(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、であることを特徴とする機能性ポリペプチドの、肺線維症の予防治療薬を製造するための使用。
【請求項２】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、であることを特徴とする機能性ポリペプチドの、肺線維症の予防治療薬の有効成分を製造するための使用。
【請求項３】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、であることを特徴とする機能性ポリペプチドの、肺線維症の予防治療薬の前駆体を製造するための使用。
【請求項４】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、であることを特徴とする機能性ポリペプチドの、ピルフェニドンとの併用で肺線維症の予防治療薬を製造するための使用。
【請求項５】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むことを特徴とする肺線維症の予防治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬技術分野に属し、詳しくは、機能性ポリペプチド及びその肺線維症の予防治療薬の製造のための使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
特発性肺線維症（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ、ＩＰＦ）は、原因不明の肺間質性炎症性疾患の１つであり、２０１１年のＩＰＦの診断および治療に関する国際ガイドラインでは、ＩＰＦが、慢性、進行性及び繊維化性の間質性肺炎であって、組織学及び（又は）胸部高解像度ＣＴで特徴的に通常型間質性肺炎（ＵＩＰ）として現れるとしている。ＩＰＦの主な病理学的特徴は、肺間質と肺胞腔内の繊維化及び炎細胞浸?の混在であり、症状が現れてから３〜８年以内で末期呼吸不全又は死亡に発展することが多い。現在、ＩＰＦの病因及び発病機構は、まだ完全には解明されておらず、効果的な治療薬及び客観的で決定的な予後指標が欠けている。コルチコステロイド、又は免疫抑制剤、細胞毒性薬は、依然としてＩＰＦの主な治療薬であるが、３０％弱の患者に治療反応が現れ、薬物が毒性副反応を伴っている。ＩＰＦの治療について、ガイドラインでは、絶対多数の患者を、グルココルチコイド、シクロスポリンＡ、コルヒチン、ＩＦＮ−β、ボセンタン及びエタネルセプトの単独で治療すべきではなく、グルココルチコイドと免疫抑制剤との併用治療も推奨しないとしている。
【０００３】
ＥＵ、日本、カナダ、中国では、ピルフェニドンをＩＰＦの治療に用いることが承認されおり、現在、該薬物は軽度から中等度のＩＰＦの治療に用いられている。ピルフェニドンが承認され市販されているが、現在、ピルフェニドンによる特発性肺線維症（ＩＰＦ）の治療はまだ議論されており、そして、ピルフェニドンによる治療過程において、光線過敏症、拒食症、めまい、トランスアミナーゼ上昇、光線過敏症、湿疹、腹部不快感、及び白血球減少症などの副作用が現れる。２０１５年、米国胸部学会（ＡＴＳ）／欧州呼吸器学会（ＥＲＳ）／日本呼吸器学会（ＪＲＳ）／ラテンアメリカ胸部学会（ＡＬＡＴ）は合同でＩＰＦ治療ガイドラインで、ピルフェニドンを用いてＩＰＦ患者を治療することを推奨した（条件付きで推奨、中等度の証拠）。その理由及び実施注意事項について、ピルフェニドンの副作用が比較的多く、ＦＶＣで治療上有益であると評価された場合でも、一部の患者がある副作用を耐えられないことがあるため、治療を開始する前に、副作用について患者教育を行うべきである。また、現在、ピルフェニドンの治療費用が比較的高く、治療を決めた場合、特に患者が治療の経済的負担を直接担う場合、この影響要因を考慮しなければならない。欧州でも日本でも、ピルフェニドンの使用価格が比較的高く、該薬物は臨床で使用されているが、ＩＰＦ患者の症状や生活の質の改善効果、及び患者死亡率の低下効果が限られている。今後は、該薬物が市販されている国家と地区の臨床観察結果によって明確な結論を出す必要がある。そのため、新たなＩＰＦの効果的な予防治療薬の開発は、依然として国内外の薬物研究のホットスポットとなっている。
【発明の概要】
【０００４】
従来技術の欠点を克服するために、本発明の目的は、ブレオマイシン誘発肺線維症の形成を顕著に抑制することができ、顕著な肺線維症の予防治療機能を有する機能性ポリペプチドを提供することである。
上述した課題を解決するために、本発明が用いる構成は下記のとおりである。
１）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は、
２）前記ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１で示されるアミノ酸配列をもとに、１個又は複数個のアミノ酸を置換、欠失又は付加した後に、同様の又は類似する機能を有するポリペプチド、
である機能性ポリペプチドである。
さらなる構成として、本発明及び前記機能性ポリペプチドは、前記ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１で示されるアミノ酸配列をもとに、１、２、８、９、１１、１３、１４位のうちの１個又は複数個のアミノ基が、同様の又は類似する機能を有するアミノ基により置換されたポリペプチドである。
本発明は、更に、前記機能性ポリペプチドと配列が同じであるコーディングヌクレオチド配列を提供する。
本発明は、更に、前記コーディングヌクレオチド配列を含む担体を提供する。
本発明は、更に、前記担体を含む宿主細胞を提供する。
本発明は、更に、前記機能性ポリペプチドの用途を提供し、前記機能性ポリペプチドは、肺線維症の予防治療薬の製造に使用し、又は肺線維症の予防治療薬の有効成分として使用し、又は該機能性ポリペプチドを利用して肺線維症の予防治療薬の前駆体として改造し、又は肺線維症の治療薬と併用して肺線維症を治療することができる。具体的な構成は、下記のとおりである。
本発明に記載の機能性ポリペプチドの、肺線維症の予防治療薬を製造するための使用である。
本発明に記載の機能性ポリペプチドの、肺線維症の予防治療薬の有効成分を製造するための使用である。
本発明に記載の機能性ポリペプチドの、肺線維症の予防治療薬の前駆体を製造するための使用である。
本発明に記載の機能性ポリペプチドの、ピルフェニドンとの併用で肺線維症の予防治療薬を製造するための使用である。
本発明に記載のポリペプチドを含む肺線維症の予防治療薬である。
【０００５】
従来技術に比べて、本発明の有利な効果は、下記の点にある。
１．本発明に記載の機能性ポリペプチドは、良好なＩＰＦの予防治療効果を有し、肺組織中のヒドロキシプロリン（ＨＹＰ）及び血漿中のマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）の含有量が明らかに低下し、血漿中の総スーパーオキシドジスムターゼ（Ｔ−ＳＯＤ）及びグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＳＨ−ＰＸ）の含有量が明らかに増加した。
２．本発明に記載の機能性ポリペプチドでは、ＩＰＦの予防治療薬又は薬物の有効成分又は薬物前駆体を製造できる。
３．本発明に記載の肺線維症を予防治療する薬物、ヘルスケア製品は、機能性ポリペプチドを含み、粉剤又は注射剤又は経口製剤などの様々な形式に製造でき、単独で製品として使用でき、有効成分として生理食塩水、葡萄糖溶液などの助剤と組成物を配合することもでき、また、現在使用されている肺線維症の治療薬と併用することもできる。
以下、図面及び発明を実施するための形態に照らして、本発明を更に詳しく説明する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１はＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる本発明に記載の機能性ポリペプチドの構造分析である。
【図２】図２はＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動による本発明に記載の機能性ポリペプチドの分析結果の図である。
【図３】図３は本発明に記載の機能性ポリペプチドの抗菌活性分析結果の図である。
【図４】図４は本発明に記載の機能性ポリペプチドがヒト正常肺上皮細胞ＢＥＡＳ−２Ｂの成長に与える影響結果の分析図である。
【図５】図５はＥＺＹ−１ポリペプチドのＩＰＦ抑制試験においてマウス肺組織切片ＨＥの染色観察（×２００）の結果図であり、そのうち、１は対照組、２はモデル組、３は０．２５ｍｇ／ｋｇ  ＥＺＹ−１ポリペプチド化合物用量組、４は０．５ｍｇ／ｋｇ  ＥＺＹ−１ポリペプチド化合物用量組、５は１．０ｍｇ／ｋｇ  ＥＺＹ−１ポリペプチド化合物用量組、６は５０ｍｇ／ｋｇピルフェニドン組である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明は、
１）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は、
２）前記ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１で示されるアミノ酸配列をもとに、１個又は複数個のアミノ酸を置換、欠失又は付加した後に、同様の又は類似する機能を有するポリペプチドである、機能性ポリペプチドを提供する。
そのうち、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１配列はＲＴＧＡＣＦＣＶＩＹＮＧＩＬＹＰである。
さらなる構成として、本発明及び前記機能性ポリペプチドは、前記ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１で示されるアミノ酸配列をもとに、１、２、８、９、１１、１３、１４位のうちの１種又は複数種のアミノ基が、同様の又は類似する機能を有するアミノ基により置換されたポリペプチドである。具体的には、下記の１種又は複数種の置換から選択できるが、これらに限定されない。ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１配列中の１位のアミノ酸ＲをＫアミノ酸に置換し、その理由は、ＲとＫはともにアルカリ性アミノ酸であり、機能上類似性を有することであり；２位のアミノ酸Ｔをアミノ基Ｓに置換し、その理由は、ＴとＳはともにヒドロキシ含有アミノ酸であり、機能上類似性を有することであり；８位のアミノ酸Ｖをアミノ基Ｉ又はＬに置換し、その理由は、Ｖ、Ｉ及びＬはともに分岐鎖アミノ酸であり、機能上類似性を有することであり；９位のアミノ酸ＩをＶ又はＬに置換し、その理由は、Ｖ、Ｉ及びＬはともに分岐鎖アミノ酸であり、機能上類似性を有することであり；１１位のアミノ酸ＮをＱに置換し、その理由は、ＮとＱはともにアミノアミド基含有アミノ酸であり、機能上類似性を有することであり；１３位のアミノ酸ＩをＶ又はＬに置換し、その理由は、Ｖ、Ｉ及びＬはともに分岐鎖アミノ酸であり、機能上類似性を有することであり；１４位のアミノ酸ＬをＶ又はＩに置換し、その理由は、Ｖ、Ｉ及びＬはともに分岐鎖アミノ酸であり、機能上類似性を有することである。
本発明は、更に、前記機能性ポリペプチドと配列が同じであるコーディングヌクレオチド配列を提供する。
本発明は、更に、前記コーディングヌクレオチド配列を含む担体を提供する。
本発明は、更に、前記担体含む宿主細胞を提供する。
本発明は、更に、前記機能性ポリペプチドの用途を提供し前記機能性ポリペプチドは、肺線維症の予防治療薬の製造に使用し、又は肺線維症（ＩＰＦ）の予防治療薬の有効成分として使用し、又は該機能性ポリペプチドを利用して肺線維症（ＩＰＦ）の予防治療薬の前駆体として改造し、又は肺線維症（ＩＰＦ）の治療薬と併用して肺線維症を治療することができる。具体的な構成は、下記のとおりである。
本発明に記載の機能性ポリペプチドの、肺線維症の予防治療薬（ＩＰＦ）を製造するための使用である。
本発明に記載の機能性ポリペプチドの、肺線維症（ＩＰＦ）の予防治療薬の有効成分を製造するための使用である。
本発明に記載の機能性ポリペプチドの、肺線維症（ＩＰＦ）の予防治療薬の前駆体を製造するための使用である。
本発明に記載の機能性ポリペプチドの、ピルフェニドンとの併用で予肺線維症（ＩＰＦ）の防治療薬を製造するための使用である。
本発明に記載の機能性ポリペプチド化合物のＩＰＦの予防治療のための使用は、下記の複数種の方法がある。
方法１：本発明の機能性ポリペプチド化合物を１〜１０ｍｇ／ｋｇで、１日に１回で、少なくとも３５日連続して経口投与する。
方法２：本発明の機能性ポリペプチド化合物を０．１〜１ｍｇ／ｋｇで、３日に１回で、少なくとも３５日連続して注射投与する。
方法３：現在使用されているＩＰＦ治療薬（例えばピルフェニドン）と併用して、ＥＺＹ−１ポリペプチド化合物を１〜１０ｍｇ／ｋｇで、１日に１回経口投与する。
本発明に記載のポリペプチドを含む肺線維症の予防治療薬である。
以下は本発明の具体的な実施例であり、下記の実施例で用いられた原料、試薬などについては、本発明で特別に規定されていない限り、すべて従来技術である。
本発明に記載の機能性ポリペプチドは、アミノ酸を原料として、ペプチド合成機器を用いて、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１に記載のアミノ酸配列に従って人工合成し、高速液体クロマトグラフィーで精製することができる。なお、生成物を測定し、測定結果は図１〜４を参照される。
そのうち、図１はＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる本発明に記載の機能性ポリペプチドの構造分析であり、図２はＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動による本発明に記載の機能性ポリペプチドの分析結果の図であり、図３は本発明に記載の機能性ポリペプチドの抗菌活性分析結果の図であり、その結果は、該機能性ポリペプチドが一定の抑菌作用を有することを示し、図４は本発明に記載の機能性ポリペプチドが人正常肺上皮細胞ＢＥＡＳ−２Ｂの成長に与える影響結果の分析図であり、その結果は、本発明に記載の機能性ポリペプチドが正常細胞に対する毒性が低いことを示す。
肺線維症ＩＰＦの予防治療実験
１．試験方法
（１）動物：ＳＰＦ級Ｃ５７マウス、２２ｇ±２ｇ、６０匹、雌。
（２）組分け
マウスを、乱数表法で、対照組、モデル組、ピルフェニドン組（５０ｍｇ／ｋｇ）、ＥＺＹ−１ポリペプチド低用量組（０．２５ｍｇ／ｋｇ）、ＥＺＹ−１ポリペプチド中用量組（０．５ｍｇ／ｋｇ）、ＥＺＹ−１ポリペプチド高用量組（１．０ｍｇ／ｋｇ）の各組に分けて、１組あたり１０匹とした。
（３）１％ペントバルビタールナトリウムを用いて、５０ｍｇ／ｋｇの量で腹腔内注射してマウスを麻酔した後、仰向けで作業台に固定し、セッシで舌を引っ張り出して気管を露出させ、コールドライトルーペ下でブレオマイシンを５ｍｇ／ｋｇゆっくり注入した。注射完了後に、速やかにマウスボードを立てにして、３分間回転させて、薬液を肺内で均一に分布させた。対照組は、前記方法と同様にして気管内に等体積の等張食塩水を注入した。１０日後に０．１ｍｌ／１０ｇで消化管投与し始め、対照組及びモデル組は等体積の等張食塩水を消化管投与し、残りの各組は対応量の薬物を消化管投与し、３５日まで、１日に１回連続して投与した。
（４）サンプリングと指標測定：
投与してから３５日後に、マウスを麻酔し、血を抜いて死亡させた。分離して完全な両肺組織が得られ、秤量し、右上葉の同一部位を取り、４％のパラホルムアルデヒドで４８時間固定し、パラフィンセクションとし、ヘマトキシリン・エオシン染色（ＨＥ）で染色して病理組織学的観察に供した。
左中葉の同一部位を取り、肺組織ＨＹＰ含有量の測定を行った。
血漿を収集して、Ｔ−ＳＯＤ、ＭＤＡ、ＧＳＨ−ＰＸ含有量を測定した。
統計学分析：ＳＰＳＳ  １７．０ソフトで統計分析を行って、測定データを平均値±標準偏差(数１に表示）で示し、複数のサンプルの平均値の比較は一元配置分散分析を用いて、組間の比較はt検定を用いて、Ｐ≦０．０５で差が統計的に有意であることを示す。
【０００８】
【数１】
0006826268.tif 000002
【０００９】
２．結果
（１）マウス肺組織のＨＹＰ含有量分析
各組のマウス肺組織のヒドロキシプロリン（ＨＹＰ）含有量(数１に表示）は対照組と比べて、各組のマウス肺組織のＨＹＰ含有量が上昇し（Ｐ＜０．０１）、モデル組と比べて、各組のＨＹＰ含有量が明らかに低下した（Ｐ＜０．０１）。表１を参照される。
（２）マウスの血漿Ｔ−ＳＯＤ、ＭＤＡ、ＧＳＨ−ＰＸ含有量を分析し、その結果は表１を参照される。
表１の結果により、各組のマウスの血漿Ｔ−ＳＯＤ、ＭＤＡ、ＧＳＨ−ＰＸ含有量(数１に表示）は対照組と比べて、モデル組、低・中用量組、高用量組のマウスの血漿ＭＤＡ含有量が上昇し（Ｐ＜０．０１）、対照組と比べて、各組のマウスの血漿Ｔ−ＳＯＤ、ＧＳＨ−ＰＸ含有量が低下した（Ｐ＜０．０１）。モデル組と比べて、各組のマウスの血漿ＭＤＡ含有量が明らかに低下し（Ｐ＜０．０１）、モデル組と比べて、各組のマウスの血漿Ｔ−ＳＯＤ、ＧＳＨ−ＰＸ含有量が上昇した（Ｐ＜０．０１）。
【００１０】
【表１】
0006826268.tif 000003
【００１１】
表１の結果から分かるように、本発明に記載の機能性ポリペプチドは、コラーゲン繊維の沈着を軽減し、肺線維症を抑制することができる。
（３）肺組織病理変化を分析し、その結果は図５を参照される。
図５に示すように、対照組では、肺構造がクリアであり、モデル組では、肺胞中隔が明らかに太くなり、肺胞構造がひどく破壊され、萎縮崩壊が深刻であり、コラーゲン繊維が明らかに増加し、多くの炎症性細胞浸潤が見られた。これに対して、ＥＺＹ−１ポリペプチドの低、中、高用量組及びピルフェニドン組では、肺胞構造の破壊を軽減し、コラーゲン繊維の生成を抑え、炎症性細胞浸潤を抑制することができることから、薬物組では、肺線維症を次第に軽減してくることが分かる。
【００１２】
上述した実施形態は本発明の好ましい実施形態に過ぎず、これによって本発明の技術的範囲が限定されるものではなく、当業者が本発明に基づいてなされた如何なる非実質的な変更及び代替も、すべて本発明の技術的範囲に含まれる。
【図１】
0006826268.tif 000004
【図２】
0006826268.tif 000005
【図３】
0006826268.tif 000006
【図４】
0006826268.tif 000007
【図５】
0006826268.tif 000008
【配列表】
0006826268000001.app