時間で高収率で培養することができる。前記幅Ｗは、中央部２１の形状が図１及び図１５Ｂに示すように円である場合は円の直径方向の細胞接着部２２の幅を指し、円が真円である場合は、直線Ｌをどのようにとっても幅Ｗは同じである。図１５Ａ、１５Ｃ、１５Ｄに示すように中央部２１が矩形である場合は幅Ｗは、直線Ｌが対角線方向の場合に最大になり、直線Ｌが短手方向の場合に最小になる。本開示では好ましくは、全周に亘り（すなわち全ての直線Ｌに対して）幅Ｗが上記範囲である。
【００８４】
細胞培養部２０の別の好ましい実施形態では、中央部２１の周縁Ｐと、中央部２１の重心Ｃを通る直線Ｌとの二つの交点Ａ１、Ａ２の間の距離Ｘの、細胞接着部２２の前記直線Ｌに沿った方向の幅Ｗに対する比Ｘ／Ｗが、好ましくは０．５以上、より好ましくは１．０以上、より好ましくは１．３以上であり、好ましくは２０．０以下、より好ましくは１５．０以下、より好ましくは１０．０以下である。前記比Ｘ／Ｗが上記の範囲にあるとき、細胞構造物を比較的短時間に高収率で培養することができる。本開示では好ましくは、全周に亘り（すなわち全ての直線Ｌに対して）前記比Ｘ／Ｗが上記範囲である。
【００８５】
上記の重心Ｃ、距離Ｘ、幅Ｗ、直線Ｌの代わりに下記の中間点Ｃ’、距離Ｘ’、幅Ｗ’、直線Ｌ’により細胞接着部２２の形状及び寸法を規定することができる。中間点Ｃ’、距離Ｘ’、幅Ｗ’、直線Ｌ’について図１５Ａ及び図１５Ｂを参照して説明する。細胞接着部２２の内周Ｑ上の、中央部２１を間に介して対向する最も離れた二つの点Ａ３，Ａ４の中間点Ｃ’を通る直線を直線Ｌ’とする。この直線Ｌ’と、細胞接着部２２の内周Ｑとの２つの交点Ａ５，Ａ６の間の距離を距離Ｘ’とする。また、細胞接着部２２の、中間点Ｃ’を通る直線Ｌ’に沿った方向の幅を幅Ｗ’とする。
【００８６】
前記距離Ｘ’は、好ましくは８０μｍ超８８０μｍ以下であり、より好ましくは、１８０μｍ以上８８０μｍ以下、特に好ましくは１８０μｍ以上６００μｍ以下、特に好ましくは１８０μｍ以上５００μｍ以下である。距離Ｘ’が小さすぎると、増殖培養時に細胞によりすぐに中央部２１が被覆されてしまい、細胞構造物の外周部に特異的な袋状構造が得られにくい。一方、距離Ｘ’が大きすぎると、細胞が増殖して中央部２１を完全に被覆するまでの時間が長時間になるため、細胞構造物の生産効率が低下する。距離Ｘ’が上記の範囲にあるとき、袋状構造の細胞構造物を比較的短時間で高収率で培養することができる。前記距離Ｘ’は、中央部２１の形状が図１及び図１５Ｂに示すように円である場合は円の直径を指し、円が真円である場合は、直線Ｌ’をどのようにとっても距離Ｘ’は同じである。図１５Ａ、１５Ｃ、１５Ｄに示すように中央部２１が矩形である場合は、距離Ｘ’は、直線Ｌ’が対角線方向の場合に最大になり、直線Ｌ’が短手方向の場合に最小になる。本開示では好ましくは、全周に亘り（すなわち全ての直線Ｌ’に対して）距離Ｘ’が上記範囲である。
【００８７】
前記幅Ｗ’は、好ましくは３０μｍ超４００μｍ以下であり、より好ましくは４０μｍ以上４００μｍ以下であり、特に好ましくは６０μｍ以上３００μｍ以下である。幅Ｗ’が小さすぎると培養中に細胞が剥離し易いという問題がある。また、袋状の細胞構造物の誘導のためには、細胞接着部２２の幅方向に複数個の細胞が接着して凝集部を形成することが望ましく、そのためには幅Ｗ’は大きいほうが好ましいことから、上記の通り幅Ｗ’は４０μｍ以上が好ましく、６０μｍ以上がより好ましい。一方、幅Ｗ’が大きすぎると、細胞接着部２２に接着した細胞の密度の偏りが生じ易く、幅方向に均一な細胞の凝集部が形成され難くなり、均一な構造の細胞構造物が得られにくい。幅Ｗ’が上記の範囲にあるとき、細胞構造物を比較的短時間に高収率で培養することができる。前記幅Ｗ’は、中央部２１の形状が図１及び図１５Ｂに示すように円である場合は円の直径方向の細胞接着部２２の幅を指し、円が真円である場合は、直線Ｌ’をどのようにとっても幅Ｗ’は同じである。図１５Ａ、１５Ｃ、１５Ｄに示すように中央部２１が矩形である場合は幅Ｗ’は、直線Ｌ’が対角線方向の場合に最大になり、直線Ｌ’が短手方向の場合に最小になる。本開示では好ましくは、全周に亘り（すなわち全ての直線Ｌ’に対して）幅Ｗ’が上記範囲である。
【００８８】
比Ｘ’／Ｗ’は、好ましくは０．５以上、より好ましくは１．０以上、より好ましくは１．３以上であり、好ましくは２０．０以下、より好ましくは１５．０以下、より好ましくは１０．０以下である。前記比Ｘ’／Ｗ’が上記の範囲にあるとき、細胞構造物を比較的短時間に高収率で培養することができる。本開示では好ましくは、全周に亘り（すなわち全ての直線Ｌ’に対して）前記比Ｘ’／Ｗ’が上記範囲である。
【００８９】
図１及び図１５Ｂでは、中央部２１が円形であり、細胞接着部２２が円形の中央部２１を同心円的に囲う環状形状であり、対称性が高いため、均一な細胞構造物を得るためには特に好ましい。しかし、このような例には限定されず、図１５Ａ、図１５Ｃ、図１５Ｄに示すように、中央部２１が矩形（正方形又は長方形）であり、細胞接着部２２が、矩形の中央部２１の周縁Ｐに沿った、内郭と外郭が矩形の形状であってもよい。また、図示しないが、中央部が楕円形で、細胞接着部が、中央部に沿って延在する楕円の環状形状であってもよい。また、上記で挙げた例では、細胞接着部の内郭と外郭が相似形状であるが、それには限定されず、例えば細胞接着部の内郭（すなわち中央部の外郭）が矩形等の多角形であり、細胞培養部の外郭が円形又は楕円形であってもよいし、逆に、細胞接着部の内郭（すなわち中央部の外郭）が円形又は楕円形であり、細胞培養部の外郭が矩形等の多角形であってもよい。また、中央部２１は、半円形状であってもよい。
【００９０】
図１、図１５Ａ、図１５Ｃ、図１５Ｄの例では、細胞接着部２２は、第２の細胞非接着部である中央部２１の周縁Ｐに沿って連続的に延在し、全周に亘って中央部２１を囲う。しかし、細胞接着部は、断続的に延在する形状であってもよい。具体的には図１５Ｂの例に示すように、細胞接着部２２は、第２の細胞非接着部である中央部２１の周縁Ｐに沿って断続的に延在し中央部２１を囲う。このような構造であっても細胞接着部２２上に接着した細胞は、増殖を経て、細胞接着部２２の切れ目の部分を繋ぐような組織を形成することができる。細胞接着部２２が、中央部２１の周縁Ｐに沿って断続的に延在する実施形態では、中断部分は、１か所あたり、中央部２１の周縁Ｐの全周の好ましくは２分の１以下、より好ましくは４分の１以下、より好ましくは６分の１以下、より好ましくは８分の１以下の長さであり、また、複数の中断部分を含む場合は、中断部分の合計が、中央部２１の周縁Ｐの全周の好ましくは２分の１以下、より好ましくは４分の１以下、より好ましくは６分の１以下、より好ましくは８分の１以下の長さである。
【００９１】
本開示で用いる細胞培養基材では、細胞接着部が、細胞非接着性の中央部を囲うように延在している構造であることで、その上に細胞が接着し増殖すると細胞が密になり栄養外胚葉細胞の性質を有する細胞への分化が促進され易く、且つ、増殖した細胞が積層し易い。この結果、外周部に栄養外胚葉細胞の性質を有する細胞が分布した袋状の細胞構造物を効率的に得ることができる。
【００９２】
これに対して、特許文献２および非特許文献３に記載の手法では、細胞接着部が円形形状であるため、栄養外胚葉細胞の性質を有する細胞が増殖により内部にまで進展してしまい、外周部に栄養外胚葉細胞の性質を有する細胞が分布した袋状の細胞構造物が得られにくく、内胚葉系細胞にも分化誘導され難い。そのため後述する比較例1の結果の通り回収率が下がっていたと考えられる。また細胞接着部が円形形状である場合、細胞接着部の面積が大きいため凝集部を作るために時間を要していたと考えられる。
【００９３】
細胞培養基材１のように複数の細胞培養部２０が存在する場合、それらは互いに隔離されており、好ましくは０．２０ｍｍ以上、より好ましくは０．３０ｍｍ以上互いに離れて配置されている。各細胞培養部２０を一定距離以上隔離することにより、各細胞培養部２０内の細胞が隣接する他の細胞培養部２０の細胞と細胞間結合を形成することなく均一に一定間隔で培養され、再現性の高い実験系を構築できる。
【００９４】
図１、図１５Ａ、図１５Ｂ、図１５Ｃ、図１５Ｄ、図２６に示す実施形態に係る細胞培養基材１は、第１の細胞非接着部１０中に、１以上の細胞培養部２０が含まれた構造を有している。第１の細胞非接着部１０を備えていない細胞培養基材の実施形態を、図３５〜３７を参照して別途説明する。
【００９５】
図３５〜３７に示す細胞培養基材１の、図１又は図２６に示す細胞培養基材１との相違点について以下に説明する。図３５〜３７に示す細胞培養基材１における、細胞培養部２０を構成する細胞非接着部（中央部）２１及び細胞接着部２２の特徴及び形成方法は、図１又は図２６に示す細胞培養基材１における細胞非接着部２１及び細胞接着部２２と同様であるため、図３５（Ｂ）、図３６（Ｂ）及び図３７（Ｂ）での細胞培養基材１の断面において、細胞非接着部２１及び細胞接着部２２の断面の特徴については描写を省略する。このほか、図３５〜３７に示す細胞培養基材１について言及しない特徴については図１及び図２６に示す細胞培養基材１と同様であるため説明を省略する。
【００９６】
図３５に示す本開示の一実施形態に係る細胞培養基材１は、細胞培養部２０を含む表面Ｓを有する。そして、細胞培養部２０は、細胞非接着部２１と、細胞非接着部２１の周縁Ｐに沿って連続的に又は断続的に延在し（図３５では連続的に延在している例を示す）、細胞非接着部２１を囲う細胞接着部２２とを備える。図３５に示す細胞培養基材１のうち、細胞接着部２０が表面に配置される部分を「支持基材３０」とする。
【００９７】
図３５に示す細胞培養基材１は、１以上の突出部３１を有する支持基材３０を有し、各突出部３１の上面Ｓに、細胞非接着部２１とその周囲を囲う細胞接着部２２とを含む。この実施形態では、突出部３１の上面Ｓは円形であるが、他の形状を有していても良い。この実施形態では、平面視において、突出部３１の上面Ｓの周縁部に細胞接着部２２が存在し、細胞接着部２２の外側には支持基材が存在しないため、細胞接着部２２に接着した細胞は、培養されると、細胞接着部２２よりも外側には広がらず、細胞接着部２２及びその内側の細胞非接着部２１上に広がり細胞構造物を形成する。
【００９８】
図３５に示す実施形態によれば、水平方向に隔離した突出部３１の上面Ｓに細胞培養部２０（細胞非接着部２１及び細胞接着部２２からなる）が存在するため各細胞培養部２０内の細胞が隣接する他の細胞培養部２０の細胞と細胞間結合を形成することなく培養され、再現性の高い実験系を構築しやすい。本実施形態において突出部３１が複数存在する場合、それらは、好ましくは０．２０ｍｍ以上、より好ましくは０．３０ｍｍ以上互いに離れて配置されている。
【００９９】
図３６に示す本開示の一実施形態に係る細胞培養基材１は、細胞培養部２０を含む表面Ｓを有する。そして、細胞培養部２０は、細胞非接着部２１と、細胞非接着部２１の周縁Ｐに沿って連続的に又は断続的に延在し（図３６では連続的に延在している例を示す）、細胞非接着部２１を囲う細胞接着部２２とを備える。図３６に示す細胞培養基材１のうち、細胞接着部２０が表面に配置される部分を「支持基材３０」とする。
【０１００】
図３６に示す細胞培養基材１は、１以上の窪み部３２を有する支持基材３０を有し、各窪み部３２の底面Ｓに、細胞非接着部２１とその周囲を囲う細胞接着部２２とを含む。この実施形態では、窪み部３２の底面Ｓは円形であるが、他の形状を有していても良い。この実施形態では、平面視において、窪み部３２の底面Ｓの周縁部に細胞接着部２２が存在し、細胞接着部２２の外側は窪み部３２の周壁面であるため、細胞接着部２２に接着した細胞は、培養されると、細胞接着部２２よりも外側には広がらず、細胞接着部２２及びその内側の細胞非接着部２１上に広がり細胞構造物を形成する。
【０１０１】
図３６に示す実施形態によれば、水平方向に隔離した窪み部３２の底面Ｓに細胞培養部２０（細胞非接着部２１及び細胞接着部２２からなる）が存在するため各細胞培養部２０内の細胞が隣接する他の細胞培養部２０の細胞と細胞間結合を形成することなく培養され、再現性の高い実験系を構築しやすい。本実施形態において窪み部３２が複数存在する場合、それらは、好ましくは０．２０ｍｍ以上、より好ましくは０．３０ｍｍ以上互いに離れて配置されている。
【０１０２】
図３７に示す本開示の一実施形態に係る細胞培養基材１は、細胞培養部２０を含む表面Ｓを有する。そして、細胞培養部２０は、細胞非接着部２１と、細胞非接着部２１の周縁Ｐに沿って連続的に又は断続的に延在し（図３７では連続的に延在している例を示す）、細胞非接着部２１を囲う細胞接着部２２とを備える。図３７に示す細胞培養基材１のうち、細胞接着部２０が表面に配置される部分を「支持基材３０」とする。
【０１０３】
図３７に示す細胞培養基材１は、支持基材３０の平坦な表面Ｓの全体に１つの細胞培養部２０が形成されており、細胞接着部２２は、表面Ｓの周縁部に配置されている。この実施形態では、支持基材３０の表面Ｓは円形であるが、他の形状を有していても良い。この実施形態では、平面視において、支持基材３０の表面Ｓの周縁部に細胞接着部２２が存在し、細胞接着部２２の外側には支持基材が存在しないため、細胞接着部２２に接着した細胞は、培養されると、細胞接着部２２よりも外側には広がらず、細胞接着部２２及びその内側の細胞非接着部２１上に広がり細胞構造物を形成する。
【０１０４】
図３７に示す実施形態によれば、１つの細胞培養基材１には細胞培養部２０（細胞非接着部２１及び細胞接着部２２からなる）のみが存在するため、細胞培養部２０内の細胞が他の細胞と細胞間結合を形成することなく培養され、再現性の高い実験系を構築しやすい。
【０１０５】
＜４．細胞構造物＞
本開示で製造される細胞構造物は、小腸上皮細胞を含む。
前記小腸上皮細胞は、典型的には、栄養外胚葉細胞マーカーを発現する小腸上皮細胞である。
【０１０６】
本開示は、細胞培養時に、細胞非接着部を囲うように延在する細胞接着部において細胞が高密度で凝集し、栄養外胚葉細胞マーカーを発現する小腸上皮細胞に分化し、それが外周部に分布した袋状構造の細胞構造物が得られるという驚くべき知見に基づくものである。実施例では、栄養外胚葉細胞のマーカーであるサイトケラチン７と、小腸上皮細胞及び栄養外胚葉細胞のマーカーであるＣＤＸ２とが、細胞接着部に凝集した細胞で強く発現していることを確認している。
【０１０７】
なお、小腸上皮細胞は、細胞核に転写因子のＣＤＸ２及びＨＮＦ４、絨毛層にｖｉｌｌｉｎが発現し、かつ内胚葉系マーカーのＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎなどが発現していることを指標に確認することができる。これらのマーカーの存在は、抗体を使用した組織免疫染色やｍＲＮＡによるＰＣＲ評価などで検出可能である。
【０１０８】
本開示の細胞構造物は、小腸上皮細胞を含んでおり、腸と同等の機能を有する腸オルガノイドとして有用である。「腸オルガノイド」とは、細胞の起源生物の腸、特にヒト等の哺乳動物の腸、特にヒト腸に類似した機能（具体的には、蠕動運動する機能、粘液分泌機能、物質吸収機能等）を有する細胞構造体（組織）を指す。本開示の細胞構造物は、腸関連疾患を予防又は治療するための薬剤の開発や、腸関連疾患の病理研究に有用である。
【０１０９】
本開示の細胞構造物の全体の形状は特に限定されないが粒状であることが通常である。「粒状」は球状も包含する。
【０１１０】
非特許文献４にあるようにマウスＥＳ細胞でＣＤＸ２が強く発現することで栄養外胚葉細胞に分化する事が示されている。本実施例においてもマーカーとなるＣＤＸ２やＣｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ７が凝集部において強く発現していることが確認されており、同様に栄養外胚葉細胞の性質を有する細胞に分化していると考えられる。
【０１１１】
さらにヒトｉＰＳ細胞からＣＤＸ２陽性細胞を含む袋状構造を有する組織が得られることは非特許文献５に記載されている。よって本開示では、培養により細胞接着部上で細胞が密集した凝集部において、幹細胞からＣＤＸ２陽性細胞に分化し、それが同様に袋状構造の形成に寄与している可能性が考えられる。
【０１１２】
また、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞が栄養外胚葉細胞への分化能を有することは非特許文献６〜８にも示されている。
【０１１３】
以上の過去知見、並びに、後に示されるように本開示では細胞接着部に凝集した細胞ではＯｃｔ３／４遺伝子の低下が観察されていることから、本開示においては、幹細胞が細胞接着部に接着し増殖して凝集部を形成し、凝集部から栄養外胚葉細胞マーカーを発現する小腸上皮細胞に分化していることが推定される。
【０１１４】
非特許文献９では、マウスＥＳ細胞を用いた検討ではＯｃｔ遺伝子の発現が低下すると栄養外胚葉に分化することが示されており、本開示の細胞構造物でも同様の分化が生じていると推定される。
【０１１５】
また本開示で誘導された細胞構造物の特徴として、ＡＢＣＧ２トランスポーターの発現が、起源動物の小腸（起源動物がヒトである場合はヒト小腸）ｃＤＮＡと発現して同等以上であることが挙げられる。これまで得られていた腸オルガノイドと比較して、ＡＢＣＧ２トランスポーターの発現が顕著に高い。
【０１１６】
腸においてＡＢＣＧ２トランスポーターの役割として腸での排出、例えば尿酸の排出に寄与しており、その機能低下は痛風などの症状を引き起こすと考えられている。薬物動態を観察するためには吸引だけではなく排出も見る必要がある。ここで相対値の基準として用いることができる起源動物の小腸、特にヒト小腸のｃＤＮＡに関しては部位や性別、年齢、人種等に特に制限は設けないが、部位に関しては後腸である空腸や回腸が望ましく、年齢に関しては成人年齢に達していることが望ましい。また各種市販品を用いることもでき、かつインフォームドコンセントを受けた上で得られたヒト組織より採取して得たものでも良い。ヒト小腸のｃＤＮＡの市販品としてはＰＣＲ  Ｒｅａｄｙ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  −  Ｈｕｍａｎ  Ａｄｕｌｔ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｔｉｓｓｕｅ：Ｓｍａｌｌ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ（ＢｉｏＣｈａｉｎ社）、またはＣＵＢＮの発現を確実に得るために回腸より取得した製品であるＰＣＲ  Ｒｅａｄｙ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ−Ｈｕｍａｎ  Ａｄｕｌｔ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｔｉｓｓｕｅ：Ｉｌｅｕｍ（ＢｉｏＣｈａｉｎ社）を用いることができる。
【０１１７】
しかし、これまで誘導されてきた腸オルガノイドではＡＢＣＧ２トランスポーターの発現が十分ではなかった。過去の解析事例として例えば非特許文献１０の例が挙げられ、これもヒト腸以下の発現しか見られない。また非特許文献３に記載されているヒトＥＳ細胞を用いて得た腸オルガノイドでもＡＢＣＧ２トランスポーターの発現はヒト腸以下の発現であった。なお後の実施例で行ったｉＰＳ細胞を用いた非特許文献２記載のこれまでのパターン培養を行った場合での値はＥＳ細胞での値と同等であった。
【０１１８】
なおＡＢＣＧ２トランスポーターが、胎盤すなわち栄養外胚葉細胞に強く発現している事が非特許文献１１および１２に記載されている。
【０１１９】
例えば非特許文献１３にはマウスの腸組織を培養することにより非特許文献１で用いられているようなＬｇｒ５陽性な腸管上皮幹細胞を用いなくても生体外培養によりオルガノイド様組織が誘導される事が報告されている。ここではＴｒｏｐ２陽性細胞がマウス胎児腸に発現しておりオルガノイドへの分化の元となっている。このＴｒｏｐ２マーカーは栄養外胚葉細胞にも強く発現しており、性質は近い。ゆえに本開示での小腸上皮細胞への発生メカニズムはこれに近いと考えられる。
【０１２０】
また、栄養外胚葉細胞と小腸上皮細胞の性質の近さに関しては非特許文献１４でも述べられている。
【０１２１】
従って本開示では、非特許文献１３と同様の現象が起きていると示唆され、栄養外胚葉細胞から栄養外胚葉細胞マーカーを発現する小腸上皮細胞が分化誘導されると考えられ、また分化誘導培養の期間が短いため、初期段階の細胞状態のまま細胞構造物（組織）が得られているため、構成している細胞のＡＢＣＧ２トランスポーターの発現量が高くなりやすいと考えられる。
【０１２２】
本開示の細胞構造物は更に、細胞構造物でのＡＢＣＧ２トランスポーターの発現量及びＡＢＣＢ１トランスポーターの発現量を、それぞれ、起源動物の小腸組織でのＡＢＣＧ２トランスポーターの発現量及びＡＢＣＢ１トランスポーターの発現量に対する相対値として表したとき、前記細胞構造物でのＡＢＣＧ２トランスポーターの発現量の前記相対値が、ＡＢＣＢ１トランスポーターの発現量の前記発現量に対して、９０倍以上、好ましくは１００倍以上である。前記比の上限は特に限定されないが、例えば１０００倍以下である。本開示の細胞構造物は幼弱なヒト腸のモデルとして有用である。例えば非特許文献１５で胎盤や胎児におけるＡＢＣＢ１トランスポーターおよびＡＢＣＧ２トランスポーターの発現について記載がある。これによると、ヒト胎児小腸においてはＡＢＣＢ１トランスポーターに関しては着床後２０週間までは低く、新生児になると成体と同程度に高くなるという記載がある。対してＡＢＣＧ２トランスポーターでは着床後５．５週間より成体と同等の高い発現が認められるとある。そのため幼弱な腸ではＡＢＣＢ１トランスポーターよりもＡＢＣＧ２トランスポーターの発現が高くなると考えられる。
【０１２３】
細胞構造物の調製に用いる幹細胞の起源動物がヒトである場合に基準として用いることができるヒト小腸のｃＤＮＡについては既述の通りである。
【０１２４】
なお非特許文献１６中には浮遊培養によりＡＢＣＧ２トランスポーターがヒト生体腸よりも高い腸オルガノイドの作製について記載がある。しかし、この製品は誘導によりＡＢＣＢ１トランスポーターの発現も高いものであり、本開示で得られる物とは異なる。また、非特許文献１６に記載の製品は小腸上皮細胞のみからなっている。
【０１２５】
トランスポーターの発現を人為的に上昇させる手法として他には遺伝子導入による過剰発現が挙げられるが、培養細胞では達成されていてもオルガノイドや動物腸のような３次元組織では、所定のトランスポーターの発現を上昇させた例はない。この点でも本開示の細胞構造物は特徴を有する。
【０１２６】
ＡＢＣＧ２トランスポーター及びＡＢＣＢ１トランスポーターの発現の強度を測定する手法として遺伝子学的手法によるｍＲＮＡを計測する方法（例えばリアルタイムＰＣＲをはじめとするｑＰＣＲ法やアガロースゲルによる電気泳動によって得られたバンドの濃さによる比較）や抗体を用いたタンパク質の発現を計測する方法（例えばフローサイトメトリー）などが挙げられるが望ましくはｍＲＮＡ量を測定する遺伝子学的手法である。
【０１２７】
ここで、ＡＢＣＧ２トランスポーターの発現量を、それ単独ではなく、ＡＢＣＢ１トランスポーターの発現量に対する比で規定する理由は以下の通りである。
【０１２８】
また、本開示の細胞構造物では、上記トランスポーターは主に上皮細胞で発現しているが、間質細胞でも発現が認められる。そのためＡＢＣＧ２トランスポーターの発現量の基準として、上皮細胞のみに発現するタンパク質（例えばＣＤＸ２やＶｉｌｌｉｎ）の発現量を用いると、細胞構造物内の間質細胞の量の大小に応じて値にバラつきが生じてしまう。細胞に共に発現するＡＢＣＧ２トランスポーターとＡＢＣＢ１トランスポーターとの比率を評価することで、上記の問題を回避することができる。
【０１２９】
なお、遺伝子ＣＵＢＮがコードしているタンパク質のｃｕｂｉｌｉｎは十二指腸、空腸には発現がほとんど見られないが回腸では見られるコバラミン（ビタミンＢ１２）の吸収に働くレセプターである（Jensen et al., Physiological Reports  e12086 2014年）。本開示で誘導された細胞構造物の一実施形態の特徴として、ＣＵＢＮの発現量が高いことが挙げられる。ＣＵＢＮの発現量が高い小腸上皮細胞を含む細胞構造物は、回腸に近い性質を少なくとも有していると考えられる。ｃｕｂｉｌｉｎは小腸上皮細胞に発現しているため、遺伝子ＣＵＢＮの発現量を評価するためには、小腸上皮細胞に特徴的なマーカーの発現量に対する相対値として評価することが好ましい。小腸上皮細胞に特徴的なマーカーとしてはＣＤＸ２、Ｖｉｌｌｉｎ、Ｅｃａｄｈｅｒｉｎが例示でき、望ましくはＶｉｌｌｉｎである。
【０１３０】
そこで本開示の細胞構造物の好ましい実施形態は、
小腸上皮細胞を含む細胞構造物であって、
前記細胞構造物のＣＵＢＮの発現量及びＶｉｌｌｉｎの発現量を、それぞれ、起源動物の小腸組織でのＣＵＢＮの発現量及びＶｉｌｌｉｎの発現量に対する相対値として表したとき、前記細胞構造物でのＣＵＢＮの発現量の前記相対値が、Ｖｉｌｌｉｎの発現量の前記相対値に対して、０．２〜１．８、より好ましくは０．２４〜１．７２の範囲にある。
【０１３１】
この特徴を有する細胞構造物は回腸に近い性質を少なくとも有する。
【０１３２】
細胞構造物の調製に用いる幹細胞の起源動物がヒトである場合に基準として用いることができるヒト小腸のｃＤＮＡについては既述の通りである。
【０１３３】
本開示の細胞構造物は、より好ましくは、内胚葉系細胞、外胚葉系細胞及び中胚葉系細胞を含む。
【０１３４】
内胚葉は消化管のほか肺、甲状腺、膵臓、肝臓などの器官の組織、消化管に開口する分泌腺の細胞、腹膜、胸膜、喉頭、耳管、気管、気管支、尿路（膀胱、尿道の大部分、尿管の一部）などを形成する。ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞から内胚葉系細胞への分化は、内胚葉に特異的な遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。内胚葉に特異的な遺伝子としては、例えば、ＡＦＰ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＳＳＴ、ＩＳＬ１、ＩＰＦ１、ＩＡＰＰ、ＥＯＭＥＳ、ＨＧＦ、ＡＬＢＵＭＩＮ、ＰＡＸ４、ＴＡＴ等を挙げることができる。
【０１３５】
本開示の細胞構造物に含まれ得る内胚葉系細胞としては特に小腸上皮細胞が挙げられる。腸オルガノイドは、小腸上皮細胞として、腸細胞、杯細胞、腸管内分泌細胞及びパネート細胞から選択される１以上を含むことが好ましく、小腸上皮細胞として、腸細胞、杯細胞、腸管内分泌細胞及びパネート細胞を全て含むことが特に好ましい。本開示の細胞構造物に内胚葉系細胞が存在することは内胚葉系細胞のマーカーの発現が陽性であることに基づき判断できる。腸細胞マーカーとしてはＣＤＸ２、杯細胞マーカーとしてはＭＵＣ２、腸管内分泌細胞マーカーとしてはＣＧＡ、パネート細胞マーカーとしてはＤＥＦＡ６が挙げられる。そのほか、ＥＣＡＤ、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ、ビリンが腸上皮細胞のマーカーである。また、胚体内胚葉マーカーＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４も内胚葉系細胞を判別するためのマーカーとして利用できる。また、初期内胚葉及び中胚葉のマーカーであるＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６又はＴ（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）も、内胚葉系細胞を判別するためのマーカーとして利用できる。
【０１３６】
外胚葉は皮膚の表皮や男性の尿道末端部の上皮、毛髪、爪、皮膚腺（乳腺、汗腺を含む）、感覚器（口腔、咽頭、鼻、直腸の末端部の上皮を含む、唾液腺）水晶体などを形成する。外胚葉の一部は発生過程で溝状に陥入して神経管を形成し、脳や脊髄などの中枢神経系のニューロンやメラノサイトなどの元にもなる。また末梢神経系も形成する。ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞から外胚葉系細胞への分化は、外胚葉に特異的な遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。外胚葉に特異的な遺伝子としては、例えば、β−ＴＵＢＬＩＮ、ＮＥＳＴＩＮ、ＧＡＬＡＮＩＮ、ＧＣＭ１、ＧＦＡＰ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＯＬＩＧ２、ＳＹＮＡＰＴＰＨＹＳＩＮ、ＤＥＳＭＩＮ、ＴＨ等を挙げることができる。
【０１３７】
本開示の細胞構造物に含まれ得る外胚葉系細胞としては特に腸管神経叢を構成する細胞が挙げられる。本開示の細胞構造物に外胚葉系細胞が存在することは外胚葉系細胞のマーカーの発現が陽性であることに基づき判断できる。外胚葉系細胞を判別するためのマーカーとしては腸管神経叢マーカーＰＧＰ９．５や、神経前駆細胞マーカーＳＯＸ１が利用できる。
【０１３８】
中胚葉は体腔及びそれを裏打ちする中皮、筋肉、骨格、皮膚真皮、結合組織、心臓、血管（血管内皮も含む）、血液（血液細胞も含む）、リンパ管、脾臓、腎臓、尿管、性腺（精巣、子宮、性腺上皮）を形成する。ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞から中胚葉系細胞への分化は、中胚葉に特異的な遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。中胚葉に特異的な遺伝子としては、例えば、ＦＬＫ−１、ＣＯＬ２Ａ１、ＦＬＴ１、ＨＢＺ、ＭＹＦ５、ＭＹＯＤ１、ＲＵＮＸ２、ＰＥＣＡＭ１等を挙げることができる。
【０１３９】
本開示の細胞構造物に含まれ得る中胚葉系細胞としては特に平滑筋細胞、カハール介在細胞が挙げられる。腸オルガノイドに中胚葉系細胞が存在することは、中胚葉系細胞マーカーの発現が陽性であることに基づき判断できる。中胚葉系細胞マーカーとしては、平滑筋細胞マーカーのα−平滑筋アクチン（ＳＭＡ）、カハール介在細胞マーカーのＣＤ３４及びＣＫＩＴ（二重陽性の場合）が利用できる。また、初期内胚葉及び中胚葉のマーカーであるＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６又はＴ（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）も、中胚葉系細胞を判別するためのマーカーとして利用できる。
【０１４０】
本開示の細胞構造物は、好ましくは、外表面の少なくとも一部に小腸上皮細胞を含む。この実施形態によれば、細胞構造物の外側にある物質を、外表面の小腸上皮細胞を介して内部に吸収することができるため好ましい。また、この実施形態において、外表面の小腸上皮細胞が更にトランスポーター陽性であるとき、トランスポーターを介した物質の取り込みが可能となるため更に好ましい。すなわち、トランスポーター陽性の小腸上皮細胞を含む腸オルガノイドは、腸と類似した物質吸収能を有する。
【０１４１】
＜５．小腸上皮細胞を含む細胞構造物の製造方法＞
本開示の、小腸上皮細胞を含む細胞構造物の製造方法は、
上記の特徴を有する細胞培養基材上に幹細胞を播種すること、並びに
播種された前記幹細胞を培養して、前記幹細胞の一部を小腸上皮細胞に分化させることを含む。
【０１４２】
前記小腸上皮細胞は、典型的には、栄養外胚葉細胞マーカーを発現する小腸上皮細胞である。
【０１４３】
本開示で用いる細胞培養基材は、幹細胞の細胞接着部への接着を促進する目的で、プレコート剤によりプレコート処理されていることが好ましい。プレコート処理剤とは、細胞培養基材に予め適用して、細胞接着部への細胞の接着を促進するための成分である。プレコート処理剤としては、細胞外マトリックス（コラーゲン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、ラミニン、ビトロネクチン）、ゼラチン、リジン、ペプチド、それらを含むゲル状マトリックス、血清等が挙げられる。プレコート処理を実施することにより、接着性の低い幹細胞の細胞接着部への接着を促進でき、細胞の接着培養及び分化誘導を効果的に実施できる。
【０１４４】
幹細胞は、播種前に未分化性を維持した条件で培養することができる。このときの培養に用いる培地は、幹細胞を分化誘導させない培地であれば特に限定されないが、例えば、マウス胚性幹細胞及びマウス人工多能性幹細胞の未分化性を維持する性質を有していることが知られているｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒを含む培地や、ヒトｉＰＳ細胞の未分化性を維持する性質を有していることが知られているｂａｓｉｃ  ＦＧＦを含む培地等が挙げられる。
【０１４５】
細胞培養基材に播種された幹細胞を培養してその一部を小腸上皮細胞に分化させる工程は、幹細胞を増殖させ、分化誘導することができる培地中で行えばよく、培地は特に限定されない。例えば、具体例として特許文献１、特許文献２、非特許文献４で使用した培地や、ＳｔｅｍＦｉｔ（味の素社）、ＳｔｅｍＦｌｅｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＲｅｐｒｏＦＦ（リプロセル社）などの市販の培地が挙げられる。また培地は、血清含有培地であってもよいし、血清に代替する性質を有する既知成分を含有した無血清培地であってもよい。なお特許文献１、特許文献２、非特許文献４に含まれている因子（ＦＧＦ２、ＩＧＦ−１、ヘレグリン）が多能性幹細胞の増殖に寄与している事は非特許文献１７及び１８に記載されている。
【０１４６】
培地としては、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地及びＲＰＭＩ１６４０培地等を用いることができる。培地には、各種増殖因子、抗生物質、アミノ酸などを加えてもよい。例えば、０．１〜２％のピルビン酸、０．１〜２％の非必須アミノ酸、０．１〜２％のペニシリン／ストレプトマイシン、０．１〜１％のグルタミン、０．１〜２％のβメルカプトエタノール、１ｍＭ〜２０ｍＭのＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ２７６３２）を添加してもよい。
【０１４７】
細胞培養基材への幹細胞の播種密度は常法に従えばよく特に限定されるものではない。本開示においては、幹細胞を細胞培養基材に対し３×１０４  ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上の密度で播種することが好ましく、３×１０４〜５×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種することがより好ましく、３×１０４〜２．５×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種することがさらに好ましい。
【０１４８】
培養温度は、通常３７℃である。ＣＯ２細胞培養装置などを利用して、５％程度のＣＯ２濃度雰囲気下で培養するのが好ましい。
【０１４９】
幹細胞を細胞培養基材へ播種した後の培養期間は、細胞の初期播種密度や細胞接着部の形状、大きさによって差異が生じるが、２〜４週間程度であることが好ましい。本発明者らは、本明細書に記載の構造の細胞培養基材上で幹細胞を培養し分化誘導するとき、播種後２〜４週間で、分化誘導された小腸上皮細胞を含む細胞構造物が自然に浮遊して剥離し、回収できること、そしてこうして回収された細胞構造物の回収率は顕著に高いことを見出した。非特許文献３に記載の、円形の細胞接着部を有する基材上では３０日以上経過後に細胞構造物が剥離し、しかもその回収率が非常に低いことと比較して、本開示の方法は有利である。
【０１５０】
また本開示の方法で分化誘導された細胞構造物は細胞培養基材から自然に浮遊して剥離するが、細胞構造物を破壊しない温和な酵素処理（例えばＡｃｃｕｔａｓｅやＴｒｙｐＬＥなど）やＥＤＴＡ処理、培地等の液体の吹きかけ、スクレーパーによる物理的な剥離等の各種手法を用いて、細胞培養基材からの細胞構造物の剥離を促進してもよい。
【０１５１】
細胞構造物が細胞培養基材から剥離した後、更に浮遊培養を継続してもよい。浮遊培養の期間は限定されない。
【０１５２】
ＡＢＣＢ１トランスポーターの発現量に対しＡＢＣＧ２トランスポーターの発現量の高い幼弱なヒト小腸の特徴を有する実施形態の本開示の細胞構造物は、播種後２〜４週間で剥離し回収することで得ることができる。
【０１５３】
＜６．細胞構造物保持基板＞
本開示の別の態様は、
細胞培養部を含む表面を有する細胞培養基材であって、
前記細胞培養部が、細胞非接着部と、前記細胞非接着部の周縁に沿って連続的に又は断続的に延在し、前記細胞非接着部を囲う細胞接着部とを含む、
細胞培養基材、並びに
前記細胞培養部上に接着された、小腸上皮細胞を含む細胞構造物
を含む、細胞構造物保持基材に関する。
【０１５４】
前記細胞構造物保持基材は、小腸上皮細胞を含む細胞構造物を基材上に保持するため、小腸上皮細胞を含む細胞構造物を、腸関連疾患を予防又は治療するための薬剤の開発や、腸関連疾患の病理研究を目的とした試験に利用する際の取り扱い性が容易である。また、前記細胞構造物保持基材は、ノロウイルス等の、小腸組織に増殖するウイルス又は微生物を培養する際の足場として利用することも可能である。
【０１５５】
また、上記で説明したような小腸上皮細胞を含む細胞構造物を培養するための培地中で、前記細胞構造物保持基材上の細胞構造物の培養を更に継続して、小腸上皮細胞を含む細胞構造物を成熟させ、細胞培養基材から遊離させて回収することも可能である。
【０１５６】
細胞構造物を構成する細胞の増殖性は、細胞構造物が細胞培養基材に接着された状態のほうが、細胞構造物が培地中に浮遊している状態よりも高いことから、本開示の細胞構造物保持基材は上記の用途に適している。
【０１５７】
また、細胞構造物は細胞が進展して広がった状態で細胞培養基材に接着している。このため、本開示の細胞構造物保持基材は、小腸組織に増殖するウイルス又は微生物を培養するための足場として適している。
【０１５８】
前記細胞構造物保持基材は、細胞構造物が生存できるように、細胞構造物が緩衝液又は培地と接触していることが好ましい。
【０１５９】
前記細胞構造物保持基材の一実施形態を図３３に基づいて説明し、別の一実施形態を図３４に基づいて説明する。
【０１６０】
図３３に示す実施形態に係る細胞構造物保持基材１００は、細胞培養基材１と、小腸上皮細胞を含む細胞構造物１０１とを含む。
【０１６１】
細胞培養基材１は、細胞培養部２０を含む表面Ｓを有する。そして、細胞培養部２０は、細胞非接着部（中央部）２１と、細胞非接着部２１の周縁Ｐに沿って連続的に又は断続的に延在し（図３３では連続的に延在している例を示す）、細胞非接着部２１を囲う細胞接着部２２とを備える。図３３に示す例では、表面Ｓは更に第１の細胞非接着部１０を含み、第１の細胞非接着部１０中に１以上の細胞培養部２０が配置されている。細胞培養基材１のうち、第１の細胞非接着部１０及び細胞接着部２０が表面に配置される部分を「支持基材３０」とする。
【０１６２】
細胞培養基材の特徴及びその製造方法は本明細書、特に前記＜２．細胞培養基材の細胞非接着部及び細胞接着部＞及び＜３．細胞培養基材の細胞培養部の形状の特徴＞において説明した通りであり、説明を省略する。細胞構造物１０１の寸法に対して、第１の細胞非接着部１０、第２の細胞非接着部（中央部）２１、細胞接着部２２の厚さ及び／又は相互間の段差は十分に小さいため、図３３（Ｂ）では、支持基材３０の、第１の細胞非接着部１０、第２の細胞非接着部（中央部）２１、及び、細胞接着部２２を含む表面Ｓは平坦な平面として示す。
【０１６３】
図３３に示す実施形態に係る細胞構造物保持基材１００では、小腸上皮細胞を含む細胞構造物１０１は、表面Ｓの法線方向に沿って細胞構造物保持基材１００を見た場合に、少なくとも細胞接着部２２と重なる位置に存在する。細胞培養基材１に幹細胞を播種して細胞培養を行うと、細胞接着部２２に幹細胞が接着し増殖して、細胞が密に凝集した凝集部が形成される。そして、凝集部の細胞は、形成された細胞の凝集部において栄養外胚葉細胞のマーカーを発現する小腸上皮細胞に分化して、図３３に示す細胞構造物１０１を形成する。表面Ｓの法線方向に沿って細胞構造物保持基材１００を見た場合に細胞接着部２２と重なる位置に存在する小腸上皮細胞は、ＣＤＸ２、サイトケラチン７及びＥ−カドヘリンから選択される１以上のマーカーを発現する細胞であることが好ましい。
【０１６４】
図３４に示す実施形態に係る細胞構造物保持基材１００は、細胞培養基材１と、小腸上皮細胞を含む細胞構造物１０１とを含み、小腸上皮細胞を含む細胞構造物１０１が、表面Ｓの法線方向に沿って細胞構造物保持基材１００を見た場合に、細胞接着部２２及び細胞非接着部（中央部）２１と重なる位置に存在する。この実施形態において、細胞培養基材１の特徴は、図３３に示す実施形態と同様であり説明を省略する。図３４（Ｂ）においても、支持基材３０の、第１の細胞非接着部１０、第２の細胞非接着部（中央部）２１、及び、細胞接着部２２を含む表面Ｓは平坦な平面として示す。
【０１６５】
細胞培養基材１に幹細胞を播種して細胞培養を行うと、細胞接着部２２に幹細胞が接着し増殖して、細胞が密に凝集した凝集部が形成されて、図３３に示すように、細胞接着部２２が、小腸上皮細胞を含む細胞構造物１０１により被覆される。更に培養を続けると、細胞接着部２２上の細胞構造物１０１から遊走した細胞により細胞非接着部（中央部）２１が被覆されて、細胞非接着部（中央部）２１及び細胞接着部２２を被覆する細胞構造物１０１が形成される。
【０１６６】
図３４に示す実施形態における細胞構造物１０１は、好ましくは、表面Ｓの法線方向に沿って細胞構造物保持基材１００を見た場合に、細胞非接着部（中央部）２１と重なる位置１０１ｂよりも、細胞接着部２２と重なる位置１０１ａにおいて、多くの小腸上皮細胞を含む。このことは、細胞培養基材１上に接着された細胞構造物１０１を、小腸上皮細胞のマーカー（例えばＣＤＸ２、サイトケラチン７及びＥ−カドヘリンから選択される１以上のマーカー）に対する抗体を使用して免疫染色し観察することで確認することができる。また、表面Ｓの法線方向に沿って細胞構造物保持基材１００を見た場合の、細胞構造物１０１の細胞接着部２２と重なる位置１０１ａから採取した細胞試料のｍＲＮＡ中の小腸上皮細胞のマーカーのｍＲＮＡ量と、細胞構造物１０１の細胞非接着部（中央部）２１と重なる位置１０１ｂから採取した細胞試料のｍＲＮＡ中の小腸上皮細胞のマーカーのｍＲＮＡ量とを比較して、前者が後者よりも大きい場合に、細胞構造物１０１が、表面Ｓの法線方向に沿って細胞構造物保持基材１００を見た場合に細胞非接着部（中央部）２１と重なる位置１０１ｂよりも、細胞接着部２２と重なる位置１０１ａにおいて、多くの小腸上皮細胞を含むと判断することができる。
【０１６７】
図３４に示す実施形態における細胞構造物１０１は、好ましくは、表面Ｓの法線方向に沿って細胞構造物保持基材１００を見た場合に、細胞非接着部（中央部）２１と重なる位置１０１ｂに、神経細胞及び筋肉細胞を含み、より好ましくは、細胞接着部２２と重なる位置１０１ａよりも細胞非接着部（中央部）２１と重なる位置１０１ｂにおいて、多くの神経細胞及び筋肉細胞を含む。
【０１６８】
図３４に示す実施形態における細胞構造物１０１の別の好ましい例は、内胚葉系細胞（小腸上皮細胞を含む）、外胚葉系細胞及び中胚葉系細胞を含むことが好ましく、袋状の構造を有することが好ましく、上記の＜４．細胞構造物＞で説明した特徴を有することが更に好ましい。
【０１６９】
本開示の一以上の実施形態に係る細胞構造物保持基材は、細胞培養基材の表面に幹細胞を播種し培養することで製造することができる。幹細胞及び培養条件の好ましい態様は上記の＜１．幹細胞＞及び＜５．小腸上皮細胞を含む細胞構造物の製造方法＞に記載した通りである。ただし、細胞構造物保持基材を製造する目的では、細胞培養基材の細胞培養部上に接着した細胞構造物が細胞培養基材から遊離する前の所望の段階に達した後に、細胞培養基材を、細胞構造物の培養及び成熟が進行しにくい条件に曝して、細胞構造物保持基材の製品とすることが好ましい。
【０１７０】
上記の「細胞構造物の培養及び成熟が進行しにくい条件」としては、低温条件や、栄養因子を含有しない又は低濃度で含む培地又は緩衝液中の条件が挙げられる。
【０１７１】
以下、具体的な実験結果を参照して本開示を説明するが、本開示の範囲は実験結果の範囲には限定されない。
【実施例】
【０１７２】
＜実施例１＞
（細胞培養基材の作製）
細胞培養基材として、ガラス基材上に形成された、ポリエチレングリコール４００の層が酸化分解されて形成された領域である、内径１８０μｍ、２８０μｍ又は３８０μｍ且つ幅６０μｍの環状パターンからなる細胞接着部（図１参照）と、前記細胞接着部の環状パターンの内側及び外側の、ガラス基材の表面がポリエチレングリコール４００で被覆された領域である細胞非接着部とを備える細胞培養基材を作製した。前記細胞培養基材は、複数個の、３００〜５００μｍ間隔で形成された前記環状パターンからなる細胞接着部を備える（図１参照）。以下の説明では、環状パターンからなる細胞接着部を「環状細胞接着部」と称する。【０１７３】
細胞培養基材は、特許第５０７０５６５号（特許文献６）及びOkochi et al., Langmuir  第25巻  6947〜6953ページ 2009年（非特許文献１９）に記載の手順により作製した。以下にその概要を説明する。【０１７４】
（一段階目の反応）
トルエン３９．０ｇ、エポキシシランＴＳＬ８３５０（ＧＥ東芝シリコーン製）０．４８ｇ、トリエチルアミン０．９７gを混合し、室温で１０分間攪拌した。このシラン溶液にＵＶ洗浄済みの１０ｃｍ角のガラス基板を洗浄面が上向きとなるように浸漬した。室温で１６時間放置した後、基板をエタノールと水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。これにより、ガラス基板表面にエポキシ基を含む薄膜が形成された。【０１７５】
（二段階目の反応）
５０ｇの平均分子量４００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ４００）を攪拌しながら２５μｌの濃硫酸を一滴ずつ添加した。そのまま数分間攪拌してから、全量をガラス皿に移した。ここに上記の基板を浸漬し、８０℃で２０分間反応させた。反応後、基板をよく水洗し、窒素ブローで乾燥させた。これにより、ガラス表面に均一な親水性薄膜が形成された。【０１７６】
（酸化処理）
表面全域に酸化チタン系光触媒を塗布したフォトマスクを作製した。フォトマスクは、複数個の、３００〜５００μｍ間隔で形成された上記寸法の環状細胞接着部に対応する形状の開口部が形成され、且つ、周囲に幅約１．５ｃｍの開口部を有する５インチサイズのものを用いた。あらかじめ露光機の照度を３５０ｎｍの波長で計測し、露光時間の設定の目安とした。このフォトマスクの光触媒層と基板表面の親水性薄膜を接触させ、フォトマスク側から光が照射されるよう露光機内に設置した。波長３５０ｎｍの照度が２０ｍＷ／ｃｍ２の水銀ランプで５０秒間露光し、基板表面の親水性薄膜を部分的に酸化分解した。この基板を２５ｍｍ×１５ｍｍの大きさに切断し、細胞接着基板として使用した。細胞培養に使用する前に、細胞培養基材に対しＥＯＧ滅菌処理を２２時間施した。【０１７７】
前記細胞培養基材を、３．５ｃｍペトリディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）の底面上に設置し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１／１００希釈したビトロネクチン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）と室温で３０分間以上接触させてコーティングした後に、ＰＢＳで３回洗浄してから使用した。
こうして得られた細胞培養基材は図１（Ｂ）に示すような断面構造を有する。【０１７８】
（培養）
国立研究開発法人国立成育医療研究センターは、月経血から取得した細胞に山中４因子をセンダイウイルスベクターによって一過的に発現させて、ヒトｉＰＳ細胞株であるＥｄｏｍ  ｉＰＳ細胞を樹立している（PLoS Genet. 2011 May; 7(5): e1002085. Published online 2011 May 26. doi: 10.1371/journal.pgen.1002085PMCID: PMC3102737）。Ｅｄｏｍ  ｉＰＳ細胞を、ビトロネクチンコートした細胞培養用ディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）中でＳｔｅｍＦｉｔ培地（味の素社）を用いてあらかじめ増殖させた。増殖した細胞を、ＰＢＳで１／１０００に希釈したＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて３７℃で１０分間処理することにより前記ディッシュから剥離し、前記細胞培養基材に１×１０６個播種し培養した。培地として、非特許文献３記載のＸＦ  ｈＥＳＣ培地を用いた。播種当日は前記培地にＹ２７６３２を含ませたが、翌日培地交換しＹ２７６３２を含まない前記培地で維持した。４日目以降、培地交換を３〜４日に１回行った。培養中、細胞培養基材から自然剥離した組織を回収し、別のペトリディッシュ内で同じ培地で浮遊培養させて維持した。【０１７９】
図２に、内径の異なる環状細胞接着部を有する各細胞培養基材を用いて培養したときの培養１日目、６日目、１１日目、１８日目の培養物の観察像を示す。培養１日目の写真は他の物と比較して拡大倍率が高い。先に環状細胞接着部で細胞が増殖し、続いて、環状細胞接着部で囲われた内側の細胞非接着部が増殖した細胞により被覆される様子が観察された。【０１８０】
図３に、培養３週の培養物の観察像を示す。図３に示す観察像は、各細胞培養基材上での培養により、袋状構造を有する組織が高い割合で形成されたことを示す。【０１８１】
この培養の結果、袋状構造を有する組織が培養開始後２〜３週間で表面から自然剥離し回収できることが示された。図４に、内径３８０μｍの環状細胞接着部を有する基材上で形成され剥離した袋状構造を有する組織の観察像（左がディッシュ全体の写真、右が組織の観察像）を示す。図４の左の写真において、ディッシュに見える白い点状の物が、袋状構造を有する組織である。図４の右の写真は、本実施例で得た袋状構造を有する組織の顕微鏡による観察像である。本実施例で得た袋状構造を有する組織の観察像は、ｉＰＳ細胞を類似した培地中で培養して得た、Uchida et al., JCI Insight 第2巻 e86492 2017年に記載の、腸機能を有する袋状の組織（腸オルガノイド）の観察像と類似していること及び後述する実施例４、実施例５の結果から、本実施例で得た袋状構造を有する組織もまた、腸オルガノイドであることが分かる。【０１８２】
細胞培養基材上の環状細胞接着部の数に対する、回収された袋状構造を有する組織の割合（以下「組織回収率」と称することがある）は８０％以上であり、高収率であった。【０１８３】
＜比較例１〜３＞
比較例１として、Uchida et al., JCI Insight 第2巻 e86492 2017年に記載されている、ポリエチレングリコール層で被覆された領域である細胞非接着部と、ポリエチレングリコール層が酸化分解されて形成された直径１５００μｍの円形の複数の細胞接着部とが形成された細胞培養基材を用意した。【０１８４】
比較例２として、複数の円形の細胞接着部の各々の直径が２８２μｍである点を除いて比較例１と同じ構造の細胞培養基材を用意した。【０１８５】
比較例１及び比較例２の細胞培養基材の製造方法は、実施例１の細胞培養基材の製造方法と同様であり、フォトマスクの開口部の形状を細胞接着部に応じて適宜変更すればよい。
比較例３として接着パターンが作られていないガラス基材を用意した。【０１８６】
比較例１〜３の各基材上で、実施例１と同様の条件で、Ｅｄｏｍ  ｉＰＳ細胞の播種及び培養を行った。【０１８７】
図５に、比較例１、比較例２、比較例３の各基材上での培養開始後３週間の培養物の顕微鏡観察像を示す。【０１８８】
比較例１では、袋状構造を有する組織の表面からの剥離開始が、培養開始後３〜４週間で観察され、組織回収率は４〜５％であった。前記実施例１と比較し比較例１では剥離までの培養期間が長く、組織回収率が低かった。【０１８９】
比較例２では、培養開始後２〜３週間で袋状構造を有する組織が得られたが、観察像が暗い細胞凝集塊が多く得られた。袋状構造を有する組織の組織回収率は１０％以下であった。また、図５の「比較例２」にて矢印で示す組織のように、隣接する複数の円形パターンでの培養物が融合して形成される、寸法の大きな袋状構造を有する組織が形成されることもあった。【０１９０】
比較例３では、小さな袋状構造が１〜２個程度得られる場合もあったが、袋状構造を有する組織が形成されるまでに基材の表面全体での細胞増殖が必要であり培養に１ヶ月以上の時間を要し、形成される袋状構造を有する組織の数は、実施例１での場合と比較して著しく少なかった。なお細胞接着部のパターンの数が定められていないため、この場合では組織回収率の計算はできていない。【０１９１】
以上の結果は、実施例１のように、環状パターンからなる細胞接着部を複数備えた基材でのｉＰＳ細胞の培養により、袋状構造を有する組織を、短い培養期間で得ることができ、且つ、組織向上率が顕著に高いことを示す。【０１９２】
＜実施例２＞
実施例１でのパターン培養の経過観察を行うため、下記のタイムラプス観察を実施した。【０１９３】
実施例１で用いた内径３８０μｍ、幅６０μｍの環状細胞接着部を複数備えた細胞培養基材を、ディッシュの底面上に固定した器材を作製した、この器材を用いて、実施例１と同様の条件で、Ｅｄｏｍ  ｉＰＳ細胞の播種及び培養を行った。【０１９４】
培養４日目から２１日目まで１２時間おきにＢｉｏＳｔａｔｉｏｎ（ニコン社）を用いて撮影を行った。撮影作業は添付のマニュアルに従い、培地交換は２〜３日に１回行った。【０１９５】
図６に、培養４日目、９日目、１３日目、２０日目の各時点での１つの環状細胞接着部周辺の細胞の観察像を示す。これより、細胞はまず環状パターン上で増殖及び積層し、その後、培養２１日目までに袋状構造を形成することが確認された。【０１９６】
＜実施例３＞
他の細胞種を用いて袋状構造を有する組織の形成を試みた。
ヒトＥＳ細胞のＳＥＥＳ２細胞株を、実施例１と同じ内径１８０μｍ、２８０μｍ又は３８０μｍ、幅６０μｍの環状細胞接着部を備えた細胞培養基材を用いて培養した。まず、１／１０００で希釈したｒｈＬＩＦ（和光純薬工業社）を添加したＳｔｅｍＦｉｔ培地（味の素社）を用い、ビトロネクチンコートした細胞培養用ディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）中で増殖培養した。増殖培養した細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を３７℃５分間処理することで剥離処理して回収し、前記基材に播種し、実施例１と同様の手順で培養した。【０１９７】
図７に、各細胞培養基材を用いた培養の１日目及び７日目の観察像と、内径２８０μｍの環状細胞接着部を有する細胞培養基材を用いた培養で培養３週間後に回収された袋状構造を有する組織の観察像を示す。袋状構造を有する組織の観察像、及び、組織回収率はｉＰＳ細胞を用いた実施例１と同様であった。【０１９８】
この結果は、環状細胞接着部を含む細胞培養基材上での幹細胞の培養により袋状構造を有する組織が効率良く作成することができること、並びに、このような組織の形成は、ＥＳ細胞を用いた場合でも実施例１のようにｉＰＳ細胞を用いた場合と同様に生じ、多能性幹細胞の種類を問わないことを示す。【０１９９】
＜実施例４＞
実施例１での培養過程を検討するために、実施例１と同じ内径３８０μｍ、幅６０μｍの環状細胞接着部を備える細胞培養基材上で細胞培養を行い、マーカーの発現を免疫染色により調べた。【０２００】
内径３８０μｍ、幅６０μｍの環状細胞接着部を備える細胞培養基材及び細胞培養の条件は実施例１に記載の通りである。【０２０１】
培養４日目、培養７日目または培養１２〜１４日目の組織を含む細胞培養基材を４％パラホルムアルデヒド（和光純薬社）により室温で２０分間固定した後にＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ含有ＰＢＳにより室温で３０分間ブロッキング操作を行った後に、前記基材を、マウスＩｇＧ１標識抗Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ７抗体（Ａｂｃａｍ社  希釈率１／５００）、マウスＩｇＧ３ｂ標識抗Ｏｃｔ３／４抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社  希釈率１／２００）、ウサギＩｇＧ標識抗Ｋｉ６７抗体（Ａｂｃａｍ社  希釈率１／５００）又はウサギＩｇＧ標識抗ＣＤＸ２抗体（Ａｂｃａｍ社  希釈率１／１０００）と室温で１時間インキュベートした。インキュベート後の前記基材をＰＢＳで３回洗浄し、次いで、ＰＢＳで希釈したＡｌｅｘａ４８８標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社  希釈率１／１０００）またはＡｌｅｘａ５４６標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社  希釈率１／１０００）と室温で３０分インキュベートした。インキュベート後の前記基材を更にＰＢＳで３回洗浄し、次いで、前記基材上の細胞の細胞核をＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ社  希釈率１／１０００）により室温で１０分間染色させた後に封入し、共焦点顕微鏡で観察した。なお抗体の種類に関しては適切に取捨選択を行った。【０２０２】
図８に、培養４日目の観察像を示す。これより培養４日目の段階で、環状細胞接着部上に、Ｋｉ６７陽性且つＯｃｔ３／４陽性な、増殖能を有する未分化細胞が存在しており、凝集部が形成され得ることが示唆された。【０２０３】
図９に、培養７日目の観察像を示す。図９の上段の観察像は、主に内部に多分化能を有するＯｃｔ３／４陽性の未分化細胞が存在し、外周部にＣＤＸ２陽性細胞が存在する組織が形成されたことを示す。図９の下段の観察像は、前記ＣＤＸ２陽性細胞は、Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ７陽性の栄養外胚葉細胞であったことを示す。【０２０４】
以上の結果より、実施例１の環状細胞接着部を有する細胞培養基材上で多能性幹細胞を培養し形成される組織において、外周部の細胞が特に密な凝集部を形成する部分は栄養外胚葉細胞からなっており、その後増殖により未分化細胞が内部に浸潤していることが示唆された。【０２０５】
更に、内径６００μｍ、幅１００μｍの環状細胞接着部を備える細胞培養基材を、実施例１に記載の条件により作製した。この細胞培養基材上で、実施例１に記載の条件によりＥｄｏｍ  ｉＰＳ細胞を培養した。培養９日目に細胞培養基材の細胞接着部に接着している細胞構造物を固定し、内胚葉系細胞マーカーのマウスＩｇＧ２ａ標識抗Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社  希釈率１／１０００）、神経細胞マーカーのウサギＩｇＧ標識抗βＩＩＩ ｔｕｂｌｉｎ抗体（Ａｂｃａｍ社  希釈率１／１０００）、筋肉細胞マーカーのマウスＩｇＧ２ａ標識抗Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ａｃｔｉｎ抗体（ＳＭＡ；Ｓｉｇｍａ社  希釈率１／５００）および上記２次抗体を用いて上記の手順により染色したうえで共焦点顕微鏡のＢＺ−Ｘ７１０（キーエンス社）で観察した。【０２０６】
結果を図２７及び図２８に示す。図２７及び図２８から、外周部にＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性細胞を含む袋状の細胞構造物が誘導されていること、並びに、その内部（環状パターンの中央部（細胞非接着部）上）が、遊走した神経細胞又は筋肉細胞により占められていること確認された。このことから、環状の細胞接着部上で、袋状の細胞構造物の外周部を構成するＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性細胞が誘導され、細胞非接着性の中央部は、遊走した神経細胞、筋肉細胞等により被覆されていると考えられる。なお図２８で見られる袋状の細胞構造物は、環状の細胞接着部の外郭寸法よりも収縮している。この収縮は、細胞遊走等の影響だと考えられる。【０２０７】
＜実施例５＞
実施例１において、内径２８０μｍ又は内径３８０μｍ、幅６０μｍの環状細胞接着部を備える細胞培養基材上での培養し、培養開始後３〜４週間で自然に剥離した組織を回収し、別のディッシュ内で培養開始後６週間まで浮遊培養して得られた袋状構造を有する組織について、組織中の腸細胞及び三胚葉由来細胞の有無を検討するために免疫染色による評価を行った。【０２０８】
ｉＰＧｅｌｌ（ＧｅｎｏＳｔａｆｆ社）および４％パラホルムアルデヒド溶液（和光純薬工業社）を用いて組織を製品添付のプロトコールに従い１晩固定した。固定した組織をパラフィン包埋した後に厚さ４〜６μｍの組織切片を作製した。Uchida et al., JCI Insight 第2巻 e86492 2017年に記載された方法で抗体染色を行った。抗体染色の方法は下記の通りである。【０２０９】
前記組織切片を、ウサギＩｇＧ標識抗ＣＤＸ２抗体（Ａｂｃａｍ社；希釈率１／１０００）及びマウスＩｇＧ標識抗Ｖｉｌｌｉｎ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社；希釈率１／２００）、又はマウスＩｇＧ標識抗Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ａｃｔｉｎ抗体（Ｓｉｇｍａ社；希釈率１／５００）、又はウサギＩｇＧ標識抗ＰＧＰ９．５抗体（ＤＡＫＯ社；希釈率１／２００）と４℃で１晩インキュベートすることで１次抗体染色を行った。１次抗体染色後の前記組織切片を、ＰＢＳで５分３回洗浄した後にＰＢＳで希釈したＡｌｅｘａ４８８標識抗ウサギＩｇＧ抗体及びＡｌｅｘａ５４６標識抗マウスＩｇＧ抗体（共にＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社；希釈率１／１０００）と室温で１時間インキュベートすることで２次抗体染色を行った。２次抗体染色後の前記組織切片をＰＢＳで５分３回洗浄した後に細胞核を（ＤＡＰＩ；Ｓｉｇｍａ社；希釈率１／１０００）で染色し、封入した。【０２１０】
図１０に、実施例１において内径２８０μｍ又は３８０μｍ、幅６０μｍの環状細胞接着部を備える細胞培養基材上で培養し形成された組織の、抗ＣＤＸ２抗体、抗Ｖｉｌｌｉｎ抗体及びＤＡＰＩによる染色の結果を示す。図１０に示す結果は、実施例１で形成された組織が、細胞核がＣＤＸ２陽性かつ上皮がＶｉｌｌｉｎ陽性な、絨毛層を有する腸管上皮組織を含むことを示す。図１１に、実施例１において内径３８０μｍ、幅６０μｍの環状細胞接着部を備える細胞培養基材上で培養し形成された組織の、抗平滑筋アクチン（Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ａｃｔｉｎ）抗体、抗ＰＧＰ９．５抗体及びＤＡＰＩによる染色の結果を示す。図１１に示す結果は、実施例１で形成された組織が、内胚葉由来の腸管上皮組織に加えて、中胚葉由来の平滑筋アクチン陽性な筋組織や、外胚葉由来のＰＧＰ９．５陽性な神経線維様組織を有することを示す。図１０及び図１１に示す結果は、実施例１で形成された組織が、三胚葉由来組織を含むことを示す。【０２１１】
＜実施例６＞
環状細胞接着部の適切なサイズ及び接着部の幅を検討するために下記の解析を行った。
内径と幅が異なる環状細胞接着部を備える細胞培養基材を、実施例１と同じ方法で作製し、実施例１と同じ方法でＥｄｏｍ  ｉＰＳ細胞の培養を行い、目視による評価で袋状構造を有する組織の出来具合により＋＋（袋状構造を有する組織が効率良く得られている）、＋（袋状構造を有する組織の分化は起きているが剥離が多い、或いは、組織の生成が比較例１と同等で遅い）、−（培養過程での細胞剥離や細胞増殖による被覆ができない等の理由で組織が得られない）の３段階に分類した。【０２１２】
代表的な例の観察像を図１２に示す。図１２は、各寸法の環状細胞接着部を備える細胞培養基材上での培養１８日目の観察像である。評価が「＋＋」の場合（左列）は、３週間以内に袋状構造を有する組織が剥離して回収できた。【０２１３】
結果を図１３に示す。なお図１３には、実施例１での解析結果内容も含まれている。この結果は、環状細胞接着部の内径は好ましくは１８０μｍ〜８８０μｍ、より好ましくは１８０μｍ〜６００μｍであることを示し、環状細胞接着部の幅は好ましくは３０μｍ〜４００μｍの範囲であり、より好ましくは４０μｍ〜４００μｍの範囲であり、特に好ましくは６０μｍ〜３００μｍであることを示す。【０２１４】
内径５８０μｍ、幅６０μｍの環状細胞接着部を備える細胞培養基材上での培養により得られた袋状構造を有する組織の観察像を図１４に示す。【０２１５】
＜実施例７＞
細胞接着部の形状に関して下記の検討を行った。
検討した実施例の細胞培養基材における細胞接着部の形状は図１５Ａ、図１５Ｂ、図１５Ｃ、図１５Ｄの通りである。
（１５Ａ）内寸が一辺２８０μｍ〜３００μｍの正方形で、幅５０〜６０μｍの細胞接着部
（１５Ｂ）内径２８０μｍ、幅６０μｍの環状で、周方向の１／８が欠落している、細胞接着部
（１５Ｃ）内寸が長辺６００μｍ、短辺３００μｍの長方形で、幅５０μｍの細胞接着部
（１５Ｄ）内寸が一辺６００μｍの正方形で、幅５０μｍの細胞接着部
細胞培養基材の製造方法及び細胞培養方法は実施例１に記載の通りである。【０２１６】
前記（１５Ａ）〜（１５Ｄ）の形状の細胞接着部を備える細胞培養基材を用いてＥｄｏｍ  ｉＰＳ細胞を培養した培養物の観察像を図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃ、１６Ｄにそれぞれ示す。いずれの形状の細胞接着部を備える細胞培養基材を用いた場合も、他の実施例と同様に短期間で袋状構造を有する組織が得られた。また（１５Ｂ）の、周方向の１／８が欠落した環状の細胞接着部であっても、欠落した部分が増殖した細胞に被覆されるため、全周に亘り完全な環状の細胞接着部と同様に、袋状構造を有する組織が形成された。【０２１７】
以上の結果より、細胞接着部の形状には特に制限は無く、必ずしも円形である必要はないことが分かる。また、培養によって閉鎖系になればよく、必ずしも初期パターンが閉鎖パターンでなくても良い。さらに細胞非接着部を囲う長方形の形状の細胞接着部でも同様に腸構造物が得られたことから、細胞接着部で囲われる細胞非接着部は、縦横の長さが等しくなくても良く、細胞接着部で囲われる細胞非接着部が例えば楕円や半円形状であってもよいことが示唆された。【０２１８】
＜実施例８＞
実施例１では細胞非接着部をポリエチレングリコールの被覆により形成した。本実施例では、ポリエチレングリコールの代わりに他の化合物を用いて同様の効果が得られるかを検討した。そこで、内径２８０μｍ又は３８０μｍ、幅６０μｍの複数の環状細胞接着部を備える細胞培養基材を以下の方法で作製した。【０２１９】
基材としてガラス（１７０μｍ厚）を１２５ｍｍ四方に切り出し、前洗浄としてアルカリ洗浄液であるパーケム（パーカーコーポレーション社、ＰＫ−ＬＣＧ２３）で４８時間以上浸漬し、純水でリンスした。その後、窒素雰囲気中で真空紫外線（１７２ｎｍ）を６分照射した。次に、環状パターンの形成プロセスとして、前記洗浄したガラス基材上に感光性ドライフィルムレジスト（ニチゴー・モートン社、ＮＩＴ９１５）を１００℃のホットプレー上でラミネートし、５分間加熱保持した。その後、上記寸法の環状パターンと同寸法の開口を有するフォトマスクを介してＵＶ光（ブロードバンド）を２００ｍＪ照射した。炭酸ナトリウム水溶液で２分処理することによりレジストでのパターンを形成し、１００℃で５分のベーク後に１８０℃５分のステップベークを行った。この状態で、１５ｍｍ×２５ｍｍ四方に切り出し、別途９９．５％エタノールに０．５ｗｔ％Ｌｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標、日油株式会社）を溶解させた溶液を準備し、これを、切り出した前記基材上に２００μｌ程度キャストコートにより被覆した。一日間の自然乾燥後、ＡＺリムーバー１００（東京応化社）中に５分間超音波を印加した状態で前記基材を浸漬し、レジストを除去後、リンスを行った。最後に、ＥＯＧ滅菌処理を２２時間行った。こうして、ガラス基材の表面が露出した内径２８０μｍ又は３８０μｍ、幅６０μｍの複数の環状細胞接着部と、環状細胞接着部の内側及び外側の、ガラス基材の表面がＬｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）で被覆された細胞非接着部とを有する基材を得た。この実施例での細胞培養基材は、実施例１と同様に図１（Ｂ）に示すような断面構造を有する。【０２２０】
前記基材を実施例１と同じく１５ｍｍ×２５ｍｍサイズに切断しｉＰＳ細胞を播種して検討した。【０２２１】
なお、前記基材上の細胞非接着部を形成するＬｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）の被膜の膜厚を段差計で測定したところ、平均２８８ｎｍであった。【０２２２】
図１７に各基材上での培養物の培養１日目、７日目、１１日目の観察像を示す。なお培養１日目と７日目の観察像の拡大倍率は、培養１１日目の観察像よりも高倍率である。図１８に、３週間培養した後に得られた袋状構造を有する組織を示す。【０２２３】
実施例１等では、細胞接着を抑制する化合物であるポリエチレングリコールにより基材表面を被覆して細胞非接着部とした。本実験の結果は、細胞接着を抑制する化合物として、ポリエチレングリコール以外の物質を用いた場合でも、ポリエチレングリコールと同様に細胞非接着部を形成することができることを示す。【０２２４】
＜実施例９＞
環状細胞接着部を備える細胞培養基材上での細胞培養により得られた組織の特徴を解析した。【０２２５】
細胞接着部として、内径１８０μｍ幅６０μｍの環状パターン、内径２８０μｍ幅６０μｍの環状パターン、内径３８０μｍ幅６０μｍの環状パターン、内径６００μｍ幅１００μｍの環状パターン、内径６００μｍ幅２００μｍの環状パターン、内径８００μｍ幅１００μｍの環状パターン、内径８００μｍ幅２００μｍの環状パターンを備え実施例１に記載の手順で作製した細胞培養基材を実施例の基材として用いた。これらの基材を用い実施例１と同様の手順でＥｄｏｍ  ｉＰＳ細胞を培養し、２〜４週間の接着培養の後に、細胞培養基材上に接着した組織に培地を吹きかけて強制的に剥離し、剥離後更に浮遊培養を１〜３週間行った組織を以下の解析に用いた。【０２２６】
比較のために、上記の比較例１（直径１５００μｍの円形の複数の細胞接着部を備える細胞培養基材を用いた）で得られた組織を同様に解析した（比較例１とする）。更に比較のために、細胞接着部として内径６００μｍ幅１００μｍの環状細胞接着部を備え実施例１に記載の手順で作製した基材を用い実施例１と同様の手順でＥｄｏｍ  ｉＰＳ細胞を培養し、１カ月以上自然剥離することなく接着していた組織に培地を吹きかけて強制的に剥離し、剥離後更に浮遊培養を１〜２週間行った組織を同様に解析した（比較例４とする）。【０２２７】
各条件で得られた組織をＰＢＳで洗浄した後に、ＱＩＡｚｏｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）９００μｌを加えた上でホモジェナイザーにより組織を溶解させた。次にＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）及びクロロホルム（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ社）を用いて添付の使用説明書に従った操作によりｍＲＮＡを抽出しＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ水に懸濁した。ＲＮＡ濃度および純度をＮａｎｏｄｒｏｐにより測定した。１００〜２００ｎｇのＲＮＡおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＶ  ＶＩＬＯ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いた逆転写操作によりｃＤＮＡを作製したうえでリアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）の操作をUchida et al., JCI Insight 第2巻 e86492 2017年に記載の方法で行った。なお比較対象としてはヒト小腸（この小腸に関しては後にあるような部位の限定はされていない製品である）または十二指腸、空腸および回腸由来のｃＤＮＡ（ＢｉｏＣｈａｉｎ社）を用い、１μｌをＵｌｔｒａＰｕｒｅ  Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  Ｗａｔｅｒ（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社）２００μｌに希釈した。ここで、部位が限定されないヒト小腸由来のｃＤＮＡとしてはＰＣＲ  Ｒｅａｄｙ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  −  Ｈｕｍａｎ  Ａｄｕｌｔ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｔｉｓｓｕｅ：Ｓｍａｌｌ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ（ＢｉｏＣｈａｉｎ社）を用い、ヒト回腸由来のｃＤＮＡとしてはＰＣＲ  Ｒｅａｄｙ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ−Ｈｕｍａｎ  Ａｄｕｌｔ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｔｉｓｓｕｅ：Ｉｌｅｕｍ（ＢｉｏＣｈａｉｎ社）を用いた。補正はＧＡＰＤＨの値により行ったうえで小腸でのＡＢＣＢ１量及びＡＢＣＧ２量の値をそれぞれ１として、各組織でのＡＢＣＢ１量及びＡＢＣＧ２量を求め、求めたＡＢＣＢ１量及びＡＢＣＧ２量から更にＡＢＣＢ１量に対するＡＢＣＧ２量の比（ＡＢＣＧ２／ＡＢＣＢ１）を求めた。また同様に補正をＧＡＰＤＨの値により行ったうえでＣＵＢＮの発現を有する回腸でのＶｉｌｌｉｎ量及びＣＵＢＮ量の値をそれぞれ１として、各組織でのＶｉｌｌｉｎ量及びＣＵＢＮ量を求め、求めたＶｉｌｌｉｎ量及びＣＵＢＮ量から更にＶｉｌｌｉｎ量に対するＣＵＢＮ量の比（ＣＵＢＮ／Ｖｉｌｌｉｎ）を求めた。【０２２８】
ここで使用したプライマーは下記の通りである。
ABCB1（フォワードプライマー）  5’-AAGGCCTAATGCCGAACACA-3’（配列番号１）
ABCB1（リバースプライマー）  5’-GTCTGGCCCTTCTTCACCTC-3’（配列番号２）
ABCG2（フォワードプライマー）  5’-GTTTATCCGTGGTGTGTCTGG-3’（配列番号３）
ABCG2（リバースプライマー）  5’-CTGAGCTATAGAGGCCTGGG-3’（配列番号４）
Villin（フォワードプライマー）5’-CGGAAAGCACCCGTATGGAG-3’（配列番号５）
Villin（リバースプライマー）5’-CGTCCACCACGCCTACATAG-3’（配列番号６）
CUBN（フォワードプライマー）5’-AATGGATGTGTGCAGCTCAG-3’（配列番号７）
CUBN（リバースプライマー）5’-GGGGTTGCTCAAACACTCAT-3’（配列番号８）
GAPDH（フォワードプライマー）  5’-CCTGCACCACCAACTGCTTA-3’（配列番号９）
GAPDH（リバースプライマー）  5’-GGCCATCCACAGTCTTCTGAG-3’（配列番号１０）【０２２９】
図１９に、各条件での、ＡＢＣＧ２／ＡＢＣＢ１比の平均値を示す。グラフ中の表記は比較例１、比較例４を除いて、環状細胞接着部の内径（単位μｍ）−幅（単位μｍ）を意味している。なお比較例１でのＡＢＣＧ２／ＡＢＣＢ１比の範囲は０．０８４〜３．６５、比較例４のＡＢＣＧ２／ＡＢＣＢ１比は０．４４であった。この結果より、本開示で得られた比較的早期に剥離した組織ではＡＢＣＢ１に対するＡＢＣＧ２の発現比率が高くなっており、Uchida et al., JCI Insight 第2巻 e86492 2017年に記載された腸オルガノイドとは性質が異なる組織が得られる事が示唆された。また、ＡＢＣＧ２／ＡＢＣＢ１比の範囲は９０より大きいことが好ましいと考えられる。【０２３０】
なお比較例４の結果より本開示のパターン基材でも長期接着培養を行えば、ＡＢＣＧ２／ＡＢＣＢ１比の低い、Uchida et al., JCI Insight 第2巻 e86492 2017年に記載された腸オルガノイドと同等の組織を得ることもできる。【０２３１】
またUchida et al., JCI Insight 第2巻 e86492 2017年の記載によるとヒトＥＳ細胞を用いて比較例１のパターンで３０日以上の長期培養した結果ではＡＢＣＢ１トランスポーターの量がＡＢＣＧ２トランスポーター量よりも高い結果であり、ＡＢＣＧ２／ＡＢＣＢ１比は１以下になることが示唆される。【０２３２】
また図２０にはＣＵＢＮ／Ｖｉｌｌｉｎの測定結果の平均値を記載している。この結果は、ＣＵＢＮ／Ｖｉｌｌｉｎの値の範囲が０．２〜１．８の範囲にあることが好ましいことを示す。なお、ＣＵＢＮ／Ｖｉｌｌｉｎの値が上記範囲にある各組織は、細胞培養基材からの剥離時期及び浮遊培養の期間が一定ではなく、２〜４週間の接着培養の後に剥離し、剥離後更に浮遊培養を１〜３週間行った組織を含んでいる。このことは、ＣＵＢＮ／Ｖｉｌｌｉｎの値が上記範囲にある組織は、接着培養の期間及び浮遊培養の期間が特定の範囲の組織には限定されないことを裏付ける。【０２３３】
＜実施例１０＞
組織における細胞密度の高い部分（凝集部）の性質変化に関して下記の解析を行った。【０２３４】
直径１５００μｍの円形の細胞接着部を有する基材を用いる上記の比較例１で得られた組織を、実施例３記載の方法に免疫染色した。使用した１次抗体は未分化性マーカーのマウスＩｇＧ標識抗Ｏｃｔ３／４抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社；希釈率１／２００）及び細胞増殖マーカーのウサギＩｇＧ標識抗Ｋｉ６７抗体（Ａｂｃａｍ社；希釈率１／５００）である。【０２３５】
結果を図２１に示す。この結果は、組織中で細胞密度の高い部分（凝集部）において未分化細胞の発現が低下していることを示唆する。【０２３６】
また容器による差の有無に関しても下記の検討を行った。
直径３．５ｃｍの細胞培養用ディッシュ（培養ディッシュ）、パターンの無いガラス基材（共に１．５ｃｍ×２．５ｃｍサイズ）（素ガラス）、直径１５００μｍの円形の細胞接着部を有する基材（パターン基材）にＥｄｏｍ  ｉＰＳ細胞を播種して実施例１と同様の方法で培養した。なお細胞密度を統一するために細胞培養用ディッシュに関しては５×１０６個の細胞を播種した。【０２３７】
上記各基材上で７日間培養した後に実施例４記載の方法に従って免疫染色を行った。ここで使用した１次抗体はマウスＩｇＧ標識抗ＣＤＸ２抗体（Ｂｉｏｇｅｎｅｘ社；希釈率１／５００）、２次抗体はＡｌｅｘａ５４６標識抗マウスＩｇＧ抗体である。細胞核はＤＡＰＩで染色した。【０２３８】
結果を図２２に示す。この結果は、基材の種類に関係なく、形成された組織中の細胞密度の高い部分（凝集部）では、ＣＤＸ２陽性な栄養外胚葉細胞が分化していることを示唆する。【０２３９】
＜実施例１１＞
実施例９の解析に関連して遺伝子学的解析を行った。
比較例１の直径１５００μｍの円形の細胞接着部を有する基材上でＥｄｏｍ  ｉＰＳ細胞を実施例１の手順で培養したときの、培養７日目の組織の観察像を図２３に示す。凝集部とは、細胞接着部に接着した組織のうち、図２３左写真の楕円で囲まれた、細胞が密集した箇所を指す。非凝集部とは、細胞接着部に接着した組織のうち、図２３右写真のように、細胞が密集していない部分を指す（図２３右写真の場合は組織の全体が非凝集部である）。培養７日目の組織から凝集部の細胞と非凝集部の細胞を、それぞれガラスキャピラリーを用いて採取した。凝集部の細胞及び非凝集部の細胞の各試料から、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてＲＮＡを取得し、ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ水に懸濁した。ＲＮＡ濃度および純度をＮａｎｏＤｒｏｐ（商標、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）により測定した。１００〜２００ｎｇのＲＮＡおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＶ  ＶＩＬＯ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いた逆転写操作によりｃＤＮＡを作製したうえでリアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）の操作をUchida et al., JCI Insight 第2巻 e86492 2017年及び実施例９記載の方法で行った。【０２４０】
ここで使用したプライマーは下記の通りである。
Oct3/4（フォワードプライマー）  5’-CGAGGAATTTGCCAAGCTCTGA-3’（配列番号１１）
Oct3/4（リバースプライマー）  5’-TTCGGGCACTGCAGGAACAAATTC-3’（配列番号１２）
GAPDH（フォワードプライマー）  5’-CCTGCACCACCAACTGCTTA-3’（配列番号９と同じ）GAPDH（リバースプライマー）  5’-GGCCATCCACAGTCTTCTGAG-3’（配列番号１０と同じ）【０２４１】
凝集部及び非凝集部の各試料について、Ｏｃｔ３／４の発現量を、ＧＡＰＤＨの発現量で補正した補正値として求めた。そして、非凝集部の試料でのＯｃｔ３／４の発現量を１としたときの、凝集部の試料のＯｃｔ３／４の発現量の相対値を求めた。【０２４２】
結果を図２４のグラフに示す。この結果は、非凝集部に対し凝集部では、未分化性マーカーであるＯｃｔ３／４遺伝子の発現が有意に低下していることを示唆する。この結果から、細胞接着部を備える基材上で多能性幹細胞を培養するとき、細胞が細胞接着部に密集して接着して形成される凝集部では、未分化マーカーのＯｃｔ３／４４遺伝子の発現が低下し、栄養外胚葉細胞になり易いことが示された。【０２４３】
なお実施例１０及び１１で観察された多能性幹細胞の培養物の凝集部の特性は、多能性幹細胞が培養時に密集して形成する凝集部に共通する特性であるため、環状細胞接着部に、多能性幹細胞が密集して形成する凝集部もまた、同様の特性を備えると考えられる。【０２４４】
＜実施例１２＞
得られた腸オルガノイド中の上皮細胞の性質を調べるため、以下の解析を行った。
実施例１と同様の方法で作製した内径５８０μｍ、幅６０μｍの環状細胞接着部を複数備えた細胞培養基材、及び、比較例１で作製した直径１５００μｍの円形の複数の細胞接着部を備えた細胞培養基材上で、Ｅｄｏｍ  ｉＰＳ細胞を、実施例１と同様で培養して袋状組織（腸オルガノイド）を作製した。得られた組織を用いて、上記実施例５記載の方法と同様に記載の方法で免疫染色を行った。抗体として、上記実施例４で用いたマウスＩｇＧ１標識抗Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ７抗体（ＫＲＴ７；Ａｂｃａｍ社  希釈率１／５００）及びウサギＩｇＧ標識抗ＣＤＸ２抗体を用いた。２次抗体も実施例４と同じものを用いて、細胞核はＤＡＰＩで染色した。【０２４５】
結果を図２５に示す。図２５から、袋状組織は上皮細胞のＣＤＸ２陽性細胞がＫＲＴ７も発現していた。さらに、この性質はパターン形状によって依存するものではなく、パターン内部で見られた凝集部に見られるＣＤＸ２陽性な栄養外胚葉細胞由来である事が示唆された。【０２４６】
＜実施例１３＞
細胞接着部のパターンを備える細胞培養基材上での培養時に形成される細胞凝集部から神経細胞が遊走するかどうか検討するために以下の解析を行った。【０２４７】
Ｅｄｏｍ  ｉＰＳ細胞を実施例１等同じ条件で培養した。ただし細胞培養基材としては、回収作業のやりやすさと凝集部と非凝集部の見分けやすさを考慮して、比較例１で用いた、直径１５００μｍの円形の細胞接着部を複数有する細胞培養基材を用いた。【０２４８】
培養開始から１週間後及び２週間後に実体顕微鏡下で培養物を観察し、形成された細胞凝集部をガラスキャピラリーにより回収し、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎによりコーティングされた直径３．５ｃｍの培養ディッシュ（ＡＧＣ社）に適当数、塊の状態で再度播種した。培地は実施例１と同じく非特許文献３記載のＸＦ  ｈＥＳＣ培養培地を用いた。その後、数日間、培養を維持した後に免疫染色による神経細胞の同定を行った。【０２４９】
染色の方法は実施例４と同じである。使用した１次抗体はマウスＩｇＧ１標識抗Ｎｅｓｔｉｎ抗体（Ｓｉｇｍａ社  希釈率１／５００）およびウサギＩｇＧ標識抗βＩＩＩ  ｔｕｂｌｉｎ抗体（Ａｂｃａｍ社  希釈率１／１０００）である。【０２５０】
培養開始から１週間後の時点で回収した凝集部を再度４日間培養した培養物の免疫染色の結果を図２９に示す。凝集部の外周部で神経マーカー陽性な細胞の存在が見られた。すなわち凝集部より神経細胞の発生が起きると考えられる。【０２５１】
培養開始から２週間後の時点で回収した凝集部を再度１日培養した培養物の免疫染色の結果を図３０に示す。この時点では遊走能が高い神経細胞が凝集部に含まれていることが示唆された。遊走能が高い神経細胞が、細胞非接着部（中央部）上に広がり被覆し得ると推定される。【０２５２】
＜実施例１４＞
細胞培養基板上で得られた細胞及び袋状の細胞構造物が、剥離せずに基板上に接着した状態で維持される条件を見出すために下記の検討を行った。
実施例１に記載の方法で作製した内径６００μｍ、幅１００μｍの環状細胞接着部を複数備える細胞培養基材を用い、実施例１と同様の条件でＥｄｏｍ  ｉＰＳ細胞の培養を行った。
培養開始から１１日目の時点で、非特許文献３記載のＸＦ  ｈＥＳＣ培地（コントロール、１１日目までと同じ）、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンを含むハンクス緩衝液（ＨＢＳＳ（＋）、ナカライテスク社）、前記ＸＦ  ｈＥＳＣ培地より栄養因子であるｂＦＧＦ、ｈｅｒｅｇｌｉｎ、ＩＧＦ−１を除いた培地（ＧＦ（−）培地）、および、前記ＸＦ  ｈＥＳＣ培地において前記栄養因子を除いた上にＸＦ−ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ＸＦ  ＣＴＳ  （ＸＦ−ＫＳＲ；  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））濃度を１％とした培地（１％ＸＦ−ＫＳＲ培地）にそれぞれ置換して培養継続し、適宜、観察した上で写真取得を行った。【０２５３】
培地を置換した後に４日間培養した時点での培養物の観察像を図３１に示し、培地を置換した後に１０日間培養した時点での培養物の観察像を図３２に示す。ＨＢＳＳ（＋）では細胞剥離が見られ不適であったのに対して、栄養因子を除去した培地（ＧＦ（−）及び１％ＸＦ−ＫＳＲ）では小さな袋状構造物及び細胞が、細胞培養基材の細胞培養部上に接着した状態で維持されていることが確認された。なおコントロールでは培養開始後３週間である図３２の段階で通常通りの大きさおよび形状での袋状構造物が見られており培養自体は正常であったと考えられる。【０２５４】
また培養を更に継続するとコントロールでは袋状の細胞構造物および付随する細胞の自然剥離が見られたのに対して、栄養因子を除去した培地（ＧＦ（−）及び１％ＸＦ−ＫＳＲ）では細胞及び袋状の細胞構造物の接着状態が維持されることが観察された。このことは、栄養因子を除去した培地中では、袋状の細胞構造物を細胞培養基材上に接着した状態で維持することができること、前記細胞構造物中での細胞や組織が維持されることを示唆する。【０２５５】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【配列表】
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