(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＣＣケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）の細胞外ドメイン内のエピトープに結合し、かつマクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）ならびに／または胸腺および活性化調節ケモカイン（ＴＡＲＣ）のＣＣＲ４への結合を阻害することができる、かつ
ＣＣＲ４＋細胞の抗体依存細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する能力を有し、インビトロで、ＣＣＲ４細胞の５０％細胞溶解に必要な抗体濃度（ＥＣ50）は７００ｎｇ／ｍＬ未満である、
単離されたヒト抗体であって、
（ａ）３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの重鎖可変領域と、３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの軽鎖可変領域とを含み、
前記重鎖可変領域は、
（ｉ）配列番号７のアミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１と、
（ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２と、
（ｉｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３とを含み、
前記軽鎖可変領域は、
（ｉｖ）配列番号１０のアミノ酸配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ１と、
（ｖ）配列番号１１のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２と、
（ｖｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３とを含む、抗体か、
（ｂ）ヒトＣＣＲ４に結合するために抗体（ａ）と競合する、３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの重鎖可変領域と、３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの軽鎖可変領域とを含む抗体であって、
前記重鎖可変領域は、
（ｉ）配列番号１０１のアミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１と、
（ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２と、
（ｉｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３とを含み、
前記軽鎖可変領域は、
（ｉｖ）配列番号１０のアミノ酸配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ１と、
（ｖ）配列番号１１のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２と、
（ｖｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３とを含む、抗体か、あるいは、
（ｃ）ヒトＣＣＲ４に結合するために抗体（ａ）と競合する、３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの重鎖可変領域と、３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの軽鎖可変領域とを含む抗体であって、
前記重鎖可変領域は、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１と、
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２と、
（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３とを含み、
前記軽鎖可変領域は、
（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ１と、
（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２と、
（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３とを含む、抗体である、
前記抗体。
【請求項２】
前記抗体は、
（ａ）配列番号７１もしくは前記配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を有するＶＨドメイン、および／または、配列番号７２もしくは前記配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を有するＶＬドメインを有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体は、
（ｂ）配列番号１０５もしくは前記配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を有するＶＨドメイン、および／または、配列番号７２もしくは前記配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を有するＶＬドメインを有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体は、
（ｃ）配列番号６９もしくは前記配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を有するＶＨドメイン、および／または、配列番号７０もしくは前記配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を有するＶＬドメインを有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体は、完全なヒト抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体は、抗体重鎖定常領域および／または抗体軽鎖定常領域の全てまたは一部分を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体がＩｇＧ抗体である、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体は、配列番号９１、１１９、もしくは８７のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を含む重鎖、および配列番号９２、１２０、もしくは８８のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を含む軽鎖を含む、請求項６に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体は、改変グリコシル化パターンを有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体のＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または少なくとも９９％は、フコースが糖鎖中の還元末端でＮ−アセチルグルコサミンに結合されない糖鎖である、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
少なくとも第２の治療薬または診断薬に結合されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体を含む、免疫抱合体。
【請求項１２】
前記第２の治療薬または診断薬は、放射線治療薬、化学療法薬、血管新生阻害剤、アポトーシス誘導剤、抗チューブリン薬、抗細胞または細胞毒性薬、ステロイド、サイトカイン拮抗薬、サイトカイン発現阻害剤、ケモカイン拮抗薬、ケモカイン発現阻害剤、抗炎症性コルチコステロイドまたはＮＳＡＩＤ、凝固剤、または抗ウイルス剤である、請求項１１に記載の免疫抱合体。
【請求項１３】
前記第２の治療薬または診断薬は、ダウノルビシン、ドキソルビシン、シタラビン、６−チオグアニン、ミトキサントロン、ブスルファン（ミレラン（登録商標））、ダサチニブ（スプリセル（商標））、プレドニゾン、硫酸ビンクリスチン（オンコビン（登録商標））、クロラムブシル、フルダラビン、ペントスタチン、またはクラドリビンから選択される、あるいはヌクレオシド、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、およびプロテアーゼ阻害剤から成る群から選択される抗ウイルス剤である、請求項１２に記載の免疫抱合体。
【請求項１４】
少なくとも請求項１〜１０のいずれか１項に記載の第１の抗体またはその免疫抱合体を含む、薬学的に許容される組成物。
【請求項１５】
リポソームまたはナノ粒子組成物である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
少なくとも第２の治療薬をさらに含む、請求項１４または１５に記載の組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体をコードするヌクレオチド配列領域を含む核酸分子。
【請求項１８】
請求項１７に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項１９】
請求項１７に記載の核酸分子、または請求項１８に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞またはウイルス。
【請求項２０】
少なくとも第１の容器内に、
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体、
請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の免疫抱合体、
請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の組成物、
請求項１７に記載の核酸分子、
請求項１８に記載の発現ベクター、または
請求項１９に記載の宿主細胞またはウイルス、を含む、キット。
【請求項２１】
抗体を産生する方法であって、
（ａ）コードされる抗体を発現するのに効果的な条件下で、請求項１８に記載の発現ベクターを含む宿主細胞を培養することと、
（ｂ）前記宿主細胞から発現した抗体を得ることとを含む、方法。
【請求項２２】
ＣＣＲ４に結合する方法であって、ＣＣＲ４を含む組成物を、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体、またはその免疫抱合体と接触させることを含む、方法。
【請求項２３】
ＣＣＲ４を検出する方法であって、前記ＣＣＲ４と前記抗体との間の複合体の形成を可能にするのに効果的な条件下で、ＣＣＲ４を含有する疑いがある組成物を、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体またはその免疫抱合体と接触させることと、そのように形成された前記複合体を検出することとを含む、方法。
【請求項２４】
動物のＣＣＲ４発現に関連する免疫抑制を軽減する方法のための薬剤の製造における、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体またはその免疫抱合体の使用。
【請求項２５】
ＣＣＲ４によって媒介されるか、ＣＣＲ４＋細胞の異常な増殖を特徴とする、ＣＣＲ４の発現または活性に関連する状態の撮像もしくは診断の方法のための撮像用もしくは診断用の組成物の製造における、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体またはその免疫抱合体の使用。
【請求項２６】
前記状態は癌、炎症性疾患、免疫疾患、または感染である、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
前記感染はウイルス感染である、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
ＣＣＲ４によって媒介されるか、ＣＣＲ４＋細胞の異常な増殖を特徴とする、ＣＣＲ４の発現または活性に関連する状態を治療するための薬剤の製造における、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体またはその免疫抱合体の使用。
【請求項２９】
前記状態は、癌、炎症性疾患、免疫疾患、もしくは感染である、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
前記疾患は、（ａ）アレルギー性疾患、（ｂ）炎症性腸疾患、（ｃ）膣炎、（ｄ）乾癬および炎症性皮膚疾患、（ｅ）脈管炎、（ｆ）脊椎関節症、（ｇ）強皮症、（ｈ）喘息および呼吸器アレルギー性疾患、（ｉ）自己免疫疾患、（ｊ）移植片拒絶、ならびに（ｋ）アテローム性動脈硬化症、筋炎、Ｔ細胞介在神経変性疾患、多発性硬化症、脳炎、髄膜炎、肝炎、腎炎、敗血症、サルコイドーシス、アレルギー性結膜炎、耳炎、キャッスルマン病、静脈洞炎、ＬＰＳ誘発内毒素性ショック、ベーチェット症候群、および痛風から選択される望ましくない炎症応答を阻害すべき他の疾患、（ｌ）乳癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、肝細胞癌、肺癌、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、末梢Ｔ細胞リンパ腫、詳細不明のびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、菌状息肉腫、セザリー症候群から選択される癌、（ｍ）ウイルス感染、から選択される、請求項２８または２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記疾患が、全身性アナフィラキシー、過敏性応答、薬物アレルギー、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ＡＢＰＡ）、虫刺されアレルギー、食物アレルギー、クローン病、潰瘍性大腸炎、回腸炎、腸炎、皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、蕁麻疹、掻痒、アレルギー喘息、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患、過敏性肺病、関節炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、１型糖尿病、糸球体腎炎、同種移植片拒絶、移植片対宿主拒絶反応、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）感染およびＨＩＶ感染から選択される、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
前記抗体またはその免疫抱合体は、請求項１に記載の特徴に加えて、以下、
（ａ）インビボでの抗腫瘍効果の誘導、
（ｂ）ＣＣＲ４＋細胞のＣＤＣの誘導、
（ｃ）ＣＣＲ４リガンドに対するＣＣＲ４介在細胞応答の阻害、
の１つ以上を引き起こす、請求項２４〜３１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３３】
ＣＣＲ４によって媒介されるか、ＣＣＲ４＋細胞の異常な増殖を特徴とする、ＣＣＲ４の発現または活性に関連する状態を治療するための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体またはその免疫抱合体を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、抗体、ＣＣＲ４生物学、および関連治療の分野に関する。より具体的には、それは、ＣＣＲ４に結合する抗体を提供する。そのような抗ＣＣＲ４抗体は、腫瘍の血管を撮像する、癌を治療する、ウイルスおよび他の感染を治療する等の、ＣＣＲ４に関連する疾患および状態、ならびに炎症性および免疫疾患における診断および治療用途を有する。本発明の抗体に基づく組成物および方法は、免疫抱合体および他の治療上の組み合わせの使用、キット、ならびに方法にも及ぶ。
【背景技術】
【０００２】
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、８００を超えるメンバーを含み、シグナル伝達に関与し、ヒトゲノムによってコードされる全遺伝子の２％超の割合を占める細胞表面分子の最大のファミリーである。ＧＰＣＲスーパーファミリーのメンバーは、共通の膜トポロジーである、３つの細胞内環および３つの細胞外環によって結合される、細胞外Ｎ末端、細胞内Ｃ末端、ならびに７回膜貫通（ＴＭ）ヘリックスを共有する。それらの共有されるトポロジー構造に基づいて、ＧＰＣＲは、７回膜貫通（７ＴＭ）受容体とも称される。これらの受容体は、神経伝達、内分泌腺および外分泌腺からのホルモンおよび酵素放出、免疫応答、心筋および平滑筋収縮、ならびに血圧調節を含む、主要な生理学的機能を制御する。それらの機能不全は、最も蔓延しているヒト疾患のいくつかに寄与する。新たに浮上した実験および臨床データは、ＧＰＣＲが癌進行および転移において重大な役割を有することを示す。したがって、いくつかのＧＰＣＲは、抗癌剤に対して好適な標的であり得る可能性が存在する。
【０００３】
ケモカインは、とりわけ、癌、ウイルス感染、喘息、およびアレルギー性疾患を含む、様々な疾患および障害における免疫および炎症応答、ならびにリウマチ性関節炎およびアテローム性動脈硬化症等の自己免疫病変において、重要な役割を果たす。これらの小さい分泌分子は、保存された４つのシステインモチーフを特徴とする、８〜１４ｋＤａタンパク質の成長性スーパーファミリーである。
【０００４】
研究は、ケモカインの作用が、Ｇタンパク質共役受容体のサブファミリーによって媒介されることを示しており、そのうち、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体４、またはＣＣケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）と呼ばれる受容体がある。ＣＣＲ４に対して特異的なリガンドは、ケモカイン胸腺および活性化調節ケモカイン（ＴＡＲＣ）（ＣＣＬ１７としても知られている）ならびにマクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）（ＣＣＬ２２としても知られている）を含む。ＣＣＲ４は、これらのリガンドに反応して、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１およびＭＩＰ−１アルファ、ならびにＣＣＲ４シグナル伝達にも結合することができることも報告された。
【０００５】
ＣＣＲ４は、とりわけ、Ｔ細胞走化性作用および炎症部位への食細胞の移動において重要であると考えられる。ＣＣＲ４は、２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）細胞および調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）上で、優先的に発現される一方で、他の正常な細胞または組織上では、限定された発現のみが発生する。
【０００６】
腫瘍細胞、特に、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫細胞は、ＣＣＲ４陽性であり得る。腫瘍細胞によるＣＣＲ４の発現は、皮膚への浸潤に関連する。ある特定のＴ細胞悪性は、典型的には、皮膚に存在する。例えば、ＣＣＲ４は、皮膚Ｔ細胞リンパ腫病変において高レベルで見出される。最近になって、ＣＣＲ４は、ある特定の固形腫瘍によって発現されることも見出された（国際公開第２００９／０３７４５４号明細書）。ＣＣＲ４発現は、固形腫瘍、特に、頸癌、食道癌、腎臓癌、脳癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、および膵臓癌の癌遺伝子における初期事象であると考えられる。したがって、血液および非血液癌細胞の両方が、ＣＣＲ４を発現し得る。その結果として、これらの癌を、抗ＣＣＲ４抗体を用いて、診断、監視、および治療することができる。
【０００７】
加えて、ＣＣＲ４は、正常な免疫および腫瘍免疫において重要な役割を有する。ＣＤ４+ＣＤ２５+調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の有意な画分は、ＣＣＲ４陽性である（Ｂａａｔａｒ  ｅｔ  ａｌ，２００７ｂ）。これらのＴｒｅｇは、多種多様の機構を介して免疫応答を抑圧し、このことは、それらが腫瘍特異的免疫を阻害することができることを示した。間質に浸潤するＴｒｅｇの増加数、腫瘍自体、または流入領域リンパ節は、多種多様の癌の悪化した結果と相関する。マウスモデルにおける研究は、Ｔｒｅｇ活性を低下させることは、内因性抗腫瘍免疫の増加および免疫系による抗腫瘍の発明の有効性の増加につながる。その結果として、Ｔｒｅｇ機能を阻害することは、腫瘍の免疫療法における有望な戦略である。Ｔｒｅｇを死滅（枯渇）させること、それらの抑圧機能を妨害すること、それらのトラフィッキングパターンを変更すること、またはそれらの分化を変更することによって、阻害を達成することができる。
【０００８】
ＣＣＲ４＋Ｔ細胞白血病／リンパ腫を有する患者の一部において、腫瘍細胞自体が、宿主抗腫瘍免疫応答に逆らって腫瘍生存に寄与しながら、Ｔｒｅｇ細胞として機能する。癌の他の種類において、宿主免疫応答からの腫瘍回避のための好意的な環境を作成するＭＤＣおよびＴＡＲＣは、腫瘍細胞および腫瘍微環境によって産生され、腫瘍にＣＣＲ４＋Ｔｒｅｇ細胞を誘引する。以下の癌、乳癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、肝細胞癌、肺癌、黒色腫、卵巣癌、および膵臓癌を有する患者の末梢血中のＴｒｅｇのより高い発生頻度が報告された。Ｔｒｅｇ細胞は、腫瘍に対して好意的な環境を作成することが報告された。したがって、ＣＣＲ４とＭＤＣ等のそのリガンドとの間の相互作用を阻止することは、癌、特に上に列記される癌の治療または予防において有用であり得る。ＳＣＩＤマウスモデルにおいて、ヒトＭＤＣ／ＣＣＬ２２に対する抗体は、ヒトＴｒｅｇ細胞の移植されたヒト卵巣腫瘍への浸潤を阻止することができたことが報告された。ヒト固形腫瘍に存在するＴｒｅｇ細胞は、腫瘍成長および転移の緩徐化に寄与し得る免疫エフェクター応答の発展を防止すると考えられる。したがって、腫瘍塊中のＴｒｅｇ細胞の死滅、および／またはＣＣＲ４に向けられる中和ＭＡｂ（モノクローナル抗体）を用いてのＴｒｅｇ細胞の腫瘍部位への移動の防止は、固形腫瘍への強化された免疫応答をもたらし、従来の細胞傷害性療法または抗ホルモン療法への補助として作用し得る。
【０００９】
癌は、全てのヒトの約１３％の死因である。米国癌協会によると、２００７年には、世界中で７６０万人が癌で死亡し、したがって、抗癌治療の緊急かつ強い必要性が存在する。
【００１０】
ＣＣＲ４は、炎症および免疫障害における役割を果たすことが示されてきた。Ｔｈ２細胞および好塩基球は、肺および皮膚のアレルギー応答における主要な細胞である。アレルゲン誘発喘息患者の気管支生検におけるＣＣＲ４発現Ｔ細胞の存在および気道上皮細胞上のＣＣＲ４リガンド（ＭＤＣ、ＴＡＲＣ）の同時発現を説明するいくつかの報告が存在する（Ｐａｎｉｎａ−Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ，２００１）。ＣＣＲ４＋Ｔ細胞は、疾患が改善された時に観察されるＣＣＲ４＋Ｔ細胞の著しい減少を伴って、増加した数のアトピー性皮膚炎を有する患者においても見出される。喘息のヒト化ＳＣＩＤマウスモデルを用いて、アレルゲン誘発前の抗体でのＣＣＲ４の遮断は、アレルギー性気道炎症、ならびに肺内のＴｈ２サイトカインのレベルを低減させたことが示された。阻止抗体の肺送達を介してのＣＣＲ４＋Ｔ細胞の枯渇は、喘息患者にとって好適な治療の選択肢であり得る。ＣＣＲ４阻止抗体の皮膚への標的化送達は、アトピー性皮膚炎の魅力的な治療でもあり得る。
【００１１】
アレルギー喘息において、アレルゲン特異的ＩｇＥの高レベルの存在は、一般に吸入される環境アレルゲンに対する異常なＴｈ２細胞免疫応答の反映である。喘息は、Ｔｈ２リンパ球および好酸球の浸潤、ならびにＴｈ２ケモカインの産生を特徴とする。アレルゲンは、新たに入ってくる外来抗原を連続的に試料採取する樹枝状細胞（ＤＣ）によって、Ｔ細胞に提示される。ＤＣによる適切な活性化の際に、疾患のある気道に存在するアレルゲン特異的リンパ球は、白血球管外遊出、杯細胞過形成、および気管支過敏性（ＢＨＲ）をさらに制御するＴｈ２サイトカインインターロイキン（ＩＬ）−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３を産生する。ＤＣによって産生されるＴＡＲＣおよびＭＤＣは、誘発ＣＣＲ４を介して、Ｔｈ２細胞の選択的移動を誘導するが、Ｔｈ１細胞の選択的移動は誘導しない（Ｐｅｒｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ，２００９）。喘息のマウスモデルにおいて、抗ＴＡＲＣ抗体での治療は、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）中のＣＤ４＋Ｔ細胞および好酸球の数、アレルゲン誘発後のＴｈ２サイトカインの産生および気道過敏応答性を低下させたことが示された（Ｋａｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ，２００１）。対照的に、ＣＣＲ４欠損マウスは、気道炎症およびＢＨＲに対する防御を示さなかった（Ｃｈｖａｔｃｈｋｏ  ｅｔ  ａｌ，２０００）。喘息のヒト化ＳＣＩＤマウスモデルを用いて、アレルゲン誘発前の抗体でのＣＣＲ４の遮断は、アレルギー性気道炎症、ならびに肺内のＴｈ２サイトカインのレベルを低減させたことが示された（Ｐｅｒｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ，２００９）。これらのデータは、ＣＣＲ４遮断が、ヒトにおけるアレルギー炎症を阻害するための実行可能な戦略であることを示す。
【００１２】
Ｔｒｅｇ細胞は、樹枝状細胞（ＤＣ）を抑圧し、それによって、疾患、特に、感染性疾患および癌の進展および進行を促進し得る。したがって、Ｔｒｅｇ細胞によって樹枝状細胞の抑圧を阻止することができる抗ＣＣＲ４抗体は、ワクチンにおけるアジュバントとして、特に、感染性疾患に対する腫瘍ワクチン接種またはワクチン接種におけるアジュバントとして、有用であり得る。したがって、抗ＣＣＲ４抗体は、ワクチンの治療効果を強化、特に、ワクチン誘導免疫応答を強化し得る。
【００１３】
ＣＣＲ４結合化合物が、マウスアレルギー炎症において有効性を示すことが報告されている（Ｐｕｒａｎｄａｒｅ  ｅｔ  ａｌ，２００７，Ｂｕｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．２００７）。ＣＣＲ４結合化合物は、ＴＡＲＣによって誘導される腹膜への白血球のＣＣＲ４依存的補充が、ほぼ９０％阻害された時に、インビボで適度な効力を有することが報告されている。Ｙｏｋｏｙａｍａおよび同僚は、マウスモデルの超過敏反応を低下させるのに効果的であるとインビボで証明されたＣＣＲ４を標的化するキナゾリン誘導体（Ｙｏｋｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ，２００８ｂ）、経口投与時に同様のインビボマウスモデルにおいて効果的であると証明されたこの化合物の誘導体（Ｙｏｋｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ，２００９）を提示した。近年、科学者グループは、シリコ内モデル化法を用いていくつかのＣＣＲ４拮抗薬を同定した（Ｂａｙｒｙ  ｅｔ  ａｌ，２００８、Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ，２００９）。化合物をモデルＣＣＲ４にドッキングさせることによって、著者は、膜貫通領域内で結合することができる分子を見出した。１６個の化合物が、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞のＣＣＲ４介在移動を阻害した。ＣＣＲ４拮抗薬を、ヒト型結核菌およびＢ型肝炎ワクチンを用いて、インビボでのそれらのアジュバント機能において試験した時に、強化された免疫原性が、細胞性および体液性免疫応答の両方において観察された。観察された効果は、Ｔｒｅｇ活性の阻害にあるとした（Ｂａｙｒｙ  ｅｔ  ａｌ，２００８、Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ，２００９）。Ｔｒｅｇ細胞の有意な画分がＣＣＲ４陽性であるという事実は、当分野で周知である（Ｂａａｔａｒ  ｅｔ  ａｌ，２００７ｂ）。観察された効果は、（例えば、ウイルス、細菌、マイコバクテリア、または原生生物等の寄生生物によって引き起こされる）感染性疾患に対するワクチン接種においてのみならず、癌ワクチンにおいても有用であると考えられる。
【００１４】
アジュバントとしてのこれらの化合物の有効性の要因は、ＣＣＲ４介在シグナル伝達を阻止することによってＴｒｅｇを阻害することに基づくことから、拮抗様式でＣＣＲ４に結合する抗体は、同一の方法で正常に機能するであろうことが予測され、小分子薬物と比較した抗体の薬理学的利点は、当分野で周知である。現在開発中のＣＣＲ４に対する唯一の抗体は、我々が知る限りでは、Ｋｙｏｗａ−ＨａｋｋｏによるＫＷ−０７６１である。しかしながら、この抗体は、ＡＤＣＣでのみ効果的であり、ＣＣＲ４受容体を介するリガンド介在シグナル伝達を防止しない。したがって、この発明に記載される抗体は、Ｔｒｅｇを介しての免疫反応のそれらの調節において明らかに優位であることが予測される。
【００１５】
Ｔｒｅｇを調節することが臨床使用である別の適用は、癌治療である。Ｔｒｅｇは、腫瘍特異的免疫を阻害することができ、それらの増加した数は、いくつかの癌において、好意的でない予後および疾患進行と相関する。マウスモデルにおける研究は、Ｔｒｅｇ活性を低下させることは、内因性抗腫瘍免疫を高め、かつ能動免疫介入の有効性を増加させることを示す。その結果として、Ｔｒｅｇ機能を阻害することは、ヒト癌免疫療法において考慮するに値する戦略である（Ｃｕｒｉｅｌ，２００８、Ｒｕｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００９）。この阻害を、Ｔｒｅｇを調節すること、およびそれらを直接的に死滅させることの両方で達成することができる。
【００１６】
この取り組みにおける例は、Ｔｒｅｇ様のＣＤ２５の他の表面を標的化する化合物によって当分野で説明される。ダクリズマブ（ゼナパックス（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ））およびバシリキシマブ（シムレクト（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）は、自己免疫疾患、移植、ならびにＨＴＬＶ−１誘発性成人Ｔ細胞リンパ腫／白血病を含む癌で使用することが承認された抗ヒトＣＤ２５抗体である（Ｃｈｕｒｃｈ，２００３）。デニロイキンジフチトクス（オンタック（登録商標）、ＤＡＢ３８９ＩＬ−２、Ｌｉｇａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）は、ジフテリア毒素の活性ドメインをヒトＩＬ−２に融合させる組換えタンパク質である。１９９８年、ＦＤＡは、皮膚Ｔ細胞白血病／リンパ腫を治療するためにこれを承認し（Ｏｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２００１）、これは、通常、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋である。デニロイキンジフチトクスは、ＩＬ−２受容体に対して標的化され、ＣＤ２５を介して、エンドサイトーシスによって内在化されるよう画策される。腎細胞癌を有する患者において、腫瘍ワクチンの免疫原性を改善するという証拠も存在する（Ｄａｎｎｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ，２００５）。加えて、最近の報告は、デニロイキンジフチトクスが、改善された黒色腫特異的免疫を有する黒色腫のＴｒｅｇ数および機能を低下させることを示した（Ｍａｈｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ，２００７）。
【００１７】
癌治療または改善された癌ワクチン効果のために標的化されるＴｒｅｇ上の他の分子は、ＧＩＴＲ（グルココルチコイド誘発性腫瘍壊死因子受容体関連遺伝子）（Ｌｅｖｉｎｇｓ  ｅｔ  ａｌ，２００２）を含み、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、ヒトＴｒｅｇ（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００４、Ｒｕｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００９）および細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１５２）（Ｓｕｔｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００１）を含む、多種多様の哺乳動物細胞上で遍在的に発現される。現在、抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体治療の第ＩＩおよび第ＩＩＩ相臨床試験が、黒色腫で実施されており、第Ｉおよび第ＩＩ相試験が、他の腫瘍種類で実施されている。２つのヒトモノクローナル抗体、イピリムマブ（ＭＤＸ−０１０、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ／Ｍｅｄａｒｅｘ）およびトレメリムマブ（ＣＰ−６７５，２０６、Ｐｆｉｚｅｒ）は、研究中である。
【００１８】
ＣＣＲ４は、とりわけ、以下の障害：成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、詳細不明のびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）感染、菌状息肉腫（成熟Ｔ細胞リンパ腫）、セザリー症候群（菌状息肉腫の変種）、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ＡＢＰＡ）、喘息、ＬＰＳ誘発内毒素性ショック、アレルギー炎症、多発性硬化症（ＭＳ）等のＴ細胞介在神経変性疾患、乾癬、キャッスルマン病、およびリウマチ性関節炎（ＲＡ）等の自己免疫疾患に関与してきた。
【００１９】
ＧＰＣＲは、その複雑な構造により、特定の抗体を産生するのに「困難な標的」として見なされている。それらを、正しく折り畳まれた可溶性タンパク質として、溶解細胞の膜画分から容易に精製することも、異なる発現システムで組換え産生することもできない。本発明者の知る限りでは、これまで、抗ＧＰＣＲ抗体を生成するための他の全ての既知の試みが不成功であったことを証明した。
【００２０】
ＧＰＣＲに対する抗体を生成することに関連する問題は、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９に提示されている。さらに、Ｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）は、ＧＰＣＲケモカイン受容体ＣＸＣＲ４に対するヒト抗体を得るための試みに関する問題を説明し、ステップバック選択と併用してパスファインダー法を用いても、特定の抗体を同定することができなかったと報告している。したがって、ＧＰＣＲの分野において、特定の抗体の生成は、主要課題のままである。
【００２１】
ヒトＣＣＲ４と反応する、１Ｇ１と呼ばれるマウスモノクローナル抗体は、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから市販されている。この抗体を、免疫蛍光染色に使用することができるが、この抗体は、中和抗体ではない。
【００２２】
ＫＭ２７６０と呼ばれるＣＣＲ４に対するキメラ抗体が、Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６に開示される。著者らは、この抗体が、そのリガンドＭＤＣまたはＴＡＲＣへのＣＣＲ４の結合を阻止しないことを報告している。
【発明の概要】
【００２３】
本発明者は、ＣＣＲ４を認識する追加の抗体の同定は、治療上の選択肢の数を拡大させる利益となるであろうことを認識した。具体的には、そのリガンドの１つ以上へのＣＣＲ４の結合を阻止する抗体は、さらなる治療手段を提供するであろう。
【００２４】
本発明者は、免疫学的観点から見て、より耐性の高いヒトの治療用の治療薬の開発が有利であろうことも認識した。この点において、ヒト抗体は、概して、ヒト治療での使用において、少なくとも３つの潜在的利点を有する。第１に、ヒト免疫系は、抗体を外来性と認識すべきでない。第２に、ヒト循環における半減期は、自然発生のヒト抗体に類似し、より少なく、かつ低頻度の用量を与える。第３に、エフェクター部分がヒトであるため、それは、ヒト免疫系の他の部分とより良好に相互作用する。
【００２５】
したがって、当分野では、長期投与を含む、ＣＣＲ４に関わる障害を有する患者の安全かつ効果的な治療で使用することができる抗ＣＣＲ４抗体が、未だ不足しており、そのような抗体の開発への課題を提起する。
【００２６】
具体的には、ＣＣＲ４に対するヒト抗体の必要性が存在する。ヒト抗体は、概して、利点を示すことが認識されているが、それらを候補にするのに十分高い親和性および適切な機能特性を有する、功を奏するヒト治療用のヒト抗体の開発は、決して簡単ではないことが知られている。これは、それらの複合体および膜貫通性質のため、ＧＰＣＲに関する事例にとってはなおさらである。
【００２７】
ＣＣＲ４とＭＤＣおよび／またはＴＡＲＣ等のそのリガンドの１つ以上との間の結合を阻止することができる抗ＣＣＲ４抗体の強い必要性が未だ存在する。
【００２８】
本発明は、腫瘍、ウイルス感染、ならびに炎症性または免疫障害等のＣＣＲ４＋細胞に関わる他の疾患および状態の安全かつ効果的な治療で用いる新規の治療上の組成物および方法を提供することによって、先行技術におけるある特定の制限を打開する。本発明は、ＣＣＲ４の細胞外ドメイン内で、ＣＣＲ４に、好ましくは、エピトープに結合する抗体、特に、ヒト抗体に基づく。そのような抗体は、腫瘍、ウイルス感染、ならびに炎症性または免疫障害等のＣＣＲ４＋細胞に関わる他の疾患および状態の治療に効果的である。本発明の組成物および方法は、抗体のこの特定のカテゴリーを用いる、免疫抱合体および組み合わせの使用にも及ぶ。
【００２９】
本発明の特別な利点は、提供する抗体が、ＭＤＣおよび／またはＴＡＲＣのＣＣＲ４への結合を阻害することである。これは、臨床分野において、ＭＤＣおよび／またはＴＡＲＣのＣＣＲ４への結合を阻害しない主要な抗体と対照的である。
【００３０】
本発明者は、ＣＣＲ４に結合するＣＣＲ４特異的抗体を調製した。例えば、本抗体は、ＣＣＲ４＋細胞、具体的には、ＣＣＲ４トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＣＣＲ４トランスフェクトＤＴ４０−細胞、および自然にＣＣＲ４を発現するＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞に結合する（実施例２を参照のこと）。重要なことには、抗体は、ＣＣＲ４−細胞、すなわち、ＣＣＲ４を発現しない細胞に有意に結合しない。したがって、本明細書に開示の抗体は、ＣＣＲ４に特異的に結合し、それらを本明細書で議論される状態の診断および治療のための好適な候補とする。
【００３１】
ＣＣＲ４の細胞外ドメイン内のエピトープに結合する、本発明の好ましい抗体分子のアミノ酸および／またはＤＮＡ配列、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むそれらのＶＨおよびＶＬドメインは、本明細書に列記される様々な配列番号で説明される。
【００３２】
したがって、本発明は、ＣＣＲ４に結合し、ＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体を提供する。
【００３３】
好ましくは、抗体は、単離される。同様に好ましくは、抗体は、ヒトである。好ましくは、抗体は、ＣＣＲ４の細胞外ドメイン内のエピトープに結合する。ＣＣＲ４は、好ましくは、ヒトである。したがって、「ＣＣＲ４に結合すること」への言及は、「ＣＣＲ４の細胞外ドメイン中のエピトープに結合すること」の好ましい実施形態を含む。
【００３４】
したがって、本発明は、好ましくは、ヒトＣＣＲ４の細胞外ドメイン中のエピトープに結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる、単離されたヒト抗体を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、ヌクレオチドと、とりわけ、クローン１７Ｇの重鎖および軽鎖のアミノ酸配列とを示す。ＳｃＦｖを、ｐＨＯＧ２１内にＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ部位を介してクローン化した。最初のクローン化（ＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＭｌｕＩ、およびＮｏｔＩ）に使用した制限部位は、斜字体で表示され、下線が引かれている。ＶＨとＶＬとの間のリンカー配列は、斜字体である。ｃ−ｍｙｃエピトープおよび６−Ｈｉｓは、それぞれ、下線、二重下線が引かれている。
【図２】図２は、ヌクレオチドと、とりわけ、クローン９Ｅの重鎖および軽鎖のアミノ酸配列とを示す。ＳｃＦｖを、ｐＨＯＧ２１内にＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ部位を介してクローン化した。最初のクローン化（ＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＭｌｕＩ、およびＮｏｔＩ）に使用した制限部位は、斜字体で表示され、下線が引かれている。ＶＨとＶＬとの間のリンカー配列は、斜字体である。ｃ−ｍｙｃエピトープおよび６−Ｈｉｓは、それぞれ、下線、二重下線が引かれている。
【図３】図３は、ヌクレオチドと、とりわけ、クローン１Ｏの重鎖および軽鎖のアミノ酸配列とを示す。ＳｃＦｖを、ｐＨＯＧ２１内にＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ部位を介してクローン化した。最初のクローン化（ＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＭｌｕＩ、およびＮｏｔＩ）に使用した制限部位は、斜字体で表示され、下線が引かれている。ＶＨとＶＬとの間のリンカー配列は、斜字体である。ｃ−ｍｙｃエピトープおよび６−Ｈｉｓは、それぞれ、下線、二重下線が引かれている。
【図４】図４は、ヌクレオチドと、とりわけ、クローン１１Ｆの重鎖および軽鎖のアミノ酸配列とを示す。ＳｃＦｖを、ｐＨＯＧ２１内にＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ部位を介してクローン化した。最初のクローン化（ＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＭｌｕＩ、およびＮｏｔＩ）に使用した制限部位は、斜字体で表示され、下線が引かれている。ＶＨとＶＬとの間のリンカー配列は、斜字体である。ｃ−ｍｙｃエピトープおよび６−Ｈｉｓは、それぞれ、下線、二重下線が引かれている。
【図５】図５は、実施例２のフローサイトメトリーの結果うちのいくつかを示す。抗体１７Ｇ  ＩｇＧおよび９Ｅ  ＩｇＧのＣＣＲ４特異性を、ＣＣＲ４トランスフェクトおよび非トランスフェクトＤＴ４０細胞を染色することによって確認した。抗ＣＣＲ４抗体ＫＭ３０６０ｖａｒ  ＩｇＧは、陽性対照の役割をし、抗ＧＦＰ  ＩｇＧを、この実験で陰性対照として使用した。
【図６】図６は、実施例２のフローサイトメトリーの結果うちのいくつかを示す。細胞株ＣＣＲＦ−ＣＥＭを発現するＣＣＲ４への抗ＣＣＲ４抗体ＫＭ３０６０ｖａｒ、１７Ｇ、９Ｅの結合を、フローサイトメトリーを用いて分析した。細胞の染色を三重に実行し、エラーバーは、小さすぎて見ることができない標準偏差を示す。陰性対照抗体の抗ＧＦＰは、任意の染色シグナルを示さなかった。
【図７】図７は、実施例２のフローサイトメトリーの結果うちのいくつかを示す。１Ｏ抗体のＣＣＲ４特異性を、ＣＣＲ４トランスフェクトおよび非トランスフェクトＤＴ４０−細胞を染色することによって確認した。抗ＧＦＰ  ｓｃＦｖは、この実験で、陰性対照の役割をした。
【図８】図８は、実施例２のフローサイトメトリーの結果うちのいくつかを示す。１１Ｆ抗体のＣＣＲ４特異性を、ＣＣＲ４トランスフェクトおよび非トランスフェクトＤＴ４０−細胞を染色することによって確認した。抗ＶＺＶ  ｓｃＦｖは、この実験で、陰性対照の役割をした。
【図９】図9は、実施例３の結果のいくつかを示すグラフである。抗ＣＣＲ４抗体１１Ｆ、９Ｅ、１７Ｇ、および１Ｏは、異なる濃度のＭＤＣとの予インキュベーション後に、ｓｃＦｖを有する細胞を染色することによって、フローサイトメトリーで決定されるように、ＣＣＲ４トランスフェクトＤＴ４０細胞に結合するリガンドＭＤＣを妨害する。先の報告と一致して、抗体ＫＭ３０６０ｖａｒは、ＣＣＲ４受容体に結合するＭＤＣを妨害しなかった。
【図１０】図１０Ａ、Ｂ、およびＣは、実施例４の競合アッセイの結果を示すグラフである。抗体のＣＣＲ４への結合は、試験抗体（すなわち、推定の競合相手）の増加濃度に対してプロットされる最大結合（すなわち、任意の競合相手の不在下での結合）の割合として示される。
【図１０Ａ】図１０Aは、非ビチオン化１７Ｇ、９Ｅ、およびＫＭ３０６０ｖａｒ  ＩｇＧの存在下での、ＣＣＲ４トランスフェクトＤＴ４０−細胞への０．２８ｎＭのビチオン化１７Ｇ  ＩｇＧの結合を示す。抗体９Ｅの存在が、ＣＣＲ４に結合する１７Ｇの量の減少を引き起こす一方で、ＫＭ３０６０ｖａｒは、１７ＧのＣＣＲ４への結合への任意のはっきりと認識できる効果を有さず、１７Ｇおよび９Ｅは、ＣＣＲ４に結合するために、相互に競合することを示す。
【図１０Ｂ】図１０Bは、非ビチオン化１７Ｇ、９Ｅ、およびＫＭ３０６０ｖａｒの存在下での、ＣＣＲ４トランスフェクトＤＴ４０−細胞への７ｎＭのビチオン化９Ｅ  ＩｇＧの結合を示す。抗体１７Ｇの存在が、ＣＣＲ４に結合する９Ｅの量の減少を引き起こす一方で、ＫＭ３０６０ｖａｒは、９ＥのＣＣＲ４への結合への任意のはっきりと認識できる効果を有さず、１７Ｇおよび９Ｅは、ＣＣＲ４に結合するために、相互に競合するという図１０Ａの結果を確認する。
【図１０Ｃ】図１０Cは、非ビチオン化１７Ｇ、９Ｅ、およびＫＭ３０６０ｖａｒの存在下での、ＣＣＲ４トランスフェクトＤＴ４０−細胞への６．８ｎＭのビチオン化ＫＭ３０６０ｖａｒ  ＩｇＧの結合を示す。１７Ｇと９Ｅのいずれも、ＣＣＲ４に結合するために、ＫＭ３０６０ｖａｒと競合しないことを理解することができる。
【図１１】図１１は、９Ｅ、１７Ｇ、およびＫＭ３０６０ｖａｒ  ＩｇＧでのカルシウム流阻害をアッセイした実施例５の結果を示す。フルオ−４で標識化した天然ＣＣＲ４+ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞株を、抗体と予インキュベートし、その後、ＴＡＲＣ（Ａ）またはＭＤＣ（Ｂ）リガンドで刺激した。リガンド添加の約１５秒後、細胞の記録を開始した。図の高ピークで見られるように、ＴＡＲＣおよびＭＤＣの両方ともに、カルシウム流を引き起こす。ＴＡＲＣ誘導カルシウム流は、それぞれ、１７Ｇおよび９Ｅによってほぼ完全に阻害されるが、ＫＭ３０６０ｖａｒによっては阻害されない。ＭＤＣ誘導カルシウム流は、それぞれ、１７Ｇおよび９Ｅによっても強力に阻害されるが、ＫＭ３０６０ｖａｒによっては阻害されない。
【図１２Ａ．Ｂ】図１２ＡおよびＢは、実施例６の抗体依存細胞細胞傷害（ＡＤＣＣ）結果を示す。図は、１７Ｇ（図１２Ｂ）および９Ｅ（図１２Ａ）が、ヒトＰＢＭＣの存在下で、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞のＡＤＣＣを誘導することができることを示す。
【図１３】図１３は、実施例２からの結果のいくつかを示すグラフである。抗体９Ｅ１０Ｊおよび９Ｅ１ＤのＣＣＲ４特異性を、ＣＣＲ４トランスフェクトおよび非トランスフェクトＤＴ４０細胞を染色することによって確認した。９Ｅは、この実験で、陽性対照の役割をした。ＣＣＲ４＋細胞への結合は、薄灰色のバーを用いて示される。ＣＣＲ４−細胞への結合は、濃灰色のバーを用いて示され、濃灰色のバーがないということは、有意な結合を検出することができなかったことを意味する。
【図１４】図１４は、実施例３からの結果のいくつかを示すグラフである。ＣＣＲ４トランスフェクトＤＴ−４０細胞への抗ＣＣＲ４ｓｃＦｖ抗体１７Ｇ、９Ｅ、１Ｏ、１１Ｆ、およびＭ３０６０ｖａｒの結合を、フローサイトメトリーによって決定されたように、ＣＣＲ４リガンドＴＡＲＣの存在下、または不在下でアッセイした。
【図１５】図１５は、実施例４からの結果のいくつかを示す。ＤＴ−４０−ＣＣＲ４+（ａ−ｂ）またはＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞（ｃ）上の非標識ＩｇＧ  ９Ｅ、９Ｅ１０Ｊ、もしくはＫＭ３０６０ｖａｒの増加濃度の存在下での０．７（ａ、ｃ）または３．３ｎＭ（ｂ）のいずれかの濃度のビチオン化ＩｇＧ１  ９Ｅの一定量の競合滴定。結合したビチオン化ＩｇＧの検出をＳｔｒｅｐ−ＰＥで実行した。ＭＦＩ＝平均蛍光強度。
【図１６】図１６は、実施例５からの結果のいくつかを示す。Ｃａ++流アッセイを、重複した濃度間隔を用いて、フルオ−４で標識化したＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞上で行った。ＣＣＲ４特異的リガンドＴＡＲＣを添加する前に、細胞を、１５分間、９Ｅ、９Ｅ１０Ｊ、またはＫＭ３０６０ｖａｒ  ＩｇＧと予インキュベートした。ＩｇＧ濃度は、０．００１μｇ／ｍＬ（ａ）、０．０１μｇ／ｍＬ（ｂ）、０．１μｇ／ｍＬ（ｃ）、０．１μｇ／ｍＬ（ｅ）、１．０μｇ／ｍＬ（ｆ）、および１０μｇ／ｍＬ（ｇ）であった。それぞれ、左列および右列のパネル（ｄ）および（ｈ）に示されるように、濃度曲線下面積（ＡＵＣ）を、ソフトウェアＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて統合し、ＴＡＲＣ単独での最大刺激におけるＡＵＣの割合としてプロットした。
【図１７】図１７は、実施例５からの結果のいくつかを示す。Ｃａ++流アッセイを、重複した濃度間隔を用いて、フルオ−４で標識化したＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞上で行った。ＣＣＲ４特異的リガンドＴＡＲＣを添加する前に、細胞を、１５分間、９Ｅ１０ＪまたはＫＭ３０６０ｖａｒ  ＩｇＧと予インキュベートした。広範囲のＩｇＧ濃度を使用した。シグナルを記録し、濃度曲線下面積（ＡＵＣ）を、ソフトウェアＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて統合し、ＴＡＲＣ単独での最大刺激におけるＡＵＣの割合としてプロットした。
【図１８】図１８は、抗ＣＣＲ４抗体によって媒介されるＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞のＡＤＣＣに関する、実施例６からの結果のいくつかを示す。図１８（ａ）ＩｇＧ  ９ＥとＩｇＧ  ９Ｅ１０Ｊとの比較、図１８（ｂ）９Ｅ１０ＪとＫＭ３０６０ｖａｒとの比較。
【図１９】図１９は、実施例１０からの結果のいくつかを示す。ＣＣＲ４（＋）を安定的にトランスフェクトした、またはすなわち、ＣＣＲ４陰性（−）非トランスフェクトＤＴ４０細胞への脱フコシル化９Ｅ１０Ｊ（９Ｅ１０Ｊｄｅｆ）、未修飾９Ｅ１０ＪおよびＫＭ３０６０ｖａｒの結合。２０μｇ／ｍｌの濃度での結合シグナルを示す。結合を、抗ヒトＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）（ヤギ）抱合ＩｇＧを用いて検出した。
【図２０】図２０は、実施例１１からの結果のいくつかを示す。脱フコシル化９Ｅ１０Ｊ（９Ｅ１０Ｊｄｅｆ）を未修飾９Ｅ１０ＪおよびＫＭ３０６０ｖａｒと比較した、抗ＣＣＲ４抗体によって媒介されるＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞のＡＤＣＣ。
【図２１】図２１は、実施例１４からの結果のいくつかを示す。ＤＴ−４０ＣＣＲ４+細胞（ａ）およびヒトＴ細胞白血病細胞ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（ｂ）上でのＩｇＧ  ９Ｅ、９Ｅ１Ｄ、およびＫＭ３０６０ｖａｒの結合滴定。検出を抗ヒトＦＩＴＣで実行した。ＭＦＩ、平均蛍光強度。
【図２２】図２２は、実施例１４からの結果のいくつかを示す。ＤＴ−４０ＣＣＲ４+細胞上でのｓｃＦｖ  ９Ｅ、９Ｅ１Ｄ、および９Ｅ１０Ｊの結合滴定。二量体ＩｇＧ様状態をシュミレートするために、ｓｃＦｖを、ｍｙｃ−ｔａｇを介して交差結合した。検出を抗ヒトＰＥで実行した。ＭＦＩ、平均蛍光強度。
【図２３】図２３は、実施例１４からの結果のいくつかを示す。ヒトＴ細胞白血病細胞ＣＣＲＦ−ＣＥＭ上でのＩｇＧ  ９Ｅ、９Ｅ１０Ｊ、およびＫＭ３０６０ｖａｒの結合滴定。検出を抗ヒトＰＥで実行した。ＭＦＩ、平均蛍光強度。
【図２４】図２４は、実施例９からの結果のいくつかを示す。ＤＴ−４０−ＣＣＲ４+（ａ）もしくはＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞（ｂ〜ｄ）上の非標識抗体（ｓｃＦｖもしくはＩｇＧ  ９Ｅ１０Ｊ）またはＣＣＲ４リガンド（ＭＤＣ）のいずれかの増加濃度の存在下での、ビチオン化ＭＤＣの一定量の競合滴定（ａ、ｂではｃａ．１０ｎＭ、およびｃ、ｄではｃａ．２０ｎＭ）。結合したビチオン化ＭＤＣの検出を、Ｓｔｒｅｐ−ＰＥで実行した。ＭＦＩ、平均蛍光強度。
【図２５】図２５は、実施例９からの結果のいくつかを示す。ＤＴ−４０−ＣＣＲ４+（ａ、ｂ）もしくはＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞（ｃ、ｄ）上の非標識抗体（ＩｇＧ  ９Ｅ１０Ｊ）またはＣＣＲ４リガンド、ＭＤＣもしくはＴＡＲＣのいずれかの増加濃度の存在下での、ビチオン化ＴＡＲＣ（ｃａ．２０ｎＭ）の一定量の競合滴定。結合したビチオン化ＴＡＲＣの検出を、Ｓｔｒｅｐ−ＰＥを用いて実行した。（ｂ）および（ｄ）において、細胞とのタンパク質のインキュベーションを、１％ＢＳＡの存在下で実行した。ＭＦＩ、平均蛍光強度。
【図２６】図２６は、実施例９からの結果のいくつかを示す。非標識抗体９Ｅ、９Ｅ１０Ｊ、または非標識リガンドの増加量の存在下での、ビチオン化ＭＤＣ（ａ）およびＴＡＲＣ（ｂ）の一定量の競合滴定。
【図２７】図２７は、とりわけ、クローン９Ｅ１０Ｊの重鎖および軽鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。ｐＨＯＧ２１へのＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ部位を介して、ＳｃＦｖをクローン化した。最初のクローン化（ＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＭｌｕＩ、およびＮｏｔＩ）に使用した制限部位は、斜字体で表示され、下線が引かれている。ＶＨとＶＬとの間のリンカー配列は、斜字体である。ｃ−ｍｙｃエピトープおよび６Ｈｉｓは、それぞれ、下線、二重下線が引かれている。
【図２８】図２８は、とりわけ、クローン９Ｅ１Ｄの重鎖および軽鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。ｐＨＯＧ２１へのＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ部位を介して、ＳｃＦｖをクローン化した。最初のクローン化（ＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＭｌｕＩ、およびＮｏｔＩ）に使用した制限部位は、斜字体で表示され、下線が引かれている。ＶＨとＶＬとの間のリンカー配列は、斜字体である。ｃ−ｍｙｃエピトープおよび６Ｈｉｓは、それぞれ、下線、二重下線が引かれている。
【図２９】図２９は、実施例１３のいくつかの結果を示す。抗ＣＣＲ４抗体および対照によるリガンド（ＴＡＲＣ、３．５ｎＭ）誘導細胞移動の阻害。ヒトＴ細胞白血病ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞を、Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ−ＭＩＣチャンバ中に移動するよう誘導した。リガンドＴＡＲＣを下方のチャンバ内に設置し、細胞を、対照としてのみ、上方のチャンバ内で抗体または媒体と共インキュベートした。下方のチャンバに移動した細胞を検出かつ計数した。三通りの平均およびＳＤ値をプロットする。（ａ）９Ｅおよび抗ＧＦＰと比較した、９Ｅ１０ＪのＴＡＲＣ誘導移動の阻害。（ｂ）１Ｇ１およびＫＭ３０６０ｖａｒと比較した、９Ｅ１０ＪのＴＡＲＣ誘導移動の阻害。
【図３０】図３０は、実施例１６からのいくつかの結果を示す。末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の染色。リンパ球を、全細胞集団からゲーティングした。Ｔ細胞を、抗ＣＤ３−ＡＰＣ−ＩｇＧ（ヒト）および抗ＣＤ８−ＰＥ−Ｃｙ５−ＩｇＧ（ヒト）とのインキュベーション時にゲーティングした。ビチオン化９Ｅ１０Ｊおよびビチオン化コンパレータＫＭ３０６０ｖａｒを、２０μｇ／ｍｌから０．３ｎｇ／ｍｌに滴定し、ＰＥ抱合ストレプトアビジンで検出した。用いたＰＢＬは、ａ．）リンパ球集団のゲーティング、ｂ．）ＣＤ３陽性細胞のゲーティングおよびＣＤ８陽性（ＣＤ４陰性）およびＣＤ８陰性（ＣＤ４陽性）細胞への細分、ｃ．）陽性事象の％で発現した、ゲーティングされたＣＤ８陰性（ＣＤ４−陽性）細胞上の９Ｅ１０ＪおよびＫＭ３０６０ｖａｒの滴定曲線。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
一実施形態において、本発明は、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体を提供し、配列番号１、７、１９、１０１、１２５、１２６、１３５、もしくは１３６のアミノ酸配列、あるいはこれらの配列のうちのいずれか１つに実質的に相同な配列を含む、重鎖ＣＤＲ１ドメインを含み、配列番号１０１、１２５、１２６、１３５、および１３６が特に好ましい。
【００３７】
この代わりに、またはこれに加えて、本発明の一実施形態において、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体は、配列番号２、８、２０、１２７、もしくは１２８のアミノ酸配列、またはこれらの配列のうちのいずれか１つに実質的に相同な配列を含む、重鎖ＣＤＲ２ドメインを含み、配列番号８、１２７、および１２８が特に好ましい。
【００３８】
この代わりに、またはこれに加えて、本発明の一実施形態において、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体は、配列番号３、９、１５、もしくは２１のアミノ酸配列、またはこれらの配列のうちのいずれか１つに実質的に相同な配列を含む、重鎖ＣＤＲ３ドメインを含み、配列番号９が特に好ましい。
【００３９】
この代わりに、またはこれに加えて、本発明の一実施形態において、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体は、配列番号４、１０、１６、２２、１０８、１２９、もしくは１３０のアミノ酸配列、またはこれらの配列のうちのいずれか１つに実質的に相同な配列を含む、軽鎖ＣＤＲ１ドメインを含み、配列番号１０、１２９、もしくは１３０が特に好ましい。
【００４０】
この代わりに、またはこれに加えて、本発明の一実施形態において、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体は、配列番号５、１１、１７、２３、１１０、１３１、もしくは３２のアミノ酸配列、またはこれらの配列のうちのいずれか１つに実質的に相同な配列を含む、軽鎖ＣＤＲ２ドメインを含み、配列番号１１、１３１、および１３２が特に好ましい。
【００４１】
この代わりに、またはこれに加えて、本発明の一実施形態において、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体は、配列番号６、１２、１８、２４、１１２、１３３、１３４、１３７、もしくは１３８のアミノ酸配列、またはこれらの配列のうちのいずれか１つに実質的に相同な配列を含む、軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含み、配列番号１２、１３３、１３４、１３７、および１３８が特に好ましい。
【００４２】
配列番号１３３および１３４は、位置１１でアミノ酸Ｙを含有するが、これらの配列の位置１１でのアミノ酸がＶであることが好ましい。配列番号１３７および１３８は、位置１１でのアミノ酸がＶであることを除いて、配列番号１３３および１３４に相当する。したがって、本明細書に開示の任意の実施形態において、配列番号１３３への任意の言及は、配列番号１３７への言及を含むことが理解されるはずであり、配列番号１３４への任意の言及は、配列番号１３８への言及を含むことが理解されるはずである。
【００４３】
したがって、特定の実施形態では、本発明は、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる、１つ以上の重鎖ＣＤＲドメインを含む抗体を提供し、重鎖ＣＤＲドメインは、
（ａ）配列番号１、７、１９、１０１、１２５、もしくは１２６のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含む、重鎖ＣＤＲ１ドメインと、
（ｂ）配列番号２、８、２０、１２７、もしくは１２８のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含む、重鎖ＣＤＲ２ドメインと、
（ｃ）配列番号３、９、１５、もしくは２１のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含む、重鎖ＣＤＲ３ドメインと、から成る群から選択される。
【００４４】
本発明は、特定の実施形態において、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる、１つ以上の軽鎖ＣＤＲドメインを含む抗体も提供し、軽鎖ＣＤＲドメインは、
（ａ）配列番号４、１０、１６、２２、１０８、１２９、もしくは１３０のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含む、軽鎖ＣＤＲ１ドメインと、
（ｂ）配列番号の５、１１、１７、２３、１１０、１３１、もしくは１３２アミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含む、軽鎖ＣＤＲ２ドメインと、
（ｃ）配列番号の６、１２、１８、２４、１１２、１３３、１３４、１３７、もしくは１３８アミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含む、軽鎖ＣＤＲ３ドメインと、から成る群から選択される。
【００４５】
特定の好ましい実施形態において、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体は、
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ３と、
（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ３と、の両方を含む。
【００４６】
より好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列、および／または配列番号４、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含むＣＤＲ１ドメイン、ならびに／あるいは配列番号２のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列、および／または配列番号５、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含むＣＤＲ２ドメインも存在する。
【００４７】
特定の好ましい実施形態において、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体は、
（ａ）配列番号９のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ３と、
（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ３と、の両方を含む。
【００４８】
より好ましくは、配列番号７のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列、および／または配列番号１０、もしくはそれに対して実質的に相同な配列、および／または配列番号１０１、またはそれに対して実質的に相同な配列を含むＣＤＲ１ドメイン、ならびに／あるいは配列番号８のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列、および／または配列番号１１、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含むＣＤＲ２ドメインも存在する。
【００４９】
特定の好ましい実施形態において、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体は、
（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ３と、
（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ３と、の両方を含む。
【００５０】
より好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列、および／または配列番号１６、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含むＣＤＲ１ドメイン、ならびに／あるいは配列番号２のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列、および／または配列番号１７、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含むＣＤＲ２ドメインも存在する。
【００５１】
特定の好ましい実施形態において、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体は、
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ３と、
（ｂ）配列番号２４のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ３と、の両方を含む。
【００５２】
より好ましくは、配列番号１９のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列、および／または配列番号２２、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含むＣＤＲ１ドメイン、ならびに／あるいは配列番号２０のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列、および／または配列番号２３、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含むＣＤＲ２ドメインも存在する。
【００５３】
特定の好ましい実施形態において、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体は、
（ａ）配列番号９のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ３と、
（ｂ）配列番号１１２のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ３と、の両方を含む。
【００５４】
より好ましくは、配列番号７のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列、および／または配列番号１０８、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含むＣＤＲ１ドメイン、ならびに／あるいは配列番号８のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列、および／または配列番号１１０、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含むＣＤＲ２ドメインも存在する。
【００５５】
特定の好ましい実施形態において、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体は、
（ａ）配列番号９のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ３と、
（ｂ）配列番号１３３、１３４、１３７、もしくは１３８のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ３と、の両方を含む。
【００５６】
より好ましくは、配列番号１２５もしくは１２６のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列、および／または配列番号１２９もしくは１３０、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含むＣＤＲ１ドメイン、ならびに／あるいは配列番号１２７もしくは１２８のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列、および／または配列番号１３１もしくは１３２、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含むＣＤＲ２ドメインも存在する。
【００５７】
好ましい一実施形態において、配列番号１のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含むＣＤＲ２、および配列番号３のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含むＣＤＲ３は、単独で、または組み合わせで存在する。
【００５８】
さらに別の好ましい実施形態において、配列番号４のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含むＣＤＲ２、および配列番号６のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含むＣＤＲ３は、単独で、または組み合わせで存在する。
【００５９】
好ましい一実施形態において、配列番号７のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含むＣＤＲ２、および配列番号９のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含むＣＤＲ３は、単独で、または組み合わせで存在する。
【００６０】
好ましい一実施形態において、配列番号１０１のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含むＣＤＲ２、および配列番号９のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含むＣＤＲ３は、単独で、または組み合わせで存在する。
【００６１】
さらに別の好ましい実施形態において、配列番号１０のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１２のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含むＣＤＲ３は、単独で、または組み合わせで存在する。
【００６２】
さらに別の好ましい実施形態において、配列番号１０８のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１０のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１１２のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含むＣＤＲ３は、単独で、または組み合わせで存在する。
【００６３】
好ましい一実施形態において、配列番号１のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１５のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含むＣＤＲ３は、単独で、または組み合わせで存在する。
【００６４】
さらに別の好ましい実施形態において、配列番号１６のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１８のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含むＣＤＲ３は、単独で、または組み合わせで存在する。
【００６５】
好ましい一実施形態において、配列番号１９のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含むＣＤＲ２、および配列番号２１のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含むＣＤＲ３は、単独で、または組み合わせで存在する。
【００６６】
さらに別の好ましい実施形態において、配列番号２２のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含むＣＤＲ２、および配列番号２４のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含むＣＤＲ３は、単独で、または組み合わせで存在する。
【００６７】
好ましい一実施形態において、配列番号１２５もしくは１２６のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１２７もしくは１２８のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含むＣＤＲ２、および配列番号９のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含むＣＤＲ３は、単独で、または組み合わせで存在する。
【００６８】
さらに別の好ましい実施形態において、配列番号１２９もしくは１３０のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１３１もしくは１３２のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１３３、１３４、１３７、もしくは１３８のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を含むＣＤＲ３は、単独で、または組み合わせで存在する。
【００６９】
見方を変えれば、特定の実施形態において、本発明は、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体を提供し、配列番号３のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメイン、および／または配列番号６のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含む。
【００７０】
本抗体は、任意選択で、配列番号２のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン、および／または配列番号５のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメインをさらに含み、ならびに／あるいは、配列番号１のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメイン、および／または配列番号４のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメインをさらに含む。
【００７１】
特定の実施形態において、本発明は、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体を提供し、配列番号９のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメイン、および／または配列番号１２のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含む。
【００７２】
本抗体は、任意選択で、配列番号８のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン、および／または配列番号１１のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメインをさらに含み、ならびに／あるいは、配列番号７のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメイン、および／または配列番号１０のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメインをさらに含む。
【００７３】
特定の実施形態において、本発明は、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体を提供し、配列番号９のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメイン、および／または配列番号１１２のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含む。
【００７４】
本抗体は、任意選択で、配列番号８のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン、および／または配列番号１１０のアミノ酸配列を含む、もしくはそれに対して実質的に相同な配列軽鎖ＣＤＲ２ドメインをさらに含み、ならびに／あるいは、配列番号７もしくは１０１のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメイン、および／または配列番号１０８のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメインをさらに含む。
【００７５】
特定の実施形態において、本発明は、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体を提供し、配列番号１５のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメイン、および／または配列番号１８のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含む。
【００７６】
本抗体は、任意選択で、配列番号２のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン、および／または配列番号１７のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメインをさらに含み、ならびに／あるいは、配列番号１のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメイン、および／または配列番号１６のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメインをさらに含む。
【００７７】
特定の実施形態において、本発明は、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体を提供し、配列番号２１のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメイン、および／または配列番号２４のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含む。
【００７８】
本抗体は、任意選択で、配列番号２０のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン、および／または配列番号２３のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメインをさらに含み、ならびに／あるいは、配列番号１９のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメイン、および／または配列番号２２のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメインをさらに含む。
【００７９】
特定の実施形態において、本発明は、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体を提供し、配列番号９のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメイン、および／または配列番号１３３、１３４、１３７、もしくは１３８のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含む。
【００８０】
本抗体は、任意選択で、配列番号１２７もしくは１２８のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン、および／または配列番号１３１もしくは１３２のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメインをさらに含み、ならびに／あるいは、配列番号１２５もしくは１２６のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメイン、および／または配列番号１２９もしくは１３０のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメインをさらに含む。
【００８１】
見方を変えれば、特定の実施形態において、本発明は、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体を提供し、配列番号２のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン、および／または配列番号５のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメインを含む。
【００８２】
本抗体は、任意選択で、配列番号３のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメイン、および／または配列番号６のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインをさらに含み、ならびに／あるいは、配列番号１のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメイン、および／または配列番号４のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメインをさらに含む。
【００８３】
特定の実施形態において、本発明は、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体を提供し、配列番号８、１２７、もしくは１２８のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン、および／または配列番号１１、１３１、もしくは１３２のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメインを含む。
【００８４】
本抗体は、任意選択で、配列番号９のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメイン、および／または配列番号１２、１３３、１３４、１３７、もしくは１３８のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインをさらに含み、ならびに／あるいは、配列番号７、１０１、１２５、もしくは１２６のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメイン、および／または配列番号１０、１２９、もしくは１３０のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメインをさらに含む。
【００８５】
特定の実施形態において、本発明は、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体を提供し、配列番号８のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン、および／または配列番号１１０のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメインを含む。
【００８６】
本抗体は、任意選択で、配列番号９のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメイン、および／または配列番号１１２のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインをさらに含み、ならびに／あるいは、配列番号７のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメイン、および／または配列番号１０８のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメインをさらに含む。
【００８７】
特定の実施形態において、本発明は、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体を提供し、配列番号２のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン、および／または配列番号１７のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメインを含む。
【００８８】
本抗体は、任意選択で、配列番号１５のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメイン、および／または配列番号１８のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインをさらに含み、ならびに／あるいは、配列番号１のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメイン、および／または配列番号１６のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメインをさらに含む。
【００８９】
見方を変えれば、特定の実施形態において、本発明は、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体を提供し、配列番号２０のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン、および／または配列番号２３のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメインを含む。
【００９０】
本抗体は、任意選択で、配列番号２１のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメイン、および／または配列番号２４のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインをさらに含み、ならびに／あるいは、配列番号１９のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメイン、および／または配列番号２２のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメインをさらに含む。
【００９１】
見方を変えれば、特定の実施形態において、本発明は、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体を提供し、配列番号１のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメイン、および／または配列番号４のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメインを含む。
【００９２】
本抗体は、任意選択で、配列番号３のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメイン、および／または配列番号６のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインをさらに含み、ならびに／あるいは、配列番号２のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン、および／または配列番号５のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメインをさらに含む。
【００９３】
特定の実施形態において、本発明は、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体を提供し、配列番号７、１２５、もしくは１２６のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメイン、および／または配列番号１０、１２９、もしくは１３０のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメインを含む。
【００９４】
本抗体は、任意選択で、配列番号９のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメイン、および／または配列番号１２、１３３、１３４、１３７、もしくは１３８のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインをさらに含み、ならびに／あるいは、配列番号８、１２７、もしくは１２８のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン、および／または配列番号１１、１３１、もしくは１３２のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメインをさらに含む。
【００９５】
見方を変えれば、特定の実施形態において、本発明は、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体を提供し、配列番号１０１のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメイン、および／または配列番号１０のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメインを含む。
【００９６】
本抗体は、任意選択で、配列番号９のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメイン、および／または配列番号１２のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインをさらに含み、ならびに／あるいは、配列番号８のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン、および／または配列番号１１のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメインをさらに含む。
【００９７】
特定の実施形態において、本発明は、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体を提供し、配列番号７のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメイン、および／または配列番号１０８のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメインを含む。
【００９８】
本抗体は、任意選択で、配列番号９のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメイン、および／または配列番号１１２のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインをさらに含み、ならびに／あるいは、配列番号８のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン、および／または配列番号１１０のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメインをさらに含む。
【００９９】
特定の実施形態において、本発明は、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体を提供し、配列番号１のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメイン、および／または配列番号１６のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメインを含む。
【０１００】
本抗体は、任意選択で、配列番号１５のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメイン、および／または配列番号１８のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインをさらに含み、ならびに／あるいは、配列番号２のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン、および／または配列番号１７のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメインをさらに含む。
【０１０１】
特定の実施形態において、本発明は、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体を提供し、配列番号１９のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメイン、および／または配列番号２２のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメインを含む。
【０１０２】
本抗体は、任意選択で、配列番号２１のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメイン、および／または配列番号２４のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインをさらに含み、ならびに／あるいは、配列番号２０のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン、および／または配列番号２３のアミノ酸配列、もしくはそれに対して実質的に相同な配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメインをさらに含む。
【０１０３】
本発明の特定の好ましい抗体は、配列番号１、２、３、４、５、および６から成る群から選択されるＣＤＲの１つ以上、または前述の配列番号のうちのいずれか１つに対して実質的に相同な配列を含む。
【０１０４】
本発明の特定の好ましい抗体は、配列番号７、８、９、１０、１１、および１２から成る群から選択されるＣＤＲの１つ以上、または前述の配列番号のうちのいずれか１つに対して実質的に相同な配列を含む。
【０１０５】
本発明の特定の好ましい抗体は、配列番号１０１、８、９、１０、１１、および１２から成る群から選択されるＣＤＲの１つ以上、または前述の配列番号のうちのいずれか１つに対して実質的に相同な配列を含む。
【０１０６】
本発明の特定の好ましい抗体は、配列番号７、８、９、１０８、１１０、および１１２から成る群から選択されるＣＤＲの１つ以上、または前述の配列番号のうちのいずれか１つに対して実質的に相同な配列を含む。
【０１０７】
本発明の特定の好ましい抗体は、配列番号１、２、１５、１６、１７、および１８から成る群から選択されるＣＤＲの１つ以上、または前述の配列番号のうちのいずれか１つに対して実質的に相同な配列を含む。
【０１０８】
本発明の特定の好ましい抗体は、配列番号１９、２０、２１、２２、２３、もしくは２４から成る群から選択されるＣＤＲの１つ以上、または前述の配列番号のうちのいずれか１つに対して実質的に相同な配列を含む。
【０１０９】
本発明の特定の好ましい抗体は、配列番号１２５、１２７、９、１２９、１３１、もしくは１３３（１３７）から成る群から選択されるＣＤＲの１つ以上、または前述の配列番号のうちのいずれか１つに対して実質的に相同な配列を含む。
【０１１０】
本発明の特定の好ましい抗体は、配列番号１２６、１２８、９、１３０、１３２、もしくは１３４（１３８）から成る群から選択されるＣＤＲの１つ以上、または前述の配列番号のうちのいずれか１つに対して実質的に相同な配列を含む。
【０１１１】
特定の好ましい抗体は、配列番号４、５、および６、もしくは１０、１１、および１２、もしくは１６、１７、および１８、もしくは２２、２３、および２４、もしくは１０８、１１０、および１１２、もしくは１２９、１３１、および１３３（１３７）、もしくは１３０、１３２、および１３４（１３８）の軽鎖ＣＤＲの２つ以上、または前述の配列番号のうちのいずれか１つに対して実質的に相同な配列を含む。
【０１１２】
特に好ましい結合分子は、配列番号４、５、および６、もしくは１０、１１、および１２、もしくは１６、１７、および１８、もしくは２２、２３、および２４、もしくは１０８、１１０、および１１２、もしくは１２９、１３１、および１３３（１３７）、もしくは１３０、１３２、および１３４（１３８）の軽鎖ＣＤＲの３つ、または前述の配列番号のうちのいずれか１つに実質的に相同な配列（すなわち、前述の軽鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ２およびＣＤＲ３のそれぞれ１つ、またはそれに対して実質的に相同な配列）を含む。
【０１１３】
他の特定の好ましい抗体は、配列番号１、２、および３、もしくは７、８、および９、もしくは１、２、および１５、もしくは１９、２０、および２１、もしくは１０１、８、および９、もしくは１２５、１２７、および９、もしくは１２６、１２８、および９の重鎖ＣＤＲの２つ以上、または前述の配列番号のうちのいずれか１つに対して実質的に相同な配列を含む。
【０１１４】
特に好ましい抗体は、配列番号１、２、および３、もしくは７、８、および９、もしくは１、２、および１５、もしくは１９、２０、および２１、もしくは１０１、８、および９、もしくは１２５、１２７、および９、もしくは１２６、１２８、および９の重鎖ＣＤＲの３つ、または前述の配列番号のうちのいずれか１つに実質的に相同な配列（すなわち、前述の重鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ２およびＣＤＲ３のそれぞれ１つ、またはそれに対して実質的に相同な配列）を含む。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１と配列番号２の重鎖ＣＤＲ２との組み合わせが特に好ましい。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、配列番号９の重鎖ＣＤＲ３と配列番号８の重鎖ＣＤＲ２および／または配列番号７もしくは１０１の重鎖ＣＤＲ１との組み合わせが特に好ましい。
【０１１７】
特定のより特に好ましい抗体は、配列番号４、５、および６の軽鎖ＣＤＲの３つ、またはこれらの配列のうちのいずれか１つに実質的に相同な配列（すなわち、前述の軽鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ２およびＣＤＲ３のそれぞれ１つ、またはそれに対して実質的に相同な配列）、ならびに配列番号１、２、および３の重鎖ＣＤＲの３つ、またはこれらの配列のうちのいずれか１つに実質的に相同な配列（すなわち、前述の重鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ２およびＣＤＲ３のそれぞれ１つ、またはそれに対して実質的に相同な配列）を含む。
【０１１８】
特定のより特に好ましい抗体は、配列番号１０、１１、および１２の軽鎖ＣＤＲの３つ、またはこれらの配列のうちのいずれか１つに実質的に相同な配列（すなわち、前述の軽鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ２およびＣＤＲ３のそれぞれ１つ、またはそれに対して実質的に相同な配列）、ならびに配列番号７、８、および９の重鎖ＣＤＲの３つ、またはこれらの配列のうちのいずれか１つに実質的に相同な配列（すなわち、前述の重鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ２およびＣＤＲ３のそれぞれ１つ、またはそれに対して実質的に相同な配列）を含む。
【０１１９】
特定のより特に好ましい抗体は、配列番号１０、１１、および１２の軽鎖ＣＤＲの３つ、またはこれらの配列のうちのいずれか１つに実質的に相同な配列（すなわち、前述の軽鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ２およびＣＤＲ３のそれぞれ１つ、またはそれに対して実質的に相同な配列）、ならびに配列番号１０１、８、および９の重鎖ＣＤＲの３つ、またはこれらの配列のうちのいずれか１つに実質的に相同な配列（すなわち、前述の重鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ２およびＣＤＲ３のそれぞれ１つ、またはそれに対して実質的に相同な配列）を含む。
【０１２０】
特定のより特に好ましい抗体は、配列番号１０８、１１０、および１１２の軽鎖ＣＤＲの３つ、またはこれらの配列のうちのいずれか１つに実質的に相同な配列（すなわち、前述の軽鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ２およびＣＤＲ３のそれぞれ１つ、またはそれに対して実質的に相同な配列）、ならびに配列番号７、８、および９の重鎖ＣＤＲの３つ、またはこれらの配列のうちのいずれか１つに実質的に相同な配列（すなわち、前述の重鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ２およびＣＤＲ３のそれぞれ１つ、またはそれに対して実質的に相同な配列）を含む。
【０１２１】
特定のより特に好ましい抗体は、配列番号１６、１７、および１８の軽鎖ＣＤＲの３つ、またはこれらの配列のうちのいずれか１つに実質的に相同な配列（すなわち、前述の軽鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ２およびＣＤＲ３のそれぞれ１つ、またはそれに対して実質的に相同な配列）、ならびに配列番号１、２、および１５の重鎖ＣＤＲの３つ、またはこれらの配列のうちのいずれか１つに実質的に相同な配列（すなわち、前述の重鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ２およびＣＤＲ３のそれぞれ１つ、またはそれに対して実質的に相同な配列）を含む。
【０１２２】
特定のより特に好ましい抗体は、配列番号２２、２３、および２４の軽鎖ＣＤＲの３つ、またはこれらの配列のうちのいずれか１つに実質的に相同な配列（すなわち、前述の軽鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ２およびＣＤＲ３のそれぞれ１つ、またはそれに対して実質的に相同な配列）、ならびに配列番号１９、２０、および２１の重鎖ＣＤＲの３つ、またはこれらの配列のうちのいずれか１つに実質的に相同な配列（すなわち、前述の重鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ２およびＣＤＲ３のそれぞれ１つ、またはそれに対して実質的に相同な配列）を含む。
【０１２３】
特定のより特に好ましい抗体は、配列番号１２９、１３１、および１３３（１３７）の軽鎖ＣＤＲの３つ、またはこれらの配列のうちのいずれか１つに実質的に相同な配列（すなわち、前述の軽鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ２およびＣＤＲ３のそれぞれ１つ、またはそれに対して実質的に相同な配列）、ならびに配列番号１２５、１２７、および９の重鎖ＣＤＲの３つ、またはこれらの配列のうちのいずれか１つに実質的に相同な配列（すなわち、前述の重鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ２およびＣＤＲ３のそれぞれ１つ、またはそれに対して実質的に相同な配列）を含む。
【０１２４】
特定の特に好ましい抗体は、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１ドメイン、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２ドメイン、および配列番号３の重鎖ＣＤＲ３ドメイン、または前述の配列のうちのいずれか１つに実質的に相同な配列を含み、ならびに／あるいは
配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１ドメイン、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２ドメイン、および配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３ドメイン、または前述の配列のうちのいずれか１つに実質的に相同な配列を含む。
【０１２５】
特定の特に好ましい抗体は、配列番号７もしくは１０１の重鎖ＣＤＲ１ドメイン、配列番号８の重鎖ＣＤＲ２ドメイン、および配列番号９の重鎖ＣＤＲ３ドメイン、もしくは前述の配列のうちのいずれか１つに実質的に相同な配列を含み、ならびに／あるいは
配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ１ドメイン、配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ２ドメイン、および配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ３ドメイン、または前述の配列のうちのいずれか１つに実質的に相同な配列を含む。
【０１２６】
特定の特に好ましい抗体は、配列番号７の重鎖ＣＤＲ１ドメイン、配列番号８の重鎖ＣＤＲ２ドメイン、および
配列番号９の重鎖ＣＤＲ３ドメイン、または前述の配列のうちのいずれか１つに実質的に相同な配列を含み、ならびに／あるいは
配列番号１０８の軽鎖ＣＤＲ１ドメイン、配列番号１１０の軽鎖ＣＤＲ２ドメイン、および配列番号１１２の軽鎖ＣＤＲ３ドメイン、または前述の配列のうちのいずれか１つに実質的に相同な配列を含む。
【０１２７】
特定の特に好ましい抗体は、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１ドメイン、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２ドメイン、および
配列番号１５の重鎖ＣＤＲ３ドメイン、または前述の配列のうちのいずれか１つに実質的に相同な配列を含み、ならびに／あるいは
配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ１ドメイン、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ２ドメイン、および配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ３ドメイン、または前述の配列のうちのいずれか１つに実質的に相同な配列を含む。
【０１２８】
特定の特に好ましい抗体は、配列番号１９の重鎖ＣＤＲ１ドメイン、配列番号２０の重鎖ＣＤＲ２ドメイン、および
配列番号２１の重鎖ＣＤＲ３ドメイン、または前述の配列のうちのいずれか１つに実質的に相同な配列を含み、ならびに／あるいは
配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ１ドメイン、配列番号２３の軽鎖ＣＤＲ２ドメイン、および配列番号２４の軽鎖ＣＤＲ３ドメイン、または前述の配列のうちのいずれか１つに実質的に相同な配列を含む。
【０１２９】
特定の特に好ましい抗体は、配列番号１２５、１２６、１３５、もしくは１３６の重鎖ＣＤＲ１ドメイン、配列番号１２７もしくは１２８の重鎖ＣＤＲ２ドメイン、および配列番号９の重鎖ＣＤＲ３ドメイン、または前述の配列のうちのいずれか１つに実質的に相同な配列を含み、ならびに／あるいは配列番号１２９もしくは１３０の軽鎖ＣＤＲ１ドメイン、配列番号１３１もしくは１３２の軽鎖ＣＤＲ２ドメイン、および配列番号１３３（１３７）もしくは１３４（１３８）の軽鎖ＣＤＲ３ドメイン、または前述の配列のうちのいずれか１つに実質的に相同な配列を含む。
【０１３０】
さらなる実施形態において、本発明は、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体を提供し、３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの重鎖可変領域と、３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの軽鎖可変領域と、を含み、該重鎖可変領域は、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１と、
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２と、
（ｉｉｉ）配列番号３または１５のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３と、を含む。
【０１３１】
この実施形態の好ましい態様において、該軽鎖可変領域ＣＤＲの１つ以上は、
（ｉ）配列番号４または１６のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１と、
（ｉｉ）配列番号５または１７のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２と、
（ｉｉｉ）配列番号６または１８のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３と、から成る群から選択される。好ましくは、該軽鎖可変領域ＣＤＲの２つまたは３つは、上述の群から選択される。
【０１３２】
さらなる実施形態において、本発明は、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体を提供し、３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの重鎖可変領域と、３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの軽鎖可変領域と、を含み、該重鎖可変領域は、
（ｉ）配列番号７または１０１のアミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１と、
（ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２と、
（ｉｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３と、を含む。
【０１３３】
この実施形態の好ましい態様において、該軽鎖可変領域ＣＤＲの１つ以上は、
（ｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１と、
（ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２と、
（ｉｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３と、から成る群から選択される。好ましくは、該軽鎖可変領域ＣＤＲの２つまたは３つは、上述の群から選択される。
【０１３４】
さらなる実施形態において、本発明は、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体を提供し、３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの重鎖可変領域と、３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの軽鎖可変領域と、を含み、該重鎖可変領域は、
（ｉ）配列番号７のアミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１と、
（ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２と、
（ｉｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３と、を含む。
【０１３５】
この実施形態の好ましい態様において、該軽鎖可変領域ＣＤＲの１つ以上は、
（ｉ）配列番号１０８のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１と、
（ｉｉ）配列番号１１０のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２と、
（ｉｉｉ）配列番号１１２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３と、から成る群から選択される。好ましくは、該軽鎖可変領域ＣＤＲの２つまたは３つは、上述の群から選択される。
【０１３６】
さらなる実施形態において、本発明は、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体を提供し、３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの重鎖可変領域と、３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの軽鎖可変領域と、を含み、該重鎖可変領域は、
（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１と、
（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２と、
（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３と、を含む。
【０１３７】
この実施形態の好ましい態様において、該軽鎖可変領域ＣＤＲの１つ以上は、
（ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１と、
（ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２と、
（ｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３と、から成る群から選択される好ましくは、該軽鎖可変領域ＣＤＲの２つまたは３つは、上述の群から選択される。
【０１３８】
さらなる実施形態において、本発明は、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体を提供し、３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの重鎖可変領域と、３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの軽鎖可変領域と、を含み、該重鎖可変領域は、
（ｉ）配列番号１２５、１２６、１３５、または１３６のアミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１と、
（ｉｉ）配列番号１２７または１２８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２と、
（ｉｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３と、を含む。
【０１３９】
この実施形態の好ましい態様において、該軽鎖可変領域ＣＤＲの１つ以上は、
（ｉ）配列番号１２９または１３０のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１と、
（ｉｉ）配列番号１３１または１３２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２と、
（ｉｉｉ）配列番号１３３（１３７）または１３４（１３８）のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３と、から成る群から選択される。好ましくは、該軽鎖可変領域ＣＤＲの２つまたは３つは、上述の群から選択される。
【０１４０】
本発明の特定のさらなる好ましい実施形態は、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体を提供し、
配列番号１、２、もしくは３の重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、もしくは３つ、または配列番号１、２、もしくは３の１つ以上に実質的に相同な配列を含むＶＨドメイン、および／あるいは配列番号４、５、もしくは６の軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、もしくは３つ、または配列番号４、５、もしくは６の１つ以上に実質的に相同な配列を含むＶＬドメインを含む。
【０１４１】
本発明の特定のさらなる好ましい実施形態は、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体を提供し、配列番号７、８、９、もしくは１０１の重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、もしくは３つ、または配列番号７、８、９、もしくは１０１の１つ以上に実質的に相同な配列を含むＶＨドメイン、および／あるいは配列番号１０、１１、もしくは１２の軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、もしくは３つ、または配列番号１０、１１、もしくは１２の１つ以上に実質的に相同な配列を含むＶＬドメインを含む。
【０１４２】
本発明の特定のさらなる好ましい実施形態は、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体を提供し、配列番号７、８、もしくは９の重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、もしくは３つ、または配列番号７、８、もしくは９の１つ以上に実質的に相同な配列を含むＶＨドメイン、および／あるいは配列番号１０８、１１０、もしくは１１２の軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、もしくは３つ、または配列番号１０８、１１０、もしくは１１２の１つ以上に実質的に相同な配列を含むＶＬドメインを含む。
【０１４３】
本発明の特定のさらなる好ましい実施形態は、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体を提供し、配列番号１、２、もしくは１５の重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、もしくは３つ、または配列番号１、２、もしくは１５の１つ以上に実質的に相同な配列を含むＶＨドメイン、および／あるいは配列番号１６、１７、もしくは１８の軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、もしくは３つ、または配列番号１６、１７、もしくは１８の１つ以上に実質的に相同な配列を含むＶＬドメインを含む。
【０１４４】
本発明の特定のさらなる好ましい実施形態は、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体を提供し、配列番号１９、２０、もしくは２１の重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、もしくは３つ、または配列番号１９、２０、もしくは２１の１つ以上に実質的に相同な配列を含むＶＨドメイン、および／あるいは配列番号２２、２３、もしくは２４の軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、もしくは３つ、または配列番号２２、２３、もしくは２４の１つ以上に実質的に相同な配列を含むＶＬドメインを含む。
【０１４５】
本発明の特定のさらなる好ましい実施形態は、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体を提供し、配列番号１２５、１２７、もしくは９の重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、もしくは３つ、または配列番号１２５、１２７、もしくは９の１つ以上に実質的に相同な配列を含むＶＨドメイン、および／あるいは配列番号１２９、１３１、もしくは１３３（１３７）の軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、もしくは３つ、または配列番号１２９、１３１、もしくは（１３７）の１つ以上に実質的に相同な配列を含むＶＬドメインを含む。
【０１４６】
本発明のより特に好ましい実施形態は、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体を提供し、３つの軽鎖ＣＤＲを含むＶＬドメインと、
配列番号１、２、および３もしくは１５の３つの重鎖ＣＤＲを含むＶＨドメインと、を含む。好ましい実施形態において、軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、もしくは３つは、配列番号４、５、および６、または１６、１７、および１８に定義される通りである。
【０１４７】
本発明のより特に好ましい実施形態は、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体を提供し、３つの軽鎖ＣＤＲを含むＶＬドメインと、
配列番号８、９、および７もしくは１０１の３つの重鎖ＣＤＲを含むＶＨドメインと、を含む。好ましい実施形態において、軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、もしくは３つは、配列番号１０、１１、および１２、または１０８、１１０、および１１２に定義される通りである。
【０１４８】
本発明のより特に好ましい実施形態は、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体を提供し、３つの軽鎖ＣＤＲを含むＶＬドメインと、
配列番号１２５、１２７、および９の３つの重鎖ＣＤＲを含むＶＨドメインと、を含む。好ましい実施形態において、軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、もしくは３つは、配列番号１２９、１３１、および１３３（１３７）に定義される通りである。
【０１４９】
本明細書に記載の本発明の全ての実施形態において、アミノ酸配列中に存在するＸは、可変アミノ酸を表す。したがって、配列が複数のＸを含む場合、各々のＸは異なり得るが、１つ以上のＸは、同一でもあり得る。好ましくは、配列番号１２５の位置１で、Ｘは、ＳもしくはＮであり、および／または配列番号１２５の位置４で、Ｘは、ＩもしくはＭであり、および／または配列番号１２７の位置１で、Ｘは、ＧもしくはＡであり、および／または配列番号１２７の位置３で、Ｘは、ＩもしくはＳであり、および／または配列番号１２７の位置５で、Ｘは、ＩもしくはＳであり、および／または配列番号１２７の位置６で、Ｘは、ＦもしくはＧであり、および／または配列番号１２７の位置８で、Ｘは、ＴもしくはＳであり、および／または配列番号１２７の位置９で、Ｘは、ＡもしくはＴおよび／または配列番号１２９の位置３で、Ｘは、ＳもしくはＧであり、および／または配列番号１２９の位置４で、Ｘは、ＴもしくはＧであり、および／または配列番号１２９の位置９で、Ｘは、ＳもしくはＲであり、および／または配列番号１２９の位置１０で、Ｘは、ＲもしくはＨであり、および／または配列番号１２９の位置１１で、Ｘは、ＹもしくはＦであり、および／または配列番号１２９の位置１３で、Ｘは、ＹもしくはＦであり、および／または配列番号１３１の位置３で、Ｘは、ＨもしくはＮであり、および／または配列番号１３３もしくは１３７の位置２で、Ｘは、ＡもしくはＶであり、および／または配列番号１３３もしくは１３７の位置６で、Ｘは、ＳもしくはＴである。
【０１５０】
配列番号１２５の好ましい実施形態は、配列番号１２６であり、配列番号１２７の好ましい実施形態は、配列番号１２８であり、配列番号１２９の好ましい実施形態は、配列番号１３０であり、配列番号１３１の好ましい実施形態は、配列番号１３２であり、配列番号１３３の好ましい実施形態は、配列番号１３４である。
【０１５１】
配列番号１２５および／または配列番号１２６の好ましい実施形態は、配列番号１３５であり、より好ましくは、配列番号１３６である。配列番号１３３の好ましい実施形態は、配列番号１３７または配列番号１３８である。配列番号１３４の好ましい実施形態は、配列番号１３８である。
【０１５２】
配列番号１２５の重鎖ＣＤＲ１が存在する実施形態が好ましい。配列番号１０１の重鎖ＣＤＲ１が存在する実施形態も好ましい。したがって、重鎖ＣＤＲ１は、好ましくは、アミノ酸Ｓ（セリン）で始まる。
【０１５３】
本発明の特定の好ましい実施形態は、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体を提供し、配列番号１３９、６９、７１、７３、７５、もしくは１０５のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を有するＶＨドメイン、および／あるいは配列番号１４０、７０、７２、７４、７６、もしくは１１５のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を有するＶＬドメインを含む。好ましくは、該ＶＨおよび／またはＶＬドメインは、本明細書に開示のＣＤＲ配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つ、例えば６つを有する。
【０１５４】
さらなる好ましい実施形態は、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体を提供し、配列番号１３９、６９、７１、７３、７５、もしくは１０５のアミノ酸配列を有するＶＨドメインと、３つの軽鎖ＣＤＲを含むＶＬドメインと、を含む好ましくは、該軽鎖ＣＤＲは、配列番号４、５、および６、または１０、１１、および１２、または１６、１７、および１８、または２２、２３、および２４、または１０８、１１０、および１１２、または１２９、１３１、および１３３（１３７）、または１３０、１３２、および１３４（１３８）を有する。
【０１５５】
さらなる好ましい実施形態は、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体を提供し、配列番号６９のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を有するＶＨドメイン、および／あるいは配列番号７０のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を有するＶＬドメインを含む。
【０１５６】
さらなる好ましい実施形態は、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体を提供し、配列番号７１のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を有するＶＨドメイン、および／あるいは配列番号７２のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を有するＶＬドメインを含む。
【０１５７】
さらなる好ましい実施形態は、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体を提供し、配列番号７１のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を有するＶＨドメイン、および／あるいは配列番号１１５のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を有するＶＬドメインを含む。
【０１５８】
さらなる好ましい実施形態は、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体を提供し、配列番号１０５のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を有するＶＨドメイン、および／あるいは配列番号７２のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を有するＶＬドメインを含む。
【０１５９】
さらなる好ましい実施形態は、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体を提供し、配列番号７３のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を有するＶＨドメイン、および／あるいは配列番号７４のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を有するＶＬドメインを含む。
【０１６０】
さらなる好ましい実施形態は、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体を提供し、配列番号７５のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を有するＶＨドメイン、および／あるいは配列番号７６のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を有するＶＬドメインを含む。
【０１６１】
さらなる好ましい実施形態は、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体を提供し、配列番号１３９のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を有するＶＨドメイン、および／あるいは配列番号１４０のアミノ酸配列、またはそれに対して実質的に相同な配列を有するＶＬドメインを含む。
【０１６２】
さらに、さらなる実施形態において、本発明は、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体を提供し、配列番号３５（本明細書で１７Ｇ  ｓｃＦｖとも称される本抗体）、配列番号４６（本明細書で９Ｅ  ｓｃＦｖとも称される本抗体）、配列番号１０４（本明細書で９Ｅ１０Ｊ  ｓｃＦｖとも称される本抗体）、配列番号１１４（本明細書で９Ｅ１Ｄ  ｓｃＦｖとも称される本抗体）、配列番号５７（本明細書で１Ｏ  ｓｃＦｖとも称される本抗体）、または配列番号６８（本明細書で１１Ｆ  ｓｃＦｖとも称される本抗体）のアミノ酸配列を含むか、あるいは、ＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体うちのいずれかの断片、または上述の配列のうちのいずれかに実質的に相同な配列を含む。
【０１６３】
本発明は、モノクローナル抗体１７Ｇ、９Ｅ、１Ｏ、１１Ｆ、９Ｅ１０Ｊ、および９Ｅ１Ｄ、表１、２、３、４、１１、および１２（それぞれ、配列番号３５、４６、５７、６８、１０３、および１１４）に示される一本鎖型で例示される。抗体１７Ｇ、９Ｅ、１Ｏ、および１１Ｆの全長ＩｇＧ型が作製されており、それらの配列は、それぞれ、表５、６、７、および８に示される。１７Ｇ、９Ｅ、１１Ｆ、および１Ｏ抗体のＣＤＲドメイン、ＶＨおよびＶＬドメインは、表１〜４ならびに図１〜４に示され、９Ｅ１０Ｊおよび９Ｅ１Ｄ抗体のＣＤＲドメイン、ＶＨおよびＶＬドメインは、表１１および１２に示される。抗体９Ｅ１０Ｊおよび９Ｅ１Ｄの全長ＩｇＧ型が作製されており、それらの配列は、表１３および１４に示される。表２３は、コンセンサス配列を列記する。これらのＣＤＲドメインもしくはＶＨおよびＶＬドメイン（またはそれに対して実質的に相同な配列）を含む抗体が、本発明の好ましい態様である。
【０１６４】
本発明の好ましい実施形態は、好ましくは、配列番号３４によってコードされる、配列番号３５を含むか、あるいはそれから成る１７Ｇ抗体のｓｃＦｖ型である。より好ましくは、抗体は、図１に示されるアミノ酸配列を含むか、あるいはそれから成り、好ましくは、この抗体は、図１に示される核酸配列によってコードされる。
【０１６５】
本発明の別の好ましい実施形態は、好ましくは、配列番号４５によってコードされる、配列番号４６を含むか、あるいはそれから成る９Ｅ抗体のｓｃＦｖ型である。より好ましくは、抗体は、図２に示されるアミノ酸配列を含むか、あるいはそれから成り、好ましくは、この抗体は、図２に示される核酸配列によってコードされる。
【０１６６】
本発明の別の好ましい実施形態は、好ましくは、配列番号１０３によってコードされる、配列番号１０４を含むか、あるいはそれから成る９Ｅ１０Ｊ抗体のｓｃＦｖ型である。より好ましくは、抗体は、図２７に示されるアミノ酸配列を含むか、あるいはそれから成り、好ましくは、この抗体は、図２７に示される核酸配列によってコードされる。
【０１６７】
本発明の別の好ましい実施形態は、好ましくは、配列番号１１３によってコードされる、配列番号１１４を含むか、あるいはそれから成る９Ｅ１Ｄ抗体のｓｃＦｖ型である。より好ましくは、抗体は、図２８に示されるアミノ酸配列を含むか、あるいはそれから成り、好ましくは、この抗体は、図２８に示される核酸配列によってコードされる。
【０１６８】
本発明の別の好ましい実施形態は、好ましくは、配列番号５６によってコードされる、配列番号５７を含むか、あるいはそれから成る１Ｏ抗体のｓｃＦｖ型である。より好ましくは、抗体は、図３に示されるアミノ酸配列を含むか、あるいはそれから成り、好ましくは、この抗体は、図３に示される核酸配列によってコードされる。
【０１６９】
本発明の別の好ましい実施形態は、好ましくは、配列番号６７によってコードされる、配列番号６８を含むか、あるいはそれから成る１１Ｆ抗体のｓｃＦｖ型である。より好ましくは、抗体は、図４に示されるアミノ酸配列を含むか、あるいはそれから成り、好ましくは、この抗体は、図４に示される核酸配列によってコードされる。
【０１７０】
他の好ましい実施形態は、１７Ｇ、９Ｅ、１Ｏ、１１Ｆ、９ＥＪ１０、および９Ｅ１Ｄ抗体のＩｇＧ型、好ましくは、全長ＩｇＧ型である。これらの抗体のうちのいずれかのＩｇＧ１型が最も好ましい。
【０１７１】
したがって、本発明の別の好ましい実施形態は、配列番号８７（アミノ酸）の重鎖および／または配列番号８８（アミノ酸）の軽鎖を含む、全長ＩｇＧ抗体である。配列番号８５によってコードされる重鎖および／または配列番号８６によってコードされる軽鎖を含むＩｇＧ抗体も好ましい。言うまでもなく、全長ＩｇＧ抗体は、２つの実質的に同一の重鎖および２つの実質的に同一の軽鎖を含むことが理解される。
【０１７２】
本発明の別の好ましい実施形態は、配列番号９１（アミノ酸）の重鎖および／または配列番号９２（アミノ酸）の軽鎖を含む、全長ＩｇＧ抗体である。配列番号８９によってコードされる重鎖および／または配列番号９０によってコードされる軽鎖を含むＩｇＧ抗体も好ましい。
【０１７３】
本発明の別の好ましい実施形態は、配列番号９５（アミノ酸）の重鎖および／または配列番号９６（アミノ酸）の軽鎖を含む、全長ＩｇＧ抗体である。配列番号９３によってコードされる重鎖および／または配列番号９４によってコードされる軽鎖を含むＩｇＧ抗体も好ましい。
【０１７４】
本発明の別の好ましい実施形態は、配列番号９９（アミノ酸）の重鎖および／または配列番号１００（アミノ酸）の軽鎖を含む、全長ＩｇＧ抗体である。配列番号９７によってコードされる重鎖および／または配列番号９８によってコードされる軽鎖を含むＩｇＧ抗体も好ましい。
【０１７５】
本発明の別の好ましい実施形態は、配列番号１１９（アミノ酸）の重鎖および／または配列番号１２０（アミノ酸）の軽鎖を含む、全長ＩｇＧ抗体である。配列番号１１７によってコードされる重鎖および／または配列番号１１８によってコードされる軽鎖を含むＩｇＧ抗体も好ましい。
【０１７６】
本発明の別の好ましい実施形態は、配列番号１２３（アミノ酸）の重鎖および／または配列番号１２４（アミノ酸）の軽鎖を含む、全長ＩｇＧ抗体である。配列番号１２１によってコードされる重鎖および／または配列番号１２２によってコードされる軽鎖を含むＩｇＧ抗体も好ましい。
【０１７７】
本発明の抗体は、異なるエピトープを、ＫＭ２１６０、ＫＭ３０６０、ＫＭ２７６０、およびＫＷ−０７６１を含む既知の抗ＣＣＲ４抗体ファミリーに結合させ得ると考えられている。抗体ＫＭ２１６０は、ＣＣＲ４のペプチド断片に対して産生され、かつヒトＣＣＲ４のＮ末端アミノ酸由来の位置２〜２９の領域内に存在するエピトープを認識するマウス抗体である（ＥＰ１２７０５９５）。ＫＭ２７６０は、同一の結合特性を有する抗体のキメラバージョンである（ＥＰ１２７０５９５）。抗体ＫＭ３０６０は、高度にフコシル化されるということを除いて、ＫＭ２７６０と同一である（Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．２００４，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ６４，２１２７−２１３３）。ＫＷ−０７６１は、ＫＭ２７６０のヒト化バージョンである（Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ２００８，ｖｏｌ１９，ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ４，５１３）。
【０１７８】
ＫＭ２７６０は、ＣＣＲ４とＴＡＲＣまたはＭＤＣとの間の相互作用を阻止しないことが報告されており（Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．２００６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ６６（１１），ｐｐ５７１６−５７２２）、これは、実施例３に示される同等の抗体ＫＭ３０６０ｖａｒ（ＫＭ３０６０に相当するが、異なる宿主で発現されたため、潜在的に異なる糖プロフィールを有する）を用いての本発明者の所見と一致する。一方、本発明の抗体は、ＣＣＲ４とＭＤＣとの間の相互作用およびＣＣＲ４とＴＡＲＣとの間の相互作用を阻止することが見出された（実施例３を参照のこと）。これは、本発明の抗体が、ＫＭ２１６０、ＫＭ３０６０、ＫＭ２７６０、およびＫＷ−０７６１を含む先行技術のファミリーよりも、異なるエピトープに結合することを強く示唆する。
【０１７９】
さらに、抗体１７Ｇおよび９Ｅは、ＣＣＲ４に結合するために相互に競合することが見出され、それらは、同一の、同様の、または少なくとも重複するエピトープに結合することを示す。これらの抗体のいずれも、ＣＣＲ４に結合するためにＫＭ３０６０ｖａｒと競合せず、ＫＭ３０６０ｖａｒは、異なるエピトープに結合することを示す。
【０１８０】
本発明の抗体は、異なるエピトープを市販の抗ＣＣＲ４抗体１Ｇ１に結合させ得ることも考えられる。ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎは、この抗体に関する技術データシート上で、この抗体は中和抗体でないことを明らかにしている。一方、本発明の抗体は、ＭＤＣおよびＴＡＲＣのＣＣＲ４への結合を阻止し、かつＭＤＣまたはＴＡＲＣによって誘発される細胞内カルシウムイオンの増加を阻害することができる。これは、本発明の抗体は、１Ｇ１抗体よりは、異なるエピトープに結合することを強く示唆する。
【０１８１】
したがって、ＣＣＲ４に結合するために、本明細書に記載の抗体のうちのいずれかと競合することができる抗体も提供される。
【０１８２】
本明細書で使用される「競合抗体」という用語は、「参照抗体」とおよそ、実質的に、もしくは本質的に同一、または全く同一のエピトープに結合する抗体を指す。「競合抗体」は、重複エピトープ特異性を有する抗体を含む。したがって、競合抗体は、ＣＣＲ４に結合するために、参照抗体と効果的に競合することができる。好ましくは、競合抗体は、参照抗体と同一のエピトープに結合することができる。見方を変えれば、競合抗体は、好ましくは、参照抗体と同一のエピトープ特異性を有する。
【０１８３】
本明細書で使用される「参照抗体」は、ヒトＣＣＲ４の細胞外ドメイン内のエピトープに結合することができ、かつ本明細書で定義されるＣＤＲ配列の１つ以上、好ましくは、本明細書で定義されるＶＨおよびＶＬドメイン、より好ましくは、配列番号１３０のＶＨおよび配列番号１４０のＶＬ、または配列番号６９のＶＨおよび配列番号７０のＶＬ、または配列番号７１のＶＨおよび配列番号７２のＶＬ、または配列番号１０５のＶＨおよび配列番号７２のＶＬ、または配列番号７１のＶＨおよび配列番号１１５のＶＬ、または配列番号７３のＶＨおよび配列番号７４のＶＬ、または配列番号７５のＶＨおよび配列番号７６のＶＬを有する抗体である。最も好ましい参照抗体は、１７Ｇ、９Ｅ、１１Ｆ、１Ｏ、９Ｅ１０Ｊ、および９Ｅ１Ｄから選択される。
【０１８４】
１つ以上の競合抗体の同定は、１７Ｇ、９Ｅ、１１Ｆ、１Ｏ、９Ｅ１０Ｊ、および９Ｅ１Ｄ等の参照抗体が提供されたため、簡単な技術事項である。競合抗体の同定が参照抗体と比較して決定されるので、一方または両方の抗体が結合するエピトープを、競合抗体を同定するために、実際に決定することが多少なりとも必要とされないことが理解される。しかしながら、所望の場合、標準の方法を用いて、エピトープマッピングを実行することができる。
【０１８５】
一例として、エピトープの同定および定義のための以下の方法が、本明細書で言及される。ＣＣＲ４のアミノ酸配列が既知であるため、合成ペプチドを、例えば、Ｐｅｐｓｃａｎアッセイを用いて、エピトープマッピングで使用することができる。部位特異的突然変異誘発もエピトープマッピングにおいて強力な手段であり、免疫複合体形成における単一アミノ酸の役割を評価するために用いることができる。タンパク質フットプリント法は、エピトープが、抗体−抗原複合体として結合される時に、分裂から保護されるという事実に依存している。酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ならびに赤血球凝集およびスロットブロッティングも、エピトープマッピングで用いることができる。非線形エピトープをマッピングするために、抗体を用いた抗原の結晶化も用いることができる。そのような方法を行うためのプロトコルは、広く入手可能であり、当業者は、エピトープマッピングの好適な代替方法を認識する。
【０１８６】
抗体競合を評価することができる多種多様の免疫学的スクリーニングアッセイのうちのいずれか１つを用いて、競合抗体の同定を容易に決定することができる全てのそのようなアッセイは、当分野で日常的であり、さらに本明細書に詳細に記載されている。米国特許第６，３４２，２１９号、同第６，５２４，５８３号、同第７，０５６，５０９号、同第６，８８７，４６８号、同第６，３４２，２２１号、同第６，６７６，９４１号、同第６，７０３，０２０号、および同第６，４１６，７５８号明細書のそれぞれは、どのように競合抗体を同定するかに関しての本教示をさらに一層補完することを含む目的のために、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。本明細書の実施例４は、好適な競合アッセイを開示する。
【０１８７】
例えば、試験される試験抗体が様々な動物から得られる場合、またはより適切に言えば、異なるアイソタイプである場合、参照および試験抗体が混合（もしくは予吸着）され、ＣＣＲ４含有組成物、好ましくは、ＣＣＲ４を発現する細胞、ＣＣＲ４を提示するファージ、または固定化されたＣＣＲ４を含有生体素子に適用される簡単な競合アッセイを採用することができる。ＥＬＩＳＡに基づくプロトコルは、特に、そのような簡単な競合研究の使用に好適である。
【０１８８】
特定の実施形態において、当業者は、抗原組成物に適用する前に、参照抗体（例えば、１７Ｇ、９Ｅ、１１Ｆ、１Ｏ、９Ｅ１０Ｊ、および９Ｅ１Ｄ）を様々な量の試験抗体（例えば、１：１０、１：１００、または１：１０００）とある期間にわたって予混合するであろう。他の実施形態において、抗原組成物への曝露中に、参照抗体および様々な量の試験抗体を、簡単に混合することができる。任意の事象において、種またはアイソタイプ二次抗体を用いることによって、当業者は、結合された参照抗体のみを検出することができ、その結合は、結合のために「競合」する試験抗体の存在によって減少する。
【０１８９】
参照抗体と任意の試験抗体（種またはアイソタイプを問わず）との間の抗体競合研究を実施する際に、当業者は、その後の同定を可能にするために、最初に、参照（例えば、１７Ｇ、９Ｅ、１１Ｆ、１Ｏ、９Ｅ１０Ｊ、および９Ｅ１Ｄ）を、例えば、ビオチンまたは酵素標識もしくは放射性標識等の検出可能な標識で標識化し得る。これらの事例において、当業者は、標識参照抗体を、様々な比率（例えば、１：１０、１：１００、もしくは１：１０００）で、試験される試験抗体と予混合またはインキュベートし、（任意選択で、好適な期間後に）次に、標識参照抗体の反応性をアッセイし、これを潜在的に競合する試験抗体のいずれもインキュベーションに含まれなかった対照値と比較するであろう。
【０１９０】
アッセイは、抗体結合に基づく様々な免疫学的アッセイのうちのいずれか１つであることができ、参照抗体は、それらの標識を検出する手段、例えば、ビチオン化抗体の事例においてストレプトアビジンを用いる手段で、または酵素標識に関連する発色基質（ペルオキシダーゼ酵素を有する３，３’５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質等）を用いて、あるいは放射性標識を簡単に検出することによって、検出されるであろう。ＣＣＲ４に結合するために参照抗体と競合する抗体は、結合標識の減少によって証明されるように、ＣＣＲ４に結合する参照抗体効果的に、または著しく減少させることができる。
【０１９１】
完全に無関係の抗体の不在下における（標識）参照抗体の反応性は、高対照値であろう。競合が発生し、標識抗体の結合を減少させるであろう時に、標識参照抗体（例えば、１７Ｇ、９Ｅ、１１Ｆ、１Ｏ、９Ｅ１０Ｊ、または９Ｅ１Ｄ）を全く同一の種類の非標識抗体とインキュベートすることによって、低対照値が得られるであろう。試験アッセイにおいて、試験抗体の存在下における標識抗体反応性の著しい減少が、ＣＣＲ４に結合するために標識抗体と「競合」する試験抗体を示す。
【０１９２】
著しい減少は、結合の「再現可能な」、すなわち、常に観察される減少である。本出願において「著しい減少」は、約１：１０〜約１：１００の任意の比率で、少なくとも約２０％、より好ましくは、少なくとも約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、または６５％、さらにより好ましくは、少なくとも約７０％、約７５％、または約８０％の（ＥＬＩＳＡにおける参照抗体のＣＣＲ４への結合の）再現可能な減少として定義される。よりストリンジェントな競合活性を有する抗体は、約１：１０〜約１：１００の任意の比率で、少なくとも約８２％、約８５％、約８８％、約９０％、約９２％、または約９５％の（ＥＬＩＳＡまたは他の好適なアッセイにおける参照抗体のＣＣＲ４への結合の）再現可能な減少を呈する。約９９％、約９８％、約９７％、もしくは約９６％程度の参照抗体のＣＣＲ４への結合の再現可能な減少を呈する等の、完全なまたはほぼ完全な競合は、本発明を実践するために決して必要とされないが、確実に除外されない。
【０１９３】
上述の方法は、好適な競合アッセイのほんの一例である。当業者は、他の好適な方法および変形を認識する。代替の競合アッセイが、以下で説明される。
【０１９４】
フローサイトメトリーを用いて代替の競合アッセイが実行される前に、試験抗体のいくつかの量を、例えば、ビオチン化によって標識化すべきである。ビチオン化産物の官能性（細胞結合特性の保持）、およびＣＣＲ４＋細胞の定数に対して準最大結合をもたらす本発明のビチオン化抗体（Ａｂ１）の最小濃度を決定する。合計１０6個の細胞を、急激に成長する培養物から採取し、好適な温度で好適な期間、例えば、４℃で１時間、様々な抗体濃度でインキュベートする。細胞を洗浄し、好適な温度で好適な期間、例えば、４℃でさらに１時間、好適な検出抗体とインキュベートする。洗浄後、細胞をフローサイトメトリーで分析する。各々の試験抗体において、抗体濃度に対して平均蛍光強度（ＭＦＩ）をプロットすることによって、飽和曲線がデータから生成される。
【０１９５】
代替の競合アッセイにおいて、ＣＣＲ４＋細胞を、上記のように調製し、標識（ビチオン化）抗体（ｂｉｏ−Ａｂ１）の一定濃度および非標識競合的抗体の増加濃度の混合物で二重に処理することができる。一定濃度は、上で決定された腫瘍細胞の定数に対して適度な蛍光シグナルを生成する抗体の最小濃度である。理想的には、ｎＭ単位のこの一定濃度は、平衡（ＫD）において、処理された抗体の親和性を下回るはずである。この事例において、説明された方法を、競合的抗体の親和性の推定のために用いることができる（Ｓｃｈｏｄｉｎ  ａｎｄ  Ｋｒａｎｚ，１９９３，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ２６８：２５７５５−７）。抗体混合物を、好適な温度で好適な期間、例えば、４℃で１時間、標的細胞とインキュベートする。細胞を洗浄し、ビチオン化抗体に結合する細胞が、ＦＩＴＣ標識ストレプトアビジンとのインキュベーションによって露呈される。バックグラウンド蛍光（ＰＢＳ−５％ＦＣＳ）を、各々の試験試料（ｂｉｏ−Ａｂ１＋Ａｂ２）において読み取った平均蛍光から差し引いた後、式に従って、阻害の割合を、各々のＡｂ２濃度「ｃ」において計算し、
阻害％＝（１−ＭＦＩbio-Ab1+Ab2"c"／ＭＦＩbio-Ab1）×１００
が計算される。
【０１９６】
ＣＣＲ４に結合することができ、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができ、かつ本明細書に記載の抗体のうちのいずれかと競合することができる任意の抗体が企図されるが、好ましい抗体は、以下に提示される。したがって、いくつかの好ましい実施形態において、以下の事項が提供される。
【０１９７】
ヒトＣＣケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）の細胞外ドメイン内のエピトープに結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体であって、本抗体は、
（ａ）３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの重鎖可変領域と、３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの軽鎖可変領域と、を含み、
該軽鎖可変領域は、
（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２、および／または
（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３、を含み、ならびに／あるいは
該重鎖可変領域は、
（ｉｖ）配列番号１のアミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１、
（ｖ）配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２、および／または
（ｖｉ）配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３、を含む、抗体か、あるいは
（ｂ）ＣＣＲ４に結合するために抗体（ａ）と競合することができる抗体である。
【０１９８】
ヒトＣＣケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）の細胞外ドメイン内のエピトープに結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体であって、本抗体は、
（ａ）３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの重鎖可変領域と、３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの軽鎖可変領域と、を含み、
該軽鎖可変領域は、
（ｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２、および／または
（ｉｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３、を含み、ならびに／あるいは
該重鎖可変領域は、
（ｉｖ）配列番号７もしくは１０１のアミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１、
（ｖ）配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２、および／または
（ｖｉ）配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３、を含むか、あるいは
（ｂ）ＣＣＲ４に結合するために抗体（ａ）と競合することができる抗体である。
【０１９９】
ヒトＣＣケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）の細胞外ドメイン内のエピトープに結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体であって、本抗体は、
（ａ）３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの重鎖可変領域と、３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの軽鎖可変領域と、を含み、
該軽鎖可変領域は、
（ｉ）配列番号１０８のアミノ酸配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号１１０のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２、および／または
（ｉｉｉ）配列番号１１２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３、を含み、ならびに／あるいは
該重鎖可変領域は、
（ｉｖ）配列番号７のアミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１、
（ｖ）配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２、および／または
（ｖｉ）配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３、を含むか、あるいは
ｂ）ＣＣＲ４に結合するために抗体（ａ）と競合することができる抗体である。
【０２００】
ヒトＣＣケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）の細胞外ドメイン内のエピトープに結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体であって、本抗体は、
（ａ）３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの重鎖可変領域と、３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの軽鎖可変領域と、を含み、
該軽鎖可変領域は、
（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２、および／または
（ｉｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３、を含み、ならびに／あるいは
該重鎖可変領域は、
（ｉｖ）配列番号１のアミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１、
（ｖ）配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２、および／または
（ｖｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３、を含むか、あるいは
ｂ）ＣＣＲ４に結合するために抗体（ａ）と競合することができる抗体である。
【０２０１】
ヒトＣＣケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）の細胞外ドメイン内のエピトープに結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体であって、本抗体は、
（ａ）３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの重鎖可変領域と、３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの軽鎖可変領域と、を含み、
該軽鎖可変領域は、
（ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２、および／または
（ｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３、を含み、ならびに／あるいは
該重鎖可変領域は、
（ｉｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１、
（ｖ）配列番号２０のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２、および／または
（ｖｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３、を含むか、あるいは
（ｂ）ＣＣＲ４に結合するために抗体（ａ）と競合することができる抗体である。
【０２０２】
ヒトＣＣケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）の細胞外ドメイン内のエピトープに結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体であって、本抗体は、
（ａ）３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの重鎖可変領域と、３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの軽鎖可変領域と、を含み、
該軽鎖可変領域は、
（ｉ）配列番号１２９もしくは１３０のアミノ酸配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号１３１もしくは１３２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２、および／または
（ｉｉｉ）配列番号１３３、１３４、１３７、もしくは１３８のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３、を含み、ならびに／あるいは
該重鎖可変領域は、
（ｉｖ）配列番号１２５、１２６、１３５、もしくは１３６のアミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１、
（ｖ）配列番号１２７もしくは１２８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２、および／または
（ｖｉ）配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３、を含むか、あるいは
（ｂ）ＣＣＲ４に結合するために抗体（ａ）と競合することができる抗体である。
【０２０３】
一実施形態において、抗体は、
（ａ）配列番号６９のＶＨドメインおよび配列番号７０のＶＬドメインを有するか、あるいは
（ｂ）ＣＣＲ４に結合するために抗体（ａ）と競合することができる抗体である。
【０２０４】
一実施形態において、抗体は、
（ａ）配列番号７１のＶＨドメインおよび配列番号７２のＶＬドメインを有するか、あるいは
（ｂ）ＣＣＲ４に結合するために抗体（ａ）と競合することができる抗体である。
【０２０５】
一実施形態において、抗体は、
（ａ）配列番号１０５のＶＨドメインおよび配列番号７２のＶＬドメインを有するか、あるいは
（ｂ）ＣＣＲ４に結合するために抗体（ａ）と競合することができる抗体である。
【０２０６】
一実施形態において、抗体は、
（ａ）配列番号７１のＶＨドメインおよび配列番号１１５のＶＬドメインを有するか、あるいは
（ｂ）ＣＣＲ４に結合するために抗体（ａ）と競合することができる抗体である。
【０２０７】
一実施形態において、抗体は、
（ａ）配列番号７３のＶＨドメインおよび配列番号７４のＶＬドメインを有するか、あるいは
（ｂ）ＣＣＲ４に結合するために抗体（ａ）と競合することができる抗体である。
【０２０８】
一実施形態において、抗体は、
（ａ）配列番号７５のＶＨドメインおよび配列番号７６のＶＬドメインを有するか、あるいは
（ｂ）ＣＣＲ４に結合するために抗体（ａ）と競合することができる抗体である。
【０２０９】
一実施形態において、抗体は、
（ａ）配列番号１３９のＶＨドメインおよび配列番号１４０のＶＬドメインを有するか、あるいは
（ｂ）ＣＣＲ４に結合するために抗体（ａ）と競合することができる抗体である。
【０２１０】
好ましくは、抗体（ｂ）は、ＣＤＲ配列、本明細書に記載のＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインの１つ以上を有する。
【０２１１】
好ましくは、抗体（ｂ）は、抗体（ａ）と同一のエピトープに結合することができる。
【０２１２】
実質的に相同な配列のある特定の例は、開示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する配列である。特定の実施形態において、本発明のＣＣＲ４に結合し、かつＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体は、配列番号のアミノ酸配列１４０、７０、７２、７４、７６、もしくは１１５に対して少なくとも約７５％、より好ましくは、少なくとも約８０％、より好ましくは、少なくとも約８５％、より好ましくは、少なくとも約９０％もしくは９５％、最も好ましくは、少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列領域を含む少なくとも１つの軽鎖可変領域、および／または配列番号のアミノ酸配列１３９、６９、７１、７３、７５、もしくは１０５に対して少なくとも約７５％、より好ましくは、少なくとも約８０％、より好ましくは、少なくとも約８５％、より好ましくは、少なくとも約９０％もしくは９５％、最も好ましくは、少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列領域を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含む。
【０２１３】
実質的に相同な配列の他の好ましい例は、開示されるアミノ酸配列の保存アミノ酸置換を含有する配列である。
【０２１４】
実質的に相同な配列の他の好ましい例は、開示されるＣＤＲ領域の１つ以上で、１、２、３、もしくは４個以下、好ましくは、１もしくは２個以下の変化したアミノ酸を含有する配列である。そのような変化は、保存もしくは非保存アミノ酸置換、またはその混合物であり得る。
【０２１５】
全てのそのような実施形態において、好ましい変化は、保存アミノ酸置換である。
【０２１６】
全ての実施形態において、実質的に相同な配列を含有する抗体は、ＣＣＲ４に結合する能力およびＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害する能力を保持する。
【０２１７】
本発明の他の実施形態は、ＣＣＲ４に結合し、ＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害する能力を有し、かつ本発明の抗体、本発明ＶＨもしくはＶＬドメイン、または本発明ＣＤＲの１つ以上を含む結合タンパク質を提供する。好ましい実施形態において、そのような結合タンパク質は、抗体である。
【０２１８】
本発明の好ましい抗体は、３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの重鎖可変領域と、３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの軽鎖可変領域とを含む。これらのＣＤＲの例示的かつ好ましい配列が、本明細書に記載される。
【０２１９】
本明細書で使用される「ＣＣＲ４」という簡潔な用語は、別途特に提示されないか、あるいは科学的専門用語から明確にされない限り、ＣＣケモカイン受容体４（ＣＤ１９４としても知られている）を意味する。
【０２２０】
ＣＣＲ４は、遊離ＣＣＲ４、例えば、組換えまたは精製されたＣＣＲ４であるが、好ましくは、それは、天然型、例えば、細胞の表面で存在する。
【０２２１】
本発明の抗体または結合タンパク質は、ＣＣＲ４の断片、具体的には、細胞外ドメインを含むか、あるいはそれから成る断片にも結合することができるか、あるいは、ＣＣＲ４またはＣＣＲ４の断片を含む実体に結合することができる。実に、本発明の抗体のエピトープは、ＣＣＲ４の細胞外ドメイン内に位置付けられる。
【０２２２】
「ＣＣＲ４」は、特にＣＣＲ４が哺乳動物種の全域で保存される時に、ＣＣＲ４の任意の型も指す。したがって、本発明の抗体または抗体断片は、例えば、ヒト、サル（例えば、カニクイザル）、ウシ[cow]（ウシ[bovine]）、マウス、ラット、ハムスター、フェレット、テンジクネズミ、および／またはウサギＣＣＲ４に結合し得る。好ましくは、本発明の抗体または抗体断片は、少なくともヒトＣＣＲ４に結合する。したがって、別途提示されない限り、本明細書における「ＣＣＲ４」への任意の参照を、「ヒトＣＣＲ４」を意味すると解読することができる。特定の好ましい実施形態において、本発明の抗体または抗体断片は、少なくともヒトおよびサル（例えば、カニクイザル）ＣＣＲ４に結合する。他の好ましい実施形態において、本発明の抗体または抗体断片は、少なくともヒトおよびマウスＣＣＲ４に結合する。他の好ましい実施形態において、本発明の抗体または抗体断片は、少なくともヒト、サル、およびマウスＣＣＲ４に結合する。他の好ましい実施形態において、本発明の抗体または抗体断片は、少なくともヒト、サル、テンジクネズミ、およびマウスＣＣＲ４に結合する。抗体９Ｅおよび９Ｅ１０Ｊは、ヒトおよびサルＣＣＲ４に結合することができるが、マウスＣＣＲ４には結合することができない（実施例８）ので、いくつかの好ましい実施形態では、本発明の抗体または抗体断片は、少なくともヒトおよびサルＣＣＲ４に結合するが、マウスＣＣＲ４に結合しない。他の好ましい実施形態において、本発明の抗体または抗体断片は、ヒトおよびサルＣＣＲ４に結合するが、マウスＣＣＲ４には結合せず、例えば、ヒトおよびサルＣＣＲ４にのみ結合する。
【０２２３】
本明細書で使用される「ＣＣＲ４に結合する」または「抗ＣＣＲ４」という用語は、本発明の抗体または抗体断片において、以下の１つ以上、好ましくは、以下の複数、最も好ましくは、以下の全ての能力がある抗体または抗体断片を意味する：
（ａ）例えば、フローサイトメトリーまたは免疫組織化学によって評価される時、細胞の表面上に発現するＣＣＲ４に結合する、
（ｂ）例えば、非還元条件下で、ウエスタンブロット法においてＣＣＲ４に結合することによって評価される時に、配座的依存（例えば、非線形）ＣＣＲ４エピトープに結合する、
（ｃ）例えば、ＥＬＩＳＡアッセイまたはＢＩＡｃｏｒｅアッセイによって評価される時に、固定票上で、遊離ＣＣＲ４、例えば、組換え発現ＣＣＲ４に結合する、
（ｄ）少なくともヒトＣＣＲ４、より好ましくは、ヒトおよびサルＣＣＲ４、またはヒトおよびマウスＣＣＲ４に結合し、最も好ましくは、ヒト、サル、およびマウスＣＣＲ４に結合するか、あるいはヒトおよびサルＣＣＲ４に結合するが、マウスＣＣＲ４に結合しない、
（ｅ）本明細書の他の箇所でも議論されるように、１０ｎＭ以下、好ましくは、５ｎＭ以下、より好ましくは、３ｎＭ以下または２ｎＭ以下、最も好ましくは、１ｎＭ以下の親和性（Ｋｄ）でヒトＣＣＲ４に結合する、
（ｆ）類似した親和性、本明細書の他の箇所でも議論されるように、例えば、１０ｎＭ以下、好ましくは、５ｎＭ以下、より好ましくは、３ｎＭ以下または２ｎＭ以下、例えば１ｎＭ以下のＫｄで、ヒトおよびサルＣＣＲ４またはヒトおよびマウスＣＣＲ４に結合する、好ましくは、ヒトおよびサルＣＣＲ４に結合するが、マウスＣＣＲ４には結合しない。
【０２２４】
本発明の好ましい抗体または抗体断片は、以下の機能特性の１つ以上、好ましくは、以下の機能特性の複数、最も好ましくは、以下の機能特性の全ての能力もある：
（ｇ）本明細書の他の箇所で説明される、ＣＣＲ４＋細胞のＡＤＣＣを誘導する、
（ｈ）少なくともＭＤＣおよび／またはＴＡＲＣ、好ましくは、ＭＤＣおよびＴＡＲＣ、または好ましくは、少なくともＭＤＣおよび／またはＴＡＲＣ、ならびにＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１、およびＭＩＰ−１アルファから選択される１つ以上へのＣＣＲ４の結合を阻害する、
（ｉ）インビボでの抗腫瘍効果を誘導する、
（ｊ）腫瘍を有する動物への投与時に、腫瘍を局在化する、
（ｋ）ＣＣＲ４＋細胞のＣＤＣを誘導する、
（ｌ）ＣＣＲ４リガンドに対するＣＣＲ４介在細胞応答を阻害する、好ましくは、ＣＣＲ４リガンドに反応して、細胞内のカルシウムイオン濃度の増加を阻害する、
（ｍ）ＭＤＣ等のＣＣＲ４リガンドに向かうＣＣＲ４＋細胞の走化性を阻害する。
【０２２５】
ＣＣＲ４＋細胞への結合において、本発明の抗体は、ＣＣＲ４＋細胞に結合し、かつＣＣＲ４-細胞に有意に結合しないことが理解されるはずである（実施例２に示される）。
【０２２６】
「ＣＣＲ４-細胞に有意に結合しない」という用語は、抗体のＣＣＲ４-細胞への任意の結合が、治療または診断目的で、本抗体の使用を妨げない。したがって、ＣＣＲ４-細胞への「有意でない」結合とは、抗体のＣＣＲ４-細胞への結合が、その１つ以上のＣＣＲ４+細胞への結合よりも弱いことを意味する。それゆえに、正常な細胞とのいくつかの交差反応が発生する場合もあるが、結合のこのレベルを、「バックグラウンド」結合と見なすことができる。治療または診断目的のために、主な考慮すべき事柄は、抗体が、治療または診断適用中に接触し得る任意のＣＣＲ４-に結合するよりも、ＣＣＲ４+細胞の１つ以上の型に強力に結合するべきであることである。
【０２２７】
本発明の抗体は、「ＣＣＲ４特異的」と称される場合もある。「ＣＣＲ特異的」という用語は、抗体のＣＣＲ４発現細胞への結合が、治療または診断目的で、本抗体の使用を可能にするのに十分特異的であるように解釈されるべきである。当業者は、標的ＣＣＲ４+細胞への結合力を、ＣＣＲ４-細胞の１つ以上の型、例えば、野生型（すなわち、ＣＣＲ４で形質転換されない）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＤＴ４０−細胞への結合力と比較することによって、任意の既定の抗体がＣＣＲ４特異的であるかを容易に決定することができる。
【０２２８】
当業者は、例えば、フローサイトメトリーを用いて、ＣＣＲ４-細胞への結合と比較した、ＣＣＲ４+細胞への結合を評価することができることを認識し、好適な例が、実施例２に記載される。
【０２２９】
抗体の細胞または試料への結合をスコア化するために、当分野で周知の免疫組織化学法を使用することができる。そのようなアッセイを、特定の抗体の特異性を試験するために、または組織試料におけるＣＣＲ４発現を検出するために、使用することができる。手短に言うと、抗体を、例えば、陽性対照（ＣＣＲ４陽性であると知られている細胞）および陰性対照（ＣＣＲ４陰性であると知られている細胞）を含むヒト組織の高密度アレイ上で試験することができる。膜染色強度を、４つのステップ尺度（０、１、２、３）における目視検査によって推定することができる。好ましい抗体は、ＣＣＲ４＋組織に対して弱いまたは強い、好ましくは、強い免疫組織化学的スコアを示す。
【０２３０】
種交差反応性を、既知の方法を用いてアッセイすることができ、好適なアッセイは、実施例８に記載される。
【０２３１】
抗体１７Ｇ、９Ｅ、１Ｏ、および１１Ｆは、そのリガンドＴＡＲＣおよびＭＤＣへのＣＣＲ４の結合を阻害することができることが示された（実施例３）。したがって、好ましくは、本発明の抗体は、そのリガンドの１つ以上へのＣＣＲ４の結合を阻害することができる。好ましくは、少なくともＭＤＣへの結合が阻害される。より好ましくは、ＭＤＣおよびＴＡＲＣへの結合が阻害される。いくつかの実施形態において、ＴＡＲＣへのＣＣＲ４の結合が阻害される。本明細書に開示の態様のうちのいずれかの実施形態において、本発明の抗体は、ＣＣＲ４へのＭＤＣおよび／またはＴＡＲＣの結合を阻害することができる。したがって、本文の至るところでＭＤＣのＣＣＲ４への結合の阻害を言及しているが、本明細書に開示の態様および実施形態のうちのいずれかのある実施形態は、ＭＤＣおよび／またはＴＡＲＣへの結合の阻害である。
【０２３２】
ＣＣＲ４へのリガンドの「結合の阻害」とは、ＣＣＲ４へのリガンドの結合が、抗体の不在下での結合と比較して、抗体の存在下で、少なくとも２０、３０、または４０％、より好ましくは、少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、または７５％、さらにより好ましくは、少なくとも８０％低下することを意味する。ＣＣＲ４へのリガンドの結合が少なくとも８５、９０、または９５％低下する実施形態も企図される。見方を変えれば、リガンドが最初にＣＣＲ４と接触し、抗体がその後に添加され時、リガンドは、ＣＣＲ４への抗体の結合を阻害することができる。
【０２３３】
抗体がＣＣＲ４へのリガンドの結合を阻害することができるかを決定するためのアッセイが周知であり、好適なアッセイは、実施例３に記載される。手短に言うと、ＣＣＲ４＋細胞を、ＭＤＣと、またはＭＤＣなしでインキュベートし、次に抗体を添加し、次いで、抗体を標識抗ヒト抗体で検出した。ＭＤＣの存在下での予インキュベーションは、ＣＣＲ４に結合する抗体の減少をもたらした。特に、ＣＣＲ４をトランスフェクトし、かつＭＤＣまたはＴＡＲＣと予インキュベートしたＤＴ４０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２１１１）への抗体の結合が阻害される。
【０２３４】
抗体がＣＣＲ４へのリガンドの結合を阻止することができるかを決定するための代替のアッセイは、標識リガンド、例えば、放射性標識リガンドの使用を含む。好適なアッセイは、実施例９に記載される。
【０２３５】
抗体１７Ｇおよび９Ｅは、具体的には、ＣＣＲ４リガンドに反応して、細胞内のカルシウムイオン濃度の増加を阻害することによって、ＣＣＲ４リガンドに対するＣＣＲ４介在細胞応答を阻害することができることが示された（実施例５を参照のこと）。ＴＡＲＣ誘導シグナル伝達の用量依存性阻害は、抗体９Ｅおよび９Ｅ１０Ｊにおいて示された（実施例５を参照のこと）。したがって、本発明の抗体は、好ましくは、具体的には、ＣＣＲ４リガンドに反応して、細胞内のカルシウムイオン濃度の増加を阻害することによって、ＣＣＲ４リガンドに対するＣＣＲ４介在細胞応答を阻害することができる。具体的には、抗体は、好ましくは、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１１９）におけるＭＤＣ誘導カルシウム流および／またはＴＡＲＣ誘導カルシウム流を阻害することができる。好適なアッセイ方法が既知であり、１つのアッセイが、実施例５に開示される。
【０２３６】
他の好ましい特性は、本発明の抗体が投与される時に、インビボで著しい毒性がないこと、およびインビボで他の著しい副作用がないことを含む。
【０２３７】
いくつかの実施形態において、抗体は、ＭＤＣまたはＴＡＲＣ等のＣＣＲ４のリガンドに向かうＣＣＲ４＋細胞の走化性を阻害し得る。抗体９Ｅおよび９Ｅ１０Ｊは、ＣＣＲ４のリガンドに向かうＣＣＲ４＋細胞の走化性を阻害することができることが示された（実施例１３）。したがって、本発明の抗体は、好ましくは、ＣＣＲ４のリガンド、好ましくは、ＭＤＣおよび／またはＴＡＲＣに向かうＣＣＲ４＋細胞の走化性を阻害することができる。
【０２３８】
いくつかの実施形態において、抗体は、ＣＣＲ４＋細胞の補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を誘導し得るが、他の実施形態では、抗体は、ＣＤＣを誘導することができない。いくつかの実施形態において、抗体は、ＣＣＲ４＋細胞のアポトーシスを誘導し得るが、他の実施形態では、抗体は、アポトーシスを誘導することができない。抗体９Ｅは、Ｒａｍｏｓ細胞のアポトーシスを誘導しないことが示されたため（実施例１２を参照のこと）、本発明の抗体は、いくつかの実施形態において、ＣＣＲ４＋細胞の著しいアポトーシスを誘導することができない。いくつかの実施形態において、抗体を、ＣＣＲ４＋細胞によって内在化することができるが、他の実施形態では、著しい内在化は起こらない。
【０２３９】
アポトーシスの誘導を、周知の標準の方法、例えば、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ染色をアッセイする方法を用いてアッセイすることができる。手短に言うと、細胞を、好適な期間、例えば、２４時間、抗体とインキュベートすることができ、細胞採取およびＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ染色後の効果を、ＦＡＣＳ分析（例えば、ＥａｓｙＣｙｔｅを用いて）によって測定することができる。
【０２４０】
ＣＤＣの誘導を、周知の標準の方法、例えば、アラマーブルー等の酸化還元色素の摂取および代謝に基づく生存細胞の相対数を測定する方法を用いてアッセイすることができる。好適なアッセイは、Ｈ  Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９７，２８；２０２（２）：１６３−７１に開示される。
【０２４１】
当業者は、例えば、フローサイトメトリー上での温度差動蛍光標識法または共焦点顕微鏡法を用いて、内在化をアッセイするのに好適な方法を認識する。好適なアッセイの例は、塩基性ｐＨで蛍光性が小さく（細胞の外側で見出される）、かつ酸性ｐＨで蛍光性が大きい（細胞の内側で見出される）、ｐＨ感受性色素（ＣｙｐＨｅｒ５Ｅ等）で標識化される二次抗体を含む。
【０２４２】
走化性の阻害を、標準の方法、例えば、トランスウェルアッセイを用いてアッセイすることができる。手短に言うと、走化性の能力があり、かつＣＣＲ４を発現する細胞を、抗体と１つのチャンバ内で接触させ、ＭＤＣ等のＣＣＲ４のリガンドを、好適な細孔の大きさを有するフィルタの膜で第１のチャンバから分離された別のチャンバ内に設置する。リガンドに向かう細胞移動（走化性）への抗体の影響を、抗体の存在下での走化性と、抗体の不在下での走化性を比較することによって判定することができる。
【０２４３】
ＣＣＲ４の「リガンド」という用語は、研究室において自然に産生するか、組換え発現するか、あるいは合成し得る、ＭＤＣ、ＴＡＲＣ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１、および／またはＭＩＰ−１アルファ等のＣＣＲ４の天然リガンドを含む。
【０２４４】
「ＣＣＲ４+細胞」とは、それらの表面で、好ましくは、少なくとも実質的に野生型立体配座で、ＣＣＲ４を発現する細胞を意味する。ＣＣＲ４＋細胞は、生来ＣＣＲ４陽性であり得るか、あるいはそれらは、組換えＣＣＲ４を発現する形質転換体であり得る。
【０２４５】
したがって、この発明を踏まえて、様々な抗ＣＣＲ４抗体を作製することができ、かつ本明細書の他の箇所で議論される障害、特に、癌、免疫障害、炎症性障害、および感染のうちのいずれかの治療を含む、多種多様の実施形態で用いることができる。
【０２４６】
本願全体を通して使用される、［ａ」および［ａｎ」という用語は、上限が後に特に提示される場合を除き、「少なくとも１つ」、「少なくとも第１」、「１つ以上」、または「複数」の参照構成要素もしくはステップを意味するという意味で使用される。したがって、本明細書で使用される、「抗体」は、「少なくとも第１の抗体」を意味する。本開示を考慮すると、操作可能な限度およびパラメータの組み合わせは、任意の単一製剤の量と同様に、当業者に既知である。
【０２４７】
本発明の好ましい実施形態は、本発明の少なくとも１つの抗ＣＣＲ４抗体、またはその抗原結合断片を含む。
【０２４８】
本明細書に定義される、本発明の抗体、またはその一部、もしくはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはそれらに実質的に相同な核酸分子は、またさらに本発明の態様を形成する。好ましい核酸分子は、（好ましくは、配列番号３４によってコードされる）配列番号３５、（好ましくは、配列番号４５によってコードされる）配列番号４６、（好ましくは、配列番号１０３によってコードされる）配列番号１０４、（好ましくは、配列番号１１３によってコードされる）配列番号１１４、（好ましくは、配列番号５６によってコードされる）配列番号５７、または（好ましくは、配列番号６７によってコードされる）配列番号６８に提示されるアミノ酸配列をコードする配列を含む。他の好ましい核酸分子は、（好ましくは、それぞれ、配列番号７７、７９、８１、８３、もしくは１０６によってコードされる）配列番号６９、７１、７３、７５、もしくは１０５、または１３９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする配列を含み、および／あるいは（好ましくは、それぞれ、配列番号７８、８０、８２、８４、もしくは１１６によってコードされる）配列番号７０、７２、７４、７６、もしくは１１５、または１４０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする配列を含む。以下の組み合わせ：配列番号１３９および１４０、または配列番号６９および７０、または配列番号７１および７２、または配列番号１０５および７２、または配列番号７１および１１５、または配列番号７３および７４、または配列番号７５および７６をコードする核酸がより好ましい。以下の組み合わせ：配列番号７７および７８、または配列番号７９および８０、または配列番号１０６および８０、または配列番号７９および１１６、または配列番号８１および８２、または配列番号８３および８４を含む核酸分子も好ましい。
【０２４９】
他の好ましい核酸分子は、本発明の抗体のＩｇＧ型、例えば、実施例１に記載されるもの、またはマウスキメラ型をコードする配列を含む。
【０２５０】
上述のように、本発明によって包含される他の核酸分子は、ヒト本発明の抗体の一部または断片をコードするもの、例えば、抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするもの（例えば、それぞれ、配列番号７７、７９、８１、８３、もしくは１０６等の、配列番号６９、７１、７３、７５、もしくは１０５をコードするもの）、または抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするもの（例えば、それぞれ、配列番号７８、８０、８２、８４、もしくは１１６等の、配列番号７０、７２、７４、７６、もしくは１１５をコードするもの）である。他の好ましい核酸分子は、本発明の抗体の重鎖をコードするもの（例えば、それぞれ、配列番号８５、８９、９３、９７、１１７、もしくは１２１等の配列番号８７、９１、９５、９９、１１９、もしくは１２３をコードするもの）または抗体の軽鎖をコードするもの（例えば、それぞれ、配列番号８６、９０、９４、９８、１１８、もしくは１２２等の配列番号８８、９２、９６、１００、１２０、もしくは１２４をコードするもの）である。
【０２５１】
したがって、本明細書に定義される本発明の抗体の断片、またはそれに実質的に相同な配列、またはそのような断片をコードする配列を含む核酸分子は、本発明のまたさらなる態様を形成する。
【０２５２】
有利に、本発明の抗体は、ＩｇＧ型式である時、ＣＣＲ４に対して高い結合親和性を有する、すなわち、１×１０-8Ｍまたは１×１０-9Ｍ以下の範囲のＫｄを有する。重要なことには、そのような親和性を有する抗体は、治療に有用であることが示された確立した範囲にある。好ましくは、本発明の抗体は、ＩｇＧ型式である時、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、または１０ｎＭ未満、より好ましくは、１０、９．５、９、８．５、８、７．５、７、６．５、６、５．５、５、４．５、４、３．５、３、２．５、２、１．５、または１ｎＭ未満、最も好ましくは、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、または０．１ｎＭ未満のＫｄに相当する、ＣＣＲ４に対する結合親和性を有する。
【０２５３】
Ｋｄを決定する任意の適切な方法を使用することができる。しかしながら、好ましくは、Ｋｄは、例えば、ラインウィーバーバーク法を用いて、または好ましくは、ＢＩＡｃｏｒｅ１０００評価ソフトウェアの１：１結合モデル等の市販の結合モデルソフトウェアを用いて、飽和曲線を確立するために、インビトロで、様々な濃度の抗原（ＣＣＲ４）に対する様々な濃度の試験抗体を試験することによって決定される。ソフトウェアＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の「一部位特異結合」モデルを用いて、ＣＣＲ＋細胞上でのＩｇＧ滴定からＫｄ値を計算した好適なアッセイを、実施例２で用いる。
【０２５４】
Ｋｄ値の決定に関して、実験条件が見かけの結合親和性に影響を及ぼすため、当業者は、標的を発現する細胞（例えば、ＣＣＲ４）を用いる結合実験から算出される見かけのＫｄ値を、絶対的な指標であると考慮することができないことを理解する。例えば、ＣＣＲ４の発現レベルは、細胞が培養される条件によって変化し、ならびに異なる細胞種類間で異なり得る。その結果として、一連の実験内で得られる見かけのＫｄ値を比較することが最善であり、一組の実験内で得られるＫｄ値を、異なる組の実験で得られるＫｄ値と比較することは、特に、実験条件が著しく変化する場合、必ずしも適切ではない場合もある。
【０２５５】
あるいは、ＣＣＲ４陽性細胞の表面上のオフ率および抗体半減期を、細胞表面保持アッセイを実行することによって決定することができる（Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔｕｍｏｕｒ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｄｉａｂｏｄｙ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＨＥＲ２／ｎｅｕＢｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ７７：１４０５−１２、Ｌｅ  Ｇａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｄｉ−，ｔｒｉ−  ａｎｄ  ｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ１９：ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｖａｌｅｎｃｙ  ｏｎ  ｃｅｌｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４５３：１６４−８）。後者の方法は、治療条件下で、ヒト患者の実際の状態のより適切な模倣を可能にする。
【０２５６】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、ヒトＣＣＲ４およびサルＣＣＲ４の両方に結合し得る。種間、具体的には、ヒトと前臨床動物モデルとして一般に使用される種との間のそのような交差反応性は、前臨床試験から臨床使用へのより効率的な転換を可能にするとして、利点であり得る。例えば、使用される特定の動物モデルに存在する天然ＣＣＲ４と交差反応する抗体を有することは、このモデルにおける結果がヒト患者における状態を反映する可能性が高く、それによって、例えば、行われる投与のより正確な評価、および任意の潜在的に関連するか、あるいは疑わしい副作用を同定する可能性の増大を可能にすることを意味する。
【０２５７】
例えば、本発明の抗体のヒトＣＣＲ４およびサルＣＣＲ４の両方に結合する能力は、そのような抗体を、治療の有害な副作用を評価し、適切な耐容性を示す用量を見出すために、前臨床毒性試験において試験することができることを意味する。
【０２５８】
加えて、ヒトＣＣＲ４およびマウスＣＣＲ４の両方に結合する能力は、マウスモデル、例えば、免疫応答性マウスを使用するマウス同系モデルにおいて、本発明のそのような抗体により示される結果が、ヒト対象における抗体の活性の典型である可能性が高いことを意味する。この理由として、ヒトＣＣＲ４に結合できるが、マウスＣＣＲ４に結合できない抗体が、マウスモデルのヒト腫瘍細胞によって発現されるＣＣＲ４に結合するが、内因性マウスＣＣＲ４に結合することができないためである。これは、言うまでもなく、腫瘍および内因性ＣＣＲ４によって発現されるＣＣＲ４が存在するであろうヒト患者の状態とは異なる。これは特に、抗体がマウスＣＣＲ４およびヒトＣＣＲ４の両方への類似した親和性を有する場合にそうである。
【０２５９】
そのような状態に欠点があるとすれば、ヒトＣＣＲ４に結合するが、マウスＣＣＲ４に結合しないか、あるいは著しく低い親和性で結合する抗体が、易感染性マウス（例えば、ヌードもしくはＳＣＩＤマウス）のヒト腫瘍異種移植モデルにおいて、良好に機能するかもしれないが、これは、より多くのＣＣＲ４が存在するヒト系において、類似する機能に反映されないかもしれないことである。言い換えると、ヒトＣＣＲ４に結合できるが、マウスＣＣＲ４に結合できない抗体を有するマウス異種移植系で見られる抗腫瘍効果は、臨床の現実性よりも良く見えるかもしれない。対照的に、ヒトＣＣＲ４およびマウスＣＣＲ４の双方に結合できる抗体を用いて作業する場合、これは、マウスモデル系に存在する全ての形態のＣＣＲ４に結合し、抗体がヒトに投入される時の状態のより典型である可能性がある。これは特に、抗体がマウスＣＣＲ４およびヒトＣＣＲ４の両方への類似した親和性を有する場合にそうである。
【０２６０】
好ましい実施形態において、本発明の抗体は、類似した親和性、例えば、１０ｎＭ以下または５ｎＭ以下、より好ましくは、３ｎＭ以下または２ｎＭ以下、最も好ましくは、１ｎＭ以下のＫｄで、ヒトおよびサルＣＣＲ４に結合する。
【０２６１】
「類似した親和性」とは、ヒトＣＣＲ４、および他の関心の種（例えば、サルまたはマウス）のうちの１つ以上への抗体の結合親和性が、比較可能である、例えば、２０以下の異なる因数であるという意味でもある。より好ましくは、結合親和性の間の相違は、１５未満の因数、より好ましくは１０未満の因数、より好ましくは５、４、３、または２未満の因数である。
【０２６２】
しかしながら、他の実施形態において、本発明の抗体は、サルＣＣＲ４に結合しない場合もあり、および／またはそれらは、マウスＣＣＲ４に結合しない場合もある。
【０２６３】
本発明の抗体は、ＣＣＲ４に結合する。したがって、本発明の抗体または結合タンパク質を、インビボまたはインビトロで、ＣＣＲ４を検出するために、具体的には、ＣＣＲ４＋細胞を検出するために使用することができる。例えば、ＣＣＲ４はある特定の腫瘍細胞上で発現されるため、本発明の抗体または結合タンパク質を、インビボまたはインビトロで、腫瘍細胞を検出するために使用することができる。加えて、抗体のＣＣＲ４＋細胞を局在化させる能力とは、本発明の抗体が、ＣＣＲ４＋細胞が存在する身体部位を標的とすることができ、そうして、抗体は標的部位で作用することができることを意味する。具体的には、抗体のＣＣＲ４＋腫瘍細胞を局在化させる能力とは、本発明の抗体が、ＣＣＲ４＋腫瘍細胞が存在する身体部位を標的とすることができ、そうして、抗体は標的部位で作用することができることを意味する。
【０２６４】
例えば、抗体は、例えば、ＡＤＣＣを活性化または誘導することによって、抗ＣＣＲ４＋細胞効果自体を、すなわち、裸抗体として誘導し得る。裸Ａｂとして作用するこの能力は、有利である。あるいは、またはさらには、抗体は、さらなる治療分子、例えば、本明細書に記載の毒素もしくは他の抗癌分子または抗炎症剤に抱合されることによって、抗腫瘍作用を誘発することができる。
【０２６５】
本発明の抗体は、好ましくは、ＣＣＲ４＋細胞の抗体依存細胞細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する能力を有する。ＡＤＣＣを、当分野で周知の方法を用いて、インビトロでアッセイすることができる。好適な方法が、実施例６に記載される。あるいは、例えば、クロム−５１放出アッセイを用いることができる。したがって、本発明の抗体は、ヒトＰＢＭＣの存在下にて、インビトロで、例えば、ＣＣＲ４＋細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２２％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の死滅を引き起こし得る。例えば、抗体１７Ｇは、ヒトＰＢＭＣの存在下で、ＣＣＲ４＋細胞株ＣＣＲＦ−ＣＥＭの少なくとも１０％、１５％、２０％、または２２％の死滅を引き起こすことが示されており、かつ抗体９Ｅは、ヒトＰＢＭＣの存在下で、ＣＣＲ４＋細胞株ＣＣＲＦ−ＣＥＭの少なくとも１０％、１５％、２０％、２２％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％の死滅を引き起こすことが示されている（実施例６を参照のこと）。抗体９Ｅ１０Ｊは、ヒトＰＢＭＣの存在下で、ＣＣＲ４＋細胞株ＣＣＲＦ−ＣＥＭの少なくとも１０％、１５％、２０％、２２％、３０％、３５％、４０％、４２％の死滅を引き起こすことが示されている（実施例６を参照のこと）。ＡＤＣＣは、いくつかの適用、特に、いくつかの治療上の適用に有利である。したがって、好ましい実施形態において、抗体は、ＣＣＲ４＋細胞、好ましくは、ＣＣＲ４＋腫瘍細胞および／またはＣＣＲ４＋Ｔｈ２細胞のＡＤＣＣを誘導することができる。いくつかの実施形態において、抗体介在ＡＤＣＣは、ＰＢＭＣの存在下であるが、抗体介在ＡＤＣＣがＰＢＭＣの不在下である実施形態も企図される。他の実施形態において、抗体は、わずかにしか有意でないか、あるいは全く有意でないＡＤＣＣを誘導する。
【０２６６】
本発明の抗体は、好ましくは、そのようなＡＤＣＣレベルを達成するために必要な抗体の濃度に関して、好適に強力であることも示す。かさねて、好適なインビトロ試験が、実施例６に記載される。したがって、インビトロで、ＣＣＲ４＋細胞、例えば、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞の５０％細胞溶解に必要な抗体濃度（ＥＣ50）は、好ましくは、７００ｎｇ／ｍＬ、６５０ｎｇ／ｍＬ、６２０ｎｇ／ｍＬ、６００ｎｇ／ｍＬ、５５０ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、４５０ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、３５０ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、４６ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、３５ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、または０．２５ｎｇ／ｍｌ未満である。例えば、本発明の１７Ｇ抗体は、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞において６１９ｎｇ／ｍｌのＥＣ50を有することが示され、本発明の抗体９Ｅは、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞において４６ｎｇ／ｍｌのＥＣ50を有することが示され、本発明の個別の実験抗体では、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞において２５ｎｇ／ｍｌのＥＣ50を有することが示された（実施例６を参照のこと）。
【０２６７】
好ましくは、上述の能力は、適切な対照レベルと比較する時、測定可能または有意なレベルで、より好ましくは、統計的に有意なレベルで観察される。
【０２６８】
異なるドナーから調製されるＰＢＭＣ（エフェクター細胞）は、非特異的および特異的腫瘍細胞溶解、ならびにＥＣ５０値に関して、ＡＤＣＣの著しい変形を呈し得ることに留意すべきである。この現象は、Ｎａｕｎｄｏｒｆ  ｅｔ  ａｌ，２００２によって説明されており、本発明の抗体でＡＤＣＣをアッセイする時にも観察された。（実施例６および１１を参照のこと）。
【０２６９】
ヒトＩｇＧ１は、Ｆｃ領域に結合する２つのＮ結合オリゴ糖鎖を担持糖タンパク質である。オリゴ糖は、コアフコースを有するか、またはコアフコースを有さないトリマンノシルコア構造から成り、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、および末端シアル酸を二分する、複合体二分岐型であり、構造的不均一性を引き起こす。ヒト血清ＩｇＧおよび治療抗体の両方が、典型的には、重度にフコシル化されることが周知である。
【０２７０】
いくつかの例において、ヒトＩｇＧ１サブクラス上でオリゴ糖の状態を操作することによって、ＡＤＣＣ強化を達成することができることが報告された。具体的には、脱フコシル化は、いくつかの抗体のＡＤＣＣ活性の増加を引き起こすことが示された（Ｎｉｗａ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ，２００４）。したがって、好ましい実施形態において、本発明に記載の抗体は、タンパク質の産生／発現中に、および／または産生／発現後にインビトロで修飾され、特定のグリコシル化パターン、特に、抗体の治療上の適用に有益であるグリコシル化パターンを生成する。好ましくは、該特定のグリコシル化パターンは、フコースに基づくグリコシル化の還元または不在であり、好ましくは、ＡＤＣＣを誘導する抗体の能力を増加させる。したがって、好ましい実施形態において、本発明の抗体は、特定のグリコシル化パターン、好ましくは、ＡＤＣＣを誘導する本抗体の能力を増加させる特定のグリコシル化パターンを有する。好ましくは、本発明の抗体は、脱フコシル化または非フコシル化される。
【０２７１】
当業者は、脱フコシル化または非フコシル化抗体を調製する好適な方法を認識している。実施例１０で説明されるように、Ｋｉｆｕｎｅｎｓｉｎｅ（例えば、１００ｎｇ／ｍＬ）、クラスＩα−マンノシダーゼの選択的阻害剤の存在下で抗体を産生することによって、これを達成することができ、産生中の分子のフコシル化の減少につながる。オリゴ糖部分のフコシル化に必要な１つ以上のタンパク質を欠く好適な宿主細胞を、脱フコシル化抗体、例えば、フコース転移酵素欠損宿主細胞を産生するために用いることができる。好適な宿主細胞の実施例は、細胞内糖ヌクレオチド、ＧＤＰ−フコースの合成に関連する酵素の活性、および／またはフコースの１位が、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖内のα結合を介して、還元末端中のＮ−アセチルグルコサミンの６位に結合される糖鎖の修飾に関連する酵素の活性が減少するか、あるいは除去される、細胞である。そのような酵素の例には、ＧＭＤ（ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ）、Ｆｘ（ＧＤＰ−ケト−６−デオキシマンノース３，５−エピメラーゼ、４−レダクターゼ）、ＧＦＰＰ（ＧＤＰ−ベータ−Ｌ−フコースピロホスホリラーゼ）を含むＧＤＰ−フコースの合成に関連する酵素が挙げられる。
【０２７２】
「脱フコシル化」とは、Ｆｃ領域に結合する、少なくとも１０％、好ましくは、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または少なくとも９９％の全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖は、フコースが、糖鎖内で還元末端中のＮ−アセチルグルコサミンに結合されない糖鎖を意味する。
【０２７３】
「非フコシル化」とは、著しいレベルのフコースが抗体中に存在しないことを意味する。
【０２７４】
いくつかの抗体を、それらが結合されるようになる細胞中に内在化することができる。したがって、本発明のいくつかの実施形態において、抗体を内在化することができる。この特性は、抗体分子に結合される任意の他の作用物質が、抗体分子とともに内在化されるはずであるとして、免疫抱合体での使用に特に有利である。他の実施形態において、著しい内在化は見られない。
【０２７５】
特に医療適用において、抗体が任意の著しい血小板凝集を誘導しないことが望ましい。血小板凝集を、実施例１５に説明されるようにアッセイすることができる。この実施例は、抗体９Ｅ１０Ｊが血小板凝集への任意の著しい影響を有さないことを示す。したがって、本発明のいくつかの実施形態において、抗体は、血小板凝集への任意の著しい影響を有さない。
【０２７６】
上述のように、Ｔｒｅｇを含むある特定のＰＢＬは、ＣＣＲ４を発現するため、ＰＢＬに対する抗体９Ｅ１０Ｊの能力を実施例１６でアッセイし、この実施例は、９Ｅ１０ＪがＰＢＬに結合することができることを示す。したがって、本発明のいくつかの実施形態では、抗体は、ＰＢＬ、好ましくは、Ｔｒｅｇおよび／またはＴｈ２細胞に結合することができる。この特徴は、Ｔｒｅｇ細胞の枯渇を可能にし得るとして、特に、免疫療法において有利である。
【０２７７】
本発明に記載の組成物、免疫抱合体、薬剤、組合物、カクテル、キット、第１および第２の医学的使用、ならびに全ての方法の以下の説明において、「抗体」および「免疫抱合体」という用語、または抗原結合領域もしくはその断片は、別途特に提示されないか、あるいは科学的専門用語から明確にされない限り、様々な抗ＣＣＲ４抗体、ならびに特定の１７Ｇ、９Ｅ、１Ｏ、１１Ｆ、９Ｅ１０Ｊ、および９Ｅ１Ｄ抗体を指す。
【０２７８】
本明細書で使用される「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、広範に、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含むヒト抗原結合ドメインを含む、任意の免疫学的結合剤または分子を指す。重鎖の定常ドメインの種類により、全抗体は、５つの主要クラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭのうちの１つに割り当てられ、本発明の抗体は、本発明の抗体は、これらのクラスのうちの任意の１つであり得る。これらのうちのいくつかは、さらにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等のサブクラス、またはアイソタイプに分類される。免疫グロブリンの異なるクラスに相当する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと称される。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元構成は周知である。
【０２７９】
概して、抗原結合領域よりはむしろ全抗体が本発明で使用される場合、ＩｇＧおよび／またはＩｇＭは、生理学的状態において最も一般的な抗体であり、かつ研究室環境で最も容易に作製されるため、好ましい。ＩｇＧ１抗体が特に好ましい。
【０２８０】
哺乳動物抗体の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列、およびそれらの可変ドメインのフレームワーク領域のいくつかのアミノ酸に基づいて、２つの明らかにはっきりと異なる種類：カッパ（κ）およびラムダ（λ）のうちの１つに割り当てられる。基本的には、本発明の抗体におけるκまたはλ軽鎖定常領域の使用に対する選好はない。
【０２８１】
当業者によって理解されるように、「抗体」という用語によって包含される免疫学的結合試薬は、全抗体、二量体、三量体、および多量体抗体、二重特性抗体、キメラ抗体、組換えおよび改変抗体、ならびにそれらの断片を含む、全ての抗体、およびそれらの抗原結合断片に及ぶ。
【０２８２】
したがって、「抗体」という用語を用いて、抗原結合領域を有する任意の抗体様分子を指し、本用語は、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）、ＴａｎｄＡｂ二量体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ）、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、Ｆｄ、直鎖状抗体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体断片、バイボディ、トリボディ（それぞれ、ｓｃＦｖ−Ｆａｂ融合、二重特異性または三重特異性）、ｓｃ−ダイアボディ、カッパ（ラムダ）ボディ（ｓｃＦｖ−ＣＬ融合）、二重特異性Ｔ細胞結びつけ（ＢｉＴＥ）（Ｔ細胞を誘引するためのｓｃＦｖ−ｓｃＦｖタンデム型）、双対変数ドメイン（ＤＶＤ）−Ｉｇ（二重特異性形式）、小免疫タンパク質（ＳＩＰ）（ミニボディの一種）、ＳＭＩＰ（「小モジュール免疫薬理学的」）ｓｃＦｖ−Ｆｃ二量体、ＤＡＲＴ（ｄｓ安定化ダイアボディ「二重親和性再標的化」）、１つ以上のＣＤＲを含む小抗体模倣物等の抗原結合ドメインを含む抗体断片を含む。
【０２８３】
様々な抗体に基づく構造体および断片を調製および使用するための技法は、当分野で周知である（参照により明確に本明細書に組み込まれる、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１を参照されたい）。ダイアボディは、具体的には、欧州特許第４０４，０９７号明細書および国際公開第９３／１１１６１号明細書にさらに説明され、一方で、直鎖状抗体は、Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）にさらに説明される。
【０２８４】
抗体を、従来の技法を使用して断片化することができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）2断片を、抗体をペプシンで処理することによって生成することができる。得られたＦ（ａｂ’）2断片を処理し、ジスルフィド架橋を還元し、Ｆａｂ’断片を産生することができる。パパイン消化は、Ｆａｂ断片の形成につながり得る。Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）2、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、ＴａｎｄＡｂ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、二量体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体断片、ならびに他の断片を、組換え技法によって合成するか、あるいは化学的に合成することもできる。抗体断片を産生するための技法が当分野で周知であり、説明されている。例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ＆  Ｈｕｄｓｏｎ，２００５、Ｌｅ  Ｇａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｒｅｆｆ  ＆  Ｈｅａｒｄ，２００１、Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６、およびＹｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５の各々は、効果的な抗体断片の産生をさらに説明し、それを可能にする。
【０２８５】
抗体または抗体断片を、天然に産生するか、あるいは完全に、または部分的に合成的に産生することができる。したがって、抗体は、任意の適切な供給源、例えば、組換え供給源由来であってもよく、および／または遺伝子組換え動物、もしくは遺伝子組換え植物で、またはＩｇＹ技法を使用することにより、卵子で産生することができる。したがって、抗体分子を、インビトロまたはインビボで産生することができる。
【０２８６】
好ましくは、抗体または抗体断片は、３つのＣＤＲドメインを含む抗体軽鎖可変領域（ＶL）と、３つのＣＤＲドメインを含む抗体重鎖可変領域（ＶH）とを含む。該ＶＬおよびＶＨは、概して、抗原結合部位を形成する。
【０２８７】
「Ｆｖ」断片は、完全な抗原認識および結合部位を含有する、最小の抗体断片である。この領域は、密接した非共有結合会合で、１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインの二量体を有する。各々の可変ドメインの３つの超可変領域（ＣＤＲ）が相互作用し、ＶH−ＶL二量体の表面上で抗原結合部位を画定するのは、この配置内である。集合的に、６つの超可変領域（ＣＤＲ）は、抗原結合特異性を抗体に付与する。
【０２８８】
しかしながら、抗体の軽鎖可変ドメインからの３つのＣＤＲと、重鎖可変ドメインからの３つのＣＤＲの存在は、抗原結合に必ずしも必要ではないことは、当分野で十分に立証されている。したがって、上述の古典的な抗体断片よりも小さい構築物が有効であることが知られている。
【０２８９】
例えば、ラクダ抗体（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３、Ａｒｂａｂｉ  Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）は、広範囲に及ぶ抗原結合レパートリーを有するが、軽鎖を欠いている。また、ＶＨドメインのみ（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９、Ｄａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，１９９５）またはＶＬドメインのみ（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｕｃｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）を含む単一ドメイン抗体での結果は、これらのドメインが、許容される高親和性で抗原に結合できることを示す。したがって、３つのＣＤＲは、効果的に抗原に結合することができる。
【０２９０】
単一のＣＤＲ、または２つのＣＤＲが効果的に抗原を結合することも知られている。第１の例として、ＧＦＰ等の異種タンパク質内に挿入されるＶＨ  ＣＤＲ３が、異種タンパク質上に抗原結合能を付与することを示すことで例示されるように、単一のＣＤＲを、異種タンパク質内に挿入し、異種タンパク質上に抗原結合能を付与することができる（Ｋｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６、Ｎｉｃａｉｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【０２９１】
２つのＣＤＲが効果的に抗原に結合し、親抗体が保有するよりも優れた特性をさらに付与することができることが、さらになお知られている。例えば、親抗体由来の２つのＣＤＲ（ＶＨ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ３領域）は、親分子の抗原認識特性を保持するが、腫瘍に浸透する優れた能力を有することが示された（Ｑｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。天然の親抗体に類似する様式で、ＣＤＲを配向するために、これらのＣＤＲドメインを適切なリンカー配列（例えば、ＶＨ  ＦＲ２由来）と結合することは、さらに良好な抗原認識を産生した。したがって、適切なフレームワーク領域が親抗体に見出される立体配座を維持するための手段によって配向される、２つのＣＤＲドメイン（好ましくは、１つはＶＨドメイン由来、および１つはＶＬドメイン由来、より好ましくは、２つのＣＤＲドメインのうちの１つがＣＤＲ３ドメインである）を含む抗原結合抗体模倣物を構築することが可能であることは、当分野において既知である。
【０２９２】
したがって、本発明の好ましい抗体は、６つのＣＤＲ領域（３つは軽鎖由来、および３つは重鎖由来）を含み得るが、６つのＣＤＲ領域より少ない、または１つもしくは２つ程度のＣＤＲ領域を有する抗体も、本明細書によって包含される。加えて、重鎖または軽鎖のみからのＣＤＲを有する抗体も企図される。
【０２９３】
好ましいＣＣＲ４に結合する本発明の好ましい抗体は、３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの重鎖可変領域と、３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの軽鎖可変領域とを含み、該重鎖可変領域は、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１、またはそれに対して実質的に相同な配列と、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２、またはそれに対して実質的に相同な配列と、
（ｃ）配列番号３もしくは１５のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３、またはそれに対して実質的に相同な配列、あるいは
（ｄ）配列番号７もしくは１０１のアミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１、またはそれに対して実質的に相同な配列と、
（ｅ）配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２、またはそれに対して実質的に相同な配列と、
（ｆ）配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３、またはそれに対して実質的に相同な配列、あるいは
（ｇ）配列番号１９のアミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１、またはそれに対して実質的に相同な配列と、
（ｈ）配列番号２０のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２、またはそれに対して実質的に相同な配列と、
（ｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３、またはそれに対して実質的に相同な配列、あるいは
（ｊ）配列番号１２５もしくは１２６のアミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１、またはそれに対して実質的に相同な配列と、
（ｋ）配列番号１２７もしくは１２８のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２、またはそれに対して実質的に相同な配列と、
（ｌ）配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３、またはそれに対して実質的に相同な配列を含む。
【０２９４】
特定の重鎖ＣＤＲ領域とともに使用するための好ましい軽鎖ＣＤＲ領域が、本明細書の他の箇所に記載されている。しかしながら、本発明の重鎖可変領域とともに使用するための３つのＣＤＲを含む他の軽鎖可変領域も企図される。本発明の重鎖可変領域とともに使用することができ、かつＣＣＲ４に結合する抗体を生み出す適切な軽鎖可変領域を、当業者は容易に同定することができる。
【０２９５】
例えば、本発明の重鎖可変領域を、単一軽鎖可変領域、または軽鎖可変領域のレパートリーと組み合わせ、得られた抗体をＣＣＲ４への結合に関して試験することができる。本発明の重鎖可変領域の異なる軽鎖可変領域との相当な数のそのような組み合わせが、ＣＣＲ４に結合する能力を保持するであろうことが予測されるであろう。
【０２９６】
同様の方法を用いて、本発明の好ましい軽鎖可変領域と組み合わせて使用するための代替的な重鎖可変領域を同定することができる。
【０２９７】
特定の実施形態において、抗体または抗体断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、ＩｇＭ、またはＩｇＤ定常領域等の重鎖定常領域の全てまたは一部を含む。好ましくは、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１重鎖定常領域、またはその一部である。さらに、抗体または抗体断片は、カッパ軽鎖定常領域、もしくはラムダ軽鎖定量領域の全てまたは一部、あるいはそれらの一部を含むことができる。そのような定常領域の全てまたは一部は、天然に産生されるか、または完全に、もしくは部分的に合成であり得る。そのような定常領域における適切な配列は、当分野において周知であり、立証されている。重鎖および軽鎖由来の定常領域の全ての補体が、本発明の抗体に含まれる場合、そのような抗体は、典型的には、「全長」抗体、または「全」抗体と本明細書で称される。
【０２９８】
Ｆｃ領域を含有する抗体は、ある特定の使用、特に、Ｆｃ領域がＡＤＣＣ等のエフェクター機能を媒介する、インビボでの治療上の使用に好ましい。
【０２９９】
アミノ酸または核酸配列に関連して本明細書で使用される「実質的に相同」という用語は、開示されるアミノ酸または核酸配列に対して、少なくとも７０％もしくは７５％、好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。したがって、本発明の実質的に相同な配列は、本発明の配列に対する単一もしくは複数の塩基またはアミノ酸改変（付加、置換、挿入、または欠失）を含む。アミノ酸レベルで、好ましい実質的に相同な配列は、本発明の配列を構成するフレームワーク領域のうちの１つ以上、および／またはＣＤＲのうちの１つ以上に、最大１、２、３、４、もしくは５個のみ、好ましくは最大１、２、もしくは３個、より好ましくは、最大１もしくは２個の改変されたアミノ酸を含有する。該改変は、保存アミノ酸または非保存アミノ酸であり得る。好ましくは、該改変は、保存アミノ酸置換である。
【０３００】
実質的に相同な核酸配列は、少なくとも適度にストリンジェントなハイブリッド形成条件下で、開示される核酸配列（またはそれらの相補的配列）、例えば、本発明の軽鎖もしくは重鎖ＣＤＲ、本発明の軽鎖もしくは重鎖可変領域、または本発明の抗体のうちの１つ以上をコードするヌクレオチド配列とハイブリッド形成する（もしくはそれらの相補的配列とハイブリッド形成する）ヌクレオチド配列も含む。
【０３０１】
「実質的に相同」という用語は、実質的に同一の方法で、本発明のタンパク質または核酸分子と実質的に同一の機能を遂行する、本発明のアミノ酸およびヌクレオチドの配列の修飾物または化学的同等物も含む。例えば、任意の実質的に相同な抗体（またはそれをコードする実質的に相同な核酸）は、上述のように、ＣＣＲ４に結合する能力を維持するはずである。好ましくは、任意の実質的に相同な抗体は、例えば、本明細書の他の箇所で定義されるように、機能的能力を保持するはずである。好ましくは、任意の実質的に相同な抗体は、問題の抗体によって認識されるエピトープと同一のＣＣＲ４のエピトープ、例えば、本明細書に記載の本発明のＣＤＲドメイン、または本発明のＶＨおよびＶＬのドメインによって認識されるエピトープと同一のエピトープに特異的に結合する能力を維持するはずである。同一のエピトープ／抗原への結合は、例えば、結合アッセイ、例えば、競合アッセイを用いて、当分野で周知であり、かつ説明される方法で、容易に試験することができる。他の機能特性の保持も、当分野で周知であり、かつ説明される方法で、容易に試験することができる。
【０３０２】
したがって、当業者は結合アッセイを用いて、「実質的に相同な」抗体が、本発明の抗体および抗体断片と同一の結合特異性を有するかを試験することができ、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイまたはＢＩＡｃｏｒｅアッセイ等の結合アッセイを用いて、そのような「実質的に相同な」抗体がＣＣＲ４に結合することができるかを容易に確証することができることを理解するであろう。上述のように、競合結合アッセイを用いて、「実質的に相同な」抗体が、本発明の抗体によって認識されるエピトープと実質的に同一のＣＣＲ４のエピトープに特異的に結合する能力を保持するかを試験することができる。以下に説明される方法は、好適な競合アッセイのほんの一例である。当業者は、他の好適な方法および変形を認識する。
【０３０３】
本発明のタンパク質の実質的に相同な配列は、保存アミノ酸置換、または例えば、異なるリンカー配列が使用されるｓｃＦｖ抗体、または抗原の結合に寄与しないタグ配列もしくは他の成分が添加される抗体を含む抗体のＶＨ、ＶＬ、もしくはＣＤＲドメインに影響を及ぼさない変化、または抗体分子もしくは断片の１つの型もしくは形式を抗体分子もしくは断片の別の型もしくは形式に変換する改変（例えば、ＦａｂからｓｃＦｖの変換もしくはその逆）、または抗体分子の特定のクラスもしくはサブクラスへの抗体分子の変換（ＩｇＧもしくはそのサブクラス、例えばＩｇＧ１もしくはＩｇＧ３への抗体分子の変換）を含むが、これらに限定されない。
【０３０４】
本明細書で使用される「保存アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が同様の側鎖を有する別のアミノ酸残基と置換されるものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当分野で定義されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラ近、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。
【０３０５】
相同性を、任意の従来の方法によって評価することができる。しかしながら、配列間の相同性の程度を決定するために、配列の複数のアライメントを作製するコンピュータプログラム、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）が有用である。所望の場合、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアルゴリズムを、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９２）、ならびに１０のギャップ開始ペナルティおよび０．１のギャップ伸長ペナルティとともに用いることができ、配列の１つの全長の少なくとも５０％がアライメントに含まれる２つの配列間で最上位の一致が得られる。配列を整列させるために使用することができる他の方法は、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）によって改訂されたＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）のアライメント法であり、最上位の一致が２つの配列間で得られ、同一のアミノ酸の数が２つの配列間で決定される。２つのアミノ酸配列間の同一性の割合を計算するための他の方法は、概して、当分野で認識されており、例えば、Ｃａｒｉｌｌｏ  ａｎｄ  Ｌｉｐｔｏｎ（１９８８）によって説明される方法、およびＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，ｅ．ｄ．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８，Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓに記載される方法を含む。
【０３０６】
概して、コンピュータプログラムを、そのような計算のために採用する。ＡＬＩＧＮ（Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，１９８８）、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８；Ｐｅａｒｓｏｎ，１９９０）、およびギャップＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、またはＧＣＧ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）のような配列の対を比較し、整列させるプロブラムも、本目的において有用である。さらに、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）のＤａｌｉサーバは、タンパク質配列の構造に基づくアライメントを提供している（Ｈｏｌｍ，１９９３、１９９５、１９９８）。
【０３０７】
基準点を提供する目的で、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有する本発明に記載の配列、配列同一性等を、デフォルトパラメータを有するＡＬＩＧＮプログラム（例えば、ＧＥＮＥＳＴＲＥＡＭネットワークサーバ、ＩＧＨ，Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅのインタネット上で入手可能である）を用いて決定することができる。
【０３０８】
「少なくとも適度にストリンジェントなハイブリッド形成条件」とは、溶液中の２つの相補的核酸分子間の選択的ハイブリッド形成を促進する条件が選択されるという意味である。ハイブリッド形成は、核酸配列分子の全てまたは一部に発生し得る。ハイブリッド形成部分は、典型的には、少なくとも１５（例えば、２０、２５、３０、４０、または５０）ヌクレオチド長である。当業者は、核酸二本鎖またはハイブリッドの安定性が、ナトリウム含有緩衝剤において、ナトリウムイオン濃度および温度の関数（Ｔｍ＝８１．５℃−１６．６（Ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％（Ｇ＋Ｃ）−６００／ｌ）、または同様の方程式）であるＴｍによって決定されることを認識する。したがって、ハイブリッド安定性を決定する洗浄条件におけるパラメータは、ナトリウムイオン濃度および温度である。既知の核酸分子と類似するが、同一ではない分子を同定するために、１％の不一致は、Ｔｍにおいて約１℃の減少をもたらすと想定される場合もある。９５％超の同一性を有する核酸分子が求められる場合、最終の洗浄温度を約５℃減少させる。これらの考慮すべき事柄に基づいて、当業者は、適切なハイブリッド形成条件を容易に選択することができる。好ましい実施形態において、ストリンジェントなハイブリッド形成条件が選択される。例として、ストリンジェントなハイブリッド形成を達成するために、以下の条件を採用することができる：上述の方程式に基づいて、５×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）／５×デンハート溶液／１．０％ＳＤＳで、Ｔｍ−５℃でハイブリッド形成し、その後、６０℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄する。適度にストリンジェントなハイブリッド形成条件は、４２℃で、３×ＳＳＣの洗浄ステップを含む。さらなる例として、「ハイブリッド形成する」配列は、非ストリンジェント条件下（例えば、室温で、６×ＳＳＣ、５０％ホルムアルデヒド）で結合（ハイブリッド形成）し、低ストリンジェント条件下（例えば、室温で２×ＳＳＣ、より好ましくは、４２℃で２×ＳＳＣ）、もしくは高ストリンジェント条件下（例えば、６５℃で２×ＳＳＣ）で洗浄される配列である（ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）。
【０３０９】
しかしながら、同等のストリンジェンシーが、代替の緩衝剤、塩、および温度を用いて達成することができることを理解する。ハイブリッド形成条件に関するさらなるガイダンスは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８９，６．３．１？６．３．６、およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９，Ｖｏｌ．３に見出すことができる。
【０３１０】
一般的に言えば、高ストリンジェンシー条件下でハイブリッド形成する配列が好ましく、コードが縮退しなければ、高ストリンジェンシー条件下でハイブリッド形成するであろう配列も好ましい。
【０３１１】
他の好ましい実施形態において、１７Ｇ、９Ｅ、１Ｏ、１１Ｆ、９Ｅ１０Ｊ、もしくは９Ｅ１Ｄ等の本来の抗ＣＣＲ４抗体と比較して、強化された特性または優れた特性を有する第２世代抗体が提供される。例えば、第２世代抗体は、ＣＣＲ４に対してより強い結合親和性、優れた交差反応プロファイル、ＣＣＲ４＋細胞、特に、腫瘍細胞を標的化する優れた能力、ＡＤＣＣを誘導する改善された能力、ＣＤＣを誘導する改善された能力、本明細書の他の箇所で議論される障害の改善された治療法を有し得る。
【０３１２】
有効な第２世代抗体を同定するための比較は、例えば、本明細書または当分野で詳しく説明される様々なアッセイのうちの１つ以上を用いて、容易に実施および定量化される。１７Ｇ、９Ｅ、１Ｏ、１１Ｆ、９Ｅ１０Ｊ、もしくは９Ｅ１Ｄ抗体で例示される本発明の抗ＣＣＲ４抗体と比較して、少なくとも約２倍、５倍、１０倍、２０倍、および好ましくは、少なくとも約５０倍の強化された生物学的特性または活性を有する第２世代抗体が、本発明に包含される。
【０３１３】
本発明の抗体、結合タンパク質、および核酸分子は、ヒトもしくは動物体内、またはヒトもしくは動物体に由来する組織試料内の原位置で存在し得る、任意のそのような成分と区別される場合、概して、「単離された」または「精製された」分子である。しかしながら、配列は、ヒトもしくは動物体に見出される配列に対応するか、または実質的に相同であり得る。したがって、核酸分子または配列およびタンパク質またはポリペプチド、例えば、抗体に関して、本明細書で使用される「単離される」または「精製される」という用語は、それらの自然環境から単離される、それから精製される、またはそれを実質的に含まれない、例えば、ヒトもしくは動物体から単離される、またはそれから精製される（実際にそれらが自然に発生する場合）場合のそのような分子を指すか、あるいは技術的過程より産生される場合の、すなわち、組換え分子および合成的に産生された分子を含むそのような分子を指す。
【０３１４】
したがって、核酸分子に関連して用いる時、そのような用語は、他の核酸／遺伝子、またはポリペプチド等の、それが自然に会合する物質を実質的に含まない核酸を指すことができる。これらの用語は、組換えＤＮＡ技法によって産生される時、細胞物質または培養培地を実質的に含まない核酸、または化学的に合成される時、化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない核酸を指すこともできる。単離または精製された核酸は、核酸が由来する核酸に自然に隣接する配列（すなわち、核酸の５’端および３’端に位置する配列）、または例えば、遺伝子組換えにより核酸に隣接するように作製された配列（例えば、タグ配列、または治療的価値を有さない他の配列）を実質的に含まない場合もある。
【０３１５】
したがって、軽鎖ＣＤＲ１、２、および３、重鎖ＣＤＲ１、２、および３、軽鎖可変領域、重鎖可変領域、ならびに全長抗体を含む本発明の結合タンパク質もしくは抗体等のタンパク質またはポリペプチド分子に関連して用いる時、「単離された」または「精製された」という用語は、典型的には、それが由来する供給源からの細胞物質または他のタンパク質を実質的に含まないタンパク質を指す。特に、タンパク質がヒトまたは動物に投与されるいくつかの実施形態において、そのような単離または精製されたタンパク質は、組換え技法により産生された時に培養培地を、または化学的に合成された時に化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。そのような単離または精製されたタンパク質は、単離された核酸分子に関する上述の配列等の隣接配列を含まない場合もある。
【０３１６】
本明細書で使用される「核酸配列」または「核酸分子」という用語は、自然発生の塩基、糖類、および糖間（骨格）結合から成る、ヌクレオシドまたはヌクレオチドの単量体の配列を指す。本用語は、自然発生しない単量体もしくはその一部を含む、修飾または置換された配列も含む。本発明の核酸配列は、デオキシリボ核酸配列（ＤＮＡ）、またはリボ核酸配列（ＲＮＡ）であってもよく、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、およびウラシルを含む、自然発生の塩基を含み得る。配列は、修飾された塩基も含み得る。そのような修飾された塩基の例として、アザおよびデアザのアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、およびウラシル、ならびにキサンチンおよびハイポキサンチンが挙げられる。核酸分子は、二本鎖または一本鎖であり得る。核酸分子は、完全に、もしくは部分的に合成であり得るか、または組換えであってもよい。
【０３１７】
好ましい実施形態において、本発明の抗体は、ヒト抗体、より好ましくは、完全なヒト抗体である。この点において、ヒト抗体は、概して、ヒト治療での使用において、少なくとも３つの潜在的利点を有する。第１に、ヒト免疫系は、抗体を外来性と認識しないはずである。第２に、ヒト循環における半減期は、自然発生のヒト抗体に類似しており、より少なくかつ低頻度の用量を与えることを可能にする。第３に、エフェクター部分がヒトであるため、それは、例えば、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）で標的細胞をより効率的に破壊するために、ヒト免疫系の他の部分と良好に相互作用する。
【０３１８】
しかしながら、ヒト抗体は、概して、これらの利点を示すように認識されるが、功を奏するヒト治療の候補にするのに十分高い親和性および適切な機能特性を有するヒト抗体の開発は、決して容易ではないことが既知である。したがって、当分野では、今もなお、ヒトの安全かつ効果的な治療用の抗ＣＣＲ４を欠いており、そのような作用物質の開発に対する課題を提起する。
【０３１９】
抗体分子および結合タンパク質に関連して本明細書で使用される「ヒト」という用語は、第１に、可変領域（例えば、ＶH、ＶL、ＣＤＲ、もしくはＦＲ領域）、かつ任意選択で、ヒトレパートリーから単離されるか、またはそれに由来する、あるいはヒト、例えば、ヒト生殖系列もしくは体細胞に見られる配列に由来するか、またはそれに対応する定常抗体領域を有する抗体および結合タンパク質を指す。１７Ｇ、９Ｅ、１Ｏ、１１Ｆ、９Ｅ１０Ｊ、および９Ｅ１Ｄ抗体は、可変領域がヒトレパートリーから単離されたそのようなヒト抗体分子の例である。
【０３２０】
本発明の「ヒト」抗体および結合タンパク質は、ヒト配列によってコードされないアミノ酸残基、例えば、インビトロでランダム変異または部位特異的変異によって導入された変異、例えば、インビトロクローン化またはＰＣＲによって導入された変異をさらに含む。そのような変異の特定の例として、抗体または結合タンパク質の残基の少数で、例えば、抗体または結合タンパク質の残基の最大５、４、３、２、もしくは１個で、好ましくは、例えば、抗体または結合タンパク質のＣＤＲのうちの１つ以上を構成する残基の最大５、４、３、２、もしくは１個で、保存置換または他の変異を伴う変異がある。そのような「ヒト」抗体のある特定の例は、潜在的に免疫原性の部位の量を減少させるために標準の修飾方法に供された抗体および可変領域を含む。
【０３２１】
したがって、本発明の「ヒト」抗体は、ヒトに見られる配列に由来および関連する配列を含むが、これは、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー内に自然に存在しない場合もある。加えて、本発明のヒト抗体および結合タンパク質は、ヒト配列から同定されるヒトコンセンサス配列、またはヒト配列に実質的に相同な配列を含むタンパク質を含む。
【０３２２】
加えて、本発明のヒト抗体および結合タンパク質は、それら自体がヒト抗体分子の組み合わせで見られるＶH、ＶL、ＣＤＲ、またはＦＲ領域の組み合わせに限定されない。本発明のヒト抗体および結合タンパク質は、ヒトにおいて必ずしも自然に存在しないそのような領域の組み合わせを含み得るか、あるいはそれに相当し得る。
【０３２３】
好ましい実施形態，では、ヒト抗体は、完全なヒト抗体である。本明細書で使用される「完全なヒト」抗体とは、実質的に非ヒト抗体配列を含まないか、あるいは任意の非ヒト抗体配列を含まない、上で定義される「ヒト」可変領域ドメインおよび／またはＣＤＲを含む抗体である。例えば、「実質的に非ヒト抗体配列を含まない」ヒト可変領域ドメインおよび／またはＣＤＲを含む抗体は、最大約５、４、３、２、または１個のアミノ酸のみが、ヒト抗体配列によってコードされないアミノ酸である、抗体、ドメイン、および／またはＣＤＲである。したがって、「完全なヒト」抗体は、「ヒト化」抗体と区別され、これは、ある特定のアミノ酸が、典型的にはヒト抗体に存在するアミノ酸とより良好に一致するように変更された、実質的に非ヒト可変領域ドメイン、例えば、マウス可変領域ドメインに基づく。
【０３２４】
本発明の「完全なヒト」抗体は、一本鎖抗体である等の、任意の他の実質的な抗体配列を含まない、ヒト可変領域ドメインおよび／またはＣＤＲであり得る。あるいは、本発明の「完全なヒト」抗体は、１つ以上のヒト抗体定常領域と一体になるか、あるいはそれに操作可能に結合する、ヒト可変領域ドメインおよび／またはＣＤＲであり得る。特定の好ましい完全なヒト抗体は、ＩｇＧ定常領域の完全補体を有するＩｇＧ抗体である。
【０３２５】
他の実施形態において、本発明の「ヒト」抗体は、部分的にヒトキメラ抗体である。本明細書で使用される「部分的にヒトキメラ」抗体とは、ラットもしくはマウス等の非ヒト種の定常領域に操作可能に結合されるか、あるいはその上に接合される「ヒト」可変領域ドメインおよび／もしくはＣＤＲを含む抗体である。そのような部分的にヒトキメラ抗体を、例えば、前臨床試験で用いることができ、定常領域は、好ましくは、前臨床検査で用いる動物と同一の種である。これらの部分的にヒトキメラ抗体を、例えば、エクスビボ診断で用いることもでき、非ヒト種の定常領域は、抗体検出のさらなる選択股を提供し得る。
【０３２６】
本明細書で使用される「断片」という用語は、生物学的関連の断片、例えば、抗原結合に寄与する、例えば、抗原結合部位の一部を形成する、および／またはＣＣＲ４抗原の機能の阻害もしくは低下に寄与する断片を指す。特定の好ましい断片は、本発明の抗体の重鎖可変領域（ＶHドメイン）および／または軽鎖可変領域（ＶLドメイン）を含む。他の好ましい断片は、本発明の抗体の重鎖ＣＤＲ（もしくは本発明のＶHドメイン）のうちの１つ以上、または本発明の抗体の軽鎖ＣＤＲの（もしくは本発明のＶLドメイン）のうちの１つ以上を含む。特定の好ましい断片は、少なくとも５アミノ酸長であり、少なくとも１つのＣＤＲ領域、好ましくはＣＤＲ３領域、より好ましくは重鎖ＣＤＲ３領域を含む。
【０３２７】
本発明の抗体が、定義される配列のうちのいずれかの断片を含む（例えば、配列番号３５、４６、５７、６８、１０４、もしくは１１４の断片を含む）か、例えば、本発明のＶHおよび／またはＶLドメインを含む抗体であるか、あるいは本発明の１つ以上のＣＤＲを含む抗体もしくは結合タンパク質である、本発明の実施形態において、これらの領域／ドメインは、概して、各々の領域／ドメインがその生物学的機能を実行することができるように、かつ抗原結合への寄与が保持されるように、抗体または結合タンパク質内で分離される。したがって、ＶHおよびＶLドメインは、好ましくは、適切な足場配列／リンカー配列によって分離され、ＣＤＲは、好ましくは、自然発生の抗体および／または効果的に改変された抗体に見られるフレームワーク領域等の、適切なフレームワーク領域によって分離される。したがって、本発明のＶH、ＶL、および個々のＣＤＲ配列は、好ましくは、抗原結合を可能にするように、適切なフレームワークまたは足場内に提供されるか、あるいは組み込まれる。そのようなフレームワーク配列または領域は、必要に応じて足場を形成するために、自然発生のフレームワーク領域、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、および／またはＦＲ４に相当し得るか、あるいは例えば、様々な自然発生のフレームワーク領域を比較することによって同定されるコンセンサスフレームワーク領域に相当し得る。あるいは、非抗体足場またはフレームワーク、例えば、Ｔ細胞受容体フレームワークを使用することができる。
【０３２８】
フレームワーク領域に使用することができる適切な配列が当分野で周知であり、かつ説明されており、これらのうちのいずれかを使用することができる。フレームワーク領域に好ましい配列は、本発明のＶHおよび／もしくはＶLドメインを構成するフレームワーク領域のうちの１つ以上（すなわち、１、２、３、もしくは４つ）、すなわち、表１、２、３、もしくは４に開示されるフレームワーク領域、またはそれに対して実質的に相同なフレームワーク領域、具体的には、抗原特異性の維持を可能にするフレームワーク領域、例えば、実質的に同一または同一の３Ｄ構造の抗体をもたらすフレームワーク領域の１つ以上である。
【０３２９】
特定の好ましい実施形態において、可変軽鎖（配列番号３０、３１、３２、および３３）ならびに／または可変重鎖（配列番号２５、２６、２７、および２８）の４つ全て、必要に応じて、配列番号３５のＦＲ領域（表１にも示される）、あるいはそれに対して実質的に相同なＦＲ領域が、本発明の抗体に見られる。
【０３３０】
特定の好ましい実施形態において、可変軽鎖（配列番号４１、４２、４３、および４４）ならびに／または可変重鎖（配列番号３６、３７、３８、および３９）の４つ全て、必要に応じて、配列番号４６のＦＲ領域（表２にも示される）、あるいはそれに対して実質的に相同なＦＲ領域が、本発明の抗体に見られる。
【０３３１】
特定の好ましい実施形態において、可変軽鎖（配列番号４１、４２、４３、および４４）ならびに／または可変重鎖（配列番号３６、３７、１０２、および３９）の４つ全て、必要に応じて、配列番号１０３のＦＲ領域、あるいはそれに対して実質的に相同なＦＲ領域が、本発明の抗体に見られる。配列番号１０２、またはそれに対して実質的に相同な配列の可変重鎖ＦＲ領域が示される実施形態が、特に好ましい。
【０３３２】
特定の好ましい実施形態において、可変軽鎖（配列番号１０７、１０９、１１１、および４４）ならびに／または可変重鎖（配列番号３６、３７、３８、および３９）の４つ全て、必要に応じて、配列番号１１４のＦＲ領域、あるいはそれに対して実質的に相同なＦＲ領域が、本発明の抗体に見られる。
【０３３３】
特定の好ましい実施形態において、可変軽鎖（配列番号５２、５３、５４、および５５）ならびに／または可変重鎖（配列番号４７、４８、４９、および５０）の４つ全て、必要に応じて、配列番号５７のＦＲ領域（表３にも示される）、あるいはそれに対して実質的に相同なＦＲ領域が、本発明の抗体に見られる。
【０３３４】
特定の好ましい実施形態において、可変軽鎖（配列番号６３、６４、６５、および６６）ならびに／または可変重鎖（配列番号５８、５９、６０、および６１）の４つ全て、必要に応じて、配列番号６８のＦＲ領域（表４にも示される）、あるいはそれに対して実質的に相同なＦＲ領域が、本発明の抗体に見られる。
【０３３５】
加えて、本発明の好ましい抗体が、本発明のＶH、ＶL、またはＣＤＲから構成されるが、本発明の抗体は、本明細書で概説される本発明の抗体のＣＣＲ４結合特性または抗ＣＣＲ４特性が今もなお存在するという条件で、本発明のものではない他のＶH、ＶL、またはＣＤＲと組み合わせて、本発明の１つ以上のＶH、ＶL、またはＣＤＲも包含することに留意すべきである。
【０３３６】
本明細書で使用される「重鎖相補性決定領域」（「重鎖ＣＤＲ」）という用語は、抗体分子の重鎖可変領域（ＶHドメイン）内の超可変性の領域を指す。重鎖可変領域は、アミノ末端からカルボキシ末端までの重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、および重鎖ＣＤＲ３と称される、３つのＣＤＲを有する。重鎖可変領域は、４つのフレームワーク領域（アミノ末端からカルボキシ末端までのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）も有する。これらのフレームワーク領域は、ＣＤＲを分離する。
【０３３７】
本明細書で使用される「重鎖可変領域」（ＶHドメイン）という用語は、抗体分子の重鎖の可変領域を指す。
【０３３８】
本明細書で使用される「軽鎖相補性決定領域」（「軽鎖ＣＤＲ」）という用語は、抗体分子の軽鎖可変領域（ＶLドメイン）内の超可変性の領域を指す。軽鎖可変領域は、アミノ末端からカルボキシ末端までの軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、および軽鎖ＣＤＲ３と称される、３つのＣＤＲを有する。軽鎖可変領域は、４つのフレームワーク領域（アミノ末端からカルボキシ末端までのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）も有する。これらのフレームワーク領域は、ＣＤＲを分離する。
【０３３９】
本明細書で使用される「軽鎖可変領域」（ＶLドメイン）という用語は、抗体分子の軽鎖の可変領域を指す。
【０３４０】
ＣＤＲの位置を定義するために、必要に応じて、本明細書は、Ｋａｂａｔ命名法に従うことに留意するべきである（参照により明確に本明細書に組み込まれる、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。
【０３４１】
当業者は、軽鎖および重鎖ＣＤＲ、軽鎖および重鎖の可変領域、抗体、抗体断片、ならびに免疫抱合体等の、本発明のタンパク質およびポリペプチドが、当分野で周知であり、かつ説明されるいくつかの方法のうちのいずれかで調製することができるが、最も好ましくは組換え法を用いて調製することを理解する。
【０３４２】
本発明の抗体の軽鎖および重鎖可変領域をコードする核酸断片を、任意の適切な方法、例えば、クローン化、または合成によって得ることができるか、あるいはそれによって産生することができる。例えば、当分野で周知であり、かつ説明される方法を用いて、本発明の配列を得るために、そのような配列を、例えば、ヒト生殖系列遺伝子由来の適切な配列をクローン化し、次に、生殖系列配列に対して任意の必要な修飾を行うことによって調製することができる。代替かつより効率的な方法は、重複プライマーとして適切な軽鎖または重鎖可変領域配列を合成し、かつプライマー伸長法を用いて全配列を得ることであろう。次に、この全配列を、さらなるクローン化および操作、例えば、適切な発現ベクターへのクローン化において適切な制限部位を含有するプライマーを有するＰＣＲを介して増幅することができる。１つの可変領域当たり５〜７個の重複プライマーが、通常十分であり、それによって、この技法を非常に効率的で正確なものにする。
【０３４３】
本発明の抗体の軽鎖および重鎖可変領域をコードする核酸断片を得た時点で、これらの断片を、例えば、可変領域断片を、適切な定常領域ドメインを有する全長抗体分子に、または例えば、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ断片等の、本明細書の他の箇所で議論される抗体断片の特定の型式に変換するために、標準の組換えＤＮＡ法によってさらに操作することができる。典型的には、またはこのさらなる操作手順の一部として、本発明の抗体分子をコードする核酸断片は、概して、本発明の抗体の産生を促進するために、適切な発現ベクターの中に組み込まれる。
【０３４４】
可能性のある発現ベクターは、ベクターが使用される宿主細胞と互換性がある限り、コスミド、プラスミド、または修飾されたウイルス（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルス）を含むが、これらに限定されない。発現ベクターが「宿主細胞の形質転換に好適」であるとは、発現ベクターが、本発明の核酸分子、および核酸分子に操作可能に結合される、発現のために使用される宿主細胞に基づいて選択される調節配列を含有することを意味する。操作可能に結合とは、核酸が核酸の発現を可能にする様式で、調節配列に結合されることを意味することが意図されている。
【０３４５】
したがって、本発明は、本発明の核酸分子またはその断片、および本発明の核酸分子によってコードされるタンパク質配列の転写および翻訳に必要な調節配列を含有する組換え発現ベクターを企図する。
【０３４６】
好適な調節配列は、細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物、または昆虫の遺伝子を含む、多種多様の供給源に由来し得る（例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，１９９０に記載される調節配列を参照のこと）。適切な調節配列の選択は、以下に議論されるように選択される宿主細胞によって決まり、当業者が容易に達成することができる。そのような調節配列の例として、翻訳開始シグナルを含む、転写プロモーターおよびエンハンサーまたはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、リボソーム結合配列が挙げられる。加えて、選択される宿主細胞、および採用されるベクターによって、複製元、追加のＤＮＡ制限部位、エンハンサー、および転写の誘導能を付与する配列等の他の配列を、発現ベクターの中に組み込むことができる。
【０３４７】
本発明の組換え発現ベクターは、本発明の組換え分子で形質転換またはトランスフェクトされた、宿主細胞の選択を促進する選択マーカー遺伝子も含有し得る。選択マーカー遺伝子の例は、ある特定の薬物への耐性を付与するネオマイシンおよびハイグロマイシン、β−ガラクトシターゼ、クロラムフェニコロールアセチルトランスフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、または免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧのＦｃ部分等の免疫グロブリンまたはその部分等のタンパク質をコードする遺伝子である。選択マーカー遺伝子の転写は、β−ガラクトシターゼ、クロラムフェニコロールアセチルトランスフェラーゼ、またはホタルルシフェラーゼ等の、選択マーカータンパク質の濃度の変化によって監視される。選択マーカー遺伝子がネオマイシン耐性等の抗生物質耐性を付与するタンパク質をコードする場合、形質転換細胞を、Ｇ４１８で選択することができる。選択マーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生存する一方で、他の細胞は死滅する。これは、本発明の組換え発現ベクターの発現を可視化およびアッセイすること、具体的には、発現および表現型の変異の効果を決定することを可能にする。選択マーカーを、関心の核酸から分離したベクター上に導入できることが理解される。
【０３４８】
組換え発現ベクターは、組換えタンパク質の増加した発現、組換えタンパク質の増加した溶解性を提供し、かつ親和性精製でリガンドとして作用することによって、標的組換えタンパク質の精製を支援する融合部分をコードする遺伝子も含有し得る（例えば、精製および／または同定を可能にする適切な「タグ」、例えば、Ｈｉｓタグもしくはｍｙｃタグが存在し得る）。例えば、タンパク質分解的切断部位を、標的組換えタンパク質に添加することができ、融合タンパク質の精製後に、融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能にする。典型的な融合発現ベクターは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはタンパク質Ａを、組換えタンパク質に融合する、それぞれ、ｐＧＥＸ（Ａｍｒａｄ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、ｐＭａｌ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を含む。
【０３４９】
組換え発現ベクターを、宿主細胞に導入し、形質転換された宿主細胞を産生することができる。「〜で形質転換された」、「〜でトランスフェクトされた」、「形質転換」、および「トランスフェクション」という用語は、当分野の多くの可能な技法のうちの１つによって、細胞への核酸（例えばベクター）の導入を包含することが意図される。本明細書で使用される「形質転換された宿主細胞」という用語は、本発明の組換え発現ベクターで形質転換されたグリコシル化することができる細胞も含むことが意図される。原核細胞を、例えば、電気穿孔または塩化カルシウム媒介形質転換によって、核酸で形質転換することができる。例えば、核酸を、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介形質移入、リポフェクション法、電気穿孔、または微量注入法等の従来の技法を介して、哺乳動物細胞内に導入することができる。宿主細胞を形質転換およびトランスフェクトするのに好適な方法を、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９、および他の研究本に見出すことができる。
【０３５０】
好適な宿主細胞は、多岐にわたる真核生物宿主細胞および原核細胞を含む。例えば、本発明のタンパク質を、酵母細胞または哺乳動物細胞内で発現することができる。他の好適な宿主細胞を、Ｇｏｅｄｄｅｌ，１９９０に見出すことができる。加えて、本発明のタンパク質は、大腸菌等の原核細胞中に発現することができる（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【０３５１】
本発明を行うのに好適な酵母細胞および真菌宿主細胞は、サッカロマイセスセレヴィシエ、ピキア属もしくはクリベロマイセス属、および様々な種類のコウジカビ属を含むが、これらに限定されない。酵母サッカロマイセスセレヴィシエ内での発現のためのベクターの例として、ＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ．ｅｔ  ａｌ．，１９８７）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ  ａｎｄ  Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，１９８２）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）、およびｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）が挙げられる。酵母および真菌の形質転換のプロトコルは、当業者に周知である（Ｈｉｎｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８、Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３、およびＣｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８７を参照のこと）。
【０３５２】
本発明を行うのに好適な哺乳動物細胞は、とりわけ、ＣＯＳ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５０もしくは１６５１）、ＢＨＫ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ６２８１）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１）、ＨｅＬａ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ２）、２９３（ＡＴＣＣ番号１５７３）、ＮＳ−１細胞、ＮＳ０（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１１１７７）、およびＰｅｒ．Ｃ６（登録商標）（Ｃｒｕｃｅｌｌ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を含む。哺乳動物細胞において発現を導くための好適な発現ベクターは、概して、プロモーター（例えば、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびサルウイルス４０等のウイルス物質に由来する）、ならびに他の転写および翻訳制御配列を含む。哺乳動物発現ベクターの例として、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．，１９８７）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）が挙げられる。
【０３５３】
本明細書に提供される教示を前提として、適切な種類の発現ベクターを、植物、鳥類、および昆虫細胞に導入するためのプロモーター、ターミネーター、ならびに方法も、容易に達成することができる。例えば、一実施形態内で、本発明のタンパク質を、植物細胞から発現することができる（アグロバクテリウムリゾゲネスベクターの使用を概説するＳｉｎｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７を参照し、とりわけ、ＰＡＰＳ２０２２、ＰＡＰＳ２０２３、およびＰＡＰＳ２０３４を含む、植物細胞への発現ベクターの使用を説明するＺａｍｂｒｙｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４も参照されたい）。
【０３５４】
本発明を行うのに好適な昆虫細胞は、カイコガ属、イラクサギンウワバ、またはスポドプテラ種由来の細胞および細胞株を含む。培養された昆虫細胞（ＳＦ９細胞）におけるタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターは、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）およびｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｏｗ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ１９８９）を含む。本発明の組換えタンパク質の発現に好適ないくつかのバキュロウイルス−昆虫細胞発現系は、ＰＣＴ／ＵＳ／０２４４２に記載される。
【０３５５】
あるいは、本発明のタンパク質を、ラット、ウサギ、ヒツジ、およびブタ等の非ヒト遺伝子導入動物において発現することもできる（Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８５、Ｐａｌｍｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８３、Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８５、Ｐａｌｍｉｔｅｒ  ａｎｄ  Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  １９８５、および米国特許第４，７３６，８６６号）。
【０３５６】
本発明のタンパク質を、固相合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６４）、Ｆｒｉｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）または均一溶液中での合成等のタンパク質の化学において周知の技法を用いて、化学合成によって調製することもできる。
【０３５７】
タンパク質等の他の分子に抱合される本発明の抗体およびタンパク質を含む、Ｎ末端またはＣ末端融合タンパク質を、組換え技法を介する融合によって調製することができる。得られた融合タンパク質は、本明細書に記載される選択されたタンパク質、またはマーカータンパク質、もしくはタグタンパク質に融合される、本発明の抗体またはタンパク質を含有する。本発明の抗体およびタンパク質は、既知の技法によって他のタンパク質にも抱合し得る。例えば、タンパク質を、国際公開第９０／１０４５７号明細書に記載されるヘテロ二機能性チオール含有リンカー、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリドイルジチオ−プロピオン酸塩）またはＮ−スクシンイミジル−５チオ酢酸塩を用いて結合することができる。融合タンパク質または抱合体を調製するために使用することができるタンパク質の例として、免疫グロブリン、ホルモン、成長因子、レクチン、インスリン、低濃度リポタンパク質、グルカゴン、エンドルフィン、トランスフェリン、ボンベシン、アシアロ糖タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、赤血球凝集素（ＨＡ）、および切断型ｍｙｃが挙げられる。
【０３５８】
第１の抗ＣＣＲ４抗体核酸セグメントの調製様式を問わず、さらなる好適な抗体核酸セグメントを、標準の分子生物学的技法によって容易に調製することができる。任意の変種、変異体、または第２世代抗ＣＣＲ４抗体核酸セグメントが、本発明での使用に好適であることを確認するために、本発明に従って、核酸セグメントを試験して、抗ＣＣＲ４抗体の発現を確認する。好ましくは、変種、変異体、または第２世代核酸セグメントを試験して、標準のハイブリッド形成条件下で、より好ましくは標準のストリンジェントなハイブリッド形成条件下で、ハイブリッド形成を確認する。例示的な好適なハイブリッド形成条件は、約５０℃で、約７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、約０．５ＭのＮａＰＯ4、約１ｍＭのＥＤＴＡでのハイブリッド形成、および約４２℃で、約１％のＳＤＳでの洗浄を含む。
【０３５９】
多種多様の抗体を容易に調製することができ、本発明の治療方法を、患者において、生物学的に有効な量の本発明の少なくとも第１の抗ＣＣＲ４抗体を発現する、少なくとも第１の核酸セグメントまたは分子を、動物または患者に提供することによって遂行することができる「抗ＣＣＲ４抗体を発現する核酸セグメントまたは分子」は、概して、少なくとも発現構築物または発現ベクターの形態であり、ウイルス内、もしくは組換え宿主細胞内に含まれる発現構築物または発現ベクターの形態であり得る。本発明の好ましい遺伝子療法ベクターは、概して、組換えレトロウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）等内に含まれる、ウイルスベクターである。
【０３６０】
またさらなる態様は、本発明の核酸セグメントまたは分子のうちの１つ以上を含む、発現構築物もしくは発現ベクターを提供する。好ましくは、発現構築物または発現ベクターは、組換え型である。好ましくは、該構築物またはベクターは、本発明の核酸分子によってコードされるタンパク質配列の転写および翻訳に必要な調節配列をさらに含む。
【０３６１】
またさらなる態様は、本発明の１つ以上の発現構築物または発現ベクターを含む、宿主細胞またはウイルスを提供する。本発明の核酸分子のうちの１つ以上を含む宿主細胞またはウイルスも提供される。本発明の抗体を発現する宿主細胞またはウイルスは、またさらなる態様を形成する。
【０３６２】
本発明のまたさらなる態様は、本発明の宿主細胞を培養するステップを含む、本発明の抗体を産生する方法を提供する。好ましい方法は、（ｉ）コードされた抗体またはタンパク質の発現に好適な条件下で、組換え発現ベクターのうちの１つ以上、または本発明の核酸配列のうちの１つ以上を含む宿主細胞を培養するステップ、および任意選択で、（ｉｉ）宿主細胞、または成長培地／上清から、抗体もしくはタンパク質を単離するか、または得るステップを含む。そのような産生方法は、抗体もしくはタンパク質産物の精製、および／または抗体もしくは産物を、薬学的に許容される担体もしくは賦形剤等の、少なくとも１つの追加の成分を含む組成物に製剤化するステップも含み得る。
【０３６３】
本発明の抗体またはタンパク質が複数のポリペプチド鎖（例えば、Ｆａｂ断片等のある特定の断片）で構成される時の実施形態において、全てのポリペプチドは、完全タンパク質、例えば、本発明の結合タンパク質を、宿主細胞中で構築し、そこから単離または精製することができるように、好ましくは、同一または異なる発現ベクターのいずれか由来の宿主細胞で発現される。
【０３６４】
本発明の抗体を用いて、ＣＣＲ４に結合する追加の抗体を産生することもできる。そのような使用は、例えば、新規の抗体を形成するために、親抗体のアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換、または挿入を含み、該親抗体は、本明細書の他の箇所で定義される本発明の抗体のうちの１つであり、得られた新規の抗体を試験して、ＣＣＲ４に結合する抗体を同定する。そのような方法を用いて、全てのＣＣＲ４に結合するそれらの能力について試験することができる、複数の新規の抗体を形成することができる。好ましくは、１つ以上のアミノ酸の該付加、欠失、置換、または挿入は、ＣＤＲドメインのうちの１つ以上で起こる。
【０３６５】
親抗体へのそのような修飾または変異を、当分野で周知であり、かつ説明された技法を用いる任意の適切な様式で、例えば、ランダム突然変異誘発もしくは定方向突然変異誘発の方法を行うことによって行うことができる。定方向突然変異誘発が用いられる場合、突然変異誘発に適切な残基を同定するための１つの戦略は、結合タンパク質−抗原複合体、例えば、Ａｂ−Ａｇ複合体の結晶構造の分解能を利用して、抗原結合に関与する主要な残基を同定する（Ｄａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，１９９６）。続いて、これらの残基を変異させて、相互作用を強化することができる。１つ以上のアミノ酸残基を、定方向突然変異誘発、および評価されるＣＣＲ４への結合への作用を簡単に標的化することができる。
【０３６６】
ランダム突然変異誘発を、任意の適切な方法で、例えば、変異性ＰＣＲ、鎖混合、または突然変異誘発因子である大腸菌株によって行うことができる。
【０３６７】
したがって、本発明のＶHドメインのうちの１つ以上を、任意の適切な供給源からの単一ＶLドメインまたはＶLドメインのレパートリーと組み合わせることができ、得られた新規の抗体を試験して、ＣＣＲ４に特異的である抗体を同定する。逆に、本発明のＶLドメインのうちの１つ以上を、任意の適切な供給源からの単一ＶHドメインまたはＶHドメインのレパートリーと組み合わせることができ、得られた新規の抗体を試験して、ＣＣＲ４に結合する抗体を同定する。
【０３６８】
同様に、本発明のＶHおよび／もしくはＶLドメインのＣＤＲのうちの１つ以上、または好ましくは、３つ全てを、必要に応じて、単一ＶHおよび／もしくはＶLドメイン、またはＶHおよび／もしくはＶLドメインのレパートリーの中に接合することができ、得られた新規の抗体を試験して、ＣＣＲ４に結合する抗体を同定する。
【０３６９】
軽鎖および／または重鎖のＣＤＲ、特にＣＤＲ３の標的変異は、抗体親和性を増加させるのに効果的な技法であることが示されており、好ましい。好ましくは、ＣＤＲ３の３〜４個のアミノ酸のブロック、または「ホットスポット」と呼ばれる特定の領域が、突然変異誘発の標的となる。
【０３７０】
「ホットスポット」は、体細胞超変異がインビボで起こる配列である（および以下Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９９５）。ホットスポット配列を、ある特定のコドンにおけるコンセンサスヌクレオチド配列と定義することができる。コンセンサス配列は、テトラヌクレオチド、ＲＧＹＷであって、Ｒが、ＡもしくはＧのいずれかであることができ、Ｙが、ＣもしくはＴであることができ、かつＷは、ＡもしくはＴのいずれかであることができるＲＧＹＷである（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９９５）。加えて、ヌクレオチドＡＧＹによってコードされるセリン残基は、潜在的なホットスポット配列に対応するＴＣＮによってコードされるものを超えて、可変ドメインのＣＤＲ領域に支配的に存在する（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。
【０３７１】
したがって、本発明の各々の抗体の重鎖および軽鎖のＣＤＲのヌクレオチド配列を、ホットスポット配列およびＡＧＹコドンの存在に関して走査することができる。次に、軽鎖および重鎖のＣＤＲ領域の同定されたホットスポットを、任意選択で、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎ  Ｔｉｃｓデータベース（ＩＭＧＴ，ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／ｔｅｘｔｅｓ／ｖｑｕｅｓｔ／）を用いて、重鎖および軽鎖の初期配列と比較することができる（Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。生殖系列と同一である配列は、体細胞変異が発生しなかったことを示唆し、したがって、インビボで発生する体細胞事象を模倣してランダム変異を導入することができるか、あるいは、部位特異的突然変異誘発を、例えば、ホットスポットおよび／またはＡＧＹコドンで行うことができる。対照的に、異なる配列は、いくつかの体細胞変異がすでに発生したことを示す。インビボ体細胞変異が最適であったかどうかはまだ決定されていない。
【０３７２】
変異において好ましいホットスポットは、露出されたアミノ酸をコードするもの、および好ましくは、抗原結合部位の一部を形成するアミノ酸をコードするものである。変異において他の好ましいホットスポットは、非保存アミノ酸をコードするものである。ＣＤＲ内の埋没または保存アミノ酸をコードするホットスポットは、好ましくは、突然変異誘発されていない。これらの残基は、通常、全体的な構造に重要であり、これらは埋没されているため、抗原と相互作用する可能性は低い。
【０３７３】
アミノ酸およびタンパク質ドメインの上述の操作を行う方法が、当業者に周知である。例えば、得られる発現タンパク質のアミノ酸配列が適切な方法で順に修飾されるように、該操作を、適切な結合タンパク質およびそのドメインをコードする核酸分子が修飾される核酸レベルで、遺伝子操作によって好都合に行うことができる。
【０３７４】
特異的にＣＣＲ４に結合する１つ以上の抗体の能力を、当分野で周知であり、かつ説明されている任意の適切な方法によって試験することができる。ＣＣＲ４＋細胞株を、微生物株保存機関から得ることができるか、あるいはＣＣＲ４陰性細胞を組換えＣＣＲ４の発現を可能にする構築物で形質転換することによって調製することができる。そのような細胞、または固定化ＣＣＲ４を使用して、結合を、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＢｉａＣｏｎ等の従来の方法でアッセイすることができる。
【０３７５】
これらの方法によって産生される新規の抗体は、好ましくは、親抗体として、改善された機能特性、例えば、ＣＣＲ４に対してより高いか、あるいは強化された親和性（または少なくとも同等の親和性）を有し、本明細書の他の箇所に記載されるように、本発明の抗体と同一の方法で処理し、かつ使用することができる（例えば、組成物等での治療、診断のために）。あるいは、または加えて、新規の抗体は、本明細書の別の箇所に記載されるように、１つ以上の他の改善された機能特性を有する。
【０３７６】
これらの方法によって産生されるか、得られるか、あるいは得ることができる新規の抗体は、本発明のまたさらなる態様を形成する。
【０３７７】
本発明は、本発明の少なくとも１つの抗体、または抗体断片を含む組成物をさらに提供し、任意選択で、希釈剤を含む。そのような組成物は、薬学的に許容される組成物、または研究室での研究用の組成物であり得る。薬学的組成物に関して、これらを、好ましくは、非経口投与、静脈内投与、またはさらに皮下投与用に製剤化することができる。
【０３７８】
本発明は、本発明のヒト抗体および抗体断片のいくつかの方法および使用を提供する。全ての方法に関して、「ａ」および「ａｎ」という用語は、具体的に提示される場合を除き、列挙される方法において、「少なくとも１つ」、「少なくとも第１」、「１つ以上」、または「複数」のステップを意味するように使用される。これは、特に、治療方法における投与ステップに関連性がある。したがって、異なる用量を本発明で採用することができるだけでなく、用量、例えば、注射の異なる数を用いることができ、最大注射数まで、かつ複数の注射を含む。併用療法を、抗ＣＣＲ４治療抗体の投与前、投与後、または投与中に使用することができる。
【０３７９】
重要な生物学的意味を有する、本発明の抗体または免疫抱合体の様々な有用なインビトロでの方法および使用を提供する。概して、ＣＣＲ４を含む組成物を、少なくとも第１の本発明の抗ＣＣＲ４抗体またはその抗原結合断片と効果的に接触させることを含む、ＣＣＲ４に結合する方法、およびそれにおける使用を提供する。したがって、本発明の抗体またはその免疫抱合体を、結合アッセイで用いることができる。好適に有用な結合アッセイには、免疫ブロット法、ウェスタンブロット法、ドットブロット法、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学法、蛍光活性化組織分類法（ＦＡＣＳ）、免疫沈降法、親和性クロマトグラフィー等の、当分野で一般的に採用されるものが含まれる。
【０３８０】
概して、ＣＣＲ４／抗体複合体の形成を可能にし、そのように形成された複合体を検出するのに効果的な条件下で、ＣＣＲ４を含有する疑いがある組成物を、少なくとも第１の抗体もしくは本発明の免疫抱合体またはその抗原結合断片と接触させることを含む、ＣＣＲ４を検出する方法、およびそれにおける使用を提供する。検出方法および使用を、生物学的試料との関連で、例えば、腫瘍の診断で用いることができ、それに基づく診断キットも提供される。
【０３８１】
本発明の方法および使用は、特に、ＣＣＲ４発現もしくは活性に関連するか、またはＣＣＲ４が生物学的役割を果たす任意の疾患または状態を有するか、あるいはそれらを進展させる危険性のある動物および患者で使用するためのものである。そのような疾患および障害は、ＣＣＲ４陽性細胞、典型的には、リガンドのＣＣＲ４への結合時に、障害または疾患を引き起こすか、あるいはそれらに寄与するシグナル伝達経路に加わり得るＣＣＲ４＋Ｔｈ２もしくはＴｈ１７細胞によって媒介される疾患を含む。それらは、ＣＣＲ４を発現する細胞の異常な増殖によって引き起こされる疾患も含む。そのような異常に増殖する細胞は、生来ＣＣＲ４＋であり得るか、あるいはそれらは、ＣＣＲ４を発現するために変異／形質転換したかもしれない。上述のように、ＣＣＲ４の発現は、この抗原を発現する癌細胞が免疫系から逃れる助けとなり得る。したがって、ＣＣＲ４によって媒介される、および／またはＣＣＲ４陽性細胞の異常な増殖を特徴とする疾患もしくは障害を治療する方法が提供される。
【０３８２】
見方を変えれば、以下の１つ以上から恩恵を受けることができる状態の治療法が提供される：
（ｉ）ＣＣＲ４＋細胞の選択的除去、
（ｉｉ）そのリガンドの１つ以上に結合するＣＣＲ４の阻害、
（ｉｉｉ）リガンドに対するＣＣＲ４介在細胞応答の阻害、特に、走化性または増加した細胞内のカルシウムイオン濃度（細胞活性化）の阻害。
【０３８３】
好ましくは、ＣＣＲ４リガンドは、ＭＤＣおよび／またはＴＡＲＣである。
【０３８４】
ＣＣＲ４が、疾患および障害の広範囲に関与する時に、かつて任意の容認できるモデルシステムで効果的であると示された既定の抗ＣＣＲ４治療を使用して、ＣＣＲ４発現に関連する疾患および障害の全範囲を治療することができることが当業者に周知である。
【０３８５】
一実施形態において、ＣＣＲ４介在状態は、ヘルパーＴ細胞型２介在免疫疾患である。「ヘルパーＴ細胞型２介在免疫疾患」とは、アレルゲン特異的Ｔｈ２細胞の発達および活性化による免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）およびマスト細胞に関係する疾患を意味する。
【０３８６】
ＣＣＲ４介在疾患または障害は、炎症、感染、および／または癌に関連する疾患もしくは状態であり得る。そのような疾患または障害を、本抗体および組成物で治療または予防することができる。好ましい疾患または状態には、（１）全身性アナフィラキシーまたは過敏性応答、薬物アレルギー、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ＡＢＰＡ）、虫刺されアレルギー、ならびに食物アレルギー等のアレルギー性疾患、（２）クローン病、潰瘍性大腸炎、回腸炎、ならびに腸炎等の炎症性腸疾患、（３）膣炎、（４）皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、蕁麻疹、ならびに掻痒等の乾癬および炎症性皮膚疾患、（５）脈管炎、（６）脊椎関節症、（７）強皮症、（８）アレルギー喘息、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患、過敏性肺病等の喘息および呼吸器アレルギー性疾患、（９）関節炎（リウマチ性および乾癬性を含む）、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、１型糖尿病、糸球体腎炎等の自己免疫疾患、（１０）移植片拒絶（同種移植片拒絶および移植片対宿主拒絶反応を含む）、ならびに（１１）アテローム性動脈硬化症、筋炎、Ｔ細胞介在神経変性疾患、多発性硬化症、脳炎、髄膜炎、肝炎、腎炎、敗血症、サルコイドーシス、アレルギー性結膜炎、耳炎、キャッスルマン病、静脈洞炎、ＬＰＳ誘発内毒素性ショック、ベーチェット症候群、および痛風等の望ましくない炎症応答を阻害すべき他の疾患、（１２）癌、血液癌および非血液癌の両方、好ましくは、乳癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、肝細胞癌、肺癌、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、末梢Ｔ細胞リンパ腫、詳細不明のびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、ＣＴＣＬ、特に、菌状息肉腫、セザリー症候群、子宮頸癌、腎臓癌、脳癌、前立腺癌、胃癌、（１３）エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）感染、ＨＩＶ感染、および他のウイルス感染等の感染が含まれる。
【０３８７】
本発明の抗体のＣＣＲ４への結合は、癌細胞等のＣＣＲ４陽性異常細胞の宿主免疫系から逃れる能力を損ない得る。本発明の抗体を使用して、Ｔｒｅｇ細胞によるＤＣの抑圧を阻止することができるため、ワクチン中のアジュバントとしての本発明の抗ＣＣＲ４抗体の使用法が提供される。ワクチンは、好ましくは、癌または感染性疾患用のワクチンである。ワクチンは、予防ワクチンまたは治療用ワクチンであり得る。「アジュバント」とは、抗原に対する宿主の免疫応答を強化する作用物質を意味する。したがって、ワクチンアジュバントとして使用する時、本発明の抗体は、典型的には、免疫応答を誘発するのに所望される抗原とともに、または抗原と合わせて投与される。
【０３８８】
本明細書で使用される「異常な増殖」という用語は、正常な、適切な、または予測されるコースから外れた細胞増殖を意味する。例えば、異常な細胞増殖は、細胞のＤＮＡまたは他の細胞成分が損傷もしくは欠損された細胞の不適切な増殖を含み得る。
【０３８９】
異常な細胞増殖は、細胞増殖特性が、不適切に高レベルの細胞分裂、不適切に低レベルのアポトーシス、またはそれらの両方によって引き起こされるか、介在されるか、あるいはそれらをもたらす兆候に関連する細胞増殖を含み得る。そのような兆候は、癌性または非癌性、良性または悪性の細胞、細胞群、（１つもしくは複数の）組織、の単一もしくは複数の局所的異常増殖を特徴とし得る。
【０３９０】
本明細書における「腫瘍」への任意の言及は、「癌」または「癌腫」も指す。原発腫瘍からの転移を減少させることができるため、転移性癌も治療することができる。術後患者内に置き去られている、いわゆる微小残存病変（ＭＲＤ）は、抗ＣＣＲ４抗体での免疫療法に従順であり得る。
【０３９１】
したがって、本発明は、そのような疾患を有する動物もしくは患者に、治療的に有効な量の本発明の抗ＣＣＲ４抗体、あるいは抗原結合断片またはそのような抗ＣＣＲ４抗体の免疫抱合体を投与することを含む、上記で定義された疾患を治療する方法および治療における使用をさらに提供する。
【０３９２】
本発明のまたさらなる態様は、治療、撮像、もしくは診断用の組成物もしくは薬剤の製造において、本発明の抗体、あるいは抗原結合断片またはそのような抗体の免疫抱合体の使用を提供する。
【０３９３】
またさらなる態様は、治療、診断、もしくは撮像用の、本発明の抗体、あるいは抗原結合断片またはそのような抗体の免疫抱合体を提供する。
【０３９４】
加えて、本発明は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤、担体、希釈剤、緩衝液、または安定剤を有する、本発明の抗体、あるいは抗原に結合断片またはそのような抗体の免疫抱合体を含む組成物を提供する。
【０３９５】
本明細書に記載のインビボ法は、概して、哺乳動物で行われる。任意の哺乳動物、例えば、ヒトおよび任意の家畜、飼育動物、または実験動物を治療することができる。特定の例には、マウス、ラット、ブタ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウサギ、ウシ、およびサルが挙げられる。しかしながら、好ましくは、哺乳動物は、ヒトである。
【０３９６】
したがって、本明細書で使用される「動物」または「患者」という用語は、任意の哺乳動物、例えば、ヒト、および任意の家畜、飼育動物、または実験動物を含む。特定の例には、マウス、ラット、ブタ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウサギ、ウシ、およびサルが挙げられる。しかしながら、好ましくは、動物または患者は、ヒト対象である。
【０３９７】
本発明は、非抱合型または裸抗体およびその断片を用いる、上で定義される障害を治療する方法と、本発明の抗体またはその抗原結合断片が治療薬に操作可能に結合される免疫抱合体を用いる、ＣＣＲ４＋細胞、好ましくは、ＣＣＲ４＋腫瘍細胞を標的化する方法の両方に関係している。したがって、別途特に提示されないか、あるいは科学的専門用語から明確にされない限り、本明細書で使用される「抗体およびその断片」という用語は、「非抱合型もしくは裸」抗体または断片を意味し、これは、別の作用物質、特に治療薬または診断薬に結合されない。これらの定義は、ほんの一例として、抗体もしくは抗体と他のエフェクターとの組み合わせの生物学的半減期、親和性、結合活性、または他の特性を改善するための修飾等の、抗体の修飾を除外しない。
【０３９８】
本発明の治療方法および使用は、非抱合型もしくは裸抗体および免疫抱合体の両方の使用も包含する。免疫抱合体に基づく治療方法において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、好ましくは、第２の治療薬（抗ＣＣＲ４抗体自体、第１の治療薬である）に操作可能に結合される。治療薬は、例えば、コルチコステロイドおよび非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を含む、抗癌剤または抗炎症剤であり得る。
【０３９９】
前述の治療方法および使用は、概して、経皮、筋肉、静脈注射等の、動物または患者への薬学的に有効な組成物の全身投与を含む。しかしながら、治療薬を腫瘍部位または複数の部位に局在化させる任意の投与経路が容認できる。したがって、他の好適な送達経路には、経口、経鼻、または呼吸、および局所が含まれる。
【０４００】
本明細書で使用される「投与」とは、治療効果、例えば、抗腫瘍効果を与えるのに有効な量および期間での、抗ＣＣＲ４抗体治療薬の提供または送達を意味する。タンパク性治療薬の受動的投与が、概して、ある程度、その単純性および再現性のため好ましい。
【０４０１】
しかしながら、本明細書で「投与」という用語が使用され、本発明の抗ＣＣＲ４抗体が標的部位に送達されるか、あるいはさもなければ提供される、任意かつ全ての手段を指す。したがって、「投与」は、標的部位への送達をもたらすのに効果的な様式で、本発明の抗ＣＣＲ４抗体を産生する細胞の提供を含む。そのような実施形態において、選択的透過性膜、構造、または埋め込み型デバイス、概して、療法を中止するために除去することができるもので、細胞を製剤化またはパッケージ化することが望ましくあり得る。これは、用量を密接に監視かつ制御することができる非侵襲性方法を表すため、本発明の外因性抗ＣＣＲ４抗体は、今もなお、概して好ましい。
【０４０２】
本発明の治療方法および使用は、腫瘍の近くでのそれらの発現、または腫瘍へのそれらの局在化をもたらすのに効果的な様式で、本発明の抗ＣＣＲ４抗体をコードする核酸の提供にも及ぶ。患者の細胞のエクスビボ操作等を含む、裸ＤＮＡ送達、組換え遺伝子およびベクター、細胞に基づく送達等の、任意の遺伝子治療技法を採用することができる。
【０４０３】
本発明の抗ＣＣＲ４抗体を用いて、他の治療薬または診断薬を標的部位に送達することができる。そのような実施形態において、他の治療薬または診断薬は、概して、操作可能に本発明の抗ＣＣＲ４抗体に結合される。
【０４０４】
本発明で使用する「治療的に有効な量」とは、標的ＣＣＲ４＋細胞の少なくとも一部を特異的に死滅させる、標的ＣＣＲ４＋細胞の少なくとも一部にアポトーシスを特異的に誘導する、標的ＣＣＲ４＋細胞の少なくとも一部の壊死を特異的に誘導する、ＣＣＲ４リガンドのＣＣＲ４への結合を阻害する、ＣＣＲ４リガンドへのＣＣＲ４介在細胞応答を阻害する、好ましくは、ＣＣＲ４リガンドに反応した細胞内カルシウムイオン濃度の増加を阻害する、炎症を軽減させる、および／またはＣＣＲ４＋腫瘍を有する動物または患者への投与時に腫瘍退行もしくは寛解を誘導するのに効果的な、本発明の抗ＣＣＲ４抗体またはその免疫抱合体の量である。そのような効果は、好ましくは、正常かつ健常な組織において、細胞への結合をほとんど、もしくは全く呈さないか、あるいは細胞の死滅をほとんど、もしくは全く呈さず、かつ動物または患者の正常かつ健常な組織上に、ごくわずかな、もしくは処理可能な有害な副作用を及ぼすと同時に達成される。
【０４０５】
「標的部位」とは、障害を媒介するか、あるいは障害を引き起こすか、または悪化させる異常な様式で増殖するＣＣＲ４＋細胞の位置を意味する。したがって、標的部位は、腫瘍またはＣＣＲ４媒介炎症の部位であり得る。「標的細胞」は、障害を媒介するか、あるいは障害を引き起こすか、または悪化させる異常な様式で増殖するＣＣＲ４＋細胞である。したがって、標的細胞は、例えば、ＣＣＲ４＋腫瘍細胞、ＣＣＲ４＋Ｔｒｅｇ細胞、および／またはＣＣＲ４＋Ｔｈ２細胞を含み得る。
【０４０６】
アポトーシスの死滅または誘導、あるいはＣＣＲ４＋腫瘍細胞等のＣＣＲ４＋細胞の壊死の誘導、あるいは炎症の軽減、あるいは腫瘍退行もしくは寛解の誘導において、本明細書で使用される「優先的に」および「特異的に」という用語は、それゆえに、本発明の抗ＣＣＲ４抗体またはその免疫抱合体が、実質的に標的部位に限定され、かつ実質的に動物もしくは対象の正常かつ健常な組織における破壊および／または組織壊死を引き起こすまでに及ばないＣＣＲ４＋標的細胞破壊、例えば、腫瘍細胞破壊および／または腫瘍壊死を達成するために機能することを意味する。
【０４０７】
本発明の抗ＣＣＲ４抗体または治療接合体は、好ましくは、１つ以上の放射線治療薬、化学療法薬、血管新生阻害剤、アポトーシス誘導剤、抗チューブリン薬、抗細胞もしくは細胞毒性薬、サイトカインもしくはケモカイン拮抗薬、サイトカインもしくはケモカイン発現阻害剤、ＡＴＰａｓｅ阻害剤、抗炎症剤、他の抗体（例えば、二重特異性抗体等）もしくは凝固剤（凝固因子）、またはコルチコステロイド、好ましくは、グルココルチコイド、もしくは非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）等の抗炎症剤に関連している。
【０４０８】
したがって、本発明は、抗ＣＣＲ４抗体が少なくとも他の１つの治療薬または診断薬に操作可能に結合される、様々な抱合抗体およびその断片を提供する。「免疫抱合体」という用語は、抗体の別の効果的な製剤との操作的会合を定義するように広範に使用され、単に操作的会合の任意の種類を指すように意図されず、特に化学的「抱合」に限定されない。特に、組換え融合タンパク質が企図される。送達作用物質または標的作用物質が標的に結合することができ、治療薬または診断薬が送達時に十分に機能的である限り、結合様式は好適である。
【０４０９】
抗体上の炭水化物部分を介する作用物質の結合も企図される。Ｏ結合およびＮ結合両方のグリコシル化が、抗体内で自然に発生する。組換え抗体を、所望の場合、追加のグリコシル化部位を再作成または作成するように修飾することができ、これは、単に、適切なアミノ酸配列（ＸはＰｒｏを除く任意のアミノ酸である、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ、Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、もしくはＴｈｒ等）を抗体の一次配列中に操作することによって達成される。
【０４１０】
本発明の抗ＣＣＲ４抗体または治療抱合体で用いるための現在の好ましい作用物質、ならびに関連する方法および使用は、抗体の効果を補完もしくは強化するもの、および／または患者の障害の特定の種類（例えば、腫瘍型）に対して選択されるものである。
【０４１１】
「抗体の効果を補完または強化する治療薬」には、放射線治療薬、化学療法薬、血管新生阻害剤、アポトーシス誘導剤、抗チューブリン薬、抗細胞または細胞毒性薬、凝固剤、サイトカインまたはケモカイン拮抗薬、サイトカインまたはケモカイン発現阻害剤、ＡＴＰａｓｅ阻害剤、コルチコステロイド、好ましくは、グルココルチコイド、または非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）等の抗炎症剤、他の抗体（例えば、二重特異性抗体等）が含まれており、それらのうちの任意の１つ以上は、それとの使用に好ましい。
【０４１２】
現在の好ましい抗癌、特に、抗白血病剤には、ダウノルビシン、ドキソルビシン、シタラビン、６−チオグアニン、ミトキサントロン、ブスルファン（ミレラン（登録商標））、ダサチニブ（スプリセル（商標））、プレドニゾン、硫酸ビンクリスチン（オンコビン（登録商標））、クロラムブシル、フルダラビン、ペントスタチン、およびクラドリビン等のアントラサイクリン系薬剤が含まれる。
【０４１３】
ＡＴＬの治療において現在の好ましい作用物質には、ジドブジン（アジドチミジン）およびＣＨＯＰ療法が含まれる。ＣＨＯＰは、シクロホスファミド、ヒドロキシダウノルビシン（アドリアマイシン）、オンコビン（ビンクリスチン）、プレドニゾン／プレドニゾロンを表す。
【０４１４】
現在の好ましい血管新生阻害剤には、アンギオスタチン、エンドスタチンと、アンジオポイエチン、バスクロスタチン、カンスタチン、およびマスピンのうちのいずれか１つが含まれる。
【０４１５】
本明細書で使用される「抗チューブリン薬」とは、細胞有糸分裂を阻害する、好ましくは、細胞有糸分裂に必要なチューブリン活性、好ましくはチューブリン重合もしくは脱重合を直接的または間接的に阻害する、任意の作用物質、薬物、プロドラッグ、またはそれらの組み合わせを意味する。現在の好ましい抗チューブリン薬には、コルヒチン、タクソール、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンと、コンブレタスタチンの１つ以上が含まれる。
【０４１６】
現在の好ましいＮＳＡＩＤには、ＣＯＸ−２阻害剤、スルホンアニリド、リコフェロン、およびオメガ３脂肪酸が含まれる。
【０４１７】
好ましい作用物質の本発明の抗ＣＣＲ４抗体との結合または会合は、「免疫抱合体」をもたらし、そのような免疫抱合体は、しばしば、強化された、およびさらには相乗的な治療特性、例えば、抗腫瘍または抗炎症特性を有する。
【０４１８】
抗細胞剤および細胞毒性薬の使用は、本発明の抗ＣＣＲ４抗体「免疫毒素」をもたらし、一方で、凝固因子の使用は、本発明の抗ＣＣＲ４抗体「凝固リガンド」をもたらす。
【０４１９】
１つ以上の放射線治療薬、化学療法薬、血管新生阻害剤、アポトーシス誘導剤、抗チューブリン薬、抗細胞剤および細胞毒性薬、サイトカインまたはケモカイン拮抗薬、サイトカインまたはケモカイン発現阻害剤、ＡＴＰａｓｅ阻害剤、コルチコステロイド、好ましくは、グルココルチコイド、または非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）等の抗炎症剤、他の抗体（例えば、二重特異性抗体等）、および凝固因子の組み合わせ等、少なくとも２つの治療薬の使用も企図される。
【０４２０】
ある特定の適用において、本発明の抗ＣＣＲ４抗体治療薬は、細胞を死滅させるか、細胞の成長または細胞分裂を抑圧する能力を有する細胞毒性薬、細胞増殖抑制剤、またはさもなければ抗細胞剤に操作可能に結合される。好適な抗細胞剤には、化学療法薬、ならびに細胞毒性薬および細胞増殖抑制剤が含まれる。細胞増殖抑制剤は、好ましくは、細胞が細胞周期から除外されるように、概して、標的細胞の自然細胞周期を妨害するものである。
【０４２１】
例示的な化学療法薬には、ステロイド等のホルモン、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサート、またはアミノプテリン等の代謝拮抗物質、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ビンカアルカロイド、抗生物質、デメコルチン、エトポシド、ミトラマイシン、およびクロラムブシルまたはメルファラン等の抗腫瘍アルキル化剤が含まれる。特定の好ましい抗細胞剤は、ダウノルビシン、ドキソルビシン／アドリアマイシン等のＤＮＡ合成阻害剤である。概して、タクソール／パクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチン、ゲムシタビン、コンブレタスタチン、およびドキソルビシン／アドリアマイシンが、現在の好ましい抗癌剤である。
【０４２２】
サリチリハラミド、コンカナマイシン、またはバフィロマイシン等のＶ型ＡＴＰａｓｅ阻害剤も、プシンベリン、ぺデリン、イルシニアスタチンＡ等のタンパク質合成阻害剤であるため、現在好ましい。
【０４２３】
ある特定の治療適用において、他の潜在的作用物質と比較して、大半の毒素が細胞死滅効果を送達する非常に大きな能力を有するという理由から、毒素部分が好ましい。したがって、本発明の抗ＣＣＲ４抗体構築物における特定の好ましい抗細胞剤は、植物、真菌、または細菌由来毒素である。例示的な毒素には、エピポドフィロトキシン、細菌内毒素もしくは細菌内毒素の脂質Ａ部分、サポリンもしくはゲロニン等のリボソーム不活性タンパク質、ａ−サルシン、アスペルギリン、レストリクトシン、胎盤リボヌクレアーゼ等のリボヌクレアーゼ、ジフテリア毒素、およびシュードモナス外毒素が含まれる。現在の好ましい例は、リシン、ゲロニン、アブリン、ジフテリア、シュードモナス、および百日咳毒素である。
【０４２４】
特定の好ましい毒素は、リシンＡ鎖等のＡ鎖毒素である。最も好ましい毒素部分は、しばしば、「脱グリコシル化Ａ鎖」（ｄｇＡ）と呼ばれる、炭水化物残基を修飾または除去するように処理されたリシンＡ鎖である。脱グリコシル化リシンＡ鎖は、その極端な効力、より長い半減期のため、およびそれを臨床品位および規模で製造することが経済的に実現可能であるため、好ましい。組換えおよび／または切断型リシンＡ鎖も使用することができる。
【０４２５】
本発明の抗ＣＣＲ４抗体治療薬は、凝固を促進することができる成分、すなわち凝固剤を含み得る。ここで、標的抗体は、例えば、別の抗体を介して、直接的または間接的に凝固を刺激する因子に直接的または間接的に結合することができる。
【０４２６】
そのような使用に好ましい凝固因子は、切断型ＴＦ（ｔＴＦ）、二量体、三量体、重量体／多量体ＴＦ、ならびにＶＩＩ因子を活性する能力を欠いた変異ＴＦ等の、組織因子（ＴＦ）およびＴＦ誘導体である。他の好適な凝固因子には、ＩＩ／ＩＩａ因子、ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、ＩＸ／ＩＸａ因子、およびＸ／Ｘａ因子等のビタミンＫ依存凝固剤、Ｇｌａ修飾を欠くビタミンＫ依存凝固因子、ラッセルクサリヘビ毒Ｘ因子阻害剤、トロンボキサンＡ2およびトロンボキサンＡ2シンターゼ等の血小板活性化化合物、ならびにα２−抗プラスミン等の線維素溶解阻害剤が含まれる。概して、切断型組織因子（ｔＴＦ）が現在好ましい。
【０４２７】
免疫抱合体および免疫毒素の調製は、概して、当分野で周知である（例えば、米国特許第４，３４０，５３５号を参照のこと）。以下の特許のそれぞれは、免疫毒素生成、精製、および使用に関して、本教示をまたさらに補足する目的で、参照により本明細書にさらに組み込まれる：米国特許第６，００４，５５４号、同第５，８５５，８６６号、同第５，９６５，１３２号、同第５，７７６，４２７号、同第５，８６３，５３８号、同第５，６６０，８２７号、および同第６，０５１，２３０号。
【０４２８】
多種多様の化学療法剤および他の薬理学的作用物質も、本発明の抗ＣＣＲ４抗体治療薬にうまく抱合することができる。抗体に抱合された例示的な抗悪性腫瘍薬には、ドキソルビシン、ダウノマイシン、メトトレキサート、およびビンブラスチンが含まれる。さらに、ネオカルチノスタチン、マクロマイシン、トレニモン、α−アマニチン等の他の作用物質の結合が説明された（それぞれ、本明細書に組み込まれる、米国特許第５，６６０，８２７号、同第５，８５５，８６６号、および同第５，９６５，１３２号を参照のこと。）。
【０４２９】
凝固リガンドの調製も容易に実践される。１つ以上の凝固因子の本発明の抗ＣＣＲ４抗体との操作可能な会合は、免疫毒素について上述されるもの等の、直接結合であり得る。あるいは、操作的会合は、抗体が、凝固因子に結合する第２の結合領域、好ましくは、抗体または抗体の抗原結合領域に操作可能に結合される等、間接結合であり得る。凝固因子は、その機能的凝固部位と異なる部位、特に共有結合を使用して分子を結合する部位で、本発明の抗ＣＣＲ４抗体に結合されるはずである。
【０４３０】
二重特異性または三重特異性抗体も、本発明の方法で採用することができる。そのような抗体において、１つのアームがＣＣＲ４に結合し、かつ本発明の抗体である。二重特異性抗体を調製するための方法は、当分野で周知であり、かつ説明されている。
【０４３１】
免疫抱合体、免疫毒素、および凝固リガンドの調製において、組換え発現を採用することができる。選択された本発明の抗ＣＣＲ４抗体をコードする核酸配列、および治療薬、毒素、または凝固剤は、発現ベクターのフレーム内で結合される。組換え発現は、それゆえに、核酸の翻訳をもたらし、所望の免疫抱合体を得る。化学架橋剤およびアビジン−ビオチン架橋も、治療薬を本発明の抗ＣＣＲ４抗体に結合し得る。
【０４３２】
本発明の組成物および方法を、他の治療学および診断法と組み合わせて用いることができる。生物学的作用物質、好ましくは、本発明に記載の抗ＣＣＲ４抗体と「組み合わせて」用いるための診断薬または治療薬に関して、「組み合わせて」という用語は、様々な実施形態を網羅するために簡潔に使用される。したがって、「組み合わせて」という専門用語は、別途特に提示されないか、あるいは科学的専門用語から明確にされない限り、組み合わされた組成物、薬剤、カクテル、キット、方法、ならびに第１および第２の医学的使用の様々な形式に適用される。
【０４３３】
本発明「組み合わされた」実施形態は、それゆえに、例えば、本発明の抗ＣＣＲ４が裸抗体であり、それに操作可能に結合されない作用物質または治療薬との組み合わせで使用される実施形態を含む。そのような場合において、作用物質または治療薬を、非標的または標的形態で使用することができる。「非標的形態」において、作用物質、特に治療薬は、概して、当分野の標準の用法に従って使用される。「標的形態」において、作用物質は、概して、作用物質または治療薬を標的疾患部位に送達する、はっきりと異なる抗体または標的領域に操作可能に結合される。診断薬および治療薬の両方の生物学的作用物質のそのような標的形態の使用も、当分野で極めて標準的である。
【０４３４】
本発明の他の「組み合わされた」実施形態において、本発明の抗ＣＣＲ４抗体は、抗体自体が、作用物質または治療薬と操作可能に会合されるか、あるいは組み合わされる、免疫抱合体である。操作的結合は、本明細書に記載され、かつ当分野で既知である、直接または間接結合の全ての形態を含む。
【０４３５】
特に、治療薬と組み合わせた本発明の抗ＣＣＲ４抗体に関して、「組み合わされた」使用には、組み合わされた組成物、製剤、カクテル、キット、方法、ならびに第１および第２の医学的使用も含まれ、治療薬はプロドラッグの形態である。そのような実施形態において、プロドラッグを薬物の機能的形態に変換することができる活性化成分を、この場合もやはり、本発明の抗ＣＣＲ４抗体と操作可能に会合することができる。
【０４３６】
特定の好ましい実施形態において、治療組成物、組合物、薬剤、カクテル、キット、方法、ならびに第１および第２の医学的使用は、「プロドラッグ組み合わせ」である。当業者によって理解される「プロドラッグ組み合わせ」という用語は、特に提示されない限り、本発明の抗体がプロドラッグを活性薬物に変換することができる成分に操作可能に結合されることを意味し、抗体がプロドラッグ自体に結合されることを意味しない。しかしながら、本発明のプロドラッグ実施形態をプロドラッグ組み合わせとして使用しなければならない必要はない。したがって、プロドラッグを、ＡＤＥＰＴおよび他の形態を含む、当分野で使用される任意の様式で使用することができる。
【０４３７】
したがって、組み合わされた組成物、薬剤、カクテル、キット、方法、ならびに第１および第２の医学的使用が説明される場合、好ましくは診断薬に関して、より好ましくは治療薬に関して、いくつかの抱合型または非抱合型において、抗体のいくつかの形態および生物学的作用物質、診断薬、または治療薬のいくつかの形態の全体的な提供が達成される限り、組み合わせは、裸抗体および免疫抱合体である抗ＣＣＲ４抗体を含み、本発明のインビボ実施形態の実践は、裸抗体または免疫抱合体、および生物学的作用物質、診断薬、または治療薬の投与前、投与時、または投与後を含む。
【０４３８】
腫瘍への本発明の効果の前述および他の説明は、操作および結合した作用物質の種類等の組み合わせ形態を簡潔に説明するためのものである。この説明的なアプローチを、本発明の抗ＣＣＲ４抗体の有益な特性の控えめな表現または過度の単純化のいずれかとして解釈すべきではない。したがって、そのような抗体自体は抗ＣＣＲ４特性を有し、そのような抗体の免疫抱合体はそれらの特性を維持し、それらを結合した作用物質の特性と組み合わせ、さらに抗体と任意の結合した作用物質の組み合わされた効果は、典型的には、強化される、および／または拡大されることが理解される。
【０４３９】
したがって、本発明は、任意選択で、少なくとも第１の組成物または容器に、生物学的に有効な量の少なくとも第１の本発明の抗ＣＣＲ４抗体、またはそのような抗ＣＣＲ４抗体の抗原結合断片もしくは免疫抱合体、ならびに生物学的に有効な量の少なくとも第２の生物学的作用物質、成分、または系を含む、組成物、薬学的組成物、治療用キット、および薬用カクテルを提供する。
【０４４０】
「少なくとも第２の生物学的作用物質、成分、または系」とは、しばしば、治療薬もしくは診断薬、成分、または系であるが、それらである必要はない。例えば、少なくとも第２の生物学的作用物質、成分、もしくは系は、抗体の修飾のための成分、および／または他の作用物質を抗体に結合するための成分を含み得る。特定の好ましい第２の生物学的作用物質、成分、または系は、プロドラッグ、またはプロドラックを作製および使用するための成分であり、プロドラッグ自体を作製するための成分、および本発明の抗体をそのようなプロドラッグまたはＡＤＥＰＴ実施形態で機能するように適合させるための成分を含む。
【０４４１】
治療薬または診断薬が少なくとも第２の生物学的作用物質、成分、または系を含む場合、そのような治療薬および／または診断薬は、典型的には、上で定義される障害の１つ以上の治療または診断に関連して使用するものである。
【０４４２】
したがって、特定の実施形態において、「少なくとも第２の治療薬」は、治療用キットまたはカクテルに含まれる。「少なくとも第２の治療薬」という用語は、本発明の抗ＣＣＲ４抗体が第１の治療薬であることに準拠して選択される。したがって、本発明の抗体を、化学療法薬、放射線治療薬、サイトカインもしくはケモカイン拮抗薬、サイトカインもしくはケモカイン発現阻害剤、血管新生阻害剤、アポトーシス誘導剤、抗癌免疫毒素もしくは凝固リガンド、またはコルチコステロイドおよびＮＳＡＩＤを含む抗炎症剤と組み合わせることができ、それらのいくつかの例が、本明細書の他の箇所で議論される。
【０４４３】
他の例示的な抗癌剤には、例えば、ネオマイシン、ポドフィロトキシン、ＴＮＦ−α、αvβ3拮抗剤、カルシウムイオノフォア、カルシウム流誘発剤、およびそれらの任意の誘導体またはプロドラッグが含まれる。現在の好ましい抗チューブリン薬には、コルヒチン、タクソール、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、コンブレタスタチン、またはそれらの誘導体もしくはプロドラッグが含まれる。
【０４４４】
本発明の組成物、キット、および／または薬剤に関して、組み合わされた有効量の治療剤を、単一の容器もしくは容器手段内に含むか、あるいははっきり異なる容器もしくは容器手段内に含むことができる。カクテルは、概して、混合使用のためにともに混合される。静脈内投与用に製剤化された作用物質がしばしば好ましい。撮像成分も含むことができる。キットは、同梱の少なくとも第１の抗体、および１つ以上の他の生物学的作用物質を使用するための説明書も含む。
【０４４５】
一般的に言えば、少なくとも第２の治療薬を、動物または患者に、単一の薬学的組成物から、または厳密にともに投与される２つの薬学的組成物等からの、本発明の抗ＣＣＲ４抗体と実質的に同時に投与することができる。
【０４４６】
あるいは、少なくとも第２の治療薬を、本発明の抗ＣＣＲ４抗体の投与後に順次的に、動物または患者に投与することができる。少なくとも第２の抗癌剤を、本発明の抗ＣＣＲ４抗体の投与とはっきり異なる時間で、動物または患者に投与するように、本明細書で使用される「〜後に順次的に」とは、「時差的」を意味する。概して、２つの作用物質を、２つの作用物質にそれら各自の治療効果を発揮させるのに有効な間隔をあけた時間で投与する、すなわち、これらを、「生物学的に有効な時間間隔」で投与する。少なくとも第２の治療薬を、本発明の抗ＣＣＲ４抗体投与前の生物学的に有効な時間で、またはその治療薬の投与後の生物学的に効果的な時間で、動物または患者に投与することができる。
【０４４７】
したがって、本発明は、腫瘍を有する動物または患者を治療するための方法を提供し、
（ａ）動物または患者を、腫瘍量を実質的に減少させる第１の治療に供すことと、
（ｂ）その後、少なくとも第１の本発明の抗ＣＣＲ４抗体またはその抗原結合断片を投与することと、を含み、任意選択で、抗体または断片は、第２の治療薬と操作可能に会合される。
【０４４８】
好ましい第１の治療薬は、外科的切除および化学療法介入を含む。
【０４４９】
他の実施形態において、本発明は、ＣＣＲ４介在障害を有する動物または患者を治療するための方法を提供し、
（ａ）動物または患者を、ＣＣＲ４介在量を実質的に減少させる第１の治療に供すことと、
（ｂ）その後、少なくとも第１の本発明の抗ＣＣＲ４抗体またはその抗原結合断片を投与することと、を含み、任意選択で、抗体または断片は、第２の治療薬と操作可能に会合される。
【０４５０】
ある特定の他の実施形態において、本発明の抗体および免疫抱合体を、１つ以上の診断薬、典型的には、上で定義される障害の診断に関連して使用するための診断薬と組み合わせることができる。したがって、様々な診断用組成物、キット、および方法が本発明内に含まれる。
【０４５１】
またさらなる態様は、本明細書に定義される、本発明の適切な量の抗体または他のタンパク質を対象に投与することと、対象における本発明の抗体または他のタンパク質の存在および／または量および／または位置を検出することと、を含む、対象の診断方法または撮像方法である。
【０４５２】
一実施形態において、本発明は、該動物に、該動物の抗体とＣＣＲ４との間に複合体を形成するのに有効な量で、本発明の抗体またはその免疫抱合体を投与し、それによって、動物のＣＣＲ４発現に関連する免疫抑制を軽減することを含む、動物のＣＣＲ４発現に関連する免疫抑制を軽減する方法を提供する。
【０４５３】
上述の使用および方法に従って、撮像または診断に適切な疾患は、任意の疾患、好ましくは、本明細書の他の箇所に記載される任意の癌を含む。
【０４５４】
一実施形態において、本発明は、動物の疾患を診断するか、あるいは疾患の進行を監視する方法を提供し、
（ａ）該動物から採取した試験試料を、本発明の抗体またはその免疫抱合体と接触させるステップを含む。
【０４５５】
さらなる実施形態において、本発明は、動物の疾患を診断するか、あるいは疾患の進行を監視する方法を提供し、
（ａ）該動物から採取した試験試料を、本発明の抗体またはその免疫抱合体と接触させるステップと、
（ｂ）試験試料中の抗体−抗原複合体の存在および／または量および／または位置を測定するか、あるいは検出するステップと、任意選択で、
（ｃ）試験試料中の抗体−抗原複合体の存在および／または量を対照と比較するステップと、を含む。
【０４５６】
上述の方法において、該接触ステップを、抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件下で行う。適切な条件を、当業者が容易に決定することができる。
【０４５７】
上述の方法において、任意の適切な試験試料、例えば、疾患に罹患した疑いがある生検細胞、組織もしくは臓器、または組織学的切片を用いることができる。
【０４５８】
上述の方法のある特定の方法において、試験試料中の抗体−抗原複合体の任意の量の存在は、疾患の存在を示すであろう。好ましくは、陽性診断されるために、試験試料中の抗体−抗原複合体の量は、適切な対照試料に見られる量よりも多い、好ましくは、著しく多い。より好ましくは、著しく高いレベルは、統計的に有意であり、好ましくは０．０５未満の確率値である。統計的有意性を決定する適切な方法は、当分野で周知であり、かつ説明されており、これらのうちのいずれかを用いることができる。
【０４５９】
疾患の進行を監視することは、試験試料中の抗体−抗原複合体の存在および／または量を経時的に監視することも含み得る。したがって、監視することは、（ｄ）第１の試験試料中の抗体−抗原複合体の存在および／または量を、該動物から採取した第２の試験試料中の抗体−抗原複合体の存在および／または量と比較することを含み得る。「第１の試験試料」とは、「第２の試験試料」を採取する前、例えば、第２の試験試料を採取する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２日前、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２週間前、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２月前、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２年前に採取された試料を意味する。第１の試験試料と比較した、第２の試験試料中の抗体−抗原複合体の量の減少は、疾患退行を示す一方で、増加は、疾患進行を示す。
【０４６０】
適切な対照試料を、当業者が容易に選択することができ、例えば、特定の疾患の診断の際、適切な対照はその疾患を有さなかった対象からの試料であろう。適切な対照「値」も、例えば、当分野で既知の正常な対象の範囲を参照することによって、試験毎に対照「試料」を走行させることなく、容易に決定することができる。
【０４６１】
診断または撮像用途での使用のために、本発明の抗体を、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ、123Ｉ、125Ｉ、131Ｉ等の放射線不透過もしくは放射線同位体、放射性エミッタ（例えば、α、β、またはγエミッタ）、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、もしくはルシフェリン等の蛍光（フルオロフォア）または化学発光（発色団）化合物、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシターゼ、もしくはセイヨウワサビペルオキシダーゼ等の酵素、造影剤、または金属イオン、あるいは特定の検出可能な同種部分への結合によって検出することができるビオチン等の化学部分、例えば、標識アビジン／ストレプトアビジン等の検出可能なマーカーで標識化することができる。標識を抗体または抗体断片等の結合タンパク質に結合する方法は、当分野で周知である。そのような検出可能なマーカーは、試験試料中の結合タンパク質−抗原複合体の存在、量、または位置を試験することを可能にする。
【０４６２】
インビボ使用に好ましい検出可能なマーカーは、ビスマス（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、ランタン（ＩＩＩ）、もしくは鉛（ＩＩ）等のＸ線検出可能な化合物、銅67、ガリウム67、ガリウム68、インジウム111、インジウム113、ヨウ素123、ヨウ素125、ヨウ素131、水銀197、水銀203、レニウム186、レニウム188、ルビジウム97、ルビジウム103、テクネチウム99m、もしくはイットリウム90等の放射性イオン、コバルト（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、クロム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、エルビウム（ＩＩＩ）、ガトリニウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、ネオジウム（ＩＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、もしくはイッテリビウム（ＩＩＩ）等の核磁気スピン共鳴アイソトープ、またはローダミンもしくはフルオレセインを含む。
【０４６３】
本発明は、検出可能なシグナルを直接的または間接的に産生する標識に結合される本発明の抗体を含む診断薬または造影剤も含む。適切な標識は、本発明の他の箇所に記載される。
【０４６４】
本発明は、本発明の抗体、免疫抱合体、もしくは組成物のうちの１つ以上、または本発明の抗体をコードする核酸分子のうちの１つ以上、または本発明の核酸配列を含む１つ以上の組換え発現ベクター、または本発明の組換え発現ベクターもしくは核酸配列を含む１つ以上の宿主細胞もしくはウイルスを含むキットをさらに含む。好ましくは、該キットは、本明細書に記載される方法および使用、例えば、本明細書に記載される治療方法、診断方法、または撮像方法における使用のためであるか、あるいは本明細書に記載されるインビトロアッセイまたは方法における使用のためである。そのようなキット中の抗体は、好ましくは、本明細書の他の箇所に記載される抗体抱合体であることができ、例えば、検出可能な部分に抱合されるか、または免疫抱合体であることができる。好ましくは、該キットは、例えば、診断における、キット成分の使用に関する取扱説明書を含む。好ましくは、該キットは、本明細書の他の箇所に記載される疾患を診断または治療するためのものであり、任意選択で、そのような疾患を診断または治療するためのキット成分の使用に関する取扱説明書を含む。
【０４６５】
本明細書に定義される本発明の抗体を、インビトロまたはインビボ適用およびアッセイの分子ツールとして使用することもできる。抗体は抗原結合部位を有するため、これらは、特異結合対のメンバーとして機能することができ、これらの分子は、特異結合対メンバーが必要とされる任意のアッセイにおいて用いることができる。
【０４６６】
したがって、本発明のまたさらなる態様は、本明細書に定義される本発明の抗体を含む試薬、および例えば、インビトロまたはインビボアッセイにおける分子ツールとしてのそのような抗体の使用を提供する。
【０４６７】
癌治療を、
（ａ）腫瘍を有する動物または患者に、本発明の抗ＣＣＲ４抗体に操作可能に結合された診断薬を含む、本発明の少なくとも第１の検出可能に標識化された抗ＣＣＲ４抗体の診断的量を投与することによって、腫瘍の画像を形成し、それによって、腫瘍の検出可能な画像を形成することと、
（ｂ）その後に、同一の動物または患者に、本発明の少なくとも第１の裸の抗ＣＣＲ４抗体またはそのような抗体を用いる治療薬−抗体構築物の治療的に最適化された量を投与し、それによって抗腫瘍効果を引き起こすことと、によって、行うこともできる。
【実施例】
【０４６８】
これから、本発明を、表および図を参照して、以下の非限定的な例においてより詳細に説明する：
表１は、抗体１７Ｇに関連する本明細書に開示の配列のいくつかのを列記し、
表２は、抗体９Ｅに関連する本明細書に開示の配列のいくつかのを列記し、
表３は、抗体１Ｏに関連する本明細書に開示の配列のいくつかのを列記し、
表４は、抗体１１Ｆに関連する本明細書に開示の配列のいくつかのを列記し、
表５は、抗体１７ＧのＩｇＧ型に関連する本明細書に開示の配列のいくつかのを列記する。可変領域には下線が引かれている。
【０４６９】
表６は、抗体９ＥのＩｇＧ型に関連する本明細書に開示の配列のいくつかのを列記する。可変領域には下線が引かれている。
【０４７０】
表７は、抗体１ＯのＩｇＧ型に関連する本明細書に開示の配列のいくつかのを列記する。可変領域には下線が引かれている。
【０４７１】
表８は、抗体１１ＦのＩｇＧ型に関連する本明細書に開示の配列のいくつかのを列記する。可変領域には下線が引かれている。
【０４７２】
表９は、ソフトウェアＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の「一部位特異結合」モデルを用いた、ＣＣＲ４+細胞上でのＩｇＧ滴定から計算された親和性（ＫD値）を示す。抗体１７Ｇ、９Ｅ、および様々なＣＣＲ４+細胞種類を用いたＫＭ３０６０ｖａｒのＩｇＧ型を使用した（実施例２を参照のこと）。
【０４７３】
表１０は、抗体ＫＭ３０６０ｖａｒの配列を示す。
【０４７４】
表１１は、抗体９Ｅ１０Ｊに関連する本明細書に開示の配列のいくつかのを列記する。
【０４７５】
表１２は、抗体９Ｅ１Ｄに関連する本明細書に開示の配列のいくつかのを列記する。
【０４７６】
表１３は、抗体９Ｅ１０ＪのＩｇＧ型に関連する本明細書に開示の配列のいくつかのを列記する。可変領域には下線が引かれている。
【０４７７】
表１４は、抗体９Ｅ１ＤのＩｇＧ型に関連する本明細書に開示の配列のいくつかのを列記する。可変領域には下線が引かれている。
【０４７８】
表１５は、実施例４で得られた結果から決定した見かけの親和性（ＩＣ50およびＫD）を示す。
【０４７９】
表１６は、Ｃａ++流アッセイにおいて決定したＩＣ50値を示す（実施例５）。
【０４８０】
表１７は、抗ＣＣＲ４抗体のＡＤＣＣ活性の比較を示す（実施例６）。
【０４８１】
表１８は、脱フコシル化９Ｅ１０Ｊを含む抗ＣＣＲ４抗体のＡＤＣＣ活性の比較を示す（実施例１１）。
【０４８２】
表１９は、実施例１４の結果のいくつかを示す。細胞上での飽和抗体滴定によってフローサイトメトリーで決定した見かけの親和性（ＫD）。
表２０は、実施例９の結果のいくつかを示す。ＤＴ−４０−ＣＣＲ４+およびＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞上での競合結合実験から決定した、ビチオン化ＭＤＣの細胞結合阻害に関するＩＣ50値および計算された親和性（ＫD）。
【０４８３】
表２１は、実施例９の結果のいくつかを示す。ＤＴ−４０−ＣＣＲ４+およびＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞での競合結合実験から決定した、ビチオン化ＴＡＲＣの細胞結合阻害に関するＩＣ50値。
【０４８４】
表２２は、実施例９の競合実験から決定したＩＣ50値の概要を示す。
【０４８５】
表２３は、本明細書に開示の抗体に基づくＣＤＲコンセンサス配列を示す。
【０４８６】
表２４は、９Ｅ１０Ｊの血小板凝集への効果の決定に関する、実施例１５の結果のいくつかを示す。血小板をドナー血液から単離し、９Ｅ１０Ｊ−ＩｇＧ（１０μｇ／ｍＬ）または天然リガンドＭＤＣおよびＴＡＲＣ（０．２５μｇ／ｍＬ）のいずれかの存在下でインキュベートした。血小板が予測通りに振る舞うことを示すために、ＡＤＰ（３μＭ）を対照として用いた。アッセイの特異性を示すために、抗ＧＦＰ（１０μｇ／ｍＬ）も同様に測定に含めた。血小板枯渇血漿（＝０％凝集）と並行して比較した、試料チャンバ内の吸収度を測定することによって、凝集を判定し、％で表した。予インキュベーションにおいては、最初に、ＩｇＧ試料を、血小板と１０分間インキュベートし、その後、リガンドを添加し、混合物においては、ＩｇＧ試料をリガンドと混合し、その後、血小板とインキュベートした。
【０４８７】
以下の非限定的な実施例は、本発明を例証する。
【０４８８】
実施例１：新規抗体
４つのヒト抗体のうち、どれが特異的にＣＣＲ４に結合することができるかを同定した。抗体の一本鎖型を、ｃ−ｍｙｃおよび６個のＨｉｓタグエピトープを含有するｐＨＯＧ２１プラスミド中にクローン化した。ＴＧ１細菌を形質転換し、ｓｃＦｖをＩＰＴＧ誘導時に発現させた。精製したｓｃＦｖの結合をＥａｓｙＣｙｔｅで確認した。
【０４８９】
クローンを産生する抗体の重鎖および軽鎖のヌクレオチド配列を配列決定した。抗体は、１７Ｇ、９Ｅ、１１Ｆ、１Ｏ、９Ｅ１０Ｊ、および９Ｅ１Ｄと指定される。１７Ｇの軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が、図１に示される。１７Ｇの軽鎖および重鎖のＣＤＲ領域が、表１に示される。９Ｅの軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が、図２に示される。９Ｅの軽鎖および重鎖のＣＤＲ領域が、表２に示される。１Ｏの軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が、図３に示される。１Ｏの軽鎖および重鎖のＣＤＲ領域が、表３に示される。１１Ｆの軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が、図４に示される。１１Ｆの軽鎖および重鎖のＣＤＲ領域が、表４に示される。
【０４９０】
さらに２つの抗体のうち、どちらが特異的にＣＣＲ４に結合することができるかを同定した。抗体の一本鎖型を、上述のように調製した。９Ｅ１０Ｊの軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が、図２７に示される。９Ｅ１０Ｊの軽鎖および重鎖のＣＤＲ領域が、表１１に示される。９Ｅ１Ｄの軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が、図２８に示される。９Ｅ１Ｄの軽鎖および重鎖のＣＤＲ領域が、表１２に示される。
【０４９１】
抗体１７Ｇ、９Ｅ、１Ｏ、１１Ｆ、９Ｅ１０Ｊ、および９Ｅ１ＤのＩｇＧ型も作製された。ＩｇＧを、標準のプロトコルを用いて調製した。手短に言うと、対応する可変ドメインをコードする遺伝子を、ヒト定常ドメインに対する遺伝子を含む哺乳動物発現ベクターｐＬＮＯ中にクローン化した（Ｎｏｒｄｅｒｈａｕｇ  ｅｔ  ａｌ，１９９７）。抗体を細胞工場内で発現させ、第１の収穫をタンパク質Ａカラム上で精製し、サイズ排除クロマトグラフィーによって単量体に分画した。ＩｇＧは、特異的にＣＣＲ４に結合する能力を保持した。
【０４９２】
ＩｇＧ型は、ＩｇＧ１アイソタイプであり、これは、２つの重鎖および２つの軽鎖を含む。各々の重鎖は、配列番号６９（１７Ｇに対して）、配列番号７１（９Ｅもしくは９Ｅ１Ｄに対して）、配列番号７３（１Ｏに対して）、配列番号７５（１１Ｆに対して）、または配列番号１０５（９Ｅ１０Ｊに対して）のＶＨドメイン、およびヒトＩｇＧ１定常領域を含む。各々の軽鎖は、ヒトカッパ軽鎖を有する１１ＦのＩｇＧ型を除いて、配列番号７０（１７Ｇに対して）、配列番号７２（９Ｅもしくは９Ｅ１０Ｊに対して）、配列番号７４（１Ｏに対して）配列番号７６（１１Ｆに対して）、または配列番号１１５（９Ｅ１Ｄに対して）のＶＬドメイン、およびヒトラムダ軽鎖定常領域を含む。１７Ｇ、９Ｅ、１Ｏ、１１Ｆ、９Ｅ１０Ｊ、および９Ｅ１Ｄの全ＩｇＧ配列が、それぞれ、表５、６、７、８、１３、および１４に示される。
【０４９３】
さらなる抗体、９Ｅ１Ｄｖを同定した。この抗体は、ＦＲ３中の位置８８で点変異を有し（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ；Ｆｉｆｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１に従った番号付け）、９Ｅ１Ｄｖは、９Ｅ１Ｄに見られるＶａｌｉｎｅ（Ｖ）の代わりにＡｌａｎｉｎｅ（Ａ）を有する。それらを試験した限りでは、９Ｅ１Ｄｖの特性は、抗体９Ｅ１Ｄの特性に相当するように見える。
【０４９４】
実施例２：発現細胞を標的化するための抗ＣＣＲ４抗体の結合
実施例１に開示の抗体のＣＣＲ４特異性を示し、かつそれらの結合親和性を推定するために、組織内ＣＣＲ４トランスフェクトおよび非トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＤＴ４０−細胞、および天然ＣＣＲ４+ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞株を、ＩｇＧ１７Ｇおよび９Ｅ、ならびにｓｃＦｖｓ１Ｏおよび１１Ｆでの染色において、フローサイトメトリーで使用した。陽性対照として、ヒトＣＣＲ４（ＥＰ１２７０５９５）のＮ末端部分における位置２〜２９に存在するエピトープに対して特異的である組織内クローン化および発現ＫＭ３０６０ｖａｒ  ＩｇＧを用いた。（緑色蛍光タンパク質に対して産生された）抗ＧＦＰ抗体または（水疱瘡ウイルスに対して産生された）抗ＶＺＶ抗体を、陰性対照として用いた（抗ＶＺＶにおいてｓｃＦｖとしてのみである一方で、抗ＧＦＰにおいては、ｓｃＦｖおよびＩｇＧの両方として）。
【０４９５】
ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（急性リンパ性白血病、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１１９）、ＨＥＫ２９３Ｔ／１７（ヒト腎臓、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１１２６８）、およびＤＴ４０（鶏リンパ腫、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２１１１）細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から得た。ＣＣＲＦ−ＣＥＭおよびＤＴ４０細胞を、ＲＰＭＩ−１６４０培養培地中に維持し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）培養培地中に維持した。全ての細胞を、ウシ胎仔血清で維持し、濃度は、ＤＴ４０およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞において１０％、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞においては２０％であった。全ての培地を、ペニシリンおよびストレプトマイシンで補充した。
【０４９６】
フローサイトメトリー実験において、細胞を、培養フラスコから採取し、ＰＢＳで２回洗浄し、０．２％ＢＳＡおよび０．０９％ＮａＮ3を有するＰＢＳ中に再懸濁し、最終的に、Ｖ字型９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中に、１ウェル当たり１×１０5細胞にアリコートした。細胞を、４００×ｇで５分間遠心分離し、次に、４℃で４５分間、異なる抗体の希釈度でインキュベートした。
【０４９７】
ｓｃＦｖｓでの染色において、ｓｃＦｖ調製物を、細胞に添加する前に、キメラ（マウス可変／ヒト定常ドメイン）抗ｃ−ｍｙｃ抗体と予インキュベートした。
【０４９８】
０．２％ＢＳＡおよび０．０９％ＮａＮ3を有するＰＢＳでの洗浄後、細胞を、４℃で３０分間、１０μｇ／ｍｌのＲＰＥ抱合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＡｂＤＳｅｒｏｔｅｃ，Ｄuｓｓｅｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で染色した。ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーター（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）上での獲得のために、染色した細胞を洗浄し、２００μｌの０．２％ＢＳＡおよび０．０９％ＮａＮ3を有するＰＢＳ中に再懸濁し、Ｕ字型９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｓｃｈｉｐｈｏｌ−Ｒｉｊｋ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に移した。
【０４９９】
得られた結果は、抗体１７Ｇ、９Ｅ、１Ｏ、および１１ＦがＣＣＲ４に対して特異的であることを明らかに示す。ＣＣＲ４陰性ＤＴ４０細胞と比較した、ＣＣＲ４陽性ＤＴ４０細胞への抗体１７Ｇおよび９Ｅの結合が、図５に示される。ＣＣＲ４発現ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞への１７Ｇおよび９Ｅの結合が、図６に示される。ＣＣＲ−ＨＥＫ２９３Ｔ細胞と比較した、ＣＣＲ＋ＨＥＫ２９３Ｔ細胞への１７Ｇおよび９Ｅの選択的結合も見出された。
【０５００】
これらのＩｇＧ滴定実験から推測された親和性値（ＫD）は、低ナノモル範囲にあることが推定された（表９を参照のこと）。
【０５０１】
ＣＣＲ４に対する抗体１Ｏ  ｓｃＦｖの特異性が図７に示され、ＣＣＲ４に対する抗体１１Ｆ  ｓｃＦｖの特異性が図８に示される。
【０５０２】
９Ｅ１０Ｊおよび９Ｅ１Ｄの結合特異性を、同様に、上述の条件に本質的に対応する条件下で、非トランスフェクトＤＴ４０細胞およびＣＣＲ４トランスフェクトＤＴ４０細胞に対して試験した。この実験において、９Ｅ１０Ｊおよび９Ｅ１Ｄを、３’末端でｃ−ｍｙｃタグを有するｓｃＦｖとして発現させ、これを用いて、ＩｇＧ型式を模倣する二量体を作成した。抗体を、細胞への添加前に、抗ｃ−ｍｙｃ抗体と予インキュベートした。染色を本質的に上述のように行った。結果は、９Ｅ１０Ｊおよび９Ｅ１ＤがＣＣＲ４陽性細胞に選択的に結合することを示す（図１３）。
【０５０３】
実施例３：リガンド結合を妨害する抗ＣＣＲ４抗体
抗ＣＣＲ４抗体が、受容体へのＣＣＲ４リガンドの結合を妨害するかを判定するために、（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  ＥＣ  Ｌｔｄ．，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫから得た）ＭＤＣを、ｓｃＦｖでの染色の前に、ＣＣＲ４−トランスフェクトＤＴ４０−細胞と予インキュベートした。陰性対照として、ヒトＣＣＲ４のＮ末端部分に特異的であるＫＭ３０６０ｖａｒ  ｓｃＦｖ（配列に関して、表１０を参照のこと）を用いた。抗体ＫＭ３０６０が受容体へのリガンド結合を妨害しないことが以前に示されている（Ｔ  Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ＣＣ  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４？Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｈｏｄｇｋｉｎ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  Ｆｏｓｔｅｒｓ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｐｒｉｖｉｌｅｇｅ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６：（１１）：５７１６−５７２２）。ＫＭ３０６０ｖａｒはＫＭ３０６０に相当するが、これを、異なる宿主細胞中で発現させており、このことは、この抗体に結合する糖鎖における相違の原因になったかもしれない。
【０５０４】
ＣＣＲ４＋ＤＴ４０−細胞を、培養フラスコから採取し、ＲＰＭＩ−１６４０培養培地で２回洗浄し、Ｖ字型９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中に、１ウェル当たり１×１０５細胞をアリコートした。細胞を、５００×ｇで５分間遠心分離し、次に、ＲＰＭＩ−１６４０培養培地中で、０、１、または１０ｎｇ／ｍｌのＭＤＣ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  ＥＣ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）と３７℃で３０分間インキュベートした。５００×ｇでの５分間の遠心分離ステップ後、上清を吸引させ、細胞を、０．５μｇ／ｍｌのｓｃＦｖおよびヒトＦｃを有する２．５μｇ／ｍｌの組織内産生抗ｃＭｙｃと、４℃で１時間インキュベートした。０．２％ＢＳＡおよび０．０９％ＮａＮ３を含有するＰＢＳで３回洗浄した後、細胞を、４℃で１時間、２．５μｇ／ｍｌのＲＰＥ抱合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＡｂＤＳｅｒｏｔｅｃ，Ｄuｓｓｅｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で染色した。細胞を洗浄し、０．２％ＢＳＡおよび０．０９％ＮａＮ３を有する２００μｌのＰＢＳ中に再懸濁し、ＥａｓｙＣｙｔｅデバイス（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いたフローサイトメトリーのために、Ｕ字型９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｓｃｈｉｐｈｏｌ−Ｒｉｊｋ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に移した。結果は、１０ｎｇ／ｍｌのＭＤＣでのＣＣＲ４トランスフェクトＤＴ４０細胞の予インキュベーション後に、ＫＭ３０６０ｖａｒ抗体での染色は別として、染色シグナルの明らかな減少を示した（図９）。これは、抗体１７Ｇ、９Ｅ、１Ｏ、および１１Ｆが、リガンド結合を妨害し、ひいては、ＣＣＲ４阻止活性を有することを示す。
【０５０５】
同様の実験は、全ての４つの抗体１７Ｇ、９Ｅ、１Ｏ、および１１Ｆも、ＴＡＲＣのＣＣＲ４への結合を妨害することを示した。結果は、図１４に示される。
【０５０６】
実施例４：抗ＣＣＲ４抗体間の競合
抗ＣＣＲ４抗体１７Ｇ、９Ｅ、およびＫＭ３０６０ｖａｒのエピトープ結合を分析するために、競合実験を、フローサイトメトリーを用いて実行した。ＣＣＲ４トランスフェクトＤＴ４０−細胞へのビチオン化抗体の結合を、非ビチオン化抗ＣＣＲ４抗体の異なる濃度の存在下で誘発した。ＣＣＲ４+ＤＴ４０細胞を培養フラスコから採取し、ＰＢＳで２回洗浄し、０．２％ＢＳＡおよび０．０９％ＮａＮ3を有するＰＢＳ中に再懸濁し、最終的に、Ｖ字型９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中に、１ウェル当たり１×１０5細胞にアリコートした。細胞を、４００×ｇで５分間遠心分離し、次に、４℃で３〜４時間、一定量のビチオン化ＩｇＧおよび異なる濃度の非ビチオン化抗体でインキュベートした。０．２％ＢＳＡおよび０．０９％ＮａＮ3を有するＰＢＳでの洗浄後、細胞を、４℃で３０分間、２．５μｇ／ｍｌのストレプトアビジン−ＲＰＥ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）で染色した。染色した細胞を洗浄し、０．２％ＢＳＡおよび０．０９％ＮａＮ3を有する２５０μｌのＰＢＳ中に再懸濁し、ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーター（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）上での獲得のために、Ｕ字型９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｓｃｈｉｐｈｏｌ−Ｒｉｊｋ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に移した。図１０Ａ、Ｂ、およびＣに示される結果は、１７Ｇおよび９Ｅ抗体が、同一のエピトープまたは少なくとも重複したエピトープを有することを示す。細胞に結合するＫＭ３０６０ｖａｒ抗体と他の２つの抗体との間の競合は存在せず、これは、１７Ｇおよび９Ｅが、ＫＭ３０６０ｖａｒと同一のエピトープには結合しないことを示す。
【０５０７】
試験抗体が、同一のエピトープまたは重複したエピトープを認識するか否かを評価するために、かつＣＣＲ４に対するそれらの相対的親和性を決定するために、さらなる競合実験を行った。競合相手として標識９Ｅを用いて、抗体９Ｅ１０Ｊ、９Ｅ、およびＫＭ３０６０ｖａｒを試験した。
【０５０８】
ＤＴ４０およびＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞を、実施例２で説明されるように培養した。細胞を、培養フラスコから採取し、ＰＢＳ（４００×ｇ、５分間、４℃）で２回洗浄し、０．２％ＢＳＡおよび０．０９％ＮａＮ３を含有するＰＢＳ中に再懸濁した。１ウェル当たり１×１０５細胞を、Ｖ字型９６ウェルプレート（Ｇｒｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，Ｆｒｉｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中でアリコートした。細胞を、遠心分離し（４００×ｇ、５分間、４℃）、５０μｌのＩｇＧ  ９Ｅ１０ＪまたはＫＭ３０６０ｖａｒ（５μｇ／ｍｌからの希釈系列）中に再懸濁し、競合相手であるビチオン化抗体９Ｅ（０．１または０．５μｇ／ｍＬ）と混合した。細胞を、４５分毎にピペットで混合しながら、４℃で２時間インキュベートした。細胞を、０．２％ＢＳＡおよび０．０９％ＮａＮ３を有する１５０μｌのＰＢＳで３回洗浄し、４℃で４５分間、３μｇ／ｍｌのストレプトアビジンＰＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。細胞を洗浄し、０．２％ＢＳＡおよび０．０９％ＮａＮ３を有する２００μｌのＰＢＳ中に再懸濁し、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたフローサイトメトリーのために、Ｕ字型９６ウェルＣｏｓｔａｒ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｓｃｈｉｐｈｏｌ−Ｒｉｊｉｋ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）プレートに移した。
【０５０９】
図１５に示される結果は、９Ｅおよび９Ｅ１０Ｊの両方ともに、用量依存性様式で、ビチオン化ＩｇＧ  ９Ｅの細胞結合を効果的に阻害したことを示す。対照的に、ＫＭ３０６０ｖａｒをビチオン化９Ｅで滴定した時に、結合シグナルの低下はほとんど観察されず、それゆえに、これらの抗体によって認識されるエピトープは、重複しないことを確認した。
【０５１０】
ＩＣ５０値（ビチオン化ＩｇＧ結合の５０％阻害をもたらす抗体濃度）を決定するために、実験データを、ソフトウェアＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）のモデル「ログ（阻害剤）対応答」を用いて、非線形回帰曲線適合に適合させた。見かけの結合親和性（ＫD）を、先に説明された方法（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ，１９９７ｂ、Ｓｃｈｏｄｉｎ  ＆  Ｋｒａｎｚ，１９９３）から算出された以下の方程式：
ＫD(I)＝ＩＣ50／（１＋［ｂｉｏ−ＩｇＧ(9E)］／ＫD(9E)）
に従って計算し、式中、Ｉは、非標識阻害剤（ＩｇＧ）であり、［ｂｉｏ−ＩｇＧ(9E)］は、ビチオン化ＩｇＧ  ９Ｅの一定濃度であり、ＫD(9E)は、飽和滴定実験（４．９５ｎＭ）から得られた、ＩｇＧ  ９Ｅの結合親和性である。結果は、表１５に示される。
【０５１１】
実施例５：拮抗活性
天然ＣＣＲ４+ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞株におけるリガンド誘導カルシウム流を減少させる９Ｅおよび１７Ｇの能力を評価した。抗体ＫＭ３０６０ｖａｒを、陰性対照として用いた。配列同一性脱フコシル化クローンＫＭ２７６０が、ＣＣＲ４シグナル伝達を阻害していないことが報告された。通常の条件下で培養したＣＣＲＦ−ＣＥＭ標的細胞を、遠心分離で沈降させ、ＲＰＭＩ−１６４０培養培地中に２回再懸濁した。１ｍＬの２．５×１０6細胞を、フルオ−４−ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、およびプロベネシドと混合し、それぞれ、１μＭ、０．０２％、および１ｍＭの最終濃度にした。細胞を、垂直回転ホイール（７ｒｐｍ）上で、３７℃で３０分間インキュベートした。その後の全てのステップを、１ｍＭプロベネシドの存在下で行った。細胞を、１０％ＦＣＳを有するＲＰＭＩ−１６４０中で２回、１回はアッセイ緩衝液（１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、０．８ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２５ｍＭヘペス、２２ｍＭグルコース）中で洗浄し、次に再懸濁して、１．２ｘ１０6細胞／ｍｌの最終密度にした。等容積の細胞、抗体およびリガンド（ＭＤＣまたはＴＡＲＣ）を有するか、あるいは有さないアッセイ緩衝液を混合した。第１の２つの成分（細胞および抗体）を、リガンドの添加前に、１５分間予インキュベートした。ＩｇＧ、ＴＡＲＣ、およびＭＤＣの最終濃度は、それぞれ、１０μｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、および２．５ｎｇ／ｍＬであった。試料を、５１５〜５４５ｎｍの帯域通過フィルタを用いて、即座にＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で分析した。
【０５１２】
図１１に示される結果は、９Ｅおよび１７Ｇの両方ともに、ＴＡＲＣおよびＭＤＣの阻害剤として作用することを明らかに示す。１０μｇ／ｍＬの濃度で９Ｅ、１７Ｇ、およびＫＭ３０６０ｖａｒ  ＩｇＧと予インキュベートした細胞は、ＴＡＲＣ単独へのシグナルを１００％と仮定して、３％、−１％、および１０４％のＴＡＲＣ刺激に対するシグナル応答を示した（図１１Ａ）。したがって、９Ｅ、１７Ｇ、およびＫＭ３０６０ｖａｒ  ＩｇＧと予インキュベートした細胞は、それぞれ、ＩｇＧの不在下で、ＭＤＣへのシグナルの６４％、４２％、および９２％のＭＤＣ刺激に対するシグナル応答を示した（図１１Ｂ）。ＴＡＲＣまたはＭＤＣリガンドの代わりに、９Ｅまたは１７Ｇ  ＩｇＧのいずれかを細胞に添加した時、シグナルは検出されなかった（データ示されず）。９Ｅまたは１７Ｇ  ＩｇＧも、ＣＸＣＲ４特異的ＳＤＦ−１リガンドの任意の阻害を示さなかった（データ示されず）。
【０５１３】
フルオ４−ＡＭを有する細胞のインキュベーションを、ホイールを回転させることなく３７℃で４０分間行ったことを除いて同様の条件下で、ヒトＩｇＧ１型式の抗体９Ｅ１０Ｊを用いた実験も行った。抗体ＫＭ３０６０ｖａｒを陰性対照として含み、抗体９Ｅも含まれた（両方ともに同じくヒトＩｇＧ１型式）。図１６に示される結果は、９Ｅおよび９Ｅ１０Ｊ抗体の両方によるＴＡＲＣ誘導シグナル伝達の用量依存性阻害を示す。
【０５１４】
Ｃａ++流阻害の詳細分析を、９Ｅ１０Ｊにおける広範囲のＩｇＧ濃度を用いて実行した（図１７）。ＩＣ50（ｎｇ／ｍＬ）値を、実施例４で説明されるように計算した。完全なシグナル阻害は、４３．３ｐＭの計算されたＩＣ50値で、１００〜３００ｎｇ／ｍＬ（０．７〜２．０ｎＭ）の濃度で到達された（表１６）。
【０５１５】
実施例６：抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）
９Ｅおよび１７ＧのＡＤＣＣを誘導する能力を、天然ＣＣＲ４+ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞株上で評価した。通常の条件下で培養したＣＣＲＦ−ＣＥＭ標的細胞を、遠心分離で沈降させ、ＲＰＭＩ−１６４０培養培地中に再懸濁した。このステップを１回繰り返した。１ｍＬの２．５×１０6細胞を、カルセイン−ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と混合して、１０μＭの最終濃度にし、次に、垂直回転ホイール（７ｒｐｍ）上で、３７℃で３０分間インキュベートした。細胞を、１０％ＦＣＳを有するＲＰＭＩ−１６４０中で３回洗浄し、細胞密度を、３×１０5／ｍＬに調整した。別に、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、従来の手順に従って調製し（Ｆｉｃｏｌｌ？Ｈｙｐａｑｕｅ勾配遠心分離によって濃縮し）、１０％ＦＣＳを有するＲＰＭＩ−１６４０中で洗浄し、１ミリリットル当たり６×１０6で再懸濁した。５０μｌの各々の標的およびエフェクター細胞を、９６？ウェルマイクロタイタープレート中の同一のウェルに添加し、２０：１の標的細胞（Ｅ：Ｔ）に対するエフェクターの比率を得た。抗体（全てＩｇＧ型式）を、２０μｌの容積中の同一のウェルに添加し、４通りの試料の各々の濃度で、１０〜１０，０００ｎｇ／ｍＬの範囲の最終濃度を得た。次に、マイクロタイタープレートを、３７℃で４時間インキュベートし、３時間４５分後に、２０μｌの０．９％トリトンＸ１００をウェルのいくつかに添加し、標的細胞の完全溶解を達成した。次に、各々の試料の１００μｌの上清を、ブラックマイクロタイタープレートに移し、蛍光（励起：４８８ｎｍ、発光：５１８ｎｍ）を、ＴＥＣＡＮ  Ｍ２００プレートリーダー内で分析した。抗体を有さない試料中の蛍光強度を、全ての他の試料の強度から差し引いた。抗体を有する試料中の溶解の割合を、トリトンＸ１００での処理後、１００％の細胞溶解を有する試料の蛍光強度に基づいて推定した。用量応答曲線を、ソフトウェアＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、非線形回帰分析および３パラメータ適合モデルによって算出した。
【０５１６】
図１２Ａおよび１２Ｂに示される結果は、９Ｅおよび１７Ｇの両方ともに、それぞれ、６１９ｎｇ／ｍＬおよび４６ｎｇ／ｍＬのＥＣ50値、ならびに５５％および２２％の最大死滅率を有するヒトＰＢＭＣの存在下で、ＡＤＣＣを誘導することができたことを明らかに示す。
【０５１７】
回転ホイールを使用しなかったことを除いて、上で説明された条件に類似した条件下で、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞のＡＤＣＣを誘導する抗体９Ｅ１０Ｊの能力も試験し、抗体９Ｅおよび抗体ＫＭ３０６０ｖａｒと比較した。図１８および表１７に示される結果は、９Ｅおよび９Ｅ１０ＪがＡＤＣＣを誘導することができ、かつ９Ｅ１０ＪによるＡＤＣＣ誘導は、ＫＭ３０６０ｖａｒによるＡＤＣＣ誘導よりも優れていることを示す。
【０５１８】
実施例７−抗ｃＭｙｃハイブリッド／ヒトＩｇＧ１抗体の調製
抗ｃＭｙｃハイブリッド／ヒトＩｇＧ１抗体：９Ｅ１０重鎖（ＡＪ０００４８８）および軽鎖９Ｅ１０軽鎖（ＡＪ０００４８９）可変ＤＮＡ配列を、ＧｅｎｅＡｒｔから取り寄せ、バイブリッドヒトＩｇＧ１／カッパタンパク質に変換した。Ｎｏｒｄｅｒｈａｕｇ  ｅｔ  ａｌ，ＪＩＭ２０４：７７−８７の方法に従って、ｓｃＦｖテンプレート上の特定のプライマーとのＰＣＲによる可変ＶＨおよびＶＬ領域をクローン化し、それぞれ、重鎖および軽鎖ベクターを消化し、その中に連結した。ＨＥＫ２９３／Ｔ細胞を、過渡的にトランスフェクトし、５〜６日後、ＩｇＧを、タンパク質Ａを介して精製し、その後、サイズ排除し、単量体ＩｇＧ画分を単離した。
【０５１９】
実施例８−種交差反応性
抗体９Ｅおよび９Ｅ１０Ｊを、ヒト以外の種由来のＣＣＲ４と交差反応するそれらの能力に関して試験した。
【０５２０】
Ｈｅｋ２９３Ｔ／１７を、１０％ＦＢＳ（ＰＡＡから、ｃａｔ番号Ａ１５−２５２）および１×ペニシリン／ストレプトマイシン（ＰＡＡから、ｃａｔ番号Ｐ１１−０１０）を有するＤＭＥＭ（ＰＡＡから、ｃａｔ番号Ｅ１５−８１０）中で培養した。それらを週に２〜３回分割した。Ｈｅｋ２９３Ｔ／１７を、４８時間３２０００細胞／ｃｍ２に、週末にわたって２７０００細胞／ｃｍ２に播種した。
【０５２１】
過渡トランスフェクションにおいて、Ｈｅｋ２９３Ｔ／１７細胞を、Ｔ７５（ＮＵＮＣ）フラスコ中に、２×１０６細胞として播種した。播種してから４８時間後、細胞を、Ｆｕｇｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ）でトランスフェクトした。Ｔ７５当たり４０μｌのＦｕｇｅｎｅおよび１６μｇのＤＮＡを使用する。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を、アッセイのために使用した。
【０５２２】
ＨＥＫ−２９３Ｔ／１７細胞を、トランスフェクション試薬としてＦｕｇｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、ヒトＣＣＲ４をコードするｐｃＤＮＡ３．１プラスミド、またはマウス（遺伝子バンクＣＡＡ６２３７２）もしくはサル（アカゲザル）ＣＣＲ４（ＰｕｂＭｅｄアクセス番号ＸＰ＿００１０９８８０７）のいずれかをコードするｐＬＮＯプラスミド（Ｎｏｒｄｅｒｈａｕｇ  ｅｔ  ａｌ，１９９７）のいずれかで過渡的にトランスフェクトした。非トランスフェクト（ＣＣＲ４陰性）細胞は、陰性対照の役割をした。細胞を、上述の通常の条件下で、さらに４８時間培養した。細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、室温で３分間、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＰＡＡ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｉｎｚ，Ａｕｓｔｒｉａ）とインキュベートしながら、培養フラスコから剥離した。次に、細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し（４００×ｇ、５分間、４℃）、０．２％ＢＳＡおよび０．０９％ＮａＮ3を含有するＰＢＳ中に再懸濁した。１ウェル当たり１×１０5細胞を、Ｖ字型９６ウェルプレート（Ｇｒｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，Ｆｒｉｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中にアリコートした。細胞を、遠心分離し（４００×ｇ、５分間、４℃）、０．２％ＢＳＡおよび０．０９％ＮａＮ３を含有するＰＢＳ中の５０μｌの１０μｇ／ｍＬ９Ｅまたは９Ｅ１０Ｊに再懸濁した。細胞を、４℃で６０分間さらにインキュベートした。次に、試料を、遠心分離で２回洗浄し、１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。最終的に、細胞ペレットを、３μｇ／ｍＬの抗ヒトＩｇＧ−ＰＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を有する５０μｌ中に再懸濁し、４℃で４５分間インキュベートした。試料を上述のように２回洗浄し、２５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、その後、ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）上でのフローサイトメトリーのために、Ｕ字型９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｓｃｈｉｐｈｏｌ−Ｒｉｊｋ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に移した。
【０５２３】
９Ｅおよび９Ｅ１０Ｊの両方ともに、ヒトおよびサルＣＣＲ４に強く結合し、マウスＣＣＲ４への結合は、検出されなかった。
【０５２４】
実施例９−リガンド結合の阻害
抗体９Ｅおよび９Ｅ１０Ｊを、競合実験において、ビチオン化リガンドを用いて、ＣＣＲ４＋細胞へのＭＤＣおよびＴＡＲＣの結合を阻害するそれらの能力において試験した。実験は、ＣＣＲ４へのリガンドの親和性と比較した、ＣＣＲ４への抗体の親和性の指標をもたらすように設計される。
【０５２５】
競合結合アッセイを、ＤＴ−４０−ＣＣＲ４＋およびＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞上で、ビチオン化ＭＤＣまたはビチオン化ＴＡＲＣを用いて実行した。ＤＴ４０およびＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞を、実施例２で説明されるように培養した。ＴＡＲＣおよびＭＤＣを、標準の手順を用いてビチオン化した。ビオチン化過程は、いくつかの損失を引き起こすため、本明細書に列挙されるビチオン化ＭＤＣおよびＴＡＲＣの濃度は、概算である。
【０５２６】
細胞を、培養フラスコから採取し、ＰＢＳで２回洗浄し（４００×ｇ、５分間、４℃）、０．２％ＢＳＡおよび０．０９％ＮａＮ３を含有するＰＢＳ中に再懸濁した。１ウェル当たり１×１０５細胞を、Ｖ字型９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，Ｆｒｉｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中にアリコートした。細胞を、遠心分離し（４００×ｇ、５分間、４℃）、５０μｌのＩｇＧ、一定濃度のビチオン化リガンド（１０もしくは２０ｎＭ、図２４に対する説明文を参照のこと）と混合した一本鎖または非標識リガンド（１００／５００／２６，４μｇ／ｍＬで開始した１：１０希釈系列）中に再懸濁した。細胞を、４℃で２時間インキュベートし、４５分間毎にピペットで混合した。細胞を、０．２％ＢＳＡおよび０．０９％ＮａＮ３を有する１５０μｌのＰＢＳで３回洗浄し、４℃で４５分間、３μｇ／ｍｌのストレプトアビジンＰＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。細胞を洗浄し、０．２％ＢＳＡおよび０．０９％ＮａＮ３を有する２００μｌのＰＢＳ中に再懸濁し、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたフローサイトメトリーのために、Ｕ字型９６ウェルＣｏｓｔａｒ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｓｃｈｉｐｈｏｌ−Ｒｉｊｉｋ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）プレートに移した。ＩＣ５０値（シグナルの５０％減少をもたらす阻害剤濃度）を決定するために、実験データを、ソフトウェアＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）のモデル「ログ（阻害剤）対応答」を用いて、非線形回帰曲線適合に適合させた。見かけの結合親和性（ＫＤ）を、先に説明された方法（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ，１９９７ｂ、Ｓｃｈｏｄｉｎ  ＆  Ｋｒａｎｚ，１９９３）から算出された以下の方程式：
ＫＤ（Ｉ）＝ＩＣ５０／（１＋［ｂｉｏ−ＭＤＣ］／ＫＤ（ＭＤＣ））
に従って計算し、式中、Ｉは、非標識阻害剤（抗体またはリガンド）であり、［ｂｉｏ−ＭＤＣ］は、一定濃度のビチオン化ＭＤＣであり、ＫＤ（ＭＤＣ）は、ＭＤＣの結合親和性、０．１８ｎＭである（Ｉｍａｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９８）。
【０５２７】
図２４および表２０に示される競合結合実験の結果は、高親和性リガンドＭＤＣのＣＣＲ４結合を、用量依存性様式で、ＩｇＧ  ９Ｅ１０Ｊによって阻害することができることを示す。ＣＣＲ４トランスフェクトＤＴ−４０細胞は、それらの表面上で１５倍少ないＣＣＲ４受容体を有するＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞よりもはるかに高い密度のＣＣＲ４を発現する。
【０５２８】
非標識ＭＤＣは、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞へのビチオン化ＭＤＣの結合を完全に阻害することができた一方で、抗体９Ｅ１０Ｊは、完全に阻害できなかったことに留意すべきである（図２４）。この観察は、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞上でのＭＤＣの別の受容体への起こり得る結合を示す。ほぼ確実に、これは、高親和性でＭＤＣに結合することができる非定型スカベンジャー（デコイ）ＧＰＣＲ受容体Ｄ６である（Ｇｒａｈａｍ，２００９、Ｌｏｃａｔｉ  ｅｔ  ａｌ，２００５）。これは、より高い見かけのＩＣ５０をも釈明する。
【０５２９】
同様の結合阻害実験を、ビチオン化ＴＡＲＣを用いて実行した。予測された通り、ＴＡＲＣ、抗体９Ｅ１０Ｊ、およびＭＤＣ全てが、標識ＴＡＲＣと効果的に競合した（図２５）。標識リガンドの非特異的細胞結合を避けるために、実験の半分を、遮断薬としての１％ＢＳＡの存在下で実行した。ＢＳＡの存在または不在は、任意の著しい効果を有するようには見受けられなかった（図２５ｂおよびｄではＢＳＡ存在、図２５ａおよびｃではＢＳＡ不在）。
【０５３０】
実施例１０−脱フコシル化９Ｅ１０Ｊの生成
ヒトＩｇＧ１サブクラス上でオリゴ糖の状態を操作することによって、ＡＤＣＣ強化を達成することができることが報告された（Ｎｉｗａ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ，ＣａｎＲｅｓ，Ｖｏｌ．６４，２００４）。フコースの量を修正することは、ＡＤＣＣの強化への有益な効果を有することを示した。したがって、抗体９Ｅ１０Ｊは、クラスＩα−マンノシダーゼの選択的阻害剤であるキフネンシンの存在下で産生され、細胞培養での産生中に、ＩｇＧのフコシル化の停止を引き起こす。良質の対照に対して、脱フコシル化９Ｅ１０Ｊ  ＩｇＧを、最初に、ＤＴ４０細胞上で結合特異性に関して試験し、ＣＣＲ４で安定的にトランスフェクトし、未修飾９Ｅ１０ＪおよびＫＭ３０６０ｖａｒと比較した。
【０５３１】
ＩｇＧを、キフネンシン（１００ｎｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）の存在下で産生した。細胞培地を採取した後、ＩｇＧを、タンパク質Ａカラム（ＨｉＴｒａｐ、５ｍｌ、ＰｒｏｔｅｉｎＡ、ＧＥ）を用いて、親和性精製時に最初に単離した。ＩｇＧを、クエン酸塩緩衝液（ｐＨ３）を用いて溶出し、１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ９）中に移した。第２の精製の前に、ＩｇＧ試料を、濃縮完了させ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＨｉＬｏａｄ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ２００、ＧＥ、走行緩衝液ＰＢＳ、ｐＨ７．４）上に装填した。単量体画分を収集し、ＩｇＧを２回目の濃縮を完了させた。結合実験において、ＩｇＧを、２０μｇ／ｍＬから始めて、０．１５６２５μｇ／ｍＬまで下げた濃度で、２倍に連続希釈した。ＩｇＧを、ＤＴ４０細胞（１．５×１０６／ｍＬ）上でインキュベートし、ヒトＣＣＲ４で安定的にトランスフェクトした。非トランスフェクトＤＴ−４０細胞を、陰性対照として使用した。結合したＩｇＧを、抗ヒトＦＩＴＣ（ヤギ）抱合抗体を介して検出した。
【０５３２】
図１９に示される結果は、フコシル化パターンの修飾は、９Ｅ１０ＪのＣＣＲ４結合能力に影響を及ぼさないことを示す。
【０５３３】
実施例１１−脱フコシル化ＩｇＧ１変種の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の誘導
実施例１０に説明されるように調製した脱フコシル化９Ｅ１０Ｊを、未修飾９Ｅ１０Ｊおよび未修飾ＫＭ３０６０ｖａｒと比較した。構成的にＣＣＲ４を発現するＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞を用いて、ＩｇＧを試験した。ＡＤＣＣ誘導を、実施例６に説明されるようにアッセイした。
【０５３４】
図２０および表１８に示される結果は、候補９Ｅ１０Ｊの脱フコシル化変種が、ヒトＰＢＭＣによるＣＣＲ４陽性ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞の死滅特性を増加させ、９Ｅ１０Ｊの未修飾バージョン（４〜５倍低いＥＣ５０）と比較して、はるかに高い細胞溶解活性を有することを示す。
【０５３５】
実施例１２−アポトーシスの成長および誘導の阻害
Ｒａｍｏｓ細胞（バーキットリンパ腫に由来するＢリンパ芽球様細胞株）中でアポトーシスを誘導する抗体９Ｅの能力を、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ染色およびＦＡＣＳ分析を用いてアッセイした。アポトーシスの著しい誘導は、観察されなかった。
【０５３６】
成長阻害試験を、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞およびＲａｍｏｓ細胞（バーキットリンパ腫に由来するＢリンパ芽球様細胞株）上の９Ｅ、９Ｅ１０Ｊ、およびＫＭ３０６０ｖａｒ（全てＩｇＧ型式）を用いて行った。成長阻害は観察されなかった。
【０５３７】
実施例１３−走化性の阻害
ｉ）抗体９Ｅおよび９Ｅ１０Ｊによる走化性の阻害を、１つのチャンバ内で、走化性を有するＣＣＲ４＋細胞を、抗体９Ｅまたは９Ｅ１０Ｊと接触させることによってアッセイし、ＣＣＲ４のリガンド（ＭＤＣまたはＴＡＲＣ）を、好適な細孔の大きさを有する膜またはフィルタで第１のチャンバから分離された別のチャンバ内に設置した。リガンドに向かう細胞移動への抗体の効果（走化性）を、抗体の存在下での走化性と抗体の不在下での走化性を比較することによって決定した。９Ｅおよび９Ｅ１０Ｊの両方ともに、ＭＤＣおよびＴＡＲＣに向かうＣＣＲ４陽性細胞の走化性を阻害することが見出された。
【０５３８】
ｉｉ）天然ＣＣＲ４＋ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞のリガンド誘導移動を減少させる９Ｅ１０Ｊの能力を評価し、９Ｅ、ＫＭ３０６０ｖａｒ、および１Ｇ１抗体と比較した。全ての抗体を、ＩｇＧ１型式で試験した。
【０５３９】
実施例２に説明されるように培養されたＣＣＲＦ−ＣＥＭ標的細胞を、遠心分離で沈降させ、ＦＣＳを有さないＲＰＭＩ−１６４０培養培地中に２回再懸濁した。第３の遠心分離ステップにおいて、細胞を、１％ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０培養培地中に再懸濁し、１．６×１０７細胞／ｍＬの最終密度に調整した。並行して、３．５ｎＭのＴＡＲＣを含有する１％ＦＣＳを補充した１５０μｌのＲＰＭＩを、Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ−ＭＩＣプレート９６ウェル（８μｍ細孔、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ、ＭＡＭＩＣ５Ｓ１０）の下方のチャンバの各々に添加した。（１６７ｎＭから０．３ｎＭに連続希釈した）ＩｇＧを有する５０μｌの細胞を、Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ−ＭＩＣ９６チャンバプレートの上方の区画に添加し、３７℃で３時間インキュベートした。フィルタを除去し、（下方のチャンバからの）１００μｌの細胞を、再懸濁後、９６−ウェルＣＯＡＳＴＡＲプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，Ｆｒｉｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中に移し、（０．２％ＢＳＡおよび０．０９％ＮａＮ３を補充した）１００μｌのＰＢＳの追加用量を、試料に添加した。移動を、ゲーティングされた細胞を数えることによって評価した。
【０５４０】
図２９に示されるデータは、９Ｅおよび９Ｅ１０ＪによるＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞のＴＡＲＣ誘導走化性の阻害を示す。抗体ＫＭ３０６０ｖａｒおよび１Ｇ１、または対照ＩｇＧ（抗ＧＦＰ）への走化性の著しい阻害は観察されなかった。
【０５４１】
実施例１４−ＣＣＲ４への結合特異性および親和性
ＤＴ４０＋細胞への特異結合の質を、滴定実験で、ｓｃＦｖまたはＩｇＧ型式の９Ｅ１Ｄおよび９Ｅ１０Ｊにおいて試験した。
【０５４２】
ＤＴ４０およびＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞を、実施例２に説明されるように培養した。ＤＴ４０ＣＣＲ４＋およびＤＴ４０（ＣＣＲ４−）細胞を、培養フラスコから採取し、ＰＢＳで２回洗浄し（４００×ｇ、５分間、４℃）、０．２％ＢＳＡおよび０．０９％ＮａＮ3を含有するＰＢＳ中に再懸濁した。１ウェル当たり１×１０5細胞を、Ｖ字型９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，Ｆｒｉｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中にアリコートした。細胞を、遠心分離し（４００×ｇ、５分間、４℃）、０．２％ＢＳＡおよび０．０９％ＮａＮ3を含有するＰＢＳ中の５０μｌのＳｃＦｖｓ（５μｇ／ｍＬ）ならびにヒトＦｃを有する組織内産生抗ｃＭｙｃ抗体（２５μｇ／ｍＬ）中に再懸濁した。１時間のインキュベーション（４℃）後、細胞を、０．２％ＢＳＡおよび０．０９％ＮａＮ3を有する１５０μｌのＰＢＳで３回洗浄し、４℃で４５分間、２．５μｇ／ｍＬのＲＰＥ抱合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＡｂＤＳｅｒｏｔｅｃ，Ｄuｓｓｅｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で染色した。細胞を洗浄し、０．２％ＢＳＡおよび０．０９％ＮａＮ3を有する２００μｌのＰＢＳ中に再懸濁し、Ｅａｓｙ  Ｃｙｔｅデバイス（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いたフローサイトメトリーのために、Ｕ字型９６ウェルＣｏｓｔａｒ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｓｃｈｉｐｈｏｌ−Ｒｉｊｉｋ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）プレートに移した。
【０５４３】
あるいは、９Ｅ１Ｄおよび９Ｅ１０Ｊを、全長ヒトＩｇＧ１に変換し、細胞結合に関して試験した。ＤＴ４０＋ＣＣＲ４およびＤＴ４０細胞を、培養フラスコから採取し、ＰＢＳで２回洗浄し（４００×ｇ、５分間、４℃）、０．２％ＢＳＡおよび０．０９％ＮａＮ3を含有するＰＢＳ中に再懸濁した。１ウェル当たり１×１０5細胞を、Ｖ字型９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，Ｆｒｉｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中にアリコートした。細胞を、遠心分離し（４００×ｇ、５分間、４℃）、１０μｇ／ｍＬ（５０μｌ／ウェル）で開始したＩｇＧの１：５希釈系列中に再懸濁した。４℃で１時間のインキュベーション後、細胞を、０．２％ＢＳＡおよび０．０９％ＮａＮ3を有する１５０μｌのＰＢＳで３回洗浄し、４℃で４５分間、２．５μｇ／ｍＬのＲＰＥ抱合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＡｂＤＳｅｒｏｔｅｃ，Ｄuｓｓｅｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）または２．５μｇ／ｍＬの抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（ヤギポリクローナルａｆｆ．ｐｕｒ）ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色した。細胞を洗浄し、０．２％ＢＳＡおよび０．０９％ＮａＮ3を有する２００μｌのＰＢＳ中に再懸濁し、Ｅａｓｙ  Ｃｙｔｅデバイス（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）またはＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたフローサイトメトリーのために、Ｕ字型９６ウェルＣｏｓｔａｒ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｓｃｈｉｐｈｏｌ−Ｒｉｊｉｋ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）プレートに移した。
【０５４４】
見かけの親和性値（ＫD）を、ソフトウェアＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の「一部位特異結合」モデルを用いて、実験データ曲線の非線形適合から推測した。ＣＣＲ４に結合することが既知であるため、ＫＭ３０６０ｖａｒを陽性対照として含んだ。結果は、図２１、２２、および２３、ならびに表１９に示される。
【０５４５】
実施例１５−血小板の凝集測定
ＣＣＲ４は、血小板上で発現されることで知られており、そのリガンドＭＤＣおよびＴＡＲＣは、血小板凝集を誘導することで知られている。ＩｇＧ分子が２つのリガンド結合部位を有しているため、このことが問題になる可能性を秘めており、両方のアームが、異なる血小板上でＣＣＲ４に結合することができる場合、ＣＣＲ４を認識することができるＩｇＧが、血小板に交差結合することができ得る可能性が存在する。これは、インビボでブロット凝固をもたらし得る。したがって、血小板凝集への９Ｅ１０Ｊ−ＩｇＧの効果を試験した。９Ｅ１０Ｊ−ＩｇＧを、単独で、またはリガンドＭＤＣもしくはＴＡＲＣとの組み合わせで、単離血小板とインキュベートした。十分に説明された凝集誘導因子であるＡＤＰ（Ｖａｒｏｎ  ａｎｄ  Ｓｐｅｃｔｒｅ“Ａｎｔｉｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｇｅｎｔｓ”Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｅｄｕｃ  Ｐｒｏｇｒａｍ．２６７−７２，２００９）を、各々の測定の間、陽性対照として含んだ。
【０５４６】
合計３０ｍｌの新鮮なドナー血液を、クエン酸ナトリウムを含有する管中に収集した。血小板が豊富な血漿を、室温（ＲＴ）にて１５分間、１８５ｇで遠心分離して得た。血小板を含有する血漿を、新鮮な管中に移した。ベースラインを定義するために、血小板枯渇血漿を、血小板が豊富な１ｍｌの血漿を、室温にて５分間、１２００ｇで遠心分離することによって調製し、上清を新しい管中に移し、血小板が豊富な試料として、以下の同一の方法で処理した。凝集測定を、Ｐａｃｋｓ−４血小板凝集計（Ｈｅｌｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ）を用いて、撹拌しながら３７℃で実行する。ＩｇＧ（陰性対照として、９Ｅ１０Ｊおよび抗ＧＦＰ）を、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．２％ＢＳＡ、０．０９％ＮａＮ3）中に、１０μｇ／ｍＬの濃度の血小板とインキュベートした。凝集において陽性対照の役割をするＡＤＰを、３μＭ．の最終濃度で用いた。０．２５μｇ／ｍＬのリガンド（ＭＤＣおよびＴＡＲＣ）を試験した。
【０５４７】
ＡＤＰとともに得られたシグナルを、１００％として設定し、ベースライン０を、全ての実験設定において並行して測定した血小板枯渇血清で定義した。
【０５４８】
試験したＩｇＧが、単離血小板に結合することを確認するために、血小板のＦＡＣＳ染色を並行して実行した。血小板を、Ｖ字型９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，Ｆｒｉｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中に移し、１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．０２％ＢＳＡおよび０．０９％ＮａＮ3で補充）を添加することによって１回洗浄した。次に、血小板を、４℃で１時間、９Ｅ１０Ｊ−ＩｇＧ（ａｔ  １０μｇ／ｍＬ）の存在下でインキュベートし、その後、１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．０２％ＢＳＡおよび０．０９％ＮａＮ3で補充）の存在下で、２回洗浄した。結合したＩｇＧを、ＩｇＧ染色細胞上での４℃で１時間のインキュベーション後、抗ヒトＰＥ（１：４００希釈）を用いて検出した。染色した血小板を、ＦＡＣＳ測定において分析した。
【０５４９】
血小板への９Ｅ１０Ｊ−ＩｇＧの結合を観察した（データ示されず）。凝集測定の結果は、表２４に集約される。結論として、９Ｅ１０Ｊ−ＩｇＧは、血小板に結合するが、血小板凝集への効果がなく、独力で凝集を誘導することも、リガンド誘導血小板凝集を阻害することもない。
【０５５０】
実施例１６−末梢血リンパ球（ＰＢＬ）へのＩｇＧ  ９Ｅ１０Ｊの結合
ＣＣＲ４は、リンパ球（例えば、Ｔｈ２細胞およびＴｒｅｇ細胞）上で発現されることが知られているように、バフィーコートから単離したＰＢＬ上の９Ｅ１０ＪおよびＫＭ３０６０ｖａｒの滴定曲線を実行した。
【０５５１】
抗体９Ｅ１０ＪおよびＫＭ３０６０ｖａｒを、ＥＺ−ｌｉｎｋ  Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ＰＥＯ固相ビオチン化キット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１１７  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．６１１０５Ｕ．Ｓ．Ａ）の手引きに従ってビチオン化した。実施例２に示されるプロトコルに従って、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞へのビチオン化および非ビチオン化抗体の結合を評価することで判断される通り、ビオチン化は、抗体の標的を認識するそれらの能力に著しく影響を及ぼさなかった（データ示されず）。
【０５５２】
ヒトＰＢＬを、Ｆｉｃｏｌｌ（Ｈｙｐａｑｕｅ）勾配遠心分離によって新鮮なドナー血液から調製し、ＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＣＳ中で洗浄した。Ｌｅｕｃｏｓｅｐ管（５０ｍＬ、Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，Ｆｒｉｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、１５ｍｌのリンパ調製液（ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｋａｂｉ  Ｎｏｒｇｅ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）で充填し、室温にて３０秒間、１０００ｇで遠心分離した。
【０５５３】
バフィーコートを、２８０ｍｌの１×ダルベッコＰＢＳ（ｐＨ７．４）および３５ｍｌの希釈血液で希釈し、各Ｌｅｕｃｏｓｅｐ管（５０ｍＬ、Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，Ｆｒｉｋｅｎｈａｕｓｅｎ）内に移した。室温にて１０分間、１０００ｇでの遠心分離（中断なし、加速なし）時に、標的細胞を、全容量５０ｍｌのＲＰＭＩ培地中の５０ｍＬの管（５０ｍＬのファルコン管、Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，Ｆｒｉｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）内に移した。ＰＢＬを、室温にて１５分間、２００ｇでペレット化し、５０ｍｌのＲＰＭＩ培地中に再懸濁し、細胞数を数える前に、７０μＭの細胞濾過器を通して濾過した。ＰＢＬを、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で１．５×１０６細胞／ｍＬの最終細胞数に希釈し、０．２％ＢＳＡおよび０．０９％ＮａＮ３で補充した。
【０５５４】
ビチオン化ＩｇＧ  ９Ｅ１０ＪおよびＫＭ３０６０ｖａｒを、１×ＰＢＳダルベッコ（ｐＨ７．４）中で２０μｇ／ｍＬから０．３ｎｇ／ｍＬに希釈し、０．２％ＢＳＡおよび０．０９％ＮａＮ３で補充し、合計１．５×１０５個のＰＢＬ上で２時間インキュベートした。細胞を１５０μｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄した後、結合していないＩｇＧを除去し、０．２％ＢＳＡおよび０．０９％ＮａＮ３で補充した。ＰＥ標識ストレプトアビジン（ＢＤ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｎｏｒｇｅ、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中１：１００の希釈度、０．２％ＢＳＡおよび０．０９％ＮａＮ３で補充）とのインキュベーション後に、結合したＩｇＧを検出した。
【０５５５】
細胞を、抗ＣＤ３−ＡＰＣ−抱合抗体および抗ＣＤ８−ＰＥ−Ｃｙ５−抱合抗体（ＢＤ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｎｏｒｇｅ、両方ともにＰＢＳ（ｐＨ７．４）中１：１０の希釈度、０．２％ＢＳＡおよび０．０９％ＮａＮ３で補充）で二重染色した。
【０５５６】
蛍光色素のシグナル重複を補正するために、抗ＣＤ４−ＰＥ抱合ＩｇＧ（ＢＤ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｎｏｒｇｅ）を、別個のウェルに添加した。試料を、ＦＡＣＳ−ｃａｎｔｏＩＩ（ＢＤ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｎｏｒｇｅ）上で分析した。
【０５５７】
９Ｅ１０ＪおよびＫＭ３０６０ｖａｒ  ＩｇＧのＰＢＬへの結合を評価するために、最初に、リンパ球を、全事象からゲーティングした。次に、ＣＤ３陽性細胞をゲーティングして、リンパ球集団を形成した。次に、ＣＤ３陽性集団を、Ｔｒｅｇ画分を含むＣＤ８陽性（＝ＣＤ４陰性）およびＣＤ８陰性（＝ＣＤ４陽性）細胞に分割した。ＰＥチャネルにおけるシグナル強度は、ＣＤ８陰性（＝ＣＤ４陽性）細胞への９Ｅ１０ＪおよびＫＭ３０６０ｖａｒ  ＩｇＧの結合を示す。陰性対照（＝ＰＥ抱合ストレプトアビジン）との比較後に、結合を、％（陽性事象）で表した。
【０５５８】
図３０に示されるように、９Ｅ１０Ｊは、ゲーティングされたＣＤ４陽性細胞（ＣＤ８陰性染色によって決定される）に結合する。結合は、３２ｎｇ／ｍＬ（ＩｇＧの約２１０ｐＭに相当する）程度の低い濃度でも検出可能である。この濃度で、コンパレータＫＭ３０６０ｖａｒへの結合シグナルは、検出不可能であった。この思慮において、９Ｅ１０Ｊは、免疫療法におけるＴｒｅｇ細胞の枯渇に有用であり得る。
【０５５９】
【表１−１】
0006141639.tif 000002
【０５６０】
【表１−２】
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【０５６１】
【表２−１】
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【０５６２】
【表２−２】
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【０５６３】
【表２−３】
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【０５６４】
【表３−１】
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【０５６５】
【表３−２】
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【０５６６】
【表３−３】
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【０５６７】
【表４−１】
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【０５６８】
【表４−２】
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【０５６９】
【表４−３】
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【０５７０】
【表５−１】
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【０５７１】
【表５−２】
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【０５７２】
【表６−１】
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【０５７３】
【表６−２】
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【０５７４】
【表７−１】
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【０５７５】
【表７−２】
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【０５７６】
【表８−１】
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【０５７７】
【表８−２】
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【０５７８】
【表９】
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【０５７９】
【表１０】
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【０５８０】
【表１１−１】
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【０５８１】
【表１１−２】
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【０５８２】
【表１２−１】
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【０５８３】
【表１２−２】
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【０５８４】
【表１３−１】
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【０５８５】
【表１３−２】
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【０５８６】
【表１４−１】
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【０５８７】
【表１４−２】
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【０５８８】
【表１５】
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【０５８９】
【表１６】
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【０５９０】
【表１７】
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【０５９１】
【表１８】
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【０５９２】
【表１９】
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【０５９３】
【表２０】
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【０５９４】
【表２１】
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【０５９５】
【表２２】
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【０５９６】
【表２３】
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【０５９７】
【表２４】
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【０５９８】
参考文献
以下の参考文献は、それらが本明細書で説明されるものに対して補充的な例示的手順または他の詳細を提供する範囲内で、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
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【配列表フリーテキスト】
【０５９９】
配列番号１２５：コンセンサス配列
配列番号１２５：Ｘは、いずれかのアミノ酸
配列番号１２６：
コンセンサス配列
Ｘは、ＳまたはＮ
Ｘは、ＩまたはＭ
配列番号１２７：
コンセンサス配列
Ｘは、いずれかのアミノ酸
配列番号１２８：
コンセンサス配列
Ｘは、ＧまたはＡ
Ｘは、ＩまたはＳ
Ｘは、ＦまたはＧ
Ｘは、ＴまたはＳ
Ｘは、ＡまたはＴ
配列番号１２９：
コンセンサス配列
Ｘは、いずれかのアミノ酸
配列番号１３０：
コンセンサス配列
Ｘは、ＳまたはＧ
Ｘは、ＴまたはＧ
Ｘは、ＳまたはＲ
Ｘは、ＨまたはＲ
Ｘは、ＹまたはＦ
配列番号１３１：
コンセンサス配列
Ｘは、いずれかのアミノ酸
配列番号１３２：
コンセンサス配列
Ｘは、ＨまたはＮ
配列番号１３３：
コンセンサス配列
Ｘは、いずれかのアミノ酸
配列番号１３４：
コンセンサス配列
Ｘは、ＡまたはＶ
Ｘは、ＳまたはＴ
配列番号１３５：
コンセンサス配列
Ｘは、いずれかのアミノ酸
配列番号１３６：
コンセンサス配列
Ｘは、ＳまたはＮ
配列番号１３７：
コンセンサス配列
Ｘは、いずれかのアミノ酸
配列番号１３８：
コンセンサス配列
Ｘは、ＡまたはＶ
Ｘは、ＳまたはＴ
配列番号１３９：
Ｘは、いずれかのアミノ酸
配列番号１４０：
コンセンサス配列
Ｘは、いずれかのアミノ酸
配列番号１４１：抗体の配列
配列番号１４２：抗体の配列
配列番号１４３：抗体の配列
配列番号１４４：抗体の配列
配列番号１４５：抗体の配列
配列番号１４６：抗体の配列
配列番号１４７：抗体の配列
配列番号１４８：抗体の配列
配列番号１４９：抗体の配列
配列番号１５０：抗体の配列
配列番号１５１：抗体の配列
配列番号１５２：抗体の配列
配列番号１５３：抗体の配列
配列番号１５４：抗体の配列
配列番号１５５：抗体の配列
配列番号１５６：抗体の配列
配列番号１５７：抗体の配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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