(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）Δ５エロンガーゼ活性を有する脂肪酸エロンガーゼ、
ｉｉ）Δ８デサチュラーゼおよび／またはΔ６デサチュラーゼ、
ｉｉｉ）Δ９エロンガーゼおよび／またはΔ６エロンガーゼ、ならびに
ｉｖ）Δ５デサチュラーゼ、
をコードする外因性ポリヌクレオチドを含み、ＤＰＡを合成する組換え植物細胞であって、各ポリヌクレオチドが、前記細胞中における前記ポリヌクレオチドの発現を誘導できる１つまたは複数のプロモーターに作動可能に連結し、ＡＬＡからＤＰＡの変換の効率が、少なくとも１５．４％であり、かつ前記細胞中において前記Δ５エロンガーゼが前記外因性ポリヌクレオチドから発現される場合、前記Δ５エロンガーゼが、少なくとも６０％の効率でＤＰＡを産生する、ＥＰＡに対する活性を有し、かつ前記Δ５エロンガーゼが配列番号６に示される配列または配列番号６と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するアミノ酸を含む、組換え植物細胞。
【請求項２】
Δ４デサチュラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチドにさらに含み、ポリヌクレオチドが、細胞中における前記ポリヌクレオチドの発現を誘導できる１つまたは複数のプロモーターに作動可能に連結され、組換え細胞はＤＨＡを合成する、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記細胞中における前記脂肪酸中におけるＤＨＡの量が、前記細胞中における全脂肪酸の少なくとも３％である、請求項２に記載の細胞。
【請求項４】
前記細胞中における前記脂肪酸中におけるＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡの総計が、前記細胞中における全脂肪酸の少なくとも１５％を含み、前記細胞中における全脂肪酸の少なくとも３％がＤＨＡであり、かつＣ２０：１のレベルが１％未満である、請求項３に記載の細胞。
【請求項５】
ω３デサチュラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチドにさらに含み、ポリヌクレオチドが、細胞中における前記ポリヌクレオチドの発現を誘導できる１つまたは複数のプロモーターに作動可能に連結されている、請求項１から４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項６】
ｉ）前記細胞が、野生型細胞と比較した場合、オレイン酸をエイコセン酸（Ｃ２０：１）に変換する低下した能力を有し、および／または前記オレイン酸の５％未満が前記細胞中においてエイコセン酸に変換される、
ｉｉ）前記細胞が、前記外因性ポリヌクレオチドを欠く対応する細胞と比較して、ＧＬＡからＳＤＡおよび／またはＡＲＡからＥＰＡの増加した変換率を含む、および
ｉｉｉ）ＡＬＡからＥＰＡ、ＤＰＡまたはＤＨＡの変換の効率が、少なくとも１７．３％である、
の内の１つまたは複数の特徴を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７】
ｉ）Δ１７デサチュラーゼ、
ｉｉ）Δ１５デサチュラーゼ、および／または
ｉｉｉ）Δ１２デサチュラーゼ
をコードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含み、
各ポリヌクレオチドが、前記細胞中における前記ポリヌクレオチドの発現を誘導できる１つまたは複数のプロモーターに作動可能に連結する、請求項１から６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項８】
前記デサチュラーゼの内の１種もしくは複数種または全てが、対応するアシル−ＰＣ基質よりも大きなアシル−ＣｏＡ基質に対する活性を有する、請求項１から７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項９】
ＤＰＡを合成できる植物細胞を得る方法であって、
ａ）  ｉ）Δ５エロンガーゼ活性を有する脂肪酸エロンガーゼ、
ｉｉ）Δ８デサチュラーゼおよび／またはΔ６デサチュラーゼ、
ｉｉｉ）Δ９エロンガーゼおよび／またはΔ６エロンガーゼ、ならびに
ｉｖ）Δ５デサチュラーゼ、
をコードする外因性ポリヌクレオチドを植物細胞に導入するステップであり、
各ポリヌクレオチドが、前記細胞中における前記ポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結し、前記Δ５エロンガーゼが配列番号６に示される配列または配列番号６と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するアミノ酸を含む、ステップ、
ｂ）前記細胞中において前記外因性ポリヌクレオチドを発現させるステップ、
ｃ）前記細胞の脂肪酸組成を分析するステップ、ならびに
ｄ）細胞を選択するステップであり、ＡＬＡからＤＰＡの変換の効率が、少なくとも１５．４％であり、前記Δ５エロンガーゼが、少なくとも６０％の効率でＤＰＡを産生する、ＥＰＡに対する活性を有する、ステップ
を含む方法。
【請求項１０】
ａ）でΔ４デサチュラーゼおよび／またはω３デサチュラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチドを細胞にさらに導入することを含み、ポリヌクレオチドが、細胞中における前記ポリヌクレオチドの発現を誘導できる１つまたは複数のプロモーターに作動可能に連結する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ａ）で使用される細胞がＤＰＡを合成することができない細胞である、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１から８のいずれか一項に記載の細胞を含むトランスジェニック植物。
【請求項１３】
請求項１から８のいずれか一項に記載の細胞を含むか、または請求項１２のトランスジェニック植物から得られる種子。
【請求項１４】
不飽和脂肪酸を含有する油の製造方法であって、請求項１から８のいずれか一項に記載の細胞、請求項１２に記載のトランスジェニック植物、および／または請求項１３に記載の種子から油を抽出するステップを含む方法。
【請求項１５】
前記種子が油料種子である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
さらに前記油を医薬組成物の製剤にすることを含む、請求項１４または請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
さらに前記油から飼料を調製することを含む、請求項１４または請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１から８のいずれか一項に記載の細胞、請求項１２に記載のトランスジェニック植物、および／または請求項１３に記載の種子を含む飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母または植物細胞等の組換え細胞中において、長鎖多価不飽和脂肪酸、とりわけエイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸を合成する方法に関する。また、長鎖多価不飽和脂肪酸を産生する組換え細胞または植物も提供される。さらに、本発明は、長鎖多価不飽和脂肪酸の合成方法において使用され得るデサチュラーゼまたはエロンガーゼ活性を有する一群の新規な酵素に関する。特に、本発明は、新規な活性を有するω３デスタウラーゼ（destaurase）、Δ５エロンガーゼおよびΔ６デサチュラーゼを提供する。また、多重遺伝子を有する細胞、特に植物細胞を一過性におよび／または安定して形質転換させるための方法およびＤＮＡ構築物も提供される。
【背景技術】
【０００２】
オメガ−３長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣ−ＰＵＦＡおよびＶＬＣ−ＰＵＦＡ）は、ヒトおよび動物の健康のための重要な化合物として現在広く認識されている。これらの脂肪酸は、食事源から得られ得、またはリノール（ＬＡ、１８：２ω６）もしくはα−リノレン（ＡＬＡ、１８：３ω３）脂肪酸の変換によって得られ得、それらの両方はヒトの食事における必須脂肪酸であると考えられる。ヒトおよび多くの他の脊椎動物は、植物源から得られたＬＡまたはＡＬＡをＶＬＣ−ＰＵＦＡに変換することが可能であるが、非常に低い速度でこの変換を行う。さらに、ほとんどの現代社会において、理想的であると考えられるω６：ω３脂肪酸についての４：１の比以下ではなく、少なくとも９０％の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）がω６脂肪酸のものであるアンバランスな食事がある（Ｔｒａｕｔｗｅｉｎ、２００１）。ヒトに対するエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５ω３）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：６ω３）等のＶＬＣ−ＰＵＦＡの直接の食事源は、ほとんどの場合、魚または魚油に由来する。従って、保健専門家は、ヒトの食事中に著しいレベルのＶＬＣ−ＰＵＦＡを含有する魚を定期的に含めることを推奨してきた。例えば、魚由来ＶＬＣ−ＰＵＦＡ油がますます食品中および乳児用調合乳（infant formula）中に組み込まれている。しかし、世界的なおよび国内の水産業の低下のため、これらの有益な健康増強油の代用源が必要とされている。
【０００３】
高等植物は、動物とは対照的に、１８個の炭素より長い鎖長を有する多価不飽和脂肪酸を合成する能力を欠く。特に、作物および園芸植物は、他の被子植物と共に、ＡＬＡに由来するＥＰＡ、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ、２２：５ω３）およびＤＨＡ等のより長い鎖のω３脂肪酸を合成するために必要な酵素を有さない。従って、植物バイオテクノロジーの重要な目標は、相当量のＶＬＣ−ＰＵＦＡを産生する作物植物の操作であり、従ってそれはこれらの化合物の代用源を提供する。
【０００４】
ＶＬＣ−ＰＵＦＡ生合成経路
微細藻類、蘚類および真菌等の生物中におけるＶＬＣ−ＰＵＦＡの生合成は、一連の酸素依存性不飽和化および伸長反応として通常起きる（図１）。これらの生物中においてＥＰＡを産生する最も一般的な経路としては、Δ６−不飽和化、Δ６−伸長およびΔ５−不飽和化（Δ６−不飽和化経路と称される）が挙げられるが、一方でより一般的でない経路は、Δ９−伸長、Δ８−不飽和化およびΔ５−不飽和化（Δ９−不飽和化経路と称される）を使用する。これらの連続的な不飽和化および伸長反応は、図１の左上部分（ω６）として概略的に示されるω６脂肪酸基質ＬＡまたは図１の右下部分（ω３）として示されるω３基質ＡＬＡのいずれかによって開始することができる。初期Δ６−不飽和化がω６基質ＬＡ上において実施される場合、３種の酵素のシリーズのＶＬＣ−ＰＵＦＡ産物は、ω６脂肪酸ＡＲＡである。ＶＬＣ−ＰＵＦＡ合成生物は、ω３−デサチュラーゼを使用してω６脂肪酸をω３脂肪酸に変換させることができ、このことは、ＥＰＡへのアラキドン酸（ＡＲＡ、２０：４ω６）の変換についての図１におけるΔ１７−デサチュラーゼステップとして示される。ω３−デサチュラーゼファミリーの幾つかのメンバーは、ＬＡからＡＲＡの範囲にわたる様々な基質に作用することができる。植物ω３−デサチュラーゼは、ＡＬＡへのＬＡのΔ１５−不飽和化をしばしば特異的に触媒するが、真菌および酵母のω３−デサチュラーゼは、ＥＰＡへのＡＲＡのΔ１７−不飽和化に対して特異的であり得る（Ｐｅｒｅｉｒａら、２００４ａ；Ｚａｎｋら、２００５）。幾つかの報告は、多種多様なω６基質をそれらの対応するω３産物に変換し得る非特異的ω３−デサチュラーゼが存在し得ることを示唆する（Ｚｈａｎｇら、２００７）。他のω３−デサチュラーゼは、ω３基質に対する選好性（preference）を有し得る（Ｓａｙａｎｏｖａら、２００３）。
【０００５】
これらの生物中におけるＥＰＡからＤＨＡの変換は、相対的に単純であり、ＤＰＡを産生するためのＥＰＡのΔ５−伸長の後、ＤＨＡを産生するためのΔ４−不飽和化から成る（図１）。対照的に、哺乳動物は、Δ４デサチュラーゼから独立した３つの別々の反応によってＤＰＡをＤＨＡに変換するいわゆる「シュプレッヒャー（Sprecher）」経路を使用する（Ｓｐｒｅｃｈｅｒら、１９９５）。
【０００６】
植物、蘚類、微細藻類および下等動物、例えばシノラブディス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）において一般に見出されるフロントエンド（front-end）デサチュラーゼは、ホスファチジルコリン（ＰＣ）基質のｓｎ−２位にエステル化した脂肪酸基質を主に受ける。従って、これらのデサチュラーゼは、アシル−ＰＣ脂質連結フロントエンドデサチュラーゼとして公知である（Ｄｏｍｅｒｇｕｅら、２００３）。対照的に、高等動物フロントエンドデサチュラーゼは、一般に、脂肪酸基質がＰＣではなくＣｏＡに連結されるアシル−ＣｏＡ基質を受ける（Ｄｏｍｅｒｇｕｅら、２００５）。
【０００７】
各ＰＵＦＡおよびＶＬＣ−ＰＵＦＡ伸長反応は、多成分タンパク質複合体によって触媒される４つのステップから成る。第１に、縮合反応は、マロニル−ＣｏＡから脂肪酸までの２Ｃ単位の付加をもたらし、β−ケトアシル中間体の形成をもたらす。次いで、これは、ＮＡＤＰＨによって還元され、その後脱水してエノイル中間体を生成する。この中間体は、最後に２度目に還元されて伸長した脂肪酸を産生する。これらの４つの反応の縮合ステップは基質特異的であるが、他のステップはそうではないと一般に考えられる。実際には、これは、非ネイティブのＶＬＣ−ＰＵＦＡ基質を伸長する際のネイティブ植物伸長機構の効率が低い可能性があるものの、ＶＬＣ−ＰＵＦＡに特異的な（典型的には、「エロンガーゼ」と呼ばれる）縮合酵素が導入される場合、ネイティブ植物伸長機構がＶＬＣ−ＰＵＦＡを伸長することができることを意味する。２００７年に、酵母伸長サイクルデヒドラターゼの同定および特徴付けが公開された（ＤｅｎｉｃおよびＷｅｉｓｓｍａｎ、２００７）。
【０００８】
植物、蘚類および微細藻類におけるＶＬＣ−ＰＵＦＡ不飽和化は、主にアシル−ＰＣプール中における脂肪酸基質に対して天然に起きるが、伸長は、アシル−ＣｏＡプール中における基質に対して起きる。アシル−ＰＣ分子からＣｏＡ担体への脂肪酸の転移は、ホスホリパーゼ（ＰＬＡ）によって行われるが、ＰＣ担体へのアシル−ＣｏＡ脂肪酸の転移は、リゾホスファチジル−コリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）によって行われる（図２）（Ｓｉｎｇｈら、２００５）。不飽和化の前に起きなければならないアシル交換による流量の低下は、伸長後に起き得るか、またはその逆であり得るが、アシル−ＣｏＡ基質に対する特異性を有するデサチュラーゼを使用することによって克服され得る（Ｈｏｆｆｍａｎｎら、２００８）。
【０００９】
ＶＬＣ−ＰＵＦＡの操作された産生
ほとんどのＶＬＣ−ＰＵＦＡ代謝操作は、好気性Δ６−不飽和化／伸長経路を使用して行われてきた。シアノバクテリアシネコシスティス（cyanobacterium Synechocystis）に由来するΔ６−デサチュラーゼを使用したタバコ中におけるγ−リノレン酸（ＧＬＡ、１８：３ω６）の生合成が、１９９６年に最初に報告された（ＲｅｄｄｙおよびＴｈｏｍａｓ、１９９６）。より最近、ＧＬＡは、ベニバナ（７３％ＧＬＡ、Ｋｎａｕｆら、２００６）およびダイズ（２８％ＧＬＡ、Ｓａｔｏら、２００４）等の作物植物中において産生されている。ＥＰＡおよびＤＨＡ等のＶＬＣ−ＰＵＦＡの産生は、含まれる不飽和化および伸長ステップの増加した数のためにより複雑になった操作を含む。陸上植物中におけるＥＰＡ産生は、Ｑｉら（２００４）によって最初に報告されたが、Ｑｉらは、イソクリシス・ガルバナ（Isochrysis galbana）に由来するΔ９−エロンガーゼ、ユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）に由来するΔ８−デサチュラーゼおよびモルティエラ・アルピナ（Mortierella alpina）に由来するΔ５−デサチュラーゼをコードする遺伝子をアラビドプシス（Arabidopsis）内に導入して最高３％のＥＰＡを産生させた。この研究には、Ａｂｂａｄｉら（２００４）が続いたが、Ａｂｂａｄｉらは、フィスコミトレラ・パテンス（Physcomitrella patens）に由来するΔ６−デサチュラーゼおよびΔ６−エロンガーゼならびにフェオダクチルム・トリコルヌツム（Phaeodactylum tricornutum）に由来するΔ５−デサチュラーゼをコードする遺伝子を使用したアマの種子中における最高０．８％のＥＰＡの産生を報告した。
【００１０】
ＤＨＡ産生および今までに報告されたＶＬＣ−ＰＵＦＡ産生の最も高いレベルの第１の報告が、ＷＯ０４／０１７４６７においてあり、その中で、サプロレグニア・ディクリナ（Saprolegnia diclina）Δ６−デサチュラーゼ、モルティエラ・アルピナΔ６−デサチュラーゼ、モルティエラ・アルピナΔ５−デサチュラーゼ、サプロレグニア・ディクリナΔ４−デサチュラーゼ、サプロレグニア・ディクリナΔ１７−デサチュラーゼ、モルティエラ・アルピナΔ６−エロンガーゼおよびパブロバ・ルテリ（Pavlova lutheri）Δ５−エロンガーゼをコードする遺伝子を導入することによる、ダイズの、種子ではなく胚の中における３％のＤＨＡの産生が記載されている。ＤＨＡをも産生する胚中における最大ＥＰＡレベルは１９．６％であったが、これは、ＥＰＡからＤＨＡの変換の効率が劣っていたことを示す（ＷＯ２００４／０７１４６７）。この知見は、Ｒｏｂｅｒｔら（２００５）によって公開された知見と同様であったが、その知見において、ＥＰＡからＤＨＡへの流量は低く、ダニオ・レリオ（Danio rerio）Δ５／６−デサチュラーゼ、シノラブディス・エレガンスΔ６−エロンガーゼならびにパブロバ・サリナ（Pavlova salina）Δ５−エロンガーゼおよびΔ４−デサチュラーゼを使用してアラビドプシス中において３％のＥＰＡおよび０．５％のＤＨＡを産生した。２００５年においても、Ｗｕらは、ピシウム・イレグラレ（Pythium irregulare）Δ６−デサチュラーゼ、スラウストキトリド（Thraustochytrid）Δ５−デサチュラーゼ、フィスコミトレラ・パテンスΔ６−エロンガーゼ、カレンデュラ・オフィシアナリス（Calendula officianalis）Δ１２−デサチュラーゼ、スラウストキトリドΔ５−エロンガーゼ、フィトフトラ・インフェスタンス（Phytophthora infestans）Δ１７−デサチュラーゼ、オンコルヒュンクス・ミキス（Oncorhyncus mykiss）ＶＬＣ−ＰＵＦＡエロンガーゼ、スラウストキトリドΔ４−デサチュラーゼおよびスラウストキトリドＬＰＣＡＴを使用したブラッシカ・ユンケア（Brassica juncea）中における２５％のＡＲＡ、１５％のＥＰＡおよび１．５％のＤＨＡの産生を公開した（Ｗｕら、２００５）。
【発明の概要】
【００１１】
従って、特に油料種子植物の種子の中における、組換え細胞中におけるＬＣ−ＰＵＦＡのより効率的な産生の必要性が残っている。
【００１２】
本発明の概要
本発明者らは、初めて、組換え細胞中においてＥＰＡをＤＰＡに効率的に変換するΔ５エロンガーゼを同定した。
【００１３】
従って、本発明は、Δ５エロンガーゼ活性を有する脂肪酸エロンガーゼをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む組換え細胞、好ましくは植物細胞、より好ましくは植物種子細胞をさらに提供するものであって、細胞中において、好ましくは植物細胞中においてエロンガーゼが外因性ポリヌクレオチドから発現される場合、エロンガーゼは、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％または少なくとも７５％の効率でＤＰＡを産生するＥＰＡに対する活性を有する。
【００１４】
一実施形態において、エロンガーゼは、配列番号６において提供される配列、その生物学的に活性な断片または配列番号６と少なくとも４７％同一であるアミノ酸配列を有するアミノ酸を含む。
【００１５】
他の一実施形態において、細胞は、
ｉ）Δ８デサチュラーゼおよび／またはΔ６デサチュラーゼ、
ｉｉ）Δ９エロンガーゼおよび／またはΔ６エロンガーゼ、
ｉｉｉ）Δ５デサチュラーゼ、ならびに
ｉｖ）場合によって、Δ４デサチュラーゼおよび／またはω３デサチュラーゼ
をコードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含み、各ポリヌクレオチドは、細胞中における前記ポリヌクレオチドの発現を誘導（direct）できる１つまたは複数のプロモーターに作動可能に連結する。
【００１６】
本発明者らは、新規な性質（property）を有するω３デサチュラーゼをも同定した。ω３デサチュラーゼは、ＥＰＡ、下流の脂肪酸ＤＰＡおよびＤＨＡならびに他のω３ＶＬＣ−ＰＵＦＡを生成するように設計された組換え経路において有用である。
【００１７】
従って、本発明は、ω３デサチュラーゼ活性を有する脂肪酸デサチュラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む組換え細胞、好ましくは植物細胞、より好ましくは植物種子細胞を提供するものであって、デサチュラーゼが細胞中における外因性ポリヌクレオチドから発現される場合、デサチュラーゼは、ＡＲＡからＥＰＡ、ＤＧＬＡからＥＴＡ、ＧＬＡからＳＤＡの内の少なくとも１つ、ＡＲＡからＥＰＡおよびＤＧＬＡからＥＴＡの両方、ＡＲＡからＥＰＡおよびＧＬＡからＳＤＡの両方、またはこれらの３つ全てを不飽和化することができる。
【００１８】
デサチュラーゼは、好ましくはフロントエンドデサチュラーゼである。
【００１９】
他の一実施形態において、デサチュラーゼは、そのアシル鎖中に少なくとも３個の炭素−炭素二重結合を有するＣ２０脂肪酸（好ましくは、ＡＲＡ）に対するΔ１７デサチュラーゼ活性を有する。
【００２０】
他の一実施形態において、デサチュラーゼは、そのアシル鎖中に３個の炭素−炭素二重結合を有するＣ１８脂肪酸（好ましくは、ＧＬＡ）に対するΔ１５デサチュラーゼ活性を有する。
【００２１】
デサチュラーゼは、好ましくは、対応するアシル−ＰＣ基質よりもアシル−ＣｏＡ基質に対して、より大きな活性を有する。
【００２２】
一実施形態において、アシル−ＣｏＡ基質はＡＲＡ−ＣｏＡであり、アシル−ＰＣ基質は、ＰＣのｓｎ−２位でＡＲＡを含む。
【００２３】
さらに他の一実施形態において、細胞は植物細胞であり、デサチュラーゼは、細胞中において外因性ポリヌクレオチドから発現される場合、少なくとも４０％の効率でＥＰＡを産生する、ＡＲＡに対する活性を有する。
【００２４】
特定の一実施形態において、デサチュラーゼは、配列番号１５、１７もしくは２０において提供される配列、その生物学的に活性な断片、または配列番号１５と少なくとも３５％同一である、配列番号１７と少なくとも６０％同一であるおよび／もしくは配列番号２０と少なくとも６０％同一であるアミノ酸配列を有するアミノ酸を含む。
【００２５】
さらに、本発明者らは、植物中および／または酵母中における対応するω６脂肪酸基質に対するよりもω３脂肪酸基質に対して、より大きな変換効率を有するΔ６デサチュラーゼをコードする遺伝子を同定した。このΔ６デサチュラーゼは、Δ８デサチュラーゼ活性をも示す。植物中における組換えＬＣ−ＰＵＦＡ経路におけるこのΔ６デサチュラーゼまたはω３不飽和化脂肪酸基質に対する高特異性を有する他のデサチュラーゼの使用は、ω３不飽和化脂肪酸基質に対する選好性のないデサチュラーゼの使用と比較してＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡのレベルを増加させる。
【００２６】
従って、本発明は、Δ６デサチュラーゼ活性を有する脂肪酸デサチュラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む組換え細胞、好ましくは植物細胞、より好ましくは植物種子細胞をさらに提供するものであって、デサチュラーゼは、以下の
ｉ）好ましくは植物細胞中における、脂肪酸基質としてのＬＡよりもＡＬＡに対して、より大きなΔ６デサチュラーゼ活性、
ｉｉ）好ましくは植物細胞中における、脂肪酸基質としてＰＣのｓｎ−２位に接合したＡＬＡに対するよりも脂肪酸基質としてのＡＬＡ−ＣｏＡに対して、より大きなΔ６デサチュラーゼ活性、および
ｉｉｉ）好ましくは植物細胞中における、ＥＴｒＡに対するΔ８デサチュラーゼ活性
の内の少なくとも２つ、好ましくは３つ全てを有することをさらに特徴とする。
【００２７】
本発明は、Δ６デサチュラーゼ活性を有する脂肪酸デサチュラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む組換え細胞、好ましくは植物細胞、より好ましくは植物種子細胞をさらに提供するものであって、デサチュラーゼは、対応するω６基質に対するよりもω３基質に対して、より大きな活性を有し、デサチュラーゼが細胞中において外因性ポリヌクレオチドから発現される場合に、デサチュラーゼが、少なくとも５％、少なくとも７．５％もしくは少なくとも１０％の効率で、または酵母細胞中において発現される場合に少なくとも３５％の効率でＳＤＡを産生する、ＡＬＡに対する活性を有する。
【００２８】
一実施形態において、デサチュラーゼは、好ましくは植物細胞中において、脂肪酸基質としてのＬＡよりもＡＬＡに対して、より大きなΔ６デサチュラーゼ活性を有する。
【００２９】
好ましくは、Δ６デサチュラーゼは、好ましくは植物細胞中において、ＬＡと比較して基質としてのＡＬＡに対する少なくとも約２倍大きなΔ６デサチュラーゼ活性、少なくとも３倍大きな活性、少なくとも４倍大きな活性または少なくとも５倍大きな活性を有する。
【００３０】
他の一実施形態において、Δ６デサチュラーゼは、好ましくは植物細胞中において、脂肪酸基質としての、ＰＣのｓｎ−２位に接合したＡＬＡに対するよりも、脂肪酸基質としてのＡＬＡ−ＣｏＡに対して、より大きな活性を有する。
【００３１】
好ましくは、Δ６デサチュラーゼは、好ましくは植物細胞中において、脂肪酸基質としての、ＰＣのｓｎ−２位に接合したＡＬＡに対するよりも、脂肪酸基質としてのＡＬＡ−ＣｏＡに対する少なくとも約５倍大きなΔ６デサチュラーゼ活性または少なくとも１０倍大きな活性を有する。
【００３２】
Δ６デサチュラーゼは、好ましくはフロントエンドデサチュラーゼである。
【００３３】
さらに他の一実施形態において、本発明による細胞は、
ｉ）Δ６エロンガーゼ、
ｉｉ）Δ５デサチュラーゼ、
ｉｉｉ）Δ５エロンガーゼ、ならびに
ｉｖ）場合によって、Δ４デサチュラーゼおよび／またはω３デサチュラーゼ
をコードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含み、各ポリヌクレオチドは、細胞中における前記ポリヌクレオチドの発現を誘導できる１つまたは複数のプロモーターに作動可能に連結する。
【００３４】
本発明の細胞中におけるΔ６デサチュラーゼは、好ましくは、ＥＴＡに対する検出可能なΔ５デサチュラーゼ活性を有さない。
【００３５】
Δ６デサチュラーゼは、好ましくは、配列番号１０において提供される配列、その生物学的に活性な断片または配列番号１０と少なくとも７７％同一であるアミノ酸配列を有するアミノ酸を含む。
【００３６】
他の一実施形態において、Δ６デサチュラーゼは、配列番号８において提供される配列、その生物学的に活性な断片または配列番号８と少なくとも６７％同一であるアミノ酸配列を有するアミノ酸を含み、Δ８デサチュラーゼ活性を有する。
【００３７】
本発明者らは、Δ９エロンガーゼ、Δ８デサチュラーゼおよびΔ５デサチュラーゼを発現する組換え細胞が、より効率的に脂肪酸基質をＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡに変換することができることをも見出した。
【００３８】
従って、本発明は、
ｉ）Δ９エロンガーゼ、
ｉｉ）Δ８デサチュラーゼ、
ｉｉｉ）Δ５デサチュラーゼ、
ｉｖ）場合によって、Δ５エロンガーゼ、および
ｖ）Δ５エロンガーゼが存在する場合、場合によって、Δ４デサチュラーゼ
をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む組換え細胞、好ましくは植物細胞、より好ましくは植物種子細胞をさらに提供するものであって、各ポリヌクレオチドは、細胞中における前記ポリヌクレオチドの発現を誘導できる１つまたは複数のプロモーターに作動可能に連結し、細胞中における全脂肪酸の少なくとも１５％、少なくとも２０％または少なくとも２５％は、それらのアシル鎖中に少なくとも２０個の炭素および少なくとも３個の炭素−炭素二重結合を含む。
【００３９】
一実施形態において、本発明の細胞中における脂肪酸中におけるＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡの総計は、細胞中における全脂肪酸の少なくとも１５％、少なくとも２０％または少なくとも２５％を含む。
【００４０】
更なる一実施形態において、本発明による細胞は、野生型植物と比較した場合、オレイン酸をエイコセン酸（Ｃ２０：１）に変換する低下した能力を有し、および／またはオレイン酸の５％未満が細胞中においてエイコセン酸に変換される。
【００４１】
特定の一実施形態において、細胞中における全脂肪酸は、１％未満のＣ２０：１を有する。
【００４２】
更なる一実施形態において、本発明による細胞は、野生型細胞と比較した場合、低下した内因性Δ１５デサチュラーゼ活性を有し、および／またはＬＡの１０％未満が細胞中においてＡＬＡに変換される。
【００４３】
特定の一実施形態において、内因性Δ１５デサチュラーゼは、好ましくはアシル基がＬＡである場合、対応するアシル−ＣｏＡ基質に対するよりもアシル−ＰＣ基質に対して、より大きな活性を有する。
【００４４】
更なる一実施形態において、本発明の細胞は、外因性ポリヌクレオチドを欠く対応する細胞と比較して、ＧＬＡからＳＤＡおよび／またはＡＲＡからＥＰＡの増加した変換率（conversion）をさらに含む。
【００４５】
一実施形態において、本発明の細胞中における脂肪酸中におけるＤＨＡの量は、細胞中における全脂肪酸の少なくとも３％、少なくとも５％または少なくとも１０％である。
【００４６】
他の一実施形態において、本発明の細胞中におけるＬＡからＡＲＡおよび／またはＡＬＡからＥＰＡの変換の効率は、少なくとも８０％または少なくとも９０％である。
【００４７】
一実施形態において、Δ９エロンガーゼは、配列番号２２において提供される配列、その生物学的に活性な断片または配列番号２２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するアミノ酸を含む。
【００４８】
更なる一実施形態において、Δ８デサチュラーゼは、配列番号２４において提供される配列、その生物学的に活性な断片または配列番号２４と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するアミノ酸を含む。
【００４９】
さらに他の一実施形態において、Δ５デサチュラーゼは、配列番号２６もしくは配列番号１３において提供される配列、その生物学的に活性な断片または配列番号２６および／もしくは配列番号１３と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するアミノ酸を含む。
【００５０】
本発明者らは、Δ６−デサチュラーゼ、Δ６エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ５エロンガーゼおよびΔ４デサチュラーゼを発現する遺伝子のセット、または特にデサチュラーゼがアシル−ＣｏＡ基質に対して活性である遺伝子の同様のセットを、実質的なレベルのＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡを合成するために使用することができることを示す結果を得た。
【００５１】
従って、本発明は、
ｉ）Δ６エロンガーゼおよび／またはΔ９エロンガーゼ、
ｉｉ）Δ６デサチュラーゼおよび／またはΔ８デサチュラーゼ、
ｉｉｉ）Δ５デサチュラーゼ、
ｉｖ）Δ５エロンガーゼ、
ｖ）Δ４デサチュラーゼ、ならびに
ｖｉ）場合によって、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ
をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む組換え細胞、好ましくは植物細胞、より好ましくは植物種子細胞をさらに提供するものであって、各ポリヌクレオチドは、細胞中における前記ポリヌクレオチドの発現を誘導できる１つまたは複数のプロモーターに作動可能に連結し、
ａ）ＡＬＡからＥＰＡ、ＤＰＡまたはＤＨＡの変換の効率が、少なくとも１７．３％または少なくとも２３％である性質、
ｂ）ＡＬＡからＤＰＡまたはＤＨＡの変換の効率が、少なくとも１５．４％または少なくとも２１％である性質、
ｃ）ＡＬＡからＤＨＡの変換の効率が、少なくとも９．５％または少なくとも１０．８％である性質、および
ｄ）ＥＰＡからＤＨＡの変換の効率が、少なくとも４５％または少なくとも５０％である性質
の内の１つもしくは複数または全てを特徴とし、好ましくはさらに、細胞中における全脂肪酸の少なくとも４％がＤＨＡであることを特徴とする。
【００５２】
好ましくは、細胞中におけるトリアシルグリセロール中に組み込まれた全脂肪酸の少なくとも６％、少なくとも１１％または少なくとも１５％が、ＤＨＡである。
【００５３】
一実施形態において、ＤＨＡは、細胞中におけるＳＤＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡの合計の２０〜６５％、好ましくは４０〜６５％を構成する。
【００５４】
好ましくは、細胞中におけるω３脂肪酸の０．１〜２５％はＳＤＡであり、０．１〜１０％はＥＴＡであり、０．１〜６０％はＥＰＡであり、０．１〜５０％はＤＰＡであり、および３０〜９５％はＤＨＡであり、より好ましくは、細胞中におけるω３脂肪酸の０．１〜２５％はＳＤＡであり、０．１〜１０％はＥＴＡであり、０．１〜５０％はＥＰＡであり、０．１〜５０％はＤＰＡであり、および４０〜９５％はＤＨＡである。
【００５５】
Δ４デサチュラーゼは、好ましくは、配列番号７３において提供される配列、その生物学的に活性な断片または配列番号７３と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するアミノ酸を含む。
【００５６】
他の一態様において、本発明は、
ｉ）Δ６エロンガーゼおよび／またはΔ９エロンガーゼ、
ｉｉ）Δ６デサチュラーゼおよび／またはΔ８デサチュラーゼ、
ｉｉｉ）Δ５デサチュラーゼ、
ｉｖ）Δ５エロンガーゼ、ならびに
ｖ）場合によって、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ
をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む組換え細胞、好ましくは植物細胞、より好ましくは植物種子細胞を提供するものであって、各ポリヌクレオチドは、細胞中における前記ポリヌクレオチドの発現を誘導できる１つまたは複数のプロモーターに作動可能に連結し、
ａ）ＡＬＡからＥＰＡまたはＤＰＡの変換の効率が少なくとも１７．３％または少なくとも２３％である性質、および
ｂ）ＡＬＡからＤＰＡの変換の効率が少なくとも１５．４％または少なくとも２１％である性質
の内の１つもしくは複数または全てを特徴とし、好ましくはさらに、細胞中における全脂肪酸の少なくとも４％がＤＰＡであることを特徴とする。
【００５７】
好ましくは、細胞中におけるトリアシルグリセロール中に組み込まれた全脂肪酸の少なくとも６％、少なくとも１１％または少なくとも１５％が、ＤＰＡである。
【００５８】
ＤＰＡは、好ましくは、細胞中におけるＳＤＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡおよびＤＰＡの合計の２０〜６５％、より好ましくは４０〜６５％を構成する。
【００５９】
好ましくは、細胞中におけるω３脂肪酸の０．１〜３５％はＳＤＡであり、０．１〜１５％はＥＴＡであり、０．１〜６０％はＥＰＡであり、および３０〜７５％はＤＰＡであり、より好ましくは、細胞中におけるω３脂肪酸の０．１〜３５％はＳＤＡであり、０．１〜１５％はＥＴＡであり、０．１〜５０％はＥＰＡであり、および４０〜７５％はＤＰＡである。
【００６０】
一実施形態において、Δ６エロンガーゼは、配列番号４において提供される配列、その生物学的に活性な断片または配列番号４と少なくとも５５％同一であるアミノ酸配列を有するアミノ酸を含む。
【００６１】
他の一実施形態において、Δ６デサチュラーゼは、配列番号８において提供される配列、その生物学的に活性な断片または配列番号８と少なくとも６７％同一であるアミノ酸配列を有するアミノ酸を含む。
【００６２】
一実施形態において、Δ５デサチュラーゼは、配列番号２６において提供される配列、その生物学的に活性な断片または配列番号２６と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するアミノ酸を含む。
【００６３】
さらに他の一実施形態において、Δ５エロンガーゼは、配列番号６において提供される配列、その生物学的に活性な断片または配列番号６と少なくとも４７％同一であるアミノ酸配列を有するアミノ酸を含む。
【００６４】
一実施形態において、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼは、配列番号７５もしくは配列番号１０８において提供される配列、その生物学的に活性な断片または配列番号７５および／もしくは配列番号１０８と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するアミノ酸を含む。
【００６５】
上記の酵素の内の任意の２種、３種、４種または全ての組合せは、本発明に明らかに包含される。
【００６６】
さらに他の一実施形態において、本発明の細胞、好ましくは植物細胞、より好ましくは植物種子細胞は、
ｉ）Δ１７デサチュラーゼ、
ｉｉ）Δ１５デサチュラーゼ、および／または
ｉｉｉ）Δ１２デサチュラーゼ
をコードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含み、各ポリヌクレオチドは、細胞中における前記ポリヌクレオチドの発現を誘導できる１つまたは複数のプロモーターに作動可能に連結する。
【００６７】
更なる一実施形態において、本発明の細胞中において外因性ポリヌクレオチドから発現したデサチュラーゼの内の１種もしくは複数種または全ては、対応するアシル−ＰＣ基質よりもアシル−ＣｏＡ基質に対して、より大きな活性を有する。特定の一実施形態において、Δ６デサチュラーゼおよびΔ５デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼおよびΔ４デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼおよびΔ４デサチュラーゼ、もしくはΔ６デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼおよびΔ４デサチュラーゼの内の３種全て、またはこれらの組合せの各々の他に、Δ１７デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼおよび／もしくはΔ１２デサチュラーゼのいずれかは、対応するアシル−ＰＣ基質よりもそれらのアシル−ＣｏＡ基質に対して、より大きな活性を有する。本実施形態において、細胞中において外因性ポリヌクレオチドから発現された他のデサチュラーゼは、対応するアシル−ＰＣ基質よりもアシル−ＣｏＡ基質に対して、より大きな活性を有することができるか、または有することができない。理解されるように、各酵素に対する好ましいアシル−ＣｏＡ基質は異なる。
【００６８】
本発明は、Δ６エロンガーゼおよびΔ９エロンガーゼ活性を有する脂肪酸エロンガーゼをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む組換え細胞、好ましくは植物細胞、より好ましくは植物種子細胞をさらに提供するものであって、エロンガーゼは、Δ９エロンガーゼ活性より大きなΔ６エロンガーゼ活性を有する。
【００６９】
一実施形態において、エロンガーゼは、少なくとも５０％もしくは少なくとも６０％であるＥＴＡを産生するＳＤＡにおける変換の効率を有し、および／または少なくとも６％もしくは少なくとも９％であるＥＴｒＡを産生するＡＬＡにおける変換効率を有する。
【００７０】
好ましくは、エロンガーゼは、Δ９エロンガーゼ活性より少なくとも約６．５倍大きなΔ６エロンガーゼ活性を有する。
【００７１】
さらに他の一実施形態において、エロンガーゼは、検出可能なΔ５エロンガーゼ活性を有さない。
【００７２】
エロンガーゼは、好ましくは、配列番号４において提供される配列、その生物学的に活性な断片または配列番号４と少なくとも５５％同一であるアミノ酸配列を有するアミノ酸を含む。
【００７３】
さらに他の一実施形態において、細胞は、
ｉ）Δ８デサチュラーゼおよび／またはΔ６デサチュラーゼ、
ｉｉ）Δ５デサチュラーゼ、
ｉｉｉ）Δ５エロンガーゼ、ならびに
ｉｖ）場合によって、Δ４デサチュラーゼおよび／またはω３デサチュラーゼ
をコードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含み、各ポリヌクレオチドは、細胞中における前記ポリヌクレオチドの発現を誘導できる１つまたは複数のプロモーターに作動可能に連結する。
【００７４】
本発明は、Δ５デサチュラーゼ活性を有する脂肪酸デサチュラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む組換え細胞、好ましくは植物細胞、より好ましくは植物種子細胞をさらに提供するものであって、デサチュラーゼは、配列番号１３において提供される配列、その生物学的に活性な断片または配列番号１３と少なくとも５３％同一であるアミノ酸配列を有するアミノ酸を含む。
【００７５】
本発明は、Δ９エロンガーゼ活性を有する脂肪酸エロンガーゼをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む組換え細胞、好ましくは植物細胞、より好ましくは植物種子細胞をさらに提供するものであって、エロンガーゼは、配列番号２８、９４および９６のいずれか１つにおいて提供される配列、その生物学的に活性な断片、配列番号２８と少なくとも８１％同一であるアミノ酸配列、または配列番号９４および／もしくは配列番号９６と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を有するアミノ酸を含む。
【００７６】
一実施形態において、Δ９エロンガーゼは、配列番号９４もしくは配列番号９６において提供される配列、その生物学的に活性な断片、または配列番号９４および／もしくは配列番号９６と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を有するアミノ酸を含み、エロンガーゼは、対応するω３基質よりもω６基質に対して、より大きな活性を有する。より好ましくは、Δ９エロンガーゼは、対応するω３基質（例えば、ＡＬＡ）よりも少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも４倍大きなω６基質（例えば、ＬＡ）に対する活性を有する。
【００７７】
他の一態様において、本発明は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む組換え細胞を提供するものであって、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼは、配列番号１０８において提供される配列、その生物学的に活性な断片または配列番号１０８と少なくとも５４％同一であるアミノ酸配列を有するアミノ酸を含む。
【００７８】
本発明による細胞の一実施形態において、デサチュラーゼおよび／もしくはエロンガーゼまたは多数のデサチュラーゼおよび／もしくはエロンガーゼは、微細藻類から精製できる。好ましい微細藻類は、パブロバ属種（Pavlova spp）、ピラミモナス属種（Pyramimonas spp）およびミクロモナス属種（Micromonas spp）である。
【００７９】
好ましい一実施形態において、本発明による細胞は、真核細胞である。例えば、細胞は、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞または酵母細胞であってよい。細胞は、組織培養における細胞、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞および／または単離された細胞であってよい。
【００８０】
一実施形態において、細胞は、植物中のものおよび／または成熟植物種子細胞である。植物は、野外（field）にあるものであってよいか、もしくは植物の部分として採取されてよく、または種子は、採取された種子であってよい。
【００８１】
特定の一実施形態において、植物または植物の種子は、それぞれ油料種子植物または油料種子である。
【００８２】
当業者である対象者（skilled addressee）が理解するように、定義されたエロンガーゼおよび／またはデサチュラーゼのより多くのものの内の１種を同一細胞中において共発現させることができる。
【００８３】
更なる一実施形態において、本発明の細胞は、長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣ−ＰＵＦＡ）を合成することができ、細胞は、前記ＬＣ−ＰＵＦＡを合成することができない細胞に由来する。
【００８４】
本発明者らは、サイレンシングサプレッサーの共発現は、特に最初に形質転換された植物からリペイトされた（repated）世代にわたって、植物細胞中における脂肪酸生合成酵素のレベルを増強し得ることをも見出した。従って、好ましい一実施形態において、本発明の細胞、好ましくは植物細胞、より好ましくは植物貯蔵器官細胞または種子細胞は、サイレンシングサプレッサーをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。
【００８５】
好ましくは、サイレンシングサプレッサーをコードする外因性ポリヌクレオチドは、植物貯蔵器官特異的プロモーターに作動可能に連結する。一実施形態において、植物貯蔵器官特異的プロモーターは、種子特異的プロモーター、または発育中の種子中において選好的に発現される子葉（cotyledon）特異的プロモーターもしくは内乳（endosperm）特異的プロモーターである。
【００８６】
本発明は、１種または複数種の長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣ−ＰＵＦＡ）を合成できる細胞、好ましくは植物細胞、より好ましくは植物種子細胞を得る方法であって、
ａ）脂肪酸ω３デサチュラーゼ活性をコードする外因性ポリヌクレオチドを細胞、好ましくは前記ＬＣ−ＰＵＦＡを合成することができない細胞中に導入するステップであり、ポリヌクレオチドが、細胞中における前記ポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結する、ステップ、
ｂ）細胞中において外因性ポリヌクレオチドを発現させるステップ、
ｃ）細胞の脂肪酸組成を分析するステップ、ならびに
ｄ）ＡＲＡからＥＰＡ、ＤＧＬＡからＥＴＡ、ＧＬＡからＳＤＡの内の少なくとも１つ、ＡＲＡからＥＰＡおよびＤＧＬＡからＥＴＡの両方、ＡＲＡからＥＰＡおよびＧＬＡからＳＤＡの両方、またはこれらの３つ全てを不飽和化し得る細胞を選択するステップ
を含む方法をさらに提供する。
【００８７】
一実施形態において、選択される細胞は、本発明による細胞である。特に、細胞は、本明細書において記載される通りのデサチュラーゼおよびエロンガーゼの組合せをさらに含むことができる。
【００８８】
本発明は、１種または複数種の長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣ−ＰＵＦＡ）を合成できる細胞、好ましくは植物細胞、より好ましくは植物種子細胞を得る方法であって、
ａ）脂肪酸Δ５エロンガーゼをコードする外因性ポリヌクレオチドを細胞、好ましくは前記ＬＣ−ＰＵＦＡを合成することができない細胞中に導入するステップであり、ポリヌクレオチドが、細胞中における前記ポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結する、ステップ、
ｂ）細胞中において外因性ポリヌクレオチドを発現させるステップ、
ｃ）細胞の脂肪酸組成を分析するステップ、および
ｄ）細胞を選択するステップであり、Δ５エロンガーゼが、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％または少なくとも７５％の効率でＤＰＡを産生するＥＰＡに対する活性を有する、ステップ
を含む方法をさらに提供する。
【００８９】
本発明の方法の一実施形態において、選択される細胞は、本発明による細胞である。特に、細胞は、本明細書において記載される通りのデサチュラーゼおよびエロンガーゼの組合せをさらに含むことができる。
【００９０】
本発明は、１種または複数種の長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣ−ＰＵＦＡ）を合成できる細胞、好ましくは植物細胞、より好ましくは植物種子細胞を得る方法をさらに提供するものであって、方法は、
ａ）脂肪酸Δ６デサチュラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチドを細胞、好ましくは前記ＬＣ−ＰＵＦＡを合成することができない細胞中に導入するステップであり、ポリヌクレオチドが、細胞中における前記ポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結する、ステップ、
ｂ）細胞中において外因性ポリヌクレオチドを発現させるステップ、
ｃ）細胞の脂肪酸組成を分析するステップ、ならびに
ｄ）以下の
ｉ）好ましくは植物細胞中における、脂肪酸基質としてのＬＡよりもＡＬＡに対して、より大きなΔ６デサチュラーゼ活性、
ｉｉ）好ましくは植物細胞中における、脂肪酸基質としてＰＣのｓｎ−２位に接合したＡＬＡに対するよりも脂肪酸基質としてのＡＬＡ−ＣｏＡに対して、より大きなΔ６デサチュラーゼ活性、および
ｉｉｉ）好ましくは植物細胞中における、ＡＬＡに対するΔ６デサチュラーゼ活性およびＥＴｒＡに対するΔ８デサチュラーゼ
の内の少なくとも２つ、好ましくは３つ全てを有する細胞を選択するステップ
を含む。
【００９１】
本発明は、１種または複数種の長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣ−ＰＵＦＡ）を合成できる細胞、好ましくは植物細胞、より好ましくは植物種子細胞を得る方法であって、
ａ）脂肪酸Δ６デサチュラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチドを細胞、好ましくは前記ＬＣ−ＰＵＦＡを合成することができない細胞中に導入するステップであり、ポリヌクレオチドが、細胞中における前記ポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結する、ステップ、
ｂ）細胞中において外因性ポリヌクレオチドを発現させるステップ、
ｃ）細胞の脂肪酸組成を分析するステップ、ならびに
ｄ）対応するω６基質よりもω３基質に対して、より大きな活性を有するΔ６デサチュラーゼ活性を有し、酵母細胞中において発現される場合、少なくとも５％、少なくとも７．５％または少なくとも１０％または少なくとも３５％の効率でＳＤＡを産生するＡＬＡに対する活性を有する細胞を選択するステップ
を含む方法をさらに提供する。
【００９２】
一実施形態において、選択される細胞は、本発明による細胞である。特に、細胞は、本明細書において記載される通りのデサチュラーゼおよびエロンガーゼの組合せをさらに含むことができる。
【００９３】
本発明は、１種または複数種の長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣ−ＰＵＦＡ）を合成できる細胞、好ましくは植物細胞、より好ましくは植物種子細胞を得る方法であって、
ａ）
ｉ）Δ９エロンガーゼ、
ｉｉ）Δ８デサチュラーゼ、
ｉｉｉ）Δ５デサチュラーゼ、
ｉｖ）場合によって、Δ５エロンガーゼ、および
ｖ）Δ５エロンガーゼが存在する場合、場合によって、Δ４デサチュラーゼ
をコードする外因性ポリヌクレオチドを細胞、好ましくは前記ＬＣ−ＰＵＦＡを合成することができない細胞中に導入するステップであり、各ポリヌクレオチドが、細胞中における前記ポリヌクレオチドの発現を誘導できる１つまたは複数のプロモーターに作動可能に連結する、ステップ
ｂ）細胞中において外因性ポリヌクレオチドを発現させるステップ、
ｃ）細胞の脂肪酸組成を分析するステップ、ならびに
ｄ）細胞を選択するステップであり、全脂肪酸の少なくとも１５％、少なくとも２０％または少なくとも２５％が、それらのアシル鎖中に少なくとも２０個の炭素および少なくとも３個の炭素−炭素二重結合を含む、ステップ
を含む方法をさらに提供する。
【００９４】
一実施形態において、選択される細胞は、本発明による細胞である。
【００９５】
本発明は、１種または複数種の長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣ−ＰＵＦＡ）を合成できる細胞、好ましくは植物細胞、より好ましくは植物種子細胞を得る方法であって、
ａ）
ｉ）Δ６エロンガーゼおよび／またはΔ９エロンガーゼ、
ｉｉ）Δ６デサチュラーゼおよび／またはΔ８デサチュラーゼ、
ｉｉｉ）Δ５デサチュラーゼ、
ｉｖ）Δ５エロンガーゼ、
ｖ）Δ４デサチュラーゼ、ならびに
ｖｉ）場合によって、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ
をコードする外因性ポリヌクレオチドを細胞、好ましくは前記ＬＣ−ＰＵＦＡを合成することができない細胞中に導入するステップであり、各ポリヌクレオチドが、細胞中における前記ポリヌクレオチドの発現を誘導できる１つまたは複数のプロモーターに作動可能に連結する、ステップ、
ｂ）細胞中において外因性ポリヌクレオチドを発現させるステップ、
ｃ）細胞の脂肪酸組成を分析するステップ、ならびに
ｄ）
１）ＡＬＡからＥＰＡ、ＤＰＡまたはＤＨＡの変換の効率が少なくとも１７．３％または少なくとも２３％である性質、
２）ＡＬＡからＤＰＡまたはＤＨＡの変換の効率が少なくとも１５．４％または少なくとも２１％である性質、
３）ＡＬＡからＤＨＡの変換の効率が少なくとも９．５％または少なくとも１０．８％である性質、および
４）ＥＰＡからＤＨＡの変換の効率が少なくとも４５％または少なくとも５０％である性質
の内の１つもしくは複数または全てを特徴とし、好ましくはさらに、細胞中における全脂肪酸の少なくとも４％がＤＨＡであることを特徴とする細胞を選択するステップ
を含む方法をさらに提供する。
【００９６】
更なる一態様において、本発明は、１種または複数種の長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣ−ＰＵＦＡ）を合成できる細胞、好ましくは植物細胞、より好ましくは植物種子細胞を得る方法であって、
ａ）
ｉ）Δ６エロンガーゼおよび／またはΔ９エロンガーゼ、
ｉｉ）Δ６デサチュラーゼおよび／またはΔ８デサチュラーゼ、
ｉｉｉ）Δ５デサチュラーゼ、
ｉｖ）Δ５エロンガーゼ、ならびに
ｖ）場合によって、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ
をコードする外因性ポリヌクレオチドを細胞、好ましくは前記ＬＣ−ＰＵＦＡを合成することができない細胞中に導入するステップであり、各ポリヌクレオチドが、細胞中における前記ポリヌクレオチドの発現を誘導できる１つまたは複数のプロモーターに作動可能に連結する、ステップ、
ｂ）細胞中において外因性ポリヌクレオチドを発現させるステップ、
ｃ）細胞の脂肪酸組成を分析するステップ、ならびに
ｄ）
ａ）ＡＬＡからＥＰＡまたはＤＰＡの変換の効率が少なくとも１７．３％または少なくとも２３％である性質、および
ｂ）ＡＬＡからＤＰＡの変換の効率が少なくとも１５．４％または少なくとも２１％である性質
の内の１つもしくは複数または全てを特徴とし、好ましくはさらに、細胞中における全脂肪酸の少なくとも４％がＤＰＡであることを特徴とする細胞を選択するステップ
を含む方法を提供する。
【００９７】
本発明による方法の一実施形態において、外因性ポリヌクレオチドは、細胞のゲノム中に安定して組み込まれる（integrated）ようになる。
【００９８】
他の一実施形態において、方法は、ステップａ）の細胞から形質転換植物を再生させるステップをさらに含む。
【００９９】
更なる一実施形態において、外因性ポリヌクレオチドまたは複数の外因性ポリヌクレオチド（polynucleotide(s)(複数可)）は、細胞中において一過性に発現される。
【０１００】
一実施形態において、細胞は、植物中における葉細胞である。
【０１０１】
本発明は、脂肪酸不飽和化に関与する核酸分子を選択する方法であって、
ｉ）プロモーターに作動可能に連結する核酸分子を得るステップであり、核酸分子が、脂肪酸デサチュラーゼであり得るポリペプチドをコードする、ステップ、
ｉｉ）プロモーターが活性である細胞中に核酸分子を導入するステップ、
ｉｉｉ）細胞中において核酸分子を発現させるステップ、
ｉｖ）細胞の脂肪酸組成を分析するステップ、ならびに
ｖ）ポリペプチドがω３デサチュラーゼ活性を有し、かつＡＲＡからＥＰＡ、ＤＧＬＡからＥＴＡ、ＧＬＡからＳＤＡの内の少なくとも１つ、ＡＲＡからＥＰＡおよびＤＧＬＡからＥＴＡの両方、ＡＲＡからＥＰＡおよびＧＬＡからＳＤＡの両方、またはこれらの３つ全てを不飽和化することができることに基づいて、脂肪酸不飽和化に関与する核酸分子を選択するステップ
を含む方法をさらに提供する。
【０１０２】
方法の一実施形態において、ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１５と少なくとも３５％同一であり、配列番号１７と少なくとも６０％同一であり、および／または配列番号２０と少なくとも６０％同一である。
【０１０３】
本発明は、脂肪酸伸長に関与する核酸分子を選択する方法であって、
ｉ）プロモーターに作動可能に連結する核酸分子を得るステップであり、核酸分子が、脂肪酸エロンガーゼであり得るポリペプチドをコードする、ステップ、
ｉｉ）プロモーターが活性である細胞中に核酸分子を導入するステップ、
ｉｉｉ）細胞中において核酸分子を発現させるステップ、
ｉｖ）細胞の脂肪酸組成を分析するステップ、および
ｖ）ポリペプチドがΔ５エロンガーゼ活性を有し、かつ少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％または少なくとも７５％であるＤＰＡを産生するＥＰＡにおける変換の効率を有することに基づいて、脂肪酸伸長に関与する核酸分子を選択するステップ
を含む方法をさらに提供する。
【０１０４】
一実施形態において、ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号６と少なくとも４７％同一である。
【０１０５】
本発明は、脂肪酸不飽和化に関与する核酸分子を選択する方法であって、
ｉ）プロモーターに作動可能に連結する核酸分子を得るステップであり、核酸分子が、脂肪酸デサチュラーゼであり得るポリペプチドをコードする、ステップ、
ｉｉ）プロモーターが活性である細胞中に核酸分子を導入するステップ、
ｉｉｉ）細胞中において核酸分子を発現させるステップ、
ｉｖ）細胞の脂肪酸組成を分析するステップ、ならびに
ｖ）ポリペプチドがΔ６デサチュラーゼ活性を有し、かつ以下の
ａ）好ましくは植物細胞中における、脂肪酸基質としてのＬＡによりもＡＬＡに対して、より大きなΔ６デサチュラーゼ活性、
ｂ）好ましくは植物細胞中における、脂肪酸基質としてＰＣのｓｎ−２位に接合したＡＬＡに対するよりも脂肪酸基質としてのＡＬＡ−ＣｏＡに対して、より大きなΔ６デサチュラーゼ活性、および
ｃ）好ましくは植物細胞中における、ＡＬＡに対するΔ８デサチュラーゼ活性
の内の少なくとも２つ、好ましくは３つ全てを有することに基づいて、脂肪酸不飽和化に関与する核酸分子を選択するステップ
を含む方法をさらに提供する。
【０１０６】
方法の一実施形態において、ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１０と少なくとも７７％同一であり、および／または配列番号８と少なくとも６７％同一である。
【０１０７】
本発明は、脂肪酸不飽和化に関与する核酸分子を選択する方法であって、
ｉ）プロモーターに作動可能に連結する核酸分子を得るステップであり、核酸分子が、脂肪酸デサチュラーゼであり得るポリペプチドをコードする、ステップ、
ｉｉ）プロモーターが活性である細胞中に核酸分子を導入するステップ、
ｉｉｉ）細胞中において核酸分子を発現させるステップ、
ｉｖ）細胞の脂肪酸組成を分析するステップ、および
ｖ）ポリペプチドがΔ６デサチュラーゼ活性およびΔ８デサチュラーゼ活性の両方を有することに基づいて、脂肪酸不飽和化に関与する核酸分子を選択するステップ
を含む方法をさらに提供する。
【０１０８】
一実施形態において、ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号８と少なくとも６７％同一である。
【０１０９】
更なる一実施形態において、本発明の方法のステップ（ｖ）は、アシル−ＣｏＡ基質に対して活性なデサチュラーゼまたはフロントエンドデサチュラーゼをコードする核酸分子を選択することを含む。
【０１１０】
本発明は、組換え細胞を産生するため、組換え細胞中において少なくとも２種の脂肪酸デサチュラーゼおよび２種の脂肪酸エロンガーゼの組合せを発現させるため、ならびに／または組換え細胞中においてＬＣ−ＰＵＦＡを産生するために使用される場合における、本明細書において定義される通りの外因性ポリヌクレオチドの組合せをさらに提供する。
【０１１１】
本発明は、実質的に精製されたおよび／または組換えの脂肪酸Δ５エロンガーゼをさらに提供するものであって、エロンガーゼは、細胞中において外因性ポリヌクレオチドから発現される場合、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％または少なくとも７５％の効率でＤＰＡを産生するＥＰＡに対する活性を有する。
【０１１２】
一実施形態において、Δ５エロンガーゼは、本明細書において定義される通りの性質の内のいずれか１つまたは複数を特徴とする。
【０１１３】
本発明は、細胞中において外因性ポリヌクレオチドから発現される場合、ＡＲＡからＥＰＡ、ＤＧＬＡからＥＴＡ、ＧＬＡからＳＤＡの内の少なくとも１つ、ＡＲＡからＥＰＡおよびＤＧＬＡからＥＴＡの両方、ＡＲＡからＥＰＡおよびＧＬＡからＳＤＡの両方、またはこれらの３つ全てを不飽和化することができる実質的に精製されたおよび／または組換えの脂肪酸ω３デサチュラーゼをさらに提供する。
【０１１４】
一実施形態において、本発明のω３デサチュラーゼは、本明細書において定義される通りの性質のいずれか１つまたは複数を特徴とする。
【０１１５】
本発明は、以下の
ｉ）好ましくは植物細胞中における、脂肪酸基質としてのＬＡよりもＡＬＡに対して、より大きなΔ６デサチュラーゼ活性、
ｉｉ）好ましくは植物細胞中における、脂肪酸基質としてＰＣのｓｎ−２位に接合したＡＬＡに対するよりも脂肪酸基質としてのＡＬＡ−ＣｏＡに対して、より大きなΔ６デサチュラーゼ活性、および
ｉｉｉ）好ましくは植物細胞中における、ＥＴｒＡに対するΔ８デサチュラーゼ活性
の内の少なくとも２つ、好ましくは３つ全てを有することをさらに特徴とする、実質的に精製されたおよび／または組換えの脂肪酸Δ６デサチュラーゼをさらに提供する。
【０１１６】
本発明は、対応するω６基質よりもω３基質に対して、より大きな活性を有し、細胞中において外因性ポリヌクレオチドから発現される場合に少なくとも５％、少なくとも７．５％もしくは少なくとも１０％の効率で、または酵母細胞中において発現される場合に少なくとも３５％の効率でＳＤＡを産生するＡＬＡに対する活性を有する、実質的に精製されたおよび／または組換えの脂肪酸Δ６デサチュラーゼをさらに提供する。
【０１１７】
一実施形態において、本発明のΔ６デサチュラーゼは、本明細書において定義される通りの性質のいずれか１つまたは複数を特徴とする。
【０１１８】
本発明は、Δ９エロンガーゼ活性より大きなΔ６エロンガーゼ活性を有する、実質的に精製されたおよび／または組換えの脂肪酸Δ６エロンガーゼおよびΔ９エロンガーゼをさらに提供する。
【０１１９】
一実施形態において、本発明のΔ６エロンガーゼおよびΔ９エロンガーゼは、本明細書において定義される通りの性質のいずれか１つまたは複数を特徴とする。
【０１２０】
本発明は、配列番号１３において提供される配列、その生物学的に活性な断片または配列番号１３と少なくとも５３％同一であるアミノ酸配列を有するアミノ酸を含む実質的に精製されたおよび／または組換えの脂肪酸Δ５デサチュラーゼをさらに提供する。
【０１２１】
本発明は、配列番号２８、９４および９６のいずれか１つにおいて提供される配列、その生物学的に活性な断片、配列番号２８と少なくとも８１％同一であるアミノ酸配列、または配列番号９４および／もしくは配列番号９６と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を有するアミノ酸を含む実質的に精製されたおよび／または組換えの脂肪酸Δ９エロンガーゼをさらに提供する。
【０１２２】
一実施形態において、Δ９エロンガーゼは、配列番号９４もしくは配列番号９６において提供される配列、その生物学的に活性な断片、または配列番号９４および／もしくは配列番号９６と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を有するアミノ酸を含み、エロンガーゼは、対応するω３基質よりもω６基質に対して、より大きな活性を有する。
【０１２３】
他の一態様において、本発明は、配列番号１０８において提供される配列、その生物学的に活性な断片または配列番号１０８と少なくとも５４％同一であるアミノ酸配列を有するアミノ酸を含む実質的に精製されたおよび／または組換えジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼを提供する。
【０１２４】
一実施形態において、本発明によるデサチュラーゼまたはエロンガーゼは、微細藻類から精製できる。好ましい微細藻類は、パブロバ属種、ピラミモナス属種およびミクロモナス属種である。
【０１２５】
本発明は、
ｉ）配列番号３、５、７、９、１１、１２、１４、１６、１８、１９、２７、２９、９３、９５、１０７もしくは１２５から１２９のいずれか１つから選択されるヌクレオチドの配列、
ｉｉ）本発明によるデサチュラーゼもしくはエロンガーゼをコードするヌクレオチドの配列、
ｉｉｉ）配列番号３、５、７、９、１１、１２、１４、１６、１８、１９、２７、２９、９３、９５、１０７もしくは１２５から１２９において記載される配列の内の１つまたは複数と少なくとも５０％同一であるヌクレオチドの配列、および／または
ｉｖ）ストリンジェントな条件下でｉ）からｉｉｉ）のいずれか１つにハイブリダイズする配列
を含む単離されたおよび／または外因性ポリヌクレオチドをさらに提供する。
【０１２６】
一実施形態において、単離されたおよび／または外因性ポリヌクレオチドは、配列番号３および／または配列番号１２６と少なくとも５７％同一であるヌクレオチドの配列を含み、かつΔ６エロンガーゼをコードする。
【０１２７】
他の一実施形態において、単離されたおよび／または外因性ポリヌクレオチドは、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および／または配列番号１９と少なくとも５０％同一であるヌクレオチドの配列を含み、かつω３デサチュラーゼをコードする。
【０１２８】
他の一実施形態において、単離されたおよび／または外因性ポリヌクレオチドは、配列番号５および／または配列番号１２８と少なくとも５０％同一であるヌクレオチドの配列を含み、かつΔ５エロンガーゼをコードする。
【０１２９】
一実施形態において、単離されたおよび／または外因性ポリヌクレオチドは、配列番号７、配列番号９、配列番号１１および／または配列番号１２５と少なくとも７５％同一であるヌクレオチドの配列を含み、かつΔ６デサチュラーゼをコードする。
【０１３０】
さらに他の一実施形態において、単離されたおよび／または外因性ポリヌクレオチドは、配列番号１２と少なくとも６０％同一であるヌクレオチドの配列を含み、かつΔ５デサチュラーゼをコードする。
【０１３１】
他の一実施形態において、単離されたおよび／または外因性ポリヌクレオチドは、配列番号２７、配列番号２９、配列番号９３および／または配列番号９６と少なくとも５０％同一であるヌクレオチドの配列を含み、かつΔ９エロンガーゼをコードする。
【０１３２】
さらに他の一実施形態において、単離されたおよび／または外因性ポリヌクレオチドは、配列番号１０７と少なくとも６０％同一であるヌクレオチドの配列を含み、かつジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼをコードする。
【０１３３】
特定の一実施形態において、単離されたおよび／または外因性ポリヌクレオチドは、配列番号３、５、７、９、１１、１２、１４、１６、１８、１９、２７、２９、９３、９５、１０７または１２５から１２９において記載される配列の内の１つと少なくとも８０％または少なくとも９０％または少なくとも９５％または少なくとも９９％同一である。
【０１３４】
本発明は、植物細胞のゲノム中に組み込むためのおよび／または組み込まれたＤＮＡ構築物をさらに提供するものであって、構築物は、植物細胞中における脂肪酸合成をモジュレートするタンパク質をコードする少なくとも３つのオープンリーディングフレームのクラスターを含み、好ましくは、各タンパク質は脂肪酸デサチュラーゼまたは脂肪酸エロンガーゼであり、同じ転写方向を有する各オープンリーディングフレームは、少なくとも７５０ｂｐ、少なくとも１，０００ｂｐまたは少なくとも１，２５０ｂｐにより分離され、オープンリーディングフレームの内の少なくとも２つは、異なる転写方向を有し、各オープンリーディングフレームは、植物細胞中において活性なプロモーターに作動可能に連結し、各プロモーターは、独立して同一または異なってよい。
【０１３５】
好ましくは、プロモーターの内の少なくとも２つは、ＤＮＡ構築物中にあり、異なる。
【０１３６】
１つもしくは複数のまたは各々のオープンリーディングフレームは、好ましくは、異種５’リーダー配列に作動可能に連結し、その各々は、独立して同一または異なってよく、各異種５’リーダー配列は、特定のオープンリーディングフレームに対する天然に存在する５’リーダー配列と比較して転写効率を増強する。
【０１３７】
本発明のＤＮＡ構築物において、異種５’リーダー配列は、好ましくは、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）５’リーダー配列である。
【０１３８】
本発明によるＤＮＡ構築物において、タンパク質は、好ましくは、エロンガーゼおよび／またはデサチュラーゼであり、より好ましくは、本明細書に記載される通りの組合せである。
【０１３９】
さらに他の一実施形態において、本発明によるＤＮＡ構築物は、タンパク質に翻訳される３または４つのオープンリーディングフレームだけを有する。
【０１４０】
本発明は、本発明によるポリヌクレオチドおよび／または本発明によるＤＮＡ構築物を含むベクターをさらに提供する。
【０１４１】
好ましくは、ポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結する。
【０１４２】
本発明は、本発明によるデサチュラーゼまたはエロンガーゼを産生する方法であって、細胞または無細胞発現系中において本発明のポリヌクレオチド、本発明のＤＮＡ構築物および／または本発明のベクターを発現させることを含む方法をさらに提供する。
【０１４３】
本発明者らはまた、驚くべきことに、異なる外因性ポリヌクレオチドを含む少なくとも３種の独立した染色体外転移核酸を真核細胞中に一過性にトランフェクトする（tranfected）ことができ、各外因性ポリヌクレオチドの活性を細胞中において共に検出することができることをも見出した。従って、他の一態様において、本発明は、
少なくとも３種の異なる外因性ポリヌクレオチドで真核細胞を一過性にトランスフェクトする方法であって、
ｉ）少なくとも
ａ）第１の外因性ポリヌクレオチドを含む染色体外転移核酸を含む第１の細菌、
ｂ）第２の外因性ポリヌクレオチドを含む染色体外転移核酸を含む第２の細菌、および
ｃ）第３の外因性ポリヌクレオチドを含む染色体外転移核酸を含む第３の細菌
を得るステップ、ならびに
ｉｉ）ステップｉ）の細菌を細胞に接触させるステップ
を含み、染色体外転移核酸の各々を細菌から細胞に転移させて一過性にトランスフェクトされた細胞を産生し、外因性ポリヌクレオチドの各々が細胞中において活性なプロモーターを含み、各プロモーターが独立して同一または異なってよく、外因性ポリヌクレオチドの内の少なくとも１つがサイレンシングサプレッサーをコードする、方法をさらに提供する。
【０１４４】
ステップｉｉ）は、細菌の内の１種または複数種と逐次的にまたは同時に行うことが可能である。例えば、細胞に第１の細菌を接触させ、次いで第２の細菌等を接触させることができる。他の一例において、好ましくは細菌の混合物として、各細菌を同時に細胞に接触させる。異なる細菌の濃度は、互いに対して異なってよく、または同じもしくは同様であってよい。細菌は、例えば株のライブラリーからの多くの分離菌を含むプールされた分離菌であってよい。
【０１４５】
一実施形態において、方法は、細胞を得るステップと、次いで細胞に異なる外因性ポリヌクレオチドを含む染色体外転移核酸を各々含む１種または複数種の更なる細菌を接触させるステップとをさらに含む。例えば、一実施形態において、方法は、細胞を得るステップと、次いで細胞に第４の外因性ポリヌクレオチドを含む染色体外転移核酸を含む第４の細菌を接触させるステップとを含む。更なる一実施形態において、方法は、細胞を得るステップと、次いで細胞に第５の外因性ポリヌクレオチドを含む染色体外転移核酸を含む第５の細菌を接触させるステップとを含む。更なる一実施形態において、方法は、細胞を得るステップと、次いで細胞に第６の外因性ポリヌクレオチドを含む染色体外転移核酸を含む第６の細菌を接触させるステップとを含む。更なる一実施形態において、方法は、細胞を得るステップと、次いで細胞に第７の外因性ポリヌクレオチドを含む染色体外転移核酸を含む第７の細菌を接触させるステップとを含む。さらに他の更なる一実施形態において、方法は、細胞を得るステップと、次いで細胞に第８の外因性ポリヌクレオチドを含む染色体外転移核酸を含む第８の細菌を接触させるステップとを含む。
【０１４６】
好ましくは、異なる外因性ポリヌクレオチドは、異なるＲＮＡ分子および／またはポリペプチドをコードする。
【０１４７】
一実施形態において、各外因性ポリヌクレオチドは、酵素経路の部分を形成する酵素をコードするか、またはかかる酵素の候補物質である。
【０１４８】
上記の態様は、特に、大きなおよび／もしくは複雑な生物学的経路を形成するポリヌクレオチドならびに／またはポリペプチドを研究するのに有用である。従って、好ましい一実施形態において、各外因性ポリヌクレオチドは、脂肪酸合成、脂肪酸修飾、ジアシルグリセロール構築（assembly）、トリアシルグリセロール構築もしくはそれらの内の２つ以上の組合せに関与する酵素をコードするか、またはかかる酵素の候補物質である。
【０１４９】
一実施形態において、細菌の内の１種または複数種は、原形質体の形態である。本発明に有用な細菌の例としては、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属種（sp.）、リゾビウム（Rhizobium）属種、シノリゾビウム・メリロティ（Sinorhizobium meliloti）、メゾリゾビウム・ロティ（Mezorhizobium loti）、シゲラ・フレクスネリ（Shigella flexneri）、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）、サルモネラ・コレレスイス（Salmonella choleraesuis）、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、エルシニア・シュードツベルクローシス（Yersinia pseudotuberculosis）およびエルシニア・エンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１５０】
本発明に有用な染色体外転移核酸の例としては、Ｐ−ＤＮＡ、アグロバクテリウム属種Ｔ−ＤＮＡまたはそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１５１】
好ましくは、上記の態様の細胞は、植物細胞または哺乳動物細胞である。一実施形態において、細胞は、組織または器官の部分である。他の一実施形態において、細胞は植物細胞であり、組織または器官は、葉、茎、根、分裂組織（meristem）、カルスまたは胚珠（ovule）である。
【０１５２】
本発明者らはまた、プロモーターが種子特異的プロモーターである場合、葉細胞中における外因性ポリヌクレオチドの発現が、リーフィコチレドン２（leafy cotyledon 2）、フスカ３（fusca3）またはアブシジン酸センスティブ３（abscisic acid-senstive3）等の種子特異的転写因子の共発現によって増強され得ることをも決定した。リーフィコチレドン２タンパク質の例としては、ＷＯ０１／７０７７７に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。従って、好ましい一実施形態において、植物細胞は、植物の葉細胞であり、プロモーターの内の少なくとも１つは、種子特異的プロモーターであり、外因性ポリヌクレオチドの内の少なくとも１つは、リーフィコチレドン２等の種子特異的転写をコードする。
【０１５３】
一実施形態において、外因性ポリヌクレオチドのいずれもウイルス遺伝子ではない。一実施形態において、外因性ポリヌクレオチドの内の１種または複数種は、定義された核酸配列のマルティマーまたは部分的マルティマーとしてではなく、単一コピーとして染色体外転移核酸中に存在するだけである。更なる一実施形態において、染色体外転移核酸の内の少なくとも１種は、細胞中において機能的な複製開始点を含まず、好ましくはウイルスの複製開始点を含まず、より好ましくはＦＢＮＹＶの複製開始点を含まない。更なる一実施形態において、外因性ポリヌクレオチドのいずれも、ＷＯ２００７／１３７７８８において記載されているものや、Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔら（２００５）によって記載されているもの等のウイルスレプリカーゼまたはウイルス移行タンパク質をコードしない。
【０１５４】
また、所望の活性について一過性にトランスフェクトされた細胞をスクリーニングする方法であって、本発明の少なくとも３種の外因性ポリヌクレオチドを真核細胞に一過性にトランスフェクトする方法を実施するステップと、所望の活性について細胞を試験するステップとを含む方法も提供される。
【０１５５】
本発明者らは、より多くのその６種の異なる遺伝子による細胞、特に植物細胞の形質転換が、異なる染色体外転移核酸を通じて遺伝子を提供して増強され得ることをも確認した。従って、他の一態様において、本発明は、
少なくとも６種の異なる外因性ポリヌクレオチドで真核細胞を形質転換する方法であって、
ｉ）少なくとも
ａ）３種、４種、５種または６種の異なる外因性ポリヌクレオチドを含む第１の染色体外転移核酸を含む第１の細菌、および
ｂ）３種、４種、５種または６種の異なる外因性ポリヌクレオチドを含む第１と異なる第２の染色体外転移核酸を含む第２の細菌
を得るステップ、
ｉｉ）ステップｉ）の細菌を細胞に接触させるステップ、ならびに
ｉｉｉ）場合によって、第１および第２の染色体外転移核酸の外因性ポリヌクレオチドで安定して形質転換された細胞を選択するステップ
を含み、第１および第２の染色体外転移核酸の外因性ポリヌクレオチドの各々を細菌から細胞に転移させて形質転換細胞を産生し、外因性ポリヌクレオチドの各々が、細胞またはそれに由来し得る細胞中において活性なプロモーターを含み、各プロモーターが、独立して同一または異なってよい、方法を提供する。
【０１５６】
ステップｉ）ａ）およびｉ）ｂ）は、２種の細菌と逐次的にまたは同時に行われ得る。例えば、細胞に、第１の細菌を接触させ、次いで第２の細菌を接触させることができる。第２の細菌と接触させた細胞は、子孫細胞であり得るか、または第１の細菌と接触させた細胞に由来し得る。他の一例において、細胞に細菌の両方を同時に接触させる。
【０１５７】
一実施形態において、ｉ）第１の染色体外転移核酸は、３から６種だけ、３から５種だけ、３から４種だけ、４から６種だけ、４から５種だけ、または５から６種だけの異なる外因性ポリヌクレオチドを有し、ｉｉ）第２の染色体外転移核酸は、３から６種だけ、３から５種だけ、３から４種だけ、４から６種だけ、４から５種だけ、または５から６種だけの異なる外因性ポリヌクレオチドを有する。
【０１５８】
好ましくは、外因性ポリヌクレオチドの各々はポリペプチドをコードし、ポリペプチドの各々が異なる。
【０１５９】
更なる一実施形態において、
ｉ）第１の染色体外転移核酸は、Δ６デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼおよびΔ１５デサチュラーゼから成る群から選択されるポリペプチドを独立してコードする２種の外因性ポリヌクレオチドを含み、ならびに
ｉｉ）第２の染色体外転移核酸は、群からの第３の酵素であるポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。
【０１６０】
好ましくは、細胞は植物細胞であり、方法は、安定形質転換細胞から形質転換植物を生成するステップをさらに含む。
【０１６１】
また、本発明の少なくとも３種の外因性ポリヌクレオチドで真核細胞を一過性にトランスフェクトする方法方法（method method）、または本発明の少なくとも６種の異なる外因性ポリヌクレオチドで真核細胞を形質転換する方法によって産生された細胞も提供される。
【０１６２】
なお更なる一態様において、本発明は、
少なくとも６種の異なる外因性ポリヌクレオチドで安定形質転換植物を産生する方法であって、
ｉ）３種、４種、５種または６種の異なる外因性ポリヌクレオチドを含む第１の外因性ゲノム領域を含む第１の安定形質転換植物を得るステップ、
ｉｉ）３種、４種、５種または６種の異なる外因性ポリヌクレオチドを含む第１と異なる第２の外因性ゲノム領域を含み、第１と性的に適合性のある種の第２の安定形質転換植物を得るステップ、
ｉｉｉ）第１の安定形質転換植物を第２の安定形質転換植物と交配するステップ、ならびに
ｉｖ）ステップｉｉｉ）から産生された植物または第１および第２のゲノム領域を含むその子孫を選択することによって安定形質転換植物を産生するステップ
を含み、
外因性ポリヌクレオチドの各々が、植物中において活性なプロモーターを含み、各プロモーターが、独立して同一または異なってよい、方法を提供する。
【０１６３】
好ましい一実施形態において、本発明のＤＮＡ構築物について上記で概説したように、第１および／または第２の外因性ゲノム領域の外因性ポリヌクレオチドが整列させられ（orientated）、間隔を置いて配置される。
【０１６４】
第１および第２の外因性ゲノム領域の中でいずれか１つのプロモーター配列が複数回存在し得るか、もしくは１回だけ使用され得、または第１および第２の外因性ゲノム領域中において１種もしくは複数種のプロモーターが複数回使用され得、かつ１種もしくは複数種の他のプロモーターが１回だけ使用される。各植物プロモーターは、植物の組織または器官中において、例えば葉または種子中において、他の組織または器官と比較して独立して選好的に活性であってよい。このことは、植物器官または組織中における導入タンパク質コード領域の全ての同時発現または重複発現を可能にすることができる。代替の一実施形態において、１種または複数種のプロモーターは植物中において構成的に発現され、１種または複数種の他のプロモーターは植物器官または組織において選好的に発現される。
【０１６５】
一実施形態において、ステップｉ）は、
ａ）３種、４種、５種または６種の異なる外因性ポリヌクレオチドを含む第１の染色体外転移核酸を含む第１の細菌を植物細胞に接触させるステップ、
ｂ）ステップａ）の植物細胞から安定形質転換植物を生成するステップ、および場合によって、
ｃ）ステップｂ）の安定形質転換植物から子孫植物を産生すること
によって第１の安定形質転換植物を産生するステップを含み、
ならびに／またはステップｉｉ）は、
ｄ）３種、４種、５種または６種の異なる外因性ポリヌクレオチドを含む第２の染色体外転移核酸を含む第２の細菌を植物細胞に接触させるステップ、
ｅ）ステップｄ）の植物細胞から安定形質転換植物を生成するステップ、および場合によって
ｆ）ステップｅ）の安定形質転換植物から子孫植物を産生すること
によって第２の安定形質転換植物を産生するステップを含む。
【０１６６】
他の一態様において、本発明は、少なくとも６種の異なる外因性ポリヌクレオチドで安定形質転換植物を産生する方法であって、
ｉ）３種、４種、５種または６種の異なる外因性ポリヌクレオチドを含む第１の外因性ゲノム領域を含む第１の安定形質転換植物または植物部分を得るステップ、
ｉｉ）第１の安定形質転換植物の細胞または植物部分に３種、４種、５種または６種の異なる外因性ポリヌクレオチドを含む染色体外転移核酸を含む細菌を接触させるステップ、
ｉｉｉ）細胞から植物を産生するステップ、および
ｉｖ）場合によって、少なくとも６種の異なる外因性ポリヌクレオチドを含むステップｉｉｉ）から産生された植物を選択するステップ
を含む方法を提供する。
【０１６７】
当業者である対象者であれば認識するように、上記の態様の「ステップｉ）の細菌を細胞に接触させる」ステップに関して、これは、細菌から細胞に転移すべき染色体外転移核酸に対して適切な条件下で、適切な時間、予め決定される。
【０１６８】
更なる一態様において、本発明は、少なくとも、
ａ）第１の外因性ポリヌクレオチドを含む第１の染色体外転移核酸、
ｂ）第２の外因性ポリヌクレオチドを含む第２の染色体外転移核酸、および
ｃ）第３の外因性ポリヌクレオチドを含む第３の染色体外転移核酸
を含む真核細胞を提供する。
【０１６９】
一実施形態において、細胞は、さらに、異なる外因性ポリヌクレオチドを含む染色体外転移核酸を各々含む１種または複数種の更なる細菌。
【０１７０】
また、３種、４種、５種または６種の異なる外因性ポリヌクレオチドを含む第１の外因性ゲノム領域と３種、４種、５種または６種の異なる外因性ポリヌクレオチドを含む第２の外因性ゲノム領域とを含む植物もしくはその子孫または種子も提供される。外因性ゲノム領域（複数可）の外因性ポリヌクレオチドは、好ましくは、ＤＮＡ構築物について上記で記載したように整列させられ、間隔を置いて配置される。
【０１７１】
本発明は、本発明による細胞を含むトランスジェニック非ヒト生物をさらに提供する。一実施形態において、生物の各細胞は、本発明による細胞である。
【０１７２】
好ましくは、トランスジェニック非ヒト生物は、トランスジェニック植物であり、より好ましくは、以下で列挙される油を産生するためのトランスジェニック油料種子植物である。更なる一実施形態において、トランスジェニック植物は、植物が表現型的に正常である植物貯蔵器官特異的プロモーターに作動可能に連結したサイレンシングサプレッサーをコードする少なくとも１種の更なる外因性ポリヌクレオチドを含む。
【０１７３】
本発明は、本発明による細胞を含んでいるか、または本発明のトランスジェニック植物から得られた種子をさらに提供する。
【０１７４】
本発明は、本発明による細胞、本発明のトランスジェニック非ヒト生物もしくは本発明の種子によって産生された、または本発明による細胞、本発明のトランスジェニック非ヒト生物もしくは本発明の種子から得られた油をさらに提供する。
【０１７５】
一実施形態において、油は、油料種子からの油の抽出によって得られる。
【０１７６】
一実施形態において、油は、キャノーラ油（ブラッシカ・ナパス（Brassica napus）、ブラッシカ・ラパ（Brassica rapa）属種（ssp.））、カラシ油（ブラッシカ・ユンケア（Brassica juncea））、他のブラッシカ油、ヒマワリ油（ヘリアンサス・アナス（Helianthus annus））、アマニ油（リナム・ウシタチシマム（Linum usitatissimum））、ダイズ油（グリシン・マックス（Glycine max））、サフラワー油（カーサマス・ティンクトリアス（Carthamus tinctorius））、トウモロコシ油（ゼア・マイス（Zea mays））、タバコ油（ニコチアナ・タバカム(Nicotiana tabacum)）、落花生油（アラキス・ヒポゲア（Arachis hypogaea））、パーム油、綿実油（ゴシピウム・ヒルスツム（Gossypium hirsutum））、ヤシ油（ココス・ヌシフェラ（Cocos nucifera））、アボカド油（ペルセア・アメリカナ（Persea americana））、オリーブ油（オレア・エウロパエア（Olea europaea））、カシュー油（アナカルジウム・オクシデンタレ（Anacardium occidentale））、マカダミア油（マカダミア・インテルグリフォリア（Macadamia intergrifolia））、扁桃（almond）油（プルヌス・アミグダルス（Prunus amygdalus））またはアラビドプシス（Arabidopsis）種子油（アラビドプシス・サリアナ（Arabidopsis thaliana））である。
【０１７７】
本発明は、本発明による細胞、本発明のトランスジェニック非ヒト生物もしくは本発明の種子によって産生された、または本発明による細胞、本発明のトランスジェニック非ヒト生物もしくは本発明の種子から得られた脂肪酸をさらに提供する。
【０１７８】
本発明は、不飽和脂肪酸を含有する油の産生方法であって、本発明による細胞、本発明のトランスジェニック非ヒト生物または本発明の種子から油を抽出するステップを含む方法をさらに提供する。
【０１７９】
本発明は、本発明による細胞、本発明によるデサチュラーゼもしくはエロンガーゼ、本発明によるポリヌクレオチド、本発明によるＤＮＡ構築物、本発明のベクター、本発明による油または本発明の脂肪酸を含む組成物をさらに提供する。
【０１８０】
本発明は、本発明による細胞、本発明によるトランスジェニック非ヒト生物、本発明による種子、本発明による油および／または本発明の脂肪酸を含む飼料、化粧品または化学物質をさらに提供する。
【０１８１】
本発明は、デサチュラーゼ反応を実施する方法であって、ＣｏＡにエステル化された多価不飽和脂肪酸に本発明のデサチュラーゼを接触させるステップを含む方法をさらに提供する。
【０１８２】
本発明は、本発明のデサチュラーゼまたはエロンガーゼを特異的に結合する実質的に精製された抗体またはその断片をさらに提供する。
【０１８３】
本発明は、ＰＵＦＡから利益を受ける状態を治療または予防する方法であって、本発明による細胞、本発明によるデサチュラーゼもしくはエロンガーゼ、本発明によるポリヌクレオチド、本発明によるＤＮＡ構築物、本発明のベクター、本発明によるトランスジェニック非ヒト生物、本発明による種子、本発明による油または本発明の脂肪酸および／または本発明の飼料を対象に投与するステップを含む方法をさらに提供する。
【０１８４】
一実施形態において、状態は、不整脈、血管形成、炎症、喘息、乾癬、骨粗鬆症、腎結石、エイズ、多発性硬化症、関節リウマチ、クローン病、統合失調症、癌、胎児性アルコール症候群、注意欠陥多動性障害、嚢胞性線維症、フェニルケトン尿症、単極性うつ病、攻撃的敵意、アドレノロイコジストフィー（adrenoleukodystophy）、冠性心疾患、高血圧、糖尿病、肥満、アルツハイマー病、慢性閉塞性肺疾患、潰瘍性大腸炎、血管形成術後の再狭窄、湿疹、高血圧症、血小板凝集、胃腸出血、子宮内膜症、月経前症候群、筋痛性脳脊髄炎、ウイルス感染後の慢性疲労または眼疾患である。
【０１８５】
本発明は、ＰＵＦＡから利益を受ける状態を治療または予防するための医薬品の製造のための、本発明による細胞、本発明によるデサチュラーゼもしくはエロンガーゼ、本発明によるポリヌクレオチド、本発明によるＤＮＡ構築物、本発明のベクター、本発明によるトランスジェニック非ヒト生物、本発明による種子、本発明による油または本発明の脂肪酸および／または本発明の飼料の使用をさらに提供する。
【０１８６】
本発明者らは、驚くべきことに、植物の発育を著しくもたらす（effecting）ことなく植物細胞中における導入遺伝子の発現のレベルを増強するように植物貯蔵器官中においてサイレンシングサプレッサーを選好的に発現させることができることを見出した。
【０１８７】
従って、本発明は、
ｉ）植物貯蔵器官特異的プロモーターに作動可能に連結したサイレンシングサプレッサーをコードする第１の外因性ポリヌクレオチド、および
ｉｉ）植物貯蔵器官中における遺伝子転写を誘導するプロモーターに作動可能に連結したＲＮＡ分子をコードする第２の外因性ポリヌクレオチド
を含む植物細胞を提供する。
【０１８８】
好ましくは、植物貯蔵器官特異的プロモーターは、種子特異的プロモーター、例えば、子葉特異的プロモーターまたは内乳特異的プロモーターである。
【０１８９】
一実施形態において、サイレンシングサプレッサーは、ウイルスサプレッサータンパク質、例えば、限定されないが、Ｐ１、Ｐ１９、Ｖ２、Ｐ３８、Ｐ１５、Ｐｅ−ＰｏおよびＲＰＶ−Ｐ０である。
【０１９０】
典型的には、ウイルスサプレッサータンパク質が植物中において構成的に発現される場合、植物は表現型的に異常であるが、サイレンシングサプレッサーが貯蔵器官中において特異的に発現される場合、植物は表現型的に正常である。かかるウイルスサプレッサータンパク質の例としては、Ｐ１、Ｐ１９およびＰ１５が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１９１】
更なる一実施形態において、ウイルスサプレッサータンパク質は、マイクロＲＮＡ蓄積および／またはマイクロＲＮＡ誘導切断を減少させる。
【０１９２】
限定されないが、アンチセンスポリヌクレオチド、触媒ポリヌクレオチド、ｄｓＲＮＡおよび／またはマイクロＲＮＡ等のＲＮＡ分子は、それ自体で機能的であり得る。別の場合、ＲＮＡ分子は、所望の機能を有するポリペプチド、例えば、限定されないが、脂肪酸合成もしくは修飾に関与する酵素、例えば穀類グルテニンもしくはグリアジン等の種子貯蔵タンパク質、炭水化物（carbohydrate）合成もしくは修飾、二次代謝に関与する酵素、または医薬をコードすることができる。医薬タンパク質の例としては、抗体ならびに抗体関連分子およびそれらの断片、例えば癌に対する免疫保護を提供し得る抗原性ポリペプチド、感染因子、サイトカイン、例えば、顆粒状マクロファージコロニー刺激因子、インターフェロンα、ヒト血清アルブミンおよびエリスロポエチンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１９３】
更なる一実施形態において、細胞は、少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種または少なくとも５種以上の更なる異なる外因性ポリヌクレオチドを含み、各々は、ＲＮＡ分子をコードし、貯蔵器官中における遺伝子転写を誘導するプロモーターに作動可能に連結する。各外因性ポリヌクレオチドは、同じプロモーター、異なるプロモーターまたはそれらの組合せに作動可能に連結することができる。
【０１９４】
一実施形態において、外因性ポリヌクレオチドは、ＤＮＡである。
【０１９５】
更なる一実施形態において、細胞は、種子等の植物貯蔵器官中にある。
【０１９６】
好ましい一実施形態において、ＲＮＡモレケウル（moleceule）は、第１の外因性ポリヌクレオチドを欠くアイソジェニックな細胞と比較して増加したレベルで存在する。好ましくは、レベルは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％増加する。
【０１９７】
他の一実施形態において、少なくとも更なる外因性ポリヌクレオチドの内によってコードされる少なくとも１種のＲＮＡ分子は、第１の外因性ポリヌクレオチドを欠くアイソジェニックな細胞と比較して増加したレベルで存在する。
【０１９８】
また、上記の態様の細胞を含むトランスジェニック植物も提供される。一実施形態において、植物の各細胞は、上記の態様において定義された通りである。特に好ましい一実施形態において、前記細胞を欠く植物と比較した場合、植物は表現型的に正常である。
【０１９９】
さらに他の一態様において、上記の態様の細胞を含むおよび／または上記で定義されたトランスジェニック植物から得られる植物貯蔵器官が提供される。
【０２００】
一実施形態において、植物貯蔵器官は種子である。
【０２０１】
更なる一態様において、
その貯蔵器官中におけるＲＮＡ分子の増加したレベルを有する表現型的に正常な植物を得る方法であって、
ａ）
ｉ）植物貯蔵器官特異的プロモーターに作動可能に連結したサイレンシングサプレッサーをコードする第１の外因性ポリヌクレオチド、ならびに
ｉｉ）植物貯蔵器官中における遺伝子転写を誘導するプロモーターに作動可能に連結したＲＮＡ分子をコードする第２の外因性ポリヌクレオチド
を植物細胞中に導入するステップ、
ｂ）ステップａ）の細胞から形質転換植物を再生させるステップ、
ｃ）形質転換植物を、形質転換植物が貯蔵器官を産生するまで成長させるステップ、
ｄ）貯蔵器官中におけるＲＮＡ分子のレベルを決定するステップ、および
ｅ）表現型的に正常な植物を選択するステップ
を含み、ＲＮＡ分子が、第１の外因性ポリヌクレオチドを欠く対応する貯蔵器官と比較して貯蔵器官中において増加したレベルで存在する、方法が提供される。
【０２０２】
その上更なる一態様において、
その貯蔵器官中におけるＲＮＡ分子の安定化された発現を有する表現型的に正常な植物を得る方法であって、
ａ）
ｉ）植物貯蔵器官特異的プロモーターに作動可能に連結したサイレンシングサプレッサーをコードする第１の外因性ポリヌクレオチド、および
ｉｉ）植物貯蔵器官中における遺伝子転写を誘導するプロモーターに作動可能に連結したＲＮＡ分子をコードする第２の外因性ポリヌクレオチド
を植物細胞中に導入するステップ、
ｂ）ステップａ）の細胞から形質転換植物を再生させるステップ、
ｃ）ステップｂ）の植物に由来する貯蔵器官を含む第３世代の子孫植物を産生するステップ、および
ｄ）第３世代の子孫植物を選択するステップ
を含み、ＲＮＡ分子が、植物の前世代の貯蔵器官中におけるレベルの少なくとも９０％のレベルで貯蔵器官中に存在する、方法が提供される。
【０２０３】
好ましくは、上記の態様の外因性ポリヌクレオチドは、細胞のゲノム中に安定して組み込まれる。
【０２０４】
さらに他の一態様において、本発明は、
トランスジェニック植物の貯蔵器官中におけるＲＮＡ分子の発現を安定化させる方法であって、
ｉ）植物貯蔵器官特異的プロモーターに作動可能に連結したサイレンシングサプレッサーをコードする第１の外因性ポリヌクレオチドを発現させるステップ、および
ｉｉ）植物貯蔵器官中における遺伝子転写を誘導するプロモーターに作動可能に連結したＲＮＡ分子をコードする第２の外因性ポリヌクレオチドを発現させるステップ
を含み、トランスジェニック植物が、外因性ポリヌクレオチドで形質転換された親植物から得られた少なくとも第３世代の子孫植物であり、ＲＮＡ分子が、植物の前世代の貯蔵器官中におけるレベルの少なくとも９０％のレベルで植物の貯蔵器官中に存在する、方法が提供される。
【０２０５】
一実施形態において、植物を野外において成長させる。
【０２０６】
明らかであるように、本発明の一態様の好ましい特性および特徴は、本発明の多くの他の態様に適用可能である。
【０２０７】
本明細書にわたって、「含む（comprise）」という語、または「含む（comprises）」もしくは「含む（comprising）」等の変形物は、所定の要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群の包含を意味すると理解されるが、他のいずれの要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群の除外を意味するものではないことが理解される。
【０２０８】
本発明を、以下の非限定的な実施例によって、および添付の図面を参照して以下に記載する。
【図面の簡単な説明】
【０２０９】
【図１】好気性ＤＨＡ生合成経路を示す図である。
【図２】ＰＣ、ＣｏＡプールおよびＴＡＧプールの間において脂肪酸を転移する様々なアシル交換酵素を示す図である。Ｓｉｎｇｈら（２００５）からの適合。
【図３】ミクロモナスＣＳ−０１７０Δ６−エロンガーゼおよび関連遺伝子の間の多重アラインメントを示す図である。ＡＡＶ３３６３０、Ｃ２０多価不飽和脂肪酸伸長酵素［パブロバ属種ＣＣＭＰ４５９］；ＡＡＹ１５１３５、エロンガーゼ１［パブロバ・サリナ］；ＡＢＲ６７６９０、Ｃ２０エロンガーゼ［パブロバ・ビリジス（Pavlova viridis）］；ＡＡＶ６７７９７、多価不飽和脂肪酸エロンガーゼ１［オストレオコッカス・タウリ（Ostreococcus tauri）］；ＣＡＬ５５４１４、多価不飽和脂肪酸エロンガーゼ２（ＩＳＳ）［オストレオコッカス・タウリ］；ＸＰ＿００１４１９７９１、予測されたタンパク質［オストレオコッカス・ルシマリヌス（Ostreococcus lucimarinus）ＣＣＥ９９０１］；ＭｉｃＣＳ０１７０−ｄ６Ｅ、ミクロモナスＣＳ−０１７０Δ６−エロンガーゼ（本研究）；ＡＡＶ６７８００、多価不飽和脂肪酸エロンガーゼ２［タラシオシラ・シュードナナ（Thalassiosira pseudonana）］；ＸＰ＿００１４１６４５４、予測されたタンパク質［オストレオコッカス・ルシマリヌスＣＣＥ９９０１］；ＡＢＣ１８３１３、多価不飽和脂肪酸エロンガーゼ１［スラウストキトリウム（Thraustochytrium）属種ＦＪＮ−１０］；ＡＡＶ６７７９９、多価不飽和脂肪酸エロンガーゼ１［タラシオシラ・シュードナナ］；ＡＡＷ７０１５７、デルタ−６−エロンガーゼ［フェオダクチルム・トリコルヌツム（Phaeodactylum tricornutum）］；ＡＢＣ１８３１４、多価不飽和脂肪酸エロンガーゼ２［スラウストキトリウム属種ＦＪＮ−１０］；ＣＡＤ５８５４０、無名のタンパク質産物［イソクリシス・ガルバナ（Isochrysis galbana）］。
【図４】ピラミモナスＣＳ−０１４０Δ６−エロンガーゼおよび関連遺伝子の間の多重アラインメントを示す図である。ＡＡＬ８４１７４、多価不飽和脂肪酸特異的伸長酵素１［フィスコミトレラ・パテンス］；ＡＡＴ８５６６２、多価不飽和脂肪酸エロンガーゼ［マルチャンチア・ポリモルファ（Marchantia polymorpha）］；ＡＡＶ６７７９７、多価不飽和脂肪酸エロンガーゼ１［オストレオコッカス・タウリ］；ＡＢＯ９４７４７、予測されたタンパク質［オストレオコッカス・ルシマリヌスＣＣＥ９９０１］；Ｐｙｒｃｏ−ｄ６Ｅ、ピラミモナスＣＳ−０１４０Δ６−エロンガーゼ（本研究）；ＡＢＣ１８３１３、多価不飽和脂肪酸エロンガーゼ１［スラウストキトリウム属種ＦＪＮ−１０］；ＢＡＦ９７０７３、多価不飽和脂肪酸伸長酵素［モルティエラ・アルピナ］；ＸＰ＿００１５６７４８８、長鎖多価不飽和脂肪酸伸長酵素様タンパク質［リーシュマニア・ブラジリエンシス（Leishmania braziliensis）ＭＨＯＭ／ＢＲ／７５／Ｍ２９０４］；ＢＡＥ７１１２９、デルタ５−エロンガーゼ［マルチャンチア・ポリモルファ］；ＸＰ＿００１７７９１０５、予測されたタンパク質［フィスコミトレラ・パテンス］。
【図５】ピラミモナスＣＳ−０１４０Δ５−エロンガーゼおよび関連遺伝子の間の多重アラインメントを示す図である。ＡＡＩ５２２０４、Ｅｌｏｖｌ４タンパク質［ダニオ・レリオ］；ＣＡＧ０１７８０、無名のタンパク質産物［テトラオドン・ニグロビリジス（Tetraodon nigroviridis）］；ＡＡＶ６７８００、多価不飽和脂肪酸エロンガーゼ２［タラシオシラ・シュードナナ］；ＡＡＶ３３６３０、Ｃ２０多価不飽和脂肪酸伸長酵素［パブロバ属種ＣＣＭＰ４５９］；ＡＢＲ６７６９０、Ｃ２０エロンガーゼ［パブロバ・ビリジス］；ＡＡＹ１５１３５、エロンガーゼ１［パブロバ・サリナ］；ＡＡＶ６７７９８、多価不飽和脂肪酸エロンガーゼ２［オストレオコッカス・タウリ］；ＡＢＯ９８０８４、予測されたタンパク質［オストレオコッカス・ルシマリヌスＣＣＥ９９０１］；Ｐｙｒｃｏ−ｄ５Ｅ、ピラミモナスＣＳ−０１４０Δ５−エロンガーゼ（本研究）。
【図６】ミクロモナスＣＣＭＰ１５４５Δ６−デサチュラーゼおよび関連遺伝子の間の多重アラインメントを示す図である。ＡＡＭ０９６８７、Δ５−脂肪酸デサチュラーゼ［スラウストキトリウム属種ＡＴＣＣ２１６８５］；ＡＡＶ３３６３１、Δ４−デサチュラーゼ［イソクリシス・ガルバナ］；ＡＡＷ７０１５９、Δ６−デサチュラーゼ［オストレオコッカス・タウリ］；ＡＢＯ９９３６６、予測されたタンパク質［オストレオコッカス・ルシマリヌスＣＣＥ９９０１］；Ｍｉｃ−ｄ６Ｄ、ミクロモナスＣＣＭＰ１５４５Δ６−デサチュラーゼ（本研究）；ＡＢＦ５８６８５、Δ５−デサチュラーゼ［パーキンサス・マリヌス（Perkinsus marinus）］；ＡＢＬ９６２９５、Δ５−デサチュラーゼ［パブロバ・サリナ］。
【図７】オストレオコッカス・ルシマリヌスΔ６−デサチュラーゼおよび関連遺伝子の間の多重アラインメントを示す図である。ＡＡＭ０９６８７、Δ５−脂肪酸デサチュラーゼ［スラウストキトリウム属種ＡＴＣＣ２１６８５］；ＡＡＲ２７２９７、Δ６−デサチュラーゼ［アミロミセス・ルキシイ（Amylomyces rouxii）］；ＡＡＳ９３６８２、Δ６−脂肪酸デサチュラーゼ［リゾプス・オリーゼ（Rhizopus oryzae）］；ＡＡＶ３３６３１、Δ４−デサチュラーゼ［イソクリシス・ガルバナ］；ＡＡＷ７０１５９、Δ６−デサチュラーゼ［オストレオコッカス・タウリ］；Ｏｓｔｌｕ−ｄ６Ｄ、オストレオコッカス・ルシマリヌスΔ６−デサチュラーゼ（本研究）；ＡＢＦ５８６８５、Δ５−デサチュラーゼ［パーキンサス・マリヌス］；ＡＢＬ９６２９５、Δ５−デサチュラーゼ［パブロバ・サリナ］；ＥＤＱ９２２３１、予測されたタンパク質［モノシガ・ブレビコリス（Monosiga brevicollis）ＭＸ１］；ＣＡＭ４１７２８、脂肪酸デサチュラーゼ、推定の［リーシュマニア・ブラジリエンシス］；ＣＡＭ６５６８３、脂肪酸デサチュラーゼ、推定の［リーシュマニア・インファンタム（Leishmania infantum）］。
【図８】ピラミモナスＣＳ−０１４０Δ５−デサチュラーゼおよび関連遺伝子の間の多重アラインメントを示す図である。ＡＡＭ０９６８７、Δ５−脂肪酸デサチュラーゼ［スラウストキトリウム属種ＡＴＣＣ２１６８５］；Ｐｙｒｃｏ−ｄ５Ｄ、ピラミモナスＣＳ−０１４０Δ５−デサチュラーゼ（本研究）；ＡＡＴ８５６６１、Δ６−脂肪酸デサチュラーゼ［マルチャンチア・ポリモルファ］；ＡＡＸ１４５０５、Δ６−脂肪酸デサチュラーゼ［タラシオシラ・シュードナナ］；ＡＢＰ４９０７８、Δ６−脂肪酸デサチュラーゼ［フェオダクチルム・トリコルヌツム］；ＡＡＷ７０１５９、Δ６−デサチュラーゼ［オストレオコッカス・タウリ］；ＸＰ＿００１４２１０７３、予測されたタンパク質［オストレオコッカス・ルシマリヌスＣＣＥ９９０１］；ＡＢＦ５８６８５、Δ５−デサチュラーゼ［パーキンサス・マリヌス］；ＣＡＪ０７０７６、脂肪酸デサチュラーゼ、推定の［リーシュマニア・マジョール（Leishmania major）］；ＡＢＬ９６２９５、Δ５−デサチュラーゼ［パブロバ・サリナ］；ＥＤＱ９２２３１、予測されたタンパク質［モノシガ・ブレビコリスＭＸ１］。
【図９】オストレオコッカス・タウリ（Ｏｔ）（配列番号３０）、オストレオコッカス・ルシマリヌス（Ｏｌ）（配列番号１０）およびミクロモナス（Ｍ）ＣＣＭＰ１５４５Δ６−デサチュラーゼタンパク質配列（配列番号８）の多重アラインメントを示す図である。
【図１０】様々なデサチュラーゼの間の関係を示す系統樹である。Ｐａｖｓａ−ｄ５Ｄ＝パブロバ・サリナΔ５−デサチュラーゼ（ＡＢＬ９６２９５）、Ｔｈｒ２１６８５−ｄ５Ｄ＝スラウストキトリウム属種ＡＴＣＣ２１６８５Δ５−デサチュラーゼ（ＡＡＭ０９６８７）、Ｍｉｃ１５４５−ｄ６Ｄ＝ミクロモナスＣＣＭＰ１５４５Δ６−デサチュラーゼ（本研究）、Ｏｓｔｔａ−ｄ６Ｄ＝オストレオコッカス・タウリΔ６−デサチュラーゼ（ＡＡＷ７０１５９）、Ｏｓｔｌｕ−ｄ６Ｄ＝オストレオコッカス・ルシマリヌスΔ６−デサチュラーゼ（本研究）、Ｇａｌｇａ−ｄ６Ｄ＝ガッルス・ガッルス（Gallus gallus）Δ６−デサチュラーゼ（ＸＰ＿４２１０５３）、Ｈｏｍｓａ−ｄ６Ｄ＝ホモ・サピエンス（Homo sapiens）Δ６−デサチュラーゼ（ＡＡＧ２３１２１）、Ｍｕｓｍｕ−ｄ６Ｄ＝ムス・ムスクルス（Mus musculus）Δ６−デサチュラーゼ（ＮＰ＿０６２６７３）、Ｄａｎｒｅ−ｄ５／６Ｄ＝ダニオ・レリオΔ５−／Δ６−デサチュラーゼ（ＡＡＧ２５７１０）、Ｓｐａａｕ−ｄ６Ｄ＝スパルス・アウラタ（Sparus aurata）推定のΔ６−デサチュラーゼ（ＡＡＬ１７６３９）、Ｓｃｏｍａ−ｄ６Ｄ＝スコフタルムス・マクシムス（Scophthalmus maximus）Δ６−デサチュラーゼ（ＡＡＳ４９１６３）、Ｏｎｃｍｙ−ｄ６Ｄ＝オンコルヒュンクス・ミキス（Oncorhynchus mykiss）Δ６−デサチュラーゼ（ＡＡＫ２６７４５）、Ｓａｌｓａ−ｄ５Ｄ＝サルモ・サラル（Salmo salar）Δ５−デサチュラーゼ（ＡＡＬ８２６３１）、Ｐｒｉｆａ−ｄ６Ｄ＝プリムラ・ファリノサ（Primula farinosa）Δ６−デサチュラーゼ（ＡＡＰ２３０３４）、Ｅｕｇｇｒ−ｄ６Ｄ＝ユーグレナ・グラシリスΔ６−デサチュラーゼ、Ｂｏｒｏｆ−ｄ６Ｄ＝ボラゴ・オフィシアナリス（Borago officianalis）Δ６−デサチュラーゼ（ＡＡＣ４９７００）、Ｃａｅｅｌ−ｄ６Ｄ＝シノラブディス・エレガンスΔ６−デサチュラーゼ（ＡＡＣ１５５８６）、Ｒｈｉｏｒ−ｄ６Ｄ＝リゾプス・オリーゼΔ６−デサチュラーゼ（ＡＡＳ９３６８２）、Ｍｏｒａｌ−ｄ６Ｄ＝モルティエラ・アルピナΔ６−デサチュラーゼ（ＡＡＦ０８６８５）、Ｍｏｒｉｓ−ｄ６Ｄ＝モルティエレラ・イサベリナΔ６−デサチュラーゼ（ＡＡＬ７３９４８）、Ｍａｒｐｏ−ｄ６Ｄ＝マルチャンチア・ポリモルファΔ６−デサチュラーゼ（ＡＡＴ８５６６１）、Ｃｅｒｐｕ−ｄ６Ｄ＝セラトドン・プルプレウス（Ceratodon purpureus）Δ６−デサチュラーゼ（ＣＡＢ９４９９３）、Ｐｈａｔｒ−ｄ６Ｄ＝フェオダクチルム・トリコルヌツムΔ６−デサチュラーゼ（ＡＡＬ９２５６３）、Ｔｈａｐｓ−ｄ６Ｄ＝タラシオシラ・シュードナナΔ６−デサチュラーゼ（ＡＡＸ１４５０５）、Ｐａｖｓａ−ｄ８Ｄ＝パブロバ・サリナΔ８−デサチュラーゼ（ＡＢＬ９６２９６）、Ｐｈａｔｒ−ｄ５Ｄ＝フェオダクチルム・トリコルヌツムΔ５−デサチュラーゼ（ＡＡＬ９２５６２）、Ｍａｒｐｏ−ｄ５Ｄ＝マルチャンチア・ポリモルファΔ５−デサチュラーゼ（ＡＡＴ８５６６３）、Ｍｏｒａｌ−ｄ５Ｄ＝モルティエラ・アルピナΔ５−デサチュラーゼ（ＡＡＲ２８０３５）、Ｄｉｃｄｉ−ｄ５Ｄ＝ジクチオステリウム・ジスコイデウム（Dictyostelium discoideum）Δ５−デサチュラーゼ（ＢＡＡ３７０９０）。
【図１１】ｌｉｎＰ−ｍｉｃ１５４５−ｄ６Ｄ−ｌｉｎＴ構築物で形質転換されたＴ２アラビドプシス種子から得られるＧＣを示す図である。個々の事象１〜１９についてＳＤＡおよびＧＬＡレベルが示され、ω６に対するω３の変換効率の比は各柱の上に示される。Ｍ．プシラ（M. pusilla）Δ６−デサチュラーゼは、ω３基質に対するはっきりとした選好性を示す。
【図１２】Ｎ．ベンサミアナ（N. benthamiana）中に浸潤させたＥＰＡ経路を構成する酵素の変換効率を示す図である。ＥＰＡ経路は、Δ６−デサチュラーゼ（エキウム・プランタギネウム（Echium plantagineum）Δ６−デサチュラーゼ、オストレオコッカス・タウリΔ６−デサチュラーゼまたはミクロモナス・プシラ（Micromonas pusilla）Δ６−デサチュラーゼ）、ピラミモナス・コルダタ（Pyramimonas cordata）Δ６−エロンガーゼおよびパブロバ・サリナΔ５−デサチュラーゼを含有する。パネルａ．は、各経路に対するω３プール変換効率を示す。ｂ．は、Ｅ．プランタギネウム経路、Ｍ．プシラ経路およびこれらの両デサチュラーゼを含有する経路の間の直接比較を含む。ｃ．は、Ｏ．タウリ経路、Ｍ．プシラ経路および両アシルＣｏＡデサチュラーゼを含有する経路の間の直接比較を含有する。
【図１３】一過性発現ミクロモナスＲＣＣ２９９ω３デサチュラーゼによるニコチアナ・ベンサミアナ（Nicotiana benthamiana）中のＥＰＡの産生のＧＣおよびＧＣ−ＭＳによる確認を示す図である。
【図１４】プロモーターの方向、ＴＭＶリーダー配列の位置、スペーサー領域の位置および遺伝子挿入に対する固有のクローニング部位が含まれるバイナリーベクターの主要な特性を示すバイナリーベクターｐＪＰ１０１ａｃｑの地図である。ＮｏｓＴ＝ＮＯＳターミネーター、ＦＰ１＝切断されたナピンターミネーター、ＬｉｎｉｎＴ＝Ｌｉｎｉｎターミネーター。
【図１５】バイナリーベクターｐＪＰ１０７の地図である。
【図１６】葉に基づくアッセイにおける、ほとんど最大の遺伝子活性を達成するために必要とされるアグロバクテリウム濃度の決定を示す図である。バイナリー発現構築物イソクリシス・ガルバナΔ９−エロンガーゼ（ＩｇΔ９ｅｌｏ）を含有するアグロバクテリウムＡＧＬ１の様々な培養密度による浸潤後のＮ．ベンサミアナにおけるＩｇΔ９ｅｌｏ活性。共浸潤Ｐ１９をＯＤ６００ｎｍ０．４の濃度に設定した。ｙ軸は、ＥＤＡおよびＥＴｒＡを産生するための両ＩｇΔ９ｅｌｏ活性の合計を示す。
【図１７】葉における一過性発現または安定発現を用いたＬＣ−ＰＵＦＡ経路のトランスジェニック発現の比較を示す図である。変換効率は、全脂肪酸プロファイルに基づく。ａ（Ｑｉら、２００４）から抽出された結果、ｂ（Ｒｏｂｅｒｔら、２００５）から抽出された結果。
【図１８】ニコチアナ・ベンサミアナにおける代謝的適合。パネルａ．は、大量のＤＨＡ以外の少量のＥＰＡだけを含有するマグロ油から産生された脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）のガスクロマトグラフィー（ＧＣ）のトレースである。パネルｂ．およびｃ．は、ミクロモナス・プシラΔ６−デサチュラーゼ、ピラミモナス・コルダタΔ６−エロンガーゼ、パブロバ・サリナΔ５−デサチュラーゼ、Ｐ．コルダタΔ５−エロンガーゼ（ｂ．）またはＰ．サリナΔ５−エロンガーゼ（ｃ．）およびＰ．サリナΔ４−デサチュラーゼを含有する単一遺伝子ＣａＭＶ３５Ｓバイナリー構築物で一過性に形質転換したＮ．ベンサミアナ葉組織のＴＡＧ画分に由来するＦＡＭＥのＧＣのトレースである。Ｐ．サリナΔ５−エロンガーゼを使用した試料中におけるＥＰＡの蓄積は、代謝経路を経路中における単一遺伝子の慎重な選択によって適合させることができる方法を実証する。
【図１９】導入遺伝子を含むベクターｐＪＰ３０７５の領域の地図である。
【図２０】導入遺伝子を含むベクターｐＪＰ３０５９の領域の地図である。
【図２１】導入遺伝子を含むベクターｐＪＰ３０６０の領域の地図である。
【図２２】導入遺伝子を含むベクターｐＪＰ３１１５の領域の地図である。
【図２３】導入遺伝子を含むベクターｐＪＰ３１１６の領域の地図である。
【発明を実施するための形態】
【０２１０】
配列表のキー
配列番号１−ミクロモナスＣＳ−０１７０Δ６−エロンガーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号２−ミクロモナスＣＳ−０１７０Δ６−エロンガーゼ。
配列番号３−ピラミモナスＣＳ−０１４０Δ６−エロンガーゼ／Δ９−エロンガーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号４−ピラミモナスＣＳ−０１４０Δ６−エロンガーゼ／Δ９−エロンガーゼ。
配列番号５−ピラミモナスＣＳ−０１４０Δ５−エロンガーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号６−ピラミモナスＣＳ−０１４０Δ５−エロンガーゼ。
配列番号７−ミクロモナスＣＣＭＰ１５４５Δ６−デサチュラーゼ／Δ８−デサチュラーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号８−ミクロモナスＣＣＭＰ１５４５Δ６−デサチュラーゼ／Δ８−デサチュラーゼ。
配列番号９−オストレオコッカス・ルシマリヌスΔ６−デサチュラーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号１０−オストレオコッカス・ルシマリヌスΔ６−デサチュラーゼ。
配列番号１１−植物中におけるオストレオコッカス・ルシマリヌスΔ６−デサチュラーゼの発現に対するコドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号１２−ピラミモナスＣＳ−０１４０Δ５−デサチュラーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号１３−ピラミモナスＣＳ−０１４０Δ５−デサチュラーゼ。
配列番号１４−ミクロモナスＣＳ−０１７０ω３−デサチュラーゼをコードする部分的オープンリーディングフレーム。
配列番号１５−部分的ミクロモナスＣＳ−０１７０ω３−デサチュラーゼ。
配列番号１６−ミクロモナスＲＣＣ２９９ω３−デサチュラーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号１７−ミクロモナスＲＣＣ２９９ω３−デサチュラーゼ。
配列番号１８−植物中におけるミクロモナスＲＣＣ２９９ω３−デサチュラーゼの発現に対するコドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号１９−ミクロモナスＣＣＭＰ１５４５ω３−デサチュラーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号２０−ミクロモナスＣＣＭＰ１５４５ω３−デサチュラーゼ。
配列番号２１−イソクリシス・ガルバナΔ９−エロンガーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号２２−イソクリシス・ガルバナΔ９−エロンガーゼ。
配列番号２３−パブロバ・サリナΔ８−デサチュラーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号２４−パブロバ・サリナΔ８−デサチュラーゼ。
配列番号２５−パブロバ・サリナΔ５−デサチュラーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号２６−パブロバ・サリナΔ５−デサチュラーゼ。
配列番号２７−エミリアニア・ハクスレイ（Emiliania huxleyi）ＣＣＭＰ１５１６Δ９エロンガーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号２８−エミリアニア・ハクスレイＣＣＭＰ１５１６Δ９エロンガーゼ。
配列番号２９−植物中におけるエミリアニア・ハクスレイΔ９エロンガーゼの発現に対するコドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号３０−オストレオコッカス・タウリΔ６−デサチュラーゼ。
配列番号３１−エロンガーゼコンセンサスドメイン１。
配列番号３２−エロンガーゼコンセンサスドメイン２。
配列番号３３−エロンガーゼコンセンサスドメイン３。
配列番号３４−エロンガーゼコンセンサスドメイン４。
配列番号３５−エロンガーゼコンセンサスドメイン５。
配列番号３６−エロンガーゼコンセンサスドメイン６。
配列番号３７−デサチュラーゼコンセンサスドメイン１。
配列番号３８−デサチュラーゼコンセンサスドメイン２。
配列番号３９−デサチュラーゼコンセンサスドメイン３。
配列番号４０−デサチュラーゼコンセンサスドメイン４。
配列番号４１〜７１および７８〜９２−オリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号７２−パブロバ・サリナΔ４−デサチュラーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号７３−パブロバ・サリナΔ４−デサチュラーゼ。
配列番号７４−アラビドプシス・サリアナジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ１をコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号７５−アラビドプシス・サリアナジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ１。
配列番号７６−エロンガーゼコンセンサスドメイン７。
配列番号７７−エロンガーゼコンセンサスドメイン８。
配列番号９３−パブロバ・ピンギス（Pavlova pinguis）Δ９−エロンガーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号９４−パブロバ・ピンギスΔ９−エロンガーゼ。
配列番号９５−パブロバ・サリナΔ９−エロンガーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号９６−パブロバ・サリナΔ９−エロンガーゼ。
配列番号９７−Ｐ１９ウイルスサプレッサー。
配列番号９８−Ｖ２ウイルスサプレッサー。
配列番号９９−Ｐ３８ウイルスサプレッサー。
配列番号１００−Ｐｅ−Ｐ０ウイルスサプレッサー。
配列番号１０１−ＲＰＶ−Ｐ０ウイルスサプレッサー。
配列番号１０２−Ｐ１９ウイルスサプレッサーをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号１０３−Ｖ２ウイルスサプレッサーをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号１０４−Ｐ３８ウイルスサプレッサーをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号１０５−Ｐｅ−Ｐ０ウイルスサプレッサーをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号１０６−ＲＰＶ−Ｐ０ウイルスサプレッサーをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号１０７−ミクロモナスＣＣＭＰ１５４５ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２をコードするコドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号１０８−ミクロモナスＣＣＭＰ１５４５ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２。
配列番号１０９〜１２４−転移核酸境界配列。
配列番号１２５−植物中におけるミクロモナスＣＣＭＰ１５４５Δ６デサチュラーゼ／Δ８デサチュラーゼの発現に対するコドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号１２６−（３’末端で切断され、かつ機能的エロンガーゼをコードする）植物中におけるピラミモナスＣＳ−０１４０Δ６エロンガーゼ／Δ９エロンガーゼの発現に対するコドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号１２７−植物中におけるパブロバ・サリナΔ５デサチュラーゼの発現に対するコドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号１２８−植物中におけるピラミモナスＣＳ−０１４０Δ５エロンガーゼの発現に対するコドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号１２９−植物中におけるパブロバ・サリナΔ４デサチュラーゼの発現に対するコドン最適化オープンリーディングフレーム。
【０２１１】
発明の詳細な説明
一般的技術および定義
特に具体的に定義されない限り、本明細書において用いられる全ての技術的および科学的な用語は、（例えば、細胞培養、分子遺伝学、脂肪酸合成、トランスジェニック植物、タンパク質化学および生化学における）当業者によって共通に理解されるものと同じ意味を有するように採用される。
【０２１２】
特に明記しない限り、本発明において利用される組換えタンパク質、細胞培養および免疫学的技術は、当業者に周知の標準的手法である。かかる技術は、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９８４）、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（編）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、１および２巻、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、Ｄ．Ｍ．ＧｌｏｖｅｒおよびＢ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（編）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、１〜４巻、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５および１９９６）、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８，現在までの全ての改訂を含む）、Ｅｄ  ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（編）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、（１９８８）、ならびにＪ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（現在までの全ての改訂を含む）等の出典の文献にわたって記載され、説明される。
【０２１３】
選択された定義
本明細書において使用される「脂肪酸」という用語は、飽和または不飽和のいずれかの、しばしば長い脂肪族テイルを有するカルボン酸（または有機酸）を指す。典型的には、脂肪酸は、長さが少なくとも８個の炭素原子、より好ましくは長さが少なくとも１２個の炭素の炭素−炭素結合鎖を有する。ほとんどの天然に存在する脂肪酸は、それらの生合成が２個の炭素原子を有するアセテートを含むので、偶数の炭素原子数を有する。脂肪酸は、遊離状態（非エステル化）またはエステル化形態、例えば、トリグリセリド、ジアシルグリセリド、モノアシルグリセリド、アシル−ＣｏＡ（チオエステル）結合もしくは他の結合形態の部分であってよい。脂肪酸は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトールまたはジホスファチジルグリセロールの形態等のリン脂質としてエステル化され得る。
【０２１４】
「飽和脂肪酸」は、鎖に沿っていずれの二重結合や他の官能基を含有しない。「飽和」という用語は、（カルボン酸［−ＣＯＯＨ］基とは別の）全ての炭素ができるだけ多くの水素を含有するという点において、水素を指す。換言すれば、オメガ（ω）末端は３個の水素（ＣＨ３−）を含有し、鎖の中の各炭素は２個の水素（−ＣＨ２−）を含有する。
【０２１５】
「不飽和脂肪酸」は、１個または複数個のアルケン官能基が鎖に沿って存在し、各アルケンが鎖の単結合「−ＣＨ２−ＣＨ２−」部分を二重結合「−ＣＨ＝ＣＨ−」部分（すなわち、他の炭素に二重結合した炭素）で置換することを除いて飽和脂肪酸と類似の形態である。二重結合のいずれかの側に結合する鎖中の２個の隣の炭素原子は、シス型またはトランス型立体配置において出現し得る。
【０２１６】
本明細書において使用される「一価不飽和脂肪酸」という用語は、その炭素鎖中において少なくとも１２個の炭素原子と鎖中において１個だけのアルケン基（炭素−炭素二重結合）とを含む脂肪酸を指す。本明細書において使用される「多価不飽和脂肪酸」または「ＰＵＦＡ」という用語は、その炭素鎖中において少なくとも１２個の炭素原子と少なくとも２個のアルケン基（炭素−炭素二重結合）とを含む脂肪酸を指す。
【０２１７】
本明細書において使用される「長鎖多価不飽和脂肪酸」および「ＬＣ−ＰＵＦＡ」という用語は、その炭素鎖中において少なくとも２０個の炭素原子と少なくとも２個の炭素−炭素二重結合とを含む脂肪酸を指し、故にＶＬＣ−ＰＵＦＡを包含する。本明細書において使用される「超長鎖多価不飽和脂肪酸」および「ＶＬＣ−ＰＵＦＡ」という用語は、その炭素鎖中において少なくとも２２個の炭素原子と少なくとも３個の炭素−炭素二重結合とを含む脂肪酸を指す。通常、脂肪酸の炭素鎖中における炭素原子数は、非分枝炭素鎖を指す。炭素鎖が分枝状である場合、炭素原子数は側基中のものを除外する。一実施形態において、長鎖多価不飽和脂肪酸は、ω３脂肪酸であり、すなわち、脂肪酸のメチル末端から３番目の炭素−炭素結合中における不飽和化（炭素−炭素二重結合）を有する。他の一実施形態において、長鎖多価不飽和脂肪酸は、ω６脂肪酸であり、すなわち、脂肪酸のメチル末端から６番目の炭素−炭素結合中における不飽和化（炭素−炭素二重結合）を有する。更なる一実施形態において、長鎖多価不飽和脂肪酸は、アラキドン酸（ＡＲＡ、２０：４Δ５，８，１１，１４、ω６）、エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ、２０：４Δ８，１１，１４，１７、ω３）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５Δ５，８，１１，１４，１７、ω３）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ、２２：５Δ７，１０，１３，１６，１９、ω３）またはドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：６Δ４，７，１０，１３，１６，１９、ω３）から成る群から選択される。ＬＣ−ＰＵＦＡは、ジホモ−γ−リノール酸（ＤＧＬＡ）またはエイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ、２０：３Δ１１，１４，１７、ω３）でもあり得る。本発明に従って産生されるＬＣ−ＰＵＦＡが、上記のいずれかまたは全ての混合物であり得、他のＬＣ−ＰＵＦＡまたはこれらのＬＣ−ＰＵＦＡのいずれかの誘導体を含み得ることは、直ちに明らかである。好ましい一実施形態において、ω３脂肪酸は、ＥＰＡ、ＤＰＡおよび／もしくはＤＨＡであり、好ましくはＥＰＡおよび／もしくはＤＰＡであるか、または好ましくはＤＰＡおよび／もしくはＤＨＡである。
【０２１８】
さらに、本明細書において使用される「長鎖多価不飽和脂肪酸」および「超長鎖多価不飽和脂肪酸」という用語は、遊離状態（非エステル化）またはエステル化形態、例えば、トリグリセリド、ジアシルグリセリド、モノアシルグリセリド、アシル−ＣｏＡ結合もしくは他の結合形態の部分にある脂肪酸を指す。脂肪酸は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトールまたはジホスファチジルグリセロールの形態等のリン脂質としてエステル化され得る。従って、ＬＣ−ＰＵＦＡは、細胞の脂質または細胞、組織もしくは生物から抽出された精製油もしくは脂質における形態の混合物として存在し得る。好ましい実施形態において、本発明は、挙げられたもの等の脂質の他の形態として存在する残部と共に、少なくともＬＣ−ＰＵＦＡを含む少なくとも７５％または８５％のトリアシルグリセロール、を含む油を提供する。油は、例えば、遊離脂肪酸を放出するための強塩基による加水分解によって、または分画、蒸留等によってさらに精製または処理され得る。
【０２１９】
本発明において使用され得るデサチュラーゼ、エロンガーゼおよびアシルトランスフェレアーゼ（transferease）タンパク質ならびにそれらをコードする遺伝子は、本技術分野において公知のもののいずれかまたはそれらの相同体もしくは誘導体である。かかる遺伝子およびコードされたタンパク質の大きさの例を表１において列挙する。ＬＣ−ＰＵＦＡ生合成に関与することが示されたデサチュラーゼ酵素は、いわゆる「フロントエンド」デサチュラーゼの群に全て属する。
【０２２０】
【表１】
0006068800.tif 000002
0006068800.tif 000003
0006068800.tif 000004
【０２２１】
本明細書において使用される「フロントエンドデサチュラーゼ」という用語は、３つの高度に保存されたヒスチジンボックスを含む典型的な脂肪酸デサチュラーゼドメインと共にＮ末端チトクロムｂ５ドメインの存在によって構造的に特徴付けられる脂質のアシル鎖のカルボキシル基と既存の不飽和部との間に二重結合を導入する酵素のクラスのメンバーを指す（Ｎａｐｉｅｒら、１９９７）。
【０２２２】
本発明における使用のためのエロンガーゼまたはデサチュラーゼのいずれかの活性は、例えば酵母細胞または植物細胞等の細胞中における酵素をコードする遺伝子を発現させ、その細胞が、酵素が発現されない同等の細胞と比較してＬＣ−ＰＵＦＡを産生する増加した能力を有するかどうかを決定することによって試験され得る。
【０２２３】
一実施形態において、本発明における使用のためのデサチュラーゼおよび／またはエロンガーゼは、微細藻類から精製できる。
【０２２４】
ある種の酵素が「二機能性」であると本明細書において具体的に記載されるのに対して、かかる用語がないことは、特定の酵素が、具体的に定義されるもの以外の活性を有さないことを必ずしも意味するわけではない。
【０２２５】
デサチュラーゼ
本明細書において使用される「デサチュラーゼ」という用語は、典型的には、例えば脂肪酸ＣｏＡエステル等のエステル化形態の脂肪酸基質のアシル基に炭素−炭素二重結合を導入し得る酵素を指す。アシル基は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）等のリン脂質に、またはアシル担体タンパク質（ＡＣＰ）に、または好ましい一実施形態においてＣｏＡにエステル化され得る。従って、デサチュラーゼは、一般に３つの群に分類され得る。一実施形態において、デサチュラーゼは、フロントエンドデサチュラーゼである。
【０２２６】
本明細書において使用される「Δ４デサチュラーゼ」は、脂肪酸基質のカルボキシル末端から４番目の位置において炭素−炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ反応を行うタンパク質を指す。「Δ４デサチュラーゼ」は、少なくともＤＰＡをＤＨＡに変換させることができる。ＤＨＡをＤＰＡから産生するための不飽和化ステップは、哺乳動物以外の生物中におけるΔ４デサチュラーゼによって触媒され、この酵素をコードしている遺伝子は、淡水原生生物種のユーグレナ・グラシリスおよび海洋種のスラウストキトリウム属種から単離されている（Ｑｉｕら、２００１；Ｍｅｙｅｒら、２００３）。一実施態様において、Δ４デサチュラーゼは、配列番号７３において提供される配列、その生物学的に活性な断片または配列番号７３と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するアミノ酸を含む。
【０２２７】
本明細書において使用される「Δ５デサチュラーゼ」は、脂肪酸基質のカルボキシル末端から５番目の位置において炭素−炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ反応を行うタンパク質を指す。Δ５デサチュラーゼの例は、表１において列挙される。一実施形態において、Δ５デサチュラーゼは、配列番号２６において提供される配列、その生物学的に活性な断片または配列番号２６と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するアミノ酸を含む。他の一実施形態において、Δ５デサチュラーゼは、配列番号１３において提供される配列、その生物学的に活性な断片または配列番号１３と少なくとも５３％同一であるアミノ酸配列を有するアミノ酸を含む。
【０２２８】
本明細書において使用される「Δ６デサチュラーゼ」は、脂肪酸基質のカルボキシル末端から６番目の位置において炭素−炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ反応を行うタンパク質を指す。Δ６デサチュラーゼの例は、表１において列挙される。
【０２２９】
一実施形態において、Δ６デサチュラーゼは、以下のｉ）脂肪酸基質としてのリノール酸（ＬＡ、１８：２Δ９，１２、ω６）よりもα−リノレン酸（ＡＬＡ、１８：３Δ９，１２，１５、ω３）に対して、より大きなΔ６デサチュラーゼ活性、ｉｉ）脂肪酸基質としてＰＣのｓｎ−２位に接合したＡＬＡに対するよりも脂肪酸基質としてのＡＬＡ−ＣｏＡに対して、より大きなΔ６デサチュラーゼ活性、およびｉｉｉ）ＥＴｒＡに対するΔ８デサチュラーゼ活性の内の少なくとも２つ、好ましくは３つ全てを、好ましくは植物細胞中において有することをさらに特徴とする。
【０２３０】
他の一実施形態において、Δ６デサチュラーゼは、対応するω６基質よりもω３基質に対して、より大きな活性を有し、組換え細胞中における外因性ポリヌクレオチドから発現される場合に少なくとも５％、より好ましくは少なくとも７．５％もしくは最も好ましくは少なくとも１０％の効率で、または酵母細胞中において発現される場合に少なくとも３５％の効率でオクタデカテトラエン酸（ステアリドン酸、ＳＤＡ、１８：４Δ６，９，１２，１５、ω３）を産生するＡＬＡに対する活性を有する。一実施形態において、Δ６デサチュラーゼは、より大きな活性、例えば、脂肪酸基質としてのＬＡよりもＡＬＡに対する少なくとも約２倍大きなΔ６デサチュラーゼ活性を有する。他の一実施形態において、Δ６デサチュラーゼは、より大きな活性、例えば、脂肪酸基質としてＰＣのｓｎ−２位に接合したＡＬＡに対するよりも脂肪酸基質としてのＡＬＡ−ＣｏＡに対する少なくとも約５倍大きなΔ６デサチュラーゼ活性または少なくとも１０倍大きな活性を有する。
【０２３１】
一実施形態において、Δ６デサチュラーゼは、ＥＴＡに対する検出可能なΔ５デサチュラーゼ活性を有さない。他の一実施形態において、Δ６デサチュラーゼは、配列番号１０において提供される配列、その生物学的に活性な断片または配列番号１０と少なくとも７７％同一であるアミノ酸配列を有するアミノ酸を含む。他の一実施形態において、Δ６デサチュラーゼは、配列番号８において提供される配列、その生物学的に活性な断片または配列番号８と少なくとも６７％同一であるアミノ酸配列を有するアミノ酸を含む。Δ６デサチュラーゼは、Δ８デサチュラーゼ活性をも有し得る。
【０２３２】
本明細書において使用される「Δ８デサチュラーゼ」は、脂肪酸基質のカルボキシル末端から８番目の位置において炭素−炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ反応を行うタンパク質を指す。Δ８デサチュラーゼは、少なくともＥＴｒＡをＥＴＡに変換することができる。Δ８デサチュラーゼの例は、表１において列挙される。一実施形態において、Δ８デサチュラーゼは、配列番号２４において提供される配列、その生物学的に活性な断片または配列番号２４と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するアミノ酸を含む。
【０２３３】
本明細書において使用される「ω３デサチュラーゼ」は、脂肪酸基質のメチル末端から３番目の位置において炭素−炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ反応を行うタンパク質を指す。ω３デサチュラーゼの例としては、Ｐｅｒｅｉｒａら（２００４ａ）、Ｈｏｒｉｇｕｃｈｉら（１９９８）、Ｂｅｒｂｅｒｉｃｈら（１９９８）およびＳｐｙｃｈａｌｌａら（１９９７）によって記載されているものが挙げられる。
【０２３４】
一実施形態において、ω３デサチュラーゼは、少なくとも、ＡＲＡからＥＰＡ、ｄＧＬＡからＥＴＡ、γ−リノレン酸（ＧＬＡ、１８：３Δ６，９，１２、ω６）からＳＤＡの内の１つ、ＡＲＡからＥＰＡおよびｄＧＬＡからＥＴＡの両方、ＡＲＡからＥＰＡおよびＧＬＡからＳＤＡの両方、またはこれらの３つ全ての変換を行うことができる。
【０２３５】
一実施形態において、ω３デサチュラーゼは、少なくとも３個の炭素−炭素二重結合を有するＣ２０脂肪酸、好ましくはＡＲＡに対するΔ１７デサチュラーゼ活性を有する。他の一実施形態において、ω３デサチュラーゼは、３個の炭素−炭素二重結合を有するＣ１８脂肪酸、好ましくはＧＬＡに対するΔ１５デサチュラーゼ活性を有する。
【０２３６】
本明細書において使用される「Δ１５デサチュラーゼ」は、脂肪酸基質のカルボキシル末端から１５番目の位置において炭素−炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ反応を行うタンパク質を指す。
【０２３７】
本明細書において使用される「Δ１７デサチュラーゼ」は、脂肪酸基質のカルボキシル末端から１７番目の位置において炭素−炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ反応を行うタンパク質を指す。
【０２３８】
他の一実施形態において、ω３デサチュラーゼは、対応するアシル−ＰＣ基質よりもアシル−ＣｏＡ基質、例えばＡＲＡ−ＣｏＡに対して、より大きな活性を有する。本明細書において使用される「対応するアシル−ＰＣ基質」は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）のｓｎ−２位においてエステル化された脂肪酸であって、アシル−ＣｏＡ基質中におけるものと同じである、脂肪酸を指す。一実施形態において、活性は少なくとも２倍大きい。
【０２３９】
更なる一実施形態において、ω３デサチュラーゼは、配列番号１５、１７もしくは２０において提供される配列、その生物学的に活性な断片、または配列番号１５と少なくとも３５％同一である、配列番号１７と少なくとも６０％同一であるおよび／もしくは配列番号２０と少なくとも６０％同一であるアミノ酸配列を有するアミノ酸を含む。 
【０２４０】
その上更なる一実施形態において、本発明における使用のためのデサチュラーゼは、対応するアシル−ＰＣ基質よりもアシル−ＣｏＡ基質に対して、より大きな活性を有する。上記で概説されるように、「対応するアシル−ＰＣ基質」は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）のｓｎ−２位においてエステル化された脂肪酸であって、アシル−ＣｏＡ基質中におけるものと同じである、脂肪酸を指す。一実施形態において、活性は少なくとも２倍大きい。一実施形態において、デサチュラーゼは、Δ５またはΔ６デサチュラーゼであり、それらの例は、限定されないが、表２において列挙されるものが提供される。
【０２４１】
【表２】
0006068800.tif 000005
【０２４２】
エロンガーゼ
生化学的証拠は、脂肪酸伸長が４つのステップ（縮合（condensation）、還元（reduction）、脱水（dehydration）および第２の還元）から成ることを示唆する。本発明の文脈において、「エロンガーゼ」は、適切な生理学的条件下で、伸長複合体の他のメンバーの存在下で縮合ステップを触媒するポリペプチドを指す。細胞における伸長タンパク質複合体の縮合成分（「エロンガーゼ」）だけの異種または相同的発現が、それぞれのアシル鎖の伸長に必要とされることが示されてきた。従って、導入されたエロンガーゼは、思い通りの（successful）アシル伸長を行うためにトランスジェニック宿主から還元および脱水活性を成功裏に補充することが可能である。鎖長と脂肪酸基質の不飽和化度とに対する伸長反応の特異性は、縮合成分にあると考えられる。この成分は、伸長反応において律速であるとも考えられる。
【０２４３】
本明細書において使用される「Δ５エロンガーゼ」は、少なくともＥＰＡをＤＰＡに変換することができる。Δ５エロンガーゼの例としては、ＷＯ２００５／１０３２５３において開示されるものが挙げられる。一実施形態において、Δ５エロンガーゼは、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％または最も好ましくは少なくとも７５％の効率でＤＰＡを産生するＥＰＡに対する活性を有する。更なる一実施形態において、Δ５エロンガーゼは、配列番号６において提供されるアミノ酸配列、その生物学的に活性な断片または配列番号６と少なくとも４７％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０２４４】
本明細書において使用される「Δ６エロンガーゼ」は、少なくともＳＤＡをＥＴＡに変換することができる。Δ６エロンガーゼの例としては、表１において列挙されるものが挙げられる。一実施形態において、エロンガーゼは、配列番号４において提供される配列、その生物学的に活性な断片または配列番号４と少なくとも５５％同一であるアミノ酸配列を有するアミノ酸を含む。
【０２４５】
本明細書において使用される「Δ９エロンガーゼ」は、少なくともＡＬＡをＥＴｒＡに変換することができる。Δ９エロンガーゼの例としては、表１において列挙されるものが挙げられる。一実施形態において、Δ９エロンガーゼは、配列番号２２において提供される配列、その生物学的に活性な断片または配列番号２２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するアミノ酸を含む。他の一実施形態において、Δ９エロンガーゼは、配列番号２８において提供される配列、その生物学的に活性な断片または配列番号２８と少なくとも８１％同一であるアミノ酸配列を有するアミノ酸を含む。他の一実施形態において、Δ９エロンガーゼは、配列番号９４において提供される配列、その生物学的に活性な断片または配列番号９４と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を有するアミノ酸を含む。他の一実施形態において、Δ９エロンガーゼは、配列番号９６において提供される配列、その生物学的に活性な断片または配列番号９６と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を有するアミノ酸を含む。更なる一実施形態において、Δ９エロンガーゼは、配列番号９４もしくは配列番号９６において提供される配列、その生物学的に活性な断片単独、または配列番号９４および／もしくは配列番号９６と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を有するアミノ酸を含み、対応するω３基質よりもω６基質に対して、より大きな活性を有する。
【０２４６】
本明細書において使用される「対応するω３基質よりもω６基質に対して、より大きな活性を有する」という用語は、ω３デサチュラーゼの作用によって異なる基質に対する酵素における相対活性を指す。好ましくは、ω６基質はＬＡであり、ω３基質はＡＬＡである。
【０２４７】
本明細書において使用される「Δ６エロンガーゼおよびΔ９エロンガーゼ活性を有するエロンガーゼ」は、少なくとも（ｉ）ＳＤＡをＥＴＡに変換すること、および（ｉｉ）ＡＬＡをＥＴｒＡに変換することが可能であり、かつΔ９エロンガーゼ活性よりも大きなΔ６エロンガーゼ活性を有する。一実施形態において、エロンガーゼは、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％であるＥＴＡを産生するＳＤＡにおける変換の効率および／または少なくとも６％以上、好ましくは少なくとも９％であるＥＴｒＡを産生するＡＬＡにおける変換の効率を有する。他の一実施形態において、エロンガーゼは、Δ９エロンガーゼ活性より少なくとも約６．５倍大きなΔ６エロンガーゼ活性を有する。更なる一実施形態において、エロンガーゼは、検出可能なΔ５エロンガーゼ活性を有さない。その上更なる一実施形態において、エロンガーゼは、配列番号４において提供される配列、その生物学的に活性な断片または配列番号４と少なくとも５５％同一であるアミノ酸配列を有するアミノ酸を含む。
【０２４８】
他の酵素
本明細書において使用される「ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ」（ＥＣ２．３．１．２０、ＤＧＡＴ）という用語は、脂肪アシル基をアシル−ＣｏＡからジアシルグリセロール基質へ転移してトリアシルグリセロールを産生するタンパク質を指す。従って、「ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性」という用語は、トリアシルグリセロールを産生するためのジアシルグリセロールへのアシル−ＣｏＡの転移を指す。それぞれＤＧＡＴ１、ＤＧＡＴ２およびＤＧＡＴ３と呼ばれるＤＧＡＴの３つの公知の型がある。ＤＧＡＴ１ポリペプチドは、典型的には１０の膜貫通ドメインを有し、ＤＧＡＴ２は、典型的には２つの膜貫通ドメインを有するが、一方でＤＧＡＴ３は、典型的には可溶である。ＤＧＡＴ１ポリペプチドの例としては、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）（受託番号ＸＰ＿７５５１７２）、アラビドプシス・サリアナ（ＣＡＢ４４７７４）、リシヌス・コムニス（Ricinus communis）（ＡＡＲ１１４７９）、ベニシア・フォルジー（Vernicia fordii）（ＡＢＣ９４４７２）、ベルノニア・ガラメンシス（Vernonia galamensis）（ＡＢＶ２１９４５、ＡＢＶ２１９４６）、エウオニムス・アラツス（Euonymus alatus）（ＡＡＶ３１０８３）、シノラブディス・エレガンス（ＡＡＦ８２４１０）、ラッツス・ノルベギクス（ＮＰ＿４４５８８９）、ホモ・サピエンス（ＮＰ＿０３６２１１）、ならびにそれらの変異体および／または突然変異体に由来するＤＧＡＴ１遺伝子によってコードされたポリペプチドが挙げられる。ＤＧＡＴ２ポリペプチドの例としては、アラビドプシス・サリアナ（受託番号ＮＰ＿５６６９５２）、リシヌス・コムニス（ＡＡＹ１６３２４）、ベルニシア・フォルジー（ＡＢＣ９４４７４）、モルティエレラ・ラマニアナ（Mortierella ramanniana）（ＡＡＫ８４１７９）、ホモ・サピエンス（Ｑ９６ＰＤ７、Ｑ５８ＨＴ５）、ボス・タウルス（Bos taurus）（Ｑ７０ＶＤ８）、ムス・ムスクルス（ＡＡＫ８４１７５）、ミクロモナスＣＣＭＰ１５４５、ならびにそれらの変異体および／または突然変異体に由来するＤＧＡＴ２遺伝子によってコードされたポリペプチドが挙げられる。ＤＧＡＴ３ポリペプチドの例としては、落花生（アラキス・ヒポゲア、Ｓａｈａら、２００６）、ならびにその変異体および／または突然変異体に由来するＤＧＡＴ３遺伝子によってコードされたポリペプチドが挙げられる。
【０２４９】
ポリペプチド／ペプチド
本発明はまた、精製されてよいまたは組換えであってよいポリペプチドをも提供する。「実質的に精製されたポリペプチド」または「精製されたポリペプチド」は、それが産生されるかまたはそのネイティブ状態にある細胞中においてそれが会合する脂質、核酸、他のペプチドおよび他の混入分子から一般に分離されているポリペプチドを意味する。好ましくは、実質的に精製されたポリペプチドは、それが産生されるかまたはそれが天然に会合する細胞中における他の成分を少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％含まない。
【０２５０】
ポリペプチドの文脈における「組換え」という用語は、ポリペプチドが天然に産生される場合におけるそのネイティブ状態と比較して改変した量または改変した速度で細胞によってまたは無細胞発現系中において産生された場合のポリペプチドを指す。一実施形態において、細胞は、ポリペプチドを天然に産生しない細胞である。しかし、細胞は、産生すべきポリペプチドの改変した量を引き起こす非内因性遺伝子を含む細胞であってよい。本発明の組換えポリペプチドとしては、ポリペプチドが産生される細胞、組織、器官もしくは生物または無細胞発現系中におけるポリペプチド、すなわち、ポリペプチドが産生されたトランスジェニック（組換え）細胞の他の成分から精製または分離されていないポリペプチド、および少なくとも一部の他の成分から続いて離れて精製される、かかる細胞または無細胞系中において産生されたポリペプチドが挙げられる。
【０２５１】
一般に、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、交換可能に使用される。
【０２５２】
ポリペプチドまたはポリペプチドのクラスは、そのアミノ酸配列の参照アミノ酸配列に対する同一性の程度（％同一性）によって、または一方の参照アミノ酸配列への他方に対するより大きな％同一性を有することによって定義され得る。参照アミノ酸配列に対するポリペプチドの％同一性は、典型的には、ギャップクリエーションペナルティ＝５およびギャップエクステンションペナルティ＝０．３のパラメータでＧＡＰ分析に（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、１９７０、ＧＣＧプログラム）よって決定される。問い合わせ配列は、長さが少なくとも１５のアミノ酸であり、ＧＡＰ分析は、少なくとも１５のアミノ酸の領域にわたって２つの配列をアラインメントする。より好ましくは、問い合わせ配列は、長さが少なくとも５０のアミノ酸であり、ＧＡＰ分析は、少なくとも５０のアミノ酸の領域にわたって２つの配列をアラインメントする。より好ましくは、問い合わせ配列は、長さが少なくとも１００のアミノ酸であり、ＧＡＰ分析は、少なくとも１００のアミノ酸の領域にわたって２つの配列をアラインメントする。さらにより好ましくは、問い合わせ配列は、長さが少なくとも２５０のアミノ酸であり、ＧＡＰ分析は、少なくとも２５０のアミノ酸の領域にわたって２つの配列をアラインメントする。さらにより好ましくは、ＧＡＰ分析は、それらの全ての長さにわたって２つの配列をアラインメントする。ポリペプチドまたはポリペプチドのクラスは、参照ポリペプチドと同じ酵素活性もしくは参照ポリペプチドと異なる活性を有してよいか、または参照ポリペプチドの活性を欠いてよい。好ましくは、ポリペプチドは、参照ポリペプチドの活性の少なくとも１０％の酵素活性を有する。
【０２５３】
本明細書において使用される「生物学的に活性な」断片は、例えばデサチュラーゼおよび／もしくはエロンガーゼ活性または他の酵素活性を有する完全長参照ポリペプチドの定義された活性を維持する本発明のポリペプチドの部分である。本明細書において使用される生物学的に活性な断片は、完全長ポリペプチドを除外する。生物学的に活性な断片は、定義された活性を維持する限り、あらゆる大きさの部分であり得る。好ましくは、生物学的に活性な断片は、完全長タンパク質の活性の少なくとも１０％を維持する。
【０２５４】
定義されたポリペプチドまたは酵素に関して、本明細書において提供されるものより高い％同一性の値が好ましい実施形態を包含することはいうまでもない。従って、適用可能である場合、最小の％同一性の値に鑑みて、ポリペプチド／酵素は、関連の指定配列番号と少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも７６％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも９９．１％、より好ましくは少なくとも９９．２％、より好ましくは少なくとも９９．３％、より好ましくは少なくとも９９．４％、より好ましくは少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９９．６％、より好ましくは少なくとも９９．７％、より好ましくは少なくとも９９．８％、よりいっそう好ましくは少なくとも９９．９％同一であるアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【０２５５】
一実施形態において、本発明の実質的に精製されたおよび／または組換えΔ６デスチュラーゼ（desturase）は、受託番号ＥＥＨ５８６３７．１またはＸＰ＿００１４２１０７３．１において提供される配列を含まない。他の一実施形態において、本発明の実質的に精製されたおよび／または組換えω３デスチュラーゼは、受託番号ＸＰ＿００２５０５５３６．１において提供される配列を含まない。他の一実施形態において、本発明の実質的に精製されたおよび／または組換えＤＧＡＴは、受託番号ＥＥＨ５４８１９．１において提供される配列を含まない。
【０２５６】
適切なヌクレオチド変化を本明細書において定義される核酸中に導入することによって、または所望のポリペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成によって、本明細書において定義されたもののポリペプチドのアミノ酸配列突然変異体を調製することができる。かかる突然変異体は、例えば、アミノ酸配列の中における残基の欠失、挿入または置換を含む。最終ペプチド産物が所望の特徴を有するならば、欠失、挿入および置換の組合せを行って最終構築物に達することができる。
【０２５７】
突然変異（改変）ペプチドは、本技術分野において公知のあらゆる技術を使用して調製され得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発に供することができる。かかるｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発技術は、ポリヌクレオチドを適切なベクター中にサブクローニングすること、ベクターをＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ−１ｒｅｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）等の「ミューテーター」株に形質転換すること、および形質転換細菌を適切な数の世代に増殖させることを含む。他の一例において、Ｈａｒａｙａｍａ（１９９８）によって概括的に記載されているように、本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡシャフリング技術に供される。突然変異／改変ＤＮＡから誘導された産物を、本明細書において記載される技術を使用してスクリーニングして、それらがデサチュラーゼおよび／またはエロンガーゼ活性を有するかどうかを決定することは容易にできる。
【０２５８】
アミノ酸配列突然変異体を設計する場合、突然変異部位の位置およびその突然変異の性質は、修飾すべき特徴（複数可）に依存する。突然変異の部位は、例えば、（１）最初に保存アミノ酸選択物で置換し、次いで達成される結果に応じてより多くのラジカル選択物で置換することによって、（２）標的残基を欠失させることによって、または（３）位置した部位に隣接して他の残基を挿入することによって、個別にまたは連続して修飾され得る。
【０２５９】
アミノ酸配列欠失は、一般に、約１から１５残基、より好ましくは約１〜１０残基、および典型的には約１〜５の連続した残基の範囲に及ぶ。
【０２６０】
置換突然変異体は、除去されたポリペプチド分子中における少なくとも１つのアミノ酸残基と、その場所に挿入された異なる残基とを有する。置換的突然変異誘発について最も大きな対象となる部位としては、活性部位（複数可）として同定された部位が挙げられる。対象となる他の部位は、様々な株または種から得られた特定の残基が同一である部位である。これらの位置は、生物学的活性にとって重要であり得る。これらの部位、とりわけ、少なくとも３つの他の同じく保存された部位の配列の中に含まれる部位は、好ましくは、相対的に保存的な方法で置換される。かかる保存的置換を表３において「例示的置換」という見出しの下で示す。
【０２６１】
好ましい一実施形態において、突然変異体／変異体ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドと比較した場合、１つもしくは２つもしくは３つもしくは４つだけまたは以下の保存アミノ酸変化を有する。保存アミノ酸変化の詳細は、表３において提供される。当業者であれば認識するように、かかる軽微な変化は、組換え細胞中において発現させる場合、ポリペプチドの活性を改変しないように合理的に予測され得る。
【０２６２】
【表３】
0006068800.tif 000006
【０２６３】
また、例えば、ビオチン化、ベンジル化、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク分解性切断、抗体分子または他の細胞リガンドへの連結等によって、合成中または合成後に差別的に修飾される本明細書において定義されるポリペプチドも、本発明の範囲内に含まれる。これらの修飾は、本発明のポリペプチドの安定性および／または生物活性を増大させる役目をすることができる。
【０２６４】
ポリペプチドは、天然ポリペプチドの産生および回収、組換えポリペプチドの産生および回収、ならびにポリペプチドの化学合成を含む様々な方法で産生され得る。一実施形態において、組換えポリペプチドは、ポリペプチドを産生するために有効な条件下でポリペプチドを発現することができる細胞を培養することによって産生される。組換えポリペプチドを、続いて細胞から分泌させ、回収することができ、または細胞から抽出して、回収することができ、好ましくは、混入分子から離れて精製する。それを、化学的にまたは酵素的にさらに修飾してよく、またはしなくてもよい。培養するために好ましい細胞は、本明細書において定義される組換え細胞である。有効な培養条件としては、ポリペプチド産生を可能にする、有効な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨおよび酸素条件が挙げられるが、これらに限定されるものではない。有効な培地は、細胞が培養されて本明細書において定義されるポリペプチドを産生するあらゆる培地を指す。かかる培地は、典型的には、同化可能な炭素、窒素およびリン酸塩源を有する水性培地、ならびに適切な塩、無機質、金属および他の栄養素、例えばビタミンを含む。本明細書において定義される細胞は、慣用の発酵バイオリアクター、振盪フラスコ、試験管、マイクロタイター皿およびペトリ皿において培養され得る。培養は、組換え細胞に適切な温度、ｐＨおよび酸素含有率で実施され得る。かかる培養条件は、当業者の専門知識の範囲内である。ポリペプチドを産生するためのより好ましい細胞は、植物中における、とりわけ植物における種子中における細胞である。
【０２６５】
本発明の目的ために、「抗体」という用語は、反対に規定されない限り、完全抗体の断片を含み、標的分析物、ならびに断片を含む化合物に対するそれらの結合活性を保持する。かかる断片としては、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）２断片、ならびに一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）が挙げられる。本発明の抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよく、本技術分野における標準的手法を用いて産生され得る。
【０２６６】
ポリヌクレオチド
本発明はまた、例えば、遺伝子、単離されたポリヌクレオチドまたはキメラＤＮＡであり得るポリヌクレオチドをも提供する。それは、二本鎖または一本鎖で、かつ本明細書において定義される特定の活性を行うために炭水化物、脂質、タンパク質または他の材料と組み合わせたゲノム由来もしくは合成由来のＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書において「核酸分子」という用語と交換可能に用いられる。「単離されたポリヌクレオチド」は、天然の源から得られる場合、それがそのネイティブ状態において会合もしくは連結しているポリヌクレオチド配列から分離されたポリヌクレオチドを意味するか、または非天然に存在するポリヌクレオチドを意味する。好ましくは、単離されたポリヌクレオチドは、それが天然に会合する他の成分を少なくとも６０％含まない、より好ましくは少なくとも７５％含まない、より好ましくは少なくとも９０％含まない。
【０２６７】
本明細書において使用される「遺伝子」という用語は、その最も広い文脈で解釈されるものとし、構造遺伝子の転写領域および、翻訳される場合、タンパク質コード領域を含み、かついずれの末端においても少なくとも約２ｋｂの距離にわたる５’および３’両末端上のコード領域に隣接して位置し、遺伝子の発現に関与する配列を含むデオキシリボヌクレオチド配列を包含する。この点に関して、遺伝子は、所定の遺伝子と天然に会合するプロモーター、エンハンサー、終止および／またはポリアデニル化シグナル等の制御シグナルを含むか、または異種制御シグナルを含み、その場合、遺伝子は、「キメラ遺伝子」と称される。タンパク質コード領域の５’に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、５’非翻訳配列と称される。タンパク質コード領域の３’または下流に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、３’非翻訳配列と称される。「遺伝子」という用語は、ｃＤＮＡ形態およびゲノム形態の両方の遺伝子を包含する。遺伝子のゲノム形態またはクローンは、「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と称される非コード配列で中断され得るコード領域を含む。イントロンは、核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）中に転写される遺伝子のセグメントである。イントロンは、エンハンサー等の調節エレメントを含むことができる。イントロンは、核内転写産物または転写一次産物から除去または「スプライス」され、従ってイントロンは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写産物中に存在しない。ｍＲＮＡは、翻訳の間に新生ポリペプチド中におけるアミノ酸の配列または順序を規定するように機能する。「遺伝子」という用語は、本明細書において記載される本発明のタンパク質の全部または一部をコードする合成または融合分子および上記のいずれか１つに対して相補的なヌクレオチド配列を包含する。
【０２６８】
本明細書において使用される「キメラＤＮＡ」は、そのネイティブな位置におけるネイティブＤＮＡ分子でないあらゆるＤＮＡ分子を指し、本明細書において「ＤＮＡ構築物」とも称される。典型的には、キメラＤＮＡまたはキメラ遺伝子は、天然において一緒に見出されることのない調節配列および転写配列またはタンパク質コード配列を含む。従って、キメラＤＮＡまたはキメラ遺伝子は、異なる源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ源に由来するが、天然において見出されるものとは異なる方法で配置される調節配列およびコード配列を含むことができる。
【０２６９】
「内因性」という用語は、本明細書において使用されて、検査されている植物と同じ発育ステップにある未修飾植物において通常に存在するかまたは産生される物質を指す。「内因性遺伝子」は、生物のゲノム中におけるその天然の位置におけるネイティブ遺伝子を指す。本明細書において使用される「組換え核酸分子」、「組換えポリヌクレオチド」またはそれらの変形物は、組換えＤＮＡ技術によって構築または修飾された核酸分子を指す。「外来ポリヌクレオチド」または「外因性ポリヌクレオチド」または「異種ポリヌクレオチド」等の用語は、実験的操作によって細胞のゲノム中に導入されるあらゆる核酸を指す。外来または外因性遺伝子は、非ネイティブ生物中に挿入された遺伝子、ネイティブ宿主の中の新規な場所に導入されたネイティブ遺伝子、またはキメラ遺伝子であってよい。「導入遺伝子」は、形質転換手法によってゲノム中に導入された遺伝子である。用語「遺伝子修飾された」、「トランスジェニック」およびそれらの変形物は、形質転換または形質導入によって遺伝子を細胞中に導入し、細胞内の遺伝子を突然変異させ、これらの行為が実行された細胞もしくは生物またはそれらの子孫において遺伝子の調節を改変またはモジュレートすることを含む。本明細書において使用される「ゲノム領域」は、導入遺伝子または導入遺伝子の群（本明細書においてクラスターとも称される）が細胞またはその祖先中に挿入されたゲノムの中の位置を指す。かかる領域は、人の介入によって、例えば本明細書において記載される方法によって組み込まれたヌクレオチドを含むだけである。
【０２７０】
ポリヌクレオチドの文脈において「外因性」という用語は、そのネイティブ状態と比較して改変された量で細胞中に存在する場合のポリヌクレオチドを指す。一実施形態において、細胞は、ポリヌクレオチドを天然に含まない細胞である。しかし、細胞は、コードされたポリペプチドの改変された産生量をもたらす非内因性ポリヌクレオチドを含む細胞であってよい。本発明の外因性ポリヌクレオチドとしては、トランスジェニック（組換え）細胞またはそれが存在する無細胞発現系の他の成分から分離されなかったポリヌクレオチド、および少なくとも一部の他の成分から続いて離れて精製される、かかる細胞または無細胞系中において産生されたポリヌクレオチドが挙げられる。外因性ポリヌクレオチド（核酸）は、天然に存在するヌクレオチドの連続したストレッチであり得るか、または単一のポリヌクレオチドを形成するように接合した（天然に存在するおよび／もしくは合成の）異なる源に由来するヌクレオチドの２つ以上の連続したストレッチを含み得る。典型的には、かかるキメラポリヌクレオチドは、対象となる細胞中におけるオープンリーディングフレームの転写を行うことに適切なプロモーターに作動可能に連結した本発明のポリペプチドをコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含む。
【０２７１】
本明細書において使用される「異なる外因性ポリヌクレオチド」という用語またはその変形物は、各ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、少なくとも１個、好ましくはより多くのヌクレオチドだけ異なることを意味する。ポリヌクレオチドは、細胞の中においてタンパク質に翻訳され得るかまたは翻訳され得ないＲＮＡをコードする。一例において、各ポリヌクレオチドは、異なる活性を有するタンパク質をコードすることが好ましい。他の一例において、各外因性ポリヌクレオチドは、他の外因性ポリヌクロチド（polynuclotide）と９５％未満、９０％未満または８０％未満同一である。好ましくは、外因性ポリヌクレオチドは、機能タンパク質／酵素をコードする。さらに、異なる外因性ポリヌクレオチドは、各ポリヌクレオチドが、例えば他の外因性ポリヌクレオチドと重複しない染色体外転移核酸の別の領域であるという点で重複しないことが好ましい。少なくとも、各外因性ポルヌクレオチド（polnucleotide）は、転写出発部位および転写終結部位、ならびに所定のプロモーターを有する。個々の外因性ポリヌクロエオチド（polynucloeotide）は、イントロンを含んでよいか、または含まなくてもよい。
【０２７２】
定義されたポリヌクレオチドに関して、上記で提供されるものより高い％同一性の値が好ましい実施形態を包含することはいうまでもない。従って、適用可能である場合、最小の％同一性の値に鑑みて、ポリヌクレオチドは、関連の指定配列番号と少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも９９．１％、より好ましくは少なくとも９９．２％、より好ましくは少なくとも９９．３％、より好ましくは少なくとも９９．４％、より好ましくは少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９９．６％、より好ましくは少なくとも９９．７％、より好ましくは少なくとも９９．８％、よりいっそう好ましくは少なくとも９９．９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むことが好ましい。
【０２７３】
一実施形態において、本発明のΔ６デスチュラーゼをコードする単離されたおよび／または外因性ポリヌクレオチドは、それぞれ受託番号ＥＥＨ５８６３７．１またはＸＰ＿００１４２１０７３．１において提供されるアミノ酸配列をコードすると予測されるミクロモナスまたはオストレオコッカス（Ostreococcus）ゲノムに由来する配列を含まない。他の一実施形態において、本発明のω３デスチュラーゼをコードする単離されたおよび／または外因性ポリヌクレオチドは、受託番号ＸＰ＿００２５０５５３６．１において提供されるアミノ酸配列をコードすると予測されるミクロモナスゲノムに由来する配列を含まない。他の一実施形態において、本発明のＤＧＡＴをコードする単離されたおよび／または外因性ポリヌクレオチドは、受託番号ＥＥＨ５４８１９．１において提供されるアミノ酸配列をコードすると予測されるミクロモナスゲノムに由来する配列を含まない。
【０２７４】
本発明のポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズすることができる。本明細書において使用される場合、ストリンジェントな条件は、（１）ハイブリダイゼーションの間、変性剤、例えばホルムアミド、例えば０．１％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンを含む５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミド、０．１％のフィコール、０．１％のポリビニルピロリドン、７５０ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ６．５の５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを４２℃で用いる条件、または（２）０．２×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳ中において４２℃で５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、音波破砕されたサケ精子ＤＮＡ（５０ｇ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳおよび１０％の硫酸デキストランを用いる条件および／または（３）洗浄のために低イオン強度および高温を用いる条件、例えば、５０℃で０．０１５ＭのＮａＣｌ／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のＳＤＳを用いる条件である。
【０２７５】
本発明のポリヌクレオチドは、天然に存在する分子と比較した場合、ヌクレオチド残基の欠失、挿入または置換である１つまたは複数の突然変異を有することができる。参照配列と比較して突然変異を有するポリヌクレオチドは、天然に存在し得る（すなわち、天然の源から単離され得る）か、または（例えば、上記のように核酸上の部位特異的変異誘発もしくはＤＮＡシャフリングを行うことによって）合成的であり得る。従って、本発明のポリヌクレオチドが、天然に存在する源に由来し得るか、または組換え型であり得ることは、明らかである。
【０２７６】
組換えベクター
本発明の一実施形態は、本明細書において定義される少なくとも１個のポリヌクレオチド分子を含む組換えベクターを含み、このポリヌクレオチド分子は、そのポリヌクレオチド分子を宿主細胞中に送達することができる任意のベクター中に挿入される。組換えベクターとしては、発現ベクターが挙げられる。組換えベクターは、異種ポリヌクレオチド配列、すなわち、好ましくはポリヌクレオチド分子（複数可）が由来する種以外の種に由来する本明細書において定義されるポリヌクレオチド分子に隣接して天然に見出されないポリヌクレオチド配列を含有する。ベクターは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであり得、原核性または真核性のいずれかであり得、典型的には、ウイルスに由来するウイルスベクターまたはプラスミドである。プラスミドベクターは、典型的には、原核細胞中における発現カセットの容易な選択、増幅および形質転換を提供する更なる核酸配列を含み、例えば、ｐＵＣ由来ベクター、ｐＳＫ由来ベクター、ｐＧＥＭ由来ベクター、ｐＳＰ由来ベクター、ｐＢＳ由来ベクターまたは１つもしくは複数のＴ−ＤＮＡ領域を含有するバイナリーベクターである。更なる核酸配列は、ベクターの自律複製を提供する複製開始点、選択可能マーカー遺伝子（好ましくは、抗生物質または除草剤耐性をコードする）、核酸構築物中においてコードされる核酸配列または遺伝子を挿入するために多重部位を提供する固有の多重クローニング部位、ならびに原核および真核（とりわけ植物）細胞の形質転換を増強する配列を含む。組換えベクターは、本明細書において定義される１つより多いポリヌクレオチド、例えば、本発明の３、４、５または６つのポリヌクレオチドを組み合わせて含むことができ、各々は、対象となる細胞中において作動可能である発現制御配列に作動可能に連結する。本発明のかかる１つより多いポリヌクレオチド、例えば、３、４、５または６つのポリヌクレオチドは、好ましくは、単一の組換えベクター中において一緒に共有結合的に接合させ、次いで単一分子として細胞中に導入して本発明による組換え細胞を形成することができ、好ましくは、例えばトランスジェニック植物における、組換え細胞のゲノム中に組み込まれ得る。このことにより、こうして接合されたポリヌクレオチドは、組換え細胞または植物の子孫中における単一の遺伝子座として一緒に遺伝する。組換えベクターまたは植物は、２つ以上のかかる組換えベクターを含んでよく、各々は、多数のポリヌクレオチドを含有し、例えば、各組換えベクターは、３、４、５または６つのポリヌクレオチドを含む。
【０２７７】
本明細書において使用される「作動可能に連結した」は、２つ以上の核酸（例えば、ＤＮＡ）セグメント間の機能的関係を指す。典型的には、それは、転写配列に対する転写調節エレメント（プロモーター）の機能的関係を指す。例えば、プロモーターは、それが適切な細胞中におけるコード配列の転写を刺激またはモジュレートする場合、そのコード配列、例えば、本明細書において定義されるポリヌクレオチドに作動可能に連結する。一般に、転写配列に作動可能に連結したプロモーター転写調節エレメントは、その転写配列に物理的に隣接しており、すなわち、それらはシス作用性である。しかし、一部の転写調節エレメント（例えばエンハンサー）は、それらが転写を増強するコード配列に物理的に隣接する必要も、近接して位置する必要もない。
【０２７８】
多重プロモーターが存在する場合、各プロモーターは、独立して同一または異なってよい。
【０２７９】
キメラＤＮＡ等の組換え分子は、（ａ）シグナルペプチド配列をコードして、本明細書において定義される発現したポリペプチドを、ポリペプチドを産生する細胞から分泌させることを可能にするか、または、例えば細胞中における小胞体（ＥＲ）中におけるポリペプチドの保持もしくはプラスチド中への転移のための発現したポリペプチドの局在化を提供する１つまたは複数の分泌シグナル、および／または（ｂ）融合タンパク質としての核酸分子の発現につながる融合配列を含有することもできる。適切なシグナルセグメントの例としては、本明細書において定義されるポリペプチドの分泌または局在化を誘導できるあらゆるシグナルセグメントが挙げられる。好ましいシグナルセグメントとしては、ニコチアナ・ネクタリン（Nicotiana nectarin）シグナルペプチド（ＵＳ５，９３９，２８８）、タバコエクステンシンシグナルまたはダイズオレオシン油体結合タンパク質シグナルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。組換え分子は、本明細書において定義される核酸分子の核酸配列を囲むならびに／またはその核酸配列の中の介在配列および／もしくは非翻訳配列を含むこともできる。
【０２８０】
形質転換体の同定を容易にするために、核酸構築物は、望ましくは、選択可能もしくはスクリーニング可能マーカー遺伝子を外来もしくは外因性ポリヌクレオチドとしてまたは外来もしくは外因性ポリヌクレオチドに加えて含む。「マーカー遺伝子」は、そのマーカー遺伝子を発現している細胞に別の表現型を付与し、従ってそのマーカーを有さない細胞からかかる形質転換細胞を区別することを可能にする遺伝子を意味する。選択可能マーカー遺伝子は、選択因子（例えば、除草剤、抗生物質、放射線、熱、または非形質転換細胞に損傷を与える他の処理）に対する耐性に基づいて「選択」することを可能にする形質を付与する。スクリーニング可能マーカー遺伝子（またはレポーター遺伝子）は、観察または試験を通して、すなわち「スクリーニング」によって同定され得る形質（例えば、非形質転換細胞中に存在しないβ−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、ＧＦＰまたは他の酵素活性）を付与する。マーカー遺伝子および対象となるヌクレオチド配列を連結させる必要はない。マーカーの実際の選択物は、植物細胞等の選択された細胞との組合せにおいてそれが機能的（すなわち、選択的）である限り重要ではない。例えばＵＳ４，３９９，２１６に記載されているように、非連結遺伝子の同時形質転換もまた植物の形質転換における効率的な方法であるので、マーカー遺伝子および対象となる外来または外因性ポリヌクレオチドを連結させる必要はない。
【０２８１】
細菌性選択可能マーカーの例は、抗生物質耐性、例えば、アンピシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコールまたはテトラサイクリン耐性、好ましくはカナマイシン耐性を付与するマーカーである。植物の形質転換体の選択のための例示的な選択可能マーカーとしては、ハイグロマイシンＢ耐性をコードするｈｙｇ遺伝子、カナマイシン、パロモマイシン、Ｇ４１８に対する耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子、例えばＥＰ２５６２２３に記載されている通りのグルタチオン由来除草剤に対する耐性を付与するラット肝臓由来のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ遺伝子、例えばＷＯ８７／０５３２７に記載されている通りの過剰発現の際にホスフィノトリシン等のグルタミンシンテターゼ阻害剤に耐性を付与するグルタミンシンテターゼ遺伝子、例えばＥＰ２７５９５７に記載されている通りの選択因子ホスフィノトリシンに対する耐性を付与するストレプトマイセス・ヴィリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）由来のアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、例えばＨｉｎｃｈｅｅら（１９８８）によって記載されている通りのＮ−ホスホノメチルグリシンに対する抵抗性を付与する５−エノルシキメート−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）をコードする遺伝子、例えばＷＯ９１／０２０７１に記載されている通りのビアラホスに対する耐性を付与するｂａｒ遺伝子、ブロモキシニルに対する耐性を付与するニトリラーゼ遺伝子、例えばクレブシーラ・オザエナエ（Klebsiella ozaenae）に由来するｂｘｎ（Ｓｔａｌｋｅｒら、１９８８）、メトトレキサートに対する耐性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（Ｔｈｉｌｌｅｔら、１９８８）、イミダゾリノン、スルフォニル尿素もしくは他のＡＬＳ阻害化学物質に対する耐性を付与する突然変異体アセトラクテートシンターゼ遺伝子（ＡＬＳ）（ＥＰ１５４，２０４）、５−メチルトリプトファンに対する耐性を付与する突然変異アントラニル酸シンターゼ遺伝子、または除草剤に対する耐性を付与するダラポンデハロゲナーゼ遺伝子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２８２】
好ましいスクリーニング可能マーカーとしては、様々な色素原基質が知られているβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）酵素をコードするｕｉｄＡ遺伝子、色素原基質が知られている酵素をコードするβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、カルシウム感受性バイオルミネセンス検出において用いられ得るエクオリン遺伝子（Ｐｒａｓｈｅｒら、１９８５）、緑色蛍光タンパク質遺伝子（Ｎｉｅｄｚら、１９９５）またはその誘導体、バイオルミネセンス検出を可能にするルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子（Ｏｗら、１９８６）および本技術分野において公知の他のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本明細書において使用される「リポーター分子」は、タンパク質産物を参照することによってプロモーター活性の決定を容易にする分析的に同定可能なシグナルを、その化学的性質によって提供する分子を意味する。
【０２８３】
好ましくは、核酸構築物は、植物細胞等の細胞のゲノム中に安定して組み込まれる。従って、核酸は、分子をゲノム中に組み込むことを可能にする適切なエレメントを含むことができるか、または構築物は、細胞の染色体中に組み込まれ得る適切なベクター中に配置される。
【０２８４】
発現
本明細書において使用される発現ベクターは、宿主細胞を形質転換することができ、かつ１個または複数個の特定されたポリヌクレオチド分子（複数可）の発現を生じさせることができるＤＮＡまたはＲＮＡベクターである。好ましくは、発現ベクターは、宿主細胞の中で複製することもできる。発現ベクターは、原核性または真核性であり得、典型的にはウイルスまたはプラスミドである。本発明の発現ベクターとしては、細菌、真菌、内寄生性生物（endoparasite）、節足動物（arthropod）、動物および植物細胞等、本発明の組換え細胞中において機能する（すなわち、遺伝子発現を誘導する）あらゆるベクターが挙げられる。本発明の特に好ましい発現ベクターは、酵母および／または植物細胞の遺伝子発現を誘導することができる。
【０２８５】
本発明の発現ベクターは、調節配列、例えば、転写制御配列、翻訳制御配列、複製開始点、および組換え細胞と適合性があり、かつ本発明のポリヌクレオチド分子の発現を制御する他の調節配列を含有する。特に、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターは、転写制御配列を含む。転写制御配列は、転写の開始、伸長および終結を制御する配列である。特に重要な転写制御配列は、転写開始を制御するもの、例えば、プロモーター、エンハンサー、オペレーターおよびリプレッサー配列である。適切な転写制御配列としては、本発明の組換え細胞の内の少なくとも１つにおいて機能することができるあらゆる転写制御配列が挙げられる。使用される調節配列の選択は、対象となる植物および／または標的器官もしくは組織等の標的生物に依存する。かかる調節配列は、あらゆる真核生物、例えば植物、もしくは植物ウイルスから得られ得るか、または化学的に合成され得る。様々なかかる転写制御配列は、当業者に公知である。特に好ましい転写制御配列は、構成的にまたはステージおよび／もしくは組織特異的に植物またはその部分の使用に依存して植物中における転写を誘導する際に活性なプロモーターである。
【０２８６】
植物細胞の安定したトランスフェクションに適切な、またはトランスジェニック植物の樹立に適切な多くのベクターは、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら、Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、１９８５、ｓｕｐｐ．１９８７；ＷｅｉｓｓｂａｃｈおよびＷｅｉｓｓｂａｃｈ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９；ならびにＧｅｌｖｉｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９０に記載されている。典型的には、植物発現ベクターは、例えば、５’および３’調節配列の転写制御下の１つまたは複数のクローニングされた植物遺伝子、ならびに優性選択可能マーカーを含む。かかる植物発現ベクターは、プロモーター調節領域（例えば、誘導もしくは構成的、環境もしくは発生的調節、または細胞もしくは組織特異的発現を制御する調節領域）、転写開始出発部位、リボソーム結合部位、ＲＮＡプロセッシングシグナル、転写終結部位および／またはポリアデニル化シグナルをも含有し得る。
【０２８７】
植物細胞中において活性である多くの構成的プロモーターが記載されている。植物中における構成的発現に適切なプロモーターとしては、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ゴマノハグサモザイクウイルス（ＦＭＶ）３５Ｓ、サトウキビ桿状ウイルスプロモーター、ツユクサ黄色斑紋ウイルスプロモーター、リブロース−１，５−ビス−リン酸カルボキシラーゼの小サブユニットからの光誘導性プロモーター、イネサイトゾルトリオースリン酸イソメラーゼプロモーター、アラビドプシスのアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼプロモーター、イネアクチン１遺伝子プロモーター、マンノピンシンターゼおよびオクトピンシンターゼプロモーター、Ａｄｈプロモーター、スクロースシンターゼプロモーター、Ｒ遺伝子複合体プロモーター、ならびにクロロフィルα／β結合タンパク質遺伝子プロモーターが挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらのプロモーターは、植物中において発現されるＤＮＡベクターを作製するために使用されている（例えば、ＷＯ８４／０２９１３参照）。これらのプロモーターの全ては、様々な型の植物発現性組換えＤＮＡベクターを作製するために使用されている。
【０２８８】
植物の源組織（例えば、葉、種子、根または茎）の発現の目的ために、本発明において利用されるプロモーターは、これらの特定の組織中において相対的に高い発現を有することが好ましい。この目的のために、組織もしくは細胞に特異的な発現、または組織もしくは細胞で増強された発現を伴う遺伝子に対する多くのプロモーターから選択することができる。文献に報告されているかかるプロモーターの例としては、エンドウ由来のクロロプラストグルタミンシンテターゼＧＳ２プロモーター、コムギ由来のクロロプラストフルクトース−１，６−ビホスファターゼプロモーター、ジャガイモ由来の核光合成ＳＴ−ＬＳ１プロモーター、セリン／トレオニンキナーゼプロモーター、およびアラビドプシス・サリアナ由来のグルコアミラーゼ（ＣＨＳ）プロモーターが挙げられる。また、イースタンカラマツ（ラリクス・ラリキナ（Larix laricina））由来のリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼプロモーター、マツ由来のＣａｂ遺伝子（Ｃａｂ６）に対するプロモーター、コムギ由来のＣａｂ−１遺伝子に対するプロモーター、ホウレンソウ由来のＣａｂ−１遺伝子に対するプロモーター、イネ由来のＣａｂ１Ｒ遺伝子に対するプロモーター、ゼア・マイス由来のピルビン酸オルトリン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）プロモーター、タバコＬｈｃｂ１＊２遺伝子に対するプロモーター、アラビドプシス・サリアナＳｕｃ２スクロース−Ｈ３０共輸送体プロモーター、およびホウレンソウ由来のチラコイド膜タンパク質遺伝子（ＰｓａＤ、ＰｓａＦ、ＰｓａＥ、ＰＣ、ＦＮＲ、ＡｔｐＣ、ＡｔｐＤ、Ｃａｂ、ＲｂｃＳ）に対するプロモーターも、光合成活性組織中において活性であることが報告されている。
【０２８９】
クロロフィルα／β結合タンパク質に対する他のプロモーター、例えば、シロガラシ（シナピス・アルバ（Sinapis alba））由来のＬｈｃＢ遺伝子およびＰｓｂＰ遺伝子に対するプロモーターを、本発明において利用することもできる。植物細胞中におけるＲＮＡ結合タンパク質遺伝子の発現には、（１）熱、（２）光（例えば、エンドウＲｂｃＳ−３Ａプロモーター、トウモロコシＲｂｃＳプロモーター）、（３）ホルモン、例えば、アブシジン酸、（４）損傷（例えば、ＷｕｎＩ）、または（５）化学物質、例えば、ジャスモン酸メチル、サリチル酸、ステロイドホルモン、アルコール、Ｓａｆｅｎｅｒｓ（ＷＯ９７／０６２６９）によって調節されるプロモーターを含む、環境、ホルモン、化学および／または発育のシグナルに応答して調節される様々な植物遺伝子プロモーターも使用することができ、または（６）器官特異的プロモーターを用いることも有利であり得る。
【０２９０】
本明細書において使用される「植物貯蔵器官特異的プロモーター」という用語は、他の植物組織と比較した場合に植物の貯蔵器官中における遺伝子転写を選好的に誘導するプロモーターを指す。好ましくは、プロモーターは、貯蔵器官における対象となる遺伝子の発現を誘導するだけであり、ならびに／または植物の他の部分（例えば、葉）における対象となる遺伝子の発現は、ノーザンブロット分析および／もしくはＲＴ−ＰＣＲによって検出され得ない。典型的には、プロモーターは、貯蔵器官の成長および発育の間、特に貯蔵器官中における貯蔵化合物の合成および蓄積期の間の遺伝子の発現を駆動する。かかるプロモーターは、植物貯蔵器官全体またはその部分だけ、例えば、双子葉植物の種子における種皮、胚もしくは子葉（複数可）、または単子葉植物の種子の内乳もしくはアリューロン（aleurone）層において遺伝子発現を駆動することができる。
【０２９１】
植物のシンク組織、例えば、ジャガイモ植物の塊茎、トマトの実、またはダイズ、キャノーラ、綿、ゼア・マイス、コムギ、イネおよびオオムギの種子における発現の目的のために、本発明において利用されるプロモーターは、これらの特定の組織において相対的に高い発現を有することが好ましい。塊茎特異的または塊茎で増強された発現を伴う遺伝子に対する多くのプロモーターが公知であり、それらとしては、クラスＩパタチンプロモーター、ジャガイモ塊茎ＡＤＰＧＰＰ遺伝子に対するプロモーター、大サブユニットおよび小サブユニットの両方、スクロースシンターゼプロモーター、２２ｋＤタンパク質複合体およびプロテイナーゼ阻害剤を含む大塊茎タンパク質に対するプロモーター、顆粒結合デンプンシンターゼ遺伝子（ＧＢＳＳ）に対するプロモーター、ならびに他のクラスＩおよびＩＩパタチンプロモーターが挙げられる。他のプロモーターを使用して、特定の組織（例えば、種子または果実）中においてタンパク質を発現させることもできる。β−コングリシニンに対するプロモーターまたは他の種子特異的プロモーター、例えば、ナピン、ゼイン、リニンおよびファゼオリンプロモーターを使用することができる。根特異的プロモーターを使用してもよい。かかるプロモーターの一例は、酸キチナーゼ遺伝子に対するプロモーターである。根組織中における発現は、同定されているＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの根特異的サブドメインを利用することによって達成することも可能である。
【０２９２】
特に好ましい一実施形態において、プロモーターは、脂肪酸および油生合成が行われる組織および器官中における発現を誘導する。かかるプロモーターは、種子中における油組成物を修飾するために適切な時点で種子発育において作用する。
【０２９３】
更なる特に好ましい一実施形態において、および本発明の幾つかの態様において、プロモーターは、植物貯蔵器官特異的プロモーターである。一実施形態において、植物貯蔵器官特異的プロモーターは、種子特異的プロモーターである。より好ましい一実施形態において、プロモーターは、種子の胚中における発現と比較して、または植物における他の器官、例えば葉と比較して、双子葉植物の子葉中における、または単子葉植物の内乳中における発現を選好的に誘導する。種子特異的発現のための好ましいプロモーターとしては、ｉ）デサチュラーゼおよびエロンガーゼ等、種子中における脂肪酸生合成および蓄積に関与する酵素をコードする遺伝子に由来するプロモーター、ｉｉ）種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子に由来するプロモーター、ならびにｉｉｉ）種子中における炭水化物生合成および蓄積に関与する酵素をコードする遺伝子に由来するプロモーターが挙げられる。適切である種子特異的プロモーターは、アブラナナピン遺伝子プロモーター（ＵＳ５，６０８，１５２）、ビキア・ファバ（Vicia faba）ＵＳＰプロモーター（Ｂａｕｍｌｅｉｎら、１９９１）、アラビドプシスオレオシンプロモーター（ＷＯ９８／４５４６１）、ファセオルス・ウルガリス（Phaseolus vulgaris）ファゼオリンプロモーター（ＵＳ５，５０４，２００）、ブラッシカＢｃｅ４プロモーター（ＷＯ９１／１３９８０）またはレグミンＢ４プロモーター（Ｂａｕｍｌｅｉｎら、１９９２）、およびトウモロコシ、オオムギ、コムギ、ライムギ、イネ等の単子葉植物中において種子特異的発現を引き起こすプロモーターである。適切である顕著なプロモーターは、オオムギｌｐｔ２もしくはｌｐｔ１遺伝子プロモーター（ＷＯ９５／１５３８９およびＷＯ９５／２３２３０）またはＷＯ９９／１６８９０に記載されているプロモーター（オオムギホルデイン遺伝子、イネグルテリン遺伝子、イネオリジン遺伝子、イネプロラミン遺伝子、コムギグリアジン遺伝子、コムギグルテリン遺伝子、トウモロコシゼイン遺伝子、オートムギグルテリン遺伝子、モロコシカジリン遺伝子、ライムギセカリン遺伝子に由来するプロモーター）である。他のプロモーターとしては、Ｂｒｏｕｎら（１９９８）、Ｐｏｔｅｎｚａら（２００４）、ＵＳ２００７０１９２９０２およびＵＳ２００３０１５９１７３によって記載されているものが挙げられる。一実施形態において、種子特異的プロモーターは、子葉（複数可）または内乳等の種子の限定部分において選好的に発現される。子葉特異的プロモーターの例としては、ＦＰ１プロモーター（Ｅｌｌｅｒｓｔｒｏｍら、１９９６）、エンドウレグミンプロモーター（Ｐｅｒｒｉｎら、２０００）およびインゲンマメフィトヘマグルトニン（phytohemagglutnin）プロモーター（Ｐｅｒｒｉｎら、２０００）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。内乳特異的プロモーターの例としては、トウモロコシｚｅｉｎ−１プロモーター（Ｃｈｉｋｗａｍｂａら、２００３）、イネグルテリン−１プロモーター（Ｙａｎｇら、２００３）、オオムギＤ−ホルデインプロモーター（Ｈｏｒｖａｔｈら、２０００）およびコムギＨＭＷグルテニンプロモーター（Ａｌｖａｒｅｚら、２０００）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。更なる一実施形態において、種子特異的プロモーターは、胚において、および／または種子が発芽した後、発現されないか、または低レベルで発現されるだけである。
【０２９４】
他の一実施形態において、植物貯蔵器官特異的プロモーターは、塊茎特異的プロモーターである。例としては、ジャガイモパタチンＢ３３、ＰＡＴ２１およびＧＢＳＳプロモーター、ならびにサツマイモスポラミンプロモーター（概説のために、Ｐｏｔｅｎｚａら（２００４）参照）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましい一実施形態において、プロモーターは、塊茎の外層（表皮、樹皮）または胚と比較して、選好的に塊茎の髄中における発現を誘導する。
【０２９５】
他の一実施形態において、植物貯蔵器官特異的プロモーターは、果実特異的プロモーターである。例としては、トマトポリガラクツロナーゼ、Ｅ８およびＰｄｓプロモーター、ならびにリンゴＡＣＣオキシダーゼプロモーター（概説のために、Ｐｏｔｅｎｚａら（２００４）参照）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましい一実施形態において、プロモーターは、果実の表皮または果実の中の種子と比較して、果実の可食部、例えば果実の髄中における発現を選好的に誘導する。
【０２９６】
５’非翻訳リーダー配列は、本発明のポリヌクレオチドの異種遺伝子配列を発現するように選択されるプロモーターに由来することができ、または産生すべき酵素のコード領域に対して異種であってよく、および所望によりｍＲＮＡの翻訳を増加させるように特異的に修飾され得る。導入遺伝子の発現の最適化の概説については、Ｋｏｚｉｅｌら（１９９６）を参照すること。５’非翻訳領域を、植物ウイルスＲＮＡ（とりわけ、タバコモザイクウイルス、タバコエッチウイルス、トウモロコシ萎縮モザイクウイルス、アルファルファモザイクウイルス）から、適切な真核細胞遺伝子、植物遺伝子（コムギおよびトウモロコシクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子リーダー）から、または合成遺伝子配列から得ることもできる。本発明は、非翻訳領域が、プロモーター配列を伴う５’非翻訳配列に由来する場合の構築物に限定されない。リーダー配列は、無関係なプロモーターまたはコード配列に由来する場合もある。本発明の文脈において有用なリーダー配列は、トウモロコシＨｓｐ７０リーダー（ＵＳ５，３６２，８６５およびＵＳ５，８５９，３４７）、ならびに実施例８において例示される通りのＴＭＶオメガエレメントを含む。
【０２９７】
転写の終結は、キメラベクターにおける対象となるポリヌクレオチドに作動可能に連結した３’非翻訳ＤＮＡ配列によって達成される。組換えＤＮＡ分子の３’非翻訳領域は、植物中においてＲＮＡの３’末端にアデニレートヌクレオチドを付加させるように機能するポリアデニル化シグナルを含有する。３’非翻訳領域は、植物細胞中において発現される様々な遺伝子から得られ得る。一般に、この能力において、ノパリンシンターゼ３’非翻訳領域、エンドウ小サブユニットＲｕｂｉｓｃｏ遺伝子由来の３’非翻訳領域、ダイズ７Ｓ種子貯蔵タンパク質遺伝子由来の３’非翻訳領域を用いることができる。アグロバクテリウム腫瘍誘導性（Ｔｉ）プラスミド遺伝子のポリアデニル化シグナルを含有する３’転写非翻訳領域も適切である。
【０２９８】
組換えＤＮＡ技術は、例えば、宿主細胞の中のポリヌクレオチド分子のコピー数、それらのポリヌクレオチド分子を転写する効率、得られた転写産物を翻訳する効率、および翻訳後修飾の効率を操作することによって、形質転換ポリヌクレオチド分子の発現を改善するために使用され得る。本明細書において定義されるポリヌクレオチド分子の発現を増大させるために有用な組換え技術としては、高コピー数プラスミドへのポリヌクレオチド分子の作動可能な連結、１つまたは複数の宿主細胞染色体中へのポリヌクレオチド分子の組込み、プラスミドへのベクター安定配列の付加、転写制御シグナル（例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー）の置換または修飾、翻訳制御シグナル（例えば、リボソーム結合部位、シャイン−ダルガルノ配列）の置換または修飾、宿主細胞のコドン利用に対応するポリヌクレオチド分子の修飾、および転写産物を不安定にする配列の欠失が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２９９】
転移核酸（Transfer Nucleic Acids）
本発明の転移核酸は、少なくとも１つ、好ましくは２つの境界配列および外因性ポリヌクレオチドを含む。転移核酸は、選択可能マーカーをコードすることができるか、またはコードすることができない。好ましくは、転移核酸は、細菌におけるバイナリーベクターの部分を形成し、バイナリーベクターは、細菌におけるベクターの複製を可能にするか、またはベクターを含有する細菌細胞の選択もしくは維持を可能にするエレメントをさらに含む。真核細胞への転移の際、バイナリーベクターの転移核酸成分は、真核細胞のゲノム中への組込みが可能である。
【０３００】
本明細書において使用される「染色体外転移核酸」という用語は、アグロバクテリウム属種等の細菌から植物の葉細胞等の真核細胞に転移され得る核酸分子を指す。染色体外転移核酸は、レシピエント細胞のゲノム中においてその境界の中に含有されるヌクレオチド配列の後続の組込みによって転移され得るエレメントとして周知である遺伝エレメントである。この点で、転移核酸は、典型的には２つの「境界」配列によって隣接される（flanked）が、幾つかの例において、一方の末端における単一の境界を使用することができ、転移された核酸の第２の末端が、転移プロセスにおいてランダムに生成される。所望の外因性ポリヌクレオチドは、典型的には転移核酸の左境界様配列と右境界様配列との間に位置する。転移核酸の中に含有される所望のポリヌクレオチドは、その発現、すなわち、ポリヌクレオチドの転写および／または翻訳を容易にする様々な異なるプロモーターおよびターミネーター調節エレメントに作動可能に連結され得る。アグロバクテリウム属種（例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスまたはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes））に由来するＴ−ＤＮＡおよびその人工の変異体／突然変異体は、転移核酸のおそらく最高に特徴付けられた例である。他の一例は、植物に由来するＴ−ＤＮＡ境界様配列を含むＰ−ＤＮＡ（「植物ＤＮＡ」）である。
【０３０１】
本明細書において使用される「Ｔ−ＤＮＡ」は、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡを指すか、またはアグロバクテリウム・リゾゲネスＲｉプラスミドもしくはＴ−ＤＮＡ（転移ＤＮＡ）として機能するその人工の変異体に由来するＴ−ＤＮＡを指す。Ｔ−ＤＮＡは、右および左境界配列の両方を含むＴ−ＤＮＡ全体を含むことができるが、転移のためにシスにおいて必要とされる最小の配列、すなわち、右およびＴ−ＤＮＡ境界配列を含むことだけ必要である。本発明のＴ−ＤＮＡは、（存在する場合）右および左境界配列の間のどこかで、それらに、部位特異的リコンビナーゼに対する標的部位によって隣接した外因性ポリヌクレオチドを挿入した。ｖｉｒ遺伝子等、植物細胞中へのＴ−ＤＮＡの転移のためにトランスにおいて必要とされる因子をコードする配列は、Ｔ−ＤＮＡ中に挿入され得るか、またはＴ−ＤＮＡと同じレプリコン上に存在してよいか、または、好ましくは、アグロバクテリウム宿主中における適合性レプリコン上のトランスにおいて存在する。かかる「バイナリーベクター系」は、本技術分野において周知である。
【０３０２】
本明細書において使用される「Ｐ−ＤＮＡ」は、植物ゲノムから単離された転移核酸またはその人工の変異体／突然変異体を指し、各末端または一方の末端だけにおいてＴ−ＤＮＡ境界様配列を含む。境界様配列は、好ましくは、アグロバクテリウム・ツメファシエンスまたはアグロバクテリウム・リゾゲネス等のアグロバクテリウム属種由来のＴ−ＤＮＡ境界配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％であるが、１００％未満の配列同一性を共有する。従って、Ｐ−ＤＮＡは、Ｐ−ＤＮＡの中に含有されたヌクレオチド配列を例えばアグロバクテリウムから他の細胞に転移するために、Ｔ−ＤＮＡの代わりに使用され得る。Ｐ−ＤＮＡは、転移させるべき外因性ポリヌクレオチドの挿入前に、クローニングを容易にするために修飾され得、好ましくは、いかなるタンパク質もコードするべきでない。Ｐ−ＤＮＡは、それが少なくとも右境界配列および好ましくは左境界配列も含有するという点で特徴付けられる。
【０３０３】
本明細書において使用される転移核酸の「境界」配列（複数可）は、選択された生物（例えば、植物もしくは細菌）から単離され得、またはその人工の変異体／突然変異体であり得る。境界配列は、それが連結する外因性ポリヌクレオチドの転移を促進し、かつ容易にし、レシピエント細胞ゲノム中におけるその組込みを容易にすることができる。
【０３０４】
一実施形態において、境界配列は、長さが５〜１００ｂｐ、長さが１０〜８０ｂｐ、長さが１５〜７５ｂｐ、長さが１５〜６０ｂｐ、長さが１５〜５０ｂｐ、長さが１５〜４０ｂｐ、長さが１５〜３０ｂｐ、長さが１６〜３０ｂｐ、長さが２０〜３０ｂｐ、長さが２１〜３０ｂｐ、長さが２２〜３０ｂｐ、長さが２３〜３０ｂｐ、長さが２４〜３０ｂｐ、長さが２５〜３０ｂｐまたは長さが２６〜３０ｂｐの間である。
【０３０５】
アグロバクテリウム属種に由来するＴ−ＤＮＡに由来する境界配列は、本技術分野において周知であり、Ｌａｃｒｏｉｘら（２００８）、ＴｚｆｉｒａおよびＣｉｔｏｖｓｋｙ（２００６）、ならびにＧｌｅｖｉｎ（２００３）において記載されているものが含まれる。Ｐ−ＤＮＡの境界配列は、任意の植物から、例えばジャガイモおよびコムギから単離され得る。一実施形態において、Ｐ−ＤＮＡは、核酸配列ＡＮＧＡＴＮＴＡＴＮ６ＧＴ（配列番号１０９）を有し、ここで「Ｎ」は、任意のヌクレオチド、例えば「Ａ」、「Ｇ」、「Ｃ」または「Ｔ」によって表されるものである。本発明に有用な他の境界配列の例としては、
TGACAGGATATATTGGCGGGTAAAC（配列番号：110）；TGGCAGGATATATTGTGGTGTAAAC（配列番号：111）；TGGCAGGATATATACCGTTGTAATT（配列番号：112）；CGGCAGGATATATTCAATTGTAATT（配列番号：113）；TGGTAGGATATATACCGTTGTAATT（配列番号：114）；TGGCAGGATATATGGTACTGTAATT（配列番号：115）；YGRYAGGATATATWSNVBKGTAAWY（配列番号：116）；CGGCAGGATATATCCTGATGTAAAT（配列番号：117）；TGGCAGGAGTTATTCGAGGGTAAAC（配列番号：118）；TGACAGGATATATCGTGATGTCAAC（配列番号：119）；GGGAAGTACATATTGGCGGGTAAAC（配列番号：120）；TTACAGGATATATTAATATGTATGA（配列番号：121）；TAACATGATATATTCCCTTGTAAAT（配列番号：122）；TGACAGGATATATGGTAATGTAAAC（配列番号：123）；およびTGGCAGGATATATACCGATGTAAAC（配列番号：124)、
配列中、* Y = CまたはT；R = AまたはG；K = GまたはT；W = AまたはT；S = CまたはG；V = A、C、またはG；B = C、G、またはT
が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０３０６】
植物細胞に遺伝子を転移するために伝統的にアグロバクテリウム属種だけが使用されているが、アグロバクテリウム属種と類似の方法で作用する、同定／発育された多くの系が、現在存在する。最近、幾つかの非アグロバクテリウム属種が、遺伝子転移に対してコンピテントとなるように遺伝子修飾された（Ｃｈｕｎｇら、２００６；Ｂｒｏｏｔｈａｅｒｔｓら、２００５）。これらとしては、リゾビウム属種ＮＧＲ２３４、シノリゾビウム・メリロティおよびメゾリゾビウム・ロティが挙げられる。細菌は、形質転換プロセスのために必要とされる機構を有する細菌、すなわち、アグロバクテリウムＴｉプラスミドおよび別々の小さいバイナリープラスミド上に存在するＴ−ＤＮＡセグメントによってコードされる病原性遺伝子のセットを細菌に提供することによって遺伝子転移に対してコンピテントとされる。この方法において操作される細菌は、異なる植物組織（葉ディスク、カルスおよび卵円形組織）、単子葉植物または双子葉植物、ならびに様々な異なる植物種（例えば、タバコ、イネ）を形質転換することができる。
【０３０７】
細菌から真核生物宿主への真核生物発現プラスミドの直接転移は、最初に、哺乳動物細胞およびプラスミド運搬エシェリヒア・コリの原形質体の融合によって数十年前に達成された（Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ、１９８０）。それ以来、４つのグループ（Ｓｉｚｅｍｏｒｅら、１９９５；Ｃｏｕｒｖａｌｉｎら、１９９５；Ｐｏｗｅｌｌら、１９９６；Ｄａｒｊｉら、１９９７）によって独立して発見された遺伝子を哺乳動物細胞中に送達することができる細菌の数は、着実に増加した（Ｗｅｉｓｓ、２００３）。
【０３０８】
Ｓ．フレクスネリの病原性プラスミド（ｐＷＲ１００）によって浸潤性（invasive）とされた弱毒化シゲラ・フレクスネリ、サルモネラ・チフィムリウムまたはＥ．コリは、宿主細胞の浸潤と代謝減衰による細胞内死との後で発現プラスミドを転移することができることを示した。かかる組換えシゲラまたはサルモネラの経鼻的または経口的のいずれかによる粘膜塗布は、発現プラスミドによってコードされた抗原に対する免疫応答を誘導した。その間、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで発現プラスミドを哺乳動物宿主細胞に転移することができることを示した細菌の一覧は、次いでより２倍になり、Ｓ．チフィ（S. typhi）、Ｓ．コレレスイス、リステリア・モノサイトゲネス、エルシニア・シュードツベルクローシスおよびＹ．エンテロコリチカについて文書に記録されている（Ｆｅｎｎｅｌｌｙら、１９９９；Ｓｈｉａｕら、２００１；Ｄｉｅｔｒｉｃｈら、１９９８、２００１；Ｈｅｎｓｅら、２００１；Ａｌ−Ｍａｒｉｒｉら、２００２）。
【０３０９】
一般に、（Ｓ．フレクスネリまたはＬ．モノサイトゲネス等の）宿主細胞のサイトゾルに入り、この細胞区画の中で溶解することができる全ての細菌は、ＤＮＡを転移することができると考えることができた。これは、細菌が生じるべきＤＮＡ転移のために溶解しなければならない場合、「不全性」（abortive）または「自殺的」（suicidal）浸潤として知られている（Ｇｒｉｌｌｏｔ−Ｃｏｕｒｖａｌｉｎら、１９９９）。さらに、（Ｓ．チフィムリウム等の）食胞のままである細菌の多くでさえ、そうすることが可能でもあり得る。従って、浸潤性であるように操作されたＥ．コリの組換え実験室株は、ファゴソーム逃避が可能でないが、それでもそれらのプラスミドロードを感染哺乳動物細胞の核に送達することができた（Ｇｒｉｌｌｏｔ−Ｃｏｕｒｖａｌｉｎら、１９９８）。さらに、最近、アグロバクテリウム・ツメファシエンスは、導入遺伝子を哺乳動物細胞中に導入することも示されている（Ｋｕｎｉｋら、２００１）。
【０３１０】
染色体外転移エレメントを使用する転移プロセスは、典型的には、エレメントの多数のコピーをレシピエント細胞中に転移する。本明細書において使用される「一過性にトランスフェクトされた」という用語は、外因性ポリヌクレオチドの一部が細胞のゲノム中に安定して組み込まれるようになることができるにもかかわらず、細胞が安定した組込みのために選択されないことを意味する。その結果、転移核酸の多くは、細胞中において染色体外のままであり、例えば、レシピエント細胞中に転移される外因性ポリヌクレオチドのコピーの９０％超がゲノム中に組み込まれない。
【０３１１】
一般に、本明細書において使用される「トランスフェクション」、「形質転換」という用語およびそれらの変形物は、交換可能に使用される。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」細胞は、外因性ポリヌクレオチド（複数可）を導入するために操作することができたか、またはそれに由来する子孫細胞であり得る。
【０３１２】
組換え細胞
本発明は、本明細書において定義されるポリヌクレオチド、キメラＤＮＡまたは組換えベクター等の１個または複数個の組換え分子で形質転換された宿主細胞である組換え細胞、好ましくは組換え植物細胞をも提供する。組換え細胞は、その任意の組合せ、例えば２つまたは３つの組換えベクター、あるいは組換えベクターおよび１つもしくは複数の更なるポリヌクレオチドまたはキメラＤＮＡを含むことができる。本発明の適切な細胞としては、例えば本明細書において記載されるポリペプチドまたは酵素をコードする分子等、本発明のポリヌクレオチド、キメラＤＮＡまたは組換えベクターで形質転換され得るあらゆる細胞が挙げられる。細胞は、好ましくは、それによりＬＣ−ＰＵＦＡを産生するために使用され得る細胞である。組換え細胞は、培養における細胞、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞、または例えば植物等の生物における細胞、または例えば種子もしくは葉等の器官における細胞であり得る。好ましくは、細胞は、植物中にあり、より好ましくは植物の種子中にある。
【０３１３】
ポリヌクレオチド（複数可）が導入される宿主細胞は、非形質転換細胞または少なくとも１個の核酸分子で既に形質転換された細胞のいずれかであり得る。かかる核酸分子は、ＬＣ−ＰＵＦＡ合成に関連があってよいか、または関連がなくてもよい。本発明の宿主細胞は、本明細書において定義されるタンパク質を内因的に（すなわち、天然に）産生することが可能であり得る（その場合、それに由来する組換え細胞がポリペプチドを産生する増強された能力を有する）か、または本発明の少なくとも１つのポリヌクレオチドで形質転換された後にだけかかるタンパク質を産生することが可能であり得る。一実施形態において、本発明の組換え細胞は、長鎖多価不飽和脂肪酸を合成する増強された能力を有する。本明細書において使用される「長鎖多価不飽和脂肪酸を合成する増強された能力を有する細胞」という用語は相対的な用語であり、ここで本発明の組換え細胞は、本発明のポリヌクレオチド（複数可）を欠く宿主細胞と比較され、組換え細胞がより多くの長鎖多価不飽和脂肪酸を産生するか、またはネイティブ細胞よりも（他の脂肪酸と比較して）ＥＰＡ、ＤＰＡまたはＤＨＡ等のＬＣ−ＰＵＦＡの濃度が大きい。例えば他の脂肪酸、脂質、炭水化物、例えばデンプン、ＲＮＡ分子、ポリペプチド、医薬または他の産物等の他の産物を合成する増強された能力を有する細胞は、対応する意味を有する。
【０３１４】
本発明の宿主細胞は、本明細書において記載される少なくとも１種のタンパク質を産生し得るあらゆる細胞であってよく、細菌、真菌（酵母を含む）、寄生生物、節足動物、動物および植物細胞が含まれる。細胞は、原核性または真核性であってよい。好ましい宿主細胞は、酵母および植物細胞である。好ましい一実施形態において、植物細胞は、種子細胞、特に種子の子葉または内乳中における細胞である。一実施形態において、細胞は、動物細胞または藻類細胞である。動物細胞は、例えば、非ヒト動物細胞、非ヒト脊椎動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、または魚類もしくは甲殻類等の水生動物、無脊椎動物、昆虫等の細胞等、動物のあらゆる型のものであってよい。節足動物細胞の非限定的な例としては、昆虫細胞、例えば、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（Ｓｆ）細胞、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、トリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni）細胞およびドロソフィラ（Drosophila）Ｓ２細胞が挙げられる。本発明の宿主細胞として有用な細菌細胞の一例は、（シネコシスティス属種としても公知である）シネココッカス（Synechococcus）属種、例えば、シネココッカス・エロンガタス（Synechococcus elongatus）である。
【０３１５】
細胞は、発酵プロセスに適切な生物のものであってよい。本明細書において使用される「発酵プロセス」という用語は、あらゆる発酵プロセスまたは発酵ステップを含むあらゆるプロセスを指す。発酵プロセスとしては、限定されないが、アルコール（例えば、エタノール、メタノール、ブタノール）、有機酸（例えば、クエン酸、酢酸、イタコン酸、乳酸、グルコン酸）、ケトン（例えば、アセトン）、アミノ酸（例えば、グルタミン酸）、ガス（例えば、Ｈ２およびＣＯ２）、抗生物質（例えば、ペニシリンおよびテトラサイクリン）、酵素、ビタミン（例えば、リボフラビン、ベータカロチン）およびホルモンを産生するために使用される発酵プロセスが挙げられる。また、発酵プロセスとしては、摂取可能アルコール業（例えば、ビールおよびワイン）、乳業（例えば、発酵乳製品）、皮革業およびタバコ業において使用される発酵プロセスも挙げられる。好ましい発酵プロセスとしては、本技術分野において周知の通りのアルコール発酵プロセスが挙げられる。好ましい発酵プロセスは、本技術分野において周知の通りの嫌気性発酵プロセスである。適切な発酵細胞、典型的には微生物は、グルコースまたはマルトース等の糖を直接的または間接的に所望の発酵産物に発酵させること、すなわち変換させることが可能である。発酵微生物の例としては、真菌性生物（例えば、酵母）が挙げられる。本明細書において使用される「酵母」としては、サッカロミセス（Saccharomyces）属種、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・カールベルゲンシス（Saccharomyces carlbergensis）、カンジダ（Candida）属種、クルヴェロマイシス（Kluveromyces）属種、ピキア（Pichia）属種、ハンゼヌラ（Hansenula）属種、トリコデルマ（Trichoderma）属種、リポミセス・スターケイ（Lipomyces starkey）およびヤローウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）が挙げられる。好ましい酵母としては、サッカロミセス属種、特にサッカロミセス・セレビジエの株が挙げられる。
【０３１６】
トランスジェニック植物
本発明はまた、本発明の細胞を含む植物、例えば、本発明の１つまたは複数のポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物をも提供する。本明細書において名詞として使用される「植物」という用語は、全植物を指すが、形容詞として使用される場合は、例えば、植物器官（例えば、葉、茎、根、花）、単細胞（例えば、花粉）、種子、植物細胞等の、植物中に存在する、植物から得られた、植物に由来する、または植物に関連したあらゆる物質を指す。「植物部分」という用語は、植物構造、例えば、葉または茎、根、花器官または構造、花粉、種子、種子部分、例えば、胚、内乳、胚盤または種皮、植物組織、例えば、維管束組織、細胞および同じものの子孫が含まれる、植物ＤＮＡを含む全ての植物部分を指す。
【０３１７】
「トランスジェニック植物」、「遺伝子修飾された植物」またはそれらの変形物は、同じ種、変種または栽培品種の野生型植物においては見出されない遺伝子構築物（「導入遺伝子」）を含有する植物を指す。本発明の文脈において定義されるトランスジェニック植物としては、所望の植物または植物器官において本明細書において定義される少なくとも１種のポリペプチドを産生させるように組換え技術を用いて遺伝子修飾された植物およびそれらの子孫が挙げられる。トランスジェニック植物細胞およびトランスジェニック植物部分は、対応する意味を有する。本明細書において言及される「導入遺伝子」は、バイオテクノロジーの技術分野における通常の意味を有し、組換えＤＮＡまたはＲＮＡ技術によって産生または改変された、本発明の細胞、好ましくは植物細胞中に導入された遺伝子配列を含む。導入遺伝子は、導入遺伝子が導入される植物細胞と同じ種、変種もしくは栽培品種のもの、または異なる種、変種もしくは栽培品種のものであってよい植物細胞に由来する、あるいは植物細胞以外の細胞に由来する遺伝子配列を含むことができる。典型的には、導入遺伝子は、人的操作によって、例えば形質転換等によって植物等の細胞中に導入されているが、当業者が認識しているようなあらゆる方法を使用することができる。
【０３１８】
「種子」および「穀粒」という用語は、本明細書において交換可能に使用される。「穀粒」は、成熟した穀粒、例えば、採取された穀粒またはなお植物にあるが採収の準備が整っている穀粒を指すが、文脈に従って、吸水または発芽の後の穀粒を指すこともできる。成熟した穀粒は、概して約１８〜２０％未満の水分含有率を有する。本明細書において使用される「発育中の種子」は、典型的には受精または開花後の植物の繁殖構造において見出される成熟前の種子を指すが、植物から単離された成熟前のかかる種子を指すこともできる。
【０３１９】
本明細書において使用される「植物貯蔵器官」という用語は、例えば、タンパク質、炭水化物、脂肪酸および／または油の形態で貯蔵エネルギーに特化した植物の部分を指す。植物貯蔵器官の例は、種子、果実、塊状根および塊茎である。本発明の好ましい植物貯蔵器官は、種子である。
【０３２０】
本明細書において使用される「表現型的に正常」という用語は、未修飾の植物または植物器官と比較した場合、成長し、繁殖する能力が著しく低下していない、遺伝子修飾された植物または植物器官、特に貯蔵器官、例えば、本発明の種子、塊茎もしくは果実を指す。一実施形態において、表現型的に正常な遺伝子修飾された植物または植物器官は、植物貯蔵器官特異的プロモーターに作動可能に連結したサイレンシングサプレッサーをコードする外因性ポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドを含まないアイソジェニック植物または器官と本質的に同じ成長または繁殖する能力を有する。好ましくは、生物量、成長率、発芽率、貯蔵器官の大きさ、種子の大きさおよび／または産生された生存種子の数は、同一の条件下で成長させた場合、外因性ポリヌクレオチドを欠く植物の生物量、成長率、発芽率、貯蔵器官の大きさ、種子の大きさおよび／または産生された生存種子の数の９０％以上である。この用語は、野生型植物と異なり得るが、例えば芽生え葉のバレリーナ表現型等の商業的目的のための植物の有用性を生じさせない植物の特性を包含しない。
【０３２１】
本発明の実施によって提供されるか、本発明の実施における使用が検討される植物は、単子葉植物および双子葉植物の両方を含む。好ましい実施形態において、本発明の植物は、作物植物（例えば、穀菽、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモ、タピオカ、イネ、モロコシ、キビ、キャッサバ、オオムギもしくはエンドウ）または他のマメ類である。植物は、食用の根、塊茎、葉、茎、花または果実の生産のために成長させ得る。植物は、野菜または観賞植物であってよい。本発明の植物は、トウモロコシ（ゼア・マイス）、キャノーラ（ブラッシカ・ナパス、ブラッシカ・ラパ種）、アマ（リナム・ウシタチシマム）、ムラサキウマゴヤシ（メジカゴ・サチバ（Medicago sativa））、イネ（オリザ・サチバ（Oryza sativa））、ライムギ（セカレ・ケラレ（Secale cerale））、モロコシ（ソルガム・ビコロール（Sorghum bicolour）、ソルガム・ブルガレ（Sorghum vulgare））、ヒマワリ（ヘリアンサス・アナス）、コムギ（トリチウム・アエスチブム（Tritium aestivum））、ダイズ（グリシン・マックス）、タバコ（ニコチアナ・タバカム）、ジャガイモ（ソラヌム・ツベロスム（Solanum tuberosum））、落花生（アラキス・ヒポゲア）、綿（ゴシピウム・ヒルスツム）、サツマイモ（ロプモエア・バタツス（Lopmoea batatus））、キャッサバ（マニホト・エスクレンタ（Manihot esculenta））、コーヒー（コフェア（Cofea）属種）、ココナッツ（ココス・ヌシフェラ）、パイナップル（アナナ・コモスス（Anana comosus））、柑橘類の樹木（シトラス（Citrus）属種）、ココア（テオブロマ・カカオ（Theobroma cacao））、茶（カメリア・セネンシス（Camellia senensis））、バナナ（ムサ属種）、アボカド（ペルセア・アメリカナ）、イチジク（フィクス・カシカ（Ficus casica））、グァバ（プシディウム・グアジャバ（Psidium guajava））、マンゴー（マンギフェラ・インディカ（Mangifer indica））、オリーブ（オレア・エウロパエア）、パパイア（カリカ・パパヤ（Carica papaya））、カシュー（アナカルジウム・オクシデンタレ）、マカダミア（マカダミア・インテルグリフォリア）、アーモンド（プルヌス・アミグダルス）、テンサイ（ベタ・ブルガリス（Beta vulgaris））、オートムギまたはオオムギであってよい。
【０３２２】
好ましい一実施形態において、植物は被子植物である。
【０３２３】
一実施形態において、植物は、油料種子植物、好ましくは油料種子作物植物である。本明細書において使用される「油料種子植物」は、植物の種子からの油の商業的生産のために使用される植物種である。油料種子植物は、アブラナ（例えば、キャノーラ）、トウモロコシ、ヒマワリ、ダイズ、モロコシ、アマ（アマニ）またはテンサイであってよい。さらに、油料種子植物は、他のブラッシカ、綿、落花生、ポピー、マスタード、トウゴマ、ゴマ、ベニバナまたはナッツを産生する植物であってよい。植物は、その果実（例えばオリーブ、アブラヤシまたはココナッツ）中において高レベルの油を産生することができる。本発明が適用され得る園芸植物は、レタス、エンダイブ、またはキャベツ、ブロッコリもしくはカリフラワーを含む野菜のアブラナ類である。本発明は、タバコ、ウリ科植物、ニンジン、イチゴ、トマトまたはコショウにおいて適用され得る。
【０３２４】
更なる好ましい一実施形態において、本発明のトランスジェニック植物を産生するために使用される非トランスジェニック植物は、とりわけ種子中において、ｉ）２０％未満、１０％未満もしくは５％未満の１８：２脂肪酸および／またはｉｉ）１０％未満もしくは５％未満の１８：３脂肪酸を有する油を産生する。
【０３２５】
好ましい一実施形態において、トランスジェニック植物は、その子孫が所望の表現型について分離しないように導入されたどの遺伝子（導入遺伝子）についてもホモ接合性である。トランスジェニック植物は、例えば雑種種子から成長したＦ１子孫の場合等、導入された導入遺伝子（複数可）についてヘテロ接合性、好ましくは導入遺伝子について一様にヘテロ接合性であってもよい。かかる植物は、本技術分野において周知の雑種強勢等の利点を提供することができる。
【０３２６】
関連のある場合、トランスジェニック植物は、限定されないが、Δ６デサチュラーゼ、Δ９エロンガーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ６エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、ω３デサチュラーゼ、Δ４デサチュラーゼ、Δ５エロンガーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼおよび／またはΔ１２デサチュラーゼ等のＬＣ−ＰＵＦＡの産生に関与する酵素をコードする更なる導入遺伝子を含むこともできる。これらの活性のより多くのものの内の１つを有するかかる酵素の例は、本技術分野において公知であり、本明細書およびＷＯ０５／１０３２５３（例えば、ＷＯ０５／１０３２５３の表１参照）に記載されるものが含まれる。具体例において、トランスジェニック植物は、
ａ）Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ５エロンガーゼおよびΔ６エロンガーゼ、
ｂ）Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ５エロンガーゼおよびΔ９エロンガーゼ、
ｃ）Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ５エロンガーゼ、Δ６エロンガーゼおよびΔ１５デサチュラーゼ、
ｄ）Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ５エロンガーゼ、Δ９エロンガーゼおよびΔ１５デサチュラーゼ、
ｅ）Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ５エロンガーゼ、Δ６エロンガーゼおよびΔ１７デサチュラーゼ、または
ｆ）Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ５エロンガーゼ、Δ９エロンガーゼおよびΔ１７デサチュラーゼ
をコードする外因性ポリヌクレオチドを少なくとも含む。
【０３２７】
植物の形質転換
トランスジェニック植物は、本技術分野において公知の技術、例えば、一般に、Ａ．Ｓｌａｔｅｒら、Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００３）、ならびにＰ．ＣｈｒｉｓｔｏｕおよびＨ．Ｋｌｅｅ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（２００４）に記載されているものを使用して産生され得る。
【０３２８】
本明細書において使用される「安定して形質転換する」、「安定して形質転換された」という用語およびそれらの変形物は、外因性核酸分子が、それらの存在に対する積極的な選択の必要なしで細胞分裂の間に子孫細胞に転移されるような細胞のゲノム中への外因性核酸分子の組込みを指す。安定した形質転換体またはその子孫は、本技術分野において公知のあらゆる手段、例えば、染色体ＤＮＡにおけるサザンブロットまたはゲノムＤＮＡのインサイチュハイブリダイゼーションによって選択され得る。
【０３２９】
一過性発現のために、または植物細胞ゲノム中におけるＤＮＡの安定した組込みのために、全植物組織もしくは植物器官中における細胞、または組織培養物中における外植体（explants）にＤＮＡを導入することができるので、アグロバクテリウム媒介転移は、遺伝子を植物細胞中に導入するための広く適用可能な系である。ＤＮＡを植物細胞中に導入するためのアグロバクテリウム媒介植物組込みベクターの使用は、本技術分野において周知である（例えば、ＵＳ５１７７０１０、ＵＳ５１０４３１０、ＵＳ５００４８６３またはＵＳ５１５９１３５参照）。転移すべきＤＮＡの領域は、境界配列によって限定され、介在性ＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）は、通常、植物ゲノム中に挿入される。さらに、Ｔ−ＤＮＡの組込みは、再配列をほとんどもたらさない相対的に厳密なプロセスである。アグロバクテリウム媒介形質転換が効率的であるそれらの植物の変種において、遺伝子転移の容易でかつ定義された性質のため、それは選択の方法である。好ましいアグロバクテリウム形質転換ベクターは、Ｅ．コリならびにアグロバクテリウムにおける複製が可能であり、記載されている通りの好都合な操作を可能にする（Ｋｌｅｅら、Ｉｎ：Ｐｌａｎｔ  ＤＮＡ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ａｇｅｎｔｓ、ＨｏｈｎおよびＳｃｈｅｌｌ（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１７９〜２０３頁（１９８５）。
【０３３０】
使用され得る加速法としては、例えば、マイクロプロジェクタイルボンバードメント（microprojectile bombardment）等が挙げられる。形質転換核酸分子を植物細胞に送達するための方法の一例は、マイクロプロジェクタイルボンバードメントである。この方法は、Ｙａｎｇら、Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９４）によって概説されている。非生物学的粒子（マイクロプロジェクタイル）に核酸をコーティングし、それらを推進力によって細胞に送達することができる。例示的粒子としては、タングステン、金、白金等より成るものが挙げられる。マイクロプロジェクタイルボンバードメントの特定の利点は、単子葉植物を繁殖可能に形質転換させる有効な手段であることに加えて、原形質体の単離も、アグロバクテリウム感染に対する感受性も必要としないことである。加速によってゼア・マイス細胞にＤＮＡを送達するための方法の例示的な一実施形態は、ＤＮＡでコーティングした粒子を、スクリーン（例えば、ステンレス鋼またはＮｙｔｅｘスクリーン）を通って、懸濁液中で培養されたトウモロコシ細胞で覆われたフィルター表面上へと推進させるために使用され得る微粒子銃α粒子送達系である。本発明と共に使用するために適切な粒子送達系は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能なヘリウム加速ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ銃である。
【０３３１】
ボンバードメントのために、懸濁液中の細胞をフィルター上において濃縮させることができる。ボンバードメントに付される細胞を含有するフィルターを、マイクロプロジェクタイル停止用プレートの下に適切な距離で配置する。所望により、銃とボンバードメントに付される細胞との間に１つまたは複数のスクリーンも配置する。
【０３３２】
別の場合、未成熟胚または他の標的細胞を固体培養培地上に配置してよい。ボンバードメントに付される細胞を、マイクロプロジェクタイル停止用プレートの下に適切な距離で配置する。所望により、加速装置とボンバードメントに付される細胞との間に１つまたは複数のスクリーンも配置する。本明細書において記載される技術の使用により、マーカー遺伝子を一過性に発現する細胞の最高１０００以上の増殖巣（foci）を得ることができる。ボンバードメントの４８時間後に外因性遺伝子産物を発現する増殖巣中の細胞数は、多くの場合、１から１０の範囲に及び、平均１から３の範囲に及ぶ。
【０３３３】
ボンバードメント形質転換において、最大数の安定した形質転換体を生成するようにボンバードメント前培養条件およびボンバードメントパラメータを最適化することができる。ボンバードメントの物理的パラメータおよび生物学的パラメータの両方が、この技術において重要である。物理的因子は、ＤＮＡ／マイクロプロジェクタイル沈殿物の操作を含むもの、または、マクロプロジェクタイルもしくはマイクロプロジェクタイルのいずれかの飛行および速度に影響を及ぼすものである。生物学的因子としては、ボンバードメントの前および直後の細胞の操作に関与する全てのステップ、ボンバードメントに伴う外傷の緩和を助長するための標的細胞の浸透圧調整、およびまた、線形化ＤＮＡまたは無損傷超螺旋プラスミド等の形質転換ＤＮＡの性質が挙げられる。ボンバードメント前操作は、未成熟胚の成功した形質転換のためにとりわけ重要であると考えられる。
【０３３４】
他の一代替的実施形態では、プラスチドを安定して形質転換させることができる。高等植物におけるプラスチド形質転換について開示されている方法としては、選択可能なマーカーを含有するＤＮＡの粒子銃送達、および相同組換えによるプラスチドゲノムへのＤＮＡの標的化が挙げられる（ＵＳ５，４５１，５１３、ＵＳ５，５４５，８１８、ＵＳ５，８７７，４０２、ＵＳ５，９３２４７９およびＷＯ９９／０５２６５）。
【０３３５】
従って、小規模な研究においてボンバードメントパラメータの様々な態様を調整して、それらの条件を十分に最適化することを望み得ると考えられる。特に、ギャップ距離、飛行距離、組織距離、およびヘリウム圧等の物理的パラメータの調整が特に望まれる可能性がある。レシピエント細胞の生理学的状態に影響を及ぼし、従って、形質転換および組込みの効率に影響を及ぼし得る条件を修飾することによって、外傷低減因子を最小にすることもできる。例えば、浸透圧状態、組織水和およびレシピエント細胞の継代培養段階または細胞周期を、最適な形質転換のために調整することができる。他のルーチンな調整の実行は、本開示に鑑みて当業者に公知である。
【０３３６】
植物原形質体の形質転換は、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレングリコール処理、エレクトロポレーションおよびこれらの処理の組合せに基づいた方法を使用して達成され得る。異なる植物変種に対するこれらの系の適用は、原形質体からその特定の植物系統を再生する能力に依存する。原形質体からの穀類の再生について例証となる方法が記載されている（Ｆｕｊｉｍｕｒａら、１９８５；Ｔｏｒｉｙａｍａら、１９８６；Ａｂｄｕｌｌａｈら、１９８６）。
【０３３７】
細胞形質転換の他の方法を使用することもでき、それらの方法としては、花粉中への直接のＤＮＡ転移によって、植物の生殖器官中へのＤＮＡの直接注入によって、または未成熟胚の細胞中へのＤＮＡの直接注入後の乾燥胚の再水和によって、植物中にＤＮＡを導入することが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０３３８】
単一植物原形質体形質転換体からの、または様々な形質転換外植体からの、植物の再生、発育および培養は、本技術分野において周知である（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈら、Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、（１９８８）。この再生および成長プロセスは、典型的には、形質転換細胞の選択のステップ、それらの個別に区別された細胞を、通常の胚発育期を経て根付き苗木期まで培養するステップを含む。トランスジェニック胚および種子は、同様に再生される。その後、得られたトランスジェニック根付き苗条を適切な植物成長培地（例えば、土壌）に植える。
【０３３９】
外来、外因性遺伝子を含有する植物の発育または再生は、本技術分野において周知である。好ましくは、再生植物を自家受粉させてホモ接合型トランスジェニック植物を提供する。それ以外の場合、再生植物から得られた花粉を、作物学的に重要な系列の種子から成長した植物に交配する。逆に、これらの重要な系列の植物からの花粉を使用して、再生植物に授粉する。所望の外因性核酸を含有する本発明のトランスジェニック植物は、当業者に周知の方法を使用して栽培される。
【０３４０】
主としてアグロバクテリウム・ツメファシエンスの使用による、双子葉植物を形質転換させるための方法およびトランスジェニック植物を得るための方法が、綿（ＵＳ５，００４，８６３、ＵＳ５，１５９，１３５、ＵＳ５，５１８，９０８）、ダイズ（ＵＳ５，５６９，８３４、ＵＳ５，４１６，０１１）、ブラッシカ（ＵＳ５，４６３，１７４）、落花生（Ｃｈｅｎｇら、１９９６）およびエンドウ（Ｇｒａｎｔら、１９９５）について公開されている。
【０３４１】
外因性核酸の導入によって遺伝的変異を植物中に導入するためのコムギおよびオオムギ等の穀物植物の形質転換方法、ならびに原形質体または未成熟植物胚からの植物の再生方法は、本技術分野において周知であり（例えば、ＣＡ２，０９２，５８８、ＡＵ６１７８１／９４、ＡＵ６６７９３９、ＵＳ６，１００，４４７、ＰＣＴ／ＵＳ９７／１０６２１、ＵＳ５，５８９，６１７、ＵＳ６，５４１，２５７参照）、他の方法は、特許明細書ＷＯ９９／１４３１４に記載されている。好ましくは、トランスジェニックコムギまたはオオムギ植物が、アグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介形質転換手法によって産生される。所望の核酸構築物を担持するベクターを、組織培養植物もしくは外植体の再生可能なコムギ細胞、または適切な植物系（例えば、原形質体）中に導入することができる。
【０３４２】
再生可能コムギ細胞は、好ましくは、未成熟胚の胚盤（scutellum）、成熟胚の胚盤（embryo）、これらから誘導されたカルス、または分裂組織（meristematic tissue）に由来する。
【０３４３】
トランスジェニック細胞およびトランスジェニック植物において導入遺伝子の存在を確認するために、当業者に公知の方法を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅またはサザンブロット分析を行うことができる。導入遺伝子の発現産物は、その産物の性質に依存して、ウエスタンブロットおよび酵素アッセイを含む様々な方法のいずれかで検出され得る。タンパク質発現を定量するためのおよび異なる植物組織中における複製を検出するための１つの特に有用な方法は、レポーター遺伝子（例えば、ＧＵＳ）を使用することである。一旦トランスジェニック植物が得られると、それらを成長させて、所望の表現型を有する植物組織または部分を産生することができる。その植物組織または植物部分を採取してもよいし、および／またはその種子を回収してもよい。この種子は、所望の特徴を有する組織または部分を有する更なる植物を成長させるための源として役立つことができる。
【０３４４】
アグロバクテリウムまたは他の形質転換方法を使用して形成されたトランスジェニック植物は、典型的には、１つの染色体上に単一の遺伝子座を含有する。かかるトランスジェニック植物は、付加遺伝子（複数可）についてヘミ接合性であると称され得る。付加遺伝子（複数可）についてホモ接合性であるトランスジェニック植物、すなわち２つの付加遺伝子（染色体対の各染色体上の同じ遺伝子座に１つの遺伝子）を含有するトランスジェニック植物が、より好ましい。ホモ接合型トランスジェニック植物は、ヘミ接合型トランスジェニック植物を自家受精させ、産生した種子の一部を発芽させ、得られた植物を対象となる遺伝子について分析することによって得られ得る。
【０３４５】
２つの独立して分離した外因性遺伝子または遺伝子座を含有する２つの異なるトランスジェニック植物を交配させて（掛け合わせて）、両組の遺伝子または遺伝子座を含有する子孫を産生することもできることも理解される。適切なＦ１子孫の自殖は、両方の外因性遺伝子または遺伝子座についてホモ接合性である植物を産生することができる。栄養繁殖のように、親植物への戻し交配および非トランスジェニック植物との異系交配も検討される。異なる形質および作物のために一般的に用いられる他の育種方法の記載は、Ｆｅｈｒ、Ｉｎ：Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｃｕｌｔｉｖａｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｗｉｌｃｏｘ  Ｊ．編、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｇｒｏｎｏｍｙ、Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓ．（１９８７）において見出され得る。
【０３４６】
トランスジェニック非ヒト動物
「トランスジェニック非ヒト動物」は、同じ種または品種の野生型動物において見出されない遺伝子構築物（「導入遺伝子」）を含有する（ヒト以外の）動物を指す。この文脈において言及される「導入遺伝子」は、バイオテクノロジーの技術分野における通常の意味を有し、および組換えＤＮＡまたはＲＮＡ技術によって産生または改変され、動物細胞中に導入された遺伝子配列を含む。導入遺伝子は、導入遺伝子が導入される細胞と同じまたは異なる種または品種のものであり得る動物細胞に由来する遺伝子配列を含むことができる。典型的には、導入遺伝子は、人的操作によって、例えば形質転換等によって動物中に導入されているが、当業者が認識している通りのあらゆる方法を使用することができる。
【０３４７】
トランスジェニック動物を産生するための技術は、本技術分野において周知である。この主題についての有用な一般的教科書は、Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌｓ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ（Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ、１９９７）である。細胞中へのポリヌクレオチド分子の形質転換は、その細胞中にポリヌクレオチド分子を挿入することができるあらゆる方法によって達成され得る。形質転換技術としては、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着および細胞融合が挙げられるが、これらに限定されるものではない。組換え細胞は、単細胞のままであり得るか、または組織、器官もしくは多細胞生物に成長し得る。形質転換ポリヌクレオチド分子は、染色体外のままであり得るか、または発現すべきそれらの能力が保持されるように形質転換（すなわち、組換え）細胞の染色体の中の１つもしくは複数の部位に組み込まれ得る。異種のＤＮＡを、例えば受精した哺乳動物卵子に導入することができる。例えば、全能性または多能性幹細胞を、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム媒介沈殿、リポソーム融合、レトロウイルス感染または他の手段によって形質転換させることができ、次いで、形質転換細胞を胚に導入し、次いで、その胚はトランスジェニック動物に発育する。非常に好ましい方法において、発育中の胚を、所望のＤＮＡを含有するレトロウイルスに感染させ、その感染させた胚からトランスジェニック動物を産生させる。しかし、最も好ましい方法において、適切なＤＮＡを、好ましくは単細胞期にある胚の前核または細胞質に同時注入し、それらの胚を成熟トランスジェニック動物へと発育させる。
【０３４８】
トランスジェニック動物を産生するために使用される他の方法は、標準法によって前核期卵子に核酸をマイクロインジェクションすることを含む。次いで、注入された卵子を培養した後、偽妊娠レシピエントの卵管中に転移する。
【０３４９】
トランスジェニック動物は、核転移技術によって産生することもできる。この方法を使用して、ドナー動物からの繊維芽細胞を、調節配列の制御下で、対象となる結合ドメインまたは結合パートナーに対するコード配列を組み込むプラスミドで安定してトランスフェクトする。次いで、安定したトランスフェクタントを除核卵母細胞に融合し、培養し、雌レシピエントに転移する。
【０３５０】
外因性ＲＮＡレベルおよび安定化した発現の増強
サイレンシングサプレッサー
転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）は、分解のために細胞ｍＲＮＡおよびウイルスｍＲＮＡの両方を標的とすることができるヌクレオチド配列特異的防御機構であり、ＰＴＧＳは、外来（異種）または内因性ＤＮＡで安定してまたは一過性に形質転換された植物または真菌において出現し、導入された核酸との配列類似性を有するＲＮＡ分子の蓄積の減少をもたらす。
【０３５１】
対象となる導入遺伝子とのサイレンシングサプレッサーの共発現が、その導入遺伝子から転写された細胞中に存在するＲＮＡのレベルを増加させることは、広く考慮されている。このことは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞について真であることを証明しているのに対して、著しい副作用が、多くの全植物共発現研究において観察されている。より具体的には、Ｍａｌｌｏｒｙら（２００２）、Ｃｈａｐｍａｎら（２００４）、Ｃｈｅｎら（２００４）、Ｄｕｎｏｙｅｒら（２００４）、Ｚｈａｎｇら（２００６）、Ｌｅｗｓｅｙら（２００７）およびＭｅｎｇら（２００８）において記載されているように、一般に構成的プロモーターの下でサイレンシングサプレッサーを発現する植物は、多くの場合、それらが商業的生産に有用でない程度まで表現型的に異常である。
【０３５２】
上記で概説されるように、本発明者らは、サイレンシングサプレッサーの発現をその植物もしくは部分の貯蔵器官に限定することによって、ＲＮＡ分子レベルが増加し得る、および／または、ＲＮＡ分子レベルが多くの世代にわたって安定化され得ることを見出した。本明細書において使用される「サイレンシングサプレッサー」は、特に最初に形質転換された植物から繰り返された世代にわたって、植物細胞中における異なる導入遺伝子に由来する発現産物のレベルを増強する植物細胞中において発現され得るあらゆるポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。一実施形態において、サイレンシングサプレッサーは、ウイルスサイレンシングサプレッサーまたはその突然変異体である。多数のウイルスサイレンシングサプレッサーが本技術分野において公知であり、それらとしては、Ｐ１９、Ｖ２、Ｐ３８、Ｐｅ−ＰｏおよびＲＰＶ−Ｐ０が挙げられるが、これらに限定されるものではない。一実施形態において、ウイルスサイレンシングサプレッサーは、配列番号９７から１０１のいずれか１つにおいて提供される配列、その生物学的に活性な断片、または配列番号９７から１０１のいずれか１つもしくは複数と少なくとも５０％同一でありかつサイレンシングサプレッサーとしての活性を有するアミノ酸配列を有するアミノ酸を含む。
【０３５３】
本明細書において使用される「発現を安定化させる」、「安定して発現された」、「安定化された発現」という用語およびそれらの変形物は、サイレンシングサプレッサーをコードする外因性ポリヌクレオチドを欠くアイソジェニック植物と比較した場合、ＲＮＡ分子のレベルが、繰り返された世代、例えば少なくとも３世代、少なくとも５世代または少なくとも１０世代にわたって子孫植物において本質的に同じまたはより高いことを指す。しかし、この用語（複数可）は、繰り返された世代にわたって、前世代と比較した場合にＲＮＡ分子のレベルの多少の低下、例えば１世代につき１０％以上の低下があるという可能性を排除しない。
【０３５４】
サプレッサーは、あらゆる源（例えば、植物、ウイルス、哺乳動物等）から選択され得る。サプレッサーは、例えば、
・  フロックハウスウイルスＢ２、
・  ポトス潜伏ウイルスＰ１４、
・  ポトス潜伏ウイルスＡＣ２、
・  アフリカキャッサバモザイクウイルスＡＣ４、
・  ベンディ黄色葉脈モザイク病Ｃ２、
・  ベンディ黄色葉脈モザイク病Ｃ４、
・  ベンディ黄色葉脈モザイク病βＣ１、
・  トマトクロロシスウイルスｐ２２、
・  トマトクロロシスウイルスＣＰ、
・  トマトクロロシスウイルスＣＰｍ、
・  トマトゴールデンモザイクウイルスＡＬ２、
・  トマト葉巻き病ジャワウイルスβＣ１、
・  トマト黄化葉巻ウイルスＶ２、
・  トマト黄化葉巻ウイルス−Ｃｈｉｎａ  Ｃ２
・  トマト黄化葉巻ＣｈｉｎａウイルスＹ１０分離菌βＣ１、
・  トマト黄化葉巻Ｉｓｒａｅｌｉ分離菌Ｖ２、
・  リョクトウ黄斑モザイクウイルス−Ｖｉｇｎａ  ＡＣ２、
・  ハイビスカスクロロシス輪点ウイルスＣＰ、
・  カブクリンクルウイルスＰ３８、
・  カブクリンクルウイルスＣＰ、
・  カリフラワーモザイクウイルスＰ６、
・  ビート萎黄ウイルスｐ２１、
・  柑橘トリステザウイルスｐ２０、
・  柑橘トリステザウイルスｐ２３、
・  柑橘トリステザウイルスＣＰ、
・  ササゲモザイクウイルスＳＣＰ、
・  サツマイモクロロシス矮化ウイルスｐ２２
・  キュウリモザイクウイルス２ｂ、
・  トマトアスパーミィウイルスＨＣ−Ｐｒｏ
・  ビートカーリートップウイルスＬ２、
・  ムギ類萎縮ウイルス１９Ｋ、
・  ムギ斑葉モザイクウイルスＧａｍｍａｂ、
・  ポア半潜伏ウイルス（poa semilatent virus）Ｇａｍｍａｂ、
・  落花生クランプペクルウイルスＰ１５、
・  イネ萎縮ウイルスＰｎｓ１０、
・  キュルビット（cururbit）アブラムシ媒介萎黄ウイルスＰ０、
・  ビート西部萎黄ウイルスＰ０、
・  ジャガイモウイルスＸ  Ｐ２５、
・  キュウリ葉脈黄病ウイルスＰ１ｂ、
・  プラムポックスウイルスＨＣ−Ｐｒｏ、
・  サトウキビモザイクウイルスＨＣ−Ｐｒｏ
・  ジャガイモウイルスＹ株ＨＣ−Ｐｒｏ、
・  タバコエッチウイルスＰ１／ＨＣ−Ｐｒｏ、
・  カブモザイクウイルスＰ１／ＨＣ−Ｐｒｏ、
・  コックスフットモットルウイルスＰ１、
・  コックスフットモットルウイルスＮｏｒｗｅｇｉａｎ分離菌Ｐ１
・  イネ黄色斑紋ウイルスＰ１、
・  イネ黄色斑紋ウイルス−Ｎｉｇｅｒｉａｎ分離菌Ｐ１、
・  イネオーハブランカウイルスＮＳ３
・  イネ縞葉枯ウイルスＮＳ３
・  アブラナ感染タバコモザイクウイルス１２６Ｋ、
・  アブラナ感染タバコモザイクウイルスｐ１２２、
・  タバコモザイクウイルスｐ１２２、
・  タバコモザイクウイルス１２６
・  タバコモザイクウイルス１３０Ｋ、
・  タバコ茎壊疽ウイルス１６Ｋ、
・  トマトブッシースタントウイルスＰ１９、
・  トマトスポッテドウイルトウイルスＮＳｓ、
・  リンゴクロロティックリーフスポットウイルスＰ５０、
・  グレープバインウイルスＡ  ｐ１０、
・  ＢＹＶ  ｐ２１のブドウ葉巻随伴ウイルス−２相同体、
ならびにそれらの変異体／突然変異体であり得る。上記の一覧は、サプレッサーを得ることができるウイルス、および各特定のウイルスに由来するサプレッサーのためのタンパク質（例えば、Ｂ２、Ｐ１４等）またはコード領域の名称を提供する。
【０３５５】
サプレッサーのマルチコピーを使用することができる。異なるサプレッサーを一緒に（例えば、相前後して）使用することができる。
【０３５６】
ＲＮＡ分子
本質的には、植物貯蔵器官中において発現させることが望ましいあらゆるＲＮＡ分子を、サイレンシングサプレッサーと共発現させることができる。ＲＮＡ分子は、農業形質、耐虫性、耐病性、除草剤抵抗性、繁殖不能性、穀粒特性等に影響を及ぼし得る。コードされたポリペプチドは、油、デンプン、炭水化物、栄養素等の代謝に関与し得るか、またはタンパク質、ペプチド、脂肪酸、脂質、ロウ、油、デンプン、糖類、炭水化物、香料、臭気、トキシン、カロチノイド、ホルモン、ポリマー、フラボノイド、貯蔵タンパク質、フェノール酸、アルカロイド、リグニン、タンニン、セルロース、糖タンパク質、糖脂質等の合成を担うことができる。
【０３５７】
特定の一例において、植物は、植物、例えばブラッシカ、例えばアブラナもしくはヒマワリ、ベニバナ、アマ、綿、ダイズまたはトウモロコシにおける油産生のための酵素、植物、例えばジャガイモ、トウモロコシおよび穀類、例えばコムギオオムギまたはイネにおけるデンプン合成に関与する酵素、天然の医薬品、例えば医薬もしくは獣医学的産物を合成する酵素、またはそれら自身であるタンパク質の増加したレベルを産生した。
【０３５８】
本発明の方法における産生のために検討されるポリペプチトド（polypeptitde）の型としては、ヒトを含む哺乳動物に使用するための医薬タンパク質、例えばインスリン、プレプロインシュリン、プロインシュリン、グルカゴン、インターフェロン、例えばα−インターフェロンおよびγ−インターフェロン、血液凝固因子、例えばＦａｃｔｏｒ  ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩおよびＸＩＩ、生殖ホルモン、例えば黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン増殖因子、例えば上皮増殖因子、血小板由来増殖因子、顆粒球コロニー刺激因子、プロラクチン、オキシトシン、甲状腺刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、カルシトニン、副甲状腺ホルモン、ソマトスタチン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、酵素、例えばβ−グルコセレブロシダーゼ、ヘモグロビン、血清アルブミン、コラーゲン、成長ホルモン、ヒト血清アルブミン、ヒト分泌アルカリホスファターゼ、アプロチニン、α１−アンチトリプシン、ＩｇＧ１（ホスホン酸エステル）、ＩｇＭ（神経ペプチドハプテン）、ＳＩｇＡ／Ｇ（ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）付着因子）、ｓｃＦｖ−ブリョジン１イムノトキシン（ＣＤ４０）、ＩｇＧ（ＨＳＶ）、ＬＳＣ（ＨＳＶ）等が挙げられる。
【０３５９】
さらに、本発明の方法は、例えば、骨形成タンパク質受容体−ＩＢ型、Ｅ１６、ＳＴＥＡＰ１、ＭＰＦ、Ｎａｐｉ３ｂ、Ｓｅｍａ５ｂ、ＰＳＣＡ、エンドセリンＢ型受容体、ＭＳＧ７８３、ＳＴＥＡＰ２、ＴｒｐＭ４、ＣＲＩＰＴＯ、ＣＤ２１、ＣＤ７９ｂ、ＦｃＲＨ２、ＨＥＲ２、ＮＣＡ、ＭＤＰ、ＩＬ２０Ｒα、ブレビカン、ＥｐｈＢ２Ｒ、ＡＳＬＧ６５９、ＰＳＣＡ、ＧＥＤＡ、Ｂ細胞活性化因子受容体、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＸＣＲ５、ＨＬＡ−ＤＯＢ、Ｐ２Ｘ５、ＣＤ７２、ＬＹ６４、ＦｃＲＨ１、ＩＲＴＡ２、ＴＥＮＢ２、ＣＤ２０、ＶＥＧＦ＿Ａ、Ｂ、ＣもしくはＤが含まれるＶＥＧＦ、ｐ５３、ＥＧＦＲ、プロゲステロン受容体、カテプシンＤ、Ｂｃｌ−２、Ｅカドヘリン、ＣＥＡ、Ｌｅｗｉｓ  Ｘ、Ｋｉ６７、ＰＣＮＡ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ｃ−Ｍｙｃ、ｔａｕ、ＰｒＰＳＣまたはＡβを結合する抗体関連分子またはそれらの活性断片が含まれる特異的抗体の産生のために使用され得る。
【０３６０】
さらに、本発明の方法は、貯蔵器官の摂取によって送達することができるか、または送達することができない抗原の産生のために使用され得るが、その抗原の例としては、Ｂ型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質、狂犬病ウイルス糖タンパク質、エシェリヒア・コリ熱不安定エンテルトキシン（entertoxin）、ノーウォークウイルスキャプシドタンパク質、糖尿病自己抗原、コレラトキシンＢサブユニット、コレラトキシンＢおよびＡ２サブユニット、ロタウイルスエンテルトキシンおよび腸内毒素原性Ｅ．コリフィムブリエ抗原融合物、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス糖タンパク質Ｓ、ヒトライノウィルス１５（ＨＲＶ−１４）およびヒト免疫不全症ウイルス型（ＨＩＶ−１）エピトープ、ミンク腸炎ウイルスエピトープ、口蹄疫ウイルスＶＰ１構造タンパク質、ヒトサイトメガロウイルス糖タンパク質Ｂ、齲蝕（Ｓ．ミュータンス）抗原、ならびに呼吸器合胞体ウイルス抗原が挙げられる。
【０３６１】
産生されたＬＣ−ＰＵＦＡのレベル
組換え細胞中において産生されたＬＣ−ＰＵＦＡまたはＬＣ−ＰＵＦＡの組合せのレベルは、重要である。レベルは、特定のＬＣ−ＰＵＦＡまたは関連のＬＣ−ＰＵＦＡ（例えばω３ＬＣ−ＰＵＦＡもしくはω６ＬＣ−ＰＵＦＡ）もしくはＶＬＣ−ＰＵＦＡの群である全脂肪酸の組成（パーセント）として、あるいは本技術分野において公知の方法によって決定され得る他のものとして表すことができる。レベルは、ＬＣ−ＰＵＦＡの含有率、例えば、組換え細胞を含む材料の乾燥重量におけるＬＣ−ＰＵＦＡの百分率等、例えば、ＬＣ−ＰＵＦＡである種子の乾燥重量の百分率として表すこともできる。油料種子中において産生されるＬＣ−ＰＵＦＡが、ＬＣ−ＰＵＦＡ含有率に関して、油産生のために成長しない野菜または穀粒よりも著しく高い場合があり、その上、両方とも、同様のＬＣ−ＰＵＦＡ組成を有することができ、両方とも、ヒトまたは動物の摂取のためのＬＣ−ＰＵＦＡの源として使用され得ることは、いうまでもない。
【０３６２】
ＬＣ−ＰＵＦＡのレベルは、本技術分野において公知の方法のいずれかによって決定され得る。好ましい方法では、全脂質を細胞、組織または生物から抽出し、脂肪酸をメチルエステルに変換した後、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって分析する。かかる技術は、実施例１に記載される。クロマトグラムのピーク位置を用いて各特定の脂肪酸を同定することができ、各ピーク下の面積を積分してその量を決定することができる。本明細書において使用される場合、反対に記載されない限り、試料中における特定の脂肪酸の百分率は、クロマトグラムにおける脂肪酸についての全面積の百分率としてのその脂肪酸についてのピーク下の面積として決定される。これは、本質的に重量百分率（ｗ／ｗ）に相当する。脂肪酸の同一性は、ＧＣ−ＭＳによって確認され得る。全脂質は、画分（例えば、ＴＡＧ画分）を精製するための本技術分野において公知の技術によって分離され得る。例えば、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、特にＴＡＧの脂肪酸組成を決定するために、ＴＡＧを他の脂質画分（例えば、ＤＡＧ、アシル−ＣｏＡまたはリン脂質）から分離するための分析規模で実施され得る。
【０３６３】
一実施形態において、細胞中における脂肪酸におけるＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡの総計は、細胞中における全脂肪酸の少なくとも１５％、より好ましくは少なくとも２０％または少なくとも２５％を含む。より好ましい一実施形態において、それらの脂肪酸の総計は、細胞中における全脂肪酸の少なくとも２９％、少なくとも３０％または少なくとも３１％である。更なる一実施形態において、細胞中における全脂肪酸は、１％未満のＣ２０：１を有する。他の一実施形態において、細胞中における脂肪酸におけるＤＨＡの量は、細胞中における全脂肪酸の少なくとも３％、より好ましくは少なくとも４％、より好ましくは少なくとも５％もしくは少なくとも７％、または最も好ましくは少なくとも１０％である。好ましい実施形態において、細胞中における抽出可能なＴＡＧは、この段落において言及されるレベルの脂肪酸を含む。これらの特性の可能な各組合せも包含される。例えば、細胞中における脂肪酸におけるＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡの総計は、細胞中における全脂肪酸の少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも２９％、少なくとも３０％または少なくとも３１％を含むことができ、その内の細胞中における全脂肪酸の少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも７％または少なくとも１０％はＤＨＡであるが、Ｃ２０：１のレベルは１％未満であり得る。
【０３６４】
これらの実施形態の各々において、組換え細胞は、例えば、原核生物もしくは真核生物、例えば酵母であり得る単細胞微生物等、発酵のために適切である生物の細胞、または植物細胞であってよい。好ましい一実施形態において、細胞は、被子植物（高等植物）の細胞である。さらに好ましい一実施形態において、細胞は、種子、例えば、油料種子または穀粒もしくは穀物中における細胞である。
【０３６５】
組換え細胞中におけるＬＣ−ＰＵＦＡの産生のレベルは、変換比として、すなわち、１種または複数種の基質ＰＵＦＡまたはＬＣ−ＰＵＦＡの百分率として形成されるＬＣ−ＰＵＦＡの量としても表され得る。ＥＰＡに関して、例えば、これは、基質脂肪酸（ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴＡまたはＥＴｒＡ）のレベルに対するＥＰＡのレベルの比として（全脂肪酸における百分率として）表され得る。
【０３６６】
一実施形態においては、ＡＬＡからＥＰＡの変換のエフィセンシー（efficency）は、少なくとも８０％またはより好ましくは９０％である。他の一実施形態において、（ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡについての百分率の合計／ＡＬＡおよびＡＬＡ由来の全てのΔ６不飽和化脂肪酸産物についての百分率の合計として計算される）ＡＬＡからＥＰＡ、ＤＰＡまたはＤＨＡの変換の効率は、少なくとも１７．３％または少なくとも２３％である。他の一実施形態において、（ＤＰＡおよびＤＨＡについての百分率の合計／ＡＬＡおよびＡＬＡ由来の全てのΔ６不飽和化脂肪酸産物についての百分率の合計として計算される）ＡＬＡからＤＰＡまたはＤＨＡの変換の効率は、少なくとも１５．４％または少なくとも２１％である。他の一実施形態において、（ＤＨＡについての百分率／ＡＬＡおよびＡＬＡ由来の全てのΔ６不飽和化脂肪酸産物についての百分率の合計として計算される）ＡＬＡからＤＨＡの変換の効率は、少なくとも９．５％または少なくとも１０．８％である。他の一実施形態において、（ＤＨＡについての百分率／ＥＰＡおよびＥＰＡ由来の全てのΔ５伸長脂肪酸産物についての百分率の合計として計算される）ＥＰＡからＤＨＡの変換の効率は、少なくとも４５％または少なくとも５０％である。他の一実施形態において、（ＥＴＡおよびＥＴＡ由来のΔ５不飽和化脂肪酸産物についての百分率の合計／ＳＤＡおよびＳＤＡ由来の全てのΔ６伸長脂肪酸産物についての百分率の合計として計算される）ＥＴＡを産生するＳＤＡの変換の効率は、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％である。他の一実施形態において、ＥＴｒＡへのＡＬＡの変換の効率は、少なくとも６％、より好ましくは少なくとも９％である。他の一実施形態において、Δ５エロンガーゼステップによる（ＤＰＡおよびＤＨＡについての百分率の合計／ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡについての百分率の合計として計算される）ＤＰＡへのＥＰＡの変換のエフィセンシーは、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％または最も好ましくは少なくとも７５％である。
【０３６７】
外因的に産生されるかまたは提供される脂肪酸基質のレベルが最適であるように、遺伝子の導入のために使用される親細胞が選択される場合、組換え細胞中におけるＬＣ−ＰＵＦＡの含有率を最大にすることができる。ＬＣ−ＰＵＦＡのレベルは、例えば多価不飽和脂肪酸の蓄積を好むと考えられるその細胞についての標準温度より僅かに低い温度で、最適条件下で細胞を成長させるかまたはインキュベートすることによって、最大にすることもできる。しかし、特に、今日までの証拠は、酵母または植物中において非相同的に発現される幾つかのデサチュラーゼが、幾つかのエロンガーゼと組み合わせて相対的に低い活性を有することを示唆する。これは、ＬＣ−ＰＵＦＡ合成における基質として脂肪酸のアシル−ＣｏＡ形態を使用する能力を有するデサチュラーゼを提供することによって緩和され得、これは、植物細胞等の酵母以外の組換え細胞において有利であると考えられる。
【０３６８】
油の産生
本技術分野においてルーチン的に実践される技術を用いて、本発明の細胞、植物、種子等によって産生された油を抽出し、処理し、分析することができる。典型的には、植物種子を火にかけ、押圧し、抽出して、原油を産生し、次いでそれを脱ガムし、精製し、漂白し、消臭する。一般に、種子を破砕するための技術は、本技術分野において公知である。例えば、油料種子を、それらに水を噴霧することによって和らげて水分含有率を例えば８．５％に高め、０．２３から０．２７ｍｍのギャップ設定の平滑ローラを使用して薄片にすることができる。種子の型に応じて、破砕の前に水を加えなくてもよい。加熱は、酵素を不活性化させ、更なる細胞破壊を容易にし、油滴を合体させ、タンパク質粒子を凝集させ、それらの全ては、抽出プロセスを容易にする。
【０３６９】
種子油の大部分は、スクリュープレスの通過によって放出される。次いで、スクリュープレスから噴出したケーキを、熱追跡カラムを用いて、例えばヘキサンで溶媒抽出する。別の場合、押圧操作によって産生した原油を、溝付きワイヤドレナージトップを有する沈降タンクを通過させて、押圧操作の間に油とともに発現される固体を除去することができる。浄化油を、加圧式濾過器（plate and frame filter）を通過させて、あらゆる残留固体微粒子を除去することができる。所望により、抽出プロセスから回収した油を浄化油と組み合わせて混合原油を産生することができる。
【０３７０】
一旦溶媒を原油から取り除くと、押圧部分および抽出部分を組み合わせ、通常の油処理手法（すなわち、脱ガム、苛性精製、漂白および脱臭）に供する。原油に濃リン酸を加えることによって脱ガムを実施して、非水和性リン脂質を水和可能形態に変換させ、存在する微量の金属をキレート化させることができる。その油からガム質を遠心分離によって分離する。十分な量の水酸化ナトリウム溶液の添加によってその油を精製して、脂肪酸の全てを滴定し、従って形成された石鹸を除去することができる。
【０３７１】
その油を真空下で２６０℃に加熱し、約０．１ｍｌ／分／１００ｍｌ油の速度でその油中に蒸気をゆっくりと導入することによって、脱臭を行うことができる。散布の約３０分後、その油を真空下で冷却させる。その油を典型的にはガラス容器に移し、アルゴンで洗浄した後、冷凍下で貯蔵する。油の量が限定されている場合、油を、例えばＰａｒｒ反応器中において真空下で配置し、それを消臭した同じ長さの時間、２６０℃に加熱することができる。この処理は、油の色を改善し、揮発性物質の大部分を除去する。
【０３７２】
飼料
本発明は、飼料として使用され得る組成物を含む。本発明の目的のために、「飼料」としては、身体中に取り込まれる場合、（ａ）組織に栄養分を与えるかもしくは組織を増大させる、またはエネルギーを供給する役目をする、および／あるいは（ｂ）適切な栄養状態または代謝機能を維持する、回復させる、またはサポートする、（経腸および／もしくは非経口摂取を含む）ヒトまたは動物の摂取のためのあらゆる食品または調製物が挙げられる。本発明の飼料は、乳児および／または幼児のための栄養組成物を含む。
【０３７３】
本発明の飼料は、例えば、本発明の細胞、本発明の植物、本発明の植物部分、本発明の種子、本発明の抽出物、本発明の方法の産物、本発明の発酵プロセスの産物、または適切な担体（複数可）と共に組成物を含む。「担体」という用語は、栄養価を有してよいかまたは有さなくてもよいあらゆる成分を包含するようにその最も広い意味で用いられる。当業者である対象者が理解するように、担体は、それが飼料を摂取する生物に対する悪影響を及ぼさないように、飼料中における使用に適切でなければならない（または十分に低い濃度で使用されなければならない）。
【０３７４】
本発明の飼料は、方法の使用により直接的または間接的に産生された油、脂肪酸エステルまたは脂肪酸、本明細書において開示される細胞または植物を含む。組成物は、固体形態または液体形態のいずれかであってよい。さらに、組成物は、特定の使用のために望まれる量の食用の多量栄養素、ビタミンおよび／または無機質を含むことができる。これらの成分の量は、組成物が、通常の個体による使用のために意図されるのか、または特殊化した必要を有する個体、例えば代謝障害等を罹患している個体による使用のために意図されるのかによって変化する。
【０３７５】
栄養価を有する適切な担体の例としては、多量栄養素、例えば食用脂肪、炭水化物およびタンパク質が挙げられるが、これらに限定されるものではない。かかる食用脂肪の例としては、ヤシ油、ルリヂサ油、真菌性油、ブラックカレント油、ダイズ油、ならびにモノ−およびジグリセリドが挙げられるが、これらに限定されるものではない。かかる炭水化物の例としては（限定されないが）、グルコース、食用のラクトースおよび加水分解された探索物が挙げられる。さらに、本発明の栄養的組成物において利用され得るタンパク質の例としては（限定されないが）、ダイズタンパク質、電気透析された乳漿、電気透析された脱脂乳、乳清、またはこれらのタンパク質の加水分解物が挙げられる。
【０３７６】
ビタミンおよび無機質に関して、以下のものを本発明の飼料組成物に加えることができる。カルシウム、リン、カリウム、ナトリウム、クロリド、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、セレン、ヨウ素、ならびにビタミンＡ、Ｅ、Ｄ、Ｃ、およびＢ複合体。他のかかるビタミンおよび無機質を加えることもできる。
【０３７７】
本発明の飼料組成物において利用される成分は、半精製または精製されたものに由来し得る。半精製または精製されたものは、天然材料の精製によってまたはデノボ合成によって調製された材料を意味する。
【０３７８】
食事の補充が必要とされない場合でさえ、本発明の飼料組成物を食物に加えることもできる。例えば、組成物をあらゆる型の食物に加えることができ、その食物としては（限定されないが）、マーガリン、改質バター、チーズ、乳、ヨーグルト、チョコレート、キャンディ、スナック、サラダ油、料理油、料理脂肪、肉、魚および飲料が挙げられる。
【０３７９】
サッカロミセス属種は、ビールの醸造およびワイン製造の両方において使用され、特にパンを焼く際の薬剤としても使用される。酵母は、野菜の抽出物の主成分である。酵母は、動物飼料における添加剤としても使用される。本明細書において記載されるように、ＬＣ−ＰＵＦＡを合成するために適合させた、遺伝子操作された酵母株を提供することができることは、明らかである。次いで、これらの酵母株を、食材、ならびにワインおよびビール製造において使用して、増強した脂肪酸含有率を有する産物を提供することができる。
【０３８０】
さらに、本発明によって産生された脂肪酸、または対象遺伝子を含有し、発現するように形質転換された宿主細胞を、動物の組織または乳脂肪酸組成をヒトまたは動物の摂取のためにより望ましいものに改変させるために動物性食品補助剤として使用することもできる。かかる動物の例としては、ヒツジ、ウシ、ウマ等が挙げられる。
【０３８１】
さらに、本発明の飼料を、ヒトまたは動物の摂取のための魚における脂肪酸のレベルを増加させるために水産養殖において使用することができる。
【０３８２】
本発明の好ましい飼料は、ヒトまたは他の動物のための食物または餌として直接使用することができる植物、種子および他の植物部分（例えば葉および茎）である。例えば、動物は、野外において成長させたかかる植物を直接食べることができるか、または制御された給餌においてより多くの測定量を動物に給餌することができる。本発明は、ヒトおよび他の動物におけるＬＣ−ＰＵＦＡレベルを増加させるための餌としてのかかる植物および植物部分の使用を含む。
【０３８３】
組成物
本発明は、本発明の方法を用いて産生された脂肪酸および／または得られた油の内の１種または複数種を含む組成物、特に医薬組成物をも包含する。
【０３８４】
医薬組成物は、標準的な、周知の、無毒性の薬学的に許容される担体、アジュバントまたはビヒクル、例えば、リン酸緩衝食塩水、水、エタノール、ポリオール、植物油、湿潤剤またはエマルジョン（例えば、油中水型エマルジョン）と組み合わせて、脂肪酸および／または油の内の１種または複数種を含むことができる。組成物は、液体形態または固体形態のいずれかであってよい。例えば、組成物は、錠剤、カプセル剤、摂取可能な液体もしくは粉剤、注射剤または局所用軟膏もしくはクリームの形態であってよい。例えば、分散液の場合、必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、適切な流動性を維持することができる。等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウム等を含むことが望ましい場合もある。かかる不活性希釈剤の他に、組成物は、アジュバント、例えば、湿潤剤、乳化および懸濁化剤、甘味剤、着香剤および賦香剤を含むこともできる。
【０３８５】
懸濁剤は、活性化合物に加えて、懸濁化剤、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天およびトラガカントゴム、またはこれらの物質の混合物を含むことができる。
【０３８６】
錠剤およびカプセル剤等の固体剤形は、本技術分野において周知の技術を使用して調製され得る。例えば、本発明に従って産生された脂肪酸を、結合剤、例えば、アカシア、コーンスターチまたはゼラチン、崩壊剤、例えば、ジャガイモデンプンまたはアルギン酸、および潤滑剤、例えば、ステアリン酸またはステアリン酸マグネシウムと組み合わせて、従来の錠剤基剤、例えば、ラクトース、スクロースおよびコーンスターチによって錠剤にすることができる。カプセル剤は、抗酸化剤および関連の脂肪酸（複数可）と共にこれらの賦形剤をゼラチンカプセル中に組み込むことによって調製され得る。
【０３８７】
静脈内投与のために、本発明によって産生された脂肪酸またはそれらの誘導体を商業的製剤中に組み込むことができる。
【０３８８】
特定の脂肪酸の典型的な用量は、０．１ｍｇから２０ｇ（１日当たり１回から５回（１日最高１００ｇ）服用）、好ましくは１日約１０ｍｇから約１、２、５または１０ｇの範囲内（１回または多回投与において服用）である。本技術分野において知られているように、少なくとも約３００ｍｇ／日の脂肪酸（とりわけ、ＬＣ−ＰＵＦＡ）が望ましい。しかし、あらゆる量の脂肪酸が対象にとって有益であることはいうまでもない。
【０３８９】
本発明の医薬組成物の可能な投与経路としては、例えば、腸内（例えば、経口および直腸）および非経口が挙げられる。例えば、液体調製物を経口的にまたは直腸に投与することができる。さらに、均質の混合物を水中に完全に分散させ、生理学的に許容し得る希釈剤、保存剤、緩衝液または噴射剤と無菌条件下で混合して、噴霧剤または吸入剤を形成することができる。
【０３９０】
患者に投与すべき組成物の用量は、当業者によって決定され得、様々な因子、例えば、患者の体重、患者の年齢、患者の全体的健康、患者の既往歴、患者の免疫状態等に依存する。
【０３９１】
さらに、本発明の組成物は、化粧品の目的のために利用され得る。それを、混合物が形成されるように、または本主題発明に従って産生された脂肪酸が化粧品組成物中における唯一の「活性」成分として使用され得るように、既存の化粧品組成物に加えることができる。
実施例
【実施例１】
【０３９２】
材料と方法
微細藻類の培養
ＣＳＩＲＯのＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｒｉｎｅ．ｃｓｉｒｏ．ａｕ／ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ）から得られたミクロモナスＣＳ−０１７０およびピラミモナスＣＳ−０１４０分離株を標準的な培養条件下で培養した。コレクションから得られたストック培養物を継代培養し、１対１０希釈で１Ｌエルレンマイヤーフラスコに、続いて１０Ｌポリカーボネートカルボイに連続的に植え継いでスケールアップした。培地は、ＧｕｉｌｌａｒｄおよびＲｙｔｈｅｒ（１９６２）のｆ培地の栄養素を半分に薄めた修正培地であるｆ／２であり、生育温度は２０±１℃であった。他の培養条件として、１００μｍｏｌ．光子ＰＡＲ．ｍ−２．ｓ−１の光強度、１２：１２時間の明：暗光周期および空気中１％ＣＯ２、速度２００ｍＬ．Ｌ−１．ｍｉｎ−１の通気が挙げられた。
【０３９３】
微細藻類ゲノムＤＮＡの単離
ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉキットシステム（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ＃６９１０６）を添付の取扱説明書に記載の通り用いて、ミクロモナスＣＳ−０１７０およびピラミモナスＣＳ−０１４０からゲノムＤＮＡを単離した。
【０３９４】
微細藻類トータルＲＮＡの単離
次の方法を用いてミクロモナスＣＳ−０１７０およびピラミモナスＣＳ−０１４０細胞からトータルＲＮＡを単離した。２ｇ（湿重量）の細胞を乳鉢と乳棒を用いて液体窒素中で粉末化し、２２ｍＬの抽出バッファーが入ったビーカーを一定に攪拌しつつそこに徐々に振り入れた。そこに、５％不溶性ポリビニルピロリドン、９０ｍＭ  ２−メルカプトエタノールおよび１０ｍＭジチオスレイトールを添加し、Ｃｏｒｅｘ（商標）チューブに移す前に混合液をさらに１０分間攪拌した。１８．４ｍＬの３Ｍ酢酸アンモニウムを加え、十分に混合した。次に試料を６０００×ｇ、２０分間、４℃で遠心分離した。上清を新しいチューブに移し、０．１容量の３Ｍ  ＮａＡｃ（ｐＨ５．２）および０．５容量の冷イソプロパノールを加えることによって核酸を沈殿させた。−２０℃で１時間インキュベーションした後、試料を６０００×ｇで３０分間、スイングローターで遠心分離した。ペレットを１ｍＬの水に再懸濁し、フェノール／クロロホルムで抽出した。水層を新しいチューブに移し、０．１容量の３Ｍ  ＮａＡｃ（ｐＨ５．２）および２．５容量の氷冷エタノールを添加することによって核酸を再度沈殿させた。ペレットを水に再懸濁し、分光光度計により核酸濃度を決定した。
【０３９５】
ベクターおよび株
プラスミドｐＹＥＳ２および酵母株ＩＮＶＳＣ１はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから、プラスミドベクターｐＧＥＭＴ−ＥａｓｙはＰｒｏｍｅｇａから、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ−はＳｔｒａｔａｇｅｎｅから入手した。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株ＡＧＬ１は、Ｌａｚｏら（１９９１）により参照され、ｐＯＲＥバイナリーベクターシリーズはＣｏｕｔｕら（２００７）により参照されている。
【０３９６】
ＰＣＲ条件
他に特に断りがない限り、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ断片の増幅には標準的な条件を用いた。条件の最適化は、増幅サイクル数、プライマーのアニーリング温度、Ｍｇ２＋濃度および本技術分野で通常用いられている他のパラメータを変化させて行った。バッファーは、ポリメラーゼ供給元に指定された通りのものであった。通常、反応条件は次の通りである。９４℃、２〜３分間の最初の変性の後、反応液を２０〜４０サイクルの変性／アニーリング／伸長（９４℃、３０〜６０秒間の変性、４０〜６０℃、３０秒間のプライマーアニーリングおよび３０〜６０秒間、７０〜７２℃のポリメラーゼ伸長）、続いて３分間、７０〜７２℃の更なる伸長ステップで処理した。
【０３９７】
逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）増幅は通常、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、１０ｐｍｏｌのフォワードプライマーと３０ｐｍｏｌのリバースプライマー、最終濃度２．５ｍＭとなるＭｇＳＯ４、４００ｎｇのトータルＲＮＡならびにメーカーの取扱説明書に従ったバッファーおよびヌクレオチド成分を用いた２５μＬ容量で行った。通常の温度形態は、逆転写を行わせるための１サイクルの４５℃３０分間、その後１サイクルの９４℃２分間、続いて４０サイクルの９４℃３０秒間、５２℃３０秒間、７０℃１分間、次に１サイクルの７２℃２分間、その後反応液を５℃で冷却であった。
【０３９８】
５’および３’−ＲＡＣＥ
部分長遺伝子断片に対応する全長ｃＤＮＡを得るため、５’−および３’−ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ）法によりｃＤＮＡの５’および／または３’末端を得た。実施例に記されている遺伝子特異的フォワードプライマーおよび全３’−ＲＡＣＥ反応に共通のオリゴｄＴリバースプライマー、５’−ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶ−３’（配列番号４１）（配列中、ＶはＡ、ＧまたはＣのいずれかを表す）を用いて、ｃＤＮＡの３’末端を単離した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、１０ｐｍｏｌフォワードプライマーと３０ｐｍｏｌリバースプライマー、最終濃度２．５ｍＭとなるＭｇＳＯ４、ｃＤＮＡ合成の鋳型として４００ｎｇのトータルＲＮＡならびに供給元に指定された通りのバッファーおよびヌクレオチド成分を用いた２５μＬ容量でＲＴ−ＰＣＲ増幅を行った。サイクル条件は通常、逆転写のための１サイクルの４５℃３０分間、その後１サイクルの９４℃２分間、続いて４０サイクルの９４℃３０秒間、５２℃３０秒間、７０℃１分間、そして１サイクルの７２℃２分間、その後５℃で冷却であった。反応液中に生じた増幅産物をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙにライゲーションし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）にクローニングし、標準的な手法により配列解析した。
【０３９９】
他に特に断りがない限り、２μｇのトータルＲＮＡをｃＤＮＡ合成の鋳型として用いた修正ターミナルトランスフェラーゼ法によってｃＤＮＡの５’末端を単離した。１０ｐｍｏｌの遺伝子特異的リバースプライマーをトータルＲＮＡおよび１０．８μＬの水に加え、その後混合液を６５℃で５分間加熱し、２分間氷上で冷却した。続いて次の成分を添加した。すなわち、４μＬのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１μＬの０．１Ｍジチオスレイトール、１μＬのＲＮＡｓｅＯＵＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１μＬのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素であった。次に混合液を５５℃で６０分間インキュベートし、７０℃で１５分間さらにインキュベーションすることにより反応を止めた。短時間氷上で冷却した後、反応液を次に２ユニットのＲＮＡｓｅＨで３７℃、２０分間処理した。続いてＱＩＡＱＵＩＣＫ  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ＃２８１０６）を用いてｃＤＮＡを精製した。次に、１０ユニットのＴｄＴ（ＮＥＢ）、５μＬのＮＥＢバッファー＃４、５μＬの２．５ｍＭ  ＣｏＣｌ２、０．５μＬの１０ｍＭ  ｄＡＴＰを用いて、２５μＬの溶出液を合計５０μＬでＡテール付加した。３７℃で３０分間反応を行い、続いて７０℃、１０分間で酵素を不活性化した。次に、５μＬのＡテール付加ｃＤＮＡ、１０ｐｍｏｌの遺伝子特異的リバースプライマー、３０ｐｍｏｌの修飾オリゴｄＴプライマー、５’−ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶ−３’（配列番号４１）（配列中、ＶはＡ、ＧまたはＣのいずれかを表す）ならびに添付のマニュアルに記載されている通りのバッファーおよびヌクレオチド成分を含む反応混合液において、２．５ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いてＰＣＲ反応を行った。サイクル条件は通常、１サイクルの９４℃２分間；５サイクルの９４℃２０秒間、５４℃１分間、７２℃１分間；３０サイクルの９４℃２０秒間、６０℃３０秒間、７２℃１分間；１サイクルの７２℃５分間；４℃で維持であった。ゲル電気泳動の後に予想したサイズ範囲にはっきりとした産物バンドが見られない場合、その領域のゲルを切り出し、ＤＮＡ産物をゲルから精製した。溶出液を１：２０希釈した試料の１μＬをＰＣＲ第二ラウンドの鋳型として用いた。反応液に生じた増幅産物をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙにライゲーションし、配列解析した。
【０４００】
酵母の培養および前駆脂肪酸の摂取
熱ショックにより酵母にプラスミドを導入し、２％ラフィノースを唯一の炭素源として含む酵母最少培地（ＹＭＭ）プレート上で形質転換体を選抜した。クローン接種培養は、２％ラフィノースを唯一の炭素源として含む液体ＹＭＭにおいて確立した。これらから、ＹＭＭ＋１％ＮＰ−４０において初期ＯＤ６００が約０．３となるよう試験培養物を接種した。培養物を３０℃で振盪（約６０ｒｐｍ）しつつ、ＯＤ６００がほぼ１．０になるまで培養した。この時点で、ガラクトースを最終濃度２％になるよう添加し、前駆脂肪酸を最終濃度０．５ｍＭになるよう添加した。遠心分離により回収する前に、培養物を２０℃で振盪しつつさらに４８時間インキュベートした。細胞ペレットを１％ＮＰ−４０、０．５％ＮＰ−４０、そして水で洗浄し、取り込まれなかったあらゆる脂肪酸を細胞表面から除去した。
【０４０１】
一過性発現システムにおける植物細胞での遺伝子発現
Ｖｏｉｎｎｅｔら（２００３）によって本質的に記載されている通り、一過性発現システムにおいて植物細胞で遺伝子発現が行われた。３５Ｓプロモーター等、強力な構成プロモーターによって発現するコード領域を有するプラスミドを、アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＧＬ１に導入した。ｐ１９ウイルスサイレンシングサプレッサー発現のためのキメラ遺伝子３５Ｓ：ｐ１９をＡＧＬ１へ別個に導入した。組換え細胞は、２８℃で５０ｍｇ／ｍＬカナマイシンおよび５０ｍｇ／ｍＬリファンピシン添加ＬＢ培地において定常期なるよう培養した。次に、細菌を５０００ｇ、１５分間室温で遠心分離することによってペレット化し、その後ＯＤ６００＝１．０になるよう１０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５．７、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１００ｕＭアセトシリンゴンを含む浸潤バッファーに再懸濁した。次に細胞を２８℃で振盪しつつ３時間インキュベートし、その後等容量の３５Ｓ：ｐ１９および対象の試験キメラ遺伝子（複数可）を含むアグロバクテリウム培養物を混合し、続いて葉組織に浸潤（infiltration）した。浸潤後、通常植物体をさらに５日間生育し、その後脂肪酸のＧＣ分析のためにリーフディスクを採取した。
【０４０２】
葉組織に外因性脂肪酸を供給した場合、適切な脂肪酸を２Ｍ水酸化アンモニウム溶液中で２０分間６０℃加熱することによって脂肪酸を調製し、その後溶液を同様に６０℃で蒸発させた。その結果生じた塩を次に０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．２）に再懸濁し、最終濃度０．５μｇ／ｍＬとした。アグロバクテリウム浸潤の４日後に脂肪酸塩を葉に注入し、脂肪酸組成を分析するために摂取後様々な時点、例えば外因性脂肪酸の添加２〜４８時間後にリーフディスクを採取した。外因性脂肪酸が省略された対照、あるいは浸潤に用いたアグロバクテリウム株が対象遺伝子を含まない対照が含まれた。
【０４０３】
脂肪酸のガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析
脂肪酸の調製
ニコチアナ・ベンサミアナ（Nicotiana benthamiana）の葉試料その他の非種子組織等、試料が大量の水を含む場合、ＢｌｉｇｈおよびＤｙｅｒ（１９５９）によって記載された方法を用いて総脂質を抽出し、その後メチル化した。テフロンで裏打ちされたねじ蓋を取り付けたガラス製試験管においてＭｅＯＨ−ＣＨＣｌ３−ＨＣｌ（１０：１：１、ｖ／ｖ／ｖ）で９０〜１００℃、２時間加熱することにより、遠心分離した酵母ペレット、アラビドプシス（Arabidopsis）種子、ニコチアナ・ベンサミアナの総脂質または他の総脂質試料をエステル転移反応して脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を生成した。ＦＡＭＥをヘキサン−ジクロロメタン（４：１、ｖ／ｖ）に抽出し、ＧＣおよびＧＣ−ＭＳにより分析した。
【０４０４】
キャピラリーガス液体クロマトグラフィー（ＧＣ）
Ｅｑｕｉｔｙ（商標）−１融合シリカキャピラリーカラム（１５ｍ×０．１ｍｍ  ｉ．ｄ．、０．１μｍフィルム厚）、ＦＩＤ、スプリット／スプリットレスインジェクターならびにＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ７６８３Ｓｅｒｉｅｓオートサンプラーおよびインジェクターを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ６８９０Ｎ  ＧＣ（パロアルト、カリフォルニア州、米国）を用いて、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によりＦＡＭＥを分析した。ヘリウムをキャリアーガスとして用いた。オーブン温度１２０℃で試料をスプリットレスモードで注入した。注入後、オーブン温度を１０℃．ｍｉｎ−１で２７０℃に上げ、最後に５℃．ｍｉｎ−１で３１０℃に上げた。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウエア（Ｒｅｖ  Ｂ．０３．０１（３１７）、＼パロアルト、カリフォルニア州、米国）を用いてピークを定量化した。
【０４０５】
ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）
オンカラム注入セットを装着したＦｉｎｎｉｇａｎ  ＧＣＱ  Ｐｌｕｓ  ＧＣ−ＭＳイオントラップにおいて４℃でＧＣ−ＭＳを行った。ＡＳ２０００オートサンプラーを用いて、ＨＰ−５  Ｕｌｔｒａ  ２結合相カラム（５０ｍ×０．３２ｍｍ  ｉ．ｄ．×０．１７μｍフィルム厚）に取り付けた保持ギャップに試料を注入した。初期温度４５℃を１分間維持し、続いて、３０℃．ｍｉｎ−１で１４０℃に、次に３℃．ｍｉｎ−１で３１０℃とし、そこで１２分間維持した温度プログラミングを行った。ヘリウムをキャリアーガスとして用いた。質量分析器の操作条件は、電子衝突エネルギー７０ｅＶ、放出電流２５０μａｍｐ、トランスファライン３１０℃、ソース温度２４０℃、走査速度０．８ｓｃａｎｓ．ｓ−１および質量範囲４０〜６５０ダルトンであった。質量スペクトルを得て、Ｘｃａｌｉｂｕｒ（商標）ソフトウエアを用いて処理した。
【０４０６】
酵母の培養および前駆脂肪酸の摂取
熱ショックにより酵母にプラスミドを導入し、２％ラフィノースを唯一の炭素源として含む酵母最少培地（ＹＭＭ）プレートで形質転換体を選抜した。２％ラフィノースを唯一の炭素源として含む液体ＹＭＭでクローン接種培養を確立した。これらから、ＹＭＭ＋１％ＮＰ−４０において初期ＯＤ６００が約０．３となるよう試験培養物を接種した。培養物を３０℃で振盪（約６０ｒｐｍ）しつつ、ＯＤ６００がほぼ１．０になるまで培養した。この時点で、ガラクトースを最終濃度２％になるよう添加し、前駆脂肪酸を最終濃度０．５ｍＭになるよう添加した。遠心分離により回収する前に、培養物を２０℃で振盪しつつさらに４８時間インキュベートした。細胞ペレットを１％ＮＰ−４０、０．５％ＮＰ−４０、そして水で洗浄して、取り込まれなかったあらゆる脂肪酸を細胞表面から除去した。
【実施例２】
【０４０７】
微細藻類のΔ６−エロンガーゼをコードするｃＤＮＡの単離および特性評価
ミクロモナスＣＳ−０１７０Δ６−エロンガーゼの遺伝子断片の単離
ＣＳＩＲＯのＬｉｖｉｎｇ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭｉｃｒｏａｌｇａｅのミクロモナスＣＳ−０１７０株（国際公開第２００５／１０３２５３号パンフレット）を、高い天然レベルでΔ５−およびΔ６−伸長を有する微細藻類株として同定した（表４）。
【０４０８】
【表４】
0006068800.tif 000007
【０４０９】
保存配列を同定する試みにおいて、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＶ６７８００、ＡＢＣ１８３１４、ＣＡＤ５８５４０、ＣＡＬ５５４１４、ＡＡＶ６７７９７、ＸＰ＿００１４１６４５４、ＡＡＷ７０１５７、ＡＡＶ６７７９９、ＡＢＣ１８３１３、ＡＡＹ１５１３５から得られたエロンガーゼのアミノ酸配列を、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを用いて整列させた。様々な程度の同一性を有する多くの相同性領域の中で、共通アミノ酸配列ブロックＫＸＸＸＸＸＤＴ（配列番号３１）およびＭＹＸＹＹ（配列番号３２）（配列中、各Ｘはそれぞれ任意のアミノ酸である）を選択し、これらはＡＡＹ１５１３５のそれぞれアミノ酸位置１４４〜１５１および２０４〜２０８と対応する。これら２種のブロックの配列に基づき、ディジェネレートプライマー、５’−ＡＡＧＷＷＣＩＫＳＧＡＲＹＩＳＹＴＣＧＡＣＡＣ−３’（配列番号４２）および５’−ＡＩＩＭＩＲＴＡＲＴＡＳＧＴＧＴＡＣＡＴ−３’（配列番号４３）（配列中、Ｉ＝イノシン、Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｋ＝ＧまたはＴ、Ｍ＝ＡまたはＣ、Ｓ＝ＣまたはＧ）を合成した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、２０ｐｍｏｌの各プライマー、最終濃度２．５ｍＭとなるＭｇＳＯ４、２００ｎｇのミクロモナスＣＳ−０１７０トータルＲＮＡならびに記載されているバッファーおよびヌクレオチド成分を用いた５０μＬ容量で、ＲＴ−ＰＣＲ増幅を行った。サイクル条件は、最初に逆転写のための４８℃３０分間、次に１サイクルの９４℃２分間、続いて５サイクルの９４℃３０秒間、４０℃３０秒間、７０℃３０秒間、次に４０サイクルの９４℃３０秒間、４５℃３０秒間、７０℃３０秒間、そして７２℃２分間であった。２０９ｂｐの増幅産物を生成し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙにライゲーションして配列解析した。
【０４１０】
ミクロモナスＣＳ−０１７０Δ６−エロンガーゼをコードする全長ｃＤＮＡの単離
５’−および３’−ＲＡＣＥにより２０９ｂｐ断片を延長するためのプライマーを設計した。遺伝子特異的フォワードプライマー、５’−ＧＡＡＣＡＡＣＧＡＣＴＧＣＡＴＣＧＡＣＧＣ−３’（配列番号４４）および２００ｎｇのミクロモナスＣＳ−０１７０トータルＲＮＡを用いて、実施例１に記載されている通りに遺伝子の３’末端を単離した。４５４ｂｐ増幅産物を生成し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙにライゲーションして配列解析した。ＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃Ｌ１５００−０１）を用いて、添付のマニュアルに記載されている通りに５５℃で１時間逆転写インキュベーションして５’−アダプター付加ｃＤＮＡを生成し、遺伝子の５’末端を単離した。ＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’プライマー、５’−ＣＧＡＣＴＧＧＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＡ−３’（配列番号４５）および遺伝子特異的リバースプライマー、５’−ＴＴＧＣＧＣＡＧＣＡＣＣＡＴＡＡＡＧＡＣＧＧＴ−３’（配列番号４６）は、１０ｐｍｏｌの各プライマー、１μｌのＧｅｎｅＲａｃｅｒ  ｃＤＮＡ鋳型ならびにメーカーの記載通りのバッファーおよびヌクレオチド成分を用いた５０μＬ容量で、ＰＦＵ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ増幅に用いた（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ＃６００６７０）。サイクル条件は、１サイクルの９４℃２分間；３５サイクルの９４℃２０秒間、５５℃３０秒間、７２℃３０秒間；次に７２℃２分間、その後４℃で冷却であった。次にこの産物を１：１０希釈し、その１μｌを、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ネステッドプライマー、５’−ＧＧＡＣＡＣＴＧＡＣＡＴＧＧＡＣＴＧＡＡＧＧＡＧＴＡ−３’（配列番号４７）および遺伝子特異的リバースプライマー、５’−ＴＴＧＣＧＣＡＧＣＡＣＣＡＴＡＡＡＧＡＣＧＧＴ−３’（配列番号４６）を用いた、第一ラウンドの増幅と同じＰＣＲ条件による第二ラウンドのＰＣＲの鋳型として用いた。５２２ｂｐ増幅産物を生成し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙにライゲーションして配列解析した。
【０４１１】
３種の増幅産物のヌクレオチド配列を、全長配列であると予測される一配列に組み立てた。次に、ミクロモナス株ＣＳ−０１７０由来のゲノムＤＮＡから、フォワードプライマー、５’−ＣＡＧＧＣＧＡＣＧＣＧＣＧＣＣＡＧＡＧＴＣＣ−３’（配列番号４８）、リバースプライマー、５’−ＴＴＡＴＴＡＧＴＴＡＣＴＴＧＧＣＣＴＴＴＡＣＣＴＴＣ−３’（配列番号４９）およびＰＦＵ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、５’ＵＴＲの短い領域を有する全長コード領域を増幅した。８６０ｂｐ増幅産物を生成し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙにライゲーションして配列解析した。遺伝子のオープンリーディングフレームの配列は、配列番号１の配列を有することが示された。
【０４１２】
この遺伝子にコードされた全長アミノ酸配列を配列番号２として示す。タンパク質配列のＢＬＡＳＴ解析は、単離ｃＤＮＡがΔ５−またはΔ６−エロンガーゼのいずれかをコードすることを明らかにした。これら２種類のエロンガーゼは、アミノ酸レベルで類似しており、どの活性がコードされているかアミノ酸配列だけでは明確ではなかった。ＢＬＡＳＴＰによるＧｅｎｂａｎｋタンパク質配列データベースへの問い合わせ配列として用いた場合、ミクロモナスＣＳ−０１７０エロンガーゼと他のエロンガーゼとの間の最大級の同一性は、オストレオコッカス・タウリ多価不飽和脂肪酸エロンガーゼ２の配列である受託番号ＣＡＬ５５４１４との６５％であった。保存ＧＮＳ１／ＳＵＲ４ファミリードメイン（ＮＣＢＩ保存ドメインｐｆａｍ０１１５１）がこの配列中のアミノ酸４９〜２７４に示されたが、これは通常、このタンパク質が長鎖脂肪酸の伸長システムに関与することを示す。
【０４１３】
元々のディジェネレートプライマーの設計に用いた配列等、ミクロモナスＣＳ−０１７０エロンガーゼに類似した配列の複数アライメントに基づく配列相関樹を図３に示す。
【０４１４】
酵母におけるミクロモナスＣＳ−０１７０Δ６−エロンガーゼ機能特性評価
ｐＧＥＭ−Ｔ  ＥａｓｙのＳａｌＩ／ＳｐｈＩ断片内に含まれているこのクローンのタンパク質コード領域全体をｐＹＥＳ２のＸｈｏＩ／ＳｐｈＩ部位に挿入し、酵母における導入および機能特性評価のためのベクターｐＹＥＳ２＋ＭｉｃＥｌｏ１を作製した。酵母株ＩＮＶＳＣ１の細胞をｐＹＥＳ２＋ＭｉｃＥｌｏ１で形質転換し、ウラシルを含まない培地上で形質転換体を選抜した。ｐＹＥＳ２＋ＭｉｃＥｌｏ１を有する酵母細胞を培地で培養し、ＭｉｃＥｌｏ１遺伝子発現のためガラクトースによりＧＡＬプロモーターを誘導した。培地にＡＬＡ、ＳＤＡまたはＥＰＡ（０．５ｍＭ）を添加して３０℃で４８時間さらに培養した後、総細胞脂質における脂肪酸を分析した。ＡＬＡを培地に添加した場合、酵母形質転換体の細胞脂質におけるＥＴｒＡの存在は総脂肪酸の０．２％として検出され、これは低いが測定可能な０．４％変換効率を表した。同様に、ＳＤＡを培地に添加した場合、酵母形質転換体の細胞脂質におけるＥＴＡの存在は０．２％として検出され、これは０．４％の変換効率を表し、低レベルのΔ６−エロンガーゼ活性を示唆した。しかし、ＥＰＡを培地に添加した場合、酵母形質転換体の細胞脂質におけるＤＰＡの存在は検出されず、これは酵母細胞におけるΔ５−エロンガーゼ活性の欠如を示唆した（表５）。
【０４１５】
【表５】
0006068800.tif 000008
【０４１６】
ピラミモナスＣＳ−０１４０Δ６−エロンガーゼの単離および特性評価
ピラミモナスＣＳ−０１４０Δ６−エロンガーゼ遺伝子断片の単離
ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢＯ９４７４７、ＣＡＩ５８８９７、ＣＡＪ３０８６９、ＣＡＬ２３３３９およびＡＡＶ６７７９７から得られたエロンガーゼのアミノ酸配列のアライメントから、ＡＡＶ６７７９７のそれぞれアミノ酸位置１４３〜１５０および１９９〜２０５に対応する、共通アミノ酸配列ブロックＫＩＹＥＦＶＤＴ（配列番号３３）およびＶＨＶＣＭＹＴ（配列番号３４）が同定された。これら２種のブロックの配列に基づいて、ディジェネレートプライマー、５’−ＡＡＲＡＴＭＴＡＹＧＡＧＴＴＹＧＴＩＧＡＴＡＣ−３’（配列番号５０）および５’−ＴＡＩＧＴＧＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡＣＲＴＧＷＡＣＣＣ−３’（配列番号５１）（略語は上に同じ）を合成した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲシステムと１００ｎｇのピラミモナスＣＳ−０１４０トータルＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲ増幅を行った。１９１ｂｐ増幅産物を生成し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙにライゲーションして配列解析した。
【０４１７】
全長ピラミモナスＣＳ−０１４０Δ６−エロンガーゼ遺伝子の単離
５’−および３’−ＲＡＣＥにより１９１ｂｐ断片を伸長するためのプライマーを設計した。実施例１に記載されている通り、遺伝子特異的フォワードプライマー、５’−ＴＴＣＧＴＧＧＡＴＡＣＧＴＴＣＡＴＣＡＴＧＣ−３’（配列番号５２）を用いて、遺伝子の３’末端を単離した。９４５ｂｐ増幅産物を生成し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙにライゲーションして配列解析した。１μｇのピラミモナスＣＳ−０１４０トータルＲＮＡから、ＧｅｎｅＲａｃｅｒキットを用いて添付のマニュアルに記載されている通り、５５℃、１時間の逆転写インキュベーションを行い５’−アダプター付加ｃＤＮＡを作製し、遺伝子の５’末端を単離した。ＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’プライマーおよび遺伝子特異的リバースプライマー、５’−ＡＧＴＴＧＡＧＣＧＣＣＧＣＣＧＡＧＡＡＧＴＡＣ−３’（配列番号５３）を、ＰＦＵ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ増幅に用いた。次にこの産物を１：１０に希釈し、その１μｌを、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ネステッドプライマー、５’−ＧＧＡＣＡＣＴＧＡＣＡＴＧＧＡＣＴＧＡＡＧＧＡＧＴＡ−３’（配列番号４７）および遺伝子特異的リバースプライマー、５’−ＡＣＣＴＧＧＴＴＧＡＣＧＴＴＧＣＣＣＴＴＣＡ−３’（配列番号５４）を用いた、第一ラウンドの増幅と同じＰＣＲ条件による第二ラウンドのＰＣＲの鋳型として用いた。７４３ｂｐ増幅産物を生成し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙにライゲーションして配列解析した。次に、３種の部分配列を１本の予測全長配列に組み立てた。
【０４１８】
続いてＲＴ−ＰＣＲにより、トータルＲＮＡから、５’ＵＴＲの短い領域を有する全長コード領域を増幅した。フォワードプライマー、５’−ＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＴＣＧＣＴＣＡＧＣＣＴ−３’（配列番号５５）およびリバースプライマー、５’−ＴＴＡＣＴＡＣＴＧＣＴＴＣＴＴＧＣＴＧＧＣＣＡＧＣＴ−３’（配列番号５６）を１００ｎｇのピラミモナスＣＳ−０１４０トータルＲＮＡと共に用いた。生成した９００ｂｐ増幅産物をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙにライゲーションして配列解析した。増幅産物のオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列に配列番号３を付与し、コードされているタンパク質のアミノ酸配列に配列番号４を付与する。
【０４１９】
ＢＬＡＳＴ解析は、配列番号４として示されている全長アミノ酸配列が他のΔ５−およびΔ６−エロンガーゼと類似性を有することを示した。ピラミモナスＣＳ−０１４０エロンガーゼと他のタンパク質との間の最大級の同一性（ＢＬＡＳＴＸ）は、オストレオコッカス・タウリ多価不飽和脂肪酸エロンガーゼ１であるＡＡＶ６７７９７との５４％であった。元々のディジェネレートプライマーの設計に用いた配列等、ピラミモナスＣＳ−０１４０エロンガーゼと類似した配列の複数のアライメントに基づく配列相関樹を図４に示す。保存ＧＮＳ１／ＳＵＲ４ファミリードメイン（ＮＣＢＩ保存ドメインｐｆａｍ０１１５１）はこの配列中のアミノ酸５２〜２９７に示され、これは通常、このタンパク質が長鎖脂肪酸伸長システムに関与することを示す。
【０４２０】
酵母におけるピラミモナスＣＳ−０１４０Δ６−エロンガーゼの機能特性評価
ｐＧＥＭ−Ｔ  ＥａｓｙのＥｃｏＲＩ断片内に含まれているこのクローンのタンパク質コード領域全体をｐＹＥＳ２のＥｃｏＲＩ部位に挿入し、酵母における導入および機能特性評価のためのベクターｐＹＥＳ２＋Ｐｙｒｃｏ−Ｅｌｏ１を作製した。酵母株ＩＮＶＳＣ１の細胞をｐＹＥＳ２＋Ｐｙｒｃｏ−Ｅｌｏ１で形質転換し、ウラシルを含まない培地上で形質転換体を選抜した。ｐＹＥＳ２＋Ｐｙｒｃｏ−Ｅｌｏ１を含む酵母細胞を培地で培養し、次にガラクトースによりＰｙｒｃｏ−Ｅｌｏ１  ｃＤＮＡを発現するよう誘導した。培地に脂肪酸を最終濃度０．５ｍＭになるよう添加し、３０℃で４８時間さらに培養し、その後、総細胞脂質における脂肪酸を分析した。ＡＬＡを培地に添加した場合、酵母形質転換体の細胞脂質におけるＥＴｒＡの存在は総脂肪酸の５．３％として検出され、これは９．３％の変換効率（Δ９−エロンガーゼ活性）を示した。ＳＤＡを培地に添加した場合、酵母形質転換体の細胞脂質におけるＥＴＡの存在は３４．１％として検出され、これは６５．６％の変換効率であり、高レベルのΔ６−エロンガーゼ活性を示した。しかし、ＥＰＡを培地に添加した場合、酵母形質転換体の細胞脂質にＤＰＡの存在は検出されず（表５）、これはｃＤＮＡが、酵母細胞において多少のΔ９−エロンガーゼ活性を有するがΔ５−エロンガーゼ活性はないΔ６−エロンガーゼ活性をコードしたことを示した。
【０４２１】
２種のΔ６−エロンガーゼ遺伝子に対する上述のデータは、ピラミモナス由来の遺伝子が、ミクロモナス由来の遺伝子より一層活性のある酵素をコードすることを示した。この結果は予想外であった。ミクロモナスのゲノムＤＮＡから増幅されたコード領域が突然変異を含む、あるいはコード領域が不完全であった可能性は除外されない。
【実施例３】
【０４２２】
微細藻類由来のΔ５−エロンガーゼをコードするｃＤＮＡの単離および特性評価
ピラミモナスＣＳ−０１４０Δ５−エロンガーゼ遺伝子断片の単離
ＣＳＩＲＯのＬｉｖｉｎｇ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭｉｃｒｏａｌｇａｅにおけるピラミモナスＣＳ−０１４０株を高い天然レベルのΔ５−およびΔ６−伸長を有する微細藻類株として同定した（表４）。
【０４２３】
ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＶ６７７９８およびＡＢＯ９８０８４由来のエロンガーゼアミノ酸配列のアライメント作成を行った。多くのマッチング配列から、ＡＡＶ６７７９８のそれぞれアミノ酸位置１３６〜１４２および１９８〜２０２に対応する共通アミノ酸配列ブロックＹＬＥＬＬＤＴ（配列番号３５）およびＭＹＳＹＹ（配列番号３６）が選択された。これら２種のブロックの配列に基づき、ディジェネレートプライマー、５’−ＡＲＴＡＹＹＴＳＧＡＲＹＴＲＹＴＧＧＡＹＡＣ−３’（配列番号５７）および５’−ＣＡＴＫＡＲＲＴＡＲＴＡＳＧＡＧＴＡＣＡＴ−３’（配列番号５８）（略語は上に同じ）を合成した。実施例１に記載されている通り、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲシステムを用いてＲＴ−ＰＣＲ増幅を行った。続いて、この反応液の０．５μｌを、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）および同一プライマーを用いた第二ラウンドのＰＣＲにおける鋳型として用いた。２００ｂｐ増幅産物を生成し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙにライゲーションして配列解析した。
【０４２４】
全長ピラミモナスＣＳ−０１４０Δ５−エロンガーゼ遺伝子の単離
５’−および３’−ＲＡＣＥにより２００ｂｐ断片を延長するためのプライマーを設計した。実施例１の通り、遺伝子特異的フォワードプライマー、５’−ＣＡＴＣＡＴＡＣＣＣＴＧＴＴＧＡＴＣＴＧＧＴＣ−３’（配列番号５９）およびオリゴｄＴリバースプライマーを用いて遺伝子の３’末端を単離した。４０８ｂｐ増幅産物を生成し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にライゲーションして配列解析した。１μｇのピラミモナスＣＳ−０１４０トータルＲＮＡから、ＧｅｎｅＲａｃｅｒキットを用い、添付のマニュアルに記載の通り５５℃で１時間逆転写インキュベーションして、５’アダプター付加ｃＤＮＡを作製して遺伝子の５’末端を単離した。遺伝子特異的リバースプライマー、５’−ＣＣＡＧＡＴＣＡＡＣＡＧＧＧＴＡＴＧＡＴＧＧＴ−３’（配列番号６０）を、ＰＦＵ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼをメーカーの記載通りに用いたＰＣＲ増幅に用いた。次に、この産物を１：１０希釈し、その１μｌを、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ネステッドプライマー、５’−ＧＧＡＣＡＣＴＧＡＣＡＴＧＧＡＣＴＧＡＡＧＧＡＧＴＡ−３’（配列番号４７）および遺伝子特異的リバースプライマー、５’−ＣＧＡＡＡＧＣＴＧＧＴＣＡＡＡＣＴＴＣＴＴＧＣＧＣＡＴ−３’（配列番号６１）を用いた第二ラウンドのＰＣＲにおける鋳型として用いた。５１４ｂｐ増幅産物を生成し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にライゲーションして配列解析した。３種の部分配列から全長配列を組み立てた。
【０４２５】
次に、ＲＴ−ＰＣＲにより、トータルＲＮＡから５’ＵＴＲの短い領域を有する全長コード領域を増幅した。フォワードプライマー、５’−ＡＡＣＡＴＧＧＣＧＴＣＴＡＴＴＧＣＧＡＴＴＣＣＧＧＣＴ−３’（配列番号６２）およびリバースプライマー、５’−ＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＴＴＣＴＴＧＧＣＡＣＣＣＴＴＧＣＴ−３’（配列番号６３）を、実施例１に記載されている通りＲＴ−ＰＣＲ増幅に用いた。８１０ｂｐ増幅産物を生成し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙにライゲーションして配列解析した。インサートのオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列を配列番号５とし、ｃＤＮＡにコードされた予測アミノ酸配列は配列番号６として表す。
【０４２６】
ＢＬＡＳＴ解析は、全長アミノ酸配列が他のΔ５−およびΔ６−エロンガーゼと相同性を有することを示した。ＢＬＡＳＴＰ解析は、ピラミモナスＣＳ−０１４０エロンガーゼとＧｅｎｂａｎｋデータベースにおける他のタンパク質との間の最大級の同一性が、パブロバ・ビリジスＣ２０エロンガーゼに対応する受託番号ＡＢＲ６７６９０との４６％であること示した。元々のディジェネレートプライマーの設計に用いた配列等、ピラミモナスＣＳ−０１４０エロンガーゼと類似した配列の複数のアライメントに基づく配列相関樹を図５に示す。
【０４２７】
酵母におけるピラミモナスＣＳ−０１４０Δ５−エロンガーゼの機能特性評価
ｐＧＥＭ−Ｔ  ＥａｓｙにおけるｃＤＮＡのＥｃｏＲＩ断片内に含まれているこのクローンのタンパク質コード領域全体をｐＹＥＳ２のＥｃｏＲＩ部位に挿入し、酵母における導入および機能特性評価のためのｐＹＥＳ２＋Ｐｙｒｃｏ−Ｅｌｏ２を作製した。酵母株ＩＮＶＳＣ１の細胞をｐＹＥＳ２＋Ｐｙｒｃｏ−Ｅｌｏ２で形質転換し、ウラシルを含まない培地上で形質転換体を選抜した。ｐＹＥＳ２＋Ｐｙｒｃｏ−Ｅｌｏ２を含む酵母細胞を培地で培養し、続いてガラクトースにより誘導してｃＤＮＡを発現させた。脂肪酸を培地に添加して３０℃でさらに４８時間培養した後、細胞脂質における脂肪酸を分析した。ＡＬＡを培地に添加した場合、酵母形質転換体の細胞脂質におけるＥＴｒＡの存在は総脂肪酸の０．３％として検出され、これは０．５％変換効率（Δ９−エロンガーゼ活性）を示した。ＳＤＡを培地に添加した場合、酵母形質転換体の細胞脂質におけるＥＴＡの存在は０．７％として検出され、これは１．３％変換効率（Δ６−エロンガーゼ活性）を示した。ＥＰＡを培地に添加した場合、酵母形質転換体の細胞脂質におけるＤＰＡの存在は１．８％として検出され、これは驚くほど高い７５％の変換効率を示し、酵母細胞における強力なΔ５−エロンガーゼ活性を表した（表６）。
【０４２８】
本発明者らは、組換え細胞におけるこのようなＥＰＡからＤＰＡへの効率的な変換が、これまでに報告されたことがないことを確信する。この酵素の植物体における変換効率は、同様に高いであろうことが推測される。保存ＧＮＳ１／ＳＵＲ４ファミリードメイン（ＮＣＢＩ保存ドメインｐｆａｍ０１１５１）は、この配列中のアミノ酸５０〜２６７に示され、これは通常、タンパク質が長鎖脂肪酸伸長システムに関与することを示唆する。
【０４２９】
【表６】
0006068800.tif 000009
【実施例４】
【０４３０】
微細藻類由来のΔ６−デサチュラーゼをコードする遺伝子の単離および特性評価
全長ミクロモナスＣＣＭＰ１５４５Δ６−デサチュラーゼ遺伝子の合成
オストレオコッカス・タウリΔ６−デサチュラーゼのアミノ酸配列であるＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＷ７０１５９を問い合わせ配列として用いて、米国エネルギー省共同ゲノム研究所（US Department of Energy Joint Genome Institute）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｇｉ．ｄｏｅ．ｇｏｖ／）により作成されたミクロモナスＣＣＭＰ１５４５選別タンパク質モデルゲノム配列を、ＢＬＡＳＴＰプログラムを用いて解析した。この解析は、ミクロモナスＣＣＭＰ１５４５におけるＡＡＷ７０１５９と相同性を有する予測タンパク質の存在を明らかにした。ミクロモナスＣＣＭＰ１５４５の予測タンパク質配列を用いて、ブラッシカ・ナパス（Brassica napus）等、双子葉植物における発現に最も適したコドンに最適化されたヌクレオチド配列を設計し、合成した。タンパク質コード領域のヌクレオチド配列に配列番号７を付与した。プラスミド構築物はｐＧＡ４と命名した。アミノ酸配列を配列番号８として示す。
【０４３１】
ミクロモナスＣＣＭＰ１５４５デサチュラーゼのアミノ酸配列である配列番号８をＧｅｎｂａｎｋデータベースの他のタンパク質に対する問い合わせ配列として用いたＢＬＡＳＴＰ解析は、タンパク質がΔ６−デサチュラーゼと相同性を有することを示した。最大級の同一性は、オストレオコッカス・タウリのΔ６−デサチュラーゼ配列である受託番号ＡＡＷ７０１５９のアミノ酸配列との全長にわたる６６％であった。ミクロモナスＣＣＭＰ１５４５デサチュラーゼに類似した配列の複数アライメントに基づく配列相関樹を図６に示す。このフロントエンドデサチュラーゼは、アミノ酸５４〜１０４にチトクロムｂ５ドメイン（ＮＣＢＩ保存ドメインｐｆａｍ００１７３）を、アミノ酸１７２〜４２８にΔ６−ＦＡＤＳ−様保存ドメイン（ＮＣＢＩ保存ドメインｃｄ０３５０６）を含む。フロントエンドデサチュラーゼを暗示する３個のヒスチジンボックスは、配列中のそれぞれ１９０〜１９５、２２７〜２３２および４０１〜４０５に存在する。これらドメインの両方を含むタンパク質は通常、高度な不飽和脂肪酸の合成に必要とされるフロントエンドデサチュラーゼである。興味深いことに、このデサチュラーゼは、現在までに刊行発表された唯一の生化学的に確認された植物様アシルＣｏＡデサチュラーゼであるＡＡＷ７０１５９近傍にクラスター形成する。
【０４３２】
酵母細胞におけるミクロモナスＣＣＭＰ１５４５Δ６−デサチュラーゼの機能特性評価
プラスミドｐＧＡ４から得られたＫｐｎＩ−ＳａｃＩ断片内に含まれているミクロモナスデサチュラーゼのコード領域全体を酵母ベクターｐＹＥＳ２のＫｐｎＩ−ＳａｃＩ部位に挿入し、酵母における導入および機能特性評価のためのｐＹＥＳ２＋Ｍｉｃｄ６Ｄを作製した。酵母株ＩＮＶＳＣ１の細胞をｐＹＥＳ２＋Ｍｉｃｄ６Ｄで形質転換し、ウラシルを含まない培地上で形質転換体を選抜した。ｐＹＥＳ２＋Ｍｉｃｄ６Ｄを含む酵母細胞を培地で培養し、次にガラクトースにより誘導した。０．５ｍＭ  ＬＡ、ＡＬＡ、ＥＴｒＡ、ＤＧＬＡまたはＥＴＡを培地に添加し、３０℃、４８時間さらに培養した後、総細胞脂質における脂肪酸を分析した。ＬＡを培地に添加した場合、酵母形質転換体の細胞脂質におけるＧＬＡの存在は、総脂肪酸の３．９％として検出され、これは１１．４％のΔ６−脱飽和変換効率を示した。ＡＬＡを培地に添加した場合、酵母形質転換体の細胞脂質におけるＳＤＡの存在は総脂肪酸の１３．９％として検出され、これは３９．０％のΔ６−脱飽和変換効率を示した。すなわち、ω３脂肪酸基質の変換効率は、対応するω６脂肪酸基質の３．５倍高かった。ＥＴｒＡを培地に添加した場合、酵母形質転換体の細胞脂質におけるＥＴＡの存在は総脂肪酸の０．２１％として検出され、これは８．０％のΔ８−脱飽和変換効率を示した。しかし、ＤＧＬＡかＥＴＡのいずれかを培地に添加した場合、それぞれＡＲＡまたはＥＰＡの存在は検出されなかった。この結果は、Δ５−脱飽和活性が全くないことを示した（表７）。
【０４３３】
【表７】
0006068800.tif 000010
【０４３４】
植物細胞におけるミクロモナスＣＣＭＰ１５４５Δ６−デサチュラーゼの機能特性評価
本明細書において陽性対照試料として用いられているミクロモナスＣＣＭＰ１５４５Δ６−デサチュラーゼ（Ｍｉｃ１５４５−ｄ６Ｄ）およびエキウム・プランタギネウムΔ６−デサチュラーゼ（Ｅｃｈｐｌ−ｄ６Ｄ；Ｚｈｏｕら、２００６）の酵素活性が、実施例１に記載されている増強ニコチアナ・ベンサミアナ一過性発現システムを用いて植物体で示された。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理して末端を平滑化した後、３５Ｓプロモーターを含むＰｓｔＩ断片をベクターｐＯＲＥ０４のＳｆｏＩ部位に挿入することによって、３５Ｓ−ｐＯＲＥ０４と命名されたベクターを作製した（Ｃｏｕｔｕら、２００７）。ＳｗａＩ断片内に含まれるｐＧＡ４のコード領域全体を３５Ｓ−ｐＯＲＥ０４のＳｍａＩ−ＥｃｏＲＶ部位に挿入してｐＪＰ２０６４を作製することによって、遺伝的構築物３５Ｓ：Ｍｉｃ１５４５−ｄ６Ｄを構築した。
【０４３５】
これらキメラベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＧＬ１に導入し、これらの培養物から得られた細胞を温室内のニコチアナ・ベンサミアナ植物体の葉組織に浸潤させた。浸潤後、植物体をさらに５日間生育させ、その後ＧＣ分析のためにリーフディスクを採取して、ニコチアナ・ベンサミアナにおいて両方の遺伝子がΔ６−デサチュラーゼとして機能することを明らかにした。
【０４３６】
エキウム・プランタギネウムΔ６−デサチュラーゼを形質転換した葉組織は、ＧＬＡ（０．４％）およびＳＤＡ（１．２％）を含んでおり、それぞれ３．８％および４．４％の変換効率を示した。ミクロモナスＣＣＭＰ１５４５Δ６−デサチュラーゼで形質転換した葉組織は、ＳＤＡ（２．２％）を含んでおり、６．９％の変換効率を示したがＧＬＡは検出されなかった。葉組織におけるＧＬＡの不在は、植物体におけるω６基質ＬＡと比べてω３基質ＡＬＡに対する非常に高い選択性、あるいは一部には、Δ６−脱飽和によって生成されたＧＬＡの一部をＳＤＡに変換し得る天然のニコチアナ・ベンサミアナω３デサチュラーゼ活性の存在に起因する可能性がある。このような効果は、ω３基質選択性を有するアシルＰＣΔ６−デサチュラーゼについて記載した以前の実験（Ｓａｙａｎｏｖａら、２００６）において可能性として注目されてきたが、このことが生じる範囲はその研究では定量化されていなかった。
【０４３７】
ミクロモナスΔ６−デサチュラーゼのオメガ−３基質選択性
ミクロモナスから単離されたΔ６−デサチュラーゼは、酵母と同様に植物体におけるω３基質に対して驚くほど高い選択性を有した。酵母細胞で発現した酵素は、対応するω６−脱飽和脂肪酸基質よりもω３−脱飽和脂肪酸基質に３．５倍高い活性を有することが観察された。観察されたω３基質に対する選択性は、Ｏ．タウリ酵素に対する選択性の欠如に関する報告（Ｄｏｍｅｒｇｕｅら、２００５）に基づいた場合、全く驚くべきことであり予期せぬことであった。酵母または植物種子におけるＯ．タウリΔ６−デサチュラーゼの発現に関する報告は、ＬＡおよびＡＬＡにおける同様の活性を示した。
【０４３８】
従って、植物体における組換えＶＬＣ−ＰＵＦＡ経路の一部としての他の脂肪酸デサチュラーゼおよびエロンガーゼと併用した、ω３−脱飽和脂肪酸基質に対してこのように高い特異性を有するこの遺伝子または他の遺伝子の使用は、ω３−脱飽和基質に対する選択性を持たないデサチュラーゼの使用と比べてＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡレベルを増加させることが予想された。このような増加は、真菌または酵母のΔ１７−デサチュラーゼによって植物体においてはそのω３対応物質に効率的に変換されない、ＬＡのＧＬＡへの、そして続くω６ＰＵＦＡ  ＤＧＬＡおよびＡＲＡへの変換が低減した結果生じることが予想された。ω３脂肪酸基質に対して選択性を有するΔ６−デサチュラーゼが単離されたが（Ｓａｙａｎｏｖａら、２００３）、これはリン脂質結合アシル鎖に活性を持っていた。対照的に、ミクロモナスから得られたデサチュラーゼは、アシルＣｏＡ基質に活性を持つことが予想される。
【０４３９】
ミクロモナスＣＣＭＰ１５４５Δ６−デサチュラーゼの二重Δ６／Δ８機能
検出可能なΔ８−デサチュラーゼ活性を持たないオストレオコッカス・ルシマリヌス酵素とは対照的に、ミクロモナスＣＣＭＰ１５４５Δ６−デサチュラーゼが顕著なレベルのΔ８−デサチュラーゼ活性を提示し、従って顕著な二重活性を持っていたことを興味深く記す（後述）。二重デサチュラーゼ活性は、植物体における二重Δ６／Δ８−デサチュラーゼ経路の構築に、あるいはこのような経路の構築に用いられるエロンガーゼがΔ９−エロンガーゼおよびΔ６−エロンガーゼ活性の両方を有する場合、有用となることが予想される。このような遺伝子の使用は、ＥＴｒＡをＥＴＡに変換し、その後ＥＰＡにΔ５−脱飽和させることにより、ＥＴｒＡ蓄積の抑制に有用となるであろう。
【０４４０】
全長オストレオコッカス・ルシマリヌスΔ６−デサチュラーゼ遺伝子の合成
オストレオコッカス・タウリΔ６−デサチュラーゼのヌクレオチド配列（受託番号ＡＹ７４６３５７）を問い合わせ配列として用いて、ＢＬＡＳＴＸにより非重複性タンパク質配列のＧｅｎＢａｎｋデータベースを解析した。この解析により、受託番号ＸＰ＿００１４２１０７３のアミノ酸配列を有する部分長タンパク質をコードするオストレオコッカス・ルシマリヌス遺伝子を同定した。次に、ＸＰ＿００１４２１０７３をコードする領域の側方にあるゲノムＤＮＡ配列を調査して、推定される翻訳開始および終止コドンを同定して全長タンパク質コード領域を画定し、そのヌクレオチド配列に配列番号９を付与した。続いて、コード領域をタンパク質配列に翻訳して、配列番号１０を付与した。このアミノ酸配列を用いて、配列番号１１に示すヌクレオチド配列を有する、ブラッシカ・ナパスおよびその他の双子葉植物における発現に最も適したコドンに最適化されたヌクレオチド配列を設計および合成した。
【０４４１】
オストレオコッカス・ルシマリヌスデサチュラーゼアミノ酸配列をＧｅｎｂａｎｋデータベース内の他のタンパク質への問い合わせ配列として用いたＢＬＡＳＴＰ解析は、配列番号１０がΔ６−デサチュラーゼと相同性を有することを示した。全長配列にわたる最大級の同一性は、オストレオコッカス・タウリΔ６−デサチュラーゼ配列である受託番号ＡＡＷ７０１５９のアミノ酸配列との７６％であった。オストレオコッカス・ルシマリヌスデサチュラーゼと類似した配列の複数のアライメントに基づく配列相関樹を図７に示す。このフロントエンドデサチュラーゼは、チトクロムｂ５ドメイン（ＮＣＢＩ保存ドメインｐｆａｍ００１７３）をアミノ酸５５〜１０８に、Δ６−ＦＡＤＳ様保存ドメイン（ＮＣＢＩ保存ドメインｃｄ０３５０６）をアミノ酸１９８〜４４４に含んでいた。フロントエンドデサチュラーゼを暗示する３個のヒスチジンボックスは、この配列内のアミノ酸２０７〜２１２、２４４〜２４９および４１７〜４２１に存在する。これらドメインの両方を含むタンパク質は通常、高度の不飽和脂肪酸の合成に必要とされるフロントエンドデサチュラーゼである。興味深いことに、このデサチュラーゼは、現在までに刊行発表された唯一の生化学的に確認された植物様アシルＣｏＡデサチュラーゼであるＡＡＷ７０１５９近傍にクラスター形成する。
【０４４２】
酵母細胞におけるオストレオコッカス・ルシマリヌスΔ６−デサチュラーゼの機能特性評価
ｐＧＥＭ−Ｔ  ＥａｓｙのＮｏｔＩ断片に含まれているオストレオコッカス遺伝子（配列番号１１）のコード領域全体をｐＹＥＳ２のＮｏｔＩ部位挿入し、酵母における導入および機能特性評価のためのキメラベクターｐＹＥＳ２＋Ｏｓｔｌｕｄ６Ｄを作製した。酵母株ＩＮＶＳＣ１の細胞をｐＹＥＳ２＋Ｏｓｔｌｕｄ６Ｄで形質転換し、ウラシルを含まない培地上で形質転換体を選抜した。ｐＹＥＳ２＋Ｏｓｔｌｕｄ６Ｄを含む酵母細胞を培地で培養し、次にガラクトースにより誘導した。ＬＡ、ＡＬＡ、ＳＤＡまたはＥＰＡを培地にそれぞれ最終濃度０．５ｍＭになるよう添加し、さらに４８時間、３０℃で培養した後、細胞脂質における脂肪酸を分析した。基質ＬＡを培地に添加した場合、酵母形質転換体の細胞脂質における産物ＧＬＡの存在を総脂肪酸の２．１％として検出し、これは６．６％のΔ６−脱飽和変換効率を示した。基質ＡＬＡを培地に添加した場合、酵母形質転換体の細胞脂質における産物ＳＤＡの存在を総脂肪酸の１３．８％として検出し、これは３８．８％のΔ６−脱飽和変換効率を示した。しかし、ＥＴｒＡ、ＤＧＬＡまたはＥＴＡの内いずれかを培地に添加した場合、それぞれＥＴＡ、ＡＲＡまたはＥＰＡの存在は検出されなかった。このことは、Δ５−またはΔ８−脱飽和活性が全くないことを示し（表７）、また、同じ長さと不飽和パターンを有する対応するω６脂肪酸と比べてω３脂肪酸基質に対する選択性を表した。
【０４４３】
デサチュラーゼのアシルＣｏＡ基質特異性
本実施例に記載のデサチュラーゼは、他のΔ６−デサチュラーゼよりも、以前単離されたオストレオコッカス・タウリ由来のΔ６−デサチュラーゼと密接に関連する（図９）。デサチュラーゼファミリーの他のメンバーと共にこれら遺伝子の系統樹を作成した場合、この類似性はさらに強調される（図１０）。オストレオコッカス・タウリΔ６−デサチュラーゼは、アシルＣｏＡ基質に活性を有することが報告された（Ｄｏｍｅｒｇｕｅら、２００５）。これらの観察に基づき、上述の遺伝子にコードされたΔ６−デサチュラーゼもまた、アシルＰＣ基質よりむしろアシルＣｏＡ基質に活性を有するであろうことが予想された。興味深いことに、パブロバ・サリナΔ５−デサチュラーゼもＯ．タウリのΔ６−デサチュラーゼとクラスター形成し、Δ８−デサチュラーゼは別の分枝を形成した。
【０４４４】
Ｍ．プシラ（ミクロモナスＣＣＭＰ１５４５）Δ６−デサチュラーゼがアシルＣｏＡ脂肪酸を基質として利用できるか、従ってΔ６−脱飽和アシルＣｏＡ脂肪酸を生成できるか否かを確立するため、デサチュラーゼ単独をコードする遺伝的構築物でＳ．セレビジエ（S.cerevisiae）を形質転換し、２５０μＭの外因性１８：３Δ９，１２，１５の存在下で形質転換体細胞系を３回培養した。続いて、培養物から総脂質を抽出し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により中性脂質（ＮＬ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）およびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）クラスに分画し、その後各クラスからＦＡＭＥを生成してＧＣにより分析した。データを表８に示す。
【０４４５】
【表８】
0006068800.tif 000011
【０４４６】
総脂質において、７１％の１８：３Δ９，１２，１５がΔ６−脱飽和されて１８：４Δ６，９，１２，１５となった。総脂質抽出物と比較した場合、ＰＣ画分において産物の濃縮は検出されなかった。確かに、ＰＣ画分には実質的に総脂質より低い割合の１８：４Δ６，９，１２，１５が存在し（２１．０％対２９．４％）、これはデサチュラーゼが１８：４Δ６，９，１２，１５をアシルＣｏＡチオエステルとして生成していたことを示した（Ｄｏｍｅｒｇｕｅら、２００３）。
【０４４７】
形質転換により、Ｍ．プシラΔ６−デサチュラーゼをコードする遺伝子をアラビドプシス植物体にも導入した。ＳｗａＩ断片内に含まれているＭ．プシラΔ６−デサチュラーゼのコード領域全体をＬｉｎｉｎ−ｐＷＶＥＣ８のＳｍａＩ部位に挿入してｌｉｎＰ−ｍｉｃ１５４５−ｄ６Ｄ−ｌｉｎＴを作製することにより、遺伝的構築物Ｌｉｎｉｎ：Ｍｉｃｐｕ−ｄ６Ｄを作製した。この構築物のプロモーターは、アマ由来の種子特異的ｌｉｎｉｎプロモーターである。この構築物は、Ａ．サリアナ（A. thaliana）生態型コロンビア（Columbia）に形質転換し、形質転換植物のＴ２種子における脂肪酸組成をＧＣにより分析した（図１１）。
【０４４８】
酵母およびＮ．ベンサミアナの両方における生化学的研究により、Ｍ．プシラ由来のΔ６−デサチュラーゼがアシルＣｏＡデサチュラーゼである証拠が提供された。その結果起こった伸長ステップの動態学的解析は、デサチュラーゼがアシルＣｏＡ産物を生成する能力を決定するための間接的な方法として、他の研究で用いられてきた。Δ６−脱飽和産物（ＳＤＡ）を、アシルＣｏＡ代謝プールで起こる次のΔ６−伸長ステップに利用できるか否かは、Δ６−デサチュラーゼの基質特異性に左右される（Ｄｏｍｅｒｇｕｅら、２００３、２００５；Ｈｏｆｆｍａｎｎら、２００８）。Ｅ．プランタギネウムのアシルＰＣΔ６−デサチュラーゼを用いた場合に観察された顕著により低レベルの伸長とは対照的に、Ｏ．タウリおよびＭ．プシラ由来のΔ６−デサチュラーゼを用いた場合、同様のΔ６−伸長率が得られた（図１２ａ）。酵母脂質クラスにおけるΔ６−デサチュラーゼ産物ＳＤＡの分布を解析した場合、更なる証拠が観察された（表８）。総脂質画分と比べてＰＣ画分における濃縮は観察されなかったが、仮にアシルＰＣデサチュラーゼによりＳＤＡが生成された場合このような濃縮が予想されるであろう（Ｄｏｍｅｒｇｕｅら、２００５）。Ｎ．ベンサミアナ葉における基質ＬＡおよびＡＬＡの大部分はプラスチドに局在して脱飽和に利用できないため、相対的に低レベルのΔ６−脱飽和（図１２）が本願の研究に観察されることが予想された。しかし、ＦＡＭＥ調製においてこれら脂肪酸もまた単離されるため、その存在は計算された総合的な変換効率を効果的に低下させる。従って、種子特異的変換効率は、同一遺伝子で非常により高いことが予想される。
【０４４９】
アシルＣｏＡとアシルＰＣΔ６−デサチュラーゼの比較
植物細胞において、ミクロモナスＣＣＭＰ１５４５Δ６−デサチュラーゼ、エキウム・プランタギネウムΔ６−デサチュラーゼおよびオストレオコッカス・タウリΔ６−デサチュラーゼ間で更なる比較を行った（Ｄｏｍｅｒｇｕｅら、２００５）。実施例４に記載されている遺伝的構築物３５Ｓ：Ｍｉｃ１５４５−ｄ６Ｄおよび３５Ｓ：Ｅｃｈｐｌ−ｄ６Ｄを、ＳｗａＩ断片内に含まれているオストレオコッカス・タウリΔ６−デサチュラーゼのコード領域全体を３５Ｓ−ｐＯＲＥ０４のＳｍａＩ−ＥｃｏＲＶ部位に挿入することによりｐＪＰ３０６５を作製して構築した遺伝的構築物３５Ｓ：Ｏｓｔｔａ−ｄ６Ｄと比較した。
【０４５０】
Ｅ．プランタギネウムと、Ｏ．タウリおよびＭ．プシラのいずれかとの間のＥＰＡ経路の直接的な比較は、より効率的なΔ６−脱飽和およびそれに続くより効率的なΔ６−伸長の両方のために、アシルＣｏＡデサチュラーゼ経路がより高レベルのＥＰＡを生じたことを示した（図１２ａ）。Ｅ．プランタギネウムΔ６−デサチュラーゼは、ω３基質の１４％の変換（１８：３Δ９，１２，１５から１８：４Δ６，９，１２，１５）およびω６基質の３０％の変換（１８：２Δ９，１２から１８：３Δ６，９，１２）を触媒した。Ｏ．タウリΔ６−デサチュラーゼの使用は、２４％のω３変換および４０％のω６変換をもたらしたが、一方Ｍ．プシラΔ６−デサチュラーゼの使用は、２７％のω３変換および１５％のω６変換をもたらした。これら変換は、Ｅ．プランタギネウム経路において１．３％の２０：４Δ５，８，１１，１４および３．４％の２０：５Δ５，８，１１，１４，１７を、Ｏ．タウリ経路において１．２％の２０：４Δ５，８，１１，１４および９．６％の２０：５Δ５，８，１１，１４，１７を、そしてＭ．プシラ経路において０．６％の２０：４Δ５，８，１１，１４および１０．７％の２０：５Δ５，８，１１，１４，１７の生成をもたらした。
【０４５１】
Ｅ．プランタギネウムデサチュラーゼを用いた場合と比べて、Ｏ．タウリまたはＭ．プシラΔ６−デサチュラーゼのいずれかが基質１８：４Δ６，９，１２，１５を生じた場合、Δ６−伸長ははるかに高かった（図１２ａ）。Ｍ．プシラΔ６−デサチュラーゼが示したω３基質特異性に加えて、Ｐ．コルダタΔ６−エロンガーゼ（実施例２を参照）は、高度に特異的であり、ω３基質１８：４Δ６，９，１２，１５を１８：３Δ６，９，１２よりも非常に高い割合で変換したことが証明された（Ｍ．プシラＥＰＡ経路においてそれぞれ８９％および２１％）。
【０４５２】
二重Δ６−デサチュラーゼ経路の使用
２種のΔ６−デサチュラーゼを含む経路を用いることによりΔ６−脱飽和を増加させる可能性を研究して比較を行った。先ず、Ｅ．プランタギネウムアシルＰＣデサチュラーゼとＭ．プシラアシルＣｏＡデサチュラーゼの組合せは、Ｍ．プシラデサチュラーゼのみを含む経路で観察された効率を超えて変換効率を顕著に増加させることはなかった（図１２ｂ）。Ｅ．プランタギネウムおよびＯ．タウリのΔ６−デサチュラーゼを組み合わせた場合、同様の結果が得られた。Ｏ．タウリとＭ．プシラ両方のデサチュラーゼを組み合わせた二重アシルＣｏＡΔ６−デサチュラーゼ経路もまた、Ｏ．タウリまたはＭ．プシラ経路のいずれかと比べた場合にω３変換効率の増加を生じなかった（図１２ｃ）。
【０４５３】
ＥＰＡ生成経路における二重Δ６−デサチュラーゼの使用の効果も試験した。第一の試験は、Ｅ．プランタギネウム由来のアシルＰＣデサチュラーゼと、別個の実験における両方のアシルＣｏＡデサチュラーゼとを組み合わせた。脂質関連デサチュラーゼの添加がアシルＰＣ基質ＬＡまたはＡＬＡのいずれかのそれぞれＧＬＡまたはＳＤＡへの変換を増加できるとの仮説を立てた。同様に、２種のアシルＣｏＡデサチュラーゼの使用がＥＰＡの蓄積を増加することができるかについても試験された。これら筋書きのいずれも正しくはないことが、Ｎ．ベンサミアナの一過性アッセイにおいて証明された。
【実施例５】
【０４５４】
微細藻類由来のΔ５−デサチュラーゼをコードする遺伝子の単離および特性評価
ピラミモナスＣＳ−０１４０Δ５−デサチュラーゼ遺伝子断片の単離
ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢＬ９６２９５、ＡＢＰ４９０７８、ＸＰ＿００１４２１０７３、ＡＡＭ０９６８７、ＡＡＴ８５６６１、ＡＡＷ７０１５９およびＡＡＸ１４５０５から得られたデサチュラーゼアミノ酸配列のアライメントは、ＡＢＬ９６２９５のそれぞれアミノ酸位置１９７〜２０６および３６８〜３７５に対応する共通アミノ酸配列ブロックＷＫＮＭＨＮＫＨＨＡ（配列番号３７）およびＨＨＬＦＰＳＭＰ（配列番号３８）を同定した。これら２ブロックの配列に基づき、ＣＯＤＥＨＯＰプログラム（Ｒｏｓｅら、１９９８）を用いて、ディジェネレートプライマー、５’−ＧＧＴＧＧＡＡＧＡＡＣＡＡＧＣＡＣＡＡＣｒｄｎｃａｙｃａｙｇｃ−３’（配列番号６４）および５’−ＧＧＧＣＡＴＣＧＴＧＧＧＧｗａｎａｒｒｔｇｒｔｇ−３’（配列番号６５）を設計した。１０ｐｍｏｌの各プライマー、５０ｎｇのピラミモナスＣＳ−０１４０ゲノムＤＮＡならびに添付のマニュアルに記載されているバッファーおよびヌクレオチド成分を用いた２０μＬ容量で、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いてタッチダウンＰＣＲ増幅を行った。サイクル条件は、１サイクルの９４℃３分間；２０サイクルの９４℃１分間、７０℃２分間（１サイクル毎に−１℃）、７２℃１分間；２０サイクルの９４℃１分間、５５℃１分間、７２℃１分間；１サイクルの７２℃５分間；４℃で維持であった。５５１ｂｐ増幅産物を生成し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にライゲーションして配列解析した。
【０４５５】
全長ピラミモナスＣＳ−０１４０Δ５−デサチュラーゼ遺伝子の単離
５’−および３’−ＲＡＣＥにより５５１ｂｐ断片を伸長するためのプライマーを設計し、実施例１に記載されている通りに用いた。遺伝子特異的フォワードプライマー、５’−ＡＧＣＧＡＧＴＡＣＣＴＧＣＡＴＴＧＧＧＴ−３’（配列番号６６）および実施例１の通りの改変型オリゴｄＴリバースプライマーを用いて、Δ５−デサチュラーゼをコードする遺伝子のｃＤＮＡの３’末端を単離した。４７７ｂｐ増幅産物を生成し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙにライゲーションして配列解析した。実施例１の通りの改変型ターミナルトランスフェラーゼ法により遺伝子の５’末端を単離した。遺伝子特異的リバースプライマーは、５’−ＡＴＡＧＴＧＣＴＴＧＧＴＧＣＧＣＡＡＧＣＴＧＴＧＣＣＴ−３’（配列番号６７）であった。２ラウンドのＰＣＲ増幅後、３１７ｂｐ増幅産物を生成し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にライゲーションして配列解析した。３種の部分配列を全長遺伝子の予測配列に組み立てた。
【０４５６】
次に、５’ＵＴＲの短い領域を有する全長タンパク質コード領域をゲノムＤＮＡから増幅した。フォワードプライマー、５’−ＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＡＡＧＧＧＡＧＧＣＡＡＴＧＣＴ−３’（配列番号６８）およびリバースプライマー、５’−ＴＴＡＣＴＡＧＴＧＣＧＣＣＴＴＧＧＡＧＴＧＡＧＡＴ−３’（配列番号６９）を、４ｐｍｏｌの各プライマーおよび５０ｎｇのピラミモナスＣＳ−０１４０ゲノムＤＮＡならびにＰＦＵ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎの添付マニュアルに記載されているバッファー組成物を用いた２０μＬ容量で、ＰＦＵ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によるＰＣＲ増幅に用いた。全長ｃＤＮＡを表す１３３６ｂｐ増幅産物を生成し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙにライゲーションして配列解析した。ｃＤＮＡのオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列は配列番号１２とする。
【０４５７】
ＢＬＡＳＴ解析は、配列番号１３として示す遺伝子にコードされた全長アミノ酸配列が、公知のΔ５−またはΔ６−デサチュラーゼと類似性を有するタンパク質をコードすることを示した。これら２種類のデサチュラーゼはアミノ酸レベルで類似しており、どの活性がコードされているかアミノ酸配列のみからは不明確であった。後述の通り酵素活性の解析を行い、これによりコードされたタンパク質がΔ５−デサチュラーゼ活性を有することが示された。ＢＬＡＳＴＰによって決定した、ピラミモナスＣＳ−０１４０デサチュラーゼとＧｅｎｂａｎｋデータベースにおける他のデサチュラーゼとの間の最大級の同一性は、モノシガ・ブレビコリスＭＸ１由来の未定義の酵素活性を有するタンパク質のアミノ酸配列である受託番号ＥＤＱ９２２３１との５２％であった。元々のディジェネレートプライマーの設計に用いた配列等、ピラミモナスＣＳ−０１４０デサチュラーゼと類似した配列の複数アライメントに基づく配列相関樹を図８に示す。このフロントエンドデサチュラーゼは、チトクロムｂ５ドメイン（ＮＣＢＩ保存ドメインｐｆａｍ００１７３）をアミノ酸１６〜６７に、Δ６−ＦＡＤＳ様保存ドメイン（ＮＣＢＩ保存ドメインｃｄ０３５０６）をアミノ酸１５９〜４１１に含む。フロントエンドデサチュラーゼを暗示する３個のヒスチジンボックスは、この配列のアミノ酸１７５〜１８０、２１２〜２１７および３８４〜３８８に存在する。これらドメインを含むタンパク質は通常、複数の不飽和脂肪酸の合成に必要とされるフロントエンドデサチュラーゼである。
【０４５８】
酵母におけるピラミモナスＣＳ−０１４０Δ５−デサチュラーゼの機能特性評価
ｐＧＥＭ−Ｔ  ＥａｓｙのＮｏｔＩ断片内に含まれているこのクローンのコード領域全体をｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｏｔＩ部位に挿入し、酵母における導入および機能特性評価のためのｐＹＥＳ２＋Ｐｙｒｃｏ−ｄｅｓ２を作製した。酵母株ＩＮＶＳＣ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の細胞をｐＹＥＳ２＋Ｐｙｒｃｏ−ｄｅｓ２で形質転換し、形質転換体をウラシルを含まない培地上で選抜した。ｐＹＥＳ２＋Ｐｙｒｃｏ−ｄｅｓ２を含む酵母細胞を培地で培養し、次にガラクトースにより誘導した。培地に０．５ｍＭ  ＬＡ、ＡＬＡ、ＤＧＬＡまたはＥＴＡを添加し、４８時間、３０℃でさらに培養した後、細胞脂質における脂肪酸を分析した。培地にＤＧＬＡを添加した場合、酵母形質転換体の細胞脂質において総脂肪酸の０．１２％のＡＲＡが検出され、これは４．０％のΔ５−脱飽和変換効率を示した。培地にＥＴＡを添加した場合、酵母形質転換体の細胞脂質において総脂肪酸の０．２６％のＥＰＡが検出され、これは３．５％のΔ６−脱飽和変換効率を示した。しかし、培地にＬＡまたはＡＬＡのいずれかを添加した場合、それぞれＧＡＬまたはＳＤＡは酵母形質転換体に生成されなかった。これは、タンパク質が酵母細胞でΔ６−脱飽和活性を全く持たないことを示した（表７）。
【０４５９】
植物細胞におけるピラミモナス・コルダタ（Pyramimonas cordata）Δ５−デサチュラーゼの発現
アラビドプシス・サリアナＤＧＡＴ１（配列番号７５によりコードされた配列番号７４）と共に、ミクロモナスＣＣＭＰ１５４５Δ６−デサチュラーゼ（配列番号７によりコードされた配列番号８）、ピラミモナスＣＳ−０１４０Δ６−エロンガーゼ（配列番号３によりコードされた配列番号４）およびピラミモナスＣＳ−０１４０Δ５−デサチュラーゼ（配列番号１２によりコードされた配列番号１３）の酵素活性は、実施例１に記載された増強ニコチアナ・ベンサミアナ一過性発現システムを用いて植物体において証明された。
【０４６０】
ＥｃｏＲＩ断片に含まれているピラミモナスＣＳ−０１４０Δ５−デサチュラーゼのコード領域全体を３５Ｓ−ｐＯＲＥ０４（実施例４、上述）のＥｃｏＲＩ部位に挿入して３５Ｓ：Ｐｙｒｃｏ−ｄ５Ｄを作製することによって、構成的３５Ｓプロモーターの制御下でΔ５−デサチュラーゼをコードする遺伝的構築物３５Ｓ：Ｐｙｒｃｏ−ｄ５Ｄを構築した。キメラベクター３５Ｓ：Ｍｉｃ１５４５−ｄ６Ｄ（実施例１０）、３５Ｓ：Ｐｙｒｃｏ−ｄ６Ｅ（実施例１０）および３５Ｓ：Ｐｙｒｃｏ−ｄ５Ｄを個々にアグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＧＬ１導入し、これらの培養物から得られたトランスジェニック細胞を混合し、混合物を温室内のニコチアナ・ベンサミアナ植物体の葉組織に浸潤した。植物体を浸潤後さらに５日間生育し、その後ＧＣ分析のためリーフディスクを採取して、これら遺伝子がニコチアナ・ベンサミアナにおけるＥＰＡ生成に機能することを明らかにした。これら遺伝子で形質転換した葉組織は、ＳＤＡ（１．０％）、ＥＴＡ（０．１％）、ＥＰＡ（１０．０％）を含んでいた。葉組織はまた、微量のＧＬＡ、ＥＴＡおよびＡＲＡも含んでいた。Δ５−デサチュラーゼの変換効率は９８．８％として計算された。
【０４６１】
本実験は、微細藻類Δ５−デサチュラーゼが、植物細胞において少なくとも９０％または少なくとも９５％の効率でＥＴＡをＥＰＡに変換できることを証明した。
【実施例６】
【０４６２】
微細藻類由来のω３−デサチュラーゼをコードする遺伝子の単離および特性評価
ミクロモナスＣＳ−０１７０ω３−デサチュラーゼ遺伝子断片の単離
ミクロモナス等、微細藻類がω３デサチュラーゼをコードする遺伝子を有するか決定し、その場合はこのような遺伝子を同定する試みにおいて、ミクロモナス株ＲＣＣ２９９のゲノム配列においてＦＡＤ３と相同性を示す遺伝子の探索を行った。しかし、この探索により候補遺伝子を同定することは全くできなかった。従って、本発明者らは、ω３デサチュラーゼがミクロモナスの他の種類のデサチュラーゼが代理となり得るか否か検討した。この仮説は、同じ株におけるΔ６デサチュラーゼが、フロントエンド型のアシルＣｏＡ依存型であるとの知見（実施例４）によって支持された。しかし、実験してみたところ、ミクロモナスＲＣＣ２９９ゲノムは、少なくとも３０種の推定脂肪酸デサチュラーゼの遺伝子を含んでいると思われるが、実際にあるとすればそれらの内いずれがω３デサチュラーゼをコードし得るかについての情報はなかった。
【０４６３】
実験において、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＢＡＤ９１４９５、ＡＢＬ６３８１３、ＢＡＤ１１９５２およびＡＡＲ２０４４４から得られたデサチュラーゼアミノ酸配列のアライメントは、ＢＡＤ９１４９５のそれぞれアミノ酸位置１０６〜１１３および２９６〜３０５に対応する共通アミノ酸配列ブロックＷＣＩＧＨＤＣＧ（配列番号３９）およびＴＦＬＱＨＨＤＥＤＭ（配列番号４０）を同定した。これら２ブロックの配列に基づき、ＣＯＤＥＨＯＰプログラムを用いて、ディジェネレートプライマー、５’−ＴＧＴＧＧＴＧＣＡＴＣＧＧＣＣＡＹＧＡＮＫＳＮＧＧ−３’（配列番号７０）および５’−ＴＧＴＣＣＴＣＧＴＣＧＴＴＧＴＧＣＴＧＮＡＲＲＷＡＮＧＴ−３’（配列番号７１）を設計した。１０ｐｍｏｌの各プライマー、５０ｎｇのミクロモナスＣＳ−０１７０ゲノムＤＮＡならびに添付のマニュアルに記載されているバッファーおよびヌクレオチド成分を用いた２０μＬ容量で、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いてタッチダウンＰＣＲ増幅を行った。サイクル条件は、１サイクルの９４℃３分間；２０サイクルの９４℃１分間、７０℃２分間（１サイクル毎に−１℃）、７２℃１分間；３５サイクルの９４℃１分間、５６℃１分間、７２℃１分間；１サイクルの７２℃５分間；４℃で維持であった。５２８ｂｐ増幅産物を生成し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にライゲーションして配列解析した。この増幅産物のヌクレオチド配列を配列番号１４として示し、コードされた部分タンパク質配列を配列番号１５として示す。
【０４６４】
全長ミクロモナスＲＣＣ２９９ω３−デサチュラーゼ遺伝子の合成
ディジェネレートＰＣＲにより作製した５２８ｂｐ断片を完全ミクロモナスＲＣＣ２９９選別タンパク質モデルゲノム配列（米国エネルギー省共同ゲノム研究所、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｇｉ．ｄｏｅ．ｇｏｖ／により作成）と比較した。ＢＬＡＳＴ解析により、ミクロモナスＲＣＣ２９９の第１３染色体領域と配列番号１４との間で高い相同性を有する領域が明らかになった。この２配列の近似した同一性に基づき、ミクロモナス株ＣＳ−０１７０およびＲＣＣ２９９は非常に密接に関連していると思われた（ミクロモナスＲＣＣ２９９のヌクレオチド配列は配列番号１６として示す）。ミクロモナスＲＣＣ２９９予測タンパク質配列（配列番号１７）を用いて、ブラッシカ・ナパスまたは他の双子葉植物における発現に最も適したコドンに最適化されたヌクレオチド配列を設計、合成した（配列番号１８）。配列番号１８のヌクレオチド１６４から始まるこの遺伝子のより短い型を酵母で試験したが、ω３デサチュラーゼ活性は検出されなかった。
【０４６５】
ＢＬＡＳＴ解析により、全長アミノ酸配列（配列番号１７）がＦＡＴ−１、ＦＡＴ−２およびω３デサチュラーゼと相同性を有することが示された。どの活性がコードされているか配列のみから推測することはできなかった。ミクロモナスＣＳ−０１７０デサチュラーゼとＧｅｎｂａｎｋデータベースにおける他のタンパク質との間のＢＬＡＳＴＸによる最大級の同一性は、脂肪酸デサチュラーゼファミリーのブルギア・マレー（Brugia malayi）タンパク質であるＸＰ＿００１８９９０８５．１との３５％であった。このフロントエンドデサチュラーゼは、Δ１２−ＦＡＤＳ様保存ドメイン（ＮＣＢＩ保存ドメインｃｄ０３５０７）を含んでいた。これらドメインの両方を含むタンパク質は通常、ω３デサチュラーゼファミリー等、脂肪酸の合成に必要とされるフロントエンドデサチュラーゼである。
【０４６６】
植物体におけるミクロモナスＲＣＣ２９９ω３−デサチュラーゼの機能特性評価
本明細書で陽性対照試料として用いた、ミクロモナスＲＣＣ２９９（Ｍｉｃ２９９−ω３Ｄ、上述通り）およびフィトフトラ・インフェスタンスΔ１７−デサチュラーゼ（Ｐｈｙｉｎ−ｄ１７Ｄ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＭ５５８８２）から単離された全長遺伝子によってコードされた推定ω３−デサチュラーゼの酵素としての機能を、上述の通り増強ニコチアナ・ベンサミアナ一過性発現システムを用いて植物体において試験した。
【０４６７】
ＥｃｏＲＩ断片内に含まれている配列番号１８のタンパク質コード領域全体をベクター３５Ｓ−ｐＯＲＥ０４（実施例４）のＥｃｏＲＩ部位にクローニングしてｐＪＰ２０７３と命名した遺伝的構築物を作製することにより、３５Ｓ：Ｍｉｃ２９９−ｗ３Ｄ構築物を構築した。ＥｃｏＲＩ断片内のフィトフトラ・インフェスタンスΔ１７デサチュラーゼのコード領域全体を３５Ｓ−ｐＯＲＥ０４のＥｃｏＲＩ部位にクローニングしてｐＪＰ２０７４を作製することにより、３５Ｓ：Ｐｈｙｉｎ−ｄ１７Ｄ構築物を構築した。同様に、ＥｃｏＲＩ断片内に含まれているアラビドプシス・サリアナＤＧＡＴ１（ＡＦ０５１８４９）のコード領域全体を３５Ｓ−ｐＯＲＥ０４のＥｃｏＲＩ部位にクローニングしてｐＪＰ２０７８を作製することにより、３５Ｓ：Ａｒａｔｈ−ＤＧＡＴ１構築物を構築した。
【０４６８】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＧＬ１を５０ｍｇ／ｍＬカナマイシンおよび５０ｍｇ／ｍＬリファンピシンを添加したＬＢ培地において２８℃で定常期になるまで培養した。次に、５０００ｇ、１５分間室温で遠心分離することにより細菌をペレット化し、その後ＯＤ６００＝１．０になるよう１０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．７、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１００μＭアセトシリンゴンを含む浸潤バッファーに再懸濁した。続いて２８℃で３時間振盪しつつ細胞をインキュベートし、その後３５Ｓ：ｐ１９、３５Ｓ：Ａｒａｔｈ−ＤＧＡＴ１および３５Ｓ：Ｐｈｙｉｎ−ｄ１７Ｄか３５Ｓ：Ｍｉｃ２９９−ｗ３Ｄのいずれかを含む等量のアグロバクテリウム細胞の培養物を、葉組織に浸潤する前に混合した。アラキドン酸塩を調製して、上述の通り形質転換葉組織に摂取させ、基質摂取の５時間後と２４時間後の両方において分析のためリーフディスクを採取した。３５Ｓ：Ｐｈｙｉｎ−ｄ１７Ｄ構築物または別個に３５Ｓ：Ｍｉｃ２９９−ｗ３Ｄ構築物で浸潤した葉スポットはいずれも、それぞれ３７％および５０％効率のＡＲＡ（２０：４ω６）からＥＰＡ（２０：５ω３）への変換を示し（図１３）、これはタンパク質がΔ１７−デサチュラーゼ活性を有することを表した。
【０４６９】
論考：最初の微細藻類ω３−デサチュラーゼのΔ１７−デサチュラーゼ活性による特性評価
本研究に記載されているミクロモナスＲＣＣ２９９ω３デサチュラーゼは、Ｃ２０以上の長さの脂肪酸基質に対して活性を有する、記載された最初の微細藻類、すなわち植物様Δ１７デサチュラーゼである。陸生植物が、ＦＡＤ３型ではなくむしろフロントエンドデサチュラーゼ型のω３デサチュラーゼを有することは知られていない。従って、菌類よりも植物に関係のある微細藻類株が、フロントエンドデサチュラーゼ型のω３デサチュラーゼを保有することを見出したことは驚くべきことであった。
【０４７０】
他のデサチュラーゼとの相同性に基づき、上述の実験で対照遺伝子として用いた真菌フィトフトラ・インフェスタンスのデサチュラーゼがアシルＰＣ基質に活性を有する一方、ミクロモナスＲＣＣ２９９のデサチュラーゼがアシルＣｏＡ基質に活性を有する可能性について検討した。他の真菌デサチュラーゼは、アシルＰＣ基質に活性を有することが知られている。ミクロモナス遺伝子に関するこの結論は、その同一株由来のΔ６−デサチュラーゼ遺伝子との、観察された類似性と矛盾しない（実施例４）。この基質選択性は基質摂取実験によりさらに研究することができ、これによると、形質転換組織に摂取させたＡＲＡ等の基質はアシルＣｏＡプールに直ちに利用できるが、アシルＰＣプールには天然の植物（例えば、ニコチアナ・ベンサミアナ）アシルトランスフェラーゼによって変換された後でしか利用できない。
【０４７１】
ミクロモナスＲＣＣ２９９ω３デサチュラーゼ遺伝子は、特にＡＲＡ等、ω６基質をω３産物に変換するその能力のため、ＥＰＡならびにその下流脂肪酸ＤＰＡおよびＤＨＡ、その他のω３ＶＬＣ−ＰＵＦＡを植物において生成するよう設計された組換え経路の構築に非常に有用となるであろう。同様に、アシルＣｏＡプールで機能するΔ５−エロンガーゼ等、エロンガーゼと組み合わせた場合、アシルＣｏＡ基質における活性はこの有用性を高める。さらに、ミクロモナス株の脂肪酸プロファイルは、ミクロモナス酵素が、ＧＬＡまたはＬＡ等、ω６Ｃ１８脂肪酸をそれぞれＳＤＡまたはＡＬＡ等、それらのω３対応物質に変換する能力も有することを示した。ＧＬＡからＳＤＡへの変換は、上述の通り基質ＡＲＡの基質摂取により酵母細胞か植物体のいずれかにおいて証明することができるが、一方ＬＡからＡＬＡへの変換は、植物に内因性Δ１５デサチュラーゼが存在するため酵母細胞においてより良く証明される。
【０４７２】
他のω３−デサチュラーゼの同定
配列番号１７を問い合わせ配列として用いたＢＬＡＳＴＰプログラムで、米国エネルギー省共同ゲノム研究所（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｇｉ．ｄｏｅ．ｇｏｖ／）により作成されたミクロモナスＣＣＭＰ１５４５選別タンパク質モデルゲノム配列を解析した。この解析により、ミクロモナスＣＣＭＰ１５４５における配列番号１７と相同性を有する遺伝子（ＥｕＧｅｎｅ．００００１５０１７９）の存在が明らかになった。オープンリーディングフレーム配列を配列番号１９とし、タンパク質配列は配列番号２０として示す。
【０４７３】
ＢＬＡＳＴ解析により、全長アミノ酸配列である配列番号２０がＦＡＴ−１、ＦＡＴ−２およびω３デサチュラーゼと相同性を有することが示された。ミクロモナスＣＣＭＰ１５４５デサチュラーゼとＧｅｎｂａｎｋデータベースにおける他のタンパク質との間の最大級の同一性（ＢＬＡＳＴＰ）は、配列番号１７との全長にわたって５９％であった。このフロントエンドデサチュラーゼは、Δ１２−ＦＡＤＳ様保存ドメイン（ＮＣＢＩ保存ドメインｃｄ０３５０７）を含んでいた。これらドメインの両方を含むタンパク質は通常、ω３デサチュラーゼファミリー等、脂肪酸合成に必要とされるフロントエンドデサチュラーゼである。このタンパク質が、植物体においてΔ１７−デサチュラーゼ活性を有するω３デサチュラーゼとしても機能するであろうことが推測された。
【実施例７】
【０４７４】
微細藻類由来のΔ９−エロンガーゼをコードするさらに別の遺伝子の単離および特性評価
エミリアニア・ハクスレイ（Emiliania huxleyi）ＣＣＭＰ１５１６Δ９−エロンガーゼの単離および特性評価
ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ３９０１７４のアミノ酸配列を問い合わせ配列として用いたＢＬＡＳＴＰプログラムにより、米国エネルギー省共同ゲノム研究所（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｇｉ．ｄｏｅ．ｇｏｖ／）により作成されたエミリアニア・ハクスレイＣＣＭＰ１５１６選別タンパク質モデルゲノム配列を解析した。この解析により、エミリアニア・ハクスレイＣＣＭＰ１５１６におけるＡＦ３９０１７４と相同性を有する推測遺伝子の存在が明らかになった。タンパク質配列は配列番号２８として示し、コードするヌクレオチド配列は配列番号２７として示す。ＢＬＡＳＴ解析により、全長アミノ酸配列がＰＵＦＡエロンガーゼと相同性を有することが示された。エミリアニア・ハクスレイＣＣＭＰ１５１６エロンガーゼと他のタンパク質との間の最大級の同一性（ＢＬＡＳＴＰ）は、ＡＦ３９０１７４との８０％であった。保存ＧＮＳ１／ＳＵＲ４ファミリードメイン（ＮＣＢＩ保存ドメインｐｆａｍ０１１５１）がこの配列内に示され、これは通常、タンパク質が長鎖脂肪酸伸長システムに関与することを示唆した。
【０４７５】
エミリアニア・ハクスレイＣＣＭＰ１５１６推測タンパク質配列を用いて、ブラッシカ・ナパス等、双子葉植物における発現に最も適したコドンに最適化されたヌクレオチド配列を設計、合成した（配列番号２９）。プラスミド構築物を０８３５６６８＿Ｅｍｉｈｕ−ｄ９Ｅ＿ｐＭＡと命名した。
【０４７６】
Ｐ．ピンギスおよびＰ．サリナΔ９−エロンガーゼの単離および特性評価
Ｐ．ピンギスおよびＰ．サリナΔ９−エロンガーゼ内の可能性のある保存領域を同定するため、Ｅ．ハクスレイΔ９−エロンガーゼＰＬＬ０００００６６５（ＴＢｅｓｔＤＢからＥ．ハクスレイエロンガーゼ配列を問い合わせ配列として用いたＢＬＡＳＴ解析により得られたＰ．ルテリ（lutheri）ＥＳＴ配列）およびＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＬ３７６２６（Ｉ．ガルバナΔ９−エロンガーゼ）から推定したエロンガーゼアミノ酸配列のアライメントを作成した。この操作により、Ｅｍｉｈｕ−ｄ９Ｅのそれぞれアミノ酸位置４０〜４８および１７０〜１７８に対応する、共通アミノ酸配列ブロックＶＤＴＲＫＧＡＹＲ（配列番号７６）およびＦＩＨＴＩＭＹＴＹ（配列番号７７）が明らかになった。これら２ブロックの配列に基づき、ディジェネレートプライマー、５’−ＴＧＧＴＧＧＡＣＡＣＡＡＧＧＡＡＧＧＧＮＧＣＮＴＡＹＭＧ−３’（配列番号７８）および５’−ＧＴＡＧＧＴＧＴＡＣＡＴＧＡＴＧＧＴＲＴＧＤＡＴＲＡＡ−３’（配列番号７９）を合成し、Ｐ．ピンギスのＲＮＡおよびＰ．サリナのｃＤＮＡライブラリー（Ｚｈｏｕら、２００７）を用いたＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ増幅を、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（商標）Ｐｌａｔｉｎｕｍ（商標登録）Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲシステムまたはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、イプスウィッチ、マサチューセッツ州、米国）を用いて行った。
【０４７７】
Ｐ．ピンギスからＲＴ−ＰＣＲにより６４１塩基対の増幅産物を生成し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ（登録商標）にライゲーションして配列解析した。５’−および３’−ＲＡＣＥにより６４１塩基対の断片を伸長するためのプライマーを設計し、遺伝子特異的フォワードプライマー、５’−ＧＴＣＣＴＴＧＣＴＣＣＡＧＧＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡ−３’（配列番号８０）およびオリゴｄＴ−ＳＰ６リバースプライマー、５’−ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号８１）を用いてＲＴ−ＰＣＲにより遺伝子の３’末端を単離した。この産物を１：１０希釈し、１．０μｌをＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）ならびに遺伝子特異的フォワードプライマー、５’−ＴＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＧＧＣＡＴＣＴＡＣＧＴ−３’（配列番号８２）および同じリバースプライマーを用いた第二ラウンドのＰＣＲの鋳型として用いた。１０７９塩基対の増幅産物を生成し、ｐＧＥＭ−Ｔ（登録商標）Ｅａｓｙにライゲーションして配列解析した。遺伝子特異的リバースプライマー、５’−ＴＴＧＧＧＴＧＡＴＣＴＧＣＡＴＧＡＧＣＧＴＧＡＴＧ−３’（配列番号８３）により作製し、ターミナルトランスフェラーゼによりＡテール付加した１．０μｇのＰ．ピンギスｃＤＮＡから、遺伝子の５’末端を単離した。次に、このｃＤＮＡをオリゴｄＴ−ＳＰ６プライマーおよび遺伝子特異的プライマー、５’−ＣＧＡＡＴＡＣＴＴＧＡＡＧＡＧＣＴＴＧＴＴＧＧＡＧＡ−３’（配列番号８４）を用いたＰＣＲ反応の鋳型として用いた。この産物を１：１０希釈し、その１．０μｌをオリゴｄＴ−ＳＰ６プライマーおよび遺伝子特異的プライマー、５’−ＧＧＧＣＴＡＣＧＡＧＣＴＧＧＣＡＧＡＴＧＡＡＧＣＡ−３’（配列番号８５）を用いた第二ラウンドのＰＣＲの鋳型として用いた。３２３塩基対の増幅産物を生成し、ｐＧＥＭ−Ｔ（登録商標）Ｅａｓｙにライゲーションして配列解析した。３種の部分配列から全長配列を組み立てた。フォワードプライマー、５’−ＧＡＡＡＡＡＡＴＧＧＴＴＧＣＧＣＣＡＣＣＣＡＴＣＡ−３’（配列番号８６）およびリバースプライマー、５’−ＴＣＡＣＴＡＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＣＣＣＧＣＧＧＣ−３’（配列番号８７）を用いたＲＴ−ＰＣＲにより、トータルＲＮＡから５’ＵＴＲの短い領域を有する全長コード領域を増幅した。８２８塩基対の増幅産物であるＰａｖｐｉ−Ｅｌｏ１を生成し、ｐＧＥＭ−Ｔ（登録商標）Ｅａｓｙにライゲーションして配列解析した（配列番号９３）。Ｐ．ピンギスΔ９−エロンガーゼの推定アミノ酸配列を配列番号９４として示す。
【０４７８】
同様に、ディジェネレートプライマーを用いたＰＣＲによりＰ．サリナから４２５塩基対の増幅産物を生成し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ（登録商標）にライゲーションして配列解析した。５’−および３’−ＲＡＣＥにより４２５塩基対の断片を伸長するためのプライマーを設計し、遺伝子特異的フォワードプライマー、５’−ＴＴＣＣＧＧＴＡＣＴＣＡＧＣＧＧＴＧＧＣＧ−３’（配列番号８８）およびオリゴｄＴ−ＳＰ６リバースプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにより遺伝子の３’末端を単離した。７７６塩基対の増幅産物を生成し、ｐＧＥＭ−Ｔ（登録商標）Ｅａｓｙにライゲーションして配列解析した。Ｐ．サリナｃＤＮＡライブラリーから、Ｍ１３Ｒプライマー、５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３’（配列番号８９）および遺伝子特異的リバースプライマー、５’−ＡＣＧＴＡＧＡＴＧＣＣＣＴＣＧＴＴＣＴＧ−３’（配列番号９０）とＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ（登録商標）Ｆｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼをメーカーに説明されている通りに用いたＰＣＲにより、遺伝子の５’末端を単離した。７１０塩基対の増幅産物を生成し、ｐＧＥＭ−Ｔ（登録商標）Ｅａｓｙにライゲーションして配列解析した。３種の部分配列から全長配列を組み立てた。フォワードプライマー、５’−ＣＡＣＣＧＡＡＴＧＧＣＧＡＣＴＧＡＡＧＧＧＡＴＧＣＣ−３’（配列番号９１）およびリバースプライマー、５’−ＣＴＡＣＴＣＧＧＴＴＴＴＣＡＴＧＣＧＧＴＴＧＣＴＧＧＡ−３’（配列番号９２）を用いたＲＴ−ＰＣＲにより、トータルＲＮＡから５’ＵＴＲの短い領域を有する全長コード領域を増幅した。８４６塩基対の増幅産物、Ｐａｖｓａ−Ｅｌｏ３を生成し、これをｐＧＥＭ−Ｔ（登録商標）Ｅａｓｙにライゲーションして配列解析した（配列番号９５）。Ｐ．サリナΔ９−エロンガーゼの推定アミノ酸配列を配列番号９６として示す。
【０４７９】
植物細胞におけるΔ９−エロンガーゼの機能特性評価
それぞれプラスミド０８３５６６８＿Ｅｍｉｈｕ−ｄ９Ｅ＿ｐＭＡ、ｐＧＥＭＴ＋Ｐａｖｐｉ−ｄ９ＥおよびｐＧＥＭＴ＋Ｐａｖｓａ−ｄ９Ｅから得られた、ＥｃｏＲＩ断片内に含まれているエミリアニアエロンガーゼ（Ｅｍｉｈｕ−ｄ９Ｅ）、パブロバ・ピンギス（Pavlova pinguis）エロンガーゼ（Ｐａｖｐｉ−ｄ９Ｅ）およびパブロバ・サリナエロンガーゼ（Ｐａｖｓａ−ｄ９Ｅ）のコード領域全体を３５Ｓ−ｐＯＲＥ０４のＥｃｏＲＩ部位に挿入して、３５Ｓ：Ｅｍｉｈｕ−ｄ９Ｅ（ｐＪＰ３０２７と命名）、３５Ｓ：Ｐａｖｐｉ−ｄ９Ｅ（ｐＪＰ３１０３と命名）、３５Ｓ：Ｐａｖｓａ−ｄ９Ｅ（ｐＪＰ３０８１と命名）および３５Ｓ：Ｉｓｏｇａ−ｄ９Ｅ（ｐＪＰ２０６２と命名）を作製した。実施例１に記載されている増強ニコチアナ・ベンサミアナ一過性発現システムを用いて、本明細書では陽性対照試料として用いたＩｓｏｇａ−ｄ９Ｅ（Ｑｉら、２００２）と共に、Ｅｍｉｈｕ−ｄ９Ｅ、Ｐａｖｐｉ−ｄ９ＥおよびＰａｖｓａ−ｄ９Ｅの酵素活性を植物で証明した。
【０４８０】
これらキメラベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＧＬ１に導入し、これらの培養物から得られた細胞を温室内のニコチアナ・ベンサミアナ植物体の葉組織に浸潤した。浸潤後、植物体をさらに５日間育成し、その後ＧＣ分析のためリーフディスクを採取し、生成物脂肪酸の存在により、ニコチアナ・ベンサミアナ等、植物細胞において両方の遺伝子がΔ９−エロンガーゼとして機能することが明らかになった。
【０４８１】
エミリアニア・ハクスレイＣＣＭＰ１５１６Δ９−エロンガーゼで形質転換した葉組織は、２０：２Δ１１，１４（６．６％）および２０：３Δ１１，１４，１７（６．４％）を含み、これはＬＡおよびＡＬＡからの変換効率がそれぞれ３９．９％および１２．４％であることを示した。パブロバ・ピンギスΔ９−エロンガーゼで形質転換した葉組織は、２０：２Δ１１，１４（１０．１％）および２０：３Δ１１，１４，１７（６．６％）を含み、これはそれぞれ５６．０％および１３．３％の変換効率を示した。パブロバ・サリナΔ９−エロンガーゼで形質転換した葉組織は、２０：２Δ１１，１４（７．７％）および２０：３Δ１１，１４，１７（４．６％）を含み、これはそれぞれ４５．０％および９．２％の変換効率を示した。イソクリシス・ガルバナΔ９−エロンガーゼで形質転換した葉組織は、２０：２Δ１１，１４（９．２％）および２０：３Δ１１，１４，１７（７．５％）を含み、これはそれぞれ４８．９％および１５．４％の変換効率を示した（表９）。
【０４８２】
【表９】
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0006068800.tif 000013
【０４８３】
Ｎ．ベンサミアナ葉における基質ＡＬＡの大部分がプラスチドに局在し、従ってプラスチド外の伸長に利用できないため、葉組織におけるω３基質ＡＬＡに対する明らかに高い選択性が予想された、また直接のメチル化においてプラスチドおよび細胞質ＡＬＡの両方が葉から単離されるため、ω３変換率が人為的に（artificially）減少した。Ｅ．ハクスレイおよびＩ．ガルバナΔ９−エロンガーゼは、ω３からω６への変換率０．３１のＮ．ベンサミアナにおける同一の基質選択性を提示した。ω６プールにおける最も効率的な変換は、５６．０％の基質が変換されるＰ．サリナΔ９−エロンガーゼで観察された。対照的に、１３．３％のω３基質が０．２４の比率で変換された。Ｐ．ピンギス酵素は、４５．０％のω６変換であるが９．２％のみのω３変換に起因する、変換率０．２０でω６基質に対して最も高い選択性を提示した。
【実施例８】
【０４８４】
ＡＲＡを産生するためのΔ９エロンガーゼを含む生合成経路の構築
トランスジェニックデルタ−９エロンガーゼ経路の構築
イソクリシス・ガルバナΔ９−エロンガーゼ（アミノ酸配列ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ３９０１７４−オープンリーディングフレーム：配列番号２１、アミノ酸配列：配列番号２２）、パブロバ・サリナΔ８−デサチュラーゼ（受託番号ＡＢＬ９６２９６−オープンリーディングフレーム：配列番号２３、アミノ酸配列：配列番号２４）およびパブロバ・サリナΔ５−デサチュラーゼ（受託番号ＡＢＬ９６２９５−オープンリーディングフレーム：配列番号２５、アミノ酸配列：配列番号２６）を含むバイナリーベクターを、バイナリーベクターｐＪＰ１０１ａｃｑから構築した。遺伝子挿入なしのこのベクターの設計を概略的に図１４に示す。
【０４８５】
先ず、イソクリシス・ガルバナΔ９−エロンガーゼを含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔクローンのＳｍａＩ−ＥｃｏＲＶ断片をｐＪＰ１０１ａｃｑのＳｍａＩ部位にライゲーションして、ｐＪＰ１０５を得た。パブロバ・サリナΔ５−デサチュラーゼを含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔクローンのＸｈｏＩ断片をｐＪＰ１０５のＸｈｏＩ部位にライゲーションして、ｐＪＰ１０６を得た。パブロバ・サリナΔ８−デサチュラーゼを含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔクローンのＮｏｔＩ断片をｐＪＰ１０６のＮｏｔＩ部位にライゲーションして、図１５に概略的に示すｐＪＰ１０７を得た。
【０４８６】
設計において幾つかの点が重要となる。第一に、３遺伝子の内２遺伝子をＴ−ＤＮＡにおいて異なって、すなわちお互い離して転写させた。これは、いずれかの遺伝子からの転写が向かうことにより別の遺伝子の発現に干渉する可能性を防ぎ、従って両者の発現を最大化するため行われた。第二に、この場合はΔ８−デサチュラーゼをコードする遺伝的構築物における第三の遺伝子は、スペーサーを挿入することにより、Δ９−エロンガーゼをコードする同じ方向を向いた第二の遺伝子と離間させた。上流遺伝子の終止コドンと下流遺伝子の開始コドンとの間の少なくとも１．０ｋｂの距離が、前者の転写が後者に干渉するリスク、あるいは遺伝子サイレンシングを引き起こす可能性を低減させるであろうと考えられた。第三に、３遺伝子それぞれの５’−ＵＴＲは、翻訳効率を高めることが知られているＴＭＶリーダー配列を含むよう改変した。翻訳効率を高めることが知られている他のいかなる５’ＵＴＲ配列をＴＭＶ配列の代わりに用いてもよかった。
【０４８７】
エレクトロポレーション法によりｐＪＰ１０７をアグロバクテリウム株ＡＧＬＩに導入し、この形質転換株を用いて、Δ８−デサチュラーゼの潜在的な出発脂肪酸基質として高レベルのＬＡを有するｆａｄ３／ｆａｅ１変異体であるアラビドプシス・サリアナ(Arabidopsis thaliana)生態型（ecotype）ＭＣ４９に遺伝的構築物を導入した。植物の形質転換および分析は、フローラルディップ法（floral dipping method）を用いて行った（ＣｌｏｕｇｈおよびＢｅｎｔ、１９９８）。処理植物（Ｔ０植物）から得られた種子（Ｔ１種子）をハイグロマイシン（２０ｍｇ／Ｌ）選抜培地上に播種し、形質転換植物を選抜して土壌に移し、２４株の確認されたＴ１トランスジェニック植物を確立した。これらＴ１植物の大部分は、導入した遺伝的構築物がヘテロ接合であることが予想された。２４株のトランスジェニック植物から得られたＴ２種子を成熟時に回収し、脂肪酸組成を分析した。これらＴ２系統は、遺伝的構築物においてヘテロ接合の系統のみならず、遺伝的構築物がホモ接合である系統を含んでいた。ハイグロマイシン（２０ｍｇ／ｍＬ）を含むＭＳ培地上での選抜によりトランス遺伝子の存在を判断し、最高レベルのＡＲＡを含む６系統のＴ２植物をＴ２種子から確立した。例えば、ＦＷ−１０と命名されたＴ１植物から得たＴ２種子を播種したところ、これは５．８％のＡＲＡを含み、後代のハイグロマイシン培地における感受性抵抗性の分離比は３：１を示し、これはＦＷ−１０が遺伝的構築物を単一の遺伝子座に含んでいたことを示唆した。ＦＷ−１０由来のＴ３種子ロットの脂肪酸プロファイルを分析し、データを表１０に示す。
【０４８８】
【表１０】
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【０４８９】
表１０に要約した通り、非形質転換アラビドプシス（生態型ＭＣ４９）の種子は、多量の前駆ω６基質ＬＡを含んでいたが、ＡＲＡまたはΔ９エロンガーゼ経路に沿って生成されることが予想される中間脂肪酸を全く含んでいなかった。対照的に、ｐＪＰ１０７構築物を含む形質転換植物ＦＷ１０−２３の種子は、ＬＡから始まる３酵素ステップの産物である、２１％のＡＲＡ等、顕著なレベルの２０：２ｎ−６、２０：３ｎ−６および２０：４ｎ−６（ＡＲＡ）を含んでいた。さらに、種子油における低レベルのＡＬＡ（対照ＭＣ４９では１．０％）は非常に効率的にＥＰＡへと変換され、これは形質転換系ＦＷ１０−２３における１．３％レベルで存在していた。
【０４９０】
論考：変換効率および生化学的意義
ｐＪＰ１０７構築物によりコードされた個々の酵素ステップの相対的効率は、ＦＷ−１０−２３における基質脂肪酸から生成物脂肪酸（続いて生成される誘導体を含む）への変換率を試験することにより評価することができる。ω６プールにおいて、イソクリシス・ガルバナΔ９エロンガーゼは、ＬＡからＥＤＡおよび続いて脱飽和される脂肪酸への４５％の変換を示した。同一種子において、パブロバ・サリナΔ８−デサチュラーゼおよびΔ５−デサチュラーゼは、ω６脂肪酸からその関連産物へのそれぞれ９０％および９５％の変換効率を示した。それに対して、ω３プールにおいて、イソクリシス・ガルバナΔ９エロンガーゼは、ＡＬＡから伸長産物への基本的に１００％の変換を示したが、一方パブロバ・サリナΔ８−デサチュラーゼおよびΔ５−デサチュラーゼはそれぞれ８８％および９０％の変換効率を示した。アラビドプシス・サリアナＭＣ４９バックグラウンドは低レベルのＡＬＡしか含まないにも関わらず、これら酵素ステップは１．３％ＥＰＡの合成をもたらした。最も劇的な結果において、種子油においてＡＬＡは検出されず、これはΔ９エロンガーゼによるＡＬＡからＡＬＡの伸長産物への基本的に１００％の変換を示すことに留意した。
【０４９１】
ＦＷ−１０−２３で見出された一般的ではない中間脂肪酸のレベルが低く（ω３プールでは＜０．４％）、様々なシーフードにおける食物連鎖で見出されたものと匹敵することに留意すると興味深い（表１１）。非形質転換体ＭＣ４９の種子油は低レベルのＡＬＡしか含まず、このことが観察された低レベルの例えば中間脂肪酸ＥＴｒＡに寄与した可能性があるが、より高レベルのＡＬＡを有する遺伝的バックグラウンドに同一経路が集合した場合、その結果得られた種子油が依然として比較的低レベル（＜３％）のＥＴｒＡを有することが予測される。Δ９伸長した中間体の非常に効率的な脱飽和のため、このような低レベルのこれら中間体が存在する可能性がある。
【０４９２】
【表１１】
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【０４９３】
パブロバ・サリナΔ８−デサチュラーゼが、特にΔ９エロンガーゼおよびΔ５デサチュラーゼと同時発現した場合、報告された他のΔ８−デサチュラーゼよりもＥＴｒＡからＥＴＡへの変換に大幅に効率的であることは、注目に値する。例えば、ダイズ胚においてユーグレナ・グラシリスΔ８−デサチュラーゼをユーグレナ・グラシリスまたはイソクリシス・ガルバナΔ９−エロンガーゼのいずれかと同時発現した場合、ω３およびω６基質の変換効率はそれぞれ６４％および７３％であったことが報告された。上述の実験で観察された各ステップの効率およびＡＬＡからＥＰＡへの全体的な変換効率も、僅か３．０％のＥＰＡと、続くＥＴｒＡ（４．６％）等、相当レベルの望ましくない中間体が観察されたＱｉら（２００４）によって報告されたアラビドプシス葉における効率よりも高かった。
【０４９４】
エロンガーゼは、アシルＣｏＡプールの基質のみとアクセスすることが知られている。Δ９−伸長産物がアシルＣｏＡプールに間違いなく生成されたとしても、続くΔ８−デサチュラーゼおよびΔ５−デサチュラーゼステップが形質転換種子において非常に高効率で機能することが観察されたという事実は、両方のパブロバ・サリナデサチュラーゼが高効率でアシルＣｏＡ基質にアクセスすることができる強力な目安である。
【０４９５】
Δ９−エロンガーゼ経路を用いた高レベルのＡＲＡおよびＥＰＡの生合成
個々のステップの効率に関するこれらのデータおよび観察から、改変されたΔ９−エロンガーゼ経路を用いて、アラビドプシス、キャノーラ、ダイズ，アマ種子またはワタ等、トランスジェニック植物において高レベルのＡＲＡおよびＥＰＡならびに続くＤＰＡおよびＤＨＡを生成することが可能であることが推測された。３種の酵素機能の内いずれか１種、すなわちアシルＣｏＡプールにおけるΔ９−伸長に利用できる基質ＬＡ量を増加させるアシルＣｏＡΔ１２−デサチュラーゼ機能をさらに追加することによって、第二に、ＥＰＡに直接変換するためにＡＬＡレベルを高めるようΔ１５−デサチュラーゼを追加することによって、第三に、実施例６に記載されているデサチュラーゼ等、ＡＲＡをＥＰＡに変換することのできるΔ１７−デサチュラーゼを追加することによって、さらに高レベルが達成できるとさらに推測される。より好ましくは、アシルＣｏＡΔ１２−デサチュラーゼと、Δ１５−デサチュラーゼまたはΔ１７−デサチュラーゼのいずれかの両方の追加により、最大レベルが提供されるであろう。従って、アシルＣｏＡプールにおける基質にアクセスすることのできる酵素の使用は、ＥＰＡ、ＤＨＡおよびＤＨＡへのより効率的な変換をもたらすことが予想される。
【０４９６】
アラビドプシス・サリアナＭＣ４９バックグラウンドが、低レベルのＡＬＡ蓄積（１〜３％）をもたらすｆａｄ３変異体を含んでいることを考慮した場合、観察された１．３％のＥＰＡ合成は、注目すべき予期せぬことであった。この、または同様のΔ９−エロンガーゼ経路（Δ９−エロンガーゼ、Δ８−デサチュラーゼおよびΔ５−デサチュラーゼ）を高レベルのＡＬＡを含む植物に形質転換した場合、高レベルのＥＰＡがもたらされるであろうことが予測された。例えば、ペルリア・フルテスケンス（Perilla frutescens）Δ１５−デサチュラーゼまたは他のΔ１５−デサチュラーゼ遺伝子を過剰発現するアラビドプシス系統にこの経路を形質転換することにより、種子油における総脂肪酸の少なくとも２５％のＥＰＡレベルがもたらされるであろうことが予測された。
【実施例９】
【０４９７】
植物細胞におけるＰＵＦＡ経路遺伝子の発現
植物の安定的な形質転換の代替案の一つに、Ｋａｐｉｌａら（１９９７）によって最初に導入された発現等、葉におけるトランス遺伝子の一過性発現がある。この技法によって、許容状態の葉細胞の核（Ｚｉｐｆｅｌら、２００６）を、ＴＤＮＡ境界内に発現構築物を有するアグロバクテリウム培養物を背軸の空隙へと浸潤することによって形質転換した。葉におけるトランス遺伝子の発現が、宿主細胞のトランス遺伝子サイレンシング機構を抑制してより長期間にわたってトランス遺伝子の発現を延長するＰ１９（Ｖｏｉｎｎｅｔら、２００３）やＨＣ−Ｐｒｏ（ＪｏｈａｎｓｅｎおよびＣａｒｒｉｎｇｔｏｎ、２００１；  Ｋａｓｓｃｈａｕら、２００３）等、ウイルスサプレッサータンパク質の同時導入によって顕著に増強された。
【０４９８】
葉は、プラスチドのガラクト脂質、モノガラクトシルジアシルグリセロール（ＭＧＤＧ）およびジガラクトシルジアシルグリセロール（ＤＧＤＧ）の大量のプールに支配された複雑な脂質代謝を有する。ホスファチジルコリン（ＰＣ）、コエンザイムＡ（ＣｏＡ）ならびにモノおよびジアシルグリセリド（ＭＡＧ、ＤＡＧ；ＯｈｌｒｏｇｇｅおよびＢｒｏｗｓｅ、１９９５）とエステル結合した脂肪酸等、脂肪酸のより少量のプールがプラスチド区画外に存在する。本実施例に用いられているＬＣ−ＰＵＦＡ合成酵素は小胞体（ＥＲ；Ｎａｐｉｅｒ、２００７）に存在し、そこでＰＣおよびＣｏＡとエステル結合した比較的少量の葉脂質プールとアクセスする。ＥＲにおいて活性のある産物等、ＰＣ−ＣｏＡ結合反応の代謝産物は、ジアシルグリセリド−Ｏ−アシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ；Ｂｏｕｖｉｅｒ−Ｎａｖｅら、２０００）の過剰発現によりトリアシルグリセリド（ＴＡＧ）に蓄積することができる。ＭＡＧまたはＤＡＧと比べて、ＴＡＧに存在する脂肪酸は、より代謝的に不活性であり、脂質生合成経路またはプラスチドへの輸送に再度参加する可能性が低い。重要なことに、ＴＡＧは、標準的な薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）技法を用いて、葉プラスチドに存在するより豊富な脂質クラスから容易に分離することができる。従って、促進されたＴＡＧ蓄積およびＴＡＧ／脂質クラス精製の組合せは、葉ＥＲにおけるＬＣ−ＰＵＦＡ酵素反応をより完全に理解するのに有用となり得る。
【０４９９】
ＬＣ−ＰＵＦＡ生成のため、本実施例におけるデサチュラーゼおよびエロンガーゼをコードする遺伝子を用いてこのシステムを試験した。
【０５００】
一過性発現のためのプラスミド構築物
カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５ＳプロモーターをＳｆｏＩ部位にクローニングして３５Ｓ−ｐＯＲＥ０４とした、Ｃｏｕｔｕら（２００７）により記載されたｐＯＲＥ０４バイナリーベクターの改変型に遺伝子のコード領域をクローニングすることにより、バイナリーベクターを調製した。Ｉ．ガルバナΔ９−エロンガーゼ遺伝子のコード領域（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＬ３７６２６）（配列番号２１）をゲノムＤＮＡから増幅し、３５Ｓ−ｐＯＲＥ０４のＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。植物発現コドン最適化型の３種のＰ．サリナデサチュラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＢＬ９６２９６、ＡＢＬ９６２９５およびＡＡＹ１５１３６−それぞれ国際公開第２００５／１０３２５３号パンフレットに記載）をＳｗａＩインサートとして３５Ｓ−ｐＯＲＥ０４のＥｃｏＲＶ−ＳｍａＩ部位にクローニングした。非最適化Ｐ．サリナΔ５−エロンガーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＹ１５１３５）をＸｈｏＩ−ＸｂａＩ断片として３５Ｓ−ｐＯＲＥ０４のＸｈｏＩ−ＮｈｅＩ部位にクローニングした。ＣａＭＶ３５Ｓ駆動型のＰ１９ウイルスサプレッサーは、Ｐｅｔｅｒ  Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ博士のご厚意により供与された。ＲＴ−ＰＣＲによりアラビドプシス・サリアナＤＧＡＴ１遺伝子のコード領域（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＦ１９２６２）（配列番号７４）を得て、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ断片として３５Ｓ−ｐＯＲＥ０４の対応する部位にクローニングした。ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、フィトフトラ・インフェスタンスからトータルＲＮＡを単離して、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ（ＱＩＡＧＥＮ）でＲＴ−ＰＣＲを行った。Ｐ．インフェスタンスΔ１７−デサチュラーゼのタンパク質コード領域（国際公開第２００５／０１２３１６号パンフレット）を含む、その結果生じた増幅産物をｐＧＥＭＴ−Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングして配列解析した。次に、ＥｃｏＲＩ断片を３５Ｓ−ｐＯＲＥ０４にクローニングした。
【０５０１】
アグロバクテリウム浸潤およびＮ．ベンサミアナ育成条件
各バイナリーベクターを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＧＬ１を、２８℃で適切な抗生物質を添加したＬＢ培地において培養した。培養物を遠心分離し、２容量の浸潤バッファー（５ｍＭ  ＭＥＳ、５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、ｐＨ５．７、１００μＭアセトシリンゴン）に穏やかに再懸濁し、さらに３時間培養した。各培養液の吸光度を測定し、各アグロバクテリウム構築物がＯＤ６００ｎｍ０．２に等しくなるよう、あるいは他に図１６に示されているように培養物の最終的な組合せを調製した。Ｖｏｉｎｎｅｔら（２００３）によって記載されているように、１０：１４の明：暗サイクルの２３℃の植物育成室に収容しておいた１ヶ月齢のＮ．ベンサミアナ植物体の葉の裏面に細胞を浸潤した。油性マジックで浸潤領域を円で囲んだ。浸潤後、植物体を２８℃で１時間置き、その後分析まで２４℃の植物育成室に移した。他に断りがなければ、全Ｎ．ベンサミアナアグロ浸潤は、Ｐ１９ウイルスサプレッサータンパク質を含む別々のバイナリー構築物の存在下で行った。
【０５０２】
脂質分析
本実施例において、メタノール／ＨＣｌ／ジクロロメタン（ＤＣＭ；容量で１０／１／１）溶液を用いて８０℃で２時間トランスメチル化して脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を生成した後、葉組織の脂肪酸プロファイルまたは脂質クラス試料をＧＣおよびＧＣ−ＭＳにより分析した。ＧＣおよびＧＣ−ＭＳ分析の前に、ＦＡＭＥをヘキサン：ＤＣＭ（４：１、ｖ／ｖ）に抽出し、ＤＣＭにおいて再構成した。
【０５０３】
脂質クラス分析のため、ＢｌｉｇｈおよびＤｙｅｒ（１９５９）によって記載された方法を用いて、約５０ｍｇ生重量の浸潤葉組織から総脂質を２回抽出した。プレコートしたシリカゲルプレート（シリカゲル６０、Ｍｅｒｃｋ）上でヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸（容量で７０／３０／１）を用いたＴＬＣによって中性脂質を精製し、一方、１回目の展開方向はクロロホルム／メタノール／水（容量で６５／２５／４）、２回目の展開方向はクロロホルム／メタノール／ＮＨ４ＯＨ／エチルプロピルアミン（容量で１３０／７０／１０／１）による二次元ＴＬＣを用いて、極性脂質を分画した（Ｋｈｏｚｉｎら、１９９７）。ヨウ素蒸気により脂質スポットを可視化し、バイアルに収集し、上述の通りＧＣ分析のためトランスメチル化してＦＡＭＥを生成した。上述の通りＧＣ分析により、また各脂肪酸のために注入した公知の外部標準量に従って評価された、脂肪酸存在の総量としてＴＡＧを定量化した。
【０５０４】
非極性Ｅｑｕｉｔｙ（商標）−１融合シリカキャピラリーカラム（１５ｍ×０．１ｍｍ  ｉ．ｄ．、０．１μｍフィルム厚）、ＦＩＤ、スプリット／スプリットレスインジェクターならびにＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ７６８３  Ｓｅｒｉｅｓオートサンプラーおよびインジェクターを備え付けたＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ６８９０Ｎ  ＧＣ（パロアルト、カリフォルニア州、米国）を用い、ヘリウムをキャリアーガスとして用いて、ＧＣを行った。１２０℃のオーブン温度で試料をスプリットレスモードで注入し、注入後、１０℃．ｍｉｎ−１で２０１℃にオーブン温度を上げ、最終的に２７０℃として２０分間維持した。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウエア（Ｒｅｖ  Ｂ．０３．０１（３１７）、パロアルト、カリフォルニア州、米国）を用いてピークを定量化した。ピーク反応は、オクタン酸からＤＨＡ、また数種の他のＬＣ−ＰＵＦＡに及ぶ、均等な比率の３１種の様々な脂肪酸メチルエステルを含む真正のＮｕ−Ｃｈｅｃｋ  ＧＬＣ  ｓｔａｎｄａｒｄ−４１１（Ｎｕ−Ｃｈｅｃｋ  Ｐｒｅｐ  Ｉｎｃ、ミネソタ州、米国）の脂肪酸に類似していた。ピーク間の僅かなピーク反応の変動は、各ピークのピーク面積に正規化係数を掛けることによって均衡を保った。総脂肪酸における各脂肪酸の比率を脂肪酸のそれぞれのピーク面積および全ピーク面積に基づいて算出した。
【０５０５】
４５℃に設定したオンカラム注入器を取り付けたＦｉｎｎｉｇａｎ  ＧＣＱ  Ｐｌｕｓ  ＧＣ−ＭＳイオントラップにおいてＧＣ−ＭＳを行って、生成した総新生脂肪酸の同一性を確認した。ＡＳ２０００オートサンプラーを用いて、非極性ＨＰ−５  Ｕｌｔｒａ  ２結合相カラム（５０ｍ×０．３２ｍｍ  ｉ．ｄ．×０．１７μｍフィルム厚）を取り付けた保持ギャップに試料を注入した。４５℃の初期温度を１分間維持、続いて３０℃．ｍｉｎ−１で１４０℃、その後３℃．ｍｉｎ−１で３１０℃に上げて１２分間維持の温度プログラムを行った。ヘリウムをキャリアーガスとして用いた。質量分析器の操作条件は、電子衝突エネルギー７０ｅＶ、放出電流２５０μａｍｐ、トランスファライン３１０℃、ソース温度２４０℃、走査速度０．８ｓｃａｎｓ．ｓ−１および質量範囲４０〜６５０ダルトンである。質量スペクトルを得て、Ｘｃａｌｉｂｕｒ（商標）ソフトウエアで処理した。
【０５０６】
一過性発現した脂肪酸エロンガーゼによるＮ．ベンサミアナ脂肪酸プロファイルの修飾
機能的トランスジェニック酵素の最大量の産生を得るために必要とされるアグロバクテリウム濃度を評価するため、Ｎ．ベンサミアナ葉に豊富であることが知られているＣｏＡ結合リノール酸（ＬＡ）およびＡＬＡ基質に作用することが知られたイソクリシス・ガルバナΔ９−エロンガーゼ（ＩｇＡ９ｅｌｏ；Ｑｉら、２００２）をコードする遺伝子を発現させた。この遺伝子をバイナリーベクターのカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター下流に導入した後、宿主の媒介するトランス遺伝子サイレンシングを抑制するためのＰ１９ウイルスサプレッサータンパク質の存在下、この構築物をＮ．ベンサミアナ葉にアグロ浸潤し、Δ９−伸長レベルを評価した。ＯＤ６００＝０．２を有するアグロバクテリウム培養物によって得られたほぼ最大の遺伝子活性により、ＬＡおよびＡＬＡの伸長産物である、それぞれＥＤＡおよびＥＴｒＡを検出した（図１６）。しかし、興味深いことに、非常に希釈した培養物濃度（ＯＤ６００＝０．０５ほどの低さ）のアグロ浸潤でも容易に検出できるレベルの酵素活性をもたらすことを記した。
【０５０７】
一過性ＤＧＡＴ発現のトリアシルグリセロール蓄積への効果
次に、Ｎ．ベンサミアナ葉におけるＴＡＧプールのサイズが増加して、ＥＲで作用する導入脂肪酸生合成酵素の生成物を得るためのより大きなシンクを提供することができるか調べた。葉は自然状態では低レベルのＴＡＧしか生成しないため、葉のＴＡＧプールを増加させる可能性のある手段として、Ｋｅｎｎｅｄｙ経路によりＴＡＧ生合成の最後のステップを触媒するアラビドプシス・サリアナＤＧＡＴ１（ＡｔＤＧＡＴ１）遺伝子を含む構築物を試験した。上述の通りに、アグロ浸潤によって構築物をＮ．ベンサミアナ葉に導入した。ＴＡＧの存在を試験するため、１％ナイルブルー水溶液（ＢＤＨ、プール、英国）の入った小型のペトリ皿に約１ｃｍ２サイズの浸潤した葉の切片を浸し、３分間減圧浸潤し、水で手早くリンスし、１％酢酸で３分間インキュベートし、水中でマウントして観察した。Ｌｅｉｃａ  ＳＰ２レーザー走査型共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、シドニー、オーストラリア）で４８８ｎｍで励起することにより、５７０〜６７０ｎｍの蛍光発光を集光した。同一葉の非形質転換領域を対照として用いた。ＩｍａｇｅＪソフトウエアを用いて各アッセイにおけるＴＡＧ蓄積の相対量を評価した。
【０５０８】
アラビドプシス・サリアナＤＧＡＴ１（ＡｔＤＧＡＴ１）の一過性発現は、ナイルブルーで染色して共焦点顕微鏡により観察したところ、顕著により多量の脂肪体の生成をもたらした。他の葉脂質クラスから中性相ＴＬＣ分離により総脂質をＴＡＧに分画することにより、ＴＡＧの増加を定量化し、その後ＴＡＧ量をＴＡＧ画分における総脂肪酸量として測定した。Ｐ１９またはＰ１９とＡｔＤＧＡＴ１の同時の一過性発現は、それぞれＴＡＧを４６μｇ．ｇ−１生重量から２０６μｇ．ｇ−１生重量へと増加させ、これはＤＧＡＴ１遺伝子の添加が、葉組織に蓄積したＴＡＧレベルを上昇させたことを示した。従って、他に断りがない限り、この遺伝子は次の実験に含まれる。
【０５０９】
外因性脂肪酸基質の一過性発現遺伝子への有用性
次に、Ｎ．ベンサミアナに天然には存在しない外因性脂肪酸基質を葉に供給することができ、トランス遺伝子の媒介する変換に有用となり得るかを調べ、これにより個々の酵素ステップを個別に試験した。これを試験するため、Ｎ．ベンサミアナに天然には存在しない基質であるＡＲＡに作用するフィトフトラ・インフェスタンスΔ１７−デサチュラーゼ（ＰｉΔｌ７ｄｅｓ）をコードする遺伝子をアグロ浸潤し、ＥＰＡを生成させた。ＰｉΔｌ７ｄｅｓ浸潤の４日後、アグロバクテリウム培養物を用いた葉の形質転換で行われたのと同様の仕方の注入により、葉にＡＲＡアンモニウム塩を摂取させた。続いて基質を葉に４時間代謝させ、その後葉組織から総脂質を抽出した。これら総脂質のＧＣおよびＧＣ−ＭＳ分析は、体外から摂取させたＡＲＡの３７％がΔ１７−脱飽和によりＥＰＡへと変換され、その効率は酵母ベースのアッセイで報告された効率に相当することを示した（国際公開第２００５／０１２３１６号パンフレット）。
【０５１０】
別個のバイナリーベクターから５段階ＬＣ−ＰＵＦＡ経路の迅速な集合
Ｎ．ベンサミアナシステムが、単一トランス遺伝子の機能およびＴＡＧ蓄積促進の決定に有用なツールであることを確立し、システムを全ＬＣ−ＰＵＦＡ経路の集合に用いることのできる範囲を調べた。本研究において、２種の平行した直線的ＬＣ−ＰＵＦＡ経路、すなわちＬＡをＤＰＡω６に変換するω６−経路およびＡＬＡをＤＨＡに変換するω３−経路を生じる５種のＬＣ−ＰＵＦＡ代謝酵素をコードする遺伝子を試験した（図１）。用いた生合成遺伝子は、イソクリシス・ガルバナΔ９−エロンガーゼ（ＩｇΔ９ｅｌｏ）、パブロバ・サリナΔ８−デサチュラーゼ（ＰｓΔ８ｄｅｓ）、Ｐ．サリナΔ５−デサチュラーゼ（ＰｓΔ５ｄｅｓ）、Ｐ．サリナΔ５−エロンガーゼ（ＰｓΔ５ｅｌｏ）およびＰ．サリナΔ４−デサチュラーゼ（ＰｓΔ４ｄｅｓ；Ｑｉら、２００４；Ｒｏｂｅｒｔら、２００９；Ｚｈｏｕら、２００７）であった。上述の通り、各遺伝子を別個に植物バイナリー発現ベクターのＣａＭＶ３５Ｓプロモーター下流にクローニングし、それぞれＯＤ６００ｎｍ＝０．２濃度で存在するこれら構築物の混合物を、ＡｔＤＧＡＴ１およびＰ１９と共にＮ．ベンサミアナ葉の背軸面にアグロ浸潤し、合計７種の個々の構築物を合計ＯＤ６００ｎｍ＝１．４とした。
【０５１１】
浸潤５日後、リーフディスクをサンプリングし、新鮮な組織から直接脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を生成して分析し、ＧＣ／ＭＳにより同定した（表１２）。経路の全酵素がω６またはω３ＰＵＦＡのいずれかを基質として受容できること、そしてこれらのＬＡまたはＡＬＡへの連続作用がそれぞれＬＣ−ＰＵＦＡ、ＡＲＡおよびＤＨＡの合成をもたらすことは明らかであった。新規に生成されたＬＣ−ＰＵＦＡ全体の比率、１６．９％が同定され、これは９．８％ω６ＬＣ−ＰＵＦＡおよび７．１％ω６ＬＣ−ＰＵＦＡを含んでいた。これら新規に生成されたＬＣ−ＰＵＦＡ、ＡＲＡ、ＥＰＡおよびＤＨＡの全ては栄養的に重要であると考えられ、これらは葉組織における総脂肪酸のそれぞれ３．６％、２．６％および１．１％を構成する。ω６およびω３経路の各ステップに関して酵素による変換効率を算出し、以前報告された効率と比較した（図１７）。ω６およびω３両方の５段階経路の最初の３ステップは、Ｑｉら（Ｑｉら、２００４）によって記載された効率と比べて同様の効率であったが、一方経路の最後の２ステップの効率はＲｏｂｅｒｔら（Ｒｏｂｅｒｔら、２００５）の用いた効率と同じであった。この一過的に発現した遺伝子と安定的に発現した遺伝子との比較は、経路を導入する両者の方法が同様の代謝フラックスまたは効率を生じることを示した。総脂肪酸プロファイルから計算したこれら変換効率は、プラスチドにおける大量のＬＡおよびＡＬＡプールの希釈効果のため、特にΔ９−伸長の第一のステップが過小評価された可能性がある。後述の通り脂質クラスを分画することにより、この問題を対処した。
【０５１２】
【表１２】
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0006068800.tif 000019
【０５１３】
ＬＣ−ＰＵＦＡの脂質クラス区分化
ＴＡＧリン脂質とプラスチドのガラクト脂質との間の新規合成ＬＣ−ＰＵＦＡの区分化を評価するため、ＬＣ−ＰＵＦＡ経路遺伝子を一過的に発現するＮ．ベンサミアナの総脂質を上述の通り脂質クラス分画に付し、その脂肪酸プロファイルを決定した（表１３）。Ｎ．ベンサミアナ葉脂質は、高等植物の葉に特有の脂質クラスおよび脂肪酸プロファイルを含む（Ｆｒａｓｅｒら、２００４；Ｍｏｒｅａｕら、１９９８）。新規合成ω６およびω３ＬＣ−ＰＵＦＡは、主に通常プラスチドの外に存在する脂質クラスに限定されるが、一方プラスチドの脂質は本質的にこれら脂肪酸を欠く。例えば、ＴＡＧおよびリン脂質（ＰＣ、ＰＥおよびＰＡ）（主要なプラスチド外の葉脂質）は、それぞれ最大２０．４％および１６．９％の新規合成ω６およびω３ＬＣ−ＰＵＦＡを含んでいた。興味深いことに、全ＬＣ−ＰＵＦＡ経路、ＡｔＤＧＡＴ１およびＰ１９を発現する葉は、３７％のＬＣ−ＰＵＦＡで強化したＴＡＧを生成した。特に興味深いことに、栄養的に重要な脂肪酸ＡＲＡ、ＥＰＡおよびＤＨＡは、それぞれ葉のＴＡＧに７．２％、５．９％および３％の存在で蓄積した。分画化により、主要なプラスチド脂質クラス、ＭＧＤＧ、ＤＧＤＧおよびＰＧが新規合成ω６およびω３ＬＣ−ＰＵＦＡのそれぞれ１．１％および０．３％のみを含んでいたことが明らかになった。これらプラスチド脂質クラスは、葉における脂肪酸の最大プールを集合的に表すが、これらクラスはＴＡＧと比べて少量のω６およびω３ＬＣ−ＰＵＦＡしか含んでいなかった。興味深いことに、ＳＱＤＧ脂質クラスは、新規合成ＬＣ−ＰＵＦＡを完全に欠いていた。
【０５１４】
プラスチド脂質に接近できない、ＴＡＧの脂肪酸のためのＥＲに関連するＬＣ−ＰＵＦＡ経路の各ステップにおける酵素の効率を脂質クラス分画も用いて算出した（図１７）。これら計算からプラスチド脂質クラスを取り除くことは、ＡＬＡからＥＴｒＡへのΔ９−伸長ステップに最も劇的な効果を有し、これは変換効率を１６％から５５％へと増加させた。このステップの酵素による変換効率におけるこの３倍増加は、このＥＲ関連酵素には無効のプラスチドにおけるＡＬＡの大量のプールに起因する（表１３）。
【０５１５】
【表１３】
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0006068800.tif 000021
【０５１６】
論考
これら実験により、Ｎ．ベンサミアナまたは他の植物の葉における一連の経路遺伝子の一過性発現は安定的な形質転換植物における発現を模倣し、従って十分に適切であり、種子におけるＬＣ−ＰＵＦＡ油脂生成のための経路の発現を予測できることが示された。一過性発現システムは、複数ステップの組換え経路において単一成分を容易に交換することのできる、経路全体の迅速で信頼のおける結果をもたらす互換性発現プラットフォームを提供した。ＬＣ−ＰＵＦＡ生合成の一過性の集合は、強力であり再現性があった。３回反復してアッセイを行い、通常５％未満の標準誤差を有する緊密なデータポイントを作成した。
【０５１７】
集合したＬＣ−ＰＵＦＡ経路における第一のステップであるΔ９伸長は、安定的に形質転換した植物で以前に観察された通り（Ｆｒａｓｅｒら、２００４）、ＡＬＡよりもＬＡで高い率の伸長を示した。酵母における発現においてＩｇΔ９エロンガーゼがＬＡとＡＬＡで等しい選択性を有することを示したため、この差は酵素の脂肪酸基質選択性では説明することができない（Ｑｉら、２００２）。ＬＡで観察されたより高い率の伸長が、葉のプラスチド外アシルＣｏＡプール（エロンガーゼが作用する部位）にＡＬＡより多量のＬＡが存在することの反映である可能性がさらにある（Ｄｏｍｅｒｇｕｅら、２００３；Ｆｒａｓｅｒら、２００４）。
【０５１８】
脂質クラス分析は、新規生成したＬＣ−ＰＵＦＡの全てがＰＣプールとＴＡＧの両方においてほぼ等しい比率で存在すること示した。ＰＣと比べてＴＡＧで豊富ではないＤＴＡおよびＤＰＡを生成するΔ５−伸長である、経路における最後から２番目のステップの生成物はこの比率に僅かな変動があった。反対に、最後のΔ４脱飽和の生成物である、ＤＰＡω６およびＤＨＡは、ＰＣと比べてＴＡＧ選択的に蓄積した。これらの変動は、膜編集酵素またはＡｔＤＧＡＴ１のこれら生成物に対する微妙な偏りを反映し得る。Δ５−伸長およびＤＧＡＴ活性の両方がＣｏＡプールに生じ、これら酵素間の基質に対する競合がこれらＰＣおよびＴＡＧプールにおける脂肪酸の存在を変化させ得ることは、注目に値する。
【０５１９】
本研究から、幾つかの予測がなされる。第一に、一過性の葉に基づくアッセイは、単独あるいは複雑な組合せで脂肪酸酵素の評価に適切であることを示した。これは特に、本研究におけるＬＣ−ＰＵＦＡ等、Ｎ．ベンサミアナの内因性脂肪酸プロファイルから容易に識別できる脂肪酸を生成する酵素に適切である。単離酵素およびＬＣ−ＰＵＦＡの油脂への迅速な集合に対する脂肪酸摂取アッセイの証明は、一過性葉アッセイがＥＲ関連脱飽和、伸長およびＴＡＧ集合に良く適していることを示した。第二に、ＬＣ−ＰＵＦＡ油脂は植物形質転換技術の現下の標的であるが、葉細胞は他の異種発現プラットフォームに対する一連の利点を提供する。葉細胞は、他の発現宿主では利用できない広範囲の代謝産物を提供し、現在これらは組換え経路を必要とする修飾の標的となり得る。さらに、植物は、ＲＮＡ編集、翻訳後修飾およびオルガネラ局在等、真核生物トランス遺伝子をより忠実に処理する。
【０５２０】
最後に、Ｎ．ベンサミアナアッセイは、ｃＤＮＡライブラリースクリーニングアッセイに適切となり得る。この示唆は、葉における単一の浸潤区画において７種の異なる遺伝子のほぼ最大の活性が検出されることに基づいており、これはこの構造において、バイナリー発現ベクター内にクローニングしたｃＤＮＡライブラリーが葉に系統的に浸潤できることを示す。計算は、ＯＤ６０００．２のＰ１９を含む少なくとも７種の異なるクローンを単一スポットに発現させることができることを示唆する。あるいは、不完全または部分経路を形成する遺伝子を各浸潤に添加することができ、従ってプールしたライブラリークローンを新規ステップまたはフラックス改善のためルーチンで試験することができる。
【実施例１０】
【０５２１】
植物細胞における効率的なＤＨＡ生合成
実施例１に記載されている増強ニコチアナ・ベンサミアナ一過性発現システムを用いて、アラビドプシス・サリアナＤＧＡＴ１（配列番号７５によりコードされた配列番号７４）と共に、ミクロモナスＣＣＭＰ１５４５Δ６−デサチュラーゼ（配列番号７によりコードされた配列番号８）、ピラミモナスＣＳ−０１４０Δ６−エロンガーゼ（配列番号３によりコードされた配列番号４）、パブロバ・サリナΔ５−デサチュラーゼ（配列番号２５によりコードされた配列番号２６）、ピラミモナスＣＳ−０１４０Δ５−エロンガーゼ（配列番号５によりコードされた配列番号６）およびパブロバ・サリナΔ４−デサチュラーゼ（配列番号７２によりコードされた配列番号７３）の酵素活性を植物体で示した。
【０５２２】
ＳｗａＩ断片内に含まれているｐＧＡ４の全コード領域を３５Ｓ−ｐＯＲＥ０４（実施例４、上述）のＳｍａＩ−ＥｃｏＲＶ部位に挿入してｐＪＰ２０６４を作製することによって、構成的３５Ｓプロモーターの制御下でΔ６−デサチュラーゼをコードする遺伝的構築物３５Ｓ：Ｍｉｃ１５４５−ｄ６Ｄを構築した。ＳｗａＩ断片内に含まれている０８０４６７３＿Ｐｙｒｃｏ−ｅｌｏ１＿ｐＧＡ１８の全コード領域を３５Ｓ−ｐＯＲＥ０４のＳｍａＩ−ＥｃｏＲＶ部位に挿入してｐＪＰ２０６０を作製することによって、Δ６−エロンガーゼをコードする遺伝的構築物３５Ｓ：Ｐｙｒｃｏ−ｄ６Ｅを構築した。ＳｗａＩ断片内に含まれている０８０４６７４＿Ｐａｖｓａ−ｄ５Ｄ＿ｐＧＡ１５の全コード領域を３５Ｓ−ｐＯＲＥ０４のＳｍａＩ−ＥｃｏＲＶ部位に挿入してｐＪＰ２０６７を作製することによって、Δ５−デサチュラーゼをコードする遺伝的構築物３５Ｓ：Ｐａｖｓａ−ｄ５Ｄを構築した。ＳｗａＩ断片内に含まれている０８０４６７５＿Ｐｙｒｃｏ−ｅｌｏ２＿ｐＧＡ４の全コード領域を３５Ｓ−ｐＯＲＥ０４のＳｍａＩ−ＥｃｏＲＶ部位に挿入してｐＪＰ２０６１を作製することによって、Δ５−エロンガーゼをコードする遺伝的構築物３５Ｓ：Ｐｙｒｃｏ−ｄ５Ｅを構築した。ＳｗａＩ断片内に含まれている０８０４６７６＿Ｐａｖｓａ−ｄ４Ｄ＿ｐＧＡ１５の全コード領域を３５Ｓ−ｐＯＲＥ０４のＳｍａＩ−ＥｃｏＲＶ部位に挿入してｐＪＰ２０６８を作製することによって、Δ４−デサチュラーゼをコードする遺伝的構築物３５Ｓ：Ｐａｖｓａ−ｄ４Ｄを構築した。ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ断片内に含まれているｐＸＺＰ５１３Ｅの全コード領域を３５Ｓ−ｐＯＲＥ０４のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ部位に挿入してｐＪＰ２０７８を作製することによって、酵素ＤＧＡＴ１をコードする遺伝的構築物３５Ｓ：Ａｒａｔｈ−ＤＧＡＴ１を構築した。
【０５２３】
これらキメラベクターを別個にアグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＧＬ１へと導入し、これらの培養物から得られたトランスジェニック細胞を混合し、混合物を温室内のニコチアナ・ベンサミアナ植物体の葉組織に浸潤させた。浸潤後、さらに５日間植物体を育成し、その後ＧＣ分析のためリーフディスクを採取し、これにより遺伝子がニコチアナ・ベンサミアナにおいてＤＨＡ生成に機能していることを明らかにした。これら遺伝子で形質転換した葉組織は、ＳＤＡ（２．３％）、ＥＴＡ（０．７％）、ＥＰＡ（０．８％）、ＤＰＡ（２．８％）およびＤＨＡ（４．４％）を含んでいた（表１４）。葉組織は、微量のＧＬＡ、ＥＴＡおよびＡＲＡも含んでいた。変換効率は次の通りである。細胞で生成されたＡＬＡの１７．４％がＥＰＡに変換され（続いてＤＰＡまたはＤＨＡに変換されるＥＰＡを含む）；ＡＬＡの１５．５％がＤＰＡまたはＤＨＡに変換され；細胞で生成されたＡＬＡの９．６％がＤＨＡに変換され；一方、Δ６−脱飽和され、細胞で生成されたＡＬＡの４０％が続いてＤＨＡに変換された。本実験におけるトランス遺伝子の一過性発現のため、安定的に形質転換された細胞においては上述よりも高い効率が期待されるであろう。
【０５２４】
葉組織から抽出した総脂質をＴＬＣにより分画して脂質クラスを分離し、ＦＡＭＥによりＴＡＧおよび極性脂質画分を脂肪酸組成のため分析した場合、ＴＡＧにおけるＤＨＡレベルが総脂肪酸の割合として７％であり、極性脂質においてはＤＨＡレベルが２．８％であることが観察された。極性脂質クラスにおいてより低レベルであったことは、極性脂質を好む葉における葉緑体脂質の相対的寄与率、およびトランス遺伝子の宿主細胞ゲノムへの安定的な挿入ではなくむしろ遺伝子の一過性発現に起因すると考えられる。
【０５２５】
【表１４】
0006068800.tif 000022
【０５２６】
本実験は、単離されたミクロモナスＣＣＭＰ１５４５Δ６−デサチュラーゼが、ω６基質ＬＡと比べてω３基質ＡＬＡに対し十分な選択性を有することを示した。実験は、適切な遺伝子の発現が葉において十分な割合のＬＣ−ＰＵＦＡ、特にＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡの蓄積をもたらし得ることも示した。
【０５２７】
本実験は、様々な脂肪酸生合成経路を迅速に試験するため、また遺伝子の最適な組合せを選択するためのニコチアナ・ベンサミアナ一過性アッセイシステムの使用も示した。このシステムは、生合成経路全体の比較と同様に、相同的な機能を有する遺伝子の相対活性を迅速に比較するために用いることができる。
【０５２８】
論考：葉および種子組織における効率的なＤＨＡ合成
このデータに基づき、種子特異的プロモーターをこの組合せの遺伝子または同様のセットの発現に用いた場合、同一レベルまたはより高レベルのＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡが種子に生成されるであろうことが予測された。観察されたＡＬＡからＥＰＡへの、そしてＤＰＡおよびＤＨＡへの効率的な脂肪酸フラックスは、効率的なエロンガーゼとアシルＣｏＡデサチュラーゼの組合せ、従って主にアシルＣｏＡプールに存在する脂肪酸に作用することに起因すると考えられた。さらに、トランスジェニック植物の葉と種子の両方における、または種子および葉以外の別の組織におけるＥＰＡ、ＤＰＡ、ＤＨＡおよびその他のＬＣ−ＰＵＦＡの生成が、適切な組織特異性を有するプロモーターまたはプロモーターの組合せの使用によって達成できることが予測される。融合プロモーターは、両方の組織型における酵素の生成を促進することができるであろう。その結果生じた植物は、特に種子からの油脂抽出と、加工が最小限の原料（feedstock）の両方に有用となるであろう。
【実施例１１】
【０５２９】
植物細胞におけるさらに効率的なＤＨＡ生合成
実施例１および実施例１０に記載されている増強ニコチアナ・ベンサミアナ一過性発現システムを用いて、アラビドプシス・サリアナＤＧＡＴ１（配列番号７５によりコードされた配列番号７４）と共に、ミクロモナスＣＣＭＰ１５４５Δ６−デサチュラーゼ（配列番号７によりコードされた配列番号８）、ピラミモナスＣＳ−０１４０Δ６−エロンガーゼ（配列番号３によりコードされた配列番号４）、パブロバ・サリナΔ５−デサチュラーゼ（配列番号２５によりコードされた配列番号２６）、ピラミモナスＣＳ−０１４０Δ５−エロンガーゼ（配列番号５によりコードされた配列番号６）およびパブロバ・サリナΔ４−デサチュラーゼ（配列番号７２によりコードされた配列番号７３）の酵素活性を植物体において証明した。より若く健常なＮ．ベンサミアナ植物体を用いることによって、この実験を最適化した。
【０５３０】
実施例１０に記載されているこれらキメラベクターを別個にアグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＧＬ１に導入し、これらの培養物から得られたトランスジェニック細胞を混合し、混合物を温室内のニコチアナ・ベンサミアナ植物体の葉組織に浸潤させた。浸潤後さらに５日間植物体を育成し、その後ＧＣ分析のためリーフディスクを採取し、これにより、これら遺伝子がニコチアナ・ベンサミアナにおけるＤＨＡ生成に機能していることを明らかにした（表１５および１６）。これら遺伝子で形質転換した葉組織は、ＳＤＡ（２．０％）、ＥＴＡ（０．４％）、ＥＰＡ（０．７％）、ＤＰＡ（４．３％）およびＤＨＡ（４．４％）を含んでいた。葉組織は、微量のＧＬＡ、ＥＴＡおよびＡＲＡも含んでいた。変換効率は、次の通りであった。細胞に生成されたＡＬＡの２３．４％はＥＰＡに変換され（続いてＤＰＡまたはＤＨＡに変換されるＥＰＡを含む）；ＡＬＡの２１．６％はＤＰＡまたはＤＨＡに変換され；細胞に生成されたＡＬＡの１０．９％はＤＨＡに変換され；一方、細胞に生成され、Ｄ６−脱飽和されたＡＬＡの３７．２％は次にＤＨＡに変換された。本実験におけるトランス遺伝子の一過性発現のため、安定的に形質転換した細胞において上述よりも高い効率が予想されるであろう。
【０５３１】
葉組織から抽出した総脂質をＴＬＣにより分画して脂質クラスを分離し、ＴＡＧおよび極性脂質画分を脂肪酸組成のためにＦＡＭＥにより分析した場合、ＴＡＧにおけるＤＨＡレベルが総脂肪酸の割合として１５．９％であり、極性脂質においてＤＨＡレベルが４．４％であることが観察された。極性脂質クラスにおけるより低いレベルは、極性脂質を好む葉における葉緑体脂質の相対的寄与率と、トランス遺伝子の宿主細胞ゲノムへの安定的な挿入ではなくむしろ遺伝子の一過性発現に起因すると考えられた。
【０５３２】
【表１５】
0006068800.tif 000023
0006068800.tif 000024
【０５３３】
【表１６】
0006068800.tif 000025
【０５３４】
論考：葉および種子組織におけるより効率的なＤＨＡ合成
この結果は、葉と種子組織との間のプラスチド外脂質合成メカニズムが実質的に保存されているため、種子ＴＡＧ収量における同様の進歩のための道を拓くであろう（ＯｈｌｒｏｇｇｅおよびＢｒｏｗｓｅ、２００４；Ｂａｔｅｓら、２００７）。数種の要素がこの大幅な生成増加の原因となり得ると仮定される。１．ω３特異的アシルＣｏＡΔ６−デサチュラーゼの使用は、ω３経路へのフラックスを増加させ、続く代謝ステップの平行なｗ６基質との競合を減少させ；２．高度に効率的なΔ５−エロンガーゼは、ＤＨＡへのΔ４−脱飽和に利用できるＤＰＡ量を明らかに増加させ；３．独立した転写ユニットの使用およびウイルスサプレッサータンパク質（Ｐ１９）の使用による遺伝子サイレンシングの減少。
【０５３５】
ＡＡ（２０：４Ｄ５，８，１１，Ｉ４）をＥＰＡに変換するのに必要な、追加的なΔ１７−デサチュラーゼ活性が必要とされず、従って代謝工学および調節上の課題を簡略化するため、Δ６−デサチュラーゼにより示された高度なω３選択性は、ω３ＬＣ−ＰＵＦＡ  ＥＰＡおよびＤＨＡを蓄積する陸生植物の設計を試行する場合、明らかに望ましい。
【０５３６】
上述の最適化されたステップに加えて、高度に効率的なＰ．コルダタΔ５−エロンガーゼの使用は、高ＤＨＡおよび低中間体含有量で有名な魚油であるマグロ油に酷似したＴＡＧ（油脂）画分の脂肪酸プロファイルをもたらした（図１８）。また、Ｐ．コルダタΔ５−エロンガーゼによって示されたＮ．ベンサミアナにおける活性は、予想された群を抜いて最も高効率のΔ５−伸長であり、この遺伝子の使用は、トランスジェニックＤＨＡ生成の他の試みにおいて見られたΔ５−伸長の大きな障害を効果的に克服する。
【０５３７】
最後に、最適な遺伝子の使用が明らかに必要とされるが、これらトランス遺伝子を導入した（すなわち、独立した発現カセットとして、遺伝子サイレンシングサプレッサーの存在下で）方法が、本研究で達成された高レベルのＤＨＡに重要な役割を果たすであろうと考えられる。従って、ＬＣ−ＰＵＦＡ生成の代謝工学は、宿主ゲノムにランダムに挿入された相対的に大きな複数遺伝子構築物に非常に依存しており、この方法により多くのグループが良好な結果を得たが、全トランス遺伝子が等しい発現を示す事象を得ることが困難であるとの兆候がある（国際公開第２００４／０１７４６７号パンフレット）。さらに、サイレンシング効果は世代にわたって効率を低減させることができる（Ｍａｔｚｋｅら、２００１）。独立的に集合したユニットにおけるｄｅ  ｎｏｖｏセントロメア形成およびミニ染色体設計に関連する人工染色体等、代替的な形質転換アプローチが、最終的に成功した安定的なＬＣ−ＰＵＦＡ代謝工学に必要とされ得る可能性がある（Ｙｕら、２００７）。
【実施例１２】
【０５３８】
単一生物由来の遺伝子を用いたＡＬＡからＤＨＡへの全経路のトランスジェニックによる集合
Δ９−エロンガーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ５−エロンガーゼおよびΔ４−デサチュラーゼからなるＰ．サリナ由来の酵素をコードする遺伝子を用いて、ＡＬＡからＤＨＡへの全経路を再構成し、Ｎ．ベンサミアナにおいて集合させた。アグロ浸潤５日後の全葉組織のＧＣ分析は、０．７％ＤＨＡの生成を示した（表１７）。これは、単一生物由来の遺伝子からなるＡＬＡからＤＨＡへのトランスジェニック経路が報告された初めてのことである。
【０５３９】
【表１７】
0006068800.tif 000026
【実施例１３】
【０５４０】
植物の発達種子におけるＶＳＰの特異的発現
最初に、５種のウイルスサプレッサータンパク質（ＶＳＰ）、すなわちＰ１９、Ｖ２、Ｐ３８、ＰｅＰｏおよびＲＰＶ−Ｐ０のタンパク質コード領域を、植物組織における強い構成的発現のための３５Ｓプロモーターの制御下バイナリーベクターｐＡＲＴ２７（Ｇｌｅａｖｅ、１９９２）に挿入した。これらタンパク質は、次の通りＶＳＰとして特徴付けられていた。Ｐ１９は、２１ヌクレオチド長のｓｉＲＮＡと結合し、その後相同性ＲＮＡのアルゴノート誘導切断を誘導する、トマトブッシースタントウイルス（ＴＢＳＶ）由来のサプレッサータンパク質である（Ｖｏｉｎｎｅｔら、２００３）。トマトＹｅｌｌｏｗ  Ｌｅａｆ  Ｒｏｌｌウイルス（ＴＹＬＲＶ）由来のサプレッサータンパク質であるＶ２は、ｓｓＲＮＡ基質から二本鎖ＲＮＡ中間体を形成するのに必要と考えられるタンパク質（Ｂｅｃｌｉｎら、２００２）である植物タンパク質ＳＧＳ３と結合する（Ｇｌｉｃｋら、２００８）。Ｐ３８は、カブクリンクルウイルス（ＴＣＶ）由来のサプレッサータンパク質であり、ｓｉＲＮＡ生成に決定的なＲＮＡ依存的ポリメラーゼ活性（ＲｄＲＰ）を阻害し、ダイサータンパク質ＤＣＬ４と結合する（ＤｉｎｇおよびＶｏｉｎｎｅｔ、２００７）。Ｐｏｌｅｒｏｖｉｒｕｓ由来のＰｅＰｏやＲＰＶ−Ｐ０等、Ｐ０タンパク質は、分解を促進するためのアルゴノートタンパク質を標的とする（Ｂａｕｍｂｅｒｇｅｒら、２００７；Ｂｏｒｔｏｌａｍｉｏｌら、２００７）。サイレンシングサプレッサーとしてトランス遺伝子発現を増加させるためのこれらタンパク質の機能を確立するため、アグロバクテリウム内の５種の３５Ｓ駆動ＶＳＰ構築物は、ニコチアナ・ベンサミアナ葉に３５Ｓ駆動ＧＦＰ構築物と共に同時浸潤した。全事例において、ＶＳＰの存在はＧＦＰの発現を増加させて拡大し、アグロバクテリウム株で接種後、特に４日後に増加レベルのＧＦＰ遺伝子活性を上昇させ、このアッセイ形式におけるサイレンシングサプレッサーとしてのタンパク質の機能を確認した。
【０５４１】
ＶＳＰの発現が種子特異的ＦＰ１プロモーター（Ｅｌｌｅｒｓｔｒｏｍら、１９９６）の制御下にあり、双子葉植物の発達種子の子葉にＶＳＰ発現を提供できるよう、５種のＶＳＰコード領域をそれぞれｐＡＲＴ２７バックボーンベクターに基づくｐＸＲＺ３９３である第二のバイナリーベクターに挿入した。実施例１に記載されている方法に従い、構築物を用いて形質転換アラビドプシス植物を作出した。ＶＳＰをコードする各キメラ遺伝子の少なくとも２０株の形質転換植物を得た。選択培地および土壌におけるその生長によって示される通り、植物体は生育可能で表現型は大部分が正常であり、生育可能な種子をつける稔性のある（fertile）成熟植物体へと正常に生長した。実生において変化して見える唯一の形態学的表現型は、Ｐ１９、ＰｅＰｏおよびＲＰＶ−Ｐ０の発芽後の一部の種子から出現する子葉に見られた。Ｐ１９を種子特異的にコードする構築物で形質転換した小植物は、野生型小植物に特有の下向きの湾曲がない、平坦な棍棒状の子葉を持っていた。ＰｅＰｏをコードする構築物で形質転換した小植物は、子葉が内側または凹形に湾曲して上を指す「バレリーナ」表現型を生成した。これら植物の本葉は正常に発達した。ＲＰＶ−Ｐ０を発現する小植物は毛が密生（bushy）し、栄養生長を通じて毛が密生する生育習性を保つ傾向があった。Ｖ２およびＰ３８の小植物は、目に見える顕著な表現型を示さなかった。
【０５４２】
子葉発達以外では、Ｐ１９およびＰｏＰｅ構築物で形質転換した小植物（plantlet）は正常に生育し、続く生長および発達において対照植物と区別できなかった。本実験でＶＳＰを発現するプロモーター、ＦＰ１は、種子発達におけるアラビドプシスの発達子葉における限定的だが強い発現によって十分に特徴付けられた（Ｅｌｌｅｒｓｔｒｏｍら、１９９６）。出現した子葉表現型に基づき、発達種子におけるＰ１９、ＰｅＰｏまたはＲＰＶ−Ｐ０のＦＰ１駆動による発現が、正常な子葉発達に必要とされる低分子ＲＮＡ生合成と重複することが示される。子葉発達におけるこれらＶＳＰ関連の変化は、トランスジェニック植物の全体的な発達に影響を与えず、続く植物体の正常な生長および発達は、発達種子以外の組織におけるＦＰ１プロモーターからＶＳＰのいかなる漏出性（leaky）発現も少量で、重要ではないことを示した。これは、植物組織における多くのＶＳＰの構成的発現が非常に有害であった以前の研究とは対照的であった（Ｍａｌｌｏｒｙら、２００２；Ｃｈａｐｍａｎら、２００４；Ｃｈｅｎら、２００４；Ｄｕｎｏｙｅｒら、２００４；Ｚｈａｎｇら、２００６；Ｌｅｗｓｅｙら、２００７：Ｍｅｎｇら、２００８）。
【０５４３】
ＶＳＰ  Ｖ２およびＰ３８の表現型の欠如は、これらＶＳＰが、発達における低分子ＲＮＡ生合成または認識に影響しない仕方で低分子ＲＮＡ代謝を標的とすることを反映し得る。各ＶＳＰの機能は、ニコチアナ・ベンサミアナにおけるＧＦＰアッセイを用いて確認した。
【実施例１４】
【０５４４】
ＶＳＰ構築物で形質転換したＴ１種子を見出し、評価するための種子特異的視覚マーカーの開発
実施例１３に記載されているデータは、種子およびその後代の植物が、顕著な悪影響を受けることなく種子特異的プロモーターによるＶＳＰの発現に耐容性を示し得ることを表した。本発明者らは、上述の通り作出した形質転換植物がごく低レベルのＶＳＰを発現しており、これによって種子が生存でき、致死量のＶＳＰを発現している可能性のある形質転換種子を効果的に選抜し、従って用いられている条件下ではこれが回収されないか否かについても考慮した。
【０５４５】
Ｔ１種子におけるトランス遺伝子の発現をより正確に評価するため、形質転換および発現の視覚マーカーをトランスジェニック種子における使用のために開発した。他の双子葉種子に関するのと同様、アラビドプシス種子は、母方の種皮に囲まれた父方の胚および胚乳を含む。アグロバクテリウムの媒介するアラビドプシスの形質転換において、父方組織はＴ−ＤＮＡにより形質転換されるようになり、一方母方の組織は形質転換されないままである。形質転換した母方組織は、次世代のＴ２種子を作るまで得られない。有用なスクリーニングシステムを提供するため、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子を改変し、タンパク質の細胞外への力強い分泌を促進した。このようなＧＦＰ局在は、形質転換Ｔ１胚および胚乳で生成され、薄いが形質転換されていない種皮を通って分泌されたＧＦＰを検出することによって、形質転換Ｔ１種子（Ｎｉｓｈｉｚａｗａら、２００３）を視覚的に回収できることを示した（Ｆｕｊｉら、２００７）。
【０５４６】
分泌ＧＦＰをコードするキメラ遺伝子を次の通り構築した。遺伝子は、一方は５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）に、もう一方はＧＦＰタンパク質コード領域に存在する、２個のイントロンを含んでいた。これらイントロンは、キメラ遺伝子の発現を増強するため（Ｃｈｕｎｇら、２００６）、また種子で検出されたいかなるＧＦＰシグナルが、アグロバクテリウム細胞からの漏出性発現ではなくむしろ植物細胞における遺伝子発現のみから生じ得ることを確実にするために含まれている。細胞質に局在するであろうＧＦＰタンパク質（Ｂｒｏｓｎａｎら、２００７）をコードするイントロン中断型のヒト化ＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、Ｎｉｓｈｉｚａｗａら（２００３）の報告に従って、小胞体（ＥＲ）を経由したアポプラストへの分泌を促進できるよう改変した。アポプラス分泌のために改変されたＧＦＰ構築物は、インフレーム翻訳融合体としてＧＦＰのＮ末端に付加されたコングリシニン分泌ペプチドおよびＣ末端に付加された４個のグリシン残基を含み、ＥＲからの分泌を促進した。５’領域の遺伝子合成およびＣ末端へのグリシン付加のためのＰＣＲによる配列改変により、キメラＧＦＰ遺伝子へのこれら付加を行った。この分泌ＧＦＰのコード領域を、カタラーゼ遺伝子由来のイントロンを５’ＵＴＲに有するＦＰ１プロモーター下流に挿入した。全ＦＰ１−分泌ＧＦＰ配列をｐＯＲＥシリーズのバイナリーベクター内のｎｏｓ３’ポリアデニル化シグナル上流に挿入した。分泌ＧＦＰをコードするキメラ遺伝子を含む構築物をｐＣＷ１４１と命名した。
【０５４７】
ＧＦＰタンパク質の発現および分泌を確認するため、分泌ＧＦＰ配列をコードするがＦＰ１プロモーターまたはｐＣＷ１４１の５’ＵＴＲを含まない遺伝子領域をｐＣａＭＶ３５Ｓ−ＯＣＳ３’発現カセットにサブクローニングしてｐＣＷ２２８を作製し、アグロバクテリウムによる形質転換によってＮ．ベンサミアナ葉に導入した。共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）を用いて、遺伝子の発現およびＧＦＰタンパク質の分泌を確認した。
【０５４８】
構築物が正確であることに基づき、実施例１に記載されている通り、アグロバクテリウム媒介法によってｐＣＷ１４１をアラビドプシスＣｏｌ−０生態型の植物体に導入した。ＦＰ１が駆動する分泌ＧＦＰ構築物であるｐＣＷ１４１で浸漬したアラビドプシス植物体から得られた種子を収集し、蛍光検出器を備える解剖顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＭＦＺＩＩＩ）を用いてＧＦＰ陽性種子をスクリーニングした。集団内のＴ１種子の大多数が非形質転換であったとしても、種子の蛍光緑色は容易に確認できた。これらＧＦＰ陽性種子を選抜し、選別培地上で培養して、Ｔ−ＤＮＡのキメラ遺伝子構築物と連結したカナマイシン抵抗性選択可能マーカー遺伝子の存在を確認した。さらに２０個の陽性種子をプールし、ＧＦＰに対する抗体を用いたウエスタンブロッティングによりＧＦＰタンパク質の発現を確認した。
【０５４９】
分泌ＧＦＰマーカーを用いたＴ１種子におけるＶＳＰ発現の選抜
それぞれ発達子葉特異的な発現のためのＦＰ１プロモーターの制御下にある、ＶＳＰ：Ｐ１９、Ｐ３８、Ｖ２およびＰ３８をコードする４種のキメラ遺伝子のそれぞれを上述のＧＦＰ選抜ベクターｐＣＷ１４１に挿入し、それぞれｐＣＷ１６１、ｐＣＷ１６２、ｐＣＷ１６３およびｐＣＷ１６４を作製した。これらバイナリーベクターのそれぞれは、ＶＳＰおよび分泌ＧＦＰを発現するための連結キメラ遺伝子を有し、従って構築物で形質転換したトランスジェニック種子を選抜培地上で培養することなく、ＧＦＰ表現型によって同定、選抜、解析することができた。形質転換体の大部分でＶＳＰをコードする遺伝子が統合され、従ってＧＦＰをコードする遺伝子と連結されるであろうことが予想された。
【０５５０】
実施例１の方法に従ってＶＳＰ−ＧＦＰ構築物の組合せを含むアグロバクテリウムを接種したアラビドプシス植物体から得られた種子を収集し、上述の通りＧＦＰ蛍光に対してスクリーニングした。蛍光緑色の種子を手作業で収集し、選抜培地上で培養してこれらが選別可能マーカー遺伝子についても形質転換されているかを決定した。あらゆる事例において、ＧＦＰ陽性種子は選抜培地で生長し、上述のＧＦＰ遺伝子なしのＶＳＰ遺伝子で形質転換した植物体と同じ子葉表現型を示した。選抜培地で生長できないＧＦＰ陽性種子が観察された事例はない。このような種子は、一部の形質転換事象が、発達種子においてＶＳＰ発現レベルが高すぎて致死を引き起こす細胞を生じた場合予想され得る。形質転換集団にこのような種子がないことは、ＦＰ１プロモーターから発現した場合、ＶＳＰ発現が種子において耐用性を示したことを表す。このような悪影響がないことは、多くのＶＳＰが構成的に発現した場合（Ｍａｌｌｏｒｙら、２００２；Ｃｈａｐｍａｎら、２００４；Ｃｈｅｎら、２００４；Ｄｕｎｏｙｅｒら、２００４；Ｚｈａｎｇら、２００６；Ｌｅｗｓｅｙら、２００７：Ｍｅｎｇら、２００８）の悪影響の報告と対照的である。
【０５５１】
従って、ＧＦＰ等、視覚的に検出可能なマーカーの使用は、ＶＳＰ、デサチュラーゼ、エロンガーゼまたは他の脂肪酸修飾酵素をコードする遺伝子等、連結された遺伝子を取り込むトランスジェニック事象を同定、選抜および解析する強力で効率的な仕方を証明した。
【０５５２】
胚の後に（post-embryonically）ＶＳＰを発現する種子におけるＧＦＰ発現の定量化
蛍光顕微鏡およびデジタル画像解析を用いて、ＦＰ１プロモーターからＶＳＰを発現するＴ１およびＴ２種子のＧＦＰ発現を定量化した。これら解析は、ＧＦＰ発現が、発達子葉特異的プロモーターの制御下でＶＳＰをコードする遺伝子の同時導入による影響を受けなかったことを明らかに示した。次世代にわたる、また独立した形質転換事象における、ＧＦＰ−ＶＳＰ構築物の性能の拡大研究が解析されるであろう。ＶＳＰの存在が、後代の種子におけるより安定したより高い平均レベルの発現をもたらすであろうことが予測される。
【実施例１５】
【０５５３】
種子におけるＶＳＰとＬＣ−ＰＵＦＡ合成遺伝子との同時発現
ＶＳＰが種子におけるトランス遺伝子の性能を保護または増強できることを立証するため、単一遺伝子のみを有するベクターよりも宿主により抑制（サイレンシング）され易いと考えられる数種の発現ベクターを設計し、ＶＳＰの相対的な有効性を高めた。それぞれにおける遺伝子の同一構造を用いて、種子におけるＤＨＡ合成のための５種のデサチュラーゼまたはエロンガーゼ遺伝子をそれぞれ含む一連のベクターを構築した。これら構築物をサイレンシング（発現を抑制）し易くすると考えられる一因子は、同一プロモーター（ＦＰ１）を使用して各遺伝子を駆動することである。ＦＰ１プロモーターは比較的小さく、全体的なベクターサイズおよび各コード領域間の間隔を縮小するため、これを用いた。さらに、各遺伝子カセットは同じ方向性を有し、これはサイレンシングの可能性を高めるであろうと考えられている。３種のＬＣ−ＰＵＦＡ経路遺伝子は、最適化された植物発現のためのコドンに最適化されたコード領域を有し（Ａ−Ｂ−Ｃ）、一方２種（Ｅ−Ｄ）は微細藻類から得られた天然の配列であった。同じ一式の５遺伝子は、以前葉において発現して完全ＬＣ−ＰＵＦＡ生合成経路を集合させた（実施例１１）。ＶＳＰ  Ｐ１９をコードするさらなる遺伝子はシリーズの第一のベクターに含まれ、Ｖ２をコードする遺伝子は第二のベクターに含まれ、一方シリーズの第三のベクターはＶＳＰを持たなかった。
【０５５４】
これらベクター、ｐＪＰ３０５７（図１９）、ｐＪＰ３０５９（図２０）および（図２１）を構築し、次の通り並行して形質転換した。先ず、クローニングベクター内に含まれているＦＰ１プロモーターとｎｏｓターミネーターとの間に、デサチュラーゼもしくはエロンガーゼ遺伝子またはウイルスサプレッサー遺伝子をクローニングした。次に、プロモーター−遺伝子−ターミネーターカセットを同じ方向でバイナリーベクターバックボーンに順次クローニングした。ｐＪＰ３０５７は全ＤＨＡ経路を含んでいたが、一方ｐＪＰ３０５９およびｐＪＰ３０６０は、それぞれＦＰ１−Ｐ１９−ＮＯＳまたはＦＰ１−Ｖ２−ＮＯＳカセットの付加だけが異なっていた。構築ステップは次の通りである。先ず、ミクロモナス・プシラΔ６−デサチュラーゼを含むＡｓｃＩ−ＰａｃＩ断片をｐＪＰ２０１５のＡｓｃＩ−ＰａｃＩ部位にクローニングし、その後、このベクターから得られたプロモーター−遺伝子−ターミネーター全体のカセットを含むＳｗａＩ断片をｐＯＲＥ０２のＥｃｏＲＶ部位にクローニングして、ｐＪＰ３０５０を作製した。次に、ピラミモナス・コルダタΔ６−エロンガーゼを含むＡｓｃＩ−ＰａｃＩ断片をｐＪＰ２０１５ＴＭＶ（ＴＭＶリーダーがプロモーターの下流、遺伝子の上流に存在する、ｐＪＰ２０１５を僅かに改変した型）のＡｓｃＩ−ＰａｃＩ部位にクローニングし、その後このベクターから得られたプロモーター−遺伝子−ターミネーター全体のカセットを含むＳｗａＩ断片をｐＪＰ３０５０のＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理したＳａｃＩ部位にクローニングして、ｐＪＰ３０５１を作製した。次に、パブロバ・サリナΔ５−デサチュラーゼを含むＡｓｃＩ−ＰａｃＩ断片をｐＪＰ２０１５ＴＭＶのＡｓｃＩ−ＰａｃＩ部位にクローニングし、その後このベクターから得られたプロモーター−遺伝子−ターミネーター全体のカセットを含むＳｗａＩ断片をｐＪＰ３０５１のＳｍａＩ部位にクローニングして、ｐＪＰ３０５２を作製した。次に、パブロバ・サリナΔ５−デサチュラーゼを含むＡｓｃＩ−ＰａｃＩ断片をｐＪＰ２０１５ＴＭＶのＡｓｃＩ−ＰａｃＩ部位にクローニングし、その後このベクターから得られたプロモーター−遺伝子−ターミネーター全体のカセットを含むＳｗａＩ断片をｐＯＲＥ０２のＳｍａＩ部位にクローニングして、ｐＪＰ３０５４を作製した。次に、ピラミモナス・コルダタΔ５−エロンガーゼを含むＡｓｃＩ−ＰａｃＩ断片をｐＪＰ２０Ｉ５ＴＭＶのＡｓｃＩ−ＰａｃＩ部位にクローニングし、その後このベクターから得られたプロモーター−遺伝子−ターミネーター全体のカセットを含むＳｗａＩ断片をｐＪＰ３０５４のＳｔｕＩ部位にクローニングして、ｐＪＰ３０５５を作製した。次に、パブロバ・サリナΔ４−デサチュラーゼを含むＡｓｃＩ−ＰａｃＩ断片をｐＪＰ２０１５ＴＭＶのＡｓｃＩ−ＰａｃＩ部位にクローニングし、その後このベクターから得られたプロモーター−遺伝子−ターミネーター全体のカセットを含むＳｗａＩ断片をｐＪＰ３０５６のＳｆｏＩ部位にクローニングして、ｐＪＰ３０５６を作製した。次に、ｐＪＰ３０５６のＰｍｅＩ−ＮｏｔＩ断片をｐＪＰ３０５１のＰｍｅＩ−ＮｏｔＩ部位にクローニングして、ＡＬＡからＤＨＡを生成するための５遺伝子を含むバイナリーベクターであるｐＪＰ３０５７を作製した。
【０５５５】
次に、Ｐ１９ウイルスサプレッサーをコードするキメラ遺伝子を含むＡｓｃＩ−ＰａｃＩ断片をｐＪＰ２０１５ＴＭＶのＡｓｃＩ−ＰａｃＩ部位にクローニングし、その後このベクターから得られたプロモーター−遺伝子−ターミネーター全体のカセットを含むＳｗａＩ断片をｐＪＰ３０５７のＺｒａＩ部位にクローニングし、ｐＪＰ３０５９を作製した。同様に、Ｖ２ウイルスサプレッサーをコードするキメラ遺伝子を含むＡｓｃＩ−ＰａｃＩ断片をｐＪＰ２０１５ＴＭＶのＡｓｃＩ−ＰａｃＩ部位にクローニングし、その後このベクターから得られたプロモーター−遺伝子−ターミネーター全体のカセットを含むＳｗａＩ断片をｐＪＰ３０５７のＺｒａＩ部位にクローニングして、ｐＪＰ３０６０を作製した。
【０５５６】
３種の構築物全てをアラビドプシス（生態型コロンビア）に形質転換した。アラビドプシス植物体（Ｃｏｌ−０生態型）を各構築物で形質転換し、ｐＪＰ３０５７を用いてキャノーラを形質転換した。Ｔ１種子を収集し、除草剤含有培地で解析し、結果生じたＴ２種子の一般的な形態学的変化およびＬＣ−ＰＵＦＡ合成を解析する。
【０５５７】
３種の構築物、ｐＪＰ３０５７、ｐＪＰ３０５９およびｐＪＰ３０６０で作出した形質転換植物（アラビドプシス・サリアナ、生態型コロンビア）を自家受精させ、Ｔ１種子を収集した。これらをカナマイシン含有培地に播種し、Ｔ１植物のヘテロ接合性／ホモ接合性を決定し、その結果各Ｔ１植物から生じたＴ２種子の一般的な形態学的変化およびＬＣ−ＰＵＦＡ合成を解析した（表１８）。
【０５５８】
ｐＪＰ３０５７で形質転換した植物の代表的なＴ２種子は、種子油中の総脂肪酸にＳＤＡ（０．４％）、ＥＴＡ（０．６％）、ＥＰＡ（０．２％）、ＤＰＡ（０．３％）およびＤＨＡ（２．４％）を含んでいた。Ｔ２植物の種子油は、ＧＬＡ（１．４％）ならびに微量のＥＴｒＡおよびＡＲＡも含んでいた。種子における変換効率は、次の通りであった。細胞において生成されたＡＬＡの１８．４％がΔ６−脱飽和され；細胞において生成されたＳＤＡの８９．７％がΔ６−伸長され；細胞におけるＥＴＡの８２．９％がΔ５−脱飽和され；細胞におけるＥＰＡの９３．１％がΔ５−伸長され；細胞におけるＤＰＡの８８．９％がΔ４−脱飽和されて、ＤＨＡを生成した（表１８）。
【０５５９】
ｐＪＰ３０５９で形質転換した植物の代表的なＴ２種子は、ＳＤＡ（０．７％）、ＥＴＡ（０．３％）、ＥＰＡ（０．２％）、ＤＰＡ（０．９％）およびＤＨＡ（１．３％）を含んでいた。種子油は、ＧＬＡ（０．８％）ならびに微量のＥＴｒＡおよびＡＲＡも含んでいた。変換効率は次の通りであった。細胞において生成されたＡＬＡの１５．７％がΔ６−脱飽和され；細胞において生成されたＳＤＡの７９．４％がΔ６−伸長され；細胞におけるＥＴＡの８８．９％がΔ５−脱飽和され；細胞におけるＥＰＡの９１．７％がΔ５−伸長され；細胞におけるＤＰＡの５９．１％がΔ４−脱飽和されて、ＤＨＡを生成した（表１８）。
【０５６０】
【表１８】
0006068800.tif 000027
【０５６１】
ｐＪＰ３０６０で形質転換した植物の代表的なＴ２種子は、ＳＤＡ（０．６％）、ＥＴＡ（０．７％）、ＥＰＡ（０．３％）、ＤＰＡ（０．２％）およびＤＨＡ（１．０％）を含んでいた。種子油は、微量のＧＬＡ、ＥＴｒＡおよびＡＲＡも含んでいた。変換効率は次の通りであった。細胞において生成されたＡＬＡの１３．３％がΔ６−脱飽和され；細胞において生成されたＳＤＡの７８．６％がΔ６−伸長され；細胞におけるＥＴＡの６８．２％がΔ５−脱飽和され；細胞におけるＥＰＡの８０．０％がΔ５−伸長され；細胞におけるＤＰＡの８３．３％がΔ４−脱飽和されて、ＤＨＡを生成した（表１８）。
【０５６２】
結果
構築物ｐＪＰ３０５７における全遺伝子は、Δ６−デサチュラーゼを除き、高活性／高効率の変換を示した。天然の基質ＡＬＡがアシルＰＣデサチュラーゼにより生成され、より低度のΔ６−脱飽和をもたらし、アシルＣｏＡプールにおいて作用することが知られているエロンガーゼによりトランスジェニックデサチュラーゼ基質ＥＴＡおよびＤＰＡが生成されるため、このことは、Δ６−、Δ５−およびΔ４−デサチュラーゼがアシルＣｏＡ基質に作用する可能性があることを示した。さらに、高効率のΔ６−およびΔ５−エロンガーゼステップ（＞８０％効率）は、直前のデサチュラーゼ（それぞれΔ６−およびΔ５−デサチュラーゼ）がアシルＣｏＡ基質に作用することを示した。これら遺伝子の活性が、ホモ接合性が達成された場合トランスジェニック植物の次世代において増加するであろうこと、またその結果ＬＣ−ＰＵＦＡ産物のレベルが増加するであろうことはある程度予想された。
【０５６３】
構築物ｐＪＰ３０５７およびｐＪＰ３０５９におけるサイレンシングサプレッサーの存在は、種子油における新生脂肪酸の全体レベルと経路の最終産物であるＤＨＡレベルの両方を増加させた。
【０５６４】
論考
実施例１３〜１５に関して、導入された外因性核酸は植物により外来ＤＮＡまたはＲＮＡとして検出され、宿主によるトランス遺伝子抑制メカニズムが原因の発現減少をもたらす可能性がある。これら抑制メカニズムは、低分子ＲＮＡ集団の生合成によりトランス遺伝子を標的とすることができ、これら低分子ＲＮＡは、抑制装置を誘導してトランス遺伝子の発現を制限することができる（Ｍａｔｚｋｅら、２００１）。トランス遺伝子の発現は、染色体挿入部位のメチル化等のＤＮＡの直接的な修飾、ＲＮＡの転写後サイレンシング（ＨａｍｉｌｔｏｎおよびＢａｕｌｃｏｍｂｅ、１９９９；Ｖｏｉｎｎｅｔら、２００３）またはタンパク質レベル（Ｂｒｏｄｅｒｓｅｎら、２００８）等、様々な方法で制限することができる。このような抑制メカニズムを誘発する外来ＤＮＡまたはＲＮＡの特性は十分には理解されていない（Ｌｉｎｄｂｏら、１９９３；Ｌｅｃｈｔｅｎｂｅｒｇら、２００３）。しかし、宿主によるこのようなトランス遺伝子発現の抑制は、高度の発現、複数のトランス遺伝子および互いにまたは宿主ゲノムと類似した領域を有するトランス遺伝子を必要とする形質に対してより可能性がある（Ｓｃｈｕｂｅｒｔら、２００４）。さらに、トランス遺伝子の性能は、恐らくトランス遺伝子のプロモーターおよびコード領域のＤＮＡメチル化により、その後各世代で徐々に低下する（Ｈａｇａｎら、２００３）。
【０５６５】
本明細書において、胚形成後の種子特異的プロモーターから発現したウイルスサプレッサータンパク質（ＶＳＰ）が、アラビドプシスの発達において耐容性を示すことが証明される。様々なＶＳＰと、定量可能な形質であるＧＦＰの同時発現は、ＶＳＰ発現種子において組換え形質もまた耐容性を示したことを示唆した（実施例１４）。ＶＳＰはトランス遺伝子抑制装置を構成する低分子ＲＮＡ代謝を遮断することが知られているため、種子におけるＶＳＰと組換え形質との同時発現が、何世代にもわたってこれら形質の高度で低下することのないレベルで機能することを保証するであろうことが示される。
【０５６６】
植物は胚形成後にＰ１９やＰｅＰｏ等、ＶＳＰ発現に耐容性を示すため、これは内因性発達シグナル、少なくとも低分子ＲＮＡを用いたシグナルはこの植物発達後期において少量または重要性が低いことを示唆した。本研究のために選択された４種のＶＳＰは、低分子ＲＮＡ生合成の異なる部分に作用し、従って異なる程度で機能する可能性がある。複数遺伝子のトランスジェニックカセットにおけるサイレンシング効果をＶＳＰ同時導入の使用により低減させることによって、トランスジェニック発現戦略における多くの変化を想定できる。先ず、調節配列またはコード領域間の配列繰り返しを避けるための要件を減らして、同じ発現カセットを繰り返し用いることができる。従ってこの特性は、同じプロモーター−ポリアデニル化シグナルを用いて、大型の複数遺伝子発現ベクターを構築させることができる。あるいは、サイレンシング効果が生じる見込みまたは程度が低下した状態で、あるいは植物の世代にわたる発現安定性が増加した状態で、単一遺伝子の複数コピーは発現レベルの増加に用いることができる。
【実施例１６】
【０５６７】
種子特異的プロモーターを用いた植物の葉細胞における遺伝子の一過性発現
それぞれ種子特異的プロモーターの制御下にあるミクロモナスＣＣＭＰ１５４５Δ６−デサチュラーゼ（配列番号７によりコードされた配列番号８）、ピラミモナスＣＳ−０１４０Δ６−エロンガーゼ（配列番号３によりコードされた配列番号４）、パブロバ・サリナΔ５−デサチュラーゼ（配列番号２５によりコードされた配列番号２６）、ピラミモナスＣＳ−０１４０Δ５−エロンガーゼ（配列番号５によりコードされた配列番号６）およびパブロバ・サリナΔ４−デサチュラーゼ（配列番号７２によりコードされた配列番号７３）遺伝子によってコードされたタンパク質の酵素活性が、次の通り増強ニコチアナ・ベンサミアナ一過性発現システムを用いた植物の葉組織で証明された。
【０５６８】
実施例１５に記載され、それぞれ種子特異的な切断ｎａｐｉｎプロモーター、ＦＰ１の制御下にある５種のＤＨＡ生合成遺伝子を含むキメラベクターｐＪＰ３０５７をアグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＧＬ１に導入した。コドンに最適化されたアラビドプシス・サリアナＬＥＡＦＹ  ＣＯＴＹＬＥＤＯＮ２（Ａｒａｔｈ−ＬＥＣ２）遺伝子を３５Ｓ：ｐＯＲＥ０４のＥｃｏＲＩ部位にクローニングすることにより、３５Ｓ：ＬＥＣ２と命名されたキメラベクターを作製した。３５Ｓ：ＬＥＣ２構築物をアグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＧＬ１に別々に導入した。ｐＪＰ３０５７か３５Ｓ：ＬＥＣ２のいずれかを含む別個のＡＧＬ１培養物から得られたトランスジェニック細胞を混合し、混合物をニコチアナ・ベンサミアナ植物体の葉組織に浸潤させた。浸潤後、植物体をさらに４日間育成し、その後葉脂質における総脂肪酸および分離した脂質画分のＧＣ分析のためにリーフディスクを採取した。これにより、これら遺伝子がニコチアナ・ベンサミアナにおけるＤＨＡ生成に機能していることが明らかになった（表１９）。これら遺伝子で形質転換した葉組織は、ＳＤＡ（１．２％）、ＥＴＡ（２．０％）、ＥＰＡ（０．６％）、ＤＰＡ（１．７％）およびＤＨＡ（２．５％）を含んでいた。葉組織は、ＧＬＡ（２．４％）および微量の他の長鎖ω６脂肪酸も含んでいた。
【０５６９】
キメラベクターｐＪＰ３１１５およびｐＪＰ３１１６（実施例１７）をアグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＧＬ１に導入した。ｐＪＰ３１１５、ｐＪＰ３１１６、３５Ｓ：Ｐ１９および３５Ｓ：ＬＥＣ２の内１種を含む４種の別個のＡＧＬ１培養物から得られたトランスジェニック細胞を混合し、混合物をニコチアナ・ベンサミアナ植物体の葉組織に浸潤させた。浸潤後、植物体をさらに４日間育成し、その後ＧＣ分析のためにリーフディスクを採取し、これにより、これら遺伝子がニコチアナ・ベンサミアナにおけるＤＨＡ生成に機能していることが明らかになった（表１９）。これら遺伝子で形質転換した葉組織は、ＳＤＡ（５．６％）、ＥＴＡ（１．４％）、ＥＰＡ（０．２％）、ＤＰＡ（１．７％）およびＤＨＡ（２．４％）を含んでいた。葉組織は、微量の長鎖ω６脂肪酸も含んでいた。
【０５７０】
この実験により、二重構築物ｐＪＰ３１１５およびｐＪＰ３１１６の組合せは、全８遺伝子を含む単一構築物と同様に効率的にＤＨＡ生成に機能していることを確認した。
【０５７１】
【表１９】
0006068800.tif 000028
【０５７２】
論考：種子特異的構築物の迅速な失敗および検証
それぞれ種子特異的プロモーター等、組織特異的プロモーターの制御下にある一揃いの遺伝子と組み合わせた転写因子、この場合はＬＥＣ２を用いた実験は、このような構築物は組織特異的プロモーターが正常に発現しない葉等、異種システムで試験でき、種子における発現を予測できることを示した。葉細胞で種子特異的プロモーターを一過的に発現する能力は、構築物設計の迅速な検証を可能にする。以前に脂肪種子モデル植物または作物への安定的な形質転換と、続く後代系統の作出、その後の表現型解析に依存した、種子特異的プロモーター、特にその複数遺伝子構築物の前後関係における有効性を決定する実験により、植物種子における構築物の有効性を決定することができる。Ｎ．ベンサミアナで得られた脂肪酸レベルが、実施例１５に記載されているこの同一構築物による安定的なアラビドプシス形質転換で観察されたレベルと類似していたという事実は、このアッセイの適用における信頼性を増す。
【実施例１７】
【０５７３】
ＤＨＡ生合成のための二重構築物
ベクターｐＪＰ３１１５（図２２）を次の通り構築した。先ず、ベクターｐＪＰ１０１ａｃｑ（図１４）のＳｂｆＩ−ＡｐａＩ断片をｐＯＲＥ０３のＰｓｔＩ−ＡｐａＩ部位にクローニングして、ｐＪＰ３０１１を得た。次に、コドンに最適化されたミクロモナス・プシラΔ６−デサチュラーゼ（配列番号１２５）を含むＳｗａＩ断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理したｐＪＰ３０１１におけるＸｈｏＩ部位にクローニングして、ｐＪＰ３１０８を得た。続いて、コドンに最適化されたパブロバ・サリナΔ５−デサチュラーゼ（配列番号１２７）を含むＳｗａＩ断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理したｐＪＰ３１０８におけるＮｏｔＩ部位にクローニングして、ｐＪＰ３１０９を得た。コドンに最適化されたピラミモナス・コルダタΔ６−エロンガーゼ（配列番号１２６）を含むＳｗａＩ断片をｐＪＰ３１０９におけるＳｍａＩ部位にクローニングして、ｐＪＰ３１１０を得た。次に、ｐＪＰ３１１０のＢｓｉＷＩ−ＡｓｉＳＩ断片をｐＯＲＥ０４のＢｓｉＷＩ−ＡｓｉＳＩ部位にクローニングすることにより、ＢＡＳＴＡ抵抗性構築物からカナマイシン抵抗性構築物へと構築物を変換し、ｐＪＰ３１１１を得た。切断ｎａｐｉｎプロモーターＦＰ１およびクレピス・パレスチナ（Ｃｒｅｐｉｓ  ｐａｌｅｓｔｉｎａ）Δ１２−デサチュラーゼを含むＮｃｏＩ（Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理）−ＳｂｆＩ断片をｐＪＰ３１１１におけるＥｃｏＲＶ−ＰｓｔＩ部位にクローニングして、ｐＪＰ３１１５を得た。
【０５７４】
ベクターｐＪＰ３１１６（図２３）を次の通り構築した。先ず、コドンに最適化されたピラミモナス・コルダタΔ５−エロンガーゼ（配列番号１２８）を含むＳｗａＩ断片をｐＪＰ３０１１におけるＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理したＸｈｏＩ部位にクローニングして、ｐＪＰ３１１２を得た。コドンに最適化されたパブロバ・サリナΔ４−デサチュラーゼ（配列番号１２９）を含むＳｗａＩ断片をｐＪＰ３１１２におけるＳｍａＩ部位にクローニングして、ｐＪＰ３１１３を得た。次に、ペルリア・フルテスケンスΔ１５−デサチュラーゼを含むＮｏｔＩ断片をｐＪＰ３１１３におけるＮｏｔＩ部位にクローニングして、ｐＪＰ３１１４を得た。続いて、ハイグロマイシン耐性カセット（カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、続いてバイナリーベクターｐＷＶＥＣ８から得られたＣＡＴ−１イントロン中断ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子、そしてＮＯＳターミネーターからなる）を含むＸｂａＩ−ＭｌｕＩ断片をｐＪＰ３１１４のＡｖｒＩＩ−ＭｌｕＩ部位にクローニングすることによって、ＢＡＳＴＡ耐性構築物からハイグロマイシン耐性構築物へと構築物を変換して、ｐＪＰ３１１６を得た。
【０５７５】
キメラベクターｐＪＰ３１１５およびｐＪＰ３１１６をアグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＧＬ１に個々に導入し、これらの培養物から得られたトランスジェニック細胞を３５Ｓ：Ｐ１９で形質転換したＡＧＬ１と混合し、混合物を温室内のニコチアナ・ベンサミアナ植物体の葉組織に浸潤させた。浸潤後、植物体をさらに５日間育成し、その後リーフディスクをＧＣ分析のため採取し、これによってこれら遺伝子がニコチアナ・ベンサミアナにおけるＤＨＡ生成に機能していることが明らかになった（表２０）。これら遺伝子で形質転換した葉組織は、ＳＤＡ（５．６％）、ＥＴＡ（１．４％）、ＥＰＡ（０．２％）、ＤＰＡ（１．７％）およびＤＨＡ（２．４％）を含んでいた。葉組織は、微量のＧＬＡ、ＥＴＡおよびＡＲＡも含んでいた。変換効率は次の通りであった。細胞におけるオレイン酸の９８．９％がΔ１２−脱飽和され（対照試料と有意差はない）；細胞におけるＬＡの９５．４％がΔ１５−脱飽和され；細胞において生成されたＡＬＡの１８．１％がΔ６−脱飽和され；細胞において生成されたＳＤＡの５０．４％がΔ６−伸長され；細胞におけるＥＴＡの７５．４％がΔ５−脱飽和され；細胞におけるＥＰＡの９５．４％がΔ５−伸長され；細胞におけるＤＰＡの５８．５％がΔ４−脱飽和されて、ＤＨＡを生成した。
【０５７６】
両構築物を用いてキャノーラを形質転換した。Ｔ１種子を収集し、一般的な形態学的変化およびＬＣ−ＰＵＦＡ合成レベルを解析する。
【０５７７】
【表２０】
0006068800.tif 000029
0006068800.tif 000030
【０５７８】
論考
ＤＨＡ生成のための全遺伝子を組み合わせて提供するため、ｐＪＰ３１１５およびｐＪＰ３１１６を設計、すなわち２種の組換えベクターを互いに補い合わせて経路を構成した。ｐＪＰ３１１５にコードされたΔ１２−デサチュラーゼにより生成された脂肪酸をｐＪＰ３１１６にコードされたΔ１５−デサチュラーゼによる基質として用い、ｐＪＰ３１１６は続くΔ６−デサチュラーゼ、Δ６−エロンガーゼおよびΔ５−デサチュラーゼの遺伝子も含んでいた。次に、Δ５−デサチュラーゼの産物であるＥＰＡはｐＪＰ３１１５にコードされたΔ５−エロンガーゼにより作用し、その産物は同じくｐＪＰ３１１５にコードされたΔ４−デサチュラーゼによりＤＨＡに変換された。植物を安定的に形質転換するために別個に用いた２種の構築物にトランス遺伝子を分配し、続く選抜植物を交雑して全経路を構成する原理は、サイズ増加による形質転換効率の低下や遺伝子発現低下等、多くのトランス遺伝子を単一構築物に含むことに関連する問題の一部を回避した。スーパー形質転換による、あるいは２種のトランスジェニック系統の交雑によるこれら構築物の安定的形質転換の組合せは、ＤＨＡ合成に必要とされる遺伝子の完全な相補物を含むトランスジェニック植物をもたらすであろう。
【０５７９】
遺伝子ペアが異なった様式で（互いに離れて）転写されるように、構築物ｐＪＰ３１１５が反転フォーマットの、すなわち２遺伝子がある一方向に、２遺伝子が別の方向に発現する４遺伝子を含んでいたことも記す。構築物ｐＪＰ１０７（実施例８）における３遺伝子の発現に用いた反転設計と比較して、このフォーマットにおける４番目の遺伝子の付加は遺伝子発現を妨げないことが結論された。
【０５８０】
興味深いことに、上述の他の実験と比べて相対的に低いΔ６−伸長効率（５０．４％）は、恐らく前の３種の脱飽和ステップのための酵素をコードする遺伝子が全てＦＰ１プロモーターから発現する一方、Δ６−エロンガーゼをコードする遺伝子がアラビドプシス・サリアナＦＡＥ１プロモーターによって駆動されるという事実に起因するであろうことを記す。これは、ＦＰ１プロモーターの後にＦＡＥ１プロモーターが活性化されるプロモーターのタイミングの差をもたらすと考えられた。Δ６−エロンガーゼがＦＰ１プロモーターによって駆動される以前の実験と比べて、これはより高度のＳＤＡ蓄積をもたらし、ＳＤＡは続いてΔ６−エロンガーゼに作用される前にΔ６−エロンガーゼによって接近される代謝プールから除去された。
【実施例１８】
【０５８１】
微細藻類ＤＧＡＴ２をコードする遺伝子の単離および特性評価
全長ミクロモナス・プシラＤＧＡＴ２遺伝子の合成
米国エネルギー省共同ゲノム研究所（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｇｉ．ｄｏｅ．ｇｏｖ／）によって作成されたミクロモナスＣＣＭＰ１５４５選別タンパク質モデルゲノム配列は、オストレオコッカス・ルシマリヌス由来の推定アミノ酸配列であるＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＸＰ＿００１４１５７６を問い合わせ配列として用いて、ＢＬＡＳＴＰプログラムで解析した。この解析により、ミクロモナスＣＣＭＰ１５４５におけるＸＰ＿００１４１５７６と相同性を有する予測タンパク質の存在が明らかになった。ミクロモナスＣＣＭＰ１５４５予測タンパク質配列を用いて、ブラッシカ・ナパス等、双子葉植物における発現に最も適したコドンに最適化されたヌクレオチド配列を設計、合成した。タンパク質コード領域のヌクレオチド配列に配列番号１０７を付与する。プラスミド構築物は０９２８８１４＿Ｍｉｃ１５４５−ＤＧＡＴ２＿ｐＭＡと命名した。アミノ酸配列は配列番号１０８として示す。ミクロモナスＣＣＭＰ１５４５デサチュラーゼアミノ酸配列である配列番号１０８をＧｅｎｂａｎｋデータベースにおける他のタンパク質に対する問い合わせ配列として用いたＢＬＡＳＴＰ解析は、タンパク質がＤＧＡＴと相同性を有することを示した。全長にわたる最大級の同一性は、ミクロモナスＲＣＣ２９９推定タンパク質の配列である受託番号ＸＰ＿００２５０３１５５のアミノ酸配列との５３％であった。この遺伝子は、アミノ酸７４〜３３４にジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼモチーフ（ＮＣＢＩ保存ドメインｐｆａｍ０３９８２）を含む。
【０５８２】
ＥｃｏＲＩ断片内に含まれている０９２８８１４＿Ｍｉｃ１５４５−ＤＧＡＴ２＿ｐＭＡのコード領域全体を３５Ｓ−ｐＯＲＥ０４（実施例４、上述）のＥｃｏＲＩ部位に挿入してｐＪＰ３１２８を作製することによって、構成的３５Ｓプロモーターの制御下でＤＧＡＴ２をコードする遺伝的構築物３５Ｓ：Ｍｉｃ１５４５−ＤＧＡＴ２を作製した。このキメラベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＧＬ１に導入し、これらの培養物から得られたトランスジェニック細胞を３５Ｓ：Ｐ１９  ＡＧＬ１と混合し、混合物を温室内のニコチアナ・ベンサミアナ植物体の葉組織に浸潤した。浸潤後、植物体をさらに５日間育成し、その後リーフディスクを脂質分析のために採取し、これによってＤＧＡＴ２をコードする遺伝子が、多価不飽和脂肪酸に選択的に形質転換した葉細胞における全ＴＡＧの増加に機能することが明らかになった（表２１）。特に形質転換細胞のＴＡＧにおける多価不飽和脂肪酸のレベルが少なくとも３倍増加した。
【０５８３】
当業者であれば、特定の実施形態に示されているように、概略的に説明されている本発明の精神または範囲から逸脱することなく、本発明に対して多くの変更および／または修正を施すことも可能であることを理解するであろう。従って本実施形態は、あらゆる点で具体例としてのものあって、限定するものではないことを考慮するべきである。
【０５８４】
本願は、その両方の内容が参照により本明細書に組み込まれる、２００８年１１月１８日に出願された米国特許出願第６１／１９９，６６９号および２００９年７月９日に出願された米国特許出願第６１／２７０，７１０号に基づく優先権を主張する。
【０５８５】
本明細書に記載および／または参照されているあらゆる刊行物は、その全体を本明細書に組み込まれる。
【０５８６】
本明細書に含まれている文書、活動、材料、装置、物品または同様のものに関するいかなる記載も、単に本発明にとっての前後関係（context）を提供するためのものである。本願の各請求項の優先日より前に存在したとして、これら事項のいずれかまたは全てが先行技術の基礎の一部を形成する、あるいは本発明の関連分野における通常の一般知識であったことを認めるものとして解釈するべきではない。
【０５８７】
【表２１】
0006068800.tif 000031
【０５８８】
（参考文献）
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0006068800.tif 000035
0006068800.tif 000036
【図１】
0006068800.tif 000037
【図２】
0006068800.tif 000038
【図３】
0006068800.tif 000039
【図４】
0006068800.tif 000040
【図５】
0006068800.tif 000041
【図６】
0006068800.tif 000042
【図７】
0006068800.tif 000043
【図８】
0006068800.tif 000044
【図９】
0006068800.tif 000045
【図１０】
0006068800.tif 000046
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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