(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）分析物を含む試料を
ｉ）分析物に特異的な、変異された脱水素酵素および
ii）人工の補酵素
を含む乾式試薬層を含んでなる診断素子に接触させる工程、ならびに、
ｂ）分析物の存在または／および量を測定する工程
を含んでなる、分析物を測定するための方法であって、
前記変異された脱水素酵素が、配列番号１のアミノ酸配列を有する変異されたグルコース脱水素酵素ＧｌｕｃＤＨ＿Ｅ１７０Ｋ＿Ｋ２５２Ｌであって、
前記人工の補酵素が、ｃａｒｂａＮＡＤである方法。
【請求項２】
前記診断素子中の分析物の代謝回転速度が、人工の補酵素の代わりに対応する野生型補酵素を含んでなる、対応する診断素子中の分析物の代謝回転速度と同じかまたはより速いことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記診断素子中の分析物の代謝回転速度が、人工の補酵素の代わりに対応する野生型補酵素を含んでなる、対応する診断素子中の分析物の代謝回転速度より、少なくとも２０％速いことを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
対応する野生型脱水素酵素と比較して低下した比酵素活性を有する、変異された脱水素酵素を使用することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記変異された脱水素酵素が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ／ＮＡＤＨ）依存性またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨ）依存性であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記変異されたグルコース脱水素酵素が、バチルス  ズブチルス由来の野生型グルコース脱水素酵素の変異により得られるグルコース脱水素酵素であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記診断素子として、テストテープ、テストディスク、テストパッド、テストストリップまたはテストストリップドラムを使用することを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記分析物の存在または／および量を、光度計測的または蛍光計測的に測定することを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
分析物を測定するための診断素子であって、
（ａ）分析物に特異的な、変異された脱水素酵素、および
（ｂ）人工の補酵素
を含有する乾式試薬層を含んでなる診断素子であって、
前記変異された脱水素酵素が、配列番号１のアミノ酸配列を有する変異されたグルコース脱水素酵素ＧｌｕｃＤＨ＿Ｅ１７０Ｋ＿Ｋ２５２Ｌであって、
前記人工の補酵素が、ｃａｒｂａＮＡＤである診断素子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析物を測定する方法およびそのために適した診断素子に関する。
【背景技術】
【０００２】
診断素子は、臨床的に意義のある分析方法の重要な構成成分である。これに関連して、主要な目的は、たとえば代謝物や基質などの分析物の測定であって、たとえば、分析物に特異的な酵素の助けをかりて直接的にまたは間接的に測定される。このケースでは分析物は、酵素−補酵素複合体の助けをかりて変換され、続いて定量される。この過程では、測定されるべき分析物は適切な酵素、補酵素および任意には、メディエーターと接触され、そして、補酵素は、物理化学的に酵素反応により、たとえば酸化または還元されることにより変えられる。メディエーターが追加で使用される場合、このメディエーターは通常、分析物の反応中に遊離される電子を還元された補酵素から光学的指示薬または電極の伝道成分に移動させるので、この過程はたとえば光化学的または電気化学的に検出することができる。較正により、測定された値と測定されるべき分析物の濃度とのあいだの直接的な関係がもたらされる。
【０００３】
先行技術より公知の診断素子は、限られた有効期限によって、および、その有効期限を全うするための周囲環境に対する特別な必要性、たとえば冷蔵または乾式貯蔵によって特徴づけられる。したがって、ある種の適用においては、たとえば血糖自己測定などのエンドユーザー自身によって行われる試験の場合には、誤りであるが気づかれることのない間違った測定システムの保管によって、消費者によって認識されることがほぼ不可能な、かつ、それぞれの疾患の誤った処置につながるかもしれないような、誤った結果が生じる可能性がある。誤りを含む結果は、主として、このような診断素子に使用される酵素、補酵素およびメディエーターが一般的に、水分および熱と敏感に反応して時間と共に不活性化されるという事実によるものである。
【０００４】
診断素子の安定性を増加させるために使用されている既知の手段は、安定な酵素の使用、たとえば好熱性生物由来の酵素の使用である。さらに、酵素は、化学的修飾によって、そして、特には架橋によって安定化され得る。さらには、たとえばトレハロース、ポリビニルピロリドンおよび血清アルブミンなどの酵素安定剤を添加することも可能であり、また、酵素をたとえば光重合によってポリマーネットワーク内に封入することも可能である。
【０００５】
酵素を安定化させるもう一つの方法は、部位特異的にまたは非部位特異的に導入される変異によるものである。この点に関して、酵素のＤＮＡコードの標的変化を利用して該当酵素の特性に特異的に影響を与える組み替え技術の使用が特に適していることが立証されてきた。
【０００６】
Baikらは、アミノ酸置換Ｅ１７０Ｋ、Ｑ２５２ＬまたはＥ１７０Ｋ／Ｑ２５２Ｌを含む、バチルス  メガテリウム（Bacillus megaterium）由来のグルコース脱水素酵素の３つの突然変異体の単離および特性評価について記載している（Appl. Environ. Microbiol (2005), 71, 3285）。変異体Ｅ１７０ＫおよびＱ２５２Ｌが、低い塩濃度および高いｐＨ値において低い安定性しか有さないのに対し、二重変異体は、二量体−二量体の界面における増強された相互作用のため、試験条件下で顕著に増大された安定性を示す。
【０００７】
Vazquez-Figueroaらは、バチルス  ズブチルス（Bacillus subtilis）、バチルス  チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）およびバチルス  リケニホルミス（Bacillus licheniformis）由来のグルコース脱水素酵素の１５５、１７０および２５２位にアミノ酸置換を導入することを含む、熱安定性グルコース脱水素酵素の開発を開示している。この点に関して、Ｅ１７０ＫおよびＱ２５２Ｌの変異は、個別におよび組み合わせて、バチルス  ズブチルス由来のグルコース脱水素酵素の安定化をもたらすと述べられている。
【０００８】
しかしながら、野生型変異体に比べて遺伝的に修飾された安定化酵素が使用される場合、それらは通常、対応する野生型酵素と比較して顕著に低い活性しか有していないという問題を生じ、したがって、単位時間あたりより低い基質の代謝回転の原因となる。高い比活性を有する酵素が、血糖の検出においてなど臨床化学および診断化学における使用には好ましいという事実を考慮すると、安定化酵素の使用は多くの場合、天然の酵素の使用の容認し難い代替でしかない。
【０００９】
別の困難性は、単位時間あたりの高い代謝回転と相関する高い酵素活性は、いずれの場合も個々の天然の補酵素によってのみ通常もたらされることである。天然の補酵素の代わりに人工の補酵素が使用される場合、酵素活性は通常大幅に低下し、そしてそれにより、基質の代謝回転の速度は低下する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、本発明の基礎である目的は、先行技術の欠点が少なくとも部分的に取り除かれている、とりわけグルコースを測定するための安定な診断素子を提供することであった。特に、診断素子は、酵素と同様に補酵素の高い安定性を保証すると同時に一方で、基質の高い代謝回転を保障すべきである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本目的は、
ａ）分析物を含む試料を
ｉ）分析物に特異的な、変異された脱水素酵素および
ii）人工の補酵素
を含む乾式試薬層を含んでなる診断素子に接触させる工程、ならびに、
ｂ）分析物の存在または／および量を測定する工程
を含んでなる、分析物を測定するための方法により、本発明にしたがい達成される。
【発明の効果】
【００１２】
驚くべきことに、本発明の範囲内で、キュベット試験（cuvette test）では人工の補酵素の存在下で非常に低い活性しか有さなかった変異された脱水素酵素が、テストストリップのような乾式試薬層を含む診断素子において、より速い反応速度を示し、天然の補酵素（野生型補酵素）の存在下の場合と少なくとも同量の代謝回転量を生み出すことが見出された。この理由はおそらく、含有物が高濃度である場合、酵素の活性以外のほかの要因が代謝回転速度に決定的な影響を及ぼすという事実によるものであり、そしてこの点に関して、酵素、補酵素、還元型補酵素、分析物および酸化された分析物との間の複合体形成の状態がとりわけ非常に重要であるようである。
【００１３】
この点に関して、本発明の方法は、好ましい実施様態において、本明細書に記載される診断素子中の分析物の代謝回転速度が、人工の補酵素の代わりに対応する野生型補酵素を含んでなる、対応する診断素子中の分析物の代謝回転速度と同等かまたはより速いことを規定している。本発明により使用される診断素子中の分析物の代謝回転速度は、野生型補酵素を含む診断素子中の分析物の代謝回転速度と比較して、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも５０％、そして最も好ましくは少なくとも１００％、たとえば１００％から２００％増大する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】補酵素としてのＮＡＤ／ＮＡＤＨ存在下、０．０ｍｇ／ｄＬ、３５．２ｍｇ／ｄＬ、５４．２ｍｇ／ｄＬ、１４６．６ｍｇ／ｄＬ、２４９．０ｍｇ／ｄＬ、３３８．６ｍｇ／ｄＬおよび５５３．６ｍｇ／ｄＬのグルコース濃度（上から下に向かって示される）における、バチルス  ズブチルス（Bacillus subtilis）由来の野生型グルコース脱水素酵素の反応速度。１５５６．２ｋＵ／１００ｇ質量の酵素活性。
【００１５】
【図１Ｂ】補酵素としてのＮＡＤ／ＮＡＤＨ存在下、０．０ｍｇ／ｄＬ、３５．２ｍｇ／ｄＬ、５４．２ｍｇ／ｄＬ、１４６．６ｍｇ／ｄＬ、２４９．０ｍｇ／ｄＬ、３３８．６ｍｇ／ｄＬおよび５５３．６ｍｇ／ｄＬのグルコース濃度（上から下に向かって示される）における、バチルス  ズブチルス（Bacillus subtilis）由来の野生型グルコース脱水素酵素の反応速度。１００４．０ｋＵ／１００ｇ質量の酵素活性。
【図１Ｃ】補酵素としてのＮＡＤ／ＮＡＤＨ存在下、０．０ｍｇ／ｄＬ、３５．２ｍｇ／ｄＬ、５４．２ｍｇ／ｄＬ、１４６．６ｍｇ／ｄＬ、２４９．０ｍｇ／ｄＬ、３３８．６ｍｇ／ｄＬおよび５５３．６ｍｇ／ｄＬのグルコース濃度（上から下に向かって示される）における、バチルス  ズブチルス（Bacillus subtilis）由来の野生型グルコース脱水素酵素の反応速度。５０２．０ｋＵ／１００ｇ質量の酵素活性。
【図１Ｄ】補酵素としてのＮＡＤ／ＮＡＤＨ存在下、０．０ｍｇ／ｄＬ、３５．２ｍｇ／ｄＬ、５４．２ｍｇ／ｄＬ、１４６．６ｍｇ／ｄＬ、２４９．０ｍｇ／ｄＬ、３３８．６ｍｇ／ｄＬおよび５５３．６ｍｇ／ｄＬのグルコース濃度（上から下に向かって示される）における、バチルス  ズブチルス（Bacillus subtilis）由来の野生型グルコース脱水素酵素の反応速度。２５１．０ｋＵ／１００ｇ質量の酵素活性。
【図１Ｅ】補酵素としてのＮＡＤ／ＮＡＤＨ存在下、０．０ｍｇ／ｄＬ、３５．２ｍｇ／ｄＬ、５４．２ｍｇ／ｄＬ、１４６．６ｍｇ／ｄＬ、２４９．０ｍｇ／ｄＬ、３３８．６ｍｇ／ｄＬおよび５５３．６ｍｇ／ｄＬのグルコース濃度（上から下に向かって示される）における、バチルス  ズブチルス（Bacillus subtilis）由来の野生型グルコース脱水素酵素の反応速度。２５．１０ｋＵ／１００ｇ質量の酵素活性。
【図２】補酵素としてのｃａｒｂａＮＡＤ／ｃａｒｂａＮＡＤＨ存在下、０．０ｍｇ／ｄＬ、３４．４ｍｇ／ｄＬ、１４１．２ｍｇ／ｄＬ、２３６．６ｍｇ／ｄＬ、３３３．８ｍｇ／ｄＬおよび５２５．８ｍｇ／ｄＬのグルコース濃度（上から下に向かって示される）における、バチルス  ズブチルス（Bacillus subtilis）由来の野生型グルコース脱水素酵素の変異によって得られた、グルコース脱水素酵素の二重変異体ＧｌｕｃＤＨ＿Ｅ１７０Ｋ＿Ｋ２５２Ｌの反応速度。酵素活性：４．６０ｋＵ／１００ｇ質量。
【図３】グルコノラクトンを用いた滴定前後における、グルコース脱水素酵素（ＧｌｕｃＤＨ）／ＮＡＤＨ複合体の蛍光スペクトル。
【図４】グルコースを用いた滴定前後における、グルコース脱水素酵素（ＧｌｕｃＤＨ）／ＮＡＤＨ複合体の蛍光スペクトル。
【図５Ａ】野生型グルコース脱水素酵素およびＮＡＤＨの存在下、種々のグルコース濃度における、グルコース変換の反応速度。７７．０ｍｇ／ｄＬ、２０７．０ｍｇ／ｄＬ、３００．０ｍｇ／ｄＬおよび５０５．０ｍｇ／ｄＬのグルコース濃度（上から下に向かって示される）における、追加のグルコノラクトン添加なしの反応速度。
【図５Ｂ】野生型グルコース脱水素酵素およびＮＡＤＨの存在下、種々のグルコース濃度における、グルコース変換の反応速度。９６．２ｍｇ／ｄＬ、２７４．０ｍｇ／ｄＬ、３９９．０ｍｇ／ｄＬおよび６００．０ｍｇ／ｄＬのグルコース濃度（上から下に向かって示される）における、追加のグルコノラクトン添加下の反応速度。
【図６】グルコース脱水素酵素の二重変異体ＧｌｕｃＤＨ＿Ｅ１７０Ｋ＿Ｋ２５２Ｌのアミノ酸配列の表示。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本願で使用される用語「変異された脱水素酵素（mutated dehydrogenase）」または「脱水素酵素の変異体（dehydrogenase mutant）」は、天然の脱水素酵素（野生型脱水素酵素）の遺伝的に改変された変異体であって、同じ数のアミノ酸を有するが野生型脱水素酵素と比較して改変されたアミノ酸配列、すなわち野生型脱水素酵素とは少なくとも１つのアミノ酸が異なる変異体を意味する。
【００１７】
変異された脱水素酵素は、あらゆる生物学的源由来の野生型脱水素酵素からの突然変異により得ることができる。ここで、用語「生物学的源」とは、本発明の意味において、細菌などの原核生物ならびに哺乳類および他の動物などの真核生物の両方を含む。変異の導入は、部位特異的にまたは非部位特異的に起こすことができ、好ましくはこの分野で既知であり、特別な要件および条件にしたがって、天然の脱水素酵素のアミノ酸配列内で少なくとも１つのアミノ酸置換が生じる組換え法を用いて部位特異的に行われる。
【００１８】
このようにして得られ、そして、本発明の方法において使用される脱水素酵素の変異体は、好ましくは、対応する野生型脱水素酵素と比較して、増大した熱または／および加水分解安定性を有する。このような変異体の例は、とりわけ、Baik（Appl. Environ. Microbiol (2005), 71, 3285）、Vazquez-Figueroa（ChemBioChem (2007), 8, 2295）および国際公開第２００５／０４５０１６号に記述されており、その開示は、本明細書に参照として明確に組み込まれる。
【００１９】
本発明の意味での変異された脱水素酵素は、とくに好ましくは、対応する野生型脱水素酵素と比較して低下した比酵素活性を有する。本願で使用される用語「比酵素活性（specific enzyme activity）」（Ｕ／ｍｇ酵素で表現される）とは、所定の条件下で毎分、酵素１ミリグラム当たり転換される基質の量を意味する。一方、用語「凍結乾燥物活性（lyophilisate activity）」とは、所定の条件下で毎分、補助物質とともに酵素を含む凍結乾燥物１ミリグラム当たり転換される基質の量を意味する。
【００２０】
本発明の方法において使用される変異された脱水素酵素は、好ましくは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ／ＮＡＤＨ）依存性またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨ）依存性の変異された脱水素酵素であって、好ましくは、変異されたアルコール脱水素酵素（ＥＣ  １．１．１．１；ＥＣ  １．１．１．２）、変異されたＬ−アミノ酸脱水素酵素（１．４．１．５）、変異されたグルコース脱水素酵素（ＥＣ  １．１．１．４７）、変異されたグルコース−６−リン酸塩脱水素酵素（ＥＣ  １．１．１．４９）、変異されたグリセロール脱水素酵素（ＥＣ  １．１．１．６）、変異された３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．３０）、変異された乳酸脱水素酵素（ＥＣ  １．１．１．２７、ＥＣ  １．１．１．２８）、変異されたリンゴ酸脱水素酵素（ＥＣ  １．１．１．３７）および変異されたソルビトール脱水素酵素から選択される。
【００２１】
本発明の範囲内で変異されたグルコース脱水素酵素が使用される場合には、対応する野生型グルコース脱水素酵素と比較して、１または複数の改変されたアミノ酸を基本的にはそのアミノ酸配列のどの位置で含んでもよい。変異されたグルコース脱水素酵素は好ましくは、野生型グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列の１７０位および２５２位の少なくともどちらかに変異を含み、１７０位および２５２位に変異を有する変異体が特に好ましい。変異されたグルコース脱水素酵素がこれらの変異に加えてそれ以上の変異を含まない場合が有利であることが立証された。
【００２２】
１７０位または／および２５２位における変異は、基本的には、安定化、たとえば野生型脱水素酵素の熱または／および加水分解安定性の増大をもたらすような、あらゆるアミノ酸置換を含み得る。１７０位での変異は、好ましくは、グルタミン酸のアルギニンまたはリジンによるアミノ酸置換、特に好ましくは、グルタミン酸のリジンによるアミノ酸置換を含み、一方、２５２位に関しては、リジンのロイシンによるアミノ酸置換が好ましい。
【００２３】
前記のグルコース脱水素酵素の変異体を作製するために使用される野生型グルコース脱水素酵素は、好ましくは細菌由来であり、バチルス  メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス  ズブチルス（Bacillus subtilis）またはバチルス  チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）由来、とりわけバチルス  ズブチルス（Bacillus subtilis）由来のグルコース脱水素酵素が特に好ましく用いられる。最も好ましい態様において、バチルス  ズブチルス（Bacillus subtilis）由来の野生型グルコース脱水素酵素の変異により得られる、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する変異されたグルコース脱水素酵素ＧｌｕｃＤＨ＿Ｅ１７０Ｋ＿Ｋ２５２Ｌが、本発明の方法の範囲内で使用される。
【００２４】
本発明にしたがって、本明細書で記述される診断素子は、分析物に特異的である変異された脱水素酵素に加えてさらに人工の補酵素を含んでなるものである。本発明の意味の範囲内で、人工の補酵素は、天然の補酵素と比較して化学修飾されている補酵素であり、天然の補酵素と比較して、大気圧下、湿度、特に０℃から５０℃までの範囲の温度、特にｐＨ４からｐＨ１０までの範囲の酸および塩基、または／ならびに、アルコールもしくはアミンなどの求核試薬に対してより高い安定性を有し、そしてこのため、同一の環境条件下で天然の補酵素よりもより長い期間にわたってその活性を示すことが可能である。
【００２５】
人工の補酵素は、好ましくは、天然の補酵素と比較してより高い加水分解安定性を有しており、試験条件下で加水分解に対し完全に抵抗性であることが特に好ましい。人工の補酵素は、天然の補酵素と比較して脱水素酵素に対する結合定数が低下しており、たとえば２倍またはそれ以上減少した結合定数を有する。
【００２６】
本発明による方法の範囲内で使用され得る人工の補酵素の好ましい例は、人工のＮＡＤ（Ｐ）／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ化合物、すなわち、天然のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ／ＮＡＤＨ）もしくは天然のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨ）の化学誘導体、または式（Ｉ）の化合物である。
【００２７】
【化１】
0006113405.tif 000002
【００２８】
人工の補酵素が、人工のＮＡＤ（Ｐ）／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ化合物である場合、人工のＮＡＤ（Ｐ）／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ化合物は、好ましくは、たとえばリン酸残基などのリン含有基にグリコシル結合なしに、直鎖もしくは環状の有機残基によって、特には環状の有機残基によって連結される、３−ピリジンカルボニルまたは３−ピリジンチオカルボニル残基を含む。
【００２９】
人工の補酵素は、特に好ましくは一般式（II）を有する化合物またはその塩、または必要に応じてそれらの還元型
【化２】
0006113405.tif 000003
（式中、
Ａ＝アデニンまたはその類似体、
Ｔ＝それぞれ独立してＯ、Ｓ、
Ｕ＝それぞれ独立してＯＨ、ＳＨ、ＢＨ3-、ＢＣＮＨ2-、
Ｖ＝それぞれ独立してＯＨまたはリン酸基、または２つの基が環状リン酸基を形成する、
Ｗ＝ＣＯＯＲ、ＣＯＮ（Ｒ）2、ＣＯＲ、ＣＳＮ（Ｒ）2、Ｒ＝それぞれ独立してＨまたはＣ1〜Ｃ2−アルキル、
Ｘ1、Ｘ2＝それぞれ独立してＯ、ＣＨ2、ＣＨＣＨ3、Ｃ（ＣＨ3）2、ＮＨ、ＮＣＨ3、
Ｙ＝ＮＨ、Ｓ、Ｏ、ＣＨ2、
Ｚ＝直鎖状または環状有機残基であって、
ただしＺおよびピリジン残基は、グリコシル結合により連結されない）
から選択される。
【００３０】
式（II）の化合物において、Ｚは、好ましくは４〜６個の炭素原子を有する直鎖状残基であって、好ましくは４個の炭素原子を有し、そのうちの１または２個の炭素原子が任意には１もしくはそれ以上のＯ、ＳおよびＮから選択されるヘテロ原子によって置換されている直鎖状残基であるか、または、任意にはＯ、ＳおよびＮから選択されるヘテロ原子ならびに任意には１もしくはそれ以上の置換基を含む５または６個の炭素原子を有する環状基、ならびに、ＣＲ42残基を含む残基であり、ここでＣＲ42は環状基およびＸ2に結合しており、Ｒ4はそれぞれ独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＣＨ3である。
【００３１】
Ｚは、特に好ましくは、飽和のまたは不飽和の炭素環式または複素環式の５員環であり、とりわけ一般式（III）を有する化合物である。
【００３２】
【化３】
0006113405.tif 000004
式中、Ｒ5'とＲ5''のあいだは単結合または二重結合であってもよく、ここで、
Ｒ4＝それぞれ独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＣＨ3を意味し、
Ｒ5＝ＣＲ42、
Ｒ5'とＲ5''のあいだが単結合である場合、Ｒ5'＝Ｏ、Ｓ、ＮＨ、Ｃ1〜Ｃ2−アルキル、ＣＲ42、ＣＨＯＨ、ＣＨＯＣＨ3、およびＲ5''＝ＣＲ42、ＣＨＯＨ、ＣＨＯＣＨ3、
Ｒ5'とＲ5''のあいだが二重結合である場合、Ｒ5'＝Ｒ5''＝ＣＲ4、ならびに
Ｒ6、Ｒ6'＝それぞれ独立してＣＨまたはＣＣＨ3を意味する。
【００３３】
好ましい実施態様において、本発明の化合物は、アデニンもしくはたとえばＣ8−およびＮ6−置換アデニンなどのアデニン類似体、７−デアザなどのデアザ変異体、８−アザなどのアザ変異体、または７−デアザもしくは８−アザなどの組合せ、またはホルモマイシンなどの炭素環類似体を含み、７−デアザ変異体はハロゲン、Ｃ1〜Ｃ6−アルキニル、Ｃ1〜Ｃ6−アルケニルまたはＣ1〜Ｃ6−アルキルによって７位が置換され得る。
【００３４】
また別の好ましい実施形態では、化合物は、リボースの代わりに、たとえば２−メトキシデオキシリボース、２’−フルオロデオキシリボース、ヘキシトール、アルトリトール、またはビシクロ糖、ＬＮＡ糖およびトリシクロ糖などの多環類似体を含むアデノシン類似体を含む。
【００３５】
特に、式（II）の化合物において、（ジ）ホスフェート酸素を等電子数的に、たとえばＯ-をＳ-またはＢＨ3-によって、ＯをＮＨ、ＮＣＨ3またはＣＨ2によって、および＝Ｏを＝Ｓによって置換してもよい。本発明の式（II）の化合物において、Ｗは、好ましくはＣＯＮＨ2またはＣＯＣＨ3である。
【００３６】
式（III）の基において、Ｒ5は好ましくはＣＨ2である。さらに、Ｒ5'はＣＨ2、ＣＨＯＨおよびＮＨから選択されることが好ましい。特に好ましい実施態様では、Ｒ5'およびＲ5''はいずれの場合にもＣＨＯＨである。なお、さらに好ましい実施態様では、Ｒ5'がＮＨかつＲ5''がＣＨ2である。Ｒ4がＨ、Ｒ5がＣＨ2、Ｒ5'およびＲ5''がＣＨＯＨかつＲ6およびＲ6'がＣＨである式（III）の化合物が最も特に好ましい。
【００３７】
最も特に好ましい実施態様において、人工の補酵素は、文献（J. T. Slama, Biochemisty (1998), 27, 183 および Biochemistry (1989), 28, 7688）より公知のカルバＮＡＤ化合物である。本発明により使用され得る他の安定な補酵素は、国際公開第９８／３３９３６号、国際公開第０１／４９２４７号、国際公開第２００７／０１２４９４号、米国特許第５,８０１,００６号明細書、米国特許出願１１／４６０,３６６号明細書およびBlackburnらによる文献（Chem. Comm. (1996), 2765）に記述されており、その開示は、本明細書に参照として明確に組み込まれる。
【００３８】
本発明の方法で使用される診断素子は、変異された脱水素酵素および人工の補酵素を含有する、乾式試薬層を含んでなるものであって、分析物を含む試料によって湿潤されることが可能であればどのような診断素子でもよい。変異された脱水素酵素および人工の補酵素に加えて、試薬層は任意には、たとえば適切なメディエーターならびに適切な補助物質または／および添加剤などの、分析物の定性的検出または定量的測定のために使用される別の試薬を含んでいてもよい。
【００３９】
水性または非水性溶液の形態で分析物が適用され得る診断素子が、本発明の範囲内で好ましく使用される。本発明の特に好ましい実施態様において、診断素子は、テストテープ、テストディスク、テストパッド、テストストリップ、テストストリップドラム、または国際公開第２００５／０８４５３０号に記載の診断素子であり、本明細書はこれを明確に参照している。本願で記述される診断素子は、いずれの場合にも、分析物を含む試料と接触させられることが可能な、かつ、分析物の定性的または／および定量的測定を適切な方法を用いて可能にする、少なくとも１つの試験領域を含む。
【００４０】
本明細書で使用される用語「テストテープ（test tape）」は、通常１個以上の個別の試験領域、好ましくは少なくとも１０個の個別の試験領域、より好ましくは少なくとも２５個の個別の試験領域および最も好ましくは少なくとも５０個の個別の試験領域を含む、テープ様の診断素子を意味する。個別の試験領域は、好ましくは数ミリメートルから数センチメートルの距離で、たとえば互いどうしが２．５ｃｍより短い距離でそれぞれ配置され、そして、テストテープは任意には、連続した試験領域の間に、テープ移動中の移動した距離を記録するためのまたは／および較正のためのマーカー領域を含んでいてもよい。このようなテストテープは、たとえば欧州特許出願公開１７３９,４３２号明細書に記述されており、その開示は、参照として明確に組み込まれる。
【００４１】
本明細書で使用される用語「テストディスク（test desk）」は、１またはそれ以上の個別の試験領域、たとえば少なくとも１０の個別の試験領域を含むことのできるディスクの形状をした診断素子を意味する。ある実施態様において、テストディスクは、試験薬品の薄層で、たとえば約２０μｍの厚さを有する層でコートされており、分析物の試料をその上に塗布することができ、それによって、大きさに程度の差はあるがテストディスクの領域が試料量に依存して試料によって湿潤され、分析物を測定するために使用され得る。薬品の層を通じて水分が通過するため、部分的にまたは完全に湿潤し得るテストディスクの非濡れ領域は、引き続き分析物のさらなる測定に利用可能である。
【００４２】
本発明の方法は、光化学的にまたは電気化学的に検出可能であるあらゆる生物学的または化学的物質の測定に使用することができる。分析物は好ましくは、マレイン酸、アルコール、アンモニウム、アスコルビン酸、コレステロール、システイン、グルコース、グルコース−６−リン酸、グルタチオン、グリセロール、尿素、３−ヒドロキシ酪酸塩、乳酸、５’−ヌクレオチダーゼ、ペプチド、ピルビン酸塩、サリチル酸塩およびトリグリセリドからなる群より選択されるが、グルコースが特に好ましい。この点に関し、分析物はあらゆる起源由来であり得るが、限定はされないが、全血、血漿、血清、リンパ液、胆汁、脳脊髄液、細胞外組織液、尿、および唾液または汗などの腺分泌物を含む体液中に好ましくは含有され得る。全血、血漿、血清もしくは細胞外組織液由来の試料中の分析物の存在および／または量は、好ましくは本明細書で記述される診断素子によって測定される。
【００４３】
分析物の定性的または／および定量的測定は、あらゆる方法で行われ得る。この目的のためには、先行技術から公知であり、かつ、手動でもしくは適切な手段を使用することによって分析されるかまたは読み出されることが可能である測定可能な信号を発生できる、酵素反応を検出するための全ての方法が、基本的には使用され得る。本発明の範囲内で、たとえば吸収、蛍光、円偏光二色性（ＣＤ）、旋光分散（ＯＲＤ）、屈折率測定などの測定を含む光学的検出法および電気化学的技術が好ましくは使用される。分析物の存在または／および量は、とくに好ましくは、光度計測的または蛍光計測的に、たとえば人工の補酵素の蛍光計測的に検出可能な変化によって間接的に測定される。
【００４４】
別の側面では、本願は、分析物を測定するための診断素子であって、
（ａ）分析物に特異的な、変異された脱水素酵素、および
（ｂ）人工の補酵素
を含有する乾式試薬層を含んでなる診断素子に関する。
【００４５】
診断素子の、および、診断素子に含有される変異された脱水素酵素または診断素子に含有される人工の補酵素の好ましい実施態様に関し、様態は発明の方法に関する記載とあわせて参照される。
【００４６】
本発明はさらに以下の図面および実施例によって説明される。
【実施例】
【００４７】
実施例１：Ｅ１７０ＫおよびＫ２５２Ｌのアミノ酸置換を有する、バチルス  ズブチルス（Bacillus subtilis）由来のグルコース脱水素酵素の二重変異体（ＧｌｕｃＤＨ＿Ｅ１７０Ｋ＿Ｋ２５２Ｌ）の調製
【００４８】
天然の脱水素酵素と比較して安定化されている酵素を作製するために、バチルス  ズブチルス（Bacillus subtilis）由来のグルコース脱水素酵素の核酸配列が、プラスミドｐＫＫ１７７に導入された（ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIIIを用いてクローニングされた）。Ｅ１７０ＫおよびＫ２５２Ｌの変異が、野生型グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列において、部位特異的変異によって始めに１７０位に、そして続いて、部位特異的変異によって２５２位に導入された。それぞれの変異誘発工程は、ＰＣＲ反応の一部として、特異的にデザインされたプライマーを用いて行われた。
【００４９】
得られたＰＣＲ産物は大腸菌ＸＬ１ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’に形質転換された。細胞が取り出され、プラスミドを含むクローンが終夜で培養され、そして、酵素活性が温度負荷（負荷試験：５０℃で３０分）の前後で測定された。結果を表１に示す。
【００５０】
【表１】
0006113405.tif 000005
【００５１】
陽性クローンはさらに２回シークエンシングの前に試験された。この方法によって得られた二重変異体ＧｌｕｃＤＨ＿Ｅ１７０Ｋ＿Ｋ２５２Ｌは、生産菌株である大腸菌ＮＭ５２２に、ヘルパープラスミドとしてｐＵＢ−５２０を用いて形質転換された。
【００５２】
実施例２：二重変異体ＧｌｕｃＤＨ＿Ｅ１７０Ｋ＿Ｋ２５２Ｌの精製
【００５３】
それぞれの１０ｇ生物量が、ｐＨ６．５の３０ｍＭリン酸カリウム緩衝液５０ｍＬに取り出され、そして、約８００ｂａｒで破砕された。細胞片を分離した後、ＤＥＡＥセファロース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ）上、１ｍＬのカラム容量あたり４０ｍｇより少ないタンパク質のロード量で、かつ、緩衝液Ａ（ｐＨ６．５の３０ｍＭリン酸カリウム緩衝液）から緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ＋５００ｍＭの塩化ナトリウム）までの線形グラディエントを用いて、クロマトグラフィーを行った。グルコース脱水素酵素活性を呈する画分がまとめられ、そして、硫酸アンモニウム（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて、２３０ｍＳ／ｃｍの電導度に調節された。
【００５４】
遠心分離後、透明な上澄みが、フェニルセファロースＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ）上、１ｍＬのカラム容量あたり最大１０ｍｇのタンパク質のロード量でクロマトグラフィーにより分離された。溶離は、硫酸アンモニウムを用いて２３０ｍＳ／ｃｍの電導度に調節された緩衝液Ａから純粋な緩衝液Ａまでの線形グラディエントを用いて行われた。画分はその酵素活性を試験され、まとめられ、ｐＨ６．５の６０ｍＭリン酸カリウム緩衝液中、約５０ｍｇ／ｍＬの濃度に再緩衝液化され、濃縮されそして凍結乾燥された。
【００５５】
実施例３：バチルス  ズブチルス（Bacillus subtilis）由来の野生型グルコース脱水素酵素および二重変異体ＧｌｕｃＤＨ＿Ｅ１７０Ｋ＿Ｋ２５２Ｌのキュベット試験における活性の測定
【００５６】
ＮＡＤ／ＮＡＤＨまたはｃａｒｂａＮＡＤ／ｃａｒｂａＮＡＤＨの存在下、バチルス  ズブチルス（Bacillus subtilis）由来の野生型グルコース脱水素酵素および実施例１で作製された二重変異体ＧｌｕｃＤＨ＿Ｅ１７０Ｋ＿Ｋ２５２Ｌの、比活性度または凍結乾燥物活性度を試験するために、両方の酵素に対しグルコース脱水素酵素活性試験が行われた。
【００５７】
試薬溶液の調製
トリス緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ８．５；０．２Ｍ  Ｎａｃｌ）
１１．６８ｇのＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙ）および１２．１１ｇのトリス（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を約９００ｍＬの再蒸留水に溶解し、１Ｎ  ＨＣｌを用いてｐＨ８．５に調製し、そして、再蒸留水を用いて１０００ｍＬとした。
【００５８】
希釈緩衝液（３．８ｍＭ  ＮＡＤ；０．１Ｍトリス、ｐＨ８．５；０．２Ｍ  ＮａＣｌ）
２５０ｍｇのＮＡＤ（Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を１００ｍＬのトリス緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ８．５；０．２Ｍ  ＮａＣｌ）に溶解した。
【００５９】
グルコース溶液
２ｇのＤ（＋）グルコース一リン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を１０ｍＬの再蒸留水に溶解した。溶液は、２時間の室温放置および変旋光平衡の調節の後、使用可能であった。
【００６０】
ＮＡＤ溶液（１５ｍＭ）
１０ｍｇのＮＡＤ（Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を１ｍＬの再蒸留水に溶解した。
【００６１】
ｃａｒｂａＮＡＤ溶液（１５ｍＭ）
１０ｍｇのｃａｒｂａＮＡＤ（Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を１ｍＬの再蒸留水に溶解した。
【００６２】
試料の調製
測定準備のため、試験される酵素１０ｍｇを１ｍＬの希釈緩衝液に溶解し、そして、再構成を可能にするために室温で６０分間静置した。続いて、希釈緩衝液で０．１２から０．２３Ｕ／ｍＬに希釈した。
【００６３】
測定手順
測定を行うために、１．３５ｍＬのトリス緩衝液、０．１ｍＬのグルコース溶液、および、０．０５ｍＬのＮＡＤ溶液または０．０５ｍＬのｃａｒｂａＮＡＤ溶液（ともに２５度でインキュベートされた）を、プラスティック製キュベットにピペットで取り出し、混合し、そして、キュベットキャリッジ中２５度でインキュベートした。
【００６４】
溶液の吸光度がもはや変化しなくなった（対照値）後、０．０２５ｍＬの試料をキュベットに導入することにより反応を開始し、そして、試料の吸光度を５分の間測定した。
【００６５】
測定波長：３４０ｎｍ
試験容量：１．５２５ｍＬ
光路長：１ｃｍ
温度：２５度
評価範囲：１〜５分
【００６６】
評価
それぞれの酵素の水溶液中での活性が以下の式を用いて評価された：
活性＝（１．５２５×ΔＡ／分×希釈因子）／（ε340×０．０２５×１）Ｕ／ｍＬ
式中：
ΔＡ＝Ａt−Ａ0＝吸光度の経時変化の傾き
ε340＝６．３［１×ｍｍｏｌ-1×ｃｍ-1］
【００６７】
測定の結果を表２に示す。
【００６８】
【表２】
0006113405.tif 000006
【００６９】
表２に示されるように、ＷＴ−ｇｌｕｃＤＨ／ｃａｒｂａＮＡＤ（８．２Ｕ／ｍｇ酵素）系のキュベット中、標準状態での活性は、ＷＴ−ＧｌｕｃＤＨ／ＮＡＤ（４８４Ｕ／ｍｇ酵素）系の活性と比較して２桁小さい。同様に、二重変異体ＧｌｕｃＤＨ＿Ｅ１７０Ｋ＿Ｋ２５２Ｌの、人工の補酵素ｃａｒｂａＮＡＤの存在下での活性（３．７Ｕ／ｍｇ酵素）は、天然の補酵素ＮＡＤの存在下（２７０Ｕ／ｍｇ酵素）と比較して約２桁小さい。
【００７０】
実施例４：乾式試薬層中の、バチルス  ズブチルス（Bacillus subtilis）由来の野生型グルコース脱水素酵素および二重変異体ＧｌｕｃＤＨ＿Ｅ１７０Ｋ＿Ｋ２５２Ｌの反応速度の測定
【００７１】
バチルス  ズブチルス（Bacillus subtilis）由来の天然のグルコース脱水素酵素（ＷＴ−ＧｌｕｃＤＨ）または実施例１で調製された二重変異体ＧｌｕｃＤＨ＿Ｅ１７０Ｋ＿Ｋ２５２Ｌのどちらか一方を、補酵素としてのＮＡＤ／ＮＡＤＨまたはｃａｒｂａＮＡＤ／ｃａｒｂａＮＡＤＨと組み合わせて含む、種々のテストストリップが、酵素の反応速度を測定するために調製された。
【００７２】
具体的には、まず初めに、ｐＨ７．０の１Ｍリン酸緩衝液１８．４ｇ、ガントレッツ（Gantrez）Ｓ９７（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ）１．４ｇ、１６％のＮａＯＨ溶液２．９４ｇ、Ｍｅｇａ８（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、Ｇｅｒｏｐｏｎ  Ｔ７７（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ）およびポリビニルピロリドン  ２５０００（Ｆｌｕｋａ  Ｃｏｍｐａｎｙ）１．９０ｇからなる部分溶液１が、このために調製された。
【００７３】
この部分溶液が続いて、０．５０ｇの塩化ナトリウム、２１．３ｇの再蒸留水、４．４３ｇのＴｒａｎｓｐａｆｉｌｌ（Ｅｖｏｎｉｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ）および２．９５ｇのＰｒｏｐｉｏｆａｎ（ＢＡＳＦ  Ｃｏｍｐａｎｙ）からなる部分溶液２、ならびに、冷蔵庫中で終夜冷却された部分溶液３と混合されたが、後者は、ｐＨ７．０の１Ｍリン酸緩衝液１７．４ｇ、塩化ナトリウム０．５０ｇ、２Ｍのリン酸水素二カリウム１４．３５ｇならびに下記の表３にそれぞれの場合において述べられている個々の量の脱水素酵素、補酵素および任意にはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ）からなる。減量された量の天然の脱水素酵素が使用される場合、テストストリップのマトリックス特性を可能な限り一定に保つために、酵素的に不活性なウシ血清アルブミンが処方に添加された。
【００７４】
【表３】
0006113405.tif 000007
【００７５】
この方法によって得られたテストストリップが、励起ＬＥＤ（３７５ｎｍ）および従来型検出器（ＢＰＷ３４  ｂｌｕｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ）を含む、実験室用測定機器（Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｍｐａｎｙの自作）によって測定された。適用された試料物質は、調整されたグルコース値を含む血液であった。測定結果が図１および２に示されている。
【００７６】
１Ａ〜１Ｅの図に示すとおり、ＮＡＤ存在下の野生型グルコース脱水素酵素によるグルコースの変換の反応速度はテストストリップ中の酵素量の減少に伴い低下した。したがって、ｃａｒｂａＮＡＤ存在下の二重変異体ＧｌｕｃＤＨ＿Ｅ１７０Ｋ＿Ｋ２５２Ｌによるグルコースの変換の反応速度は、４．６０ｋＵ／１００ｇ質量（表３参照）しかない顕著により低い酵素活性のために、より悪い結果さえもたらすであろうことが予期された。
【００７７】
図２は、補酵素としてｃａｒｂａＮＡＤ存在下、実施例１によって得られた変異されたグルコース脱水素酵素の反応速度を示している。図２に示されるとおり、低下した酵素活性にともない予期される反応速度の低下は起こっていない。むしろ、二重変異体はｃａｒｂａＮＡＤ存在下で、表３に記載の、対応する野生型グルコース脱水素酵素および天然の補酵素ＮＡＤを含む全ての処方と比べてより良好な反応速度を示している。
【００７８】
実施例３および４に記載されている結果を考慮したならば、乾式試薬層中のグルコースの代謝回転率を決定づけるものは、酵素の活性ではなく、むしろ、酵素、補酵素、還元型補酵素、グルコースおよびグルコノラクトンの間の複合体形成の状態であるようであり、その複合体形成の状態は明らかに、野生型酵素とＮＡＤ／ＮＡＤＨとの場合よりも、実施例１において調製された変異体とｃａｒｂａＮＡＤ／ｃａｒｂａＮＡＤＨの場合に、より良好である。
【００７９】
実施例５：グルコース脱水素酵素、ＮＡＤＨおよびグルコースまたはグルコラクトンからなる三重複合体の検出
【００８０】
酵素、還元型補酵素およびグルコースまたはグルコラクトンからなる三重重複合体の存在を確認するために、ＮＡＤＨの蛍光特性をもとにした分析物の結合実験がキュベット試験において行われた。
【００８１】
この目的のために、１ｍｇのＮＡＤＨ（Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ）が１ｍＬのリン酸緩衝液に溶解され、そして、関連する蛍光スペクトルが記録された。続いて、１０ｍｇのバチルス  ズブチルス（Bacillus subtilis）由来の野生型グルコース脱水素酵素（ＧｌｕｃＤＨ）が添加されると、ただちに、文献より公知の複合体ＧｌｕｃＤＨ−ＮＡＤＨが形成し、ＮＡＤＨの顕著な長寿命性（遊離状態における０．４ｎｓと比較して３ｎｓ）によって複合体はシフトした発光極大を４５０ｎｍに生じた（図３参照）。この複合体のグルコラクトンによる滴定は蛍光を減少させ、一方、同時に発光極大を４２７ｎｍにシフトさせたが、後者は、ＧｌｕｃＤＨ−ＮＡＤＨ−グルコラクトン三重複合体である新規複合体の存在を示している（図３参照）。
【００８２】
蛍光の減少、これはまた寿命の短縮にも対応しているが、この減少はおそらくＮＡＤＨ−グルコラクトンの酸化還元対による迅速なエネルギー減少によるものと思われる。二元複合体ＧｌｕｃＤＨ−ＮＡＤＨがグルコースで滴定された場合には、効果のないＧｌｕｃＤＨ−ＮＡＤＨ−グルコース三重複合体が形成され、還元種の欠如により、これは特別な様式でエネルギーを低下させることができないので、したがって、同じ発光極大において、より長い寿命およびより高い強度さえも示す傾向がある。
【００８３】
三重複合体ＧｌｕｃＤＨ−ＮＡＤＨ−グルコラクトンの開裂および、それによる酵素の再利用可能性が、乾式試薬層中でのグルコースのグルコノラクトンへの変換速度を決定しているのならば、（反応中に形成されたグルコノラクトンに加えて）追加されるグルコノラクトンはそれ以上の酵素複合体を抑制するはずであるから、グルコノラクトンの添加はグルコースの変換速度を低下させるはずである。
【００８４】
この仮定は、本出願の実施例４による、グルコラクトンの非存在下（図５Ａ参照）または存在下（図５Ｂ参照）の乾式試薬層に血液が適用された、反応速度測定で確認された。図５Ｂは、図５Ａで測定された試料と比較して、変換の顕著な減少を示している。
【図１Ａ】
0006113405.tif 000008
【図１Ｂ】
0006113405.tif 000009
【図１Ｃ】
0006113405.tif 000010
【図１Ｄ】
0006113405.tif 000011
【図１Ｅ】
0006113405.tif 000012
【図２】
0006113405.tif 000013
【図３】
0006113405.tif 000014
【図４】
0006113405.tif 000015
【図５Ａ】
0006113405.tif 000016
【図５Ｂ】
0006113405.tif 000017
【図６】
0006113405.tif 000018
【配列表】
0006113405000001.app