(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む早老症の予防または治療用薬学組成物：
【化１】
0006826674.tif 000016
【請求項２】
前記早老症は、ウェルナー症候群及びハッチンソン・ギルフォード症侯群からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の早老症の予防または治療用薬学組成物。
【請求項３】
前記化学式１で表される化合物及びその薬学的に許容可能な塩は、プロジェリンとラミンＡとの結合を抑制することを特徴とする請求項１に記載の早老症の予防または治療用薬学組成物。
【請求項４】
下記化学式２で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含むしわの予防または改善用化粧料組成物：
【化２】
0006826674.tif 000017
【請求項５】
前記化学式２で表される化合物及びその薬学的に許容可能な塩は、ケラチン細胞及び線維芽細胞でコラーゲン生成を向上させることを特徴とする請求項４に記載のしわの予防または改善用化粧料組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なデクルシン誘導体及びそれを有効成分として含有する老化関連疾患の予防または治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
人間の寿命が増加するにつれて、老化の進行過程についての関心が活発に提起されているが、いまだに明確に明らかになっていない部分が多く、最近、研究は、主にヒト早老症を対象にして遺伝的または分子的な老化メカニズムに対してなされている。
【０００３】
早老症またはハッチンソン・ギルフォード症侯群（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｇｉｌｆｏｒｄ  ｐｒｏｇｒｉａ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＨＧＰＳ）は、子供に早期老化現象が表われる致命的であり、珍しい遺伝疾患であって、早老症を有した小児の場合、初期幼児期には、正常な形状を示すが、約９〜２４ヶ月になると、深刻な成長遅延を示し始めて、結局、背が小さく、体重が少ない態様を示す。特徴的な顔型を有しており、全身アテローム硬化症、心血関係疾患、脳卒中、股関節脱臼などが表われ、皮下脂肪層が損失され、指爪の欠陥、関節の硬質、骨格損傷などが表われる。このような早老症小児患者は、心臓疾患によって、通常８〜２１歳に死亡し、平均寿命が１３歳程度である。
【０００４】
ＨＧＰＳは、非常に珍しい常染色体優性遺伝的疾病であって、ラミンＡ（Ｌａｍｉｎ  Ａ、ＬＭＮＡ）のＧ６０８Ｇの沈黙突然変異によって発生する。前記突然変異は、新たな切断ドナーサイトを生成し、ラミンＡのＣ末端ドメインの５０個のアミノ酸が欠失した選択的な切断部位産物であるプロジェリン（Ｐｒｏｇｅｒｉｎ、Ｐｒｇ）を生産する。
【０００５】
プロジェリンの発現は、核膜不規則性または核−細胞質ラミンＡの減少のような形態学的な変化を誘発し、プロジェリンの発現を阻害する場合、核変形の減少が誘発されるので、ＨＧＰＳの主要因子として確認された。
【０００６】
これにより、早老症治療方法でプロジェリンのファルネシル化（ｆａｒｎｅｓｙｌａｔｉｏｎ）を阻害させるか、自己捕食（ａｕｔｏｐｈａｇｅ）を用いてファルネシル化されたラミンＡを除去して、プロジェリンを緩和させる方法があるが、２つの場合、いずれも副作用の問題があり、現在までは早老症の根本的な治療方法に対して報告されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、プロジェリンとラミンＡとの結合を抑制する新規な化合物を提供し、該化合物を有効成分として含む組成物を早老症のような老化関連疾患の予防または治療用薬学組成物として提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、下記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【０００９】
【化１】
0006826674.tif 000002
【００１０】
本発明は、下記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する老化関連疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【００１１】
【化２】
0006826674.tif 000003
【００１２】
また、本発明は、下記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含むしわの予防または改善用化粧料組成物を提供する。
【００１３】
【化３】
0006826674.tif 000004
【発明の効果】
【００１４】
本発明による新規な化合物は、早老症が誘導された細胞及び動物モデルで優れたプロジェリン発現及びプロジェリンとラミンＡとの結合抑制効果を示し、特に、経口投与で腹腔内注射と類似したレベルでプロジェリンとラミンＡとの結合抑制効果及び早老症が誘導された動物モデルの生存期間を延長させると確認されることによって、本発明の化合物は、ハッチンソン・ギルフォード症侯群（ＨＧＰＳ）及びウェルナー症候群（ｗｅｒｎｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）のような老化関連疾患の治療に効果的に使われ、本発明の新規な化合物が、皮膚細胞のコラーゲン生成を増加させると確認されることによって、しわの予防または改善用化粧料組成物で提供されうる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】プロジェリン−ラミンＡの結合抑制効果を確認した結果であって、図１の（Ａ）は、ＪＨ４の生体内ＰＫ分析結果であって、ＪＨ４が腹腔内注射されたプロゲリアモデルマウスで老化表現型抑制が確認されたが、ＰＯ処理時に、非常に迅速に消えることが確認された結果である。図１の（Ｂ）は、ＪＨ４誘導体形成を示す模式図であって、生体内で迅速に分解されることを抑制するために、側鎖をアミノ結合（ＪＨ０１０）またはエーテル結合（ＳＬＣ−Ｄ０１１）に代替して合成されたＪＨ４誘導体化合物を確認した結果である。図１の（Ｃ）は、ＪＨ４誘導体がラミンＡ（ＬＭＮＡ）及びプロジェリン相互作用を抑制する効果を確認した結果であって、ビーズが結合されたＬＭＮＡをＧＦＰ−プロジェリンに形質転換された２９３細胞溶解物とそれぞれの化合物とを共にインキュベーションして結合抑制分析を行った結果である。図１の（Ｄ）は、プロジェリン発現分析を通じてＳＬＣ−Ｄ０１１（Ｄ０１１）のプロジェリン発現抑制効果を確認した結果であって、各化合物をプロジェリンに形質転換された２９３細胞に２４時間処理し、プロジェリン発現を確認した結果、ＪＨ４またはＪＨ０１０と比較して、Ｄ０１１が明確にプロジェリン発現の抑制効果を示すことを確認した結果である。図１の（Ｅ）は、Ｄ０１１が核形態を改善し、プロジェリン発現を抑制させる効果を確認した結果であって、ＨＧＰＳ細胞（ＡＧ０３１９８、１０−ｙｅａｒ−ｏｌｄ  ｆｅｍａｌｅ；ＡＧ０３１９９；１０−ｙｅａｒ−ｏｌｄ  ｆｅｍａｌｅ）と化合物とを４８時間インキュベーションした後、プロジェリン（赤色）を染色した結果、化合物は非正常な核の形態を改善させ、特に、Ｄ０１１の改善効果に優れたことが確認された結果であり、ＤＡＰＩは、ＤＮＡを意味する。図１の（Ｆ）は、ＪＨ０１０及びＤ０１１によるＨ３Ｋ９ｍｅ３発現誘導効果を確認した免疫染色結果であって、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３抑制は、早老症細胞で非常によく知られたマーカーであり、免疫染色結果、あらゆる化合物は、ＨＧＰＳ細胞でＨ３Ｋ９ｍｅ３発現を効果的にｄｂｅｈｇする結果を示した。
【図２】ＳＬＣ−Ｄ０１１の生体内の有意的な効果を確認した結果であって、図２の（Ａ）は、ＪＨ０１０及びＳＬＣ−Ｄ０１１の生体内ＰＫ分析結果であって、２つの化合物いずれも適切なＰＫプロファイルを示し、Ｂ．Ａは、生物学的利用可能性（ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）を意味する。図２の（Ｂ）は、ＳＬＣ−Ｄ０１１のヒトＥＲＧ（ｈＥＲＧ）抑制効果を確認した結果であって、ＪＨ０１０でｈＥＲＧ抑制効果が確認されることによって、ＳＬＣ−Ｄ０１１がｈＥＲＧに及ぼす影響を確認した結果、ＳＬＣ−Ｄ０１１は、ｈＥＲＧ抑制効果が表われなかった。図２の（Ｃ）は、ＳＬＣ−Ｄ０１１がプロゲリア（ｐｒｏｇｅｒｉａ）モデルマウスであるＬｍｎａＧ６０９Ｇ／Ｇ６０９Ｇの寿命延長に及ぼす効果を確認した結果であって、平均寿命が１４．８週（最大寿命１５週）であるものと比較して、ＳＬＣ−Ｄ０１１  ２０ｍｇ／ｋｇを一週間に二回腹腔内注射した場合、１９．５週に寿命が延長されたことを確認した結果であり（最大２１週）、ＳＬＣ−Ｄ０１１は、５週齢ＬｍｎａＧ６０９Ｇ／Ｇ６０９Ｇマウスに注射された。図２の（Ｄ）は、注射された１０週齢ＬｍｎａＧ６０９Ｇ／Ｇ６０９Ｇマウスの全体形態を確認した結果であって、同じ年齢でＳＬＣ−Ｄ０１１が注射されたマウスは、対照群マウスよりもさらに大きいことが確認された。図２の（Ｅ）は、Ｌｍｎａｗｔ／Ｇ６０９Ｇマウスの寿命に及ぼすＳＬＣ−Ｄ０１１の効果を確認した結果であって、ｖｅｈｉｃｌｅ（ａｖｅ＝４４．６及びｍａｘ＝４６）及びＪＨ４（ａｖｅ＝５４及びｍａｘ＝５６）と比較して、ＳＬＣ−Ｄ０１１が注射されたグループは、平均寿命が６５週まで延長されたことを確認した結果であって、注射は、４３週齢から始める。図２の（Ｆ）は、Ｄ０１１が注射されたＬｍｎａｗｔ／Ｇ６０９Ｇマウスの全体形態であって、ｖｅｈｉｃｌｅマウスと同じ年齢にも拘らず、４５週齢Ｌｍｎａｗｔ／Ｇ６０９Ｇマウスには病弱であり、弱い形状が確認されていない。
【図３】ＳＬＣ−Ｄ０１１の経口投与が早老（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ａｇｉｎｇ）に及ぼす効果を確認した結果であって、図３の（Ａ）は、溶解度を確認した結果であって、ＳＬＣ−Ｄ０１１は、非常に疎水性を示すので、水溶液に溶解されないことが確認され（左側）、前記問題点を解決するために、既に医薬的剤型として使われている溶液で溶解度を確認した結果、オレイン（ｍｏｎｏｏｌｅｉｎ）基盤の溶液（右側）が溶解溶液として選択された。図３の（Ｂ）は、ＳＬＣ−Ｄ０１１の安定性を確認した結果であって、完全な溶解のためには、８０℃の加熱及び超音波処理段階が要求されるが、ＳＬＣ−Ｄ０１１は、ＬＣ−ＭＳ分析結果、加熱及び超音波処理にも元の化合物と同じパターンを示して、分解されないことが確認された。図３の（Ｃ）は、ＳＬＣ−Ｄ０１１の経口投与によるＬｍｎａＧ６０９Ｇ／Ｇ６０９Ｇマウスの寿命延長効果を確認した結果であって、オレイン溶液に溶解されたＳＬＣ−Ｄ０１１を５週齢マウスに毎日５０ｍｇ／ｋｇずつ経口投与した結果、ｖｅｈｉｃｌｅ（ａｖｅ＝１４．９及びｍａｘ＝１５．５）と比較して、経口投与されたグループの寿命が延長（ａｖｅ＝１９．３及びｍａｘ＝１９．５）された。図３の（Ｄ）は、ＳＬＣ−Ｄ０１１の経口投与によるＬｍｎａＧ６０９Ｇ／Ｇ６０９Ｇマウスの体重増加を確認した結果であって、ｖｅｈｉｃｌｅグループと比較して、処理されたマウスの体重が３５％増加したことを確認した。図３の（Ｅ）は、８週齢ＳＬＣ−Ｄ０１１処理されたマウスの全体形態を確認した結果であって、処理されたマウスの身体サイズがｖｅｈｉｃｌｅ−マウスよりも大きくなったことを確認した結果である。
【図４】ウェルナー症候群細胞でＳＬＣ−Ｄ０１１の早老改善効果を確認した結果であって、図４の（Ａ）は、それぞれのベクターで４８時間形質転換させたＨＧＰＳ細胞を固定した後、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３抗体で染色してＨ３Ｋ９ｍｅ３発現レベルを確認した結果であって、ヒトＷＲＮ（ｈＷＲＮ）に形質転換されたＨＧＰＳ細胞では、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３発現が確認された一方、マウスＷＲＮ（ｍＷＲＮ）に形質転換されたＨＧＰＳ細胞では、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３発現が表われなかった。図４の（Ｂ）は、プロジェリン−ＷＲＮ結合に関連したヒト特異的二重領域を確認した結果であって、ビーズが結合されたＧＳＴ  ＷＲＮ−Ｒ１（非反復的なペプチド）及びＷＲＮ−Ｒ２（重複ペプチド）をＧＦＰ−ＬｍｎＡまたはプロジェリン形質注入された２９３細胞溶解物とインキュベーションし、遠心分離して免疫沈降（ｐｕｌｌ  ｄｏｗｎ  ａｓｓａｙ）分析を行った後、結合されたＧＦＰタンパク質を確認したウェスタンブロット分析結果である。図４の（Ｃ）は、ＷＲＮ−Ｒ２がラミンＡとプロジェリンとの相互作用を抑制する効果を確認した結果であって、ビーズが結合されたＧＳＴ−プロジェリンをＧＦＰ−ラミンＡに形質転換された２９３溶解物とＷＲＮ−Ｒ１またはＲ２が存在または存在しない条件でインキュベーションした結果、組換えＷＲＮ−Ｒ２が添加されたグループでラミンＡ−プロジェリン相互作用が確実に減少したことを確認した結果である。図４の（Ｄ）は、タンパク質運搬試薬を用いてＷＲＮ−Ｒ１及びＲ２ペプチドをＨＧＰＳ細胞に２４時間挿入させた後、組換えＷＲＮ−Ｒ２ペプチドがＨ３Ｋ９ｍｅ３を誘導し、核奇形を改善した効果を確認した結果であって、ＷＲＮ−Ｒ２が運ばれた細胞でＨ３Ｋ９ｍｅ３発現が増加し、核形状が改善されたことを確認した結果である。図４の（Ｅ）は、ウェルナー症候群（ＷＳ）患者細胞でプロジェリン除去を通じるＨ３Ｋ９ｍｅ３発現誘導の有無を確認した結果であって、ＷＳ細胞をｓｉ−対照群（ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）またはｓｉ−プロジェリンで４８時間形質転換させ、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３抗体及びＤＡＰＩ（核染色）で染色した結果、ｓｉＲＮＡを用いてプロジェリンを発現抑制させたＷＳ細胞では、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３発現が誘導され、核サイズが減少した。図４の（Ｆ）は、ＳＬＣ−Ｄ０１１がＷＳ細胞の核奇形を改善させた効果を確認した結果であって、ＷＳ細胞とＳＬＣ−Ｄ０１１とを４８時間インキュベートし、ラミンＡ／Ｃ抗体及びＤＡＰＩで染色して確認した結果である。図４の（Ｇ）は、ＷＳ細胞とＳＬＣ−Ｄ０１１とを４８時間インキュベーションした後、ＩＦ染色してＷＳ細胞でＳＬＣ−Ｄ０１１によるＨ３Ｋ９ｍｅ３発現誘導効果を確認した結果であって、ＳＬＣ−Ｄ０１１処理によってＨ３Ｋ９ｍｅ３が非常に低く発現されるＷＳ細胞にＨ３Ｋ９ｍｅ３発現が明確に誘導されたことを確認した。
【図５】ヒト皮膚ケラチン細胞であるＨａＣａＴ細胞及び線維芽細胞でＳＬＣ−Ｄ０１１の効果を確認した結果であって、図５の（Ａ）は、ＨａＣａＴ細胞にＳＬＣ−Ｄ０１１を処理して２４時間インキュベーションした後、ＨａＣａＴ細胞でコラーゲン１Ａ発現量を確認したウェスタンブロット分析結果であり、図５の（Ｂ）は、正常線維芽細胞９Ｎ（ＧＭ  ０００３８、９−ｙｅａｒ−ｏｌｄ  ｆｅｍａｌｅ）及びＮ４６（ＡＧ１３２９９、４６−ｙｅａｒ−ｏｌｄ  ｍａｌｅ）にＳＬＣ−Ｄ０１１を処理して２４時間インキュベーションした後、コラーゲン１Ａ発現量を確認したウェスタンブロット分析結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、下記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を提供することができる。
【００１７】
【化４】
0006826674.tif 000005
【００１８】
本発明は、下記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する老化関連疾患の予防または治療用薬学組成物を提供することができる。
【００１９】
【化５】
0006826674.tif 000006
【００２０】
より詳細には、前記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩は、（７Ｓ）−（＋）−８，８−ジメチル−７−（３−フェニル−アリルオキシ）−７，８−ジヒドロ−６Ｈ−ピラノ［３，２−ｇ］クロメン−２−オン｛（７Ｓ）−（＋）−８，８−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−７−（３−ｐｈｅｎｙｌ−ａｌｌｙｌｏｘｙ）−７，８−ｄｉｈｙｄｒｏ−６Ｈ−ｐｙｒａｎｏ［３，２−ｇ］ｃｈｒｏｍｅｎ−２−ｏｎｅ；ＳＬＣ−Ｄ０１１）｝であり得る。
【００２１】
前記老化関連疾患は、早老症であり得る。
【００２２】
より詳細には、前記早老症は、ウェルナー症候群及びハッチンソン・ギルフォード症侯群からなる群から選択されうる。
【００２３】
前記化学式１で表される化合物及びその薬学的に許容可能な塩は、プロジェリンとラミンＡとの結合を抑制することができる。
【００２４】
本発明の一具体例において、前記薬学組成物は、通常の方法によって注射剤、顆粒剤、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、座剤、ゲル、懸濁剤、乳剤、点滴剤または液剤からなる群から選択された何れか１つの剤型を使用することができる。
【００２５】
本発明の他の具体例において、薬学組成物は、薬学組成物の製造に通常使う適切な担体、賦形剤、崩壊剤、甘味剤、被覆剤、膨張剤、潤滑剤、滑沢剤、香味剤、抗酸化剤、緩衝液、靜菌剤、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、及び潤滑剤からなる群から選択される１つ以上の添加剤をさらに含みうる。
【００２６】
具体的に、担体、賦形剤及び希釈剤は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、非晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油を使用し、経口投与のための固型製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固型製剤は、前記組成物に少なくとも１つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロースまたはラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調剤することができる。また、単純な賦形剤の以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も使用することができる。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などがあり、よく使われる単純希釈剤である水、流動パラフィンの以外に、さまざまな賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれうる。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、座剤などが含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使われる。座剤の基剤としては、ウイテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、トウイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使われる。
【００２７】
本発明の一実施例によれば、前記薬学組成物は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、腹腔内、胸骨内、経皮、鼻側内、吸入、局所、直腸、経口、眼球内または皮内経路を通じて通常の方式で対象体に投与することができる。
【００２８】
前記化学式１で表される化合物の望ましい投与量は、対象体の状態及び体重、疾患の種類及び程度、薬物形態、投与経路及び期間によって変わり、当業者によって適切に選択されうる。本発明の一実施例によれば、これに制限されるものではないが、１日投与量が０．０１〜２００ｍｇ／ｋｇ、具体的には、０．１〜２００ｍｇ／ｋｇ、より具体的には、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇであり得る。投与は、一日一回投与することもでき、数回に分けて投与することもでき、これにより、本発明の範囲が制限されるものではない。
【００２９】
本発明において、前記「対象体」は、人間を含む哺乳動物であり得るが、これら例に限定されるものではない。
【００３０】
また、本発明は、下記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含むしわの予防または改善用化粧料組成物を提供することができる。
【００３１】
【化６】
0006826674.tif 000007
【００３２】
前記化学式１で表される化合物及びその薬学的に許容可能な塩は、ケラチン細胞及び線維芽細胞でコラーゲン生成を向上させうる。
【００３３】
前記化粧料組成物は、有効成分である化学式１で表される化合物の以外に、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料及び香料のような通常の補助剤、そして、担体を含みうる。
【００３４】
前記化粧料組成物は、当業者において、通常製造される如何なる剤型にも製造可能であり、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、オイル、パウダーファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション及びスプレーなどに剤型化されうるが、これらに限定されるものではない。より詳細には、サンクリーム、柔軟化粧水、収斂化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、パック、スプレーまたはパウダーの剤型として製造可能である。
【００３５】
前記剤型が、ペースト、クリームまたはゲルである場合には、担体成分として、動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルクまたは酸化亜鉛などが用いられうる。
【００３６】
前記剤型が、パウダーまたはスプレーである場合には、担体成分として、ラクトース、タルク、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムまたはポリアミドパウダーが用いられ、特に、スプレーである場合には、さらにクロロフルオロハイドロカーボン、プロパン／ブタンまたはジメチルエーテルのような推進体を含みうる。
【００３７】
前記剤型が、溶液または乳濁液である場合には、担体成分として、溶媒、溶解化剤または乳濁化剤が用いられ、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコールまたはソルビタンの脂肪酸エステルがある。
【００３８】
前記剤型が、懸濁液である場合には、担体成分として、水、エタノールまたはプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガまたはトラガントなどが用いられうる。
【００３９】
以下、本発明の理解を助けるために、実施例を挙げて詳細に説明する。但し、下記の実施例は、本発明の内容を例示するものであり、本発明の範囲が、下記の実施例に限定されるものではない。本発明の実施例は、当業者に本発明をより完全に説明するために提供されるものである。
【００４０】
＜参考例＞物質及び装備
【００４１】
１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、ＪＮＭ−ＡＬ  ４００  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（４００ＭＨｚ、ＪＥＯＬ、Ｊａｐａｎ）を用いて測定され、融点（Ｍｅｌｔｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ）は、Ｅｌｅｃｔｒｏｔｈｅｒａｍａｌ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ  ａｐｐａｒａｔｕｓ（Ｙａｍａｃｏ  ＭＤ−Ｓ３）で、質量分析のための機器としては、ＡＰＩ  ２０００  ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＰＥ  Ｓｃｉｅｘ、Ｃａｎａｄａ）をそれぞれ使用して行った。
【００４２】
また、偏光度（Ｏｐｔｉｃａｌ  ｒｏｔａｔｉｏｎｓ）は、ＪＡＳＣＯ  ＤＩＰ−３６０  ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｄｉｇｉｔａｌ  ｐｏｌａｒｉｍｅｔｅｒで測定され、キラル物質に対する純度測定は、ＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ−６ＡＤ、Ｊａｐａｎ）、カラム（ＣＨＩＲＡＣＥＬ  ＯＤ−Ｈ  ０．４６ｃｍｘ２５ｃｍ、ＤＡＩＣＥＬ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＩＮＤ．，Ｃｏ．Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）を使用して測定した。
【００４３】
物質分離のためのシリカゲル（Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ）は、ＳｉｌｉａＦｌａｓｈ(R)Ｐ６０（ＳＩＬＩＣＹＣＬＥ、２３０〜４００ｍｅｓｈ）を使用し、薄膜ＴＬＣ板は、ＴＬＣ  ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４（ＭＥＲＣＫ）製品を使用した。
【００４４】
物質の合成に使われた溶媒と試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆｌｕｋａ、ＴＣＩ、Ｊｕｎｓｅｉ、Ｄｕｋｓａｎ  ｐｕｒｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ、ＳＫ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ及びＳＡＭＣＨＵＮ  ｃｈｅｍｉｃａｌ社からＲｅａｇｅｎｔ等級を購入して使用した。
【００４５】
＜実施例１＞エーテル型（Ｅｔｈｅｒ−ｆｏｒｍ）の（＋）−デクルシン（ｄｅｃｕｒｓｉｎ）誘導体の合成（ＳＬＣ−Ｄ０１１）
【００４６】
下記反応式１及び反応式２のような過程で（７Ｓ）−（＋）−８，８−ジメチル−７−（３−フェニル−アリルオキシ）−７，８−ジヒドロ−６Ｈ−ピラノ［３，２−ｇ］クロメン−２−オン；ＳＬＣ−Ｄ０１１）を合成した。
【００４７】
１．合成過程Ｉ
【００４８】
［反1］
【化７】
0006826674.tif 000008
【００４９】
段階（Ｉ）：１００ｍｌラウンドフラスコにトランス−ケイ皮酸（ｔｒａｎｓ−ｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ；Ｄ０１１ａ、５ｇ、３３．７ｍｍｏｌ）をメタノール（５０ｍｌ）で溶解させた後、濃縮されたＨ２ＳＯ４  ５滴を入れ、８０℃で２４時間加熱して還流させ、反応混液を室温で冷却させた後、減圧濃縮した。
【００５０】
次いで、ジクロロメタン（３００ｍｌ）と蒸留水（３００ｍｌ）とに分液して、有機層を集めて硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ）で脱水後、濾過した。
【００５１】
濾過後、得た濾液を減圧濃縮して、純粋な生成物である３−フェニル−アクリル酸，メチルエステル（３−ｐｈｅｎｙｌ−ａｃｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ，ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ；Ｄ０１１ｂ、５．３９ｇ、ｙｉｅｌｄ＝９８．５％）を得て、それを次の段階に適用した。
【００５２】
段階（II）：Ｎ２ガスが充填された５００ｍｌラウンドフラスコに３−フェニル−アクリル酸，メチルエステル（Ｄ０１１ｂ、４ｇ、２４．７ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を入れ、無水ジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）で溶解させた後、−７８℃に合わせられた低温反応器に設置した。
【００５３】
反応液に水素化ジイソブチルアルミニウム（Ｄｉｉｓｏｂｕｔｙｌａｌｕｍｍｉｎｉｕｍ  ｈｙｄｒｉｄｅ）１Ｍ溶液（ＤＩＢＡＬ−Ｈ；１Ｍ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｅｘａｎｅ、７４ｍｌ、７４．０ｍｍｏｌ、３ｅｑ）を３０分にわたって徐々に滴加した後、反応温度を０℃に高めて、１時間撹拌しながら、メタノール（２２ｍｌ）を徐々に滴加した。
【００５４】
前記反応液を室温に移して、３０分間撹拌した後、飽和ロッシェル塩水溶液（Ｒｏｃｈｅｌｌｅ´ｓ  ｓａｌｔ、８８ｍｌ）を加えた。
【００５５】
反応混合液を室温で激しく２時間撹拌し、ジクロロメタン（３００ｍｌ）と蒸留水（３００ｍｌ）とに２回分液した後、有機層を集めて硫酸ナトリウムで脱水後、濾過して、濾液を減圧濃縮した。
【００５６】
濃縮液は、シリカゲルカラム分離（ｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ：ｎ−ｈｅｘａｎｅ＝３：１）を通じて純粋な生成物３−フェニル−プロ−２−ペン−１−オル（３−ｐｈｅｎｙｌ−ｐｒｏ−２−ｐｅｎ−１−ｏｌ；Ｄ０１１ｃ、３．１ｇ、ｙｉｅｌｄ＝９３．９％、Ｒｆ＝０．３７（２：１  ｎ−ｈｅｘａｎｅ−ｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ））を得て、それを次の段階に適用した。
【００５７】
段階（III）：１００ｍｌラウンドフラスコに３−フェニル−プロ−２−ペン−１−オル（Ｄ０１１ｃ、１ｇ、７．４５ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を入れ、無水ジクロロメタンで溶解させた後、水蒸氷溶上でＰＢｒ３（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ  ｔｒｉｂｒｏｍｉｄｅ、２５３．６μl、２．６０８ｍｍｏｌ、０．３５ｅｑ）を入れ、１時間撹拌した。
【００５８】
反応混液は、濃縮した後、シリカゲルカラム分離（ｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ：ｎ−ｈｅｘａｎｅ＝１：８）を通じて純粋な生成物（３−ブロモ−プロペニル）−ベンゼン［（３−ｂｒｏｍｏ−ｐｒｏｐｅｎｙｌ）−ｂｅｎｚｅｎｅ、Ｄ００５ｄ、１．４２ｇ、ｙｉｅｌｄ＝９６．２％、Ｒｆ＝０．３４（５：１  ｎ−ｈｅｘａｎｅ−ｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ）］を得て、それを次の段階に適用した。
【００５９】
段階（IV）：Ｎ２ガス下で、１００ｍｌラウンドフラスコに（Ｓ）−（＋）−デクルシノール（ｄｅｃｕｒｓｉｎｏｌ）（ＳＬＣ−Ｂ００１、２．３３ｇ、９．４７ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ、ＤＭＦ；１０ｍｌ）で溶解し、それを−２０℃に設定された低温反応器に設置した。
【００６０】
反応混合液に（３−ブロモ−プロペニル）−ベンゼン［Ｄ００５ｄ、２．８ｇ、１４．２ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ］と硫酸ナトリウム（ＮａＨ  ６０％、７５７ｍｇ、１８．９ｍｍｏｌ、２ｅｑ）とを入れ、４時間撹拌した後、蒸留水３ｍｌを入れ、１０分後に低温反応器から取り出した後、ジクロロメタン２００ｍｌと蒸留水２００ｍｌとに２回分液し、有機層を集めて硫酸ナトリウムで脱水し、濾過した後、濾液を減圧濃縮した。
【００６１】
濃縮液は、シリカゲルカラム分離（ｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ：ｎ−ｈｅｘａｎｅ＝ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｅｌｕｔｉｏｎ  ｔｏ  １：３  ｆｒｏｍ  １：１０）して、（７Ｓ）−（＋）−８，８−ジメチル−７−（３−フェニル−アリルオキシ）−７，８−ジヒドロ−６Ｈ−ピラノ［３，２−ｇ］クロメン−２−オン；ＳＬＣ−Ｄ０１１）１．２１ｇ、（３５．３％）を得た；収率３５．３％、白色固体、ｍｐ：１４３℃、Ｒｆ＝０．３９（２：１  ｎ−ｈｅｘａｎｅ−ｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ）；［α］２５Ｄ＋１１７．６（ｃ＝１、ＣＨＣｌ３）；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δＨ  ７．５６（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．６Ｈｚ、Ｈ−４）、７．３８−７．２３（５Ｈ、ｍ、Ｈ−５’、Ｈ−６’、Ｈ−７’、Ｈ−８’、Ｈ−９’）、７．１５（１Ｈ、ｓ、Ｈ−５）、６．７６（１Ｈ、ｓ、Ｈ−１０）、６．５９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１６．０Ｈｚ、Ｈ−３’）、６．３０−６．２３（１Ｈ、ｍ、Ｈ−２’）、６．２０（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．６Ｈｚ、Ｈ−３）、４．３４（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝６．０、１２．８Ｈｚ、Ｈ−１ａ’）、４．２１（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝６．０、１２．４Ｈｚ、Ｈ−１ｂ’）、３．５９（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝５．２、７．６Ｈｚ、Ｈ−７）、３．０７（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝４．８、１６．０Ｈｚ、Ｈ−６ａ）、２．８５（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝７．２、１６．４Ｈｚ、Ｈ−６ｂ）、１．４１（３Ｈ、ｓ、ＣＨ３−８）、１．３６（３Ｈ、ｓ、ＣＨ３−８）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ａｃｅｔｏｎｅ−ｄ６）δＣ  １６１．２（Ｃ−２）、１５７．８（Ｃ−９ａ）、１５５．３（Ｃ−１０ａ）、１４４．５（Ｃ−４）、１３７．９（Ｃ−４’）、１３２．９（Ｃ−３’）、１３０．４（Ｃ−５）、１２９．６（Ｃ−６’、Ｃ−８’）、１２８．６（Ｃ−７’）、１２７．５（Ｃ−２’）、１２７．４（Ｃ−５’、Ｃ−９’）、１１８．３（Ｃ−５ａ）、１１３．７（Ｃ−３）、１１３．６（Ｃ−４ａ）、１０４．５（Ｃ−１０）、７８．８（Ｃ−７）、７６．４（Ｃ−８）、７０．８（Ｃ−１’）、２７．８（Ｃ−６）、２６．１（ＣＨ３−８）、２２．２（ＣＨ３−８）；ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝３６３［Ｍ＋Ｈ］＋．Ａｎａｌ．Ｃａｌｃ．ｆｏｒ  Ｃ２３Ｈ２２Ｏ４：Ｃ、７６．２２；Ｈ、６．１２；Ｆｏｕｎｄ：Ｃ、７６．２０；Ｈ、６．１０。
【００６２】
２．合成過程II
【００６３】
[反２]
【化８】
0006826674.tif 000009
【００６４】
段階（Ｉ）：１００ｍｌラウンドフラスコにトランス−ケイ皮酸（Ｄ０１１ａ、５ｇ、３３．７ｍｍｏｌ）をメタノール５０ｍｌに溶解させた後、濃縮されたＨ２ＳＯ４  ５滴を入れ、８０℃で２４時間加熱して還流させた。反応混液を室温で冷却させた後、減圧濃縮し、ジクロロメタン（３００ｍｌ）と蒸留水（３００ｍｌ）とに分液して、有機層を収集し、硫酸ナトリウムで脱水した後、濾過した。
【００６５】
濾過後、得た濾液を減圧濃縮して純粋な生成物である３−フェニル−アクリル酸，メチルエステル（Ｄ０１１ｂ、５．３９ｇ、ｙｉｅｌｄ＝９８．５％）を得て、前記化合物を次の段階に適用した。
【００６６】
段階（II）：Ｎ２ガスが充填された５００ｍｌラウンドフラスコに３−フェニル−アクリル酸，メチルエステル（Ｄ０１１ｂ、４ｇ、２４．７ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を入れ、無水ジクロロメタンで溶解させた後、−７８℃に合わせられた低温反応器に設置した。
【００６７】
反応液に水素化ジイソブチルアルミニウム  １Ｍ溶液（ＤＩＢＡＬ−Ｈ；１Ｍ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｅｘａｎｅ、７４ｍｌ、７４．０ｍｍｏｌ、３ｅｑ）を３０分にわたって徐々に滴加させた後、反応温度を０℃に高めて、１時間撹拌しながら、メタノール（２２ｍｌ）を徐々に滴加した。
【００６８】
反応液を室温に移して、３０分間撹拌した後、飽和ロッシェル塩水溶液（８８ｍｌ）を加えた。反応混液を室温で激しく２時間撹拌し、ジクロロメタン（３００ｍｌ）と蒸留水（３００ｍｌ）とに２回分液した。
【００６９】
有機層を集めて硫酸ナトリウムで脱水し、濾過した後、濾液を減圧濃縮した。
【００７０】
濃縮液をシリカゲルカラム分離（ｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ：ｎ−ｈｅｘａｎｅ＝３：１）して、純粋な生成物３−フェニル−プロ−２−ペン−１−オル（Ｄ０１１ｃ、３．１ｇ、ｙｉｅｌｄ＝９３．９％、Ｒｆ＝０．３７（２：１  ｎ−ｈｅｘａｎｅ−ｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ））を得て、前記化合物を次の段階に適用した。
【００７１】
段階（III）：Ｎ２ガスが充填された１００ｍｌラウンドフラスコに３−フェニル−プロ−２−ペン−１−オル（Ｄ０１１ｃ、１ｇ、７．４５ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を入れ、無水ジクロロメタンで溶解させた後、トリメチルアミン（Ｅｔ３Ｎ、１．０４ｍｌ、７．４５ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、４−ジメチルアミノピリジン（４−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ、４−ＤＭＡＰ、９２ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ、０．１ｅｑ）、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（ｄｉ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ−ｄｉｃａｒｂｏｎａｔｅ、Ｂｏｃ２Ｏ、２．５７ｍｌ、１１．１８ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を順次に添加した後、反応液を室温で２時間撹拌した。
【００７２】
反応混液を濃縮した後、シリカゲルカラム分離（ｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ：ｎ−ｈｅｘａｎｅ＝１：３０）を行って、純粋な生成物ｔｅｒｔ−ブチルシンナミルカーボネート（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ  ｃｉｎｎａｍｙｌ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ、Ｄ０１１ｄ、１．３０ｇ、ｙｉｅｌｄ＝７４．７％、Ｒｆ＝０．３２（２０：１  ｎ−ｈｅｘａｎｅ−ｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ））を得て、前記化合物を次の段階に適用した。
【００７３】
段階（IV）：１００ｍｌラウンドフラスコにｔｅｒｔ−ブチルシンナミルカーボネート（Ｄ０１１ｄ、１．４３ｇ、６．０９ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）、（Ｓ）−（＋）−デクルシノール（ＳＬＣ−Ｂ００１、１ｇ、４．０６ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を入れ、真空状態で１時間乾燥した。
【００７４】
乾燥された混合物をＮ２ガス下で無水テトラヒドロフラン（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ）で溶解させ、Ｎ２ガスを用いて溶解液を１時間バブリング（ｂｕｂｂｌｉｎｇ）した後、反応混液にテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（Ｐｄ（ＰＰｈ３）４、１８８ｍｇ、０．１６２ｍｍｏｌ、０．０４ｅｑ）を投入した後、一晩還流させた。混合液を減圧条件下で濃縮させた後、シリカゲルカラム分離（ｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ：ｎ−ｈｅｘａｎｅ＝ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｅｌｕｔｉｏｎ  ｔｏ  １：４  ｆｒｏｍ  １：８）して、化合物（７Ｓ）−（＋）−８，８−ジメチル−７−（３−フェニル−アリルオキシ）−７，８−ジヒドロ−６Ｈ−ピラノ［３，２−ｇ］クロメン−２−オン；ＳＬＣ−Ｄ０１１）１．２０ｇ（８１．３％）を得た。
【００７５】
収率８１．３％、白色固体、ｍｐ：１４３℃、Ｒｆ＝０．３９（２：１  ｎ−ｈｅｘａｎｅ−ｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ）；［α］２５Ｄ＋１１７．６（ｃ＝１、ＣＨＣｌ３）；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δＨ  ７．５６（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．６Ｈｚ、Ｈ−４）、７．３８−７．２３（５Ｈ、ｍ、Ｈ−５’、Ｈ−６’、Ｈ−７’、Ｈ−８’、Ｈ−９’）、７．１５（１Ｈ、ｓ、Ｈ−５）、６．７６（１Ｈ、ｓ、Ｈ−１０）、６．５９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１６．０Ｈｚ、Ｈ−３’）、６．３０−６．２３（１Ｈ、ｍ、Ｈ−２’）、６．２０（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．６Ｈｚ、Ｈ−３）、４．３４（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝６．０、１２．８Ｈｚ、Ｈ−１ａ’）、４．２１（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝６．０、１２．４Ｈｚ、Ｈ−１ｂ’）、３．５９（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝５．２、７．６Ｈｚ、Ｈ−７）、３．０７（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝４．８、１６．０Ｈｚ、Ｈ−６ａ）、２．８５（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝７．２、１６．４Ｈｚ、Ｈ−６ｂ）、１．４１（３Ｈ、ｓ、ＣＨ３−８）、１．３６（３Ｈ、ｓ、ＣＨ３−８）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ａｃｅｔｏｎｅ−ｄ６）δＣ  １６１．２（Ｃ−２）、１５７．８（Ｃ−９ａ）、１５５．３（Ｃ−１０ａ）、１４４．５（Ｃ−４）、１３７．９（Ｃ−４’）、１３２．９（Ｃ−３’）、１３０．４（Ｃ−５）、１２９．６（Ｃ−６’、Ｃ−８’）、１２８．６（Ｃ−７’）、１２７．５（Ｃ−２’）、１２７．４（Ｃ−５’、Ｃ−９’）、１１８．３（Ｃ−５ａ）、１１３．７（Ｃ−３）、１１３．６（Ｃ−４ａ）、１０４．５（Ｃ−１０）、７８．８（Ｃ−７）、７６．４（Ｃ−８）、７０．８（Ｃ−１’）、２７．８（Ｃ−６）、２６．１（ＣＨ３−８）、２２．２（ＣＨ３−８）；ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝３６３［Ｍ＋Ｈ］＋．Ａｎａｌ．Ｃａｌｃ．ｆｏｒ  Ｃ２３Ｈ２２Ｏ４：Ｃ、７６．２２；Ｈ、６．１２；Ｆｏｕｎｄ：Ｃ、７６．２０；Ｈ、６．１０。
【００７６】
＜実施例２＞ラミンＡ（ＬＭＮＡ）−プロジェリン結合抑制剤としてＳＬＣ−Ｄ０１１の効果確認
【００７７】
１．動物実験
【００７８】
動物実験は、大韓民国釜山国立大学で承認された動物政策によって、認証評価協会及び実験室動物管理認証機関で行われた。
【００７９】
Ｃａｒｌｏｓ  Ｌｏｐｅｚ−Ｏｔｉｎ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ  ｄｅ  Ｏｖｉｅｄｏ、Ａｓｔｕｒｉａｓ、Ｏｖｉｅｄｏ、Ｓｐａｉｎ）から提供された異型接合Ｌｍｎａ＋／Ｇ６０９Ｇの適切な交配を通じてＬｍｎａＧ６０９Ｇ／６０９Ｇマウスを発生させた。
【００８０】
ＤＭＯＳ及びＰＢＳと混合したＳＬＣ−Ｄ０１１  ２０ｍｇ／ｋｇを５週齢マウスに一週間に二回腹腔内注射した。また、オレイン基盤の溶液に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解させたＳＬＣ−Ｄ０１１を一週間に５回マウスに経口投与し、対照群マウスは、前記と同じ条件でオレイン基盤の溶液のみ投与した。
【００８１】
ＬｍｎａＧ６０９Ｇ／６０９Ｇマウスは、５週齢から投与を始め、寿命中に新鮮な化合物溶液を処理した。Ｌｍｎａ＋／Ｇ６０９Ｇマウスは、３２週齢から腹腔内処理を始めた。
【００８２】
２．細胞培養及び試薬
【００８３】
ＨＧＰＳ患者（ＡＧ０３１９８、１０−ｙｅａｒ−ｏｌｄ  ｆｅｍａｌｅ；ＡＧ０３１９９；１０−ｙｅａｒ−ｏｌｄ  ｆｅｍａｌｅ）、ＷＳ  ｐａｔｉｅｎｔｓ（ＡＧ０６３００、３７−ｙｅａｒ−ｏｌｄ  ｍａｌｅ；ＡＧ０３１４１、３０−ｙｅａｒ−ｏｌｄ  ｆｅｍａｌｅ；ＡＧ００７８０、６０−ｙｅａｒ−ｏｌｄ  ｍａｌｅ）及び対照群（ＧＭ  ０００３８、９−ｙｅａｒ−ｏｌｄ  ｆｅｍａｌｅ）のヒト線維芽細胞をＣｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｍｄｅｎ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）から得て、１５％  ＦＢＳ、２ｍＭグルタミンが含まれたＥＭＥＭ培地または抗生剤なしに２６ｍＭ  ＨＥＰＥＳが含まれたＨＥＭＥＭで保持させた。
【００８４】
ＨＥＫ２９３細胞株は、ＡＴＣＣから得て、１０％  ＦＢＳ及び１％抗生剤が含まれたＤＭＥＭ液体培地を用いて３７℃で保持された。
【００８５】
３．抗体及び試薬
【００８６】
ＧＦＰ（Ｆｕｌｌ  ｎａｍｅ；１：１０００；ｓｃ−９９９６；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；グルタチオンＳ−転移酵素（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＧＳＴ；１：５０００；ｓｃ−１３８；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；アクチン（Ａｃｔｉｎ；１：１００００；ｓｃ−４７７７８；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；ラミンＡ／Ｃ（Ｌａｍｉｎ  Ａ／Ｃ；１：１００００；ｓｃ−３７６２４８；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；プロジェリン（１：３００；ｓｃ−８１６１１；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；プロジェリン（１：３００；ａｂ６６５８７；Ａｂｃａｍ）；Ｈ３Ｋ９ｍｅ３（１；２０００；Ａｂ８８９８；Ａｂｃａｍ）のような抗体を実験に使用した。
【００８７】
４．組換えタンパク質
【００８８】
組換えタンパク質を生産するために、ＰＣＲを通じて終止コドンのアップストリームから１００ＡＡのクローニングして、組換えラミンＡ−Ｃ末端領域（Ｌａｍｉｎ  Ａ−Ｃ）及びプロジェリンＣ末端領域（Ｐｒｏｇｅｒｉｎ  Ｃ）を生産した。
【００８９】
ＷＲＮ−Ｒ１領域（ｈＷＲＮ  ４２４−４５０）及びＷＲＮ−Ｒ２領域（ｈＷＲＮ  ４２４−４７６）を類似した方法で生産した。各断片をＧＳＨ−アガロースにローディングした後、広範囲に洗浄し、２０ｍＭ還元されたグルタチオンが含有されたバッファを用いて溶出させた。
【００９０】
溶出された断片を陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨｉｔｒａｐＱ）を用いて追加精製して、下記のようなＷＲＮ−Ｒ１及びＷＲＮ−Ｒ２アミノ酸配列を得た。
【００９１】
ＷＲＮ−Ｒ１：ＨＬＳＰＮＤＮＥＮＤＴＳＹＶＩＥＳＤＥＤＥＬＥＭＥＭＬＫ
【００９２】
ＷＲＮ−Ｒ２：ＨＬＳＰＮＤＮＥＮＤＴＳＹＶＩＥＳＤＥＤＥＬＥＭＥＭＬＫ  ＨＬＳＰＮＤＮＥＮＤＴＳＹＶＩＥＳＤＥＤＥＬＥＭＥＭＬＫ
【００９３】
５．ウェスタンブロット分析
【００９４】
ＲＩＰＡを用いて全体細胞溶解物を準備した。
【００９５】
１５μｇの細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥから分離させ、ＰＶＤＦ膜上に移した。
【００９６】
膜を１次抗体と共に１時間ないし一晩４℃でインキュベーションした後、二次抗体を用いて室温で１時間反応させた。
【００９７】
ＥＣＬキット（Ｉｎｔｒｏｎ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）を使用して製造社の説明書によって、化学発光でペルオキシダーゼ活性を確認した。
【００９８】
６．タンパク質−タンパク質相互作用分析
【００９９】
タンパク質−タンパク質相互作用を分析するために、グルタチオンＳ−転移酵素（ＧＳＴ）免疫沈降（ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ）分析を行った。
【０１００】
相互作用を検出するために、ＧＳＴ−基盤融合ラミンＡ−Ｃ末端領域、プロジェリン−Ｃ末端領域、ＷＲＮ−Ｒ１領域またはＷＲＮ−Ｒ２領域をＧＦＰタギングされたプロジェリン（ＧＦＰ−Ｐｒｏｇｅｒｉｎ）及びラミンＡ（ＧＦＰ−Ｌａｍｉｎ  Ａ）が形質注入されたＨＥＫ２９３細胞溶解物と室温で３０分間インキュベーションした。
【０１０１】
次いで、ＰＢＳで１回洗浄し、沈澱された物質を収集してＳＤＳ−ＰＡＧＥから分離させた後、抗ＧＦＰ及びＧＳＴでウェスタンブロットを行った。
【０１０２】
プロジェリンとラミンＡの結合に対するＷＲＮ−Ｒ１及びＲ２の競争反応を確認するために、ＷＲＮ−Ｒ１またはＲ２組換えタンパク質が存在または存在しない条件でＧＳＴ−プロジェリンが結合されたビーズをＧＦＰ−ラミンＡが過発現された２９３溶解物とインキュベーションした。
【０１０３】
７．免疫蛍光染色及び老化特異的酸性のβ−ガラクトシダーゼ活性染色
【０１０４】
細胞をカバーガラス上に接種し、適切なベクターを形質注入した。
【０１０５】
１００％メタノールまたは１％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて４℃で１時間固定させた後、細胞をブロッキングバッファ（ＰＢＳ＋ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ−Ａｂ；１：４００）でインキュベートした。
【０１０６】
ＰＢＳで二回洗浄した後、抗ラミンＡ／Ｃ、プロジェリンまたはＨ３Ｋ９Ｍｅ３をブロッキングバッファに１：２００に希釈して、細胞と一晩インキュベートし、連続して抗ゴートＡｂ−ＦＩＴＣまたは抗ラビットＡｂ−ローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎ）が含まれたブロッキングバッファ（１：５００）を７時間インキュベーションし、核は、ＤＡＰＩで染色した。次いで、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（Ｚｅｉｓｓ  ａｎｄ  Ｌｏｇｏｓ）を用いて免疫蛍光信号を検出した。
【０１０７】
老化特異的酸性−β−ガラクトシダーゼ活性染色のために、細胞をＰＢＳ（ｐＨ７．２）で一回洗浄し、０．５％グルタルアルデヒドが含まれたＰＢＳで固定した。
【０１０８】
次いで、ＰＢＳで洗浄し、３７℃で細胞をＸ−ｇａｌ溶液で一晩染色した。
【０１０９】
８．プラズマ形質注入及びタンパク質運搬
【０１１０】
ＧＦＰ−プロジェリン及びＧＦＰ−融合ラミンＡ発現ベクターをＴ．Ｍｉｓｔｅｌｉ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ［ＮＣＩ］、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡ）から提供され、Ｍｙｃ−ヒトＷＲＮベクター及びＭｙｃ−マウスＷＲＮベクターは、Ａｄｄｇｅｎｅから購入した。
【０１１１】
ｊｅｔＰＥＩ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）及びＰＵＬＳｉｎ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ）を用いて製造社の説明書によって、形質注入を行った。
【０１１２】
ＷＲＮ−Ｒ１及びＲ２タンパク質をＨＧＰＳ細胞内に伝達するために、製造社の説明書によって、ＰＵＬＳｉｎ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ）を使用した。
【０１１３】
２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ２００μlに組換えタンパク質（２μｇ）を希釈した後、ＰＵＬＳｉｎ試薬（８μl）を添加した。前記混合物を室温で１５分間インキュベートした後、細胞を添加した。３時間後、無血清培地を１０％  ＦＢＳが含まれた培地に置き換え、４時間インキュベーションした。次いで、培地が含まれた混合物をウェルから除去し、血清が含まれた新鮮な培地を満たした。
【０１１４】
９．細胞計数
【０１１５】
奇形の核を有した細胞を計数するために、獲得された免疫蛍光イメージを使用した。ラミンＡ染色依存的に奇形と見られる核膜をランダムに選択された区域で計数し、該計数された細胞を百分率で示した。
【０１１６】
細胞増殖を測定するために、ＤＡＰＩ染色された細胞を免疫蛍光イメージで計数した。
【０１１７】
１０．化合物薬物動態学（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ；ＰＫ）の分析及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＭＥ確認
【０１１８】
薬物動態学（ＰＫ）の分析のために、ＪＨ４  ５ｍｇ／ｋｇを溶解させた１０％  ＤＭＳＯ、５％  Ｔｗｅｅｎ９０及び９５％生理食塩水溶液を腹腔内注射し、ＪＨ４  １０ｍｇ／ｋｇを溶解させた１０％  ＮＭＰ及び９０％  ＰＥＧ４００溶液を経口投与した。所定時間ごとにＪＨ４の血液濃度をＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析し、他の化合物も、同じ過程でＰＫ分析した。
【０１１９】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＭＥ研究（プラズマタンパク質結合、ＣＹＰ抑制、ミクロゾーム（ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ）安定性、プラズマ安定性及びｈＥＲＧ抑制）は、標準方法で新規薬物開発センターで行われた。
【０１２０】
１１．プロジェリン−ラミンＡ結合抑制剤としてのＳＬＣ−Ｄ０１１効果確認
【０１２１】
ハッチンソン・ギルフォード症侯群は、よく知られたプロジェリン症侯群であって、非常に珍しい遺伝疾患である。遺伝的原因としては、ラミンＡ内に一点突然変異が発生して非正常な供与部接合が表われ、これにより、Ｃ末端５０アミノ酸が内部から削除されたプロジェリンを生成する。
【０１２２】
以前の報告で、本発明の発明者は、ＨＧＰＳ細胞の核奇形は、ラミンＡとプロジェリンとの間の非常に強力な結合によることであることを確認し、ラミンＡ結合からプロジェリン抑制剤（ＪＨ４）は、ＨＧＰＳ細胞の核変形を改善させ、ｐ１６／ＩＮＫ４Ａ、ＤＮＡ−ＰＫ、及びＨ３Ｋ９ｍｅ３発現のような老化関連マーカーを回復させた。また、腹腔内注射（ｉ．ｐ）を通じるＪＨ４処理は、プロジェリンモデルマウスの寿命を約４週間延長させた。
【０１２３】
しかし、患者の条件を考慮する時、ＨＧＰＳ患者は、非常に薄い血管壁を有して、静脈内注射は適切な伝達方法ではないので、ＪＨ４の経口投与可能性を確認した。
【０１２４】
その結果、図１の（Ａ）、表１及び表２のように、静脈内注射及び経口投与されたＪＨ４は、生体内で非常に短い半減期を示し、これにより、生体内利用可能性（Ｂ．Ａ）を確認することができなかった。
【０１２５】
【表１】
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【０１２６】
【表２】
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【０１２７】
これにより、生体内で安定した化合物を得るために、ＪＨ４から多様に化合物を変形させ、ＧＳＴ−免疫沈降分析（ｐｕｌｌ  ｄｏｗｎ  ａｓｓａｙ）及びプロジェリン発現分析を行って、他の４１種のＪＨ４誘導体を確認した結果、図１の（Ｃ）のように、ＪＨ０１０及びＳＬＣ−Ｄ０１１化合物が、ＪＨ４と類似した活性を示し、図１の（Ｄ）のように、プロジェリン発現を抑制させる効果を示すと確認された。
【０１２８】
また、図１の（Ｅ）及び図１の（Ｆ）を参照すれば、ＪＨ０１０及びＳＬＣ−Ｄ０１１化合物が、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３発現を誘導し、ＨＧＰＳ細胞の核奇形を改善させた。
【０１２９】
ＰＫ分析結果でも、図２の（Ａ）のように、ＪＨ０１０及びＳＬＣ−Ｄ０１１（ｐｒｏｇｅｒｉｎｉｎ）は、生体内利用可能性（Ｂ．Ａ）をそれぞれ７０％及び６６％改善させた。
【０１３０】
しかし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＭＥ分析結果から、ＪＨ０１０化合物でｈＥＲＧイオンチャネル抑制が確認されることによって、ＳＬＣ−Ｄ０１１がｈＥＲＧイオンチャネルに及ぼす影響を確認した結果、図２の（Ｂ）のように、ＪＨ０１０と比較して、ＳＬＣ−Ｄ０１１では、深刻なｈＥＲＧ抑制が表われず、表３ないし表６のように、ＳＬＣ−Ｄ０１１化合物は、良好なプラズマ安定性とＣＹＰ抑制の適当な範囲を示すことが確認された。
【０１３１】
【表３】
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【０１３２】
【表４】
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【０１３３】
【表５】
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【０１３４】
【表６】
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【０１３５】
前記結果のように安定性が確認されたＳＬＣ−Ｄ０１１の生体内効果を確認するために、ｉ．ｐ注射した結果、図２の（Ｃ）のように、ＬａｍｎＧ６０９Ｇ／Ｇ６０９Ｇマウスの寿命が２０週まで延長され、図２の（Ｄ）のように、ＳＬＣ−Ｄ０１１処理によって身体サイズの増加及び全体形態（Ｇｒｏｓｓ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）も改善された。
【０１３６】
特に、面白いことは、Ｌａｍｎｗｔ／Ｇ６０９ＧモデルでＳＬＣ−Ｄ０１１処理によって４５から６４週までマウスの寿命が延長されたものであって、図２の（Ｅ）を参照すれば、約１０週寿命を延長させたＪＨ４と比較して、非常に向上した結果である。また、図２の（Ｆ）のように、ＳＬＣ−Ｄ０１１が処理されたマウスの毛の状態及び身体サイズのような形態が非常に改善されたことを確認することができた。
【０１３７】
前記結果から、ＳＬＣ−Ｄ０１１は、ＨＧＰＳに対する非常に優れた候補として提案される。
【０１３８】
１２．ＳＬＣ−Ｄ０１１経口投与の効果確認
【０１３９】
ＪＨ４だけではなく、ＳＬＣ−Ｄ０１１は、非常に低い水溶性が表われ、このような低い水溶性は、経口投与を通じる化合物伝達に問題になるために、ＳＬＣ−Ｄ０１１溶解率を高めうる適した溶液をスクリーニングした。
【０１４０】
その結果、図３の（Ａ）のように、オレイン基盤の溶液がＳＬＣ−Ｄ０１１を溶解させるのに有用であることを確認することができ、溶液内ＳＬＣ−Ｄ０１１は、図３の（Ｂ）のように、加熱及び超音波処理にも分解されず、安定したことを確認することができた。
【０１４１】
また、オレイン基盤の溶液は、毒性なしに腸内吸収を増加させることができるので、ＳＬＣ−Ｄ０１１搬送体として非常に適した。
【０１４２】
オレイン基盤の溶液に溶解させて、経口投与用剤型で製造されたＳＬＣ−Ｄ０１１をＬａｍｎＧ６０９Ｇ／Ｇ６０９Ｇマウスに経口投与して生体内効果を確認した結果、図３の（Ｃ）及び図３の（Ｄ）のように、ＬａｍｎＧ６０９Ｇ／Ｇ６０９Ｇマウスの寿命が４．５週まで延長され、体重増加が確認された。
【０１４３】
前記結果から、オレイン基盤のＳＬＣ−Ｄ０１１溶液が、ＨＧＰＳ治療に非常に有用であると確認された。
【０１４４】
＜実施例３＞ウェルナー症候群の治療剤としてのＳＬＣ−Ｄ０１１効果確認
【０１４５】
老化によってプロジェリン発現が増加するために、他の早老症疾患であるウェルナー症候群（ＷＳ）と正常老化モデルでも、ＳＬＣ−Ｄ０１１の効果を確認した。
【０１４６】
まず、ベルナー遺伝子（ＷＲＮ）の不足とプロゲリアとの関連性を確認した。以前の報告によれば、ＷＲＮ発現が抑制されたマウスの体重及び寿命は、野生型マウスと明らかな差が確認されず、本発明でも、やはりｍＷＲＮ−／−マウスの寿命及び体重がＬａｍｎｗｔ／Ｇ６０９Ｇマウスと差を示さないことを確認することができた。
【０１４７】
また、マウスとヒトＷＲＮとのアミノ酸配列を比較した結果、ヒトＷＲＮで特異的に反復される配列（ＷＲＮ−Ｒ２）が確認され、実際にｈＷＲＮの重複は、反復されたｃＤＮＡによって発生した。
【０１４８】
ｈＷＲＮとプロジェリンとの関連性を調査するために、ＨＧＰＳ細胞内にヒト及びマウスＷＲＮを形質注入し、核形態及びＨ３Ｋ９ｍｅ３発現を確認した。
【０１４９】
その結果、興味深くも、図４の（Ａ）のように、ただｈＷＲＮで核変形が改善され、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３発現が誘導された。また、単一及び二重反復されたアミノ酸で組換えペプチドを作り、プロジェリンとの相互作用を確認した。
【０１５０】
ＷＲＮ−Ｒ１と比較した結果、図４の（Ｂ）のように、二重ペプチドは、プロジェリンと強く結合することを確認することができ、図４の（Ｃ）のように、ＷＲＮ−Ｒ２は、プロジェリンとラミンＡとの相互作用を遮断することが確認された。
【０１５１】
前記結果から、ＷＲＮ−Ｒ２が天然プロジェリン抑制剤であることが確認されることによって、組換えＷＲＮ−Ｒ２をＨＧＰＳ細胞とＷＳ細胞とに処理した結果、図４の（Ｄ）のように、ＨＧＰＳ細胞内に組換えＷＲＮ−Ｒ２が運ばれた細胞では、核形態が正常化され、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３発現が向上したことを確認することができた。
【０１５２】
しかし、プロジェリンが除去されたＷＳ細胞でも、前記のような効果が表われることが確認されることによって、ＳＬＣ−Ｄ０１１が、ＷＳ細胞治療に適した治療剤として使われるか否かを確認するために、ＷＳ細胞にＳＬＣ−Ｄ０１１を処理した後、核形態及び細胞増殖を確認した。
【０１５３】
その結果、図４の（Ｆ）のように、ＳＬＣ−Ｄ０１１は、ＷＳ患者の細胞でＨＧＰＳと類似に核形態及び細胞増殖を改善させ、図４の（Ｇ）のように、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３の発現を誘導した。
【０１５４】
前記結果から、ＳＬＣ−Ｄ０１１は、成人早老症であるウェルナー症候群の治療にも使われうるということが確認された。
【０１５５】
＜実施例４＞ＳＬＣ−Ｄ０１１化合物の皮膚老化改善効果の確認
【０１５６】
以前実験で、ＳＬＣ−Ｄ０１１化合物が老化関連疾患に治療効果を示すと確認されることによって、ヒト皮膚ケラチン細胞であるＨａＣａＴ細胞及び線維芽細胞で化合物の影響を確認した。
【０１５７】
ヒト皮膚ケラチン細胞であるＨａＣａＴ細胞と正常線維芽細胞９Ｎ（ＧＭ  ０００３８、９−ｙｅａｒ−ｏｌｄ  ｆｅｍａｌｅ）及びＮ４６（ＡＧ１３２９９、４６−ｙｅａｒ−ｏｌｄ  ｍａｌｅ）に２または５μＭ  ＳＬＣ−Ｄ０１１を処理して、２４時間インキュベーションした後、ＨａＣａＴ細胞及び線維芽細胞でコラーゲン１Ａ発現量を確認した。
【０１５８】
その結果、図５の（Ａ）及び図５の（Ｂ）のように、ＳＬＣ−Ｄ０１１は、ヒト線維芽細胞及びケラチン細胞でコラーゲン発現を増加させる効果を示すことを確認することができた。
【０１５９】
前記結果から、ＳＬＣ−Ｄ０１１化合物は、プロジェリン−ラミンＡ結合抑制剤として適したと確認され、前記ＳＬＣ−Ｄ０１１化合物は、経口投与用として提供されて、効果的な早老症治療剤またはしわ改善用組成物として使われる。
【０１６０】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳しく記述したところ、当業者において、このような具体的な記述は、単に望ましい実施態様であり、これにより、本発明の範囲が制限されるものではないという点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、下記の特許請求の範囲とそれらの等価物とによって定義される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図５】
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