(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シーケンシングのために二本鎖標的核酸フラグメントを調製する方法であって、
前記方法が、
a．前記標的核酸フラグメントの3’末端に第一のアダプター配列を第一のリガーゼで連結する工程、ここで、前記第一のリガーゼが平滑末端連結を実施する、及び
b．前記標的核酸フラグメントの5’末端に第二のアダプター配列を第二のリガーゼで連結する工程、ここで、前記第二のリガーゼがスプリント連結を実施する、
を含み、
前記第一のアダプター配列が、その5’末端でアデニル化されている第一の鎖と、前記第一の鎖と相補性でありかつその3’末端にジデオキシヌクレオチドを有する第二の鎖とを含む二本鎖核酸配列であり、さらに
前記第一のリガーゼがアデニル化欠損ATP依存リガーゼである、前記方法。
【請求項２】
前記第一のリガーゼがK159でアミノ酸置換を有するT4 DNAリガーゼである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記アミノ酸置換がK159Sである、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記第二のリガーゼがATP依存リガーゼである、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記第二のリガーゼが非ATP依存リガーゼである、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記第二のリガーゼがNAD依存リガーゼである、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
シーケンシングのために標的核酸フラグメントのサンプルを調製する方法であって、
前記方法が、
a．前記標的核酸フラグメントの3’末端に複数の第一のアダプター配列を第一のリガーゼで連結する工程、ここで、
前記第一のリガーゼが平滑末端連結を実施し、
前記第一のアダプター配列は、i．その5’末端の第一の可変タグ配列と、ii．前記第一の可変タグ配列の3’に位置する定常配列とを含み、
前記第一の可変タグ配列は、各標的核酸フラグメントのセンスおよびアンチセンス鎖を3’末端で別個に標識するために機能する；
b．前記連結された第一のアダプター配列の各々の定常配列に第二のアダプター配列をアニーリングさせる工程、ここで、前記第二のアダプター配列は、各第一のアダプター配列の定常配列と相補性である定常配列をその3’末端に含む；
c．前記第一のアダプター配列の第一の可変タグ配列にわたって生じたギャップをポリメラーゼで充填して、複数の第二の可変タグ配列を生じさせる工程、ここで、
前記第二の可変タグ配列の各々は、その対応する前記第一のアダプター配列の第一の可変タグ配列と相補性であり、
前記第一及び第二の可変タグ配列は前記標的核酸フラグメントのセンスおよびアンチセンス鎖をそれらの5’末端で別個に標識するために機能する；及び
d．前記標的核酸フラグメントの5’末端に、前記第二の可変タグ配列の3’末端を第二のリガーゼで連結する工程、ここで、前記第二のリガーゼがスプリント連結を実施する、
を含み、
前記第一のアダプター配列がその5’末端でアデニル化されており、さらに
前記第一のリガーゼがアデニル化欠損ATP依存リガーゼである、前記方法。
【請求項８】
前記第一のリガーゼがK159でアミノ酸置換を有するT4 DNAリガーゼがである、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記アミノ酸置換がK159Sである、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記第二のリガーゼがATP依存リガーゼである、請求項7に記載の方法。
【請求項１１】
前記第二のリガーゼが非ATP依存リガーゼである、請求項7に記載の方法。
【請求項１２】
前記第二のリガーゼがNAD依存リガーゼである、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記タグ配列の塩基が縮退性である、請求項7に記載の方法。
【請求項１４】
前記タグ配列の塩基が固定される、請求項7に記載の方法。
【請求項１５】
前記タグ配列の塩基が縮退性または固定である、請求項7に記載の方法。
【請求項１６】
前記タグ配列が3から20ヌクレオチドの長さである、請求項7に記載の方法。
【請求項１７】
シーケンシングのために標的核酸フラグメントのサンプルを調製する方法であって、
前記方法が、
a．前記標的核酸フラグメントの3’末端に複数の第一のアダプター配列を第一のリガーゼで連結する工程、ここで、
前記第一のリガーゼが平滑末端連結を実施し、
前記第一のアダプター配列は、i．その5’末端の第一の可変タグ配列と、ii．前記第一の可変タグ配列の3’に位置する第一の定常配列とを含む、ここで、前記第一の可変タグ配列は、各標的核酸フラグメントのセンスおよびアンチセンス鎖をそれらの3’末端で別個に標識するために機能する；
b．複数の第二のアダプター配列を、前記連結された第一のアダプター配列の定常および第一の可変タグ配列にアニーリングさせる工程、ここで、
前記第二のアダプター配列が、i．それらの3’末端の第二の可変タグ配列と、ii．前記第二の可変タグ配列の5’に位置する第二の定常配列とを含み、
前記第二の可変タグ配列の各々は、その対応する前記第一の可変タグ配列と相補性であり、かつ各標的核酸フラグメントのセンスおよびアンチセンス鎖をそれらの5’末端で別個に標識するために機能し、
前記第二の定常配列は、各第一のアダプター配列の第一の定常配列と相補性である；及び
c．前記標的核酸フラグメントの5’末端に、前記第二のタグ配列の3’末端を第二のリガーゼで連結する工程、ここで、前記第二のリガーゼがスプリント連結を実施する、
を含み、
前記第一のアダプター配列がそれらの5’末端でアデニル化されており、さらに
前記第一のリガーゼがアデニル化欠損ATP依存リガーゼである、前記方法。
【請求項１８】
前記第一のリガーゼがK159でアミノ酸置換を有するT4 DNAリガーゼがである、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記アミノ酸置換がK159Sである、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記第二のリガーゼがATP依存リガーゼである、請求項17に記載の方法。
【請求項２１】
前記第二のリガーゼが非ATP依存リガーゼである、請求項17に記載の方法。
【請求項２２】
前記第二のリガーゼがNAD依存リガーゼである、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記タグ配列の塩基が縮退性である、請求項17に記載の方法。
【請求項２４】
前記タグ配列の塩基が固定される、請求項17に記載の方法。
【請求項２５】
前記タグ配列の塩基が縮退性又は固定である、請求項17に記載の方法。
【請求項２６】
前記タグ配列が3から20ヌクレオチドの長さである、請求項17に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全ゲノムシーケンシング（sequencing）、全エクソームシーケンシング、標的照準再シーケンシング、シーケンシングに依拠するスクリーニングアッセイ、メタゲノミクス、またはNGS用サンプル調製が要求される任意の他の応用のための次世代DNAシーケンシング（NGS）ライブラリーの構築に関する。
【背景技術】
【０００２】
次世代シーケンシング（NGS）は分子生物学で非常に強力なツールとして発展し、複数の分野（例えばゲノム識別、遺伝子検査、薬剤発見、および疾患診断）における急速な進捗を可能にした。この技術は進歩を続けているので、一度に配列決定できる核酸の量は増え続けている。このことは、研究者がより大量のサンプルの配列を決定するだけでなくサンプル当たりの読取り（read）数を増加させることを許容し、当該サンプル内の小さな配列変動の検出を可能にする。
NGSプロセッシングの量および複雑性は増加しているので、実験誤差率も増加している。この誤差の多くはシーケンシング工程およびプロセッシング工程で生じるが、それらはまたサンプル調製工程中にも生じ得る。このことは、特に、均一な態様で断片化されたサンプルの各フラグメント（ライブラリーフラグメント）の末端にアダプター配列を接着させ、読み取り可能なNGSライブラリーにサンプルを変換する時に言えることである。
次世代シーケンシング（NGS）の実行中に生じ得るいくつかのタイプの誤差があり、真の希少変種（例えば患者に存在する希少な対立遺伝子または変異）とシーケンシングおよび/またはサンプル調製から生じる誤差との間の弁別を可能にすることは重要である。特に問題があるのは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によるライブラリー増幅前に、ライブラリー構築中に導入される誤差である。そのような誤差はPCR中に増殖し、誤差を含む配列の多数のコピーを生じて誤差と真の変種との間の区別を困難にさせる。これを克服するために用いられる一般的な対策はコンセンサス呼出しであり、それによって、ただ1つのオリジナルフラグメントのPCRコピーである配列読取りは一緒にグループ分けされ、他のオリジナルフラグメントに由来し配列がオーバーラップする類似のコピーグループと比較される。変動が1つのクローングループに存在し他には存在しない場合、当該変動はおそらくPCRによって増殖した誤差であり、他方、いくつかのグループに存在する変動はおそらく真の変種である。この分析を実施するためには、1つの分子に由来するクローンと別の分子に由来するクローンとの間を弁別する能力が要求される。
【０００３】
本明細書で用いられる“フラグメント”、“標的フラグメント”または“挿入物”という用語は、DNAサンプルの断片化から生じたDNAフラグメントを指し、前記はNGSライブラリーへと処理され、配列が決定される。これらのフラグメントのプロセッシングは通常、末端修復およびA-テール付加、その後のシーケンシングアダプターの添加および増幅を含む。
本明細書で用いられる“カバー範囲の深さ”、“カバー範囲深度”または“標的カバー範囲”という用語は、ゲノム標的にマッピングされる配列決定済みDNAフラグメント（すなわち読取り）の数を指す。標的領域のカバー範囲が深ければ深いほど（すなわち領域が配列決定される回数が多ければ多いほど）、シーケンシングアッセイの信頼性および感度は高い。概して、低頻度の配列変動の検出には、500−1000Xまたはそれより高いカバー範囲深度がしばしば要求される。
本明細書で用いられる“アデニル化されている”または“前アデニル化されている”は、DNAの1つの鎖が、ピロリン酸結合を介してその5’末端リン酸に共有結合されたアデノシン5’一リン酸（AMP）を有する状態を指す。本明細書で用いられる“アデニル化する”または“アデニル化”という用語は、タンパク質側鎖にまたはDNA鎖の5'末端リン酸にAMPを共有結合させるプロセスを指す。本明細書で用いられる“アデニル基”という用語は、タンパク質側鎖および/またはDNA鎖と共有結合した、またはそれらの間で移しかえられるAMPを指す。
【０００４】
本明細書で用いられる“コンセンサス配列”という用語は、1つのファミリー配列内の多数の配列を比較することによって得られる配列を指す。当該ファミリー内のいくつかの配列には存在するが大半の配列には存在しない配列変動を誤差と呼び、続いて分析から除去することができる。他方、1つのファミリー内の大半の配列に存在する配列変動は、分析されているオリジナルな遺伝材料に存在していた真の変種と呼ぶことができる。本明細書で用いられる“コンセンサス呼出し”という用語は、遺伝的変動が真の変動かまたは誤差であるか否かを決定するプロセスを指す。
本明細書で用いられる“変種呼出し”という用語は、配列がオリジナルサンプルに由来する真の変種でありしたがって分析で用いられるか、または処理誤差の結果であり廃棄されるかを決定するプロセスを指す。
本明細書で用いられる“ファミリー”という用語は複数の読取りの1つのグループを指し、当該複数の読取りは同じ開始終止部位および/またはUMIを有するということに基づいて重複物であると決定される。変種呼出しでは、多数のクローンを有する大きなファミリーが所望される。なぜならば、それらを用いて、少ししかクローンを含まないファミリーよりも強力なコンセンサス配列を形成することができるからである。1つまたは2つのクローンを含む非常に小さなファミリーサイズについて、コンセンサスを呼び出すことは不可能であり、潜在的に重要なデータの廃棄をもたらす。
【０００５】
本明細書で用いられる“重複排除”または“デデュープ（dedup）”という用語は、重複物であると決定される読取りを分析から除去することを指す。読取りは、それらが同じ開始終止部位および/またはUMI配列を共有する場合、重複物と決定される。重複排除の1つの目的は、コンセンサス配列を作出することであり、それによって誤差を含むそれら重複物は分析から除去される。重複排除の別の目的はライブラリーの複雑性を概算することである。本明細書で用いられるライブラリーの“複雑性”または“サイズ”は、固有でオリジナルなフラグメントを表し、分析配列にマッピングされる個々の配列の読取りの数を指す。
本明細書で用いられる“開始終止部位”または“フラグメント末端”という用語は、シーケンシングアダプターに直接連結されるせん断ライブラリーフラグメントの5’および3’末端配列を指す。開始終止部位を用いて、2つの類似配列が別々の分子に由来するか、または同じオリジナルフラグメントのクローン化コピーであるかを決定できる。異なるオリジナルフラグメントが同じ開始終止部位をもつためには、それらを生じるせん断事象が正確に同じ部位を切断している必要があり、それは低い確率を有する。他方、クローンは同じ開始終止部位を有するはずである。したがって、同じ開始終止部位を共有する任意のフラグメントは、（ランダムせん断のために）通常は重複物と考えられる。本明細書で用いられる“位置に基づく”という用語は、読取りが別のものの重複物であるか否かを決定するための基準として終止開始部位を使用することを指す。
【０００６】
本明細書で用いられる“開始終止コリジョン（start stop collision）”という用語は、同じ開始終止部位を含む多数の固有フラグメントの発生である。開始終止コリジョンの希少性のために、それらは通常、非常に多数の読取りによる超深度シーケンシングを実施するとき（例えば低変種検出を実施するとき）または小さなサイズ分布を有するDNAサンプル（例えば血漿DNA）を用いて作業するときにのみ観察される。したがって、それらのシナリオでは開始終止部位では十分ではないかもしれない。なぜならば、重複排除工程で重複物と誤解して固有のフラグメントを除去するというリスクを誤って冒してしまうことがあり得るからである。これらの事例では、ワークフローへのUMIの取り込みが多数の複雑性を潜在的にレスキューし得る。
本明細書で用いられる“UMI”または“固有分子識別子”は縮退または多様な塩基の配列から成るタグを指し、前記はせん断された核酸サンプルのオリジナル分子を標識するために用いられる。理論上、作成できる種々のUMI配列の数は極めて多いので、2つのオリジナルフラグメントが同じUMI配列を有することはない。したがって、UMIを用いて、2つの類似する配列の読取りが各々異なるオリジナルフラグメントに由来するのか、またはそれらはライブラリーのPCR増幅時に生じる単なる重複物（それらは同じオリジナルフラグメントに由来した）であるかを決定することができる。
【０００７】
UMIは、開始終止部位と組合わせて用いられるとき、希少配列変種のコンセンサス呼出しのために特に有用である。例えば、2つのフラグメントが同じ開始終止部位を有するが、異なるUMI配列を有する場合、そうでなかった場合に同じオリジナルフラグメントから生じた2つのクローであると考えられたであろうものが、固有の分子と正しく呼ばれることができよう。したがって、開始終止部位と組合わせたUMIの使用は、開始終止部位のみを用いて重複物と標識されたしまったであろう固有のフラグメントを、それらが異なるUMIを有するために互いに固有であると標識されるのでしばしばカバー範囲数の急上昇をもたらす。それはまた、偽陽性を除くことによって陽性的中率の向上に役立つ。UMIを用いるコンセンサス呼出しを介してのみ見出され得るいくつかの希少な変種が存在するので、従来UMIについては多くの需要がある。
“PPV”または陽性的中率は、固有として呼び出される配列が実際に固有である確率である。PPV＝真の陽性/(真の陽性＋偽陽性)。“感度”は、固有である配列が固有として呼び出される確率である。感度＝真の陽性/(真の陽性＋偽陰性)。
【０００８】
ライブラリー構築中に生じる2つの誤差（それらは本発明によって減少する）は、（1）フラグメントキメラおよび（2）アダプターダイマーの生成である。
フラグメントキメラは、アダプター配列無しにライブラリーフラグメントが互いに連結し合う結果であり、互いに並置し合う無関係の配列を含むより長いフラグメントをもたらす。したがって、これらの無関係の配列は連続配列として誤って読み取られよう。したがって、ライブラリー構築時のフラグメントキメラ生成を抑制することは、下流のシーケンシング誤差を減少させるために重要である。
アダプターダイマーは、ライブラリー挿入配列無しにアダプターが自己連結する結果である。これらのダイマーは非常に効率よくクラスターを形成し、反応効率を低下させ、フロー細胞で貴重な空間を消費する。このことは、ピコグラム範囲の超低DNAインプット量を取り扱うときに特に問題となる。そのような低DNAインプットレベルでは、アダプターダイマーは形成されたNGSライブラリー分子の大半を構成することが可能で、したがってDNAシーケンシングによって生じる有用な情報の量を減少させる。この理由のために、ライブラリー構築時のアダプターダイマー生成を抑制することは非常に重要であるが、困難な仕事である。
本明細書で提供されるものは、新規なアダプター連結策に基づくNGSライブラリー構築のための高処理方法である。前記対策は、フラグメントキメラおよびアダプターダイマーの両方の生成を最小限にし、さらに1日足らずでDNAサンプルをシーケンシングライブラリーに正確に変換することができる。これらの利点およびその他の利点は発明の付加特性と併せて、本明細書で提供する発明の説明から明白となるであろう。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、全ゲノムシーケンシング、標的照準再シーケンシング、シーケンシング依拠スクリーニングアッセイ、メタゲノミクス、またはNGS用サンプル調製が要求される任意の他の応用のための次世代DNAシーケンシング（NGS）ライブラリーの構築に関する。提唱される方法は各々二工程連結プロセスから成る。前記プロセスによって、第一のシーケンシングアダプターは末端修復DNAフラグメントに平滑末端連結を介して連結され、続いて第二のシーケンシングアダプターは第一の連結生成物にスプリント末端連結を介して連結される。このNGSライブラリー調製プロセスはここでは競合的鎖置換（Competitive Strand Displacement, CSD）と称されるであろう。初期の研究は、イルミナ（Illumina）シーケンシングのためにP5およびP7アダプターの接着に焦点があてられていたが、本方法は、1つ以上の合成配列の接着が必要とされるまた別のプラットフォーム（例えばIon Torrent(商標)シーケンシングプラットフォーム）でも用いることができよう。
【００１０】
当該方法の第一の実施態様（図1）では、断片化DNAを末端修復反応に付して、遊離3’OH末端を有するブラント5’リン酸化挿入物を生成する。これは、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（PNK）およびT4 DNAポリメラーゼ、または5’リン酸基および3’ヒドロキシル基を有する平滑末端を生じる酵素の任意の他の組合せを用いて達成できる。末端修復に続いて、第一のシーケンシングアダプター（イルミナプラットフォームではP5またはP7）が、挿入物DNAの3’末端にT4 DNAリガーゼを用いてブラント連結を介して接着される。すなわち、アダプターの一方の鎖は5’リン酸化されて連結を促進し、一方、相補鎖は3’末端でジデオキシヌクレオチド（ddN）により封鎖されて連結を防ぐ。続いて、第二のシーケンシングアダプターを生物学的挿入物の5’末端にスプリント連結反応を介して接着して、当該挿入物のリン酸化5’末端にアダプター分子の3'末端を連結する。この連結は、Taq DNAリガーゼ、または平滑末端基質ではほとんど活性を示さないでスプリント連結を実施できる任意の他のリガーゼ（アンプリガーゼ（Ampligase）、9°N、Tthなど）を用いて実施できる。これらのリガーゼはスプリント連結を優先するので、アダプターダイマーは最小限となり、それは連結後のサイズ選別の必要性を軽減させる。第二の連結の後で、新しく構築されたライブラリー分子を直接（“PCRフリー”）配列決定するか、または配列決定の前にPCRにより増幅することができる。第一の実施態様のための第一のシーケンシングアダプターの第一鎖および第二鎖の代表的な例は、それぞれ配列番号:3−10および配列番号:17として提供される。第一の実施態様のための第二のシーケンシングアダプターの代表的な例は配列番号:1−2として提供される。第一の実施態様のための代表的な例は、本発明の（限定のためではなく）例証のために提供される。
【００１１】
上記記載の方法の第二の実施態様では、変異体T4 DNAリガーゼ、K159S（米国出願15/426,543を参照されたい（参照によってその全体が本明細書に含まれる））が第一の連結のために用いられる。この変異体は連結前の基質をATPを利用してアデニル化することができず、したがって前アデニル化された基質のみを連結することができる。この特色は、前アデニル化シーケンシングアダプターを用いて連結を実施することによって活用することができる。なぜならば、前記特色は、（挿入物対挿入物連結事象ではなくて）キメラ形成を大きく抑制するアダプター対挿入物連結事象のみを生じるからである。さらにまた、野生型T4 DNAリガーゼの連結効率は“連結中断”事象によって損なわれると考えられる。前記事象では、アデニル化リガーゼユニットはアデニル基を挿入物に移転させるが、5’および3’末端に効率よく合流できない。そのような事例では、リガーゼユニットは迅速に再アデニル化されて、それらを既にアデニル化されているDNA上で不活化させる。変異体はアデニル化できないため、連結中断事象は問題ではなく、連結効率は野生型T4 DNAリガーゼの効率と対比して増加する。第二の実施態様のための第一のシーケンシングアダプターの代表的な例は配列番号:11−16として提供される。第二の実施態様のための全ての代表的な例は、本発明の（限定のためではなく）例証のために提供される。
本発明の第三の実施態様では、第一の連結工程の前アデニル化アダプターは、標的フラグメントの3'末端にK159S変異体の代わりに野生型T4リガーゼを介してかつATPの非存在下で、したがってフラグメントキメラの形成を防止しながら連結される（図3）。
【００１２】
上記記載の方法の第四の実施態様では、まず初めにシーケンシングアダプターを挿入物の5’末端に連結することができる（図4）。この実施態様では、第一のシーケンシングアダプター（イルミナシーケンシングのためにはP5またはP7）の3’末端をリン酸化挿入物の5’末端にブラント連結を介して接着することができる。ダイマー形成を防ぐために、このアダプターは二重鎖部分で5’リン酸化されず、したがって挿入物または他のアダプター分子に連結されないであろう。第二のアダプター配列（イルミナシーケンシングのためにはP5またはP7）は、挿入物の3’末端に一本鎖オリゴを用いるスプリント連結を介して接着され、前記オリゴは5’末端にリン酸基および3’末端にC3スペーサーを有する。この連結は、Taq DNAリガーゼ、または平滑末端基質ではほとんど活性を示さないでスプリント連結を実施できる任意の他のリガーゼ（アンプリガーゼ、9°N、Tthなど）を用いて実施できる。これらのリガーゼはスプリント連結を優先するので、アダプターダイマーは最小限となり、それは連結後のサイズ選別の必要性を軽減させる。
本発明の第五の実施態様では、ddNの代わりに、切詰められた連結ヘルパーオリゴヌクレオチドの3’末端にRNA塩基が存在する。この事例では、アダプターの5'末端および切詰められたステムの3’末端の両方が挿入物に連結される。しかしながら、当該ステムは、RNA塩基の5'を切断するRNase H2酵素の活性により切断される。SPRIクリーンアップ工程後に、第二の連結が生じる（図5）。
【００１３】
本発明の第六の実施態様では、第一のシーケンシングアダプターはその5’末端にタグ配列を有し、前記タグは標的のセンスおよびアンチセンス鎖をそれらの3'末端で別個に標識するために機能する（図6および7）。これらの配列タグはいずれの特定の長さまたは配列にも限定されない。塩基は縮退、固定（fix）または両方の組合せであり得る。改変塩基もまた用いることができる。以前の通り、アダプターの5'末端は前アデニル化され、K159S変異体のT4 DNAリガーゼまたはATPの非存在下の野生型T4リガーゼによって標的の修復3’末端に連結される。続いて、第二のシーケンシングアダプターを第一の連結済みアダプターにその相補性ステム配列でアニーリングさせて、タグ配列に広がるギャップを生じる。このギャップを続いてポリメラーゼで充填し、第一のUMIと相補性であるUMIをin situで作出する。この充填工程の後で、新しくin situで作出されたUMIの3’末端を標的フラグメントの5’末端に連結する。場合によって、この後に、第一および第二アダプター配列からプライミングを開始するプライマーを用いるPCR増幅工程が続き、場合によって追加の配列（例えばサンプルバーコードおよび/またはP5/P7配列）を添加することができる。第六の実施態様のための第一のシーケンシングアダプターの第一鎖の代表的な例は配列番号:18−33として提供される。第六の実施態様のための第一のシーケンシングアダプターの第二鎖の代表的な例は配列番号:34−49として提供される。第六の実施態様のための第二のシーケンシングアダプターの代表的な例は配列番号:50として提供される。第六の実施態様のPCR増幅のために用い得るフォワードおよびリバースプライマー選択肢の代表的な例は、それぞれ配列番号:75−98および配列番号:51−74として提供される。これらの具体的な代表的フォワードおよびリバースPCRプライマーは、それぞれP5およびP7アダプター配列を含むとともにサンプルバーコード配列も含む。第六の実施態様のための全ての代表的な例は、本発明の（限定のためではなく）例証のために提供される。
【００１４】
本発明の第七の実施態様は第六の実施態様の変形であり、前記では、第二のシーケンシングアダプターは、第一の連結工程時に添加されるタグ配列と相補性である追加の配列を有する（図7）。結果として、第二のシーケンシングアダプターの第一の連結生成物とのアニーリング後にギャップは存在せず、連結前のDNAポリメラーゼによる充填工程は不要である。これは限定された数の可変タグを用いることによって達成できる。例えば、この実施態様は、潜在的に、複数の第一のシーケンシングアダプター（各々は24の別個の可変タグ配列の1つを有する）および複数の第二のシーケンシングアダプター（各々は第一のシーケンシングアダプターの可変配列と相補性である24の別個の配列の1つを有する）から成り得よう。
上記実施態様のいずれにおいても、固有分子識別子（UMI）およびサンプルバーコードをシーケンシングアダプターの一方または両方に取り込むことができる。分子識別子は、イルミナ配列と適合性がある任意の長さの固定または縮退配列を用いて構築することができる。
上記実施態様のいずれにおいても、第一および/または第二の連結に用いられる1つ以上のシーケンシングアダプターは、完全なシーケンシングアダプターの短縮型であり、その場合、シーケンシングアダプターの残りの部分は、後でテール付加プライマーを用いるPCRにより添加される。
【００１５】
本発明はDNAシーケンシングを必要とする任意の応用に用いることができるが、腫瘍DNAおよび正常DNAの混合集団で希少変種の検出が極めて重要な癌診断のために特に重要である。本発明はまた、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）サンプルからシーケンシングライブラリーを構築するために用いることができる。本発明はまた、PCRを伴うまたはPCRを伴わない超低インプットDNAからシーケンシングライブラリーを構築するために用いることができる。前記は、限られた量のDNAしか利用できないか、および/またはPCRが容認され得ない法医学的または微生物学的試験で助けとなり得る。
アダプターダイマーの形成のためにサイズ選別を要する従来技術とは異なり、本発明はサイズ選別を要しない連結策を特色とする。サイズ選別を欠くということは優れたDNA回収を可能にし、それはライブラリーの複雑性/カバー範囲および低頻度変種に対する感度を大いに高める。アダプターダイマーはまたライブラリーの定量およびシーケンシングにとっても問題である。なぜならば、DNA定量の標準的な方法は、アダプターダイマーの存在によって大きく歪められるからである。これは最適に達しないクラスター密度を生じ、実際のサンプルに適合する読取り数を顕著に減少させ、それはシーケンシングコストを増大させる。さらにまた、従来技術と異なり、K159Sを利用する本発明の実施態様は連結によるキメラを生じることがなく、癌に関連する希少な構造変種の検出を大きく改善するはずである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】競合的鎖置換（CSD）方法の第一の実施態様を示す。第一の工程は、T4 DNAリガーゼによって触媒される平滑末端連結による、DNA標的フラグメント（1）への第一のシーケンシングアダプター（2）の接着から成る。前記第一のシーケンシングアダプターは第一および第二のDNA鎖から成る。第一のDNA鎖（4）は、その3’末端にC3封鎖基、その5’末端にリン酸基（5’PO）を有し、さらに第一の配列（6）および第二の非相補性タグ配列（5）から成り、前記第一の配列（6）は第二のDNA鎖（3）と相補性であるがそれより長く、前記タグ配列（5）は第一のシーケンシングプライマー結合部位および、場合によってUMIおよび/またはサンプルバーコード配列を含む。第二のDNA鎖（3）は切詰められたオリゴヌクレオチドでその3’末端にジデオキシヌクレオチド塩基（ddN）を有し、第二のDNA鎖の5’末端と標的フラグメントの3’OHとの平滑末端連結を促進するために機能して、第一の連結生成物（7）をもたらす。第二の工程は、Taqリガーゼによって触媒されるスプリント末端連結による、第二のシーケンシングアダプター（8）と第一の連結生成物（7）との接着から成る。前記第二のシーケンシングアダプターは3’OHを有し、さらに第一の配列（10）および第二の配列（9）から成り、前記第一の配列（10）は第一のシーケンシングアダプターの第一の配列（6）と相補性であり、前記第二の配列（9）は第二のシーケンシングプライマー結合部位および、場合によって第二のUMIおよび/またはサンプルバーコード配列を含む。第二のアダプター（10）の相補性配列の長さは第一のアダプター（3）の切詰めオリゴのそれより長いので、切詰めオリゴをスプリント末端連結に先行するアニーリング工程時に第二のアダプターで置換することができる。スプリント末端連結は最終ライブラリー生成物（11）をもたらす。
【図２】CSD方法の第二の実施態様を示す。第二の実施態様の構成要素は第一の実施態様のものと同様であるが、相違は、第一のシーケンシングアダプターは第一鎖の5’末端で前アデニル化（5’ppA）されること、および平滑末端連結はT4 DNAリガーゼ変異体（K159S）によって触媒されることである。前記変異体K159Sは連結のために基質としてATPを利用できず、したがって第一のアダプターの前アデニル化鎖を標的フラグメントの3’OHに連結できるだけである。
【図３】CSD方法の第三の実施態様を示す。第三の実施態様の構成要素は第二の実施態様のものと同様であるが、相違は、平滑末端連結はATPの非存在下で野生型T4 DNAリガーゼによって触媒されることである。連結のために基質としてATPを利用することができないので、したがって野生型T4 DNAリガーゼは第一のアダプターの前アデニル化鎖を標的フラグメントの3’OHに連結できるだけである。
【図４】CSD方法の第四の実施態様を示す。第四の工程は、T4 DNAリガーゼによって触媒される平滑末端連結による、第一のシーケンシングアダプター（12）とDNA標的フラグメントとの接着から成る。前記第一のシーケンシングアダプターは第一および第二のDNA鎖から成る。第一のDNA鎖は、その3’末端に3’OH基を有し、さらに第一の配列（14）および第二の非相補性タグ配列（13）から成り、前記第一の配列（14）は第二のDNA鎖（15）と相補性であるがそれより長く、前記タグ配列（13）は第一のシーケンシングプライマー結合部位および、場合によってUMIおよび/またはサンプルバーコード配列を含む。第二のDNA鎖（15）は、その3’末端にC3封鎖基、脱リン酸化5’末端を有する切詰められたオリゴヌクレオチドであり、標的フラグメントの5’POと第一のシーケンシングアダプターの第一鎖の3’OHとの平滑末端連結を促進するために機能して、第一の連結生成物（16）をもたらす。第二の工程は、Taqリガーゼによって触媒されるスプリント末端連結による、第二のシーケンシングアダプター（17）と第一の連結生成物との接着から成る。前記第二のシーケンシングアダプターは5’POを有し、さらに第一の配列（40）および第二の配列（41）から成り、前記第一の配列（40）は第一のシーケンシングアダプターの第一の配列（14）と相補性であり、前記第二の配列（41）は第二のシーケンシングプライマー結合部位および、場合によって第二のUMIおよび/またはサンプルバーコード配列を含む。第二のアダプター（40）の相補性配列の長さは第一のアダプター（15）の切詰めオリゴのそれより長いので、切詰めオリゴをスプリント末端連結に先行するアニーリング工程時に第二のアダプターで置換することができる。スプリント末端連結は最終ライブラリー生成物をもたらす。
【図５】CSD方法の第五の実施態様を示す。第五の実施態様の構成要素は第二の実施態様のものと同様であるが、相違は、第一のシーケンシングアダプターの切詰められた第二鎖（18）はその3’末端にRNA残基を有することである。続いて、K159S変異体T4 DNAリガーゼによって触媒される平滑末端連結により、前記第一のシーケンシングアダプターをDNA標的フラグメントに接着させる。以前の実施態様と異なり、第一のシーケンシングアダプターの第一および第二鎖の両方が標的フラグメントに連結され、切詰め第二鎖はその3’Rを介して標的フラグメントの5’POに連結されて最終連結生成物（19）を生じる。続いて、切詰め第二鎖はRNase H2切断により除去される（前記切断はRNA残基の5’側のホスホジエステル結合で生じる）。生じた生成物（20）は以前の実施態様の第一の連結生成物と類似するが、相違はそれが3’RNA残基を有することである。続いて、第二の連結工程時に前記3’RNA残基を第二のシーケンシングアダプターの5’POに連結し、内部RNA残基を有するライブラリー生成物（21）を生じる。
【図６】CSD方法の第六の実施態様を示す。第六の実施態様の構成要素は第二の実施態様のものと同様であるが、ただし以下の相違がある。本実施態様では、第一のシーケンシングアダプター（22）の第一のDNA鎖（24）はその5’末端に可変タグ配列（26、27）を含む。前記タグ配列は、第一の連結工程時に標的フラグメントのセンスおよびアンチセンス鎖を弁別的に標識するために機能し、各々の鎖が異なって標識される第一の連結生成物（28）をもたらす。以前の実施態様と同様に、平滑末端連結は、封鎖され切詰められた第二の鎖（23）を用いて強化される。本実施例では前記第二の鎖は、第一のDNA鎖（24）の可変領域（26，27）および定常領域（25）の部分と相補性である。第二の連結工程時に、第二のシーケンシングアダプター（29）はその配列（30）を介して第一の連結生成物とアニーリングする。前記配列（30）は、第一のシーケンシングアダプター（25）によって添加される定常配列と相補性であるが、可変領域（26、27）とはそうではない。このことは、DNAポリメラーゼおよびDNAリガーゼ（31）により充填されるギャップを生じ、そのセンスおよびアンチセンス鎖が異なって標識される最終ライブラリー生成物（32）をもたらす。
【図７】CSD方法の第七の実施態様を示す。第七の実施態様の構成要素は第六の実施態様のものと同様であるが、相違は、第二のシーケンシングアダプター（33）は追加の配列（34、35）を有し、前記追加の配列は、第一のシーケンシングアダプターによって添加される可変タグ配列（36、37）と相補性であるということである。結果として、第二のシーケンシングアダプターが第一の連結生成物とアニーリングした後でギャップは発生せず、ポリメラーゼ工程は必要とされない。
【図８Ａ】実施例1に記載の方法を用いて得られた3つの複製ライブラリーの各々のカバー範囲深度値が、DNAインプットが10ng（左側）及び1ng（右側）のCSD（暗灰色の丸印）およびNEB（明灰色の丸印）についてプロットされている。10ngのDNAインプットの場合、CSDのカバー範囲平均深度は1009Xであるのに対して、NEBでは598Xであった。1ngのDNAインプットの場合、CSDのカバー範囲平均深度は131Xであるのに対して、NEBでは53Xであった。
【図８Ｂ】実施例1に記載の実験から得られた3つの複製ライブラリーの各々のカバー範囲深度値が、CSD（暗灰色の丸印）およびKapa（明灰色の丸印）についてプロットされている。CSDのカバー範囲平均深度は1006Xであるのに対して、Kapaでは628Xであった。
【図８Ｃ】実施例2に記載の実験から得られた3つの複製ライブラリーの各々のカバー範囲深度値が、“真の”cfDNA（左側）および“擬似”cfDNA（右側）に由来するライブラリーでCSD（暗灰色の丸印）およびNEB（明灰色の丸印）についてプロットされている。“真の”DNAインプットの場合、CSDのカバー範囲平均深度は276Xであるのに対して、NEBでは77Xであった。“擬似”DNAインプットの場合、CSDのカバー範囲平均深度は241Xであるのに対して、NEBでは104Xであった。
【図８Ｄ】実施例3に記載の実験から得られた3つの複製ライブラリーの各々のカバー範囲深度値が、DNAインプット1ng（左側）、5ng（中央）および10ng（右側）の場合のCSD（暗灰色）およびNEB（明灰色）についてプロットされている。NEB方法と比較したとき、CSDのカバー範囲平均深度は、ゲノムDNA由来FFPEの1ng、5ngまたは10ngについてそれぞれ1.8X、1.4Xおよび1.3X高かった。
【図９】実施例4に記載の実験から得られた3つの複製ライブラリーの各々のパーセントキメラ値が、“真の”cfDNA（左側）および“擬似”cfDNA（右側）に由来するライブラリーのCSD（暗灰色の丸印）およびNEB（明灰色の丸印）についてプロットされている。NEB方法と比較したとき、CSDで存在するキメラの平均％は、“真の”cfDNAインプットで1.6X低く、“擬似”cfDNAインプットで1.8X低かった。
【図１０Ａ】バイオアナライザーDNA1000チップを用いて作製したトレースであり、前記トレースは、1％または0.5％の微量の対立遺伝子分画を有するサンプルDNAからNEBまたはCSD方法を用いて作製した3つの複製ライブラリーの各々に存在するDNA分子のサイズ分布を示す。CSD方法では150bpマークでダイマーピークが存在しないこと（39）およびNEB方法ではそのようなピークが存在すること（38）は、NEB方法で調製したライブラリーと比較したとき、CSDで調製したライブラリーではアダプターダイマーの発生頻度が低下することを示している。
【図１０Ｂ】150bp、200bpまたは300bpにせん断した高品質ゲノムDNAを用いて作製した3つの複製ライブラリーの各々について、バイオアナライザーDNA1000チップを用いて作製した（PCR後）トレースである（gDNAはATCCから調達した細胞株NA12878から抽出された）。3つのフラグメントの全ての長さで、典型的には125bp−150bpの範囲で観察されるダイマーピークは存在しなかった。
【図１０Ｃ】200bpにせん断した高品質ゲノムDNAの10ngまたは1ngを用いて作製した3つの複製ライブラリーの各々について、バイオアナライザーDNA1000チップを用いて作製した（PCR後）トレースである。両インプット量で、典型的には125bp−150bpの範囲で観察されるダイマーピークは存在しなかった。  以下の実施例は本発明の例示であり、本発明を制限するものではない。
【実施例１】
【００１７】
本実施例は、CSD方法の第二の実施態様を用いて高品質ゲノムDNAから調製したNGSライブラリーのカバー範囲深度は、NEB(商標)UltraTMIIライブラリー（New England BioLabs）またはKapa Hyper Prep（Kapa Biosystems）の方法を用いて得られたものと比較して強化されることを示す。高品質ゲノムDNAは細胞株NA12878（ATCC）から抽出された。1または10ngの抽出DNAを超音波断片化（Covaris S220）により平均サイズ150bpにせん断し、続いて末端修復に付した。前記末端修復は、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（PNK）による30分間の5'末端リン酸化とその後の2.5X AMPureビーズによる精製を含んでいた。CSD処理のためには、切詰め3’ddN封鎖オリゴヌクレオチド（配列番号:17）とハイブリダイズさせたP7アダプター（配列番号:11−16）を、変異体K159S T4 DNAリガーゼを15分間用いて平滑末端連結により末端修復標的に連結し、その後熱死滅工程を15分間実施した。続いて、Taq DNAリガーゼを15分間用いてP5アダプター（配列番号:1または配列番号:2）を第一の連結生成物に連結し、その後2.5X AMPureビーズを用いて精製した。NGS処理については、製造業者の指示にしたがってライブラリーを調製した。両ライブラリーを続いてPCR増幅に付した。P5およびP7アダプターと相補性の配列を含むプライマーを以下の条件で用いた：98℃で45秒、（98℃15秒、60℃30秒、72℃30秒）の12サイクル、72℃で1分間、4℃で保持。続いて約800のIDTのロックダウン（Lockdown）プローブのカスタムパネルを用いてライブラリーでハイブリッド捕捉を実施して標的配列を含むフラグメントを引き下ろし、前記を用いてカバー範囲深度値を決定した。得られた標的濃縮生成物を1.8X AMPureビーズにより精製し、MiSeq(商標)シーケンサー（Illumina）で配列を決定した。2X 150ペア形成末端読取りを用い製造業者のプロトコルにしたがった。3複製ライブラリーを調製した。10および1ngのDNAインプットでCSDから得た3つのライブラリーの各々についてカバー範囲深度値が、NEB（図8A）およびKapa（図8B）から得たそれらの値と比較してプロットされている。NEB方法と比較したとき、CSDの場合のカバー範囲の平均深度は、10ngのDNAインプットでは1.7倍高く、1ngのDNAインプットでは2.5倍高かった（図8A）。Kapa方法と比較したとき、10ngのDNAインプットでは、CSDの場合のカバー範囲の平均深度は1.6倍高かった（図8B）。カバー範囲深度値は、800プローブロックダウンパネルにより濃縮された予想標的配列に対してマッピングされた固有の読取り数（PCR重複物は数えない）によって決定された。
【実施例２】
【００１８】
本実施例は、CSD方法の第二の実施態様を用いて循環細胞フリーDNA（cfDNA）から調製したNGSライブラリーのカバー範囲深度は、NEBNext(商標)UltraTMIIライブラリー（New England BioLabs）を用いて得られたものと比較して強化されることを示す。“真の”cfDNAサンプルは、Biochainによって健康な個体から単離された本当の無細胞DNAであり、一方、“擬似”cfDNAサンプルはCovaris S2を用いて150bpにせん断された細胞株ゲノムDNA（NA12878）である。実施例1に記載したように、CSDおよびNEB方法を用いて1ngのcfDNAを用いてライブラリーを調製した。NEB方法と比較したとき、CSDのカバー範囲平均深度は“真の”cfDNAインプットでは3.6倍高く、“擬似”cfDNAインプットでは2.3倍高かった（図8C）。
【実施例３】
【００１９】
本実施例は、CSD方法の第二の実施態様を用いてFFPEサンプルから抽出した低品質ゲノムDNAから調製したNGSライブラリーのカバー範囲深度は、NEB Ultra IIライブラリーを用いて得られたものと比較して強化されることを示す。FFPEサンプルは業者（Asterand Bioscience）から調達した。ライブラリーは上記のように調製した。ゲノムDNAに由来するFFPEの1ng、5ngまたは10ngを用い、出発材料として200bpの平均サイズにせん断した。NEB方法と比較したとき、CSDのカバー範囲の平均深度は、FFPE由来ゲノムDNAの1ng、5ngまたは10ngの場合のそれぞれ1.8X、1.4Xおよび1.3Xであった（図8D）。
【実施例４】
【００２０】
本実施例は、CSD方法の第二の実施態様を用いてcfDNAから調製したNGSライブラリーのキメラ率は、NEB方法を用いて調製したcfDNAに存在するものと比較して低いことを示す。ライブラリーを上記に記載したように調製し、インプットとして1ngの“真の”または“擬似”cfDNAを3複製で用いた。NEB方法と比較したとき、CSDで存在するキメラの平均％は、“真の”cfDNAインプットでは1.6倍低く、“擬似”cfDNAインプットでは1.8倍低かった（図9）。％キメラ値は、参照配列との不適切なアラインメントを有する固有の読取り数に基づいて算出された（hg19）。以下のいずれかを有するフラグメントを“キメラ”として分類した：（1）ペアを形成した読取りが同じ方向（同じ向き）で向き合う、（2）ペアを形成した読取りが3kbを超えて離れている参照配列の領域とアラインメントする、（3）ペアを形成した読取りが異なる染色体とアラインメントする。
【実施例５】
【００２１】
本実施例は、CSD方法の第二の実施態様を用いたとき、高品質ゲノムDNAから調製したNGSライブラリーのアダプターダイマーの発生率は、NEB方法を用いて調製したライブラリーに存在するものと比較して低いことを示す。高品質ゲノムDNAサンプルを2つの細胞株（NA12878およびNA24385）から抽出し、2つの異なる比率で混合してそれぞれ1％および0.5％の微量対立遺伝子分画を有する2つの混合物を生成した。サンプルを300bpフラグメントにせん断した。NEBライブラリーを連結後に0.9X AMPure比を用いて作製し、これはアダプターダイマーのサイズ選別排除を意味する。CSDライブラリーを連結後に2.5X比で作製し、これは完全長のアダプターダイマーを効率的に除去するためには高すぎる。NEBライブラリーをPCR後に1.0X AMPureで処理して一切の残留ダイマーを除去し、一方、CSDライブラリーは1.8X比で処理した。最終ライブラリー生成物をバイオアナライザーDNA1000チップで分析し、各ライブラリーに存在するDNA分子のサイズ分布を示すトレースを作製した。サイズ選別を実施しないCSD方法の場合150bpマークでダイマーピークが存在しないことは、CDS方法で調製したライブラリーではダイマー形成は無視できるかまたはダイマー形成は存在しないことを示す（図10A）。他方で、NEB方法を用いて調製したライブラリーは、2回のサイズ選別工程にもかかわらず、トレースの150bpマークの小さなピークによって示されるようになお少量のアダプターダイマーを含む（図10A）。
【実施例６】
【００２２】
本実施例は、CSD方法の第二の実施態様を用いて調製したNGSライブラリーにおけるアダプターダイマーの存在低下は、出発点として用いた標的フラグメントの長さに左右されないことを示す。細胞株NA12878から抽出し、150bp、200bpまたは300bpにせん断した10ngの高品質ゲノムDNAを用い上記のようにライブラリーを作製した。上記に記載したように、最終ライブラリー生成物をバイオアナライザーDNA1000チップで分析し、サイズ分布トレースを作製した。典型的には125bp−150bpの範囲で観察されるダイマーピークは、3つのフラグメントの長さの全てで存在しなかった（図10B）。
【実施例７】
【００２３】
本実施例は、CSD方法の第二の実施態様を用いて調製したNGSライブラリーにおけるアダプターダイマーの存在低下は、出発点として用いたインプットDNAの量に左右されないことを示す。細胞株NA12878から抽出し、200bpにせん断した高品質ゲノムDNAの10ngまたは1ngを用い上記のようにライブラリーを作製した。典型的には125bp−150bpの範囲で観察されるダイマーピークは、両インプット量で存在しなかった（図10C）。参考までに、後期マーカーとともに出現する約1500bpの二次ピークはPCR中の過剰増幅による公知の現象である。
【実施例８】
【００２４】
本実施例は、CSD方法の第六の実施態様を用いて高品質ゲノムDNAから調製したNGSライブラリーで達成される感度は、Kapa Hyper Prepの方法を用いて得られたものと比較して強化されることを示す。高品質ゲノムDNAサンプルを細胞株（NA12878およびNA24385）から抽出して1/100の比率で混合し、それぞれ1％および0.5％のホモ接合およびヘテロ接合微量対立遺伝子頻度を得た。インプットが1から25ngの範囲のゲノム混合物を超音波断片化（Covaris S220）を用いて平均サイズ150bpにせん断し、末端修復に付した。前記末端修復は、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（PNK）による30分間の5'末端リン酸化とその後の2.5X AMPureビーズによる精製を含んでいた。CSD処理のためには、切詰め3’ddN封鎖オリゴヌクレオチド（配列番号:34−49）とハイブリダイズさせたP7アダプター（配列番号:18−33）を、変異体K159S T4 DNAリガーゼを15分間用いて平滑末端連結により末端修復標的に連結し、その後熱死滅工程を15分間実施した。続いて、第一のシーケンシングアダプタによって添加された定常領域に切詰めP5アダプター（配列番号:50）をアニーリングさせた（ただし可変領域とはアニーリングしない）（図6の26および27）。生じたギャップをTaq DNAポリメラーゼで充填し、続いてTaq DNAリガーゼによる連結を実施した。この後、2.5X AMPureビーズを用いて精製した。生成物を続いてPCR増幅に付し、P7およびP5アダプター配列の残りの部分を含むテール付加プライマーを用いた。P7テール付加プライマー配列は配列番号:51−74として示され、一方、P5テール付加配列は配列番号:75−98として示される。PCR条件は以下の通りであった：98℃で45秒；98℃15秒、60℃30秒、72℃30秒の12サイクル；72℃で1分間；4℃で保持。Kapa処理については、製造業者の指示にしたがってライブラリーを調製した。IDT Lockdown(商標)プローブの約100kbカスタムパネルを用いてライブラリーでハイブリッド捕捉を実施し、混合遺伝子型サブセットを引き下ろした。これらのサブセットでは、NA12878とNA24385配列との間に291の公知のヌクレオチド相違が存在し、これらを用いてこの2つのライブラリー調製方法の感度およびPPVを査定した。これらのライブラリーで、2X 150のペア形成末端読取りを用い製造業者のプロトコルにしたがってMiSeq(商標)シーケンサー（Illumina）で超深度シーケンシングを実施した。この後、VarDictソフトウェアを用いて変種呼出しを実施した。20ngのインプットではKapaライブラリーで呼び出された3つの偽陽性があったが、10ngのDNAインプットのKapaライブラリーで、およびCSDライブラリーでは10および20ngの両DNAインプットで呼び出された偽陽性は0であり、両ライブラリーについて1のPPVをもたらした。しかしながら、偽陰性の数は、同じ量のインプットでKapaライブラリーを用いて得られた数と比較したとき、20ngのインプットのCSDライブラリーを用いたときは3X低く、10ngのインプットでは2X低かった。結果は表2に示される。
【００２５】
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【００２６】
表2：CSDまたはKapa調製ライブラリーを用いた変種呼出しの感度および陽性的中率
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本明細書に引用する全ての参考文献(刊行物、特許出願および特許を含む)は、参照によって、参考文献の各々があたかも個々にかつ具体的に表示されたかのごとく同じ内容で本明細書に含まれる。
用語、“a”、“an”、“the”並びに本発明の説明の文脈（特に特許請求の範囲の文脈）で同様な対応語は、本明細書で特段の指示がなければ、または文脈において明瞭な矛盾がなければ単数および複数の両方を含むと解されるべきである。“comprising（含む）”、“having（有する）”、“including（含む）”および“containing（含む）”という用語は、特段の規定がなければ末端に制限を設けない用語と解されるべきである。値の範囲の記載は、本明細書で特段に規定されなければ、当該範囲内に入る各々分離した値を個々に指す簡略化方法として機能し、各々分離した値は、あたかも個々に記載されたかのように本明細書に含まれる。本明細書に記載する全ての方法を任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提供される、任意のまたは全ての例示、または例示的表現（例えば“such as（例えば）”）の使用は、単に本発明のより良好な説明を意図するものであり、特段の規定がなければ本発明の範囲を限定するものではない。本明細書の表現はいずれも、特許請求されていない任意の要素を本発明の実施に必須のものとして示していると解されるべきではない。
本発明の好ましい実施態様が、本明細書に記載されている（本発明の実施のために最良の態様であると本発明者らが認識しているものを含む）。それらの好ましい実施態様の変形は、前述の記載を読めば当業者には明白となるかもしれない。本発明者らは当業者がそのような変形を適宜利用することを予想し、さらに本発明者らは本明細書に具体的に記載したものではない態様で本発明が実施されることを意図する。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲に列挙した内容の全ての改変物および等価物を、適用され得る法律によって許容されるように含む。さらにまた、全ての可能な変形における上記の要素の任意の組合せが、本明細書で特段に規定されないかぎり、または文脈において明瞭に矛盾しないかぎり本発明に包含される。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕シーケンシングのために標的核酸フラグメントを調製する方法であって、
前記方法が、
a．当該標的核酸フラグメントの3’末端に第一のアダプター配列を第一のリガーゼで連結し、さらに
b．前記標的核酸フラグメントの5’末端に第二のアダプター配列を第二のリガーゼで連結し、
c．それによって、前記第一のアダプター配列がその5’末端でアデニル化され、さらに
d．それによって、前記第一のリガーゼがアデニル化欠損ATP依存リガーゼであることを含む、前記方法。
〔２〕当該第一のリガーゼがK159でアミノ酸置換を有するT4 DNAリガーゼがである、前記〔1〕に記載の方法。
〔３〕当該アミノ酸置換がK159Sである、前記〔2〕に記載の方法。
〔４〕当該第二のリガーゼがATP依存リガーゼである、前記〔1〕に記載の方法。
〔５〕当該第二のリガーゼが非ATP依存リガーゼである、前記〔1〕に記載の方法。
〔６〕当該第二のリガーゼがNAD依存リガーゼである、前記〔5〕に記載の方法。
〔７〕シーケンシングのために標的核酸フラグメントのサンプルを調製する方法であって、
前記方法が、
a．当該標的核酸フラグメントの3’末端に複数の第一のアダプター配列を第一のリガーゼで連結し、それによって、当該第一のアダプター配列が、i．各標的フラグメントのセンスおよびアンチセンス鎖を3’末端で別個に標識するために機能する5’末端の可変タグ配列およびii．当該可変タグ配列の3’に位置する定常配列を含み、
b．当該連結された第一のアダプター配列の各々の定常配列に第二のアダプター配列をアニーリングさせ、それによって、第二のアダプター配列が、各第一のアダプター配列の定常配列と相補性である定常配列をその3’末端に含み、
c．当該第一の可変タグ配列にわたって生じたギャップをポリメラーゼで充填して、複数の第二の可変タグ配列を生じ、各々はその対応する第一の可変タグ配列と相補性であり、前記は当該標的フラグメントのセンスおよびアンチセンス鎖をそれらの5’末端で別個に標識するために機能し、さらに
d．当該標的配列の5’末端に当該第二のタグ配列の3’末端を第二のリガーゼで連結し、
e．それによって、前記第一のアダプター配列がその5’末端でアデニル化され、さらに
f．それによって、前記第一のリガーゼがアデニル化欠損ATP依存リガーゼであることを含む、前記方法。
〔８〕当該第一のリガーゼがK159でアミノ酸置換を有するT4 DNAリガーゼがである、前記〔7〕に記載の方法。
〔９〕当該アミノ酸置換がK159Sである、前記〔8〕に記載の方法。
〔１０〕当該第二のリガーゼがATP依存リガーゼである、前記〔7〕に記載の方法。
〔１１〕当該第二のリガーゼが非ATP依存リガーゼである、前記〔7〕に記載の方法。
〔１２〕当該第二のリガーゼがNAD依存リガーゼである、前記〔11〕に記載の方法。
〔１３〕当該タグ配列の塩基が縮退性である、前記〔7〕に記載の方法。
〔１４〕当該タグ配列の塩基が固定される、前記〔7〕に記載の方法。
〔１５〕当該タグ配列の塩基が縮退性および固定の両方である、前記〔7〕に記載の方法。
〔１６〕当該タグ配列が3から20ヌクレオチドの長さである、前記〔7〕に記載の方法。
〔１７〕シーケンシングのために標的核酸フラグメントのサンプルを調製する方法であって、
前記方法が、
a．当該標的核酸の3’末端に複数の第一のアダプター配列を第一のリガーゼで連結し、それによって、当該第一のアダプター配列が、i．各標的フラグメントのセンスおよびアンチセンス鎖をそれらの3’末端で別個に標識するために機能するそれらの5’末端の第一の可変タグ配列およびii．当該可変タグ配列の3’に位置する定常配列を含み、
b．複数の第二のアダプター配列を当該連結された第一のアダプター配列の定常および可変タグ配列にアニーリングさせ、それによって、第二のアダプター配列が、i．それらの3’末端の第二の可変タグ配列であって、それらの対応する第一のタグ配列と相補性であり、かつ各標的フラグメントのセンスおよびアンチセンス鎖をそれらの5’末端で別個に標識するために機能する前記第二の可変タグ配列、およびii．各第一のアダプター配列の第一の定常配列と相補性である第二の可変タグ配列の5’に位置する第二の定常配列を含み、
c．当該標的配列の5’末端に当該第二のタグ配列の3’末端を第二のリガーゼで連結し、
d．それによって、前記第一のアダプター配列がそれらの5’末端でアデニル化され、
さらに
e．それによって、前記第一のリガーゼがアデニル化欠損ATP依存リガーゼであることを含む、前記方法。
〔１８〕当該第一のリガーゼがK159でアミノ酸置換を有するT4 DNAリガーゼがである、前記〔17〕に記載の方法。
〔１９〕当該アミノ酸置換がK159Sである、前記〔18〕に記載の方法。
〔２０〕当該第二のリガーゼがATP依存リガーゼである、前記〔17〕に記載の方法。
〔２１〕当該第二のリガーゼが非ATP依存リガーゼである、前記〔17〕に記載の方法。
〔２２〕当該第二のリガーゼがNAD依存リガーゼである、前記〔21〕に記載の方法。
〔２３〕当該タグ配列の塩基が縮退性である、前記〔17〕に記載の方法。
〔２４〕当該タグ配列の塩基が固定される、前記〔17〕に記載の方法。
〔２５〕当該タグ配列の塩基が縮退性および固定の両方である、前記〔17〕に記載の方法。
〔２６〕当該タグ配列が3から20ヌクレオチドの長さである、前記〔17〕に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【配列表】
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