(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
８−メチルノナン酸（8-methyl nonanoic acid、８Ｍ）を生成するための生合成方法であって、
ａ）形質転換細胞系において（ｉ）ＫＡＳＩＩＩａ遺伝子またはＫＡＳＩＩＩｂ遺伝子、及び（ｉｉ）アシル−アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）チオエステラーゼをコードする遺伝子を発現させることと、
ｂ）前記形質転換細胞系において、ＫＡＳＩＩＩａまたはＫＡＳＩＩＩｂのための基質として、イソブチリル−ＣｏＡを提供することと、および
ｃ）８−メチルノナン酸を生成することと、を含み、
ここで、前記ＫａｓＩＩＩａ遺伝子は、配列番号６と少なくとも９０％同一である核酸配列を含み、前記ＫＡＳＩＩＩｂ遺伝子は、配列番号７と少なくとも９０％同一である核酸配列を含む、生合成方法。
【請求項２】
前記アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子が、Ｃａｐｓｉｃｕｍ属の植物のＦＡＴＢおよびＦＡＴＢ２から選択される脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼＢをコードする、請求項１に記載の生合成方法。
【請求項３】
ＦＡＴＢ２が、前記形質転換細胞系において、配列番号５と少なくとも９０％同一である核酸配列によってコードされる、請求項２に記載の生合成方法。
【請求項４】
ＦＡＴＢが、前記形質転換細胞系において、配列番号４と少なくとも９０％同一である核酸配列によってコードされる、請求項２に記載の生合成方法。
【請求項５】
前記形質転換細胞系が、酵母、非カプサイシノイド生成植物、藻類、及び細菌から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の生合成方法。
【請求項６】
前記形質転換細胞系が、Ｅ．Ｃｏｌｉである、請求項５に記載の生合成方法。
【請求項７】
前記８Ｍを、７０％超の純度に精製することをさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の生合成方法。
【請求項８】
前記形質転換細胞系においてイソ酪酸を提供し、アシル−ＣｏＡシンセターゼ（ＡＣＳ）遺伝子を共発現させることによって、前記形質転換細胞系においてイソブチリル−ＣｏＡを提供する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の生合成方法であって、
ここで、前記ＡＣＳ遺伝子は、イソ酪酸をイソブチリル−ＣｏＡに変換するイソブチリル−ＣｏＡシンセターゼをコードする、方法。
【請求項９】
前記ＡＣＳ遺伝子が、配列番号８と少なくとも９０％同一である核酸配列を含むＣＣＬ４遺伝子である、請求項８に記載の生合成方法。
【請求項１０】
前記形質転換細胞系においてイソ酪酸およびアセチル−ＣｏＡを提供し、プロピオネートＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＰＣＴ）遺伝子を共発現させることによって、前記形質転換細胞系においてイソブチリル−ＣｏＡを提供し、それによって、プロピオネートＣｏＡ−トランスフェラーゼが、イソ酪酸およびアセチル−ＣｏＡをイソブチリル−ＣｏＡおよびアセテートに変換する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の生合成方法。
【請求項１１】
前記ＰＣＴ遺伝子が、配列番号９と少なくとも９０％同一である核酸配列を含む、請求項１０に記載の生合成方法。
【請求項１２】
前記形質転換細胞系においてグルコースを提供し、ａｌｓＳ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＤおよびｂｋｄ遺伝子を共発現させることによって、前記形質転換細胞系においてイソブチリル−ＣｏＡを提供する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の生合成方法。
【請求項１３】
前記形質転換細胞系が、Ｅ．Ｃｏｌｉである、請求項１２に記載の生合成方法。
【請求項１４】
カプサイシンを生成するための８Ｍの使用をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の生合成方法。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の生合成方法の実施において使用するための、（ｉ）ＫＡＳＩＩＩａ遺伝子またはＫＡＳＩＩＩｂ遺伝子、及び（ｉｉ）アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を発現することができる、形質転換細胞系であって、
ここで、前記ＫａｓＩＩＩａ遺伝子は、配列番号６と少なくとも９０％同一である核酸配列を含み、前記ＫＡＳＩＩＩｂ遺伝子は、配列番号７と少なくとも９０％同一である核酸配列を含む、形質転換細胞系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１２月２２日出願の米国仮特許出願第６２／４３７，７９２号の優先権を主張し、その内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明の分野は、カプサイシンの直接前駆体である８−メチルノナン酸（ＣＡＳ番号５９６３−１４−４）（以下、「８Ｍ」）の微生物生成に有用な方法及びプロセスに関する。重要なことに、本開示は、植物由来の系及びＦａｔＢ２タンパク質の配列においては不可能な産生量で８Ｍを生成する方法を提供する。本開示は、８Ｍを生合成するように改変された遺伝子改変Ｅ．ｃｏｌｉ株、遺伝子改変微生物を生成して８Ｍを生成する方法、並びに特定の出発材料から開始して高産生量及び純度レベルで８Ｍを生成する生成方法を提供する。本開示において、ＫＡＳＩＩＩａ、ＫＡＳＩＩＩｂ、ＦａｔＢ、及びＦａｔＢ２遺伝子は、８Ｍの生合成における関与を含め、同定及び特徴付けされた。
【背景技術】
【０００３】
本開示は、いくつかの実施形態では、微生物生成株のためのイソブトリル（isobutryl）−ＣｏＡ形成に利用される異なる経路に応じてグルコース又はイソ酪酸を供給源として使用して、高産生量で望ましい分岐鎖中鎖脂肪酸化合物である微生物生成株を改変して８−メチルノナン酸（イソカプリン酸）を生成する方法を目的とする。カプサイシノイド化合物（カプサイシン（ＣＰ）、ジヒドロカプサイシン（ＤＨＣＰ）、ノニバミド（ＮＶ）を含むがこれらに限定されない）は、唐辛子の「スパイシー」成分であり、エネルギー代謝を促進し、中枢神経系を刺激し、脂肪分解酵素を活性化させることによっていくつかの病理を予防するのに有効であり得る。加えて、これらの化合物は消化管を滅菌するように作用することができ、消費されると免疫を改善し、免疫の活性化及び疲労の回復にも有効でもある。カプサイシンの生成において、８Ｍ化合物は、ＣＰの必須の中間生成物及び分解生成物である（図１）。
【０００４】
カプサイシノイド化学
「スパイシーさ」又は刺激性は、カプサイシノイドと呼ばれるアルカロイドを生成するＣａｐｓｉｃｕｍ属における唐辛子特有の特徴である。本質的に、カプサイシノイドは、哺乳動物がそれらの果実を消費すること、及び種子を破壊することを抑止するために、植物中に存在する。ヒトは、一過性受容体潜在性チャネル（又はイオンチャネルの「ＴＲＰ」ファミリーの）メンバーに構造的に関連する受容体を介してカプサイシノイドを感知することができる。感覚ニューロンにおいて重要である他の受容体と同様に、カプサイシノイド受容体（「ＴＲＰＶ１」、バニロイドＴＲＰ、バニロイド１受容体、又はＴＲＰＶ１とも呼ばれる）は、カプサイシンに対する感度を可逆的に失うことにより、カプサイシン及びピペリンと関連付けられる刺激性の臭気及び痛み／辛味感覚、並びに同じ刺激への長期的曝露下において他の痛み及び辛味刺激を媒介する（Ｃａｔｅｒｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。この現象は、長時間にわたる曝露の後に痛みセンサがオフにされ得るため、人が辛い食品に堪え、更には楽しむことができる理由を部分的に説明し得る。
【０００５】
カプサイシン（ＣＰ）、８−メチル−Ｎ−バニリル−トランス−６−ノネンアミド、及びジヒドロカプサイシン（ＤＨＣＰ）、８−メチル−Ｎ−バニリルノナンアミドは、典型的に植物において見出される２つの主要なカプサイシノイドであり、これらは合わせて、唐辛子ファミリーの刺激性の最大９０％の原因である（Ｇａｒｃｅｓ−Ｃｌａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。本開示に関して、８Ｍは、ＣＰの直接生合成前駆体であるが、一般に、植物由来の材料から供給される場合には、ほとんどない程の少量でのみ利用可能である。
【０００６】
一般に、唐辛子のカプサイシン含量は、０．１〜１％ｗ／ｗの範囲であり（Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊａｎ  ａｎｄ  Ｓａｔｈｙａｎａｒａｙａｎａ  １９９１）、多くの用途において、任意の産業的又は商業的使用のためにＣＰ及び／又はＤＨＣＰ化合物を濃縮するための方法の使用が必要とされている。８Ｍについて、Ｃ．ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓの不動化された自由懸濁細胞に添加されると、カプサイシンの産生量を有意に増加させるが、植物由来の供給源から明らかな量で抽出することはほとんど不可能である。
【０００７】
原材料又は少量の添加剤としての食品におけるそれらの主要な使用に加えて、カプサイシノイドは、多くの医薬及び医療用途を有する。これらは、鎮痛、抗癌、抗炎症、抗酸化、及び抗肥満活性を含む一連の生理学的及び薬理学的効果を発揮することが見出されており、血管運動性鼻炎、変形性関節症、及び関節リウマチ等のいくつかの疾患によって引き起こされる疼痛を緩和するように設計された軟膏、パッチ、オイル、及びクリームの主要成分として使用されている（Ａｚａ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。カプサイシノイドは現在、市販の護身用エアゾールスプレーの主要な活性成分として使用されている（Ｒｅｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、通称「ペッパースプレー」）。加えて、最近では、ハムスターにおいてカプサイシノイド消費が血漿コレステロールを低下させ、内皮機能を改善させることが報告された（Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。食品、医薬品、及び防衛におけるカ、８Ｍを含むプサイシノイドのこれらの多様かつ増加した用途により、カプサイシン及びカプサイシノイドの国際市場における需要が増加している。
【０００８】
Ｃａｐｓｉｃｕｍ属は、２０種を超える唐辛子を含み、Ｃ．ａｎｎｕｕｍ、Ｃ．ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ、Ｃ．ｃｈｉｎｅｎｓｅ、Ｃ．ｂａｃｃａｔｕｍ、及びＣ．ｐｕｂｅｓｃｅｎｓが栽培されている（Ｗａｌｓｈ  ａｎｄ  Ｈｏｏｔ，２００１）。存在するカプサイシノイドの異なるレベル及び種類に起因して、様々なＣａｐｓｉｃｕｍ種にわたり、刺激性又はスパイシーさのレベルにおいて幅広い遺伝子的変動性がある。例えば、Ｃ．ａｎｎｕｕｍ由来の非刺激性のパプリカのスコアは０．０ＳＨＵ（スコヴィル・ヒート・ユニット；カプサイシンの量を示すスケール）である一方、「ブート・ジョロキア」又はゴーストチリは、インド北東部原産のＣ．ｃｈｉｎｅｎｓｅ及びＣ．ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓのハイブリッドであり、スコアは最大１，００１，３０４ＳＨＵである（Ｂｏｓｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｂａｒａｌ，２００７）（表１を参照されたい）。
【０００９】
表１．
【表１】
0006986084.tif 000002
【００１０】
インビボでは、カプサイシンは、８−メチルノネノイル部分を８−メチルノネノイル−ＣｏＡからバニルアミンに移送してアミドコンジュゲートを形成するアミドアシルトランスフェラーゼであるカプサイシンシンターゼ（ＣＳ／ＡＴ３／Ｐｕｎ１）によって合成される（図１、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１５及びＯｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）。バニリルアミンは、フェニルプロパノイド経路から形成されるが、分岐鎖脂肪酸は、分岐鎖アミノ酸、例えばバリンから誘導される（Ｃｕｒｒｙ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９、Ｓｔｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．２００７、Ｍａｚｏｕｒｅｋ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｔ  ａｌ．，２００９）。カプサイシンの生成及び使用における制限は、事前にそれを植物から抽出する必要性から主にもたらされる。典型的に、植物から抽出された純ＣＰは、典型的には、辛味指数において約１６，０００，０００のスコヴィル単位を有し、この濃度では、１グラム当たり５０００ＵＳドル超で販売され得る（Ｂａｃｋｅｌｏｒ，２０００）（表１を参照されたい）。しかしながら、唐辛子中に実際に存在するカプサイシノイドの含量は、一般に非常に低く、環境及び成長条件によって大幅に影響を受ける場合があり、これは、持続可能性及び一貫性の問題をもたらす。８Ｍの生成は、無傷のＣ．ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ細胞と共にインキュベートしたときのカプサイシン含有促進剤としての使用、並びに様々な薬理学的及び商業的製剤におけるその直接的な使用によって、この問題を解決する助けとなり得る。本開示によれば、いくつかの実施形態では、８Ｍの生合成に関連する遺伝子の同定は、改変された微生物における生物変換によりカプサイシノイド生成を増加させるのに役立つことになる。
【００１１】
植物から抽出される場合、典型的には、ヘキサン、クロロホルム、及びエタノール等の溶媒を使用した固−液抽出がカプサイシノイド回収に一般に使用される（Ｃａｔｃｈｐｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。しかしながら、溶媒抽出自体は、エネルギー集約的であり、毒性廃棄物処分の問題をもたらし、植物自体が成長するのに広大なエーカー数を必要とし、８Ｍ等の微量構成物質を回収するためにさらなる精製を必要とする生成物をもたらす。したがって、純粋なカプサイシノイド若しくは８Ｍの生成及び／又は他のカプサイシノイドの回収のコストを低減し、大規模栽培及び処理の環境影響の低下させるために、新たな生成方法が必要とされている（Ｙａｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。選択された微生物株の遺伝子操作は、これらの必要な改善に対処し、特定のカプサイシノイドの選択性、豊富さ、及び生成を増加させる可能性を有する。
【００１２】
現在生成されている純粋なカプサイシンのうちの約６０％が医薬品中の原材料又は成分として使用され、約１５％が農薬に使用され、残りは食品添加物として使用されていると推定される。２０１６年現在、カプサイシン抽出物は、現在の国際市場において１キログラム当たり約＄５，０００で価格設定されており、全世界で年間１，２００トンが生成されている。
【００１３】
上記に加えて、消費者は、食品、芳香剤、香味剤、又は医薬構成成分のための天然及び生物学的供給源を承認し、それらを活発に求める一方で、調達、一貫性のある効力、及び環境的に持続可能な生成を懸念している。この状況により、本開示の微生物発酵及び生成方法は、様々な産業及び研究に有用な量で生物学的に生成物を生成する能力を有する改変微生物株により生成された化合物を、有機化学合成よりも自然な様式で提供する。
【００１４】
過去３０年間で、世界の化石燃料貯蔵量が減少しており、最終的に枯渇し、世界中のニーズを満たすことが不可能になり、かつ／又は回復するのに費用がかかりすぎることになることが明らかになっている。それに応じて、再生可能資源の開発に、政府及び同等に科学者が関心を集中させている。この流れで、本開示は、大量に生成された場合に、本明細書で提供される他の利益と共に、増強されたバイオ燃料のための基盤を提供し得る、中鎖（Ｃ８〜Ｃ１４）分枝鎖脂肪酸の生成を提供する。したがって、本開示の構成要素は、ディーゼルの生成に使用するための中鎖脂肪酸又はその誘導体を生成することを目的とした微生物脂肪酸生合成に焦点を当てる。
【００１５】
工業的に重要な生物として、及び最もよく研究されている微生物脂肪酸生合成により、Ｅ．ｃｏｌｉは、多くの場合、脂肪酸生合成の研究のために選択される生物となっている。燃料使用のための脂肪酸の植物由来の生成が利用可能であるが、世界人口が増加するにつれて、バイオ燃料生成のための食品及び農業用地の使用の社会的及び環境的帰結を懸念する論争も大きくなっている。植物由来のバイオ燃料生成に関連して、本明細書の方法は、いくつかの実施形態では、バイオ燃料の生成に有用な中鎖（Ｃ８〜Ｃ１４）遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の微生物生成を提供する。このような生成は、迅速な生成時間及び再生可能な性質に有益となる。これらはまた、さもなければ増加する人口のための食糧の栽培に使用され得る農業用地の使用を回避することになる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
したがって、消費者又は産業ニーズのために、８Ｍ等の特定のカプサイシン中間体を生成する新規の方法の開発が必要とされている。具体的には、本開示は、いくつかの実施形態では、商業的に関連する量で発酵プロセスから８Ｍを生成する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本開示は、８−メチルノナノン酸の改善された生成方法を包含する。本開示は、いくつかの実施形態では、酵母又は細菌などの細胞系を含む改変微生物において８−メチルノナン酸を生成する方法を提供する。本開示によると、８Ｍを合成する微生物発酵プロセスが提供される。いくつかの実施形態では、本開示の培養物は、改変微生物株が、グルコース又はイソ酪酸などの天然前駆体から供給されるとき、８Ｍを生成することができる。例えば、ＦａｔＢ及びＫＡＳＩＩＩの８Ｍ生成に関連する遺伝子の同定もまた、本開示の必須部分である。
【００１８】
直鎖燃料よりも優れた分岐鎖脂肪酸の低温操作性により、分岐鎖長鎖脂肪酸を生成するいくつかの微生物発酵プロセスが、バイオ燃料研究の分野で記載されている（Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．２０１３、Ｈａｕｓｈａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１４、Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１５、Ｔａｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１５、及びＢｅｎｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．２０１６）。しかしながら、本明細書に提供されるような微生物発酵技術又は方法を使用して、分岐鎖中鎖脂肪酸生成をもたらす能力については報告されていない。
【００１９】
図１に示されるように、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、脂肪酸の鎖長を制御し、８Ｍ生合成経路における主要酵素のうちの１つである。しかしながら、そのような８Ｍ特異的チオエステラーゼは、これまでに特徴付けられていない。Ａｌｕｒｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）は、示次的発現技術を使用して、唐辛子果実からＦａｔＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ３１８２８８．１）を単離し、このチオエステラーゼが８Ｍ生合成に関与し得ることが理論化された（図１、Ｓｔｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．２００７）。しかしながら、Ａｌｕｒｕらは、ＦａｔＡの生化学的活性を提供せず、ＦａｔＡのこの特徴について報告して以来、研究していない。バイオインフォマティクスツールを使用して、Ｍａｚｏｕｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）は、唐辛子から別のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、ＦａｔＢ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＵ６１６５６２）を単離した。同様に、ＦａｔＢは、これまで特徴付けられておらず、８Ｍ生合成におけるその役割は、依然として不明である。本出願において、我々は、Ｃ．ａｎｎｕｕｍ  Ｌ＿Ｚｕｎｌａ−１のゲノムからの第３のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の同定を報告し（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）、それをＦａｔＢ２と名付けた（ＮＣＢＩ参照配列：ＸＭ＿０１６７０８６０５．１）。ＦａｔＢ２は、それを標的化された葉緑体として指定する６４  ａａのシグナルペプチドを含有する３７２  ａａを有する。（配列番号１〜５を参照）。
【００２０】
いくつかの実施形態では、本方法は、遺伝子改変、及びより費用効率が高く、より入手が容易である特定の出発分子の標的化された供給によって、有意な体積の８−メチルノナノイン酸を生成し得る細菌株の開発のためのアプローチを提供する。本開示のいくつかの実施形態によると、イソブチリル−ＣｏＡの生成は、主要な中間体である。いったんこれが生成されると、ＫＡＳＩＩＩａ／ＫＡＳＩＩＩｂは、その伸長に関与し、チオエステラーゼ（ＦａｔＢ／ＦａｔＢ２）は、伸長された脂肪酸の長さを制御する。８Ｍは、ＦａｔＢ／ＦａｔＢ２による切断を伴う３回の伸長後に生成される。（配列番号６〜９を参照）。本明細書で生成される脂肪酸を更に伸長するために、追加の回が含まれ得る。
【００２１】
本開示の一実施形態は、グルコース又はイソ酪酸からイソブチリル−ＣｏＡを作製することによって、８−メチルノナン酸を開発する生合成方法である。
【００２２】
本開示において、我々は、イソブチリル−ＣｏＡを作製する３つの方法を示した。１）グルコース／ピルビン酸由来のデノボ、２）ＡＣＳ（ＡＡＥ、アシル−ＣｏＡシンセターゼ）、及び３）ＰＣＴ（プロピオネートＣｏＡ−トランスフェラーゼ）。いくつかの実施形態では、この中間体は、微生物によって８Ｍを生成するためにそれ自体が重要である。
【００２３】
代替の実施形態では、細胞系へのグルコースの供給は、細胞系においてイソブチリル−ＣｏＡのデノボ生合成のための遺伝子を発現させることを含み、細胞系へのイソ酪酸の供給は、イソブチリル−ＣｏＡシンセターゼ（ＡＣＳ）遺伝子、又はプロピオネート／イソブチレート−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＰＣＴ）遺伝子を発現させることを含む。
【００２４】
本開示は、１つには、イソブチリル−ＣｏＡ形成のための３つの経路を提供し（追加の経路情報については以下に列挙された刊行物を参照）、その後、遺伝子操作された微生物において分岐鎖中鎖脂肪酸の生成を提供する。
１．ａｌｓＳ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＤ、及びｂｋｄ遺伝子を使用してデノボのため（Ｊｉａｎｇら）、
２．ＡＣＳ（ＡＡＥ）経路を使用して（Ｚｈａｎｇら）、並びに
３．ＰＣＴ経路を使用して（ＭｃＭａｈｏｎ  ＭＤら）
【００２５】
製品／商業的有用性の点で、カプサイシン又は米国の市販の８Ｍなどの近接類似体を含有する数十個の製品が存在し、鎮痛剤から害虫防除までありとあらゆるものにおいて、並びに食物において、かつ運動栄養補助食品として使用され得る。８Ｍを含有する製品は、エアゾール、液体、又は粒状配合物であり得る。
【００２６】
本開示のいくつかの実施形態によると、バイオ燃料生成で使用するための中鎖（Ｃ８〜Ｃ１４）分岐鎖脂肪酸（ＢＣＦＡ）が生成され得る。これらの分子は、特に優れた低温流動性を有する燃料の開発に関して、燃料の動作温度範囲を強化するため、バイオ燃料の開発において重要である。対照的に、単鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）は、微生物の生物変換を介して生成するのがはるかに容易であるように思われる。ＳＣＦＡ及びＢＣＦＡの両方の細胞合成は、マロニル−ＡＣＰと短鎖アシル−ＣｏＡとの間の縮合反応を触媒することができるＦａｂＨ酵素を必要とする。
【００２７】
いくつかの態様では、本開示は、（ａ）形質転換細胞系においてＫＡＳＩＩＩａ、ＫＡＳＩＩＩｂ、及びチオエステラーゼを発現させることと、（ｂ）形質転換細胞系においてイソブトリル−ＣｏＡを生成することと、（ｃ）８−メチルノナン酸を生成することとを含む、カプサイシノイド８−メチルノナン酸（８Ｍ）を作製する生合成方法を提供する。
【００２８】
本方法のいくつかの実施形態では、チオエステラーゼは、ＦＡＴＢ又はＦＡＴＢ２である。本方法のいくつかの実施形態では、ＫＡＳＩＩＩａは、Ｃａｐｓｉｃｕｍ属の植物（例えば、ゴーストチリ）からクローニングされる。本方法のいくつかの実施形態では、ＫＡＳＩＩＩｂは、Ｃａｐｓｉｃｕｍ属の植物（例えば、ゴーストチリ）からクローニングされる。本方法のいくつかの実施形態では、チオテラーゼはＦＡＴＢ２であり、Ｃａｐｓｉｃｕｍ属の植物（例えば、ゴーストチリ）からクローニングされる。本方法のいくつかの実施形態では、チオテラーゼはＦＡＴＢであり、Ｃａｐｓｉｃｕｍ属の植物（例えば、ゴーストチリ）からクローニングされる。
【００２９】
本方法のいくつかの実施形態では、細胞系はまた、形質転換細胞系のためのグルコース培地を含む。本方法のいくつかの実施形態では、細胞系はまた、形質転換細胞系のためのピルビン酸培地を含む。
【００３０】
本方法のいくつかの実施形態では、形質転換細胞系は、アシル−ＣｏＡシンセターゼを更に含む。本方法のいくつかの実施形態では、形質転換細胞系は、プロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼを更に含む。
【００３１】
本方法のいくつかの実施形態では、形質転換細胞系は、酵母、非カプサイシノイド生成植物、藻類、及び細菌を含む群から選択される。本方法のいくつかの実施形態では、細胞系は、Ｅ．Ｃｏｌｉである。本方法のいくつかの実施形態では、細胞系は、細菌、酵母、植物細胞、動物細胞、インビトロ翻訳系、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。本方法のいくつかの実施形態では、形質転換細胞系は、酵母又は細菌の微生物培養物である。
【００３２】
本方法のいくつかの実施形態では、８Ｍは精製されている。本方法のいくつかの実施形態では、８Ｍは、７０％超（例えば、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超、９８％超、又は９９％超）の純度である。本方法のいくつかの実施形態では、８Ｍ含量は、乾燥基準で約８５重量％超（例えば、約８５重量％超、約９０重量％超、約９５重量％超、約９８重量％超、約９９重量％超）である。
【００３３】
本方法のいくつかの実施形態では、ステップｃ）は、ｉ）粗生成物を精製することと、ｉｉ）真空下で溶媒を除去して、濃縮カプサイシノイド生成物を提供することと、を含む。本方法のいくつかの実施形態では、粗生成物は、カラムクロマトグラフィによって精製される。本方法のいくつかの実施形態では、粗生成物は、酸塩基抽出によって精製される。本方法のいくつかの実施形態では、粗生成物は、真空蒸留によって精製される。本方法のいくつかの実施形態では、粗生成物は、半分取ＨＰＬＣによって精製される。
【００３４】
他の態様では、本開示は、配列番号５の核酸配列、又は配列番号５と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％）同一である核酸配列を有するチオエステラーゼ遺伝子を提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子は、宿主細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、又は動物細胞）内にある。いくつかの実施形態では、遺伝子は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞内にある。
【００３５】
他の態様では、本開示は、配列番号６の核酸配列、又は配列番号６と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％）同一である核酸配列を有する改変ＫａｓＩＩＩａ遺伝子を提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子は、宿主細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、又は動物細胞）内にある。いくつかの実施形態では、遺伝子は、大腸菌（E. coli）細胞内にある。
【００３６】
他の態様では、本開示は、配列番号７の核酸配列、又は配列番号７と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％）同一である核酸配列を有する改変ＫａｓＩＩＩｂ遺伝子を提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子は、宿主細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、又は動物細胞）内にある。いくつかの実施形態では、遺伝子は、大腸菌（E. coli）細胞内にある。
【００３７】
他の態様では、本開示は、配列番号８の核酸配列、又は配列番号８と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％）同一である核酸配列を有する改変ＣＣＬ４遺伝子を提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子は、宿主細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、又は動物細胞）内にある。いくつかの実施形態では、遺伝子は、大腸菌（E. coli）細胞内にある。
【００３８】
他の態様では、本開示は、配列番号９の核酸配列、又は配列番号９と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％）同一である核酸配列を有する改変ＰＣＴ遺伝子を提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子は、宿主細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、又は動物細胞）内にある。いくつかの実施形態では、遺伝子は、大腸菌（E. coli）細胞内にある。
【００３９】
他の態様では、本開示は、配列番号２のアミノ酸配列、又は配列番号２と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列を有するＦａｔ２Ｂタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、宿主細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、又は動物細胞）内にある。いくつかの実施形態では、タンパク質は、大腸菌（E. coli）細胞内にある。
【００４０】
他の態様では、本開示は、配列番号５の核酸配列の翻訳から誘導されたアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、宿主細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、又は動物細胞）内にある。いくつかの実施形態では、タンパク質は、大腸菌（E. coli）細胞内にある。
【００４１】
他の態様では、本開示は、（ａ）形質転換細胞系においてＫＡＳＩＩＩａ、ＫＡＳＩＩＩｂ、及びチオエステラーゼを発現させることと、（ｂ）形質転換細胞系においてイソブトリルＣｏＡを生成することと、（ｃ）Ｃ８〜Ｃ１４分枝鎖脂肪酸を生成することと、を含む、中鎖ＢＣＦＡ（分岐鎖脂肪酸）を作製する生合成方法を提供する。本方法のいくつかの実施形態では、生成される分枝鎖脂肪酸は、バイオ燃料生成に使用される。本方法のいくつかの実施形態では、生成される分枝鎖脂肪酸は、バイオ燃料生成に使用され、低温流動性の向上を有する。本方法のいくつかの実施形態では、本方法は、分枝鎖脂肪酸の伸長のための脂肪酸シンターゼ（fatty acid synthase、ＦＡＳ）系を生成するためのＦａｂＨ及びイソブイチル（isobuytyl）ＣｏＡの使用を更に含む。本方法のいくつかの実施形態では、本方法は、α−ケトイソ吉草酸又はそのナトリウム塩を形質転換細胞系に供給して、８Ｍを発現させることを更に含む。本方法のいくつかの実施形態では、本方法は、形質転換細胞系においてｂｋｄを発現させることを更に含む。本方法のいくつかの実施形態では、本方法は、イソ酪酸及び／又はその塩を形質転換細胞系に供給して、８Ｍを発現させることを更に含む。本方法のいくつかの実施形態では、本方法は、形質転換細胞系においてＣＣＬ４を発現させることを更に含む。本方法のいくつかの実施形態では、本方法は、イソ酪酸及び／又はその塩を形質転換細胞系に供給して、８Ｍを発現させることを更に含む。本方法のいくつかの実施形態では、本方法は、形質転換細胞系においてＰＣＴを発現させることを更に含む。本方法のいくつかの実施形態では、本方法は、イソ酪酸及び／又はその塩を形質転換細胞系に供給して、８Ｍを発現させることを更に含む。本方法のいくつかの実施形態では、本方法は、形質転換細胞系においてａｌｓＳ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＤ、及びｂｋｄを発現させることを更に含む。
【００４２】
本方法のいくつかの実施形態では、形質転換細胞系は、酵母、非カプサイシノイド生成植物、藻類、及び細菌を含む群から選択される。本方法のいくつかの実施形態では、細胞系は、Ｅ．Ｃｏｌｉである。本方法のいくつかの実施形態では、細胞系は、細菌、酵母、植物細胞、動物細胞、インビトロ翻訳系、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。本方法のいくつかの実施形態では、形質転換細胞系は、酵母又は細菌の微生物培養物である。
【００４３】
本方法のいくつかの実施形態では、分岐鎖脂肪酸及び／又は８Ｍは精製されている。本方法のいくつかの実施形態では、分岐鎖脂肪酸及び／又は８Ｍは、７０％超（例えば、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超、９８％超、又は９９％超）の純度である。本方法のいくつかの実施形態では、分岐鎖脂肪酸及び／又は８Ｍの含量は、乾燥基準で約８５重量％超（例えば、約８５重量％超、約９０重量％超、約９５重量％超、約９８重量％超、約９９重量％超）である。
【００４４】
本方法のいくつかの実施形態では、ステップｃ）は、ｉ）粗生成物を精製することと、ｉｉ）真空下で溶媒を除去して、濃縮分岐鎖脂肪酸及び／又は８Ｍ生成物を提供することと、を含む。本方法のいくつかの実施形態では、粗生成物は、カラムクロマトグラフィによって精製される。本方法のいくつかの実施形態では、粗生成物は、酸塩基抽出によって精製される。本方法のいくつかの実施形態では、粗生成物は、真空蒸留によって精製される。本方法のいくつかの実施形態では、粗生成物は、半分取ＨＰＬＣによって精製される。
【００４５】
細胞系について、いくつかの実施形態では、それは、細菌、酵母、及びそれらの組み合わせ、又は選択された遺伝子の遺伝子形質転換、及びその後、グルコース（デノボ経路）若しくはイソ酪酸（ＡＣＳ若しくはＰＣＴ経路）前駆体の供給からの所望の８−メチルノナン酸の生合成を可能にする任意の細胞系からなる群から選択される。最も好ましい微生物系においては、所望の８Ｍを生成するためにＥ．ｃｏｌｉが使用される。
【００４６】
本開示は様々な修正及び代替形態をとり得るが、その特定の実施形態が図面において例として示され、本明細書において詳細に説明される。しかしながら、本明細書において示される図面及び詳細な説明は、本開示を開示される特定の実施形態に限定するものではなく、逆に、本発明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の趣旨及び範囲内の全ての修正、均等物、及び代替物を包含するものであることを理解されたい。
【００４７】
本発明の他の特徴及び利点は、添付の図面を参照してなされる、本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な説明において明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】カプサイシノイド生合成経路。アミノトランスフェラーゼ（ｐＡＭＴ）は、バニリンからのバニリアミンの形成を触媒する。Ｐａｌ、フェニルアラニンリアーゼ；Ｃａ４Ｈ、ケイ皮酸４−ヒドロキシラーゼ；４ＣＬ、４−クマレートＣｏＡリガーゼ；ＨＣＴ、ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ；Ｃ３Ｈ、クマロイルシキマート／キナ酸３−ヒドロキシラーゼ；ＣＯＭＴ、カフェイン酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼ；ｐＡＭＴ、アミノトランスフェラーゼ；ＢＣＡＴ、分岐鎖アミノ酸トランスフェラーゼ；Ｋａｓ、３−ケト−アシルＡＣＰシンターゼ；ＡＣＬ、アシル輸送タンパク質；Ｆａｔ、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ；ＡＣＳ、アシル−ＣｏＡシンセターゼ；ＣＳ、カプサイシンシンターゼ（Ｓｔｅｗａｒｔ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．２００７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．５８：９７９−９９１）。
【図２】様々なアシル−ＣｏＡに対する精製されたＦａｔＡ（ＴＥ１、棒の各対の左の棒）及びＦａｔＢ（ＴＥ２、棒の各対の右の棒）タンパク質の活性アシル−ＣｏＡは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。チオエステラーゼ（thioesterase、ＴＥ）の活性を、３０℃で１００ｍｇ／Ｌのアシル−ＣｏＡ及び５μＬの精製酵素を含有する１００ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．５中でアッセイした。遊離ＣｏＡ及びアシル−ＣｏＡをＨＰＬＣによって分析した。Ａｃｃｌａｉｍ（登録商標）１２０  ＣＩ  ８逆相カラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３μ、１２０Ａ、１５０χ３ｍｍ）を使用して、Ｄｉｏｎｅｘ−ＵｌｔｉＭａｔｅ（登録商標）３０００  ＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＨＰＬＣを実施した。移動相は、溶媒Ａ（０．１％トリフルオロ酢酸）及び溶媒Ｂ（アセトニトリル）から構成された。勾配溶離手順は、以下の通りであった。０〜５分、５％のＢ；５〜９分、５〜８０％のＢの線形勾配；９〜１１分、８０％のＢ、１１〜１２分、５％のＢ。流速は、０．６ｍＬ／分であった。ダイオードアレイ検出器は、２００〜４００ｎｍの範囲のデータを収集した。基質及び製品の検出及び定量化のために、ピーク面積を２５７ｎｍで測定した。市販のアシル−ＡＣＰの非有用性により、Ｓｉｇｍａからの様々なアシル−ＣｏＡをチオエステラーゼの基質として使用した。
【図３】ＩＰＴＧ誘発ＢＬ２１（ＤＥ３）培養物からの上清のＧＣ／ＭＳ分析。ＩＰＴＧ誘発ＢＬ２１（ＤＥ３）培養物からの上清のＧＣ／ＭＳ分析。空のベクターを有するＣＫ、ＢＬ２１（ＤＥ３）；ＴＥ１、ＦａｔＡ；ＴＥ２、ＦａｔＢ；ＴＥ３、ＦａｔＢ２。培養物を、１ｍＭのＩＰＴＧによる誘発後に１６℃で増殖させ、１日後に上清から脂肪酸を抽出した。
【図４】シス−５−ドデセン酸（ＣＡＳ  Ｎｏ．２４３０−９４−６）。
【図５】異なるＦａｂＨ遺伝子を有する株における８Ｍの生成。ＫＢＢ、ＫＡＳ  ＩＩＩｂ；ＫＡＢ、ＫＡＳ  ＩＩＩａ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８由来のＫＢｓＢ１、ＦａｂＨ２；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ由来のＫＳａＢ、ＦａｂＨ。ＫＢｓＢ及びＫＳａＢは、２つの陽性対照である（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）。実験を３回実施した。
【図６】推定８ＭピークのＭＳスペクトル。より低いスペクトルは、ライブラリ一致である。
【図６−１】８Ｍ標準のＭＳスペクトル。より低いスペクトルは、ライブラリ一致である。
【図６−２】８Ｍ標準のＧＣプロファイル。より低いスペクトルは、ライブラリ一致である。
【図７】ＣＣＬ４、ＦａＢ２、及び異なるＦａｂＨ遺伝子を有する株における８Ｍの生成。ＢＢＡ、ＫＡＳ  ＩＩＩｂ；ＡＢＡ、ＫＡＳ  ＩＩＩａ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８由来のＢｓＢＡ１、ＦａｂＨ２；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ由来のＳａＢＡ、ＦａｂＨ。実験を３回実施した。
【図８】Ｅ．ｃｏｌｉにおける８Ｍのデノボ生成。Ｅ．ｃｏｌｉにおける８Ｍのデノボ生成。着色された遺伝子は、遺伝子操作された遺伝子である。ａｌｓＳ及びｂｋｄは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８由来であり、ｉｌｖＣ及びｉｌｖＤは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来であり、ＫＡＳ  ＩＩＩａ／ＫＡＳ  ＩＩＩｂ及びＦａｔＢ／ＦａｔＢ２は、唐辛子由来である。この図は、出典がＪｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）の図１であった。（配列番号１〜７を参照）。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
好ましい実施形態の説明
本明細書において使用される用語の説明：
カプサイシン又はＣＰは、無色の刺激性フェノール性アミドＣ１８Ｈ２７ＮＯ３であり、唐辛子にその辛味又は刺激性を与え、かつ食品、医薬品、及び安全性用途に使用される、様々なＣａｐｓｉｃｕｍ種及びそれらのハイブリッドにおいて見出される一連のフェノール性アミドの一種であるである。純粋なＣＰは、揮発性、疎水性、無色、無臭、結晶性〜ロウ状の化合物である。
【００５０】
本明細書において使用される場合、カプサイシノイドは、唐辛子の辛味に関与するカプサイシンに関連する刺激性化合物のクラスを指す。それらは、ヒトを含む哺乳動物に対する刺激物であり、それらが接触するあらゆる組織に焼ける感覚をもたらす。８Ｍを含むカプサイシノイドは、ほぼ確実にある特定の哺乳動物及び菌類に対する抑止剤として、唐辛子による二次代謝産物として生成され得る。
【００５１】
細胞系は、異所性タンパク質の発現を提供する任意の細胞である。これは、細菌、酵母、植物細胞、及び動物細胞を含む。これは、原核細胞及び真核細胞の両方を含む。また、これは、リボソーム等の細胞成分に基づくタンパク質のインビトロ発現を含む。
【００５２】
脂肪酸、Ｃ８〜Ｃ１４。本開示によれば、様々な脂肪酸が出発原材料として使用され得る。原材料としては、バニリン、バニリルアミン、又はメチル化、エチル化、若しくはグリコシル化等の芳香環における修飾を有するそれらの誘導体が挙げられ、より具体的には、８〜１４炭素直鎖若しくは分岐鎖脂肪酸、又はヒドロキシ脂肪酸等のそれらの誘導体（例えば、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸、及びドデカン酸）は、直鎖脂肪酸又は分岐鎖脂肪酸であってもよく、本開示の８−メチルノナン酸を作製するために使用され得る。
【００５３】
細胞系の成長。成長は、細胞を増殖及び分化させることを可能にする適切な培地を提供することを含む。これはまた、細胞又は細胞成分が、組換えタンパク質を翻訳及び作製できるような供給源を提供することも含む。
【００５４】
タンパク質発現。タンパク質生成は、遺伝子発現後に生じ得る。これは、ＤＮＡがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写された後の段階からなる。次いで、ｍＲＮＡは、ポリペプチド鎖に翻訳され、最終的にタンパク質に折り畳まれる。ＤＮＡは、核酸を細胞中に意図的に導入するプロセスであるトランスフェクションを介して細胞中に存在してもよい。この用語は、多くの場合、真核細胞の非ウイルス法に使用される。これはまた、他の方法及び細胞型を指す場合があるが、他の用語が好ましい。「形質転換」は、細菌、植物細胞を含む非動物真核細胞における非ウイルスＤＮＡ移送を説明するためにより頻繁に使用される。動物細胞では、形質転換はまたこれらの細胞におけるがん性状態（発がん性）への進行を指すために使用されるため、トランスフェクションが好ましい用語である。形質導入は、多くの場合、ウイルス媒介ＤＮＡ移送を説明するために使用される。形質転換、形質導入、及びウイルス感染は、本出願においてトランスフェクションの定義に含まれる。
【００５５】
酵母。本開示によれば、本明細書において特許請求される酵母は、真菌界のメンバーとして分類される真核生物の単一細胞微生物である。酵母は、多細胞性の祖先から進化した単細胞生物であるが、本開示に有用ないくつかの種は、仮性菌糸又は偽菌糸として知られる接続した出芽性細胞のストリングを形成することにより多細胞の特性を発達させることができるものである。
【００５６】
頭字語：
ＡＡＥ、アシル活性化酵素
ＰＣＴ、プロピオン酸／イソ酪酸−ＣｏＡトランスフェラーゼ
ＴＥ、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ
Ｐａｌ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ；
Ｃａ４Ｈ、ケイ皮酸４−ヒドロキシラーゼ；
４ＣＬ、４−クマル酸ＣｏＡリガーゼ；
ＨＣＴ、ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ；
Ｃ３Ｈ、クマロイルシキミ酸／キナ酸３−ヒドロキシラーゼ；
ＣＯＭＴ、カフェイン酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼ；ｐＡＭＴ、アミノトランスフェラーゼ；
ＢＣＡＴ、分岐鎖アミノ酸トランスフェラーゼ、
ＫＡＳ、３−ケト−アシルＡＣＰシンターゼ；
ＡＣＬ、アシルキャリアタンパク質；
ＦａｔＡ、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ；
ＡＣＳ、アシル−ＣｏＡシンターゼ；及び
ＣＳ、カプサイシン合成酵素。
【００５７】
本開示は、１つには、８Ｍの生成のための微生物発酵系を提供する。
【００５８】
直鎖燃料よりも優れた分岐鎖脂肪酸の低温操作性により、分岐鎖長鎖脂肪酸の生成のためのいくつかの微生物発酵プロセスが、バイオ燃料研究の分野で記載されている（Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．２０１３、Ｈａｕｓｈａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１４、Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１５、Ｔａｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１５、Ｂｅｎｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．２０１６）。しかしながら、微生物発酵を使用した分岐鎖中鎖脂肪酸生成については報告されていない。
【００５９】
図１に示されるように、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、脂肪酸の鎖長を制御し、８Ｍ生合成経路における主要酵素のうちの１つである。しかしながら、そのような８Ｍ特異的チオエステラーゼは、これまでに特徴付けられていない。Ａｌｕｒｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）は、示次的発現に基づき、唐辛子果実からＦａｔＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ３１８２８８．１）を以前に単離し、人々は、このチオエステラーゼが８Ｍ生合成に関与すると信じる傾向がある（図１、Ｓｔｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．２００７）。しかしながら、ＦａｔＡの生化学的活性は、これまで報告されていない。バイオインフォマティクスツールを使用して、Ｍａｚｏｕｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）は、唐辛子から別のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、ＦａｔＢ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＵ６１６５６２）を単離した。しかしながら、ＦａｔＢは、これまで特徴付けられておらず、８Ｍ生合成におけるその役割は、依然として不明である。本出願において、我々は、Ｃ．ａｎｎｕｕｍ  Ｌ＿Ｚｕｎｌａ−１のゲノムからの第３のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の同定を報告し（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）、それをＦａｔＢ２と名付けた（ＮＣＢＩ参照配列：ＸＭ＿０１６７０８６０５．１）。ＦａｔＢ２は、葉緑体標的化のための６４  ａａのシグナルペプチドを含有する３７２  ａａを有する。（配列番号１〜５を参照）。
【００６０】
本明細書で生成される８Ｍを、唐辛子由来のＫＳＩＩＩａ／ＫＡＳＩＩＩｂ及びＦａｔＢ／ＦａｔＢ２遺伝子、並びにイソブチリル−ＣｏＡの生成に関連する他の遺伝子を担持するように改変された改変Ｅ．ｃｏｌｉ培養物中で合成した。（配列番号１〜６を参照）。イソブチリル−ＣｏＡは、ａｌｓＳ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＤ、及びｂｋｄ遺伝子の過剰発現によってグルコースからデノボ生成され得る。あるいは、イソブチリル−ＣｏＡは、ＡＣＳ（イソブチリル−ＣｏＡシンセターゼ）又はＰＣＴ（プロピオネートＣｏＡ−トランスフェラーゼ）遺伝子の過剰発現によって、供給されたイソ酪酸から生成され得る。これらの遺伝子は、適切に供給された選択された株が、８−メチルノナン酸を合成することを可能にした（図８）。
【００６１】
カプサイシン及びその類似体の合成のための有機又は非生物学的プロセスが報告されており、例えば、Ｃｒｏｍｂｉｅら（Ｊ．Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．，１０２５−２７（１９５５））は、赤唐辛子の有効成分であるカプサイシン、Ｎ−（４−ヒドロキシ−３−メトキシベンジル）−８−メチルノン−トランス−６−エナミドの無機合成を説明している。他の有機経路は、ＬａＨａｎｎらに対して発行された米国特許第４，４９３，８４８号、及びＣｈｅｎらに対して発行された米国特許第５，０９４，７８２号に示されている。
【００６２】
カプサイシノイドは、痛みを信号伝達すると考えられる小径求心性神経線維Ｃ繊維及びＡ−デルタ繊維に対するその選択的作用のため、実験ツールとして長い間使用されてきた。動物における研究から、カプサイシノイドは、カルシウム及びナトリウム透過性のカチオンチャネルを開くことにより、Ｃ−繊維膜脱分極を誘引すると考えられる。近年では、カプサイシノイド効果のための受容体の１つがクローニングされている。
【００６３】
ほとんどの唐辛子において、バニリルアミンは、フェルリン酸、バニリン、及び関連化合物を介してフェニルアラニンから形成され、カプサイシノイドは、カプサイシンシンターゼによりバニルアミン及び分岐鎖肪酸から生成される（図１）。
【００６４】
合成生物学
遺伝子操作された微生物は、再生可能な供給源からの薬物、化学物質、及びバイオ燃料の生成のための益々重要なプラットフォームとなってきている（Ｄｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。これらのバイオ技術製品は、食品において使用される場合、現在の規制に従って食品セクターにおいて「天然」と標示され得る（Ｈａｕｓｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｕｎｃｈ，１９９７）。
【００６５】
例示的なカプサイシノイドとしては、ノニバミド、Ｎ−バニリルノナンアミド、Ｎ−バニリルスルホンアミド、Ｎ−バニリルウレア、Ｎ−バニリルカルバメート、Ｎ［（置換フェニル）メチル］アルキルアミド、メチレン置換Ｎ［（置換フェニル）メチル］アルカンアミド、Ｎ［（置換フェニル）メチル］−シス−単飽和アルケンアミド、Ｎ［（置換フェニル）メチル］二不飽和アミド、８Ｍ、３−ヒドロキシアセトアニリド、ヒドロキシフェニルアセトアミド、シュードカプサイシン、ジヒドロカプサイシン、ノルジヒドロカプサイシン、ホモカプサイシン、ホモジヒドロカプサイシンＩ、アナンダミド、ピペリン、ジンゲロン、ワーバーガナル、ポリゴジアール、アフラモジアール、シンナモジアール、シンナモスモライド、シンナモライド、シバムド、ノニバミド、オルバニル、Ｎ−オレイル−ホモバニルアミジア、イソベレラル、スカララジアール、アンシストロジアール、及びこれらの任意の組み合わせ又は混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
ハイブリダイゼーション技法を使用した配列類似性の決定
核酸ハイブリダイゼーションは、ＤＮＡ操作の当業者に周知の技法である。核酸の所与の対のハイブリダイゼーション特性は、それらの類似性又は同一性の指標である。
【００６７】
「ハイブリダイゼーション」という用語は、一般に、相補的塩基鎖対合を介して結合する核酸分子の能力を指す。そのようなハイブリダイゼーションは、核酸分子が、適切な条件下で接触する場合に生じ得る。「特異的にハイブリダイズする」とは、逆平行二本鎖核酸構造を形成する２つの核酸分子の能力を指す。核酸分子は、それらが「完全な相補性」を示す場合、別の核酸分子の「補体」であると言われ、すなわち、１つの配列内の各ヌクレオチドは、別の配列におけるその塩基対合パートナーヌクレオチドと相補的である。２つの分子は、少なくとも従来の「低ストリンジェンシー」条件下で互いにアニールしたままであることを許容するのに十分な安定性で互いにハイブリダイズすることができる場合に、「最小限に相補的」であると言われる。同様に、２つの分子は、従来の「高ストリンジェンシー」条件下で互いにアニールしたままであることを許容するのに十分な安定性で互いにハイブリダイズすることができる場合に、「相補的」であると言われる。例えば、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、他の核酸分子にハイブリダイズする核酸分子は、他の核酸分子の「ハイブリダイズ可能な同族体」と言われる。従来の低ストリンジェンシー及び高ストリンジェンシー条件は、本明細書において、並びにＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）及びＨａｙｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ（１９８５）により説明されている。完全相補性からの逸脱は、そのような逸脱が二本鎖構造を形成する分子の能力を完全に排除しない限り、許容され得る。
【００６８】
低ストリンジェンシー条件は、標的核酸配列に対するより低い配列同一性を有する核酸配列を選択するために使用され得る。約２０℃〜約５５℃の範囲の温度で約０．１５Ｍ〜約０．９Ｍの塩化ナトリウム等の条件を採用することが望ましい場合がある。高ストリンジェンシー条件は、開示された核酸配列に対するより高い同一性の程度を有する核酸配列を選択するために使用され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。高ストリンジェンシー条件は、典型的には、約２×〜約１０×ＳＳＣ（３Ｍ塩化ナトリウム及び０．３Ｍクエン酸ナトリウムを含む２０×ＳＳＣ原液、ｐＨ７．０から蒸留水中に希釈）、約２．５×〜約５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液（蒸留水中、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン、１％（ｗ／ｖ）フィコール、及び１％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドンを含有する５０×原液から希釈）、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの魚精子ＤＮＡ、並びに約０．０２％（ｗ／ｖ）〜約０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中、約５０℃〜約７０℃で数時間〜一晩のインキュベーション下での核酸ハイブリダイゼーションを含む。高ストリンジェンシー条件は、好ましくは、５５℃で数時間のインキュベーション下での６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１００ｍｇ／ｍＬの魚精子ＤＮＡ、及び０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳにより提供される。ハイブリダイゼーションに続いて、一般にいくつかの洗浄ステップが行われる。洗浄組成物は、一般に、約２０℃〜約７０℃で１５分間のインキュベーション下での、０．５×〜約１０×ＳＳＣ及び０．０１％（ｗ／ｖ）〜約０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む。好ましくは、核酸セグメントは、０．１×ＳＳＣ中６５℃で少なくとも１回の洗浄後、ハイブリダイズした状態を維持する。
【００６９】
同一性スコアを使用した配列類似性の分析
本明細書において使用される場合、「配列同一性」とは、２つの最適に整列したポリヌクレオチド又はペプチド配列が、成分、例えばヌクレオチド又はアミノ酸の整列のウィンドウ全体にわたり不変である程度を指す。試験配列及び参照配列の整列セグメントの「同一性割合」は、２つの整列した配列により共有される同一成分の数を、参照配列セグメント、すなわち参照配列全体又は参照配列のより小さい所定の部分における成分の総数で除した値である。
【００７０】
本明細書において使用される場合、「配列同一性パーセント」又は「同一性パーセント」という用語は、２つの配列が最適に整列した場合の、試験（「対象」）ポリヌクレオチド分子（又はその相補鎖）と比較した、参照（「クエリ」）ポリヌクレオチド分子（又はその相補鎖）の直線ポリヌクレオチド配列における同一ヌクレオチドのパーセンテージを指す（比較ウィンドウにわたり、適切なヌクレオチド挿入、欠失、又はギャップは合計して参照配列の２０パーセント未満である）。比較ウィンドウを整列させるための配列の最適な整列は、当業者に周知であり、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎの局所的ホモロジーアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのホモロジー整列アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎの類似性検索方法等のツールによって、並びに好ましくはＧＣＧ（登録商標）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（登録商標）（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）の一部として利用可能なＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ等のアルゴリズムのコンピュータ実装により行われてもよい。試験配列及び参照配列の整列セグメントの「同一性割合」は、２つの整列した配列により共有される同一成分の数を、参照配列セグメント、すなわち参照配列全体又は参照配列のより小さい所定の部分における成分の総数で除した値である。配列同一性パーセントは、１００を乗じた同一性割合として表される。１つ以上のポリヌクレオチド配列の比較は、全長ポリヌクレオチド配列若しくはその一部、又はより長いポリヌクレオチド配列にわたってもよい。本開示の目的において、「同一性パーセント」はまた、翻訳されたヌクレオチド配列に対してはＢＬＡＳＴＸバージョン２．０、及びポリヌクレオチド配列に対してはＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を使用して決定され得る。
【００７１】
配列同一性のパーセントは、好ましくは、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（商標）（Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）の「Ｂｅｓｔ  Ｆｉｔ」又は「Ｇａｐ」プログラムを使用して決定される。「Ｇａｐ」は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４８：４４３−４５３，１９７０）のアルゴリズムを利用して、マッチの数を最大化してギャップの数を最小化する２つの配列の整列を見つける。「ＢｅｓｔＦｉｔ」は、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  Ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ，２：４８２−４８９，１９８１、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１：２２０５−２２２０，１９８３）の局所的ホモロジーアルゴリズムを使用して、２つの配列間の類似性の最善のセグメントの最適な整列を実行し、マッチの数を最大化するためにギャップを挿入する。同一性パーセントは、最も好ましくは、「Ｂｅｓｔ  Ｆｉｔ」プログラムを使用して決定される。
【００７２】
配列同一性を決定するための有用な方法はまた、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）から公的に利用可能なＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）プログラムに開示されている。ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＣＢＩ，ＮＬＭ，ＮＩＨ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）を参照されたい。ＢＬＡＳＴプログラムのバージョン２．０以降では、整列内にギャップ（欠失及び挿入）を導入することができる。ペプチド配列については、ＢＬＡＳＴＸを使用して配列同一性を決定することができ、ポリヌクレオチド配列についてＢＬＡＳＴＮを使用して配列同一性を決定することができる。
【００７３】
本明細書において使用される場合、「実質的な配列同一性パーセント」という用語は、少なくとも約７０％の配列同一性、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、又はさらにより高い配列同一性、例えば約９８％若しくは約９９％の配列同一性の配列同一性パーセントを指す。したがって、本開示の一実施形態は、本明細書に記載のポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％の配列同一性、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、又はさらにより高い配列同一性、例えば約９８％若しくは約９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド分子である。本開示のＡＣＳ及びＣＳ遺伝子の活性を有するポリヌクレオチド分子は、様々なカプサイシノイドの生成を導くことができ、本明細書において提供されるポリヌクレオチド配列に対して実質的な配列同一性パーセントを有し、本開示の範囲内に包含される。
【００７４】
「相同性」とは、位置同一性（すなわち配列類似性又は同一性）のパーセントに関する２つ以上の核酸又はアミノ酸配列間の類似性のレベルを指す。相同性はまた、異なる核酸又はタンパク質間の類似の官能特性の概念を指す。
【００７５】
代替の実施形態において、核酸分子は、配列番号１〜配列番号９、若しくは本明細書に記載の任意の他の核酸配列、それらの任意の補体、それらの任意の断片、又はそれらの任意のシスエレメントからなる群から選択される核酸分子に対して、７０％以上の同一性、より好ましくは少なくとも８０％以上、８５％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を示す核酸配列を含む。核酸分子は、好ましくは、配列番号１〜配列番号９、若しくは本明細書に記載の任意の他の核酸配列、それらの任意の補体、それらの任意の断片、又はそれらの任意のシスエレメントからなる群から選択される核酸分子に対して７５％以上の同一性を示す核酸配列を含む。核酸分子は、より好ましくは、配列番号１〜配列番号９、若しくは本明細書に記載の任意の他の核酸配列、それらの任意の補体、それらの任意の断片、又はそれらの任意のシスエレメントからなる群から選択される核酸分子に対して８０％以上の同一性を示す核酸配列を含む。核酸分子は、最も好ましくは、配列番号１〜配列番号９、若しくは本明細書に記載の任意の他の核酸配列、それらの任意の補体、それらの任意の断片、又はそれらの任意のシスエレメントからなる群から選択される核酸分子に対して８５％以上の同一性を示す核酸配列を含む。
【００７６】
本開示の目的において、「同一性パーセント」はまた、翻訳されたヌクレオチド配列についてはＢＬＡＳＴＸバージョン２．０、及びポリヌクレオチド配列についてはＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を使用して決定され得る。本開示の好ましい実施形態では、本明細書において開示されるトウモロコシゲノムプロモーター配列は、それぞれのホモログに関して２００超のＢＬＡＳＴスコア、好ましくは３００超のＢＬＡＳＴスコア、さらにより好ましくは４００超のＢＬＡＳＴスコアを有する核酸分子又は断片を含む。
【００７７】
本開示の別の実施形態によれば、微生物系における異種タンパク質生成の効率は、生成される最終的ポリペプチドを変化させることなく、発現に使用される細胞系に好ましくなり得るが元の遺伝子源生物とは異なるものにＤＮＡ配列を改変するコドン変化により向上され得る。この問題を克服するために通常使用されるアプローチには、稀なコドンを除去するための標的化突然変異誘発、又は目的のポリペプチドを生成する宿主生物によって好まれるコドン配列に指向させるための特定の細胞株における稀なコドンｔＲＮＡの付加が含まれる。近年、そのような「コドン最適化」技術における改善は、合成遺伝子の費用効果の高い生成を可能にし、それによってこれは本発明のために実行可能な代替物及び潜在的に有用なものとなる。
【００７８】
同一性及び類似性
同一性は、配列の整列（配列情報若しくは構造情報のみ、又はいくつかの他の情報を使用して行うことができるが、通常は配列情報のみに基づく）後に配列の対の間で同じであるアミノ酸の割合であり、類似性は、いくつかの類似性マトリックスを使用した整合に基づいて割り当てられたスコアである。類似性指数は、タンパク質の配列整列のために当業者により使用される以下のＢＬＯＳＵＭ６２、ＰＡＭ２５０、若しくはＧＯＮＮＥＴ、又は任意のマトリックスのうちのいずれか１つであり得る。
【００７９】
同一性は、２つの下位配列間の対応度である（配列間にギャップはない）。２５％以上の同一性は、機能の類似性を示し、１８〜２５％は構造又は機能の類似性を示す。２つの完全に無関係な又はランダム配列（１００残基を超える）が２０％超の同一性を有し得ることに留意されたい。類似性は、それらが比較された場合の２つの配列間の類似度である。これは、それらの同一性に依存する。
【００８０】
前述の説明から明らかであるように、本開示のある特定の態様は、本明細書において例示される実施例の詳細によって限定されず、したがって、当業者は、他の修正及び用途、又はそれらの等価物を思いつくことが企図される。したがって、特許請求の範囲は、本開示の趣旨及び範囲から逸脱しない全てのそのような修正及び用途を網羅するものであることが意図される。
【００８１】
更に、別段の定義がない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載される、又はそれらと同様若しくは同等であるいずれの方法及び材料も、本開示の実践又は試験に使用され得るが、好ましい方法及び材料が上で説明されている。
【００８２】
上記発明は、理解の目的のために例証及び例示としてある程度詳細に説明されているが、ある特定の変更及び修正が実践され得ることが当業者には明らかであろう。したがって、説明及び実施例は、添付の特許請求の範囲により説明される本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。
【００８３】
したがって、８−メチルノナン酸の生成を提供する本明細書における本発明の実施形態は、本発明の原理の例示であることを理解されたい。上記の説明から、開示される生成方法及び選択された微生物株の要素の形態、使用方法、及び要素の用途の変更が、本発明の趣旨から逸脱することなく使用され得ることが明らかであろう。
【実施例】
【００８４】
実施例１
異なる経路のクローニング及び特徴付け
以前に、様々なカプサイシノイドが脂肪酸及びバニリルアミン／バニリンの供給後に生成され得る、Ｅ．ｃｏｌｉ発酵プラットフォームが開発された（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）。ノニバミドの生成もまた、この系によって実証された。本開示では、この系を使用して、３つのＣａｐｓｉｃｕｍアシル−ＡＣＰチオエステラーゼを完全に配列し、特徴付け、それにより８Ｍ生合成におけるそれらの役割を解明した。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるそれらの発現を促進するために、一過性ペプチドのない成熟タンパク質をコードするヌクレオチド配列を、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムに対してコドン最適化し、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって合成した。合成された遺伝子をｐＣＤＦＤｕｅｔ−１ベクター（Ｓｐｅｃｔ＋）にクローニングし、インビトロ及びインビボ研究の両方に対してＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。
【００８５】
図２に示されるように、ＦａｔＡ（図２のＴＥ１）が、長鎖アシル−ＣｏＡチオエステラーゼである一方で、ＦａｔＢは、中鎖アシル−ＣｏＡを選ぶ（図２のＴＥ２）。ＦａｔＡよりもＦａｔＢが、８Ｍ生合成に関与すると思われる。この結論は、細胞培養物における脂肪酸組成の分析によって裏付けられる（図３）。ピーク１は、この保持時間及び質量スペクトルをＳｉｇｍａからのシス−５ドデセン酸標準のものと比較することによって、シス−５ドデセン酸（図４）として同定した。図３に示されるように、シス−５−ドデセン酸は、ＦａｔＢ及びＦａｔＢ２によって生成され、８Ｍ生成への関与を確認する。
【００８６】
植物並びに細菌において、ＫＡＳ  ＩＩＩ（β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩＩ、ＦａｂＨ）が、脂肪酸生合成経路における初期ステップであるアセチル−ＣｏＡ及びマロニル−ＣｏＡの縮合を触媒する一方で、ＫＡＳ  Ｉは、脂肪酸伸長に関与する。８Ｍ生合成経路において、ＫＡＳ  ＩＩＩ酵素は、基質としてイソブチリル−ＣｏＡを受容することが可能でなければならない（図１）。しかしながら、そのような酵素は、植物界では同定されていないが、基質としてイソブチリル−ＣｏＡを使用する細菌ＫＡＳＩＩＩ酵素は、十分に特徴付けられている（Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．２０１３、Ｈａｕｓｈａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１４、Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１５、Ｔａｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１５、Ｂｅｎｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．２０１６）。
【００８７】
バイオインフォマティクスアプローチ（Ｍａｚｏｕｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００９））を使用することで、唐辛子からＫＡＳ  ＩＩＩａ（ＥＵ６１６５６９）及びＫＡＳ  ＩＩＩｂ（ＥＵ６１６５７０）遺伝子を単離した。しかしながら、それらの酵素活性及び８Ｍ生合成における役割は、報告されていない。本開示では、これらの２つのＫＡＳ  ＩＩＩ酵素を、８Ｍ生合成におけるそれらの役割を理解するために特徴付けた。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるそれらの発現を促進するために、一過性ペプチドのない成熟タンパク質をコードするヌクレオチド配列を、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムに対してコドン最適化し、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって合成した（それぞれ、配列番号６及び７）。合成された遺伝子をｐＲＳＦＤｕｅｔ−１ベクター（Ｋａｎ＋）にクローニングし、インビボ研究のためにｐＣＤＦＤｕｅｔ−ＦａｔＢ又はｐＣＤＦＤｕｅｔ−ＦａｔＢ２を含有するＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。
【００８８】
しかしながら、ＫＡＳ  ＩＩＩａ／ＫＡＳ  ＩＩＩｂがＢＬ２１（ＤＥ３）細胞においてＦａｔＢ／ＦａｔＢ２と共発現させた場合、８Ｍは、１ｍＭのＩＰＴＧによる誘発後に生成されず（データは示さず）、内因性イソブチリル−ＣｏＡ濃度が８Ｍ生合成を支持するには低すぎる可能性があることを示唆している。ｂｋｄオペロンをＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８のゲノムからクローニングし、ケトイソ吉草酸デヒドロゲナーゼ（図１）をｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクター（ＡＭＰ＋）にコードし、ｂｋｄをＫＡＳ  ＩＩＩａ／ＫＡＳ  ＩＩＩｂ及びＢＬ２１（ＤＥ３）におけるＦａｔＢ／ＦａｔＢ２と共発現させた。ＩＰＴＧ−誘発後、１ｇ／Ｌのα−ケトイソ吉草酸（図１）を供給すると、８Ｍが生成された（図５及び６）。
【００８９】
別の例では、Ｈｕｍｕｌｕｓ  ｌｕｐｕｌｕｓ由来のＣＣＬ４遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＧＡ１７９２１．１）を、Ｅ．ｃｏｌｉのゲノムに対するコドン最適化を用いて合成した。ＣＣＬ４は、イソ酪酸をイソブチリル−ＣｏＡに変換するイソブチリル−ＣｏＡシンセターゼをコードする（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。ＣＣＬ４をｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクター（ＡＭＰ＋）にクローニングし、ＣＣＬ４をＫＡＳ  ＩＩＩａ／ＫＡＳ  ＩＩＩｂ及びＢＬ２１（ＤＥ３）におけるＦａｔＢ／ＦａｔＢ２と共発現させた。ＩＰＴＧ誘発後、１ｇ／Ｌのイソ酪酸を供給すると、８Ｍが生成された（図７）。配列番号６及び７は、唐辛子由来の最適化されたＫＡＳ核酸配列を表す。ＫＡＳ  ＩＩＩａ（ＥＵ６１６５６９）及びＫＡＳ  ＩＩＩｂ（ＥＵ６１６５７０）は、唐辛子由来の遺伝子である。
【００９０】
別の実施例では、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ由来のＰＣＴ遺伝子（ＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ＿０１４０１５７０５．１）を、Ｅ．Ｃｏｌｉのゲノムに対するコドン最適化を用いて合成した。ＰＣＴは、イソ酪酸及びアセチル−ＣｏＡをイソブチリル−ＣｏＡ及びアセテートに変換するアセテートＣｏＡ−トランスフェラーゼをコードする（ＭｃＭａｈｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒａｔｈｅｒ，２０１４）。ＰＣＴをｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクター（ＡＭＰ＋）にクローニングし、ＰＣＴをＫＡＳ  ＩＩＩａ／ＫＡＳ  ＩＩＩｂ及びＢＬ２１（ＤＥ３）におけるＦａｔＢ／ＦａｔＢ２と共発現させた。ＩＰＴＧ誘発後、１ｇ／Ｌのイソ酪酸を供給すると、８Ｍが生成された。
【００９１】
別の例では、Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）の研究に基づき、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８のゲノム由来のａｌｓＳ及びｂｋｄ遺伝子を、それぞれＫＡＳ  ＩＩＩａ／ＫＡＳ  ＩＩＩｂ  ｐＲＳＦＤｕｅｔ−１ベクターと共にｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクターにクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉのゲノム由来のｉｌｖＣ及びｉｌｖＤ遺伝子を、それぞれｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１ベクター（ＣＭ＋）の２つの多重クローニング部位にクローニングした（図８）。ａｌｓＳ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＤ、ｂｋｄ、及びＫＡＳ  ＩＩＩａ／ＫＡＳ  ＩＩＩｂ遺伝子をＢＬ２１（ＤＥ３）におけるＦａｔＢ／ＦａｔＢ２と共発現させた場合、ＩＰＴＧ誘発後、８Ｍがデノボ経路から生成された。
【００９２】
発現
上記のように、８Ｍを生成するために、出願者らは、最初に、イソブチリル−ＣｏＡを作製する３つの方法、即ち、デノボ、ＡＣＳ（ＡＡＥ）、又はＰＣＴ経路を使用した。次いで、イソブチリル−ＣｏＡを、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉなどの微生物宿主の脂肪酸伸長サイクルに入るためにＫＡＳ  ＩＩＩａ又はＫＡＳ  ＩＩＩｂによって使用した。３回の伸長後、８ＭをＦａｔＢ又はＦａｔＢ２によって放出した。ｐＲＳＦＤｕｅｔ−１を使用してＫＡＳ  ＩＩＩａ又はＫＡＳ  ＩＩＩｂを発現させ、ｐＣＤＦＤｕｅｔ−１を使用してＦａｔＢ又はＦａｔＢ２を発現させ、ｐＥＴＤｕｅｔ−１を使用してＡＣＳ（ＡＡＥ）又はＰＣＴを発現させ、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔを使用してｉｌｖＣ及びｉｌｖＤを発現させ、ｐＥＴＤｕｅｔを使用してｂｋｄを発現させ、ｐＲＳＦＤｕｅｔ−１を使用してａｌｓＳ及びＫＡＳ  ＩＩＩａを発現させた。（配列番号１〜９を参照）。ＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）において形質転換された培養物をＩＰＴＧによって誘発した。ＡＣＳ又はＰＣＴ経路を８Ｍ生成のために利用した場合、１ｇ／Ｌのイソ酪酸を培養物に供給した。脂肪酸をエチルアセテートで抽出し、メタノール中２．５％硫酸でメチル化した。脂肪酸のメチルエステルをヘキサンで抽出し、ＧＣ／ＭＳによって分析した。
【００９３】
製品分析
ＧＣ／ＭＳを使用して、メチル化後に脂肪酸組成物を分析した。ＧＣＭＳ−ＱＰ２０１０Ｓ検出器を有し、分析カラムがＳＨＲＸＩ−５ＭＳ（厚さ０．２５μｍ、長さ３０ｍ、直径０．２５ｍｍ）であるＳｈｉｍａｄｚｕ  ＧＣ−２０１０システムで、注入温度２６５℃においてＧＣ／ＭＳ分析を実施した。注入モードを分割し、炉内温度５０℃、温度勾配：０〜４分５０℃、４〜７．３分５０℃〜１００℃、１５の勾配、７．３〜１５．３分、１００℃〜２６０℃、２０の勾配であった。発酵生成物中の８Ｍ化合物の同一性及び存在を、その保持時間及び質量スペクトルをＣａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）から購入した８Ｍ標準のものと比較することによって確認した。それらは、同一であった。
【００９４】
８−メチルノナン酸の生成
図５に示されるように、培養系は、約１ｍｇ／Ｌの力価を有していた。８Ｍを生成するために、ＡＣＳ又はＰＣＴ、ＫＡＳＩＩＩａ又はＫＡＳＩＩＩｂ、及びＦａｔＢ又はＦａｔＢ２を過剰発現させるＥ．Ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）株のグリセロールストックからの培養物を、ＬＢ（ＡＭＰ＋Ｋａｎ＋Ｓｐｅｃｔ＋）プレートに画線し、３７℃で一晩インキュベートした。単一コロニーを採取して５ｍＬのＬＢ（ＡＭＰ＋Ｋａｎ＋Ｓｐｅｃｔ＋）液体培地に接種し、培養物を３７℃において一晩２５０ｒｐｍで振盪した。２０ｍＬのＬＢ（ＡＭＰ＋Ｋａｎ＋Ｓｐｅｃｔ＋）液体培地に２％の一晩培養物を接種し、ＯＤ６００が０．６に達するまで（通常３時間）、培養物を３７℃において２５０ｒｐｍで振盪した。次いで、培養物を３０℃まで冷却し、１ｍＭのＩＰＴＧを添加してタンパク質発現を誘発した。３時間後、１ｇ／Ｌのイソ酪酸を添加し、８Ｍ分析のために試料を採取した。
【００９５】
８Ｍの生成を分析するために、０．５ｍＬの培養物を０．５ｍＬのエチルアセテートで３０分間振盪しながら抽出した。１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、１００μＬのエチルアセテート相をガラス管に移し、窒素ガスで乾燥させた。１ｍＬの２．５％硫酸をメトナール中に入れ、管を６５℃の水浴中で６０分間インキュベートした。次いで、２ｍＬの０．９％ＮａＣｌ及び２ｍＬのヘキサンを添加して、脂肪酸のメチルエステルを抽出した。２５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上記の８Ｍ濃度の分析のためにヘキサン相をＧＣ／ＭＳに注入した。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
技術分野の記述
本開示は、食品、医薬、及び薬理学的産業における利用可能性を有する。本開示は、一般に、改変微生物株を介した８−メチルノナン酸の生合成生成のための方法に関する。
【００９７】
目的の配列
【００９８】
【表２】
0006986084.tif 000003
【００９９】
【表３】
0006986084.tif 000004
【０１００】
【表４】
0006986084.tif 000005
【０１０１】
【表５】
0006986084.tif 000006
【０１０２】
【表６】
0006986084.tif 000007
【０１０３】
引用文献及び参照により組み込まれる文献：
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７．Ｃａｔｃｈｐｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３），Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｉｌｉ，ｂｌａｃｋ  ｐｅｐｐｅｒ，ａｎｄ  ｇｉｎｇｅｒ  ｗｉｔｈ  ｎｅａｒ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ＣＯ２，ｐｒｏｐａｎｅ，ａｎｄ  ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｅｔｈｅｒ：ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｔｓ  ｂｙ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ，Ｊ．Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５１：４８５３−６０．
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９．Ｃｏｎｓｔａｎｔ  ＨＬ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６），Ｎｏｎｉｖａｍｉｄｅ，ａ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔ  ｏｆ  Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ｏｌｅｏｒｅｓｉｎ，Ｊ．Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，５９：４２５−２６．
１０．Ｃｒｏｍｂｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９５５）．Ａｍｉｄｅｓ  ｏｆ  ｖｅｇｅｔａｂｌｅ  ｏｒｉｇｉｎ．Ｐａｒｔ  ＶＩ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｃａｐｓａｉｃｉｎ，Ｊ．Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．，１０２５−２７．
１１．Ｃｕｒｒｙ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９９），Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ｆｏｒ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｃａｐｓａｉｃｉｎｏｉｄ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｅｎｅｓ  ａｒｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｐｕｎｇｅｎｔ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｐｕｎｇｅｎｔ  Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ｓｐｐ．，Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．１４８：４７−５７．
１２．Ｄｕ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１），Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｆａｃｔｏｒｉｅｓ  ｆｏｒ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｖａｌｕｅ−ａｄｄｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｊ  Ｉｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：８７３−９０．
１３．Ｆｌａｇａｎ  Ｓ．Ｆ．，Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｐｓａｉｃｉｎ  ａｎｄ  ｖａｎｉｌｌｙｌａｍｉｎｅ  ａｓ  ｇｒｏｗｔｈ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｂｙ  Ｃａｐｓｉｃｕｍ（ｈｏｔ  ｐｅｐｐｅｒ）−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ，Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ８（３）５６０−６５（２００６）．
１４．Ｇａｒｃｅｓ−Ｃｌａｖｅｒ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（２００７）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＳＮＰ）ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｕｎｇｅｎｃｙ  ｉｎ  Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ｓｐｐ．Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ  １１５：９０７−１６．
１５．Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊａｎ  ａｎｄ  Ｓａｔｈｙａｎａｒａｙａｎａ（１９９１），Ｃａｐｓｉｃｕｍ−ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａｎｄ  ｑｕａｌｉｔｙ．Ｐａｒｔ  Ｖ．Ｉｍｐａｃｔ  ｏｎ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ；ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｐｕｎｇｅｎｃｙ，ｐａｉｎ，ａｎｄ  ｄｅｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ２９（６）：４３５−７４．
１６．Ｈａｕｓｈａｌｔｅｒ  Ｒ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｅｉｓｏ−ｂｒａｎｃｈｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ；ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｂｉｏｆｕｅｌｓ  ｗｉｔｈ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｃｏｌｄ−ｆｌｏｗ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．２６：１１１−１８（２０１４）．
１７．Ｈａｕｓｌｅｒ  Ａ，ａｎｄ  Ｍｕｎｃｈ  Ｔ．，（１９９７），Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｆｌａｖｏｒｓ，ＡＳＭ  Ｎｅｗｓ  ６３：５５１−５９．
１８．Ｈｉｇａｓｈｉｇｕｃｈｉ  Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓｉｄｅｓ  ｏｆ  ｃａｐｓａｉｃｉｎ  ａｎｄ  ｄｉｈｙｄｒｏｃａｐｓａｉｃｉｎ  ｆｒｏｍ  ｖａｒｉｏｕｓ  Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ｆｒｕｉｔｓ，Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．５４：５９４８−５９５３．
１９．Ｈｏｗａｒｄ  Ｔ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｃｕｓｔｏｍｉｚｅｄ  ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ−ｒｅｐｌｉｃａ  ｆｕｅｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｂｙ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｒｅｅ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｐｏｏｌｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １１０：７６３６−４１（２０１３）．
２０．Ｊｉａｎｇ  Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｒａｎｃｈｅｄ−ｃｈａｉｎ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ｂｙ  ｒｅｐｌａｃｉｎｇ  β−ｋｅｔｏａｃｙｌ−（ａｃｙｌ−ｃａｒｒｉｅｒ−ｐｒｏｔｅｉｎ）ｓｙｎｔｈａｓｅ  ＩＩＩ（ＦａｂＨ），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．１１２：１６１３−２２（２０１５）．
２１．Ｊｏｒｄｔ  ＳＥ．ａｎｄ  Ｊｕｌｉｕｓ  Ｄ．，（２００２），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ「ｈｏｔ」ｃｈｉｌｉ  ｐｅｐｐｅｒｓ．Ｃｅｌｌ．１０８：４２１−３０．
２２．Ｋａｍｉｎａｇａ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｃａｔａｌｙｚｉｎｇ  ｇｌｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｕｒｃｕｍｉｎ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ  ｃｅｌｌｓ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５６７：１９７−２０２．
２３．Ｋｏｍｅｔａｎｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｇｌｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｐｓａｉｃｉｎ  ｂｙ  ｃｅｌｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７，２１９２−２１９３．
２４．Ｌｉａｎｇ  Ｙ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｐｓａｉｃｉｎｏｉｄｓ  ｌｏｗｅｒ  ｐｌａｓｍａ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈａｍｓｔｅｒｓ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｕｔｒ．５２：３７９−８８（２０１３）．
２５．Ｌｉｎｄｓｅｙ  Ｋ．ａｎｄ  Ｙｅｏｍａｎ  Ｍ．，Ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｓｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ  ｍｉｌｌ  ｃｖ．ａｎｎｕｕｍ．Ｐｌａｎｔａ  １６２  ４９５−５０１（１９８４）．
２６．ＭｃＭａｈｏｎ  Ｍ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｐｒａｔｈｅｒ  Ｋ．Ｌ．，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｒｅｖｅａｌ  ｔｈｉｏｅｓｔｅｒａｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｔｈａｔ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８０：１０４２−５０（２０１４）．
２７．Ｍａｚｏｕｒｅｋ，ｅｔ  ａｌ．，（２００９）．Ａ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｆｏｒ  Ｃａｐｓａｉｃｉｎｏｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．，１５０：１８０６−２１．
２８．Ｏｇａｗａ  Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃａｐｓａｉｃｉｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｕｎ１−ｅｎｃｏｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｏｌｅ  ａｓ  ａ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  ｏｆ  ｃａｐｓａｉｃｉｎｏｉｄ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｅｐｐｅｒ，ＢＭＣ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．１５：９３（２０１５）．
２９．Ｐｒａｓａｄ  ＢＣ．，（２００６），Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｐｓａｉｃｉｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｇｅｎｅ（ｃｓｙｌ）ｆｏｒ  ｐｕｎｇｅｎｃｙ  ｆａｃｔｏｒ  ｃａｐｓａｉｃｉｎ  ｉｎ  ｐｅｐｐｅｒ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ｓｐ．）．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１０３：１３３１５−２０．
３０．Ｐｒａｓａｄ  ＢＣ．ｅｔ  ａｌ．，（２００８．），Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｐｓａｉｃｉｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｇｅｎｅ（ｃｓｙｌ）ｆｏｒ  ｐｕｎｇｅｎｃｙ  ｆａｃｔｏｒ  ｃａｐｓａｉｃｉｎ  ｉｎ  ｐｅｐｐｅｒ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ｓｐ．）．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１０５：２０５５８．
３１．Ｑｉｎ  Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ  ａｎｄ  ｗｉｌｄ  ｐｅｐｐｅｒｓ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉａｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１１１：５１３５−４０（２０１４）．
３２．Ｒｅｉｌｌｙ  ＣＡ．ｅｔ  ａｌ．，（２００１），Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｐｓａｉｃｉｎ，ｄｉｈｙｄｒｏｃａｐｓａｉｃｉｎ，ａｎｄ  ｎｏｎｉｖａｍｉｄｅ  ｉｎ  ｓｅｌｆ−ｄｅｆｅｎｓｅ  ｗｅａｐｏｎｓ  ｂｙ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ．９１２：２５９−６７．
３３．Ｓｔｅｗａｒｔ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｔｈｅ  Ｐｕｎｌ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｐｕｎｇｅｎｃｙ  ｉｎ  ｐｅｐｐｅｒ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．４２：６７５−８８．
３４．Ｓｔｅｗａｒｔ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｐｕｎｇｅｎｃｙ  ｉｎ  Ｃ．ｃｈｉｎｅｎｓｅ  ｖｉａ  ｔｈｅ  Ｐｕｎｌ  ｌｏｃｕｓ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｏｔ．５８：９７９−９１．
３５．Ｓｈｉｍｏｄａ  Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｐｓａｉｃｉｎ  ａｎｄ  ８−ｎｏｒｄｉｈｙｄｒｏｃａｐｓａｉｃｉｎ  ｂｙ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６８：１３９１−９６．
３６．Ｓｈｏｃｋｅｙ  ＪＭ．Ｅｔ  ａ．，（２００３），Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｃｏｎｔａｉｎｓ  ａ  ｌａｒｇｅ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ａｃｙｌ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ：ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ｎｅｗ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ａｃｙｌ−ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １３２  １０６５−７６．
３７．Ｓｔｅｗａｒｔ  Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｐｕｎ１  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｐｕｎｇｅｎｃｙ  ｉｎ  ｐｅｐｐｅｒ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．４２：６７５−８８（２００５）．
３８．Ｓｕｚｕｋｉ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８０）Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｐｓａｉｃｉｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｎａｌｏｇｓ  ｃａｐｓａｉｃｉｎｏｉｄ  ｉｎ  Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ｆｒｕｉｔ，ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｌａｃｅｎｔａ  ｏｆ  Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｕｍ  ｖａｒ  ａｎｎｕｕｍ  ｃｖ．Ｋａｒａｙａｔｓｕｂｕｓａ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２１  ８３９−５３．
３９．Ｓｕｚｕｋｉ  Ｔ  ａｎｄ  Ｉｗａｉ  Ｋ，（１９８４），Ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ  ｏｆ  ｒｅｄ  ｐｅｐｐｅｒ  ｓｐｉｃｅｓ：ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｆｏｏｄ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｕｎｇｅｎｔ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｏｆ  Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｉｎ  Ａ  Ｂｒｏｓｓｉ，ｅｄ，ＴＨＥ  ＡＬＫＡＬＯＩＤＳ：ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ  ２３．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬ，ｐｐ  ２２７−９９．
４０．Ｔａｏ  Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  ｂｒａｎｃｈｅｄ−ｃｈａｉｎ  ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｌｏｗ−ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｆｕｅｌｓ．８：９２（２０１５）．
４１．Ｔｈｏｍａｓ  ＢＶ．Ｅｔ  ａｌ．，（１９９８），Ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｐｓａｉｃｉｎｏｉｄｓ  ｉｎ  ｐｅｐｐｅｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｇａｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，４６：２６５５−６３．
４２．Ｔｏｍｉｎａｇａ  Ｍ．ａｎｄ  Ｔｏｍｉｎａｇａ  Ｔ．，（２００５），Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＲＰＶ１，Ｐｆｌｕｇｅｒｓ  Ａｒｃｈ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．；４５１：１４３−５０．
４３．Ｘｕ  Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｒａｎｃｈｅｄ  ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ：ＣｏＡｓ  ｆｏｒ  ｂｉｔｔｅｒ  ａｃｉｄ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｈｏｐ  ｇｌａｎｄｕｌａｒ  ｔｒｉｃｈｏｍｅ，ＭＯＬ．，ＰＬＡＮＴ．６：１３０１−１７（２０１３）．
４４．Ｗａｌｓｈ  ａｎｄ  Ｈｏｏｔ，（２００１），Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｏｆ  Ｃａｐｓｉｃｕｍ（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）ｕｓｉｎｇ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｗｏ  ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ：Ｔｈｅ  ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ  ａｔｐＢ−ｒｂｃＬ  ｓｐａｃｅｒ  ｒｅｇｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｗａｘｙ  ｉｎｔｒｏｎｓ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．１６２：１４０９−１８．
４５．Ｗｅｂｅｒ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１４），Ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｖａｎｉｌｌｉｎ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ｃｈｉｎｅｎｓｅ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：２５．
４６．Ｙａｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４），Ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ  ｃａｒｂｏｎ  ｄｉｏｘｉｄｅ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｃｏｔｃｈ  Ｂｏｎｎｅｔ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｕｍ）ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｐｓａｉｃｉｎ  ａｎｄ  ｄｉｈｙｄｒｏｃａｐｓａｉｃｉｎ，Ｊ．Ａｇｒ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．４２：１３０３−０５．
【０１０４】
引用特許及び参照により組み込まれる特許：
１．Ｃｈｅｎ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｕｓｉｎｇ  ｃａｐｓａｉｃｉｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｐｓａｉｃｉｎｏｉｄｓ．国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１１７２９号
２．Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，０９４，７８２号
３．ＬａＨａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，４９３，８４８号
４．Ｚｈｏｕ  Ｒ．，ａｎｄ  Ｙｕ  Ｘ．，（２０１４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｍａｋｉｎｇ  ｖａｎｉｌｌｉｎ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｅｒｕｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｒｏｍ  ｅｕｇｅｎｏｌ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｐｌａｎｔ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ．国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６３９５２号
【図１】
0006986084.tif 000008
【図２】
0006986084.tif 000009
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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