(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基５０７番目でグルタミン酸（Ｅ）がリシン（Ｋ）に置換され、アミノ酸残基５３６番目でアルギニン（Ｒ）がリシン（Ｋ）に置換され、およびアミノ酸残基６６０番目でアルギニン（Ｒ）がバリン（Ｖ）に置換されている、配列番号８のＴａｑ重合酵素アミノ酸配列、または、
配列番号１のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基５０７番目でグルタミン酸（Ｅ）がリシン（Ｋ）に置換され、アミノ酸残基５３６番目でアルギニン（Ｒ）がリシン（Ｋ）に置換され、アミノ酸残基５８７番目でアルギニン（Ｒ）がイソロイシン（Ｉ）に置換され、およびアミノ酸残基６６０番目でアルギニン（Ｒ）がバリン（Ｖ）に置換されている、配列番号３７のＴａｑ重合酵素アミノ酸配列
を含むＤＮＡ重合酵素。
【請求項２】
前記ＤＮＡ重合酵素は、マッチしたプライマーとミスマッチしたプライマーを区別し、前記マッチしたプライマーとミスマッチしたプライマーは、標的配列とハイブリダイゼーションされ、前記ミスマッチしたプライマーは、ハイブリダイゼーションされる標的配列に対してその３’末端に非標準ヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ重合酵素。
【請求項３】
前記ＤＮＡ重合酵素は、マッチしたプライマーを含む標的配列の増幅がミスマッチしたプライマーを含む標的配列の増幅より低いＣｔ値を示すことを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ重合酵素。
【請求項４】
請求項１に記載のＤＮＡ重合酵素のアミノ酸配列をコードする核酸分子。
【請求項５】
請求項４に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項７】
請求項１に記載のＤＮＡ重合酵素を
ａ）一つ以上の鋳型；
ｂ）一つ以上のマッチしたプライマー、一つ以上のミスマッチしたプライマー、または一つ以上のマッチしたプライマーと一つ以上のミスマッチしたプライマーの両方とも；および
ｃ）ヌクレオシドトリホスフェートと接触させることを含む、一つ以上の鋳型で一つ以上の遺伝子変異またはＳＮＰを生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で検出する方法であって、
前記一つ以上のマッチしたプライマー、前記一つ以上のミスマッチしたプライマー、または前記一つ以上のマッチしたプライマーと一つ以上のミスマッチしたプライマーの両方は、標的配列とハイブリダイゼーションされることを特徴とする方法。
【請求項８】
前記方法は、二本鎖特異的染料を利用した溶融温度分析をさらに含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記方法は、リアルタイムＰＣＲ、標準ＰＣＲ後のアガロースゲルでの分析、リアルタイムＰＣＲを通した遺伝子変異特異的増幅または対立遺伝子−特異的増幅、テトラ−プライマー増幅−不応性突然変異システムＰＣＲまたは等温増幅により行われることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１に記載のＤＮＡ重合酵素を含む遺伝子変異またはＳＮＰ検出用組成物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組成物を含むＰＣＲキット。
【請求項１２】
前記ＰＣＲキットは、Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ（キャストＰＣＲ、登録商標名）、ドロプレットデジタルＰＣＲ（Ｄｒｏｐｌｅｔ  ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ）（登録商標名）、またはマスアレイ（ＭａｓｓＡＲＲＡＹ）（登録商標名）に使用されることを特徴とする請求項１１に記載のＰＣＲキット。
【請求項１３】
一つ以上のマッチしたプライマー、一つ以上のミスマッチしたプライマー、または一つ以上のマッチしたプライマーと一つ以上のミスマッチしたプライマーの両方ともをさらに含み、前記一つ以上のマッチしたプライマー、前記一つ以上のミスマッチしたプライマー、または前記一つ以上のマッチしたプライマーと一つ以上のミスマッチしたプライマーの両方は、標的配列とハイブリダイゼーションされることを特徴とする請求項１１に記載のＰＣＲキット。
【請求項１４】
ヌクレオシドトリホスフェートをさらに含むことを特徴とする請求項１１に記載のＰＣＲキット。
【請求項１５】
ａ）一つ以上のバッファー；
ｂ）二本鎖ＤＮＡに結合する定量化のための試薬；
ｃ）重合酵素遮断抗体；
ｄ）一つ以上の対照値または対照配列；および
ｅ）一つ以上の鋳型；をさらに含むことを特徴とする請求項１１に記載のＰＣＲキット。
【請求項１６】
２５〜１００ｍＭのＫＣｌ；および
１〜１５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４；を含み、最終ｐＨが８．０〜９．０である、遺伝子変異特異的増幅効率が増加したＤＮＡ重合酵素の活性増加用ＰＣＲバッファー組成物；ならびに
請求項１に記載のＤＮＡ重合酵素を含む、遺伝子変異またはＳＮＰ検出用ＰＣＲキット。
【請求項１７】
前記ＫＣｌの濃度は、６０〜９０ｍＭであることを特徴とする請求項１６に記載の遺伝子変異またはＳＮＰ検出用ＰＣＲキット。
【請求項１８】
前記（ＮＨ４）２ＳＯ４の濃度は、２．５〜８ｍＭであることを特徴とする請求項１６に記載の遺伝子変異またはＳＮＰ検出用ＰＣＲキット。
【請求項１９】
前記ＫＣｌの濃度は、７０〜８０ｍＭであり、前記（ＮＨ４）２ＳＯ４の濃度は、４〜６ｍＭであることを特徴とする請求項１６に記載の遺伝子変異またはＳＮＰ検出用ＰＣＲキット。
【請求項２０】
５〜８０ｍＭのＴＭＡＣ（Ｔｅｔｒａ  ｍｅｔｈｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）をさらに含むことを特徴とする請求項１６に記載の遺伝子変異またはＳＮＰ検出用ＰＣＲキット。
【請求項２１】
前記ＫＣｌの濃度は、４０〜９０ｍＭであることを特徴とする請求項２０に記載の遺伝子変異またはＳＮＰ検出用ＰＣＲキット。
【請求項２２】
前記（ＮＨ４）２ＳＯ４の濃度は、１〜７ｍＭであることを特徴とする請求項２０に記載の遺伝子変異またはＳＮＰ検出用ＰＣＲキット。
【請求項２３】
前記ＴＭＡＣの濃度は、１５〜７０ｍＭであり、前記ＫＣｌの濃度は、５０〜８０ｍＭであり、前記（ＮＨ４）２ＳＯ４の濃度は、１．５〜６ｍＭであることを特徴とする請求項２０に記載の遺伝子変異またはＳＮＰ検出用ＰＣＲキット。
【請求項２４】
Ｔｒｉｓ・ＣｌおよびＭｇＣｌ２をさらに含むことを特徴とする請求項１６に記載の遺伝子変異またはＳＮＰ検出用ＰＣＲキット。
【請求項２５】
ａ）ヌクレオシドトリホスフェート；
ｂ）二本鎖ＤＮＡに結合する定量化のための試薬；
ｃ）重合酵素遮断抗体；
ｄ）一つ以上の対照値または対照配列；および
ｅ）一つ以上の鋳型；をさらに含むことを特徴とする請求項１６に記載の遺伝子変異またはＳＮＰ検出用ＰＣＲキット。
【請求項２６】
請求項１６に記載のＰＣＲキットを利用して一つ以上の鋳型で一つ以上の遺伝子変異またはＳＮＰを生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子変異特異性が増加したＤＮＡ重合酵素およびその活性増加用ＰＣＲバッファー組成物に関し、より具体的に、特定のアミノ酸位置で突然変異が誘発されて遺伝子変異特異性が増加したＤＮＡ重合酵素、前記重合酵素をコードする核酸配列、前記核酸配列を含むベクターおよび前記ベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、また、前記遺伝子変異特異性が増加したＤＮＡ重合酵素を利用して一つ以上の鋳型で一つ以上の遺伝子変異またはＳＮＰを生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で検出する方法、前記ＤＮＡ重合酵素を含む遺伝子変異またはＳＮＰ検出用組成物および前記組成物を含むＰＣＲキットを提供する。
【０００２】
ひいては、本発明は、前記遺伝子変異特異性が増加したＤＮＡ重合酵素の活性を増加させるためのＰＣＲバッファー組成物、前記ＰＣＲバッファー組成物および／または遺伝子変異特異性が増加したＤＮＡ重合酵素を含む遺伝子変異またはＳＮＰ検出用ＰＣＲキット、および前記キットを利用して一つ以上の鋳型で一つ以上の遺伝子変異またはＳＮＰを生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で検出する方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
最初のヒト遺伝子配列が明らかになって以来、研究者らは、単一塩基突然変異（単一塩基多形成、ＳＮＰｓ）のような個体間の遺伝的差異を発見するのに集中してきた。遺伝子において単一塩基変異は、非常に多様な疾病に対する互いに異なる薬物耐性または疾病素質と関連していることがますます明らかになっているので、関心の対象となる。今後医学的に関連のあるヌクレオチド変異に対する知識は、個人の遺伝的供給に対する治療法を適用することができ、非効果的であるか、副作用を起こし得る薬物治療を防止することができる。ヌクレオチド変異の時間および費用効率的な識別を可能にする技術の開発は、薬理遺伝学でのさらなる進歩をもたらすだろう。
【０００４】
ＳＮＰｓは、ヒト遺伝子において主な遺伝的変異を占め、個体間の差異の９０％以上を誘発する。このような遺伝的変異と突然変異のような他の核酸変異を検出するために、多様な方法が使用され得る。例えば、標的核酸の変異体を同定することは、分析しようとする核酸サンプルを適合したハイブリダイゼーション条件で配列変異体に対して特異的なハイブリダイゼーションプライマーとハイブリダイゼーションすることによって行われ得る。
【０００５】
しかしながら、このようなハイブリダイゼーション方法は、特に、アッセイの必須の敏感度の観点において臨床学的要求を満足させないことを発見した。したがって、ＰＣＲは、分子生物学およびＳＮＰおよび他の対立遺伝子配列変異体のような突然変異の検出のための診断検査方法において幅広く使用されてきており、ここで変異体の存在を考慮して検査しようとする標的核酸は、ハイブリダイゼーション前に重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。このようなアッセイのためにハイブリダイゼーションプローブとして、一般的に単鎖オリゴヌクレオチドが使用される。前記アッセイの変形された具現例は、蛍光ハイブリダイゼーションプローブを使用することを含む。一般的に、ＳＮＰおよび他の配列変異の測定方法を自動化するために努力した（Ｇｕｔ，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．１７，４７５−４９２（２００１））。
【０００６】
当該技術分野に公知された配列変異特異的ハイブリダイゼーションの代案は、いわゆる遺伝子変異特異的増幅により提供される。このような検出方法で、すでに増幅する間、変異特異的増幅プライマーが使用され、これは、通常、プライマーの３’−末端にいわゆる差別的末端ヌクレオチド残基を有し、残基は、単に検出しようとする標的核酸の一つの特異的変異にのみ相補的である。この方法で、ヌクレオチド変異体は、ＰＣＲ増幅後にＤＮＡ産物の存在または不在によって測定される。遺伝子変異特異的増幅の原理は、遺伝子変異特異的増幅プライマー末端で標準（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）または非標準プライマー−鋳型複合体の形成を基盤とする。正確にペアを成す３’プライマー末端で、ＤＮＡ重合酵素による増幅が起こる反面、ミスマッチされたプライマー末端では、延長が抑制される。
【０００７】
例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，５９５，８９０は、遺伝子変異特異的増幅のための方法およびその適用、例えばｋ−ｒａｓ腫瘍遺伝子において臨床的に関連した点突然変異（ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）の検出のための適用を開示している。また、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，５２１，３０１は、ＡＢＯ血液型システムの遺伝型分析のための対立遺伝子−特異的増幅方法を開示している。対照的に、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，６３９，６１１は、鎌状赤血球貧血の原因となる点突然変異の検出に関連した対立遺伝子−特異的増幅の使用を開示している。しかしながら、遺伝子変異特異的増幅または対立遺伝子−特異的増幅は、選択性が低いという問題があり、これは、さらに複雑であり、時間および費用集約的な最適化段階を必要とする。
【０００８】
配列変異、多形成および主に点突然変異を検出するための前記のような方法は、特に、検出しようとする配列変異が同じ核酸分節（または同じ遺伝子）の優勢な変異と比較して不足した場合、対立遺伝子−特異的増幅（または遺伝子変異特異的増幅）を必要とする。
【０００９】
例えば、遺伝子変異特異的増幅により散在性腫瘍細胞が血液、血清または血しょうのような体液で検出される場合、このような状況が発生する（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，４９６，６９９）。このために、ＤＮＡは、最初に血液、血清または血しょうのような体液から分離され、ＤＮＡは、不足した散在性腫瘍細胞と過量の非増殖性細胞から構成される。したがって、ｋ−ｒａｓ遺伝子において腫瘍ＤＮＡに重要な突然変異は、過量の野生型ＤＮＡの存在の下に複数の複製本から検出されなければならない。
【００１０】
従来技術に開示された遺伝子変異特異的増幅に対するすべての方法は、３’−末端差別的オリゴヌクレオチド残基が使用されなければならないという短所がある。また、３’−差別的ヌクレオチド残基の使用にもかかわらず、標的核酸が検出しようとする配列変異体と正確に一致しなくても、適合したＤＮＡ重合酵素の存在下にプライマー延長が低い水準で発生するという短所を有する。特に、特定の配列変異体が他の配列変異体を含む過量のバックグラウンド核酸として検出される場合、偽陽性結果を招く。このようなＰＣＲ基盤方法が有する短所の主な理由は、ミスマッチされる塩基を十分に区別するための方法に使用される重合酵素の不適合性である。したがって、ＰＣＲで突然変異の有無に対する明確な情報を直接的に得ることはまだ可能でない。現在まで、更なる時間および費用集約的精製と分析方法が突然変異の明確な診断のために要求された。したがって、遺伝子変異特異的または対立遺伝子−特異的ＰＣＲ増幅の選択性を向上させることができる新規の方法は、ＰＣＲによる直接的な遺伝子変異またはＳＮＰ分析の信頼性および強力さに大きい影響を及ぼすだろう。
【００１１】
これに伴い、遺伝子変異特異性が増加したＤＮＡ重合酵素および前記ＤＮＡ重合酵素が自らの機能を発揮することができるように多様な物質が混合された最適な反応バッファーに対する開発が持続的に要求されている。
【００１２】
これより、本発明者らは、遺伝子変異特異的ＰＣＲ増幅の選択性を向上させることができる新規のＤＮＡ重合酵素およびその活性を増加させるための反応バッファーを開発するために努力した結果、Ｔａｑ重合酵素の特定位置のアミノ酸残基に突然変異を誘発する場合、遺伝子変異特異性が顕著に増加し、ＰＣＲバッファー組成物の成分のうち、ＫＣｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４および／またはＴＭＡＣ（Ｔｅｔｒａ  ｍｅｔｈｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）の濃度を調節する場合、前記遺伝子変異特異性が増加したＤＮＡ重合酵素の活性が増加することを確認し、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、前記のような問題点を解決するためになされたものであって、遺伝子変異またはＳＮＰが含まれた標的配列で一つ以上の遺伝子変異またはＳＮＰを検出するためのＤＮＡ重合酵素を提供する。
【００１４】
本発明の他の目的は、本発明によるＤＮＡ重合酵素をコードする核酸配列、前記核酸配列を含むベクターおよび前記ベクターで形質転換された宿主細胞を提供することにある。
【００１５】
本発明のさらに他の目的は、本発明によるＤＮＡ重合酵素の製造方法を提供することにある。
【００１６】
本発明のさらに他の目的は、本発明のＤＮＡ重合酵素を利用して一つ以上の鋳型で一つ以上の遺伝子変異またはＳＮＰを生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で検出する方法を提供することにある。
【００１７】
本発明のさらに他の目的は、本発明によるＤＮＡ重合酵素を含む遺伝子変異またはＳＮＰ検出用組成物を提供することにある。
【００１８】
本発明のさらに他の目的は、本発明による遺伝子変異またはＳＮＰ検出用組成物を含む遺伝子変異またはＳＮＰ検出用キットを提供することにある。
【００１９】
本発明の他の目的は、遺伝子変異特異性が増加したＤＮＡ重合酵素の活性増加用ＰＣＲバッファー組成物を提供することにある。
【００２０】
本発明のさらに他の目的は、本発明によるＰＣＲバッファー組成物および／または遺伝子変異特異性が増加したＤＮＡ重合酵素を含む遺伝子変異またはＳＮＰ検出用ＰＣＲキットを提供することにある。
【００２１】
本発明のさらに他の目的は、本発明によるＰＣＲキットを利用して一つ以上の鋳型で一つ以上の遺伝子変異またはＳＮＰを生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で検出する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
上記目的を達成するために、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列からなるＴａｑ重合酵素を有するＤＮＡ重合酵素であって、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列で５０７番目アミノ酸残基の置換；および
（ｂ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列で５３６番目アミノ酸残基の置換、
（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列で６６０番目アミノ酸残基の置換、
（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列で５３６番目および６６０番目アミノ酸残基の置換、または
（ｉｖ）配列番号１のアミノ酸配列で５３６番目、５８７番目および６６０番目アミノ酸残基の置換；を含むＤＮＡ重合酵素を提供する。
【００２３】
本発明の好ましい一実施例によれば、前記５０７番目アミノ酸残基の置換は、グルタミン酸（Ｅ）からリシン（Ｋ）に置換されるものであり、前記５３６番目アミノ酸残基の置換は、アルギニン（Ｒ）からリシン（Ｋ）に置換されるものであり、前記５８７番目アミノ酸残基の置換は、アルギニン（Ｒ）からイソロイシン（Ｉ）に置換されるものであり、前記６６０番目アミノ酸残基の置換は、アルギニン（Ｒ）からバリン（Ｖ）に置換されるものでありうる。
【００２４】
本発明の好ましい他の一実施例によれば、前記ＤＮＡ重合酵素は、マッチしたプライマーとミスマッチしたプライマーを区別し、前記マッチしたプライマーとミスマッチしたプライマーは、標的配列とハイブリダイゼーションされ、前記ミスマッチしたプライマーは、ハイブリダイゼーションされる標的配列に対してその３’末端に非標準ヌクレオチドを含むことができる。
【００２５】
本発明の好ましいさらに他の一実施例によれば、前記ＤＮＡ重合酵素は、マッチしたプライマーを含む標的配列の増幅がミスマッチしたプライマーを含む標的配列の増幅より低いＣｔ値（高い増幅効率）の向上を示すことができる。
【００２６】
また、本発明は、本発明によるＤＮＡ重合酵素をコードする核酸配列、前記核酸配列を含むベクター、前記ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
【００２７】
また、本発明は、前記宿主細胞を培養する段階；および培養物およびその培養上澄み液からＤＮＡ重合酵素を分離する段階；を含むＤＮＡ重合酵素の製造方法を提供する。
【００２８】
また、本発明は、本発明によるＤＮＡ重合酵素を
ａ）一つ以上の鋳型；
ｂ）一つ以上のマッチしたプライマー、一つ以上のミスマッチしたプライマーまたは一つ以上のマッチしたプライマーと一つ以上のミスマッチしたプライマーの両方とも；および
ｃ）ヌクレオシドトリホスフェートと接触させることを含み、
前記一つ以上のマッチしたプライマーおよびミスマッチしたプライマーは、標的配列とハイブリダイゼーションされ、前記ミスマッチしたプライマーは、ハイブリダイゼーションされる標的配列に対してその３’末端から７個までの塩基位置に非標準（ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ）ヌクレオチドを含む、一つ以上の鋳型で一つ以上の遺伝子変異またはＳＮＰを生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で検出する方法を提供する。
【００２９】
本発明の好ましい一実施例によれば、前記方法は、二本鎖特異的染料を利用した溶融温度（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ）分析を含むことができる。
【００３０】
本発明の好ましい他の一実施例によれば、前記方法は、リアルタイムＰＣＲ、標準ＰＣＲ後のアガロースゲルでの分析、リアルタイムＰＣＲを通した遺伝子変異特異的増幅または対立遺伝子−特異的増幅、テトラ−プライマー増幅−不応性突然変異システムＰＣＲまたは等温増幅により行われ得る。
【００３１】
また、本発明は、本発明によるＤＮＡ重合酵素を含む遺伝子変異またはＳＮＰ検出用組成物を提供する。
【００３２】
また、本発明は、前記遺伝子変異またはＳＮＰ検出用組成物を含むＰＣＲキットを提供する。
【００３３】
本発明の好ましい一実施例によれば、前記ＰＣＲキットは、キャストＰＣＲ（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ）、ドロプレットデジタルＰＣＲ（Ｄｒｏｐｌｅｔ  ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ）またはマスアレイ（ＭａｓｓＡＲＲＡＹ）に使用され得る。
【００３４】
本発明の好ましい一実施例によれば、前記ＰＣＲキットは、一つ以上のマッチしたプライマー、一つ以上のミスマッチしたプライマーまたは一つ以上のマッチしたプライマーと一つ以上のミスマッチしたプライマーの両方ともをさらに含み、前記一つ以上のマッチしたプライマーおよび一つ以上のミスマッチしたプライマーは、標的配列とハイブリダイゼーションされ、前記ミスマッチしたプライマーは、ハイブリダイゼーションされる標的配列に対してその３’末端から７個までの塩基位置に非標準（ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ）ヌクレオチドを含むことができる。
【００３５】
本発明の好ましい他の一実施例によれば、前記ＰＣＲキットは、ヌクレオシドトリホスフェートをさらに含むことができる。
【００３６】
本発明の好ましいさらに他の一実施例によれば、前記ＰＣＲキットは、
ａ）一つ以上のバッファー；
ｂ）二本鎖ＤＮＡに結合する定量化のための試薬；
ｃ）重合酵素遮断抗体；
ｄ）一つ以上の対照値または対照配列；および
ｅ）一つ以上の鋳型；をさらに含むことができる。
【００３７】
また、本発明は、２５〜１００ｍＭのＫＣｌ；および１〜１５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４；を含み、最終ｐＨが８．０〜９．０である、遺伝子変異特異性が増加したＤＮＡ重合酵素の活性増加用ＰＣＲバッファー組成物を提供する。
【００３８】
本発明の好ましい一実施例によれば、前記ＫＣｌの濃度は、６０〜９０ｍＭでありうる。
【００３９】
本発明の好ましい他の一実施例によれば、前記（ＮＨ４）２ＳＯ４の濃度は、２〜８ｍＭでありうる。
【００４０】
本発明の好ましいさらに他の一実施例によれば、前記ＫＣｌの濃度は、７０〜８０ｍＭであり、前記（ＮＨ４）２ＳＯ４の濃度は、４〜６ｍＭでありうる。
【００４１】
また、本発明は、前述したＰＣＲバッファー組成物に５〜８０ｍＭのＴＭＡＣ（Ｔｅｔｒａ  ｍｅｔｈｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）をさらに含む、遺伝子変異特異性が増加したＤＮＡ重合酵素の活性増加用ＰＣＲバッファー組成物を提供する。
【００４２】
本発明の好ましい一実施例によれば、前記ＫＣｌの濃度は、４０〜９０ｍＭでありうる。
【００４３】
本発明の好ましい他の一実施例によれば、前記（ＮＨ４）２ＳＯ４の濃度は、１〜７ｍＭでありうる。
【００４４】
本発明の好ましいさらに他の一実施例によれば、前記ＴＭＡＣ（Ｔｅｔｒａ  ｍｅｔｈｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）の濃度は、１５〜７０ｍＭであり、前記ＫＣｌの濃度は、５０〜８０ｍＭであり、前記（ＮＨ４）２ＳＯ４の濃度は、１．５〜６ｍＭでありうる。
【００４５】
本発明の好ましい他の一実施例によれば、前記ＰＣＲバッファー組成物は、Ｔｒｉｓ・ＣｌおよびＭｇＣｌ２をさらに含むことができる。
【００４６】
また、本発明は、前述したＰＣＲバッファー組成物を含む遺伝子変異またはＳＮＰ検出用ＰＣＲキットを提供する。
【００４７】
本発明の好ましい一実施例によれば、前記ＰＣＲキットは、配列番号１のアミノ酸配列からなるＴａｑ重合酵素を有するＤＮＡ重合酵素として、次のアミノ酸置換を含むＤＮＡ重合酵素を含むことができる：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列で５０７番目アミノ酸残基の置換；および
（ｂ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列で５３６番目アミノ酸残基の置換、
（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列で６６０番目アミノ酸残基の置換、
（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列で５３６番目および６６０番目アミノ酸残基の置換、または
（ｉｖ）配列番号１のアミノ酸配列で５３６番目、５８７番目および６６０番目アミノ酸残基の置換。
【００４８】
本発明の好ましい一実施例によれば、前記５０７番目アミノ酸残基の置換は、グルタミン酸（Ｅ）からリシン（Ｋ）に置換されるものであり、前記５３６番目アミノ酸残基の置換は、アルギニン（Ｒ）からリシン（Ｋ）に置換されるものであり、前記５８７番目アミノ酸残基の置換は、アルギニン（Ｒ）からイソロイシン（Ｉ）に置換されるものであり、前記６６０番目アミノ酸残基の置換は、アルギニン（Ｒ）からバリン（Ｖ）に置換されるものでありうる。
【００４９】
本発明の好ましいさらに他の一実施例によれば、前記ＰＣＲキットは、ａ）ヌクレオシドトリホスフェート；ｂ）二本鎖ＤＮＡに結合する定量化のための試薬；ｃ）重合酵素遮断抗体；ｄ）一つ以上の対照値または対照配列；およびｅ）一つ以上の鋳型；をさらに含むことができる。
【００５０】
また、本発明は、本発明のＰＣＲキットを利用して一つ以上の鋳型で一つ以上の遺伝子変異またはＳＮＰを生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で検出する方法を提供する。
【発明の効果】
【００５１】
本発明の遺伝子変異特異性が増加したＤＮＡ重合酵素は、従来のＴａｑ重合酵素と比較してさらに高いミスマッチ対比マッチ伸長選択性を有するので、いかなる基質変形なくとも信頼性ある遺伝子変異特異的増幅を可能にする。また、本発明は、遺伝子変異特異性が増加したＤＮＡ重合酵素が自らの機能を効果的に発揮できる最適なＰＣＲバッファー組成物を提供し、遺伝子変異特異性が増加したＤＮＡ重合酵素とともに使用して前記ＤＮＡ重合酵素の活性を顕著に向上させることによって、信頼性ある遺伝子変異−特異的増幅を可能にする。かつ、本発明のＰＣＲバッファー組成物および／または遺伝子変異特異性が増加したＤＮＡ重合酵素を含むキットは、遺伝子変異またはＳＮＰを効果的に検出することができるので、疾病の医学的診断および組換えＤＮＡの研究に有用に活用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、Ｒ５３６Ｋ、Ｒ６６０ＶおよびＲ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖ変異をそれぞれ含むＴａｑ  ＤＮＡ重合酵素の製造過程を示すものであり、（ａ）は、断片ＰＣＲおよびオーバーラップＰＣＲを図式化して示すものであり、（ｂ）は、断片ＰＣＲで増幅された産物を電気泳動で確認した結果を示すものであり、（ｃ）は、オーバーラップＰＣＲで全長を増幅して増幅された産物を電気泳動で確認した結果を示すものである。
【図２】図２は、ゲル抽出のために、制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩで分解した後、ＳＡＰを処理したｐＵＣ１９ベクターと精製した図１（ｃ）のオーバーラップＰＣＲ産物を電気泳動で確認した結果である。
【図３】図３は、Ｅ５０７Ｋ、Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ、Ｅ５０７Ｋ／Ｒ６６０ＶおよびＥ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖ変異をそれぞれ含むＴａｑ  ＤＮＡ重合酵素の製造過程のうち断片ＰＣＲおよびオーバーラップＰＣＲを図式化して示すものである。
【図４】図４は、ゲル抽出のために、制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩで分解した後、ＳＡＰを処理したｐＵＣ１９ベクターと精製した図３のオーバーラップＰＣＲ産物を電気泳動で確認した結果である。
【図５】図５は、口腔上皮細胞を採取してＰＣＲ鋳型を製造する過程を図式化したものである。
【図６ａ−ｄ】図６ａ〜図６ｄは、本発明のＥ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ、Ｅ５０７Ｋ／Ｒ６６０ＶおよびＥ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖ  Ｔａｑ重合酵素を使用して、ｒｓ１４０８７９９に対してＡＳ−ｑＰＣＲを行った結果を示すものであり、対照群としては、Ｅ５０７Ｋ変異を含むＴａｑ重合酵素を使用した。
【図７ａ−ｄ】図７ａ〜図７ｄは、本発明のＥ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ、Ｅ５０７Ｋ／Ｒ６６０ＶおよびＥ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖ変異を有するＴａｑ重合酵素を使用して、ｒｓ１０１５３６２に対してＡＳ−ｑＰＣＲを行った結果を示すものであり、対照群としては、Ｅ５０７Ｋ変異を含むＴａｑ重合酵素を使用した。
【図８ａ−ｄ】図８ａ〜図８ｄは、本発明のＥ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ、Ｅ５０７Ｋ／Ｒ６６０ＶおよびＥ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖ変異を有するＴａｑ重合酵素を使用して、ｒｓ４９１１４１４に対してＡＳ−ｑＰＣＲを行った結果を示すものであり、対照群としては、Ｅ５０７Ｋ変異を含むＴａｑ重合酵素を使用した。
【図９】図９は、Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ５８７Ｉ／Ｒ６６０Ｖ変異を含むＴａｑ  ＤＮＡ重合酵素の製造過程を示すものであり、（ａ）は、断片ＰＣＲおよびオーバーラップＰＣＲを図式化して示すものであり、（ｂ）は、断片ＰＣＲで増幅された産物を電気泳動で確認した結果を示すものである。
【図１０ａ−ｄ】図１０ａ〜図１０ｄは、Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ５８７Ｉ／Ｒ６６０Ｖ重合酵素を使用して、ＫＲＡＳ遺伝子においてＱ６１ＨのＳＮＰを含む鋳型に対してＡＳ−ｑＰＣＲを行った結果を示すものであり、図１０ａと図１０ｂは、長さ２４ｍｅｒのプライマーを使用した結果であり、図１０ｃと図１０ｄは、長さ１８ｍｅｒのプライマーを使用した結果であり、対照群としては、Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖ変異を含むＴａｑ重合酵素を使用した。
【図１１】図１１は、Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ５８７Ｉ／Ｒ６６０Ｖ重合酵素を使用して、ＫＲＡＳ遺伝子でＧ１３ＤのＳＮＰを含む鋳型に対してＡＳ−ｑＰＣＲを行った結果を示すものであり、対照群としては、Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖ変異を含むＴａｑ重合酵素を使用した。
【図１２】図１２は、Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ５８７Ｉ／Ｒ６６０Ｖ重合酵素を使用して、ＫＲＡＳ遺伝子においてＧ１２ＳのＳＮＰを含む鋳型に対してＡＳ−ｑＰＣＲを行った結果を示すものであり、対照群としては、Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖ変異を含むＴａｑ重合酵素を使用した。
【図１３】図１３は、Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ５８７Ｉ／Ｒ６６０Ｖ重合酵素を使用して、ＥＧＦＲ遺伝子においてＬ５８５ＲのＳＮＰを含む鋳型に対してＡＳ−ｑＰＣＲを行った結果を示すものであり、対照群としては、Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖ変異を含むＴａｑ重合酵素を使用した。
【図１４ａ−ｄ】図１４ａ〜図１４ｄは、本発明のＥ５０７Ｋ、Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ、Ｅ５０７Ｋ／Ｒ６６０ＶおよびＥ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖ  Ｔａｑ重合酵素を使用して、反応バッファーのＫＣｌ濃度変化に応じたミスマッチによる増幅遅延効果を確認したグラフである。
【図１５】図１５は、反応バッファーにおいて最適なＫＣｌ濃度を確認するために（ＮＨ４）２ＳＯ４濃度を一定に固定し、ＫＣｌ濃度を多様に変化させて増幅を行った後、ＰＣＲ産物を電気泳動で確認した結果を示すものである。
【図１６】図１６は、反応バッファーにおいて最適な（ＮＨ４）２ＳＯ４濃度を確認するために、ＫＣｌ濃度を一定に固定し、（ＮＨ４）２ＳＯ４濃度を多様に変化させて増幅を行った後、ＰＣＲ産物を電気泳動で確認した結果を示すものである。
【図１７】図１７は、反応バッファーの（ＮＨ４）２ＳＯ４濃度変化に応じたミスマッチによる増幅遅延効果を確認したグラフである。
【図１８ａ−ｂ】図１８ａおよび図１８ｂは、反応バッファーにおいてＫＣｌと（ＮＨ４）２ＳＯ４濃度を一定に固定した後、ＴＭＡＣ濃度変化に応じたミスマッチによる増幅遅延効果を確認したグラフである。
【図１９ａ−ｂ】図１９ａおよび図１９ｂは、反応バッファーにおいてＴＭＡＣと（ＮＨ４）２ＳＯ４濃度を一定に固定した後、ＫＣｌ濃度変化に応じたミスマッチによる増幅遅延効果を確認したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００５４】
上述したように、従来技術に開示された遺伝子変異−特異的増幅方法の短所を改善させるために、遺伝子変異特異性が増加したＤＮＡ重合酵素および前記ＤＮＡ重合酵素が自らの機能を発揮することができるように多様な物質が混合された最適な反応バッファーに対する開発が持続的に要求されており、このような方法の開発は、ＰＣＲによる直接的な遺伝子変異またはＳＮＰ分析の信頼性および強力さに大きい影響を及ぼすだろう。本発明者らは、遺伝子変異−特異的ＰＣＲ増幅の選択性を向上させることができる新規のＤＮＡ重合酵素およびその活性を増加させるための反応バッファーを開発するために努力した結果、Ｔａｑ重合酵素の特定位置のアミノ酸残基に突然変異を誘発する場合、遺伝子変異特異性が顕著に増加し、ＰＣＲバッファー組成物の成分のうちＫＣｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４および／またはＴＭＡＣ（Ｔｅｔｒａ  ｍｅｔｈｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）の濃度を調節する場合、前記遺伝子変異的増幅効率が増加したＤＮＡ重合酵素の活性が増加することを確認し、本発明を完成した。
【００５５】
本発明の遺伝子変異特異性が増加したＤＮＡ重合酵素は、従来のＴａｑ重合酵素と比較してさらに高いミスマッチ対比マッチ伸長選択性を有するので、いかなる基質変形がなくとも信頼性ある遺伝子変異特異的増幅を可能にする。また、本発明は、遺伝子変異特異性が増加したＤＮＡ重合酵素が自らの機能を効果的に発揮できる最適なＰＣＲバッファー組成物を提供し、遺伝子変異特異性が増加したＤＮＡ重合酵素とともに使用して前記ＤＮＡ重合酵素の活性を顕著に向上させることによって、信頼性ある遺伝子変異−特異的増幅を可能にする。かつ、本発明のＰＣＲバッファー組成物および／または遺伝子変異特異性が増加したＤＮＡ重合酵素を含むキットは、遺伝子変異またはＳＮＰを効果的に検出することができるので、疾病の医学的診断および組換えＤＮＡの研究に有用に活用され得る。
【００５６】
以下、本願に使用される用語を説明する。
【００５７】
「アミノ酸」は、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に混入され得る任意の単量体単位を指す。本願に使用されるように、用語「アミノ酸」は、下記２０個の天然または遺伝的にエンコーディングされたアルファ−アミノ酸を含む：アラニン（ＡｌａまたはＡ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、リシン（ＬｙｓまたはＫ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、およびバリン（ＶａｌまたはＶ）。
【００５８】
アミノ酸は、典型的に有機酸であり、これは、置換されるか置換されないアミノ基、置換されるか置換されないカルボキシ基、および一つ以上の側鎖（ｓｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）または基（ｇｒｏｕｐ）、またはこれら基の任意の類似体を含む。例示的な側鎖は、例えば、チオール、セレノ、スルホニル、アルキル、アリール、アシル、ケト、アジド、ヒドロキシル、ヒドラジン、シアノ、ハロ、ヒドラジッド、アルケニル、アルキニル、エーテル、ボレート、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、ヘテロサイクリック、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、またはこれら基の任意の組合せを含む。
【００５９】
他の例示的なアミノ酸は、下記を含むが、これに限定されない：光活性化可能な架橋剤を含むアミノ酸、金属結合アミノ酸、スピン−ラベリングされたアミノ酸、蛍光アミノ酸、金属−含有アミノ酸、新規官能基を有するアミノ酸、他の分子と共有的にまたは非共有的に相互作用するアミノ酸、光ケージ化したおよび／または光異性化可能なアミノ酸、放射性アミノ酸、ビオチンまたはビオチン類似体を含むアミノ酸、グリコシル化アミノ酸、他のカーボハイドレート変形されたアミノ酸、ポリエチレングリコールまたはポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換されたアミノ酸、化学分解性および／または光分解性アミノ酸、炭素−リンクされた糖−含有アミノ酸、酸化還元−活性アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸、および一つ以上の毒性部分を含むアミノ酸。
【００６０】
本発明のＤＮＡ重合酵素において、用語「突然変異体」は、相当する自然発生または変形されないＤＮＡ重合酵素に比べて一つ以上のアミノ酸置換を含む組換えポリペプチドを意味する。
【００６１】
用語「熱安定性重合酵素」（熱に安定した酵素を指す）は、熱抵抗性があり、後続のポリヌクレオチド伸長反応を達成するのに十分な活性を保有し、二本鎖核酸の変性を達成するために要求される時間の間昇温で処理されるとき、非可逆的に変性（不活性化）されない。本願に使用されるように、ＰＣＲのような反応をサイクリングする温度に使用されるのに適している。本願で非可逆性変性は、永久であり、酵素活性の完全な損失を指す。熱安定性重合酵素に対して、酵素活性は、鋳型核酸鎖に対して相補的なポリヌクレオチド伸長生成物を形成するための適切な方式でヌクレオチドの組合せを触媒作用することを指す。好熱性バクテリア由来熱安定性ＤＮＡ重合酵素は、例えば下記を含む：サーモトガ・マリティマ、テルムス・アクウァーティクス、サーマス・サーモフィルス、サーマス・フラブス、サームス・フィリフォルミス、サーマス種Ｓｐｓ１７、サーマス種Ｚ０５、サーマス・カルドフィルス、バチルス・カルドテナクス、サーモトガ・ネアポリタナ、およびサーモシフォ・アフリカヌス由来ＤＮＡ重合酵素。
【００６２】
用語「熱活性」は、ＲＴ−ＰＣＲおよび／またはＰＣＲ反応で逆転写またはアニーリング／伸長段階に通常的に使用される温度（すなわち、４５〜８０℃）で触媒特性を維持する酵素を指す。熱安定性酵素は、核酸変性に要求される上昇された温度で処理されるとき、非可逆的に不活性化したり変性されないものである。熱活性酵素は、熱安定性であってもよく、熱安定性でなくてもよい。熱活性ＤＮＡ重合酵素は、下記を含むが、これに限定されない好熱性種または中温性種から依存的なＤＮＡまたはＲＮＡでありうる。
【００６３】
用語「宿主細胞」は、細胞培養液で培養するとき、高等植物または動物から両方ともの単一細胞性原核生物および真核生物有機体（例えば、バクテリア、酵母、および放線菌）および単一細胞を指す。
【００６４】
用語「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」とは、複製可能であり、遺伝子のような外来ＤＮＡを受容細胞に伝達できるＤＮＡ分子であって、プラスミド、ファージ、人造染色体などがある。本願において「プラスミド」、「ベクター」または「プラスミドベクター」は、同じ意味で使用され得る。
【００６５】
用語「ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は、単鎖（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ）または二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄ）の形態で存在するデオキシリボヌクレオチド（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ；ＤＮＡ）またはリボヌクレオチド（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ；ＲＮＡ）であり、別途特別に言及されていない限り、自然のヌクレオチドの類似体を含むことができる。
【００６６】
用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ重合体、またはその類似体に相当し得る重合体を指す。核酸は、例えば、染色体または染色体分節、ベクター（例えば、発現ベクター）、発現カセット、ネイキッドＤＮＡまたはＲＮＡ重合体、重合酵素鎖反応（ＰＣＲ）の生成物、オリゴヌクレオチド、探針、およびプライマーでありうるか、これを含むことができる。核酸は、例えば、単鎖、二本鎖、または三本鎖でありうるが、任意の特定長さに限定されない。別途言及されない限り、特定の核酸配列は、明示される任意の配列の他にも相補配列を含むか、またはこれをコードする。
【００６７】
用語「プライマー」は、ポリヌクレオチド伸長が開始される条件下に置かれるとき、鋳型−方向に核酸合成の開始点として作用できるポリヌクレオチドを指す。また、プライマーは、ｄｅ  ｎｏｖｏ  ＲＮＡ合成および試験管内転写−関連工程の開始剤として含まれる、多様なその他オリゴヌクレオチド−仲裁合成工程で使用され得る。プライマーは、典型的には、単鎖オリゴヌクレオチド（例えば、オリゴデオキシリボヌクレオチド）である。プライマーの適切な長さは、典型的には、６〜４０個のヌクレオチドの範囲、より典型的には、１５〜３５個のヌクレオチドの範囲で意図される使用によって変わる。短いプライマー分子は、一般的に鋳型と十分に安定したハイブリダイゼーション錯体を形成するために、さらに低温の温度を要求する。プライマーは、鋳型の正確な配列を反映するのに要求されないが、プライマーが伸長するための鋳型とハイブリダイゼーションされるために十分に相補的でなければならない。特定の具現例において、用語「プライマーペア」は、増幅される核酸配列の５’−末端に相補的にハイブリダイゼーションされる５’−センスプライマーを含み、増幅される配列の３’末端にハイブリダイゼーションされる３’−アンチセンスプライマーを含むプライマーのセットを意味する。プライマーは、必要な場合、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学的手段により検出され得る標識を混入することによって標識され得る。例えば、有用な標識は、下記を含む：３２Ｐ、蛍光染料、電子−デンス試薬、酵素（ＥＬＩＳＡ分析で通常的に使用される）、ビオチン、またはハプテンおよび抗血清またはモノクロナール抗体が利用され得るタンパク質。
【００６８】
用語「５’−核酸加水分解酵素（ｎｕｃｌｅａｓｅ）プローブ」は、核酸検出を標的化するために５’−核酸加水分解酵素反応で使用される一つ以上の発光標識部分を含むオリゴヌクレオチドを指す。いくつかの具現例において、例えば、５’−核酸加水分解酵素プローブは、ただ単一発光部分（例えば、蛍光染料など）を含む。特定の具現例において、５’−核酸加水分解酵素プローブは、プローブが選択条件下でヘアピン構造を形成することができるように自己相補的領域を含む。いくつかの具現例において、５’−核酸加水分解酵素プローブは、２個以上の標識部分を含み、２個のうち一つの標識がオリゴヌクレオチドから分離されたり分解された後、放射強度が増加して放出される。特定の具現例において、５’−核酸加水分解酵素プローブは、２個の異なる蛍光染料、例えば５’−末端レポータ染料および３’−末端消光剤染料または部分と標識される。いくつかの具現例において、５’−ヌクレアーゼ探針は、末端の上に加えて、または末端位置以外の一つ以上の位置で標識される。プローブが本来通りである場合、典型的に、レポータ染料から蛍光放出が部分以上消光されるように、２個の蛍光物質の間でエネルギー移動が発生する。重合酵素鎖反応の伸長段階の間、例えば鋳型核酸に結合される５’−核酸加水分解酵素プローブがレポータ染料の蛍光発光がこれ以上消光されないようにする活性を有する、例えば、Ｔａｑ重合酵素または他の重合酵素の５’〜３’−核酸加水分解酵素活性により分解される。いくつかの具現例で、５’−核酸加水分解酵素プローブが二つ以上の異なるレポータ染料および３’−末端消光剤染料または部分と標識され得る。
【００６９】
用語「ＦＲＥＴ」または「蛍光共鳴エネルギー移動」または「フェルスター共鳴エネルギー移動」は、二つ以上の発色団、供与体発色団および受容体発色団（消光剤として称される）の間のエネルギーの移動を指す。供与体は、典型的には、供与体が適合した波長の光が放射されることによって励起されるとき、エネルギーを受容体に移動させる。受容体は、典型的には、異なる波長で放射される光の形態に移動したエネルギーを再放射する。受容体が「癌」消光剤である場合、これは、光以外の形態に移動したエネルギーを分散させる。特定の蛍光物質が供与体または受容体として作用するか否かは、ＦＲＥＴペアの他のメンバーの特性に依存的である。通常的に使用される供与体−受容体ペアは、ＦＡＭ−ＴＡＭＲＡペアを含む。通常的に使用される消光剤は、ＤＡＢＣＹＬおよびＴＡＭＲＡである。通常的に使用される癌消光剤は、下記を含む：ＢｌａｃｋＨｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（ＢＨＱ）、（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｏｖａｔｏ，Ｃａｌ．）、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈ．，Ｉｎｃ．，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ）、およびＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  ６５０（ＢＢＱ−６５０）（Ｂｅｒｒｙ  ＆  Ａｓｓｏｃ．，Ｄｅｘｔｅｒ，Ｍｉｃｈ．）。
【００７０】
核酸塩基、ヌクレオシドトリホスフェート、またはヌクレオチドを指すとき、用語「通常的な」または「天然」は、記述されるポリヌクレオチドで天然発生するものを指す（すなわち、ＤＮＡに対してこれらは、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰである）。また、ｄＩＴＰ、および７−デアザ−ｄＧＴＰは、ｄＧＴＰの代わりに頻繁に利用され、配列化のような試験管内ＤＮＡ合成反応でｄＡＴＰの代わりに利用され得る。
【００７１】
核酸塩基、ヌクレオシド、またはヌクレオチドを指すとき、用語「通常的でない」または「変形された」は、特定のポリヌクレオチドで天然的に発生する通常的な塩基、ヌクレオシド、またはヌクレオチドの変形、誘導体または類似体を含む。特定の通常的でないヌクレオチドは、通常的なｄＮＴＰと比較してリボース糖の２’位置で変形される。したがって、ＲＮＡに対して自然発生ヌクレオチドがリボヌクレオチド（すなわち、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、集合的ｒＮＴＰ）であるとしても、ヌクレオチドが糖の２’位置でヒドロキシル基を有するので、これは、比較してｄＮＴＰが不在であり、本願に使用されるように、リボヌクレオチドは、ＤＮＡ重合酵素に対する基質として通常的でないヌクレオチドである。本願に使用されるように、通常的でないヌクレオチドは、核酸配列化に対する終結子として使用される化合物を含むが、これに限定されない。例示的な終結子化合物は、２’，３’−ジデオキシ構造を有する化合物を含むが、これに限定されず、これは、ジデオキシヌクレオシドトリホスフェートとして称される。ジデオキシヌクレオシドトリホスフェートｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰおよびｄｄＧＴＰは、ｄｄＮＴＰとして集合的に称される。終結子化合物の更なる例は、リボヌクレオチドの２’−ＰＯ４類似体を含む。他の通常的でないヌクレオチドは、ホスホロチオエートｄＮＴＰ（［［α］−Ｓ］ｄＮＴＰ）、５’−［α］−ボラノ−ｄＮＴＰ、［α］−メチル−ホスホネートｄＮＴＰ、およびリボヌクレオシドトリホスフェート（ｒＮＴＰ）を含む。通常的でない塩基は、放射性同位元素、例えば３２Ｐ、３３Ｐ、または３５Ｓ；蛍光標識；化学発光の標識；生物発光の標識；ハプテン標識、例えばビオチン；または酵素標識、例えばストレプトアビジンまたはアビジンで標識され得る。蛍光標識は、陰性で荷電された染料、例えばフルオセインファミリーの染料、または中性で荷電された染料、例えばローダミンファミリーの染料、または陽性で荷電された染料、例えばシアニンファミリーの染料を含むことができる。フルオセインファミリーの染料は、例えば、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＮＡＮおよびＺＯＥを含む。ローダミンファミリーの染料は、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ＲＯＸ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ、およびＴＡＭＲＡを含む。ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＮＡＮ、ＺＯＥ、ＲＯＸ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ、Ｔｅｘａｓ  ＲｅｄおよびＴＡＭＲＡでラベリングされた多様な染料またはヌクレオチドは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）により市販される。シアニンファミリーの染料は、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、およびＣｙ７を含み、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｌａｃｅ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）により市販される。
【００７２】
用語「ミスマッチ区別」は、核酸に対して一つ以上のヌクレオチドを付着することによって（例えば、共有的に）、鋳型−依存的方式に、核酸（例えば、プライマーまたは他のオリゴヌクレオチド）を延長するとき、ミスマッチ−含有配列から完全に相補的な配列を区別するための、生体触媒（例えば、酵素、例えば重合酵素、リガーゼなど）の能力を指す。用語「ミスマッチ区別」は、延長される核酸（例えば、プライマーまたは他のオリゴヌクレオチド）が核酸がハイブリダイゼーションされる鋳型に比べて３’−末端核酸でミスマッチを有する、ミスマッチ−含有（略相補的）配列から完全に相補的な配列を区別するための生体触媒の能力を指す。いくつかの具現例において、延長される核酸は、完全に相補的な配列に対して３’−末端でミスマッチを含む。いくつかの具現例において、延長される核酸は、完全に相補的な配列に対して末端から２番目（Ｎ−１）３’−位置および／またはＮ−２位置でミスマッチを含む。
【００７３】
別途定義されない限り、本願に使用されるすべての技術的および科学的用語は、当業者により通常的に理解されるところと同じ意味を有する。
【００７４】
本発明は、配列番号１のアミノ酸配列からなるＴａｑ重合酵素を有するＤＮＡ重合酵素であって、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列で５０７番目アミノ酸残基の置換；および
（ｂ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列で５３６番目アミノ酸残基の置換、
（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列で６６０番目アミノ酸残基の置換、
（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列で５３６番目および６６０番目アミノ酸残基の置換、または
（ｉｖ）配列番号１のアミノ酸配列で５３６番目、５８７番目および６６０番目アミノ酸残基の置換；を含むＤＮＡ重合酵素に関するものである。
【００７５】
前記「Ｔａｑ重合酵素」は、高温性細菌であるテルムス・アクウァーティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）の名前を取って命名された耐熱性ＤＮＡ重合酵素であって、前記細菌から最初に分離された。テルムス・アクウァーティクスは、温泉および熱水噴出孔に棲息する細菌であって、Ｔａｑ重合酵素は、ＰＣＲ過程で要求されるタンパク質変性条件（高温）に耐えることができる酵素であることが確認された。Ｔａｑ重合酵素の最適活性温度は、７５〜８０℃であり、９２．５℃で２時間以上、９５℃で４０分、９７．５℃で９分の半減期を有し、７２℃で１０秒以内に１０００個の塩基対ＤＮＡを複製することができる。これは、３’→５’核酸末端加水分解酵素（ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）校正活性が欠如しており、９，０００個のヌクレオチドのうち約１個でエラー率が測定される。例えば耐熱性Ｔａｑを使用すると、高温（６０℃以上）でＰＣＲを実行することができる。Ｔａｑ重合酵素に対して配列番号１に示したアミノ酸配列が基準配列として使用される。
【００７６】
本発明の好ましい一実施例によれば、前記５０７番目アミノ酸残基の置換は、グルタミン酸（Ｅ）からリシン（Ｋ）に置換されるものであり、前記５３６番目アミノ酸残基の置換は、アルギニン（Ｒ）からリシン（Ｋ）に置換されるものであり、前記５８７番目アミノ酸残基の置換は、アルギニン（Ｒ）からイソロイシン（Ｉ）に置換されるものであり、前記６６０番目アミノ酸残基の置換は、アルギニン（Ｒ）からバリン（Ｖ）に置換されることもできる。
【００７７】
本発明において、配列番号１のアミノ酸配列で５０７番目アミノ酸残基がグルタミン酸（Ｅ）からリシン（Ｋ）に置換されたＴａｑ重合酵素は、「Ｅ５０７Ｋ」（配列番号２）と命名し；配列番号１のアミノ酸配列で５０７番目アミノ酸残基がグルタミン酸（Ｅ）からリシン（Ｋ）に置換され、５３６番目アミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）からリシン（Ｋ）に置換されたＴａｑ重合酵素は、「Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ」（配列番号６）と命名し；配列番号１のアミノ酸配列で５０７番目アミノ酸残基がグルタミン酸（Ｅ）からリシン（Ｋ）に置換され、６６０番目アミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）からバリン（Ｖ）に置換されたＴａｑ重合酵素は、「Ｅ５０７Ｋ／Ｒ６６０Ｖ」（配列番号７）と命名し；配列番号１のアミノ酸配列で５０７番目アミノ酸残基がグルタミン酸（Ｅ）からリシン（Ｋ）に置換され、５３６番目アミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）からリシン（Ｋ）に置換され、６６０番目アミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）からバリン（Ｖ）に置換されたＴａｑ重合酵素は、「Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖ」（配列番号８）と命名し；最後に配列番号１のアミノ酸配列で５０７番目アミノ酸残基がグルタミン酸（Ｅ）からリシン（Ｋ）に置換され、５３６番目アミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）からリシン（Ｋ）に置換され、５８７番目アミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）からイソロイシン（Ｉ）に置換され、６６０番目アミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）からバリン（Ｖ）に置換されたＴａｑ重合酵素は、「Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ５８７Ｉ／Ｒ６６０Ｖ」（配列番号３７）と命名した。
【００７８】
本発明の好ましい一実施例によれば、前記ＤＮＡ重合酵素は、マッチしたプライマーとミスマッチしたプライマーを区別し、前記マッチしたプライマーとミスマッチしたプライマーは、標的配列とハイブリダイゼーションされ、前記ミスマッチしたプライマーは、ハイブリダイゼーションされる標的配列に対してその３’末端に非標準ヌクレオチドを含むことができる。
【００７９】
前記ミスマッチしたプライマーは、標的配列とハイブリダイゼーションされるように十分に相補的であることが求められるが、標的配列の正確な配列を反映しない混成オリゴヌクレオチドである。
【００８０】
前記「標準ヌクレオチド（ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」または「相補的ヌクレオチド」は、標準ワトソン−クリック塩基対、Ａ−Ｕ、Ａ−ＴおよびＧ−Ｃを意味する。
【００８１】
前記「非標準ヌクレオチド（ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」または「非相補的ヌクレオチド」は、ワトソン−クリック塩基対の他にＡ−Ｃ、Ａ−Ｇ、Ｇ−Ｕ、Ｇ−Ｔ、Ｔ−Ｃ、Ｔ−Ｕ、Ａ−Ａ、Ｇ−Ｇ、Ｔ−Ｔ、Ｕ−Ｕ、Ｃ−Ｃ、Ｃ−Ｕを意味する。
【００８２】
本発明の好ましい一実施例によれば、前記ＤＮＡ重合酵素は、マッチしたプライマーを含む標的配列の増幅がミスマッチしたプライマーを含む標的配列の増幅より低いＣｔ値を示すことができる。
【００８３】
例えば、ＤＮＡ重合酵素は、プライマーに一つ以上のヌクレオチドを共有的に結合させることによって標的配列依存的な方式にミスマッチしたプライマーより大きい効率性でマッチしたプライマーを伸長することができる。ここで、さらに大きい効率性は、例えばＲＴ−ＰＣＲでミスマッチしたプライマーよりマッチしたプライマーに対して低いＣｔ値が観察され得る。マッチしたプライマーとミスマッチしたプライマーのＣｔ値の差異は、１０以上、好ましくは１０〜２０であるか、ミスマッチしたプライマーによるアンプリコンの合成がないことがある。
【００８４】
例えば一番目の反応でマッチした正方向プライマーと逆方向プライマー、同じ実験セッティングで二番目の反応でミスマッチした正方向プライマーとマッチした逆方向プライマーを使用して標準ＰＣＲで形成された生成物が二番目の反応より一番目の反応に対してさらに大きいことを意味する。
【００８５】
Ｃｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｒｏｓｓｉｎｇ  ｃｙｃｌｅ）値は、ログ目盛上、サイクル数に対する蛍光をプロットすることに依存する定量的ＰＣＲでＤＮＡ定量化方法を示す。ＤＮＡ基盤蛍光検出に対する限界値は、少なくともバックグラウンドより若干高く設定される。蛍光が限界値を超過するサイクル数をＣｔまたはＭＩＱＥガイドラインによってＣｑ（ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｃｙｃｌｅ）という。与えられた反応に対するＣｔ値は、蛍光放出が固定された限界値を交差するサイクル数で定義される。例えば、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉおよび蛍光プローブは、鋳型ＤＮＡ定量化に対するリアルタイムＰＣＲに使用され得る。サンプルからの蛍光は、ＰＣＲの間に毎サイクルごとに収集され、サイクル数に対してプロットされる。出発鋳型濃度は、蛍光信号が最初に現れる時間に反比例する。信号は、鋳型の濃度が高いほどさらに早く現れる（低いサイクル数で現れる）。
【００８６】
また、本発明は、前述したＤＮＡ重合酵素をコードする核酸配列および前記核酸配列を含むベクターおよび宿主細胞に関するものである。本発明のＤＮＡ重合酵素をコードする核酸を利用して多様なベクターが製造され得る。宿主細胞と互換される種に由来するレプリコンおよび制御配列を含む任意のベクターが使用され得る。本発明のベクターは、発現ベクターであってもよく、本発明のＤＮＡ重合酵素をコードする核酸配列に作動可能に連結される転写および翻訳を調節する核酸領域を含む。調節配列は、特定の宿主有機体で作動可能に連結されるコード配列の発現に要求されるＤＮＡ配列をいう。例えば、原核生物に適合した制御配列は、プロモーター、任意の作動配列およびリボソーム結合部位を含む。また、ベクターは、転写されるｍＲＮＡの半減期を増強させるために、「Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｒｅｔｒｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｅｌｅｍｅｎｔ（ＰＲＥ）」を含むことができる。転写および翻訳調節核酸領域は、一般的に重合酵素を発現するために使用される宿主細胞に対して適切である。多様な類型の適切な発現ベクター、および適合した調節配列は、多様な宿主細胞に対して当業界に公知されている。一般的に、転写および翻訳調節配列は、例えば、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および終結配列、翻訳開始および終結配列、およびエンハンサーまたは活性化配列を含むことができる。典型的な具現例で、調節配列は、プロモーターおよび転写開始および終結配列を含む。ベクターも、典型的には、外来ＤＮＡの挿入のための数個の制限部位を含有するポリリンカー領域を含む。特定の具現例において、「融合フラッグ」は、精製を促進するために使用され、必要に応じて、タグ／フラッグが後続除去される（例えば、「Ｈｉｓ−Ｔａｇ」）。しかしながら、「加熱−段階」が使用される中温性宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）から熱活性および／または熱安定性タンパク質を精製するとき、これらは、一般的に不要である。ＤＮＡコーディング複製配列、調節配列、表現型選択遺伝子を含有する適合したベクターの構築、および関心突然変異体重合酵素が標準組換えＤＮＡ技術を使用して製造される。単離されたプラスミド、ウイルスベクター、およびＤＮＡ断片が分解され切断されて、当業界に公知されているように所望のベクターを生成するために特定の順序で共にライゲーションされる。
【００８７】
本発明の好ましい一実施例において、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択のために選択可能なマーカー遺伝子を含有する。選択遺伝子は、当業界に公知されており、使用される宿主細胞に対して多様である。適合した選択遺伝子は、アンピシリンおよび／またはテトラサイクリン抵抗性に対する遺伝子コーディングを含むことができ、これは、これらの抗生剤の存在下にこれらのベクターを培養する細胞を形質転換させることができる。
【００８８】
本発明の好ましい一実施例において、本発明のＤＮＡ重合酵素をコードする核酸配列は、細胞に単独でまたはベクターと組合わせられて導入される。導入またはその等価的な表現は、核酸が後続統合、増幅および／または発現に適合した方式に細胞に入ることを意味する。導入方法は、例えばＣａＰＯ４沈殿、リポソーム融合、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ、電気泳動、ウイルス感染などを含む。
【００８９】
原核生物は、本発明の初期クローニング段階に対して宿主細胞として使用される。多量のＤＮＡを速かに製造するために、部位−指向突然変異の生成に使用される単鎖ＤＮＡ鋳型を製造するために、多くの突然変異体を同時にスクリーニングするために、生成される突然変異体のＤＮＡ配列化のために、これらが特に有用である。適合したウォン核細胞の宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２菌株９４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３１，４４６）、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２７，３２５）、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２菌株ＤＧ１１６（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．５３，６０６）、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３１，５３７）、およびＥ．ｃｏｌｉ  Ｂ；Ｅ．ｃｏｌｉの多くの他の菌株、例えばＨＢ１０１、ＪＭ１０１、ＮＭ５２２、ＮＭ５３８、ＮＭ５３９、およびその他他の種を含み、バチリ、例えばバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、他のエンテロバクテリアセアエ、例えばサルモネラチフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）またはセラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓａｎｓ）、および多様なシュドモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）を含む原核生物属がホストとして使用され得る。典型的にＥ．ｃｏｌｉの形質転換に使用されるプラスミドは、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣＩ８、ｐＵＣＩ９、ｐＵＣＩｌ８、ｐＵＣ１１９およびＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  Ｍ１３を含む。しかしながら、多くの他の適合したベクターがまた利用され得る。
【００９０】
また、本発明は、前記宿主細胞を培養する段階；および培養物およびその培養上澄み液からＤＮＡ重合酵素を分離する段階；を含むＤＮＡ重合酵素の製造方法を提供する。
【００９１】
本発明のＤＮＡ重合酵素は、ＤＮＡ重合酵素の発現を誘導したり引き起こす適切な条件下で、ＤＮＡ重合酵素をコードする核酸配列を含有する発現ベクターで形質転換される宿主細胞を培養することによって製造される。タンパク質発現に適合した条件下で形質転換された宿主細胞を培養する方法は、当業界に公知されている。ラムダｐＬプロモーター−含有プラスミドベクターから重合酵素の製造に適合した宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＤＧ１１６（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．５３６０６）を含む。発現によって、重合酵素は、収穫され分離され得る。
【００９２】
一旦精製されれば、本発明のＤＮＡ重合酵素のミスマッチ区別が検定され得る。例えば、ミスマッチ区別活性は、プライマーの３−末端で単一塩基ミスマッチを有する標的の増幅に対してプライマーで完全にマッチする標的配列の増幅を比較することによって測定される。増幅は、例えば、ＴａｑＭａｎＴＭプローブの使用によってリアルタイム検出され得る。２個の標的配列の間を区分するための重合酵素の能力は、２個の反応のＣｔを比較することによって推定され得る。
【００９３】
したがって、本発明は、本発明によるＤＮＡ重合酵素を
ａ）一つ以上の鋳型；
ｂ）ヌクレオシドトリホスフェート；および
ｃ）一つ以上のマッチしたプライマー、一つ以上のミスマッチしたプライマーまたは一つ以上のマッチしたプライマーと一つ以上のミスマッチしたプライマーの両方ともと接触させることを含み、前記一つ以上のマッチしたプライマーおよびミスマッチしたプライマーは、標的配列とハイブリダイゼーションされ、前記ミスマッチしたプライマーは、ハイブリダイゼーションされる標的配列に対してその３’末端から７個までの塩基位置に非標準（ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ）ヌクレオチドを含む、一つ以上の鋳型で一つ以上の遺伝子変異またはＳＮＰを生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で検出する方法を提供する。
【００９４】
前記「ＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）」は、ＤＮＡ塩基配列で一つの塩基配列（Ａ、Ｔ，ＧまたはＣ）の差異を示す遺伝的変化または変異をいう。
【００９５】
本発明の生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）遺伝子変異またはＳＮＰ検出方法において、標的配列は、テストサンプルに存在することができ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくは遺伝体ＤＮＡを含む。テストサンプルは、バクテリア、バクテリア培養物または細胞培養物から製造された細胞溶解物でありうる。また、テストサンプルは、動物、好ましくは脊椎動物、より好ましくはヒト対象体に含まれたものでありうる。標的配列は、遺伝体ＤＮＡ、好ましく個体の遺伝体ＤＮＡ、より好ましくはバクテリアまたは脊椎動物、最も好ましくはヒト対象体の遺伝体ＤＮＡに含まれたものでありうる。
【００９６】
本発明のＳＮＰ検出方法は、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉのような二本鎖特異的染料を利用して溶融温度分析を含むことができる。
【００９７】
溶融温度曲線分析は、オンボードソフトウェア（ＳＤＳ  ２．１）を含むＡＢＩ  ５７００／７０００（９６ウェルフォーマット）またはＡＢＩ  ７９００（３８４ウェルフォーマット）装置のようなリアルタイムＰＣＲ装置で行われ得る。代案的には、溶融温度曲線分析は、終結点分析として行われ得る。
【００９８】
「二本鎖ＤＮＡに結合する染料」または「二本鎖特異的染料」は、結合されない状態より二本鎖ＤＮＡに結合したとき、高い蛍光を有する場合に使用され得る。このような染料の例としては、ＳＯＹＴＯ−９、ＳＯＹＴＯ−１３、ＳＯＹＴＯ−１６、ＳＯＹＴＯ−６０、ＳＯＹＴＯ−６４、ＳＹＴＯ−８２、臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）、ＳＹＴＯＸ  Ｏｒａｎｇｅ、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、ＴＯ−ＰＲＯ−３またはＥｖａＧｒｅｅｎがある。ＥｔＢｒおよびＥｖａＧｒｅｅｎ（Ｑｕｉａｇｅｎ）を除いたこれらの染料は、リアルタイム応用に試験されてきた。
【００９９】
本発明の生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）遺伝子変異またはＳＮＰ検出方法は、リアルタイムＰＣＲ、標準ＰＣＲ後のアガロースゲルでの分析、リアルタイムＰＣＲを通した遺伝子変異特異的増幅または対立遺伝子−特異的増幅、テトラ−プライマー増幅−不応性突然変異システムＰＣＲまたは等温増幅により行われ得るが、これに制限されない。
【０１００】
例えば、本発明のＳＮＰ検出方法は、シーケンシング、ミニ−シーケンシング、対立遺伝子特異的ＰＣＲ（ａｌｌｅｌｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ）、ダイナミック対立遺伝子ハイブリダイゼーション（ｄｙｎａｍｉｃ  ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；ＤＡＳＨ）、ＰＣＲ延長分析（例えば、単一塩基延長（ｓｉｎｇｌｅ  ｂａｓｅ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ；ＳＢＥ）、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ分析またはＴａｑＭａｎ技法、ＳＮＰｌｅｘプラットホーム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、質量分析法（例で、ＳｅｑｕｅｎｏｍのＭａｓｓＡＲＲＡＹシステム）、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘシステム（ＢｉｏＲａｄ）等を利用して行われ得る。
【０１０１】
前記「標準ＰＣＲ」は、通常的な技術者に知られたＤＮＡまたはｃＤＮＡの単一または数個の複製を増幅させる技術である。ほぼ多くのＰＣＲは、Ｔａｑ重合酵素またはＫｌｅｎ  Ｔａｑのような熱安定性ＤＮＡ重合酵素を使用する。ＤＮＡ重合酵素は、鋳型として一本鎖ＤＮＡを使用し、オリゴヌクレオチド（プライマー）を使用することによって、ヌクレオチドから新しいＤＮＡ鎖を酵素的に組み立てる。ＰＣＲにより生成されたアンプリコンは、例えば、アガロースゲルで分析され得る。
【０１０２】
前記「リアルタイムＰＣＲ」は、ＰＣＲをするとき、リアルタイムでその過程をモニターすることができる。したがって、データは、ＰＣＲが終了する時点でなく、ＰＣＲ過程全般にわたって収集される。リアルタイムＰＣＲで、反応は、固定されたサイクル数の後に蓄積された標的量よりは、増幅が初めて検出されるときのサイクル中の時点を特徴とする。主に染料基盤検出およびプローブ基盤検出の二つの方法が定量的ＰＣＲを行うのに使用される。
【０１０３】
前記「対立遺伝子−特異的増幅（Ａｌｌｅｌｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＡＳＡ）」は、ＰＣＲプライマーを単一ヌクレオチド残基が異なる鋳型を区別することができるように考案された増幅技術である。
【０１０４】
前記「リアルタイムＰＣＲを通した対立遺伝子−特異的増幅または遺伝子変異特異的増幅」は、非常に効率的な方法で遺伝子変異またはＳＮＰを検出する。遺伝子変異またはＳＮＰを検出するための他の多くの方法とは異なって、標的遺伝子物質の予備増幅が必要でない。ＡＳＡは、マッチおよびミスマッチしたプライマー／標的配列複合体の区別を基に単一反応で増幅および検出を結合する。反応中に増幅されたＤＮＡの増加は、二本鎖ＤＮＡに結合することによって発光するＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉのような染料により引き起こされる蛍光信号の増加でリアルタイムモニターされ得る。リアルタイムＰＣＲを通した対立遺伝子−特異的増幅または遺伝子変異特異的増幅は、ミスマッチした場合に対する蛍光信号の遅延または不在が現れる。遺伝子変異またはＳＮＰ検出において、これは、遺伝子変異またはＳＮＰ存在有無に対する情報を提供する。
【０１０５】
前記「テトラ−プライマー増幅−不応性突然変異システムＰＣＲ」は、単一チューブＰＣＲ反応において対照断片と共に野生型および突然変異対立遺伝子を全部増幅する。非対立遺伝子特異的対照アンプリコンは、突然変異領域の側面の２個の共通の（外側）プライマーにより増幅される。２個の対立遺伝子特異的（内側）プライマーは、共通プライマーと反対方向に設計され、共通プライマーとともに野生型および突然変異アンプリコン両方ともを同時に増幅させることができる。結果的に、２個の対立遺伝子−特異的アンプリコンは、突然変異が共通（外側）プライマーに対して非対称に位置するので、異なる長さを有し、標準ゲル電気泳動で容易に分離することができる。前記対照アンプリコンは、増幅失敗だけでなく、偽陰性に対する内部対照を提供し、２個の対立遺伝子−特異的アンプリコンのうち少なくとも一つは、テトラ−プライマー増幅−不応性突然変異システムＰＣＲに常に存在する。
【０１０６】
前記「等温増幅」は、サーモサイクラーに依存せず、好ましくは、増幅する間に温度が変化する必要なしに核酸の増幅がさらに低い温度で行われることを意味する。等温増幅で使用される温度は、室温（２２〜２４℃）〜約６５℃の間、または約６０〜６５℃、４５〜５０℃、３７〜４２℃または２２〜２４℃の常温でありうる。等温増幅結果の生成物は、ゲル電気泳動、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＯＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｏｌｉｇｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）、リアルタイムＰＣＲ、ＥＣＬ（改善された化学発光）、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびタンパク質または濁度を分析するチップ基盤の毛細管電気泳動機器であるｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒにて検出され得る。
【０１０７】
本発明の一実施例では、Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ、Ｅ５０７Ｋ／Ｒ６６０Ｖ、またはＥ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖ  Ｔａｑ重合酵素を使用してＳＮＰ（ｒｓ１４０８７９９、ｒｓ１０１５３６２および／またはｒｓ４９１１４１４）を含む鋳型に対してミスマッチしたプライマーを延長するための能力が減少したか否かを確認した。
【０１０８】
その結果、図６〜図８に示されたように、Ｅ５０７Ｋ  Ｔａｑ重合酵素に比べてＥ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ、Ｅ５０７Ｋ／Ｒ６６０Ｖ、またはＥ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖ  Ｔａｑ重合酵素の場合、ミスマッチしたプライマーによる増幅が遅延されることを確認でき、その効果は、Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖ  Ｔａｑ重合酵素で最も顕著に現れた。
【０１０９】
これを通じて、前記３種のＤＮＡ重合酵素は、従来のＴａｑ重合酵素（Ｅ５０７Ｋ）と比較してさらに高いミスマッチ伸長選択性を有することを確認した。したがって、本発明のＤＮＡ重合酵素は、疾病の医学的診断および組換えＤＮＡの研究に有用に活用され得ると予想される。
【０１１０】
本発明の他の一実施例では、Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ／Ｒ６６０Ｖ  Ｔａｑ重合酵素を使用して、ＫＲＡＳ遺伝子においてＱ６１Ｈ、Ｇ１３ＤまたはＧ１２ＳのＳＮＰを含む鋳型、そしてＥＧＦＲ遺伝子においてＬ８５８ＲのＳＮＰを含む鋳型に対してミスマッチしたプライマーを延長するための能力が減少したか否かを確認した。
【０１１１】
その結果、図１０ａ〜図１０ｄ、図１１、図１２および図１３に示されたように、Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ５８７Ｉ／Ｒ６６０Ｖ変異を含むＴａｑ  ＤＮＡ重合酵素は、Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖ変異を含むＴａｑ重合酵素に比べて優れたミスマッチ伸長選択性を有することを確認した。したがって、本発明のＥ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ５８７Ｉ／Ｒ６６０Ｖ変異を含むＴａｑ  ＤＮＡ重合酵素も、疾病の医学的診断および組換えＤＮＡの研究に有用に活用され得ると予想される。
【０１１２】
また、本発明は、本発明によるＤＮＡ重合酵素を含む遺伝子変異またはＳＮＰ検出用組成物およびこれを含むＰＣＲキットに関するものである。
【０１１３】
本発明の好ましい一実施例によれば、前記ＰＣＲキットは、一般ＰＣＲ（１世代ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ（２世代ＰＣＲ）、デジタルＰＣＲ（３世代ＰＣＲ）またはマスアレイ（ＭａｓｓＡＲＲＡＹ）に適用して使用することができる。
【０１１４】
本発明のＰＣＲキットにおいて、前記デジタルＰＣＲは、キャストＰＣＲ（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ）またはドロプレットデジタルＰＣＲ（Ｄｒｏｐｌｅｔ  ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ；ｄｄＰＣＲ）であり得、より具体的に、対立遺伝子特異的キャストＰＣＲまたは対立遺伝子特異的ドロプレットデジタルＰＣＲでありうるが、これに限定されない。
【０１１５】
前記「キャストＰＣＲ」は、多量の正常な野生型ｇＤＮＡを含有するサンプルで希な突然変異を検出し数量化する方法であって、野生型対立遺伝子からの非特異的増幅を抑制するために対立遺伝子−特異的ＴａｑＭａｎ（登録商標）ｑＰＣＲを対立遺伝子−特異的ＭＧＢ遮断剤と組み合わせて伝統的な対立遺伝子−特異的ＰＣＲより優れた特異性を生成することができる。
【０１１６】
前記「ドロプレットデジタルＰＣＲ」は、２０μｌのＰＣＲ反応を２万個のドロプレットに分けて増幅させた後、標的ＤＮＡを計数するシステムであって、ドロプレットでの標的ＤＮＡの増幅の有無により陽性ドロプレット（１）と陰性ドロプレット（０）でデジタル信号のように受け入れて計数し、ポアソン分布を通じて標的ＤＮＡのコピー数を計算して最終的にサンプルμｌ当たりコピー数で結果値を確認することができ、希な突然変異検出、極少量の遺伝子増幅、突然変異類型を同時に確認しようとする場合などに使用され得る。
【０１１７】
前記「マスアレイ」は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）を利用して遺伝型質分析（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）等多様な遺伝体研究に適用可能なマルチプレキシング分析方法であって、少ない費用で多数のサンプルとターゲットを早く分析しようとする場合、または特定の標的のみに対してマスカスタイズ型（ｃｕｓｔｏｍｉｚｅｄ）分析をしようとする場合などに使用され得る。
【０１１８】
本発明のＰＣＲキットは、通常的な技術者にプライマー伸長過程に使用されることを認知される任意の試薬または他の要素を含むことができる。
【０１１９】
本発明の好ましい一実施例によれば、前記ＰＣＲキットは、一つ以上のマッチしたプライマー、一つ以上のミスマッチしたプライマーまたは一つ以上のマッチしたプライマーと一つ以上のミスマッチしたプライマーの両方ともをさらに含み、前記一つ以上のマッチしたプライマーおよび一つ以上のミスマッチしたプライマーは、標的配列とハイブリダイゼーションされ、前記ミスマッチしたプライマーは、ハイブリダイゼーションされる標的配列に対しその３’末端から７個までの塩基位置に非標準（ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ）ヌクレオチドを含むことができる。
【０１２０】
本発明のＰＣＲキットは、ヌクレオシドトリホスフェートをさらに含むことができる。
【０１２１】
また、本発明のＰＣＲキットは、ａ）一つ以上のバッファー；ｂ）二本鎖ＤＮＡに結合する定量化のための試薬；ｃ）重合酵素遮断抗体；ｄ）一つ以上の対照値または対照配列；およびｅ）一つ以上の鋳型；をさらに含むことができる。
【０１２２】
また、本発明は、２５〜１００ｍＭのＫＣｌ；および１〜１５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４；を含み、最終ｐＨが８．０〜９．０である、遺伝子変異特異性が増加したＤＮＡ重合酵素の活性増加用ＰＣＲバッファー組成物に関するものである。
【０１２３】
ＰＣＲに使用される重合酵素は、自らの機能を発揮するために多様な物質が混合された最適な反応バッファーを使用しなければならない。反応バッファーには、一般的にｐＨ安定化のための要素、補助因子（ｃｏｆａｃｔｏｒ）としての金属イオン、重合酵素の変性を防ぐための安定化要素が含まれている。
【０１２４】
前記ＫＣｌは、酵素安定化に必要な要素としてプライマーが標的ＤＮＡに結合（ｐａｉｒｉｎｇ）することを助ける役割をする。本発明では、ミスマッチによる増幅を最大で遅延させながら、マッチによる増幅効率が減少しない状態の高いカチオン濃度を確認するために、反応バッファー内ＫＣｌの濃度を調節して最適な濃度を導き出した。
【０１２５】
Ｅ５０７Ｋ、Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ、Ｅ５０７Ｋ／Ｒ６６０ＶおよびＥ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖ  Ｔａｑ重合酵素をそれぞれ使用して反応バッファーのＫＣｌ濃度変化に応じたミスマッチによる増幅遅延効果を確認した結果、図１４ａ〜図１４ｄに示されたように、Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖ  Ｔａｑ重合酵素は、反応バッファーにＫＣｌが含まれていなくても、ミスマッチによる増幅遅延効果に優れ、Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６ＫとＥ５０７Ｋ／Ｒ６６０Ｖの場合には、５０ｍＭ、対照群であるＥ５０７Ｋの場合には、１００ｍＭでミスマッチによる増幅遅延効果に優れていた。結果的に、ＫＣｌ濃度限界値は、Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖ  Ｔａｑ重合酵素が最も低く、Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６ＫとＥ５０７Ｋ／Ｒ６６０Ｖの場合には、Ｅ５０７Ｋより低いことを確認することができた。
【０１２６】
さらに、適正なＫＣｌ濃度を導き出すために、Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖ  Ｔａｑ重合酵素を使用し、反応バッファーにおいて（ＮＨ４）２ＳＯ４の濃度を一定に固定した状態でＫＣｌの濃度を多様に変化させて増幅を行った。増幅産物を電気泳動で確認した結果、図１５に示されたように、適正なＫＣｌ濃度は、７５ｍＭであることを確認することができた。
【０１２７】
したがって、本発明のＰＣＲバッファー組成物のＫＣｌ濃度は、２５〜１００ｍＭ、好ましくは６０〜９０ｍＭ、より好ましくは７０〜８０ｍＭであってもよく、最も好ましくは７５ｍＭであってもよい。
【０１２８】
ＫＣｌが２５ｍＭ未満で含まれる場合、一般的な標的増幅には影響がないが、マッチしたプライマーによる増幅とミスマッチしたプライマーによる増幅の差異が減少し得、１００ｍＭを超過して含まれる場合、一般的な標的増幅の効率が低くなる問題が発生し得る。
【０１２９】
ＰＣＲバッファー組成物において、前記（ＮＨ４）２ＳＯ４は、酵素活性に必要な補助因子としてＴｒｉｓとともに重合酵素の活性を高めるために使用される。本発明の一実施例では、前記で導き出された結果を基に、反応バッファー内ＫＣｌの濃度を７５ｍＭに一定に固定し、（ＮＨ４）２ＳＯ４の濃度を２．５ｍＭ〜２５ｍＭに多様に変化させることによって適正な（ＮＨ４）２ＳＯ４の濃度を確認した。
【０１３０】
その結果、図１６に示されたように、２．５〜１５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の濃度で増幅産物が確認され、適正な（ＮＨ４）２ＳＯ４の濃度は、５ｍＭであることを確認することができた。
【０１３１】
さらに、（ＮＨ４）２ＳＯ４の５ｍＭの濃度付近（それぞれ２．５ｍＭ、５ｍＭおよび１０ｍＭ）ＡＳ−ｑＰＣＲを行った結果、図１７に示されたように、１０ｍＭでＣｔ値の差異が最も大きかったが、マッチによる増幅でＣｔが多少遅延され、ピークが横になる現象が現れることを確認し、適正な（ＮＨ４）２ＳＯ４の濃度を５ｍＭに決定した。
【０１３２】
したがって、本発明のＰＣＲバッファー組成物の（ＮＨ４）２ＳＯ４の濃度は、１〜１５ｍＭ、好ましくは２．５〜８ｍＭ、より好ましくは４〜６ｍＭであってもよく、最も好ましくは５ｍＭであってもよい。
【０１３３】
（ＮＨ４）２ＳＯ４が１ｍＭ未満で含まれる場合、一般的な標的増幅には影響がないが、マッチしたプライマーによる増幅とミスマッチしたプライマーによる増幅の差異が減少し得、１５ｍＭを超過して含まれる場合、一般的な標的増幅の効率が低くなる問題が発生し得る。
【０１３４】
したがって、本発明の最適化したＰＣＲバッファー組成物は、７０〜８０ｍＭのＫＣｌおよび４〜６ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４を含み、最終ｐＨが８．０〜９．０であるものでありうる。
【０１３５】
また、本発明のＰＣＲバッファー組成物は、５〜８０ｍＭのＴＭＡＣ（Ｔｅｔｒａ  ｍｅｔｈｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）をさらに含むことができる。
【０１３６】
ＴＭＡＣは、一般的にミスマッチによる増幅を減少させたりハイブリダイゼーション反応の忠実性（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）を向上させるのに使用される。本発明の一実施例では、前記で導き出された結果を基に、反応バッファー内ＫＣｌの濃度を７５ｍＭ、（ＮＨ４）２ＳＯ４の濃度を５ｍＭに一定に固定し、ＴＭＡＣの濃度を０〜８０ｍＭに多様に変化させることによって、適正なＴＭＡＣの濃度を確認した。
【０１３７】
その結果、図１８ａおよび図１８ｂに示されたように、Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ  Ｔａｑ重合酵素は、７０ｍＭ、Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖ  Ｔａｑ重合酵素は、２５ｍＭのＴＭＡＣが適正であることが確認された。さらに、ＴＭＡＣの濃度を２５ｍＭ，（ＮＨ４）２ＳＯ４の濃度を２．５ｍＭに一定に固定した後、ＫＣｌの濃度を２０，４０，６０および８０ｍＭにそれぞれ変化させて増幅を行った結果、図１９ａおよび１９ｂに示されたように、ＳＮＰ  ｒｓ１０１５３６２およびｒｓ４９１１４１４に対して適正なＫＣｌの濃度は、６０ｍＭであることが確認された。
【０１３８】
ＴＭＡＣが８０ｍＭを超過して含まれる場合、増幅効率が減少するので、前記範囲内の濃度でＴＭＡＣを含むことが好ましい。
【０１３９】
したがって、本発明のＰＣＲバッファー組成物は、５〜８０ｍＭのＴＭＡＣを含む場合、ＫＣｌの濃度は、４０〜９０ｍＭ、好ましくは５０〜８０ｍＭであってもよく、（ＮＨ４）２ＳＯ４の濃度は、１〜７ｍＭ、好ましくは１．５〜６ｍＭであってもよい。
【０１４０】
ＴＭＡＣを含む場合、本発明の最適化したＰＣＲバッファー組成物は、１５〜７０ｍＭのＴＭＡＣ、５０〜８０ｍＭのＫＣｌ、１．５〜６ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４を含み、最終ｐＨが８．０〜９．０であるものでありうる。
【０１４１】
本発明のＰＣＲバッファー組成物は、Ｔｒｉｓ・ＣｌおよびＭｇＣｌ２をさらに含むことができ、Ｔｗｅｅｎ  ２０および牛血清アルブミン（ＢＳＡ）をさらに含むことができる。
【０１４２】
また、本発明は、前述したＰＣＲバッファー組成物を含む遺伝子変異またはＳＮＰ検出用ＰＣＲキットを提供する。
【０１４３】
本発明のＰＣＲキットは、配列番号１のアミノ酸配列からなるＴａｑ重合酵素を有するＤＮＡ重合酵素であって、次のアミノ酸置換を含むＤＮＡ重合酵素をさらに含むことができる：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列で５０７番目アミノ酸残基の置換；および
（ｂ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列で５３６番目アミノ酸残基の置換、
（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列で６６０番目アミノ酸残基の置換、
（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列で５３６番目および６６０番目アミノ酸残基の置換、または
（ｉｖ）配列番号１のアミノ酸配列で５３６番目、５８７番目および６６０番目アミノ酸残基の置換。
【０１４４】
本発明の好ましい一実施例によれば、前記５０７番目アミノ酸残基の置換は、グルタミン酸（Ｅ）からリシン（Ｋ）に置換されるものであり、前記５３６番目アミノ酸残基の置換は、アルギニン（Ｒ）からリシン（Ｋ）に置換されるものであり、前記５８７番目アミノ酸残基の置換は、アルギニン（Ｒ）からイソロイシン（Ｉ）に置換されるものであり、前記６６０番目アミノ酸残基の置換は、アルギニン（Ｒ）からバリン（Ｖ）に置換されるものでありうる。
【０１４５】
本発明のＰＣＲキットに含まれるＤＮＡ重合酵素に対する更なる説明は、前述したものと同一なので、その記載を省略する。
【０１４６】
本発明のＰＣＲバッファー組成物を含む遺伝子変異またはＳＮＰ検出用ＰＣＲキットのその他の構成は、前述したものと同一なので、その記載を省略する。
【０１４７】
また、本発明は、前述した遺伝子変異性が増加したＤＮＡ重合酵素の活性増加用ＰＣＲバッファー組成物を含む遺伝子変異またはＳＮＰ検出用キットを利用して一つ以上の鋳型で一つ以上の遺伝子変異またはＳＮＰを生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で検出する方法に関するものである。
【０１４８】
前記方法は、ＰＣＲバッファー組成物の構成を除いて、本発明の遺伝子変異特異性が増加したＤＮＡ重合酵素を利用して一つ以上の鋳型で一つ以上の遺伝子変異またはＳＮＰを生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で検出する方法と同一なので、その記載を省略する。
【０１４９】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、ただ本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されるものと解されないことは、当業界において通常的な知識を有する者において自明だろう。
【０１５０】
［実施例１］
Ｔａｑ重合酵素の突然変異誘発
１−１．断片ＰＣＲ
本実施例では、配列番号１のアミノ酸配列で５３６番目アミノ酸残基をアルギニンからリシンに置換されたＴａｑ  ＤＮＡ重合酵素（以下「Ｒ５３６Ｋ」という）、６６０番目アミノ酸残基をアルギニンからバリンに置換されたＴａｑ  ＤＮＡ重合酵素（以下「Ｒ６６０Ｖ」という）および５３６番目アミノ酸残基をアルギニンからリシンに置換され、６６０番目アミノ酸残基をアルギニンからバリンに置換されたＴａｑ  ＤＮＡ重合酵素（以下「Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖ」という）を下記のように製造した。
【０１５１】
まず、表１に記載された突然変異特異的プライマーを利用して図１（ａ）に示されたように、Ｔａｑ  ＤＮＡ重合酵素断片（Ｆ１〜Ｆ５）をＰＣＲで増幅した。反応条件は、表２に示された通りである。
【０１５２】
【表１】
0006986299.tif 000002
【０１５３】
【表２】
0006986299.tif 000003
【０１５４】
ＰＣＲ産物を電気泳動上で確認してみた結果、図１（ｂ）に示されたように、各断片に対するバンドが確認されて、目的とする断片が増幅されたことを確認した。
【０１５５】
１−２．オーバーラップ（ｏｖｅｒｌａｐ）ＰＣＲ
前記１−１で増幅した各断片を鋳型にして両末端のプライマー（Ｅｃｏ−ＦおよびＸｂａ−Ｒプライマー）を利用して全長を増幅した。反応条件は、表３および表４に示された通りである。
【０１５６】
【表３】
0006986299.tif 000004
【０１５７】
【表４】
0006986299.tif 000005
【０１５８】
その結果、図１（ｃ）に示されたように、「Ｒ５３６Ｋ」、「Ｒ６６０Ｖ」および「Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖ」のＴａｑ重合酵素が増幅されたことを確認した。
【０１５９】
１−３．ライゲーション
ｐＵＣ１９を下記表５の条件で３７℃で４時間の間制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩで分解した後、ＤＮＡを精製し、精製されたＤＮＡを表６の条件で３７℃で１時間の間ＳＡＰを処理してベクターを準備した。
【０１６０】
【表５】
0006986299.tif 000006
【０１６１】
【表６】
0006986299.tif 000007
【０１６２】
インサート（ｉｎｓｅｒｔ）の場合、前記実施例１−２のオーバーラップＰＣＲ産物を精製して表７の条件で３７℃で３時間の間制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩで分解した後、準備されたベクターとともにゲル抽出した（図２）。
【０１６３】
【表７】
0006986299.tif 000008
【０１６４】
表８の条件で室温（ＲＴ）で２時間の間ライゲーションした後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに形質転換してアンピシリンが含まれた培地で選別した。収得されたコロニーから準備されたプラスミドをシーケンシングして、所望の変異が導入されたＴａｑ  ＤＮＡ重合酵素突然変異体（「Ｒ５３６Ｋ」、「Ｒ６６０Ｖ」および「Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖ」）を収得した。
【０１６５】
【表８】
0006986299.tif 000009
【０１６６】
［実施例２］
Ｅ５０７Ｋ変異の導入
２−１．断片ＰＣＲ
前記実施例１で製造された「Ｒ５３６Ｋ」、「Ｒ６６０Ｖ」および「Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖ」のＴａｑ重合酵素活性をテストしてみた結果、活性が劣ることを確認し（データ不図示）、Ｒ５３６Ｋ、Ｒ６６０Ｖ、Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖそれぞれに追加にＥ５０７Ｋ変異（配列番号１のアミノ酸配列で５０７番目アミノ酸残基をグルタミン酸からリシンに置換）を導入し、対照群として使用するために野生型Ｔａｑ  ＤＮＡ重合酵素（ＷＴ）にもＥ５０７Ｋ変異を導入した。Ｅ５０７Ｋ変異が導入されたＴａｑ  ＤＮＡ重合酵素の製造方法は、実施例１と同一である。
【０１６７】
表９に記載された突然変異特異的プライマーを利用して図３に示されたように、Ｔａｑ  ＤＮＡ重合酵素断片（Ｆ６〜Ｆ７）をＰＣＲで増幅した。反応条件は、表１０に示された通りである。
【０１６８】
【表９】
0006986299.tif 000010
【０１６９】
【表１０】
0006986299.tif 000011
【０１７０】
＊鋳型プラスミド：ｐＵＣ１９−Ｔａｑ（ＷＴ）、ｐＵＣ１９−Ｔａｑ（Ｒ５３６Ｋ）、ｐＵＣ１９−Ｔａｑ（Ｒ６６０Ｖ）、ｐＵＣ１９−Ｔａｑ（Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖ）
【０１７１】
２−２．オーバーラップ（ｏｖｅｒｌａｐ）ＰＣＲ
前記２−１で増幅した各断片を鋳型にして両末端のプライマー（Ｅｃｏ−ＦおよびＸｂａ−Ｒプライマー）を利用して全長を増幅した。反応条件は、表１１に示された通りである。
【０１７２】
【表１１】
0006986299.tif 000012
【０１７３】
２−３．ライゲーションｐＵＣ１９を表５の条件で３７℃で４時間の間制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩで分解した後、ＤＮＡを精製し、精製されたＤＮＡを表６の条件で３７℃で１時間の間ＳＡＰを処理してベクターを準備した。
【０１７４】
インサート（ｉｎｓｅｒｔ）の場合、前記実施例２−２のオーバーラップＰＣＲ産物を精製して表７の条件で３７℃で３時間の間制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩで分解した後、準備されたベクターとともにゲル抽出した（図４）。
【０１７５】
表８の条件で室温（ＲＴ）で２時間の間ライゲーションした後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αまたはＤＨ１０βに形質転換してアンピシリンが含まれた培地で選別した。収得されたコロニーから準備されたプラスミドをシーケンシングしてＥ５０７Ｋ変異が導入されたＴａｑ  ＤＮＡ重合酵素突然変異体（「Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ」、「Ｅ５０７Ｋ／Ｒ６６０Ｖ」および「Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖ」）を収得した。
【０１７６】
［実施例３］
本発明のＤＮＡ重合酵素を利用したｑＰＣＲ実行
前記実施例２で収得した「Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ」、「Ｅ５０７Ｋ／Ｒ６６０Ｖ」および「Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖ」変異をそれぞれ含むＴａｑ重合酵素を使用してＳＮＰを含む鋳型に対してミスマッチしたプライマーを延長するための能力が減少したか否かを確認した。対照群としては、Ｅ５０７Ｋ変異を含む「Ｅ５０７Ｋ」  Ｔａｑ重合酵素を使用した。
【０１７７】
本実施例で使用したＳＮＰを含む鋳型は、ｒｓ１４０８７９９，ｒｓ１０１５３６２およびｒｓ４９１１４１４であり、各鋳型の遺伝子型とこれらそれぞれに対する特異的プライマー（ＩＤＴ、米国）の配列情報は、下記表１２および表１３に示された通りである。
【０１７８】
【表１２】
0006986299.tif 000013
【０１７９】
【表１３】
0006986299.tif 000014
【０１８０】
ｑＰＣＲ条件（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００  Ｆａｓｔ）は、下記表１４に示された通りである。
【０１８１】
【表１４】
0006986299.tif 000015
【０１８２】
プローブは、下記表１５のように二重で標識した。
【０１８３】
【表１５】
0006986299.tif 000016
【０１８４】
Ｎｏｂｌｅ  ｂｉｏから購入した口腔上皮細胞採取キットを利用して口腔上皮細胞を採取した後、５００μｌの溶解液（ｌｙｓｉｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に溶解させて１２，０００×ｇで３分間遠心分離した。上澄み液は、新しいチューブに移して実験時に１μｌずつ使用した（図５）。反応条件は、表１６、反応バッファーの組成は、表１７に示された通りである。
【０１８５】
【表１６】
0006986299.tif 000017
【０１８６】
【表１７】
0006986299.tif 000018
【０１８７】
前記表１３の特異的なプライマーを除いた残りの反応液は、同一にして２個のチューブに準備し、各対立遺伝子特異的プライマーを添加してｑＰＣＲを行った。この際、各チューブで検出される蛍光信号を併合してＡＢ  ７５００ソフトウェア（ｖ２．０．６）上で計算されて導き出される限界（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）蛍光値に到達するサイクル（Ｃｔ）値の差異を分析した。ミスマッチしたプライマーによる増幅でのＣｔ値が遅延されるほど、すなわち遺伝子変異特異性または対立遺伝子特異性が良いものと判断する。ｒｓ１４０８７９９、ｒｓ１０１５３６２およびｒｓ４９１１４１４に対するＡＳ−ｑＰＣＲ結果、図６〜図８に示されたように、対照群であるＥ５０７Ｋに比べてＥ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ、Ｅ５０７Ｋ／Ｒ６６０Ｖ、またはＥ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖ変異を含むＴａｐ重合酵素の場合、ミスマッチしたプライマーによる増幅が遅延されることを確認することができ、その効果は、Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖの突然変異で最も顕著に現れた。
【０１８８】
本発明のＥ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ、Ｅ５０７Ｋ／Ｒ６６０Ｖ、またはＥ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖ変異を含むＴａｐ  ＤＮＡ重合酵素は、Ｅ５０７Ｋ変異を含むＴａｑ重合酵素と比較して優れたミスマッチ伸長選択性を有することを確認した。したがって、前記３種のＴａｑ  ＤＮＡ重合酵素は、疾病の医学的診断および組換えＤＮＡの研究に有用に活用され得ると予想される。
【０１８９】
［実施例４］
Ｒ５８７Ｉ変異の導入
４−１．断片ＰＣＲ
実施例２で製造された「Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖ」変異が導入されたＴａｑクローンにＲ５８７Ｉ変異（配列番号１のアミノ酸配列で５８７番目アミノ酸残基をアルギニンからイソロイシンに置換）を追加に導入するために、下記表１８に記載されたプライマーを利用して図９（ａ）に示されたように、２個の断片をＰＣＲで増幅した。反応条件は、表１９に示された通りである。
【０１９０】
【表１８】
0006986299.tif 000019
【０１９１】
【表１９】
0006986299.tif 000020
【０１９２】
ＰＣＲ産物を電気泳動上で確認してみた結果、図９（ｂ）に示されたように、各断片に対するバンドが確認されて、目的とする断片が増幅されたことを確認した。
【０１９３】
４−２．インフュージョンクローニング（Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ  ｃｌｏｎｉｎｇ）
Ｔａｑプラスミドベクター（Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖ）は、表２０の条件で３７℃で４時間の間制限酵素ＫｐｎＩ／ＸｂａＩで分解した後、精製して（溶出：２５ｕｌ）、分解された線状のベクターで準備した。その後、表２１の条件でインフュージョンクローニング反応を３７℃で１５分の間行った後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αまたはＤＨ１０βに形質転換してアンピシリンが含まれた培地で選別した。収得されたコロニーから準備されたプラスミドをシーケンシングしてＲ５８７Ｉ変異が導入されたＴａｑ  ＤＮＡ重合酵素突然変異体（「Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ５８７Ｉ／Ｒ６６０Ｖ」）を収得した。
【０１９４】
【表２０】
0006986299.tif 000021
【０１９５】
【表２１】
0006986299.tif 000022
【０１９６】
［実施例５］
「Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ５８７Ｉ／Ｒ６６０Ｖ」Ｔａｑ重合酵素を利用したｑＰＣＲ実行
５−１．ＫＲＡＳ遺伝子のＱ６１Ｈ変異区分
前記実施例４で収得した「Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ５８７Ｉ／Ｒ６６０Ｖ」変異を含むＴａｑ重合酵素を使用してＫＲＡＳ遺伝子でＱ６１ＨのＳＮＰを含む鋳型に対してミスマッチしたプライマーを延長するための能力が減少したか否かを確認した。対照群としては、「Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖ」変異を含むＴａｑ重合酵素を使用した。
【０１９７】
前記ＳＮＰを含む鋳型は、ＨｅｐＧ２肝癌細胞株から収得したｇＤＮＡ（１０４  ｃｏｐｉｅｓ、３３ｎｇ／ｒｘｎ）であり、通常的なＤＮＡ抽出方法を通じて収得した。検出標的部位が全部ＮＣＢＩレファレンス配列（ＮＧ＿００７５２４．１）と一致することを確認し、野生型（ＷＴ）に使用した。
【０１９８】
前記鋳型に対する特異的プライマーの配列情報は、下記表２２に示された通りである。
【０１９９】
【表２２】
0006986299.tif 000023
【０２００】
ｑＰＣＲ条件（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００  Ｆａｓｔ）は、前記実施例３の表１４と同一である。プローブは、下記表２３のように標識した。
【０２０１】
【表２３】
0006986299.tif 000024
【０２０２】
反応条件は、前記実施例３の表１６と同一であり、反応バッファーの組成は、下記表２４に示された通りである。
【０２０３】
【表２４】
0006986299.tif 000025
【０２０４】
前記表２２の特異的なプライマーを除いた残りの反応液は、同一にして２個のチューブに準備し、各対立遺伝子特異的プライマーを添加してｑＰＣＲを行った。この際、各チューブで検出される蛍光信号を併合してＡＢ  ７５００ソフトウェア（ｖ２．０．６）上で計算されて導き出される限界（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）蛍光値に到達するサイクル（Ｃｔ）値の差異を分析した。ミスマッチしたプライマーによる増幅でのＣｔ値が遅延されるほど、すなわち遺伝子変異特異性または対立遺伝子特異性が良いものと判断する。ＡＳ−ｑＰＣＲ結果、図１０（ａ）および（ｂ）に示されたように、対照群であるＥ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖに比べてＥ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ５８７Ｉ／Ｒ６６０Ｖ変異を含むＴａｑ重合酵素は、ΔＣｔが５まで増加してミスマッチしたプライマーによる増幅が遅延されることを確認することができた。
【０２０５】
本発明者らは、追加で、前記表２２の長さ２４ｍｅｒのプライマーを１８ｍｅｒに短く製作した下記表２５のプライマーを使用してもう一度前記実験を繰り返して実施した。下記表２６の反応バッファー組成を使用したことを除いて、すべての条件は、前記長さ２４ｍｅｒのプライマーを使用した実験と同一である。
【０２０６】
【表２５】
0006986299.tif 000026
【０２０７】
【表２６】
0006986299.tif 000027
【０２０８】
その結果、図１０（ｃ）および１０（ｄ）に示されたように、対照群であるＥ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖに比べてＥ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ５８７Ｉ／Ｒ６６０Ｖ変異を含むＴａｑ重合酵素は、ミスマッチしたプライマーによる増幅が遅延されることを確認することができた。特に、Ｒ５８７Ｉが導入された重合酵素のΔＣｔがさらに顕著に増加した。
【０２０９】
５−２．ＫＲＡＳ遺伝子のＧ１３Ｄ変異区分
前記実施例４で収得した「Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ５８７Ｉ／Ｒ６６０Ｖ」変異を含むＴａｑ重合酵素を使用してＫＲＡＳ遺伝子でＧ１３ＤのＳＮＰを含む鋳型に対してミスマッチしたプライマーを延長するための能力が減少したか否かを確認した。対照群としては、「Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖ」変異を含むＴａｑ重合酵素を使用した。
【０２１０】
前記ＳＮＰを含む鋳型は、ＨｅｐＧ２肝癌細胞株から収得したｇＤＮＡ（１０４  ｃｏｐｉｅｓ、３３ｎｇ／ｒｘｎ）であり、通常的なＤＮＡ抽出方法を通じて収得した。検出標的部位が全部ＮＣＢＩレファレンス配列（ＮＧ＿００７５２４．１）と一致することを確認して野生型（ＷＴ）に使用した。
【０２１１】
前記鋳型に対する特異的プライマーの配列情報は、下記表２７に示された通りである。
【０２１２】
【表２７】
0006986299.tif 000028
【０２１３】
ｑＰＣＲ条件（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００  Ｆａｓｔ）は、前記実施例３の表１４と同一である。プローブは、下記表２８のように標識した。
【０２１４】
【表２８】
0006986299.tif 000029
【０２１５】
反応条件は、前記実施例３の表１６と同一であり、反応バッファーの組成は、前記実施例５−１の表２４と同一である。前記表２７の特異的なプライマーを除いた残りの反応液は、同一にして２個のチューブに準備し、各対立遺伝子特異的プライマーを添加してｑＰＣＲを行った。この際、各チューブで検出される蛍光信号を併合してＡＢ  ７５００ソフトウェア（ｖ２．０．６）上で計算されて導き出される限界（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）蛍光値に到達するサイクル（Ｃｔ）値の差異を分析した。ミスマッチしたプライマーによる増幅でのＣｔ値が遅延されるほど、すなわち遺伝子変異特異性または対立遺伝子特異性が良いものと判断する。
【０２１６】
ＡＳ−ｑＰＣＲ結果、図１１に示されたように、対照群であるＥ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖに比べてＥ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ５８７Ｉ／Ｒ６６０Ｖ変異を含むＴａｑ重合酵素は、ミスマッチしたプライマーによる増幅が遅延されることを確認することができた。
【０２１７】
５−３．ＫＲＡＳ遺伝子のＧ１２Ｓ変異区分
前記実施例４で収得した「Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ５８７Ｉ／Ｒ６６０Ｖ」変異を含むＴａｑ重合酵素を使用してＫＲＡＳ遺伝子でＧ１３ＳのＳＮＰを含む鋳型に対してミスマッチしたプライマーを延長するための能力が減少したか否かを確認した。対照群としては、「Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖ」変異を含むＴａｑ重合酵素を使用した。
【０２１８】
前記ＳＮＰを含む鋳型は、ＨｅｐＧ２肝癌細胞株から収得したｇＤＮＡ（１０４  ｃｏｐｉｅｓ、３３ｎｇ／ｒｘｎ）であり、通常的なＤＮＡ抽出方法を通じて収得した。検出標的部位が全部ＮＣＢＩレファレンス配列（ＮＧ＿００７５２４．１）と一致することを確認し、野生型（ＷＴ）に使用した。
【０２１９】
前記鋳型に対する特異的プライマーの配列情報は、下記表２９に示された通りである。
【０２２０】
【表２９】
0006986299.tif 000030
【０２２１】
ｑＰＣＲ条件（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００  Ｆａｓｔ）は、前記実施例３の表１４と同一である。プローブは、下記表３０のように標識した。
【０２２２】
【表３０】
0006986299.tif 000031
【０２２３】
反応条件は、前記実施例３の表１６と同一であり、反応バッファーの組成は、前記実施例５−１の表２４と同一である。前記表２９の特異的なプライマーを除いた残りの反応液は、同一にして２個のチューブに準備し、各対立遺伝子特異的プライマーを添加してｑＰＣＲを行った。この際、各チューブで検出される蛍光信号を併合してＡＢ  ７５００ソフトウェア（ｖ２．０．６）上で計算されて導き出される限界（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）蛍光値に到達するサイクル（Ｃｔ）値の差異を分析した。ミスマッチしたプライマーによる増幅でのＣｔ値が遅延されるほど、すなわち遺伝子変異特異性または対立遺伝子特異性が良いものと判断する。
【０２２４】
ＡＳ−ｑＰＣＲ結果、図１２に示されたように、対照群であるＥ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖに比べてＥ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ５８７Ｉ／Ｒ６６０Ｖ変異を含むＴａｑ重合酵素は、ミスマッチしたプライマーによる増幅が遅延されることを確認することができた。
【０２２５】
５−４．ＥＧＦＲ遺伝子のＬ８５８Ｒ変異区分
前記実施例４で収得した「Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ５８７Ｉ／Ｒ６６０Ｖ」変異を含むＴａｑ重合酵素を使用してＥＧＦＲ遺伝子でＬ８５８ＲのＳＮＰを含む鋳型に対してミスマッチしたプライマーを延長するための能力が減少したか否かを確認した。対照群としては、「Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖ」変異を含むＴａｑ重合酵素を使用した。
【０２２６】
前記ＳＮＰを含む鋳型は、ＨｅｐＧ２肝癌細胞株から収得したｇＤＮＡ（１０４  ｃｏｐｉｅｓ、３３ｎｇ／ｒｘｎ）であり、通常的なＤＮＡ抽出方法を通じて収得した。検出標的部位が全部ＮＣＢＩレファレンス配列（ＮＧ＿００７７２６．３）と一致することを確認し、野生型（ＷＴ）に使用した。
【０２２７】
前記鋳型に対する特異的プライマーの配列情報は、下記表３１に示された通りである。
【０２２８】
【表３１】
0006986299.tif 000032
【０２２９】
ｑＰＣＲ条件（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００  Ｆａｓｔ）は、前記実施例３の表１４と同一である。プローブは、下記表３２のように二重で標識した。
【０２３０】
【表３２】
0006986299.tif 000033
【０２３１】
反応条件は、前記実施例３の表１６と同一であり、反応バッファーの組成は、前記実施例５−１の表２４と同一である。前記表３１の特異的なプライマーを除いた残りの反応液は、同一にして２個のチューブに準備し、各対立遺伝子特異的プライマーを添加してｑＰＣＲを行った。この際、各チューブで検出される蛍光信号を併合してＡＢ  ７５００ソフトウェア（ｖ２．０．６）上で計算されて導き出される限界（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）蛍光値に到達するサイクル（Ｃｔ）値の差異を分析した。ミスマッチしたプライマーによる増幅でのＣｔ値が遅延されるほど、すなわち遺伝子変異特異性または対立遺伝子特異性が良いものと判断する。
【０２３２】
ＡＳ−ｑＰＣＲ結果、図１３に示されたように、対照群であるＥ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖに比べてＥ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ５８７Ｉ／Ｒ６６０Ｖ変異を含むＴａｑ重合酵素は、ミスマッチしたプライマーによる増幅が遅延されることを確認することができた。
【０２３３】
以上のように、本発明のＥ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ５８７Ｉ／Ｒ６６０Ｖ変異を含むＴａｑ  ＤＮＡ重合酵素は、一部の場合、Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖ変異を含むＴａｑ重合酵素に比べて優れたミスマッチ伸長選択性を有することを確認した。したがって、本発明のＥ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ５８７Ｉ／Ｒ６６０Ｖ変異を含むＴａｑ  ＤＮＡ重合酵素も、疾病の医学的診断および組換えＤＮＡの研究に有用に活用され得るものと予想される。
【０２３４】
［実施例６］
反応バッファーのＫＣｌ濃度最適化
本実施例では、ミスマッチによる増幅を最大に遅延させながら、マッチによる増幅効率が減少しない状態の高いカチオン濃度を探すために、ＰＣＲ反応バッファー内でＫＣｌの濃度を調節して最適なＫＣｌ濃度を確認した。
【０２３５】
実施例２で収得した「Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ」、「Ｅ５０７Ｋ／Ｒ６６０Ｖ」および「Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖ」変異をそれぞれ含むＴａｑ重合酵素を使用し、Ｅ５０７Ｋ変異を含むＴａｑ重合酵素とＫＣｌ濃度限界値を比較した。
【０２３６】
ＳＮＰを含む鋳型は、ｒｓ１４０８７９９を使用し、鋳型の遺伝子型は、ＴＴであり、プライマーは、表２に記載されたｒｓ１４０８７９９プライマーを使用した。ｑＰＣＲ条件（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００  Ｆａｓｔ）は、表１４の条件で行い、二重標識されたプローブは、表１５の１４０８７９９−ＦＡＭ、反応条件は、表３３、反応バッファーの組成は、表３４に示された通りである。
【０２３７】
【表３３】
0006986299.tif 000034
【０２３８】
【表３４】
0006986299.tif 000035
【０２３９】
その結果、図１４ａ〜図１４ｄに示されたように、ＫＣｌ濃度限界値は、Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖ  Ｔａｑ重合酵素が最も低く、Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６ＫとＥ５０７Ｋ／Ｒ６６０Ｖの場合には、Ｅ５０７Ｋより低いことを確認した。前記結果を基に、適正なＫＣｌ濃度を決定するために、Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖ  Ｔａｑ重合酵素を使用して追加実験を実施した。プライマーは、表１３に記載されたｒｓ１４０８７９９−Ｔ特異的プライマーを使用し、ｑＰＣＲ条件（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００  Ｆａｓｔ）は、表１４の条件で３５サイクルを行い、反応条件は、表３５に示された通りである。
【０２４０】
【表３５】
0006986299.tif 000036
【０２４１】
対照群の反応バッファー組成は、表３６と同一であり、実験群の反応バッファー組成は、表３４のように（ＮＨ４）２ＳＯ４の濃度を２．５ｍＭに一定に固定し、ＫＣｌの濃度を多様に変化させた。
【０２４２】
【表３６】
0006986299.tif 000037
【０２４３】
前記の条件で増幅を行った後、ＰＣＲ産物を電気泳動で確認した結果、図１５に示されたように、ミスマッチによる増幅を最大に遅延させながら、マッチによる増幅効率が減少しない状態の適正なＫＣｌの濃度は、７５ｍＭであることを確認した。
【０２４４】
［実施例７］
反応バッファーの（ＮＨ４）２ＳＯ４濃度最適化
本実施例では、前記実施例４の結果を基に、反応バッファー内ＫＣｌ濃度を７５ｍＭに一定に固定した後、（ＮＨ４）２ＳＯ４の濃度を多様に変化させて最適な（ＮＨ４）２ＳＯ４濃度を確認した。プライマーは、表１３に記載されたｒｓ１４０８７９９−Ｔ特異的プライマーを使用し、ｑＰＣＲ条件（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００  Ｆａｓｔ）は、表１４の条件で３５サイクルを行い、反応条件は、表３５、対照群反応バッファーの組成は、表３６に示された通りである。
【０２４５】
その結果、図１６に示されたように、適正な（ＮＨ４）２ＳＯ４の濃度は、５ｍＭであることを確認した。
【０２４６】
前記結果を基に、反応バッファー内ＫＣｌ濃度を７５ｍＭに一定に固定した後、（ＮＨ４）２ＳＯ４の濃度を５ｍＭ付近（それぞれ２．５ｍＭ、５ｍＭおよび１０ｍＭ）に設定し、ミスマッチによる増幅遅延効果を追加確認した。
【０２４７】
プライマーは、表１３に記載されたｒｓ１４０８７９９プライマーを使用し、二重標識されたプローブは、表１５の１４０８７９９−ＦＡＭ、反応条件は、下記表３７に示された通りである。
【０２４８】
【表３７】
0006986299.tif 000038
【０２４９】
その結果、図１７に示されたように、（ＮＨ４）２ＳＯ４の濃度が１０ｍＭであるとき、Ｃｔ値の差異が最も大きかったが、マッチによる増幅でＣｔが多少遅延され、ピークが横になる現象が現れることを確認し、適正な（ＮＨ４）２ＳＯ４の濃度を５ｍＭに決定した。実施例６および７の結果を総合すると、最適な反応バッファーの組成は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・Ｃｌ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、７５ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０および０．０１％  ＢＳＡを含むことを確認した。
【０２５０】
［実施例８］
反応バッファーのＴＭＡＣ追加および濃度最適化
本実施例では、反応バッファーにＴＭＡＣを追加して最適な濃度を確認した。前記実施例６および７の結果を基に、反応バッファー内ＫＣｌの濃度は、７５ｍＭ、（ＮＨ４）２ＳＯ４の濃度は、５ｍＭに一定に固定した後、ＴＭＡＣを多様な濃度に変化させて、適正なＴＭＡＣの濃度を導き出した。
【０２５１】
Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６ＫまたはＥ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖ  Ｔａｑ重合酵素を使用し、ＳＮＰを含む鋳型は、ｒｓ１４０８７９９を使用し、鋳型の遺伝子型は、ＴＴであり、プライマーは、表１３に記載されたｒｓ１４０８７９９プライマーを使用した。ｑＰＣＲ条件（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００  Ｆａｓｔ）は、表１４の条件で行い、二重標識されたプローブは、表１５の１４０８７９９−ＦＡＭ、反応条件は、表３７に示された通りである。
【０２５２】
実験結果、図１８ａおよび図１８ｂに示されたように、Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ  Ｔａｑ重合酵素は、６０ｍＭ、Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖ  Ｔａｑ重合酵素は、２５ｍＭのＴＭＡＣ濃度が適正であることが確認され、ＴＭＡＣの濃度があまり高ければ、増幅効率が減少することを確認することができた。
【０２５３】
［実施例９］
反応バッファーのＫＣｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４およびＴＭＡＣ濃度最適化
本実施例では、前記実施例８で確認された結果を基に、Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖ  Ｔａｑ重合酵素を使用して反応バッファー内最適なＫＣｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４およびＴＭＡＣ濃度を確認した。
【０２５４】
具体的に、ＴＭＡＣの濃度は、２５ｍＭ、（ＮＨ４）２ＳＯ４の濃度は、２．５ｍＭに一定に固定した後、ＫＣｌの濃度を２０、４０、６０および８０ｍＭにそれぞれ変化させた。ｒｓ１０１５３６２およびｒｓ４９１１４１４の２個のＳＮＰに対して実験を行い、鋳型の遺伝子型は、表１２に記載された通りであり、プライマーは、表１３に記載されたｒｓ１０１５３６２およびｒｓ４９１１４１４プライマーを使用し、ｑＰＣＲ条件（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００  Ｆａｓｔ）は、表１４の条件で行い、二重標識されたプローブは、表１５の１４０８７９９−ＦＡＭ、反応条件は、表３７に示された通りである。
【０２５５】
実験結果、図１９ａおよび図１９ｂに示されたように、２個のＳＮＰに対して６０ｍＭ濃度のＫＣｌが適正であり、８０ｍＭでは、増幅効率が減少することを観察することができた。
【０２５６】
以上の結果を通じて、反応バッファー内最適なＫＣｌ濃度は、６０ｍＭ、（ＮＨ４）２ＳＯ４の濃度は、２．５ｍＭ、ＴＭＡＣの濃度は、２５ｍＭであることを確認し、より細部的にＥ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ重合酵素の場合、７５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４および６０ｍＭのＴＭＡＣを使用することが最も効果的であり、Ｅ５０７Ｋ／Ｒ５３６Ｋ／Ｒ６６０Ｖ重合酵素の場合、６０ｍＭのＫＣｌ、２．５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４および２５ｍＭのＴＭＡＣを使用することが最も効果的であることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【０２５７】
本発明の遺伝子変異特異性が増加したＤＮＡ重合酵素は、従来のＴａｑ重合酵素と比較してさらに高いミスマッチ対比マッチ伸長選択性を有するので、いかなる基質変形なくとも信頼性ある遺伝子変異特異的増幅を可能にする。また、本発明は、遺伝子変異特異性が増加したＤＮＡ重合酵素が自らの機能を効果的に発揮できる最適なＰＣＲバッファー組成物を提供し、遺伝子変異特異性が増加したＤＮＡ重合酵素とともに使用して前記ＤＮＡ重合酵素の活性を顕著に向上させることによって、信頼性ある遺伝子変異−特異的増幅を可能にする。かつ、本発明のＰＣＲバッファー組成物および／または遺伝子変異特異性が増加したＤＮＡ重合酵素を含むキットは、遺伝子変異またはＳＮＰを効果的に検出することができるので、疾病の医学的診断および組換えＤＮＡの研究に有用に活用され得る。
【図１】
0006986299.tif 000039
【図２】
0006986299.tif 000040
【図３】
0006986299.tif 000041
【図４】
0006986299.tif 000042
【図５】
0006986299.tif 000043
【図６ａ】
0006986299.tif 000044
【図６ｂ】
0006986299.tif 000045
【図６ｃ】
0006986299.tif 000046
【図６ｄ】
0006986299.tif 000047
【図７ａ】
0006986299.tif 000048
【図７ｂ】
0006986299.tif 000049
【図７ｃ】
0006986299.tif 000050
【図７ｄ】
0006986299.tif 000051
【図８ａ】
0006986299.tif 000052
【図８ｂ】
0006986299.tif 000053
【図８ｃ】
0006986299.tif 000054
【図８ｄ】
0006986299.tif 000055
【図９】
0006986299.tif 000056
【図１０ａ】
0006986299.tif 000057
【図１０ｂ】
0006986299.tif 000058
【図１０ｃ】
0006986299.tif 000059
【図１０ｄ】
0006986299.tif 000060
【図１１】
0006986299.tif 000061
【図１２】
0006986299.tif 000062
【図１３】
0006986299.tif 000063
【図１４ａ】
0006986299.tif 000064
【図１４ｂ】
0006986299.tif 000065
【図１４ｃ】
0006986299.tif 000066
【図１４ｄ】
0006986299.tif 000067
【図１５】
0006986299.tif 000068
【図１６】
0006986299.tif 000069
【図１７】
0006986299.tif 000070
【図１８ａ】
0006986299.tif 000071
【図１８ｂ】
0006986299.tif 000072
【図１９ａ】
0006986299.tif 000073
【図１９ｂ】
0006986299.tif 000074
【配列表】
0006986299000001.app