(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の頭蓋内出血を治療するための薬剤において、
臍帯組織由来細胞、
を含み、
前記臍帯組織由来細胞は、実質的に血液のないヒト臍帯組織由来であり、
前記細胞は、培養中に自己再生および増殖することができ、少なくとも神経の表現型の細胞に分化する能力を有し、
前記細胞は、ＣＤ１１７およびｈＴＥＲＴのいずれをも発現しないか、または、ＣＤ１１７およびテロメラーゼのいずれをも発現せず、
前記細胞は、塩基性線維芽細胞成長因子および上皮成長因子を加えた神経前駆細胞増殖培地で培養されたとき神経細胞のマーカーであるＴＵＪ１の発現について陽性である細胞に分化するものであり、
前記薬剤は、前記出血後７日以内に静脈内投与されるべきものである、
薬剤。
【請求項２】
請求項１に記載の薬剤において、
前記細胞は、前記頭蓋内出血の治療を促進する遺伝子産物を産生するように、遺伝子操作される、薬剤。
【請求項３】
請求項１に記載の薬剤において、
前記細胞は、少なくとも１つの他の細胞型の細胞と共に投与される、薬剤。
【請求項４】
請求項３に記載の薬剤において、
前記他の細胞型の細胞は、星状細胞、乏突起膠細胞、ニューロン、神経前駆細胞、神経幹細胞、または他の多分化能もしくは多能性幹細胞である、薬剤。
【請求項５】
請求項１に記載の薬剤において、
前記細胞は、前記患者の中枢または末梢神経系の所定部位に投与される、薬剤。
【請求項６】
請求項１に記載の薬剤において、
前記細胞は、注射または注入により投与される、薬剤。
【請求項７】
請求項１に記載の薬剤において、
前記細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃのそれぞれを発現する、薬剤。
【請求項８】
請求項１または７に記載の薬剤において、
前記細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのいずれも発現しない、薬剤。
【請求項９】
患者の頭蓋内出血を治療するための医薬組成物において、
頭蓋内出血を治療するのに有効な量の、医薬的に許容可能な担体、および単離臍帯組織由来細胞、
を含み、
前記臍帯組織由来細胞は、実質的に血液のないヒト臍帯組織由来であり、
前記細胞は、培養中に自己再生および増殖することができ、少なくとも神経の表現型の細胞に分化する能力を有し、
前記細胞は、ＣＤ１１７およびｈＴＥＲＴのいずれをも発現しないか、または、ＣＤ１１７およびテロメラーゼのいずれをも発現せず、
前記細胞は、塩基性線維芽細胞成長因子および上皮成長因子を加えた神経前駆細胞増殖培地で培養されたとき神経細胞のマーカーであるＴＵＪ１の発現について陽性である細胞に分化するものであり、
前記医薬組成物は、前記出血後７日以内に静脈内投与されるべきものである、
医薬組成物。
【請求項１０】
請求項９に記載の医薬組成物において、
前記細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃのそれぞれを発現する、医薬組成物。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載の医薬組成物において、
前記細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのいずれも発現しない、医薬組成物。
【請求項１２】
患者の頭蓋内出血を治療するためのキットであって、医薬的に許容可能な担体、単離臍帯組織由来細胞集団、および前記患者を治療するための方法において前記キットを使用するための説明書を含む、キットにおいて、
前記臍帯組織由来細胞は、実質的に血液のないヒト臍帯組織由来であり、少なくとも神経の表現型の細胞に分化し、
前記細胞は、ＣＤ１１７およびｈＴＥＲＴのいずれをも発現しないか、または、ＣＤ１１７およびテロメラーゼのいずれをも発現せず、
前記細胞は、塩基性線維芽細胞成長因子および上皮成長因子を加えた神経前駆細胞増殖培地で培養されたとき神経細胞のマーカーであるＴＵＪ１の発現について陽性である細胞に分化するものであり、
前記細胞は、前記出血後７日以内に静脈内投与されるべきものである、
キット。
【請求項１３】
請求項１２に記載のキットにおいて、
少なくとも１つの他の細胞型の細胞の集団、
をさらに含む、キット。
【請求項１４】
請求項１２に記載のキットにおいて、
前記細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃのそれぞれを発現する、キット。
【請求項１５】
請求項１２または１４に記載のキットにおいて、
前記細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのいずれも発現しない、キット。
【発明の詳細な説明】
【開示の内容】
【０００１】
〔関連出願への相互参照〕
本出願は、２００８年１２月１９日出願の米国仮特許出願第６１／１３９，３０５号の利益を主張するものであり、この内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
〔発明の分野〕
本発明は、神経傷害のための、細胞に基づく、または再生療法の分野に関する。具体的には、本発明は、細胞を用いた神経組織の再生または修復のための医薬組成物、キット、および方法を提供する。
【０００３】
〔発明の背景〕
様々な特許および他の文献が、この明細書全体にわたって言及される。これらの文献はそれぞれ、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０００４】
中枢および末梢神経系の神経疾患および他の障害は、身体的影響だけでなく、耐久性によっても、個人が受けるかもしれない、最も衰弱させるものである。過去には、２〜３例を挙げるとパーキンソン病、アルツハイマー病、もしくは複数の硬化症など、脳もしくは脊髄傷害、または中枢もしくは末梢神経系の神経変性状態に苦しむ患者は、回復または治癒の見込みがほとんどなかった。
【０００５】
神経学的損傷および神経変性疾患は、ニューロン、および神経系の他の細胞が成体において成長できないために、長い間、不可逆的だと考えられてきた。しかしながら、成体哺乳動物の脳は、傷害後の可塑およびニューロン再生の幾らかの能力を有する（ＫｏＩｂ，  Ｂ，Ｃａｎ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｐｓｙｃｈｏ，１９９９；５３：６２−７６；Ｓｔｒｏｅｍｅｒ，  ＲＰ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｔｒｏｋｅ，１９９８；２９：２３８１−９３；Ｗａｌｔｅｒ，  ＤＨ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２００２；１０５（２５）：３０１７−２４；Ｐｌａｔｅ，  ＫＨ，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ，１９９９；５８（４）：３１３−２０；Ｓｚｐａｋ，  ＧＭ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｌｉａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ，  １９９９；３７（４）：２６４−８；Ｊｉｎ，  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，２００１；  ９８（８）：４７１０−５；Ｐａｒｅｎｔ，  ＪＭ，  ｅｔ  ａｌ，  Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ，２００２；５２（６）：８０２−１３；Ｓｔｒｏｅｍｅｒ，  ＲＰ，  ｅｔ  ａｌ，Ｓｔｒｏｋｅ，１９９５；２６（ｌｌ）：２１３５−４４；Ｋｅｙｖａｎｉ，  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ，  ２００２；６１（１０）：８３１−４０；Ｌｏｉｓ，  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １９９６；  ２７１（５２５１）：９７８−８１；Ｄｕｔｔｏｎ，  Ｒ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｄｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２０００；２２（１−２）：９６−１０５を参照）。例えば、脳室下帯（ＳＶＺ）は、ニューロンを含む様々な細胞型への分化を受けることができる細胞集団を含み（Ｃｈｅｎ，  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ，Ｓｔｒｏｋｅ，  ２００１；３２：１００５−１０１１；Ｅｖｅｒｓ，  ＢＭ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｓｕｒｇ，  ２００３；１９７：４５８−４７８；Ｓｅｙｆｒｉｅｄ，  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ，  ２００６；１０４：３１３−３１８を参照）、虚血性傷害および外傷性脳傷害（ＴＢＩ）の実験は、この領域の細胞が回復プロセスに関与していることを示唆する。臨床研究および動物モデル双方が、頭蓋内出血（ＩＣＨ）後に細胞の傷害にかかわる幾つかのメカニズムがあることを示唆している。これらは、血餅の外傷性または機械的成分、虚血性成分、および直接的な有毒作用を含む（Ｇｏｎｇ，  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，  ２００１；４８：８７５−８８３；Ｇｏｎｇ，  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ，  ２０００；８７１：５７−６５；Ｈｕａ，  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ，  ２００２；２２：５５−６１；Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ，  ２０００；２０：３９６−４０４；Ｘｉ，  Ｇ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｔｒｏｋｅ，  ２００１；３２：２９３２−２９３８；Ｓｅｙｆｒｉｅｄ，  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ，  ２００４；１０１：１０４−１０７を参照）。臨床的に、ＩＣＨは、脳室系の極めて近くで起こり、そのため、ＩＣＨ後の傷害からの回復は、ＳＶＺを巻き込み得る。
【０００６】
さらに、組織修復および再生のための幹細胞に基づく療法が最近出現したことにより、いくつかの神経変性病状および他の神経性障害の有望な治療がもたらされる。幹細胞は、自己再生および分化することができ、様々な成熟神経細胞系統を作る。そのような細胞の移植は、標的組織を再構成する臨床ツールとして利用でき、それにより、生理学的および解剖学的機能性を回復する。幹細胞テクノロジーの適用は、幅広く、組織工学、遺伝子治療送達、および細胞治療学、すなわち、そのような薬物を生成または含有する、外因的に供給された生細胞または細胞成分により、標的場所に生物学的薬物を送達することが含まれる。
【０００７】
神経効力（ｎｅｕｒａｌ  ｐｏｔｅｎｃｙ）を有する幹細胞は、成体組織から単離されてきた。例えば、神経幹細胞は、発生中の脳および成体神経系に存在する。これらの細胞は、増殖を受けることができ、また、ニューロン、星状細胞、および乏突起膠細胞に分化することができる。しかしながら、成体神経幹細胞は、稀であり、また、侵襲的処置によってのみ入手することができ、胚幹細胞よりも培養中に増殖する能力が限られ得る。
【０００８】
他の成体組織はまた、細胞に基づく神経療法に有用な前駆細胞をもたらすこともできる。例えば、骨髄及び皮膚由来の成体幹細胞は、培養中に増殖し、いくつかの神経系統を含む複数の細胞系統を生じ得ることが最近報告されている。
【０００９】
臍帯などの分娩後組織は、幹細胞の代替供給源として、関心を引き起こしてきた。例えば、胎盤の灌流、または臍帯血もしくは組織からの収集による幹細胞の回復方法が、説明されてきた。これらの方法による幹細胞調達の制約は、入手する臍帯血の容量または細胞の量が不十分であること、ならびにそれらの供給源から入手する細胞集団における異種性、または細胞集団の特緒付けがないこと、であった。
【００１０】
さらに、脳虚血後の間葉幹細胞（ＭＳＣ）による神経再生は、傷害のエリアに局在化される血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）などの成長因子レベルの上昇と関連する。実験的梗塞周囲の脳領域では、微小血管形成の増大、およびその微小血管に沿って遊走する細胞、特に、ＳＶＺからの細胞の証拠があることが示されている（Ｅｖｅｒｓ，  ＢＭ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｓｕｒｇ，  ２００３；１９７：４５８−４７８を参照）。また、ＭＳＣは、シナプス形成の増大と関連し、新たに形成されるか、または回復している細胞は、さらなる結合（ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｓ）を示し、これは、機能回復改善の観察に一致していることが示されている（Ｓｅｙｆｒｉｅｄ，  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ，  ２００６；１０４：３１３−３１８を参照）。細胞回復プロセスは、残骸の除去および／または成長因子の分泌により支援されることができ、それによって、ニューロン細胞再生に対して誘導性の環境を作り出す。神経傷害の衰弱特性を前提として、細胞再生療法を開発して、回復を助ける必要がある。
【００１１】
〔発明の概要〕
本発明は、神経傷害のための細胞に基づく再生療法に適用可能な組成物、キット、および方法を提供する。具体的には、本発明は、分娩後組織由来細胞を用いて神経組織を再生または修復する医薬組成物、装置、および方法を特徴とする。
【００１２】
本発明の一態様は、神経傷害を有する患者を治療する方法を特徴とし、この方法は、神経変性状態を治療するのに有効な量で、臍帯組織由来細胞（ＵＴＣ）を患者に投与することを含む。ある実施形態では、神経傷害は、脳虚血、急性虚血後の再灌流、出生時低酸素虚血性傷害、心停止、頭蓋内出血、頭蓋内病変、揺さぶられ症候群である。
【００１３】
本発明の別の態様は、患者のＳＶＺの再生能力を刺激する方法を特徴とし、この方法は、ＳＶＺにおける神経発生、血管新生、またはシナプス形成を増大させるのに有効な量で、臍帯組織由来細胞を患者に投与することを含む。
【００１４】
本発明の別の態様は、患者の脳の損傷または傷害部分におけるアポトーシスを減少させる方法を特徴とし、この方法は、患者の脳の損傷または傷害部分におけるアポトーシス細胞の数を減らすのに有効な量で、臍帯組織由来細胞を患者に投与することを含む。
【００１５】
本発明の別の態様は、神経傷害を有する患者の神経機能を改善する方法を特徴とし、この方法は、神経機能を改善するのに有効な量で、臍帯組織由来細胞を患者に投与することを含む。
【００１６】
本発明の別の態様は、神経傷害を有する患者を治療する医薬組成物を特徴とし、これは、医薬的に許容可能な担体と、臍帯組織由来細胞と、を含む。治療されるべき神経傷害は、脳虚血、急性虚血後の再灌流、出生時低酸素虚血性傷害、心停止、頭蓋内出血、頭蓋内病変、揺さぶられ症候群であってよい。
【００１７】
ある実施形態では、医薬組成物は、組成物の処方前に神経細胞もしくは他の細胞系統に分化するようｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導された細胞、または神経傷害の治療を促進する遺伝子産物を産生するよう遺伝子操作された細胞を含む。
【００１８】
ある実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１つの他の細胞型、例えば、星状細胞、乏突起膠細胞、ニューロン、神経前駆細胞、神経幹細胞、または他の多分化能もしくは多能性幹細胞を含む。これらの、または他の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１つの他の薬剤、例えば、神経療法用薬剤、または、抗炎症薬、抗アポトーシス薬、抗酸化剤もしくは成長因子などの別の有益な補助薬を含む。
【００１９】
ある実施形態では、医薬組成物は、注射または注入による投与のために処方される。あるいは、中に細胞が被包される植え込み可能な装置、または、その細胞を含有するマトリックスもしくは足場を含んでもよい。
【００２０】
本発明のさらに別の態様によると、神経傷害を有する患者を治療するキットを提供する。キットは、医薬的に許容可能な担体と、臍帯組織由来細胞集団と、患者の治療方法におけるキットの使用説明書と、を含む。キットは、少なくとも１つの試薬、および臍帯組織由来細胞を培養するための説明書をさらに含むことができる。少なくとも１つの他の細胞型の集団、または、神経傷害を治療する少なくとも１つの他の薬剤も含んでよい。
【００２１】
本発明の別の態様によると、神経傷害を有する患者を治療する方法が提供され、この方法は、臍帯組織由来細胞から作った製剤を患者に投与することを含む。このような製剤は、臍帯組織由来細胞の細胞可溶化液（またはその分画）、臍帯組織由来細胞の細胞外マトリックス、または臍帯組織由来細胞が成長させられた馴化培地を含むことができる。別の態様では、本発明は、医薬的に許容可能な担体と、臍帯組織由来細胞から作った製剤と、を含む医薬組成物を特徴とし、この製剤は、臍帯組織由来細胞の細胞可溶化液（もしくはその分画）、臍帯組織由来細胞の細胞外マトリックス、または臍帯組織由来細胞が成長させられた馴化培地、であってよい。本発明のこの態様を実施するキットも提供される。これらは、医薬的に許容可能な担体もしくは他の薬物もしくは試薬のうち１つまたは複数、細胞可溶化液もしくはその分画のうち１つまたは複数、臍帯組織由来細胞からの細胞外マトリックスもしくは馴化培地、およびキット構成要素の使用説明書、を含むことができる。
【００２２】
様々な実施形態では、臍帯組織由来細胞は、投与前に神経細胞または他の細胞系統に分化するよう、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導される。いくつかの実施形態では、細胞は、神経傷害の治療を促進し、神経機能を促進し、かつ／または再生能力を促進する遺伝子産物を産生するように遺伝子操作される。
【００２３】
本発明の様々な実施形態では、臍帯組織由来細胞は、少なくとも１つの他の細胞型、例えば星状細胞、乏突起膠細胞、ニューロン、神経前駆細胞、神経幹細胞または他の多分化能もしくは多能性幹細胞と共に投与される。これらの実施形態では、その他の細胞型が、臍帯組織由来細胞と同時に、またはその前、またはその後に、投与されることができる。同様に、これらの、または他の実施形態では、細胞は、少なくとも１つの他の薬物、例えば、神経療法用薬物、または、抗炎症薬、抗アポトーシス薬、抗酸化剤もしくは成長因子などの、別の有用な補助薬と共に投与される。これらの実施形態では、その他の薬物は、臍帯組織由来細胞と同時に、またはその前、またはその後に投与されることができる。
【００２４】
いくつかの実施形態では、細胞は、患者の中枢または末梢神経系の所定部位に投与される。細胞は、注射もしくは注入、または植え込み可能な装置内に被包されることによって、あるいは、細胞を含有するマトリックスまたは足場の植え込みによって、投与され得る。
【００２５】
ある実施形態では、細胞は、神経傷害後、異なる時点で投与される。例えば、細胞は、傷害後、約２４時間〜約１６８時間（約１日〜約７日）の範囲の時間に投与され得る。
【００２６】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明および実施例から明らかとなるであろう。
【００２７】
〔発明の詳細な説明〕
例示的な実施形態に関する、以下の詳細な説明では、その一部を形成する添付図面を参照する。これらの実施形態は、当業者が本発明を実施できるよう十分詳細に説明され、他の実施形態が利用され得ること、ならびに論理的、構造的、機械的、電気的、化学的変更が、本発明の趣旨または範囲を逸脱せずに行われ得ることが、理解される。本明細書に記載する実施形態を当業者が実施するのに必要でない詳細を省くため、説明では、当業者に既知の情報は省略され得る。したがって、以下の詳細な説明は、限定的な意味で理解されるべきではない。
【００２８】
本明細書および請求項にわたり使用される様々な用語は、以下に記載するとおり定義される。
【００２９】
本明細書で使用される用語「個体」、「患者」、または「被験者」は、任意の形態の動物を指し、それには、ヒトおよびサルなどの哺乳動物が含まれ、医薬組成物または治療組成物によって、あるいは記載される方法に従って、治療される。
【００３０】
「幹細胞」は、一つの細胞が自己再生し、子孫細胞を産生するよう分化する能力により定められる、未分化細胞であり、自己再生前駆細胞、非再生前駆細胞、および最終分化細胞が含まれる。幹細胞は、複数の胚葉（内胚葉、中胚葉、外肺葉）から様々な細胞系統の機能細胞に分化し、移植後に複数の胚葉の組織を生じさせ、また、胚盤胞への注射後、すべてではなくてもほとんどの組織に、実質的に貢献する能力により、特徴づけられている。
【００３１】
幹細胞は、それらの発生能に従って、（１）全能性；（２）多能性；（３）多分化能性；（４）寡能性（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）；および（５）単能性と分類される。「全能性」細胞は、全ての胚細胞および胚体外細胞型を生じることができる。「多能性」細胞は、全ての胚細胞型を生じさせることができる。「多分化能」細胞は、細胞系統のサブセットではあるが、全てが特定の組織、臓器、もしくは生理系内にあるものを生じさせることができるものを含む。（例えば、造血性幹細胞（ＨＳＣ）が、ＨＳＣ（自己再生性）、血液細胞に制限された寡能性前駆体、ならびに、血液の正常な成分である全ての細胞型および要素（例えば、血小板）を含む子孫を産生することができる。）「寡能性」の細胞は、多分化能幹細胞よりも制限された細胞系統のサブセットを生じさせることができる。「単能性」の細胞は、単一の細胞系統（例えば、精子形成幹細胞）を生じさせることができる。
【００３２】
幹細胞はまた、幹細胞を入手する供給源に基づいて分類される。「成体幹細胞」は、概して、複数の分化細胞型を含む組織に見られる、多分化能未分化細胞である。成体幹細胞は、それ自体で再生することができる。通常環境下では、起源を発する組織の特殊化された細胞型、および恐らくは他の組織型を生じるように分化することもできる。「胚幹細胞」は、胚盤胞期胚の内側細胞集団からの多能性細胞である。「胎児」幹細胞は、胎児組織または膜から生じるものである。「分娩後幹細胞」は、出生後利用可能な胚外組織、すなわち臍帯および胎盤から実質的に生じる多分化能または多能性細胞である。これらの細胞は、急速な増殖、および多くの細胞系統に分化する可能性を含む、多能性幹細胞に特有の特徴を有することが分かっている。分娩後幹細胞は、血液由来（例えば、臍帯血から得られるもの）、または非血液由来（例えば、臍帯および胎盤の非血液組織から得られるもの）であってよい。
【００３３】
培養中の細胞を説明するため、さまざまな用語が使用される。「細胞培養」は、概して、生物から採取され制御条件下で成長した（「培養中」または「培養された」）細胞を指す。「初代細胞培養」は、生物から直接採取された細胞、組織または臓器を、最初の二次培養前に培養することである。細胞は、細胞増殖および／または分裂を促進する条件下で成長培地に入れられると、培養中に「増殖（ｅｘｐａｎｄｅｄ）」し、結果として、大きな細胞集団をもたらす。細胞が培養中に増加すると、細胞増殖速度は、時には、細胞が２倍の数になるのに必要な時間の長さで測定される。これを、「倍加時間」という。
【００３４】
用語「間葉幹細胞」（ＭＳＣ）は、未成熟の胚連結組織由来の細胞を指す。いくつかの細胞型は、軟骨を生成する軟骨細胞を含む間葉幹細胞由来である。
【００３５】
用語「脳室下帯」（ＳＶＺ）は、側脳室の側壁にわたり位置する対になった脳構造体を指す。側脳室は、脳の脳室系の一部である。終脳の一部として分類されるのは、脳室のうち最も大きいものである。側脳室は、心室間のモンロー孔を通って中央第３脳室に接続する。歯状回の顆粒下ゾーンと共に、脳室下帯は、成体神経発生のプロセスにおいて神経幹細胞源として機能する。
【００３６】
本明細書で使用される用語「標準的な成長条件」は、５％のＣＯ２、および約１００％に維持された相対湿度を含む標準大気において３７℃で細胞を培養することを指す。前述した条件は、培養に有用であるが、そのような条件は、細胞を培養するために当技術分野で利用可能なオプションを認識するであろう当業者によって変えられ得ることが理解される。
【００３７】
本発明で使用する細胞は、概して「分娩後細胞」または「分娩後由来細胞」（ＰＰＤＣ）と呼ばれる。細胞は、より具体的には、「臍由来細胞」、または「臍帯由来細胞」（ＵＤＣ）、または「臍帯組織由来細胞」（ＵＴＣ）である。さらに、細胞は、幹細胞または前駆細胞として説明されてよく、前駆細胞は、広い意味で使用される。用語「由来（ｄｅｒｉｖｅｄ）」は、細胞が、それらの生物学的供給源から得られ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで成長または別様に操作されていることを示すのに使用される（例えば、成長培地で培養され、集団を増殖させ、かつ／または細胞株を産生する）。本発明の臍幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ操作、および臍由来細胞の独自の特徴は、以下で詳細に説明する。
【００３８】
「分化」は、分化していない（ｕｎｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ）（「コミットしていない（ｕｎｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）」）かまたはあまり分化していない（ｌｅｓｓ  ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ）細胞が例えば神経細胞もしくは筋細胞などの、分化した細胞の特徴を取得するプロセスである。「分化」細胞は、細胞系統内で、より分化した（「コミットした」）位置についたものである。用語「コミットした（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）」は、分化のプロセスに使用される場合、通常環境下で特定の細胞型または細胞型のサブセットに分化し続け、また、通常環境下で、異なる細胞型に分化したり、あまり分化していない細胞型に戻ったりできない時点まで、分化経路を進んできた細胞を指す。「脱分化」は、細胞が細胞系統内で、あまり分化していない（またはコミットした）位置に戻るプロセスを指す。本明細書で使用される、細胞「系統」は、細胞の遺伝形質、すなわち、どの細胞から生じたか、また、何の細胞を生じさせることができるのかを定める。細胞系統は、発生および分化の遺伝的スキームの中にその細胞を位置付ける。
【００３９】
広義には、「前駆細胞」は、それ自身よりも分化した子孫を作る能力を有するが、前駆体の集まり（ｐｏｏｌ）を補充する能力を有する、細胞である。その定義により、幹細胞自体は、最終分化細胞に対してより直接的な前駆体であるので、これも前駆細胞である。本発明の細胞について言及する場合、以下でさらに詳細に説明するように、前駆細胞の、この広義の定義を使用することができる。狭義では、前駆細胞は、分化経路における中間体である細胞としばしば定義される。すなわち、前駆細胞は、幹細胞から生じており、成熟細胞型または細胞型のサブセットの産生における中間体である。この型の前駆細胞は、概して、自己再生することができない。したがって、この型の細胞に本明細書中で言及する際、「非再生前駆細胞」または「中間前駆細胞」もしくは「中間前駆体細胞」と呼ぶ。
【００４０】
本明細書で使用される語句「神経系統または表現型に分化する」は、ＣＮＳまたはＰＮＳの特異的な神経表現型に部分的または完全にコミットされる細胞、すなわちニューロンまたはグリア細胞を指す。グリア細胞のカテゴリーには、限定するものではないが、星状細胞、乏突起膠細胞、シュワン細胞およびミクログリアが含まれる。
【００４１】
「細胞株」という用語は、概して、初代細胞培養の１回または複数回の二次培養により形成された細胞集団を指す。二次培養の各ラウンドは、継代と呼ばれる。細胞が二次培養されると、それらは、「継代されて」きたと言われる。特定の細胞集団、または細胞株は、時には、継代されてきた回数で呼ばれるか、またはそれによって特徴付けられる。例えば、１０回継代されてきた培養細胞集団は、Ｐ１０培養物と呼ばれ得る。初代培養物、すなわち、組織から細胞を単離した後の最初の培養物は、Ｐ０と呼ばれる。最初の二次培養の後、細胞は、２度目の培養物（Ｐ１または１代継代）と説明される。２度目の二次培養後、細胞は、第３培養物（Ｐ２または２代継代）になる、等である。継代期間中に多くの集団倍加があり得、そのため、培養物の集団倍加数は、継代数より大きいことが、当業者には理解されるであろう。継代相互間の時間中の細胞増殖（すなわち、集団倍加数）は、播種密度、基質、培地、成長条件、および継代相互間の時間を含むがこれらに限定されない多くの要因に依存している。
【００４２】
本明細書で使用される用語「成長培地」は、概して、臍帯組織由来細胞を培養するのに十分な培地を指す。具体的には、本発明の細胞を培養する１つの培地は、ダルベッコ変法基本培地（ＤＭＥＭ）を含む。特に好ましいのは、ＤＭＥＭ−低グルコース（ＤＭＥＭ−ＬＧ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ．）である。ＤＭＥＭ−ＬＧは、好ましくは、血清を補充され、最も好ましくは、ウシ血清またはヒト血清を補充される。典型的には、１５％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清（例えば、規定のウシ胎仔血清，Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ  ＵＴ）が、抗生物質／抗真菌薬（好ましくは１００単位／ｍＬのペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍＬアンホテリシンＢ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ．）、ならびに０．００１％（ｖ／ｖ）の２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ  Ｍｏ．）と共に加えられる。場合によっては、異なる成長培地を使用するか、または異なる補充物が提供され、これらは通常、成長培地への補充物として本文中で示される。化学的に定義されたある培地では、細胞は、血清が全く存在しない状態で成長することができる。そのような場合、細胞は、ある成長因子を必要としてよく、この成長因子は、培地に加えられて、細胞を支持および維持することができる。無血清培地で成長するために加えられるべき、現在好ましい因子は、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、およびＰＤＧＦのうち１つまたは複数を含む。さらに好適な実施形態では、これらの因子のうち２つ、３つ、または４つ全てが無血清培地または化学的に定義された培地に加えられる。他の実施形態では、ＬＩＦを無血清培地に加えて、細胞の成長を支持または改善する。
【００４３】
「馴化培地」は、特定の細胞または細胞集団が培養され、その後取り除かれる培地である。細胞が培地で培養されると、細胞因子を分泌することができ、この細胞因子は、他の細胞に栄養に関する支援を与えることができる。そのような栄養因子には、ホルモン、サイトカイン、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）、タンパク質、小胞、抗体、および顆粒が含まれるがこれらに限定されない。細胞因子を含む培地は、馴化培地である。
【００４４】
概して、「栄養因子」は、細胞の生存、成長、増殖および／または成熟化を促進するか、または細胞の活性増大を刺激する、物質として定義される。
【００４５】
培養された脊髄動物細胞に言及する場合、用語「老化」（「複製老化」もしくは「細胞老化」とも）は、有限細胞培養物に起因し得る特性、すなわち、有限数の集団倍加を超えて成長できないことを指す（ヘイフリックの限界と呼ばれることもある）。細胞老化は、最初は線維芽細胞様細胞を用いて説明されたが、培養中にうまく成長できる最も正常なヒト細胞型は、細胞老化を受ける。異なる細胞型のｉｎ  ｖｉｔｒｏ寿命はさまざまであるが、最長寿命は、典型的には１００集団倍加より少ない（１００は、培養中の全細胞が老化することにより、培養物を分割できなくなる倍加数である）。老化は経時的時間に依存しないが、むしろ、培養物が受ける、細胞分裂、すなわち集団倍加により測定される。よって、必須成長因子を除去することで静止状態になった細胞は、その成長因子が再び導入されると、成長および分裂を再開でき、その後、継続して成長した同等の細胞と同じ数の倍加を行う。同様に、細胞が、さまざまな数の集団倍加後に液体窒素で凍結され、その後解凍および培養されると、培養中に凍結されなかった細胞と実質的に同じ数の倍加を受ける。老化細胞は、死んだもしくは死にかけの細胞ではなく、それらは、プログラムされた細胞死（アポトーシス）に対し実際に耐性があり、３年もの間、非分裂状態に保たれている。これらの細胞は、非常によく生きており、代謝的に活性であるが、分裂はしない。老化細胞の非分裂状態は、あらゆる生物学的、化学的、ウイルス性薬物によって可逆性であることは分かっていない。
【００４６】
用語「神経傷害」は、ニューロン細胞死または不全に関連する状態を含む包括的用語であり、これには、脳血管不全、局所的、もしくはびまん性脳外傷、びまん性脳損傷、および外傷性ニューロパチー（圧縮、粉砕、断裂および分節ニューロパチーを含むがこれらに限定されない）が含まれる。神経傷害の例は、塞栓性閉塞および血栓性閉塞を含む脳虚血または梗塞；急性虚血後の再灌流；出生時低酸素−虚血性傷害；心停止；あらゆるタイプの頭蓋内出血（例えば硬膜外、硬膜下、くも膜下および脳内）；頭蓋内および椎骨内病変（例えば、挫傷、貫通、せん断、圧縮および断裂）；揺さぶられ症候群である。
【００４７】
他の神経性傷害は、腫瘍、およびＣＮＳおよびＰＮＳに作用する腫瘍性状態を含む。基礎疾患は、（傷害というより）増殖性と考えられるが、周囲組織が損なわれ得る。さらに、細胞療法は、例えば、そのような薬物を産生する遺伝子改変細胞の送達によって、アポトーシスまたは他の抗悪性腫瘍の分子を腫瘍部位に送達するのに使用され得る。
【００４８】
用語「神経傷害を治療する（または神経傷害の治療）」は、本明細書で定義される神経傷害の影響を軽減するか、その進行を遅らせ、停止させ、もしくは逆行させるか、またはその発症を遅らせ、もしくは防止することを指す。
【００４９】
用語「ＳＶＺの再生能力」の刺激は、脳室下帯が神経性および内皮組織を含む周囲組織を再形成もしくは作り変える能力の増大を指す。
【００５０】
用語「神経機能」の改善は、例えば、筋力、反射反応、または知覚などの機能をよくすることを指す。神経機能が改善されたという判断は、様々な行動試験、ならびに運動、感覚、反射、およびバランス試験によって評価される。
【００５１】
用語「患者の脳の損傷または傷害部分におけるアポトーシスの減少」は、何らかの他の傷害もしくは損傷を受けている患者の脳の一部で、アポトーシスを受ける細胞、またはプログラムされた細胞死の数を低下させることを指す。アポトーシスは、当技術分野で既知の任意の方法によって判断され得、それは、フローサイトメトリーに基づくアポトーシス検出方法、免疫組織化学方法、ＤＮＡ断片化アッセイ、カスパーゼ活性アッセイなどを含むがこれらに限定されない。アポトーシスはまた、ｉｎ  ｖｉｖｏ反応をモデル化または予測するよう、当技術分野で既知のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイによって判断され得る。
【００５２】
用語「有効量」は、特定の生物学的結果を達成するのに有効な、本明細書に記載する化合物、材料、組成物の濃度または量を指す。そのような結果は、本明細書に記載する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏの細胞成長および／または分化、および神経傷害治療を含むがこれらに限定されない。成長因子に関して、有効量は、約１ｎｇ／ｍＬ〜約１μｇ／ｍＬの範囲であってよい。ｉｎ  ｖｉｖｏで患者に投与されるＵＴＣについては、有効量は、わずか数百以下から数百万以上の範囲であってよい。特定の実施形態では、有効量は、約１０３〜約１０１１個の細胞、さらに具体的には少なくとも約１０４個の細胞の範囲でよい。投与されるべき細胞数は、医薬生物学者によく知られている要因の中でも、治療される大きさまたは総体積／表面積、治療される領域の場所に対する投与部位の近さを含むがこれらに限定されない、治療されるべき神経傷害の詳細によって異なることが認識されるであろう。
【００５３】
用語「有効期間（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｐｅｒｉｏｄ）」、「有効時間（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｐｅｒｉｏｄ  ｏｆ  ｔｉｍｅ）」または「有効条件」は、概して、意図する結果を達成するために、薬剤または医薬組成物に必要であるかまたは好ましい、時間、または他の制御可能な条件（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法の温度、湿度）を指す。
【００５４】
用語「医薬的に許容可能な担体」または「薬剤的に許容可能な培地」は、用語「生物学的に適合性の担体」または「生物学的に適合性の培地」と交換して使用されてよく、治療的に投与されるべき細胞および他の薬剤と適合性があるだけでなく、妥当なリスク／ベネフィット比に比例した過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の合併症なしで、ヒトおよび動物の組織と接触して使用されるのに適している、試薬、細胞、化合物、材料、組成物、および／または剤形を指す。本明細書でさらに詳細に説明するように、本発明で使用するのに適した、医薬的に許容可能な担体には、液体、半固体（例えばゲル）、および固体材料（例えば、細胞足場およびマトリックス、チューブ、シート、ならびに、当技術分野で既知であり、本明細書でさらに詳細に説明される、他のそのような材料）が含まれる。これらの半固体および固体材料は、体内での分解に抵抗するよう設計されてよく（非生分解性）、またはそれらは、体内で分解するように設計されてもよい（生分解性、生体侵食性）。生分解性材料は、さらに、生体再吸収性（ｂｉｏｒｅｓｏｒｂａｂｌｅ）または生体吸収性（ｂｉｏａｂｓｏｒｂａｂｌｅ）であってよい。すなわち、生分解性材料は、体液中に溶解および吸収されてよく（水溶性インプラントが１例である）、または他の材料への変換、もしくは天然経路を通じた崩壊および排除によって、分解され、最終的には体から排除される。
【００５５】
細胞もしくは組織移植、または細胞置換療法に関して、いくつかの用語を本明細書で使用する。用語「自家移転」、「自家移植」、「自家移植片（ａｕｔｏｇｒａｆｔ）」などは、細胞または移植ドナーが細胞または移植レシピエントでもある処理を指す。用語「同種移転」、「同種移植」、「同種移植片」などは、細胞または移植ドナーがレシピエントと同じ種であるが、同じ個体ではない処理を指す。ドナーの細胞がレシピエントと組織適合的に一致している細胞移転は、時には、「同系移転」と呼ばれる。用語「異種移転」、「異種移植」、「異種移植片」などは、細胞または移植ドナーがレシピエントとは異なる種である処理を指す。
【００５６】
本明細書で使用される用語「単離する」は、概して、自然環境から分離されている細胞を指す。この用語は、自然環境からの全体的な物理的分離（ｇｒｏｓｓ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）、例えば、ドナー動物からの除去、を含む。好適な実施形態では、単離した細胞は、組織に存在しない、すなわち、その細胞は、通常は接触している隣接細胞から分離または解離する。好ましくは、細胞は、細胞懸濁液として投与される。本明細書で使用される語句「細胞懸濁液」は、培地に接触していて、また、例えば組織片を穏やかな粉砕（ｇｅｎｔｌｅ  ｔｒｉｔｕｒａｔｉｏｎ）にかけることによって、解離されている、細胞を含む。
【００５７】
本明細書で使用される用語「マトリックス」は、概して、細胞と共に患者に投与される、生分解性および／または生体再吸収性材料を指す。マトリックスは、新たに成長した細胞により置き換えられるまで、一時的な足場として作用することができる。いくつかの実施形態では、マトリックスは、細胞と関連して使用される因子または他の薬剤の徐放をもたらすことができ、また、患者における組織成長を展開する構造体を提供することができる。他の実施形態では、マトリックスは単に、発達している組織の一時的な足場を提供するだけである。マトリックスは、粒子形態（直径が１０μｍ（１０ミクロン）超のマクロ粒子、または直径が１０μｍ（１０ミクロン）未満の微小粒子）であってよく、あるいは、構造的に安定した３次元インプラント（例えば足場）の形態であってもよい。マトリックスは、スラリー、ヒドロゲル、または３次元構造体、例えば、立方体、円筒、チューブ、ブロック、フィルム、シート、もしくは適切な解剖学的な形態、であってよい。
【００５８】
本明細書で使用される用語「足場」は、概して、細胞成長のテンプレートを提供する３次元の多孔性構造体を指す。足場は、体内で時間とともに分解する生分解性および／または生体再吸収性材料で作られる。足場が分解するのにかかる時間の長さは、材料の分子量に依存していてよい。したがって、より高い分子量の材料は、より長い期間にわたって構造的完全性を維持するポリマー足場を生じることができ、一方、より低い分子量のものは、遅い放出、および短い足場寿命を生じる。足場は、当技術分野で既知の任意の手段により作られてよい。足場を形成するのに使用され得るポリマーの例には、天然および合成ポリマーが含まれる。
【００５９】
説明
ニューロン細胞死または不全（これは、脳血管不全、局所的もしくはびまん性脳外傷、びまん性脳損傷、および外傷性ニューロパチーを含む）に関連する状態を含む、神経傷害は、共通の特徴として、特定のまたは脆弱な神経細胞群の機能障害または損失を有する。この共通性により、脆弱なまたは損傷した神経組織の修復および再生のため、同様の治療アプローチが開発でき、そのうちの１つは、細胞に基づく療法である。本明細書に記載するその様々な実施形態では、本発明は、分娩後組織由来の前駆細胞および細胞集団を利用する、神経の修復および再生のための方法および医薬組成物を特徴とする。本発明は、任意の神経傷害に適用可能であるが、いくつかの傷害に特に適していると思われる。その傷害には、限定することなく、塞栓性閉塞および血栓性閉塞を含む脳虚血または梗塞、急性虚血後の再灌流、出生時低酸素−虚血性傷害、心停止、ならびに任意のタイプの頭蓋内出血（例えば硬膜外、硬膜下、くも膜下および脳内）、および頭蓋内および椎骨内病変（例えば挫傷、貫通、せん断、圧縮および断裂）、および揺さぶられ症候群を含む。
【００６０】
前記にまとめたように、本発明は、その態様のうちの１つにおいて、実質的に血液がなくなった臍帯組織由来である、単離した臍帯組織由来細胞（ＵＴＣ）を使用して神経傷害を治療する方法に関する。ＵＴＣは、培養中に自己再生および増殖でき、神経表現型細胞に分化する能力を有する。ある実施形態は、そのような細胞を含む集団、細胞またはその成分もしくは産物を含む医薬組成物、および神経傷害を有する患者の治療のためその医薬組成物を使用する方法を特徴とする。臍帯組織由来細胞は、その培養中の成長特性によって、その細胞表面マーカーによって、遺伝子発現によって、特定の生化学的栄養因子を生成する能力によって、および免疫学的特性によって、特徴付けられている。
【００６１】
本明細書に記載の方法に従って、哺乳動物の臍帯組織は消化され、ＵＴＣは、好ましくは無菌環境で単離される。血液および残骸は、好ましくは、ＵＴＣの分離前に分娩後組織から除去される。例えば、分娩後組織は、リン酸緩衝生理食塩水などであるがこれに限定されない緩衝溶液で洗浄され得る。洗浄用緩衝液はまた、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン、およびニスタチンなどであるがこれらに限定されない、１つまたは複数の抗真菌薬および／または抗生物質も含み得る。
【００６２】
組織全体、またはその断片もしくは切片は、機械の力（刻む力または剪断力）によって脱凝集されることができる。現在好適な実施形態では、単離処置はまた、酵素消化プロセスを用いる。多くの酵素が培養中の成長を促進するため複合組織マトリックスからの個々の細胞の単離に有用であることが、当技術分野で既知である。消化性の弱いもの（例えば、デオキシリボヌクレアーゼおよび中性プロテアーゼ、ディスパーゼ）から、消化性の強いもの（例えば、パパインおよびトリプシン）まで様々な、このような消化酵素が市販されている。そのような酵素の限定的なリストには、粘液溶解酵素活性、メタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ（トリプシン、キモトリプシン、もしくはエラスターゼなど）、およびデオキシリボヌクレアーゼが含まれる。現在好適なのは、メタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、および粘液溶解活性から選択される酵素活性である。例えば、コラゲナーゼは、さまざまな細胞を組織から単離するのに有用であることが知られている。デオキシリボヌクレアーゼは、単鎖ＤＮＡを消化でき、単離中、細胞凝集を最小限に抑えることができる。好適な方法は、コラゲナーゼおよびディスパーゼ、またはコラゲナーゼ、ディスパーゼ、およびヒアルロニダーゼによる酵素処理を含む。当業者は、さまざまな組織源から細胞を単離する、そのような多くの酵素処理が当技術分野で知られていることを認識するであろうし、本発明の細胞単離における有用性について、新しいかまたは追加の酵素または酵素の組み合わせを評価する知識を身につけている。好適な酵素処理は、約０．５〜２時間以上であってよい。他の好適な実施形態では、組織は、解離工程の酵素処理中、約３７℃でインキュベートされる。
【００６３】
単離した細胞は、細胞培養を開始するかまたは播種するために使用されてよい。単離した細胞は、コーティングされていないか、または細胞外マトリックス、またはラミニン、コラーゲン（天然、変性、もしくは架橋）、ゼラチン、フィブロネクチン、および他の細胞外マトリックスタンパク質などのリガンドでコーティングされた、無菌組織培養容器に移される。細胞は、ＤＭＥＭ（高または低グルコース）、先端的なＤＭＥＭ（ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ２０１、イーグルの基本培地、ハムＦ１０培地（Ｆ１０）、ハムＦ−１２培地（Ｆ１２）、イスコフ改変ダルベッコ培地、間葉系幹細胞成長培地（ＭＳＣＧＭ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０、およびＣＥＬＬ−ＧＲＯ−ＦＲＥＥなどであるがこれらに限定されない、細胞の成長を維持できる任意の培養培地で培養される。培養培地は、例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、好ましくは約２〜１５％（ｖ／ｖ）；ウマ血清（ＥＳ）；ヒト血清（ＨＳ）；β−メルカプトエタノール（ＢＭＥもしくは２−ＭＥ）、好ましくは約０．００１％（ｖ／ｖ）；１つもしくは複数の成長因子、例えば、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−Ｉ）、白血球阻害因子（ＬＩＦ）、およびエリスロポエチン；Ｌ−バリンを含むアミノ酸；ならびに例えば、ペニシリンＧ、ストレプトマイシン硫酸塩、アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン、およびニスタチンなど、微生物汚染を制御する１つもしくは複数の抗生物質および／または抗真菌薬を含む、１つまたは複数の成分を、単独または組み合わせて、補充されることができる。培養培地は、好ましくは、成長培地（例えば、ＤＭＥＭ低グルコース、血清、ＢＭＥ、および抗生物質）を含む。
【００６４】
細胞は、細胞を成長させる密度で培養容器に播種される。好ましくは、細胞は、空気中、約０〜約５容量％のＣＯ２で、空気中、約２〜約２５容量％のＯ２で、好ましくは空気中、約５〜約２０％のＯ２で、培養される。細胞は、好ましくは約２５℃〜約４Ｏ℃で培養され、さらに好ましくは、３７℃で培養される。細胞は、好ましくはインキュベーターで培養される。培養容器中の培地は、静止しているか、または例えばバイオリアクターを使用して、攪拌されてもよい。ＵＴＣは、好ましくは、低酸化的ストレス下で（例えば、グルタチオン、ビタミンＣ、カタラーゼ、ビタミンＥ、Ｎ−アセチルシステインを加えて）成長する。本明細書で使用される「低酸化的ストレス」は、培養される細胞に対して、フリーラジカルによるダメージが全くないかまたは最小限である状態を指す。
【００６５】
本発明のいくつかの実施形態では、ＵＴＣは、継代されるか、または最初に使用したものと同じかまたは異なる種類の新鮮培地を含む別個の培養容器へと除去されてよく、ここで細胞集団は、有糸分裂的に増殖し得る。本発明の方法で有用な細胞は、０代継代と老化との間のどの時点でも使用されてよい。細胞は、好ましくは、約３〜約２５回継代され、さらに好ましくは約４〜約１２回継代され、好ましくは、１０または１１回継代される。クローン化および／またはサブクローン化は、細胞のクローン集団が単離したことを確認するために行われてよい。
【００６６】
さらに、分娩後組織に存在する異なる細胞型は、分集団に分割され、その分集団からＵＴＣを単離することができる。これは、分娩後組織をその構成細胞に解離する酵素処理、それに続く特定の細胞型のクローン化および選択（これには、形態学的および／または生化学的マーカーに基づいた選択；所望の細胞の選択的成長（ポジティブ選択）；不必要な細胞の選択的破壊（ネガティブ選択）；例えば大豆アグルチニンによる、混合集団における差次的細胞凝集力に基づいた分離；凍結融解処置；混合集団における細胞の差次的接着特性；ろ過；従来の、およびゾーン遠心分離；遠心性水簸（流動に対抗する遠心分離（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｔｒｅａｍｉｎｇ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ））；単位重力分離；向流分配；電気泳動；および蛍光励起細胞選別（ＦＡＣＳ）が含まれるがこれらに限定されない）を含むがこれらに限定されない、細胞分離の標準技術を用いて達成することができる。
【００６７】
培養培地は必要に応じて変えられる。インキュベーションは、十分な数または密度の細胞が皿に蓄積するまで続けられる。その後、存在する任意の元の外植組織切片を除去してよく、残りの細胞は、標準技術を用いたトリプシン処理によって、または細胞スクレーパーを使用することによって、皿から分離される。トリプシン処理後、細胞は、前記のとおり、収集され、新鮮培地へと除去され、インキュベートされる。いくつかの実施形態では、培地は、トリプシン処理後の約２４時間で、少なくとも１回変えられて、浮遊細胞を除去する。培養物に残る細胞は、ＵＴＣであると考えられる。
【００６８】
ＵＴＣは、冷凍保存されてよい。したがって、自家移転（母もしくは子）のためのＵＴＣは、子供を出産した後の適切な分娩後組織由来であってよく、その後、移植のため後で必要になった場合に利用可能となるよう、冷凍保存され得る。
【００６９】
ＵＴＣは、例えば、成長特性（例えば、集団倍加能力、倍加時間、老化までの継代）、核型分析（例えば、正常な核型；母系性もしくは新生児系列）、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ分析）、免疫組織化学および／または免疫細胞化学（例えば、エピトープ検出のため）、遺伝子発現プロファイリング（例えば、遺伝子チップアレイ；ポリメラーゼ連鎖反応（例えば、逆転写酵素ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、および従来のＰＣＲ））、タンパク質アレイ、タンパク質分泌（例えば、血漿凝固アッセイまたはＵＴＣ−馴化培地の分析による、例えば酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）による）、混合リンパ球反応（例えば、ＰＢＭＣ刺激の指標として）、ならびに／または当技術分野で既知の他の方法によって、特徴付けられ得る。
【００７０】
臍組織由来細胞の例は、２００４年６月１０日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎが預かっており、以下のとおりＡＴＣＣ受入番号が割り当てられている：（１）菌株表示ＵＭＢ０２２８０３（Ｐ７）は、受入番号ＰＴＡ−６０６７を割り当てられ；（２）菌株表示ＵＭＢ０２２８０３（Ｐ１７）は受入番号ＰＴＡ−６０６８を割り当てられた。
【００７１】
本発明の方法に有用なＵＴＣは、以下の成長特徴のうち１つまたは複数を有することができる：（１）培養中、成長のためＬ−バリンを必要とする；（２）約５％〜約２０％の酸素を含有する大気中で、成長することができる；（３）老化に達する前に、培養中、少なくとも約４０倍加する可能性を有する；（４）コーティングされていない組織培養容器、またはゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオルニチン、ビトロネクチンまたはフィブロネクチンでコーティングされた組織培養容器に付着し、その容器上で増加する。
【００７２】
さらに、本発明の方法に有用なＵＴＣは、細胞が継代するときに維持される正常な核型を有する。核型分析方法が利用可能であり、また、当業者に既知である。
【００７３】
また、本発明の方法に有用なＵＴＣは、（１）組織因子、ビメンチン、およびα−平滑筋アクチンのうち少なくとも１つの産生、ならびに（２）フローサイトメトリーにより検出されたときに、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＰＤ−Ｌ２、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ細胞表面マーカーのうち少なくとも１つの産生、を含む、あるタンパク質の産生により特徴づけられることができる。さらに、本発明の方法に有用なＵＴＣは、フローサイトメトリーにより検出されたときにＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤｌ１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ細胞表面マーカーのうち少なくとも１つの産生がないことにより特徴付けられ得る。本発明の方法に有用なＵＴＣは、組織因子；ビメンチン；およびα−平滑筋アクチンのうち少なくとも２つ、または組織因子、ビメンチン、およびα−平滑筋アクチンのタンパク質の３つすべてを産生することができる。
【００７４】
さらに、本発明の方法に有用なＵＴＣは、遺伝子発現により特徴付けられることができ、遺伝子発現は、線維芽細胞、間葉系幹細胞、もしくは腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞に関し、interleukin 8; reticulon 1; chemokine (C-X-C motif) ligand 1 (melonoma growth stimulating activity, alpha); chemokine (C-X-C motif) ligand 6 (granulocyte chemotactic protein 2); chemokine (C-X-C motif) ligand 3; およびtumor necrosis factor, alpha-induced protein 3のうちの少なくとも１つをコード化する遺伝子について、増加する。
【００７５】
また、本発明の方法に有用なＵＴＣは、遺伝子発現により特徴付けられることができ、遺伝子発現は、線維芽細胞、間葉系幹細胞、もしくは腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞に関し、short stature homeobox 2; heat shock 27 kDa protein 2; chemokine (C-X-C motif) ligand 12 (stromal cell- derived factor 1); elastin (supravalvular aortic stenosis, Williams-Beuren syndrome); Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp586M2022 (from clone DKFZp586M2022); mesenchyme homeo box 2 (growth arrest-specific homeo box); sine oculis homeobox homolog 1 (Drosophila); crystallin, alpha B; disheveled associated activator of morphogenesis 2; DKFZP586B2420 protein; similar to neuralin 1; tetranectin (plasminogen binding protein); src homology three (SH3) and cysteine rich domain; cholesterol 25 -hydroxylase; runt-related transcription factor 3; interleukin 11 receptor, alpha; procollagen C-endopeptidase enhancer; frizzled homolog 7 (Drosophila); hypothetical gene BC008967; collagen, type VIII, alpha 1; tenascin C (hexabrachion); iroquois homeobox protein 5; hephaestin; integrin, beta 8; synaptic vesicle glycoprotein 2; neuroblastoma, suppression of tumorigenicity 1; insulin-like growth factor binding protein 2, 36kDa; Homo sapiens cDNA FLJ12280 fis, clone MAMMA1001744; cytokine receptor-like factor 1; potassium intermediate/small conductance calcium-activated channel, subfamily N, member 4; integrin, beta 7; transcriptional co-activator with PDZ-binding motif (TAZ); sine oculis homeobox homolog 2 (Drosophila); KIAA1034 protein; vesicle- associated membrane protein 5 (myobrevin); EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1; early growth response 3; distal-less homeo box 5; hypothetical protein FLJ20373; aldo-keto reductase family 1, member C3 (3-alpha hydroxysteroid dehydrogenase, type II); biglycan; transcriptional co-activator with PDZ-binding motif (TAZ); fibronectin 1; proenkephalin; integrin, beta-like 1 (with EGF-like repeat domains); Homo sapiens mRNA full length insert cDNA clone EUROIMAGE 1968422; EphA3; KIAA0367 protein; natriuretic peptide receptor C/guanylate cyclase C (atrionatriuretic peptide receptor C); hypothetical protein FLJ14054; Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp564B222 (from clone DKFZp564B222); BCL2/adenovirus ElB 19kDa interacting protein 3-like; AE binding protein 1; および cytochrome c oxidase subunit VIIa polypeptide 1 (muscle)のうち少なくとも１つをコード化する遺伝子について、減少する。
【００７６】
さらに、本発明の方法に有用なＵＴＣは、以下のうち少なくとも１つの分泌により特徴付けられ得る：ＭＣＰ−１；ＩＬ−６；ＩＬ−８；ＧＣＰ−２；ＨＧＦ；ＫＧＦ；ＦＧＦ；ＨＢ−ＥＧＦ；ＢＤＮＦ；ＴＰＯ；ＭＩＰ１ｂ；Ｉ３０９；ＭＤＣ；ＲＡＮＴＥＳ；ＴＭＰｌ。さらに、本発明の方法に有用なＵＴＣは、ＥＬＩＳＡにより検出されたときに、以下のうち少なくとも１つの分泌がないことにより特徴付けられ得る：ＴＧＦ−β２；ＡＮＧ２；ＰＤＧＦｂｂ；ＭＩＰ１ａ；ＶＥＧＦ。
【００７７】
本発明の方法に有用なＵＴＣは、好ましくは前記の成長、タンパク質／表面マーカー産生、遺伝子発現もしくは物質分泌特性のうち２つまたは３つ以上を含む。本発明の方法に有用なＵＴＣは、それらの特徴のうち３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、またはそれ以上を含むことができる。本発明の方法に有用なＵＴＣは、前記の特徴を全て含むこともできる。
【００７８】
態様のうちいくつかにおいて、本発明の方法に有用なＵＴＣの中には、前述した特徴を有するＵＴＣ、さらに具体的には、細胞が正常な核型を有し、継代と共に正常な核型を維持し、さらには、細胞がマーカーＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃのそれぞれを発現し、細胞が列挙したマーカーに対応する免疫学的に検出可能なタンパク質を産生するものがある。本発明の方法に有用なＵＴＣは、前記に加え、フローサイトメトリーにより検出されたときに、マーカーＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、またはＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの任意のものに対応するタンパク質を産生しない細胞を含むことができる。
【００７９】
さまざまな表現型を生じさせる株（ｌｉｎｅｓ）に沿って分化する能力を有する、ある細胞は、不安定であるので、自発的に分化し得る。本発明の方法に有用なＵＴＣは、例えば、神経の株に沿って、自発的に分化しない細胞である。本発明の方法に有用なＵＴＣは、成長培地で成長すると、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧＥＮＥＣＨＩＰを使用して判断されるときにその表面で産生される細胞マーカーに対して、および様々な遺伝子の発現パターンに対して、実質的に安定している。細胞は、継代中にわたり、また、複数回の集団倍加にわたって、例えばそれらの表面マーカー特徴においては、実質的に一定のままである。
【００８０】
しかしながら、本発明の方法に有用なＵＴＣの１つの特徴は、分化を誘導する細胞培養条件にさらすことによって、神経系統表現型へ分化するよう計画的に誘導され得ることである。これは、当技術分野で既知の１つまたは複数の方法により達成することができる。例えば、本明細書に例示するように、ＵＴＣは、Ｂ２７（Ｂ２７  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｌグルタミン、およびペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  Ｃａ．）の中で、ラミニンコートされたフラスコ上に蒔かれてよく、この組み合わせは、本明細書では神経前駆細胞増殖（ＮＰＥ）培地という。ＮＰＥ培地は、ｂＦＧＦおよび／またはＥＧＦをさらに補充されてもよい。あるいは、本発明の方法に有用なＵＴＣは、（１）ＵＴＣを神経前駆細胞と共培養すること、または（２）ＵＴＣを神経前駆細胞馴化培地で成長させることによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化するように誘導され得る。
【００８１】
ＵＴＣの分化は、長期プロセスでの双極細胞形態によって証明され得る。誘導された細胞集団は、ネスチンの存在についてポジティブ染色される。分化したＵＴＣは、ネスチン、ＴｕＪｌ（ＢＩＩＩ  ｔｕｂｕｌｉｎ）、ＧＦＡＰ、チロシンヒドロキシラーゼ、ＧＡＢＡ、０４および／またはＭＢＰの検出により評価され得る。さらに、本発明の方法に有用なＵＴＣは、ニューロスフェアのニューロン幹細胞形成に特徴的な３次元体を形成する能力を示すことができる。
【００８２】
本発明の方法に有用なＵＴＣは、異種性の細胞集団を含み得る。本発明の方法に有用な異種性の細胞集団は、前述のＵＴＣを少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％を含むことができる。本発明の方法に有用な異種性の細胞集団は、幹細胞または他の前駆細胞、例えば神経前駆細胞をさらに含んでよく、あるいは、完全に分化した神経細胞をさらに含んでよい。さらに、集団は、実質的に同種であってよく、すなわち、実質的にＵＴＣのみ（例えば少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上のＵＴＣ）を含む。本発明の方法に有用な同種の細胞集団は、臍または胎盤由来細胞を含み得る。同種の臍由来細胞集団は、好ましくは母系統の細胞を含まない。同種の胎盤由来細胞集団は、新生児または母系統であってよい。細胞集団の同種性は、当技術分野で既知の任意の方法によって、例えば、既知の方法に従って、細胞選別（例えば、フローサイトメトリー）によって、またはクローン増殖によって達成できる。ゆえに、本発明の方法に有用な同種ＵＴＣ集団は、臍帯組織由来細胞のクローン細胞株を含むことができる。そのような集団は、非常に望ましい機能性を持つ細胞クローンが単離されたときに、特に有用である。
【００８３】
さらに、本発明の方法に有用なＵＴＣは、１つまたは複数の因子の存在下で、神経経路に沿って幹細胞分化を刺激する、他の条件下で、インキュベートされた細胞集団を含むことができる。そのような因子は、当技術分野で既知であり、当業者は、適切な分化条件の決定が、所定の実験で達成され得ることを認識するであろう。そのような条件の最適化は、統計学的な実験デザインおよび分析により達成することができ、例えば、応答曲面法は、例えば生物学的培養における複数の変数を同時に最適化することができる。例示的な因子は、神経経路または系統に沿った幹細胞分化を刺激することが当技術分野で既知の他の条件に加え、成長または栄養因子、脱メチル化剤、神経系統細胞との共培養、または神経系統細胞−馴化培地での培養などの因子を含むがこれらに限定されない（例えば、Ｌａｎｇ，  ＫＪＤ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｒｅｓ．，  ２００４；７６：１８４−１９２；Ｊｏｈｅ，  ＫＫ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌ，  １９９６；１０：３１２９−３１４０；Ｇｏｔｔｌｅｉｂ，  Ｄ，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  ２００２；２５：３８１−４０７を参照）。
【００８４】
本発明の方法に有用なＵＴＣは、例えば、神経治療的に有用な遺伝子産物を産生するか、または腫瘍の治療のための抗悪性腫瘍薬を産生するために、遺伝子操作されることもできる。遺伝子操作は、組み込みウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、もしくは、アデノ随伴ウイルスベクター；非組み込み複製ベクター、例えば、パピローマウイルスベクター、ＳＶ４０ベクター、アデノウイルスベクター；もしくは、複製欠陥ウイルスベクターを含むがこれらに限定されない、様々なベクターのいずれかを使用して達成され得る。ＤＮＡを細胞に導入する他の方法は、リポソーム、エレクトロポレーション、パーティクルガンの使用、または直接的なＤＮＡ注入によるものを含む。
【００８５】
宿主細胞は、とりわけプロモーターもしくはエンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位などの１つまたは複数の適切な発現制御要素によって制御されるか、またはそれらと操作的に関連するＤＮＡ、および選択可能なマーカーで、形質転換もしくは形質移入され得る。任意のプロモーターが、挿入遺伝子の発現を駆動するために用いられてよい。例えば、ウイルスプロモーターは、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー、ＳＶ４０、パピローマウイルス、エプスタイン・バーウイルス、またはエラスチン遺伝子プロモーターを含むがこれらに限定されない。さらに、目的の遺伝子の発現を制御するのに使用される制御要素により、遺伝子の発現を調節することができ、産物は、ｉｎ  ｖｉｖｏで必要とされる場合にのみ合成される。一時的な発現を望むならば、非組み込みベクターおよび／もしくは複製欠陥ベクターとともに、好ましくは、構成的プロモーターを用いることができる。あるいは、もし必要ならば、誘導プロモーターを、挿入遺伝子の発現を駆動するために用いることができる。誘導プロモーターは、メタロチオネイン、もしくは、ヒートショックタンパク質と関連したものを含むがこれらに限定されない。
【００８６】
外来ＤＮＡ導入後、操作された細胞を、強化培地で成長させ、その後、選択培地に切り換えることができる。外来ＤＮＡ中の選択可能なマーカーは、選択物に対する耐性を与え、細胞が（例えば、プラスミド上の）外来ＤＮＡを染色体中に安定的に組み込み、巣（ｆｏｃｉ）を形成するよう成長することを可能にし、この巣は、クローン化し、細胞株中へと増殖することができる。この方法は、遺伝子産物を発現するような細胞株を操作するために、有利に用いることができる。
【００８７】
本発明の方法に有用なＵＴＣは、炎症および植え込み部位の拒絶反応を促進する因子の発現を「ノックアウト」もしくは「ノックダウン」するように遺伝子操作されてもよい。標的遺伝子の発現レベルもしくは標的遺伝子産物の活性レベルを低減するための陰性調節技術を、以下で説明する。本明細書で用いられる「陰性調節」は、調節処理の不存在下の標的遺伝子産物のレベルおよび／もしくは活性に対する、標的遺伝子産物のレベルおよび／もしくは活性の低減をいう。ニューロンまたはグリア細胞を原産とする遺伝子の発現は、いくつかの技術を用いて、低減するか、またはノックアウトすることができる。その技術には、例えば、相同的組み換え技術を用いて遺伝子を不活性化することによる発現の抑制が含まれる。典型的には、標的遺伝子からの正常なｍＲＮＡの産生を阻害し、結果的に遺伝子の不活性化を生じる陽性選択可能マーカー、例えばｎｅｏ、によって、タンパク質の重要な領域をコードするエキソン（すなわち、その領域の５’側エキソン）が、割り込まれる。また、遺伝子の一部に欠失を作り出すことで、もしくは、全体の遺伝子を欠失することによって、遺伝子を不活性化してもよい。ゲノム中で、離れた、標的遺伝子と相同な２つの領域を備えた構築物を用いることによって、その２つの領域に介在する配列を欠失することができる（Ｍｏｍｂａｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  １９９１；８８：３０８４）。また、アンチセンス、ＤＮＡザイム、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）（ｓｉＲＮＡ）、および、標的遺伝子の発現を抑制する他のこのような分子を、標的遺伝子活性のレベルを低減するために用いることができる。例えば、主要組織適合性遺伝子複合体（ＨＬＡ）の発現を抑制するアンチセンスＲＮＡ分子は、免疫反応について、最も多用途であることが示されてきた。さらに、三重らせん分子を、標的遺伝子活性のレベルを低減する上で利用することができる。このような技術は、Ｄａｖｉｓ，  ＬＧ，  ｅｔ  ａｌ．，  （ｅｄｓ），  Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  １９９４，  Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，  Ｃｔ．に詳細に説明されている。
【００８８】
さらに、本発明の方法に有用な、ＵＴＣから準備した細胞可溶化液および細胞溶解性分画、またはＵＴＣを含む異種もしくは同種細胞集団、ならびに、遺伝子操作されたか、もしくは神経経路に沿って分化するよう刺激されたＵＴＣもしくは集団が提供される。ＵＴＣ可溶化液可溶性分画（すなわち、実質的に膜がない）のｉｎ  ｖｉｖｏでの使用は、例えば、拒絶反応もしくは他の逆免疫反応の誘因となる可能性が最も高い細胞表面タンパク質を相当量導入することなしに、患者において、有利な細胞内環境を同種的に用いることを可能にする。細胞を可溶化する方法は、当技術分野では周知であり、機械的破砕、酵素的破砕、化学的破砕、またはそれらの組み合わせといった様々な手段を含む。そのような細胞可溶化液は、それらの成長培地において直接細胞から準備されてよく、したがって、分泌された成長因子などを含んでよく、あるいは、例えばＰＢＳもしくは他の溶液中で、洗浄され培地を含まない細胞から準備されてもよい。洗浄された細胞は、好適な場合、元の集団密度より高い濃度で再懸濁されてもよい。
【００８９】
例えば細胞分画を後に分離せずに、細胞を破砕することによって、本発明の方法に有用なＵＴＣの全体的な細胞可溶化液が準備される。あるいは、細胞膜分画は、当技術分野で既知の所定の方法、例えば、遠心分離、ろ過もしくは同様の方法、によって、細胞の可溶性分画から分離され得る。
【００９０】
本発明の方法に有用な、臍帯組織由来細胞集団から準備された細胞可溶化液または細胞可溶性分画は、そのまま使用されるか、例えば限外ろ過もしくは凍結乾燥によってさらに濃縮されるか、あるいは、乾燥して、部分的に精製して、当技術分野において既知の製薬上許容できる担体もしくは希釈剤と組み合わせるか、または、例えば、製薬上有用なタンパク質組成物といった生物製剤のような他の化合物と組み合わせてもよい。細胞可溶化液またはその分画は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、単独で、または、例えば自家もしくは同系の生細胞と共に、使用されることができる。可溶化液は、ｉｎ  ｖｉｖｏで導入される場合、治療部位で局所的に導入してもよいし、あるいは、例えば、患者に必要とされる細胞成長因子を提供するために、遠隔的に導入してもよい。
【００９１】
さらに、本発明の方法に有用なＵＴＣは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養されて、生物学的産物を高い収量で産生することができる。例えば、目的の特定の生物学的産物（例えば、栄養因子）を天然で産生するか、または生物学的産物を産生するよう遺伝子操作したそのような細胞は、本明細書で説明する培養技術を用いて、クローン的に増殖することができる。あるいは、細胞は、神経系統または他の細胞系統への分化を誘導する培地中で増殖することができる。いずれの場合も、細胞によって産生され、培地中に分泌された生物学的産物を、標準的分離技術、例えば、数例挙げると、差次的タンパク質沈殿、イオン交換クロマトグラフィ、ゲルろ過クロマトグラフィ、電気泳動、および、ＨＰＬＣを用いて、馴化培地から容易に単離することができる。「バイオリアクター」を、フィーディング（ｆｅｅｄｉｎｇ）のためのフロー法、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの３次元培養、を利用するために用いてもよい。基本的に、新鮮培地が３次元培養を通過するので、生物学的産物が培養物から洗い出され、その後、上記のように流出物から単離されてもよい。
【００９２】
あるいは、目的の生物学的産物は、細胞の中にとどまってもよい。したがって、その収集には、上記で説明したように、細胞を可溶化する必要があるかもしれない。生物学的産物を、その後、前記に列記した技術のうち任意の１つまたは複数を用いて、精製してもよい。
【００９３】
さらに、本発明の方法に有用な培養ＵＴＣ由来の馴化培地は、以下で述べるようにｉｎ  ｖｉｔｒｏ  およびｉｎ  ｖｉｖｏで使用され得る。ＵＴＣ馴化培地の使用により、拒絶反応もしくは他の逆免疫反応の誘因となりうる無処理細胞を導入することなしに、ＵＴＣによって分泌された有利な栄養因子を患者において同種的に使用することができる。培養培地中で細胞を培養し、その後、培地から細胞を取り除くことによって、馴化培地を準備する。
【００９４】
本発明の方法に有用なＵＴＣ集団から準備した馴化培地は、そのまま使用されるか、例えば限外ろ過もしくは凍結乾燥によってさらに濃縮するか、あるいは、乾燥して、部分的に精製して、当技術分野において既知の医薬的に許容可能な担体もしくは希釈剤と組み合わせるか、または、例えば医薬的に有用なタンパク質組成物といった生物製剤のような他の化合物と組み合わせることができる。馴化培地を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏで、単独で使用するか、または、例えば、自家もしくは同系生細胞と組み合わせることができる。馴化培地は、ｉｎ  ｖｉｖｏで導入される場合、治療部位で局所的に導入してもよいし、例えば患者に必要とされる細胞成長もしくは栄養因子を提供するために、遠隔的に導入してもよい。
【００９５】
さらに、液体、固体、半固体の基質上で本発明の方法に有用なＵＴＣを培養することで産生された細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を、組織修復もしくは置換を必要とする被験者に生細胞を埋め込む代替物として、準備し、収集し、利用することができる。ＵＴＣは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、本明細書中で別の箇所で説明するような３次元フレームワーク上で、所望の量のＥＣＭをそのフレームワーク上へ分泌するような条件下で、培養される。新組織を含む細胞を取り除き、例えば注入可能な製剤として更に使用するために、ＥＣＭを加工する。これを達成するために、フレームワーク上の細胞を殺し、フレームワークから任意の細胞壊死破片を取り除いた。このプロセスは、いくつかの異なる方法で実行されてもよい。例えば、生組織を低温保存することなしに液体窒素中で急速冷凍することができるか、または、組織を無菌蒸留水に浸すことができ、細胞は浸透圧に反応して破裂する。
【００９６】
一度細胞を殺すと、細胞膜は破砕されて、ＥＤＴＡ、ＣＨＡＰＳ、もしくは、双性イオン洗剤のような中性洗剤によるすすぎ処理をすることによって、細胞壊死破片が取り除かれる。あるいは、細胞膜を破壊し、細胞内容物を除去することのできる試薬によって、組織を酵素的に消化し、かつ／もしくは抽出することができる。このような酵素の例は、ヒアルロニダーゼ、ディスパーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼを含むがこれらに限定されない。洗剤の例は、例えば、アルキルアリルポリエーテルアルコール（トリトンＸ−１００）、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．）、ＢＲＩＪ−３５、ポリエトキシエタノールラウリルエーテル（Ａｔｌａｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａ．）、ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ  ２０）、ポリエトキシエタノールソルビタンモノラウレート（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ）、ポリエチレンラウリルエーテル（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ）のような非イオン性洗剤、および、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、硫酸化高級脂肪族アルコール、スルホン酸化アルカン、枝分かれ鎖もしくは非枝分かれ鎖中に７〜２２個の炭素原子を含むスルホン酸化アルキルアーレンのようなイオン性洗剤を含む。
【００９７】
例えば、新しい組織が、生分解性もしくは非生分解性の３次元フレームワーク上で形成されたかどうかに応じて、様々な方法で、ＥＣＭの収集を達成することができる。例えば、フレームワークが非生分解性の場合、フレームワークを超音波処理、高圧力水噴流、機械的剥離、または、洗剤もしくは酵素での軽い処理、あるいは、上記の任意の組み合わせにかけることによって、ＥＣＭを取り除くことができる。
【００９８】
フレームワークが生分解性である場合、ＥＣＭは、例えば、フレームワークを溶液中に分解もしくは溶解させることによって、収集され得る。あるいは、生分解性フレームワークがＥＣＭとともに注入することが可能な材料から構成される場合、フレームワークおよびＥＣＭは全体として、その後の注入のために加工することができる。あるいは、上記で説明した非生分解性フレームワークからＥＣＭを収集するための方法のいずれかによって、ＥＣＭを生分解性フレームワークから除去することができる。好ましくは、全収集プロセスが、ＥＣＭを変性することがないように設計される。
【００９９】
収集後、ＥＣＭを更に加工してもよい。例えば、超音波処理のような当技術分野で周知の技術を用いて、ＥＣＭを細かい粒子に均質化することができ、外科用針を通過することが可能である。所望の場合、ガンマ線照射によって、ＥＣＭの成分を架橋することもできる。例えば、ＥＣＭを滅菌し架橋するために、０．２５〜２メガラドで、ＥＣＭを照射することができる。グルタルアルデヒドのような有毒な薬剤を用いた化学的架橋は可能であるが、概して好まれない。
【０１００】
ＥＣＭ中に存在するさまざまな型のコラーゲンのような、タンパク質の量および／もしくは割合は、本発明の方法に有用なＵＴＣによって産生されたＥＣＭを１つまたは複数の他の細胞型のＥＣＭと混ぜることによって調整してもよい。さらに、タンパク質、成長因子、および／もしくは、薬剤のような生物活性物質を、ＥＣＭ中に取り込むことができる。例示的な生物活性物質は、注入部位での治癒および組織修復を促進する組織成長因子、例えばＴＧＦ−βおよび同様のもの、を含む。このような追加的な薬剤は、例えば、ＵＴＣによって産生された全細胞可溶化液、可溶性細胞分画、もしくは、さらに精製した成分および産物とともに利用してもよい。
【０１０１】
別の態様では、本発明は、神経傷害を治療し、神経機能を改善し、ＳＶＺの再生の能力を刺激するか、またはＳＶＺ中のアポトーシスを減少させるための様々な方法で、ＵＴＣ、ＵＴＣ集団、ＵＴＣの成分および産物を利用する医薬組成物を提供する。一部の医薬組成物は、生細胞を含む（ＵＴＣ単独、他の細胞型と混合されたＵＴＣ）。他の医薬組成物は、ＵＴＣ細胞成分（例えば、細胞可溶化液、可溶性細胞分画、馴化培地、ＥＣＭ、もしくは前記のいずれかの成分）、または、産物（例えば、ＵＴＣによって天然に、もしくは、遺伝子操作を通じて産生された栄養因子および他の生物学的因子、ＵＴＣ培養由来の馴化培地）を含む。いずれの場合も、医薬組成物は、当技術分野で既知の抗炎症薬、抗アポトーシス薬、抗酸化剤、成長因子、神経栄養因子、または神経再生薬もしくは神経保護薬のような他の活性薬剤をさらに含んでもよい。
【０１０２】
ＵＴＣ医薬組成物に加えられ得る他の成分の例は、２〜３例を挙げると、（１）他の神経保護薬または神経に有用な薬；（２）選択された細胞外マトリックス成分、例えば、１つまたは複数のタイプの当技術分野で既知のコラーゲンおよび／または成長因子、多血小板血漿、および薬剤（あるいは、ＵＴＣは、遺伝子操作されて成長因子を発現および産生することができる）；（３）抗アポトーシス薬（例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＥＰＯミメティボディ、トロンボポエチン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）−１、ＩＧＦ−ＩＩ、肝細胞成長因子、カスパーゼ抑制物質）；（４）抗炎症化合物（例えば、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ抑制物質、ＴＧＦ−β抑制物質、スタチン、ＩＬ−６およびＩＬ−１抑制物質、ペミロラスト、トラニラスト、レミケード、シロリムス、および非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）（例えばＴＥＰＯＸＡＬＩＮ、トルメチン、およびＳＵＰＲＯＦＥＮ）；（５）免疫抑制もしくは免疫調節薬、例えば、カルシニューリン抑制物質、ｍＴＯＲ抑制物質、抗増殖性薬、副腎皮質ステロイドおよび様々な抗体；（６）抗酸化剤、例えばプロブコール、ビタミンＣおよびＥ、コエンザイムＱ−ＩＯ、グルタチオン、Ｌ−システインおよびＮ−アセチルシステイン；ならびに（７）局所麻酔薬を含むが、これらに限定されない。
【０１０３】
本発明に含まれる医薬組成物は、医薬的に許容可能な担体または培地で処方された、ＵＴＣ、またはその成分もしくは産物を含む。適切な医薬的に許容可能な担体は、水、塩類溶液（例えばＲｉｎｇｅｒ溶液）、アルコール、油、ゼラチン、および炭水化物、例えばラクトース、アミロース、もしくはでんぷん、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、およびポリビニルピロリドンを含む。このような製剤は、滅菌され、所望であれば、補助薬、例えば潤滑剤、保存料、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、および浸透圧に影響する塩類、緩衝液、および着色料と混合されることができる。本発明で使用するのに適した医薬的担体は、当技術分野で既知であり、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１７ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）およびＷＯ９６／０５３０９に記載される。
【０１０４】
典型的には、しかし非排他的に、ＵＴＣ成分または産物を含むが生細胞を含まない医薬組成物は、液体として（または、経口送達が適切である場合、固体タブレット、カプセルなどとして）処方される。これらは、薬剤および生物分子を標的神経組織に送るため、当技術分野で既知の受け入れ可能な任意のルートによる投与のために処方されてよく、ルートは、経口、経鼻、眼、および静脈内を含む非経口を含むがこれらに限定されない。非経口投与の特定のルートは、ポンプ装置を備えるかもしくは備えない頭蓋内もしくは椎骨内針および／またはカテーテルを通じた送達による、筋肉内、皮下、腹腔内、脳内、脳室内、側脳室内、くも膜下腔内、大槽内、脊髄内および／または脊髄周辺の投与ルートを含むがこれらに限定されない。
【０１０５】
ＵＴＣ生細胞を含む医薬組成物は、典型的には、液体、半固体（例えばゲル）または固体（例えば、神経組織の操作に適切な、マトリックス、足場など）として調剤される。生細胞の標的神経組織への送達を達成するため、当技術分野で既知である任意の許容できる経路によって投与するために液体組成物が調剤される。典型的には、これらは、ポンプ装置を備えるかもしくは備えない頭蓋内もしくは椎骨内針および／またはカテーテルを経由した送達による、眼内、脳内、脳室内、側脳室内、くも膜下腔内、大槽内、脊髄内および／または脊髄周辺の投与経路を含むがこれらに限定されない投与経路によって、拡散性の方法の、または神経傷害もしくは苦痛の部位を標的として、ＣＮＳまたはＰＮＳへの注射または注入を含む。
【０１０６】
半固体または固体担体中に生細胞を含む医薬組成物は、典型的には、神経傷害または苦痛の部位での外科的植え込みのために調剤される。液体組成物は外科的手法によっても投与され得ることが理解されるだろう。さらに、半固体または固体医薬組成物は、非生分解性もしくは生分解性であってよい半透過性のゲル、格子、細胞足場などを含んでよい。例えば、外因性細胞をその周囲から隔離するが、細胞が生物学的分子（例えば、神経栄養因子）を周辺神経細胞に分泌および送達できるようにすることが望ましいかまたは適切である場合がある。したがって、細胞を、自律性インプラントとして、処方してもよい。そのインプラントは、移植細胞を宿主組織から物理的に分離する非分解性で選択的に透過性の障壁によって囲まれた、生きたＵＴＣまたはＵＴＣを含む細胞集団を含む。そのようなインプラントは、薬理学的に誘導された免疫抑制の不存在下で免疫細胞および巨大分子が移植細胞を殺すことを妨げる能力があるので、「免疫保護性」と呼ばれることがある。
【０１０７】
あるいは、異なる分解性ゲルおよびネットワークを、本発明の医薬組成物のために使用する。例えば、徐放処方に特に適当な分解性材料は、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、メチルセルロース、ヒアルロン酸、コラーゲン、および、同様のもののような生物適合性ポリマーを含む。
【０１０８】
さらに、生分解性、好ましくは、生体再吸収性もしくは生体吸収性の足場もしくはマトリックスの上、またはそれらの中に細胞を送達することが、望ましいかまたは適切である場合がある。これらの典型的には３次元の生体材料は、足場に付着するか、足場内に拡散するか、または足場の中にとらえられた細胞外マトリックスに取り込まれる、生細胞を含む。いったん体の標的領域に植え込まれると、これらのインプラントは、宿主組織と統合されるようになり、移植細胞は段階的に定着するようになる（例えば、Ｔｒｅｓｃｏ，  ＰＡ，  ｅｔ  ａｌ，  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．，  ２０００；４２：３−２７を参照；Ｈｕｔｍａｃｈｅｒ，  ＤＷ，  Ｊ．  Ｂｉｏｍａｔｅｒ．  Ｓｃｉ．  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｅｄｎ．，  ２００１；１２：１０７−１７４も参照のこと）。
【０１０９】
本発明で使用され得る足場またはマトリックス（まとめて「フレームワーク」と呼ばれることもある）の材料の例は、不織マット、多孔性フォーム、または自己集合性ペプチドを含む。不織マットは、例えば、ＶＩＣＲＹＬ（Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，Ｎ．Ｊ．）の商品名で販売される、グリコール酸と乳酸との合成吸収性コポリマー（ＰＧＡ／ＰＬＡ）で構成される繊維を用いて形成してもよい。例えば、ポリ（ε−カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（ＰＣＬ／ＰＧＡ）コポリマーから構成され、米国特許第６，３５５，６９９号に記載されるような、フリーズドライすなわち凍結乾燥などのプロセスにより形成される、フォームを利用してもよい。自己集合性ペプチド（例えば、ＲＡＤ１６）などのヒドロゲルを使用してもよい。ｉｎ  ｓｉｔｕ形成性分解ネットワークも本発明での使用に適切である（例えば、Ａｎｓｅｔｈ，  ＫＳ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ２００２；  ７８：１９９−２０９；  Ｗａｎｇ，  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，  ２００３；２４：３９６９−３９８０；米国特許出願公開第２００２／００２２６７６号を参照）。これらの材料は注射に適切な流体として処方され、その後、様々な手段（例えば、温度、ｐＨ、光への曝露の変更）によりｉｎ  ｓｉｔｕまたはｉｎ  ｖｉｖｏで分解性ヒドロゲルネットワークを形成するよう、誘導され得る。
【０１１０】
また、フレームワークは、生体吸収性材料、例えば、ＰＧＡ、ＰＬＡ、ＰＣＬコポリマーもしくはブレンド、または、ヒアルロン酸、から作られた、マルチフィラメント糸で構成され得るフェルトであってよい。糸は、圧着、裁断、梳綿、穿刺からなる標準的な織物加工技術を使用してフェルトへと製造される。別の実施形態では、複合構造体であってもよいフォーム足場上に、細胞を播種する。
【０１１１】
さらに、フレームワークは、例えば、神経路修復のため分離した柱（ｓｅｇｒｅｇａｔｅｄ  ｃｏｌｕｍｎｓ）を備えた脊髄の形状のような、有用な形状に成型され得る（Ｆｒｉｅｄｍａｎ，  ＪＡ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，  ２００２；５１：７４２−５１）。さらに、ＵＴＣは、例えば、例えば線維芽細胞を含むＧＤＣ血管内コイルを準備するために使用されるものに対応する形で、前形成された、非分解性の外科的なもしくは植え込み可能な装置上で、培養されてよいことが理解されるであろう（Ｍａｒｘ，  ＷＦ，  ｅｔ  ａｌ，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｒａｄｉｏｌ，２００１；２２：３２３−３３３）。
【０１１２】
マトリックス、足場、もしくは、装置は、細胞の植え込みに先立って、細胞付着を高めるよう処理されてよい。例えば、植え込みに先立って、ナイロンマトリックスは、ナイロンをコートするために、０．１モル酢酸で処理し、ポリリジン、ＰＢＳ、および／もしくは、コラーゲン中でインキュベートすることができる。ポリスチレンは、硫酸を用いて同様に処理することができる。フレームワークの外側表面は、フレームワークをプラズマコーティングすることによって、または、１つまたは複数のタンパク質（例えば、コラーゲン、弾性線維、細網線維）、糖タンパク質、グリコサミノグリカン（例えば、硫酸ヘパリン、コンドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、ダルマタン硫酸、ケラチン硫酸）、細胞マトリックス、ならびに／または、他の材料（例えば、とりわけ、ゼラチン、アルギン酸塩、寒天、アガロース、植物ゴム、であるがこれらに限定されない）を添加することによって、細胞の付着もしくは成長、および、組織の分化を改善するために、修飾されてもよい。
【０１１３】
ＵＴＣ含有フレームワークを当技術分野で既知の方法に従って準備する。例えば、細胞を、培養容器中でサブコンフルエンスもしくはコンフルエンスまで、自由に成長させ、培養から引き上げ、フレームワーク上に植えつけることができる。成長因子を、所望の場合、分化および組織形成を誘引するよう、細胞の植えつけの前に、その最中に、もしくは、その後、培養培地に加えてもよい。あるいは、フレームワーク自体は、フレームワーク上での細胞成長を高めるか、またはインプラントの拒絶のリスクが減少するように、改変してもよい。したがって、抗炎症剤、免疫抑制剤、もしくは、成長因子を含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の生物活性化合物を、局所的放出のためにフレームワークに加えてもよい。
【０１１４】
ＵＴＣ、もしくは、ＵＴＣを含む細胞集団、または、ＵＴＣの成分もしくはＵＴＣによって産生された産物が、神経細胞および組織の修復および再生を補助し促進する様々な方法で、使用されてよい。このような実用性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法、ｅｘ  ｖｉｖｏ法、およびｉｎ  ｖｉｖｏ法を包含する。
【０１１５】
Ｉｎ  ＶｉｔｒｏおよびＥｘ  Ｖｉｖｏ法：
医薬品、成長因子、調節因子などの有効性および細胞毒性について広範な化合物をスクリーニングするために、ＵＴＣをｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用することができる。例えば、神経傷害の治療のため、ＵＴＣと共に処方されるか、または同時に投与されるべき候補化合物の有効性または毒性を評価するために、実質的に同種のＵＴＣ集団で、このようなスクリーニングを行ってもよい。あるいは、このようなスクリーニングは、新たな医薬品候補の有効性を評価する目的で、神経細胞もしくは神経前駆細胞へと分化するよう刺激されたＵＴＣに対して行うことができる。この実施形態では、ＵＴＣは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持され、試験されるべき化合物に曝される。潜在的に細胞毒性の化合物の活性は、培養中の細胞を損傷するかまたは殺す能力により測定され得る。これは、生体染色技術により容易に評価することができる。成長または調節因子の効果は、それらの因子にさらされていない細胞と比較して、培養細胞の数または頑強性を分析することで評価できる。これは、型特異性の細胞抗原を定める抗体を利用する免疫細胞化学的技術の使用を含む、標準的な細胞学的および／または組織学的技術を用いて達成することができる。
【０１１６】
さらに、前述のとおり、ＵＴＣは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養されて、細胞により自然に産生されるか、神経もしくは他の細胞系統に分化するよう誘導された場合に細胞により産生されるか、または遺伝子操作で細胞によって産生される、生物学的産物を産生することができる。例えば、ＴＩＭＰｌ、ＴＰＯ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＭＩＰＩｂ、ＭＣＰ１、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、ＴＡＲＣ、ＭＤＣ、およびＩＬ−８は、成長培地で成長したＵＴＣから分泌されることが分かっている。これらの栄養因子の一部、例えばＢＤＮＦおよびＩＬ−６は、神経の再生に重要な役割を有する。神経の修復および再生に使用される、まだ検出されていないかまたは調べられていない他の栄養因子は、ＵＴＣにより産生され、恐らくは培地中へ分泌されるものと思われる。
【０１１７】
また、ＵＴＣは、未分化ＵＴＣから、または神経または他の細胞系統への分化を刺激する条件下でインキュベートされたＵＴＣからの、馴化培地の生成のために使用され得る。そのような馴化培地は、例えば、神経形成前駆細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ培養で、または同種ＵＴＣ集団もしくはＵＴＣおよび神経前駆細胞を含む異種性集団を含む移植細胞を支援するためｉｎ  ｖｉｖｏで、使用されることを企図される。
【０１１８】
さらに、ＵＴＣ可溶化液、可溶化性細胞分画もしくはその成分、またはＥＣＭもしくはその成分を様々な目的に使用することができる。前記のとおり、これらの成分の一部は、医薬組成物に使用することができる。また、細胞可溶化液またはＥＣＭは、外科的に使用されるべき物質もしくは装置をコートもしくは別様に処理するために、または植え込みのため、またはｅｘ  ｖｉｖｏ目的で、使用され、このような治療経過中に接触する細胞または組織の治癒または生存を促進することができる。
【０１１９】
さらに、ＵＴＣは、他の細胞、具体的には、神経細胞および神経前駆細胞に栄養補助を与えるためｉｎ  ｖｉｔｒｏで共培養で使用されることができる。共培養では、ＵＴＣおよび所望の他の細胞が、２つの細胞型が接触する条件下で共培養されることが望ましいであろう。これは、例えば、異種性の細胞集団として細胞を培養培地または適切な培養基質に播種することによって、達成することができる。あるいは、ＵＴＣは、最初にコンフルエンスまで成長してよく、次に培養中に、第２の所望の細胞型の基質として役立つ。さらに、細胞は、例えば、膜または類似装置によって、さらに物理的に分離されてよく、その他の細胞型は、共培養期間の後、除去され、別個に使用されてよい。神経の細胞型の増殖および分化を促進するため共培養されるＵＴＣの使用は、調査、および臨床／治療エリアでの適用性を見出すことができる。例えば、ＵＴＣの共培養を使用して、例えば、基礎研究目的で、または薬剤スクリーニングアッセイで使用するために、培養中に神経細胞の成長および分化を促進することができる。ＵＴＣ共培養はまた、治療目的で後で投与するために神経前駆細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ増殖に使用されてよい。例えば、神経前駆細胞は、個体から回収され、ＵＴＣと共に共培養でｅｘ  ｖｉｖｏで増殖され、その後、その個体（自家移転）または別の個体（同系もしくは同種移転）に戻されることができる。ｅｘ  ｖｉｖｏ増殖後、ＵＴＣおよび神経前駆細胞を含む混合細胞集団は、治療を必要とする患者に投与され得る。あるいは、自家移転が適切または望ましい場合には、共培養した細胞集団は、培養中に物理的に分離されてよく、患者に投与するため、自家神経前駆細胞を除去することができる。
【０１２０】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ方法：
実施例２〜１０で述べるように、ＵＴＣは、体内に有効に移植され、ヒトにおける有効性を予測するために受け入れられた動物モデルに、失われた神経機能を供給することが分かっている。いったん体内の標的神経場所に移植されると、ＵＴＣはそれら自体が、１つまたは複数の神経の表現型に分化でき、あるいは、栄養的補助を神経前駆細胞および神経細胞にｉｎ  ｓｉｔｕで供給でき、あるいは、それらの形で、ならびに他の形で、有益な効果をもたらすことができる。
【０１２１】
ＵＴＣを、単独で（例えば、実質的に同種の集団として）投与してもよいし、他の細胞とともに混合剤として投与してもよい。前述のように、ＵＴＣを、マトリックスもしくは足場と共に、または、従来の医薬的に許容可能な担体と共に、医薬製剤の中に処方するように、投与してもよい。ＵＴＣを他の細胞と共に投与した場合、他の細胞と同時に投与してもよいし、他の細胞と連続して投与してもよい（他の細胞の前後どちらでも）。ＵＴＣと共に投与され得る細胞は、ニューロン、星状細胞、乏突起膠細胞、神経前駆細胞、神経幹細胞および／または他の多分化能もしくは多能性幹細胞を含むがこれらに限定されない。異なる型の細胞は、ＵＴＣ投与の直前もしくはすぐ前にＵＴＣと混合されてよく、あるいは、投与の前のある期間にわたり、共培養されてよい。
【０１２２】
ＵＴＣは、当技術分野で既知の、他の神経に有効な薬剤もしくは生物学的分子、または他の活性薬剤、例えば抗炎症薬、抗アポトーシス薬、抗酸化剤、成長因子、神経栄養因子もしくは神経再生もしくは神経保護薬と共に投与されてよい。ＵＴＣが他の薬剤と共に投与される場合、単一の医薬組成物と共に、または別個の医薬組成物において、他の薬剤と同時または連続して（他の薬剤の投与の前もしくは後）投与されることができる。
【０１２３】
ＵＴＣと共に投与され得る他の成分の例は、２〜３例を挙げると、以下を含むがこれらに限定されない：（１）他の神経保護薬または神経に有効な薬剤；（２）選択された細胞外マトリックス成分、例えば１つまたは複数のタイプの当技術分野で既知のコラーゲン、および／または成長因子、多血小板血漿、および薬剤（あるいは、ＵＴＣは、遺伝子操作されて、成長因子を発現および産生することができる）；（３）抗アポトーシス薬（例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＥＰＯミメティボディ、トロンボポエチン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、肝細胞成長因子、カスパーゼ抑制物質）；（４）抗炎症化合物（例えば、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ抑制物質、ＴＧＦ−β抑制物質、スタチン、ＩＬ−６およびＩＬ−１抑制物質、ペミロラスト、トラニラスト、レミケード、シロリムス、および非ステロイド抗炎症薬剤（ＮＳＡＩＤＳ）（例えば、ＴＥＰＯＸＡＬＩＮ、トルメチン、およびＳＵＰＲＯＦＥＮ）；（５）免疫抑制もしくは免疫調節薬、例えばカルシニューリン抑制物質、ｍＴＯＲ抑制物質、抗増殖性薬、副腎皮質ステロイドおよび様々な抗体；（６）抗酸化剤、例えばプロブコール、ビタミンＣおよびＥ、コエンザイムＱ−１０、グルタチオン、Ｌ−システインおよびＮ−アセチルシステイン；ならびに（６）局所麻酔薬。
【０１２４】
例えば、ＵＴＣは、未分化細胞として、すなわち成長培地で培養されたものとして、投与されることができる。あるいは、ＵＴＣは、培養中に、所望の神経の表現型、例えば、星状細胞、乏突起膠細胞もしくはニューロン、および、さらに具体的には、セロトニン作動性、トーパミン作動性、コリン作用性、ＧＡＢＡ作用性、またはグルタミン酸作動性のニューロン（例えば、Ｉｓａｃｓｏｎ、Ｏ、Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、２００３；２（７）：４１７−４２４を参照）、または神経の再生または修復を支援する他の細胞系統に向けて、分化を刺激する状態にされた後で、投与されることができる。
【０１２５】
ＵＴＣは、（例えば、カテーテルまたは注射器によって）外科的に植え込まれ、注入され、送達されるか、あるいは別様に神経学的損傷または苦痛の部位に直接または間接的に投与されることができる。ＵＴＣまたはその組成物の投与経路は、ポンプ装置を備えるかもしくは備えない頭蓋内もしくは椎骨内針および／またはカテーテルでの送達による、静脈内、筋肉内、皮下、鼻内、脳内、脳室内、側脳室内、くも膜下腔内、大槽内、脊髄内および／または脊髄周辺投与経路を含むがこれらに限定されない。
【０１２６】
細胞が半固体または固体装置に投与される場合、体内の正しい場所への外科的植え込みは、典型的には、適切な投与手段である。液体または流体医薬組成物は、しかしながら、ＣＮＳまたはＰＮＳの、より一般的な場所（例えば、びまん性虚血性傷害の場合のように、びまん性罹患エリア全体にわたって）に投与されてよく、これは、神経前駆細胞は、神経系への進入地点から特定の場所まで、例えば、放射状グリアに従って、または化学信号に応答することで、広く遊走することができることが分かっているためである。
【０１２７】
この神経幹細胞の遊走能は、悪性の脳腫瘍を治療する新しい手段、すなわちこれらの遊走腫瘍の治療用の治療遺伝子／遺伝子産物を送達するための前駆細胞の使用、を切り開いた。例えば、神経幹細胞は、成体げっ歯類にｉｎ  ｖｉｖｏで頭蓋内グリオーマに植え込まれると、それ自体を迅速に、かつ腫瘍床にわたって広範に分配し、増殖および前進腫瘍細胞に並んで遊走し、外来遺伝子を安定に発現し続けることが報告された（Ａｂｏｏｄｙ、Ｋ、ｅｔ  ａｌ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、２０００；９７：１２８４６−１２８５１）。ＵＴＣは、このタイプの使用に適切であると予測され、すなわち、アポトーシスまたは他の抗悪性腫瘍剤、例えば、ＩＬ−１２（Ｅｈｔｅｓｈａｍ、Ｍ、ｅｔ  ａｌ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００２；  ６２：５６５７−５６６３）または腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘発リガンド（Ｅｈｔｅｓｈａｍ、Ｍ、ｅｔ  ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００２；６２：７１７０−７１７４）を産生するために遺伝子操作されたＵＴＣは、悪性腫瘍の一般的な部位（例えば、グリア芽腫）に注入または別様に投与されてよく、その後、ＵＴＣは、治療薬の局所送達のため、腫瘍細胞まで遊走することができる。ＵＴＣはまた、１つまたは複数の神経の表現型への分化により、または栄養的補助を神経前駆細胞および神経細胞に与えることにより、前述のとおり、腫瘍治療後に神経修復を促進することができる。
【０１２８】
さらに、ＵＴＣ細胞成分（例えば、細胞可溶化液もしくはその成分）、または、産物（例えば、ＵＴＣによって天然に、もしくは、遺伝子操作を通じて産生された栄養因子および他の生物学的因子、ＵＴＣ培養由来の馴化培地）を含む医薬組成物を投与することにより、神経傷害を治療する方法が、本発明により提供される。ここでも、これらの方法は、当技術分野で既知の他の活性薬剤、例えば成長因子、神経栄養因子もしくは神経再生もしくは神経保護薬を投与することをさらに含んでよい。
【０１２９】
本明細書に記載のＵＴＣまたは他の医薬組成物のいずれかを投与する剤形および療法は、個々の患者の状態、例えば、神経変性状態の性質および範囲、年齢、性別、体重および全身病状、ならびに開業医に既知の他の因子、を考慮して、適切な医療行為によって、行われる。したがって、患者に投与すべき医薬組成物の有効量は、当技術分野で既知のこれらの事柄により判断される。
【０１３０】
ＣＮＳは、いくらか免疫特権の組織なので、ＵＴＣによる細胞療法を開始する前に、患者の免疫反応を抑制することが必要かまたは好ましいであろう。先に、ＵＴＣは、混合リンパ球反応において同種異系のＰＢＭＣを刺激しないことが示されている（米国特許出願第１０／８７７，２６９（現在は米国特許第７，５２４，４８９号）を参照）。したがって、同種または、さらには異種のＵＴＣによる移植は、場合によっては許容され得る。
【０１３１】
他の場合には、細胞療法を開始する前に、薬理学的に患者の免疫反応を抑制することが望ましいかまたは適切である場合がある。これは、全身または局所免疫抑制剤の使用によって達成でき、あるいは、前述のとおり、被包装置に細胞を送達することによって、達成することができる。移植細胞に対する免疫反応を低減または排除する、これらの、および他の手段は、当技術分野で既知である。代替手段として、ＵＴＣは、前記のとおり、遺伝子操作されて、免疫原性を減少させることができる。
【０１３２】
生きている患者中の移植ＵＴＣの生存は、様々なスキャン技術、例えば、コンピューター断層撮影（ＣＡＴもしくはＣＴ）スキャン、磁気共鳴映像（ＭＲＩ）または陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）スキャン、の使用により判断され得る。移植物の生存の判断は、神経組織を除去し、それを視覚的にもしくは顕微鏡で調べることによって、死後行われてもよい。あるいは、細胞は、神経伝達物質など、神経細胞もしくはその産物に特異的な染料で処理されてよい。移植細胞はまた、ローダミンまたはフルオレセイン標識したミクロスフィア、ファストブルー（ｆａｓｔ  ｂｌｕｅ）、三価鉄微粒子、ビスベンザミド、または、β−ガラクトシダーゼもしくはβ−グルクロニダーゼのような遺伝的に導入されたレポーター遺伝子産物のような、トレーサー染料を前もって取り込むことで、識別され得る。
【０１３３】
移植されたＵＴＣの、被験者の神経組織への機能的統合は、損傷または罹患した神経機能の回復を調べることで評価され得る。そのような機能は、神経生物学者および医師に周知の処置に従って、運動、認知、感覚、および内分泌機能を含むがこれらに限定されない。ＵＴＣによる、この神経機能回復は、神経傷害後に患者の神経機能を改善する方法で使用することができる。
【０１３４】
さらに、ＵＴＣは、患者のＳＶＺの再生能力を刺激する方法で使用することができる。例えば、ＳＶＺの再生の能力は、神経発生、血管新生またはシナプス形成の増加があることを示すことにより、刺激され得る。神経発生の増加は、ＳＶＺの前駆細胞が、製剤中で増殖して、傷害もしくは損傷神経細胞を置き換えること、ならびに、新たに形成された神経芽細胞および他の未成熟ニューロンがあること、を示す。血管新生の増加は、新しい血管形成が、傷害または損傷エリアで生じていて、傷害または損傷組織に、または傷害または損傷組織を置き換えるよう形成される組織に、酸素供給を行うことを示す。シナプス形成の増加は、恐らく、既に存在する機能シナプスの数の減少を引き起こす何らかの刺激に応答して、新しいシナプスが形成されていることを示す。神経発生、血管新生およびシナプス形成を増加させるＵＴＣの能力は、実施例３〜１０に記載する。
【０１３５】
さらに、ＵＴＣは、脳の傷害または損傷部分の、アポトーシス細胞数を減少させることができる。アポトーシスは、外傷性脳傷害後の二次的な脳傷害の原因となり得、高い割合のアポトーシスは、外傷性脳傷害後の不十分な予後にかかわり得る（Ｍｉｎａｍｂｒｅｓ、ｅｔ  ａｌ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ、２００８；２５（６）：５８１−５９１を参照）。したがって、傷害または損傷を経験した脳のエリアでのアポトーシスの減少は、生存を増大させ、神経機能および傷害からの回復を改善でき、また、傷害後の患者におけるＳＶＺの再生の能力の刺激など、他の療法の補助として作用することができる。実施例７および９は、脳組織の損傷部分におけるアポトーシスを減少させるＵＴＣの能力を証明する。
【０１３６】
別の態様では、本発明は、前述のとおり、ＵＴＣ、ＵＴＣ集団、ＵＴＣの成分および産物を、神経の再生および修復のための様々な方法で使用するキットを提供する。神経傷害の治療、または他の予定された治療に使用される場合、キットは、少なくともＵＴＣおよび医薬的に許容可能な担体（液体、半固体または固体）を含む、１つまたは複数の細胞集団を含むことができる。キットはまた、オプションとして、例えば注射によって細胞を投与する手段を含んでよい。キットはさらに、細胞の使用説明書を含むことができる。軍用などの野戦病院用に準備されたキットは、組織足場、外科縫合糸、および、同様のものを含む完全な手順の供給物を含んでもよく、細胞は、急性傷害の修復と関連付けて用いられるものである。本明細書で説明されたアッセイおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ法のためのキットは、（１）ＵＴＣ、またはＵＴＣの成分もしくは産物、（２）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法を実践するための試薬、（３）適切な、他の細胞もしくは細胞集団、（４）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法を実行するための説明書、のうちの１つまたは複数を含んでもよい。
【０１３７】
以下の実施例は、本発明を、より詳細に説明するため提供される。これらの実施例は、本発明を例示することを意図しており、限定することを意図していない。
【０１３８】
以下の略語が、明細書の実施例およびその他、ならびに請求項で使用され得る：  
ＡＮＧ２（またはＡｎｇ２）：アンジオポエチン２
ＡＰＣ：抗原提示細胞
ＢＤＮＦ：脳由来神経栄養因子
ｂＦＧＦ：塩基性線維芽細胞成長因子
ｂｉｄ（ＢＩＤ）：「ｂｉｓ  ｉｎ  ｄｉｅ」（１日に２回）
ＣＫ１８：サイトケラチン１８
ＣＮＳ：中枢神経系  
ＣＸＣリガンド３：ケモカインレセプターリガンド３  
ＤＭＥＭ：ダルベッコ最小基本培地  
ＤＭＥＭ：ｌｇ（またはＤＭＥＭ：Ｌｇ、ＤＭＥＭ：ＬＧ）：低グルコースのＤＭＥＭ
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸  
ＥＧＦ（またはＥ）：上皮成長因子
ＦＡＣＳ：蛍光活性化細胞選別
ＦＢＳ：ウシ胎仔血清  
ＦＧＦ（またはＦ）：線維芽細胞成長因子
ＧＣＰ−２：顆粒球走化性タンパク質−２
ＧＦＡＰ：グリア線維酸性タンパク質  
ＨＢ−ＥＧＦ：ヘパリン結合上皮成長因子
ＨＣＡＥＣ：ヒト冠動脈内皮細胞
ＨＧＦ：肝細胞成長因子  
ｈＭＳＣ：ヒト間葉幹細胞
ＨＮＦ−１α：肝細胞特異性転写因子１α
ＨＵＶＥＣ：ヒト臍静脈内皮細胞
Ｉ３０９：ケモカインおよびＣＣＲ８レセプターのリガンド
ＩＧＦ−１：インスリン様成長因子１  
ＩＬ−６：インターロイキン−６
ＩＬ−８：インターロイキン８  
Ｋ１９：ケラチン１９
Ｋ８：ケラチン８  
ＫＧＦ：ケラチノサイト成長因子  
ＬＩＦ：白血病抑制因子
ＭＢＰ：ミエリン塩基性タンパク質  
ＭＣＰ−１：単球走化性タンパク質１  
ＭＤＣ：マクロファージ由来ケモカイン  
ＭＩＰ１α：マクロファージ炎症性タンパク質１α  
ＭＩＰｌβ：マクロファージ炎症性タンパク質１β  
ＭＭＰ：マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）  
ＭＳＣ：間葉幹細胞
ＮＨＤＦ：正常ヒト皮膚線維芽細胞
ＮＰＥ：神経前駆細胞増殖培地  
０４：乏突起膠細胞もしくはグリア分化マーカー０４  
ＰＢＭＣ：末梢血単核細胞  
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水  
ＰＤＧＦｂｂ：血小板由来成長因子  
ＰＯ：「ｐｅｒ  ｏｓ」（経口）  
ＰＮＳ：末梢神経系  
Ｒａｎｔｅｓ（もしくはＲＡＮＴＥＳ）：発現及び分泌され、活性時調節（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）された、正常なＴ細胞
ｒｈＧＤＦ−５：組み換えヒト成長および分化因子５  
ＳＣ：皮下
ＳＤＦ−１α：間質由来因子１α  
ＳＨＨ：ソニックヘッジホッグ  
ＳＯＰ：標準的な手術手順  
ＴＡＲＣ：胸腺および活性調節ケモカイン  
ＴＣＰ：組織培養プラスチック
ＴＣＰＳ：組織培養ポリスチレン  
ＴＧＦβ２：形質転換成長因子β２  
ＴＧＦβ−３：形質転換成長因子β−３  
ＴＩＭＰ１：組織マトリックスメタロプロテイナーゼ抑制物質１  
ＴＰＯ：トロンボポエチン  
ＴｕＪｌ：ＢＩＩＩ  Ｔｕｂｕｌｉｎ  
ＶＥＧＦ：血管内皮成長因子  
ｖＷＦ：フォン・ヴィルブランド因子  
αＦＰ：α−フェトプロテイン
【０１３９】
さらに、本明細書の実施例その他で使用するように、本発明の方法に有用なＵＴＣは、米国特許出願第１０／８７７，２６９号の開示に従って単離および特徴付けされてよく、これは、ＵＴＣの説明、単離、および特徴付けに関連するので、参照により全体として組み込まれる。
【０１４０】
実施例１
長期間にわたる細胞の神経の分化
臍由来細胞が長期間の神経系統細胞への分化を受ける能力が評価された。ＵＴＣは、実施例１３〜１５に記載するように単離および増殖された。
【０１４１】
成長培地で先に成長したＵＴＣの凍結アリコート（臍（０２２８０３）Ｐ１１；（０４２２０３）Ｐ１１ｌ；（０７１００３）Ｐ１２）は解凍され、５，０００個の細胞／ｃｍ２で、Ｔ−７５ラミニンコートフラスコ（ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，Ｎ．Ｊ．）に、Ｂ２７（Ｂ２７  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｌグルタミン（４ｍＭ）、およびペニシリン／ストレプトマイシン（１０ｍＬ）を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ．）（この組み合わせは、本明細書では神経前駆細胞増殖（ＮＰＥ）培地と呼ぶ）において、蒔かれた。ＮＰＥ培地は、ｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，Ｎ．Ｊ．）およびＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，Ｎ．Ｊ．）（本明細書ではＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦと呼ぶ）をさらに補充された。
【０１４２】
さらに成体ヒト皮膚線維芽細胞（Ｐ１１，Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）および間葉幹細胞（Ｐ５，Ｃａｍｂｒｅｘ）は、解凍され、同じ細胞播種密度で、ラミニンコートＴ−７５フラスコに、ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦにおいて蒔かれた。さらなる対照として、線維芽細胞、臍、および胎盤由来細胞が、全培養について指定の期間にわたり成長培地で成長した。
【０１４３】
全培養からの培地は、１週間に１回新鮮培地で置き換えられ、細胞は、増殖について観察された。概して、各培養は、ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦの限られた成長のため、１カ月にわたり１回継代された。
【０１４４】
１カ月の後、全フラスコは、４％（ｗ／ｖ）冷パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）で、１０分間室温で固定された。免疫細胞化学はＴｕＪｌ（ＢＩＩＩ  Ｔｕｂｕｌｉｎ；１：５００；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）およびＧＦＡＰ（グリア線維酸性タンパク質；１：２０００；ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，Ｃａ．）に対する抗体を用いて行われた。端的には、培養物は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄され、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，Ｃａ．）、および０．３％（ｖ／ｖ）トリトン（トリトンＸ−１００；Ｓｉｇｍａ）を含むタンパク質遮断溶液に３０分間さらされて、細胞内抗原にアクセスした。遮断溶液で希釈された一次抗体は次に、１時間室温で、培養に加えられた。次に、一次抗体溶液は、除去され、培養物は、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（１：２５０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）およびヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８（１：２５０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と共に遮断溶液を含む二次抗体溶液を加える前にＰＢＳで洗浄された（１時間室温で）。培養物は次に洗浄され、１０マイクロモルＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）が１０分間適用されて、細胞核を可視化した。
【０１４５】
免疫染色後、蛍光が、適切な蛍光フィルターを使用して、Ｏｌｙｍｐｕｓ倒立落射蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，Ｎ．Ｙ．）上で可視化された。すべての場合において、陽性染色は、一次抗体溶液を適用したことを除いて前記に概説した手順全体に従った場合、ポジティブ染色は対照染色を超えて蛍光信号を表した。代表的な画像が、デジタルカラービデオカメラ、およびＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ．）を用いて取り込まれた。三重染色（ｔｒｉｐｌｅ−ｓｔａｉｎｅｄ）サンプルでは、各画像は、１回にただ１つの放出フィルターを使用して撮られた。層をなすモンタージュが、次に、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ａｄｏｂｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａ．）を用いて準備された。
【表１】
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【０１４６】
蒔いた後ただちに、ＵＴＣ部分集合が、ラミニンコートされた培養フラスコに付着した。これは、凍結／解凍プロセスの関数としての細胞死によるか、または新たな成長条件のためである。付着した細胞は、成長培地で観察されたものと異なる形態を採用していた。
【０１４７】
コンフルエンスになると、培養物は、継代されて、成長を観察された。非常に少ない増殖が、継代を切り抜けた細胞で起きた。この時点で、拡散形態がなく、明るい相（ｐｈａｓｅ−ｂｒｉｇｈｔ）の特徴を有する非常に小さな細胞が、臍由来細胞の培養に現れ始めた。これらのフラスコのエリアが、経時的に続いた。これらの小さな細胞から、分岐突起が、その長さに沿って結節状構造で現れ、これは先に説明したＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋ニューロン前駆細胞およびＴｕＪｌ＋脳および脊髄由来の未成熟ニューロン（Ｍａｙｅｒ−Ｐｒｏｓｃｈｅｌ，Ｍ，ｅｔ  ａｌ．  Ｎｅｕｒｏｎ，１９９７；１９（４）：７７３−８５；Ｙａｎｇ，Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ、２０００；９７（２４）：１３３６６−７１）に非常に似た特徴である。時間と共にこれらの細胞は、より多数になるが、依然としてクローンに見られるにすぎない。このことは、ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ培地がＰＰＤＣの増殖を遅くし、その形態を変えることを示している。
【０１４８】
培養物は、解凍／播種から１カ月後に固定され、ニューロンタンパク質ＴｕＪｌおよびＧＦＡＰ（星状細胞で見られる中間フィラメントである）について染色された。成長培地で成長したすべての対照培養物、ならびにＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ培地で成長したヒト線維芽細胞およびＭＳＣは、ＴｕＪｌ−／ＧＦＡＰ−であることが分かり、ＴｕＪｌは、臍および胎盤ＰＰＤＣで検出された。発現は、ニューロン様形態のある細胞およびそれがない細胞で観察された。ＧＦＡＰの発現は、いずれの培養でも観察されなかった。ニューロン様形態を有するＴｕＪｌを発現する細胞のパーセンテージは、全集団の１％以下であった（ｎ＝３  試験された臍由来細胞単離物）。定量化していないが、ニューロン形態のないＴｕＪｌ＋細胞のパーセンテージは、胎盤由来細胞培養よりも臍由来細胞培養のほうが高かった。これらの結果は、成長培地中の同年齢対照がＴｕＪｌを発現しなかったため、特異的であるようだ。これらの結果は、ＵＴＣのクローンがニューロンタンパク質を発現することを示す。
【０１４９】
ＵＴＣから（ＴｕＪｌ発現およびニューロン形態に基づいて）分化したニューロンを生成する方法が確立された。ＴｕＪｌの発現は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで１カ月より前に調べられなかったが、少なくとも小さなＵＴＣ集団が、デフォルト分化を通じて、またはＬグルタミン、塩基性ＦＧＦ、およびＥＧＦを補充された最小培地に１カ月曝した後の長期間誘導を通じて、ニューロンを生じさせることができるのは明らかである。
【０１５０】
実施例２  神経機能に対する、脳傷害後の細胞の投与効果
ラットにおける脳内出血（ＩＣＨ）モデル
Ｓｅｙｆｒｉｅｄ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ，２００６；１０４：３１３−３１８（２００６）によって本質的には説明されるように、１００μＬの自家血液を注入することによって、３００〜３５０ｇの体重のオスのＷｉｓｔａｒラットにおいて、ＩＣＨが誘導された。端的には、ラットは、キシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）およびケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔された。いったん適切な麻酔が行われたら、ラットは、フィードバック調節された温水パッドを用いて、外科的手法中３７℃に維持された。切開スコープ下で、２ｃｍ腹部皮膚切開部が、腹部および右大腿により形成されたしわにそって、作られた。内転筋の鈍的切開を使用して、右大腿動脈を可視化する。５〜１０ｍｍの動脈は、隣接する大腿静脈および伏在神経から注意深く動かされた。動脈は、遠位端で結紮され、近位部分は、４−０縫合糸で一時的に遮断された。ＰＥ５０カテーテルが次に、小さな穿刺部を通して１〜２ｃｍ血管に挿入され、４−０縫合糸で所定の場所に固定される。次に、ラットは、定位固定フレーム（Ｄａｖｉｄ  Ｋｏｐｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｔｕｊｕｎｊａ，Ｃａ．）上でうつぶせに置かれた。正中切開が、頭蓋冠に行われ、骨膜まで実行された。小さな骨膜エレベーターが使用され、頭蓋骨を露出した。いったんこれが達成されると、定位固定フレームの測定を使用して、頭蓋骨切除術が行われる部位をガイドした。ブレグマの最初の識別が行われ、次に、頭蓋骨切除術が、定位固定ドリル（外側から正中線３．５ｍｍ、前方からブレグマ０．５ｍｍ、正中線までの表面下、深さ５．５ｍｍ）を用いて行われる。大腿動脈から採取した０．３ｍＬの自家血液が、定位固定フレームに取り付けられた２６Ｇ１／２針を有する１ｍＬ（１ｃｃ）の注射器に入れられた。０．１ｍＬの血液が次に、注入ポンプ（６００−９１０／９２０，Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐｒａｔｕｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）で１分間に１０μＬの速度で、注入された。血液の逆流を防ぐため、骨ワックス片が使用されて、頭蓋骨切除部位を閉鎖し、血液を脳に維持する。皮膚は、４．０絹縫合糸を単純に通すことで、再び近づけられた。
【０１５１】
ＩＣＨ後、２４時間または７２時間で、無作為選択した動物が細胞移植を受けた。動物は、Ｎ２Ｏ：Ｏ２（２：１）中の３．５％ハロタンで麻酔し、フェイスマスクを用いて０．５％ハロタンで維持した。２ｍＬの全流体容積のＰＢＳ中のＵＴＣ（本発明の方法に有用なＵＴＣの単離および特徴付けの説明については米国特許出願第１０／８７７，２６９号を参照）、またはＰＢＳ単独（対照）が、動物の尾静脈に注入された。実験群（ｎ＝８／群）は、ＰＢＳ単独、およびＵＴＣ（３ｘ１０６）のみからなった。全ラットは、手術後２８日目まで生存させられた。全動物で、行動試験バッテリーが、その後１日目、４日目、および１週間ごとに測定された。
【０１５２】
ｍＮＳＳは、運動、感覚、バランス、および反応試験の複合体である。ｍＮＳＳ（Ｃｈｅｎ，Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｏｋｅ，２００１；３２：１００５−１０１１により説明）により評価される神経機能が、０〜１８のスケールで等級づけされた（正常なスコアが０；最大欠損のスコア１８）。傷害の深刻さのスコアでは、１つの点が、ある異常な行動の現れ、または試験された反射作用の欠落について与えられる。よって、スコアが高いほど、傷害は深刻である。使用された運動試験は、しっぽでラットを持ちあげること（それについて以下のスコアが与えられた：前肢屈曲（１）、後肢屈曲（１）、３０秒以内に垂直軸に対して１０°超頭が動くこと（１））、床上歩行させること（これについて以下のスコアが与えられた：正常な歩行（０）、真っすぐ歩けないこと（１）、麻痺した側に向かって回る（２）、麻痺した側に転ぶ（３））であった。使用した感覚試験は、配置試験（視覚および触覚試験）ならびに固有受容性試験（深部感覚、足をテーブルの端に押し付け、肢筋肉を刺激する）であった。使用したバランス試験は、平均台試験で、これについて以下のスコアが与えられた：安定した姿勢のバランス（０）、平均台の側面をつかむ（１）、平均台につかまり、一方の肢は平均台から落ちる（２）、平均台につかまり、両肢が平均台から落ちるか、または平均台の上で回転する（＞６０秒）（３）、平均台上でバランスを取ろうとするが、落ちる（＞４０秒）（４）、平均台上でバランスを取ろうとするが、落ちる（＞２０秒）（５）、および、バランスを取ろうとしたり、平均台にしがみつこうとせずに、落ちる（＜２０秒）（６）。
【０１５３】
Ｚｈａｎｇ，Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００２；１１７（２）：２０７−１４に記載されるコーナーテストを行った。端的には、ラットが、２つの取付ボード間に置かれた（寸法：３０ｘ２０ｘ１ｃｍ３）。２つのボードの端は、３０°であり、接合部に沿って小さな開口部があり、コーナーへの進入を容易にした。ラットは、コーナーに面して、コーナーへの中間地点に置かれた。コーナーの中へ深く進入すると、触毛の両側が共に刺激された。ラットは次に、上前方に後ろ足で立ち、次に引き返して、開口端部に面した。非傷害ラットは、左または右に曲がったが、傷害ラットは、優先的に、障害のない側の方を向いた。他の方向に対する１方向の回転が、各試験について１０回のトライアルから記録され、回転の分画が、コーナーテストスコアとして使用された。
【０１５４】
機能試験の結果は、ＵＴＣ（３ｘ１０６）で２４時間および７２時間に処理されたラットは、ｍＮＳＳ試験およびコーナーテストで著しい改善を示した（ｐ＜０．０５）ことを表した（図１および２を参照）。ｍＮＳＳトータルスコアは、１４日目、２１日目、および２８日目において、対照と比較すると、２４時間および７２時間で３ｘ１０６個のＵＣＴで処理されたラット間で、著しく減少した（図１参照）。
【０１５５】
実施例３
脳室下帯の細胞増殖に対する、脳傷害後の細胞投与の影響
ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）、チミジン類似体が、細胞周期のＳ期中に細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれ得る。脳室下帯（ＳＶＺ）内のＢｒｄＵ陽性細胞は、細胞周期のＳ期にＤＮＡ合成を受ける前駆細胞だと考えられる。ＳＶＺ内のＢｒｄＵ細胞数は、神経発生の指標として使用される。
【０１５６】
ラットは、ＩＣＨ後２４時間で開始し、その後、次の１４日目にわたり、１００ｍｇ／ＫｇのＢｒｄＵの腹腔内注射（ＩＰ）を毎日受けた。２８日後、動物は、ケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）および（キシラジン１３ｍｇ／ｋｇ）のＩＰ注射で再び麻酔され、屠殺された（最初に、心臓穿刺により体から血液をすべて排出し、生理食塩水で、次に４％パラホルムアルデヒドで系を洗い流すことによる）。頭蓋を次に骨鉗子で除去し、脳を除去し、その後４％パラホルムアルデヒドで固定し、スライス／切開され、肉眼でかつ組織学的に出血領域を評価した。免疫組織化学的染色が、ＢｒｄＵ（マウスモノクローナル抗体、１：１００；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎ．）に使用された。端的には、第３ブロックのブレグマの＋０．１〜０．８６ｍｍにある脳組織は、最もひどく傷害があり、それゆえ、第３ブロックは、免疫染色に特異的に選択された。ブレグマの＋０．１〜０．８６ｍｍからの冠状切片４０個ごとに、同じ抗体で免疫化学染色に使用した。切片は、５％正常ヤギ血清、１％ＢＳＡおよび０．０５％ＴＷＥＥＮ−２０を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水で遮断された。切片は、次に、一次抗体でインキュベートされ、その後、適切な二次抗体でインキュベーションされた。対照実験は、脳冠状組織切片を、前記に概説したように染色することのみからなったが、一次抗体を省略した。同側脳室下帯（ＳＶＺ）のＢｒｄＵ陽性細胞数は、ＭＣＩＤ画像分析システム（Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔ．  Ｃａｔｈａｒｉｎｅｓ，Ｃａｎａｄａ）と適合した、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ４０顕微鏡および３−ＣＣＤカラービデオカメラ（Ｓｏｎｙ  ＤＸＣ−９７０ＭＤ）を使用してカウントされた。同側ＳＶＺのＢｒｄＵ陽性細胞総数を報告する。
【０１５７】
結果は、ＢｒｄＵ陽性細胞の数が、３ｘ１０６個のＵＴＣでＩＣＨ後２４時間または７２時間に処理されたラットの同側半球のＳＶＺにおいて、対照ＰＢＳ群と比べて、著しく増加したことを示す（ｐ＜０．０５）（図３Ｅおよび３Ｆを参照）。
【０１５８】
実施例４
脳の損傷エリアにおける血管新生に対する、脳傷害後の細胞投与の影響
病変周辺の境界の拡張および薄壁血管は、血管新生を示す（Ｌｉ，Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２００２；５９：５１４−５２３）。２８日後、組織学的評価のため、実施例３に詳述したように、動物は、再び麻酔され、屠殺され、脳が除去された。ｖＷＦに対するモノクローナル抗体（１：４００，Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，Ｃａ．）を使用した。
【０１５９】
結果は、血管の周囲長が、対照ＰＢＳ群と比べ、ＩＣＨ後２４時間または７２時間に３ｘ１０６個のＵＴＣで処理した処理群で、著しく増大したことを示す（ｐ＜０．０５）（図４Ｅおよび４Ｆを参照）。
【０１６０】
さらに、実施例３に前記したように、ＢｒｄＵは、細胞周期のＳ期中に細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれ得る。ＢｒｄＵ取り込みと関連したフォン・ヴィルブランド因子の発現を評価することにより、活発に分裂する細胞が、ＩＣＨ境界において新しい血管の成長に貢献しているかどうか、判断することができる（前記プロトコルを参照）。
【０１６１】
ＢｒｄＵに陽性の内皮細胞を図５Ａに示す。フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）に陽性の血管を図５Ｂに示す。図５Ｃは、血管においてｖＷＦ陽性染色組織と共存するＢｒｄＵ反応細胞の二重免疫染色を示す。二重染色は、血管マーカーを発現するとともに依然として分裂している細胞部分集団を明らかにし、これは、血管表現型に陽性の細胞が回復期中に新たに形成されることを示唆する。
【０１６２】
実施例５
脳室下帯の神経発生に対する脳傷害後の細胞投与の影響
ダブルコルチン（ＤＣＸ）は、神経発生のマーカーであり、これは、新たに形成される神経芽細胞に一時的に発現する（約２〜３週間）。２８日後、組織学的評価のため、実施例３に詳述したように動物は、再び麻酔され、屠殺され、脳が除去された。ヤギ抗−ＤＣＸ（１：２００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｃａ．）を使用した。
【０１６３】
結果は、ＳＶＺ中のＤＣＸの免疫発現が、ＩＣＨ後２４時間または７２時間に３ｘ１０６個のＵＴＣで処理した処理群では、対照ＰＢＳ群に比べて著しく増大していることを示す（ｐ＜０．０５）（図６Ｅおよび６Ｆ）。
【０１６４】
さらに、ＢＩＩＩ  Ｔｕｂｕｌｉｎ（ＴＵＪｌ）は、ニューロン特異的チューブリンであり、胎仔および出生後発達中、およびＳＶＺの仮想ニューロン細胞において発現する。ＴＵＪｌ発現は、新たに形成される未成熟ニューロンを検出するため評価された。マウス抗−ＴＵＪｌ（１：１０００，Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，ＣＯ）を使用した。
【０１６５】
結果は、ＳＶＺ中のＴＵＪｌの免疫発現が、ＩＣＨ後２４時間または７２時間に３ｘ１０６個のＵＴＣで処理した処理群では、対照ＰＢＳ群に比べて、著しく増加したことを示す（ｐ＜０．０５）（図７Ｅおよび７Ｆを参照）。
【０１６６】
実施例６
血腫の境界域のシナプス形成に対する脳傷害後の細胞投与の影響
シナプトフィジン、プレシナプス小胞タンパク質が、シナプス形成の指標として使用される（Ｕｊｉｋｅ，Ｈ，ｅｔ  ａｌ，Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  ＳｃＬ、２００２；９６５：５５−６７）。２８日後、組織学的評価のため、実施例３に詳述したように動物は再び麻酔され、屠殺され、脳が除去された。シナプトフィジン（１：４０  ｍＡｂ，Ｃｌｏｎｅ  ＳＹ  ３８，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用した。
【０１６７】
結果は、シナプトフィジンの発現が、対照ＰＢＳ群と比較して、ＩＣＨ後２４時間または７２時間に３ｘ１０６個のＵＴＣで処理した血腫の境界域に沿って、著しく増大したことを示す（ｐ＜０．０５．）（図８Ｅおよび８Ｆを参照）。
【０１６８】
実施例７
脳の損傷エリアのアポトーシスに対する脳傷害後の細胞投与の影響
２８日後、組織学的評価のため、実施例３に詳述したように、動物は再び麻酔され、屠殺され、脳が除去された。終端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）媒介ｄＵＴＰ−ビオチンニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）方法（ＡｐｏｐＴａｇ  Ｋｉｔ；Ｏｎｃｏｒ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）が使用されて、製造業者の仕様書に従って、ｉｎ  ｓｉｔｕのアポトーシスの検出を評価した。ＴＵＮＥＬ方法は、ＤＮＡの３‘−ＯＨ末端に対するＴｄＴの特異的結合、および後に続く、ポリデオキシヌクレオチドポリマー細胞の合成に基づく。端的には、脳切片の脱パラフィン処理、およびプロテイナーゼＫを使用したタンパク質の消化、その後の、ＰＢＳ中２％のＨ２Ｏ２による内因性ペルオキシダーゼ活性のクエンチの後、スライドは、平衡緩衝液に、その後、作用強度ＴｄＴ酵素中に置かれ、続いて、作用強度停止／洗浄用緩衝液に置かれた。抗ジゴキシゲニンペルオキシダーゼを２滴スライドに加えた後、ペルオキシダーゼは、ＤＡＢで検出された。陰性対照が、作用強度ＴｄＴの製剤中、ＴｄＴ酵素に関して蒸留水を使用して行われた。ＴＵＮＥＬ方法の標識標的は、ＤＮＡ断片化により生成された新しい３’−ＯＨ  ＤＮＡ末端であり、これは、典型的には、暗褐色で丸いかまたは楕円の本体の、形態的に識別可能な核およびアポトーシス体に局在化する。
【０１６９】
ＴＵＮＥＬ染色は、典型的な暗褐色で丸いかまたは楕円のアポトーシス体を持つアポトーシス細胞を示した。分散したアポトーシス細胞は、損傷組織全体にわたり存在し、その大部分が血腫の境界域に位置した。結果は、アポトーシス細胞数が、対照ＰＢＳ群と比べて、ＩＣＨ後２４時間または７２時間に３ｘ１０６個のＵＴＣで処理した同側半球において、著しく減少したことを示す（ｐ＜０．０５）（図９Ｅおよび９Ｆを参照）。
【０１７０】
実施例８
脳の損傷エリアの組織損失に対する、脳傷害後の細胞投与の影響
２８日後、組織学的評価のため、実施例３に詳述したように、動物は、再び麻酔され、屠殺され、脳が除去された。大脳組織は、等しく離間した（２ｍｍ）７つの冠状ブロックに切り分けられ、その後、パラフィン切片化処理された。一連の隣接した６μｍ厚さの切片が、冠状面で各ブロックから切られ、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色された。切片は、Ｇｌｏｂａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｍａｇｅ分析システム（Ｄａｔａ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ｍａｒｉｂｏｒｎ，Ｍａ．）により追跡された。出血の側の保存された線条体のエリアは、反対側のものから取り去られ、したがって、ＩＣＨに起因する組織損失の程度が判断され、処理動物と未処理動物が比較される。結果は、対照ＰＢＳ群と比べて、ＩＣＨ後２４時間または７２時間に３ｘ１０６個のＵＴＣで処理したものには、組織損失の著しい減少はなかったことを示した（図１０Ａおよび１０Ｂを参照）。
【０１７１】
実施例９
脳傷害後の異なる時点における細胞投与の影響
実施例２〜８は、傷害後２４時間および７２時間におけるＵＴＣ投与の影響を示す。本研究では、治療濃度域が、７日目に遅延投与により広げられ、これにより、臨床的状況がよりよく模倣される（すなわち、細胞を７日目に投与することができれば、より多くの患者が、治療を受けることができる）。
【０１７２】
ＩＣＨは、実施例２に示されるように、成体Ｗｉｓｔａｒラットで誘導され（Ｓｅｙｆｒｉｅｄ，Ｄ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ，２００６；１０４：３１３−３１８を参照）、ラット群（ｎ＝４０）が各１０動物の４群に分けられた。ＩＣＨ後７２時間または１週間で、無作為選択した動物は、細胞移植を受けた。動物は、Ｎ２Ｏ：Ｏ２（２：１）中３．５％ハロタンで麻酔され、フェイスマスクを用いて０．５％ハロタンで維持される。２ｍＬの全流体容積ＰＢＳ中ＵＴＣ、またはＰＢＳ単独（対照）は、尾静脈に注入された。実験群（ｎ＝１０／群）は、ＰＢＳ単独およびＵＴＣ（３００万）のみからなった。細胞移植後、全ラットが、２８日目まで生かされた。
【０１７３】
全動物の行動試験バッテリーが、その後、１日目、４日目、１週間、２週間、３週間、４週間、３１日目、および３５日目に測定された。
【０１７４】
実施例２に示されるように、ｎＭＳＳ（Ｃｈｅｎ，Ｊ，ｅｔ  ａｌ，Ｓｔｒｏｋｅ，２００１；３２：１００５−１０１１を参照）およびコーナーテスト（Ｚｈａｎｇ，Ｌ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００２；１１７：２０７−２１４を参照）が神経機能を示す。
【０１７５】
円筒試験（Ｚｈａｎｇ，Ｌ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００２；１１７：２０７−２１４，Ｈｕａ，Ｙ，ｅｔ  ａｌ，Ｓｔｒｏｋｅ，２００２；３３：２４７８−２４８４を参照）が、トライアル中の活性の程度に応じて３〜１０分間、透明な円筒体（直径２０ｃｍおよび高さ３０ｃｍ）中で、前肢の使用および回転非対称を評価するため、ラットにおける使用に適合された。鏡が、円筒体のそばに角度を付けて置かれ、動物がカメラからそれた場合でも前肢の動きを記録することを可能にした。スコア付けは、スローモーションおよびクリアストップフレーム能を有するビデオカセットレコーダーを用いて、動物の条件に対して盲目の実験者により行われた。行動は、以下の基準に従ってスコア付けされた：（１）体重移動の動きを開始するか、または重心を取り戻すとともに、垂直姿勢で横に動くように、完全に後ろ足で立っている間に壁に接触するための、左または右前肢の独立した使用、ならびに（２）完全に後ろ足で立っている間に円筒体壁に接触するため、また壁に沿って交互に横方向足踏み運動をするために、左および右前肢の両方を同時に使うこと。
【０１７６】
付着‐除去体知覚試験について（Ｃｈｅｎ，Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｏｋｅ，２００１；３２：２６８２−２６８８を参照）、接着剤が裏に付いた紙の斑点の小片（等しいサイズ、５６．５５ｍｍ２）が、各前肢の手首の遠位−半径方向領域を占める両側触覚刺激として使用された。ラットは、次に、ケージに戻された。前肢から各刺激を取り除く時間は、１日に５回のトライアルで記録された。手術前、動物は、３日間しつけられた。ラットが斑点を１０秒以内で取り除けるようになると、ＩＣＨにかけられた。
【０１７７】
結果
１．  神経機能
機能試験の結果は、３ｘ１０６個のＵＴＣで７日目または３日目に処理されたラットは、ｍＮＳＳ試験、コーナーテスト、および円筒試験で著しい神経機能改善を表した（ｐ＜０．０５）ことを示した。
【０１７８】
ｍＮＳＳ：ｍＮＳＳトータルスコアは、７日目に処理を受けたラットで、２１、２８、および３５日目に著しく減少し、トータルスコアは、対照に比べて、３ｘ１０６個のＵＴＣで３日目に処理されたラット間で、１４、２１、２８、および３１日目に著しく減少した（図１１Ａおよび１１Ｂを参照）。
【０１７９】
コーナーテスト：コーナーテストのスコアは、スコアは、対照に比べて、３ｘ１０６個のＵＴＣで７または３日目に処理されたラット間で、２１および２８日目に著しく減少し、３１および３５日目に著しくではないが、減少した（図１２Ａおよび１２Ｂを参照）。
【０１８０】
円筒試験：円筒スコアは、対照に比べて、３ｘ１０６個のＵＴＣで７または３日目に処理されたラット間で２１、２８、３１、および３５日目に、著しく減少した（図１３Ａおよびｌ３Ｂを参照）。
【０１８１】
付着試験：付着試験スコアは、対照に比べて、３ｘ１０６個のＵＴＣで７または３日目に処理されたラット間では、どの時点でも著しく減少しなかった（図１４Ａおよび１４Ｂを参照）。
【０１８２】
２．  組織学
ＢｒｄＵ陽性細胞の数は、対照ＰＢＳ群と比較して、ＩＣＨ後３または７日目に３ｘ１０６個のＵＴＣで処理されたラットの同側半球のＳＶＺで著しく増加した（ｐ＜０．０５）（図１５Ａ〜１５Ｆを参照）。
【０１８３】
病変周辺の境界における拡張および薄壁血管は、血管新生を示す（Ｌｉ，Ｙ，ｅｔ  ａｌ，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２００２；５９：５１４−５２３を参照）。データは、血管の周囲長が、対照ＰＢＳ群と比較してＩＣＨ後７日または３日目の３ｘ１０６個のＵＴＣによる処理群で、著しく増加したことを示した（ｐ＜０．０５）（図１６Ａ〜１６Ｆを参照）。
【０１８４】
ＢｒｄＵ陽性内皮細胞およびｖＷＦ陽性血管は、図１７Ａ〜１７ＤにＩＣＨ境界で示される。図１７Ｅおよび１７Ｆは、血管内でｖＷＦ陽性染色組織と共存するＢｒｄＵ反応細胞の二重免疫染色を示す。二重染色は、血管マーカーを発現するとともに、依然として分裂している細胞部分集団を表し、これは、血管表現型に陽性の細胞が回復期中に新たに形成されることを示唆する（図１７Ｅ〜１７Ｆを参照）。
【０１８５】
ＴＵＪｌ標識は、新たに形成される未成熟ニューロンの検出のため行われた。この研究では、ＳＶＺのＴＵＪｌに対する免疫発現が、対照ＰＢＳ群と比較して、ＩＣＨ後７日または３日目での３ｘ１０６個のＵＴＣ細胞による処理群で著しく増加した（ｐ＜０．０５）（図１８Ａ〜１８Ｆを参照）。
【０１８６】
シナプトフィジン、プレシナプス小胞タンパク質が、シナプス形成の指標として使用された（Ｕｊｉｋｅ，Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．，２００２；９６５：５５−６７を参照）。データは、シナプトフィジンの発現が、対照ＰＢＳ群と比較して、ＵＴＣ細胞処理群において血腫の境界域に沿って著しく増加したことを示した（ｐ＜０．０５）（図１９Ａ〜１９Ｆを参照）。
【０１８７】
ＴＵＮＥＬ染色は、典型的な暗褐色で丸いかまたは楕円のアポトーシス体を有する脳のアポトーシス細胞を示した。分散したアポトーシス細胞は、損傷組織全体にわたり存在し、その大部分は血腫の境界域に位置した。アポトーシス細胞は、対照ＰＢＳ群と比較して、ＩＣＨ処理後３日目のＵＴＣ処理群において同側半球で著しく減少した（ｐ＜０．０５）。７日目の群間では、総アポトーシス細胞数の著しい差異は検出されなかった（図２０Ａ〜２０Ｆを参照）。
【０１８８】
組織損失を判断するため、大脳組織は、等しく離間した（２ｍｍ）７つの冠状ブロックに切り分けられ、次にパラフィン切片化のため処理された。一連の隣接する６μｍ厚さの切片が、冠状面で各ブロックから切断され、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色された。切片は、Ｇｌｏｂａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｍａｇｅ分析システム（Ｄａｔａ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ｍａｒｌｂｏｒｏ，ＭＡ）により追跡された。出血側の保存された線条体のエリアは、反対側のものから取り除かれたので、ＩＣＨによる組織損失の程度が考えられ、処理された動物と未処理動物との比較が行われた。結果は、対照ＰＢＳ群と比較して、ＩＣＨ後３または７日目の３ｘ１０６個のＵＴＣでの組織損失に著しい差異はないことを示す（図２１Ａおよび２１Ｂを参照）。
【０１８９】
ドナー細胞識別のため、ラットの脳の移植ヒト細胞は、３つの異なる抗体：ＮｕＭａ（Ａｂ−２）Ｍｏｕｓｅ  ｍＡｂ  （１０７−７）（抗核マトリックス、カタログ＃  ＮＡ０９Ｌ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）；精製マウス抗−ヒトβ２−ミクログロブリン（カタログ＃５５５５５０，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；およびマウス抗−ヒトミトコンドリア（カタログ＃Ｅ５２０４，Ｓｐｒｉｎｇ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐ）で染色された。免疫染色は、免疫学的検定手順の品質管理のため、２つの陰性対照（すなわち一次抗体の省略、および免疫前血清の使用）ならびに１つの陽性対照と同時に行われた。陽性対照は、マウスの脳に移植されたヒト細胞であった。結果は、陽性対照が非常によく作用したが、陽性染色細胞が、実験スライドおよび陰性対照スライドでは見られなかったことを示した。われわれは、抗体と反応を起こさなかった組織加工または注入細胞のバッチによる因子があるのではないかと考える。
【０１９０】
結果は、対照ＰＢＳ群と比較して、ＩＣＨ後７日または３日目に投与された移植ＵＴＣが、処理群においてｍＮＳＳ試験、コーナーターン試験および円筒試験により機能的結果を著しく改善したことを示す（Ｐ＜０．０５）。治療効果は、ＩＣＨ後１４日目に統計的に有意となり、手術後少なくとも２８日目まで持続した。さらに統計的により多くのＢｒｄＵ陽性細胞およびＴＵＪｌ発現する細胞が、対照ＰＢＳ群と比較して、ＩＣＨ後７日または３日目に３ｘ１０６個のＵＴＣを与えられた処理群でラットの同側半球のＳＶＺに存在した（ｐ＜０．０５）。微小血管およびシナプトフィジン発現は、傷害エリアの境界域で著しく増加し、著しく少ない数のアポトーシス細胞が、対照群と比べて、ＩＣＨ後３日目の注入細胞での処理群で見られた。ＵＴＣの静脈内注入の有益な効果は、ＩＣＨ後７日目の投与と３日目の投与との間で大きく異ならなかった。
【０１９１】
実施例１０
組織修復を促進する脳傷害後の細胞投与の影響
ＵＴＣおよびＭＳＣは、組織修復を促進する新しい方法を探すため、外傷性脳傷害のラットを処理するために試験された。ＵＴＣまたはＭＳＣは、ＴＢＩ後、若い成体のオスのラットを処理するため投与された。
【０１９２】
２４匹のオスのＷｉｓｔａｒラット（体重３００〜３３０ｇ）が、この実験に使用された（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ）。適切な隔離期間の後、各ラットは抱水クロラール（４００ｍｇ／ｋｇ）で麻酔された。Ｂｕｐｒｅｎｅｘ０．０５ｍｇ／ｋｇが手術前に全ての動物に与えられた。ラットは、制御式皮質衝撃（ＣＣＩ）にかけられた。体温は、加熱パッドおよびＫモジュールにより３７℃に維持された。
【０１９３】
２４匹のラットが３群（１群当たり８匹）に分けられた。２つの処理群が、ＴＢＩ後２４時間で尾静脈を通して投与されるＵＴＣまたはＭＳＣ（２ｍＬのＰＢＳ中４ｘ１０６個）を与えられた。これについて、ラットは、腹腔内（ｉ．ｐ）に投与された抱水クロラール４００ｍｇ／ｋｇで麻酔された。対照動物は、ｉ．ｖ．で２ｍＬのＰＢＳのみを与えられた。
【０１９４】
全ラットは、ＴＢＩ後異なる時点に、改変神経重症度スコア（ｍＮＳＳ）試験およびリス水迷路試験について試験された。増殖細胞標識のため、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ、２００ｍｇ／ｋｇ；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）が、１４日間毎日ラットに（腹腔内で）注入された（ＴＢＩ後１日目に開始）。全ラットは、ケタミン（１６０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（２０ｍｇ／ｋｇ）をｉ．ｐ．注入することによりＴＢＩ後３５日目に安楽死させられた。脳組織は、組織学的分析のため処理された（染色）。
【０１９５】
ｍＮＳＳは、ＴＢＩ前の１日目、その後、ＴＢＩ後１、４、７、１４、２８および３５日目に行われた。モリス水迷路試験は、ＴＢＩ後３１〜３５日に行われた。データ収集は、ＨＶＳ  Ｉｍａｇｅ  ２０２０  Ｐｌｕｓ  Ｔｒａｃｋｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＵＳ  ＨＶＳ  Ｉｍａｇｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａ．）により自動化された。
【０１９６】
全ての脳サンプルは、標準Ｈ＆Ｅならびに免疫組織化学により染色された。Ｈ＆Ｅ染色は、病変容量を計算するために行われた。免疫組織化学は、抗ヒトミトコンドリア抗体（Ｅ５２０４）を用いてＵＴＣまたはＭＳＣの識別のため行われた。
【０１９７】
新しく増殖する細胞ＢｒｄＵを識別するため、免疫組織化学を行った。ＭＡＰ−２およびｖＷＦによる二重染色は、新たに増殖する細胞の表現型を識別するため行われた。
【０１９８】
結果
両処理群（ＵＴＣまたはＭＳＣ処理のラット）と対照群との間で、ｍＮＳＳに有意差があった。これは７日目に初めて目に見え、トライアル終了まで続いた（図２２を参照）。２つの処理群には、差がなかった。
【０１９９】
モリス水迷路試験では、対照と比べて、ＵＴＣまたはＭＳＣ処理群で３５日目に改善が見られた（図２３を参照）。
【０２００】
病変容量計算では、ＵＴＣまたはＭＳＣ処理したラットと動物の対照群との間で、病変容量に有意差はなかった（図２４を参照）（＊Ｐ＝０．０７、＃Ｐ＝０．２）。
【０２０１】
ＵＴＣまたはＭＳＣを識別するため、免疫組織化学が、Ｅ５２０４抗体を用いて行われ、ドナーＵＴＣまたはＭＳＣを識別した。３５日後、われわれは、ＵＴＣおよびＭＳＣ処理群のわずかな脳切片においてＥ５２０４陽性染色細胞を見つけた。細胞は、主に病変境界域に見られた。陽性染色細胞は、対照群では見られなかった（図２５Ａおよび２５Ｂを参照）。
【０２０２】
ＢｒｄＵ陽性細胞は、主に病変境界域（図２７を参照）では、ＵＴＣ（図２６Ａを参照）およびＭＳＣ（図２６Ｂを参照）に見られ、これは新細胞の増殖を示す。非常に少ない細胞が歯状回で見えた（図２８を参照）。しかしながら、動物の処理群と対照群との間に、差はなかった（図２７および２８を参照）。
【０２０３】
ｖＷＦ／ＤＡＢ染色は、ＵＴＣ（図２９Ａを参照）およびＭＳＣ（図２９Ｂを参照）の血管新生を識別するために行われた。動物の処理群と対照群では、境界域または歯状回において、陽性染色血管の数に統計的有意差はなかった（図３０および図３１を参照）。
【０２０４】
新たに生成された細胞の表現型識別のため、切片は、Ｍａｐ−２（ニューロンマーカー）およびｖＷＦ（内皮マーカー）で染色された。動物の処理群の一部では、ＢｒｄＵとＭａｐ−２との間でオーバーラップが見られた。ＢｒｄＵとＭａｐ−２免疫組織化学との間の陽性オーバーラップは、新たに増殖する細胞がニューロンに分化できることを示した（図３２を参照）。対照動物では陽性二重染色は見えなかった。細胞はまた、ＢｒｄＵおよびｖＷＦでも二重染色された。これらの間でオーバーラップは見えなかった。
【０２０５】
実施例１１
神経前駆細胞補助のための栄養因子
非接触依存（栄養）メカニズムを通じた、成体の神経幹細胞および前駆細胞の生存ならびに分化に対するＵＴＣの影響を調べた。
【０２０６】
３４４匹のＦｉｓｈｅｒ成体ラットが、ＣＯ２による窒息で屠殺され、それに続いて頸部が脱臼された。脳全体が、骨鉗子を用いて無傷で取り除かれ、海馬組織が、脳の運動および知覚領域に対して後方の冠状切開に基づいて切断された（Ｐａｘｉｎｏｓ，Ｇ，＆  Ｗａｔｓｏｎ，Ｃ，１９９７，Ｔｈｅ  Ｒａｔ  Ｂｒａｉｎ  ｉｎ  Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）。組織は、Ｂ２７（Ｂ２７  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｌグルタミン（４ｍＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ．）で洗浄され、この組み合わせは、本明細書で神経前駆細胞増殖（ＮＰＥ）培地と呼ぶ。ＮＰＥ培地は、ｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，Ｎ．Ｊ．）およびＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，Ｎ．Ｊ．）をさらに補充され、これは本明細書ではＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦと呼ぶ。
【０２０７】
洗浄後、上にある髄膜が除去され、組織がメスで刻まれた。刻んだ組織は、収集され、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が総容量の７５％として加えられた。デオキシリボヌクレアーゼ（８ｍＬ総容量当たり１００μＬ、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）も加えられた。次に、組織／培地が、１８ゲージ針、２０ゲージ針、および最後には２５ゲージ針に、連続して、１回ずつ通された（針は全てＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，Ｎ．Ｊ．より）。混合物は２５０ｘｇで３分間遠心分離された。上澄みを取り除き、新鮮なＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦが加えられ、ペレットが再懸濁された。結果として得られた細胞懸濁液は、４０μｍ細胞ストレーナー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に通され、ラミニンコートＴ−７５フラスコ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）または低クラスター２４ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に蒔かれ、十分な細胞数が概説した研究用に得られるまでＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ培地で成長させられた。
【０２０８】
成長培地で先に成長した臍帯組織由来細胞（臍（０２２８０３）Ｐ１２、（０４２１０３）Ｐ１２、（０７１００３）Ｐ１２）は、５，０００個の細胞／トランスウェルインサート（２４ウェルプレート用のサイズ）で蒔かれ、１週間、インサート内の成長培地で成長し、コンフルエンスを達成した。
【０２０９】
ニューロスフェアとして、または単一細胞として成長した神経前駆細胞は、ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ内で、１日間、２，０００個の細胞／ウェルの適切な密度でラミニンコート２４ウェルプレート上に播種され、細胞付着を促進した。１日後、ＵＴＣを含有するトランスウェルインサートが、以下のスキームに従って加えられた：
（１）トランスウェル（成長培地中臍由来細胞、２００μＬ）＋神経前駆細胞（ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ、１ｍＬ）
（２）トランスウェル（成体ヒト皮膚線維芽細胞［１Ｆ１８５３；Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ］Ｐ１２、成長培地中、２００μＬ）＋神経前駆細胞（ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ、１ｍＬ）
（３）対照：神経前駆細胞単独（ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ、１ｍＬ）
（４）対照：神経前駆細胞単独（ＮＰＥのみ、１ｍＬ）。
【０２１０】
共培養して７日後、全条件が、室温で１０分間、４％（ｗ／ｖ）冷パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）で固定された。免疫細胞化学が、表１１−１に挙げるエピトープに対する抗体を用いて行われた。端的には、培養は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄され、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，Ｃａ．）、および０．３％（ｖ／ｖ）トリトン（トリトンＸ−１００；Ｓｉｇｍａ）を含有するタンパク質遮断溶液に、３０分間さらされて、細胞内抗原にアクセスした。遮断溶液で希釈された一次抗体は、次に１時間室温で、培養に適用される。次に、一次抗体溶液を取り除き、培養が、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（１：２５０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）およびヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  ４８８（１：２５０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と共に遮断溶液を含有する二次抗体溶液（１時間室温で）が適用される前に、ＰＢＳで洗浄される。培養物は次に洗浄され、１０μｍのＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）が１０分間適用され、細胞核を可視化した。
【０２１１】
免疫染色後、蛍光が、Ｏｌｙｍｐｕｓ倒立落射蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，Ｎ．Ｙ．）上で適切な蛍光フィルターを用いて可視化された。すべての場合において、陽性染色は、一次抗体溶液を適用したことを除いて前記に概説した手順全体に従った場合、対照染色を超えて蛍光信号を表した。代表的な画像が、デジタルカラービデオカメラ、およびＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ．）を用いて取り込まれた。三重染色（ｔｒｉｐｌｅ−ｓｔａｉｎｅｄ）サンプルでは、各画像は、１回にただ１つの放出フィルターを使用して撮られた。層をなすモンタージュが次に、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ａｄｏｂｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａ．）を用いて準備された。
【表２】
0006095893.tif 000003
【０２１２】
海馬の神経前駆細胞分化の定量化を調べた。最小で１０００個の細胞が、条件ごとにカウントされ、これより少ない場合、その条件で観察された細胞の総数がカウントされた。所定の染料に陽性の細胞のパーセンテージが、陽性細胞数をＤＡＰＩ（核）染色により判断された細胞の総数で割ることにより評価された。
【０２１３】
共培養の結果として、独自の分泌因子を識別するため、培養固定前に採取された馴化培地サンプルが、一晩−８０℃で凍結された。サンプルは次に、限外ろ過回転装置（分子量カットオフ  ５．０×１０−２０ｇ（３０ｋＤ））に適用された。残余分が、免疫親和性クロマトグラフィカラム（抗ヒトアルブミン；ＩｇＹ）に適用された（免疫親和性は、サンプルからアルブミンを除去しなかった）。ろ液がＭＡＬＤＩにより分析された。通過（ｐａｓｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ）が、Ｃｉｂａｃｈｒｏｎ  Ｂｌｕｅ親和性クロマトグラフィカラムに適用された。サンプルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび２Ｄゲル電気泳動により分析された。
【０２１４】
臍由来細胞での培養後、成体ラット海馬由来の、共培養された神経前駆細胞は、中枢神経系の３つの主要系統に沿った著しい分化を呈した。この効果は、共培養で５日後にはっきり観察され、多くの細胞が複合突起（ｃｏｍｐｌｅｘ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）を産生し、分裂する前駆細胞に特徴的な、明位相特徴（ｐｈａｓｅ  ｂｒｉｇｈｔ  ｆｅａｔｕｒｅｓ）を失う。逆に、ｂＦＧＦおよびＥＧＦの不存在下で単独で成長した神経前駆細胞は、不健康に見え、生存は限られていた。
【０２１５】
処置の完了後、培養物は、未分化幹細胞および前駆細胞を示すマーカー（ネスチン）、未成熟および成熟ニューロンを示すマーカー（ＴｕＪｌ）、星状細胞を示すマーカー（ＧＦＡＰ）、および成熟乏突起膠細胞を示すマーカー（ＭＢＰ）について染色された。三つ全ての系統に沿った分化が確認され、一方、対照条件では、大部分の細胞間のネスチン−陽性染色の保持で分かるように、著しい分化を示さなかった。
【０２１６】
臍由来細胞との共培養後の、分化した神経前駆細胞のパーセンテージは、定量化された。臍由来細胞は、成熟乏突起膠細胞（ＭＢＰ）の数を著しく増大させた（２４．０％対０％、両対照条件で）。さらに、共培養は、培養中、ＧＦＡＰ＋星状細胞およびＴｕＪｌ＋ニューロンの数も増大させた（それぞれ４７．２％および８．７％）。これらの結果は、共培養後に前駆細胞の状態が損失されたことを示すネスチン染色により確認された（１３．４％対７１．４％、対照条件４）。
【０２１７】
分化は、成体ヒト線維芽細胞により影響を受けているようだが、そのような細胞は、成熟乏突起膠細胞の分化を促進できず、また、許容可能な量のニューロンを生成することもできなかった。しかしながら、定量化していないが、線維芽細胞は、神経前駆細胞の生存を高めるようである。
【表３】
0006095893.tif 000004
【０２１８】
適切な対照（ＮＰＥ培地±１．７％血清、線維芽細胞との共培養からの培地）と共に、臍由来共培養からの馴化培地が、差異について調べられた。潜在的に独自の化合物が識別され、対応する２Ｄゲルから切り取られた。
【０２１９】
臍由来細胞との成体神経前駆細胞の共培養は、それらの細胞の分化をもたらす。この実施例で示された結果は、臍由来細胞との共培養後の成体神経前駆細胞の分化が、特に著明であることを示す。具体的には、著しい割合の成熟乏突起膠細胞が、臍由来細胞の共培養で生成された。臍由来細胞と神経前駆細胞との間に接触がないことを考慮すると、この結果は、臍由来細胞から放出される可溶性因子の関数のようである（栄養効果）。
【０２２０】
いくつかの他の観察が行われた。まず、ＥＧＦおよびｂＦＧＦが除去された対照条件では、細胞が非常に少なかった。大半の細胞は死に、平均すると、約１００個以下の細胞が１個のウェルにあった。第二に、ＥＧＦおよびｂＦＧＦが全体にわたり培地に保持された対照条件では、ほとんど分化がないことが予測される。これは、通常は増殖培地であるためである。細胞の約７０％が前駆細胞の状態（ネスチン＋）を保持していると観察されたが、約３０％は、ＧＦＡＰ＋を保持すると観察された（星状細胞を示す）。これは、そのような著しい増殖が、この分化で誘導された前駆細胞間で接触する処置の過程全体で生じる事実によるものであろう（Ｓｏｎｇ，Ｈ，ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，２００２；４１７：２９−３２）。
【０２２１】
実施例１２
細胞の短期間の神経の分化
臍由来細胞が神経系統細胞に分化する能力を調べた。臍帯組織は、実施例１２に示すように、単離され、増殖された。
【０２２２】
改変Ｗｏｏｄｂｕｒｙ−Ｂｌａｃｋプロトコルは、骨髄間質細胞の神経誘導能力を試験するのにもともと行われたものだが、これが、ＵＴＣが神経系統細胞へ分化する能力を評価するために用いられた（Ｗｏｏｄｂｕｒｙ，Ｄ，ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０００；６１（４）：３６４−７０）。端的には、ＵＴＣ（０２２８０３）Ｐ４は解凍され、培養物が、サブコンフルエンス（７５％）に達するまで５，０００個の細胞／ｃｍ２で成長培地において増殖した。細胞はその後、トリプシン処理され、Ｔｉｔｒｅｔｅｋ  ＩＩスライドガラスのウェル当たり６，０００個の細胞で播種された（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＣＴ）。対照として、間葉幹細胞（Ｐ３；１Ｆ２１５５；Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、骨芽細胞（Ｐ５；ＣＣ２５３８；Ｃａｍｂｒｅｘ）、脂肪由来細胞（Ａｒｔｅｃｅｌ、ＵＳ６，５５５，３７４Ｂ１）（Ｐ６；ドナー２）、および新生児ヒト皮膚線維芽細胞（Ｐ６；ＣＣ２５０９；  Ｃａｍｂｒｅｘ）も、同じ条件下で播種された。  
【０２２３】
全細胞は、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ；２０ｎｇ／ｍＬ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，Ｎ．Ｊ．）、上皮成長因子（ＥＧＦ；２０ｎｇ／ｍＬ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、およびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ．）で４日間、最初に増殖した。４日後、細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ですすがれ、次に、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地＋２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ＋ペニシリン／ストレプトマイシンで２４時間培養された。２４時間後、細胞はＰＢＳですすがれた。細胞は、誘導培地で１〜６時間培養され、この培地は、２００ｍＭブチルヒドロキシアニソール、１０μｍ塩化カリウム、５ｍｇ／ｍＬインスリン、１０μｍフォルスコリン、４μｍバルプロ酸、および２μｍヒドロコルチゾンを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２（無血清）で構成された（全ての化学薬品はＳｉｇｍａ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．より）。細胞は次に、１００％氷のように冷たいメタノールで固定され、免疫細胞化学が行われ（以下の方法を参照）、ヒトネスチンタンパク質発現を評価した。
【０２２４】
ＵＴＣ（０２２８０３  Ｐ１１）および成体ヒト皮膚線維芽細胞（１Ｆ１８５３、Ｐ１１）が解凍され、サブコンフルエンス（７５％）に達するまで、成長培地で５，０００個の細胞／ｃｍ２で培養成長させられた。細胞は次にトリプシン処理され、前記と同様の密度で、しかし（１）２４ウェル組織培養処理プレート（ＴＣＰ，Ｆａｌｃｏｎ  ｂｒａｎｄ、ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、（２）ＴＣＰウェル＋１時間室温で吸着された２％（ｗ／ｖ）ゼラチン、または（３）ＴＣＰウェル＋２０μｇ／ｍＬ吸着マウスラミニン（最小で２時間３７℃で吸着；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に、播種された。
【０２２５】
前記のとおり、細胞は、最初に増殖し、培地は、前述のタイムフレームで切り替えられる。１組の培養物が前記のとおり、５日と６時間で固定され、このときは、氷のように冷たい４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）により１０分間室温で行った。第２組の培養物では、培地が除去され、Ｂ２７（Ｂ２７  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｌグルタミン（４ｍＭ）、およびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のみからなる神経前駆細胞増殖培地（ＮＰＥ）に切り替えられた。ＮＰＥ培地は、レチノイン酸（ＲＡ；１μＭ；Ｓｉｇｍａ）をさらに補充された。この培地は、４日後に除去され、培養物は、氷のように冷たい４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）で、１０分間室温で固定され、ネスチン、ＧＦＡＰ、ＴｕＪｌタンパク質発現について染色された（表１２−１を参照）。
【表４】
0006095893.tif 000005
【０２２６】
臍由来細胞（０４２２０３；Ｐ１１）、成体ヒト皮膚線維芽細胞（Ｐ１１；１Ｆ１８５３；  Ｃａｍｂｒｅｘ）が解凍され、サブコンフルエンス（７５％）に達するまで、５，０００個の細胞／ｃｍ２で成長培地において培養増殖させられた。細胞は次にトリプシン処理され、２，０００個細胞／ｃｍ２で、しかし、ラミニンでコートした２４ウェルプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，Ｎ．Ｊ．）上に、ｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，Ｎ．Ｊ．）およびＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補充されたＮＰＥ培地存在下で、播種された［培地組成全体はさらに、ＮＰＥ＋Ｆ＋Ｅと呼ばれる］。同時に、海馬から単離した成体ラット神経前駆細胞（Ｐ４；（０６２６０３）も、ＮＰＥ＋Ｆ＋Ｅ培地で２４ウェルラミニンコートプレート上に蒔かれる。全培養物は、６日間、このような条件に維持され（細胞は、その期間中１回だけ栄養を与えられた）、その時点で、培地が、さらに７日間、リストされた分化条件に切り替えられた。培養は、氷のように冷たい４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）で、１０分間室温で、固定され、ヒトまたはラットネスチン、ＧＦＡＰ、およびＴｕＪｌタンパク質発現について染色された。
【表５】
0006095893.tif 000006
【０２２７】
臍由来細胞（Ｐｌ１；（０４２２０３））は解凍され、サブコンフルエンス（７５％）に達するまで、５，０００個の細胞／ｃｍ２で成長培地において培養増殖させられた。細胞は次にトリプシン処理され、ＮＰＥ＋Ｆ（２０ｎｇ／ｍＬ）＋Ｅ（２０ｎｇ／ｍＬ）の存在下で、２４ウェルラミニンコートプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に、２，０００個細胞／ｃｍ２で播種された。さらに、一部のウェルは、ＮＰＥ＋Ｆ＋Ｅ＋２％ＦＢＳまたは１０％ＦＢＳを含有した。「前分化」条件の４日後、全培地が除去され、サンプルは、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ；２００ｎｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）、ＦＧＦ８（１００ｎｇ／ｍＬ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ＢＤＮＦ（４０ｎｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ）、ＧＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ）、およびレチノイン酸（１μｍ；Ｓｉｇｍａ）を補充されたＮＰＥ培地に切り替えられた。培地変更後７日で、培養物は、氷のように冷たい４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）で、１０分間室温で固定され、ヒトネスチン、ＧＦＡＰ、ＴｕＪｌ、デスミン、およびα−平滑筋アクチン発現について染色された。
【０２２８】
成体ラットの海馬前駆細胞（０６２６０３）が、ニューロスフェアまたは単一細胞（１０，０００個細胞／ウェル）として、ラミニンコート２４ウェル皿（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に、ＮＰＥ＋Ｆ（２０ｎｇ／ｍＬ）＋Ｅ（２０ｎｇ／ｍＬ）中で蒔かれた。
【０２２９】
別個に、臍由来細胞（０４２２０３）Ｐ１１が解凍され、ＮＰＥ＋Ｆ（２０ｎｇ／ｍＬ）＋Ｅ（２０ｎｇ／ｍＬ）中で、５，０００個の細胞／ｃｍ２で４８時間、培養増殖された。細胞は次にトリプシン処理され、存在する神経前駆細胞培養物上に、２，５００個細胞／ウェルで播種された。このとき、存在した培地は、新鮮培地に交換された。４日後、培養物は、氷のように冷たい４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）で、１０分間室温で固定され、ヒト核タンパク質（ｈＮｕｃ；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）について染色され（前記表１１−１）、ＵＴＣを識別した。
【０２３０】
免疫細胞化学が、表１１−１にリストした抗体を用いて行われた。培養物は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄され、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、Ｃａ．）、および０．３％（ｖ／ｖ）トリトン（トリトンＸ−１００；  Ｓｉｇｍａ）を含有するタンパク質遮断溶液に３０分間さらされて、細胞内抗原にアクセスした。遮断溶液で希釈された一次抗体は、次に、１時間室温で培養物に適用された。次に、一次抗体溶液は除去され、培養物は、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（１：２５０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒ．）およびヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８（１：２５０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と共に遮断溶液を含有する二次抗体溶液を（１時間室温で）適用する前に、ＰＢＳで洗浄される。培養物は次に洗浄され、１０マイクロモルＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）が１０分間適用されて、細胞核を可視化した。
【０２３１】
免疫染色後、蛍光は、Ｏｌｙｍｐｕｓ倒立落射蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，Ｎ．Ｙ．）上で、適切な蛍光フィルターを用いて可視化された。すべての場合において、陽性染色は、一次抗体溶液を適用したことを除いて前記に概説した手順全体に従った場合、対照染色を超えて蛍光信号を表した。代表的な画像は、デジタルカラービデオカメラ、およびＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ．）を用いて取り込まれた。三重染色（ｔｒｉｐｌｅ−ｓｔａｉｎｅｄ）サンプルでは、各画像は、１回にただ１つの放出フィルターを使用して撮られた。層をなすモンタージュが次に、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ａｄｏｂｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａ．）を用いて準備された。
【０２３２】
前記にリストした第１の神経誘導組成物のインキュベーションの際、スライドガラスを用いて、全細胞型が、双極形態の細胞に形質転換し、突起を引き延ばした。他の、より大きな非双極形態も観察された。さらに、誘導された細胞集団は、多分化能神経幹細胞および前駆細胞のマーカーであるネスチンに対して陽性染色された。
【０２３３】
組織培養プラスチック（ＴＣＰ）皿で反復されると、前記にリストした第２の神経誘導組成物に説明するように、ネスチン発現は、ラミニンが培養表面に前もって吸着されるまで、観察されなかった。ネスチン発現細胞が次に成熟ニューロンを生成できるかどうかさらに評価するため、ＵＴＣおよび線維芽細胞が、ＮＰＥ＋ＲＡ１（μＭ）（神経幹細胞および前駆細胞をそのような細胞に分化させるのを誘導することが知られている培地組成物である）にさらされた（Ｊａｎｇ，ＹＫ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４；７５（４）：５７３−８４；Ｊｏｎｅｓ−Ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅ，ＥＭ，ｅｔ  ａｌ，ＭｏＩ  ＣｅＩ  Ｂｉｏｌ，１９８３；３（１２）：２２７１−９；Ｍａｙｅｒ−Ｐｒｏｓｃｈｅｌ，Ｍ、ｅｔ  ａｌ，Ｎｅｕｒｏｎ，１９９７；１９（４）：７７３−８５）。細胞は、未成熟および成熟ニューロンのマーカーであるＴｕＪｌ、星状細胞のマーカーであるＧＦＡＰ、およびネスチンについて染色された。如何なる条件下でも、ＴｕＪｌは検出されず、ニューロン形態を持つ細胞も観察されず、このことは、ニューロンが短期間に生成されないことを示唆している。さらに、ネスチンおよびＧＦＡＰは、は、免疫細胞化学により判断されるときに、もはやＵＴＣによって発現されなかった。
【０２３４】
ＵＴＣ分離物は（それぞれ陰性および陽性対照細胞型としての、ヒト線維芽細胞およびげっ歯類神経前駆細胞と同様に）、ラミニン（神経促進）コート皿上に蒔かれ、神経前駆細胞のニューロンおよび星状細胞への分化を促進することが知られている、１３個の異なる成長条件（および２つの対照条件）にさらされた。さらに２つの条件が、ＰＰＤＣ分化に対するＧＤＦ５およびＢＭＰ７の影響を調べるために加えられた。概して、２段階分化アプローチが取られ、細胞は最初に６日間、神経前駆細胞増殖条件に置かれ、その後、７日間、完全分化条件に置かれた。形態的に、臍および胎盤由来細胞は双方、この処置の時間的経過にわたり、細胞形態の基本的な変化を呈した。しかしながら、ニューロンまたは星状細胞形状の細胞が、対照の、神経前駆細胞を蒔いた条件を除いて、観察されなかった。ヒトネスチン、ＴｕＪｌ、およびＧＦＡＰに陰性の免疫細胞化学が、形態観察を確認した。
【０２３５】
様々な神経分化薬剤に１週間さらした後、細胞は、神経前駆細胞（ヒトネスチン）、ニューロン（ＴｕＪｌ）、および星状細胞（ＧＦＡＰ）を示すマーカーについて染色された。無血清含有培地で第１段階に成長した細胞は、血清含有（２％または１０％）培地のそのような細胞とは異なる形態を有しており、このことは、潜在的な神経分化を示す。特に、臍由来細胞をＥＧＦおよびｂＦＧＦにさらし、その後ＳＨＨ、ＦＧＦ８、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、およびレチノイン酸にさらす２段階処置の後、細胞は、培養された星状細胞の形態と同様の、長く延びる突起（ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）を示した。２％ＦＢＳまたは１０％ＦＢＳが第１分化段階に含まれた場合、細胞数は増加し、細胞形態は、高密度では、対照培養と変化しなかった。潜在的な神経の分化は、ヒトネスチン、ＴｕＪｌ、またはＧＦＡＰについての免疫細胞化学的分析によって証明されなかった。
【０２３６】
ＵＴＣは、神経増殖条件（ＮＰＥ＋Ｆ＋Ｅ）において２日前に播種されたラット神経前駆細胞の培養物に蒔かれた。蒔かれたＵＴＣの視覚的確認は、これらの細胞が単一細胞として蒔かれたことを証明したが、播種から４日目の（合計で６日）ヒト特異的核染色（ｈＮｕｃ）は、それらが、一塊になって（ｂａｌｌ  ｕｐ）神経前駆細胞との接触を回避する傾向があったことを示した。さらに、ＵＴＣが付着した場合、これらの細胞は、分散し、ラット由来の分化したニューロンにより神経支配されているように見え、このことは、ＵＴＣが筋細胞に分化したかもしれないことを示唆する。この観察は、位相差顕微鏡観察下で、形態に基づいていた。他の観察は、典型的には大きな細胞体（神経前駆細胞より大きい）が、神経前駆細胞に似た形態を有したことであり、薄い突起が複数の方向にわたっていた。ＨＮｕｃ染色（細胞核の半分で見られた）は、場合によっては、これらのヒト細胞は、ラット前駆細胞と融合しており、それらの表現型をとっているであろうことを示唆した。神経前駆細胞のみを含有する対照ウェルは、臍または胎盤由来細胞を含有する共培養ウェルよりも、より少ない総数の前駆細胞および明らかな分化細胞を有しており、このことは、臍および胎盤由来細胞両方が、ケモカインおよびサイトカインの放出によって、または接触を介した効果によって、神経前駆細胞の分化および行動に影響を与えたことをさらに示す。
【０２３７】
複数のプロトコルが実行され、ＵＴＣが神経系統細胞に分化する短期間の可能性を判断した。これらは、それぞれ多分化能神経幹細胞および前駆細胞、未成熟および成熟ニューロン、および星状細胞に関するタンパク質である、ネスチン、ＴｕＪｌ、およびＧＦＡＰについての免疫細胞化学と組み合わせて、形態の位相差画像法を含んだ。証拠は、神経の分化が、ある場合には、これらの短期間のプロトコルにおいて生じたことを示唆することが観察された。
【０２３８】
神経前駆細胞とのＵＴＣの共培養では、いくつかの注目に値する観察があった。異種細胞型と共にヒトＵＴＣを使用したこのアプローチは、これらの培養における各細胞の起源の絶対的判断を可能にした。まず、いくつかの細胞が、これらの培養で観察され、ここで細胞質は拡張し、神経突起様突起が、細胞体から延出していたが、細胞体の半分のみが、ｈＮｕｃタンパク質で標識されていた。それらの細胞は、神経系統細胞に分化したヒトＵＴＣであるかもしれず、あるいは、神経前駆細胞と融合したＵＣＴであるかもしれない。第二に、ニューロンに分化しＵＴＣを神経支配した前駆細胞を示すような形で、神経前駆細胞が神経突起をＵＴＣまで延ばすように思われる。第三に、神経前駆細胞およびＵＴＣの培養は、神経前駆細胞単独の対照培養に比べ、より多くのラット由来細胞、およびより多量の分化を有し、これは、蒔かれたＵＴＣが、神経前駆細胞の生存、増殖、および／または分化を刺激した可溶性因子および／または接触依存のメカニズムを提供したことをさらに示す。
【０２３９】
実施例１３
細胞単離
臍帯が、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．）から入手された。組織は、正常な配達に従って入手された。細胞単離プロトコルは、層流フードで無菌で行われた。血液および残骸を除去するため、臍帯が、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および０．０２５μｇ／ｍＬのアンホテリシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ．）の存在下で、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａ．）で洗浄された。組織は次に、組織が細かな柔らかい塊（ｆｉｎｅ  ｐｕｌｐ）に刻まれるまで、５０ｍＬの培地（ＤＭＥＭ−低グルコースまたはＤＭＥＭ−高グルコース；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下で、１５０ｃｍ２組織培養プレートにおいて、機械的に解離された。切り刻まれた組織は、５０ｍＬの円錐チューブ（チューブ当たり約５ｇの組織）に移された。
【０２４０】
組織が、次に、ＤＭＥＭ−低グルコース培地もしくはＤＭＥＭ−高グルコース培地のいずれかで消化された。これらの培地はそれぞれ、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍＬのアンホテリシンＢ、および消化酵素を含有する。いくつかの実験では、コラゲナーゼおよびディスパーゼの酵素混合物が使用された（「Ｃ：Ｄ」）（コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）、５００単位／ｍＬ；およびディスパーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５０単位／ｍＬ、ＤＭＥＭ−低グルコース培地中）。他の実験では、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、およびヒアルロニダーゼの混合物（「Ｃ：Ｄ：Ｈ」）が使用された（Ｃ：Ｄ：Ｈ＝コラゲナーゼ、５００単位／ｍＬ；ディスパーゼ、５０単位／ｍＬ；およびヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）、５単位／ｍＬ、ＤＭＥＭ−低グルコース中）。組織、培地および消化酵素を含む円錐チューブは、オービタルシェーカー（Ｅｎｖｉｒｏｎ，  Ｂｒｏｏｋｌｙｎ，Ｎ．Ｙ．）中、３７℃で、２２５ｒｐｍで２時間インキュベートされた。
【０２４１】
消化後、組織を、１５０ｘｇで５分間遠心分離し、上澄みを吸引した。ペレットは、２０ｍＬの成長培地（ＤＭＥＭ：低グルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；規定のウシ胎仔血清；ロット＃ＡＮＤ１８４７５；Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，Ｕｔ．）、０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍＬのアンホテリシンＢ；（それぞれＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ．より））中で再懸濁された。細胞懸濁液は、７０μｍ（７０ミクロン）のナイロンＢＤ  ＦＡＬＣＯＮ細胞ストレーナー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、Ｃａ．）を通してろ過された。成長培地を含む、５ｍＬの追加のリンス剤を、ストレーナーに通した。細胞懸濁液を次に、４０μｍナイロン細胞ストレーナー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａ．）に通し、追加の５ｍＬの成長培地のリンス剤がその後に入れられる（ｃｈａｓｅｄ）。
【０２４２】
ろ過液は、成長培地（総容量５０ｍＬ）に再懸濁され、１５０ｘｇで５分間遠心分離された。上澄みを吸引し、細胞を、５０ｍＬの新鮮な成長培地に再懸濁した。このプロセスを、さらに２回繰り返した。
【０２４３】
最終的な遠心分離の後、上澄みを吸引し、細胞ペレットを、５ｍＬの新鮮な成長培地に再懸濁した。トリパンブルー染色を用いて、生存細胞数を判断した。細胞を、標準条件下で培養した。
【０２４４】
臍帯組織から単離された細胞を、成長培地において、ゼラチンコートしたＴ−７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｎ．Ｙ．）上に５，０００個の細胞／ｃｍ２で播種した。２日後、使用済み培地、および未付着細胞を、フラスコから吸引した。付着細胞を、ＰＢＳで３回洗浄し、残骸および血液由来細胞を除去した。次に、細胞は、成長培地を補充され、コンフルエンスまで成長した（０代継代から１代継代まで約１０日）。次の継代では（１から２代継代まで、など）、細胞は、４〜５日でサブコンフルエンス（７５〜８５％コンフルエンス）に達した。続いて起こるこれらの継代では、細胞を、５，０００細胞／ｃｍ２で播種した。細胞は、加湿インキュベーター中、５％の二酸化炭素により、３７℃で成長した。
【０２４５】
いくつかの実験では、細胞は、ＬＩＢＥＲＡＳＥ（２．５ｍｇ／ｍＬ、ＢＬＥＮＤＺＹＭＥ３；Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎ．）およびヒアルロニダーゼ（５単位／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）による消化の後、ＤＭＥＭ−低グルコース培地で臍帯組織から単離された。組織の消化、および細胞の単離は、他のプロテアーゼ消化について前述したとおりであるが、ＬＩＢＥＲＡＳＥ／ヒアルロニダーゼ混合物を、Ｃ：ＤもしくはＣ：Ｄ：Ｈ酵素混合物の代わりに使用した。ＬＩＢＥＲＡＳＥによる組織消化は、容易に増殖した分娩後組織からの細胞集団単離をもたらした。
【０２４６】
異なる酵素の組み合わせを用いて、臍帯から細胞を単離する処置を比較した。消化について比較された酵素は以下を含んだ：ｉ）コラゲナーゼ；ｉｉ）ディスパーゼ；ｉｉｉ）ヒアルロニダーゼ；ｉｖ）コラゲナーゼ：ディスパーゼ混合物（Ｃ：Ｄ）；ｖ）コラゲナーゼ：ヒアルロニダーゼ混合物（Ｃ：Ｈ）；ｖｉ）ディスパーゼ：ヒアルロニダーゼ混合物（Ｄ：Ｈ）；およびｖｉｉ）コラゲナーゼ：ディスパーゼ：ヒアルロニダーゼ混合物（Ｃ：Ｄ：Ｈ）。これらの異なる酵素消化条件を使用した細胞単離の差異を観察した（表１３−１）。
【０２４７】
異なるアプローチによって臍帯から細胞の集まりを単離する、他の試みを行った。ある場合には、臍帯をスライスし、成長培地で洗浄して、血餅およびゼラチン質の材料を取り除いた。血液、ゼラチン質の材料、および成長培地の混合物を収集し、１５０ｘｇで遠心分離した。ペレットを再懸濁し、成長培地において、ゼラチンコートフラスコ上に播種した。これらの実験から、容易に増殖した細胞集団を単離した。
【０２４８】
細胞はまた、ＮＤＲＩから入手した臍帯血サンプルからも単離された。使用した単離プロトコルは、Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．による国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００２／０２９９７１のものである。臍帯血のサンプル（それぞれ５０ｍＬおよび１０．５ｍＬ）（ＮＤＲＩ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  Ｐａ．）は、溶解緩衝液（ろ過滅菌された（ｆｉｌｔｅｒ−ｓｔｅｒｉｌｉｚｅｄ）１５５ミリモルの塩化アンモニウム、１０ミリモルの炭酸水素カリウム、０．１ミリモルのＥＤＴＡ、ｐＨ７．２に緩衝化（全成分はＳｉｇｍａ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．より）と混合された。細胞は、臍帯血と溶解緩衝液が１：２０の割合で溶解された。結果として得られた細胞懸濁液を５秒間ボルテックスし、周囲温度で２分間インキュベートした。可溶化液を遠心分離した（２００ｘｇで１０分間）。細胞ペレットは、１０％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ  ＵＴ）、４ミリモルのグルタミン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）、１００単位／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ．）を含有する完全最小基本培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  Ｃａ．）で再懸濁された。再懸濁した細胞を遠心分離し（２００ｘｇで１０分間）、上澄みを吸引し、細胞ペレットを完全培地中で洗浄した。細胞は、Ｔ７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｎ．Ｙ．）、Ｔ７５ラミニンコートフラスコ、またはＴ１７５フィブロネクチンコートフラスコ（２つともＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａ．）のいずれかに直接播種された。
【０２４９】
細胞集団が異なる条件下で単離し、単離直後にさまざまな条件下で増殖できるかどうかを判断するため、Ｃ：Ｄ：Ｈの酵素組み合わせを用いて、前記の手順に従って、０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）を含むかまたは含まない成長培地で、細胞を消化した。１００単位／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンの存在下で全ての細胞が成長した。全試験条件下で、細胞は、０代継代と１代継代との間で、十分に付着し増殖した（表１３−２）。５〜８および１３〜１６の条件での細胞は、播種後、細胞が低温保存される４回目の継代までは十分増殖したことが示された。
【０２５０】
Ｃ：Ｄ：Ｈの組み合わせは、単離後、最もよい細胞の収量を提供し、他の条件よりも多くの世代にわたって培養中に増殖した細胞を生成した（表１３−１）。増殖可能な細胞集団は、コラゲナーゼまたはヒアルロニダーゼ単独では、得られなかった。この結果が試験したコラゲナーゼに特異的なものであるかどうかを判断する試みは行っていない。
【表６】
0006095893.tif 000007
略語：＋＝良い、  ＋＋＝非常に良い、  ＋＋＋＝極めて良い、  Ｘ＝試験した条件下では成功せず
【０２５１】
細胞は、酵素消化および成長について試験した全条件下において、０代継代と１代継代との間で十分付着および増殖した。実験条件５〜８および１３〜１６の細胞は、低温保存される４回目の継代までは、播種後十分に増殖した。全ての細胞をさらなる分析のため、低温保存した。
【表７】
0006095893.tif 000008
【０２５２】
有核細胞が、急速に付着および成長した。これらの細胞は、フローサイトメトリーにより分析され、酵素消化により得られた細胞と同様であった。
【０２５３】
製剤は、赤血球および血小板を含有した。最初の３週間は、有核細胞は付着および分裂しなかった。培地は、播種後３週間で変えられ、付着および成長した細胞は観察されなかった。
【０２５４】
細胞集団は、酵素の組み合わせ、すなわちコラゲナーゼ（メタロプロテアーゼ）、ディスパーゼ（中性プロテアーゼ）およびヒアルロニダーゼ（ヒアルロン酸を分解する粘液溶解酵素）を用いて、効果的に臍組織から単離できた。コラゲナーゼと中性プロテアーゼとのブレンドであるＬＩＢＥＲＡＳＥも使用することができる。コラゲナーゼ（４Ｗｕｎｓｃｈ単位／ｇ）およびサーモリシン（１７１４カゼイン単位／ｇ）である、Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅ３もヒアルロニダーゼと共に使用されて、細胞を単離することができる。これらの細胞は、成長増殖培地においてゼラチンコートプラスチック上で培養されると、多くの継代にわたり容易に増殖した。
【０２５５】
細胞は、臍帯中の残りの血液からも単離されたが、臍帯血からは単離されなかった。使用した条件下で付着および成長した、組織から洗浄された血餅中の細胞の存在は、切開プロセス中に放出されている細胞によるものであろう。
【０２５６】
実施例１４
細胞の成長特性
臍帯組織由来細胞の細胞増殖能力を、他の単離された幹細胞集団と比較した。老化までの細胞増殖のプロセスは、ヘイフリックの限界と呼ばれる（Ｈａｙｆｌｉｃｋ、Ｌ、Ｊ．  Ａｍ．  Ｇｅｒｉａｔｒ．  Ｓｏｃ、１９７４；２２（１）：１−１２；Ｈａｙｆｌｉｃｋ、Ｌ、Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｉｓｔ、１９７４；１４（ｌ）：３７−４５）、１９７４）。
【０２５７】
組織培養プラスチックフラスコは、室温で、２０分間、２０ｍＬの２％（ｗ／ｖ）ゼラチン（タイプＢ：２２５  Ｂｌｏｏｍ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）をＴ７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．，  Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｎ．Ｙ．）に加えることによってコートされた。ゼラチン溶液の除去後、１０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ．）が加えられ、その後吸引された。
【０２５８】
成長増殖能力の比較のため、以下の細胞集団を使用した；ｉ）間葉幹細胞（ＭＳＣ；Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）；ｉｉ）脂肪由来細胞（米国特許第６，５５５，３７４Ｂ１；米国特許出願公開第ＵＳ２００４００５８４１２）；ｉｉｉ）正常な皮膚線維芽細胞（ｃｃ−２５０９  ロット＃  ９Ｆ０８４４；Ｃａｍｂｒｅｘ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）；および、ｉｖ）臍由来細胞。細胞は、最初に５，０００細胞／ｃｍ２で、ゼラチンコートＴ７５フラスコに成長培地において播種された。その後の継代では、細胞培養を以下のとおり処理した。トリプシン処理後、トリパンブルー染色の後で生存細胞をカウントした。細胞懸濁液（５０μＬ）を、トリパンブルー（５０μＬ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ  Ｍｏ）と混ぜ合わせた。生存細胞数は、血球計数器を用いて見積もった。
【０２５９】
カウントの後、細胞は、５，０００個の細胞／ｃｍ２で、ゼラチンコートＴ７５フラスコに、２５ｍＬの新鮮な成長培地中で播種された。細胞は、３７℃で、標準大気（５％（ｖ／ｖ）二酸化炭素）中で成長した。成長培地は、１週間に２回変えた。細胞が約８５％のコンフルエンスに達すると、細胞を継代した；このプロセスは、細胞が老化に達するまで繰り返された。
【０２６０】
各継代で、細胞をトリプシン処理してカウントした。生存細胞収量、集団倍加［ｌｎ（最終の細胞／最初の細胞）／ｌｎ２］、および倍加時間（培養中の時間／集団倍加）を計算した。最適な細胞増殖を決定する目的で、継代当たりの総細胞収量が、各継代の増殖因子に、前の継代の総収量を掛け合わせることにより、決定された（すなわち、増殖因子＝最終的な細胞／最初の細胞）。
【０２６１】
１０代継代で保存された（ｂａｎｋｅｄ）の細胞の増殖能力も試験した。異なる１組の条件を使用した。正常な皮膚の線維芽細胞（ｃｃ−２５０９  ロット＃９Ｆ０８４４；  Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ）および臍由来細胞を試験した。これらの細胞集団は、その前に１０代継代で保存されており、各継代５，０００個の細胞／ｃｍ２で、その時点まで培養されていた。１０代継代での細胞解凍後の細胞集団に対する細胞密度の影響を決定した。細胞は、標準条件下で解凍され、トリパンブルー染色を用いてカウントされた。解凍した細胞は次に、成長培地中、１，０００個の細胞／ｃｍ２で播種された。細胞は、３７℃で、通常の大気条件下で成長した。成長培地は１週間に２回変えられた。細胞は、約８５％コンフルエンスに達すると、継代された。細胞は、その後、老化まで、すなわち、それ以上増殖できなくなるまで、継代された。細胞は、各継代で、トリプシン処理されカウントされた。細胞収量、集団倍加（ｌｎ（最終的な細胞／最初の細胞）／ｌｎ２）、および倍加時間（培養中時間）／集団倍加）を計算した。継代当たりの総細胞収量は、各継代の増殖因子に、その前の継代の総収量を掛け合わせることにより決定された（すなわち、増殖因子＝最終的な細胞／最初の細胞）。
【０２６２】
低細胞播種条件下での、新たに単離された臍帯組織由来細胞培養物の増殖能力を、別の実験で試験した。臍由来細胞は、実施例１２で述べたように単離された。細胞は、１，０００個の細胞／ｃｍ２で播種され、老化するまで前記のように継代された。細胞は、３７℃で、標準的な大気条件下で成長した。成長培地は、１週間に２回変えられた。細胞は、約８５％コンフルエンスに達すると、継代された。各継代で、細胞をトリプシン処理してトリパンブルー染色によりカウントした。細胞収量、集団倍加（ｌｎ（最終的な細胞／最初の細胞）／ｌｎ２）、および倍加時間（培養中の時間／集団倍加）を、各継代について計算した。継代当たりの総細胞収量は、各継代の増殖因子と、先の継代の総収量を掛け合わせることにより決定された（すなわち、増殖因子＝最終的な細胞／最初の細胞）。細胞は、ゼラチンコートフラスコ、および非ゼラチンコートフラスコで成長した。
【０２６３】
低Ｏ２細胞培養条件が、ある場合には、細胞増殖を改善することが証明されている（米国特許出願公開第ＵＳ２００４０００５７０４）。ＵＴＣの細胞増殖が、細胞培養条件を変えることにより改善され得るかどうかを決定するため、臍由来細胞の培養物を低酸素条件で成長させた。細胞を、ゼラチンコートフラスコにおいて成長培地中に５，０００細胞／ｃｍ２で播種した。細胞は、最初は、５代継代にわたり標準的な大気条件下で培養され、５代継代の時点で、低酸素（５％Ｏ２）培養条件に移された。
【０２６４】
他の実験では、細胞は、コート無しプレート、コラーゲンコートプレート、フィブロネクチンコートプレート、ラミニンコートプレート、およびマトリゲルコートプレート上で増殖された。培養物は、これらの異なるマトリックス上で十分増殖することが示された。
【０２６５】
臍由来細胞は、４０継代超にわたり増殖し、６０日で＞１ｘ１０１７個の細胞の細胞収量を生成した。それとは対照的に、ＭＳＣおよび線維芽細胞は、＜２５日後、および＜６０日後にそれぞれ老化した。脂肪由来細胞および網細胞は双方、ほぼ６０日にわたり増殖したが、、これらは、４．５ｘ１０１２個のおよび４．２４ｘ１０１３個のの総細胞収量をそれぞれ生成した。したがって、使用した実験条件下で、５，０００個細胞／ｃｍ２で播種されると、臍由来細胞は、同じ条件下で成長した他の細胞型よりも、はるかによく増殖した（表１４−１）。
【表８】
0006095893.tif 000009
【０２６６】
臍由来細胞および線維芽細胞は、１０継代超にわたり増殖し、６０日で＞１ｘ１０１１個の細胞の細胞収量を生成した（表１４−２）。これらの条件下で６０日たった後、線維芽細胞は、老化したが、臍由来細胞集団は、８０日後に老化し、＞４０集団倍加を完了した。
【表９】
0006095893.tif 000010
【０２６７】
細胞は低酸素条件下で十分に増殖するが、低酸素条件下での培養は、臍帯組織由来細胞の細胞増殖に対してはあまり効果がないようである。標準的大気条件は、十分な数の細胞を成長させるのにうまくいくことが既に証明されており、低酸素培養は、臍帯組織由来細胞の成長には必要でない。
【０２６８】
標準的な大気中酸素の下、約５，０００個の細胞／ｃｍ２密度で、成長培地中で、ゼラチンコートされるかまたはコートされないフラスコ上で、単離された臍帯組織由来細胞を成長させる現在の細胞増殖条件は、多数の細胞を１１代継代で生成するのに十分である。さらに、データは、細胞が低密度培養条件（例えば、１，０００個細胞／ｃｍ２）で容易に増殖し得ることを示唆している。低酸素条件における臍帯組織由来細胞増殖も、細胞増殖を促進するが、細胞増殖能力の漸進的改善は、これらの成長条件を使用した場合に、観察されていない。現在、標準的な大気条件下で臍帯組織由来細胞を培養することが、細胞の大きな集まりを生成するのに好ましい。しかしながら、培養条件を変えた場合、臍帯組織由来細胞増殖は同様に変えられることができる。このストラテジーを用いて、これらの細胞集団の増殖および分化能力を高めることができる。
【０２６９】
利用した条件下で、ＭＳＣおよび脂肪由来細胞の増殖能力は限られているが、ＵＴＣは、容易に多くの数まで増殖した。
【０２７０】
実施例１５
Ｄ‐バリン含有培地での細胞成長
通常のＬ−バリンアイソフォームの代わりにＤ−バリンを含有する培地を用いて、培養中の線維芽細胞様細胞の成長を選択的に抑制できることが報告されている（Ｈｏｎｇｐａｉｓａｎ  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔ．，２０００；２４：１−７；Ｓｏｒｄｉｌｌｏ  ＬＭ，ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔ  Ｒｅｐ．，１９８８；１２：３５５−６４）。実験を行って、臍帯組織由来細胞が、Ｄ−バリンを含有する培地で成長できるかどうか判断した。
【０２７１】
臍由来細胞（Ｐ５）および線維芽細胞（Ｐ９）を、５，０００個細胞／ｃｍ２で、ゼラチンコートＴ７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｎ．Ｙ．）において播種した。２４時間後、培地を取り除き、細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ．）で洗浄して、残りの培地を取り除いた。培地は、修飾成長培地（Ｄ−バリンを含むＤＭＥＭ（特注品  Ｇｉｂｃｏ）、１５％（ｖ／ｖ）透析ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、０．００１％（ｖ／ｖ）βメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、５０単位／ｍＬのペニシリン、および５０ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ））と取り替えられた。
【０２７２】
Ｄ−バリン含有培地に播種された臍由来細胞および線維芽細胞は、透析血清を含有する成長培地に播種された細胞と異なり、増殖しなかった。線維芽細胞は形態学的に変化し、サイズが大きくなり、形状が変わった。細胞は全て死滅し、最終的には、４週間後にフラスコ表面から離れた。したがって、臍帯組織由来細胞は、細胞成長のため、および長期間の生存を維持するために、Ｌ−バリンを必要とすると結論付けることができる。Ｌ−バリンは、好ましくは、臍帯組織由来細胞については成長培地から取り除かれない。
【０２７３】
実施例１６
細胞の核型分析
細胞療法に使用される細胞株は、好ましくは、同種であり、汚染細胞型を含まない。細胞療法に使用されるヒト細胞は、正常な構造を有する、正常な数（４６個）の染色体を有していなければならない。同種であり、分娩後組織由来でない細胞を含まない、臍帯組織由来細胞株を識別するため、細胞サンプルの核型を分析した。
【０２７４】
オスの新生仔（ｍａｌｅ  ｎｅｏｎａｔｅ）の分娩後組織からの臍帯由来組織細胞を成長培地で培養した。オスの新生仔からの臍帯組織（Ｘ、Ｙ）は、新生児由来細胞と母系由来細胞（Ｘ、Ｘ）との間で識別を行うように選択された。細胞は、１平方センチ当たり５，０００個の細胞で、Ｔ２５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｎ．Ｙ）中、成長培地において播種され、８０％コンフルエンスまで増殖された。細胞を含有するＴ２５フラスコは、ネック部分まで成長培地を入れられた。サンプルは、臨床組織遺伝学研究所までクーリエにより送達された  （研究所間の輸送時間は１時間と予測される）。染色体分析は、ニュージャージー州ニューアークのＮｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＳｃｈｏｏｌにあるＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓにより行われた。細胞は、染色体が最もよく見える分裂中期の間に分析された。カウントされた分裂中期の２０個の細胞のうち、５個が、正常な同種核型数（２）について分析された。細胞サンプルは、２つの核型が観察された場合に同種であると特徴付けられた。細胞サンプルは、３つ以上の核型が観察された場合に異種であると特徴付けられた。異種性の核型数（４）が識別されると、追加の分裂中期細胞をカウントし、分析した。
【０２７５】
染色体分析に送られた全細胞サンプルは、細胞遺伝学研究室のスタッフによって、正常外見を呈していると解釈された。分析された１６の細胞株のうち３つが、異種性の表現型（ＸＸおよびＸＹ）を表し、これは、新生児由来および母系由来の双方に由来する細胞が存在することを示している。細胞サンプルはそれぞれ、同種であると特徴付けられた（表１５−１）。
【表１０】
0006095893.tif 000011
略語：Ｎ：新生児相；  Ｖ：絨毛領域；  Ｍ：母系相；  Ｃ：クローン
【０２７６】
染色体分析は、臨床細胞遺伝学研究室により解釈されたように、核型が正常である臍由来ＵＴＣを識別した。核型分析はまた、同種核型により判断される、母系性細胞を含まない細胞株も識別した。
【０２７７】
実施例１７
細胞表面マーカーのフローサイトメトリー評価  
フローサイトメトリーによる細胞表面タンパク質または「マーカー」の特徴づけを用いて、細胞株の同一性を判断することができる。発現の一貫性は、複数のドナーから、異なる処理および培養条件にさらされた細胞において、判断され得る。臍から単離された細胞株は、（フローサイトメトリーにより）特徴付けられ、これらの細胞株の同定のプロファイルを与えた。
【０２７８】
細胞は、ペニシリン／ストレプトマイシンで、成長培地（Ｇｉｂｃｏ  Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ．）において培養された。細胞は、プラズマ処理されたＴ７５、Ｔ１５０、およびＴ２２５組織培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｎ．Ｙ．）中、コンフルエントまで培養された。フラスコの成長表面は、２％（ｗ／ｖ）ゼラチン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉ，Ｍｏ．）を２０分間室温でインキュベートすることにより、ゼラチンによりコートされた。
【０２７９】
フラスコ中の付着細胞を、ＰＢＳで洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡで分離した。細胞を回収し、遠心分離し、ＰＢＳ中の３％（ｖ／ｖ）ＦＢＳで、１ｘ１０７／ｍＬの細胞濃度で再懸濁した。製造業者の仕様書に従って、目的の細胞表面マーカーに対する抗体（以下参照）が、１００μＬの細胞懸濁液に加えられ、混合物が、３０分間４℃で暗所においてインキュベートされた。インキュベーション後、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、遠心分離して、非結合抗体を除去した。細胞を、５００μＬのＰＢＳ中に再懸濁して、フローサイトメトリーにより分析した。フローサイトメトリー分析は、ＦＡＣＳ  ｃａｌｉｂｕｒ器具（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａ．）を用いて行った。
【０２８０】
細胞表面マーカーに対する以下の抗体を使用した。
【表１１】
0006095893.tif 000012
【０２８１】
臍帯細胞は、８代継代、１５代継代、および２０代継代で分析された。
【０２８２】
ドナー間の差異を比較するため、異なるドナー由来の臍帯由来細胞を互いに比較した。
【０２８３】
ゼラチンコートフラスコで培養された臍帯由来細胞が、非コートフラスコで培養された臍帯由来細胞と比較された。
【０２８４】
細胞の単離および準備に使用される４つの処理を比較した。１）コラゲナーゼ；２）コラゲナーゼ／ディスパーゼ；３）コラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ；４）コラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ／ディスパーゼでの処理による、分娩後組織由来の細胞を比較した。
【０２８５】
フローサイトメトリーで分析した、８代継代、１５代継代、および２０代継代における臍帯由来細胞は全て、ＩｇＧ対照に対する蛍光の増大で示される、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−αおよびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃを発現した。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱに対して陰性であり、これは、ＩｇＧ対照と一致する蛍光値により示される。
【０２８６】
フローサイトメトリーにより分析された別個のドナーから単離された臍帯由来細胞はそれぞれ、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの産生に対して陽性を示し、これは、ＩｇＧ対照に対する蛍光値の増大に反映される。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの産生に対して陰性であり、蛍光値はＩｇＧ対照と一致した。
【０２８７】
フローサイトメトリーにより分析された、ゼラチンコートフラスコおよび非コートフラスコで増殖した臍帯由来細胞は全て、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの産生に対して陽性であり、ＩｇＧ対照に対する蛍光値は増大した。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの産生に対して陰性であり、蛍光値はＩｇＧ対照と一致した。
【０２８８】
フローサイトメトリーによる臍帯由来細胞分析は、これらの細胞株の同一性を証明した。これらの臍帯由来分娩後細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃに対して陽性であり、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱに対して陰性である。この同一性は、ドナー、継代、培養容器表面コーティング、消化酵素および胎盤層を含む変数の変動間で一致していた。個々の蛍光値のヒストグラム曲線平均および範囲におけるいくらかの変動が観察されたが、試験した全条件下での全ての正の曲線（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｕｒｖｅｓ）は、正常であり、ＩｇＧ対照より大きな蛍光値を発現したため、細胞は、マーカーの陽性発現を有する同種集団を含むことが、確認される。
【０２８９】
実施例１８
オリゴヌクレオチドアレイによる細胞の分析  
オリゴヌクレオチドアレイを使用して、臍由来細胞および胎盤由来細胞の遺伝子発現プロファイルを、線維芽細胞、ヒト間葉系幹細胞、およびヒト骨髄由来の別の細胞株と比較した。この分析により、分娩後由来細胞の特徴付けがもたらされ、これらの細胞に対する独自の分子マーカーが識別された。
【０２９０】
ヒト臍帯および胎盤が、患者の同意を得て、正常満期分娩から、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ  （ＮＤＲＩ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．）によって入手された。組織を受け取り、Ｃ：Ｄ：Ｈ混合物による消化後、実施例１３に記載するように細胞を単離した。細胞は、成長培地において、ゼラチンコートプラスチック組織培養フラスコ上で培養された。培養物は、３７℃、５％のＣＯ２でインキュベートされた。
【０２９１】
ヒトの皮膚の線維芽細胞を、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ；ロット番号９Ｆ０８４４）およびＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５０１（ＣＣＤ３９ＳＫ）から購入した。いずれの株も、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、およびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ．）で培養した。細胞は、標準の組織処理プラスチック上で成長した。
【０２９２】
ｈＭＳＣｓを、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ；ロット番号２Ｆ１６５５，２Ｆ１６５６および２Ｆ１６５７）から購入し、製造業者の仕様書に従って、ＭＳＣＧＭ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）で培養した。細胞は、標準の組織培養プラスチック上で３７℃、５％ＣＯ２で成長した。
【０２９３】
ヒト腸骨稜骨髄は、患者の同意を得てＮＤＲＩから受け取った。骨髄を、Ｈｏ，  ｅｔ  ａｌにより概説された方法に従って処理した（ＷＯ０３／０２５１４９）。骨髄は、溶解緩衝液（１５５ｍＭのＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭのＫＨＣＯ３、および０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）と、１部の骨髄：２０部の溶解緩衝液の割合で混合された。細胞懸濁液は、ボルテックスされ、周囲温度で２分間インキュベートされ、５００ｘｇで１０分間遠心分離された。上澄みを廃棄し、細胞ペレットを、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清および４ｍＭのグルタミンを補充された、最小基本培地−α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で再懸濁した。細胞をもう一度遠心分離し、細胞ペレットを、新鮮培地で再懸濁した。生存単核細胞は、トリパンブルー排除（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）を使用してカウントした。単核細胞は、プラスチック組織培養フラスコ中、５ｘ１０４個の細胞／ｃｍ２で播種された。細胞は、３７℃、５％ＣＯ２で、標準の周囲Ｏ２もしくは５％Ｏ２で、インキュベートされた。細胞は、培地を変えずに５日間培養された。培地および非付着細胞を、培養から５日後に除去した。付着細胞は、培養物中に維持された。
【０２９４】
細胞の、活発に成長する培養物は、冷たいリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、細胞スクレーパーによりフラスコから除去された。細胞を、３００ｘｇで５分間遠心分離した。上澄みを除去し、細胞を新鮮なＰＢＳ中に再懸濁し、再び遠心分離した。上澄みを除去し、細胞ペレットをすぐに冷凍し、−８０℃で保管した。細胞ｍＲＮＡが抽出され、ｃＤＮＡに転写された。ｃＤＮＡは次に、ｃＲＮＡに転写され、ビオチン標識された。ビオチン標識ｃＲＮＡは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧＥＮＥＣＨＩＰ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａオリゴヌクレオチドアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，Ｃａ．）によりハイブリダイズされた。ハイブリダイゼーションおよびデータ収集を、製造業者の仕様書に従って行った。ハイブリダイゼーションおよびデータ収集を、製造業者の仕様書に従って行った。データ分析が、「Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ」（ＳＡＭ）バージョン１．２１コンピューターソフトウェア（Ｔｕｓｈｅｒ，  Ｖ．Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  ＳｃＬ  ＵＳＡ  ９８：５１１６−５１２１）を用いて行われた。
【０２９５】
１４個の異なる細胞集団を、この研究では分析した。継代情報、培養基質、および培養培地と共に細胞を表１８−１に挙げる。
【表１２】
0006095893.tif 000013
【０２９６】
データは、前記のようにＳＡＭソフトウェアで、主要成分分析によって評価された。分析により、試験した細胞において異なる相対量で発現した２９０個の遺伝子が明らかになった。この分析により、集団間の相対比較がもたらされた。
【０２９７】
表１８−２は、細胞対の比較のために計算されたユークリッド距離を示す。ユークリッド距離は、細胞型間で差次的に発現した２９０個の遺伝子に基づいた細胞の比較に基づいていた。ユークリッド距離は、２９０個の遺伝子の発現間の類似性に反比例している。
【表１３】
0006095893.tif 000014
【０２９８】
表１８−３、１８−４、および１８−５は、臍組織由来細胞で増加した遺伝子の発現（表１８−３）、胎盤由来細胞で増加した遺伝子の発現（表１８−４）、臍および胎盤由来細胞で減少した遺伝子の発現（表１８−５）を示す。
【表１４】
0006095893.tif 000015
【表１５】
0006095893.tif 000016
【表１６−１】
0006095893.tif 000017
【表１６−２】
0006095893.tif 000018
【表１６−３】
0006095893.tif 000019
【０２９９】
表１８−６、１８−７、および１８−８は、ヒト線維芽細胞（表１８−６）、ＩＣＢＭ細胞（表１８−７）、およびＭＳＣ（表１８−８）で増加した遺伝子の発現を示す。
【表１７】
0006095893.tif 000020
【表１８】
0006095893.tif 000021
【表１９】
0006095893.tif 000022
【０３００】
本実施例は、臍帯および胎盤由来の細胞の分子の特徴づけをもたらすために実行された。この分析は、３つの異なる臍帯および３つの異なる胎盤由来の細胞を含んだ。研究はまた、２つの異なる皮膚線維芽細胞株、３つの間葉系幹細胞株、および３つの腸骨稜骨髄細胞株も含んだ。これらの細胞により発現されたｍＲＮＡは、オリゴヌクレオチドプローブを含むＧＥＮＥＣＨＩＰオリゴヌクレオチドアレイにおいて、２２，０００個の遺伝子について分析された。
【０３０１】
分析により、２９０個の遺伝子の転写物が、これらの５つの異なる細胞型に、異なる量で存在することが明らかになった。これらの遺伝子は、臍組織由来細胞で特に増加した７個の遺伝子、および胎盤由来細胞で特に増加した１０個の遺伝子を含む。５４個の遺伝子が、胎盤由来細胞および臍帯由来細胞において特に低い発現レベルを有することが分かった。
【０３０２】
選択された遺伝子の発現は、実施例１８に示すように、ＰＣＲで確認された。一般的には、分娩後由来細胞、詳細には臍由来細胞は、例えば、ここで試験した骨髄由来細胞および線維芽細胞などの、他のヒト細胞と比較すると、別個の遺伝子発現プロファイルを有する。
【０３０３】
実施例１９
臍帯組織由来細胞の細胞マーカー
臍帯由来の細胞の遺伝子発現プロファイルが、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧＥＮＥＣＨＩＰを用いて、他の供給源由来の細胞のものと比較された。６つの「シグネチャー（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）」遺伝子が識別された、すなわち、酸化ＬＤＬレセプター１（oxidized LDL receptor 1）、インターロイキン−８（interleukin-8）（ＩＬ−８）、レニン（renin）、レティキュロン（reticulon）、ケモカインレセプターリガンド３（chemokine receptor ligand 3）（ＣＸＣリガンド３（CXC ligand 3））、および顆粒球走化性タンパク質２（granulocyte chemotactic protein 2）（ＧＣＰ−２）である。これらの「シグネチャー」遺伝子は、臍由来細胞において比較的高いレベルで発現した。
【０３０４】
この実施例で説明される手順は、マイクロアレイデータを確認し、遺伝子およびタンパク質の発現についてデータを比較するため、ならびに、臍帯組織由来細胞について独自の識別子を検出する一連の確実なアッセイを確立するために、実行された。
【０３０５】
臍由来細胞（４つの分離物（ｉｓｏｌａｔｅｓ））、および正常なヒトの皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ；新生児および成体）を、ゼラチンコートＴ７５フラスコで、成長培地において成長させた。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が、間葉系幹細胞成長培地Ｂｕｌｌｅｔキット（ＭＳＣＧＭ；  Ｃａｍｂｒｅｘ，  Ｗａｌｋｅｒｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）で成長した。
【０３０６】
ＩＬ−８実験について、細胞が、液体窒素から解凍され、ゼラチンコートフラスコに、５，０００個の細胞／ｃｍ２で蒔かれ、成長培地で４８時間成長し、１０ｍＬの血清飢餓培地［ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ）、ペニシリン（５０単位／ｍＬ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ）（Ｇｉｂｃｏ）、および０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）］で８時間さらに成長した。ＲＮＡを次に抽出し、上澄みを、１５０ｘｇで５分間、遠心分離して、細胞の残骸を除去した。上澄みを、ＥＬＩＳＡ分析まで−８０℃で凍らせた。
【０３０７】
臍帯組織由来細胞、ならびに、ヒト新生児包皮由来のヒト線維芽細胞を、ゼラチンコートＴ７５フラスコにおいて、成長培地で培養した。細胞は、液体窒素中で、１１代継代において凍らせた。細胞を解凍し、１５ｍＬ遠心分離チューブに移した。１５０ｘｇで５分間の遠心分離の後、上澄みを捨てた。細胞を、４ｍＬの培養培地中に再懸濁し、カウントした。細胞は、１５ｍＬの成長培地を含む７５ｃｍ２フラスコにおいて、３７５，０００個の細胞／フラスコで２４時間、成長した。培地は、８時間かけて血清飢餓培地に変えた。血清飢餓培地は、インキュベーションの最後に収集され、１４，０００ｘｇで５分間遠心分離された（そして−２０℃で保管された）。
【０３０８】
各フラスコ内の細胞数を見積もるため、２ｍＬのトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ．）を各フラスコに加えた。細胞がフラスコから離れた後、トリプシン活性が、８ｍＬの成長培地で中和された。細胞を、１５ｍＬ遠心分離チューブに移し、１５０ｘｇで５分間、遠心分離した。上澄みを除去し、１ｍＬの成長培地を各チューブに加えて、細胞を再懸濁させた。細胞の数は、血球計数器により判断された。
【０３０９】
細胞が血清飢餓培地中に分泌したＩＬ−８の量は、ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｎ．）を使用して分析された。全てのアッセイは、製造業者が提供する説明書に従って行われた。
【０３１０】
ＲＮＡを、コンフルエントの臍帯由来細胞および線維芽細胞から、またはＩＬ−８発現のため、前記のとおり処理された細胞から、抽出した。細胞は、製造業者の説明書（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａ．）に従って、βメルカプトエタノールを含有する、３５０μＬの緩衝液ＲＬＴ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）で溶解した。ＲＮＡは、製造業者の説明書（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａ．）に従って抽出され、デオキシリボヌクレアーゼ処理にかけられた（２．７単位／サンプル）（Ｓｉｇｍａ  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）。ＲＮＡは、５０μＬのＤＥＰＣ処理水により溶出し、−８０℃で保管された。ＲＮＡはまた、ヒト臍帯からも抽出された。組織（３０ｍｇ）は、βメルカプトエタノールを含有する７００μＬの緩衝液ＲＬＴ中に懸濁された。製造業者の仕様書に従って、サンプルを機械的に均質化し、ＲＮＡ抽出を進めた。ＲＮＡは、５０μＬのＤＥＰＣ処理水で抽出され、−８０℃で保管された。
【０３１１】
ＲＮＡは、ＴａｑＭａｎ逆転写試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）と共にランダムヘキサマーを使用して、２５℃で１０分間、３７℃で６０分間、９５℃で１０分間、逆転写された。サンプルを−２０℃で保管した。
【０３１２】
ｃＤＮＡマイクロアレイによって、臍帯細胞で特異的に調節されたとして識別された遺伝子（シグネチャー遺伝子‐酸化ＬＤＬレセプター、インターロイキン−８、レニン、およびレティキュロンを含む）は、リアルタイムＰＣＲおよび従来のＰＣＲを使用して、さらに調べられた。
【０３１３】
ＰＣＲは、商品名Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）遺伝子発現産物として販売される遺伝子発現産物を用いて、ｃＤＮＡサンプルに対して行われた。酸化ＬＤＬレセプター（Ｈｓ００２３４０２８）；レニン（ＨｓＯＯ１６６９１５）；レティキュロン（Ｈｓ００３８２５１５）；ＣＸＣリガンド３（Ｈｓ００１７１０６１）；ＧＣＰ−２（Ｈｓ００６０５７４２）；ＩＬ−８（Ｈｓ００１７４１０３）；およびＧＡＰＤＨが、  ７０００配列検出システムをＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７０００  ＳＤＳソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に使用して、製造業者の説明書（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従って、ｃＤＮＡおよびＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲマスターミックスと混合された。熱サイクル条件は、最初は、５０℃で２分間、および９５℃で１０分間で、その後、９５℃で１５秒間、および６０℃で１分間の４０サイクルが続いた。ＰＣＲデータは、製造業者の仕様書（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍについてＡｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＵｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＃２）に従って分析された。
【０３１４】
従来のＰＣＲは、リアルタイムＰＣＲからの結果を確認するため、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａ．）を用いて行われた。ＰＣＲは、２μＬのｃＤＮＡ溶液（１ｘＴａｑポリメラーゼ（商品名：ＡＭＰＬＩＴＡＱ  ＧＯＬＤ）ユニバーサルミックスＰＣＲ反応緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および初期変性を使用して、９４℃で５分間行われた。増幅が、各プライマーセットについて最適化された。ＩＬ−８、ＣＸＣリガンド３、およびレティキュロン（９４℃で１５秒間、５５℃で１５秒間、および７２℃で３０秒を３０サイクル）；レニン（９４℃で１５秒間、５３℃で１５秒間、および７２℃で３０秒間を３８サイクル）；酸化ＬＤＬレセプターおよびＧＡＰＤＨ（９４℃で１５秒間、５５℃で１５秒間、および７２℃で３０秒間を３３サイクル）。増幅に使用したプライマーを表１９−１に挙げる。最終ＰＣＲ反応におけるプライマー濃度は１マイクロモルであったが、これは、０．５マイクロモルであったＧＡＰＤＨを除く。ＧＡＰＤＨプライマーは、製造業者のＴａｑＭａｎプローブが最終ＰＣＲ反応に加えられなかったことを除けば、リアルタイムＰＣＲと同じであった。サンプルは、２％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上で分離され、臭化エチジウム（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）で染色された。画像が、単焦点ＰＯＬＡＲＯＩＤカメラ（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，Ｎ．Ｊ．）を使用して、６６７フィルム（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｔｗｉｎｐａｃｋ，ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，Ｎ．Ｊ．）に取り込まれた。
【表２０】
0006095893.tif 000023
Ｓ＝センス、Ａ＝アンチセンス
【０３１５】
臍帯由来細胞が、４％（ｗ／ｖ）の冷パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で１０分間、室温にて固定された。０代継代（Ｐ０）（単離直後）および１１代継代（Ｐ１１）における臍帯由来細胞のそれぞれ１つの単離物（臍帯由来細胞の２つの単離物）、ならびに線維芽細胞（Ｐ１１）の単離物を使用した。免疫細胞化学は、以下のエピトープに対する抗体を用いて行った。エピトープは、ビメンチン（１：５００，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、デスミン（１：１５０；Ｓｉｇｍａ−  ウサギに対して産生；または１：３００；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ−  マウスに対して産生）、α平滑筋アクチン（ＳＭＡ；１：４００；Ｓｉｇｍａ）、サイトケラチン１８（ＣＫ１８；１：４００；Ｓｉｇｍａ）、フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ；１：２００；Ｓｉｇｍａ），およびＣＤ３４（ヒトＣＤ３４クラスＩＩＩ；１：１００；ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，  Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，  ＣＡ）である。さらに、以下のマーカーを、１１代継代臍帯由来細胞に対して試験した：抗−ヒトＧＲＯα−ＰＥ（１：１００；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）、抗−ヒトＧＣＰ−２（１：１００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、抗−ヒト酸化ＬＤＬレセプター１（ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１；１：１００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、および抗−ヒトＮＯＧＡ−Ａ（１：１００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈ）。
【０３１６】
培養物を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）、および０．３％（ｖ／ｖ）トリトン（トリトンＸ−１００；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含むタンパク質遮断溶液に３０分間さらして、細胞内抗原にアクセスした。目的のエピトープ（ＣＤ３４，  ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１）が細胞表面に位置する場合、トリトンＸ−１００は、エピトープ損失を防ぐために手順の全工程で省略した。さらに、一次抗体がヤギに対して産生された場合（ＧＣＰ−２，ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１，ＮＯＧＯ−Ａ）、３％（ｖ／ｖ）のロバ血清をプロセス全体にわたって、ヤギ血清の代わりに使用した。遮断溶液中で希釈された一次抗体を次に、１時間にわたり室温で培養物に加えた。一次抗体溶液を除去し、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（１：２５０；  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）および／またはヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  ４８８（１：２５０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）またはロバ抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１：１５０，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）と共に遮断溶液（ｂｌｏｃｋ）を含む二次抗体溶液（室温で１時間）を加える前に、培養物をＰＢＳで洗浄した。培養物をその後洗浄し、１０マイクロモルのＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を１０分間適用して、細胞核を可視化する。
【０３１７】
免疫染色後、Ｏｌｙｍｐｕｓ倒立落射蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，Ｎ．Ｙ．）上で適切な蛍光フィルターを用いて、蛍光を可視化した。すべての場合において、陽性染色は、一次抗体溶液を適用したことを除いて前記に概説した手順全体に従った場合、対照染色を超えて蛍光信号を表した（１°対照なし）。代表的な画像が、デジタルカラービデオカメラ、およびＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａ．）を用いて取り込まれた。三重染色（ｔｒｉｐｌｅ−ｓｔａｉｎｅｄ）サンプルでは、各画像は、１回にただ１つの放出フィルターを使用して撮られた。層をなすモンタージュが次に、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ソフトウェア（Ａｄｏｂｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａ．）を用いて準備された。
【０３１８】
フラスコ中の付着細胞が、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で洗浄され、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）により分離された。細胞を回収し、遠心分離し、１ｘ１０７／ｍＬの細胞濃度で、ＰＢＳ中３％（ｖ／ｖ）ＦＢＳで再懸濁させた。１００μＬのアリコートを円錐チューブへ送った。細胞内抗原について染色された細胞は、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で透過処理された。製造業者の仕様書のとおり、抗体を、アリコートに加え、細胞を、暗所で３０分間、４℃でインキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離して、余分な抗体を除去した。二次抗体を必要とする細胞を、１００μＬの３％ＦＢＳで再懸濁した。二次抗体を、製造業者の仕様書に従って加え、細胞を、暗所で３０分間、４℃でインキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離して、余分な二次抗体を除去した。洗浄した細胞を、０．５ｍＬのＰＢＳで再懸濁し、フローサイトメトリーにより分析した。以下の抗体を使用した：酸化ＬＤＬレセプター１（ｓｃ−５８１３；  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＧＲＯａ（５５５０４２；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）、マウスＩｇＧ１κ（Ｐ−４６８５およびＭ−５２８４；Ｓｉｇｍａ）、ならびにロバ抗ヤギＩｇＧ（ｓｃ−３７４３；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈ．）。フローサイトメトリー分析が、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）によって行われた。
【０３１９】
ヒト臍帯由来の細胞、成体および新生児線維芽細胞、ならびに間葉系幹細胞（ＭＳＣ）からのｃＤＮＡに対して行われた、選択された「シグネチャー」遺伝子に関するリアルタイムＰＣＲの結果は、レティキュロンおよび酸化ＬＤＬレセプター双方の発現が、臍由来細胞の方が、その他の細胞に比べて高かったことを示している。リアルタイムＰＣＲから得られたデータは、ΔΔＣＴ方法によって分析され、対数尺度で表示された。分娩後細胞と対照との間では、ＣＸＣリガンド３およびＧＣＰ−２の発現レベルに有意な差は見られなかった。リアルタイムＰＣＲの結果が、従来のＰＣＲにより確認された。ＰＣＲ産物の配列決定が、これらの観察をさらに確認した。表１９‐１に挙げた従来のＰＣＲ  ＣＸＣリガンド３プライマーを使用して、分娩後細胞と対照との間で、ＣＸＣリガンド３の発現レベルに有意差は見られなかった。
【０３２０】
臍帯組織由来細胞におけるサイトカイン、ＩＬ−８の発現は、成長培地で培養した臍帯組織由来細胞、および血清が欠乏した臍帯由来細胞の双方で、上昇した。リアルタイムＰＣＲデータ全てが、従来のＰＣＲで、またＰＣＲ産物を配列決定することによって、有効であった。
【０３２１】
無血清培地で成長した後、馴化培地が、ＩＬ−８の存在について調べられた。最も多い量のＩＬ−８が、臍細胞が成長した培地で検出された（表１９−２）。ヒトの皮膚線維芽細胞が成長した培地では、ＩＬ−８が検出されなかった。
【表２１】
0006095893.tif 000024
【０３２２】
０代継代でのヒト臍帯由来の細胞が、免疫細胞化学的分析によって、選択されたタンパク質の産生について調べられた。単離（０代継代）直後、細胞は、４％パラホルムアルデヒドで固定され、６個のタンパク質の抗体に曝露された。それらのタンパク質とは、フォン・ヴィルブランド因子、ＣＤ３４、サイトケラチン１８、デスミン、α−平滑筋アクチン、およびビメンチンである。臍帯由来細胞は、α−平滑筋アクチンおよびビメンチンに対して陽性であり、染色パターンは、１１代継代にわたり一貫していた。
【０３２３】
１１代継代での臍帯由来細胞におけるＧＲＯα、ＧＣＰ−２、酸化ＬＤＬレセプター１およびレティキュロン（ＮＯＧＯ−Ａ）の産生を、免疫細胞化学により調べた。臍帯由来細胞は、ＧＣＰ−２陽性であったが、ＧＲＯαの産生は、この方法では検出されなかった。さらに、細胞は、ＮＯＧＯ−Ａ陽性であった。
【０３２４】
マイクロアレイおよびＰＣＲ（リアルタイムおよび従来のもの）により測定された遺伝子発現レベル間の一致が、４つの遺伝子：酸化ＬＤＬレセプター１、レニン、レティキュロン、およびＩＬ−８について証明された。これらの遺伝子の発現は、臍帯由来細胞において、ｍＲＮＡレベルで差次的に調節され、ＩＬ−８も、タンパク質レベルで差次的に調節された。ＧＣＰ−２およびＣＸＣリガンド３の差次的発現は、ｍＲＮＡレベルでは確認されなかった。この結果は、マイクロアレイ実験からもともと入手されたデータを支持するものではないが、これは、方法の感受性における違いによるものであろう。
【０３２５】
０代継代でのヒト臍帯由来の細胞が、α−平滑筋アクチンおよびビメンチンの発現について調べられ、この双方について陽性であった。染色パターンは、１１代継代にわたり保たれた。
【０３２６】
結論として、完全なｍＲＮＡデータは、マイクロアレイ実験から入手したデータを、少なくとも部分的に検証した。
【０３２７】
実施例２０
細胞表現型の免疫組織化学的特徴付け
ヒト臍帯内で発見された細胞の表現型を、免疫組織化学的検査により分析した。
【０３２８】
ヒト臍帯組織を回収し、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドで一晩、４℃で浸漬固定した。免疫組織化学的検査が、以下のエピトープに対する抗体を用いて行われた（表２０−１）。エピトープは、ビメンチン（１：５００；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、デスミン（１：１５０，ウサギに対して産生；Ｓｉｇｍａ；または１：３００，マウスに対して産生；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）、α−平滑筋アクチン（ＳＭＡ；１：４００；Ｓｉｇｍａ）、サイトケラチン１８（ＣＫ１８；１：４００；Ｓｉｇｍａ）、フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ；１：２００；Ｓｉｇｍａ）、およびＣＤ３４（ヒトＣＤ３４クラスＩＩＩ；１：１００；ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）である。さらに、以下のマーカーを試験した。そのマーカーは、抗ヒトＧＲＯα−ＰＥ（１：１００；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）、抗ヒトＧＣＰ−２（１：１００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、抗ヒト酸化ＬＤＬレセプター１（ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１；１：１００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、および抗ヒトＮＯＧＯ−Ａ（１：１００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）である。固定された検体は、メスで刈り込まれ、エタノールを含むドライアイス浴上で、ＯＣＴ包埋化合物（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  ＯＣＴ；Ｓａｋｕｒａ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）の中に置かれた。凍結ブロックは、標準のクリオスタット（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて切開され（１０μｍ（１０ミクロン）厚さ）、染色のため、スライドガラスに載せられた。
【０３２９】
免疫組織化学的検査が、先の研究と同様に行われた（例えば、Ｍｅｓｓｉｎａ、ｅｔ  ａｌ、Ｅｘｐｅｒ．  Ｎｅｕｒｏｌ、２００３；１８４：８１６−８２９）。組織切片を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，Ｃａ．）、および０．３％（ｖ／ｖ）トリトン（トリトンＸ−１００；  Ｓｉｇｍａ）を含むタンパク質遮断溶液に１時間さらして、細胞内抗原にアクセスした。目的のエピトープが細胞表面（ＣＤ３４，ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１）上にある場合、トリトンは、エピトープ損失を防ぐために、手順の全工程で省略された。さらに、一次抗体がヤギ（ＧＣＰ−２，ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１，ＮＯＧＯ−Ａ）に対して産生される場合、３％（ｖ／ｖ）ロバ血清が、手順全体にわたってヤギ血清の代わりに使用された。遮断溶液で希釈された一次抗体は、次に、切片に４時間、室温で適用された。一次抗体溶液を除去し、培養物は、ヤギ抗−マウスＩｇＧ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（１：２５０；  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒ．）および／またはヤギ抗−ウサギ  ＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  ４８８（１：２５０；  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）またはロバ抗−ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１：１５０；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）と共に、遮断溶液を含有する二次抗体溶液を適用する（室温で１時間）前に、ＰＢＳで洗浄された。培養物を洗浄し、１０マイクロモルのＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を１０分間適用し、細胞核を可視化した。
【０３３０】
免疫染色後、Ｏｌｙｍｐｕｓ  倒立落射蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，  Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、Ｎ．Ｙ．）上で適切な蛍光フィルターを用いて蛍光を可視化した。．ポジティブ染色は、対照染色を上回って、蛍光信号により表された。代表的な画像は、デジタルカラービデオカメラ、およびＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ．）を用いて取り込まれた。三重染色（ｔｒｉｐｌｅ−ｓｔａｉｎｅｄ）サンプルでは、各画像は、１回にただ１つの放出フィルターを使用して撮られた。層をなすモンタージュが次に、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ａｄｏｂｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａ．）を用いて準備された。
【表２２】
0006095893.tif 000025
【０３３１】
ビメンチン、デスミン、ＳＭＡ、ＣＫ１８、ｖＷＦおよびＣＤ３４マーカーが、臍帯内で発見された細胞の部分集団で発現した（データは不図示）。具体的には、ｖＷＦおよびＣＤ３４の発現は、臍帯に含まれる血管に制限された。ＣＤ３４＋細胞は、最も内側の層（管腔側）にあった。ビメンチン発現は、臍帯のマトリックスおよび血管全体で見られた。ＳＭＡは、動脈および静脈のマトリックスおよび外壁に限定されたが、血管自体には含まれなかった。ＣＫ１８およびデスミンは、血管内部のみで観察され、デスミンは、中間及び外側の層に限定された。
【０３３２】
ビメンチン、デスミン、α−平滑筋アクチン、サイトケラチン１８、フォン・ヴィルブランド因子、およびＣＤ３４は、ヒト臍帯内部の細胞で発現した。ビメンチンおよびα−平滑筋アクチンのみが発現したことを示す、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの特徴付けの研究に基づいて、データは、臍帯由来細胞単離の現行のプロセスにより細胞の部分集団が回収されること、または単離細胞が、マーカーの発現を変えて、ビメンチンおよびα−平滑筋アクチンを発現することを示唆している。
【０３３３】
実施例２１
栄養因子の分泌
臍由来細胞からの、選択された栄養因子の分泌を測定した。検出のため選択された因子は以下を含んだ：（１）血管新生作用を有することが知られるもの、例えば、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）（Ｒｏｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄ．  Ｓｙｍｐ．，１９９７；２１２：２１５−２６）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）（Ｓａｌｃｅｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２０００；９６：３４−４０）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００３；１７０：３３６９−７６）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）（Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．  Ｔｈｏｒａｃ．  Ｓｕｒｇ．，２００４；７７：８１２−８）、マトリックスメタロプロテイナーゼ１（ＴＩＭＰ１）、アンジオポエチン２（ＡＮＧ２）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ−ｂｂ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ヘパリン結合上皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、間質由来因子１α（ＳＤＦ−１α）；（２）神経栄養／神経保護活性を有することが知られるもの、例えば、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．，２００３；２５８；３１９−３３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球走化性タンパク質−２（ＧＣＰ−２）、形質転換成長因子β２（ＴＧＦβ２）；および、（３）ケモカイン活性を有することが知られるもの、例えばマクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ１ａ）、マクロファージ炎症性タンパク質１β（ＭＩＰ１ｂ）、単球走化性因子−１（ＭＣＰ−１）、Ｒａｎｔｅｓ（活性時に調節される、発現および分泌された正常なＴ細胞）、Ｉ３０９、胸腺および活性調節ケモカイン（ＴＡＲＣ）、エオタキシン、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）、およびＩＬ−８。
【０３３４】
臍帯由来の細胞、ならびにヒト新生児の皮膚由来のヒト線維芽細胞が、成長培地中で、ゼラチンコートＴ７５フラスコにおいて培養された。細胞は、１１代継代で冷凍保存され、液体窒素中に保存された。解凍後、成長培地が細胞に加えられ、その後、１５ｍＬ遠心分離チューブに移され、細胞の遠心分離を１５０ｘｇで５分間行った。細胞ペレットが、４ｍＬの成長培地で再懸濁され、、細胞をカウントした。細胞を、５，０００個の細胞／ｃｍ２で、１５ｍＬの成長培地をそれぞれ含むＴ７５フラスコに播種し、２４時間培養した。培地を、無血清培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ）、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、ペニシリン（５０単位／ｍＬ）およびストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ，Ｇｉｂｃｏ））に８時間かけて変えた。馴化無血清培地が、１４，０００ｘｇで５分間の遠心分離によるインキュベーションの終わりに収集され、‐２０℃で保管された。
【０３３５】
各フラスコ内の細胞数を見積もるため、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、２ｍＬのトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて分離した。８ｍＬの成長培地を加えることにより、トリプシン活性が抑制された。細胞を１５０ｘｇで５分間、遠心分離した。上澄みを除去し、細胞を、１ｍＬ成長培地で再懸濁した。細胞数は、血球計数器を用いて見積られた。
【０３３６】
細胞は、５％二酸化炭素および大気中酸素中で、３７℃で成長した。各細胞サンプルにより産生されたＭＣＰ−Ｉ、ＩＬ−６、ＶＥＧＦ、ＳＤＦ−Ｉα、ＧＣＰ−２、ＩＬ−８、およびＴＧＦ−β２の量は、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｎ）によって判断された。すべてのアッセイは、製造業者の説明書に従って行われた。示された値は、１００万個の細胞当たりのピコグラム／ｍＬ（ｎ＝２，ｓｅｍ）であった。
【０３３７】
ケモカイン（ＭＩＰ１α、ＭｌＰ１β、ＭＣＰ−１、Ｒａｎｔｅｓ、Ｉ３０９、ＴＡＲＣ、エオタキシン、ＭＤＣ、ＩＬ８）、ＢＤＮＦ、および血管新生因子（ＨＧＦ、ＫＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＩＭＰ１、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、ＴＰＯ、ＨＢ−ＥＧＦが、Ｓｅａｒｃｈｌｉｇｈｔ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ａｒｒａｙｓ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）を用いて測定された。Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ａｒｒａｙｓは、１つのウェル当たり２〜１６個のタンパク質の定量的測定をするための、多重サンドイッチＥＬＩＳＡである。アレイは、２ｘ２、３ｘ３、または４ｘ４パターンの、４〜１６個の異なる捕捉抗体を、９６ウェルプレートの各ウェルにスポッティングすることにより産生される。サンドイッチＥＬＩＳＡ手順の後、プレート全体が画像化され、プレートの各ウェル内部の各スポットで生成された化学発光信号を捕捉する。各スポットで生成された信号は、元の標準またはサンプルにおける標的タンパク質の量に比例する。
【０３３８】
ＭＣＰ−１およびＩＬ−６が、臍由来細胞および皮膚線維芽細胞から分泌された（表２１−１）。ＳＤＦ−１αおよびＧＣＰ−２が線維芽細胞により分泌された。ＧＣＰ−２およびＩＬ−８は、臍由来細胞により分泌された。ＴＧＦ−β２は、ＥＬＩＳＡによってはいずれの細胞型からも検出されなかった。
【表２３】
0006095893.tif 000026
略語：ＮＤ：不検出せず
【０３３９】
ＴＩＭＰ１、ＴＰＯ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＭＩＰ１ｂ、ＭＣＰ１、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、ＴＡＲＣ、ＭＤＣ、およびＩＬ−８が臍由来細胞から分泌された（表２１−２および２１−３）。Ａｎｇ２、ＶＥＧＦ、またはＰＤＧＦ−ｂｂは検出されなかった。
【表２４】
0006095893.tif 000027
略語：ｈＦＢ（ヒト線維芽細胞）、Ｕ１（臍由来細胞（０２２８０３））、Ｕ３（臍由来細胞（０７１００３））、ＮＤ：不検出せず
【表２５】
0006095893.tif 000028
略語：ｈＦＢ（ヒト線維芽細胞）、Ｕ１（臍由来ＰＰＤＣ（０２２８０３））、Ｕ３（臍由来ＰＰＤＣ（０７１００３））、ＮＤ：不検出せず
【０３４０】
臍由来細胞は、いくつかの栄養因子を分泌した。これらの栄養因子の一部、例えばＨＧＦ、ｂＦＧＦ、ＭＣＰ−１およびＩＬ−８、は血管新生において重要な役割を果たす。他の栄養因子、例えば、ＢＤＮＦおよびＩＬ−６は、神経再生に重要な役割を有する。
【０３４１】
実施例２２
Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ免疫学
免疫学的反応を予測しようとして、臍帯細胞株が、それらの免疫学的特徴についてｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価され、もしあれば、これらの細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏ移植の際に引き出すであろう。臍帯細胞株は、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＢ７−Ｈ２の発現についてフローサイトメトリーによりアッセイされた。これらのタンパク質は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）により発現され、未処理のＣＤ４＋Ｔ細胞（Ａｂｂａｓ  ＆  Ｌｉｃｈｔｍａｎ，  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．（２００３）  Ｓａｕｎｄｅｒｓ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ｐ．１７１）の直接刺激のために必要である。細胞株はまた、ＨＬＡ−Ｇ（Ａｂｂａｓ  ＆  Ｌｉｃｈｔｍａｎ，  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ５ｔｈ  Ｅｄ.（２００３）  Ｓａｕｎｄｅｒｓ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ｐ.１７１）、ＣＤ１７８（Ｃｏｕｍａｎｓ  ｅｔ．ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １９９９；２２４：１８５−１９６）、およびＰＤ−Ｌ２（Ａｂｂａｓ  ＆  Ｌｉｃｈｔｍａｎ，  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ５ｔｈ  Ｅｄ.  （２００３）  Ｓａｕｎｄｅｒｓ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ｐ.１７１；  Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ２００３；１７０：１２５７−１２６６）の発現について、フローサイトメトリーによって分析された。胎盤組織にある細胞によるこれらのタンパク質の発現は、子宮内での胎盤組織の免疫特権状態を媒介すると考えられる。どの程度まで臍帯組織由来細胞株がｉｎ  ｖｉｖｏで免疫反応を引き出すかを予測するため、細胞株は、一方向混合リンパ球反応（ＭＬＲ）で試験された。
【０３４２】
細胞は、２％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）でコートされたＴ７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｎ．Ｙ．）でコンフルエントまで、成長培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ．）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）；（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，Ｕｔ．）、０．００１％（ｖ／ｖ）βメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）、５０単位／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ．）で培養された。
【０３４３】
細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ．）で洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ．）で分離した。細胞を回収し、遠心分離し、１ｘ１０７／ｍＬの細胞濃度で、ＰＢＳ中の３％（ｖ／ｖ）ＦＢＳで再懸濁した。抗体（表２２−１）は、製造業者の仕様書のとおりに、１００μＬの細胞懸濁液に加えられ、暗所で３０分間、４℃でインキュベートされた。インキュベーション後、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、遠心分離して、非結合抗体を除去した。細胞は、５００μＬのＰＢＳ中で再懸濁され、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ器具（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａ．）を用いてフローサイトメトリーによって分析された。
【表２６】
0006095893.tif 000029
【０３４４】
細胞株「Ａ」と標識された、１０代継代の臍帯由来細胞の冷凍保存バイアルが、ドライアイス上で包装され、ＣＴＢＲ（Ｓｅｎｎｅｖｉｌｌｅ，Ｑｕｅｂｅｃ）に送られて、ＣＴＢＲ  ＳＯＰ  ｎｏ．ＣＡＣ−０３１を用いて混合リンパ球反応を行った。末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）が、複数の男性及び女性のボランティアドナーから収集された。刺激剤（ドナー）同種ＰＢＭＣ、自家ＰＢＭＣ、および臍帯組織由来細胞株が、マイトマイシンＣで処理された。自家およびマイトマイシンＣで処理した刺激細胞が、反応者（レシピエント）ＰＢＭＣに加えられ、４日間培養された。インキュベーション後、［３Ｈ］チミジンが各サンプルに加えられ、１８時間培養された。細胞の回収後、放射標識ＤＮＡが抽出され、［３Ｈ］チミジンの取り込みが、シンチレーションカウンターを用いて測定された。
【０３４５】
同種ドナー（ＳＩＡＤ）の刺激指数が、レシーバー＋マイトマイシンＣ処理同種ドナーをレシーバーのベースライン増殖で割ったものの平均増殖として、計算された。臍帯由来細胞の刺激指数が、レシーバーのベースライン増殖で割った、レシーバー＋マイトマイシンＣ処理臍帯組織由来細胞株の平均増殖として計算された。
【０３４６】
６個のヒトボランティア血液ドナーがスクリーニングされて、残りの５つの血液ドナーとの混合リンパ球反応で強い増殖反応を示すであろう単一の同種ドナーを識別した。このドナーは、同種陽性対照ドナーとして選択された。残りの５つの血液ドナーは、レシピエントとして選択された。同種陽性対照ドナーおよび臍帯由来細胞株は、マイトマイシンＣ処理され、５個の個々の同種レシーバーとの混合リンパ球反応において培養された。反応は、プレート当たり３つのレシーバーで２つの細胞培養プレートを用いて３回行われた（表２２−２）。平均刺激指数は、６．５（プレート１）〜９（プレート２）の範囲であり、同種ドナー陽性対照は、４２．７５（プレート１）〜７０（プレート２）の範囲であった（表２２−３）。
【表２７】
0006095893.tif 000030
【表２８】
0006095893.tif 000031
【０３４７】
フローサイトメトリーにより分析された臍帯由来細胞のヒストグラムは、ＩｇＧ対照と一致した蛍光値により示されるように、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＢ７−Ｈ２の陰性発現を示し、このことは、臍帯由来細胞株には、同種ＰＢＭＣを直接刺激するのに必要な細胞表面分子がないこと（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞）を示している。
【０３４８】
フローサイトメトリーにより分析された臍帯由来細胞のヒストグラムは、ＩｇＧ対照に対する蛍光の増大に示されるように、ＰＤ−Ｌ２の陽性発現を示し、また、ＩｇＧ対照と一致した蛍光値により示されるように、ＣＤ１７８およびＨＬＡ−Ｇの陰性発現を示した。
【０３４９】
臍帯由来細胞株で実施された混合リンパ球反応では、平均刺激指数は、６．５〜９の範囲であり、同種陽性対照では、４２．７５〜７０の範囲であった。臍帯由来細胞株は、フローサイトメトリーにより測定された場合に、刺激タンパク質ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＢ７−Ｈ２の発現について陰性であった。臍帯由来細胞株はまた、フローサイトメトリーにより測定された場合に、免疫調節タンパク質ＨＬＡ−ＧおよびＣＤ１７８の発現には陰性で、ＰＤ−Ｌ２の発現には陽性であった。同種ドナーＰＢＭＣは、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＱ、ＣＤ８、ＣＤ８６、およびＢ７−Ｈ２を発現する抗原提示細胞を含み、それにより、同種ＰＢＭＣの刺激を可能にする（例えば未処理のＣＤ４＋Ｔ細胞）。同種のＰＢＭＣ（例えば未処理のＣＤ４＋Ｔ細胞）の直接刺激に必要な臍帯由来細胞上の抗原提示細胞表面分子がないこと、ならびにＰＤ−Ｌ２、免疫調節タンパク質の存在は、同種対照と比較した場合に、ＭＬＲ中でこれらの細胞により示される低い刺激指数の説明となる。
【０３５０】
実施例２３
テロメラーゼ活性のアッセイ
テロメラーゼは、染色体の完全性を保護し、また細胞の複製寿命を延ばすのに役立つ、テロメア繰り返し体を合成するよう機能する（Ｌｉｕ，Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９９９；９６：５１４７−５１５２）。テロメラーゼは、２つの成分、テロメラーゼＲＮＡテンプレート（ｈＴＥＲ）、およびテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）のみからなる。テロメラーゼの調節は、ｈＴＥＲではなく、ｈＴＥＲＴの転写により決定される。ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ゆえに、細胞のテロメラーゼ活性を決定する、認められた方法である。
【０３５１】
細胞単離
リアルタイムＰＣＲ実験が行われ、ヒト臍帯組織由来細胞のテロメラーゼ産生が決定された。ヒト臍帯組織由来細胞が、実施例１３〜１５、および、米国特許第７，５１０，８７３号として特許となった米国特許出願第１０／８７７，０１２号（‘０１２号出願）に記載される実施例に従って、準備された。概して、正常な運搬後にＮａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．）から入手された臍帯が洗浄され、血液および残骸を除去し、機械的に解離される。組織は次に、コラゲナーゼ、ディスパーゼおよびヒアルロニダーゼを含む消化酵素で、培養培地において３７℃でインキュベートされる。ヒト臍帯組織由来細胞は、‘０１２号出願の実施例に記載された方法に従って培養された。間葉系幹細胞および正常な皮膚線維芽細胞（ｃｃ−２５０９  ロット＃  ９Ｆ０８４４）が、Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．から入手された。多能性ヒト精巣胎児性癌（テラトーマ）細胞株ｎＴｅｒａ−２細胞（ＮＴＥＲＡ−  ２  ｃｌ．Ｄｌ）（Ｐｌａｉａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，  ２００６；２４（３）：５３１−５４６を参照）を、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．）から購入し、‘０１２号出願に記載した方法に従って培養した。
【０３５２】
全ＲＮＡ単離
ＲＮＡが、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａ．）を用いて細胞から抽出された。ＲＮＡは、５０μＬのＤＥＰＣ処理水で溶出され、−８Ｏ℃で保管された。ＲＮＡは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）逆転写試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａ．）により、２５℃で１０分間、３７℃で６０分間、９５℃で１０分間、ランダムヘキサマーを用いて逆転写された。サンプルを−２０℃で保管した。
【０３５３】
リアルタイムＰＣＲ
ＰＣＲが、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ａｓｓａｙｓ−Ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（商標）（ＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイとしても知られる）を用いて、製造業者の仕様書（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従って、ｃＤＮＡサンプルに対して行われた。この市販のキットは、ヒト細胞のテロメラーゼのアッセイに広く使われる。端的には、ｈＴＥＲＴ（ヒトテロメラーゼ遺伝子）（Ｈｓ００１６２６６９）およびヒトＧＡＰＤＨ（内部対照）が、ＡＢＩ  ｐｒｉｓｍ  ７０００  ＳＤＳソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に７０００配列検出システムを用いて、ｃＤＮＡおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲマスターミックスと混合された。熱サイクル条件は、最初は、５０℃で２分、９５℃で１０分、その後、９５℃で１５秒および６０℃で１分の４０サイクルであった。ＰＣＲデータは、製造業者の仕様書に従って分析された。
【０３５４】
ヒト臍帯組織由来細胞（ＡＴＣＣ受入番号  ＰＴＡ−６０６７）、線維芽細胞、および間葉系幹細胞は、ｈＴＥＲＴおよび１８ＳＲＮＡについてアッセイされた。表２２−１に示すように、ｈＴＥＲＴ、したがってテロメラーゼは、ヒト臍帯組織由来細胞では検出されなかった。
【表２９】
0006095893.tif 000032
ＮＤ：検出せず；  ＋：信号検出
【０３５５】
ヒト臍帯組織由来細胞（ｉｓｏｌａｔｅ  ０２２８０３，ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−６０６７）およびｎＴｅｒａ−２細胞が、アッセイされ、結果は、ｈＵＴＣの２つのロットではテロメラーゼの発現を示さず、一方、テラトーマ細胞株は、高レベルの発現を表した（表２２−２）。
【表３０】
0006095893.tif 000033
【０３５６】
したがって、ヒト臍組織由来細胞は、テロメラーゼを発現しないと結論付けることができる。
【０３５７】
〔実施の態様〕
（１）  神経傷害を有する患者を治療する方法において、
前記神経傷害を治療するのに有効な量の単離臍帯組織由来細胞を、前記患者に投与すること、
を含み、
前記臍帯組織由来細胞は、実質的に血液のないヒト臍帯組織由来であり、
前記細胞は、培養中に自己再生および増殖することができ、少なくとも神経の表現型の細胞に分化する能力を有し、
前記細胞は、ＣＤ１１７を発現しない、方法。
（２）  実施態様１に記載の方法において、
前記神経傷害は、脳虚血、急性虚血後の再灌流、出生時低酸素虚血性傷害、心停止、頭蓋内出血、頭蓋内病変、揺さぶられ症候群である、方法。
（３）  実施態様１に記載の方法において、
前記細胞は、前記神経傷害の治療を促進する遺伝子産物を産生するように、遺伝子操作される、方法。
（４）  実施態様１に記載の方法において、
前記細胞は、少なくとも１つの他の細胞型と共に投与される、方法。
（５）  実施態様４に記載の方法において、
前記他の細胞型は、星状細胞、乏突起膠細胞、ニューロン、神経前駆細胞、神経幹細胞、または他の多分化能もしくは多能性幹細胞である、方法。
【０３５８】
（６）  実施態様１に記載の方法において、
前記細胞は、前記患者の中枢または末梢神経系の所定部位に投与される、方法。
（７）  実施態様１に記載の方法において、
前記臍帯組織由来細胞は、ｈＴＥＲＴまたはテロメラーゼを発現しない、方法。
（８）  実施態様１に記載の方法において、
前記細胞は、注射または注入により投与される、方法。
（９）  患者の脳室下帯（ＳＶＺ）の再生能力を刺激する方法において、
神経発生、血管新生、またはシナプス形成を増大させるのに有効な量で、単離臍帯組織由来細胞を前記患者に投与すること、
を含み、
前記臍帯組織由来細胞は、実質的に血液のないヒト臍帯組織由来であり、
前記細胞は、培養中に自己再生および増殖することができ、少なくとも神経の表現型の細胞に分化する能力を有し、
前記細胞は、ＣＤ１１７を発現しない、方法。
（１０）  実施態様９に記載の方法において、
前記細胞は、前記脳室下帯の前記再生能力を促進する遺伝子産物を産生するように、遺伝子操作される、方法。
【０３５９】
（１１）  実施態様９に記載の方法において、
前記細胞は、少なくとも１つの他の細胞型と共に投与される、方法。
（１２）  実施態様１１に記載の方法において、
前記他の細胞型は、星状細胞、乏突起膠細胞、ニューロン、神経前駆細胞、神経幹細胞、または他の多分化能もしくは多能性幹細胞である、方法。
（１３）  実施態様９に記載の方法において、
前記細胞は、前記患者の中枢または末梢神経系の所定部位で投与される、方法。
（１４）  実施態様９に記載の方法において、
前記細胞は、注射または注入により投与される、方法。
（１５）  実施態様１に記載の方法において、
前記細胞は、成長にＬ−バリンを必要とし、少なくとも約５％の酸素中で成長することができる、方法。
【０３６０】
（１６）  実施態様１に記載の方法において、
前記細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃのうち１つまたは複数を発現する、方法。
（１７）  実施態様１に記載の方法において、
前記細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃのそれぞれを発現する、方法。
（１８）  実施態様１に記載の方法において、
前記細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのうち１つまたは複数を発現しない、方法。
（１９）  実施態様１に記載の方法において、
前記細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのいずれも発現しない、方法。
（２０）  実施態様９に記載の方法において、
前記細胞は、成長のためＬ−バリンを必要とし、少なくとも約５％の酸素中で成長することができる、方法。
【０３６１】
（２１）  実施態様１に記載の方法において、
前記細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃのうち１つまたは複数を発現する、方法。
（２２）  実施態様１に記載の方法において、
前記細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃのそれぞれを発現する、方法。
（２３）  実施態様１に記載の方法において、
前記細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのうち１つまたは複数を発現しない、方法。
（２４）  実施態様１に記載の方法において、
前記細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのいずれも発現しない、方法。
（２５）  神経傷害を有する患者を治療する医薬組成物において、
前記神経傷害を治療するのに有効な量の、医薬的に許容可能な担体、および単離臍帯組織由来細胞、
を含み、
前記臍帯組織由来細胞は、実質的に血液のないヒト臍帯組織由来であり、
前記細胞は、培養中に自己再生および増殖することができ、少なくとも神経の表現型の細胞に分化する能力を有し、
前記細胞は、ＣＤ１１７を発現しない、医薬組成物。
【０３６２】
（２６）  実施態様２５に記載の医薬組成物において、
前記細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃのうち１つまたは複数を発現する、医薬組成物。
（２７）  実施態様２５に記載の医薬組成物において、
前記細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃのそれぞれを発現する、医薬組成物。
（２８）  実施態様２５に記載の医薬組成物において、
前記細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのうち１つまたは複数を発現しない、医薬組成物。
（２９）  実施態様２５に記載の医薬組成物において、
前記細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのいずれも発現しない、医薬組成物。
（３０）  神経傷害を有する患者を治療するキットであって、医薬的に許容可能な担体、単離臍帯組織由来細胞集団、および前記患者を治療する方法において前記キットを使用するための説明書を含む、キットにおいて、
前記臍帯組織由来細胞は、実質的に血液のないヒト臍帯組織由来であり、
前記細胞は、培養中に自己再生および増殖することができ、少なくとも神経の表現型の細胞に分化する能力を有し、
前記細胞は、ＣＤ１１７を発現しない、キット。
【０３６３】
（３１）  実施態様３０に記載のキットにおいて、
少なくとも１つの他の細胞型の集団、
をさらに含む、キット。
（３２）  実施態様３０に記載のキットにおいて、
前記細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃのうち１つまたは複数を発現する、キット。
（３３）  実施態様３０に記載のキットにおいて、
前記細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃのそれぞれを発現する、キット。
（３４）  実施態様３０に記載のキットにおいて、
前記細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのうち１つまたは複数を発現しない、キット。
（３５）  実施態様３０に記載のキットにおいて、
前記細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのいずれも発現しない、キット。
【図面の簡単な説明】
【０３６４】
【図１】傷害後２４時間または７２時間後にＰＢＳまたは３ｘ１０６個のＵＴＣで処理したラットにおいて、傷害後１日目、４日目、７日目、１４日目、２１日目、および２８日目に、運動、感覚、平衡、および反射試験によって判断される改変神経重症度スコアを、０〜１８の段階的等級で（０は正常スコア、１８は最大欠損）示している（ｎ＝８）。
【図２】傷害後２４時間または７２時間後にＰＢＳまたは３ｘ１０６個のＵＴＣで処理したラットにおいて、傷害後１日目、４日目、７日目、１４日目、２１日目、および２８日目の、コーナーテスト（ｃｏｒｎｅｒ  ｔｅｓｔ）のスコアを示している（ｎ＝８）。
【図３Ａ】傷害、およびそれに続く、傷害後７２時間のＰＢＳによる処理の後の、ラットにおけるＳＶＺの細胞内へのＢｒｄＵ取り込みを示す。
【図３Ｂ】傷害、およびそれに続く、傷害後７２時間の３ｘ１０６個のＵＴＣによる処理の後の、ラットにおけるＳＶＺの細胞内へのＢｒｄＵ取り込みを示す。
【図３Ｃ】傷害、およびそれに続く、傷害後２４時間のＰＢＳによる処理の後の、ラットにおけるＳＶＺの細胞内へのＢｒｄＵ取り込みを示す。
【図３Ｄ】傷害、およびそれに続く、傷害後２４時間の３ｘ１０６個のＵＴＣによる処理の後の、ラットにおけるＳＶＺの細胞内へのＢｒｄＵ取り込みを示す。
【図３Ｅ】傷害、およびそれに続く、傷害後７２時間のＰＢＳまたは３ｘ１０６個のＵＴＣでの治療の後の、ラットのＳＶＺ中のＢｒｄＵ陽性細胞の平均数を示す（ｎ＝８）。
【図３Ｆ】傷害後２４時間のＰＢＳまたは３ｘ１０６個のＵＴＣによる平均数を示す（ｎ＝８）。
【図４Ａ】傷害、それに続く、傷害後２４時間のＰＢＳでの処理の後の、ラット脳の損傷エリアの血管におけるＶＷＦ発現を示す。
【図４Ｂ】傷害、それに続く、傷害後２４時間の３ｘ１０６個のＵＴＣでの処理の後の、ラット脳の損傷エリアの血管におけるＶＷＦ発現を示す。
【図４Ｃ】傷害、それに続く、傷害後７２時間のＰＢＳでの処理の後の、ラット脳の損傷エリアの血管におけるＶＷＦ発現を示す。
【図４Ｄ】傷害、それに続く、傷害後７２時間の３ｘ１０６個のＵＴＣでの処理の後の、ラット脳の損傷エリアの血管におけるＶＷＦ発現を示す。
【図４Ｅ】傷害、およびそれに続く、傷害後２４時間のＰＢＳまたは３ｘ１０６個のＵＴＣによる処理の後の、ラット脳の損傷エリアの血管の平均直径（μｍ）を示す（ｎ＝８）。
【図４Ｆ】傷害後７２時間のＰＢＳまたは３ｘ１０６個のＵＴＣによる処理の後の、平均直径（μｍ）を示す（ｎ＝８）。
【図５Ａ】傷害後のラット脳の損傷エリアの血管の内皮細胞におけるＢｒｄＵ取り込みを示す。
【図５Ｂ】傷害後のラット脳の損傷エリアの血管におけるＶＷＦ発現を示す。
【図５Ｃ】傷害後のラット脳の損傷エリアの血管におけるＶＷＦ発現組織と共存する内皮細胞のＢｒｄＵ取り込みを示す。
【図６Ａ】傷害、およびそれに続く、傷害後２４時間のＰＢＳ処理の後の、ラット脳のＳＶＺにおけるダブルコルチン（ＤＣＸ）発現を示す。
【図６Ｂ】傷害、およびそれに続く、傷害後２４時間の３ｘ１０６個のＵＴＣ処理の後の、ラット脳のＳＶＺにおけるダブルコルチン（ＤＣＸ）発現を示す。
【図６Ｃ】傷害、およびそれに続く、傷害後７２時間のＰＢＳ処理の後の、ラット脳のＳＶＺにおけるダブルコルチン（ＤＣＸ）発現を示す。
【図６Ｄ】傷害、およびそれに続く、傷害後７２時間の３ｘ１０６個のＵＴＣ処理の後の、ラット脳のＳＶＺにおけるダブルコルチン（ＤＣＸ）発現を示す。
【図６Ｅ】傷害、およびそれに続く、傷害後２４時間のＰＢＳまたは３ｘ１０６個のＵＴＣ処理の後の、ダブルコルチン（ＤＣＸ）発現に陽性であるラット脳のＳＶＺの平均面積パーセントを示す（ｎ＝８）。
【図６Ｆ】傷害後７２時間のＰＢＳまたは３ｘ１０６個のＵＴＣによる、ダブルコルチン（ＤＣＸ）発現に陽性である平均面積パーセントを示す（ｎ＝８）。
【図７Ａ】傷害、およびそれに続く、傷害後２４時間のＰＢＳ処理の後の、ラット脳のＳＶＺにおけるＴＵＪｌ発現を示す。
【図７Ｂ】傷害、およびそれに続く、傷害後２４時間の３ｘ１０６個のＵＴＣ処理の後の、ラット脳のＳＶＺにおけるＴＵＪｌ発現を示す。
【図７Ｃ】傷害、およびそれに続く、傷害後７２時間のＰＢＳ処理の後の、ラット脳のＳＶＺにおけるＴＵＪｌ発現を示す。
【図７Ｄ】傷害、およびそれに続く、傷害後７２時間の３ｘ１０６個のＵＴＣ処理の後の、ラット脳のＳＶＺにおけるＴＵＪｌ発現を示す。
【図７Ｅ】傷害、およびそれに続く、傷害後２４時間のＰＢＳまたは３ｘ１０６個のＵＴＣ処理の後の、ＴＵＪｌ発現に陽性であるラット脳のＳＶＺの平均面積パーセントを示す（ｎ＝８）。
【図７Ｆ】傷害後７２時間のＰＢＳまたは３ｘ１０６個のＵＴＣによる、ＴＵＪｌ発現に陽性である平均面積パーセントを示す（ｎ＝８）。
【図８Ａ】傷害、およびそれに続く、傷害後２４時間のＰＢＳ処理の後の、ラット脳の血腫の境界域におけるシナプトフィジン発現を示す。
【図８Ｂ】傷害、およびそれに続く、傷害後２４時間の３ｘ１０６個のＵＴＣ処理の後の、ラット脳の血腫の境界域におけるシナプトフィジン発現を示す。
【図８Ｃ】傷害、およびそれに続く、傷害後７２時間のＰＢＳ処理の後の、ラット脳の血腫の境界域におけるシナプトフィジン発現を示す。
【図８Ｄ】傷害、およびそれに続く、傷害後７２時間の３ｘ１０６個のＵＴＣ処理の後の、ラット脳の血腫の境界域におけるシナプトフィジン発現を示す。
【図８Ｅ】傷害、およびそれに続く、傷害後２４時間のＰＢＳまたは３ｘ１０６個のＵＴＣ処理の後の、シナプトフィジン発現に陽性であるラット脳の血腫の境界域の平均面積パーセントを示す（ｎ＝８）。
【図８Ｆ】傷害後７２時間のＰＢＳまたは３ｘ１０６個のＵＴＣによる、シナプトフィジン発現に陽性である平均面積パーセントを示す（ｎ＝８）。
【図９Ａ】傷害、およびそれに続く、傷害後２４時間のＰＢＳ処理の後の、ラット脳の損傷エリアにおけるアポトーシス細胞のＴＵＮＥＬ染色を示す。
【図９Ｂ】傷害、およびそれに続く、傷害後２４時間の３ｘ１０６個のＵＴＣ処理の後の、ラット脳の損傷エリアにおけるアポトーシス細胞のＴＵＮＥＬ染色を示す。
【図９Ｃ】傷害、およびそれに続く、傷害後７２時間のＰＢＳ処理の後の、ラット脳の損傷エリアにおけるアポトーシス細胞のＴＵＮＥＬ染色を示す。
【図９Ｄ】傷害、およびそれに続く、傷害後７２時間の３ｘ１０６個のＵＴＣ処理の後の、ラット脳の損傷エリアにおけるアポトーシス細胞のＴＵＮＥＬ染色を示す。
【図９Ｅ】傷害、およびそれに続く、傷害後２４時間のＰＢＳまたは３ｘ１０６個のＵＴＣ処理の後の、ラット脳の損傷エリアにおけるスライド当たりのアポトーシス細胞の平均数を示す（ｎ＝８）。
【図９Ｆ】傷害後７２時間のＰＢＳまたは３ｘ１０６個のＵＴＣによる、平均数を示す（ｎ＝８）。
【図１０Ａ】傷害、およびそれに続く、傷害後２４時間のＰＢＳまたは３ｘ１０６個のＵＴＣ処理の後の、ラット脳の線条体損失の平均パーセンテージを示す（ｎ＝８）。
【図１０Ｂ】傷害、およびそれに続く、傷害後７２時間のＰＢＳまたは３ｘ１０６個のＵＴＣ処理の後による、ラット脳の線条体損失の平均パーセンテージを示す（ｎ＝８）。
【図１１Ａ】傷害後７日目にＰＢＳまたは３ｘ１０６個のＵＴＣ処理したラットにおける、傷害から１日目、４日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目、３１日目、および３５日目におけるｍＮＳＳを示す（ｎ＝１０）。
【図１１Ｂ】傷害後３日目にＰＢＳまたは３ｘ１０６個のＵＴＣ処理したラットにおける、傷害から１日目、４日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目、３１日目、および３５日目におけるｍＮＳＳを示す（ｎ＝１０）。
【図１２Ａ】傷害後７日目にＰＢＳまたは３ｘ１０６個のＵＴＣ処理したラットにおける、傷害から１日目、４日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目、３１日目、および３５日目におけるコーナーテストスコアを示す（ｎ＝１０）。
【図１２Ｂ】傷害後３日目にＰＢＳまたは３ｘ１０６個のＵＴＣ処理したラットにおける、傷害から１日目、４日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目、３１日目、および３５日目におけるｍＮＳＳを示す（ｎ＝１０）。
【図１３Ａ】傷害後７日目にＰＢＳまたは３ｘ１０６個のＵＴＣ処理したラットにおける、傷害から１日目、４日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目、３１日目、および３５日目における円筒試験スコアを示す（ｎ＝１０）。
【図１３Ｂ】傷害後３日目にＰＢＳまたは３ｘ１０６個のＵＴＣ処理したラットにおける、傷害から１日目、４日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目、３１日目、および３５日目における円筒試験スコアを示す（ｎ＝１０）。
【図１４Ａ】傷害後７日目にＰＢＳまたは３ｘ１０６個のＵＴＣ処理したラットにおける、傷害から１日目、４日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目、３１日目、および３５日目における付着試験スコアを示す（ｎ＝１０）。
【図１４Ｂ】傷害後３日目にＰＢＳまたは３ｘ１０６個のＵＴＣ処理したラットにおける、傷害から１日目、４日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目、３１日目、および３５日目における付着試験スコアを示す（ｎ＝１０）。
【図１５Ａ】傷害、およびそれに続く、傷害後７２時間のＰＢＳ処理の後の、ラットにおけるＳＶＺ細胞へのＢｒｄＵ取り込みを示す。
【図１５Ｂ】傷害、およびそれに続く、傷害後７２時間の３ｘ１０６個のＵＴＣ処理の後の、ラットにおけるＳＶＺ細胞へのＢｒｄＵ取り込みを示す。
【図１５Ｃ】傷害、およびそれに続く、傷害後７日目のＰＢＳ処理の後の、ラットにおけるＳＶＺ細胞へのＢｒｄＵ取り込みを示す。
【図１５Ｄ】傷害、およびそれに続く、傷害後７日目の３ｘ１０６個のＵＴＣ処理の後の、ラットにおけるＳＶＺ細胞へのＢｒｄＵ取り込みを示す。
【図１５Ｅ】傷害、およびそれに続く、傷害後７２時間のＰＢＳまたは３ｘ１０６個のＵＴＣ処理の後の、ラットにおけるＳＶＺ中のＢｒｄＵ陽性細胞の平均数を示す（ｎ＝８）。
【図１５Ｆ】傷害後７日目のＰＢＳまたは３ｘ１０６個のＵＴＣ処理による平均数を示す（ｎ＝８）。
【図１６Ａ】傷害、およびそれに続く、傷害後７日目のＰＢＳ処理の後の、ラット脳の損傷エリアの血管におけるＶＷＦ発現を示す。
【図１６Ｂ】傷害、およびそれに続く、傷害後７日目の３ｘ１０６個のＵＴＣ処理の後の、ラット脳の損傷エリアの血管におけるＶＷＦ発現を示す。
【図１６Ｃ】傷害、およびそれに続く、傷害後７２時間のＰＢＳ処理の後の、ラット脳の損傷エリアの血管におけるＶＷＦ発現を示す。
【図１６Ｄ】傷害、およびそれに続く、傷害後７２時間の３ｘ１０６個のＵＴＣ処理の後の、ラット脳の損傷エリアの血管におけるＶＷＦ発現を示す。
【図１６Ｅ】傷害、およびそれに続く、傷害後７日目のＰＢＳまたは３ｘ１０６個のＵＴＣ処理の後の、ラット脳の損傷エリアの血管の平均直径（μｍ）を示す（ｎ＝１０）。
【図１６Ｆ】傷害後７２時間のＰＢＳまたは３ｘ１０６個のＵＴＣ処理での、平均直径（μｍ）を示す（ｎ＝１０）。
【図１７Ａ】傷害、および傷害後３日目の３ｘ１０６個のＵＴＣ処理の後の、ラット脳の損傷エリアの血管における内皮細胞へのＢｒｄＵ取り込みを示す（ｎ＝１０）。
【図１７Ｂ】傷害後７日目の３ｘ１０６個のＵＴＣ処理での内皮細胞へのＢｒｄＵ取り込みを示す（ｎ＝１０）。
【図１７Ｃ】傷害、および傷害後３日目の３ｘ１０６個のＵＴＣ処理の後の、ラット脳の損傷エリアの血管におけるＶＷＦ発現を示す（ｎ＝１０）。
【図１７Ｄ】傷害後３日目の３ｘ１０６個のＵＴＣ処理での血管におけるＶＷＦ発現を示す（ｎ＝１０）。
【図１７Ｅ】傷害、および傷害後３日目の３ｘ１０６個のＵＴＣ処理の後の、ラット脳の損傷エリアの血管におけるＶＷＦ発現組織と共存する内皮細胞へのＢｒｄＵ取り込みを示す（ｎ＝１０）。
【図１７Ｆ】傷害後７日目の３ｘ１０６個のＵＴＣ処理での内皮細胞へのＢｒｄＵ取り込みを示す（ｎ＝１０）。
【図１８Ａ】傷害、およびそれに続く、傷害後７日目のＰＢＳ処理の後の、ラット脳のＳＶＺでのＴＵＪｌ発現を示す。
【図１８Ｂ】傷害、およびそれに続く、傷害後７日目の３ｘ１０６個のＵＴＣ処理の後の、ラット脳のＳＶＺでのＴＵＪｌ発現を示す。
【図１８Ｃ】傷害、およびそれに続く、傷害後３日目のＰＢＳ処理の後の、ラット脳のＳＶＺでのＴＵＪｌ発現を示す。
【図１８Ｄ】傷害、およびそれに続く、傷害後３日目の３ｘ１０６個のＵＴＣ処理の後の、ラット脳のＳＶＺでのＴＵＪｌ発現を示す。
【図１８Ｅ】傷害、およびそれに続く、傷害後７日目のＰＢＳまたは３ｘ１０６個のＵＴＣ処理の後の、ＴＵＪｌ発現に陽性であるラット脳のＳＶＺの面積の平均パーセンテージを示す（ｎ＝１０）。
【図１８Ｆ】傷害後７２時間のＰＢＳまたは３ｘ１０６個のＵＴＣ処理での、ＴＵＪｌ発現に陽性である面積の平均パーセンテージを示す（ｎ＝１０）。
【図１９Ａ】傷害、およびそれに続く、傷害後７２時間のＰＢＳ処理の後の、ラット脳の血腫の境界域におけるシナプトフィジン発現を示す。
【図１９Ｂ】傷害、およびそれに続く、傷害後７２時間の３ｘ１０６個のＵＴＣ処理の後の、ラット脳の血腫の境界域におけるシナプトフィジン発現を示す。
【図１９Ｃ】傷害、およびそれに続く、傷害後７日目のＰＢＳ処理の後の、ラット脳の血腫の境界域におけるシナプトフィジン発現を示す。
【図１９Ｄ】傷害、およびそれに続く、傷害後７日目の３ｘ１０６個のＵＴＣ処理の後の、ラット脳の血腫の境界域におけるシナプトフィジン発現を示す。
【図１９Ｅ】傷害、およびそれに続く、傷害後７２時間のＰＢＳまたは３ｘ１０６個のＵＴＣ処理の後の、シナプトフィジン発現に陽性であるラット脳の血腫の境界域の平均面積パーセントを示す（ｎ＝１０）。
【図１９Ｆ】傷害後７日目のＰＢＳまたは３ｘ１０６個のＵＴＣによる、シナプトフィジン発現に陽性である平均面積パーセントを示す（ｎ＝１０）。
【図２０Ａ】傷害、およびそれに続く、傷害後７日目のＰＢＳ処理の後の、ラット脳の損傷エリアにおけるアポトーシス細胞のＴＵＮＥＬ染色を示す。
【図２０Ｂ】傷害、およびそれに続く、傷害後７日目の３ｘ１０６個のＵＴＣ処理の後の、ラット脳の損傷エリアにおけるアポトーシス細胞のＴＵＮＥＬ染色を示す。
【図２０Ｃ】傷害、およびそれに続く、傷害後７２時間のＰＢＳ処理の後の、ラット脳の損傷エリアにおけるアポトーシス細胞のＴＵＮＥＬ染色を示す。
【図２０Ｄ】傷害、およびそれに続く、傷害後７２時間の３ｘ１０６個のＵＴＣ処理の後の、ラット脳の損傷エリアにおけるアポトーシス細胞のＴＵＮＥＬ染色を示す。
【図２０Ｅ】傷害、およびそれに続く、傷害後７日目のＰＢＳまたは３ｘ１０６個のＵＴＣ処理の後の、ラット脳の損傷エリアにおけるスライド当たりのアポトーシス細胞の平均数を示す（ｎ＝１０）。
【図２０Ｆ】傷害後７２時間のＰＢＳまたは３ｘ１０６個のＵＴＣによる、平均数を示す（ｎ＝１０）。
【図２１Ａ】傷害、およびそれに続く、傷害後７日目のＰＢＳまたは３ｘ１０６個のＵＴＣ処理の後の、ラット脳の線条体損失の平均パーセンテージを示す（ｎ＝１０）。
【図２１Ｂ】傷害後７２時間のＰＢＳまたは３ｘ１０６個のＵＴＣ処理の後による、ラット脳の線条体損失の平均パーセンテージを示す（ｎ＝１０）。
【図２２】傷害後２４時間後にＰＢＳまたは４ｘ１０６個のＵＴＣまたはＭＳＣで処理したラットにおいて、傷害後１日目、４日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目、および３５日目の、改変神経重症度スコアを示している（ｎ＝８）。
【図２３】傷害後２４時間後にＰＢＳまたは４ｘ１０６個のＵＴＣまたはＭＳＣで処理したラットにおいて、傷害後３１日目、３２日目、３３日目、３４日目、および３５日目の、モリス水迷路スコアを示す（ｎ＝８）。
【図２４】傷害後２４時間後にＰＢＳまたは４ｘ１０６個のＵＴＣまたはＭＳＣで処理したラットにおいて、傷害後の脳半球の病変容量をパーセントで示す（ｎ＝８）。
【図２５】図２５Ａは、傷害後２４時間後にＰＢＳまたは４ｘ１０６個のＵＴＣまたはＭＳＣで処理したラットにおいて、傷害から３５日目にＵＴＣを識別するためのＥ５２０４抗体染色を示す（ｎ＝８）。ＰＢＳ対照では、陽性染色された細胞は見られなかった。図２５Ｂは、傷害後２４時間後にＰＢＳまたは４ｘ１０６個のＵＴＣまたはＭＳＣで処理したラットにおいて、傷害から３５日目にＭＳＣを識別するためのＥ５２０４抗体染色を示す（ｎ＝８）。
【図２６】図２６Ａは、傷害後２４時間後にＰＢＳまたは４ｘ１０６個のＵＴＣまたはＭＳＣで処理したラットにおいて、傷害から３５日目のＢｒｄＵ陽性ＵＴＣ細胞を示す。図２６Ｂは、傷害後２４時間後にＰＢＳまたは４ｘ１０６個のＵＴＣまたはＭＳＣで処理したラットにおいて、傷害から３５日目のＢｒｄＵ陽性ＭＳＣ細胞を示す。
【図２７】傷害後２４時間後にＰＢＳまたは４ｘ１０６個のＵＴＣまたはＭＳＣで処理したラットにおいて、傷害から３５日目に病変境界域におけるｍｍ２当たりのＢｒｄＵ陽性細胞数を示す（ｎ＝８）。
【図２８】傷害後２４時間後にＰＢＳまたは４ｘ１０６個のＵＴＣまたはＭＳＣで処理したラットにおいて、傷害から３５日目に歯状回におけるｍｍ２当たりのＢｒｄＵ陽性細胞数を示す（ｎ＝８）。
【図２９】図２９Ａは、傷害後２４時間後に４ｘ１０６個のＵＴＣで処理したラットにおいて、傷害から３５日目のｖＷＦ染色血管を示す。図２９Ｂは、傷害後２４時間後に４ｘ１０６個のＭＳＣで処理したラットにおいて、傷害から３５日目のｖＷＦ染色血管を示す。
【図３０】傷害後２４時間後にＰＢＳまたは４ｘ１０６個のＵＴＣまたはＭＳＣで処理したラットにおいて、傷害から３５日目の病変境界域のｖＷＦ陽性血管数を示す（ｎ＝８）。
【図３１】傷害後２４時間後にＰＢＳまたは４ｘ１０６個のＵＴＣまたはＭＳＣで処理したラットにおいて、傷害から３５日目の歯状回のｖＷＦ陽性血管数を示す（ｎ＝８）。
【図３２Ａ】病変境界域におけるＢｒｄＵおよびＭａｐ−２陽性二重染色細胞、ならびにＢｒｄＵ−のみの陽性染色細胞を示す。
【図３２Ｂ】歯状回におけるＢｒｄＵおよびＭａｐ−２陽性二重染色細胞、ならびにＢｒｄＵ−のみの陽性染色細胞を示す。
【図１】
0006095893.tif 000034
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
0006095893.tif 000038
【図３Ｄ】
0006095893.tif 000039
【図３Ｅ】
0006095893.tif 000040
【図３Ｆ】
0006095893.tif 000041
【図４Ａ】
0006095893.tif 000042
【図４Ｂ】
0006095893.tif 000043
【図４Ｃ】
0006095893.tif 000044
【図４Ｄ】
0006095893.tif 000045
【図４Ｅ】
0006095893.tif 000046
【図４Ｆ】
0006095893.tif 000047
【図５Ａ】
0006095893.tif 000048
【図５Ｂ】
0006095893.tif 000049
【図５Ｃ】
0006095893.tif 000050
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
0006095893.tif 000052
【図６Ｃ】
0006095893.tif 000053
【図６Ｄ】
0006095893.tif 000054
【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
0006095893.tif 000076
【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
0006095893.tif 000081
【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
0006095893.tif 000084
【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１５Ｆ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１８Ｆ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図１９Ｆ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２０Ｆ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【配列表】
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