(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブダペスト条約の下、２０１６年６月６日にＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎに寄託され、アクセッション番号ＤＳＭ  ３２３２３が付与された、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０である、単離された乳酸菌（ＬＡＢ）。
【請求項２】
配列番号１〜３に示される核酸配列のいずれかを有する、請求項１に記載の単離されたＬＡＢ。
【請求項３】
対象における気分障害もしくは神経学的状態を改善するため、および神経細胞のアポトーシスもしくは神経変性に関連する疾患を治療もしくは予防するための組成物であって、請求項１または２に記載のＬＡＢ細胞のタンパク質画分を含み、 かつ、配列番号４のアミノ酸配列を有するＥＦ−Ｔｕタンパク質を含む、組成物。
【請求項４】
請求項１もしくは２に記載のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０から成るＬＡＢ細胞、または、請求項１もしくは２に記載のＬＡＢのタンパク質画分を含み、かつ、配列番号４のアミノ酸配列を有するＥＦ−Ｔｕタンパク質、および食用担体もしくは薬学的に許容される担体を含む組成物であって、発酵ソーセージではない、組成物。
【請求項５】
栄養製品、栄養補助食品、食品または医薬品である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
粉末、懸濁液、顆粒、錠剤、丸薬、カプセル、飲料、または乳製品である、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
対象における気分障害もしくは神経学的状態を改善するため、および神経細胞のアポトーシスもしくは神経変性に関連する疾患を治療もしくは予防するための医薬の製造における、請求項１もしくは２に記載のＬＡＢ細胞、配列番号４のアミノ酸配列を有するＥＦ−Ｔｕタンパク質、請求項３に記載のタンパク質画分、または請求項４に記載の組成物の使用。
【請求項８】
ＬＡＢ細胞が約１０５から約１０１３コロニー形成単位（ｃｆｕ）の範囲の量である、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
ＬＡＢ細胞が約１０６から約１０１２ｃｆｕの範囲の量である、請求項７に記載の使用。
【請求項１０】
タンパク質画分が約１５ｍｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇの範囲の量である、請求項７に記載の使用。
【請求項１１】
タンパク質画分が約４０ｍｇ／ｋｇから約３００ｍｇ／ｋｇの範囲の量である、請求項７に記載の使用。
【請求項１２】
ＥＦ−Ｔｕタンパク質が約１５μｇ／ｋｇから約５００μｇ／ｋｇの範囲の量である、請求項７に記載の使用。
【請求項１３】
気分障害および神経学的状態が、不安、鬱、ストレス、睡眠障害、認知機能低下、認知機能障害（軽度認知機能障害（ＭＣＩ）を含む）、記憶力低下、一般的な想起の問題、認知障害、または神経変性疾患である、請求項７に記載の使用。
【請求項１４】
ストレスが慢性的な軽度のストレスである、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
気分障害および神経学的状態が、不安、鬱、ストレス、または睡眠障害である、請求項７に記載の使用。
【請求項１６】
神経変性疾患がアルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、認知症、筋萎縮性側索硬化症、脳卒中または統合失調症である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１７】
神経細胞のアポトーシスまたは神経変性に関連する疾患が、脳卒中、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、ピック病、クロイツフェルトヤコブ病、パーキンソンＡＬＳ認知症複合、ウィルソン病、多発性硬化症、進行性核上性麻痺、神経障害性疼痛関連双極性障害、皮質基底核変性症、統合失調症、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、認知症、筋萎縮性側索硬化症、網膜疾患、てんかん、卒中、一過性虚血発作、心筋虚血、筋虚血、脳への血流の長期の不通に関する外科的手法により引き起こされる虚血、頭部外傷、脊髄外傷、低酸素、または鬱である、請求項７に記載の使用。
【請求項１８】
ＬＡＢ細胞、ＥＦ−Ｔｕタンパク質、タンパク質画分または組成物が、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の発現を低下させるか、トリプトファンのキヌレニンへの代謝回転速度を下げるか、セロトニンレベルを増やすか、または血漿コルチコステロン濃度を下げることができる、請求項７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明はプロバイオティクスおよびそれを含む組成物に関する。特に、本発明は新規乳酸菌ならびに、気分障害もしくは神経学的状態の改善および神経細胞のアポトーシスもしくは神経変性に関連する疾患の治療もしくは予防におけるその特定の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
発酵食品は、乳酸菌（ＬＡＢ）を含む様々な有用な細菌を含む。牛乳、パン、野菜、および他の食用植物材料を含む、発酵食品の製造において、ＬＡＢの様々な菌株が使用されている。ＬＡＢは発酵食品の生産に一般的に使用されている一群のグラム陽性菌である。食事および臨床応用におけるＬＡＢの利点が広く研究されてきた。ＬＡＢは、低いｐＨおよびその発酵活動の間に生成される発酵生成物の作用を利用して、腐敗細菌の増殖を抑制するために、食品の保存のための発酵剤として利用されてきた。この目的のために、ＬＡＢは、チーズ、ヨーグルトおよび他の乳汁由来の発酵乳製品などの、様々な異なる食料を調製するために使用されてきた。ＬＡＢが摂取時にヒトや動物に価値ある特性を示すことが判明したことで、それは大きな注目を集めてきた。特に、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）またはビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の特定の株は腸粘膜にコロニーを形成することができ、そしてヒトおよび動物の福祉の維持を助け得ることがわかっている。抗炎症活性および免疫調節活性は、ＬＡＢのよく知られた特徴である。特許文献１は、微生物とそれらがコロニーを形成する宿主との相互作用を解明するための、そしてさらには、そのような株によって示されるプロバイオティック特性の基礎を解明するためのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ株のＤＮＡ配列、特にそのゲノム配列の使用に関する。
【０００３】
世界的に増加している精神障害は、すでに障害の主要原因の１つにランクされている。気分障害は一般的、慢性的な精神疾患である。人の気分が強度および／またはタイプの両方において持続的な極端な状態によって特徴付けられる場合、その人は、情動障害としても知られている気分障害を患っているとみなされ得る。睡眠障害は、気分障害の急性エピソードを有する患者において最も一般的な症状の１つであり、気分障害を有する患者は、寛解期間中でさえも、一般集団よりも高い割合の睡眠障害を示す（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第７８７５４２１号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．２００６  Ｄｅｃ；２９（４）：１００９−３２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ストレス反応の調節に関与する主要な生理学的系の１つは、視床下部−下垂体−副腎である。様々なストレス性の刺激が、視床下部−下垂体−副腎系を活性化して循環系にグルココルチコイドを放出させることが知られている。グルココルチコイドは、ストレスに対する体の反応の重要不可欠なホルモンメディエーターであり、疾患を促進するストレスの能力において役割を担うと推測されている。乳酸菌は、健康な腸を維持する上での役割について十分に実証されている。しかしながら、腸の外側で起こる疾患の軽減における胃腸内微生物叢の役割が、多くの注目を集めている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
本発明は、新規乳酸菌（ＬＡＢ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ（ラクトバチルス・ファーメンタム）ＰＳ１５０に関し、前記ＬＡＢによって産生される生物活性タンパク質は、気分障害または神経学的状態を改善し、神経変性疾患を治療または予防するのに有利な効果を有する。
【０００８】
本発明は、配列番号１〜３に示される核酸配列のいずれかを有する、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＰＳ１５０（ＰＳ１５０）である、単離されたＬＡＢを提供する。本発明はまた、ブダペスト条約の下、２０１６年６月６日にＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎに寄託され、アクセッション番号ＤＳＭ  ３２３２３が付与された、単離されたＬＡＢも提供する。
【０００９】
本発明はまた、ＰＳ１５０細胞の細胞外タンパク質から得られ、配列番号４のアミノ酸配列を有するＥＦ−Ｔｕタンパク質を含む、タンパク質画分も提供する。驚くべきことに、本発明は第一に、ＥＦ−Ｔｕタンパク質が気分障害、神経学的状態および神経変性疾患の改善に有効であることを同定する。
【００１０】
本発明はまた、ＰＳ１５０細胞、本発明のＥＦ−Ｔｕタンパク質または本発明のＰＳ１５０のタンパク質画分、および場合により食用担体または薬学的に許容される担体を含む組成物も提供する。本発明の組成物は投与、特に経口投与に適した任意の形態であり得る。これには例えば、固体、半固体、液体、および粉末が含まれる。
【００１１】
本発明はまた、気分障害もしくは神経学的状態の改善、または神経細胞のアポトーシスもしくは神経変性に関連する疾患の治療もしくは予防のための調製物の製造における、本発明のＰＳ１５０細胞もしくはそれを含有する組成物の使用も提供する。１つの実施態様において、ＰＳ１５０細胞は、約１０５から約１０１３コロニー形成単位（ｃｆｕ）の範囲の量である。本発明はさらに、気分障害または神経学的状態の改善、あるいは神経細胞のアポトーシスまたは神経変性に関連する疾患の治療または予防のための調製物の製造における、本発明のタンパク質画分またはそれを含有する組成物の使用を提供する。１つの実施態様において、タンパク質画分は約１５ｍｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇの範囲の量である。本発明はさらに、気分障害または神経学的状態の改善、あるいは神経細胞のアポトーシスまたは神経変性に関連する疾患の治療または予防のための調製物の製造における、ＥＦ−Ｔｕタンパク質またはそれを含有する組成物の使用を提供する。
【００１２】
気分障害または神経学的状態の態様は、不安、鬱、ストレスおよび脳の認知を含むが、これらに限定されない。
【００１３】
図面の簡単な説明
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１（ａ）および（ｂ）は、ラットの不安行動が、４週間の慢性軽度ストレスプロトコルの後に、高架式十字迷路を用いて評価されることを示す；（ａ）ラットにおいて、高架式十字迷路で観察されたオープンアームへの侵入数；（ｂ）クローズドアームで過ごされた時間とオープンアームで過ごされた時間の比率。ラットをケージ内に静置した未処置の対照群。ラットに慢性的な軽度のストレスを与え、２００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）を与えたネガティブコントロール。ラットに慢性的な軽度のストレスを与え、０．０４５ｍｇ／ｋｇのアルプラゾラムを含む２００μＬのＰＢＳを与えたポジティブコントロール。ラットに慢性的な軽度のストレスを与え、１×１０９ｃｆｕの生存可能なＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０を含むＰＢＳ２００μＬを与えたＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０群。ラットに慢性的な軽度のストレスを与え、３００ｍｇ／ｋｇのタンパク質を含む２００μＬのＰＢＳを与えたＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０のタンパク質画分群。エラーバーは、平均の標準誤差を表す；ｎ＝６。ａｂ異なる群間における、ＥＰＭのオープンアームへのラットの侵入数（ａ）およびオープンアームで過ごした時間に対するクローズドアームで過ごした時間の比率（ｂ）の有意差；Ｐ＜０．０５。
【図２】図２は、４週間の慢性軽度ストレスプロトコル後における、オープンフィールド試験を用いたラットの不安関連行動の測定を示す。５分間のオープンフィールド試験中にラットで観察された探索および不動の期間。ラットをケージ内に静置した未処置対照群。ラットに慢性的な軽度のストレスを与え、２００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）を与えたネガティブコントロール。ラットに慢性的な軽度のストレスを与え、０．０４５ｍｇ／ｋｇのアルプラゾラムを含む２００μＬのＰＢＳを与えたポジティブコントロール。ラットに慢性的な軽度のストレスを与え、１×１０９ｃｆｕの生存可能なＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０を含むＰＢＳ２００μＬを与えたＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０群。ラットに慢性的な軽度のストレスを与え、３００ｍｇ／ｋｇのタンパク質を含む２００μＬのＰＢＳを与えたＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０のタンパク質画分群。エラーバーは、平均の標準誤差を表す；ｎ＝６。ａｂ異なる群間における、ラットの探索および不動の期間の有意差；Ｐ＜０．０５。
【図３】図３は、４週間の慢性軽度ストレスプロトコル後に、強制水泳試験を用いてラットにおいて観察された鬱関連行動の測定を示す。５分間の強制水泳試験の間にラットが不動であった時間が記録される。ラットをケージ内に静置した未処置対照群。ラットに慢性的な軽度のストレスを与え、２００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）を与えたネガティブコントロール。ラットに慢性的な軽度のストレスを与え、０．０４５ｍｇ／ｋｇのアルプラゾラムを含む２００μＬのＰＢＳを与えたポジティブコントロール。ラットに慢性的な軽度のストレスを与え、１×１０９ｃｆｕの生存可能なＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０を含むＰＢＳ２００μＬを与えたＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０群。ラットに慢性的な軽度のストレスを与え、３００ｍｇ／ｋｇのタンパク質を含む２００μＬのＰＢＳを与えたＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０のタンパク質画分群。エラーバーは、平均の標準誤差を表す；ｎ＝６。ａｂ異なる群間における、ラットが不動のままで過ごした時間の有意差；Ｐ＜０．０５。
【図４】図４は、４週間の慢性軽度ストレスプロトコルの後にラットで観察された血漿コルチコステロンレベルの濃度を示す。ラットをケージ内に静置した未処置対照群。ラットに慢性的な軽度のストレスを与え、２００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）を与えたネガティブコントロール。ラットに慢性的な軽度のストレスを与え、０．０４５ｍｇ／ｋｇのアルプラゾラムを含む２００μＬのＰＢＳを与えたポジティブコントロール。ラットに慢性的な軽度のストレスを与え、１×１０９ｃｆｕの生存可能なＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０を含むＰＢＳ２００μＬを与えたＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０群。ラットに慢性的な軽度のストレスを与え、３００ｍｇ／ｋｇのタンパク質を含む２００μＬのＰＢＳを与えたＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０のタンパク質画分群。エラーバーは、平均の標準誤差を表す；ｎ＝６。ａｂｃｄ異なる群間における、ラットのコルチコステロンレベルの有意差；Ｐ＜０．０５。
【図５】図５は、４週間の慢性軽度ストレスプロトコルの後における、ラットの血漿ＴＮＦアルファとインターロイキン−１０レベルの比を示す。ラットをケージ内に静置した未処置対照群。ラットに慢性的な軽度のストレスを与え、２００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）を与えたネガティブコントロール。ラットに慢性的な軽度のストレスを与え、０．０４５ｍｇ／ｋｇのアルプラゾラムを含む２００μＬのＰＢＳを与えたポジティブコントロール。ラットに慢性的な軽度のストレスを与え、１×１０９ｃｆｕの生存可能なＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０を含むＰＢＳ２００μＬを与えたＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０群。ラットに慢性的な軽度のストレスを与え、３００ｍｇ／ｋｇのタンパク質を含む２００μＬのＰＢＳを与えたＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０のタンパク質画分群。エラーバーは、平均の標準誤差を表す；ｎ＝６。ａｂｃｄ異なる群間における、ラットの血漿ＴＮＦアルファとインターロイキン−１０レベルの比の有意差；Ｐ＜０．０５。
【００１５】
【図６】図６（ａ）および（ｂ）は、４週間の慢性軽度ストレスプロトコル後に、モーリス水迷路および新規オブジェクト認識テストを用いて、ラットにおいて観察された記憶および認知機能評価を示す；（ａ）モーリス水迷路におけるラットの脱出時間；（ｂ）新規オブジェクト認識テストにおけるラットの識別指数。ラットをケージ内で静置した未処置対照群；ラットに慢性的な軽度のストレスを課し、２００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）を与えたネガティブコントロール；ラットに慢性的な軽度のストレスを課し、０．０４５ｍｇ／ｋｇのアルプラゾラムを含む２００μＬのＰＢＳを与えたポジティブコントロール；ラットに慢性的な軽度のストレスを課し、１×１０９ｃｆｕの生存可能なＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０を含む２００μＬのＰＢＳを与えたＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０群；ラットに慢性的な軽度のストレスを課し、３００ｍｇ／ｋｇのタンパク質を含む２００μＬのＰＢＳを与えたＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０タンパク質画分群。エラーバーは、平均の標準誤差を表す；ｎ＝６。ａｂ異なる群間におけるラットの脱出時間（ａ）および識別指数（ｂ）の有意差；Ｐ＜０．０５。
【図７】図７（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、４週間の慢性軽度ストレスプロトコル後のラットにおける、血漿インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）（ａ）、トリプトファン（ｂ）およびキヌレニン（ｃ）を示している。ラットをケージ内で静置した未処置対照群；ラットに慢性的な軽度のストレスを課し、２００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）を与えたネガティブコントロール；ラットに慢性的な軽度のストレスを課し、０．０４５ｍｇ／ｋｇのアルプラゾラムを含む２００μＬのＰＢＳを与えたポジティブコントロール；ラットに慢性的な軽度のストレスを課し、１×１０９ｃｆｕの生存可能なＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０を含む２００μＬのＰＢＳを与えたＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０群；ラットに慢性的な軽度のストレスを課し、３００ｍｇ／ｋｇのタンパク質を含む２００μＬのＰＢＳを与えたＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０タンパク質画分群。エラーバーは、平均の標準誤差を表す；ｎ＝６。ａｂ異なる群間における、血漿ＩＤＯ（ａ）、トリプトファン（ｂ）、およびキヌレニン（ｃ）濃度の有意差；Ｐ＜０．０５。
【図８】図８は、４週間の慢性軽度ストレスプロトコル後におけるラットの脳内のセロトニン濃度を示している。ラットをケージ内で静置した未処置対照群；ラットに慢性的な軽度のストレスを課し、２００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）を与えたネガティブコントロール；ラットに慢性的な軽度のストレスを課し、０．０４５ｍｇ／ｋｇのアルプラゾラムを含む２００μＬのＰＢＳを与えたポジティブコントロール；ラットに慢性的な軽度のストレスを課し、１×１０９ｃｆｕの生存可能なＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０を含む２００μＬのＰＢＳを与えたＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０群；ラットに慢性的な軽度のストレスを課し、３００ｍｇ／ｋｇのタンパク質を含む２００μＬのＰＢＳを与えたＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０タンパク質画分群。エラーバーは、平均の標準誤差を表す；ｎ＝４。ａｂ異なる群間における、脳内セロトニン濃度の有意差；Ｐ＜０．０５。
【図９】図９（ａ）および（ｂ）は、４週間の慢性軽度ストレスプロトコル後のラット全脳における、モノアミンオキシダーゼＡ（ＭＡＯ−Ａ）（ａ）および過酸化水素（ｂ）の濃度を示している。ラットをケージ内で静置した未処置対照群；ラットに慢性的な軽度のストレスを課し、２００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）を与えたネガティブコントロール；ラットに慢性的な軽度のストレスを課し、０．０４５ｍｇ／ｋｇのアルプラゾラムを含む２００μＬのＰＢＳを与えたポジティブコントロール；ラットに慢性的な軽度のストレスを課し、１×１０９ｃｆｕの生存可能なＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０を含む２００μＬのＰＢＳを与えたＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０群；ラットに慢性的な軽度のストレスを課し、３００ｍｇ／ｋｇのタンパク質を含む２００μＬのＰＢＳを与えたＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０タンパク質画分群。エラーバーは、平均の標準誤差を表す；ｎ＝４。ａｂ異なる群間における、全脳ＭＡＯ−Ａ（ａ）および過酸化水素（ｂ）濃度の有意差；Ｐ＜０．０５。
【図１０】図１０は、分析用ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰカラム上での、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０によって生成されるタンパク質の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）の溶出プロファイルを示している。溶出は、０％から１００％の溶媒Ｂ（１ＭのＮａＣｌを含有する２５ｍＭのトリスＨＣｌ）の直線勾配を用いて、８０分、０．８ｍＬ／分の流速で実施した。
【図１１】図１１は、デキサメタゾン誘発神経毒性に対するＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞の細胞生存率を示す。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を未発酵ＭＲＳで処置したポジティブコントロール；ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞をデキサメタゾン（２５μＭ）の存在下、未発酵ＭＲＳで処置したネガティブコントロール；ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞をデキサメタゾン（２５μＭ）の存在下、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０のタンパク質画分で処置したＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０のタンパク質画分；ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞をＨＰＬＣから回収した精製タンパク質画分で処置した画分Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨおよびＩ。エラーバーは、平均の標準誤差を表す；ｎ＝６。ａｂｃ異なる群間における、細胞生存率の有意差；Ｐ＜０．０５。
【図１２】図１２は、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０の粗タンパク質画分由来の精製画分ＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル画像を示している。レーン１：タンパク質マーカー；レーン２：ＰＳ１５０の粗タンパク質画分；レーン３：精製タンパク質画分Ａ。
【図１３】図１３（ａ）および（ｂ）は、ペントバルビタール誘発睡眠試験における睡眠潜時（ａ）および睡眠時間（ｂ）に対するＰＳ１５０の効果を示している。２００μＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）を与えたＰＢＳ群マウス；マウスに２０ｍｇ／ｋｇの塩酸ジフェンヒドラミンを含有する２００μＬのＰＢＳを与えたＤＩＰＨ−ＨＣＬ群。マウスに１×１０９ｃｆｕの生存可能なＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０を含む２００μＬのＰＢＳを与えたＰＳ１５０群。エラーバーは、平均の標準誤差を表す；ｎ＝１０。ａｂ異なる群間におけるマウスの睡眠潜時（ａ）と睡眠時間（ｂ）の有意差；Ｐ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、驚くべきことに、新たな乳酸菌（ＬＡＢ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０および、このＬＡＢにより産生される生物活性タンパク質が、気分障害または神経学的状態を改善し、そして神経変性疾患を治療または予防するのに有利な効果を有することを見出した。
【００１７】
定義
本明細書において特に定義されていない用語は、本開示および文脈に照らし、当業者によってそれらに与えられるであろう意味に従って理解されるべきである。しかしながら、本明細書中で使用される場合、そうでないと明記されない限り、以下の用語は、以下の慣例に従って示される意味を有する。
【００１８】
本明細書において列挙される略語は、以下のとおりである：
ＣＤＳ：コード領域；ＣＯＧ：オーソロググループクラスター；ＣＲＩＳＰＲ：クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドローム反復；ＥＦ−Ｔｕ：伸長因子Ｔｕ；ＧＯ：遺伝子オントロジー；ＨＧＡＰ：階層的ゲノム構築法。
【００１９】
接続詞「および（ａｎｄ）」で連結された一群の項目は、それらの項目のすべてが群に含まれていることを要求するものとして解釈すべきではなく、特に明記しない限り、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」として解釈すべきである。同様に、接続詞「または（ｏｒ）」で連結された一群の項目も、その群中において相互排他性を要求とするものとして解釈すべきではなく、特に明記しない限り、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」として解釈すべきである。さらに、本発明の項目、要素または成分は、単数形で記載または特許請求される場合があるが、単数形への限定が明示的に述べられていない限り、複数形もその範囲内にあると意図される。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、他に明示的に述べられていない限り、単数形および複数形の両方を意味すると理解すべきである。したがって、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」（および必要に応じてその文法的な変形）は、１つまたはそれ以上を指す。
【００２１】
「プロバイオティクス（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ）」という用語は、技術の現状において、適切な量で投与された場合、宿主に健康上の利益を与える微生物として認識されている。プロバイオティック微生物は、毒性の欠如、生存能力、付着性、および有益な効果に関する、いくつかの要件を満たさなければならない。これらのプロバイオティクスの特徴は、同一種の細菌の間であっても株に依存的である。
【００２２】
本明細書中で使用される「薬学的に許容される」という用語は、健全な医学的判断の範囲内で、対象（ヒトまたは非ヒト動物のいずれか）の組織と接触して使用するのに適し、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を持たず、合理的な利益／リスク比の釣り合いがとれている、化合物、材料、組成物、および／または剤形を指す。各担体、賦形剤などもまた、製剤の他の成分と適合性であるという意味で「許容される」ものでなければならない。適切な担体、賦形剤などは、標準的な薬学の教科書の中に見出すことができる。
【００２３】
用語「食用担体」は、対象の組織と接触して使用するのに適している化合物、材料、組成物、および／または剤形を指す。各担体もまた、製剤の他の成分と適合性であるという意味で「許容される」ものでなければならない。
【００２４】
本明細書中で使用される「有効量」という用語は、組成物中の各株についてのコロニー形成単位（ｃｆｕ）の量であり、健全な医学的判断の範囲内で、積極的に治療すべき状態を有意に修正するのに十分に高いが、（合理的な利益／リスク比で）重篤な副作用を回避するのに十分に低い量である。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、用語「疾患（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）」は、「病気（ｄｉｓｅａｓｅ）」または「状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」と交換可能に使用される。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、「気分障害」という用語は、ＤＳＭ−ＩＶ−ＴＲに記載されており、気分の深刻な変化を説明する病気のカテゴリである。気分障害のある病気には、大鬱病性障害、双極性障害（躁病−多幸症、活動亢進、あまりに高慢な自我、非現実的な楽観主義）、持続性鬱病性障害（長期にわたる低悪性度の鬱病）、気分循環症（穏やかな形の双極性障害）、およびＳＡＤ（季節性情動障害）が含まれる。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、用語「神経学的状態」は、行動、記憶または認知の観点から、脳機能に対する神経学的損傷および疾患の影響を説明する病気のカテゴリである。神経学的状態にある病気には、ストレス（慢性の軽度ストレスなど）、認知機能低下、認知機能障害（軽度認知障害（ＭＣＩ）を含む）、記憶力の衰え、一般的な想起問題、認知障害、またはアルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、認知症、筋萎縮性側索硬化症、卒中、および統合失調症などの神経変性疾患が含まれるが、これらに限定はされない。
【００２８】
用語「治療」は、特定の疾患または状態の少なくとも１つの兆候、症状、徴候、または影響を軽減または減少させることを意味すると理解される。本明細書中で使用される場合、「予防」は疾患もしくは状態の少なくとも１つの徴候もしくは症状の発症を制限する、発症の割合もしくは程度を低下させる、または発症を抑制すると理解される。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、用語「対象」は、本明細書中に開示されるような化合物または組成物の投与から利益を得ることができる任意の動物である。いくつかの実施態様では、対象は哺乳動物、例えば、ヒト、霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウスである。典型的には、哺乳動物はヒトである。
【００３０】
乳酸菌
１つの側面において、本発明は、配列番号１〜３に示される核酸配列のいずれかを有する、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０（ＰＳ１５０）である、単離されたＬＡＢを提供する。配列番号１〜３の配列を以下に列挙する。
【００３１】
【表１】
0006986288.tif 000002
【００３２】
Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０は、２，２３８，４０１ｂｐの環状染色体を有しており、そのＧＣ含有量は５１％である。２，２０６個のタンパク質コード遺伝子、５９個のｔＲＮＡ、１５個のｒＲＮＡおよび１個のｔｍＲＮＡから構成される合計２，２８１個の遺伝子が予測されている。さらに、２つのクラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）領域が見いだされ、これは外来遺伝要素に対する免疫を提供し得る。２，２０６個のタンパク質をコードする遺伝子のうち４６５個は、それらに帰される機能を持たない仮定上のタンパク質であると予測された。オーソロググループクラスター（ＣＯＧ）機能分類に基づき、２００５個のタンパク質コード遺伝子（すなわち、全予測コード配列（ＣＤＳ）の９１％）をＣＯＧ機能カテゴリに割り当てることができた。２００５個のタンパク質コード遺伝子のうち、６２％が５つの主要なＣＯＧカテゴリに属していた：カテゴリＳ（機能不明）に４４７個のＣＤＳ、カテゴリＬ（複製、組み換え、および修復）に３６４個のＣＤＳ、カテゴリＥ（アミノ酸輸送および代謝）に１６２個のＣＤＳ、カテゴリＪ（翻訳、リボソーム構造および生合成）に１４０個のＣＤＳ、そして、カテゴリＫ（転写）に１３６個のＣＤＳ。さらに、プロファージ領域が９つ同定されたが、興味深いことに、それらのうちの４つは完全な状態のプロファージであると予測されている。抗生物質耐性遺伝子の検索により、３０Ｓリボソームタンパク質Ｓ１２、マルトースＯ−アセチルトランスフェラーゼ、ガラクトシドＯ−アセチルトランスフェラーゼ、推定上のアセチルトランスフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼおよびチミジル酸シンターゼを含む６つの候補耐性遺伝子が明らかにされた。細菌株間の染色体比較は、特定の株に特有のゲノムの特徴を明らかにし得る。それは、本発明のＬＡＢが、独特な９８個のタンパク質コード配列を有することを示している。９８個の配列のうち、それらの３５個は、仮定のタンパク質をコードしており、これは、それらが未知の機能を有するか、またはおそらく誤って遺伝子として予測されたことを意味する。残りの６３個の遺伝子は、１５ｋｂ未満の範囲の遺伝子のクラスター中に見られる３つの推定上のグリコシルトランスフェラーゼを含む、タンパク質産物を予測している。９８個の配列の中の代表的な配列が、配列番号１〜３に列挙されている。
【００３３】
１つの実施態様では、本発明は、ブダペスト条約の下、２０１６年６月６日にＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎに寄託され、アクセッション番号ＤＳＭ  ３２３２３が付与された、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＰＳ１５０（ＰＳ１５０）である、単離され、精製された乳酸菌を提供する。
【００３４】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０は、発酵した肉ソーセージから単離されたプロバイオティクス株である。
【００３５】
ＰＳ１５０は、気分障害または神経学的状態の改善、および神経変性疾患の治療または予防に効果的である。
【００３６】
ＰＳ１５０のタンパク質画分およびそこから精製されたＥＦ−Ｔｕタンパク質
別の側面において、本発明は、配列番号４のアミノ酸配列を含む、ＰＳ１５０のＥＦ−Ｔｕタンパク質を提供する。
【００３７】
配列番号４
ＭＡＥＫＥＨＹＥＲＴＫＰＨＶＮＩＧＴＩＧＨＶＤＨＧＫＴＴＬＴＡＡＩＴＫＶＬＡＡＫＧＬＡＫＡＥＤＹＳＤＩＤＡＡＰＥＥＫＥＲＧＩＴＩＮＴＡＨＶＥＹＥＴＥＫＲＨＹＡＨＩＤＡＰＧＨＡＤＹＶＫＮＭＩＴＧＡＡＱＭＤＧＡＩＬＶＶＡＡＴＤＧＰＭＰＱＴＲＥＨＩＬＬＡＲＱＶＧＶＥＹＩＶＶＦＬＮＫＴＤＬＶＤＤＤＥＬＶＤＬＶＥＭＥＶＲＤＬＬＳＥＹＤＦＰＧＤＤＶＰＶＶＲＧＳＡＬＫＡＬＥＧＤＰＥＱＥＱＶＶＬＨＬＬＤＶＶＤＥＹＩＰＴＰＫＲＰＴＤＫＰＦＭＭＰＶＥＤＶＦＴＩＴＧＲＧＴＶＡＳＧＲＩＤＲＧＴＶＫＩＧＤＥＶＥＩＶＧＬＫＥＤＶＩＫＳＴＶＴＧＶＥＭＦＨＫＴＬＤＬＧＥＡＧＤＮＶＧＶＬＬＲＧＶＳＨＤＱＩＥＲＧＱＶＬＡＥＰＧＳＩＱＴＨＫＱＦＫＧＥＶＹＶＭＴＫＥＥＧＧＲＨＴＰＦＦＳＮＹＲＰＱＦＹＦＨＴＴＤＶＴＧＴＩＥＬＰＤＧＶＥＭＶＭＰＧＤＮＶＴＦＴＶＥＬＱＫＰＶＡＬＥＫＧＬＫＦＴＩＲＥＧＧＨＴＶＧＡＧＶＶＳＥＶＬＤ
【００３８】
別の側面において、本発明は、ＰＳ１５０細胞の細胞外タンパク質から得られ、配列番号４のアミノ酸配列を有するＥＦ−Ｔｕタンパク質またはその機能的断片を含む、タンパク質画分を提供する。
【００３９】
タンパク質画分はＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０からの細胞外タンパク質である。Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０のタンパク質画分は、例えば、ゲルを用いない分画および逆相高速液体クロマトグラフィーによって分離および精製され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって同定される。驚くべきことに、本発明は、約５５ｋＤａの分子量を有する精製タンパク質画分が、気分障害または神経学的状態および神経変性疾患の改善に有効性を示すことを見出し、これは後に、３９６アミノ酸残基（配列番号４）を有する伸長因子Ｔｕとして同定された。
【００４０】
ＥＦ−Ｔｕをコードするｔｕｆと命名された遺伝子が、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０におけるプロバイオティクス因子として見出された。脳の健康にポジティブな影響を与えるこの重要な遺伝子の発見は、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０の予測されるプロテオームに対して、唯一明確に１００％の同一性と１ｅ−５のＢＬＡＳＴＰ  ｅ値でヒットした生理活性画分由来のペプチド配列の正体を決定することにより達成された。このヒットはＥＦ−Ｔｕであったため、その分子進化に関する詳細な調査を行い、観察された健康への影響を引き出すタンパク質間相互作用に関与していると推定される残基を同定した。
【００４１】
ＥＦ−Ｔｕタンパク質は、原核生物の伸長因子の１つであり、伸長因子は、リボソームでの翻訳により新しいタンパク質を合成するメカニズムの一部である。驚くべきことに、本発明は第一に、ＥＦ−Ｔｕタンパク質が気分障害または神経学的状態および神経変性疾患の改善に有効であることを特定する。したがって、本発明は、有効量のＥＦ−Ｔｕタンパク質を対象に投与することを含む、神経変性疾患を治療または予防する方法を提供する。１つの実施態様では、ＥＦ−Ｔｕタンパク質はＰＳ１５０由来のものである。別の実施態様では、ＥＦ−Ｔｕタンパク質は、約１５μｇ／ｋｇから約５００μｇ／ｋｇの範囲の量である。好ましくは、ＥＦ−Ｔｕタンパク質は、約１５μｇ／ｋｇ〜約４００μｇ／ｋｇ、約１５μｇ／ｋｇ〜約３５０μｇ／ｋｇ、約１５μｇ／ｋｇ〜約３００μｇ／ｋｇ、約１５μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ、約１５μｇ／ｋｇ〜約２００μｇ／ｋｇ、約１５μｇ／ｋｇ〜約１５０μｇ／ｋｇ、約１５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ、約１５μｇ／ｋｇ〜約５０μｇ／ｋｇ、約５０μｇ／ｋｇ〜約５００μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ〜５００μｇ／ｋｇ、約１５０μｇ／ｋｇ〜約５００μｇ／ｋｇ、約２００μｇ／ｋｇ〜約５００μｇ／ｋｇ、約２５０μｇ／ｋｇ〜約５００μｇ／ｋｇ、約３００μｇ／ｋｇ〜約５００μｇ／ｋｇ、約３５０μｇ／ｋｇ〜約５００μｇ／ｋｇまたは約４００μｇ／ｋｇ〜約５００μｇ／ｋｇの範囲の量である。
【００４２】
残基（４０Ｋ、４１Ｇ、４２Ｌ、４４Ｋ、４６Ｅ、１６１Ｅ、１８５Ｅ、１９５Ｄ、３２７Ｓ、３４５Ｅおよび３６０Ｔ）は、脳の健康への影響の観点から、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０  ＥＦ−Ｔｕの重要な識別因子であると推定される結合部位に相当する。
【００４３】
本発明のＥＦ−Ｔｕタンパク質は、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の刺激を介して神経変性の病因に寄与するＴＮＦ−アルファを低減させ得る。これは、最終的にトリプトファンのキヌレニンへの代謝回転率を低下させ、セロトニンの生産増加が導かれる。ＥＦ−Ｔｕタンパク質はまた、血漿コルチコステロンレベルを低下させ、よって、不安、鬱病、ストレスの軽減に寄与する。
【００４４】
組成物および適用
別の側面では、本発明は、ＰＳ１５０細胞、本発明のＥＦ−Ｔｕタンパク質または本発明のＰＳ１５０のタンパク質画分、および場合により、食用担体または薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。本発明の組成物において、前記ＰＳ１５０細胞は、生きているか否かにかかわらず、細菌全体の形で使用され得る。好ましくは、細菌細胞は、生きている生細胞として存在する。
【００４５】
本発明の組成物は、投与、特に経口投与に適した任意の形態であり得る。これには例えば、固体、半固体、液体、および粉末が含まれる。
【００４６】
本発明の組成物の例は、食品、特に乳製品を含む栄養組成物である。
【００４７】
組成物は例えば、カプセル、錠剤、飲料、粉末または乳製品であり得る。場合により、ＬＡＢの他の株が存在してもよい。好ましくは、本栄養組成物は、ベビーフード、乳児用調乳または乳児用後続調製物である。好ましくは、本組成物は、ニュートラシューティカルまたは医薬品、栄養サプリメントまたは病人向けの特別食である。
【００４８】
本発明の栄養組成物には、栄養補助食品および機能性食品も含まれる。「栄養補助食品」とは、通常、食品に使用される化合物から作られる製品であるが、錠剤、粉末、カプセル、ポーション、または通常は食物に関連しないその他の形態であり、健康に有益な効果を有するものを指す。「機能性食品」は、健康に有益な効果も有する食物である。特に、栄養補助食品と機能性食品は、病気に対して「保護的または治療的」な生理学的効果を有し得る。
【００４９】
本発明に従う組成物が栄養補助食品である場合、それは、そのまま投与されても、水、ヨーグルト、ミルクまたはフルーツジュースなどの適切な飲用液体と混合されても、または固体または液体食品と混合されてもよい。これに関連して、栄養補助食品は、錠剤、丸薬、カプセル、ロゼンジ、顆粒、粉末、懸濁液、小袋、香錠、菓子、バー、シロップ、および対応する投与形態、通常は単位用量の形態であり得る。好ましくは、本発明の組成物を含む栄養補助食品は、栄養補助食品を調製する従来のプロセスで製造された錠剤、ロゼンジ、カプセルまたは粉末の形態で投与される。
【００５０】
本明細書に記載の組成物は、１つまたはそれ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤、結合剤、希釈剤などを含み得る、薬学的に許容される組成物であり得る。本組成物は、例えば経口投与による様々な投与経路用に製剤化され得る。それらはまた、何らかのカプセル化技術などで、送達媒体と組み合わせて提供されてもよい。
【００５１】
経口投与の場合、粉末、懸濁液、顆粒、錠剤、丸薬、カプセル、ゼラチンカプセル、およびカプレットが固体剤形として許容される。これらは、例えば、本明細書に開示の１つまたはそれ以上の化合物をデンプンまたは他の添加剤などの少なくとも１つの添加剤と混合することにより調製され得る。適切な添加物は、ショ糖、乳糖、セルロース糖、マンニトール、マルチトール、デキストラン、デンプン、寒天、アルギン酸塩、キチン、キトサン、ペクチン、トラガカントゴム、アラビアゴム、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン、アルブミン、合成または半合成のポリマーまたはグリセリドである。場合により、経口剤形は、不活性希釈剤、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、パラベンまたはソルビン酸などの防腐剤、アスコルビン酸、トコフェロールまたはシステインなどの抗酸化剤、崩壊剤、結合剤、増粘剤、緩衝剤、甘味料、調味料または香料などの、投与を補助する他の成分を含んでいてもよい。錠剤および丸剤は、当該分野で公知の適切なコーティング材料でさらに処理されていてもよい。
【００５２】
経口投与用の液体剤形は、薬学的に許容されるエマルジョン、シロップ、エリキシル、懸濁液、および溶液の形態であってもよく、これは水などの不活性希釈剤を含んでもよい。医薬製剤および組成物は、油、水、アルコール、およびこれらの組み合わせなどであるが、これらに限定はされない無菌液体を使用して、液体懸濁液または溶液として調製され得る。経口または非経口投与のために薬学的に適切な界面活性剤、懸濁剤、乳化剤を添加してもよい。
【００５３】
さらなる側面において、本発明は、有効量の本発明のＰＳ１５０細胞もしくはそれを含有する組成物を対象に投与することを含む、気分障害もしくは神経学的状態を改善する方法、または神経細胞のアポトーシスもしくは神経変性に関連する疾患を治療または予防する方法を提供する。したがって、本発明は、気分障害もしくは神経学的状態の改善、または神経細胞のアポトーシスもしくは神経変性に関連する疾患の治療もしくは予防のための調製物の製造における、本発明のＰＳ１５０細胞もしくはそれを含有する組成物の使用を提供する。１つの実施態様において、ＰＳ１５０細胞は、約１０５から約１０１３コロニー形成単位（ｃｆｕ）の範囲の量である。好ましくは、ＰＳ１５０細胞の量は、約１０６〜約１０１３ｃｆｕ、１０６〜約１０１２ｃｆｕ、約１０６〜約１０１１ｃｆｕ、約１０６〜約１０１０ｃｆｕ、約１０６〜約１０９ｃｆｕ、約１０６〜約１０８ｃｆｕ、約１０６〜約１０７ｃｆｕ、約１０７〜約１０１３ｃｆｕ、約１０７〜約１０１２ｃｆｕ、約１０７〜約１０１１ｃｆｕ、約１０７〜約１０１０ｃｆｕ、約１０７〜約１０９ｃｆｕ、約１０７〜約１０８ｃｆｕ、約１０８〜約１０１３ｃｆｕ、約１０８〜約１０１２ｃｆｕ、約１０８〜約１０１１ｃｆｕ、約１０８〜約１０１０ｃｆｕ、約１０８〜約１０９ｃｆｕ、約１０９〜約１０１３ｃｆｕ、約１０９〜約１０１２ｃｆｕ、約１０９〜約１０１１ｃｆｕ、または約１０９〜約１０１０ｃｆｕである。より好ましくは、ＰＳ１５０細胞の量は約１０６〜約１０１２ｃｆｕである。
【００５４】
さらなる別の側面において、本発明は、有効量の本発明のタンパク質画分もしくはそれを含有する組成物を対象に投与することを含む、気分障害もしくは神経学的状態を改善する方法、または神経細胞のアポトーシスもしくは神経変性に関連する疾患を治療または予防する方法を提供する。したがって、本発明は、気分障害もしくは神経学的状態の改善、または神経細胞のアポトーシスもしくは神経変性に関連する疾患の治療もしくは予防のための調製物の製造における、本発明のタンパク質画分もしくはそれを含有する組成物の使用を提供する。１つの実施態様において、タンパク質画分は約１５ｍｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇの範囲の量である。好ましくは、タンパク質画分の量は、約１５ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ〜約４００ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ〜約４００ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ〜約４００ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ〜約１５０ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ〜約４００ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇ、または約１００ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇの範囲である。より好ましくは、タンパク質画分は、約４０ｍｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇの範囲の量である。
【００５５】
さらなる別の側面において、本発明は、有効量の本発明のＥＦ−Ｔｕタンパク質を対象に投与することを含む、気分障害、神経学的状態を改善する方法、または神経細胞のアポトーシスもしくは神経変性に関連する疾患を治療または予防する方法を提供する。したがって、本発明は、気分障害、神経学的状態の改善、または神経細胞のアポトーシスもしくは神経変性に関連する疾患の治療もしくは予防のための調製物の製造における、ＥＦ−Ｔｕタンパク質もしくはそれを含有する組成物の使用を提供する。１つの実施態様では、ＥＦ−Ｔｕタンパク質はＰＳ１５０由来のものである。別の実施態様において、ＥＦ−Ｔｕタンパク質は、約１５μｇ／ｋｇ〜約５００μｇ／ｋｇ；好ましくは、約１５μｇ／ｋｇ〜約４００μｇ／ｋｇ、約１５μｇ／ｋｇ〜約３００μｇ／ｋｇ、約１５μｇ／ｋｇ〜約２００μｇ／ｋｇ、約１５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ、約５０μｇ／ｋｇ〜約５００μｇ／ｋｇ、約５０μｇ／ｋｇ〜約４００μｇ／ｋｇ、約５０μｇ／ｋｇ〜約３００μｇ／ｋｇ、約５０μｇ／ｋｇ〜約２００μｇ／ｋｇ、約５０μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ〜約５００μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ〜約４００μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ〜約３００μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ〜約２００μｇ／ｋｇ、約１５０μｇ／ｋｇ〜約５００μｇ／ｋｇ、約１５０μｇ／ｋｇ〜約４００μｇ／ｋｇ、約１５０μｇ／ｋｇ〜約３００μｇ／ｋｇ、約１５０μｇ／ｋｇ〜約２００μｇ／ｋｇ、約２００μｇ／ｋｇ〜約５００μｇ／ｋｇ、約２００μｇ／ｋｇ〜約４００μｇ／ｋｇ、または約２００μｇ／ｋｇ〜約３００μｇ／ｋｇの投与量範囲である。
【００５６】
気分障害および神経学的状態には、不安、鬱病、睡眠障害、ストレス（慢性の軽度ストレスなど）、認知機能低下、認知機能障害（軽度認知障害（ＭＣＩ）を含む）、記憶力の衰え、一般的な想起問題、認知障害、またはアルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、認知症、筋萎縮性側索硬化症、卒中、および統合失調症などの神経変性疾患が含まれるが、これらに限定はされない。
【００５７】
神経細胞のアポトーシスまたは神経変性に関連する疾患は、脳卒中、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、ピック病、クロイツフェルトヤコブ病、パーキンソンＡＬＳ認知症複合、ウィルソン病、多発性硬化症、進行性核上性麻痺、神経障害性疼痛関連双極性障害、皮質基底核変性症、統合失調症、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、認知症、筋萎縮性側索硬化症、網膜疾患、てんかん、卒中、一過性虚血発作、心筋虚血、筋虚血、脳への血流の長期の不通に関する外科的手法により引き起こされる虚血、頭部外傷、脊髄外傷、低酸素、および鬱から成る群より選択され得る。
【００５８】
本発明の細胞、タンパク質、およびタンパク質画分は、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の発現を低下させるか、トリプトファンのキヌレニンへの代謝回転速度を下げるか、セロトニンレベルを増やすか、血漿コルチコステロン濃度を下げることができる。したがって、本発明の細胞、タンパク質、およびタンパク質画分は特に不安、鬱病、およびストレスを軽減し得る。
【００５９】
本発明は、図面の簡単な説明に続き、以下に提示される実施例により詳細に説明される。しかしながら、これらの実施例は、本発明の主題の例示として与えられており、いかなる方法でもそれに限定するものでないことは言うまでもない。
【実施例】
【００６０】
実施例
材料および方法
１．０  細菌株および増殖条件
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０は、マレーシア科学大学産業技術学部バイオプロセス技術学科（ペナン、マレーシア）の微生物株保存機関から入手したが、これは地元で購入された発酵ソーセージから以前に単離されたものである。使用に先立ち、細菌をｄｅ  Ｍａｎ  Ｒｏｇｏｓａ  Ｓｈａｒｐｅ（ＭＲＳ）（Ｂｉｏｍａｒｋ、インド）ブロス中、３７℃で２０時間インキュベートした。この特定の株はプロバイオティクスであり、その全体的な脳の健康増進効果に関する実証がなされる。
【００６１】
２．０  ＤＮＡの調製
Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０のゲノムＤＮＡは、Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．，ｖｏｌ．２２，ｎｏ．３，ｐｐ．２１４−２２２，２００７に従って単離、精製した。得られた精製ＤＮＡは、ゲノム配列決定の前に−２０℃で保存した。
【００６２】
３．０  ゲノム配列決定
Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０のゲノムＤＮＡは、２つの異なる次世代シークエンシングプラットフォーム（Ｐａｃｂｉｏ  ＲＳ  ＩＩおよびＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２０００）を使用して配列決定した。Ｐａｃｂｉｏプラットフォームでは、Ｃ２−Ｐ４化学プロトコルにより、単一のＳＭＲＴセルのみを用いて、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０のゲノムＤＮＡの約１０ｋｂの挿入ライブラリーに対し、ＳＭＲＴシークエンシングを行った。フィルタリング前の生のＤＮＡシーケンスデータは４８９，６３３，４４２ｂｐであり、平均読み取り長は３２５７ｂｐである。生の配列データを次の基準に従ってフィルタリングした：最小サブリード長５００ｂｐ、最小ポリメラーゼ読み取り品質０．８、最小ポリメラーゼ読み取り長１００ｂｐ。フィルタリング後のデータセットは、２．５Ｍｂｐのゲノムに対して約１６６倍のカバレッジを有している。フィルタリングされたデータをそれから、染色体を組み立てることを目的として、ＳＭＲＴ  ｐｏｒｔａｌｖｅｒ  ２．３．０．１４０８９３に実装されているＨＧＡＰ法（Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．１０，ｎｏ．６，ｐｐ．５６３−５６９，２０１３）にかけた。ドットプロット分析により、環状ゲノムであることが確認されたが、これは、報告されている他のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ株の染色体とも一致している。
【００６３】
Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームでは、ペアエンド（２ｘ１００ｂｐ）シークエンシングのためにＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０ゲノムＤＮＡの５００ｂｐライブラリーを使用した。ライブラリの調製は、製造元のプロトコルに従って行った（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、「次世代シークエンス技術の紹介」、Ｉｌｌｕｍｉｎａ．Ｉｎｃ．，２０１１）。このシークエンサーは、合計２０，５２２，４６４の読み取りをもたらし、これは、２００万塩基対のゲノムの各塩基を平均で１０００回以上カバーしたことを意味する。ただし、後の分析のために高品質の配列データのみが通過するように、生のシークエンシングデータをフィルタリングする必要があった。ＦＡＳＴＱＣ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂｂｓｒｃ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｆａｓｔｑｃ／で利用可能）をシークエンス品質チェックツールとして用いたところ、タイルごとの配列品質が問題点として警告されたため、各ペアエンドにつき、読み取りのタイルごとの品質が良好であった最後の２００万リードのみを使用した。それから、低品質の塩基を除外するために、これらの読み取りをＴＲＩＭＭＯＭＡＴＩＣにかけた。フィルター処理したデータは、ＶＥＬＶＥＴＯＰＴＩＭＩＳＥＲを用いて決定したｋｍｅｒの選択を使用して、ＶＥＬＶＥＴを使用してアセンブリした（Ｓ．Ｇｌａｄｍａｎ＆Ｔ．Ｓｅｅｍａｎｎ，“ＶｅｌｖｅｔＯｐｔｉｍｉｓｅｒ，”２０１２）。得られたアセンブリは２６２個のコンティグを有していた。これらのコンティグを順序よく並べ、ＭＡＵＶＥを使用してＰａｃｂｉｏ  ＨＧＡＰ法により生成されたアセンブリに対してアライメントした（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．１４，ｎｏ．７，ｐｐ．１３９４−４０３，２００４）。フィルター処理した高品質のシークエンスデータはまた、ＢＷＡソフトウェアを使用して、ＨＧＡＰアセンブルデータともアライメントさせた（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，ｖｏｌ．２５，ｎｏ．１４，ｐｐ．１７５４−６０，２００９）。アライメントファイルは、ＳＡＭＴＯＯＬＳを使用して操作し、ソートされたｂａｍファイルを生成した（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，ｖｏｌ．２５，ｎｏ．１６，ｐｐ．２０７８−２０７９，２００９）。マッピングされた読み取りをＡＲＴＥＭＩＳを用いて可視化した（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，ｖｏｌ．１６，ｎｏ．１０，ｐｐ．９４４−９４５，２０００）。ＶＥＬＶＥＴを使用してＩｌｌｕｍｉｎａのシークエンスデータに対して作成されたアセンブリには、ＨＧＡＰ法で作成されたものよりも多くのコンティグが含まれていたため、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ染色体の以降の解析にはＰａｃｂｉｏでアセンブルしたゲノムのみを使用した。
【００６４】
４．０  ゲノムのアノテーション
ソフトウェアツールＰＲＯＫＫＡを使用して、タンパク質コード遺伝子、ｔＲＮＡ、ｔｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、およびＣＲＩＳＰＥＲなどの反復領域のアノテーションを行った（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，ｖｏｌ．３０，ｎｏ．１４，ｐｐ．２０６８−２０６９，２０１４）。各タンパク質コード遺伝子の遺伝子オントロジー（ＧＯ）の観点からの機能分類は、ＥｇｇＮＯＧオーソロググループクラスター（ＣＯＧ）のベストヒットを検索することによって行った（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．４２，ｎｏ．Ｄ１，ｐｐ．Ｄ２３１−Ｄ２３９，２０１４）。予測されたタンパク質中のタンパク質ドメインは、Ｐｆａｍデータベースに対してデフォルトのｅ値１を使用して同定した（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．４２，ｎｏ．Ｄ１，ｐｐ．Ｄ２２２−Ｄ２３０，２０１４）。ゲノム内のプロファージ配列は、ＰＨＡＳＴを用いて予測した（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．３９，ｎｏ．ｓｕｐｐｌ，ｐｐ．Ｗ３４７−Ｗ３５２，２０１１）。プロバイオティクス開発の文脈においては、抗生物質耐性が懸念事項であるため、包括的な抗生物質耐性データベースに対し、ＢＬＡＳＴＰを使用して、潜在的な耐性遺伝子の検索を行った（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，ｖｏｌ．５７，ｎｏ．７，ｐｐ．３３４８−３３５７，２０１３）。ＢＬＡＳＴＰのｅ値の閾値はカットオフとして１ｅ−５未満に設定し、抗生物質耐性データベース中の遺伝子と６０％以上の同一性を有するヒットを分析した。ＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ）Ｍａｐｐｅｒを使用して、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０の関心のあるいくつかの代謝経路を再構築した。
【００６５】
５．０  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍゲノムの比較
Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０以外にも、ゲノムが解読されている株が他に４つある。ＢＲＩＧソフトウェア［ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，ｖｏｌ．１２，ｎｏ．１，ｐ．４０２，２０１１］の参照株としてＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０を使用して、他の４つの既知の株のゲノムをそれにアライメントさせた。ＰＨＡＳＴから予測された９つのプロファージ領域を１つのシークエンスとして連結し、それも参照に対してアライメントした。ＢＬＡＳＴＮ同一性閾値の上限および下限は、それぞれ９０％および７０％に設定した。
【００６６】
６．０  ｔｕｆンパク質の可変性分析
ＥＦ−Ｔｕの可変性分析では、２３５の細菌種から見つかったすべてのタンパク質をシャノンエントロピーの計算の入力として使用した［Ｂｅｌｌ  Ｓｙｓｔ．Ｔｅｃｈ．Ｊ．，ｖｏｌ．２７，ｎｏ．Ｊｕｌｙ  １９２８，ｐｐ．３７９−４２３，１９４８］。シャノンエントロピー式は、タンパク質中のアミノ酸配列の可変性を推定する方法を提供する。所与の複数のタンパク質配列アラインメントについての、アラインメント列番号ごとのシャノンエントロピー（Ｈ）は以下のとおり：
【００６７】
【数１】
0006986288.tif 000003
【００６８】
ここで、Ｈはエントロピー値であり、
Ｘはアライメント列番号であり、
Ｎはアミノ酸種の数およびギャップ記号（２１）＊であり、
ｐｉはＮ中のｉ番目の記号の頻度であり、
＊ギャップを記号として含めるかどうかは場合によること点に注意。この分析では、ギャップは記号と見なされている。
【００６９】
加えて、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの属のレベルでは、２５の異なる種でゲノムが利用可能であった。これらの２５の種におけるｔｕｆ遺伝子を上記と同様のアプローチを使用してマイニングした。これらのタンパク質はまた、シャノンエントロピー計算の入力としても使用した。エントロピーを計算する前に、タンパク質をまずＭＡＦＦＴ［Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，ｖｏｌ．２８，ｎｏ．２３，ｐｐ．３１４４−３１４６，２０１２］を使用してアライメントし、その後、ＣＬＵＳＴＡＬＸ［Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，ｖｏｌ．２３，ｎｏ．２１，ｐｐ．２９４７−２９４８，２００７］を使用して手作業で調べた。その後、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０  ＥＦ−Ｔｕ上に見つかったギャップを取り除いた。最後に、トリミングしたアライメントを使用し、カスタムメイドのＲスクリプトを用いて、アライメント内の位置ごとのシャノンエントロピーを計算した。
【００７０】
７．０  細胞培養
７．１  細菌および上清の調製
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０は、発酵肉ソーセージからの単離株である。培養物は、マレーシア科学大学の微生物株保存機関（ペナン、マレーシア）から入手した。凍結乾燥されたストック培養物を凍結防止剤（ペクチン）の存在下で調製し、乾燥、低温（−２０℃）で保存した。実験に使用する前に、凍結乾燥培養物を滅菌ｄｅ  Ｍａｎ  Ｒｏｇｏｓａ  Ｓｈａｒｐｅ（ＭＲＳ）（Ｈｉ−Ｍｅｄｉａ、ムンバイ、インド）ブロス中で３回連続して活性化させた。継代培養の際は、培養物を滅菌ＭＲＳブロス中に播種し（１０％ｖ／ｖ）、３７℃で１８時間インキュベートした。無細胞上清（ＣＦＳ）を３５００ｇ、１５分間（４℃）の遠心分離によって取得し、１０ＭのＮａＯＨでｐＨ７．０に中和し、それから０．２２ｍｍフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ、ゲッティンゲン、ドイツ）で濾過して滅菌し、直ちに使用するか、または必要になるまで−２０℃で保存した。
【００７１】
７．２  ヒト神経芽腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の培養
神経芽細胞腫細胞株、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、韓国の細胞株バンク（ＫＣＬＢ、ソウル、韓国）から購入した。細胞は、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ、グランドアイランド、ニューヨーク州、米国）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ、グランドアイランド、ニューヨーク州、米国）を添加した高グルコースダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｄｉｆｃｏ、デトロイト、ミシガン州、米国）中で維持した。補充培地を含むフラスコに培養物を播種し、５％ＣＯ２および９５％空気の加湿雰囲気下、３７℃で維持した。
【００７２】
７．３  細胞培養処理および細胞生存率アッセイ
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を１ウェルあたりの播種密度１×１０５細胞で９６ウェル培養プレートに播種した。本試験のすべての細胞は、デキサメタゾン（Ｄｅｘ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、シュタインハイム、ドイツ）処置まで、１０％血清培地中で維持した。細胞を２４時間インキュベートし、処置前に培養プレートに付着させた。細菌のＣＦＳの効果を調べるために、無血清培地中、２５μＭのＤｅｘで処置した１００μＬのＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を含むウェルに２０μＬの細菌ＣＦＳを加えた。３−（４，５ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−テトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、シュタインハイム、ドイツ）の還元を処置の４８時間後に分析した。
【００７３】
細胞生存率は、Ｄｅｎｉｚｏｔ＆Ｌａｎｇ（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９８６  Ｍａｙ  ２２；８９（２）：２７１−７．）に以前に記載されているようにして、ＭＴＴを用いた定量比色分析により測定した。神経損傷の評価のためにＭＴＴを使用した。生細胞がＭＴＴを取り込むと、それは細胞の脱水素酵素によって黄色から紫色のホルマザン結晶に変換される。簡単に説明すると、処置期間の最後に１０％のＭＴＴ標識試薬を０．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度で各ウェルに加え、プレートを３７℃、５％ＣＯ２および９５％空気（ｖ／ｖ）の加湿したインキュベーター中に、さらに６時間置いた。それから、不溶性のホルマザンをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、シュタインハイム、ドイツ）で溶解させた。ＭＴＴ還元の比色定量は、マイクロプレートリーダーを使用して５７０ｎｍで測定した（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）。未発酵ＭＲＳで処置した対照の細胞を１００％の生存率とみなした。
【００７４】
８．０  Ｉｎ  ｖｉｖｏ調査
８．１  生細胞および粗タンパク質調製物
８．１．１  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０生細胞
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０は、マレーシア科学大学産業技術学部バイオプロセス技術学科（ペナン、マレーシア）の微生物株保存機関から入手した。使用に先立ち、培養物をｄｅ  Ｍａｎ  Ｒｏｇｏｓａ  Ｓｈａｒｐｅ（ＭＲＳ）（Ｂｉｏｍａｒｋ、インド）ブロス中、３７℃で２０時間、３回活性化させた。Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０を一晩培養したものを４℃、８０００ｇで３０分間遠心分離して、細胞ペレットを得た。細胞ペレットが得られた後、リン酸緩衝生理食塩水（１．０Ｍ、ｐＨ７．４）を使用して、細胞ペレットを３回洗浄した。１０％（ｖ／ｖ）のペクチン溶液を細胞ペレットに加えてから、−２０℃で一晩凍結させる。次に、凍結細胞ペレットを−５５℃で一晩凍結乾燥させた。得られた凍結乾燥細胞のＣＦＵ／ｇを、混釈平板法を用いて決定した。その後、凍結乾燥細胞を、９ｌｏｇＣＦＵ／ラット／日の投与量で各ラット用に調製した。調製物は、使用するまで−２０℃で保存した。
【００７５】
８．１．２  Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０無細胞上清から抽出された粗タンパク質
Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０を一晩培養したものを４℃、８０００ｇで３０分間遠心分離して、無細胞上清を得た。上清を回収し、３．０Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）でｐＨを７．０に調整した。４℃で攪拌しながら、中和した無細胞上清に８０％ｗ／ｖの硫酸アンモニウムを添加することにより、粗タンパク質を沈殿させ、その後４℃で一晩放置した。沈殿した中和無細胞上清を４℃で３０分間、１００００ｇで遠心分離にかけた。得られたペレットを滅菌蒸留水で再懸濁し、０．２２μＭ酢酸セルロースシリンジフィルターで濾過した。それから、得られた粗タンパク質画分を−２０℃で一晩凍結させた後、−５５℃で一晩凍結乾燥させた。凍結乾燥粗タンパク質は、各ラット用に３００ｍｇ／ｋｇの投与量で調製される。調製物は、使用するまで−２０℃で保存した。
【００７６】
８．２  動物
本試験は、マレーシア科学大学（ＵＳＭ）のバータムキャンパスにある先端医科歯科研究所（ＩＰＰＴ）のＧＬＰ認定動物研究センターで実施された。３０匹の雄ウィスターラット（７〜８週齢、体重１８０〜２００ｇ）は、ペナンのＵＳＭメインキャンパスの動物研究サービスセンターから入手した。到着後、ラットをウッドチップを敷いた標準的なポリプロピレン製靴箱ケージ中に収容し（１ケージあたり３匹）、標準的な実験室条件（１２時間照明／１２時間夜間サイクル（照明：０７００〜１９００）、温度１９〜２５℃、湿度３０〜７０％ＲＨ）下でそっとしておいた。実験期間中、ケージの敷物は２日に１回交換した。受領した動物には、１週間の検疫を課し、動物の病気またはシラミの存在を毎日監視した。動物に病気やシラミがないことを確認した後、慢性軽度ストレスのプロトコルおよび処置の前に、１週間の順化を行った。検疫および順化の期間中、すべてのラットに食物および水を自由に摂取させた。動物の体重は毎週測定し、監視した。
【００７７】
８．３  慢性軽度ストレスプロトコル
ラットを５つの群（１群あたりラット６匹（ｎ＝６））、すなわち、未処置の対照、ネガティブコントロール、ポジティブコントロール、生細胞処置群、およびタンパク質処置群に分けた。未処置対照群を除き、すべてのラットに慢性軽度ストレスプロトコル（表１）を適用した。未処置対照群では、すべての動物にいかなる処置も与えなかった。ネガティブコントロール群では、すべての動物に０．２ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（１．０Ｍ、ｐＨ７．４）を毎日与えた。ポジティブコントロール群では、０．２ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（１．０Ｍ、ｐＨ７．４）に懸濁した０．４５ｍｇ／ｋｇの用量のアルプラゾラム粉末をすべての動物に毎日与えた。生細胞処置群では、すべての動物に毎日９ｌｏｇＣＦＵ／ラット／日の生きたＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０を与えた。最後に、タンパク質処置群では、すべての動物に、前述のように調製した凍結乾燥タンパク質（３００ｍｇ／ｋｇラット／日）を毎日与えた。経口強制飼養は、２．２５ｍｍのボールを備えた１．５インチ、２０ゲージのステンレス鋼供給針を使用して実施した。慢性軽度ストレスプロトコルは、表１に示されているように、いくつかのストレス要因期間と非ストレス要因期間から構成され、１週間全体を通して合計２８日間のスケジュールとした。
【００７８】
【表２】
0006986288.tif 000004
【００７９】
８．４  行動評価
２８日間の慢性軽度ストレス介入後、すべてのラットを行動評価に付した。評価した行動評価には、モーリス水迷路（ＭＷＭ）、高架式十字迷路（ＥＰＭ）、Ｔ迷路、強制水泳試験（ＦＳＴ）、オープンフィールド試験（ＯＦＴ）、およびオブジェクト認識が含まれる。実験はすべて、まばらな光だけで照らされた静かで暗い部屋で行った。
【００８０】
８．４．１  モーリス水迷路（ＭＷＭ）
機器のセットアップ
使用したＭＷＭの直径は２１０ｃｍで、プールの高さは５１ｃｍ、内面は非反射性であった。迷路を室内に置き、迷路の上にビデオカメラを設置して、動物の行動を捕捉して記録した。水迷路は１９〜２２℃の範囲の温度の水で満たし、ラットが温度ショック（低体温症または高体温症）を起こさないようにした。それから、直径１０〜１２ｃｍの無色透明な円形のゴールまたはプラットフォーム（エスケーププラットフォームと呼ばれる）を水面下１〜２ｃｍに沈め、ラットがそれに登るときに動物が転倒しないように安定性を確保した。
【００８１】
脱出時間評価
ＭＷＭのスタート地点は東、西、および南東に指定され、エスケーププラットフォームは北東に沈められる。これら３つのスタート地点を使用して、毎日、連続４回の試験を行った。簡単に説明すると、動物を最初のスタート地点に静かに置き、自由に泳がせてエスケーププラットフォームを探索させた。エスケーププラットフォームの探索を行うために、各動物に最大２分間を与えた。モーリス試験後、すべてのラットを清潔なタオルで完全に乾燥させてから、それぞれのケージに戻した。各動物が脱出位置を特定するのにかかった時間、脱出時間（秒）は、群ごとに６回の反復実験（ｎ＝６）の平均±標準誤差として表されている。
【００８２】
８．４．２  高架式十字迷路（ＥＰＭ）
機器のセットアップ
高架式十字迷路（ＥＰＭ）は４つのアーム、壁のない２つのオープンアーム、高さ４０ｃｍ、長さ５０ｃｍ、幅１５ｃｍの２つのクローズドアームから構成される。迷路の各アームには、高さ７０ｃｍの硬い金属製の脚が付いている。ＥＰＭは、明るい照明のある部屋の部屋の中央近くに設置した。オープンアームとクローズドアームの両方の照明レベルは同様に維持した。高架式十字迷路の上にビデオカメラを設置して、動物の行動を捕捉し、記録した。
【００８３】
評価
動物をケージから取り出し、迷路から壁に向かって直面しているＥＰＭの中央（つまり、オープンアームとクローズドアームの接合部）に置いた。ＥＰＭ上での自由探索のために、各動物に５分間与えた。評価中、次の動物にアクセスする前にＥＰＭを洗浄し、７０％エタノールで乾燥させた。オープンアームの侵入数とオープンアームで過ごされた時間を観察し、時間を計り、記録した。オープンアームへの侵入数とオープンアームで過ごされた期間を記録し、群ごとに６回の反復実験からの平均±標準誤差として表示した（ｎ＝６）。
【００８４】
８．４．３  強制水泳試験
機器のセットアップ
強制水泳試験（ＦＳＴ）は、深さ６８ｃｍ、直径４０ｃｍの黒い不透明な水泳用シリンダーにおいて実施した。シリンダーに水を３０ｃｍの深さまで満たし、ラットの脱出を防ぐために上部にスペースを残した。試験中の動物の行動を捕捉して記録するために、ビデオカメラを水泳用シリンダーの上に設置した。
【００８５】
評価
各動物を水泳用シリンダー中の水に優しく入れ、５分間与えて、水泳用シリンダー中で自由に泳がせた。試験中、動物の行動を観察し、記録した。評価期間中、ＦＳＴ後にすべてのラットを清潔なタオルで完全に乾燥させてから、それぞれのケージに戻した。ラットの不動の期間を計測し、その後、群ごとに６回の反復実験（ｎ＝６）からの平均±標準誤差として表示した。
【００８６】
８．４．４  オープンフィールド試験
機器のセットアップ
明るい照明を備えた実験室の中央に配置した高さ３２ｃｍ、幅３８ｃｍ、長さ５２ｃｍの大きさの不透明な長方形の箱を使用して、オープンフィールド試験を実施した。動物の行動を捕捉するために、長方形の箱の上にビデオカメラを設置した。
【００８７】
評価
各動物をケージからＯＦＴに優しく移し、箱の中を自由に探索できるようにした。５分間のオープンフィールド試験中にラットの探索および不動の期間を観察した。評価期間中、各試験の合間中に箱を７０％エタノールで洗浄した。探索および不動の期間は、群ごとに６回の反復実験（ｎ＝６）からの平均±標準誤差として表示した。
【００８８】
８．４．５  新規オブジェクト認識テスト
機器のセットアップと評価
【００８９】
実験室の中央に配置した高さ３２ｃｍ、幅３８ｃｍ、長さ５２ｃｍの不透明な長方形の箱において、新規オブジェクト認識テストを実施した。この行動評価には２つのフェーズ、つまり、習熟フェーズと試験フェーズが含まれる。習熟フェーズでは、２つの同一のオブジェクト（形状、サイズ、重量が同じ）を長方形の箱に入れた。各動物を長方形の箱に入れ、２分間与えて、その中を自由に探索させた。一方、試験フェーズでは、古いオブジェクトの１つを、異なる形状の新しいオブジェクト（重量とサイズは同様）と置き換えた。同様に、各動物を長方形の箱に入れ、２分間与えて、その中を自由に探索させた。実験全体を通して、長方形の箱の上にビデオカメラを設置し、両方のフェーズで動物の行動を捕捉した。各テストの合間に箱を液体石鹸、水で洗浄し、乾燥させた。習熟フェーズと試験フェーズの間隔は１時間であった。新規オブジェクトの探索に費やされた時間は、以下の式に従って、識別指数として表される：
【００９０】
識別指数＝（新規オブジェクトに費やした時間）／（古いオブジェクト＋新規オブジェクトに費やした合計時間）×１００％（Ｃｏｇｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ，２０１２，１３（２）：９３−１１０）
【００９１】
データは、群ごとに６回の反復実験（ｎ＝６）からの平均±標準誤差として表示した。
【００９２】
８．４．６  統計分析
データはすべて、ＩＢＭ  ＳＰＳＳ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ２０．０（ＩＢＭ  Ｃｏ．、アーモンク、ニューヨーク州、米国）によって統計的に分析した。群平均間の統計的差異を分析するために、一元配置分散分析を実施した。有意性の統計的レベルはα＝０．０５に設定し、平均の多重比較はＴｕｋｅｙ検定によって評価した。特に明記しない限り、すべてのデータは３つの独立した実験の平均値（ｎ＝６）として示した。
【００９３】
８．５  採血および臓器抽出
実験の終わりに、二酸化炭素窒息を使用してラットを屠殺した直後に、血液サンプルを心臓穿刺により採取し、ＥＤＴＡコーティングチューブに移した。採血後まもなく、断頭して脳を取り出した。ＥＬＩＳＡおよび過酸化水素分析に使用した脳組織サンプルは、氷冷ＰＢＳ中に保存した。
【００９４】
８．５．１  生化学分析
脳サンプルの均質化
４℃の１×リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中に保存した抽出ラット脳を解剖の直後に処理した。脳組織サンプルを３つの領域（小脳、大脳、海馬）に分割した。それから、切片化した脳組織サンプルを氷冷条件下、７０〜１００Ｈｚで１０分間均質化した。均質化したサンプルはすべて、使用まで−２０℃で保存した。
【００９５】
血液サンプル
抗凝固性ＥＤＴＡチューブ中に採取した血液を室温で１０〜２０分間インキュベートした後、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を血漿サンプルとして回収し、１．５ｍｌのマイクロ遠心チューブ中に保存し、すぐに分析できるように４℃に保った。余分な血漿サンプルは、使用まで−２０℃で保管した。
【００９６】
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）
酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を実施して、いくつかのサイトカイン、重要な神経伝達物質、および神経発生に関連するバイオマーカーを定量化した。ＥＬＩＳＡは、製造元の指示（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ、米国）に従って実施した。
【００９７】
簡単に言えば、１０μｌのホモジナイズした脳組織または血漿を、ウェルの壁に触れさせることなく、ウェルの底に添加した。４０μｌのサンプル希釈バッファーを加えて、サンプルを希釈する。希釈したサンプルを３７℃で３０分間インキュベートした。その後、サンプルを廃棄し、付属の洗浄バッファーで５回洗浄した。続いて、５０μｌの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗体を各ウェルに加えた。混合液を３７℃でさらに３０分間インキュベートした。それから、混合液を廃棄し、付属の洗浄バッファーで５回洗浄した。続いて、５０μｌの色素原溶液Ａおよび５０μｌの色素原溶液Ｂを各ウェルに加え、穏やかに振盪しながら混合した。それから、混合液を３７℃で１５分間インキュベートした。この工程中は、光への露出を避けた。次に、５０μｌの停止液を各ウェルに加えて反応を停止させた。最後に、４５０ｎｍの吸光度ＯＤをＴｈｅｒｍｏ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ−ＧＯ  ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して読み取った。標準曲線は、上記と同じ手順を用いて生成される。
【００９８】
脳における過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の測定
脳ホモジネートサンプル中の過酸化水素レベルは、製造元のプロトコルに従って、Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄアッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．、ユージーン、オレゴン州、米国）を用いて評価した。
【００９９】
９．０  Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０由来のタンパク質の同定
これらすべてのポジティブな発見に続いて、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０のタンパク質画分を単離し、さらに特定した。タンパク質画分は、硫酸アンモニウム沈殿によって予備精製し、それから３段階のクロマトグラフィー処置により回収した。
【０１００】
９．１  タンパク質の抽出
粗タンパク質画分は、上に述べたようにして抽出した（８．１．２）。それから、粗タンパク質画分を７５％アセトンを使用して脱塩し、遠心分離（７０００ｇ、３０分、４℃）により塩を除去し、これを３回繰り返した。回収したペレットを脱イオン水に溶解させた。タンパク質含有量は、ＢＳＡを標準として用いて、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ハーキュリーズ、カリフォルニア州、米国）を使用して推定した。
【０１０１】
９．２  ゲルを用いない分画
予め調合したＨＥＰＥＳランニングバッファーと酢酸トリスサンプルバッファー（ＡＭＲ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）を含むＧＥＬＦＲＥＥ（商標）８１００  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）を製造業者の指示に従って使用して、分子量に基づいてタンパク質を複数の画分に分離した。Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０タンパク質をサンプルバッファーに溶解して、質量範囲６０〜３００ｋＤａのタンパク質を分離するように設計された５％酢酸トリスカートリッジの個々のローディングチャンバーに添加した。事前に定義した間隔で機器を自動的に一時停止させ、液体画分をピペットで除去した。それから、一連の操作を再開し、次のサイズに基づく画分を回収するプロセスを継続した。すべての画分が回収されるまで、このプロセスを繰り返した。
【０１０２】
１２個の個別の画分を回収した後、画分を集め、アセトンを使用して２回洗浄し、アセトンを除去するために真空濃縮器にかけた。個々の各画分を同じタンパク質含有量（２．０μｇ／ｍＬ）に標準化し、以前に７．３で述べた方法を使用して、細胞培養処置において試験した。
【０１０３】
９．３  １ＤＥゲル分析
ＧＥＬＦＲＥＥ（商標）８１００  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍから１２個の画分を回収した後、個々の各タンパク質画分の分子サイズを推定するため、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して標準的な１ＤＥを実施した。タンパク質の分離は、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ電気泳動装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、トリス／グリシン／ＳＤＳランニングバッファー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中、１１０Ｖで８０分間行った。ゲル中のタンパク質をクーマシーブリリアントブルータンパク質ゲル染料（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ユージーン、オレゴン州、米国）を使用して染色し、タンパク質のバンドをＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳカメラとＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ  １Ｄ分析ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して可視化した。
【０１０４】
９．４  逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）
ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰカラムでの逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によるタンパク質画分の最終精製工程。溶出は、溶媒Ａ（２５ｍＭトリスＨＣｌ）により、０．８ｍＬ／分の流量で１０分間行った。次に、０％〜１００％の溶媒Ｂ（１ＭのＮａＣｌを含む２５ｍＭトリスＨＣｌ）の直線勾配溶出を７０分間行った。溶出したピークを個別に回収し、上記（７．３）のようにして、デキサメタゾンに対する神経保護活性を確認した。
【０１０５】
９．５  オービトラップＬＣ／ＭＳによるタンパク質画分の同定
ペプチドの同定は、マレーシア科学大学の先進毒物分析サービス施設センターで遂行された。ＲＰ−ＨＰＬＣからの目的の画分（０．２ｍｇ）を変性バッファー（６ＭグアニジンＨＣｌ／２５ｍＭ重炭酸アンモニウム、ｐＨ８．５）で可溶化し、それから、１ｍｇ／ｍｌのＤＴＴ／２５ｍＭ重炭酸アンモニウム（新たに調製）をタンパク質溶液に添加し、５５℃で３０分間インキュベートした。その後、１ｍｇ／ｍＬヨードアセトアミド／２５ｍＭ重炭酸アンモニウム（新たに調製）を添加し、それから、アルミホイルで覆って、５５℃で１５分間インキュベートした。それから、１５ｋＤａ分子カットオフのスピンカラムを３回（各回３０分）使用して、還元し、アルキル化したタンパク質サンプルを２５ｍＭ重炭酸アンモニウムでバッファー交換した。それから、トリプシンをサンプルに加え、３７℃で１８時間インキュベートした。凍結乾燥する前に、サンプルにギ酸を加えた。サンプルをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析で分析し、質量ピークを特定した。すべての可能な断片を生成し、それらに対応する分子量とペプチド配列を同定した。その後、ＰＥＡＫＳ  ｓｔｕｄｉｏバージョン６．０を使用してデータ分析を実行し、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０のゲノム中にコードされているすべてのタンパク質について、機能アノテーションのデータベースを使用して、潜在的な生理活性ペプチド配列の選択を行った。
【０１０６】
９．６  ドッキングシミュレーション
Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０の伸長因子ｔｕ（ＥＦ−Ｔｕ）の３Ｄモデルは、Ｓｗｉｓｓ−ＭＯＤＥＬを用いて構築した（Ｓｃｈｗｅｄｅ  ２００３）。２つの理由から、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＥＦ−Ｔｕ（ＰＤＢ  ＩＤ：２Ｃ７７）をテンプレートとして使用した：１）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）には利用可能なｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ由来ＥＦ−Ｔｕの結晶構造が無いため、また、２）データベース中でＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ由来のＥＦ−Ｔｕが、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０のＥＦ−Ｔｕに対して、最も高い配列同一性（７４．８１％）を示したため。インターフェロン−γ（ＩＦＮγ）およびインターフェロン−γ受容体（ＩＦＮγＲ；ＰＤＢ  ＩＤ：１ＦＹＨ；解像度２．０４Ａ）の結晶構造は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）から入手した。さらに、ＩＦＮγ３９（ＩＦＮγＲの反応性を阻害することが知られているＩＦＮγの最初の３９個のアミノ酸に由来する合成ペプチド）もまた、本試験においてポジティブコントロールとして供するためにＩＦＮγの結晶構造から得た。
【０１０７】
ＩＦＮγからＩＦＮγ受容体への分子ドッキング
Ｃｌｕｓｐｒｏ  ２．０：タンパク質−タンパク質ドッキングジョブの登録の前に、すべての水分子とリガンドを除去した。Ｃｌｕｓｐｒｏ  ２．０：タンパク質−タンパク質ドッキング（抗体モード）では、ＩＦＮγとＩＦＮγＲをそれぞれリガンドと受容体として登録した。生成されたすべてのコンフォメーションをＢＩＯＶＩＡ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ４．５（Ｈｕｍｐｈｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）でさらに分析し、それらの二乗平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）値を評価した。最も低い結合自由エネルギー、最も低いＲＭＳＤ値、および最も多く存在するクラスターを有するコンフォメーションを、さらなる分析で比較するためのベンチマークコントロールとして使用した。選択したコンフォメーションのＩＦＮγとＩＦＮγＲの相互作用性残基（ＴＹＲ４９、ＴＲＰ８２、ＧＬＵ１０１、ＨＩＳ２０５、ＶＡＬ２０６、ＴＲＰ２０７；Ｒａｎｄａｌ＆Ｋｏｓｓｉａｋｏｆｆ，２００１）との間の相互作用をＬｉｇｐｌｏｔ＋  ｖ１．４．５（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ＆Ｓｗｉｎｄｅｌｌｓ，２０１１）を使用して可視化した。
【０１０８】
ＩＦＮγ３９からＩＦＮγ受容体への分子ドッキング
Ｃｌｕｓｐｒｏ  ２．０：タンパク質−タンパク質ドッキングジョブの登録の前に、すべての水分子とリガンドを除去した（Ｋｏｚａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。Ｃｌｕｓｐｒｏ  ２．０：タンパク質−タンパク質ドッキング（抗体モード）では、ＩＦＮγ３９とＩＦＮγＲをそれぞれリガンドと受容体として登録した。結合自由エネルギーが最も低く、最も多く存在するクラスターを有するコンフォメーションを使用して、以前に完成したベンチマークコントロールと比較した。選択したコンフォメーションのＩＦＮγ３９とＩＦＮγＲの相互作用性残基（ＴＹＲ４９、ＴＲＰ８２、ＧＬＵ１０１、ＨＩＳ２０５、ＶＡＬ２０６、ＴＲＰ２０７；Ｒａｎｄａｌ＆Ｋｏｓｓｉａｋｏｆｆ，２００１）との間の相互作用をＬｉｇｐｌｏｔ＋  ｖ１．４．５（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ＆Ｓｗｉｎｄｅｌｌｓ，２０１１）を使用して可視化した。
【０１０９】
ＥＦ−ＴｕからＩＦＮγ受容体への分子ドッキング
Ｃｌｕｓｐｒｏ  ２．０：タンパク質−タンパク質ドッキングジョブの登録の前に、すべての水分子とリガンドを除去した。Ｃｌｕｓｐｒｏ  ２．０：タンパク質−タンパク質ドッキング（抗体モード）では、ＥＦ−ＴｕとＩＦＮγＲをそれぞれリガンドと受容体として登録した。結合自由エネルギーが最も低く、最も多く存在するクラスターを有するコンフォメーションを使用して、以前に完成したベンチマークコントロールと比較した。選択したコンフォメーションのＥＦ−ＴｕとＩＦＮγＲの相互作用性残基（ＴＹＲ４９、ＴＲＰ８２、ＧＬＵ１０１、ＨＩＳ２０５、ＶＡＬ２０６およびＴＲＰ２０７）との間の相互作用をＬｉｇｐｌｏｔ＋  ｖ１．４．５（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ＆Ｓｗｉｎｄｅｌｌｓ，２０１１，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｍｏｄｅｌ，５１：  ２７７８−２７８６）を使用して可視化した。
【０１１０】
実施例１  Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０の同定と染色体のゲノムの一般的特徴
本発明において使用されるＰＳ１５０の糖利用をＡＰＩ  ５０  ＣＨＬキット（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、フランス）を使用して調査した結果を表２に示す。発酵試験は、ＰＳ１５０がＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍと同様な生化学的特性を有することを指し示している。
【０１１１】
【表３】
0006986288.tif 000005
0006986288.tif 000006
【０１１２】
Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０を特異的な人工培地中で培養した。Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０の１６Ｓ  ｒＲＮＡおよびｐｈｅＳ遺伝子をＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片の直接配列決定により分析した。ゲノムＤＮＡの抽出、１６Ｓ  ｒＤＮＡおよびｐｈｅＳ  ＤＮＡのＰＣＲによる増幅、ＰＣＲ産物の精製、および精製ＰＣＲ産物の配列決定は、当技術分野で公知の方法を使用して実施した。
【０１１３】
Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号５）
ＴＣＡＧＧＡＴＧＡＡＣＧＣＣＧＧＣＧＧＴＧＴＧＣＣＴＡＡＴＡＣＡＴＧＣＡＡＧＴＣＧＡＡＣＧＣＧＴＴＧＧＣＣＣＡＡＴＴＧＡＴＴＧＡＴＧＧＴＧＣＴＴＧＣＡＣＣＴＧＡＴＴＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＡＡＣＧＡＧＴＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＴＧＡＧＴＡＡＣＡＣＧＴＡＧＧＴＡＡＣＣＴＧＣＣＣＡＧＡＡＧＣＧＧＧＧＧＡＣＡＡＣＡＴＴＴＧＧＡＡＡＣＡＧＡＴＧＣＴＡＡＴＡＣＣＧＣＡＴＡＡＣＡＡＣＧＴＴＧＴＴＣＧＣＡＴＧＡＡＣＡＡＣＧＣＴＴＡＡＡＡＧＡＴＧＧＣＴＴＣＴＣＧＣＴＡＴＣＡＣＴＴＣＴＧＧＡＴＧＧＡＣＣＴＧＣＧＧＴＧＣＡＴＴＡＧＣＴＴＧＴＴＧＧＴＧＧＧＧＴＡＡＣＧＧＣＣＴＡＣＣＡＡＧＧＣＧＡＴＧＡＴＧＣＡＴＡＧＣＣＧＡＧＴＴＧＡＧＡＧＡＣＴＧＡＴＣＧＧＣＣＡＣＡＡＴＧＧＧＡＣＴＧＡＧＡＣＡＣＧＧＣＣＣＡＴＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴＡＧＧＧＡＡＴＣＴＴＣＣＡＣＡＡＴＧＧＧＣＧＣＡＡＧＣＣＴＧＡＴＧＧＡＧＣＡＡＣＡＣＣＧＣＧＴＧＡＧＴＧＡＡＧＡＡＧＧＧＴＴＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＡＡＧＣＴＣＴＧＴＴＧＴＴＡＡＡＧＡＡＧＡＡＣＡＣＧＴＡＴＧＡＧＡＧＴＡＡＣＴＧＴＴＣＡＴＡＣＧＴＴＧＡＣＧＧＴＡＴＴＴＡＡＣＣＡＧＡＡＡＧＴＣＡＣＧＧＣＴＡＡＣＴＡＣＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＴＡＧＧＴＧＧＣＡＡＧＣＧＴＴＡＴＣＣＧＧＡＴＴＴＡＴＴＧＧＧＣＧＴＡＡＡＧＡＧＡＧＴＧＣＡＧＧＣＧＧＴＴＴＴＣＴＡＡＧＴＣＴＧＡＴＧＴＧＡＡＡＧＣＣＴＴＣＧＧＣＴＴＡＡＣＣＧＧＡＧＡＡＧＴＧＣＡＴＣＧＧＡＡＡＣＴＧＧＡＴＡＡＣＴＴＧＡＧＴＧＣＡＧＡＡＧＡＧＧＧＴＡＧＴＧＧＡＡＣＴＣＣＡＴＧＴＧＴＡＧＣＧＧＴＧＧＡＡＴＧＣＧＴＡＧＡＴＡＴＡＴＧＧＡＡＧＡＡＣＡＣＣＡＧＴＧＧＣＧＡＡＧＧＣＧＧＣＴＡＣＣＴＧＧＴＣＴＧＣＡＡＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＡＣＴＣＧＡＡＡＧＣＡＴＧＧＧＴＡＧＣＧＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＴＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＧＴＡＡＡＣＧＡＴＧＡＧＴＧＣＴＡＧＧＴＧＴＴＧＧＡＧＧＧＴＴＴＣＣＧＣＣＣＴＴＣＡＧＴＧＣＣＧＧＡＧＣＴＡＡＣＧＣＡＴＴＡＡＧＣＡＣＴＣＣＧＣＣＴＧＧＧＧＡＧＴＡＣＧＡＣＣＧＣＡＡＧＧＴＴＧＡＡＡＣＴＣＡＡＡＧＧＡＡＴＴＧＡＣＧＧＧＧＧＣＣＣＧＣＡＣＡＡＧＣＧＧＴＧＧＡＧＣＡＴＧＴＧＧＴＴＴＡＡＴＴＣＧＡＡＧＣＴＡＣＧＣＧＡＡＧＡＡＣＣＴＴＡＣＣＡＧＧＴＣＴＴＧＡＣＡＴＣＴＴＧＣＧＣＣＡＡＣＣＣＴＡＧＡＧＡＴＡＧＧＧＣＧＴＴＴＣＣＴＴＣＧＧＧＡＡＣＧＣＡＡＴＧＡＣＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＴＧＧＴＣＧＴＣＧＴＣＡＧＣＴＣＧＴＧＴＣＧＴＧＡＧＡＴＧＴＴＧＧＧＴＴＡＡＧＴＣＣＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣＴＴＧＴＴＡＣＴＡＧＴＴＧＣＣＡＧＣＡＴＴＡＡＧＴＴＧＧＧＣＡＣＴＣＴＡＧＴＧＡＧＡＣＴＧＣＣＧＧＴＧＡＣＡＡＡＣＣＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＧＧＡＣＧＡＣＧＴＣＡＧＡＴＣＡＴＣＡＴＧＣＣＣＣＴＴＡＴＧＡＣＣＴＧＧＧＣＴＡＣＡＣＡＣＧＴＧＣＴＡＣＡＡＴＧＧＡＣＧＧＴＡＣＡＡＣＧＡＧＴＣＧＣＧＡＡＣＴＣＧＣＧＡＧＧＧＣＡＡＧＣＡＡＡＴＣＴＣＴＴＡＡＡＡＣＣＧＴＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＡＣＴＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＡＣＴＣＧＣＣＴＧＣＡＣＧＡＡＧＴＣＧＧＡＡＴＣＧＣＴＡＧＴＡＡＴＣＧＣＧＧＡＴＣＡＧＣＡＴＧＣＣＧＣＧＧＴＧＡＡＴＡＣＧＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＣＣＡＴＧＡＧＡＧＴＴＴＧＴＡＡＣＡＣＣＣＡＡＡＧＴＣＧＧＴＧＧＧＧＴＡＡＣＣＴＴＴＴＡＧＧＡＧＣＣＡＧＣＣＧＣＣＴＡＡＧＧＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＧＡＴＴＡＧＧＧＴＧＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧＴＡＧＣＣＧＴＡＧＧＡＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧＴＴＧ
【０１１４】
ｐｈｅＳ  遺伝子配列（配列番号６）
ＡＡＧＡＣＡＣＣＴＴＣＴＡＣＧＴＧＡＣＣＣＣＧＴＣＴＧＴＴＴＴＧＡＴＧＣＧＧＡＣＣＣＡＡＡＣＧＴＣＧＣＣＡＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＧＧＡＴＧＣＴＧＧＡＡＣＡＡＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＡＧＧＧＧＣＣＧＴＴＧＡＡＧＡＴＧＡＴＣＴＣＡＣＣＧＧＧＧＡＡＧＧＴＴＴＡＣＣＧＣＣＧＣＧＡＣＡＣＣＧＡＴＧＡＣＧＣＴＡＣＣＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＴＴＣＣＡＣＣＡＧＧＴＴＧＡＡＧＧＡＡＴＣＧＴＧＧＴＣＧＧＴＧＡＡＣＡＣＧＴＣＡＣＧＡＴＧＧＣＡＧＡＴＴＴＡＡＡＧＧＧＧＡＣＣＣＴＡＧＡＧＧＣＡＧＴＧＧＣＣＣＡＡＡＡＣＣＴＧＴＴＴＧＧＣＧＡＣＣＡＧＣＴＣＡＡＧＧＴＧＣＧＴＣＴＧＣＧＣＣＣＧＡＧＴＴＡＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＡＣＧＧＡＡＣＣＧＴＣＣＧＴＣＧＡＧＧＣＣＧＡＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＴＴＴＡＡＴＴＧＣＣＴＧＧＧＧＧＣＣＧＧＴＴＧＣＴＣＡＡＴＣＴＧＴＡＡＧＧＧＧＡＣＴＧＧＴＴＧＧＡＴＣＧＡＧＧＴＧＴＴＧＧＧＧＧＣＣＧＧＣ
【０１１５】
結果として得られた配列を国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）によりオンラインで提供されているアライメントソフトウェアに入力して、手動でアライメントし、代表的な生物の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列と比較した。比較のために、ＮＣＢＩがオンラインで提供するデータベースから１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列も取得した。この分析の結果として、以下の表３に、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列と比較して、その１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列が最も高い類似性を示す生物を列記する。
【０１１６】
【表４】
0006986288.tif 000007
【０１１７】
Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０は、２，２３８，４０１ｂｐの環状染色体を有しており、そのＧＣ含有量は５１％である。２，２０６個のタンパク質コード遺伝子、５９個のｔＲＮＡ、１５個のｒＲＮＡおよび１個のｔｍＲＮＡから構成される、合計２，２８１個の遺伝子が予測されている（表４）。さらに、２つのクラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）領域が見いだされ、これは外来遺伝要素に対する免疫を提供し得る。２，２０６個のタンパク質をコードする遺伝子のうち４６５個は、それらに帰される機能を持たない仮定上のタンパク質であると予測された。オーソロググループクラスター（ＣＯＧ）機能分類に基づき、２００５個のタンパク質コード遺伝子（すなわち、全予測コード配列（ＣＤＳ）の９１％）をＣＯＧ機能カテゴリに割り当てることができた。２００５個のタンパク質コード遺伝子のうち、６２％が５つの主要なＣＯＧカテゴリに属していた：カテゴリＳ（機能不明）に４４７個のＣＤＳ、カテゴリＬ（複製、組み換え、および修復）に３６４個のＣＤＳ、カテゴリＥ（アミノ酸輸送および代謝）に１６２個のＣＤＳ、カテゴリＪ（翻訳、リボソーム構造および生合成）に１４０個のＣＤＳ、そして、カテゴリＫ（転写）に１３６個のＣＤＳ。さらに、プロファージ領域が９つ同定されたが、興味深いことに、それらのうちの４つは完全な状態のプロファージであると予測された。抗生物質耐性遺伝子の検索により、３０Ｓリボソームタンパク質Ｓ１２、マルトースＯ−アセチルトランスフェラーゼ、ガラクトシドＯ−アセチルトランスフェラーゼ、推定上のアセチルトランスフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼおよびチミジル酸シンターゼを含む６つの候補耐性遺伝子が明らかにされた。
【０１１８】
【表５】
0006986288.tif 000008
【０１１９】
他のＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ株との染色体の比較
細菌株間の染色体比較は、特定の株に特有のゲノムの特徴を明らかにし得る。Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０の染色体を別の４つの株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ３８７２、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＣＥＣＴ  ５７１６、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＩＦＯ  ３９５６およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  Ｆ６の全ゲノムと比較した。Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０の予測されるプロファージは連結して、比較に含めた。予想通り、新たなゲノムはプロファージ領域などにおいて明らかに異なっている。
【０１２０】
３８７２株とＰＳ１５０との間に非重複領域を見つけるために検索を行い、後者の株に固有のタンパク質コード配列を９８個明らかにした。９８個の配列のうち、それらの３５個は、仮定のタンパク質をコードしており、これは、それらが未知の機能を有するか、またはおそらく誤って遺伝子として予測されたことを意味する。残りの６３個の遺伝子は、１５ｋｂ未満の範囲の遺伝子のクラスター中に見られる３つの推定上のグリコシルトランスフェラーゼを含む、タンパク質産物を予測している。
【０１２１】
実施例２  不安、抑鬱およびストレスの緩和についての分析
ラットの行動の分析を４週間の慢性軽度ストレスプロトコルの後に実施した。高架式十字迷路は、げっ歯類で広く使用されている行動アッセイであり、薬剤とステロイドホルモンの抗不安効果の評価について実証されている。実験で使用した高架式十字迷路は、４本のアーム（２本のオープンアームと２本のクローズドアーム）で構成され、地面から５０ｃｍの高さに持ち上げられていた。ラットを迷路の４本のアームの接合部に、オープンアームに向けて置き、各アームの進入／滞在時間を５分間記録した。オープンアームでの活動（滞在時間および／または侵入）の増加は、抗不安行動を反映する。Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０およびタンパク質画分処置群は、ネガティブコントロール群と比較して、オープンアームへのラットの侵入数が有意に多いが（Ｐ＜０．０５；図１．（ａ））、未処置対照群、ポジティブコントロール群（抗鬱薬処置）、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍＰＳ１５０処置群、およびタンパク質画分処理群の間に有意差はなかった（図１．（ａ））。さらに、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０およびタンパク質画分で処置した際のクローズドアームで過ごした時間とオープンアームで過ごした時間の比率は、ネガティブコントロール群と比較して有意に低く（Ｐ＜０．０５；図１．（ｂ））、一方、未処置対照群、ポジティブコントロール群（抗鬱薬処置）、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０処置群、およびタンパク質画分処置群の間には、有意差は認められなかった（図１（ｂ））。結果は、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０およびＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０のタンパク質画分が、慢性軽度ストレスに起因する不安行動を正常化し、元の非不安状態に戻し得ることを指し示している。加えて、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０およびタンパク質画分群はまた、アルプラゾラムと同様の抗不安効果を示し、市販の抗鬱薬と同様の効果も示した。
【０１２２】
オープンフィールド試験は、探索的行動を評価するために広く使用されており、不安関連行動の測定における使用について実証されている。この手順は、周囲の壁により脱出が阻まれている未知の環境にラットを置くことから構成される。Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０およびＰＳ１５０のタンパク質画分処置群は、ネガティブコントロール群と比較して、ラットの探索活動の期間を有意に延長した（Ｐ＜０．０５；図２）。ラットの探索活動および不動は、未処置対照群、ポジティブコントロール群（抗鬱薬処置）、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０処置群およびタンパク質画分処置群の間で有意に違わなかった（図２）。ラットの探索行動の増加は不安状態が少ないことを示す一方、不動性はラットの不安行動を指し示す。慢性軽度ストレスは、ラットに不安を誘発したが、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０およびＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０のタンパク質画分は、慢性軽度ストレスに起因する不安行動を正常化し、元の非不安状態に戻すことができた。加えて、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０およびタンパク質画分群はまた、アルプラゾラムと同様の抗不安効果を示し、市販の抗鬱薬と同様の効果も示した。
【０１２３】
強制水泳試験は、げっ歯類における鬱様行動の研究のために最も一般的に使用されるアッセイの１つである。強制水泳試験は、水で満たされた容器に動物を入れると、最初は逃げる努力をするが、最終的には、行動上の絶望の尺度を反映すると考えられる不動を呈するという仮定に基づいている。強制水泳試験では、水泳シリンダーを水深３０ｃｍの水で満たした。ラットの鬱評価は、３００秒の試験の５秒ごとに、優勢な行動をスコアリングすることにより実施した。Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０およびタンパク質画分処置群は、ネガティブコントロール群と比較して、有意に短い時間、不動を呈した（Ｐ＜０．０５；図３）。ラットが不動で過ごした時間は、未処置対照群、ポジティブコントロール群（抗鬱薬処置）、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０およびタンパク質画分処置群の間で有意に異なっていない（図３）。同様な効果がＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０、タンパク質画分、および抗鬱薬で観察され、慢性軽度ストレスによって引き起こされる鬱様行動は、未処置対照におけるのと同じレベルに対して標準化された。Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０およびＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０のタンパク質画分は、慢性軽度ストレスに起因する鬱行動を正常化し、元の非鬱状態に戻し得る。加えて、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０およびタンパク質画分はまた、アルプラゾラムと同様の抗鬱効果を示し、市販の抗鬱薬と同様の効果も示した。
【０１２４】
血漿コルチコステロン濃度は、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０およびタンパク質画分群では、ネガティブコントロール群およびポジティブコントロール群と比較して、有意に低くなっていた（Ｐ＜０．０５；図４）。ストレス要因に繰り返し、または長期間さらされると、慢性的なストレスが生じる。慢性的ストレスは最終的に、ＨＰＡ軸の調節不全を引き起こし、その結果、血漿コルチコステロンレベルが増加する。コルチコステロン値の上昇は、不安および抑鬱関連行動を指し示す。我々のデータは、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０およびＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０のタンパク質画分が、慢性軽度ストレスに起因する不安、鬱、およびストレス行動を正常化して、元の非ストレス状態に戻し、市販の抗鬱薬であるアルプラゾラムよりも良好な病理学的効果を発揮することさえあることを示した。
【０１２５】
血漿ＴＮＦアルファとインターロイキン−１０の比率は、ネガティブコントロール群と比較して、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０処置群およびタンパク質画分処置群では有意に低くなっていた（Ｐ＜０．０５；図５）。ＴＮＦアルファは炎症促進性のサイトカインである一方、インターロイキン−１０は抗炎症性のサイトカインである。鬱病の患者はしばしば、非鬱病患者よりも高いＴＮＦアルファレベルを有するが、低いＩＬ−１０レベルを有し、ＴＮＦアルファ：ＩＬ−１０比は、鬱症状の重症度と有意に相関している。我々の今回の所見は、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０およびＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０のタンパク質画分が、おそらくサイトカインの調節を介して、慢性軽度ストレスに起因する不安、鬱およびストレス行動を正常化し、元の非ストレス状態に戻すことを示唆した。Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０およびＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０のタンパク質画分はまた、アルプラゾラムと同様の効果も有し、市販の抗鬱薬と同様のストレス軽減効果を指し示している。
【０１２６】
実施例３  脳認知の改善および神経細胞アポトーシスの保護に関する分析
ストレスがしばしば、記憶やその他の認知機能に悪影響を与えることが十分に文書化されている。認知パフォーマンスを評価するために、モーリス水迷路を使用して記憶保持を評価し、新規オブジェクト認識テストを使用して学習および認識記憶にアクセスした。
【０１２７】
モーリス水迷路は、げっ歯類の学習と記憶を評価および比較するために、行動生理学者および薬理学者によって広く使用され、受け入れられているタスクである。実験では、最も基本的なモーリス水迷路の手順である空間学習が使用される。その背後にある概念は、動物が、タンクの周囲の様々なランダムな場所からスタートして、遠くの手がかりを使用し、隠されたプラットフォームへの直接的な経路を進むことを学ばなければならないということである。水迷路の直径は２１０ｃｍで、側面の高さは５１ｃｍ、内面は非反射性である。脱出時間（ＥＬ）は、動物がスタートの四分円から移動して標的の四分円に隠れているプラットフォームを見つけるのにかかる時間である。Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０およびタンパク質画分処置群では、ネガティブコントロール群と比較して、脱出時間が有意に減少していたが、ネガティブコントロール群では他の群と比較して脱出時間が有意に増加していた（Ｐ＜０．０５；図６（ａ））。未処置対照群、ポジティブコントロール群、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０処置群およびタンパク質画分処置群の間では、有意差は観察されなかった（図６（ａ））。新規オブジェクト認識テストにおいて、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０およびタンパク質画分処置群は、ネガティブコントロールのラットと比較して有意に高い識別指数を示し（図６（ｂ））、ポジティブコントロール（抗鬱剤群）および未処置対照（ストレス無し）のラットと同様な効果を有している（Ｐ＜０．０５）。我々の今回の所見は、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０およびＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０のタンパク質画分が、ラットの慢性軽度ストレスに起因する認知機能障害を正常化することを指し示した（ネガティブコントロール群よりも有意に良好）。
【０１２８】
ＴＮＦ−アルファは、視床下部−下垂体−副腎皮質（ＨＰＡ）軸の活性化、トリプトファン枯渇を導くインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の刺激、神経細胞の免疫介在性の破壊、またはグルタミン酸の神経毒性放出により、神経変性疾患の病因に寄与する。ＩＤＯは、トリプトファンをキヌレニンに分解する酵素であり、神経変性疾患の病態生理に関与している。血漿ＴＮＦアルファとインターロイキン−１０レベルの比率が低い場合、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０およびタンパク質画分群では、ネガティブコントロールおよびポジティブコントロールと比較して、血漿ＩＤＯレベルの有意な低下も観察された（Ｐ＜０．０５；図７（ａ））。ネガティブコントロール群と比較して、より低い濃度の血漿ＩＤＯがＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０およびタンパク質画分群において検出されたが、より高いレベルの血漿トリプトファンも観察された（Ｐ＜０．０５、図７（ｂ））。我々のデータは、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０およびタンパク質画分群では、ネガティブコントロール群と比較して、より少ない量のトリプトファンがキヌレニンに分解され、また、血漿キヌレニンのレベルも有意に低いことを示した（Ｐ＜０．０５；図７（ｃ））。我々の今回の所見は、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０およびＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０のタンパク質画分について、以下を指し示した：（ａ）キヌレニンの産生を減らすことで神経変性を防ぐこと（ネガティブコントロール群よりも有意に良好）、および（ｂ）神経変性を正常状態に回復させ、抗鬱薬と同程度に有効であること（ポジティブコントロール／アルプラゾラムおよび未処置対照群と同等な効果）。
【０１２９】
一方、トリプトファンはセロトニンの前駆体でもある。セロトニンレベルの測定のために脳サンプルも回収した。セロトニンは、神経インパルスの伝達と神経細胞間の信号の調節に関与する神経伝達物質である。我々の今回の所見は、脳内のセロトニンの濃度が、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０およびタンパク質画分群では、ネガティブコントロール群と比較して、有意に上昇することを示した（Ｐ＜０．０５；図８）。結果は、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０およびタンパク質画分群で観察された血漿トリプトファンレベルの増加と合致している。我々の今回の所見は、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０およびＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０のタンパク質画分について、以下を指し示した：（ａ）慢性軽度ストレスにより低下したラットの脳内神経細胞の伝達を回復させ、認知の改善を導くこと（ネガティブコントロール群よりも有意に良好）、（ｂ）市販の抗鬱薬よりも優れた効果を発揮すること（ポジティブコントロール／アルプラゾラム群よりも有意に良好）。
【０１３０】
ストレスがかかると、ラットの脳に様々なアポトーシスの特徴が観察された。モノアミン酸化酵素（ＭＡＯ）は、脳内の神経伝達物質のレベルを制御するミトコンドリア酵素であり、ＭＡＯ−Ａはカスパーゼ−３の活性化と活性酸素種の生成を介してアポトーシスにおいて機能する。過酸化水素はしばしば、アポトーシス細胞死のメディエーターとしてのその役割により、アポトーシス細胞から検出される。慢性ストレスプロトコルでは、ＰＳ１５０を投与されたラットは、ネガティブコントロールのラットと比較して、より低いＭＡＯ−Ａの脳内濃度を示した（図９（ａ））（Ｐ＜０．０５）。ＰＳ１５０またはタンパク質画分を投与したラットでは、ネガティブコントロール群と比較して、脳の過酸化水素濃度が低いことが観察され、アポトーシスの特徴の軽減が明らかであった（図９（ｂ）、Ｐ＜０．０５）。
【０１３１】
行動と脳の評価はどちらも、ＰＳ１５０およびＰＳ１５０のタンパク質画分が、市販の抗鬱薬と同等の効力で、慢性軽度ストレスによって引き起こされるラットの脳損傷を防ぎ、空間学習、長期記憶、認知機能を正常化し、神経変性および神経細胞のアポトーシスを防ぐことを指し示した。
【０１３２】
実施例４  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０の遺伝子およびタンパク質の同定
これらすべてのポジティブな発見に続いて、さらにＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０のタンパク質画分を単離し、特定した。タンパク質画分は、硫酸アンモニウム沈殿によって予備精製し、それから３段階のクロマトグラフィー処置により回収した。ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰカラムでの逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によるタンパク質画分の最終精製ステップは、５％、１５％、２０％、２５％、３０％、５０％、５５％、６０％、および９０％の溶媒Ｂ（１ＭのＮａＣｌを含む２５ｍＭトリスＨＣｌ）で溶出される９つの主要なピークの存在を明らかした（図１０）。溶出されたピーク（それぞれ画分Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、およびＩと命名）を個別に回収し、デキサメタゾンに対する神経保護活性を確認した。
【０１３３】
アポトーシスは、生理学的にプログラムされた正常な細胞死であり、ストレスのバイオマーカー、コルチコステロンなどといった、様々な外部刺激によって増大され得る。合成コルチコステロンであるデキサメタゾンを使用して、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０のタンパク質の画分の神経保護能力を評価した。データは、画分Ａのみが最も優勢な神経保護効果を持つことを示した（図１１）。デキサメタゾンなしで処置したポジティブコントロールの細胞を１００％の生存率とみなした。Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０のタンパク質画分は、デキサメタゾンの存在下または非存在下において、両方の非発酵培地処置細胞と比較して、有意な細胞保護効果を示した。
【０１３４】
精製画分Ａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で約５５ｋＤａの推定分子量を有する単一のバンドを示した（図１２）。タンパク質の同定のために、ＨＰＬＣから回収した精製タンパク質をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析にかけた。トリプシン消化の過程で観察された質量ピークを特定した。すべての可能な断片を生成し、それらに対応する分子量とペプチド配列を同定した。その後、ＰＥＡＫＳ  ｓｔｕｄｉｏバージョン６．０を使用してデータ分析を実行し、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０のゲノム中にコードされているすべてのタンパク質について、機能アノテーションのデータベースを使用して、潜在的な生理活性ペプチド配列の選択を行った。
【０１３５】
Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０のアノテーションされたゲノムを用いて、質量分析から得られたすべてのペプチド配列を、細菌のヌクレオチド翻訳タンパク質配列に対してＢＬＡＳＴ分析した。ＢＬＡＳＴで分析した１５０のペプチドのうち、２つのペプチドのみが細菌のタンパク質と同一であることが判明したが、どちらのペプチド配列もＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０の１つのタンパク質と１００％一致していた。この一致により、タンパク質の配列は配列番号４の配列であると決定した。そのようなタンパク質をヌクレオチド配列に逆翻訳して、配列番号７の配列を有する遺伝子配列を得た。
【０１３６】
配列番号７
ＡＴＧＧＣＡＧＡＡＡＡＡＧＡＡＣＡＴＴＡＴＧＡＡＣＧＴＡＣＴＡＡＧＣＣＣＣＡＣＧＴＴＡＡＣＡＴＣＧＧＴＡＣＴＡＴＴＧＧＣＣＡＣＧＴＴＧＡＣＣＡＣＧＧＧＡＡＧＡＣＴＡＣＴＴＴＡＡＣＣＧＣＡＧＣＴＡＴＣＡＣＣＡＡＧＧＴＡＴＴＧＧＣＣＧＣＴＡＡＧＧＧＣＣＴＴＧＣＣＡＡＧＧＣＡＧＡＡＧＡＣＴＡＣＴＣＴＧＡＴＡＴＣＧＡＴＧＣＴＧＣＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡＡＡＧＧＡＡＣＧＴＧＧＴＡＴＣＡＣＴＡＴＣＡＡＣＡＣＴＧＣＣＣＡＣＧＴＴＧＡＡＴＡＣＧＡＡＡＣＧＧＡＡＡＡＧＣＧＴＣＡＣＴＡＣＧＣＴＣＡＣＡＴＣＧＡＣＧＣＴＣＣＡＧＧＧＣＡＣＧＣＣＧＡＣＴＡＣＧＴＴＡＡＧＡＡＣＡＴＧＡＴＣＡＣＴＧＧＧＧＣＣＧＣＴＣＡＡＡＴＧＧＡＣＧＧＴＧＣＧＡＴＣＴＴＡＧＴＴＧＴＴＧＣＣＧＣＡＡＣＴＧＡＴＧＧＴＣＣＧＡＴＧＣＣＡＣＡＡＡＣＴＣＧＴＧＡＡＣＡＣＡＴＣＣＴＴＣＴＧＧＣＴＣＧＣＣＡＧＧＴＣＧＧＴＧＴＴＧＡＡＴＡＣＡＴＣＧＴＴＧＴＣＴＴＣＣＴＴＡＡＣＡＡＧＡＣＴＧＡＣＣＴＴＧＴＴＧＡＣＧＡＴＧＡＣＧＡＡＣＴＧＧＴＴＧＡＣＴＴＡＧＴＴＧＡＡＡＴＧＧＡＡＧＴＴＣＧＴＧＡＣＣＴＴＣＴＧＴＣＣＧＡＡＴＡＣＧＡＣＴＴＣＣＣＴＧＧＣＧＡＴＧＡＴＧＴＴＣＣＧＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＴＣＴＴＡＡＧＧＣＣＣＴＣＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＣＡＧＡＡＣＡＡＧＡＡＣＡＡＧＴＴＧＴＴＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＧＴＣＧＴＴＧＡＣＧＡＡＴＡＣＡＴＣＣＣＡＡＣＴＣＣＡＡＡＧＣＧＴＣＣＴＡＣＴＧＡＣＡＡＧＣＣＡＴＴＣＡＴＧＡＴＧＣＣＴＧＴＣＧＡＡＧＡＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＡＴＣＡＣＴＧＧＴＣＧＴＧＧＴＡＣＴＧＴＴＧＣＴＴＣＴＧＧＴＣＧＴＡＴＣＧＡＣＣＧＴＧＧＴＡＣＴＧＴＴＡＡＧＡＴＣＧＧＴＧＡＣＧＡＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＧＴＴＧＧＴＴＴＧＡＡＧＧＡＡＧＡＣＧＴＴＡＴＣＡＡＧＴＣＣＡＣＴＧＴＴＡＣＣＧＧＴＧＴＴＧＡＡＡＴＧＴＴＣＣＡＣＡＡＧＡＣＣＣＴＴＧＡＴＣＴＴＧＧＧＧＡＡＧＣＣＧＧＧＧＡＣＡＡＣＧＴＣＧＧＴＧＴＣＣＴＴＴＴＡＣＧＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＣＡＣＧＡＣＣＡＡＡＴＣＧＡＡＣＧＴＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＴＧＧＣＡＧＡＡＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＴＣＣＡＡＡＣＧＣＡＣＡＡＧＣＡＡＴＴＣＡＡＧＧＧＴＧＡＡＧＴＣＴＡＣＧＴＴＡＴＧＡＣＣＡＡＧＧＡＡＧＡＡＧＧＧＧＧＣＣＧＴＣＡＣＡＣＧＣＣＡＴＴＣＴＴＣＴＣＣＡＡＣＴＡＣＣＧＣＣＣＡＣＡＡＴＴＣＴＡＣＴＴＣＣＡＣＡＣＴＡＣＴＧＡＣＧＴＴＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＴＴＧＡＡＣＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＴＧＴＴＧＡＡＡＴＧＧＴＴＡＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＡＣＧＴＴＡＣＣＴＴＣＡＣＴＧＴＴＧＡＡＣＴＧＣＡＡＡＡＧＣＣＡＧＴＴＧＣＣＣＴＴＧＡＡＡＡＧＧＧＴＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＴＧＧＴＣＡＣＡＣＴＧＴＴＧＧＴＧＣＣＧＧＴＧＴＧＧＴＡＴＣＣＧＡＡＧＴＧＣＴＣＧＡＣＴＡ
【０１３７】
この生物活性タンパク質は、３９６アミノ酸残基の伸長因子Ｔｕとして同定されている。実際、この分子はグアノシンヌクレオチド結合タンパク質であり、細胞質でのタンパク質合成において中心的な役割を果たしている。しかし、微生物の異なる区画におけるＥＦ−Ｔｕの存在が十分に実証されている。ＥＦ−Ｔｕ分子は、元々は細菌の細胞質に限定されると考えられていたが、大腸菌の膜にも関連していることが示されている。最近の研究は、ＥＦ−Ｔｕが細胞から放出されるエンベロープ関連タンパク質であることを示した。
【０１３８】
伸長因子Ｔｕは、ラットにおいて免疫調節応答を引き起こすことができた。この研究において、タンパク質画分で処置したラットは、抗炎症性免疫応答を誘導した（ＴＮＦ−アルファとＩＬ−１０の比率を低減；Ｐ＜０．０５；図５）。インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の刺激を介して神経変性の病因に寄与するＴＮＦ−アルファを減少させることにより、血漿ＩＤＯレベルも低下する（Ｐ＜０．０５；図７（ａ））。これは最終的に、トリプトファンのキヌレニンへの代謝回転率を低下させ（Ｐ＜０．０５；図７（ｂ）＆（ｃ））、セロトニン生産の増加を導く。また、伸長因子Ｔｕの免疫調節能力は、血漿コルチコステロンレベルも低下させたが、これは不安、鬱、ストレスの緩和に寄与する。
【０１３９】
全体として、我々のデータは、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０により産生される上記配列番号４の配列を有するこの生物活性タンパク質が免疫調節性の化合物であることを証明しており、認知機能の改善に加えて、より健康な脳機能にすべて関連する、不安、鬱、ストレスの緩和に関するデータをサポートしている。我々は本明細書において、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０により産生される伸長因子などのプロバイオティクス生理活性化合物が、脳の健康に利益をもたらし得ることの証拠を提示している。
【０１４０】
実施例５  Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０の伸長因子Ｔｕのタンパク質可変性解析
シャノンエントロピーを使用して、ＥＦ−Ｔｕタンパク質の可変性を推定した。２１文字の系において、Ｈの範囲は０（つまり、高度に保存、アライメント列中に１文字のみ）から４．３９２（つまり、２１文字すべてが等しく存在）である。タンパク質の３つの主要なドメイン（ＧＴＰ  ＥＦＴＵ、ＧＴＰ  ＥＦＴＵ  Ｄ２、およびＧＴＰ  ＥＦＴＵ  Ｄ３）を有するタンパク質の全長にわたって、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属の２３５種のバクテリアと２５種の細菌に関して、エントロピーを推定した。
【０１４１】
変動性の高い残基は、平均エントロピーに標準偏差の２倍を加えた閾値を超えるエントロピーを有するものとして分類される。平均値に標準偏差の２倍を加えた値を使用するのは、ほとんどの分布では、それより大きい値は極値と見なされるためである。したがって、最初のドメインのＧＴＰ  ＥＦＴＵには最も多くの可変残基があり、それに最後のドメインのＧＴＰ  ＥＦＴＵ  Ｄ２、それからＧＴＰ  ＥＦＴＵ  Ｄ３が続く。特に興味深いのは、２３５種すべての細菌種を考慮すると可変性が高いが、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の種のみを含めた場合には可変性が高くない残基である。上記の基準を満たす残基のリストは次のとおりである：４０Ｋ、４１Ｇ、４２Ｌ、４４Ｋ、４６Ｅ、１６１Ｅ、１８５Ｅ、１９５Ｄ、３２７Ｓ、３４５Ｅ、および３６０Ｔ。２３５種すべての細菌を考慮した場合、これらの残基はすべてエントロピーが２．６３より高く、これは、各残基が理論上の最大可変性（４．３９２）の少なくとも６０％の可変性を示すことを意味する。これらの残基は、その脳の健康への影響の観点からＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０  ＥＦ−Ｔｕの重要な特徴因子となり得る推定上の結合部位に相当する。
【０１４２】
タンパク質の結合部位は通常露出されているか、またはコンフォメーションの変化に応じて露出されるようになる。前のセクションで検出された可変性の高い残基がＥＦ−Ｔｕの３Ｄタンパク質構造の露出部分にあるかどうかを評価するために、タンパク質の相同モデルを構築した。可変性の高い残基を三次元ＥＦ−Ｔｕタンパク質構造相同モデルにマッピングすると、残基４０Ｋ、４１Ｇ、４２Ｌ、４４Ｋ、４６Ｅ、および３２７Ｓが分子の表面にあることが明らかになった。残基４０Ｋ、４１Ｇ、４２Ｌ、４４Ｋ、および４６Ｅは、残基４３Ａと４５Ａでのみ連続性が中断されていることに注目すると興味深い。実際、４３Ａと４５Ａの両残基は、それぞれ２．００４と２．５７８のエントロピー値で高い可変性を示すが、これらの値はカットオフ閾値を下回っている。残基３２７Ｓも可変性が高いが、残基４０〜４６からは遠く離れている。他の残基、１６１Ｅ、１８５Ｅ、１９５Ｄ、３４５Ｅ、および３６０Ｔは、ＥＦ−Ｔｕ分子自身の中に埋め込まれている。
【０１４３】
実施例６  ＰＳ１５０の睡眠促進効果
ＢＡＬＢ／ｃマウスに１日１回、連続１４日間、１０９ＣＦＵ／マウスのＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＰＳ１５０を経口投与した。対照のマウスにはＰＢＳのみを与えた動物を用いて、並行して試験した。ポジティブコントロール群には、ＤＩＰＨ−ＨＣＬ（ジフェンヒドラミン塩酸塩、２０ｍｇ／ｋｇ）を陽性対照として与えた。１４日間の実験期間中、体重（ＢＷ）を毎日測定した。１４日目に、ペントバルビタール誘発睡眠の持続時間をテストするため、ＰＢＳ、ＰＳ１５０およびＤＩＰＨ−ＨＣＬの胃内（ｉ．ｇ．）投与の３０分後、ペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ）を各マウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。各マウスの睡眠潜時と睡眠時間を観察した。ペントバルビタール注射から立ち直り反射の喪失までの経過時間を睡眠潜時として記録し、立ち直り反射の喪失から回復までの経過時間を睡眠時間として記録した。図１３は、ペントバルビタール誘発睡眠試験における睡眠潜時（ａ）および睡眠時間（ｂ）に対するＰＳ１５０の効果を示している。結果は、ＰＳ１５０が睡眠潜時を短縮し、睡眠時間を延長できることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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