(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
透明の容器に収容された観察対象の像を結像させる結像光学系と、
前記容器および前記結像光学系の少なくとも一方を、水平面内において移動させる水平方向駆動部と、
前記水平方向駆動部を制御して、前記結像光学系の観察域を移動することにより前記容器を走査する走査制御部と、
前記容器の鉛直方向の位置を検出する少なくとも１つの変位センサを有し、前記容器に対する前記結像光学系の観察域の位置よりも該観察域の移動方向前側の位置において前記容器の鉛直方向の位置を検出する検出部と、
前記検出部によって検出された前記容器の鉛直方向の位置に応じた調整値に基づいて、
前記観察対象の像の結像位置を調整する結像位置調整部と、
前記検出部を支持する支持部材の温度を第１の温度として計測する第１の温度計測部と、
前記結像光学系を支持する支持部材の温度を第２の温度として計測する第２の温度計測部と、
前記容器の温度を第３の温度として計測する第３の温度計測部と、
前記第１の温度、前記第２の温度、および前記第３の温度に応じた前記容器の屈折率に基づいて、前記調整値を補正する補正部とを備え、
前記結像位置調整部は、前記補正された調整値により、前記観察対象の像の結像位置を調整する観察装置。
【請求項２】
前記検出部は、前記観察域の移動方向の変更に応じて、前記変位センサの位置または使用する前記変位センサを切り替える請求項１に記載の観察装置。
【請求項３】
前記容器は、複数のウェルを有するウェルプレートであり、
前記第３の温度計測部は、前記複数のウェルのそれぞれの温度を計測し、
前記補正部は、前記複数のウェルのそれぞれに応じた前記調整値を補正する請求項１または２に記載の観察装置。
【請求項４】
前記結像光学系は、前記容器内の前記観察対象の像を結像させる対物レンズを有し、
前記結像位置調整部は、前記対物レンズの鉛直方向の位置を調整することにより、前記観察対象の像の結像位置を調整し、
前記第２の温度計測部は、前記結像位置調整部を支持する支持部材の温度を計測する請求項１から３のいずれか１項に記載の観察装置。
【請求項５】
前記補正部は、前記第１の温度と前記第２の温度との温度差に基づいて、前記調整値を補正する請求項４に記載の観察装置。
【請求項６】
前記補正部は、前記第１の温度と前記調整値を補正するための第１の補正係数との関係
を規定した第１のルックアップテーブル、前記第２の温度と前記調整値を補正するための第２の補正係数との関係を規定した第２のルックアップテーブル、および前記第３の温度に応じた前記容器の屈折率を考慮した前記調整値を補正するための第３の補正係数との関係を規定した第３のルックアップテーブルを参照して、前記第１の補正係数、前記第２の補正係数および前記第３の補正係数を導出し、該第１の補正係数、該第２の補正係数および該第３の補正係数により前記調整値を補正する請求項１から５のいずれか１項に記載の観察装置。
【請求項７】
観察対象が収容された透明の容器および前記容器内の前記観察対象の像を結像させる結像光学系の少なくとも一方を水平面内において移動させ、前記結像光学系により結像された前記観察対象の画像を撮像素子により撮像する観察方法であって、
前記容器の鉛直方向の位置を検出する少なくとも１つの変位センサを有し、前記容器に対する前記結像光学系の観察域の位置よりも該観察域の移動方向前側の位置において前記容器の鉛直方向の位置を検出する検出部により、前記容器の鉛直方向の位置を検出するステップと、
前記検出部によって検出された前記容器の鉛直方向の位置に応じた調整値に基づいて、
前記観察対象の像の結像位置を調整するステップと、
前記検出部を支持する支持部材の温度を第１の温度として計測するステップと、
前記結像光学系を支持する支持部材の温度を第２の温度として計測するステップと、
前記容器の温度を第３の温度として計測するステップと、
前記第１の温度、前記第２の温度、および前記第３の温度に応じた前記容器の屈折率に基づいて、前記調整値を補正するステップとを有し、
前記結像位置を調整するステップは、前記補正された調整値により、前記観察対象の像の結像位置を調整する観察方法。
【請求項８】
観察対象が収容された透明の容器および前記容器内の前記観察対象の像を結像させる結像光学系の少なくとも一方を水平面内において移動させ、前記結像光学系により結像された前記観察対象の画像を撮像素子により撮像する手順をコンピュータに実行させる観察装置制御プログラムであって、
前記容器の鉛直方向の位置を検出する少なくとも１つの変位センサを有し、前記容器に対する前記結像光学系の観察域の位置よりも該観察域の移動方向前側の位置において前記容器の鉛直方向の位置を検出する検出部により、前記容器の鉛直方向の位置を検出する手順と、
前記検出部によって検出された前記容器の鉛直方向の位置に応じた調整値に基づいて、
前記観察対象の像の結像位置を調整する手順と、
前記検出部を支持する支持部材の温度を第１の温度として計測する手順と、
前記結像光学系を支持する支持部材の温度を第２の温度として計測する手順と、
前記容器の温度を第３の温度として計測する手順と、
前記第１の温度、前記第２の温度、および前記第３の温度に応じた前記容器の屈折率に基づいて、前記調整値を補正する手順とをコンピュータに実行させ、
前記結像位置を調整する手順は、前記補正された調整値により、前記観察対象の像の結像位置を調整する観察装置制御プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、観察対象が収容された容器と観察対象の像を結像させる結像光学系とを相対的に移動させることによって、観察対象全体の像を観察する観察装置および方法並びに観察装置制御プログラムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、ＥＳ（Embryonic Stem）細胞およびｉＰＳ（Induced Pluripotent Stem）細胞等の多能性幹細胞および分化誘導された細胞等を顕微鏡等の観察装置で撮像し、その画像の特徴を捉えることで細胞の分化状態等を判定する方法が提案されている。
【０００３】
ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞は、種々の組織の細胞に分化する能力を備えたものであり、再生医療、薬の開発、および病気の解明等において応用が可能なものとして注目されている。
【０００４】
一方、上述したように細胞を顕微鏡で撮像する際、高倍率な広視野画像を取得するため、例えばウェルプレート等の培養容器の範囲内を結像光学系の観察域によって走査し、観察域毎の画像を撮像した後、その観察域毎の画像を結合する、いわゆるタイリング撮影を行うことが提案されている。
【０００５】
このようなタイリング撮影を行う際には、観察領域毎に結像光学系の焦点位置を合わせるオートフォーカス制御を行う必要がある。このようなオートフォーカス制御を高速に行うための手法が提案されている。例えば特許文献１には、容器が設置されるステージを主走査方向および副走査方向に移動させつつ、結像光学系によりタイリング撮影を行う手法が提案されている。特許文献１に記載された手法においては、容器に対する結像光学系の観察域の位置よりも観察域の移動方向前側の位置における容器の鉛直方向の位置を変位センサを用いて検出し、検出した容器の鉛直方向の位置に基づいて、圧電素子等により対物レンズを光軸方向に移動させることによってオートフォーカス制御を行うようにしている。これにより、特許文献１に記載された手法においては、高速にオートフォーカス制御を行うことができる。
【０００６】
ところで、細胞を培養する際には温度管理が重要である。このため、観察装置においては温度管理がなされた環境で容器の撮影が行われる。しかしながら、温度調整を開始してから、観察装置内の温度が安定するまでには時間を要する。ここで、対物レンズおよび変位センサは、アルミニウムまたは真鍮等の金属製の支持部材により、装置の基台に支持されている。金属製の支持部材は温度変化により伸縮する。このため、温度調整の開始時と温度が安定した後とで、対物レンズの位置および変位センサの位置が変化することとなる。
【０００７】
細胞の構造は微小であるため、観察装置により細胞を撮像する際には、サブミクロン単位で焦点位置を合わせる必要がある。しかしながら、温度変化により対物レンズの位置および変位センサの位置が変化すると、焦点位置を正確に合わせることができなくなる。このため、細胞等の試料を観察する装置において、温度を計測し、計測した温度に応じた対物レンズの焦点位置の変動および変位センサの変動を考慮して、対物レンズの焦点位置を補正する手法が提案されている（特許文献２〜４参照）。特許文献２〜４に記載された手法を用いることにより、環境温度の変化に拘わらず、オートフォーカス制御を精度よく行うことができるため、ボケが低減された画像を取得することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１７−２０７５６７号公報
【特許文献２】特開２０１４−１９４５２１号公報
【特許文献３】特開２００７−２４８０８６号公報
【特許文献４】特開２００８−２５６９２７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ところで、対物レンズはウェルプレート等の培養容器におけるウェルの底部、すなわち観察対象とウェルトの境界面に焦点位置が合うように駆動される。ここで、ウェルプレート等の培養容器は樹脂製であることが多い。樹脂は温度の変化により屈折率が変化する。
このように容器の屈折率が変化すると、容器を透過した光の結像位置が変化する。このため、計測した温度に応じて対物レンズの焦点位置を補正しても、補正された焦点位置と容器におけるウェルの底部の位置とがずれ、その結果、撮影された画像がぼけてしまうという問題がある。
【００１０】
本開示は上記事情に鑑みなされたものであり、環境温度が変化してもボケが低減された画像を取得できるようにすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本開示による観察装置は、透明の容器に収容された観察対象の像を結像させる結像光学系と、
容器および結像光学系の少なくとも一方を、水平面内において移動させる水平方向駆動部と、
水平方向駆動部を制御して、結像光学系の観察域を移動することにより容器を走査する走査制御部と、
容器の鉛直方向の位置を検出する少なくとも１つの変位センサを有し、容器に対する結像光学系の観察域の位置よりも観察域の移動方向前側の位置において容器の鉛直方向の位置を検出する検出部と、
検出部によって検出された容器の鉛直方向の位置に応じた調整値に基づいて、観察対象の像の結像位置を調整する結像位置調整部と、
検出部を支持する支持部材の温度を第１の温度として計測する第１の温度計測部と、
結像光学系を支持する支持部材の温度を第２の温度として計測する第２の温度計測部と、
容器の温度を第３の温度として計測する第３の温度計測部と、
第１の温度、第２の温度、および第３の温度に応じた容器の屈折率に基づいて、調整値を補正する補正部とを備え、
結像位置調整部は、補正された調整値により、観察対象の像の結像位置を調整する。
【００１２】
ここで「透明」とは、すべての波長域の光を透過することのみならず、特定の波長域の光を透過することも、本開示における「透明」に含まれるものとする。また、光源については測定条件によって任意に選択することができ、白色光源の様な複数波長を含む光源を用いても良いし、特定の波長域のみの単色光源を用いても良い。さらに、ここで言う「水平面内」において容器および結像光学系の少なくとも一方を移動させるとは、容器と結像光学系との離間距離を一定に維持しつつも両者を相対移動させることを言うものである。さらに、ここで言う「容器の鉛直方向」とは、容器の水平面における法線方向を言うものである。
【００１３】
なお、本開示による観察装置においては、検出部は、観察域の移動方向の変更に応じて、変位センサの位置または使用する変位センサを切り替えるものであってもよい。
【００１４】
また、本開示による観察装置においては、容器は、複数のウェルを有するウェルプレートであり、
第３の温度計測部は、複数のウェルのそれぞれの温度を計測し、
補正部は、複数のウェルのそれぞれに応じた調整値を補正するものであってもよい。
【００１５】
また、本開示による観察装置においては、結像光学系は、容器内の観察対象の像を結像させる対物レンズを有し、
結像位置調整部は、対物レンズの鉛直方向の位置を調整することにより、観察対象の像の結像位置を調整し、
第２の温度計測部は、結像位置調整部を支持する支持部材の温度を計測するものであってもよい。
【００１６】
また、本開示による観察装置においては、補正部は、第１の温度と第２の温度との温度差に基づいて、調整値を補正するものであってもよい。
【００１７】
また、本開示による観察装置においては、補正部は、第１の温度と調整値を補正するための第１の補正係数との関係を規定した第１のルックアップテーブル、第２の温度と調整値を補正するための第２の補正係数との関係を規定した第２のルックアップテーブル、および第３の温度に応じた容器の屈折率を考慮した調整値を補正するための第３の補正係数との関係を規定した第３のルックアップテーブルを参照して、第１の補正係数、第２の補正係数および第３の補正係数を導出し、第１の補正係数、第２の補正係数および第３の補正係数により調整値を補正するものであってもよい。
【００１８】
また、本開示による観察方法においては、観察対象が収容された透明の容器および容器内の観察対象の像を結像させる結像光学系の少なくとも一方を水平面内において移動させ、結像光学系により結像された観察対象の画像を撮像素子により撮像する観察方法であって、
【００１９】
容器の鉛直方向の位置を検出する少なくとも１つの変位センサを有し、容器に対する結像光学系の観察域の位置よりも観察域の移動方向前側の位置において容器の鉛直方向の位置を検出する検出部により、容器の鉛直方向の位置を検出するステップと、
検出部によって検出された容器の鉛直方向の位置に応じた調整値に基づいて、観察対象の像の結像位置を調整するステップと、
検出部を支持する支持部材の温度を第１の温度として計測するステップと、
結像光学系を支持する支持部材の温度を第２の温度として計測するステップと、
容器の温度を第３の温度として計測するステップと、
第１の温度、第２の温度、および第３の温度に応じた容器の屈折率に基づいて、調整値を補正するステップとを有し、
結像位置を調整するステップは、補正された調整値により、観察対象の像の結像位置を調整する。
【００２０】
本開示による観察装置の制御プログラムは、観察対象が収容された透明の容器および容器内の観察対象の像を結像させる結像光学系の少なくとも一方を水平面内において移動させ、結像光学系により結像された観察対象の画像を撮像素子により撮像する手順をコンピュータに実行させる観察装置制御プログラムであって、
容器の鉛直方向の位置を検出する少なくとも１つの変位センサを有し、容器に対する結像光学系の観察域の位置よりも観察域の移動方向前側の位置において容器の鉛直方向の位置を検出する検出部により、容器の鉛直方向の位置を検出する手順と、
検出部によって検出された容器の鉛直方向の位置に応じた調整値に基づいて、観察対象の像の結像位置を調整する手順と、
検出部を支持する支持部材の温度を第１の温度として計測する手順と、
結像光学系を支持する支持部材の温度を第２の温度として計測する手順と、
容器の温度を第３の温度として計測する手順と、
第１の温度、第２の温度、および第３の温度に応じた容器の屈折率に基づいて、調整値を補正する手順とをコンピュータに実行させ、
結像位置を調整する手順は、補正された調整値により、観察対象の像の結像位置を調整する。
【００２１】
本開示による他の観察装置は、コンピュータに実行させるための命令を記憶するメモリ、および
記憶された命令を実行するよう構成されたプロセッサを備え、プロセッサは、
観察対象が収容された透明の容器および容器内の観察対象の像を結像させる結像光学系の少なくとも一方を水平面内において移動させ、結像光学系により結像された観察対象の画像を撮像素子により撮像するに際し、
容器の鉛直方向の位置を検出する少なくとも１つの変位センサを有し、容器に対する結像光学系の観察域の位置よりも観察域の移動方向前側の位置において容器の鉛直方向の位置を検出する検出部により、容器の鉛直方向の位置を検出するステップと、
検出部によって検出された容器の鉛直方向の位置に応じた調整値に基づいて、観察対象の像の結像位置を調整するステップと、
検出部を支持する支持部材の温度を第１の温度として計測するステップと、
結像光学系を支持する支持部材の温度を第２の温度として計測するステップと、
容器の温度を第３の温度として計測するステップと、
第１の温度、第２の温度、および第３の温度に応じた容器の屈折率に基づいて、調整値を補正するステップとを実行し、
結像位置を調整するステップは、補正された調整値により、観察対象の像の結像位置を調整するものである。
【発明の効果】
【００２２】
本開示によれば、環境温度が変換してもボケが低減された画像を取得することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本開示の観察装置の実施形態を用いた顕微鏡観察システムの概略構成を示す図
【図２】結像光学系の構成を示す模式図
【図３】ステージの構成を示す斜視図
【図４】本開示の観察装置の第１の実施形態を用いた顕微鏡観察システムの概略構成を示すブロック図
【図５】位置情報と調整値との関係を示す図
【図６】第１の温度と補正係数との関係を示す図
【図７】第２の温度と補正係数との関係を示す図
【図８】温度とウェルプレートを構成する材料の屈折率との関係を示す図
【図９】培養容器の底面に合焦した状態における対物レンズの光路を示す図
【図１０】厚さ補正係数の導出を説明するための図
【図１１】ウェルプレートを構成する材料と対物レンズの焦点距離との関係を示す図
【図１２】第３の温度と補正係数との関係を示す図
【図１３】培養容器内における観察域の走査位置を示す図
【図１４】培養容器内の任意の位置に観察域がある場合における結像光学系、第１の変位センサおよび第２の変位センサと、培養容器との位置関係を示す図
【図１５】第１の変位センサと第２の変位センサとの切り替えを説明するための図
【図１６】本開示の観察装置の第１の実施形態を用いた顕微鏡観察システムの作用を説明するためのフローチャート
【図１７】調整値補正処理のフローチャート
【図１８】本開示の観察装置の第２の実施形態を用いた顕微鏡観察システムの概略構成を示すブロック図
【図１９】本開示の観察装置の第２の実施形態の検出部の構成を示す図
【図２０】本開示の観察装置の第２の実施形態の検出部における変位センサの位置の切り替えを説明するための図
【図２１】第１の温度および第２の温度の差分値と補正係数との関係を示す図
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本開示の観察装置および方法並びに観察装置制御プログラムの実施形態を用いた顕微鏡観察システムについて、図面を参照しながら詳細に説明する。図１は、本実施形態の顕微鏡観察システムにおける顕微鏡装置１０の概略構成を示すブロック図である。
【００２５】
顕微鏡装置１０は、観察対象である培養された細胞の位相差画像を撮像する。具体的には、顕微鏡装置１０は、図１に示すように、白色光を出射する白色光源１１、コンデンサレンズ１２、スリット板１３、結像光学系１４、結像位置調整部１５、撮像素子１６、および検出部１８を備える。
【００２６】
スリット板１３は、白色光源１１から出射された白色光を遮光する遮光板に対して白色光を透過するリング形状のスリットが設けられたものであり、白色光がスリットを通過することによってリング状の照明光Ｌ０が形成される。
【００２７】
図２は、結像光学系１４の詳細な構成を示す図である。結像光学系１４は、図２に示すように、位相差レンズ１４ａおよび結像レンズ１４ｄを備える。位相差レンズ１４ａは、対物レンズ１４ｂおよび位相板１４ｃを備える。位相板１４ｃは、照明光Ｌ０の波長に対して透明な透明板に対して位相リングを形成したものである。なお、上述したスリット板
１３のスリットの大きさは、位相板１４ｃの位相リングと共役な関係にある。
【００２８】
位相リングは、入射された光の位相を１／４波長ずらす位相膜と、入射された光を減光する減光フィルタとがリング状に形成されたものである。位相リングに入射された直接光は、位相リングを通過することによって位相が１／４波長ずれ、かつその明るさが弱められる。一方、観察対象によって回折された回折光は大部分が位相板１４ｃの透明板を通過し、その位相および明るさは変化しない。
【００２９】
対物レンズ１４ｂを有する位相差レンズ１４ａは、図１に示す結像位置調整部１５によって、対物レンズ１４ｂの光軸方向に移動される。本実施形態においては、対物レンズ１４ｂの光軸方向とＺ方向（鉛直方向）とは同じ方向である。対物レンズ１４ｂのＺ方向への移動によってオートフォーカス制御が行われ、撮像素子１６によって撮像される位相差画像のコントラストが調整される。
【００３０】
撮像素子１６は、結像光学系１４によって結像された位相差画像を撮像する。撮像素子
１６としては、ＣＣＤ（Charge-Coupled Device）イメージセンサまたはＣＭＯＳ（Complementary Metal-Oxide Semiconductor）イメージセンサ等が用いられる。撮像素子としては、ＲＧＢ（Red Green Blue）のカラーフィルタが設けられた撮像素子を用いてもよいし、モノクロの撮像素子を用いるようにしてもよい。
【００３１】
検出部１８は、ステージ５１に設置された培養容器５０のＺ方向（鉛直方向）の位置を検出する。検出部１８は、第１の変位センサ１８ａおよび第２の変位センサ１８ｂを備える。第１の変位センサ１８ａおよび第２の変位センサ１８ｂは、結像光学系１４を挟んで、図１に示すＸ方向に並べて設けられている。本実施形態における第１の変位センサ１８ａおよび第２の変位センサ１８ｂはレーザ変位計であり、培養容器５０にレーザ光を照射し、その反射光を検出することによって、培養容器５０の底面のＺ方向の位置を検出する。なお、培養容器５０の底面とは、観察対象である細胞との境界面、すなわち観察対象設置面である。
【００３２】
なお、培養容器５０と空気の屈折率との相違により、第１および第２の変位センサ１８ａ，１８ｂが検出した培養容器５０の底面のＺ方向の位置は見かけ上の位置となり、培養容器５０の底面の実際の位置とは異なる。本実施形態においては、第１および第２の変位センサ１８ａ，１８ｂは、培養容器５０の底面のＺ方向の位置および培養容器５０の底面に対向する面（すなわち、培養容器５０におけるステージ側の面、以下最下面とする）のＺ方向の位置を検出する。本実施形態においては、後述するように、検出部１８が検出した培養容器５０の底面および最下面の位置を用いて、培養容器５０の底部の見かけ上の厚さが導出され、培養容器５０と空気の屈折率との相違に基づいて培養容器５０の底部の見かけ上の厚さが補正された上で、培養容器５０の底面のＺ方向の実際の位置が導出される。ここで、培養容器５０の底部とは、培養容器５０の底面と最下面との間の部分を示す。
培養容器５０の底面のＺ方向の実際の位置の導出については後述する。なお、検出部１８は、検出された培養容器５０の底面および最下面のそれぞれの位置を表す位置情報を出力する。
【００３３】
検出部１８によって検出された培養容器５０のＺ方向の位置情報は、後述する結像光学系制御部２１に出力される。結像光学系制御部２１は、入力された位置情報に応じた調整値に基づいて、観察対象の結像位置を調整してオートフォーカス制御を行う。本実施形態においては、調整値に基づいて結像位置調整部１５を制御してオートフォーカス制御を行う。なお、検出部１８によって検出された培養容器５０のＺ方向の位置に基づくオートフォーカス制御については、後述する。
【００３４】
スリット板１３と位相差レンズ１４ａおよび検出部１８との間には、ステージ５１が設けられている。ステージ５１上には、観察対象である細胞が収容された培養容器５０が設置される。
【００３５】
培養容器５０は本開示の透明の容器に対応する。培養容器５０としては、シャーレ、ディッシュ、フラスコまたはウェルプレート等を用いることができる。また、これらの他、容器としては、スライドガラスまたは微細な流路が加工されてなるマイクロ流路デバイス等を用いることができる。培養容器５０は透明であるが、すべての波長の光を透過するものに限定されるものではなく、特定の波長の光のみを透過するものであってもよい。なお、本実施形態においては、培養容器５０として６つのウェルＷを有するウェルプレートを用いる。
【００３６】
培養容器５０に収容される細胞としては、ｉＰＳ細胞およびＥＳ細胞といった多能性幹細胞、幹細胞から分化誘導された神経、皮膚、心筋および肝臓の細胞、並びに人体から取り出された皮膚、網膜、心筋、血球、神経および臓器の細胞等がある。
【００３７】
ステージ５１は、後述する水平方向駆動部１７（図４参照）によって互いに直交するＸ方向およびＹ方向に移動する。Ｘ方向およびＹ方向は、Ｚ方向に直交する方向であり、水平面内において互いに直交する方向である。本実施形態においては、Ｘ方向を主走査方向とし、Ｙ方向を副走査方向とする。
【００３８】
図３は、ステージ５１の一例を示す図である。ステージ５１の中央には、矩形の開口５１ａが形成されている。この開口５１ａを形成する部材の上に培養容器５０が設置され、培養容器５０内の細胞の位相差画像が開口５１ａを通過するように構成されている。
【００３９】
結像位置調整部１５は、例えば圧電素子のようなアクチュエータであり、後述する結像光学系制御部２１により駆動される。本実施形態においては、結像位置調整部１５は圧電素子であり、結像光学系制御部２１は、結像位置調整部１５への印加電圧を制御するものとなる。なお、結像位置調整部１５は、位相差レンズ１４ａおよび結像レンズ１４ｄを通過した位相差画像をそのまま通過させる構成となっている。また、結像位置調整部１５は圧電素子に限らず、対物レンズ１４ｂ（位相差レンズ１４ａ）をＺ方向に移動可能なものであればよく、その他の公知の構成を用いることができる。
【００４０】
第１の変位センサ１８ａおよび第２の変位センサ１８ｂはそれぞれ支持部材３０ａおよび支持部材３０ｂにより支持されている。また、結像光学系１４は結像位置調整部１５を介して支持部材３１により支持されている。また、支持部材３０ａ、支持部材３０ｂおよび支持部材３１は、装置内の基台３２に支持されている。なお、支持部材３０ａ、支持部材３０ｂおよび支持部材３１は、アルミニウムまたは真鍮等の金属材料からなる。
【００４１】
支持部材３０ａ，３０ｂには、支持部材３０ａ，３０ｂのそれぞれの温度を計測する第１の温度センサ４１ａ，４１ｂが取り付けられている。支持部材３１には、支持部材３１の温度を計測する第２の温度センサ４２が取り付けられている。また、ステージ５１には培養容器５０の温度を計測する第３の温度センサ４３が取り付けられている。第１の温度センサ４１ａ，４１ｂ、第２の温度センサ４２および第３の温度センサ４３は、熱電対または非接触のセンサからなる。第１の温度センサ４１ａ，４１ｂ、第２の温度センサ４２および第３の温度センサ４３は、それぞれ第１の温度計測部、第２の温度計測部および第３の温度計測部に対応する。なお、第３の温度センサ４３は、培養容器５０における複数のウェルＷの温度をそれぞれ計測する。このため、第３の温度センサ４３は非接触のセンサであることが好ましい。第１の温度センサ４１ａ，４１ｂ、第２の温度センサ４２および第３の温度センサ４３のそれぞれが検出した第１の温度Ｔ１、第２の温度Ｔ２および第３の温度Ｔ３を表す温度情報は後述する結像光学系制御部２１に出力される。
【００４２】
次に、顕微鏡装置１０を制御する顕微鏡制御装置２０の構成について説明する。図４は、本実施形態の顕微鏡観察システムの構成を示すブロック図である。なお、顕微鏡装置１０については、顕微鏡制御装置２０の各部により制御される一部の構成のブロック図を示している。また、顕微鏡装置１０において、第１の温度センサ４１ａ，４１ｂ、第２の温度センサ４２および第３の温度センサ４３を代表して温度センサ４０として示している。
【００４３】
顕微鏡制御装置２０は、顕微鏡装置１０全体を制御するものであり、特に、結像光学系制御部２１、補正部２２、走査制御部２３、表示制御部２４および記憶部２５を備える。
【００４４】
顕微鏡制御装置２０は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）等の中央処理装置、半導体メモリおよびハードディスク等を備えたコンピュータから構成されるものであり、ハードディスクに本開示の観察装置制御プログラムの一実施形態がインストールされている。
そして、この観察装置制御プログラムが中央処理装置によって実行されることによって、図４に示す結像光学系制御部２１、補正部２２、走査制御部２３および表示制御部２４が機能する。なお、図４には、半導体メモリおよびハードディスク等を記憶部２５として示している。
【００４５】
結像光学系制御部２１は、上述したように検出部１８によって検出された培養容器５０のＺ方向の位置を表す位置情報に応じた調整値Ｃ０に基づいて、結像位置調整部１５を制御する。本実施形態において、調整値Ｃ０は結像位置調整部１５（すなわち圧電素子）に対する印加電圧である。圧電素子はその印加電圧に応じて伸縮する。したがって、結像光学系制御部２１からの印加電圧に応じた結像位置調整部１５の駆動によって、結像光学系１４の対物レンズ１４ｂが光軸方向に移動し、オートフォーカス制御が行われる。
【００４６】
本実施形態においては、記憶部２５には、図５に示すような、培養容器５０の底面の位置情報と調整値（すなわち、圧電素子への印加電圧）との関係がルックアップテーブルＬＵＴ０として記憶されている。ルックアップテーブルＬＵＴ０は、予め定められた基準温度Ｔｂにおける位置情報と、基準となる調整値（以下、基準調整値とする）Ｃｂとの関係を表すものとなる。
【００４７】
本実施形態において、対物レンズ１４ｂは、基準温度Ｔｂの場合に基準となる位置にある培養容器５０の底面に合焦するように、顕微鏡装置１０に取り付けられている。この取り付け位置を、対物レンズ１４ｂの基準位置Ｐｂ１とする。また、この場合の基準となる培養容器５０の底面の位置を基準位置Ｐｂ２とする。対物レンズ１４ｂが基準位置Ｐｂ１にあり、培養容器５０の底面が基準位置Ｐｂ２にある場合、培養容器５０の底面の位置は対物レンズ１４ｂの合焦位置にある。したがって、支持部材３０ａ，３０ｂおよび支持部材３１が基準温度Ｔｂにある場合において、後述するように検出部１８が検出した培養容器５０の底面の位置が基準位置Ｐｂ２である場合、対物レンズ１４ｂの位置を基準位置Ｐｂ１に移動させるべく、結像位置調整部１５に対する印加電圧は、図５に示すルックアップテーブルＬＵＴ０における基準となる印加電圧（以下、基準電圧とする）Ｖ０となる。
【００４８】
結像光学系制御部２１はルックアップテーブルＬＵＴ０を参照して、検出部１８によって検出された位置情報から基準調整値Ｃｂを導出する。支持部材３０ａ，３０ｂおよび支持部材３１の温度が基準温度Ｔｂにある場合においては、基準調整値Ｃｂにより結像位置調整部１５を制御することにより、培養容器５０の底面の位置が照明光Ｌ０の合焦位置となるように対物レンズ１４ｂがＺ方向に移動する。このため、観察対象の像は撮像素子１６に結像し、これにより、適切にオートフォーカス制御を行うことができる。なお、本実施形態においては、検出部１８により検出された位置情報が大きいほど、検出部１８と培養容器５０との距離が小さくなるように、検出部１８の座標系を設定している。このため、図５に示すルックアップテーブルＬＵＴ０においては、位置情報が大きいほど基準調整値Ｃｂの値が小さくなる。したがって、位置情報が大きい、すなわち検出部１８と培養容器５０との距離が小さいほど、対物レンズ１４ｂは培養容器５０から離れることとなる。
【００４９】
補正部２２は、基準調整値Ｃｂを補正する。以下、基準調整値Ｃｂの補正について説明する。補正部２２には、第１の温度センサ４１ａ，４１ｂが計測した支持部材３０ａ，３０ｂの温度である第１の温度Ｔ１を表す第１の温度情報、第２の温度センサ４２が計測した支持部材３１の温度である第２の温度Ｔ２を表す第２の温度情報、および第３の温度センサ４３が計測した培養容器５０の温度である第３の温度Ｔ３を表す第３の温度情報が入力される。支持部材３０ａ，３０ｂは金属製であり、温度の変化により伸縮する。このため、支持部材３０ａ，３０ｂの温度が変化すると、変位センサ１８ａ，１８ｂのＺ方向の位置が変化する。また、支持部材３１も金属製であり、温度の変化により伸縮する。このため、支持部材３１の温度が変化すると、対物レンズ１４ｂのＺ方向の位置が変化する。
【００５０】
上述したように、基準調整値Ｃｂは、基準温度Ｔｂにおける変位センサ１８ａ，１８ｂが検出した、培養容器５０の底面の位置を表す位置情報に応じて導出される。ここで、第１の温度Ｔ１が基準温度Ｔｂでない場合、変位センサ１８ａ，１８ｂの先端のＺ方向の位置は、基準温度Ｔｂにおける位置とは異なる。また、第２の温度Ｔ２が基準温度Ｔｂでない場合、対物レンズ１４ｂのＺ方向の位置は、基準温度Ｔｂにおける位置とは異なる。このため、基準調整値Ｃｂにより対物レンズ１４ｂのＺ方向の位置を制御しても、培養容器５０の底面の位置は対物レンズ１４ｂの合焦位置とは異なる位置となることから、適切にオートフォーカス制御を行うことができなくなる。
【００５１】
このため、補正部２２は基準調整値Ｃｂを補正する。具体的には、補正部２２は、まず第１の温度Ｔ１および第２の温度Ｔ２に基づいて基準調整値Ｃｂを補正するための補正係数ｋ１，ｋ２を導出する。本実施形態において、記憶部２５には、第１の温度Ｔ１と基準調整値Ｃｂに対する補正係数ｋ１の関係を規定したルックアップテーブルＬＵＴ１、および第２の温度Ｔ２と基準調整値Ｃｂに対する補正係数ｋ２の関係を規定したルックアップテーブルＬＵＴ２が記憶されている。図６および図７はルックアップテーブルＬＵＴ１、ＬＵＴ２をそれぞれ示す図である。ルックアップテーブルＬＵＴ１は、基準温度Ｔｂの場合の補正係数ｋ１を１．０とした場合における第１の温度Ｔ１と補正係数ｋ１との関係を表すものとなる。ここで、第１の温度Ｔ１が高いと支持部材３０ａ，３０ｂが伸びるため、検出部１８と培養容器５０との距離が小さくなる。これにより、検出部１８により検出される位置情報が大きくなるため、図５から基準調整値Ｃｂが小さくなる。この場合、対物レンズ１４ｂと培養容器５０との距離が小さくなるように、基準調整値Ｃｂを大きくする必要がある。このため、図６に示すように、ルックアップテーブルＬＵＴ１は、第１の温度Ｔ１が高いほど、補正係数ｋ１の値が大きいものとなっている。
【００５２】
ルックアップテーブルＬＵＴ２は、基準温度Ｔｂの場合の補正係数ｋ２を１．０とした場合における第２の温度Ｔ２と補正係数ｋ２との関係を表すものとなる。ここで、第２の温度Ｔ２が高いと支持部材３１が伸びるため、対物レンズ１４ｂと培養容器５０との距離が小さくなる。この場合、対物レンズ１４ｂと培養容器５０との距離が大きくなるように、基準調整値Ｃｂを小さくする必要がある。このため、図７に示すように、ルックアップテーブルＬＵＴ２は、第２の温度Ｔ２が高いほど、補正係数ｋ２の値が小さいものとなっている。なお、ルックアップテーブルＬＵＴ１が第１のルックアップテーブル、補正係数ｋ１が第１の補正係数、ルックアップテーブルＬＵＴ２が第２のルックアップテーブル、補正係数ｋ２が第２の補正係数に対応する。
【００５３】
補正部２２は、ルックアップテーブルＬＵＴ１を参照して、第１の温度Ｔ１に基づいて補正係数ｋ１を導出する。また、補正部２２は、ルックアップテーブルＬＵＴ２を参照して、第２の温度Ｔ２に基づいて補正係数ｋ２を導出する。したがって、基準調整値Ｃｂに補正係数ｋ１および補正係数ｋ２を乗算することにより導出される調整値により対物レンズ１４ｂのＺ方向の位置を調整することにより、対物レンズ１４ｂの焦点位置は、支持部材３０ａ，３０ｂおよび支持部材３１の温度に拘わらず、培養容器５０の底面に位置することとなる。
【００５４】
本実施形態においては、補正部２２は、さらに第３の温度情報により表される第３の温度Ｔ３に基づいて基準調整値Ｃｂを補正するための補正係数ｋ３を導出する。本実施形態においては、培養容器５０は例えばポリスチレン等の樹脂材料からなる。樹脂材料は温度に応じてその屈折率が変化する。図８はポリスチレンにおける温度と屈折率との関係を示す図である。図８に示すように、ポリスチレンにおいては、温度が高いほど屈折率が低くなる。
【００５５】
図９は培養容器５０の底面に合焦した状態における対物レンズ１４ｂの光路を示す図である。図９において、Ｍ１は培養容器５０の底面、Ｍ２は培養容器５０の最下面、Ｘ０は照明光Ｌ０の光軸、θ１は培養容器５０から出射される照明光Ｌ０の出射角、θ２は培養容器５０から空気への照明光Ｌ０の入射角、Ｄは検出部１８により検出された位置情報から導出される培養容器５０の底部の見かけ上の厚さ、ｔは培養容器５０の材料の屈折率を考慮した厚さ補正係数、ｆ′は培養容器５０が存在する場合の対物レンズ１４ｂの焦点距離、φは位相板１４ｃの半径である。
【００５６】
まず、厚さ補正係数ｔについて説明する。厚さ補正係数ｔは、培養容器５０の底部の見かけ上の厚さを実際の厚さに補正するための係数である。図１０は厚さ補正係数の導出を説明するための図である。ここで、屈折率が空気よりも大きい材料の厚さを計測する場合、見かけ上の厚さが薄い方向にシフトする。図１０において、θ３は培養容器５０へ入射される変位センサ１８ａ，１８ｂから出射されたレーザ光Ｌ１の入射角、θ４はレーザ光Ｌ１の空気からの出射角、ｄ１は変位センサ１８ａ，１８ｂが検出した培養容器５０の底部の見かけ上の厚さ、ｄ２は培養容器５０の底部の実際の厚さ、Ｘ１は培養容器５０の底面Ｍ１においての培養容器５０と空気との境界におけるレーザ光Ｌ１の法線、Ａはレーザ光Ｌ１の入射面における法線Ｘ１とレーザ光Ｌ１の入射位置との距離である。なお、レーザ光Ｌ１の入射角θ３は、変位センサ１８ａ，１８ｂに依存する。また、厚さｄ１は、変位センサ１８ａ，１８ｂが検出した培養容器５０の底面Ｍ１までの距離から最下面Ｍ２までの距離を減算することにより導出することができる。
【００５７】
ここで、空気の屈折率をｎ１、培養容器５０の材料の屈折率をｎ２とすると、スネルの法則から、θ４＝ｓｉｎ-1（ｎ１・ｓｉｎθ３／ｎ２）となる。また、ｔａｎθ３＝Ａ／ｄ１、ｔａｎθ４＝Ａ／ｄ２であるため、ｔａｎθ４＝ｄ１・ｔａｎθ１／ｄ２となる。
また、厚さ補正係数ｔは、培養容器５０の底部の見かけ上の厚さを実際の厚さに補正するための係数であるため、ｄ１・ｔ＝ｄ２である。このため、厚さ補正係数ｔは、下記の式
(１)により算出される。
【００５８】
ｔ＝ｔａｎθ３／ｔａｎθ４
＝ｔａｎθ３／ｔａｎ［ｓｉｎ-1（ｎ１・ｓｉｎθ３／ｎ２）］  （１）
【００５９】
したがって、変位センサ１８ａ，１８ｂから出射されるレーザ光Ｌ１の入射角θ３および培養容器５０の材料の屈折率ｎ２が分かれば、上記式（１）により厚さ補正係数ｔを算出できる。このため、変位センサ１８ａ，１８ｂが検出した位置情報から培養容器５０の底部の見かけ上の厚さを導出し、導出された培養容器５０の底部の見かけ上の厚さに厚さ補正係数ｔを乗算することにより、培養容器５０の底部の実際の厚さを導出することができる。なお、図８に示すように、温度に応じて材料の屈折率ｎ２が変化するため、補正係数ｔは、培養容器５０の温度である第３の温度Ｔ３に応じて変化する。
【００６０】
図９に戻り、上記式(１)についての説明と同様に、空気の屈折率をｎ１、培養容器５０の材料の屈折率をｎ２とすると、培養容器５０が存在する場合の対物レンズ１４ｂの焦点距離ｆ′は以下の式（２）により表される。なお、式（２）において、ｆは培養容器５０が存在しない場合の対物レンズ１４ｂの焦点距離である。
【００６１】
【数１】
0006982198.tif 000002
【００６２】
式（１）および式（２）に示す関係に基づいて、培養容器５０の屈折率ｎ２と対物レンズ１４ｂの焦点距離ｆ′との関係を算出することができる。図１１は培養容器５０の屈折率と対物レンズ１４ｂの焦点距離ｆ′との関係の例を示す図である。図１１に示すように、屈折率ｎ２が大きくなるほど、対物レンズ１４ｂの焦点距離が大きくなる。したがって、図８に示す温度と屈折率との関係および式（１）に基づいて、第３の温度Ｔ３に応じた厚さ補正係数ｔを導出することができる。また、導出した厚さ補正係数ｔを用いて、図１１に示す屈折率と焦点距離との関係および式（２）に基づいて、第３の温度Ｔ３に応じた対物レンズ１４ｂの焦点距離ｆ′を導出することができる。また、導出した焦点距離ｆ′を培養容器５０の底面に一致させるように対物レンズ１４ｂをＺ方向に移動させるための、結像位置調整部１５への印加電圧を導出することができる。さらに、導出した印加電圧を基準電圧Ｖ０で除算することにより、基準電圧Ｖ０に対する補正係数を導出することができる。
【００６３】
したがって、各種温度に対して結像位置調整部１５への印加電圧を導出して基準電圧Ｖ０で除算することにより、培養容器５０の温度、すなわち第３の温度Ｔ３に対する基準調整値Ｃｂの補正係数ｋ３の関係を求めることができる。本実施形態においては、第３の温度Ｔ３と補正係数ｋ３との関係を規定したルックアップテーブルを予め生成して、記憶部２５に記憶しておく。図１２は、第３の温度Ｔ３と補正係数ｋ３との関係を規定したルックアップテーブルを示す図である。なお、ルックアップテーブルＬＵＴ３は、基準温度Ｔｂの場合の補正係数ｋ３を１．０とした場合における、第３の温度Ｔ３と補正係数ｋ３との関係を表すものとなる。ここで、第３の温度Ｔ３が高いと、図８から培養容器５０の屈折率が低くなり、その結果、図１１から対物レンズ１４ｂの焦点距離が小さくなる。この場合、対物レンズ１４ｂと培養容器５０との距離が小さくなるように、基準調整値Ｃｂを大きくする必要がある。このため、図１２に示すように、ルックアップテーブルＬＵＴ３は、第３の温度Ｔ３が高いほど、補正係数ｋ３の値が大きいものとなっている。なお、ルックアップテーブルＬＵＴ３が第３のルックアップテーブル、補正係数ｋ３が第３の補正係数に対応する。
【００６４】
補正部２２は、上述したルックアップテーブルＬＵＴ１〜ＬＵＴ３を参照して、第１〜第３の温度から補正係数ｋ１〜ｋ３を導出する。そして、補正部２２は下記の式（３）により基準調整値Ｃｂを補正して補正済みの調整値Ｃ０を算出する。
【００６５】
Ｃ０＝Ｃｂ・ｋ１・ｋ２・ｋ３      （３）
【００６６】
なお、上記実施形態においては、ルックアップテーブルＬＵＴ１〜ＬＵＴ３を記憶部２５に保存しておき、ルックアップテーブルＬＵＴ１〜ＬＵＴ３を参照して補正係数ｋ１〜ｋ３を導出して基準調整値Ｃｂを補正し、調整値Ｃ０を導出しているが、これに限定されるものではない。第１〜第３の温度Ｔ１〜Ｔ３に応じて基準調整値Ｃｂを補正するための演算式を記憶部２５に記憶しておき、第１〜第３の温度Ｔ１〜Ｔ３に応じて調整値Ｃ０導出するようにしてもよい。
【００６７】
走査制御部２３は、水平方向駆動部１７を駆動制御し、これによりステージ５１をＸ方向およびＹ方向に移動させて、培養容器５０をＸ方向およびＹ方向に移動させる。水平方向駆動部１７は、圧電素子等のアクチュエータから構成される。
【００６８】
以下、走査制御部２３によるステージ５１の移動制御および結像光学系制御部２１によるオートフォーカス制御について、詳細に説明する。
【００６９】
本実施形態においては、走査制御部２３による制御によってステージ５１をＸ方向およびＹ方向に移動させ、結像光学系１４の観察域を培養容器５０内において２次元状に移動して培養容器５０を走査し、各観察域の位相差画像を撮像する。図１３は、培養容器５０内における観察域による走査位置を実線６０で示した図である。なお、本実施形態においては、培養容器５０は６つのウェルＷを有する。
【００７０】
図１３に示すように、結像光学系１４の観察域は、走査開始点Ｓから走査終了点Ｅまで実線６０に沿って移動する。すなわち、観察域は、Ｘ方向の正方向（図６の右方向）に移動された後、Ｙ方向（図１３の下方向）に移動し、逆の負方向（図６の左方向）に移動される。次いで、観察域は、再びＹ方向に移動し、再び正方向に移動される。このように、観察域のＸ方向についての往復移動とＹ方向への移動を繰り返し行うことによって、培養容器５０は２次元状に走査される。
【００７１】
図１４および図１５は、培養容器５０内の任意の位置に観察域Ｒがある場合における結像光学系１４、第１の変位センサ１８ａおよび第２の変位センサ１８ｂと、培養容器５０との位置関係を示す図である。
【００７２】
本実施形態においては、図１４および図１５に示すように、第１の変位センサ１８ａと第２の変位センサ１８ｂとが結像光学系１４を挟んでＸ方向に並べて設けられている。そして、結像光学系１４の観察域Ｒは、上述したように培養容器５０内を２次元状に移動されるが、この際、培養容器５０に対する結像光学系１４の観察域Ｒの位置よりも観察域Ｒの移動方向前側の位置において培養容器５０のＺ方向の位置が検出される。具体的には、観察域Ｒが、図１４に示す矢印方向（図１４の右方向）に移動している場合には、第１の変位センサ１８ａおよび第２の変位センサ１８ｂのうち、観察域Ｒの移動方向前側の第１の変位センサ１８ａによって培養容器５０のＺ方向の位置（この場合、培養容器５０の底面および最下面のＺ方向の位置を含む）が検出される。そして、観察域Ｒが、図１４に示す位置から第１の変位センサ１８ａによって培養容器５０のＺ方向の位置が検出された位置まで移動した場合に、前もって検出された培養容器５０のＺ方向の位置情報が用いられてオートフォーカス制御が行われ、位相差画像の撮像が行われる。
【００７３】
一方、観察域Ｒが、図１５の矢印方向（図１５の左方向）に移動している場合には、第１の変位センサ１８ａおよび第２の変位センサ１８ｂのうち、観察域Ｒの移動方向前側の第２の変位センサ１８ｂによって培養容器５０のＺ方向の位置が検出される。そして、観察域Ｒが、図１５に示す位置から第２の変位センサ１８ｂによって培養容器５０のＺ方向の位置が検出された位置まで移動した場合に、前もって検出された培養容器５０のＺ方向の位置情報が用いられてオートフォーカス制御が行われ、位相差画像の撮像が行われる。
【００７４】
このように第１の変位センサ１８ａを用いた培養容器５０の検出と第２の変位センサ１８ｂを用いた培養容器５０の検出とを観察域Ｒの移動方向に応じて切り替えることによって、常に、観察域Ｒの位相差画像の撮像に先行して、その観察域Ｒの位置における培養容器５０のＺ方向の位置情報を取得することができる。
【００７５】
そして、結像光学系制御部２１は、上述したように先行して検出された培養容器５０のＺ方向の位置情報に基づいて、結像位置調整部１５を駆動制御することによって、オートフォーカス制御を行う。具体的には、結像光学系制御部２１は、上述したように補正部２２が導出した調整値Ｃ０を結像位置調整部１５に出力する。結像位置調整部１５は、入力された調整値Ｃ０に応じて駆動し、これにより対物レンズ１４ｂがＺ方向に移動し、培養容器５０の底面のＺ方向の位置に応じたオートフォーカス調整が行われる。
【００７６】
次に、図４に戻り、表示制御部２４は、顕微鏡装置１０によって撮像された各観察域Ｒの位相差画像を結合することによって、１枚の合成位相差画像を生成し、その合成位相差画像を表示装置２６に表示させる。
【００７７】
表示装置２６は、上述したように表示制御部２４によって生成された合成位相差画像を表示するものであり、例えば液晶ディスプレイ等を備える。また、表示装置２６をタッチパネルによって構成し、入力装置２７と兼用するようにしてもよい。
【００７８】
入力装置２７は、マウスおよびキーボード等を備え、ユーザによる種々の設定入力を受け付けるものである。
【００７９】
次に、本実施形態の顕微鏡観察システムの作用について、図１６に示すフローチャートを参照して説明する。まず、観察対象である細胞が収容された培養容器５０が、ステージ５１上に設置される（ステップＳＴ１１）。次に、ステージ５１が移動して結像光学系１４の観察域Ｒが、図１３に示す走査開始点Ｓの位置に設定され、観察域Ｒによる走査が開始される（ステップＳＴ１２）。
【００８０】
ここで、本実施形態においては、上述したように各観察域Ｒについて、先行して培養容器５０の位置検出が行われ、その検出位置まで観察域Ｒが到達した時点において、位相差画像の撮像が行われる。そして、この培養容器５０の位置検出と位相差画像の撮像は、観察域Ｒを移動しながら行われ、ある位置の観察域Ｒの位相差画像の撮像と、その位置よりも移動方向について前側の位置における培養容器５０の位置検出とが並行して行われる。
【００８１】
具体的には、図１３の矢印方向に観察域Ｒが移動している場合には、第１の変位センサ１８ａによって培養容器５０のＺ方向の位置が検出され（ステップＳＴ１３）、第１の温度センサ４１ａ，４１ｂ、第２の温度センサ４２および第３の温度センサ４３により第１〜第３の温度Ｔ１〜Ｔ３が計測され（ステップＳＴ１４）、検出された位置情報が結像光学系制御部２１によって取得され、計測された温度情報が補正部２２によって取得される。
【００８２】
結像光学系制御部２１は、検出された位置情報に基づいて、ルックアップテーブルＬＵＴ０を参照して基準調整値Ｃｂを取得する（ステップＳＴ１５）。次いで、補正部２２が、温度情報に基づいて補正係数ｋ１〜ｋ３を導出し、基準調整値Ｃｂを補正する（ステップＳＴ１６）。図１７は調整値補正処理のフローチャートである。補正部２２は、まず第１の温度Ｔ１および第２の温度Ｔ２に基づいて、補正係数ｋ１，ｋ２を導出する（ステップＳＴ３１）。さらに、補正部２２は、第３の濃度Ｔ３に基づいて補正係数ｋ３を導出する（ステップＳＴ３２）。そして、補正部２２は、補正係数ｋ１〜ｋ３により基準調整値Ｃｂを補正する（ステップＳＴ３３）。これにより、補正済みの調整値Ｃ０が取得され、調整値補正処理を終了する。なお、調整値Ｃ０は、培養容器５０の検出位置のＸ−Ｙ座標上の位置と対応づけられて、記憶部２５に記憶される。
【００８３】
図１６に戻り、ステップＳＴ１７において第１の変位センサ１８ａによって培養容器５０の位置検出が行われた位置に向かって観察域Ｒが移動する（ステップＳＴ１７）。そして、結像光学系制御部２１は、培養容器５０の位置検出が行われた位置に観察域Ｒが到達する直前において補正済みの調整値Ｃ０を取得し、オートフォーカス制御を行う（ステップＳＴ１８）。すなわち、結像光学系制御部２１は、調整値Ｃ０に基づいて結像位置調整部１５を駆動制御し、対物レンズ１４ｂをＺ方向に移動させる。そして、オートフォーカス制御後、培養容器５０の位置検出が行われた位置に観察域Ｒが到達した時点において、位相差画像の撮像を行う（ステップＳＴ１９）。観察域Ｒの位相差画像は、撮像素子１６から表示制御部２４に出力されて記憶される。なお、上述したように、ステップＳＴ１９における観察域Ｒの位相差画像の撮像が行われている間、上記観察域Ｒよりも移動方向について前側の位置において培養容器５０の位置検出が並行して行われる。
【００８４】
そして、観察域Ｒが、培養容器５０の端部まで移動した場合には（ステップＳＴ２０；ＹＥＳ）、観察域ＲはＹ方向に移動した後、逆方向、すなわち図１４の矢印方向から図１５の矢印方向に移動方向が変更され、使用する変位センサが第１の変位センサ１８ａから第２の変位センサ１８ｂに切り替えられる（ステップＳＴ２１）。観察域Ｒが培養容器の端部まで移動していない場合には(ステップＳＴ２０；ＮＯ）、引き続き培養容器５０の位置検出と位相差画像の撮像が順次行われる（ステップＳＴ１３〜ステップＳＴ１９）
【００８５】
そして、すべての走査が終了していない場合には（ステップＳＴ２２；ＮＯ）、再び、観察域ＲがＸ方向に移動し、上述した培養容器５０の位置検出と位相差画像の撮像が順次行われる（ステップＳＴ１３〜ステップＳＴ１９）。
【００８６】
観察域Ｒが、培養容器５０の端部まで移動する度に使用する変位センサが切り替えられ、すべての走査が終了するまでステップＳＴ１３〜ステップＳＴ２１の処理が繰り返して行われる。そして、観察域Ｒが、図１３に示す走査終了点Ｅの位置に到達した時点においてすべての走査が終了する（ステップＳＴ２２；ＹＥＳ）。
【００８７】
すべての走査が終了した後、表示制御部２４は、各観察域Ｒの位相差画像を結合して合成位相差画像を生成して、生成した合成位相差画像を表示装置２６に表示させる（ステップＳＴ２３）。
【００８８】
このように、本実施形態においては、検出部１８によって検出された培養容器５０の鉛直方向の位置に応じた調整値Ｃ０に基づいて、観察対象の像の結像位置が調整される。この際、検出部１８を支持する支持部材３０ａ，３０ｂの温度である第１の温度Ｔ１および対物レンズ１４ｂを支持する支持部材３１の温度である第２の温度Ｔ２が計測され、培養容器５０の温度である第３の温度Ｔ２が計測される。そして、第１の温度Ｔ１、第２の温度Ｔ２、および第３の温度Ｔ３に応じた培養容器５０の屈折率に基づいて、基準調整値Ｃｂが補正され、補正された調整値Ｃ０により対物レンズ１４ｂのＺ方向の位置が移動されて、オートフォーカス制御が行われる。このため、温度に応じた検出部１８および結像光学系１４の位置、並びに温度に応じた培養容器５０の屈折率に応じて、観察対象の像の結像位置が調整される。したがって、本実施形態によれば、環境温度が変換してもボケが低減された位相差画像を取得することができる。
【００８９】
なお、上記実施形態において、位相差画像を撮像する毎に温度を計測しているが、培養容器５０の撮像時間はそれほど長いものではなく、撮像中の温度は一定であると見なすことができる場合がある。このような場合は、撮像の開始前に第１〜第３の温度Ｔ１〜Ｔ３を計測し、補正部２２において補正係数ｋ１〜ｋ３を導出して記憶部２５に記憶しておくことが好ましい。これにより、位置情報が検出される毎に第１〜第３の温度Ｔ１〜Ｔ３の計測および補正係数ｋ１〜ｋ３も導出を行う必要がなくなる。
【００９０】
次に、本開示の第２の実施形態を用いた顕微鏡観察システムについて、図面を参照しながら詳細に説明する。図１８は、第２の実施形態の顕微鏡観察システムの概略構成を示す図である。第２の実施形態の顕微鏡観察システムは、第１の実施形態の顕微鏡観察システムとは、検出部の構成が異なる。第２の実施形態の顕微鏡観察システムは、その他の構成は、第１の実施形態と同様であるので、以下、第２の実施形態の顕微鏡観察システムの検出部の構成を中心に説明する。
【００９１】
第１の実施形態の検出部１８は、２つの変位センサ１８ａ，１８ｂを備え、観察域Ｒの移動方向の変更に応じて使用する変位センサ１８ａ，１８ｂを切り替えるようにしたが、第２の実施形態の検出部１９は、１つの変位センサを有し、観察域Ｒの移動方向の変更に応じて、その変位センサの位置を切り替えるようにしたものである。なお、第２の実施形態においては、検出部１９は支持部材３０ｃにより支持されている。また、支持部材３０ｃの温度は温度センサ４１ｃにより第１の温度Ｔ１として検出される。
【００９２】
図１９および図２０は、検出部１９の具体的な構成を示す図である。検出部１９は、図１９および図２０に示すように、変位センサ１９ａ、および変位センサ１９ａを案内してその位置を移動させるガイド機構１９ｂを備えている。
【００９３】
変位センサ１９ａは、第１の実施形態の第１および第２の変位センサ１８ａ，１８ｂと同様に、レーザ変位センサから構成される。
【００９４】
ガイド機構１９ｂは、半円弧状のガイド部材を備え、このガイド部材に沿って変位センサ１９ａを移動させる。ガイド部材は、結像光学系１４を挟んでＸ方向について一方の側から他方の側に変位センサ１９ａを移動させる。
【００９５】
図１９は、観察域Ｒの移動方向が、図１９の矢印方向（図１９の右方向）である場合における変位センサ１９ａの位置を示す図である。一方、図２０は、観察域Ｒの移動方向が、図２０の矢印方向（図２０の左方向）である場合における変位センサ１９ａの位置を示す図である。観察域Ｒの移動方向が図１９の矢印方向から図２０に矢印方向に変更された場合には、変位センサ１９ａは図１９に示す位置からガイド機構１９ｂのガイド部材に沿って移動し、図２０に示す位置に切り替えられる。
【００９６】
なお、本実施形態においては、変位センサ１９ａの位置を移動させる変位センサ移動機構として上述したガイド機構１９ｂを設けるようにしたが、変位センサ移動機構の構成としてはこれに限らず、変位センサ１９ａの位置を同様に変更可能な構成であれば、その他の構成を用いてもよい。
【００９７】
第２の実施形態の顕微鏡観察システムのその他の構成および作用については、第１の実施形態の顕微鏡観察システムと同様である。
【００９８】
なお、上記実施形態においては、第１の温度センサ４１ａ，４１ｂが計測した支持部材３０ａ，３０ｂの第１の温度Ｔ１および第２の温度センサ４２が計測した支持部材３１の第２の温度Ｔ２のそれぞれから補正係数ｋ１，ｋ２を導出して基準調整値Ｃｂを補正している。しかしながら、第１の温度Ｔ１と第２の温度Ｔ２との差分値に基づいて、基準調整値Ｃｂを補正してもよい。この場合、図２１に示すように、第１の温度Ｔ１および第２の温度Ｔ２の差分値ΔＴと基準調整値Ｃｂに対する補正係数ｋ１２との関係をルックアップテーブルＬＵＴ４として記憶部２５に記憶しておく。そして、補正部２２は、第１の温度Ｔ１および第２の温度Ｔ２との差分値ΔＴを算出し、ルックアップテーブルＬＵＴ４を参照して補正係数ｋ１２を導出する。この場合、補正部２２は、補正係数ｋ１２および補正係数ｋ３を用いて、下記の式（４）により、基準調整値Ｃｂを補正して、調整値Ｃ０を導出すればよい。なお、ルックアップテーブルＬＵＴ４は、ルックアップテーブルＬＵＴ１とルックアップテーブルＬＵＴ２との関係から求めることができるものである。図２１においては、差分値ΔＴが大きいほど補正係数ｋ１２の値が大きいものとなっているが、差分値ΔＴが大きいほど補正係数ｋ１２の値が小さくなることもあり得る。
【００９９】
Ｃ０＝Ｃｂ・ｋ１２・ｋ３    （４）
【０１００】
また、上記実施形態においては、図５〜７，１２，２１に各種ルックアップテーブルを示しているが、一例に過ぎないものである。対物レンズ１４ｂ、レーザ変位計１８ａ，１８ｂ、培養容器５０、レーザ変位計１８ａ，１８ｂの支持部材３０ａ，３０ｂ、および対物レンズ１４ｂの支持部材３１の性質（材料、サイズおよび温度特性等）に応じて、ルックアップテーブルの特性が変化することはもちろんである。
【０１０１】
また、上記各実施形態においては、ステージ５１を移動させることによって観察域Ｒを移動するようにしたが、これに限らず、ステージ５１を固定とし、結像光学系１４を移動させることによって観察域Ｒを移動して、培養容器５０の観察域Ｒによる走査を行うようにしてもよいし、ステージ５１および結像光学系１４の双方を移動させることによって観察域Ｒによる走査を行うようにしてもよい。
【０１０２】
また、上記各実施形態は、本開示を位相差顕微鏡に適用したものであるが、本開示は、位相差顕微鏡に限らず、微分干渉顕微鏡および明視野顕微鏡等のその他の顕微鏡に適用してもよい。
【０１０３】
また、上記各実施形態においては、結像光学系１４によって結像された位相差画像を撮像素子１６によって撮像するようにしたが、撮像素子を設けることなく、結像光学系１４によって結像された観察対象の位相差像をユーザが直接観察できるように観察光学系等を設けるようにしてもよい。
【０１０４】
また、上記各実施形態において、例えば、結像光学系制御部２１、補正部２２、走査制御部２３、および表示制御部２４といった各種の処理を実行する処理部（processing unit）のハードウェア的な構造としては、次に示す各種のプロセッサ（processor）を用いることができる。上記各種のプロセッサには、上述したように、ソフトウェア（プログラム）を実行して各種の処理部として機能する汎用的なプロセッサであるＣＰＵに加えて、ＦＰＧＡ（Field  Programmable Gate Array）等の製造後に回路構成を変更可能なプロセッサであるプログラマブルロジックデバイス（Programmable Logic Device :PLD）、ＡＳＩＣ（Application Specific Integrated Circuit）等の特定の処理を実行させるために専用に設計された回路構成を有するプロセッサである専用電気回路等が含まれる。
【０１０５】
１つの処理部は、これらの各種のプロセッサのうちの１つで構成されてもよいし、同種または異種の２つ以上のプロセッサの組み合わせ（例えば、複数のＦＰＧＡの組み合わせまたはＣＰＵとＦＰＧＡとの組み合わせ）で構成されてもよい。また、複数の処理部を１つのプロセッサで構成してもよい。
【０１０６】
複数の処理部を１つのプロセッサで構成する例としては、第１に、クライアントおよびサーバ等のコンピュータに代表されるように、１つ以上のＣＰＵとソフトウェアとの組み合わせで１つのプロセッサを構成し、このプロセッサが複数の処理部として機能する形態がある。第２に、システムオンチップ（System On Chip:SoC）等に代表されるように、複数の処理部を含むシステム全体の機能を１つのＩＣ（Integrated Circuit）チップで実現するプロセッサを使用する形態がある。このように、各種の処理部は、ハードウェア的な構造として、上記各種のプロセッサの１つ以上を用いて構成される。
【０１０７】
さらに、これらの各種のプロセッサのハードウェア的な構造としては、より具体的には、半導体素子等の回路素子を組み合わせた電気回路（circuitry）を用いることができる。
【符号の説明】
【０１０８】
１０    顕微鏡装置
１１    白色光源
１２    コンデンサレンズ
１３    スリット板
１４    結像光学系
１４ａ  位相差レンズ
１４ｂ  対物レンズ
１４ｃ  位相板
１４ｄ  結像レンズ
１５    結像位置調整部
１６    撮像素子
１７    水平方向駆動部
１８，１９  検出部
１８ａ  第１の変位センサ
１８ｂ  第２の変位センサ
１９    検出部
１９ａ  変位センサ
１９ｂ  ガイド機構
２０    顕微鏡制御装置
２１    結像光学系制御部
２２    補正部
２３    走査制御部
２４    表示制御部
２５    記憶部
２６    表示装置
２７    入力装置
３０ａ，３０ｂ，３０ｃ，３１    支持部材
３２    基台
４１ａ，４１ｂ，４１ｃ，４２，４３    温度センサ
５０    培養容器
５１    ステージ
５１ａ  開口
６０      観察域による走査位置
Ｃｂ    基準調整値
ｄ１，Ｄ    培養容器の底部の見かけ上の厚さｄ２    培養容器の底部の厚さＥ      走査終了点
ｆ′    焦点距離
ｋ１〜ｋ３，ｋ１２    補正係数
Ｌ０    照明光
Ｌ１    レーザ光
ＬＵＴ０〜ＬＵＴ４    ルックアップテーブル
Ｍ１    培養容器の底面
Ｍ２    培養容器の最下面
Ｓ      走査開始点
ｔ    厚さ補正係数
Ｔ１    第１の温度
Ｔ２    第２の温度
Ｔ３    第３の温度
Ｖ０    基準電圧
Ｗ    ウェル
Ｘ０  光軸
Ｘ１    法線
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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