(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のナノ粒子を含んでなる診断剤組成物であって、１以上のナノ粒子が、
ａ）本質的にシリカを含まないコア表面（３０）を有するコア（２０）と
ｂ）コア表面（３０）に結合したシェル（４０）であって、１以上のシラン官能化双性イオン性部分を含むシェル（４０）と
を含んでなるナノ粒子（１０）であって、ナノ粒子が標的化リガンドを含んでおらず、前記シラン官能化双性イオン性部分が前駆体トリアルコキシシランの加水分解生成物を含んでいる、ナノ粒子（１０）である、診断剤組成物。
【請求項２】
前記コア（２０）が遷移金属又は遷移金属化合物を含む、請求項１記載の診断剤組成物。
【請求項３】
前記コア（２０）が酸化タンタルを含む、請求項２記載の診断剤組成物。
【請求項４】
前記コア（２０）が超常磁性材料を含む、請求項１記載の診断剤組成物。
【請求項５】
前記コア（２０）が超常磁性酸化鉄を含む、請求項４記載の診断剤組成物。
【請求項６】
前記シラン官能化双性イオン性部分が、正に帯電した部分、負に帯電した部分、及び正に帯電した部分と負に帯電した部分との間に位置する第１のスペーサー基を含み、任意には前記スペーサー基がアルキル基である、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の診断剤組成物。
【請求項７】
前記正に帯電した部分が第四アルキルアミンを含む、請求項６記載の診断剤組成物。
【請求項８】
前記負に帯電した部分が脱プロトン化カルボン酸又は脱プロトン化スルホン酸を含む、請求項６又は請求項７記載の診断剤組成物。
【請求項９】
前記シラン官能化双性イオン性部分のケイ素原子が、第２のスペーサー基を介して正又は負に帯電した部分に連結されており、任意には前記スペーサー基がアルキル基である、請求項６乃至請求項８のいずれか１項記載の診断剤組成物。
【請求項１０】
複数のナノ粒子を含んでなる診断剤組成物であって、１以上のナノ粒子が、
ａ）本質的にシリカを含まないコア表面（３０）を有するコア（２０）と
ｂ）コア表面（３０）に結合したシェル（４０）であって、１以上のシラン官能化双性イオン性部分を含むシェル（４０）と
を含んでなるナノ粒子（１０）であって、前記シラン官能化双性イオン性部分が、前駆体トリアルコキシシランの加水分解生成物を含んでおり、前駆体トリアルコキシシランが、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−スルホ−Ｎ−（３−（トリメトキシシリル）プロピル）プロパン−１−アミニウム、３−（メチル（３−（トリメトキシシリル）プロピル）アミノ）プロパン−１−スルホン酸、３−（３−（トリメトキシシリル）プロピルアミノ）プロパン−１−スルホン酸、２−（２−（トリメチルシリル）エトキシ（ヒドロキシ）ホスホリルオキシ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルエタンアミニウム、２−（２−（トリメトキシシリル）エチル（ヒドロキシ）ホスホリルオキシ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルエタンアミニウム、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−３−（Ｎ−３−（トリメトキシシリル）プロピオニルスルファモイル）プロパン−１−アミニウム、Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（トリメトキシシリル）プロパン−１−アミニウム、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（トリメトキシシリル）プロパン−１−アミニウム、３−（メチル（３−（トリメトキシシリル）プロピル）アミノ）プロピオン酸、３−（３−（トリメトキシシリル）プロピルアミノ）プロピオン酸、Ｎ−（カルボキシメチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（トリメトキシシリル）プロパン−１−アミニウム、２−（メチル（３−（トリメトキシシリル）プロピル）アミノ）酢酸、２−（３−（トリメトキシシリル）プロピルアミノ）酢酸、２−（４−（３−（トリメトキシシリル）プロピルカルバモイル）ピペラジン−１−イル）酢酸、３−（４−（３−（トリメトキシシリル）プロピルカルバモイル）ピペラジン−１−イル）プロピオン酸、２−（メチル（２−（３−（トリメトキシシリル）プロピルウレイド）エチル）アミノ）酢酸、２−（２−（３−（トリメトキシシリル）プロピルウレイド）エチル）アミノ酢酸又はこれらの組合せからなる、診断剤組成物。
【請求項１１】
前駆体トリアルコキシシランが、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−スルホ−Ｎ−（３−（トリメトキシシリル）プロピル）プロパン−１−アミニウム、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（トリメトキシシリル）プロパン−１−アミニウム、Ｎ−（カルボキシメチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（トリメトキシシリル）プロパン−１−アミニウム又は２−（４−（３−（トリメトキシシリル）プロピルカルバモイル）ピペラジン−１−イル）酢酸からなる、請求項１０記載の診断剤組成物。
【請求項１２】
前記コアが酸化タンタルを含む、請求項１０又は請求項１１記載の診断剤組成物。
【請求項１３】
ナノ粒子（１０）が５０ｎｍ以下の粒度を有する、請求項１乃至請求項１２のいずれか１項記載の診断剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、一般的にはＸ線／コンピューター断層撮影（ＣＴ）又は磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）で使用するもののような診断イメージング用の造影剤に関する。さらに詳しくは、本願はナノ粒子系造影剤並びにかかる薬剤の製造方法及び使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床的に承認されている診断用造影剤は、ほとんどすべてが小分子系のものである。ヨウ素化芳香族化合物は標準的なＸ線又はＣＴ用造影剤として役立ってきた一方、磁気共鳴イメージング用としてはＧｄキレートが使用されている。診断イメージングのために常用されているものの、小分子系造影剤は、血管壁からの漏れに原因する短い血中循環時間、低い感度、高い粘度及び高い重量オスモル濃度のような一定の欠点を有することがある。これらの化合物は、一般に、ある種の患者集団では腎合併症に関係していた。この部類の小分子系薬剤は急速に体外に排出されることが知られている結果、血管系の効果的なイメージングのために使用できる時間が限定されると共に、他の適用例に関してはこれらの薬剤を疾患部位に標的化することが困難になる。したがって、新規な部類の造影剤に対するニーズが存在している。
【０００３】
ナノ粒子は、診断用及び治療用を含め、医学用途で使用するために広く研究されている。磁気共鳴イメージング用途及び薬物送達用途に関して臨床的に承認されているナノ粒子系薬剤はほんの僅かであるが、数百のかかる薬剤がなおも開発中である。現在使用されている小分子系薬剤に比べ、ナノ粒子は診断薬及び治療薬としての効力の点で有利であることを示す実質的な証拠が存在している。しかし、ナノ粒子薬剤のインビボでの生体分布及びクリアランスに対する粒度、構造及び表面特性の効果は十分には理解されていない。ナノ粒子は、その粒度に応じ、小分子に比べて長い時間にわたり体内に留まる傾向がある。造影剤の場合、いかなる器官に対しても短期又は長期毒性を引き起こすことなく、体外への薬剤の最大腎クリアランスを有することが好ましい。
【０００４】
上記の事実に鑑みて、特に腎クリアランス及び毒性効果に関して改善された性質を有するナノ粒子系造影剤又はイメージング剤に対するニーズが存在している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００６／２１６２３９号明細書
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、新規な部類のＸ線、ＣＴ及びＭＲＩ用ナノ粒子系造影剤を提供する。本発明者らは、双性イオン性基（zwitterionic group）で官能化されたナノ粒子が意外にも小分子系造影剤に比べて改善されたイメージング特性を有することを見出した。本発明のナノ粒子は、他のナノ粒子に比べ、体内への粒子の保持を最小にする特性を有している。これらのナノ粒子は、確実な合成、コストの削減、画像コントラストの増強、血中半減期の増大及び毒性の低下の１以上の点で改善された性能及び利益をもたらすことができる。
【０００７】
本発明は、ナノ粒子及び前記ナノ粒子を含む組成物に関する。さらに、本発明は前記ナノ粒子の製造方法及びそれの使用方法並びにそれの使用にも関する。
【０００８】
かくして、本発明の一態様はナノ粒子に関する。かかるナノ粒子は、本質的にシリカを含まないコア表面を有するコアと、コア表面に結合したシェルとを含んでいる。シェルは、１以上のシラン官能化双性イオン性部分を含んでいる。一実施形態では、コアは遷移金属を含んでいる。別の実施形態では、コアは、酸化物、炭化物、硫化物、窒化物、リン化物、ホウ化物、ハロゲン化物、セレン化物、テルル化物及びこれらの組合せからなる群から選択される遷移金属化合物を含んでいる。一実施形態では、本発明は３４以上の原子番号を有する金属を含んでいる。
【０００９】
若干の実施形態では、ナノ粒子は、本質的にシリカを含まないコア表面を有する酸化タンタルコアと、コア表面に結合したシェルであって、１以上のシラン官能化双性イオン性部分を含むシェルとを含んでいる。かかるナノ粒子は約６ｎｍ以下の平均粒度を有している。
【００１０】
若干の実施形態では、ナノ粒子は、本質的にシリカを含まないコア表面を有する超常磁性酸化鉄コアと、コア表面に結合したシェルであって、１以上のシラン官能化双性イオン性部分を含むシェルとを含んでいる。かかるナノ粒子は約５０ｎｍ以下の平均粒度を有している。
【００１１】
１以上の実施形態では、本発明は診断剤組成物に関する。かかる組成物は複数のナノ粒子を含み、複数のナノ粒子の１以上が本質的にシリカを含まないコア表面を有するコアとコア表面に結合したシェルとを含んでいる。シェルは、１以上のシラン官能化双性イオン性部分を含んでいる。若干の実施形態では、かかる組成物はさらに薬学的に許容されるキャリヤー及び任意には１種以上の賦形剤を含んでいる。
【００１２】
本発明の一態様は、ナノ粒子の製造方法に関する。かかる方法は、（ａ）本質的にシリカを含まないコア表面を有するコアを用意する段階、及び（ｂ）コア表面に結合したシェルであって、シラン官能化双性イオン性部分を含むシェルを配設する段階を含んでいる。
【００１３】
本発明の別の態様は、診断剤組成物を被験体に投与する段階及びＸ線装置を用いて被験体のイメージングを行う段階を含んでなる方法に関する。診断剤組成物は複数のナノ粒子を含み、複数のナノ粒子の１以上がコア及びシェルを含んでいる。シェルは、１以上のシラン官能化双性イオン性部分を含んでいる。１以上の実施形態では、コアは酸化タンタルを含んでいる。
【００１４】
若干の実施形態では、かかる方法は、診断剤組成物を被験体に投与する段階及び診断装置を用いて被験体のイメージングを行う段階を含んでいる。診断剤組成物は複数のナノ粒子を含んでいる。複数のナノ粒子の１以上は、本質的にシリカを含まないコア表面を有するコアと、コア表面に結合したシェルとを含んでいる。シェルは、１以上のシラン官能化双性イオン性部分を含んでいる。
【００１５】
１以上の実施形態では、かかる使用方法はさらに、診断装置を用いて被験体への診断剤組成物の送達をモニターする段階、及び被験体を診断する段階を含んでいる。若干の実施形態では、診断装置は、磁気共鳴イメージング、光学イメージング、光学コヒーレンス断層撮影、Ｘ線断層撮影、コンピューター断層撮影、ポジトロン放出断層撮影及びこれらの組合せからなる群から選択されるイメージング方法を使用する。
【００１６】
本発明の別の態様は、診断剤組成物として使用するための組成物の製造における、前述したナノ粒子１０の使用に関する。
【００１７】
本発明の上記その他の特徴、態様及び利点は、添付の図面を参照しながら以下の詳細な説明を読んだ場合に一層よく理解されよう。添付の図面中では、図面全体を通じて類似の部分は同一の符号で示されている。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、本発明の若干の実施形態に従ってコア及びシェルを含んでなるナノ粒子の断面図である。
【図２】図２は、双性イオン性官能基を形成し得る有機酸及び有機塩基を記載している。
【図３Ａ】図３Ａは、コアと反応させることでシラン官能化双性イオン性部分を含むシェルを形成し得るシラン官能化双性イオン性部分を記載している。
【図３Ｂ】図３Ｂは、コアと反応させることでシラン官能化双性イオン性部分を含むシェルを形成し得るシラン官能化双性イオン性部分を記載している。
【図３Ｃ】図３Ｃは、コアと反応させることでシラン官能化双性イオン性部分を含むシェルを形成し得るシラン官能化双性イオン性部分を記載している。
【図３Ｄ】図３Ｄは、コアと反応させることでシラン官能化双性イオン性部分を含むシェルを形成し得るシラン官能化双性イオン性部分を記載している。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下の詳細な説明は例示的なものであり、本願の発明又は該発明の用途を限定するものではない。さらに、先行する発明の背景又は以下の詳細な説明中に示されるいかなる理論によっても限定されるものではない。
【００２０】
本明細書及びそれに続く特許請求の範囲中では、言及される用語の数は以下の意味を有する。“ａ”、“ａｎ”及び“ｔｈｅ”を伴う単数形で記載したものであっても、前後関係から明らかでない限り、複数の場合も含めて意味する。本明細書及び特許請求の範囲の全体を通じて使用される概略表現用語は、それが関係する基本機能の変化を生じることなしに変動することが許容される任意の数量表現を修飾するために適用できる。したがって、「約」のような用語で修飾された値は、明記された厳密な値に限定すべきでない。場合によっては、概略表現用語は値を測定するための計器の精度に対応することがある。同様に、「含まない（ｆｒｅｅ）」という語句はある用語と組み合わせて使用することができるが、これは修飾された用語を含まないと見なされる限りは実質的でない数又は微小な量を含み得る。例えば、「溶媒を含まない」又は「無溶媒」及び類似の用語や語句は、溶媒化物質から実質的な量、一部又は全部の溶媒を除去した場合を表すことができる。
【００２１】
本発明の１以上の実施形態は、図１に示されるようなナノ粒子に関する。ナノ粒子１０は、本質的にシリカを含まないコア表面３０を有するコア２０を含んでいる。１以上の実施形態では、コア２０は遷移金属、例えば遷移金属元素の化合物を含んでいる。ナノ粒子１０はさらに、コア表面３０に結合したシェル４０（「コーティング」ともいう）を含んでいる。シェル４０は、１以上のシラン官能化双性イオン性部分を含んでいる。コア表面３０が本質的にシリカを含まないので、シラン官能化双性イオン性部分はシリカに結合せず、介在するシリカ層なしにコア２０のコア表面３０に結合する。シラン官能化双性イオン性部分は、シラン部分及び双性イオン性部分を含んでいる。本明細書中で使用する「双性イオン性部分」という用語は、電気的に中性であるが、相異なる原子上にある正及び負の形式電荷を運ぶ部分をいう。双性イオンは極性であり、通常は水に対する高い溶解性及び大抵の有機溶媒に対する不良な溶解性を有する。若干の実施形態では、「双性イオン性部分」は双性イオン性部分の前駆体をいう。かかる実施形態では、前駆体は二次的な又は後続の化学反応を受けて双性イオン性部分を生成する。
【００２２】
本明細書中で使用する「ナノ粒子」とは、ナノメートルスケールの粒度、一般に１マイクロメートル未満の粒度を有する粒子をいう。一実施形態では、ナノ粒子は約５０ｎｍ以下の粒度を有する。別の実施形態では、ナノ粒子は約１０ｎｍ以下の粒度を有する。別の実施形態では、ナノ粒子は約６ｎｍ以下の粒度を有する。
【００２３】
本発明の１以上の実施形態は、複数のナノ粒子を含んでなる組成物に関する。複数のナノ粒子は、メジアン粒度、平均粒径又は粒度、粒度分布、平均粒子表面積、粒子形状及び粒子断面形の１以上によって特徴づけることができる。さらに複数のナノ粒子は、数平均粒度及び重量平均粒度の両方によって特徴づけることができる粒度分布を有し得る。数平均粒度は、ＳN＝Σ（ｓiｎi）／Σｎi（式中、ｎiは粒度ｓiを有する粒子数である。）によって表すことができる。重量平均粒度は、ＳW＝Σ（ｓiｎi2）／Σ（ｓiｎi）によって表すことができる。すべての粒子が同一の粒度を有する場合、ＳN及びＳWは等しくなり得る。一実施形態では、ある粒度分布が存在し、ＳNはＳWと異なることがあり得る。重量平均と数平均との比は、多分散性指数（ＳPDI）として定義できる。一実施形態では、ＳPDIは約１に等しいことがあり得る。他の実施形態では、ＳPDIはそれぞれ約１〜約１．２、約１．２〜約１．４、約１．４〜約１．６又は約１．６〜約２．０の範囲内にあり得る。一実施形態では、ＳPDIは約２．０を超える範囲内にあり得る。
【００２４】
一実施形態では、複数のナノ粒子は正規分布、モノモーダル分布及びバイモーダル分布からなる群から選択される粒度分布を有し得る。一定の粒度分布は一定の利益を得るために有用であり得る。モノモーダル分布は、単一モードの回りに分布した粒度分布ということができる。別の実施形態では、２つの相異なる亜集団粒度範囲（バイモーダル分布）を有する粒子集団が組成物中に含まれていてもよい。
【００２５】
ナノ粒子は各種の形状及び断面形を有し得るが、これは一部では粒子を製造するために使用する方法に依存し得る。一実施形態では、ナノ粒子は、球、棒、管、フレーク、繊維、板、ワイヤ、立方体又はホイスカーである形状を有していてよい。ナノ粒子は、上述の形状の２以上を有する粒子を含んでいてよい。一実施形態では、粒子の断面形は円形、楕円形、三角形、長方形又は多角形の１以上であってよい。一実施形態では、ナノ粒子は本質的に非球形粒子からなっていてよい。例えば、かかる粒子は、３つの主軸のすべてが相異なる長さを有するか、或いは扁平（ｏｂｌａｔｅ）又は扁長（ｐｒｏｌａｔｅ）回転楕円体であってよい楕円体の形態を有し得る。別法として、非球形ナノ粒子は薄層状の形態のものであってもよい。ここで薄層とは、１つの軸に沿った最大寸法が他の２つの軸の各々に沿った最大寸法より実質的に小さい粒子をいう。非球状ナノ粒子はまた、角錐又は円錐の切頭体の形状或いは細長い棒の形状を有していてもよい。一実施形態では、ナノ粒子は不規則な形状を有していてもよい。一実施形態では、複数のナノ粒子は本質的に球状のナノ粒子からなっていてよい。
【００２６】
ナノ粒子の集団は、高い表面／体積比を有し得る。ナノ粒子は結晶質であっても非晶質であってもよい。一実施形態では、単一タイプ（粒度、形状など）のナノ粒子を使用してもよいし、或いは相異なるタイプのナノ粒子の混合物を使用してもよい。ナノ粒子の混合物を使用する場合、これらは組成物中に均質又は不均質に分布していてよい。
【００２７】
一実施形態では、ナノ粒子は凝集体又は集塊体形成に対して安定であり得る。凝集体は互いに物理的に接触した２以上のナノ粒子を含み得る一方、集塊体は互いに物理的に接触した２以上の凝集体を含み得る。若干の実施形態では、ナノ粒子は強く集合及び／又は凝集しておらず、したがって粒子は組成物中に比較的容易に分散することができる。
【００２８】
一実施形態では、コアは遷移金属を含み得る。本明細書中で使用する「遷移金属」とは、周期表３〜１２族の元素をいう。特定の実施形態では、コアは、これらの遷移金属元素の１種以上を含む酸化物、炭化物、硫化物、窒化物、リン化物、ホウ化物、ハロゲン化物、セレン化物及びテルル化物のような１種以上の遷移金属化合物を含んでいる。したがって、本明細書中で「金属」という用語は、必ずしもゼロ原子価金属が存在することを意味せず、それどころか、この用語の使用は遷移金属元素を成分として含有する金属又は非金属物質の存在を意味している。
【００２９】
若干の実施形態では、ナノ粒子は単一のコアを含み得る。若干の他の実施形態では、ナノ粒子は複数のコアを含み得る。ナノ粒子が複数のコアを含む実施形態では、コアは同一のものでも相異なるものでもよい。若干の実施形態では、ナノ粒子組成物は２以上のコアを含んでいる。他の実施形態では、ナノ粒子組成物の各々は単一のコアを含んでいる。
【００３０】
若干の実施形態では、コアはただ１種の遷移金属化合物を含んでいる。別の実施形態では、コアは２種以上の遷移金属化合物を含んでいる。コアが２種以上の遷移金属化合物を含む実施形態では、遷移金属元素又は遷移金属陽イオンは同一の元素からなるものでも２種以上の原子からなるものでもよい。例えば、一実施形態では、コアは酸化タンタル又は酸化鉄のようなただ１種の化合物を含み得る。別の実施形態では、コアは２種以上の金属元素（例えば、酸化タンタル及び酸化ハフニウム、又は酸化タンタル及び窒化ハフニウム、又は鉄及びマンガンの酸化物）を含み得る。別の実施形態では、コアは同一金属元素の２種以上の化合物（例えば、酸化タンタル及び硫化タンタル）を含み得る。
【００３１】
一実施形態では、コアはＸ線又はコンピューター断層撮影（ＣＴ）イメージングにおいてコントラスト増強を生み出す。通常のＣＴスキャナーは、約１０ｋｅＶ〜約１５０ｋｅＶという広い範囲のＸ線エネルギーを使用している。当業者であればわかるように、特定の物質を通過するＸ線の単位長さあたりの減衰量は、線形減衰係数として表される。ＣＴイメージングにおいて典型的なＸ線エネルギースペクトルでは、物質の減衰は光電吸収効果及びコンプトン散乱効果によって支配される。さらに、線形減衰係数は、入射Ｘ線のエネルギー、（モル濃度に関係する）物質の密度及び物質の原子番号（Ｚ）の関数であることが良く知られている。分子化合物又は異なる原子の混合物に関しては、「有効原子番号」Ｚeffを構成元素の有効原子番号の関数として計算することができる。化学式が知られている化合物の有効原子番号は、次の関係式から求められる。
【００３２】
【数１】
0006063627.tif 000002
式中、Ｚkは金属元素の原子番号、Ｐは金属元素の総量、Ｗfkは（モル濃度に関係する）分子の総分子量に対する金属元素の重量分率である。ＣＴイメージングのための入射Ｘ線エネルギーの最適量は、撮影すべき対象物のサイズの関数であって、公称値から大きく変動することはないと予想される。また、造影剤材料の線形減衰係数が材料の密度に直線的に依存することも良く知られている。即ち、材料の密度を増大させたり、或いは造影剤のモル濃度を増大させたりすれば、線形減衰係数を増大させることができる。しかし、患者への造影剤材料の注射やそれに伴う毒性効果という実際上の側面から、達成し得るモル濃度には限界がある。したがって、造影剤候補材料を有効原子番号によって分けるのは妥当である。約５０ｍＭのモル濃度を有する典型的な材料の典型的なＣＴエネルギースペクトルに対するＣＴコントラスト増強のシミュレーションに基づけば、３４以上の有効原子番号を有する材料は、約３０ハウンスフィールド単位（ＨＵ）という概略コントラスト増強、即ち水より３％高いコントラストを与え得るものと推定される。したがって、特定の実施形態では、コアは３４以上の有効原子番号を有する材料を含んでいる。例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ，  Ｖｏｌｕｍｅ  １．  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｓｙｃｈｏｐｈｙｓｉｃｓ，  Ｅｄｓ．  Ｊ．  Ｂｅｕｔｅｌ，  Ｈ．Ｌ．  Ｋｕｎｄｅｌ，  Ｒ．Ｌ．  Ｖａｎ  Ｍｅｔｔｅｒ，  ＳＰＩＥ  Ｐｒｅｓｓ，  ２０００の第１章を参照されたい。
【００３３】
上述のように比較的高い原子番号を有する遷移金属を含むコアは、一定の望ましい特性を有する実施形態を提供し得る。かかる実施形態では、コアは実質的に放射線不透過性である。これは、コア材料が生体中に通例見出される物質より実質的に少ないＸ線しか通過させず、したがってかかる粒子をコンピューター断層撮影（ＣＴ）のようなＸ線イメージング技法での造影剤として有用なものにすることができる。このような特性を与え得る遷移金属元素の例には、タングステン、タンタル、ハフニウム、ジルコニウム、モリブデン、銀及び亜鉛がある。酸化タンタルは、Ｘ線イメージング用途で使用するのに適したコア組成物の１つの具体例である。１以上の実施形態では、ナノ粒子のコアは酸化タンタルを含み、ナノ粒子は約６ｎｍ以下の粒度を有している。この実施形態は、タンタル含有コアの高度の放射線不透過性及び例えば急速な腎クリアランスを助ける小さい粒度のため、Ｘ線を照射してイメージングデータを生成するイメージング技法での用途にとって特に魅力的であり得る。
【００３４】
若干の実施形態では、ナノ粒子のコアは約３０重量％以上の遷移金属材料を含んでいる。特定の実施形態では、コアは約５０重量％以上の遷移金属材料を含んでいる。さらに別の実施形態では、コアは約７５重量％以上の遷移金属材料を含んでいる。コア中に高い遷移金属材料含有量を有することは、高度の単位体積当たり放射線不透過性を有するナノ粒子を生み出し、それにより造影剤としての一層効率的な性能を付与する。
【００３５】
別の実施形態では、コアは、例えば超常磁性挙動をはじめとする磁性挙動を示す材料を含んでいる。本明細書中で使用する「超常磁性材料」とは、キュリー温度又はネール温度未満の温度であっても常磁性と同様な挙動を示し得る材料をいう。使用可能な磁性又は超常磁性材料の例には、鉄、マンガン、銅、コバルト及びニッケルの１種以上を含む材料がある。一実施形態では、超常磁性材料は超常磁性酸化鉄を含んでいる。若干の実施形態では、本発明のナノ粒子は磁気共鳴（ＭＲ）造影剤として使用できる。これらのナノ粒子は、磁場に暴露されるとＴ２*、Ｔ２又はＴ１磁気共鳴信号を生じ得る。１以上の実施形態では、ナノ粒子のコアは超常磁性酸化鉄を含み、ナノ粒子は約５０ｎｍ以下の粒度を有している。
【００３６】
一実施形態では、ナノ粒子１０はコア２０を実質的に被覆するシェル４０を含んでいる。このシェル４０はコア２０を安定化するために役立ち得る。即ち、シェル４０は、あるコア２０が隣接するコア２０に接触するのを防止することで複数のかかるナノ粒子が本明細書中に記載したように凝集又は集合するのを防止し、或いは例えばインビボイメージング実験の時間スケール上での金属又は金属酸化物の浸出を防止することができる。一実施形態では、シェル４０はコア２０を安定化しかつかかる接触を防止するのに十分な厚さを有すればよい。一実施形態では、シェル４０は約５０ｎｍ以下の平均厚さを有する。別の実施形態では、シェル４０は約３ｎｍ以下の平均厚さを有する。
【００３７】
本明細書中で使用する「実質的に被覆する」という用語は、ナノ粒子の表面被覆パーセントが約２０％を超えていることを意味する。表面被覆パーセントとは、シェルで被覆されたナノ粒子表面とシェルで被覆されていない表面積との比をいう。若干の実施形態では、ナノ粒子の表面被覆パーセントは約４０％を超えることがある。
【００３８】
若干の実施形態では、シェルは水溶性の向上を容易にし、凝集体形成を低減させ、集塊体形成を低減させ、ナノ粒子の酸化を防止し、コア−シェル物体の均一性を維持し、或いはナノ粒子に生体適合性を付与することができる。別の実施形態では、シェルを構成する材料はさらに特定の用途（例えば、特に限定されないが診断用途）に合わせて調整される他の材料を含むことができる。例えば、一実施形態では、ナノ粒子はさらに標的化リガンドで官能化することができる。標的化リガンドは、所望の器官、組織又は細胞に対するナノ粒子の標的化をもたらす分子又は構造であり得る。標的化リガンドには、特に限定されないが、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸、糖誘導体及びこれらの組合せがある。若干の実施形態では、ナノ粒子はさらに標的化剤を含むことができる。その結果、造影剤として使用する場合、粒子は被験体の特定の罹患領域に対して標的化することができる。若干の実施形態では、ナノ粒子は血液プール剤として使用できる。
【００３９】
コアを１以上のシェルで被覆することもできる。若干の実施形態では、複数のコアを同一のシェルで被覆することができる。一実施形態では、単一のシェルがナノ粒子組成物中に存在するすべてのコアを被覆することができる。若干の実施形態では、個々のコアを１以上のシェルで被覆することができる。別の実施形態では、ナノ粒子中に存在するすべてのコアを２
以上のシェルで被覆することができる。個々のシェルは同一の材料からなっていてもよいし、或いは２種以上の材料からなっていてもよい。コアを２以上のシェルで被覆し得る実施形態では、シェルは同一の材料又は異種の材料からなり得る。
【００４０】
一実施形態では、シェルは１以上のシラン官能化双性イオン性部分を含んでいる。ここで、シラン官能化双性イオン性部分はシラン部分及び双性イオン性部分を含んでいる。若干の実施形態では、シラン官能化双性イオン性シェルのシラン部分はコアに直接結合している。
【００４１】
一実施形態では、シェルは複数のシラン部分を含み、複数のシラン部分の１以上が１以上の双性イオン性部分で官能化されている。若干の実施形態では、シェルはシラン官能化双性イオン性部分及びシラン官能化非双性イオン性部分を含んでいる。かかる実施形態では、シラン官能化双性イオン性部分とシラン官能化非双性イオン性部分との比は約０．０１〜約１００である。若干の他の実施形態では、シラン官能化双性イオン性部分とシラン官能化非双性イオン性部分との比は約０．１〜約２０である。
【００４２】
若干の実施形態では、シェルは複数のシラン官能化双性イオン性部分を含んでいる。「複数のシラン官能化双性イオン性部分」という用語は、１つの特定のシラン部分が１以上の双性イオン性部分で官能化されてものの複数の例をいう。シラン部分は同一のものでも相異なるものでもよい。一実施形態では、各コアは複数のシラン官能化双性イオン性部分で包囲されていて、すべてのシラン部分は同一タイプのものである。別の実施形態では、各コアは複数のシラン官能化双性イオン性部分で包囲されていて、シラン部分は相異なるタイプのものである。一実施形態では、複数のシラン部分の各々が１以上の双性イオン性部分で官能化されている。一実施形態では、複数のシラン部分の１以上が双性イオン性部分で官能化されている結果、各ナノ粒子は平均して１以上の双性イオン性部分を含んでいる。１以上の実施形態では、各ナノ粒子は複数の双性イオン性部分を含んでいる。
【００４３】
シェルが複数のシラン官能化双性イオン性部分を含む実施形態では、シラン部分及び双性イオン性部分は同一のものでも相異なるものでもよい。例えば、一実施形態では、すべてのシラン部分が同一のものであってよく、かつすべての双性イオン性部分が同一のものであってよい。別の実施形態では、シラン部分は同一のものであるが、双性イオン性部分は相異なるものである。例えば、シェルは２種のシラン官能化双性イオン性部分を含むことができる。第１のものは、タイプ１のシラン部分及びタイプ２の双性イオン性部分、又はタイプ２のシラン部分及びタイプ１の双性イオン性部分、又はタイプ２のシラン部分及びタイプ２の双性イオン性部分を含んでいる。１以上の実施形態では、シラン官能化双性イオン性部分は２以上の双性イオン性部分を含み得る。シラン官能化双性イオン性部分が２以上の双性イオン性部分を含む実施形態では、双性イオン性部分は同一のものでも相異なるものでもよい。
【００４４】
若干の実施形態では、シラン官能化双性イオン性部分は、正に帯電した部分、負に帯電した部分、及び正に帯電した部分と負に帯電した部分との間に位置する第１のスペーサー基を含んでいる。正に帯電した部分は有機塩基から形成でき、負に帯電した部分は有機酸から形成できる。図２は、負に帯電した部分及び正に帯電した部分を形成できる例示的な有機酸及び塩基のリストを示している。
【００４５】
若干の実施形態では、正に帯電した部分は、プロトン化第一アミン、プロトン化第二アミン、プロトン化第三アルキルアミン、プロトン化アミジン、プロトン化グアニジン類、プロトン化ピリジン類、プロトン化ピリミジン類、プロトン化ピラジン類、プロトン化プリン体、プロトン化イミダゾール類、プロトン化ピロール類、第四アルキルアミン又はこれらの組合せからなる。
【００４６】
若干の実施形態では、負に帯電した部分は、脱プロトン化カルボン酸、脱プロトン化スルホン酸、脱プロトン化スルフィン酸、脱プロトン化ホスホン酸、脱プロトン化リン酸、脱プロトン化ホスフィン酸又はこれらの組合せからなる。
【００４７】
１以上の実施形態では、第１のスペーサー基は、アルキル基、アリール基、置換アルキル基、置換アリール基、ヘテロアルキル基、ヘテロアリール基、カルボキシル基、エーテル、アミド、エステル、カルバメート、尿素、炭素原子数１〜１０の直鎖アルキル基又はこれらの組合せからなる。
【００４８】
若干の実施形態では、シラン官能化双性イオン性部分のケイ素原子は第２のスペーサー基を介して正又は負に帯電した部分に連結されている。若干の実施形態では、第２のスペーサー基は、アルキル基、アリール基、置換アルキル基、置換アリール基、ヘテロアルキル基、ヘテロアリール基、カルボキシル基、エーテル、アミド、エステル、カルバメート、尿素、炭素原子数１〜１０の直鎖アルキル基又はこれらの組合せからなる。
【００４９】
若干の実施形態では、シラン官能化双性イオン性部分は、図３Ａ〜３Ｄに例示されているもののような前駆体トリアルコキシシランの加水分解生成物からなる。若干の実施形態では、前駆体トリアルコキシシランは、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−スルホ−Ｎ−（３−（トリメトキシシリル）プロピル）プロパン−１−アミニウム、３−（メチル（３−（トリメトキシシリル）プロピル）アミノ）プロパン−１−スルホン酸、３−（３−（トリメトキシシリル）プロピルアミノ）プロパン−１−スルホン酸、２−（２−（トリメチルシリル）エトキシ（ヒドロキシ）ホスホリルオキシ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルエタンアミニウム、２−（２−（トリメトキシシリル）エチル（ヒドロキシ）ホスホリルオキシ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルエタンアミニウム、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−３−（Ｎ−３−（トリメトキシシリル）プロピオニルスルファモイル）プロパン−１−アミニウム、Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（トリメトキシシリル）プロパン−１−アミニウム、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（トリメトキシシリル）プロパン−１−アミニウム、３−（メチル（３−（トリメトキシシリル）プロピル）アミノ）プロピオン酸、３−（３−（トリメトキシシリル）プロピルアミノ）プロピオン酸、Ｎ−（カルボキシメチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（トリメトキシシリル）プロパン−１−アミニウム、２−（メチル（３−（トリメトキシシリル）プロピル）アミノ）酢酸、２−（３−（トリメトキシシリル）プロピルアミノ）酢酸、２−（４−（３−（トリメトキシシリル）プロピルカルバモイル）ピペラジン−１−イル）酢酸、３−（４−（３−（トリメトキシシリル）プロピルカルバモイル）ピペラジン−１−イル）プロピオン酸、２−（メチル（２−（３−（トリメトキシシリル）プロピルウレイド）エチル）アミノ）酢酸、２−（２−（３−（トリメトキシシリル）プロピルウレイド）エチル）アミノ酢酸又はこれらの組合せからなる。
【００５０】
複数のナノ粒子を含んでなる組成物は、診断剤組成物として使用できる。かくして、別の態様では、本発明は診断剤組成物に関する。かかる診断剤組成物は、前述した複数のナノ粒子１０を含んでいる。一実施形態では、診断剤組成物はさらに、薬学的に許容されるキャリヤー及び任意には１種以上の賦形剤を含んでいる。一実施形態では、薬学的に許容されるキャリヤーは実質的に水であり得る。任意の賦形剤は、塩類、崩壊剤、結合剤、フィラー及び滑沢剤の１種以上からなり得る。
【００５１】
小さい粒度は、例えば腎臓及び他の器官からのクリアランスを容易にする点で有利であり得る。一実施形態では、複数のナノ粒子は約５０ｎｍ以下のメジアン粒度を有し得る。別の実施形態では、複数のナノ粒子は約１０ｎｍ以下のメジアン粒度を有し得る。別の実施形態では、複数のナノ粒子は約６ｎｍ以下のメジアン粒度を有し得る。
【００５２】
本発明の一態様は、ナノ粒子の製造方法に関する。一般に、１つの方法は、（ａ）本質的にシリカを含まないコア表面を有するコアを用意する段階、及び（ｂ）コア表面に結合したシェルであって、シラン官能化双性イオン性部分を含むシェルを配設する段階を含んでいる。
【００５３】
１以上の実施形態では、コアを用意する段階は、１種以上の遷移金属を含む第１の前駆体材料を用意することを含んでいる。一実施形態では、第１の前駆体材料は反応することで、１種以上の遷移金属を含むコアを生成する。一実施形態では、第１の前駆体材料は分解することでコアを生成する。別の実施形態では、第１の前駆体材料は加水分解することでコアを生成する。別の実施形態では、第１の前駆体材料は反応することでコアを形成する。ナノ粒子合成方法は当技術分野で公知であり、適当な材料からナノ粒子コアを製造するための任意適宜の方法が本方法での使用に適し得る。
【００５４】
１以上の実施形態では、シェルを配設する段階は、シラン部分又はシラン部分の前駆体を含む材料のような第２の前駆体材料を用意することを含んでいる。シラン部分はコアと反応することで、シラン部分を含むシェルを形成し得る。若干の実施形態では、前駆体はコアと反応する前に加水分解反応を受けることができる。若干の実施形態では、シラン部分は１以上の双性イオン性部分又は１以上の双性イオン性部分前駆体で官能化することができる。シラン部分が１以上の双性イオン性部分で官能化される実施形態では、こうして形成されるシェルはシラン官能化双性イオン性部分を含んでいる。シラン部分が双性イオン性部分前駆体で官能化される実施形態では、こうして形成されるシェルは双性イオン性を有しないことがあるが、続いて適当な試薬と反応させることで前駆体を双性イオン性部分に転化できる。１以上の実施形態では、第２の前駆体材料はシラン官能化双性イオン性部分又はシラン官能化双性イオン性部分の前駆体（例えば、上述した前駆体トリアルコキシシランの１種以上）を含んでいる。
【００５５】
段階の順序及び／又は組合せは様々に変化させ得ることが理解されよう。したがって、若干の実施形態に従えば、段階（ａ）及び（ｂ）を逐次段階として実施することで、コア及び第２の前駆体材料からナノ粒子が形成される。限定ではなく例示を目的として示せば、若干の実施形態では、第１の前駆体材料は１種以上の遷移金属を含んでいる。この場合、コアは１種以上の遷移金属の酸化物を含み、段階（ａ）はさらに第１の前駆体材料の加水分解を含む。若干の実施形態に従えば、第１の前駆体材料は遷移金属のアルコキシド又はハライドを含み、加水分解プロセスは第１の前駆体材料をアルコール溶媒中で酸及び水と化合させることを含む。若干の実施形態では、シランは重合性の基を含むことができる。重合は、酸触媒縮合重合によって進行し得る。若干の他の実施形態では、シラン部分をコア上に物理的に吸着させてもよい。若干の実施形態では、シラン部分をさらに他のポリマーで官能化することができる。かかるポリマーは、水溶性かつ生体適合性のものであり得る。一実施形態では、かかるポリマーには、特に限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリメタクリレート、ポリビニルスルフェート、ポリビニルピロリジノン及びこれらの組合せがある。
【００５６】
若干の実施形態では、コアは金属酸化物を含んでいる。一実施形態では、金属酸化物コアは、有機酸の存在下で金属アルコキシドを加水分解することで合成できる。若干の実施形態では、金属アルコキシドはタンタルアルコキシド（例えば、タンタルエトキシド）であり、有機酸はカルボン酸（例えば、イソ酪酸、プロピオン酸又は酢酸）であり、加水分解反応はアルコール溶媒（例えば、１−プロパノール又はメタノール）の存在下で実施することができる。
【００５７】
別の実施形態では、コア及び第２の前駆体材料を互いに接触させることができる。一実施形態では、第２の前駆体材料は、有機官能性トリアルコキシシラン又は有機官能性トリアルコキシシランの混合物のようなケイ素含有化学種を含み得る。有機官能性トリアルコキシシランの１種以上が１以上の双性イオン性基又は双性イオン性基前駆体を含む結果、各ナノ粒子は平均して１以上の双性イオン性部分又は双性イオン性部分前駆体を含み得る。一実施形態では、各ナノ粒子は平均して複数の双性イオン性部分又は双性イオン性部分前駆体を含み得る。他の実施形態では、コアは１種以上のシラン部分を含む混合物で処理できる。一実施形態では、１つのシラン部分を双性イオン性部分又は双性イオン性部分前駆体で官能化しながら、第２のシラン部分はいかなる双性イオン性部分でも官能化しなくてよい。帯電したシラン部分は同時に又は逐次に添加できる。若干の実施形態では、双性イオン性部分又は双性イオン性部分前駆体で官能化された１種以上のシラン部分を、非双性イオン性部分で官能化されたコアに同時に又は逐次に添加することができる。
【００５８】
一実施形態では、酸化タンタルコアを、第四級窒素原子及びスルホネート基又はカルボキシル基の両方（例えば、スルホベタイン基又はベタイン基）を含有するアルコキシシランと反応させることができる。一実施形態では、酸化タンタルコアを（ＲＯ）3Ｓｉ（ＣＨ2）xＮＲ'2（ＣＨ2）yＳＯ3（式中、Ｒはアルキル基又はアリール基、ｘは１〜１０、ｙは１〜１０、Ｒ'はＨ、アルキル基又はアリール基である。）と反応させることができる。一実施形態では、Ｒはアルキル基（例えば、メチル又はエチル）、ｘは３、ｙは２〜５、Ｒ'はＨ又はアルキル基（例えば、メチル）である。
【００５９】
一実施形態では、スルホベタイン官能化シランは、アルキルスルトン又はアルキルスルトンの混合物をアミン置換シランと開環反応させることで合成できる。別の実施形態では、アルキルスルトンの代わりにアルキルラクトン又はアルキルラクトンの混合物を使用することもできる。特定の実施形態では、シェルはスルホベタイン及びベタイン官能化シランの混合物を含んでいる。別の実施形態では、金属酸化物コアはスルホベタイン又はベタイン官能化シラン部分と反応し得るが、この場合にはスルホネート基又はカルボキシル基を化学的に保護することができる。
【００６０】
別の実施形態では、酸化タンタルコアをアミン含有シラン（例えば、アミノ官能性トリアルコキシシラン）と反応させることで、アミン含有シランで官能化された酸化タンタルコアを形成できる。第２の段階では、シラン官能化コアを単離することができる。代替実施形態では、シラン官能化コアをインサイチュで使用することができる。シラン官能化コアをアルキルスルトン、アルキルラクトン、ハロアルキルカルボン酸又はエステル、アルキルスルトンの混合物、アルキルラクトンの混合物、ハロアルキルカルボン酸又はエステルの混合物、或いはアルキルスルトンとアルキルラクトンとの混合物と反応させることで、双性イオン性部分を形成できる。スルトン、ラクトン或いはスルトン及び／又はラクトンの混合物の量は、平均してナノ粒子１個当たり１以上の双性イオン性部分を与えるのに十分なものであればよい。アルキルスルトンの非限定的な例には、プロパンスルトン及びブチルスルトンがある。アルキルラクトンの非限定的な例には、プロパンラクトン及びブチルラクトンがある。
【００６１】
一実施形態では、本方法はさらに複数のナノ粒子を分別する段階を含む。分別段階は、ナノ粒子を濾過することを含み得る。別の実施形態では、本方法はさらに複数のナノ粒子を精製する段階を含む。精製段階は、透析、接線流濾過、ダイアフィルトレーション
又はこれらの組合せの使用を含み得る。別の実施形態では、本方法はさらに精製ナノ粒子の単離を含む。
【００６２】
上述した実施形態のいずれかと組み合わせて、若干の実施形態は、Ｘ線／コンピューター断層撮影又はＭＲＩ用の診断剤組成物を製造する方法に関する。かかる診断剤組成物は複数のナノ粒子を含んでいる。若干の実施形態では、複数のナノ粒子のメジアン粒度は約１０ｎｍを超えないのがよく、例えば約７ｎｍ以下であり、特定の実施形態では約６ｎｍ以下である。若干の実施形態に従えば、複数のナノ粒子の粒度はナノ粒子を哺乳動物の腎臓（例えば、ヒトの腎臓）から微粒子形態で実質的に排出可能にするように選択できることが理解されよう。
【００６３】
若干の実施形態では、本発明は、本明細書中に記載した複数のナノ粒子を含む診断剤組成物の使用方法に関する。若干の実施形態では、本方法は、若干の例では生きている被験体（例えば、哺乳動物）であり得る被験体に診断剤組成物をインビボ又はインビトロで投与する段階、続いてＸ線／ＣＴ装置を用いて被験体の画像生成を行う段階を含んでなる。ナノ粒子は、上述したようにコア及びシェルを含み、シェルは１以上のシラン官能化双性イオン性部分を含んでいる。一実施形態では、コアは酸化タンタルを含んでいる。ナノ粒子は、各種の公知方法で被験体中に導入できる。被験体中にナノ粒子を導入するための方法の非限定的な例には、静脈内、動脈内又は経口投与、皮膚適用、及び筋肉、皮膚、腹腔或いは他の組織又は体腔中への直接注入がある。
【００６４】
別の実施形態では、本方法は、診断剤組成物を被験体に投与する段階及び診断装置を用いて被験体のイメージングを行う段階を含んでなる。診断装置はイメージング方法を使用するが、その例には、特に限定されないが、ＭＲＩ、光学イメージング、光学コヒーレンス断層撮影、Ｘ線断層撮影、コンピューター断層撮影、ポジトロン放出断層撮影及びこれらの組合せがある。かかる使用方法では、被験体に診断剤組成物を予め投与することもできる。診断剤組成物は、上述したように複数のナノ粒子１０を含んでいる。
【００６５】
一実施形態では、上述した診断造影剤の使用方法はさらに、診断装置を用いて被験体への診断剤組成物の送達をモニターする段階、及び被験体を診断する段階を含んでいる。この方法では、一般に医学診断イメージング装置の通常の動作に合わせて、データをコンパイルして分析することができる。診断剤組成物はＸ線又はＣＴ造影剤（例えば、酸化タンタルコアを含む組成物）であり得る。診断剤組成物は、約１００〜約５０００ハウンスフィールド単位の範囲内のＣＴ信号を与えることができる。別の例では、診断剤組成物はＭＲＩ造影剤（例えば、超常磁性酸化鉄コアを含む薬剤）であり得る。
【００６６】
本発明の一実施形態は、本明細書中に記載したナノ粒子１０（例えば、酸化タンタル又は酸化鉄コアを有するナノ粒子）が被験体内に分布した範囲を測定するための方法を提供する。被験体は、哺乳動物或いは組織試料又は細胞を含む生物学的材料であり得る。本方法はインビボ又はインビトロ方法であり得る。ナノ粒子は、各種の公知方法で被験体中に導入できる。被験体中にナノ粒子を導入するための方法の非限定的な例には、上述した公知方法のいずれかがある。一実施形態では、本方法は、（ａ）被験体中にナノ粒子を導入する段階、及び（ｂ）被験体内におけるナノ粒子の分布を測定する段階を含んでなる。被験体内における分布は、前述したもののような診断イメージング技法を用いて測定できる。別法として、生物学的材料中におけるナノ粒子の分布は元素分析によって測定できる。一実施形態では、誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）を使用することで、生物学的材料中におけるナノ粒子の濃度を測定できる。
【００６７】
本発明の別の態様は、診断剤組成物として使用するための組成物の製造における、前述したナノ粒子１０の使用に関する。
【００６８】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を実証するために示される。当業者であれば、以下の実施例中に開示される方法は、単に本発明の例示的な形態を表すにすぎないことが理解されるはずである。しかし当業者であれば、本開示内容に照らせば、本発明の技術思想及び技術的範囲から逸脱することなく記載された特定の実施形態に数多くの変更を加えることができ、それでも同様又は類似の結果が得られることが理解されるはずである。
【実施例】
【００６９】
本発明の実施は、以下の実施例からなお一層完全に理解されよう。これらの実施例は例示のみを目的として本明細書中に示されるものであって、決して本発明を限定するものと解すべきでない。
【００７０】
実施例セクションで使用される略語は、以下に示す通りである。「ｍｇ」：ミリグラム、「ｍＬ」：ミリリットル、「ｍｇ／ｍＬ」：ミリグラム／ミリリットル、「ｍｍｏｌ」：ミリモル、「μＬ」：マイクロリットル、「ＬＣ」：液体クロマトグラフィー、「ＤＬＳ」：動的光散乱、「ＤＩ」：脱イオン水、「ＩＣＰ」：誘導結合プラズマ。
【００７１】
特記しない限り、すべての試薬用化学薬品は受け入れたままで使用し、すべての水溶液の調製にはミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）水を使用した。
【００７２】
実施例１
酸化タンタル系ナノ粒子の合成
段階１：Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−スルホ−Ｎ−（３−（トリメトキシシリル）プロピル）プロパン−１−アミニウムの合成
撹拌棒を含む５００ｍＬ丸底フラスコに、トルエン（無水、２５０ｍＬ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノトリメトキシシラン（２５ｇ、１２１ｍｍｏｌ）及び１，３−プロパンスルトン（１３．４ｇ、１１０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で４日間撹拌した。次いで、混合物を濾過して沈殿した生成物を単離し、続いてこれを新鮮な無水トルエン（２×６０ｍＬ）で洗浄した。真空下で乾燥した後の白色粉末の収集は２３．６ｇであった。
【００７３】
段階２：Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−スルホ−Ｎ−（３−（トリメトキシシリル）プロピル）プロパン−１−アミニウムと酸化タンタル系コアとの反応
方法１：溶媒として１−プロパノール
撹拌棒を含む２５０ｍＬ三つ口丸底フラスコに１−プロパノール（７３ｍＬ）を仕込み、次いでイソ酪酸（１．１６ｍＬ、１２．５１ｍｍｏｌ、Ｔａに対して１．２７ｅｑ）及びＤＩ水（１．０８ｍＬ、５９．９５ｍｍｏｌ、Ｔａに対して６．０９ｅｑ）を添加して反応混合物を形成した。反応混合物中に窒素を２０分間吹き込み、次いで撹拌しながら反応混合物にタンタルエトキシド（Ｔａ（ＯＥｔ）5）（２．５５ｍＬ、４ｇ、９．８４ｍｍｏｌ）を室温で１５分かけて滴下した。Ｔａ（ＯＥｔ）5の添加中、反応混合物中への窒素の吹込みを続けた。Ｔａ（ＯＥｔ）5の添加が完了した後、上述した反応混合物を窒素下において室温で１６時間撹拌した。
【００７４】
反応混合物を室温で１６時間撹拌し、次いで反応混合物からアリコート（１．５ｍＬ）を採取し、２０ｍｍ濾過膜で濾過し、濾過段階の直後にＤＬＳによって粒度を水中で（流体力学的半径として）測定した。平均粒度は約３．６ｎｍと測定された。Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−スルホ−Ｎ−（３−（トリメトキシシリル）プロピル）プロパン−１−アミニウム（４．０３ｇ、１２．２３ｍｍｏｌ、Ｔａに対して１．２４ｅｑ）を５０ｍＬのＤＩ水に溶解した。この溶液を上述した反応混合物に数分かけて滴下した。無色で均質な反応混合物が直ちに濁った白色溶液に変化し、最終的にはシラン官能化双性イオン性部分の添加終了までに乳状溶液となった。添加が完了した後、フラスコに凝縮器を取り付け、反応混合物を窒素ブランケット下に保った。フラスコを７５℃に予熱した油浴中に配置し、反応混合物を６時間撹拌した。反応混合物は一層透明になった。６時間後、反応混合物を空気ブランク下で室温に冷却した。１（Ｍ）ＮＨ4ＯＨを用いて不均質な反応混合物をｐＨ６〜７に中和した。反応混合物を空気ブランク下で第２の丸底フラスコに移した。反応混合物を第２のフラスコに移す際、ある量の白色物質がフラスコ内に残ったが、第２のフラスコには移さなかった（粗生成物Ａ）。粗生成物Ａを窒素流下で一晩乾燥した。他方、回転蒸発器を用いて第２のフラスコの溶液を５０℃で蒸発させた。溶液の蒸発後に得られた乾燥白色残留物（粗生成物Ｂ）を窒素流下に一晩放置した。
【００７５】
粗生成物Ａを一晩乾燥した。この固体をＤＩ水中に完全に溶解した。粗生成物ＢもＤＩ水中に完全に溶解し、２種の溶液（粗生成物Ａ及び粗生成物Ｂ）を合わせた（総量は６０ｍＬであった）。水溶液を４５０ｎｍ、２００ｎｍ及び１００ｎｍの濾過膜で順次に濾過し、最後に２０ｎｍの濾過膜で濾過した。次いで、溶液をまずリン酸ナトリウム緩衝液を用いてｐＨ７．０で透析し（１０Ｋ分子量カットオフのスネークスキン再生セルロースチューブ）、次いでＤＩ水中で３回透析した。
【００７６】
最後に、ナノ粒子を凍結乾燥によって単離した。白色粉末の収量＝１．７４８ｇ（Ｔａを基準にして収率３８％）。ゼータ電位：（−）８．１８ｍＶ。元素分析：３８．３±０．３％Ｔａ、４．８±０．１％Ｓｉ。平均粒度はＤＬＳによって８．９ｎｍと測定された。ナノ粒子の純度は、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）／誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）によって測定した。
【００７７】
方法２：溶媒としてトリフルオロエタノール
撹拌棒を含む１００ｍＬ三つ口丸底フラスコにトリフルオロエタノール（４２ｍＬ）を仕込んだ。溶媒に窒素を吹き込みながら、注射器を用いてイソ酪酸（０．５３ｍＬ、５．７ｍｍｏｌ）を添加し、次いで水（０．１３ｍＬ、７．４ｍｍｏｌ）を添加した。連続的に窒素を吹き込みながら、溶液をさらに１５分間撹拌した。注射器を用いてタンタルエトキシド（Ｔａ（ＯＥｔ）5）（２ｇ、４．９ｍｍｏｌ）を滴下した。僅かに濁った溶液を窒素下において室温で１７時間撹拌した。Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−スルホ−Ｎ−（３−（トリメトキシシリル）プロピル）プロパン−１−アミニウム（実施例１、３．２ｇ、９．８ｍｍｏｌ）を水（１５ｍＬ）に溶解した。この均質で無色の溶液を撹拌しながら空気下でタンタル含有反応混合物に手早く滴下した。フラスコに凝縮器を取り付け、次いで７８℃に予熱した油浴中に配置した。この温度で６時間撹拌した後、無色で均質の反応混合物を室温に冷却した。水（２０ｍＬ）を添加した後、回転蒸発器でトリフルオロエタノールを実質的に除去した。濃水酸化アンモニウムを用いて水溶液を中和し、次いで２００ｎｍ、１００ｎｍ及び２０ｎｍフィルターで順次に濾過した。次いで、３５００ＭＷカットオフの再生セルローススネークスキン透析チューブを用いて溶液を４回透析した。最初の透析は、５０：５０のＤＩ水：ｐＨ７．０リン酸塩緩衝液中で実施した。以後の透析はＤＩ水中で実施した。精製ナノ粒子生成物は水から単離しなかった。アリコートに関する％固形分試験を用いて、被覆ナノ粒子の収量が１．５５ｇであることを決定した。平均粒度は動的光散乱によって１．６ｎｍと測定された。
【００７８】
実施例２
酸化タンタル系ナノ粒子の合成
段階１：２−（４−（３−（トリメトキシシリル）プロピルカルバモイル）ピペラジン−１−イル）酢酸エチルの合成
エチルアセトキシピペラジン（３．７８９ｇ）の塩化メチレン（２０ｍＬ）に（３−イソシアナトプロピル）トリメトキシシラン（４．１０６ｇ）を添加した。溶液を１６時間撹拌し、次いで溶媒を減圧下で除去して８．３７ｇの物質を得、これをそれ以上精製せずに使用した。
【００７９】
段階２：２−（４−（３−（トリメトキシシリル）プロピルカルバモイル）ピペラジン−１−イル）酢酸エチルと酸化タンタル系コアとの反応
５００ｍＬ丸底フラスコに、ｎ−プロパノール（９９ｍＬ）、イソ酪酸（１．４ｍＬ）及び水（１．２ｍＬ）を仕込んだ。溶液を５分間撹拌し、次いでＴａ（ＯＥｔ）5（５．３７ｇ）を溶液に滴下した。溶液を窒素下において室温で１８時間撹拌した。次いで、全部で６０ｍＬのこの溶液を２−（４−（３−（トリメトキシシリル）プロピルカルバモイル）ピペラジン−１−イル）酢酸エチル（６．３７ｇ）に添加し、溶液を窒素下において１００℃で２時間撹拌した。次いで、混合物を室温に冷却し、水（２０ｍＬ）に添加し、混合物を室温で１８時間撹拌した。次いで、全部で７５ｍＬの０．３３Ｎ塩酸水溶液を添加し、溶液を６０℃で６時間加熱した。次いで、混合物を室温に冷却し、２５０ｍＬの２８％アンモニア水を添加し、混合物を５日間撹拌した。アンモニア及びプロパノールを減圧下で除去し、次いで材料を３０００ＭＷカットオフの再生セルロース透析チューブに注入し、透析緩衝液を１２時間ごとに交換しながら蒸留水に対して４８時間透析した。次いで、溶液を３００００ＭＷカットオフの遠心フィルターで濾過することで、ＤＬＳにより測定して４．５ｎｍの粒度を有する粒子を得た。
【００８０】
実施例３
酸化鉄系ナノ粒子の合成
超常磁性酸化鉄ナノ粒子の合成
１００ｍＬ三つ口丸底フラスコに７０６ｍｇのＦｅ（ａｃａｃ）3及び２０ｍＬの無水ベンジルアルコールを仕込んだ。溶液中に窒素を吹き込み、次いで窒素雰囲気下において１６５℃で２時間加熱した。次いで、溶液を室温に冷却し、その温度で貯蔵した。
【００８１】
２−（４−（３−（トリメトキシシリル）プロピルカルバモイル）ピペラジン−１−イル）酢酸エチルと超常磁性酸化鉄との反応
ベンジルアルコール中の超常磁性酸化鉄ナノ粒子（５．５８ｍｇ  Ｆｅ／ｍＬ）の１０ｍＬアリコートを５０ｍＬのテトラヒドロフランで希釈した。２．００ｇの２−（４−（３−（トリメトキシシリル）プロピルカルバモイル）ピペラジン−１−イル）酢酸エチルを添加し、混合物を撹拌しながら６０℃で２時間加熱し、次いで室温に冷却した。５０ｍＬの１．０Ｍ炭酸カリウム水溶液を添加した後、フラスコを密封し、撹拌しながら６０℃で１８時間加熱した。次いで、混合物を冷却して遠心分離し、水性層を１００００ＭＷカットオフの再生セルロース透析チューブに注入し、透析緩衝液を１２時間ごとに交換しながら４リットルの１０ｍＭクエン酸ナトリウムに対して４８時間透析した。最終容量は９４ｍＬであり、溶液１ｍＬ当たり全部で０．４１６ｍｇの鉄を含んでいた。かかる物質は、動的光散乱により１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液中で測定して８．４ｎｍの平均粒度を有していた。
【００８２】
Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−スルホ−Ｎ−（３−（トリメトキシシリル）プロピル）プロパン−１−アミニウムと超常磁性酸化鉄との反応
ベンジルアルコール中の超常磁性酸化鉄ナノ粒子（５．５８ｍｇ  Ｆｅ／ｍＬ）の１６．７５ｍＬアリコートをテトラヒドロフランに添加して全容量を９４．５ｍＬにした。次いで、この溶液を３．１ｇのＮ，Ｎ−ジメチル−３−スルホ−Ｎ−（３−（トリメトキシシリル）プロピル）プロパン−１−アミニウムと共に耐圧フラスコに添加し、混合物を撹拌しながら５０℃で２時間加熱した。室温に冷却した後、全部で３１ｍＬのイソプロパノール及び７６ｍＬの濃水酸化アンモニウム水溶液（水中２８％ＮＨ3）を添加し、次いでフラスコをを密封し、撹拌しながら５０℃で１８時間加熱した。混合物を冷却し、ヘキサン（１００ｍＬ×３）で洗浄した。水性層を１００００ＭＷカットオフの再生セルロース透析チューブに注入し、４リットルの１０ｍＭクエン酸ナトリウムに対して１８時間透析した。最終溶液は、溶液１ｍＬ当たり全部で０．６７ｍｇの鉄を含んでいた。かかる物質は９．２ｎｍの粒度を有していた。
【００８３】
水中でのナノ粒子の粒度及び安定性の測定
方法１からのナノ粒子（３６．２ｍｇ）を２ｍＬのＤＩ水に溶解した。溶液を２０ｎｍ濾過膜で濾過した。濾過段階の直後に、平均粒度を動的光散乱（ＤＬＳ）により流体力学的半径として測定した。ＤＬＳによって定期的にモニターしながら、試料を３７℃で１５日間貯蔵した。結果を表１に示す。
【００８４】
【表１】
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実施例４
ナノ粒子の生体分布試験
体重１５０〜５００グラムの範囲内のサイズを有する雄Ｌｅｗｉｓラットを用いてインビボ試験を実施した。ラットは標準的なハウジング内に収容し、食物及び水を随意に与えると共に、１２時間昼夜照明サイクル下に置いた。生体分布試験のために使用したすべての動物は、他の点では未処置の健常被験体であった。
【００８５】
ナノ粒子を水又は食塩水中のフィルター滅菌溶液として投与した。投与は、側尾静脈中に挿入した２６Ｇカテーテルを通して、イソフルラン麻酔（導入４％、維持２％）下で実施した。注射量は注射液中のナノ粒子濃度及びラットのサイズに基づいて決定したが、一般に齧歯類血液量の１０％未満であった。標的用量は、体重１ｋｇ当たり１００ｍｇのコア金属（例えば、タンタル）であった。注射後、動物を麻酔から解放し、悪影響に関する観察期間後に通常のハウジングに戻した。それから最小数分乃至最大６ヶ月の期間後に、ラットを安楽死させ、検査対象器官を回収し、秤量し、ＩＣＰ分析によって総金属（例えば、タンタル）含有量を分析した。注射液の正確な濃度を求めるため、器官と共に注射物質の試料も分析に供した。これらのデータを総合することで、検査対象組織中に残留している注射用量のパーセント（「％ＩＤ」）を求めた。これらのデータは、％ＩＤ／器官又は％ＩＤ／組織１グラムとして報告された。実験は一般に各時点において四重反復試験ラットを用いて実施され、実験誤差（±標準偏差）を求めることができた。
【００８６】
【表２】
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表２は、静脈内注射から１週間後における、非双性イオン性コーティング（ＰＨＳ）並びに双性イオン性コーティング（ＳＺＷＩＳ及びＣＺＷＩＳ）を有する分別ナノ粒子の主要排出器官内の生体分布を示している。「ＮＤ」は「検出せず」を表している。
【００８７】
器官当たりのタンタル保持量が、注射用量に対する分率として表２中に示されている。同等なサイズの非双性イオン性被覆ナノ粒子は、試験した双性イオン性コーティングのいずれよりも遙かに高いレベル（ほぼ１桁高いレベル）で保持されている。
【００８８】
以上、本明細書中には本発明の若干の特徴のみを例示し説明してきたが、当業者には数多くの修正及び変更が想起されるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は本発明の真の技術思想に含まれるこのような修正及び変更のすべてを包含することを理解すべきである。
【符号の説明】
【００８９】
１０  ナノ粒子
２０  コア
３０  コア表面
４０  シェル
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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