(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトフェリン又はその塩を有効成分とする経口投与剤である、不妊患者の子宮内の細菌叢改善用剤。
【請求項２】
子宮内細菌叢の乱れ又はラクトバチルス非支配的子宮内細菌叢に起因する不妊症の治療又は予防剤である、請求項１記載の剤。
【請求項３】
請求項１又は２記載の剤を含有する、不妊患者の子宮内の細菌叢改善用組成物。
【請求項４】
医薬組成物である、請求項３記載の組成物。
【請求項５】
飲食品組成物である、請求項３記載の組成物。
【請求項６】
腸溶性錠剤又は腸溶性カプセル剤の形態である、請求項３〜５のいずれか１項記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、子宮内の細菌叢を改善するための剤及び子宮内の細菌叢改善用組成物、及び子宮内細菌叢が改善又は正常化された状態の判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生殖適齢期の健康な女性の膣内には、ラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌が豊富に存在し、ラクトバチルスが生産する乳酸や抗菌物質によって、他の病原性細菌やウイルスなどが増殖できない環境が作られ、ラクトバチルスは感染症から膣を守る役割を担っていることが知られていた。【０００３】
一方、子宮内の細菌環境については、腟と空間的につながっているものの、子宮頸管から分泌される粘膜バリアの存在によって、無菌であると考えられてきた（非特許文献１）。２０００年初頭、個々の細菌に特徴的な１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子のＤＮＡ増幅法が確立され、単離された細菌のＤＮＡ配列情報で細菌を同定できるようになった。さらには、膨大なＤＮＡを一度に解析できる次世代シーケンシングテクノロジーが登場し、試料中に存在するすべての細菌に由来する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子をまとめて解析することにより、単離することなく難培養性や微量な細菌の存在を調べることが可能となった。複数の細菌によって複雑に構成される細菌コミュティは、細菌叢、マイクロバイオータ、フローラと呼ばれ、どの細菌が全体のどれぐらいの割合を占めているのかを把握できるようになった。近年になり、この次世代シーケンサーを用いた細菌叢解析によって、子宮内にも細菌叢が存在することが明らかとなった。２０１５年に米国ラトガース大学のFranasiakらは、次世代シーケンサーを用いて体外受精を行う際の子宮内細菌環境を調べ、子宮内にもラクトバチルス属細菌が多く生息していることを報告した（非特許文献２）。同年、ワシントン大学のMitchellらも、子宮内にも膣内に由来する細菌叢があり、正常な子宮内膜にはラクトバチルス属細菌が多く生息していることを報告した（非特許文献３）。【０００４】
生殖器内の細菌環境は、生殖医療において重要であり、不妊症や流産・早産又は死産を繰り返す不育症と関わることが報告されている。特に、子宮内細菌叢は、体外受精した受精卵を戻す子宮内の環境を理解するためにとても重要である。２０１６年に、スペインのMorenoらは、不妊と膣及び子宮内の細菌叢の関係を調査した。その結果、子宮内の細菌叢は着床期間中非常に安定に保たれること、また、ラクトバチルス属細菌の低下が、体外授精患者の妊娠率・妊娠継続率・出産成功率の低下と相関していることなどを報告した（非特許文献４）。同様に、２０１７年に、中国のJiaらは、女性生殖管の細菌叢を調査し、膣から輸卵管に至る生殖管で、独特な細菌叢が定着していることを報告した。膣内及び子宮内の菌は、不妊を伴う生殖器疾患と相関を示し、今後、疾患のバイオマーカーとして使える可能性が示唆されている（非特許文献５）。【０００５】
本発明者らは、膣と比べ細菌の存在量が１，０００〜１０，０００倍近く少ない子宮内細菌叢を検出するため、独自のサンプル採取方法及び解析方法を確立した（非特許文献６）。これらの方法により、健常者ボランティア７名、体外受精実施患者７９名、一般不妊患者２３名の子宮内及び腟内細菌叢を調べた結果、全体の約３０％の被験者において、腟内細菌叢と子宮内細菌叢の乖離が認められた。また、子宮内ラクトバチルス占有率は、健常者ボランティアにおいて平均９９．５０％であったのに対して、体外受精実施患者では平均６３．９０％であった。さらに、研究期間中に妊娠した１８名のラクトバチルス占有率は９６．４５％となり、妊娠群では子宮内のラクトバチルス占有率が高いことが明らかとなった。【０００６】
以上述べたように、新しい解析技術によって子宮内には腟内と異なる細菌叢が構成されることが明らかとなった。現在までに、子宮内細菌叢は、妊娠成績のほか、子宮内膜症、子宮内膜癌、子宮内膜炎、絨毛羊膜炎とも関連があることが指摘されている（非特許文献１）。子宮頚部の感染症は、子宮頚管炎と呼ばれている。一方、子宮体部の炎症は、その罹患病巣によって子宮内膜の炎症を子宮内膜炎、筋層の炎症を子宮筋層炎、漿膜の炎症を子宮周囲炎というが、大部分は子宮内膜炎である。大部分の子宮内膜炎は上行性感染であり、起炎菌としては連鎖球菌、ブドウ球菌、大腸菌、嫌気性菌などが挙げられる。妊娠期においてこれらの菌が絨毛や羊水に感染すると絨毛羊膜炎を引き起こし、早産の原因となる。このような感染は、軽度の子宮内細菌叢の乱れに起因すると考えられるので、子宮内細菌叢の改善が重要である。【０００７】
しかし、従来どおりの、膣内洗浄、抗生物質投与、ホルモン療法などの様々な処置では、子宮内環境の改善に対して十分な効果を発揮していないのが実情である。代表的抗生物質である、アンピシリン、アモキシシリンなどのペニシリン系抗菌薬は、嫌気性菌への効果が弱く、ＪＡＩＤ／ＪＳＣ感染症治療ガイドライン２０１４、サンフォードでも細菌性腟症の治療法として推奨されていない。したがって、これらの抗生物質単体ではラクトバチルスを増やす効果は低いと考えられる。また、抗菌薬治療による副作用として、稀に皮膚や肝臓などに障害が生じることも知られている。【０００８】
このように、子宮内細菌叢の乱れを正常化することによる治療法の開発の必要性が高まっているが、これまでのところ、子宮内細菌叢を改善する治療・介入方法についての報告は全く存在しない。【０００９】
ラクトフェリンは、１９３９年に牛乳中に発見された鉄結合性のタンパク質であり、その後、ウシ以外の多くの哺乳動物の乳汁中に含まれていることが判明した。ラクトフェリンは、ヒトでは母乳、特に初乳に多く含まれるが、成人においても涙、唾液、膵液その他の外分泌液や好中球に含まれている鉄結合性の生理活性タンパク質である。ラクトフェリンは、細菌の生存及び増殖に必要な鉄を奪う能力により静菌活性を有しており、また、細菌膜のリポ多糖への結合を介した細菌溶解、上皮細胞への細菌接着の阻害、宿主細胞への侵入阻害といった抗菌活性を有する（非特許文献７）。【００１０】
２０１２年、Giuntaらは、鉄欠乏症の妊婦に１日２００ｍｇのラクトフェリンを一カ月間経口投与したところ、膣内の感染症が治癒し、膣内の微生物菌叢が正常化し早産リスクが低下したことを報告した（非特許文献８）。同様に２０１４年、大槻らは、乳由来のタンパク成分の一つであるラクトフェリンが早産の予防に有効であるとの報告を行った（非特許文献９）。２０１７年の大槻らの論文によると、早産を繰り返す難治性細菌性膣炎患者の女性の膣内の細菌叢は、正常な膣内に多い乳酸菌の一種であるラクトバチルス属細菌が顕著に減少しており、ラクトフェリンを長期間経口（７００ｍｇ／日）及び膣内に直接投与することにより、ラクトバチルス属細菌が増加し、妊娠に至り、その後早産せずに出産したことが報告されている（非特許文献１０）。２０１７年、イタリアのPinoらは、細菌性膣炎の患者に、１００〜２００ｍｇのラクトフェリンを膣内投与し２週間後に細菌の検査を行ったところ、ガルドネレラ（Gardnerella）、プレボテラ（Prevotella）、及びラチノスピラ（Lachnospira）が顕著に減少し、ラクトバチルスが増加していたことを報告した（非特許文献１１）。以上により、ラクトフェリンには、ラクトバチルスに対して膣内で増殖効果を示すプレバイオティクス作用が認められおり、ラクトフェリンは細菌性膣炎の治療にも有効であることが示されている。【００１１】
このように、生理活性タンパク質であるラクトフェリンについては、腟内細菌叢を改善する効果が近年になって相次いで発表されているが、子宮内細菌叢に着目した効果は未だ知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Baker JM et al., Front Immunol. 2018 Mar 2;9:208. Uterine Microbiota: Residents, Tourists, or invaders?
【非特許文献２】Franasiak JM et al., J Assist Reprod Genet. 2016 Jan;33(1):129-36. Endometrial microbiome at the time of embryo transfer: next-generation sequencing of the 16S ribosomal subunit.
【非特許文献３】Mitchell CM et al., Am J Obstet Gynecol. 2015 May;212(5):611.e1-9. Colonization of the upper genital tract by vaginal bacterial species in nonpregnant women.
【非特許文献４】Moreno I et al., Am J Obstet Gynecol. 2016 Dec;215(6):684-703. Evidence that the endometrial microbiota has an effect on implantation success or failure.
【非特許文献５】Chen C et al., Nat Commun. 2017 Oct 17;8(1):875. The microbiota continuum along the female reproductive tract and its relation to uterine-related diseases.
【非特許文献６】Kyono K et al., Reprod Med Biol. Jul; 17(3): 297-306. Analysis of endometrial microbiota by 16S ribosomal RNA gene sequencing among infertile patients: a single-center pilot study.
【非特許文献７】Valenti P et al. Front Immunol. 2018; 9: 376. Role of Lactobacilli and Lactoferrin in the Mucosal Cervicovaginal Defense
【非特許文献８】Giunta G et al., Mol Med Rep. 2012 Jan;5(1):162-6. Influence of lactoferrin in preventing preterm delivery: a pilot study.
【非特許文献９】Otsuki et al., J Obstet Gynaecol Res. 2014 Feb;40(2):583-5. Administration of oral and vaginal prebiotic lactoferrin for a woman with a refractory vaginitis recurring preterm delivery: appearance of lactobacillus in vaginal flora followed by term delivery.
【非特許文献１０】Otsuki et al., Biochem Cell Biol. 2017 Feb;95(1):31-33. Effects of lactoferrin in 6 patients with refractory bacterial vaginosis.
【非特許文献１１】Pino A et al., Microb Ecol Health Dis. 2017; 28(1): 1357417. Bacterial biota of women with bacterial vaginosis treated with lactoferrin: an open prospective randomized trial.
【非特許文献１２】Walters, W. et al., mSystems, 2016; 1(1), e00009-15. Improved bacterial 16S rRNA gene (V4 and V4-5) and fungal internal transcribed spacer marker gene primers for microbial community surveys.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、子宮内の細菌叢の改善剤及び改善用組成物を提供することを目的とする。本発明は、さらに、子宮内の細菌叢の改善又は正常化を判定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、ラクトフェリンが子宮内細菌叢を改善することを見出し、本発明を完成した。
本発明によれば、
〔１〕  ラクトフェリン又はその塩を有効成分とする子宮内の細菌叢改善用剤；
〔２〕  ラクトフェリン又はその塩を有効成分とする、不妊症、流産、早産、不育症、子宮内膜症、子宮内膜癌、子宮頚管炎、子宮内膜炎、及び／又は絨毛羊膜炎等の子宮内の細菌叢の乱れに起因する疾患の治療又は予防剤；
〔３〕  前記〔１〕又は〔２〕記載の剤を含有する組成物；
〔４〕  医薬組成物である、前記〔３〕記載の組成物；
〔５〕  飲食品組成物である、前記〔３〕記載の組成物；
〔６〕  前記〔１〕〜〔５〕のいずれか１項記載の剤又は組成物の投与又は摂取前、投与又は摂取中、あるいは投与又は摂取後の２以上の時点で被験者の子宮内から採取された複数の検体を用いて、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の増幅に基づく細菌叢解析手法により、子宮内細菌叢におけるラクトバチルス占有率を測定する工程、及び前記複数の検体の前記占有率の差を算出する工程を含むことを特徴とする、子宮内細菌叢が改善又は正常化された状態の判定方法；
〔７〕  前記細菌叢解析手法が、１６ＳリボソームＶ４領域を増幅対象とするアンプリコンシーケンス法である、前記〔６〕記載の方法；
〔８〕  ラクトフェリン又はその塩を有効成分とする子宮内の細菌叢改善用剤又はこの剤を含有する組成物を対象に投与することを含む、子宮内細菌叢の乱れに起因する疾患の治療又は予防方法；
〔９〕  前記子宮内の細菌叢の乱れに起因する疾患が、不妊症、流産、早産、不育症、子宮内膜症、子宮内膜癌、子宮頚管炎、子宮内膜炎、及び／又は絨毛羊膜炎のいずれか１以上である、前記〔８〕記載の方法；
が提供される。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、子宮内細菌叢を正常化する有効な手段が提供される。ラクトフェリンは、母乳にも含まれる成分であって非常に安全性が高く、副作用の恐れがほとんどないため、他の医薬等との併用も容易である。また、ラクトフェリンは、食品やサプリメントの成分としても利用されており、容易に経口投与又は摂取することが可能であるため、医療機関による施術を必要とせずに、子宮内細菌叢を改善することができる。したがって、本発明の剤又は組成物により、安全に簡便に子宮内細菌叢を正常化することができる。【００１６】
本発明の子宮内細菌叢の改善又は正常化された状態の判定方法により、本発明の剤又は組成物の効果を簡便に判定することができ、本発明の剤又は組成物の投与又は摂取の継続の要否をはじめ、他の治療の追加又は変更の要否などの判断を容易に行うことができる。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の剤は、ラクトフェリン又はその塩を有効成分とする。また、本発明の組成物、たとえば医薬組成物又は飲食品組成物は、そのようなラクトフェリンを有効成分とする本発明の剤を含有する組成物である。本発明の剤、又は組成物、たとえば医薬組成物又は飲食品組成物は、子宮内細菌叢改善に有効なものである。本発明において子宮内細菌叢の改善とは、子宮内細菌叢におけるラクトバチルスの占有率を向上させることを指す。子宮内細菌叢の改善又は正常化を判定する方法については後述する。
【００１８】
ラクトフェリンは分子量が８万程度の高分子であり、２個の３価鉄イオンとキレートをつくる性質があるが、本発明において使用される「ラクトフェリン」は、哺乳動物の乳汁等から抽出される生体由来のラクトフェリンに限らず、ラクトフェリンの生物活性、特に子宮内膜細菌叢の改善作用を発揮するものであれば、いかなるラクトフェリンを用いてもよい。その例を挙げると、ヒトをはじめとする各種哺乳動物（たとえば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダなど）から得られる天然のラクトフェリン（たとえば、ウシの乳に含まれるウシラクトフェリン）、ラクトフェリンから常法によって鉄を除去したアポラクトフェリン（鉄イオンフリー型）、アポラクトフェリンに金属（鉄、銅、亜鉛、マンガンなど）イオンをキレートさせた金属飽和又は非飽和ラクトフェリン、遺伝子工学技術により生産される遺伝子組換えラクトフェリン、及びこれらのラクトフェリンにポリエチレングリコール鎖を結合させたものなどがある。なお、遺伝子組換えラクトフェリンには、改変されたラクトフェリン遺伝子に基づいて産生される組換え型ラクトフェリンのほか、トランスジェニック動物が泌乳するラクトフェリン、ラクトフェリンの活性フラグメントなどの機能的等価物も包含される。
【００１９】
本発明において使用され得るラクトフェリンの塩とは、上記のような任意のラクトフェリンの、生理学的に許容され得る塩であり、たとえばナトリウム塩、カリウム塩、硫酸塩、リン酸塩などである。
【００２０】
本発明の剤又は組成物は、上記のようなラクトフェリンの１種類のみを含んでいてもよく、又は２種類以上を含んでいてもよい。ラクトフェリンは公知の物質であるので、市販品を用いることができる。また、ラクトフェリンを含有する乳などから、公知の方法、たとえばスルホン化担体を用いてラクトフェリンを精製する方法（特開平３−１０９４００号公報）によって精製したラクトフェリンを使用することができる。さらに、用途によっては、乳などからの分画物であってラクトフェリンを高濃度で含有するもの（たとえば、乳から糖類を除去した分画物）を使用することもできる。
【００２１】
本発明の剤は、ラクトフェリンを唯一の必須成分とするが、本発明の剤又は組成物は、所望により、製薬又は食品業界で公知の種々の成分や添加剤を含んでいてもよい。本発明の医薬組成物や飲食品組成物の形態は、特に限定されない。本発明の飲食品組成物は経口投与されるものであり、その形態は、種々の、食品、食品素材、飲料、ドリンク剤などの形態であってもよい。本発明の組成物は、経口投与に便利な剤形、たとえば粉末剤、散剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であることが好ましい。
【００２２】
本発明の医薬組成物や飲食品組成物のような組成物が含んでいてもよい添加剤としては、製薬又は食品業界で日常的に使用されている賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、流動性促進剤、着色剤、香料などを挙げることができる。これらの添加剤は、所望の剤型等に応じて、適宜選択される。
【００２３】
たとえば、本発明の医薬組成物又は飲食品組成物が、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤などの形態である場合には、用いる賦形剤としては、乳糖、蔗糖、グルコース、ソルビトール、ラクチトールなどの単糖又は二糖類、コーンスターチ、ポテトスターチのような澱粉類、結晶セルロース、無機物としては軽質シリカゲル、合成珪酸アルミニウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム、リン酸水素カルシウム、二酸化ケイ素などがある。また、必要に応じ、前記賦形剤の他に、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、着色料、香料などを適宜使用することができる。
【００２４】
崩壊剤としては、澱粉類、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、カルボキシメチルセルロース・ナトリウム塩、ポリビニルピロリドンなどがある。滑沢剤としては蔗糖脂肪酸エステル、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウムなどを使用することができる。
結合剤としては、たとえば、澱粉、デキストリン、アラビアガム末、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、結晶性セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドンが挙げられる。
界面活性剤としては、大豆レシチン、蔗糖脂肪酸エステルなどが、滑沢剤としては、タルク、ロウ、蔗糖脂肪酸エステル、水素添加植物油、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウムなどが、流動性促進剤としては、無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウム、ケイ酸マグネシウムなどが、それぞれ挙げられる。
【００２５】
ラクトフェリンは高温・多湿では不安定であるため、本発明の組成物は、乾燥状態で製剤化することが好ましい。
【００２６】
ラクトフェリン粉末は通常、非常に比重が軽いためにそのまま打錠できないことから、より薬理効果の維持された安定な製剤である本発明の組成物を得るには、たとえば、有効成分と賦形剤、結合剤、崩壊剤を混合し、混合物をスラグマシンで強圧成形し薄い大きな平たい円盤をつくり、それを砕いて篩過し、一定の大きさの顆粒をそろえる。錠剤とする場合には、顆粒に滑沢剤を加えて打錠し、錠剤を所望によりコーティング皮膜で覆って製品化するのがよい。また、カプセル剤とする場合には、顆粒の一定量をカプセルに充填して、カプセル剤とするのがよい。
【００２７】
本発明の経口（医薬又は飲食品）組成物は、腸溶性の製剤としてもよい。ラクトフェリンは、胃酸酸性の状態で、胃内のタンパク分解酵素であるペプシンによって分解されることが知られており、また、ラクトフェリンの吸収作用部位は小腸を中心とする腸管に存在すると考えられている。ラクトフェリンを腸溶性製剤に加工する方法は、特に限定されない。たとえば、腸溶性とするには、胃液に対しては抵抗性があり、小腸内で溶解する基剤、たとえばシェラック、ヒドロキシプロピルメチルセルロース・フタレート、カルボキシメチルエチルセルロース、酢酸フタル酸セルロース、メタクリル酸コポリマー、水に不溶のエチルセルロース及びアミノアルキルメタアクリレートコポリマーからなる群より選択される基剤を主成分とする皮膜で腸溶性のカプセルを調製して有効成分を含む顆粒を充填するか、又は有効成分を含む顆粒に滑沢剤を加えて打錠して得た錠剤を前記の皮膜でコーティングするとよい。
【００２８】
製造された組成物が、腸溶性であるか否かは、塩化ナトリウム２．０ｇに塩酸及び水を加えて溶かし、１０００ｍｌとした第一液（ｐＨ１．２，日本薬局方・一般試験法４１）及び０．２Ｍリン酸２水素カリウム試液２５０ｍｌに０．２Ｎ水酸化ナトリウム試液１１８ｍｌ及び水を加えて１０００ｍｌとした第二液（ｐＨ６．８）を用いて崩壊性を試験することにより、確認することができる。第一液に１２０分間浸しても崩壊せず、第二液中では６０分間浸すと崩壊する錠剤又は顆粒は、胃では溶解せず、十二指腸に流入して始めて崩壊し、有効成分が溶出されるものであり、腸溶性であると判断することができる。
【００２９】
腸溶性製剤の使用以外で、ラクトフェリンを腸管まで届けることができる方法としては、脂質２重層からなるリポソーム製剤の使用が挙げられる。リポソーム製剤も、胃内で崩壊せず、小腸で胆汁により乳化、崩壊するので、ラクトフェリンを腸管の吸収部位にまで届けることができるのである。或いは、単純に胃内のｐＨを高くして、すなわちアルカリ剤を併用して、ラクトフェリンにペプシンが作用しなくなるようにする方法であってもよい。
【００３０】
本発明の剤又は組成物の投与経路は、たとえば、経口、経皮、注射、経腸、直腸内投与などである。本発明の医薬組成物及び飲食品組成物の好ましい投与経路は経口である。
【００３１】
本発明の剤又は組成物は、単独で投与してもよく、他の薬剤と併用してもよい。また、本発明の剤又は組成物を他の薬剤と併用する場合は、両者を同時に用いてもよく、前後して用いてもよい。
【００３２】
子宮内細菌叢の改善に有効な本発明の剤又は組成物の１日当たりの投与又は摂取量は、その製剤形態、投与方法、対象者の年齢及び体重などによって異なるが、ヒトでは、一般的には、有効成分として１日当たりラクトフェリンとして約０．１ｍｇ〜約５，０００ｍｇ、好ましくは約０．５ｍｇ〜約２，０００ｍｇを、最も好ましくは約１０ｍｇ〜約１，０００ｍｇを、一度に又は分割して、食前、食事後、食間及び／又は就寝前等に、投与することができる。
【００３３】
本発明の剤又は組成物は、ヒト及びヒト以外の動物、好ましくは哺乳類の対象に投与することができる。ヒト以外の動物の例としては、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジなどの家畜、及びイヌ、ネコなどのコンパニオン動物が挙げられる。投与又は摂取量は、ペット等の哺乳動物（ヒトを除く）では、ラクトフェリンとして好ましくは０．２ｍｇ〜３００ｍｇ／ｋｇ体重／日である。
【００３４】
本発明の剤又は組成物により、子宮内細菌叢が改善又は正常化されたか否かは、本発明の剤又は組成物の投与又は摂取前、投与又は摂取中、あるいは投与又は摂取後の２以上の時点で被験者の子宮内から採取した検体を用いて、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の増幅に基づく細菌叢解析手法により、子宮内細菌叢におけるラクトバチルス占有率を測定し、採取された時点の異なる複数の検体の占有率を比較してその差を算出することにより、判定することができる。
【００３５】
検体としては、子宮内から採取される試料であって、子宮内の細菌が含まれるものであればよく、採取方法も限定されないが、たとえば吸引ピペットを用いて採取した子宮内腔液などが使用される。
【００３６】
検体を採取する時点の組み合わせについては特に限定されず、１日以上のインターバルがあればよく、本発明の剤又は組成物の投与又は摂取前、投与又は摂取中、あるいは投与又は摂取後の任意の時点であることができる。２以上の時点の検体は、本発明の剤又は組成物の投与又は摂取中、あるいは投与又は摂取後の少なくとも１つの検体を含むことが好ましい。たとえば、２つの時点の検体を採取する場合、本発明の剤又は組成物の投与又は摂取前と、投与又は摂取中あるいは後；投与又は摂取中の２回の異なる時点；投与又は摂取中と、投与又は摂取後；投与又は摂取後の２回の異なる時点のいずれかであることが好ましい。
【００３７】
本発明の判定方法において使用される細菌叢解析手法は、一般に、以下の工程を含む：（１）被験者から採取した検体中のゲノムＤＮＡを抽出し、細菌由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ配列の一部又は全長を増幅させる；（２）ＤＮＡ増幅産物にアダプター配列を付与したライブラリーを作製し、次世代シーケンサーにてシーケンスを行う；（３）得られたシーケンスリードは、データ解析のソフトウェアを組みあわせて、菌の由来と検体中の占有率を推定する。
【００３８】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の増幅に基づく細菌叢解析手法としては、たとえば１６Ｓアンプリコンシーケンス法、ショットガンシーケンス法、１６Ｓ全長アンプリコンシーケンス法など、又はそれらと同等の細菌叢解析法が挙げられる。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の増幅対象領域としては、ヒト検体の１６Ｓ  ｒＲＮＡシーケンシングに一般的に使われるＶ１−Ｖ２、Ｖ３−Ｖ５、及び／又はＶ４の可変領域を使用することが好ましい。特に、生殖器に存在する菌が高感度に検出できるＶ４領域を対象としたプライマーセットを用いることが好ましく、Ｖ４領域を対象としたアンプリコンシーケンス法は、シュードモナス（Pseudomonas）、エシェリヒア（Escherichia）、サルモネラ（Salmonella）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、エンテロコッカス（Enterococcus）、リステリア（Listeria）、バチルス（Bacillus）、ガルドネレラ（Gardnerella）とビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）及び２種類の酵母を含む広範囲の微生物を検出することができるため、最も好ましい。
【００３９】
本発明に関して、子宮内細菌叢が正常化された状態は、前記のような１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の増幅に基づく細菌叢解析手法により、子宮内から採取された検体を測定した場合に、ラクトバチルス占有率が５０％以上である状態を指し、このラクトバチルス占有率は、７０％以上であることが好ましく、より好ましくは９０％以上である。同じ検体について各種方法による測定値の差が一般的な誤差の範囲を超える場合は、次世代シーケンサー（たとえば商品名「MiSeq」（Illumina K.K.））を用いた１６Ｓアンプリコンシーケンス法による細菌叢解析法により測定した値を基準とする。
【００４０】
本発明に関して、子宮内細菌叢が改善された状態とは、前記のとおりの細菌叢解析法により２つの時点で子宮内から採取された検体を測定した場合に、先に採取された検体と比較して、後に採取された検体におけるラクトバチルス占有率が増加していることを指す。
【実施例】
【００４１】
以下に、例を示して、本発明をより具体的に説明する。【００４２】
［実施例１］
本発明者らは、不妊治療クリニックを受診した４５歳以下の体外受精実施患者を対象に子宮内菌叢解析を実施し、その結果、子宮内細菌のバランスが乱れていた患者（被験者）にラクトフェリンの経口投与を行い、その効果を検討した。【００４３】
＜子宮内菌叢解析＞
子宮内菌叢解析は、基本的に非特許文献６に記載された方法に従って、以下のように実施した。被験者の子宮頸管及び子宮頸部の粘液をぬぐいとり、胚移植用カテーテル（商品名「Kitazato（登録商標） IUI catheter」(Kitazato Corporation, Japan)）を腟から子宮内へ丁寧に挿入し、検体として子宮内腔液を回収した。回収した子宮内腔液は、菌の不活化及び安定化のための保存液１ｍＬ（商品名「MMB collection tube」(DNA Genotek Inc., Canada)）に移した。【００４４】
菌ゲノムＤＮＡを抽出するため、保存液にプロテイナーゼＫ（Proteinase K）及びリゾチーム（lysozyme）を加え、菌を溶解させた。ゲノムＤＮＡは、ＤＮＡ抽出キット（商品名「Agencourt Genfind v2 Blood & Serum DNA Isolation Kit」(Beckman Coulter Inc, USA)）を用いて抽出した。抽出したＤＮＡの濃度は、商品名「Qubit dsDNA HS Assay Kit」（ThermoFisher Scientific K.K.）を用いて測定した。【００４５】
菌叢解析は、次世代シーケンサーを用いた１６Ｓアンプリコンシーケンス法によって実施した。「Earth Microbiome Project」のプロトコル（非特許文献１２）に基づき、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＶ４領域を増幅する配列とIllumina Nextera XT アダプター配列を連結したプライマーを用いて菌ＤＮＡの増幅を行った（非特許文献６）。ＰＣＲ用に２５ｎｇ／μＬのＤＮＡ、各２００μｍｏｌ／Ｌのデオキシリボヌクレオチド３リン酸、４００ｎｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５Ｕの商品名「FastStart HiFi polymerase」、２０ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ(Sigma)、０．５ｍｏｌ／Ｌ  ベタイン(Sigma)とＭｇＣｌ２を含むバッファー(Roche)の混合液を作製した。ＰＣＲはサーマルサイクラー（商品名「SimpliAmp Thermal Cycler」(Thermo Fisher)）で行い、９４℃で２分間変性させた後、９４℃で２０秒、５０℃で３０秒、７２℃で１分を３０サイクル行い、最後に７２℃で５分反応させた。ＰＣＲ産物は商品名「Agencourt AMPure XP」(Beckman Coulter Inc, USA)で精製した。次に、「Illumina 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation protocol」（https://support.illumina.com/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf）に基づき、商品名「Nextera XT Index kit」(Illumina Inc., USA)を用いてライブラリーを作製した。作製されたライブラリーは、商品名「MiSeq Reagent Kit v3」（Illumina K.K.）を用いて２×２００−ｂｐのペアエンドシーケンスにて配列決定を行った。データ解析は、「fastqQC」（ https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）を用いてシーケンス全体のクオリティチェックを行い、「USEARCH」（https://www.drive5.com/usearch/）と「QIIME」（http://qiime.org/）を用いて菌の属レベルの同定を行った。【００４６】
＜症例１＞
この被験者は、ラクトバチルス４０％、ストレプトコッカス（Streptococcus）６０％によって構成されるラクトバチルス非支配的細菌叢（Non-Lactobacillus Dominant Microbiota）が認められた。この被験者に対し、ペニシリン系抗生物質アモキシシリン７５０ｍｇ／日を７日間投与した。その後、市販のラクトフェリン製剤（商品名「ラクトフェリンＧＸ」（ＮＲＬファーマ製））を、ラクトフェリン量３００ｍｇ／日の用量で経口投与した。５０日間の継続的なラクトフェリン投与後に２回目の子宮内菌叢解析を行ったところ、ラクトバチルスが１００％に増加し、子宮内細菌叢の改善が認められた。【００４７】
アモキシシリンは嫌気性菌への効果が弱く、アモキシシリン単体ではラクトバチルスを増やす効果は低く、かえってラクトバチルスもアモキシシリンの標的になった可能性がある。したがって、ラクトフェリンを投与したことにより、子宮内においてラクトバチルスが増殖し子宮内細菌叢が改善されたと考えられる。【００４８】
＜症例２＞
この被験者は、子宮内細菌叢が極度にアンバランスであり、初回の子宮内菌叢解析の結果がラクトバチルス０．１％、ストレプトコッカス９４．７％、その他５．２％であった。この被験者に対し、アモキシシリンを７５０ｍｇ／日を１４日間投与した。アモキシシリン投与開始後５日目（初回検査後３２日目）から、症例１と同じラクトフェリン製剤を、ラクトフェリン量３００ｍｇ／日の用量で継続的に経口投与した。アモキシシリン投与終了後（初回検査後５７日目／ラクトフェリン投与開始後２５日目）に行った２回目の子宮内菌叢解析では、ストレプトコッカスが１７％に減少し、ラクトバチルスは１６．２％に増加したものの、エシェリヒア（Escherichia）などのその他の菌の増加が顕著に認められた。アモキシシリン単体での効果が認められなかったため、セフェム系抗生物質セフジニルを３００ｍｇ／日をラクトフェリン投与開始後５３日目（初回検査後８５日目）から７日間投与するとともにプロバイオティクスタンポン（商品名「Florgynal Tampon Probiotique」（Laboratoires IPRAD, Paris, France））を併用した。これらの処置の終了後はラクトフェリン製剤の投与のみを継続し、その結果、初回検査から１１９日目に実施した３回目の検査では、ラクトバチルスは９８．１％に改善した。ラクトフェリン製剤の投与は、ラクトフェリン量３００ｍｇ／日の用量で１４２日間継続した。この被験者は、その後自然妊娠した。【００４９】
したがって、ラクトフェリンは、子宮内細菌叢のアンバランスを改善することができ、子宮内菌叢の乱れに起因する諸問題を予防又は改善する効果を示すことができることがわかった。また、この試験の実施中、副作用に関する報告はなかった。したがって、この方法及び使用したラクトフェリン製剤は、安全性が高いといえる。【００５０】
［実施例２］  ラクトフェリン錠の製造
牛乳から抽出したラクトフェリン原末（タンパク質として純度９５％以上；蛋白質中のラクトフェリンは９０％以上）２０ｋｇに、乳糖１８．５ｋｇ、結晶セルロース（商品名「アビセル」）１９．７ｋｇ、カルボキシメチルセルロース・カルシウム塩１．２ｋｇ、ショ糖脂肪酸エステル０．６ｋｇを加え、得られた混合物をミキサーで粉砕し、１００メッシュを通過する粉末とした。この混合粉末を打錠機により打錠して、長径９ｍｍ、重量３００ｍｇの錠剤とした。１錠中には、ラクトフェリン原末１００ｍｇが含有されている。【００５１】
［実施例３］  腸溶性ラクトフェリン錠の製造（その１）
コーティング機（フロイント産業（株）製、ハイコーターＨＣＴ−４８Ｎ）に、実施例１で製造した錠剤を入れた。この錠剤に、シェラック９．６質量％、Ｌ−アルギニン１．５質量％、ソルビトール１．９質量％、ショ糖脂肪酸エステル２．４質量％、エタノール４．８質量％、精製水７９．８％よりなる腸溶性コーティング液を噴霧し、対錠剤比で８〜９質量％の腸溶性コーティングを施して製品とした。【００５２】
［実施例４］  腸溶性ラクトフェリン錠の製造（その２）コーティング機（フロイント産業（株）製、ハイコーターＨＣＴ−４８Ｎ）に、実施例１で製造した錠剤を入れた。この錠剤に、カルボキシメチルセルロース９質量％、グリセリン脂肪酸エステル１質量％、エタノール４５質量％、塩化メチレン４５質量％よりなる腸溶性コーティング液を噴霧し、対錠剤比で１２質量％の腸溶性コーティングを施して製品とした。【００５３】
［実施例５］  腸溶性ラクトフェリン錠の製造（その３）
コーティング機（フロイント産業（株）製、ハイコーターＨＣＴ−４８Ｎ）に、実施例１で製造した錠剤を入れた。この錠剤に、トウモロコシ穀粒から得られる蛋白質であるゼイン８質量部、グリセリン２質量部を、７０質量％エタノール水溶液１５０質量部に溶解してなる腸溶性コーティング液を噴霧し、対錠剤比で１０質量％のコーティングが施されてなる錠剤を得た。【００５４】
［実施例６］  腸溶性ラクトフェリン錠の製造（その４）
コーティング機（フロイント産業（株）製、ハイコーターＨＣＴ−４８Ｎ）に、実施例１で製造した錠剤を入れた。この錠剤に、セラック３０質量部、ヒマシ油７質量部をイソプロパノール６３質量部に溶解してなる腸溶性コーティング液を噴霧し、対錠剤比で１０質量％のコーティングが施されてなる錠剤を得た。【００５５】
この出願は、平成３０年９月２０日出願の日本特許出願、特願２０１８−１７６４７３に基づくものであり、特願２０１８−１７６４７３の明細書及び特許請求の範囲に記載された内容は、すべてこの出願明細書に包含される。