(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グアナベンズ又はその塩を有効成分とすることを特徴とする、肝臓におけるＨｅｌｚ２発現の増加及び／又はＬｅｐｒｂ発現の低下を伴う脂肪肝の改善剤。
【請求項２】
高血圧を伴う脂肪肝の改善剤である、請求項１に記載の脂肪肝の改善剤。
【請求項３】
肥満を伴う脂肪肝の改善剤である、請求項１に記載の脂肪肝の改善剤。
【請求項４】
グアナベンズ酢酸塩を有効成分とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の脂肪肝の改善剤。
【請求項５】
メタボリック症候群を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の脂肪肝の改善剤。
【請求項６】
グアナベンズ又はその塩を有効成分とすることを特徴とする、肝臓におけるＨｅｌｚ２作用の低下剤。
【請求項７】
食欲を低下させずに抗肥満作用を示す、請求項６に記載の肝臓におけるＨｅｌｚ２作用の低下剤。
【請求項８】
グアナベンズ又はその塩を有効成分とすることを特徴とする、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）又は非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の改善を示す、肝臓におけるＨｅｌｚ２作用の低下剤。
【請求項９】
グアナベンズ酢酸塩を有効成分とする、請求項６〜８のいずれか１項に記載の肝臓におけるＨｅｌｚ２作用の低下剤。
【請求項１０】
メタボリック症候群を含む、請求項６〜９のいずれか１項に記載の肝臓におけるＨｅｌｚ２作用の低下剤。
【請求項１１】
グアナベンズ又はその塩を有効成分とすることを特徴とする、肝臓におけるＬｅｐｒｂ発現促進剤。
【請求項１２】
食欲を低下させずに抗肥満作用を示す、請求項１１に記載の肝臓におけるＬｅｐｒｂ発現促進剤。
【請求項１３】
グアナベンズ又はその塩を有効成分とすることを特徴とする、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）又は非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の改善を示す、肝臓におけるＬｅｐｒｂ発現促進剤。
【請求項１４】
グアナベンズ酢酸塩を有効成分とする、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の肝臓におけるＬｅｐｒｂ発現促進剤。
【請求項１５】
メタボリック症候群を含む、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の肝臓におけるＬｅｐｒｂ発現促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Helz2（Helicase with zinc finger 2） [別名、peroxisome proliferator-activated receptor （PPAR） DNA-binding domain-interacting protein1 （PDIP1）]に結合する化合物を有効成分とする肥満関連代謝疾患の改善剤に関するものであり、更に詳しくは、Helz2に結合してその活性を低下させることにより、肥満及び、又はインスリン抵抗性に基因する肥満関連代謝疾患の改善を示す化合物を有効成分とする薬剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
肥満と健康障害
肥満が高度になるに従って、種々の健康障害が生じる。我国においてはボディマスインデックス（body mass index：BMI）が２５以上を示す際に肥満と定義される。肥満による代謝障害の結果、耐糖能障害・糖尿病、脂質異常症、高血圧、脂肪肝、高尿酸血症・痛風、冠動脈疾患、脳血管障害、肥満関連腎臓病のような健康障害が生じ、又、肥満による過体重の結果、睡眠時無呼吸、月経異常、整形外科的運動器疾患のような健康障害が生ずる。BMIが２５以上で、且つ、上記に記載する肥満関連の健康障害の内の１つ以上の健康障害を示す際、又は、BMIが２５以上で内蔵脂肪面積が一定以上を示す際、肥満症と診断さ
れる（非特許文献１）。【０００３】
肥満におけるインスリン抵抗性と肥満関連代謝疾患
肥満による代謝障害には、その発症にインスリン抵抗性（インスリンが効きにくい状態）が強く関与する肥満関連代謝疾患、例えば、糖尿病と脂肪肝がある。生体内で血糖を下げるホルモンは膵臓のβ細胞で合成・分泌されるインスリンである。又、糖新生の約９０％を肝臓が担っており、インスリンは、正常状態では肝臓での糖新生を抑制して血糖を一定に保ち、肝臓での脂肪合成も一定に制御する。一方、肥満の程度が進むとその殆どが、インスリン抵抗性となり、高血糖と同時に高インスリン血症を示すようになり、糖尿病や脂肪肝の他に、高血圧や高脂血症の発症を促進する（非特許文献２）。更に、高インスリン血症は心臓脳血管系病変の発症にも関与する。又、インスリン抵抗性は脂肪や筋肉でも認められ、それらは肥満関連代謝疾患の発症にも関与するが、肝臓のインスリン抵抗性は、他臓器のインスリン抵抗性とは独立して早期に出現する（非特許文献３）。【０００４】
肝臓とインスリン抵抗性
肥満で認められるインスリン抵抗性の、肝臓での糖新生系と脂質合成系に対する影響は乖離しており、肝臓では選択的インスリン抵抗性（selective hepatic insulin resistance）が起こる（非特許文献４）。即ち、糖新生系はインスリン抵抗性となり、高インスリン血症にも拘わらず、高血糖は抑制されなくなる。更に、インスリン抵抗性が長期にわたり持続すると、膵β細胞は高インスリン状態を維持出来なくなり、次第にβ細胞機能が疲弊してインスリン分泌が低下して糖尿病が発症する。【０００５】
一方、上記脂質合成系はインスリン抵抗性とならず、高インスリン血症は肝臓の脂質合成を促進して、過剰なtriglyceride （Tg）蓄積を特徴とする非アルコール性脂肪性肝疾患（non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD）を発症し、NAFLDの発症は、インスリン抵抗性を更に悪化する。NAFLDの肝脂質の殆どは、肝臓での脂質合成系の亢進に由来し、又、NAFLD肝での脂肪酸酸化は低下する。そのため、合成された過剰なTgは代謝されずに、コレステロールと共に、Tgが肝細胞の脂肪滴に蓄積される。更に、長期に亘る高インスリン血症状態は、肥満関連代謝疾患、例えば高血糖、高脂血症、高血圧と共に、NAFLD肝の繊維化や炎症を促進し、又、肝臓に過剰に蓄積したTgとコレステロールが脂肪毒性に作用して肝細胞を障害し、これらの結果、非アルコール性脂肪肝炎（non-alcoholic steatohepatitis, NASH）が発症する（非特許文献５）。１０年以上、未治療であったNAFLDの２０〜２７％がNASHに進行し、NASH状態からは、肝硬変や肝不全、肝臓癌が非常に高率で発症する。【０００６】
即ち、体重を減量し、肥満によるインスリン抵抗性を減少して高血糖、高脂血症、高血圧を改善し、肝臓のTg及びコレステロール含量を減少してNAFLDを改善することにより、NASHの発症を防ぎ、NASHを改善することが可能となる。事実、１０％の体重減量により、NASHの特徴である繊維化が減少することが示されている（非特許文献６）。【０００７】
Helz2のクローニング
本発明の発明者は、yeast two-hybrid法により、核内転写因子で、代謝調節のマスターレギュレーターとして作用する人PPARγ蛋白のDNA結合領域に結合する、当時は機能未知な蛋白としてHelz2 （別名、PDIP1）をcloningした（非特許文献７）。Helz2は特定の核内転写因子に対して遺伝子活性を調節する転写共役因子である。【０００８】
Helz2発現と肝臓
マウスでのHelz2は、代謝を調節する臓器の中では肝細胞に最も強く発現しており、次いで脂肪（白色脂肪・褐色脂肪）細胞にも肝臓の１／２以下の発現量で認められるが、筋肉、脳視床下部での発現は殆ど認められず、Helz2はヒトの臓器でも同様の発現パターンを示し、肝臓に強く発現する。これらの臓器において、Helz2の発現が摂食による影響を受けるのは、肝臓だけである。又、高脂肪食飼育による肥満マウスは、食欲亢進を示すヒト肥満のモデル動物であり、肥満の程度が強くなると、インスリン抵抗性を示す脂肪肝となり、その脂肪肝ではHelz2の発現が高まっている。【０００９】
Helz2作用と食欲
肥満は食欲増加と、エネルギー消費減少の結果として起こる。レプチンは末梢の脂肪細胞が増大するのに比例して血中に分泌され、摂食を制御する中枢の脳視床下部に作用して食欲を低下させる。しかし、脂肪細胞が増大するヒト肥満では血中レプチン濃度は高いが、中枢性レプチン抵抗性が生じており、摂食量は低下しない。又、ヒト肥満と同様に、高脂肪食による肥満マウスでも血中レプチン濃度は上昇するにも拘わらず、中枢性レプチン抵抗性のため摂食量は減少しない。ところが、脳視床下部にはHelz2発現を殆ど認めないので、Helz2欠損（ノックアウト）となったマウスでも中枢性レプチン抵抗性が持続され、血中レプチン濃度は高いが、摂食量は減少しない（非特許文献８）。【００１０】
Helz2作用と脂肪肝
高脂肪食による肥満マウスでは、早期にはインスリン抵抗性による高インスリン血症と高血糖を認め、長期には高血糖に加えヒトの肝臓で認められるNAFLDに類似する脂肪肝を認める。肥満を伴うヒトのNAFLD肝臓では、肥満マウス脂肪肝と同様、Helz2発現量は明らかに増加していた（非特許文献８）。【００１１】
一方、高脂肪食飼育下にも拘わらず、Helz2欠損マウスでは、肥満により惹起されるインスリン抵抗性が減少して、高インスリン血症及び高血糖は低下した。更に、長期に渡る高脂肪食摂食でも、Helz2欠損マウスでは、肝臓での脂質合成は低下し、脂肪酸酸化は増加してエネルギー消費が亢進する結果、肝臓のTg含量は低下し、脂肪肝は明らかに改善して、体重も減少した。又、Helz2欠損マウスの褐色脂肪乃至は白色脂肪では、脂肪酸酸化亢進によるエネルギー消費マーカーの脱共役蛋白質（uncoupling protein, UCP）-1乃至はUCP-2/3の発現増加を認めず、それらのエネルギー消費亢進の結果生じる体温上昇も認めなかった。更に、Helz2欠損マウスの筋肉でも、脂肪酸酸化の亢進を認めず、運動量も変化しなかった。これらの成績は、Helz2欠損状態では末梢の肝臓を中心として、エネルギー消費亢進が惹起され、体重減少が起こる事を示している（非特許文献８）。【００１２】
又、12週間のメチオニン・コリン欠乏食飼育の雄マウス肝臓では、ヒトで認められるNASH所見が誘導されるが、同じ欠乏食飼育でも雄Helz2欠損マウスではNASHの肝機能障害マーカーは明らかに減少し、NASHは改善した。一方、低脂肪食による非肥満マウスにおいては、Helz2の欠損は血中インスリン並びに血糖値に影響を及ぼさなかった（非特許文献８）。【００１３】
Helz2作用と肝臓Leprb 
Helz2欠損により変動する分子を探索するため、肝臓のcDNA microarray解析を行い、Helz2欠損マウスの肝臓ではレプチン受容体完全型（Leptin receptor long form, Leprb）の発現量が著明に増加していることを認めた（非特許文献８）。一方、脳視床下部のLeprb発現には変化を認めなかった。又、肥満マウスでは脂肪肝が増大するに従って肝臓のHelz2発現は増加し、それに伴い肝臓のLeprb発現は低下した。逆に、肥満マウスの脂肪肝で、Helz2の発現を低下させると、肝臓のLeprb発現は増加した（非特許文献８）。次いで、肝臓のLeprbの下流シグナルにはAMP-activated protein kinase (AMPK)が局在しており、Leprbの活性作用にはその燐酸化が重要であることが判明した。更に、培養肝細胞におけるレプチン受容体プロモーター（Leptin receptor promoter）活性は、Helz2作用が低下（転写共役因子作用の低下）すると、促進されることが判明した。（非特許文献８）。【００１４】
Helz2の作用機構
これらの成績により、肝臓でのHelz2作用が低下すると、遺伝子転写調節が変化して、レプチン受容体プロモーターが活性化されて肝臓でのLeprb発現が高まり、次いで、下流シグナルのAMPKが活性化され、肥満により生じるインスリン抵抗性が低下し、肥満関連代謝疾患、例えば高血糖や脂肪肝が改善され、食欲は低下しないが、エネルギー消費が亢進して体重が減少することが明らかになった。【００１５】
インスリン抵抗性改善と既存薬剤
臨床で現在、使用されている血糖降下を示す、既存の経口小分子化合物薬剤の中で、インスリン抵抗性改善作用を有し、インスリン依存性に高血糖を下げる薬剤として、メトフォルミンとピオグリタゾンがある（非特許文献２）。又、インスリン抵抗性を示す肥満関連代謝疾患の中で、特に、NAFLD並びにNASHを改善する薬剤としてピオグリタゾンがあり、他の薬剤の開発もなされている（非特許文献５）。しかし、Helz2に結合して、その作用を低下させることにより、インスリン抵抗性を抑制し、肥満関連代謝疾患の改善を示す薬剤は提供されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】肥満症診療ガイドライン 2016、日本肥満学会  ライフサイエンス出版株式会社 2016.
【００１７】
【非特許文献２】Regulation of hepatic glucose metabolism in health and disease. Nature Rev Endocrinol 13: 572-587, 2017.
【００１８】
【非特許文献３】Hepatokine: linking nonalcoholic fatty liver disorder and insulin resistance, Nature Rev Endocrinol 13: 509-520, 2017.
【００１９】
【非特許文献４】Selective versus total insulin resistance: a pathogenic paradox. Cell Metab 7: 95-96, 2008.
【００２０】
【非特許文献５】Mechanisms of NAFLD development and therapeutic strategies. Nature Medicine 24: 908-922, 2018.
【００２１】
【非特許文献６】Weight loss through lifestyle modification significantly reduces features of nonalcoholic steatohepatitis. Gastroenterology 149: 367-378, 2015.
【００２２】
【非特許文献７】Isolation and characterization of a transcriptional cofactor and its novel isoform that binds the deoxyribonucleic acid-binding domain of peroxisome proliferator-activated receptor-γ. Endocrinology 147: 377-388, 2006.
【００２３】
【非特許文献８】Protection against high-fat diet-induce obesity in Helz2-defiecient male mice due to enhanced expression of hepatic leptin receptor. Endocrinology 155: 3459-3472, 2014.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
本発明は、上記のような従来の現状に鑑みてなされたものであり、Helz2はヒトでもマウスでも肝臓に強く発現しており、又、肥満関連代謝疾患であるヒトNAFLD肝臓や肥満マウス脂肪肝でのHelz2発現量は有意に増加するので、Helz2に結合してその作用を低下させることにより肥満関連代謝疾患の改善を示す、小分子化合物を有効成分とする薬剤を提供することを目的としてなされた。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
上記目的を達成するために本発明が提供する肥満関連代謝疾患の改善剤の構成は、グアナベンズ又はその塩を有効成分とすることを特徴とするものである。【００２６】
又、グアナベンズの塩としては、例えば酢酸塩を挙げることができる。【００２７】
尚、本発明が改善の対象とする肥満関連代謝疾患は、グアナベンズ又はその塩が高親和性でHelz2に結合してその活性を低下させることにより、肥満関連代謝疾患の改善を示すものである。【００２８】
上記肥満関連代謝疾患としては、例えば２型糖尿病、脂肪肝、脂質異常症、高血圧、高尿酸血症・痛風、冠動脈疾患、脳梗塞、肥満関連腎臓病が挙げられ、肥満及び、又はインスリン抵抗性に基因するものが好ましい。又、本発明の肥満関連代謝疾患の改善剤の薬効としては、特に食欲を低下させずに抗肥満作用及び抗脂肪肝作用を示すことができる。尚、前記脂肪肝としては非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）及び非アルコール性脂肪肝炎（NASH）を含む。【００２９】
即ち、本発明の発明者は、これまでの肥満関連代謝疾患の発症に関わるHelz2の作用についての研究成果を踏まえて、肥満関連代謝疾患の改善剤の探索と薬理効果の解析を行った。具体的には、本発明の発明者は、1,200の小分子化合物の中から、Helz2蛋白に高〜中親和性で結合・乖離する小分子化合物を選定し、次に、培養肝細胞におけるLeprb発現亢進を指標にしてHelz2作用低下を示す小分子化合物を特定し、更に、その小分子化合物を、インスリン抵抗性を示す脂肪肝を伴う肥満マウスに経口投与することにより、肥満関連代謝疾患の改善作用を解析することにより本発明を完成した。
【発明の効果】
【００３０】
本発明により、Helz2に結合してその作用を低下させる経口小分子化合物が選定され、これを有効成分とする肥満関連代謝疾患の改善剤が開発された。本発明の肥満関連代謝疾患の改善剤は、インスリン抵抗性を低下させて、肥満及び、又はインスリン抵抗性に基因する肥満関連代謝疾患の改善剤であることが好ましい。
本発明の肥満関連代謝疾患の改善剤は、２型糖尿病、高血圧、高脂血症、脂肪肝等を改善し、特に、食欲を低下させずに抗肥満作用を示し、非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）及び非アルコール性脂肪肝炎（NASH）の発症を抑制・改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】HepG2培養肝細胞に、グアナベンズ酢酸塩（図1-A）又はサルブタモール（図1-B）を添加後に細胞内Leprb mRNAをqRT-PCRで測定した結果を示すグラフである。
【図２】雄マウスを高脂肪食又は低脂肪食で飼育後の経時的な体重変化を示すグラフである。
【図３】肥満マウスへのグアナベンズ酢酸塩の経口投与14日後の肝臓Leprb mRNA発現を示すグラフである。以下、同様に黒カラムが、グアナベンズ酢酸塩の投与群を示す。
【図４】肥満マウスへのグアナベンズ酢酸塩の経口投与による投与前からの体重増加量（図4-A）及び体重（図4-B）の経時的変化を示すグラフである。
【図５】肥満マウスへのグアナベンズ酢酸塩の経口投与14日後の血中レプチン濃度（図5-A）及び、経時的１日摂取量（図5-B）及び総摂食蓄積量（図5-C）の変化を示すグラフである。
【図６】肥満マウスへのグアナベンズ酢酸塩の経口投与14日後のインスリン抵抗性指数HOMA-IR index（図6-A）、血中インスリン値（図6-B）及び血糖値（図6-C）を示すグラフである。
【図７】肥満マウスへのグアナベンズ酢酸塩の経口投与14日後の膵重量（図7-A）及び膵β細胞機能の指標HOMA-βindex（図7-B）を示すグラフである。
【図８−１】肥満マウスへのグアナベンズ酢酸塩の経口投与14日後の肝臓のtriglyceride含量（Tg, 図8-A）及びcholesterol含量（Chol, 図8-B）を示すグラフである。
【図８−２】肝細胞内に蓄積した細胞当たりの脂肪量ならびに形状の変化を示す。各グループにおける、BODIPY染色陽性を示す肝細胞の代表的脂肪球図（図8-C）と、染色陽性細胞面積（図8-D）及び染色陽性細胞サイズ（図8-E）を示すグラフである。G剤投与とは、グアナベンズ酢酸塩投与を意味する。
【図９】肥満マウスへのグアナベンズ酢酸塩の経口投与14日後の肝臓（図9-A）及び心臓（図9-B）の各重量変化を示すグラフである。
【図１０】肥満マウスへのグアナベンズ酢酸塩の経口投与14日後の血中chylomicron-triglyceride （CM-Tg,図10-A）, very low density lipoprotein-triglyceride （VLD-Tg, 図10-B）, low density lipoprotein-cholesterol （LDLc, 図10-C）, high density lipoprotein-cholesterol （HDLc, 図10-D）値を示すグラフである。
【図１１】肥満マウスへのグアナベンズ酢酸塩の経口投与14日後の脾臓（図11-A）及び腎臓（図11-B）の各重量変化を示すグラフである。
【図１２】肥満マウスへのグアナベンズの経口投与14日後の腸管膜脂肪（図12-A）、精巣周囲脂肪（図12-B）、全内蔵脂肪（図12-C）、ヒラメ筋（図12-D）、足底筋（図12-E）及び腓腹筋（図12-F）の各重量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明の代謝調節障害改善剤の有効成分であるグアナベンズは、式
【化１】
0006978126.tif 000002
で表され、中枢性のα2-アドレナリン受容体作動薬として作用し、心臓に対しては交感神経作用を減弱して血圧を低下し、末梢血管抵抗を改善する高血圧治療薬として臨床で使用されている公知化合物である。尚、グアナベンズのα2-アドレナリン受容体に対するKi値は7x10-9Mである。
【００３３】
上記グアナベンズの分子式はC8H8Cl2N4で、分子量は291.1であり、International Union of Pure and Applied Chemistryによる名称は2-{[（2,6-dichlorophenyl）methylidene] amino}guanidineである。又、グアナベンズの血中半減期は４．３〜６．４時間で、消化管からの吸収率は約７５％であり、殆どが肝臓で代謝される。
【００３４】
本発明の肥満関連代謝疾患の改善剤は、上記グアナベンズ或いは例えばその酢酸塩等の塩を有効成分とし、単独で或いは製剤上許容される他の成分と共に、適宜の剤型に製剤される。
【００３５】
本発明の肥満関連代謝疾患の改善剤は、医薬組成物として用いられる剤型であってよく、例えば、錠剤（口腔内崩壊錠を含む）、カプセル剤、徐放剤、腸溶剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、トローチ剤、座薬剤、注射剤、又は経皮吸収剤として公知の方法により各製剤を製造すればよい。製剤の製造においては、各国の規制や規定に基づいて製剤してよく、最新の日本薬局方、例えば、第十七改正日本薬局方に基づいて製剤することができる。
これら医薬製剤に含まれる添加剤は、特に限定されるものではなく、一例として、デンプン、マンニトール、乳糖等の賦形剤；カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース等の結合剤；結晶セルロース、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤；タルク、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤；軽質無水ケイ酸等の流動性向上剤等を適宜組み合わせて用いることができる。
また、医薬製剤として、注射剤等の液剤とすることもでき、例えば、界面活性剤や分散剤等を含む生理食塩水や蒸留水等に分散化又は可溶化した製剤であってもよく、必要時に都度分散化又は可溶化する凍結乾燥製剤であってもよい。液剤においては、ｐＨ調整剤や安定化剤が添加されていてもよい。
【００３６】
本発明の肥満関連代謝疾患の改善剤の投与方法は、対象となる肥満関連代謝疾患の症状や患者に適合して適宜設定することができる。
投与量は、通常１日に０．０１〜１０００ｍｇの範囲内で投与してよく、当該範囲内で、０，１ｍｇ以上、１ｍｇ以上、あるいは５００ｍｇ以下、２００ｍｇ以下、１００ｍｇ以下、５０ｍｇ以下、２０ｍｇ以下であってもよい。
投与回数も特に限定されず、１日1回であってもよく、1日複数回投与してもよい。また、1日以上間隔をあけて投与してもよい。投与するタイミングも、食前、食後、食中等適宜設定される。
投与経路も特に限定されず、経口剤、点鼻剤、口腔用剤、膣用剤、座剤、注射剤等の剤型により投与可能であり、経口投与又は非経口投与され、非経口投与としては、例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、組織内、鼻腔内、皮内、脳内、直腸内、膣内、腹腔内投与等が挙げられる。注射剤として投与される場合、１ショットで投与されてもよく、点滴投与されてもよい。
投与される患者も特に限定されないが、ヒトに投与することが好ましい。
【００３７】
本発明においては、それを必要とする患者に対して治療学的に有効量のグアナベンズ又はその塩を投与して、肥満関連代謝疾患の改善方法であってもよい。
本発明において、それを必要とする患者に、グアナベンズ又はその塩を含有する肥満関連代謝疾患の改善剤を投与することができる。
肥満関連代謝疾患の改善剤は、肥満関連代謝疾患の予防又は治療剤であり得、肥満関連代謝疾患の改善方法は、肥満関連代謝疾患の予防又は治療方法であり得る。
本発明においては、以下の発明も提供する。
肥満関連代謝疾患の改善のためのグアナベンズ又はその塩。
肥満関連代謝疾患の予防又は治療のためのグアナベンズ又はその塩。
肥満関連代謝疾患の改善のためのグアナベンズ又はその塩の使用。
肥満関連代謝疾患の予防又は治療のためのグアナベンズ又はその塩の使用。
肥満関連代謝疾患を改善するための医薬組成物／医薬製剤の調整／製造のためのグアナベンズ又はその塩の使用。
肥満関連代謝疾患を予防又は治療するための医薬組成物／医薬製剤の調整・製造のためのグアナベンズ又はその塩の使用。
本明細書で記載する各発明における肥満関連代謝疾患としては、インスリン抵抗性に基因する肥満関連代謝疾患であってもよく、及び、又は肥満に基因する肥満関連代謝疾患であってもよい。本発明における、肥満関連代謝疾患としては、特に限定されるものではないが、例えば、耐糖能障害或いは糖尿病、脂質異常症、高血圧、高尿酸血症或いは痛風、冠動脈疾患、脳梗塞、脂肪肝、肥満関連腎臓病等が挙げられる。肥満関連代謝疾患として、中でも、脂肪肝が好ましく、非アルコール性脂肪性肝疾患や非アルコール性脂肪肝炎であってもよい。本発明においては、インスリン抵抗性に基因する及び、又は肥満に基因する肥満関連代謝疾患として、脂肪肝であってもよく、インスリン抵抗性に基因する及び、又は肥満に基因する脂肪肝であってもよく、これらの脂肪肝として、非アルコール性脂肪性肝疾患や非アルコール性脂肪肝炎であってもよい。
これら各種肥満関連代謝疾患の改善剤は、食欲を低下させずに抗肥満作用を示してもよく、メタボリック症候群を含む肥満関連代謝疾患の改善剤であってもよい。
本発明においては、肥満関連代謝疾患の改善に用いられる、あるいは、予防又は治療に用いられるグアナベンズの塩として、特に限定されないが、グアナベンズ酢酸塩であること好ましい。
【００３８】
本発明の肥満関連代謝疾患の改善剤は、肥満関連代謝疾患に用いられることが知られた他の薬剤と、併用してもよく、合剤としてもよい。併用して用いる場合、キット製剤であってもよいし、それぞれ独立した医薬製剤であってもよいし、合剤であってもよい。
肥満関連代謝疾患に用いられることが知られた他の薬剤については、特に限定されるものではなく、耐糖能障害或いは糖尿病、脂質異常症、高血圧、高尿酸血症或いは痛風、冠動脈疾患、脳梗塞、脂肪肝（非アルコール性脂肪性肝疾患や非アルコール性脂肪肝炎を含む）、肥満関連腎臓病の予防又は治療に用いることができることが知られた薬剤を用いてよい。
【００３９】
又、その投与形態としては、
グアナベンズ或いはその酢酸塩単剤の錠剤（口腔内崩壊錠を含む）、カプセル剤、徐放剤、腸溶剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、又はトローチ剤による経口投与
グアナベンズ或いはその酢酸塩の座薬剤、注射剤、又は経皮吸収剤による非経口投与
グアナベンズ或いはその酢酸塩及びメトフォルミン剤との配合剤の上記投与形態による投与
グアナベンズ或いはその酢酸塩及びピオグリタゾン剤との配合剤の上記投与形態による投与
グアナベンズ或いはその酢酸塩及びジペプチジルペプチダーゼ４阻害薬との配合剤の上記投与形態による投与
グアナベンズ或いはその酢酸塩及びα−グルコシダーゼ阻害薬との配合剤の上記投与形態による投与
グアナベンズ或いはその酢酸塩及びsodium/glucose cotransporter2阻害薬との配合剤の上記投与形態による投与
グアナベンズ或いはその酢酸塩及びスルフォニールウレア系薬との配合剤の上記投与形態による投与
グアナベンズ或いはその酢酸塩及びグリニド系薬との配合剤の上記投与形態による投与
グアナベンズ或いはその酢酸塩及びglucagon-like peptide-1アナログ又はその受容体作動薬との配合剤の上記投与形態による投与
を例示することができるが、これらに限定されるものではない。
【実施例】
【００４０】
手法
1.Helz2に結合する小分子化合物のhigh-throughput screening
Helz2発現ベクター（p3xFLAG-CMV10-pDIP2）を用いて、HEK293細胞でHelz2を発現させ、Helz2蛋白を精製した。次に、アメリカ食品医薬品局で承認されている1,200の小分子化合物を固定してあるアレイを用いて、Helz2に結合する小分子化合物を表面プラズモン共鳴法でhigh-throughput screening assayを行い（Flexera Japan KK, Tokyo）、Helz2に結合・解離する低分子化合を選定した。【００４１】
2.培養肝細胞Leprb発現を促進する小分子化合物の特定
小分子化合物の結合によりHelz2の作用が低下すると、Leprb遺伝子発現が促進されるので、培養肝細胞でのLeprb遺伝子発現増加を指標に、Helz2に結合する小分子化合物をスクリーニングした。Helz2に高〜中親和性で結合・乖離を示す小分子化合物（Sigma-Aldrich社）の各々を、最終濃度が10-9〜10-7 Mになる様に希釈して、培養肝細胞株HepG2細胞（6well plateで105cells/well）に添加した。37℃で24〜48時間培養し、培養肝細胞のLeprb遺伝子発現をquantitative real time polymerase chain reaction （qRT-PCR, TaqMan Gene expression assays LEPRB probes使用）法で測定した。【００４２】
3.小分子化合物経口投与による肝臓Leprb発現
生後6週齢の雄マウス（C57BL6J）を高脂肪食（脂肪含量60 kcal%, Research diet社）又は低脂肪食（脂肪含量10.5 kcal%, 日本クレア社）で18週間飼育した。その後、高脂肪食摂食による肥満マウスを２群に分け、一方は生理食塩水0.3 mLを、他方は生理食塩水で溶解した小分子化合物液0.3 mLを、マウス用胃チューブを用いて経口投与した。経口投与は14日間連日18:00の消灯前30分の間に行った（6:00点灯、12時間明暗サイクル、室温22℃）。15日後には9:00に絶食を開始し、14:00にイソフルランで麻酔後、腹部下大静脈より採血し（血糖は尾状脈血で測定）、各臓器の重量を測定後、臓器を-80℃で保管した。肝臓のLeprb発現をqRT-PCR法で測定した。【００４３】
4.小分子化合物経口投与による体重の経時的変化
生理食塩水投与及び小分子化合物投与におけるマウスの体重を、各投与前に連日18:00前に測定した。【００４４】
5.小分子化合物経口投与による血中レプチン濃度及び摂食量の変化
生理食塩水投与及び小分子化合物投与における、血中レプチン濃度をマウスレプチンELISAキット（森永生化学研究所）で測定した。又、個々のマウスの1日摂食量を、投与前に連日18:00に測定した。【００４５】
6.小分子化合物経口投与によるインスリン抵抗性と血糖値の変化
生理食塩水投与及び小分子化合物投与における空腹時血糖をグルコースオキシダーゼ酵素電極法により、血中インスリン濃度をマウスインスリンELISAキット（森永生化学研究所）で測定した。マウスのインスリン抵抗性をHomeostatic model assessment of insulin resistance （HOMA-IR） [insulin （mU/L） x 血糖 （mM） ÷22.5] index （x100）で示した（Brit J Nutr 101: 701-708, 2009）。【００４６】
7.小分子化合物経口投与による膵臓重量と膵β細胞機能の変化
生理食塩水投与及び小分子化合物投与における膵臓の重量を測定した。又、マウスの膵β細胞機能をHomeostatic model assessment-β cell function （HOMA-β） { [insulin（mU/L） x 20] ÷[血糖 （mM）- 3.5] } index （x100）で示した（Brit J Nutr 101:701-708, 2009）。【００４７】
8.小分子化合物経口投与による肝臓の脂質含量の変化
生理食塩水投与及び小分子化合物投与における肝臓のTg,及びChol含量をLipoSEARCH法（スカイライト・バイオテック社）で測定した。【００４８】
また、肝細胞内に蓄積した細胞当たりの脂肪量ならびに形状の変化を可視化し数値化するために、BODIPYによる脂肪球蛍光染色（励起光、493 nm； 蛍光、503 nm）を行った。各グループのマウス肝細胞当たり、10視野の染色陽性面積並びに染色陽性細胞サイズを測定した。図8-D, Eにおける、各グループ間の有意差検定にはANOVAを用いた（****. P<0.001）。【００４９】
9.小分子化合物経口投与による肝臓及び心臓の重量変化
生理食塩水投与及び小分子化合物投与における肝臓及び心臓の各重量を測定した。【００５０】
10.小分子化合物経口投与による血中の脂質濃度の変化
生理食塩水投与及び小分子化合物投与における空腹時血中CM-Tg, VLDL-Tg, LDLc, 及びHDLc濃度をLipoSEARCH法で測定した。【００５１】
11.小分子化合物経口投与による脾臓及び腎臓の重量変化
生理食塩水投与及び小分子化合物投与における脾臓及び腎臓の各重量を測定した。【００５２】
12.小分子化合物経口投与による脂肪及び筋肉の重量変化
生理食塩水投与及び小分子化合物投与における、代謝障害を惹起する内臓脂肪量および筋肉（右側）量を測定した。【００５３】
13.有意差検定
各群は平均値±標準誤差で示した。２群間の有意差検定には、paired Student’s t testを用い、３群以上の多群間の有意差検定には、two-way ANOVA followed by Bonferroni’s testを用いた。【００５４】
結果
1.Helz2に結合する小分子化合物のhigh-throughput screening
Helz2に結合・解離する1,200の小分子化合物を解析した。その結果、高〜中親和性（KD値 10-9〜4.9x10-7M）で結合・解離する１４の小分子化合物（アミフォスチン水和物／Amifostine trihydraye, ブロムフェニラミンマレイン酸塩／Brompheniramine maleate, クレマスチンフマル酸塩／Clemastine fumarate, フェンベンダゾール／Fenbendazole, グアナベンズ酢酸塩／Guanabenz acetate, ロペラミド塩酸塩／Loperamide hydrochloride, ピレンペロン／Pirenperone, リトドリン塩酸塩／Ritodrine hydrochloride, リバスティグミン酒石酸塩／Rivastigmine tartrate, サルブタモール／Salbutamol, シブトラミン塩酸塩／Sibutramine hydrochloride, スルバクタム／Sulbactam, ボリコナゾール／Voriconazole, ゾキサゾラミン／Zoxazolamine）を選定した。他の小分子化合物のKD値は5x10-7 M以上の低親和性を示した。【００５５】
2.培養肝細胞Leprb発現を促進する小分子化合物グアナベンズの特定
培養肝細胞に添加した上記１４種類の各小分子化合物により濃度依存性にLeprb発現が増加することを、Helz2作用低下の指標にして、１つの小分子化合物候補であるグアナベンズ酢酸塩を特定した（図1-A）。そのHelz2に結合・解離するKD値は2.3x10-9 Mの高親和性を示した。一方、Helz2に対して2.2x10-7 Mの中親和性を示すサルブタモールの添加はLeprb発現に有意の影響を及ぼさなかった（図1-B）。又、グアナベンズと同様に、中枢性のα2-アドレナリン受容体作動薬として作用し血圧低下作用を示す、クロニジン塩酸塩／Clonidine hydrochloride及びメチルドパ／MethyldopaのHelz2に対するKD値は10-6M以上の低親和性であった。【００５６】
3.グアナベンズ経口投与による肝臓Leprb発現
高脂肪食摂取（N=16）14週後には雄マウスの体重は約50 gのプラトーに達し、低脂肪食摂取（N=4）の雄マウスよりも、著明な肥満を示した（図2）。グアナベンズ酢酸塩の経口投与量は人での常用量とし、又、グアナベンズ酢酸塩の血中半減期、腸管からの吸収率などを考慮して0.32 mg/kg体重マウス/日とした。18週間高脂肪食で飼育した肥満マウスへの14日間連続のグアナベンズ酢酸塩の経口投与（黒カラム、N=8）により、生理食塩水投与（白カラム、N=8）と比較して、肝臓のLeprb遺伝子発現は有意に増加した（図3）。【００５７】
4.グアナベンズ経口投与による経時的体重の変化
肥満マウスへの生理食塩水投与（白丸、N=8）では体重の変化は認めなかった（図4）。一方、グアナベンズ酢酸塩投与（黒丸、N=8）では、体重増加量は投与4日目より有意に低下し（図4-A）、又、投与8日目には有意な体重減少が認められ（図4-B）、この体重減少は投与期間中維持されていた。これらの成績は、高脂肪食状態でもグアナベンズ酢酸塩の投与により抗肥満作用が認められることを示している。【００５８】
5.グアナベンズ経口投与による血中レプチン濃度及び摂食量の変化
肥満マウスで認められる増加した血中レプチン濃度は、生理食塩水投与(白カラム、N=8)に比較して、グアナベンズ酢酸塩投与(黒カラム、N=8)により、むしろ僅かに減少したが、その濃度は非肥満マウスのレプチン濃度（2.3±0.5 ng/mL、N=4）よりも尚、10倍以上高値であった（図5-A）。肥満マウスへのグアナベンズ酢酸塩投与(黒丸、N=8)では生理食塩水投与(白丸、N=8)と比較して、投与3日目以外の１日摂食量（図5-B）の変化を認めず、総摂食蓄積量（図5-C）にも有意の変化を認めなかった。これらの成績により、常用量のグアナベンズ酢酸塩の経口投与は高脂肪食飼育下でも、食欲を低下させず、エネルギー消費亢進作用により、抗肥満作用を示す事が明らかになった。【００５９】
6.グアナベンズ経口投与によるインスリン抵抗性と血糖値の変化
高脂肪食摂取による肥満マウスにおける、インスリン抵抗性指標HOMA-IR index（図6-A）、血中インスリン値（図6-B）及び血糖値（図6-C）は、非肥満マウスの各指標（HOMA-IR index、0.65±0.12、インスリン値0.48±0.08 ng/mL、血糖値142.8±9.8 mg/dL、N=4）よりも増加していた。肥満マウスへのグアナベンズ酢酸塩の投与（黒カラム、N=8）は、生理食塩水投与（白カラム、N=8）に比較して、HOMA-IR indexを抑制し、高インスリン血症を低下し、高血糖を非肥満マウスのレベルまで減少させた。これらの成績は、グアナベンズの2週間投与は、インスリン抵抗性を著明に減少して、肥満関連代謝疾患の高血糖を改善することを示している。【００６０】
7.グアナベンズ経口投与による膵臓重量と膵β細胞機能の変化
肥満マウスの膵臓量は、非肥満マウスの膵臓量（0.34±0.01 g、N=4）より増加しており、肥満により増加した膵臓量は、生理食塩水投与（白カラム、N=8）に比較して、グアナベンズ酢酸塩投与（黒カラム、N=8）により変化しなかった（図7-A）。又、膵β細胞機能の指標であるHOMA-β indexもグアナベンズ酢酸塩投与により変化しなかった（図7-B）。これらの成績は、常用量のグアナベンズの投与は、膵β細胞機能には影響しない事を示している。【００６１】
8.グアナベンズ経口投与による肝臓の脂質含量の変化
高脂肪食摂取による肥満マウスで認められる脂肪肝（NAFLD）の肝臓Tg含量及びChol含量は、非肥満マウスの肝臓での含量（Tg含量、11.3±2.6 mg/g、Chol含量、2.5±0.1 mg/g、N=4）より著明に増加していた。これらの増加した肝臓のTg含量（図8-A）及びChol含量（図8-B）は生理食塩水の投与(白カラム、N=8)と比較して、グアナベンズ酢酸塩の投与（黒カラム、N=8）により、有意に減少した。これらの成績は、グアナベンズの2週間の経口投与でも、肥満関連代謝疾患であるTgとCholの蓄積を特徴とする脂肪肝の改善が認められることを示している。【００６２】
また、高脂肪食摂取により生じた脂肪肝はグアナベンズ酢酸塩の投与により、肝細胞当たりの脂肪量を反映する脂肪球面積及び脂肪球細胞サイズが有意に減少し（図8-C〜8-E）、グアナベンズ酢酸塩の抗脂肪肝作用が示された。【００６３】
9.グアナベンズ経口投与による肝臓及び心臓の重量変化
肥満マウスの肝臓（図9-A）と心臓（図9-B）の各重量は、非肥満マウスの各重量（肝臓、1.17±0.02 g、心臓、0.14±0.09 g、N=4）よりも増加し、これらの各重量は生理食塩水投与(白カラム、N=8)に比較して、グアナベンズ酢酸塩投与(黒カラム、N=8)により有意に減少した。これらの成績は、グアナベンズ酢酸塩の投与による脂肪肝の改善に伴って、肥満によって惹起される肝腫大は減少することを示している。又、グアナベンズ酢酸塩は中枢性α2-アドレナリン受容体作用により、肥満による心臓負担を軽減する事を示唆する。【００６４】
10.グアナベンズ経口投与による血中の脂質濃度の変化
肥満マウスの血中CM-Tg（図10-A）, VLDL-Tg（図10-B）, HDLc（図10-D）濃度は生理食塩水投与（白カラム、N=8）に比較して、グアナベンズ酢酸塩投与（黒カラム、N=8）により変化しなかったが、動脈硬化促進性に作用するLDLc濃度（図10-C）はグアナベンズ酢酸塩の投与により有意に減少した。【００６５】
11.グアナベンズ経口投与による脾臓及び腎臓の重量変化
脾臓と腎臓の各重量は生理食塩水投与(白カラム、N=8)に比較して、グアナベンズ酢酸塩投与(黒カラム、N=8)による変化を認めなかった（図11-A, B）。【００６６】
12.グアナベンズ経口投与による脂肪及び筋肉の重量変化
肥満により増加した腸管膜脂肪量（図12-A）、精巣周囲脂肪量（図12-B）、全内蔵脂肪量（図12-C）は生理食塩水投与（白カラム、N=8）に比較して、グアナベンズ酢酸塩投与（黒カラム、N=8）により変化しなかった。又、肥満マウスのヒラメ筋（図12-D）、足底筋（図12-E）及び腓腹筋（図12-F）の各筋肉重量はグアナベンズ酢酸塩投与による影響を受けなかった。これらの成績は、肥満マウスへの2週間のグアナベンズ投与により、内蔵脂肪量及び筋肉量の減少は生じないことを示している。【００６７】
尚、有意差については以下の通りである。
図１：**p<0.01
図３：*p<0.05
図４：*p<0.05, **p<0.01 
図５：*p<0.05, **p<0.01
図６：**p<0.01
図８：**p<0.01
図９：*p<0.05, **p<0.01
図１０：**p<0.01【００６８】
インスリン抵抗性改善剤の作用比較
肥満関連代謝疾患に伴うインスリン抵抗性を改善する経口薬剤（インスリン依存性）として、メトフォルミンとピオグリタゾンがある。メトフォルミンは、主に肝臓のAMPK燐酸化を活性化してインスリン抵抗性改善を示し（1）高血糖降下作用を示すが、（2）抗脂肪肝作用を示さず、（3）抗肥満作用も示さない。又、ピオグリタゾンは、Helz2と異なりPPARγ蛋白C端側の機能活性化領域-2に結合してPPARγ転写活性を高め、インスリン抵抗性を改善し（1）高血糖降下作用を示し、（2）臨床的には抗脂肪肝作用を示すが、PPARγの特異的リガンド投与は、脂肪肝をむしろ誘導するとの成績もある（Matsusue K et al; J Clin Invest 111: 737, 2003）。また、脂肪細胞の増殖作用により、むしろ（3）抗肥満作用ではなく、体重増加を来たす。一方、Helz2に結合して、その作用を低下させる小分子化合物として同定されたグアナベンズ又はその酢酸塩等の塩は、インスリン抵抗性を改善し（1）高血糖降下作用を示し、（2）抗脂肪肝作用を有し、（3）食欲を低下させずに抗肥満作用を示し、且つ、(4)高LDLコレステロール減少作用を示す。これらの肥満関連代謝疾患と、各薬剤作用の特徴を以下の表１に纏める。【００６９】
【表１】
0006978126.tif 000003
↓、低下又は軽減作用；↑、増加作用；→、変化なしを示す。
* 臨床データーに基づく【００７０】
以上の成績より、常用量のグアナベンズ又はその酢酸塩等の塩の経口投与は、従来から知られている中枢性α2-アドレナリン受容体に結合して血圧降下を示す作用に加えて、Helz2に結合してその作用を低下させ、肥満及び、又はインスリン抵抗性を改善することにより、食欲を低下させずに抗肥満作用等を示し、単剤で上記の異なる４種類の肥満関連代謝疾患に対する薬理効果（drug repositioning）を有することが明らかにされた。【００７１】
従って、グアナベンズ又はその塩を有効成分とする本発明の肥満関連代謝疾患の改善剤の投与対象疾患としては、肥満及び、又はインスリン抵抗性に基因する以下のようなものを例示することができる。
インスリン抵抗性に伴う糖尿病
肥満に伴う糖尿病
インスリン抵抗性に伴う高血圧
肥満に伴う高血圧
インスリン抵抗性に伴う高脂血症
肥満に伴う高脂血症
インスリン抵抗性に伴う脂肪肝（NAFLD及びNASH）
肥満に伴う脂肪肝（NAFLD及びNASH）
インスリン抵抗性に伴う糖尿病と高血圧、高脂血症、脂肪肝、冠動脈疾患、肥満症の全て又はいずれかの合併
肥満に伴う糖尿病と高血圧、高脂血症、脂肪肝、冠動脈疾患、肥満症の全て又はいずれかの合併
インスリン抵抗性による肥満症
肥満による肥満症
インスリン抵抗性によるメタボリック症候群（内臓脂肪増加、耐糖能異常、軽度高血圧、軽度高脂血症から成る）
肥満によるメタボリック症候群
肥満によるメタボリック症候群【００７２】
表２に示す処方（含有割合）で、第十七改正日本薬局方の製剤総則記載の公知方法に従って各種製剤を得る。【００７３】
【表２】
0006978126.tif 000004
【図１】
0006978126.tif 000005
【図２】
0006978126.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0006978126.tif 000011
【図８−１】
0006978126.tif 000012
【図８−２】
0006978126.tif 000013
【図９】
0006978126.tif 000014
【図１０】
0006978126.tif 000015
【図１１】
0006978126.tif 000016
【図１２】
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