(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸をハイブリダイズさせるインサイツの方法において、
−  二本鎖核酸を変性させるのに有効な量の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒を含有する第一の水性組成物中で第一の核酸配列を含む第一の二本鎖核酸を変性させ、
−  二本鎖核酸を変性させるのに有効な量の少なくとも変性剤を含有する第二の水性組成物中で第二の核酸配列を含む第二の二本鎖核酸を変性させ、
−  第一の核酸配列を含む核酸及び第二の核酸配列を含む核酸をハイブリダイズさせるために８時間未満、第一及び第二の水性組成物を組み合わせることを含み、
ここで極性非プロトン溶媒は、
【化１】
0006091753.tif 000047
からなる群から選択されるインサイツの方法。
【請求項２】
第二の水性組成物中の変性剤が極性非プロトン溶媒である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第一及び／又は前記第二の二本鎖核酸を変性させる時間が１分、２分、３分、４分、５分、１０分、１５分、又は３０分である請求項１及び請求項２の何れか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記第一の核酸配列を含む核酸及び前記第二の核酸配列を含む核酸を前記ハイブリダイズさせる際に、前記第一及び第二の水性組成物を加熱及び冷却する工程を含む、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記第一の核酸配列を含む核酸及び前記第二の核酸配列を含む核酸を前記ハイブリダイズさせるのに要する時間が１時間未満、３０分未満、１５分未満、又は５分未満である請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
第一及び第二の水性組成物中の極性非プロトン溶媒の濃度が５％から１０％（ｖ／ｖ）、１０％から２０％（ｖ／ｖ）、又は２０％から３０％（ｖ／ｖ）である請求項２に記載の方法。
【請求項７】
第一及び第二の水性組成物中の極性非プロトン溶媒が無毒性である請求項２に記載の方法。
【請求項８】
第一及び第二の水性組成物中の極性非プロトン溶媒が、１７．７から２２．０ＭＰａ１／２の範囲の分散溶解度パラメータ、１３から２３ＭＰａ１／２の範囲の極性溶解度パラメータ、及び３から１３ＭＰａ１／２の範囲の水素結合溶解度パラメータを有する請求項２に記載の方法。
【請求項９】
第一及び第二の水性組成物が、緩衝剤、塩、促進剤、キレート剤、洗浄剤、及びブロッキング剤からなる群から選択される少なくとも一種の更なる成分を更に含む請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
促進剤がデキストラン硫酸であり、塩がＮａＣｌ及び／又はホスフェートバッファーである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
デキストラン硫酸が５％から４０％の濃度で存在し、ＮａＣｌが０ｍＭから１２００ｍＭの濃度で存在し、及び／又はホスフェートバッファーが０ｍＭから５０ｍＭの濃度で存在する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
デキストラン硫酸が１０％から３０％の濃度で存在し、ＮａＣｌが３００ｍＭから６００ｍＭの濃度で存在し、及び／又はホスフェートバッファーが５ｍＭから２０ｍＭの濃度で存在する請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
促進剤が、ホルムアミド、ＤＭＳＯ、グリセロール、プロピレングリコール、１，２−プロパンジオール、ジエチレングリコール、エチレングリコール、グリコール、及び１，３プロパンジオールからなる群から選択され、緩衝剤がクエン酸バッファーである請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
ホルムアミドが０．１−５％の濃度で存在し、ＤＭＳＯが０．０１％から１０％の濃度で存在し、グリセロール、プロピレングリコール、１，２−プロパンジオール、ジエチレングリコール、エチレングリコール、グリコール、及び１，３プロパンジオールが０．１％から１０％の濃度で存在し、クエン酸バッファーが１ｍＭから５０ｍＭの濃度で存在する請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
第一及び第二の水性組成物が４０％の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒、１０％のデキストラン硫酸、３００ｍＭのＮａＣｌ、及び／又は５ｍＭのホスフェートバッファーを含有する請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
第一及び第二の水性組成物が１５％の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒、２０％のデキストラン硫酸、６００ｍＭのＮａＣｌ、及び１０ｍＭのクエン酸バッファーｐＨ６．２を含有する請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
インサイツハイブリダイゼーション用途における標的核酸の別々の変性を実施するための、
【化２】
0006091753.tif 000048
からなる群から選択される極性非プロトン溶媒を１％から９５％（ｖ／ｖ）含有する組成物の使用。
【請求項１８】
組成物が極性非プロトン溶媒を５％から１０％（ｖ／ｖ）、１０％から２０％（ｖ／ｖ）、又は２０％から３０％（ｖ／ｖ）含有する、請求項１７に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ターゲット及びプローブを別々に変性させることを含むハイブリダイゼーション用途のための組成物及び方法に関する。一実施態様では、本発明は、ＤＮＡ及びＲＮＡのインビボ、インビトロ、及びインサイツでの分子的検査に使用できる。特に、本発明は、細胞診、組織診断、及び分子生物学の分野におけるＤＮＡ及びＲＮＡの分子的検査に使用することができる。他の実施態様では、本発明はインサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）に使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
二本鎖核酸分子（例、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸)、ＤＮＡ／ＲＮＡ（リボ核酸）及びＲＮＡ／ＲＮＡ）は、二重螺旋構造で結合する。この二重螺旋構造は、塩基が特定の様式（Ａ＋Ｔ／Ｕ又はＧ＋Ｃ）でペアをなした場合の対鎖の塩基間の水素結合及び積み重なった塩基間の疎水性結合によって安定化される。相補的な塩基対合（ハイブリダイゼーション）は核酸が関わる全てのプロセスの中心である。
【０００３】
ハイブリダイゼーションの基本的な例では、核酸プローブ又はプライマーは、試料中の標的核酸、例えばＤＮＡ又はＲＮＡと結合するか又は「ハイブリダイズ」するように設計される。一つのタイプのハイブリダイゼーション応用であるインサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、検体中の標的へのハイブリダイゼーションを含み、ここで、検体はインビボ、インサイツ又はインビトロで、例えばガラススライドに固定され又は付着されうる。プローブは標識され、蛍光又は明視野顕微鏡／スキャナーの使用によってプローブ・標的ハイブリッドの同定が可能になる。
【０００４】
核酸ハイブリダイゼーションアッセイの効率と精度は、殆どは３つの主要な因子の少なくとも一つに依存する：ａ）変性条件、ｂ）再生条件、及びｃ）ハイブリダイゼーション後の洗浄条件。
【０００５】
プローブ又はプライマーが試料中の標的核酸に結合するためには、核酸の相補鎖が分離されねばならない。この鎖の分離工程は、「変性」と名付けられるが、二重螺旋の水素結合と疎水性結合を破壊する活動的状態を一般的に必要とする。プローブ及び標的分子は、別々に又は一緒に（共変性）変性しうる。別々の変性は形態をより良く保つ一方、共変性は具体的な工程数を減らすと議論されてきた。これらの理由により、別々な変性の工程は、ほとんどの場合分子細胞遺伝学の用途に使用され、共変性はほとんどの場合組織切片を分析する場合に使用される。
【０００６】
伝統的なハイブリダイゼーション実験、例えばＩＳＨアッセイは、二本鎖核酸を変性させるためにホルムアミド含有溶液を使用する。ホルムアミドは、ゆるくかつ均質に結合した水和物分子を置換することにより、またワトソン・クリック結合部位の「ホルムアミド化」により塩基対を破壊する。従って、ホルムアミドは二本鎖の核酸及びアナログに不安定化作用を有する。
【０００７】
ひとたび、核酸の相補鎖が分離されると、「再生」又は「再アニーリング」工程により、プライマー又はプローブが試料中の標的核酸へ結合することができるようになる。この工程は時に「ハイブリダイゼーション」工程とも呼ばれる。ホルムアミドは二本鎖の核酸及びアナログの変性を促進するが、ホルムアミドの無い水性変性溶液と比較して再生時間を著しく延長もする。実際、再アニーリング工程は伝統的なハイブリダイゼーション用途における最も時間を要する態様である。伝統的なハイブリダイゼーション時間の例を図１及び２に示す。
【０００８】
更に、ホルムアミドは長い処理時間を上回る不利な点がある。ホルムアミドは、毒性で有害物質であり、使用と廃棄に対して厳しい規制を受ける。更に、高濃度のホルムアミドの使用は細胞、核、及び／又は染色体構造の形態破壊を引き起こしうるので、検出の最中に高いバックグランドシグナルを生じる。
【０００９】
而して、従来のハイブリダイゼーション用途に関する不利を克服する必要性が存在する。この必要性に対応することにより、本発明は先行技術のハイブリダイゼーション用途に対して幾つかの潜在的な利点を提供する。
【発明の概要】
【００１０】
先行技術のハイブリダイゼーション用途に対して次の利点の少なくとも一つを持つハイブリダイゼーション用途を生じる方法及び組成物を提供することが本発明の目的である：より低いバックグランド、より均質なバックグランド、試料形態の保存、より容易な自動化、より早い手順、及びより安全な（より毒性の少ない）試薬。本発明がそれらの目的を達成する一つの方法は、プローブと標識を別々に変性するための方法と組成物を提供することによる。
【００１１】
本発明の組成物及び方法は任意のハイブリダイゼーション法に応用可能である。本発明の組成物及び方法は、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、及びその合成及び天然アナログのような塩基対を使用してハイブリダイズし又は結合する任意の分子系にも適用可能である。
【００１２】
本発明の核酸ハイブリダイゼーション方法及び組成物は、ゲノムＤＮＡ、染色体、染色体断片、遺伝子、及び染色体異常、例えば正常な状態又は疾患に関連する転座、欠損、増幅、挿入、変異、又は逆位のインビボ、インビトロ又はインサイツ分析に使用されうる。更に、その方法と組成物は、感染剤並びに例えばｍＲＮＡのようなＲＮＡ及びその相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の発現レベルの変化の検出に有用である。
【００１３】
他の用途は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルスＲＮＡ、ウイルスＤＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、非翻訳ＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ、例えばｔＲＮＡ及びｒＲＮＡ）、転移メッセンジャーＲＮＡ（ｔｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用(piwi-interacting)ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、長非翻訳ＲＮＡ、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、メチレーション及び他の塩基修飾、一塩基多型（ＳＮＰｓ）、コピー数多型（ＣＮＶｓ）、及び例えば単独で又は非抄紙機核酸と組み合わせて、放射性同位体、蛍光分子、ビオチン、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）又は抗原で標識された核酸のインビボ又はインビトロ分析を含む。
【００１４】
本発明の核酸ハイブリダイゼーション方法及び組成物は、ＰＣＲ、インサイツＰＣＲ、ノーザンブロット、サザンブロット、フローサイトメトリー、オートラジオグラフィー、蛍光顕微鏡、化学発光、免疫組織化学、仮想核型、遺伝子アッセイ、ＤＮＡマイクロアレイ（例えば、アレイ比較的ゲノムハイブリダイゼーション（アレイＣＧＨ））、遺伝子発現プロファイリング、遺伝子ＩＤ、タイリングアレイ、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、及びインサイツハイブリダイゼーション、例えばＦＩＳＨ、ＳＩＳＨ、ＣＩＳＨのような技術を使用する核酸のインビボ又はインビトロ分析に有用である。本発明の組成物及びキットは、骨髄スメア、血液スメア、パラフィン包埋組織調製物、酵素的に解離された組織試料、骨髄、羊膜細胞、サイトスピン調製物、インプリント等のようなインビトロ及びインビボ試料に使用されうる。
【００１５】
一実施態様では、本発明は、分子と標的に対して別々の変性工程を使うことで、少なくとも一つの分子（例えば、プローブ）を標的（例えば、生物学的試料）へハイブリダイズするための方法及び組成物を提供する。他の実施態様では、本発明は、伝統的な変性バッファー中の例えば７０％のホルムアミドから本発明の組成物及び方法においては５０％、２５％、１５％、１０％、５％、２％、１％又は０％ｖ／ｖのホルムアミドとし、かかる変性工程においてホルムアミドの使用を排除し、又はそれへの依存性を低減しうる。よって、ある態様では、本発明は、そうした伝統的なハイブリダイゼーションアッセイにおけるホルムアミドの使用に関係した主要な毒性問題及び時間のかかる再生工程を含む伝統的なハイブリダイゼーションアッセイにおける幾つかの不具合を克服する。
【００１６】
本発明の一態様は、ハイブリダイゼーション用途におけるプローブ及び標的を別々に変性させるための組成物及び溶液である。標的を変性させるための組成物はプローブを変性させるための組成物と同じ成分を含み得、又は二つの組成物は異なる構成成分を含みうる。本発明に使用される組成物は、二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるのに有効な量の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒を含有する水性組成物を含みうる。二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるために有効な量は、ハイブリダイゼーションを可能にする量である。例えば、極性非プロトン溶媒がハイブリダイゼーションをなすのに効果的かどうかを試験する一方法は、極性非プロトン溶媒が、例えば実施例１におけるように、ここに記載のハイブリダイゼーション方法及び組成物に使用される場合、検出可能なシグナル及び／又は増幅された核酸産物を生じるかどうかを決定することである。
【００１７】
極性非プロトン溶媒の有効量の非限定的例は、例えば約１％から約９５％（ｖ／ｖ）を含む。ある実施態様では、極性非プロトン溶媒の濃度は５％から６０％（ｖ／ｖ）である。他の実施態様では、極性非プロトン溶媒の濃度は１０％から６０％（ｖ／ｖ）である。更に他の実施態様では、極性非プロトン溶媒の濃度は３０％から５０％（ｖ／ｖ）である。１％から５％、５％から１０％、１０％、１０％から２０％、２０％から３０％、３０％から４０％、４０％から５０％、５０％から６０％、又は６０％から７０％（ｖ／ｖ）の濃度もまた適している。ある実施態様では、極性非プロトン溶媒は０．１％、０．２５％、０．５％、１％、２％、３％、４％、又は５％（ｖ／ｖ）の濃度で存在するであろう。他の実施態様では、極性非プロトン溶媒は７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１０．５％、１１％、１１．５％、１２％、１２．５％、１３％、１３．５％、１４％、１４．５％、１５％、１５．５％、１６％、１６．５％、１７％、１７．５％、１８％、１８．５％、１９％、１９．５％、又は２０％（ｖ／ｖ）の濃度で存在するであろう。
【００１８】
本発明の別の態様によれば、極性非プロトン溶媒を含有する水性組成物は減少した毒性を有している。例えば、ハイブリダイゼーション用途で使用される伝統的な溶液よりも毒性の少ない組成物は、組成物がホルムアミドを含まない条件、又は組成物が２５％未満、又は１０％未満、又は５％未満、又は２％未満、又は１％未満、又は０．５％未満、又は０．１％未満、又は０．０５％未満、又は０．０１％未満のホルムアミドを含む条件の組成物を含みうる。一実施態様では、毒性の少ない組成物は、組成物がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含まない条件、又は組成物が２５％、１０％、５％、２％未満、又は１％未満、又は０．５％未満、又は０．１％未満、又は０．０５％未満、又は０．０１％未満のＤＭＳＯを含む条件の組成物を含みうる。
【００１９】
本発明の一態様では、本発明での使用のために適した極性非プロトン溶媒は、そのハンセン溶解度パラメータに基づき選択されうる。例えば、適切な極性非プロトン溶媒は、１７．７から２２．０ＭＰａ１／２の分散溶解度パラメータ、１３から２３ＭＰａ１／２の極性溶解度パラメータ、及び３から１３ＭＰａ１／２の水素結合溶解度パラメータを有しうる。
【００２０】
本発明の一態様によれば、本発明において使用される適切な極性非プロトン溶媒は環状化合物である。環状化合物は環状基本構造を有する。例にはここに開示された環状化合物を含む。他の実施態様では、極性非プロトン溶媒は以下の式１−４から選択されうる：
0006091753.tif 000002
ここで、ＸはＯであり、Ｒ１はアルキルジイルである。
【００２１】
本発明の他の態様によれば、本発明において使用される適切な極性非プロトン溶媒は以下の式５から選択されうる：
0006091753.tif 000003
ここで、Ｘは任意であり、存在する場合は、Ｏ又はＳから選択され；
ここで、Ｚは任意であり、存在する場合は、Ｏ又はＳから選択され；
ここで、Ａ及びＢは独立してＯ又はＮ又はＳ又はアルキルジイルの一部又は第１級アミンであり；
ここで、Ｒはアルキルジイルであり；
ここで、ＹはＯ又はＳ又はＣである。
【００２２】
式５に係る適切な極性非プロトン溶媒の例を以下の式６−９に提供する：
0006091753.tif 000004
【００２３】
本発明の更なる他の実施態様によれば、極性非プロトン溶媒はラクトン、スルホン、 ニトリル、サルファイト、又はカーボネート官能性を有する。かかる化合物は、その比較的高い比誘電率、高い双極子モーメント及び水への溶解度によって区別される。
【００２４】
本発明の他の態様によれば、ラクトン官能性を有する極性非プロトン溶媒はγ−ブチロラクトン（ＧＢＬ）であり、スルホン官能性を有する極性非プロトン溶媒はスルホラン（ＳＬ）であり、ニトリル官能性を有する極性非プロトン溶媒はアセトニトリル（ＡＮ）であり、サルファイト官能性を有する極性非プロトン溶媒はグリコールサルファイト／エチレンサルファイト（ＧＳ）であり、カーボネート官能性を有する極性非プロトン溶媒はエチレンカーボネート（ＥＣ）、プロピレンカーボネート（ＰＣ）、又はエチレンチオカーボネート（ＥＴＣ）である。本発明の更に他の態様では、本発明の組成物及び方法は、極性非プロトン性溶媒を含有し、但し極性非プロトン性溶媒はアセトニトリル（ＡＮ）又はスルホラン（ＳＬ）ではない。
【００２５】
更に他の態様によれば、本発明は、核酸をハイブリダイズする方法において、
−  第一核酸配列を、二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるのに有効な量の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒を含有する第一水性組成物と組合わせ、
−  第二核酸配列を、二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるに有効な量の少なくとも一種の変性剤を含有する第二水性組成物と組合わせ、
−  第一及び第二核酸配列を、第一及び第二核酸配列をハイブリダイズするために少なくとも十分な時間の間、組合わせ
ることを含む方法を開示する。
【００２６】
他の更なる態様によれば、本発明は、核酸配列をハイブリダイズする方法において、
−  第一核酸配列を、二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるのに有効な量の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒を含有する第一水性組成物と組合わせ、
−  第二核酸配列と二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるのに有効な量の少なくとも一種の変性剤を上記第一核酸配列に、第一及び第二核酸配列をハイブリダイズさせるのに少なくとも十分な時間の間、適用する
ことを含む方法を開示する。
【００２７】
一実施態様では、第二水性組成物中の変性剤は極性非プロトン性溶媒である。一実施態様では、第一及び第二水性組成物は同一成分を含有する。他の実施態様では、第一及び第二水性組成物は異なる成分を含む。
【００２８】
一実施態様では、第一核酸配列は生物学試料中にある。他の実施態様では、生物学試料は細胞学又は組織学試料である。
【００２９】
一実施態様では、第一核酸配列は単鎖配列であり、第二核酸配列は二本鎖配列である。他の実施態様では、第一核酸配列は二本鎖配列であり、第二核酸配列は単鎖配列である。更に他の実施態様では、第一及び第二核酸配列は両方とも二本鎖である。更に他の実施態様では、第一及び第二核酸配列は両方とも一本鎖である。
【００３０】
一実施態様では、第一核酸配列を変性させるために十分な時間が与えられる。一実施態様では、第一核酸配列を変性させるために十分なエネルギーが与えられる。他の実施態様では、第二核酸配列を変性させるために十分な時間が与えられる。他の実施態様では、第二核酸配列を変性させるために十分なエネルギーが与えられる。他の実施態様では、第一及び第二核酸配列をハイブリダイズさせるために十分な時間が与えられる。他の実施態様では、第一及び第二の核酸をハイブリダイズさせるために十分なエネルギーが与えられる。
【００３１】
本発明の更に他の態様によれば、エネルギーは、水性組成物と核酸配列を加熱することにより提供される。よって、本発明の方法は、水性組成物と核酸配列を加熱し冷却する工程を含みうる。
【００３２】
本発明の更なる態様では、十分な量のエネルギーを提供する工程は、マイクロ波、温浴、熱板、熱電線、ペルチェ素子、誘導加熱、又は加熱ランプの使用により実施される加熱工程を含む方法を含む。
【００３３】
更なる態様によれば、本発明はハイブリダイゼーション用途における標的及び試料を別々に変性させるための、１から９５％（ｖ／ｖ）の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒を含有する組成物の使用に関する。
【００３４】
別の他の態様によれば、本発明はプローブ及び標的が別々に変性されるハイブリダイゼーションアッセイに使用するための本発明の組成物を含んでなるキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、ホルムアルデヒド固定パラフィン包埋組織片（組織検体）で共変性した一次標識ＦＩＳＨプローブを用いた単一遺伝子座検出の典型的な時間経過を示す。バーは、伝統的なハイブリダイゼーション溶液を使用して実施されたハイブリダイゼーションアッセイを表す。左側の最初のバーは脱パラフィン工程を表し；二番目のバーは加熱前処理工程を表し；三番目のバーは消化工程を表し；四番目のバーは変性及びハイブリダイゼーション工程を表し；五番目のバーはストリンジェンシー洗浄工程を表し；六番目のバーはマウント工程を表す。
【図２】図２は、細胞検体と共変性された一次標識ＦＩＳＨプローブを用いた単一遺伝子座検出の典型的な時間経過を示す。バーは、伝統的なハイブリダイゼーション溶液を使用して実施されたハイブリダイゼーションアッセイを表す。左側の最初のバーは固定工程を表し；二番目のバーは変性及びハイブリダイゼーション工程を表し；三番目のバーはストリンジェンシー洗浄工程を表し；四番目のバーはマウント工程を表す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
Ａ．定義
本発明の文脈において、次の用語は次の通りに理解されなければならない：
「生物学的試料」は、一又は複数の細胞又は細胞断片の任意のインビボ、インビトロ、又はインサイツ試料として理解されなければならない。これは、例えば単細胞又は多細胞生物、組織片、細胞試料、染色体スプレッド、精製核酸配列、例えば生物学ベースのシステム又は化学合成、マイクロアレイ、又は核酸チップの他の形態によって作製された人工的に作製された核酸配列でありうる。一実施態様では、試料は哺乳動物試料、例えば ヒト、マウス、ネコ、ラット、又はイヌ試料である。
【００３７】
「核酸」、「核酸鎖」、及び「核酸配列」は、天然に生じるヌクレオチドから形成された骨格を有するオリゴマー又はポリマー及び／又は非標準核酸塩基及び／又は非標準骨格を含む核酸アナログ（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）又はロックド核酸（ＬＮＡ））、又は核酸の任意の誘導体化形態を含む、塩基対形成を使用して結合又はハイブリダイズする任意のものを意味する 。
【００３８】
ここで使用される場合、「ペプチド核酸」又は「ＰＮＡ」なる用語は、限定するものではないが、例えば全てが出典明示によりここに援用される米国特許第５５３９０８２号、第５５２７６７５号、第５６２３０４９号、第５７１４３３１号、第５７１８２６２号、第５７３６３３６号、第５７７３５７１号、第５７６６８５５号、第５７８６４６１号、第５８３７４５９号、第５８９１６２５号、第５９７２６１０号、第５９８６０５３号、第６１０７４７０号、第６２０１１０３号、第６２２８９８２号及び第６３５７１６３号、国際公開第９６／０４０００号又はそこで引用されている文献の任意のものにおいてペプチド核酸として言及され又は請求項に記載されたオリゴマー又はポリマーセグメントの任意のものを含むペンダント核酸塩基と共にポリアミド骨格を有する合成ポリマー（天然に生じるもの及び修飾されたもの）を意味する。例えばＰＮＡ上のプリン又はピリミジン塩基のようなペンダント核酸塩基は、例えばＰＣＴ／ＵＳ０２／３０５７３又はそこに引用された文献の任意のものに教示されているリンカーの一つのようなリンカーを介して骨格に連結されうる。一実施態様では、ＰＮＡはＮ−（２−アミノエチル）−グリシン）骨格を有している。ＰＮＡは、ＰＣＴ／ＵＳ０２／３０５７３又はそこに引用された文献の任意のものに教示されているようにして合成され（場合によっては標識され）うる。ＰＮＡは、ＰＮＡ骨格が変わらないので、ＤＮＡ及びＲＮＡと堅固にかつ高い配列特異性をもってハイブリダイズする。よって、短いＰＮＡプローブは長いＤＮＡ又はＲＮＡプローブに匹敵する特異性を示しうる。ＰＮＡプローブはまた相補ＤＮＡ又はＲＮＡへの結合において大なる特異性を示しうる。
【００３９】
ここで使用される場合、「ロックド核酸」又は「ＬＮＡ」なる用語は、少なくとも一又は複数のＬＮＡサブユニットを含むオリゴマー又はポリマーを意味する。ここで使用される場合、「ＬＮＡサブユニット」なる用語は、リボースの２’−酸素を４’−炭素と結合させるメチレン架橋を含むリボヌクレオチドを意味する。一般に、Kurreck, Eur. J. Biochem., 270:1628-44 (2003)を参照のこと。
【００４０】
核酸及び核酸アナログの例はまた二本鎖及び一本鎖デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）、そのα−アノマー型、その合成及び天然アナログ等々を含むヌクレオチドモノマーのポリマーを含む。核酸鎖は全体がデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、その合成又は天然アナログ、又はその混合物から構成されうる。ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はここに定義される他の核酸を本発明の方法及び組成物において使用することができる。
【００４１】
「極性非プロトン溶媒」は、雰囲気温度又はその近傍、例えば約２０℃で、少なくとも５％（体積）の水溶性、約２デバイ単位以上の双極子モーメントを有し、略中性のｐＨ、つまりｐＨ５から９の範囲、又は６から８の範囲で有意な水素交換を受けない有機溶媒を意味する。極性非プロトン溶媒は以下に検討される ハンセン溶解度パラメータに従って定義されるものを含む。
【００４２】
「アルキルジイル」は、親のアルカン、アルケン、又はアルキンの二つの異なった炭素原子から一つの水素原子を除去することによって誘導された二つの一価ラジカル中心を有する飽和又は不飽和、分枝、直鎖又は環状炭化水素基を意味する。
【００４３】
「水溶液」は、例え少量の水でさえ、水を含む溶液として理解されなければならない。例えば、１％の水を含む溶液は水溶液として理解されなければならない。
【００４４】
「ハイブリダイゼーション用途」、「ハイブリダイゼーションアッセイ」、「ハイブリダイゼーション実験」、「ハイブリダイゼーション手順」、「ハイブリダイゼーション技術」、「ハイブリダイゼーション法」等は、核酸のハイブリダイゼーションを含む任意のプロセズを意味するものと理解されなければならない。別の定義がなされない限り、「ハイブリダイゼーション」及び「ハイブリダイゼーション工程」という用語は、ハイブリダイゼーション手順の再アニーリング工程並びに再変性工程（もし存在すれば）を意味するものと理解されなければならない。
【００４５】
「ハイブリダイゼーション組成物」は、例えば核酸配列にプローブを結合させるためにハイブリダイゼーション手順を実施するための本発明の水溶液を意味する。ハイブリダイゼーション組成物は、例えば少なくとも一種の極性非プロトン溶媒、少なくとも一つの核酸配列、及びハイブリダイゼーション溶液を含みうる。ハイブリダイゼーション組成物は、酵素又は例えば生物学的試料中の核酸を増幅させるためのデオクシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）のような他の成分を含まない。
【００４６】
「ハイブリダイゼーション溶液」は、本発明のハイブリダイゼーション組成物において使用される水溶液を意味する。ハイブリダイゼーション溶液は以下に詳細に検討され、例えば緩衝剤、促進剤、キレート剤、塩、洗浄剤、及びブロッキング剤を含みうる。
【００４７】
「ハンセン溶解度パラメータ」及び「ＨＳＰ」は次の凝集エネルギー（溶解度）パラメータを意味する：（１）原子間力から誘導された非極性相互作用を測定する分散溶解度パラメータ（ｄＤ、「Ｄパラメータ」）；（２）永久双極子−永久双極子相互作用を測定する極性溶解度パラメータ（ｄＰ、「Ｐパラメータ」）；及び（３）電子交換を測定する水素結合溶解度パラメータ（ｄＨ、「Ｈパラメータ」）。ハンセン溶解度パラメータは更に以下に定義する。
【００４８】
「反復配列」は、哺乳動物ゲノムの成分を急速に再アニールする（およそ２５％）及び／又は中間的に再アニールする（およそ３０％）ことを意味するものと理解されなければならない。急速に再アニールする成分は、通常はタンデムで見出される（例えばサテライトＤＮＡ）小さい（数ヌクレオチド長）高度に反復性の配列を含む一方、中間的に再アニールする成分は散在反復ＤＮＡを含む。散在反復配列はＳＩＮＥｓ（短い散在反復配列）又はＬＩＮＥｓ（長い散在反復配列）の何れかとして分類され、その双方が霊長類においてレトロトランスポゾンとして分類される。ＳＩＮＥｓ及びＬＩＮＥｓは、限定しないが、Ａｌｕ−リピート、Ｋｐｎ−リピート、ジヌクレオチドリピート、トリヌクレオチドリピート、テトラヌクレオチドリピート、ペンタヌクレオチドリピート及びヘキサヌクレオチドリピートを含む。ＡｌｕリピートはヒトＳＩＮＥｓの大部分を構成し、ヘッドトゥーテール二量体として配された二つの類似配列からなるおよそ２８０から３００ｂｐのコンセンサス配列によって特徴付けられる。ＳＩＮＥｓ及びＬＩＮＥｓに加えて、リピート配列は染色体の末端の染色体テロメア及び染色体セントロメアにもまた存在し、これは、染色体の中心領域にのみ存在する別のリピート配列を含む。しかしながら、ゲノム全体にわたって無作為に分散しているＳＩＮＥｓ及びＬＩＮＥｓとは異なり、テロメア及びセントロメアリピート配列は染色体のある領域内に局在化している。
【００４９】
「非毒性」及び「減少した毒性」は、ホルムアミドの毒性標識に関して、"Directive 1999/45/EC of the European Parliament and of the Council of 31 May 1999 concerning the approximation of the laws, regulations及びadministrative provisions of the Member States relating to the classification, packaging, and labelling of dangerous preparations" (ecb.jrc.it/legislation/1999L0045EC.pdf) (「Directive」)に従って定義される。Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅに従えば、毒性は次の分類順を使用して定義される：Ｔ＋「非常に毒性」；Ｔ「毒性」、Ｃ「腐食性」、Ｘｎ「有害」、Ｘｉ「刺激性」。リスクフレーズ（「Ｒフレーズ」）は分類された毒性のリスクを記述する。ホルムアミドはＴ（毒性）及びＲ６１（胎児に害を及ぼしうる）としてリストされている。次の化学物質の全てがホルムアミドよりも毒性が少ないものとして分類されている：アセトニトリル（Ｘｎ、Ｒ１１、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ３６）；スルホラン（Ｘｎ、Ｒ２２）；γ−ブチロラクトン（Ｘｎ、Ｒ２２、Ｒ３２）；及びエチレンカーボネート（Ｘｉ、Ｒ３６、Ｒ３７、Ｒ３８）。本出願の出願時には、エチレントリチオカーボネート及びグリコールサルファイトは現在は分類されていない。
【００５０】
ここで使用される「変性」は、核酸又はタンパク質が、化合物、例えば強酸又は塩基、濃縮無機塩、有機溶媒の適用により、及び／又は例えば熱のような外部ストレスにより、その三次及び／又は二次構造を減少させたり又は失わせたりする過程を意味する。これは、変性が核酸に関連し、上記核酸が二本鎖である場合、その鎖が部分的に又は完全に分離することを意味する。これは、更に、二本鎖核酸の結合相互作用が、変性によって十分に弱められ、例えば、別の相補鎖とのハイブリダイゼーションが、変性が無い場合よりも効率的に起こり得ることを意味する。
【００５１】
「変性剤」は、水に比して核酸の相補鎖の相互結合親和性を低減させることのできる任意の物質を意味する。変性剤の非限定的な典型例は、ホルムアミド、尿素、ＤＭＳＯ及びテトラアルキルアンモニウムハロゲン化物又はその組み合わせのような有機溶媒を含む。変性条件は配列依存性であり、異なる環境パラメータ下で異なる。融解温度（Ｔｍ）は、変性剤の存在下で相補的塩基対合を減少させるために変性条件を調節するために使用できる。Ｔｍは標的配列の５０％が完全に適合したプローブとハイブリダイズする（定義されたイオン強度及びｐＨ下での）温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドでは、Ｔmは以下の式から近似できる。
Ｔｍ＝81.5℃＋16.6(logＭ)＋0.41(％ＧＣ)−0.61(％form)−500/Ｌ
ここで、Ｍは一価カチオンの濃度、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシン及びシトシンヌクレオチドの割合、％ｆｏｒｍはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの割合であり、Ｌは塩基対のハイブリッド長である。Ｔｍは各１％のミスマッチに対し約１℃減少する。
【００５２】
ここで使用される「別々の変性」は、標的核酸がプローブの非存在下で変性し、及び／又はプローブが標的核酸の非存在下で変性させられるハイブリダイゼーション法を意味する。例えば、標的は第一溶液中で変性され得、プローブは第二溶液中で変性され得、ついで変性されたプローブは、標的とプローブをハイブリダイズするのに十分な時間の間、変性された標的と組み合わされうる。他の例では、標的は第一溶液中で変性され得、ついで標的とプローブをハイブリダイズするのに十分な時間の間、プローブと組み合わされうる。また更なる例では、プローブは第一溶液中で変性させら得、ついで標的とプローブをハイブリダイズするのに十分な時間の間、標的と組み合わされうる。
【００５３】
Ｂ．溶媒選択
本発明に使用される適切な極性非プロトン溶媒は、そのハンセン溶解度パラメータに基づいて選択することができる。ある溶媒に対してＨＳＰを実験的に決定し及び／又は計算するための方法は当該分野で知られており、ＨＳＰは１２００を越える化学物質に対して報告されている。
【００５４】
例えば、Ｄパラメータは、屈折率に基づいて合理的な精度で計算することができ、又は臨界温度及びモル体積を樹立した後、類似のサイズ、形状、及び組成の既知の溶媒と比較したチャートから誘導することができる。Ｐパラメータは、式１を使用して既知の双極子モーメント（例えば、McClellan A.L., Tables of Experimental Dipole Moments (W.H. Freeman 1963)を参照）から推定することができる：
式１：δＰ＝３７．４(双極子モーメント)／Ｖ１／２
ここで、Ｖはモル体積である。Ｈパラメータを計算するための式はない。その代わりに、Ｈパラメータは通常グループ寄与に基づいて決定される。
【００５５】
ＨＳＰ特徴付けは、球の中心の実験的に決定された適切な参照溶媒のＨＳＰを用いて、簡便には球標示を使用して可視化される。球半径（Ｒ）は、「良好な」相互作用が起こるのを尚可能にする参照溶媒のＨＳＰからの最大の許容可能な変動を示す。良好な溶媒は球の内部にあり悪いものは外である。その各ＨＳＰ値に基づく２つの溶媒間の距離 Raは、式２を使用して決定することができる：
式２：(Ｒａ)２＝４(δＤ１−δＤ２)２＋(δＰ１−δＰ２)２(δＨ１−δＨ2)２
ここで、添え字１は参照試料を示し、添え字２は試験化学物質を示し、全ての値はＭＰａ１／２である。良好な溶解度は、Ｒａが溶解度球の実験的に決定された半径Ｒｏよりも少ないことを必要とする。２つの溶媒間の相対的なエネルギー差、つまりＲＥＤ数は、式３に示すように、Ｒｏに対するＲａの比をとることによって計算することができる。
式３：ＲＥＤ＝Ｒａ／Ｒｏ
１．０未満のＲＥＤ数は高親和性を示し；１．０に等しいか近いＲＥＤ数は境界条件を示し；漸次高くなるＲＥＤ数は漸次低くなる親和性を示している。
【００５６】
ある実施態様では、本発明の極性非プロトン溶媒のＤパラメータは、１７．７から２２．０ＭＰａ１／２である。このような相対的に高いＤパラメータは一般に環状構造及び／又は硫黄又はハロゲンを持つ構造の溶媒に関連する。直鎖状化合物は本発明で使用されるための最も適した溶媒にはなり得ないが、そのＰ及びＨパラメータが以下に検討する範囲内にあれば考慮されうる。Ｄパラメータは式２において４倍されているので、限界はＲｏの半分である。また、約２１又はそれ以上のＤ値はしばしば固体の特徴であることに留意されなければならない。
【００５７】
ある実施態様では、本発明の極性非プロトン溶媒のＰパラメータは１３から２３ＭＰａ１／２である。そのような指数的に高いＰパラメータは、一般に、高い双極子モーメント及びおそらくは相対的に低いモル体積を有する溶媒に関連する。例えば、６０ｃｃ／モルに近いＶでは、双極子モーメントは４．５と３．１の間である。９０ｃｃ／モルに近いＶでは、双極子モーメントは５．６と３．９の間でなければならない。
【００５８】
ある実施態様では、本発明の極性非プロトン溶媒のＨパラメータは３から１３ＭＰａ１／２である。一般に、アルコール基を有する極性非プロトン溶媒は、かかる溶媒のＨパラメータが余りに高いので、本発明の組成物及び方法においては有用ではない。
【００５９】
極性非プロトン溶媒のモル体積は、それが３つのハンセン溶解度パラメータ全ての評価に入るので、また関係している。モル体積が小さくなるにつれて、液体は急速に蒸発する傾向にある。モル体積が大きくなるにつれ、液体が上述のＤ及びＰパラメータの範囲の固体領域に入る傾向がある。よって、本発明の極性非プロトン溶媒は、ＨＳＰ空間における液体／固体境界にむしろ近い。
【００６０】
ある実施態様では、本発明の極性非プロトン溶媒は、ラクトン、スルホン、ニトリル、サルファイト、及び／又はカーボネート官能性を有する。かかる化合物は、その相対的に高い比誘電率、高い双極子モーメント、及び水への溶解度によって区別される。ラクトン官能性を有する例示的な極性非プロトン溶媒はγ−ブチロラクトン（ＧＢＬ）であり、スルホン官能性を有する例示的な極性非プロトン溶媒はスルホラン（ＳＬ；テトラメチレンスルフィド−ジオキシド）であり、ニトリル官能性を有する例示的な極性非プロトン溶媒はアセトニトリル（ＡＮ）であり、サルファイト官能性を有する例示的な極性非プロトン溶媒はグリコールサルファイト／エチレンサルファイト（ＧＳ）であり、カーボネート官能性を有する例示的な極性非プロトン溶媒はエチレンカーボネート（ＥＣ）、プロピレンカーボネート（ＰＣ）、又はエチレントリチオカーボネート（ＥＴＣ）である。これらの例示的な溶媒の構造を以下に提供し、そのハンセン溶解度パラメータ、ＲＥＤ数、及びモル体積を表１にまとめる。
【００６１】
0006091753.tif 000005
0006091753.tif 000006
【００６２】
本発明で使用されうる他の適切な極性非プロトン溶媒は環状化合物、例えばε−カプロラクトンある。また、置換ピロリジノン及び５−又は６−員環の窒素を含む関連構造、及び二つのニトリル基、又は一つの臭素及び一つのニトリル基を持つ環状構造がまた本発明の使用に適している場合がある。例えば、Ｎ−メチルピロリドン（以下に示す）は本発明の方法及び組成物における使用に適している極性非プロトン溶媒でありうる。
0006091753.tif 000007
他の適切な極性非プロトン溶媒は環ウレタン基（ＮＨＣＯＯ−）を含みうる。しかしながら、必ずしもかかる化合物の全てが適切な訳ではない。当業者はここに記載の本発明の組成物及び方法に有用な化合物をスクリーニングすることができる。本発明における使用に適していよう例示的な化学物質を以下の表２及び３に記載する。
【００６３】
0006091753.tif 000008
0006091753.tif 000009
【００６４】
表２はそのハンセン溶解度パラメータに基づき本発明の組成物及び方法において使用される潜在的な化学物質の例示的なリストを記載する。勿論、他の化合物、例えば表３に記載されたものもこれらの要件を満たしうる。
0006091753.tif 000010
【００６５】
表２及び３に列挙される化学物質の幾つかは、従来からハイブリダイゼーション及び／又はＰＣＲ用途に使用されてきた（例えば、ジメチルスルホキサイド（ＤＭＳＯ）はハイブリダイゼーション及びＰＣＲ用途に使用され、スルホラン（ＳＬ）、アセトニトリル（ＡＮ）、２−ピロリドン、ε−カプロラクタム、及びエチレングリコールはＰＣＲ用途に使用されてきた）。よって、幾つかの実施態様では、極性非プロトン溶媒は、ＤＭＳＯ、スルホラン、アセトニトリル、２−ピロリドン、ε−カプロラクタム、又はエチレングリコールではない。しかしながら、ほとんどの極性非プロトン溶媒は、従来のハイブリダイゼーション用途には使用されてこなかった。その上、そうした化合物が使用された時でさえ、先行技術では、それらが、本出願で開示したように、そのようなハイブリダイゼーション用途においてプローブ及び標識を別々に変性することに有利に使用されうることは認識されていなかった。
【００６６】
加えて、表２及び３に列挙される化学物質の全てが、本発明の組成物及び方法においての使用に適しているわけではない。例えば、ＤＭＳＯは、ハンセン溶解度パラメータ（ＨＳＰｓ）が上に記載された範囲に入るので、表２に列挙されているが、ＤＭＳＯは、本発明の組成物及び方法のプローブと標的を別々に変性させるためには機能しない。しかしながら、提供された実施例の一つにおける化合物の試験を含むここで提供されるガイダンスを使用して適切な化合物をスクリーニングすることは当業者の技量の範囲内である。例えば、ある実施態様では、適切な極性非プロトン溶媒は、上に記載された範囲のＨＳＰｓと上記の式１−９に示された構造を有している。
【００６７】
Ｃ．組成物、バッファー、及び溶液
（１）変性溶液
プローブ及び標的を別々に又は共に変性させるための伝統的な組成物は当該分野で知られている。かかる溶液は、例えば緩衝剤、促進剤、キレート剤、塩、洗浄剤、及びブロッキング剤を含みうる。
例えば、緩衝剤は、ＳＳＣ、ＨＥＰＥＳ、ＳＳＰＥ、ＰＩＰＥＳ、ＴＭＡＣ、ＴＲＩＳ、ＳＥＴ、クエン酸、リン酸バッファー、例えばリン酸カリウム又はピロリン酸ナトリウム等を含みうる。緩衝剤は０．０１×から５０×の濃度で、例えば、０．０１×、０．１×、０．５×、１×、２×、５×、１０×、１５×、２０×、２５×、３０×、３５×、４０×、４５×、又は５０×で存在しうる。典型的には、緩衝剤は０．１×から１０×の濃度で存在する。
【００６８】
促進剤は、ポリマー、例えばＦＩＣＯＬＬ、ＰＶＰ、ヘパリン、デキストラン硫酸、タンパク質、例えばＢＳＡ、グリコール、例えばエチレングリコール、グリセロール、１，３プロパンジオール、プロピレングリコール、又はジエチレングリコール、その組合せ、例えばデンハート溶液及びＢＬＯＴＴＯ、及び有機溶媒、例えばホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ＤＭＳＯ等を含みうる。促進剤は、１％から８０％又は０．１×から１０×の濃度、例えば、０．１％（又は０．１×）、０．２％（又は０．２×）、０．５％  （又は０．５×）、１％（又は１×）、２％（又は２×）、５％（又は５×）、１０％（又は１０×）、１５％（又は１５×）、２０％（又は２０×）、２５％（又は２５×）、３０％（又は３０×）、４０％（又は４０×）、５０％（又は５０×）、６０％（又は６０×）、７０％（又は７０×）、又は８０％（又は８０×）で存在しうる。典型的には、ホルムアミドは２５％から７５％の濃度で、例えば、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、又は７５％で存在する一方、ＤＭＳＯ、デキストラン硫酸、及びグリコールは５％から１０％の濃度で、例えば、５％、６％、７％、８％、９％又は１０％で存在する。
【００６９】
キレート剤は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ等を含みうる。キレート剤は０．１ｍＭから１０ｍＭの濃度で、例えば、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、又は１０ｍＭで存在しうる。典型的には、キレート剤は０．５ｍＭから５ｍＭの濃度で、例えば、０．５ｍＭ、１ｍＭ、１．５ｍＭ、２ｍＭ、２．５ｍＭ、３ｍＭ、３．５ｍＭ、４ｍＭ、４．５ｍＭ、又は５ｍＭで存在する。
【００７０】
塩は塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸マグネシウム等を含みうる。塩は１ｍＭから７５０ｍＭの濃度で、例えば、１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭ、５００ｍＭ、６００ｍＭ、７００ｍＭ、又は７５０ｍＭで存在しうる。典型的には、塩は１０ｍＭから５００ｍＭの濃度で、例えば、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭ、又は５００ｍＭで存在する。
【００７１】
洗浄剤は、Ｔｗｅｅｎ、ＳＤＳ、トリトン、ＣＨＡＰＳ、デオキシコール酸等を含みうる。洗浄剤は０．００１％から１０％の濃度で、例えば、０．００１、０．０１、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０％で存在しうる。典型的には、洗浄剤は０．００１％から１０％の濃度で、例えば、０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、又は１％で存在する。
【００７２】
核酸ブロッキング剤は、例えば酵母ｔＲＮＡ、ホモポリマーＤＮＡ、変性サケ精液ＤＮＡ、ニシン精液ＤＮＡ、全ヒトＤＮＡ、ＣＯＴ１ ＤＮＡ等を含みうる。ブロッキング核酸は、０．０５ｍｇ／ｍＬから１００ｍｇ／ｍＬの濃度で存在しうる。しかしながら、本発明の組成物及び方法は、驚くべきことに、ブロッキング剤を必要としないで著しく減少したバックグランドレベルを示す。
【００７３】
ハイブリダイゼーション用途のための伝統的な変性溶液に関する文献には様々な変形例が存在している。例えば、伝統的な溶液は５ｘ又は６ｘのＳＳＣ、０．０１ＭのＥＤＴＡ、５×デンハート液、０．５％のＳＤＳ、及び１００ｍｇ／ｍＬの剪断変性サケ精液ＤＮＡを含みうる。他の伝統的な溶液は、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．５ＭのＮａＣｌ、及び０．２ｍＭのＥＤＴＡを含みうる。ＲＮＡ検出のための生物学的検体でのＦＩＳＨの典型的な溶液は、例えば２ｘＳＳＣ、１０％のデキストラン硫酸、２ｍＭのバナジル−リボヌクレオシド複合体、５０％のホルムアミド、０．０２％のＲＮＡｓｅ不含有ＢＳＡ、及び１ｍｇ／ｍＬの大腸菌ｔＲＮＡを含みうる。ＤＮＡ検出のための生物学的検体でのＦＩＳＨの典型的な溶液は、例えば２ｘＳＳＣ、１０％のデキストラン硫酸、５０％のホルムアミド、及び例えば０．３ｍｇ／ｍＬのサケ精液ＤＮＡ又は０．１ｍｇ／ｍＬのＣＯＴ１ ＤＮＡを含みうる。他の典型的な溶液は、４０％のホルムアミド、１０％のデキストラン硫酸、３０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのリン酸バッファー、Ａｌｕ−ＰＮＡ（ブロッキングＰＮＡ）又はＣＯＴ−１ ＤＮＡを含み得、ある場合には０．１μｇ／μＬの全ヒトＤＮＡ（ＴＨＤ）を含みうる。更なる変性バッファーは、「ハイブリダイゼーション条件」と題したセクションで以下に検討する。
【００７４】
本発明の組成物は、少なくとも一種の極性非プロトン溶媒と組み合わせた、上述の伝統的な組成物の何れかを含みうる。伝統的な組成物は伝統的な変性溶液において使用されるものと同じ濃度で存在し得、又はより高いかもしくはより低い濃度で存在し得、あるいは完全に省かれてもよい。
【００７５】
例えば、本発明の組成物が塩、例えばＮａＣｌ及び／又はリン酸バッファーを含む場合、塩は、０−１２００ｍＭのＮａＣｌ及び／又は０−２００ｍＭのリン酸バッファーの濃度で存在しうる。ある実施態様では、塩の濃度は、例えば０ｍＭ、１５ｍＭ、３０ｍＭ、４５ｍＭ、６０ｍＭ、７５ｍＭ、９０ｍＭ、１０５ｍＭ、１２０ｍＭ、１３５ｍＭ、１５０ｍＭ、１６５ｍＭ、１８０ｍＭ、１９５ｍＭ、２１０ｍＭ、２２５ｍＭ、２４０ｍＭ、２５５ｍＭ、２７０ｍＭ、２８５ｍＭ、又は３００ｍＭのＮａＣｌ及び５ｍＭのリン酸バッファー、又は６００ｍＭのＮａＣｌ及び１０ｍＭのリン酸バッファーでありうる。他の実施態様では、塩の濃度は、例えば０．１×、０．２×、０．３×、０．４×、０．５×、０．６×、０．７×、０．８×、０．９×、１×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、又は８×ＳＳＣで存在する濃度でありうる。
【００７６】
本発明の組成物がデキストラン硫酸、グリコール、又はＤＭＳＯのような促進剤を含む場合、デキストラン硫酸は５％から４０％の濃度で存在し得、グリコールは０．１％から１０％の濃度で存在し得、ＤＭＳＯは０．１％から１０％でありうる。ある実施態様では、デキストラン硫酸の濃度は１０％又は２０％であり得、エチレングリコール、１，３プロパンジオール、又はグリセロールの濃度は１％から１０％でありうる。ある実施態様では、ＤＭＳＯの濃度は１％でありうる。ある実施態様では、水性組成物は促進剤としてＤＭＳＯを含まない。ある実施態様では、水性組成物は促進剤としてホルムアミドを含まず、又はホルムアミドを含むが、但し、２５％未満、又は１０％未満、又は５％未満、又は２％未満、又は１％未満、又は０．５％未満、又は０．１％未満、又は０．０５％未満、又は０．０１％未満である。
【００７７】
本発明の組成物がクエン酸を含む場合、濃度は１ｍＭから１００ｍＭの範囲であり得、ｐＨは５．０から８．０の範囲であり得る。ある実施態様では、クエン酸の濃度は１０ｍＭ及びｐＨは６．２でありうる。
【００７８】
本発明の組成物は、例えば細胞膜への非特異的結合を減少させる薬剤、例えばサケ精液又は少量の全ヒトＤＮＡを含み得、又は例えばそれらは標的への例えば反復配列の結合をブロックするためのブロッキング剤、例えば多量の全ヒトＤＮＡ又はリピートリッチ化ＤＮＡ又は特異的ブロッキング剤、例えばＰＮＡ又はＬＮＡ断片及び配列を含みうる。これらの薬剤は０．０１−１００μｇ／μＬ又は０．０１−１００μＭの濃度で存在しうる。例えば、ある実施態様では、これらの薬剤は０．１μｇ／μＬの全ヒトＤＮＡ、又は０．１μｇ／μＬの非ヒトＤＮＡ、例えばニシン精液、サケ精液、又はウシ胸腺ＤＮＡ、又は５μＭのブロッキングＰＮＡであろう。しかしながら、本発明の組成物及び方法は、ブロッキング試薬を必要とすることなく、有意に減少したバックグランドレベルを示す。
【００７９】
本発明の一態様は、ハイブリダイゼーション用途で、プローブ及び標的を別々に変性するための組成物又は方法である。標的を変性するための組成物はプローブを変性させる組成物と同じ成分を含有し得、又は２つの組成物は異なる成分を含有しうる。本発明において使用される組成物は、二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるのに有効な量の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒を含む水性組成物を含む。二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるのに有効な量はハイブリダイゼーションを可能にする量である。例えば、極性非プロトン溶媒の量がハイブリダイゼーションを可能にするのに有効かどうかを試験する一方法は、実施例１のようにここに記載のハイブリダイゼーション方法及び組成物に使用される場合、極性非プロトン溶媒が検出可能なシグナル及び／又は増幅された核酸産物を生じるかどうかを決定することである。
【００８０】
極性非プロトン溶媒の有効量の非限定的な例は、例えば約１％から約９５％（ｖ／ｖ）を含む。ある実施態様では、極性非プロトン溶媒の濃度は５％から６０％（ｖ／ｖ）である。他の実施態様では、極性非プロトン溶媒の濃度は１０％から６０％（ｖ／ｖ）である。更に他の実施態様では、極性非プロトン溶媒の濃度は３０％から５０％（ｖ／ｖ）である。１％から５％、５％から１０％、１０％、１０％から２０％、２０％から３０％、３０％から４０％、４０％から５０％、５０％から６０％、又は６０％から７０％（ｖ／ｖ）の濃度がまた適切である。ある実施態様では、極性非プロトン溶媒は０．１％、０．２５％、０．５％、１％、２％、３％、４％、又は５％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する。他の実施態様では、極性非プロトン溶媒は７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１０．５％、１１％、１１．５％、１２％、１２．５％、１３％、１３．５％、１４％、１４．５％、１５％、１５．５％、１６％、１６．５％、１７％、１７．５％、１８％、１８．５％、１９％、１９．５％、又は２０％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する。
【００８１】
本発明の組成物がハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用される場合、それらは一又は複数の核酸プローブを更に含みうる。プローブは直接的に又は間接的に検出可能な化合物、例えば酵素、発色団、蛍光色素、及びハプテンで標識されうる。ＤＮＡプローブは０．１から１００ｎｇ／μＬの濃度で存在しうる。例えば、ある実施態様では、プローブは１から１０ｎｇ／μＬの濃度で存在しうる。ＰＮＡプローブは０．５から５０００ｎＭの濃度で存在しうる。例えば、ある実施態様では、プローブは５から１０００ｎＭの濃度で存在しうる。
【００８２】
一実施態様では、本発明の組成物は、４０％の極性非プロトン溶媒（ｖ／ｖ）（例えばエチレンカーボネート、「ＥＣ」）、１０％のデキストラン硫酸、３００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのリン酸バッファー、及び１−１０ｎｇ／μＬプローブの混合物を含有する。本発明の他の例示的な組成物は、１５％のＥＣ、２０％のデキストラン硫酸、６００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのリン酸バッファー、及び０．１μｇ／μｌの全ヒトＤＮＡの混合物を含有する。更に他の例示的な組成物は、１５％のＥＣ、２０％のデキストラン硫酸、６００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのクエン酸ｐＨ６．２、及び０．１μｇ／μＬの非ヒトＤＮＡ（例えばニシン精子、サケ精液、又はウシ胸腺）又は０．５％ホルムアミド又は１％グリコール（例えばエチレングリコール、１，３プロパンジオール、又はグリセロール）を含む。更に他の例示的な組成物は、１５％ＥＣ、２０％デキストラン硫酸、６００ｍＭのＮａＣｌ、及び１０ｍＭのクエン酸、ｐＨ６．２を含有する。
【００８３】
（２）極性非プロトン溶媒
異なった極性非プロトン溶媒は本発明の組成物に異なった性質を付与しうる。例えば、極性非プロトン溶媒の選択は、ある種の極性非プロトン溶媒は経時的に分解しうるので、組成物の安定性に寄与しうる。例えば、極性非プロトン溶媒のエチレンカーボネートは比較的安定な分子であるエチレングリコールと、水と相互作用して炭酸を形成しうる二酸化炭素に分解し、本発明の組成物の酸性を変える。理論に拘束されるものではないが、エチレンカーボネートの分解時のｐＨ変化及び長期保存によるＤＮＡ損傷は本発明の組成物をハイブリダイゼーションに対して効果的ではないものにすると思われる。しかしながら、安定性は、典型的には約ｐＨ７．４で使用される伝統的なリン酸バッファーの代わりにｐＨ６．２のバッファーとしてクエン酸を添加し、及び／又は例えば０．１％から１０％、又は０．５％から５％、例えば１％、２％、３％等の濃度でエチレングリコールを添加することにより、組成物のｐＨを減少させることによって改善することができる。例えば、１０ｍＭのクエン酸バッファーでは、本発明の組成物はおよそ８ヶ月の間、２−８℃で安定している。安定性はまた組成物を低い温度（例えば−２０℃）に保存すると、改善されうる。
【００８４】
また、ある種の極性非プロトン溶媒は、ある条件下で本発明の組成物を多相系に分離せしめうる。多相系が得られる条件は、異なった極性非プロトン溶媒に対して異なりうる。しかしながら、一般に、極性非プロトン溶媒の濃度が増加すると、相の数が増加する。例えば、低濃度のエチレンカーボネート（つまり、２０％未満）を含む組成物は一相として存在しうるが、より高濃度のエチレンカーボネートを含有する幾つかの組成物は二、又は三相にさえ分離しうる。例えば、２０％デキストラン硫酸、６００ｍＭのＮａＣｌ、及び１０ｍＭのクエン酸バッファー中に１５％のエチレンカーボネートを含有する組成物は室温で単一相として存在するが、１０％デキストラン硫酸、３００ｍＭのＮａＣｌ、及び５ｍＭのリン酸バッファー中に４０％のエチレンカーボネートを含有する組成物は室温で粘性のある下相（全容量のおよそ２５％）と粘性の少ない上相（全容量のおよそ７５％）からなる。しかしながら、例えば４０％極性非プロトン溶媒（例えば、１０ｍＭのクエン酸バッファー中の４０％ＥＣ）又は５０％極性非プロトン溶媒（例えば、２×ＳＳＣ中の５０％ＥＣ）は一相系である。
【００８５】
他方、ある種の極性非プロトン溶媒は低濃度においてさえ二相で存在しうる。例えば、スルホラン、γ−ブチロラクトン、エチレントリチオカーボネート、グリコールサルファイト、及びプロピレンカーボネートは、室温で１０、１５、２０、又は２５％（２０％のデキストラン硫酸、６００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのクエン酸バッファー）の濃度で二相として存在する。対照的に、デキストラン硫酸が低い割合であるか、又はデキストラン硫酸が無い極性非プロトン溶媒組成物は、室温で一相のままである（例えば、２×ＳＳＣ中の２０％ＧＢＬ又は２×ＳＳＣ中の２０％ＳＬ）。
【００８６】
本発明の組成物の温度を調節することにより相の数を変更することもまたできる場合がある。一般に、温度が上昇すると、相の数は減少する。例えば、２−８℃では、１０％デキストラン硫酸、３００ｍＭのＮａＣｌ、及び５ｍＭのリン酸バッファー中で４０％のエチレンカーボネートを含有する組成物は三相系に分離しうる。
【００８７】
組成物中のデキストラン硫酸及び／又は塩の濃度を調節することにより相の数を変更することもまたできる場合がある。一般に言えば、デキストラン硫酸濃度（伝統的な濃度が１０％である）及び／又は塩濃度の低下は相の数を減少させうる。しかしながら、組成物中の特定の極性非プロトン溶媒及びその濃度に応じて、単一相をたとえ高濃度の塩及びデキストラン硫酸ででも製造できる。例えば、低量のＥＣ（例えば１５％、１０％、又は５％）を含有する組成物は、デキストラン硫酸及び塩濃度を増加させることにより、一相系を尚維持しながら、良好に作用しうる。特定の実施態様では、ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ、ＣＥＮ７ ＰＮＡプローブ、１５％のＥＣ、２０％のデキストラン硫酸、６００ｍＭのＮａＣｌ、及び１０ｍＭのリン酸バッファーを含有する組成物は、−２０℃で凍結されている。他の実施態様では、組成物は−２０℃で液体である。
【００８８】
ある極性非プロトン溶媒は、ある相又は他の相においてプローブに強いシグナルを生じさせうる。例えば、４０％のグリコールサルファイトは下相に強いシグナルを生じ、上相にシグナルを生じない。同様に、あるタイプのプローブはある相又は他の相に強いシグナルを生じうる。例えば、ＰＮＡプローブは上相より下相に強いシグナルを示す傾向がある。
【００８９】
従って、本発明の多相系は、試料の異なった側面を簡便に検査するために使用することができる。
【００９０】
ハイブリダイゼーション用途は、本発明の一相組成物を用いて、本発明の多相組成物の個々の相を用いて、又は本発明の多相組成物中の相の何れか一又は複数の混合物で実施されうる。例えば、一相系では、ある容量の試料がハイブリダイゼーションにおいて使用するために抽出されうる。多相系では、ハイブリダイゼーションに使用するために関心のある相（例えば上、下、又は中間相）からある容量の試料を抽出することができる。あるいは、多相系中の相を、ハイブリダイゼーションでの使用に対して混合試料のある容量を抽出する前に混合することができる。しかしながら、多相系は、組成物に応じて、強く不均等な局所的バックグラウンド染色を生じうる。低量のホルムアミドの添加は一相系におけるバックグラウンドを低減させる一方、高濃度（例えば４０％）の極性非プロトン溶媒を含む多相系には殆ど効果がない。
【００９１】
ハイブリダイゼーション工程で使用される組成物は、別々の変性工程で使用される組成物とは異なりうるため、本発明の組成物のデキストラン硫酸及び塩の濃度は重要ではない。実際、デキストラン硫酸、塩、及びバッファーを欠いた本発明の組成物は、プローブ及び標的が共変性させられるハイブリダイゼーション用途に比して、プローブ及び標的が別々に変性させられるハイブリダイゼーション用途において、より低いバックグランド（例えば、１＋1/2から２程度低いスコア）及びより均質なバックグランドを生じる。しかしながら、バッファー（例えば、４０％ＥＣと１０ｍＭのクエン酸バッファー）を含む組成物は、バッファリングされていない組成物よりも、僅かに高いバックグランド（例えば、１／２程度高いスコア）を生じる。一実施態様では、ＥＣ及びバッファー（例えば、１５％ＥＣと１０ｍＭのクエン酸バッファー）を含む組成物はデキストラン硫酸無しで機能した。
【００９２】
本発明の組成物を使用して標的及びプローブが別々に変性させられるハイブリダイゼーション用途は、伝統的なバッファーを使用して標的及びプローブが共変性させられるハイブリダイゼーション用途よりも、より均質なシグナル強度及びより低く均質なバックグランド染色を生み出す。
【００９３】
（３）特定の応用に対する最適化
本発明の組成物は、特定の応用に対して結果を最適化するために変更しうる。例えば、極性非プロトン溶媒、塩、促進剤、ブロッキング剤、及び／又は水素イオン（つまりｐＨ）の濃度を、特定の応用に対する結果を改善するために変更しうる。
【００９４】
例えば、極性非プロトン溶媒の濃度を、シグナル強度及びバックグラウンド染色を改善するために変更しうる。一般に、極性非プロトン溶媒の濃度が増加するにつれて、シグナル強度が増加し、バックグラウンド染色が減少する。例えば、１５％のＥＣを含有するプローブを変性させるための組成物は、５％のＥＣを含有する組成物より強いシグナルと少ないバックグラウンドを示す傾向がある。しかしながら、シグナル強度は、塩及び／又はデキストラン硫酸の濃度が増加させられる場合、低濃度の極性非プロトン溶媒（例えば０％から２０％）を有する組成物に対して改善されうる。例えば、塩濃度が伝統的な塩濃度（つまり、およそ１２００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのリン酸バッファー）のおよそ３から４倍上昇させられると、５％から１０％のＥＣで強いシグナルが観察されうる。同様に、低濃度の極性非プロトン溶媒が使用されると、高濃度のデキストラン硫酸が良好なシグナル及びバックグラウンド強度を維持するために一般に必要とされる。
【００９５】
従って、塩及びデキストラン硫酸の濃度を、シグナル強度及びバックグラウンド染色を改善するためにまた変更しうる。一般に、プローブを変性させるための組成物中の塩及びデキストラン硫酸の濃度が増加すると、シグナル強度が増加し、バックグラウンドが減少する。例えば、伝統的な濃度（つまり３００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのリン酸バッファー）のおよそ２から４倍の塩濃度は、強いシグナルと低いバックグラウンドを生じる。しかしながら、驚いたことに本発明の組成物は、たとえ塩が完全に存在しない場合でも使用できる。シグナル強度は、促進剤及び／又は極性非プロトン溶媒の濃度を増加させることによって非塩条件下で改善することができる。
【００９６】
同様に、プローブを変性させるための組成物は、デキストラン硫酸濃度が０％から２０％まで増加するとシグナル強度の増加を示す。しかしながら、良好なシグナルは０％のデキストラン硫酸濃度においてさえ観察されうる。シグナル強度は、極性非プロトン溶媒及び／又は塩濃度を増加させることによって低デキストラン硫酸条件下で改善することができる。
【００９７】
また、本発明の組成物において使用されるプローブのタイプを、結果を改善するために変更しうる。例えば、本発明のある態様では、ＤＮＡ／ＤＮＡプローブの組合せが、本発明の組成物におけるＤＮＡ／ＰＮＡプローブの組合せより少ないバックグラウンドを示し得、又はその逆もしかりである。他方、ＰＮＡプローブは、低塩及び／又は低極性非プロトン溶媒濃度下でＤＮＡプローブよりも強いシグナルを示す傾向がある。実際、ＰＮＡプローブは極性非プロトン溶媒が存在しない場合にもシグナルを示す一方、ＤＮＡプローブは、極性非プロトン溶媒がないと弱いシグナルを示すかシグナルを示さない。
【００９８】
本発明の更なる最適化は、例えば、標的を変性するために標識されたプローブを含まない特異的な変性バッファーを使用するなどして、プローブ及び標的の変性をお互い別々にすることである。そうした別々な変性のための本発明の組成物の使用は、バックグランド染色を減少させ、バックグランド及びシグナル強度双方に関して染色をより均質にすることが見いだされた。更に本発明の組成物は、別々の変性が低温で起きることを可能にし、それは例えば、試料の形態及び核酸配列構造を保持するために都合が良い。上記で検討された通り、本発明の組成物はまた例えば伝統的なホルムアミド変性バッファーよりも毒性が少ない。当業者には明らかであるが、標的のためのそうした変性組成物は、極性非プロトン溶媒の代わりに、尿素、ＤＭＳＯ又はホルムアミドのようなより伝統的な変性剤で構成されるかもしれない一方、プローブのための変性組成物はより伝統的な変性剤の代わりに、極性非プロトン溶媒を含みうる。次にプローブ及び標的は、例えばＰＣＴ／ＩＢ０９／００５８９３に記載された速いハイブリダイゼーションバッファーと共にハイブリダイゼーション工程において組み合わされうる。
【００９９】
Ｄ．応用、方法、及び使用
（１）分析試料
本発明の方法及び組成物は、細胞診、組織診断、又は分子生物学の分野における標的及びプローブの別々の変性を含む全てのタイプのハイブリダイゼーション用途において完全に又は部分的に使用されうる。一実施態様によれば、本発明の方法における第一又は第二の核酸配列が生物学的試料中に存在する。かかる試料の例は、組織試料、細胞調製物、細胞断片調製物、及び単離された又はリッチ化された細胞成分調製物を含む。試料は、様々な組織、例えば乳房、結腸直腸、前立腺、肺、頭頸部、胃、膵臓、食道、肝臓、及び膀胱、又は他の関連する組織及びその腫瘍、任意の細胞懸濁液、血液試料、細針生検、腹水、痰、腹膜洗浄液、尿、糞便、細胞掻爬、細胞スミア、サイトプシン又は細胞プレップ細胞から由来しうる。
【０１００】
試料は標準的なプロトコルを使用して単離され、プロセシングされうる。細胞断片調製物は、例えば細胞ホモジナイズ、凍結融解処理又は細胞溶解により得ることができる。単離された試料は、試料を得る目的に応じてまた部位に常套的な手段に応じて、多くの異なった方法で処理されうる。しばしば、試料は後での試料分析のために組織を保存するために様々な試薬を用いて処理され、あるいは、試料は直接分析されうる。試料を保存するために広く使用されている方法の例は、ホルマリン固定とそれに続くパラフィン包埋及び凍結保存である。
【０１０１】
分裂中期スプレッドでは、細胞培養物を、一般に、コルセミド、又は他の適切な紡錘極破壊剤で処理して、分裂中期における細胞サイクルを停止させる。ついで、細胞を固定し、顕微鏡スライド上に染みつけ、ホルムアルデヒドで処理し、洗浄し、エタノールで脱水する。ついで、プローブを加え、以下に検討する技術の何れかによって試料を分析する。
【０１０２】
細胞診は生物学的試料からの個々の細胞及び／又は染色体スプレッドの検査を含む。試料の細胞診は、細胞の検体を得ることで始まり、これは、典型的には、頸部検体の場合におけるように、擦過し、拭き取り、又は領域をブラシでこすることにより、又は胸部腔、 膀胱、又は脊柱から得られるもののように、体液を集めることにより、又は内部の腫瘍の場合のように、穿刺吸引又は細針生検により、なすことができる。一般的な手作業での細胞調製では、試料は液体懸濁材料に移され、液体中の細胞がついで直接又は遠心分離ベースのプロセシング工程によってガラス顕微鏡スライド上へ検査のために移される。典型的な自動化された細胞調製では、フィルターアセンブリが液体懸濁液に配され、フィルターアセンブリが細胞を分散させると共にフィルター上の細胞を捕捉する。ついで、フィルターを除去し、顕微鏡スライドに接触させて位置させる。ついで、細胞を、以下で検討する技術の何れかによる分析前に顕微鏡スライドに固定する。
【０１０３】
細胞試料を使用する伝統的なＤＮＡハイブリダイゼーション実験では、検体を含むスライドをホルムアルデヒドバッファー中に浸漬し、洗浄し、ついでエタノールで脱水する。ついで、プローブを加え、検体をカバーガラスで覆う。ついで、プローブ及び検体を、検体中の任意の二本鎖核酸を分離させるのに十分な温度で共変性させた後（例えば８２℃で５分）、ハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な温度でインキュベートする（例えば４５℃で一晩）。ハイブリダイゼーション後、カバーガラスを取り除き、検体に高ストリンジェントな洗浄（例えば６５℃で１０分）と続く一連の低ストリンジェントな洗浄（例えば室温で２×３分）を施す。ついで、試料を脱水し、分析のためにマウントする。
【０１０４】
細胞試料を使用する伝統的なＲＮＡハイブリダイゼーション実験では、細胞を４０％ホルムアミド、１×ＳＳＣ、及び１０ｍＭのリン酸ナトリウム中で５分間平衡化させ、３７℃で、オリゴヌクレオチドプローブ２０ｎｇ（例えば、標識化５０ｂｐオリゴの混合物）、１×ＳＳＣ、４０％ホルムアミド、１０％デキストラン硫酸、０．４％のＢＳＡ、２０ｍＭのリボヌクレオチドバナジル複合体、サケ精巣ＤＮＡ、大腸菌ｔＲＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）、及び１０ｍＭのリン酸ナトリウムを含むハイブリダイゼーション反応で一晩インキュベートする。次に、３７℃で４×ＳＳＣ／４０％ホルムアミドで２回洗い、再び２×ＳＳＣ／４０％ホルムアミドで２回洗い、次に室温で２×ＳＳＣ／４０％ホルムアミドで３回洗う。次にジゴキシゲニン標識化プローブを、例えばＣｙ３にコンジュゲートさせたジゴキシゲニンに対するモノクロナール抗体を用いて検出することができる。次にビオチン標識化プローブは、例えばストレプトアビジン−Ｃｙ５を使用することにより検出できる。検出は蛍光又はＣＩＳＨによりできる。
【０１０５】
組織診断は組織の薄いスライス中の細胞の検査を含む。組織検査のための組織試料を調製するには、組織片を適切な固定液、典型的にはアルデヒド、例えばホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒドで固定し、ついで、融解パラフィンロウに包埋する。ついで、組織試料を含むロウブロックをミクロトームで切断し、典型的には２から１０ミクロン厚の組織を含む薄いパラフィンスライスを得る。ついで、検体スライスを顕微鏡スライドに適用し、空気乾燥させ、加熱して、検体をガラススライドに付着させる。ついで、残留パラフィンを適切な溶媒、典型的にはキシレン、トルエン又は他のもので溶解させる。ついで、これらのいわゆる脱パラフィン化溶媒を、以下に検討される技術の何れかによる試料の分析の前に、洗浄-脱水タイプの試薬を用いて除去する。別法では、スライスを凍結検体から調製し、１０％ホルマリン又は他の適切な固定液に簡単に固定し、ついで試料の分析前に脱水試薬を注入する。
【０１０６】
組織試料を使用する伝統的なＤＮＡハイブリダイゼーション実験では、ホルマリン固定パラフィン包埋組織検体を２−６μｍの切片に切断しスライド上に集める。パラフィンを溶かし（例えば６０℃で３０−６０分）、ついでキシレン（又はキシレン代替物）で、例えば２×５分洗浄することによって除去（脱パラフィン化）する。試料を再水和させ、洗浄し、ついで前処理する（例えば９５−１００℃で１０分）。スライドを洗浄し、ついでペプシン又は他の適切な透過剤で、例えば３７℃で３−１５分、処理する。スライドを洗浄し（例えば２×３分）、脱水し、プローブを適用する。検体をカバーガラスで覆い、プローブ及び検体を、任意の二本鎖核酸を分離させるに十分な温度でスライドをインキュベートすることで共変性させ（例えば８２℃で５分）、ハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な温度でインキュベートする（例えば４５℃で一晩）。ハイブリダイゼーション後、カバーガラスを取り除き、検体に高ストリンジェントな洗浄（例えば６５℃で１０分）と続く一連の低ストリンジェントな洗浄（例えば室温で２×３分）を施す。ついで、試料を脱水し、分析のためにマウントする。
【０１０７】
組織試料を使用する伝統的なＲＮＡハイブリダイゼーション実験では、ＦＦＰＥ組織切片のスライドをキシレン中で２×５分脱パラフィン処理し、９９％エタノール中に２×３分、９６％エタノール中に２×３分、ついで純水に３分浸す。スライドを湿度チャンバーに配する。プロテイナーゼＫを添加し、スライドを５分−１５分間、室温でインキュベートする。スライドを純水中に２×３分浸し、９６％エタノール中に１０秒間浸し、５分間空気乾燥させる。プローブを組織切片に添加し、カバーガラスで覆う。スライドを湿度チャンバーで９０分間インキュベートする。インキュベート後、スライドをストリンジェントな洗浄溶液中に５５℃にて２５分間浸し、ついでＴＢＳ中に１０秒間浸す。スライドを湿度チャンバー中で抗体と共に３０分間インキュベートする。スライドをＴＢＳ中に２×３分間、ついで純水中に２×１分間浸し、ついで湿度チャンバー中に配する。ついで、スライドを６０分間基質と共にインキュベートし、５分間水道水に浸す。
【０１０８】
伝統的なノーザンブロット手順で、ＲＮＡ標的試料を１０分間、６５℃でＲＮＡ負荷バッファー中で変性させ、直ちに氷上に置く。ゲルを負荷し、１×ＭＯＰＳバッファー（１０×ＭＯＰＳは２００ｍＭのモルフォリノプロパンスルホン酸、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ７．０を含む）と共に２５Ｖで一晩電気泳動させる。ついで、ゲルを２０×ＳＳＣで１０分間予め平衡化し、ＲＮＡをトランスファーバッファーとして無菌２０×ＳＳＣを使用してナイロン膜へ移動させる。核酸を次いで例えば１２０ｍＪにてＵＶクロスリンクを使用して、又は１２０℃で３０分間ベーキングすることで膜上に固定する。膜をついで水で洗浄して空気乾燥させる。膜をシール可能なプラスチック袋に入れて、プローブ無しで３０分間６８℃にてプレハイブリダイズする。プローブを１００℃で５分間変性させて、直ちに氷上に置く。ハイブリダイゼーションバッファー（予め６８℃に温める）を添加し、プローブを６８℃で一晩ハイブリダイズさせる。ついで膜を袋から取り除き、室温にて低ストリンジェンシーの洗浄バッファー（例えば、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）で震盪して毎回５分間２回洗浄する。膜をついで高ストリンジェンシーの洗浄バッファー（例えば、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）で６８℃で毎回１５分間２回洗浄する。膜をついで保管され、又は速やかに検出のために展開されうる。
【０１０９】
伝統的ハイブリダイゼーション技術の更なる例は、例えばSambrook等、 Molecular Cloning A Laboratory Manual, 第２版、 Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989) の章 1.90-1.104, 2.108-2.117, 4.40-4.41, 7.37-7.57, 8.46-10.38, 11.7-11.8, 11.12-11.19, 11.38及び 11.45-11.57；及びAusubel等, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1998) の章 2.9.1-2.9.6, 2.10.4-2.10.5, 2.10.11-2.10.16, 4.6.5-4.6.9, 4.7.2-4.7.3, 4.9.7-4.9.15, 5.9.18, 6.2-6.5, 6.3, 6.4, 6.3.3-6.4.9, 5.9.12-5.9.13, 7.0.9, 8.1.3, 14.3.1-14.3.4, 14.9, 15.0.3-15.0.4, 15.1.1-15.1.8、及び20.1.24-20.1.25に見いだすことができる。
【０１１０】
（２）ハイブリダイゼーション技術
本発明の組成物及び方法は、細胞及び組織試料に対して標的及びプローブの別々な変性を含む全てのタイプの核酸ハイブリダイゼーション技術において完全に又は部分的に使用することができる。かかる技術は、例えばインサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ；多色ＦＩＳＨ、Ｆｉｂｅｒ−ＦＩＳＨ等を含む）、発色性インサイツハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）、銀インサイツハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、染色体彩色、及びアレイインサイツを含む。
【０１１１】
本発明のハイブリダイゼーションに使用するのに適した分子プローブは、例えば出典明示によりここに援用される米国特許出願公開第２００５／０２６６４５９号に記載されている。一般に、プローブは、プローブは、化学合成、ＰＣＲにより、又はクローニングにより特異的ＤＮＡ配列を増幅させ、ベクター中にＤＮＡを挿入し、ベクターを適切な宿主細胞中で増幅させることにより、調製することができる。一般的に使用されるベクターは細菌プラスミド、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣｓ）、ＰＩ転用人工染色体（ＰＡＣｓ）、又は酵母人工染色体（ＹＡＣｓ）を含む。ついで、増幅されたＤＮＡは抽出され、プローブとしての使用のために精製される。プローブを調製し及び／又は合成するための方法は、例えばＰＣＴ／ＵＳ０２／３０５７３に開示されているように、当該分野で知られている。
【０１１２】
一般に、プローブのタイプが、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて検出しうる特徴のタイプを決定する。例えば、全核又はゲノムＤＮＡを種特異的プローブとして使用することができる。染色体彩色は、単一の染色体タイプから誘導されたＤＮＡ配列の収集物であり、分裂中期及び静止期の核中のその特定の染色体を同定でき、ある種の染色体の数を計数し、転座を示し、又はクロマチンの染色体外断片を同定しうる。異なった染色体タイプは、また、特定の染色体を検出し計数するために、プローブハイブリダイゼーションの標的とされうる独特の反復配列を有する。独特の単一コピー配列を標的とするために大きな挿入プローブを使用することができる。これらの大きなプローブでは、ハイブリダイゼーション効率はプローブサイズに逆比例する。より小さいプローブをまた欠失、増幅、逆位、複製、及び異数性のような異常を検出するために使用することもできる。例えば、異なった色になった遺伝子座特異的プローブを使用して、スプリットシグナルインサイツハイブリダイゼーションを介して転座を検出することができる。
【０１１３】
一般に、密接に関連した配列を区別する能力は、プローブ長が増加するにつれて熱安定性の差が野生型と変異複合体間で減少するので、ハイブリダイゼーションプローブの長さに逆比例する。１０ｂｐ長より大きいプローブが、一般に、関心ある独特の生物又は臨床状態を正しく同定するのに必要な配列多様性を得るのに必要とされる。他方、非常に短いオリゴマー（＜１０塩基対）における単一の塩基（点突然変異）のような微妙な配列差は、非標的配列と比較した相補的核酸標的配列へのハイブリダイゼーションの識別を可能にするのに十分であり得る。
【０１１４】
一実施態様では、インサイツハイブリダイゼーションプローブの少なくとも一セットは、出典明示によりここに援用される米国特許第７１０５２９４号に記載されているように、一又は複数のＰＮＡプローブを含みうる。ＰＮＡプローブを合成する方法はＰＣＴ／ＵＳ０２／３０５７３に記載されている。あるいは、又は加えて、上で検討された技術の何れかにおけるハイブリダイゼーションプローブの少なくとも一セットは、出典明示によりここに援用される国際公開第９９／１４２２６号に記載されているように、一又は複数のロックド核酸（ＬＮＡ）プローブを含みうる。ＬＮＡ骨格は、２’及び４’炭素間に更なる架橋結合があるため、ハイブリダイゼーションに対して事前組織化される。ＬＮＡ／ＤＮＡ及びＬＮＡ／ＲＮＡ相互作用は、高融解温度によって示されるように、対応するＤＮＡ／ＤＮＡ及びＤＮＡ／ＲＮＡ相互作用より強い。よって、ハイブリダイゼーションに対して必要とされるエネルギーを減少させる本発明の組成物及び方法は、ＬＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーションに対して特に有用である。
【０１１５】
一実施態様では、プローブは、出典明示によりここに援用される米国特許出願公開第２００５／０２６６４５９号に記載されているように、検出可能な標識（プローブ・標的ハイブリッドの検出を可能にする分析によって同定可能なシグナルを与える分子）を含みうる。プローブは、例えば蛍光又は明視野顕微鏡／スキャナーを使用することによりプローブ−標的ハイブリッドを同定可能とするために標識されうる。幾つかの実施態様では、プローブは３１Ｐ、３３Ｐ、又は３２Ｓのような放射標識、ジゴキシゲニン及びビオチン、又は蛍光標識のような非放射性標識を使用することで標識されうる。検出可能な標識は、プローブに直接的に結合されてもよいし、又は例えばリンカーを使用してプローブに間接的に結合されてもよい。酵素的及び化学的プロセスを含む当業者に知られている任意の標識法を使用して、本発明の方法及び組成物において使用されるプローブを標識することができる。他の実施態様では、プローブは標識されない。
【０１１６】
一般に、ＣＧＨ、ＦＩＳＨ、ＣＩＳＨ、及びＳＩＳＨのようなハイブリダイゼーション技術は、細胞の染色体中の遺伝子又は遺伝子断片に変動するストリンジェンシーでハイブリダイズする大きな主に特定されない核酸プローブを用いる。かかるプローブは、コズミッククローン、ＹＡＣクローン、又は他のクローン化ＤＮＡ断片から誘導されうる。大きなプローブの使用はインサイツハイブリダイゼーション技術を非常に高感度なものにする。しかしながら、伝統的なハイブリダイゼーションアッセイにおける大きなゲノムプローブの使用の成功は、ゲノム中に存在している例え名反復配列から誘導された望まれないバックグラウンド染色をブロックすることに依存している。非特異的プローブ結合を減らす伝統的な方法は、フィコール、ウシ血清アルブミン、ポリビニルピロリドン、及び核酸を含むプレハイブリダイゼーション溶液と共に組織をインキュベートすることで、タンパク質及び組織上の結合部位を飽和させることを含む。かかるブロッキング工程は時間を費やし高価である。有利なことに、本発明の方法及び組成物は、ブロッキング工程の必要性を減少させ及び／又は排除し、ブロッキング剤の必要性無しに、及びホルムアミド含有バッファー中で一晩ハイブリダイゼーションする必要無しに、著しく減少したバックグランドレベルを示す。しかしながら、一実施態様では、例えばＰＣＴ／ＵＳ０２／３０５７３に開示されているように、当該分野で知られている方法によって反復配列を抑制することもできる。
【０１１７】
結合したプローブは、細胞及び組織試料中において直接的に又は蛍光色素（例えばＦＩＳＨ）、有機色素原（例えばＣＩＳＨ）、銀粒子（例えばＳＩＳＨ）、又は他の金属粒子（例えば金支援蛍光インサイツハイブリダイゼーション、ＧＯＬＤＦＩＳＨ）で間接的に検出することができる。よって、検出方法に依存して、試験される試料から得られた細胞集団は蛍光顕微鏡又は一般的な明視野光学顕微鏡を介して可視化されうる。
【０１１８】
細胞及び組織試料でのハイブリダイゼーションアッセイは、特異的ＤＮＡ配列の数、サイズ、及び／又は位置を決定するための重要なツールである。例えば、ＣＧＨでは、全ゲノムが染色され、異常なコピー数の領域の検出に対して、正常な参照ゲノムと比較される。典型的には、患者組織及び正常なコントロール組織からのＤＮＡが異なった色のプローブで標識される。ＤＮＡのプールが混合され、正常な染色体の分裂中期スプレッドに（又はアレイ−又はマトリックス−ＣＧＨでは、マイクロアレイチップに）加えられる。ついで、異常なコピー数を持つ領域を同定するために色の比が比較される。
【０１１９】
ＦＩＳＨは、典型的には、複数のカラー画像処理が必要とされるとき、及び／又はプロトコルがシグナルの定量を求めるときに使用される。該技術は、一般に、細胞試料を調製し、プローブを標識し、標的染色体及びプローブを変性させ、プローブを標的配列にハイブリダイズさせ、及びシグナルを検出することを必要とする。典型的には、ハイブリダイゼーション反応は、標的にされた配列を蛍光的に染色する結果、その位置、サイズ、又は数を、蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、又は他の適切な機器を使用して決定することができる。全ゲノムから数キロベースの範囲のＤＮＡ配列を、ＦＩＳＨを使用して研究することができる。例えばデコンボリューションのような高度な蛍光顕微鏡技術により、単鎖ｍＲＮＡ分子でさえも検出可能である。ＦＩＳＨはまた分裂中期スプレッド及び静止期核について使用することもできる。
【０１２０】
ＦＩＳＨは、分裂中期染色体、静止期核、クロマチン線維、及びネイキッドＤＮＡ分子上の反復及び単一コピーＤＮＡのマッピングに対して、また大きな反復ファミリー、典型的にはリボソームＤＮＡ及び主要なタンデムアレイファミリーの局在化を通しての染色体同定及び核型解析に対して成功裏に使用されている。ＦＩＳＨの最も重要な応用の一つは、単一コピーＤＮＡ配列、特にヒト及び他の真核生物モデル種における疾患関連遺伝子の検出、及び感染薬剤の検出にあった。ＦＩＳＨは、例えば出生前診断における染色体異数性、血液学的癌、及び固形腫瘍；遺伝子異常性、例えば癌遺伝子増幅、遺伝子欠失、又は遺伝子融合；染色体構造異常性、例えば転座、複製、挿入、又は逆位；近接遺伝子症候群、例えば微小欠失症候群；様々な治療法の遺伝子効果；体細胞におけるウイルス核酸及び染色体中のウイルス組込み部位等々を検出するために使用することができる。多色ＦＩＳＨでは、各染色体が別個の色で染色され、異常な染色体が誘導された正常な染色体を決定することが可能になる。かかる技術は、多重ＦＩＳＨ（ｍ−ＦＩＳＨ）、スペクトル核型決定（ＳＫＹ）、総合二値化標識（ＣＯＢＲＡ）、色変化核型決定、異種間色バンド形成、高分解能多色バンド形成、テロメア多重ＦＩＳＨ（ＴＭ−ＦＩＳＨ）、スプリットシグナルＦＩＳＨ（ｓｓＦＩＳＨ）、及びヒュージョンシグナルＦＩＳＨを含む。
【０１２１】
ＣＩＳＨ及びＳＩＳＨは、ＦＩＳＨと同じ用途の多くに使用することができ、例えば病理組織学的用途において、根底にある組織形態の分析を可能にするという更なる利点を有している。ＦＩＳＨが実施される場合は、出典明示によりここに援用される米国特許第６７３０４７４号に記載されているように、ハイブリダイゼーション混合物は、別個のバランスがとれた対のプローブのセットを含みうる。ＣＩＳＨでは、ハイブリダイゼーション混合物は、一又は複数の一般的な有機色素原での検出に対して構成された少なくとも一のセットのプローブを含み得、Powell RD等, "Metallographic in situ hybridization"に記載されたように、ＳＩＳＨに対しては、ハイブリダイゼーション混合物は、銀粒子での検出に対して構成された
【０１２２】
本発明の組成物はまたブロッティング及びプロービング（例、サザーン、ノーザーン等）を含むハイブリダイゼーションを含む分子生物学技術の全てのタイプにおいて完全に又は部分的に使用することができる。
【０１２３】
（３）ハイブリダイゼーション条件
本発明の方法は標的及びプローブの別々の変性を含むハイブリダイゼーション用途において極性非プロトン溶媒を使用することを含む。本発明の組成物は上記方法でプローブ及び試料を別々に変性させることに特に有用である。
本発明の組成物を使用するハイブリダイゼーション方法は、殆どは二本鎖の形態である標的核酸配列を含む試料に組成物を適用することを含みうる。通常、標的配列とハイブリダイズするプローブへのアクセスを確保するために、プローブ及び試料を一緒に加熱して任意の二本鎖核酸を変性させる。別々の変性は形態をより良く保つ一方、共変性は実際の工程数を減らすと議論されてきた。これらの理由により、別々の変性工程は分子細胞遺伝学の用途にほとんどの場合使用され、共変性は組織切片を分析する際にほとんどの場合使用される。
【０１２４】
変性は典型的には標的及びプローブを（一緒に又は別々に）、熱（例えば、約７０℃から約９０℃の温度で）及びホルムアミド及びテトラアルキルアンモニウムハロゲン化物又はその組み合わせのような有機溶媒の存在下でインキュベートすることで実施される。例えば、染色体ＤＮＡは７０℃以上の温度（例えば、約７３℃）及び７０％ホルムアミド及び２×ＳＳＣ（０．３Ｍ塩化ナトリウム及び０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）を含む変性バッファーの組み合わせにより変性させることができる。変性条件は典型的には細胞形態を保持するように樹立される（例えば、比較的低い温度及び高ホルムアミド濃度）。
【０１２５】
標的及びプローブの別々の変性を含む伝統的ハイブリダイゼーション用途において、標的は例えば７０℃から８５℃で５−３０分間、５０％から７０％ホルムアミド及び２×ＳＳＣを含むバッファー中で変性されうるが、一方プローブは例えば７５℃から９５℃で５−１０分間、５０％から１００％ホルムアミドを含むバッファー中で変性されうる。標識及びプローブを別々に変性させる他の伝統的なプロトコールは、標的を７５℃で２分間、７０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、１０％（ｖ／ｖ）２０×ＳＳＣ、及び１０％ （ｖ／ｖ）リン酸バッファー中で、又は７０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、２×ＳＳＣ（ｐＨ７．０）、及び０．１ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ７．０中でインキュベートする方法、及び７５℃で５−１０分間、２％（ｗ／ｖ）デキストラン硫酸、５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ、及び５０ｍＭリン酸バッファー中で標的をインキュベートする方法を含みうる。プローブ及び標的を別々に変性する更に他のプロトコールは、標的を室温で５分間、０．０５ＭのＮａＯＨ及び２ＸＳＳＣ中でインキュベートすること、及び２×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、１０％デキストラン硫酸、０．１５％ＳＤＳ中で１０分間７０−７５℃でインキュベートすることを含みうる。  
【０１２６】
標的及びプローブを共変性させることを含む伝統的なハイブリダイゼーション用途において、典型的プロトコールは標的及びプローブを一緒に２×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、１０％デキストラン硫酸、０．１５％ＳＤＳ中で３０秒から５分、８０℃でインキュベートすることを含んでも良い。標的及びプローブを共変性させる他の伝統的なプロトコールは、標的及びプローブを一緒に７５℃で、２−４分間、７０％ホルムアミド及び２×ＳＳＣ（ｐＨ７．２に調節）中でインキュベートすることを含みうる。更に、標的及びプローブを共変性させる他の伝統的なプロトコールは、標的及びプローブを一緒に６５℃から７０℃にて５分間、５０％ホルムアミド、１０％デキストラン硫酸、及び０．１％ＳＤＳ中でインキュベートすることを含みうる。
【０１２７】
しかしながら、本発明の方法では、プローブ及び試料は別々のバッファー中で変性させられ、ついで、試料及びプローブはハイブリダイゼーション工程のために組み合わされる。試料変性バッファー及びプローブ変性バッファーは同じ成分を含有し得、又は異なる成分を含有しうる。例えば、両方のバッファーは少なくとも一つの極性非プロトン溶媒を含有し、又は２つのバッファーの一つのみが極性非プロトン溶媒を含有しうる。極性非プロトン溶媒は核酸と相互作用し、変性及び再アニーリング工程を容易にする。極性非プロトン溶媒は、また、より低い変性温度の使用を可能にし、ホルムアミドのような毒性化学薬品の必要性を回避する。その結果、本発明で特定される極性非プロトン溶媒は、より低いバックグランド及びより均質なバックグランドを生じ、試料形態を保持し、容易な自動化を可能にし、及びより安全な（より低毒性な）試薬を提供する。
【０１２８】
本発明の変性組成物を使用するハイブリダイゼーションは、伝統的な組成物により実施されるハイブリダイゼーションと同じアッセイ法を使用して実施されうる。例えば、熱の前処理、温浸、変性、ハイブリダイゼーション、洗浄、及びマウント工程は、容量、温度、試薬、インキュベーション時間において、伝統的な組成物と同じ条件を使用しうる。しかしながら、本発明の組成物は、プローブ及び試料の別々の変性を含むハイブリダイゼーション用途に対し改良された結果をもたらす。当該分野で知られた伝統的なハイブリダイゼーションプロトコールに大きな変法が存在する。本発明の組成物は、当該分野で知られた伝統的なハイブリダイゼーションプロトコールの何れにても使用されうる。例えば、組成物は、伝統的なホルムアミドハイブリダイゼーションバッファーを含むハイブリダイゼーション用途に使用されうるし、又はＰＣＴ／ＩＢ０９／００５８９３に開示された極性非プロトン溶媒ハイブリダイゼーションバッファーを含むハイブリダイゼーション用途で使用されうる。
【０１２９】
別法では、本発明の組成物を使用するアッセイは、例えば、標的及びプローブを別々に変性するために、温度及び／又は時間を増加又は減少させることによって、伝統的な方法から変化せしめられ得、最適化されうる。当業者には理解されるであろうが、ある場合には、例えばＲＮＡ検出で、変性工程は必要としない。
【０１３０】
例えば、ある実施態様では、標的及びプローブを別々に変性するために使用される変性温度は５５℃から１００℃に可変し得、ハイブリダイゼーション温度は２０℃から５５℃へ可変しうる。他の実施態様で、変性温度は５５から７０℃、７０から８０℃、８０から９０℃又は９０から１００℃へ、及びハイブリダイゼーション温度は２０から３０℃、３０から４０℃、４０から５０℃、又は５０から５５℃へ可変しうる。他の実施態様では、変性温度は、６７、７２、８２、又は９２℃、及びハイブリダイゼーション温度は３７，４０、４５、又は５０℃をとりうる。
【０１３１】
他の実施態様は、試料及びプローブを別々に変性するための時間は０から１５分であり、ハイブリダイゼーション時間は０分から７２時間に可変しうる。他の実施態様では、変性時間は０から５分に可変し得、ハイブリダイゼーション時間は０から８時間に可変しうる。他の実施態様では、変性時間は０、１、２、３、４、５、１０、１５、又は３０分であり得、ハイブリダイゼーション時間は０分、５分、１５分、３０分、６０分、１８０分、又は２４０分でありうる。
【０１３２】
従って、本発明の組成物を使用するハイブリダイゼーションは、８時間未満で実施することができる。他の実施態様では、ハイブリダイゼーション工程は、６時間未満で実施することができる。更に他の実施態様では、ハイブリダイゼーション工程は、４時間以内に実施することができる。他の実施態様では、ハイブリダイゼーション工程は、３時間以内に実施することができる。更に他の実施態様では、ハイブリダイゼーション工程は、２時間以内に実施することができる。他の実施態様では、ハイブリダイゼーション工程は、１時間以内に実施することができる。更に他の実施態様では、ハイブリダイゼーション工程は、３０分以内に実施することができる。他の実施態様では、ハイブリダイゼーション工程は１５分以内に生じうる。ハイブリダイゼーション工程は１０分以内又は５分未満でさえ生じうる。
【０１３３】
ハイブリダイゼーション時間が変化すると、プローブの濃度はまた強いシグナルを生じさせ及び／又はバックグラウンドを減少させるために変更されうる。例えば、ハイブリダイゼーション時間が減少すると、シグナル強度を改善するためにプローブの量が増加させられうる。他方、ハイブリダイゼーション時間が減少すると、バックグラウンド染色を改善するためにプローブの量が減少させられうる。
【０１３４】
本発明の組成物はまた標的ＤＮＡに対する例えば反復配列の結合をブロックすることによってシグナル及びバックグラウンド強度を改善することにより、ハイブリダイゼーション用途中におけるブロッキング工程の必要性を除去する。よって、ブロッキング剤として全ヒトＤＮＡ、ブロッキング−ＰＮＡ、ＣＯＴ−１ ＤＮＡ、又は任意の起源由来のＤＮＡを使用する必要性はない。加えて、驚くべきことに、本発明の組成物及び方法は、ホルムアミド含有バッファー中で一晩ハイブリダイゼーションする必要性無しに、著しく低減したバックグランドレベルを示す。
【０１３５】
本発明の水性組成物は、組成物に含められる核酸配列の濃度をかなり低減させる可能性を更にもたらす。一般に、プローブの濃度は、伝統的な濃度と比較して２から８倍、減少されうる。例えば、ＨＥＲ２ ＤＮＡプローブ及びＣＥＮ１７ ＰＮＡプローブが本発明の組成物において使用される場合、その濃度は、伝統的なハイブリダイゼーション溶液中におけるその濃度と比較して、それぞれ１／４及び１／２減少されうる。この特徴は、ブロッキング−ＰＮＡ又はＣＯＴ１のようにＤＮＡブロッキングの必要性がない点と共に、伝統的な組成物系において使用される伝統的な１０μＬ体積と比較して自動化機器システムにおいて増大されたプローブ体積を可能にし、これが、以下に更に詳細に検討されるように、蒸発による損失を低減させる。
【０１３６】
プローブ濃度の減少はまたバックグラウンドを減少させる。しかしながら、プローブ濃度の減少はハイブリダイゼーション時間に逆に相関する、つまり、濃度が低くなると、必要とされるハイブリダイゼーション時間が長くなる。にもかかわらず、極端に低濃度のプローブが本発明の水性組成物と共に使用されたときでさえ、ハイブリダイゼーション時間は伝統的な組成物の場合よりも尚短い。
【０１３７】
本発明の組成物はしばしば伝統的なハイブリダイゼーション組成物よりも良好なシグナル・ノイズ比を可能にする。例えば、ある種のプローブでは、本発明の組成物での一時間のハイブリダイゼーションは、伝統的な組成物の一晩のハイブリダイゼーションと同様の又はより低いバックグラウンドとより強いシグナルを生じる。バックグラウンドはプローブが添加されない場合は見られない。
【０１３８】
当業者は理解するであろうが、異なるタイプのハイブリダイゼーションアッセイ、異なるタイプの試料、異なるタイプのプローブ標的、異なる長さのプローブ、異なるタイプのプローブ、例えばＤＮＡ、／ＲＮＡ／ＰＮＡ／ＬＮＡオリゴ、短いＤＮＡ／ＲＮＡプローブ（０．５−３ｋｂ）、染色体染色プローブ、ＣＧＨ、反復プローブ（例えば、アルファサテライト反復）、単一遺伝子座等は、例えば最も効果的なハイブリダイゼーションを得るために必要な塩及び極性非プロトン溶媒の濃度に影響を与えるであろう。ハイブリダイゼーション用途において温度及びインキュベーション時間もまた重要な変数である。ここで提供される指針に鑑みて、当業者であれば本発明の方法を最適化するためにこれらの因子を如何に変えるかは分かるであろう。
【０１３９】
伝統的なアッセイ法は、システムがマニュアルか、半自動か、又は全自動化されているかどうかに応じて、本発明の組成物を使用するときに、また変更され、最適化されうる。例えば、プローブ及び標的の変性を別々にすることによって、伝統的に温度勾配を必要とする共変性プロトコールに比べてより単純な自動化した方法により、より少ない量のハイブリダイゼーションバッファーを使用することが可能である。更に、半自動化又は全自動化システムは、本発明の組成物で得られる短いハイブリダイゼーション時間から恩恵を受けるであろう。短いハイブリダイゼーション時間はそのような系で伝統的な組成物が使用された場合に遭遇する困難を減らしうる。例えば、半自動化及び全自動化システムの一つの問題は、そのような系では少い試料量（例１０−１５０μＬ）、温度上昇、及びハイブリダイゼーション時間の延長（例、１４時間））を要するため、ハイブリダイゼーション中に試料のかなりの蒸発が起こりうることである。よって、伝統的ハイブリダイゼーション組成物中の構成成分の割合はかなり不変である。しかしながら、本発明の組成物は標的及びプローブを別々に変性させるため、蒸発は減少し、半自動化及び全自動化したシステムで使用されるハイブリダイゼーション組成物中の成分の割合における柔軟性を増大させている。
【０１４０】
例えば、二つの自動化機器が、伝統的な共変性工程（つまり、試料及びプローブを一緒に変性させた）を有するハイブリダイゼーション用途における本発明の組成物を使用したハイブリダイゼーションの実施に使用されてきた。４０％エチレンカーボネート（ｖ/ｖ）を含有する組成物がＰＣＴ出願ＤＫ２００８／０００４３０で開示された装置で使用されており、１５％エチレンカーボネート（ｖ／ｖ）を含有する組成物がＨＹＢＲＩＭＡＳＴＥＲ ＨＳ−３００（Ａｌｏｋａ ＣＯ. ＬＴＤ，Ｊａｐａｎ）にて使用されている。本発明の組成物がＨＹＢＲＩＭＡＳＴＥＲ ＨＳ−３００で使用される場合、該機器は、伝統的な毒性のあるホルムアミドミックスの代わりに水を用いて迅速なＦＩＳＨハイブリダイゼーションを実施することができ、よって安全性を改善し、蒸発を減少させる。例えば出典明示によりここに援用される米国特許出願第１１／０３１５１４号に記載されているように、水で湿らされたストリップがＡｌｏｋａ機器の反応ユニット（ハイブリダイゼーションチャンバー）の内方部の蓋に付設される場合は、蒸発はまた更に減少させられる。有利なことに、標的及びプローブを別々に変性させることにより、上述した２つの機器の例において蒸発及び試料へのストレスを減少させる。
【０１４１】
自動化された画像解析に伴う他の問題は、必要とされる画像の数、必要とされる保存場所の莫大な量、及び画像を撮るのに必要とされる時間である。本発明の組成物は、伝統的な組成物と比較して非常に強いシグナルを生じせしめることによって課題に対処している。本発明の組成物によって生じせしめられる非常に強いシグナルのため、画像処理を、伝統的な組成物に必要なものよりも低い倍率でなすことができ、尚も検出し、例えばアルゴリズムによって解析できる。焦点面は低い倍率では広くなるので、本発明の組成物は連続試料切片を採取する必要性を低減又は解消する。本発明による別々の変性法により提供されるより均質なバックグランド染色及びシグナル強度はまたイメージング解析に有益である。その結果、本発明の組成物は連続切片が少ないか又は含まず、各画像が大きな面積をカバーするので、全体の画像処理が更に速い。加えて、分析のための全体の時間は、全画像ファイルが小さいので、より速い。
【０１４２】
よって、本発明の組成物及び方法は、伝統的なハイブリダイゼーション溶液及び方法に関連する問題の多くを解決する。
【０１４３】
本開示は、開示に従う組成物の好ましい実施態様を構成する以下の非限定的実施例を参照してより明確に理解されうる。
【０１４４】
広い範囲を定める数値範囲及びパラメータは近似値であるが、特定の実施例に記載した数値はできる限り正確に報告している。しかしながら、全ての数値は、その各試験測定に見出される標準偏差から必然的に生じるある程度の誤差を本来的に含んでいる。以下の実施例は本発明を例証するもので、本発明を限定するものと決して考えてはいけない。
【実施例】
【０１４５】
以下、本発明の特定の実施態様を詳細に参照する。本発明をこれら実施態様との関連で説明するが、それらは本発明をその実施態様に限定することを意図するものではないことが理解されるであろう。反対に、本発明は、添付の特許請求の範囲によって定まる本発明に含められうる代替物、変形例、及び均等物をカバーすることが意図される。
【０１４６】
次の実施例で使用される試薬は、Ｄａｋｏの組織診ＦＩＳＨアクセサリーキット（Ｋ５５９９）及び細胞診ＦＩＳＨアクセサリーキット（Ｋ５４９９）（Dako Denmark A/S, Glostrup Denmark）からのものである。キットは、ホルマリン固定、パラフィン包埋組織片献体に対するＦＩＳＨ手順を完了させるのに必要なプローブを除く全ての重要な試薬を含んでいる。全ての試料は製造者の記述に従って調製した。Ｄａｋｏハイブリダイザー（S2450, Dako）を消化、変性、及び及びハイブリダイゼーション工程に使用した。
【０１４７】
ＦＩＳＨスライドの評価は、ＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、テキサスレッド単一フィルター及びＦＩＴＣ／テキサスレッド二重フィルターを備えたＬｅｉｃａ ＤＭ６０００Ｂ蛍光顕微鏡を使用して、１０ｘ、２０ｘ、４０ｘ、及び１００ｘオイル対物下で、ハイブリダイゼーションから一週間以内に実施した。
ＣＩＳＨスライドの評価は、オリンパスＢＸ５１光学顕微鏡を使用して、４ｘ、１０ｘ、２０ｘ、４０ｘ、及び６０ｘの対物下で実施した。
【０１４８】
以下の実施例において、「デキストラン硫酸」は分子量Ｍｗ＞５０００００のデキストラン硫酸のナトリウム塩（Ｄ８９０６，Ｓｉｇｍａ）を意味する。極性非プロトン溶媒の全ての濃度はｖ／ｖパーセントとして与えられる。ホスフェートバッファーは、ＮａＨ２ＰＯ４，２Ｈ２Ｏ（リン酸ナトリウム二塩基二水和物）及びＮａ２ＨＰＯ４，Ｈ２Ｏ（リン酸ナトリウム一塩基一水和物）を含むリン酸緩衝溶液を意味する。シトレートバッファーは、クエン酸ナトリウム（Ｎａ３Ｃ６Ｈ５Ｏ７，２Ｈ２Ｏ；１．０６４４８，Ｍｅｒｃｋ）及びクエン酸一水和物（Ｃ６Ｈ８Ｏ７，Ｈ２Ｏ；１．００２４４，Ｍｅｒｃｋ）を含むクエン酸緩衝溶液を意味する。
【０１４９】
実施例１−２０の一般的組織診断ＦＩＳＨ／ＣＩＳＨ手順
ヒト（扁桃腺、乳癌、腎臓及び結腸）由来の切断されたホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）複数組織アレイ片を有するスライドを、６０℃で３０−６０分べークし、キシレン浴で脱パラフィンし、エタノール浴で再水和させ、ついで、洗浄バッファーに移した。ついで、試料を前処理溶液中で最小９５℃で１０分間前処理し、２×３分洗浄した。ついで、試料を３７℃でペプシンＲＴＵを用いて３分間、消化させ、２×３分洗浄し、一連のエタノール蒸発で脱水し、空気乾燥させた。ついで、試料を、個々の実験で記載されたようにして１０μＬのＦＩＳＨプローブと共にインキュベートした。ついで、試料を６５℃で１０分ストリンジェントな洗浄によって洗浄した後、２×３分洗浄し、ついで一連のエタノール蒸発で脱水し、空気乾燥させた。最後に、スライドを１５μＬのアンチフェードマウント培地にマウントした。染色が完了したところで、染色スライドのシグナル強度、形態、及びバックグラウンドを評価するために訓練を受けた観察者がスコア付けを実施した。
【０１５０】
実施例２１−２２の一般的な細胞診ＦＩＳＨ手順
分裂中期調製物のスライドを、３．７％のホルムアルデヒドに２分間固定し、２×５分洗浄し、一連のエタノール蒸発で脱水し、空気乾燥させた。ついで、試料を、個々の実験で記載されたようにして１０μＬのＦＩＳＨプローブと共にインキュベートした。ついで、試料を６５℃で１０分ストリンジェントな洗浄によって洗浄した後、２×３分洗浄し、ついで一連のエタノール蒸発で脱水し、空気乾燥させた。最後に、スライドを１５μＬのアンチフェードマウント培地にマウントした。染色が完了したところで、染色スライドのシグナル強度及びバックグラウンドを評価するために訓練を受けた観察者が、組織片のスコア付けガイドラインに記載されたようにしてスコア付けを実施した。
【０１５１】
実施例２３−３０の一般的な組織診断ＦＩＳＨ１／ＣＩＳＨ手順
ヒト（扁桃腺、乳癌、腎臓及び結腸）由来の切断されたホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）複数組織アレイ片を有するスライドを、６０℃で３０−６０分べークし、キシレン浴で脱パラフィンし、エタノール浴で再水和させ、ついで、洗浄バッファーに移した。ついで、試料を前処理溶液中で最小９５℃で１０分間前処理し、２×３分洗浄した。ついで、試料を３７℃でペプシンＲＴＵを用いて３分間、消化させ、２×３分洗浄し、一連のエタノール蒸発で脱水し、空気乾燥させた。ついで、試料を、個々の実験で記載されたようにして、１０μＬのＦＩＳＨプローブで共変性させるか、又はＦＩＳＨプローブ及び試料を最初に別々に変性させ、ついで一緒にインキュベートした。ついで、試料をストリンジェントな洗浄バッファー中で６５℃で１０分洗浄した後、２×３分洗浄バッファー中で洗浄し、ついで一連のエタノール蒸発で脱水し、空気乾燥させた。最後に、スライドを１５μＬのアンチフェードマウント培地にマウントした。染色が完了したところで、染色スライドのシグナル強度、形態、及びバックグランドを評価するために訓練を受けた観察者がスコア付けを実施した。
【０１５２】
組織切片のスコア付けガイドライン
シグナル強度は０−３のスケールで評価され、０はシグナルなし、３は強いシグナルとした。細胞／組織構造は０−３スケールで評価し、０は構造なしで核境界なしを意味し、３はインタクトな構造と明確な核境界とした。０と３の間には、観察者がシグナル強度、組織構造、及びバックグラウンドを評価できる０．５離れた更なるグレードがある。
【０１５３】
シグナル強度を等級システムに従って０−３スケールでスコア付けする。
０          シグナルは見られない。
１          シグナル強度は弱い。
２          シグナル強度は中程度である。
３          シグナル強度は強い。
スコア付けシステムは１／２グレードの使用を許容する。
【０１５４】
組織及び核構造を等級システムに従って０−３スケールでスコア付けする。
０          組織構造及び核境界は完全に破壊されている。
１          組織構造及び／又は核境界は乏しい。このグレードは、幾つかの領域が空の核である状況を含む。
２          組織構造及び／又は核境界が見られるが、核境界は不明瞭である。このグレードは数個の核が空である状況を含む。
３          組織構造及び核境界は無傷で明瞭である。
スコア付けシステムは１／２グレードの使用を許容する。
【０１５５】
バックグラウンドを等級システムに従って０−３スケールでスコア付けする。
０          見られるバックグラウンドは少しないしはない。
１          幾つかのバックグラウンド。
２          中程度のバックグラウンド。
３          高いバックグラウンド。
スコア付けシステムは１／２グレードの使用を許容する。
【０１５６】
実施例１
この実施例は、本発明の組成物又は伝統的なハイブリダイゼーション溶液で処理した試料からのシグナル強度及び細胞形態を変性温度の関数として比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物Ｉ：１０％デキストラン硫酸、３００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのリン酸バッファー、４０％のホルムアミド（１５５１５−０２６，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），５μＭのブロッキングＰＮＡｓ（Kirsten Vang Nielsen等, PNA Suppression Method Combined with Fluorescence In Situ Hybridisation (FISH) Technique inPRINS and PNA Technologies in Chromosomal Investigation, Chapter 10 (Franck Pellestor ed.) (Nova Science Publishers, Inc. 2006)を参照）、１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ（ＲＰ１１−１１４３Ｅ２０，サイズ１９２ｋｂ）。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩ：１０％デキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のエチレンカーボネート（０３５１９，Ｆｌｕｋａ），５μＭのブロッキングＰＮＡｓ，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ（ＲＰ１１−１１４３Ｅ２０，サイズ１９２ｋｂ）。
存在する場合、異なった粘度の相を使用前に混合した。ＦＩＳＨプローブを示したように５分間変性し、４５℃で６０分間ハイブリダイズした。
0006091753.tif 000011
【０１５７】
実施例２
この実施例は、本発明の組成物又は伝統的なハイブリダイゼーション溶液で処理した試料からのシグナル強度及びバックグラウンド染色をハイブリダイゼーション時間の関数として比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物Ｉ：１０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のホルムアミド，５μＭのブロッキングＰＮＡｓ，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩ：１０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のエチレンカーボネート，５μＭのブロッキングＰＮＡｓ，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ。
存在する場合、異なった粘度の相を使用前に混合した。ＦＩＳＨプローブを８２℃で５分間、ついで４５℃で１４時間、４時間、２時間、６０分、３０分、１５分、０分、インキュベートした。
0006091753.tif 000012
【０１５８】
実施例３
この実施例は、異なった極性非プロトン溶媒を有する本発明の組成物又は伝統的なハイブリダイゼーション溶液で処理した試料からのシグナル強度を比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物Ｉ：１０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のホルムアミド，５μＭのブロッキングＰＮＡｓ，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩ：１０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のエチレンカーボネート（ＥＣ），５μＭのブロッキングＰＮＡｓ，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩＩ：１０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のプロピレンカーボネート（ＰＣ）（５４００１３，Ａｌｄｒｉｃｈ），５μＭのブロッキングＰＮＡｓ，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＶ：１０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のスルホラン（ＳＬ）（Ｔ２２２０９，Ａｌｄｒｉｃｈ），５μＭのブロッキングＰＮＡｓ，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物Ｖ：１０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のアセトニトリル（ＡＮ）（Ｃ０２ＣＩＩＸ，Ｌａｂ−Ｓｃａｎ），５μＭのブロッキングＰＮＡｓ，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＶＩ：１０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のγ−ブチロラクトン（ＧＢＬ）（Ｂ１０３６０８，Ａｌｄｒｉｃｈ），５μＭのブロッキングＰＮＡｓ，７．５ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ。
存在する場合、異なった粘度の相を使用前に混合した。ＦＩＳＨプローブを８２℃で５分間、ついで４５℃で６０分間、インキュベートした。
0006091753.tif 000013
【０１５９】
実施例４
この実施例は、異なった濃度の極性非プロトン溶媒を有する本発明の組成物で処理した試料からのシグナル強度を比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物：１０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，１０−６０％のエチレンカーボネート（標示通り），５μＭのブロッキングＰＮＡｓ，７．５ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＩＧＫ−定常ＤＮＡ遺伝子プローブ（（ＣＴＤ−３０５０Ｅ１５，ＲＰ１１−１０８３Ｅ８；サイズ２２７ｋｂ）及び７．５ｎｇ／μＬのＦＩＴＣ標識ＩＧＫ−可変遺伝子ＤＮＡプローブ（ＣＴＤ−２５７５Ｍ２１，ＲＰ１１−１２２Ｂ６，ＲＰ１１−３１６Ｇ９；サイズ３５０及び４２９ｋｂ）。  
存在する場合、異なった粘度の相を使用前に混合した。ＦＩＳＨプローブを８２℃で５分間、ついで４５℃で６０分間、インキュベートした。
0006091753.tif 000014
【０１６０】
実施例５
この実施例は、ＰＮＡブロッキングを伴う及び伴わない組成物で処理した試料からのシグナル強度及びバックグラウンド強度を比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物：１０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のエチレンカーボネート，７．５ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ。
存在する場合、異なった粘度の相を使用前に混合した。ＦＩＳＨプローブを８２℃で５分間、ついで４５℃で６０分間、インキュベートした。
0006091753.tif 000015
【０１６１】
実施例６  
この実施例は本発明の組成物で処理された試料からのシグナル強度をプローブ濃度及びハイブリダイゼーション時間の関数として比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物：１０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のエチレンカーボネート，及び１０、７．５、５又は２．５ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ（標記の通り）。
存在する場合、異なった粘度の相を使用前に混合した。ＦＩＳＨプローブを８２℃で５分間、ついで４５℃で３時間、２時間及び１時間、インキュベートした。
0006091753.tif 000016
【０１６２】
実施例７
この実施例は、本発明の組成物で処理された試料からのシグナル強度を、塩、ホスフェート、及びバッファー濃度の関数として比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物：１０％のデキストラン硫酸，（［ＮａＣｌ］，［リン酸バッファー］，［ＴＲＩＳバッファー］結果に示した通り），４０％のエチレンカーボネート，７．５ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ。
存在する場合、異なった粘度の相を使用前に混合した。ＦＩＳＨプローブを８２℃で５分間、ついで４５℃で６０分間、インキュベートした。
0006091753.tif 000017
【０１６３】
実施例８
この実施例は、本発明の組成物で処理された試料からのシグナル強度をデキストラン硫酸濃度の関数として比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物：０、１、２、５、又は１０％のデキストラン硫酸（標記の通り），３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のエチレンカーボネート，５ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＳＩＬ−ＴＡＬ１遺伝子ＤＮＡプローブ（ＲＰ１−２７８Ｏ１３；サイズ６７ｋｂ）及び６ｎｇ／μＬのＦＩＴＣ ＳＩＬ−ＴＡＬ１（ＩＣＲＦｃ１１２−１１２Ｃ１７９４，ＲＰ１１−１８４Ｊ２３，ＲＰ１１−８Ｊ９，ＣＴＤ−２００７Ｂ１８，１３３Ｂ９；サイズ５６０ｋｂ）。
存在する場合、異なった粘度の相を使用前に混合した。ＦＩＳＨプローブを８２℃で５分間、ついで４５℃で６０分間、インキュベートした。ブロッキングなし。
0006091753.tif 000018
【０１６４】
実施例９
この実施例は、本発明の組成物で処理された試料からのシグナル強度を、デキストラン硫酸、塩、ホスフェート、及び極性非プロトン溶媒濃度の関数として比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物Ｉａ：３４％のデキストラン硫酸，０ｍＭのＮａＣｌ，０ｍＭのリン酸バッファー，０％のエチレンカーボネート，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ（サイズ２１８ｋｂ）及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物Ｉｂ：３４％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，０％のエチレンカーボネート，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ（サイズ２１８ｋｂ）及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物Ｉｃ：３４％のデキストラン硫酸，６００ｍＭのＮａＣｌ，１０ｍＭのリン酸バッファー，０％のエチレンカーボネート，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ（サイズ２１８ｋｂ）及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩａ：３２％のデキストラン硫酸，０ｍＭのＮａＣｌ，０ｍＭのリン酸バッファー，５％のエチレンカーボネート，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ（サイズ２１８ｋｂ）及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩｂ：３２％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，５％のエチレンカーボネート，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ（サイズ２１８ｋｂ）及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ．  
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩｃ：３２％のデキストラン硫酸，６００ｍＭのＮａＣｌ，１０ｍＭのリン酸バッファー，５％のエチレンカーボネート，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ（サイズ２１８ｋｂ）及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ．  
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩＩａ：３０％のデキストラン硫酸，０ｍＭのＮａＣｌ，０ｍＭのリン酸バッファー，１０％のエチレンカーボネート，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ（サイズ２１８ｋｂ）及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩＩｂ：３０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，１０％のエチレンカーボネート，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ（サイズ２１８ｋｂ）及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩＩｃ：３０％のデキストラン硫酸，６００ｍＭのＮａＣｌ，１０ｍＭのリン酸バッファー，１０％のエチレンカーボネート，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ（サイズ２１８ｋｂ）及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ．  
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＶａ：２８％デキストラン硫酸，０ｍＭのＮａＣｌ，０ｍＭのリン酸バッファー，１５％のエチレンカーボネート，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ（サイズ２１８ｋｂ）及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＶｂ：２８％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，１５％のエチレンカーボネート，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ（サイズ２１８ｋｂ）及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＶｃ：２８％のデキストラン硫酸，６００ｍＭのＮａＣｌ，１０ｍＭのリン酸バッファー，１５％のエチレンカーボネート，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ（サイズ２１８ｋｂ）及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ参照Ｖ：ブロッキングＰＮＡを含むＨＥＲ２ ＰｈａｒｍＤｘプローブミックス（Ｋ５３３１，Ｄａｋｏ）の標準販売バイアル。２０時間の一晩のハイブリダイゼーション。
全組成物は単一相として存在していた。ＦＩＳＨプローブを８２℃で５分間、ついで４５℃で６０分間、ブロッキングなしでインキュベートしたが、ＦＩＳＨプローブ参照Ｖは、ＰＮＡブロッキングし、２０時間ハイブリダイズした。
0006091753.tif 000019
【０１６５】
実施例１０
この実施例は、本発明の組成物で処理された試料からのシグナル強度を、高塩（４×正常）条件下で極性非プロトン溶媒及びデキストラン硫酸濃度の関数として比較する。  
ＦＩＳＨプローブ組成物Ｉ：０％のエチレンカーボネート，２９％のデキストラン硫酸，１２００ｍＭのＮａＣｌ，２０ｍＭのリン酸バッファー，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ。組成物は単一相であった。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩ：５％のエチレンカーボネート，２７％のデキストラン硫酸，１２００ｍＭのＮａＣｌ，２０ｍＭのリン酸バッファー，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ。組成物は単一相であった。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩＩ：１０％のエチレンカーボネート，２５％のデキストラン硫酸，１２００ｍＭのＮａＣｌ，２０ｍＭのリン酸バッファー，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ。組成物は単一相であった。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＶ（試験せず）：２０％のエチレンカーボネート，２１％のデキストラン硫酸，１２００ｍＭのＮａＣｌ，２０ｍＭのリン酸バッファー，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ。組成物は二つの相を有していた。
0006091753.tif 000020
【０１６６】
実施例１１
この実施例は、本発明の組成物の異なった相で処理した試料からのシグナル強度及びバックグラウンドを比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物：１０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のエチレンカーボネート，８ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ及び６００ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−１７ ＰＮＡプローブ。ＦＩＳＨプローブを８２℃で５分間、ついで４５℃で６０分間、インキュベートした。ブロッキングなし。
0006091753.tif 000021
【０１６７】
実施例１２
この実施例は前の実施例と同様であるが、異なったＤＮＡプローブ及びＥＣの代わりにＧＢＬを使用している。
ＦＩＳＨプローブ組成物：１０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のＧＢＬ，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ及び６００ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−１７ ＰＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブを８２℃で５分間、ついで４５℃で６０分間、インキュベートした。ブロッキングなし。
0006091753.tif 000022
【０１６８】
実施例１３
この実施例は、本発明の組成物中の相の数を、極性非プロトン溶媒及びデキストラン硫酸濃度の関数として調べる。
ＦＩＳＨプローブ組成物：１０又は２０％のデキストラン硫酸；３００ｍＭのＮａＣｌ；５ｍＭのリン酸バッファー；０、５、１０、１５、２０、２５、３０％のＥＣ；１０ｎｇ／μＬのプローブ．  
0006091753.tif 000023
【０１６９】
実施例１４
この実施例は、本発明の異なった組成物で処理した試料からのシグナル強度及びバックグラウンドをプローブ濃度及びハイブリダイゼーション時間の関数として比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物Ｉ：１０ｎｇ／μＬのＨＥＲ２ ＴｘＲｅｄ標識ＤＮＡプローブ（標準濃度）及び標準濃度のＣＥＮ７ ＦＩＴＣ標識ＰＮＡプローブ（５０ｎＭ）；１５％のＥＣ；２０％のデキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのリン酸バッファー。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩ：５ｎｇ／μＬのＨＥＲ２ ＴｘＲｅｄ標識ＤＮＡプローブ（標準濃度の１／２）及び標準濃度（５０ｎＭ）のＦＩＴＣ標識ＣＥＮ７ ＰＮＡプローブ；１５％のＥＣ；２０％のデキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのリン酸バッファー。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩＩ：２．５ｎｇ／μＬのＨＥＲ２ ＴｘＲｅｄ標識ＤＮＡプローブ（標準濃度の１／４）及び１／２の標準濃度（２５ｎＭ）のＣＥＮ７ ＰＮＡプローブ；１５％のＥＣ；２０％のデキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのリン酸バッファー。
組成物Ｉ−ＩＩＩは単一相として存在していた。ＦＩＳＨプローブを８２℃で５分間、ついで４５℃で３時間、２時間及び１時間、インキュベートした。
0006091753.tif 000024
【０１７０】
実施例１５
この実施例は、本発明の組成物で処理された試料からのシグナル強度及びバックグラウンドを、ブロッキング剤の関数として比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物：１５％のＥＣ；２０％のデキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのリン酸バッファー；２．５ｎｇ／μＬのＨＥＲ２ ＴｘＲｅｄ標識ＤＮＡプローブ（標準濃度の１／４）及び標準濃度の１／２の（３００ｎＭ）ＦＩＴＣ標識ＣＥＮ１７ ＰＮＡプローブ。試料は、本発明の組成物を使用するハイブリダイゼーション前に、（ａ）なし；（ｂ）０．１μｇ／μＬのＣＯＴ１（１５２７９−０１１，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；（ｃ）０．３μｇ／μＬのＣＯＴ１；又は（ｄ）０．１μｇ／μＬの全ヒトＤＮＡでブロックした。
全ての試料は単一相として存在していた。ＦＩＳＨプローブを８２℃で５分間、ついで４５℃で６０分、インキュベートした。
0006091753.tif 000025
【０１７１】
実施例１６
この実験は、本発明の組成物を使用してバックグラウンド染色を除去する異なった方法を比較する。
全ての組成物は、１５％のＥＣ、２０％のデキストラン硫酸、６００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのリン酸バッファー、２．５ｎｇ／μＬのＨＥＲ２ ＤＮＡプローブ（標準濃度の１／４）、３００ｎＭのＣＥＮ１７ ＰＮＡプローブ（標準濃度の１／２）、及び次のバックグラウンド低減剤の一つを含んでいた：
Ａ）５ｍＭのブロッキング−ＰＮＡ（Kisrsten Vang Nielsen等, PNA Suppression Method Combined with Fluorescence In Situ Hybridisation (FISH) Technique inPRINS and PNA Technologies in Chromosomal Investigation, Chapter 10 (Franck Pellestor編）  (Nova Science Publishers, Inc. 2006)を参照）
Ｂ）０．１μｇ／μＬのＣＯＴ−１ ＤＮＡ
Ｃ）０．１μｇ／μＬの全ヒトＤＮＡ（ＴＨＤ）（超音波処理未標識ＴＨＤ）
Ｄ）０．１μｇ／μＬの剪断サケ精液  ＤＮＡ（ＡＭ９６８０，Ａｍｂｉｏｎ）
Ｅ）０．１μｇ／μＬのウシ胸腺  ＤＮＡ（Ｄ８６６１，Ｓｉｇｍａ）
Ｆ）０．１μｇ／μＬのニシン精液ＤＮＡ（Ｄ７２９０，Ｓｉｇｍａ）
Ｇ）０．５％のホルムアミド
Ｈ）２％のホルムアミド
Ｉ）１％のエチレングリコール（１．０９６２１，Ｍｅｒｃｋ）
Ｊ）１％のグリセロール（１．０４０９５，Ｍｅｒｃｋ）
Ｋ）１％の１，３−プロパンジオール（５３３７３４，Ａｌｄｒｉｃｈ）
Ｌ）１％のＨ２Ｏ（コントロール）
全ての試料は単一相として存在していた。プローブを８２℃で５分間、ついでＦＦＰＥ組織片上で４５℃で６０分及び１２０分、インキュベートした。
0006091753.tif 000026
【０１７２】
実施例１７  
この実験は、二つの異なった極性非プロトン溶媒を使用する上相及び下相からのシグナル強度を比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物Ｉ：１０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のエチレントリチオカーボネート（ＥＴ）（Ｅ２７７５０，Ａｌｄｒｉｃｈ），５μＭのブロッキングＰＮＡｓ，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩ：１０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のグリコールサルファイト（ＧＳ）（Ｇ７２０８，Ａｌｄｒｉｃｈ），５μＭのブロッキングＰＮＡｓ，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブを８２℃で５分間、ついで４５℃で６０分、インキュベートした。
0006091753.tif 000027
【０１７３】
実施例１８
この実験は一相系を形成する様々な極性非プロトン溶媒の能力を調べる。
全ての組成物は、２０％のデキストラン硫酸、６００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのリン酸バッファー、及び１０、１５、２０、又は２５％の次の極性非プロトン溶媒の一つを含んでいた：
スルホラン
γ−ブチロラクトン
エチレントリチオカーボネート
グリコールサルファイト  
プロピレンカーボネート
結果：  調べた全ての濃度で極性非プロトン溶媒の全てが使用された組成物において少なくとも２相系をつくり出した。しかしながら、これは、これらの化合物が他の組成物条件下で一相系をつくることができることを排除しない。
【０１７４】
実施例１９
この実験は、複数のＦＦＰＥ組織切片に対する発色性インサイツハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）解析における本発明の組成物の使用を調べる。
ＦＩＳＨプローブ組成物Ｉ：４．５ｎｇ／μＬのＴＣＲＡＤ ＦＩＴＣ標識遺伝子ＤＮＡプローブ（標準濃度の１／４）（ＲＰ１１−６５４Ａ２，ＲＰ１１−２４６Ａ２，ＣＴＰ−２３５５Ｌ２１，ＲＰ１１−１５８Ｇ６，ＲＰ１１−７８０Ｍ２，ＲＰ１１−４８１Ｃ１４；サイズ１０１８ｋｂ）；１５％のＥＣ；２０％のデキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．０。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩ：４．５ｎｇ／μＬのＴＣＲＡＤ ＦＩＴＣ標識遺伝子ＤＮＡプローブ（標準濃度の１／４）（サイズ１０１８ｋｂ）；１５％のＥＣ；２０％のデキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．０；０．１ｕｇ／ｕＬの剪断サケＤＮＡ精子。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩＩ：３００ｎＭの各個々のＦＩＴＣ標識ＰＮＡ ＣＥＮ１７プローブ（標準濃度の１／２）；１５％のＥＣ；２０％のデキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．０。
全ての試料は、Ｄａｋｏ ＤｕｏＣＩＳＨプロトコル（ＳＫ１０８）及びスプリットプローブの組成物を使用して分析したが、但し、ストリンジェントな洗浄を１０分の代わりに２０分間実施され、ＤｕｏＣＩＳＨレッド色素原工程は使用しなかった。
0006091753.tif 000028
【０１７５】
実施例２０  
この実施例は、二つのＤＮＡプローブを持つ本発明の組成物で処理されたＦＦＰＥ組織切片からのシグナル強度及びバックグラウンドを比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物Ｉ：９ｎｇ／μＬのＩＧＨ ＦＩＴＣ標識遺伝子ＤＮＡプローブ（ＲＰ１１−１５１Ｂ１７，ＲＰ１１−１１２Ｈ５，ＲＰ１１−１０１Ｇ２４，ＲＰ１１−１２Ｆ１６，ＲＰ１１−４７Ｐ２３，ＣＴＰ−３０８７Ｃ１８；サイズ６１２ｋｂ）；６．４ｎｇ／μＬのＭＹＣ ＴｘＲｅｄ標識ＤＮＡプローブ（ＣＴＤ−２１０６Ｆ２４，ＣＴＤ−２１５１Ｃ２１，ＣＴＤ−２２６７Ｈ２２；サイズ４１８ｋｂ）；１５％のＥＣ；２０％のデキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．０。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩ：９ｎｇ／μＬのＩＧＨ ＦＩＴＣ標識遺伝子ＤＮＡプローブ；６．４ｎｇのＭＹＣ ＴｘＲｅｄ標識ＤＮＡプローブ；１５％のＥＣ、２０％のデキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．０；０．１ｕｇ／ｕＬの剪断サケ精液ＤＮＡ。
0006091753.tif 000029
【０１７６】
実施例２１
この実験は細胞試料での本発明の組成物の使用を調べる。
ＦＩＳＨプローブ組成物：１５％のＥＣ；２０％のデキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのリン酸バッファー；５ｎｇ／μＬのＨＥＲ２ ＴｘＲｅｄ標識ＤＮＡプローブ（標準濃度の１／２）及び１／２の標準濃度のＣＥＮ７（２５ｎＭ）。
ＦＩＳＨプローブを、全てブロッキングなしで、分裂中期染色体スプレッド上で８２℃で５分間、ついで４５℃で３０分間、インキュベートした。
0006091753.tif 000030
典型的にはＲバンド形成を示す伝統的なＩＳＨ溶液と比較して、本発明の組成物では、染色体バンド形成（Ｒバンド形成パターン）は観察されなかった。静止期核及び分裂中期の低い均質な赤いバックグラウンド染色が観察された。
【０１７７】
実施例２２  
この実施例は、細胞診試料、分裂中期スプレッド上での、ブロッキングを伴い、またブロッキングなしでの、ＤＮＡプローブからのシグナル強度及びバックグラウンドを比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物Ｉ：６ｎｇ／μＬのＴＣＲＡＤテキサスレッド標識遺伝子ＤＮＡプローブ（標準濃度）（ＣＴＰ−３１６６６Ｋ２０，ＣＴＰ−２３７３Ｎ７；サイズ３０１ｋｂ）及び４．５ｎｇ／μＬのＦＩＴＣ標識遺伝子ＤＮＡプローブ（標準濃度の１／４）；  １５％ＥＣ、２０％デキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．０。  
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩ：６ｎｇ／μＬ  ＴＣＲＡＤ  テキサスレッド標識遺伝子ＤＮＡプローブ（標準濃度）（サイズ３０１ｋｂ）及び４．５  ｎｇ／μＬ  ＦＩＴＣ標識遺伝子ＤＮＡプローブ（標準濃度の１／４）；１５％ＥＣ、２０％デキストラン硫酸；  ６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．０；０．１ｕｇ／ｕＬの剪断サケ精液ＤＮＡ。
ＦＩＳＨプローブを８２℃で５分間、ついで４５℃で６０分、インキュベートした。
0006091753.tif 000031
再び、染色体バンド（Ｒ−バンドパターン）は本発明の組成物では観察されなかった。加えて、静止期核又は分裂中期染色体のバックグラウンド染色は観察されなかった。
【０１７８】
実施例２３
この実施例はハイブリダイゼーション前のプローブ及び試料の共変性を含む実験と、ハイブリダイゼーション前のプローブ及び検体の別々の変性を含む実験に対して、シグナル強度及びバックグランドを比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物：２．５ｎｇ／μＬのＨＥＲ２テキサスレッド標識ＤＮＡプローブ（標準濃度の１／４）及び標準濃度の１／２（３００ｎＭ）のＣＥＮ１７ ＰＮＡプローブ；１５％ＥＣ，２０％デキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．０。
検体変性組成物：１５％ＥＣ，２０％デキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．０。
変性は表に示した通りに５分実施した。ハイブリダイゼーションは４５℃で６０分実施した。参照試料では、ＦＩＳＨプローブ及び組織を一緒に変性させた。
0006091753.tif 000032
これらの結果は、バックグランド染色は変性が検体及びプローブにおいて別々に実施された場合に、より低いことを示している。バックグランド染色はまた変性が試料及びプローブにおいて別々に実施された場合に、より一層均質であることを示している（データ示さず）。
【０１７９】
実施例２４
この実施例はハイブリダイゼーション前のプローブ及び検体の共変性を含む実験と、ハイブリダイゼーション前のプローブ及び検体の別々の変性を含む実験に対して、シグナル強度及びバックグランドを比較する。
検体変性組成物Ｉ：１５％ＥＣ，１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．０
検体変性組成物ＩＩ：２０％ＥＣ，１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．０
検体変性組成物ＩＩＩ：２５％ＥＣ，１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．０
検体変性組成物ＩＶ：３０％ＥＣ，１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．０
検体変性組成物Ｖ：４０％ＥＣ，１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．０
検体変性組成物ＶＩ：４０％ＥＣ
検体変性組成物ＶＩＩ：１５％ＥＣ，２０％デキストラン硫酸，６００ｍＭのＮａＣｌ，１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．０
上記の６つ全てのバッファー組成物は室温で一相である。
ＦＩＳＨプローブ組成物：２．５ｎｇ／μＬのＨＥＲ２テキサスレッド標識ＤＮＡプローブ（標準濃度の１／４）及び１／２の濃度（３００ｎＭ）のＣＥＮ１７ ＰＮＡプローブ；１５％ＥＣ，２０％デキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．０。
プローブバッファーは８２℃で５分間変性させた。組織試料は異なる試料変性組成物により８２℃で５分間変性させた。
スライドを、最初の脱水工程まで上記のように前処理した。試料がペプシンにより消化された後、スライドを２×３分洗浄し、検体変性組成物の一つを２００μＬ加えた。ついで、スライドをカバーガラスで覆い、ハイブリダイザー（Ｄａｋｏ）で８２℃５分インキュベートした。ついでカバーガラスを外し、スライドを、２×ＳＳＣで洗浄した検体変性組成物Ｉ＊のスライドを除いて、洗浄バッファーで２×３分間洗浄した。ついでスライドを９６％エタノール中で２分間脱水し、空気乾燥した。
ＦＩＳＨプローブはヒートブロック上にて１．５ｍＬ遠心チューブ中で８２℃で５分間変性させ、氷上に配した。１０μＬの変性ＦＩＳＨプローブを、変性した脱水検体に添加し、スライドをカバーガラスで覆い密封し、ついで４５℃で６０分間ハイブダイズした。ハイブリダイゼーションの後、検体を上記のように処理した。
参照試料中、ＦＩＳＨプローブ及び組織は一緒に変性させた。
【０１８０】
結果：
0006091753.tif 000033
これらの結果は、試料及びプローブの別々の変性はプローブ及び検体の共変性に比しバックグランドを著しく減少させることを示している。バックグランド染色はまたプローブ及び検体を共変性させた時よりもより均質である（データ示さず）。
【０１８１】
実施例２５
この実施例はハイブリダイゼーション前のプローブ及び検体の共変性を含む実験と、ハイブリダイゼーション前のプローブ及び検体の別々の変性を含む実験のシグナル強度及びバックグランドを比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物：２．５ｎｇ／μＬのＨＥＲ２テキサスレッド標識ＤＮＡプローブ（標準濃度の１／４）及び標準濃度の１／２（３００ｎＭ）のＣＥＮ１７ ＰＮＡプローブ；１５％ＥＣ，２０％デキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．０。
検体変性組成物：１５％ＥＣ，２０％デキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．０。
スライドを、最初の脱水工程まで上記のように前処理した。試料がペプシンにより消化された後、スライドを２×３分間洗浄し、検体変性組成物を２００μＬ加えた。ついで、スライドをカバーガラスで覆い、ハイブリダイザー（Ｄａｋｏ）で７２℃１０分間インキュベートした。ついでカバーガラスを外し、洗浄バッファーで２×３分間洗浄した。ついでスライドを９６％エタノール中で２分間脱水し、空気乾燥した。
ＦＩＳＨプローブ（１１μＬ分量）を、表に示した通りにヒートブロック上にて１．５ｍＬ遠心チューブ中で変性させ、ついて氷上に置いた。１０μＬの変性ＦＩＳＨプローブを変性した脱水検体に添加し、スライドをカバーガラスで覆い密封し、ついで４５℃で６０分間ハイブダイズした。ハイブリダイゼーションの後、検体を上記のように処理した。
【０１８２】
結果：
0006091753.tif 000034
これらの結果は、シグナル強度又はバックグランドに負の影響を与えること無しに、ＦＩＳＨプローブの変性温度を、例えば６２℃で１分間に下げることが可能であることを示している。
【０１８３】
実施例２６
この実施例はハイブリダイゼーション前のプローブ及び検体の共変性を含む実験と、ハイブリダイゼーション前のプローブ及び検体の別々の変性を含む実験のシグナル強度及びバックグランドを比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物Ｉ：２．５ｎｇ／μＬのＨＥＲ２テキサスレッド標識ＤＮＡプローブ（標準濃度の１／４）及び標準濃度の１／２（３００ｎＭ）のＣＥＮ１７ ＰＮＡプローブ；１５％ＥＣ，２０％デキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．２。
検体変性組成物ＩＩ：１５％ＥＣ，１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．２。
検体変性組成物ＩＩＩ： １５％ＥＣ，２０％デキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．０。
スライドを変性工程まで上記のように前処理した。試料を脱水した後、２００μＬの検体変性組成物を添加した。スライドをカバーガラスで覆い、ついで６７℃で１０分間、ハイブリダイザー（Ｄａｋｏ）でインキュベートした。ついでカバーガラスを外し、スライドを２×３分間洗浄し、９６％エタノール中で２分間脱水し、空気乾燥した。
ＦＩＳＨプローブをヒートブロック上にて１．５ｍＬ遠心チューブ中で６７℃で３分間変性させた後、直ちに使用した。１０μＬの変性ＦＩＳＨプローブを、変性された脱水検体に添加した。スライドをカバーガラスで覆い密封し、４５℃で６０分間ハイブダイズした。ハイブリダイゼーションの後、検体は上記のように処理した。
比較試料では、ＦＩＳＨプローブ及び組織を６７℃で１０分間一緒に変性させ、４５℃で６０分間ハイブリダイズさせた。
【０１８４】
結果：
0006091753.tif 000035
これらの結果は試料及びプローブの別々の変性はプローブ及び検体の共変性に比しバックグランドを著しく減少させることを示している。バックグランド染色はまたプローブ及び検体を共変性させた時よりもより均質である。バックグランド染色は変性バッファーがデキストラン硫酸又はＮａＣｌを含まないときよりもわずかに低い。
【０１８５】
実施例２７
この実施例はハイブリダイゼーション前のプローブ及び検体の共変性を含む実験と、プローブ及び検体を、ハイブリダイゼーション前の各々異なる変性剤による別々の変性を含む実験に対して、シグナル強度及びバックグランドを比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物Ｉ：４０％ホルムアミド，１０％デキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，５μＭのブロッキングＰＮＡ，１０ｎｇ／μＬのＨＥＲ２テキサスレッド標識ＤＮＡ遺伝子プローブ標準濃度（６００ｍＭ）のＣＥＮ１７ ＰＮＡプローブ。
検体変性組成物ＩＩ：４０％ホルムアミド，１０％デキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，５μＭのブロッキングＰＮＡ。
検体変性組成物ＩＩＩ：１５％ＥＣ，１０ｍＭクエン酸バッファー、ｐＨ６．２。
スライドを変性工程まで上記のように前処理した。試料を脱水した後、１００μＬの検体変性組成物を添加した。スライドをカバーガラスで覆いハイブリダイザー（Ｄａｋｏ）で示した通りにインキュベートした。ついでカバーガラスを外し、スライドを２×３分間洗浄し、９６％エタノール中で２×３分間脱水し、空気乾燥した。
ＦＩＳＨプローブはヒートブロック上にて１．５ｍＬ遠心チューブ中で８２℃で５分間変性させた後、直ちに使用した。１０μＬの変性ＦＩＳＨプローブを、変性した脱水検体に添加した。スライドをカバーガラスで覆い密封し、ついで４５℃で一晩（約２０時間）ハイブダイズした。ハイブリダイゼーションの後、検体を上記のように処理された。
比較試料では、ＦＩＳＨプローブ及び組織を、示した通りに一緒に変性させ、４５℃で一晩（約２０時間）ハイブリダイズさせた。
【０１８６】
結果：
0006091753.tif 000036
これらの結果は、ホルムアミドによるプローブ及び検体の共変性と比較したとき、ＥＣによる試料の別々の変性は等価な染色バックグランド及びシグナル強度を提供することを示している。ＤＮＡシグナルは、しかし、より低い変性温度ではホルムアミド（ＩＩ）よりもＥＣ（ＩＩＩ）の方が僅かに強い。バックグランド染色は検体組成物ＩＩ（ホルミアミド）よりも検体組成物ＩＩＩ（ＥＣ）による方が低い。別々の及び共変性の双方において６７℃／１０分間での変性に対して最良の結果が、参照と同等の結果を生み出した組成物ＩＩＩ（ＥＣ）を使用する別々の変性において得られた。
【０１８７】
実施例２８
この実施例はハイブリダイゼーション前にプローブ及び検体を別々に変性させることを含む実験において、シグナル強度及びバックグランドを比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物Ｉ：３．３ｎｇ／μＬのＨＥＲ２テキサスレッド標識ＤＮＡプローブ（標準濃度の１／３）及び標準濃度の１／２（３００ｎＭ）のＣＥＮ１７ ＰＮＡプローブ；１５％ＥＣ（Ｅ２６２５８，Ａｌｄｒｉｃｈ−Ｓｉｇｍａ），２０％デキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．２。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩ：３．３ｎｇ／μＬのＨＥＲ２テキサスレッド標識ＤＮＡプローブ（標準濃度の１／３）及び標準濃度の１／２（３００ｎＭ）のＣＥＮ１７ ＰＮＡプローブ；１５％ＳＬ，２０％デキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．２。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩＩ：３．３ｎｇ／μＬのＨＥＲ２テキサスレッド標識ＤＮＡプローブ（標準濃度の１／３）及び標準濃度の１／２（３００ｎＭ）のＣＥＮ１７ ＰＮＡプローブ；１５％ＰＣ，２０％デキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．２。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＶ：３．３ｎｇ／μＬのＨＥＲ２テキサスレッド標識ＤＮＡプローブ（標準濃度の１／３）及び標準濃度の１／２（３００ｎＭ）のＣＥＮ１７ ＰＮＡプローブ；１５％ＧＢＬ，２０％デキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．２。
ＦＩＳＨプローブ組成物Ｖ：３．３ｎｇ／μＬのＨＥＲ２テキサスレッド標識ＤＮＡプローブ（標準濃度の１／３）及び標準濃度の１／２（３００ｎＭ）のＣＥＮ１７ ＰＮＡプローブ；１５％ホルムアミド，２０％デキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．２。
検体変性組成物ＶＩ：１５％ＥＣ，１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．２。
検体変性組成物ＶＩＩ：１５％ＳＬ，１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．２。
検体変性組成物ＶＩＩＩ：１５％ＰＣ，１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．２。
検体変性組成物ＩＸ：１５％ＧＢＬ，１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．２。
検体変性組成物Ｘ：１５％ホルムアミド，１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．２。
スライドを変性工程まで上記のように前処理した。試料を脱水した後、２００μＬの検体変性組成物を添加した。スライドをカバーガラスで覆い、ハイブリダイザー（Ｄａｋｏ）で６７℃で１０分間インキュベートした。ついでカバーガラスを外し、スライドを２×３分間洗浄し、９６％エタノール中で２分間脱水し、空気乾燥した。
ＦＩＳＨプローブはヒートブロック上にて１．５ｍＬ遠心チューブ中で６７℃で５分間変性させた後、直ちに使用した。１０μＬの変性ＦＩＳＨプローブを、変性した脱水検体に添加した。スライドをカバーガラスで覆い密封し、ついで４５℃で６０分間ハイブダイズした。ハイブリダイゼーションの後、検体を上記のように処理した。
【０１８８】
0006091753.tif 000037
これらの結果は、ＥＣ、ＳＬ、ＰＣ及びＧＢＬによる変性は、短いハイブリダイゼーションインキュベーション時間（６０分）を使用するときに、ホルムアミドによる別々の変性と比較して、ＤＮＡプローブのより強いシグナル強度を与えることを示している。
【０１８９】
実施例２９
この実施例はハイブリダイゼーション前にプローブ及び検体を別々に変性させることを含む実験において、シグナル強度及びバックグランドを比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物Ｉ：３．３ｎｇ／μＬのＨＥＲ２テキサスレッド標識ＤＮＡプローブ（標準濃度の１／３）及び標準濃度の１／２（３００ｎＭ）のＣＥＮ１７ ＰＮＡプローブ；１５％ＥＣ（Ｅ２６２５８，Ａｌｄｒｉｃｈ−Ｓｉｇｍａ），２０％デキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．２。
検体変性組成物ＩＩ：１５％ＥＣ，１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．２。
検体変性組成物ＩＩＩ：１５％ＳＬ，１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．２。
検体変性組成物ＩＶ：１５％ＰＣ，１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．２。
検体変性組成物Ｖ：１５％ＧＢＬ，１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．２。
検体変性組成物ＶＩ：１５％ホルムアミド，１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．２。
スライドを変性工程まで上記のように前処理した。試料を脱水した後、２００μＬの検体変性組成物を添加した。スライドをカバーガラスで覆い、ハイブリダイザー（Ｄａｋｏ）で６７℃で１０分間インキュベートした。ついでカバーガラスを外し、スライドを２×３分間洗浄し、９６％エタノール中で２分間脱水し、空気乾燥した。
ＦＩＳＨプローブはヒートブロック上にてチューブ中で６７℃で５分間変性させ、直ちに使用した。１０μＬの変性ＦＩＳＨプローブを、変性した脱水検体に添加した。スライドをカバーガラスで覆い密封し、ついで４５℃で６０分間ハイブダイズした。ハイブリダイゼーションの後、検体を上記のように処理した。
【０１９０】
0006091753.tif 000038
これらの結果は、ＥＣ（ＩＩ）、ＳＬ（ＩＩＩ）、ＰＣ（ＩＶ）、ＧＢＬ（Ｖ）及びホルムアミド（ＶＩ）による別々の組織変性は、極性非プロトンベースのプローブバッファー（Ｉ）及び短いハイブリダイゼーションインキュベーション時間（６０分）を使用するときに、等価な染色バックグランド及びシグナル強度を与えることを示している。
【０１９１】
実施例３０
この実施例はハイブリダイゼーション前にプローブ及び検体を別々に変性させることを含む実験において、シグナル強度及びバックグランドを比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物Ｉ（Ｋ５３３１，Ｄａｋｏ）：４０％ホルムアミド，１０％デキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，５μＭのブロッキングＰＮＡ，１０ｎｇ／μＬのＨＥＲ２テキサスレッド標識ＤＮＡ遺伝子プローブ標準濃度（６００ｍＭ）のＣＥＮ１７ ＰＮＡプローブ。
検体変性組成物ＩＩ：１５％ＥＣ，１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．２。
検体変性組成物ＩＩＩ：１５％ＳＬ，１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．２。
検体変性組成物ＩＶ：１５％ＰＣ，１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．２。
検体変性組成物Ｖ：１５％ＧＢＬ，１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．２。
検体変性組成物ＶＩ：１５％ホルムアミド，１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．２。
スライドを変性工程まで上記のように前処理した。試料を脱水した後、２００μＬの検体変性組成物を添加した。スライドをカバーガラスで覆いハイブリダイザー（Ｄａｋｏ）で６７℃で１０分間インキュベートした。ついでカバーガラスを外し、スライドを２×３分間洗浄し、９６％エタノール中で２分間脱水し、空気乾燥した。
ＦＩＳＨプローブはヒートブロック上にてチューブ中で８２℃で５分間変性させ、直ちに使用した。１０μＬの変性ＦＩＳＨプローブを、変性した脱水検体に添加した。スライドをカバーガラスで覆い密封し、ついで４５℃で一晩ハイブダイズした。ハイブリダイゼーションの後、検体を上記のように処理した。
【０１９２】
0006091753.tif 000039
これらの結果は、ＥＣ（ＩＩ）、ＳＬ（ＩＩＩ）、ＰＣ（ＩＶ）及びＧＢＬ（Ｖ）による別々の組織変性は、ホルムアミド（ＶＩ）による別々の組織変性と比較して、等価又はより良いシグナル強度を与えることを示している。このことは、予め変性させた伝統的なホルミアミドを基にしたプローブ（Ｉ）及び長いハイブリダイゼーションインキュベーション時間（約２０時間）を使用するときにも当てはまった。バックグランド染色も同等であった。
【０１９３】
更なる実施態様
実施態様１．  核酸配列をハイブリダイズさせる方法において、
−  第一の核酸配列を、二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるのに有効な量の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒を含有する第一の水性組成物と組み合わせ、
−  第二の核酸配列を、二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるのに有効な量の少なくとも変性剤を含有する第二の水性組成物と組み合わせ、
−  第一及び第二の核酸配列を第一及び第二の核酸配列をハイブリダイズさせるのに少なくとも十分な時間の間組み合わせる
ことを含み、ここで極性非プロトン溶媒はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）では無い方法。
実施態様２．  核酸配列をハイブリダイズさせる方法において、
−  第一の核酸配列を、二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるのに有効な量の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒を含有する第一の水性組成物と組み合わせ、
−  上記第一の核酸配列を、第二の核酸配列と二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるのに効果的な量の少なくとも一種の変性剤を含有する第二の水性組成物と、第一及び第二の核酸配列をハイブリダイズさせるのに少なくとも十分な時間の間、組み合わせる
ことを含み、ここで極性非プロトン溶媒はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）では無い方法。
実施態様３．  核酸配列をハイブリダイズさせる方法において、
−  第一の核酸配列を、二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるのに有効な量で少なくとも一種の極性非プロトン溶媒を含有する第一の水性組成物と組み合わせ、
−  上記第一の核酸配列を、第一及び第二核酸配列をハイブリダイズさせるのに少なくとも十分な時間の間、第二の核酸配列と組み合わせる
ことを含み、ここで極性非プロトン溶媒はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）では無い方法。
実施態様４．  第二の水性組成物中の変性剤が極性非プロトン溶媒である実施態様１又は２に記載の方法。
実施態様５．  第一の核酸配列が生物学的試料中にある実施態様１から４のいずれか一つに記載の方法。
実施態様６．  生物学的試料は細胞学又は組織学の試料である実施態様５に記載の方法。
実施態様７．  第一の核酸配列が一本鎖配列であり及び第二の核酸配列が二本鎖配列である実施態様１−６のいずれかに記載の方法。
実施態様８．  第一の核酸配列が二本鎖配列であり及び第二の核酸配列が一本鎖配列である実施態様１−６のいずれかに記載の方法。
実施態様９．  第一及び第二の核酸配列が二本鎖配列である実施態様１−６のいずれかに記載の方法。
実施態様１０．  第一及び第二の核酸配列が一本鎖配列である実施態様１−６のいずれかに記載の方法。
実施態様１１．  第一及び第二の核酸配列を変性させるのに十分な量のエネルギーが提供される実施態様１−１０のいずれかに記載の方法。
実施態様１２．  第一の核酸配列を変性させるのに十分な量のエネルギーが提供される実施態様１−１１のいずれかに記載の方法。
実施態様１３．  第二の核酸配列を変性させるのに十分な量のエネルギーが提供される実施態様１−１２のいずれかに記載の方法。
実施態様１４．  エネルギーが組成物を加熱することで提供される実施態様１１−１３に記載の方法。
実施態様１５．  加熱工程が、マイクロ波、温浴、熱板、熱線、ペルチェ素子、誘導加熱又は加熱ランプの使用によって実施される実施態様１４に記載の方法。
実施態様１６．  第一の核酸を変性させる温度が７０℃から８５℃である実施態様１２−１５のいずれか一項に記載の方法。
実施態様１７．  第二の核酸を変性させる温度が７０℃から８５℃である実施態様１２−１６のいずれか一項に記載の方法。
実施態様１８．  第一の核酸を変性させる温度が６０℃から７５℃である実施態様１２−１５のいずれか一項に記載の方法。
実施態様１９．  第二の核酸を変性させる温度が６０℃から７５℃である実施態様１２−１５又は１８のいずれか一項に記載の方法。
実施態様２０．  第一の核酸を変性させる温度が６２℃、６７℃、７２℃又は８２℃である実施態様１２−１５のいずれか一項に記載の方法。
実施態様２１．  第二の核酸を変性させる温度が６２℃、６７℃、７２℃又は８２℃である実施態様１２−１５又は２０のいずれか一項に記載の方法。
実施態様２２．  第一の核酸を変性させるのに十分な時間が提供される実施態様１−２１のいずれか一項に記載の方法。
実施態様２３．  第二の核酸を変性させるのに十分な時間が提供される実施態様１−２２のいずれか一項に記載の方法。
実施態様２４．  時間は１分、２分、３分、４分、５分、１０分、１５分、又は３０分である実施態様２２又は２３に記載の方法。
実施態様２５．  ハイブリダイジング工程が組成物を加熱し冷却する工程を含む実施態様１−２４のいずれか一項に記載の方法。
実施態様２６．  ハイブリダイゼーション工程が８時間未満を要する実施態様１−２５のいずれか一項に記載の方法。
実施態様２７．  ハイブリダイゼーション工程が１時間未満を要する実施態様２６に記載の方法。
実施態様２８．  ハイブリダイゼーション工程が３０分未満を要する実施態様２７に記載の方法。
実施態様２９．  ハイブリダイゼーション工程が１５分未満を要する実施態様２８に記載の方法。
実施態様３０．  ハイブリダイゼーション工程が５分未満を要する実施態様２９に記載の方法。
実施態様３１．  ブロッキング工程を更に含む実施態様１−３０のいずれか一項に記載の方法。
実施態様３２．  水性組成物中の極性非プロトン溶媒の濃度が約１％から９５％（ｖｖ）である実施態様１−３１の何れか一に記載の方法。
実施態様３３．  極性非プロトン溶媒の濃度が５％から１０％（ｖｖ）である実施態様３２に記載の方法。
実施態様３４．  極性非プロトン溶媒の濃度が１０％から２０％（ｖｖ）である実施態様３２に記載の方法。
実施態様３５．  極性非プロトン溶媒の濃度が２０％から３０％（ｖｖ）である実施態様３２に記載の方法。
実施態様３６．  水性組成物中の極性非プロトン溶媒が無毒性である実施態様１−３５の何れか一に記載の方法。
実施態様３７．  但し、水性組成物中の極性非プロトン溶媒はホルムアミドを含有しない実施態様１−３６の何れか一に記載の方法。
実施態様３８．  但し、水性組成物中の極性非プロトン溶媒は１０％未満のホルムアミドを含有する実施態様１−３６の何れか一に記載の方法。
実施態様３９．  但し、水性組成物は２％未満のホルムアミドを含有する実施態様３８に記載の方法。
実施態様４０．  但し、水性組成物は１％未満のホルムアミドを含有する実施態様３９に記載の方法。
実施態様４１．  水性組成物中の極性非プロトン溶媒は、ラクトン、スルホン、ニトリル、サルファイト、及び／又はカーボネートの官能性を有する実施態様１−４０の何れか一に記載の方法。
実施態様４２．  水性組成物中の極性非プロトン溶媒が、１７．７から２２．０ＭＰａ１／２の範囲の分散溶解度パラメータ、１３から２３ＭＰａ１／２の範囲の極性溶解度パラメータ、及び３から１３ＭＰａ１／２の範囲の水素結合溶解度パラメータを有する実施態様１−４１の何れか一に記載の方法。
実施態様４３．  水性組成物中の極性非プロトン溶媒が環状塩基構造を有する実施態様１−４２の何れか一に記載の方法。
実施態様４４．  水性組成物中の極性非プロトン溶媒が
0006091753.tif 000040
（ここで、ＸがＯであり、Ｒ１がアルキルジイルである）、及び
0006091753.tif 000041
（ここで、Ｘは任意であり、存在する場合は、Ｏ又はＳから選択され、
Ｚは任意であり、存在する場合は、Ｏ又はＳから選択され、
Ａ及びＢは独立してＯ又はＮ又はＳ又はアルキルジイルの一部又は第１級アミンであり、
Ｒはアルキルジイルであり、
ＹはＯ又はＳ又はＣである）
からなる群から選択される実施態様１−４３の何れか一に記載の方法。
実施態様４５．  水性組成物中の極性非プロトン溶媒が、アセトアニリド、アセトニトリル、Ｎ−アセチルピロリドン、４−アミノピリジン、ベンズアミド、ベンズイミダゾール、１，２，３−ベンゾトリアゾール、ブタジエンジオキシド、２，３−ブチレンカーボネート、γ−ブチロラクトン、カプロラクトン（イプシロン）、クロロ無水マレイン酸、２−クロロシクロヘキサノン、クロロエチレンカーボネート、クロロニトロメタン、無水シトラコン酸、クロトンラクトン、５−シアノ−２−チオウラシル、シクロプロピルニトリル、硫酸ジメチル、ジメチルスルホン、１，３−ジメチル−５−テトラゾール、１，５−ジメチルテトラゾール、１，２−ジニトロベンゼン、２，４−ジニトロトルエン、ジフェイニルスルホン、１，２−ジニトロベンゼン、２，４−ジニトロトルエン、ジフェイニルスルホン、イプシロン−カプロラクタム、エタンスルホニルクロリド、エチルエチルホスフィネート、Ｎ−エチルテトラゾール、エチレンカーボネート、エチレントリチオカーボネート、エチレングリコールサルフェート、グリコールサルファイト、フルフラール、２−フロニトリル、２−イミダゾール、イサチン、イソキサゾール、マロノニトリル、４−メトキシベンゾニトリル、１−メトキシ−２−ニトロベンゼン、メチルαブロモテトロネート、１−メチルイミダゾール、Ｎ−メチルイミダゾール、３−メチルイソキサゾール、Ｎ−メチルモルホリン−Ｎ−オキシド、メチルフェニルスルホン、Ｎ−メチルピロリジノン、メチルスルホラン、メチル−４−トルエンスルホネート、３−ニトロアニリン、ニトロベンズイミダゾール、２−ニトロフラン、１−ニトロソ−２−ピロリジノン、２−ニトロチオフェン、２−オキサゾリジノン、９，１０−フェナントレンキノン、Ｎ−フェニルシドノン、無水フタル酸、ピコリノニトリル（２−シアノピリジン）、１，３−プロパンスルトン、β−プロピオラクトン、プロピレンカーボネート、４Ｈ−ピラン−４−チオン、４Ｈ−ピラン−４−オン（γ−ピロン）、ピリダジン、２−ピロリドン、サッカリン、スクシノニトリル、スルファニルアミド、スルホラン、２，２，６，６−テトラクロロシクロヘキサノン、テトラヒドロチアピランオキシド、テトラメチレンスルホン（スルホラン）、チアゾール、２−チオウラシル、３，３，３−トリクロロプロペン、１，１，２−トリクロロプロペン、１，２，３−トリクロロプロペン、トリメチレンスルフィド−ジオキシド、及びトリメチレンサルファイトからなる群から選択される実施態様１−４４の何れか一に記載の方法。
実施態様４６．  水性組成物中の極性非プロトン溶媒が、
0006091753.tif 000042
からなる群から選択される実施態様１−４４の何れか一に記載の方法。
実施態様４７．  水性組成物中の極性非プロトン溶媒が、
0006091753.tif 000043
である実施態様１−４４の何れか一に記載の方法。
実施態様４８．  水性組成物が、緩衝剤、塩、促進剤、キレート剤、洗浄剤、及びブロッキング剤からなる群から選択される少なくとも一種の更なる成分を更に含む実施態様１−４７に記載の方法。
実施態様４９．  促進剤がデキストラン硫酸であり、塩がＮａＣｌ及び／又はホスフェートバッファーである実施態様４８に記載の方法。
実施態様５０．  デキストラン硫酸が５％から４０％の濃度で存在し、ＮａＣｌが０ｍＭから１２００ｍＭの濃度で存在し、及び／又はホスフェートバッファーが０ｍＭから５０ｍＭの濃度で存在する実施態様４９に記載の方法。
実施態様５１．  デキストラン硫酸が１０％から３０％の濃度で存在し、ＮａＣｌが３００ｍＭから６００ｍＭの濃度で存在し、及び／又はホスフェートバッファーが５ｍＭから２０ｍＭの濃度で存在する実施態様５０に記載の方法。
実施態様５２．  促進剤が、ホルムアミド、ＤＭＳＯ、グリセロール、プロピレングリコール、１，２−プロパンジオール、ジエチレングリコール、エチレングリコール、グリコール、及び１，３プロパンジオールからなる群から選択され、緩衝剤がクエン酸バッファーである実施態様４８に記載の方法。
実施態様５３．  ホルムアミドが０．１−５％の濃度で存在し、ＤＭＳＯが０．０１％〜１０％の濃度で存在し、グリセロール、プロピレングリコール、１，２−プロパンジオール、ジエチレングリコール、エチレングリコール、グリコール、及び１，３プロパンジオールが０．１％から１０％の濃度で存在し、クエン酸バッファーが１ｍＭから５０ｍＭの濃度で存在する実施態様５２に記載の方法。
実施態様５４．  ブロッキング剤が、全ヒトＤＮＡ、ニシン精液ＤＮＡ、サケ精液ＤＮＡ、及びウシ胸腺ＤＮＡからなる群から選択される実施態様４８に記載の方法。
実施態様５５．  全ヒトＤＮＡ、ニシン精液ＤＮＡ、サケ精液ＤＮＡ、及びウシ胸腺ＤＮＡが０．０１から１０μｇ／μＬの濃度で存在する実施態様５４に記載の方法。
実施態様５６．  水性組成物が４０％の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒、１０％のデキストラン硫酸、３００ｍＭのＮａＣｌ、及び／又は５ｍＭのホスフェートバッファーを含有する実施態様４８に記載の方法。
実施態様５７．  水性組成物が１５％の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒、２０％のデキストラン硫酸、６００ｍＭのＮａＣｌ、及び／又は１０ｍＭのホスフェートバッファー含有する実施態様４８に記載の方法。
実施態様５８．  水性組成物が１５％の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒、２０％のデキストラン硫酸、６００ｍＭのＮａＣｌ、及び１０ｍＭのクエン酸バッファーｐＨ６．２を含有する実施態様４８に記載の方法。
実施態様５９．  水性組成物が室温で一相を含む実施態様１−５８の何れか一に記載の方法。
実施態様６０．  水性組成物が室温で複数相を含む実施態様１−５８の何れか一に記載の方法。
実施態様６１．  水性組成物が室温で二相を含む実施態様６０に記載の方法。
実施態様６２．  水性組成物の相が混合される実施態様６０又は６１に記載の方法。
実施態様６３．  ハイブリダイゼーション用途における標的の別々の変性を実施するための水性組成物において、２本鎖ヌクレオチド配列を変性させるのに有効な量の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒を含有し、該極性非プロトン溶媒がジメチルスルホキサイド（ＤＭＳＯ）ではない組成物。
実施態様６４．  極性非プロトン溶媒の濃度が実施態様３２から３５の何れか一に記載の通りに定義される実施態様６３の水性組成物。
実施態様６５．  極性非プロトン溶媒が実施態様３６、又は４１から４７の何れか一に記載の通りに定義される実施態様６３又は６４の水性組成物。
実施態様６６．  水性組成物が実施態様３７から４０又は４８から６２の何れか一に記載の通りに定義される実施態様６１から６５の何れか一の水性組成物。
実施態様６７．  ハイブリダイゼーション用途における標的の別々の変性を実施するための、少なくとも一種の極性非プロトン溶媒を１％から９５％（ｖ／ｖ）含有する組成物の使用。
実施態様６８．  極性非プロトン溶媒の濃度が実施態様３２から３５の何れか一に記載の通りに定義される実施態様６７に記載の組成物の使用。
実施態様６９．  極性非プロトン溶媒が実施態様３６又は４１から４７の何れか一に記載の通りに定義される実施態様６７又は６８に記載の組成物の使用。
実施態様７０．  水性組成物が実施態様３７から４０又は４８から６２の何れか一に記載の通りに定義される実施態様６７から６９の何れか一に記載の組成物の使用。
実施態様７１．  ハイブリダイゼーションアッセイを実施するためのキットにおいて、
−  実施態様６３−６６の何れか一に記載の第一の水性組成物と、
−  少なくとも一の核酸配列を含んでなる第二の水性組成物
を含むキット。
実施態様７２．  第二の水性組成物が、二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるのに有効な量の少なくとも一種の変性剤を更に含有する実施態様７１に記載のキット。
実施態様７３．  第二の水性組成物中の変性剤が極性非プロトン溶媒である実施態様７２のキット。
実施態様７４．  第二の水性組成物中の極性非プロトン溶媒の濃度が実施態様３２から３５の何れか一に記載の通りに定義される実施態様７３のキット。
実施態様７５．  第二の水性組成物中の極性非プロトン溶媒が実施態様３６又は４１から４７の何れか一に記載の通りに定義される実施態様７３又は７４のキット。
実施態様７６．  第二の水性組成物が実施態様３７から４０又は４８から６２の何れか一に記載の通りに定義される実施態様７１から７５の何れか一のキット。
実施態様２−１．
核酸配列をハイブリダイズさせるインサイツの方法において、
−  二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるのに有効な量の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒を含有する第一の水性組成物中で第一の核酸配列を含む第一の二本鎖核酸配列を変性させ、
−  二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるのに有効な量の少なくとも変性剤を含有する第二の水性組成物中で第二の核酸配列を含む第二の二本鎖核酸配列を変性させ、
−  第一及び第二の核酸配列を、第一及び第二の核酸配列をハイブリダイズさせるために８時間未満少なくとも一の極性非プロトン溶媒を含有する水性組成物中で組み合わせる
ことを含み、
ここで極性非プロトン溶媒はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）では無いインサイツの方法。
実施態様２−２．
第二の水性組成物中の変性剤が極性非プロトン溶媒である実施態様２−１に記載の方法。
実施態様２−３．
例えば前記第一及び／又は前記第二の核酸を変性させる時間が１分、２分、３分、４分、５分、１０分、１５分、又は３０分である実施態様２−１及び実施態様２−２の何れか一に記載の方法。
実施態様２−４．
ハイブリダイジングの工程が、組成物を加熱及び／又は冷却する工程を含み、例えばハイブリダイゼーションの工程が１時間未満、例えば３０分未満、例えば１５分未満、例えば５分未満を要する実施態様１−２から２−３の何れか一に記載の方法。
実施態様２−５．
水性組成物中の極性非プロトン溶媒の濃度が約１％から９５％（ｖ／ｖ）、例えば５％から１０％（ｖ／ｖ）、例えば１０％から２０％（ｖ／ｖ）、例えば２０％から３０％（ｖ／ｖ）である実施態様２−１から２−４の何れか一に記載の方法。
実施態様２−６．
水性組成物中の極性非プロトン溶媒が無毒性である実施態様２−１から２−５の何れか一に記載の方法。
実施態様２−７．
水性組成物中の極性非プロトン溶媒が、ラクトン、スルホン、ニトリル、サルファイト、及び／又はカーボネートの官能性を有する実施態様２−１から２−６の何れか一に記載の方法。
実施態様２−８．
水性組成物中の極性非プロトン溶媒が、１７．７から２２．０ＭＰａ１／２の範囲の分散溶解度パラメータ、１３から２３ＭＰａ１／２の範囲の極性溶解度パラメータ、及び３から１３ＭＰａ１／２の範囲の水素結合溶解度パラメータを有する実施態様２−１から２−７の何れか一に記載の方法。
実施態様２−９．
水性組成物中の極性非プロトン溶媒が
0006091753.tif 000044
（ここで、ＸがＯであり、Ｒ１がアルキルジイルである）、及び
0006091753.tif 000045
（ここで、Ｘは任意であり、存在する場合は、Ｏ又はＳから選択され、
Ｚは任意であり、存在する場合は、Ｏ又はＳから選択され、
Ａ及びＢは独立してＯ又はＮ又はＳ又はアルキルジイルの一部又は第１級アミンであり、
Ｒはアルキルジイルであり、
ＹはＯ又はＳ又はＣである）
からなる群から選択される実施態様２−１から２−８の何れか一に記載の方法。
実施態様２−１０．
水性組成物中の極性非プロトン溶媒が、
0006091753.tif 000046

からなる群から選択される実施態様２−１から２−９の何れか一に記載の方法。
実施態様２−１１．
水性組成物が、緩衝剤、塩、促進剤、キレート剤、洗浄剤、及びブロッキング剤からなる群から選択される少なくとも一種の更なる成分を更に含む実施態様２−１から２−１０の何れか一に記載の方法。
実施態様２−１２．
促進剤がデキストラン硫酸であり、塩がＮａＣｌ及び／又はホスフェートバッファーである実施態様２−１１に記載の方法。
実施態様２−１３．
デキストラン硫酸が５％から４０％の濃度で存在し、ＮａＣｌが０ｍＭから１２００ｍＭの濃度で存在し、及び／又はホスフェートバッファーが０ｍＭから５０ｍＭの濃度で存在し、例えば、デキストラン硫酸が１０％から３０％の濃度で存在し、ＮａＣｌが３００ｍＭから６００ｍＭの濃度で存在し、及び／又はホスフェートバッファーが５ｍＭから２０ｍＭの濃度で存在する実施態様２−１２に記載の方法。
実施態様２−１４．
促進剤が、ホルムアミド、ＤＭＳＯ、グリセロール、プロピレングリコール、１，２−プロパンジオール、ジエチレングリコール、エチレングリコール、グリコール、及び１，３プロパンジオールからなる群から選択され、緩衝剤がクエン酸バッファーである実施態様２−１１に記載の方法。
実施態様２−１５．
ホルムアミドが０．１−５％の濃度で存在し、ＤＭＳＯが０．０１％から１０％の濃度で存在し、グリセロール、プロピレングリコール、１，２−プロパンジオール、ジエチレングリコール、エチレングリコール、グリコール、及び１，３プロパンジオールが０．１％から１０％の濃度で存在し、クエン酸バッファーが１ｍＭから５０ｍＭの濃度で存在する実施態様２−１４に記載の方法。
実施態様２−１６．
水性組成物が４０％の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒、１０％のデキストラン硫酸、３００ｍＭのＮａＣｌ、及び／又は５ｍＭのホスフェートバッファーを含有する実施態様２−１１に記載の方法。
実施態様２−１７．
水性組成物が１５％の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒、２０％のデキストラン硫酸、６００ｍＭのＮａＣｌ、及び１０ｍＭのクエン酸バッファーｐＨ６．２を含有する実施態様２−１１に記載の方法。
実施態様２−１８．
インサイツハイブリダイゼーション用途における標的の別々の変性を実施するための、少なくとも一種の極性非プロトン溶媒を１％から９５％（ｖ／ｖ）含有する組成物の使用。
実施態様２−１９．
極性非プロトン溶媒の濃度が実施態様２−５又は２−６又は２−７から２−１０に記載される、実施態様２−１８に記載の組成物の使用。
【図１】
0006091753.tif 000049
【図２】
0006091753.tif 000050