(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラム陽性菌もしくはグラム陰性菌、古細菌又は藻類によって産生された１以上の菌体外多糖（ＥＰＳ）を含む膜で被覆された核であって、前記膜が、少なくとも３週間４℃〜３０℃の範囲の温度で海水と接触している間に溶解しないことを特徴とする、前記核。
【請求項２】
前記膜が、１以上の生理活性分子をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の核。
【請求項３】
前記生理活性分子が、殺菌剤又は静菌剤、治癒剤及び／又は抗炎症剤の中から選択されることを特徴とする、請求項２に記載の核。
【請求項４】
前記殺菌剤又は静菌剤が、抗菌性ペプチド（ＡＭＰ）の中から選択されることを特徴とする、請求項３に記載の核。
【請求項５】
前記抗菌性ペプチド（ＡＭＰ）が、タキプレシンまたはカキデフェンシンＣｇ−Ｄｅｆｓである、請求項４に記載の核。
【請求項６】
前記ＥＰＳが、ＨＥ８００、ＥＰＳ７２１、ＭＯ２４５、ＧＧ１、ＨＹＤ６５７、ＨＹＤ１６４４、ＨＹＤ１５４５、ＧＹ７８５、ＭＳ９０７、ＳＴ７１６、ＨＹＤ７２１、ＧＹ７７２、ＨＹＤ７５０、ＧＹ７６８、ＧＹ７８８、ＢＩ７４６、ＧＹ７８６、ＧＹ６８５、ＧＹ６８６、ＳＴ７１９、ＨＹＤ１５７４、ＨＹＤ１５７９、ＨＹＤ１５８２、ＨＹＤ１５８４、ＳＴ７０８、ＳＴ７２２、ＳＴ３４２、ＳＴ３４９、ＨＹＤ１６２５、及びＨＹＤ１６６６の中から選択されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核。
【請求項７】
前記ＥＰＳが、ＭＯ２４５、ＨＥ８００、ＧＧ１、ＨＹＤ７２１、及びＳＴ７１６の中から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の核。
【請求項８】
グラム陽性菌もしくはグラム陰性菌、古細菌又は藻類によって産生された１以上の菌体外多糖（ＥＰＳ）を含む膜で被覆された核を得る工程であって、
前記膜が、少なくとも３週間４℃〜３０℃の範囲の温度で海水と接触している間に溶解せず、
前記工程が、溶液の総体積に対して０．１〜１０重量％の前記ＥＰＳを含有する前記溶液に浸漬させることによって、前記ＥＰＳで核を被覆するステップを含む、前記工程。
【請求項９】
１以上の殺菌剤又は静菌剤を１〜１０ＭＩＣの濃度で含有する溶液中への核の浸漬を含む第２のステップをさらに含むことを特徴とする、請求項８に記載の工程。
【請求項１０】
グラム陽性菌もしくはグラム陰性菌、古細菌又は藻類によって産生された１以上の菌体外多糖（ＥＰＳ）を含む膜で被覆された核を得る工程であって、
前記膜が、少なくとも３週間４℃〜３０℃の範囲の温度で海水と接触している間に溶解せず、
前記工程が、溶液の体積に対して０．０５〜１０重量％の前記ＥＰＳおよび１〜１０ＭＩＣの殺菌剤もしくは静菌剤を含有する前記溶液に浸漬させることによって、前記ＥＰＳおよび前記殺菌剤もしくは静菌剤で核を被覆するステップを含む、前記工程。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の核を含む真珠貝。
【請求項１２】
レシピエント真珠貝への移植工程であって、
前記工程が、前記レシピエント真珠貝の真珠袋へ移植片を核とともに挿入することを含み、
前記移植片が、ドナーの真珠貝（ｏｙｓｔｅｒ）の外套膜上皮に相当し、
前記核が、グラム陽性菌もしくはグラム陰性菌、古細菌又は藻類によって産生された１以上の菌体外多糖（ＥＰＳ）を含む膜で被覆され、かつ、前記膜が、少なくとも３週間４℃〜３０℃の範囲の温度で海水と接触している間に溶解しないことを特徴とする核であるか、
または、
前記核が、溶液の総体積に対して０．１〜１０重量％の前記グラム陽性菌もしくはグラム陰性菌、古細菌または藻類によって産生されたＥＰＳを含有する前記溶液に浸漬させることによって前記ＥＰＳで核を被覆するステップを含み、さらに任意選択で、１以上の殺菌剤又は静菌剤を１〜１０ＭＩＣの濃度で含有する溶液中への核の浸漬を含む第２のステップを含む、工程によって得られることを特徴とする核である、
前記移植工程。
【請求項１３】
請求項１２に記載の工程を含む、養殖真珠を製造する工程。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の核を含有する真珠、あるいは、
グラム陽性菌もしくはグラム陰性菌、古細菌又は藻類によって産生される１以上の菌体外多糖（ＥＰＳ）を含有する膜を、1以上の真珠層の下に有する真珠であって、前記膜が、少なくとも３週間４℃〜３０℃の範囲の温度で海水と接触している間に溶解しないことを特徴とする、前記真珠。
【請求項１５】
真珠の品質を向上させるためのおよび／またはレシピエント真珠貝への核の移植の失敗を減少させるための工程であって、
前記失敗が、前記レシピエント真珠貝の死亡率または前記レシピエント真珠貝による核の拒絶に対応するものであり、
前記工程が、核をレシピエント真珠貝へ移植することを含み、
前記核が、グラム陽性菌もしくはグラム陰性菌、古細菌又は藻類によって産生された１以上の菌体外多糖（ＥＰＳ）を含む膜で被覆されており、前記膜が、少なくとも３週間４℃〜３０℃の範囲の温度で海水と接触している間に溶解しないことを特徴とする核であるか、
あるいは、
前記核が、溶液の総体積に対して０．１〜１０重量％の前記グラム陽性菌もしくはグラム陰性菌、古細菌または藻類によって産生されたＥＰＳを含有する前記溶液に浸漬させることによって前記ＥＰＳで核を被覆するステップを含み、さらに任意選択で、１以上の殺菌剤又は静菌剤を１〜１０ＭＩＣの濃度で含有する溶液中への核の浸漬を含む第２のステップを含む、工程によって得られることを特徴とする核である、
前記工程。
【請求項１６】
レシピエント真珠貝への核の移植の失敗を減少させるためのおよび／または得られる真珠の品質を向上させるための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の核の使用であって、
前記失敗が、前記レシピエント真珠貝の死亡率または前記レシピエント真珠貝による核の拒絶に対応するものであることを特徴とする、
前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は真珠の養殖（真珠貝による真珠生産）環境における核被膜の分野に関する。それ故、本発明は、治癒及び抗菌特性を有する膜を用いた核被膜に関し、前記核のレシピエントの真珠貝への挿入由来の死亡と核拒絶の現象とを低減させることができる。
【背景技術】
【０００２】
真珠養殖は養殖真珠を生産するためにアコヤガイ種の真珠貝を自然環境で養殖することを含む人間活動である。第一工程は真珠貝を集めかつ育てることを含み、これがドナーの真珠貝とレシピエントの真珠貝との両方で利用される。移植は外科的施術から成り、ここで移植片、ドナーの真珠貝（約４mm２）の外套上皮部は、真珠層ビーズ、核との組合せで、レシピエントの真珠貝の真珠袋に挿入される。レシピエントの真珠貝へ挿入されると、核を覆う真珠袋を生成するように移植片に並ぶ上皮は増殖しかつ真珠袋を覆う。前記真珠袋は核を覆う真珠層の層に蓄積し、結果として真珠を生成する（Ｍｏｎｔａｇｎａｎｉ等、２００９年）。
【０００３】
死亡及び核拒絶は移植後に、可変的割合で４５日周期で発生する。施術後３週間以内の真珠貝の４０〜５０％に影響するこれらの現象は、感染病理から又は不適当な移植片から生じる結果として現れる。核挿入後の炎症反応の進展及び病原細菌による汚染は、移植中の組織切片の迅速な治療を欠いたことと組合せて、十中八九、核拒絶の主原因である（Ｃｏｃｈｅｎｎｅｃ等、２０１０年）。
【０００４】
それ故移植施術の失敗率を低減する（特に死亡と核拒絶を低減させることによる）結果となる工程が求められている。
【０００５】
特開平０５−２１９８５６号公報は、移植工程時におけるレシピエントの真珠貝であって、核と結合して又は抗生剤と関連した高分子をその表面に含む固体材の核を用いて、挿入することについて記載する。
【０００６】
特開平０２−３０８８６９号公報及び特開昭６３−２１５６０９号公報は、特に得られた真珠の質を改善するために、核表面の同種均一性を増加させることにより、並びに、例えば様々な寄生による核のコロニー化を防ぐことにより拒絶及び死亡の現象を減少させるために、高分子を用いた核被膜の利用について主張する。
【０００７】
特開０２−１７４６２１号公報は移植時の汚染を制限するために抗菌剤に関連した核被膜用の自然な高分子の利用について記載する。
【０００８】
米国特許第６５１４６１４号明細書は、抗菌活性を有する物質と関連するのだが、前記核挿入に対する摩擦及び抵抗を効果的に低減させるように、水溶性の高分子、海水によって部分的に溶解した（２５％超の溶解率）前記高分子を用いた核被膜について記載する。
【０００９】
最後に、特開平０３−１８３４２４号公報は水溶性高分子を用いた（又は管理の遅延を可能にする任意の他の化合物により）核被膜の機構について記載し、前記高分子と関連した抗菌制御速度の管理を可能にしている。
【００１０】
しかし、上記引用公報は移植時に形成される切開の治癒の問題を解決していない。更には、抗菌剤の利用はそれらの不完全な生分解性を原因とする環境問題、及び耐性細菌の進化を原因とする公共福祉の問題を生じている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
驚くべきことに、本出願はＥＰＳ（菌体外多糖）膜を用いた核被膜が移植施術の失敗率を減少させることについて記載する。いかなる理論による束縛も受けずに、ＥＰＳ膜による核被膜はレシピエントの真珠貝の治癒を促進することを可能にするだろう。更には、例えば抗菌性ペプチド（ＡＭＰ）などの殺菌剤又は静菌剤と前記ＥＰＳ膜との関連により、微生物汚染の発生を減少させることができる。ＥＰＳ単独または殺菌剤もしくは静菌剤との組合せにより、移植工程での失敗を減少させることが可能となり、特に、レシピエント真珠貝の死亡率ならびに該レシピエント真珠貝による核の拒絶を減少させることが可能となる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は１つ以上の菌体外多糖を含む膜を用いた核被膜に関する。
本発明の実施形態によれば、ＥＰＳはグラム陽性菌又はグラム陰性菌、古細菌又は藻類によって生成される。
【００１３】
本発明の実施形態によれば、被膜は１つ以上の生理活性分子を更に含む。
【００１４】
本発明の実施形態によれば、前記生理活性分子は１つ以上の殺菌剤又は静菌剤、１つ以上の治療剤及び／又は１つ以上の抗炎症剤の中から選択される。
【００１５】
本発明の実施形態によれば、ＥＰＳはＨＥ８００、ＥＰＳ７２１、ＭＯ２４５、ＧＧ１、ＨＹＤ６５７、ＨＹＤ１６４４、ＨＹＤ１５４５、ＧＹ７８５、ＭＳ９０７、ＳＴ７１６、ＨＹＤ７２１、ＧＹ７７２、ＨＹＤ７５０、ＧＹ７６８、ＧＹ７８８、ＢＩ７４６、ＧＹ７８６、ＧＹ６８５、ＧＹ６８６、ＳＴ７１９、ＨＹＤ１５７４、ＨＹＤ１５７９、ＨＹＤ１５８２、ＨＹＤ１５８４、ＳＴ７０８、ＳＴ７２２、ＳＴ３４２、ＳＴ３４９、ＨＹＤ１６２５、及びＨＹＤ１６６６、及び好ましくはＭＯ２４５、ＨＥ８００、ＧＧ１、ＨＹＤ７２１及びＳＴ７１６の中から選択される。
【００１６】
本発明の実施形態によれば、殺菌剤又は静菌剤は抗菌ペプチド（ＡＭＰ）から選択される。
【００１７】
本発明の実施形態によれば、前記ＡＭＰはタキプレシン又はカキデフェンシン、Ｃｇ−Ｄｅｆｓの中から選択される。
【００１８】
本発明はまた上述の様に核を獲得する工程に関するものであり、前記工程は溶液体積に対するＥＰＳの重量で０．１〜１０％含む溶液中に浸漬することによるＥＰＳを用いた核被膜の工程を含む。
【００１９】
本発明の実施形態によれば、本工程は、以下を含む：
−上記した第１のステップ、および
−１〜１０ＭＩＣの殺菌剤もしくは静菌剤を含有する溶液に浸漬することにより、１種以上の該殺菌剤もしくは静菌剤と、あらかじめ形成された上記ＥＰＳ膜とを関連付ける第２のステップ。
【００２０】
別の実施形態によれば、１種以上の殺菌剤もしくは静菌剤と組合せて１種以上のＥＰＳを含有する膜で被覆された核を得る工程は、溶液および１〜１０ＭＩＣの該殺菌剤もしくは静菌剤の総体積に対して０．０５〜１０重量％の前記ＥＰＳを含有する該溶液中に浸漬させることによって、該ＥＰＳおよび該殺菌剤もしくは静菌剤で核を被覆するステップを含む
【００２１】
本発明はまた上述のように核を含む真珠貝に関する。
【００２２】
本発明はまた、レシピエント真珠貝の移植の失敗を減少させるための上記した核の使用または上記した工程の使用に関する。該失敗は、該レシピエント真珠貝の死亡率または該レシピエント真珠貝による核の拒絶に起因する。
【００２３】
本発明はまた、レシピエント真珠貝の移植工程に関する。該工程は、移植片を該レシピエント真珠貝の真珠袋に、上記の核もしくは上記の工程により得られた核と共に、挿入することを含む。該移植片は、ドナー真珠貝（ｄｏｎｏｒ  ｏｙｓｔｅｒ）の外套膜の上皮に相当する。
【００２４】
また、本発明は、上述する移植工程を含む、養殖真珠を生成する工程に関する。
【００２５】
本発明はまた、真珠を得る工程にも関する。該工程は、本発明に係る核または本発明に係る工程により得られた核を、上記ドナー真珠貝の外套膜上皮の一部と組合せて、上記レシピエント真珠貝の真珠袋の中に移植することを含む。
【００２６】
また、本発明は、上述の様に真珠を得る工程によって得られる真珠に関するものであり、又は本発明による核若しくは本発明による工程によって得られる核を含み、又は１つ以上の真珠層の厚みの下、グラム陽性若しくはグラム陰性細菌、古細菌若しくは藻類によって生成された１つ以上の菌体外多糖（ＥＰＳ）を含む膜を含むものである。
【００２７】
本発明はまた、真珠の品質を向上させるためおよび／またはレシピエント真珠貝への核の移植の失敗を減少させるための工程にも関する。該失敗は、該レシピエント真珠貝の死亡率または該レシピエント真珠貝による該核の拒絶に対応するものである。そして、該工程は、該レシピエント真珠貝へ、本発明に係る核または本発明に係る核を得る工程により得られた核を移植することを含む。
【００２８】
本発明はまた、レシピエント真珠貝への核の移植の失敗を減少させるためおよび／または得られる真珠の品質の向上のための、本発明に係る核の使用、または、本発明に係る核を得る工程によって得られた核の使用にも関する。該失敗は、該レシピエント真珠貝の死亡率または該レシピエント真珠貝による核の拒絶に起因する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】顕微鏡撮影により得られた写真の一式であり、被膜されていない核（ａ）及び被膜された核（ｂ、ｃ及びｄ）である。印は膜の存在を確認するための意図的な破断に対応する。
【図２】核を培養した微生物の溶液を用いて実施された養殖後のペトリ皿の写真一式である。（ａ）被膜されていない又はＥＰＳ単独で被膜されている核である。（ｂ）核がそそぎなしのＥＰＳ／ＡＭＰの組合せで被膜された核である。（ｃ）ＥＰＳ／ＡＭＰの組合せで被膜されかつ海水又はＭｉｌｌＱ水で洗浄した核である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明において、以下の言葉は以下の意味を有する。
核：一般的には球状の、天然化合物（例えば、ミシシッピのムラサキガイ（Ａｍｂｌｅｍａ  ｐｌｉｃａｔａ）の真珠層）または合成化合物（例えば、ビロナイト（Ｂｉｒｏｎｉｔｅ））によって形成される成分であり、上記移植ステップの間に上記レシピエント真珠貝の中に挿入され、レシピエント真珠貝が産生する真珠層の堆積のための支持体として機能する。該核は、得られる真珠の品質を向上させるために、特定の物質で被覆されていてもよい。
【００３１】
真珠養殖：一般的にアコヤガイ種の系統に属する真珠貝によって養殖された真珠を生成する目的での人間活動をいう。
【００３２】
殺菌剤：殺菌作用を有する物質、すなわち、細菌の死をもたらす作用を有する物質。
【００３３】
静菌剤：静菌作用を有する物質、すなわち、細菌の発育、増殖および／または分裂を阻害する作用を有する物質。
【００３４】
ＭＩＣ：最少阻止濃度。これは、一晩のインキュベーションの後の微生物の明らかな増殖を阻害することができる剤の最小濃度に相当する。ある剤のＭＩＣを決定する方法は、当業者によく知られている。
【００３５】
治癒：例えば切開などの傷、より詳細には開放創の回復又は治癒の促進可能因子として記載する。
【００３６】
約：数値的要素の前に置く、この数値的要素の大小１０％を意味する。
【００３７】
真珠層：（真珠層の約９０％を形成する）霰石の結晶及びコンキオリンによって形成されたバイオ鉱物化した構造。霰石は式ＣａＣＯ３＋少量のストロンチウム；鉛；亜鉛の化学合成物である。
【００３８】
真珠養殖において、真珠の生成は、移植ステップの間にレシピエント真珠貝の中へ挿入した核上に真珠層が堆積することにより生じる。該核の移植ステップは、一般的に、高い失敗率を有するが、それは、移植中に生じた切開に対する該レシピエント真珠貝の治癒不良または細菌汚染に起因する。したがって、真珠養殖において使用する核は、該移植ステップの失敗率を減らせるように、被膜剤によってますます被覆されている。
【００３９】
それ故、本発明は１つ以上の菌体外多糖（ＥＰＳ）を含む膜を用いて覆われ又は被膜された複数の核と関連する。
【００４０】
ＥＰＳ膜は治癒特性を有し、移植工程によって誘発された傷の治癒促進を可能とし、かつそれ故に移植失敗をもたらすレシピエントの真珠貝の死亡を減少させることを可能とする。
【００４１】
ある細菌は制御条件下において、栄養学上不均衡な状況に応答して、菌体外多糖（ＥＰＳ）を含むエキソ高分子を合成する潜在性を有する。菌体外多糖は類似する炭化水素（一般に糖又は単糖と呼ばれる）によって形成された高分子として定義される可能性がある。これらの菌体外多糖は産業規模で生成され、かつ他の特性の中では、（自然界においてこれらの分子の機能と関連して）粘着性及び膜形成特性を有する。
【００４２】
ＥＰＳは、グラム陽性菌又はグラム陰性菌、古細菌、菌、かつある藻類などの多数の微生物によって生成されている。好都合にも、ＥＰＳはグラム陽性菌又はグラム陰性菌、古細菌又は藻類によって生成されている。
【００４３】
ＥＰＳは、例えば超音波処理、遠心分離、アルカリ処理、エタノール抽出、酵素抽出などの周知の物理的又は化学的抽出方法によって微生物培養から抽出できる。
【００４４】
本発明の実施形態によれば、ＥＰＳは、例えばＳａｔｐｕｔｅ等が記述している（バイオテクノロジー  アドバンス、２０１０年２８巻４３６頁〜４５０頁）ように、Ｂａｃｉｌｌｕｓ，  Ｈａｌｏｍｏｎａｓ，  Ｐｌａｎｏｃｏｃｃｕｓ，  Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ，  Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ，  Ｐｓｕｅｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ，  Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ，  Ｚｏｏｇｌｏｅａ，  Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ，  Ｖｉｂｒｉｏ等の海洋微生物によって生成されるこれらの中から選択される。分類学が修正される必要があるならば、本発明で使用可能なこのＥＰＳを推論するために、当業者は分類学上の修正を適用するだろう。
【００４５】
本発明の実施形態によれば、ＥＰＳは深海水熱生態系由来の細菌発酵によって得られる。より具体的には、これらのＥＰＳは、深海水熱生態系由来の細菌発酵時に制限条件下（炭化水素飽和の栄養環境が原因の高い炭素／窒素比率により生じた栄養の偏り）であれらが生成される（例えば、Ｇｕｅｚｅｎｎｅｃ，Ｊ（２００２年）深海水熱口：生物工学的に重要な革新的細菌の菌体外多糖の新資源？ジャーナル  オブ  インダストリアル  マイクロバイオロジー  アンド  バイオテクノロジー２９巻：２０４頁〜２０８頁参照）。
【００４６】
実施形態によれば、ＥＰＳは例えばＧＧ１などの、非帯電（すなわち中性）ＥＰＳから成る群より選択される。
【００４７】
実施形態によれば、ＥＰＳは例えばＨＥ８００及びＭＯ２４５などの、帯電ＥＰＳから成る群から選択される。
【００４８】
実施形態によれば、ＥＰＳはＨＥ８００、ＥＰＳ７２１、ＭＯ２４５、ＧＧ１、ＨＹＤ６５７、ＨＹＤ１６４４、ＨＹＤ１５４５、ＧＹ７８５、ＭＳ９０７、ＳＴ７１６、ＨＹＤ７２１、ＧＹ７７２、ＨＹＤ７５０、ＧＹ７６８、ＧＹ７８８、ＢＩ７４６、ＧＹ７８６、ＧＹ６８５、ＧＹ６８６、ＳＴ７１９、ＨＹＤ１５７４、ＨＹＤ１５７９、ＨＹＤ１５８２、ＨＹＤ１５８４、ＳＴ７０８、ＳＴ７２２、ＳＴ３４２、ＳＴ３４９、ＨＹＤ１６２５、及びＨＹＤ１６６６、好ましくはＭＯ２４５、ＨＥ８００、ＧＧ１、ＨＹＤ７２１及びＳＴ７１６から選択されることがある。
【００４９】
実施形態によれば、ＥＰＳは本来のものである。別の実施形態によれば、ＥＰＳは（例えば、硫酸塩、酢酸塩、乳酸塩、コハク酸塩又はピルビン酸塩を加えることにより）化学的又は物理的に修正され得る。
【００５０】
本発明の実施形態によれば、ＥＰＳ膜は核の周囲に連続している。
【００５１】
また、本発明は、１つ以上のＥＰＳ及び１つ以上の生理活性物質から成る膜による核皮膜に関する。
【００５２】
実施形態によれば、これらの生理活性物質は殺菌剤又は静菌剤である。真珠養殖では、核上に殺菌剤又は静菌剤を追加すると、レシピエントの真珠貝での細菌汚染の発生が前記真珠貝の核拒絶や死の結果となる可能性を制限すること可能となる。
【００５３】
別の実施形態によれば、これらの生理活性物質は例えばコラーゲン、フィブリノーゲン、ラミニン又は成長因子などの治癒剤又は抗炎症剤である。
本発明の実施形態によれば、殺菌剤又は静菌剤は例えば、テトラサイクリン、カナマイシン、スルホモノメトキシン、及びアンピシリンなどの化学抗体の中から選択される。
【００５４】
本発明の別の実施形態によれば、殺菌剤又は静菌剤は抗菌性ペプチド（ＡＭＰ）の中から選択される。
【００５５】
抗菌性ペプチド（ＡＭＰ）は生来の免疫作動体分子であり、進化上保存されかつ活性領域全体に広く普及している。APMの広域な多様性は近年、構造条件上で多くの多様性、大きさ及び活動形態を表すことを示している。ＡＭＰは陽イオン性及び疎水性アミノ酸の高表示により一般的に特徴付けられている。これらの分子は通常細菌膜との相互作用のため両親媒性の特徴的要素を有する（Ｂｕｌｅｔ等、２００４年）。洗浄型効果を用いるか又は気孔を形成することによりそれらの膜を透過性にすることで、又は細菌の細胞壁を構成するペプチドグリカンの合成を阻害することで、又は細菌の代謝経路を阻害することで、ＡＭＰは微生物を殺す（Ｂｒｏｄｇｅｎ等、２００５年）。
【００５６】
一般的に使用される化学抗生物質の観点から、ＡＭＰは全く生分解可能な利点を有する。それらの生物的特性故に、それらは型にはまった化学抗生剤の代用の良い候補者として現れる。実際にそれらは抗菌活性の薬効範囲の広域性、低い特異性、異なった行動形態を有しかつ環境への害が無い。
【００５７】
ＡＭＰは化学合成によって又は微生物若しくは酵母の組み換え機構の発現（クローニング、発現、精製）によって生成され得る。
【００５８】
本発明の実施形態によれば、ＡＭＰはアルファヘリックスを有する直線状のＡＭＰのファミリーに属することがあり、ＡＭＰファミリーは１つ以上のアミノ酸の過剰出現又は１又は２のジスルフィド結合を有するヘアピンＡＭＰファミリー（ベータヘアピン）又はベータシートを有するサイクリックＡＭＰ及び３つ以上のジスルフィド結合を有するアルファヘリックスを有する（Ｂｕｌｅｔ等、イムノロジカル  リヴュー、２００４年、１９８巻、１６９頁〜１８４頁；Ｂｒｏｇｄｅｎ、ネイチャーリヴュー  マイクロバイオロジー、２００５年、３巻：２３８頁〜２５０頁）。
【００５９】
アルファヘリックスを有する直線状のＡＭＰの例は、制限するものではないが、セクロピン、ストモキシン、ポネリシン、スピニゲリン、オキシオピニン、カピエンニン、カラバニン、スチエリン、パルダキシン、ミスグリン、プレウロシジン、パラシン、オンコルハインシン、モロネシジン、マガイニン、テンポリン、カテリシジン及びインドリシジンを含む。
【００６０】
１つ以上のアミノ酸、プロリン、アルギニン、グリシン又はトリプトファンの飽和なＡＭＰの例は、制限するものではないが、バクテネシン、PR-３９、アバエシン、アピダエシン、ドロソシン、ピルルホコリシン、Cg-Prp、プロフェニン及びインドリシンを含む。
【００６１】
２〜４のシステインを含むヘアピンＡＭＰの例は、制限するものではないが、タキプレシン、プロテグリン、タナチン、アンドロクトニン、ゴメシン、ポリフェムシン、ヘプシジン、ブレビニン、エスカレンチン、チゲリニン及びバクテネシンを含む。
【００６２】
６つ以上のシステイン残渣又は開放周期を含むサイクリックＡＭＰの例は、制限するものではないが、デフェンシン（脊椎動物、無脊椎動物又は植物）、ターミシン、ヘリオマイシン、ヘリオマイシン、ドロソマイシン、ＡＳＡＢＦ、ｐＢＤ、ペナエイジン、ＡＬＦ及びビッグ‐デフェンシンを含む。無脊椎動物のデフェンシンの例はＣｇ−Ｄｅｆカキデフェンシン又はＭＧＤアコヤガイデフェンシンである。
【００６３】
本発明の実施形態によれば、ＡＭＰはタキプレシン及びＣｇ−Ｄｅｆｓカキデフェンシンの中から選択される。
【００６４】
本発明の実施形態によれば、ＡＭＰは化学合成により合成される。本発明の別の実施形態によれば、ＡＭＰは細菌又は菌類の遺伝子組換え機構及び好ましくは酵母の機構において生物学的合成によって合成される。
【００６５】
レシピエントの真珠貝の移植に由来する死亡や核拒絶は施術後４５日で発生し、及び一般的には施術後最初の３週間で生じる。
【００６６】
本発明の実施形態によれば、ＡＭＰは前記ＥＰＳ膜に安定的に関連している。
【００６７】
本発明の実施形態によれば、ＥＰＳ及び任意に殺菌剤又は静菌剤を含む膜は、海水を用いた洗浄に対して耐性を有し、かつ３週間超、好ましくは４℃から３０℃の範囲で１ヶ月超安定であった。それから、ＥＰＳ及び任意に殺菌剤又は静菌剤を含む膜は海水（例１）との接触の間、少なくとも３週間溶解しない。
【００６８】
本発明の実施形態によれば、ＥＰＳ及び任意に殺菌剤又は静菌剤を含む膜は、細菌成長抑制活性を３週間超、好ましくは３７℃の温度で１ヶ月超維持する。
【００６９】
本発明の実施形態によれば、上記ＥＰＳ膜と、例えばＡＭＰなどの殺菌剤もしくは静菌剤との間の関連は、該ＥＰＳと該剤との間の吸着現象又は化学反応に由来する。
【００７０】
また、本発明は、細菌起源の１つ以上の菌体外多糖を含むフィルムを有する真珠培養核を被膜する工程に関する。
【００７１】
本発明の実施形態によれば、前記工程は水性のＥＰＳ溶液、好ましくは逆浸透水中のＥＰＳ溶液で核を浸漬する第一ステップを含む。本発明の好ましい実施形態によれば、該水性ＥＰＳ溶液は、０．１〜１０％重量／体積、より好ましくは０．５〜５％、さらにより好ましくは、１％の、該水性溶液体積に対する該ＥＰＳ重量の濃度を有する。
【００７２】
本発明の実施形態によれば、１つ以上のＥＰＳを含む溶液に核を浸漬する前記第一工程は一定の温度で、好ましくは周囲温度で（例えば１５℃〜２５℃）、より好ましくは約２０℃で実施される。本発明の実施形態によれば、１つ以上のＥＰＳを含む溶液中へ核を浸漬する前記第一工程は好ましくは１分間〜６０分間、より好ましくは５分間〜２０分間、さらにより好ましくは１０分間実施される。
【００７３】
本発明の別の実施形態によれば、１つ以上のＥＰＳを含む溶液へ核を浸漬する前記第一工程は一定の温度で、好ましくは１℃〜１０℃、より好ましくは約４℃で実施される。本発明のこの実施形態によれば、１つ以上のＥＰＳを含む溶液へ核を浸漬する前記第一工程は好ましくは１時間〜３時間、より好ましくは約２時間実施される。
【００７４】
本発明の実施形態によれば、被膜された核はその後真空下で乾燥される。
【００７５】
上記核を被覆する膜が、１種以上の殺菌剤もしく静菌剤を含有する場合、上記第１ステップの後に第２ステップが続く。該第２ステップは、１〜１０ＭＩＣ、好ましくは１０ＭＩＣの濃度で１種以上の殺菌剤もしくは静菌剤を含有する溶液への該核の浸漬を含む。
【００７６】
本発明によれば、殺菌剤又は静菌剤は、例えば水（例えば逆浸透水）、エタノール、トリフルオロエタノール（ＣＦ３ＣＨ２ＯＨ、ＴＦＥ）又はこれらの混合液で例えば、水／ＴＥＦ、好ましくはトリフルオロエタノール（ＣＦ３ＣＨ２ＯＨ）又は逆浸透水などの、生物学的に許容可能な極性溶媒中の溶液内にある。
【００７７】
本発明の第一の実施形態によれば、核浸漬の第二工程は一定温度で、好ましくは１℃〜１０℃、より好ましくは約４℃で実施される。本発明のある実施形態によれば、核を浸漬する前記第二工程は好ましくは２４時間から１２０時間、より好ましくは４８時間から９６時間、さらにより好ましくは７２時間で実施される。別の実施形態によれば、核を浸漬する第二工程は１２時間から４８時間、好ましくは１２時間から２４時間及び更により好ましくは２４時間で実施される。
【００７８】
本発明の第二の実施形態によれば、核を浸漬する上記第２ステップは、一定の温度で、好ましくは周囲温度（２０℃〜３０℃）で、より好ましくは約２５℃で実施される。本発明の実施形態によれば、核を浸漬する上記第２ステップは、好ましくは３０分間から３時間の間、好ましくは１時間から２時間、及び更により好ましくは約１時間３０分で実施される。
【００７９】
本発明の実施形態によれば、被膜核はその後真空下で乾燥される。
【００８０】
本発明の実施形態によれば、上記工程は、任意選択で、第１の浸漬ステップと第２の浸漬ステップとの間に洗浄ステップを含む。この実施形態によれば、上記核は、１０ｍＬ〜１０００ｍＬの体積の蒸留水、好ましくは１００〜３００ｍＬの蒸留水、より好ましくは約２００ｍＬの蒸留水で洗浄される。
【００８１】
また、本発明は、１つ以上のＥＰＳ及び１つ以上の殺菌剤又は静菌剤を含むフィルムで覆われた核を得る工程に関するものであり、前記工程はＥＰＳ及び殺菌剤又は静菌剤を含む溶液中で核を浸漬する単一のステップを含む。
【００８２】
実施形態によれば、ＥＰＳは溶液の全体積に占める重量で０．０５〜１０％、好ましくは０．１〜５％の濃度、より好ましくは１％の濃度で溶液に存在する。
実施形態によれば、殺菌剤又は静菌剤は１ＭＩＣ〜１０ＭＩＣの濃度で溶液に存在する。
【００８３】
実施形態によれば、この浸漬工程は一定の温度、１℃〜１０℃、好ましくは４℃、及び１２時間〜１２８時間、好ましくは４８時間〜９６時間、及びより好ましくは７２時間で実施される。
【００８４】
本発明の実施形態によれば、本発明による、又は本発明の工程により得られた被膜核は４℃に保たれる。本発明の別の実施形態によれば、本発明による、又は本発明の工程により得られた被膜核は周囲温度に保たれる。
【００８５】
本発明の実施形態によれば、核は自然由来のもので、より好ましくは前記核はＡｍｂｌｅｍａ種起源、好ましくはＡｍｂｌｅｍａ  ｐｌｉｃａｔａに属するミシシッピ  ムラサキガイの真珠層により形成されたものである。核の例はＡｍｉｎｇ（Ａｍｉｎｇ  Ｓｔａｎｄａｒｄ）又はＰｏｅ  Ｉｍｐｏｒｔにより販売されている。
【００８６】
本発明の実施形態によれば、前記核は１ｍｍ〜２０ｍｍ、好ましくは２ｍｍ〜１５ｍｍ、より好ましくは２ｍｍ〜４ｍｍ、及び更により好ましくは２．１ｍｍ〜３．５ｍｍの直径を有する。
【００８７】
本発明の実施形態によれば、前記核は２ＢＵ〜２．５ＢＵ、好ましくは約２．４ＢＵの直径を有する。ＢＵは計量単位で、１ＢＵは３．０３ｍｍに対応する。
【００８８】
また、本発明は、上記の核または上記の工程により得られた核を含有する真珠貝（ｏｙｓｔｅｒ）に関する。
【００８９】
好ましくは、真珠貝はアコヤガイ種起源、より好ましくはアコヤガイ  Ｆｕｃａｔａ、アコヤガイ  ｍａｘｉｍａ又はアコヤガイ  ｍａｒｇａｒｉｔｉｆｅｒａ種に属する。
【００９０】
本発明はまた、レシピエント真珠貝の移植工程にも関する。該工程は、移植片を、該レシピエント真珠貝の真珠袋の中に、上記核または上記工程により得られた核と組合せて挿入することを含む。該移植片は、上記ドナー真珠貝の外套膜上皮に相当する。
【００９１】
本発明の実施形態によれば、移植工程は（ｉ）レシピエントの真珠貝の手動での開口、（ｉｉ）真珠袋を入手しかつ第三工程で可能とするためにレシピエントとなる真珠貝の組織切開を生成、（ｉｉｉ）上述の様なＥＰＳ膜で覆われた核との組合せで、レシピエントの真珠貝（約４mm２）の外套上皮部に対応する移植の、レシピエントの真珠貝の真珠袋への挿入を含む。
【００９２】
また、本発明は、上述の様な移植工程を含む、養殖真珠を生成する工程に関する。
【００９３】
また、本発明は、上述の様な皮膜核の利用を含む、又は上述の様な皮膜工程によって得られる真珠を得る工程に関する。
【００９４】
本発明の実施形態によれば、真珠を得るための工程は、ドナーの真珠貝の外套上皮部と組合せて、レシピエントの真珠貝の真珠袋に本発明による核を移植することを含む。
【００９５】
本発明の実施形態によれば、提供者の真珠貝及びレシピエントの真珠貝を得る為に、真珠を生産又は獲得する前記工程は、好ましくは上記の属及び種に属する真珠貝の収集及び育成を含む第一工程を含む。
【００９６】
本発明の実施形態によれば、提供者とレシピエントの真珠貝はその後寄生生物をも除去する為洗浄される。
【００９７】
本発明の実施形態によれば、前記生成工程は、移植後、レシピエントの真珠貝の、好ましくは１０ヶ月〜２４ヶ月、より好ましくは１２ヶ月〜２０ヶ月、更により好ましくは１６ヶ月〜１８ヶ月の期間の養殖工程を更に含む。養殖期間の間は、核の周りの真珠袋を生成する為に移植片上皮の裏側は増殖しかつ真珠袋を覆い、核の周りの真珠層の層を堆積させ、その後、結果として真珠が生成する。
【００９８】
本発明はまた上述の様な真珠獲得工程により得られた真珠に関する。
【００９９】
本発明はまた本発明により被膜された核、又は本発明による工程によって得た核を含む真珠に関する。
【０１００】
また、本発明は、任意で１つ以上の生理活性分子に関連したＥＰＳ膜、好ましくはグラム陽性菌又はグラム陰性菌、古細菌又は藻類により生成されたＥＰＳ膜で被膜された核の真珠に関する。
【０１０１】
また、本発明は、１つ以上の真珠層の厚みの下で、任意で１つ以上の生理活性分子に関連したＥＰＳ膜、好ましくはグラム陽性菌又はグラム陰性菌、古細菌又は藻類により生成されたＥＰＳ膜からなる真珠に関する。
【０１０２】
本発明の実施形態によれば、真珠は大きさ、好ましくは２ｍｍ〜２０ｍｍ、好ましくは５ｍｍ〜１５ｍｍ、さらにより好ましくは６．８ｍｍ〜１０ｍｍの直径を有する。
【０１０３】
本発明によれば、上記した核周囲の膜の存在は、多くの利点を有する：
−核表面の均質性の向上、および／または
−得られた真珠の品質の向上（表面欠陥の発生の制限）、および／または
−移植中に形成された切開の治癒の促進、および／または
−上記移植片および真珠袋の細胞上の、真珠の成長を向上させる作用、および／または
−微生物の汚染現象の抑制、および／または
−切開での感染によるレシピエント真珠貝の死亡率の減少。
本発明はまた、核の均質性を向上させる工程に関する。該工程は、該核を上記した本発明の膜で被覆することを含む。
【０１０４】
また、本発明は、レシピエントの真珠貝の移植で得られた真珠の質を改善する工程に関するものであり、本発明に関する核利用を含む。本発明の実施形態によれば、移植工程間の本発明による核の利用は、真珠の表面欠陥の出現を制限する。
【０１０５】
また、本発明は、核を有するレシピエントの真珠貝の移植失敗を低減させる工程に関するものであり、前記失敗はレシピエントの真珠貝による死亡と核拒絶に対応するものであり、かつ前記工程は本発明による又は本発明により核を得る工程によって得られる核を用いたレシピエントの真珠貝の移植を含む。
【０１０６】
本発明はまた移植時に核拒絶を抑止する工程に関するものであり、前記工程は移植で本発明により被膜された核の利用を含む。
【０１０７】
本発明は移植工程由来のレシピエントの真珠貝の死亡を減少させる工程に関するものであり、移植で本発明により被膜された核の利用を含む。本発明のある実施形態によれば、本発明の工程によって抑止された死亡は移植時生成された切開の影響に依る。
【０１０８】
本発明はまた、レシピエント真珠貝への核の移植の失敗を減少させるためのおよび／または得られる真珠の品質を向上させるための、本発明に係る核の使用、または、本発明に係る核を得る工程の使用にも関する。該失敗は、該レシピエント真珠貝の死または該レシピエント真珠貝による核の拒絶に起因する。
【０１０９】
また、本発明は、移植時に生成される切開の治癒を促進する工程に関するものであり、本発明による被膜核の利用を含む。
【０１１０】
また、本発明は、移植時に生じる微生物汚染現象を抑止する工程に関する者であり、前記工程は移植で本発明による被膜核の利用を含む。
【０１１１】
加えて、殺菌剤又は静菌剤としてのＡＭＰの利用は、従来の化学抗生物質の使用よりも環境に良く、真珠貝の筋肉を生で消費することができる程に、より健康に良い。
【実施例】
【０１１２】
本発明は、以下の実施例により、簡単に理解かつ解釈できるであろう。
【０１１３】
実施例１：ＥＰＳ膜の存在
ＥＰＳ  ＭＯ２４５を含有しおよび任意にタキプレシンを含有する膜で、核を被覆した。これらの核を、２ステップの工程によって得た：
１）１％ＭＯ２４５を含む溶液中、４℃で２時間の浸漬、
２）タキプレシン７０ｍｇ／Ｌ（すなわち、１０ＭＩＣ）を含有するＴＦＥ溶液中、４℃で７２時間の浸漬。
【０１１４】
顕微鏡撮影により得られた図１は明確に膜の存在を示す。図ｂ及び図ｃは破断後に膜の存在を示しかつ図ｄは水及び／又はＴＦＥを用いた洗浄後膜が安定的に残ることを示す。
【０１１５】
実施例２：抗菌活性
実験：
標準直径の核は微生物発酵から得られた生体高分子で表面を前処理した影響に関する研究のため利用された。
【０１１６】
核はＥＰＳ  ＭＯ２４５単独又はタキプレシンとの組合せを含む膜で被膜される。
【０１１７】
これらの核は、単一のステップにより得られる。すなわち、該核を０．１％のＭＯ２４５を含有しおよび任意にタキプレシン７０ｍｇ／Ｌ（すなわち、１０ＭＩＣ）を含有する溶液中、４℃で４８時間の浸漬をするステップにより得られる。
【０１１８】
特定の核は乾燥前に海水又はＭｉｌｌＱ水２００ｍｌを用いて洗浄した。全ての核はその後真空下で乾燥された。
【０１１９】
従来技術の細菌増殖抑制試験を、これらの核に対して実施した：
クロチョウガイ（Ｐｉｎｃｔａｄａ  ｍａｒｇａｒｉｔｉｆｅｒａ）から単離されたビブリオ属菌株（Ｖｉｂｒｉｏ  Ｐｍａｒ０２−１４９）の対数増殖期である細菌溶液と接触させた状態で、該核を置いた。その後、該細菌の増殖を、光学密度６３０ｎｍにて分光光度計で測定した。該細菌溶液を、その後、ペトリ皿（ゾベル寒天培地）に展開し、生長したコロニーをその後計測する。
【０１２０】
図２ａは被膜していない核の存在が細菌増殖を阻害しないことを示す。似た結果がＥＰＳを含む膜のみで被膜された核で得られた。
図２ｂはＥＰＳとＡＭＰの組合せを含む膜により被膜された核の存在が細菌の増殖を阻害することを示す。
【０１２１】
図２ｃはＥＰＳとＡＭＰの組合せを含む膜で被膜された核の抗菌活性が核洗浄後保存されることを示す。
【０１２２】
さらに、抗菌活性の安定性を、経時的に、海水での処理（該真珠貝の真珠空洞における必須要素）に対して、調査した。その結果は、ＥＰＳ＋ＡＭＰの組合せを含有する膜で被覆された核の該抗菌活性が、周囲温度（１８〜２１℃）において少なくとも２週間、安定であることを示している。
【０１２３】
同じ実験がその後タキプレシンとＥＰＳ  ＭＯ２４５又はＥＰＳ  ＧＧ１とを組み合せて被膜された核において実施された。
核の抗菌活性は対照群（核の無い細菌培養）に対し１８時間接触後に細菌増殖の阻害の百分率により測定された。測定された百分率の阻害は、以下の表に示される。
【表１】
0006158083.tif 000002
ＥＰＳとＡＭＰ（タキプレシン）との組合せで被膜された核は細菌増殖を強く阻害した（ＥＰＳ  ＭＯ２４５及びＧＧ１、それぞれに対して９７％及び９５％）。
【０１２４】
実施例３：移植試験における、本発明の核の効果
１‐死亡率
非被膜核、または、ＥＰＳ  ＧＧ１単独でまたはＡＭＰ（タキプレシン）との組合せで被覆された核を、レシピエント真珠貝の外套膜上皮の一部（移植片）と共に、レシピエント真珠貝に移植した。６７のドナー真珠貝を、この試験において使用した。核のタイプ毎およびドナーのタイプ毎に、８つの移植片試験を実施した。
【０１２５】
レシピエント真珠貝の死亡率を、移植から４０日後に評価した。死亡率は、非被膜核を受け取った真珠貝に対する百分率として評価した。結果を下表に示す。
【表２】
0006158083.tif 000003
該核上のＥＰＳ膜の存在またはＥＰＳ＋ＡＭＰ膜の存在により、該真珠貝の死亡率を約２５％抑制する。
２−移植拒絶
非被膜核、または、ＥＰＳ  ＭＯ２４５およびＡＭＰ（タキプレシン）で被覆した核を、上記した移植試験に使用した。
移植４０日後の核拒絶を測定した。結果を下表に示している。また、結果は、非被膜核を受け取った真珠貝に対する数値として表している。
【表３】
0006158083.tif 000004
ＥＰＳおよびＡＭＰを含有する本発明の膜の存在により、核拒絶を２０％より多く減少させることができる。
【図１】
0006158083.tif 000005
【図２】
0006158083.tif 000006