(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホウレンソウ（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３８４）、または、
第４染色体領域に低シュウ酸遺伝子座を有する前記ホウレンソウ（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３８４）の後代であって、
前記低シュウ酸遺伝子座が、下記（１）及び（２０）のＳＮＰマーカーのホモ接合、又は下記（１）、（１７）及び（２０）のＳＮＰマーカーのホモ接合を少なくとも含む、
低シュウ酸含量のホウレンソウ。
（１）ＳＬ０１：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の２８５４３番目の塩基ＡがＴである多型、及び
（１７）ＳＬ０２：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の１８４７９１８番目のＣがＴである多型
（２０）ＳＬ０３：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００１４１７．１の９０４９０番目の塩基ＧがＡである多型
【請求項２】
前記（１）の多型を含む低シュウ酸遺伝子座が、下記（１−１）又は（１−２）から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドで特定される、請求項１に記載の低シュウ酸含量のホウレンソウ。
（１−１）配列番号１の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（１−２）配列番号１の塩基配列の５７番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号１の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号１の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
【請求項３】
前記（２０）の多型を含む低シュウ酸遺伝子座が、下記（２０−１）又は（２０−２）から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドで特定される、請求項１又は２に記載の低シュウ酸含量のホウレンソウ。
（２０−１）配列番号２０の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（２０−２）配列番号２０の塩基配列の５１番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号２０の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号２０の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
【請求項４】
前記（１７）の多型を含む低シュウ酸遺伝子座が、下記（１７−１）又は（１７−２）から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドで特定される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の低シュウ酸含量のホウレンソウ。
（１７−１）配列番号１７の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（１７−２）配列番号１７の塩基配列の１２番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号１７の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号１７の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
【請求項５】
前記低シュウ酸遺伝子座が、下記（２）〜（１６）、（１８）〜（１９）及び（２１）〜（２２）からなる群から選択される少なくとも１つのＳＮＰマーカーをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の低シュウ酸含量のホウレンソウ。
（２）ＳＬ２０８５４５：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の２０８５４５番目の塩基ＣがＴである多型
（３）ＳＬ２２０２７５：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の２２０２７５番目の塩基ＣがＧである多型
（４）ＳＬ２４１７５４：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の２４１７５４番目の塩基ＣがＡである多型
（５）ＳＬ２９３２６５：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の２９３２６５番目の塩基ＡがＴである多型
（６）ＳＬ２９３６５８：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の２９３６５８番目の塩基ＧがＡである多型
（７）ＳＬ２９３９０２：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の２９３９０２番目の塩基ＧがＡである多型
（８）ＳＬ２９４０８１：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の２９４０８１番目の塩基ＡがＧである多型
（９）ＳＬ４３０２３７：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の４３０２３７番目の塩基ＧがＡである多型
（１０）ＳＬ７４７２３１：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の７４７２３１番目の塩基ＧがＡである多型
（１１）ＳＬ７５９００８：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の７５９００８番目の塩基ＴがＧである多型
（１２）ＳＬ８１２３６７：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の８１２３６７番目の塩基ＧがＣである多型
（１３）ＳＬ８１２３８４：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の８１２３８４番目の塩基ＴがＣである多型
（１４）ＳＬ８１２５１４：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の８１２５１４番目の塩基ＣがＴである多型
（１５）ＳＬ８１２６０１：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の８１２６０１番目の塩基ＡがＧである多型
（１６）ＳＬ１２５２２３４：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の１２５２２３４番目の塩基ＡがＣである多型
（１８）ＳＬ２１６７３４４：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の２１６７３４４番目の塩基ＣがＴである多型
（１９）ＳＬ７８８１２：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００１４１７．１の７８８１２番目の塩基ＣがＴである多型
（２１）ＳＬ９７２４３：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００１４１７．１の９７２４３番目の塩基ＧがＡである多型
（２２）ＳＬ３２３３３６：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００１４１７．１の３２３３３６番目の塩基ＴがＡである多型
【請求項６】
前記低シュウ酸遺伝子座が、下記（２−１）〜（１６−２）、（１８−１）〜（１９−２）及び（２１−１）〜（２２−２）からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドで特定される多型をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の低シュウ酸含量のホウレンソウ。
（２−１）配列番号２の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（２−２）配列番号２の塩基配列の５１番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号２の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号２の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（３−１）配列番号３の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（３−２）配列番号３の塩基配列の１３５番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号３の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号３の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（４−１）配列番号４の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（４−２）配列番号４の塩基配列の５１番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号４の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号４の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（５−１）配列番号５の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（５−２）配列番号５の塩基配列の５１番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号５の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号５の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（６−１）配列番号６の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（６−２）配列番号６の塩基配列の３７番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号６の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号６の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（７−１）配列番号７の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（７−２）配列番号７の塩基配列の２４４番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号７の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号７の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（８−１）配列番号８の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（８−２）配列番号８の塩基配列の３６番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号８の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号８の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（９−１）配列番号９の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（９−２）配列番号９の塩基配列の８１番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号９の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号９の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（１０−１）配列番号１０の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（１０−２）配列番号１０の塩基配列の１８０番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号１０の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号１０の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（１１−１）配列番号１１の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（１１−２）配列番号１１の塩基配列の５１番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号１１の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号１１の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（１２−１）配列番号１２の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（１２−２）配列番号１２の塩基配列の５１番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号１２の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号１２の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（１３−１）配列番号１３の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（１３−２）配列番号１３の塩基配列の９番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号１３の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号１３の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（１４−１）配列番号１４の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（１４−２）配列番号１４の塩基配列の５１番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号１４の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号１４の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（１５−１）配列番号１５の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（１５−２）配列番号１５の塩基配列の５番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号１５の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号１５の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（１６−１）配列番号１６の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（１６−２）配列番号１６の塩基配列の１５４番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号１６の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号１６の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（１８−１）配列番号１８の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（１８−２）配列番号１８の塩基配列の１４４番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号１８の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号１８の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（１９−１）配列番号１９の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（１９−２）配列番号１９の塩基配列の９１番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号１９の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号１９の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（２１−１）配列番号２１の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（２１−２）配列番号２１の塩基配列の５１番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号２１の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号２１の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（２２−１）配列番号２２の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（２２−２）配列番号２２の塩基配列の２３６番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号２２の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号２２の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
【請求項７】
植物体またはその一部である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の低シュウ酸含量のホウレンソウ。
【請求項８】
種子である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の低シュウ酸含量のホウレンソウ。
【請求項９】
植物細胞、組織及び器官から選ばれる少なくとも１つである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の低シュウ酸含量のホウレンソウ。
【請求項１０】
葉身の先端のシュウ酸含量が６００ｍｇ／１００ｇＦＷ以下であること、及び
可食部のシュウ酸含量が４００ｍｇ／１００ｇＦＷ以下であること、
の少なくともいずれかを満たす、請求項１〜７のいずれか１項に記載の低シュウ酸含量のホウレンソウ。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の低シュウ酸含量のホウレンソウと、他のホウレンソウとを交雑する交雑工程、および、
交雑工程において得られたホウレンソウまたはその後代系統から、第４染色体領域に存在する少なくとも１つの低シュウ酸遺伝子座を有する植物を選抜する選抜工程を少なくとも含み、
前記低シュウ酸遺伝子座が、下記（１）及び（２０）のＳＮＰマーカーのホモ接合、又は下記（１）、（１７）及び（２０）のＳＮＰマーカーのホモ接合を少なくとも含む、
低シュウ酸含量のホウレンソウの製造方法。
（１）ＳＬ０１：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の２８５４３番目の塩基ＡがＴである多型、及び
（１７）ＳＬ０２：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の１８４７９１８番目のＣがＴである多型
（２０）ＳＬ０３：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００１４１７．１の９０４９０番目の塩基ＧがＡである多型
【請求項１２】
前記（１）の多型を含む低シュウ酸遺伝子座が、下記（１−１）又は（１−２）から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドで特定される、請求項１１に記載の製造方法。
（１−１）配列番号１の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（１−２）配列番号１の塩基配列の５７番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号１の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号１の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
【請求項１３】
前記（２０）の多型を含む低シュウ酸遺伝子座が、下記（２０−１）又は（２０−２）から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドで特定される、請求項１１又は１２に記載の製造方法。
（２０−１）配列番号２０の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（２０−２）配列番号２０の塩基配列の５１番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号２０の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号２０の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
【請求項１４】
前記（１７）の多型を含む低シュウ酸遺伝子座が、下記（１７−１）又は（１７−２）から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドで特定される、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の製造方法。
（１７−１）配列番号１７の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（１７−２）配列番号１７の塩基配列の１２番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号１７の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号１７の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
【請求項１５】
前記低シュウ酸遺伝子座が、下記（２）〜（１６）、（１８）〜（１９）及び（２１）〜（２２）からなる群から選択される少なくとも１つのＳＮＰマーカーをさらに含む、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の製造方法。
（２）ＳＬ２０８５４５：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の２０８５４５番目の塩基ＣがＴである多型
（３）ＳＬ２２０２７５：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の２２０２７５番目の塩基ＣがＧである多型
（４）ＳＬ２４１７５４：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の２４１７５４番目の塩基ＣがＡである多型
（５）ＳＬ２９３２６５：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の２９３２６５番目の塩基ＡがＴである多型
（６）ＳＬ２９３６５８：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の２９３６５８番目の塩基ＧがＡである多型
（７）ＳＬ２９３９０２：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の２９３９０２番目の塩基ＧがＡである多型
（８）ＳＬ２９４０８１：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の２９４０８１番目の塩基ＡがＧである多型
（９）ＳＬ４３０２３７：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の４３０２３７番目の塩基ＧがＡである多型
（１０）ＳＬ７４７２３１：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の７４７２３１番目の塩基ＧがＡである多型
（１１）ＳＬ７５９００８：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の７５９００８番目の塩基ＴがＧである多型
（１２）ＳＬ８１２３６７：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の８１２３６７番目の塩基ＧがＣである多型
（１３）ＳＬ８１２３８４：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の８１２３８４番目の塩基ＴがＣである多型
（１４）ＳＬ８１２５１４：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の８１２５１４番目の塩基ＣがＴである多型
（１５）ＳＬ８１２６０１：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の８１２６０１番目の塩基ＡがＧである多型
（１６）ＳＬ１２５２２３４：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の１２５２２３４番目の塩基ＡがＣである多型
（１８）ＳＬ２１６７３４４：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の２１６７３４４番目の塩基ＣがＴである多型
（１９）ＳＬ７８８１２：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００１４１７．１の７８８１２番目の塩基ＣがＴである多型
（２１）ＳＬ９７２４３：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００１４１７．１の９７２４３番目の塩基ＧがＡである多型
（２２）ＳＬ３２３３３６：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００１４１７．１の３２３３３６番目の塩基ＴがＡである多型
【請求項１６】
前記低シュウ酸遺伝子座が、下記（２−１）〜（１６−２）、（１８−１）〜（１９−２）及び（２１−１）〜（２２−２）からなる群から選択される少なくとも１つで特定される多型をさらに含む、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の製造方法。
（２−１）配列番号２の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（２−２）配列番号２の塩基配列の５１番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号２の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号２の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（３−１）配列番号３の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（３−２）配列番号３の塩基配列の１３５番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号３の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号３の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（４−１）配列番号４の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（４−２）配列番号４の塩基配列の５１番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号４の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号４の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（５−１）配列番号５の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（５−２）配列番号５の塩基配列の５１番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号５の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号５の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（６−１）配列番号６の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（６−２）配列番号６の塩基配列の３７番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号６の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号６の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（７−１）配列番号７の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（７−２）配列番号７の塩基配列の２４４番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号７の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号７の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（８−１）配列番号８の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（８−２）配列番号８の塩基配列の３６番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号８の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号８の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（９−１）配列番号９の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（９−２）配列番号９の塩基配列の８１番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号９の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号９の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（１０−１）配列番号１０の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（１０−２）配列番号１０の塩基配列の１８０番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号１０の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号１０の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（１１−１）配列番号１１の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（１１−２）配列番号１１の塩基配列の５１番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号１１の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号１１の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（１２−１）配列番号１２の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（１２−２）配列番号１２の塩基配列の５１番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号１２の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号１２の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（１３−１）配列番号１３の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（１３−２）配列番号１３の塩基配列の９番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号１３の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号１３の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（１４−１）配列番号１４の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（１４−２）配列番号１４の塩基配列の５１番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号１４の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号１４の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（１５−１）配列番号１５の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（１５−２）配列番号１５の塩基配列の５番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号１５の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号１５の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（１６−１）配列番号１６の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（１６−２）配列番号１６の塩基配列の１５４番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号１６の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号１６の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（１８−１）配列番号１８の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（１８−２）配列番号１８の塩基配列の１４４番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号１８の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号１８の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（１９−１）配列番号１９の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（１９−２）配列番号１９の塩基配列の９１番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号１９の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号１９の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（２１−１）配列番号２１の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（２１−２）配列番号２１の塩基配列の５１番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号２１の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号２１の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（２２−１）配列番号２２の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（２２−２）配列番号２２の塩基配列の２３６番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号２２の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号２２の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物に関し、詳しくは、低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物、その製造方法、スクリーニング方法、スクリーニング用プライマー又はプローブ、及びスクリーニング用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ホウレンソウは、シュウ酸を多く含む植物である。シュウ酸は体内でカルシウムと結合するため、カルシウムの吸収阻害や結石の原因になると考えられており（非特許文献１及び２）、結石の予防には、シュウ酸を多く含む食品の大量摂取は控えたほうがよいとされている（非特許文献３）。アメリカ合衆国で行われた調査では、食事で摂取されるシュウ酸の４０％がホウレンソウ由来であり、男性と高齢女性においてホウレンソウを頻繁に食べる人ほど結石を発症しやすかったと報告している（非特許文献４）。さらにシュウ酸はえぐみの原因物質とされ、シュウ酸濃度低減は重要な課題である（非特許文献１）。【０００３】
一般に、ホウレンソウのシュウ酸含量については、以下のことが報告されている：季節によって変動し、夏より冬に多いこと（非特許文献５）；季節変動に比べて品種間差は小さく、早生より晩生品種で高い傾向があるが差は小さく２０％ほどであること（非特許文献５、６）；生育に併せて上昇すること（非特許文献１）；葉柄より葉身に多いこと（非特許文献７）；品種の新旧、ＯＰ種（単種）とＦ１種の間でシュウ酸含量に差はないこと（非特許文献８）。【０００４】
これまで、放射線照射（特許文献１）、化学処理を利用した突然変異処理（非特許文献１０）によるシュウ酸含量の低いホウレンソウ品種の育成が試みられてきた。また、非特許文献９には、ホウレンソウの水耕栽培において窒素肥料のうちアンモニア態窒素の割合を多くすることでシュウ酸の少ないホウレンソウを作ることができると記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１４−１５０７６３号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】香川  彰（１９９７）「高品質ホウレンソウの栽培生理」株式会社いしずえ、７４−８４
【非特許文献２】Ｌｉｂｅｒｔ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉ（１９８７）Ｏｘａｌａｔｅ  ｉｎ  ｃｒｏｐ  ｐｌａｎｔｓ．  Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．３５，９２６−９３８
【非特許文献３】日本泌尿器科学会、日本泌尿器内視鏡学会、日本尿路結石症学会編（２０１３）「尿路結石症診療ガイドライン  ２０１３年版」金原出版、ｈｔｔｐｓ：／／ｍｉｎｄｓ．ｊｃｑｈｃ．ｏｒ．ｊｐ／ｎ／ｍｅｄ／４／ｍｅｄ００２２／Ｇ００００６３４／００２１
【非特許文献４】Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｃｕｒｈａｎ（２００７）Ｏｘａｌａｔｅ  ｉｎｔａｋｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｉｓｋ  ｆｏｒ  ｎｅｐｈｒｏｌｉｔｈｉａｓｉｓ．  Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏ  ｌ１８：２１９８−２２０４
【非特許文献５】Ｋａｍｉｎｉｓｈｉ  ａｎｄ  Ｋｉｔａ（２００６）Ｓｅａｓｏｎａｌ  ｃｈａｎｇｅ  ｏｆ  ｎｉｔｒａｔｅ  ａｎｄ  ｏｘａｌａｔｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｒａｔｅ  ｏｆ  ｓｐｉｎａｃｈ  ｃｕｌｔｉｖａｒｓ．  ＨｏｒｔＳｃｉｅｎｃｅ  ４１（７）：１５８９−１５９５
【非特許文献６】Ｋａｗａｚｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｖａｒｉｅｔａｌ  ａｎｄ  ｓｅａｓｏｎａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｏｘａｌａｔｅ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｏｆ  ｓｐｉｎａｃｈ．  Ｓｃｉｅｎｔｉａ  Ｈｏｒｔｉｃａｒｔｕｒａｅ  ９７：２０３−２１０
【非特許文献７】Ｅｌｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，ｙｉｅｌｄ  ａｎｄ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｓｐｉｎａｃｈ．  Ｊ  Ｓｃｉ  Ｆｏｏｄ  Ａｇｒｉｃ  ７６，３４１−３４６
【非特許文献８】Ｓｏｌｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｎｉｔｒａｔｅ  ａｎｄ  ｏｘａｌａｔｅ  ｉｎ  ｇｅｒｍｐｌａｓｍ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓｐｉｎａｃｈ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｌｅａｆｙ  ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ．  Ｅｍｉｒａｔｅｓ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  ２７（９）：６９８−７０５
【非特許文献９】三井和子（２００６）「ホウレンソウをつくる人々  日本ホウレンソウ紀行  １７の栽培現場から」誠文堂新光社発行
【非特許文献１０】Ｍｕｒａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｌｏｗ−ｏｘａｌａｔｅ  ｓｐｉｎａｃｈ  ｍｕｔａｎｔ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．Ｊ．Ｊａｐａｎ．Ｓｏｃ．Ｈｏｒｔ．Ｓｃｉ．７８（２）：１８０−１８４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、実用的なシュウ酸含量の低いホウレンソウ品種は現状では得られていない。非特許文献１０記載の変異株は、著しく脆弱であり、栽培が極めて困難である。また、非特許文献９に記載の方法のようなホウレンソウの水耕栽培は、管理に要する費用及び手間等の理由で、ごく一部の生産者のみに限られ、広く普及しているとは言えない。そのため、依然として、シュウ酸含量が通常の半分以下になるものや一般的な土耕栽培でも低シュウ含量を達成できるホウレンソウ品種は知られていないのが現状である。【０００８】
本発明の目的は、低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物、中でも、環境条件に左右されず安定してシュウ酸含量が低いホウレンソウ属植物、その製造方法、スクリーニング方法及びスクリーニング用キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、以下を提供する。
〔１〕第４染色体領域に存在する少なくとも１つの低シュウ酸遺伝子座を有する、低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物。
〔２〕低シュウ酸遺伝子座が、第４染色体領域の、Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１に相当する部分、ＬＺＹＰ０１００１４１７．１であるゲノムＤＮＡ断片に相当する部分及び両部分の間に存在する低シュウ酸遺伝子座である、〔１〕に記載の低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物。
〔３〕前記低シュウ酸遺伝子座が、低シュウ酸ＳＮＰマーカーで特定される、〔１〕又は〔２〕に記載の低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物。
〔４〕前記低シュウ酸遺伝子座が、下記（１）〜（２２）からなる群から選択される少なくとも１つのＳＮＰマーカーで特定される、〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載の低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物。
（１）ＳＬ０１：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の２８５４３番目の塩基ＡがＴである多型
（２）ＳＬ２０８５４５：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の２０８５４５番目の塩基ＣがＴである多型
（３）ＳＬ２２０２７５：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の２２０２７５番目の塩基ＣがＧである多型
（４）ＳＬ２４１７５４：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の２４１７５４番目の塩基ＣがＡである多型
（５）ＳＬ２９３２６５：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の２９３２６５番目の塩基ＡがＴである多型
（６）ＳＬ２９３６５８：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の２９３６５８番目の塩基ＧがＡである多型
（７）ＳＬ２９３９０２：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の２９３９０２番目の塩基ＧがＡである多型
（８）ＳＬ２９４０８１：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の２９４０８１番目の塩基ＡがＧである多型
（９）ＳＬ４３０２３７：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の４３０２３７番目の塩基ＧがＡである多型
（１０）ＳＬ７４７２３１：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の７４７２３１番目の塩基ＧがＡである多型
（１１）ＳＬ７５９００８：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の７５９００８番目の塩基ＴがＧである多型
（１２）ＳＬ８１２３６７：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の８１２３６７番目の塩基ＧがＣである多型
（１３）ＳＬ８１２３８４：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の８１２３８４番目の塩基ＴがＣである多型
（１４）ＳＬ８１２５１４：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の８１２５１４番目の塩基ＣがＴである多型
（１５）ＳＬ８１２６０１：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の８１２６０１番目の塩基ＡがＧである多型
（１６）ＳＬ１２５２２３４：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の１２５２２３４番目の塩基ＡがＣである多型
（１７）ＳＬ０２：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の１８４７９１８番目のＣがＴである多型
（１８）ＳＬ２１６７３４４：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の２１６７３４４番目の塩基ＣがＴである多型
（１９）ＳＬ７８８１２：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００１４１７．１）の７８８１２番目の塩基ＣがＴである多型
（２０）ＳＬ０３：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００１４１７．１の９０４９０番目の塩基ＧがＡである多型
（２１）ＳＬ９７２４３：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００１４１７．１の９７２４３番目の塩基ＧがＡである多型
（２２）ＳＬ３２３３３６：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００１４１７．１の３２３３３６番目の塩基ＴがＡである多型
〔５〕前記低シュウ酸遺伝子座が前記（１）、（１７）及び（２０）からなる群から選択される少なくとも１つのＳＮＰマーカーで特定される、〔４〕に記載の低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物。
〔６〕前記低シュウ酸遺伝子座が、下記（１−１）〜（２２−２）からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドで特定される、〔１〕〜〔５〕のいずれか１項に記載の低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物。
（１−１）配列番号１の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（１−２）配列番号１の塩基配列の５７番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号１の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号１の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（２−１）配列番号２の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（２−２）配列番号２の塩基配列の５１番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号２の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号２の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（３−１）配列番号３の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（３−２）配列番号３の塩基配列の１３５番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号３の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号３の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（４−１）配列番号４の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（４−２）配列番号４の塩基配列の５１番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号４の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号４の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（５−１）配列番号５の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（５−２）配列番号５の塩基配列の５１番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号５の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号５の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（６−１）配列番号６の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（６−２）配列番号６の塩基配列の３７番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号６の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号６の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（７−１）配列番号７の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（７−２）配列番号７の塩基配列の２４４番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号７の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号７の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（８−１）配列番号８の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（８−２）配列番号８の塩基配列の３６番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号８の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号８の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（９−１）配列番号９の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（９−２）配列番号９の塩基配列の８１番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号９の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号９の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（１０−１）配列番号１０の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（１０−２）配列番号１０の塩基配列の１８０番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号１０の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号１０の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（１１−１）配列番号１１の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（１１−２）配列番号１１の塩基配列の５１番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号１１の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号１１の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（１２−１）配列番号１２の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（１２−２）配列番号１２の塩基配列の５１番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号１２の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号１２の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（１３−１）配列番号１３の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（１３−２）配列番号１３の塩基配列の９番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号１３の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号１３の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（１４−１）配列番号１４の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（１４−２）配列番号１４の塩基配列の５１番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号１４の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号１４の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（１５−１）配列番号１５の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（１５−２）配列番号１５の塩基配列の５番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号１５の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号１５の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（１６−１）配列番号１６の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（１６−２）配列番号１６の塩基配列の１５４番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号１６の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号１６の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（１７−１）配列番号１７の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（１７−２）配列番号１７の塩基配列の１２番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号１７の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号１７の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（１８−１）配列番号１８の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（１８−２）配列番号１８の塩基配列の１４４番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号１８の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号１８の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（１９−１）配列番号１９の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（１９−２）配列番号１９の塩基配列の９１番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号１９の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号１９の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（２０−１）配列番号２０の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（２０−２）配列番号２０の塩基配列の５１番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号２０の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号２０の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（２１−１）配列番号２１の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（２１−２）配列番号２１の塩基配列の５１番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号２１の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号２１の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
（２２−１）配列番号２２の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（２２−２）配列番号２２の塩基配列の２３６番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号２２の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号２２の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
〔７〕前記低シュウ酸遺伝子座が、前記（１−１）、（１−２）、（１７−１）、（１７−２）、（２０−１）及び（２０−２）からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドで特定される、〔６〕に記載の低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物。
〔８〕前記低シュウ酸遺伝子座が、ホウレンソウ（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３８４）が有する低シュウ酸遺伝子座である、〔１〕〜〔７〕のいずれか１項に記載の低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物。
〔９〕ホウレンソウ（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３８４）またはその後代である、〔１〕〜〔８〕のいずれか１項に記載の低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物。
〔１０〕植物体またはその一部である、〔１〕〜〔９〕のいずれか１項に記載の低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物。
〔１１〕種子である、〔１〕〜〔１０〕のいずれか１項に記載の低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物。
〔１２〕植物細胞、組織及び器官から選ばれる少なくとも１つである、〔１〕〜〔１１〕のいずれか１項に記載の低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物。
〔１３〕葉身の先端のシュウ酸含量が６００ｍｇ／１００ｇＦＷ以下であること、及び
可食部のシュウ酸含量が４００ｍｇ／１００ｇＦＷ以下であること、
の少なくともいずれかを満たす、〔１〕〜〔１２〕のいずれか１項に記載の低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物。
〔１４〕〔１〕〜〔１３〕のいずれか１項に記載の低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物と、他のホウレンソウ属植物とを交雑する交雑工程を少なくとも含む、低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物の製造方法。
〔１５〕交雑工程において得られたホウレンソウ属植物またはその後代系統から、第４染色体領域に存在する少なくとも１つの低シュウ酸遺伝子座を有する植物を選抜する選抜工程を更に含む、〔１４〕に記載の製造方法。
〔１６〕前記（１）〜（２２）からなる群から選択される少なくとも１つのＳＮＰマーカーにより、低シュウ酸遺伝子座を有する植物を選抜する、〔１５〕に記載の製造方法。
〔１７〕選抜工程において、前記（１−１）〜（２２−２）からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドの有無により、低シュウ酸遺伝子座を有する植物を選抜する、〔１５〕又は〔１６〕に記載の製造方法。
〔１８〕第４染色体領域に存在する少なくとも１つの低シュウ酸遺伝子座を有するホウレンソウ属植物を選抜する、低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物のスクリーニング方法。
〔１９〕前記（１）〜（２２）からなる群から選択される少なくとも１つのＳＮＰマーカーにより、低シュウ酸遺伝子座を有する植物を選抜する、〔１８〕に記載のスクリーニング方法。
〔２０〕前記（１−１）〜（２２−２）からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドの有無により、低シュウ酸遺伝子座を有する植物を選抜する、〔１８〕又は〔１９〕に記載のスクリーニング方法。
〔２１〕Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１及びＬＺＹＰ０１００１４１７．１であるゲノムＤＮＡ断片に相当する部分に存在する少なくとも１つの低シュウ酸遺伝子座の少なくとも一部に特異的に結合する、低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物スクリーニング用プライマー又はプローブを少なくとも含む、低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物スクリーニング用キット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、環境条件に左右されず安定してシュウ酸含量が低いホウレンソウ属植物を得ることができる。また低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物を効率的に製造できる製造方法も提供される。また、様々なホウレンソウ属植物の中から、低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物を効率的にスクリーニングできる方法及びキットが提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の説明において「％」は、特に説明がない場合「重量％」を示す。
【００１２】
〔低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物〕
本発明において、低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物は、低シュウ酸遺伝子座を有する。
【００１３】
（ホウレンソウ属植物）
本明細書において、ホウレンソウ属植物とは、ヒユ科アカザ亜科に属する植物であるホウレンソウ属（Ｓｐｉｎａｃｅａ）に属する植物全般を意味し、例えば、ホウレンソウ（Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）が挙げられる。原産地、品種、播種時期（秋播き、春播き）は特に限定されない。ホウレンソウ属植物は、その植物体またはその一部であればよい。植物体の一部としては、例えば、葉、茎、花、根、種子及びこれらから選ばれる２以上の組み合わせが挙げられ、可食部（例、葉、茎及びこれらの組み合わせ）を少なくとも含むか、又は種子であることが好ましい。ホウレンソウ属植物の細胞、組織、器官でもよく、これらの由来は特に限定されず、例えば、ホウレンソウ属植物から直接抽出したものでもよく、それを培養したものでもよい。
【００１４】
（低シュウ酸含量）
本明細書において、低シュウ酸含量である、低シュウ酸であるとは、ホウレンソウ属植物のシュウ酸含量が、通常のホウレンソウ属植物よりも低いことを意味する。好ましくは、葉身の先端のシュウ酸含量が６００ｍｇ／１００ｇＦＷ以下であるか、可食部（葉身と葉柄を含む株全体）のシュウ酸含量が４００ｍｇ／１００ｇＦＷ以下であるか、またはこれらの両方を満たすことである。シュウ酸含量は、ＨＰＬＣ法により測定できる。測定の時期は特に限定されず、葉身の先端のシュウ酸含量の場合、１枚の本葉の葉身から３００ｍｇのサンプルを採取できる段階であれば特に限定されない。また、可食部のシュウ酸含量の場合、可食部を収穫できる段階であれば特に限定されない。本明細書において、高シュウ酸含量である、又は高シュウ酸であるとは、ホウレンソウ属植物のシュウ酸含量が、通常のホウレンソウ属植物と同等以上である（低シュウ酸含量ではない）ことを意味する。
【００１５】
（低シュウ酸遺伝子座）
本発明において低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物が有する低シュウ酸遺伝子座の少なくとも１つは、第４染色体領域に存在する低シュウ酸遺伝子座である。好ましくは、第４染色体領域の、Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１であるゲノムＤＮＡ断片に相当する部分、ＬＺＹＰ０１００１４１７．１であるゲノムＤＮＡ断片に相当する部分、及び両部分の間に存在し、より好ましくは、Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１であるゲノムＤＮＡ断片に相当する部分、ＬＺＹＰ０１００１４１７．１であるゲノムＤＮＡ断片に相当する部分に存在する。Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１及びＬＺＹＰ０１００１４１７．１であるゲノムＤＮＡ断片の配列を含む情報は、ＮＣＢＩのデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＬＺＹＰ０１００００３３．１？ｒｅｐｏｒｔ＝ｆａｓｔａ；ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＬＺＹＰ０１００１４１７．１？ｒｅｐｏｒｔ＝ｆａｓｔａ；ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｔｒａｃｅｓ／ｗｇｓ／ＬＺＹＰ０１？ｄｉｓｐｌａｙ＝ｃｏｎｔｉｇｓ）に記載されている。ホウレンソウ属植物の第４染色体の対応する位置を確認する方法としては、例えば、ホウレンソウ属植物のゲノムの公開データベースと照会（例えば、ＳｐｉｎａｃｈＢａｓｅのＢＬＡＳＴ検索ページを利用：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｐｉｎａｃｈｂａｓｅ．ｏｒｇ／？ｑ＝ｂｌａｓｔ）する方法が挙げられる。
【００１６】
低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物は、第４染色体領域に存在する低シュウ酸遺伝子座を１つ又は２つ以上有していてもよい。ホウレンソウ属植物は、第４染色体領域に存在する低シュウ酸遺伝子座を有していればよく、斯かる遺伝子座を、第４染色体以外の染色体領域（例えば、第１〜第６染色体のいずれか）に有してもよい。また、第４染色体領域に存在する低シュウ酸遺伝子座のほかに、他の染色体領域に存在する低シュウ酸遺伝子座を有していてもよい。
【００１７】
低シュウ酸遺伝子座としては、例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）、単純反復配列（マイクロサテライト、ＳＳＲ）、挿入／欠失（ＩｎＤｅｌ）、配列タグ部位（ＳＴＳ）等の遺伝子マーカーで特定される遺伝子座が挙げられ、ＳＮＰマーカーで特定される遺伝子座が好ましい。
【００１８】
低シュウ酸遺伝子座を特定するＳＮＰマーカーとしては、例えば以下の（１）〜（２２）が挙げられる。低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物は、（１）〜（２２）の少なくとも１つで特定する所定の多型を有することが好ましい。言いかえると、（１）〜（２２）の少なくとも１つの多型を有する場合に、低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物であることが確認できる。
【００１９】
（１）ＳＬ０１：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の２８５４３番目の塩基ＡがＴである多型
（２）ＳＬ２０８５４５：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の２０８５４５番目の塩基ＣがＴである多型
（３）ＳＬ２２０２７５：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の２２０２７５番目の塩基ＣがＧである多型
（４）ＳＬ２４１７５４：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の２４１７５４番目の塩基ＣがＡである多型
（５）ＳＬ２９３２６５：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の２９３２６５番目の塩基ＡがＴである多型
（６）ＳＬ２９３６５８：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の２９３６５８番目の塩基ＧがＡである多型
（７）ＳＬ２９３９０２：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の２９３９０２番目の塩基ＧがＡである多型
（８）ＳＬ２９４０８１：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の２９４０８１番目の塩基ＡがＧである多型
（９）ＳＬ４３０２３７：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の４３０２３７番目の塩基ＧがＡである多型
（１０）ＳＬ７４７２３１：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の７４７２３１番目の塩基ＧがＡである多型
（１１）ＳＬ７５９００８：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の７５９００８番目の塩基ＴがＧである多型
（１２）ＳＬ８１２３６７：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の８１２３６７番目の塩基ＧがＣである多型
（１３）ＳＬ８１２３８４：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の８１２３８４番目の塩基ＴがＣである多型
（１４）ＳＬ８１２５１４：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の８１２５１４番目の塩基ＣがＴである多型
（１５）ＳＬ８１２６０１：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の８１２６０１番目の塩基ＡがＧである多型
（１６）ＳＬ１２５２２３４：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の１２５２２３４番目の塩基ＡがＣである多型
（１７）ＳＬ０２：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の１８４７９１８番目のＣがＴである多型
（１８）ＳＬ２１６７３４４：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３．１の２１６７３４４番目の塩基ＣがＴである多型
（１９）ＳＬ７８８１２：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００１４１７．１）の７８８１２番目の塩基ＣがＴである多型
（２０）ＳＬ０３：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００１４１７．１の９０４９０番目の塩基ＧがＡである多型
（２１）ＳＬ９７２４３：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００１４１７．１の９７２４３番目の塩基ＧがＡである多型
（２２）ＳＬ３２３３３６：Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００１４１７．１の３２３３３６番目の塩基ＴがＡである多型
【００２０】
（１）〜（２２）のホウレンソウ属植物の第４染色体の対応する位置を確認する方法としては、例えば、前述のＮＣＢＩのデータベース、ホウレンソウ属植物のゲノムの公開データベースと照会する方法が挙げられる。ＳＮＰマーカーは、上記（１）〜（２２）からなる群より選ばれる少なくとも１つであればよく、２つ以上の組み合わせでもよく、（１）、（１７）及び（２０）から選ばれる少なくとも１つを含むことが好ましく、（１）及び（２０）の少なくともいずれかを含むことがより好ましい。
【００２１】
一方、低シュウ酸遺伝子座は、以下の（１−１）〜（２２−２）のポリヌクレオチドで特定されてもよい。低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物は、（１−１）〜（２２−２）の少なくとも１つを有することが好ましい。言いかえると、（１−１）〜（２２−２）の少なくとも１つのポリヌクレオチドを有する場合に、低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物であることが確認できる。
【００２２】
（１−１）配列番号１の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（１−２）配列番号１の塩基配列の５７番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号１の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号１の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
配列番号１の塩基配列の５７番目の塩基Ｔは、前記（１）のＳＮＰマーカーに相当する。配列番号１の塩基配列の５７番目の塩基がＴの場合、ホウレンソウ属植物は低シュウ酸含量であり、Ｔ以外でありかつ他の低シュウ酸遺伝子座を有しない場合、ホウレンソウ属植物は高シュウ酸含量である。
【００２３】
（２−１）配列番号２の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（２−２）配列番号２の塩基配列の５１番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号２の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号２の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
配列番号２の塩基配列の５１番目の塩基Ｔは、前記（２）のＳＮＰマーカーに相当する。配列番号２の塩基配列の５１番目の塩基がＴの場合、ホウレンソウ属植物は低シュウ酸含量であり、Ｔ以外でありかつ他の低シュウ酸遺伝子座を有しない場合、ホウレンソウ属植物は高シュウ酸含量である。
【００２４】
（３−１）配列番号３の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（３−２）配列番号３の塩基配列の１３５番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号３の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号３の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
配列番号３の塩基配列の１３５番目の塩基Ｇは、前記（３）のＳＮＰマーカーに相当する。配列番号３の塩基配列の１３５番目の塩基がＧの場合、ホウレンソウ属植物は低シュウ酸含量であり、Ｇ以外でありかつ他の低シュウ酸遺伝子座を有しない場合、ホウレンソウ属植物は高シュウ酸含量である。
【００２５】
（４−１）配列番号４の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（４−２）配列番号４の塩基配列の５１番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号４の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号４の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
配列番号４の塩基配列の５１番目の塩基Ａは、前記（４）のＳＮＰマーカーに相当する。配列番号４の塩基配列の５１番目の塩基がＡの場合、ホウレンソウ属植物は低シュウ酸含量であり、Ａ以外でありかつ他の低シュウ酸遺伝子座を有しない場合、ホウレンソウ属植物は高シュウ酸含量である。
【００２６】
（５−１）配列番号５の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（５−２）配列番号５の塩基配列の５１番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号５の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号５の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
配列番号５の塩基配列の５１番目の塩基Ｔは、前記（５）のＳＮＰマーカーに相当する。配列番号５の塩基配列の５１番目の塩基がＴの場合、ホウレンソウ属植物は低シュウ酸含量であり、Ｔ以外でありかつ他の低シュウ酸遺伝子座を有しない場合、ホウレンソウ属植物は高シュウ酸含量である。
【００２７】
（６−１）配列番号６の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（６−２）配列番号６の塩基配列の３７番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号６の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号６の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
配列番号６の塩基配列の３７番目の塩基Ａは、前記（６）のＳＮＰマーカーに相当する。配列番号６の塩基配列の３７番目の塩基がＡの場合、ホウレンソウ属植物は低シュウ酸含量であり、Ａ以外でありかつ他の低シュウ酸遺伝子座を有しない場合、ホウレンソウ属植物は高シュウ酸含量である。
【００２８】
（７−１）配列番号７の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（７−２）配列番号７の塩基配列の２４４番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号７の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号７の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
配列番号７の塩基配列の２４４番目の塩基Ａは、前記（７）のＳＮＰマーカーに相当する。配列番号７の塩基配列の２４４番目の塩基がＡの場合、ホウレンソウ属植物は低シュウ酸含量であり、Ａ以外でありかつ他の低シュウ酸遺伝子座を有しない場合、ホウレンソウ属植物は高シュウ酸含量である。
【００２９】
（８−１）配列番号８の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（８−２）配列番号８の塩基配列の３６番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号８の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号８の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
配列番号８の塩基配列の３６番目の塩基Ｇは、前記（８）のＳＮＰマーカーに相当する。配列番号８の塩基配列の３６番目の塩基がＧの場合、ホウレンソウ属植物は低シュウ酸含量であり、Ｇ以外でありかつ他の低シュウ酸遺伝子座を有しない場合、ホウレンソウ属植物は高シュウ酸含量である。
【００３０】
（９−１）配列番号９の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（９−２）配列番号９の塩基配列の８１番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号９の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号９の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
配列番号９の塩基配列の８１番目の塩基Ａは、前記（９）のＳＮＰマーカーに相当する。配列番号９の塩基配列の８１番目の塩基がＡの場合、ホウレンソウ属植物は低シュウ酸含量であり、Ａ以外でありかつ他の低シュウ酸遺伝子座を有しない場合、ホウレンソウ属植物は高シュウ酸含量である。
【００３１】
（１０−１）配列番号１０の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（１０−２）配列番号１０の塩基配列の１８０番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号１０の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号１０の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
配列番号１０の塩基配列の１８０番目の塩基Ａは、前記（１０）のＳＮＰマーカーに相当する。配列番号１０の塩基配列の１８０番目の塩基がＡの場合、ホウレンソウ属植物は低シュウ酸含量であり、Ａ以外でありかつ他の低シュウ酸遺伝子座を有しない場合、ホウレンソウ属植物は高シュウ酸含量である。
【００３２】
（１１−１）配列番号１１の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（１１−２）配列番号１１の塩基配列の５１番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号１１の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号１１の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
配列番号１１の塩基配列の５１番目の塩基Ｇは、前記（１１）のＳＮＰマーカーに相当する。配列番号１１の塩基配列の５１番目の塩基がＧの場合、ホウレンソウ属植物は低シュウ酸含量であり、Ｇ以外でありかつ他の低シュウ酸遺伝子座を有しない場合、ホウレンソウ属植物は高シュウ酸含量である。
【００３３】
（１２−１）配列番号１２の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（１２−２）配列番号１２の塩基配列の５１番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号１２の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号１２の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
配列番号１２の塩基配列の５１番目の塩基Ｃは、前記（１２）のＳＮＰマーカーに相当する。配列番号１２の塩基配列の５１番目の塩基がＣの場合、ホウレンソウ属植物は低シュウ酸含量であり、Ｃ以外でありかつ他の低シュウ酸遺伝子座を有しない場合、ホウレンソウ属植物は高シュウ酸含量である。
【００３４】
（１３−１）配列番号１３の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（１３−２）配列番号１３の塩基配列の９番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号１３の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号１３の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
配列番号１３の塩基配列の９番目の塩基Ｃは、前記（１３）のＳＮＰマーカーに相当する。配列番号１３の塩基配列の９番目の塩基がＣの場合、ホウレンソウ属植物は低シュウ酸含量であり、Ｃ以外でありかつ他の低シュウ酸遺伝子座を有しない場合、ホウレンソウ属植物は高シュウ酸含量である。
【００３５】
（１４−１）配列番号１４の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（１４−２）配列番号１４の塩基配列の５１番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号１４の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号１４の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
配列番号１４の塩基配列の５１番目の塩基Ｔは、前記（１４）のＳＮＰマーカーに相当する。配列番号１４の塩基配列の５１番目の塩基がＴの場合、ホウレンソウ属植物は低シュウ酸含量であり、Ｔ以外でありかつ他の低シュウ酸遺伝子座を有しない場合、ホウレンソウ属植物は高シュウ酸含量である。
【００３６】
（１５−１）配列番号１５の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（１５−２）配列番号１５の塩基配列の５番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号１５の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号１５の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
配列番号１５の塩基配列の５番目の塩基Ｇは、前記（１５）のＳＮＰマーカーに相当する。配列番号１５の塩基配列の５番目の塩基がＧの場合、ホウレンソウ属植物は低シュウ酸含量であり、Ｇ以外でありかつ他の低シュウ酸遺伝子座を有しない場合、ホウレンソウ属植物は高シュウ酸含量である。
【００３７】
（１６−１）配列番号１６の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（１６−２）配列番号１６の塩基配列の１５４番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号１６の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号１６の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
配列番号１６の塩基配列の１５４番目の塩基Ｃは、前記（１６）のＳＮＰマーカーに相当する。配列番号１６の塩基配列の１５４番目の塩基がＣの場合、ホウレンソウ属植物は低シュウ酸含量であり、Ｃ以外でありかつ他の低シュウ酸遺伝子座を有しない場合、ホウレンソウ属植物は高シュウ酸含量である。
【００３８】
（１７−１）配列番号１７の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（１７−２）配列番号１７の塩基配列の１２番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号１７の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号１７の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
配列番号１７の塩基配列の１２番目の塩基Ｔは、前記（１７）のＳＮＰマーカーに相当する。配列番号１７の塩基配列の１２番目の塩基がＴの場合、ホウレンソウ属植物は低シュウ酸含量であり、Ｔ以外でありかつ他の低シュウ酸遺伝子座を有しない場合、ホウレンソウ属植物は高シュウ酸含量である。
【００３９】
（１８−１）配列番号１８の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（１８−２）配列番号１８の塩基配列の１４４番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号１８の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号１８の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
配列番号１８の塩基配列の１４４番目の塩基Ｔは、前記（１８）のＳＮＰマーカーに相当する。配列番号１８の塩基配列の１４４番目の塩基がＴの場合、ホウレンソウ属植物は低シュウ酸含量であり、Ｔ以外でありかつ他の低シュウ酸遺伝子座を有しない場合、ホウレンソウ属植物は高シュウ酸含量である。
【００４０】
（１９−１）配列番号１９の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（１９−２）配列番号１９の塩基配列の９１番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号１９の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号１９の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
配列番号１９の塩基配列の９１番目の塩基Ｔは、前記（１９）のＳＮＰマーカーに相当する。配列番号１９の塩基配列の９１番目の塩基がＴの場合、ホウレンソウ属植物は低シュウ酸含量であり、Ｔ以外でありかつ他の低シュウ酸遺伝子座を有しない場合、ホウレンソウ属植物は高シュウ酸含量である。
【００４１】
（２０−１）配列番号２０の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（２０−２）配列番号２０の塩基配列の５１番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号２０の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号２０の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
配列番号２０の塩基配列の５１番目の塩基Ａは、前記（２０）のＳＮＰマーカーに相当する。配列番号２０の塩基配列の５１番目の塩基がＡの場合、ホウレンソウ属植物は低シュウ酸含量であり、Ａ以外でありかつ他の低シュウ酸遺伝子座を有しない場合、ホウレンソウ属植物は高シュウ酸含量である。
【００４２】
（２１−１）配列番号２１の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（２１−２）配列番号２１の塩基配列の５１番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号２１の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号２１の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
配列番号２１の塩基配列の５１番目の塩基Ａは、前記（２１）のＳＮＰマーカーに相当する。配列番号２１の塩基配列の５１番目の塩基がＡの場合、ホウレンソウ属植物は低シュウ酸含量であり、Ａ以外でありかつ他の低シュウ酸遺伝子座を有しない場合、ホウレンソウ属植物は高シュウ酸含量である。
【００４３】
（２２−１）配列番号２２の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（２２−２）配列番号２２の塩基配列の２３６番目の塩基以外の少なくとも１つの塩基が変異しているが、配列番号２２の塩基配列と９５％以上の同一性を有し、かつ配列番号２２の塩基配列を有するポリヌクレオチドと同等の機能を有するポリヌクレオチド
配列番号２２の塩基配列の２３６番目の塩基Ａは、前記（２２）のＳＮＰマーカーに相当する。配列番号２２の塩基配列の２３６番目の塩基がＡの場合、ホウレンソウ属植物は低シュウ酸含量であり、Ａ以外でありかつ他の低シュウ酸遺伝子座を有しない場合、ホウレンソウ属植物は高シュウ酸含量である。
【００４４】
（１−１）〜（２２−２）のホウレンソウ属植物の第４染色体の対応する位置を確認する方法としては、例えば、前述のＮＣＢＩのデータベース、ホウレンソウ属植物のゲノムの公開データベースと照会する方法が挙げられる。なお、各ポリヌクレオチドはそれぞれを特定する塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドも含む意味である。
【００４５】
各ポリヌクレオチドにおいて、それぞれの塩基配列との同一性が９５％以上である塩基配列とは、ホウレンソウ属植物の植物種、好ましくは品種間における塩基配列のバリエーションに対応する塩基配列を意味する。同一性は、好ましくは９６％以上、９７％以上又は９８％以上、より好ましくは９９％以上である。それぞれの塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列とは、それぞれの塩基配列において数個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１、２または３個）の塩基の修飾（置換、欠失、挿入、付加など）を含む塩基配列であってもよい。ホウレンソウ属植物の植物種における対応箇所の塩基配列は、当該技術分野における当業者にとって明らかである。例えば、ホウレンソウ属植物における対応領域の塩基配列を解読することにより、またはホウレンソウ属植物の遺伝子情報を登録しているデータベースを参照することにより、決定できる。同一性の解析は、ＢＬＡＳＴ等のアルゴリズム、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ等のプログラムを用いて行えばよい。
【００４６】
低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物の好ましい例としては、ホウレンソウ（Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３８４及びその後代が挙げられる。ホウレンソウＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３８４は、２０１９年１２月２４日付で独立行政法人  製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジーセンター  特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ−ＩＰＯＤ：〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２０号室）に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３８４としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
【００４７】
低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物の育成条件は、特に限定されず、通常のホウレンソウ属植物の育成条件と同様の条件を採用できる。早生性、収量性、抽苔性を向上させるための他の処理（例えば、温度、湿度管理、播種時期の選択）を行ってもよい。ホウレンソウは、通常、葉柄と葉身部が食用されることから、抽苔前の、草丈２０〜３０ｃｍに達した段階で収穫される。抽苔は、長日条件によって促進されることから、抽苔を回避するため、春夏まきでは晩抽性の品種が選択される。通常、播種後５日前後で発芽するが、収穫期までの日数は季節によって大きく変動する。例えば、生育適温（１５〜２５℃）では３０日前後で収穫期に達するが、この限りではない。
【００４８】
〔低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物の製造方法〕
本発明によれば、第２に、低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物の製造方法が提供される。製造方法は、交雑工程を少なくとも含み、さらに、選抜工程を更に含んでもよい。各工程について以下説明する。
【００４９】
（交雑工程）
交雑工程は、低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物と、他のホウレンソウ属植物とを交雑する工程である。低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物は、前段で説明したとおりである。他のホウレンソウ属植物は、前述の低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物であってもよく、そうでなくてもよく、特に限定されない。植物交雑の方法は、常法に従って行えばよい。
【００５０】
（選抜工程）
選抜工程は、交雑工程において得られたホウレンソウ属植物またはその後代系統から、第４染色体領域に存在する少なくとも１つの低シュウ酸遺伝子座を有する植物を選抜する工程である。低シュウ酸遺伝子座については、前段で説明したとおりである。
【００５１】
選抜にあたり、ホウレンソウ属植物が低シュウ酸遺伝子座を有することを確認する際の手段は、通常のマーカー解析手段によればよく、例えば、ＰＣＲ法（例えば、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ等）、インベーダー法、タックマン法、一塩基伸長法、パイロシーケンス法、ＤｉｇｉＴａｇ２法、ルミネックス法、ダイレクトシークエンス法、ＬＡＭＰ法、マイクロアレイ法、エキソヌクレアーゼサイクリングアッセイ法が挙げられ、ＰＣＲ法が好ましく、ＰＣＲ‐ＲＦＬＰ法がより好ましい。ＰＣＲ法による確認の際には、前述の（１）〜（２２）からなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰマーカーを検出可能なプライマー又はプローブ、前述の（１−１）〜（２２−２）からなる群より選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドを検出できるプライマー又はプローブを用いればよい。プライマー及びプローブの塩基配列は、前述の（１）〜（２２）の多型近傍の塩基配列、又は前述の（１−１）〜（２２−２）の、（１）〜（２２）の多型に相当する塩基近傍の塩基配列から、常法に従い適宜設計すればよい。プライマー及びプローブを構成するヌクレオチド残基（標的部位にアニーリングする相補部分のヌクレオチド残基）の数は、例えば、１５個以上、１６個以上、１７個以上、１８個以上、または２０個以上が挙げられ、上限は例えば、５０個以下、４０個以下、または３０個以下が挙げられるが、特に限定されない。プライマーの場合は標的部位にアニーリングして目的産物を特異的に増幅できればよい。プローブ及びプライマーは、増幅産物の検出の観点などから、必要に応じて、蛍光物質（例えば、６−ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＮＥＤ、ＰＥＴ）で標識されていてもよい。
【００５２】
選抜工程の時期は、植物体からサンプルを採取できる段階であれば特に限定されない。そのため、収穫後に行ってもよいし、収穫前の、ある程度生長しサンプルを採取できる段階まで生長してからの段階で行ってもよい。交雑工程及び選抜工程は、これらを１サイクルとして少なくとも１回行えばよく、２回以上繰り返して行ってもよい。
【００５３】
〔低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物のスクリーニング方法〕
本発明によれば、第３に、低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物のスクリーニング方法が提供される。スクリーニング方法では、第４染色体領域に存在する少なくとも１つの低シュウ酸遺伝子座を有するホウレンソウ属植物を選抜する。選抜の条件については、製造方法の選抜工程において説明したのと同様である。
【００５４】
〔低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物選抜用キット〕
本発明によれば、第４に、低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物選抜用キットが提供される。斯かるキットは、第４染色体に存在する少なくとも１つの低シュウ酸マーカーを含む塩基部分に特異的に結合するプライマー又はプローブを少なくとも含む。プライマー、プローブは、製造方法の選抜工程において説明したのと同様である。キットは、プライマー及びプローブ以外の構成要素、例えば、増幅反応で用いられる酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素、リボヌクレアーゼＨ、ライゲース、ヘリカーゼ、リコンビナーゼ）、蛍光試薬、基質（ｄＮＴＰｓなど）、補酵素（例えば、ＡＴＰ）をさらに含んでいてもよい。また、選抜基準としての、ポジティブコントロール（例えば、ＧＡＰＤＨ、β−アクチン、β２−マイクログロブリン、ＨＰＲＴ１等のハウスキーピング遺伝子）及び／又はネガティブコントロール、コントロールに対する２以上のプライマーをさらに含んでいてもよい。キットは、個々の容器（例えば、チューブ）に隔離された形態で各成分を含んでいてもよいが、２種以上の成分が同一容器中で予め混合されていてもよい。
【実施例】
【００５５】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。以下の各実施例は、本発明を好適に説明するためのものであって、本発明を限定するものではない。【００５６】
実施例１及び比較例１〜２６（既存の品種とのシュウ酸含量の比較）
低シュウ酸ホウレンソウ植物を開発するため、（株）トーホク清原育種農場（栃木県宇都宮市）で継代育種により採取された大量のホウレンソウ系統の種子について育種を行い、シュウ酸含量を測定した。その結果、シュウ酸含量が著しく低い新規の低シュウ酸系統（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３８４）を得た。【００５７】
２０１６年、２０１８年、２０１９年の３カ年、（株）トーホク清原育種農場にて、低シュウ酸含量を示す寄託系統（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２３８４：以下、単に「寄託系統」と言う）と、対照品種としての既存のホウレンソウ品種（国内外の販売Ｆ１品種、在来種、遺伝資源を含む：表１）を栽培し、シュウ酸含量を比較した結果を表１に示す。
調査は、９月に播種し約４０日栽培、草丈２０〜３０ｃｍほどに生育した時点で一斉に行った。各試験区の５個体から最大葉の先端を採取し、ＨＰＬＣ法によりシュウ酸含量の分析・定量を行った。【００５８】
【表１】
0006978608.tif 000002
【００５９】
（表１の注）
ＵＳＤＡ：Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ【００６０】
シュウ酸は葉の先端に蓄積されやすく、既存のホウレンソウ品種はすべて高い値（１２６９〜２１８８ｍｇ／１００ｇＦＷ、平均１７５３ｍｇ／１００ｇＦＷ）を示したのに対し、寄託系統では２８１〜４９０ｍｇ／１００ｇＦＷと安定して低く、既存品種の１／３〜１／４程度と顕著に少ない値であった（表１）。【００６１】
実施例２及び比較例２７〜２８（可食部全体のシュウ酸含量の比較）
寄託系統と既存のホウレンソウ品種を市販の培養土で栽培し、シュウ酸含量を測定した（表２）。【００６２】
調査は、２０１６年９月に播種し、約４０日栽培し、草丈が約２０ｃｍに生育した時点で一斉に行った。【００６３】
シュウ酸含量の分析・定量は、一般財団法人日本食品分析センターに依頼し、ＨＰＬＣ法により行った。各試験区の５個体を収穫し、分析・定量には収穫した葉身と葉柄を含む可食部全体を用いた。【００６４】
【表２】
0006978608.tif 000003
【００６５】
寄託系統のシュウ酸含量は、土耕栽培でも１５０ｍｇ／１００ｇＦＷと低く、目標値を大きく下回った。対照品種と比較しても１／５〜１／６の値であり、明らかに低い値であった（表２）。【００６６】
実施例３及び比較例２９〜３１（栽培特性）
寄託系統、突然変異系統（非特許文献１０）及び対照品種としての既存のホウレンソウ品種（表３）を（株）トーホク清原育種農場（栃木県宇都宮市）で２０１７年４月１５日に播種し、露地栽培した。栽培密度は株間５ｃｍ、条間１８ｃｍ、４条とした。【００６７】
２０１７年５月１８日及び２４日に収穫調査を行った。すなわち、各試験区から１０個体を収穫し、草丈（最大葉長）、１株重量を測定した。【００６８】
各試験区の抽苔日を測定した。各試験区の１５％の個体が抽苔した日を抽苔日と定めた。【００６９】
結果を表３に示す。【００７０】
【表３】
0006978608.tif 000004
【００７１】
寄託系統は突然変異系統に比べて、早生性、収量性、抽苔性ともに優れていた。対照品種に比べて生育は同等〜やや緩慢であったが、遅くとも５日程度の差で十分な草丈及び株重に至った。調査を継続した６月４日までに抽苔は観察されず、春まき栽培に十分な晩抽性を示した。一方、突然変異系統は５月１９日に抽苔し、これは早抽品種の日本ほうれん草と同等であった（データ非掲載）。抽苔したためその後の収穫調査は行わなかった。生育は著しく緩慢で、栽培は極めて困難であった。【００７２】
実施例４
寄託系統と通常のシュウ酸含量を示すホウレンソウ系統（トーホク育成系統Ｄ）を交配し、Ｆ１集団を作出した。Ｆ１集団の個体を確認したところ、すべてシュウ酸含量は通常の高い値（１７１８〜２０１５ｍｇ／１００ｇＦＷ、平均１９０３ｍｇ／１００ｇＦＷ）を示した。続いて、Ｆ１個体を自殖してＦ２後代を作出した。Ｆ２個体２１８株について最大葉の先端をサンプリングしＨＰＬＣ法によりシュウ酸含量を測定した。【００７３】
Ｆ２個体のうち、シュウ酸含量が６００ｍｇ／１００ｇＦＷ以下の低シュウ酸個体は５９個体、高シュウ酸個体（１２７３〜１９７７ｍｇ／１００ｇＦＷ、平均１６１７ｍｇ／１００ｇＦＷ）が１５９個体であった。すなわち、１：３に分離したことから、寄託系統の低シュウ酸遺伝子座の遺伝様式は１因子劣性であることがわかった。同時に栽培調査した寄託系統のシュウ酸含量は２６８ｍｇ／１００ｇＦＷ、トーホク育成系統Ｄのシュウ酸含量は１８８５ｍｇ／１００ｇＦＷであった。【００７４】
実施例５（低シュウ酸特異的ＳＮＰマーカー）
以下の（Ｉ）〜（ＩＩ）の処理を行い、低シュウ酸特異的ＳＮＰマーカーの特定を行った。【００７５】
（Ｉ）原因遺伝子座乗領域の推定
実施例４のＦ２集団のシュウ酸含量分離比より、低シュウ酸系統は劣性１因子で決定されることが明らかとなっている。座乗領域を推定するため、実施例４で作出したＦ２集団を供試し、ＱＴＬｓｅｑを実施した。次世代シークエンサーより取得した配列データをホウレンソウのゲノム配列（ＮＣＢＩより入手、ＬＺＹＰ０１０００００１−ＬＺＹＰ０１０７８２６２、７８２６２本のＳｃａｆｆｏｌｄｓ）にマッピングし、ＳＮＰｓ候補を得た。得られたＳＮＰｓをマーカー化し、更に強連鎖領域を絞り込んだところＳｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３とＬＺＹＰ０１００１４１７が抽出された。これら２本のＳｃａｆｆｏｌｄｓの配列を「ＳｐｉｎａｃｈＢａｓｅ」ｈｔｔｐ：／／ｓｐｉｎａｃｈｂａｓｅ．ｏｒｇでＢＬＡＳＴ検索したところ、第４染色体末端に隣接して座乗していることが示唆された。【００７６】
（ＩＩ）作成したマーカーの特異性向上
前記ＱＴＬｓｅｑで得られたＳＮＰｓから更に低シュウ酸系統特異的なＳＮＰｓを選択するため、ＧＢＳ（Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｂｙ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を実施した。既存のホウレンソウ品種４品種（トーホク育成系統Ｄ（ｎ＝６）、サプライズ７、日本、次郎丸（以上３品種各ｎ＝１０））および低シュウ酸系統１品種（寄託系統（ｎ＝１０））間で多型となる、Ｓｃａｆｆｏｌｄ番号ＬＺＹＰ０１００００３３とＬＺＹＰ０１００１４１７内のＳＮＰｓを選択した。（表４〜６）【００７７】
【表４】
0006978608.tif 000005
【００７８】
【表５】
0006978608.tif 000006
【００７９】
【表６】
0006978608.tif 000007
【００８０】
（表４〜６の注）
Ａ：低シュウ酸ホモ
Ｂ：高シュウ酸ホモ【００８１】
実施例６（低シュウ酸含量ホウレンソウ属植物とＳＮＰマーカーの相関性の確認）
ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（ＣＡＰＳ（ｃｌｅａｖｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）ともいう）マーカー化可能なＳＮＰｓを選択し、マーカー化した。ＰＣＲ−ＲＦＬＰプロトコルは以下のとおりである。【００８２】
（１）ＰＣＲ反応
・反応液（２０μＬ反応系）
２×Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（登録商標）Ｐｌｕｓ            １０μＬ
ＢＩＯＴＡＱＴＭ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ０．１μＬ
Ｐｒｉｍｅｒ１                                          ０．１μＬ
Ｐｒｉｍｅｒ２                                          ０．１μＬ
ＤＮＡ  ｓａｍｐｌｅ                                    １．０μＬ
Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  Ｗａｔｅｒ                          ８．７μＬ【００８３】
・ＰＣＲ条件
（９５℃，１０ｍｉｎ）‐（９５℃，３０ｓｅｃ）‐（６１℃，３０ｓｅｃ）、を３５ｃｙｃｌｅｓ行った後、（７２℃，１ｍｉｎ）、（７２℃，５ｍｉｎ）【００８４】
（２）制限酵素処理
各ＳＮＰマーカーに適した制限酵素を選択し、制限酵素処理を行った。例えば、ＬＺＹＰ０１００００３３．１の２４１７５４番目の塩基でのＳＮＰの場合、Ｍｂｏ  Ｉ（Ｔａｋａｒａ）を選択し、制限酵素処理を行った結果、遺伝子型が低シュウ酸型の場合多型部位で切断され、低シュウ酸型以外の場合には切断されなかった。【００８５】
・反応液（２０μＬ反応系）
Ｍｂｏ  Ｉ                        ０．６μＬ
１０×Ｋ  Ｂｕｆｆｅｒ            ２．０μＬ
ＰＣＲ産物                        ５．０μＬ
Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  Ｗａｔｅｒ  １２．４μＬ【００８６】
・反応条件
３７℃，ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ【００８７】
実施例４のＦ２集団２１８個体を用い、ＰＣＲ−ＲＦＬＰマーカーでジェノタイピングを行った。これらの結果のうち特徴的な遺伝子型を示した１６個体の結果を記載した（表７）。【００８８】
【表７】
0006978608.tif 000008
【００８９】
（表７の注）
Ａ：低シュウ酸ホモ
Ｂ：高シュウ酸ホモ
Ｈ：ヘテロ【００９０】
ＳＬ０１〜０３はいずれも低シュウ酸含量であることとの相関がみられた。中でも、ＬＺＹＰ０１００００３３の２８５４３番目のＡがＴであるＳＮＰ（ＳＬ０１）とＬＺＹＰ０１００１４１７の９０４９０番目のＧがＡであるＳＮＰ（ＳＬ０３）に低シュウ酸含量であることと高い相関が見られた。【００９１】
実施例７（実施例６のＰＣＲ−ＲＦＬＰマーカーの特異性確認）
実施例６で作成したＰＣＲ−ＲＦＬＰマーカーの特異性を確認した（各品種ｎ＝５）。（表８）【００９２】
【表８】
0006978608.tif 000009
【００９３】
（表８の注）
Ａ：低シュウ酸ホモ
Ｂ：高シュウ酸ホモ
表８より、作成したＰＣＲ−ＲＦＬＰマーカーは低シュウ酸含量ホウレンソウ属植物を判別する特異性の高いマーカーであることが明らかとなった。
【配列表フリーテキスト】
【００９４】
以下、配列中の［  ］で囲んだ塩基は、多型部位であることを示す。
（配列番号１）ＳＬ０１
５’−ＣＡＣＧＡＡＡＴＡＡＧＴＣＡＡＡＣＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＡＧＴＡＧＡＡＡＴＴＡＴＣＴＴＴＴＣＴＡＡ［Ｔ］ＴＡＡＣＴＡＡＴＡＡＴＧＴＡＴＡＴＡＡＡＡＡＴＴＡＴＣＣＡＴＡＡＡＡＡＡＴＴＡＣＧＧＡＧ−３’
（配列番号２）ＳＬ２０８５４５
５’−ＡＡＧＴＴＴＴＧＡＴＴＧＴＴＣＧＡＣＡＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＡＧＣＧＴＡＡＡＧＡＡＴＴＴＡＡＴＧＡＡＡ［Ｔ］ＡＧＡＴＧＴＡＴＴＡＴＧＴＧＴＴＡＧＡＴＡＴＣＧＡＡＧＴＴＧＴＡＴＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＴ−３’
（配列番号３）ＳＬ２２０２７５
５’−ＧＴＴＡＡＧＧＡＣＣＴＣＴＴＧＣＴＣＣＴＴＡＡＴＣＡＡＧＧＴＣＣＣＧＧＧＴＴＣＧＡＧＣＣＴＴＧＧＡＡＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＣＴＣＡＡＣＴＧＧＧＡＧＧＡＴＧＣＴＧＣＣＣＡＴＣＧＡＡＡＴＡＣＣＣＡＴＧＣＡＡＡＣＴＣＣＣＧＣＧＧＡＡＧＡＴＴＡＧＴＣＣＡＣＴＣＧＣＣＧＡＡＧＧ[Ｇ]ＣＧＴＧＧＧＡＡＣＴＣＣＴＣＧＴＡＧＴＡＧＡＡＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＡＡＴＴＴＧＡＡＧＡＡＡＴＡＣＴＧＡＣＴＡＴＡＡＡＡＡＴＴＴＧＣＴＧＣＴＡＴＴＡＡＴＡＡＡＡＴＧＴＣＣＡＡＴＡＡＧＴＣＧＧＴＡＡＣＴＡＴＣＣＴＴＣＴＴＡＣＴＣＣＣＴＣＣＴＴＡＡＡＴＴＴＧＧＡＴＴＧＧＧ−３’
（配列番号４）ＳＬ２４１７５４
５’−ＧＴＣＴＣＣＣＴＴＧＡＡＧＡＧＡＡＣＡＴＡＧＣＣＡＡＣＣＴＣＧＡＣＧＡＧＧＣＣＧＣＧＡＣＣＧＡＧＧＧ［Ａ］ＴＣＣＡＡＴＡＧＧＡＧＧＡＧＴＧＧＧＴＴＧＧＴＴＧＴＴＧＴＣＴＣＡＧＣＴＡＡＣＴＴＣＴＧＴＴＴＴＴＧ−３’
（配列番号５）ＳＬ２９３２６５
５’−ＴＧＣＴＴＡＴＴＧＣＡＧＡＣＣＧＴＣＡＡＴＧＡＴＧＴＧＣＴＴＴＴＧＧＧＧＧＴＣＡＴＡＴＣＧＣＡＴＧＧ［Ｔ］ＣＴＡＴＣＣＡＡＧＴＡＣＧＴＡＧＧＴＧＣＣＡＡＡＴＣＡＣＡＣＡＡＧＧＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＣＡＡＣＡＡ−３’
（配列番号６）ＳＬ２９３６５８
５’−ＡＧＧＡＡＧＡＴＣＡＡＡＴＡＴＧＡＡＡＧＡＣＡＴＴＴＡＴＡＧＡＡＡＣＡＧ［Ａ］ＡＡＧＡＴＡＡＡＡＡＡＧＧＡＡＴＧＧＡＧＧＧＡＧＴＡＡＴＴＡＣＴＧＣＡＴＡＧＣＴＧＧＴＴＧＴＴＡＣＧＧＡＧＴＡＧＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＡＴＧＣＧＴＣＡＡＴＧＣＣＣＴＡＡＴＡＡＴＴＧＴＣＣＴＴＴＣＴＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＧＣＡＧＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＡＡＧＴＣＡＣＴＧＣＴＡＴＴＣＴＧＧＴＴＧＴＣＡＡＴＣＴＡＣＧＣＧＧＡＧＴＣＴＣＴＴＧＣＴＴＡＣＡＧＧＴＴＧＧＴＴＧＣＴＴＡＴＣＧＴＴＡＧＧＴＧＡＡＣＡＣＡＡＡＴＴＣＡＣＣＧＡＡＡＡＧＧＣＴＡＣＡＴＡＴＡＣＣＣＣＡＴＧＧＧＴＡＴ−３’
（配列番号７）ＳＬ２９３９０２
５’−ＡＡＧＡＴＡＡＡＡＡＡＧＧＡＡＴＧＧＡＧＧＧＡＧＴＡＡＴＴＡＣＴＧＣＡＴＡＧＣＴＧＧＴＴＧＴＴＡＣＧＧＡＧＴＡＧＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＡＴＧＣＧＴＣＡＡＴＧＣＣＣＴＡＡＴＡＡＴＴＧＴＣＣＴＴＴＣＴＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＧＣＡＧＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＡＡＧＴＣＡＣＴＧＣＴＡＴＴＣＴＧＧＴＴＧＴＣＡＡＴＣＴＡＣＧＣＧＧＡＧＴＣＴＣＴＴＧＣＴＴＡＣＡＧＧＴＴＧＧＴＴＧＣＴＴＡＴＣＧＴＴＡＧＧＴＧＡＡＣＡＣＡＡＡＴＴＣＡＣＣＧＡＡＡＡＧＧＣＴＡＣＡＴＡＴＡＣＣＣＣＡＴＧＧＧＴＡＴ［Ａ］ＧＡＡＴＡＧＴＧＴＣＡＴＡＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＡＴＴＧＧＴＴＴＡＧＡＴＴＴＡＴＡＡＡＴＴＣＣＡＴＧＴＧＧＧＧＴＴＧ−３’
（配列番号８）ＳＬ２９４０８１
５’−ＴＡＣＴＣＡＴＴＧＡＧＴＡＴＡＴＧＴＡＴＣＡＧＣＴＴＣＣＣＡＡＡＴＴＣ［Ｇ］ＣＴＧＣＴＡＴＴＡＴＧＧＴＴＧＴＣＡＡＴＡＴＴＣＣＡＴＡＴＴＴＴＣＡＴＡＧＴＡＴＡＡＡＡＣＡＡＧＴＧＴＧＧＴＡＴＴＧＴＡＡＣＡＧＧ−３’
（配列番号９）ＳＬ４３０２３７
５’−ＴＧＡＡＡＧＴＧＡＡＣＣＣＴＣＣＧＡＡＡＴＧＧＣＡＴＣＡＴＡＴＴＣＣＡＣＣＡＴＴＧＡＡＧＧＡＧＣＴＴＧＡＧＴＧＴＴＣＴＴＣＧＡＧＧＡＴＧＣＧＣＧＡＧＴＡＡＴＡＧ［Ａ］ＣＴＴＡＧＴＡＡＧＡＧＣＡＴＣＣＴＴＡＴＴＣＴＴＡＴＴＣＧＧＴＴＧＴＴＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＴＴＴ−３’
（配列番号１０）  ＳＬ７４７２３１
５’−ＣＣＧＴＣＣＣＴＴＡＡＴＡＣＴＣＧＡＣＣＣＧＴＴＴＴＧＡＣＴＴＴＴＴＧＣＡＣＴＡＴＴＣＡＣＡＴＡＡＴＴＣＡＣＴＴＴＧＡＣＣＣＴＡＴＴＴＴＡＴＴＴＡＴＡＧＴＧＴＡＴＧＡＡＡＡＣＧＡＡＴＧＴＴＡＧＴＡＴＡＴＡＡＴＡＴＡＴＴＧＴＴＧＧＣＴＴＣＡＴＣＴＴＡＡＴＡＴＡＴＡＴＴＴＴＣＡＡＡＡＴＡＴＴＡＡＴＡＴＴＴＴＴＡＴＡＡＧＴＴＴＴＴＡＴＡＡＴＡＴＧＴＡＣＴＴＡＡＡ［Ａ］ＡＡＡＴＴＡＧＴＧＡＴＣＡＡＡＧＴＴＡＴＧＣＡＴＴＡＡＣＡＡＡＣＧＴＧＴＣＣＧＡＴＣＡＡＡＡＣＡＧＡＴＣＡＡＧＴＡＴＴＡＡＧＧＧＡＣＡＧＡＧＧＧＡＧＴＡＣＴＡＣＡＣＧＴＣＴＡＣＴＣＣＡＡＡＧＴＣＴＣＡＡＣＴＡＧＡＡＧＣＡＡＡＡＡＴＧＧＣＣＡＡＣＣＴＴＡＧＴＡＧＴＧＡＡＡＴＣＡＣＧＴＧＧＡＴ−３’
（配列番号１１）ＳＬ７５９００８
５’−ＴＣＣＴＡＴＴＴＴＣＡＡＡＡＴＣＡＣＡＣＡＴＧＡＡＡＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＧＡＡＡＡＡＴＣＴＣＡＣＴ［Ｇ］ＣＡＣＴＴＡＧＴＧＴＴＴＧＡＧＧＡＣＧＣＴＡＡＧＡＣＣＴＣＡＴＡＴＴＡＣＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡ−３’
（配列番号１２）ＳＬ８１２３６７
５’−ＴＴＴＴＣＡＧＧＡＡＡＴＴＧＴＣＧＡＴＴＧＧＡＡＡＡＴＴＡＡＴＴＴＡＣＧＴＣＣＣＡＴＴＴＡＣＴＣＴＧ［Ｃ］ＣＡＧＴＡＴＣＡ−３’
（配列番号１３）ＳＬ８１２３８４
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（配列番号１４）ＳＬ８１２５１４
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（配列番号１５）ＳＬ８１２６０１
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（配列番号１６）ＳＬ１２５２２３４
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（配列番号１７）ＳＬ０２
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（配列番号１８）ＳＬ２１６７３４４
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（配列番号１９）ＳＬ７８８１２
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（配列番号２０）ＳＬ０３
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（配列番号２１）ＳＬ９７２４３
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（配列番号２２）ＳＬ３２３３３６
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【要約】
本発明の課題は、低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物、中でも、環境条件に左右されず安定してシュウ酸含量が低いホウレンソウ属植物、その製造方法、スクリーニング方法及びスクリーニング用キットを提供することである。本発明は、第４染色体領域に存在する少なくとも１つの低シュウ酸遺伝子座を有する、低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物；前記低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物と、他のホウレンソウ属植物とを交雑する交雑工程を少なくとも含む、低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物の製造方法；第４染色体領域に存在する少なくとも１つの低シュウ酸遺伝子座を有するホウレンソウ属植物を選抜する、低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物のスクリーニング方法；前記低シュウ酸遺伝子座に特異的に結合するプライマー又はプローブを少なくとも含む、低シュウ酸含量のホウレンソウ属植物スクリーニング用キットを提供する。【配列表】
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