(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素処理をしていない脂肪組織を裁断ろ過し，微小脂肪を得る裁断ろ過工程と，
裁断ろ過工程後に，培養用培地を用いて前記微小脂肪を培養し，成熟脂肪細胞を得る微小脂肪培養工程と，
前記成熟脂肪細胞と前記微小脂肪培養工程を経て得られる馴化培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）とを含む成熟脂肪細胞含有組成物を得る成熟脂肪細胞含有組成物取得工程とを含む，
成熟脂肪細胞含有組成物の製造方法であって，
前記裁断ろ過工程は，遠心分離を行い，沈殿する間質血管細胞群を除去し，液相の上部に浮き上がる脂肪成分である微小脂肪を回収する工程を含み，
前記培養用培地は，
ＦＢＳ，ヒドロコルチゾン及びＦＧＦ−２を含む培地である
成熟脂肪細胞含有組成物の製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の成熟脂肪細胞含有組成物の製造方法であって，
前記脂肪組織は，吸引脂肪を洗浄後，血液成分を除去されたものである成熟脂肪細胞含有組成物の製造方法。
【請求項３】
請求項２に記載の成熟脂肪細胞含有組成物の製造方法であって，
前記馴化培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）は，ＩＬ−８，ＧＲＯ及びＭＣＰ−１を，それぞれＩＬ−６の４倍以上含む，成熟脂肪細胞含有組成物の製造方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の成熟脂肪細胞含有組成物の製造方法であって，前記成熟脂肪細胞含有組成物は，皮下脂肪組織の代用として用いられる成熟脂肪細胞含有組成物の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載の成熟脂肪細胞含有組成物の製造方法であって，前記成熟脂肪細胞含有組成物は，乳房増大術，乳房再建術，又は組織陥凹形成術に用いられる組成物である方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれかに記載の成熟脂肪細胞含有組成物の製造方法によって得られた成熟脂肪細胞含有組成物を含む血管再生促進剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は，成熟脂肪細胞含有組成物の製造方法に関する。より詳しく説明すると，移植用脂肪組織の血管再生を上げて脂肪移植の生着率を向上させる成熟脂肪細胞と馴化培地（例えば成熟脂肪細胞の上清液）を含む成熟脂肪細胞含有組成物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳癌切除後に行われる乳房再建術としての脂肪移植は癌転移を促進せずに安全であるとされておいる。このため，乳房再建術は，形成外科並びに美容外科の領域で頻繁に行われる．しかし，乳房の組織量は大量なため，これまで単に生体の脂肪組織を吸引し得た脂肪組織片を移植しても30〜45％の生着率しか得られなかった（Ｚｈｏｕら非特許文献１）.
【０００３】
レシピエント環境での吸引脂肪組織片の生存率が低い主な原因は，栄養血管がないことである.移植された脂肪組織片は元の栄養血管から分離されるので，栄養不良となり壊死に陥る.脂肪組織片は移植後に異物として認識され，吸収，嚢腫形成，石灰化が起こることはよく知れている. 次に生着率を高める方法として，脂肪組織の血管周囲に存在する間質血管画分にあるＳＶＦ（small vascular fraction）に存在する脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）と共に脂肪組織を移植する方法が報告された(cell−assisted lipotransfer細胞支援脂移植肪: ＣＡＬ（Ｅｔｏら非特許文献２).  この方法は吸引脂肪組織を酵素処理して脂肪成分を除去し，血管周囲にある細胞，ＳＶＦ脂肪前駆幹細胞を得て，吸引脂肪組織と一緒に移植する方法である。ＳＶＦは自己再生する能力が高くおよび多能性を有すると特徴付けられる（Ｚｕｋ ＰＡ.ら非特許文献３).
【０００４】
Ｚｈｏｕらはsystematic reviewで387件のケースを含む17件の記事を系統的レビューした（Ｚｈｏｕら非特許文献１）．脂肪生存率は，単独吸引脂肪移植群よりもCAL群の方が有意に高かった（60％対45％，p = 0.0096）. CALは，顔の脂肪生存率を大幅に改善し（19％），複数の手術の発生率を減少させました（13.6％）。 しかし，乳房脂肪移植では，脂肪生存率は9％しか改善されず，統計的に有意ではなかった. 
【０００５】
一方，乳房症例のＣＡＬ（Ｅｔｏら非特許文献２)は，顔面症例と比較して合併症の発生率が高かった（p <0.001）。もっともＣＡＬの多くは，移植脂肪の吸収が起きて失敗におわる．その原因として，移植された脂肪組織は元の栄養血管から分離されるので，栄養不良となり壊死に陥ることが考えられる．その為，間質血管細胞群（ＳＶＦ：small vascular fraction）に存在する脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）と脂肪組織を，移植後に血管を再生させる細胞と共に移植する方法が取られて来た．
【０００６】
その中で，現在までに成功している血管再生用細胞としては脂肪前駆細胞である脂肪幹細胞（ＡＳＣ）と脱分化脂肪細胞（ＤＦＡＴ）の２つが開発されている．
【０００７】
ＡＳＣは脂肪前駆細胞であるが，脂肪細胞に分化するだけではなく，骨細胞，筋細胞，軟骨細胞などへの多分化能を有する幹細胞である（Ｚｕｋ ＰＡ.ら非特許文献３).また，癌転移を促進するとの報告があるので，乳癌切除後の乳房再形成術に頻繁に行う脂肪移植には不適である．また，ＡＳＣは低酸素下では多量のＴＮＦ−αが誘導されるので，炎症を惹起する可能性があり，移植には適さない．
【０００８】
また，ＤＦＡＴ細胞が血管を誘導する因子が何であるか特定されておらず，そのメカニズムの不明確性もヒトへの適応を阻む原因である．
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Zhou Y, Wang J, Li H, et al. Efficacy and Safety of Cell−Assisted Lipotransfer: A Systematic Review and Meta−Analysis. Plast Reconstr Surg 2016: 137: 44e−57e.
【非特許文献２】Eto H, et al.: The fate of adipocyte after non vascularized fat grafting: Evidence of early death and replacement of adipocytes. Plast Reconstr Surg. 2012;129(5):1081−92.
【非特許文献３】Zuk PA. et al.: Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol Biol Cell 2001; 13:4279-95.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記の背景もあり，血管再生能の高い成熟脂肪細胞含有組成物が望まれた。また，炎症を惹起する可能性の低い成熟脂肪細胞含有組成物が望まれた。
【００１１】
さらに，そのような成熟脂肪細胞含有組成物を含む血管再生促進剤や，皮下脂肪組織の代用として森要られる組成物や，乳房増大術，乳房再建術，又は組織陥凹形成術に用いるための脂肪含有剤が望まれた。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は，基本的には，脂肪組織を裁断ろ過し，培地を用いて微小脂肪を培養し，成熟脂肪細胞を得るとともに，その培養の際に得られる馴化培地（培養上清）を含む組成物が，ＩＬ−８，ＧＲＯ及びＭＣＰ−１といった血管形成を促進するケモカイン／サイトカインを多く含み，この組成物を用いれば例えば乳房再生術が極めてうまくいったという実施例による知見に基づく。
【００１３】
この明細書に記載される第１の発明は，成熟脂肪細胞含有組成物の製造方法に関する。この方法は，裁断ろ過工程と，微小脂肪培養工程と，成熟脂肪細胞含有組成物取得工程とを含む。
裁断ろ過工程は，酵素処理をしていない脂肪組織を裁断ろ過し，微小脂肪を得るための工程である。
微小脂肪培養工程は，裁断ろ過工程後に，培養用培地を用いて前記微小脂肪を培養し，成熟脂肪細胞を得るための工程である。培養用培地は，自己血清を含むか，ＦＢＳ，ヒドロコルチゾン及びＦＧＦ−２を含む。
成熟脂肪細胞含有組成物取得工程は，前記成熟脂肪細胞と前記微小脂肪培養工程を経て得られる馴化培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）とを含む成熟脂肪細胞含有組成物を得るための工程である。
【００１４】
脂肪組織の好ましい例は，吸引脂肪を洗浄後，血液成分を除去されたものである。
【００１５】
裁断ろ過工程の好ましい例は，遠心分離を行い，沈殿する間質血管細胞群（ＳＶＦ）を除去する工程を含む。
【００１６】
成熟脂肪細胞の好ましい例は，ケモカイン／サイトカインであるＩＬ−８，ＧＲＯ及びＭＣＰ−１を，それぞれＩＬ−６よりも４倍以上発現する細胞である。
【００１７】
成熟脂肪細胞含有組成物の好ましい利用例は，皮下脂肪組織代用として用いるものである。また，成熟脂肪細胞含有組成物を乳房増大術，乳房再建術，又は組織陥凹形成術に用いてもよい。
【００１８】
この明細書に記載される第２の発明は，皮下脂肪組織の代用として用いられる組成物に関する。この組成物は，上記したいずれかの成熟脂肪細胞含有組成物の製造方法により製造された成熟脂肪細胞含有組成物であって，皮下脂肪組織の代用として用いられる。この組成物は，例えば，乳房増大術，乳房再建術，又は組織陥凹形成術に用いられる。
【００１９】
この明細書に記載される第３の発明は，血管再生促進剤に関する。この血管再生促進剤は，例えば，上記したいずれかの成熟脂肪細胞含有組成物の製造方法によって得られた成熟脂肪細胞含有組成物を含む。
【発明の効果】
【００２０】
第１の発明により得られた成熟脂肪細胞含有組成物は，通常，血管形成促進能の高いＩＬ−８，ＧＲＯ及びＭＣＰ−１を高発現する。このため，この成熟脂肪細胞含有組成物は，血管再生能が高い。
【００２１】
また，上記の通り，ＡＳＣは低酸素下では多量のＴＮＦ−αが誘導されるので，炎症を惹起する可能性があり，移植には適さない。一方，第１の発明により得られた成熟脂肪細胞含有組成物は，血管形成を促進するＩＬ−８，ＧＲＯ及びＭＣＰ−１を高発現する一方で，ＴＮＦ−αやＩＬ−１β，ＩＮＦ−γがほとんど発現しない。このため，上記の方法で得られた成熟脂肪細胞含有組成物は，炎症を惹き起こす可能性が低い。
【００２２】
そして，第２の発明は，上記の通り，成熟脂肪細胞含有組成物を含むので，皮下脂肪組織の代用として用いることができるほか，乳房増大術，乳房再建術，又は組織陥凹形成術に用いることができる。さらに，成熟脂肪細胞含有組成物は，血管形成を促進するＩＬ−８，ＧＲＯ及びＭＣＰ−１を高発現するので血管再生促進剤として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は，細切濾過し破砕した微小脂肪を培養フラスコに入れた状態を示す図面に代わる写真である。
【図２】図２は，培養下の成熟脂肪細胞を示す図面に代わる位相差顕微写真である。
【図３】図３は，培養下の成熟脂肪細胞をズダンＩＩＩ染色した際の図面に代わる写真である。
【図４】図４は，馴化培地のサイトカイン／ケモカイン分析の結果を示す図面に代わるグラフである
【図５】図５は，ヌードマウス腹部にヒト吸引脂肪片を単独移植した組織の移植6ヶ月後の摘出標本を示す図面に代わる写真である。
【図６】図６は，ヌードマウス腹部のヒト脂肪組織，培養脂肪細胞及び馴化培地を共移植した移植後6ヶ月の摘出標本を示す図面に代わる写真である。
【図７】図７は，ヌードマウス腹部のヒト脂肪組織，培養脂肪細胞及び馴化培地を共移植した移植後6ヶ月の摘出標本を示す図面に代わる写真である。
【図８】図８は，左乳癌術後の乳房再建術の例を示す図面に代わる写真である。
【図９】図９は，VEGFR2とPDGFRβの免疫染色の結果を示す図面に代わる写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下，本発明を実施するための形態について説明する。本発明は，以下に説明する形態に限定されるものではなく，以下の形態から当業者が自明な範囲で適宜修正したものも含む。
【００２５】
この明細書に記載される第１の発明は，成熟脂肪細胞含有組成物の製造方法に関する。成熟脂肪細胞含有組成物とは，例えばヒト由来の成熟脂肪細胞を含む組成物である。例えば，特許第５９９１６８７号公報には，成熟脂肪細胞を単離する方法が記載されている。このように成熟脂肪細胞は公知である。成熟脂肪細胞の大きさ（最大長さを与える部分の長さ）は，６０〜１００μｍであってもよいし，１μｍ以上６０μｍ以下」であることが好ましく，５μｍ以上４０μｍ以下でもよい。
【００２６】
この方法は，裁断ろ過工程と，微小脂肪培養工程と，成熟脂肪細胞含有組成物取得工程とを含む。
【００２７】
裁断ろ過工程
裁断ろ過工程は，酵素処理をしていない脂肪組織を裁断ろ過し，微小脂肪を得るための工程である。脂肪組織の好ましい例は，吸引脂肪を洗浄後，血液成分を除去されたものである。血液成分を除去された脂肪組織を抗生物質で除菌後にろ過することで，細胞を細かく破砕してもよい。裁断ろ過工程は，遠心分離を行い，沈殿する間質血管細胞群（ＳＶＦ）を除去する工程を含むものが好ましい。この場合，遠心分離により得られる液相の上部に浮き上がる脂肪成分のみを回収し，微小細胞を得ればよい。遠心分離は公知の方法を適宜採用すればよい。
【００２８】
微小脂肪培養工程
微小脂肪培養工程は，裁断ろ過工程後に，培養用培地を用いて微小脂肪を培養し，成熟脂肪細胞を得るための工程である。培養用培地は，自己血清を含むか，ＦＢＳ，ヒドロコルチゾン及びＦＧＦ−２を含む。
【００２９】
本発明の無血清培地は，基本培地に適宜必要な要素を添加すればよい。基本培地の例は，α−ＭＥＭ培地，イーグル基礎培地，及びＤＭＥＭである。試薬は，培地に用いる公知のものを適宜添加すればよい。試薬の例は，ウシ胎児血清（ＦＢＳ），ＨＣ（ヒドロコルチゾン），ＦＧＦ２（ビーズ），ＩＧＦ（インスリン様増殖因子），インスリン，ＰＤＧＦ（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ），ＡＣＴＨ（副腎皮質刺激ホルモン），ＬＩＦ（白血病阻害因子），ＴＧＦβ，ＢＭＰ，ステロイド，脂肪酸，大豆トリプシン阻害剤，アスコルビン酸，ヒアルロン酸，プロリン，デキサメタゾン，インスリン，トランスフェリン，亜セレン酸である。アスコルビン酸などを培地に添加する場合，２−リン酸塩など塩の形のものを添加してもよい。それぞれ培地に０．１ｎｇ／ｍＬ以上２０μｇ／ｍＬ以下（又は０．２ｎｇ／ｍＬ以上１０μｇ／ｍＬ以下）となるように添加すればよい。これらは精製の程度や必要量に応じて適宜調整して添加すればよい。
【００３０】
培養用培地の例はα−ＭＥＭ培地に１〜１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）, ２０ｎｇ/ｍｌ以上１００ｎｇ／ｍｌ以下のヒドロコルチゾン（Hydrocortisone）, ５ｎｇ／ｍｌ以上２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２（Fibroblast Growth Factor 2）を添加したものである。
【００３１】
微小脂肪を通常の培養条件で培養・増殖させてもよい。細胞量は１０％前後から１００％コンフルエントな状態まで可能であり，また，１００％コンフルエントを超えるような高密度，重層状態での培養も可能である。移植後すぐに，あるいはしばらく静置した後，低酸素状態に移行させてもよい。低酸素培養は，例えば市販の窒素ガスなどを混合し，酸素分圧を低下させるタイプの低酸素インキュベーターを用いることもできるし，適当な空間に窒素ガスなどを吹き込んで酸素分圧を下げるなどして培養してもよい。
【００３２】
培養条件は，３％以上２０％以下の炭酸ガス，１％以上１０％以下の酸素ガス下で行うことが好ましく，５％以上２０％以下の炭酸ガス，２％以上１０％以下の酸素ガス下でもよく，８％以上１２％以下の炭酸ガス，３％以上７％以下の酸素ガス下でもよい。
【００３３】
成熟脂肪細胞含有組成物取得工程
成熟脂肪細胞含有組成物取得工程は，成熟脂肪細胞と微小脂肪培養工程を経て得られる馴化培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）とを含む成熟脂肪細胞含有組成物を得るための工程である。成熟脂肪細胞含有組成物は，成熟脂肪細胞と培養上清を含むものであってもよい。
【００３４】
成熟脂肪細胞の好ましい例は，ケモカイン／サイトカインであるＩＬ−８，ＧＲＯ及びＭＣＰ−１を，それぞれＩＬ−６よりも４倍以上発現する細胞である。ＩＬ−８，ＧＲＯ及びＭＣＰ−１のいずれか又は２種以上をＩＬ−６よりも１０倍以上発現するものであってもよいし，ＩＬ−６よりも２０倍以上発現するものであってもよいし，ＩＬ−６よりも２０倍以上発現するものであってもよい。このように血管再生促進能が高く炎症性の少ないサイトカイン／ケモカインを含むことで，成熟脂肪細胞含有組成物は，移植した際に，炎症を惹き起こさずに高い血管促進能を発揮するため，移植に適している。この成熟脂肪細胞含有組成物は，特に移植を行う患者から採取した脂肪を含む物が好ましい。
【００３５】
成熟脂肪細胞の好ましい例は，ＩＬ−８，ＧＲＯ及びＭＣＰ−１のいずれか又は２種以上を，ＴＮＦ−αに比べて１０倍以上発現するものであり，ＴＮＦ−αに比べて５０倍以上発現するものが好ましく，ＴＮＦ−αに比べて１００倍以上発現するものが好ましく，ＴＮＦ−αに比べて５００倍以上発現するものが好ましい。
【００３６】
成熟脂肪細胞の好ましい例は，ＩＬ−８，ＧＲＯ及びＭＣＰ−１のいずれか又は２種以上を，ＩＬ−１−βに比べて１０倍以上発現するものであり，ＩＬ−１−βに比べて５０倍以上発現するものが好ましく，ＩＬ−１−βに比べて１００倍以上発現するものが好ましく，ＩＬ−１−βに比べて５００倍以上発現するものが好ましい。
【００３７】
成熟脂肪細胞の好ましい例は，ＩＬ−８，ＧＲＯ及びＭＣＰ−１のいずれか又は２種以上を，ＩＮＦ−γに比べて１０倍以上発現するものであり，ＩＮＦ−γに比べて５０倍以上発現するものが好ましく，ＩＮＦ−γに比べて１００倍以上発現するものが好ましく，ＩＮＦ−γに比べて５００倍以上発現するものが好ましい。
【００３８】
成熟脂肪細胞含有組成物は，目的に応じて適切な量の成熟脂肪細胞や馴化培地（又は培養上清）を含めばよい。また，この組成物は，通常の組成物と同様に必要な容器に収容し，必要に応じて利用できるようにすればよい。成熟脂肪細胞の量は，例えば，１回用途当たり１×１０４ 細胞以上１×１０１０細胞でもよいし，１回用途当たり１×１０５ 細胞以上１×１０８細胞でもよい。
【００３９】
培養上清を有効成分として含む剤は，例えば，特開２０１３−１８７５６号公報，特許第５１３９２９４号，及び特許第５５２６３２０号公報に開示されるとおり公知である。したがって，馴化培地を含む組成物を，公知の方法を用いて製造することができる。
【００４０】
成熟脂肪細胞の培養上清の例は，遠心分離により培養上清を固液分離して得られる上清成分である培養上清を，凍結乾燥により水分を除去して得られる処理物，エバポレーター等を用いて培養上清を減圧濃縮して得られる処理物，限外ろ過膜等を用いて培養上清を濃縮して得られる処理物，又はフィルターを用いて培養上清を固液分離して得られる処理物，もしくは，上述のような処理をする前の培養上清の原液である。また，例えば，本発明の成熟脂肪細胞を培養した上澄みを,遠心分離（例えば，１，０００×ｇ，１０分）した後，硫安（例えば，６５％飽和硫安）で分画し，沈殿物を適切な緩衝液で懸濁した後に透析処理を行い,シリンジフィルター（例えば，０．２μｍ）で濾過し，無菌的な培養上清を得てもよい。採取した培養上清を，そのまま用いても，また凍結保存しておき使用時に解凍して用いることもできる。また薬剤学的に許容される担体を加えて，取り扱いやすい液量となるように滅菌容器に分注してもよい。さらに,感染性病原体リスクの対策として,培養上清をウイルスクリアランスフィルターや紫外線照射により処理してもよい。成熟脂肪細胞含有組成物は，培養上清を１投与単位として１ｍＬ以上１，０００ｍＬ以下含むことが好ましく，さらに好ましくは，３０ｍＬ以上３００ｍＬ以下である。
【００４１】
成熟脂肪細胞含有組成物の好ましい利用例は，皮下脂肪組織代用として用いるものである。この明細書は，ヒトである患者に対し，成熟脂肪細胞含有組成物を投与する工程を含む皮下脂肪組織代用方法をも提供する。この際の成熟脂肪細胞含有組成物は，成熟脂肪細胞や馴化培地の他に，この患者の脂肪組織をさらに含む物であることが好ましい。また，成熟脂肪細胞含有組成物を乳房増大術，乳房再建術，又は組織陥凹形成術に用いてもよい。例えば，乳房再建術は，脂肪成分を欠損した乳房に成熟脂肪細胞含有組成物を注入する工程を含む。
【００４２】
この明細書に記載される第２の発明は，皮下脂肪組織の代用として用いられる組成物に関する。この組成物は，上記したいずれかの成熟脂肪細胞含有組成物の製造方法により製造された成熟脂肪細胞含有組成物であって，皮下脂肪組織の代用として用いられる。この組成物は，例えば，乳房増大術，乳房再建術，又は組織陥凹形成術に用いられる。
【００４３】
この明細書に記載される第３の発明は，血管再生促進剤に関する。この血管再生促進剤は，例えば，上記したいずれかの成熟脂肪細胞含有組成物の製造方法によって得られた成熟脂肪細胞含有組成物を含む。つまりこの血管再生促進剤は，上記した成熟脂肪細胞含有組成物と同様である。血管再生促進剤は，例えば注射剤であってもよい。注射器内に，上記した成熟脂肪細胞含有組成物を含有させておき，必要に応じて患者の組織と混合し，患者の必要個所に移植すればよい。
【実施例１】
【００４４】
培養法培養脂肪の培地の組成
インフォームドコンセントを得て，腹部，大腿部より脂肪組織を径２ｍｍ以下のカニューラで吸引採取した。吸引採取した脂肪を洗浄し，血液成分を除去した。この組織を抗生物質で除菌後に細切濾過し，脂肪を細かく破砕し，遠心して液相に上部に浮き上がる脂肪成分のみを培養した．ＳＶＦは遠心すると下層にペレット（pellet）として沈殿するので除去した.
【００４５】
この微小脂肪を培養フラスコに入れて，培養を開始した．図１は，細切濾過し破砕した微小脂肪を培養フラスコに入れた状態を示す図面に代わる写真である。図１に示される通り，ＳＶＦが除去されて脂肪成分のみが残留している。培養時の培地量は組織が浮かない程度の少量とした．培養５日後に組織片から接着する細胞が出てきたのを確認したので，培地を追加して培養を続けた．
【００４６】
培地はα−ＭＥＭ培地に５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ：Fetal Bovine Serum）, 40ng/ml ヒドロコルチゾン（Hydrocortisone）, 10ng/ml  ＦＧＦ２（Fibroblast Growth Factor 2）を添加したものを使用した．培養条件は，１０％炭酸ガス，５％酸素ガス下で行った．
【００４７】
初代培養12日目に２〜３×１０６ cellsの培養細胞を回収した．この細胞の一部を凍結し，他の細胞を４〜５×１０４／ｃｍ２の密度で播種し，5日間培養した．6日後にＰＢＳ（−）で３回洗浄し，2日間上記の培地成分からＦＢＳを除いた培地にて培養した．この培地を馴化培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）として分析に用いた．
【００４８】
図２は，培養下の成熟脂肪細胞を示す図面に代わる位相差顕微写真である。図２に示される通り，脂肪細胞は脂肪顆粒を多く含んでいた。培養下の成熟脂肪細胞を確認するためズダンＩＩＩ染色を行った。脂肪の特殊染織であるズダンIII においても成熟脂肪細胞は特異的に赤く染まる。その結果を図３に示す。図３は，培養下の成熟脂肪細胞をズダンＩＩＩ染色した際の図面に代わる写真である。図３に示される通り，培地は，脂肪顆粒を多く含んでいることがわかる。
【実施例２】
【００４９】
抗体固体化磁気ビーズ法（Antibody−Immobilized Magnetic Beads法）で培養成熟脂肪細胞の馴化培地（Conditioned Medium）のサイトカイン／ケモカイン分析を行った． 馴化培地（Conditioned Medium）サンプルを１３，０００ G，4℃で5分間遠心して得られた上清を測定に使用した。馴化培地（Conditioned Medium）内の４０の標的タンパク質の濃度を，Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）システムを使用して測定した。前処理されたサンプルをウェルあたり２５μLで使用し，測定を3回行った。標準液をマニュアルに基づいて1点追加し，5倍希釈系列を7点用意し，3回測定した。対象タンパク質40品目は，EGF，FGF−2，エオタキシン，TGF−α，G−CSF，Flt−3L，GM−CSF，フラクタルカイン，IFNα2, IFNg, GRO, IL−10, MCP−3, IL− 12P40, MDC, IL−12P70, PDGF−AA, IL−13, PDGF−AB  ／  BB, IL−15, sCD40L, IL−17A, IL−1RA, IL−1α, IL−9, IL−1b, IL−2, IL−3, IL−4, IL−5, IL−6, IL−7, IL−8, IP−10, MCP−1, MIP−1α, MIP−1b, RANTES, TNFα, TNFb, 及びVEGFであった。
【００５０】
図４は，馴化培地（Conditioned Medium）のサイトカイン／ケモカイン分析の結果を示す図面に代わるグラフである。図４に示されるように，培養成熟脂肪細胞の馴化培地は，血管再生能の高いサイトカインであるＩＬ−８,  ＧＲＯ，ＭＣＰ−1が多量（ｎｇ／ｍｌ）に産生していることが証明された．一方，脂肪幹細胞で増え炎症を起こすTNF−αや炎症惹起力の強いIL−1−β，INF−γはこの細胞では殆ど産生されていないので，安全であることも示された．
【実施例３】
【００５１】
ヌードマウスへの脂肪移植実験
−マウスの移植実験と移植組織像の検討−
インフォームドコンセントを得て，腹部より脂肪組織を吸引採取した．上記と同様な方法で，除菌して播種した．初代培養１２日目に２×１０６ cells の培養脂肪細胞を回収した．この細胞を一旦凍結保存した．移植前に細胞を解凍して，５×１０４ cells／ｃｍ２の密度で播種し，５日間培養した．移植する脂肪０．６〜０．７ｇに対して酵素処理で回収した培養脂肪細胞を３×１０６ cells加えて混和し，翌日にヌードマウスの背部皮下に移植した．対照群のマウスには脂肪のみ移植した．移植後6か月目に摘出して，組織染色に供した．ヒト脂肪組織のみの単独移植では脂肪組織は殆ど吸収されていたが，培養細胞とヒト脂肪の共移植では完全に脂肪組織が残っていた．しかも中心に血管の形成が認められた．
【００５２】
ヒト吸引脂肪片をヌードマウス腹部に単独移植した組織の移植6ヶ月後の摘出標本を，オイルレッドＯを用いて染色した。図５は，ヌードマウス腹部にヒト吸引脂肪片を単独移植した組織の移植6ヶ月後の摘出標本を示す図面に代わる写真である。図５の倍率は１００倍である。脂肪組織が形成された部分は周辺に一部認めるが中央部は空洞化しているのは移植後に脂肪が吸収された部位である。そのまわりは瘢痕組織と一部脂肪が組織形成されている。
【００５３】
ヒト脂肪組織，培養脂肪細胞及び馴化培地（Conditioned Medium）を，ヌードマウス腹部に共移植した移植後6ヶ月の摘出標本を，オイルレッドＯを用いて染色した。図６は，ヌードマウス腹部のヒト脂肪組織，培養脂肪細胞及び馴化培地（Conditioned Medium）を共移植した移植後6ヶ月の摘出標本を示す図面に代わる写真である。図６の倍率は１００倍である。その倍率は100倍である。標本組織全体に脂肪組織が95％以上形成されている。内部に血管組織も認められた。
【００５４】
ヒト脂肪組織，培養脂肪細胞及び馴化培地（Conditioned Medium）をヌードマウス腹部に共移植した。脂肪の蛍光免疫染色（Human nuclear Antigen Antibody 231-1  [Alexa Fluor（登録商標）488] Novus社 Southpark Way US)を用いて染色した。図７は，ヌードマウス腹部のヒト脂肪組織，培養脂肪細胞及び馴化培地（Conditioned Medium）を共移植した移植後6ヶ月の摘出標本を示す図面に代わる写真である。標本組織全体に脂肪組織が形成されている。内部に血管様組織も認められた．
【実施例４】
【００５５】
ヒトへの脂肪移植（乳房再建術）
実施例４−１：左乳癌術後の乳房再建への培養成熟脂肪細胞，馴化培地（Conditioned Medium）及び自家脂肪移植例− 
左乳癌術後の46歳女性に対し，乳がん切除時に胸部に組織拡張器を留置して，皮下組織と大胸筋を拡張（expansion）して胸に膨らみを作製した。その後，本人の希望により本法を予定した。腹部より脂肪を２ｃｃ吸引採取し，除菌して播種培養を行った。初代培養１４日目に３×１０６ cellsの培養脂肪細胞を回収した。 この培養脂肪細胞は一旦凍結保存した。 移植前に，解凍して細胞を，底面積150 cm２のフラスコ12枚に6日間培養した。移植に用いる吸引脂肪組織と培養成熟培養細胞と馴化培地（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ Ｍｅｄｉｕｍ）を混和して移植した。１回目の移植は皮下組織拡張器の周囲に，合計252ml（１７．１６×１０７ cells）を左胸部皮下に直ぐに移植した．約6ヶ月後に組織拡張器を抜去する際に内腔とその周囲にフラスコ8枚合計258ml（１１．４４×１０７cells）を左胸部皮下に直ぐに移植した．
【００５６】
移植後１年の移植脂肪組織をＭＲＩで画像解析した結果，移植された脂肪組織は吸収されず，元の大きさのまま維持していることが示された．その結果を図８に示す。図８は，左乳癌術後の乳房再建術の例を示す図面に代わる写真である。画面はMRIの水平断で下方からみた所見，健常側で乳腺組織乳頭が認められる。再建側は移植された脂肪が吸収されることなくほぼ100％近く生着している。脂肪組織の輝度は白く，全層性に脂肪が形成されているのがわかる。また内部には多数の血管の走行が認められる。脂肪壊死や嚢腫，石灰化,しこり(硬結)が認められない。安定して脂肪形成が認められた（その他10症例においても同じ結果が得られた）。腹臥位で撮影したため，健常側は下垂している
【００５７】
ヒトへの脂肪移植（乳房再建術）
実施例４−２：左乳癌温存手術術後および右乳房萎縮低形成への培養成熟脂肪細胞，馴化培地（Conditioned Medium）及び自家脂肪移植例
左乳癌術後の44歳女性に対し，左乳がん温存手術後に著しい乳房陥凹変形（1/2以上の変形）を認め，右乳房は低形成と萎縮を認めた。本人の希望により本法を予定した。腹部より脂肪を2cc吸引採取し，除菌して播種培養を行った。初代培養14日目に3.4×１０６ cellsの培養細胞を回収した。 この培養細胞を一旦凍結保存した。 移植前に，解凍して細胞を，底面積150 cm２のフラスコ15枚に7日間培養した。移植に用いる吸引脂肪組織と培養脂肪細胞と成熟培養細胞と馴化培地（Conditioned Medium）を混和して移植した。移植総量は310ml(21.45×１０７ cells)であった。左乳がん温存部には皮下組織全体に合計220mlを注入移植した．右乳房萎縮低形成部には90ｍｌを注入移植した．移植後1年，脂肪組織は吸収されずに大きさが維持され，しこり(硬結)など認めず、外貌形態は良好であった。
【００５８】
ヒトへの脂肪移植（乳房再建術）
実施例４−３：顔面萎縮への培養成熟脂肪細胞，馴化培地（Conditioned Medium）及び自家脂肪移植例
左乳癌術後の68歳女性は右顔面萎縮のため陥凹変形を認めた。また，他医院で腹部，大腿などの脂肪吸引を受けているため通常の脂肪採取が難しい症例であった。本人の希望により本法を予定した。腹部より脂肪を2cc吸引採取し，除菌して播種培養を行った。初代培養16日目に4.4×１０６cellsの培養細胞を回収した。 この培養細胞は一旦凍結保存した。 移植前に，解凍して細胞を，底面積175 cm２のフラスコ5枚に7日間培養した。移植に用いる吸引脂肪組織と培養細胞と成熟培養細胞とConditioned medium を混和して移植した。移植総量は35ml(8.35X１０７ cells)であった。移植後1年，脂肪組織は吸収されずに大きさが維持され,しこり（硬結）など認めず，外貌形態は良好であった。
【００５９】
また，漏斗胸は胸の胸壁陥凹変形であるので実施例４−２と同様，医学的に陥凹変形の高度なものと考えることができるため，本法の適応疾患である。
【００６０】
考察
従来の概念では脂肪幹細胞を含むSVF(ASC)は血管新生を促すことにより、脂肪と共移植すると移植のsurvival  rateが向上すると考えられていた。Animal study では移植片の生存可能領域は、縁から約1.5 0.5 mmであり、生存細胞内の脂肪細胞の60％が死んでいる。 Adipocytes にSVFに含まれるAdipose derived stromal cell (ASCs)を添加してもSurvival zoneは300μmよりすくないsurvival zone  しか得られていない。またhuman studyではCell assisted lipotrasfer(CAL) といわれ、乳房の脂肪移植は  通常の脂肪移植と変わらない報告と、通常の脂肪移植が39％でCALは65％であったと報告した（Toyserkani MN., Quaade ML, and Sｏrensen. JA. Cell-Assisted Lipotransfer: A Systematic Review of Its Efficacy. Aesthetic Plast Surg.2016; 40:309-318）。乳房へのCALの survival rate は10の報告中の5報告で記載しており、51.8％、47％、40％〜80％、54％、50％と安定していない（Cell assisted lipotransfer in breast augmentation and reconstruction: A systematic review of safety, efficacy, use of patient reported outcomes and study quality.Arshad Z, Karmen L, Choudhary R, Smith JA, Branford OABrindley DA, Pettitt D and Davies BM. JPRAS OPEN .2016 Dec;10:5-20）
【００６１】
ＧＲＯは血管形成能が文献（Caunt M,1 Liang Hu,1 Thomas Tang,1 Peter C. Brooks,2 Sherif Ibrahim,3 and Simon Karpatkin Growth-regulated Oncogene Is Pivotal in Thrombin-Induced Angiogenesis. Cancer Res 2006;66(8):4125 -32，
Keglowich1 L, Roth M, Philippova1 M, Resink T, Tjin G, Bronchial Smooth Muscle Cells of Asthmatics Promote Angiogenesis Through Elevated Secretion of CXC-chemokines (ENA-78, GRO-α, and IL-8) PLoS One.2013 ;8(12):e81494. doi: 10.1371/journal.pone.0081494）で示されている。
【００６２】
ＩＬ−８の血管形成能も文献（Ｍｉｋｕｌａ−Pietrasik J Kuczmarska A, Kucin´ska M. Muriaset M. al. Resveratrol and its synthetic derivatives exert opposite effects on mesothelial cell-dependent angiogenesis via modulating secretion of VEGF and IL-8/CXCL8. Angiogenesis 2012; 15:361-376及び上記Keglowich1ら）で示されている。
【００６３】
ＭＣＰ−１は血管新生ケモカインとして報告され血管形成能も他の１つの文献（6.Niu J, Azfer A, Zhelyabovska O, Fatma S, and Kolattukudy PE.Monocyte Chemotactic Protein (MCP)-1 Promotes Angiogenesis via a Novel Transcription Factor, MCP-1-induced Protein (MCPIP). J Biol Chem2008 May 23;283(21): 14542-51.doi: 10.1074/jbc.M802139200）で示されている。また、ＭＣＰ−１がVEGFの血管形成能にmediateすることが文献（3.Hong KH, Ryu J, Han KH. Monocyte Chemoattractant protein-1-induced Angiogenesis Is Mediated by Vascular Endothelial Growth factor-A. Blood 2005; 105:1405-1407 DOI:10,1182/blood-2004-08-3178）で示されている。血管形成にはマクロファージの出動が必須であり、ＭＣＰ−１がそれを行う必須因子である。
【００６４】
したがって，実施例における培養脂肪細胞が分泌する馴化培地の中にあるものの３種のサイトカイン（ＭＣＰ−１, ＩＬ−８, ＧＲＯ）全てに血管形成能があることが示された。
【実施例５】
【００６５】
成熟培養脂肪細胞P2を1X10４／6well（8ｃｍ２／well）播種し，成熟培養脂肪細胞単独群と成熟培養脂肪細胞+吸引脂肪の共培養群を作成し５日間培養し、VEGFR2(Vascular endothelial growth factor receptor 2)とPDGFRβ（platelet-derived growth factor beta） の免疫染色を行った。
使用薬品はAnti−VEGFR2 polyclonal antibody (フナコシ：bs-10412)Anti−PDGFRbeta polyclonal antiboby [Y92]−C−terminal (ab32570) Goat Anti−Rabbit IgG H＆L (HRP) (ab205718) DAB substrate kit (フナコシ：CSK-4100, VEC)である．
得られた結果を図９に示す。2群はどちらもVEGFR2とPDGFRβが強く発現していることが示された．
VEGFR2はVEGF signalのprimary responderで血管内皮細胞とその前駆細胞にしか発現しないので，血管が造成することが示された．PDGFRβは脂肪前駆細胞のそのPPARγがFatty acid等に刺激される時に発現する。したがって、脂肪前駆細胞も含まれているという結果を得た．そして、この刺激でVEGFをこの脂肪前駆細胞造る。したがって血管形成方向に向かう．両者の細胞が含まれているので移植後に血管形成と脂肪形成が同時に促進されると考えたれた．また前回の血管促進因（MCP−1,IL−8,GRO,VEGF）も多量に出ているので移植後の血管形成が（両輪の輪：細胞種＋因子）となり,非常に強い血管新生作用を持っていることがわかった．また,成熟脂肪細胞と吸引脂肪を共培養した群においてもＶＥＧＦＲ２とＰＤＧＦＲβが強く発現していることが示された．
【産業上の利用可能性】
【００６６】
この発明は，医療機器の分野などで利用されうる。
【要約】      （修正有）【課題】血管再生能が高く、炎症を惹起する可能性の低い成熟脂肪細胞含有組成物の製造方法、及び成熟脂肪細胞含有組成物の提供。【解決手段】酵素処理をしていない脂肪組織を裁断ろ過し、微小脂肪を得る裁断ろ過工程と、裁断ろ過工程後に、培養用培地を用いて微小脂肪を培養し、成熟脂肪細胞を得る微小脂肪培養工程と、成熟脂肪細胞と微小脂肪培養工程を経て得られる馴化培地とを含む成熟脂肪細胞含有組成物を得る成熟脂肪細胞含有組成物取得工程とを含む、成熟脂肪細胞含有組成物の製造方法であって、培養用培地は、自己血清を含むか、ＦＢＳ、ヒドロコルチゾン及びＦＧＦ−２を含む培地である、成熟脂肪細胞含有組成物の製造方法。【選択図】図１【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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